Από το γονίδιο στην πρωτεΐνη

Transcript

1 Κεφάλαιο 17 Από το γονίδιο στην πρωτεΐνη Original Slides by Erin Barley Kathleen Fitzpatrick Γρηγόρης Παπαγρηγορίου 1

2 Η ροή της γενετικής πληροφορίας Η πληροφορία που περιέχεται στα γονίδια έχει την μορφή συγκεκριμένων αλληλουχιών νουκλεοτιδίων στο DNA Το DNA κωδικωποιεί συγκεκριμένα γνωρίσματα, καθορίζοντας την σύνθεση των πρωτεϊνών σ ένα οργανισμό Οι πρωτεΐνες αποτελούν τον σύνδεσμο μεταξύ γονοτύπου και φαινότυπου 2

3 Η διεργασία με την οποία το DNA κατευθύνει τη σύνθεση των πρωτεϊνών ονομάζεται γονιδιακή έκφραση (gene expression)......και περιλαμβάνει δύο στάδια, τη μεταγραφή (transcription) και τη μετάφραση (translation) Πως όμως ανακαλύφθηκε η θεμελιώδης σχέση μεταξύ γονιδίων και πρωτεϊνών; 3

4 Το 1909 ο Archibald Garrod, γιατρός, πρότεινε ότι τα γονίδια καθορίζουν το φαινότυπο επειδή κωδικοποιούν τα διάφορα ένζυμα που καταλύουν τις αντιδράσεις του οργανισμού Την εποχή εκείνη είχε αρχίσει να γίνεται κατανοητό ότι τα περισσότερα οργανικά μόρια των κυττάρων συντίθενται και αποικοδομούνται μέσω μεταβολικών οδών (δηλ. σε στάδια)......στις οποίες κάθε επιμέρους χημική αντίδραση καταλύεται από ένα συγκεκριμένο ένζυμο 4

5 Θεώρησε ότι οι διάφορες κληρονομικές ασθένειες οφείλονται στην ανικανότητα του οργανισμού να συνθέσει ένα συγκεκριμένο, για κάθε ασθένεια, ένζυμο Για παράδειγμα η αλκαπτονουρία είναι μια ασθένεια στην οποία τα ούρα του ασθενή έχουν μαύρο χρώμα γιατί περιέχουν αλκαπτόνη Ο Garrod συμπέρανε ότι αυτό συμβαίνει γιατί τα άτομα με αλκαπτονουρία αδυνατούν, για κληρονομικούς λόγους, να συνθέσουν το ένζυμο που μεταβολίζει την αλκαπτόνη 5

6 Πειράματα με το Neurospora Crassa Λίγα χρόνια αργότερα, οι Beadle και Tatum έκαναν πειράματα με ένα μύκητα που αναπτύσσεται στο ψωμί Το αγρίου τύπου (φυσιολογικό)neurosporaμπορεί να αναπτυχθεί σε θρεπτικό μέσο με ελάχιστα συστατικά ( minimal medium ) Οι ερευνητές βομβάρδησαν το Neurospora με ακτίνες Χ......και αναζήτησαν μεταλλάγματα που είχαν διαφορετικές διατροφικές ανάγκες Τα μεταλλάγματα αυτά δε μπορούσαν να αναπτυχούν στο ελάχιστο καλλιεργητικό μέσο, αλλά επιβίωναν σε πλήρες καλλιεργητικό μέσο (ίδιο με το ελάχιστο + αμινοξέα και μερικά άλλα θρεπτικά) 6

7 Το επόμενο βήμα ήταν να βρούν ποιο ακριβώς θρεπτικό συστατικό ήταν αυτό που χρειαζόταν κάθε μετάλλαγμα Δείγμα από μεταλλάγματα και μεταφορά σε άλλους σωλήνες......οι οποίοι περιείχαν το ελάχιστο θρεπτικό ΣΥΝ ένα μόνο επιπλέον θρεπτικό Χρησιμοποιώντας διασταυρώσεις: Αναγνώρισαν τρείς διαφορετικές κατηγορίες μεταλλαγμένων στελεχών που απαιτούσαν την προσθήκη αργινίνης Συμπέραναν ότι κάθε ένα από αυτά τα μεταλλάγματα είχε έλλειψη διαφορετικού ενζύμου από το μονοπάτι βιοσύνθεσης της αργινίνης 7

8 8

9 Διατύπωσαν την υπόθεση ένα γονίδιο ένα ένζυμο......δηλαδή ότι η λειτουργία κάθε γονιδίου είναι να υπαγορεύει την παραγωγή συγκεκριμένου ενζύμου Αργότερα έγινε κατανοητό ότι δεν είναι όλες οι πρωτεΐνες ένζυμα και η υπόθεση έγινε ένα γονίδιο μία πρωτεΐνη......αλλά ξέρουμε ότι πολλές πρωτεΐνες αποτελούνται από περισσότερα του ενός πολυπεπτίδια, οπότε τελικά η ιδέα επαναδιατυπώθηκε ως ένα γονίδιο ένα πολυπεπτίδιο Ακόμα κι έτσι, υπάρχουν εξαιρέσεις, αφού σε κάποια γονίδια έχουμε εναλλακτική συναρμογή του RNA, ενώ κάποια άλλα γονίδια κωδικοποιούν μόρια RNA τα οποία δε μεταφράζονται ποτέ 9

10 Βασικές αρχές της μεταγραφής και της μετάφρασης Η σύνθεση μιας πρωτεΐνης δε γίνεται απευθείας από το γονίδιο που την κωδικοποιεί Το DNA πρώτα μεταγράφεται σε mrna To RNA είνα η «γέφυρα» που συνδέει το DNA με τη διεργασία της πρωτεϊνοσύνθεσης Αγγελιοφόρο RNA (mrna, messenger RNA) Θα μεταφραστεί σε πρωτεΐνη στο ριβόσωμα 10

11 Στα προκαρυωτικά κύτταρα η μετάφραση μπορεί να ξεκινήσει πριν να τελειώσει η μεταγραφή Στα ευκαρυωτικά κύτταρα αυτό δε μπορεί να συμβεί, αφού η μεταγραφή γίνεται μέσα στον πυρήνα, ενώ η μετάφραση έξω Επιπλέον, τα ευκαρυωτικά mrna υπόκεινται σε επεξεργασία πριν να μεταφραστούν Το αρχικό μετάγραφο RNA, είτε πρόκειται για mrna είτε για RNA που δε θα μεταφραστεί, ονομάζεται πρωτογενές μετάγραφο (primary transcript) 11

12 Στους προκαρυωτικούς οργανισμούς το mrna που παράγεται από την μεταγραφή αυτομάτως μεταφράζεται χωρίς περαιτέρω επεξεργασία 12

13 Στα ευκαρυωτικά κύτταρα η παρουσία πυρηνικού φακέλου διαχωρίζει τη μεταγραφή από τη μετάφραση Στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς τα μετάγραφα RNA των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες δεν εγκαταλείπουν τον πυρήνα αν δεν υποστούν τ ρ ο π ο π ο ι ή σ ε ι ς Προ mrna (pre mrna): Το μεταγράφημα προτού τροποποιηθεί Ώριμο mrna (mature mrna): Μπορεί πλέον να μεταφραστεί 13

14 Ανακεφαλαιώνοντας: ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ: Η διεργασία σύνθεσης RNA υπό την καθοδήγηση του DNA ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ: Η διεργασία σύνθεσης πρωτεϊνών υπό την καθοδήγηση μορίων RNA Το κεντρικό δόγμα της βιολογίας (όπως το χαρακτήρισε ο Crick): DNA ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ RNA ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΗ 14

15 Ο γενετικός κώδικας Πώς κωδικοποιούνται στο DNA οι οδηγίες για τη «συναρμολόγηση» των διαφορετικών αμινοξέων σε μια πρωτεΐνη; Υπάρχουν 20 αμινοξέα, αλλά το DNA αποτελείται από τέσσερις μόνο διαφορετικές βάσεις Η πρώτη ερώτηση που τίθεται λοιπόν είναι όσα νουκλεοτίδια αντιστοιχούν σε ένα αμινοξύ; Δρ Φοίβη 2011 Pearson Σταυρίδη Education, Inc. 15

16 Κωδικόνια (Codons): Τριπλέτες βάσεων Η πληροφορία που περιέχει ένα γονίδιο βασίζεται σε ένα κώδικα τριπλετών (triplet code): μια σειρά από «λέξεις» τριών νουκλεοτιδίων η κάθε μία, που δεν αλληλεπικαλύπτονται Οι «λέξεις» ενός γονιδίου μεταγράφονται στις συμπληρωματικές «λέξεις» στο μόριο του mrna Οι λέξεις αυτές μεταφράζονται στη συνέχεια σε μία αλυσίδα αμινοξέων, σχηματίζοντας έτσι ένα πολυπεπτίδιο Δρ Φοίβη 2011 Pearson Σταυρίδη Education, Inc. 16

17 17

18 Κατά τη μεταγραφή μόνο η μία από τις δύο αλυσίδες του DNA χρησιμοποιείται για τη σύνθεση του RNA Η αλυσίδα αυτή ονομάζεται αλυσίδα εκμαγείο (template strand) Η αλυσίδα εκμαγείο είναι πάντα η ίδια για ένα συγκεκριμένο γονίδιο Δρ Φοίβη 2011 Pearson Σταυρίδη Education, Inc. 18

19 Κατά τη μετάφραση, οι τριπλέτες βάσεων του mrna, που ονομάζονται κωδικόνια (codons), διαβάζονται από το άκρο 5 προς το 3 Καθε κωδικόνιο καθορίζει την προσθήκη ενός συγκεκριμένου αμινοξέος στην αντίστοιχη θέση του πεπτιδίου Δρ Φοίβη 2011 Pearson Σταυρίδη Education, Inc. 19

20 «Σπάζοντας» τον κώδικα Μέχρι τα μέσα της δεκαετίας του 60 και τα 64 κωδικόνια είχαν αποκωδικοποιηθεί Από τις 64 τριπλέτες, 61 κωδικοποιούν αμινοξέα, ενώ 3 τριπλέτες χρησιμεύουν ως σήματα λήξης της μετάφρασης Ο γενετικός κώδικας είναι εκφυλισμένος (redundant) (παρατηρείται δηλαδή πλεονασμός, αφού υπάρχουν περισσότερα από ένα κωδικόνια για κάθε αμινοξύ)......αλλά χωρίς αμφισημίες (not ambiguous) αφού κάθε κωδικόνιο ορίζει ένα μόνο αμινοξύ Δρ Φοίβη 2011 Pearson Σταυρίδη Education, Inc. 20

21 Τα κωδικόνια πρέπει να διαβαστούν με το σωστό πλαίσιο ανάγνωσης (reading frame) προκειμένου να δώσουν το σωστό πεπτίδιο the red dog ate the bug her edd oga tet heb ug ΕΧΕ ΤΟΝ ΝΟΥ ΣΟΥ ΣΤΑ ΖΩΑ ΧΕΤ ΟΝΝ ΟΥΣ ΟΥΣ ΤΑΖ ΩΑ 21

22 22

23 Εξέλιξη του γενετικού κώδικα Ο γενετικός κώδικας είναι σχεδόν καθολικός ίδιος από το απλούστερο βακτήριο μέχρι τους πιο περίπλοκους οργανισμούς Γονίδια που μεταφέρουμε από ένα είδος σε άλλο μπορούν να μεταγραφούν και μεταφραστούν σωστά! (α) Φυτό καπνού εκφράζει γονίδιο πυγολαµπίδας (α) Γουρούνι εκφράζει γονίδιο µέδουσας Δρ Φοίβη 2011 Pearson Σταυρίδη Education, Inc. 23

24 17.2 Μεταγραφή Όπως είδαμε, η μεταγραφή είναι το πρώτο στάδιο της έκφρασης ενός γονιδίου ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ: Η σύνθεση RNA με βάση μία αλυσίδα DNA εκμαγείο (template strand) 24

25 Μοριακά συστατικά της μεταγραφής Η πολυμεράση του RNA ανοίγει τη διπλή έλικα του DNA και ενώνει τα νουκλεοτίδια RNA......καθώς αυτά σχηματίζουν ζεύγη με τις βάσεις των αντίστοιχών νουκλεοτιδίων του DNA. Η σύνθεση του RNA ακολουθεί τους ίδιους κανόνες ζευγαρώματος των βάσεων με το DNA, με την διαφορά ότι αντί για θυμίνη (T) έχουμε ουρακίλη (U) 25

26 Τα βακτήρια έχουν μόνο μία πολυμεράση RNA Οι ευκαρυώτες έχουν τουλάχιστον τρεις αυτή που είναι υπεύθυνη για τη μεταγραφή του mrna είναι η πολυμεράση ΙΙ του RNA 26

27 ΥΠΟΚΙΝΗΤΗΣ (promoter): Η αλληλουχία του DNA όπου προσδένεται η πολυμεράση του RNA για να ξεκινήσει την μεταγραφή Στα βακτήρια, υπάρχει επίσης μια αλληλουχία που σηματοδοτεί το τέλος της μεταγραφής και ονομάζεται σημείο τερματισμού Η περιοχή του DNA που μεταγράφεται σε ένα μόριο RNA ονομάζεται μεταγραφική μονάδα 27

28 Σύνθεση μεταγράφου RNA Τα τρία στάδια της μεταγραφής: Έναρξη Επιμήκυνση Τερματισμός 28

29 Animation: Transcription Right-click slide / select Play Δρ Φοίβη 2011 Pearson Σταυρίδη Education, Inc. 29

30 ΕΝΑΡΞΗ 30

31 ΕΠΙΜΗΚΥΝΣΗ Κατιούσα κατεύθυνση (downstream): Κατεύθυνση από το 5 προς το 3 άκρο Ανιούσα κατεύθυνση (upstream): Ανάποδα 31

32 ΤΕΡΜΑΤΙΣΜΟΣ 32

33 Πρόσδεση πολυμεράσης RNA στο DNA και έναρξη της μεταγραφής Ο υποκινητής ενός γονιδίου καθορίζει το σημείο έναρξης της μεταγραφής, καθώς και το ποια αλυσίδα θα χρησιμοποιηθεί σαν εκμαγείο Οι ευκαρυωτικοί υποκινητές περιλαμβάνουν συνήθως ένα πλαίσιο TATA (TATA box) Σύμπλοκο έναρξης της μεταγραφής: Το συνολικό σύμπλοκο, που περιλαμβάνει τον υποκινητή, μεταγραφικούς παράγοντες, και την πολυμεράση ΙΙ του RNA ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ: Πρωτεΐνες που διαμεσολαβούν Για την πρόσδεση της πολυμεράσης του RNA στον υποκινητή Για την έναρξη της μεταγραφής 33

34 Έναρξη της μεταγραφής Αναγνώριση του πλαισίου ΤΑΤΑ Είναι ΜΕΡΟΣ του υποκινητή Σε απόσταση περίπου 25 νουκλεοτιδίων από την έναρξη της μεταγραφής 34

35 Έναρξη της μεταγραφής Αναγνώριση του πλαισίου ΤΑΤΑ Έρχονται οι πρώτοι μεταγραφικοί παράγοντες να αναγνωρίσουν το πλαίσιο ΤΑΤΑ Προσδένονται στο DNA Επάγουν την πρόσδεση και της Πολυμεράσης II του RNA Μεταγραφικοί Παράγοντες 35

36 Έναρξη της μεταγραφής Αναγνώριση του πλαισίου ΤΑΤΑ Έρχεται μια δεύτερη ομάδα μεταγραφικών παραγόντων στο σημείο Μαζί με την Πολυμεράση ΙΙ του RNA θα σχηματιστεί τελικά το Σύμπλοκο Έναρξης της Μεταγραφής ΕΝΑΡΞΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ 36

37 Επιμήκυνση της αλυσίδας RNA Καθώς η πολυμεράση του RNA κινείται κατά μήκος του DNA συνεχίζει να ξετυλίγει τη διπλή έλικα, εκθέτοντας κάθε φορά 10 με 20 βάσεις του DNA Η μεταγραφή προχωρά με ταχύτητα περιπου 40 νουκλεοτίδια το δευτερόλεπτο Ένα γονίδιο είναι δυνατόν να μεταγραφεί ταυτόχρονα από πολλά μόρια πολυμεράσης του RNA Τα καινούργια νουκλεοτίδια προστίθονται στο άκρο 3 της αλυσίδας του RNA 37

38 38

39 Τερματισμός της μεταγραφής Ο μηχανισμός τερματισμού διαφέρει ανάμεσα στα βακτήρια και τους ευκαρυώτες Στα βακτήρια, ο τερματισμός επιτελείται από την αλληλουχία τερματισμού στο DNA Στους ευκαρυώτες, η πολυμεράση του RNA μεταγράφει μια αλληλουχία του DNA που ονομάζεται αλληλουχία σήματος πολυαδενυλίωσης Αυτή κωδικοποιεί την ενσωμάτωση του σήματος πολυαδενυλίωσης (ΑΑUAAA) στο προ mrna νουκλεοτίδια μετά, το μόριο του RNA που σχηματίστηκε θα απελευθερωθεί από το σύμπλοκο της πολυμεράσης RNA 39

40 17.3 Τροποποίηση του RNA κατά την μεταγραφή Στα ευκαρυωτικά κύτταρα Πριν γίνει η αποστολή του γενετικού μηνύματος στο κυτταρόπλασμα, το μόριο του προ mrna τροποποιείται από έναν αριθμό ενζύμων του πυρήνα Κατά την διάρκεια αυτής της επεξεργασίας του RNA και τα δύο άκρα του μορίου τροποποιούνται Επίσης ορισμένα εσωτερικά τμήματα αποκόπτονται και τα εναπομένοντα τμήματα ενώνονται 40

41 Τροποποίηση των άκρων του mrna Κάθε άκρο του προ mrna τροποποιείται με συγκεκριμένο τρόπο: Στο 5 άκρο προστίθεται το κάλυμμα 5 ή καλύπτρα 5 (5 cap) μια τροποποιημένη μορφή γουανίνης (G) Στο 3 άκρο προστίθενται νουκλεοτίδια αδενίνης η πολυαδενυλική ουρά ή ουρά πόλυ Α (poly A tail) Αυτές οι τροποποιήσεις: Διευκολύνουν την έξοδο του ώριμου mrna από τον πυρήνα Προστατεύουν το mrna από υδρολυτικά ένζυμα Διευκολύνουν την πρόσδεση των ριβοσωμάτων στο άκρο 5 του mrna (στο κυτταρόπλασμα) 41

42 Στο παραπάνω σχήμα φαίνονται επίσης οι αμετάφραστες περιοχές UTR (UnTranslated Regions) Αυτές βρίσκονται τόσο στο άκρο 5 (5 UTR) όσο και στο άκρο 3 (3 UTR) Αν και δε μεταφράζονται εξυπηρετούν άλλες λειτουργίες, μία από τις οποίες μπορεί να είναι η πρόσδεση του ριβοσώματος 42

43 Διαμερισμένα γονίδια και συναρμογή του RNA Στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς τα γονίδια περιλαμβάνουν μεγάλα τμήματα που ΔΕΝ ΜΕΤΑΦΡΑΖΟΝΤΑΙ ΌΜΩΣ... ΘΑ ΜΕΤΑΓΡΑΦΟΥΝ Έτσι τα αρχικά μεταγραφήματα (προ mrna) θα περιέχουν και ΜΗ ΜΕΤΑΦΡΑΖΟΜΕΝΕΣ ΠΕΡΙΟΧΕΣ......οι οποίες πρέπει να αφαιρεθούν 43

44 ΙΝΤΡΟΝΙΑ: Οι μη μεταφραζόμενες περιοχές ΕΞΟΝΙΑ: Τα κωδικά τμήματα, δηλαδή οι αλληλουχίες που τελικά εκφράζονται Η διεργασία όπου τα ιντρόνια αφαιρούνται από το προmrna και τα εξόνια επικολλούνται μεταξύ τους ονομάζεται ΣΥΝΑΡΜΟΓΗ ΤΟΥ RNA (RNA splicing) 44

45 Ησυναρμογή τουrna επιτελείται από το σωμάτιο συναρμογής (spliceosome) Τα σωμάτια συναρμογής αποτελούνται από διάφορές πρωτεΐνες......και ειδικά υπερμοριακά σύμπλοκα που ονομάζονται μικρές πυρηνικές ριβονουκλεοπρωτείνες (snrnps) Μόρια RNA προσδεδεμένα σε μικρές πρωτεΐνες Αναγνωρίζουν νουκλεοτίδια στα αρχικά σημεία των ιντρονίων 45

46 5 Μετάγραφο RNA (προ-mrna) Εξόνιο 1 Ιντρόνιο Εξόνιο 2 Πρωτεΐνη snrna snrnps Άλλες πρωτεΐνες 46

47 5 Μετάγραφο RNA (προ-mrna) Εξόνιο 1 Ιντρόνιο Εξόνιο 2 Πρωτεΐνη snrna snrnps Άλλες πρωτεΐνες Σωμάτιο Συναρμογής Ζευγάρωμα συμπληρωματικών νουκλεοτιδίων των μορίων RNA των snrnps με ακολουθίες του ιντρονίου 5 47

48 5 Μετάγραφο RNA (προ-mrna) Εξόνιο 1 Ιντρόνιο Εξόνιο 2 Πρωτεΐνη snrna snrnps Άλλες πρωτεΐνες Σωμάτιο Συναρμογής 5 Συστατικά Σωματίου Συναρμογής 5 mrna Εξόνιο 1 Εξόνιο 2 Αποκομμένο ιντρόνιο 48

49 Ριβοένζυμα Τα ριβοένζυμα είναι μόρια RNA που λειτουργούν ως ένζυμα...όπως αυτά που συμμετέχουν στην συναρμογή του RNA Η ανακάλυψη των ριβοενζύμων ανέτρεψε την ιδέα ότι όλοι οι βιολογικοί καταλύτες είναι πρωτεΐνες 49

50 Ιδιότητες που επιτρέπουν σε ορισμένα μόρια RNA να λειτουργούν ως ένζυμα Συγκεκριμένη τρισδιάστατη δομή ενός μορίου RNA Επειδή το RNA είναι μονόκλωνο, ορισμένες περιοχές του μορίου μπορούν να ζευγαρώσουν με συμπληρωματικές βάσεις άλλων περιοχών του ιδίου μορίου Έχουν λειτουργικές ομάδες Μερικές βάσεις του RNA περιέχουν λειτουργικές ομάδες που συμμετέχουν στην κατάλυση Ικανότητα RNA να σχηματίζει δεσμούς υδρογόνου με άλλα μόρια νουκλεϊκών οξέων Αυτό του επιτρέπει να έχει ειδικότητα 50

51 Λειτουργική και εξελικτική σημασία των ιντρόνιων Η παρουσία των ιντρονίων σε ένα γονίδιο επιτρέπει την κωδικοποίηση από το ίδιο γονίδιο περισσότερων του ενός πολυπεπτιδίων Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται εναλλακτική συναρμογή του RNA (alternative RNA splicing) Λόγω της εναλλακτικής συναρμογής, ο αριθμός των διαφόρων πρωτεϊνικών προϊόντων που παράγει ένας οργανισμός είναι πολύ μεγαλύτερος από τον αριθμό των γονιδίων του 51

52 Ορισμένες πρωτεΐνες αποτελούνται από διακριτές δομικές και λειτουργικές περιοχές που ονομάζονται πρωτεϊνικοί τομείς (domains) Πολλές φορές, διαφορετικά εξόνια κωδικοποιούν διαφορετικούς πρωτεϊνικούς τομείς Η παρουσία ιντρονίων σε ένα γονίδιο μπορεί να διευκολύνει την εξέλιξη νέων πρωτεϊνών μέσω ενός μηχανισμού που είναι γνωστός ως αναδιάταξη εξονίων (exon shuffling) 52

53 53

54 Μετάφραση Μετάφραση είναι η σύνθεση ενός πολυπεπτιδίου σύμφωνα με τις οδηγίες που περιέχονται στο mrna 54

55 Μοριακά Συστατικά της Μετάφρασης Το κύτταρο ερμηνεύει το γενετικό μήνυμα και συνθέτει ένα πολυπεπτίδιο με την βοήθεια των μεταφορικών RNA (trna) Τα trna (transfer RNA) μεταφέρουν τα αμινοξέα στο υπό κατασκευή πολυπεπτίδιο ΔΕΝ είναι όλα τα μόρια των trna όμοια μεταξύ τους: Στο ένα άκρο του μορίου φέρουν ένα συγκεκριμένο αμινοξύ Στο άλλο άκρο του μορίου υπάρχει μια τριπλέτα νουκλεοτιδίων που ονομάζεται αντικωδικόνιο Το αντικωδικώνιο σχηματίζει ζεύγη βάσεων με ένα συμπληρωματικό κωδικόνιο στο μόριο του mrna 55

56 56

57 Δόμη και λειτουργία του μεταφορικού RNA Ένα μόριο trna αποτελείται από μια αλληλουχία RNA που έχει μήκος μόλις 80 νουκλεοτίδια Αν το προβάλλουμε σε δύο μόνο διαστάσεις η δομή που αποκτά ένα μόριο trna, βλέπουμε ότι μοιάζει με τριφύλλι 57

58 Εξαιτίας των δεσμών υδρογόνου το trna αναδιπλώνεται και η τρισδιάστατη δομή του μοιάζει με το γράμμα L 58

59 Ο ρόλος των trnas Η ακρίβεια της μετάφρασης εξαρτάται από: 1. Το trna που προσδένεται σε ένα κωδικόνιο του mrna πρέπει να φέρει το αμινοξύ που αντιστοιχεί στο συγκεκριμένο κωδικόνιο Το trna θα πρέπει να φέρει στο άλλο του άκρο το συγκεκριμένο αμινοξύ και κανένα άλλο Η πρόσδεση του αμινοξέως με το trna γίνεται από μια ομάδα ενζύμων που ονομάζονται συνθετάσες του αμινοακυλο trna 2. Την σωστή αντιστοίχιση του κάθε trna με το αντίστοιχο κωδικόνιο του mrna Ταλάντευση (wobble): Ελαστικότητα στο ζευγάρωμα βάσεων που χαρακτηρίζει τις βάσεις που είναι ΤΕΛΕΥΤΑΙΕΣ στην τριπλέτα του κωδικονίου Στην πραγματικότητα υπάρχουν γύρω στα 45 trna και όχι 61 59

60 Σχηματισμός των αμινοάκυλο trna: Ειδικά ένζυμα, οι συνθετάσες του αμινοάκυλο trna είναι υπεύθυνα για το «φόρτωμα» των trna με το κατάλληλο αμινοξύ 20 συνθετάσες, μία για κάθε τύπο αμινοξέως Σχηματισμός ομοιοπολικού δεσμού μεταξύ αμινοξέως και trna Κατανάλωση ΑΤΡ Σχηματίζονται τα αμινοάκυλοtrna «Φορτισμένα» μόρια Έχουν σαν φορτίο ένα αμινοξύ! 60

61 Ριβοσώματα Τα ριβοσώματα διευκολύνουν την ειδική σύζευξη των αντικωδικονίων trna με τα κωδικόνια mrna Ένα ριβόσωμα αποτελείται από δύο υπομονάδες (μεγάλη και μικρή υπομονάδα) Κάθε υπομονάδα αποτελείται από πρωτεΐνες και μόρια RNA, τα ριβοσωματικά RNA (rrna) Τα ευκαρυωτικά και τα προκαρυωτικά ριβοσώματα μοιάζουν πολύ μεταξύ τους, αλλά υπάρχουν κάποιες μικρές διαφορές στη μοριακή τους σύσταση Εφαρμογή στην ιατρική για την παραγωγή αντιβιοτικών (π.χ. Τετρακυκλίνη, στρεπτομυκίνη) 61

62 Σε κάθε ριβόσωμα υπάρχει θέση σύνδεσης του mrna......τρεις θέσεις σύνδεσης για τα trna και......θέση εξόδου για την πολυπεπτιδική αλυσίδα που συντίθεται 62

63 Ένα ριβόσωμα έχει τρειςθέσειςπρόσδεσηςγια τα trna: Η θέση P είναι η θέση στην οποία βρίσκετα το trna είναι συνδεδεμένο με την πολυπεπτιδική αλυσίδα που συντίθεται Η θέση A συγκρατεί το φορτισμένο trna που φέρει το επόμενο αμινοξύ που θα προστεθεί στην αλυσίδα Η θέση E είναι η θέση εξόδου. Τα αποφορτισμένα trnas εγκαταλείπουν το ριβόσωμα 63

64 64

65 Σχηματισμός πολυπεπτιδίου Τρία στάδια της μετάφρασης: Έναρξη Επιμήκυνση Τερματισμός Και τα 3 στάδια προϋποθέτουν την συμμετοχή πρωτεϊνικών παραγόντων που συνεισφέρουν στην μετάφραση 65

66 Σύμπλοκο του ριβοσώματος και έναρξη της μετάφρασης Κατά την ΕΝΑΡΞΗ έρχονται κοντά τα τρία πιο κάτω συστατικά: Το mrna Το trna που φέρει το πρώτο αμινοξύ Οι δύο υπομονάδες του ριβοσώματος Παράγοντες έναρξης: Πρωτεΐνες που είναι απαραίτητες για το συνδυασμό των παραπάνω συστατικών Ο σχηματισμός οτυ συμπλόκου χρειάζεται επίσης την καταβολή ενέργειας, η οποία προσφέρεται από την υδρόλυση GTP (μόριο συγγενές με το ATP) 66

67 Η μικρή υπομονάδα δεσμεύεται με το mrna και με ένα συγκεκριμένο trna (trna έναρξης)......και κινείται κατά μήκος του mrna μέχρι να συναντήσει το κωδικόνιο έναρξης (AUG) Ακολουθεί η πρόσδεση της μεγάλης υπομονάδας, οπότε και ολοκληρώνεται το σύμπλοκο έναρξης της μετάφρασης 67

68 Επιμήκυνση της πολυπεπτιδικής αλυσίδας ΕΠΙΜΗΚΥΝΣΗ:Τα αμινοξέα προστίθενται το ένα μετά το άλλο στο εκάστοτε προηγούμενο αμινοξύ Τα νέα αμινοξέα προστίθονται στο καρβοξυ άκρο της πολυπεπτιδικής αλυσίδας......ενώ το mrna διαβάζεται σε κατεύθυνση από το 5 προς το 3 άκρο Η προσθήκη κάθε αμινοξέος γίνεται με τη βοήθεια πρωτεϊνών που ονομάζονται παράγοντες επιμήκυνσης (elongation factors) και περιλαμβάνει 3 βήματα: Αναγνώριση του κωδικονίου Σχηματισμός πεπτιδικού δεσμού Μετάθεση 68

69 Αμινοτελικό άκρο πολυπεπτιδίου mrna 5 E Θέση Ρ Θέση Α 3 Αναγνώριση Κωδικονίου: Έρχεται ένα μόριο φορτισμένου trna στη θέση Α, ικανό να αναγνωρίσει το επόμενο κωδικόνιο στο mrna. Ζευγαρώνει το αντικωδικόνιo του trna με το κωδικόνιο του mrna (Καταναλώνεται GTP)... 69

70 Αμινοτελικό άκρο πολυπεπτιδίου E mrna 5 3 Θέση Θέση Ρ Α GTP GDP Σχηματισμός πεπτιδικού δεσμού: Στη θέση Ρ ένα από τα μόρια rrna της μεγάλης υπομονάδας του ριβοσώματος,καταλύει την δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού Ο δεσμός δημιουργείται μεταξύ του νέου αμινοξέως που μπήκε (θέση Α) και αυτού που προϋπήρχε (θέση Ρ) E P A 70

71 Αμινοτελικό άκρο πολυπεπτιδίου E 3 mrna 5 Μετάθεση: Το ριβόσωμα μετατοπίζει το νέο trna από την θέση Α στην θέση Ρ......ενώ το «αποφορτισμένο» trna θα μετατεθεί από την θέση Ρ στην θέση Ε, την θέση εξόδου Το mrna που ζευγαρώνει με τα trna θα μετακινηθεί και αυτό μαζί τους......οπότε έχουμε το επόμενο κωδικόνιο στηθέσης Α Θέση Θέση Ρ Α GTP GDP E P A E P A 71

72 Αμινοτελικό άκρο πολυπεπτιδίου E Ριβόσωμα έτοιμο για το επόμενο αμινοακυλο-trna 3 mrna Θέση Θέση Ρ Α 5 GTP GDP E E P A P A GDP GTP E P A 72

73 Τερματισμός της μετάφρασης Όλα προχωρούν κανονικά μέχρι που......στη θέση Α καταφθάσει ένα ΚΩΔΙΚΟΝΙΟ ΤΕΡΜΑΤΙΣΜΟΥ! Δεν θα δεσμευθεί «φορτισμένο» trna Θα δεσμευθεί όμως μια πρωτεΐνη, ο ΠΑΡΑΓΟΝΤΑΣ ΑΠΕΛΕΥΘΕΡΩΣΗΣ Ο οποίος προκαλεί την υδρόλση του δεσμού μεταξύ του τελευταίου αμινοξέως της αλυσίδας και του trna στη θέση Ρ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ: Απελευθερώση του πολυπεπτιδίου και αποσυναρμολόγηση του συμπλοκού μετάφρασης 73

74 Παράγοντας απελευθέρωσης 3 5 Κωδικόνιο λήξης (UAG, UAA, or UGA) 74

75 Παράγοντας απελευθέρωσης Ελεύθερο πολυπεπτίδιο 5 3 Κωδικόνιο λήξης (UAG, UAA, or UGA) 3 2 GTP 2 GDP 75

76 Παράγοντας απελευθέρωσης Ελεύθερο πολυπεπτίδιο 5 3 Κωδικόνιο λήξης (UAG, UAA, or UGA) GTP 2 GDP 3 76

77 Animation: Translation Right-click slide / select Play Δρ Φοίβη 2011 Pearson Σταυρίδη Education, Inc. 77

78 Πολυριβοσώματα Ένα μόριο mrna μεταφράζεται ταυτοχρόνως από πολλά ριβοσώματα, που συλλογικά μαζί ονομάζονται πολυριβοσώματα Ταυτόχρονη σύνθεση πολλών αντιγράφων Βακτήρια αλλά και ευκαρυώτες 78

79 Ολοκλήρωση και στόχευση της λειτουργικής πρωτεΐνης Για να είναι λειτουργική η πρωτεΐνη χρειάζεται να γίνουν ορισμένες διεργασίες ή μετατροπές μετά τη σύνθεση της Αναδίπλωση Μετα μεταφραστικές τροποποιήσεις Στόχευση και μεταφορά των πρωτεϊνών στις λειτουργικές τους θέσεις 79

80 Αναδίπλωση πρωτεϊνών Καθώς συντίθεται ένα πολυπεπτίδιο αναδιπλώνεται ΑΥΘΟΡΜΗΤΑ, ως συνέπεια της αμινοξικής ακολουθίας του (=πρωτοταγής δομή)......έτσι ώστε τελικά σχηματίζεται ένα τρισδιάστατο μόριο (Δευτεροταγής και Τριτοταγής δομή) Μπορεί επίσης στην πρωτεΐνη να συμμετέχουν περισσότερα από ένα πολυπεπτίδια Σε κάποιες περιπτώσεις την αναδίπλωση βοηθά μια ειδική πρωτεΐνη (σαπερονίνη), αλλά πάντα η τρισδιάστατη δομή μιας πρωτεΐνης είναι «κωδικοποιημένη» στην αμινοξική της αλληλουχία 80

81 Μετα μεταφραστικές Τροποποιήσεις Μετα μεταφραστικές Τροποποιήσεις (post translational modifications) Πχ. Προσθήκη σακχάρων, λιπιδίων, φωσφορυλίωση κλπ Επίσης, σε κάποιες περιπτώσεις μια πρωτεΐνη μπορείε να ενεργοποιείται αφού γίνει αποκοπή αμινοξέων από την πεπτιδική αλυσίδα Τελικά, οι ολοκληρωμένες πρωτεΐνες στοχεύονται σε συγκεκριμένες περιοχές του κυττάρου 81

82 Στόχευση πολυπεπτιδίων σε συγκεκριμένες θέσεις Υπάρχουν δύο πληθυσμοί ριβοσωμάτων στα κύτταρα, τα ελεύθερα ριβοσώματα και τα δεσμευμένα Τα ριβοσώματα είναι μεταξύ τους όμοια και μπορούν να μεταβούν από τη μία κατάσταση στην άλλη Ελεύθερα ριβοσώματα Κυτταρόπλασμα Σύνθεση κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών Δεσμευμένα ριβοσώματα Ενδοπλασματικό Δίκτυο Σύνθεση πρωτεϊνών που ενσωματώνονται στο σύστημα των ενδοκυτταρικών μεμβρανών και στην κυτταροπλασματική μεμβράνη 82

83 Η σύνθεση ενός πολυπεπτιδίου πάντα ξεκινά στο κυτταρόπλασμα Όμως... Είτε θα ολοκληρωθεί στο κυτταρόπλασμα Είτε θα ολοκληρωθεί στο ΕΔ Το ίδιο το πολυπεπτίδιο κατευθύνει την πρόσδεση του ριβοσώματος στο ΕΔ Τα πολυπεπτίδια που προορίζονται για ενσωμάτωση στις μεμβράνες ή για έκκριση φέρουν στην αλληλουχία τους ένα σηματοδοτικό πεπτίδιο 83

84 Σηματοδοτικό Πεπτίδιο Ακολουθία 20 περίπου αμινοξέων Στο αμινοτελικό άκρο ή κοντά σ αυτό Το σηματοδοτικό πεπτίδιο αναγνωρίζεται από ένα ειδικό σύμπλοκό πρωτεΐνης RNA, το Σωμάτιο Αναγνώρισης Σήματος (SRP) Το SRP καθοδηγεί το ριβόσωμα προς το ΕΔ Προς ένα υποδοχέα στην μεμβράνη του ΕΔ Σύμπλοκο μετάθεσης Μεταφέρει την πρωτεΐνη στο εσωτερικό του ΕΔ Αφαιρείται το σηματοδοτικό πεπτίδιο 84

85 85

86 BioFlix: Protein Synthesis Δρ Φοίβη 2011 Pearson Σταυρίδη Education, Inc. 86

87 17.5 Σημειακές μεταλλάξεις Μεταλλάξεις = αλλαγές στη γενετική πληροφορία Σημειακές μεταλλάξεις : οι χημικές μεταβολές σε ένα μόνο ζεύγος βάσεων κάποιου γονιδίου Η αλλαγή σε ένα μόνο νουκλεοτίδιο στο DNA μπορεί να καταλήξει σε μία μη λειτουργική πρωτεΐνη 87

88 Τύποι μεταλλάξεων μικρής κλίμακας Αντικατάσταση ζεύγους βάσεων Σιωπηρές (silent) Παρανοηματικές (missense) Μη νοηματικές (nonsense) Ένθεση (+) ή έλλειμμα ( ) ζεύγους βάσεων (ή και μερικών ζευγών βάσεων) Μετατόπιση αναγνωστικού πλαισίου (frameshift) αν το ζεύγη βάσεων που προστέθηκαν/αφαιρέθηκαν δεν είναι πολλαπλάσια του 3 Απουσία αμινοξέως/παρουσία επιπρόσθετου αμινοξέως αν τα ζεύγη που αφαιρέθηκαν/προστέθηκαν είναι πολλαπλάσια του 3 88

89 Σιωπηρή μετάλλαξη (καμία επίδραση) 89

90 Παρανοηματική μετάλλαξη (λάθος αμινοξύ) 90

91 Μη νοηματική μετάλλαξη (stop) 91

92 Μετατόπιση πλαισίου ανάγνωσης με ένθεση 92

93 Μετατόπιση πλαισίου ανάγνωσης με έλλειμμα 93

94 Έλλειμμα τριπλέτας 94

95 Μεταλλαξιγόνα Μεταλλάξεις μπορεί να προκύψουν αυθόρμητα, από λάθη κατά την αντιγραφή ή την επιδιόρθωση του DNA Μεταλλαξιγόνα είναι φυσικοί ή χημικοί παράγοντες που μπορούν να προκαλέσουν μεταλλάξεις στο DNA Π.χ. Ακτίνες Χ 95

96 Η καθολικότητα της έννοιας του γονιδίου Παρόλο που η γονιδιακή έκφραση ποικίλλει μεταξύ οργανισμών, εντούτοις η έννοια του γονιδίου παραμένει καθολική Τα αρχαία είναι προκαρυώτες, αλλά ορισμένες πλευρές των μηχανισμών της γονιδιακής τους έκφρασης είναι ίδιες με εκείνες των ευκαρυωτών 96

97 Σύγκριση γονιδιακής έκφρασης Σύγκριση Αρχαίων Βακτηρίων Ευκαρύων Οι Πολυμεράσες του RNA: Σημαντικές διαφορές μεταξύ βακτηρίων και ευκαρυωτών Των Αρχαίων μοίαζει με αυτές των ευκαρυώτων Μεταγραφή: Τα ριβοσώματα βακτηρίων ευκαρυωτών είναι σχεδόν όμοια, αν και παρουσιάζουν διαφορετικές ευαισθησίες σε καταστολείς Η έναρξη διαφέρει κάπως τα αρχαία μοίαζουν με τα βακτήρια Σχέση μεταγραφής/μετάφρασης: Σύζευξη: Τα βακτήρια μπορούν να μεταγράψουν και να μεταφράσουν ταυτόχρονα το ίδιο γονίδιο Διαμερισματοποίηση: Στα ευκάρυα η μεταγραφή και η μετάφραση διαχωρίζονται από την πυρηνική μεμβράνη Στα αρχαία πιστεύεται ότι είναι συζευγμένες όπως στα βακτήρια 97

98 98

99 Τελικά τι είναι γονίδιο; Γονίδιο είναι μια περιοχή DNA, από την έκφραση της οποίας παράγεται ένα τελικό λειτουργικό προϊόν που είναι πολυπεπτίδιο ή μόριο RNA 99

100 Σύνοψη διαδικασιών στους ευκαρυώτες 100