ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΓΙΑ ΤΟ ΧΗΜΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ. Σύνθεση και μάτισμα του RNA. Úfi ÚÔÌÔ ÌfiÚÈÔ ÙÔ mrna

Transcript

1 Σύνθεση και μάτισμα του R Úfi ÚÔÌÔ ÌfiÚÈÔ ÙÔ mr EÎÙÔÌËÌ ÓÔ ÈÓÙÚfiÓÈÔ mr ΚΕΦΑΛΑΙΟ 28 H σύνθεση R είναι ένα καθοριστικό βήμα στην έκφραση των γενετικών πληροφοριών. Για τα ευκαρυωτικά κύτταρα, το αρχικό μεταγράφημα R (του πρόδρομου μορίου του R) συχνά ματίζεται, αφαιρώντας τα ιντρόνια τα οποία δεν κωδικεύουν αλληλουχίες πρωτεϊνών. Πολλές φορές, το ίδιο προmr ματίζεται διαφορετικά σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων ή σε διαφορετικά στάδια της ανάπτυξης. Στην εικόνα αριστερά, πρωτεΐνες που σχετίζονται με το μάτισμα R (χρωσμένες με ένα φθορίζον αντίσωμα) τονίζουν περιοχές του γονιδιώματος αμφίβιου ζώου οι οποίες μεταγράφονται ενεργά. [(ριστερά) Eυγενική προσφορά Mark B. Roth και Joseph. all.] Το D αποθηκεύει τις γενετικές πληροφορίες σε μια σταθερή μορφή η οποία μπορεί εύκολα να αντιγραφεί. Ωστόσο, η έκφραση αυτών των γενετικών πληροφοριών προϋποθέτει τη ροή της από το D στο R στις πρωτεΐνες, όπως αναφέρθηκε εισαγωγικά στο Κεφάλαιο 5. Το παρόν κεφάλαιο ασχολείται με το πώς συντίθεται και ματίζεται το R. Αρχίζουμε με τη μεταγραφή στο βακτήριο Escherichia coli και εστιάζουμε την προσοχή μας σε τρεις ερωτήσεις: Ποιες είναι οι ιδιότητες των προαγωγέων (των θέσεων του D στις οποίες αρχίζει η μεταγραφή του R) και πώς λειτουργούν οι προαγωγείς; Πώς αλληλεπιδρούν μεταξύ τους η R πολυμεράση, το εκμαγείο D και η νεοσυντιθέμενη αλυσίδα του R; Πώς τερματίζεται η μεταγραφή; Στη συνέχεια στρέφουμε την προσοχή μας στη μεταγραφή των ευκαρυωτικών, αρχίζοντας από τη δομή των προαγωγέων και των πρωτεϊνικών παραγόντων της μεταγραφής, οι οποίοι ρυθμίζουν τη δραστικότητα του προαγωγέα. Ένα ευδιάκριτο χαρακτηριστικό των ευκαρυωτικών εκμαγείων D είναι η παρουσία ενισχυτικών αλληλουχιών, οι οποίες διεγείρουν την έναρξη της μεταγραφής από απόσταση μεγαλύτερη των χιλίων βάσεων από τη θέση έναρξης. Τα πρωτογενή μεταγραφήματα στα ευκαρυωτικά υφίστανται εκτεταμένη τροποποίηση, όπως παραδείγματος χάριν με το κάλυμμα του 5 -άκρου ενός προδρόμου του mr και την προσθήκη μακριών ουρών πολυ(α) στο 3 -άκρο του. Πιο εντυπωσιακό είναι το μάτισμα πρόδρομων μορίων του mr, το οποίο καταλύεται από σωμάτια ματίσματος που αποτελούνται από μικρά πυρηνικά ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σωμάτια (snr). Τα μικρά μόρια πυρηνικού R (snr) στα σύμπλοκα αυτά παίζουν καθοριστικό ρόλο, ΠΕΡΙΓΡΑΜΜΑ 28.1 H μεταγραφή καταλύεται από την R πολυμεράση 28.2 H ευκαρυωτική μεταγραφή και η μετάφραση είναι διαχωρισμένες στον χώρο και στον χρόνο 28.3 Tα προϊόντα της μεταγραφής και των τριών ευκαρυωτικών πολυμερασών υφίστανται επεξεργασία 28.4 H ανακάλυψη του καταλυτικού R ήταν αποκαλυπτική τόσο σε σχέση με τον μηχανισμό όσο και με την εξέλιξη

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ 880 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 28 Σύνθεση και μάτισμα R ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΓΙΑ ΤΟ ΧΗΜΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ κατευθύνοντας τη διάταξη των θέσεων ματίσματος και μεσολαβώντας στην κατάλυση. Πραγματικά, μερικά μόρια R μπορούν να ματίζονται μόνα τους απουσία πρωτεϊνών. Η θεμελιώδης αυτή ανακάλυψη του Thomas hech και του Sidney ltman έδειξε ότι τα μόρια R μπορούν να χρησιμεύσουν ως καταλύτες και επηρέασε σημαντικά την άποψή μας για τη μοριακή εξέλιξη. Το μάτισμα του R δεν είναι απλώς μια εξαίρεση. Περίπου το 15% όλων των γενετικών ασθενειών προκαλούνται από μεταλλάξεις οι οποίες επηρεάζουν το μάτισμα του R. Ακόμη, το ίδιο μόριο προ-mr μπορεί να ματίζεται διαφορετικά σε διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους και σε διαφορετικά στάδια της ανάπτυξης, ή ως απόκριση σε άλλα βιολογικά σήματα. Επιπλέον, επιμέρους βάσεις σε μερικά μόρια προ-mr αλλάζουν, με μια διεργασία που ονομάζεται διόρθωση R. Μια από τις μεγαλύτερες εκπλήξεις από την ανάλυση της αλληλουχίας του ανθρώπινου γονιδιώματος ήταν ότι αναγνωρίστηκαν μόνο γονίδια περίπου συγκριτικά με προηγούμενες εκτιμήσεις για ή περισσότερα. Η ικανότητα ενός γονιδίου να κωδικεύει περισσότερα από ένα διάκριτα mr, και επομένως περισσότερα από ένα πρωτεϊνικά μόρια, μπορεί να παίζει καθοριστικό ρόλο στη διεύρυνση της ποικιλίας του γονιδιώματός μας Ανασκόπηση της σύνθεσης του R EIK 28.1 Δομές των R πολυμερασών. Οι τριδιάστατες δομές των R πολυμερασών από έναν προκαρυωτικό (Thermus aquaticus) και έναν ευκαρυωτικό (Saccharomyces cerevisiae) οργανισμό. Οι δύο μεγαλύτερες υπομονάδες για κάθε δομή φαίνονται σε σκούρο κόκκινο και σκούρο μπλε. Η ομοιότητα των δομών αυτών αποκαλύπτει ότι τα ένζυμα αυτά έχουν την ίδια εξελικτική προέλευση και έχουν πολλά κοινά μηχανιστικά χαρακτηριστικά. Η σύνθεση του R, ή μεταγραφή, είναι η διεργασία της μεταγραφής των πληροφοριών της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του D σε πληροφορίες αλληλουχίας R. Η σύνθεση του R καταλύεται από ένα μεγάλο ένζυμο που ονομάζεται R πολυμεράση. Η βασική βιοχημεία της σύνθεσης του R είναι κοινή στα προκαρυωτικά και στα ευκαρυωτικά, αν και η ρύθμισή της είναι πιο πολύπλοκη στα ευκαρυωτικά. Η στενή σύνδεση μεταξύ προκαρυωτικής και ευκαρυωτικής μεταγραφής έχει απεικονιστεί υπέροχα από τις τριδιάστατες δομές των αντιπροσωπευτικών R πολυμερασών από προκαρυωτικά και ευκαρυωτικά κύτταρα που προσδιορίστηκαν πρόσφατα (Eικόνα 28.1). Παρά τις ουσιώδεις διαφορές στο μέγεθος και τον αριθμό των πολυπεπτιδικών υπομονάδων, οι συνολικές δομές αυτών των ενζύμων είναι πολύ όμοιες, αποκαλύπτοντας μια κοινή εξελικτική προέλευση. Η σύνθεση του R, όπως σχεδόν όλες οι βιολογικές αντιδράσεις πολυμερισμού, πραγματοποιείται σε τρία στάδια: έναρξη, επιμήκυνση και τερματισμό. Η R πολυμεράση στη διεργασία αυτή έχει πολλαπλές λειτουργίες: ÚÔÎ Ú ˆÙÈÎ R ÔÏ ÌÂÚ ÛË E Î Ú ˆÙÈÎ R ÔÏ ÌÂÚ ÛË

3 1. Αναζητά στο D θέσεις έναρξης, οι οποίες ονομάζονται επίσης θέσεις προαγωγέων ή απλώς προαγωγείς. Παραδείγματος χάριν, το D της E. coli έχει 2000 περίπου θέσεις προαγωγέων στο γονιδίωμά της που έχει μέγεθος 4, bp. Επειδή οι αλληλουχίες αυτές βρίσκονται στο ίδιο μόριο D με τα μεταγραφόμενα γονίδια, ονομάζονται στοιχεία με δράση cis. 881 R πολυμεράση 2. Ξετυλίγει ένα μικρό τμήμα δίκλωνου ελικοειδούς D για να δημιουργήσει ένα μονόκλωνο εκμαγείο D από το οποίο παίρνει οδηγίες. 3. Επιλέγει τον σωστό τριφωσφορικό ριβονουκλεοζίτη και καταλύει τον σχηματισμό ενός φωσφοδιεστερικού δεσμού. Η διεργασία αυτή επαναλαμβάνεται πολλές φορές καθώς το ένζυμο μετακινείται προς τη μία κατεύθυνση κατά μήκος του εκμαγείου D. Η R πολυμεράση είναι ένα εντελώς επεξεργαστικό ένζυμο δηλαδή, ένα μεταγράφημα συντίθεται από την αρχή μέχρι το τέλος από ένα μόνο μόριο R πολυμεράσης. 4. Ανιχνεύει σήματα τερματισμού τα οποία προσδιορίζουν το πού τελειώνει ένα μεταγράφημα. 5. Αλληλεπιδρά με ενεργοποιητικές και κατασταλτικές πρωτεΐνες, οι οποίες προσαρμόζουν την ταχύτητα της έναρξης μεταγραφής για πολύ μεγάλο και δυναμικό εύρος. Οι πρωτεΐνες αυτές, οι οποίες παίζουν έναν πιο σημαντικό ρόλο στα ευκαρυωτικά παρά στα προκαρυωτικά, ονομάζονται παράγοντες μεταγραφής ή στοιχεία με δράση trans. Η γονιδιακή έκφραση ελέγχεται κυρίως στο επίπεδο της μεταγραφής, όπως θα συζητηθεί λεπτομερώς στο Κεφάλαιο 31. Η θεμελιώδης αντίδραση της σύνθεσης του R είναι ο σχηματισμός ενός φωσφοδιεστερικού δεσμού. Η 3 -υδροξυλική ομάδα του τελευταίου νουκλεοτιδίου της αλυσίδας προσβάλλει πυρηνοφιλικά την α-φωσφορική ομάδα του εισερχόμενου τριφωσφορικού νουκλεοζίτη με ταυτόχρονη απελευθέρωση ενός πυροφωσφορικού (βλ. Eικόνα 5.25). Η αντίδραση αυτή ευνοείται θερμοδυναμικά και η επακόλουθη διάσπαση του πυροφωσφορικού προς ορθοφωσφορικό ασφαλίζει την αντίδραση προς την κατεύθυνση της σύνθεσης του R. Η χημεία της σύνθεσης του R είναι η ίδια για όλες τις μορφές R, συμπεριλαμβανομένων του αγγελιαφόρου R, του μεταφορικού R και του ριβοσωματικού R. Τα βασικά βήματα που μόλις σκιαγραφήθηκαν ισχύουν για όλες τις μορφές R. H συνθετική διεργασία διαφέρει κυρίως στη ρύθμιση, στη μετα-μεταγραφική επεξεργασία και στην ειδική πολυμεράση η οποία συμμετέχει Η ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΚΑΤΑΛΥΕΤΑΙ ΑΠΟ ΤΗΝ R ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗ Αρχίζουμε την περιγραφή της μεταγραφής με την εξέταση της διεργασίας στα βακτήρια, όπως είναι η E. coli. Η R πολυμεράση από την E. coli είναι ένα πολύ μεγάλο (~ 400 kd) και πολυσύνθετο ένζυμο, αποτελούμενο από τέσσερα είδη υπομονάδων (Πίνακας 28.1). Η σύσταση των υπομονάδων του συνολικού ενζύμου, το οποίο ονομάζεται ολοένζυμο, είναι α 2 ββ σ. Η υπομονάδα σ βοηθά να βρεθεί μια θέση προαγωγέα όπου αρχίζει η μεταγραφή, συμμετέχει στην έναρξη της σύνθεσης του RΝΑ και στη συνέχεια αποσυνδέεται από το υπόλοιπο ένζυμο. Η R πολυμεράση χωρίς την υπομονάδα αυτή (δηλαδή το τμήμα α 2 ββ ) ονομάζεται πυρήνας του ενζύμου. Ο πυρήνας του ενζύμου περιέχει το καταλυτικό κέντρο. Το καταλυτικό κέντρο μοιάζει με εκείνο της D πολυμεράσης (Εδάφιο

4 882 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 28 Σύνθεση και μάτισμα R ΠΙΝΑΚΑΣ 28.1 Yπομονάδες της R πολυμεράσης από την E. coli Yπομονάδα Γονίδιο ριθμός Mάζα (kd) rpo 2 37 rpob rpo rpod 1 70 Í ÓfiÌÂÓË Ï Û R sp sp M 2+ α TÚÈʈÛÊÔÚÈÎfi ÚÈ ÔÓÔ ÎÏÂÔ ÙË γ ) ως προς το ότι στη δραστική μορφή του περιέχει δύο μεταλλικά ιόντα (Eικόνα 28.2). Το ένα μεταλλικό ιόν παραμένει δεσμευμένο στο ένζυμο, ενώ το άλλο φαίνεται ότι εισέρχεται μαζί με τον τριφωσφορικό νουκλεοζίτη και αποχωρεί με το πυροφωσφορικό. Τρία συντηρημένα κατάλοιπα ασπαραγινικού του ενζύμου συμμετέχουν στη δέσμευση αυτών των μεταλλικών ιόντων. Επισημαίνεται ότι οι συνολικές δομές των D πολυμερασών και των R πολυμερασών είναι τελείως διαφορετικές. Τα παρόμοια ενεργά κέντρα τους είναι προϊόντα συγκλίνουσας εξέλιξης H μεταγραφή αρχίζει σε θέσεις προαγωγέων στο εκμαγείο D sp M 2+ EIK 28.2 Το ενεργό κέντρο της R πολυμεράσης. Ένα μοντέλο της μεταβατικής κατάστασης για τον σχηματισμό φωσφοδιεστερικού δεσμού στο ενεργό κέντρο της R πολυμεράσης. Η 3 -υδροξυλική ομάδα της αυξανόμενης αλυσίδας του R προσβάλλει την α-φωσφορική ομάδα του εισερχόμενου τριφωσφορικού νουκλεοζίτη. Αυτή η μεταβατική κατάσταση είναι δομικά όμοια με εκείνη της D πολυμεράσης (βλ. Eικόνα 27.12). β Η μεταγραφή αρχίζει στους προαγωγείς του εκμαγείου D. Οι προαγωγείς είναι αλληλουχίες του D, οι οποίες κατευθύνουν την R πολυμεράση στην κατάλληλη θέση έναρξης της μεταγραφής. Οι περιοχές προαγωγέων μπορούν να αναγνωριστούν και να ταυτοποιηθούν με συνδυασμό διαφόρων τεχνικών. Μια ισχυρή τεχνική για τον χαρακτηρισμό αυτών και άλλων θέσεων δέσμευσης πρωτεϊνών στο D ονομάζεται αποτύπωση (Eικόνα 28.3). Αρχικά, ένας από τους κλώνους ενός θραύσματος D που χρησιμοποιείται για τη μελέτη αυτή σημαίνεται στο ένα άκρο του με 32 Ρ. Στο σημασμένο D προστίθεται R πολυμεράση και το μείγμα υφίσταται επεξεργασία με DΑση για τόσο χρονικό διάστημα ώστε να προκύψει περίπου ένα κόψιμο σε κάθε αλυσίδα των μορίων του μείγματος. Ένα μέρος του ραδιενεργού D υφίσταται την ίδια επεξεργασία αλλά χωρίς την προ- ÕÎÚÔ ÙÔ D ÛËÌ ÛÌ ÓÔ Ì 32 EÈ ÈÎ ÂÛÌÂ Ô Û appleúˆùâ Ó EÁÎÔapple applefi DÛË EÁÎÔapple applefi DÛË EIK 28.3 Η τεχνική της αποτύπωσης. Το ένα άκρο μιας αλυσίδας του D σημαίνεται με 32 Ρ (δείχνεται με κόκκινο κύκλο) Στη συνέχεια, το σημασμένο D υφίσταται τέτοια επίδραση ώστε κάθε θραύσμα να προκύπτει από ένα μόνο κόψιμο του αρχικού μορίου. Το ίδιο κόψιμο πραγματοποιείται μετά την προσθήκη μιας πρωτεΐνης, η οποία δεσμεύεται σε συγκεκριμένες θέσεις του D. Η δεσμευμένη πρωτεΐνη προστατεύει ένα τμήμα του D από το δράση της Dσης. Επομένως, ορισμένα θραύσματα που υπάρχουν στην αντίδραση, η οποία πραγματοποιείται χωρίς την πρωτεΐνη αυτή, απουσιάζουν. Οι ζώνες που δεν εμφανίζονται στο πρότυπο ηλεκτροφόρησης προσδιορίζουν τη θέση δέσμευσης στο D. Ú ÛÌ Ù ÛËÌ ÛÌ Ó Ì 32 appleôù ÏÂÛÌ ËÏÂÎÙÚÔÊfiÚËÛË Û appleëîù Ú ÛÌ Ù ÛËÌ ÛÌ Ó Ì 32

5 σθήκη R πολυμεράσης για να χρησιμεύσει ως μάρτυρας. Τα θραύσματα του D που προκύπτουν διαχωρίζονται σύμφωνα με το μέγεθός τους με ηλεκτροφόρηση. Το πρότυπο ηλεκτροφόρησης είναι εξαιρετικά αποκαλυπτικό: μια σειρά από ζώνες που εμφανίζονται στο δείγμα του μάρτυρα δεν υπάρχουν στο δείγμα το οποίο περιέχει την R πολυμεράση. Οι ζώνες αυτές δεν υπάρχουν διότι η R πολυμεράση προστατεύει το D από σχάσεις, από τις οποίες θα προέκυπταν τα αντίστοιχα θραύσματα. Ένα εντυπωσιακό σχήμα είναι επίσης προφανές όταν συγκρίνονται οι αλληλουχίες πολλών προκαρυωτικών προαγωγέων. Δύο κοινά μοτίβα παρουσιάζονται προς την 5 -πλευρά της θέσης έναρξης (ανοδικά του μηνύματος). Είναι γνωστά ως η αλληλουχία 10 και η αλληλουχία 35, διότι είναι συμμετρικά τοποθετημένες περίπου 10 και 35 νουκλεοτίδια ανοδικά από τη θέση έναρξης. Η κάθε μία από τις αλληλουχίες αυτές έχει μήκος 6 bp. Οι ομόφωνες (κατά μέσον όρο) αλληλουχίες τους, οι οποίες προέκυψαν από την ανάλυση πολλών προαγωγέων (Eικόνα 28.4), είναι: TT TT T +1 ÛË Ó ÚÍË Το πρώτο νουκλεοτίδιο (η θέση έναρξης) μιας μεταγραφόμενης αλληλουχίας D σημειώνεται ως +1 και το δεύτερο ως +2. Το νουκλεοτίδιο που προηγείται της θέσης έναρξης σημειώνεται ως 1. Οι συμβολισμοί αυτοί αναφέρονται στον κωδικεύοντα κλώνο του D. Υπενθυμίζεται ότι η αλληλουχία του κλώνου-εκμαγείου του D είναι συμπληρωματική της αλληλουχίας του μεταγραφήματος R (βλ. Eικόνα 5.26). Αντιθέτως, ο κωδικεύων κλώνος του D έχει την ίδια αλληλουχία με εκείνη του μεταγραφήματος R, με τη διαφορά ότι έχει θυμίνη (Τ) στη θέση της ουρακίλης (). Ο κωδικεύων κλώνος είναι επίσης γνωστός ως ο νοηματικός (+) κλώνος και ο κλώνος του εκμαγείου ως ο αντινοηματικός ( ) κλώνος. Οι προαγωγείς διαφέρουν σημαντικά ως προς τη δραστικότητά τους. Γονίδια με ισχυρούς προαγωγείς μεταγράφονται πολύ συχνά κάθε δύο δευτερόλεπτα στην E. coli. Αντιθέτως, γονίδια με πολύ ασθενείς προαγωγείς μεταγράφονται περίπου μία φορά κάθε 10 λεπτά. Οι περιοχές 10 και 35 των περισσότερων ισχυρών προαγωγέων έχουν αλληλουχίες που αντιστοιχούν αρκετά στις ομόφωνες αλληλουχίες, ενώ οι ασθενείς προαγωγείς τείνουν να φέρουν πολλές αντικαταστάσεις βάσεων στις θέσεις αυτές. Πράγματι, η μετάλλαξη ακόμη και μίας βάσης είτε στην 10 είτε στην 35 αλληλουχία μπορεί να μειώσει τη δραστικότητα του προαγωγέα. Η απόσταση μεταξύ των συντηρημένων αυτών αλληλουχιών είναι επίσης σημαντική. Ένας διαχωρισμός τους σε έκταση 17 νουκλεοτιδίων είναι ο βέλτιστος. Επομένως, η αποτελεσματικότητα ή η ισχύς μιας αλληλουχίας προαγωγέων χρησιμεύει στη ρύθμιση της μεταγραφής. Ρυθμιστικές πρωτεΐνες οι οποίες δεσμεύονται σε ειδικές αλληλουχίες κοντά σε θέσεις προαγωγέων και οι οποίες αλληλεπιδρούν με την R πολυμεράση (Κεφάλαιο 31) επηρεάζουν επίσης σημαντικά τη συχνότητα μεταγραφής πολλών γονιδίων. () (B) ( ) ( ) (E) 883 R πολυμεράση H ÌÂÙ ÁÚ Ê Ú ÂÈ Â Ò 10 T T T T T T T T T T T T T TT T T T T T TT T T T T T T T EIK 28.4 Προκαρυωτικές αλληλουχίες προαγωγέων. Η σύγκριση πέντε αλληλουχιών από προκαρυωτικούς προαγωγείς αποκαλύπτει μια επανεμφανιζόμενη αλληλουχία ΤΑΤΑΑΤ με κέντρο τη θέση 10. Η ομόφωνη αλληλουχία της θέσης 10 (κόκκινη) καθορίστηκε από έναν μεγάλο αριθμό αλληλουχιών προαγωγέων. Οι αλληλουχίες της εικόνας αυτής προέρχονται από τα οπερόνια (Α) lac, (Β) gal, (Γ) trp της E. coli, (Δ) τον φάγο λ και (Ε) τον φάγο φχ ι υπομονάδες σ της R πολυμεράσης αναγνωρίζουν θέσεις προαγωγέων Ο πυρήνας α 2 ββ της R πολυμεράσης δεν μπορεί να αρχίσει μόνος του τη μεταγραφή σε θέσεις προαγωγέων. Αντιθέτως, το πλήρες ολοένζυμο α 2 ββ σ είναι απαραίτητο για την έναρξη της μεταγραφής στη σωστή θέση. Η υπομονάδα σ συμβάλλει στην ειδική έναρξη με δύο τρόπους. Πρώτον, μειώνει τη χημική συγγένεια της R πολυμεράσης για άλλες τυχαίες θέσεις στο D κατά έναν παράγοντα Απουσία της υπομονάδας σ, ο πυρήνας του ενζύμου δεσμεύεται

6 884 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 28 Σύνθεση και μάτισμα R ŒÏÈÎ Ì ÚfiÏÔ ÛÙËÓ Ó ÁÓÒÚÈÛË ÙË appleâúèô ÙË ÏÏËÏÔ 10 EIK 28.5 Η δομή της υπομονάδας σ. Η δομή ενός θραύσματος από την υπομονάδα σ 70 της E. coli αποκαλύπτει τη θέση μιας α-έλικας στην επιφάνεια της πρωτεΐνης. Η έλικα αυτή παίζει σημαντικό ρόλο για τη δέσμευση στην αλληλουχία 10 ΤΑΤΑΑΤ. στο D αδιάκριτα και ισχυρά. Δεύτερον, η υπομονάδα σ δίνει τη δυνατότητα στην R πολυμεράση να αναγνωρίζει θέσεις προαγωγέων. Ένα μεγάλο θραύσμα υπομονάδας σ βρέθηκε να έχει στην επιφάνειά της μια α-έλικα. Η έλικα αυτή έχει βρεθεί ότι εμπλέκεται στην αναγνώριση της αλληλουχίας 5 -ΤΑΤΑΑΤ της περιοχής 10 (Eικόνα 28.5). Το ολοένζυμο δεσμεύεται σε δίκλωνο D και κινείται κατά μήκος της διπλής έλικας σε αναζήτηση ενός προαγωγέα, σχηματίζοντας προσωρινούς δεσμούς υδρογόνου με εκτεθειμένες ομάδες δεκτών και δοτών των ζευγών βάσεων. Η αναζήτηση είναι ταχύτατη διότι η R πολυμεράση ολισθαίνει κατά μήκος του D αντί να δεσμεύεται και να αποδεσμεύεται από αυτό συνεχώς. Με άλλα λόγια, η θέση του προαγωγέα προσεγγίζεται με ένα τυχαίο βάδισμα σε μία διάσταση και όχι σε τρεις διαστάσεις. Η παρατηρούμενη σταθερά ταχύτητας δέσμευσης του ολοενζύμου της R πολυμεράσης σε αλληλουχίες προαγωγέων είναι Μ 1 s 1, περισσότερο από 100 φορές ταχύτερη από ό,τι θα επιτυγχανόταν με επαναλαμβανόμενες προσεγγίσεις καθώς θα δεσμευόταν και θα αποδεσμευόταν από το D. Η υπομονάδα σ ελευθερώνεται όταν η νεοσυντιθέμενη αλυσίδα R αποκτήσει μήκος εννέα ή δέκα νουκλεοτιδίων. Μετά την ελευθέρωσή της μπορεί να βοηθήσει την έναρξη της μεταγραφής από έναν άλλο πυρήνα ενζύμου. Επομένως, η υπομονάδα σ δρα καταλυτικά. Η E. coli περιέχει πολλαπλούς παράγοντες σ, οι οποίοι αναγνωρίζουν διάφορους τύπους αλληλουχιών προαγωγέων στο D της Ε. coli. Ο τύπος που αναγνωρίζει την ομόφωνη αλληλουχία που περιγράφηκε παραπάνω ονομάζεται σ 70, διότι έχει μοριακή μάζα 70 kd. Ένας διαφορετικός παράγοντας σ αρχίζει να δρα όταν η θερμοκρασία αυξάνεται απότομα. Η Ε. coli αποκρίνεται με τη σύνθεση του σ 32, ο οποίος αναγνωρίζει τους προαγωγείς των γονιδίων της θερμικής καταπληξίας. Οι προαγωγείς αυτοί έχουν αλληλουχίες 10, οι οποίες είναι κατά τι διαφορετικές από τις αλληλουχίες 10 των συνηθισμένων προαγωγέων (Eικόνα 28.6). Η αυξημένη μεταγραφή των γονιδίων της θερμικής καταπληξίας οδηγεί στη συντονισμένη σύνθεση μιας σειράς προστατευτικών πρωτεϊνών. Άλλοι παράγοντες σ αποκρίνονται σε περιβαλλοντικές συνθήκες, όπως η τροφοπενία αζώτου. Τα ευρήματα αυτά δείχνουν ότι η υπομονάδα σ παίζει καθοριστικό ρόλο στο να προσδιορίζει από πού αρχίζει τη μεταγραφή η R πολυμεράση TT TTT ÓËıÈÛÌ ÓÔ appleúô ÁˆÁ TTT TT ÚÔ ÁˆÁ ÁÔÓÈ ˆÓ ıâúìèî Î Ù appleïëí T T T ÚÔ ÁˆÁ ÙÚÔÊÔappleÂÓ ÒÙÔ EIK 28.6 Εναλλακτικές αλληλουχίες προαγωγέων. Μια σύγκριση των ομόφωνων αλληλουχιών συνηθισμένων προαγωγέων, προαγωγέων γονιδίων της θερμικής καταπληξίας και προαγωγέων της τροφοπενίας αζώτου της E. coli. Οι προαγωγείς αυτοί αναγνωρίζονται από τις υπομονάδες σ 70, σ 32 και σ 54, αντίστοιχα Για να πραγματοποιηθεί η μεταγραφή, η R πολυμεράση πρέπει να ξετυλίξει το εκμαγείο της δίκλωνης έλικας Αν και η R πολυμεράση μπορεί να αναζητά θέσεις προαγωγέων όταν δεσμεύεται στο δίκλωνο ελικοειδές D, ένα τμήμα της έλικας πρέπει να ξετυλιχτεί πριν δοθεί η δυνατότητα να αρχίσει η σύνθεση. Μια περιοχή δίκλωνου D πρέπει να χωρίσει, ούτως ώστε τα νουκλεοτίδια του ενός από τους κλώνους να γίνουν προσιτά για σχηματισμό ζευγών βάσεων με τους εισερχόμενους τριφωσφορικούς ριβονουκλεοζίτες. Ο κλώνος-εκμαγείο του D επιλέγει τον σωστό τριφωσφορικό νουκλεοζίτη σχηματίζοντας με αυτόν ένα ζεύγος βάσεων Watson-rick (Εδάφιο 5.2.1), όπως συμβαίνει και στη σύνθεση του D. Πόσο από το εκμαγείο του D ξετυλίγεται από την R πολυμεράση; Επειδή το ξετύλιγμα αυξάνει την αρνητική υπερσπείρωση του D (Εδάφιο ), το πρόβλημα αυτό λύθηκε αναλύοντας την υπερσπείρωση ενός κυκλι-

7 κού δίκλωνου D που είχε εκτεθεί σε ποικίλες ποσότητες R πολυμεράσης. Η τοποϊσομεράση Ι, ένα ένζυμο που καταλύει τη συντονισμένη σχάση και επανένωση του δίκλωνου D (Εδάφιο ), προστέθηκε στη συνέχεια για να χαλαρώσει το τμήμα του κυκλικού D που δεν βρισκόταν σε επαφή με τα μόρια της πολυμεράσης. Τα δείγματα αυτά του D μετά την απομάκρυνση της δεσμευμένης πρωτεΐνης αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή. Ο βαθμός της αρνητικής υπερσπείρωσης αυξήθηκε αναλογικά με τον αριθμό των μορίων της R πολυμεράσης που είναι δεσμευμένα ανά εκμαγείο D, γεγονός που δείχνει ότι το ένζυμο ξετυλίγει το D. Κάθε δεσμευμένο μόριο πολυμεράσης ξετυλίγει ένα τμήμα D 17 bp, το οποίο αντιστοιχεί σε 1,6 στροφές έλικας B- D (Eικόνα 28.7). Η αρνητική υπερσπείρωση του κυκλικού D ευνοεί τη μεταγραφή γονιδίων διότι διευκολύνει το ξετύλιγμα (Εδάφιο ). Επομένως, η εισαγωγή αρνητικών υπερσπειραμάτων στο D από την τοποϊσομεράση ΙΙ μπορεί να αυξήσει την αποτελεσματικότητα προαγωγέων που βρίσκονται σε απομακρυσμένες θέσεις. Ωστόσο, δεν διεγείρονται όλοι οι προαγωγείς από την αρνητική υπερσπείρωση. Η θέση του προαγωγέα για την ίδια την τοποϊσομεράση ΙΙ αποτελεί μια αξιοσημείωτη εξαίρεση. Η αρνητική υπερσπείρωση μειώνει την ταχύτητα μεταγραφής αυτού του γονιδίουø πρόκειται για έναν κομψό μηχανισμό επανατροφοδοτικού ελέγχου ο οποίος φροντίζει να μην προκαλείται εκτεταμένη αρνητική υπερσπείρωση του D. H αρνητική υπερσπείρωση μπορεί να μειώσει την αποτελεσματικότητα αυτού του προαγωγέα αλλάζοντας τη δομική σχέση των περιοχών 10 και 35. Η μετάβαση από το σύμπλοκο του κλειστού προαγωγέα (στο οποίο το D είναι δίκλωνο) στο σύμπλοκο του ανοιχτού προαγωγέα (στο οποίο το D είναι ξετυλιγμένο) αποτελεί ένα σημαντικό γεγονός για τη μεταγραφή. Το σκηνικό είναι τώρα έτοιμο για τον σχηματισμό του πρώτου φωσφοδιεστερικού δεσμού της νέας αλυσίδας R. ÎψÓÔ ÂÏÈÎÔÂÈ D R appleôï ÌÂÚ ÛË 885 R πολυμεράση ÂÙ ÏÈÁÌ ÓÔ D ( ÓÔ ÁÌ ÙÔ 17 bp) EIK 28.7 Ξετύλιγμα του D. Η R πολυμεράση ξετυλίγει 17 περίπου βάσεις του εκμαγείου D ι αλυσίδες του R σχηματίζονται de novo και αυξάνονται προς την κατεύθυνση 5 προς 3 Σε αντίθεση προς τη σύνθεση του D, η σύνθεση του R μπορεί να αρχίσει de novo, χωρίς να χρειάζεται εκκινητής. Οι περισσότερες νεοσυντιθέμενες αλυσίδες R έχουν στο 5 -άκρο τους μια εξαιρετικά ευδιάκριτη ετικέτα: η πρώτη βάση στο άκρο αυτό είναι είτε ppp είτε ppp. EÙÈÎ Ù ÛÙÔ - ÎÚÔ 2 ( ) B ÛË H H Η παρουσία της τριφωσφορικής ομάδας υποδηλώνει ότι η σύνθεση R αρχίζει στο 5 -άκρο. Από τα αποτελέσματα πειραμάτων σήμανσης με υποστρώματα γ- 32 Ρ επιβεβαιώθηκε ότι οι αλυσίδες R, όπως και οι αλυσίδες D, αναπτύσσονται κατά την κατεύθυνση 5 3. X X Y X Y Z YT i ZT i H H H Ó appleù ÍË

8 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 28 Σύνθεση και μάτισμα R H επιμήκυνση πραγματοποιείται στις φυσαλίδες μεταγραφής οι οποίες μετακινούνται κατά μήκος του εκμαγείου D Η φάση επιμήκυνσης της σύνθεσης του R αρχίζει μετά τον σχηματισμό του πρώτου φωσφοδιεστερικού δεσμού. Μια σημαντική αλλαγή είναι η απώλεια του παράγοντα σ. Υπενθυμίζεται ότι ο πυρήνας του ενζύμου χωρίς τον σ δεσμεύεται στο εκμαγείο του D πιο ισχυρά. Πραγματικά, η R πολυμεράση παραμένει δεσμευμένη στο εκμαγείο της μέχρι να προσεγγίσει ένα σήμα τερματισμού. Η περιοχή που έχει R πολυμεράση, D και νεοσυντιθέμενο R ονομάζεται φυσαλίδα μεταγραφής διότι περιέχει μια «φυσαλίδα» τοπικά αποδιαταγμένου D (Eικόνα 28.8). Το R που μόλις έχει συντεθεί σχηματίζει μια υβριδική έλικα με τον κλώνο-εκμαγείο του D. Αυτή η έλικα D-R έχει μήκος 8 περίπου bp, που αντιστοιχεί σχεδόν σε μια στροφή της διπλής έλικας (Εδάφιο ). Η 3 -υδροξυλική ομάδα του R σε αυτήν την υβριδική έλικα είναι τοποθετημένη με τέτοιο τρόπο ώστε να μπορεί να προσβάλλει το α-άτομο του φωσφόρου ενός εισερχόμενου τριφωσφορικού ριβονουκλεοζίτη. Ο πυρήνας του ενζύμου περιέχει επίσης μια θέση δέσμευσης για τον άλλο κλώνο του D. Περίπου 17 bp D ξετυλίγονται κατά τη φάση επιμήκυνσης, όπως και κατά τη φάση έναρξης. Η φυσαλίδα μεταγραφής διανύει μια απόσταση 170 Å (17 nm) ανά δευτερόλεπτο, που αντιστοιχεί σε έναν ρυθμό επιμήκυνσης 50 περίπου νουκλεοτιδίων ανά δευτερόλεπτο. Αν και αρκετά γρήγορη, η ταχύτητα αυτή είναι πολύ μικρότερη από εκείνη της σύνθεσης του D, η απόδοση της οποίας είναι 1000 νουκλεοτίδια ανά δευτερόλεπτο. R appleôï ÌÂÚ ÛË EIK 28.8 Φυσαλίδα μεταγραφής. Σχηματική αναπαράσταση της φυσαλίδας μεταγραφής κατά την επιμήκυνση ενός μεταγραφήματος R. Το δίκλωνο D ξετυλίγεται στο πρόσθιο άκρο της R πολυμεράσης και ξανατυλίγεται στο οπίσθιο. Το υβρίδιο R-D περιστρέφεται κατά την επιμήκυνση. Ó Ù ÏÈÁÌ ÂÔÛ ÓÙÈı ÌÂÓÔ R KÏÒÓÔ -ÂÎÌ ÁÂ Ô Y ÚÈ ÈÎ ÏÈÎ R D Kˆ ÈÎÂ ˆÓ ÎÏÒÓÔ ÛË ÂappleÈÌ Î ÓÛË ÂÙ ÏÈÁÌ ppp K ÓËÛË ÙË appleôï ÌÂÚ ÛË D R EIK 28.9 Διαχωρισμός υβριδίου R-D. Μια δομή μέσα στην R πολυμεράση επιβάλλει τον διαχωρισμό του υβριδίου R- D, επιτρέποντας στην αλυσίδα του D να εξέρχεται από το ένα μέρος και στην αλυσίδα του R να εξέρχεται από το άλλο. Το μήκος του υβριδίου R-D και της ξετυλιγμένης περιοχής του D παραμένει μάλλον σταθερό καθώς η R πολυμεράση μετακινείται κατά μήκος του εκμαγείου D. Αυτό το εύρημα υποδηλώνει ότι το D ξανατυλίγεται με την ίδια περίπου ταχύτητα στο οπίσθιο μέρος της R πολυμεράσης όπως ξετυλίγεται στο εμπρόσθιο μέρος του ενζύμου. Το υβρίδιο R-D πρέπει επίσης να περιστρέφεται κάθε φορά που ένα νουκλεοτίδιο προστίθεται, ούτως ώστε το 3 -ΟΗ άκρο του R να παραμένει στην καταλυτική θέση. Το μήκος του υβριδίου R-D προσδιορίζεται από μια δομή μέσα στο ένζυμο που αναγκάζει το υβρίδιο R-D να χωρίζει, επιτρέποντας έτσι στην αλυσίδα του R να εξέρχεται από το ένζυμο και στην αλυσίδα του D να ξαναενώνεται με τη συμπληρωματική της (Eικόνα 28.9). Είναι αξιοσημείωτο ότι η R πολυμεράση δεν έχει δραστικότητα νουκλεάσης. Έτσι, σε αντίθεση προς την D πολυμεράση, η R πολυμεράση δεν διορθώνει τη νεοσυντιθέμενη πολυνουκλεοτιδική αλυσίδα. Συνεπώς, η πιστότητα της μεταγραφής είναι πολύ μικρότερη από εκείνη της αντιγραφής. H συχνότητα σφάλματος της σύνθεσης R είναι της τάξεως του ενός λάθους ανά 10 4 έως

9 10 5 νουκλεοτίδια, περίπου 10 5 φορές μεγαλύτερη από εκείνη της σύνθεσης D. Η πολύ μικρότερη πιστότητα της σύνθεσης R είναι ανεκτή διότι τα λάθη δεν μεταβιβάζονται στους απογόνους. Για τα περισσότερα γονίδια συντίθενται πολλά αντίγραφα μεταγραφημάτων R, και επομένως μερικά ελαττωματικά είναι απίθανο να είναι βλαβερά. 887 R πολυμεράση Mια δομή φουρκέτας R που ακολουθείται από ορισμένα κατάλοιπα ουρακίλης τερματίζει τη μεταγραφή μερικών γονιδίων Ο τερματισμός της μεταγραφής είναι τόσο επακριβώς ελεγχόμενος όσο είναι και η έναρξή της. Στη φάση του τερματισμού της μεταγραφής, ο σχηματισμός των φωσφοδιεστερικών δεσμών παύει, το υβρίδιο R-D αποσυνδέεται, η αποδιαταγμένη περιοχή του D ξανατυλίγεται και η R πολυμεράση ελευθερώνει το D. Ποιος ορίζει το πού τερματίζεται η μεταγραφή; Οι μεταγραφόμενες περιοχές των εκμαγείων D περιέχουν σήματα τερματισμού. Η απλούστερη περιοχή τερματισμού είναι μια παλινδρομική περιοχή πλούσια σε ζεύγη που ακολουθείται από μια περιοχή πλούσια σε ζεύγη ΑΤ. Το μεταγράφημα του R αυτής της παλινδρομικής αλληλουχίας του D είναι αυτοσυμπληρωματικό (Eικόνα 28.10). Επομένως, οι βάσεις του μπορούν να ζευγαρώσουν σχηματίζοντας μια δομή φουρκέτας με έναν βραχίονα και μια θηλιά, μια δομή που ευνοείται από την υψηλή περιεκτικότητα καταλοίπων και. Τα ζεύγη γουανίνης-κυτοσίνης είναι πιο σταθερά από τα ζεύγη αδενίνης-θυμίνης λόγω του επιπλέον δεσμού υδρογόνου που περιέχουν. Αυτή η σταθερή δομή φουρκέτας ακολουθείται από μια αλληλουχία τεσσάρων ή περισσότερων καταλοίπων ουρακίλης, τα οποία είναι επίσης κρίσιμα για τον τερματισμό. Το μεταγράφημα του R τελειώνει μέσα ή λίγο μετά από αυτά τα κατάλοιπα. Πώς όμως αυτός ο συνδυασμός της δομής φουρκέτας-ολιγο() τερματίζει τη μεταγραφή; Πρώτον, φαίνεται πιθανόν ότι η R πολυμεράση σταματά αμέσως μετά τη σύνθεση του τμήματος R, το οποίο αναδιπλώνεται σε μια φουρκέτα. Επιπλέον, η υβριδική έλικα R-D που παράγεται μετά τη φουρκέτα είναι ασταθής, διότι τα ζεύγη των βάσεων r-d είναι τα ασθενέστερα από τα τέσσερα είδη τους. Επομένως, η παύση της μεταγραφής που προκαλείται από τη φουρκέτα επιτρέπει στο χαλαρά συνδεδεμένο νεοσυντιθέμενο R να αποσυνδεθεί από το εκμαγείο D και στη συνέχεια από το ένζυμο. Η απομονωμένη αλυσίδα του εκμαγείου D ξαναενώνεται με τη συμπληρωματική της ανασχηματίζοντας το δίκλωνο D, και η φυσαλίδα της μεταγραφής κλείνει H πρωτεΐνη ρ βοηθά στον τερματισμό της μεταγραφής ορισμένων γονιδίων Η R πολυμεράση δεν χρειάζεται βοήθεια για να τερματίσει τη μεταγραφή σε μια φουρκέτα που ακολουθείται από μερικά κατάλοιπα. Σε άλλες θέσεις όμως ο τερματισμός χρειάζεται τη συμμετοχή και ενός πρόσθετου παράγοντα. Στην ανακάλυψη αυτή συνετέλεσε η παρατήρηση ότι μερικά μόρια R, που συντέθηκαν in vitro από την R πολυμεράση και μόνον, ήταν μακρύτερα από εκείνα που συντέθηκαν in vivo. Ο παράγοντας που έλειπε, μια πρωτεΐνη που προκαλούσε τον σωστό τερματισμό, απομονώθηκε και ονομάστηκε ρ. Άλλες πληροφορίες για τη δράση της πρωτεΐνης ρ αποκτήθηκαν με την προσθήκη αυτού του παράγοντα τερματισμού σε ένα μείγμα επώασης, σε διάφορους χρόνους μετά την έναρξη της σύνθεσης του R (Eικόνα 28.11). Μόρια R με συντελεστές καταβύθισης 10 S, 13 S και 17 S αποκτήθηκαν όταν η ρ προστέθηκε κατά την έναρξη, λίγα δευτερόλεπτα μετά την έναρξη και δύο λεπτά με- H EIK Σήμα τερματισμού. Ένα σήμα τερματισμού που βρέθηκε στο 3ã-άκρο ενός μεταγραφήματος R αποτελείται από μια σειρά βάσεων οι οποίες σχηματίζουν μια σταθερή δομή βραχίονα-θηλιάς και μια σειρά καταλοίπων.

10 888 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 28 Σύνθεση και μάτισμα R EÎÌ ÁÂ Ô D ŒÓ ÚÍË TÂÚÌ ÙÈÛÌfi appleô Û Ú ı ÛÂÈ Ú XˆÚ appleúˆùâ ÓË Ú MfiÚÈ R 23S MÂÙ ÁÚ Ê Ì Ù R H appleúˆùâ ÓË Ú ÛÙËÓ Ú ÙË Û ÓıÂÛË H appleúˆùâ ÓË Ú appleúôûùèı ÌÂÓË 30'' ÚÁfiÙÂÚ MfiÚÈ R 10S MfiÚÈ R 13S H appleúˆùâ ÓË Ú appleúôûùèı ÌÂÓË 2 ÏÂappleÙ ÚÁfiÙÂÚ MfiÚÈ R 17S EIK Η επίδραση της πρωτεΐνης ρ στο μέγεθος των μεταγραφημάτων R. T + H 2 D + i ÚˆÙ ÓË Ú ppp R appleôï ÌÂÚ ÛË EIK Μηχανισμός τερματισμού της μεταγραφής από την πρωτεΐνη ρ. H πρωτεΐνη αυτή είναι μια ελικάση εξαρτώμενη από την ΑΤΡ, η οποία δεσμεύεται στη νεοσυντιθέμενη αλυσίδα R και την έλκει μακριά από την R πολυμεράση και το εκμαγείο D. τά την έναρξη, αντίστοιχα. Χωρίς την προσθήκη της ρ, η μεταγραφή απέδωσε ένα προϊόν R μεγέθους 23 S. Είναι προφανές ότι το εκμαγείο περιέχει τουλάχιστον τρεις θέσεις τερματισμού που αποκρίνονται στη ρ (και αποδίδουν R μεγέθους 10 S, 13 S και 17 S), καθώς και μία θέση τερματισμού η οποία δεν αποκρίνεται στη ρ (και η οποία αποδίδει ένα RΝΑ 23 S). Έτσι, ένας ειδικός τερματισμός σε μια θέση που παράγει R 23 S μπορεί να γίνει απουσία της πρωτεΐνης ρ. Ωστόσο, η ρ ανιχνεύει πρόσθετα σήματα τερματισμού που δεν αναγνωρίζονται μόνο από την R πολυμεράση. Με ποιον τρόπο η πρωτεΐνη ρ προκαλεί τον τερματισμό της σύνθεσης R; Ένα καθοριστικό στοιχείο είναι η ανακάλυψη ότι η ρ υδρολύει ΑΤΡ παρουσία μονόκλωνου R και όχι παρουσία D ή δίκλωνου R. Η εξαμερής ρ, η οποία δομικά είναι παρόμοια και ομόλογη με τη συνθάση της ΑΤΡ (Εδάφιο ), δεσμεύεται ειδικά σε μονόκλωνο R. Μια έκταση 72 νουκλεοτιδίων δεσμεύεται με τέτοιο τρόπο ώστε το R να διέρχεται διά μέσου του κέντρου της δομής εκείνης (Eικόνα 28.12). Η ρ αποκτά δραστικότητα από αλληλουχίες που βρίσκονται στο νεοσυντιθέμενο R, οι οποίες είναι πλούσιες σε κυτοσίνες και φτωχές σε γουανίνες. Η δραστικότητα ΑΤΡάσης της ρ βοηθά την πρωτεΐνη αυτή να τραβήξει το νέο R ενώ ακολουθεί την R πολυμεράση. Όταν η ρ φθάσει την R πολυμεράση στη φυσαλίδα μεταγραφής σπάει την υβριδική έλικα R-D δρώντας όπως μια R-D ελικάση. Δεδομένης της δομικής και εξελικτικής σύνδεσης, είναι πιθανόν ο μηχανισμός δράσης της πρωτεΐνης ρ να είναι παρόμοιος με εκείνον της συνθάσης της ΑΤΡ, με το μονόκλωνο R να παίζει τον ρόλο της υπομονάδας γ. Και άλλες πρωτεΐνες εκτός από την ρ μεσολαβούν και συντονίζουν τον τερματισμό της μεταγραφής. Παραδείγματος χάριν, η πρωτεΐνη nus βοηθά την R πολυμεράση στην E. coli να αναγνωρίσει μια χαρακτηριστική ομάδα θέσεων τερματισμού. Στην Ε. coli ειδικά σήματα τερματισμού που ονομάζονται εξασθενιστές ρυθμίζονται για να ικανοποιήσουν τις θρεπτικές ανάγκες του κυττάρου (Εδάφιο ). Ένα κοινό χαρακτηριστικό του τερματισμού που δεν εξαρτάται από πρωτεΐνες και εκείνου που εξαρτάται από πρωτεΐνες είναι ότι τα λειτουργικά σήματα τερματισμού βρίσκονται στο νεοσυντιθέμενο R και όχι στο εκμαγείο D.

11 Τα πρόδρομα μόρια του μεταφορικού και του ριβοσωματικού R διασπώνται και τροποποιούνται χημικά μετά τη μεταγραφή rr 16S tr rr 23S rr 5S Στα προκαρυωτικά, τα μόρια του αγγελιαφόρου R υφίστανται μικρή ή καμία τροποποίηση μετά τη σύνθεσή τους από την R πολυμεράση. Πράγματι, πολλά μόρια mr μεταφράζονται καθώς μεταγράφονται. Αντίθετα, τα μόρια του μεταφορικού και του ριβοσωματικού R δημιουργούνται από σχάσεις και άλλες τροποποιήσεις των νέων αλυσίδων R. Παραδείγματος χάριν, στην E. coli τρία είδη μορίων rr και ένα tr εξάγονται από ένα μόνο πρωτογενές μεταγράφημα R, το οποίο επίσης περιέχει ενδιάμεσες περιοχές (Eικόνα 28.13). Άλλα μεταγραφήματα περιέχουν σειρές από μερικά είδη tr ή μερικά αντίγραφα του ίδιου tr. Οι νουκλεάσες οι οποίες διασπούν και ψαλιδίζουν αυτά τα πρόδρομα μόρια του rr και του tr είναι εξαιρετικά εξειδικευμένες. Η ριβονουκλεάση Ρ, παραδείγματος χάριν, δημιουργεί το σωστό 5 -άκρο όλων των μορίων tr της E. coli. Το ενδιαφέρον αυτό ένζυμο περιέχει ένα καταλυτικά ενεργό μόριο R. Η ριβονουκλεάση ΙΙΙ εκτέμνει προδρόμους των rr μεγέθους 5 S, 16 S και 23 S από το πρωτογενές μεταγράφημα, διασπώντας περιοχές δίκλωνων φουρκετών σε ειδικές θέσεις. Ένας δεύτερος τύπος επεξεργασίας είναι η προσθήκη νουκλεοτιδίων στα άκρα ορισμένων αλυσίδων R. Παραδείγματος χάριν, η, μια τελική αλληλουχία που απαιτείται για τη λειτουργία όλων των μορίων tr, προστίθεται στα 3 -άκρα των μορίων tr που δεν έχουν ήδη αυτήν την τελική αλληλουχία. Ένας τρίτος τύπος επεξεργασίας είναι η τροποποίηση βάσεων και μονάδων ριβόζης μορίων ριβοσωματικών R. Στα προκαρυωτικά, μερικές βάσεις του rr μεθυλιώνονται. Ασυνήθεις βάσεις βρίσκονται σε όλα τα μόρια tr (Εδάφιο ). Οι βάσεις αυτές σχηματίζονται με την ενζυμική τροποποίηση ενός κανονικού ριβονουκλεοτιδίου σε ένα πρόδρομο μόριο tr. Παραδείγματος χάριν, κατάλοιπα ουριδυλικού τροποποιούνται μετά τη μεταγραφή σχηματίζοντας ριβοθυμιδυλικό και ψευδοουριδυλικό. Αυτές οι τροποποιήσεις δημιουργούν ποικιλομορφία, επιτρέποντας μεγαλύτερη δομική και λειτουργική προσαρμοστικότητα. EIK Πρωτογενές μεταγράφημα. Διάσπαση αυτού του μεταγραφήματος παράγει μόρια rr μεγέθους 5S, 16S και 23S. Οι ενδιάμεσες περιοχές φαίνονται κίτρινες. H H H 2'--MÂı ÏÔÚÈ fi Ë (ÛÙ Â Î Ú ˆÙÈÎ ) H 3 6- ÈÌÂı ÏÔ ÂÓÔÛ ÓË (ÛÙ appleúôî Ú ˆÙÈÎ ) H H 3 H 3 H H 3 H ÚÈ fi Ë H H È Ôı ÌÈ ÏÈÎfi H ÚÈ fi Ë H H ÚÈ ÏÈÎfi H ÚÈ fi Ë æâ ÔÔ ÚÈ ÏÈÎfi ντιβιοτικά ως αναστολείς της μεταγραφής Πολλά αντιβιοτικά είναι εξαιρετικά ειδικοί αναστολείς βιολογικών διεργασιών. Η ριφαμπικίνη και η ακτινομυκίνη είναι δύο αντιβιοτικά που αναστέλλουν τη μεταγραφή, αν και με τελείως διαφορετικό τρόπο. Η ρι-

12 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ 890 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 28 Σύνθεση και μάτισμα R ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΓΙΑ ΤΟ ΧΗΜΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ φαμπικίνη είναι ένα ημισυνθετικό παράγωγο των ριφαμυκινών, οι οποίες παράγονται από ένα στέλεχος Streptomyces. H 3 H 3 H H 3 H 3H H H H 3 H3 H 3 H 3 H H 3 H H 3 ÈÊ Ì ÈÎ ÓË EIK Αντιβιοτική δράση. Η ριφαμπικίνη δεσμεύεται σε μια θήκη μέσα στον δίαυλο, η οποία φυσιολογικά είναι κατειλημμένη από το νεοσχηματιζόμενο υβρίδιο R-D. Επομένως, το αντιβιοτικό εμποδίζει την επιμήκυνση μετά από την προσθήκη μόνο δύο ή τριών νουκλεοτιδίων. Το αντιβιοτικό αυτό αναστέλλει ειδικά την έναρξη της σύνθεσης R. Η ριφαμπικίνη δεν εμποδίζει τη δέσμευση της R πολυμεράσης στο εκμαγείο D. Αντίθετα, παρεμβαίνει στον σχηματισμό του πρώτου φωσφοδιεστερικού δεσμού στην αλυσίδα του R. Η δομή ενός συμπλόκου μεταξύ μιας προκαρυωτικής R πολυμεράσης και της ριφαμπικίνης αποκαλύπτει ότι το αντιβιοτικό φράσσει τον δίαυλο μέσα από τον οποίο πρέπει να περάσει το υβρίδιο R-D που δημιουργείται από το ένζυμο (Eικόνα 28.14). Η θέση δέσμευσης απέχει 12 Å από το ίδιο το ενεργό κέντρο. Η ριφαμπικίνη δεν εμποδίζει την επιμήκυνση της αλυσίδας όταν έχει αρχίσει, διότι το υβρίδιο RD που ενυπάρχει στο ένζυμο αποτρέπει τη δέσμευση του αντιβιοτικού. Η ακτινομυκίνη D, ένα πολυπεπτιδικό αντιβιοτικό από ένα διαφορετικό στέλεχος Streptomyces, αναστέλλει τη μεταγραφή με έναν τελείως διαφορετικό μηχανισμό. Η ακτινομυκίνη D δεσμεύεται ισχυρά και ειδικά στο δίκλωνο ελικοειδές D και με τον τρόπο αυτό το εμποδίζει να είναι ένα αποτελεσματικό εκμαγείο για τη σύνθεση R. Δεν δεσμεύεται σε μονόκλωνο D ή R, δίκλωνο R ή υβρίδια R-D. Τα αποτελέσματα φασματοσκοπικών και υδροδυναμικών μελετών συμπλόκων ακτινομυκίνης D και D υποδηλώνουν ότι ο φαινοξαζονικός δακτύλιος της ακτινομυκίνης παρεμβάλλεται μεταξύ γειτονικών ζευγών βάσεων του D. Αυτός ο τρόπος δέσμευσης ονομάζεται παρεμβολή (intercalation). Σε χαμηλές συγκεντρώσεις, η ακτινομυκίνη D αναστέλλει τη μεταγραφή χωρίς να επηρεάζει σημαντικά την αντιγραφή του D ή τη σύνθεση πρωτεϊνών. Επομένως, η ακτινομυκίνη D χρησιμοποιείται ευρέως ως ένας εξαιρετικά εξειδικευμένος αναστολέας του σχηματισμού νέου R τόσο στα προκαρυωτικά όσο και στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Η ικανότητά της να αναστέλλει την ανάπτυξη ταχέως διαιρούμενων κυττάρων την καθιστά έναν αποτελεσματικό θεραπευτικό παράγοντα στην αντιμετώπιση ορισμένων μορφών καρκίνου. ÈÊ Ì ÈÎ ÓË

13 28.2 Η ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΚΑΙ Η ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ ΕΙΝΑΙ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΕΝΕΣ ΣΤΟΝ ΧΩΡΟ ΚΑΙ ΣΤΟΝ ΧΡΟΝΟ 891 Eυκαρυωτική μεταγραφή και μετάφραση Στρέφουμε τώρα την προσοχή μας στη μεταγραφή των ευκαρυωτικών, μια πολύ πιο πολύπλοκη διεργασία από ό,τι στα προκαρυωτικά. Στα ευκαρυωτικά, η μεταγραφή και η μετάφραση πραγματοποιούνται σε διαφορετικά κυτταρικά διαμερίσματα: η μεταγραφή πραγματοποιείται στον περιβαλλόμενο από διπλή μεμβράνη πυρήνα, ενώ η μετάφραση λαμβάνει χώρα στο κυτταρόπλασμα. Στα προκαρυωτικά, οι δύο διεργασίες είναι στενά συζευγμένες (Eικόνα 28.15). Πράγματι, η μετάφραση του βακτηριακού mr αρχίζει ενώ το μεταγράφημα ακόμη συντίθεται. Ο χωροταξικός και χρονικός διαχωρισμός της μεταγραφής και της μετάφρασης καθιστούν ικανά τα ευκαρυωτικά να ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση με πολύ πιο περίπλοκους τρόπους, συνεισφέροντας στην αφθονία των ευκαρυωτικών μορφών και λειτουργιών. () (B) D D Ú Ó EappleÂÍÂÚÁ Û ÚˆÙÔÁÂÓ ÌÂÙ ÁÚ ÊËÌ K ÙÔÛfiÏÈÔ mr MÂÙ ÊÔÚ mr È fiûˆì ÂÔÛ ÓÙÈı ÌÂÓË appleúˆùâ ÓË È fiûˆì ÂÔÛ ÓÙÈı ÌÂÓË appleúˆùâ ÓË KYøTIK EYKYøTIK EIK Μεταγραφή και μετάφραση. Αυτές οι δύο διεργασίες είναι στενά συζευγμένες στα προκαρυωτικά, ενώ είναι χωροταξικά και χρονικά χωρισμένες στα ευκαρυωτικά. (Α) Στα προκαρυωτικά, το πρωτογενές μεταγράφημα χρησιμεύει ως mr και χρησιμοποιείται αμέσως ως εκμαγείο για τη σύνθεση πρωτεϊνών. (Β) Στα ευκαρυωτικά, οι πρόδρομοι του mr υφίστανται επεξεργασία και ματίζονται μέσα στον πυρήνα πριν από τη μεταφορά τους στο κυτταρόπλασμα για μετάφραση σε πρωτεΐνες. [Κατά J. Darnell, H. Lodish και D. Baltimore. Molecular ell Biology, 2η έκδοση. (Scientific merican Books, 1990), p. 230.] Μια δεύτερη κύρια διαφορά μεταξύ των προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών είναι η έκταση της επεξεργασίας του R. Αν και τόσο τα προκαρυωτικά όσο και τα ευκαρυωτικά τροποποιούν το tr και το rr, τα ευκαρυωτικά επεξεργάζονται σε πολύ μεγάλη έκταση το νεοσυντιθέμενο R που προορίζεται να γίνει mr. Πρωτογενή μεταγραφήματα (μόρια προ-mr), τα προϊόντα της δράσης της R πολυμεράσης, αποκτούν ένα κάλυμμα στα 5 -άκρα τους και μια ουρά πολυ(α) στα 3 -άκρα τους. Αυτό που είναι πιο σημαντικό είναι ότι σχεδόν όλα τα πρόδρομα μόρια του mr στα ανώτερα ευκαρωτικά ματίζονται (Εδάφιο 5.6.1). Τα ιντρόνια εξάγονται με ακρίβεια από τα πρωτογενή μεταγραφήματα και τα εξόνια συνδέονται για να σχηματιστούν τα ώριμα μόρια mr με συνεχή μηνύματα. Μερικά μόρια mr έχουν μόνο το ένα δέκατο του μεγέθους των προδρόμων τους, που μπορεί να είναι 30 kb ή και μεγαλύτερο. Ο τύπος του ματίσματος μπορεί να ρυθμίζεται κατά την πορεία της ανάπτυξης για να δημιουργήσει παραλλαγές σε ένα θέμα, όπως είναι οι μεμβρανικές και οι εκκρινόμενες μορφές μορίων αντισωμάτων. Το εναλλακτικό μάτισμα αυξάνει την ποικιλία των πρωτεϊνών στα ευκαρυωτικά και αποτελεί μια καθαρή απεικόνιση του γιατί το πρωτέωμα είναι πολύ πιο πολύπλοκο από το γονιδίωμα.

14 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 28 Σύνθεση και μάτισμα R Tο R στα ευκαρυωτικά κύτταρα συντίθεται από τρεις τύπους R πολυμεράσης Στα προκαρυωτικά, το R συντίθεται από ένα μόνο είδος πολυμεράσης. Αντίθετα, ο πυρήνας ενός ευκαρυωτικού περιέχει τρεις τύπους R πολυμεράσης που διαφέρουν ως προς την εξειδίκευση του εκμαγείου τους, τη θέση τους μέσα στον πυρήνα και την ευαισθησία τους σε αναστολείς (Πίνακας 28.2). Όλες αυτές οι πολυμεράσες είναι μεγάλες πρωτεΐνες που περιέχουν από 8 έως 14 υπομονάδες και έχουν μια συνολική σχετική μοριακή μάζα μεγαλύτερη από 500 kd. Η R πολυμεράση Ι βρίσκεται στους πυρηνίσκους, όπου μεταγράφει τη διαδοχική σειρά των γονιδίων για τα ριβοσωματικά R των 18 S, 5,8 S και 28 S (Εδάφιο ). Το άλλο μόριο ριβοσωματικού R (rr 5 S, Εδάφιο ) και όλα τα μόρια μεταφορικού R (Εδάφιο ) συντίθενται από την R πολυμεράση ΙΙΙ, η οποία βρίσκεται στο πυρηνόπλασμα και όχι στους πυρηνίσκους. Η R πολυμεράση ΙΙ, η οποία επίσης απαντά στο πυρηνόπλασμα, συνθέτει τα πρόδρομα μόρια του mr καθώς επίσης μερικά μικρά μόρια R όπως εκείνα του μηχανισμού ματίσματος (Εδάφιο ). Αν και όλες οι ευκαρυωτικές R πολυμεράσες είναι ομόλογες μεταξύ τους και με την προκαρυωτική R πολυμεράση, η R πολυμεράση ΙΙ περιέχει μια μοναδική καρβοξυ-τελική δομική περιοχή στην υπομονάδα των 220 kd. Η δομική αυτή περιοχή είναι ασυνήθης διότι περιέχει πολλαπλές επαναλήψεις μιας ομόφωνης αλληλουχίας YSTSS. Η δραστικότητα της R πολυμεράσης ΙΙ ρυθμίζεται από φωσφορυλιώσεις στα κατάλοιπα σερίνης και θρεονίνης της καρβοξυ-τελικής δομικής περιοχής. Μια άλλη κύρια διάκριση μεταξύ των πολυμερασών έγκειται στην απόκρισή τους προς την τοξίνη α-αμανιτίνη, ένα κυκλικό οκταπεπτίδιο το οποίο περιέχει μερικά τροποποιημένα αμινοξέα. H H 2 H H H 3 H S H H H H 3 H 2 H H H H H H 3 -Ì ÓÈÙ ÓË ΠΙΝΑΚΑΣ 28.2 Eυκαρυωτικές R πολυμεράσες Tύπος Θέση Kυτταρικά μεταγραφήματα Ευαισθησία στην α-αμανιτίνη I Πυρηνίσκος rr 18 S, 5,8 S και 28 S νθεκτική II Πυρηνόπλασμα πρόδρομα μόρια mr ναστέλλεται ισχυρά και snr III Πυρηνόπλασμα tr και rr 5 S ναστέλλεται από υψηλές συγκεντρώσεις

15 Η α-αμανιτίνη παράγεται από το δηλητηριώδες μανιτάρι manita phaloides, το οποίο ονομάζεται επίσης κύπελλο θανάτου ή δολοφονικός άγγελος (Eικόνα 28.16). Περισσότεροι από 100 θάνατοι προκαλούνται παγκοσμίως κάθε χρόνο από την κατανάλωση δηλητηριωδών μανιταριών. Η α-αμανιτίνη δεσμεύεται πολύ ισχυρά (K d = 10 nm) στην R πολυμεράση ΙΙ, και με τον τρόπο αυτό εμποδίζει τη φάση επιμήκυνσης της σύνθεσης R. Υψηλότερες συγκεντρώσεις α-αμανιτίνης (1 μμ) αναστέλλουν την πολυμεράση ΙΙΙ, ενώ η πολυμεράση Ι είναι ανθεκτική στην τοξίνη. Αυτό το σχήμα της ευαισθησίας είναι εξαιρετικά συντηρημένο σε όλο το ζωϊκό και φυτικό βασίλειο. 893 Eυκαρυωτική μεταγραφή και μετάφραση Στοιχεία με δράση cis και trans: οι κλειδαριές και τα κλειδιά της μεταγραφής Τα ευκαρυωτικά γονίδια, όπως τα αντίστοιχα προκαρυωτικά, χρειάζονται προαγωγείς για την έναρξη της μεταγραφής. Κάθε ένας από τους τρεις τύπους πολυμερασών αναγνωρίζει διαφορετικούς προαγωγείς. Η R πολυμεράση Ι μεταγράφει μόνο από ένα είδος προαγωγέα, ο οποίος υπάρχει μόνο σε γονίδια rr και περικλείει τη θέση έναρξης. Σε μερικά γονίδια, η R πολυμεράση ΙΙΙ αποκρίνεται σε προαγωγείς που βρίσκονται στην κανονική ανοδική θέση. Σε άλλα γονίδια, αποκρίνεται σε προαγωγείς που βρίσκονται στα γονίδια καθοδικά της θέσης έναρξης. Οι προαγωγείς για την R πολυμεράση ΙΙ μπορεί να είναι απλοί ή πολύπλοκοι (Εδάφιο ). Όπως και στην περίπτωση των προκαρυωτικών, οι προαγωγείς βρίσκονται πάντοτε στο ίδιο μόριο D όπου βρίσκεται και το γονίδιο που ρυθμίζουν. Συνεπώς, οι προαγωγείς αναφέρονται ως στοιχεία με δράση cis. Ωστόσο, οι προαγωγείς δεν είναι ο μόνος τύπος στοιχείων D που έχουν δράση cis. Τα ευκαρυωτικά και οι ιοί τους περιέχουν επιπλέον ενισχυτές (enhancers). Αυτές οι αλληλουχίες D, αν και δεν είναι οι ίδιες προαγωγείς, μπορούν να αυξήσουν σημαντικά την αποτελεσματικότητα των προαγωγέων. Είναι εξαιρετικά ενδιαφέρον το ότι οι θέσεις των ενισχυτών σχετικά με τους προαγωγείς δεν είναι καθορισμένες. Οι θέσεις αυτές μπορεί να ποικίλλουν ουσιαστικά. Οι ενισχυτές παίζουν καθοριστικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης σε ειδικούς ιστούς ή στάδια της ανάπτυξης (Εδάφιο ). Οι αλληλουχίες των στοιχείων του D που έχουν δράση cis είναι θέσεις δέσμευσης πρωτεϊνών, οι οποίες ονομάζονται παράγοντες μεταγραφής. Μια τέτοια πρωτεΐνη συχνά ονομάζεται παράγοντας με δράση trans, διότι μπορεί να κωδικεύεται από ένα γονίδιο σε ένα μόριο D διαφορετικό από εκείνο που περιέχει το γονίδιο το οποίο ρυθμίζεται. Η δέσμευση ενός παράγοντα μεταγραφής στη σχετική αλληλουχία του στο D βοηθά την R πολυμεράση να εντοπίσει την κατάλληλη θέση έναρξης. Θα συνεχίσουμε την έρευνά μας για τη μεταγραφή με την εξέταση αυτών των στοιχείων με δράση cis και trans. EIK Δηλητήριο R πολυμεράσης. Το manita phaloides, ένα δηλητηριώδες μανιτάρι που παράγει α-αμανιτίνη. [Κατά. Lincoff και D. H. Mitchel, Τoxic and Hollucinogenic Mushroom oisoning (Van ostrand Reinhold, 1977), p.30.] ι περισσότεροι προαγωγείς για την R πολυμεράση II περιέχουν ένα πλαίσιο TT κοντά στη θέση έναρξης της μεταγραφής Οι προαγωγείς για την R πολυμεράση ΙΙ, όπως εκείνοι για τις βακτηριακές πολυμεράσες, είναι τοποθετημένοι στην πλευρά 5 της θέσης έναρξης της μεταγραφής. Τα αποτελέσματα πειραμάτων μεταλλαξιγένεσης, μελετών αποτύπωσης και συγκρίσεις πολλών γονιδίων ανώτερων ευκαρυωτικών οργανισμών έχουν δείξει τη σημασία αρκετών περιοχών ανοδικά της θέσης έναρξης. Για τα περισσότερα γονίδια που μεταγράφονται από την R πολυμεράση ΙΙ το πιο σημαντικό στοιχείο με δράση cis ονομάζεται πλαίσιο ΤΑΤΑ με βάση την ομόφωνη αλληλουχία του (Eικόνα 28.17). Το πλαίσιο ΤΑΤΑ επικεντρώνεται συνήθως μεταξύ των θέσεων 30 και 100. Επισημαίνεται ότι το ευκαρυωτικό πλαίσιο ΤΑΤΑ μοιάζει πολύ με την προκαρυωτική αλληλουχία 10 T T Ï ÛÈÔ TT EIK Πλαίσιο ΤΑΤΑ. Συγκρίσεις των αλληλουχιών περισσότερων από 100 ευκαρυωτικών προαγωγέων οδήγησαν στην ομόφωνη αλληλουχία που φαίνεται. Οι δείκτες σημειώνουν τη συχνότητα (%) της βάσης σε κάθε θέση.

16 894 (ΤΑΤΑΑΤ), ΚΕΦΑΛΑΙΟ 28 Σύνθεση και μάτισμα R T T Ï ÛÈÔ T Ï ÛÈÔ EIK Πλαίσιο T και πλαίσιο. Ομόφωνες αλληλουχίες των πλαισίων T και ευκαρυωτικών προαγωγέων για πρόδρομα μόρια mr D TT D TT D TT D TT D TT D TT F F F B B B R appleôï ÌÂÚ ÛË II B R appleôï ÌÂÚ ÛË II EÎÌ ÁÂ Ô D EIK Έναρξη της μεταγραφής. Οι παράγοντες μεταγραφής TFII, B, D, E και F είναι ουσιώδεις για την έναρξη της μεταγραφής από την R πολυμεράση ΙΙ. Η βήμα-προς-βήμα συναρμολόγηση αυτών των γενικών παραγόντων μεταγραφής αρχίζει με τη δέσμευση του TFIID (πορφυρό) στο πλαίσιο ΤΑΤΑ. Το βέλος σημειώνει τη θέση έναρξης της μεταγραφής. [Κατά L. uarente. Trends enet. 8(1992):28.] E αλλά βρίσκεται πολύ μακρύτερα από τη θέση έναρξης. Η μετάλλαξη μίας μόνον βάσης στο πλαίσιο ΤΑΤΑ μειώνει σημαντικά τη δραστικότητα του προαγωγέα. Επομένως, το σημαντικό στοιχείο είναι η ακριβής αλληλουχία και όχι απλώς η περιεκτικότητα σε ΑΤ. Το πλαίσιο ΤΑΤΑ είναι απαραίτητο αλλά όχι αρκετό για ισχυρή δραστικότητα προαγωγέα. Πρόσθετα στοιχεία είναι τοποθετημένα μεταξύ των θέσεων 40 και 150. Πολλοί προαγωγείς περιέχουν ένα πλαίσιο T και μερικοί άλλοι ένα πλαίσιο (Eικόνα 28.18). Ιδιοσυστατικά γονίδια (γονίδια τα οποία εκφράζονται συνεχώς και δεν ρυθμίζονται) τείνουν να φέρουν πλαίσια στους προαγωγείς τους. Οι θέσεις αυτών των ανοδικών αλληλουχιών ποικίλλουν από τον ένα στον άλλο προαγωγέα, σε αντίθεση με τη μάλλον σταθερή τοποθεσία της αλληλουχίας 35 των προκαρυωτικών. Μια άλλη διαφορά είναι ότι τα πλαίσια T και μπορεί να είναι αποτελεσματικά όταν βρίσκονται στον κλώνο-εκμαγείο (αντινοηματικό), σε αντίθεση με την αλληλουχία 35, η οποία πρέπει να βρίσκεται στο κωδικεύοντα (νοηματικό) κλώνο. Οι διαφορές αυτές μεταξύ προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών αντανακλούν ουσιαστικά διαφορετικούς μηχανισμούς για την αναγνώριση στοιχείων με δράση cis. Οι αλληλουχίες 10 και 35 των προκαρυωτικών προαγωγέων αντιστοιχούν σε θέσεις δέσμευσης της R πολυμεράσης και του σχετιζόμενου με αυτή παράγοντα σ. Αντίθετα, τα πλαίσια ΤΑΤΑ, T και καθώς και άλλα στοιχεία με δράση cis στους ευκαρυωτικούς προαγωγείς, αναγνωρίζονται από πρωτεΐνες διαφορετικές από την ίδια την R πολυμεράση H πρωτεΐνη που δεσμεύεται στο πλαίσιο TT αρχίζει τη συναρμολόγηση του ενεργού συμπλόκου μεταγραφής Τα στοιχεία με δράση cis αποτελούν μέρος μόνο του γρίφου της ευκαρυωτικής γονιδιακής έκφρασης. Χρειάζονται επίσης παράγοντες μεταγραφής που δεσμεύονται στα στοιχεία αυτά. Παραδείγματος χάριν, η R πολυμεράση ΙΙ οδηγείται στη θέση έναρξης από ένα σύνολο παραγόντων μεταγραφής που είναι γνωστοί συλλογικά ως TFII (τα αρχικά TF προέρχονται από τις λέξεις transcription factors = παράγοντες μεταγραφής, και το ΙΙ αναφέρεται στην R πολυμεράση ΙΙ). Ξεχωριστοί παράγοντες TFII ονομάζονται TFII, TFIIB κ.λπ. Η έναρξη αρχίζει με τη δέσμευση του TFIID στο πλαίσιο ΤΑΤΑ (Eικόνα 28.19). Το καθοριστικό αρχικό γεγονός είναι η αναγνώριση του πλαισίου ΤΑΤΑ από την πρωτεΐνη που δεσμεύεται στο πλαίσιο ΤΑΤΑ (ΤΒΡ), ένα συστατικό 30 kd του συμπλόκου TFIID των 700 kd. Η ΤΒΡ δεσμεύεται 10 5 φορές πιο ισχυρά στο πλαίσιο ΤΑΤΑ από ό,τι σε μη σχετικές αλληλουχίες. Η σταθερά διάστασης του συγκεκριμένου συμπλόκου είναι περίπου 1 nm. Η ΤΒΡ είναι μια πρωτεΐνη με σχήμα σέλας που αποτελείται από δύο όμοιες δομικές περιοχές (Εδάφιο 7.3.3, Eικόνα 28.20). Το πλαίσιο ΤΑΤΑ του D δεσμεύεται στην κοίλη επιφάνεια της ΤΒΡ. Η δέσμευση αυτή επάγει μεγάλες αλλαγές της στερεοδιάταξης του δεσμευμένου D. Η δίκλωνη έλικα ξετυλίγεται αρκετά ώστε να διευρύνει τη μικρή της αύλακα, διευκολύνοντας την εκτεταμένη επαφή με τους αντιπαράλληλους κλώνους β της κοίλης πλευράς της ΤΒΡ. Υδροφοβικές αλληλεπιδράσεις είναι κυρίαρχες στην επιφάνεια επαφής. Τέσσερα κατάλοιπα φαινυλαλανίνης, παραδείγματος χάριν, περιλαμβάνονται μεταξύ των ζευγών βάσεων του πλαισίου ΤΑΤΑ. Γενικά, η ευλυγισία των αλληλουχιών που είναι πλούσιες σε ζεύγη ΑΤ αξιοποιείται εδώ για την κάμψη του D. Αμέσως έξω από το πλαίσιο ΤΑΤΑ επανασυνδέεται η κλασική δομή του Β-D. Αυτό το σύμπλοκο είναι σαφώς ασύμμετρο. Η ασυμμετρία είναι κρίσιμη για να εξειδικεύσει μια μοναδική θέση έναρξης και για να εξασφαλίσει την εξέλιξη της μεταγραφής προς μία μόνο κατεύθυνση.

17 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΓΙΑ ΤΟ ΧΗΜΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ Η ΤΒΡ που δεσμεύεται στο πλαίσιο ΤΑΤΑ είναι η καρδιά του συμπλόκου έναρξης (βλ. Eικόνα 28.19). Η επιφάνεια της σέλας της ΤΒΡ παρέχει θέσεις για την πρόσδεση και άλλων συστατικών (Eικόνα 28.21). Πρόσθετοι παράγοντες μεταγραφής συναρμολογούνται στον πυρήνα αυτόν με μια ορισμένη σειρά. Πρώτα στρατολογείται ο TFII, ακολουθούμενος από τον TFIIB και στη συνέχεια τον TFIIF μια ελικάση εξαρτώμενη από την ΑΤΡ, που αρχικά χωρίζει τους δύο κλώνους του D για την πολυμεράση. Τελικά, η R πολυμεράση ΙΙ και στη συνέχεια ο TFIIE ενώνονται με τους άλλους παράγοντες για να σχηματίσουν ένα σύμπλοκο που ονομάζεται βασικός μηχανισμός μεταγραφής. Κάποια στιγμή κατά τον σχηματισμό του συμπλόκου αυτού η καρβοξυ-τελική δομική περιοχή της πολυμεράσης φωσφορυλιώνεται στα κατάλοιπα της σερίνης και θρεονίνης, μια διεργασία που απαιτείται για μια επιτυχημένη έναρξη. Η σημασία της καρβοξυ-τελικής δομικής περιοχής τονίζεται από την ανακάλυψη ότι ζυμομύκητες που περιέχουν μεταλλαγμένη R πολυμεράση ΙΙ με λιγότερες από 10 επαναλήψεις δεν είναι βιώσιμοι. Οι περισσότεροι από τους παράγοντες μεταγραφής ελευθερώνονται πριν η πολυμεράση αφήσει τον προαγωγέα και στη συνέχεια μπορούν να συμμετάσχουν σε έναν άλλο κύκλο έναρξης. ÚˆÙÂ ÓË Ô ÚÔÛ ÓÂÙ È ÛÙÔ Ï ÛÈÔ TT TFII EIK Συναρμολόγηση του συμπλόκου έναρξης. Ένα τριπλό σύμπλοκο μεταξύ της πρωτεΐνης που δεσμεύεται στο πλαίσιο ΤΑΤΑ (πορφυρό), του TFII (πορτοκαλί) και του D. Ο TFII αλληλεπιδρά αρχικά με την άλλη πρωτεΐνη. Αν και τα βακτήρια δεν έχουν ΤΒΡ, τα αρχαία χρησιμοποιούν ένα μόριο ΤΒΡ το οποίο είναι δομικά παρόμοιο με την ευκαρυωτική πρωτεΐνη. Πράγματι, διεργασίες μεταγραφικού ελέγχου στα αρχαία είναι, γενικά, πολύ πιο όμοιες με εκείνες των ευκαρυωτικών από ό,τι είναι οι διεργασίες των βακτηρίων. Πολλά συστατικά της ευκαρυωτικής μεταγραφικής μηχανής έχουν εξελιχθεί από έναν πρόγονο των αρχαίων Πολλοί παράγοντες μεταγραφής αλληλεπιδρούν με ευκαρυωτικούς προαγωγείς Το βασικό μεταγραφικό σύμπλοκο που περιγράφηκε στο Εδάφιο αρχίζει τη μεταγραφή με σχετικά χαμηλή συχνότητα. Πρόσθετοι παράγοντες μεταγραφής οι οποίοι δεσμεύονται σε άλλες θέσεις χρειάζονται για την επίτευξη υψηλών ρυθμών σύνθεσης R και για την επιλεκτική διέγερση ειδικών γονιδίων. Ενισχυτικές θέσεις ανοδικά του μηνύματος ευκαρυωτικών γονιδίων ποικίλλουν τόσο ως προς την αλληλουχία όσο και ως προς τη θέση. Η ποικιλία τους υποδηλώνει ότι αναγνωρίζονται από πολλές διαφορετικές ειδικές πρωτεΐνες. Πράγματι, πολλοί παράγοντες μεταγραφής έχουν απομονωθεί και οι θέσεις δέσμευσής τους έχουν προσδιοριστεί με πειράματα αποτύπωσης (Eικόνα 28.22). Παραδείγματος χάριν, ο Sp1, μια πρωτεΐνη περίπου 100 kd από 895 Eυκαρυωτική μεταγραφή και μετάφραση EIK Το σύμπλοκο που σχηματίζεται από την πρωτεΐνη η οποία δεσμεύεται στο πλαίσιο ΤΑΤΑ. Η δομή της πρωτεΐνης που μοιάζει με σέλα κάθεται σε ένα τμήμα D που είναι αρκετά ξετυλιγμένο και λυγισμένο.

18 896 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 28 Σύνθεση και μάτισμα R SV Ÿ ÈÌÔ R ÚÒÈÌÔ R () DHFR Ï ÛÈÔ R (B) ÔÓ ÈÔ ıâúìèî Î Ù appleïëí ÙÔÈ Â Ô ıâúìèî Î Ù appleïëí TT R EIK Περιοχές πρόσδεσης παραγόντων μεταγραφής. Αυτές οι πολλαπλές θέσεις πρόσδεσης παραγόντων μεταγραφής χαρτογραφήθηκαν με αποτύπωση. (Α) Πρόσδεση του Sp1 (πράσινο) σε ιικό προαγωγέα του SV40 και στον προαγωγέα για την αναγωγάση του διυδροφυλλικού (DHFR). (B) Πρόσδεση του HSTF (μπλε) σε έναν προαγωγέα θερμικής καταπληξίας της Drosophila. [Κατά W.S. Dynan και R. Tjan, ature, 316(1985):774.] κύτταρα θηλαστικών, προσδένεται σε προαγωγείς που περιέχουν πλαίσια. Το δίκλωνο D του ιού SV40 (ενός καρκινογόνου ιού που μολύνει κύτταρα πιθήκων) περιέχει πέντε πλαίσια σε περιοχές 50 έως 100 bp ανοδικά ή καθοδικά των θέσεων έναρξης της μεταγραφής. Ο παράγοντας μεταγραφής που δεσμεύεται στη θέση T (TFØ ονομάζεται και F1), μια πρωτεΐνη 60 kd από κύτταρα θηλαστικών, προσδένεται στο πλαίσιο T. Ένας παράγοντας μεταγραφής θερμικής καταπληξίας (HSTF) εκφράζεται στη Drosophila μετά από απότομη αύξηση της θερμοκρασίας. Αυτή η πρωτεΐνη των 93 kd που δεσμεύεται σε D αναγνωρίζει την αλληλουχία: 5 -T-3 Υπάρχουν αρκετά αντίγραφα της αλληλουχίας αυτής, γνωστής ως στοιχείο απόκρισης στη θερμική καταπληξία, που αρχίζουν 15 bp ανοδικά του πλαισίου ΤΑ- ΤΑ. Ο HSTF διαφέρει από την σ 32, μια πρωτεΐνη θερμικής καταπληξίας της E. coli (Εδάφιο ) ως προς το ότι δεσμεύεται άμεσα σε στοιχεία απόκρισης προαγωγέων θερμικής καταπληξίας αντί να συνδέεται πρώτα με την R πολυμεράση Eνισχυτικές αλληλουχίες μπορούν να διεγείρουν τη μεταγραφή σε θέσεις έναρξης που βρίσκονται χιλιάδες βάσεις μακριά Οι δραστικότητες πολλών προαγωγέων στα ανώτερα ευκαρυωτικά αυξάνονται σημαντικά από ένα άλλο είδος στοιχείου με δράση cis, το οποίο ονομάζεται ενισχυτής. Οι αλληλουχίες ενισχυτών δεν έχουν δική τους δραστικότητα προαγωγέα. Μπορούν όμως να ασκήσουν τις διεγερτικές δράσεις τους από αποστάσεις μερικών χιλιάδων βάσεων. Μπορούν να βρίσκονται ανοδικά, καθοδικά, ή ακόμη και στη μέση ενός γονιδίου που έχει μεταγραφεί. Ακόμη, οι ενισχυτές είναι αποτελεσματικοί όταν υπάρχουν σε οποιαδήποτε αλυσίδα του D (ισότιμα και σε κάθε κατεύθυνση). Οι ενισχυτές των ζυμομυκήτων είναι γνωστοί ως ανοδικές ενισχυτικές αλληλουχίες (upstream activator sequences, S). Ένας συγκεκριμένος ενισχυτής είναι αποτελεσματικός μόνο σε ορισμένα κύτταρα. Παραδείγματος χάριν, ο ενισχυτής της ανοσοσφαιρίνης λειτουργεί στα λεμφοκύτταρα Β αλλά όχι σε άλλα. Καρκίνος μπορεί να προκύψει εάν η σχέση μεταξύ γονιδίων και ενισχυτών διακοπεί. Στο λέμφωμα Burkitt και τη λευχαιμία κυττάρων Β μια χρωμοσωματική μετατόπιση φέρνει το πρωτο-ογκογονίδιο myc (που κωδικεύει έναν παράγοντα μεταγραφής) υπό τον έλεγχο ενός ισχυρού ενισχυτή ανοσοσφαιρίνης. Η επακόλουθη απορρύθμιση του γονιδίου myc πιστεύεται ότι παίζει ρόλο στην πρόοδο του καρκίνου. Παράγοντες μεταγραφής και άλλες πρωτεΐνες που προσδένονται σε ρυθμιστικές θέσεις του D μπορούν να θεωρηθούν ως κωδικοί αριθμοί που συνεργειακά ανοίγουν πολλαπλές κλειδαριές, δίνοντας πρόσβαση στην R πολυμεράση για ειδικά

19 γονίδια. Η ανακάλυψη των προαγωγέων και των ενισχυτών έχει ανοίξει την πόρτα για την κατανόηση του πώς γονίδια εκφράζονται επιλεκτικά στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Η ρύθμιση της μεταγραφής γονιδίων, η οποία περιγράφεται στο Κεφάλαιο 31, αποτελεί τον θεμελιώδη τρόπο για τον έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης. 897 Eπεξεργασία των προϊόντων της μεταγραφής 28.3 ΤΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ ΚΑΙ ΤΩΝ ΤΡΙΩΝ ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΩΝ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΩΝ ΥΦΙΣΤΑΝΤΑΙ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑ Ουσιαστικά, όλα τα αρχικά προϊόντα της μεταγραφής στα ευκαρυωτικά υφίστανται περαιτέρω επεξεργασία. Παραδείγματος χάριν, πρόδρομα μόρια tr μετατρέπονται σε ώριμα μόρια tr μετά από μια σειρά μεταβολών: διάσπαση μιας αλληλουχίας-οδηγού του 5 -άκρου, μάτισμα για την αφαίρεση του ιντρονίου, αντικατάσταση της 3 -τελικής αλληλουχίας από την αλληλουχία και τροποποίηση μερικών βάσεων (Eικόνα 28.23). Μια σειρά από ένζυμα μπορεί να δρουν στην αλυσίδα του ριβονουκλεϊκού οξέος ή στις βάσεις που το αποτελούν για να επιτύχουν το τελικό προϊόν. ËÁfi H m m y IÓÙÚfiÓÈÔ ÚÒÈÌÔ ÌÂÙ ÁÚ ÊËÌ EappleÂÍÂÚÁ Û m D D D D D m m H m m T y D y 1 y ÓÙÈΈ ÎÈÔ flúèìô tr ÛË ÛÌ ÛË ÌÈÓÔÍ Ô EIK Επεξεργασία πρόδρομων μορίων μεταφορικού R. Η μετατροπή ενός πρόδρομου μορίου tr ζυμομυκήτων σε ώριμο tr χρειάζεται την αφαίρεση ενός ιντρονίου 14 νουκλεοτιδίων (κίτρινο), τη διάσπαση μιας αλληλουχίας του 5 άκρου (πράσινο) και την αφαίρεση του με την προσάρτηση της αλληλουχίας στο 3 -άκρο (κόκκινο). Επιπλέον, μερικές βάσεις τροποποιούνται Tα άκρα του μεταγραφήματος του προ-mr αποκτούν ένα 5 -κάλυμμα και μια ουρά 3 -πολυ() Ίσως το προϊόν της μεταγραφής που υφίσταται την πιο εκτεταμένη τροποποίηση να είναι εκείνο της R πολυμεράσης ΙΙ: το μεγαλύτερο μέρος αυτού του R υφίσταται επεξεργασία σε mr. Το άμεσο προϊόν μιας R πολυμεράσης μερικές φορές αναφέρεται ως προ-mr. Τα περισσότερα μόρια προ-mr ματίζονται για την αφαίρεση των ιντρονίων. Επιπλέον, τα 5 - και 3 -άκρα τους τροποποιούνται, και αυτές οι μεταβολές διατηρούνται καθώς το προ-mr μετατρέπεται σε mr (Εδάφιο ). Όπως στα προκαρυωτικά, η ευκαρυωτική μεταγραφή συνήθως αρχίζει με Α ή. Ωστόσο, το τριφωσφορικό 5 -άκρο της νεοσυντιθέμενης αλυσίδας R τροποποιείται αμέσως. Στην αρχή ελευθερώνεται μια φωσφορική ομάδα με υδρόλυση. Στη συνέχεια, το διφωσφορικό 5 -άκρο προσβάλλει το α-άτομο του φωσφόρου μιας T για να σχηματιστεί ένας πολύ ασυνήθης 5-5 τριφωσφορικός σύνδεσμος. Αυτό το

20 MÂı ÏÈˆÌ ÓË ÛÙ Î Ï ÌÌ Ù 0, 1 Î È 2 H ÛË H 3 MÂı ÏÈˆÌ ÓË ÛÙ Î Ï ÌÌ Ù 1 Î È 2 ÛË H 3 MÂı ÏÈˆÌ ÓË ÛÙÔ Î Ï ÌÌ 2 H H 3 + H EIK Καλύπτοντας το 5 -άκρο. Καλύμματα στο 5 -άκρο ευκαρυωτικού mr περιλαμβάνουν 7-μεθυλογουανυλικό (κόκκινο) προσαρτημένο με έναν τριφωσφορικό σύνδεσμο στη ριβόζη του 5 -άκρου. Καμία από τις ριβόζες δεν είναι μεθυλιωμένη στο κάλυμμα 0, μία είναι μεθυλιωμένη στο κάλυμμα 1 και οι δύο είναι μεθυλιωμένες στο κάλυμμα 2. K Ï ÌÌ K Ï ÌÌ EÎÌ ÁÂ Ô D H 2 ÂÔÛ ÓÙÈı ÌÂÓÔ R Ì È Ûapple ÛË T i () n ÔÏ ÂÓ ÏÈˆÌ ÓÔ appleúfi ÚÔÌÔ mr διάκριτο άκρο ονομάζεται κάλυμμα (Eικόνα 28.24). Στη συνέχεια, το άζωτο Ν- 7 της ακραίας γουανίνης μεθυλιώνεται από την S-αδενοσυλομεθειονίνη για να σχηματιστεί το κάλυμμα 0. Οι παρακείμενες ριβόζες μπορούν να μεθυλιωθούν και να σχηματιστεί το κάλυμμα 1 ή το κάλυμμα 2. Σε αντίθεση με το αγγελιαφόρο R και μικρά μόρια R που συμμετέχουν στο μάτισμα, τα μόρια του μεταφορικού και του ριβοσωματικού R δεν έχουν καλύμματα. Τα καλύμματα συμβάλλουν στη σταθερότητα των μορίων mr, προστατεύοντας τα 5 -άκρα τους από τη δράση φωσφατασών και νουκλεασών. Επιπλέον, τα καλύμματα ενισχύουν τη μετάφραση του mr από τα ευκαρυωτικά συστήματα σύνθεσης πρωτεϊνών (Υποκεφάλαιο 29.5). Όπως αναφέρθηκε νωρίτερα, το προ-mr τροποποιείται επίσης στο 3 άκρο. Τα περισσότερα ευκαρυωτικά mr περιέχουν μια πολυαδενυλική, πολυ(α), ουρά σε αυτό το άκρο, η οποία προστίθεται μετά τον τερματισμό της μεταγραφής. Επομένως, το D δεν κωδικεύει αυτήν την ουρά πολυ(α). Στην πραγματικότητα, το νουκλεοτίδιο που προηγείται της ουράς πολυ(α) δεν είναι το τελευταίο νουκλεοτίδιο που μεταγράφεται. Μερικά πρωτογενή μεταγραφήματα περιέχουν εκατοντάδες νουκλεοτίδια πέρα από το 3 -άκρο του ώριμου mr. Πώς όμως το 3 -άκρο του προ-mr παίρνει την τελική μορφή του; Ευκαρυωτικά πρωτογενή μεταγραφήματα διασπώνται από μια ειδική ενδονουκλεάση, η οποία αναγνωρίζει την αλληλουχία (Eικόνα 28.25). Η διάσπαση δεν γίνεται εάν αφαιρεθεί η αλληλουχία αυτή ή ένα τμήμα 20 νουκλεοτιδίων από το 3 -άκρο. Η παρουσία εσωτερικών αλληλουχιών σε ορισμένα ώριμα μόρια mr δείχνει ότι η είναι μόνο ένα μέρος του σήματος διάσπασηςø αυτό που επίσης είναι σημαντικό είναι το περιβάλλον της. Μετά τη διάσπαση από την ενδονουκλεάση, μια πολυ(α) πολυμεράση προσθέτει περίπου 250 αδενυλικά κατάλοιπα στο 3 -άκρο του μεταγραφήματος. Στην αντίδραση αυτή η ΑΤΡ είναι ο δότης αδενυλικών. Ο ρόλος της ουράς πολυ(α) δεν έχει ακόμη διευκρινιστεί με βεβαιότητα, παρά τις μεγάλες προσπάθειες. Ωστόσο, συσσωρεύονται ολοένα και περισσότερες ενδείξεις ότι ενισχύει την αποτελεσματικότητα της μετάφρασης και τη σταθερότητα του mr. Η παρεμπόδιση της σύνθεσης της ουράς πολυ(α) μετά από έκθεση σε 3 -δεοξυαδενοσίνη (κορδυσεπίνη) δεν παρεμβαίνει στη σύνθεση του πρωτογενούς μεταγραφήματος. Το μόριο È Ûapple ÛË applefi ÂÈ ÈÎ ÂÓ ÔÓÔ ÎÏ ÛË ÚÔÛı ÎË Ô Ú applefi ÙËÓ appleôï () appleôï ÌÂÚ ÛË H αγγελιαφόρου R που δεν έχει ουρά πολυ(α) μπορεί να μεταφέρεται έξω από τον πυρήνα. Ένα μόριο mr, όμως, που δεν έχει ουρά πολυ(α) συνήθως είναι πολύ λιγότερο αποτελεσματικό ως εκμαγείο για σύνθεση πρωτεϊνών από ό,τι αυτό που έχει ουρά πολυ(α). Πράγματι, μερικά μόρια mr αποθηκεύονται με μια μη αδενυλιωμένη μορφή και αποκτούν την ουρά πολυ(α) μόνον όταν επίκειται μετάφραση. Η περίοδος ημιζωής ενός μορίου mr μπορεί να προσδιοριστεί εν μέρει από τον ρυθμό αποικοδόμησης της ουράς πολυ(α). EIK Πολυαδενυλίωση ενός πρωτογενούς μεταγραφήματος. Μια ειδική ενδονουκλεάση διασπά το R καθοδικά του. Στη συνέχεια η πολυ(α) πολυμεράση προσθέτει περίπου 250 κατάλοιπα αδενυλικών Ο μηχανισμός διόρθωσης του R αλλάζει τις πρωτεΐνες που κωδικεύονται από το mr Το περιεχόμενο της αλληλουχίας μερικών μορίων mr αλλάζει μετά τη μεταγραφή. Διόρθωση R (R editing) είναι ο όρος για μια αλλαγή της αλληλουχίας των βάσεων του R μετά τη μεταγραφή με διεργασίες διαφορετικές του ματίσματος. Η διόρθωση R είναι χαρακτηριστική σε μερικά συστήματα που έχουν ήδη συζητηθεί. Η απολιποπρωτεΐνη Β (apo-b) παίζει σημαντικό ρόλο στη μεταφορά τριακυλογλυκερολών και χοληστερόλης σχημα-