ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΚΑΙ ΔΗΜΟΣΙΑ ΥΓΕΙΑ

Transcript

1 ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΚΑΙ ΔΗΜΟΣΙΑ ΥΓΕΙΑ

2 «Η βελτίωση της Δημόσιας Υγείας, μπορεί να επιτευχθεί, κυρίως μέσω της πρόληψης αλλά και του ελέγχου των περιβαλλοντικών συνθηκών, γεγονός που θα οδηγήσει και στην πρόληψη των νοσημάτων».

3 Γιατί είναι απαραίτητες οι μοριακές τεχνικές; Κάθε χρόνο άνθρωποι ( παιδιά) πεθαίνουν από υδατογενείς ασθένειες. Στις Η.Π.Α ασθένειες και 900 θάνατοι συμβαίνουν κάθε χρόνο εξαιτίας μικροβιολογικής μόλυνσης του πόσιμου νερού. Το ετήσιο κόστος περίθαλψης των υδατογενών ασθενειών στις Η.Π.Α ανέρχεται σε 19 δισεκατομμύρια δολάρια Επίσης η ASM τονίζει ότι πολλές από τις υδατογενείς επιδημίες συνδέονται με παθογόνα που εισέρχονται στα συστήματα ύδρευσης αν και αυτά ελέγχονται από τις υπηρεσίες ύδρευσης, θέτοντας σε κίνδυνο τη Δημ. Υγεία. Αυτό σημαίνει ότι οι τεχνικές που χρησιμοποιούνται πολλές φορές από τις εταιρείες ύδρευσης είναι ανεπαρκείς και δεν μπορούν ικανοποιητικά να καταγράψουν την μικροβιολογική ποιότητα του νερού. Οι τεχνικές που υπάρχουν σήμερα δεν έχουν την ακρίβεια και την εξειδίκευση για να καταμετρήσουν χαμηλά επίπεδα παθογόνων μικροοργανισμών. Ειδικά πολλοί μικροοργανισμοί όπως ιοί και παράσιτα ανιχνεύονται ιδιαίτερα δύσκολα με τις υπάρχουσες τεχνικές.

4 Γιατί είναι απαραίτητες οι μοριακές τεχνικές; Στo περιβάλλον και ειδικά στα φυσικά νερά, οι συνθήκες αλλάζουν συνεχώς διότι το νερό αλλάζει συνεχώς. Είναι πρόκληση η εφαρμογή των μοριακών τεχνικών που έχουν χρησιμοποιηθεί κυρίως σε κλινικά στελέχη, σε στελέχη που απομονώνονται από περιβαλλοντικά δείγματα Οι μικροοργανισμοί στο περιβάλλον βρίσκονται σε πολύ μικρή συγκέντρωση Οι μικροοργανισμοί στο υδάτινο περιβάλλον μπορεί να είναι βιώσιμοι αλλά μη καλλιεργήσιμοι (viable but not culturable) Ενώ έχουν αναφερθεί πολλές υδατογενείς ασθένειες μόνο στο 50% των περιπτώσεων ήταν δυνατόν να βρεθεί η αιτία λόγω της έλλειψης κατάλληλων τεχνικών ανίχνευσης και τυποποίησης.

5 Μοριακή προσέγγιση στην ταυτοποίηση και τυποποίηση μικροβίων Ανάλυση νουκλεϊκών οξέων Ανάλυση πλασμιδίων Ανάλυση χρωμοσωμικού DNA Τεχνικές υβριδοποίησης Τεχνικές πολλαπλασιασμού DNA και sequencing Ανάλυση πρωτεϊνών Ανάλυση πρωτεϊνικού προτύπου Αντιγονική ανάλυση πρωτεϊνών

6 Μοριακές τεχνικές που εφαρμόζονται συνήθως στην ανάλυση περιβαλλοντικών δειγμάτων Blot hybridization assay Μειονεκτήματα 1. Μικρή ευαισθησία σε σχέση με την PCR 2. Υψηλό μη ειδικό σήμα λόγω παρεμβολής από διάφορους παράγοντες των περιβαλλοντικών δειγμάτων In situ Nucleic acid Hybridization 1.Μεγάλη ευαισθησία και ειδικότητα 2. Ανίχνευση μολυσματικών ιών 3. Εντοπισμός του νουκλεϊκού οξέος στο κύτταρο ξενιστή 4. Πιο σύντομη από την καλλιέργεια PCR

7 Αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (PCR) σε περιβαλλοντικά δείγματα Πλεονεκτήματα PCR 1. Ταχεία 2. Ευαίσθητη(ανιχνεύονται πολύ μικρές ποσότητες νουκλεϊκού οξέος) 3. Αξιόπιστη 4. Εξειδικευμένη (ανάλογα με τους εκκινητές) 5. Ανιχνεύονται και οι μη καλλιεργήσιμοι μικροοργανισμοί Μειονεκτήματα PCR 1. Ψευδώς θετικά αποτελέσματα (επιμολύνσεις ειδικά στη περίπτωση της nested PCR) 2. Ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα (λόγω παρουσίας αναστολέων) 3. Απαιτούνται εξειδικευμένα εργαστήρια και προσωπικό 4. Ανιχνεύονται και μη μολυσματικοί μικροοργανισμοί 5. Μη ποσοτική μέθοδος

8 Τα σημαντικότερα προβλήματα της PCR στον έλεγχο των περιβαλλοντικών δειγμάτων είναι: α) ότι δεν μπορούμε εύκολα να γνωρίζουμε τον αριθμό των μικροοργανισμών στα περιβαλλοντικά δείγματα β) οι μικροοργανισμοί που ανιχνεύονται μπορεί να μην είναι βιώσιμοι ή μολυσματικοί και γ) αναστολή της PCR από διάφορες ουσίες που βρίσκονται στα δείγματα. Για τη λύση του πρώτου προβλήματος έχουν χρησιμοποιηθεί τελευταία: 1.Taqman system (Perkin Elmer, 1998) 2. LightCycler system (Boehringer Mannheim, 1998) Τα συστήματα αυτά χρησιμοποιούν την ανίχνευση των αλλαγών στα επίπεδα φθορισμού των φθορίζοντων ανιχνευτών ή του DNA που δεσμεύει τις φθορίζουσες χρωστικές.

9 Για τη λύση του δεύτερου προβλήματος έχει χρησιμοποιηθεί τελευταία η RT-PCR με την οποία γίνεται ανίχνευση του m-rna των μικροοργανισμών το οποίο έχει μικρό χρόνο ζωής. Η ανίχνευσή του δηλώνει πρόσφατη μόλυνση Για τη λύση του τρίτου προβλήματος έχουν χρησιμοποιηθεί διάφορες στήλες του καθαρισμού του νουκλεϊκού οξέος, διάφορες ρητίνες κ.α. Τελευταία χρησιμοποιείται μια τεχνική (Nucleic Acid Capture) κατά την οποία το νουκλεϊκό οξύ που προέρχεται από τη λύση του περιβαλλοντικού στελέχους υβριδίζεται με ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές ή πολυ-τ που είναι δεσμευμένοι πάνω σε μαγνητικά σφαιρίδια. Στη συνέχεια τοποθετείται ένας μαγνήτης, έξω από το σωλήνα που περιέχει το διάλυμα και έλκει τα μαγνητικά σωματίδια.το διάλυμα μαζί με τους αναστολείς απορρίπτεται και το DNA παραμένει καθαρό για PCR.

10 Nested PCR ΜΕΡΙΚΕΣ ΑΠΟ ΤΙΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ PCR Σημαντική εφαρμογή της PCR που έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για επιβεβαίωση του αρχικού αποτελέσματος της PCR για την ταυτοποίηση των μικροοργανισμών απόρριψη των ψευδών αρνητικών αποτελεσμάτων της 1ης PCR (λόγω αραίωσης των ουσιών που αναστέλλουν την PCR) και απόρριψη ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων Στην nested PCR χρησιμοποιούνται εκκινητές (πιο εξειδικευμένοι) οι οποίοι ενισχύουν ένα μικρότερο τμήμα από την 1η PCR. PCR-Restriction Enzyme Analysis (PCR-REA) ή PCR-RFLP H μέθοδος αυτή στηρίζεται στην ενίσχυση ορισμένου τμήματος DNA, που ακολουθείται από ενζυμική πέψη του προϊόντος της PCR με ένα ή περισσότερα ένζυμα περιορισμού. Δημιουργούνται με αυτό τον τρόπο πολυμορφισμοί (RFLP) βάση των οποίων γίνεται η ταυτοποίηση του στελέχους Multiplex PCR Εφαρμογή της PCR κατά την οποία χρησιμοποιούνται περισσότεροι από ένα ζευγάρι εκκινητών που έχουν σχεδιαστεί για την ανίχνευση διαφορετικών μικροβίων σε μία μόνο PCR.

11 ΜΕΡΙΚΕΣ ΑΠΟ ΤΙΣ ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ PCR Cell Culture- PCR Συνδυασμός καλλιέργειας και PCR.Τεχνική χρήσιμη για την ανίχνευση κυρίως ιών σε περιβαλλοντικά δείγματα που είχαν βρεθεί αρνητικά για την ύπαρξη ιών με την PCR λόγω της ύπαρξης παραγόντων αναστολής. Η καλλιέργεια πριν την PCR μειώνει την παρουσία παραγόντων αναστολής. Καθορίζει και την μολυσματικότητα των ιών Randomly Amplified Polymorphic DNA Τεχνική που έχει χρησιμοποιηθεί σε περιβαλλοντικά δείγματα. Χρησιμοποιούνται τυχαίοι εκκινητές (συνήθως 10μερή ολιγονουκλεοτίδια) που μπορούν και υβριδίζονται σε διάφορα σημεία του γενετικού υλικού. Αποτέλεσμα είναι η δημιουργία ζωνών χαρακτηριστικών ανάλογα με το στέλεχος. Η ταυτοποίηση και τυποποίηση του στελέχους γίνεται ανάλογα με το είδος και τον αριθμό των ζωνών που προκύπτουν Πλεονεκτήματα:Δεν απαιτείται γνώση της αλληλουχίας του DNA, μπορεί να εφαρμοστεί σε οποιοδήποτε μικροοργανισμό, ταχεία τεχνική (48 ώρες), όχι ιδιαίτερα ακριβή, εύκολη στην εφαρμογή της Μειονεκτήματα: Επαναληψιμότητα των αποτελεσμάτων

12 Οι μοριακές τεχνικές σε ένα εργαστήριο μικροβιολογίας νερού μπορούν να χρησιμοποιηθούν για: Α) Ανίχνευση, ταυτοποίηση και τυποποίηση των ιών σε περιβαλλοντικά δείγματα όπως νερό (Θαλασσινό, πόσιμο, εμφιαλωμένα), λύματα Β) Ανίχνευση και ταυτοποίηση βακτηρίων που απομονώθηκαν από το νερό σε πολύ σύντομο χρονικό διάστημα σχετικά με τις καλλιεργητικές τεχνικές Γ) Τυποποίηση των βακτηρίων που απομονώθηκαν από το περιβάλλον Δ) Ανίχνευση μη καλλιεργήσιμων μορφών βακτηρίων Ε) Επιδημιολογική μελέτη των μικροοργανισμών που απομονώθηκαν από τα περιβαλλοντικά δείγματα

13 PCR και βακτήρια Τα παθογόνα βακτήρια γενικά καλλιεργούνται εύκολα στα διάφορα θρεπτικά υλικά που χρησιμοποιούνται και για τα κλινικά στελέχη. Υπάρχουν όμως αρκετοί λόγοι για τη χρησιμοποίηση της PCR: 1. Δυσκολίες στην ταυτοποίηση των βακτηρίων 2. Μεγάλος χρόνος που απαιτείται για την ταυτοποίηση με τις καλλιεργητικές τεχνικές 3. Αρκετά ακριβά τα υλικά που απαιτούνται για την ταυτοποίηση των βακτηρίων 4. Μερικά βακτήρια στο περιβάλλον πέφτουν σε «κατάσταση ύπνου» και δεν είναι καλλιεργήσιμα (viable but not culturable).

14 PCR και ιοί Πλεονεκτήματα της PCR έναντι των καλλιεργητικών τεχνικών στην ανίχνευση ιών Μεγαλύτερη ευαισθησία στην ανίχνευση των ιών, γεγονός που είναι απαραίτητο για τα περιβαλλοντικά δείγματα. Έχει αναφερθεί μέχρι και 50% βελτίωση στην ευαισθησία Μεγάλη ποικιλία ιών που ανιχνεύονται Μικρός χρόνος ανάλυσης Μικρό κόστος σε σχέση με τις καλλιέργειες Μειονεκτήματα της PCR έναντι των καλλιεργητικών τεχνικών στην ανίχνευση ιών Ψευδώς αρνητικά (αναστολή με διάφορες ουσίες) Ψευδώς θετικά Μη ποσοτική Δεν καθορίζει την μολυσματικότητα των ιών

15 Στάδια ανίχνευσης και ταυτοποίησης μικροοργανισμών Δειγματοληψία κατάλληλου όγκου ανάλογα με το είδος και την καθαρότητα του περιβαλλοντικού δείγματος Διήθηση του δείγματος μέσα από κατάλληλο φίλτρο (μικροβιοκρατές ή ιοκρατές) Εφαρμογή κάποιου από τα ακόλουθα βήματα ανάλογα με το μικροοργανισμό που αναζητούμε στο δείγμα α) Καλλιέργεια των βακτηρίων που ενδεχομένως υπάρχουν στο δείγμα ή β) Απομόνωση του νουκλεϊκού οξέος του μικροοργανισμού γ) Αν πρόκειται για ιούς εκ νέου συμπύκνωση των μικροοργανισμών σε μικρότερο όγκο νερού και στη συνέχεια απομόνωση του νουκλεϊκού του οξέος Ανίχνευση του νουκλεϊκού οξέος του μικροοργανισμού που υπάρχει στο δείγμα (συνήθως με PCR) Επιβεβαίωση του αποτελέσματος και ταυτοποίηση του μικροοργανισμού

16 Μερικές από τις εφαρμογές των μοριακών τεχνικών σε περιβαλλοντικά δείγματα Ανίχνευση και τυποποίηση των περιβαλλοντικών μυκοβακτηριδίων στο νερό Ανάπτυξη μεθόδου για την ταυτόχρονη ανίχνευση Salmonella spp. και Shigella spp. στα μύδια (multiplex PCR) Ανάπτυξη μοριακών μεθόδων για την ανίχνευση ιών και φάγων στα οστρακοειδή Ταυτοποίηση στελεχών Pseudomonas που απομονώνονται από δείγματα νερού με σύγκριση των ηλεκτροφορητικών προτύπων των πρωτεϊνών τους και των γενετικών προτύπων με RAPD. Ανάπτυξη τεχνικής για τη διάκριση της προέλευσης (ανθρώπινα ή ζωικά κόπρανα) της E.coli που απομονώνεται από το περιβάλλον. Χρησιμοποιείται η RAPD-PCR και η Μultiple Αntibiotic Resistance (MAR). Ανίχνευση, ταυτοποίηση και τυποποίηση των Entero-ιών, Adeno-ιών, ιού της ηπατίτιδας Α, Rota-ιών, Norwalk ιών που απομονώνονται από τα λύματα. Χρησιμοποιείται PCR και Sequencing Ανίχνευση παρασίτων (κρυπτοσποριδίου και Γιάρδιας) στο πόσιμο νερό Ανάπτυξη μεθόδου για την ταυτόχρονη ανίχνευση των στελεχών Vibrio και Salmonella και Ε.coli σε περιβαλλοντικά δείγματα (multiplex PCR).

17 1. ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΜΥΚΟΒΑΚΤΗΡΙΔΙΩΝ ΣΤΟ ΝΕΡΟ ΜΕ PCR-REA Διήθηση του δείγματος νερού (200 ml) Προ-εμπλουτισμός σε Middlebrook broth Καλλιέργεια των μυκοβακτηριδίων σε Middlebrook Agar Απομόνωση DNA από τις αποικίες που αναπτύχθηκαν (MicromiX Kit 660) PCR (με hsp69 εκκινητές) Πέψη του PCR προϊόντος με ένζυμα περιορισμού (BstEII, HaeIII) Ταυτοποίηση των στελεχών με βάση το πρότυπο που εμφανίζουν σύμφωνα με ένα αλγόριθμο

18 Αποτελέσματα (I) Figure 1. PCR product (439 bp) with use of primers by the gene hsp65. Lane 1: φx174 x HaeIII (1353, 1078, 872, 603, 310, 281, 271, 234, 194, 118,72 bp), Lane 4: negative control, Lane 2,3,5,6,7 PCR products (439 bp) Lane 2: 10 2 cfu/ml, Lane 3: 10 3 cfu/ml, Lane 5:10 4 cfu/ml, Lane 6: 10 cfu/ml Lane 7,8,9: PCR products after pre-enrichment of the sample, 1 cfu/ ml, 10 cfu/ ml and 100 cfu/ ml correspondingly.

19 Αποτελέσματα (II) Fig 2: The electrophoretical patterns obtained by Restriction Enzyme Analysis of the environmental mycobacteria. Identification of the bands was made according Telenti algorithms. Lane1: φχ174xhaeiii, Lane 2: M.chelonae PCR product x Bst EII, Lane 3: M.chelonae PCR product x HaeIII, Lane 4: M.chelonae PCR product x BstEII, Lane 5: M.chelonae PCR product x HaeIII, Lane 6: M.gordonae PCR product x BstEII, Lane 7: M.gordonae PCR product x HaeIII, Lane 8: M. chelonae PCR product x BstEII, Lane 9: M.chelonae PCR product x HaeIII

20 Περιβαλλοντικά μυκοβακτηρίδια που έχουν ανιχνευτεί στο νερό Upper Gel: PCR products digested by BstEII Bottom Gel: PCR products digested by HaeIII Lane 1: Marker φx174 xhaeiii Lane 2: M.chelonae Lane 3: M. chelonae Lane 4: Unidentified Lane 5: M. gordonae Lane 6: M. chelonae Lane 7: M.gastrii/M. kansasii Lane 8: M.chelonae Lane 9: M.gordonae

21 Αλγόριθμος για την ταυτοποίηση των μυκοβακτηριδίων (Adapted by Telenti et al.)

22 Μυκοβακτηρίδια στο πόσιμο νερό Strain Frequency before the replacement Frequency after the replacement (number of positive samples) Number of positive samples M. chelonae 8 2 M.gordonae 6 0 M.fortuitum 5 0 M. kansasii 4 0 M. terrae 2 0 M. phlei 2 0 Not identified 4 0 Lost 5 0 Positive samples 42 (21.3%) 2 ( 1.8 %) Negative samples 155 (78.7%) 107 (98.2%) Total number of samples

23 Μυκοβακτηρίδια στο πόσιμο νερό νοσοκομείων Hospital/ Number of posi tive MYC/RIA Species Identification Ward or Unit samples CFU/L ST. ANDREW(20 Samples examined) UROLOGICAL 2 10 Unidentified " 5 M.terrae DIALYSIS M.chelonae *U.H.P. (26 samples examined) UROLOGICAL M.chelonae INTERNAL MEDICINE 2 33 M.chelonae " 35 Not analyzed DERMATOLOGICAL 1 90 Not analyzed EAR NOSE THROAT 1 20 M.flavescens 409 (4 samples examined) BABY UNIT 1 20 M.gordonae BIRTH UNIT 1 10 M.gordonae HOSPITAL OF THORACIC DISEASES (10 samples examined) KARAMANDANIO CHILDREN'S (4 samples examined) - 0 -

24 Μυκοβακτηρίδια σε εμφιαλωμένα νερά cfu/l 1% cfu/l 2% >1000cfu/l 4% 1-100cfu/l 8% cfu/l cfu/l cfu/l >1000cfu/l 0 cfu/l 85%

25 2. Ανάπτυξη μεθόδου για την ταυτόχρονη ανίχνευση Salmonella spp. και Shigella spp. στα μύδια Σάρκα Μυδιών σε Buffered Peptone water Ομογενοποίηση Ανάμιξη σε Waring mixer Φυγοκέντρηση Απόρριψη Υπερκείμενου Καθίζηση των βακτηρίων Ξέπλυμα δύο φορές με PBS Προσθήκη GITC και επώαση για 90 min Καθαρισμός και απομόνωση με Phenol και καθίζηση του DNA με αιθανόλη Multiplex PCR detection (Salmonella και Shigella)

26 Ανάπτυξη Multiplex PCR για την ανίχνευση Salmonella και Shigella spp. στα μύδια

27 Αποτελέσματα ελέγχου παρουσίας Salmonella και Shigella σε μύδια της Αττικής Αριθμός δειγμάτων Ν=41 Θετικά Αρνητικά Salmonella 9 (21%) 32 Shigella 0 41 H μέθοδος ανίχνευσης είναι η nested PCR.

28 Αποτελέσματα Επιτεύχθηκε η ταυτόχρονη PCR ανίχνευση Salmonella spp. και Shigella spp. Η ανίχνευση ολοκληρώνεται το πολύ σε 2 ημέρες Ευαισθησία τεχνικής (χωρίς προεμπλουτισμό) κύτταρα Salmonella spp./ml 1000 κύτταρα Shigella spp./ ml Ευαισθησία τεχνικής (με προεμπλουτισμό) Salmonella spp.ή Shigella spp. Ανιχνεύθηκε Salmonella σε διάφορα δείγματα που ελέγχθηκαν από διάφορους σταθμούς Η multiplex PCR έδειξε μεγάλη εξειδίκευση γιατί δεν ανιχνεύθηκε κανένας από τους άλλους μικροοργανισμούς (Ε.cloacae, E.coli, Aeromonas hydrophila, Klebsiella spp) με τους συγκεκριμένους εκκινητές

29 3. ΕΥΡΩΠΑΪΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΙΩΝ ΚΑΙ ΦΑΓΩΝ ΣΤΑ ΟΣΤΡΑΚΟΕΙΔΗ Σκοπός του προγράμματος ήταν η ανάπτυξη νέων μοριακών τεχνικών για την ταχεία ανίχνευση ιών στα οστρακοειδή Εργαστήρια από την Ισπανία, Αγγλία, Ελλάδα και Σουηδία συνεργάστηκαν 8 δείγματα μυδιών και στρειδιών ελέγχθηκαν κάθε μήνα από διάφορες περιοχές της Ελλάδας Τα μύδια ελέγχθηκαν για την παρουσία εντεροϊών, αδενοϊών, ιού της ηπατίτιδας Α, Norwalk ιών, φάγων (coliphages, F-specific, phages against B.fragilis) και E.coli. προκειμένου να αξιολογηθεί ο καλύτερος δείκτης κοπρανώδους μόλυνσης

30 ΕΥΡΩΠΑΪΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΙΩΝ ΚΑΙ ΦΑΓΩΝ ΣΤΑ ΟΣΤΡΑΚΟΕΙΔΗ Όλοι οι παράμετροι (εκτός από τους βακτηριοφάγους) ελέγχθηκαν με nested PCR. Οι βακτηριοφάγοι ελέγχθηκαν με τη μέθοδο της διπλοστοιβάδας. Ελέγχθηκε η ευαισθησία και η επαναληψιμότητα στο ίδιο εργαστήριο αλλά και μεταξύ εργαστηρίων στις τεχνικές που αναπτύχθηκαν Τα θετικά δείγματα για τους εντεροϊούς ελέγχθηκαν και με κυτταροκαλλιέργεια σε κύτταρα BGM Στα θετικά δείγματα για όλους τους ιούς έγινε τυποποίηση των ιών με Sequencing

31 ΕΥΡΩΠΑΪΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΙΩΝ ΣΤΑ ΟΣΤΡΑΚΟΕΙΔΗ live bivalve shellfish 20 oysters /20-30 mussels digestive gland elution and homogenisation with glycine buffer at ph10 1:5 (w/v) Μεθοδολογία ανίχνευσης ιών σε οστρακοειδή magnetic stirring for 15 min adjust ph to 7 ± 0.2 centrifugation x g for 15 min at 4ºC centrifugation of the supernatant at x g for 45 min at 4ºC supernatant ultracentrifugation at x g for 1 h at 4ºC pellet resuspension in µl PBS viral concentrate stored at -80ºC isolation by cell culture nucleic acid extraction GuSCN and silica particles reverse transcription HAV, EV, NLV PCR amplification of Adv DNA and HAV, EV and NLV cdna Taqman quantification virus typification

32 ΕΥΡΩΠΑΪΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΙΩΝ ΣΤΑ ΟΣΤΡΑΚΟΕΙΔΗ 4,3% 2,1% 1,5% 34,0% 16,7% 41,4% Negative Enteroviruses Adenoviruses HAV Norw alk I Norw alk II

33 ΕΥΡΩΠΑΪΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΙΩΝ ΣΤΑ ΟΣΤΡΑΚΟΕΙΔΗ 51.0 Jena Na2-contig Grimsby CEFAS-CATB2 CEFAS-CATDb Umea 2b Barcelona 11 CEFAS-CATD Lordsdale Patras 13 Patras NI CEFAS-CATD Patras 1 Murl JP CEFAS-CATA CEFAS-CATC CEFAS-CATC Harrow Barcelona 9 Richmond Hawaii Umea 3b Barcelona 14 Barcelona 19 CEFAS-CATD Mexico CEFAS-CATB1 CEFAS-CATB1 CEFAS-CATB1 CEFAS-CATC CEFAS-CATD Barcelona S1 Barcelona S2 Umea 10b Umea 11b Valetta CEFAS-CATD CEFAS-CATB CEFAS-CATC CEFAS-CATD Haytread Umea 3b.SEQ Phylogenetic tree showing genetic relationship between Genogroup I and Genogroup II Norwalk-Like Virus (NLV) positive shellfish in comparison with representative clinical and published NLV strains at the nucleotide level. The phylogenetic tree was generated using the Clustal V algorithm within MegAlign (DNA Star inc). The tree is based on approximately 80 nucleotides within the RNA polymerase excluding primers. Reference strains are in bold letters.

34 4. SDS-Ηλεκτροφόρηση στελεχών Ps. Aeruginosa που απομονώθηκαν από το θαλασσινό νερό

35 SDS-Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών στελεχών Ps.Aeruginosa που απομονώθηκαν από εμφιαλωμένα νερά

36 RAPD στα είδη της Pseudomonas spp.

37 5. RAPD για τη διάκριση Ε.coli ανθρώπινης ή ζωικής προέλευσης Ζωικά στελέχη Ανθρώπινα στελέχη

38 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Με τις μοριακές τεχνικές, γίνεται πολύ πιο σύντομος, ευαίσθητος και αξιόπιστος, ο έλεγχος των περιβαλλοντικών δειγμάτων για την παρουσία παθογόνων μικροοργανισμών. Δίνεται η δυνατότητα να ανιχνευθούν και οι μη καλλιεργήσιμοι μικροοργανισμοί (Viable But Not Culturable). Η PCR, συγκεκριμένα, είναι μια ιδιαίτερα εξειδικευμένη και ευαίσθητη τεχνική που έχει την ικανότητα να ανιχνεύει τις πολύ μικρές ποσότητες των μικροοργανισμών στα περιβαλλοντικά δείγματα. Στο ίδιο δείγμα, είναι δυνατόν να ανιχνευθούν ταυτόχρονα πολλοί μικροοργανισμοί (π.χ. multiplex PCR) όπως είναι δυνατόν να ανιχνευθούν κυρίως οι «ζωντανοί» μικροοργανισμοί (RT-PCR). Με το συνδυασμό καλλιεργητικών και μοριακών τεχνικών, μπορούμε να ανιχνεύσουμε τους παθογόνους και «ζωντανούς» μικροοργανισμούς Το μεγαλύτερο μειονέκτημα των μοριακών τεχνικών είναι ότι πρέπει να χρησιμοποιούνται από εξειδικευμένο προσωπικό. Οι μοριακές τεχνικές και κυρίως η PCR αποτελούν ένα πολύτιμο εργαλείο στον έλεγχο των υδατογενών και τροφιμογενών επιδημιών και συνεπώς στην προστασία της Δημ. Υγείας.