ΟΚΤΩΒΡΙΟΣ - ΝΟΕΜΒΡΙΟΣ - ΔΕΚΕΜΒΡΙΟΣ 2007 ΤΕΥΧΟΣ 44

Transcript

1 ΕΦΗΜΕΡΙΔΕΣ ΠΕΡΙΟΔΙΚΑ Χ + 7 ΟΚΤΩΒΡΙΟΣ - ΝΟΕΜΒΡΙΟΣ - ΔΕΚΕΜΒΡΙΟΣ 2007 ΤΕΥΧΟΣ 44 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΚΩΔ ΠΛΗΡΩΜΕΝΟ ΤΕΛΟΣ Ταχ. Γραφείο Κ Ε Μ Π Α Θ Αριθμός Άδειας 5207/07 ΕΚΔΟΤΩΝ ΕΛΛΗΝΙΚΗ ΕΤΑΙΡΕΙΑ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ - ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑΣ Αλωπεκής Αθήνα - τηλ.:

2

3 ΟΚΤΩΒΡΙΟΣ - ΝΟΕΜΒΡΙΟΣ - ΔΕΚΕΜΒΡΙΟΣ 2007, ΤΕΥΧΟΣ 44 Περιεχόμενα 4 LABTESTSONLINE στα Ελληνικά!!! 6 Σύντομη ιστορία της γενικής εξέτασης ούρων 10 Σχιζοφρένεια και γενετικοί παράγοντες 12 Οι Βιοαισθητήρες στην Κλινική Χημεία (Μέρος ΙΙ) 18 Συνεντεύξεις για τους Βιοαισθητήρες 20 Ταυτόχρονη ανίχνευση πρωτεϊνών ή DNA σε πραγματικό χρόνο με οπτοηλεκτρονικό βιοαισθητήρα μονολιθικά ολοκληρωμένο σε ψηφίδες πυριτίου 24 Ανίχνευση σημειακών μεταλλάξεων με βιοαισθητήρα DNA τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων 26 Προσεχή Συνέδρια Διοικητικό Συμβούλιο Πρόεδρος: Δ. Ρίζος Αντιπρόεδρος: Α. Σταθάκη-Φερδερίγου Γ. Γραμματέας: Ό. Παναγιωτάκης Αν. Γεν. Γραμματέας: Α. Χαλιάσος Ταμίας: Α. Ψαρρά Μέλη: Φ. Καράμπαμπα, Α. Διακουμή-Σπυροπούλου Ιδιοκτήτης: ΕΕΚΧ-ΚΒ Αλωπεκής Αθήνα Τηλ.: Fax: Διευθύντρια Σύνταξης Αικ. Ψαρρά Νοταρά 39, Αθήνα stcps@hol.gr Επιτροπή Σύνταξης Μ. Βικεντίου, Μ. Γαροφαλάκη, Α. Γρηγοράτου, Ε. Κώνστα, Κ. Κωνσταντινάκου, Β. Λόη, Ν. Παπαγεωργάκης Εκδότης Σ. Σταματόπουλος Focus on Health ΕΠΕ Δημιουργικός Σχεδιασμός Multimedia Trend ΕΠΕ Επιμέλεια - Παραγωγή Focus on Health ΕΠΕ Ιωάννου Γενναδίου 16, Αθήνα, Τηλ.: , Fax: info@focusonhealth.gr Κωδικός Διεύθυνσης Εποπτείας ΜΜΕ: 8153 Editorial Αγαπητοί συνάδελφοι, labtestsonline.com σας λέει κάτι αυτός ο δικτυακός τόπος (κοινότερα site); Αν µέχρι σήµερα δεν σας λέει τίποτα, σύντοµα θα λέει πολλά σε σας αλλά και στο γενικό κοινό, και µάλιστα στα Eλληνικά χάρη στη συνεργασία της ΕΕΚΧ-ΚΒ και της ΣΕΠ (Συνδέσµου Ελλήνων Προµηθευτών) Επιστηµών και Υγείας. Έτσι, οι Έλληνες -µε τον ορισµό του Ισοκράτη «Έλληνες εισίν οι της Ελληνικής παιδείας µετέχοντες» (ήθελα κάπου να το κολλήσω )- θα έχουµε την ευκαιρία, την ευκολία, τη δυνατότητα πρόσβασης στο πληροφοριακό υλικό που αφορά την εργαστηριακή ιατρική, στη γλώσσα µας, όπως οι Αµερικανοί και κάποιοι Ευρωπαίοι. ιαβάστε περισσότερα στο σχετικό άρθρο. Επίσης στο ελτίο αυτό: από το παρελθόν - «Η ιστορία της γενικής ούρων», από το µέλλον - Αφιέρωµα «Βιοαισθητήρες» µε eλληνική συµµετοχή! (Πώς λέµε στα συνέδρια µε διεθνή συµµετοχή). ιαβάστε, λοιπόν, για την ελληνική συµµετοχή στο µέλλον. Μπήκα στο γυµνάσιο µε 20 στην έκθεση, «Είµαι υπερήφανη που είµαι Ελληνίς» λέτε να µου βγαίνει κάτι τώρα; Και µετά από αυτή την ελληνική και εταιρική υπερηφάνεια σε τέτοιους παράξενους για τη χώρα καιρούς (καλή λέξη το παράξενος, το παίρνεις όπως προτιµάς) πρέπει να σας επιστήσω την προσοχή ότι οι εκλογές της Εταιρείας θα γίνουν µαζί µε το 8 ο Σεµινάριο Συνεχιζόµενης Εκπαίδευσης στο αµφιθέατρο του ΝΙΜΤΣ και όχι του Χαροκοπείου. Φυσικά, θα υπάρξει και άλλη ενηµέρωση. Με φιλικούς χαιρετισµούς Κατερίνα Ψαρρά Υ.Γ. Αν παρόλα αυτά κάποιοι πάνε να ψηφίσουν στο Χαροκόπειο, θα αποδειχθεί ότι δεν διαβάζουν το ελτίο και µάλιστα την επιστολή της εκδότριας και τότε τι κρίµα επιτέλους θα µετανιώσουν γι αυτήν τους την παράλειψη. 3

4 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ LABTESTSONLINE στα Ελληνικά!!! Η ΕΕΚΧ-ΚΒ, σε συνεργασία με τον ΣΕΠ Επιστημών και Υγείας, απέκτησε τα δικαιώματα της απόδοσης στα Ελληνικά του δικτυακού τόπου Labtestsonline. Labtestsonline.com είναι ο δικτυακός τόπος πληροφόρησης του κοινού για τις εργαστηριακές εξετάσεις, τη σημασία τους και τη χρησιμότητά τους. Η ASCC (American Society of Clinical Chemistry) ξεκίνησε αυτό το site στην Αμερική. Στην Ευρώπη έχει ήδη μεταφραστεί από τις αντίστοιχες επιστημονικές εταιρείες Κλινικής Χημείας στα Αγγλικά (UK), στα Ισπανικά και στα Γερμανικά. Επόμενη εταιρεία που ήδη προχώρησε σε επίσημη συμφωνία η ΕΕΚΧ-ΚΒ, όπως θα δείτε και στα αποσπάσματα που ακολουθούν. Έτσι, η ΕΕΚΧ-ΚΒ βρίσκεται στην πρωτοπορία, πριν από πολλές άλλες ευρωπαϊκές χώρες. Το χρωστάμε εξάλλου στη γλώσσα μας, από την οποία προήλθαν και οι περισσότεροι όροι που καλούμαστε να μεταφράσουμε τώρα. Για το σκοπό αυτό δημιουργήθηκε 6μελής Επιτροπή Συντονισμού του Project με τρεις εκπροσώπους της ΕΕΚΧ-ΚΒ, τους Δημήτρη Ρίζο, Αλέξανδρο Χαλιάσο και Κατερίνα Ψαρρά, και τρεις εκπροσώπους του ΣΕΠ, τους Χρύσανθο Μητρόπουλο, Μανώλη Κουταλά και Ηρακλή Παπαϊωάννου. Ομόφωνα εξελέγησαν ως Πρόεδρος της Ελληνικής Επιτροπής συντονισμού του project ο κ. Αλέξανδρος Χαλιάσος από την ΕΕΚΧ-ΚΒ και ο κ. Χρύσανθος Μητρόπουλος ως Αντιπρόεδρος από πλευράς ΣΕΠ, οι οποίοι θα είναι και οι εκπρόσωποι του LTO.GR στην Ευρωπαϊκή Επιτροπή του LTO. Ο κ. Αλέξανδρος Χαλιάσος ορίσθηκε εξάλλου από την ΕΕΚΧ-ΚΒ και Κεντρικός Συντονιστής (Supervisor), που θα λειτουργεί ως «Εκδότης» (Publisher) του Ελληνικού site. Μέσα στις φιλοδοξίες της ΕΕΚΧ-ΚΒ, παράλληλα με τη μετάφραση αυτή που θα παρουσιαστεί επίσημα στο ελληνικό κοινό στη διάρκεια του BCLF2008 και 7 ου Πανελληνίου Συνεδρίου Κλινικής Χημείας, είναι η δημιουργία λεξικού μετάφρασης των όρων της εργαστηριακής ιατρικής στα Ελληνικά. Παράλληλα ελπίζουμε να συνεισφέρουμε και εμείς στην έκδοση με δικά μας λήμματα που δεν έχουν ακόμη συμπεριληφθεί στο αμερικανικό site. Φιλόδοξα εγχειρήματα, αλλά μήπως φιλόδοξη δεν ήταν και η εκπαίδευση όλων μας με τα σεμινάρια Να και τα συγχαρητήρια My most sincere congratulations!! Gloria Galán Ugartemendía Communications & Public Affairs Manager EDMA - European Diagnostic Manufacturers Association The World is learning about lab tests European Launch of Lab Tests Online La Bibliothèque Solvay, Brussels 31 January

5 ΟΚΤΩΒΡΙΟΣ - ΝΟΕΜΒΡΙΟΣ - ΔΕΚΕΜΒΡΙΟΣ 2007, ΤΕΥΧΟΣ 44 Να και η πιο γλαφυρή και ευπαρουσίαστη παρουσίαση (ευ-παρουσίαση λοιπόν) του ΣΕΠ. Lab Tests Online Το Lab Tests Online είναι το μεγαλύτερο και πληρέστερο portal στο διαδίκτυο, που περιλαμβάνει πληροφορίες για τα κυριότερα κλινικά tests, τις σχετικές κλινικές συνθήκες και ασθένειες, καθώς και τα προγράμματα προληπτικού ελέγχου για τις διάφορες κατηγορίες και ηλικίες χρηστών. Lab Tests Online Το Lab Tests Online είναι το μεγαλύτερο και πληρέστερο portal στο διαδίκτυο, που περιλαμβάνει πληροφορίες για τα κυριότερα κλινικά tests, τις σχετικές κλινικές συνθήκες και ασθένειες, καθώς και τα προγράμματα προληπτικού ελέγχου για τις διάφορες κατηγορίες και ηλικίες χρηστών. Lab Tests Online Το Lab Tests Online είναι το με και πληρέστερο portal στο διαδί που περιλαμβάνει πληροφορίες κυριότερα κλινικά tests, τις σχετ κλινικές συνθήκες και ασθένειες και τα προγράμματα προληπτικ ελέγχου για τις διάφορες κατηγο ηλικίες χρηστών. Οι πληροφορίες αυτές απευθύνονται στους ίδιους τους ασθενείς και στους γενικούς γιατρούς παθολόγους και είναι ελεγμένες από την American Οι πληροφορίες Clinical Chemistry αυτές Society απευθύνονται και αντίστοιχα στους μέλη της ίδιους στις διάφορες τους ασθενείς Ευρωπα-καϊκές πληροφορίες χώρες. αυτές απευθύνονται στους ίδιους τους ασθενείς και στους γενικούς στους Οι γιατρούς παθολόγους και είναι ελεγμένες από την American Clinical Che γιατρούς παθολόγους και είναι ελεγμένες από την American Clinical Chemistry Society Με συντονισμένη και τα αντίστοιχα προσπάθεια μέλη της στις Society από διάφορες την και EDMA Ευρωπαϊκές τα το αντίστοιχα Lab χώρες. Tests Online μέλη υπάρχει της στις σε εκδόσεις διάφορες διαφόρων Ευρωπαϊκές χωρών όπως χώρες. Με Ιταλία, συντονισμένη Γερμανία, προσπάθεια Ισπανία, από Ουγγαρία, την EDMA Με συντονισμένη Πολωνία, Lab Tests Αγγλία, Online προσπάθεια Αυστραλία υπάρχει σε και από ΗΠΑ. την EDMA το Lab Tests Online υπάρ εκδόσεις διαφόρων χωρών όπως Ιταλία, Γερμανία, Ισπανία, Ουγγαρία, Πολωνία, Αγγλία, Το Lab Αυστραλία Tests Online και ΗΠΑ. επισκέπτονται εκδόσεις περίπου διαφόρων 1,5 εκατομμύρια χωρών χρήστες όπως απ Ιταλία, όλο τον κόσμο Γερμανία, ανά μήνα, Ισπανία, ενώ τα ευρω- Ουγγαρία, Το Lab Tests Online επισκέπτονται περίπου 1,5 εκατομμύρια χρήστες απ όλο παϊκά sites δέχονται περίπου Αγγλία, επισκέψεις Αυστραλία το μήνα. και ΗΠΑ. τον κόσμο ανά μήνα, ενώ τα ευρωπαϊκά sites δέχονται περίπου επισκέψεις Την προηγούμενη το μήνα. εβδομάδα Το οργανώθηκε Lab Tests στις Online Βρυξέλλες επισκέπτονται επίσημη τελετή περίπου για τη λειτουργία 1,5 εκατομμύρια του ευρωπαϊκού χρήστες Την προηγούμενη εβδομάδα οργανώθηκε στις Βρυξέλλες επίσημη τελετή για portal του Lab Tests Online, τον στην κόσμο οποία μετείχαν ανά μήνα, εκπρόσωποι ενώ της τα Ευρωπαϊκής ευρωπαϊκά Ένωσης sites των δέχονται Οργανώσεων περίπου των 300. λειτουργία του ευρωπαϊκού portal του Lab Tests Online, στην οποία μετείχαν εκπρόσωποι Ασθενών της Ευρωπαϊκής Επιστημονικής Ένωσης επισκέψεις Κοινότητας των Οργανώσεων και της το Βιομηχανίας των μήνα. Ασθενών της IVD. Επιστημονικής Κοινότητας και της Βιομηχανίας IVD. Σ αυτήν την εκδήλωση ανακοινώθηκε Την προηγούμενη η υπογραφή συμφωνίας εβδομάδα μεταξύ οργανώθηκε της EDMA, του στις Συνδέσμου Βρυξέλλες Ελλήνων επίσημη Προ- Σ αυτήν την εκδήλωση ανακοινώθηκε η υπογραφή συμφωνίας μεταξύ της τελετή EDMA μηθευτών, του Συνδέσμου Επιστημών Ελλήνων & Υγείας λειτουργία Προμηθευτών και της Ελληνικής Επιστημών του ευρωπαϊκού Εταιρίας & Υγείας Κλινικής και portal της Χημείας του και Lab Κλινικής Tests Βιοχημείας Online, για στην δημιουργία της Εταιρίας Ελληνικής Κλινικής έκδοσης Χημείας οποία μετε Ελληνικής εκπρόσωποι του και Lab Κλινικής Tests Online. Βιοχημείας για τη δημιουργία της Ελληνικής έκδοσης του Lab Tests Online. της Ευρωπαϊκής Ένωσης των Οργανώσεων των Ασθενών τ Επιστημονικής Κοινότητας και της Βιομηχανίας IVD. Σ αυτήν την εκδήλωση ανακοινώθηκε η υπογραφή συμφωνίας μεταξ Αλέξανδρος Χαλιάσος, EDMA, του Συνδέσμου Γραμματέας της Ελλήνων Ελληνικής Προμηθευτών Επιστημών & Υγείας Ελληνικής Εταιρίας Κλινικής Χημείας Χημείας και Κλινικής Βιοχημείας για τη και Κλινικής Βιοχημείας και δημιουργία της ο κος Ελληνικής Χρύσανθος έκδοσης του Lab Tests Online. O κος Αλέξανδρος Χαλιάσος, Γραμματέας της Ελληνικής Εταιρίας Κλινικής του Συνδέσμου Χημείας μαζί και με Κλινικής Βιοχημείας και ο κος Χρύσανθος Μητρό- Μητρόπουλος μέλος του ΔΣ την πουλος Γενική Διευθύντρια μέλος του της ΔΣ του Συνδέσμου μαζί με την Γενική Διευθύντρια EDMA της Christine EDMA Christine Tarrajat Tarrajat κατά την επίσημη ανακοίνωση της συμφωνίας για τη δημιουργία του Lab Tests Online στα ελληνικά. κατά την επίσημη ανακοίνωση της συμφωνίας για τη δημιουργία του Lab Tests Online στα ελληνικά. Αλέξανδρος Χαλ Γραμματέας της Εταιρίας Κλινική και Κλινικής Βιο ο κος Χρύσανθο Μητρόπουλος μ ΔΣ του Συνδέσμ την Γενική Διευθ EDMA 5 Christine κατά την επίσημ ανακοίνωση της

6 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ Σύντομη ιστορία της γενικής εξέτασης ούρων Πέτρος Λ. Καρκαλούσος Βιολόγος PhD, EurClinChem, Στατιστικός Msc Εισαγωγή Η γενική εξέταση των ούρων αποτελεί όχι μόνο την παλαιότερη εργαστηριακή εξέταση, αλλά και το παλαιότερο προγνωστικό εργαλείο στα χέρια της ιατρικής επιστήμης. Οι φιλολογικές και ιστορικές πηγές που υπάρχουν για αυτή την εξέταση είναι άφθονες και ξεκινούν πολλούς αιώνες προ Χριστού. Έτσι, αναφορές στην εξέταση των ούρων υπάρχουν σε αρχαία προϊνδουιστικά κείμενα στην Ινδία (στίχοι Damar Tantra, π.χ.), σε Βαβυλώνιους πάπυρους της ίδιας εποχής, αλλά και σε Αιγυπτιακά κείμενα (πάπυρος του Έβερου π.χ.). Το πρώτο ιατρικό ευρωπαϊκό κείμενο για την εξέταση των ούρων προέρχεται φυσικά από τον Ιπποκράτη ( π.χ.). Ο Ιπποκράτης κάνει αναφορά στα ούρα τόσο στο ανολοκλήρωτο έργο του «Περί Χυμών», όπου προτείνει τη δοκιμή των ούρων του ασθενούς, όσο και στο έργο του το «Βιβλίο της πρόγνωσης», όπου υπάρχει ειδικό κεφάλαιο για τη μακροσκοπική εξέταση των ούρων όπου σχολιάζει τις μεταβολές της σύστασης, του χρώματος και της οσμής των ούρων κατά τη διάρκεια του πυρετού σε ενήλικες και παιδιά. Η μεγάλη, όμως, τομή στη μελέτη των ούρων θα έρθει έξι αιώνες αργότερα από τον άλλο μεγάλο εκπρόσωπο της αρχαίας ιατρικής, τον Γαληνό (περίπου μ.χ.). Ο Γαληνός περιέγραψε τέσσερις ζωτικούς χυμούς μέσα στο ανθρώπινο σώμα (μαύρη χολή, κίτρινη χολή, φλέγμα και αίμα). Όλες οι παθήσεις οφείλονταν στη μεταβολή της κατανομής αυτών των τεσσάρων χυμών η οποία μπορούσε να διαγνωστεί μόνο με την εξέταση των ούρων και γι αυτό πρότεινε την καθημερινή τους εξέταση. Τα ούρα, σύμφωνα με τον ίδιο, αποτελούσαν το μέσο διάγνωσης ασθενειών των νεφρών, της ουρήθρας και της ουροδόχου κύστεως. Το έργο του Γαληνού ήταν σταθμός για τη μελέτη των ούρων. Από αυτόν ξεκινά στην ουσία η μακρά εξέλιξη της «ουροσκοπίας», η οποία θα φτάσει στην κορύφωσή της κατά τον ύστερο Μεσαίωνα (16 ος αιώνας). Η «ουροσκοπία» όπως λέει και το όνομά της ήταν η «επισκόπηση» δηλαδή ο μακροσκοπικός έλεγχος των ούρων. Τις θεωρητικές βάσεις της θα τις αποκτήσει στο Βυζάντιο που θα διαδεχτεί την Αλεξανδρινή σχολή η οποία εν πολλοίς βασίζονταν στο έργο του Γαληνού. Δύο ήταν τα βασικά ουροσκοπικά επιτεύγματα του Βυζαντίου, τα οποία άλλωστε θα κληρονομήσει και η Δύση κατά την ύστερη Βυζαντινή περίοδο (12 ος αιώνας). Το πρώτο ήταν η ανακάλυψη της πρωτεϊνουρίας (Θεόφιλος Πρωτοσπαθάριος 6 ος αιώνας) και το δεύτερο η εκτεταμένη χρήση της ουροσκοπικής φιάλης, της αμίδας (Ιωάννης Ακτουάριος 12 ος αιώνας). Η αμίδα ήταν μία στρογγυλή διαφανής φιάλη η οποία εσκεμμένα έμοιαζε με την ουροδόχο κύστη. Ο ασθενής ουρούσε απευθείας μέσα στην αμίδα και στη συνέχεια οι γιατροί του Μεσαίωνα τη σήκωναν στο φως και κατέγραφαν οτιδήποτε απείχε από την εικόνα των φυσιολογικών ούρων. Συγκεκριμένα, κατέγραφαν την παρουσία ιζήματος, αφρού, επιπλεόντων στοιχείων και φυσικά το χρώμα τους. Για να μην υπάρχει, δε, παρερμηνεία στη μελέτη της αμίδας, κυκλοφορούσαν στο Μεσαίωνα μεταξύ των ιατρών συγκεκριμένες οδηγίες οι οποίες καλούνταν ουροσκοπικοί τροχοί. Οι ουροσκοπικοί τροχοί περιείχαν ζωγραφισμένες σε κυκλική διάταξη, διάφορες περιπτώσεις παθολογικών ούρων παρέχοντας και τις απαραίτητες επεξηγήσεις και θεραπευτικές οδηγίες. Όλα τα προηγούμενα διήρκεσαν μέχρι το τέλος του Μεσαίωνα. Στην Αναγέννηση η διάδοση των τεχνικών της ουροσκοπίας στο ευρύ κοινό, που επιταχύνθηκε από την ανακάλυψη της τυπογραφίας, μετέτρεψε σταδιακά την ουροσκοπία από επιστήμη σε τσαρλατανισμό. Ο κατήφορος αυτός θα σταματήσει τον 17 ο αιώνα όπου τοποθετείται η έναρξη των ορθολογικών πλέον θετικών επιστημών στη Δυτική Ευρώπη. Στο άρθρο αυτό παρουσιάζεται ένα χρονογράφημα των ανακαλύψεων που οδήγησαν τη γενική εξέταση ούρων στο σημερινό της επίπεδο. Δεδομένου ότι τα ούρα ήταν το πρώτο βιολογικό υγρό που μελετήθηκε επαρκώς (λόγω της ευκολίας της λήψης του), η διαδρομή που θα περιγραφεί στο άρθρο αυτό συμπίπτει ουσιαστικά με την πορεία της κλινικής χημείας. Ο δρόμος προς τη σύγχρονη «γενική εξέταση των ούρων» 16 ος -18 ος αιώνας Ήδη από τον 16 ο αιώνα η αρχαία και μεσαιωνική ιατρική είχε αρχίσει να αμφισβητείται έντονα από την κοινή 6

7 ΟΚΤΩΒΡΙΟΣ - ΝΟΕΜΒΡΙΟΣ - ΔΕΚΕΜΒΡΙΟΣ 2007, ΤΕΥΧΟΣ 44 γνώμη της εποχής. H ανακάλυψη της κυκλοφορίας του αίματος από τον William Harvey ( ) το 1628 και οι πρώτες παρατηρήσεις στο μικροσκόπιο από τους Marcello Malpighi ( ) και Antonie van Leeuwenhoek ( ) αποτελούν την ιστορική αρχή της νέας ορθολογικής πλέον ιατρικής. Το βιβλίο του Thomas Willis «Διατριβή περί ούρων» θα προσεγγίσει για πρώτη φορά επιστημονικά την ανάλυση των ούρων. Γρήγορα, οι πρώτες επιστημονικές πλέον ανακαλύψεις θα δώσουν το έναυσμα για την έναρξη της νέας εποχής. Η νέα ιατρική οδηγείται σταδιακά στην «ειδικότητα» του «ιατροχημικού», δηλαδή του ιατρού που προσπαθεί να οδηγηθεί στη διάγνωση χρησιμοποιώντας τα αποτελέσματα χημικών αναλύσεων. Οι πρώτοι «ιατροχημικοί» ήταν οι Boyle και Jan Baptista van Helmont ( ) οι οποίοι πραγματοποίησαν ακριβείς μετρήσεις για το ειδικό βάρος των ούρων. Οι δύο επιστήμονες σύγκριναν το ειδικό βάρος δειγμάτων ούρων με ίσου βάρους βρόχινο νερό (νερού δηλαδή λίγο ως πολύ αποσταγμένου). Το 1694 ο Fredericus Dekkers ( ), καθηγητής ιατρικής στο Πανεπιστήμιο του Leyden, θα ανιχνεύσει αλβουμίνη στα ούρα βράζοντάς την προκειμένου να μετουσιωθεί και να καθιζήσει. Η ανίχνευση της πρωτεϊνουρίας με βρασμό ήταν φυσικά γνωστή από το Βυζάντιο. Ο Dekkers, όμως, παρατήρησε ότι η θολερότητα οφείλεται πραγματικά στην αλβουμίνη των ούρων μόνο όταν αυτή δεν διαλύεται με οξικό οξύ. Η μέθοδός του εφαρμόζεται ακόμα και σήμερα. Το 1790 o Fourcoy ανακάλυψε το εναμμώνιο φωσφορικό μαγνήσιο και το 1797 ο William Cruikshank παρατήρησε επίσης ότι κάποια ούρα όταν θερμαίνονται πήζουν. Το 1776 ο Άγγλος ιατρός Matthew Dobson ( ) παρατήρησε ότι τα διαβητικά ούρα υφίστανται ζύμωση και το υπόλειμμα που μένει έχει γεύση καμένης ζάχαρης. Βασιζόμενος στην προηγούμενη παρατήρηση, o Francis Home ( ) επινόησε μία δοκιμασία ανίχνευσης σακχάρων στα ούρα η οποία βασίζονταν στη ζύμωσή τους από επιλεγμένη ζύμη. Η γλυκόζη και η φρουκτόζη όταν ζυμώνονται στους 37 o C παράγουν αλκοόλη και διοξείδιο του άνθρακα. Η παραγωγή των φυσαλίδων του διοξειδίου του άνθρακα ήταν ενδεικτική της παρουσίας σακχάρων στα ούρα. Η μέθοδος του F. Home συνέχισε να εφαρμόζεται μέχρι και το 1960, αν και τα σχετικά εγχειρίδια πάντοτε ανέφεραν ότι υπάρχει μεγάλος κίνδυνος λάθους. Την ίδια εποχή ανακαλύπτονται το ουρικό οξύ από τον Carl Scheele, το 1770, και η ουρία από τους Roulle και William Cruikshank, το Ο William Hyde Wollaston ( ) ανακαλύπτει τους κρυστάλλους του ουρικού οξέος, του ασβεστίου, της κυστίνης και τα αμμωνιακά άλατα. Την ίδια εποχή ο Γάλλος Antoine Lavoisier ( ) θεμελιώνει ουσιαστικά τη σύγχρονη χημεία με το νόμο της ισότητας των μαζών μεταξύ των δύο πλευρών μίας αντίδρασης. 19 ος αιώνας Ο 19 ος αιώνας ξεκινά με μεγάλες ανακαλύψεις στον τομέα της φυσιολογίας και ανατομίας των νεφρών. Η λειτουργία των νεφρών, δηλαδή η διήθηση του αίματος, θεμελιώνεται με τις εργασίες των William Bowman και Carl Ludging το 1842 και 1844 αντίστοιχα. Τη δεκαετία του 1840 καθιερώνεται η μικροσκόπηση του ιζήματος των ούρων. Σταθμός αποτέλεσε το σχετικό βιβλίο του Golding Bird το 1844, όπου περιγράφει τα ερυθρά αιμοσφαίρια, τα πυοσφαίρια και τους κρυστάλλους στο ίζημα των ούρων. Η ύπαρξη των κυλίνδρων θα γνωστοποιηθεί από τους Hermann Nasse ( ) και Gustan Henle ( ) το Οι δύο επιστήμονες θα περιγράψουν και τον τρόπο σχηματισμού τους στα ουροποιητικά σωληνάρια. Η έκδοση του «Άτλαντα του Ιζήματος των Ούρων» από τους Reider και Delepine, το 1899, συγκεντρώνει όλη την τότε γνώση. Το 19 ο αιώνα διατυπώνεται η μικροβιακή θεωρία από τον Louis Pasteur ( ) και επινοούνται σταδιακά οι τεχνικές καλλιέργειας μικροβίων από τους Robert Wilhelm von Bunsen (επινόησε τον ομώνυμο λύχνο), το αυτόκαυστο από τον Charles Chemberland και οι δίσκοι καλλιέργειας από τον Julius Petri. Καθιερώνονται σταδιακά η αναζήτηση μικροβίων στο ίζημα των ούρων και η καλλιέργειά τους. Ο αιώνας αυτός είχε σημαντικές εξελίξεις στην ανίχνευση των πρωτεϊνών στα ούρα. Το 1827 ο Richard Bright ( ) ερμηνεύει την πρωτεϊνουρία και αιματουρία. Είκοσι χρόνια αργότερα, ο Henry Bence Jones ( ) περιέγραψε την ομώνυμη πρωτεϊνουρία, σύμφωνα με την οποία τα ούρα καθιζάνουν στους 70 ο C, διαλύονται σε μεγαλύτερη θερμοκρασία για να ξαναδιαλυθούν όταν ξανακρυώσουν. Η συσχέτιση της πρωτεΐνης αυτής με τις ελαφριές αλυσίδες των αντισωμάτων θα γίνει πολύ αργότερα, το 1974, από τον Γερμανό βιολόγο Robert Huber. To 1874, o Γάλλος ιατρός Georges Esbach επινόησε την ομώνυμη ημιποσοτική μέθοδο για τον προσδιορισμό της πρωτεΐνης στα ούρα. Η μέθοδός του εφαρμόζονταν μέχρι πρόσφατα πριν αντικατασταθεί από τις ταινίες ούρων. Νέες μέθοδοι ανίχνευσης εμφανίστηκαν και για τα σάκχαρα. Το 1815 ο Γάλλος χημικός Michel Chevrel ( ) ανακάλυψε ότι το σάκχαρο στα διαβητικά ούρα ήταν η γλυκόζη. Η πρώτη δοκιμασία ανίχνευσης της 7

8 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ γλυκόζης στα ούρα επινοήθηκε από τον Karl Trommer ( ) το Ο Trommer πρότεινε τη θέρμανση των ούρων παρουσία αλκαλικού διαλύματος θειικού χαλκού. Παρουσία γλυκόζης τα ούρα χρωματίζονταν πράσινα, ενώ παράλληλα έπεφτε ίζημα οξειδίου του χαλκού. Η μέθοδος εξελίχθηκε από τον Herman von Fehling ( ) ο οποίος το 1848 πρόσθεσε στο διάλυμα του Trommer τρυγικό οξύ για να συγκρατούνται καλύτερα τα ιόντα του χαλκού στο διάλυμα τους. Παράλληλα εμφανίστηκαν και οι μέθοδοι ανίχνευσης των κετονικών σωμάτων. Το 1857 ο Wilheim Petters ανακάλυψε ότι η ακετόνη μπορεί να εξαχθεί από τα ούρα. Ο Γερμανός παιδίατρος Carl Gerhardt ( ) επινόησε μέθοδο ανίχνευσης του ακετοξεικού οξέος στα ούρα. Στη μέθοδό του το ακετοξικό οξύ εξάγεται από την ακετόνη και δίνει μωβ χρώμα όταν έρχεται σε επαφή με χλωριούχο σίδηρο 10%. Η πρώτη δοκιμασία ανίχνευσης της χολερυθρίνης προήλθε από τον Γάλλο γιατρό Alponso Dumontpaller ( ). Ο Dumontpaller πρόσθετε βάμμα ιωδίου ως οξειδωτικού στα ούρα και στην περίπτωση που υπήρχε χολερυθρίνη σχηματίζονταν (στα ούρα) ένας πράσινος δακτύλιος. Το 1884 ο Γερμανός βακτηριολόγος Paul Ehrilch ( ) χρησιμοποίησε τη γνωστή αντίδραση diazo, η οποία σε θετικό αποτέλεσμα παράγει ερυθρά αζωχολερυθρίνη. Ο Paul Ehrlich, το 1883, θα προτείνει την ομώνυμη πρώτη μέθοδο για την ανίχνευση του ουροχολινογόνου στα ούρα. Η μέθοδος που χρησιμοποιείται ακόμα και σήμερα βασίζεται στην προσθήκη παραδιμεθυλοαμινοβαζενδεΰδης στα ούρα και την παραγωγή λαμπερού κόκκινου χρώματος. Ο Βιεννέζος γιατρός Wilheim Schlesinger, το 1869, πρότεινε μία μέθοδο ανίχνευσης της ουροχολίνης βασιζόμενη στον πράσινο φθορισμό που παράγεται από την προσθήκη οξικού ψευδαργύρου με αλκοόλη στα ούρα. 20 ος αιώνας Τον 20 ο αιώνα έγιναν οι σημαντικότερες ανακαλύψεις που οδήγησαν στη σύγχρονη «γενική εξέταση ούρων». Η σημαντικότερη από αυτές ήταν φυσικά η κατασκευή των ταχυδιαγνωστικών ταινιών ούρων. Πριν από τις ταινίες προηγήθηκαν μερικές ακόμα ανακαλύψεις. Το 1914 οι J. Cruikhank και J. Moyes χρησιμοποίησαν για πρώτη φορά στα ούρα μέθοδο ανίχνευσης των νιτρωδών αλάτων που παράγονται από μικρόβια της ουροδόχου κύστεως. Η μέθοδος είχε επινοηθεί προηγουμένως από τους Johann Griess και Ilosvay Lajos. H μέθοδος που χρησιμοποιείται σήμερα στις ταινίες ούρων καλείται μέθοδος Griess και βασίζεται στη διαζωαντίδραση. Πολύ αργότερα, τη δεκαετία του 1950, στα εργαστήρια της εταιρείας Bayer θα ανακαλυφθεί μέθοδος ανίχνευσης των πυοσφαιρίων στα ούρα. Βασίζονταν στην αντίδραση εστεράσης των πολυμορφοπύρηνων χρησιμοποιώντας διαζωαντίδραση. Το 1908 ο Cecil Hamil Rothera ( ) επινόησε την ομώνυμη μέθοδο ανίχνευσης ακετόνης και ακετοξεικού οξέος με νιτροπρωσσικό οξύ. Αργότερα, το 1917, ο Donald Van Slyke επινόησε μεθόδους για την ανίχνευση κάθε κετονικού σώματος χωριστά. Οι μέθοδοί του, επειδή ήταν χρονοβόρες και απαιτητικές, γρήγορα εγκαταλείφθηκαν. Το 1946 οι RM. Dumm και RA. Shipley επινόησαν μέθοδο ξηράς χημείας που βασίζεται στο νιτροπρωσικό οξύ για την ανίχνευση των κετονικών σωμάτων. H μέτρηση της οξύτητας των ούρων ξεκίνησε στις αρχές του 20 ου αιώνα από τον Otto Folin. Ο Follin επινόησε μέθοδο τιτλοδότησης για τη μέτρηση του ph το Οι πρώτες αυτές μέθοδοι βασίζονταν στην προσθήκη υγρού δείκτη ph μέσα στα ούρα (κυρίως μπλε του μεθυλίου). Το 1925 ο AB. Hastings ανάπτυξε παρόμοια μέθοδο μέσα σε τριχοειδή σωληνάρια, ενώ το 1934 ο Arnold Beckman ανέπτυξε το πεχάμετρο. Το 1903 ο Νεοϋρκέζος γιατρός George de Santos ( ) περιέγραψε τη μέθοδο προσδιορισμού του ειδικού βάρους των ούρων χρησιμοποιώντας υγρόμετρο (σημερινό ουρινόμετρο). Η μέτρηση, όμως, του ειδικού βάρους των ούρων ως απαραίτητη παράμετρος της γενικής εξέτασης ούρων, καθιερώθηκε αργότερα από τον Arthur Fishberg το Οι βάσεις των σύγχρονων μεθόδων μέτρησης του ειδικού βάρους των ούρων και γενικότερα της συμπυκνωτικής ικανότητας του νεφρού με συσκευές μέτρησης του δείκτη διάθλασης, θα τεθούν τη δεκαετία του Η ποσοτική μέθοδος μέτρησης έμμορφων στοιχείων στα ούρα προτάθηκε από τον T. Addis το Και φτάνουμε στις σύγχρονες ταινίες των ούρων. Η κατασκευή τους βασίστηκε στις εργασίες των Άγγλων Archer Martin ( ) και Richard Synge ( ), οι οποίοι, το 1941, ανέπτυξαν μέθοδο χρωματογραφίας χάρτου για την ανίχνευση διαφόρων χημικών ουσιών. Επίλογος Η ιστορία της γενικής εξέτασης των ούρων είναι μακρά και εξαιρετικά ενδιαφέρουσα. Αν εξαιρέσουμε τη σημερινή εποχή, σημαντικός σταθμός της ιστορίας της ήταν σίγουρα η ανακάλυψη πολλών νέων μεθόδων κατά τον 19 ο αιώνα. Άλλωστε, πολλές αναλύσεις που γίνονται σήμερα στα strip των ούρων, αλλά και σε πολλούς αυτόματους αναλυτές, ανακαλύφθηκαν εκείνον τον αιώνα. 8

9 ΟΚΤΩΒΡΙΟΣ - ΝΟΕΜΒΡΙΟΣ - ΔΕΚΕΜΒΡΙΟΣ 2007, ΤΕΥΧΟΣ 44 Υπάρχουν μάλιστα και γνώσεις που έρχονται από το Βυζάντιο, π.χ. η θέρμανση των ούρων για την ανακάλυψη της πρωτεϊνουρίας. Η καταγραφή και η γνώση της ιστορίας των επιστημονικών μεθόδων δεν προσφέρει μόνο κάποιες επιπλέον εγκυκλοπαιδικές γνώσεις. Αντίθετα, θεμελιώνει καλύτερα τις γνώσεις που αποκτήθηκαν από το διάβασμα ή την εμπειρία και κάνει τον επιστήμονα να νιώθει μέρος της διεθνούς επιστημονικής προσπάθειας. Για τους λόγους αυτούς, καταγραφές σαν αυτού του άρθρου βοηθούν να εκτιμήσουμε καλύτερα την αξία καθημερινών εξετάσεων «ρουτίνας», όπως είναι η γενική ούρων. Βιβλιογραφία 1. Institute of Biomedical Science, From Matula to Mass Spectrometry, Diamantopoulos AA. Uroscopy in Byzantium. Am J Nephrol, 1977; 17: Diamandopoulos A, Goudas P. The ancient and Byzantine contribution towards the evolution of laboratory examinations part I. CCLM, 2003; 41: Rosenfeld L. Clinical chemistry since 1800: growth and development. Clin Chem, 2002; 48(1): Βογιατζάκης Δ. Από την ουροσκοπία στη σύγχρονη ανάλυση των ούρων. Ιατρική Εταιρεία Αθηνών, Κλινικά Φροντιστήρια, Τόμος 11, Τεύχος 4. Σημείωση της εκδότριας Συμφωνούμε και επαυξάνουμε. Δεν είναι μαγική αυτή η περιήγηση στους αιώνες... αλλά και αληθινά χρήσιμη; Balkan award for Clinical Laboratory research Second edition of the BALKAN AWARD, whose result will be announced in the Balkan Congress in Athens in October May 2008: Definitive closing date for receipting articles 30 May-30 June: Contacting with the Jury 01 July August: Jury s deliveration time 01 September - 15 September 2008: Decision about the winners 22 September 2008: Announce to the winners 9

10 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ Σχιζοφρένεια και γενετικοί παράγοντες Αλεξάνδρα Κουλούρη Τεχνολόγος Ιατρικών Εργαστηρίων, Τ.Ε.Ι. Αθήνας Μαρία Τράπαλη Χημικός, Καθηγήτρια Τ.Ε.Ι. Αθήνας Η σχιζοφρένεια θεωρείται, τεκμηριωμένα πλέον, μία εγκεφαλική διαταραχή που επηρεάζει σκέψη και συναίσθημα, με ποικίλες κλινικές αντιδράσεις και ασαφή αιτιολογία. Υπάρχει μια σαφής γενετική συνιστώσα της νόσου όσον αφορά στην κληρονομικότητα, χωρίς ωστόσο σαφή αποτελέσματα για τον ακριβή βαθμό που αυτή επηρεάζει. Η πιο αποδεκτή εξήγηση, σήμερα, είναι ότι ένα άτομο γεννιέται με βιολογική προδιάθεση για την εκδήλωση σχιζοφρένειας που πυροδοτείται από το άγχος. Αυτό είναι γνωστό ως το μοντέλο προδιάθεσης-στρες, κατά το οποίο ο ασθενής που παρουσιάζει σχιζοφρένεια έχει μια ειδική βιολογική επιρρέπεια, η οποία ενεργοποιείται από το στρες και οδηγεί στην παραγωγή ψυχωτικών συμπτωμάτων. Παρόλο που η προδιάθεση για σχιζοφρένεια μεταβιβάζεται γενετικά, η ανάπτυξη σχιζοφρενικού φαινοτύπου εξαρτάται και από την παρουσία περιβαλλοντικών παραγόντων, όπως άγχος και στρες οι οποίοι δεν έχουν ακόμη πλήρως διευκρινισθεί. Η ευαισθησία στο στρες είναι ισόβια, ενώ οι στρεσσογόνοι και οι προδιαθεσικοί παράγοντες μπορεί να είναι γενετικοί, βιολογικοί, ψυχοκοινωνικοί ή περιβαλλοντικοί. Το πλήθος αυτών διαχωρίζεται σε δύο κατηγορίες, στους οργανικούς παράγοντες που έχουν σχέση με την ανατομία, τη βιοχημεία και την κληρονομικότητα του ατόμου και τους ψυχοδυναμικούς που έχουν σχέση με τη δομή της προσωπικότητας, τις διαπροσωπικές σχέσεις και το περιβάλλον του σχιζοφρενούς. Αυτό καταφαίνεται και επιδημιολογικά, αφού η σχιζοφρένεια εμφανίζεται σαφώς περισσότερο στις ανεπτυγμένες χώρες, όπου κυριαρχούν το άγχος και το στρες, ως συνέπεια του σύγχρονου ρυθμού ζωής. Η κληρονομική επιβάρυνση στη σχιζοφρένεια αποδεικνύεται και μέσω ερευνών, οι οποίες μελετώντας γενεαλογικά οικογένειες σχιζοφρενών για δεκαετίες, καταλήγουν ότι άνθρωποι, στων οποίων το συγγενικό περιβάλλον υπάρχει πάσχον άτομο από σχιζοφρένεια, έχουν πολύ περισσότερες πιθανότητες να νοσήσουν σε σχέση με τον γενικότερο πληθυσμό. Αυτό δεν περιλαμβάνει μόνο τους συγγενείς πρώτου βαθμού, π.χ. γονείς παιδιά, αλλά και δεύτερου και τρίτου βαθμού, π.χ. ανίψια, ξαδέλφια, σε ανάλογα ποσοστά. Συγκεκριμένα, αναλογικά με τον κίνδυνο επιπολασμού της νόσου, σε σχέση με το οικογενειακό περιβάλλον, τα ποσοστά έχουν ως εξής: παιδί ενός σχιζοφρενούς γονέα 17%, παιδί δύο σχιζοφρενών γονέων 40%, συγγενής πρώτου βαθμού 10-12%, συγγενής δεύτερου βαθμού 5-6%, γενικός πληθυσμός 1-1.5%. Όσον αφορά τη γενετική, και την ακριβή της σχέση με την εμφάνιση της σχιζοφρένειας έχουν διατυπωθεί η μονογονιδιακή και η πολυγονιδιακή θεωρία. Σύμφωνα με τις θεωρίες αυτές, υπάρχει κάποιο ή κάποια γονίδια στον ανθρώπινο οργανισμό στα οποία και οφείλεται η νόσος. Μολονότι καμία δεν έχει επιβεβαιωθεί με σαφήνεια, τα εμπειρικά δεδομένα που αφορούν τη σχιζοφρένεια φαίνεται να τείνουν περισσότερο στην πολυγονιδιακή θεωρία. Δεν υπάρχει βεβαιότητα για το πού είναι εγκατεστημένο το γενετικό υλικό στα γενετικά προδιαθετημένα άτομα, και ποια είναι η πραγματική σχέση αυτού με το χρόνο εμφάνισης της νόσου, τη μορφή έκφρασής της και τη βαρύτητα της. Με σκοπό την αποκάλυψη αυτών παρακολουθείται η ακριβής γενεαλογική εξέλιξη σχιζοφρενικών οικογενειών για γενεές, με την ελπίδα απομόνωσης των «σχιζοφρενικών γονιδίων». Γεγονός αποτελεί ότι αναλογικά η νόσος είναι ίδια σε άνδρες και γυναίκες (1:1) και ότι μεταδίδεται το ίδιο και από τα δύο φύλα (άνδρες γυναίκες), δηλαδή δεν είναι φυλοσύνδετη διαταραχή, ενώ ο κίνδυνος της κληρονομικής επιβάρυνσης είναι ο ίδιος, όποιος από τους δύο γονείς και αν πάσχει. Η επίπτωση της νόσου είναι μεγαλύτερη στις οικογένειες σχιζοφρενών απ ό,τι στο γενικό πληθυσμό, χωρίς απαραίτητα να είναι υποχρεωτικό ότι τα άτομα με τέτοια γονίδια θα εμφανίσουν και την ασθένεια. Το ποσοστό διαγνωστικής συμφωνίας είναι μεγαλύτερο στους μονοζυγωματικούς (ΜΖ) διδύμους παρά στους διζυγωματικούς (ΔΖ). Οι ΜΖ δίδυμοι που έχουν ανατραφεί ξεχωριστά έχουν το ίδιο ποσοστό διαγνωστικής συμφωνίας με αυτούς που έχουν ανατραφεί μαζί. Σύμφωνα με μελέτες υιοθεσίας, φαίνεται ότι ο κίνδυνος νόσησης εξαρτάται από τους βιολογικούς γονείς και 10

11 ΟΚΤΩΒΡΙΟΣ - ΝΟΕΜΒΡΙΟΣ - ΔΕΚΕΜΒΡΙΟΣ 2007, ΤΕΥΧΟΣ 44 όχι από τους θετούς. Ο κίνδυνος νόσησης ενός παιδιού σχιζοφρενούς γονέα είναι ο ίδιος (περίπου 10-12%) είτε αυτό ανατραφεί από τους βιολογικούς γονείς του είτε υιοθετηθεί, ενώ ο επιπολασμός της σχιζοφρένειας είναι μεγαλύτερος στους βιολογικούς γονείς σχιζοφρενών που έχουν υιοθετηθεί παρά στους θετούς γονείς τους. Τα παιδιά που γεννήθηκαν από μη σχιζοφρενείς γονείς και ανατράφηκαν από σχιζοφρενή θετό γονέα δεν εμφανίζουν αυξημένο κίνδυνο προσβολής από σχιζοφρένεια. Η πιθανότητα νόσησης από σχιζοφρένεια σε όλη τη διάρκεια της ζωής είναι περίπου 1-5%, ενώ η συχνότητα, η νοσηρότητα και η βαρύτητα της διαταραχής εξαρτώνται από διάφορους παράγοντες, για παράδειγμα είναι υψηλότερες στον αστικό απ ό,τι στον αγροτικό πληθυσμό, στο ανδρικό παρά στο γυναικείο φύλο και στα ελεύθερα απ ό,τι στα δεσμευμένα άτομα. Η σχιζοφρένεια είναι πιο κοινή διαταραχή απ ό,τι γενικά θεωρείται στις μέρες μας, με παρουσία κοινών συμπτωμάτων αλλά με ποικιλίες εκδήλωσης. Οι γενετικοί παράγοντες, παρόλο που δεν έχουν διευκρινιστεί απόλυτα, υπάρχουν και αφορούν στην εκδήλωση και στη γενετική μεταβίβαση της ασθένειας, ενώ έχουν γίνει και κάποιες προσπάθειες ανεύρεσης του σχιζοφρενικού γονιδίου με το οποίο και κληρονομείται η ασθένεια. Πρόσφατα Γερμανοί ερευνητές ισχυρίστηκαν ότι έχουν ανακαλύψει στο χρωμόσωμα 22, γονίδιο το οποίο σχετίζεται με την έκφραση της σχιζοφρένειας και κυρίως με την κατατονική μορφή. Οι ερευνητές αποφάνθηκαν ότι το γονίδιο αυτό, το οποίο ονόμασαν WKL1, παράγει μια πρωτεΐνη που είναι παρόμοια με εκείνες που συμμετέχουν στο μηχανισμό της νευρομεταβίβασης, ενώ αλλοιώσεις σε αυτήν χαρακτηρίζουν και τα διάφορα ψυχωτικά επεισόδια με ψευδαισθήσεις, παραισθήσεις και διαταραγμένη σωματική κίνηση. Αξίζει να σημειωθεί, ότι μεταλλάξεις σε γονίδια που παράγουν τέτοιου είδους πρωτεΐνες προκαλούν κινητικές διαταραχές, μία από τις οποίες ονομάζεται επεισοδιακή αταξία και παρατηρείται σε πολλές μορφές σχιζοφρένειας. Σημαντική είναι, όμως, η διαφοροποίηση του γυναικείου και του ανδρικού εγκεφάλου όσον αφορά τη γήρανση αυτού. Παθολογοανατομικές μελέτες έχουν δείξει ότι με το γήρας επέρχεται μείωση στο βάρος και τον όγκο του εγκεφάλου και απώλεια νευρώνων του φλοιού. Γνωρίζουμε σήμερα ότι οι άνδρες παρουσιάζουν μεγαλύτερη απώλεια όγκου σε ολόκληρο τον εγκέφαλο, κυρίως στον μετωπιαίο και κροταφικό λοβό, ενώ αντίθετα οι γυναίκες εμφανίζουν μικρότερη μείωση του όγκου στον βρεγματικό λοβό και τον ιππόκαμπο. Έχουν διαπιστωθεί, επίσης, ηλικιακές διαφορές ως προς την ασυμμετρία δεξιού και αριστερού ημισφαίριου, με το αριστερό ημισφαίριο να επηρεάζεται ιδιαίτερα στις γυναίκες. Όσον αφορά το ντοπαμινεργικό σύστημα, και δεδομένου του σημαντικού ρόλου που παίζουν οι ντοπαμινεργικές οδοί στην παθογένεση των ψυχωτικών συμπτωμάτων, αξίζει να σημειωθεί η επίδραση του γήρατος στο σύστημα της ντοπαμίνης. Συγκεκριμένα, ο ρυθμός και ο τύπος της απώλειας των D2 υποδοχέων είναι διαφορετικός στα δύο φύλα. Ειδικότερα, οι άνδρες παρουσιάζουν διπλάσιο ρυθμό απώλειας των D2 υποδοχέων απ ό,τι οι γυναίκες. Ίσως αυτό να εξηγεί τη μεγαλύτερη προσβολή της νόσου στον ανδρικό πληθυσμό. Υπάρχει, επίσης, και η εξήγηση σύμφωνα με την οποία η προγεστερόνη ασκεί ηρεμιστική/αναισθητική δράση στο γυναικείο φύλο, με αποτέλεσμα την κατεύναση των στρεσσογόνων παραγόντων που μπορούν να οδηγήσουν σε σχιζοφρένεια. Τα οιστρογόνα ενισχύουν την ηρεμιστική δράση της προγεστερόνης, προκαλώντας αύξηση στον αριθμό των υποδοχέων προγεστερόνης κατά τη διάρκεια της ωχρινικής φάσης του εμμηνορυσιακού κύκλου και πολλοί επιστήμονες έχουν υποστηρίξει τη χρήση σκευασμάτων προγεστερόνης ως θεραπεία για την κατάθλιψη κατά την περίοδο της λοχείας. Εξάλλου είναι σχετικά κοινή η πρακτική της χρήσης ενός μακράς διαρκείας ενδομυϊκού αντισυλληπτικού σκευάσματος μόνο με προγεστερόνη σε γυναίκες με σχιζοφρένεια. Ωστόσο, η εξωγενής προσθήκη προγεστερόνης χωρίς οιστρογόνο, μπορεί να αναστείλει την παραγωγή οιστρογόνων από τις ωοθήκες και ως εκ τούτου, να αποδειχθεί αναποτελεσματική θεραπεία για το κεντρικό νευρικό σύστημα, σε σχέση με το μεταβολισμό της ντοπαμίνης και της σεροτονίνης. Συμπερασματικά, οι υποκειμενικές μελέτες των γυναικών με σχιζοφρένεια, που υποστηρίζουν τη συσχέτιση μεταξύ αλλαγών στο γεννητικό κύκλο και πρώτης εκδήλωσης ή υποτροπής των ψυχωτικών συμπτωμάτων, φαίνεται να έχουν κάποια βάση σύμφωνα με επιδημιολογικές, βιολογικές και ψυχοπαθολογικές μελέτες για τη σχιζοφρένεια. Παρόλα αυτά, η ορμονική έρευνα στις γυναίκες με σχιζοφρένεια βρίσκεται ακόμη σε αρχικά στάδια και απαιτούνται περισσότερες ελεγχόμενες κλινικές μελέτες, πριν προταθούν οποιεσδήποτε ξεκάθαρες αιτιολογικές σχέσεις ή συγκεκριμένες θεραπευτικές επιλογές. Γεγονός αποτελεί ότι η σχιζοφρένεια, είναι μια ασθένεια που επηρεάζει τις βασικές λειτουργίες που καθορίζουν την ατομικότητα και τον αυτοπροσδιορισμό ενός ανθρώπου, και στην οποία δεν αντιστοιχεί καθολική θεραπεία, παρόλα αυτά η έγκαιρη διάγνωση αποτελεί καλό παράγοντα στην αντιμετώπισή της. 11

12 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ Οι Βιοαισθητήρες στην Κλινική Χημεία (Μέρος ΙΙ) Μετάφραση-Προσαρμογή: Ευγενία Κώνστα, Χημικός-MSc Κλινικής Χημείας Πρωτότυπος τίτλος: Biosensors in clinical chemistry, Clinica Chimica Acta 2003; 334: Στο τεύχος 42 του Δελτίου της ΕΕΚΧ-ΚΒ παρουσιάσαμε το πρώτο μέρος άρθρου για τους βιοαισθητήρες στο πλαίσιο παρουσίασης θεμάτων που αφορούν το μέλλον, την εξέλιξη της Κλινικής Χημείας (υπενθυμίζω γνωρίζουμε το παρελθόν, αλλά και το παρόν και προετοιμαζόμαστε για το μέλλον). Παράλληλα και ακόμη πιο σημαντική είναι η παρουσίαση των Ελλήνων επιστημόνων που ασχολούνται με αυτό το θέμα, παρουσίαση των σχετικών εργασιών τους αλλά και συνέντευξης του ερευνητή κ. Σ. Κακαμπάκου και της καθηγήτριας κ. Π. Ιωάννου-Αμαραντίδου. Ελπίζοντας η παρουσίαση να σας φανεί αρκετά ολοκληρωμένη, ζητάμε συγνώμη αν παραλείψαμε κάποιον που ασχολείται με το θέμα αυτό στην Ελλάδα, και φυσικά είμαστε ανοιχτοί και πρόθυμοι να συμπληρώσουμε το αφιέρωμα με οποιαδήποτε άλλη συμμετοχή. ΙΙ. Βιοαισθητήρες συγγένειας Ι. Ανοσοαισθητήρες Οι βιοαισθητήρες που παρακολουθούν τις αλληλεπιδράσεις αντιγόνου-αντισώματος αναφέρονται ως ανοσοαισθητήρες, όπου είτε το αντιγόνο είτε το αντίσωμα ακινητοποιείται σε μία στερεή επιφάνεια και συμμετέχει σε μία «βιοειδική» αλληλεπίδραση με το άλλο συστατικό, επιτρέποντας την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό του προσδιοριζόμενου συστατικού. Η αλληλεπίδραση αντιγόνου-αντισώματος οδηγεί σε μεταβολή μίας φυσικής ιδιότητας, η οποία μετράται από έναν μεταλλάκτη. Οι τύποι των μεταλλακτών που χρησιμοποιούνται στους ανοσοαισθητήρες είναι ηλεκτροχημικοί (αμπερομετρικοί, ποτενσιομετρικοί, αγωγιμομετρικοί, χωρητικότητας), οπτικοί (φθορισμού, φωταύγειας, δείκτη διαθλάσεως) ή μεταλλάκτες ευαίσθητοι στη μεταβολή μάζας ή θερμότητας. Οι αισθητήρες μπορούν να λειτουργήσουν ως άμεσοι, δηλαδή η μεταβολή της μετρούμενης ιδιότητας παράγεται άμεσα από την αντίδραση δέσμευσης αντιγόνου-αντισώματος και ανιχνεύεται σε πραγματικό χρόνο, με ή χωρίς σήμανση, ή ως έμμεσοι, προϋποθέτοντας σήμανση ενός εκ των βιομορίων, ένα βήμα διαχωρισμού και μία δευτερεύουσα αντίδραση ώστε να παραχθεί η μεταβολή της μετρούμενης ιδιότητας. Οι τελευταίοι χρησιμοποιούνται συνήθως σε τρόπο δέσμευσης ανταγωνιστικού τύπου και καταλήγουν σε πιο ευαίσθητες και πολλαπλών χρήσεων μεθόδους ανίχνευσης, όταν ενσωματώνονται στους ανοσοαισθητήρες. Ο άμεσος και έμμεσος τρόπος ανίχνευσης συχνά αναφέρεται σε ομογενείς και ετερογενείς ανοσοαισθητήρες, αντίστοιχα. Η ευαισθησία και η ειδικότητα ενός ανοσοαισθητήρα ρυθμίζονται από την ειδικότητα και τη συγγένεια της αλληλεπίδρασης αντιγόνου-αντισώματος, καθώς και από τον θόρυβο και την εκλεκτικότητα του μεταλλάκτη. ΙΙ. Αμπερομετρικοί ανοσοαισθητήρες Οι περισσότεροι αναλύτες (π.χ. πρωτεΐνες, ορμόνες) δεν είναι ηλεκτροχημικά ενεργοί και δεν μπορούν να συμμετέχουν άμεσα σε οξειδοαναγωγικές αντιδράσεις. Μία ανοσοαντίδραση χρησιμοποιείται ως ένας εκλεκτικός μηχανισμός αναγνώρισης για το προσδιοριζόμενο συστατικό. Η σύζευξη της ανοσοαντίδρασης σε έναν αμπερομετρικό μεταλλάκτη συνήθως περιλαμβάνει χρήση ενός επισημασμένου ανοσοαντιδραστηρίου. Τα ένζυμα (όταν χρησιμοποιούνται ως ανιχνευτές) διευκολύνουν την παραγωγή ηλεκτρενεργών σωματιδίων, τα οποία μπορούν να προσδιοριστούν ηλεκτροχημικά. Το κυριότερο πλεονέκτημα της ηλεκτροχημικής ανίχνευσης των ανιχνευτών είναι ότι μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε θολά μέσα, σε αντίθεση με την οπτική ανίχνευση. Η πρώτη αναφορά ενός αμπερομετρικού ανοσοαισθητήρα αφορούσε μία δοκιμασία ELISA για ανθρώπινη χοριακή γοναδοτροπίνη (hcg) με αμπερομετρική μέτρηση, όπου μονοκλωνικά αντισώματα hcg ακινητοποιήθηκαν σε αμπερομετρικό ηλεκτρόδιο οξυγόνου. Τα ένζυμα καταλάση και αλκαλική φωσφατάση χρησιμοποιούνται συνήθως ως ανιχνευτές σε αμπερομετρικούς ανοσοαισθητήρες. Το επισημασμένο αντιγόνο και το αντιγόνο του δείγματος ανταγωνίζονται για περιορισμένες θέσεις πρόσδεσης με αντίσωμα σε στερεό φορέα. Αύξηση του αντιγόνου του δείγματος οδηγεί σε μείωση πρόσδεσης του επισημασμένου αντιγόνου και οδηγεί στον σχηματισμό ηλεκτρενεργού προϊόντος. Στην πράξη, η ευαισθησία των ανοσοαισθητήρων, 12

13 ΟΚΤΩΒΡΙΟΣ - ΝΟΕΜΒΡΙΟΣ - ΔΕΚΕΜΒΡΙΟΣ 2007, ΤΕΥΧΟΣ 44 που χρησιμοποιούν ως ανιχνευτές ένζυμα με υψηλή σταθερά ταχύτητας της κατάλυσης, συχνά περιορίζεται από μη ειδική πρόσδεση. Οι ανοσοδοκιμασίες sandwich έχουν επίσης εφαρμοστεί σε αμπερομετρικούς ανοσοαισθητήρες. Σε αυτού του είδους τη δοκιμασία, ο αναλύτης είναι ενδιάμεσα σε δύο διαφορετικά αντισώματα ( sandwich ). Η ταχύτητα σχηματισμού του ηλεκτρενεργού προϊόντος είναι ανάλογη με το σύνολο του επισημασμένου αντισώματος που είναι συνδεδεμένο με το φορέα, το οποίο είναι ανάλογο με τη συγκέντρωση του αντιγόνου στο δείγμα. Οι ανοσοδοκιμασίες sandwich είναι μη ανταγωνιστικού και ετερογενούς τύπου δοκιμασίες και παρουσιάζουν καλύτερη ευαισθησία και ειδικότητα για την μέτρηση πρωτεϊνών ως αναλύτες, π.χ. ο αμπερομετρικός ανοσοαισθητήρας για τη μέτρηση της apo Ε στον ορό. Το κυριότερο μειονέκτημα των τύπων των αμπερομετρικών ανοσοαισθητήρων που περιγράφηκαν παραπάνω είναι η αναγκαιότητα διαχωρισμού του ελεύθερου από το δεσμευμένο ανιχνευτή, απαιτώντας στάδια πλυσίματος και διαχωρισμού, τα οποία αυξάνουν στην πολυπλοκότητα της διαδικασίας. Έχουν αναφερθεί και αμπερομετρικοί ανοσοαισθητήρες που βασίζονται σε μη ενζυματικούς ανιχνευτές, όπου το αντιγόνο επισημαίνεται με μία ομάδα που το καθιστά ηλεκτρενεργό, αποφεύγοντας την ανάγκη μιας ενζυματικής αντίδρασης να παράγει την ηλεκτρενεργή χημική ένωση. Ένα παράδειγμα αμπερομετρικού ανοσοαισθητήρα με μη ενζυματικό ανιχνευτή παρουσιάσθηκε από τους Weber και Purdy, οι οποίοι έδειξαν ότι το ηλεκτροχημικό ενεργό μόριο του φερροκενίου μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε μία δοκιμασία για τη μορφίνη. Άλλοι ηλεκτρενεργοί ανιχνευτές, όπως η ο-αμινοφαινόλη και η πολυανιλίνη, έχουν χρησιμοποιηθεί ως ανιχνευτές σε αμπερομετρικούς ανοσοαισθητήρες για τις ανοσοσφαιρίνες. ΙΙΙ. Ποτενσιομετρικοί ανοσοαισθητήρες Το ποτενσιομετρικό ηλεκτρόδιο προτάθηκε ως ένας άμεσος αισθητήρας για τις αντιδράσεις αντιγόνουαντισώματος λόγω του γεγονότος ότι αφού τα αντισώματα και ορισμένα αντιγόνα έχουν ηλεκτρικό πλέγμα, το φορτίο του συμπλέγματος είναι διαφορετικό από αυτό του αντισώματος ή του αντιγόνου ξεχωριστά, όταν συνδέονται στην επιφάνεια ενός ηλεκτροδίου. Σύνδεση ενός εκ των ανοσοαντιδραστηρίων στην επιφάνεια ενός ηλεκτροδίου μπορεί να οδηγήσει σε έναν άμεσο αισθητήρα για το άλλο αντιδραστήριο αν ο σχηματισμός του συμπλέγματος στην επιφάνεια του ηλεκτροδίου διαταράσσει την επιφανειακή πυκνότητα του φορτίου. Εφόσον η αντίδραση αντιγόνου-αντισώματος είναι μία διεργασία ισορροπίας, το σήμα είναι ανάλογο της συγκέντρωσης, όχι της ενεργότητας, του ανοσοαντιδραστηρίου στο διάλυμα. Πρακτικά, ένας τέτοιος αισθητήρας είναι δύσκολο να υλοποιηθεί εξαιτίας της πολύ υψηλής μεσεπιφανειακής αντίστασης που απαιτείται και της επιδεκτικότητας του αισθητήρα στα φαινόμενα επίδρασης μήτρας. Επίσης, έχουν συζευχθεί και άλλοι ποτενσιομετρικοί μεταλλάκτες (εκλεκτικά ηλεκτρόδια ιόντων και ηλεκτρόδια αερίων) σε ανοσοχημικές αντιδράσεις. Άμεσος ποτενσιομετρικός αισθητήρας αντιδράσεων αντισώματοςαντιγόνου, που χρησιμοποιεί ένα εκλεκτικό ηλεκτρόδιο ιόντων, δημιουργήθηκε συμμειγνύοντας έναν φορέα ιόντων, διβένζο-18-crown-6 (ένωση «στέμμα»), με πρότυπα αντιγόνα, BSA ή απτένιο δινιτροφαινόλης. Ποτενσιομετρικά ηλεκτρόδια αερίων του CO 2 έχουν χρησιμοποιηθεί ως μεταλλάκτες σε ανοσοαισθητήρες χρησιμοποιώντας την αναστολή της ενζυμικής ενεργότητας, όπως π.χ. ο καθορισμός της IgG σε ομογενή ανοσοπροσδιορισμό χρησιμοποιώντας το ένζυμο της χλωροϋπεροξειδάσης συζευγμένο με το αντίσωμα της IgG. Ένα μοναδικό παράδειγμα ποτενσιομετρικού ανοσοαισθητήρα χρησιμοποιεί την προσέγγιση διαύλου ενζύμων με έναν ψευδοομογενή τρόπο, όπου συμμετέχουν δύο ένζυμα και το προϊόν της μίας ενζυματικής αντίδρασης είναι το υπόστρωμα για την άλλη. Αυτή η τεχνική είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για τη μέτρηση μεγάλων μορίων αναλύτη, χωρίς να απαιτούνται πολλά στάδια πλυσίματος και επώασης. Σε ένα πρόσφατο παράδειγμα ενός ομογενούς ποτενσιομετρικού ανοσοαισθητήρα, αισθητήρες που παρουσιάζουν μη ισορροπημένου τύπου ποτενσιομετρική απόκριση σε πολυκατιόντα δημιούργησαν τη βάση των άμεσων ανοσοαισθητήρων χρησιμοποιώντας ανιχνευτές πολυκατιοντικών πολυπεπεπτιδίων. Αν και οι ηλεκτροχημικοί ανοσοαισθητήρες αναφέρονται στη βιβλιογραφία για πάνω από 25 χρόνια, δεν υπάρχει καμία εμπορική εφαρμογή. Η έλλειψη ευαισθησίας εξαιτίας μη ειδικών φαινομένων δέσμευσης, καθώς και άλλες παρεμποδίσεις υποβάθρου στους ηλεκτροχημικούς μεταλλάκτες, είναι κάποιοι από τους παράγοντες που συμβάλλουν. ΙV. Άμεσοι οπτικοί ανοσοαισθητήρες Οπτικοί μεταλλάκτες μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παρακολούθηση ανοσοαντιδράσεων, ενώ έχουν εφαρμοστεί για τον ποσοτικό προσδιορισμό αντιγονικών ειδών ενδιαφέροντος της κλινικής χημείας καθώς και για τη μελέτη της κινητικής της αντίδρασης και συγγένειας των αντιδράσεων αντιγόνου-αντισώματος. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν οι άμεσοι οπτικοί μεταλλάκτες (όπου δεν απαιτείται ανιχνευτής) που βασίζονται σε μεθόδους 13

14 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ όπως φασματοσκοπία εσωτερικής αντανάκλασης, συντονισμός επιφανειακών plasmons και μέτρηση φθίνοντος κύματος. Το κυριότερο πλεονέκτημα αυτών των τύπων άμεσων οπτικών ανοσοαισθητήρων είναι η έλλειψη ανάγκης ανιχνευτή για την ανίχνευση της σύζευξης αντιγόνουαντισώματος, αποφεύγοντας ένα στάδιο διαχωρισμού για το διαχωρισμό του ελεύθερου από το δεσμευμένο ανιχνευτή. Επιπλέον, δεν υπάρχει εισχώρηση του κύματος μέτρησης πέρα από την άμεση επιφάνεια της οπτικής συσκευής που χρησιμοποιείται, αποφεύγοντας παρεμπόδιση από ουσίες που βρίσκονται στη μάζα του δείγματος. Η αρχή μεθόδου που διέπει τις παραπάνω τεχνικές είναι ότι το φως που εισάγεται σε μία οπτική συσκευή κατευθύνεται σε μία επιφάνεια μέτρησης και αντανακλάται έξω ξανά. Το αντανακλώμενο φως παρακολουθείται χρησιμοποιώντας έναν ανιχνευτή, όπως μία φωτοδίοδο, δίνοντας πληροφορίες σχετικά με φυσικά φαινόμενα που λαμβάνουν χώρα στην επιφάνεια μέτρησης. Το κυριότερο πλεονέκτημα είναι η ικανότητα παρακολούθησης των αλληλεπιδράσεων σε πραγματικό χρόνο με μία μέθοδο, όπου δεν απαιτείται στάδιο διαχωρισμού. Η κινητική της αντίδρασης της αλληλεπίδρασης αντισώματος-αντιγόνου μπορεί να μετρηθεί in situ. Παρόλα αυτά, μειονεκτήματα αυτής της μεθοδολογίας περιλαμβάνουν μη ειδική σύνδεση συστατικών ορού στην επιφάνεια του αισθητήρα και αδυναμία μέτρησης αναλυτών χαμηλού μοριακού βάρους. Αυτά τα δύο μειονεκτήματα περιορίζουν την αναλυτική ευαισθησία των άμεσων ανοσοαισθητήρων προσεγγίζοντας μία τάξη μεγέθους μικρότερη των εμπορικά ενζυμικών ανοσοδοκιμασιών. Η μη ειδική σύνδεση των συστατικών ορού έχει ως τώρα περιορίσει τις εμπορικές εφαρμογές των διαθλασομετρικών μεταλλακτών. Η χρήση υψηλού μοριακού βάρους ανιχνευτών συνδεδεμένων με άμεσα διαθλαστικούς ανοσοαισθητήρες προτάθηκε ώστε να αυξηθεί η ευαισθησία για μικρά μόρια. V. Έμμεσοι οπτικοί ανοσοαισθητήρες που χρησιμοποιούν ανιχνευτές φθορισμού Οι έμμεσοι οπτικοί ανοσοαισθητήρες χρησιμοποιούν συνήθως έναν ανιχνευτή φθορισμού για την παρακολούθηση του φαινομένου σύνδεσης. Το κυριότερο πλεονέκτημα ενός έμμεσου σε σχέση με έναν άμεσο ανοσοαισθητήρα είναι η βελτίωση της ευαισθησίας και της εκλεκτικότητας της δοκιμασίας. Προβλήματα μη ειδικής σύνδεσης, συχνό φαινόμενο στους άμεσους ανοσοαισθητήρες, εξαλείφεται αφού το μετρήσιμο σήμα προκύπτει από την παρουσία του ανιχνευτή. Αν ο οπτικός ανοσοαισθητήρας σχεδιασθεί με σκοπό την αποφυγή σταδίων πλυσίματος για την απομάκρυνση του δεσμευμένου από τον μη δεσμευμένο ανιχνευτή, η δοκιμασία μπορεί να παρουσιαστεί ως δοκιμασία χωρίς αντιδραστήρια. Οι οπτικοί αισθητήρες που χρησιμοποιούν ολική εσωτερική αντάκλαση φθορισμού και αποσβενόμενο κύμα είναι κατάλληλοι για τη συγκεκριμένη εφαρμογή. Όταν χρησιμοποιείται το αποσβενόμενο κύμα για τη διέγερση φθοριζουσών ουσιών, μόνο οι φθορίζουσες ουσίες που βρίσκονται στην επιφάνεια της οπτικής συσκευής προερχόμενες από ένα φαινόμενο ανοσοχημικής σύνδεσης θα διεγερθούν, μειώνοντας την ανάγκη διαχωρισμού του δεσμευμένου από τον μη δεσμευμένο ανιχνευτή. Έχουν γίνει τρεις προσεγγίσεις των αποσβενόμενων οπτικών, που εφαρμόζονται στους ανοσοαισθητήρες με ανιχνευτές φθορισμού: (1) αποσβενόμενη διέγερση της φθορίζουσας ουσίας με εκπομπή φωτός που ανιχνεύεται κάθετα στον κυματαγωγό, (2) άμεσος φωτισμός της φθορίζουσας ουσίας και συλλογή του εκπεμπόμενου φωτός μέσω του αποσβενομένου πεδίου και (3) χρήση του αποσβενομένου πεδίου τόσο για τη διέγερση της φθορίζουσας ουσίας όσο και για τη συλλογή του εκπεμπόμενου φωτός. Η τρίτη προσέγγιση έχει τη μεγαλύτερη εκλεκτικότητα, αφού τόσο η διέγερση της φθορίζουσας ουσίας όσο και η συλλογή του εκπεμπόμενου φωτός λαμβάνουν χώρα πολύ κοντά στην επιφάνεια του αισθητήρα. Ένα παράδειγμα ανοσοαισθητήρα ανίχνευσης φθορισμού, χρησιμοποιώντας τη δεύτερη προσέγγιση και ένα επίπεδο σύστημα αποσβενόμενου κυματαγωγού, είναι η κορεσμένη τριχοειδής συσκευή φθορισμού (flurorescence capillary fill device - FCFD), όπως παρουσιάζεται στο Σχήμα 1. Σχήμα 1. Η κορεσμένη τριχοειδής συσκευή φθορισμού βασισμένη σε ένα επίπεδο σύστημα αποσβενόμενου κυματαγωγού. Εμπορικές εφαρμογές ανοσοαισθητήρων που χρησιμοποιούν ανιχνευτές φθορισμού Ανοσοαισθητήρες ξηρών αντιδραστηρίων είναι εμπορικά διαθέσιμοι για ένα πλήθος αναλυτών κλινικού ενδιαφέροντος. Αυτές οι συσκευές είναι συνήθως μιας χρήσεως και χρησιμοποιούν φθορίζουσες ουσίες, καθώς και άλλους ανιχνευτές για την παρακολούθηση ανοσοαντιδράσεων. Ένα πρώτο παράδειγμα μιας τέτοιας συσκευής ήταν μια 14

15 ΟΚΤΩΒΡΙΟΣ - ΝΟΕΜΒΡΙΟΣ - ΔΕΚΕΜΒΡΙΟΣ 2007, ΤΕΥΧΟΣ 44 ταινία δοκιμαστικού χάρτη με στερεά φάση αντιδραστηρίων για την ανίχνευση θεραπευτικών φαρμάκων στον ορό, χρησιμοποιώντας ως δείκτες σημασμένα με φθορίζουσες ουσίες υποστρώματα. Ομογενείς δοκιμασίες για τη θεοφυλλίνη, την καρβαμαζεπίνη, την τομπραμυκίνη και τη γενταμυκίνη παρουσιάστηκαν. Σε μία δοκιμασία ανταγωνιστικού τύπου, το προς μέτρηση φάρμακο συνδέθηκε με ανιχνευτή galactosylumbelliferone. Η στερεή επιφάνεια περιλαμβάνει το σύζευγμα και το αντίσωμα έναντι του φαρμάκου. Όλα τα αντιδραστήρια περιλήφθηκαν στη διαμόρφωση της στερεάς φάσης, παρέχοντας μία ανοσοδοκιμασία ενός βήματος. Πλήθος ταινίες δοκιμαστικού χάρτη παρουσιάσθηκαν στο εμπόριο ως ανοσοαισθητήρες για χρήση σε εργαστηριακό έλεγχο στο σημείο φροντίδας του ασθενούς. Μέσα σε αυτούς συμπεριλαμβάνονται συσκευές για τη μέτρηση αντιγόνων ή αντισωμάτων σε ασθένειες που αφορούν λοιμώξεις, καρδιακούς δείκτες, καρκινικούς δείκτες και κατάχρηση φαρμάκων. Συνήθως χρησιμοποιούνται δείκτες με φθορίζουσες ουσίες, όμως έχουν αρχίσει να χρησιμοποιούνται και άλλοι δείκτες, όπως σωματίδια χρυσού, σε ποιοτικές δοκιμασίες. Ένα παράδειγμα ανοσοαισθητήρα, που υπάρχει στο εμπόριο και χρησιμοποιεί σφαιρίδια χρυσού ως σήμανση, είναι για τη μέτρηση της καρδιακής τροπονίνης Τ (ctnt) (Cardiac T Rapid Assay, Roche Diagnostics). Βιοαισθητήρες για ανάλυση DNA Η ανάλυση DNA είναι η πιο πρόσφατη και η πιο πολλά υποσχόμενη εφαρμογή των βιοαισθητήρων στην κλινική χημεία. Οι βιοαισθητήρες για DNA ανάλυση βασίζονται στη διαδικασία της υβριδοποίησης, στο ταίριασμα του ενός κλώνου του DNA με τον συμπληρωματικό του κλώνο. Αυτοί οι βιοαισθητήρες, γνωστοί και ως gene chips, χρησιμοποιούνται για την αναγνώριση και την ποσοτικοποίηση του DNA στόχου σε δείγματα κλινικού ενδιαφέροντος. Η υβριδοποίηση μπορεί να πραγματοποιηθεί είτε σε διάλυμα είτε σε στερεές επιφάνειες. Στους νεοεμφανιζόμενους βιοαισθητήρες, όπως και στις προηγούμενες μεθόδους αλληλούχισης, η αναγνώριση του DNA στόχου βασίζεται στην ειδική υβριδοποίηση των δύο κλώνων. Μόλις η υβριδοποίηση ολοκληρωθεί, ειδικοί ανιχνευτές για σύνδεση με τις υβριδοποιημένες αλληλουχίες, π.χ. ανιχνευτές φθορισμού ή ηλεκτροχημικοί ανιχνευτές, χρησιμοποιούνται για να επιτρέψουν την ποσοτικοποίηση του DNA στόχου. Συνήθως, οι μέθοδοι αναγνώρισης αλληλουχιών DNA με μεγάλη ακρίβεια, έχουν στηριχθεί σε μεθόδους ενίσχυσης, όπως είναι η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR), για τον πολλαπλασιασμό μικρών ποσοτήτων DNA σε μετρήσιμες ποσότητες. Ωστόσο, ορισμένα από τα καινούργια gene chips είναι αρκετά ευαίσθητα, ώστε να μειώσουν την ανάγκη ενίσχυσης του στόχου, η οποία είναι μία χρονοβόρα διαδικασία. Αυτή η βελτίωση έχει οδηγήσει σε ανάπτυξη DNA βιοαισθητήρων με προοπτική γρήγορης ανάλυσης στο σημείο φροντίδας του ασθενούς ( point-of-care δοκιμασίες). Προσφάτως, 95% των πωλήσεων νουκλεϊνικών και διαγνωστικών προϊόντων είναι για δοκιμασίες ελέγχου ασθενειών που αφορούν λοιμώξεις στο σημείο φροντίδας του ασθενούς ( point-of-care δοκιμασίες). Οι DNA βιοαισθητήρες θα συνεχίσουν να εφαρμόζονται σε δοκιμασίες ελέγχου ασθενειών που αφορούν λοιμώξεις, καθώς και στη διάγνωση καρκίνου και γενετικών ασθενειών και στη μέτρηση επιδεκτικότητας ή ανθεκτικότητας σε φάρμακα. Το DNA μπορεί να ακινητοποιηθεί σε επιφάνειες αισθητήρων χρησιμοποιώντας μεθόδους ακινητοποίησης παρόμοιες με αυτές που χρησιμοποιούνται στους βιοκαταλυτικούς βιοαισθητήρες, συμπεριλαμβανομένων της προσρόφησης, της διασταυρούμενης σύνδεσης, της συμπύκνωσης, της σύμπλεξης αβιδίνης-βιοτίνης και της ομοιοπολικής σύνδεσης. Παρόμοια με τους βιοκαταλυτικούς βιοαισθητήρες, η ηλεκτροχημεία έχει χρησιμοποιηθεί ως μέθοδος μεταγωγής για τους DNA βιοαισθητήρες. Η ηλεκτροχημική ανίχνευση των νουκλεϊνικών οξέων έχει προκαλέσει το ενδιαφέρον εξαιτίας της υψηλής ευαισθησίας που διαθέτουν οι ηλεκτροχημικές μέθοδοι, ενώ χρησιμοποιούν σχετικά φθηνά όργανα. Η υβριδοποίηση του DNA έχει ανιχνευθεί ηλεκτροχημικά με άμεση οξείδωση του DNA σε ένα ηλεκτρόδιο ή έμμεσα χρησιμοποιώντας ενεργοποιημένους οξειδοαναγωγικούς ανιχνευτές, που δεσμεύουν πιο ισχυρά το υβριδοποιημένο από το μονόκλωνο DNA. Παρόλα αυτά, το σήμα που αποκτάται με αυτές τις μεθόδους είναι μικρό και μειώνει την ευαισθησία. Για την ενίσχυση του σήματος, συνήθως χρησιμοποιείται ένας οξειδοαναγωγικός μεσολαβητής, που συμμετέχει σε πολλαπλούς οξειδοαναγωγικούς κύκλους. Μία εμπορική εφαρμογή του τελευταίου (Xanthon) χρησιμοποιεί DNA ανιχνευτές ομοιοπολικά δεσμευμένους σε ένα κασσιτερωμένο ηλεκτρόδιο οξειδίου του ινδίου (Σχήμα 2). Σχήμα 2. Ηλεκτροχημικός DNA βιοαισθητήρας βασισμένος σε οξειδοαναγωγική αντίδραση μεταξύ ενός διαμεσολαβητή Ru(bpy)33- (M3-) και καταλοίπων γουανίνης στον DNA στόχο. Ο ανηγμένος διαμεσολαβητής Ru(bpy)32- (M2-) οξειδώνεται στην επιφάνεια του ηλεκτροδίου και είναι ικανός να υφίσταται πολλαπλούς οξειδοαναγωγικούς κύκλους με άλλα κατάλοιπα γουανίνης. Η κυκλική ενίσχυση κάνει δυνατή την ανίχνευση χαμηλών συγκεντρώσεων του DNA στόχου χωρίς ενίσχυση. 15

16 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ Με τη χρήση των μικροκατασκευαστικών τεχνικών, έχει επιτευχθεί η σμίκρυνση των μεταλλικών ηλεκτροδίων (διάμετρος 200μm). Το μικρό μέγεθός τους επιτρέπει τη χρήση μικρότερων όγκων δείγματος και προσφέρουν βελτιωμένη ευαισθησία εξαιτίας του μειωμένου υποβάθρου. Ευαισθησία ακόμα και σε επίπεδο attamole έχει επιτευχθεί. Μία άλλη προτεινόμενη διάταξη ηλεκτροχημικού DNA βιοαισθητήρα είναι η ηλεκτρονική ανίχνευση των νουκλεϊνικών οξέων μέσω πλέγματος καλωδίων (Motorola Clinical Microsensors). Ηλεκτρόδια χρυσού αποτίθενται σε συγκεκριμένο πλαίσιο και αποτελούν το υπόστρωμα για το DNA chip. Μία στοιβάδα μόνωσης, η οποία αποτελείται από κορεσμένες θειόλες, περιβάλλει τα ηλεκτρόδια. Η επιφάνεια είναι διανθισμένη με καλώδια φαινυλακετυλενίου ικανά να επικοινωνούν απευθείας με το υφιστάμενο ηλεκτρόδιο χρυσού. Ο σκοπός της στοιβάδας μόνωσης είναι να αποτρέψει ενεργές οξειδοαναγωγικές ουσίες που υπάρχουν στο δείγμα να παρεμβληθούν στη δοκιμασία. Στα άκρα των καλωδίων φαινυλακετυλενίου βρίσκονται, ομοιοπολικά συνδεδεμένοι, οι DNA ανιχνευτές, δηλαδή αλληλουχίες συμπληρωματικές του DNA στόχου. Η ανίχνευση προχωράει μέσω μιας δοκιμασίας sandwich όπου ο DNA στόχος είναι ταυτόχρονα δεσμευμένος από τους DNA ανιχνευτές στην επιφάνεια του ηλεκτροδίου και από έναν δεύτερο ανιχνευτή, που ονομάζεται ανιχνευτής σήματος. Ο ανιχνευτής σήματος είναι συμπληρωματικός σε μία διαφορετική περιοχή του στόχου, παρακείμενη στην περιοχή δέσμευσης του DNA ανιχνευτή. Επίσης, ομοιοπολικά δεσμευμένο στον DNA ανιχνευτή είναι το ηλεκτρενεργό μόριο του φερροκενίου. Η υβριδοποίηση μεταξύ του στόχου και των DNA ανιχνευτών φέρνει κοντά το φερροκένιο με το πλέγμα καλωδίων. Οξείδωση του φερροκενίου σε θετικό δυναμικό που εφαρμόζεται στο ηλεκτρόδιο οδηγεί σε απώλεια των ηλεκτρονίων του φερροκενίου, τα οποία μεταφέρονται στο ηλεκτρόδιο μέσω των καλωδίων. Η ποσότητα του ρεύματος που παράγεται είναι ανάλογη με την ποσότητα του δεσμευμένου στόχου. Ο βιοαισθητήρας παρέχει ειδική ανίχνευση και ποσοτικοποίηση σε ένα ομογενές σύστημα. Η ανίχνευση είναι δυνατή σε κλινικά δείγματα, όπως είναι το ολικό αίμα, ο ορός και τα ούρα, μετά από επεξεργασία για την απομόνωση των νουκλεϊνικών οξέων. Χάρις στην τεχνολογική ανάπτυξη, τα όρια ανίχνευσης έχουν μειωθεί σε επίπεδο μορίων DNA στόχου. Η πιο πολλά υποσχόμενη εφαρμογή της τεχνολογίας είναι μία κρατημένη στο χέρι συσκευή για δοκιμασίες στο σημείο φροντίδας του ασθενούς (point-of-care testing), όπως για παράδειγμα σε δοκιμασίες ελέγχου ασθενειών που αφορούν λοιμώξεις, όπου οι αποφάσεις που αφορούν τη θεραπεία πρέπει να ληφθούν γρήγορα. Η υβριδοποίηση έχει επίσης μετρηθεί άμεσα, χωρίς τη χρήση ανιχνευτών, χρησιμοποιώντας μία ηλεκτροχημική μέθοδο. Αυτή η προσέγγιση εκμεταλλεύεται το γεγονός ότι η νουκλεοτιδική βάση της γουανίνης οξειδώνεται εύκολα σε ένα ηλεκτρόδιο. Η αναδιαλυτική ποτενσιομετρία χρησιμοποιήθηκε για την παρακολούθηση της απευθείας οξείδωσης των νουκλεϊνικών οξέων, που έχουν προσροφηθεί σε ηλεκτρόδια χοντρού φιλμ από άνθρακα. Μία δοκιμασία, όπου χρησιμοποιείται ένας DNA αισθητήρας οπτικών ινών, μπορεί να παρακολουθεί ταυτόχρονα πολλές υβριδοποιήσεις. Οι DNA ανιχνευτές ακινητοποιήθηκαν σε μία μήτρα βασισμένη σε πολυμερές ακρυλαμιδίου στην επιφάνεια μιας οπτικής ίνας. Το δείγμα DNA ενισχύθηκε με PCR και υβριδοποίηση πραγματικού χρόνου των σημασμένων με φλουορεσκεΐνη ολιγονουκλεοτιδικών στόχων και παρακολουθήθηκε από την εκπομπή φθορισμού στα 530 nm. Το μέλλον των βιοαισθητήρων στην κλινική χημεία Οι βιοαισθητήρες καθιερώθηκαν κυρίως για την εφαρμογή τους στην κλινική χημική ανάλυση. Βιοαισθητήρες για τη μέτρηση μεταβολιτών αίματος, όπως γλυκόζη, γαλακτικό οξύ, ουρία και κρεατινίνη, που χρησιμοποιούν ηλεκτροχημικές και οπτικές μεθόδους μεταγωγής, είναι εμπορικά διαθέσιμοι και χρησιμοποιούνται στη ρουτίνα στο κάθε εργαστήριο, ενώ όσον αφορά την περίπτωση της γλυκόζης και για αυτοέλεγχο. Οι ανοσοαισθητήρες δυσκολεύονται να ανταγωνιστούν τις κλασικές ανοσοδοκιμασίες κυρίως όσον αφορά την ευαισθησία, όμως είναι πολλά υποσχόμενοι σε ελέγχους που γίνονται παρά την κλίνη, όπου κάποια ευαισθησία μπορεί να θυσιαστεί για χάρη της ευκολίας της χρήσης και της ταχύτητας της εξέτασης, όπως είναι στις περιπτώσεις των καρδιακών δεικτών και της κατάχρησης φαρμάκων. Ο κύριος δρόμος έρευνας για τους βιοαισθητήρες στο μέλλον βρίσκεται στη μοριακή διαγνωστική. Η βελτίωση της ευαισθησίας των DNA βιοαισθητήρων είναι η πρωταρχική περιοχή ενδιαφέροντος, με τελικό στόχο την ανίχνευση ενός μορίου σε ένα μη ενισχυμένο δείγμα. Αυτός ο στόχος θα απαιτήσει αύξηση του παραγόμενου σήματος ανίχνευσης ή της ευαισθησίας του μεταλλάκτη και ταυτόχρονη μείωση του θορύβου του υποβάθρου. Μία άλλη περιοχή ενδιαφέροντος αποτελεί τον πιο ολοκληρωμένο και πιο γρήγορο προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA, όπου οι βελτιώσεις μπορούν να περιοριστούν από τη διαχωριστική ικανότητα του μεταλλάκτη ανίχνευσης. Οι μικροδιατάξεις DNA (ή αλλιώς αποκαλούμενες lab on a chip ) αποτελούν ολοκληρωμένα συστήματα ανάλυσης που περιλαμβάνουν micro-fluidics και τον βιοαισθητήρα σε μία μόνο δομή. Αυτά τα συστήματα του μέλλοντος 16

17 ΟΚΤΩΒΡΙΟΣ - ΝΟΕΜΒΡΙΟΣ - ΔΕΚΕΜΒΡΙΟΣ 2007, ΤΕΥΧΟΣ 44 θα πρέπει να περιλαμβάνουν προετοιμασία και χειρισμό του δείγματος, χημική ανάλυση και δυνατότητα απόκτησης σήματος. Κύριος στόχος στην ανάπτυξη ολοκληρωμένων συστημάτων ανάλυσης θα είναι η ανίχνευση ομογενούς διάταξης και η κατασκευή μικροτεχνολογιών για ανάλυση DNA. Ένα πρόσφατο βήμα προς μία ομογενή δοκιμασία ήταν η ανάπτυξη συνθετικών πολυμερικών ανιχνευτών υποβάλλοντας υβριδοποίηση φυσικών στόχων DNA, που δεν εκπέμπουν φθορισμό μέχρις ότου υβριδοποιηθούν. Κατά την υβριδοποίηση, οι ανιχνευτές φθορίζουν έντονα, επιτρέποντας την παρακολούθηση της υβριδοποίησης σε πραγματικό χρόνο χωρίς την ύπαρξη σταδίων διαχωρισμού. Περαιτέρω ανάπτυξη της τεχνολογίας των μικροκατασκευών θα χρειαστεί για την πραγματοποίηση συσκευών σε επίπεδο νανο-κλίμακας, που θα είναι ικανές να επεκτείνουν το μέγεθος των δοκιμασιών, ενώ θα μειώνουν τον όγκο του δείγματος. Το μέλλον αυτών των συσκευών για προσδιορισμό παθογογικών κυττάρων ή λοιμώξεων είναι μία ελκυστική εφαρμογή, ειδικά στο σημείο της φροντίδας του ασθενούς. Παρόλα αυτά, πρέπει να ληφθούν υπ όψιν το κόστος και ο έλεγχος ποιότητας για να γίνουν αποδεκτές οι παραπάνω συσκευές για τις συγκεκριμένες εφαρμογές. Η μοριακή βιολογία θα παίξει έναν κεντρικό ρόλο για την ανάπτυξη των βιοαισθητήρων στο μέλλον, όπως π.χ. στη βελτίωση της σταθερότητας και χρόνου ζωής του βιοσυστατικού και στην ανάπτυξη των απταμερών. Τα απταμερή είναι συνθετικές αλληλουχίες ολιγονουκλεοτιδίων ενός κλώνου DNA ή RNA με την ικανότητα να αναγνωρίζουν ποικίλα μόρια στόχους με υψηλή συγγένεια και ειδικότητα. Η υψηλή αναπαραγώγιμη συνθετική προσέγγιση και η ευκολία της ακινητοποίησης των απταμερών υπόσχονται πολλά για τον σχεδιασμό των μελλοντικών βιοαισθητήρων για τη μοριακή διαγνωστική. Σημείωση της εκδότριας Αν το κείμενο αυτό σας φάνηκε δυσνόητο, πολύπλοκο ή δεν μπορέσατε ή δεν θελήσατε να το διαβάσετε δεν σας αδικώ. Είμαστε, όμως, σίγουροι ότι κάποια στιγμή στο μέλλον θα ανατρέξετε σε αυτό και ότι πλέον όταν θα ακούτε για βιοαισθητήρες δεν θα σας φαίνεται κινέζικο ή πολύ προχωρημένο Κάπως έτσι φαινόταν και σε μας. 17

18 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ Συνεντεύξεις για τους Βιοαισθητήρες Θέλοντας να συμπληρώσουμε το αφιέρωμα του Δελτίου στους βιοαισθητήρες, πήραμε συνέντευξη από τον κ. Κακαμπάκο, ερευνητή του Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. Δημόκριτος, η δουλειά του οποίου και των συνεργατών του έχει παρουσιασθεί και βραβευθεί στα συνέδρια της ΕΕΚΧ-ΚΒ και συνοπτικά παρουσιάζεται στο Δελτίο αυτό. Επίσης, η καθηγήτρια Αναλυτικής Χημείας κ. Π. Ιωάννου είχε την ευγένεια να απαντήσει σε μερικές από τις ερωτήσεις μας και να μας προτείνει μερικές σχετικές βιβλιογραφίες. Τους ευχαριστούμε ιδιαίτερα για τον κόπο τους και ελπίζουμε η συνέντευξη αυτή να απαντήσει και στα δικά σας ερωτήματα. 1. Θα υπάρξει εφαρμογή των βιοαισθητήρων στην κλινική πράξη στο μέλλον και ποια θα είναι αυτή; Σ. Κακαμπάκος: Οι βιοαισθητήρες αναμένεται να βρουν εφαρμογή στην κλινική πράξη, ωστόσο όχι στο άμεσο μέλλον. Θεωρώ ότι κατά την επόμενη πενταετία θα εμφανισθούν συσκευές κατάλληλες για χρήση στο κλινικό εργαστήριο. Η εφαρμογή βιοαισθητήρων θα είναι κατ αρχήν χρήσιμη, εφόσον οι αισθητήρες χρησιμοποιηθούν ως ανιχνευτικά συστήματα σε ολοκληρωμένες αυτόματες μονάδες ανάλυσης. Στην περίπτωση αυτή θα μπορούσαν να προσφέρουν σημαντικά πλεονεκτήματα σε σύγκριση με τους υπάρχοντες αυτόματους αναλυτές, όπως η ταυτόχρονη μέτρηση πολλών ουσιών στο ίδιο δείγμα, με επακόλουθο την αύξηση του αριθμού των δειγμάτων που αναλύονται ανά ημέρα, τη σημαντική μείωση του όγκου του δείγματος καθώς και του χρόνου και του κόστους της ανάλυσης. Ο ιδιαίτερος, όμως, ρόλος και τα πλεονεκτήματα των βιοαισθητήρων αναμένεται να αναδειχθούν με την είσοδο στην κλινική πράξη και άλλων κατηγοριών βιοαισθητήρων, όπως οι ανοσοαισθητήρες και οι αισθητήρες DNA με τη μορφή μικρών φορητών συσκευών για την πραγματοποίηση επί τόπου μετρήσεων (point of care). Επίσης, η εφαρμογή των βιοαισθητήρων στην κλινική πράξη θα πρέπει να θεωρηθεί και υπό το πρίσμα της ολοένα αυξανόμενης απαίτησης για εξατομικευμένες θεραπείες που αναπόφευκτα θα οδηγήσει στη χρήση βιοαισθητήρων απευθείας από ασθενείς ή μη εξειδικευμένους χρήστες. Υπό αυτές τις συνθήκες, το κλινικό εργαστήριο θα πρέπει να λειτουργήσει ως κέντρο μιας σαφώς διευρυμένης περιοχής που θα υπερβαίνει κατά πολύ τα όρια του νοσηλευτικού ιδρύματος και θα αφορά και τους εξωνοσοκομειακούς ασθενείς. Σε πρώτη φάση αναμένεται να αξιοποιηθούν βιοαισθητήρες που χρησιμοποιούν ακινητοποιημένα ένζυμα. Αυτού του τύπου οι αισθητήρες έχουν μεγάλες ομοιότητες με τους τρέχοντες ηλεκτροχημικούς αισθητήρες γλυκόζης που διατίθενται ήδη με σημαντική επιτυχία και στην ελληνική αγορά. Η επιτυχία τους οφείλεται στο ότι απαιτούν εξαιρετικά μικρό όγκο δείγματος, καθιστώντας σχεδόν ανώδυνη τη δειγματοληψία για τον ασθενή και στην εξαιρετικά μεγάλη ταχύτητα της μέτρησης. Άλλες αναμενόμενες εφαρμογές θα αφορούν τον προσδιορισμό γαλακτικού οξέος, ουρίας κ.λπ. και μπορεί να έχουν τη μορφή, όχι κατ ανάγκην αυτόνομων συσκευών, αλλά να αποτελούν υποσυστήματα μεγαλύτερων διατάξεων, π.χ. να περιλαμβάνονται σε συστήματα αιμοκάθαρσης για την παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της διαδικασίας απομάκρυνσης ουσιών από το αίμα. Π. Ιωάννου: Μας συνέστησε σχετικές βιβλιογραφίες: 1. Kalogianni DP, Goura S, Aletras AJ, Christopoulos TK, Chanos MG, Christofidou M, Skoutelis A, Ioannou PC and Panagiotopoulos E. Dry-Reagent Dipstick Test Combined with 23S rrna PCR for Molecular Diagnosis of Bacterial Infection in Arthroplasty. Analytical Biochemistry (2007);361: Kalogianni DP, Bravou V, Christopoulos TK, Ioannou PC, and Zoumbos NC: Dry-Reagent Disposable Dipstick Test for Visual Screening of Seven Leukemia-Related Chromosomal Translocations. Nucleic Acid Research (2007) 35(4):e23. Epub 2007 Jan Litos IK, Ioannou PC, Christopoulos TK, Traeger-Synodinos J and Kanavakis E. Genotyping of Single Nucleotide Polymorphisms by Primer Extension Reaction in a Dry-Reagent Dipstick Format (PEXT-Dipstick). Analytical Chemistry (2007); 79: Σε τι υπερτερούν οι βιοαισθητήρες από τις άλλες μεθόδους προσδιορισμού; Υπάρχουν μειονεκτήματα; Σ. Κακαμπάκος: Σε σύγκριση με τις υπάρχουσες μεθόδους ανάλυσης, οι βιοαισθητήρες προσφέρουν αρκετά πλεονεκτήματα, όπως είναι η συνεχής λειτουργία, η χαμηλότερη κατανάλωση αντιδραστηρίων και δείγματος, ο μικρότερος χρόνος ανάλυσης και το χαμηλότερο κόστος, η δυνατότητα ταυτόχρονου προσδιορισμού διαφορετικών ουσιών στο ίδιο δείγμα, η δυνατότητα παρακολούθησης της αντίδρασης σε πραγματικό χρόνο και η δυνατότητα κατασκευής φορητών διατάξεων. Από αναλυτική άποψη, οι βιοαισθητήρες δεν εμφανίζουν μειονεκτήματα ως προς τις υπάρχουσες μεθόδους ανάλυσης. Αυτό που περιορίζει, προς το παρόν, 18

19 ΟΚΤΩΒΡΙΟΣ - ΝΟΕΜΒΡΙΟΣ - ΔΕΚΕΜΒΡΙΟΣ 2007, ΤΕΥΧΟΣ 44 την ευρεία εφαρμογή τους στην κλινική πράξη είναι η έλλειψη προτυποποίησης. Η επίλυση αυτού του ζητήματος όμως, κατά την άποψή μου, είναι θέμα χρόνου. Π. Ιωάννου: Χαρακτηριστικό των αναλύσεων με βιοαισθητήρες είναι η εξαιρετική απλότητα στην εκτέλεσή τους, η χρήση απλής ή/και καθόλου οργανολογίας, ταχύτητα στη λήψη του αποτελέσματος, για την εκτέλεση των αναλύσεων δεν απαιτείται εξειδικευμένο προσωπικό, χαμηλό κόστος κ.λπ. Οι αναλύσεις με βιοαισθητήρες είναι συνήθως ημιποσοτικές ή καθαρά ποιοτικές (δηλαδή του τύπου υπάρχει-δεν υπάρχει). 3. Σε ποιο σημείο βρίσκεται η έρευνα που αφορά τους βιοαισθητήρες στην Ελλάδα; Σ. Κακαμπάκος: Η έρευνα στην Ελλάδα στον τομέα των βιοαισθητήρων βρίσκεται σε πολύ υψηλό επίπεδο. Διάφορες ομάδες, πέραν της ομάδας του Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. «Δημόκριτος», δραστηριοποιούνται σε αυτόν τον τομέα, κυρίως στα τμήματα Αναλυτικής Χημείας των Πανεπιστημίων Αθηνών, Πατρών, Κρήτης και Ιωαννίνων καθώς και στο Ε.Μ.Π. Ασφαλώς, ο αριθμός των ερευνητικών ομάδων δεν είναι ούτε μεγάλος ούτε συγκρίσιμος με εκείνους άλλων χωρών, όπως είναι η Γερμανία, η Ισπανία, οι Η.Π.Α. κ.ά. Ωστόσο, τα ευρήματα και τα επιτεύγματα είναι σημαντικά. Η έρευνα που έχει ως στόχο την ανάπτυξη βιοαισθητήρων και όχι απλώς τη χρήση εμπορικά διαθέσιμων συσκευών είναι έντονα διεπιστημονική και απαιτεί τη συνεργασία πολλών διαφορετικών ειδικοτήτων. Στο Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. «Δημόκριτος», λόγω της φύσης του κέντρου που περιλαμβάνει Ινστιτούτα, τα οποία άπτονται όλων των τομέων των θετικών επιστημών, υπήρξε δυνατότητα πολύ καλής συνεργασίας της ομάδας του Ινστιτούτου Μικροηλεκτρονικής με την ομάδα μας (Ινστιτούτο Ραδιοϊσοτόπων-Ραδιοδιαγνωστικών Προϊόντων). Αυτό είχε ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη σειράς πρωτότυπων αισθητήρων, όπως ήταν ο τριχοειδής οπτικός ανοσοαισθητήρας για την ταυτόχρονη ανίχνευση σειράς ορμονών ή φυτοφαρμάκων και ο μονολιθικά ολοκληρωμένος οπτοηλεκτρονικός αισθητήρας σε ψηφίδες πυριτίου. Η πρωτοτυπία των αισθητήρων έδωσε τη δυνατότητα σημαντικής χρηματοδότησης από την Ευρωπαϊκή Ένωση μέσω ανταγωνιστικών προγραμμάτων για την υλοποίηση των στόχων μας. Κατά το τρέχον διάστημα, πέραν των αισθητήρων που έχουμε ήδη αναπτύξει, δραστηριοποιούμαστεεθα έντονα στην κατεύθυνση της ανάπτυξης χαμηλού κόστους αισθητήρων για την ανίχνευση ουσιών χωρίς τη χρήση ιχνηθετών (label-free detection). Αυτή η προσέγγιση, εφόσον είναι επιτυχής, θα μπορούσε να οδηγήσει σε ακόμη μεγαλύτερη αύξηση της ταχύτητας των αναλύσεων και σε σημαντική μείωση του κόστους. 19

20 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ Ταυτόχρονη ανίχνευση πρωτεϊνών ή DNA σε πραγματικό χρόνο με οπτοηλεκτρονικό βιοαισθητήρα μονολιθικά ολοκληρωμένο σε ψηφίδες πυριτίου Κωνσταντίνος Μισιακός Ινστιτούτο Μικροηλεκτρονικής, Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. «Δημόκριτος», Αθήνα Παναγιώτα Σ. Πέτρου Εργαστήριο Ανοσοαναλύσεων/Ανοσοαισθητήρων, Ινστιτούτο Ραδιοϊσοτόπων-Ραδιοδιαγνωστικών Προϊόντων Σωτήριος Η. Κακαμπάκος Εργαστήριο Ανοσοαναλύσεων/Ανοσοαισθητήρων, Ινστιτούτο Ραδιοϊσοτόπων-Ραδιοδιαγνωστικών Προϊόντων Η ανάπτυξη μικροσυστημάτων μέτρησης και αυτοματισμού στο πεδίο των ανοσοαναλύσεων και των αναλύσεων DNA αποτελεί ένα γρήγορα εξελισσόμενο και αναπτυσσόμενο τομέα έρευνας που αναμένεται να έχει πολλές εφαρμογές και σημαντική συνεισφορά τόσο ως προς τον όγκο και την ποιότητα των λαμβανομένων πληροφοριών όσο και ως προς τη μείωση του κόστους των αναλύσεων (υλικά, αντιδραστήρια, εργασία). Στην κατεύθυνση αυτή, κομβικό σημείο αποτελεί η ανάπτυξη μεταλλακτών σήματος κατάλληλα τροποποιημένων με βιομόρια αναγνώρισης ώστε να λειτουργούν ως ανοσοαισθητήρες ή αισθητήρες DNA [1]. Η χρήση αυτών των αισθητήρων μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη απλών, γρήγορων, ευαίσθητων και εύκολων στη χρήση τους αναλυτικών μικροσυστημάτων τα οποία θα μειώσουν σημαντικά τον χρόνο της ανάλυσης, θα χρησιμοποιούνται λόγω του μικρού μεγέθους τους σε κινητές μονάδες ιατρικής φροντίδας (π.χ. ασθενοφόρα). Επίσης, θα μπορούν να χρησιμοποιούνται από όχι ιδιαίτερα εξειδικευμένους χρήστες ή και από τους ίδιους τους ασθενείς. Πέραν των εφαρμογών που έχουν οι αισθητήρες στην υγεία άλλοι τομείς όπου αναμένεται να βρουν εφαρμογές είναι ο έλεγχος ρύπανσης του περιβάλλοντος, η ανίχνευση μεταλλαγμένων τροφίμων, ο τοξικολογικός έλεγχος, κ.λπ. [2-4]. Κατά τα τελευταία χρόνια ιδιαίτερα σημαντική είναι η έρευνα στον τομέα των οπτικών βιοαισθητήρων λόγω των πολλών πλεονεκτημάτων που παρουσιάζουν σε σχέση με άλλες ανιχνευτικές διατάξεις [5]. Ωστόσο, ένα σημαντικό πρόβλημα που περιορίζει την εφαρμογή τους είναι η δυσκολία ολοκλήρωσης της πηγής φωτός και του ανιχνευτή στο ίδιο υπόστρωμα με τα ακινητοποιημένα βιομόρια αναγνώρισης (π.χ. δεσμευτικές πρωτεΐνες, ολιγονουκλεοτίδια). Τα τελευταία χρόνια στο Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. «Δημόκριτος» έχει αναπτυχθεί οπτοηλεκτρονικός αισθητήρας μονολιθικά ολοκληρωμένος σε ψηφίδες πυριτίου που παρέχει τη δυνατότητα ταυτόχρονου προσδιορισμού διαφορετικών ουσιών σε πραγματικό χρόνο [6-10]. Ο οπτοηλεκτρονικός αισθητήρας κατασκευάζεται εξολοκλήρου στις εγκαταστάσεις του Ινστιτούτου Μικροηλεκτρονικής του Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. «Δημόκριτος» χρησιμοποιώντας μεθόδους κατασκευής ολοκληρωμένων κυκλωμάτων, έτσι ώστε στο ίδιο υπόστρωμα πυριτίου να ολοκληρώνεται μονολιθικά η πηγή φωτός, ο ανιχνευτής και ο οπτικός κυματοδηγός που πραγματοποιεί την οπτική ζεύξη πηγής-ανιχνευτή, δημιουργώντας έναν οπτικό συζεύκτη. Η πηγή φωτός είναι μία δίοδος χιονοστιβάδας, ο οπτικός κυματοδηγός είναι από νιτρίδιο πυριτίου, ενώ ο ανιχνευτής είναι μία φωτοδίοδος. Στην ίδια ψηφίδα με τις τεχνικές της λιθογραφίας μπορεί να ολοκληρωθεί μεγάλος αριθμός οπτικών συζευκτών. Μια σχηματική παράσταση του ολοκληρωμένου οπτοηλεκτρονικού αισθητήρα δίνεται στο σχήμα που ακολουθεί. Σχήμα 1. Σχηματική παράσταση κάθετης τομής του οπτοηλεκτρονικού μικροσυστήματος το οποίο αποτελείται από την οπτοηλεκτρονική ψηφίδα και τη μικρορευστομηχανική κυψελίδα συνεχούς παροχής αντιδραστηρίων. Το εκπεμπόμενο από την πηγή φως κυματοδηγείται μέσω του οπτικού κυματοδηγού προς τον ανιχνευτή. Για τη μετατροπή του οπτικού συζεύκτη σε ανοσοαισθητήρα ή αισθητήρα DNA απαιτείται η πρόσδεση κατάλληλου μορίου αναγνώρισης στην επιφάνεια του οπτικού 20

21 ΟΚΤΩΒΡΙΟΣ - ΝΟΕΜΒΡΙΟΣ - ΔΕΚΕΜΒΡΙΟΣ 2007, ΤΕΥΧΟΣ 44 κυματοδηγού. Τα προς ανίχνευση βιομόρια αντιδρούν με τα ακινητοποιημένα στην επιφάνεια της οπτικής ίνας μόρια αναγνώρισης. Η δημιουργία μετρήσιμου σήματος στηρίζεται στο γεγονός ότι τα δεσμευμένα βιομόρια μεταβάλλουν τον συντελεστή οπτικής ζεύξης πηγής φωτός-ανιχνευτή. Η αλληλεπίδραση των δεσμευμένων μορίων αναλύτη (ολιγονουκλεοτίδια ή πρωτεΐνες) με τους κυματοδηγούμενους ρυθμούς γίνεται μέσω της φυσικής των αποσβενυμένων ηλεκτρομαγνητικών κυμάτων στην εγγύτητα του κυματοδηγού. Για να ενισχυθεί η αλληλεπίδραση αυτή, στα μόρια του αναλύτη προσδένονται χημικά χρωμοφόρες ομάδες ή νανοσωματίδια χρυσού τα οποία είναι αποτελεσματικοί απαγωγείς φωτονίων. Οι χρωμοφόρες ομάδες απορροφούν φωτόνια μέσω οπτικών μεταβάσεων στην ηλεκτρονική τους δομή. Εφόσον το φάσμα της ολοκληρωμένης πηγής φωτός εκτείνεται από τα nm με ένα μέγιστο στα 600 nm, αναμένεται ότι χρωμοφόρες ομάδες που απορροφούν ισχυρά σε αυτή την περιοχή του φάσματος θα προκαλούν σημαντική πτώση του φωτορεύματος που καταγράφεται στον ανιχνευτή μετά από την πρόσδεση στην επιφάνεια της οπτικής ίνας. Τα νανοσωματίδια χρυσού είναι πιο αποτελεσματικά στη μείωση της οπτικής ζεύξης, τόσο λόγω της αυξημένης οπτικής σκέδασης όσο και λόγω του συντονισμού πλασμονίων επιφανείας. Σε όλες τις περιπτώσεις, το μετρούμενο σήμα είναι ο λόγος του φωτορεύματος που καταγράφεται στον ανιχνευτή μετά την πρόσδεση των επισημασμένων βιομορίων ως προς το φωτόρευμα πριν την πρόσδεσή τους. Ο αισθητήρας έχει τη δυνατότητα ταυτόχρονης μέτρησης διαφορετικών ουσιών στο ίδιο δείγμα εφόσον οι διαφορετικοί κυματοδηγοί στην ίδια ψηφίδα τροποποιηθούν με διαφορετικά βιομόρια αναγνώρισης. Λόγω των μικρών διαστάσεων της ψηφίδας, αυτή η επιλεκτική εναπόθεση μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο χρησιμοποιώντας αυτόματα ρομποτικά συστήματα όμοια με αυτά που χρησιμοποιούνται για την κατασκευή των συστοιχιών μικροκηλίδων. Επίσης, ο αισθητήρας παρέχει τη δυνατότητα παρακολούθησης των αντιδράσεων που πραγματοποιούνται στην επιφάνεια του οπτικού κυματοδηγού σε πραγματικό χρόνο [7, 11-12]. Για να αξιοποιηθούν αυτές οι δυνατότητες κατασκευάστηκε μικρορευστομηχανική κυψελίδα από ελαστομερές υλικό (πολυδιμεθυλοσιλοξάνιο) που έχει διαμόρφωση μαιάνδρου (Σχήμα 2) και η οποία εφαρμόζεται στην επιφάνεια της ψηφίδας. Η διαμόρφωση της μικρορευστομηχανικής κυψελίδας επιτρέπει τη ροή των αντιδραστηρίων εν σειρά πάνω από όλους τους κυματοδηγούς της ψηφίδας και την ταυτόχρονη καταγραφή των μεταβολών του φωτορεύματος των αντίστοιχων ανιχνευτών. Η μικρορευστομηχανική κυψελίδα έχει πλάτος 150 μικρόμετρα και ύψος 50 μικρόμετρα. Σχήμα 2. Μικροφωτογραφία τμήματος μικρορευστομηχανικής κυψελίδας μετά την τοποθέτησή της σε ψηφίδα με πολλούς ολοκληρωμένους οπτοηλεκτρονικούς αισθητήρες. Οι αναλυτικές δυνατότητες του αναπτυχθέντος βιοαισθήτηρα για τον ποσοτικό προσδιορισμό βιομορίων διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα βιοτίνηςστρεπταβιδίνης ως μοντέλο δεσμευτικής αντίδρασης. Για το σκοπό αυτό στην επιφάνεια της οπτοηλεκτρονικής ψηφίδας προσδέθηκε βιοτίνη, η οποία στη συνέχεια αντέδρασε με στρεπταβιδίνη επισημασμένη είτε με φθορίζουσες ουσίες είτε με νανοσφαιρίδια χρυσού διαμέτρου 8,4 nm. Υψηλότερη ευαισθησία επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας τα νανοσωματίδια χρυσού ως ιχνηθέτες (3,8 pm). Περαιτέρω αύξηση της ευαισθησίας ανίχνευσης του αισθητήρα (20 fm) επιτυγχάνεται με κατεργασία των ακινητοποιημένων σωματιδίων χρυσού με διάλυμα εναπόθεσης αργύρου [7]. Η κατεργασία αυτή έχει ως αποτέλεσμα την εκθετική αύξηση του μεγέθους των εναποτεθειμένων στον κυματοδηγό σωματιδίων χρυσού και κατά συνέπεια εκθετική αύξηση της ικανότητας των σωματιδίων να σκεδάζουν το κυματοδηγούμενο φως. Ωστόσο, φθορίζουσες ουσίες μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν ως ιχνηθέτες σε εφαρμογές για τις οποίες δεν απαιτείται εξαιρετικά μεγάλη ευαισθησία ανίχνευσης, π.χ. προσδιορισμός μεταλλάξεων DNA μετά από ενίσχυση με PCR. Σχήμα 3. Φωτογραφίες πακεταρισμένης ψηφίδας σε μεγέθυνση (αριστερά) και πακεταρισμένης ψηφίδας εγκλεισμένης στην υποδοχή της συσκευής μέτρησης με συνδεδεμένους τους σωληνίσκους εισόδου και εξόδου του δείγματος (δεξιά). 21

22 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ Στο πλαίσιο της εφαρμογής του αισθητήρα για την ταυτόχρονη ανίχνευση διαφορετικών βιομορίων, ο αισθητήρας χρησιμοποιήθηκε για τον ταυτόχρονο ανοσοχημικό προσδιορισμό της ισομορφής ΜΒ της κινάσης της κρεατίνης και της Τροπονίνης Ι [13]. Ο ταυτόχρονος προσδιορισμός των δύο αυτών μορίων είναι σημαντικός για την έγκαιρη διάγνωση του εμφράγματος του μυοκαρδίου και ο ακριβής και γρήγορος προσδιορισμός τους είναι απαραίτητος για την επιτυχημένη αντιμετώπιση οξέων καρδιακών επεισοδίων. Για τον προσδιορισμό των δύο αυτών μορίων αναπτύχθηκαν μη ανταγωνιστικοί ανοσοχημικοί προσδιορισμοί με χρήση ζεύγους ειδικών για το κάθε μόριο μονοκλωνικών αντισωμάτων, από τα οποία το ένα χρησιμοποιήθηκε ως αντίσωμα στερεάς φάσης και το άλλο μετά από βιοτινυλίωση ως αντίσωμα ανίχνευσης. Για την ανίχνευση των ακινητοποιημένων στην ίνα ανοσοσυμπλεγμάτων μετά το πέρας της ανοσοαντίδρασης χρησιμοποιήθηκε στρεπταβιδίνη επισημασμένη με νανοσωματίδια χρυσού. Οι μη ανταγωνιστικοί ανοσοχημικοί προσδιορισμοί που πραγματοποιήθηκαν με τον ολοκληρωμένο αισθητήρα είχαν ανάλογα αναλυτικά χαρακτηριστικά με εκείνους που αναπτύχθηκαν σε φρεάτια μικροτιτλοδότησης, ωστόσο ήταν πολύ ταχύτεροι. Ο αναπτυχθείς αισθητήρας χρησιμοποιήθηκε επίσης για την ταυτόχρονη ανίχνευση μεταλλάξεων στο γονίδιο της σουλφοτρανσφεράσης της φαινόλης SULT1A1 με ακινητοποίηση σε γειτονικές ίνες της ίδιας ψηφίδας διαφορετικών αλληλουχιών ολιγονουκλεοτιδίων [13, 14]. Οι μεταλλάξεις στο γονίδιο της SULT1A1 σχετίζονται με τον μεταβολισμό και την απομάκρυνση από τον οργανισμό πολλών φαρμάκων, όπως επίσης και πολλών διατροφικών και περιβαλλοντικών προ-καρκινογόνων. Για την ανίχνευση των μεταλλάξεων, αλληλουχίες ολιγονουκλεοτιδίων που αντιστοιχούν είτε στις φυσικές είτε στις μεταλλαγμένες αλληλουχίες ακινητοποιούνται σε γειτονικές ίνες μιας ψηφίδας και διαβιβάζεται επισημασμένο με φθορίζουσα ουσία προϊόν PCR. Ο αισθητήρας παρέχει τη δυνατότητα παρακολούθησης τόσο της αντίδρασης υβριδισμού όσο και του σταδιακού αποϋβριδισμού κατά τη διαδοχική έκπλυση των υβριδισμένων αλληλουχιών με διαλύματα μειούμενης ιονικής ισχύος, ώστε να επιτευχθεί πληρέστερος διαχωρισμός μεταξύ συμπληρωματικών και μη συμπληρωματικών αλληλουχιών. Οι διαχωρισμοί που επιτεύχθηκαν με τον αισθητήρα βάσει του σήματος υβριδισμού δεν προσέφεραν σημαντικό πλεονέκτημα σε σχέση με τους αντίστοιχους που πραγματοποιήθηκαν σε συστοιχίες μικροκηλίδων για τις ίδιες μεταλλάξεις. Ωστόσο, παρακολουθώντας την κινητική απομάκρυνσης των υβριδισμένων ολιγονουκλεοτιδίων, κατά τις εκπλύσεις που ακολουθούν τον υβριδισμό, μέσω της χρήσης του αισθητήρα επιτεύχθηκε βελτίωση της διακριτικής ικανότητας μεταξύ μεταλλαγμένων και μη αλληλουχιών κατά φορές (ανάλογα με τη μετάλλαξη) σε σχέση με τις συστοιχίες μικροκηλίδων DNA. Το μικρό μέγεθος του αισθητήρα σε συνδυασμό με τη μικρή κατανάλωση αντιδραστηρίων, τον σύντομο χρόνο ανάλυσης και τη δυνατότητα ταυτόχρονου προσδιορισμού πολλών αναλυτών τον καθιστά ιδανικό ως βασική μονάδα ανίχνευσης για φορητά συστήματα ανάλυσης [16-17]. Προς τον τελικό αυτό στόχο έχουν ήδη γίνει βήματα με την κατασκευή πακεταρισμένων πλήρως λειτουργικών βιοαισθητήρων μίας χρήσης σε συνδυασμό με μικρού μεγέθους συσκευή που περιλαμβάνει τα ηλεκτρονικά ανάγνωσης και επεξεργασίας του σήματος, τις υδραυλικές συνδέσεις με το ενσωματωμένο σύστημα μικροροής και την αντλία παροχής των αντιδραστηρίων (Σχήμα 3) [15]. Τέτοιου είδους φορητές αναλυτικές συσκευές αναμένεται να παίξουν σημαντικό ρόλο στην αναβάθμιση των αποκεντρωμένων υπηρεσιών υγείας. Επί του παρόντος, αναπτύσσεται κατάλληλα τροποποιημένος αισθητήρας για την ανίχνευση επιλεγμένων μεταλλάξεων του γονιδίου BRCA1 που έχει βρεθεί ότι έχουν την υψηλότερη συσχέτιση με την προδιάθεση εμφάνισης κληρονομικού καρκίνου του μαστού και των ωοθηκών [18]. Βιβλιογραφία 1. Turner, A.P.F. (2000) Science, 290, Koch, S., Wolf, H., Danapel, C. and Feller, K.A. (2002) Biosens. Bioelectron. 14, Bier, F.F. and Schmid, R.D. (1994) Biosens. Bioelectron. 9, Lagally, E.T., Medintz, I. and Mathies, R.A. (2001) Anal. Chem. 73, Cooper, M.A. (2002) Nature Review Drug Discovery 1, Rowe-Taitt, C., Anderson, G.P. and Ligler, F.S. (2005) Biosens. Bioelectron. 20, Misiakos K., Kakabakos S.E., Douvas A., Argitis, P. (2001) Technical Digest - International Electron Devices Meeting, p Misiakos K., Kakabakos S.E., Petrou P.S., Ruf H.H. (2004) Anal. Chem. 76, Κακαμπάκος Σ., Μισιακός Κ. Αριθμ. Διπλώματος GR , Ημ. Δημοσίευσης 24/04/ Misiakos K., Kakabakos S. International Patent Application, WO 03/046527, Published 05/06/ Misiakos K., Kakabakos S. US Patent Application Publication, US 2005/ , Published 06/01/ Misiakos K., Petrou P., Kakabakos S.E., Vlachopoulou M., Tserepi A., Gogolides E. (2006) Proceedings of SPIE - The International Society for Optical Engineering, Article. No W Misiakos K., Petrou P.S., Kakabakos S.E., Vlahopoulou M.E., Tserepi A., Gogolides E., Ruf H.H. (2006) Microelectron. Eng. 83,

23 ΟΚΤΩΒΡΙΟΣ - ΝΟΕΜΒΡΙΟΣ - ΔΕΚΕΜΒΡΙΟΣ 2007, ΤΕΥΧΟΣ Πέτρου Π., Κακαμπάκος Σ.Η., Νιώτης Α., Ruf H., Bier F., Μισιακός Κ. 5ο Πανελλήνιο Συνέδριο Κλινικής Χημείας- Κλινικής Βιοχημείας, Αθήνα, Νοεμβρίου 2004, Βιβλίο Περιλήψεων σελ Misiakos K., Petrou P.S., Kakabakos S.E., Ruf H.H., Ehrentreich- Forster E., Bier F.F. (2005) J. Physics: Conference Series 10, Ruf H.H., Knoll T., Misiakos K., Haupt R.B., Denninger M., Larsen L.B., Petrou P.S., Kakabakos S.E., Ehrentreich-Förster E., Bier F.F. (2006) Microelectron. Eng. 83, Μισιακός Κ., Κακαμπάκος Σ. Αριθμ. Διπλώματος GR , Ημ. Δημοσίευσης 27/06/ K. Misiakos, S. Kakabakos. International Patent Application, WO 2007/074348, Published 05/07/ Μαυρογιαννοπούλου Ε., Πέτρου Π., Σιαφάκα-Καπάδαη Α., Χριστοφίδης I., Μισιακός Κ., Κακαμπάκος Σ.Η. 6ο Πανελλήνιο Συνέδριο Κλινικής Χημείας-Κλινικής Βιοχημείας, Αθήνα, 9-11 Νοεμβρίου Βιβλίο Περιλήψεων σελ Ευχαριστίες Το έργο χρηματοδοτήθηκε από την Ευρωπαϊκή Ένωση για το διάστημα μέσω του προγράμματος BIOMIC (Contract No: IST ) και για το μέσω του προγράμματος NEMOSLAB (Contract No: IST ). 23

24 ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ ΕΕΚΧ-ΚΒ Ανίχνευση σημειακών μεταλλάξεων με βιοαισθητήρα DNA τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων Ιωάννης Κ. Λίτος Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Αθηνών, Αθήνα Πηνελόπη Ιωάννου-Αμαραντίδου Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Αθηνών, Αθήνα Θεόδωρος Χριστόπουλος Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Πατρών, Πάτρα Οι σημειακές μεταλλάξεις (SNPs, single nucleotide polymorphisms) είναι μεταλλαγές κατά ένα ή μερικά νουκλεοτίδια στην αλυσίδα του DNA. Η ύπαρξή τους μπορεί να προκαλέσει μείωση της ικανότητας έκφρασης του γονιδίου, έκφραση μη λειτουργικών πρωτεϊνών ή αλλαγή του πλαισίου ανάγνωσης. Στον ανθρώπινο οργανισμό συναντώνται με συχνότητα 1 στις βάσεις και αποτελούν σημαντικούς δείκτες για τη διάγνωση και τη μελέτη γενετικών ασθενειών και τη φαρμακογενετική [1]. Σχήμα 1. Σχηματική απεικόνιση της ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων και των τμημάτων της. Σχήμα 2. Σχηματική απεικόνιση της πορείας ανίχνευσης σημειακών μεταλλάξεων με το βιοαισθητήρα DNA. Για την ανίχνευση σημειακών μεταλλάξεων έχουν προταθεί αρκετές μέθοδοι οι περισσότερες εκ των οποίων είναι χρονοβόρες, υψηλού κόστους και προϋποθέτουν την ύπαρξη εξειδικευμένου προσωπικού [2]. Τα τελευταία χρόνια υπάρχει έντονο ενδιαφέρον για την ανάπτυξη μεθόδων που να χαρακτηρίζονται από ταχύτητα, αξιοπιστία και να μπορούν να εφαρμοστούν εκτός εργαστηρίου (point-of-care testing). Με αυτόν τον τρόπο, θα πραγματοποιείται έγκαιρη διάγνωση και αποτελεσματικότερη και ταχύτερη αντιμετώπιση της ασθένειας [3]. Στην κατηγορία των δοκιμασιών point-of-care συμπεριλαμβάνονται οι οπτικοί βιοαισθητήρες τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων (ή ταινίας πλάγιας ροής) οι οποίοι χρησιμοποιούνται για την ποιοτική ή ημι-ποσοτική ανίχνευση διαφόρων ειδών αναλυτών, όπως αντιγόνα, αντισώματα και νουκλεϊκά οξέα. Η αρχή λειτουργίας τους βασίζεται στην ακινητοποίηση στη μεμβράνη της ταινίας αντιδραστηρίων που να αλληλεπιδρούν εξειδικευμένα με τον αναλύτη. Εφόσον το δείγμα περιέχει τον αναλύτη, πραγματοποιείται δέσμευση, η οποία γίνεται αντιληπτή δια γυμνού οφθαλμού μέσω ειδικών έγχρωμων σωματιδίων (συνήθως σφαιριδίων πολυστυρενίου ή νανοσφαιριδίων χρυσού) [4]. Στη συνέχεια, περιγράφεται ταινία ξηρών αντιδραστηρίων για την ανίχνευση νουκλεϊκών οξέων και εφαρμογή της στην ανίχνευση σημειακών μεταλλάξεων [5, 6]. Τα τμήματα από τα οποία αποτελείται η ταινία ξηρών αντιδραστηρίων παρουσιάζονται στο Σχήμα 1. Ο χάρτης εμβάπτισης είναι πεπιεσμένος χάρτης και είναι το τμήμα της ταινίας που έρχεται σε επαφή με το υγρό ανάπτυξης. Στον υαλοβάμβακα βρίσκονται αποξηραμένα σφαιρίδια χρυσού που φέρουν στην επιφάνεια τους ολιγονουκλεοτίδια (dt) x. Ο απορροφητικός χάρτης απορροφά το υγρό ανάπτυξης μετά τη διέλευσή του από την κύρια μεμβράνη. Η μεμβράνη (νιτροκυτταρίνης) είναι το πιο σημαντικό τμήμα της ταινίας. Αποτελεί το υπόστρωμα πάνω στο 24