ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΥΚΗΤΟΛΟΓΙΑΣ. Δρ. Νταμάνη Ανθή

Transcript

1 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΥΚΗΤΟΛΟΓΙΑΣ Δρ. Νταμάνη Ανθή

2 ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ Κατά Whittaker (1969): Υπάρχουν πέντε βασίλεια των έμβιων όντων. Οι μύκητες αποτελούν σ ένα από τα πέντε βασίλεια. Σήμερα αυτή η ταξινόμηση είναι αμφιλεγόμενη διότι βασίζεται μόνο σε μορφολογικά χαρακτηριστικά. Σύγχρονες μελέτες που βασίζονται στη λεπτή δομή, στη βιοχημεία και μοριακή βιολογία παρέχουν νέα στοιχεία για την κατάταξη των μυκήτων σε νέες ταξινομικές θέσεις. ΒΑΣΙΛΕΙΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΟ ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ Monera προκαρυώτης βακτήρια Πρώτιστα ευκαρυώτης πρωτόζωα Μύκητες Ευκαρυώτης* μύκητες Φυτά ευκαρυώτης φυτά, βρύα Ζώα Ευκαρυώτης* αρθρόποδα θηλαστικά ΑΝΘΡΩΠΟΣ * Αυτό το κοινό χαρακτηριστικό είναι υπεύθυνο για το θεραπευτικό δίλλημα κατά την αντιμυκητιακή θεραπεία.

3 ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΕΜΒΙΩΝ ΟΝΤΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΑ ΑΡΧΑΙΑ ΕΥΚΑΡΥΑ μύκητες κατά Woese (1990): 3 επικράτειες- Domains Η κατάταξη έγινε με βάση την συγκριτική γενετική ανάλυση της ακολουθίας των νουκλεοτιδίων μιας μικρής υπομονάδας του ριβοσωματικού RNA. Οι μύκητες κατατάσσονται στην επικράτεια των ευκαρυωτών.

4 ΜΥΚΗΤΟΛΟΓΙΑ Μυκητολογία: είναι η μελέτη των μυκήτων και των πολλαπλών λειτουργιών τους στη φύση. Α. ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ Οι μύκητες που ενδιαφέρουν την Ιατρική Μυκητολογία διαχωρίζονται αδρά στις εξής ομάδες: Ακτινομύκητες: έχουν χαρακτήρες βακτηριδίων Αληθινοί μύκητες: σχηματίζουν μυκήλια Ακτινομύκητες Νοκάρδιες Στρεπτομύκητες Δερματόφυτα Μαδουρομύκητες Πενικίλλια Ασπέργιλλοι Μουκόρια και άλλες μούχλες Ζυμομύκητες: μονοκύτταροι οργανισμοί που πολλαπλασιάζονται με εκβλαστήσεις χωρίς να παράγουν μυκήλια. Στην ομάδα αυτή ανήκουν όλες οι μαγιές (ζύμες). Από τους παθογόνους κυρίως ο κρυπτόκοκκος. Ζυμοειδείς μύκητες: είναι μονοκύτταροι οργανισμοί που πολλαπλασιάζονται με εκβλαστήσεις. Δεν παράγουν αληθινό μυκήλιο αλλά ψευδομυκήλιο. Κάντιντες Γεώτριχο Διμορφικοί μύκητες: είναι μονοκύτταροι ζυμοειδείς στην θερμοκρασία των 37 0 C και αληθινοί μύκητες σε θερμοκρασία δωματίου. Λέγονται και διφασικοί. Ιστόπλασμα Βλαστομύκητες Κοκκιδιοειδές Σπορότριχο κλπ

5 Β. ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ Για Ιατρική χρήση πιο κατάλληλη ταξινόμηση είναι η παρακάτω: A. Επιφανειακές Μυκητιάσεις ή Δερματόφυτα Μικρόσπορα Τριχόφυτα Επιδερμόφυτα Β. Δερματικές και Υποδόριες μυκητιάσεις Κάντιντες Χρωμοβλαστομύκητες Τριχόσπορο Ρινοσπορίδιο C. Συστηματικές Μυκητιάσεις Ακτινομύκητες-Νοκάρδιες Βλαστομύκητες Ιστόπλασμα Κοκκιδιοειδές Κάντιντες Γεώτριχο Κρυπτόκοκκος

6 ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑ ΜΥΚΗΤΩΝ Οι παθογόνοι μύκητες μπορούν να υφίστανται σε μορφή ζυμομύκητα ή μυκήλιου. Ζυμομύκητες ή Ζύμες είναι μονοκύτταροι οργανισμοί που αναπαράγονται με εκβλάστηση. Οι υφές (hypha) είναι πολυκύτταρες νηματοειδείς δομές, που αποτελούνται από κυλινδρικά κύτταρα με κυτταρικά τοιχώματα. Το σύνολο των υφών συγκροτεί το μυκήλιο το οποίο αποτελεί το αδιαφοροποίητο σώμα ή θαλλό του μύκητα. Τα μυκήλια σχηματίζουν διακλαδώσεις. Το μοντέλο των διακλαδώσεων καθώς και το πλάτος του μυκήλιου βοηθούν στην μορφολογική του ταυτοποίηση. Οι υφές μπορεί να είναι συνεχείς ή κοινοκυτταρικές οπότε εμφανίζονται σαν ένα κύτταρο ή πολυκυτταρικές όταν χωρίζονται σε περισσότερα κύτταρα με κάθετα χωρίσματα τα οποία ονομάζονται διαφράγματα ή σέπτα. Μερικοί παθογόνοι μύκητες ανάλογα με την θερμοκρασία μπορεί να εμφανίζονται είτε σαν ζύμες είτε σαν μυκήλια. Αυτοί οι μύκητες ονομάζονται διμορφικοί Ζύμες Κοινοκυτταρικός Πολυκυτταρικός με σέπτα

7 Μερικοί βασικοί όροι μορφολογίας και βιολογίας μυκήτων oσπόρια: πρωταρχικά κύτταρα από τα οποία βλασταίνει κάθε μύκητας oβλαστοσπόρια: μονογονικά σπόρια που έχουν την ικανότητα να πολλαπλασιάζονται με εκβλάστηση ενός άλλου μονοκύτταρου σπόρου. oχλαμυδοσπόρια: είναι σπόροι με διπλό άκαμπτο τοίχωμα που βλασταίνουν από τις υφές του μύκητα oαρθροσπόρια: είναι μονογονικά μονοκύτταρα σπόρια που παράγονται με κατάτμηση των υφών του μυκήλιου oασκοσπόρια: είναι αμφιγονικά σπόρια που προήλθαν από τη σύμμιξη των πυρήνων δύο κυττάρων και βρίσκονται μέσα σε σάκο. oκονίδια: είναι τα σπόρια των μυκήτων που βρίσκονται ακόμη στο μυκήλιο, γύρω ή πάνω σε ένα κονιδιοφόρο όργανο του μύκητα (μικροκονίδια, μακροκονίδια) oυφή : είναι το κλαδί που βλασταίνει από τον σπόρο. Πολλές υφές αποτελούν το μυκήλιο. oμυκήλιο : το σύνολο των υφών και όλων των οργάνων αναπαραγωγής του μύκητα. Στην ουσία πρόκειται για την αποικία του μύκητα που βλάστησε από ένα σπόρο. oψευδομυκήλιο : είναι η υφή που σχηματίζεται από μια αλυσίδα βλαστοσπορίων oπολλαπλασιασμός: γίνεται στους μεν ζυμομύκητες και ζυμοειδείς μύκητες κυρίως με εκβλάστηση (αγενής αναπαραγωγή) ενώ στους άλλους με σύμμιξη των πυρήνων αρσενικών και θηλυκών κυττάρων (εγγενής αναπαραγωγή).

8 Αμφιγονικά σπόρια μυκήτων ή σπόρια εγγενούς αναπαραγωγής

9 Βλαστοσπόρια Μονογονικά σπόρια μυκήτων ή σπόρια αγενούς αναπαραγωγής

10 ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΜΥΚΗΤΩΝ 1. Ευκαρυωτικοί οργανισμοί 2. Δεν περιέχουν χλωροφύλλη 3. Δεν είναι φωτοσυνθετικοί οργανισμοί 4. Ετερότροφοι οργανισμοί-πρώτα πέψη της τροφής και μετά απορρόφηση στο σώμα τους 5. Παράγουν πεπτικά ένζυμα για την διάσπαση της οργανικής ύλης ή του ξενιστή τους 6. Αποθήκευση της ενέργειας που προσλαμβάνουν μέσω της τροφής ως γλυκογόνο 7. Οι περισσότεροι μύκητες είναι σαπρόφυτα διαβιώνοντας πάνω σε νεκρούς οργανισμούς 8. Σπουδαίοι αποικοδομητές και ανακυκλωτές των θρεπτικών ουσιών 9. Μερικοί μύκητες είναι εξωτερικά ή εσωτερικά παράσιτα 10. Μερικοί μύκητες είναι αρπακτικοί με μηχανισμούς παγίδευσης μικροσκοπικών ζώων 11. Μοιάζουν με φυτά γιατί είναι ακίνητοι 12. Διαθέτουν άκαμπτο και ανθεκτικό κυτταρικό τοίχωμα 13. Απουσία πραγματικών ριζών, μίσχων και φύλλων 14. Αναπτύσσονται ως μικροσκοπικοί σωλήνες ή νήματα που ονομάζονται υφές και περιέχουν κυτταρόπλασμα και πυρήνες 15. Τα δίκτυα των υφών ονομάζονται μυκήλια 16. Μονοκύτταροι (ζύμες) ή πολυκύτταροι (μυκήλια) με υψηλή κυτταρική οργάνωση 17. Μερικοί μύκητες είναι βρώσιμοι 18. Αναπαράγονται με σπόρους αγενώς ή εγγενώς 19. Το πρώτο αντιβιοτικό η πενικιλλίνη προέρχεται από τη μούχλα του μύκητα Penicillium 20. Η ταξινόμηση τους βασίζεται στις αναπαραγωγικές τους δομές 21. Άριστη ανάπτυξη σε σκιώδες, θερμό και υγρό περιβάλλον 22. Στους μύκητες περιλαμβάνονται οι ζύμες, η μούχλα, οι λειχήνες,οι σκουριές κλπ 23. Οι μύκητες εξελίχθηκαν από τους προκαρυώτες με ενδοσυμβίωση

11 ΠΑΘΟΓΟΝΟΙ ΓΙΑ ΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ ΜΥΚΗΤΕΣ Χωρίζονται σε 4 ομάδες: 1 η ομάδα: ανήκουν οι μύκητες που έχουν προσαρμοστεί να εισβάλλουν στους ιστούς των θηλαστικών και είναι γνωστοί κυρίως με αυτή την παρασιτική σχέση. 2 η ομάδα: ανήκουν οι μύκητες που προκαλούν παθολογικές καταστάσεις μόνο σε ορισμένες περιστάσεις 3 η ομάδα: ανήκουν οι μύκητες που προκαλούν νόσο ή και θάνατο όταν προσληφθούν από το στόμα 4 η ομάδα: ανήκουν οι μύκητες που προκαλούν αλλεργίες ή τοξικά φαινόμενα

12 ΠΑΘΟΓΟΝΟΙ ΓΙΑ ΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ ΜΥΚΗΤΕΣ Δράση παθογόνων μυκήτων στον άνθρωπο 1. Προσβάλλουν εσωτερικά όργανα και προκαλούν νόσο των συστημάτων 2. Προκαλούν σοβαρές τοπικές υποδόριες μολύνσεις ή μολύνσεις του δέρματος και των συνδεδεμένων με αυτό κεράτινων ιστών ή βλεννογόνων, σπανίως δε εισδύουν και στους ιστούς που βρίσκονται πιο βαθειά 3. Προκαλούν αλλεργικές καταστάσεις 4. Τοξικοί μύκητες που μπορούν να προκαλέσουν και θάνατο (δηλητηριώδη μανιτάρια) είδη μυκήτων αναφέρονται στην διεθνή βιβλιογραφία > 50 μύκητες είναι σαφώς παθογόνοι για τον άνθρωπο

13 ΕΥΚΑΙΡΙΑΚΑ ΠΑΘΟΓΟΝΟΙ ΓΙΑ ΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ ΜΥΚΗΤΕΣ Μη φυσιολογικές καταστάσεις: που μπορεί ο άνθρωπος να προσβληθεί και από ευκαιριακά παθογόνους μύκητες. Ο συνυπολογισμός κι αυτών των μυκήτων ανεβάζει τον αριθμό τους από 50 στους 180. o γενική εξασθένηση του οργανισμού μετά από νόσο o διαβητική κατάσταση o ασθενής σε ανοσοκαταστολή μετά από μεταμόσχευση o μετά από θεραπεία με στεροειδή oμετά από θεραπεία με αντιβιοτικά o ασθενείς με AIDS o μικροεκδορές ενός, χωρίς αγγεία ή ανεπαρκούς ανοσολογικά, ιστού όπως είναι ο κερατοειδής χιτώνας του οφθαλμού o επανειλημμένη έκθεση των ποδιών σε διείσδυση αγκαθιών (ξυπόλητοι εργάτες ή αγρότες όπως συμβαίνει συχνά σε τροπικές περιοχές)

14 Χαρακτηριστικά ΠΑΘΟΓΟΝΟΙ ΓΙΑ ΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΟ ΜΥΚΗΤΕΣ σοβαρών μυκητιάσεων συστημάτων και υποδορίων ιστών που προκαλούνται συνήθως από παθογόνους σαπροφυτικούς μύκητες δεν είναι μεταδοτικές η μόλυνση ανθρώπου και ζώου πραγματοποιείται με την εισπνοή ή με την τραυματική εμφύτευση μυκήτων από την φυσική σαπροφυτική κατοικία του μύκητα στο περιβάλλον του ανθρώπου φυσική σαπροφυτική κατοικία: αποσυντιθέμενη βλάστηση, φυτική ευρωτίαση- - μούχλα, σκόνη εδάφους επιμολυσμένη από απεκκρίματα πτηνών ή ζώων η πρόκληση νόσου συστημάτων από σαπρόφυτους μύκητες που είναι ευκαιριακά παθογόνα είναι ο κανόνας παρά η εξαίρεση

15 Ταξινόμηση μυκητιάσεων σε ομάδες Η Ταξινόμηση των μυκητιάσεων σε ομάδες, σκοπό έχει την ορθή διάγνωση τους διότι λαμβάνονται υπόψη κάποια στοιχεία που βοηθούν την κατεύθυνση των εξετάσεων. Γεωγραφική ομάδα: ταξινόμηση των μυκητιάσεων ανάλογα με την γεωγραφική τους κατανομή πχ μερικές μυκητιάσεις έχουν παγκόσμια εξάπλωση, ενώ άλλες περιορίζονται σε ορισμένες χώρες ή περιοχές. Τοπογραφική ομάδα: ταξινόμηση των μυκητιάσεων ανάλογα με την περιοχή του σώματος που προσβάλλουν Επιδημιολογική ομάδα: ταξινόμηση των μυκητιάσεων ανάλογα με τον τρόπο εμφάνισης, εξάπλωσης, μετάδοσης, απομόνωσης κλπ

16 ΜΥΚΗΤΙΑΚΕΣ ΑΣΘΕΝΕΙΕΣ Υπάρχουν τέσσερις τύποι μυκητιακών ασθενειών που προκαλούνται από: 1. Υπερευαισθησία - μια αλλεργική αντίδραση από μούχλα και τα σπόρια μυκήτων. Συνήθως οφείλεται σε εσωτερική ατμοσφαιρική ρύπανση 2. Μυκοτοξίκωση- δηλητηρίαση του ανθρώπου και των ζώων από τροφές και προϊόντα τροφίμων που έχουν μολυνθεί από μύκητες που παράγουν τοξίνες. 3. Mυκητισμός-η κατάποση προσχηματισμένων τοξινών (δηλητηρίαση από μανιτάρι). 4. Λοίμωξη Οι πλέον συνηθισμένοι παθογόνοι μύκητες δεν παράγουν τοξίνες.

17 ΟΡΙΣΜΟΙ ΜΥΚΗΤΙΑΣΕΩΝ Η ιατρική μυκητολογία: ασχολείται με τη μελέτη μυκητιάσεων του ανθρώπου και των αιτιολογικών παραγόντων. Οι περισσότερες μυκητιάσεις του ανθρώπου παρουσιάζονται και στα ζώα. Μυκητίαση: χαρακτηρίζεται το νόσημα που προκαλείται από μύκητα. Προσδιορίζει κυρίως τις μυκητιάσεις των συστημάτων και χρησιμοποιείται ως κατάληξη πολλών από τις μυκητιάσεις. Υπάρχουν και ορισμένες εξαιρέσεις στην ονοματολογία όπως ιστοπλάσμωση, μυκέτωμα, καντιτίαση. Δερματοφυτώσεις ή δερματομυκητιάσεις (τριχοφυτία, άχωρ, δερματοφύτωση του ποδιού) είναι επιφανειακές μυκητιακές μολύνσεις. Είναι μια ομάδα μυκητιακών μολύνσεων που συνήθως περιορίζονται στην επιδερμίδα και στους ιστούς που είναι άμεσα συνδεδεμένοι μ αυτήν. Προκαλούνται από μια ομάδα μυκήτων τα δερματόφυτα που έχουν φυσιολογικώς προσαρμοστεί και αναπτύσσονται επάνω στην κερατίνη στιβάδα της επιδερμίδας και μόνο σπάνια εισβάλλουν στους ιστούς που βρίσκονται πιο βαθιά. Μυκητώματα είναι εντοπισμένες υποδόριες μυκητιάσεις που χαρακτηρίζονται από διόγκωση διαπύηση, σχηματισμό πολλαπλών συριγγωδών πόρων και την παρουσία κοκκίων. Τα κοκκία είναι στην πραγματικότητα μικρές αποικίες του μύκητα μέσα στο πύον που διοχετεύεται από τους συριγγώδεις πόρους.

18 ΕΞΕΤΑΣΗ ΜΥΚΗΤΙΑΣΕΩΝ Η εξέταση των μυκητιάσεων περιλαμβάνει την κλινική εξέταση και την εργαστηριακή εξέταση των μυκητιάσεων. Κλινική εξέταση: πραγματοποιείται μελέτη των συμπτωμάτων της μυκητίασης. Η κλινική εξέταση περιλαμβάνει την επιδημιολογία της νόσου, το ιστορικό του ασθενούς, τα συμπτώματα, επίσης το τμήμα ή το σύστημα που έχει προσβληθεί ώστε να κατευθυνθεί η εξέταση προς τη σωστή διάγνωση. Αφού γίνει και η διαφορική διάγνωση της νόσου θα πρέπει για να αποφασιστεί η τελική διάγνωση της νόσου να προηγηθεί και η εργαστηριακή επιβεβαίωση.

19 Ο ρόλος του εργαστηρίου στις μυκητιάσεις: 1. η εργαστηριακή διαδικασία είναι δυνατόν να επιβεβαιώσει μια κλινική διάγνωση 2. να αποδείξει ότι ένας μύκητας είναι η αιτία μιας νόσου αγνώστου αιτιολογίας 3. να αποκλείσει την εμπλοκή οποιουδήποτε μύκητα σε μια νόσο 4. σε ευκαιριακές μυκητιάσεις μόνο το εργαστήριο μπορεί να προσφέρει αντικειμενικές ενδείξεις μυκητίασης 5. η εργαστηριακή απόδειξη κατευθύνει την θεραπευτική μέθοδο 6. παρακολουθεί την πορεία της νόσου 7. επιβεβαιώνει την αποθεραπεία της νόσου Η στενή συνεργασία κλινικού και εργαστηριακού ερευνητή είναι απαραίτητη

20 Οι εργαστηριακές εξετάσεις στη μυκητολογία χρησιμοποιούνται επίσης: 1. Για να βοηθήσουν στη διάγνωση όταν η κλινική εικόνα δεν είναι αρκετά σαφής οπότε είναι απαραίτητη η απομόνωση του αιτιολογικού παράγοντα. 2. Όταν ο κλινικός γιατρός, παρόλο που μπορεί να έχει σαφή συμπτώματα, θέλει να επιβεβαιώσει την τεθείσα κλινική διάγνωση με εργαστηριακό αποτέλεσμα. 3. Για ερευνητικούς ή επιδημιολογικούς σκοπούς

21 Περιλαμβάνονται: ΕΞΕΤΑΣΗ ΜΥΚΗΤΙΑΣΕΩΝ Εργαστηριακή εξέταση: χρώσεις και καλλιέργειες σε ειδικά υποστρώματα για τη διαπίστωση των μορφολογικών χαρακτηριστικών του μύκητα. ορολογικές, ανοσολογικές και ιστοπαθολογικές εξετάσεις. Στην εργαστηριακή εξέταση είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν και πειραματόζωα για μετάδοση και πρόκληση της νόσου και ακολούθως να εξεταστούν τομές ιστών από αυτά.

22 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΜΥΚΗΤΩΝ Ορολογικές εξετάσεις: με τις ορολογικές εξετάσεις αναζητούμε στον ορό του αίματος αντισώματα προς τα αντιγόνα του μύκητα που προκάλεσε μια νόσο. Τα αντιγόνα αυτά μπορεί να είναι σωματικά-περιβληματικά του μύκητα ή εξωσωματικά δηλαδή τοξίνες ή ένζυμα του μύκητα. Περιλαμβάνουν : 1. Διαπίστωση τίτλου κυκλοφορούντων αντισωμάτων: υπάρχουν σταθεροποιημένες μέθοδοι για την διαπίστωση του τίτλου. Γενικά τίτλοι κάτω από 1:8 δεν λαμβάνονται υπόψη. 2. Ιζηματιναντιδράσεις: στηρίζονται στην αρχή κατά την οποία όταν αντιγόνο και αντίσωμα συναντηθούν στην αρίστη τους αναλογία καθιζάνουν. Οι ιζηματίνες όταν υπάρχουν εμφανίζονται νωρίς στο διάλυμα και η ανίχνευση τους μπορεί να είναι χρήσιμη για τη διάγνωση. Η τεχνική της ανοσοδιάχυσης σε άγαρ είναι χρήσιμη στην κατάδειξη πολλαπλών αντισωμάτων του ορού. 3. Αιμοσυγκόλληση: το αντιγόνα στη μέθοδο αυτή είναι κάποια διαλυτή ουσία του καλλιεργήματος ή ουσία που αποχωρίστηκε από το σώμα του μύκητα και προσκολλήθηκε στην επιφάνεια των ερυθρών αιμοσφαιρίων. Για την προσρόφηση αυτή εφαρμόζεται συνήθως τεχνική προκατεργασίας και τα ευαισθητοποιηθέντα με τον τρόπο αυτόν ερυθρά συγκολλώνται παρουσία του ομόλογου αντισώματος. Τα αντιγόνα στην περίπτωση των μυκήτων είναι λίγο δύσκολο να σταθεροποιηθούν. 4. Χρώση φθοριζόντων αντισωμάτων: μπορεί να καταδείξει μύκητες στους ιστούς και έχει διαγνωστική σε τομές από περιστατικά στα οποία δεν υπάρχει διαθέσιμος ορός.

23 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΜΥΚΗΤΩΝ Ανοσολογικές εξετάσεις: Χρησιμοποιούνται ως βοηθητικές εξετάσεις διότι παρουσιάζουν αρκετά μειονεκτήματα: τα αντιγονικά παρασκευάσματα που κυκλοφορούν έναντι των αντισωμάτων των μυκήτων δεν είναι καθαρά υλικά. Περιέχουν μίγματα αντιγόνων κοινά για δύο ή περισσότερους μύκητες όσο αυξάνει όμως η καθαρότητα του αντιγόνου τόσο μειώνεται η δύναμη του Παρατηρείται διαφορετική αντίδραση σε αντιγόνα κατά την αρχή της μόλυνσης απ ότι αργότερα. Αυτό αντιστρέφεται με την πάροδο του χρόνου. υπάρχουν ασθενείς από μυκητιάσεις που δεν παράγουν ποτέ ανιχνεύσιμα αντιγόνα

24 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΜΥΚΗΤΩΝ Ιστοπαθολογικές εξετάσεις Η μελέτη των μυκήτων που βρίσκονται μέσα στους ανθρώπινους ιστούς δίνει πολύ καλά αποτελέσματα όσον αφορά την ταυτοποίηση και επομένως την διάγνωση μιας μυκητίασης. Αυτό οφείλεται στο μέγεθος των μυκήτων, στη χαρακτηριστική μορφολογία τους και την ιστοχημική σύσταση τους. Χρησιμοποιούνται πολλές ιστολογικές χρώσεις για την ταυτοποίηση με μεγάλη ακρίβεια μυκήτων.

25 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΕΣ ΕΞΕΤΑΣΕΙΣ ΜΥΚΗΤΩΝ Ιστοπαθολογικές εξετάσεις Μερικές από τις χρωστικές μεθόδους που χρησιμοποιούνται είναι: χρώση PAS (Periodic Acid Shift reaction): με την οποία διακρίνονται ωραία οι ζύμες και οι υφές με χρώμα ροζ σε φόντο πράσινο υπό την προϋπόθεση να είναι ζωντανοί οι μύκητες κατά την ώρα της χρώσης. χρώση Gridley: μέθοδος χρήσιμη για το ξεκαθάρισμα (screening). Χρησιμοποιείται για ζύμες και υφές μυκήτων δίνοντας μορφολογικές λεπτομέρειες σε χρώμα μωβ κόκκινο αλλά όπως και η προηγούμενη μέθοδος απαιτεί να είναι ζωντανοί οι μύκητες την ώρα της χρώσης. χρώση GMS (Gomori methenamine-silver stain): αυτή δίνει σε όλες τις μορφές των μυκήτων μελανο-καστανό χρωματισμό. Χρωματίζει τα γηραιότερα και νεκρά στοιχεία των μυκήτων καλύτερα από τις προηγούμενες μεθόδους. Βλεννοκαρμίνη του Mayer (κόκκινη χρωστική ουσία της κοκκινέλης): οι βλεννοσακχαρίτες των τοιχωμάτων του Cryptococcus χρωματίζονται ωραία μ αυτή τη χρωστική, όπως και οι μύκητες Rhinosporidium, Blastomyces κλπ Χρώση Gram: βοηθά στη διαφορική διάγνωση και μελέτη των βακτηρίων που βρίσκονται στους ιστούς μαζί με τους μύκητες. Χρώση Ziehl Neelsen: χρησιμοποιείται για τα οξεάντοχα βακτήρια.

26 ΒΑΣΙΚΕΣ ΟΔΗΓΙΕΣ ΣΥΛΛΟΓΗΣ ΤΩΝ ΚΛΙΝΙΚΩΝΔΕΙΓΜΑΤΩΝ χρήση ειδικών εργαλείων λήψης δειγμάτων αντιπροσωπευτικό δείγμα χωρίς επιμολύνσεις επαρκής ποσότητα δείγματος κατάλληλο δοχείο συλλογής και χρήση ειδικών υλικών μεταφοράς και συντήρησης ορθή και πλήρης σήμανση των δοχείων συλλογής με τα στοιχεία του ασθενούς και την προέλευση του δείγματος. πληροφορίες σχετικά με ταξίδι ή διαμονή στο εξωτερικό του ασθενούς επαφή με ζώα επάγγελμα του ασθενούς Οι τρείς τελευταίοι παράγοντες δίνουν την δυνατότητα στο εργαστήριο να κατευθύνει ή να διαφοροποιήσει τις μεθόδους, προσανατολιζόμενο προς ένα συγκεκριμένο μύκητα ή ομάδα μυκήτων που να ταιριάζει στις πληροφορίες.

27 Είδη κλινικών δειγμάτων για μύκητες A. Κλινικά δείγματα επιφανειακών μυκητιάσεων B. Κλινικά δείγματα υποδόριων μυκητιάσεων C. Κλινικά δείγματα μυκητιάσεων των συστημάτων

28 Επιφανειακές μυκητιάσεις Προετοιμασία της προσβληθείσης από μύκητα περιοχής Σε όλες τις περιπτώσεις επιφανειακών μυκητιάσεων συνιστάται να γίνεται καθαρισμός του μέρους της δειγματοληψίας με χειρουργικό οινόπνευμα προσεκτικά ώστε να μη χαθεί υλικό απόξεσης. Ο καθαρισμός αυτός είναι απαραίτητος ειδικά όταν έχουν χρησιμοποιηθεί λιπαρές αλοιφές ή πούδρα για θεραπεία. Συλλογή και μεταφορά κλινικού υλικού το υλικό συλλέγεται και μεταφέρεται μέσα σε ειδικά μαύρα αναδιπλωμένα τετράγωνα τμήματα χάρτου τα οποία μειώνουν την μικροβιακή μόλυνση διότι αποξηραίνουν το δείγμα. μπορεί να συλλεγεί και να μεταφερθεί σε αποστειρωμένο τρυβλία Petri μετά από καλό κλείσιμο με parafilm. σε αποστειρωμένο δοχείο για συλλογή ούρων με βιδωτό καπάκι για άμεση μικροσκοπική εξέταση χρησιμοποιείται το ειδικό γυάλινο πλακάκι μικροσκόπησης με την καλυπτρίδα.

29 Βασικές οδηγίες λήψης και συλλογής Λήψη υλικού: Για να γίνει μια εργαστηριακή εξέταση πρέπει να υπάρχει το κατάλληλο παθολογικό υλικό. Για να είναι το υλικό κατάλληλο πρέπει να ακολουθούνται ορισμένοι κανόνες 1. Για ορισμένο χρονικό διάστημα πριν από την λήψη του υλικού θα πρέπει να διακοπεί οποιαδήποτε τυχόν χορηγούμενη φαρμακευτική αγωγή. 2. Η λήψη πρέπει να γίνεται από ενεργά σημεία της αλλοίωσης, τα οποία εννοείται ότι είναι και τα πιο νέα. Στις δερματομυκητιάσεις αυτά βρίσκονται στην περιφέρεια της αλλοίωσης. 3. Όταν οι εστίες της αλλοίωσης είναι περισσότερες από μία θα πρέπει να να λαμβάνεται υλικό χωριστά από κάθε εστία της πιθανής μυκητίασης.

30 Γένη δερματόφυτων: ΕΠΙΦΑΝΕΙΑΚΕΣ ΜΥΚΗΤΙΑΣΕΙΣ Δερματόφυτα οι αιτιολογικοί παράγοντες των δερματοφυτιάσεων κατατάσσονται σε τρία γένη μυκήτων: Επιδερμόφυτα -Epidermophyton (Μόνο ένα παθογόνο είδος E.floccosum) Μικρόσπορα -Microsporum spp (13 είδη) Τριχόφυτα -Trichophyton spp (19 είδη)

31 ΕΠΙΦΑΝΕΙΑΚΕΣ ΜΥΚΗΤΙΑΣΕΙΣ Δερματόφυτα Επιδερμόφυτα-Epidermophyton (Μόνο ένα παθογόνο είδος επιδερμόφυτου το E.floccosum) Προσβάλει το δέρμα και τα νύχια και σπανίως τα μαλλιά. Σχηματίζει αποικίες κίτρινου χρώματος σαν βαμβάκι. Αναγνωρίζονται εύκολα στο μικροσκόπιο από τις παχιές, ραβδωτές υφές με πολλαπλά, λεία και άφθονα μακροκονίδια των 2-4 κυττάρων. Epidermophyton floccosum Χρώση Gram μακροκονίδια

32 ΕΠΙΦΑΝΕΙΑΚΕΣ ΜΥΚΗΤΙΑΣΕΙΣ Δερματόφυτα Μικροσπόριο -Microsporum spp (13 είδη μικροσπορίων) Μπορεί να προσβάλει το δέρμα και τα μαλλιά και σπανίως τα νύχια. Κάποια είδη όπως τομ. audouini μπορεί εύκολα να εντοπιστεί στο τριχωτό της κεφαλής, επειδή οι μολυσμένες τρίχες φθορίζουν ένα φωτεινό πράσινο χρώμα όταν φωτίζεται με υπεριώδες φως Wood. Τα χαλαρά, βαμβακερά μυκήλια παράγουν μακροκονίδια με παχιά τοιχώματα, ατρακτοειδή, πολυκύτταρα και ακανθώδη. Το Microsporum canis είναι ένα από τα πιο κοινά είδη δερματόφυτων που μολύνουν τον άνθρωπο. Microsporum Audouinii. Η πιο κοινή αιτία του tinea capitis στα παιδιά σχολικής ηλικίας στις ΗΠΑ Χρώση Gram του Microsporum canis Μακροκονίδια με παχιά τοιχώματα, ατρακτοειδή, πολυκύτταρα και ακανθώδη. Microsporum canis

33 ΕΠΙΦΑΝΕΙΑΚΕΣ ΜΥΚΗΤΙΑΣΕΙΣ Δερματόφυτα Τριχόφυτα -Trichophyton spp (19 είδη τριχόφυτων) Προσβάλει το δέρμα, τα μαλλιά και τα νύχια. Τα κονίδια είναι μεγάλα (μακροκονίδια), έχουν λείο, λεπτό τοίχωμα ενώ στο εσωτερικό τους διακρίνονται από 1-12 διαφράγματα (σέπτες). Συνήθως είναι κυλινδρικά περιγράφονται με σχήμα μολυβιού- αλλά υπάρχουν και ραβδοειδή και ατρακτοειδή. Σπανίως μπορούν να προκαλέσουν και υποδόριες μολύνσεις (κηρία) σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς (χρόνια μυελογενή λευχαιμία) Ερυθηματώδης, αλωπεκιακή πλάκα με κρούστα και φλύκταινες στην κρανιακή κορυφή. Η μυκητιακή καλλιέργεια ήταν θετική για Trichophyton rubrum. Χρώση Gramκυλινδρικά μακροκονίδια περιγράφονται με σχήμα μολυβιού Καλλιέργεια του Trichophyton verrucosum

34 ΕΠΙΦΑΝΕΙΑΚΕΣ ΜΥΚΗΤΙΑΣΕΙΣ Δερματόφυτα Ονοματολογία - Κλινική εικόνα Οι μολύνσεις που προκαλούνται από δερματόφυτα ονομάζονται ανάλογα με το ανατομικό σημείο όπου εμφανίζονται οι αλλοιώσεις με την προσθήκη του λατινικού ονόματος του σημείου προσβολής μετά τη λέξη Tinea (λειχήνα) Κλινικές εκδηλώσεις: o Tinea corporis δερματοφυτία του ψιλού δέρματος ή του σώματος o Tinea pedis δερματοφυτία του άκρου ποδός -"athlete's foot" o o o o o o o Tinea unguium (onychomycosis) δερματοφυτία των ονύχων Tinea capitis δερματοφυτία του τριχωτού της κεφαλής Tinea cruris δερματοφυτία των μηροβουβωνικών πτυχών Tinea barbae δερματοφυτία του γενείου Tinea versicolor δερματοφυτία αποχρωματισμού Tinea faciei δερματοφυτία του προσώπου Tinea imbricate Τοκελό (νησί της Πολυνησίας), δερματοφυτία του σώματος

35 Βασικές οδηγίες λήψης και συλλογής Παθολογικό υλικό για εργαστηριακές εξετάσεις: 1) Λέπια επιδερμίδας 2) Τρίχες 3) Ρινίσματα νυχιών 4) Πύο 5) Υγρό φυσαλίδων 6) Ούρα 7) Κόπρανα 8) Πτύελα 9) Αίμα

36 ΠΡΟΑΝΑΛΥΤΙΚΗ ΦΑΣΗ Βασικές οδηγίες λήψης και συλλογής Τεχνική δειγματοληψίας Ο τρόπος λήψης του υλικού είναι ανάλογος με τη μορφή της αλλοίωσης, του μέρους του σώματος από το οποίο γίνεται η λήψη και του είδους του υλικού προς εξέταση. 1. Τρίχες-Χνούδι: Για την λήψη χρησιμοποιείται μια κοινή αποστειρωμένη τριχολαβίδα. Η τρίχα πρέπει να βγαίνει ολόκληρη από τη ρίζα της δηλαδή να μην σπάζει, ώστε να είναι δυνατή η ακριβής μελέτη της υφής της και του παρασιτισμού της. Πριν από τη λήψη πρέπει να καθαρίζονται οι τρίχες με οινόπνευμα για να απομακρύνονται οι λιπαρές ουσίες. Επίσης εφαρμόζεται η μέθοδος της μοκέτας με την οποία το υλικό λαμβάνεται γρήγορα και καλά, γι αυτό η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται σε επιδημιολογικές έρευνες. 2. Λέπια επιδερμίδας: Λαμβάνονται με απόξεση της επιδερμίδας με την βοήθεια μιας αντικειμενοφόρου πλάκας ή με ειδικά ξέστρα ή με ένα απλό νυστέρι. Επίσης η λήψη μπορεί να γίνει με μια διάφανη, διπλής κολλητικής όψεως, ταινία (scotch double face)

37 3. Νύχια (ρινίσματα-μικροτεμάχια): ΠΡΟΑΝΑΛΥΤΙΚΗ ΦΑΣΗ Βασικές οδηγίες λήψης και συλλογής Τεχνική δειγματοληψίας Για τη λήψη χρησιμοποιούνται τα ειδικά ξέστρα, όπως ειπώθηκε προηγουμένως ή μεταλλικό αιχμηρό ή λογχοειδές αντικείμενο για λήψη υπονύχιου υλικού. Πρέπει επίσης να υπάρχουν δύο ψαλίδια, το ένα χοντρό με στρογγυλεμένα άκρα και το άλλο λεπτότερο με μυτερά άκρα. Σε ορισμένες περιπτώσεις που τα νύχια είναι πολύ σκληρά και παχιά ή έχουν παραμορφωθεί οπότε η λήψη είναι δύσκολη, μπορεί να χρησιμοποιηθεί και η φρέζα του οδοντιάτρου. Σε βαθιά υπονύχια βλάβη χρησιμοποιείται η μέθοδος του «παραθύρου» δηλαδή το άνοιγμα μιας τρύπας στο όριο της αλλοίωσης με το υγιές μέρος και η λήψη του υλικού πραγματοποιείται μέσα από την τρύπα από την κοίτη του νυχιού. Το υλικό από τα νύχια πρέπει να είναι άφθονο και η λήψη να γίνεται με πολύ προσοχή διότι πολλές φορές τα αποτελέσματα από τις εργαστηριακές εξετάσεις είναι αρνητικά.

38 ΠΡΟΑΝΑΛΥΤΙΚΗ ΦΑΣΗ Βασικές οδηγίες λήψης και συλλογής Τεχνική δειγματοληψίας 4. Πύο-εξιδρωματικό υγρό: Λαμβάνεται εύκολα και η λήψη γίνεται με ένα αποστειρωμένο βαμβακοφόρο στυλεό ή με κρίκο. 5. Πτύελα-ούρα-κόπρανα-αίμα: Λαμβάνονται σύμφωνα με τις οδηγίες που ισχύουν και για άλλες εξετάσεις(βιοχημικέςμικροβιολογικές-αιματολογικές) και η συλλογή τους πρέπει να γίνεται σε αποστειρωμένα σκεύη. Το προς εξέταση υλικό στη συνέχεια λαμβάνεται με κρίκο ή λαβίδα για την άμεση εξέταση τους ή την καλλιέργεια τους.

39 Κλινικά δείγματα επιφανειακών μυκητιάσεων Μορφή δερματικής μόλυνσης: μια μυκητιακή αλλοίωση συνήθως απλώνεται προς τα έξω φυγοκεντρικά με επούλωση στο κέντρο της περιοχής Τρόπος λήψης: Το υλικό συλλέγεται με απόξεση εξωτερικά από τα όρια της αλλοίωσης με την κόψη ενός νυστεριού. Όταν υπάρχει ελάχιστη απολέπιση όπως για παράδειγμα στις αλλοιώσεις άτριχου δέρματος θα πρέπει να προτιμάται ή και να είναι αναγκαίο να χρησιμοποιηθεί κολλητική ταινία για να παρθεί επαρκές υλικό για εξέταση.

40 Βασικές οδηγίες λήψης και συλλογής Κλινικά δείγματα επιφανειακών μυκητιάσεων Μορφή επιφανειακής μυκητίασης στο τριχωτό της κεφαλής Τα δείγματα συλλέγονται καλύτερα με ένα αμβλύ νυστέρι έτσι ώστε το δείγμα να περιλαμβάνει απομεινάρια τριχών, περιεχόμενα βουλωμένων θυλακίων και λέπια. Τρίχες που μάλλον έχουν κοπεί παρά αποσπαστεί σπάνια αποτελούν ικανοποιητικό δείγμα. Το φως της λάμπας Wood μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διαπίστωση της τριχοφυτίας εξαιτίας κυρίως του μύκητα Microsporum αudouinii για το ενδεχόμενο η μόλυνση να προκαλείται από είδη που παράγουν φθορισμό των προσβεβλημένων τριχών. Εξέταση με το φως της λάμπας Wood: Τρίχες μολυσμένες από τους μικρόσπορους M. αudouinii, M.canis, M. schoenleinii, φθορίζουν κάτω από το φως της λάμπας που είναι μια πηγή υπεριώδους φωτός μεγάλου μήκους κύματος (3650 nm). Η χρήση της βοηθάει στην κλινική διάγνωση και στην επιλογή του κατάλληλου παθολογικού υλικού για την εργαστηριακή εξέταση. Χρώμα αυτοφθορισμού της κερατίνης: σκούρο μπλέ (φυσιολογικό) Χρώμα μυκητιακού φθορισμού: λαμπρό πράσινο (παθολογικό) Χρειάζεται προσοχή και καθαρισμό της περιοχής γιατί φθορίζει και από την παρουσία αλοιφών που ενδεχόμενα έχουν χρησιμοποιηθεί για θεραπεία.

41 Κλινικά δείγματα επιφανειακών μυκητιάσεων (συνέχεια) Η τριχοφυτία που προκαλείται από ανθρωπόφιλα είδη μυκήτων συνήθως προκαλεί πολύ μικρές αλλοιώσεις οι οποίες είναι δύσκολο να διαπιστωθούν κλινικά Στην περίπτωση αυτή συνιστάται δειγματοληψία με ολοκληρωτικό βούρτσισμα του τριχωτού ή εντριβή με ταμπόν και διενέργεια καλλιέργειας από τη βούρτσα ή το ταμπόν με απευθείας ενοφθαλμισμό σε τρυβλία Petri με το κατάλληλο υπόστρωμα Στις μεμβράνες των βλεννογόνων προτιμώνται τα ξέσματα παρά τα βύσματα. Εάν το κλινικό δείγμα περιέχει και βύσμα η αποστολή του προς το εργαστήριο μεταφοράς είναι να πραγματοποιείται σε ειδικό υπόστρωμα μεταφοράς διότι οι μύκητες σε ξηρά βύσματα χάνουν γρήγορα την βιωσιμότητα τους.

42 Βασικές οδηγίες λήψης και συλλογής Κλινικά δείγματα επιφανειακών μυκητιάσεων Τα δείγματα από τα νύχια πρέπει να λαμβάνονται με τσιμπίδα ή με ειδικό αμβλύ ψαλίδι ή νυχοκόπτη. Η δειγματοληψία πραγματοποιείται από το ελεύθερο άκρο (παρυφή) μέχρι όσο το δυνατόν βαθύτερα και θα πρέπει να περιλαμβάνει όλο το πάχος του νυχιού. Οι μύκητες συνήθως δεν επιβιώνουν στο απομακρυσμένο μέρος του νυχιού (άκρη) και μπορεί αυτό να είναι αιτία της αποτυχίας μιας καλλιέργειας. Για αποφυγή ψευδώς αρνητικής καλλιέργειας προσπαθούμε να λάβουμε δείγμα παρμένο από πολύ κοντά στη βάση του νυχιού. Βίντεο επίδειξης

43 Εργαστηριακές εξετάσεις Άμεση μικροσκοπική εξέταση: Στις εξετάσεις για τη διάγνωση των μυκητιάσεων πρέπει να γίνεται τουλάχιστον μια άμεση εξέταση με μικροσκόπηση στη οποία να φαίνεται η μορφή του μύκητα. Μικροσκοπική εξέταση 1. Νωπό παρασκεύασμα με διαύγαση της κερατίνης με αλκάλιο 2. Νωπό παρασκεύασμα χωρίς διαύγαση 3. Έμβια χρώση 4. Αρνητική χρώση 5. Χρώση με κυανό του μεθυλενίου 6. Χρώση Gram 7. Χρώση Giemsa 8. Χρώση ιστολογικών παρασκευασμάτων

44 Εργαστηριακές εξετάσεις Μικροσκοπική εξέταση: 1. Νωπό παρασκεύασμα με διαύγαση της κερατίνης με αλκάλιο. Με τη μέθοδο αυτή εξετάζονται οι τρίχες, τα ξέσματα νυχιών και του δέρματος. Το αντιδραστήριο είναι KOH ή NaOH: 10% για τα λέπια 20% για τις τρίχες 30% για τα νύχια Το εξεταστέο δείγμα τοποθετείται πάνω σε αντικειμενοφόρο πλάκα, προστίθενται μερικές σταγόνες διαλύματος αλκαλίου, θερμαίνεται πάνω σε μια φλόγα για μερικά λεπτά (5-10) ανάλογα με το πάχος της κερατίνης, σκεπάζεται με καλυπτρίδα και μικροσκοπείται με ξηρό φακό.

45 Εργαστηριακές εξετάσεις Μικροσκοπική εξέταση 2. Νωπό παρασκεύασμα χωρίς διαύγαση χρησιμοποιείται για την μικροσκόπηση καλλιεργήματος αναπτυσσόμενο μύκητα. Κόβεται ένα κομμάτι από το άκρο της αναπτυσσόμενης αποικίας ή από τις αέριες υφές, σκεπάζεται με καλυπτρίδα πιέζεται και μικροσκοπείται. 3. Έμβια χρώση Το αντιδραστήριο είναι το κυανό της λακτοφαινόλης που έχει την εξής σύσταση: Κρυσταλλική φαινόλη 20 g Γαλακτικό οξύ 20 g Γλυκερίνη 40 ml Κυανό του μεθυλενίου 0.75 g Νερό 20 ml Εκτέλεση: Πρώτα λιώνουμε τη φαινόλη και μετά την ζυγίζουμε. Σταγόνες από το αντιδραστήριο αυτό προστίθενται στο κομμάτι από την αναπτυσσόμενη καλλιέργεια ή σε διαυγαστικό κλινικό υλικό μετά την απομάκρυνση του αλκαλικού διαλύματος. Τα μυκητιακά στοιχεία χρωματίζονται γαλάζια.

46 Εργαστηριακές εξετάσεις Μικροσκοπική εξέταση 4. Αρνητική χρώση: Το αντιδραστήριο είναι κοινή σινική μελάνη (India ink). Χρησιμοποιείται χωρίς αραίωση για την αναγνώριση του κρυπτόκοκκου στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ). Σε μια ρανίδα σινικής μελάνης προστίθεται το ίζημα φυγοκεντρημένου ΕΝΥ. Σκεπάζεται με καλυπτρίδα και μικροσκοπείται. Ο κρυπτόκοκκος αναγνωρίζεται σαν λευκό σωματίδιο με εκβλάστηση σε κατάμαυρο οπτικό πεδίο. 5. Χρώση με κυανό του μεθυλενίου: Τα λεπτά λέπια της πιτυρίασης τοποθετούνται πάνω σε αντικειμενοφόρο πλάκα προστίθενται σταγόνες παγόμορφου οξικού οξέος και θερμαίνεται πάνω από φλόγα μέχρι που να εξατμιστεί το οξύ. Προστίθενται σταγόνες δ/τος κυανού του μεθυλενίου αφήνεται για 5-15 λεπτά και ξεπλένεται καλά. Η διακρίνεται καλά χρωματισμένη ανάμεσα στα επιθήλια του δέρματος

47 Εργαστηριακές εξετάσεις Μικροσκοπική εξέταση 6. Χρώση Gram: για την αναζήτηση μυκήτων στα πτύελα ή άλλα κλινικά υλικά Οι περισσότεροι μύκητες αναγνωρίζονται εύκολα γιατί είναι Gram θετικοί ιδιαίτερα οι κάντιντες. Ο κρυπτόκοκκος χρωματίζεται Gram αρνητικός. 7. Χρώση Giemsa: Χρησιμοποιείται για το ιστόπλασμα σε επιχρίσματα πάσχοντος ιστού 8. Χρώση ιστολογικών παρασκευασμάτων: Χρώση PAS, Mucicarmine, Comori κλπ Βίντεο επίδειξης

48 Εργαστηριακές εξετάσεις Θρεπτικά υλικά: Καλλιέργεια μυκήτων Αυτά διαφέρουν από τα υλικά καλλιέργειας των βακτηριών στα εξής: Έχουν όξινο ph 5.5 για τους περισσότερους μύκητες Είναι φτωχότεροι σε θρεπτικές ύλες και σε εκχυλισματικές ουσίες. Συνήθως περιέχουν κάποιο σάκχαρο. Στα θρεπτικά υποστρώματα που προορίζονται για την ανάπτυξη μυκήτων και κάποιες ουσίες για άλλους λόγους. Τέτοιες είναι αντιβιοτικά ή άλλες ανασταλτικές ουσίες Τα αντιβιοτικά προστίθενται για να παρεμποδίζεται η ανάπτυξη και ο πολλαπλασιασμός βακτηρίων και σαπροφυτικών μυκήτων

49 Εργαστηριακές εξετάσεις Καλλιέργεια μυκήτων Στα υλικά πρωτοκαλλιέργειας εκτός από τα αντιβιοτικά προστίθενται ουσίες όπως η κυκλοεξαμίδη ή ακτιδιόνη για την παρεμπόδιση ανάπτυξης των σαπροφυτικών μη παθογόνων μυκήτων. Η ακτιδιόνη αναστέλλει τους σαπροφυτικούς, αλλά και μερικούς παθογόνους, όπως τον κρυπτόκοκκο, μερικά είδη των Candida, τους ασπέργιλλους και έναν τριχόσπορο. Οι ανασταλτικές ουσίες προστίθενται στις εξής αναλογίες: Ουσίες g/100 ml υλικού mg/ml Ακτιδιόνη 0, Γενταμικίνη 0, Τετρακυκλίνη 0, Χλωραμφαινικόλη 0,

50 Εργαστηριακές εξετάσεις Καλλιέργεια μυκήτων Τα συνηθέστερα θρεπτικά υλικά είναι: Για τις πρωτοκαλλιέργειες: Άγαρ Sabouraud με γλυκόζη ή μαλτόζη Ζωμός Sabouraud με γλυκόζη ή μαλτόζη Ειδικά υλικά για πρωτοκαλλιέργειες υπάρχουν στο εμπόριο διάφορα, όπως το Mycophila agar για πρωτοκαλλιέργεια κρυπτόκοκκου και τα BHI. Για τις ταυτοποιητικές ανακαλλιέργειες: Ειδικά υλικά είναι το Corn meal agar,το Chlamydospore αγαρ, το potato dextrose agar, το rice grain και άλλα. Πολλοί μύκητες, ιδιαίτερα οι κάντιντες και ο κρυπτόκοκκος αναπτύσσονται στο αιματούχο άγαρ, στο McConkey, στο EMB.

51 Εργαστηριακές εξετάσεις Καλλιέργεια μυκήτων Θρεπτικά υποστρώματα: Στο εμπόριο υπάρχουν πολλά υποστρώματα σε αφυδατωμένη μορφή. Για την απομόνωση μυκήτων θα πρέπει να προστίθενται αντιβιοτικά για να παρεμποδίζεται η ανάπτυξη και ο πολλαπλασιασμός βακτηρίων και σαπροφυτικών μυκήτων λόγω επιμόλυνσης. Τα αντιβιοτικά που προστίθενται συνήθως είναι χλωραμφαινικόλη και κυκλοεξιμίδη. 1. Άγαρ εκχυλίσματος βύνης: Παρασκευή θρεπτικών υποστρωμάτων Εκχύλισμα βύνης Άγαρ Απεσταγμένο νερό 40 g 20 g 1000 ml Κατάλληλο για την ανάπτυξη και συντήρηση των περισσότερων μυκήτων (2%). Αν αντί 40 g βύνης χρησιμοποιηθούν 20 g τότε το υπόστρωμα είναι κατάλληλο για δερματόφυτα (4%)

52 Εργαστηριακές εξετάσεις Καλλιέργεια μυκήτων 2. Άγαρ Sabouraud (Sabouraud s dextrose agar-sda) Δεξτρόζη(γλυκόζη) Πεπτόνη (μυκητολογική) Απεσταγμένο νερό 40 g 10 g 1000 ml To υπόστρωμα αυτό χρησιμοποιείται για απομόνωση και καλλιέργεια των δερματόφυτων και άλλων παθογόνων μυκήτων που απαιτούν ένα πλούσιο υπόστρωμα με υψηλή περιεκτικότητα σε οργανικό άζωτο

53 Εργαστηριακές εξετάσεις Καλλιέργεια μυκήτων 3. Άγαρ Czapek-Dox: MgSO g KCl 0.5 g NaNO 3 2 g FeSO 4 O.O1 g K 2 HPO 4 1 g Σακχαρόζη 30g Άγαρ 20 g Το υπόστρωμα αυτό συνιστάται για την καλλιέργεια πενικιλλίων και ασπεργίλων. Είναι ικανοποιητικό για τα περισσότερα σαπρόφυτα εκτός από τους ζυμομύκητες για τους οποίους είναι καταλληλότερο το εκχύλισμα βύνης 2%. Μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για την διαφοροποίηση των δερματόφυτων από τα σαπρόφυτα

54 Εργαστηριακές εξετάσεις Καλλιέργεια μυκήτων Ειδικά υποστρώματα για δερματόφυτα: 1.Θρεπτικό άγαρ (Nutrient agar) Beef extract 10 g Πεπτόνη 10 g NaCl 5 g Agar 20 g Απεσταγμένο νερό 1000 ml Αυτό είναι καλύτερο για την απομόνωση του μύκητα Trichophyton verrucosum απ ότι το Sabouraud ή το εκχύλισμα βύνης

55 Εργαστηριακές εξετάσεις Καλλιέργεια μυκήτων 2. Άγαρ ουρίας (urea agar) urea agar base Αποσταγμένο νερό 2.4 g 95 ml Βρασμός για να διαλυθεί το άγαρ και αποστείρωση στους C. Αφήνεται να ψυχθεί στους 55 C και προστίθενται ασηπτικώς 5 ml διαλύματος ουρίας 40% και διανέμεται. Χρησιμοποιείται για την διαφοροποίηση μεταξύ του T. rubrum και του T. mentagrophytes. Η δράση της ουρεάσης του T. mentagrophytes μετατρέπει τον δείκτη του υποστρώματος σε κόκκινο μέσα σε 2-3 μέρες ενώ στο T. rubrum δεν παράγει ουρεάση ή χρειάζεται πολύ περισσότερο χρόνο για να την παραγάγει.

56 Εργαστηριακές εξετάσεις Εμβολιασμός- Σπορά Η σπορά γίνεται με εμφύτευση του προς καλλιέργεια δείγματος στην επιφάνεια του στερεού θρεπτικού υλικού. Η επώαση είναι πάντα αερόβια (εκτός των ακτινομυκήτων) και σε θερμοκρασία δωματίου. Λίγοι μύκητες προτιμούν τη θερμοκρασία των 37 ο C. Οι περισσότεροι αναπτύσσονται ταχύτερα, αφθονότερα και με τυπική μορφολογία στους ο C. Η διάρκεια της επώασης είναι 3-7 μέρες μέχρι πολλές βδομάδες. Η ανάγνωση των καλλιεργημάτων περιλαμβάνει: Α. την μικροσκοπική μορφολογία του μύκητα που αναπτύχθηκε. Β. την μορφολογία των αποικιών.

57 Εργαστηριακές εξετάσεις Καλλιέργεια μυκήτων Μικροκαλλιέργεια Είναι μέθοδος ταχύτερη απ την κανονική καλλιέργεια. Με τη μέθοδο αυτή παρακολουθείται η ανάπτυξη του μύκητα κάτω από το μικροσκόπιο. Το θρεπτικό υλικό είναι ένα κομμάτι άγαρ Sabouraud 1x1 cm που το κόψαμε από ένα τρυβλίο με το υλικό αυτό και το τοποθετήσαμε σε αντικειμενοφόρο πλάκα. Πάνω στο κομματάκι αυτό κάνουμε τη σπορά και σκεπάζουμε με αποστειρωμένη καλυπτρίδα. Βάζουμε την πλάκα σε τρυβλίο με βρεγμένο βαμβάκι και το αφήνουμε στον πάγκο. Μετά από 2-3 μέρες και καθημερινά κοιτάζουμε κάτω από το μικροσκόπιο για την ανάπτυξη του μύκητα. Βίντεο επίδειξης

58 Εργαστηριακές εξετάσεις στους μύκητες Βιοχημικές Ταυτοποιητικές δοκιμές 1. Ζύμωση σακχάρων 2. Αυξανόγραμμα 3. Διάσπαση της ουρίας 4. Κατανάλωση νιτρικών 5. Ρευστοποίηση πηκτής 6. Υδρόλυση αμύλου

59 1. Ζύμωση σακχάρων Χρησιμοποιείται πεπτονούχο νερό με τα διάφορα σάκχαρα και δείκτη. Η διάσπαση του σακχάρου διαβάζεται από την αλλαγή της χροιάς. Χρησιμοποιείται κυρίως για την ταυτοποίηση των διαφόρων ειδών κάντιντα. 2.Αυξανόγραμμα Βιοχημικές Ταυτοποιητικές δοκιμές Δοκιμάζεται η ικανότητα του μύκητα να χρησιμοποιεί κάποιο σάκχαρο σαν πηγή άνθρακα και ανάπτυξης. Ο μύκητας καλλιεργείται σε συνθετικό θρεπτικό υλικό στο οποίο δεν μπορεί να αναπτυχθεί γιατί δεν υπάρχει πηγή άνθρακα. Στην επιφάνεια του καλλιεργήματος, τοποθετούνται δισκία εμποτισμένα το καθένα με κάποιο σάκχαρο. Το τρυβλίο επωάζεται σε θερμοκρασία δωματίου. Ο μύκητας αναπτύσσεται γύρω από το δισκίο που περιέχει το σάκχαρο, το οποίο μπορεί να χρησιμοποιήσει και να αυξηθεί. Χρησιμοποιείται στο διαχωρισμό των ειδών του γένους κάντιντα, στην ταυτοποίηση του γεώτριχου και άλλων μυκήτων.

60 3.Διάσπαση ουρίας Γίνεται όπως και με τα βακτήρια. Χρησιμοποιείται στο διαχωρισμό ζυμομυκήτων πχ. ο κρυπτόκοκκος τη διασπά, ενώ η κάντιντα δεν τη διασπά. Δοκιμάζεται στο υλικό Christensen με ουρία και δείκτη. 4.Κατανάλωση νιτρικών Το υλικό περιέχει νιτρικό κάλιο. 5. Ρευστοποίηση πηκτής Το υλικό περιέχει 4% πηκτή και έχει ph Υδρόλυση αμύλου Βιοχημικές Ταυτοποιητικές δοκιμές

61 Εργαστηριακές εξετάσεις Ορολογικές εξετάσεις για αντισώματα και μυκητιακά αντιγόνα Οι ορολογικές μέθοδοι για την αναζήτηση αντισωμάτων που έχουν αποδειχθεί σαφείς ότι έχουν διαγνωστική αξία είναι οι εξής: 1. Σύνδεση συμπληρώματος 2. Έμμεσος ανοσοφθορισμός 3. Ανοσοδιάχυση 4. Συγκολλητιναντίδραση 5. Συγκόλληση σωματιδίων latex 6. Ανοσοηλεκτροφόρηση αντίθετης φοράς Οι δύο τελευταίες αντιδράσεις χρησιμοποιούνται κυρίως για την αναζήτηση μυκητιακών αντιγόνων στα εκκρίματα και στα παθολογικά υλικά. Η τεχνική της εκτέλεσης των ορολογικών αυτών δοκιμών δεν διαφέρει από αυτή που εφαρμόζεται στα μικροβιακά νοσήματα (λίγες διαφορές ως προς την τιτλοποίηση των αντιγόνων). Αυτά περιγράφονται στα έντυπα που συνοδεύουν τα αντιγόνα και τα λοιπά αντιδραστήρια της κάθε μιας δοκιμής. Τα περισσότερα υπάρχουν στο εμπόριο.

62 ΣΥΣΤΗΜΑΤΙΚΕΣ ΜΥΚΗΤΙΑΣΕΙΣ Λοιμώξεις συστημάτων και οργάνων-οξεία και χρόνιa ΝΟΣΟΙ Καντιντίαση Κρυπτοκοκκίαση Ιστοπλάσμωση Γεωτρίχωση Βλαστομυκώσεις ΜΥΚΗΤΕΣ Candida ablicans, C. tropicalis, C. stellatoidea Cryptococcus neoformans Histoplasma capsulatum Geotrichum candidum Blastomyces dermatiditis, B. brasiliensis Η κάθε μια από τις μυκητιάσεις αυτές εκδηλώνεται με διάφορες κλινικές μορφές. Τα μέσα της εργαστηριακής διάγνωσης τους διαφέρουν γι αυτό σημειώνονται με συντομία χωριστά.

63 Candida sp Καντιντίαση Νόσοι: Οι συνηθέστερες τοπικές καντιντιάσεις είναι του κόλπου, των βλεννογόνων, του ορθού, του στόματος, των νυχιών, ενώ οι συστηματικές, κυρίως σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς είναι του εντέρου, του αναπνευστικού, του δέρματος, του ουροποιητικού και γενικευμένη σηψαιμία με μηνιγγίτιδα. Λαρυγγική καντιντίαση από Candida albicans

64 Candida spp Καντιντίαση Εργαστηριακή διάγνωση Μικροσκοπική εξέταση του παθολογικού υλικού με χρώση Gram (Gram θετικά βλαστοσπόρια πολύ χαρακτηριστικά). Άμεσο νωπό παρασκεύασμα. Στο κολπικό έκκριμα η παρουσία του αξιολογείται σαν αίτιο της κολπίτιδας, αν υπάρχουν σπόρια με ψευδομυκήλιο. Κυτταρικοί τύποι της Candida albicans gram χρώση με βλαστικές ζύμες και υφές -βλαστικά κύτταρα

65 Εργαστηριακή διάγνωση Candida Καλλιέργεια Καλλιέργεια σε Sabouraud agar με γλυκόζη και ανασταλτικές ουσίες, εφόσον το δείγμα είναι από περιοχή με μικροβιακή χλωρίδα. Αναπτύσσεται και στα κοινά υλικά καλλιέργειας των βακτηρίων (αιματούχο άγαρ, mcconkey κ.α.) Εύκολα αναγνωρίζεται από τις λευκές μεγάλες αποικίες και από τη χρώση Gram. Candida albicans σεsabouraud-dextrose Agar σε 48 ώρες στους 30 0 C

66 Εργαστηριακή διάγνωση Candida albicans Απαραίτητη η ταυτοποίηση του είδους Candida albicans με τις εξής δοκιμές: a. Δοκιμή παραγωγής χλαμυδοσπορίων b. Δοκιμή παραγωγής σωλήνα βλάστησης (germ tube) ή δοκιμή σε ορό ή Mackenzie c. Δοκιμή ανάπτυξη σε McConkey α. Δοκιμή παραγωγής χλαμυδοσπορίων Ανακαλλιέργεια σε ειδικό υλικό χλαμυδοσπορίων ή υλικό με καλαμποκάλευρο ή οποιοδήποτε άλλο. Τα χλαμυδοσπόρια αναγνωρίζονται με μικροσκοπική εξέταση του καλλιεργήματος στα υλικά αυτά. Θετική στην Candida albicans, σπανιότερα στη C. tropicalis. Το κύτταρο ζύμης αναπαράγεται με εκβλάστηση. Όταν καλλιεργείται σε καλλιεργητικά μέσα, διατροφικά φτωχά, η εκβλάστηση μπορεί να δημιουργήσει επιμήκη κύτταρα που παρατάσσονται κατά μήκος του διαχωριστικού επιπέδου, και μιμούνται την εμφάνιση μιας υφής, ωστόσο, αυτά τα μεμονωμένα κύτταρα, αναφέρονται ως ψευδοϋφές. Κάποιες αληθινές υφές μπορεί επίσης να σχηματιστούν. Κατά μήκος της ψευδοϋφής, η Candida albicans αναπτύσσει βλαστοκονίδια γύρω από την περιοχή της σέπτας (διαίρεση). Αυτά εμφανίζονται σαν σταφυλοειδή αθροίσματα.

67 Εργαστηριακή διάγνωση Candida albicans b. Δοκιμή παραγωγής σωλήνα βλάστησης -germ tube test- ή δοκιμή σε ορό ή Mackenzie Το καλλιέργημα εμβολιάζεται σε 0.5 ml ορό αίματος. Επωάζεται στους 37 ο C για 2 ώρες. Η C. albicans βλασταίνει στον ορό και παράγει μια σωληνοειδή υφή που δεν είναι ψευδομυκήλιο. Θετική δοκιμή δίνει και η C. stellatoidea. Παραγωγή σωλήνα βλάστησης Δεν υπάρχει σύσφιξη στο σημείο που ο βλαστικός σωλήνας συνδέεται με το κύτταρο

68 Εργαστηριακή διάγνωση Candida albicans c. Δοκιμή ανάπτυξης σε McConkey H C. albicans μετά από 24ωρη επώαση στους 37 ο C παρουσιάζει σωληνοειδή εκβλάστηση με σφαιρική διόγκωση στο άκρο της.

69 Εργαστηριακή διάγνωση Candida albicans Βιοχημικές δοκιμές Ζύμωση σακχάρων: γλυκόζη, σουκρόζη, μαλτόζη, λακτόζη, ραφινόζη Με δοκιμές ζύμωσης σακχάρων γίνεται ο διαχωρισμός και η ταυτοποίηση των διαφόρων ειδών της Candida. Η C. albicans ζυμώνει τη γλυκόζη και μαλτόζη, όχι όμως λακτόζη και ραφινόζη. Μπορεί να γίνει και αυξανόγραμμα είτε με τη μέθοδο των δισκίων είτε με έτοιμα συστήματα API. Ορολογικές δοκιμές Αντισώματα στον ορό των πασχόντων αναπτύσσονται κατά τη διάρκεια των συστηματικών καντιντιάσεων που ανιχνεύονται και τιτλοποιούνται με διάφορες μεθόδους: Η απλούστερη είναι 1) η μέθοδος της συγκόλλησης latex, το αντιδραστήριο της οποίας υπάρχει και στο εμπόριο. 2) Ανοσοδιάχυση σε αγαρόζη είναι μια μέθοδος που χρησιμοποιείται όπως και η 3) ηλεκτροφόρηση αντίθετης φοράς. Βίντεο επίδειξης Live Candida Spit Test 9.

70 Cryptococcus neoformans Κρυπτοκοκκίαση Nόσοι: Κρυπτοκοκκική μηνιγγίτιδα που μοιάζει κλινικά και εργαστηριακά (χαρακτήρες ΕΝΥ) με φυματιώδη μηνιγγίτιδα Σε ασθενείς με AIDS Οξεία ή χρονία πρωτοπαθής αναπνευστική νόσος Άλλες διάφορες εντοπίσεις όπως ενδοκαρδίτιδα σε ανοσοκατεσταλμένους Σπάνια στη χώρα μας Αυτή είναι μια πολυσακχαρική κάψουλα Cryptococcus neoformans σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο

71 Cryptococcus neoformans Κρυπτοκοκκίαση Εργαστηριακή εξέταση: Μικροσκοπική εξέταση του ιζήματος του ΕΝΥ με αρνητική χρώση με σινική μελάνη Έγχρωμη παρασκεύασμα με Gram χρώση Στο πύο είναι Gram αρνητικά σφαιρικά κύτταρα σαν σταγονίδια ή πολυκύτταροι κόκκοι με Gram θετικά κοκκία μέσα Cryptococcus neoformans Αρνητική χρώση σινικής μελάνης (India ink) Σφαιρικά κύτταρα με παχύ έλυτρο πολυσακχαρίτη που δεν βάφεται Gram χρώση του Cryptococcus neoformans Εμφανίζεται το φαινόμενο του γλυκοκάλυκα(έλυτρο)

72 Cryptococcus neoformans Κρυπτοκοκκίαση Καλλιέργεια: Σε mycophilic άγαρ ή σε Sabouraud με ή χωρίς ανασταλτικές ουσίες ανάλογα αν το δείγμα έχει πολλά μικρόβια ή όχι αλλά οπωσδήποτε σε υλικό χωρίς ακτιδιόνη Αναπτύσσεται και στο αιματούχο άγαρ και στο MacConkey. Η ταυτοποίηση των αποικιών γίνεται: με μικροσκοπική εξέταση με δοκιμή παρουσίας ελύτρου (χρώση σινικής μελάνης-india ink) έλλειψης υφών και μυκήλιου Cryptococcus neoformans Ανάπτυξη γαλακτοειδών αποικιών (κρεμώδεις βουτυρώδεις αποικίες)

73 Cryptococcus neoformans Κρυπτοκοκκίαση Βιοχημικές δοκιμασίες: 1. Διάσπαση ουρίας: ουρεάση (+) 2. Κατανάλωση νιτρικών: ΚΝΟ 3 (-) 3. Ανάπτυξη στους 37 0 C (+) 4. Δοκιμή σωλήνα βλάστησης (-) Ορολογικές δοκιμασίες: Προσφέρουν πραγματική διαγνωστική βοήθεια σε περιπτώσεις που δεν πετυχαίνει η απομόνωση του μύκητα. 1)Έμμεσος ανοσοφθορισμός: χρησιμεύει για την ανίχνευση και τιτλοποίηση των αντισωμάτων στο αίμα 2)Συγκόλληση σωματιδίων latex: χρησιμεύει για την ανίχνευση καψικού αντιγόνου και όχι αντισώματος στο αίμα ατόμων που πάσχουν από γενικευμένη ή συστηματική κρυπτοκοκκίαση ("Crag" test) 3)Άμεση συγκολλητιναντίδραση: εναιωρήματος καλλιεργήματος κρυπτόκοκκου από τα αντισώματα του αίματος του πάσχοντα.

74 Histoplasma capsulatum Ιστοπλάσμωση Νόσοι: Η πνευμονική ιστοπλάσμωση είναι μια καλοήθης οξεία ή χρονίζουσα νόσος με ακτινολογικά ευρήματα και διόγκωση των αδένων. Είναι πρωτοπαθής νόσος. Η γενικευμένη ιστοπλάσμωση είναι βαριά νόσος με συμμετοχή όλων των οργάνων όπου υπάρχει ΔΕΣ. Η «κατάρα του Τουταγχαμών»

75 Εργαστηριακή διάγνωση: Μικροσκοπική εξέταση Histoplasma capsulatum Ιστοπλάσμωση Πτυέλων Οπού λεμφαδένων Σπληνικού πολφού Μυελού οστών κλπ Χρωματίζεται το παρασκεύασμα με Giemsa και αναζητούνται μονοκύτταρα βλαστοσπόρια με έντονα χρωματισμένο περίβλημα. Ο μύκητας είναι διμορφικός και στους ιστούς βρίσκεται στη μονοκύτταρη ζυμοειδή μορφή του.

76 Histoplasma capsulatum Ιστοπλάσμωση Καλλιέργεια: Σε άγαρ Sabouraud με ή χωρίς αντιμικροβιακές ουσίες και ακτιδιόνη ανάλογα με το δείγμα. Τα τρυβλία επωάζονται το ένα σε θερμοκρασία δωματίου και το άλλο στους 37 0 C. Η επώαση διαρκεί πολλές εβδομάδες. Ο μύκητας αναγνωρίζεται από την μορφολογία του στο μικροσκόπιο και από την μορφή των αποικιών του.

77 Histoplasma capsulatum Ιστοπλάσμωση Ορολογικές δοκιμασίες: Στον ορό του πάσχοντα βρίσκονται αντισώματα που ανιχνεύονται με τις ακόλουθες μεθόδους: oσύνδεση συμπληρώματος oανοσοδιάχυση σε άγαρ κατά Ouchterlony με δύο αντιγόνα Μ και το Η oηλεκτροφόρηση αντίθετης φοράς oδερμοαντίδραση με ιστοπλασμίνη Δερματική δοκιμασία για Histoplasma είναι μια μέθοδος ελέγχου έκθεσης στον μύκητα που ονομάζεται Histoplasma capsulatum. Ο μύκητας προκαλεί μια λοίμωξη που ονομάζεται ιστοπλάσμωση. Πώς εκτελείται η δοκιμή Ο πάροχος υγειονομικής περίθαλψης θα καθαρίσει μια περιοχή του δέρματος σας, συνήθως τον αντιβραχίονα. Ένα αλλεργιογόνο (ιστοπλασμίνη) ενίεται ακριβώς κάτω από την καθαρισμένη επιφάνεια του δέρματος. Το σημείο της ένεσης ελέγχεται μετά από 24 ώρες και 48 ώρες για σημάδια μιας αντίδρασης. Περιστασιακά, η αντίδραση μπορεί να μην εμφανιστεί μέχρι και την τέταρτη ημέρα.

78 Geotrichum candidum Γεωτρίχωση Νόσοι: Αποικίζει βρόγχους, πνεύμονες και στόμα. Προκαλεί καλοήθη πνευμονική νόσο που κλινικά μοιάζει με φυματίωση. Το Geotrichum candidum είναι ένα πανταχού παθογόνο που παρατηρείται μετά τη συγκομιδή των φρούτων και την αλλοίωση των λαχανικών. Gouda At 25 Days, Natural Rind With Natural Protective Geotrichum candidum Mold Development

79 Geotrichum candidum Γεωτρίχωση Εργαστηριακή διάγνωση: Μικροσκοπική εξέταση των πτυέλων με άμεσο νωπό παρασκεύασμα ή μετά από ρευστοποίηση των πτυέλων με παγκρεατίνη. Αναγνωρίζονται τα βλαστοσπόρια που είναι ορθογώνια διατεταγμένα σαν αρθροσπόρια. Καλλιέργεια στο Sabouraud δίνει λευκές αποικίες σε λίγες μέρες. Geotrichum candidum υφές και κονίδια (αρθροσπόρια) Καλλιέργεια στο Sabouraud

80 Βιοχημικές δοκιμασίες: Geotrichum candidum Γεωτρίχωση Οι βιοχημικές δοκιμασίες πραγματοποιούνται για να τον ξεχωρίσουν από τις Candida. 1. Ουρεάση: (-) 2. ΚΝΟ 3 : (-) 3. Ψευδοϋφές: (-) 4. Germ tubes: (-) 5. Ανάπτυξη στους 37 0 C: (-) 6. Ζύμωση σακχάρων: (-) 7. Αυξανόγραμμα: αφομοιώνει τη γλυκόζη, τη γαλακτόζη και την ξυλόζη Η ταυτοποίηση του μύκητα γίνεται από την μικροσκοπική μορφολογία του μύκητα, τη μακροσκοπική της αποικίας καθώς και τις βιοχημικές δοκιμές.

81 Coccidioides immitis Κοκκιδιοειδές Νόσος: σαν την Ιστοπλάσμωση. Ο μύκητας είναι διμορφικός. Στους ιστούς βρίσκεται με μορφή σφαιρικών σωματιδίων, με μυκήλια στην καλλιέργεια. Εργαστηριακή διάγνωση: Όπως στην ιστοπλάσμωση. Οι ορολογικές εξετάσεις είναι οι εξής: Ιζηματιναντίδραση κλασσική με κροκύδωση σε σωληνάριο. Το αντιγόνο είναι εναιώρημα του καλλιεργήματος. Σύνδεση συμπληρώματος Ανοσοδιάχυση

82 Coccidioides immitis Κοκκιδιοειδές Positive reaction to coccidioidin skin test

83 Blastomyces dermatitis Βλαστομύκωση Νόσος: Δερματική και γενικευμένη. Ενδημεί κυρίως σε περιοχές της Β. Αμερικής και Αφρικής. Ο μύκητας είναι διμορφικός. Βρίσκεται σαν ζυμοειδές με βλαστοσπόρια στους ιστούς και με υφές και κονίδια στις καλλιέργειες. Εργαστηριακή διάγνωση: Από τους μορφολογικούς χαρακτήρες στα μικροσκοπικά παρασκευάσματα από τις καλλιέργειες. Ορολογική διάγνωση: Ανοσοδιάχυση Σύνδεση συμπληρώματος και οι δύο μέθοδοι έχουν εξελιχθεί πολύ σε ειδικότητα και ευαισθησία.

84 Ευκαιριακές μυκητιάσεις από τέλειους μύκητες Είναι τοπικές ή συστηματικές ή οργάνων μυκητιάσεις από μύκητες που είναι μικροοργανισμοί του φυσικού περιβάλλοντος και που αποικίζουν παροδικά το σώμα του ανθρώπου. Για την εμφάνιση των μυκητιάσεων αυτών απαραίτητοι είναι οι προδιαθεσικοί παράγοντες όπως η μείωση της τοπικής αντοχής. Νόσοι Μύκητες Ασπεργίλλωση Πενικιλλινίαση Aspergillus fumigatus, A. niger A. nidulans A. flavus Penicillium sp Μουκορμηκητιάσεις ή φυκομυκώσεις Rhizopus sp. Absidia sp. Mucor sp. Mortierella sp.

85 Aspergillus sp Ασπεργίλλωση Ομάδα ασκομυκήτων (μούχλα) σαπροφυτικών του φυσικού περιβάλλοντος που μορφολογικά χαρακτηρίζεται από το κυστίδιο του. Το κυστίδιο είναι ένα κονιδιοφόρο όργανο σαν ραντιστήρας με στηρίγματα και κονίδια (ο ασπέργιλλος των καθολικών). Αποικίζει τυχαία το σώμα του ανθρώπου αλλά μπορεί να προκαλέσει νόσους όπως πνευμονική ασπεργίλλωση, ασπεργίλλωση του έξω αυτιού, των βρόγχων, των νυχιών κλπ πνευμονική ασπεργίλλωση Με ιστολογική χρώση Το aspergillum (ή aspergilium ή aspergil) είναι τελετουργικό σκεύος που χρησιμοποιεί η καθολική εκκλησία για το ράντισμα του αγιάσματος.

86 Aspergillus sp Ασπεργίλλωση Εργαστηριακή διάγνωση: Από την χαρακτηριστική μικροσκοπική εικόνα του μυκηλλίου και των κεφαλών δηλ. των ασπεργίλλων στο άμεσο άχρωμο ή με Gram χρωματισμένο καλλιέργημα τους σε άγαρ Sabouraud. Στο άμεσο παρασκεύασμα του παθολογικού υλικού θα δούμε υφές πολύ σπάνια τις κεφαλές. Η ταυτοποίηση γίνεται από την μορφολογία του καλλιεργήματος. Μικροσκοπική χρώση ασπέργιλλου Aspergillus flavus Με κιτρινοπράσινες αποικίες Aspergillus fumigatus Με γκριζογάλανες αποικίες

87 Penicillium sp Πενικιλλινίαση Ομάδα τελειόμορφων μυκήτων-ασκομύκητες- με εκατοντάδες είδη μεταξύ των οποίων και το Penicillium notatum από το οποίο απομονώθηκε για πρώτη φορά η πενικιλλίνη (πρώτο αντιβιοτικό). Ζουν στο φυσικό μας περιβάλλον αλλά αποικίζουν παροδικά το σώμα μας και προκαλούν νόσο μόνο σε μειωμένης αντίστασης άτομα ή ιστούς όπως η ωτομύκωση και η πνευμονική μυκητίαση. Αυτές περιγράφονται ως: Monoverticillate (φιαλίδια που εκτείνονται απ 'ευθείας από τις υφές), Biverticillate (φιαλίδια που εκτείνονται από τους κλάδους που εκτείνονται από τις υφές), Terviticillate (φιαλίδια εκτείνονται από δομές που ονομάζονται μέτουλες και εμφανίζονται ως δευτερεύοντες κλάδοι, οι οποίοι εκτείνονται από τα πρωτογενή κλαδιά που εκτείνονται από τις υφές)