ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΑΝΘΡΩΠΙΝΩΝ ΓΝΑΘΩΝ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ RAMAN

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΔΜΠΣ "Ιατρική Χημεία: Σχεδιασμός και Ανάπτυξη Φαρμακευτικών Προϊόντων" ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΑΝΘΡΩΠΙΝΩΝ ΓΝΑΘΩΝ ΜΕ ΦΑΣΜΑΤΟΣΚΟΠΙΑ RAMAN ΚΟΥΒΑΡΙΤΑΚΗ ΣΟΦΙΑ ΧΗΜΙΚΟΣ ΠΑΤΡΑ ΝΟΕΜΒΡΙΟΣ 2013

2 Τριμελής Επιτροπή Κοντογιάννης Γ. Χρίστος Καθηγητής Τμήματος Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Πατρών (Επιβλέπων Καθηγητής) Όρκουλα Γ. Μαλβίνα Επίκουρη Καθηγήτρια Τμήματος Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Πατρών Παντελιού Δ. Σοφία Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τμήματος Μηχανολόγων και Μηχανικών Αεροναυπηγών Πανεπιστημίου Πατρών [I]

3 Περίληψη Το οστό είναι ένα βιογενές υλικό, το οποίο συνίσταται από μια ανόργανη φάση, το βιοαπατίτη (~70%) και την οργανική φάση (~30%). Η οργανική φάση αποτελείται από ίνες κολλαγόνου τύπου Ι (οι οποίες αποτελούν το 90% της ολικής πρωτεΐνης του οστού) και πολυάριθμες μη κολλαγονούχες πρωτεΐνες (οι οποίες αποτελούν το υπόλοιπο 10% της ολικής πρωτεΐνης του οστού). Το κολλαγόνο τύπου Ι είναι μια εξαιρετικά ινώδης πρωτεΐνη με σταυροδεσμούς, που προσδίδει στο οστό μηχανικές και βιοχημικές ιδιότητες. Οι κρύσταλλοι του βιοαπατίτη, ενός μη στοιχειομετρικού αναλόγου του υδροξυαπατίτη [Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 ], βρίσκονται πάνω και μέσα στις ίνες του κολλαγόνου και τείνουν να είναι προσανατολισμένοι στην ίδια κατεύθυνση με αυτές. Ο όρος «ποιότητα οστού» αναφέρεται στο σύνολο των συνθετικών και αρχιτεκτονικών ιδιοτήτων του οστέινου ιστού που καθορίζουν τις ιδιότητες του υλικού και την ικανότητά του να εκτελεί μηχανικές λειτουργίες. Οι μη-επεμβατικές τεχνικές που χρησιμοποιούνται για τη μέτρηση της Οστικής Πυκνότητας (Bone Mineral Density) παρουσιάζουν εγγενή προβλήματα, καθώς η απορρόφηση ακτίνων Χ στις οποίες βασίζονται, είναι ευαίσθητη μόνο στο ανοργανο συστατικό του οστού (βιοαπατίτη) χωρίς να λαμβάνουν υπόψη το οργανικό (κολλαγόνο τύπου Ι). Έτσι, υπάρχει η ανάγκη για ανάπτυξη νέων τεχνικών, όπως η φασματοσκοπία Raman, με την οποία μπορεί να αξιολογηθεί η ποιότητα ενός οστού χρησιμοποιώντας πληροφορίες όπως είναι η ποσότητα και το είδος των σταυροδεσμών του, ο λόγος ανόργανης προς οργανική φάση, η κρυσταλλικότητα του οστού (λόγος ανθρακικών προς φωσφορικά), κ.ά. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε λοιπόν η ποιότητα ανθρώπινων γνάθων με χρήση φασματοσκοπίας Raman. Από τα φάσματα Raman που καταγράφηκαν επελέγησαν οι κορυφές που οφείλονται στο βιοαπατίτη και στο κολλαγόνο. Χρησιμοποιήθηκαν δυο δείκτες, ο λόγος βιοαπατίτη προς κολλαγόνο (Mineral to Matrix Ratio) και ο λόγος των μη αναγώγιμων σταυροδεσμών του κολλαγόνου προς τους αναγώγιμους σταυροδεσμούς του. Στην πρώτη περίπτωση, χρησιμοποιήθηκε ο λόγος των κορυφών στους 960 cm -1 για το βιοαπατίτη και το άθροισμα των κορυφών στους 855, 875 και [II]

4 920 cm -1 για το κολλαγόνο, οι οποίες αποδίδονται στα αμινοξέα προλίνη και υδροξυπρολίνη του κολλαγόνου [960 cm -1 / (855 cm cm cm -1 )]. Στην περίπτωση του λόγου των σταυροδεσμών του κολλαγόνου, χρησιμοποιήθηκε η περιοχή του αμιδίου Ι, και συγκεκριμένα οι δονήσεις στους 1658 και 1668 cm -1 για τους μη αναγώγιμους σταυροδεσμούς και οι δονήσεις στους 1680 και 1690 cm -1 για τους αναγώγιμους σταυροδεσμούς του κολλαγόνου [(1658 cm cm -1 ) / (1680 cm cm -1 )]. Χρησιμοποιώντας αυτούς του δείκτες κατασκευάστηκαν διαγράμματα για την εκτίμηση της ποιότητας των οστών ανά σημείο ή/και ανά περιοχή των γνάθων. Από τη μελέτη προέκυψε ότι κάθε οστό έχει διαφορετικές μηχανικές ιδιότητες οι οποίες ποικίλουν είτε από πλευρά σε πλευρά της γνάθου ή σημειακά. Οι διαφοροποιήσεις αυτές πιθανόν σχετίζονται με τις συνήθειες του ανθρώπου, όπως π.χ. η μάσηση. Επίσης, έγινε προσπάθεια σύγκρισης των αποτελεσμάτων της φασματοσκοπίας Raman με την εγκαθιδρυμένη τεχνική DEXA η οποία αποτελεί το golden standard. Οι τιμές BMD (Bone Mineral Density) που συνελλέγησαν με την DEXA, συγκρίθηκαν με τις τιμές του MMR. Παρόλο που οι δυο τεχνικές αξιολογούν διαφορετικά στοιχεία, φάνηκε ότι υπάρχει συσχέτιση αποτελεσμάτων, καθώς περιοχές υψηλής και χαμηλής οστικής πυκνότητας αντιστοιχούν σε υψηλές και χαμηλές τιμές του MMR, αντίστοιχα. Επιπλέον, μελετήθηκαν και οι μεταβολές που προκλήθηκαν στο κολλαγόνο του οστού λόγω της μη συντήρησης του υλικού. Φάσματα Raman καταγράφηκαν σε τμήμα οστού της ανθρώπινης γνάθου πριν και μετά την ενυδάτωση με ρυθμιστικό διάλυμα PBS (Phosphate Buffer Solution). Οι κορυφές της περιοχής του αμιδίου Ι, χρησιμοποιηθήκαν για τον υπολογισμό των εξής λόγων: 1660 cm -1 / 1690 cm -1, 1658 cm -1 / 1660 cm -1 και (1658 cm cm -1 ) / 1690 cm -1. Από τους παραπάνω λόγους, φαίνεται ότι η κορυφή στα 1658 cm -1 μπορεί να αποδοθεί στην αφυδατωμένη μορφή του κολλαγόνου. Η χρήση του ρυθμιστικού διαλύματος PBS βοηθά στη συντήρηση των οστών χωρίς να επηρεάζει τη δευτεροταγή δομή του κολλαγόνου τους. Λέξεις κλειδιά: Ανθρώπινη Γνάθος, Φασματοσκοπία Raman, Ποιότητα Οστού, Βιοαπατίτης, Υδροξυαπατίτης, Κολλαγόνο [III]

5 UNIVERSITY OF PATRAS SCHOOL OF NATURAL SCIENCES "Medicinal Chemistry: Drug Discovery and Design" STUDY OF HUMAN MANDIBLES USING RAMAN SPECTROSCOPY KOUVARITAKI SOFIA CHEMIST PATRAS NOVEMBER 2013 [IV]

6 Evaluation Committee Christos G. Kontoyannis Professor and Director of Instrumental Pharmaceutical Analysis, Department of Pharmacy, University of Patras (Supervisor Professor) Orkoula G. Malvina Assistant Professor of Instrumental Pharmaceutical Analysis, Department of Pharmacy, University of Patras Panteliou D. Sofia Associate Professor, Mechanical and Aeronautics Engineering Department, University of Patras [V]

7 Abstract Bone is a biogenic material which is distinguished from other forms of connective tissues by the fact that it becomes extremely hard. It consists of an inorganic phase, the bioapatite (~70%), and an organic matrix (~30%). Bone matrix is formed by type I collagen fibers (which make up 90% of the total protein of bone) and numerous noncollagenous proteins. Type I collagen is a highly cross-linked fibrillar protein which enhances the mechanical and biochemical properties of bone. On the other hand, crystals of bioapatite, a non-stoichiometric analogous of hydroxyapatite [Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 ] are found on and within the collagen fibers and they tend to be oriented in the same direction as the collagen fibers. The term "bone quality" refers to the ensemble of composition and architectural properties of bone tissue that together determine its material properties and its ability to perform mechanical functions. Non invasive techniques are used to measure Bone Mineral Density (BMD) but they have the disadvantage that they emit X rays and that they are able to account just the mineral matrix of bone (bioapatite) without considering the organic which also contributes to the bone strength. These reasons reinforce the need for finding new methods as Raman spectroscopy, which may be used for the estimation of numerous indicators associated with bone strength, such as the amount and the kind of collagen fibers, the ratio of inorganic/organic phase, crystallinity, bone aging, etc. In this work, Raman spectroscopy was used for the study of the quality of human mandibles. Raman spectra were recorded and the bands attributed to bioapatite and collagen were analyzed. The ratio of bioapatite to collagen (Mineral to Matrix Ratio) and the ratio of non-reducible to reducible collagen cross-links were determined. In the first case, the Mineral to Matrix ratio (MMR) was calculated using the intensities of the bands at 960 cm -1 for bioapatite and 855 cm -1, 875 cm -1 and 920 cm -1 for proline and hydroxyproline, [I (960 cm -1 / (855 cm cm cm -1 )], while the ratio of collagen cross-links was calculated using the amide I envelope, and specifically, using the intensities of the bands at 1658, 1668 cm -1 for non-reducible cross-links and 1680, 1690 cm -1 for reducible collagen cross-links [I (1658 cm cm -1 ) / (1680 cm cm -1 )]. These indicators were applied for the [VI]

8 construction of diagrams showing the changes of bone quality within the same mandible. It was shown that each bone has different mechanical properties which vary spatially. These variations are possibly related to human habits such as chewing. Comparison of Raman spectroscopy (MMR) results against dual-energy X-ray absorptiometry BMD measurements was also attempted and similarity in their trends was noticed. Finally, the Raman spectral changes induced to mandible collagen due to different storage conditions, such as dehydration, were studied. Raman spectra were recorded from a sample of an as received human mandible and after immersion in PBS (Phosphate Buffer Solution). Sub-bands of amide I envelope were used for the calculation of the ratios 1660 cm -1 / 1690 cm -1, 1658 cm -1 / 1660 cm -1 and (1658 cm cm -1 ) / 1690 cm -1. From these ratios it was found that the presence of the band at 1658 cm -1 was due to dehydration and that immersion in PBS solution can, at least partially, rehydrate the collagen. At the same time, no collagen cross-linking changes were observed. Keywords: Human Mandible, Raman Spectroscopy, Bone Quality, Bioapatite, Hydroxyapatite, Collagen [VII]

9 Ευχαριστίες Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Ενόργανης Φαρμακευτικής Ανάλυσης, του Τμήματος Φαρμακευτικής, του Πανεπιστημίου Πατρών, στα πλαίσια του Διατμηματικού Μεταπτυχιακού Προγράμματος Σπουδών "Ιατρική Χημεία: Σχεδιασμός και Ανάπτυξη Φαρμακευτικών Προϊόντων" με επιβλέποντα τον Καθηγητή κ. Χρίστο Κοντογιάννη. Αρχικά, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον καθηγητή μου κ. Χρίστο Κοντογιάννη για την ευκαιρία που μου έδωσε να ενταχθώ στο εργαστήριό του και να ασχοληθώ με το συγκεκριμένο θέμα. Οι πολύτιμες συμβουλές και ιδέες του αποτέλεσαν για μένα οδηγό της ερευνητικής μου πορείας. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα, την Επίκουρη Καθηγήτρια κα. Μαλβίνα Όρκουλα, για την καθοδήγηση και την πολύτιμη συμβολή της σε όλη αυτή τη δουλειά παρέχοντάς μου πολλές γνώσεις και συμβουλές. Πέρα όμως, από το ερευνητικό αντικείμενο, μου έδωσε την ευκαιρία να εμπλακώ και σε άλλες δραστηριότητες αποκομίζοντας μοναδικές εμπειρίες. Δε θα μπορούσα να παραλείψω να εκφράσω την εκτίμησή μου για αυτούς τους δυο ανθρώπους και να τους ευχαριστήσω για τη υποστήριξη και την κατανόηση που μου έδειξαν αυτά τα χρόνια αλλά και για τις ξεχωριστές στιγμές που ζήσαμε στο "εργαστήριο-σπίτι". Θερμές ευχαριστίες θα ήθελα επίσης, να εκφράσω στην Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κα. Σοφία Παντελιού, για την αποδοχή της πρόσκλησης συμμετοχής στην τριμελή επιτροπή, για τη συνεργασία μας και για το ενδιαφέρον που έδειξε σε αυτό το ερευνητικό αντικείμενο. Σημαντικό κομμάτι επίσης, επιτέλεσε η συνεργασία μας με το Ινστιτούτο Έρευνας Χημικής Μηχανικής (ΙΕΧΜΗ) για την απρόσκοπτη πρόσβαση που μας παρείχε στα διάφορα όργανα και για την οικονομική του συμβολή. Κατόπιν, νιώθω την ανάγκη να ευχαριστήσω μερικούς ανθρώπους, των οποίων η βοήθεια ήταν καθοριστική από το ξεκίνημα έως και το τέλος του ερευνητικού μου έργου. Αρχικά, ευχαριστώ τον Δρ. κ. Ιωάννη Καραμπά και την υποψήφια διδάκτορα [VIII]

10 κα. Μάρθα Βαρδάκη, που ήταν τα άτομα με τα οποία συνεργάστηκα στα πρώτα μου βήματα στο εργαστήριο. Μου παρείχαν πολύτιμες γνώσεις πάντα με ευχαρίστηση και προθυμία, εξελίσσοντας με τον καιρό μια σχέση συνεργασίας σε σχέση φιλίας. Φυσικά, ιδιαίτερες ευχαριστίες θα ήθελα να εκφράσω στις συναδέλφους και φίλες μου, Ελένη Καμηλάρη, Γιούλη Παπασπυριδάκου και Γεωργία Μανίκα για τη βοήθεια, το ενδιαφέρον και τη στήριξη που μου παρείχαν όλα αυτά τα χρόνια, τόσο σε ερευνητικά θέματα όσο και σε προσωπικά. Μαζί μοιραστήκαμε προβληματισμούς, ανησυχίες, ζήσαμε τις καλές και κακές στιγμές που χαράζουν τη ζωή μας. Τέλος, δε θα μπορούσα να μην ευχαριστήσω όλους τους συναδέλφους και φίλους με τους οποίους βρεθήκαμε μαζί στον ίδιο εργαστηριακό χώρο αλλά και τους φίλους εκτός εργαστηρίου που αποτέλεσαν ψυχολογικό στήριγμα σε αυτή την προσπάθεια. Τις πιο θερμές ευχαριστίες θέλω να εκφράσω στην οικογένειά μου για την ανεκτίμητη αγάπη και στήριξη που μου παρείχαν όλα αυτά τα χρόνια. Τέλος, ένα μεγάλο ευχαριστώ οφείλω στον αγαπημένο μου για την αμέριστη ηθική υποστήριξη και αγάπη που μου προσέφερε και συνεχίζει να μου προσφέρει. Κουβαριτάκη Σοφία Χημικός [IX]

11 Περιεχόμενα Κεφάλαιο 1 ο Οστό: Ένας Συνδετικός Ιστός με Ιδιαίτερα Χαρακτηριστικά 1.1 Εισαγωγή Χημεία του Οστού Η Ανόργανη Φάση του Οστού Η Οργανική Φάση του Οστού Κολλαγόνο Μη-κολλαγονούχες πρωτεΐνες Κύτταρα του Οστού Οστική Δημιουργία και Οστική Ανακατασκευή Μυελός Νερό Ιεραρχική Δομή του Οστού Ασβεστοποίηση Ανατομικά Χαρακτηριστικά του Οστού Συμπαγές και Σπογγώδες οστό Κεφάλαιο 2 ο Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών. Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman 2.1 Ποιότητα Οστού Χαρακτηριστικά Γνωρίσματα του Οστού της Κάτω Γνάθου [X]

12 2.3 Τεχνικές εκτίμησης της ποιότητας του οστού Εφαρμοσμένες Τεχνικές Εκτίμησης Ποιότητας Οστών σε Κλινικό Επίπεδο Χρησιμοποιούμενες Τεχνικές σε Ερευνητικό Επίπεδο για την Εκτίμηση της Ποιότητας των Οστών Η Φασματοσκοπία Raman Θεωρητικό υπόβαθρο Μαθηματική προσέγγιση Οργανολογία Είδη Φασματοσκοπίας Raman Εφαρμογές Φασματοσκοπίας Raman Φασματοσκοπία Raman και Ποιότητα Οστού Μελέτες σχετικά με την Ποιότητα του Οστού της Ανθρώπινης Κάτω Γνάθου Σκοπός της παρούσας εργασίας Κεφάλαιο 3 ο Συλλογή Υλικών και Μέθοδος 3.1 Συλλογή και Κατεργασία Δειγμάτων Συντήρηση δειγμάτων Υπολογισμός πυκνότητας υλικού Οργανολογία Φασματόμετρα Raman Καταγραφή φασμάτων με FT-Raman Καταγραφή φασμάτων με micro-raman [XI]

13 3.2.2 Καταγραφή μετρήσεων BMD Επεξεργασία Φασμάτων Στατιστική Ανάλυση Φασμάτων με PCA και SIMCA Κεφάλαιο 4ο Απόδοση Κορυφών σε Φάσμα Raman Οστού 4.1 Περιοχή βιοαπατίτη ( cm -1 ) Περιοχή προλίνης-υδροξυπρολίνης του κολλαγόνου ( cm -1 ) Περιοχή αμιδίου Ι του κολλαγόνου ( cm -1 ) Κεφάλαιο 5 ο Μελέτη της Μεταβολής του Κολλαγόνου. Το φαινόμενο της Αφυδάτωσης 5.1 Εισαγωγή Εξέταση της Μεταβολής του Κολλαγόνου Χημειομετρική Ανάλυση Δεδομένων Σύνοψη Αποτελεσμάτων Κεφάλαιο 6 ο Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων 6.1 Εισαγωγή Ανάλυση Αποτελεσμάτων Εκτίμηση της Ποιότητας της L Γνάθου Εκτίμηση της Ποιότητας της Μ Γνάθου Εκτίμηση της Ποιότητας της Ο Γνάθου [XII]

14 6.2.4 Εκτίμηση της Ποιότητας της Ρ Γνάθου Εκτίμηση της Ποιότητας της S Γνάθου Σύγκριση Αποτελεσμάτων Φασματοσκοπίας Raman με μετρήσεις Οστικής Πυκνότητας Ανάλυση αποτελεσμάτων Κεφάλαιο 7 ο Συμπεράσματα - Μελλοντικοί Στόχοι Βιβλιογραφία Παράρτημα Α' Παράρτημα Β' Παράρτημα Γ' Βιογραφικό Σημείωμα [XIII]

15 Κεφάλαιο 1 ο Οστό: Ένας Συνδετικός Ιστός με Ιδιαίτερα Χαρακτηριστικά 1.1 Εισαγωγή Το οστό είναι ένας εξειδικευμένος συνδετικός ιστός που συνιστά μαζί με το χόνδρο, το σκελετό [1]. Ο σκελετός εξυπηρετεί τρεις σημαντικές λειτουργίες: (1) μηχανικές, στηρίζει και κατευθύνει τους μυς για κίνηση, (2) προστατευτικές, για τα ζωτικά όργανα και το μυελό του οστού και (3) μεταβολικές, λειτουργεί σαν αποθήκη ιόντων, ειδικά ασβεστίου και φωσφορικών, για τη διατήρηση της ομοιόστασης του ορού που είναι απαραίτητος για τη ζωή [1]. Τα οστά συνιστούν περίπου το 15% του σωματικού βάρους των ενήλικων ανδρών, ενώ το 12% των ενήλικων γυναικών. Στον ανθρώπινο οργανισμό, το οστό αναπτύσσεται κυρίως μέχρι την ηλικία των 20 χρόνων κι έπειτα, συνεχίζει να αναπτύσσεται αλλά με πιο αργούς ρυθμούς. Η ρύθμιση της ανάπτυξης του σκελετού είναι σύνθετη και περιέχει γενετικές, μηχανικές, ορμονικές και θρεπτικές επιρροές [1]. Υπάρχουν διάφορα μεγέθη και σχήματα οστών με σκοπό να προσδίδουν στο σώμα ασφάλεια και μηχανική υποστήριξη [2]. Τέλος, ο οστίτης ιστός ξεχωρίζει από τους άλλους ιστούς λόγω της σκληρότητάς του που οφείλεται στην εναπόθεση μέσα στην σχετικά μαλακή οργανική φάση του, μιας σύνθετης ανόργανης ουσίας. 1.2 Χημεία του οστού Η χημική σύσταση και η κρυσταλλική δομή του οστού έχει σημαντικό ρόλο στις βιολογικές και δομικές του λειτουργίες [3]. Τα οργανικά και ανόργανα συστατικά και οι αλληλεπιδράσεις τους συνεισφέρουν στις μηχανικές του ιδιότητες, όπως είναι η αντοχή, η σκληρότητα και η ελαστικότητά του [4]. Περίπου τα 2/3 του οστού (κατά βάρος) αποτελούνται από την ανόργανη ύλη, δηλαδή κρυστάλλους μη στοιχειομετρικού υδροξυαπατίτη, και το 1/3 από την οργανική. Η οργανική φάση του οστού αποτελείται από ίνες κολλαγόνου τύπου Ι (αποτελούν το 90% της συνολικής πρωτεΐνης του οστού) και πολυάριθμες μη-κολλαγονούχες πρωτεΐνες (το υπόλοιπο 10% της συνολικής πρωτεΐνης του οστού) [5]. Επιπλέον, το οστό περιέχει νερό, που χρησιμεύει στην αποθήκευση χρήσιμων συστατικών και μυελό του οστού. [1]

16 Κεφάλαιο 1 Οστό: Ένας Συνδετικός Ιστός με Ιδιαίτερα Χαρακτηριστικά H Ανόργανη Φάση του Οστού Οι μηχανικές ιδιότητες του οστού εξαρτώνται κατά ένα μέρος από τη χημική σύσταση και τη δομή της ανόργανης φάσης του. Το κύριο και θερμοδυναμικά σταθερότερο συστατικό της ανόργανης φάσης είναι ο βιοαπατίτης (ΒΑP) [Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 ], ένα στοιχειομετρικό ανάλογο του γεωλογικού πετρώματος υδροξυαπατίτη. Ανήκει στην οικογένεια των "απατιτών", που είναι μια οικογένεια κρυσταλλικών ενώσεων με παρόμοιες δομές αλλά όχι απαραίτητα ίδιας σύστασης, έχοντας γενικό μοριακό τύπο [Ca 5 (PO 4 ) 3 (OH, F, Cl)]. Σημαντικά χαρακτηριστικά της δομής του βιοαπατίτη είναι η εξαγωνική συμμετρία και οι μικρού μεγέθους κρύσταλλοι της τάξεως των νανομέτρων. Αναλυτικότερα, κρυσταλλογραφικές μελέτες έδειξαν ότι το εξαγωνικό σύστημα που ανήκει ο απατίτης χαρακτηρίζεται από ένα εξαπλό c-άξονα κάθετο σε τρεις ίσους α-άξονες (α 1, α 2, α 3 ) έχοντας γωνία 120 ο μεταξύ τους. Η στοιχειώδης κυψελίδα (unit-cell) του απατίτη αποτελείται από δυο τριγωνικές πρισματικές υπομονάδες που σχηματίζουν ένα πρίσμα με ρομβοειδείς κάθετες πλευρές. Τα ιόντα ΟΗ - βρίσκονται στις γωνίες της κυψελίδας και περιβάλλονται από δυο άτομα Ca(ΙΙ) με τριγωνική διάταξη, από δυο φωσφορικές ομάδες που είναι επίσης σε τριγωνική διάταξη και από άτομα Ca(I) σε απομακρυσμένες αποστάσεις έχοντας εξαγωνική παράταξη [6, 7]. Εικόνα 1: Στοιχειώδης κυψελίδα ενός απατίτη [8, 9]. Η χημική σύσταση των κρυστάλλων του οστού δεν αντιστοιχεί με αυτή του στοιχειομετρικού υδροξυαπατίτη. Δομικά και συνθετικά χαρακτηριστικά, που αναφέρονται στη σύσταση και σε διάφορες παραμέτρους του πλέγματος, [2]

17 Κεφάλαιο 1 Οστό: Ένας Συνδετικός Ιστός με Ιδιαίτερα Χαρακτηριστικά διαχωρίζουν σαφώς τον απατίτη του οστού από τον καθαρό υδροξυαπατίτη. Εκτός από τα κύρια συστατικά Ca 2+, PO 3-4 και ΟΗ -, ο βιολογικός απατίτης περιέχει και μικρότερης σημασίας συστατικά (Na +, K +, Mg +, CO 2-3, HPO 2-4, P 2 O 4-7, κλπ) και ιχνοστοιχεία (Sr 2+, Ba 2+, Pb 2+, Zn 2+, κλπ) τα οποία σχετίζονται με τη σταθερότητά του. Μερικά από τα ιχνοστοιχεία βρίσκονται στη στερεά ανόργανη φάση (F -, Sr 2+ ), άλλα βρίσκονται κυρίως στην οργανική φάση (π.χ Si, Cu) και άλλα όπως, ο Zn μπορεί να βρίσκονται στη μια ή και στις δυο φάσεις [10]. Μερικά ιχνοστοιχεία δεν μπορούν να εντοπιστούν ακόμα με ακρίβεια σε συγκεκριμένα συστατικά του οστού [11, 12]. Με τη χρήση τεχνικών όπως το NMR [13], φασματοσκοπία Raman [14] και ανελαστική σκέδαση νετρονίων [15], ανακαλύφθηκε μια άλλη σημαντική διαφοροποίηση του βιολογικού απατίτη από τον υδροξυαπατίτη. Αυτή είναι η έλλειψη ή η σημαντική ανεπάρκεια ιόντων OH -. Αναφέρεται [16] ότι σε βιολογικό απατίτη οστού περιέχεται ένα πολύ μικρό ποσοστό υδροξυλομάδων ενώ περιέχονται σημαντικά ποσοστά ανθρακικών και HPO4 ιόντων [6, 17]. Το μέγεθος και το σχήμα των κρυστάλλων του απατίτη του οστού ξεκίνησε να μελετάται από τις δεκαετίες του Χρησιμοποιώντας δυο κυρίως τεχνικές, την περίθλαση ακτίνων-χ και την ηλεκτρονική μικροσκοπία [18], βρήκαν ότι οι κρύσταλλοι του απατίτη εμφανίζονται είτε με μορφή ράβδων ή με τη μορφή πλάκας (plate-like). Ύστερα όμως από πολλές μελέτες, κατέληξαν ότι οι ραβδόμορφοι κρύσταλλοι είναι στην ουσία οι προβολές της άκρης των δομών με τη μορφή πλάκας. Το μέγεθος των κρυστάλλων του απατίτη ποικίλλει (μήκος nm, πλάτος nm, πάχος 2-10 nm) ανάλογα με τον τύπο του ασβεστοποιημένου ιστού [17-19]. Οι κρυσταλλίτες είναι εξαιρετικά μικροί και πολλές φορές χαρακτηρίζονται ως «ανεπαρκώς κρυσταλλικοί» εξαιτίας των ενσωματωμένων προσμίξεων, όπως τα 2- ιόντα CO 3 (4-6%), Na + (0.9%) και Mg + (0.5%) και της ασυμμετρίας του βιογενούς υλικού [17]. Η εκτεταμένη αντικατάσταση των βασικών ιόντων του βιοαπατίτη (Ca 2+, PO 3-4 ) από άλλα ιόντα, προκαλεί απώλεια της συμμετρίας των κρυστάλλων, προσδίδοντας ένα ακόμα χαρακτηριστικό του βιολογικού απατίτη [20]. Μεταξύ των υπόλοιπων ιόντων, χαρακτηριστική είναι η παρουσία του μαγνησίου (Mg + ) λόγω της σχετικά υψηλής περιεκτικότητάς του και του δομικού του ρόλου στον υδροξυαπατίτη. Είναι γνωστό ότι το μαγνήσιο αναστέλλει την κρυσταλλοποίηση του απατίτη σε διάλυμα, μπορεί και υποκαθιστά το ασβέστιο στη [3]

18 Κεφάλαιο 1 Οστό: Ένας Συνδετικός Ιστός με Ιδιαίτερα Χαρακτηριστικά δομή του υδροξυαπατίτη (περίπου 10% άτομα) και είναι κυρίως προσροφημένο στην κρυσταλλική επιφάνεια [21]. Τα ανθρακικά ιόντα (CO 2-3 ) μπορεί να περιέχονται σε δυο διαφορετικές περιοχές, στη μια υποκαθιστούν ιόντα υδροξυλίου (ΟΗ - ) και στην άλλη αντικαθιστούν φωσφορικές ομάδες (PO 3-4 ). Η παρουσία των ανθρακικών στους βιολογικούς απατίτες παρατηρείται κυρίως με την αντικατάσταση φωσφορικών ομάδων και μπορεί να μειώσει την αποσταθεροποίηση κάποιων ιόντων, όπως του μαγνησίου, στη δομή του υδροξυαπατίτη [21]. Επιπλέον, οι σχετικές αναλογίες των ιόντων CO και HPO 4 στον απατίτη του οστού ποικίλουν ως συνάρτηση της ηλικίας (ωρίμανση) του οστίτη ιστού. Φασματοσκοπικές μελέτες της ανόργανης φάσης του οστού ανίχνευσαν την ύπαρξη ανόργανων ιόντων σε μη-απατιτικές περιοχές [22, 23]. Αυτά τα ιόντα (Εικόνα 2), βρίσκονται σε μια ένυδρη περιοχή στις επιφάνειες των κρυστάλλων, εκ των οποίων μεγάλο μέρος είναι CO 2-3 και HPO 2-4 ιόντα. Τα ιόντα της ένυδρης στοιβάδας μπορούν εύκολα και αναστρέψιμα να ανταλλαχθούν με ιόντα από άλλα διαλύματα ή με φορτισμένες πρωτεΐνες καθορίζοντας έτσι τις αλληλεπιδράσεις της επιφάνειας στην οποία περιέχονται οι νανοκρύσταλλοι [11, 24-26]. Ωστόσο, η ακριβής δομή και χημική σύνθεση αυτού του ένυδρου στρώματος δεν είναι ακόμα απολύτως γνωστή, καθώς δεν έχουν βρεθεί τεχνικές απομόνωσης. Το ένυδρο αυτό στρώμα προσδίδει απροσδόκητες ιδιότητες στους νανοκρυστάλλους απατίτη, σημαντικές για τους ζωτικούς οργανισμούς [2]. [4]

19 Κεφάλαιο 1 Οστό: Ένας Συνδετικός Ιστός με Ιδιαίτερα Χαρακτηριστικά Εικόνα 2: Πλέγμα απατίτη και της ένυδρης στοιβάδας που τον περιβάλει [11] Η Οργανική Φάση του Οστού Η οργανική φάση του οστού αποτελείται από ίνες κολλαγόνου τύπου Ι (αποτελούν το 90% της συνολικής πρωτεΐνης του οστού) και πολυάριθμες μη-κολλαγονούχες πρωτεΐνες (το υπόλοιπο 10% της συνολικής πρωτεΐνης του οστού) [5] Κολλαγόνο Εικόνα 3: Τριπλή έλικα κολλαγόνου. Στην οικογένεια του κολλαγόνου ανήκουν τουλάχιστον 13 διαφορετικοί τύποι κολλαγόνου, χαρακτηρισμένοι με τους αριθμούς I-XII [27]. Τα κολλαγόνα διαχωρίζονται σε δυο κύριες κατηγορίες i) τα ινώδη κολλαγόνα (fibrillar), στα οποία ανήκουν οι τύποι I, II, III, V και XI και ii) τα μη ινώδη κολλαγόνα, στα οποία συμπεριλαμβάνονται όλοι οι άλλοι τύποι. Οι ομάδες που διαμορφώνουν τα ινώδη κολλαγόνα είναι μόρια σε μορφή ράβδου με μακριές επαναλαμβανόμενες τριπλές έλικες, οι οποίες είναι τα συστατικά των κλιμακωτών ινιδίων κολλαγόνου προσδίδοντας αντοχή στους ιστούς. Τα μη ινώδη κολλαγόνα σχηματίζουν μια ετερογενή ομάδα υπερμοριακών δομών και δικτύων [28]. [5]

20 Κεφάλαιο 1 Οστό: Ένας Συνδετικός Ιστός με Ιδιαίτερα Χαρακτηριστικά Το κολλαγόνο τύπου Ι είναι μια εξαιρετικά ινώδης πρωτεΐνη, η οποία μέσω της τρισδιάστατης δομής της, προσδίδει στο οστό την αντοχή στον εφελκυσμό. Η ιδιαίτερη μοριακή δόμηση του κολλαγόνου τύπου Ι αλλά και η τοποθέτησή του, προσδίδουν στο οστό αντοχή σε ελαστικές και θλιπτικές δυνάμεις [29]. Το κολλαγόνο αποτελείται από μια δεξιόστροφη τριπλή έλικα, η οποία γενικά αποτελείται από δυο πανομοιότυπες αλυσίδες (α1) και μια επιπλέον αλυσίδα που διαφέρει λίγο στη χημική της σύνθεση (α2) [30]. Οι τρεις αλυσίδες ενώνονται μεταξύ τους με δεσμούς υδρογόνου μεταξύ του αμινοξέος υδροξυπρολίνη και άλλων φορτισμένων αμινοξέων [31]. Η διερεύνηση της δομής πολυτριπεπτιδίων (περίθλαση ακτίνων-χ και οπτικές φασματοσκοπικές μέθοδοι) κατέδειξε ότι η διαμόρφωση της τριπλής έλικας μπορεί να σχηματιστεί μόνο εάν στην πρώτη θέση υπάρχει γλυκίνη (Gly) και στις άλλες δυο προλίνη (Pro) και υδροξυπρολίνη (Hyp) [32]. Η παρουσία της γλυκίνης ανά τρία αμινοξέα, που είναι ένα μικρό αμινοξύ με ένα άτομο υδρογόνου στην πλευρική αλυσίδα, διευκολύνει την τριπλή ελικοειδή δομή του κολλαγόνου και επιτρέπει τη δημιουργία δεσμών υδρογόνου μεταξύ των αλυσίδων μέσα στην έλικα. Κάποια μετάλλαξη στη γλυκίνη μπορεί να προκαλέσει αλλαγή στη δομή και κυρίως οδηγεί σε ποικίλες παθήσεις των συνδετικών ιστών. Για παράδειγμα, μετάλλαξη σε μια από τις α-αλυσίδες του κολλαγόνου τύπου Ι συνήθως οδηγεί σε ατελή οστεογένεση, που χαρακτηρίζεται από ευθραυστότητα των οστών [28]. Το συγκρότημα της τριπλής έλικας τοποθετεί στον εσωτερικό άξονα της έλικας τα αμινοξέα της γλυκίνης, όπου δεν υπάρχει χώρος για κάποια μεγαλύτερη ομάδα από το πλευρικό άτομο υδρογόνου της γλυκίνης. Για το λόγο αυτό, οι δακτύλιοι προλίνης και υδροξυπρολίνης πρέπει να δείχνουν προς τα έξω [30, 31, 33] (Εικόνα 4). Το αμινοξύ γλυκίνη αποτελεί περίπου το 1/3 των αμινοξέων διαμορφώνοντας δυο κύρια μοτίβα, το Gly-Pro-X και το Gly-X-Hyp, όπου X είναι κάποιο αμινοξύ πέρα της γλυκίνης, προλίνης και υδροξυπρολίνης. Το υψηλό ποσοστό σε υδροξυπρολίνη είναι ασυνήθιστο στις πρωτεΐνες και σχετίζεται άμεσα με τη σταθερότητα και την αδιαλυτότητα του μορίου. [6]

21 Κεφάλαιο 1 Οστό: Ένας Συνδετικός Ιστός με Ιδιαίτερα Χαρακτηριστικά Εικόνα 4: Διαμόρφωση της τριπλής έλικας του κολλαγόνου [34]. Η επαναλαμβανόμενη φύση της ακολουθίας των αμινοξέων του κολλαγόνου, (Gly- X-Y-) n -, όπου X και Y είναι συνήθως προλίνη και υδροξυπρολίνη, επιτρέπει στην πρωτεΐνη να παίρνει τη μορφή τριπλής έλικας που αναφέρεται ως μόρια τροποκολλαγόνου. Δευτερογενείς αλληλεπιδράσεις δέσμευσης μεταξύ των μονάδων τροποκολλαγόνου οδηγούν σε αυτό-οργάνωση σε ινίδια. Το ινίδιο δηλαδή είναι μια παράλληλη συστοιχία μορίων κολλαγόνου σχηματίζοντας ράβδο. Το κολλαγόνο τύπου Ι συγκεντρώνει όλες τις μονάδες τροποκολλαγόνου σε κλιμακωτές περιοχές [17]. Τα ινίδια έχουν την τάση να διατάσσονται παράλληλα το ένα προς το άλλο σχηματίζοντας ομάδες οργανωμένων δομών οι οποίες ονομάζονται ίνες. Ο αριθμός των ινιδίων που οργανώνονται σε ίνες δεν είναι σταθερός και μπορεί να ποικίλει από μερικές δεκάδες ως χιλιάδες [35]. [7]

22 Κεφάλαιο 1 Οστό: Ένας Συνδετικός Ιστός με Ιδιαίτερα Χαρακτηριστικά Εικόνα 5: Ιεραρχική δομή του κολλαγόνου. Μεταξύ των κενών περιοχών στη δομή των ινιδίων του κολλαγόνου δημιουργούνται συστροφές λόγω της υψηλότερης ευκαμψίας των μορίων του κολλαγόνου που οφείλεται αφενός στα χαμηλά επίπεδα προλίνης και υδροξυπρολίνης [36] και αφετέρου, στη μειωμένη πυκνότητα πλήρωσης αυτής της περιοχής [37]. Ο τρόπος με τον οποίο διατάσσονται οι ίνες του κολλαγόνου διαφέρει μεταξύ των τύπων του οστέινου ιστού. Στη μια περίπτωση οι ίνες διατάσσονται παράλληλα η μια στην άλλη, όπως παρατηρείται κυρίως στους τένοντες και στα νεοσχηματισμένα οστά, και στην άλλη περίπτωση, οι ίνες έχουν ακανόνιστη διάταξη, ορίζοντας το "περιπλεγμένο οστό" (woven bone) [38]. Χαρακτηριστικό γνώρισμα του κολλαγόνου είναι οι σταυροδεσμοί του. Πρόκειται για τους ομοιοπολικούς δεσμούς που αναπτύσσονται σχεδόν αμέσως μέσα στα μόριά του κολλαγόνου (ενδομοριακοί σταυροδεσμοί), αλλά και μεταξύ των μορίων (διαμοριακοί σταυροδεσμοί) σταθεροποιώντας τη δομή των ινιδίων του κολλαγόνου (Εικόνα 6). [8]

23 Κεφάλαιο 1 Οστό: Ένας Συνδετικός Ιστός με Ιδιαίτερα Χαρακτηριστικά Εικόνα 6: Σταυροδεσμοί του κολλαγόνου. Μέχρι τώρα, εφτά σημαντικοί σταυροδεσμοί του κολλαγόνου έχουν καθιερωθεί ως φυσικώς διαμοριακοί σταυροδεσμοί. Αυτοί είναι: (1) δεϋδροδιυδροξυλυσινορλευκίνη (deh-dhlnl), (2) δεϋδρο-υδροξυλυσινορλευκίνη (deh- HLNL), (3) δεϋδροϊστιδινοϋδροξυμεροδεσμοσίνη (deh-hhmd), (4) πυριδινολίνη (Pyr), (5) δεοξυπυριδινολίνη (d-pyr), (6) πυρρόλιο και (7) ιστιδινοϋδροξυλυσινορλευκίνη (HHL). Οι πρώτοι τρεις είναι NaBH 4 -αναγώγιμοι και οι υπόλοιποι είναι μη αναγώγιμοι [39, 40]. Ο σχηματισμός των σταυροδεσμών είναι ουσιαστικά η ενζυματική οξειδωτική απαμίνωση των ε-άμινο ομάδων σε συγκεκριμένα πεπτιδικά αμινοξέα λυσίνης/υδροξυλυσίνης στις μη ελικοειδείς τελοπεπτιδικές περιοχές των μορίων του κολλαγόνου. Οι λυσιλικές και υδροξυλυσιλικές αλδεΰδες παράγονται από αυτή την αντίδραση και τα αμινοξέα με τους σταυροδεσμούς μπορούν στη συνέχεια να δημιουργήσουν αυθόρμητα μέσω συμπύκνωσης με την ε-αμινομάδα ενός υδροξυλυσιλικού αμινοξέος του γειτονικού μορίου κολλαγόνου. Αργότερα, αυτοί οι δισθενείς αναγώγιμοι σταυροδεσμοί μπορεί να προσδεθούν με υδροξυλυσιλική αλδεΰδη σχηματίζοντας έτσι έναν τρισθενή σταυροδεσμό που μπορεί να ανιχνευθεί σε δυο μορφές, τον υδροξυλυσυλο-πυριδινολικό και τον λυσυλο-πυριδινολικό [41, 42]. Δηλαδή, οι ενεργές αλδεΰδες που παράγονται υφίστανται μια σειρά αντιδράσεων συμπύκνωσης για να δημιουργηθούν δις- (π.χ. DHLNL), τρι- (π.χ. Pyr) και τετρασθενείς σταυροδεσμοί που περιέχουν την παρατιθέμενη λυσίνη, υδροξυλυσίνη ή ιστιδίνη σε γειτονικά μόρια [39, 40]. Η συγκέντρωση των πυριδινολικών σταυροδεσμών είναι σχετικά χαμηλή, καθώς η διαδικασία σχηματισμού σταυροδεσμών μπορεί να σταματήσει κατά το στάδιο των δισθενών αναγώγιμων σταυροδεσμών. Καθώς το κολλαγόνο ωριμάζει, το περιεχόμενο των δισθενών [9]

24 Κεφάλαιο 1 Οστό: Ένας Συνδετικός Ιστός με Ιδιαίτερα Χαρακτηριστικά σταυροδεσμών DHLNL μειώνεται ενώ αυτό των Pyr αυξάνεται επειδή το πρώτο μετατρέπεται σε δεύτερο με τον καιρό [40]. Έχει βρεθεί ότι η αναλογία δισθενείς/τρισθενείς σταυροδεσμοί είναι 4/1 στους νέους οργανισμούς ενώ στους μεγαλύτερους οργανισμούς μειώνεται στο 2/1 [42]. Η μείωση αυτή του λόγου των σταυροδεσμών μπορεί να οδηγήσει σε μείωση της δύναμης και της σταθερότητας του οστού [43]. Γενικότερα, οι διαμοριακοί σταυροδεσμοί προσδίδουν στα ινίδια ποικίλες μηχανικές ιδιότητες όπως αντοχή σε εφελκυσμό και ιξωδοελαστικότητα [44] προσδίδοντας στο οστό επαρκή ικανότητα παραμόρφωσης, παραλαβής φορτίων και σκληρότητας [45-49]. Το μοτίβο των σταυροδεσμών καθορίζεται και επηρεάζεται από πολλούς παράγοντες όπως είναι η υδροξυλίωση της λυσίνης [50] και η ασβεστοποίηση [51] Μη-κολλαγονούχες πρωτεΐνες Άλλα οργανικά συστατικά του οστού είναι μικρές πρωτεογλυκάνες, οστεονεκτίνη, φωσφοπρωτεΐνες και θρομβοσπονδίνη (Πίνακας 1). Η οστεονεκτίνη ή αλλιώς SPARC (Secreted Protein, Acidic and Rich in Cystein) είναι το αφθονότερο μη-κολλαγονούχο συστατικό του οστού. Μπορεί να συμμετέχει στη διαδικασία ασβεστοποίησης καθώς προσδένει το ασβέστιο. Πιθανόν, να έχει κι άλλες λειτουργίες δεδομένου ότι εκφράζεται ευρέως σε ανθρώπινους εμβρυικούς ιστούς. Η οστεοκαλσίνη περιέχει τρία τροποποιημένα κατάλοιπα γ-καρβοξυγλουταμινικού οξέος (Gla), τα οποία προσδίδουν στην πρωτεΐνη τις συνδετικές ιδιότητες του ασβεστίου κι έτσι φαίνεται να ρυθμίζει την ανάπτυξη των κρυστάλλων του υδροξυαπατίτη. Στην κατηγορία των φωσφοπρωτεϊνών ανήκουν η οστεοποντίνη και η σιαλοπρωτεΐνη, που είναι πολύ όξινες φωσφοριλυωμένες πρωτεΐνες. Τέλος, μια άλλη πρωτεΐνη είναι η θρομβοσπονδίνη, η οποία μπορεί να προσδένει την οστεονεκτίνη και το ασβέστιο [28]. [10]

25 Κεφάλαιο 1 Οστό: Ένας Συνδετικός Ιστός με Ιδιαίτερα Χαρακτηριστικά Πίνακας 1: Τα κύρια οργανικά συστατικά του οστού [28]. Πρωτεΐνες στο οστό Κολλαγόνο τύπου Ι Κολλαγόνο τύπου V Κολλαγόνο τύπου VI Κολλαγόνο τύπου VIII Κολλαγόνο τύπου ΧΙΙ Οστεοκαλσίνη Οστεονεκτίνη (SPARC) Φωσφοπρωτεΐνες [οστεοποντίνη, σιαλοπρωτεΐνη] Θρομβοσπονδίνη PG-S1, διγλυκάνη PG-S2, δεκορίνη Ινωδομοντουλίνη Κύτταρα του Οστού Λειτουργία Κύρια δομική πρωτεΐνη, προσδίδει αντοχή σε εφελκυσμό Μικρό συστατικό των ινιδίων τύπου Ι, ελέγχει την τελική διάμετρο των ινών και τη δημιουργία ινιδίων Μεσολαβεί στο δέσιμο των κυττάρων και των ινιδίων τύπου I/V Άγνωστη Σχετίζεται με τα ινίδια τύπου Ι, ενώνοντάς τα μεταξύ τους και με άλλα συστατικά της ύλης, ελέγχει την τελική διάμετρο των ινιδίων Προσδένει τον υδροξυαπατίτη Προσδένει το ασβέστιο Προσδένουν τον υδροξυαπατίτη και τα κύτταρα Προσδένει το ασβέστιο, την οστεονεκτίνη και τα κύτταρα Άγνωστη, ομόλογη με τη PG-S2 και την ινωδομοντουλίνη Ρυθμίζει το σχηματισμό ινών κολλαγόνου, προσδένει τον TGF-β και ρυθμίζει τη δράση του Ρυθμίζει το σχηματισμό ινών κολλαγόνου Στο οστό, όπως και σε όλους τους συνδετικούς ιστούς, βασικά συστατικά του είναι τα κύτταρα και η εξωκυττάρια ύλη (οστεοειδές), το οποίο συνίσταται από τις ίνες κολλαγόνου και από τις μη-κολλαγονούχες πρωτεΐνες [5]. [11]

26 Κεφάλαιο 1 Οστό: Ένας Συνδετικός Ιστός με Ιδιαίτερα Χαρακτηριστικά Τα κύρια κύτταρα που σχετίζονται με τις διαδικασίες κατασκευής των οστών του σκελετού των θηλαστικών είναι οι οστεοβλάστες, οι οποίοι συνθέτουν τη μήτρα του οστού στις επιφάνειές τους, τα οστεοκύτταρα που είναι οργανωμένα μέσα στν μήτρα και τα προστατευτικά γραμμικά κύτταρα της επιφάνειας του οστού. Τα κύρια κύτταρα που μεσολαβούν στη διαδικασία απορρόφησης του οστού είναι τα πολυπυρηνικά γιγαντιαία κύτταρα, γνωστά ως οστεοκλάστες. Είναι αποδεχτό ότι τα κύτταρα που σχετίζονται με τα οστά, κυρίως οι οστεοβλάστες και οι οστεοκλάστες, κατέχουν πολύ σημαντικό ρόλο στη φυσιολογική κατασκευή ασβεστοποιημένων ιστών. Τα κύτταρα αυτά πιθανολογείται ότι συμμετέχουν στο σχηματισμό βιοανόργανων (biominerals) και νανοδομών των οστών και ότι ρυθμίζουν συνεχώς την πυκνότητα, την αναδημιουργία και την αποικοδόμηση των οστών [2]. Οστεοβλάστες Οι οστεοβλάστες είναι τα κύτταρα που είναι υπεύθυνα για τη σύνθεση και την ασβεστοποίηση του κολλαγόνου τύπου Ι. Προέρχονται από βλαστικά κύτταρα, τα οποία καθώς αναπτύσσονται διαχωρίζονται σε προ-οστεοβλάστες και ύστερα σε ώριμους οστεοβλάστες. Ένας ώριμος οστεοβλάστης που συνθέτει ενεργά τη μήτρα του οστού έχει πολλά διακριτά δομικά χαρακτηριστικά, όπως είναι ένας μεγάλος πυρήνας, ένα διευρυμένο σύστημα Golgi και εκτενές ενδοπλασματικό δίκτυο. Επίσης, έχει μοναδικά βιοχημικά χαρακτηριστικά, όπως είναι τα υψηλά επίπεδα κολλαγόνου τύπου Ι, αλκαλική φωσφατάση και οστεοκλασίνη. Οι οστεοβλάστες φτιάχνουν μια δομή στην επιφάνεια του οστού, όπως την επιθηλιακή, όπου μονοκατευθυνόμενα εκκρίνουν το οστεοειδές. Στο επόμενο βήμα, αυτή η μήτρα ασβεστοποιείται εξωκυττάρια, μια διαδικασία όπου ο ρόλος των οστεοβλαστών δεν είναι ακόμα ξεκάθαρος [1]. Οστεοκύτταρα Τα οστεοκύτταρα είναι τα αφθονότερα κύτταρα της ύλης του οστού (περίπου κύτταρα ανά mm 3 οστού). Ανεξάρτητα όμως από την αφθονία τους δεν είναι πλήρως κατανοητή η λειτουργία τους. Προέρχονται από ώριμους οστεοβλάστες που έχουν αφομοιωθεί στη μήτρα του οστού και που μετά ασβεστοποιούνται. Τα οστεοκύτταρα είναι διαφορετικά από τους οστεοβλάστες και έχουν μακριές πρωτοπλασματικές [12]

27 Κεφάλαιο 1 Οστό: Ένας Συνδετικός Ιστός με Ιδιαίτερα Χαρακτηριστικά εκτάσεις που διαπερνούν τη μήτρα του οστού και τους επιτρέπεται να διασυνδέονται και να επικοινωνούν με άλλα οστεοκύτταρα και οστεοβλάστες. Πρόσφατη έρευνα έδειξε ότι τα οστεοκύτταρα μπορεί να δρουν σαν αισθητήρες του στρες εντός της μήτρας του οστού και έτσι μπορεί να είναι σημαντικοί στην ανάπτυξη του οστού κατά την άσκηση με βάρη [1]. Εικόνα 7: Οστεοβλάστης συνδέεται με οστεοκύτταρο (Μικροσκοπία Ηλεκτρονίων Μετάδοσης, ΤΕΜ [52]) Συνδετικά κύτταρα του οστού Τα κύτταρα αυτά είναι οστεοβλάστες που δεν συνθέτουν ενεργά το οστό κι έτσι είναι γνωστά ως επιφανειακά οστεοκύτταρα. Καλύπτουν περίπου το 80% της επιφάνειας του σκελετού, όπου δρουν σαν ένα είδος φράγματος μεταξύ αίματος και οστού. Θεωρείται ότι είναι αναγκαία για τη συντήρηση των επιπέδων ασβεστίου στο αίμα, πιθανώς με την ενεργή άντληση ιόντων ασβεστίου από το ρευστό διαμέρισμα οστού στο εξωκυττάριο ρευστό διαμέρισμα. Οστεοκλάστες Οι οστεοκλάστες προέρχονται από το αιμοποιητικό σύστημα και ειδικότερα από το κοκκιοκυτταρικό μακροφάγο που σχηματίζει αποικιακές μονάδες για τα κοκκιοκύτταρα και τα μακροφάγα (CFU-GM). Πριν αναπτυχθούν σε ώριμα απορροφούμενα οστεοκύτταρα τα CFU-GM κύτταρα υποβάλλονται σε πολλαπλασιασμό και περαιτέρω διαφοροποίηση μετά από την οποία μεταβαίνουν στην επιφάνεια του οστού όπου συγχωνεύονται ώστε να γίνουν μεγάλα πολυπύρηνα κύτταρα. Αυτοί οι μεγάλοι, κινητήριοι, πολυπυρηνικοί οστεοκλάστες είναι τοποθετημένοι είτε στην επιφάνεια του συμπαγούς ή του σπογγώδους οστού, ή μέσα [13]

28 Κεφάλαιο 1 Οστό: Ένας Συνδετικός Ιστός με Ιδιαίτερα Χαρακτηριστικά στο συμπαγές οστό και είναι υπεύθυνοι για την απορρόφηση του οστού σε αυτές τις περιοχές. Η διαφοροποίηση και η δράση των οστεοκλαστών φαίνεται να σχετίζεται με εκείνη των οστεοβλαστών και των πρόδρομων ουσιών του. Οι ενεργοποιημένοι οστεοκλάστες απορροφούν το οστό σε ένα περίκλειστο μικροπεριβάλλον. Αυτό φτιάχνεται από τη σύνδεση των οστεοκλαστών με την ασβεστοποιημένη επιφάνεια από ένα οριακό χείλος συσταλμένων πρωτεϊνών, που καλείται καθαρή ζώνη ή περίκλειστη ζώνη. Η σύνδεση αυτή περιέχει υποδοχείς της κυτταρικής μεμβράνης, γνωστές ως ιντεγκρίνες, που αναγνωρίζουν συγκεκριμένες πεπτιδικές ακολουθίες της μήτρας. Ο οστεοκλάστης περιβάλλει έναν επενδυμένο θάλαμο με πτυχωτές μεμβράνες και εκκρίνει αυτοπαραγόμενα πρωτόνια τα οποία μετά διαλύουν το ανόργανο υλικό του οστού. Τα πρωτεολυτικά ένζυμα, ειδικά οι καθεψίνες και οι κολλαγονάσες, συντίθενται από τους οστεοκλάστες και εκκρίνονται μέσω των πτυχωτών συνόρων στο εξωκυττάριο οστικό απορροφούμενο διαμέρισμα όπου αφομοιώνεται το κολλαγόνο [5] Οστική Δημιουργία και Οστική Ανακατασκευή Το οστό είναι ένας δυναμικός συνδετικός ιστός που περιλαμβάνει μια εξαίσια συναρμολόγηση λειτουργικά διακριτών κυτταρικών πληθυσμών που απαιτούνται για να υποστηρίξουν τη δομική, βιοχημική και μηχανική ακεραιότητα και τον κεντρικό του ρόλο στην ανόργανη ομοιόσταση. Ο οστίτης ιστός συνεχώς μετατρέπεται μέσα από δυο κυτταρικές διαδικασίες, την οστική δημιουργία (bone modeling) και την οστική ανακατασκευή (bone remodeling). [14]

29 Κεφάλαιο 1 Οστό: Ένας Συνδετικός Ιστός με Ιδιαίτερα Χαρακτηριστικά Εικόνα 8: Κύκλος ανακατασκευής ενός σπογγώδους οστού [52]. Ο σκοπός της οστικής κατασκευής και ανακατασκευής κατά την ανάπτυξη είναι η συνεχής ενδυνάμωση του σκελετού. Όταν εμφανίζεται στο οστό κάποιο κάταγμα τότε μόνο αυτό είναι σε θέση να αναγνωρίζει την ακριβή του θέση και το μηχανισμό για την επούλωσή του, την αντικατάστασή του με καινούργιο οστό κι έπειτα την ανακατασκευή του υλικού, την μικρο- και μακροαρχιτεκτονική του. Η διαδικασία αυτή ρυθμίζεται από τους οστεοκλάστες, οστεοβλάστες και τα οστεοκύτταρα [52]. Η αποκατάσταση της δομής απαιτεί ισορροπημένη ανακατασκευή, καθώς ο όγκος του κατεστραμμένου οστού που απομακρύνεται πρέπει να αντικατασταθεί από τον ίδιο όγκο φυσιολογικού οστού. Μια μικρορωγμή προκαλεί κυτταρική απόπτωση. Τα συνδετικά κύτταρα και τα οστεοκύτταρα απελευθερώνουν τοπικούς παράγοντες που έλκουν κύτταρα από το αίμα και το μυελό, προκαλώντας έτσι οστεοκλαστογέννεση. Οι οστεοκλάστες εναποτίθενται στη μικρορωγμή ενώ ομάδες οστεοβλαστών συνθέτουν νέο πεταλλωτό οστό. Οι οστεοβλάστες που παγιδεύονται στη μήτρα είτε μετατρέπονται σε οστεοκύτταρα ή σε συνδετικά κύτταρα ή οδηγούνται σε κυτταρικό θάνατο [52]. Κατά την οστική κατασκευή το νέο οστό δημιουργείται σε μια περιοχή διαφορετική από εκείνη που είχε καταστραφεί. Αυτό επιτρέπει στο οστό να επιμηκύνεται και να διευρύνεται μεταβάλλοντας το σχήμα του σκελετού. Αυτή η αλλαγή συμβαίνει κυρίως στα παιδιά και στους εφήβους επιτρέποντας έτσι τη φυσιολογική ανάπτυξη [15]

30 Κεφάλαιο 1 Οστό: Ένας Συνδετικός Ιστός με Ιδιαίτερα Χαρακτηριστικά του σκελετού. Κατά την ενηλικίωση όμως, η οστική ανακατασκευή είναι η κύρια διαδικασία μετατροπής του οστού. Αν και η δημιουργία των οστών εξακολουθεί να πραγματοποιείται σε μερικές περιοχές του οστού όπως είναι το περιόστεο, η οστική ανακατασκευή αποτελεί τη διαδικασία κατά την οποία μεγαλώνουν οι σπόνδυλοι. Επιπλέον, η ανακατασκευή των οστών έχει σημαντικό ρόλο στη συντήρηση της ασβεστιτικής ομοιόστασης και είναι μια διαδικασία που αντικαθιστά το 2-10% του σκελετού ενός ενήλικα κατά έτος. Η οστική ανακατασκευή περιλαμβάνει την απορρόφηση και κατασκευή του οστού και πραγματοποιείται στο ίδιο μέρος χωρίς να προκαλεί αλλαγή στο σχήμα του οστού αλλά επιτρέποντας την αναζωογόνησή του, την αντοχή του στο στρες, την αποκατάσταση μικροκαταγμάτων και ως εκ τούτου τη διατήρηση της μηχανικής ακεραιότητας [1]. Κατά την οστική ανακατασκευή, η απορρόφηση από τους οστεοκλάστες προηγείται από τη δημιουργία του οστού από τους οστεοβλάστες. Οι οστεοβλάστες και οι οστεοκλάστες φτιάχνουν την πολυκυττάρια μονάδα που ανακατασκευάζει το οστό σε συγκεκριμένες θέσεις τριών συστατικών (ενδοσυμπαγές, διασυμπαγές και δοκιδωτό) στην περιοχή του ενδόστεου και σε μικρότερο ποσοστό στην περιοχή του περιόστεου [53]. Αυτές οι δυο διαδικασίες καθορίζουν το εξωτερικό μέγεθος και το περίγραμμα του οστού καθώς και την εξωτερική του αρχιτεκτονική, προκαλώντας την πύκνωση του συμπαγούς και του δοκιδωτού οστού κατά την ανάπτυξη και τη λέπτυνση κατά τη γήρανση [52] Μυελός Ο μυελός των οστών αποτελεί τον εύκαμπτο ιστό που βρίσκεται στο εσωτερικό των οστών. Υπάρχουν δυο τύποι μυελού, ο μυελός οστού rubra (κόκκινος μυελός), ο οποίος αποτελείται κυρίως από αιμοποιητικούς ιστούς και ο μυελός flava ossium (κίτρινος μυελός), ο οποίος αποτελείται κυρίως από λιπώδη κύτταρα. Τα ερυθρά αιμοσφαίρια, τα αιμοπετάλια και τα περισσότερα λευκά αιμοσφαίρια βρίσκονται στον κόκκινο μυελό, ενώ και οι δυο τύποι περιέχουν πολλά αιμοφόρα αγγεία και τριχοειδή. Κατά τη γέννηση, επικρατεί ο κόκκινος μυελός του οστού ο οποίος μετατρέπεται σε κίτρινο μυελό με το πέρας των χρόνων, κι έτσι ένας ενήλικας φτάνει να έχει κόκκινο μυελό του οστού κατά το ήμισυ. Κόκκινος μυελός των οστών βρίσκεται κυρίως στα επίπεδα οστά όπως είναι η λεκάνη, το κρανίο, οι σπόνδυλοι, η ωμοπλάτη και στο σπογγώδες οστό των μακρών οστών, όπως το βραχίονα και το μηριαίο οστό. Ο [16]

31 Κεφάλαιο 1 Οστό: Ένας Συνδετικός Ιστός με Ιδιαίτερα Χαρακτηριστικά κίτρινος μυελός βρίσκεται στη μυελική κοιλότητα, το κοίλο εσωτερικό του μεσαίου τμήματος των μακρών οστών [54] Νερό Ένα από τα πιο σημαντικά φαινόμενα της ζωής είναι η σχέση μεταξύ νερού και βιολογικών μακρομορίων. Οι συνδετικοί ιστοί για παράδειγμα, εξαρτώνται από την ένωσή τους με το νερό για να έχουν τις μοναδικές μηχανικές ιδιότητες. Το νερό που σχετίζεται με τις πρωτεΐνες κατηγοριοποιείται σε τρεις τύπους: το δομικό, το δεσμευμένο και το ελεύθερο νερό. Το δομικό νερό σχετίζεται με τον κρύσταλλο και περιγράφεται από συγκεκριμένη στοιχειομετρία όπως τις ένυδρες μορφές ανόργανων αλάτων. Ο όρος του δεσμευμένου νερού συχνά χρησιμοποιείται για να περιγράψει τις αλληλεπιδράσεις της πρωτεΐνης με το νερό τόσο σε υδατικό διάλυμα όσο και στην ένυδρη μορφή. Η υδατική φάση στο οστό καταλαμβάνει περίπου το 35% της μάζας του. Απαντάται τόσο στην επιφάνεια των κρυσταλλιτών του βιοαπατίτη όσο και στα μόρια του κολλαγόνου. Στο κολλαγόνο, το ποσοστό του δεσμευμένου νερού είναι περίπου της τάξεως 0.35 g/g, ενώ, οι περισσότεροι κολλαγονούχοι ιστοί περιέχουν επιπλέον νερό σε διάφορες ποσότητες που έχει τις ιδιότητες του ελεύθερου νερού [55]. Μελέτες προτείνουν δυο μοντέλα ένωσης νερού και κολλαγόνου: μέσω των υδροφιλικών ομάδων του μορίου του κολλαγόνου (γλυκίνη, υδροξυλυσίνη, καρβοξύλια) αλλά και μέσω δεσμών υδρογόνου μεταξύ νερού και του υδροξυλίου της υδροξυπρολίνης [55, 56]. [17]

32 Κεφάλαιο 1 Οστό: Ένας Συνδετικός Ιστός με Ιδιαίτερα Χαρακτηριστικά 1.3 Ιεραρχική Δομή του Οστού Το οστό θεωρείται ένα συγκρότημα εφτά διακριτών επιπέδων ιεραρχικών δομικών μονάδων, από μακρο- σε μικρό- και νανο- βαθμίδα [57] (εικόνα 9). Εικόνα 9: Σχηματική αναπαράσταση της ιεραρχικής δομής ενός συμπαγούς οστού [2]. [18]

33 Κεφάλαιο 1 Οστό: Ένας Συνδετικός Ιστός με Ιδιαίτερα Χαρακτηριστικά Μακροσκοπικό επίπεδο Σε μακροσκοπικό επίπεδο, το οστό διακρίνεται σε συμπαγές και σε σπογγώδες οστό (Ενότητα 1.4.1). Έτσι, το οστό αποτελείται από ένα συμπαγές, πυκνό κέλυφος με δοκίδες στο εσωτερικό του. Μικροσκοπικό επίπεδο Σε μικροσκοπικό επίπεδο, το συμπαγές οστό είναι οργανωμένο σε δευτερεύοντες οστεόνες [58]. Οι ασβεστοποιημένες ίνες κολλαγόνου έχουν τη μορφή επίπεδων κατανομών που καλούνται πετάλια (3-7 μm πλάτος). Σε μερικές περιπτώσεις αυτά τα φύλλα ασβεστοποιημένων ινών κολλαγόνου τυλίγονται σε ομόκεντρα στρώματα (3-8 πετάλια) γύρω από ένα κεντρικό κανάλι σχηματίζοντας έναν οστεόνα ή ένα Χαβερσιανό σύστημα. Ο οστεόνας μοιάζει με έναν κύλινδρο ( μm διαμέτρου), που είναι σχεδόν παράλληλος με τον μακρύ άξονα του οστού. Συντίθενται από μεγάλα αγγειακά κανάλια (50-90 μm διαμέτρου) περιβαλλόμενα από περιφερειακά πεταλοειδή δαχτυλίδια (3-7 μm πάχος), που καλούνται επίσης cement lines [59, 60]. Αυτοί οι δευτερεύοντες οστεόνες είναι το τελικό αποτέλεσμα της διαδικασίας της ανακατασκευής του οστού που επιδιορθώνει κάποια βλάβη in vivo και θεωρείται ότι σχετίζεται με τη σκληρότητα του οστού [61]. Το σπογγώδες οστό είναι φτιαγμένο από ένα διασυνδεμένο πλαίσιο δοκίδων σε πολλούς συνδυασμούς, ακολουθώντας τις κυτταρικές δομές: ράβδος-ράβδος, ράβδοςπλάκα ή πλάκα-πλάκα. Η δοκιδωτή ράβδος έχει διάμετρο περίπου μm [62]. Εικόνα 10: Οστεόνες που περικλείονται από ενδιάμεσο οστό και πολλά χαβερσιανά κανάλια (αριστερά), Χαβερσιανό σύστημα ενός συμπαγούς οστού (Μικροτομογραφία, micro-ct) (δεξιά) [52]. [19]

34 Κεφάλαιο 1 Οστό: Ένας Συνδετικός Ιστός με Ιδιαίτερα Χαρακτηριστικά Νανοδομικό επίπεδο Τέλος, σε νανοδομικό επίπεδο, τα πετάλια αποτελούνται από ασβεστοποιημένες ίνες κολλαγόνου τύπου Ι (πάνω από 15 μm μήκος, nm διάμετρος) δεσμευμένα και εμποτισμένα με ανόργανους νανοκρυστάλλους απατίτη (δέκατα του νανόμετρου σε μήκος και πλάτος, 2-3 nm πάχος) και από μη-κολλαγονούχες οργανικές πρωτεΐνες [57, 62]. Οι πλατοειδείς (plate-like) κρύσταλλοι απατίτη εμφανίζονται μέσα στους ευδιάκριτους χώρους στις ίνες κολλαγόνου, περιορίζοντας έτσι την πιθανή πρόωρη ανάπτυξη των ασβεστοποιημένων κρυστάλλων και αναγκάζοντας τους κρυστάλλους να είναι διακριτοί και ασυνεχείς. Όλοι οι κρύσταλλοι του οστού βρίσκονται μέσα στις ίνες του κολλαγόνου, σε συγκεκριμένες επαναλαμβανόμενες θέσεις, με αποτέλεσμα το σχηματισμό ενδομοριακών κρυστάλλων, που είναι πολύ μικροί (μόλις μερικές στοιχειώδεις κυψελίδες σε πάχος), και που φυσιολογικά δεν θα ήταν θερμοδυναμικά σταθεροί εάν δεν ήταν εγκιβωτισμένοι στην οργανική φάση. Κρύσταλλοι μπορούν επίσης να σχηματιστούν στην επιφάνεια και μεταξύ των ινών κολλαγόνου, που αναφέρονται ως διαμοριακοί κρύσταλλοι. Οι κρύσταλλοι που είναι τοποθετημένοι μέσα στις ίνες του κολλαγόνου δεν διαφέρουν πολύ στο μέγεθος από αυτούς που είναι δίπλα στις ίνες, ανεξαρτήτως του περιβάλλοντος ανάπτυξής τους [38]. Η συνεχής δημιουργία νέων κρυστάλλων και η ανάπτυξη κρυστάλλων που έχουν ήδη εναποτεθεί, καταλήγει στην κατάληψη όλου του ελεύθερου χώρου ανάμεσα στις ίνες του κολλαγόνου [11, 63-65]. Έχει βρεθεί [66] ότι το 58% της ανόργανης φάσης είναι κατανεμημένο στο οστό μέσα στις ίνες, 14% δια μέσου των ινών και 28% στα κενά μεταξύ των ακρών των ινιδίων του κολλαγόνου [17]. Επίσης, οι ασβεστοποιημένοι κρύσταλλοι αναπτύσσονται με συγκεκριμένο κρυσταλλικό προσανατολισμό, καθώς, οι c-άξονες των κρυστάλλων είναι σχεδόν παράλληλοι με τις ίνες του κολλαγόνου [65]. Τα μόρια του κολλαγόνου που εκκρίνονται από τους οστεοβλάστες αυτόσυναρμολογούνται σε ίνες με συγκεκριμένη τριτοταγή δομή έχοντας περιοδικότητα 67 nm και κενά ή τρύπες 40 nm μεταξύ των μορίων [17, 57]. Έτσι εξηγείται γιατί το οστό αναφέρεται συνήθως σαν ένα ινώδες συνθετικό υλικό βιολογικής προέλευσης, όπου σκληροί νανομετρικοί κρύσταλλοι είναι εγκιβωτισμένοι σε μαλακή πρωτεΐνη [2, 67]. Οι μη-κολλαγονούχες πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένου τις φωσφοπρωτεΐνες [20]

35 Κεφάλαιο 1 Οστό: Ένας Συνδετικός Ιστός με Ιδιαίτερα Χαρακτηριστικά όπως είναι η οστεοποντίνη, η σιαλοπρωτεΐνη, η οστεονεκτίνη και η οστεοκλασίνη, μπορεί να λειτουργούν ρυθμίζοντας το μέγεθος και τον προσανατολισμό των ανόργανων συστατικών και την αποθήκευση ιόντων ασβεστίου και φωσφόρου [64]. Εικόνα 11: Θέση κρυστάλλων βιοαπατίτη στο κολλαγόνο του οστού Ασβεστοποίηση Η φύση της ανόργανης και της οργανικής φάσης, αλλά και η μεταξύ τους σχέση, είναι κρίσιμα για την αντοχή ενός ασβεστοποιημένου ιστού, όπως το οστό. Για έναν ασβεστοποιημένο ιστό, η ελαστικότητα σχετίζεται με την ανόργανη φάση του ιστού και η πλαστικότητά του από την οργανική [63]. Η διαδικασία της ασβεστοποίησης στα σπονδυλωτά περιλαμβάνει μια σειρά γεγονότων που καταλήγουν στην εναπόθεση άλατος φωσφορικού ασβεστίου, υδροξυαπατίτη, στην οργανική ύλη, που συντίθεται κυρίως από κολλαγόνο σε όλους τους ιστούς, εκτός από το σμάλτο και τους ωτόλιθους. Προτείνονται δυο τρόποι πραγματοποίησης της ασβεστοποίησης. Στην πρώτη περίπτωση, οι κρύσταλλοι του απατίτη είναι ενσωματωμένοι μέσα στις ίνες του κολλαγόνου (intrafibrillar ασβεστοποίηση), ενώ στην άλλη, οι στιβάδες του απατίτη βρίσκονται σε παράλληλες συστοιχίες. Αν και το μοντέλο αυτό είναι γενικά αποδεκτό κυρίως από ερευνητές της βιοϊατρικής κοινότητας, δεν αποτελεί μια ακριβή αναπαράσταση της νανο-δοδημένης αρχιτεκτονικής του οστού, επειδή οι κρύσταλλοι δεν είναι διαξονικοί [17]. Καθώς το οστό αναπτύσσεται, από τα πρώτα στάδια μέχρι την ωρίμανση, ο βαθμός υποκατάστασης του πλέγματος απατίτη και ο βαθμός της ασβεστοποίησης ποικίλλει. [21]

36 Κεφάλαιο 1 Οστό: Ένας Συνδετικός Ιστός με Ιδιαίτερα Χαρακτηριστικά Μεταξύ των παραγόντων που επηρεάζουν τη διαδικασία της ασβεστοποίησης σημαντικό ρόλο έχει το μέγεθος του κρυστάλλου γιατί καθορίζει την επιφάνεια και συνεπώς επηρεάζει τη στοιχειομετρία και τη διαλυτότητα των βιολογικών απατιτών. Παράλληλα, σε οστά και φυσιολογικούς ασβεστοποιημένους τένοντες, η ποσότητα του μαγνησίου και των φωσφορικών ιόντων μειώνεται, ενώ τα ανθρακικά, ο λόγος Ca/P, το μέγεθος των κρυσταλλιτών και η σταθερότητα του υδροξυαπατίτη αυξάνονται καθώς αυξάνεται η ασβεστοποίηση. Άρα, σε λιγότερο ασβεστοποιημένο οστό υπάρχει μεγαλύτερο σχετικό ποσό φωσφορικών και μικρότερο ποσό ανθρακικών [23, 68, 69]. Επιπλέον, καθώς αυξάνεται η ηλικία του οστίτη ιστού αυξάνεται και ο βαθμός ασβεστοποίησης, που οδηγεί σε μείωση της ολκιμότητας και της αντοχής στην ευθραυστότητα του οστού. Συνεπώς, καθώς αυξάνεται η ηλικία αυξάνεται και η ευθραυστότητα των οστών [70]. Σε γενικές γραμμές, φαίνεται ότι ο βαθμός ασβεστοποίησης και ο βαθμός κρυσταλλικότητας επηρεάζουν τις μηχανικές ιδιότητες του οστού. 1.4 Ανατομικά Χαρακτηριστικά του Οστού Ανατομικά, διακρίνονται δυο τύποι οστού στο σκελετό: τα επίπεδα οστά (π.χ. τα οστά του κρανίου, ωμοπλάτη, γνάθος) και τα μακριά οστά (μηριαίο οστό, κνήμη, βραχίονας, κλπ). Εξετάζοντας το μακρύ οστό παρατηρούνται οι δυο ακρότητες (οι επιφύσεις), ένας περισσότερο ή λιγότερο κυλινδρικός σωλήνας στο μέσο (η διάφυση) και μια αναπτυσσόμενη ζώνη μεταξύ τους (η μετάφυση) (Εικόνα 12). Στο αναπτυσσόμενο οστό, η επίφυση και η μετάφυση, που προέρχονται από δυο διαφορετικά κέντρα οστεοποίησης, διαχωρίζονται από ένα στρώμα χόνδρου, τον επιφυσιακό χόνδρο, που έχει σημαντικό ρόλο στην διαμήκη ανάπτυξη των οστών. Το εξωτερικό μέρος των οστών είναι κατασκευασμένο από ένα παχύ και πυκνό στρώμα ασβεστοποιημένου ιστού, το φλοιώδες ή συμπαγές οστό (cortical bone), το οποίο στη διάφυση περιλαμβάνει τη μυελώδη κοιλότητα όπου βρίσκεται ο αιματοποιητικός μυελός των οστών. Από τη μετάφυση προς την επίφυση, ο φλοιός γίνεται σταδιακά πιο λεπτός, και ο εσωτερικός χώρος πληρούται με ένα δίκτυο λεπτών, ασβεστοποιημένων δοκίδων, που καλείται σπογγώδες ή δοκιδωτό οστό (trabecullar bone). Οι χώροι που περικλείονται από αυτές τις λεπτές δοκίδες περιέχουν επίσης αιμοτοποιητικό μυελό των οστών και είναι σε συνέχεια με τη μυελώδη κοιλότητα της [22]

37 Κεφάλαιο 1 Οστό: Ένας Συνδετικός Ιστός με Ιδιαίτερα Χαρακτηριστικά διάφυσης. Οι επιφάνειες του οστού στις επιφύσεις των αρθρώσεων είναι καλυμμένες με ένα στρώμα αρθρικού χόνδρου που δεν σκληραίνει. Εικόνα 12: Μορφολογική απεικόνιση οστού. Υπάρχουν δυο επιφάνειες του οστού στις οποίες το οστό είναι σε επαφή με τους μαλακούς ιστούς: μια εξωτερική επιφάνεια (περιόστεα επιφάνεια) και μια εσωτερική επιφάνεια (ενδοστική επιφάνεια). Οι επιφάνειες είναι συνδεδεμένες με οστεογενετικά κύτταρα οργανωμένα σε στρώματα, το περιόστεο και το ενδόστεο. Ο επιφυσιακός χόνδρος λειτουργεί σαν το χώρο που κατασκευάζεται αρχικά το οστό και είναι ο συνδυασμός μιας θεμέλιας ουσίας και πολλών χαλαρών, μικρών δεσμίδων ινών κολλαγόνου [17]. [23]

38 Κεφάλαιο 1 Οστό: Ένας Συνδετικός Ιστός με Ιδιαίτερα Χαρακτηριστικά Εικόνα 13: Ανατομία οστού Συμπαγές και Σπογγώδες Οστό Ο σκελετός περιλαμβάνει δυο διαφορετικούς τύπους οστού, το συμπαγές οστό (cortical bone) και το σπογγώδες ή δοκιδωτό οστό (trabecullar bone). Το συμπαγές οστό είναι ένας σκληρός, πυκνός ιστός που βρίσκεται στο εξωτερικό των μακρών οστών και υπολογίζεται ότι αποτελεί περίπου το 80% της μάζας του οστού. Το συμπαγές οστό είναι σαν μια σήραγγα οστεοβλαστών με κωνική δομή η οποία γεμίζει με κυκλικά πετάλια, σχηματίζοντας οστεόνες. Παλαιότερες μελέτες έδειξαν ότι οι ιξωδοελαστικές ιδιότητες του συμπαγούς οστού σχετίζονται με την απόλυτη δύναμη και σκληρότητα του ιστού [71]. Το σπογγώδες οστό είναι λιγότερο πυκνό και βρίσκεται μέσα στους σπονδύλους και στις άκρες των μακρών οστών αποτελώντας περίπου το 20% του συνολικού σκελετού. Η δομή του μπορεί να χαρακτηριστεί ως σπογγώδης, που τα κενά της περιέχουν μυελό των οστών [12]. Οι σχετικές αναλογίες του συμπαγούς και του σπογγώδους οστού διαφέρουν ανά περιοχή του σκελετού (π.χ. το σπογγώδες οστό περιλαμβάνει >66% του συνολικού οστού στην οσφυική μοίρα της σπονδυλικής στήλης, αλλά μόλις το 25% του συνολικού οστού στον αυχένα του μηριαίου οστού). Αν και οι δυο τύποι οστού περιέχουν τα ίδια βασικά συστατικά, οι διαδικασίες με τις οποίες αναπτύσσονται αυτοί οι δυο τύποι οστού είναι λίγο διαφορετικές. Και οι δυο δημιουργούνται από τους οστεοβλάστες και απορροφούνται από τους οστεοκλάστες. Η ελεγχόμενη αλληλεπίδραση των δυο κυτταρικών τύπων [24]

39 Κεφάλαιο 1 Οστό: Ένας Συνδετικός Ιστός με Ιδιαίτερα Χαρακτηριστικά επιτρέπει την ανάπτυξη των οστών κατά την ανάπτυξη του οργανισμού και την αποκατάσταση καταγμάτων κατά την ωρίμανση για τη διατήρηση της μηχανικής αντοχής. Εικόνα 14: Αρχιτεκτονική δομή μηριαίου οστό. [Πηγή: American college of Rheumatology] Παρά το γεγονός ότι και το συμπαγές με το σπογγώδες οστό αποτελούνται από τα ίδια κύτταρα και τα ίδια ανόργανα στοιχεία, έχουν δομικές και λειτουργικές διαφορές. Η πρωταρχική δομική διαφορά είναι ποσοτική καθώς το 80-90% του όγκου του συμπαγούς οστού είναι ασβεστοποιημένο, ενώ μόνο το 15-25% του σπογγώδους οστού είναι ασβεστοποιημένο (το υπόλοιπο καταλαμβάνεται από μυελό των οστών, αιμοφόρα αγγεία και συνδετικό ιστό). Το αποτέλεσμα είναι ότι το 70-85% της επιφάνειας με μαλακούς ιστούς είναι στην ενδοστεϊκή επιφάνεια του οστού, που οδηγεί σε δομική διαφορά: το συμπαγές οστό έχει κυρίως μηχανική και προστατευτική λειτουργία, ενώ το σπογγώδες οστό μεταβολική. Έτσι, σε μακροσκοπικό επίπεδο, το οστό μπορεί να θεωρηθεί σαν ένα εξωτερικό συμπαγές περίβλημα και ένα εσωτερικό τρισδιάστατο δοκιδωτό δίκτυο, η συνεργασία των οποίων υποστηρίζει τη βέλτιστη μηχανική και βιοχημική λειτουργία [5]. Επίσης, σε μακροσκοπικό επίπεδο, οι δυο αυτοί τύποι οστού παρουσιάζουν διαφορές καθώς το συμπαγές οστό αποτελείται από κυλινδρικούς οστεόνες και το σπογγώδες αποτελείται από ένα πλέγμα πλακών και ράβδων. Και οι δυο τύποι έχουν ομοιότητες σε μοριακό επίπεδο καθώς συντίθενται από ασβεστοποιημένες ίνες κολλαγόνου, οι οποίες χαρακτηρίζονται από καθορισμένο προσανατολισμό πεταλίων. Το σπογγώδες [25]

40 Κεφάλαιο 1 Οστό: Ένας Συνδετικός Ιστός με Ιδιαίτερα Χαρακτηριστικά οστό λόγω της μεγάλης του επιφάνειας είναι περισσότερο ενεργά μεταβολικό από το συμπαγές οστό και φαίνεται να παρουσιάζει ταχύτερη απόκριση σε εξωτερικούς παράγοντες. Για παράδειγμα, μελέτες έχουν δείξει ότι σε τρωκτικά που αθλούνται και σε ανθρώπους [72], η ωοθηκεκτομή, η υπερέκφραση της καθεψίνης Κ και η έλλειψη ή η περίσσεια της παραθηροειδούς ορμόνης επηρεάζουν με πιο άμεσο τρόπο το σπογγώδες οστό. Στην οστεοπόρωση, την κυριότερη ασθένεια των οστών, τα κατάγματα παρουσιάζονται κυρίως στο ισχίο, τον καρπό και τη σπονδυλική στήλη, δηλαδή ανατομικές περιοχές με υψηλή περιεκτικότητα σε σπογγώδες οστό [73]. Ωστόσο, σε φάσεις ταχείας δημιουργίας οστού (κατά την εμβρυική ανάπτυξη και την αποκατάσταση καταγμάτων) οι ίνες του κολλαγόνου, δε βρίσκονται σε σφιχτή σύνδεση αλλά σε τυχαία προσανατολισμένες δέσμες, με αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός τύπου οστού που καλείται περιπλεγμένο οστό (woven bone). Αυτό το ανώριμο οστό συνήθως αντικαθίσταται από το πεταλοειδές οστό κι έτσι ουσιαστικά απουσιάζει από τον ενήλικο σκελετό, εκτός, από μερικές περιπτώσεις που μπορεί να εξακολουθεί να υφίσταται κοντά στους τένοντες και σε προσκολλημένους συνδέσμους [5]. Μερικοί ερευνητές [74-76] θεωρούν ότι το συμπαγές και το σπογγώδες οστό είναι ένα υλικό που μπορεί να χαρακτηριστεί από πορώδες εξαιρετικά μεταβλητών γεωμετρικών και φυσικών χαρακτηριστικών, ενώ άλλοι [77-79] θεωρούν ότι οι δυο αυτοί τύποι οστού αποτελούν δυο διαφορετικά υλικά. Γενικά όμως, επειδή, το σπογγώδες οστό είναι περισσότερο ενεργό μεταβολικά, διαμορφώνεται πιο συχνά από το συμπαγές οστό κι έτσι είναι «νεότερο» κατά μέσο όρο από το συμπαγές. Επομένως, ακόμα κι αν το σπογγώδες και το συμπαγές οστό θεωρηθούν ως υλικά παρεμφερούς μηχανικής συμπεριφοράς, η ωρίμανση του συμπαγούς οστού μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα μεταβολή των μηχανικών ιδιοτήτων σε μικροσκοπικό επίπεδο [62]. [26]

41 Κεφάλαιο 2 ο Εκτίμηση της Ποιότητας των Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές Φασματοσκοπία Raman 2.1 Ποιότητα Οστού Η ισορροπία ανάμεσα στη δυσκαμψία και την ευκαμψία του σοτού είναι αποτέλεσμα της διαφοροποίησης του ανόργανου συστατικού του [52]. Μεγαλύτερη περιεκτικότητα σε ανόργανο συστατικό οδηγεί σε λιγότερο ελαστικό οστό [80]. Ο όρος «ποιότητα οστού» αναφέρεται στη σύνθεση και στις αρχιτεκτονικές ιδιότητες του οστίτη οστού, ο συνδυασμός των οποίων καθορίζει τις ιδιότητες και την ικανότητά του να παραλαμβάνει μηχανικά φορτία. Στις γεωμετρικές ιδιότητες συμπεριλαμβάνονται η μακροσκοπική γεωμετρία ολόκληρου του οστού και η μικροσκοπική αρχιτεκτονική του συμπαγούς οστού. Στις ιδιότητες του υλικού θεωρούνται οι ιδιότητες του συστατικού του ιστού, όπως η σύνθεση και η οργάνωση των αρχικών μικροδομικών συστατικών, του κολλαγόνου και του ανόργανου, όπως επίσης και των μικροδομικών ασυνεχειών [81]. Εικόνα 15: Μικρορωγμή στο διάμεσο οστό που περιβάλλει τους οστεόνες του συμπαγούς οστού [52]. Το οστό πρέπει να είναι δύσκαμπτο και να μην παραμορφώνεται, ταυτόχρονα όμως, πρέπει να είναι εύκαμπτο, να απορροφά την ενέργεια παραμόρφωσης, και να είναι [27]

42 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman ικανό να παραλαμβάνει φορτία χωρίς να σπάει. Εάν το οστό παρουσιάζει ψαθυρή συμπεριφορά (δηλαδή πολύ σκληρό και ανίκανο να παραμορφωθεί λίγο) η ενέργεια που παραλαμβάνει από εξωτερικά φορτία απελευθερώνεται ως δομική θραύση, αρχικά, με τη δημιουργία μικρορωγμών (Εικόνα 15), και στη συνέχεια με ολοκληρωμένο κάταγμα. Εάν το οστό χαρακτηρίζεται από μεγαλύτερη ευκαμψία και μπορεί να παραμορφωθεί περισσότερο, τότε θα σπάσει και πάλι με διαφορετική διαδικασία [80]. Δηλαδή, έλλειψη των ανόργανων συστατικών προκαλεί στο οστό ευκαμψία, ενώ, έλλειψη του κολλαγόνου του προκαλεί ευθραυστότητα. Το οστό πρέπει επίσης να είναι ελαφρύ για την αποφυγή πρόσθετων φορτίων και διευκόλυνση της κίνησης. Ένα μοναδικό χαρακτηριστικό του είναι ότι μπορεί να συνδυάσει αυτές τις αντιφατικές ανάγκες, τη σκληρότητα με την ευκαμψία και την ελαφρότητα με τη δύναμη [52]. Εικόνα 16: Συνέπειες στη διαφοροποίηση της σύστασης του οστού [82]. Μέχρι σήμερα δεν είναι ακόμα ξεκάθαρο πως οι διαφορές στη σύσταση του υλικού (ανόργανο συστατικό, κολλαγόνο), στη δομή (μέγεθος οστού, πάχος και πορώδες του συμπαγούς οστού, συνδεσιμότητα και πάχος δοκιδωτού οστού) και σε άλλους παράγοντες, όπως είναι η πυκνότητα οστεοκυττάρων, ή ακόμα και διαφορές μεταξύ [28]

43 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman των δυο φύλων και των φυλών, επηρεάζουν την ευθραυστότητα του οστού [80]. Η ευθραυστότητα των οστών είναι πιο κοινό γνώρισμα των γυναικών, επειδή, εν μέρει η παραγωγή φυλετικών ορμονών στα αρσενικά μειώνεται με πιο αργό ρυθμό και δεν αυξάνεται η οστική ανακατασκευή κατά τη μέση ηλικία [52]. Επιπλέον, η ευθραυστότητα των οστών δεν οφείλεται στην ίδια παθογένεια ή στις ίδιες δομικές ανωμαλίες. Για παράδειγμα, μερικά κατάγματα σχετίζονται με χαμηλή οστική πυκνότητα και άλλα με μειωμένη πυκνότητα οστεοκυττάρων [83, 84]. Αύξηση της πυκνότητας του οστού αυξάνει τη σκληρότητά του αλλά μειώνει την ευκαμψία του. Η τριπλή έλικα του κολλαγόνου τύπου Ι προσδίδει στο οστό μηχανική αντοχή. Η σύνθεση και ο βαθμός των σταυροδεσμών του κολλαγόνου επηρεάζουν επίσης τη λειτουργία του οστού [85, 86] καθώς διατηρούν τις έλικες ενωμένες. Εάν υπάρχουν λίγοι σταυροδεσμοί οι έλικες μπορούν να χωριστούν και αν υπάρχουν πολλοί, μειώνεται η ικανότητα να απορροφούν ενέργεια, να αντέχουν δηλαδή στην παραλαβή γενικής μορφής φορτίων [52]. Ο παράγοντας που χρησιμοποιείται για την κλινική διάγνωση της οστεοπόρωσης και την εκτίμηση ενός κατάγματος, είναι η μάζα του οστού, που χαρακτηρίζεται από την οστική πυκνότητα (Bone Mineral Density, BMD) [87]. Ως οστική πυκνότητα θα έπρεπε να ορίζεται η μάζα του οστού προς τον όγκο του, ο οποίος όμως να περιλαμβάνει μόνο τα τμήματα του οστού, χωρίς να λαμβάνεται υπόψη ο όγκος του μυελού των οστών. Επειδή αυτό όμως δεν είναι εφικτό, όλες οι τεχνικές διάγνωσης θεωρούν ως όγκο του οστού το συνολικό όγκο του οστού και του μυελού. Κάποιες τεχνικές μετρούν τη φαινόμενη οστική πυκνότητα, η οποία ορίζεται ως η οστική μάζα του οστού (Bone Mineral Content, BMC) προς το εμβαδόν της προβολής της επιφάνειας που σαρώθηκε [88]. Επειδή όμως ο BMD είναι ένας περιορισμένος προγνωστικός δείκτης μιας θραύσης [89], το κλινικό και επιστημονικό ενδιαφέρον κινείται σε επιπλέον μετρήσεις της ποιότητας του οστού που θα μπορούν να βελτιώσουν την πρόβλεψη του κινδύνου ενός κατάγματος [90]. Μια σχετικά πρόσφατη μελέτη [91] έδειξε ότι η ωρίμανση του κολλαγόνου του συμπαγούς και του σπογγώδους οστού σχετίζεται άμεσα με τη συχνότητα εμφάνισης κατάγματος, τονίζοντας έτσι τη συμβολή της ποιότητας του κολλαγόνου στη μελέτη της αντοχής του οστού. Έτσι, επιστημονική πρόκληση αποτελεί η χρήση μιας [29]

44 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman τεχνικής για την εκτίμηση της ποιότητας ενός οστού, που θα μπορεί να συνεκτιμά το ανόργανο και το οργανικό συστατικό του οστού. 2.2 Χαρακτηριστικά Γνωρίσματα του Οστού της Κάτω Γνάθου Η γνάθος είναι οστό του κρανίου που καταλαμβάνει το μέσο εμπρόσθιο και κατώτερο τμήμα του. Καλύπτεται εν μέρει από δέρμα, εξωτερικά, ενώ εσωτερικά σχηματίζει την κοιλότητα του στόματος και καλύπτεται από βλεννογόνο. Αποτελείται από δυο επιμέρους οστά, την άνω γνάθο, που είναι ακίνητη, και την κάτω γνάθο, η οποία αποτελεί και το μόνο κινητό οστό του κρανίου. Η κύρια λειτουργία των γνάθων σχετίζεται με τη μάσηση, στην οποία λαμβάνουν μέρος, με παθητικό τρόπο η άνω και με ενεργητικό η κάτω. Η κάτω γνάθος είναι ένα από τα πρώτα οστά του σκελετού που αναπτύσσονται κατά την εμβρυική ανάπτυξη [92]. Η κάτω γνάθος συγκεκριμένα, συνιστά ενιαία οντότητα, αποτελούμενη από τέσσερα μέρη: το σώμα, δηλαδή, το κεντρικό τμήμα επί του οποίου εκφύονται τα δόντια από κοιλότητες που καλούνται φατνία τους δυο κονδύλους, τα αποστρογγυλεμένα άκρα του οστού, τα οποία συμπλέκονται με το κροταφικό οστό της άνω γνάθου για τη δημιουργία της κροταφογναθικής άρθρωσης τους δυο κλάδους, τα πεπλατυσμένα, ευθέα τμήματα στα πλάγια του οστού που ενώνουν το σώμα με τις απολήξεις του οστού, και τις δυο κορωνοειδείς αποφύσεις, δηλαδή τις τριγωνικές εξοχές, οι οποίες βρίσκονται στις δυο άκρες της κάτω γνάθου και χρησιμεύουν για την πρόσφυση των μυών της περιοχής. Στην κάτω γνάθο υπάρχουν και δυο τρήματα, ανοίγματα του οστού της από όπου διέρχονται αγγεία και νεύρα. [30]

45 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman Εικόνα 17: Τα βασικά μέρη του οστού της κάτω γνάθου. Ιστολογικά, το σώμα της γνάθου αποτελείται από οστεόνες και διάμεσα πετάλια. Κεντρικά κανάλια οστεόνων σχηματίζουν ένα πυκνό χωριακό δίκτυο με πλούσιες διασυνδέσεις [93]. Σε μορφολογικό επίπεδο, το οστό της κάτω γνάθου διακρίνεται σε δυο μέρη, το βασικό και το φατνιακό. Το βασικό μέρος σχηματίζεται από ένα παχύ τόξο με παράλληλους οστεόνες στο χαμηλότερο όριο του σώματος της γνάθου. Το φατνιακό οστό βρίσκεται σε αυτό το τόξο αλλά με τους οστεόνες να έχουν προνομιακό κάθετο προσανατολισμό [94, 95]. Εικόνα 18: Θέση του φατνιακού οστού [ [31]

46 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman Η κάτω γνάθος έχει σχήμα U ή διαφορετικά σχήμα πετάλου και η δομή της είναι πιο περίπλοκη από αυτή του μηριαίου οστού ή της κνήμης. Για παράδειγμα, στην περιοχή των γομφίων, το οστό χαρακτηρίζεται από πόρους και μια αποδιοργανωμένη και ακανόνιστη δομή (περιπλεγμένο οστό), σε αντίθεση με το βασικό τεταρτημόριο, για παράδειγμα, το οποίο συνίσταται από οστεόνες και λεπτούς δοκιδωτούς δίσκους διατεταγμένους σε επίπεδες, κυλινδρικές και πορώδεις διαμορφώσεις (Εικόνα 19) [96]. Εικόνα 19: Οπτική μικρογραφία της περιοχής των γομφίων (α) και της βασικής περιοχής (β) του οστού της κάτω γνάθου, οι οποίες χαρακτηρίζονται από το πορώδες και την έλλειψη οργάνωσης του υλικού, στην πρώτη περίπτωση και από τα πετάλια, τους οστεόνες και τα γραμμικά πετάλια στην άλλη [96]. Η ανθρώπινη γνάθος είναι ένα μοναδικό οστό που διευκολύνει τη μάσηση, διαθέτει ειδικές δομικές ιδιότητες και επηρεάζεται από δυνάμεις μάσησης και διάφορες άλλες λειτουργικές πιέσεις που μεταδίδονται μέσω των δοντιών [97]. Ωστόσο, η άμεση εκτίμηση της μηχανικής πίεσης είναι δύσκολη, ενώ, έμμεσα υπολογίζεται από τις μετρήσεις της αντοχής του οστού [97, 98]. Λόγω των διαστάσεων, του σχήματος και της θέσης στο ανθρώπινο σώμα, η γνάθος είναι ένα οστό που υπόκειται συχνά τραύματα που μπορεί να καταλήξουν σε κατάγματα. Ο FX. Michelet ανέπτυξε μια τεχνική για τη θεραπεία των καταγμάτων των γνάθων η οποία τροποποιήθηκε από τους R. Bolourian και M. Champy [99, 100]. [32]

47 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman Η τεχνική αυτή περιλαμβάνει τη χρήση εύπλαστων, μικροπλακών που τοποθετούνται σε στρατηγικά ανατομικές θέσεις με σκοπό να αντισταθμίσουν λειτουργικές δυνάμεις. Το πάχος των ανθρώπινων οστών ποικίλλει ανά ηλικία και φύλο. Όσο αφορά την κάτω γνάθο, το πάχος, αποτελεί καθοριστικό παράγοντα για την εφαρμογή οδοντικών εμφυτευμάτων. Η ενσωμάτωση ενδοστικών οδοντικών εμφυτευμάτων είναι μια συνεχής διαδικασία ανακατασκευής που εξαρτάται από τις μηχανικές ιδιότητες του οστού [101, 102]. Για την αποτελεσματική θεραπεία των καταγμάτων και τη σωστή τοποθέτηση εμφυτευμάτων είναι αναγκαία η εκτίμηση της ποιότητας του οστού της κάτω γνάθου. Το μέτρο ελαστικότητας, τα όρια αντοχής και η πυκνότητα του διαθέσιμου οστού στη νωδή περιοχή συνεκτιμώνται κατά το σχεδιασμό της θεραπείας, τη χειρουργική προσέγγιση, το χρόνο επούλωσης και την ικανότητα προοδευτικής φόρτισης του οστού κατά τη διάρκεια της προσθετικής ανακατασκευής [101]. Σε διάφορες μελέτες έχει διερευνηθεί η μέτρηση της ελαστικότητας και της οστικής πυκνότητας του οστού (BMD). Οι μετρήσεις BMD είναι ακατάλληλες για τον υπολογισμό της αντοχής του οστού, έτσι, επιπλέον παράμετροι που ελέγχουν την ποιότητα του οστού όπως είναι η δομή του οστού σε μικρο και μακρο επίπεδο, ο προσανατολισμός των κρυστάλλων βιοαπατίτη, η οργανική ύλη του, η ασβεστοποίηση, πρέπει να συνεκτιμηθούν [97]. 2.3 Τεχνικές Εκτίμησης της Κατάστασης του Οστού Διάφορες τεχνικές εκτίμησης της ποιότητας του οστού εφαρμόζονται ανάλογα με το επίπεδο της ιεραρχικής δομής του. Έτσι, σε μακροσκοπικό επίπεδο εφαρμόζονται τεχνικές, όπως οι Whole-bone Mechanical Testing [103], Bulk Tissue Specimen Testing [104, 105], Microbeam Testing [77, 106] κ.ά., με σκοπό τη μελέτη των μηχανικών ιδιοτήτων του οστού, όπως μέτρο ελαστικότητας, σκληρότητα, κ.λ.π. Για το χαρακτηρισμό της γεωμετρίας του οστού και της μικροαρχιτεκτονικής του εφαρμόζονται κυρίως τεχνικές απεικόνισης, όπως Ποσοτική Αξονική Τομογραφία (QCT), η Μαγνητική Τομογραφία (MRI), η Μικροτομογραφία (micro-ct), ενώ για την μελέτη της δομικής ακεραιότητας ολόκληρου του οστού χρησιμοποιούνται μηχανικές, μικροσκοπικές, φασματοσκοπικές, φυσικές και χημικές τεχνικές που μελετούν το ανόργανο και το οργανικό συστατικό του οστού. Τέτοιες τεχνικές είναι ο [33]

48 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman Μορφικός Συντελεστής Απόσβεσης (Model Damping Factor, MDF), η Φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (NMR), η Φασματοσκοπία Υπερύθρου (FTIR), η Φασματοσκοπία Raman (RS), η Ηλεκτρονική Μικροσκόπια Σάρωσης (SEM), κ.ά. [81]. Στα επόμενα αναπτύσσονται μερικές από τις τεχνικές που εφαρμόζονται για την εκτίμηση της ποιότητας των οστών σε κλινικό και σε ερευνητικό επίπεδο. Εικόνα 20: Σχηματική απεικόνιση της ιεραρχικής δομής του οστού με τις τεχνικές ανάλυσης που χρησιμοποιούνται για τη μελέτη του [81] Εφαρμοσμένες Τεχνικές Εκτίμησης Ποιότητας Οστών σε Κλινικό Επίπδο Απορρόφηση Διπλής Ενέργειας Ακτίνων-Χ (Dual-Energy X-ray Absorptiometry, DXA ή DEXA) Η DEXA είναι η πιο κοινή και ευρέως χρησιμοποιούμενη τεχνική ποσοτικοποίησης των οστικών αλάτων και παρέχει μετρήσεις οστικής πυκνότητας (BMD). Μία δέσμη ακτίνων-x διαφορετικής ενέργειας κατευθύνονται στα οστά των ασθενών. Ένας ανιχνευτής συλλέγει τη μη απορροφημένη ακτινοβολία διερχόμενη από τα οστά. Ανάλογα με το βαθμό απορρόφησης των ακτίνων από τους ιστούς εκτιμάται η [34]

49 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman σύσταση του σώματος, συνεπώς, η ενέργεια που απορρόφησε το ασβέστιο είναι ανάλογη της ποσότητάς του στο οστό [107]. Όταν η απορρόφηση του μαλακού ιστού αφαιρεθεί, καθορίζεται o BMD από την απορρόφηση κάθε δέσμης από το οστό. Γνωρίζοντας την αναλογία του ασβεστίου στο βιοαπατίτη προσδιορίζεται η μάζα του βιοαπατίτη (BMC). Ο BMD σε μονάδες [g/cm 2 ] προκύπτει από τη διαίρεση του BMC δια του εμβαδού της προβαλλόμενης επιφάνειας που σαρώθηκε [88]. Εικόνα 21: Απεικόνιση DEXA ανθρώπινης κάτω γνάθου [108]. Η ακρίβεια των μετρήσεων της τεχνικής DEXA εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το πάχος και τη σύσταση των μαλακών ιστών. Οι διαφορές στη σύνθεση των μαλακών ιστών, στη διαδρομή που ακολουθούν οι ακτίνες στη διάρκεια της μέτρησης, συγκρινόμενες με τις γειτονικές επιφάνειες αναφοράς που απαιτεί η μέθοδος, εισάγουν σφάλματα στη μέτρηση DEXA [109]. Ποσοτική Αξονική Τομογραφία (Quantitative Computer Tomography, QCT) Η τεχνική αυτή πραγματοποιείται in vivo και παρέχει πληροφορίες για τη τρισδιάστατη γεωμετρία του οστού. Το πλεονέκτημα αυτής της τεχνικής, σε σχέση με τη DEXA, είναι η τρισδιάστατη απεικόνιση των οστών της σπονδυλικής στήλης, των οποίων η οστική μάζα μεταβάλλεται περισσότερο από άλλα οστά σε παθολογικές καταστάσεις [110]. Μια πηγή ακτίνων-χ εκπέμπει τις ακτίνες οι οποίες εξασθενούν από το εξεταζόμενο αντικείμενο, ενώ ένας ανιχνευτής από την αντίθετη πλευρά ανιχνεύει το σήμα. Η πηγή και ο ανιχνευτής εκτελούν ταυτόχρονα περιστροφική κίνηση, όπου σε κάθε περιστροφή συλλέγονται περίπου 1000 απεικονίσεις του [35]

50 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman σκελετού. Από το άθροισμα όλων αυτών των εικόνων προκύπτει η τρισδιάστατη απεικόνιση, η οποία όμως είναι ανεπαρκής. Μειονεκτήματα αυτής της μεθόδου είναι η ανεπαρκής απορρόφηση (περίπου 0.5 mm) για να δείξει την αρχιτεκτονική του σπογγώδους οστού και φυσικά η ακτινοβολία που δέχεται ο ασθενής [81]. Υψηλής Ανάλυσης Περιφερειακή Ποσοτική Αξονική Τομογραφία (High-resolution Peripheral QCT, HR-pQCT) Η έλευση υψηλής ανάλυσης περιφερειακών σαρωτών QCT επιτρέπει την in vivo τρισδιάστατη απεικόνιση της μορφολογίας του σπογγώδους οστού σε περιφερειακά τμήματα [111], όπως είναι τα άνω και κάτω άκρα. Βασικό προτέρημα αυτής της τεχνικής είναι ο υπολογισμός διαφόρων μορφολογικών παραμέτρων όπως είναι για παράδειγμα το πάχος του σπογγώδους οστού (Tb.Th) και η περιορισμένη έκθεση σε ακτινοβολία σε σύγκριση με αυτή της QCT [81]. Μαγνητική Τομογραφία Υψηλής Ανάλυσης (High-resolution MRI, HR-MRI) Η τεχνική αυτή επιτρέπει τη μη ιονισμένη τρισδιάστατη απεικόνιση του σπογγώδους δικτύου σε περιφερειακά τμήματα. Κατά τη σάρωση, ένα ισχυρό μαγνητικό πεδίο και μια σειρά από παλμούς ραδιοσυχνότητας εφαρμόζονται στο δείγμα με σκοπό τη δημιουργία τρισδιάστατων απεικονίσεων των υδρογόνων του νερού μέσα στους ιστούς του σκελετού. Ο οστίτης ιστός δε δίνει σήμα λόγω του μικρού περιεχομένου σε νερό και του χημικού περιβάλλοντος των πρωτονίων στο υλικό του οστού. Μπορεί να ανιχνεύει αλλαγές που προκαλούνται λόγω ηλικίας ή ασθένειας στη μορφολογία του σπογγώδους οστού [102]. Σημαντικό πλεονέκτημα αυτής της τεχνικής αποτελεί η 3D απεικόνιση του οστού και η μικροαρχιτεκτονική του χωρίς να εκπέμπεται ιονισμένη ακτινοβολία, ενώ μειονέκτημα αποτελεί η μεγάλης διάρκειας σάρωση που απαιτείται για τη λήψη εικόνων υψηλής ανάλυσης [81]. Μικροτομογραφία με ακτίνες-χ (X-ray Microtomography, Micro-CT) Η micro-ct τεχνική παρέχει πληροφορίες για τη μικροαρχιτεκτονική του σπογγώδους οστού με μικρές ισοτροπικές αναλύσεις (1-6 μm). Το δείγμα περιστρέφεται με γωνιακές προσαυξήσεις μεταξύ της πηγής ακτίνων-χ και του ανιχνευτή και τα δεδομένα από την εξασθένιση σε κάθε θέση αναδιαμορφώνονται σε [36]

51 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman τρισδιάστατη διάταξη, τα οποία μετατρέπονται στη συνέχεια σε τιμές οστικής πυκνότητας. Υπάρχει όμως ένας περιορισμός στο μέγεθος του δείγματος το οποίο δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 100 nm διάμετρος x 140 nm μήκος σε καινούργιους σαρωτές [112]. Παρ όλα αυτά, το Micro-CT αποτελεί μια δυναμική τεχνική για την ex vivo ποσοτικοποίηση της μορφολογίας του σπογγώδους οστού [81]. Εικόνα 22: Τρισδιάστατη απεικόνιση σπογγώδους οστού ενός υγιούς (αριστερά) και ενός οστεοπορωτικού (δεξιά) ακρολόφιου οστού ληφθέντα με την τεχνική Micro-CT [112]. Εικόνα 23: μct από το περιφερικό άκρο της κερκίδας με τις τρισδιάστατες απεικονίσεις του σπογγώδους και του συμπαγούς οστού (δεξιά) [111]. [37]

52 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman Η ανάπτυξη micro-ct σαρωτών για in vivo χρήση επιτρέπει το χαρακτηρισμό της μακροσκοπικής γεωμετρίας και μικροαρχιτεκτονικής των οστών ζωντανών ζώων. Σημαντικό μειονέκτημα όμως αποτελούν οι μεγάλης διάρκειας σαρώσεις και συνεπώς η μεγάλη δόση ακτινοβολίας. Η χρήση μιας πηγής επιταχυντή σωματιδίων (συγχροτρόνιας πηγής) επιτρέπει την υψηλότερη ανάλυση σε in vivo και ex vivo μελέτες, αυξάνοντας την ανάλυση μικροαρχιτεκτονικών χαρακτηριστικών και τοπικών διαβαθμίσεων του ανόργανου συστατικού των οστών. Το micro-ct με συγχροτρόνιο είναι το χρυσό εργαλείο για την εκτίμηση σε σημειακό επίπεδο του TMD (True Mineral Density) [113] και της εύρεσης των μικροκαταγμάτων [114]. Ωστόσο, η σχετική μη διαθεσιμότητα των απαιτούμενων εγκαταστάσεων περιορίζει τη χρήση αυτής της τεχνικής [81] Χρησιμοποιούμενες Τεχνικές σε Ερευνητικό Επίπεδο για την Εκτίμηση της Ποιότητας των Οστών Μορφικός Συντελεστής Απόσβεσης (Model Damping Factor, MDF) Ο μορφικός συντελεστής απόσβεσης είναι μια καινούργια αναλυτική, αριθμητική, πειραματική μέθοδος για την αξιολόγηση της δομικής ακεραιότητας και της ποιότητας των οστών. Θεωρείται ότι είναι ίσος ή καλύτερος προγνωστικός δείκτης της αντοχής του οστού από τον BMD [115, 116]. Η μέθοδος αυτή μετράει τον εσωτερικό συντελεστή απόσβεσης του υλικού που αναπτύσσεται λόγω της φόρτισης που ασκείται στο μέσο από εξωτερικό εξαναγκασμό, όπως είναι ένα κρουστικό φορτίο. Ο υπολογισμός του Παράγοντα Ποιότητας (Quality Factor, Q) που βασίζεται στην απόσβεση του υλικού μπορεί θεωρητικά να εφαρμοστεί σε κλινικές δοκιμές για την εκτίμηση της μηχανικής επάρκειας του οστού και να χρησιμοποιηθεί έτσι, σαν διαγνωστικό εργαλείο για την οστεοπόρωση [115, 117]. Υψηλές τιμές του συντελεστή απόσβεσης αντιστοιχούν σε πιο αποδιοργανωμένες δομές, ενώ, η αυξημένη τιμή του και η μειωμένη τιμή πυκνότητας του οστού δείχνει τη δομική ακεραιότητα του οστού [117]. Θα πρέπει να διευκρινιστεί ότι η μέθοδος MDF που χρησιμοποιείται ως ένα εργαλείο για την παρακολούθηση της κατάστασης του οστού δεν παρέχει [38]

53 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman πληροφορίες για την κατανομή του πορώδους στο οστό [117]. Ωστόσο, έχει παρατηρηθεί αύξηση του εσωτερικού συντελεστή απόσβεσης με την αύξηση του πορώδους σε οστά λόγω υποβάθμισης της μικροαρχιτεκτονικής του δικτύου των οστεοδοκίδων [116]. Το γεγονός ότι οι μετρήσεις απόσβεσης είναι ευαίσθητες στις αλλαγές της δομής του οστού μπορεί να καταστήσει τη μέθοδο αυτή, ένα ταχύτερο εργαλείο για τη διάγνωση των αλλαγών της αρχιτεκτονικής του οστού σε σχέση με άλλες μεθόδους [115]. Φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (Nuclear Magnetic Resonance Imaging, NMR) Η τεχνική του NMR παρέχει πληροφορίες για το περιεχόμενο νερό και τη δομή της ανόργανης φάσης του ιστού. Για αναλύσεις του νερού και του ανόργανου συστατικού, τα ισότοπα που παρουσιάζουν ενδιαφέρον είναι το 1 Η και 31 Ρ, αντίστοιχα. Παρουσία ισχυρού μαγνητικού πεδίου, οι ενεργοί πυρήνες 1 Η και 31 Ρ του ανόργανου στοιχείου του οστού συντονίζονται σε ελαφρώς διαφορετικές συχνότητες ανάλογα με το χημικό τους περιβάλλον. Φάσματα NMR καταγράφονται διαφοροποιώντας τη συχνότητα του πεδίου της ραδιοσυχνότητας που εφαρμόζεται και ρυθμίζοντας την απορρόφηση του δείγματος [118]. Ο εκατοστιαίος όγκος του νερού του οστού (%ΒW) μπορεί να μετρηθεί από τις 1 Η εικόνες και μπορεί να χρησιμοποιηθεί σαν μια μέτρηση του πορώδους του συμπαγούς οστού. Το 31 Ρ NMR μπορεί να χρησιμοποιηθεί στο χαρακτηρισμό της χημικής δομής της ανόργανης φάσης του οστού, επιτρέποντας την ανίχνευση προσωρινών αλλαγών στη χημική του σύσταση. Επιπλέον, η τεχνική αυτή μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον ποσοτικό προσδιορισμό της μάζας του ανόργανου συστατικού του οστού. Ποσοτικές αναλύσεις NMR περιορίζονται μόνο στα δάχτυλα, στον καρπό και στο χέρι λόγω της χρονοβόρας διαδικασίας και των ειδικών σαρωτών [119, 120]. Πρόσφατες όμως εξελίξεις στην οργανολογία επιτρέπουν την απεικόνιση in vivo με χρήση κλινικών σαρωτών [121]. Συμπερασματικά, η τεχνική του NMR επιτρέπει τον in vivo χαρακτηρισμό των αλλαγών στη σύσταση του οστού μη επεμβατικά και μη ιονισμένα. Μπορεί να ανιχνεύει πολύ μικρές αλλαγές στο χημικό περιβάλλον του [39]

54 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman ανόργανου συστατικού αλλά δεν παρέχει πληροφορίες για το οργανικό συστατικό του οστού [81, 122]. Φασματοσκοπικές απεικονίσεις: Φασματοσκοπία Υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier (Fourier Transform Infrared, FTIR) και η Φασματοσκοπία Raman (Raman Spectroscopy, RS) Οι φασματοσκοπικές τεχνικές δόνησης χρησιμοποιούνται για το χαρακτηρισμό της χημικής σύστασης και του περιβάλλοντος των συστατικών του ιστού. Σε αυτές τις τεχνικές, οι δονήσεις των χημικών δεσμών του δείγματος, σε συγκεκριμένο μήκος κύματος, δίνουν πληροφορίες για το ανόργανο και το οργανικό συστατικό του οστού [12, 123]. Και οι δυο τεχνικές μπορούν να ανιχνεύσουν αλλαγές του ιστού που οφείλονται στην ηλικία ή σε κάποια ασθένεια [123]. Η σύζευξη ενός FTIR ή ενός Raman φασματόμετρου με ένα οπτικό μικροσκόπιο ενισχύει τη χρησιμότητα αυτών των τεχνικών καθώς διευκολύνεται η χαρτογράφηση ενός ιστού [81]. Από τις μετρήσεις FTIR λαμβάνονται πληροφορίες για το ανόργανο και το οργανικό συστατικό (λόγος ανόργανο/οργανικό) [124], την υποκατάσταση των ανθρακικών στο πλέγμα του απατίτη (λόγος ανθρακικά/φωσφορικά) [125, 126], την ωρίμανση των σταυροδεσμών του κολλαγόνου (λόγος σταυροδεσμών) [ ] και για το μέγεθος των κρυστάλλων του απατίτη [127], οι οποίες βελτιώνουν την πρόβλεψη του κινδύνου ενός κατάγματος σε σχέση με τις μεμονωμένες μετρήσεις του BMD [130]. Η διακριτική ικανότητα φτάνει τα 6 μm [123]. Η μέθοδος αυτή είναι ευρέως χρησιμοποιούμενη καθώς παρέχει έγκυρα αποτελέσματα, ενώ περιορισμοί υπάρχουν στην απαίτηση αφυδατωμένων, λεπτών τμημάτων οστού. Η φασματοσκοπία Raman είναι μια δονητική φασματοσκοπία που χρησιμοποιεί τη σκεδαζόμενη ακτινοβολία για να λάβει πληροφορίες για τους δεσμούς των εξεταζόμενων μορίων. Συνοπτικά, η φασματοσκοπία Raman βασίζεται στη σκέδαση της ακτινοβολίας με διαφορετικό μήκος κύματος από αυτό της προσπίπτουσας ακτινοβολίας. Οι δονήσεις των μορίων οδηγούν ένα μικρό μέρος των φωτονίων να χάσουν ενέργεια και να σκεδαστούν σε άλλα μήκη κύματος [131]. Η διαφορά του μήκους κύματος μεταξύ του σκεδαζόμενου και του προσπίπτοντος φωτός αντιστοιχεί σε μοριακές δονήσεις που αποδίδονται σε χαρακτηριστικές συχνότητες στο φάσμα Raman [127]. [40]

55 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman Η φασματοσκοπία Raman και το FTIR παρέχουν τις ίδιες χημικές πληροφορίες για τη σύσταση του οστού. Ωστόσο, υπάρχουν σημαντικές διαφορές στις δονητικές καταστάσεις που είναι "ενεργές" κατά Raman και κατά IR και για το λόγο αυτό οι δυο τεχνικές παρέχουν συμπληρωματικές πληροφορίες, με την καθεμία να υπερτερεί ή να υστερεί έναντι της άλλης ανάλογα με τη φύση του δείγματος. Χαρακτηριστικό παράδειγμα τέτοιας υπεροχής της φασματοσκοπίας Raman είναι ότι το νερό δεν αποτελεί εμπόδιο στη μελέτη των δειγμάτων γιατί η σκέδαση της ακτινοβολίας κατά Raman από τα μόρια του νερού είναι πολύ ασθενής, στοιχείο πολύ σημαντικό για την in vivo μελέτη ανεπεξέργαστων βιολογικών δειγμάτων, τα οποία περιέχουν σημαντικό ποσοστό νερού [12, 132]. Επίσης, η φασματοσκοπία Raman χαρακτηρίζεται από υψηλότερη διακριτική ικανότητα (περίπου 1μm) [133]. Επιπλέον, μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε μεμονωμένα ή σε ενσωματωμένα δείγματα και σε δείγματα επεξεργασμένα με χρώσεις [134] ή ακόμα κι επισημασμένα με φθόριο [135]. Ο συνδυασμός της φασματοσκοπίας Raman με τη χρήση οπτικών ινών επιτρέπει τη μη επεμβατική in vivo χρήση [127, 136]. Παρά τα προτερήματά της έναντι του FTIR, δεν είναι τόσο ευρέως χρησιμοποιούμενη τεχνική ακόμα, αλλά αποτελεί ένα πολλά υποσχόμενο, μη επεμβατικό εργαλείο διάγνωσης της σύστασης του οστού [81]. Περισσότερες λεπτομέρειες για τη Φασματοσκοπία Raman, η οποία χρησιμοποιήθηκε ως κύριο εργαλείο στην παρούσα διπλωματική εργασία, δίνονται στο κεφάλαιο 2.4. Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (Scanning Electron Microscopy, SEM) Η τεχνική του SEM επιτρέπει το χαρακτηρισμό της μορφολογίας και της σύστασης της επιφάνειας του οστού. Μια δέσμη ηλεκτρονίων εστιάζεται και σαρώνει όλη την επιφάνεια του δείγματος, τα ηλεκτρόνια αλληλεπιδρούν με τα άτομα του δείγματος παράγοντας διάφορα ανιχνεύσιμα σήματα τα οποία περιέχουν πληροφορίες για τη μορφολογία και τη σύσταση της επιφάνειας του δείγματος. Παράγονται τρεις τύποι σήματος: τα δευτερεύοντα ηλεκτρόνια (secondary electrons, SEs), τα οπισθοσκεδαζόμενα ηλεκτρόνια (backscattered electrons, BSEs) και οι ακτίνες-χ [137]. Η τεχνική αυτή μπορεί να πετύχει ανάλυση καλύτερη και από 1 nm. Τα δείγματα μπορούν να παρατηρηθούν σε υψηλό ή χαμηλό κενό ή και σε υγρές συνθήκες (συνθήκες περιβάλλοντος). [41]

56 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman Σταθμική Ανάλυση Με τη μέθοδο αυτή καθορίζεται άμεσα το ανόργανο συστατικό του οστού. Τα οστά ξηραίνονται στους 110 o C, ζυγίζονται και ύστερα θερμαίνονται στους 600 o C έτσι ώστε να αφαιρεθεί η οργανική φάση. Από τη διαφορά του βάρους προσδιορίζεται το ποσοστό της ανόργανης φάσης. Βασικό πλεονέκτημα αυτής της τεχνικής είναι η ευκολία της, αλλά απαιτεί την ομογενοποίηση του ιστού και δεν μπορεί να χαρακτηρίσει την κατανομή του ανόργανου συστατικού στο οστό [81]. Χημική ανάλυση των σταυροδεσμών του κολλαγόνου Το κολλαγόνο του οστού μπορεί να αναλυθεί με σκοπό να καθοριστούν οι τύποι των σταυροδεσμών του αλλά και να προσδιορισθεί ποσοτικά. Το συνολικό ποσοστό του κολλαγόνου και η μη ενζυματική γλυκοζυλίωση μπορεί να αναλυθεί άμεσα με φθορισμομετρική ανάλυση. Πιο λεπτομερείς αναλύσεις πραγματοποιούνται με την τεχνική της Υγρής Χρωματογραφίας (High-Pressure Liquid Chromatography, HPLC). Τα δείγματα του ιστού υδρολύονται και αναλύονται με σκοπό να καθοριστούν ποσοτικά οι αναγώγιμοι και οι μη αναγώγιμοι σταυροδεσμοί του κολλαγόνου. Αυτή η μέθοδος μπορεί να ανιχνεύσει μικρές διαφορές στη χημεία της οργανικής φάσης του οστού, αλλά απαιτεί ομογενοποίηση του δείγματος και ταυτόχρονα εξειδίκευση και εξοπλισμός [81]. Οι μέθοδοι που περιγράφονται δεν χρησιμοποιούνται στην κλινική πρακτική αλλά μπορούν να μετατραπούν από ex vivo ερευνητικές τεχνικές σε in vivo και τελικώς σε κλινικές μεθόδους. 2.4 Φασματοσκοπία Raman Η φασματοσκοπία Raman πήρε το όνομά της από τον Ινδό φυσικό Chandrasekhara Venkata Raman ( ), ο οποίος βραβεύτηκε με Nobel Φυσικής το 1930 για την ανακάλυψη, ότι όταν ακτινοβολία διασχίζει ένα διαφανές υλικό, ένα μέρος της εκτρέπεται και αλλάζει μήκος κύματος [138]. Σε αυτό το φαινόμενο, που πλέον καλείται σκέδαση Raman στηρίζεται και η ομώνυμη τεχνική της φασματοσκοπίας Raman. [42]

57 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman Η φασματοσκοπία Raman βασίζεται στην ανελαστική σκέδαση μονοχρωματικής ακτινοβολίας, δηλαδή στη σκέδαση της ακτινοβολίας με διαφορετικό μήκος κύματος από αυτό της προσπίπτουσας ακτινοβολίας. Λόγω των αλληλεπιδράσεων με τα μόρια του δείγματος, ένα πολύ μικρό αλλά ανιχνεύσιμο ποσό της σκεδαζόμενης ακτινοβολίας, μόλις το 0.001%, έχει διαφορετική ενέργεια από την προσπίπτουσα ακτινοβολία, με αποτέλεσμα το μήκος κύματος της σκεδαζόμενης ακτινοβολίας να μετατοπίζεται. Αυτές οι μετατοπίσεις Raman, δηλαδή οι μεταβολές της συχνότητας, αποδίδονται σε συγκεκριμένες μοριακές δονήσεις, οι οποίες καταγράφονται σε ένα φάσμα, δηλαδή σε μια γραφική παράσταση της απόκρισης του φωτοπολλαπλασιαστή σε συνάρτηση με τη διαφορά συχνοτήτων. Η συχνότητα ν εκφράζει τον αριθμό των δονήσεων ενός είδους στη μονάδα χρόνου. Η αντίστοιχη ποσότητα σε κυματάριθμους εκφράζει τον αριθμό των κυμάτων ανά cm, Δν (cm -1 ). Έτσι, χρησιμοποιείται ο όρος συχνότητα, ακόμα και όταν γίνεται αναφορά σε κυματάριθμους. Η διαφορά ενέργειας μεταξύ των δονητικών επιπέδων είναι χαρακτηριστική για κάθε μόριο, όπως και το φάσμα Raman, παρέχοντας χημικές και δομικές πληροφορίες για το εξεταζόμενο δείγμα [ ]. Εικόνα 24: Απεικόνιση της σκέδασης Raman. [43]

58 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman Θεωρητικό Υπόβαθρο Η σκέδαση Raman είναι ένα παράδειγμα ανελαστικής σκέδασης λόγω της μεταφοράς της ενέργειας μεταξύ των φωτονίων και των μορίων κατά την αλληλεπίδρασή τους. Το φαινόμενο Raman εξηγείται με βάση την κβάντωση των ενεργειακών επιπέδων. Η ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία αλληλεπιδρά με το μόριο. Όταν η προσπίπτουσα ακτινοβολία έχει τέτοια συχνότητα ώστε να μην ευνοείται η άμεση δονητική ή ηλεκτρονιακή μετάπτωση, τότε το μόριο διεγείρεται σε μια εικονική ασταθή ηλεκτρονιακή κατάσταση (virtual state) στην οποία όμως δεν μπορεί να παραμείνει. Για το λόγο αυτό, επιστρέφει πάλι στη θεμελιώδη ενεργειακή κατάσταση [143]. Εικόνα 25: Ενεργειακές μεταπτώσεις ενός μορίου κατά το φαινόμενο Raman [144]. Η επιστροφή προς τη θεμελιώδη κατάσταση μπορεί να πραγματοποιηθεί με τρεις τρόπους. Στη μια περίπτωση, το μόριο επιστρέφει στο ενεργειακό επίπεδο στο οποίο βρισκόταν και πριν την ακτινοβόληση. Τότε, η σκέδαση είναι ελαστική καθώς η σκεδαζόμενη ακτινοβολία έχει την ίδια ενέργεια με την προσπίπτουσα και καλείται σκέδαση Rayleigh. Στη δεύτερη περίπτωση, το μόριο μετά τη σκέδαση βρίσκεται σε ένα δονητικό επίπεδο της θεμελιώδους ηλεκτρονιακής κατάστασης υψηλότερης ενέργειας από αυτό που βρισκόταν αρχικά, με αποτέλεσμα, η σκεδαζόμενη ακτινοβολία να χαρακτηρίζεται από μικρότερη ενέργεια, άρα και μικρότερη [44]

59 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman συχνότητα, σε σχέση με την προσπίπτουσα. Τέτοιου είδους σκέδαση ονομάζεται σκέδαση Stokes. Στην αντίθετη και τελευταία περίπτωση, που καλείται μετατόπιση anti-stokes, το μόριο μεταπίπτει σε δονητικό επίπεδο χαμηλότερης ενέργειας από το αρχικό. Επομένως, η σκεδαζόμενη ακτινοβολία σε αυτήν την περίπτωση, χαρακτηρίζεται από υψηλότερη ενέργεια και μεγαλύτερη συχνότητα από την προσπίπτουσα. Συνήθως, η σκέδαση Stokes έχει περισσότερες πιθανότητες να συμβεί από τη σκέδαση anti-stokes και αυτό γιατί η αρχική κατάσταση από την οποία ξεκινάει το μόριο στη σκέδαση Stokes είναι πολύ πιο πιθανή σε σχέση με αυτή στη σκέδαση anti- Stokes. Ωστόσο, ο λόγος των εντάσεων Stokes και anti-stokes αυξάνει με την αύξηση της θερμοκρασίας επειδή κάτω από τις συνθήκες αυτές, ένα μεγάλο ποσό μορίων θα βρίσκεται στην πρώτη δονητική διεγερμένη κατάσταση. Οι διαφορετικοί τύποι δόνησης ενός μορίου μπορούν να ταυτοποιηθούν αναγνωρίζοντας τις μετατοπίσεις Raman στο φάσμα της ανελαστικά σκεδαζόμενης ακτινοβολίας του. Το γεγονός αυτό αξιοποιείται από τη φασματοσκοπία Raman για την απόκτηση χρήσιμων πληροφοριών για τη χημική σύσταση του δείγματος. Υπάρχουν δυο βασικές μορφές δονήσεων: Δονήσεις τάσης (stretching): Οι αποστάσεις μεταξύ των ατόμων κατά μήκος του άξονα του δεσμού τους μεταβάλλονται συνεχώς. Τα άτομα δηλαδή του δεσμού διαδοχικά πλησιάζουν και απομακρύνονται μεταξύ τους. Δονήσεις κάμψης (bending): Παρατηρείται αλλαγή στη γωνία μεταξύ δυο δεσμών και μπορεί να είναι ψαλιδοειδής (scissoring), λικνιζόμενη (rocking), παλλόμενη (wagging) ή συστρεφόμενη (twisting). [45]

60 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman Εικόνα 26: Βασικές μορφές δονήσεων. Το μήκος κύματος της προσπίπτουσας ακτινοβολίας συνήθως βρίσκεται στην περιοχή του ορατού ή του υπερύθρου αλλά μπορεί να βρίσκεται και στη υπεριώδη περιοχή του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος. Στην περίπτωση που η ακτινοβολία βρίσκεται στην περιοχή του υπερύθρου, η ενέργεια της ακτινοβολίας είναι μικρή με αποτέλεσμα να μη διεγείρεται το υλικό σε ανώτερη ηλεκτρονιακή κατάσταση και κατά συνέπεια να αποφεύγεται ταυτόχρονη εμφάνιση φθορισμού. Το φαινόμενο του φθορισμού, δηλαδή η μετάπτωση του μορίου από μια διεγερμένη κατάσταση στην αρχική ενεργειακή κατάσταση με εκπομπή ακτινοβολίας, μπορεί να προκληθεί συχνότερα αν το δείγμα ακτινοβοληθεί με laser στην περιοχή του ορατού και του υπεριώδους. Η ταυτόχρονη εμφάνιση του φθορισμού δημιουργεί προβλήματα γιατί η έντασή της είναι πολύ ισχυρότερη από αυτή λόγω της σκέδασης Raman και επομένως την υπερκαλύπτει. [46]

61 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman Εικόνα 27: Διάγραμμα ενεργειακών επιπέδων ενός μορίου κατά το φαινόμενο Raman και φθορισμού [145]. Η σκέδαση Raman παρατηρείται κυρίως σε ομοιοπολικούς δεσμούς και πολύ ασθενώς σε ιοντικούς. Αυτό συμβαίνει γιατί απαραίτητη προϋπόθεση για να προκληθεί σκέδαση Raman σε ένα μόριο είναι να υπάρξει αλλαγή στην πολωσιμότητά του, δηλαδή, να παραμορφωθεί ο δεσμός υπό την επίδραση ενός ηλεκτρικού πεδίου. Η πολωσιμότητα εξαρτάται από το πόσο ισχυρά έλκονται τα ηλεκτρόνια από τον πυρήνα και είναι διαφορετική σε κάθε τύπο δόνησης. Μόνο στους δεσμούς που παρατηρείται αυτό το φαινόμενο παρουσιάζεται σκέδαση Raman. Επιπλέον, η ένταση ή η ισχύς μιας κανονικής κορυφής Raman εξαρτάται από παράγοντες όπως είναι, η πολωσιμότητα του μορίου, η ένταση της πηγής, η συγκέντρωση της δραστικής ομάδας, κ.ά. Απουσία απορρόφησης, η ένταση της εκπομπής Raman είναι ανάλογη της τέταρτης δύναμης της συχνότητας της πηγής. Ωστόσο, σπάνια μπορούμε να εκμεταλλευτούμε αυτήν τη σχέση, λόγω της πιθανότητας φωτοδιάσπασης από την υπεριώδη ακτινοβολία. [47]

62 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman Μαθηματική Προσέγγιση Μια δέσμη ακτινοβολίας με συχνότητα v ex προσπίπτει σε ένα διάλυμα αναλύτη. Το ηλεκτρικό πεδίο Ε αυτής της ακτινοβολίας περιγράφεται από την εξίσωση [143]: Ε=Ε 0 cos(2 π v ex t) (3.1) όπου Ε 0 είναι το πλάτος του κύματος. Όταν το ηλεκτρικό πεδίο της ακτινοβολίας αλληλεπιδρά με το ηλεκτρονιακό νέφος ενός δεσμού του αναλύτη επάγει διπολική ροπή m στον δεσμό που παρέχεται από τη σχέση m=a E=a Ε 0 cos(2 π v ex t) (3.2) όπου α είναι μια σταθερά αναλογίας, που ονομάζεται πολωσιμότητα του δεσμού. Η σταθερά αυτή αποτελεί μέτρο της δυνατότητας παραμόρφωσης του δεσμού υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Για να είναι ένα μόριο ενεργό κατά Raman, η πολωσιμότητα α ενός δεσμού αποτελεί συνάρτηση της απόστασης των πυρήνων σύμφωνα με την εξίσωση (3.3) όπου α 0 είναι η πολωσιμότητα στην διαπυρηνική απόσταση ισορροπίας r eq και r η απόσταση σε οποιαδήποτε στιγμή. Η μεταβολή στη διαπυρηνική απόσταση ποικίλλει ανάλογα με τη συχνότητα δόνησης v v όπως δίνεται από τη σχέση r - r eq =r m cos (2 π v v t) (3.4) όπου r m είναι η μέγιστη διαπυρηνική απόσταση σε σχέση με τη θέση ισορροπίας. Από τις εξισώσεις (1-4) υπολογίζεται η επαγόμενη διπολική ροπή στη μορφή (3.5) και τέλος, με εφαρμογή της τριγωνομετρικής ταυτότητας (3.6) προκύπτει η εξίσωση [48]

63 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman m= α 0 Ε 0 cos(2 π v ex t)+(ε 0 /2) r m ( a r) cos [2 π(v ex -v v )t]+ (Ε 0 /2) r m ( a r) cos [2 π(v ex +v v )t] (3.7) Ο πρώτος όρος της εξίσωσης αντιπροσωπεύει τη σκέδαση Rayleigh, η οποία συμβαίνει στη συχνότητα διέγερσης v ex. Ο δεύτερος και ο τρίτος όρος αντιστοιχούν στις συχνότητες Stokes και anti-stokes, (v ex -v v ) και (v ex +v v ), όπου η συχνότητα διέγερσης έχει διαμορφωθεί από τη συχνότητα δόνησης του δεσμού. Επίσης, η σκέδαση Raman απαιτεί η πολωσιμότητα ενός δεσμού να εξαρτάται από την απόσταση, δηλαδή το ( a r) της εξίσωσης πρέπει να είναι μεγαλύτερο από το μηδέν για να εμφανισθούν γραμμές Raman Οργανολογία Τα βασικά τμήματα ενός φασματόμετρου Raman είναι τρία: μια πηγή ακτινοβολίας (laser), ένα σύστημα για την ακτινοβόληση του δείγματος και ένα κατάλληλο φασματόμετρο. Η πηγή λέιζερ χρησιμοποιείται για την εκπομπή ισχυρής ακτινοβολίας ώστε να παρατηρηθεί έντονη σκέδαση Raman και να μπορεί να μετρηθεί με ικανοποιητικό λόγο σήματος-προς-θόρυβο. Εικόνα 28: Ένα τυπικό σύστημα φασματοσκοπίας Raman με οπτικό μικροσκόπιο [146]. [49]

64 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman Οι πιο συνηθισμένες πηγές λέιζερ είναι ιόντων αργού, ιόντων κρυπτού, He/Ne, λέιζερ διόδου και Nd/YAG. Οι πηγές εγγύς υπερύθρου όπως είναι οι δυο τελευταίες, πλεονεκτούν από αυτές που εκπέμπουν σε μικρότερο μήκος κύματος ότι μπορούν να λειτουργήσουν σε μεγαλύτερη ισχύ (μέχρι 50W) χωρίς να προκαλέσουν φωτοδιάσπαση του δείγματος και ότι περιορίζουν την ένταση του φθορισμού. Ο χειρισμός του δείγματος είναι εύκολος επειδή μπορεί να χρησιμοποιηθεί ύαλος με βάση το διοξείδιο του πυριτίου για τα παράθυρα, τους φακούς και τα άλλα οπτικά τμήματα, αντί για τα πιο εύθραυστα και ασταθή στην ατμόσφαιρα κρυσταλλικά αλογονίδια. Τα φάσματα Raman στερεών δειγμάτων λαμβάνονται είτε με απευθείας ακτινοβόληση του δείγματος, είτε σε μικρές κοιλότητες γεμάτες με πολύ καλά λειοτριβημένο δείγμα. Τα υγρά δείγματα μπορούν να τοποθετηθούν σε κυψελίδες είτε σε αντικειμενοφόρους πλάκες, πλακίδια Si, κ.ά. Ένα σημαντικό πλεονέκτημα της φασματοσκοπίας Raman σε σύγκριση με τη φασματοσκοπία υπερύθρου, όπως έχει ήδη αναφερθεί, είναι ότι το νερό παρουσιάζει ελάχιστη σκέδαση Raman, ενώ απορροφά έντονα την υπέρυθρη ακτινοβολία [147]. Επομένως, υδατικά διαλύματα μπορούν να μελετηθούν με φασματοσκοπία Raman, σημαντικό πλεονέκτημα για τη μελέτη βιολογικών και ανόργανων συστημάτων. Η ακτινοβολία που διαχέεται από το δείγμα κατευθύνεται με καθρέπτες σε ένα φασματόμετρο. Τα περισσότερα φασματόμετρα είναι είτε όργανα μετασχηματισμού Fourier εξοπλισμένα με ψυχόμενους ανιχνευτές γερμανίου, είτε πολυδιαυλικά όργανα, που βασίζονται σε ανιχνευτές σύζευξης φορτίου (CCD). Τα φασματόμετρα διασποράς και τα φασματόμετρα με μετασχηματισμό Fourier, παρέχουν τις ίδιες ακριβώς πληροφορίες. Ωστόσο, το κύριο πλεονέκτημα του FT-Raman είναι ότι δεν παρεμβάλλεται το φαινόμενο του φθορισμού. Απεναντίας, επειδή το Raman διασποράς λειτουργεί στο ορατό, το σήμα είναι ισχυρότερο, κάνοντας την τεχνική αυτή πιο ευαίσθητη και καταλληλότερη για την ανάλυση μικρότερων συστατικών. Ένα απλό φασματόμετρο διασποράς αποτελείται από μια πηγή μονοχρωματικής ακτινοβολίας η οποία εστιάζεται στο δείγμα μέσω ενός φακού, και ένα σύστημα φίλτρου από το οποίο διέρχεται η εκπεμπόμενη ακτινοβολία Raman και απορρίπτεται το μεγαλύτερο μέρος της ακτινοβολίας Rayleigh. Η ακτινοβολία που εξέρχεται από [50]

65 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman το φίλτρο μεταφέρεται στη σχισμή του CCD ανιχνευτή μέσω του φράγματος περίθλασης (Εικόνα 29). Εικόνα 29: Διάγραμμα φασματόμετρου διασποράς Raman. Ένα φράγμα περίθλασης αποτελείται από πολλές ισαπέχουσες γραμμές/εγκοπές που ανακλούν τη σκεδαζόμενη ακτινοβολία. Όσο μεγαλύτερος είναι ο αριθμός των γραμμών ανά μονάδα επιφάνειας του φράγματος περίθλασης τόσο μεγαλύτερη η γωνία περίθλασης και τελικά η ανάλυση που επιτυγχάνεται. Στη μικροσκοπία Raman διασποράς ο ευρέως χρησιμοποιούμενος ανιχνευτής είναι ο CCD (charge-coupled device) λόγω της υψηλής του ευαισθησίας που τον καθιστά κατάλληλο για την ανάλυση του ασθενούς σήματος του φαινομένου. Το εύρος μήκους κύματος στο οποίο αποκρίνεται, κυμαίνεται μεταξύ nm. Βασικό πλεονέκτημα αυτού του είδους ανιχνευτή είναι η μεγάλη ευαισθησία που διαθέτει, καθώς μπορεί να συλλάβει σχεδόν το 60% των φωτονίων που προσπίπτει. Ωστόσο, δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για laser που είναι στην περιοχή του υπερύθρου καθώς δεν είναι ευαίσθητος σε ασθενή φωτόνια (Δν>3000 cm -1 ). Είναι άξιο να επισημανθεί ότι στην παρούσα εργασία όπου έχουν χρησιμοποιηθεί FT- Raman και micro-raman διασποράς, ο ανιχνευτής του κάθε φασματόμετρου ήταν [51]

66 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman ένας φωτοαγώγιμος ανιχνευτής γερμανίου που ψύχεται με υγρό άζωτο στην πρώτη περίπτωση, και στη δεύτερη, ένας CCD ανιχνευτής. Επίσης, χρησιμοποιείται ένας μονοχρωμάτορας και φίλτρα εγκοπής (notch filters) για το διαχωρισμό της ακτινοβολίας που θα φτάσει στον ανιχνευτή και που θα έχει μήκος κύματος μεγαλύτερο από αυτό της πηγής Είδη Φασματοσκοπίας Raman Διάφορα είδη φασματοσκοπίας Raman έχουν αναπτυχθεί με σκοπό να καλυφθούν όλο και περισσότερες ανάγκες και για την απόκτηση πιο εξειδικευμένων πληροφοριών. Μερικά από αυτά είναι: Resonance Raman Spectroscopy: το μήκος κύματος διέγερσης συνδυάζεται με την ηλεκτρονιακή μετάβαση του μορίου ή του κρυστάλλου, με τέτοιο τρόπο που οι δονητικές διαμορφώσεις που σχετίζονται με τη διεγερμένη ηλεκτρονιακή κατάσταση, είναι πολύ ενισχυμένες. Αυτό είναι χρήσιμο στη μελέτη μεγάλων μορίων όπως είναι τα πολυπεπτίδια, τα οποία σε ένα φάσμα Raman θα έδιναν εκατοντάδες κορυφές [143]. Surface Enhanced Raman Spectroscopy (SERS): περιλαμβάνει τη λήψη φασμάτων σε δείγματα που είναι προσροφημένα στην επιφάνεια κολλοειδών σωματιδίων μετάλλων (συνήθως αργύρου, χρυσού ή χαλκού) ή σε τραχείες επιφάνειες των μετάλλων αυτών. Οι εντάσεις Raman είναι ανάλογες με το ηλεκτρικό πεδίο [143]. Surface-Enhanced Resonance Raman Spectroscopy (SERRS): αποτελεί συνδυασμό της SERS και της Resonance Raman spectroscopy, χρησιμοποιώντας ένα μήκος κύματος διέγερσης σε συντονισμό με τα μοριακά ηλεκτρονιακά επίπεδα [143]. Optical Tweezers Raman Spectroscopy (OTRS): χρησιμοποιείται για τη μελέτη μεμονωμένων σωματιδίων ή βιοχημικών διαδικασιών σε κύτταρα μέσω οπτικών λαβίδων [148]. Spatially Offset Raman Spectroscopy (SORS): είναι μια νέα μέθοδος για την ακριβή και αξιόπιστη χημική ανάλυση αντικειμένων όπου επισκιάζονται από επιφάνειες, όπως για παράδειγμα είναι η ανάλυση δισκίων σε μπουκάλια ή σε blister [149, 150]. [52]

67 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman Coherent anti-stokes Raman Spectroscopy (CARS): δυο δέσμες ακτινοβολίας χρησιμοποιούνται για να αλληλεπιδράσουν συντονιστικά με μια συγκεκριμένη μοριακή δόνηση και να παραχθεί μια συνεκτική anti-stokes δέσμη [151]. Raman Optical Activity (ROA): μετράει την δονητική οπτική δραστηριότητα μέσω της μικρής διαφοράς της έντασης της σκέδασης Raman από χειρόμορφα μόρια σε δεξιά- και αριστερά- κυκλικώς πολωμένο προσπίπτον φως [152] Εφαρμογές της φασματοσκοπίας Raman Η φασματοσκοπία Raman εφαρμόζεται σε πολλά πεδία της επιστήμης, όπως την ιατρική, τη φαρμακευτική, περιβαλλοντολογική, κ.ά. Οι δονητικές πληροφορίες είναι συγκεκριμένες για τους χημικούς δεσμούς και τη συμμετρία των μορίων, έτσι, κάθε φάσμα Raman αποτελεί ένα αποτύπωμα για το εξεταζόμενο μόριο. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί με επιτυχία στον ποιοτικό και ποσοτικό χαρακτηρισμό της μοριακής σύστασης στερεών, υγρών και αέριων δειγμάτων [139]. Με την in vivo λήψη φάσματος σε ανθρώπινο ιστό έχει ανοίξει ο δρόμος για πολλές εφαρμογές της φασματοσκοπίας Raman, κυρίως δερματολογικές αλλά και άλλες, όπως τη διάγνωση ασθενειών και τη μη επεμβατική ανίχνευση φαρμακευτικών προϊόντων [153]. Πρόσφατα η φασματοσκοπία Raman έχει ενταχθεί ως ένα από τα κύρια εργαλεία βιοϊατρικών εφαρμογών και κάνει σημαντική πρόοδο στο πεδίο κλινικής εκτίμησης. Χαρακτηριστική είναι η εφαρμογή της φασματοσκοπίας Raman σε βιολογικούς ιστούς καθώς είναι μια τεχνική σχετικά απλή, αναπαραγώγιμη, μη καταστροφική για τους ιστούς και απαιτεί μόνο μικρή ποσότητα υλικού (από μικρογραμμάρια έως νανογραμμάρια) [154]. Έχει γίνει πλέον μια τεχνική επιλογής για τους επιστήμονες που ενδιαφέρονται να μάθουν τις χημικές δομικές ιδιότητες φυσικών και συνθετικών ιστών [154]. Η μη αναγκαία προετοιμασία του δείγματος την καθιστά πολύ χρήσιμη για την ανάλυση βιολογικών δειγμάτων, σε αντίθεση με τις συνηθισμένες χρησιμοποιούμενες τεχνικές ανάλυσης όπως την ιστολογική μελέτη, την ανοσοϊστοχημική μελέτη ή την ηλεκτρονική μικροσκοπία. Μέχρι σήμερα, αναφέρονται στη βιβλιογραφία πολλές εφαρμογές της στη μελέτη και ανάλυση βιολογικών και βιογενών δειγμάτων όπως [53]

68 Σχετική ένταση Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman είναι διάφοροι μαλακοί ιστοί (επιθηλιακός ιστός [155], μαστός [ ], δέρμα [159, 160], κ.ά), οστά, πνεύμονας [161], σάλιο, DNA, αίμα, ερυθρά κύτταρα [162], καρκινικά κύτταρα [163] και πολλά άλλα [141, 154, 164]. Όσο αφορά την εφαρμογή της φασματοσκοπίας Raman στα οστά, έχουν πραγματοποιηθεί πολλές μελέτες που σχετίζονται με τη μελέτη των δομικών συστατικών του [70, 131, 165, 166], τις διαφοροποιήσεις των ιδιοτήτων του υλικού ανάλογα με την ηλικία ή κάποιες ασθένειες [125, 127, 167, 168], τη μελέτη ασθενειών των οστών [ ], τη μελέτη καλοηθών ή κακοηθών όγκων του οστού [164], την παρακολούθηση της διαδικασίας επούλωσης οστών [173, 174]. 2.5 Φασματοσκοπία Raman και Ποιότητα Οστού Φωσφορικά CH Προλίνη- Υδροξυπρολίνη Ανθρακικά Αμίδιο ΙΙΙ Αμίδιο Ι Μετατόπιση Raman (cm -1 ) Σχήμα 1: Φάσμα Raman οστού με τις χαρακτηριστικές κορυφές του. [54]

69 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman Στο Σχήμα 1 απεικονίζεται ένα φάσμα Raman οστού με τις χαρακτηριστικές κορυφές του. Αυτές είναι, για την ανόργανη φάση του οστού, η κύρια δόνηση των φωσφορικών ομάδων του βιοαπατίτη στους 960 cm -1 και τα ανθρακικά του στους ~1070 cm -1, ενώ για την οργανική φάση του οστού, χαρακτηριστικές είναι η περιοχή των αμινοξέων προλίνης-υδροξυπρολίνης στην περιοχή ~ cm -1, το αμίδιο ΙΙΙ, ΙΙ και το αμίδιο Ι του κολλαγόνου αλλά και η οξεία κορυφή στους ~2940 cm -1 που αποδίδεται δονήσεις του C-H δεσμού. Αναλυτικότερα, η περιοχή στους cm -1 δίνει πληροφορίες για το ανόργανο τμήμα του οστού. Χαρακτηριστικές είναι οι δονήσεις των φωσφορικών ομάδων και των ανθρακικών του βιοαπατίτη. Για τις ανθρακικές ομάδες αντιστοιχεί η δόνηση στους 1070 cm -1 [12, 68, 164, 175], ενώ για τις φωσφορικές ομάδες του αποδίδονται οι δονήσεις ν 1 στους 960 cm -1, ν 2 στους 430 και 450 cm -1, ν 3 στην περιοχή cm -1 και η ν 4 δόνηση φωσφορικών στους 587 και 604 cm -1 [12, 164, 171]. Να σημειωθεί ότι σε φυσιολογικό οστό, η κορυφή που οφείλεται στη δόνηση φωσφορικών ν 1 παρουσιάζεται στους 960 cm -1 [176] ενώ στον καθαρό υδροξυαπατίτη ασβεστίου (αβεστίτη) συναντάται στους 964 cm -1. Αυτό οφείλεται στη φτωχή κρυσταλλική φύση της ανόργανης φάσης του οστού [135]. Αντίστοιχα, η φασματική περιοχή από τους 1000 έως τους 1800 cm -1 περιέχει κυρίως συστατικά της οργανικής φάσης, που είναι κυρίως κολλαγόνο τύπου Ι. Για το κολλαγόνο υπάρχουν πολλές δονήσεις δεσμών που μπορούν να εξεταστούν και αφορούν χαρακτηριστικές ομάδες των αμινοξέων του, όπως είναι της προλίνης και της υδροξυπρολίνης, δονήσεις που αποδίδονται σε αμιδικούς δεσμούς ακόμα και σε δεσμούς της βασικής αλυσίδας της πρωτεΐνης. Αναφορικά, οι δονήσεις στους 1241 cm -1 και 1271 cm -1 αντιστοιχούν στο αμίδιο ΙΙΙ, στους 1452 cm -1 σε δονήσεις δch 2 πρωτεϊνών και στους 1660 cm -1 στο αμίδιο Ι του κολλαγόνου. Οι περιοχές και cm -1 αποδίδονται σε δονήσεις κάμψης και δονήσεις έκτασης των ομάδων CH, αντιστοίχως [12, 164]. Οι κορυφές των CH ομάδων συνήθως επικαλύπτουν τις μπάντες των λιπιδίων. Όμως, μια ευδιάκριτη μπάντα στα 2852 cm -1 οφείλεται αναμφίβολα σε λιπίδια του οστού [164, 171]. Οι σχετικές εντάσεις των περιοχών cm -1 και της C-H δόνησης έκτασης μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη μελέτη της αναλογίας των λιπιδίων, πρωτεϊνών και ανόργανων συστατικών του οστού [171]. [55]

70 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman Πίνακας 2: Χαρακτηριστικές δονήσεις φασματοσκοπίας Raman από δείγματα οστών [171]. Μετατόπιση Raman (cm -1 ) Απόδοση κορυφής ν 2 PO ν 2 PO 3-4, Υδροξυπρολίνη ν 4 PO ν 4 PO P-OH stretch, ν(c-c) δακτύλιος Pro 946 ν(c-c) protein backbone ν 1 PO Phe, ν 3 HPO ν 3 PO 3-4, pro 1047 ν 3 PO 3-4, C-N stretch ν 1 CO Αμίδιο ΙΙΙ-β και random 1271 Αμίδιο ΙΙΙ 1323 Αμίδιο ΙΙΙ (α fibrous) 1342 Αμίδιο ΙΙΙ (α helix) 1542 Αμίδιο ΙΙ 1639 Αμίδιο Ι 1657 ν(c=c) cis (lipids), Αμίδιο Ι (α helix) 1670 Αμίδιο Ι 1684 Αμίδιο Ι (β-sheet and disordered) 2936 ν(ch 3 ) sym and ν(ch 2 ) asym, proteins and ν(ch 3 ) sym, lipids Η φασματοσκοπία Raman αποδίδει τουλάχιστον τέσσερις δείκτες για τη μελέτη της ποιότητας των οστών. Αυτοί είναι: ο λόγος του ανόργανου συστατικού (βιοαπατίτης) προς το οργανικό συστατικό (συνήθως, αμίδιο Ι του κολλαγόνου), (Mineral to Matrix Ratio, MMR), ο λόγος των ανθρακικών προς τα φωσφορικά (Carbon to Phosphate Ratio, CPR), η κρυσταλλικότητα του βιοαπατίτη και η ποιότητα του δικτύου του [56]

71 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman κολλαγόνου, δηλαδή, ο λόγος των σταυροδεσμών του (μη αναγώγιμοι προς αναγώγιμους σταυροδεσμούς) [127]. Λόγος ανόργανου προς οργανικό συστατικό (Mineral to Matrix Ratio, MMR) Ο λόγος της κορυφής των φωσφορικών που προκύπτει από την ολοκλήρωση της περιοχής του βιοαπατίτη προς την περιοχή του αμιδίου (συνήθως του αμιδίου Ι). Είναι αντιπροσωπευτικός του ποσοστού του ανόργανου συστατικού προς το κολλαγόνο και αποτελεί μια μέτρηση του BMD [177]. Γενικότερα, ο λόγος αυτός θεωρείται χρήσιμος καθώς μπορεί να περιγράψει εάν ο οστίτης ιστός είναι υπέρ- ή υποασβετοποιημένος μιας και υπολογίζει και τα δυο κύρια συστατικά του οστού (το βιοαπατίτη και το κολλαγόνο), κι επειδή το οστό θεωρείται ένα σύνθετο υλικό, η μηχανική του απόδοση εξαρτάται από την ποσότητα και την ποιότητα και των δυο αυτών υλικών [178]. Το αρνητικό αυτής της παραμέτρου είναι ότι επειδή πρόκειται για λόγο, η σταθερή τιμή του μπορεί να σημαίνει είτε καμία αλλαγή στα υλικά του οστού είτε ταυτόχρονη αλλαγή. Έτσι, είναι πιο χρήσιμη όταν συνδυάζεται με τα αποτελέσματα άλλης τεχνικής όπως για παράδειγμα της SEM [179], η οποία παρέχει πληροφορίες για τη συνολική κατανομή της ανόργανης φάσης σε μικροσκοπικό επίπεδο [178]. Η επιλογή της περιοχής της οργανικής φάσης που θα χρησιμοποιηθεί εξαρτάται από την οργανολογία και την ευαισθησία στον προσανατολισμό των ινιδίων του κολλαγόνου. Στα φάσματα Raman που προέρχονται από δείγματα υψηλού προσανατολισμού οι λόγοι ανόργανο/οργανικό συστατικό εξαρτώνται από την πολωσιμότητα των περιοχών που χρησιμοποιούνται για να υπολογιστούν. Μελέτες που πραγματοποιήθηκαν με πολωμένο Raman σε ανθρώπινους οστίτες ιστούς έδειξαν ότι η περιοχή του αμιδίου Ι του κολλαγόνου, που σχετίζεται κυρίως με δονήσεις έκτασης C=O, είναι ευαίσθητη στον προσανατολισμό των ινιδίων κι έτσι αναμένονται πολλές διαφοροποιήσεις στις εντάσεις των κορυφών αυτής της περιοχής [180]. Αντίθετα, οι δονήσεις των προλινών που οφείλονται σε δ(cch) και/ή ν(cc) δονήσεις έντασης, δεν είναι τόσο ισχυρά πολωμένες όσο του αμιδίου Ι. Για το λόγο αυτό, οι 3- μετρήσεις που χρησιμοποιούν στο λόγο ανόργανο/οργανικό συστατικό ν 1 PO 4 / [57]

72 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman (Pro+Hyp) επηρεάζονται λιγότερο από τη διαφορετικότητα του προσανατολισμού [181, 182]. Λόγος ανθρακικών προς φωσφορικά (Carbonate to Phosphate Ratio, CPR) Τα ανθρακικά καταλαμβάνουν την μπάντα στα 1070 cm -1 στο φάσμα Raman του οστού και δείχνουν την υποκατάσταση των φωσφορικών θέσεων στο πλέγμα του απατίτη. Οι μετρήσεις του λόγου ανθρακικά/φωσφορικά (1070 cm -1 / 960 cm -1 ) δίνει πληροφορίες για τη χημική σύσταση των οστών καθώς ποικίλει με την αρχιτεκτονική του οστού, την ηλικία και την κρυσταλλικότητα του ανόργανου συστατικού [125, 126]. Ωστόσο, η περιοχή των ανθρακικών επικαλύπτεται μερικώς από την μπάντα των φωσφορικών περίπου στα 1076 cm -1, που σημαίνει ότι μπορεί να μειωθεί η ακρίβεια της μέτρησης, ειδικά για απατίτες με χαμηλό ποσοστό ανθρακικών. Για το λόγο αυτό, η μέτρηση έχει βαθμονομηθεί και χρησιμοποιείται για τον καθορισμό του ποσοστού των ανθρακικών σε βοοειδή οστά (περίπου 7.7%). Άλλη παράμετρος που συμπεριλαμβάνει τα ανθρακικά είναι ο λόγος ανθρακικά προς το αμίδιο Ι (1665 cm - 1 ), που πιθανόν δείχνει την οστική ανακατασκευή [127, 183]. Κρυσταλλικότητα Βιοαπατίτη Η αντοχή του οστού δεν εξαρτάται μόνο από το βαθμό ασβεστοποίησης αλλά και από βαθμό της κρυσταλλικότητας του βιοαπατίτη. Για τη μέτρησή της χρησιμοποιείται το εύρος της κύριας μπάντας φωσφορικών στους 960 cm -1 και συγκεκριμένα μετριέται το πλάτος κατανομής στο μισό του ύψους του (full-width half-maximal, FWHM), σε cm -1, ή και το αντίστροφό του [127]. Οι αλλαγές του ανόργανου συστατικού που προκύπτουν από την ηλικία του ιστού δίνουν και πληροφορίες για την ωρίμανση του βιοαπατίτη μέσα στο ίδιο το δείγμα. Για παράδειγμα, όχι μόνο το περιεχόμενο σε ανθρακικά αλλά και ο τύπος της υποκατάστασης (ο τύπος Α αντιπροσωπεύει τα ανθρακικά στη θέση υδροξυλίων, ο τύπος Β αντιπροσωπεύει τα χαλαρά απορροφημένα ανθρακικά στην επιφάνεια) αλλάζει με την ηλικία του ιστού [184], επηρεάζοντας τη διαλυτότητα και την κρυσταλλικότητα (σχήμα και μέγεθος) των κρυστάλλων του βιοαπατίτη [178]. [58]

73 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman Η συμβολή της κρυσταλλικότητας του βιοαπατίτη στη δύναμη του οστού ίσως είναι σημαντικότερη στην περίπτωση των οστεοπορωτικών οστών, που θεραπεύονται με φθόριο. Σε αυτήν την περίπτωση, το οστό γίνεται πιο εύθραυστο καθώς αυξάνεται η κρυσταλλικότητα λόγω της χημικής επίδρασης του φθορίου στους βιολογικούς απατίτες [178, 185]. Δίκτυο κολλαγόνου Το αμίδιο Ι και το αμίδιο ΙΙ δίνουν δονήσεις κοντά στα 1650 και 1550 cm -1 αντίστοιχα, και μπορεί να υποστούν αλλαγές στη συχνότητα και στην ένταση λόγω αλλαγών της δευτεροταγούς δομής της πρωτεΐνης. Πληροφορίες για την δομή της πρωτεΐνης αποκτούνται από την ευρύτερη περιοχή του αμιδίου Ι και τις κορυφές που συνίσταται [178]. Μεταξύ των κορυφών που αποτελούν την περιοχή του αμιδίου Ι, δυο έχουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον στη μελέτη του κολλαγόνου: μια στους ~1660 cm -1 και μια στους ~1690 cm -1. Σε μελέτες οστού, μετατόπιση της κορυφής από 1665 στα 1678 cm -1 στην περιοχή του αμιδίου Ι, αποτελεί ένδειξη σπασμένων σταυροδεσμών του κολλαγόνου [168], ενώ οι λόγοι των εμβαδών των παραπάνω κορυφών αποτελούν δείκτη της ποιότητας του δικτύου του κολλαγόνου [127]. Ο λόγος αυτός, μη αναγώγιμοι/αναγώγιμοι σταυροδεσμοί του κολλαγόνου (περίπου ο λόγος 1660/1690 cm -1 ) σχετίζεται με το βαθμό της ωρίμανσης του κολλαγόνου με το πέρασμα του χρόνου [128, 129] και με το βαθμό των σταυροδεσμών που έχουν αναχθεί ως απόκριση σε μηχανικά ερεθίσματα [186, 187]. Πειραματικά έχει βρεθεί ότι κατά την αποικοδόμηση του κολλαγόνου, η σχετική ένταση της πρώτης μειώνεται ενώ της δεύτερης αυξάνεται [32, 188]. Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι σε ανθρώπινα οστεοπορωτικά οστά [189] ο λόγος διαφέρει από αυτόν ενός υγιούς οστού, και συγκεκριμένα, είναι υψηλότερος στην πρώτη περίπτωση, ακόμα και αν οι τιμές του BMD είναι φυσιολογικές. Αυτό οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η κακή ποιότητα κολλαγόνου πιθανόν συμβάλει στην ευθραυστότητα του οστού [128]. Η ποιότητά του οστού καθορίζει σε μεγάλο βαθμό την αντοχή του οστού και τον κίνδυνο κατάγματος [190]. Ως αντοχή οστού ορίζεται η πίεση στο σημείο που του αποδίδεται πέρα από την παραμόρφωση που προκαλεί βλάβη στον ιστό. Η οριακή αντοχή είναι η μέγιστη πίεση που μπορεί να υποστεί το οστό, ενώ, η αντοχή [59]

74 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman σπασίματος είναι η πίεση στην οποία το οστό θα σπάσει. Στο οστό οι δυο αυτοί όροι συνήθως έχουν την ίδια ερμηνεία. Η τιμή της οριακής αντοχής του οστού εξαρτάται από τον τύπο της πίεσης και διαφέρει ανάλογα με την κατεύθυνση [94]. Παθολογικές αλλαγές που συμβαίνουν με την ηλικία και μέσω διαφόρων ασθενειών οδηγούν σε συνθετικές και δομικές αλλαγές του οστού, όπως είναι η απώλεια της ανόργανης μάζας στην οστεοπόρωση [191], η μη ενζυματική γλυκοζυλίωση του κολλαγόνου τύπου Ι στους διαβητικούς [170, 192] ή η ταυτόχρονη επιδείνωση της ανόργανης και της οργανικής φάσης του οστού σε φλεγμονώδεις ασθένειες όπως τη ρευματοειδή αρθρίτιδα [193, 194]. Αυτές οι αλλαγές επηρεάζουν την αντοχή του οστού και τη σκληρότητα, που δεν μπορούν να μετρηθούν μη επεμβατικά ή να προβλεφθούν με τις τρέχουσες κλινικές μεθοδολογίες [172]. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η τεχνική DEXA είναι η πιο κοινή μέθοδος για τη διάγνωση της οστεοπενίας και της οστεοπόρωσης. Ωστόσο, η οστική πυκνότητα (BMD) αποτελεί ένα μέτριο και αμφιλεγόμενο προγνωστικό δείκτη του κινδύνου ενός κατάγματος [87, ]. Η σύνθετη σύσταση και δομή του οστού εξηγεί τον περιορισμό της DEXA να προβλέπει με ακρίβεια την ευαισθησία σε κατάγματα. Η δομική διάταξη ολόκληρου του οστού έχει σημαντική επίδραση στη λειτουργία του [103]. Δεδομένης της σημασίας της δομής του, δεν μπορεί να γίνει συσχετισμός μεταξύ του BMD μόνο και της αντοχής του οστού [200]. Μηχανικές μελέτες ex vivo ανέφεραν σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ του BMD και ολόκληρης της αντοχής του οστού με διάφορους τρόπους φόρτισης [ ]. Ωστόσο, αυτές οι μετρήσεις που βασίζονται στην αντοχή δεν υπολογίζουν την κούραση του οστού που υφίσταται ή την αντοχή του σε θραύση, που είναι σημαντικές εκτιμήσεις για τον καθορισμό της ποιότητας του οστού και για την πρόβλεψη της ευθραυστότητας σε περίπτωση κατάγματος [172]. Η σχέση μεταξύ του BMD και του κινδύνου κατάγματος είναι πολύπλοκη [203]. Υπάρχει επομένως ανάγκη, για εξελιγμένες διαγνωστικές τεχνικές με δυνατότητες ανίχνευσης μεταβολών του οστού και να πρόβλεψης της αντοχής ανεξάρτητα από λειτουργικές ιδιότητες [172]. Η φασματοσκοπία Raman παρέχει πληροφορίες μοριακής σύστασης που σχετίζονται με τον κίνδυνο κατάγματος και με την αντοχή του οστού σε θραύση [127, 172]. Το [60]

75 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman φάσμα Raman μπορεί να αναδείξει ιδιότητες της σύστασης του οστού που σχετίζονται με τις μηχανικές του ιδιότητες. Παρέχει ένα πλούτο συνθετικών και φυσικοχημικών δεδομένων για τα οστά, όπως είναι η κρυσταλλικότητα της ανόργανης φάσης, ο βαθμός της ασβεστοποίησης και ο βαθμός των υποκαταστάσεων των ανθρακικών ιόντων στις στοιχειομετρικές θέσεις φωσφορικών, που το καθένα μπορεί να επιδρά στη μηχανική λειτουργία τους [125]. Ο λόγος του ανόργανου προς το οργανικό συστατικό και ο λόγος ανθρακικών προς την οργανική φάση είναι οι πιο δυνατοί προγνωστικοί δείκτες των μηχανικών ιδιοτήτων. Η κρυσταλλικότητα που σχετίζεται επίσης με τους λόγους αυτούς, αναφέρεται στην ελαστικότητα και στην πίεση κατάγματος [204]. Για παράδειγμα, η μειωμένη ικανότητα ελαστικής παραμόρφωσης οστών αυξημένης ηλικίας σχετίζεται με την αυξημένη ασβεστοποίηση του κολλαγόνου, την κρυσταλλικότητα και την υποκατάσταση ανθρακικών της ανόργανης φάσης [125]. Επιπλέον, έρευνα που πραγματοποιήθηκε σε οστά από γυναίκες με και χωρίς οστεοπορωτικά κατάγματα [183] έδειξε διαφορές στη σύσταση του οστού που ανιχνεύτηκαν με φασματοσκοπία Raman. Συγκεκριμένα, φάνηκε μεγαλύτερος βαθμός ανθρακικών υποκαταστάσεων στην ανόργανη φάση στις γυναίκες με οστεοπορωτικά κατάγματα [183]. Αυτά τα ευρήματα δείχνουν ότι οι μετρήσεις της σύστασης του οστού με φασματοσκοπία Raman μπορεί να αποτελούν σημαντικούς δείκτες πρόβλεψης κατάγματος και του σκελετικού μεταβολισμού σε μεταστατικές ασθένειες του οστού [190]. 2.6 Μελέτες σχετικά με την Ποιότητα του Οστού της Ανθρώπινης Κάτω Γνάθου Όπως έχει αναφερθεί, ένας σημαντικός λόγος της αναγκαιότητας της εκτίμησης της ποιότητας του οστού της γνάθου είναι η σωστή τοποθέτηση οδοντικών εμφυτευμάτων. Επειδή τα οδοντικά εμφυτεύματα τοποθετούνται κυρίως σε επαφή με το σπογγώδες οστό είναι χρήσιμη η γνώση της μικροαρχοτεκτονικής του ανάλογα με την περιοχή της γνάθου, την οδοντική κατάσταση όπως επίσης και ανάλογα με το φύλο [205]. Ωστόσο, χρήσιμη είναι και η γνώση των ιδιοτήτων του συμπαγούς και του φατνιακού οστού για ολοκληρωμένη εκτίμηση της ποιότητας του οστού της κάτω [61]

76 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman γνάθου. Ετσι, μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί εφαρμόζοντας τεχνικές που χρησιμοποιούνται κυρίως σε κλινικό επίπεδο. Το 2003 έγινε προσπάθεια εκτίμησης της ποιότητας ανθρώπινων γνάθων εφαρμόζοντας μετρήσεις ελαστικότητας και αξονικής τομογραφίας (CT) σε φρέσκα οστά. Η έρευνα αυτή έδειξε ότι η περιοχή των προγομφίων είναι η πιο "ισχυρή" μηχανικά περιοχή της γνάθου. Σύγκριση όμως των αποτελεσμάτων από την αξονική τομογραφία και του μέτρου της ελαστικότητας ανέδειξε μια αδύναμη γραμμική σχέση μεταξύ τους [206]. Επιπλέον μελέτες ακολούθησαν με χρήση αξονικής τομογραφίας. Το 2010 ο Fernandes τη χρησιμοποίησε για να μετρήσει το χώρο του ενδοφατνιακού οστού και το πάχος του συμπαγούς οστού ώστε να διευκολύνεται η σωστή τοποθέτηση οδοντικού εμφυτεύματος [207], ενώ πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η άκρη στην περιοχή του οριζόντιου κλάδου κατέχει το μεγαλύτερο πάχος στρώματος συμπαγούς οστού στο σύνολό της [208]. Άλλη μελέτη με την τεχνική micro-ct αναφέρει ότι παρατηρήθηκε γενική συμφωνία μεταξύ της πυκνότητας των οστών και των δεικτών από τη micro-ct, με το σπογγώδες οστό στην πρόσθια περιοχή της γνάθου να παρουσιάζει υψηλότερες τιμές πυκνότητας από την οπίσθια [209]. Μελέτη έχει πραγματοποιηθεί και με την τεχνική DEXA που εφαρμόστηκε σε κάτω γνάθους ανδρών και γυναικών. Η έρευνα αυτή έδειξε αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ της ηλικίας και της οστικής πυκνότητας στο τμήμα του κλάδου. Η οστική πυκνότητα της περιοχής των κοπτήρων-κυνόδοντα (πρόσθιο μέρος γνάθου) φαίνεται να είναι υψηλότερη από την πυκνότητα των άλλων τμημάτων του οστού, ενώ τα αρσενικά έχουν υψηλότερη οστική πυκνότητα από τα θηλυκά σε όλα τα τμήματα που αναλύθηκαν. Τέλος, αναφέρει ότι η πυκνότητα των οστών της κάτω γνάθου επηρεάζεται από την ηλικία και το φύλο, με διαφορετικούς τρόπους ανάλογα με το τμήμα της κάτω γνάθου, ενώ η οδοντική κατάσταση δε φαίνεται να επηρεάζει την πυκνότητα των οστών της κάτω γνάθου [210]. Σε αντιπαράθεση, πρόσφατη έρευνα αναφέρει ότι η περιοχή των γομφίων τόσο στους άνδρες όσο και στις γυναίκες παρουσιάζει υψηλότερες τιμές BMD που λήφθηκαν με αξονική τομογραφία [208]. [62]

77 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman Επιπλέον, άλλη έρευνα έδειξε ότι οι τιμές του BMD δε διέφεραν αισθητά στο φατνιακό και στη βάση του οστού, ενώ, κατά μήκος της γνάθου ο προσανατολισμός των κρυστάλλων του βιοαπατίτη ήταν υψηλότερος στη βάση και χαμηλός στη φατνιακή περιοχή [97]. Ύστερα από μελέτες, βρέθηκε ότι η αντοχή του οστού της κάτω γνάθου διαφέρει ανάλογα με την μικροδομή του οστού. Συγκεκριμένα, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το οστό που είναι λιγότερο οργανωμένο, όπως στη φατνιακή περιοχή, είναι ασθενέστερο. Ωστόσο, η αντοχή του οστού αυξάνεται με την παρουσία οστεόνων και τον προσανατολισμό τους αλλά και με τη φαινόμενη πυκνότητα [96]. Σε ανθρώπινα οστά κάτω γνάθου, η αντοχή του σπογγώδους οστού είναι πολύ λιγότερη από αυτή του συμπαγούς οστού, με τιμές οριακής αντοχής του σπογγώδους οστού να κυμαίνονται μεταξύ 1 και 20 MPa [94]. Επίσης βρέθηκε ότι το σπογγώδες οστό στο κέντρο της γνάθου (πρόσθια περιοχή γνάθου) παρουσιάζει υψηλότερες τιμές ακαμψίας, απόλυτης δύναμης συμπίεσης από την οπίσθια περιοχή [101]. Οι υψηλές δυνάμεις μάσησης που συμβαίνουν στην οπίσθια γνάθο μπορεί να είναι 2 ή 3 φορές υψηλότερες από αυτές στην πρόσθια περιοχή [101]. Τέλος, μελέτη με κύματα υπερήχων, αναφέρει ότι το συμπαγές οστό της γνάθου είναι ελαστικά ομογενές αλλά ανισότροπο (οι μηχανικές ιδιότητες εξαρτώνται από τη διεύθυνση φόρτισης) [101, 211]. Μια μεγάλη ανισοτροπία παρατηρείται σε νωδά και μη νωδά δείγματα στα τμήματα των κοπτήρων, τον προγομφίων και των γομφίων. Η υψηλότερη ανισοτροπία παρατηρείται στην περιοχή των κοπτήρων που οφείλεται στις πιέσεις που δέχεται η περιοχή αυτή λόγω των γλωσσικών μυών κατά την κατάποση και των εκφράσεων του προσώπου [205]. Η ανάπτυξη κυρίως μη επεμβατικών τεχνικών για την εκτίμηση της αρχιτεκτονικής και των μηχανικών ιδιοτήτων του οστού της κάτω γνάθου αποτελεί ένα σημαντικό εργαλείο για την οδοντιατρική και τη γναθοπροσωπική χειρουργική που θα χρησιμοποιηθεί στη θεραπεία καταγμάτων και στη σωστή τοποθέτηση οδοντικών εμφυτευμάτων. Σε αυτήν την κατεύθυνση οδεύει η φασματοσκοπία Raman ως μια μέθοδος που παρέχει δομικές και μηχανικές πληροφορίες με μη επεμβατικό [63]

78 Κεφάλαιο 2 Εκτίμηση της Ποιότητας Οστών Εγκαθιδρυμένες Τεχνικές και η Φασματοσκοπία Raman χαρακτήρα [153] συνεκτιμώντας το οργανικό συστατικό του οστού, το κολλαγόνο, το οποίο συμβάλει στις ιδιότητες του οστού. 2.7 Σκοπός της παρούσας εργασίας Η εκτίμηση της ποιότητας του οστού της κάτω γνάθου αποτελεί ένα πολύ σημαντικό κομμάτι της οδοντιατρικής. Η παράμετρος που χρησιμοποιείται συχνότερα για να δίνεται μια εικόνα της κατάστασης του οστού, είναι η πυκνότητά του. Αυτή μετράται κλινικά με μη επεμβατικές τεχνικές που όμως χρησιμοποιούν ακτινοβολία-χ. Ένα ακόμη μειονέκτημά τους είναι η απόκρισή τους μόνο στο ανόργανο συστατικό του οστού (βιοαπατίτης) χωρίς να λαμβάνουν υπόψη τους το οργανικό (κυρίως κολλαγόνο τύπου Ι), το οποίο όμως και αυτό υφίσταται αλλοιώσεις. Έτσι, δημιουργήθηκε η ανάγκη για ανάπτυξη νέων τεχνικών, όπως είναι και η φασματοσκοπία Raman, η οποία αποδίδει στην ποιότητα οστού ένα σύνολο δομικών, φυσικοχημικών και βιολογικών παραμέτρων που σχετίζονται με την αντοχή του όπως είναι ο λόγος ανόργανης/οργανικής φάσης, το μέγεθος των κρυσταλλιτών του βιοαπατίτη, ο προσανατολισμός των ινών του κολλαγόνου, η ποσότητα και το είδος των σταυροδεσμών του, κ.α Η φασματοσκοπία Raman μπορεί να δώσει πληροφορίες τόσο για την ποσότητα του ανόργανου συστατικού το οποίο προσδίδει υψηλή μηχανική αντοχή όσο και για την κατάσταση του δικτύου του κολλαγόνου, το οποίο επίσης συμβάλει στις μηχανικές ιδιότητες του οστού, με βασικό πλεονέκτημά της, την εφαρμογή της σε ζωντανούς ιστούς. Κύριος σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η ανάδειξη της φασματοσκοπίας Raman ως ένα κλινικό εργαλείο για την εκτίμηση της ποιότητας της κάτω γνάθου. [64]

79 Κεφάλαιο 3 ο Συλλογή Υλικών και Μέθοδος 3.1 Συλλογή και Κατεργασία Δειγμάτων Για την πραγματοποίηση της μελέτης αυτής χρησιμοποιήθηκαν συνολικά έντεκα ανθρώπινα οστά κάτω γνάθου χαρακτηρισμένα με τα γράμματα K, L, M, N, O, P, Q, R, S, T και Sliced. Από τις γνάθους αυτές, η τελευταία είχε κοπεί με τροχό σε μικρότερες εγκάρσιες τομές πάχους περίπου 1 cm. Οι γνάθοι προήλθαν από χωνευτήριο οστών. Εικόνα 30: Τομή από ανθρώπινη γνάθο Ενυδάτωση Οστού Όπως προαναφέρθηκε τα οστά ήταν εκτεθειμένα σε περιβαλλοντικές συνθήκες με αποτέλεσμα να επέρχεται φυσική αφυδάτωση και το κολλαγόνο σταδιακά να αλλοιώνεται. Για τη μελέτη λοιπόν της μεταβολής του κολλαγόνου λόγω του τρόπου συντήρησης των δειγμάτων ήταν αναγκαία η ενυδάτωση μιας τομής μιας γνάθου. Η ενυδάτωση πραγματοποιήθηκε με την τοποθέτηση της τομής σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών, PBS (Phosphate Buffered Saline solution). Για την παρασκευή του ακολουθήθηκε η εξής διαδικασία: [65]

80 Κεφάλαιο 3 Συλλογή Υλικών και Μέθοδος 1. Διάλυση σε 800 ml απεσταγμένου H 2 Ο, των: 8 g NaCl 0.2 g KCl 1.44 g Na 2 HPO g KH 2 PO 4 2. Ρύθμιση του ph σε Προσθήκη απεσταγμένου H 2 Ο έως τελικό όγκο 1L. Το PBS είναι ένα ρυθμιστικό διάλυμα που χρησιμοποιείται ευρέως σε βιολογικές έρευνες. Είναι ένα υδατικό διάλυμα άλατος που περιέχει χλωριούχο νάτριο, φωσφορικό νάτριο και σε μερικά σκευάσματα χλωριούχο κάλιο και φωσφορικό κάλιο. Οι φωσφορικές ομάδες του διαλύματος συμβάλουν στη διατήρηση σταθερού ph. Επιπλέον, το διάλυμα είναι ισοτονικό και μη τοξικό για τα κύτταρα με αποτέλεσμα να χρησιμοποιείται για διάλυση ουσιών και έκπλυση κυττάρων. Παράδειγμα αποτελεί η σύνθεση γέλης (gel) κολλαγόνου προσθέτοντας διάλυμα PBS σε μονομερές διάλυμα κολλαγόνου, εξουδετερώνοντας το ph και διευκολύνοντας τη δημιουργία ινιδίων [212]. Βασικό προτέρημα του PBS είναι ότι συμβάλει στην αποφυγή διάλυσης του βιοαπατίτη, της ανόργανης φάσης του οστού Υπολογισμός Πυκνότητας Οστού Κατά την πορεία των πειραμάτων, προέκυψε η ανάγκη να υπολογιστεί η πυκνότητα του υλικού. Από τις γνάθους που χρησιμοποιήθηκαν, επελέγησαν δυο από αυτές (Ο και Ρ) για τις οποίες είχε γίνει πιο εμπεριστατωμένη μελέτη. Οι γνάθοι αυτές κόπηκαν σε δώδεκα κάθετες τομές με τη βοήθεια τροχού. Οι τομές αυτές ονομάστηκαν από δεξιά προς αριστερά με το συμβολισμό α1, α2,.., α10, παραλείποντας τις τομές που είναι σημαδεμένες με Pb, όπως θα αναφερθεί παρακάτω. Στη συνέχεια, για την κάθε γνάθο επελέγησαν 2 τομές για την Ρ και 1 τομή για την Ο, με τις οποίες υπολογίστηκε η πυκνότητα του συμπαγούς αλλά και του σπογγώδους μέρους τους. Αναλυτικότερα, ακολουθήθηκε η εξής διαδικασία: [66]

81 Κεφάλαιο 3 Συλλογή Υλικών και Μέθοδος Ζύγισμα τομής. Απομάκρυνση του σπογγώδους οστού με χρήση σφυριού και dremel, ώστε να μείνει μόνο το συμπαγές οστό. Εικόνα 31: Τομή κάτω γνάθου ύστερα από την απομάκρυνση του σπογγώδους οστού. Ζύγισμα του συμπαγούς οστού και υπολογισμός της μάζας του σπογγώδους, ύστερα από την αφαίρεση της μάζας του συμπαγούς οστού από τη μάζα ολόκληρης της τομής. Υπολογισμός της πυκνότητας του συμπαγούς οστού, με το φαινόμενο της άνωσης. Αναλυτικότερα, η τομή τοποθετήθηκε σε ογκομετρικό σωλήνα που περιείχε συγκεκριμένη ποσότητα νερού. Χρησιμοποιώντας τη διαφορά του όγκου του νερού που προέκυψε με την εμβάπτιση της τομής και τη μάζα της, υπολογίστηκε η πυκνότητα του δείγματος. Υπολογισμός της πυκνότητας του σπογγώδους οστού. Για τον υπολογισμό της πυκνότητας του σπογγώδους οστού μετρήθηκε ο όγκος νερού που χρειάστηκε για να πληρωθεί η επιφάνεια που καλύπτει το σπογγώδες οστό εντός του συμπαγούς. Για να γίνει αυτό, το οστό τοποθετήθηκε σε αδιάβροχη επιφάνεια και με τη χρήση προχοΐδας πληρώθηκε με νερό ο χώρος που καταλαμβάνει το σπογγώδες οστό. 3.2 Οργανολογία Πέρα από τα φασματόμετρα Raman που αποτέλεσαν τα βασικά εργαλεία για την πραγματοποίηση της παρούσας εργασίας, χρησιμοποιήθηκαν και άλλες τεχνικές ώστε να γίνει σύγκριση και αξιολόγηση των αποτελεσμάτων της φασματοσκοπίας Raman. Έτσι, σύγκριση ενός μέρους των αποτελεσμάτων της φασματοσκοπίας Raman, πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της τεχνικής DEXA (Dual-Energy X-ray [67]

82 Κεφάλαιο 3 Συλλογή Υλικών και Μέθοδος Absorptiometry), με τη βοήθεια της οποίας καταγράφηκαν τιμές οστικής πυκνότητας (BMD) για δυο γνάθους. Η λήψη των μετρήσεων πραγματοποιήθηκε στη Μαγνητική Πατρών, με χρήση του μοντέλου GE Lunar DPX Φασματόμετρα Raman Χρησιμοποιήθηκαν δυο είδη φασματόμετρων, ένα με μετασχηματισμό Fourier (FT- Raman) και ένα φασματόμετρο συζευγμένο με οπτικό μικροσκόπιο (micro-raman). Το καθένα χρησιμοποιούσε ακτινοβολία διαφορετικού μήκους κύματος ενώ η ισχύς της και η διακριτική ικανότητα (resolution) ρυθμίζονταν πριν τη λήψη φασμάτων. Το micro-raman πλεονεκτεί έναντι του FT-Raman στο ότι μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη πολύ μικρής περιοχής του δείγματος με τη βοήθεια του συζευγμένου μικροσκοπίου. Το μικρό μήκος κύματος του lazer είναι το βέλτιστο για την ανάλυση μικρών χαρακτηριστικών του δείγματος και επειδή λειτουργεί στο ορατό, το σήμα του είναι πολύ πιο ισχυρό. Επιπλέον, είναι πιο ευαίσθητη τεχνική και προσφέρει υψηλότερη διακριτική ικανότητα. Πίνακας 3: Χαρακτηριστικά των φασματόμετρων Raman που χρησιμοποιήθηκαν για την καταγραφή των φασμάτων. Επιλεγμένο Διακριτική Ισχύς μήκος Είδος Όργανο Μοντέλο Εταιρεία ικανότητα Χαρακτηριστικά (mw) κύματος ανιχνευτή (cm -1 ) (nm) Φασματόμετρο FT- Έως LN 2 -cooled Ge Raman με FRA-106/S Bruker Raman 500 (D 418) μετασχηματισμό Fourier Φασματόμετρο Renishaw Raman με Micro- invia Έως Renishaw CCD συνεστιακό Raman Raman 250 μικροσκόπιο Microscope Leica (20x φακό) [68]

83 Κεφάλαιο 3 Συλλογή Υλικών και Μέθοδος Καταγραφή φασμάτων με FT-Raman Η διάταξη που χρησιμοποιήθηκε περιέχει Nd:YAG laser με μήκος κύματος 1064 nm, ονομαστική ισχύ 500 mw και ρυθμισμένη διακριτική ικανότητα (resolution) στα 4 cm -1. Ένα δεύτερο φίλτρο χρησιμοποιήθηκε για την απομάκρυνση της ακτινοβολίας Rayleigh, ενώ η σκεδαζόμενη ακτινοβολία συλλέχθη σε γωνία 180 ο (backscattering mode). Πριν την λήψη μετρήσεων από το δείγμα, γινόταν ευθυγράμμιση και μεγιστοποίηση του σήματος με δείγμα θείου (S). Χρησιμοποιώντας τη φασματοσκοπία FT-Raman συλλέχθηκαν φάσματα για όλες τις γνάθους. Πιο αναλυτικά, κάθε γνάθος είχε χωριστεί σε τρεις νοητές περιοχές, τη δεξιά, τη μέση και την αριστερή (Εικόνα 32). Για κάθε περιοχή καταγράφηκαν πέντε φάσματα, ξεκινώντας πάντα από δεξιά προς αριστερά. Η απόσταση μεταξύ δυο γειτονικών σημείων είναι περίπου 1 cm, ενώ σημεία με κοιλότητες ή κάποια ανομοιομορφία αποφεύγονταν. Έτσι, συνολικά για την εξωτερική επιφάνεια κάθε γνάθου καταγράφηκαν δεκαπέντε φάσματα Raman, καθένα από τα οποία αποτελούσε το σύνολο 300 σαρώσεων (scans) με ισχύ ακτινοβολίας 450 mw. Εικόνα 32: Ανθρώπινη γνάθος χωρισμένη σε τρεις νοητές περιοχές. [69]

84 Κεφάλαιο 3 Συλλογή Υλικών και Μέθοδος Εικόνα 33: Θάλαμος δείγματος FT-Raman. Τοποθέτηση δείγματος (γνάθου) ώστε να ληφθεί φάσμα στο μέσο τμήμα της. Τα φάσματα Raman που καταγράφηκαν για τις δέκα γνάθους (Κ-Τ) παρατίθενται στο Παράρτημα Α Καταγραφή φασμάτων με micro-raman Η άλλη διάταξη που χρησιμοποιήθηκε ήταν φασματόμετρο Raman συζευγμένο με μικροσκόπιο (micro-raman). Το micro-raman χρησιμοποιεί ακτινοβολία στην περιοχή του ορατού (785 nm), μέσω ενός 20x φακού, με ονομαστική ισχύ 250 mw. Το όργανο έχει ρυθμισμένη διακριτική ικανότητα (resolution) 2 cm -1 ενώ το φράγμα περίθλασης έχει 1200 γραμμές/mm. Το λογισμικό χειρισμού του οργάνου είναι το WiRE 2.0. Για την καταγραφή φασμάτων στην τομή της γνάθου, ο χρόνος έκθεσης του δείγματος στην ακτινοβολία ήταν ρυθμισμένος στα 10 sec, ο αριθμός των σαρώσεων ήταν 5 και η ισχύς της ακτινοβολίας στο 80% της μέγιστης ισχύος του laser (δηλαδή 60 mw). Η επιλογή της έντασης της ακτινοβολίας έγινε ύστερα με δοκιμές. Παρατηρήθηκε ότι με τη χρήση υψηλότερης έντασης του laser, σε κάποια σημεία υπήρξε κορεσμός και σε κάποια άλλα σημεία το δείγμα κάηκε (Εικόνα 34). Επιπλέον, για κάθε σημείο του δείγματος λήφθηκαν μετρήσεις για τρεις ξεχωριστές φασματικές περιοχές, cm -1, cm -1 και cm -1. Με αυτόν το τρόπο, σε μικρότερο εύρος κατανέμονται περισσότερα φωτόνια. Πριν από τις μετρήσεις των δειγμάτων γινόταν καταγραφή της κορυφής πυριτίου (Si) στα 785 nm για τον έλεγχο της έντασης του laser και για τον έλεγχο μετατόπισης του κυματάριθμου. [70]

85 Σχετική ένταση Κεφάλαιο 3 Συλλογή Υλικών και Μέθοδος Εικόνα 34: Εικόνα από το οπτικό μικροσκόπιο του micro-raman, από σημείο οστού που κάηκε λόγω της υψηλής ισχύος της ακτινοβολίας. Η μαύρη τρύπα δείχνει το καμένο σημείο Μετατόπιση Raman (cm -1 ) Σχήμα 2: Φάσμα micro-raman της τεμαχισμένης γνάθου, 5 σαρώσεων με ένταση ακτινοβολίας 80%, για την περιοχή cm -1. [71]

86 Σχετική ένταση Σχετική ένταση Κεφάλαιο 3 Συλλογή Υλικών και Μέθοδος Μετατόπιση Raman (cm -1 ) Σχήμα 3: Φάσμα micro-raman της τεμαχισμένης γνάθου, 5 σαρώσεων με ένταση ακτινοβολίας 80%, για την περιοχή cm Μετατόπιση Raman (cm -1 ) Σχήμα 4: Φάσμα micro-raman της τεμαχισμένης γνάθου, 5 σαρώσεων με ένταση ακτινοβολίας 80%, για την περιοχή cm -1. [72]

87 Σχετική ένταση Κεφάλαιο 3 Συλλογή Υλικών και Μέθοδος Στην αρχή των πειραματικών μετρήσεων, έγινε η κατάλληλη επιλογή της έντασης ακτινοβολίας, συγκρίνοντας φάσματα που ακτινοβολήθηκαν με διαφορετική ένταση του laser. Όπως φαίνεται και από το σχήμα 5, τα φάσματα εντάσεως 10-60% δε δείχνουν όλες τις κορυφές καθαρά, σε αντίθεση με αυτά από 70 έως 100% ένταση που έχουν λιγότερο θόρυβο με αποτέλεσμα να διακρίνονται και οι μικρότερες κορυφές. Έτσι, επιλέχθηκε ότι τα φάσματα θα λαμβάνονται στο 60-80% της ισχύος του laser. 100% 100% 80% 70% 60% 50% 40% 20% 10% Μετατόπιση Raman (cm -1 ) Σχήμα 5: Φάσματα micro-raman από συμπαγές τμήμα του οστού, 5 σαρώσεων, για την περιοχή cm -1 με διαφορετική ένταση ακτινοβολίας, όπου 100% : 250 mw, 80% : 200 mw, 70% : 175 mw, 60% : 150 mw, 50% : 125 mw, 40% : 100 mw, 20% : 50 mw και 10% : 25 mw Καταγραφή Μετρήσεων Οστικής Πυκνότητας (BMD) Μετρήσεις της οστικής πυκνότητας πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση της τεχνικής DEXA. Οι μετρήσεις λήφθηκαν με τη βοήθεια του μοντέλου GE Lunar DPX. Σε κάθε γνάθο τοποθετήθηκαν στα άκρα τους δυο κομμάτια Pb, ο οποίος απορροφά την ακτινοβολία-χ, ως σημεία αναφοράς για τις μετρήσεις, δηλώνοντας δηλαδή την ως προς μέτρηση περιοχή της γνάθου. Δέκα συνολικά μετρήσεις του BMD λήφθηκαν για κάθε γνάθο, από την άνω μεριά του οστού (Εικόνα 35). Δηλαδή, ακτίνα με επιφάνεια [73]

88 Κεφάλαιο 3 Συλλογή Υλικών και Μέθοδος διατομής περίπου 0.2 cm 2 διέτρεχε εγκάρσια το οστό, συμπεριλαμβανομένου και του σπογγώδους τμήματος του οστού. Εικόνα 35: Απεικόνιση των σημείων λήψης μετρήσεων BMD σε οστό ανθρώπινης γνάθου. Οι μετρήσεις του BMD επηρεάζονται σε σημαντικό βαθμό λόγω της μορφολογίας του δείγματος, όπως είναι οι υψομετρικές διαφορές εξαιτίας των οδοντικών κενών για παράδειγμα, η διαφορετική πυκνότητα του συμπαγούς και του σπογγώδους οστού, αλλά και ανομοιομορφία στη μάζα του οστού. Έτσι, έπρεπε να δημιουργηθεί ένας όρος ο οποίος θα συνυπολογίζει και αυτές τις ανατομικές παραμέτρους. Αρχικά, οι τιμές του BMD διαιρέθηκαν με το ύψος του δείγματος σε κάθε κάθετο σημείο όπου μετρήθηκε [BMD / Height], ώστε να καλυφθούν οι υψομετρικές διαφορές. Έπειτα το κάθε δείγμα τεμαχίστηκε με τροχό σε δέκα εγκάρσιες τομές, ανάλογα με τα σημεία όπου είχαν καταγραφεί μετρήσεις BMD. Ακολούθησε ο υπολογισμός της πυκνότητας του συμπαγούς και του σπογγώδους οστού (Ενότητα 3.1.2) με σκοπό να συνυπολογιστεί στις μετρήσεις του BMD η επίδραση της γεωμετρίας του υλικού (Παράρτημα Β). Έτσι, οι τιμές του BMD διαιρέθηκαν με το γινόμενο του ύψους επί τη μέση πυκνότητα της τομής (Average Density): [BMD / (Height cortical +Height trabecular )*Average Density] [74]

89 Κεφάλαιο 3 Συλλογή Υλικών και Μέθοδος Όπου, Για την αντιστοιχία των μετρήσεων Raman και του BMD, μετρήθηκαν οι αποστάσεις των σημείων από όπου συλλέχθηκαν τα δεδομένα. Το κομμάτι Pb που βρίσκεται στο δεξί άκρο της γνάθου θεωρήθηκε αυθαίρετα το σημείο μηδέν. Τα σημεία μετρήσεων Raman δεν ταυτίζονται με αυτά του BMD καθώς λήφθηκαν σε διαφορετικές μεριές του οστού. Στην περίπτωση της φασματοσκοπίας Raman οι μετρήσεις λήφθηκαν από την εξωτερική επιφάνεια περιμετρικά της γνάθου, ενώ οι μετρήσεις του BMD λήφθηκαν από την άνω μεριά της. Ωστόσο, έχοντας το Pb της δεξιάς πλευράς της γνάθου ως σημείο αναφοράς, μπόρεσε να γίνει αντιστοίχιση των θέσεων των μετρήσεων. Εικόνα 36: Οριοθέτηση της εξεταζόμενης περιοχής του οστού με κομμάτια Pb. 3.3 Επεξεργασία Φασμάτων Από το φάσμα του οστού μελετήθηκαν και αναλύθηκαν τρεις περιοχές. Αυτές είναι, η περιοχή του βιοαπατίτη για το ανόργανο συστατικό του οστού, η περιοχή των αμινοξέων προλίνη-υδροξυπρολίνη και η περιοχή του αμιδίου Ι για το κολλαγόνο. [75]

90 Κεφάλαιο 3 Συλλογή Υλικών και Μέθοδος Για να υπάρχει ακρίβεια, τα όρια της κάθε εξεταζόμενης περιοχής ήταν, για τον απατίτη περίπου cm -1, για τις προλίνες-υδροξυπρολίνη περίπου cm -1 και για το αμίδιο Ι η περιοχή περίπου cm -1. Από τις περιοχές αυτές, έπρεπε να διαχωριστούν οι κορυφές που θα χρησιμοποιηθούν στην πορεία για τον υπολογισμό των λόγων του MMR [960 cm -1 / (855 cm cm cm -1 )] και των σταυροδεσμών του κολλαγόνου [(1658 cm cm -1 ) /(1680 cm cm -1 )]. Επειδή στις περιοχές αυτές υπάρχει αλληλοεπικάλυψη κορυφών με αποτέλεσμα να επηρεάζονται οι μετρήσεις και να μην υπάρχει ακρίβεια, κρίθηκε απαραίτητο να γίνει διαχωρισμός των κορυφών (deconvolution) ώστε να μπορέσουν να φανούν μικρότερες κορυφές που επηρεάζουν είτε ενισχύοντας είτε επικαλύπτοντας άλλες κορυφές, μια διαδικασία που συνετέλεσε στην καλύτερη και διεξοδικότερη μελέτη συγκεκριμένων κορυφών του φάσματος. Συγκεκριμένα, η διαδικασία αυτή πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του προγράμματος Peakfit (Peakfit v4.0, Jandel Scientific, San Rafael, CA), με την τεχνική της δευτέρας παραγώγου και προσομοίωση κορυφής με μικτή κορυφή Gauss και Lorentzian. Με το πρόγραμμα αυτό επεξεργάστηκαν όλα τα φάσματα που λήφθηκαν από τις γνάθους από το FT-Raman αλλά από το micro-raman. Αναλυτικότερα, κάθε περιοχή του φάσματος μελετήθηκε ξεχωριστά, φέροντας αρχικά τη γραμμή βάσης (2 point linear baseline) από το ένα άκρο έως το άλλο, ώστε να παραλειφθεί το υπόβαθρο (background). Στη συνέχεια, εφαρμόζεται η τεχνική της δευτέρας παραγώγου (second derivative method) η οποία βοηθάει στην ανίχνευση των κορυφών της περιοχής, μιας και τα τοπικά ελάχιστα του γραφήματος δείχνουν τις θέσεις των κορυφών [213]. Είναι χρήσιμη για την εύρεση μικρών κορυφών και αλληλοεπικαλύψεων αρκεί να μην συγχέονται κορυφές με το θόρυβο. Προσομοίωση κορυφών γίνεται με μικτή κορυφή Gauss και Lorentz. Η κατανομή ενέργειας των σκεδαζόμενων φωτονίων στο Raman δεν μπορεί να προσδιοριστεί καλά από μια συνάρτηση Gauss αλλά απαιτείται ένας γραμμικός συνδυασμός των συναρτήσεων Gauss και Lorentz, ώστε να επιτυγχάνεται καλύτερη προσομοίωση από τη χρήση μόνο κορυφής Gauss ή μόνο Lorentz [214, 215]. Η προσομοίωση κορυφών γίνεται με τέτοιο τρόπο ώστε οι θεωρητικές καμπύλες να συμπέσουν με τις πειραματικές καμπύλες του φάσματος. Στόχος είναι οι κορυφές της εξεταζόμενης [76]

91 Κεφάλαιο 3 Συλλογή Υλικών και Μέθοδος περιοχής να είναι "αιχμηρές" και να αντιπροσωπεύουν ένα τοπικό μέγιστο, το οποίο αποδίδεται σε δόνηση κάποιου δεσμού σύμφωνα με τη βιβλιογραφία. Με τη βοήθεια των παραμέτρων r 2, SE και F που εμφανίζονταν μετά από κάθε επεξεργασία κορυφής, μπορεί να κριθεί εάν έχει γίνει καλή προσομοίωση κορυφής. Η τιμή r 2 δείχνει πόσο καλά ταιριάζουν τα δεδομένα στην καμπύλη (θεωρητικά πρέπει r 2 >0.9), η τιμή SE (Standard Error) δηλώνει την τυπική απόκλιση των δεδομένων και ο δείκτης F (F-test) δηλώνει εάν το μοντέλο που έχει εφαρμοστεί ταιριάζει στα πειραματικά δεδομένα. \ Σχήμα 6: Διαχωρισμός κορυφών της περιοχής cm -1 φάσματος Raman από οστό ανθρώπινης κάτω γνάθου. [77]

92 Κεφάλαιο 3 Συλλογή Υλικών και Μέθοδος Σχήμα 7: Διαχωρισμός κορυφών της περιοχής cm -1 φάσματος Raman από οστό ανθρώπινης κάτω γνάθου. [78]

93 Κεφάλαιο 3 Συλλογή Υλικών και Μέθοδος Σχήμα 8: Διαχωρισμός κορυφών της περιοχής cm -1 φάσματος Raman από οστό ανθρώπινης κάτω γνάθου. Τέλος, για κάθε γράφημα καταγράφονταν σε πίνακες η ένταση και το εμβαδόν κάθε εξεταζόμενης κορυφής. Με τις τιμές αυτές κατασκευάστηκαν τα διαγράμματα μεταβολής του MMR και του λόγου των σταυροδεσμών του κολλαγόνου. 3.4 Στατιστική Ανάλυση Φασμάτων με PCA και SIMCA Για την περαιτέρω μελέτη των φασμάτων και τη μελέτη της διαφοροποίησή τους εφαρμόστηκε πολυπαραγοντική ανάλυση (Multivariate Analysis) και χρησιμοποιήθηκαν χημειομετρικά μοντέλα που επιβεβαιώνουν τις διαφοροποιήσεις [79]

94 Κεφάλαιο 3 Συλλογή Υλικών και Μέθοδος που παρατηρήθηκαν στα διαγράμματα μεταβολής των λόγων. Η διαδικασία αυτή πραγματοποιήθηκε με τη βοήθεια του προγράμματος Umetrics SIMCA-P 11, όπου εφαρμόστηκαν οι τεχνικές Principal Component Analysis (PCA) και Soft Independent Modeling of Class Analogies (SIMCA). Η τεχνική της Ανάλυσης Κύριων Συνιστωσών (PCA) αποτελεί τη βασικότερη μέθοδο ανάλυσης πολλών μεταβλητών, η οποία χρησιμοποιείται ευρέως για τη μελέτη μεγάλων βάσεων δεδομένων. Με την τεχνική αυτή είναι δυνατή η μείωση των μεταβλητών που περιγράφουν μια πολυδιάστατη βάση δεδομένων σε ένα μικρό αριθμό κύριων συνιστωσών, οι οποίες μπορεί να αναδείξουν συσχετίσεις μεταξύ των μεταβλητών ή μεταξύ των παρατηρήσεων. Έστω μια βάση δεδομένων η οποία αποτελείται από Κ μεταβλητές (στήλες) και Ν παρατηρήσεις (γραμμές) και έστω ένα ορθοκανονικό σύστημα τριών αξόνων από τους οποίους ο κάθε άξονας αντιστοιχεί σε καθεμία από τις μεταβλητές. Κάθε παρατήρηση μπορεί να θεωρηθεί ως ένα σημείο στο συγκεκριμένο τρισδιάστατο σύστημα. Στην περίπτωση που οι τιμές των μεταβλητών διαφέρουν κατά τάξεις μεγέθους τότε γίνεται κανονικοποίηση των τιμών. Στην PCA για την κανονικοποίηση των τιμών εφαρμόζεται η διακύμανση μονάδας (Unit Variance, UV). Με αυτή τη διαδικασία, οι τιμές κάθε μεταβλητής διαιρούνται με την τυπική τους απόκλιση, προκαλώντας με αυτόν τον τρόπο μια ισοδύναμη διακύμανση και για τις μεταβλητές. Στη συνέχεια ακολουθεί η επικέντρωση των τιμών (mean centering) των παρατηρήσεων γύρω από τη μέση τιμή. Δηλαδή, για κάθε παρατήρηση υπολογίζεται η μέση τιμή και η τιμή κάθε μεταβλητής για μια συγκεκριμένη παρατήρηση αφαιρείται από τη μέση τιμή. Μετά τις παραπάνω προεργασίες των δεδομένων ακολουθεί η δημιουργία των συνιστωσών που περιγράφουν το σύστημα που προέκυψε. Με τη βοήθεια των ελαχίστων τετραγώνων σχεδιάζεται η βέλτιστη ευθεία για τα σημεία, η οποία διέρχεται από την αρχή των αξόνων (μέση τιμή) και το διάνυσμα το οποίο αντιπροσωπεύεται από την ευθεία αυτή αποτελεί την κύρια συνιστώσα, PC1 (Principal Component). Κατά τη διεύθυνσή της παρατηρείται η μέγιστη διακύμανση των δεδομένων. Η απόσταση της προβολής κάθε σημείου σε αυτό το διάνυσμα από την αρχή των αξόνων αποτελεί μια συντεταγμένη που καλείται τιμή (score) και συμβολίζεται με t. Με αυτόν τον τρόπο μειώνεται ο μεγάλος αριθμός των [80]

95 Κεφάλαιο 3 Συλλογή Υλικών και Μέθοδος μεταβλητών σε έναν μικρό αριθμό κύριων συνιστωσών, οι οποίες ερμηνεύουν σε σημαντικό βαθμό τη διακύμανση των αρχικών μεταβλητών [216]. Επειδή όμως σπάνια μια μόνο κύρια συνιστώσα μπορεί να ερμηνεύσει τη συνολική διακύμανση των δεδομένων, απαιτείται η χάραξη δεύτερης, τρίτης, κλπ. Για να σχεδιαστούν θα πρέπει τα διανύσματα να είναι κάθετα μεταξύ τους, δηλαδή ασυσχέτιστα. Συνεπώς, το δεύτερο διάνυσμα θα σχεδιαστεί στη διεύθυνση της βέλτιστης ευθείας, θα περνά από την αρχή των αξόνων και θα είναι κάθετο στο PC1. Με τη χάραξη και της δεύτερης κύριας συνιστώσας, PC2, κάθε σημείο χαρακτηρίζεται από δυο συντεταγμένες, οι οποίες αντιστοιχούν στα score για το PC1 (t1) και για το PC2 (t2). Οι δυο κύριες συνιστώσες που έχουν προκύψει δημιουργούν ένα επίπεδο πάνω στο οποίο μπορούν να προβληθούν όλα τα σημεία, λειτουργώντας ως ένα κάτοπτρο. Δημιουργείται έτσι ένα νέο σύστημα με άξονες PC1-PC2, πάνω στο οποίο προβάλλονται τα σημεία. Οι συντεταγμένες στο συγκεκριμένο σύστημα της προβολής κάθε σημείου αποτελεί το διάγραμμα τιμών (score plot). Οι θέσεις απεικόνισης των σημείων στο επίπεδο μπορούν να αποκαλύψουν πιθανές συσχετίσεις μεταξύ των παρατηρήσεων ή ακόμα παρατηρήσεις οι οποίες αποκλίνουν σημαντικά από το γενικό σύνολο και καλούνται απομακρυσμένες τιμές (outliers). Σχήμα 9: Διάγραμμα απεικόνισης των δυο κύριων συνιστωσών PC1 και PC2 για τις δυο μεταβλητές Χ 1 και Χ 2 [216]. Όσο αφορά την κανονικοποίηση των μεταβλητών σε μερικές περιπτώσεις χρησιμοποιήθηκαν κάποια φίλτρα. Τα φίλτρα αυτά κανονικοποιούν τις τιμές των μεταβλητών με κάποιο μαθηματικό μετασχηματισμό. Τα φίλτρα που εφαρμόστηκαν είναι: [81]

96 Κεφάλαιο 3 Συλλογή Υλικών και Μέθοδος Standard Normal Variate Transform (SNV): εφαρμογή του μετασχηματισμού του Barnes Multiplicative Signal Correction (MSC): κάθε φάσμα (παρατήρηση) κανονικοποιείται μέσω της παλινδρόμησής του έναντι του μέσου όρου του φάσματος 1 st & 2 nd Derivative: όπως δηλώνεται από το όνομα, η κανονικοποίηση γίνεται με χρήση της πρώτης ή/και της δεύτερης παραγώγου Wavelet Denoise Spectral (WDS): αποσυνθέτει το σήμα σε σύνολα των συντελεστών του με βάση τη ζώνη συχνοτήτων. Αυτή η ζώνη είναι σε λογαριθμική κλίμακα και μειώνεται με τη δύναμη του 2 από τη συχνότητα του Nyrquist στη χαμηλότερη συχνότητα του σήματος. Η μέθοδος SIMCA (Soft Independent Modeling of Class Analogies) επιτρέπει τον διαχωρισμό των μελών και των μη μελών μιας κατηγορίας με βάση έναν κανόνα/όριο που ορίζεται. Για κάθε κατηγορία δημιουργείται ένα διαφορετικό μοντέλο το οποίο χρησιμοποιείται για να δοκιμάσει εάν το άγνωστο αντικείμενο, δηλαδή το μέλος κάποιας άλλης κατηγορίας, μπορεί να αποτελέσει μέλος της κατηγορίας. Η διαδικασία αυτή καλείται Ασυνεχές Μοντέλο Κατηγορίας (Disjoint Class Modelling). Στην περίπτωση πολλών μεταβλητών προηγείται η PCA ανάλυση ώστε να μειωθούν τα δεδομένα. Έτσι, με το SIMCA δημιουργείται ένα μοντέλο για κάθε εξεταζόμενη κατηγορία όσο αφορά τις πρώτες κύριες συνιστώσες αυτής της κατηγορίας [216]. Στην προκειμένη περίπτωση οι παραπάνω μέθοδοι χρησιμοποιούνται για την ανάδειξη της σχέσης που υπάρχει μεταξύ διαφόρων φασμάτων (συνιστούν τις παρατηρήσεις), εάν αυτά δηλαδή σχετίζονται ή αν διαφοροποιούνται [139]. Σε κάποιες περιπτώσεις η επεξεργασία ολόκληρων των φασμάτων δε βοήθησε στην παρατήρηση διαφορών μεταξύ των περιοχών της γνάθου κι έτσι μελετήθηκαν τα φάσματα σε μικρότερες περιοχές ξεχωριστά, δηλαδή, στην περιοχή του απατίτηπρολινών και στην περιοχή του αμιδίου Ι. [82]

97 Κεφάλαιο 4 ο Απόδοση Κορυφών σε Φάσμα Raman Οστού Στην παρούσα εργασία μελετήθηκαν τρεις φασματικές περιοχές. Για την ανόργανη φάση του οστού χρησιμοποιήθηκε η περιοχή του βιοαπατίτη ενώ για την οργανική φάση οι περιοχές των αμινοξέων προλίνη-υδροξυπρολίνη και του αμιδίου Ι του κολλαγόνου. Απαραίτητο κομμάτι της έρευνας αποτέλεσε ο διαχωρισμός κορυφών που αλληλεπικαλύπτονται για τις παραπάνω περιοχές, ώστε να χρησιμοποιηθούν μόνο οι εξεταζόμενες κορυφές. Ο διαχωρισμός των κορυφών πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με βιβλιογραφικές αναφορές, ώστε κάθε κορυφή να αντιπροσωπεύει τη δόνηση ενός δεσμού του μορίου. Παρακάτω, για καθεμία από τις εξεταζόμενες φασματικές περιοχές παρουσιάζονται οι κορυφές που τις συνιστούν. [83]

98 Κεφάλαιο 4 Απόδοση Κορυφών σε Φάσμα Raman Οστού 4.1 Περιοχή βιοαπατίτη ( cm -1 ) Σχήμα 10: Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1. Στην περιοχή cm -1 παρατηρούνται τέσσερις κύριες κορυφές, στους 920, 940, 946, και 960 cm -1 [217]. Σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, μελέτες που έγιναν σε οστά με χρήση φασματοσκοπίας IR και Raman, η μεγάλη, οξεία, καλοσχηματισμένη κορυφή του φάσματος στους 960 cm -1 οφείλεται στην κύρια δόνηση των φωσφορικών 3- ομάδων του απατίτη, ν 1 PO 4 [12, 165, 175, 218], ενώ ο ώμος που διακρίνεται στο αριστερό άκρο της περιοχής, οφείλεται σε άλλες μικρότερες αλληλεπικαλυπτόμενες κορυφές. Συγκεκριμένα, οι δονήσεις στους 940 cm -1 και 945 cm -1 οφείλονται σε μη αρωματικές δονήσεις ν(c-c) του απατίτη ενώ αυτή στους 920 cm -1 οφείλεται σε δόνηση του δακτυλίου της προλίνης [164]. Η κύρια κορυφή στους 960 cm -1 χρησιμοποιείται ως δείκτης της κρυσταλλικότητας του απατίτη μετρώντας το πλάτος της κορυφής [73, 125, 127], αποτελεί δείκτη της [84]

99 Κεφάλαιο 4 Απόδοση Κορυφών σε Φάσμα Raman Οστού ποιότητας του οστού όταν χρησιμοποιείται ως λόγος με το αμίδιο Ι ή τις προλίνες του κολλαγόνου [123, 127] αλλά χρησιμοποιείται και για τον ποσοτικό προσδιορισμό του ανόργανου συστατικού του οστού [219]. 4.2 Περιοχή προλίνης-υδροξυπρολίνης του κολλαγόνου ( cm -1 ) Σχήμα 11: Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1. Στην περιοχή των προλινών διακρίνονται έξι κορυφές εκ των οποίων οι 855 και 875 cm -1 οφείλονται σε δεσμούς δ(cch) και/ή ν(cc) δονήσεις έκτασης των αμινοξέων προλίνη και υδροξυπρολίνη του κολλαγόνου [164, 186, 219, 220]. Επιπλέον δόνηση του δακτυλίου της προλίνης εντοπίζεται και στους 840 και 920 cm -1 [219, 220]. Άλλες κορυφές στην περιοχή αυτή, όπως αυτή στους 880 cm -1 πιθανολογείται να οφείλεται σε πρωτεογλυκάνες που βρίσκονται στο οστό [154]. [85]

100 Κεφάλαιο 4 Απόδοση Κορυφών σε Φάσμα Raman Οστού Σε πρόσφατες μελέτες [127, 169, 219] όπως και στην παρούσα, η περιοχή των αμινοξέων προλίνης και υδροξυπρολίνης χρησιμοποιείται ως δείκτης της ποιότητας του οστού στο λόγο του ανόργανου/οργανικό συστατικό του οστού καθώς δεν επηρεάζεται από τον προσανατολισμό του κολλαγόνου. 4.3 Περιοχή αμιδίου Ι του κολλαγόνου ( cm -1 ) Σχήμα 12: Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή cm -1. Η μπάντα του αμιδίου Ι οφείλεται στη δόνηση του πεπτιδικού δεσμού (-C=O) του κολλαγόνου. Χαρακτηρίζεται από ένα υποσύνολο κορυφών των οποίων οι σχετικές εντάσεις εξαρτώνται από τη δευτεροταγή δομή του κολλαγόνου [129]. Το σχήμα της μπάντας του αμιδίου Ι, η θέση του και η έντασή τοε εξαρτώνται από τη σύσταση των αμινοξέων και την ακολουθία τους στις τριπλέτες και την υγρασία [188]. [86]

101 Κεφάλαιο 4 Απόδοση Κορυφών σε Φάσμα Raman Οστού Από τη βιβλιογραφία για την περιοχή αυτή αποδίδονται τρία συστατικά στις θέσεις ~1633 cm -1, ~1643 cm -1 και ~1660 cm -1, με ισχυρότερη δόνηση την κορυφή στους 1660 cm -1 [221]. Άλλες μελέτες που έχουν γίνει κυρίως σε οστά με χρήση FT-IR και Raman αποδίδουν στην περιοχή αυτή τις κορυφές στους 1638, 1651, 1665, 1685 και 1694 cm -1 [129, 171]. Επίσης, όπως έχει αναφερθεί, το κολλαγόνο χαρακτηρίζεται από την ακολουθία των αμινοξέων (Gly-X-Y-) n -, όπου X και Y είναι συνήθως προλίνη και υδροξυπρολίνη. Μελέτη με FT-IR του ολιγουμερούς -(Gly-Pro-Pro) n - που ταιριάζει με το κολλαγόνο, έδειξε στην περιοχή του αμιδίου Ι τις κορυφές στους 1650 cm -1, 1640 cm -1 και 1632 cm -1 με μέγιστη ένταση αυτή την τελευταία [188]. Μικρότερες κορυφές στην περιοχή του αμιδίου Ι μπορεί να σχετίζονται με μη ισοδύναμους δεσμούς υδρογόνου που περιέχονται στα καρβονύλια του πεπτιδίου, με την ύπαρξη τριών διαφορετικών θέσεων των καρβονυλίων στο κολλαγόνο, με τις διαφοροποιήσεις στη δομή του κολλαγόνου, με τις καλά οργανωμένες μη πολικές περιοχές να εναλλάσσονται με τις πολικές που πιθανόν είναι λιγότερο οργανωμένες, με τη μεγάλη αναλογία των ιμινικών αμινοξέων τα οποία δίνουν χαμηλότερη συχνότητα του αμιδίου Ι και τέλος με τη διάσπαση του καρβονυλίου λόγω των αλληλεπιδράσεων με τις επαναλαμβανόμενες πεπτιδικές μονάδες [222]. Ωστόσο, οι διαφορές στις συχνότητες του κολλαγόνου μπορεί να οφείλονται όχι μόνο στο υλικό, εάν είναι δηλαδή καθαρό κολλαγόνο ή κολλαγόνο με ιστό, αλλά έχει να κάνει και με τον τύπο του οργάνου και τις μεθόδους χειρισμού των μετρήσεων [223]. Από την περιοχή του αμιδίου Ι πιο χαρακτηριστικές είναι οι κορυφές στους 1660 και 1690 cm -1 που αποδίδονται στους μη αναγώγιμους και στους αναγώγιμους σταυροδεσμούς του κολλαγόνου, αντίστοιχα [129]. Ο λόγος αυτών των κορυφών χρησιμοποιείται ως δείκτης της ωρίμανσης [128] και της ποιότητας του κολλαγόνου [127] με σκοπό να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης της ευθραυστότητας των οστών. [87]

102 Κεφάλαιο 5 ο Μελέτη της Μεταβολής του Κολλαγόνου. Το Φαινόμενο της Αφυδάτωσης 5.1 Εισαγωγή Τα οστά κάτω γνάθου που χρησιμοποιήθηκαν ως κύριο αντικείμενο μελέτης της παρούσας εργασίας χαρακτηρίζονταν από τη μακρόχρονη έκθεσή τους σε περιβαλλοντικές συνθήκες. Αυτό είχε σαν αποτέλεσμα τη φυσική μεταβολή δομικών συστατικών τους, όπως είναι το κολλαγόνο, το οποίο πιθανόν να έχει υποστεί μεταβολή ή αλλοίωση. Το έναυσμα για τη συγκεκριμένη μελέτη, δόθηκε κατά την επεξεργασία της φασματικής περιοχής του αμιδίου Ι, (Σχήμα 13) όπου παρατηρήθηκε η επαναλαμβανόμενη ύπαρξη μικρότερων κορφών σε σύγκριση με την αντίστοιχη περιοχή ενός φρέσκου οστού. Σχήμα 13: Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή του αμιδίου Ι ( cm -1 ) ενός φάσματος από φρέσκο οστό (στην περίπτωση αυτή πρόκειται για ανθρώπινη κεφαλή μηριαίου οστού) (αριστερά) και ενός φάσματος από οστό ανθρώπινης κάτω γνάθου (δεξιά). Η φασματοσκοπία Raman χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη της μεταβολής του κολλαγόνου που μπορεί να προέλθει στη συγκεκριμένη περίπτωση από την αφυδάτωση του οστού. Αναλυτικότερα, μελετήθηκε η μεταβολή του κολλαγόνου του [88]

103 Κεφάλαιο 5 Μελέτη της Μεταβολής του Κολλαγόνου Το φαινόμενο της Αφυδάτωσης οστού λόγω πολυκαιρισμού και της έκθεσής του σε φυσικές περιβαλλοντικές συνθήκες σε σύγκριση με τη συντήρησή του σε ρυθμιστικό διάλυμα PBS, ακολουθώντας δυο χρονικούς κύκλους: 1 ος κύκλος: παραμονή της τομής σε διάλυμα PBS για 5 ημέρες και 2 ος κύκλος: παραμονή της τομής σε διάλυμα PBS για 53 ημέρες συνολικά. Φάσματα από micro-raman καταγράφηκαν για την τομή πριν την ενυδάτωση με PBS και μετά από κάθε χρονικό κύκλο παραμονής σε PBS, από το συμπαγές οστό των τομών, καθώς το σπογγώδες τμήμα του ήταν ελλιπές (Eικόνα 39). Εικόνα 38: Ανθρώπινη γνάθος (Α) και κάθετη τομή της (Β). Εικόνα 39: Σύγκριση του σπογγώδους τμήματος από τομές της ίδιας ανθρώπινης γνάθου. Πληροφορίες για την κατάσταση του δικτύου του κολλαγόνου συλλέχθησαν από τη φασματική περιοχή του αμιδίου Ι ( cm -1 ), η οποία όπως έχει προαναφερθεί, είναι ευαίσθητη στη δευτεροταγή δομή του κολλαγόνου. Ύστερα από μέτρηση των [89]

104 Κεφάλαιο 5 Μελέτη της Μεταβολής του Κολλαγόνου Το φαινόμενο της Αφυδάτωσης σχετικών εντάσεων των κορυφών που βρίσκονται στην περιοχή αυτή, υπολογίστηκε η αναλογία των μη αναγώγιμων προς τους αναγώγιμους σταυροδεσμούς του κολλαγόνου, παράμετρος που απεικονίζει την καλή ή κακή κατάσταση στην οποία βρίσκεται το δίκτυο του κολλαγόνου. Χρήση φασματοσκοπίας IR για ανάλυση ανθρώπινων δειγμάτων λαγόνιου ακρολοφίου από ασθενείς που είχαν υποστεί κατάγματα, έδειξε υψηλότερο λόγο σταυροδεσμών σε σύγκριση με τα υγιή, δείχνοντας ότι η ποιότητα του κολλαγόνου συμβάλει στην ευθραυστότητα του οστού [224]. Επίσης, από φάσματα Raman σε οστό ποντικιού φάνηκε ότι η αναλογία των σχετικών εντάσεων των κορυφών 1660 cm -1 /1690 cm -1 μειώνεται με την κόπωση και οφείλεται στην αποδιοργανωμένη δομή του αμιδίου Ι και στη ρήξη των σταυροδεσμών του κολλαγόνου [128]. Τέλος, έχει αναφερθεί ότι η επίδραση της ηλικίας στη διαμόρφωση του κολλαγόνου σημειώνεται με αύξηση της κορυφής στους 1660 cm -1, η οποία συνάδει με αύξηση των μη αναγώγιμων σταυροδεσμών του κολλαγόνου [129, 225]. 5.2 Εξέταση της Μεταβολής του Κολλαγόνου Παρατηρώντας τα φάσματα που λήφθηκαν πριν και μετά την ενυδάτωση του οστού με PBS, όπως παρουσιάζεται στα παρακάτω διαγράμματα, δε φάνηκε να υπάρχει διαφοροποίηση μεταξύ τους. Αυτό φαίνεται κυρίως από την περιοχή του αμιδίου Ι, όπου δεν παρατηρείται μετατόπιση ή διεύρυνση κάποιας κορυφής. Περισσότερες πληροφορίες όμως για την κατάσταση του δικτύου του κολλαγόνου λήφθηκαν μετά το διαχωρισμό των κορυφών που βρίσκονται κάτω από την περιοχή αυτή. [90]

105 Σχετική ένταση Κεφάλαιο 5 Μελέτη της Μεταβολής του Κολλαγόνου Το φαινόμενο της Αφυδάτωσης αφυδατωμένο 1ος κύκλος PBS 2ος κύκλος PBS Μετατόπιση Raman (cm -1 ) Σχήμα 14: Φάσματα micro-raman που λήφθηκαν για ένα σημείο της γνάθου ακολουθώντας τους 3 κύκλους μετρήσεων για την ενυδάτωσή του (μπλε: οστό χωρίς ενυδάτωση, πράσινο: 5 ημέρες ενυδάτωσης με PBS και κόκκινο: 53 ημέρες ενυδάτωσης με PBS). Τα φάσματα είναι αποτέλεσμα 5 σαρώσεων με ένταση ακτινοβολίας ρυθμισμένη στο 80%, για την περιοχή cm -1. [91]

106 Σχετική ένταση Κεφάλαιο 5 Μελέτη της Μεταβολής του Κολλαγόνου Το φαινόμενο της Αφυδάτωσης αφυδατωμένο 1ος κύκλος PBS 2ος κύκλος PBS Μετατόπιση Raman (cm -1 ) Σχήμα 15: Φάσματα micro-raman που λήφθηκαν για ένα σημείο της γνάθου ακολουθώντας τους 3 κύκλους μετρήσεων για την ενυδάτωσή του (μπλε: οστό χωρίς ενυδάτωση, πράσινο: 5 ημέρες ενυδάτωσης με PBS και κόκκινο: 53 ημέρες ενυδάτωσης με PBS). Τα φάσματα είναι αποτέλεσμα 5 σαρώσεων με ένταση ακτινοβολίας ρυθμισμένη στο 80%, για την περιοχή cm -1 (περιοχή αμιδίου Ι). [92]

107 Κεφάλαιο 5 Μελέτη της Μεταβολής του Κολλαγόνου Το φαινόμενο της Αφυδάτωσης Σχήμα 16: Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή του αμιδίου Ι ( cm -1 ) για ένα σημείο του συμπαγούς οστού της τομής της γνάθου πριν την προσθήκη σε διάλυμα PBS. Το φάσμα Raman είναι 5 σαρώσεων με ένταση ακτινοβολίας ρυθμισμένη στα 80%. [r 2 :0.996, SE: , F: ] Σχήμα 17: Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή του αμιδίου Ι ( cm -1 ) για ένα σημείο του συμπαγούς οστού της τομής της γνάθου μετά την πρώτη προσθήκη σε [93]

108 Κεφάλαιο 5 Μελέτη της Μεταβολής του Κολλαγόνου Το φαινόμενο της Αφυδάτωσης διάλυμα PBS (5 ημέρες). Το φάσμα Raman είναι 5 σαρώσεων με ένταση ακτινοβολίας ρυθμισμένη στα 80%. [r 2 :0.997, SE: , F: ] Σχήμα 18: Διαχωρισμός κορυφών στην περιοχή του αμιδίου Ι ( cm -1 ) για ένα σημείο του συμπαγούς οστού της τομής της γνάθου μετά τη δεύτερη προσθήκη σε διάλυμα PBS (53 ημέρες). Το φάσμα Raman είναι 5 σαρώσεων με ένταση ακτινοβολίας ρυθμισμένη στα 80%. [r 2 :0.994, SE: , F: ] Κατά το διαχωρισμό των κορυφών στην περιοχή του αμιδίου Ι, παρατηρήθηκαν οι μικρότερες και επαναλαμβανόμενες κορυφές στους 1658 cm -1 και 1680 cm -1, οι οποίες αποδόθηκαν υποθετικά, στην αφυδατωμένη μορφή των κύριων κορυφών στους 1668 cm -1 και 1690 cm -1, αντιστοίχως. Επίσης, παρατηρήθηκε ότι η κορυφή στους 1668 cm -1 ενισχύθηκε αισθητά σε αντίθεση με αυτή στους 1658 cm -1 μετά την ενυδάτωση με PBS. Σύμφωνα με βιβλιογραφική αναφορά [171], έρευνα που διεξήχθη σε ανθρώπινες γνάθους με φασματοσκοπία Raman, η κορυφή στους 1657 cm -1 αποδίδεται στο αμίδιο Ι (α-έλικα) όπως και η κορυφή στους 1685 cm -1 στο αμίδιο Ι (β-πτύχωση, διαταραγμένου κολλαγόνου). Αλλαγές στην ένταση των αλληλοεπικαλυπτόμενων κορυφών στην περιοχή του αμιδίου Ι είναι απόδειξη της δομικής αλλαγής του κολλαγόνου. Έχει βρεθεί ότι η κύρια κορυφή του αμιδίου Ι μπορεί να μετατοπιστεί έως και 12 κυματάριθμους, από [94]

109 Υ (1658 cm -1 )/ Y(1668 cm -1 ) Κεφάλαιο 5 Μελέτη της Μεταβολής του Κολλαγόνου Το φαινόμενο της Αφυδάτωσης 1668 στους 1656 cm -1 στο περιβάλλον ταφής του οστού [226], ενώ, αποικοδόμηση του κολλαγόνου με χρήση διαλύματος εξαφθορο-ισοπροπανόλης προκάλεσε μετατόπιση της κορυφής του αμιδίου Ι κατά 5 cm -1 (από 1661 στους 1656 cm -1 ) [222]. Μελέτη σχετικά με την αποικοδόμηση του κολλαγόνου λόγω θέρμανσης αναφέρει ότι η έλικα του κολλαγόνου γίνεται πιο εκτεταμένη ενώ η μοριακή του ακτίνα μειώνεται. Έτσι, το αμίδιο Ι λόγω της αφυδάτωσης που οφείλεται στη θέρμανση γίνεται αισθητά πιο ευρύ. Αυτές οι αλλαγές στη δομή του κολλαγόνου είναι αναστρέψιμες [188]. Για την απόδοση και ερμηνεία των κορυφών στους 1658 cm -1 και 1680 cm -1 υπολογίστηκαν οι εξής αναλογίες των σταυροδεσμών του κολλαγόνου: Υ (1658 cm -1 ) / Υ (1668 cm -1 ), Υ (1668 cm -1 ) / Υ (1690 cm -1 ), Υ (1680 cm -1 ) / Υ (1690 cm -1 ), Υ (1658 cm cm -1 ) / Υ (1680 cm cm -1 ) και Υ (1658 cm cm -1 ) / Υ (1690 cm -1 ) και κατασκευάστηκαν τα αντίστοιχα διαγράμματα μεταβολής τους για διάφορα σημεία της τομής πριν και μετά την ενυδάτωσή της με PBS. 1,2 Αφυδατωμένο οστό 1ος κύκλος PBS 1 2ος κύκλος PBS 0,8 0,6 0,4 0, Σημείο οστού Σχήμα 19: Διάγραμμα μεταβολής του λόγου Υ(1658 cm -1 ) / Υ(1668 cm -1 ) για διάφορα σημεία του συμπαγούς οστού της τομής της γνάθου, πριν και μετά την [95]

110 Y (1668 cm -1 )/Y (1690 cm -1 ) Κεφάλαιο 5 Μελέτη της Μεταβολής του Κολλαγόνου Το φαινόμενο της Αφυδάτωσης προσθήκη διαλύματος PBS. Από το διάγραμμα του οστού πριν την ενυδάτωση προκύπτει ότι [Υ(1658 cm -1 ) / Υ(1668 cm -1 )] average =0.77, για το 5 ημερών ενυδατωμένο οστό με PBS (1 ος κύκλος PBS) [Υ(1658 cm -1 ) / Υ(1668 cm - 1 )] average =0.39 και για το 53 ημερών ενυδατωμένο οστό με PBS (2 ος κύκλος PBS) [Υ(1658 cm -1 ) / Υ(1668 cm -1 )] average = ,5 Αφυδατωμένο οστό 3 1ος κύκλος PBS 2ος κύκλος PBS 2,5 2 1,5 1 0, Σημείο οστού Σχήμα 20: Διάγραμμα μεταβολής του λόγου Υ(1668 cm -1 ) / Υ(1690 cm -1 ) για διάφορα σημεία του συμπαγούς οστού της τομής της γνάθου, πριν και μετά την προσθήκη διαλύματος PBS. Από το διάγραμμα του οστού πριν την ενυδάτωση προκύπτει ότι [Υ(1668 cm -1 ) / Υ(1690 cm -1 )] average =1.84, για το 5 ημερών ενυδατωμένο οστό με PBS (1 ος κύκλος PBS) ότι [Υ(1668 cm -1 ) / Υ(1690 cm - 1 )] average =2.30 και για το 53 ημερών ενυδατωμένο οστό με PBS (2 ος κύκλος PBS) ότι [Υ(1668 cm -1 ) / Υ(1690 cm -1 )] average =2.88. [96]

111 Y (1680 cm-1) / Y (1690 cm-1) Κεφάλαιο 5 Μελέτη της Μεταβολής του Κολλαγόνου Το φαινόμενο της Αφυδάτωσης 1,8 1,6 1,4 Πριν την ενυδάτωση 1ος κύκλος PBS 2ος κύκλος PBS 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, Σημείο οστού Σχήμα 21: Διάγραμμα μεταβολής του λόγου Υ(1680 cm -1 ) / Υ(1690 cm -1 ) για διάφορα σημεία του συμπαγούς οστού της τομής της γνάθου, πριν και μετά την προσθήκη διαλύματος PBS. Από το διάγραμμα του οστού πριν την ενυδάτωση προκύπτει ότι [Υ(1680 cm -1 ) / Υ(1690 cm -1 )] average =1.12, για το 5 ημερών ενυδατωμένο οστό με PBS (1 ος κύκλος PBS) ότι [Υ(1680 cm -1 ) / Υ(1690 cm - 1 )] average =1.07 και για το 53 ημερών ενυδατωμένο οστό με PBS (2 ος κύκλος PBS) ότι [Υ(1680 cm -1 ) / Υ(1690 cm -1 )] average =0.98. [97]

112 Υ( )cm-1/Y( )cm-1 Κεφάλαιο 5 Μελέτη της Μεταβολής του Κολλαγόνου Το φαινόμενο της Αφυδάτωσης 2,5 Πριν την ενυδάτωση 2 1ος κύκλος PBS 2ος κύκλος PBS 1,5 1 0, Σημείο οστού Σχήμα 22: Διάγραμμα μεταβολής του λόγου Υ(1658 cm cm -1 ) / Υ(1680 cm cm -1 ) για διάφορα σημεία του συμπαγούς οστού της τομής της γνάθου, πριν και μετά την προσθήκη διαλύματος PBS. Από το διάγραμμα του οστού πριν την ενυδάτωση προκύπτει ότι [Υ (1658 cm cm -1 ) / Υ (1680 cm cm - 1 )] average =1.52, για το 5 ημερών ενυδατωμένο οστό με PBS (1 ος κύκλος PBS) ότι [Υ (1658 cm cm -1 ) / Υ (1680 cm cm -1 )] average =1.55 και για το 53 ημερών ενυδατωμένο οστό με PBS (2 ος κύκλος PBS) ότι [Υ (1658 cm cm -1 ) / Υ (1680 cm cm -1 )] average =1.66. [98]

113 Y (1658 cm cm -1 )/Y (1690 cm -1 ) Κεφάλαιο 5 Μελέτη της Μεταβολής του Κολλαγόνου Το φαινόμενο της Αφυδάτωσης 5 4,5 Αφυδατωμένο οστό 1ος κύκλος PBS 4 2ος κύκλος PBS 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0, Σημείο οστού Σχήμα 23: Διάγραμμα μεταβολής του λόγου Υ(1658 cm cm -1 ) / Υ(1690 cm -1 ) για διάφορα σημεία του συμπαγούς οστού της τομής της γνάθου, πριν και μετά την προσθήκη διαλύματος PBS. Από το διάγραμμα του οστού πριν την ενυδάτωση προκύπτει ότι [Υ (1658cm cm -1 ) / Υ (1690 cm -1 )] average =3.25, για το 5 ημερών ενυδατωμένο οστό με PBS (1 ος κύκλος PBS) ότι [Υ (1658cm cm -1 ) / Υ (1690 cm -1 )] average =3.20 και για το 53 ημερών ενυδατωμένο οστό με PBS (2 ος κύκλος PBS) ότι [Υ (1658cm cm -1 ) / Υ (1690 cm -1 )] average =3.27. Σε μερικά από τα παραπάνω διαγράμματα (Σχήματα 21-23) δεν είναι εμφανής η μεταβολή των λόγων των σταυροδεσμών του κολλαγόνου. Για το λόγο αυτό, υπολογίστηκαν οι μέσοι όροι των λόγων για τα δέκα σημεία του οστού όπου λήφθηκαν μετρήσεις πριν και μετά την ενυδάτωση με PBS (Πίνακας 4) και κατασκευάστηκαν τα αντίστοιχα διαγράμματα (Σχήμα 24). [99]

114 Κεφάλαιο 5 Μελέτη της Μεταβολής του Κολλαγόνου Το φαινόμενο της Αφυδάτωσης Πίνακας 4: Μεταβολή των μέσων όρων των λόγων Y 1658 /Y 1668, Υ 1668 /Υ 1690, Υ 1680 /Υ 1690, Y ( ) /Y 1690 και Y ( ) /Y ( ) των σταυροδεσμών του κολλαγόνου, από τα δέκα σημεία του οστού όπου λήφθηκαν φάσματα κατά τη μελέτη της ενυδάτωσής του με PBS. Μέσος όρος λόγων σταυροδεσμών Οστό πριν την ενυδάτωση 1 ος κύκλος με PBS 2 ος κύκλος με PBS Y 1658 /Y ± ± ±0.06 Y 1668 /Y ± ± ±0.27 Y 1680 /Y ± ± ±0.17 Y ( ) /Y ± ± ±0.30 Y ( ) /Y ( ) 1.52± ± ±0.16 [100]

115 Κεφάλαιο 5 Μελέτη της Μεταβολής του Κολλαγόνου Το φαινόμενο της Αφυδάτωσης Σχήμα 24: Διαγράμματα μεταβολής των μέσων όρων των λόγων Y 1658 cm-1 / Y 1668 cm-1, Υ 1668 cm-1 / Υ 1690 cm-1, Υ 1680 cm-1 / Υ 1690 cm-1, και Y ( ) cm-1 / Y ( ) cm-1 των σταυροδεσμών του κολλαγόνου για τα τα δέκα σημεία του οστού όπου λήφθηκαν φάσματα κατά τη μελέτη της ενυδάτωσής του με PBS. Από τα παραπάνω διαγράμματα και από τον πίνακα επιβεβαιώνεται και αριθμητικά η μεταβολή στην αναλογία των σταυροδεσμών του κολλαγόνου που παρατηρήθηκε μετά το διαχωρισμό των κορυφών στην μπάντα του αμιδίου Ι. Κατά την ενυδάτωση λοιπόν, ο λόγος Y 1658 /Y 1668 μειώθηκε ενώ ο λόγος Y 1668 /Y 1690 αυξήθηκε που συγκλίνει στο αποτέλεσμα ότι η κορυφή στους 1668 cm -1 ενισχύθηκε με την προσθήκη PBS. Παρατηρήθηκε επίσης, ότι με την ενυδάτωση μειώθηκε ο λόγος Y 1680 /Y 1690 υποδηλώνοντας μείωση της κορυφής στους 1680 cm -1. Τέλος, φαίνεται ότι ο λόγος Y ( ) / Y ( ) παραμένει σχεδόν σταθερός, επιβεβαιώνοντας την αρχική υπόθεση ότι οι κορυφές στους 1658 cm -1 και 1680 cm -1 είναι [101]

116 Κεφάλαιο 5 Μελέτη της Μεταβολής του Κολλαγόνου Το φαινόμενο της Αφυδάτωσης συμπληρωματικές των κύριων κορυφών στους 1668 cm -1 και 1690 cm -1 αντίστοιχα, και δηλώνουν την αφυδάτωση του οστού. 5.3 Χημειομετρική Ανάλυση Δεδομένων Για την περαιτέρω μελέτη των φασμάτων και την παρατήρηση της μεταβολής ή όχι του κολλαγόνου με την ενυδάτωση με PBS έγινε επεξεργασία των φασμάτων με χημειομετρικά μοντέλα εφαρμόζοντας PCA και SIMCA για την περιοχή του αμιδίου Ι στα φάσματα που λήφθηκαν από το οστό πριν την ενυδάτωση και στα φάσματα που λήφθηκαν μετά την ενυδάτωσή του με PBS. Τα φάσματα που καταγράφηκαν πριν την ενυδάτωση της τομής και μετά από κάθε κύκλο ενυδάτωσής της με PBS, αποτελούν τις παρατηρήσεις και κάθε κατηγορία αντιστοιχεί σε διαφορετικό χρώμα. Η ομάδα των σημείων που διαχωρίζεται από τις υπόλοιπες σημαίνει ότι διαφοροποιείται. Οι δείκτες R 2 και Q 2 δείχνουν εάν το μοντέλο που αναπτύχθηκε προσομοιάζει καλά τα πειραματικά δεδομένα και πόσο καλά μπορεί να τα προβλέψει αντίστοιχα. Τέλος, ο αριθμός των συστατικών (Components) δείχνει ως προς πόσες παραμέτρους μπορεί να διαφοροποιούνται τα δεδομένα. Ένα ικανοποιητικό μοντέλο θα πρέπει να έχει τιμές 0.6 < R 2, Q 2 1 και Component > 1. [102]

117 Κεφάλαιο 5 Μελέτη της Μεταβολής του Κολλαγόνου Το φαινόμενο της Αφυδάτωσης Σχήμα 25: Principal Component Analysis με φίλτρο Standard Normal Variate Transform για διάφορα σημεία του συμπαγούς οστού πριν και μετά την ενυδάτωσή του με PBS για την περιοχή του αμιδίου Ι. (Τα δυο μαρκαρισμένα σημεία έχουν αφαιρεθεί καθώς βρίσκονται σε μακρινή απόσταση έξω από τον κύκλο.) [R 2 =0.864, Q 2 =0.853, 1 Component] (μπλε: οστό πριν την ενυδάτωση με PBS, κόκκινο: 1 ος κύκλος με PBS, πράσινο: 2 ος κύκλος PBS) Σύμφωνα με τη μέθοδο SIMCA κάθε ομάδα εξετάζεται ξεχωριστά ως προς τις υπόλοιπες ομάδες. Τα δεδομένα της εξεταζόμενης κατηγορίας βρίσκονται κάτω από μια οριζόντια κόκκινη γραμμή. Όσα δεδομένα άλλης κατηγορίας διαφοροποιούνται, βρίσκονται πάνω από αυτήν τη γραμμή. [103]

118 Κεφάλαιο 5 Μελέτη της Μεταβολής του Κολλαγόνου Το φαινόμενο της Αφυδάτωσης Σχήμα 26: SIMCA με φίλτρο SNV για διάφορα σημεία του συμπαγούς οστού κατηγοριοποιώντας ως προς το οστό πριν ην ενυδάτωση με PBS για την περιοχή του αμιδίου Ι. Οι σκιαγραφημένες στήλες αντιστοιχούν στα σημεία που έχουν αφαιρεθεί. [R 2 =0.980, Q 2 =0.953, 2 Components] (μπλε: οστό πριν την ενυδάτωση με PBS, κόκκινο: 1 ος κύκλος με PBS, πράσινο: 2 ος κύκλος PBS). Σχήμα 27: SIMCA με φίλτρο SNV για διάφορα σημεία του συμπαγούς οστού κατηγοριοποιώντας ως προς τον πρώτο κύκλο με PBS για την περιοχή του αμιδίου Ι. [104]

119 Κεφάλαιο 5 Μελέτη της Μεταβολής του Κολλαγόνου Το φαινόμενο της Αφυδάτωσης Οι σκιαγραφημένες στήλες αντιστοιχούν στα σημεία που έχουν αφαιρεθεί. [R 2 =0.803, Q 2 =0.748, 1 Component] (μπλε: οστό πριν την ενυδάτωση με PBS, κόκκινο: 1 ος κύκλος με PBS, πράσινο: 2 ος κύκλος PBS). Σχήμα 28: SIMCA με φίλτρο SNV για διάφορα σημεία του συμπαγούς οστού κατηγοριοποιώντας ως προς το δεύτερο κύκλο με PBS για την περιοχή του αμιδίου Ι. Οι σκιαγραφημένες στήλες αντιστοιχούν στα σημεία που έχουν αφαιρεθεί. [R 2 =0.781, Q 2 =0.726, 1 Component] (μπλε: οστό πριν την ενυδάτωση με PBS, κόκκινο: 1 ος κύκλος με PBS, πράσινο: 2 ος κύκλος PBS). Από τα αποτελέσματα των δυο μεθόδων χημειομετρικής ανάλυσης των φασμάτων προκύπτει ότι το κολλαγόνο δεν έχει υποστεί κάποια χημική μεταβολή. 5.4 Σύνοψη αποτελεσμάτων Η φασματοσκοπία Raman εφαρμόστηκε για την παρατήρηση χημικών μεταβολών του κολλαγόνου τύπου Ι του οστού, που μπορεί να οφείλονται στο διαφορετικό τρόπο συντήρησής τους. Μετά από μακρόχρονη έκθεση του οστού σε περιβαλλοντικές συνθήκες είναι φυσιολογικό να έχει υποστεί αλλαγές στη χημική σύστασή του. Τέτοια αλλαγή μπορεί να οφείλεται στην αφυδάτωση. Στην προκειμένη περίπτωση μελετήθηκε εάν το φαινόμενο της αφυδάτωσης επηρέασε το κολλαγόνο του οστού. Αυτό μελετήθηκε από τα φάσματα Raman και συγκεκριμένα από την μπάντα του αμιδίου Ι του κολλαγόνου. [105]

120 Κεφάλαιο 5 Μελέτη της Μεταβολής του Κολλαγόνου Το φαινόμενο της Αφυδάτωσης Η ύπαρξη των μικρότερων κορυφών στους 1658 cm -1 και 1680 cm -1 στην περιοχή του αμιδίου Ι δηλώνει την αφυδάτωση που έχει υποστεί το οστό. Το συμπέρασμα αυτό επιβεβαιώθηκε από τη μελέτη του λόγου των σταυροδεσμών του κολλαγόνου. Αύξηση του λόγου Y 1668 /Y 1690, ταυτόχρονη μείωση του λόγου Y 1658 /Y 1668, μείωση του λόγου Y 1680 /Y 1690 και σταθερή τιμή του λόγου Y ( ) /Y ( ), δείχνουν ότι οι κορυφές στους 1658 cm -1 και 1680 cm -1 είναι συμπληρωματικές των κύριων κορυφών στους 1668 cm -1 και 1690 cm -1, αντιστοίχως. Συνεπώς, οι κορυφές αυτές δεν επηρεάζουν στην ποσοτική μελέτη του λόγου των σταυροδεσμών του κολλαγόνου που χρησιμοποιείται παρακάτω για την εκτίμηση της κατάστασης του δικτύου του κολλαγόνου. Συντήρηση του οστού σε διάλυμα PBS είχε σαν αποτέλεσμα την ενυδάτωση του κολλαγόνου του. Εξετάζοντας την περιοχή του αμιδίου Ι, δεν παρατηρήθηκε αλλαγή στη μορφολογία της μπάντας του αμιδίου Ι που θα σήμαινε αλλαγή στη διαμόρφωση της δομής του κολλαγόνου. Παρατηρήθηκε όμως διαφοροποίηση στις σχετικές αναλογίες των σταυροδεσμών του. Μείωση της σχετικής έντασης της κορυφής στους 1658 cm -1 που οφείλεται στην αφυδατωμένη του οστού και αύξηση της κορυφής στους 1668 cm -1 αποδεικνύει την ενυδάτωση του κολλαγόνου. Με τη μελέτη αυτή, αποδεικνύεται ότι η φασματοσκοπία Raman είναι μια δονητική φασματοσκοπική τεχνική που μπορεί να ανιχνεύσει αλλοιώσεις της χημικής σύστασης που μπορεί να έχουν υποστεί βιολογικά μόρια. Αλλαγές που μπορεί να οφείλονται σε πολλά αίτια, όπως ασθένειες, αποικοδόμηση υλικού, κλπ [106]

121 Κεφάλαιο 6 ο Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων 6.1 Εισαγωγή Στη φασματοσκοπία Raman σπάνια χρησιμοποιούνται οι απόλυτες εντάσεις των κορυφών γιατί επηρεάζονται από την απόδοση της σκέδασης Raman και από άλλες παραμέτρους, όπως το μέγεθος των κόκκων του δείγματος, ο δείκτης διάθλασης και η επιφάνεια του δείγματος [227]. Για το λόγο αυτό οι κορυφές εξετάστηκαν ως λόγοι και όχι μεμονωμένα από τις εντάσεις τους. Όπως έχει αναφερθεί, η φασματοσκοπία Raman αποδίδει τουλάχιστον τέσσερις δείκτες για τη μελέτη της ποιότητας των οστών. Αυτοί είναι: ο λόγος του ανόργανου συστατικού (βιοαπατίτης) προς το οργανικό συστατικό (συνήθως, αμίδιο Ι του κολλαγόνου), (Mineral to Matrix Ratio, MMR), ο λόγος των ανθρακικών προς τα φωσφορικά (Carbon to Phosphate Ratio, CPR), η κρυσταλλικότητα του βιοαπατίτη και η ποιότητα του δικτύου του κολλαγόνου, δηλαδή, ο λόγος των σταυροδεσμών του (μη αναγώγιμοι προς αναγώγιμους σταυροδεσμούς) [127]. Στην παρούσα μελέτη η εκτίμηση της ποιότητας των γνάθων έγινε με την εφαρμογή του λόγου του ανόργανου συστατικού (βιοαπατίτης) του οστού προς το οργανικό του (Mineral to Matrix Ratio, MMR) και του λόγου των σταυροδεσμών του κολλαγόνου (μη αναγώγιμοι προς αναγώγιμους σταυροδεσμούς) [127]. Στην περίπτωση του ανόργανου προς το οργανικό συστατικό του οστού χρησιμοποιείται συνήθως ο λόγος των φωσφορικών του βιοαπατίτη προς το αμίδιο Ι του κολλαγόνου. Μελέτες που πραγματοποιήθηκαν με πολωμένο Raman σε ανθρώπινους οστίτες ιστούς έδειξαν ότι η περιοχή του αμιδίου Ι του κολλαγόνου, που σχετίζεται κυρίως με δονήσεις έκτασης C=O, είναι ευαίσθητη στον προσανατολισμό των ινιδίων κι έτσι αναμένονται πολλές διαφοροποιήσεις στις σχετικές εντάσεις των κορυφών αυτής της περιοχής [180]. Αντίθετα, οι δονήσεις των προλινών που οφείλονται σε δ(cch) και/ή ν(cc) δονήσεις έκτασης, δεν είναι τόσο ισχυρά πολωμένες όσο του αμιδίου Ι, με αποτέλεσμα να επηρεάζονται λιγότερο από τη [107]

122 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων διαφορετικότητα του προσανατολισμού. Για το λόγο αυτό, για τον υπολογισμό του MMR μπορεί να χρησιμοποιηθεί στη θέση του οργανικού συστατικού οι προλίνες του 3- κολλαγόνου [ν 1 PO 4 / (Pro+Hyp)] [127, 169, 182, 186, 219]. Επιπλέον, όπως έχει ήδη επισημανθεί, μεταξύ των κορυφών που αποτελούν την περιοχή του αμιδίου Ι, δυο έχουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον στη μελέτη του κολλαγόνου: μια στους ~1660 cm -1 και μια στους ~1690 cm -1, όπου σύμφωνα με τη βιβλιογραφία, ο λόγος των υψών ή των εμβαδών αυτών των κορυφών (1660cm -1 / 1690cm -1 ) αντιστοιχεί στο λόγο μη αναγώγιμων προς αναγώγιμους σταυροδεσμούς του κολλαγόνου του οστού [189]. Ο λόγος αυτός σχετίζεται με το βαθμό της ωρίμανσης του κολλαγόνου με το πέρασμα του χρόνου [128, 129] και με το βαθμό των σταυροδεσμών που έχουν αναχθεί ως απόκριση σε μηχανικά ερεθίσματα [186, 187]. Μιας και οι σταυροδεσμοί συμβάλουν στις μηχανικές ιδιότητες του οστού, όπως είναι η αντοχή στον εφελκυσμό και η ελαστικότητα [189], η αναλογία τους μπορεί να προσδιορίσει την κατάσταση του δικτύου του κολλαγόνου. Συγκεκριμένα, το δίκτυο του κολλαγόνου είναι σε καλή κατάσταση όταν ο λόγος είναι χαμηλός, καθώς σημαίνει ότι αυξάνεται η σχετική ένταση των αναγώγιμων σταυροδεσμών που οφείλεται στην ωρίμανση των δισθενών σταυροδεσμών σε τρισθενείς και τετρασθενείς. Αντίθετα, μειωμένη ελαστικότητα του οστού παρατηρείται όταν ο λόγος είναι αυξημένος διότι σε αυτή την περίπτωση υπερισχύουν οι μη αναγώγιμοι σταυροδεσμοί έναντι των αναγώγιμων. Όπως έχει ήδη αναφερθεί σε προηγούμενο κεφάλαιο, κατά την επεξεργασία των φασμάτων στην περιοχή του αμιδίου Ι, παρατηρήθηκαν οι επαναλαμβανόμενες κορυφές στους 1658 cm -1 και 1680 cm -1, οι οποίες αποδίδονται στην αφυδατωμένη μορφή των κορυφών 1668 και 1690 cm -1 αντίστοιχα. Έτσι, κατά τον υπολογισμό του λόγου μη αναγώγιμων προς αναγώγιμους σταυροδεσμούς του κολλαγόνου χρησιμοποιήθηκε ο λόγος [Υ (1658 cm cm -1 ) / Υ (1680 cm cm -1 )]. Επίσης, για την επεξεργασία των αποτελεσμάτων χρησιμοποιήθηκαν κυρίως τα διαγράμματα που προκύπτουν από τα ύψη των κορυφών και όχι από τα εμβαδά τους γιατί όπως προαναφέρθηκε, υπάρχει αλληλοεπικάλυψη κορυφών και στο εμβαδόν μιας κορυφής προσμετρείται και η συνεισφορά κάποιας άλλης μικρότερης κορυφής που μπορεί να την ενισχύει, να την διευρύνει ή και το αντίθετο. Παρά το γεγονός αυτό, τα αποτελέσματα που προέρχονται από τους λόγους των υψών των κορυφών, έχουν παρόμοια συμπεριφορά με αυτά των λόγων των εμβαδών τους. [108]

123 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Στο τέλος, μέρος των αποτελεσμάτων της φασματοσκοπίας Raman συγκρίθηκαν με μετρήσεις οστικής πυκνότητας. 6.2 Ανάλυση Αποτελεσμάτων Φάσματα από FT-Raman καταγράφηκαν για διάφορα διαδοχικά σημεία κατά μήκος των γνάθων, όπως περιγράφεται στην ενότητα Μετά την καταγραφή των υψών και των εμβαδών των εξεταζόμενων κορυφών υπολογίστηκαν οι αντίστοιχοι λόγοι κορυφών Υ [960 cm -1 /(855 cm cm cm -1 )], Α [960 cm -1 / (855 cm cm cm -1 )], Υ [(1658 cm cm -1 ) / (1680 cm cm -1 )] και Α [(1658 cm cm -1 ) / (1680 cm cm -1 )] και κατασκευάστηκαν διαγράμματα που απεικονίζουν τη μεταβολή τους για όλα τα σημεία του οστού όπου είχαν ληφθεί φάσματα. Στη συνέχεια, με βάση τα διαγράμματα αυτά έγινε προσπάθεια εκτίμησης της ποιότητας κάθε γνάθου, εάν διαφέρει δηλαδή, από σημείο σε σημείο ή από πλευρά σε πλευρά. Η επεξεργασία των δεδομένων που πραγματοποιήθηκε είναι κοινή για όλα τα δείγματα, όπως αυτή περιγράφεται στην ενότητα 3.3 και 3.4. Στη συνέχεια παρατίθενται τα αποτελέσματα από μερικές γνάθους, ενώ για τις υπόλοιπες τα διαγράμματα μεταβολής των λόγων MMR και των σταυροδεσμών του κολλαγόνου αποτελέσματα βρίσκονται στο Παράρτημα Β. [109]

124 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Εκτίμηση της ποιότητας της L γνάθου Εικόνα 40: Απεικόνιση των σημείων λήψης φασμάτων FT-Raman κατά μήκος της γνάθου. 25 Y[960cm -1 /( )cm -1 ] 30 A[960cm -1 /( )cm -1 ] Σημείο λήψης φάσματος στη γνάθο Σημείο λήψης φάσματος στη γνάθο Σχήμα 29: Διάγραμμα μεταβολής του MMR σε διάφορα διαδοχικά σημεία κατά μήκος της γνάθου L, χρησιμοποιώντας λόγους υψών (Υ) και λόγους εμβαδών (Α) κορυφών. (πράσινο: δεξιό τμήμα, μπλε: μέσο τμήμα, κόκκινο: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο). [110]

125 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων 3 Y[( )cm -1 /( )cm -1 ] 4,5 A[( )cm -1 /( )cm -1 ] 2,5 4 3, ,5 2, ,5 0,5 1 0, Σημείο λήψης φάσματος στη γνάθο Σημείο λήψης φάσματος στη γνάθο Σχήμα 30: Διάγραμμα μεταβολής του λόγου των υψών των σταυροδεσμών του κολλαγόνου σε διάφορα διαδοχικά σημεία κατά μήκος της γνάθου L, χρησιμοποιώντας τους λόγους των υψών (Υ) και των εμβαδών (Α) των κορυφών. (πράσινο: δεξιό τμήμα, μπλε: μέσο τμήμα, κόκκινο: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο). Για τη συγκεκριμένη γνάθο, από το διάγραμμα μεταβολής του MMR (Σχήμα 29) παρατηρείται ότι ο λόγος διαφέρει από σημείο σε σημείο αλλά και από πλευρά σε πλευρά. Συγκεκριμένα, είναι αυξημένος στην αριστερή πλευρά της γνάθου σε αντίθεση με τις άλλες δυο πλευρές. Αυτό πρακτικά σημαίνει ότι η αριστερή πλευρά του οστού παρουσιάζει μεγαλύτερη αντοχή από τις άλλες δυο (P=0.006 για τη δεξιά πλευρά και P=0.003 για τη μέση πλευρά, σύμφωνα με τον έλεγχο υποτιθέμενων άνισων διακυμάνσεων Ρ<0.05, t-test). Ταυτόχρονα, μελετώντας το διάγραμμα μεταβολής του λόγου των σταυροδεσμών του κολλαγόνου (Σχήμα 30), παρατηρείται ότι στην ίδια περιοχή ο λόγος είναι μειωμένος, που σημαίνει ότι υπερισχύουν οι αναγώγιμοι σταυροδεσμοί έναντι των μη αναγώγιμων σταυροδεσμών του κολλαγόνου και συνεπώς, η ποιότητα του δικτύου του κολλαγόνου είναι καλή σε σχέση με τις άλλες δυο περιοχές και κυρίως σε σύγκριση με τη δεξιά πλευρά (P=0.002). Η αριστερή πλευρά δηλαδή της L γνάθου, σε σχέση με τις άλλες δυο πλευρές, φαίνεται να παρουσιάζει αυξημένη αντοχή λόγω του υψηλού MMR και αυξημένη ελαστικότητα λόγω του χαμηλού λόγου των σταυροδεσμών του κολλαγόνου. Αξίζει επίσης να αναφερθεί, ότι το μέσο τμήμα της γνάθου παρουσιάζει χαμηλές τιμές MMR, δηλώνοντας μειωμένη ανθεκτικότητα στους κραδασμούς σε σχέση με τα δυο πλαϊνά τμήματα της γνάθου. [111]

126 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Χημειομετρική ανάλυση φασμάτων Χημειομετρικά μοντέλα χρησιμοποιήθηκαν και πάλι για την περαιτέρω μελέτη των φασμάτων και τη διαφοροποίησή τους ανά περιοχή περιμετρικά της γνάθου επιβεβαιώνοντας τις διαφοροποιήσεις που παρατηρήθηκαν στα διαγράμματα μεταβολής των λόγων. Στην PCA κάθε ομάδα φασμάτων που μελετάται όπως είναι στη συγκεκριμένη περίπτωση τα φάσματα που καταγράφηκαν από τη δεξιά, τη μέση και την αριστερή μεριά της γνάθου, αντιστοιχεί σε διαφορετικό χρώμα. Τα σημεία ή η ομάδα των σημείων που διαχωρίζονται από τα υπόλοιπα σημαίνει ότι διαφοροποιούνται. Σχήμα 31: Principal Component Analysis με φίλτρο Standard Normal Variate Transform (SNV) για τη γνάθο L. [R 2 =0.914, Q 2 =0.847, 3 Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Έτσι, για τη γνάθο L, εφαρμόζοντας PCA για ολόκληρα τα φάσματα περιμετρικά της γνάθου, παρατηρήθηκε ότι μόνο η αριστερή πλευρά της (μπλε σημεία, Σχήμα 28) μπορεί να διαφοροποιηθεί από τις υπόλοιπες. Στη συνέχεια εφαρμόστηκε η μέθοδος SIMCA. Σε αυτή την περίπτωση, κάθε ομάδα, δηλαδή κάθε πλευρά της γνάθου εξετάζεται ξεχωριστά ως προς τις υπόλοιπες πλευρές της. Τα δεδομένα της εξεταζόμενης κατηγορίας βρίσκονται κάτω από μια οριζόντια [112]

127 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων κόκκινη γραμμή. Όσα δεδομένα άλλης κατηγορίας διαφοροποιούνται, βρίσκονται πάνω από αυτήν τη γραμμή. Από το SIMCA (Σχήμα 34) έγινε πιο σαφές ότι τα φάσματα της αριστερής πλευράς διαχωρίζονται από αυτά των άλλων τμημάτων της γνάθου καθώς κανένα άλλο σημείο δεν είναι κάτω από το όριο (κόκκινη γραμμή). Σχήμα 32: SIMCA με φίλτρο SNV για τη γνάθο L, κατηγοριοποιώντας ως προς τη δεξιά πλευρά της. [R 2 =0.819, Q 2 =0.514, 2Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) [113]

128 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Σχήμα 33: SIMCA με φίλτρο SNV για τη γνάθο L, κατηγοριοποιώντας ως προς τη μέση πλευρά της. [R 2 =0.960, Q 2 =0.905, 2 Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Σχήμα 34: SIMCA με φίλτρο SNV για τη γνάθο L, κατηγοριοποιώντας ως προς την αριστερή πλευρά της. [R 2 =0.967, Q 2 =0.922, 2 Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) [114]

129 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Στη συνέχεια, εφαρμόστηκε PCA και SIMCA σε μικρότερες περιοχές των φασμάτων έτσι ώστε να μικρύνει το εξεταζόμενο εύρος και να μη συμπεριληφθούν κορυφές που οφείλονται στην παρουσία και άλλων ουσιών, όπως είναι η κορυφή στα 2940 cm -1. Οι περιοχές αυτές είναι του απατίτη-προλινών ( cm -1 ) και του αμιδίου Ι ( cm -1 ). Περιοχή απατίτη-προλινών ( cm -1 ) Σχήμα 35: Principal Component Analysis με φίλτρο 1 st & 2 nd Derivative για την περιοχή απατίτη-προλινών της γνάθου L. [R 2 =0.876, Q 2 =0.811, 2 Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Τα μπλε σημεία που ανήκουν στην αριστερή πλευρά της γνάθου φαίνεται ότι είναι συγκεντρωμένα και διαχωρισμένα από τα υπόλοιπα σημεία, υποδηλώνοντας τη διαφοροποίηση της αριστερής πλευράς στη φασματική περιοχή cm -1, όπως φάνηκε και από τα διαγράμματα μεταβολής του MMR (Σχήμα 29). [115]

130 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Σχήμα 36: SIMCA για την περιοχή απατίτη-προλινών της γνάθου L, κατηγοριοποιώντας ως προς τη δεξιά πλευρά της. [R 2 =0.999, Q 2 =0.998, 2 Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Σχήμα 37: SIMCA για την περιοχή απατίτη-προλινών της γνάθου L, κατηγοριοποιώντας ως προς τη μέση πλευρά της. [R 2 =0.999, Q 2 =0.998, 2 [116]

131 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Σχήμα 38: SIMCA για την περιοχή απατίτη-προλινών της γνάθου L, κατηγοριοποιώντας ως προς την αριστερή πλευρά της. [R 2 =0.997, Q 2 =0.993, 2 Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Εφαρμόζοντας SIMCA και εξετάζοντας κάθε πλευρά της γνάθου ξεχωριστά στην περιοχή cm -1 γίνεται ξεκάθαρο και πάλι ότι ή αριστερή της πλευρά διαφοροποιείται από τις άλλες δυο. [117]

132 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Περιοχή αμιδίου Ι ( cm -1 ) Σχήμα 39: Principal Component Analysis με φίλτρο Standard Normal Variate Transform για την περιοχή του αμιδίου Ι της γνάθου L. [R 2 =0.914, Q 2 =0.847, 3 Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Σχήμα 40: SIMCA με φίλτρο Standard Normal Variate Transform για την περιοχή του αμιδίου Ι της γνάθου L, κατηγοριοποιώντας ως προς τη δεξιά πλευρά της. [118]

133 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων [R 2 =0.819, Q 2 =0.513, 2 Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Σχήμα 41: SIMCA με φίλτρο Standard Normal Variate Transform για την περιοχή του αμιδίου Ι της γνάθου L, κατηγοριοποιώντας ως προς τη μέση πλευρά της. [R 2 =0.960, Q 2 =0.906, 2 Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Σχήμα 42: SIMCA με φίλτρο Standard Normal Variate Transform για την περιοχή του αμιδίου Ι της γνάθου L, κατηγοριοποιώντας ως προς την αριστερή πλευρά της. [119]

134 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων [R 2 =0.967, Q 2 =0.921, 2 Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Τόσο από την PCA όσο και από το SIMCA είναι εμφανές ότι η αριστερή πλευρά της γνάθου L διαφοροποιείται και στην περιοχή του αμιδίου Ι (Σχήματα 39, 42). Συνεπώς, οι διαφοροποιήσεις των τιμών του MMR και του λόγου των σταυροδεσμών ως προς την αριστερή πλευρά της L γνάθου συγκλίνουν με τα αποτελέσματα που προκύπτουν από τις χημειομετρικές αναλύσεις, οι οποίες φανερώνουν φασματικές διαφοροποιήσεις στην πλευρά αυτή Εκτίμηση της ποιότητας της Μ γνάθου 14 Υ[960cm -1 /( )cm -1 ] 18 Α[960cm -1 /( )cm -1 ] Σημείο λήψης φάσματος στη γνάθο Σημείο λήψης φάσματος στη γνάθο Σχήμα 43: Διάγραμμα μεταβολής του MMR σε διάφορα διαδοχικά σημεία κατά μήκος της γνάθου Μ, χρησιμοποιώντας λόγους υψών (Υ) και λόγους εμβαδών (Α) κορυφών. (πράσινο: δεξιό τμήμα, μπλε: μέσο τμήμα, κόκκινο: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο). [120]

135 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Y[( )cm -1 /( )cm -1 ] Σημείο λήψης φάσματος στη γνάθο 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 A[( )cm -1 /( )cm -1 ] Σημείο λήψης φάσματος στη γνάθο Σχήμα 44: Διάγραμμα μεταβολής του λόγου των σταυροδεσμών του κολλαγόνου σε διάφορα διαδοχικά σημεία κατά μήκος της γνάθου Μ, χρησιμοποιώντας λόγους των υψών και των εμβαδών των κορυφών. (πράσινο: δεξιό τμήμα, μπλε: μέσο τμήμα, κόκκινο: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο). Στην Μ γνάθο παρατηρείται ότι ο λόγος του MMR δε διαφοροποιείται ιδιαίτερα ανά πλευρά της γνάθου. Αν και φαίνεται να είναι μικρότερος στην αριστερή πλευρά της γνάθου, το t-test φανερώνει ότι οι τιμές του MMR του αριστερού τμήματος της γνάθου δε διαφοροποιούνται από αυτές των άλλων τμημάτων της (Ρ=0.30 ως προς το δεξιό τμήμα και Ρ=0.15 ως προς το μέσο τμήμα της γνάθου). Παράλληλα, το δίκτυο του κολλαγόνου φαίνεται να είναι σε καλή κατάσταση στην πλευρά αυτή μιας και ο λόγος των σταυροδεσμών του είναι χαμηλός (Ρ=0.033 ως προς τη δεξιά και Ρ=0.019 ως προς τη μέση πλευρά) προσδίδοντας σε αυτό το τμήμα του οστού αυξημένη ελαστικότητα. [121]

136 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Χημειομετρική ανάλυση φασμάτων Σχήμα 45: Principal Component Analysis για τη γνάθο Μ, με φίλτρο SNV. [R 2 =0.945, Q 2 =0.815, 4 Components]. (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Η επεξεργασία των δεδομένων με SIMCA έδινε μικρές ή αρνητικές τιμές των R 2 και Q 2 οπότε και δεν παρουσιάζονται. Ωστόσο, από την PCA φάνηκε η διαφοροποίηση της αριστερής πλευράς της γνάθου μιας και τα μπλε σημεία που την αντιπροσωπεύουν διαχωρίζονται από τα υπόλοιπα (Σχήμα 45). [122]

137 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Περιοχή απατίτη-προλινών ( cm -1 ) Σχήμα 46: Principal Component Analysis για την περιοχή απατίτη-προλινών της γνάθου M. [R 2 =0.995, Q 2 =0.991, 2 Components]. (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Σχήμα 47: SIMCA για την περιοχή απατίτη-προλινών για τη γνάθο Μ, κατηγοριοποιώντας ως προς τη δεξιά πλευρά της. [R 2 =0.995, Q 2 =0.984, 2 [123]

138 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Σχήμα 48: SIMCA για την περιοχή απατίτη-προλινών για τη γνάθο Μ, κατηγοριοποιώντας ως προς τη μέση πλευρά της. [R 2 =0.997, Q 2 =0.992, 2 Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Σχήμα 49: SIMCA για την περιοχή απατίτη-προλινών για τη γνάθο Μ, κατηγοριοποιώντας ως προς την αριστερή πλευρά της. [R 2 =0.996, Q 2 =0.988, 2 [124]

139 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Components]. (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Από την ανάλυση με PCA και SIMCA στη φασματική περιοχή προλίνες-απατίτη φάνηκε ότι τα φάσματα της αριστερής πλευράς της γνάθου δε διαφοροποιούνται από τα υπόλοιπα. Αυτό πιθανόν σημαίνει ότι η διαφορετικότητα αυτής της πλευράς που φάνηκε από τα διαγράμματα μεταβολής του MMR αλλά και από τα αποτελέσματα της PCA και SIMCA για ολόκληρο το φάσμα του οστού μπορεί να οφείλεται σε άλλα συστατικά του, και όχι στο βιοαπατίτη, του οποίου η κύρια κορυφή παρουσιάζεται στη συγκεκριμένη φασματική περιοχή. Περιοχή αμιδίου Ι ( cm -1 ) Σχήμα 50: Principal Component Analysis για την περιοχή του αμιδίου Ι της γνάθου Μ. [R 2 =0.999, Q 2 =0.998, 2 Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) [125]

140 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Σχήμα 51: SIMCA για την περιοχή αμιδίου Ι για τη γνάθο Μ, κατηγοριοποιώντας ως προς τη δεξιά πλευρά της. [R 2 =0.996, Q 2 =0.991, 2 Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Σχήμα 52: SIMCA για την περιοχή αμιδίου Ι για τη γνάθο Μ, κατηγοριοποιώντας ως προς τη μέση πλευρά της. [R 2 =0.991 Q 2 = Component] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) [126]

141 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Σχήμα 53: SIMCA για την περιοχή αμιδίου Ι για τη γνάθο Μ, κατηγοριοποιώντας ως προς την αριστερή πλευρά της. [R 2 =1.000, Q 2 =0.999, 2 Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Αυτό που παρατηρείται από τα αποτελέσματα της PCA και SIMCA για την περιοχή του αμιδίου Ι είναι ότι η αριστερή πλευρά της γνάθου τείνει να διαφοροποιείται από τις άλλες δυο, επιβεβαιώνοντας τα αποτελέσματα από τα διαγράμματα μεταβολής του λόγου των σταυροδεσμών του κολλαγόνου Εκτίμηση της ποιότητας της Ο γνάθου 25 Υ[960cm -1 /( )cm -1 ] 30 A[960cm -1 /( )cm -1 ] Σημείο λήψης φάσματος στη γνάθο Σημείο λήψης φάσματος στη γνάθο Σχήμα 54: Διάγραμμα μεταβολής του MMR σε διάφορα διαδοχικά σημεία κατά μήκος της γνάθου Ο, χρησιμοποιώντας λόγους υψών (Υ) και λόγους εμβαδών (Α) [127]

142 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων κορυφών. (πράσινο: δεξιό τμήμα, μπλε: μέσο τμήμα, κόκκινο: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο). 2,5 Y[( )cm -1 /( )cm -1 ] 2,5 Α[( )cm -1 /( )cm -1 ] 2 2 1,5 1, ,5 0, Σημείο λήψης φάσματος στη γνάθο Σημείο λήψης φάσματος στη γνάθο Σχήμα 55: Διάγραμμα μεταβολής του λόγου των σταυροδεσμών του κολλαγόνου σε διάφορα διαδοχικά σημεία κατά μήκος της γνάθου Ο, χρησιμοποιώντας λόγους των υψών (Υ) και των εμβαδών (Α) των κορυφών. (πράσινο: δεξιό τμήμα, μπλε: μέσο τμήμα, κόκκινο: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο). Για την Ο γνάθο φαίνεται από το διάγραμμα παρακολούθησης της μεταβολής του MMR ότι το σημείο 8, που είναι το σημείο ακριβώς στο μέσο της γνάθου, η τιμή του MMR είναι αρκετά χαμηλή που σημαίνει ότι στο συγκεκριμένο σημείο το οστό παρουσιάζει πολύ μικρή αντοχή. Από την άλλη, ο λόγος των σταυροδεσμών φαίνεται να μην παρουσιάζει καμία διαφοροποίηση ανά πλευρά της γνάθου. Τα συμπεράσματα αυτά επιβεβαιώνονται και από το t-test όπου Ρ>0.05. Αξιοσημείωτο είναι ότι παρουσιάζει υψηλότερες τιμές MMR, συγκρινόμενη με τις υπόλοιπες γνάθους, δηλαδή το συγκεκριμένο οστό παρουσιάζει αυξημένη αντοχή ενώ οι τιμές του λόγου των σταυροδεσμών του κολλαγόνου είναι στην ίδια κλίμακα με τις τιμές των άλλων γνάθων. [128]

143 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Χημειομετρική ανάλυση φασμάτων Σχήμα 56: Principal Component Analysis για τη γνάθο Ο, με φίλτρο SNV. [R 2 =0.954, Q 2 =0.869, 3 Components]. (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Σχήμα 57: SIMCA για τη γνάθο Ο, με φίλτρο SNV, κατηγοριοποιώντας ως προς τη δεξιά πλευρά της. [R 2 =0.972, Q 2 =0.918, 2 Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) [129]

144 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Σχήμα 58: SIMCA για τη γνάθο Ο, με φίλτρο SNV, κατηγοριοποιώντας ως προς τη μέση πλευρά της. [R 2 =0.972, Q 2 =0.918, 2 Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Σχήμα 59: SIMCA για τη γνάθο Ο, με φίλτρο SNV, κατηγοριοποιώντας ως προς την αριστερή πλευρά της. [R 2 =0.979, Q 2 =0.882, 2 Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) [130]

145 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Από τα αποτελέσματα της PCA και SIMCA για ολόκληρο το φάσμα φαίνεται ότι δε διαφοροποιείται κάποια από τις πλευρές της γνάθου. Περιοχή απατίτη-προλινών ( cm -1 ) Σχήμα 60: Principal Component Analysis για την περιοχή απατίτη-προλινών της γνάθου Ο. [R 2 =0.996, Q 2 =0.994, 2 Components]. (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Σχήμα 61: SIMCA για την περιοχή απατίτη-προλινών για τη γνάθο Ο, κατηγοριοποιώντας ως προς τη δεξιά πλευρά της. [R 2 =0.996, Q 2 =0.989, 2 [131]

146 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Σχήμα 62: SIMCA για την περιοχή απατίτη-προλινών για τη γνάθο Ο, κατηγοριοποιώντας ως προς τη μέση πλευρά της. [R 2 =1.000, Q 2 =1.000, 1 Component] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Σχήμα 63: SIMCA για την περιοχή απατίτη-προλινών για τη γνάθο Ο, κατηγοριοποιώντας ως προς την αριστερή πλευρά της. [R 2 =0.998, Q 2 =0.996, 2 [132]

147 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Η περιοχή του αμιδίου Ι έδινε πολύ χαμηλές τιμές των R 2 και Q 2 κι έτσι δεν έγινε περεταίρω επεξεργασία. Ωστόσο, τα αποτελέσματα από την PCA και SIMCA δείχνουν να διαφοροποιείται έντονα το κεντρικό σημείο της γνάθου, όπως φάνηκε και από τα αποτελέσματα του MMR και του λόγου των σταυροδεσμών Εκτίμηση της ποιότητας της Ρ γνάθου Y[960cm -1 /( )cm -1 ] Σημείο λήψης φάσματος στη γνάθο A[960cm -1 /( )cm -1 ] Σημείο λήψης φάσματος στη γνάθο Σχήμα 64: Διάγραμμα μεταβολής του MMR σε διάφορα διαδοχικά σημεία κατά μήκος της γνάθου Ρ, χρησιμοποιώντας λόγους υψών (Υ) και εμβαδών (Α) κορυφών. (πράσινο: δεξιό τμήμα, μπλε: μέσο τμήμα, κόκκινο: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο). [133]

148 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Y[( )cm -1 /( )cm -1 ] Σημείο λήψης φάσματος στη γνάθο 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 A[( )cm -1 /( )cm -1 ] Σημείο λήψης φάσματος στη γνάθο Σχήμα 65: Διάγραμμα μεταβολής του λόγου των σταυροδεσμών του κολλαγόνου σε διάφορα διαδοχικά σημεία κατά μήκος της γνάθου Ρ, χρησιμοποιώντας λόγους των υψών (Υ) και των εμβαδών (Α) των κορυφών. (πράσινο: δεξιό τμήμα, μπλε: μέσο τμήμα, κόκκινο: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο). Το διάγραμμα μεταβολής του MMR για την Ρ γνάθο φανερώνει ότι το δεξιό τμήμα της γνάθου έχει υψηλότερες τιμές MMR από τα άλλα δυο τμήματα, ενώ σημαντική διαφορά παρατηρείται πάλι στο πιο κεντρικό σημείο της γνάθου (σημείο 8) όπου ο MMR είναι αρκετά μικρότερος από τα άλλα σημεία. Αυτό σημαίνει ότι το δεξιό τμήμα της γνάθου παρουσιάζει αυξημένη αντοχή, ενώ στο μέσο του οστού πολύ λιγότερη. Από το διάγραμμα μεταβολής του λόγου των σταυροδεσμών του κολλαγόνου παρατηρείται και πάλι ότι στη δεξιά πλευρά της γνάθου οι τιμές είναι χαμηλότερες από τις υπόλοιπες πλευρές. Συνεπώς, η καλή κατάσταση του κολλαγόνου συμβάλει στην ελαστικότητα του οστού. [134]

149 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Χημειομετρική ανάλυση φασμάτων Σχήμα 66: Principal Component Analysis για τη γνάθο Ρ. [R 2 =0.992, Q 2 =0.973, 6 Components]. (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Σχήμα 67: SIMCA για τη γνάθο Ρ, κατηγοριοποιώντας ως προς τη δεξιά πλευρά της. [R 2 =0.929, Q 2 =0.728, 2 Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) [135]

150 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Σχήμα 68: SIMCA για τη γνάθο Ρ, κατηγοριοποιώντας ως προς τη μέση πλευρά της. [R 2 =0.933, Q 2 =0.785, 2 Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Σχήμα 69: SIMCA για τη γνάθο Ρ, κατηγοριοποιώντας ως προς την αριστερή πλευρά της. [R 2 =0.985, Q 2 =0.964, 2 Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) [136]

151 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Από την PCA και SIMCA φαίνεται ότι η δεξιά πλευρά της Ρ γνάθου διαφοροποιείται από τις υπόλοιπες, όπως έδειξαν και τα διαγράμματα μεταβολής του MMR και του λόγου των σταυροδεσμών του κολλαγόνου. Περιοχή απατίτη-προλινών ( cm -1 ) Σχήμα 70: Principal Component Analysis για την περιοχή απατίτη-προλινών της γνάθου Ρ. [R 2 =0.995, Q 2 =0.993, 2 Components]. (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα) [137]

152 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Σχήμα 71: SIMCA για την περιοχή απατίτη-προλινών για τη γνάθο Ρ, κατηγοριοποιώντας ως προς τη δεξιά πλευρά της. [R 2 =0.994, Q 2 =0.975, 2 Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα) Σχήμα 72: SIMCA για την περιοχή απατίτη-προλίνες για τη γνάθο Ρ, κατηγοριοποιώντας ως προς τη μέση πλευρά της. [R 2 =0.993, Q 2 =0.986, 2 Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα) [138]

153 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Σχήμα 73: SIMCA για την περιοχή απατίτη-προλινών για τη γνάθο Ρ, κατηγοριοποιώντας ως προς την αριστερή πλευρά της. [R 2 =0.998, Q 2 =0.996, 2 Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα) Τόσο τα αποτελέσματα της PCA όσο και από το SIMCA για την περιοχή απατίτηπρολινών δείχνουν ότι δεν υπάρχει διαφοροποίηση μεταξύ τους. Συνεπώς, η διαφορετικότητα που φαίνεται να παρουσιάζει η δεξιά πλευρά της γνάθου σε σχέση με τις άλλες πλευρές σύμφωνα με τα αποτελέσματα των λόγων αλλά και τα αποτελέσματα χημειομετρικής ανάλυσης για ολόκληρα τα φάσματα πιθανόν οφείλονται σε άλλα συστατικά του οστού και όχι στο ανόργανο συστατικό του. [139]

154 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Περιοχή αμιδίου Ι ( cm -1 ) Σχήμα 74: Principal Component Analysis για την περιοχή του αμιδίου Ι της γνάθου Ρ. [R 2 =0.993, Q 2 =0.987, 3 Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Σχήμα 75: SIMCA για την περιοχή αμιδίου Ι για τη γνάθο Ρ, κατηγοριοποιώντας ως προς τη δεξιά πλευρά της. [R 2 =0.992, Q 2 =0.980, 2 Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) [140]

155 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Σχήμα 76: SIMCA για την περιοχή αμιδίου Ι για τη γνάθο Ρ, κατηγοριοποιώντας ως προς τη μέση πλευρά της. [R 2 =0.994, Q 2 =0.982, 2 Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Σχήμα 77: SIMCA για την περιοχή αμιδίου Ι για τη γνάθο Ρ, κατηγοριοποιώντας ως προς τη μέση πλευρά της. [R 2 =0.997, Q 2 =0.991, 2 Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) [141]

156 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Από τα παραπάνω αποτελέσματα χημειομετρικής ανάλυσης στην περιοχή του αμιδίου Ι προκύπτει ότι η δεξιά πλευρά της Ρ γνάθου διαφοροποιείται από τις άλλες πλευρές της γνάθου, επιβεβαιώνοντας τα αποτελέσματα από τα διαγράμματα μεταβολής του λόγου των σταυροδεσμών του κολλαγόνου Εκτιμηση της ποιότητας της S γνάθου 16 Υ[960cm -1 /( )cm -1 ] 25 A[960cm -1 /( )cm -1 ] Σημείο λήψης φάσματος στη γνάθο Σημείο λήψης φάσματος στη γνάθο Σχήμα 78: Διάγραμμα μεταβολής του MMR του κολλαγόνου σε διάφορα διαδοχικά σημεία κατά μήκος της γνάθου S, χρησιμοποιώντας λόγους των υψών (Υ) και εμβαδών (Α) των κορυφών. (πράσινο: δεξιό τμήμα, μπλε: μέσο τμήμα, κόκκινο: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο). 3 Y[( )cm -1 /( )cm -1 ] 4,5 Α[( )cm -1 /( )cm -1 ] 2,5 4 3, ,5 2, ,5 0,5 1 0, Σημείο λήψης φάσματος στη γνάθο Σημείο λήψης φάσματος στη γνάθο Σχήμα 79: Διάγραμμα μεταβολής του λόγου των σταυροδεσμών του κολλαγόνου σε διάφορα διαδοχικά σημεία κατά μήκος της γνάθου S, χρησιμοποιώντας λόγους των υψών (Υ) και των εμβαδών (Α) των κορυφών. (πράσινο: δεξιό τμήμα, μπλε: μέσο τμήμα, κόκκινο: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο). [142]

157 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Από τα παραπάνω διαγράμματα είναι φανερό ότι στην αριστερή πλευρά της S γνάθου ο λόγος του MMR είναι αυξημένος ενώ ο λόγος των σταυροδεσμών είναι χαμηλός σε σύγκριση με τις άλλες πλευρές. Αυτό σημαίνει ότι το αριστερό τμήμα της γνάθου παρουσιάζει αυξημένη αντοχή, λόγω του αυξημένου MMR αλλά και ελαστικότητα, λόγω χαμηλών τιμών του λόγου των σταυροδεσμών του κολλαγόνου (Ρ=0.04 ως προς το μέσο τμήμα και Ρ=0.02 ως προς το αριστερό τμήμα της γνάθου). Ο συνδυασμός αυτών των ιδιοτήτων αποτελούν τα χαρακτηριστικά στοιχεία του οστού. Χημειομετρική ανάλυση φασμάτων Σχήμα 80: Principal Component Analysis για τη γνάθο S. [R 2 =0.995, Q 2 =0.991, 3 Components]. (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα) [143]

158 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Σχήμα 81: SIMCA για τη γνάθο S, κατηγοριοποιώντας ως προς τη δεξιά πλευρά της. [R 2 =0.981, Q 2 =0.969, 1 Component] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Σχήμα 82: SIMCA για τη γνάθο S, κατηγοριοποιώντας ως προς τη μέση πλευρά της. [R 2 =0.929, Q 2 =0.888, 1 Component] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) [144]

159 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Σχήμα 83: SIMCA για τη γνάθο S, κατηγοριοποιώντας ως προς την αριστερή πλευρά της. [R 2 =0.997, Q 2 =0.992, 2 Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Από τα αποτελέσματα της PCA και SIMCA για ολόκληρα τα φάσματα φαίνεται η διαφοροποίηση της αριστερής πλευράς (μπλε κουκίδες και στήλες) επιβεβαιώνοντας τα αποτελέσματα από τους λόγους μεταβολής του MMR και του λόγου των σταυροδεσμών του κολλαγόνου. [145]

160 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Περιοχή απατίτη-προλινών ( cm -1 ) Σχήμα 84: Principal Component Analysis για την περιοχή απατίτη-προλινών της γνάθου S. [R 2 =0.999, Q 2 =0.998, 2 Components]. (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Σχήμα 85: SIMCA για την περιοχή απατίτη-προλινών για τη γνάθο S, κατηγοριοποιώντας ως προς τη δεξιά πλευρά της. [R 2 =0.949, Q 2 =0.926, 1 [146]

161 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Component] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Σχήμα 86: SIMCA για την περιοχή απατίτη-προλινών για τη γνάθο S, κατηγοριοποιώντας ως προς τη μέση πλευρά της. [R 2 =0.998, Q 2 =0.993, 2 Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Σχήμα 87: SIMCA για την περιοχή απατίτη-προλινών για τη γνάθο S, κατηγοριοποιώντας ως προς την αριστερή πλευρά της. [R 2 =0.998, Q 2 =0.995, 2 [147]

162 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Components] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Από τα παραπάνω σχήματα φαίνεται και πάλι ο διαχωρισμός της αριστερής πλευράς της γνάθου στην περιοχή απατίτη-προλινών αλλά υπάρχουν κάποια σημεία που δεν συμφωνούν απόλυτα, όπως συμβαίνει στα Σχήματα 85 και 86. Περιοχή αμιδίου Ι ( cm -1 ) Σχήμα 88: Principal Component Analysis για την περιοχή απατίτη-προλίνες της γνάθου Μ. [R 2 =0.995, Q 2 =0.994, 1 Component]. (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) [148]

163 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Σχήμα 89: SIMCA για την περιοχή αμιδίου Ι για τη γνάθο S, κατηγοριοποιώντας ως προς τη δεξιά πλευρά της. [R 2 =0.998, Q 2 =0.997, 1 Component] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Σχήμα 90: SIMCA για την περιοχή αμιδίου Ι για τη γνάθο S, κατηγοριοποιώντας ως προς τη μέση πλευρά της. [R 2 =0.987, Q 2 =0.982, 1 Component] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) [149]

164 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Σχήμα 91: SIMCA για την περιοχή αμιδίου Ι για τη γνάθο S, κατηγοριοποιώντας ως προς την αριστερή πλευρά της. [R 2 =0.998, Q 2 =0.996, 1 Component] (κόκκινο: δεξιό τμήμα, πράσινο: μέσο τμήμα, μπλε: αριστερό τμήμα ως προς τη γνάθο) Για την περιοχή του αμιδίου Ι τα αποτελέσματα από την PCA δεν έδειξαν το αναμενόμενο αποτέλεσμα, δηλαδή τη διαφοροποίηση του αριστερού τμήματος της γνάθου. Ωστόσο, τα αποτελέσματα από το SIMCA έδειξαν τη διαφοροποίηση αυτή, επαληθεύοντας τα αποτελέσματα από το διάγραμμα μεταβολής του λόγου των σταυροδεσμών του κολλαγόνου. 6.3 Σύγκριση Αποτελεσμάτων Φασματοσκοπίας FT-Raman με Μετρήσεις Οστικής Πυκνότητας Η φασματοσκοπία Raman αποτελεί ένα εργαλείο για την εκτίμηση της ποιότητας οστών κι έτσι κρίνεται απαραίτητο να συγκριθεί με άλλες ευρέως χρησιμοποιούμενες τεχνικές. Χαρακτηριστικός δείκτης της ποιότητας των οστών αποτελεί η οστική πυκνότητα (Bone Mineral Density). Στα επόμενα, παρουσιάζονται τα αποτελέσματα από τη σύγκριση της φασματοσκοπίας Raman με αυτά της οστικής πυκνότητας για τις γνάθους Ο και Ρ. Αρχικά όμως, δημιουργήθηκε ένας όρος που μπορεί να κάνει συγκρίσιμα τα αποτελέσματα των δυο τεχνικών, καθώς η μορφολογία του υλικού όπως είναι οι υψομετρικές διαφορές αλλά και η διαφορετική πυκνότητα του συμπαγούς και του [150]

165 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων σπογγώδους οστού, επηρεάζει σε σημαντικό βαθμό τις μετρήσεις του BMD. Για το λόγο αυτό, οι τιμές του BMD διαιρέθηκαν αρχικά με το ύψος κάθε τομής [BMD / Height], ώστε να καλυφθούν υψομετρικές διαφορές που μπορεί να οφείλονται για παράδειγμα στις κενές οδοντικές θέσεις. Στην πορεία όμως, υπολογίστηκε η πυκνότητα του συμπαγούς και του σπογγώδους μέρους του οστού, όπως περιγράφεται στην παράγραφο 3.1.2, με σκοπό να συνυπολογιστεί στις μετρήσεις του BMD η επίδραση της γεωμετρίας του υλικού (Παράρτημα Γ). Έτσι, οι τιμές του BMD διαιρέθηκαν με το γινόμενο του ύψους επί τη μέση πυκνότητα της τομής [BMD / (Height cortical +Height trabecular )*Average Density], όπου Πίνακας 5: Τιμές της πυκνότητας του συμπαγούς και του σπογγώδους οστού για τις γνάθους Ο και Ρ. Δείγμα Πυκνότητα συμπαγούς οστού Πυκνότητα σπογγώδους οστού [g/cm 3 ] [g/cm 3 ] Γνάθος Ο Γνάθος Ρ Στα διαγράμματα που ακολουθούν, για τους όρους του MMR και του BMD χρησιμοποιήθηκε πολλαπλασιαστής, ώστε να είναι πιο ευδιάκριτη η σύγκριση των μεγεθών. Στην πρώτη περίπτωση, οι τιμές του MMR πολλαπλασιάστηκαν με το 50% ενώ στην άλλη περίπτωση, οι τιμές του BMD δεκαπλασιάστηκαν. [151]

166 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Σχήμα 92: Σύγκριση τιμών του MMR/2 και BMD/Height για διάφορα διαδοχικά σημεία της γνάθου Ο. Σχήμα 93: Σύγκριση τιμών του MMR/2 και BMD/(Height*Aver.Density) για διάφορα σημεία της γνάθου Ο. [152]

167 Κεφάλαιο 6 Εκτίμηση της Ποιότητας Ανθρώπινων Γνάθων Σχήμα 94: Σύγκριση τιμών του MMR/2 και BMD/Height για διάφορα σημεία της γνάθου P. Σχήμα 95: Σύγκριση τιμών του MMR και BMD/(Height*Aver.Density) για διάφορα σημεία της γνάθου P. [153]