Ιατρική Χημεία: Σχεδιασμός και Ανάπτυξη Φαρμακευτικών Προϊόντων

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ, ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΚΑΙ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ Ιατρική Χημεία: Σχεδιασμός και Ανάπτυξη Φαρμακευτικών Προϊόντων ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ «Διερεύνηση μικροβιολογικής ποιότητας καλλυντικών προϊόντων και εκτίμηση κινδύνου για τη δημόσια υγεία» Σατόγλου Μαρία-Φωτεινή Χημικός ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ: Βανταράκης Απόστολος (Αν. Καθηγητής Υγιεινής του Τμήματος Ιατρικής) ΠΑΤΡΑ 2015

2 2

3 UNIVERSITY OF PATRAS DEPARTMENT OF CHEMISTRY, PHARMACY AND MEDICINE INTERDEPARTMENTAL POSTGRADUATE PROGRAMME Medicinal Chemistry: Drug Discovery and Design MASTER THESIS "Investigation of microbiological quality in cosmetics and risk assessment for public health" Satoglou Maria-Foteini Chemist SUPERVISOR: Vantarakis Apostolos (Associate Professor of Public Health in the Department of Medicine) PATRAS

4 4

5 ΜΕΛΗ ΤΡΙΜΕΛΟΥΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ 1. Βανταράκης Απόστολος Επιβλέπων Καθηγητής Αναπληρωτής καθηγητής, Εργαστήριο Υγιεινής Τμήματος Ιατρικής, Πανεπιστημίου Πατρών 2. Σπηλιοπούλου Ίρις Μέλος Τριμελούς Επιτροπής Καθηγήτρια, Εργαστήριο Μικροβιολογίας Τμήματος Ιατρικής, Πανεπιστημίου Πατρών 3.Τσέλιος Θεόδωρος Μέλος Τριμελούς Επιτροπής Επίκουρος Καθηγητής Τμήματος Χημείας, Πανεπιστημίου Πατρών 5

6 6

7 Evaluation Committee 1. Vantarakis Apostolos Supervisor Assοciate Professor, Laboratory of Hygiene Department of Medicine, University of Patras 2. Spiliopoulou Iris Co- examiner Professor, Department of Microbiology School of Medicine, University of Patras 3. Τselios Theodoros Co- examiner Assistant Professor Department of Chemistry, University of Patras 7

8 8

9 Στην οικογένειά μου 9

10 10

11 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Υγιεινής του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών. Η εκπόνηση της συγκεκριμένης διπλωματικής εργασίας, η οποία σχετίζεται με τα καλλυντικά προϊόντα και τον έλεγχο ποιότητάς τους, αποτελεί μέρος των μεταπτυχιακών μου σπουδών στο διατμηματικό μεταπτυχιακό στην Ιατρική Χημεία στο Πανεπιστήμιο Πατρών. Με την εργασία αυτή, μου δόθηκε η δυνατότητα να μελετήσω τόσο τον τομέα των καλλυντικών, όσο και τον τομέα της Μικροβιολογίας. Θα ήθελα να εκφράσω θερμά την ευγνωμοσύνη μου σε όλους που συνέβαλαν στο να ολοκληρωθεί αυτή η εργασία, ειδικότερα, στον επιβλέποντα καθηγητή μου, Αναπληρωτή Καθηγητή του Τμήματος Ιατρικής κ. Απόστολο Βανταράκη για την επιστημονική του καθοδήγηση και την εμπιστοσύνη που μου έδειξε για την ανάθεση της διπλωματικής εργασία.. Ευχαριστίες αρμόζουν επίσης στην δίδα Κούγια Έφη, Βιολόγο, Μεταπτυχιακή φοιτήτρια με την οποία συνεργάστηκα στενά στην συγκεκριμένη διπλωματική εργασία και πάντα ήταν πρόθυμη να ακούσει τα προβλήματά μου και να προτείνει λύσεις οι οποίες ήταν καθοριστικές για την επίτευξή της. Ακόμη, ευχαριστώ την συμφοιτήτριά μου και υπεύθυνη αναλύτρια του εργαστηρίου Περιβαλλοντικής Μικροβιολογίας, Τσελεπή Μαρία, για τις θετικές επιστημονικές της παρατηρήσεις και για το ευχάριστο κλίμα που μας παρείχε στο εργαστήριο καθώς και τον κο Βασιλόπουλο Γαβριήλ για τη βοήθεια που μου προσέφερε μέσα στο εργαστήριο. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω όλα τα μέλη του Eργαστηρίου Υγιεινής για την πρόθυμη συνεργασία τους. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τους γονείς μου, που με στήριζαν πάντα και τους φίλους μου Κωνσταντίνου Πένυ και Δέδε Χρήστο που στάθηκαν δίπλα μου καθ όλη τη διάρκεια της έρευνας αυτής. 11

12 12

13 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Τα καλλυντικά προϊόντα έχουν ενταχθεί στην κοινωνία μας τα τελευταία χρόνια καθώς αποτελούν αγαθά που για πολύ κόσμο θεωρούνται απαραίτητα για την καθημερινή ζωή. Η μόλυνσή τους από ποικίλους παράγοντες είναι ένα φαινόμενο που εμφανίζεται τα τελευταία χρόνια σε παγκόσμιο επίπεδο, αποτελώντας ένα σημαντικό θέμα δημόσιας υγείας. Έτσι λοιπόν, όπως και στον τομέα των φαρμάκων, έτσι και στον τομέα των καλλυντικών, κρίνεται απαραίτητος ο έλεγχος ποιότητάς τους ώστε να γίνεται η χρήση τους με γνώση και ασφάλεια από τους καταναλωτές. Σκοπός της παρούσας έρευνας είναι να μελετηθεί η μικροβιακή ποιότητα καλλυντικών προϊόντων, είτε καινούριων, κλειστών δειγμάτων, είτε ήδη χρησιμοποιημένων, σε ένα ευρύ φάσμα περιβαλλοντικών στελεχών όπως: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli και ολική μεσόφιλη χλωρίδα. Η επιλογή αυτή δεν έγινε τυχαία εφόσον οι ίδιες αναλύσεις γίνονται και στις εξειδικευμένες εταιρείες για τον έλεγχο των καλλυντικών. Επιλέχθηκαν οι συγκεκριμένοι μικροοργανισμοί καθώς είναι στελέχη παθογόνα για τον άνθρωπο και ήδη έχουν αναφερθεί κρούσματα μόλυνσης που σε ορισμένες περιπτώσεις έχουν αποβεί θανατηφόρες, θέτοντας σε κίνδυνο τη δημόσια υγεία. Στην έρευνα αυτή συμμετείχαν γυναίκες διαφόρων ηλικιών και ερωτήθηκαν σχετικά με το προϊόν που χρησιμοποιούσε η καθεμιά βοηθώντας στη συμπλήρωση ενός ερωτηματολογίου όπου αναγράφονται και άλλα χαρακτηριστικά των προϊόντων. Συγκεντρώθηκαν 84 διαφορετικά δείγματα καλλυντικών κρεμών, όπου οι γυναίκες χρησιμοποιούν σε καθημερινή βάση. Οι μικροβιολογικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν υπό άσηπτες συνθήκες και οι μέθοδοι που εφαρμόστηκαν ήταν κυρίως η pour plate και η spread plate method. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια της στατιστικής ανάλυσης του προγράμματος Microsoft Εxcel. Παράλληλα γίνεται μια προσπάθεια για την αξιολόγηση της επικινδυνότητας της μικροβιακής τους μόλυνσης για το ευρύ κοινό. O κίνδυνος που επιφέρουν τα μολυσμένα προϊόντα στη δημόσια υγεία των καταναλωτών είναι ύψιστης σημασίας και οφείλεται είτε στην άγνοια του κοινού, είτε σε ανεπαρκή έλεγχο των προϊόντων. Για το λόγο αυτό, χρειάζεται να ληφθούν μέτρα για την ασφάλεια της υγείας από μέρους τόσο των παραγωγών όσο και των καταναλωτών. Λέξεις κλειδιά: Μικροβιολογική ανάλυση, Μικροοργανισμοί, Καλλυντικά, Εκτίμηση κινδύνου, Δημόσια Υγεία 13

14 14

15 ABSTRACT Recently, cosmetic products have been integrated in our society since they are products that for many people are considered as necessary for daily life. Their contamination by a variety of microorganisms is a worldwide phenomenon, occurring in recent years, converting it to a major public health issue. As in the field of medicine, so in the field of cosmetics, the quality control is essential in order to be aware of the effective use of the products and for the safety of the consumers as well. The purpose of this research is to study the microbial quality of cosmetic products, either new, sealed samples, or already used, in a wide range of environmental microbial strains such as: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Escherichia coli and total mesophilic bacteria. The target microorganisms were not selected randomly but were chosen because most companies specialized on cosmetics, focus the microbial quality assurance on them. These specific bacteria are considered as human pathogens and there are many reported cases of infection that turned out to be fatal to humans, putting public health in danger. In this research, the women that were involved were of different ages and were interviewed about the use of the products, helping us to complete a questionnaire fully detailed about the characteristics of each one. Eighty-four different samples of cosmetic creams that were used on a daily base were collected. Microbiological analyses were performed under aseptic conditions and the methods that were primarily applied were pour plate and spread plate method. The results were analyzed with statistic tools of the Microsoft Excel program. At the same time an attempt was made to assess the risk of their microbial contamination for the public. The risk from contaminated products on public health of consumers is of great importance and probably is due to the ignorance of the public or to inadequate monitoring systems. For this reason, measures need to be taken for the safety of our health both by the part of producers and consumers. Κeywords: Microbiological analysis, Microorganisms, Cosmetics, Risk assessment, Public health 15

16 16

17 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ ΠΕΡΙΛΗΨΗ Λέξεις κλειδιά ABSTRACT keywords ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: ΕΙΣΑΓΩΓΗ- Καλλυντικά Γενικά ιστορικά στοιχεία Ορισμός των καλλυντικών Νομοθεσία για τα καλλυντικά Εκτίμηση της ασφάλειας του προϊόντος Κατηγορίες καλλυντικών προϊόντων Οργανικά καλλυντικά Φυσικής προέλευσης καλλυντικά Συνθετικά ή συνθετικής προέλευσης καλλυντικά Συστατικά των καλλυντικών Ενεργά συστατικά Ανενεργά συστατικά (έκδοχα) Καλλυντικές κρέμες Σύσταση και χαρακτηριστικά Διάρκεια ζωής των καλλυντικών προϊόντων Καλλυντικά και αλλεργίες Μολυσματικοί παράγοντες Εισαγωγή στην Μικροβιολογία Μορφολογικά στοιχεία των βακτηρίων Ταξινόμηση των βακτηρίων Κύκλος ζωής και ανάπτυξη των βακτηρίων Είδη παθογόνων και δυνητικά παθογόνων βακτηρίων Ολική μεσόφιλη χλωρίδα (ΟΜΧ) Escherichia coli Μορφολογία και γενικά χαρακτηριστικά Escherichia coli στο περιβάλλον και λοιμώξεις

18 1.8.3 Pseudomonas aeruginosa Μορφολογία και γενικά χαρακτηριστικά Pseudomonas aeruginosa στο περιβάλλον και λοιμώξεις Staphylococcus aureus Μορφολογία και γενικά χαρακτηριστικά Staphylococcus aureus στο περιβάλλον και λοιμώξεις Kαλλυντικά και Δημόσια Υγεία Μικροβιακή χλωρίδα κα παθογόνα βακτήρια στα καλλυντικά Μικροβιολογικές αλλοιώσεις Επικινδυνότητα Επιδημιολογία των λοιμώξεων από καλλυντικά Έλεγχος ποιότητας των καλλυντικών- Challenge test...67 ΣΚΟΠΟΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ. 71 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Υλικά Σκεύη και εξοπλισμός Αναλώσιμα Θρεπτικά υλικά και αντιδραστήρια Παρασκευή θρεπτικών υλικών και διαλυμάτων Διαλύτης για τις δεκαδικές αραιώσεις Tryptic Soy Agar για ανίχνευση της ΟΜΧ Tryptone Bile X-glucuronide Agar για ανίχνευση του E.coli Baird Parker Agar για ανίχνευση του S.aureus BBL Brain Heart Infusion για ταυτοποίηση του S.aureus Pseudomonas selective Agar για ανίχνευση της P.aeruginosa Acetamide Nutrient Broth για ταυτοποίηση της P.aeruginosa Peptone Saline για αναζωογόνηση των μικροοργανισμών Μέθοδοι Μέθοδος δειγματοληψίας Μέθοδοι μικροβιολογικών αναλύσεων Άσηπτες μέθοδοι εργασίας Μέθοδος αποστείρωσης

19 Μέθοδος διαδοχικών αραιώσεων Μέθοδος καλλιέργειας σε στερεό θρεπτικό μέσο (pour plate) Mέθοδος διασποράς σε στερεό θρεπτικό μέσο (spread plate) Πειραματική πορεία Προκατεργασία δείγματος Μικροβιολογικές αναλυσεις Καταμέτρηση ολικής μεσόφιλης χλωρίδας Καταμέτρηση E.coli Καταμέτρηση P.aeruginosa Καταμέτρηση S.aureus Επικύρωση της μεθόδου ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3: ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Διαχωρισμός δειγμάτων ανά κατηγορία καλλυντικού Διαχωρισμός δειγμάτων με βάση το κόστος Ομαδοποίηση ερωτηθέντων με βάση την ηλικία Ομαδοποίηση δειγμάτων με βάση το χρόνο ανοίγματος Ακρίβεια των μετρήσεων Καταλληλότητα δειγμάτων ως προς τη χρήση Σχέση του χρόνου ανοίγματος των προϊόντων με την καταλληλότητά τους Καταλληλότητα προϊόντων σύμφωνα με τα αποτελέσματα των μικροβιολογικών αναλύσεων Συσχέτιση ακατάλληλων δειγμάτων με το κόστος και το χρόνο ανοίγματος Αποτελέσματα από το τεστ εγκυρότητας

20 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4: ΣΥΖΗΤΗΣΗ 125 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΝΟΜΟΘΕΣΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙΙ ΕΥΡΩΠΑΪΚΗ ΝΟΜΟΘΕΣΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙΙΙ ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΚΑΛΛΥΝΤΙΚΟΥ. 159 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙV ΕΡΩΤΗΜΑΤΟΛΟΓΙΟ

21 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Ο ΕΙΣΑΓΩΓΗ Καλλυντικά 21

22 1.1 Γενικά ιστορικά στοιχεία Εδώ και χιλιάδες χρόνια τα καλλυντικά προϊόντα διαδραματίζουν πολύ σημαντικό ρόλο στη ζωή των ανθρώπων. Από την αρχαιότητα, η χρήση καλλυντικών προϊόντων απαντάται σε πολλούς λαούς όπως της Αιγύπτου, της Κίνας, της Ινδίας, της Ελλάδας και της Ρώμης. Οι βασικότερες πηγές της ιστορίας για την χρήση των καλλυντικών είναι από πίνακες, γλυπτά, τοιχογραφίες και γραπτά κείμενα. Τα πρώτα αρχαιολογικά στοιχεία για την χρήση των καλλυντικών προέρχονται από την Αίγυπτο γύρω στο 3500 π.χ. Κρέμα περίπου ετών βρέθηκε στον τάφο του Τουταγχαμών μαζί με πολλά άλλα δοχεία καλλυντικών προϊόντων. Η Κλεοπάτρα, βασίλισσα της Αιγύπτου, χρησιμοποιούσε μεγάλο αριθμό καλλυντικών προϊόντων και αρωμάτων τόσο για το σώμα όσο και για το πρόσωπο. Στην Αίγυπτο εκείνης της εποχής, υπήρχε συνταγή κρέμας αντιμετώπισης των ρυτίδων. Την ίδια εποχή, επίσης, έτριβαν το δέρμα τους με λάδια και αρώματα (Chaudhri and Jain, 2009). Ο αρχαίος ελληνικός πολιτισμός επιδεικνύει επίσης μια ποικιλία στοιχείων σχετικά με τον καλλωπισμό του ανθρώπου. Οι άνθρωποι σύμφωνα με ιστορικές πηγές είχαν αναπτύξει πολλές συνταγές καλλυντικών χρησιμοποιώντας ως συστατικά άγρια φυτά, φυτικά έλαια και κατσικίσιο γάλα (Adkins and Roy,1998). Ακόμη, χρησιμοποιούσαν πάστες με βάση το χαλκό ή τον λευκό μόλυβδο για την λεύκανση του προσώπου. Πρόκειται για μια παράδοση που πέρασε στην συνέχεια και στους Ρωμαίους. Οι Εβραίοι, για την προστασία από τον ήλιο χρησιμοποιούσαν ελαιόλαδο, αμύγδαλα, σπόρους σουσαμιού, κολοκύθια καθώς και λιπαρά στοιχεία από ζώα ή ψάρια. Στο Βυζάντιο χρησιμοποιούσαν διάφορα υλικά για τον καθαρισμό του προσώπου με κυριότερα την κιμωλία, το λάδι, τα φύκια και το μέλι. Για τη λεύκανση του προσώπου χρησιμοποιούσαν ψιμύθιο, συνδυασμός ανθρακικού μολύβδου και λευκής σκόνης (Butler, 2010; Draelos, 2000). Στη μεσαιωνική περίοδο, αν και η χρήση τους αποδοκιμάστηκε από τους εκκλησιαστικούς ηγέτες, πολλές γυναίκες χρησιμοποιούσαν ακόμα καλλυντικά. Αρκετά δημοφιλής ήταν η επιθυμία των γυναικών να έχουν χλωμό δέρμα, το οποίο μπορούσε να επιτευχθεί είτε εφαρμόζοντας πάστες μολύβδου είτε αλεύρου (Rao and Prathiba, 1998). Η υπερβολική χρήση του μολύβδου όμως την εποχή αυτή οδήγησε μεγάλο πληθυσμό στο θάνατο. Από τον 20 ο αιώνα και έπειτα επήλθε αλματώδης βιομηχανική ανάπτυξη και η σύνθεση των καλλυντικών προϊόντων βελτιώθηκε ραγδαία. Από το 1908 κιόλας άρχισε ο ιατρικός έλεγχος σε όλες σχεδόν τις χώρες της Ευρώπης και σταμάτησε και η χρήση τοξικών ουσιών για τη σύνθεση των προϊόντων. Άρχισε η εισαγωγή ζωικών εκχυλισμάτων στα προϊόντα και συνεπώς και τα πειράματα σε ζώα για τη διαπίστωση της ασφάλειάς τους. (Burlando et al., 2010; Schneider et al., 2005) 22

23 1.2 Ορισμός των καλλυντικών Η ονομασία «καλλυντικό» σχετίζεται ετυμολογικά με τη λέξη «κάλλος». Σύμφωνα με την ισχύουσα ελληνική νομοθεσία όπως δημοσιεύεται στο ΦΕΚ 352/Β / υπ αρ. Άρθρο 2 : Ως «καλλυντικό» νοείται κάθε ουσία ή παρασκεύασμα που προορίζεται να έλθει σε επαφή με διάφορα εξωτερικά μέρη του ανθρωπίνου σώματος (επιδερμίδα, τριχωτά μέρη του σώματος και της κεφαλής, νύχια, χείλη και εξωτερικά γεννητικά όργανα) ή με τα δόντια και το βλεννογόνο της στοματικής κοιλότητας με αποκλειστικό ή κύριο σκοπό τον καθαρισμό τους, τον αρωματισμό τους, τη μεταβολή της εμφάνισής τους ή/και τη διόρθωση των σωματικών οσμών ή/και την προστασία τους ή τη διατήρησή τους σε καλή κατάσταση (Oyedeji et al., 2011; ΦΕΚ 352/Β / , ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ II-article 1) Η Αμερικανική Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA), η οποία ελέγχει τα καλλυντικά στις Ηνωμένες Πολιτείες, ορίζει τα καλλυντικά ως: προϊόντα που προορίζονται να χρησιμοποιηθούν στο ανθρώπινο σώμα για τον καθαρισμό, καλλωπισμό, προώθηση της ελκυστικότητας, ή να τροποποιήσουν την εμφάνιση χωρίς να επηρεάζουν τη δομή του σώματος ή τις λειτουργίες του (Lewis, 1998; Reed, 2007). Τα καλλυντικά προϊόντα χρησιμοποιούνται επίσης: 1. Ως συμπληρωματική αγωγή διαφόρων δερματικών καταστάσεων ή νόσων, όπως: δυσχρωμία, απολέπιση, ξηροδερμία, ακμή, δερματίτιδα, πιτυρίδα κ.ά. 2. Για την πρόληψη ποικίλων δερματοπαθειών, όπως: καρκίνος δέρματος, φωτογήρανση 3. Στην αντιμετώπιση μεταθεραπευτικών καταστάσεων, όπως: μεταφλεγμονώδεις ουλές ακμής, εγκαυμάτων κ.ά. Στο σημείο αυτό σημειώνουμε ότι τα καλλυντικά δεν πρέπει να βλάπτουν την ανθρώπινη υγεία όταν χρησιμοποιούνται υπό κανονικές ή εύλογα αναμενόμενες συνθήκες χρήσης (Πουλάς και συν., 2014; Παπαϊωάννου, 2010). 23

24 1.3 Νομοθεσία για τα καλλυντικά Η ύπαρξη προειδοποιήσεων πάνω στη συσκευασία των καλλυντικών δεν απαλλάσσει τον προμηθευτή από την ευθύνη του να θέτει στην αγορά μόνο ασφαλή προϊόντα. Για το λόγο αυτό, οι παρασκευαστικές εταιρείες καλούνται να ακολουθούν ορθά την ισχύουσα νομοθεσία της εκάστοτε χώρας. Η Επιστημονική Επιτροπή Κοσμετολογίας (SCC) ιδρύθηκε το 1978 στα πλαίσια της Ευρωπαϊκής Ένωσης, προκειμένου να βοηθήσει τις ευρωπαϊκές χώρες-μέλη στην εφαρμογή της σχετικής κοινοτικής οδηγίας 76/768/EEC, η οποία ρυθμίζει την παραγωγή και πώληση καλλυντικών προϊόντων. Τα καλλυντικά προϊόντα που διατίθενται στην αγορά της Ε.Ε πρέπει να είναι ασφαλή για την ανθρώπινη υγεία όταν χρησιμοποιούνται υπό κανονικές και εύλογα προβλέψιμες συνθήκες. Για τον σκοπό αυτό, ο κανονισμός (ΕΚ) αριθ. 1223/2009 απαιτεί τα καλλυντικά προϊόντα να υπάγονται σε εκτίμηση ασφάλειας ώστε να διαπιστωθεί εάν το καλλυντικό προϊόν είναι ασφαλές υπό τις συνθήκες αυτές ή όχι (CPNP, 2013). Με την εφαρμογή του κανονισμού (ΕΚ) 1223/2009 για τα καλλυντικά προϊόντα, οι κυριότερες αλλαγές στον τομέα των καλλυντικών είναι: Αυστηρότερες απαιτήσεις ασφαλείας για τα καλλυντικά προϊόντα. Εισαγωγή της έννοιας του «υπεύθυνου προσώπου» Κοινοποίηση στην Ευρωπαϊκή βάση δεδομένων CPNP όλων των καλλυντικών προϊόντων που διατίθενται στην αγορά της ΕΕ. Εισαγωγή της αναφοράς των σοβαρών ανεπιθύμητων ενεργειών. Νέοι κανόνες για τη χρήση των νανοϋλικών στα καλλυντικά προϊόντα. Η έναρξη της ισχύος και η ημερομηνία εφαρμογής των περισσοτέρων άρθρων είναι η 11 Ιουλίου 2013 μεταξύ των οποίων και του άρθρου 8 για την ορθή παρασκευαστική πρακτική (Pauwels and Rogiers, 2011). Κύρια άρθρα του κανονισμού (ΕΚ) αριθ. 1223/2009 είναι: Άρθρο 4 Υπεύθυνο πρόσωπο Άρθρο 5 Υποχρεώσεις του υπεύθυνου προσώπου Άρθρο 8 Ορθή παρασκευαστική πρακτική Άρθρο 7 Ταυτοποίηση εντός των ορίων της εφοδιαστικής αλυσίδας Άρθρο 10 Εκτίμηση ασφάλειας Άρθρο 11 Φάκελος πληροφοριών προϊόντος 24

25 Άρθρο 13 Κοινοποίηση Άρθρο 16 Νανοϋλικά Άρθρο 19 Επισήμανση Άρθρο 22 Εσωτερικός έλεγχος της αγοράς Άρθρο 23 Γνωστοποίηση σοβαρών ανεπιθύμητων ενεργειών Άρθρο 25 Μη συμμόρφωση του υπεύθυνου προσώπου Άρθρο 37 Κυρώσεις (ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι) Ακολουθείται μια απλουστευμένη διαδικασία κατά την οποία γνωστοποιείται η κυκλοφορία τους στον Εθνικό Οργανισμό Φαρμάκων (Ε.Ο.Φ.) και οι υπεύθυνοι είναι υποχρεωμένοι να τηρούν φάκελο με στοιχεία για την παραγωγή, τον έλεγχο και την ασφάλεια των προϊόντων τους, ο οποίος είναι στη διάθεση του Ε.Ο.Φ. σύμφωνα με τις σχετικές οδηγίες της Ευρωπαϊκής Επιτροπής. Ο Ε.Ο.Φ. απαγορεύει την κυκλοφορία στην αγορά καλλυντικών που δεν είναι ασφαλή (περιέχουν δηλαδή επικίνδυνες ουσίες), που έχουν δοκιμαστεί σε ζώα, που φέρουν παραπλανητική ή καθόλου σήμανση και που δεν τηρεί ο προμηθευτής τους το φάκελο με τις πληροφορίες που προβλέπονται από τη νομοθεσία. Τα καλλυντικά φέρουν αριθμό άδειας κυκλοφορίας από τον Ε.Ο.Φ. ή την αντίστοιχη ευρωπαϊκή αρχή, που είναι ο Ευρωπαϊκός Οργανισμός φαρμάκων ΕΜΕΑ. Ο αριθμός αυτός πρέπει να αναγράφεται οπωσδήποτε στη συσκευασία, αλλιώς το προϊόν μπορεί να κυκλοφορεί παράνομα ή να είναι επικίνδυνο. Με τη νέα ευρωπαϊκή νομοθεσία, η εκτίμηση ασφαλείας του καλλυντικού προϊόντος δεν είναι απαραίτητο να διενεργείται στην χώρα κατασκευής του προϊόντος, αλλά μπορεί να γίνει σε οποιαδήποτε χώρα εντός Ε.Ε. Ήδη υπάρχουν αρκετές ιδιωτικές εταιρίες στο Ηνωμένο Βασίλειο, την Γαλλία και αλλού που διενεργούν ελέγχους «safety assessment» για την ποιότητα των καλλυντικών. Ακόμα και στην Ελλάδα υπάρχουν αρκετές ιδιωτικές εταιρίες που αναλαμβάνουν να διεκπεραιώσουν εκτιμήσεις ασφαλείας και ποιότητας [ΚΑΝΟΝΙΣΜΌΣ (ΕΚ) αριθ. 1223/2009 του Ευρωπαϊκού Κοινοβουλίου και του συμβουλίου της 30ής Νοεμβρίου 2009 για τα καλλυντικά προϊόντα; Official Journal of the European Union, 2009; Pauwels and Rogiers, 2007, 2011]. Όσον αφορά τις μικροβιολογικές προδιαγραφές της ουσίας ή του μείγματος ουσιών και του καλλυντικού προϊόντος, ιδιαίτερη προσοχή δίνεται σε καλλυντικά που χρησιμοποιούνται γύρω από τα μάτια, γενικά στους βλεννογόνους ή σε δέρμα με βλάβες, σε παιδιά ηλικίας κάτω των τριών ετών, σε ηλικιωμένους και σε άτομα με μειωμένη ανοσολογική απόκριση (USP 34, 2011). Πιο συγκεκριμένα, η νομοθεσία προβλέπει: 25

26 Α) Τα προϊόντα που προορίζονται για μωρά ή για την περιοχή των ματιών, πρέπει μα περιέχουν λιγότερα από 100 cfu ανά gr ή ml προϊόντος (όπου cfu είναι οι «colony forming units»). Β) Όλα τα άλλα προϊόντα πρέπει να περιέχουν λιγότερα των cfu ανά gr ή ml προϊόντος. Γ) Μικρόβια που είναι παθογόνα, όπως Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Candida albicans, δεν πρέπει να περιέχονται καθόλου στο προϊόν (Detmer et al., 2010). Στο σημείο αυτό χρειάζεται να αναφέρουμε ότι σε άλλες ηπείρους όπως για παράδειγμα στην Αμερική και στην Ασία η νομοθεσία διαφοροποιείται ως προς τον αριθμό αποικιών και τα γραμμάρια του προϊόντος (Lundov et al., 2009; ΚΑΝΟΝΙΣΜΟΣ ΕΕ αριθ. 655/2013; ISO 18415). Για χώρες της Ε.Ε. στη συσκευασία των καλλυντικών προϊόντων πρέπει να αναφέρεται: Το όνομα ή η επωνυμία και η διεύθυνση του κατασκευαστή ή του εκπροσώπου του, ο οποίος έχει θέσει το προϊόν σε κυκλοφορία στην Ευρωπαϊκή αγορά Η χώρα προέλευσης, σε περίπτωση που το καλλυντικό παρασκευάστηκε εκτός Ευρωπαϊκής Ένωσης Τα συστατικά του προϊόντος κατά σειρά βάρους ή όγκου Η ημερομηνία λήξης Το χρονικό διάστημα μέσα στο οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί το προϊόν, από τη στιγμή που έχει ανοιχτεί, χωρίς να βλάψει τον καταναλωτή (Για παράδειγμα όταν αναγράφεται 12 Μ σημαίνει 12 μήνες.) Τυχόν ειδικές προφυλάξεις οι οποίες πρέπει να ληφθούν (Σε περίπτωση όπου δεν επαρκεί χώρος στη συσκευασία για να αναγραφούν όλες οι προφυλάξεις, πρέπει να τίθεται ειδικό φυλλάδιο με όλες τις απαραίτητες πληροφορίες.) Ο αριθμός αναφοράς ή ο αριθμό έγκρισης που έχει λάβει το προϊόν στην άδεια κυκλοφορίας του Η χρησιμότητα του προϊόντος (ΙSO 18415; ISO 22717; ISO 22718; ISO 16212; ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙΙ, article 5 and 6) 26

27 1.3.1 Εκτίμηση της ασφάλειας του προϊόντος Τόσο οι μικροβιολογικές προδιαγραφές των πρώτων υλών, όσο του τελικού προϊόντος και του challenge test, πρέπει να περιέχονται στην έκθεση ασφάλειας καλλυντικού προϊόντος. Στο κείμενο της νομοθεσίας αναφέρεται ότι «Ιδιαίτερη προσοχή δίνεται σε καλλυντικά που χρησιμοποιούνται γύρω από μάτια, γενικά στους βλεννογόνους, ή σε δέρμα με βλάβες, σε παιδιά ηλικίας κάτω των τριών ετών, σε ηλικιωμένους και σε άτομα που εμφανίζουν μειωμένη ανοσολογική απόκριση». O αξιολογητής ασφάλειας θα κρίνει εάν το όριο ασφάλειας που έχει τεθεί είναι αρκετό ή όχι. Ως επακόλουθο, καλείται να αξιολογήσει όλες τις παραπάνω πληροφορίες και να καταλήξει σε μία τεκμηριωμένη και σαφή δήλωση ασφάλειας του τελικού προϊόντος. Όλη αυτή η άσκηση απαιτεί αρκετή εμπειρία και μεγάλη δόση κοινής λογικής από τον αξιολογητή ασφάλειας. Στην καλύτερη περίπτωση μπορεί να στηριχθεί σε in vitro / in vivo μελέτες του τελικού προϊόντος, οι οποίες ωστόσο δεν είναι εύκολο να διεκπεραιώνονται για κάθε προϊόν. Για προϊόντα που ήδη κυκλοφορούν στην αγορά για κάποιο χρονικό διάστημα, τα αρχεία του συστήματος παραπόνων παίζουν σημαντικό ρόλο στην αξιολόγηση. Σε αυτό το σημείο αναφέρεται μόνο το τελικό συμπέρασμα, ενώ η αιτιολόγηση αναφέρεται σε ξεχωριστό σημείο (Nohynek et al., 2010; Pauwels and Rogiers, 2007,2010). O αξιολογητής μπορεί να αποδώσει με διαφορετικούς τρόπους το συμπέρασμα. Μπορεί, λαμβάνοντας υπόψη όλα τα παραπάνω, να εκτιμήσει ότι το προϊόν δεν εμπεριέχει κανένα πρόβλημα για την ανθρώπινη υγεία κάτω από κανονική και εύλογα αναμενόμενη χρήση, ενώ με βάση την πιο πρόσφατη επιστημονική γνώση μπορεί να υποδείξει κάποιες τροποποιήσεις, πριν δώσει την τελική του έγκριση (όπως π.χ. αλλαγές στον τρόπο χρήσης, στο ποσοστό κάποιων ουσιών, στην ετικέτα κ.τ.λ.) (ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΙΙΙ). Για την τελική έγκριση του προϊόντος συνοπτικά λαμβάνονται τα εξής μέτρα: Υπολογίζονται και συζητούνται τα περιθώρια ασφάλειας. Γίνεται ειδική αξιολόγηση για καλλυντικά προϊόντα τα οποία απευθύνονται σε παιδιά κάτω των τριών ετών και προϊόντα που προορίζονται για την υγιεινή των ευαίσθητων περιοχών. Εκτιμώνται πιθανές αλληλεπιδράσεις ουσιών που περιέχει το καλλυντικό προϊόν. Η εξέταση ή η μη εξέταση κάποιων τοξικολογικών ουσιών πρέπει να δικαιολογηθεί. Εξετάζονται και οι επιπτώσεις της σταθερότητας στην ασφάλεια του καλλυντικού προϊόντος (Rodriguez, 2002; Nohynek et al., 2010) 27

28 1.4 Κατηγορίες καλλυντικών προϊόντων Σύμφωνα με την ισχύουσα ελληνική νομοθεσία όπως δημοσιεύεται στο ΦΕΚ 352/Β / στο Παράρτημα 1, τα καλλυντικά χωρίζονται στις εξής κατηγορίες: - Κρέμες, γαλακτώματα, λοσιόν, πηκτώματα (gels) και λάδια για το δέρμα (χέρια, πρόσωπο, πόδια κλπ.) - Μάσκες ομορφιάς (εξαιρουμένων των συνθετικών απολεπιστικών προϊόντων-peeling) - Χρωματισμένες βάσεις μακιγιάζ (υγρά, κρέμες, πούδρες) - Πούδρες για μακιγιάζ, για χρήση μετά το λουτρό, για την υγιεινή του σώματος κλπ. - Σαπούνια λουτρού, αποσμητικά σαπούνια κλπ. - Αρώματα, κολόνιες, κλπ. - Παρασκευάσματα για το λουτρό και το ντους (άλατα, αφροί, λάδια, πηκτώματα κλπ.) - Αποτριχωτικά - Αποσμητικά και αντιιδρωτικά - Προϊόντα για την περιποίηση των μαλλιών - Προϊόντα ξυρίσματος - Προϊόντα για το μακιγιάζ και το ντεμακιγιάζ του προσώπου και των ματιών - Προϊόντα που προορίζονται να χρησιμοποιηθούν στα χείλη - Προϊόντα για την περιποίηση των δοντιών και του στόματος - Προϊόντα για την περιποίηση και το βάψιμο των νυχιών - Προϊόντα εξωτερικής χρήσεως για την περιποίηση των ευαίσθητων περιοχών - Προϊόντα αντηλιακά - Προϊόντα για μαύρισμα χωρίς ήλιο - Προϊόντα για την λεύκανση του δέρματος - Προϊόντα αντιρυτιδικά (Γκελμπέσης, 2006) 28

29 Λαμβάνοντας υπόψη τη σύσταση των καλλυντικών, μπορούμε να διακρίνουμε τις εξής κατηγορίες: τα οργανικά καλλυντικά, τα καλλυντικά φυσικής προέλευσης και τα καλλυντικά συνθετικής προέλευσης Οργανικά καλλυντικά Πρόκειται για καλλυντικά προϊόντα όπου η παρασκευή τους πληροί όλους τους διεθνείς κανονισμούς περί μεθόδων παραγωγής και πιστοποίησης προϊόντων βιολογικής γεωργίας. Αποτελούνται από φυτά σε διάφορες μορφές και από μία ελάχιστη ποσότητα μεταλλικών στοιχείων. Οφείλουν να είναι πιστοποιημένα από τον διεθνή Οργανισμό ECOCERT/COSMEBIO (Chen, 2009; Βέγκος, 2004) Φυσικής προέλευσης καλλυντικά Η συγκεκριμένη κατηγορία καλλυντικών περιέχει συνήθως μερικά ή όλα τα ενεργά συστατικά από φυσικές ουσίες και ίσως μέρος των ανενεργών. Είναι γενικά αποδεκτό ότι σαν φυσικά χαρακτηρίζονται τα καλλυντικά προϊόντα των οποίων τα συστατικά και κυρίως οι δραστικοί παράγοντες (active agents), οι ουσίες δηλαδή που χρησιμοποιούνται με σκοπό να δώσουν τις επιδιωκόμενες καλλυντικές ιδιότητες, έχουν φυσική προέλευση. Τα φυσικά καλλυντικά μπορεί να έχουν φυτικά (π.χ. εκχυλίσματα, αιθέρια έλαια, δραστικά συστατικά των φυτών κ.ά.), ζωικά, θαλάσσιας ή ορυκτής προέλευσης συστατικά με τη λιγότερη και πιο ασφαλή, δυνατή επεξεργασία. Στην πλειοψηφία των περιπτώσεων, το ποσοστό των πραγματικών φυτικής προέλευσης προϊόντων ποικίλει από 10%-80%, όμως δε μπορεί να φτάσει το 100% και ενδέχεται να περιέχουν και ποσότητα συνθετικών ουσιών (Millikan, 2001; Chen, 2009) Συνθετικά ή συνθετικής προέλευσης καλλυντικά Είναι η πιο ευρέως διαδεδομένη κατηγορία καλλυντικών σήμερα και τα προϊόντα της αποτελούνται στο μεγαλύτερο ποσοστό τους από συστατικά χημικής-συνθετικής προέλευσης. Μπορεί να περιέχουν και αυτά φυτικά, ζωικά συστατικά, ιχθυέλαια, συστατικά ορυκτής προέλευσης τα οποία έχουν υποστεί χημικές διεργασίες. Έχουν τα περισσότερα μείγματα συστατικών και τον τελευταίο καιρό έχουν ενοχοποιηθεί για το πλήθος των 29

30 αρνητικών επιδράσεων για την ανθρώπινη υγεία λόγω αλλεργιών που δύναται να προκαλέσουν (Βέγκος, 2004). Ο κυριότερος λόγος για τον οποίο οι εταιρίες συνθετικών καλλυντικών είναι κατά πλειοψηφία περισσότερες, είναι διότι υπάρχει μεγάλη προσφορά των πρώτων υλών και η παρασκευή των προϊόντων αυτών οδηγεί σε άμεσα και δραστικά αποτελέσματα. Τα συστατικά που συνήθως χρησιμοποιούνται στα συνθετικά καλλυντικά και πρέπει να γνωρίζουμε λόγω των βλαβερών τους συνεπειών είναι: Λιθανθρακόπισσα (coal tar) Φορμαλδεΰδες Παραφενυλονοδιαμίνη (P-phenylenediamine ή PPD) Πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) Λαουρυλ θειικό νάτριο (Sodium Lauryl Sulface) Συνθετικά χρώματα Πετρελαιοειδή ή ορυκτέλαια (paraffin oil, petrolatum) Ενώσεις τεταρτοταγούς Αμμωνίου Συνθετικά αρώματα Parabens (κυρίως το butyl και isobutyl paraben) Σιλικόνη και παράγωγά της (Dimethicone, Cyclomethicone) Κάποιοι επιστήμονες ισχυρίζονται ότι τα συστατικά που έχουν κατά καιρούς ενοχοποιηθεί χρησιμοποιούνται σε τόσο μικρές ποσότητες στα καλλυντικά που τα καθιστούν ασφαλή χωρίς όμως να συνυπολογίζουν ότι οι ουσίες αυτές έχουν «αθροιστική δράση» (Melloship, 2009; Chen, 2009). 30

31 1.5 Συστατικά των καλλυντικών Τα συστατικά που περιέχουν τα καλλυντικά διακρίνονται γενικά σε δυο κατηγορίες: στα ενεργά συστατικά, που είναι δηλαδή οι δραστικές ουσίες και στα ανενεργά, γνωστά στο ευρύ κοινό και ως «έκδοχα» Ενεργά συστατικά Είναι εκείνα που προσδίδουν την βιολογική δράση του καλλυντικού και επιδρούν θετικά στον ιστό με τον οποίο έρχονται σε επαφή. Ο συνδυασμός περισσοτέρων του ενός ενεργών συστατικών σε μια κρέμα δεν είναι πάντα αποτελεσματικός. Ορισμένα δραστικά συστατικά δεν απορροφώνται με την ίδια ευκολία από την επιδερμίδα, οπότε η ανάμιξη περισσοτέρων δημιουργεί προβλήματα στην απορρόφηση του καλλυντικού και πολυπλοκότητα στη συνταγή μας. Ανάλογα με το εκάστοτε συστατικό που θέλουμε να χρησιμοποιήσουμε υπάρχουν κάποιοι ενδεδειγμένοι συνδυασμοί που είναι ασφαλείς και που μπορούν να έχουν πράγματι αποτελεσματική δράση στο δέρμα. Τα βασικότερα ενεργά συστατικά προέρχονται από φυτικά έλαια, υδρογλυκολικά εκχυλίσματα και χημικά καθαρά ενεργά συστατικά (Dweck, 2001; Otto et al., 2008). Τα υδρογλυκολικά εκχυλίσματα προέρχονται από τη διάλυση ενός εκχυλίσματος νερού με γλυκόλη από φυτά που παραμένουν σε νερό. Είναι τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα στην κοσμητολογία, εξαιτίας της πολύ καλής διαλυτότητάς τους και της εύκολης ενσωμάτωσης σε φόρμουλα (Carretero and Poso, 2010). Φλαβονοειδή, τανίνες, σαπωνίνες, υδατοδιαλυτές βιταμίνες (Β και C), αμινοξέα κ.λπ. μπορούν να εξαχθούν από φυτά με αυτήν την τεχνική. Τα φυτικά έλαια έχουν υγρή συνοχή και αποτελούνται κυρίως από τριγλυκερίδια: μακρές αλυσίδες κορεσμένων και ακόρεστων λιπαρών οξέων με γλυκερίνη. Παραλαμβάνονται με τεχνικές εκχύλισης με μη πολικούς διαλύτες. Τα αιθέρια έλαια είναι ενεργά συστατικά τα οποία προσδίδουν στην κρέμα το βασικό χαρακτηριστικό, πχ. το έλαιο τριαντάφυλλου είναι αντιρυτιδικό. Τα περισσότερα παράγονται από απόσταξη καρπών, ανθών κτλ. και το καθένα έχει τις δικές του ιδιότητες. Η αλλαντοΐνη, η ελαστίνη, το υαλουρονικό οξύ, το κολλαγόνο, το κιτρικό οξύ και τα υπόλοιπα οξέα φρούτων είναι από τα πιο διαδεδομένα ενεργά συστατικά που χρησιμοποιούνται (Καμμένου και συν.,2007; Carretero and Poso, 2010). 31

32 1.5.2 Ανενεργά συστατικά (έκδοχα) Πρόκειται για βοηθητικές ουσίες χωρίς δράση, με σκοπό να βοηθούν τη σταθερότητα και την υφή των προϊόντων. Τα ανενεργά συστατικά όχι μόνο δεν ωφελούν τον ιστό αλλά μπορεί να τον βλάψουν σοβαρά (Otto et al., 2008). Επιπλέον το δέρμα αναπτύσσει αμυντικούς μηχανισμούς αποβολής των συνθετικών ουσιών με αποτέλεσμα να εμποδίζεται η διείσδυση των ενεργών συστατικών του καλλυντικού με αποτέλεσμα αυτό να καθίσταται αναποτελεσματικό. Αντίθετα, στα φυσικά καλλυντικά τα οποία δεν περιέχουν ανενεργά συστατικά, το δέρμα απορροφά σε βάθος τα ενεργά συστατικά με αποτέλεσμα να παρέχουν αποτελεσματική προστασία και φροντίδα του δέρματος (Winter, 2009). Αυτά τα συστατικά είναι: Οι γαλακτωματοποιητές: Είναι ουσίες που δίνουν τη γαλακτώδη σύσταση στο μείγμα του καλλυντικού. Ο γαλακτωματοποιητής για τα φυσικά καλλυντικά είναι κυρίως το κερί μέλισσας ή κάποιο άλλο φυτικό κερί ή έλαιο που έχουν υποστεί ήπια χημική επεξεργασία. Σε πολλά καλλυντικά ως γαλακτωματοποιητής αναφέρεται το στεατικό οξύ (Miller et al., 2001). Τα συντηρητικά: Είναι οι ουσίες που διατηρούν το παρασκεύασμα σταθερό και ελεύθερο μικροβίων. Δεν πρέπει να συγχέονται με τα αντισηπτικά γιατί τα τελευταία δρουν επί των μικροοργανισμών που τυχόν υπάρχουν στο δέρμα, στο στόμα ή σε άλλο σημείο του σώματος. Τα πιο κοινά χημικά συντηρητικά είναι οι παραβένες (parabens), ιμιδουρία (imidazolidinyl urea), σορβικό οξύ, διμεθυλόδιμεθυλ υδαντοΐνη (DMDM υδαντοΐνης), βενζοϊκό οξύ και βενζυλική αλκοόλη (Gruvberger et al., 1998). Υπάρχουν και ορισμένα φυσικά συντηρητικά που είναι γνωστά με τις ονομασίες: neem seed και tea tree oil. Επίσης ως φυσικά συντηρητικά λειτουργούν εκχυλίσματα από σπόρους γκρέιπφρουτ και διάφορα αιθέρια έλαια (Abu et al., 2014). Καλλυντικά που περιέχουν συγκεντρώσεις 40 και 50 % γλυκερίνης και σορβιτόλης αποτελούν λόγω ωσμωτικής πίεσης ανασταλτικό παράγοντα αναπτύξεων μικροβίων (Παπαϊωάννου και Ράλλης, 2008). Τα αρώματα: Στην πλειονότητά τους είναι συνθετικές ουσίες που προσδίδουν ευχάριστο άρωμα στα καλλυντικά προϊόντα. Συνήθως είναι οργανικές ενώσεις όπως αλκοόλες, αλδεΰδες ή κετόνες, από ζωικές ή φυσικές πηγές, οι οποίες περιλαμβάνονται κυρίως στα αιθέρια έλαια (Larsen, 1997). 32

33 Τα χρώματα: Είναι πολυάριθμες ενώσεις, που ανευρίσκονται σε ποικίλα καλλυντικά προϊόντα του προσώπου και περιλαμβάνουν: 1. Χημικές χρωστικές, πχ. Οξείδιο του ψευδαργύρου, διοξείδιο του τιτανίου κ.ά. 2. Φυτικές χρωστικές, πχ. Καροτένια-παντζάρια κ.ά. (Carretero and Poso, 2010) Πρόσθετα συστατικά: Για παράδειγμα αντηλιακά φίλτρα, κηροί κ.ά. που είναι οι ουσίες που σταθεροποιούν και δεν επιτρέπουν το διαχωρισμό των διαφόρων φάσεων των συστατικών του μείγματος (Καμμένου και συν., 2007; Carretero and Poso, 2010). 33

34 1.6 Καλλυντικές κρέμες O όρος «κρέμα» αναφέρεται σε καλλυντικά προϊόντα τα οποία έχουν ιξώδες τέτοιο, ώστε να μην μπορούν να ρέουν στη θερμοκρασία του περιβάλλοντος. Πρόκειται για παρασκευάσματα που προορίζονται να έρθουν σε επαφή με το δέρμα του προσώπου ή του σώματος με σκοπό τον καθαρισμό ή την προστασία του για να διατηρηθεί σε καλή κατάσταση και να μεταβάλλει την εμφάνισή του (Millikan, 2001). Συνήθως οι κρέμες είναι στερεά ή ημιστέρεα γαλακτώματα. Γαλάκτωμα ορίζεται ένα ετερογενές σύστημα δύο υγρών φάσεων που σχηματίζεται από ένα υγρό που διασπείρεται υπό μορφή σταγονιδίων σε ένα άλλο αναμειγνυόμενο με το πρώτο. Είναι ασταθή προϊόντα που με την προσθήκη συγκεκριμένων ουσιών που ονομάζονται γαλακτοματοποιητές γίνονται σταθερά. Ανάλογα με την εσωτερική ή εξωτερική τους φάση χαρακτηρίζονται ως Υ/Ε, δηλαδή ύδωρ στο έλαιο, εάν η εξωτερική φάση είναι έλαιο και Ε/Υ, δηλαδή έλαιο σε στο ύδωρ, εάν η εξωτερική φάση είναι ύδωρ (W/O ή Ο/W). Ερχόμενα σε επαφή το νερό και το λάδι, εξαιτίας της επιφανειοδραστικής τάσης δεν είναι δυνατή η άμεση διασπορά του ενός υγρού μέσα στο άλλο. Ο γαλακτοματοποιητής σχηματίζει μια προστατευτική μεμβράνη γύρω από τα μικροσκοπικά σωματίδια είτε του νερού είτε του λαδιού. Όσο πιο ισχυρή είναι η ανάδευση, τόσο πιο λεπτό θα είναι το μέγεθος των σωματιδίων, άρα θα έχουμε και πιο σταθερά γαλακτώματα. Οι περισσότεροι χρησιμοποιούμενοι γαλακτοματοιητές είναι επιφανειοδραστικοί, διαλύονται δε και στην υδρόφιλη και στη λιπόφιλη φάση και για αυτό ονομάζονται διαλυτοί γαλακτοματοποιητές. Επιφανειοδραστικές ονομάζονται οι ουσίες που διαλύονται σε ένα υγρό ή σύστημα δυο φάσεων και προσροφώνται στην επιφάνεια διαχωρισμού των δυο φάσεων με αποτέλεσμα να μειώνεται η επιφανειακή τάση. Η ενέργεια που χρειάζεται για την γαλακτοματοποίηση είναι τόσο μεγαλύτερη, όσο μεγαλύτερη θα είναι η επιφανειακή τάση (Johansen, 2011; Schneider et al., 2005) Σύσταση και χαρακτηριστικά Οι καλλυντικές κρέμες ταξινομούνται ανάλογα με τον τύπο του δέρματος, τα δραστικά συστατικά και τη δράση τους στο δέρμα. Έχει επικρατήσει η ταξινόμησή τους ανάλογα με 34

35 τη δράση τους στο δέρμα, με την οποία κατατάσσονται σε κρέμες καθαρισμού και ψυχρές κρέμες, κρέμες νύχτας και μασάζ, κρέμες ημέρας, εξαφανιζόμενες κρέμες και κρέμες βάσης make up, κρέμες χεριών σώματος και τέλος κρέμες για όλες τις χρήσεις. Συνοπτικά, τα βασικά συστατικά μιας καλλυντικής κρέμας γενικά είναι: Η υδατική βάση, που συνήθως πρόκειται για το νερό ή ανθόνερο, χυμό ή γέλη αλόης και άλλα υδατικά εκχυλίσματα. Η λιπαρή βάση (ή βάση των ελαίων), όπου συνήθως είναι φυτικά έλαια σε υγρή (π.χ. αμυγδαλέλαια) ή στερεή μορφή. Οι αντισηπτικές ουσίες Οι αντιοξειδωτικές ουσίες Τα συντηρητικά Οι χρωστικές ουσίες (Μουλοπούλου και συν., 1998) Υπάρχουν διάφοροι τρόποι για την διατήρηση της υγρασίας του δέρματος ή την ενίσχυση της εάν χρειάζεται. Αυτό το πετυχαίνουμε με την χρήση ουσιών που δεν διαπερνιούνται από το νερό όπως λόγου χάρη: Παραφινέλαιο: Είναι προϊόν του πετρελαίου, μαλακτικό και λιπαντικό. Χρησιμοποιείται σαν καθαριστικό και ενυδατικό, ιδιαίτερα για λιπαρά δέρματα που κρατούν την υγρασία του δέρματος Βαζελίνη: Είναι ουσία σε μορφή γέλης που λαμβάνεται από το πετρέλαιο και έχει μαλακτικές ιδιότητες. Χρησιμοποιείται σαν βάση για αλοιφές, γιατί κρατά την υγρασία του δέρματος. Κεραμίδια: Είναι μια μορφή λιπιδικών ουσιών που συγκρατούν την υγρασία στο δέρμα και το διατηρούν σφριγηλό. Τα κεραμίδια προέρχονται από φυτικές πηγές (σιτάρι), καθώς και από συνθετικές πηγές. Μια καλή ενυδάτωση πετυχαίνει με την χρήση υγραντικών παραγόντων οι οποίοι απορροφούν το νερό από την ατμόσφαιρα ή βοηθούν άλλες ουσίες να διατηρούν την υγρασία τους έτσι ώστε να συμπληρώνουν την περιεκτικότητα του δέρματος σε νερό, βελτιώνοντας την υφή και την εμφάνιση του. Φυτικά λίπη Σιλικόνες 35

36 Οι διυγραντικές ουσίες επίσης προστίθενται στις κρέμες του τύπου o/w για να περιορίσουν την ξήρανσή τους κατά την έκθεση στον αέρα (Πουλάς και συν., 2014). Οι πιο διαδεδομένες είναι: Προπυλενογλυκόλη Νερό Σορβιτόλη Γλυκερίνη Υαλουρονικό οξύ: Πρόκειται για το συστατικό με έντονα υγροσκοπικές ιδιότητες (απορροφά μέχρι και 300 φορές το βάρος του σε νερό). Έχει την ιδιότητα να μαζεύει νερό και να το εναποθέτει στον συνδετικό ιστό. Natural Moisturizing Factor (N.M.F.): Πρόκειται για τον φυσικό παράγοντα ενυδάτωσης που βρίσκεται στις υδατικές ζώνες της κεράτινης στιβάδας του. Ο παράγοντας αυτός βοηθάει στη σταθεροποίηση του νερού στις στιβάδες του διατηρώντας την πλαστικότητα του δέρματος. Πολυμερισμένο ζελέ: Είναι ουσία με υπερυδατική σύσταση (95% νερό) που προσκολλάται με ευκολία στα κερατινοκύτταρα αποδίδοντας την υγρασία του. Λεκιθίνη Πανθενόλη Λιποσώματα: Είναι μικροσφαιρίδια που δημιουργούνται από τη λεκιθίνη, ένα φυτικό προϊόν. Εισχωρούν μέσα στο δέρμα και απελευθερώνουν τα συστατικά τους που είναι αρκετά δραστικά, λειτουργώντας ως μεταφορικά μέσα. Έχουν ενυδατική δράση. Μέρος της αποτελεσματικότητας τους οφείλεται στο σχήμα και το μέγεθός τους που τους επιτρέπει να εισχωρούν και στις πιο βαθιές κυτταρικές μεμβράνες του δέρματος. Κατά την τακτική εφαρμογή κρέμας με λιποσώματα η περιεκτικότητα του δέρματος σε υγρασία μέσα σε μία βδομάδα μπορεί να αυξηθεί μέχρι και 100%. Αυτό δεν το καταφέρνει καμία άλλη ουσία κρεμών (Μουλοπούλου και συν., 1998; Schneider et al., 2005). Οι ενυδατικές κρέμες ματιών έχουν παρόμοια σύσταση με τις ενυδατικές κρέμες προσώπου και σώματος. Τα κυριότερα συστατικά τους είναι: Ρετινόλη (Βιταμίνη Α): Η βιταμίνη αυτή είναι ισχυρό αντιοξειδωτικό, το οποίο καταπολεμά τις ελεύθερες ρίζες. Αμινοξέα και πεπτίδια: Διεγείρουν την παραγωγή του κολλαγόνου. Ενυδατικά συστατικά: Βοηθούν το δέρμα να διατηρήσει την υδατική του ισορροπία, καθώς η ξηρότητα συμβάλει σημαντικά στην εμφάνιση των ρυτίδων Καφεΐνη 36

37 Τανίνη Συνοψίζοντας οι βασικές πρώτες ύλες των καλλυντικών προϊόντων είναι οι εξής: νερό (Water) αιθανόλη (Ethanol) αιθέρια έλαια (Essential oils) αρώματα (Perfumes) γλυκερίνη (Glycerol) βιταμίνη Α (ρετινόλη/ Retinol) βιταμίνη Ε (τοκοφερόλη/ Tocopherol) λανολίνη (Lanolin) λεκιθίνη (Lecithin) υαλουρονικό οξύ (Hyaluronic acid) υπεροξείδιο του υδρογόνου παραφίνη (Paraffinum) (Παπαϊωάννου, 2010; Winter, 2009) Άλλες σημαντικές πρώτες ύλες που συναντάμε συχνά είναι οι ακόλουθες: αλλαντοΐνη (Allantoin): μαλακτική ουσία με επουλωτικές και καταπραϋντικές ιδιότητες Αlacel 165 (Glyceryl Stearate, PEG-100 Stearate): επιφανειοδραστικός παράγοντας με μαλακτικές ιδιότητες βενζοϊκό οξύ (Benzoic acid): αντιοξειδωτικός και αντισηπτικός παράγοντας διοξείδιο του Τιτανίου (Τitaniumdioxide): φυσικό αντηλιακό φίλτρο εκχύλισμα χαμομηλιού και αμαμέλιδας (Extrapon Camomile & Hamamelis): μαλακτικοί και στυπτικοί παράγοντες έλαιο γλυκών αμυγδάλων (Sweet Almond Oil): λιπαντικός και μαλακτικός παράγοντας έλαιο σιλικόνης (Silicon Oil, Dimethicone): ρυθμιστής γλυκύτητας και ως παχυντική ουσία κετυλική αλκοόλη (Cetyl Alcohol): βοηθητικός γαλακτοματοποιητής κιτρικό οξύ (Citric Acid): διορθωτικό του ph με αντισηπτικές και λευκαντικές ιδιότητες λάδι Χοχόμπα (Jojoba oil) καροτέλαιο (Carrot oil ) ελαιόλαδο (Olive oil) 37

38 προπυλενογλυκόλη (Propylene Glycol): διαλύτης με υγροσκοπικές ιδιότητες στεατικό οξύ (Stearic acid): μαλακτικός παράγοντας Tween 80 (Polysorbate 80): επιφανειοδραστική ουσία (διαλυματοποιός ουσία αιθέριων ελαίων) Χλωριούχο νάτριο (Sodium Chloride): ρυθμιστής ωσμωτικής πίεσης του προϊόντος (Carretero and Poso, 2010) Διάρκεια ζωής των καλλυντικών Τα περισσότερα καλλυντικά παράγονται με προδιαγραφές για μεγάλο χρονικό διάστημα ζωής. Κατά μέσο όρο οι καλλυντικές κρέμες έχουν διάρκεια ζωή περίπου ένα χρόνο. Είναι υποχρεωτικό, όπως ήδη έχει αναφερθεί, να αναγράφεται η ημερομηνία ελάχιστης περιόδου χρήσης σε όλα τα προϊόντα, εκτός από εκείνα όπου η περίοδος που διατηρούνται είναι μεγαλύτερη των 30 μηνών. Τα καλλυντικά των οποίων η διάρκεια ζωής είναι μεγαλύτερη των 30 μηνών φέρουν ένδειξη για το χρονικό διάστημα που μπορούν να διατηρηθούν ασφαλή, μετά το άνοιγμα της συσκευασίας τους. Αυτή η περίοδος αναφέρεται ως «Period After Opening» (PAO). Το σύμβολο PAO δείχνει ένα βαζάκι κρέμας ανοιχτό και η διάρκεια ζωής καθορίζεται σε μήνες (Μ) και εμφανίζεται εντός ή εκτός του συμβόλου της ανοιχτής καλλυντικής κρέμας. Η πληροφορία εμφανίζεται τόσο στο δοχείο (ή σωληνάριο) του προϊόντος όσο και στη συσκευασία του (American Public Health Association, 1984; Συξέρης, 1998). Οι καταναλωτές πρέπει να είναι ενημερωμένοι για το γεγονός ότι οι ημερομηνίες λήξης είναι απλά "ενδεικτικές" και ότι ένα προϊόν μπορεί να καταστεί μη ασφαλές πολύ πριν την ημερομηνία λήξης του εάν δεν έχει διατηρηθεί σωστά. Τα καλλυντικά όπου για παράδειγμα εκτέθηκαν σε υψηλές θερμοκρασίες ή ανοίχθηκαν και εξετάστηκαν από τους καταναλωτές πριν την τελική πώληση μπορεί να γίνουν ακατάλληλα για χρήση πριν την αναγραφόμενη ημερομηνία λήξης. Εκείνα που δύναται να έχουν μια ιδιαίτερα μικρή διάρκεια ζωής είναι τα «φυσικά προϊόντα» που περιέχουν φυτικές ουσίες. Τόσο οι κατασκευαστές όσο και οι καταναλωτές πρέπει να λαμβάνουν υπόψιν τους τον αυξημένο κίνδυνο ανάπτυξης μικροοργανισμών. Από την άλλη μεριά όμως, προϊόντα τα οποία διατηρούνται σε ιδανικές συνθήκες και χρησιμοποιούνται με προσοχή, μπορεί να παραμείνουν κατάλληλα για χρήση ακόμα και μετά την ημερομηνία λήξης. Όμως, σε καμία περίπτωση δεν πρέπει να χρησιμοποιούνται ληγμένα καλλυντικά (Συξέρης, 1998; Okeke and Lamikanra, 2001). 38

39 1.6.3 Καλλυντικά και αλλεργίες Με τον όρο «αλλεργία» εννοείται η παθολογική κατάσταση κατά την οποία ο οργανισμός αντιδρά απέναντι σε αβλαβείς περιβαλλοντολογικές ουσίες που ονομάζονται αλλεργιογόνα. Πιο συγκεκριμένα, η αλλεργία είναι αντίδραση υπερευαισθησίας κατά την οποία πρωταγωνιστές είναι συγκεκριμένα κύτταρα του αίματος (βασεόφιλα και μαστοκύτταρα) και ένας ειδικός τύπος αντισώματος (ανοσοσφαιρίνη Ε) (Murphy, 2007). Ετυμολογικά η λέξη αλλεργία προέρχεται από το συνδυασμό των λέξεων «άλλο + έργο». Με απλά λόγια το ανοσοποιητικό σύστημα αντί να εμφανίζει φυσιολογική δραστηριότητα για την οποία έχει ταχθεί από τη φύση, δηλαδή φύλαξη του οργανισμού, παρουσιάζει άλλο έργο δηλαδή α-φύλαξη (αναφυλαξία). Ορισμένα συστατικά των καλλυντικών, κυρίως αρώματα και συντηρητικά, μπορούν να δράσουν ως αλλεργιογόνα (Silva et al., 2012). Eικόνα 1-1 Αλλεργία δέρματος ( media/file:blausen_0014_allergicdermatitis.png) Τα πιο συνηθισμένα ερεθιστικά συστατικά που χρησιμοποιούνται στα καλλυντικά είναι: Λευκαντικά: Τα λευκαντικά κυρίως που περιέχουν υδροκινόνη προκαλούν διάφορα συμπτώματα. Συμπτώματα της χρήσης αυτών των ουσιών είναι κοκκινίλες ή φυσαλίδες αλλά και αλλεργίες και σε μακροχρόνια χρήση γενική πτώση της άμυνας του οργανισμού (De Groot et al., 1988). 39

40 Συντηρητικά: Τα συντηρητικά παλιά προκαλούσαν συχνά ερεθισμούς και αλλεργίες. Μετά από πολύχρονες έρευνες αποκλείστηκαν τα πιο βλαβερά και τα χρησιμοποιούμενα σήμερα συντηρητικά είναι σχεδόν ακίνδυνα (Kohl et al., 2004; Waton, 2014). Αιθέρια έλαια: Κοινά αιθέρια έλαια που ερεθίζουν τα ευαίσθητα δέρματα είναι το δεντρολίβανο, το ευκαλυπτέλαιο, το δαφνέλαιο, το έλαιο του πιπεριού, το ριγανέλαιο, το γαρυφαλέλαιο, το έλαιο μέντας και φασκόμηλου (De Groot et al., 1988). Χρωστικές ουσίες: Οι επιτρεπόμενες χρωστικές ουσίες στα καλλυντικά σήμερα είναι πλήρως ελεγμένες και κάθε μια χαρακτηρίζεται με ένα κωδικό C.I. (Colour Index), όμως είναι δυνατόν ακόμη και ένα επιτρεπόμενο χρώμα να προκαλέσει αλλεργία γι αυτό και η αναγραφή του C.I. πάνω στη συσκευασία κάθε καλλυντικού είναι απαραίτητη (Kohl et al., 2004; Ortiz K.J. and Yiannias J. 2004). Αντισηπτικά: Δυνατά αντισηπτικά όπως π.χ. εξαχλωροφαίνιο και χλωροεξιδίνη (που μπαίνουν π.χ. σε αποσμητικά για να θανατώνουν τα βακτήρια) προκαλούν συχνά αλλεργίες. (Marks, 2003; Kohl et al., 2004) Εικόνα 1-2 Αλλεργική δερματίτιδα από επαφή (ΑΔΑΕ) από καλλυντικά. Πηγή: Περιοδικό Κοσμητολογίας: Το καλλυντικό, Τεύχος 30 Σε κάθε περίπτωση, εάν ο χρήστης έρθει αντιμέτωπος με οποιοδήποτε δερματικό ή αλλεργικό σύμπτωμα έπειτα από χρήση κάποιου καλλυντικού προϊόντος, καλείται να σταματήσει τη χρήση του και να επισκεφτεί τον ειδικό. 40

41 1.6.4 Μολυσματικοί παράγοντες Τα καλλυντικά και τα προϊόντα προσωπικής φροντίδας κατασκευάζονται σύμφωνα με τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA), ο οποίος μπορεί να επιβάλει αυστηρές κυρώσεις για τα προϊόντα που δεν συμμορφώνονται με τα πρότυπα του Οργανισμού Τροφίμων, Φαρμάκων και Καλλυντικών. Αν οι πρώτες ύλες (κυρίως φυτικές) που χρησιμοποιούνται για την παρασκευή των καλλυντικών είναι εξαρχής μολυσμένες, αυτό έχει ως επακόλουθο και το τελικό προϊόν να είναι μολυσμένο. Για αυτό το λόγο χρειάζεται να γίνεται ο μικροβιολογικός έλεγχος σε πολλά διαφορετικά στάδια κατά την παραγωγή των προϊόντων. Οι κυριότεροι πιθανοί παράγοντες που επιμολύνουν το προϊόν είναι οι εξής: 1) Το νερό του περιβάλλοντος που μπορεί να περιέχει σπόρους βακτηρίων και μυκήτων, αλλά και κόκκους. 2) Ο μηχανικός εξοπλισμός, εάν δεν απολυμαίνεται προσεκτικά, είναι ίσως η πιο σοβαρή πηγή μόλυνσης. 3) Τα υλικά συσκευασίας, οι περιέκτες και τα πώματά τους πρέπει να είναι απαλλαγμένα από μικροοργανισμούς και να κλείνουν αεροστεγώς. Προϊόντα που είναι συσκευασμένα σε ευρύστομα ή ευλύγιστα δοχεία, όπως τα πλαστικά φιαλίδια που εισροφούν αέρα, είναι πιο ευαίσθητα σε μόλυνση από τα προϊόντα που είναι συσκευασμένα σε σωληνάρια ή φιαλίδια με μικρό στόμιο ή γυάλινα (Denyer et al., 2004; Okeke and Lamikanra, 2001). 4) Το εργατικό προσωπικό, σε περιπτώσεις όπου δεν ακολουθεί προσεκτικά τους κανόνες υγιεινής, είναι μια από τις μεγαλύτερες πηγές μολύνσεως. 5) Για καλλυντικά που δύνανται να μολυνθούν κατά την χρήση τους, επικίνδυνα θεωρούνται τα βαζάκια, επειδή το προϊόν έρχεται σε επαφή με τα χέρια και επιπλέον, όταν καταναλώνεται, αφήνει μεγάλο χώρο για αέρα, με συνέπεια την ανάπτυξη μικροοργανισμών. Το οξυγόνο, η υγρασία και η θερμοκρασία είναι τρεις από τους κυριότερους παράγοντες που ευνοούν την ανάπτυξη των μικροοργανισμών στα καλλυντικά γι αυτό και ο έλεγχος της ασφάλειας του τελικού προϊόντος είναι αρκετά δύσκολος εφόσον πρέπει να σχεδιαστούν με τέτοιο τρόπο ώστε να ληφθεί υπόψιν και το διάστημα αλλά και οι συνθήκες όπου θα γίνει η χρήση τους από το ευρύ κοινό (Chung et al., 2014). 41

42 1.7 Εισαγωγή στη Μικροβιολογία Η Μικροβιολογία ετυμολογικά προέρχεται από τις λέξεις: «μικρός», «βίος» και «λόγος». Είναι επιμέρους κλάδος της επιστήμης της Βιολογίας, που ασχολείται με τη μελέτη των μικροοργανισμών, οι οποίοι μπορεί να είναι είτε μονοκύτταροι, είτε μικροσκοπικοί πολυκύτταροι οργανισμοί. Τα κύτταρα μπορεί να είναι ευκαρυωτικά, δηλαδή να έχουν πυρήνα, όπως οι μονοκύτταροι μύκητες και τα πρώτιστα, ή προκαρυωτικά, χωρίς δηλαδή να διαθέτουν σχηματισμένο πυρήνα, όπως τα βακτήρια και τα αρχαιοβακτήρια. Αντικείμενο της Μικροβιολογίας αποτελούν επίσης και οι ιοί. Λόγω λοιπόν του μικρού μεγέθους τους κρίνεται απαραίτητη η χρήση του μικροσκοπίου προκειμένου να γίνουν λεπτομερώς ορατά με γυμνό οφθαλμό (Harvey et al., 2006). Το όνομα «βακτήρια» (λιγότερο ορθά βακτηρίδια), έχει καταστεί διεθνής όρος και προέρχεται από την αρχαία ελληνική λέξη «βακτηρία», δηλαδή ράβδος, λόγω του σχήματος που είχαν οι πρώτοι εξ αυτών παρατηρηθέντες μικροοργανισμοί. Στην νεότερη ελληνική γλωσσολογία ο όρος «βακτηρίδια» εισήχθη το 1879 από τον Γεώργιο Καραμήτσα (Βουτσινάς, 1997). Το ανθρώπινο σώμα, τόσο εξωτερικά όσο και στο εσωτερικό του, συνυπάρχει με πλήθος μικροοργανισμών οι οποίοι αποτελούν τη φυσική μικροβιακή χλωρίδα του, από τη στιγμή της γέννησης του μέχρι τη στιγμή του θανάτου (Prescott et al., 1999). Αν και η φυσική μικροβιακή χλωρίδα δεν είναι επιβλαβής για τον άνθρωπο και στις περισσότερες περιπτώσεις έχει ωφέλιμες ιδιότητες, κάτω από ορισμένες συνθήκες δημιουργούνται μολύνσεις και το ανθρώπινο σώμα ασθενεί (Oliveira and Pinhata, 2008). Η διαφοροποίηση ανάμεσα σε έναν υγιή και έναν ασθενή οργανισμό εξαρτάται από την ισορροπία ανάμεσα στη φυσική άμυνα του σώματος και τη δράση του μικροοργανισμού που προκαλεί την ασθένεια. Εικόνα 1-3 (a) Bacillus megaterium, (b) Saccharomyces cerevisiae, (c) Mucor plumbeus, (d) Streptomyces rimosus, (e) Micrococcus, (f) Aspergillus niger (Hugo and Russell s Pharmaceutical Microbiology, 7th edition, 2004; p.12) 42

43 1.7.1 Μορφολογικά στοιχεία των βακτηρίων H μορφολογία των βακτηρίων περιλαμβάνει διάφορα σχήματα όπως λόγου χάριν: Σφαιρικό (κόκκοι - cocci) Ραβδοειδές (rods) Σπειροειδές (spirilla) Πολυμορφικό (ακαθόριστης μορφής - pleomorphic) Τα σφαιρικά διαιρούνται προς κάθε επίπεδο και διακρίνονται σε διπλόκοκκους, τετράκοκκους, σαρκίνες, στρεπτόκοκκους και σταφυλόκοκκους. Τα ραβδόμορφα διαιρούνται εγκάρσια και διακρίνονται σε λεπτοτριχοειδή κλωστρίδια (διόγκωση στο μέσο) και κεφαλοσπόρια (διόγκωση στο άκρο). Τα σπειροειδή είναι σαν τα ραβδόμορφα με τη διαφορά ότι παρουσιάζουν απολήξεις ή ελικοειδή περιστροφή και διακρίνονται σε δονάκια και σπειρύλια. Τα βακτήρια που παρουσιάζουν σπορίωση ονομάζονται βάκιλλοι. (Alberts et al., 2006) Εικόνα 1-4 Μορφολογία διαφόρων βακτηρίων Πηγή: ( 43

44 1.7.2 Ταξινόμηση των βακτηρίων Η ονοματολογία των βακτηρίων στηρίζεται στο διωνυμικό σύστημα του Λινναίου. Η περιγραφή ενός «είδους» μικροοργανισμών γίνεται με το γένος και το είδος π.χ. Clostridium tetani, Escherichia coli. Πιο συγκεκριμένα, το όνομα του γένους αρχίζει με κεφαλαίο γράμμα ενώ του είδους που ακολουθεί με μικρό. Τα επιστημονικά ονόματα γράφονται στα Λατινικά και τυπώνονται με πλάγια γράμματα. Οι ταξινομικές βαθμίδες είναι: 1. Στέλεχος (strain): αναφέρεται σε καθαρό καλλιέργημα που προέρχεται από μία μόνο αποικία του μικροβίου. 2. Είδος (species): αναφέρεται σε σύνολο στελεχών με μεγάλο βαθμό ομοιότητας φαινοτυπικών χαρακτήρων. 3. Γένος (genus): περιλαμβάνει συγγενή, από απόψεως χαρακτήρα, είδη. 4. Οικογένεια (family): αποτελείται από ένα ή περισσότερα γένη. 5. Τάξη (order): αποτελείται από μια ή περισσότερες οικογένειες. 6. Ομάδα (group): για βακτήρια που δεν έχουν οριστικά ταξινομηθεί. 7. Ποικιλία: όταν σε ορισμένο είδος παρουσιάζονται μεταβολές που αφορούν αρκετά στελέχη. (Shlegel, 1987) Πέραν όμως αυτής της ταξινόμησης, τα βακτήρια χωρίζονται και με βάση την πηγή άνθρακα, αζώτου και ενέργειας σε τέσσερις κατηγορίες: τα φωτοαυτότροφα, που χρησιμοποιούν ως πηγή ενέργειας την ηλιακή ακτινοβολία και ως πηγή άνθρακα το CO2, τα φωτοετερότροφα, τα οποία χρησιμοποιούν ως πηγή ενέργειας την ηλιακή ακτινοβολία και ως πηγή άνθρακα οργανικές ενώσεις, τα χημειοαυτότροφα, που χρησιμοποιούν το CO2 ως μοναδική πηγή άνθρακα και αντλούν ενέργεια από τις οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις ανόργανων ουσιών, τα χημειοετερότροφα, τα οποία χρησιμοποιούν ως πηγή άνθρακα οργανικές ουσίες και αντλούν ενέργεια από οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις οργανικών πάντα ουσιών. Τα χημειοετερότροφα μικρόβια υποδιαιρούνται σε τρεις κατηγορίες ανάλογα με τη σχέση που έχουν ως προς το υπόστρωμα ή τον ξενιστή στον οποίο αναπτύσσονται και αυτές είναι οι εξής: 44

45 τα παθογόνα μικρόβια, τα οποία αναπτύσσονται σε ζωντανούς οργανισμούς, δημιουργώντας με τον πολλαπλασιασμό τους παθολογικές καταστάσεις. Τα μικρόβια που μεταφέρονται με τα τρόφιμα και το πόσιμο νερό, φθάνουν ως τον άνθρωπο και τα ανώτερα ζώα, τον μολύνουν και δημιουργούν παθολογικές καταστάσεις, γι αυτό και παρουσιάζουν το μεγαλύτερο ενδιαφέρον. τα παρασιτικά μικρόβια, τα οποία υπό ομαλές συνθήκες, αναπτύσσονται πάνω σε ζωντανούς οργανισμούς χωρίς να δημιουργούν νοσηρές ή παθολογικές καταστάσεις. Σε περίπτωση όμως λοίμωξης, όπου μειώνεται η αντοχή του οργανισμού, εξελίσσονται σε ισχυρά παθογόνα και προξενούν σοβαρές παθολογικές καταστάσεις. τα σαπρόφυτα μικρόβια, τα οποία αναπτύσσονται πάνω σε νεκρή οργανική ουσία και όχι πάνω σε ζωντανούς οργανισμούς. Στις νεκρές οργανικές ουσίες, όπως τα τρόφιμα, προξενούν αλλοιώσεις, οπότε είναι ανεπιθύμητα, ή διασπάσεις προς ενδιάμεσα προϊόντα που είναι ωφέλιμα για τον άνθρωπο και συνεπώς επιθυμητά (Μπαλατσούρας, 1992). Τέλος, άλλη κατηγοριοποίηση των βακτηρίων γίνεται με κριτήριο τη χρώση τους κατά Gram. Έτσι, διακρίνονται σε δυο μεγάλες κατηγορίες: στα θετικά (+) κατά Gram, αν η τελική χρώση τους είναι κυανοϊώδης στα αρνητικά (-) κατά Gram, αν είναι κόκκινη Η κυριότερη ουσία της τεχνικής αυτής είναι το κρυσταλλικό ιώδες (crystal violet) ή ιώδες της γεντιανής (gentian violet), κατά IUPAC ονομασία χλωριούχος εξαμεθυλοπαραροσανιλίνη (hexamethyl pararosaniline chloride). Σε κάποιες περιπτώσεις μπορεί να αντικατασταθεί από κυανούν του μεθυλενίου, το οποίο παρέχει εξ ίσου αποτελεσματική χρώση. Η τεχνική αυτή στηρίζεται στην ικανότητα του κυτταρικού τοιχώματος των βακτηρίων να συγκρατούν το κρυσταλλικό ιώδες κατά την επεξεργασία τους με διαλύτες. Τα θετικά κατά Gram βακτήρια διαθέτουν τοίχωμα υψηλής περιεκτικότητας σε πεπτιδογλυκάνη και χαμηλότερης σε λιπίδια. Το κυτταρικό τοίχωμα χρωματίζεται μπλε με την επίδραση του κρυσταλλικού ιώδους. Στη συνέχεια προστίθεται ιώδιο ως στερεωτικό, το οποίο σχηματίζει σύμπλοκο με το κρυσταλλικό ιώδες, με αποτέλεσμα τη στερέωση της χρώσης. Στη συνέχεια στο παρασκεύασμα προστίθεται ένας διαλύτης, Εικόνα 1-5 Hans Christian Gram ( ) Πηγή: gr/search?q=hans+christi an+gram&biw=1366&bi h=650&tbm=isch&tbo=u &source=univ&sa=x&ei =2BCdVcClDcLYU6iOgK gl&ved=0ccyqsaq συνήθως η αιθυλική αλκοόλη, ακετόνη ή μίγμα και των δύο. Ο διαλύτης απομακρύνει τη 45

46 στιβάδα των λιπιδίων από τα αρνητικά κατά Gram βακτήρια, πράγμα που διευκολύνει τη διάχυση της αρχικής χρώσης στο περιβάλλον. Αντίθετα, ο διαλύτης αφυδατώνει το κυτταρικό τοίχωμα των θετικών κατά Gram βακτηρίων, εμποδίζοντας έτσι τη διάχυση της χρωστικής, οπότε τα βακτήρια παραμένουν χρωματισμένα. Σημαντικό σημείο στην επιτυχία της διαδικασίας είναι ο χρόνος που αφήνεται να επιδράσει ο διαλύτης: Αν είναι ιδιαίτερα παρατεταμένος, ο διαλύτης μπορεί να απομακρύνει τη χρωστική τόσο από τα αρνητικά κατά Gram όσο και από τα θετικά κατά Gram βακτήρια. Τέλος, στο παρασκεύασμα προστίθεται νέα χρωστική, συνήθως φουξίνη ώστε να χρωματιστούν τα ήδη αποχρωματισμένα αρνητικά κατά Gram βακτήρια και να διευκολύνεται η παρατήρησή τους στο μικροσκόπιο (Αγγελής, 2007) Κύκλος ζωής και ανάπτυξη των βακτηρίων Η «ανάπτυξη των βακτηρίων» είναι ταυτόσημη με την «πληθυσμιακή αύξηση». Σε υγρό θρεπτικό υλικό περνά διάφορες φάσεις, οι οποίες είναι δυνατό να παρασταθούν γραφικά με μία καμπύλη που ονομάζεται «καμπύλη αναπτύξεως». Οι φάσεις της καμπύλης αναπτύξεως είναι οι ακόλουθες: Η λανθάνουσα φάση, δηλαδή η αρχική στάσιμη φάση που αντικατοπτρίζει την προετοιμασία του κυττάρου για πολλαπλασιασμό. Η λογαριθμική φάση αναπτύξεως, που χαρακτηρίζεται από πολλαπλασιασμό μικροβίων, στηριζόμενη στο γεγονός ότι σε κάθε διαίρεση μικροβιακού κυττάρου, ο αριθμός μικροβίων στο καλλιέργημα διπλασιάζεται. O ολικός πληθυσμός των κυττάρων αυξάνει λογαριθμικά με γεωμετρική πρόοδο. dn/dt = k*no όπου dn: η μεταβολή μικροβιακού πληθυσμού k: η σταθερά ανάπτυξης Νο: ο αριθμός μικροβίων (σε γνωστό dt) 46

47 Η στάσιμη φάση, κατά την οποία παρατηρείται η ισορροπία του αριθμού ζώντων και νεκρών μικροβίων στο καλλιέργημα. Οι παράγοντες που αναστέλλουν την ανάπτυξη είναι η εξάντληση των θρεπτικών συστατικών του υλικού και η συσσώρευση τοξικών ουσιών που προέρχονται από το μεταβολισμό των κυττάρων. Η φάση απόκλισης, η οποία αντιπροσωπεύεται από μεγαλύτερο αριθμό νεκρών παρά ζωντανών μικροβίων καθώς ο αριθμός των κυττάρων που καταστρέφονται από τα τοξικά προϊόντα του μεταβολισμού ολοένα και αυξάνεται και αντίστοιχα ο αριθμός των ζωντανών κυττάρων ολοένα ελαττώνεται. Ο πολλαπλασιασμός σε στερεά θρεπτικά υποστρώματα ακολουθεί περίπου τους ίδιους κανόνες. Οι σχηματιζόμενες αποικίες των βακτηρίων εξαρτώνται τόσο από το θρεπτικό υπόστρωμα όσο και από το είδος του μικροοργανισμού. Άλλοι παράμετροι που επηρεάζουν το σχηματισμό αποικιών είναι η θερμοκρασία, το ph, η ωσμωτική πίεση, η παρουσία οξυγόνου Ο2 κ.ά. (Αναστασίου, 2014). Εικόνα 1-6 Απεικόνιση φάσεων ανάπτυξης των βακτηρίων. Πηγή: r%206/06-20_microbial Growth_L.jpg Εικόνα 1-7 Διαγράμματα της ανάπτυξης των βακτηρίων συναρτήσει της θερμοκρασίας και του ph. Πηγή: (Hugo and Russell s Pharmaceutical Microbiology, 7th edition, 2004; p.36) 47

48 1.8 Είδη παθογόνων και δυνητικά παθογόνων βακτηρίων Γενικά, με τον όρο «παθογόνο μικροοργανισμό» εννοούμε κάθε μικροοργανισμό ο οποίος μπορεί να βλάψει τον ξενιστή του, όπως για παράδειγμα με το να ανταγωνίζεται μαζί του για τους μεταβολικούς πόρους του, να καταστρέφει τα κύτταρα ή τους ιστούς του ή να εκκρίνει τοξίνες. Οι βλαπτικοί μικροοργανισμοί περιλαμβάνουν ιούς, βακτήρια, μυκοβακτήρια, μύκητες, πρωτόζωα και κάποιους έλμινθες. Οι παθογόνοι μικροοργανισμοί μπορούν να μεταφερθούν από τον ένα ξενιστή στον άλλο και να προκαλέσουν σοβαρές λοιμώξεις. Στη συνέχεια, θα ασχοληθούμε μόνο με συγκεκριμένα παθογόνα και δυνητικά παθογόνα βακτήρια που σχετίζονται άμεσα με αυτή την ερευνητική εργασία. Πίνακας 1-1 Τα κυριότερα παθογόνα βακτήρια και η δράση τους ΕΙΔΟΣ Μ/ΟΥ Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae Neisseria meningitidis Neisseria gonorrchoeae Brucela melitensis Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Proteus mirabilis Salmonella typhi Singella dysenteriae Vibrio cholerae ΠΑΘΟΓΟΝΟΣ ΔΡΑΣΗ Αιμόλυση ερυθρών αιμοσφαιρίων, καταστροφή λευκών αιμοσφαιρίων, οστεομυελίτιδα, ενδοκαρδίτιδα, μαστίτιδα, μηνιγγίτιδα, πνευμονία, τροφικές δηλητηριάσεις Εξανθήματα (οστρακιά), στρεπτοκοκκική αμυγδαλίτιδα Οξεία λοβώδης πνευμονία, παραρρινοκολπίτιδα Μηνιγγίτιδα Βλεννόρροια Μελιταίος πυρετός Ρινοφαρυγγίτιδα, παραρρινοκολπίτιδα, πνευμονία Ουρολοιμώξεις, μηνιγγίτιδα Ουρολοιμώξεις Σαλμονελώσεις (τυφοειδής πυρετός) Σιγκελώσεις (πυρετός, κοιλιακοί πόνοι, διάρροιες) Χολέρα 48

49 Pseudomonas aeruginosa Νοσοκομειακές λοιμώξεις Corynebacterium diphtheriae Διφθερίτιδα Mycobacterium tuberculosis Bacillus anthracis Treponema pallidum Φυματίωση Ασθένεια του άνθρακα Σύφιλη Ολική μεσόφιλη χλωρίδα (ΟΜΧ) Η ολική μεσόφιλη χλωρίδα αποτελείται από μικροοργανισμούς που συνήθως ανιχνεύονται στο δέρμα και αποτελούν τη φυσική μικροβιακή χλωρίδα του, με τον κίνδυνο όμως να εξελιχθούν σε ευκαιριακά παθογόνα, προκαλώντας διάφορες ασθένειες. Το φυσιολογικό δέρμα είναι γενικά ανθεκτικό στον αποικισμό και την προσβολή από την πλειοψηφία των μικροβίων. Όμως, η συνεχής παρουσία των βακτηρίων στην επιφάνεια του δέρματος, καθιστά ευάλωτο τον οργανισμό στις λοιμώξεις (ISO 21149). Η καταμέτρηση της ολικής μεσόφιλης χλωρίδας ή Total Mesophilic Bacteria είναι μια από τις βασικότερες αναλύσεις που γίνονται σε τρόφιμα, καλλυντικά κ.λπ. για να υπάρχει μια γενική εικόνα της μικροβιακής κατάστασης του προϊόντος και εκφράζεται συνήθως σε CFU/mL ή gr προϊόντος, όπου CFU είναι ο αριθμός σχηματιζόμενων αποικιών (Colony Forming Units). Στο σημείο αυτό να επισημάνουμε ότι οι αποικίες είναι ορατές μάζες κυττάρων που σχηματίζονται από διαδοχικές διαιρέσεις ενός ή λίγων κυττάρων ενώ το μέγεθος, το σχήμα, η υφή και το χρώμα τους καθορίζονται από το μικροοργανισμό που τις σχηματίζει. Η βέλτιστη θερμοκρασία για την ανάπτυξη των συγκεκριμένων μικροοργανισμών είναι 30-37ºC ενώ γενικά ζουν σε θερμοκρασίες με εύρος ºC. Χαρακτηριστικά μεσόφιλα παθογόνα βακτήρια είναι για παράδειγμα η Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus και Escherichia coli (Gerhardt et al., 1981) Εικόνα 1-8 Απεικόνιση από τυπικές αποικίες από ΟΜΧ. Πηγή: du/courses/env195micro/less on7_print.htm 49

50 1.8.2 Escherichia coli Η Escherichia coli είναι ένα βακτήριο που απομονώθηκε για πρώτη φορά από παιδικά περιττώματα το 1881, από το Γερμανό καθηγητή Eserich από τον οποίο πήρε και το όνομά της. Ανήκει στα κολοβακτηριοειδή, συνεπώς είναι μέλος της οικογένειας των εντεροβακτηριοειδών, Εnterobacteriaceae. Ανήκει στους μικροοργανισμούς που αναπαράγεται γρήγορα και μπορεί να επεξεργαστεί εύκολα γι αυτό και αποτελεί ένα από τα καλύτερα είδη για πειραματικές μελέτες (Δημητρακόπουλος, 1987). Στην οικογένεια των Εnterobacteriaceae ανήκουν και άλλοι εντερικοί παθογόνοι μικροοργανισμοί που συναντάμε στον άνθρωπο όπως για παράδειγμα η Salmonella, η Shigella και η Yersinia. Άλλοι είναι απλοί άποικοι του ανθρώπινου γαστρεντερικού σωλήνα όπως τα γένη Escherichia, Enterobacter, Klebsiella αλλά και αυτά τα βακτήρια, μπορεί περιστασιακά να συσχετιστούν με σοβαρές ασθένειες του ανθρώπου (Harvey et al., 2006) Μορφολογία και γενικά χαρακτηριστικά H οικογένεια Εnterobacteriaceae περιλαμβάνει μικρά Gram-αρνητικά βακτήρια. Τα στελέχη E.coli είναι κολοβακτηρίδια ραβδοειδούς σχήματος, με πάχος 0,5μm και μήκος 1-5μm. Δεν παράγουν σπόρια και τα κύτταρα τους έχουν μορφή κοκκώδη ή νηματοειδή. Πρόκειται για περίτριχα κινητά μικρόβια που φέρουν βλεφαρίδες γύρω από όλο το μικροβιακό σώμα ενώ υπάρχουν και στελέχη που είναι ακίνητα. Πολλά στελέχη φέρουν έλυτρο ή μια αδιαφοροποίητη στοιβάδα, που περιλαμβάνει το κυτταρικό τοίχωμα. Όσον αφορά τις βιολογικές τους δράσεις, προκαλούν ζύμωση της γλυκόζης με ή χωρίς παραγωγή αερίου, παράγουν καταλάση, ανάγουν τα νιτρικά άλατα σε νιτρώδη και τέλος δεν παράγουν οξειδάση, γι αυτό και είναι θετικά στο τεστ καταλάσης και αρνητικά στο τεστ οξειδάσης που γίνονται στα εργαστήρια με στόχο την ταυτοποίησή τους (Fotadar et al., 2005; Harvey et al., 2006). Εικόνα 1-9 E.coli από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Πηγή: K/Bacteria/96534E.html 50

51 Πρόκειται για ένα μικροοργανισμό που αναπτύσσεται σε αερόβιες συνθήκες και προαιρετικά σε αναερόβιες. Η καλλιέργεια του γίνεται με ευχέρεια σε κοινά θρεπτικά υλικά. Έχει βέλτιστη θερμοκρασία αναπτύξεως τους 37ºC αλλά μπορεί να αναπτυχθεί και σε όρια θερμοκρασιών από 10ºC-45ºC. Το καλύτερο ph ανάπτυξής του είναι κοντά στο ουδέτερο. Δεν αντέχει σε υψηλές θερμοκρασίες και πεθαίνει όταν ζεσταίνεται στου 70ºC για αρκετό χρονικό διάστημα, ενώ μπορεί να επιβιώσει στο ψυγείο για αρκετές μέρες υπό ορισμένες συνθήκες (Prescott et al., 1993; Han and Lee, 2006) Escherichia coli στο περιβάλλον και λοιμώξεις Στον ανθρώπινο οργανισμό η E.coli συναντάται στο παχύ έντερο (ορθό), όπως και στα περισσότερα θηλαστικά και ανήκει στη φυσιολογική μικροβιακή χλωρίδα τους. Έχει την ικανότητα να επιβιώνει εκτός του σώματος για αρκετό καιρό. Τα περισσότερα είδη E.coli δεν προκαλούν λοιμώξεις, αντιθέτως παράγουν την βιταμίνη Κ και αποτρέπουν άλλα παθογόνα βακτήρια από το να προκαλέσουν λοιμώξεις στο έντερο. Είναι δηλαδή γενικώς ωφέλιμα για τον άνθρωπο. Πρόκειται για δυνητικά παθογόνο μικροοργανισμό, που σημαίνει ότι υπό συγκεκριμένες συνθήκες μπορεί να καταστεί επικίνδυνος. Κάποια είδη όπως ο ορότυπος O157:H7 προκαλούν τροφικές δηλητηριάσεις με επικείμενες διάρροιες που μπορούν να οδηγήσουν ακόμα και στο θάνατο (Βovee-Οudenhoven et al., 2003; Vogt and Dippold, 2005). Άλλα είδη E.coli προκαλούν ουρολοιμώξεις σχηματίζοντας αποικίες στην ουρήθρα και στη συνέχεια εξαπλώνονται στην ουροδόχο κύστη. Το πλέον παθογόνο είδος της E.coli μπορεί να προκαλέσει γαστρεντερίτιδα, αιμορραγική κολίτιδα, μετωπιαία κολπίτιδα κ.ά. Η πιθανότητα μόλυνσης αυξάνεται σε άτομα μικρής ηλικίας ή αδύνατου ανοσοποιητικού συστήματος. Η εντεροτοξινογόνος Ε.coli προκαλεί συμπτώματα των οποίων η σοβαρότητα εξαρτάται από τις παραγόμενες τοξίνες. Η εμφάνιση των συμπτωμάτων είναι αιφνίδια και σε οξεία μορφή με κύριο χαρακτηριστικό την υδαρή διάρροια, συνοδευόμενη από έμετο και κοιλιακό πόνο. Ο πυρετός είναι σπάνιος, αλλά η αφυδάτωση συνήθης και έντονη, με αποτέλεσμα, εφόσον καθυστερήσει η θεραπεία, να απειλείται η ζωή. H εντεροπαθογόνος Ε.coli προκαλεί επίμονη μεγάλης διάρκειας διάρροια με σοβαρή εντερίτιδα. Τα συμπτώματα εμφανίζονται σε ώρες (Lanier et al., 2011). Άτομα που διαγιγνώσκονται με λοίμωξη από εντεροαιμορραγικό στέλεχος E.coli δύναται σε ποσοστό 5-10% να αναπτύξουν μια επιπλοκή, που είναι γνωστή ως ουραιμικό αιμολυτικό σύνδρομο (hemolytic uremic syndrome, HUS). Το σύνδρομο αυτό συνδυάζεται με συμπτώματα όπως η μειωμένη ούρηση, η κόπωση και η ωχρή όψη του προσώπου. Τα 51

52 άτομα που πάσχουν από το σύνδρομο πρέπει να εισάγονται για νοσηλεία άμεσα γιατί κινδυνεύουν να αναπτύξουν νεφρική ανεπάρκεια καθώς και άλλα σοβαρά προβλήματα. Τα πάσχοντα άτομα συνήθως αναρρώνουν μέσα σε λίγες εβδομάδες, χωρίς όμως να αποκλείεται κι ο κίνδυνος για κάποιους να υποστούν μόνιμες βλάβες ή και να οδηγηθούν στο θάνατο (Tozzi et al., 2003; Rangel et al., 2005). Στην Ελλάδα η μέση ετήσια δηλούμενη επίπτωση της λοίμωξης από το εντεροαιμορραγικό κολοβακτηρίδιο για το χρονικό διάστημα ήταν 0,06/ κατοίκους κατ έτος (συνολικά δηλώθηκαν 5 κρούσματα). Σύμφωνα με τα τελευταία δημοσιευμένα δεδομένα, η μέση δηλούμενη εμφάνιση κρουσμάτων από E.coli στις χώρες της Ευρωπαϊκής Ένωσης και των χωρών της EEA/EFTA (European Economic Area/European Free Trade Association) ήταν 6,60 κρούσματα ανά κατοίκους (European Centre for Disease Prevention and Control, 2009). Ο συνήθης ορότυπος που έχει ενοχοποιηθεί για το μεγαλύτερο ποσοστό επιδημιών διεθνώς είναι το στέλεχος Ο157:Η7 (Lanier et al., 2011) Pseudomonas aeruginosa Η Pseudomonas aeruginosa γνωστή και ως Ψευδομονάδα η αεριογόνος, ανήκει στην οικογένεια Pseudomonadaceae που περιλαμβάνει διάφορα είδη, με την πλειονότητα να ζει ελεύθερα στο χώμα, το νερό, τη θάλασσα, κτλ. Ιστορικά, ο μικροοργανισμός αυτός απομονώθηκε για πρώτη φορά από τον Gessard το 1882 και χαρακτηρίσθηκε ως παθογόνο βακτήριο από τον Charrin το Ορισμένα είδη προκαλούν νόσο σε φυτά, ζώα αλλά και στον άνθρωπο. Τον τελευταίο καιρό, ολοένα και περισσότερο χαρακτηρίζεται ως ευκαιριακά παθογόνος μικροοργανισμός από κλινική σκοπιά, σύμφωνα με μελέτες που έχουν διεξαχθεί γι αυτό και παθογόνος μικροοργανισμός παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον η μελέτη του από την επιστημονική κοινότητα (Hirulkar and Soni, 2011) Μορφολογία και γενικά χαρακτηριστικά Εικόνα 1-10 Pseudomonas aeruginosa Πηγή: Public Health Image Library (PHIL) Πρόκειται για ένα αρνητικό κατά Gram βακτήριο, σχήματος ραβδοειδούς με πλάτος µm και μήκος µm. Σχεδόν όλα τα στελέχη παρουσιάζουν κίνηση υποβοηθούμενη 52

53 από ένα μαστίγιο στους πόλους του, γι αυτό και χαρακτηρίζονται ως μονότριχα. Τα κύτταρά του διατάσσονται μεμονωμένα, σε ζεύγη ή σε μικρές αλυσίδες. Συνήθως το συναντάμε στα κόπρανα, το έδαφος, το νερό και τα απόβλητα. Μπορεί να πολλαπλασιαστεί σε υδάτινα συστήματα και στην επιφάνεια οργανικών υλών που διαβρέχονται από νερό (Madigan et al., 2008; Hirulkar and Soni, 2011). H P.aeruginosa έχει ιδιαίτερα απλουστευμένες διατροφικές απαιτήσεις. Συχνά παρατηρείται πληθυσμιακή αύξηση σε απεσταγμένο νερό, που αποτελεί απόδειξη των ελάχιστων διατροφικών αναγκών της. Καλλιεργείται εύκολα στα κοινά θρεπτικά υλικά με βέλτιστη θερμοκρασία αναπτύξεως στους 37 ºC. Είναι το μόνο είδος του γένους που αναπτύσσεται στους 42 ºC και αυτή η ιδιότητα χρησιμοποιείται για την ταυτοποίησή του. Είναι αυστηρά αερόβιος μικροοργανισμός, δηλαδή χρησιμοποιεί το O2 ως τελικό δέκτη ηλεκτρονίων. Σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να χρησιμοποιήσει τα νιτρικά ως εναλλακτικό δέκτη ηλεκτρονίων και με τον τρόπο αυτό να αναπτύσσεται αναερόβια. Όλα τα στελέχη παράγουν καταλάση και οξειδάση (Δημητρακόπουλος, 1987). Δε ζυμώνει τη γλυκόζη, ενώ τη διασπά οξειδωτικά, χωρίς παραγωγή αερίου, επειδή περιέχει υψηλές συγκεντρώσεις κυττοχρωματικής οξειδάσης. Αυτές τις ιδιότητες χρησιμοποιούν στα εργαστήρια προκειμένου να ταυτοποιήσουν το συγκεκριμένο στέλεχος. Όσον αφορά τις αποικίες της, μπορεί να είναι επίπεδες ή κυρτές με κυματώδη ή διαβρωμένη περιφέρεια. Παρουσιάζει δύο τύπους αποικιών διαφορετικού χρώματος: τη φθορίζουσα pyoverdin και τη μπλε πυοκυανίνης. Η τελευταία παράγεται σε αφθονία σε θρεπτικά μέσα με χαμηλή περιεκτικότητα σε σίδηρο και συμβάλλει στις λειτουργίες του μεταβολισμού του σιδήρου στο βακτήριο. Ο όρος «πυοκυανίνη» αναφέρεται στο «μπλε πύον» που αποτελεί χαρακτηριστικό της πυώδους λοιμώξεως που προκαλείται από P.aeruginosa (Todar, 2012) Pseudomonas aeruginosa στο περιβάλλον και λοιμώξεις Στην πραγματικότητα, η P.aeruginosa είναι ένας ευκαιριακά παθογόνος μικροοργανισμός των φυτών. Ωστόσο, τον τελευταίο καιρό, ολοένα και περισσότερο χαρακτηρίζεται ως ευκαιριακά παθογόνος μικροοργανισμός από κλινική σκοπιά. Αρκετές επιδημιολογικές μελέτες το χαρακτηρίζουν ως σοβαρότατο παράγοντα νοσοκομειακών λοιμώξεων και επισημαίνουν ότι ολοένα και αυξάνεται η ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά από πολλά κλινικά στελέχη που απομονώνονται. 53

54 Το συχνότερο είδος ψευδομονάδας που προκαλεί νόσο στον άνθρωπο είναι η P.aeruginosa. Σπανιότερα είδη που ενοχοποιούνται για λοιμώξεις στον άνθρωπο ανήκουν στην ομάδα των Fluorescent μαζί με την P.aeruginosa και είναι η P.fluorescens και η P.putida, ενώ συναντάμε παθογόνα στελέχη και στην ομάδα των Pseudomallei, με κυριότερα την P.mallei, την P.cepacia και άλλα είδη (Harvey et al., 2006). H P.aeruginosa ενοχοποιείται για ευκαιριακές λοιμώξεις σε ειδικές ομάδες ασθενών, όπως άτομα που βρίσκονται σε ανοσοκαταστολή, άτομα με κακοήθεις όγκους, με εκτεταμένα εγκαύματα, προσφάτως χειρουργημένα, άτομα που υφίστανται μεταμοσχεύσεις, διαβητικά άτομα, νεογνά και άτομα ηλικιωμένα (Cross et al., 1983). Σπάνια προκαλούνται λοιμώξεις σε υγιή άτομα παρά το γεγονός ότι σε σχετικά μεγάλο ποσοστό τα άτομα αυτά μπορεί να αποικίζονται με το βακτήριο στο δέρμα και τα περιττώματα. Παρ όλα αυτά, οι λοιμώξεις που προκαλούνται είναι σοβαρές και επικίνδυνες διότι αφενός μεν η P.aeruginosa προκαλεί νόσο σε ήδη άτομα νοσούντα, αφετέρου δε γιατί εμφανίζει ανθεκτικότητα στα περισσότερα αντιβιοτικά (Andonova and Urumova, 2013; Dettman et al., 2014). Άλλες λοιμώξεις που προκαλεί το συγκεκριμένο βακτήριο είναι οι εξής: Οφθαλμικές λοιμώξεις: Οι κυριότερες λοιμώξεις του οφθαλμού που προκαλεί είναι η επιπεφυκίτιδα και η δακρυοκυστίτιδα. Παρατηρούνται όμως σπάνια και μετά από χειρουργικές επεμβάσεις του οφθαλμού. Πρωτίστως οι οφθαλμοί μολύνονται από P.aeruginosa καθώς είναι πολύ υγροί και οι υψηλές συνθήκες υγρασίας ευνοούν την ανάπτυξη του συγκεκριμένου μικροοργανισμού. Συχνότερες είναι οι λοιμώξεις της επιμόλυνσης τραυμάτων του κερατοειδούς, καθώς το είδος αυτό έχει χαρακτηριστεί ως το πλέον καταστρεπτικό βακτήριο του κερατοειδούς (Wilson and Ahearn, 1997). Εικόνα 1-11 Α. Οφθαλμός με μόλυνση από P.aeruginosa B. Υγιής οφθαλμός E%BF%CE%B9%CE%BC%CF%89%CE%BE %CE%B5%CE%B9%CF%82+%CF%84%CE %BF%CF%85+%CE%BC%CE%B1%CF%84 %CE%B9%CE%BF%CF%85+%CE%B1%CF %80%CE%BF+%CF%88%CE%B5%CF%85% CE%B4%CE Δερματικές μολύνσεις: Έχουν αναφερθεί κρούσματα φλυκταινώδους βλάβης του δέρματος, θυλακίτιδες αλλά και σοβαρότερες δερματοπάθειες οφειλόμενες στην P.aeruginosa (Ratnam et al., 1986; Khabbaz et al., 1983). Επίσης, κατά περιόδους έχουν γνωστοποιηθεί λοιμώξεις εγκαυμάτων όπου παρατηρείται εξωγενής αποικισμός του εγκαύματος προερχόμενος από το νοσοκομειακό περιβάλλον. Η μόλυνση αυτή, ανάλογα με την κρισιμότητά της και την κατάσταση υγείας του ασθενή, μπορεί να εξελιχθεί σε διαπύηση 54

55 του εγκαύματος, με βαθιές βλάβες του δέρματος, με συχνό επακόλουθο τη βακτηριαιμία και το θάνατο (Iglewski et al., 1989; Gustafson et al., 1983). Λοιμώξεις του αναπνευστικού και του Κ.Ν.Σ: Το βακτήριο αυτό δύναται να προκαλέσει πρωτοπαθή ή δευτεροπαθή μηνιγγίτιδα. Σε ασθενείς που νοσηλεύονταν στο νοσοκομείο έχουν καταγραφεί κρούσματα πνευμονίας μετά από χρήση μολυσμένων αναπνευστικών βοηθημάτων με συνέπεια ακόμα και το θάνατο (Feizabadi et al., 2010). Χρόνιες λοιμώξεις του αναπνευστικού συστήματος που προκαλούνται από P.aeruginosa παρουσιάζονται συχνά σε ασθενείς με κυστική ίνωση. Πιο συγκεκριμένα, το βακτήριο ανιχνεύεται στο αναπνευστικό σύστημα ατόμων που πάσχουν από ινοκυστική νόσο του παγκρέατος. Η πλειοψηφία των στελεχών που απομονώνονται από τα πτύελα τέτοιων ασθενών είναι βλεννώδη και εκριζώνονται πολύ δύσκολα. (Dettman et al., 2014; Stoler et al., 2015) Κατά καιρούς έχουν προκληθεί επιδημίες που οφείλονται στην P.aeruginosa: Σε ασθενείς με βρογχοπνευμονία που νοσηλεύτηκαν σε 1417 μονάδες εντατικής θεραπείας σε 17 χώρες της Δυτικής Ευρώπης η P.aeruginosa ήταν το συχνότερο, σε ποσοστό 8,7%, Gram-αρνητικό είδος που απομονώθηκε σύμφωνα με μελέτη του «European prevalence of infection in Intensive Care (EPIC)» (Vincent et al., 1995). Σύμφωνα με μελέτη του «National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS)», στελέχη Gram-αρνητικών βακτηριδίων συλλέχθηκαν στις Η.Π.Α. μεταξύ 1990 και 1999, με την P.aeruginosa να υπερισχύει σε ποσοστό 17% μεταξύ των Gram-αρνητικών που συνδέθηκαν αιτιολογικά με νοσοκομειακή πνευμονία σε μονάδες εντατικής θεραπείας (Centers for Disease Control and Prevention. National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) system report, 1999) Staphylococcus aureus Ο μικροοργανισμός αυτός ταυτοποιήθηκε για πρώτη φορά στη Σκωτία το 1880 από τον χειρούργο Alexander Ogston κατά τη διάρκεια μιας χειρουργικής επέμβασης σε άρθρωση γόνατος. Η ονομασία «Staphylococcus» χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά το 1883 από τον ίδιο, για να περιγράψει βακτήρια σφαιρικού σχήματος, τα οποία σχημάτιζαν αθροίσματα που έμοιαζαν με τσαμπιά από σταφύλια. Ο ίδιος περιέγραψε τη σταφυλοκοκκική λοίμωξη έπειτα από μια σειρά κλινικών και εργαστηριακών μελετών (Ogston, 1881). Το 1884, ο Friedrich Julius Rosenbach έκανε το διαχωρισμό των σταφυλοκόκκων σε παθογόνους (με 55

56 κυριότερο τον S.aureus) και μη παθογόνους (όπως ο S.epidermidis). Ο διαχωρισμός αυτός βασίζεται στην ικανότητα των στελεχών S.aureus να προκαλούν πήξη του πλάσματος. Είναι γνωστός και με το όνομα «χρυσίζων σταφυλόκοκκος», καθώς παράγει αποικίες που έχουν κιτρινωπό χρώμα (Δημητρακόπουλος, 1987) Μορφολογία και γενικά χαρακτηριστικά Οι σταφυλόκοκκοι είναι Gram θετικοί κόκκοι με διάμετρο 0.5 έως 1.5 μm. Παρατηρούμενοι στο μικροσκόπιο εμφανίζονται σε ζεύγη, μικρές αλυσίδες, ή συσσωματώματα. Ανήκουν στην οικογένεια Micrococcaceae η οποία περιλαμβάνει τα γένη Staphylococcus, Planococcus, Rothia και Micrococcus. O Staphylococcus aureus δε διαθέτει κίνηση, ούτε είναι σπορογόνος. Είναι προαιρετικά αναερόβιος μικροοργανισμός και αναπτύσσεται σε εύρος θερμοκρασιών 6,5-45ºC και ph 4,3-9,3 (Koτζεκίδου, 2000). Επίσης, έχει την ικανότητα να αναπτύσσεται σε υλικά που περιέχουν % NaCl. Διασπά διάφορα σάκχαρα χωρίς την παραγωγή αερίου. Αποτελεί τον κύριο παθογόνο μικροοργανισμό από την κατηγορία των σταφυλοκκόκων, με δεύτερο κατά σειρά συχνότητας τον S.epidermidis, ο οποίος μαζί με τα υπόλοιπα είδη είναι γνωστοί ως πηκτάση-αρνητικοί σταφυλόκοκκοι (Coagulase Negative Staphylococci, CNS) (Kloos et al., 1992). Εικόνα 1-12 Staphylococcus aureus, Electron micrograph. Πηγή: Todar's Online textbook of bacteriology Καλλιεργούμενος σε κατάλληλα θρεπτικά μέσα, δημιουργεί μεγάλες κιτρινωπές ή μαύρες στρογγυλές αποικίες, ανάλογα το υπόστρωμα. Προκαλεί αιμόλυση σε θρεπτικό άγαρ εμπλουτισμένο με αίμα (blood agar), σε αντίθεση με τον S.epidermidis που δεν είναι αιμολυτικός. Πρόκειται για στέλεχος που παράγει καταλάση, ενώ δεν παράγει οξειδάση, ιδιότητες που χρησιμοποιούνται στα εργαστήρια για την ταυτοποίησή του. Επίσης, σχεδόν 56

57 όλα τα στελέχη του S.aureus παράγουν κοαγκουλάση (Coagulase Positive Staphylococus), κάτι που επίσης βοηθάει ιδιαίτερα στο διαχωρισμό του από άλλους σταφυλοκκόκους. Ως παθογόνος μικροοργανισμός στον άνθρωπο, έχει πρωταρχική σημασία σε σχέση με τους υπόλοιπους σταφυλοκκόκους. Οι επιστημονικές κοινότητες επικεντρώνονται κυρίως στην κατανόηση της παθογένειας του S.aureus, αλλά και στην ολοένα αυξανόμενη ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά που παρουσιάζει (Mierzejewski and Woźniak 2012). Εικόνα 1-13 Aποικίες βακτηρίων του γ.staphylococcus και του Staphylococcus aureus στο B.P.agar. Πηγή: Εργαστήριο Υγιεινής. Μον. Περιβαλ. Μικροβιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών Staphylococcus aureus στο περιβάλλον και λοιμώξεις Ο Staphylococcus aureus βρίσκεται στον αέρα, στο νερό και στα απόβλητα. Φυσικός βιότοπός του είναι η ρινική κοιλότητα και το δέρμα του ανθρώπου και των ζώων. Μάλιστα, περίπου 20-30% του πληθυσμού είναι χρόνιοι φορείς του βακτηρίου. Σε αντίθεση με τον S.aureus που είναι καθαρά παθογόνος μικροοργανισμός και μπορεί να προκαλέσει σοβαρές ασθένειες στον άνθρωπο, τα περισσότερα στελέχη του S.epidermidis είναι μη παθογόνα και μπορεί ακόμη να παίζουν σημαντικό ρόλο στον άνθρωπο ως φυσιολογική, μικροβιακή χλωρίδα (Koτζεκίδου, 2000; Kloos et al., 1992). Όσον αφορά την παθογόνο δράση του, μπορεί να προκαλέσει από ελαφρές δερματικές λοιμώξεις (δερματίτιδα, θυλακίτιδα κ.α.) έως επικίνδυνες για τη ζωή λοιμώξεις όπως πνευμονία, μηνιγγίτιδα, οστεομυελίτιδα, ενδοκαρδίτιδα, βακτηριαιμία και σήψη. Αποτελεί 57

58 ακόμα σήμερα μία από τις 5 συχνότερες αιτίες νοσοκομειακών λοιμώξεων και συνήθως προκαλεί επιμολύνσεις χειρουργικών τραυμάτων. Οι σταφυλοκοκκικές λοιμώξεις χαρακτηρίζονται από έντονη πυώδη φλεγμονή των ιστών, με τάση σχηματισμού κύστης, που συχνά αποβαίνει στη δημιουργία αποστήματος (Bailey et al., 1990; Heilmann et al. 2002). Στη συνέχεια περιγράφονται λεπτομερώς οι κυριότερες λοιμώξεις που προκαλούνται: Δερματικές λοιμώξεις: Είναι από τις πιο κοινές, με επικρατέστερη τη θυλακίτιδα, όπου αναπτύσσεται φλεγμονή του θύλακα της τρίχας και συχνά εξελίσσεται σε φλυκταινώδης. Άλλη δερματική λοίμωξη που προκαλεί ο S.aureus είναι η πυοδερματίτιδα (μολυσματικό κηρίο). Πρόκειται για μια μόλυνση που εμφανίζεται κυρίως σε νεογνά και μικρά παιδιά. Μεταδίδεται πολύ εύκολα (π.χ. από τη χρήση κοινών μολυσμένων πετσετών), ενώ εμφανίζεται κυρίως στο πρόσωπο και τα άκρα. (Pulido et al., 2014) Βακτηριαιμία: Όταν το βακτήριο εισέρχονται στην κυκλοφορία του αίματος και εξαπλώνεται σε άλλα όργανα προκαλείται βακτηριαιμία ή σηψαιμία, που μπορούν να οδηγήσουν ακόμα και στο θάνατο (Mylotte et al., 1987). Λοιμώξεις του Κ.Ν.Σ: Η μηνιγγίτιδα είναι ίσως η σοβαρότερη λοίμωξη του κεντρικού νευρικού συστήματος που μπορεί να προκαλέσει αυτός ο μικροοργανισμός. Αποτελεί συνήθως επιπλοκή διαγνωστικών ή χειρουργικών επεμβάσεων στο κεντρικό νευρικό σύστημα (Bailey et al., 1990). Λοιμώξεις του καρδιοαναπνευστικού: Η πνευμονία είναι κατά κύριο λόγο δευτερογενής, δηλαδή εμφανίζεται συνήθως στους ενήλικες μετά από γρίπη, ενώ στα μικρά παιδιά (<2 ετών) παρατηρείται αιμορραγική νέκρωση του πνεύμονα και σχηματισμός αποστήματος, με μεγάλο κίνδυνο θνησιμότητας. Η μικροβιακή ενδοκαρδίτιδα που οφείλεται στον S.aureus εμφανίζεται κυρίως στους τοξικομανείς και σε όσους λαμβάνουν ενδοφλέβια ναρκωτικά, σε ηλικιωμένους ασθενείς, σε ασθενείς με προσθετικές βαλβίδες, καθώς και σε άλλους νοσηλευόμενους ασθενείς (Caputo et al., 1987). Σύνδρομο τοξικής καταπληξίας: Είναι μια από τις σοβαρότερες καταστάσεις που προκαλεί ο S.aureus, που οφείλεται στη σύνθεση της αντίστοιχης τοξίνης (toxic shock syndrome toxin, TSST-1). Τα συμπτώματα που το συνοδεύουν είναι ο υψηλός πυρετός ( 38.9ºC), η υπόταση, εξανθήματα που καταλαμβάνουν όλο το σώμα και δυσλειτουργία 58

59 διαφόρων οργάνων (διάρροια, εμετοί, αύξηση τρανσαμινασών και χολερυθρίνης, υπασβεσταιμία, ελάττωση του αριθμού των αιμοπεταλίων, αρθραλγίες, μυαλγίες κ.ά.) (Shands et al., 1980). Οστεομυελίτιδα: Η οστεομυελίτιδα είναι η πιο συχνή μικροβιακή φλεγμονή του οστού, που οδηγεί σε σχηματισμό πύου και νεκρωμάτων. Αποτελεί μια βακτηριακή λοίμωξη του οστού ή του μυελού των οστών που επηρεάζει κυρίως ασθενείς που εισάγονται στα νοσοκομεία Ο S.aureus είναι ο πιο συχνός αιτιολογικός παράγοντας της λοίμωξης. Η θεραπεία της οστεομυελίτιδας αποτελεί πρόκληση λόγω μιας ποικιλίας παραγόντων, συμπεριλαμβανομένης της κακής βιοδιαθεσιμότητας των αντιβιοτικών στον ιστό του οστού, της αύξησης της ανθεκτικότητας του μικροοργανισμού στα αντιβιοτικά κ.ά. Σε πολλές περιπτώσεις, οι γιατροί προβαίνουν σε «χειρουργικό καθαρισμό» ως μόνη επιλογή για να απομακρύνουν τα βακτήρια. Προσβάλλει συνήθως τους άντρες (αναλογία 3:1) μέχρι την ηλικία των 20 ετών και σπανιότερα άτομα μεγαλύτερης ηλικίας. Η μεγαλύτερη συχνότητα παρατηρείται στις ηλικίες μηνών. (Olson and Horswill, 2013) Τροφικές δηλητηριάσεις: Διάφορα στελέχη του παράγουν εντεροτοξίνες στις οπoίες οφείλεται γαστρεντερίτιδα που συνήθως περιορίζεται από τον ίδιο τον οργανισμό. Μέχρι σήμερα έχουν προσδιοριστεί πολλοί ορολογικά διαφορετικοί τύποι εντεροτοξινών (SEA - SEU) (Le Loir et al., 2003). Η ποσότητα αυτών που απαιτείται για να προκαλέσουν δηλητηρίαση σε έναν άνθρωπο είναι το λιγότερο 1mg τοξίνη/100g τροφίμου. Τα συμπτώματα από την δηλητηρίαση είναι ζάλη, εμετός, κοιλιακός πόνος, διάρροια και εμφανίζονται 2-6 ώρες μετά την κατάποση του τροφίμου και διαρκούν 1-3 μέρες (Bhatia and Zahoor, 2007). Τα περισσότερα επιδημιολογικά στοιχεία που οφείλονται στον S.aureus είναι συνδεδεμένα με τροφικές δηλητηριάσεις που προκαλεί ο μικροοργανισμός αυτός. Για παράδειγμα, το 1996 και το 1998 στην Γερμανία σημειώθηκαν πολλά κρούσματα από σταφυλοκοκκική τροφική δηλητηρίαση που προκλήθηκε από κατανάλωση άψητου καπνιστού ζαμπόν. Επιπλέον την άνοιξη του 2000 υπήρξε μια έξαρση από σταφυλοκοκκική τροφική δηλητηρίαση με τον αριθμό κρουσμάτων να φτάνει τα 297 άτομα (Atanassova et al., 2001). Στις ΗΠΑ, ο σταφυλόκοκκος αποτελεί το 25% των τροφιμογενών δηλητηριάσεων. Ωστόσο από το 1992 έως το 1998 ο S.aureus συγκεκριμένα, ήταν υπεύθυνος αντίστοιχα για 1,8%, 2,8%, 2,4%, 1,7% και 1,5% των τροφιμογενών λοιμώξεων (Bean et al.,1997). 59

60 Τα τελευταία χρόνια γίνεται λόγος για ένα εξαιρετικά παθογόνο στέλεχος που προκαλεί ολοένα και περισσότερα κρούσματα παγκοσμίως. Πρόκειται για το S.aureus ανθεκτικό στη methicillin (MRSA), ο οποίος είναι ανθεκτικός εκτός από τη μεθικιλλίνη και σε άλλα αντιμικροβιακά της ίδιας κατηγορίας, συμπεριλαμβανομένης της πενικιλίνης, της αμοξικιλλίνης και της οξακιλλίνης. Έχει ιδιαίτερο ενδιαφέρον στην κλινική πράξη καθώς δυστυχώς, είναι από τους μικροοργανισμούς που είναι ανθεκτικοί στα περισσότερα αντιβιοτικά που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία της σταφυλοκοκκικής λοίμωξης (Voss et al., 1994). Ο MRSA εμφανίστηκε για πρώτη φορά σε ασθενείς σε νοσοκομεία και άλλες μονάδες υγείας, ιδίως σε περιπτώσεις ηλικιωμένων, βαριά αρρώστων ή ατόμων σε κατάκλιση με ανοικτές πληγές ή καθετήρα στο σώμα. Το 1981 στο Μίτσιγκαν έγινε η πρώτη επίσημη αναφορά κρουσμάτων που εμφανίστηκαν κυρίως σε χρήστες ενδοφλέβιων ουσιών. Το 1997, συνδέθηκε με το θάνατο τεσσάρων παιδιών στη Μινεσότα και στη Ντακότα. Κρούσματα εμφανίστηκαν και στο Τέξας το 2003 και μετέπειτα (Kassis et al., 2011). Στις ΗΠΑ, τις τελευταίες δεκαετίες ο αριθμός των κρουσμάτων έχει αυξηθεί σημαντικά. Σύμφωνα με μια δημοσίευση του Κέντρου Ελέγχου Ασθενειών και Πρόληψης (Centers for Disease Control and Prevention) του 2007, εκτιμάται ότι ο αριθμός κρουσμάτων από τον MRSA στο νοσοκομειακό περιβάλλον έχει διπλασιαστεί σε εθνικό επίπεδο από περίπου περιστατικά το 1999 σε το 2005, ενώ το ίδιο διάστημα οι θάνατοι ανέρχονται από που ήταν το 1999 στους (Klein et al., 2007). Η πλειοψηφία των κρουσμάτων παγκοσμίως συνδέεται με νοσοκομειακές λοιμώξεις γι αυτό και απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή στους χώρους των Μονάδων Υγείας, ενώ οι επιστήμονες συνεχίζουν τις έρευνες για τη μελέτη της ανθεκτικότητας που εμφανίζει το συγκεκριμένο στέλεχος προσπαθώντας να βρουν λύση στο πρόβλημα που δημιουργεί. 60

61 1.9 Kαλλυντικά και Δημόσια Υγεία Τα καλλυντικά, με πρωταρχικό ρόλο να έχουν οι ενυδατικές κρέμες, τα σαμπουάν, τα αποσμητικά, το make up και οι κολόνιες, έχουν γίνει αναπόσπαστο κομμάτι της καθημερινής περιποίησης του δέρματος. Οι ενήλικες γυναίκες χρησιμοποιούν την πλειονότητα των καλλυντικών σε καθημερινή βάση. Παρά το γεγονός ότι χρησιμοποιούνται για λόγους υγείας και τόνωσης του δέρματος, μπορούν να προκαλέσουν δερματικό ερεθισμό ή αλλεργική αντίδραση λόγω ορισμένων συστατικών που χρησιμοποιούνται κατά την παρασκευή τους ή λόγω επιμόλυνσής τους (Lee et al., 2007; Mislivec et al., 1998). Τα συστατικά τους υπόκεινται σε ελέγχους και περνούν από νομικές διαδικασίες για την έγκριση τους. Δυστυχώς όμως, δεν υπάρχει απόλυτη εγγύηση για την ασφάλεια του προϊόντος Μικροβιακή χλωρίδα των καλλυντικών κα παθογόνα βακτήρια στα καλλυντικά Τα καλλυντικά λόγω των θρεπτικών συστατικών που διαθέτουν, αποτελούν πρόσφορο έδαφος για την ανάπτυξη και αποικισμό συγκεκριμένων μικροοργανισμών. Οι μικροοργανισμοί αυτοί με τη σειρά τους μπορεί να συμβιώνουν με τα καλλυντικά χωρίς να τα αλλοιώνουν. Μπορεί όμως και να προκαλέσουν αλλοιώσεις και μετέπειτα μολύνσεις στον άνθρωπο, θέτοντας σε κίνδυνο την υγεία του. Οι πιο διαδεδομένοι μικροοργανισμοί που συναντώνται στα καλλυντικά προϊόντα είναι τα βακτήρια και οι μύκητες (Grigo, 1976; Katusin et al. 2003). Οι μύκητες διακρίνονται στους κυρίως μύκητες ή ευρωτομύκητες ή μούχλες, που είναι συνήθως πολυκύτταροι μικροοργανισμοί και στις ζύμες ή ζυμομύκητες, που είναι συνήθως μονοκύτταροι. Οι πιο διαδεδομένοι από τους κυρίως μύκητες που συναντώνται στα καλλυντικά είναι οι ακόλουθοι: Τα πενικίλλια (Penicillium spp.): Το γένος αυτό διακρίνεται από τις διακλαδώσεις που σχηματίζει, που έχουν το σχήμα πινέλου, από το οποίο προέρχεται και η ονομασία τους. Έχουν πρασινωπές αποχρώσεις και στα καλλυντικά προκαλούν ευρωτιάσεις. Δρουν σε όξινο περιβάλλον, αποσυνθέτοντας πρωτεΐνες, λίπη και σάκχαρα. 61

62 Οι ασπέργιλλοι (Aspergillus spp.): Πρόκειται για μικροοργανισμούς γενικά τοξικούς για τον άνθρωπο. Πιο συγκεκριμένα, σοβαρή μυκοτοξίκωση προκαλεί η αφλατοξίνη που παράγουν ορισμένα είδη του (Α.flavus). Ο Aspergillus niger, που προκαλεί μαύρη μούχλα στα αμυλούχα προϊόντα, μπορεί να προκαλέσει χρόνια μυκητίαση στο δέρμα του έξω ακουστικού πόρου. Έχουν χρώμα κίτρινο, μαύρο ή πράσινο και απαιτούν θερμές συνθήκες για την ανάπτυξή τους. Αυξημένες ωστόσο είναι και οι διατροφικές τους απαιτήσεις. Εικόνα 1-14 Αspergillus niger. Πηγή: r/2012/09/a-relatively-completelist-of-fungi-in.html Τα ριζόποδα και Μουκόρια (Rhizopus spp., Mucor spp.): Οι συγκεκριμένοι μικροοργανισμοί αναπτύσσονται σε υγρό περιβάλλον, υδρολύοντας το άμυλο σε γλυκά σάκχαρα. Παρατηρούμενα στο μικροσκόπιο αναπτύσσουν χαρακτηριστικά σποριοάγγεια. Χαρακτηριστικότερο είδος του γένους είναι το Rhizopus nigricanas. Όσον αφορά τους ζυμομύκητες, πρόκειται για μονοκύτταρους κυρίως μικροοργανισμούς σχήματος ωοειδούς, πυραμιδοειδούς κ.ά. που αναπαράγονται κυρίως με εκβλάστηση αλλά κάποιοι και με διχοτόμηση (Αγγελής, 2007). Από τους ζυμομύκητες οι κυριότεροι που συναντώνται στα καλλυντικά είναι: Οι σακχαρομύκητες: Το είδος που συναντάται κυρίως είναι το Saccharomyces ellipsoideus. Οι κρυπτόκοκκοι: Με επικρατέστερο στα καλλυντικά το είδος Cryptococcus neoformans. Οι κάντιντες: Σύμφωνα με τη νομοθεσία το είδος Candida albicans πρέπει να είναι απών από ένα καλλυντικό παρασκεύασμα. Εικόνα 1-15 Στ αριστερά απεικόνιση του γένους Saccromyces, στο κέντρο το γένος Cryptococcus και δεξιά το γένος Candida. Πηγή: Στοιχεία Χημείας- Κοσμητολογίας, Φιωτάκης Κ. 62

63 Τα βακτήρια που συναντάμε κατά κύριο λόγο σε καλλυντικά προϊόντα, αναπτύσσονται ανάλογα με την υγρασία, τη θερμοκρασία, το ph, την παρουσία οξυγόνου, την ωσμωτική πίεση και το θρεπτικά συστατικά του εκάστοτε προϊόντος. Τα μεταλλοκατιόντα είναι κάποιες από τις πηγές παρεμπόδισης της ανάπτυξής τους στα καλλυντικά. Τα συνηθέστερα βακτήρια που συναντάμε είναι τα ακόλουθα: Τα κολοβακτηρίδια: Επικρατέστερα στην κατηγορία αυτή είναι το γένος Escherichia και ειδικότερα το είδος E.coli, η παρουσία του οποίου είναι ανεπιθύμητη. Μια επικείμενη μόλυνση προκαλεί στο προϊόν αλλοιώσεις του ιξώδους, «γλοιώδη» υφή και δυσοσμία. Οι σταφυλόκοκκοι: Κυριότερος αντιπρόσωπος όπως ήδη έχουμε αναφέρει είναι ο Staphylococcus aureus, η παρουσία του οποίου είναι επίσης ανεπιθύμητη στα καλλυντικά καθώς μπορεί να προκαλέσει από ήπιες δερματοπάθειες μέχρι σοβαρές λοιμώξεις ακόμη και του αναπνευστικού συστήματος. Οι ψευδομονάδες: Ήδη έχει γίνει αναφορά για την Pseudomonas aeruginosa καθώς αυτή είναι η πλέον παθογόνα που βρίσκεται κατά καιρούς στα καλλυντικά θέτοντας σε κίνδυνο την υγεία του χρήστη. Είναι ανθεκτική στα περισσότερα χρησιμοποιούμενα συντηρητικά των καλλυντικών και η υγρασία ευνοεί κατά κόρων την ανάπτυξή της Μικροβιολογικές αλλοιώσεις - Επικινδυνότητα Πολλές από τις ουσίες που χρησιμοποιούνται για την παρασκευή των καλλυντικών παρουσιάζουν μεγάλη ευαισθησία σε βιολογική αποσύνθεση. Η προέλευση της βιολογικής αποσύνθεσης των καλλυντικών μπορεί να οφείλεται στις πρώτες ύλες, στον αέρα του περιβάλλοντος, στις εγκαταστάσεις (μηχανικός εξοπλισμός), στα υλικά συσκευασίας, στο εργατικό προσωπικό και στο χρήστη. Η αλλοίωση που προκαλείται οφείλεται κατά κύριο λόγο στους μικροοργανισμούς (Grigo, 1976). Αλλοιώσεις που μπορούν να προκαλέσουν οι μικροοργανισμοί, υποβαθμίζοντας την ποιότητα του προϊόντος είναι η μεταβολή του ph και του ιξώδους τους, η δημιουργία οσμής, η μεταβολή χρώματος, η τάγγιση κ.ά. Σε περιπτώσεις γαλακτώματος, μπορεί να δημιουργηθεί διαχωρισμός ή και αναστροφή των δύο φάσεων που το αποτελούν, ενώ σε περιπτώσεις διαυγών λοσιόν μπορεί να παρατηρηθούν θολώματα ή ιζήματα. Επιπλέον, 63

64 μπορεί να δημιουργηθούν αέρια που οφείλονται στο μεταβολισμό μερικών μικροοργανισμών και μπορεί να γίνουν αντιληπτά από φυσαλίδες ή αφρό στο προϊόν. Σε σπάνιες περιπτώσεις, τα δημιουργούμενα αέρια μπορεί να προκαλέσουν ακόμα και παραμόρφωση στο υλικό συσκευασίας (Lundov et al., 2009). Όταν ένα πολύπλοκο σκεύασμα, όπως ένα γαλάκτωμα, μολυνθεί από μικροοργανισμούς, τότε ακολουθεί μια προοδευτική αλλοίωση του προϊόντος: ο μεταβολισμός των επιφανειοδραστικών ουσιών θα μειώσει τη σταθερότητα και θα επιταχύνει τη μετατροπή των σφαιριδίων ελαίου σε «κρέμα». Η απελευθέρωση των λιπαρών οξέων από την ελαιώδη φάση θα μειώσει το pη και θα ευνοήσει τη συσσωμάτωση των σφαιριδίων ελαίου, προκαλώντας αλλοίωση στην υφή του γαλακτώματος. Τα λιπαρά οξέα και τα προϊόντα κετονικής οξείδωσής τους θα προσδώσουν μια πικρή γεύση και δυσάρεστη οσμή, ενώ μπορεί να γίνουν ορατές φυσαλίδες από μεταβολίτες, που θα παγιδευτούν στο προϊόν. Τέλος, οι χρωστικές ουσίες μπορεί να το αποχρωματίσουν (Denyer et al., 2004). Γενικά, το υγιές δέρμα (χωρίς αμυχές) είναι αρκετά ανθεκτικό στη μόλυνση από μικροοργανισμούς. Η έκθεση του δέρματος σε παθογόνους μικροοργανισμούς δεν οδηγεί από μόνη της σε ασθένεια. Μόλυνση μπορεί να προκληθεί σε ειδικές συνθήκες όπως: Όταν ένα προϊόν στο οποίο έχουν αναπτυχθεί μικροοργανισμοί, έρθει σε επαφή με δέρμα τραυματισμένο που εμφανίζει ανοιχτές πληγές. Σε περιπτώσεις ευαίσθητου δέρματος, όπως στις μικρές ηλικίες ή στους ηλικιωμένους, όπου το ανοσοποιητικό σύστημα είναι σε καταστολή. Κατά τη διάρκεια μιας ασθένειας, όπου η αντίσταση του οργανισμού είναι αρκετά μειωμένη. Όταν ο χρήστης βρίσκεται υπό την θεραπεία αντιβιοτικών ή στεροειδών. Στην περιοχή των ματιών, που είναι περιοχή με μεγάλη υγρασία και τα καθιστά ευάλωτα, κυρίως στην Pseudomonas aeruginosa. Για το λόγο αυτό τα καλλυντικά για την περιοχή των ματιών χρειάζονται ιδιαίτερη προσοχή (Παπαϊωάννου και Ράλλης, 2008). Πολλά καλλυντικά όπως οι κρέμες και τα γαλακτώματα, διαθέτουν υπόστρωμα ευνοϊκό για την ανάπτυξη βακτηρίων και μυκήτων και με τη χρήση τους τα μικρόβια μεταδίδονται από τον άνθρωπο στο καλλυντικό και αντιστρόφως. Γι αυτό και συχνά σε ανοιγμένα καλλυντικά μπορεί να βρεθεί ο ίδιος τύπος μικροβίων με αυτά του ανθρωπίνου σώματος. Η συντήρηση και η χρήση κατάλληλης συσκευασίας όπως σωληνάρια ή στενά δοχεία, συνεισφέρουν ώστε τα επίπεδα μόλυνσης να παραμένουν σε χαμηλά επίπεδα κατά την αποθήκευση και τη χρήση του προϊόντος (Brannan and Dille, 1990). Ο κίνδυνος από μια πιθανή μόλυνση από καλλυντικό παρασκεύασμα μπορεί να είναι αμελητέος αλλά μπορεί 64

65 και να προκαλέσει σοβαρή, προχωρημένη λοίμωξη, ακόμη και το θάνατο (Hutchinson et al., 2004; Olumide et al., 2008), όπως θα αναφερθούμε και παρακάτω Επιδημιολογία των λοιμώξεων από καλλυντικά Τα καλλυντικά όπως και όλα τα φαρμακευτικά προϊόντα δύναται να εμφανίσουν ανεπιθύμητες ενέργειες. Ανάλογα με την ευρεία καθημερινή, επαναληπτική χρήση τους, οι σοβαρές ανεπιθύμητες ενέργειες από τα καλλυντικά είναι γενικώς πολύ σπάνιες. Παρατηρούνται συνήθως στο δέρμα με συχνότερα συμπτώματα τον ήπιο τοπικό ερεθισμό, τη δυσανεξία, τον κνησμό, δερματίτιδα ερεθιστική ή αλλεργική, επιδείνωση προϋπάρχουσας δερματοπάθειας πρόκληση ασυνήθιστων δερματοπαθειών, όπως οίδημα βλεφάρων από τριχοβαφές, ακμή κ.ά. (Tran and Hitchins, 1994; Μουλοπούλου και συν., 2001; Olumide et al., 2008). Ήδη έχει γίνει λεπτομερής αναφορά στις λοιμώξεις που προκαλούνται από E.coli, P.aeruginosa και S.aureus στον άνθρωπο όταν έρθει σε επαφή με τους παθογόνους αυτούς μικροοργανισμούς στην παράγραφο 1.8. Μεμονωμένες λοιμώξεις που οφείλονται σε μολύνσεις από καλλυντικά είναι απίθανο να βγουν στη δημοσιότητα. Τα κρούσματα που αναγράφονται είναι ουσιαστικά τα κρούσματα στα νοσοκομεία. Παρόλο που η εισαγωγή GMP συστημάτων παγκοσμίως και η ισχύουσα νομοθεσία για την ασφάλεια των καλλυντικών έχουν βελτιώσει τις μικροβιολογικές προδιαγραφές τους, δυστυχώς συνεχίζονται να γνωστοποιούνται κρούσματα μολυσμένων καλλυντικών που σε ορισμένες περιπτώσεις έχουν πολύ σοβαρές συνέπειες για τους χρήστες. Κρούσματα λοιμώξεων στην Ισπανία από Burkholderia cepacia που οφείλονταν σε μολυσμένα στοματικά διαλύματα έχουν αναφερθεί από άτομα που νοσηλεύονταν στο νοσοκομείο (Kutty et al., 2007). Άλλη επιδημία από Burkholderia cepacia καταγράφηκε πάλι σε ισπανική μονάδα εντατικής θεραπείας και προκλήθηκε από μολυσμένο ενυδατικό γαλάκτωμα (Alvarez-Lerma et al., 2008). Κρούσματα μολύνσεων από Ρ.aeruginosa που προκλήθηκαν από μολυσμένα καλλυντικά έχουν αναφερθεί από άτομα που νοσηλεύονταν στο νοσοκομείο (Becks et al., 1995). Κρούσματα από μολυσμένα καλλυντικά δεν έχουν παρατηρηθεί μόνο στα νοσοκομεία. Έχουν γίνει έρευνες σε περιπτώσεις όπου καλλυντικά προϊόντα αποσύρθηκαν από την αγορά εκτάκτως λόγω μόλυνσής τους. Οι επιστήμονες Anelich και Korsten εντόπισαν διάφορα μικροβιακά γένη σε 58 διαφορετικές κρέμες που αποσύρθηκαν λόγω επικινδυνότητας στη Νότια Αφρική. Το πιο συχνά εντοπιζόμενος γένος ήταν Pseudomonas spp (30%), ακολουθούμενo από Enterobacter spp.(17%), Aspergillus spp.(13%) και Staphylococcus spp. (9%) (Anelich et al., 1996). Επίσης, ο Wong και οι 65

66 συνεργάτες του ανίχνευσαν τα παθογόνα στελέχη P.aeruginosa και Β.cepacia σε 25 (45%) και 19 (33%) από τα 56 διαφορετικά καλλυντικά προϊόντα που αποσύρθηκαν στις ΗΠΑ (Wong et al., 2000). Από το 2005 μέχρι το Μάϊο του 2008, η ΕΕ απέσυρε 24 διαφορετικά καλλυντικά προϊόντα λόγω της μικροβιολογικής μόλυνσης και μάλιστα τουλάχιστον το 42% αυτών ήταν μολυσμένα με το βακτήριο P.aeruginosa (Lundov et al., 2008). Στην Αγγλία διεξήχθη έρευνα σε 232 διαφορετικά προϊόντα για βρέφη και 53 από αυτά (23%) είχαν μολυνθεί. Η μελέτη περιλάμβανε μη χρησιμοποιημένα προϊόντα, προϊόντα που χρησιμοποιούνταν στο σπίτι και προϊόντα που χρησιμοποιούνταν σε ένα μαιευτήριο. Μολύνσεις εντοπίστηκαν και στις τρεις ομάδες, όπου τα γένη Staphylococcus spp. και Pseudomonas spp ήταν τα κυριότερα βακτήρια που απομονώθηκαν (Baird, 1984). Μια ιταλική μελέτη πραγματοποιήθηκε με στόχο τον έλεγχο της μικροβιακής ποιότητας σε 91 διαφορετικά καλλυντικά πριν από τη χρήση και μετά από τη χρήση τους. Κανένα από τα προϊόντα που ερευνήθηκαν δεν ήταν μολυσμένο πριν από τη χρήση. Όμως έξι προϊόντα και συγκεκριμένα προϊόντα μπάνιου, μολύνθηκαν κατά τη διάρκεια χρήσης τους, κυρίως με Staphylococcus spp (Campana et al., 2006). Τις δεκαετίες 1950/'60, η χρήση αποσμητικών που περιείχαν ζιρκόνιο είχε ως αποτέλεσμα να εμφανιστούν κρούσματα μεγάλης διαρκείας αλλεργικών φλεγμονωδών αντιδράσεων του δέρματος στους χρήστες στην Ευρώπη και τις ΗΠΑ (Shelley και Hurley, 1958). Άλλη έρευνα που πραγματοποιήθηκε στη Νιγηρία το 1992 σε καλλυντικές κρέμες και λοσιόν, έδειξε ότι όλα τα προϊόντα που συμμετείχαν στην έρευνα είχαν μικροοργανισμούς πάνω από τα όρια που ορίζει η νομοθεσία και μάλιστα απομονώθηκαν και παθογόνα στελέχη όπως E.coli (Okore, 1992). To 2008, στις Η.Π.Α. έγινε έρευνα σε μάσκαρες ματιών για τον έλεγχο της μικροβιακής ποιότητας και τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική μικροβιακή μόλυνση (Pack et al., 2008). Το 2011, στη Δανία έγιναν έρευνες σε ασθενείς με δερματοπάθειες οι οποίοι χρησιμοποιούσαν κρέμες χεριών που σύμφωνα με τις αναλύσεις, απομονώθηκε S.aureus, χωρίς όμως να σιγουρευτούν εάν προκλήθηκε απλή ενδονοσοκομειακή μόλυνση ή εάν τα προϊόντα ήταν μολυσμένα (Lundov et al., 2011). Εικόνα 1-16 Μολύνσεις από S.aureus. Πηγή: _reading/staph_aureus.php 66

67 1.9.4 Έλεγχος ποιότητας των καλλυντικών- Challenge test O έλεγχος της ποιότητας του προϊόντος έχει ως στόχο να καθορίσει αν όλα τα χαρακτηριστικά του είναι σύμφωνα με τους κανονισμούς και αν διατηρούνται κατά τη διάρκεια ζωής του (Shewhart, 1980). Τα προϊόντα που κατασκευάζονται στην φαρμακευτική βιομηχανία σήμερα πρέπει να πληρούν υψηλές μικροβιολογικές προδιαγραφές. Παρ όλα αυτά, κυκλοφορούν στην αγορά προϊόντα που δεν πληρούν τις απαραίτητες προδιαγραφές για την ασφάλεια του χρήστη με αποτέλεσμα να τίθεται σε κίνδυνο η υγεία του (Grigo et al., 1976). Οι συνέπειες αυτής της επικείμενης μόλυνσης μπορεί να είναι σοβαρές και εκτεταμένες, ιδιαίτερα αν οι μολυσματικοί μικροοργανισμοί έχουν τη δυνατότητα να πολλαπλασιάζονται σε υψηλά επίπεδα. Ουσιαστικά, οι έλεγχοι διαφέρουν ελάχιστα από αυτούς που εφαρμόζονται στα φαρμακευτικά προϊόντα που προορίζονται για τοπική χρήση. Κατ αρχήν, εφαρμόζονται φυσικοχημικοί έλεγχοι τόσο στις χρησιμοποιούμενες πρώτες ύλες, όσο και στο τελικό προϊόν. Μάλιστα, σε κάθε κατηγορία καλλυντικού προϊόντος (π.χ. κρέμες, γαλακτώματα, σαμπουάν) απαιτούνται ειδικοί φυσικοχημικοί έλεγχοι. Ακόμη, γίνονται έλεγχοι σταθερότητας του τελικού προϊόντος, έλεγχοι αποτελεσματικότητας και τοξικολογικοί έλεγχοι. Τέλος, απαραίτητοι τόσο πριν από την επιλογή χρήσης του κατάλληλου συντηρητικού όσο και στον έλεγχο του τελικού προϊόντος, είναι οι μικροβιολογικοί έλεγχοι, με τους οποίους και ασχολούμαστε στην παρούσα ερευνητική εργασία (Galdorfini et al., 2012; Parente et al., 2005; Gerginova et al., 2013). Η Διεθνής Οργάνωση Προτύπων (I.S.O.) και η ισχύουσα για τα καλλυντικά νομοθεσία είναι αυτά που ορίζουν τελικά τα πρότυπα ποιότητας παραγωγής και σύμφωνα με αυτά θα πρέπει να κινούνται και οι εταιρείες παραγωγής (Παπαϊωάννου και Ράλλης, 2008). Η περιγραφή τόσο των πρώτων υλών όσο και του τελικού προϊόντος είναι ένας άμεσος έλεγχος που γίνεται χωρίς καμία ειδική ανάλυση και συνοπτικά αποτελείται από τους εξής ελέγχους: Οπτικός έλεγχος Έλεγχος οσμής Έλεγχος της συστάσεως του προϊόντος Εξετάζονται κυρίως η μορφή, το χρώμα, η οσμή, η παρουσία ή απουσία ξένων σωμάτων, η διαλυτότητα σε ορισμένους κοινούς διαλύτες όπως νερό και αλκοόλη κ.ά. Ακόμη, συμπεριλαμβάνονται και οι έλεγχοι του ph, του ιξώδους, του αριθμού οξύτητας, της 67

68 περιεκτικότητας σε νερό, της σκληρότητας (για τις κρέμες) κ.ά. (Παπαϊωάννου και Ράλλης, 2008; Parente et al., 2005). Μικροβιολογική μόλυνση ενός καλλυντικού προϊόντος μπορεί να συμβεί κατά τη διάρκεια της παραγωγής και της συσκευασίας ή κατά τη διάρκεια χρήσης του από τον καταναλωτή. Στην πρώτη περίπτωση η μικροβιολογική ποιότητα διασφαλίζεται από τον έλεγχο του τελικού προϊόντος μετά από κάθε παραγωγή και συσκευασία. Η δεύτερη αποτρέπεται με την διεξαγωγή επιτυχούς δοκιμασίας πρόκλησης (Challenge Test) (Manou et al., 2002; Hitchins, 1993). Η κάθε μονάδα παραγωγής καλλυντικών προϊόντων οφείλει να εξασφαλίζει τις απαραίτητες συνθήκες καθαριότητας στους χώρους και στα μηχανήματά της. Η μείωση της πιθανότητας μόλυνσης του προϊόντος εξαρτάται και από το βαθμό καθαρότητας του χρησιμοποιούμενου νερού, το οποίο θα πρέπει να είναι απαλλαγμένο από προσμείξεις και μικροοργανισμούς, καθώς και από την καθαρότητα των χρησιμοποιούμενων πρώτων υλών. Η Επιστημονική Επιτροπή για τη Ασφάλεια του Καταναλωτή (SCCS) προτείνει στα προϊόντα όπου απαιτείται ιδιαίτερη προσοχή, όπως τα καλλυντικά για την περιοχή των ματιών και τα προϊόντα βρεφικής χρήσης, το ολικό αερόβιο φορτίο να μην ξεπερνά τα 100 cfu/gr, ενώ στα υπόλοιπα καλλυντικά προϊόντα το όριο των cfu/gr. Παράλληλα, παθογόνα μικρόβια όπως P.aeruginosa, S.aureus, E.coli δεν πρέπει να περιέχονται καθόλου στο τελικό προϊόν (Baird, 1996; Dunningan, 1968). Οι μέθοδοι για την απομόνωση των μικροοργανισμών από τα καλλυντικά προϊόντα είναι η καλλιέργεια εμπλουτισμού τους με κάποιο θρεπτικό μέσο και στη συνέχεια ο εμβολιασμός του δείγματος σε τρυβλία με κατάλληλο υπόστρωμα τα οποία τοποθετούνται στη συνέχεια σε κλιβάνους ώστε να επωαστούν και να επιταχυνθεί η ανάπτυξή τους. Έτσι οι μικροοργανισμοί που τυχόν υπήρχαν στο προϊόν θα γίνουν ορατοί και μετρήσιμοι με τη μορφή αποικιών στο τρυβλίο. Τα προϊόντα που δεν είναι διαλυτά στο νερό αρχικά επεξεργάζονται για να καταστούν αναμίξιμα πριν τη διαδικασία της ανάλυσης. Η εν σειρά διάλυσή τους πραγματοποιείται ώστε να επιτευχθούν μικροβιακές συγκεντρώσεις τέτοιες που να μπορούν να μετρηθούν. Μόλις ένας μικροοργανισμός απομονωθεί σε καθαρή καλλιέργεια, συνήθως από μια αποικία που αναπτύχθηκε σε agar plate, τότε περαιτέρω χαρακτηρισμός μπορεί να γίνει με την χρήση του μικροσκοπίου σε συνδυασμό με κάποιες σχετικά απλές βιοχημικές εξετάσεις. Αυτή είναι η βασική ιδέα του μικροβιολογικού ελέγχου που πραγματοποιείται (Herigstad et al., 2001). Το νερό που είναι βασικότατο συστατικό των καλλυντικών ελέγχεται πολύ συχνά, επειδή σ αυτό οφείλονται πολλά από τα προβλήματα μολύνσεως του τελικού προϊόντος. 68

69 Λιγότερα των 100 cfu/ml και παντελής έλλειψη ψευδομονάδων είναι τα διαδεδομένα κριτήρια αποδοχής του. Έλεγχος γίνεται ακόμη στα μηχανήματα παραγωγής συσκευασίας, στους χώρους όπου βρίσκονται τα ίδια τα μηχανήματα, στον αέρα και τα φίλτρα συμπιεσμένου αέρα που χρησιμοποιούνται για να απαλλάξουν από τη σκόνη τα υλικά συσκευασίας (Orth, 1989). Απαραίτητο όμως, είναι και ένα σύστημα συντήρησης ώστε να επιτυγχάνεται η ασφάλεια του προϊόντος κατά την αποθήκευσή του, αλλά και κατά τη διάρκεια της χρήσης του από τον καταναλωτή. Αυτό επιτυγχάνεται με τα challenge tests που πραγματοποιούνται. Εάν τα συντηρητικά που περιέχονται είναι δραστικά μόνο για περιορισμένο φάσμα μικροβίων, το προϊόν είναι ευάλωτο σε μόλυνση από άλλους μικροοργανισμούς. Ο σκοπός τη δοκιμασίας της αποτελεσματικότητας των συντηρητικών είναι ο προσδιορισμός του τύπου και της μικρότερης δυνατής συγκέντρωσης των συντηρητικών, που απαιτείται για την πρόληψη της μικροβιακής μόλυνσης από την ώρα της παραγωγής του προϊόντος έως τη πλήρη χρήση του (Manou et al., 2002). Η συντήρηση καλλυντικών προϊόντων είναι περίπλοκο θέμα γιατί πρέπει να ληφθούν υπόψη πολυάριθμοι παράγοντες, οι πιο σημαντικοί από τους οποίους είναι: η μορφή του καλλυντικού (υγρό, σκόνη, γαλάκτωμα) η ποσότητα του θρεπτικού υλικού που αποτελεί καλό υπόστρωμα για την ανάπτυξη και επιβίωση των μικροοργανισμών (νερό, υδρογονάνθρακες, πρωτεΐνες, φωσφολιπίδια) η οξύτητα ή η αλκαλικότητα του προϊόντος η παρουσία συστατικών που έχουν αντιμικροβιακές ιδιότητες οι μικροοργανισμοί που πιθανώς θα εμπλακούν κατά την παρασκευή του καλλυντικού Η δράση των συντηρητικών εκτιμάται με την αξιολόγηση της δυνατότητας να προλαμβάνουν την ανάπτυξη μικροβίων που προστίθενται (εμβολιάζονται) υπό ορισμένες συνθήκες. Οι συνθήκες αυτές εξαρτώνται από τις εταιρείες και τα μικροβιολογικά εργαστήρια που διαθέτουν. Εκτιμάται λοιπόν η αποτελεσματικότητα του συστήματος συντήρησης σε σχέση με την ικανότητά του να μειώνει τους μικροοργανισμούς. Αν το αρχικό μικροβιακό φορτίο που εκτίθεται στο προϊόν αυξάνει ή παραμένει σταθερό, τότε το προϊόν κρίνεται ατελώς συντηρημένο και δε θα πρέπει να εξέλθει στην αγορά (Παπαϊωάννου και Ράλλης, 2008; Civille and Dus 1991). 69

70 70

71 ΣΚΟΠΟΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ 71

72 ΣΚΟΠΟΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Στις μέρες μας η χρήση καλλυντικών προϊόντων είναι ιδιαίτερα διαδεδομένη παγκοσμίως. Μάλιστα, η πρόσβαση στα καλλυντικά προϊόντα είναι ιδιαίτερα εύκολη, καθώς το δίκτυο διανομής τους είναι αρκετά εκτεταμένο. Διατίθενται σε μεγάλα καταστήματα καλλυντικών, σε φαρμακεία, σε εξειδικευμένα καταστήματα φυτικών καλλυντικών, σε super markets, ακόμα και στο διαδίκτυο. Δυστυχώς όμως, πολλές εταιρείες δεν δίνουν την ιδιαίτερη προσοχή που απαιτείται κατά την παρασκευή των προϊόντων με αποτέλεσμα να θέτουν σε κίνδυνο τη δημόσια υγεία. Επιπλέον, ευθύνες για πιθανή μόλυνση από κάποιο καλλυντικό σκεύασμα δεν έχουν μόνο οι παρασκευαστές, αλλά και το ίδιο το καταναλωτικό κοινό καθώς δεν ενημερώνεται σωστά ή δεν τηρεί τις απαραίτητες προϋποθέσεις για τη χρήση των προϊόντων, γεγονός που αποδεικνύεται από ποικίλα περιστατικά και κρούσματα μολύνσεων που έρχονται στην επιφάνεια ανά τακτά χρονικά διαστήματα σε όλο τον κόσμο. Η ύπαρξη παθογόνων μικροοργανισμών στα καλλυντικά προϊόντα κρίνεται επικίνδυνη για τη δημόσια υγεία και γι αυτό χρειάζεται να γίνονται έλεγχοι ως προς την ποιότητα του προϊόντος πριν την εξαγωγή του. Ο χρήστης καλείται να ενημερώνεται επαρκώς ώστε να φροντίζει και ο ίδιος για τη διασφάλιση της υγείας του. Η παρακολούθηση και ο έλεγχος των καλλυντικών προϊόντων αποτελεί πλέον σημαντικό θέμα δημόσιας υγείας. Σκοπός λοιπόν της παρούσας εργασίας είναι να διερευνηθεί η μικροβιολογική ποιότητα ορισμένων καλλυντικών προϊόντων που χρησιμοποιούνται από γυναίκες διαφόρων ηλικιών, ώστε να χαρακτηριστούν κατάλληλα ή ακατάλληλα για χρήση. Ακόμη, με τη βοήθεια ερωτηματολογίου και κατάλληλων στατιστικών που διεξήχθησαν, σκοπός είναι να εκτιμηθεί ο κίνδυνος που οφείλεται σε μόλυνση από τα καλλυντικά για τη δημόσια υγεία αλλά και η ευθύνη που φέρει ο ίδιος ο χρήστης λόγω πιθανής ανεπαρκούς ενημέρωσης ή λόγω μη συμμόρφωσης με τις οδηγίες για την ορθή και ασφαλή χρήση του προϊόντος. 72

73 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ο ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 73

74 2.1 ΥΛΙΚΑ Σκεύη και εξοπλισμός Τα εργαστηριακά σκεύη (γυαλικά και πλαστικά) και τα ειδικά όργανα και μηχανήματα που χρησιμοποιήθηκαν κατά την διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας παρουσιάζονται παρακάτω κατά αλφαβητική σειρά, συνοδευόμενα και από το μοντέλο και την προμηθεύτρια εταιρεία: Αναδευτήρας Vortex (Genie 2, Scientific Industries, INC,K) Αποστειρωμένοι ογκομετρικοί κύλινδροι, 100 ml, 500 ml Αποστειρωμένες υάλινες ράβδοι Αυτόματες πιπέτες 100 μl, 1000 μl (Eppendorf / Gilson) Αυτόκαυστο υγρής αποστείρωσης (autoclave) (Yamato Autoclave SM52) Γάντια (VWR) Επωαστικοί κλίβανοι 32,5 ± 2 C, 37 ± 1 C και 44 ± 2 C (Grand Instruments, Cambridge, UK) Ηλεκτρονική πιπέτα (Pipetboy Plus, Technomara) Ηλεκτρονικός ζυγός ακριβείας (A&D Industries) Καταψύκτης -20 C (Tropical Ariston) Καταψύκτης -70 C (Telstar Igloo) Κλίβανος ξηρής αποστείρωσης (Ehret TK 3237) Λαβίδα μεταλλική 74

75 Λύχνος Bunsen Μεταλλικό κουτάλι Πλυντήριο (Miele mielebro G7783) Συσκευή καταμέτρησης αποικιών με μεγεθυντικό φακό (IUL Instruments, Spain) Υάλινες κωνικές φιάλες 200 ml, 500 ml, 1000 ml Υδατόλουτρο 50 ο C (Gfld 3006 Burgwedel) Ψυγείο 5 ± 3 ο C (Frigorex Fv650) Κατά τη διάρκεια των πειραματικών δραστηριοτήτων, η χρήση εργαστηριακής ρόμπας και γαντιών ήταν υποχρεωτική, όχι μόνο για τη διασφάλιση των άσηπτων συνθηκών που απαιτούνται σε κάθε μικροβιολογικό εργαστήριο, αλλά και για την ασφάλεια της σωματικής ακεραιότητάς μας Αναλώσιμα Τα αναλώσιμα που χρησιμοποιήθηκαν κατά την διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας παρουσιάζονται παρακάτω κατά αλφαβητική σειρά, συνοδευόμενα από την προμηθεύτρια εταιρεία: Cryovials (Mast Diagnostics) Falcons 50 ml (Athal) Glass beads 2 mm (Merck) Αλουμινόχαρτο Απεσταγμένο νερό Αποστειρωμένα tips για πιπέτες 1000 μl, 200 μl (Sarstedt) 75

76 Αποστειρωμένο βαμβάκι Δείγματα καλλυντικών κρεμών και γαλακτωμάτων Tαινία ελέγχου αποστείρωσης Τρυβλία αποστειρωμένα διαμέτρου 92 mm*16 mm, 60 mm*15 mm (Athal) Θρεπτικά υλικά και αντιδραστήρια Θρεπτικό υπόστρωμα είναι κάθε υγρό ή στερεό υλικό που χρησιμοποιείται στο εργαστήριο για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών. Πρέπει να περιέχει όλα τα απαραίτητα συστατικά για τις θρεπτικές απαιτήσεις των μικροοργανισμών. Παρακάτω παρουσιάζονται τα θρεπτικά υλικά και τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν κατά την διάρκεια της πειραματικής διαδικασίας για τους μικροοργανισμούς με τους οποίους ασχολήθηκα, συνοδευόμενα από την προμηθεύτρια εταιρεία και τη σύσταση του καθενός: Acetamide Nutrient Broth (00185, Fluka) Σύσταση (g/liter): Acetamide 2.0, Magnesium sulfate 0.158, Sodium chloride 0.2, Sodium molybdate 0.005, Ferrous sulfate , Dipotassium hydrogen phosphate 0.2 Baird Parker Agar, BP (11705, Fluka) Σύσταση (g/liter): Casein Peptone 10.0, Meat Extract 5.0, Yeast Extract 1.0, Lithium Chloride 5.0, Glycine 12.0, Sodium pyruvate 10.0, Agar 15.0 BBL Brain Heart Infusion (211059, BD Difco) Σύσταση (g/liter): Brain Heart, Infusion from (solids) 6.0, Peptic Digest of Animal Tissue 6.0, Pancreatic Digest of Gelatin 14.5, Dextrose 3.0, Sodium Chloride 5.0, Disodium Phosphate 2.5 BBL Coagulase Plasma, Rabbit (240661, BD Difco) Σύσταση: Rabbit plasma με 0.85% Sodium citrate και 0.85% Sodium chloride Egg Yolk Tellurite Emulsion (75208, Fluka) 76

77 Σύσταση ανά φιαλίδιο των 100 ml (ml): Egg yolk 30.0, Sterile saline 64.0, Sterile 3.5% potassium tellurite solution 6.0 Modified Letheen Broth, MLB (263010, BD Difco) Σύσταση (g/liter): Letheen Broth 25.7, Tryptone 5.0, Proteose Peptone No , Yeast Extract 2.0, Sodium Bisulfite 0.1 Nessler s reagent (72190, Fluka) Πρόκειται για το χημικό αντιδραστήριο τετραϊωδο-υδραργυρικό κάλιο (Potassium tetraiodomercurate), που είναι διάλυμα 0.09 mol/l του τετραϊωδο-υδραργυρικό καλίου (Κ2 [HgI4]) σε 2,5 mol/l υδροξείδιο του καλίου και χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση αμμωνίας. Peptone Saline 1% από Bacteriological Peptone (LP0037, OXOID) και Sodium chloride (31434, SIGMA-ALDRICH) Σύσταση (g/liter): Peptone 1.0, sodium chloride 8.5 Pseudomonas CN Selective Supplement (107624, Merck) Σύσταση (mg/vial): Cetrimide 100.0, Nalidixic acid 7.5 Pseudomonas Selective Agar Base (107620, Merck) Σύσταση (g/liter): Peptone from gelatine 16.0, Casein hydrolysate 10.0, Potassium sulfate 10.0, Magnesium chloride 1.4, Agar-agar 11.0 Tryptic Soy Agar, TSA ή CASO Agar-Casein-peptone Soymeal-peptone Agar (105458, Merck) Σύσταση (g/liter): Peptone from casein 15.0, Peptone from soymeal 5.0, Sodium chloride 5.0, Agar-agar 15.0 Tryptone Bile X-glucuronide Agar, ChromoCult TBX (116122, Merck) Σύσταση (g/liter): Peptone 20.0, bile salts No , X-β-D-glucuronide 0.075, Agar-agar

78 Tween 80/ Polysorbate 80 (822187, Merck) Πρόκειται για χημικό αντιδραστήριο με συστατικά την ελαϊκή πολυοξυαιθυλενο σορβιτάνη (Polyoxyethylene sorbitan oleate) και μίγμα των εστέρων της Παρασκευή θρεπτικών υλικών και διαλυμάτων Για την προετοιμασία των θρεπτικών υλικών που χρησιμοποιούμε για κάθε μικροοργανισμό ακολουθούμε την εξής διαδικασία: Διαβάζουμε με προσοχή τις οδηγίες παρασκευής του εκάστοτε θρεπτικού υλικού που αναγράφονται στη συσκευασία και ελέγχουμε κάποια βασικά χαρακτηριστικά όπως η ημερομηνία λήξης, η ημερομηνία ανοίγματος, το χρώμα και η υφή του προϊόντος κ.τ.λ. Εάν είναι απαραίτητο, ανατρέχουμε σε τυχόν επιπρόσθετο φυλλάδιο με οδηγίες. Έπειτα, λαμβάνεται η ποσότητα του υλικού που πρέπει να ζυγιστεί ώστε να διαλυθεί σε συγκεκριμένη ποσότητα απιονισμένου νερού που έχει υπολογισθεί προηγουμένως με βάση τις αναγραφόμενες οδηγίες στη συσκευασία του υλικού. Πριν τη χρήση του ηλεκτρονικού ζυγού ακριβείας ελέγχουμε την επιφάνεια του, η οποία πρέπει να είναι καθαρή, καθώς και το χώρο ώστε να μην υπάρχουν ρεύματα αέρος που θα μπορούσαν να οδηγήσουν σε σφάλματα κατά τη ζύγιση. Στη συνέχεια, ο ηλεκτρονικός ζυγός μηδενίζεται και με το αποστειρωμένο μεταλλικό κουτάλι ζυγίζουμε τη σκόνη με ακρίβεια. Ακολούθως, με τον κατάλληλο ογκομετρικό κύλινδρο μετράμε τον όγκο του νερού που χρειαζόμαστε. Αποχύνουμε μέρος του νερού σε μια κωνική φιάλη διπλάσιας χωρητικότητας από τον όγκο που χρειάζεται να παρασκευαστεί το θρεπτικό με στόχο τη διάλυσή του. Προσθέτουμε τη σκόνη σιγά-σιγά, ώστε να μη δημιουργείται σύννεφο σκόνης, ανακινώντας πολύ καλά. Έπειτα προστίθεται το υπόλοιπο νερό και γίνεται ανάμειξη. Η σφαιρική φιάλη πωματίζεται ελαφρώς και θερμαίνεται μέχρι την πλήρη διάλυση της σκόνης. Συνήθως από θολό το διάλυμα γίνεται διαυγές και έτσι καταλαβαίνουμε ότι έχει γίνει καλή διάλυση. Στη συνέχεια, τοποθετούμε τη φιάλη με το διάλυμα στο αυτόκαυστο για αποστείρωση στη θερμοκρασία και το χρόνο που ορίζει ο κατασκευαστής. Κάποια θρεπτικά υλικά δεν χρειάζονται αποστείρωση και μάλιστα κάποια σε υψηλές θερμοκρασίες καταστρέφονται. Αφού αποστειρωθεί το υλικό (συνήθως η αποστείρωση πραγματοποιείται για 15 λεπτά στους 120 βαθμούς Κελσίου υπό πίεση 1 atm), αφήνεται το διάλυμα να κρυώσει σε υδατόλουτρο στη θερμοκρασία που αναγράφεται στη συσκευασία του υλικού (συνήθως στους 45 βαθμούς Κελσίου). Ταυτόχρονα, απολυμαίνεται με διάλυμα αιθανόλης ο πάγκος εργασίας. 78

79 Πάντα είναι απαραίτητο να έχουμε άσηπτες συνθήκες σε όλες τις μικροβιολογικές εργασίες γι αυτό και ανάβουμε το λύχνο Bunsen στο χώρο που εργαζόμαστε, δουλεύοντας δίπλα στη φλόγα. Ανακινούμε απαλά τη φιάλη με το υλικό, αφαιρούμε το καπάκι και αποστειρώνουμε το στόμιό της καίγοντάς το στο λύχνο. Στη συνέχεια, ανοίγεται το καπάκι του τρυβλίου υπό γωνία 45 ο περίπου και ρίχνουμε στο τρυβλίο περίπου ml υλικού. Κλείνεται αμέσως μετά το καπάκι του τρυβλίου. Καίμε ξανά το στόμιο της φιάλης και επαναλαμβάνεται η παραπάνω διαδικασία σε όλα τα τρυβλία. Αφού περιμένουμε να πήξει το υλικό, τοποθετούμε τα τρυβλία ανάποδα ώστε οι υδρατμοί να μαζευτούν στο καπάκι και όχι στο υλικό. Στη συνέχεια με ανεξίτηλο μαρκαδόρο γράφουμε στην κάτω επιφάνεια του τρυβλίου με καθαρά γράμματα τα αρχικά του υλικού και την ημερομηνία παρασκευής του. Έπειτα, τοποθετούμε τα έτοιμα προς χρήση τρυβλία στην ειδική σακούλα και τα τοποθετούμε στο ψυγείο. Αναγράφουμε και στη σακούλα την ημερομηνία παρασκευής και το όνομα του θρεπτικού υλικού. Θα πρέπει να δίνουμε ιδιαίτερη προσοχή, στην πιθανή επιμόλυνση των τρυβλίων κατά τη συντήρησή τους και να απομακρύνουμε στα απόβλητα τα μολυσμένα τρυβλία Διαλύτης για τις δεκαδικές αραιώσεις Ο διαλύτης που χρησιμοποιήθηκε καθ όλη τη διάρκεια του πειραματικού μέρους για τις δεκαδικές αραιώσεις που χρειάστηκε να κάνουμε στα καλλυντικά δείγματα ώστε να είναι μετρήσιμα τα αποτελέσματα είναι το Modified Letheen Broth (MLB). Ήταν, δηλαδή, ο διαλύτης των κρεμών που μελετήσαμε και ταυτόχρονα ο διαλύτης που χρησιμοποιήσαμε για τις αραιώσεις. Για την παρασκευή του, ανάλογα με τον αριθμό των δειγμάτων που θα επεξεργαζόμουν εβδομαδιαία, υπολογιζόταν η ποσότητα σε g του θρεπτικού και η αντίστοιχη ποσότητα του νερού με βάση τις οδηγίες στη συσκευασία. Στις οδηγίες δίνεται η πληροφορία ότι σε 1 lt απιονισμένου H2O αντιστοιχούν 42,8 gr θρεπτικού υλικού, βάσει της οποίας υπολογίζονται οι αναλογίες των υλικών για την δημιουργία της αναγκαίας ποσότητας του θρεπτικού. Απιονισμένο νερό και ζυγισμένη σκόνη τοποθετούνται σε γυάλινη φιάλη με πώμα των 250 ml (Συνήθως γινόταν παρασκευή 130 ml εβδομαδιαία) και στη συνέχεια γίνεται ανακίνηση της φιάλης με ταυτόχρονη θέρμανση για διαλυτοποίηση της σκόνης. Έπειτα, ακολουθεί αποστείρωση στο αυτόκαυστο στους 121ºC, επί 15 λεπτά και αφότου πέσει η θερμοκρασία του, γίνεται τοποθέτηση της φιάλης στο ψυγείο στους 4ºC. 79

80 Tryptic Soy Agar για ανίχνευση της ΟΜΧ (ολική μεσόφιλη χλωρίδα) Το θρεπτικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε για την ολική μεσόφιλη χλωρίδα των καλλυντικών δειγμάτων ήταν το Tryptic Soy Agar (TSA). Για την παρασκευή του, ανάλογα με τον αριθμό των δειγμάτων που θα επεξεργαζόμουν εβδομαδιαία, υπολογιζόταν ο αριθμός των τρυβλίων που θα χρειάζονταν και αναλόγως παρασκευαζόταν η κατάλληλη ποσότητα θρεπτικού. Το ίδιο συμβαίνει και με τα υπόλοιπα θρεπτικά που χρησιμοποιήθηκαν. Σύμφωνα με τις οδηγίες, σε 1 lt απιονισμένου H2O αντιστοιχούν 40 gr θρεπτικού υλικού. Απιονισμένο νερό και ζυγισμένη σκόνη τοποθετούνται σε γυάλινη φιάλη με πώμα. Στη συνέχεια γίνεται ανακίνηση της φιάλης με ταυτόχρονη θέρμανση για διαλυτοποίηση της σκόνης. Ακολουθεί αποστείρωση στο αυτόκαυστο στους 121ºC, επί 15 λεπτά και όταν τελειώσει η διαδικασία, αναμένουμε να πέσει η θερμοκρασία του ώστε να γίνει τοποθέτηση της φιάλης στο ψυγείο στους 4 ºC Tryptone Bile X-glucuronide Agar για ανίχνευση του E.coli Το θρεπτικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του E.coli στα δείγματα ήταν το Tryptone Bile X-glucuronide Agar (TBX). Σε 1 lt απιονισμένου H2O αντιστοιχούν 31,6 gr θρεπτικού υλικού TBX. Το υπολογιζόμενο νερό και η ζυγισμένη σκόνη τοποθετούνται σε γυάλινη φιάλη με πώμα. Στη συνέχεια γίνεται ανακίνηση της φιάλης με ταυτόχρονη θέρμανση για διαλυτοποίηση της σκόνης. Ακολουθεί αποστείρωση στο αυτόκαυστο στους 121ºC, επί 15 λεπτά και όταν τελειώσει η διαδικασία, αναμένουμε να πέσει η θερμοκρασία του ώστε να γίνει τοποθέτηση της φιάλης στο ψυγείο στους 4 ºC Baird Parker Agar για ανίχνευση του S.aureus Το θρεπτικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του S.aureus στα δείγματα ήταν το Baird Parker Agar (BP). Σε 950 ml απιονισμένου H2O αντιστοιχούν 58 gr θρεπτικού υλικού BP. Απιονισμένο νερό και ζυγισμένη σκόνη τοποθετούνται σε γυάλινη φιάλη με πώμα. Στη συνέχεια γίνεται θερμαινόμενη ανάδευση της φιάλης για διαλυτοποίηση της σκόνης. Ακολουθεί αποστείρωση στο αυτόκαυστο στους 121ºC, επί 15 λεπτά. Έπειτα, τοποθετείται η φιάλη στο 80

81 υδατόλουτρο στους 50ºC. Παράλληλα ετοιμάζουμε το supplement που απαιτείται που ονομάζεται Egg Yolk Tellurite Emulsion. Με αποστειρωμένη πιπέτα ρίχνουμε το συμπλήρωμα σιγά-σιγά στη φιάλη με το διάλυμα αναδεύοντας με κυκλικές κινήσεις. Για 950 ml διαλύματος θρεπτικού υλικού απαιτείται η προσθήκη 50 ml Egg yolk. Μετά την ομογενοποίηση του διαλύματος, γίνεται επίστρωση των τρυβλίων, προσθέτοντας περίπου ml σε κάθε τρυβλίο. Αφήνουμε το άγαρ να στερεοποιηθεί και έπειτα γυρνάμε τα τρυβλία ανάποδα ώστε η υγρασία να συσσωρεύεται στο καπάκι και όχι στο υλικό. Στη συνέχεια, βάζουμε τα τρυβλία στην ειδική σακούλα και τα αποθηκεύουμε στο ψυγείο στους 4ºC BBL Brain Heart Infusion για ταυτοποίηση του S.aureus Το θρεπτικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση του S.aureus ήταν το BBL Brain Heart Infusion. Διαλύονται 37 g σε 1 lt αποσταγμένου νερού σε γυάλινη φιάλη. Ακολουθεί θερμαινόμενη ανάδευση για πλήρη διάλυση της σκόνης. Με αυτόματη πιπέτα, μοιράζουμε το περιεχόμενο σε σωλήνες των 5 ml και ακολουθεί αποστείρωση στο αυτόκαυστο στους 121ºC για 15 λεπτά. Το broth είναι έτοιμο για χρήση και αποθηκεύεται στο ψυγείο στους 4ºC Pseudomonas selective Agar για ανίχνευση της P.aeruginosa Το θρεπτικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της P.aeruginosa στα δείγματα ήταν το Pseudomonas selective Agar. Σε 500 ml απιονισμένου H2O αντιστοιχούν 24,2 gr θρεπτικού υλικού και 5 ml γλυκερόλης που θα πρέπει να προστεθούν πριν τη θέρμανση για διαλυτοποίηση της σκόνης. Απιονισμένο νερό, ζυγισμένη σκόνη και γλυκερόλη τοποθετούνται σε φιάλη. Πραγματοποιείται θερμαινόμενη ανάδευση για διαλυτοποίηση. Ακολουθεί αποστείρωση στο αυτόκαυστο στους 121ºC, επί 15 λεπτά και όταν τελειώσει η διαδικασία, τοποθετούμε τη φιάλη στο υδατόλουτρο στους 50ºC. Παράλληλα ετοιμάζουμε το supplement που απαιτείται που ονομάζεται Pseudomonas CN Selective Supplement. Για παρασκευή 500 ml θρεπτικού υλικού, προσθέτουμε ένα φιαλίδιο από τα supplements. Για την προετοιμασία του supplement, προσθέτουμε με αποστειρωμένη πιπέτα 1 ml αιθανόλης και 1 ml αποστειρωμένου νερού. Γίνεται καλή ανακίνηση του φιαλιδίου και 81

82 ρίχνουμε όλο το περιεχόμενό του στη φιάλη με το θρεπτικό αναδεύοντας με κυκλικές κινήσεις, ώστε να ομογενοποιηθεί το μίγμα. Συνεχίζουμε με επίστρωση των τρυβλίων, προσθέτοντας περίπου ml σε κάθε τρυβλίο. Αφήνουμε το άγαρ να στερεοποιηθεί και έπειτα γυρνάμε τα τρυβλία ανάποδα και στη συνέχεια, βάζουμε τα τρυβλία στην ειδική σακούλα και τα αποθηκεύουμε στο ψυγείο στους 4 ºC Acetamide Nutrient Broth για ταυτοποίηση της P.aeruginosa Το θρεπτικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση της P.aeruginosa στα δείγματα ήταν το Acetamide Nutrient Broth. Διαλύονται 2,56 g σε 950 ml αποσταγμένου νερού σε γυάλινη φιάλη. Ακολουθεί θερμαινόμενη ανάδευση για πλήρη διαλυτοποίηση της σκόνης. Με αυτόματη πιπέτα, μοιράζουμε το περιεχόμενο σε σωλήνες των 5 ml. Ακολουθεί αποστείρωση των σωλήνων στο αυτόκαυστο στους 121ºC για 15 λεπτά. Το broth είναι έτοιμο για χρήση και αποθηκεύεται στο ψυγείο στους 4 ºC Peptone Saline για αναζωογόνηση των μικροοργανισμών Το θρεπτικό υλικό που χρησιμοποιήθηκε για την αναζωογόνηση των μικροοργανισμών ώστε να κάνουμε την επικύρωση της μεθόδου, είναι το Peptone Saline 1%. Το συγκεκριμένο διάλυμα παρασκευάζεται προσθέτοντας 1 g Bacteriological Peptone και 8,5 g Sodium chloride. Το ph ρυθμίζεται στο 7± 0,2 με την βοήθεια διαλύματος ΝαΟΗ 1Ν. 82

83 2.2 ΜΕΘΟΔΟΙ Μέθοδος δειγματοληψίας Κατά τη διάρκεια κάθε δειγματοληψίας, είναι απαραίτητη η τήρηση ορισμένων κανόνων, όσον αφορά τη λήψη του δείγματος. Πιο συγκεκριμένα, θα πρέπει να γίνεται με ακρίβεια και προσοχή τόσο η χρήση του εξοπλισμού, όσο και η μεθοδολογία που θα ακολουθούμε ώστε τα δείγματα να είναι αντιπροσωπευτικά. Στη συγκεκριμένη περίπτωση, το δείγμα πρέπει να απεικονίζει τη μικροβιολογική σύσταση του εκάστοτε καλλυντικού προϊόντος και γι αυτό πρέπει να παίρνονται όλα τα κατάλληλα μέτρα ασηψίας, ώστε κατά τη συλλογή, τη μεταφορά και την ανάλυσή του να αποφεύγουμε τη μικροβιολογική μόλυνση από εξωτερικούς παράγοντες. Για τη διαδικασία της δειγματοληψίας ήταν απαραίτητα τα εξής υλικά: Αποστειρωμένα falcon δειγματοληψίας Γάντια μιας χρήσης Πλαστική σακούλα αποθήκευσης και μεταφοράς των δειγμάτων Λύχνος Bunsen Αποστειρωμένη σπάτουλα Αιθανόλη Βαμβάκι Ανεξίτηλος μαρκαδόρος Έντυπο δειγματοληψίας Πιο συγκεκριμένα, πριν από το άνοιγμα και τη δειγματοληψία, είτε γινόταν στο χώρο του εργαστηρίου, είτε σε εξωτερικό χώρο, υπό άσηπτες συνθήκες, γινόταν απολύμανση της επιφάνειας του δοχείου της κρέμας με υδατικό μίγμα αιθανόλης. Η χρήση γαντιών ήταν απαραίτητη ώστε να μην επιμολυνθεί το δείγμα κατά τη διαδικασία λήψης του. Στη συνέχεια, μετά το άνοιγμα της κρέμας, με τη βοήθεια συνήθως αποστειρωμένης σπάτουλας εάν δεν ήταν το καλλυντικό με τη μορφή σωληνάριου, λαμβανόταν στο αποστειρωμένο falcon επαρκής ποσότητα για τα πειράματα που θα ακολουθούσαν. Το καπάκι έκλεινε και ακολουθούσε ξανά απολύμανση της εξωτερικής επιφάνειας του falcon. Τέλος, ακολουθούσε η αναγραφή του αριθμού του δείγματος και των στοιχείων που ήταν 83

84 απαραίτητων για την αναγνώρισή του, τόσο πάνω στο falcon, όσο και στο έντυπο δειγματοληψίας Μέθοδοι μικροβιολογικών αναλύσεων Στη συνέχεια, θα γίνει περιγραφή των βασικότερων μεθόδων και κανόνων που ακολουθούμε γενικά στις μικροβιολογικές αναλύσεις και ειδικότερα στη συγκεκριμένη σειρά πειραμάτων που έγιναν για τη διεκπεραίωση της διπλωματικής εργασίας Άσηπτες μέθοδοι εργασίας Είναι ευρέως αποδεκτό πως οι μικροοργανισμοί υπάρχουν παντού, στο έδαφος, στο νερό, στα τρόφιμα, στο σώμα μας και σε όλα τα αντικείμενα γύρω μας. Σε κάθε μικροβιολογική μελέτη, είναι απαραίτητη η λήψη ορισμένων μέτρων προστασίας του ερευνητή για την αποφυγή της επιμόλυνσης από τους μικροοργανισμούς που μελετώνται, αλλά και από μικροοργανισμούς των γύρω επιφανειών ή του περιβάλλοντος. Για την εξασφάλιση στειρότητας καθώς και για τη μείωση του κινδύνου της μόλυνσης, κατά τη διάρκεια εφαρμογής διαφόρων μεθόδων καλλιέργειας, μελέτης ή μεταφοράς των μικροοργανισμών, χρησιμοποιούμε μια τεχνική που ονομάζεται άσηπτη τεχνική. Για την ορθή εφαρμογή της είναι απαραίτητες οι ακόλουθες προϋποθέσεις: 1) Απολύμανση του εργαστηριακού χώρου 2) Αποστείρωση των μέσων μεταφοράς των μικροοργανισμών (λαβίδες, κρίκοι κλπ) 3) Χρήση αποστειρωμένων εργαστηριακών μέσων και υλικών (θρεπτικά υποστρώματα, τρυβλία Petri, δοκιμαστικοί σωλήνες, πιπέτες και σιφώνια κλπ) 4) Συνεχής λειτουργία του λύχνου Bunsen καθ όλη τη διάρκεια της εργασίας, ούτως ώστε να διατηρηθούν οι συνθήκες αποστείρωσης. Η φλόγα δημιουργεί ένα ανοδικό ρεύμα θερμού αέρα στην περιοχή, μειώνοντας την πιθανότητα μόλυνσης από αερομεταφερόμενους μικροοργανισμούς. 5) Σωστός χειρισμός εργαστηριακών μέσων και υλικών Ορθός χειρισμός δοκιμαστικών σωλήνων 84

85 Κρατώντας τον δοκιμαστικό σωλήνα υπό γωνία με το αριστερό χέρι, αφαιρούμε το κάλυμμα χωρίς να αφεθεί κάτω και περνάμε το στόμιο του σωλήνα από τη φλόγα του λύχνου Bunsen για σύντομο χρονικό διάστημα, πριν και μετά από τη μεταφορά υλικού. Ορθός χειρισμός τρυβλίων Τα κενά αποστειρωμένα τρυβλία ή τα τρυβλία με καλλιέργειες μικροοργανισμών, πρέπει να παραμένουν πάντα κλειστά. Για το χρονικό διάστημα που απαιτείται να ανοιχτούν, παραμένουμε κοντά στη φλόγα του λύχνου Bunsen, κρατώντας το καπάκι με το άνοιγμα προς τα κάτω υπό μικρή κλίση (Σαμολαδά, 2011) Μέθοδος αποστείρωσης Με τον όρο αποστείρωση εννοούμε την πλήρη καταστροφή των βλαστικών μορφών και σπορίων των μικροοργανισμών, με συνέπεια την απώλεια της ικανότητας αναπαραγωγής τους όλων όσων υπάρχουν σ ένα αντικείμενο ή χώρο. Η καταστροφή των ενζύμων ή προϊόντων του μικροβιακού μεταβολισμού, όπως είναι οι τοξίνες, είναι άμεσα συνδεδεμένη με τον τρόπο αποστείρωσης που θα χρησιμοποιηθεί. Οι πιο διαδεδομένοι μέθοδοι αποστείρωσης που χρησιμοποιούνται είναι οι εξής: Α. Θερμότητα Β. Χημικές ουσίες Γ. Διήθηση με ηθμούς Δ. Ακτινοβολία Η μέθοδος αποστείρωσης με θερμότητα είναι εκείνη με την οποία θα ασχοληθούμε, εφόσον ήταν η μέθοδος που χρησιμοποιούσαμε καθημερινά στο εργαστήριο. Η ύπαρξη και ανάπτυξη ενός μικροοργανισμού βασίζεται σε ένα σύνολο χημικών αντιδράσεων, οι οποίες επηρεάζονται με την μεταβολή της θερμοκρασίας. Συνεπώς, θερμοκρασίες μεγαλύτερες της μέγιστης θερμοκρασίας κάθε μικροοργανισμού, οδηγούν στον θάνατο του. Υπάρχουν δυο ειδών αποστειρώσεις με χρήση θερμότητας: 1. Αποστείρωση με ξηρή θερμότητα: Κατά την μέθοδο αυτή, το κύτταρο των μικροοργανισμών αφυδατώνεται, τα συστατικά του κυττάρου οξειδώνονται, και έπεται ο θάνατος τους. Εφαρμόζεται σε αντικείμενα ανθεκτικά στις υψηλές θερμοκρασίες ή στις 85

86 απότομες μεταβολές της θερμοκρασίας, όπως τα γυάλινα και μεταλλικά σκεύη. Πραγματοποιείται κυρίως: -με φλόγα Bunsen, σε κρίκο ή βελόνα εμβολιασμού, σε στόμιο δοκιμαστικού σωλήνα κ.ά. -με ξηρό κλίβανο, σε θερμοκρασία περίπου ºC για μια ώρα, σε γυάλινα και μεταλλικά αντικείμενα 2. Αποστείρωση με υγρή θερμότητα: Εφαρμόζεται σε αντικείμενα από καουτσούκ, θρεπτικά υποστρώματα, καθώς και σε ανεπιθύμητες μικροβιακές καλλιέργειες. Γίνεται σε ειδική συσκευή που ονομάζεται αυτόκαυστο (autoclave). Με τη χρήση κορεσμένου ατμού, προκαλείται η θανάτωση των μικροοργανισμών κάτω από συνθήκες υψηλής πίεσης και θερμοκρασίας (περίπου στους 121 ºC), επιτυγχάνοντας έτσι την αποστείρωση. Άλλος τρόπος υγρής αποστείρωσης είναι και ο βρασμός. Η λειτουργία του αυτόκαυστου στηρίζεται στο ότι ο ατμός υπο πίεση που παράγεται, λόγω μη δυνατότητας εξόδου, αποκτά θερμοκρασίες μεγαλύτερες του βραστού νερού. Αποτελείται από ένα ανοξείδωτο λέβητα με διπλά τοιχώματα που γεμίζει με κορεσμένο ατμό και διατηρεί την επιθυμητή θερμοκρασία και υγρασία για ορισμένο χρόνο. Πάνω στο καπάκι του αυτόκαυστου υπάρχει μια βαλβίδα ασφαλείας, μια κάνουλα αποχέτευσης και ένας μετρητής δύο παραμέτρων (πίεσης και θερμοκρασίας). Έτσι, κατά τη διάρκεια της λειτουργίας, υπάρχει συνεχής και σαφής παρακολούθηση της πίεσης και της θερμοκρασίας. Για να αποστειρώσουμε στο αυτόκαυστο ακολουθούμε τα παρακάτω βήματα: 1. Ελέγχουμε εάν υπάρχει η απαιτούμενη ποσότητα νερού. 2. Τοποθετούμε το υλικό προς αποστείρωση (κωνικές φιάλες, δοκιμαστικούς σωλήνες, γυάλινα μπουκάλια με πλαστικά πώματα ελαφρώς κλειστά κ.α.) 3. Κλείνουμε το καπάκι 4. Ρυθμίζουμε το θερμοστάτη στην επιθυμητή θερμοκρασία, ανοίγουμε τη βαλβίδα του αέρα και το διακόπτη του ρεύματος 5. Ρυθμίζουμε τον επιθυμητό χρόνο 6.Όταν η αποστείρωση τελειώσει, αφήνουμε την πίεση να πέσει στο 0 και έπειτα ανοίγουμε το αυτόκαυστο (Σαμολαδά, 2011; Rutala et al., 2008) Μέθοδος διαδοχικών αραιώσεων Η μέθοδος των διαδοχικών αραιώσεων πραγματοποιείται με σκοπό την απομόνωση ενός μικροοργανισμού σε καθαρή καλλιέργεια. Κατά τις διαδοχικές αραιώσεις, το αρχικό 86

87 εναιώρημα/δείγμα που εμβολιάζεται με τη χρήση πιπέτας/σιφωνίου, αραιώνεται σε μια σειρά δοκιμαστικών σωλήνων/δοχείων. Μετά από κάθε αραίωση ο δοκιμαστικός σωλήνας θα περιέχει το 1/10 κυττάρων, σε σχέση με τον ακριβώς προηγούμενο. Κατόπιν, δείγματα από κάθε αραίωση εμβολιάζονται σε τρυβλία Petri όπου σχηματίζονται αποικίες και είναι δυνατό να καταμετρηθούν. Χρησιμοποιούμε όσες αραιώσεις χρειάζεται ώστε τελικά όταν εμβολιάσουμε από κάποια αραιώση τα τρυβλία, να είναι μετρήσιμες οι αποικίες που θα σχηματιστούν σε αυτά (Σαμολαδά, 2011). Εικόνα 2-1 Μέθοδος διαδοχικών αραιώσεων. Πηγή: s5.htm Μέθοδος καλλιέργειας σε στερεό θρεπτικό μέσο (pour plate) Η μέθοδος αυτή (pour plate count) είναι η πιο συνηθισμένη τεχνική για την απαρίθμηση των ζωντανών μικροοργανισμών σε διάφορα προϊόντα (όπως τα τρόφιμα, τα φάρμακα και τα καλλυντικά). Βασίζεται στην υπόθεση ότι τα μικροβιακά κύτταρα που υπάρχουν σε ένα δείγμα αναμειγμένο με άγαρ και θρεπτικά υλικά (πεπτόνες, πολυπεπτίδια, αμινοξέα, 87

88 εκχύλισμα κρέατος, ανόργανα συστατικά), αναπτύσσονται και σχηματίζουν ξεχωριστές και ορατές αποικίες. H μέθοδος όμως αυτή δεν μετρά απαραίτητα τον πραγματικό συνολικό αριθμό των ζωντανών κυττάρων ανά γραμμάριο δείγματος, αφού τα βακτηριακά κύτταρα υφίστανται μόνα τους ή σε ζευγάρια, αλυσίδες, συμπλέγματα και ομάδες. Για το λόγο αυτό, οι μετρήσεις που προκύπτουν από τη μέθοδο αυτή δεν πρέπει να αναφέρονται ως μετρήσεις ζωντανών οργανισμών αλλά ως μετρήσεις αποικιών ανά μονάδα ή μονάδες σχηματισμού αποικιών ανά μονάδα (Colony Forming Units, cfu). Επίσης χρησιμοποιείται ο όρος TPC (Total Plate Count). Πιο συγκεκριμένα, υπό άσηπτες συνθήκες, έπειτα από κατάλληλες αραιώσεις του δείγματος, ώστε τελικά να έχουμε μετρήσιμο αριθμό CFU μεταξύ 30 και 300, εμβολιάζεται με πιπέτα ποσότητα δείγματος, συνήθως 1 ml, σε ένα κενό αποστειρωμένο τρυβλίο Petri. Στη συνέχεια, προστίθεται περίπου ml αποστειρωμένο, τηγμένο, ψυχρό άγαρ με ταυτόχρονη κυκλική ανάδευση του τρυβλίου. Η ανάδευση χρειάζεται να γίνεται σιγά-σιγά ώστε να έχουμε πλήρη μίξη θρεπτικού και δείγματος χωρίς να μεταφέρεται το μίγμα στα τοιχώματα. Μετά την ανάμειξη, αφήνουμε το περιεχόμενο στα τρυβλία να στερεοποιηθεί και έπειτα τα τοποθετούμε ανάποδα (με το καπάκι προς τα κάτω) στους επωαστικούς κλιβάνους, για να εμποδίσουν τη συμπύκνωση της υγρασίας στην επιφάνεια του άγαρ, σε συγκεκριμένη θερμοκρασία και χρόνο, αναλόγως το με το είδος του μικροοργανισμού (ψυχρότροφα, μεσόφιλα ή θερμόφιλα) που μελετάμε (Gilchrist et al., 1972) Μέθοδος διασποράς σε στερεό θρεπτικό μέσο (spread plate) Μια παραλλαγή της παραπάνω μεθόδου είναι η επιφανειακή ανάπτυξη των μικροοργανισμών σε τρυβλία (spread plate count). Σύμφωνα με την τεχνική αυτή, το αποστειρωμένο, τηγμένο και ψυχρό άγαρ απλώνεται πρώτα σε αποστειρωμένα κενά τρυβλία Petri. Ύστερα από τη στερεοποίηση, τα τρυβλία προεπωάζονται στους κλιβάνους για λίγη ώρα ώστε να ξηραθεί η επιφάνεια του άγαρ, έτσι ώστε οι μικροοργανισμοί να μην συνενωθούν κατά το «άπλωμά» τους πάνω στο άγαρ. Παράλληλα, εργαζόμενοι πάντα υπο άσηπτες συνθήκες, θα πρέπει να αποστειρώνουμε σε φλόγα τους διανομείς (spreaders) με εμβάπτιση τους σε αιθανόλη πριν από κάθε χρήση. Το spreader στη συνέχεια αφήνεται να ψυχθεί. Αφού εμβολιάσουμε την επιθυμητή ποσότητα στο θρεπτικό υπόστρωμα του τρυβλίου (συνήθως 0,1 ml), με τη βοήθεια του αποστειρωμένου spreader, διανέμουμε το δείγμα με τους μικροοργανισμούς σε όλη την επιφάνεια του άγαρ, περιστρέφοντας με το άλλο χέρι το τρυβλίο, αποφεύγουμε την εξάπλωση της εμβολιαζόμενης ποσότητας στα 88

89 τοιχώματα του τρυβλίου. Ο στόχος είναι η ομοιόμορφη διανομή του δείγματος ώστε να προσροφηθεί στην επιφάνεια του άγαρ. Μετά τη διασπορά, αφήνονται τα τρυβλία για λίγα λεπτά και στη συνέχεια, τοποθετούνται αναποδογυρισμένα στους επωαστικούς κλιβάνους σε συγκεκριμένη θερμοκρασία και χρόνο, αναλόγως το με το είδος του μικροοργανισμού (ψυχρότροφα, μεσόφιλα ή θερμόφιλα) που μελετάμε. Η μέθοδος αυτή παρουσιάζει κάποια σημαντικά πλεονεκτήματα σε σχέση με την κλασσική μέθοδο απαρίθμησης σε τρυβλία (pour plate count). Η μορφολογία των αποικιών μπορεί να παρατηρηθεί καλύτερα στις επιφανειακές αποικίες, βελτιώνοντας την ικανότητα του αναλυτή να διακρίνει ανάμεσα σε διαφορετικά είδη αποικιών. Ακόμη, είναι ευκρινείς όλες οι αποικίες, σε αντίθεση με την pour plate μέθοδο, όπου κάποιες αποικίες λόγω ενσωμάτωσής τους στο θρεπτικό υλικό σε βάθος, δεν γίνονται εύκολα αντιληπτές. Επιπλέον, οι μικροοργανισμοί δεν εκτίθενται στην θερμότητα του τηγμένου άγαρ που μπορεί σε ορισμένες περιπτώσεις να οδηγήσει σε χαμηλότερες τιμές μετρήσεων. Απ' την άλλη μεριά, η μέθοδος αυτή υστερεί σε ακρίβεια για δείγματα που περιέχουν λίγους μικροοργανισμούς, αφού πρέπει να χρησιμοποιηθούν σχετικά μικροί όγκοι δείγματος. (Wise, 2013) Εικόνα 2-2 Απεικόνιση των μεθόδων spread plate και pour plate συνοπτικά 89

90 2.3 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΠΟΡΕΙΑ Στη συνέχεια, θα γίνει η περιγραφή του πειραματικού πρωτοκόλλου που ακολουθήσαμε για τη διερεύνηση της μικροβιακής ποιότητας των καλλυντικών προϊόντων. Κατ αρχάς, αναλύθηκαν συνολικά 84 δείγματα. Τα δείγματα αυτά ήταν όλα ενυδατικές κρέμες για διαφορετικά μέρη του σώματος που θα μπορούσαμε να τα χωρίσουμε σε τέσσερις μεγάλες κατηγορίες: ενυδατικές κρέμες προσώπου (είτε ημέρας, είτε νύχτας), ενυδατικές κρέμες ματιών, ενυδατικές κρέμες χεριών και ενυδατικές κρέμες σώματος (συμπεριλαμβανομένων και των γαλακτωμάτων). Προέρχονται κατά κύριο λόγο από γυναίκες διαφόρων ηλικιών που συμμετείχαν στην έρευνα, αλλά και από φαρμακεία και καταστήματα καλλυντικών που τα παρείχαν δωρεάν. Πίνακας 2-1 Κατηγορίες καλλυντικών προς μελέτη Α/Α Κατηγορίες Αριθμός καλλυντικών δειγμάτων 1 Κρέμες ματιών 7 2 Κρέμες προσώπου 32 3 Κρέμες σώματος 34 4 Κρέμες χεριών 11 Γενικό Άθροισμα 84 Οι γυναίκες, που προθυμοποιήθηκαν να συμμετάσχουν στο πείραμα δίνοντας τις κρέμες για τη δειγματοληψία, διερωτήθηκαν τόσο για την ηλικία τους όσο και για κάποια χαρακτηριστικά της κρέμας, όπως ο χρόνος ανοίγματος, η μάρκα της κρέμας, τα συστατικά της και το κόστος της. Έγινε διαχωρισμός των κρεμών σε κατηγορίες ανάλογα με την περιοχή του σώματος για την οποία προορίζονται, αλλά και διαχωρισμός των ερωτηθέντων σε ηλικιακές ομάδες. Ενδεικτικά, παρουσιάζονται παρακάτω τα 4 πρώτα δείγματα με τις αντίστοιχες πληροφορίες συμπληρωμένες από το ερωτηματολόγιο που συνέβαλε στην έρευνα αυτή. Αντίστοιχα συνεχίστηκε η συμπλήρωσή του και για τα υπόλοιπα 80 δείγματα. Το ερωτηματολόγιο παρατίθεται ολόκληρο στο Παράρτημα ΙV. 90

91 Τα δείγματα στα falcons φυλάχτηκαν σε σκιερό μέρος στο εργαστήριο σε θερμοκρασία δωματίου. Εβδομαδιαίως αναλύονταν συνήθως 6 δείγματα. Η διαδικασία της ανάλυσης ήταν ίδια για όλα τα δείγματα, εφόσον ανήκουν όλα στην κατηγορία «κρέμες» και είχαν παρόμοια σύσταση και υφή. Το φάσμα των μικροοργανισμών που διερευνήθηκαν περιοριζόταν στην ολική μεσόφιλη χλωρίδα, την P.aeruginosa, τον S.aureus και την E.coli, λόγω της παθογένειάς τους. Πίνακας 2-2 Μικροοργανισμοί που διερευνήθηκαν Α/Α Μικροοργανισμοί προς μελέτη 1 Ολική μεσόφιλη χλωρίδα (ΟΜΧ) 2 E.coli 3 S.aureus 4 P.aeruginosa 91

92 Εικόνα 2-3 Απεικόνιση μερικών από τα δείγματα προς ανάλυση Στόχος ήταν να κριθούν μετά την ανάλυση κατάλληλα ή ακατάλληλα για χρήση και να γίνει κάποια συσχέτιση της ασφάλειάς τους με το χρόνο ανοίγματός τους, τη σύστασή τους και άλλα στοιχεία που συμπεριλαμβάνονται στο ερωτηματολόγιο. Έπειτα από κάθε ανάλυση, τα αποτελέσματα καταγράφονταν για μελλοντική επεξεργασία. Σε κάποια δείγματα θετικά για τον S.aureus με βάση τις αναλύσεις για την ταυτοποίησή του, επειδή τα αποτελέσματα δεν ήταν ξεκάθαρα, φυλάχτηκαν τα απομονωθέντα στελέχη σε cryovial ώστε να γίνει περαιτέρω βιοχημικός έλεγχος για την οριστική επιβεβαίωση. Κατά τη διάρκεια των πειραμάτων έγινε μια δοκιμή, Validation test, για να επικυρώσουμε την ισχύ της μεθόδου που ακολουθήσαμε. 92

93 2.3.1 Προκατεργασία δείγματος Αρχικά, σε όλα τα δείγματα όπως ήδη αναφέραμε, εφαρμόστηκε η ίδια τεχνική, ακολουθώντας τα ίδια βήματα: - Πρώτο βήμα είναι η απολύμανση με αιθανόλη του δοχείου που περιέχει το δείγμα του καλλυντικού που θα μελετήσουμε και ιδιαίτερα το στόμιο/καπάκι. - Ζυγίζεται 1gr κρέμας στον ηλεκτρονικό ζυγό, έχοντας πρώτα τοποθετήσει το falcon και μηδενίσει το ζυγό. Σε περίπτωση που χρησιμοποιούμε σπάτουλα για τη διευκόλυνση της ζύγισης, φροντίζουμε να είναι πάντα αποστειρωμένη. - Στη συνέχεια, υπό άσηπτες συνθήκες πάντα, με αποστειρωμένη πιπέτα προσθέτουμε στο falcon με την κρέμα 9 ml Modified Letheen Broth (enrichment broth). Ο διαλύτης αυτός είναι κατάλληλος τόσο για τη διάλυση της κρέμας, όσο και για την παροχή απαραίτητων θρεπτικών συστατικών για την ανάπτυξη των μικροοργανισμών που περιέχει. - Έπειτα, προσθέτουμε 1 ml Tween 80 στα δείγματα που είναι ιδιαιτέρως πηκτά, καθώς το Tween 80 λειτουργεί σαν «απορρυπαντικό» που διαλύει τα λίπη. (Στο σημείο αυτό υπενθυμίζουμε ότι οι κρέμες αποτελούνται από την υδατική και τη λιπαρή φάση.) - Ακολουθεί η προσθήκη 5-10 glass beads διαμέτρου 5-7 mm, περνώντας πρώτα το στόμιο του δοχείου από τη φλόγα, με σκοπό την ταχύτερη διάλυση της κρέμας. - Αφού έχουν προστεθεί τα απαραίτητα υλικά, πραγματοποιείται πολύ καλή ανάδευση στο Vortex επί 2 min και ταχύτητα 8000 rpm με σκοπό την ομογενοποίηση του δείγματος. Το δείγμα αυτό αποτελεί την πρώτη αραίωση (10-1 ) ή αρχικό εναιώρημα (initial suspension). Η ομογενοποίηση στοχεύει στο να κατανείμει τα μικρόβια όσο γίνεται πιο ομοιόμορφα μέσα στο δείγμα, ώστε η ποσότητα που θα εξετάσουμε να δώσει αντιπροσωπευτική εικόνα της ολικής χλωρίδας και των υπολοίπων βακτηρίων. - Κάνουμε μια επιπλέον διαδοχική δεκαδική αραίωση. Δηλαδή, δουλεύοντας κοντά στη φλόγα, παίρνουμε με αποστειρωμένη πιπέτα 1 ml από το αρχικό εναιώρημα και το τοποθετώ σε νέο falcon που περιέχει 9 ml MLB. Το falcon αυτό αποτελεί τη δεύτερη αραίωση (αραίωση 10-2 ). - Ακολουθεί πολύ καλή ανάμειξη με Vortex. Τα δυο falcons (1 η και 2 η αραίωση) είναι έτοιμα ώστε να γίνει ο εμβολιασμός στα τρυβλία για την ανίχνευση των μικροοργανισμών. 93

94 Εικόνα 2-4 Ανάδευση δείγματος με Vortex και προετοιμασία για εμβολιασμό στα τρυβλία Μικροβιολογικές αναλύσεις Καταμέτρηση ολικής μεσόφιλης χλωρίδας Για την καταμέτρηση της ΟΜΧ ακολουθούμε τα εξής βήματα ως συνέχεια της προκατεργασίας του δείγματος της κρέμας: - Υπό άσηπτες συνθήκες, εμβολιάζεται με αποστειρωμένη πιπέτα από 1 ml δείγματος σε δυο τρυβλία για κάθε αραίωση ξεχωριστά (10-1 και 10-2 ), στο κέντρο του πυθμένα τους. Χρησιμοποιείται η ίδια πιπέτα όταν εμβολιάζουμε το ίδιο δείγμα, με προσοχή πάντα από την αραιότερη προς την πυκνότερη συγκέντρωση. Για την κάθε αραίωση εμβολιάζονται δύο τρυβλία για λόγους επαναληψιμότητας και ακρίβειας του πειράματος. - Παράλληλα, το θρεπτικό Τryptic Soy Agar (μη εκλεκτικό θρεπτικό άγαρ) που θα χρησιμοποιήσουμε, τοποθετείται σε υδατόλουτρο στους 45 ο C για λίγα λεπτά, εφόσον ήδη βρίσκεται σε ρευστή μορφή. - Στη συνέχεια, αφού περάσουμε το στόμιο του θρεπτικού από τη φλόγα, προστίθενται ml μέχρι να καλυφθεί η επιφάνεια του τρυβλίου και να δημιουργηθεί ελαφρώς παχιά στρώση. - Σύμφωνα με την pour plate method, ανακινούμε ελαφρά με κυκλικές κινήσεις τα τρυβλία ώστε το δείγμα να μεταφερθεί ομοιόμορφα σε όλο το τρυβλίο και να αναμειχθεί καλά με το θρεπτικό υλικό. 94

95 - Αφού αφήσουμε τα τρυβλία να κρυώσουν και αφού στερεοποιηθεί το υλικό, τα τοποθετούμε γυρισμένα ανάποδα στον κλίβανο στους 32,5 ± 2,5 º C για 48 ώρες. Στις θερμοκρασίες αυτές και σε αερόβιες συνθήκες επωάσεως, η καταμέτρηση αφορά τα αερόβια, μεσόφιλα βακτήρια. Εικόνα 2-5 Εμβολιασμός τρυβλίων με τη μέθοδο pour plate - Έπειτα από τις 48 ώρες, με τη βοήθεια μετρητή αποικιών κάνουμε καταμέτρηση όλων των ανεπτυγμένων αποικιών και από τα δυο τρυβλία της ίδιας αραίωσης παίρνουμε το μέσο όρο. Εικόνα 2-6 Θετικό δείγμα για ΟΜΧ σε τρυβλίο ΤSA agar σε μαύρο φόντο 95

96 - Γίνεται καταγραφή των αποτελεσμάτων και οι μετρήσεις εκφράζονται σε cfu/g. Συνοπτικά, η διαδικασία που ακολουθούμε παρουσιάζεται στο εξής διάγραμμα: 1g δείγματος 9 ml διαλύτη (10-1 ) 1 ml από την 10-1 αραίωση 9 ml διαλύτη (10-2 ) Εμβολιασμός σε τρυβλία Petri Επώαση Μέτρηση αποικιών Καταμέτρηση E.coli Για την καταμέτρηση της E.coli ακολουθούμε τα ίδια βήματα με την καταμέτρηση της ΟΜΧ με τη διαφορά ότι χρησιμοποιούμε άλλο θρεπτικό υπόστρωμα. Τα βήματα είναι τα εξής: - Υπό άσηπτες συνθήκες, εμβολιάζεται με αποστειρωμένη πιπέτα από 1 ml δείγματος σε δυο τρυβλία για κάθε αραίωση ξεχωριστά (10-1 και 10-2 ), στο κέντρο του πυθμένα τους. Χρησιμοποιείται η ίδια πιπέτα όταν εμβολιάζουμε το ίδιο δείγμα, με προσοχή πάντα από την αραιότερη προς την πυκνότερη συγκέντρωση. Για την κάθε αραίωση εμβολιάζονται δύο τρυβλία για λόγους επαναληψιμότητας και ακρίβειας του πειράματος. - Παράλληλα, το θρεπτικό Tryptone Bile X-glucuronide Agar (TBX, εκλεκτικό θρεπτικό άγαρ για E.coli) που θα χρησιμοποιήσουμε, τοποθετείται σε υδατόλουτρο στους 45 ο C για λίγα λεπτά, εφόσον ήδη βρίσκεται σε ρευστή μορφή. - Στη συνέχεια, αφού περάσουμε το στόμιο του θρεπτικού από τη φλόγα, προστίθενται ml μέχρι να καλυφθεί η επιφάνεια του τρυβλίου και να δημιουργηθεί ελαφρώς παχιά στρώση. - Σύμφωνα με την pour plate method, ανακινούμε ελαφρά με κυκλικές κινήσεις τα τρυβλία ώστε το δείγμα να μεταφερθεί ομοιόμορφα σε όλο το τρυβλίο και να αναμειχθεί καλά με το θρεπτικό. 96

97 - Αφού αφήσουμε τα τρυβλία να κρυώσουν και αφού στερεοποιηθεί το υλικό, τα τοποθετούμε γυρισμένα ανάποδα στον κλίβανο στους 44 º C για 24 ώρες. - Έπειτα από τις 24 ώρες, με τη βοήθεια μετρητή αποικιών κάνουμε καταμέτρηση των χαρακτηριστικών μπλε αποικιών και από τα δυο τρυβλία της ίδιας αραίωσης παίρνουμε το μέσο όρο. Εικόνα 2-7 Τρυβλία προς καταμέτρηση αποικιών E.coli και ΟΜΧ - Γίνεται καταγραφή των αποτελεσμάτων και οι μετρήσεις εκφράζονται σε cfu/g. Εικόνα 2-8 Χαρακτηριστικές μπλε αποικίες της E.coli σε TBX agar 97

98 Καταμέτρηση P.aeruginosa Για την καταμέτρηση της P.aeruginosa ακολουθούμε τα εξής βήματα ως συνέχεια της προκατεργασίας του δείγματος της κρέμας: - Προετοιμάζουμε τρυβλία με θρεπτικό υπόστρωμα Pseudomonas CN agar (εκλεκτικό για P.aeruginosa). Λίγο πριν τη χρήση τους, τα τοποθετούμε για λίγα λεπτά στους επωαστικούς κλιβάνους ώστε η επιφάνεια του άγαρ να είναι απαλλαγμένη από σταγονίδια υγρασίας. - Υπό άσηπτες συνθήκες, εμβολιάζονται με αυτόματη πιπέτα 0,1 ml δείγματος σε διπλά τρυβλία για την κάθε αραίωση ξεχωριστά (10-1 και 10-2 ), στο κέντρο του πυθμένα τους. Χρησιμοποιείται η ίδια πιπέτα όταν εμβολιάζουμε το ίδιο δείγμα, με προσοχή πάντα από την αραιότερη προς την πυκνότερη συγκέντρωση. Για την κάθε αραίωση εμβολιάζονται δύο τρυβλία για λόγους επαναληψιμότητας και ακρίβειας του πειράματος. - Σύμφωνα με την spread plate method, χρησιμοποιούνται ειδικά γυάλινα ή μεταλλικά ραβδάκια (spreader), σχήματος Γ, αφού πρώτα έχουν αποστειρωθεί με εμβάπτιση σε διάλυμα αιθανόλης και έπειτα περαστεί από τη φλόγα και διασπείρουμε με κυκλικές κινήσεις το δείγμα στην επιφάνεια του θρεπτικού υποστρώματος. Μετά από το spreading κάθε τρυβλίου, απολυμαίνουμε τη ράβδο. Για το ίδιο δείγμα, σε περίπτωση που χρησιμοποιούμε το ίδιο spreader, ξεκινάμε από τη μεγαλύτερη αραίωση προς τη μικρότερη (αραιότερο πυκνότερο). - Τα τρυβλία έπειτα αφήνονται στον πάγκο για λίγα λεπτά και στη συνέχεια τοποθετούνται για επώαση σε κλίβανο στους 32,5 ± 2,5 º C για 48 ώρες. - Έπειτα από τις 48 ώρες, κάνουμε καταμέτρηση των χαρακτηριστικών αποικιών (μπλεπράσινες αποικίες ή/και κιτρινωπές, φθορίζουσες αποικίες στην υπεριώδη ακτινοβολία 365nm). Ο φθορισμός δεν αποτελεί το μοναδικό κριτήριο για την ταυτοποίηση του στελέχους, γι αυτό προχωράμε σε περαιτέρω ελέγχους ταυτοποίησης, καθώς πρέπει να ισχύουν όλα τα κριτήρια για να είναι το δείγμα θετικό στο συγκεκριμένο στέλεχος. - Τουλάχιστον 5 ύποπτες αποικίες από κάθε τρυβλίο ανακαλλιεργούνται σε θρεπτικό υλικό Nutrient agar με τρόπο ώστε να αναπτυχθούν μεμονωμένες αποικίες. - Τα τρυβλία, αφού αναγράψουμε πάνω τον αριθμό τις απαραίτητες πληροφορίες (αριθμός δείγματος, αραίωση, στέλεχος και ημερομηνία), επωάζονται στους 37 ο C για 24 ώρες. 98

99 - Έπειτα από τις 24 ώρες, η κάθε αποικία που έχει αναπτυχθεί, ταυτοποιείται με τη δοκιμασία οξειδάσης, τα βήματα του οποίου αναλύονται ακολούθως. Η P.aeruginosa είναι θετική στο τεστ οξειδάσης. Δοκιμασία οξειδάσης 1) Απολυμαίνουμε τον εργαστηριακό πάγκο όπου θα δουλέψουμε. Υπό άσηπτες συνθήκες, τοποθετούμε το ειδικό δισκίο για τη δοκιμασία οξειδάσης πάνω στον πάγκο (δεν επανατοποθετούμε ένα χρησιμοποιημένο δισκίο στη θήκη). 2) Με τη χρήση αποστειρωμένου, πλαστικού μικροβιολογικού κρίκου επιχρίζουμε το μικροοργανισμό απευθείας πάνω στην περιοχή αντίδρασης της μεμβράνης (του δισκίου), μεταφέροντας μέρος από την απομονωμένη αποικία από την καλλιέργεια που θα εξεταστεί. 3) Εξετάζουμε την περιοχή αντίδρασης για τυχόν εμφάνιση σκούρου μωβ χρώματος εντός sec. Οι θετικοί στην οξειδάση μικροοργανισμοί εμφανίζουν μωβ ή σκούρο χρώμα εντός 20 sec. Οι αρνητικοί στην οξειδάση μικροοργανισμοί δεν εμφανίζουν χρωματική μεταβολή ή εμφανίζουν μεταβολή σε ανοιχτό γκρι εντός της περιόδου εξέτασης. - Επιπλέον, η κάθε αποικία ταυτοποιείται με τον έλεγχο παραγωγής αμμωνίας σε διάλυμα ακεταμιδίου. Πιο συγκεκριμένα, μέρος της κάθε αποικίας εμβολιάζεται σε σωληνάκι που περιέχει 5ml Αcetamide broth. Το σωληνάκι επωάζεται στους 37 ο C για 24 ώρες. - Έπειτα από τις 24 ώρες, με την προσθήκη 2-3 σταγόνων Nessler reagent σε κάθε σωληνάκι, παρατηρείται η παραγωγή πορτοκαλί-καφέ ιζήματος και η αντίδραση θεωρείται θετική σε περίπτωση που είναι το στέλεχος P.aeruginosa. Εικόνα 2-9 Δείγμα θετικό για P.aeruginosa με προσθήκη Nessler reagent σε εμβολιασμένο Αcetamide broth 99

100 - Σε αντίθετη περίπτωση, δεν παρατηρείται καθόλου ίζημα ή παρατηρείται ίζημα άλλου χρώματος. Όμως, όπως αναφέραμε, το κριτήριο αυτό από μόνο του δεν επαρκεί για την ταυτοποίηση του στελέχους. - Γίνεται καταγραφή των αποτελεσμάτων και οι μετρήσεις εκφράζονται σε cfu/g Καταμέτρηση S.aureus Για την καταμέτρηση του S.aureus ακολουθούμε τα εξής βήματα ως συνέχεια της προκατεργασίας του δείγματος της κρέμας: - Προετοιμάζουμε τρυβλία με θρεπτικό υπόστρωμα Baird Parker agar (εκλεκτικό για S.aureus). Λίγο πριν τη χρήση τους, τα τοποθετούμε για λίγα λεπτά στους επωαστικούς κλιβάνους ώστε η επιφάνεια του άγαρ να είναι απαλλαγμένη από σταγονίδια υγρασίας. - Υπό άσηπτες συνθήκες, εμβολιάζονται με αυτόματη πιπέτα 0,1 ml δείγματος σε διπλά τρυβλία για την κάθε αραίωση ξεχωριστά (10-1 και 10-2 ), στο κέντρο του πυθμένα τους. Χρησιμοποιείται η ίδια πιπέτα όταν εμβολιάζουμε το ίδιο δείγμα, με προσοχή πάντα από την αραιότερη προς την πυκνότερη συγκέντρωση. Για την κάθε αραίωση εμβολιάζονται δύο τρυβλία για λόγους επαναληψιμότητας και ακρίβειας του πειράματος. - Σύμφωνα με την spread plate method, χρησιμοποιούνται ειδικά γυάλινα ή μεταλλικά ραβδάκια (spreader), σχήματος Γ, αφού πρώτα έχουν αποστειρωθεί με εμβάπτιση σε διάλυμα αιθανόλης και έπειτα περαστεί από τη φλόγα και διασπείρουμε με κυκλικές κινήσεις το δείγμα στην επιφάνεια του θρεπτικού υποστρώματος. Μετά από το spreading κάθε τρυβλίου, απολυμαίνουμε τη ράβδο ή χρησιμοποιούμε άλλη ώστε να αποφύγουμε τυχόν επιμόλυνση που οφείλεται είστε στο άγαρ, είτε στη ράβδο. - Τα τρυβλία έπειτα αφήνονται στον πάγκο για λίγα λεπτά και στη συνέχεια τοποθετούνται για επώαση σε κλίβανο στους 32,5 ± 2,5 º C για 48 ώρες. - Έπειτα από τις 48 ώρες, κάνουμε καταμέτρηση των αποικιών. Τα χαρακτηριστικά των αποικιών του S.aureus στο Baird Parker είναι αποικίες μαύρες, γυαλιστερές, κυρτές, διαμέτρου 1-1,5 mm με στενή λευκή περιφέρεια που περιβάλλονται από διαφανή ζώνη πλάτους 2-5 mm. Μερικά στελέχη παρουσιάζουν ζώνη διαφανή μόνο μετά από 36 ώρες (Δεληγκάρης, 2004). 100

101 Εικόνα 2-10 Δείγμα θετικό σε πρώτη φάση για S.aureus σε τρυβλίο Baird Parker agar - Στη συνέχεια, ακολουθεί ειδικό τεστ για την ταυτοποίησή του. Η κάθε αποικία ταυτοποιείται με τον έλεγχο παραγωγής πηκτάσης σε rabbit plasma. Πιο συγκεκριμένα, υπό άσηπτες συνθήκες και με τη βοήθεια μικροβιολογικού αποστειρωμένου κρίκου, από το κάθε τρυβλίο παίρνουμε τμήμα της αποικίας και την ανακαλλιεργούμε σε σωληνάκι με 5ml Brain heart infusion broth. Ανακαλλιεργούμε τουλάχιστον 5 ύποπτες αποικίες από κάθε τρυβλίο. - Τα σωληνάκια επωάζονται στους 37 ο C για 24 ώρες. - Μετά τις 24 ώρες, από το κάθε σωληνάκι, έπειτα από ελαφριά ανάδευση στο vortex, εμβολιάζονται με αυτόματη πιπέτα 0,05 ml σε eppendorf που περιέχει 0,5 ml Rabbit plasma. (Γίνεται ανασύσταση του Rabbit plasma με ισόποση ποσότητα αποστειρωμένου νερού υπό άσηπτες συνθήκες, συνήθως 3 ml νερού προστίθενται στα 3 ml που περιέχει το φιαλίδιο.) - Ύστερα, τα eppendorf επωάζονται στους 37 ο C για 4-6 ώρες και παρατηρείται ο σχηματισμός πηγμάτων και η τελική πήξη του διαλύματος για να θεωρηθεί η δοκιμασία θετική στον S.aureus. Περαιτέρω επιβεβαιωτικό τεστ για τον S.aureus Με τα δείγματα όπου ήταν θετικά για S.aureus με τη μέθοδο που περιγράψαμε, προχωρήσαμε σε περαιτέρω έλεγχο, καθώς είχαν αμφίβολα αποτελέσματα στην επιβεβαιωτική δοκιμασία με το Rabbit plasma, δηλαδή δεν σχημάτιζαν ξεκάθαρα πήγμα. 1) Πιο συγκεκριμένα, υπό άσηπτες συνθήκες, απομονώνουμε με τη βοήθεια αποστειρωμένου μικροβιολογικού κρίκου από το Baird Parker τις αποικίες από όλα τα 101

102 θετικά για S.aureus δείγματα και τις ανακαλλιεργούμε σε θρεπτικό υλικό TSA, ώστε να είναι πιο φρέσκες. 2) Επωάζουμε τα τρυβλία στους κλιβάνους στους 37 ο C για 24 ώρες. 3) Έπειτα από 24 ώρες, απομονώνουμε με τη βοήθεια μικροβιολογικού κρίκου, υπό άσηπτες συνθήκες, τις αποικίες που αναπτύχθηκαν στα τρυβλία για κάθε δείγμα ξεχωριστά και τις αποθηκεύουμε με τη μορφή cryovial στους καταψύκτες στους -70 ο C, σημειώνοντας κάθε φορά με μαρκαδόρο το νούμερο του δείγματος. Εικόνα 2-11 Προετοιμασία για αποθήκευση στελεχών σε cryovial - Η αποθήκευση σε μορφή cryovial είναι ένα βολικό, έτοιμο προς χρήση σύστημα, σχεδιασμένο να απλοποιήσει σημαντικά την αποθήκευση και την ανάκτηση των βακτηριακών καλλιεργειών. Πρόκειται για ένα μοναδικό σύστημα κρυοφιαλιδίων, δηλαδή πλαστικά φιαλίδια που περιέχουν χρωματιστά σφαιρίδια (beads) και ένα υγρό μέσο κρυοσυντήρησης, που αποτελείται από σακχαρόζη, γλυκερίνη, αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό και πεπτόνη. - Οι απομονωμένες αποικίες, μέσω του κρίκου, υπό άσηπτες συνθήκες, μεταφέρονται στο υγρό μέσο και ακολουθεί καλή ανάδευση, αναποδογυρίζοντας το φιαλίδιο για λίγα λεπτά. Δεν πρέπει σε καμία περίπτωση να χρησιμοποιείται Vortex. Έτσι, προσκολλώνται στις χημικώς επεξεργασμένα σφαιρίδια (beads) και στη συνέχεια, αφαιρείται το υγρό με αποστειρωμένη πιπέτα και οι μικροοργανισμοί είναι σε θέση να αποθηκευτούν στους καταψύκτες για μεγάλο χρονικό διάστημα. 102

103 4) Για την ανάκτηση των μικροοργανισμών από τα cryovial, υπό άσηπτες συνθήκες, παίρνουμε 1-2 beads από το κάθε δείγμα και με τη μέθοδο spreading, κάνοντας τις απαραίτητες αραιώσεις με τον αποστειρωμένο κρίκο, κάνουμε ανακαλλιέργεια σε έτοιμα τρυβλία με 5% Blood agar (Trypticase soy agar with sheep blood). 5) Tοποθετούμε τα τρυβλία για επώαση στους ο C για ώρες. 6) Έπειτα από την επώαση, διαχωρίζουμε τα τρυβλία σε όσα έχουν καθαρές καλλιέργειες και σε όσα έχουν μεικτές καλλιέργειες. 7) Κάνουμε το επιβεβαιωτικό Latex test για S.aureus (Pastorex TM Staph-plus της εταιρείας BIORAD) παίρνωντας, υπό άσηπτες συνθήκες, τις αποικίες προσεκτικά με μικροβιολογικό κρίκο και απλώνοντάς τες στο ειδικό αντιδραστήριο για να δούμε αν θα υπάρξει κροκίδωση. Σε περίπτωση κροκίδωσης, η δοκιμασία είναι θετική για S.aureus (coagulase-positive). Σε αντίθετη περίπτωση, πρόκειται για άλλο στέλεχος, συνήθως S.epidermidis (coagulasenegative). 8) Γίνεται καταγραφή των αποτελεσμάτων και οι μετρήσεις εκφράζονται σε cfu/g. Εικόνα 2-12 Ανακαλλιέργεια των αποθηκευμένων σε cryovial στελεχών S.aureus σε τρυβλία με 5% Blood agar με τη μέθοδο spreading 103

104 Πίνακας 2-3 μικροοργανισμό Συνοπτική απεικόνιση των συνθηκών επώασης των τρυβλίων για κάθε Μικροοργανισμοί προς μελέτη Συνθήκες επώασης τρυβλίων Θερμοκρασία (ºC ) ΟΜΧ 32,5 ± 2,5 48 S.aureus 32,5 ± 2,5 48 P.aeruginosa 32,5 ± 2,5 48 E.coli Χρόνος (hours) Επικύρωση της μεθόδου Η επικύρωση της μεθόδου (Validation of method) ήταν απαραίτητη ώστε να δούμε εάν το πειραματικό πρωτόκολλο που ακολουθούμε για τη διερεύνηση των μικροοργανισμών είναι έγκυρο. Η βασική ιδέα είναι ότι εμβολιάζουμε το καλλυντικό δείγμα με γνωστή συγκέντρωση μικροοργανισμών. Στη μία περίπτωση, επωάζουμε το καλλυντικό με τον μικροοργανισμό στον κλίβανο στις ίδιες συνθήκες με το πείραμά μας και στην άλλη περίπτωση, χωρίς επώαση, ακολουθούμε την πορεία του πειράματος κανονικά, ώστε να επιβεβαιώσουμε ότι οι μικροοργανισμοί θα ανιχνευτούν με την πειραματική διαδικασία που ακολουθούμε. Ταυτόχρονα, εμβολιάζουμε τα θρεπτικά υλικά απευθείας, χωρίς την ύπαρξη καλλυντικού, για να τα έχουμε ως control και να μπορούμε να συγκρίνουμε τα αποτελέσματα. Με αυτό τον τρόπο ελέγχουμε ταυτόχρονα εάν τα συστατικά του καλλυντικού έχουν αντιμικροβιακή δράση. Για τον εμβολιασμό των υλικών χρησιμοποιούνται μικροοργανισμοί που αναζωογονούνται από lenticules. Πιο συγκεκριμένα, κάναμε ενδεικτικά ένα πείραμα για την επικύρωση της μεθόδου, που ταυτόχρονα αποτελούσε και Challenge test για να δούμε την αντιμικροβιακή δράση του καλλυντικού. Στο πείραμα, χρησιμοποιήσαμε το δείγμα S1, δηλαδή μια κρέμα χεριών και τον S.aureus (NCTC 6571). Η πορεία που ακολουθήσαμε ήταν η εξής: - Για την ενυδάτωση των μικροοργανισμών χρησιμοποιούμε διάλυμα Peptone saline 1%. Σε αποστειρωμένο tube (falcon) των 50 ml προστίθενται 10 ml peptone saline. - Έπειτα, ρίχνεται το περιεχόμενο του lenticule και αφήνεται για ενυδάτωση επί 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 104

105 - Μετά το πέρας των 20 λεπτών, ανακινείται πολύ καλά το tube με Vortex. Περιμένουμε σύμφωνα με τις οδηγίες του lenticule, για τον S.aureus να έχουμε περίπου cfu/ tube των 10 ml (σε 1 ml cfu). - Από το διάλυμα του Peptone saline με τον μικροοργανισμό, υπό άσηπτες συνθήκες, εμβολιάζουμε 1 ml σε ξεχωριστό tube που περιέχει τα 9 ml του διαλύτη MLB και το 1 g κάποιου από τα καλλυντικά προς μελέτη. (Περιμένουμε στο μίγμα του καλλυντικού με το διαλύτη και τον εμβολιασμένο μικροοργανισμό να έχουμε περίπου 380 cfu, λόγω δεκαδικής αραίωσης) - Χωρίς επώαση, από το δεύτερο tube εμβολιάζουμε 0,1 ml απ ευθείας σε τρυβλία Baird Parker agar εις διπλούν και με τη μέθοδο spread plate διασπείρουμε το μείγμα σε όλη την επιφάνεια. - Τα τρυβλία τοποθετούνται για επώαση σε κλίβανο στους 32,5 ο C για 48 ώρες. - Μετά τις 48 ώρες, κάνουμε καταμέτρηση των αποικιών, όπου υπολογίζουμε να έχουμε γύρω στις 38 cfu εάν το καλλυντικό δεν έχει βακτηριοκτόνο δράση και εάν η μέθοδος που ακολουθούμε είναι έγκυρη. - Έπειτα, το δεύτερο tube με το καλλυντικό, το διαλύτη και τον εμβολιασμένο μικροοργανισμό, επωάζεται για 24 ώρες στους 32,5 ο C. - Μετά τις 24 ώρες, εμβολιάζουμε 0,1 ml σε τρυβλία Baird Parker agar εις διπλούν και με τη μέθοδο spread plate διασπείρουμε το μείγμα σε όλη την επιφάνεια. - Τα τρυβλία τοποθετούνται για επώαση σε κλίβανο στους 32,5 ο C για 48 ώρες. - Παράλληλα, από το διάλυμα του Peptone saline με τον μικροοργανισμό, υπό άσηπτες συνθήκες, κάνουμε δεκαδική αραίωση (9 ml Peptone saline + 1 ml από το διάλυμα αυτό), ώστε να έχουμε cfu/ 10 ml σε νέο tube. - Από αυτόν, εμβολιάζουμε 0,1 ml σε τρυβλία Baird Parker agar εις διπλούν και με τη μέθοδο spread plate διασπείρουμε το μείγμα σε όλη την επιφάνεια. - Τα τρυβλία τοποθετούνται για επώαση σε κλίβανο στους 32,5 ο C για 48 ώρες. Αυτό το κομμάτι, αποτελεί το Control μας καθώς δεν περιέχει την καλλυντική κρέμα. Περιμένουμε επίσης να έχουμε 38 cfu στο τρυβλίο. - Καταγράφουμε τα αποτελέσματα. 105

106 Ουσιαστικά κάνουμε τρεις αναλύσεις παράλληλα που απεικονίζονται στο διάγραμμα που ακολουθεί. Εικόνα 2-13 Σχεδιαγραμματική απεικόνιση της πορείας για την επικύρωση μεθόδου 106

107 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 Ο ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 107

108 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 Ο - ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ο σκοπός της διπλωματικής εργασίας ήταν να διερευνηθεί η μικροβιακή ποιότητα ορισμένων καλλυντικών δειγμάτων σε ένα συγκεκριμένο εύρος μικροοργανισμών (ολική μεσόφιλη χλωρίδα, S.aureus, P.aeruginosa και E.coli) και να κριθούν κατάλληλα ή ακατάλληλα ως προς τη χρήση σύμφωνα με την Ευρωπαϊκή Νομοθεσία. Με βάση τα αποτελέσματα αυτά, στόχος είναι να γίνει και εκτίμηση κινδύνου για τη δημόσια υγεία και σε αυτό συνέβαλε και το ερωτηματολόγιο που δόθηκε στους εθελοντές που έδωσαν τα δείγματα προς ανάλυση. Οι μικροβιολογικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν καθ όλη τη διάρκεια των πειραμάτων υπό άσηπτες συνθήκες και οι δύο κύριες μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν ήταν η pour plate και η spread plate method με επακόλουθη καταμέτρηση των αποικιών. Τα τρυβλία επωάστηκαν στους 32,5 ± 2,5 ºC για 48 hours για τη μελέτη της ΟΜΧ, του S.aureus και της P.aeruginosa, ενώ για τη μελέτη της E.coli η επώαση έγινε τους 44 ºC για 24 hours. Η επεξεργασία των αποτελεσμάτων και η στατιστική ανάλυση έγιναν με τη βοήθεια του προγράμματος Microsoft Excel. 3.1 Διαχωρισμός δειγμάτων ανά κατηγορία καλλυντικού Το έντυπο δειγματοληψίας (ερωτηματολόγιο) περιλαμβάνει στοιχεία σχετικά με το χρήστη, όπως η ηλικία του, αλλά και χαρακτηριστικά των δειγμάτων που αναλύθηκαν, όπως η κατηγορία του καλλυντικού, η σύσταση και ο χρόνος ανοίγματός του. Από τις πληροφορίες αυτές έγινε η στατιστική ανάλυση, που απεικονίζεται με τα διαγράμματα που ακολουθούν. Κρέμα χεριών 13% Κρέμα ματιών 8% Κρέμα σώματος 41% Κρέμα προσώπου 38% Κρέμα ματιών Κρέμα προσώπου Κρέμα σώματος Κρέμα χεριών Γράφημα 3-1 Δείγματα που αναλύθηκαν ανά κατηγορία 108

109 Σύνολο δειγμάτων Όπως παρατηρούμε, η πλειοψηφία των δειγμάτων που αναλύθηκαν ήταν κρέμες σώματος (41%), ακολουθούμενες από τις κρέμες προσώπου (38%), τις κρέμες χεριών (13%) και τέλος, τις κρέμες ματιών (8%). 3.2 Διαχωρισμός δειγμάτων με βάση το κόστος Οι εθελοντές που συμμετείχαν στην έρευνα ερωτήθηκαν σχετικά με το κόστος του προϊόντος και στη συνέχεια έγινε διαχωρισμός των προϊόντων σε οικονομικά και μη οικονομικά. Το κόστος σχετίζεται συνήθως και με την επωνυμία του καλλυντικού, χωρίς όμως αυτό να συμβαίνει πάντα, καθώς υπάρχουν και επώνυμα καλλυντικά σε χαμηλές τιμές αλλά και καλλυντικά άγνωστης προέλευσης με υψηλό κόστος. Πίνακας 3-2 Διαχωρισμός δειγμάτων ανάλογα με το κόστος Οικονομικό προϊόν Αριθμός δειγμάτων ΝΑΙ 55 ΟΧΙ 29 Γενικό Άθροισμα (65 %) (35 %) ΝΑΙ ΟΧΙ Άθροισμα Οικονομικό προϊόν Γράφημα 3-2 Διαχωρισμός δειγμάτων ανάλογα με το κόστος Σύμφωνα με το διάγραμμα, το 65% των δειγμάτων είναι προϊόντα οικονομικά και μόλις το 35% αυτών είναι προϊόντα υψηλού κόστους. Πιθανόν αυτό να οφείλεται στο γεγονός ότι το κοινό που συμμετείχε ήταν κυρίως φοιτήτριες μικρής σχετικά ηλικίας, οπότε προτιμάται 109

110 η αγορά οικονομικότερων προϊόντων. Το 35% των δειγμάτων που αναλύθηκαν είναι προϊόντα επώνυμης μάρκας και ακριβά ως προς το κόστος (ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IV). 3.3 Ομαδοποίηση ερωτηθέντων με βάση την ηλικία Οι εθελοντές ερωτήθηκαν σχετικά με την ηλικία τους και έπειτα έγινε ο διαχωρισμός τους σε τρεις ηλικιακές ομάδες: 18-24, και ετών. Το σύνολο των ερωτηθέντων είναι 52 και όχι 84 που είναι ο συνολικός αριθμός των δειγμάτων διότι τα υπόλοιπα 32 δείγματα ήταν κλειστά και προέρχονται είτε από φαρμακεία, είτε από εθελοντές, είτε από καταστήματα καλλυντικών. Πίνακας 3-3 Ομαδοποίηση ερωτηθέντων ανάλογα με την ηλικία Ηλικιακές ομάδες Σύνολο ερωτηθέντων Γενικό Άθροισμα 52 (κενό) Ηλικιακές ομάδες (6 %) 18 (35 %) 31 (59 %) Σύνολο ερωτηθέντων Άθροισμα Γράφημα 3-3 Διαχωρισμός ερωτηθέντων σε ηλικιακές ομάδες Παρατηρούμε ότι οι περισσότεροι εθελοντές που συμμετείχαν στην έρευνα ανήκουν στην ηλικιακή ομάδα ετών (59%). Αμέσως μετά ακολουθούν οι εθελοντές ηλικίας 110

111 25-35 ετών (35%) και τέλος άτομα ηλικίας (6%). Πρόκειται λοιπόν για ένα νεανικό κοινό, αποτελούμενο κυρίως από φοιτητές. 3.4 Ομαδοποίηση δειγμάτων με βάση το χρόνο ανοίγματος Οι συμμετέχοντες στην έρευνα ερωτήθηκαν σχετικά με το χρονικό διάστημα που είναι ανοιχτό το προϊόν προς εξέταση που χρησιμοποιούν, το οποίο εκφράστηκε σε μήνες. Στη συνέχεια, έγινε ο διαχωρισμός των δειγμάτων αυτών σε τρεις ομάδες ανάλογα με το χρόνο που ήταν τα προϊόντα ανοιχτά: 0-1, 1-3 και 3-10 έτη. Στην πρώτη κατηγορία περιλαμβάνονται και τα κλειστά δείγματα που συλλέχθηκαν. Πίνακας 3-4 Ομαδοποίηση δειγμάτων ανάλογα με το χρόνο ανοίγματος Χρόνος ανοίγματος (έτη) Αριθμός δειγμάτων Γενικό Άθροισμα % % % Χρόνος ανοίγματος (έτη) Γράφημα 3-4 Διαχωρισμός δειγμάτων βάσει χρόνου ανοίγματος Τα περισσότερα δείγματα που αναλύθηκαν ήταν δείγματα ανοιχτά το πολύ μέχρι ενός έτους σε ποσοστό 76%. Μάλιστα τα 32 από τα 84 δείγματα είναι δείγματα κλειστά σε 111

112 ποσοστό 38% σύμφωνα και με το ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IV. Το 20% των δειγμάτων είναι ανοιχτά από 1-3 έτη, ενώ μόνο το 4% αυτών είναι ανοιχτά από 3-10 έτη. 3.5 Ακρίβεια των μετρήσεων Από αυτό το σημείο και έπειτα παρατίθενται τα αποτελέσματα που προέκυψαν από τις μικροβιολογικές αναλύσεις που πραγματοποιήθηκαν. Για την κάθε ανάλυση τα πειράματα έγιναν εις διπλούν και πραγματοποιήθηκαν δύο αραιώσεις για το κάθε δείγμα. Πίνακας 3-5 Αποτελέσματα μετρήσεων για όλα τα δείγματα Α/Α ΟΜΧ ΟΜΧ ΟΜΧ ΟΜΧ E.coli E.coli E.coli E.coli S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S.aure us S.aure us S.aur eus S.aur eus P.aeru ginosa P.aeru ginosa P.aer ugino sa P.aer ugino sa

113 S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S S Αρχικά, έγινε μια εκτίμηση της ακρίβειας και επαναληψιμότητας των μετρήσεων. Όπως ήδη αναφέραμε, συνολικά είχαμε 84 δείγματα. Έγιναν δύο αραιώσεις για το κάθε δείγμα και εμβολιάστηκαν τρυβλία εις διπλούν για την κάθε ανάλυση με στόχο να πάρουμε το μέσο όρο και να έχουμε μεγαλύτερη ακρίβεια στις μετρήσεις μας. Μολυσμένα δείγματα, με εξαίρεση 1 από τα 84 που ήταν θετικό για P.aeruginosa, είχαμε μόνο ως προς την ολική μεσόφιλη χλωρίδα και γι αυτό το λόγο η μελέτη έγινε για τις συγκεκριμένες αναλύσεις. Όπως φαίνεται και από τον Πίνακα 3-5 οι αναλύσεις έγιναν εις διπλούν, δηλαδή χρησιμοποιήθηκαν δυο τρυβλία για την καταμέτρηση των τελικών αποικιών. 113

114 Γράφημα 3-5 Απόκλιση των διπλών μετρήσεων για την 1 η αραίωση στην ΟΜΧ Οι μετρήσεις για την ΟΜΧ της πρώτης αραίωσης των δειγμάτων ήταν πολύ κοντινές για κάθε δείγμα, γεγονός που δείχνει μεγάλη ακρίβεια. Το Γράφημα 3-5 δείχνει τη διασπορά της διαφοράς των διπλών μετρήσεων για κάθε δείγμα. Γράφημα 3-6 Απόκλιση μετρήσεων ανάμεσα στις δύο διαδοχικές αραιώσεις Το Γράφημα 3-6 εμφανίζει τη διασπορά της διαφοράς του μέσου όρου της πρώτης αραίωσης της ΟΜΧ με το δεκαπλάσιο της δεύτερης αραίωσης, θεωρώντας ότι στις διαδοχικές αραιώσεις εφόσον γίνονται με μεγάλη προσοχή, αναμένουμε να καταμετρήσουμε υποδεκαπλάσιες αποικίες προχωρώντας κάθε φορά στην επόμενη 114

115 δεκαδική αραίωση. Σε αυτή την περίπτωση επίσης φαίνεται από το διάγραμμα πως έγιναν σωστά οι αναλύσεις και με καλή ακρίβεια δεδομένου ότι λίγες είναι οι μετρήσεις που αποκλίνουν από τις αναμενόμενες μετρήσεις. 3.6 Καταλληλότητα δειγμάτων ως προς τη χρήση Σύμφωνα με την Ευρωπαϊκή Νομοθεσία, όπως ήδη έχει γίνει λόγος: - Tα προϊόντα που προορίζονται για την περιοχή των ματιών πρέπει να περιέχουν λιγότερα από 100 cfu ανά gr ή ml προϊόντος. - Όλα τα υπόλοιπα προϊόντα πρέπει να περιέχουν λιγότερα των 1000 cfu ανά gr ή ml προϊόντος. - Μικρόβια που είναι παθογόνα, όπως S.aureus, P.aeruginosa και E.coli δεν πρέπει να περιέχονται καθόλου στο προϊόν. Με βάση λοιπόν την ισχύ και των τριών κριτηρίων χαρακτηρίστηκαν τα δείγματα ως κατάλληλα και μη κατάλληλα προς χρήση. Στη συνέχεια ακολουθεί πίνακας με όλες τις τελικές μετρήσεις και το χαρακτηρισμό των δειγμάτων ως κατάλληλα ή μη για χρήση. 115

116 Πίνακας 3-6 Τελικές μετρήσεις των δειγμάτων και χαρακτηρισμός τους Α/Α Κατηγορία Μέγιστο επιτρεπτό όριο (CFU/g) ΟΜΧ αρχικό (CFU/g) Κατάλληλο (ΟΜΧ) E.coli αρχικό (CFU/g) S.aureus αρχικό (Τελικός έλεγχος) P.aeruginosa αρχικό (CFU/g) Κατάλληλο προς χρήση S1 Κρέμα χεριών ΝΑΙ ΝΑΙ S2 Κρέμα προσώπου ΝΑΙ ΝΑΙ S3 Κρέμα χεριών ΝΑΙ ΝΑΙ S4 Κρέμα προσώπου ΝΑΙ ΝΑΙ S5 Κρέμα σώματος ΝΑΙ ΝΑΙ S6 Κρέμα σώματος ΝΑΙ ΟΧΙ S7 Κρέμα σώματος ΝΑΙ ΝΑΙ S8 Κρέμα ματιών ΝΑΙ ΝΑΙ S9 Κρέμα χεριών ΝΑΙ ΝΑΙ S10 Κρέμα χεριών ΝΑΙ ΝΑΙ S11 Κρέμα σώματος ΝΑΙ ΝΑΙ S12 Κρέμα σώματος ΝΑΙ ΝΑΙ S13 Κρέμα χεριών ΝΑΙ ΝΑΙ S14 Κρέμα σώματος ΝΑΙ ΝΑΙ S15 Κρέμα σώματος ΝΑΙ ΝΑΙ S16 Κρέμα σώματος ΝΑΙ ΝΑΙ S17 Κρέμα σώματος ΝΑΙ ΝΑΙ S18 Κρέμα προσώπου ΝΑΙ ΝΑΙ S19 Κρέμα σώματος ΝΑΙ ΝΑΙ S20 Κρέμα σώματος ΝΑΙ ΝΑΙ S21 Κρέμα σώματος ΝΑΙ ΝΑΙ S22 Κρέμα σώματος ΝΑΙ ΝΑΙ S23 Κρέμα χεριών ΝΑΙ ΝΑΙ S24 Κρέμα χεριών ΝΑΙ ΝΑΙ S25 Κρέμα χεριών ΝΑΙ ΝΑΙ S26 Κρέμα σώματος ΝΑΙ ΝΑΙ S27 Κρέμα προσώπου ΟΧΙ ΟΧΙ S28 Κρέμα σώματος ΝΑΙ ΝΑΙ S29 Κρέμα σώματος ΝΑΙ ΝΑΙ S30 Κρέμα σώματος ΝΑΙ ΝΑΙ S31 Κρέμα προσώπου ΝΑΙ ΝΑΙ S32 Κρέμα σώματος ΝΑΙ ΝΑΙ S33 Κρέμα χεριών ΝΑΙ ΝΑΙ S34 Κρέμα σώματος ΝΑΙ ΝΑΙ S35 Κρέμα προσώπου ΝΑΙ ΝΑΙ S36 Κρέμα χεριών ΝΑΙ ΝΑΙ S37 Κρέμα σώματος ΝΑΙ ΝΑΙ S38 Κρέμα προσώπου ΝΑΙ ΝΑΙ S39 Κρέμα ματιών ΝΑΙ ΝΑΙ S40 Κρέμα ματιών ΝΑΙ ΝΑΙ 116

117 S41 Κρέμα προσώπου ΝΑΙ ΝΑΙ S42 Κρέμα ματιών ΝΑΙ ΝΑΙ S43 Κρέμα σώματος ΝΑΙ ΝΑΙ S44 Κρέμα προσώπου ΝΑΙ ΝΑΙ S45 Κρέμα σώματος ΝΑΙ ΝΑΙ S46 Κρέμα προσώπου ΝΑΙ ΝΑΙ S47 Κρέμα προσώπου ΝΑΙ ΝΑΙ S48 Κρέμα ματιών ΝΑΙ ΝΑΙ S49 Κρέμα ματιών ΝΑΙ ΝΑΙ S50 Κρέμα σώματος ΟΧΙ ΟΧΙ S51 Κρέμα προσώπου ΟΧΙ ΟΧΙ S52 Κρέμα σώματος ΝΑΙ ΝΑΙ S53 Κρέμα χεριών ΝΑΙ ΝΑΙ S54 Κρέμα σώματος ΟΧΙ ΟΧΙ S55 Κρέμα σώματος ΝΑΙ ΝΑΙ S56 Κρέμα σώματος ΝΑΙ ΝΑΙ S57 Κρέμα σώματος ΝΑΙ ΝΑΙ S58 Κρέμα σώματος ΟΧΙ ΟΧΙ S59 Κρέμα προσώπου ΝΑΙ ΝΑΙ S60 Κρέμα προσώπου ΝΑΙ ΝΑΙ S61 Κρέμα προσώπου ΝΑΙ ΝΑΙ S62 Κρέμα ματιών ΝΑΙ ΝΑΙ S63 Κρέμα προσώπου ΝΑΙ ΝΑΙ S64 Κρέμα προσώπου ΝΑΙ ΝΑΙ S65 Κρέμα προσώπου ΝΑΙ ΝΑΙ S66 Κρέμα προσώπου ΝΑΙ ΝΑΙ S67 Κρέμα προσώπου ΝΑΙ ΝΑΙ S68 Κρέμα σώματος ΝΑΙ ΝΑΙ S69 Κρέμα προσώπου ΝΑΙ ΝΑΙ S70 Κρέμα προσώπου ΝΑΙ ΝΑΙ S71 Κρέμα προσώπου ΝΑΙ ΝΑΙ S72 Κρέμα προσώπου ΝΑΙ ΝΑΙ S73 Κρέμα προσώπου ΝΑΙ ΝΑΙ S74 Κρέμα προσώπου ΝΑΙ ΝΑΙ S75 Κρέμα προσώπου ΝΑΙ ΝΑΙ S76 Κρέμα προσώπου ΝΑΙ ΝΑΙ S77 Κρέμα σώματος ΝΑΙ ΝΑΙ S78 Κρέμα προσώπου ΝΑΙ ΝΑΙ S79 Κρέμα σώματος ΝΑΙ ΝΑΙ S80 Κρέμα σώματος ΝΑΙ ΝΑΙ S81 Κρέμα προσώπου ΝΑΙ ΝΑΙ S82 Κρέμα προσώπου ΝΑΙ ΝΑΙ S83 Κρέμα προσώπου ΝΑΙ ΝΑΙ S84 Κρέμα σώματος ΝΑΙ ΝΑΙ 117

118 ΟΧΙ 7% Καταλληλότητα προϊόντων ΝΑΙ ΟΧΙ ΝΑΙ 93% Γράφημα 3-7 Συνολική απεικόνιση της καταλληλότητας δειγμάτων προς χρήση Η πλειοψηφία των δειγμάτων που αναλύθηκαν κρίθηκαν κατάλληλα προς χρήση σε ποσοστό 93%. Μόνο 6 από τα 84 προϊόντα (7%) ήταν ακατάλληλα για χρήση σύμφωνα με τη νομοθεσία. Αυτό μας δείχνει γενικά ότι ο έλεγχος των τελικών προς πώληση προϊόντων είναι αρκετά ικανοποιητικός, μειώνοντας έτσι τον κίνδυνο μόλυνσης των χρηστών. 3.7 Σχέση του χρόνου ανοίγματος των προϊόντων με την καταλληλότητά τους Αφότου συλλέχθηκαν όλες οι μετρήσεις από τις μικροβιολογικές αναλύσεις και διαχωρίστηκαν τα δείγματα σε κατάλληλα και μη κατάλληλα, έγινε μια προσπάθεια να συσχετιστούν τα ακατάλληλα προς χρήση προϊόντα με το χρονικό διάστημα που ήταν ανοιχτά. Πίνακας 3-7 Συσχέτιση της καταλληλότητας των προϊόντων με το χρόνο ανοίγματός τους Χρόνος ανοίγματος (έτη) Κατάλληλο προϊόν ΝΑΙ ΟΧΙ Γενικό Άθροισμα Γενικό Άθροισμα Όπως φαίνεται από τον Πίνακα 3-7, τα 64 από τα 84 δείγματα που αναλύθηκαν (76%) είναι ανοιχτά από 0-1 έτος και από αυτά μόνο τα 2 δείγματα κρίθηκαν ακατάλληλα προς 118

119 Αριθμός δειγμάτων χρήση (3%). Τα 17 από τα 84 δείγματα ήταν ανοιχτά από 1-3 έτη και τα 3 από αυτά κρίθηκαν ακατάλληλα (18%). Μόνο το 4% των δειγμάτων ήταν ανοιχτά πάνω από 3 χρόνια (3 δείγματα από τα 84) και από αυτά το 1 ήταν ακατάλληλο προς χρήση (33%). Καταλληλότητα προϊόντος και χρόνος ανοίγματος ΝΑΙ ΟΧΙ (3 %) 3 (18 %) 2 1 (33 %) Χρόνος ανοίγματος (έτη) Γράφημα 3-8 Συσχέτιση της καταλληλότητας των προϊόντων με το χρόνο ανοίγματός τους Παρατηρούμε δηλαδή ότι όσο αυξάνεται το χρονικό διάστημα που είναι ανοιχτό το καλλυντικό, τόσο αυξάνεται το ποσοστό εμφάνισης μολυσμένων δειγμάτων, ακατάλληλων προς χρήση. 3.8 Καταλληλότητα προϊόντων σύμφωνα με τα αποτελέσματα των μικροβιολογικών αναλύσεων Οι μικροβιολογικές αναλύσεις που επιλέχθηκαν να γίνουν περιορίζονταν ως προς το μικροβιολογικό φάσμα στους εξής μικροοργανισμούς: OMX, E.coli, P.aeruginosa και S.aureus καθώς σύμφωνα με τα πειραματικά πρωτόκολλα που εφαρμόζονται για τον έλεγχο ποιότητας των καλλυντικών επιλέγονται οι συγκεκριμένες αναλύσεις. Οι μικροοργανισμοί E.coli, P.aeruginosa και S.aureus πρέπει να απουσιάζουν από τα τελικά προϊόντα, ενώ η ΟΜΧ πρέπει να μην ξεπερνάει τις 100 cfu/g προϊόντος για καλλυντικά που προορίζονται για τα μάτια και τις 1000 cfu/g για όλα τα υπόλοιπα. 119

120 Πίνακας 3-8 Καταλληλότητα προϊόντων για ασφαλή χρήση σύμφωνα με τις μικροβιολογικές αναλύσεις Μικροβιολογικές αναλύσεις Κατάλληλο προϊόν ΝΑΙ ΟΧΙ Σύνολο ΟΜΧ E.coli P.aeruginosa S.aureus Συνολικά Καταλληλότητα προϊόντων σύμφωνα με το μικροβιακό φάσμα προς μελέτη (94 %) 5 84 (100%) 83 (99%) 84 (100%) ΝΑΙ ΟΧΙ 0 Σύμφωνα με ΟΜΧ Σύμφωνα με E.coli Σύμφωνα με Ps.aeruginosa Σύμφωνα με S.aureus Γράφημα 3-9 Καταλληλότητα προϊόντων σύμφωνα με τις αναλύσεις για τον κάθε μικροοργανισμό ξεχωριστά Όπως βλέπουμε και στο Γράφημα 3-9, όσον αφορά τις αναλύσεις για την ανίχνευση E.coli και S.aureus όλα τα δείγματα ήταν αρνητικά, δηλαδή απαλλαγμένα από τους συγκεκριμένους μικροοργανισμούς. Ως προς την ανίχνευση της P.aeruginosa μόνο ένα δείγμα από τα 84 ήταν θετικό, δηλαδή μολυσμένο με το μικροοργανισμό. Τέλος, ως προς την ΟΜΧ το 94% των δειγμάτων ήταν κατάλληλα προς χρήση, είτε απαλλαγμένα εντελώς 120

121 από ολική μεσόφιλη χλωρίδα είτε με αριθμό αποικιών εντός ορίων. Από τα 84 δείγματα τα 5 δηλαδή κρίθηκαν ακατάλληλα. Στο σημείο αυτό να αναφέρουμε ότι αρχικά υπήρξαν μολυσμένα δείγματα με S.aureus, όπως φαίνεται στον Πίνακα 3-5, αλλά με το επιβεβαιωτικό τεστ για την ανίχνευση του S.aureus δεν δόθηκαν ξεκάθαρα αποτελέσματα και για το λόγο αυτό χρειάστηκε να γίνει περαιτέρω έλεγχος με ένα βιοχημικό Latex test ειδικό για S.aureus (Pastorex TM Staph-plus της εταιρείας BIORAD) όπως περιγράφηκε αναλυτικά στην παράγραφο Όπως έδειξε όμως το τεστ, τα προς εξέταση στελέχη που θεωρούσαμε ότι είναι S.aureus, ήταν coagulase-negative. Συνεπώς αποκλείστηκε η πιθανότητα να είναι S.aureus. Τα στελέχη αυτά ήταν κατά πάσα πιθανότητα άλλο είδος Staphylococcus και μάλιστα κλίνουμε στο συμπέρασμα ότι πρόκειται για S.epidermidis, εφόσον το συγκεκριμένο στέλεχος είναι coagulase-negative (πηκτάση αρνητικό) και βρίσκεται φυσιολογικά στα χέρια μας, ενώ μεταφέρεται εύκολα από αυτά στο καλλυντικό και αντίστροφα χωρίς γενικά να αποτελεί κίνδυνο. Πίνακας 3-9 Συγκεντρωτική απεικόνιση των ακατάλληλων δειγμάτων 3.9 Συσχέτιση ακατάλληλων δειγμάτων με το κόστος και το χρόνο ανοίγματος Σε αυτό το σημείο γίνεται μια προσπάθεια συσχέτισης των μολυσμένων δειγμάτων με το κόστος που είχαν και με το χρόνο ανοίγματός τους ταυτόχρονα. 121

122 Αριθμός δειγμάτων Ακατάλληλα δείγματα και κόστος ΝΑΙ ΟΧΙ Άθροισμα 5 1 Οικονομιικό προϊόν Αριθμός δειγμάτων Ακατάλληλα δείγματα και χρόνος ανοίγματος Άθροισμα Χρόνος ανοίγματος (έτη) Γράφημα 3-10 Συσχέτιση των ακατάλληλων προς χρήση δειγμάτων με το κόστος και το χρόνο ανοίγματος Σύμφωνα και με τον Πίνακα 3-8, ο αριθμός των μολυσμένων δειγμάτων που κρίθηκαν ακατάλληλα προς χρήση ήταν 6, εκ των οποίων το 1 ήταν ακατάλληλο λόγω παρουσίας P.aeruginosa και τα υπόλοιπα 5 ήταν ακατάλληλα λόγω αυξημένου (εκτός ορίων) μικροβιακού φορτίου ως προς την ΟΜΧ. Από τα ακατάλληλα δείγματα τα 5 ήταν προϊόντα χαμηλού κόστους και το 1 ακριβό προϊόν. Τα 3 από τα 6 δείγματα ήταν ανοιχτά από 1-3 έτη, τα 2 μέχρι 1 έτος και το 1 ανοιχτό από 3 έτη και πάνω. Παρατηρούμε δηλαδή ότι τα 4 από τα 6 μολυσμένα καλλυντικά ήταν ανοιχτά πάνω από ένα χρόνο, γεγονός που δείχνει όπως αναφέραμε και πριν, ότι με την πάροδο του χρόνου που μένουν τα προϊόντα ανοιχτά αυξάνεται και ο κίνδυνος επιμόλυνσής τους Αποτελέσματα από τον έλεγχο εγκυρότητας Όπως αναφέρθηκε και στην παράγραφο και στην εικόνα 2-13 της ίδιας παραγράφου, το αναμενόμενο αποτέλεσμα από το Validation test που έγινε ενδεικτικά για τον S.aureus είναι η τελική καταμέτρηση 38 cfu στο control που είναι εμβολιασμένο με το μικροοργανισμό χωρίς το δείγμα και 38 cfu στο εμβολιασμένο δείγμα χωρίς να επέλθει επώαση, στην περίπτωση που το καλλυντικό δεν παρουσιάζει αντιμικροβιακή δράση. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται συνοπτικά στον ακόλουθο πίνακα: 122

123 Πίνακας 3-10 Συγκεντρωτική απεικόνιση των αποτελεσμάτων από το Validation test Αναλύσεις Αποτελέσματα μετρήσεων σε cfu (εις διπλούν) Μ.Ο. μετρήσεων (cfu) Αναμενόμενες cfu σύμφωνα με το τεστ (θεωρητικά) S1 + S.aureus (χωρίς επώαση) S1 + S.aureus + επώαση Detection Detection Detection Uncountable Control + S.aureus (χωρίς το δείγμα) Σύμφωνα με τον Πίνακα 3-10, φαίνεται ότι η μέθοδος που ακολουθούμε είναι έγκυρη, δεδομένου ότι ακολουθώντας την ίδια μεθοδολογία στις αναλύσεις, παίρνουμε τα επιθυμητά αποτελέσματα που είναι η τελική ανίχνευση του προς μελέτη μικροοργανισμού. Άρα το πρωτόκολλο που ακολουθούμε λειτουργεί. Στο συγκεκριμένο ενδεικτικό πείραμα ασχοληθήκαμε με τον S.aureus τον οποίο και εμβολιάσαμε, γνωρίζοντας της αρχική συγκέντρωσή του, στο δείγμα S1. Η επιλογή του δείγματος ήταν τυχαία. Έπειτα από τις προαπαιτούμενες αραιώσεις για να έχουμε τελικώς μετρήσιμες αποικίες, θεωρώντας ότι η κρέμα από μόνη της δεν διαθέτει αντιμικροβιακή δράση περιμέναμε να βρούμε γύρω στις 38 αποικίες. Παρατηρούμε ότι στο εμβολιασμένο δείγμα χωρίς επώαση και στο Control (εμβολιασμός χωρίς το δείγμα) οι τιμές δεν διαφέρουν πολύ. Υπάρχει μια μικρή μείωση στις cfu στο εμβολιασμένο δείγμα αλλά είναι μικρότερη της τάξεως του ενός λογαρίθμου επομένως δε μπορούμε να θεωρήσουμε ότι η κρέμα παρουσιάζει βακτηριοκτόνο δράση. Η μείωση μπορεί να οφείλεται σε κάποιες μικρές ποσότητες αιθανόλης της κρέμας ή και σε σφάλματα κατά την πειραματική διαδικασία. Στον εμβολιασμό του δείγματος με S.aureus με ακολουθούμενη επώαση παρατηρούμε ότι τα αποτελέσματα στα τρυβλία είναι μη μετρήσιμα λόγω υπερπληθυσμού. Αυτό είναι αναμενόμενο δεδομένου ότι σε αυξημένη θερμοκρασία και κατάλληλες συνθήκες οι μικροοργανισμοί αναπαράγονται ταχέως. 123

124 124

125 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Ο ΣΥΖΗΤΗΣΗ 125

126 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Ο ΣΥΖΗΤΗΣΗ Στην παρούσα μελέτη εξετάστηκαν 84 δείγματα καλλυντικών κρεμών από διαφορετικές εταιρείες, επώνυμες και ανώνυμες, που χρησιμοποιούν γυναίκες διαφόρων ηλικιών σε καθημερινή βάση με στόχο τη διερεύνηση της μικροβιακής τους ποιότητας. Ακόμη, γίνεται μια προσπάθεια εκτίμησης του κινδύνου που επιφέρει η μόλυνση του καλλυντικού προϊόντος για τη Δημόσια Υγεία. Το μικροβιακό φάσμα που εξετάσθηκε περιλαμβάνει τους εξής παθογόνους για τον άνθρωπο μικροοργανισμούς: S.aureus, P.aeruginosa και E.coli. Επιπλέον, διερευνήθηκαν τα δείγματα ως προς την ολική μεσόφιλη χλωρίδα καθώς οι προδιαγραφές για να είναι ένα προϊόν ασφαλές να βγει στην αγορά σύμφωνα με τη Νομοθεσία, πρέπει να έχει μικροβιακό φορτίο ΟΜΧ μικρότερο του 100 CFU/g προϊόντος για τα καλλυντικά που προορίζονται για την περιοχή των ματιών και μικρότερο του CFU/g για όλα τα υπόλοιπα. Επιπλέον, πρέπει να απουσιάζουν οι παθογόνοι μικροοργανισμοί που αναφέραμε. Τα αποτελέσματα από την παρούσα μελέτη υποδεικνύουν ότι σε γενικές γραμμές τηρούνται τα μέτρα προστασίας για τη Δημόσια Υγεία, τόσο από την μεριά των παραγωγών όσο και από τη μεριά των καταναλωτών, καθώς το 93% των εξεταζόμενων δειγμάτων κρίθηκε κατάλληλο προς χρήση με βάση τον έλεγχο της μικροβιακής του ποιότητας. Μόνο το 7%, δηλαδή 6 από τα 84 δείγματα, ήταν ακατάλληλο προς χρήση καθώς είχαν μολυνθεί και δεν πληρούσαν τις προϋποθέσεις για ασφαλή χρήση. Το δείγμα που παρουσιάστηκε να έχει τη μεγαλύτερη μικροβιακή μόλυνση είχε CFU/g, ενώ το αμέσως επόμενο είχε CFU/g. Συνεπώς, το μικροβιακό φορτίο δεν ξεπερνά τις 10 4 CFU/g, γεγονός που δείχνει ότι η μόλυνση δεν ήταν εκτεταμένη. Παρ όλ αυτά, κρίνονται ακατάλληλα για χρήση καθώς ξεπερνάνε το όριο των CFU/g. Τα αποτελέσματα της έρευνας έδειξαν επίσης ότι η E.coli και ο S.aureus ήταν απόντες από όλα τα δείγματα. Μόνο 1 δείγμα από τα 84 ήταν μολυσμένο με P.aeruginosa, ενώ 5 από τα 84 ήταν ακατάλληλα λόγω υψηλής ολικής μεσόφιλης χλωρίδας (ΟΜΧ). Σχεδόν όλα τα δείγματα προς εξέταση δηλαδή, ήταν απαλλαγμένα από παθογόνους μικροοργανισμούς. Τα δείγματα που αναλύθηκαν ήταν τόσο κλειστά και αχρησιμοποίητα, όσο και ήδη χρησιμοποιούμενα. Τα πιο πολλά από τα δείγματα ήταν ανοιχτά το πολύ μέχρι ένα έτος (76%). Όμως, υπήρχαν και πολλά που ήταν ανοιχτά πάνω από 2 και 3 χρόνια και η χρήση τους συνεχιζόταν κανονικά. Παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν και στην Ιταλία από τον Campana και συν., 2006 που εξέτασε 91 καλλυντικά προϊόντα, εκ των οποίων τα 23 ήταν κρέμες, σε τρεις διαφορετικές φάσεις: πριν το άνοιγμα, 126

127 κατά τη διάρκεια της χρήσης και λίγο καιρό αργότερα προς το τελευταίο στάδιο χρήσης. Δε βρέθηκε καμία μόλυνση στις καλλυντικές κρέμες και οι παθογόνοι μικροοργανισμοί προς μελέτη ήταν απόντες, ενώ όλες οι μολύνσεις που βρέθηκαν στα υπόλοιπα δείγματα ήταν προς το τελευταίο στάδιο χρήσης τους. Παρ όλ αυτά, δεν είναι λίγες οι περιπτώσεις όπου συναντάμε μεγαλύτερα ποσοστά μολυσμένων καλλυντικών προϊόντων σε παγκόσμιο επίπεδο όπως αναφέρει ο Underwood, Οι Hitchin και Tran, 1993 έδειξαν ότι το 50% από τα δείγματα καλλυντικών που εξετάστηκαν ήταν μολυσμένα. Πρόκειται όμως για δείγματα που πήραν από καταστήματα καλλυντικών που ήταν για δοκιμή, συνεπώς ήταν κοινής χρήσης καλλυντικά και ο κίνδυνος επιμόλυνσης αυξάνεται. Σύμφωνα με τους Becks και Lorenzoni, 1995 κρούσματα μόλυνσης από P.aeruginosa εμφανίστηκαν σε νοσοκομειακή μονάδα και συνδέθηκαν με μολυσμένες κρέμες χεριών. Ακόμα όμως και πιο πρόσφατα, από το 2005 μέχρι το 2008 η Ευρωπαϊκή Ένωση απέσυρε 24 διαφορετικά καλλυντικά προϊόντα λόγω μικροβιακής μόλυνσης και μάλιστα το 42% εξ αυτών ήταν μολυσμένα με την παθογόνο P.aeruginosa, όπως αναφέρουν οι Lundov και Zachariae, O Baird, 1984 ανέλυσε 232 διαφορετικά καλλυντικά προϊόντα για βρέφη και το 23% αυτών ήταν μολυσμένα. Πιο συγκεκριμένα κάποια από τα προϊόντα ήταν αχρησιμοποίητα ενώ κάποια ήδη χρησιμοποιούνταν σε σπίτια και βρέθηκαν μολυσμένα με στελέχη Staphylococcus και Pseudomonas. Ο Ashour και συν., 1989 ανέλυσε 54 δείγματα καλλυντικών προϊόντων εκ των οποίων τα 3 ήταν μολυσμένα με S aureus και άλλα 3 μολυσμένα με E.coli ενώ η OMX ήταν σε επιτρεπτά όρια. Οι Anelich και Korsten, 1996 στη Νότια Αφρική διερεύνησαν τη μικροβιακή ποιότητα 46 καλλυντικών προϊόντων και διαπίστωσαν ότι τα 33 ήταν μολυσμένα με την ΟΜΧ να ξεπερνάει κατά πολύ τις 10 5 CFU/g δείγματος, ενώ απομονώθηκαν και τα στελέχη P.aeruginosa και Ε.coli. Σε άλλη μελέτη που διεξήχθη, 8 από τις 49 κρέμες σώματος που εξετάστηκαν ως προς την μικροβιακή τους ποιότητα ήταν μολυσμένες με περισσότερες από 10 3 CFU/g καλλυντικού, ενώ απομονώθηκαν στελέχη του γένος Escherichia coli, Pseudomonas spp., Staphylococcus spp. και Bacillus spp., όπως έδειξαν οι Okeke και Lamikanra, O Macvren και συν., 2011 ανέλυσε 60 δείγματα καλλυντικών από τρεις διαφορετικές μάρκες και η ΟΜΧ κατά μέσο όρο κυμαινόταν από CFU/g. Το 50% των δειγμάτων ήταν μολυσμένα με S.aureus αλλά η P.aeruginosa απουσίαζε εντελώς. Το θέμα του packaging φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στη μείωση του κινδύνου μόλυνσης της κρέμας. Η οξείδωση της πέρα από αλλοιώσεις ως προς την υφή, μπορεί να δημιουργήσει πρόσφορο έδαφος για την ανάπτυξη μικροοργανισμών και γι αυτό έχουν 127

128 γίνει μελέτες σχετικά με το πώς η συσκευασία και οι περιέκτες (container) μπορούν να επηρεάσουν την ασφάλεια του καλλυντικού, όπως αναφέρει ο Wang, Ο Poulsen και Strandesen, 2011 αναφέρουν ότι για να διατηρηθεί η κρέμα όσο περισσότερο γίνεται πρέπει να βιδώνεται καλά το πώμα ώστε να αποφεύγεται η εξάτμιση και η οξείδωση. Πρέπει να διατηρείται σε σκοτεινό μέρος. Σύμφωνα με τον Denyer και συν., 2004 είναι σημαντικό, αφού ανοιχτεί το βαζάκι, η κρέμα να χρησιμοποιείται συνεχώς ή διαφορετικά, να φυλάσσεται στο ψυγείο και όταν ανοίγεται πρέπει να μην αφήνεται για μεγάλο χρονικό διάστημα ανοιχτή καθώς οξειδώνεται από τον αέρα. Τα χέρια είναι απαραίτητο να είναι καλά πλυμένα πριν χρησιμοποιηθούν για τη λήψη της κρέμας. Μερικές μάρκες παρέχουν μία μικρή σπάτουλα που είναι μία καλή λύση, αρκεί να πλένεται τακτικά. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα από το Validation test που έγινε ενδεικτικά για ένα από τα δείγματα τυχαία, παρατηρούμε μια μικρή μείωση στην καταμέτρηση αποικιών του καλλυντικού δείγματος με τον εμβολιασμένο μικροοργανισμό σε σχέση με το δείγμα Control που είναι χωρίς το καλλυντικό δείγμα. Η μείωση αυτή είναι μικρότερη του ενός λογαρίθμου και δε μπορούμε να συμπεράνουμε ότι το συγκεκριμένο δείγμα έχει αντιμικροβιακή δράση. Αυτή η μικρή μείωση μπορεί να οφείλεται στα συστατικά της κρέμας που όπως έχουν δείξει έρευνες από τον Kunicka συν., 2009 πολλά από τα έλαια που περιέχουν όπως το tea tree oil, το lemon oil, το levander oil κ.ά. παρουσιάζουν αντιμικροβιακή δράση σε συγκεκριμένες ποσότητες και συνδυασμούς. Όσον αφορά τη σύσταση των δειγμάτων που αναλύθηκαν, δεν εντοπίστηκε κάποια συσχέτιση των ακατάλληλων δειγμάτων με αυτήν. Τα συστατικά των μολυσμένων προϊόντων δε διέφεραν συγκριτικά με τα υπόλοιπα προς μελέτη δείγματα. Παρατηρούμε όμως ότι τα επικρατέστερα συστατικά σύμφωνα με τα στοιχεία της αναλυτικής σύστασης των προϊόντων (ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IV) είναι τα εξής: Aqua, Glycerol, Cetyl Alchol, Dimethicone, Fragrance, Disodium EDTA, Parabens, Tocopherol, Xanthan Gum, Oil (seed oil, jojoba oil, olive oil κ.ά.). Από αυτά, οι αλκοόλες και η γλυκερόλη (ή γλυκερίνη) προσφέρουν σύστημα αυτοδιατήρησης στα καλλυντικά προστατεύοντάς τα από αλλοίωση με το πέρασμα του χρόνου αλλά βοηθάνε ταυτόχρονα και στη γαλακτωματοποίηση της κρέμας. Το νερό και η γλυκερόλη είναι οι κατά βάσιν διυγραντικές ουσίες που προσφέρουν τις ενυδατικές ιδιότητες στην κρέμα. Ο Hussein και συν., 2009 αναφέρει ότι οι παραβένες (parabens) παρ όλο που υπάρχουν μελέτες που κατακρίνουν τη χρήση τους καθώς έχει συσχετισθεί με καρκινογένεση, συνεχίζουν να χρησιμοποιούνται ως βασικά συστατικά, κυρίως ως συντηρητικά με αντιμικροβιακή δράση. Τα έλαια αποτελούν τη μια από τις δυο φάσεις της κρέμας (λιπαρή και υδατική φάση) και προσδίδουν ανάλογα με το είδος τους τις 128

129 υπόλοιπες ιδιότητες στην κρέμα (αντιγηραντικές, συσφικτικές, ενυδατικές, λευκαντικές κ.ά.). Σύμφωνα με τον Winter, 2009 αλλά και με τον CTFA, 2002, η διμεθικόνη ή αλλιώς πολυδιμεθυλοσιλοξάνιο, ανήκει στις σιλικόνες και έχει κυρίως αντιαφριστικές και μαλακτικές ιδιότητες. Το Xanthan Gum χρησιμοποιείται ως πυκνωτικό μέσο και ρυθμιστής της ρευστότητας στα καλλυντικά. Η τοκοφερόλη ή αλλιώς Βιταμίνη Ε έχει αντιοξειδωτικές και αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες αλλά βοηθάει και στην ενυδάτωση. Το Disodium EDTA συνδέεται με μεταλλικά ιόντα στα καλλυντικά και τα απενεργοποιεί. Η σύνδεση των μεταλλικών ιόντων βοηθά στην πρόληψη της υποβάθμισης των καλλυντικών προϊόντων προσωπικής φροντίδας. Βοηθά επίσης στο να διατηρήσουν την διαύγειά τους ενώ συμβάλλει στην προστασία των αρωματικών συστατικών. Η τοκοφερόλη ή αλλιώς Βιταμίνη Ε έχει αντιοξειδωτικές και αντιφλεγμονώδεις ιδιότητες αλλά βοηθάει και στην ενυδάτωση. Χρησιμοποιείται κυρίως στις κρέμες ματιών γιατί έχει καλές αντιγηραντικές ιδιότητες. Παρατηρούμε ότι οι νέοι δίνουν πολύ σημασία στο κόστος των καλλυντικών. Οι περισσότεροι προτιμούν να αγοράζουν προϊόντα οικονομικά σε ποσοστό 65%. Πιθανόν αυτό να οφείλεται στις οικονομικές δυσκολίες της εποχής, όπου ο κόσμος στρέφεται στα χαμηλού κόστους καλλυντικά, είτε γνωστής εταιρείας είτε άγνωστης, αγνοώντας τον κίνδυνο που μπορεί να υπάρξει λόγω ανεπαρκούς ελέγχου του προϊόντος. Από τα 6 προϊόντα που κρίθηκαν ακατάλληλα τα 5 ήταν οικονομικά προϊόντα (83,3%), γεγονός που αποτελεί ένδειξη ότι η πιθανή μόλυνση των καλλυντικών έχει κάποια σχέση με το κόστος του προϊόντος. Συγκεκριμένα, όσο πιο ακριβό είναι το προϊόν τόσο λιγότερες είναι οι πιθανότητες να είναι μολυσμένο και αντίστροφα. Παλαιότερα, δεν υπήρχε ποικιλία καλλυντικών και οι επιλογές των γυναικών ήταν περιορισμένες. Στη σημερινή εποχή αντίθετα, οι γυναίκες δεν ψάχνουν τον πιο υγιεινό τρόπο για τον καλλωπισμό τους. Όπως δείχνουν τα αποτελέσματα, αρκούνται στην ευκολότερη και οικονομικότερη λύση των επεξεργασμένων καλλυντικών. Από τα αποτελέσματα παρατηρούμε ότι ο χρόνος ανοίγματος των καλλυντικών και η συνέχιση της χρήσης τους μετά από την ημερομηνία λήξης σχετίζεται με τη μόλυνσή τους. Ο μέσος όρος ζωής των κρεμών είναι ένας χρόνος. Το 20% των δειγμάτων που αναλύθηκαν είναι ανοιχτά 1-3 χρόνια, ενώ το 4% αυτών είναι ανοιχτά 3-8 χρόνια και συνεχίζουν οι εθελοντές να τα χρησιμοποιούν. Στο σημείο αυτό αξίζει να σημειωθεί ότι όλα τα κλειστά δείγματα κρίθηκαν κατάλληλα για χρήση καθώς είχαν μηδενικό μικροβιακό φορτίο ΟΜΧ και απουσία παθογόνων μικροοργανισμών, ένδειξη ότι στην Ελλάδα γίνονται αυστηροί έλεγχοι πριν εξέλθει το καλλυντικό στην αγορά. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, τα 4 από τα 6 μολυσμένα καλλυντικά ήταν ανοιχτά πάνω από ένα χρόνο, γεγονός που δείχνει ότι με την 129

130 πάροδο του χρόνου που μένουν τα προϊόντα ανοιχτά αυξάνεται και ο κίνδυνος μόλυνσής τους. Πρόκειται λοιπόν για άγνοια από μέρους των χρηστών, οι οποίοι αδιαφορώντας για το χρόνο ανοίγματος του προϊόντος και τον κίνδυνο μιας επικείμενης μόλυνσης συνεχίζουν να τα χρησιμοποιούν παρά την ημερομηνία λήξης. Ο Pack και συν., 2008 έδειξε παρόμοια αποτελέσματα στην έρευνά τους σε μάσκαρες ματιών. Το 36,4 % των δειγμάτων παρουσίαζε υψηλή μικροβιακή μόλυνση μετά το πέρας των 3 μηνών χρήσης που θεωρείται ο μέσος όρος ζωής στα συγκεκριμένα προϊόντα. Αντίστοιχα, ο Okeke και συν., 2001 έδειξε ότι σε μια μελέτη 49 καλλυντικών από σούπερ μάρκετ που αναλύθηκαν στην αρχή και μετά από δύο βδομάδες χρήσης, τα μολυσμένα προϊόντα έφταναν τις 10 4 CFU/ml στην αρχή και τις 10 5 CFU/ml μετά από το συγκεκριμένο διάστημα χρήσης. Όσον αφορά τα αποτελέσματα των αναλύσεων, καμία από τις κρέμες ματιών δε βρέθηκε μολυσμένη. Πιθανόν αυτό να οφείλεται στο γεγονός ότι στα καλλυντικά για την περιοχή των ματιών, επειδή από μόνη της λόγω αυξημένης υγρασίας είναι ευάλωτη για μια μόλυνση, γίνονται αυστηρότεροι έλεγχοι ως προς την ποιότητά τους. Το δέρμα στην περιοχή αυτή είναι πολύ λεπτό και αυτό το καθιστά πιο ευαίσθητο στην ερεθιστική και αλλεργική δερματίτιδα εξ επαφής Μάλιστα, το όριο για την ΟΜΧ είναι μικρότερο από τα υπόλοιπα καλλυντικά όπως αναφέρει και ο Lundov και συν., Σύμφωνα με τον Spencer, 1953 μια μόλυνση στην περιοχή των ματιών μπορεί να οδηγήσει ακόμη και στην τύφλωση. Η μόλυνση των έξι δειγμάτων που αναλύθηκαν μπορεί να οφείλεται είτε σε μόλυνση που είχε προέλθει πριν τη δειγματοληψία, είτε κατά τη διάρκεια της δειγματοληψίας, είτε κατά τη διάρκεια των αναλύσεων. Κατά τη διαδικασία παρασκευής η μη ορθή μελέτη του χρόνου ζωής των καλλυντικών προϊόντων μπορεί να είναι η αιτία για μελλοντική μόλυνση. Ο χρόνος ζωής τους εξαρτάται από παραμέτρους όπως: η έκθεση στο φως, οι υψηλές θερμοκρασίες, η υγρασία και το μηχανικό στρες. Ελλιπείς συνθήκες ασηψίας κατά τις μικροβιολογικές αναλύσεις θα μπορούσαν να προκαλέσουν επιμόλυνση και συνεπώς σφάλματα στις μετρήσεις. Άλλο σφάλμα μπορεί να προέρχεται κατά την διάρκεια της pour plate method. Η θερμοκρασία του υποστρώματος προς απόχυση δεν πρέπει να είναι υψηλότερη από 50⁰C, γιατί θα καταστρέψει τα θερμοευαίσθητα βακτηριακά κύτταρα και αυτή μπορεί να είναι και μια αιτία των χαμηλών ή και μηδενικών μικροβιακών συγκεντρώσεων. Ανακεφαλαιώνοντας, η μόλυνση των καλλυντικών, όπως υποστηρίζει και ο Abu και συν., 2014 μπορεί να οφείλεται σε πολλούς παράγοντες, οι σημαντικότεροι από τους οποίους είναι: οι μολυσμένες πρώτες ύλες, η επιμόλυνση κατά τη διάρκεια της παραγωγής και αποθήκευσής τους, η έκθεσή τους σε οξυγόνο, στον ήλιο, σε υψηλές θερμοκρασίες, σε 130

131 σκόνη, ο ανεπαρκής τελικός έλεγχος ποιότητας, η εφαρμογή ανεπαρκών συστημάτων συντήρησης μετά το άνοιγμά τους και η μόλυνση που μπορεί να οφείλεται σε έλλειψη προσοχής και καθαριότητας από τη μεριά των χρηστών. Με βάση λοιπόν τα αποτελέσματα μας μπορούμε να κάνουμε μια γενική εκτίμηση πως στην Ελλάδα τηρείται επαρκώς η νομοθεσία για τον έλεγχο των καλλυντικών και σε γενικές γραμμές κρούσματα από μολύνσεις που οφείλονται σε καλλυντικά δεν έχουν έλθει στην επιφάνεια. Πιθανόν αυτό να οφείλεται στην προσοχή που δίνουν οι χρήστες ως προς τα προϊόντα που χρησιμοποιούν. Αντίθετα, όπως ήδη αναφέραμε, το πρόβλημα εμφανίζεται κατά κόρων σε τριτοκοσμικές χώρες οι οποίες δεν εφαρμόζουν επαρκώς τα απαραίτητα μέτρα ελέγχου των προϊόντων με κίνδυνο τη Δημόσια Υγεία (Anelich and Korsten, 1996; Abu et al., 2014; Okeke and Lamikanra, 2001). Παρ όλ αυτά, στη μελέτη μας 6 καλλυντικά προϊόντα που συνεχίζουν από τους εθελοντές να χρησιμοποιούνται, κρίθηκαν ακατάλληλα προς χρήση και συνεπώς αποτελούν κίνδυνο για τη Δημόσια Υγεία. Αυτό σημαίνει ότι παρ όλο που στην Ελλάδα ο κίνδυνος μόλυνσης από τα καλλυντικά είναι πολύ μικρός, εξακολουθεί να υπάρχει και γι αυτό το λόγο κρίνεται απαραίτητος ο τακτικότερος έλεγχος ποιότητάς τους, τόσο κατά τη διάρκεια παραγωγής, όσο και πριν τεθεί το τελικό προϊόν στην αγορά. Κρίνεται αναγκαίο για τη διασφάλιση της Δημόσιας Υγείας να τηρούνται όλα τα νομοθετικά μέτρα ασφάλειας του καλλυντικού καθώς υπάρχουν κοινωνικές ομάδες όπως μωρά, ηλικιωμένοι, άτομα με χρόνιες δερματοπάθειες και σοβαρότερες ασθένειες, που διατρέχουν υψηλότερο κίνδυνο μόλυνσης από τη χρήση ενός καλλυντικού ελλιπώς ελεγμένου. Συνιστάται να παρατεθεί ο ορισμός της Υγιεινής σε όλες τις παρασκευαστικές εταιρείες, ανεξαρτήτως μεγέθους, που έδωσε ο FAO/WHO το 1979: «Υγιεινή είναι το σύνολο των προφυλάξεων και των μέτρων που πρέπει να λαμβάνονται κατά την παραγωγή, επεξεργασία, αποθήκευση και την διάθεση των προϊόντων, ούτως ώστε να είναι αισθητικώς αποδεκτά από τον καταναλωτή, να μην προκαλούν βλάβη στην υγεία του, να έχουν την ικανότητα να συντηρούνται εύκολα και να ανταποκρίνονται προς τους σταθερούς τύπους ή τις κατευθυντήριες γραμμές που θεσπίστηκαν από την πολιτεία ή τη βιομηχανία» (FAO/WHO, 1997). Σύμφωνα με τους Poulsen και Strandesen, 2011 οι παρασκευαστικές εταιρείες χρειάζεται να δίνουν ιδιαίτερη σημασία στην καθαριότητα και στην απολύμανση τω χώρων παραγωγής και αποθήκευσης, δηλαδή στην εφαρμογή σωστών συνθηκών υγιεινής. Το challenge test είναι απαραίτητο να εφαρμόζεται από κάθε παρασκευαστική εταιρεία και για κάθε καλλυντικό προϊόν καθώς μας δίνει πληροφορίες για τα συντηρητικά του και για το χρονικό διάστημα που μπορεί αυτό να διατηρηθεί ανοιχτό. Καλούνται όλοι 131

132 οι παρασκευαστές να αναγράφουν αυτές τις πληροφορίες στην ετικέτα των καλλυντικών, ώστε ο χρήστης να γνωρίζει κάθε απαραίτητη πληροφορία για το προϊόν που χρησιμοποιεί. Ευθύνη όμως για τη Δημόσια Υγεία δεν έχουν μόνο οι παρασκευαστές και αξιολογητές των καλλυντικών προϊόντων αλλά έχουν και οι ίδιοι οι χρήστες. Καλούνται λοιπόν οι πολίτες, ανεξαρτήτως εθνικότητας, φύλου και ηλικίας, να διαβάζουν προσεχτικά τις ετικέτες των προϊόντων που χρησιμοποιούν. Ιδιαίτερη προσοχή πρέπει να δίνουν στην επιλογή και χρήση των καλλυντικών για την περιοχή των ματιών, καθώς παρουσιάζει μεγαλύτερη ευαισθησία σε επικείμενη μόλυνση. Επιπλέον, μεγαλύτερη προσοχή πρέπει να δίνουν τα άτομα με ευαίσθητο δέρμα αλλά και οι ομάδες υψηλού κινδύνου. Σε περίπτωση εμφάνισης ερεθισμού ή αλλεργικής αντίδρασης καλούνται να επισκεφτούν αμέσως κάποια ιατρική μονάδα. Συνιστάται το τακτικό πλύσιμο των χεριών και η τήρηση των κανόνων υγιεινής όταν γίνεται χρήση του καλλυντικού, τόσο στο πρόσωπο όσο και στο σώμα. Τα προϊόντα θα πρέπει να διατηρούνται σε θερμοκρασία δωματίου και να τοποθετούνται στο ψυγείο μετά το άνοιγμα εάν αυτό κρίνεται απαραίτητο από τις εκάστοτε ενδείξεις. Το πιο σημαντικό όμως, είναι η διακοπή χρήσης του καλλυντικού με το πέρας της ημερομηνίας λήξης του, καθώς παρατηρείται μεγάλο ποσοστό, κυρίως γυναικών, που συνεχίζουν να χρησιμοποιούν ληγμένα προϊόντα, με τον κίνδυνο μόλυνσης να αυξάνεται συνεχώς. Χρειάζεται να δίνεται ιδιαίτερη προσοχή στην ετικέτα και στην ημερομηνία λήξης των καλλυντικών. Με την τήρηση των μέτρων, τόσο από τη μεριά της πολιτείας όσο και από τη μεριά των παρασκευαστών, η Δημόσια Υγεία ως προς τον τομέα αυτό, θα καταφέρει να διατηρηθεί ασφαλής. 132

133 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 133

134 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Abu Shaqra Q., Al-Momani W., Al-Groom M. (2014). Susceptibility of Some Bacterial Contaminants Recovered from Commercial Cosmetics in Jordan to Preservatives and Antibiotics, Tropical Journal of Pharmaceutical Research February; 13(2): Adkins L., Roy A. (1998). Handbook to Life in Ancient Greece. Oxford University Press. Alberts B., Bray D., Hopkin K., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. (2006). Bασικές αρχές κυτταρικής βιολογίας, 2 η έκδοση, Ιατρικές εκδόσεις Πασχαλίδη Alvarez-Lerma F., Maull E., Terradas R., Segura C., Planells I., Coll P., Knobel H., Vazquez A. (2008). Moisturizing body milk as a reservoir of Burkholderia cepacia: outbreak of nosocomial infection in a multidisciplinary intensive care unit. Crit Care: 12: R10 American Public Health Association (1984). Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 2nd ed. (Speck, M. L., Ed.). Compiled by the APHA Technical Committee on Microbiological Methods for Foods. Washington, DC, American Public Health Association Andonova M., Urumova V. (2013). Immune surveillance mechanisms of the skin against the stealth infection strategy of Pseudomonas aeruginosa- Review. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases; 36: Anelich L.E., Korsten L. (1996). Survey of microorganisms associated with spoilage of cosmetic creams manufactured in South Africa, Int. J. Cosmet, Sci.; 18: Anonymous (1985). Preservation testing of aqueous liquid and semi-liquid eye cosmetics. In: CTFA Technical Guidelines. The Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Washington, DC 134

135 Ashour M.S.E., Abdelaziz A.A., Hefni H., El-Tayeb O.M. (1989). Microbial contamination of cosmetics and personal care items in egypt-body lotions and talcum powders. Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics; 14: Atanassova V., Meindl A., Ring C. (2001). Prevalence of Staphylococcus aureus and staphylococcal enterotoxins in raw pork and uncooked smoked ham-a comparison of classical culturing detection and RFLP-PCR. International Journal of Food Microbiology; 68: Bailey E.M., Constance T.D., Albrecht L.M., Rybak M.J. (1990). Coagulase-negative staphylococci: Incidence, pathogenicity and treatment in the 1990's. Ann Pharmacol; 24: Baird R M. (1984). Bacteriological contamination of products used for the skin care in babies. Int J Cosmet Sci; 6: Baird R.M. and Bloomfield S. F. L. (1996). Microbial Quality Assurance of Cosmetics, Toiletries and Non-sterile Pharmaceuticals. Taylor & Francis, London Bhatia A. and Zahoor S. (2007). Staphylococcus aureus enterotoxin: A review. Journal of clinical and diagnostic research; 3: Bean N.H., Goulding J.S., Matthew T.D., Angulo F.J. (1987). Surveillance for foodborne disease outbreaks-united States, J. Food Prot; 60: Becks V.E., Lorenzoni N.M. (1995). Pseudomonas aeruginosa outbreak in a neonatal intensive care unit: a possible link to contaminated hand lotion. Am J Infect Control; 23: Bovee-Oudenhoven I.M.J., Lettink-Wissink M.L.G., Van Doesburg W., Witteman B.J.M., Van der Meer R. (2003). Diarrhea Caused by Enterotoxigenic Escherichia coli Infection of Humans Is Inhibited by Dietary Calcium. Gastroenterology; 125: Brannan D. and Dille J. (1990). Type of closure prevents microbial contamination of cosmetics during consumer use. Applied and Environmental Microbiology; 56: Brannan D. K. (1995). Cosmetic preservation. J Soc Cosmet Chem.; 46:

136 Burlando B., Cornara L., Bottini-Massa E. (2010). Herbal Principle in Cosmetics. CRC Press Butler H. (2010). Poucher's Perfumes, Cosmetics and Soaps, Springer Verlag 10th Edition; 13-64, ISBN: Campana R., Scesa C., Patrone V., Vittoria E., Baffone W. (2006). Microbiological study of cosmetic products during their use by consumers: Health risk and efficacy of preservative systems, Lett. Appl. Microbiol.; 43: Caputo G.M., Archer G.L., Caulderwood S.B., DiNubile M.J., Karchmer A.W. (1987). Native valve endocarditis due to coagulase-negative Staphylococci. Am J Med.; 83: Carretero I., Poso M. (2010). Clay and non-clay minerals in the pharmaceutical and cosmetic industries Part II. Active ingredients. Applied Clay Science; Vol. 47, Issues 3-4: Centers for Disease Control and Prevention (1999). National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) system report Chaudhri S.K., Jain N.J. (2009). History of cosmetics. Asian Journal of Pharmaceutics; Vol.3, Issue 3: Chen Q. (2009). Evaluate the Effectiveness of the Natural Cosmetic Product Compared to Chemical-Based Products. Vol 1, No 2; August 2009 ( Chiari B.G., Martini P.C., Moraes J.D.D., Andréo R., Corrêa M.A., Cicarelli R.M.B. and Isaac V.L.B. (2012). Use of HepG2 cells to assay the safety of cosmetic active substances. International Journal of Research in Cosmetic Science; 2(2): 8-14 Chung M.H., Huang W.S., Chang Y.C., Chen Y.S., Lee M.S., Huang S.C., Chen Y.P., Shih D.Y.S., Cheng H.F. (2014). A review of quality surveillance projects on cosmetics in Taiwan. Journal of food and drug analysis; 22:

137 Civille C.V. and Dus C.A. (1991). Evaluating tactile properties of skincare products: A descriptive analysis technique. Cosmet. Toilet; 106: Comunidad Andina (2011). Límites de contenido microbiológico de productos cosméticos. Obtenido de Resolución CPNP (2013). Cosmetic Products Notification Portal - Eγχειρίδιο για το άρθρο 13 Cross A.S., Allen J., Burke J., Ducel G., Haris A., John J., Johnson D., Lew M., MacMillan B., Meers P., Skalova R., Wenzel R., Tenney J. (1983). Nosocomial infections due to Pseudomonas aeruginosa. Review of recent trends. Rev. Inf.Dis; 5: S5 CTFA (2002). International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook, 9th edition, Washington, DC: Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association De Groot A.C., Bruynzeel D.P., Bos J.D., Van der Meeren H.L., Van Joost T., Jagtman B.A., Weyland J.W. (1988). The allergens in cosmetics. Arch Dermatol.; 124(10): Denyer S.P., Hodges N.A., Gorman S.P. (2004). Hugo and Russell s Pharmaceutical Microbiology, 7 th edition: Detmer A., Jørgensen C., Nylén D. (2010). Danish Ministry of the Environment- Environmental protection agency: A guidance document on microbiological control of cosmetic products; Environmental Project No Dettman J.R., Rodrigue N., Kassen R. (2014). Genome-wide patterns of recombination in the opportunistic human pathogen Pseudomonas aeruginosa. Genome Biology and Evolution Advance Access published December 4, 2014 Draelos Z.D. (2000). Cosmetics and skin care products: A Historical Perspective. Dermatologic Clinics; Vol. 18, Issue 4:

138 Dunningan, A.P. (1968). Microbiological control of cosmetics. Drug Cosmet. Ind.; 102: 43-45, Dweck A.C. (2001). Formulating with Natural Ingredients. Cosmetics and Toiletries, April 2001 European Centre for Disease Prevention and Control (2009): Annual Epidemiological Report on Communicable Diseases in Europe cal_report_on_communicable_diseases_in_europe.pdf FAO, WHO (1997). Risk management and food safety. Report of a Joint FAO/WHO Consultation Rome, Italy, 27 to 31 January 1997: Feizabadi M.M., Majnooni A., Nomanpour B., Fatolahzadeh B., Raji N., Delfani S., Habibi M., Asadi S., Parvin M. (2010). Direct detection of Pseudomonas aeruginosa from patients with healthcare associated pneumonia by real time PCR. Infection, Genetics and Evolution; 10: Fotadar U., Zaveloff P., Terracio L. (2005). Growth of Escherichia coli at elevated temperatures. Journal of Basic Microbiology; 45 (5): Galdorfini Chiari B., José de Almeida M.G., Corrêa M.A., Borges Isaac V.L. (2012). Cosmetics Quality Control, "Latest Research into Quality Control", book edited by Isin Akyar; Chapter 16 Gerginova N., Ivanova E., Bozhanchev K., Geneva S., Tachev A. (2013). Survey and health assessment of new cosmetic product based on natural ingredients. Bulgarian Journal of Agricultural Science; 19: Gerhardt P., Murray R.G.E., Costilow R.N., Nester E.W., Wood W.A., Krieg N.R. and Phillips G.R. (1981). Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Microbiology, Washington, DC 138

139 Gilchrist J. E., Campbell J. E., Donnelly C. B., Peeler J. T., Delaney J. M. (1972). Spiral Plate Method for Bacterial Determination. Applied Microbiology; 25: Goto S. and Enomoto S. (1970). Nalidixic Acid Cetrimide Agar. A New Selective Plating Medium for the Selective Isolation of Pseudomonas aeruginosa. Japan. J. Microbiol.; 14: Grigo J. (1976). Microorganisms in drugs and cosmetics - occurrence, harms and consequences in hygienic manufacturing (author's transl). Zentralblatt fur Bakteriologie, Parasitenkunde, Infektionskrankheiten und Hygiene. Erste Abteilung Originale. Reihe B: Hygiene, Praventive Medizin; 162 (3-4): Gruvberger B., Bruze M., Tammela M. (1998). Preservatives in Moisturizers on the Swedish Market. Acta Derm Venereol (Stockh); 78: Gustafson T.L., Band J.D., Hutcheson R.H.., Schaffner W. (1983). Folliculitis an outbreak and review. Rev. Infect. Dis.; 5: 1-8 Han M.J., Lee S.Y. (2006). The Escherichia coli proteome: past, present, and future prospects. Microbiology and Molecular Biology Reviews: MMBR 70 (2): Harvey R., Champe P.C., Fisher B., Strohl W.A. (2006). Microbiology, Lippincott Williams & Wilkins, Second Edition Heilmann C., Peters G., Von Eliff C. (2002). Pathogenesis of infections due to coagulase negative Staphylococci. THE LANCET Infectious Diseases; Volume 2, No. 11: Herigstad B., Hamilton M., Heersink J. (2001). How to optimize the drop plate method for enumerating bacteria. Journal of Microbiological Methods; Vol. 44, Issue 2: Hirulkar N.B., Soni B. (2011). Incidence of Antibiotic-Resistant Pseudomonas aeruginosa Isolated from Drinking Water. International Journal of Pharmaceutical & Biological Archives; 2(2):

140 Hitchins A.D. (1993). Cosmetic preservation and safety: FDA Status. J. Assoc. Food Drug Officials; 57: Hitchin A.D., Tran T. (1993). Microbiological survey of shared-use cosmetic test kits available to the public. J. Ind. Microbiol; 13: Hussein S.E., Muret P., Berard M., Makki S., Humbert P. (2007). Assessment of principal parabens used in cosmetics after their passage through human epidermis dermis layers (ex-vivo study). Experimental Dermatology; Vol. 16, Issue 10: Hutchinson J., Runge W., Mulvey M., Norris G., Yetman M., Valkova N., Villemur R., Lepine F. (2004). Burkholderia cepacia Infections Associated With Intrinsically Contaminated Ultrasound Gel: The Role of Microbial Degradation of Parabens. Infection Control & Hospital Epidemiology; Vol. 25, Issue 04: Iglewski B. (1989). Probing Pseudomonas aeruginosa, an opportunistic pathogen. ASM News; 55: ISO Cosmetics-Microbiology-Detection of specified microorganisms (Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans) and non specifies microorganisms ISO Cosmetics-Microbiology-Enumeration and detection of aerobic mesophilic bacteria ISO Standard (2008) Cosmetics - Microbiology - Enumeration of yeast and mould ISO Cosmetics-Microbiology-Detection of Staphylococcus aureus ISO Cosmetics-Microbiology-Detection of Pseudomonas aeruginosa Johansen P. (2011). Cremas Faciales. Obtenido de Salud y Medicinas, Febrero de 2011: Kassis C., Hachem R., Raad I., Perego C.A., Dvorak T., Hulten K., Frenzel E., Thomas G., Chemaly R.F. (2011). Outbreak of community-acquired methicillin-resistant 140

141 Staphylococcus aureus skin infections among health care workers in a cancer center. Association for Professionals in Infection Control and Epidemiology. Am J Infect Control; 39: Katusin-Razem B., Mihaljevic B., Razem D. (2003). Microbial decontamination of cosmetic raw materials and personal care products by irradiation. Radiation Physics and Chemistry; 66: Khabbaz R.F., McKinley T.W., Goodman R.A., Hightower A.W., High-Smith A.K., Tait K.A., Band J.D. (1983). Pseudomonas aeruginosa serotype O:9 new cause of whirlpool associated dermatitis. Am.J. Med.; 74: Klein E, Smith DL, Laxminarayan R. (2007). Hospitalizations and deaths caused by methicillin-resistant Staphylococcus aureus, United States, Emerg Infect Dis., Dec 2007 Kloos W.E., Schleifer K.H. and Gotz F. (1992). The Genus Staphylococcus. In: Balows et al., The Prokaryotes. A Handbook on the Biology of Bacteria: Ecophysiology, Isolation, Identification, Applications 2nd Ed.; Vol.II, Springer-Verlag: Kohl L., Blondeel A. and Song M. (2002). Allergic contact dermatitis from cosmetics. Retrospective analysis of 819 patch-tested patients. Dermatology; 204(4): Kunicka-Styczynska A., Sikora M., Kalemba D. (2009). Antimicrobial activity of lavender, tea tree and lemon oils in cosmetic preservative systems. Journal of Applied Microbiology; 107: Kutty P.K., Moody B., Smartt G.J. (2007). Multi-state outbreak of Burkholderia cenocepacia colonization and infection associated with the use of intrinsically contaminated alcohol-free mouthwash, Chest 2007 Lanier W.A., Hall J.M., Herlihy R.K. (2011). Outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli O157:H7 Infections Associated with Rodeo Attendance, Utah and Idaho, Foodborne Pathog Dis.; 8(10):

142 Larsen W.G. (1997). Fragrances and cosmetics. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology; Vol. 9: 50 Lee E., An S., Choi D., Moon S., Chang I. (2007). Comparison of objective and sensory skin irritations of several cosmetic preservatives. Contact Dermatitis; 56 (3): Le Loir Y.L., K. Baron and M. Gautier (2003). Staphylococcus aureus and food poisoning. Genetics and molecular research; 2(1): Lewis Carol (1998). Clearing up Cosmetic Confusion., FDA; 1998 Lundov M.D., Zachariae C. (2008). Recalls of microbiological contaminated cosmetics in EU from 2005 to May Int J Cosmet Sci; 130: Lundov D.M., Moesby L., Zachariae C. and Johansen J.D. (2009). Contamination versus preservation of cosmetics: a review on legislation, usage, infections, and contact allergy. Contact Dermatitis; 60: Lundov M.D., Jeanne J.D., Johansen D., Zachariae C. and Moesby L. (2011). Creams Used by Hand Eczema Patients are often Contaminated with Staphylococcus aureus. Acta Derm Venereol; 92 Macvren Dashen M., Fremu Chollom P., Ngueme Okechalu J., Ashulee Ma aji J. (2011). Microbiological quality assessment of some brands of cosmetics powders sold within Jos Metropolis, Plateau State. Journal of Microbiology and Biotechnology Research; 1 (2): Madden J.M. (1984). Microbiological methods for cosmetics, In: Cosmetic and Drug Preservation: Principles and Practice; , J.J. Kabara (Ed). Marcel Dekker, New York and Basel Madigan M.T., Martinko J.M., Parker J. (2008). BROCK: Βιολογία των μικροοργανισμών, Πανεπιστημιακές Εκδόσεις Κρήτης,

143 Manou I., Bouillard L., Devleeschouwer M.J., Barel A.O. (2002). Evaluation of the preservative properties of Thymus vulgaris essential oil in topically applied formulations under a challenge test. Journal of Applied Microbiology; 84: Marks J.G., Belsito D.V., DeLeo V.A. et al. (2003). North American contact dermatitis group patch-test results, Am J Contact Dermatol.; 14: Melloship D. (2009). Toxic Beauty: How hidden chemical in cosmetics harm you. Εκδόσεις: Octopus Publishing Group, 2009 Mierzejewski J., Woźniak-Kosek A. (2012). Microbes indicating the efficiency of cosmetics preservation. Part II. Staphylococcus aureus. Military Pharmacy and Medicine; 3: Miller D.J., Henning T., Grünbein W. (2001). Phase inversion of W/O emulsions by adding hydrophilic surfactant a technique for making cosmetics products. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects; Vol : Millikan L.E. (2001). Cosmetology, Cosmetics, Cosmeceuticals: Definitions and Regulations. Clinics in Dermatology; 19: Mislivec P.B., Bandler R., Allen G. (1993). Incidence of fungi in shared-use cosmetics available to the public. Journal of AOAC International; 76(2): Murphy K. (2007). Janeway s Immunobiology (7η έκδοση). Garland Science. November 2007; Mylotte J.M., McDermott C., Spooner J.A. (1987). Prospective study of 114 consecutive episodes of Staphylococcus aureus bacteraemia. Rev Infect Dis; 9: Nohynek G.J., Antignac E., Re T., Toutain H. (2010). Safety assessment of personal care products/cosmetics and their ingredients. Toxicology and Applied Pharmacology; Vol. 243, Issue 2: Official Journal of the European Union (2009). ISSN , Volume 52 Ogston A. (1881). Classics in Infectious Diseases. Rev Infect Dis 6; (1):

144 Okeke I.N., Lamikanra A. (2001). Bacteriological quality of skin-moisturizing creams and lotions distributed in a tropical developing country. Journal of Applied Microbiology; 91: Okore V.A. (1992). Study of the microbiological purity of some body creams and lotions marketed in Nigeria. African Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences; 22: Oliveira A.J.F.C. and Pinhata J.M.W. (2008). Antimicrobial resistance and species composition of Εnterococcus spp Isolated from waters and sands of marine recreational beaches in Southeastern Brazil. Wat. Res.; 42: Olson A., Horswill R. (2013). Staphylococcus aureus Osteomyelitis: Bad to the Bone. Cell Host and Microbe; 13, Issue 6: Olumide Y.M., Akinkugbe A.O., Altraide D., Mohammed T., Ahamefule N., Ayanlowo S., Onyekonwu C., Essen N. (2008). Complications of chronic use of skin lightening cosmetics. International Journal of Dermatology; 47: Ortiz K.J. and Yiannias J. (2004). Dermatologic Therapy- Contact dermatitis to cosmetics, fragrances, and botanicals; 17: 264 Orth D.S. (1989). Microbiological Considerations in Cosmetic Formula Development and Evaluation. Cosmet & Toilet.; 104: Otto A., Wiechers J.W., Kelly C.L., Hadgraft J., Plessis J. (2008). Effect of Penetration Modifiers on the Dermal and Transdermal Delivery of Drugs and Cosmetic Active Ingredients. Skin Pharmacology and Physiology; 21: Oyedeji F.O., Hassan G.O., Adeleke B.B. (2011). Hydroquinone and heavy metal levels in cosmetics marketed in Nigeria. Trends Appl. Sci. Res.; 6: Pack L.D., Wickham M.G., Enloe R.A. and Hill D.N. (2008). Microbial contamination associated with mascara use. Optometry; 79:

145 Parente M.F., Gambaro A., Solana G. (2005). Study of sensory properties of emollients used in cosmetics and their correlation with physicochemical properties. Journal of Cosmetic Science; 56 (3): Pauwels M., Rogiers V. (2010). Human health safety evaluation of cosmetics in the EU: A legally imposed challenge to science. Toxicology and Applied Pharmacology; 243: Pauwels M., Rogiers V. (2007). EU legislations affecting safety data availability of cosmetic ingredients. Regulatory Toxicology and Pharmacology; 49: Prescott L.M., Harley J.P. & Klein D.A. (1993). Microbiology, Wm.C.Brown Communications Inc, Dubuque, USA Pulido Pérez A., Rodríguez B., Ceballos Rodríguez M.C., Cembranos M., Campos Domínguez M., Suárez Fernández R. (2014). Skin Infections Caused by Community- Acquired Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Clinical and Microbiological Characteristics of 11 Cases. Actas Dermosifilio gr; 105(2): Poulsen P.B., Strandesen M. (2011). Survey and health assessment of cosmetic products marketed as non-preserved. Survey of Chemical Substances in Consumer Products No. 111, Danish Environmental Protection Agency Rangel J.M., Sparling P.H., Crowe C. et al. (2005). Epidemiology of Escherichia coli O157:H7 outbreaks, United States, Emerg. Infect. DiS.; 11(4): Rao N., Prathiba S. (1998). Cosmetics and personal care products. Elsevier Inc: Ratnam S., Hogan K., March S.B., Butler R.W. (1986). Whirlpool-Associated Folliculitis Caused by Pseudomonas aeruginosa: Report of an Outbreak and Review. Journal of clinical microbiology, Mar. 1986: Reed S.I. (2007). Cosmetics and Your Health., US Department of Health and Human Services; May 14, 2007: Rodriguez D. (1976). Control de la calidad durante la fabricación de productos farmacéuticos y cosméticos. 145

146 Rutala W., Weber D., Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (HICPAC) (2008). Guideline for Disinfection and Sterilization in Healthcare Facilities, Centers for Disease Control and Prevention (U.S.) Schneider G., Gohla S., Schreiber J., Kaden W., Schönrock U., Schmidt-Lewerkühne H., Kuschel A., Petsitis X., Pape W., Ippen H. and Diembeck W. (1958). Skin Cosmetics in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry 2005, Wiley-VCH, Weinheim.Shelley, W.B., Hurley, H., The allergic origin of zirconium deodorant granulomas. Brit. J. Dermatol.; 70(3): Shands K., Schmid G.P., Dan B., Blum D., Guidotti R.J., Hargrett N.T., Anderson R.L., Hill D.L., Broome C.V., Band J. and Fraser D.W. (1980). Toxic-Shock Syndrome in Menstruating Women-Association with Tampon Use and Staphylococcus aureus and Clinical Features in 52 Cases. The New England Journal of Medicine, December 18; 1980 Shewhart W.A. (1980). Economic control of quality of manufactured product, American Society for Quality Control Shlegel Η.G. (1987). Basic Microbiology, 6 th edition, Cambridge University Press Silva E.A.., Bosco M.R., Mozer E. (2012). Study of the frequency of allergens in cosmetics components in patients with suspected allergic contact dermatitis. An. Bras. Dermatol.; vol. 87: no.2, Rio de Janeiro Mar./Apr Spencer W.H. (1953). Pseudomonas aeruginosa infections of the eye. California Medicine; 79(6): Stoler J., Ahmed H., Frimpong L.A., Bello M. (2015). Presence of Pseudomonas aeruginosa in coliform-free sachet drinking water in Ghana. Food Control; 55: Todar Kenneth (2012). Online Textbook of Bacteriology Kenneth Todar, PhD - Madison, Wisconsin 146

147 Tozzi A., Caprioli A., Minelli F., Gianviti A., De Petris L., Edefonti A., Montini G., Ferretti G., De Palo T., Gaido M., Rizzoni G. (2003). Shiga Toxin Producing Escherichia coli Infections Associated with Hemolytic Uremic Syndrome, Italy, Emerging Infectious Diseases. Jan; 9(1): Tran T.T. and Hitchins A.D. (1994). Microbiological survey of shared-use cosmetic test kits available to the public. J. Ind. Microbiol.; 13: Vincent L.J., Bihari L.D., Suter M.P., Bruining A.H., White J., Nicolas-Chanoin M., Wolff M., Spencer C.R., Hemmer M. (1995). The prevalence of nosocomial infection in intensive care units in Europe: results of the European prevalence of infection in intensive care (EPIC) Study. JAMA; 74: Vogt R.L., Dippold L. (2005). Escherichia coli O157:H7 outbreak associated with consumption of ground beef, June July Public Health Rep; 120(2): Voss A., Milatovic D., Wallrauch-Schwarz C.,.Rosdahl V.T., Braveny I. (1994). Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus in Europe. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. January 1994: Underwood E. (1998). Ecology of Microorganisms as it Affects the Pharmaceutical Industry. Pharmaceutical Microbiology, 6th ed. Blackwell Science, Oxford, p USP 34 (2011). The United States Pharmacopoeia. USA: United Press Book. Wang Chao-Ying (2006). The development of Package Design For Cosmetic Products. Journal of Anyang Institute of Technology; Waton J. (2014). Hidden allergens in cosmetics. Revue Française d'allergologie; Vol. 54, Issue 3: Wilson L.A., Jilian A.J., Ahearn D. (1975). The survival and growth of microorganisms in mascara during use. Am. J. Ophthalmol.; 79:

148 Wilson L.A. and Ahearn D.G. (1977). Pseudomonas-induced corneal ulcers associated with contaminated eye mascaras. Am. J. Ophthalmol; 84: Winter R. (2009). A consumer s dictionary of cosmetic ingredients. 7 th Edition by Three Rivers Press: p Wise K. (2013). Preparing Spread Plates Protocols. American Society for Microbiology, ASM Microbe Library: Wong S., Street D., Delgado S.I., Klontz K.C. (2000). Recalls of foods and cosmetics due to microbial contamination reported to the U.S. Food and Drug Administration. J Food Prot.; 63: Αγγελής Γ. (2007). Μικροβιολογία και μικροβιακή τεχνολογία, Εκδόσεις: Σταμούλη Α.Ε. Αναστασίου Ε. (2014). Βασική μικροβιολογία, σημειώσεις. Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιου Πατρών Βέγκος A. (2004). "Κοσμετολογία", εκδ. INTERBOOKS Νικητόπουλος Ε. & ΣΙΑ ΟΕ Βουτσινάς Γ. (1997). «Βακτήρια: Ένας κόσμος με πολλά πρόσωπα», Περισκόπιο της Επιστήμης, τεύχος 206 (Μάιος 1997), σελ. 38 Γαλάνη Δ. (2013). Η στάση των καταναλωτών στα προϊόντα ιδιωτικής ετικέτας των σούπερ μάρκετ. Μια εμπειρική έρευνα. Nemertes: Γκελμπέσης Γ. (2006). Κοσμητολογία (Συστατικά-Παρασκευή-Χρήση Καλλυντικών), Αθήνα 2006 Δημητρακόπουλος Γ.Ο. (1987). «Εισαγωγή στην Κλινική Μικροβιολογία και τα Λοιμώδη Νοσήματα», Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ.Πασχαλίδη ΕΦΗΜΕΡΙΔΑ ΤΗΣ ΚΥΒΕΡΝΗΣΕΩΣ , Καμμένου-Παπαγεωργίου Ε., Κοτονιάς Γ., Σκανδάλη Α. (2007). Κοσμετολογία. ΤΕΕ Ειδικότητα Αισθητικής Τέχνης, Οργανισμός Εκδόσεων διδακτικών βιβλίων, Αθήνα 148

149 Koτζεκίδου-Ρούκα Π. (2000). Μικροβιολογία τροφίμων, Έκδοση Υπηρεσία Δημοσιευμάτων, Αθήνα σελ , Μουλοπούλου-Καρακίτσου Κ., Ρηγόπουλος Δ., Στρατηγός Ι.Δ. (1998). ΚΑΛΛΥΝΤΙΚΑ-Συστατικά και Εφαρμογές. Εκδόσεις: ΒΗΤΑ Ιατρικές Εκδόσεις, 1998 Παπαϊωάννου Γ. (2010). Κοσμητολογία, Εκδόσεις Παρισιάνος Παπαϊωάννου Γ., Ράλλης Μ.Χ. (2008). Έλεγχος και αξιολόγηση καλλυντικών προϊόντων. Αθήνα, 2008 Πουλάς Κ., Καλλιβωκάς Α., Παπαγιαννοπούλου Α. (2014). Καλλυντικά. Πρώτη έκδοση: Μάρτιος 2014, Εκδόσεις ΤΟ ΔΟΝΤΙ Σαμολαδά Μ., Κουτσουμάνης Κ. (2011). Εργαστηριακές Ασκήσεις Γενικής Μικροβιολογίας, Ανώτατη Γεωπονική Σχολή Θεσσαλονίκης Συξέρης Δ. (1998). Βιοτεχνολογία & Καλλυντικά. Χρονικό Δημιουργών Κοσμητολογίας; 10: SCCS/1416/11: The SCCS Notes of Guidance for the Testing of Cosmetic Ingredients and their Safety Evaluation ΚΑΝΟΝΙΣΜΟΣ (ΕΕ) αριθ. 655/ el.pdf ΚΕ.Π.ΚΑ 149

150 European Commission Health and consumers Cosmetics- CosIng ISO ISO ISO ISO United States Pharmacopeia 150

151 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 151

152 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΝΟΜΟΘΕΣΙΑ 152

153 153