Μοριακή Περιβαλλοντική Επιδημιολογία

Transcript

1 Μοριακή Περιβαλλοντική Επιδημιολογία ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΥΓΙΕΙΝΗΣ ΜΟΝ. ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΙΚΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ Α.Βανταράκης Επικ. Καθηγητής Υγιεινής

2 «Η προάσπιση της Δημόσιας Υγείας, μπορεί να επιτευχθεί, κυρίως μέσω: πρόληψης του ελέγχου των περιβαλλοντικών συνθηκών, γεγονός που θα οδηγήσει και στην πρόληψη των νοσημάτων» Λάρισα 10 Ιανουαρίου 2012

3 Η ταυτοποίηση και τυποποίηση ενός μικροοργανισμού είναι σημαντική για την πρόληψη, τη διάγνωση, και τη θεραπεία των μολυσματικών ασθενειών. Ο προσδιορισμός των διαφορετικών στελεχών ενός είδους είναι σημαντικός για επιδημιολογικούς λόγους. Λάρισα 10 Ιανουαρίου 2012

4 .Γιατί είναι απαραίτητη η Μοριακή Βιολογία; Στo περιβάλλον και ειδικά στα φυσικά νερά, οι συνθήκες αλλάζουν συνεχώς διότι το περιβάλλον αλλάζει συνεχώς. Είναι πρόκληση η εφαρμογή των μοριακών τεχνικών που έχουν χρησιμοποιηθεί κυρίως σε κλινικά στελέχη, σε στελέχη που απομονώνονται από περιβαλλοντικά δείγματα Οι μικροοργανισμοί στο περιβάλλον μπορεί να είναι βιώσιμοι αλλά μη καλλιεργήσιμοι (viable but not culturable) Ενώ έχουν αναφερθεί πολλές υδατογενείς και τροφιμογενείς ασθένειες μόνο στο 50% των περιπτώσεων ήταν δυνατόν να βρεθεί η αιτία λόγω της έλλειψης κατάλληλων τεχνικών ανίχνευσης και τυποποίησης. Λάρισα 10 Ιανουαρίου 2012

5 Γιατί είναι απαραίτητη η Μοριακή Βιολογία; Οι τεχνικές που χρησιμοποιούνται πολλές φορές είναι ανεπαρκείς Οι καλλιεργητικές τεχνικές που υπάρχουν σήμερα δεν έχουν την ακρίβεια και την εξειδίκευση για να καταμετρήσουν χαμηλά επίπεδα παθογόνων μικροοργανισμών Οι καλλιεργητικές τεχνικές χρειάζονται χρόνο για την έκδοση των αποτελεσμάτων Ορισμένοι μικροοργανισμοί δεν καλλιεργούνται Λάρισα 10 Ιανουαρίου 2012

6 Κριτήρια για την επιλογή της κατάλληλης τεχνικής για την ταυτοποίηση και τυποποίηση των μικροοργανισμών Ικανότητα τυποποίησης Ποσοστό των βακτηρίων που μπορούν να τυποποιηθούν Αναπαραγωγιμότητα Επαναληψιμότητα του αποτελέσματος Σταθερότητα Ικανότητα των οργανισμών να διατηρούν το προφίλ τους Ικανότητα διαχωρισμού (περίπου 95%) Επιδημιολογική ταύτιση και συμφωνία Μεταβλητότητα Ικανότητα να ταυτοποιούνται οποιαδήποτε παθογόνα με μικρές τροποποιήσεις στη μεθοδολογία Ευκολία χρήσης Ευκολία ερμηνείας αποτελεσμάτων Κόστος Λάρισα 10 Ιανουαρίου 2012

7 ...Χαρακτηριστικά μοριακών τεχνικών που βοηθούν σε θέματα Δημόσιας Υγείας Ευαισθησία Εξειδίκευση Σύντομος χρόνος ανάλυσης Μη καλλιεργήσιμες μορφές Λάρισα 10 Ιανουαρίου 2012

8 Λάρισα 10 Ιανουαρίου 2012

12 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

13 .Γιατί είναι απαραίτητη η Μοριακή Βιολογία; Μοριακή ανίχνευση και τυποποίηση μικροοργανισμών σε κλινικά και περιβαλλοντικά δείγματα Μοριακή συσχέτιση και επιδημιολογία μικροοργανισμών σε λοιμώδη νοσήματα Ποιοτικός έλεγχος δειγμάτων περιβάλλοντος και τροφίμων Εκτίμηση κινδύνου από τον καθορισμό της προέλευσης της μόλυνσης Καθορισμός βιολογικών δεικτών σε χρόνια νοσήματα 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

14 ...Οι μοριακές τεχνικές μπορούν να χρησιμοποιηθούν για: α) Ανίχνευση, ταυτοποίηση και τυποποίηση βακτηρίων και ιών σε περιβαλλοντικά δείγματα (Θαλασσινό, πόσιμο, εμφιαλωμένα, λύματα) ή και τρόφιμα β) Ανίχνευση και ταυτοποίηση παθογόνων που απομονώθηκαν από περιβαλλοντικά δείγματα και τρόφιμα σε πολύ σύντομο χρονικό διάστημα σχετικά με τις καλλιεργητικές τεχνικές γ) Ανίχνευση μη καλλιεργήσιμων μορφών βακτηρίων και ιών δ) Επιδημιολογική μελέτη της παρουσίας των μικροοργανισμών καθώς και συσχέτιση της παρουσίας τους 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

15 Τεχνικές ταυτοποίησης και τυποποίησης Οι μέθοδοι ταυτοποίησης και τυποποίησης των μικροοργανισμών διακρίνονται σε δύο κατηγορίες: Α) Φαινοτυπικές Β) Γονοτυπικές 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

16 Φαινοτυπικές τεχνικές Βασίζονται στην ανάλυση των προϊόντων της γονιδιακής έκφρασης προκειμένου να διαφοροποιηθούν τα στελέχη μεταξύ τους. Ελέγχονται : Βιοχημικά προφίλ (API test) Ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά Αντιγόνα πάνω στην κυτταρική επιφάνεια Τύποι βακτηριοφάγων 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

17 Μοριακές τεχνικές Βασίζονται στην ανάλυση της μοριακής δομής του οργανισμού. Η μοριακή τυποποίηση χρησιμοποιεί τη μοριακή ποικιλομορφία μεταξύ των μικροοργανισμών από το ίδιο είδος. Ο τυχαίος επανασυνδυασμός και οι μεταλλάξεις του DNA δημιουργούν τη γενετική ποικιλομορφία μεταξύ των ίδιων ειδών που συλλέγονται από τις διαφορετικές πηγές, περιοχές, ή/ και χρόνο. Ανάλυση πλασμιδίων Ανάλυση χρωμοσωμικού DNA Τεχνικές υβριδοποίησης Τεχνικές πολλαπλασιασμού DNA και sequencing 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

18 Μοριακή προσέγγιση στην ταυτοποίηση και τυποποίηση μικροβίων Ανάλυση νουκλεϊκών οξέων Ανάλυση πλασμιδίων Ανάλυση χρωμοσωμικού DNA Τεχνικές υβριδοποίησης Τεχνικές πολλαπλασιασμού DNA και sequencing Ανάλυση πρωτεϊνών Ανάλυση πρωτεϊνικού προτύπου Αντιγονική ανάλυση πρωτεϊνών 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

19 Συγκριτικός πίνακας μεθόδων τυποποίησης Μέθοδοι τυποποίησης Ικανότητα τυποποίησης Αναπαραγωγιμότητα Ευκολία εφαρμογής Φαινοτυπικές μέθοδοι Βιότυποι Ανθεκτικότητα σε αντιβιοτικά Εύρεση ορότυπου Τυποποίηση με βακτηριοφάγους Ηλεκτροφόρηση με Multi-locus Enzyme Όλα Όλα Τα πιο σημαντικά Ποικίλη Τέλεια Μέτρια Μέτρια Καλή Μέτρια Καλή Τέλεια Τέλεια Καλή Μέτρια Καλή Γονοτυπικές τεχνικές Plasmid profile analysis Ανάλυση με ένζυμα περιορισμού Ανάλυση ριβότυπου Ηλεκτροφόρηση μεταβαλλόμενου πεδίου PCR-Ribotyping PCR-REA RAPD Sequencing Καλή Όλα Όλα Όλα Όλα Όλα Όλα Όλα Καλή Καλή Καλή Άριστη Καλή Καλή Πολύ καλή Καλή Άριστη Άριστη Καλή Καλή Πολύ καλή Πολύ καλή Πολύ καλή Μέτρια 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

20 Μερικές από τις μοριακές τεχνικές που εφαρμόζονται συνήθως σε εργαστήρια Δημόσιας Υγείας Blot hybridization assay In situ Nucleic acid Hybridization PCR, Nested PCR, RT-PCR PCR-restriction enzyme analysis (PCR-REA) ή PCR-RFLP Multiplex PCR (Triplex PCR) Cell culture-pcr PFGE Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Real-Time PCR 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

21 Μερικές εφαρμογές των μοριακών τεχνικών σε περιβαλλοντικά δείγματα Ιχνηλάτηση της πηγής προέλευσης της μικροβιολογικής μόλυνσης Ανάπτυξη τεχνικής για τη διάκριση της προέλευσης (ανθρώπινα ή ζωικά κόπρανα) της E.coli που απομονώνεται από το περιβάλλον. Ανίχνευση και τυποποίηση των περιβαλλοντικών μυκοβακτηριδίων στο νερό Ανάπτυξη μεθόδου για την ταυτόχρονη ανίχνευση Salmonella spp. και Shigella spp. στα μύδια (multiplex PCR) Ανίχνευση, ταυτοποίηση και τυποποίηση των Entero-ιών, Adeno-ιών, ιού της ηπατίτιδας Α, Rota-ιών, Noro ιών που απομονώνονται από τα λύματα. Χρησιμοποιείται PCR και Sequencing Ανάπτυξη μεθόδου για την ταυτόχρονη ανίχνευση των στελεχών Vibrio και Salmonella και Ε.coli σε περιβαλλοντικά δείγματα (triplex PCR) Επιδημιολογική προσέγγιση της παρουσίας ιών σε λύματα 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

22 Επιδημιολογία και Βιοεπιστήμες Επιδημιολογία τροφιμογενών και υδατογενών επιδημιών Ανίχνευση παθογόνου μικροοργανισμού σε δείγματα Συσχέτιση του στελέχους που απομονώθηκε από το δείγμα και του στελέχους από τους ασθενείς Μοριακή επιδημιολογία Μοριακή συσχέτιση στελεχών μικροοργανισμών που έχουν απομονωθεί από διαφορετικά δείγματα 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

23 Παραδείγματα Δημόσιας Υγείας που εφαρμόζεται η Μοριακή Βιολογία Ιχνηλάτηση Πηγής προέλευσης της μόλυνσης Microbial Source Tracking 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

24 Πρόληψη με την εκτίμηση κινδύνου Κίνδυνος Πρόληψη 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

25 Μετρήσεις Κοπρανώδους Μόλυνσης Μικροβιακοί Κοπρανώδεις δείκτες. Αντιπροσωπεύουν το γεγονός κοπρανώδους μόλυνσης. Βακτήρια από το εντερικό περιεχόμενο των ζώων Παραδοσιακές τεχνικές Παρουσία /Απουσία Αριθμός/όγκο νερού 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

26 Microbial Source Tracking _Στόχος Αντιστοίχιση μικροβίου που απομονώθηκε από το νερό με μικρόβιο που απομονώθηκε από μια ζωική πηγή για να καθοριστεί η προέλευση της περιττωματικής ρύπανσης. 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

27 Πότε είναι χρήσιμες οι τεχνικές MST; Για να συμπληρωθούν υγειονομικές έρευνες: Ταυτοποίηση πηγών μόλυνσης σε αποδέκτες Για ανάλυση κινδύνου: Ανθρώπινη εναντίον μη ανθρώπινης Ανθρώπινη εναντίον οικιακών ζώων 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

28 Δείκτες ταυτοποίησης πηγών μόλυνσης Ορισμός Μικροβιακοί πληθυσμοί που είναι χαρακτηριστικοί σε ένα συγκεκριμένο ζωικό ξενιστή Τα ιδανικά μικρόβια Δείχνουν εξειδίκευση στο ξενιστή Άφθονα στο ξενιστή Σταθερότητα στο ξενιστή Γεωγραφική συνέχεια 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

29 Τεχνικές που απαιτούν δημιουργία βιβλιοθήκης 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

30 Μέθοδος που εξαρτάται από τη δημιουργία βιβλιοθήκης Ανάλυση ανθεκτικότητας σε αντιβιοτικά (MAR) 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

31 Library Dependent Method: rep-pcr DNA Fingerprint Patterns (Dombek et al.,2000) 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

32 Τεχνικές ανεξάρτητες από την παρουσία Βιβλιοθήκης Phage typing Gene specific PCR Total community analysis Host-specific PCR 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

33 Πλεονεκτήματα Host-Specific PCR Ανεξάρτητη από καλλιέργεια Δεν απαιτείται βιβλιοθήκη Ταχεία Ευαίσθητη Καθορισμός στόχου Απομόνωση στόχου σε ένα σύνθετο περιβάλον Αυτοματοποιημένη ανάλυση 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

34 Περιορισμοί Host-Specific PCR Αναστολή PCR. Στόχος ένα γονίδιο. Στόχος μόνο μια βακτηριακή ομάδα. Οι οργανισμοί στόχοι βρίσκονται σε μικρό αριθμό. Περιορισμένος αριθμός παραδειγμάτων. Μικρές γονιδιακές αλληλουχίες στόχοι. Τα γονίδια δεν έχουν σχέση με την αλληλεπίδραση ξενιστών μικροβίων 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

35 Host-Specific PCR: Bacteroides 16S rdna Primer sets που διαχωρίζουν μεταξύ ανθρώπινων υπολλειμμάτων, αλόγων και ρύπανσης Target 16S rdna από Bacteroides Επιτυχημένη στα φρέσκα και θαλασσινά νερά 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

36 Bacteroides για χρήση σε MST Ανιχνεύεται σε κόπρανα, υπολλείμματα και κοιλότητες του σώματος Υποχρεωτικά αναερόβια Περιορισμένη επιβίωση στο περιβάλλον. Host-specific: ποικιλία σε ζωικούς ξενιστές 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

37 ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΜΥΚΟΒΑΚΤΗΡΙΔΙΩΝ ΣΤΟ ΝΕΡΟ ΜΕ PCR-REA Figure 1. PCR product (439 bp) with use of primers by the gene hsp65. Lane 1: φx174 x HaeIII (1353, 1078, 872, 603, 310, 281, 271, 234, 194, 118,72 bp), Lane 4: negative control, Lane 2,3,5,6,7 PCR products (439 bp) Lane 2: 10 2 cfu/ml, Lane 3: 10 3 cfu/ml, Lane 5:10 4 cfu/ml, Lane 6: 10 cfu/ml Lane 7,8,9: PCR products after pre-enrichment of the sample, 1 cfu/ ml, 10 cfu/ ml and 100 cfu/ ml correspondingly. 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011 Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής

38 Περιβαλλοντικά μυκοβακτηρίδια που έχουν ανιχνευτεί στο νερό Upper Gel: PCR products digested by BstEII Bottom Gel: PCR products digested by HaeIII Lane 1: Marker φx174 xhaeiii Lane 2: M.chelonae Lane 3: M. chelonae Lane 4: Unidentified Lane 5: M. gordonae Lane 6: M. chelonae Lane 7: M.gastrii/M. kansasii Lane 8: M.chelonae Lane 9: M.gordonae 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

39 Αλγόριθμος για την ταυτοποίηση των μυκοβακτηριδίων (Adapted by Telenti et al.) 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

40 Ανάπτυξη Multiplex PCR για την ανίχνευση Salmonella και Shigella spp. στα μύδια 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

41 RAPD στα είδη της Pseudomonas spp. 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

42 RAPD για τη διάκριση Ε.coli ανθρώπινης ή ζωικής προέλευσης Ζωικά στελέχη 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Ανθρώπινα στελέχη Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

43 RAPD για τη διάκριση ανθρώπινης ή ζωικής προέλευσης της Ε.coli που απομονώθηκε από νερά Ζωικά στελέχη Ανθρώπινα στελέχη 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

44 Risk modelling 1. Εκτίμηση κινδύνου Ταυτοποίηση κινδύνου: Ταυτοποίηση τροφιμογενών ιών Χαρακτηρισμός κινδύνων: Μολυσματική δόση σε σχέση με το ξενιστή Αξιολόγηση έκθεσης: Κατανάλωση ιών στα τρόφιμα Ανάλυση κινδύνου: Υπολογισμός κινδύνου μόλυνσης 2.Διαχείριση κινδύνου Ανάλυση κόστους-επίπτωσης: Αξιολόγηση πιθανών παρεμβάσεων Εφαρμογή επιλεγμένων παρεμβάσεων Επιτήρηση: Αποτελεσματικότητα επιλεγμένων παρεμβάσεων 3. Ενημέρωση κινδύνου Ενημέρωση στα εμπλεκόμενα μέρη 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

45 Ταυτοποίηση κινδύνου-risk profile Ταυτοποίηση υδατογενών παθογόνων Προέλευση πληροφοριών Ασθένεια και αποτέλεσμα που συνδέεται με το παθογόνο Αναφορά στις αναδυόμενες μολυσματικές ασθένειες Συμπτωματικοί και ασυμπτωματικοί ξενιστές εκκρίνουν παθογόνα Αριθμός παθογόνων που εκκρίνονται στο χρόνο Πιθανή υδατογενή μετάδοση Παθογόνο που σχετίζεται με υδατογενείς επιδημίες Κριτήρια για να ελέγξουμε και να βάλουμε προτεραιότητες στα παθογόνα 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

46 To μέλλον της MST 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

48 Στόχοι του έργου Εκτίμηση της παρουσίας ιών (παθογόνων και μη) σε αλυσίδες τροφίμων HACCP οδηγίες για ιογενή μόλυνση διαφόρων αλυσίδων τροφίμων Εκτίμηση κινδύνου για ιογενή μόλυνση των αλυσίδων παραγωγής Οδηγίες στο νέο Codex Alimentarius για την πρόληψη από ιογενή μόλυνση Εκτίμηση μεθόδων απολύμανσης και ικανότητάς τους στα διαφορετικά είδη τροφίμων 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

49 Συνολικός αριθμός δειγμάτων που θα αναλυθούν σε όλες τις αλυσίδες τροφίμων Π.Ε.2 Παραγωγή Π.Ε.3 Επεξεργασία Π.Ε.4 Τελικό προϊόν Χοιρινό κρέας Λαχανικά (μαρούλια) Μαλακά φρούτα (φράουλες, βατόμουρα) Οστρακοειδή (μύδια, στρείδια, κοχύλια) o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

53 Μερικά παραδείγματα εργασιών με μοριακή τυποποίηση Environmental Surveillance. An Additional/Alternative Approach for Virological Surveillance in Greece? Published in Int. J. Environ. Res. Public Health 2011, 8, ; A Gastroenteritis Outbreak Caused by Noroviruses in Greece published in IJERH REGION-SPECIFIC GENETIC HETEROGENEITY OF HBB MUTATION DISTRIBUTION IN SOUTH-WESTERN GREECE 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

54 Molecular detection of multiple viral targets in untreated urban sewage from Greece 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

55 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Με τις μοριακές τεχνικές, γίνεται πολύ πιο σύντομος, ευαίσθητος και αξιόπιστος, ο έλεγχος των περιβαλλοντικών δειγμάτων για την παρουσία παθογόνων μικροοργανισμών. Δίνεται η δυνατότητα να ανιχνευθούν και οι μη καλλιεργήσιμοι μικροοργανισμοί (Viable But Not Culturable). Η PCR, συγκεκριμένα, είναι μια ιδιαίτερα εξειδικευμένη και ευαίσθητη τεχνική που έχει την ικανότητα να ανιχνεύει τις πολύ μικρές ποσότητες των μικροοργανισμών στα περιβαλλοντικά δείγματα. Στο ίδιο δείγμα, είναι δυνατόν να ανιχνευθούν ταυτόχρονα πολλοί μικροοργανισμοί (π.χ. multiplex PCR) όπως είναι δυνατόν να ανιχνευθούν κυρίως οι «ζωντανοί» μικροοργανισμοί (RT-PCR). Με το συνδυασμό καλλιεργητικών και μοριακών τεχνικών, μπορούμε να ανιχνεύσουμε τους παθογόνους και «ζωντανούς» μικροοργανισμούς Οι μοριακές τεχνικές και κυρίως η PCR αποτελούν ένα πολύτιμο εργαλείο στον έλεγχο των υδατογενών και τροφιμογενών επιδημιών και συνεπώς στην προστασία της Δημ. Υγείας. 2o Πανελλήνιο Συνέδριο του Forum Δημόσιας Υγείας και Κοινωνικής Ιατρικής Λάρισα 25 Νοεμβρίου 2011

56 OUTBREAK OF HEPATITIS A ASSOCIATED WITH SEMI-DRIED TOMATOES Apostolos Vantarakis Ass. Professor Medical School University of Patras

57 HAV outbreak - Turkish sun dried tomatoes

58 Hepatitis A outbreak in Australia In May 2009, the food authorities of Australia and New Zealand (OzFoodNet) reported an increase in locally-acquired hepatitis A cases in Victoria, South Australia, and Queensland triggering a multijurisdictional outbreak investigation. Case-control studies confirmed strong associations between illness and consumption of semi-dried tomatoes. Outbreak cases were infected with a genotype designated 1B. The number of reported cases of hepatitis A nationally returned to expected levels by the end of May

59 Victoria reported a second wave of cases beginning at the end of June Notifications have been declining since November. Overall 178 locally acquired cases were reported from Victoria between 29 June 2009 and 29 January out of 164 of these cases reported the consumption of semidried tomatoes and 14 cases were likely due to secondary transmission from previously reported cases. In the same period an additional 62 locally-acquired cases of hepatitis A were reported from other States and Territories (among them 20 reporting consumption of semi-dried tomatoes and 4 suspected secondary cases).

60 Samples of semi-dried tomatoes and undressed tomatoes collected during the first wave of the outbreak have tested positive for hepatitis A RNA by PCR methods. Currently, there are no reliable methods that can determine whether the viruses present on food products are infectious. Some of the semi-dried tomatoes implicated in the Australian outbreak originated from Turkey.

61 Hepatitis A outbreak in the Netherlands Five patients with onset of symptoms between 11 and 22 January 2010 were reported on 16 February 2010 with the same sequence as the Australian isolates. As of 25 February, 9 cases were identified with the same sequence. The onset of symptoms ranges between 11 January and 10 February Two cases developed acute liver failure and required liver transplantation. Of 8 primary cases, 7 have indicated to have consumed semi-dried tomatoes during their incubation period but a case-control study is ongoing and other possible common food products have not been ruled out. The tomatoes were bought in different supermarkets or delicacy stores, and used for home preparation (dry or prepared with oil and herbs) or in ready to eat mixed salads. So far, the origin of the suspected tomatoes remains unknown, and a full traceback investigation is ongoing.

62 Hepatitis A outbreak in France As of 16 February 2010, 43 cases have been identified, of whom 35 are primary cases. The cases are scattered throughout France. Twenty-three (53%) of the 43 cases have been hospitalized and all patients recovered. This hospitalisation rate is similar to that of routinely notified hepatitis A infections in France from 2007 to Cases report onset of symptoms between 20 November 2009 and 26 January Cases are aged between 7 and 52 years (median age 31 years). A case-control study carried out showed that there is an association between eating sandwiches or salads from a bakery or semi-dried tomatoes and hepatitis A infection. Investigations highlighted a common supplier, located in France, importing semi-dried and frozen tomatoes from Turkey (exact place of production unknown). The French supplier received several tons of frozen semi-dried tomatoes, representing a single batch, with a best before date of 1 year after reception. The quantity received varied by shipment. In France, the frozen semi-dried tomatoes were defrosted during 48 hours and then processed with oil and herbs before distributing for sale in the French market. One batch of frozen semi-dried tomatoes is defrosted and processed over a period of 1-2 months. Following processing, the final products are immediately distributed in plastic containers of 500g to sandwich shops across France.

63 Hepatitis A outbreak in France Cross-referenced data from the trace-back investigation of the primary material of the semidried tomatoes received by the French supplier and from the estimated periods of case exposure, indicate to one particular batch of frozen semi-dried tomatoes. According to the French supplier, this batch was produced in Turkey in August 2009 and was bought by the French supplier from the Turkish producer/wholesaler in September It was distributed in October and November 2009 after processing in France and was consumed by sandwich shop customers until December This particular batch was also distributed to retailers in Belgium, Luxembourg, Spain and Switzerland (see figure 1). The Rapid Alert System for Food and Feed (RASFF) issued a news notification on February 25, 2010 ( add02) with this information.

64

65 Laboratory investigations Sequences from patient strains in Australia were identical to the sequences from patient strains in the Netherlands. The French strain reveals a significant difference to both the Australian and the Dutch strain. All strains identified in the three countries do belong to genotype 1B, and are closely related to viruses that have been identified in Turkey.

66 Timeline of international actions ECDC became aware of the outbreak in Australia in September 2009, when Australia issued an urgent inquiry through our network for risk assessment of food- and waterborne diseases. Mid-November INFOSAN issued an emergency alert implicating semi-dried tomatoes. On 29 January 2010, France informed through EWRS about their cases. At the same time, they issued an urgent inquiry through our food- and waterborne diseases network. Subsequently, The Netherlands informed of 5 and then four additional (totalling 9) related cases. Several communications took place through the EWRS and rapid inquiries as a result. On 17 February, we reviewed the situation with ECDC Advisory Forum members. On 23 February, INFOSAN organised an international teleconference involving all concerned countries and France issued an IHR notification. It was agreed that ECDC is coordinating the investigation among the EU affected countries.

67 Semi-dried tomatoes are widely distributed throughout Europe through different distribution channels (e.g. retailers, grocery stores, restaurants, bakery); have a long shelf life (especially if they are frozen); are often further processed and the trace-back is difficult.

68 The most likely period of exposure in France was between mid October and mid December Although the investigations indicate a specific contaminated batch, that is not longer available, it is possible that other batches are contaminated or products prepared from the contaminated batch are still in the market. The estimate shelf life of the frozen batch of tomatoes was one year. However, the suspected batch in France was processed and distributed completely within 3 months, including to at least four other European countries (Belgium, Luxembourg, Spain and Switzerland). Therefore, it is possible that HAV contaminated products (frozen, semi-processed or processed) might be still on the European market and consumers remain at risk.

69 The sequence homology between hepatitis A cases within one outbreak is typically 100% [25]. However, greater diversity is observed in outbreaks where the source has been sewage contamination, e.g. products that have been in contact with sewage contaminated water. The observed sequence difference between the strains characterized in France and the Netherlands/Australia may indicate two distinct outbreaks occurring simultaneously. However, the outbreaks are suspected to have a common source (vehicle and country of origin), are linked in time and share the same genotype (1B). Therefore, there is a probability that the outbreaks are related. Finding different sequences in a common source event can occur if there is a diffuse source of contamination in a high endemic country (e.g. contaminated water containing several HAV strains used during the production process). The alternative hypothesis is that there were separate contamination events (e.g. contamination at different steps in the production process through food handling).

70 The following actions should be considered Immediate active trace-back and recall of the contaminated product. The recall effectiveness should be monitored; Review of surveillance data for hepatitis A since October 2009 by EU Member States and carry out sequencing of the strains belonging to the genotype 1B according to the circulated Dutch protocol. Strengthening links between public health and food authorities in potentially affected countries to allow the country specific risk assessment and estimation of the need to increase public awareness; Strengthen the investigations in Turkey under the lead of WHO.

71 HAV outbreak - Turkish sun dried tomatoes Official Greek laboratory for the analysis of all the imported tomato samples (Ministry of Rural Development and Food, Hellenic Food Authority). Analysis of samples with the VITAL protocol (SOP 006).

72 HAV outbreak - Turkish sun dried tomatoes 65 samples from 08/03/2010 to 13/05/2010. Sun dried tomatoes, semi dried tomatoes, marinated sun dried tomatoes (in olive oil, sunflower oil, vinegar, herbs, etc), hole, half, strips, cubs, powder, etc.

74 HAV outbreak - Turkish sun dried tomatoes Poor bibliographical data regarding tomatoes Tomato sauce Highly Complex Market of the dried - semi dried - sun dried Tomatoes

75 COST 929: Training Course in Food and Environmental Virology University of Patras, Greece nday 10 May, a.m. Friday, 14 May p

76

77

78 Μοριακή Περιβαλλοντική Επιδημιολογία

79 Μοριακή Επιδημιολογία Am J Epidemiol Jun 15;153(12): Molecular epidemiology: focus on infection. Foxman B, Riley L.

80 Μοριακή Επιδημιολογία Am J Epidemiol Jun 15;153(12): Molecular epidemiology: focus on infection. Foxman B, Riley L.

81 Παράδειγμα Μελέτης Επιδημίας Ηπατίτιδας Α

84 Φυλογενετική ανάλυση

85 Μοριακή τυποποίηση ιών σε δείγματα αστικών λυμάτων

86 Μοριακή τυποποίηση ιών σε δείγματα αστικών λυμάτων Βιολογικός καθαρισμός Πάτρας έξοδος είσοδος

87 Μοριακή τυποποίηση ιών σε δείγματα αστικών λυμάτων Βιολογικός καθαρισμός Αλεξανδρούπολης έξοδος είσοδος

88 Μοριακή τυποποίηση ιών σε δείγματα αστικών λυμάτων

92 Μοριακή τυποποίηση ιών ηπατίτιδας Α σε περιβαλλοντικά και κλινικά δείγματα

93 Μεθοδολογία Συμπύκνωση ιϊκών σωματιδίων Ανίχνευση γονιδιώματος τους με τεχνική (RT-nested PCR) Επιβεβαίωση θετικών HAV δειγμάτων μέσω αλληλούχησης Επεξεργασία των αλληλουχιών με πακέτα βιοπληροφορικής και

96 Μοριακή τυποποίηση πολλαπλών ιικών στόχων σε δείγματα ακατέργαστων αστικών λυμάτων Περιβαλλοντική επιτήρηση

102 Περιβαλλοντική επιτήρηση

103 Περιβαλλοντική επιτήρηση

104 Παράδειγμα Μελέτης Επιδημίας Νοροϊών

109 Μοριακή τυποποίηση Legionella spp. από νοσοκομεία και ξενοδοχεία της Δυτικής Ελλάδας

110 Μοριακή τυποποίηση Legionella spp. από νοσοκομεία και ξενοδοχεία της Δυτικής Ελλάδας

113 Μοριακή τυποποίηση εντερικών ιών από παιδιά με οξεία γαστρεντερίτιδα Detection and molecular characterization of enteric viruses from hospitalized childern with acute gastroenteritis in Patras, Greece. Identification of Rotavirus G12 strains

116 Πρόσφατο Παράδειγμα Μελέτης Υδατογενούς Επιδημίας

117 Παράδειγμα ανάλυσης κλινικών και περιβαλλοντικών δειγμάτων για την ανίχνευση και μοριακή τυποποίηση ιών NCBI Excel δεδομένων BLAST Φυλογενετικό δέντρο Νουκλεοτιδικές αλληλουχίες Νουκλεοτιδικές αλληλουχίες Genotyping tools alignment

118

119

120

121

122

123 HAV outbreak - Turkish sun dried tomatoes Official Greek laboratory for the analysis of all the imported tomato samples (Ministry of Rural Development and Food, Hellenic Food Authority). Analysis of samples with the VITAL protocol (SOP 006).

124 HAV outbreak - Turkish sun dried tomatoes 65 samples from 08/03/2010 to 13/05/2010. Sun dried tomatoes, semi dried tomatoes, marinated sun dried tomatoes (in olive oil, sunflower oil, vinegar, herbs, etc), hole, half, strips, cubs, powder, etc.

126

127 Μονάδα Περιβαλλοντικής Μικροβιολογίας, Εργαστήριο Υγιεινής, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Πατρών