Μελέτη αλλοιώσεων στο DNA καρκινικών κυττάρων MCF7 κατόπιν ακτινοβόλησης και χρήσης του αναστολέα NU7026

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΜΕΤΣΟΒΙΟ ΠΟΛΥΤΕΧΝΕΙΟ ΣΧΟΛΗ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΩΝ ΜΑΘΗΜΑΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΟΜΕΑΣ ΦΥΣΙΚΗΣ Μελέτη αλλοιώσεων στο DNA καρκινικών κυττάρων MCF7 κατόπιν ακτινοβόλησης και χρήσης του αναστολέα NU7026 Διπλωματική Εργασία Δανάη Βασιλική Λασκαράτου Επιβλέποντες: Δρ. Γεωργακίλας Αλέξανδρος, Επίκ. Καθ. Ε. Μ. Πολυτεχνείο Δρ. Τερζούδη Γεωργία, Ερευνήτρια Β, Ε.ΚΕ.Φ.Ε. Δημόκριτος Αθήνα, Ιούλιος 2013

2 ΕΘΝΙΚΟ ΜΕΤΣΟΒΙΟ ΠΟΛΥΤΕΧΝΕΙΟ ΣΧΟΛΗ ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΩΝ ΜΑΘΗΜΑΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΦΥΣΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΟΜΕΑΣ ΦΥΣΙΚΗΣ Μελέτη αλλοιώσεων στο DNA καρκινικών κυττάρων MCF7 κατόπιν ακτινοβόλησης και χρήσης του αναστολέα NU7026 Διπλωματική Εργασία Δανάη Βασιλική Λασκαράτου Επιβλέποντες: Δρ. Γεωργακίλας Αλέξανδρος, Επίκ. Καθ. Ε. Μ. Πολυτεχνείο Δρ. Τερζούδη Γεωργία, Ερευνήτρια Β, Ε.ΚΕ.Φ.Ε. Δημόκριτος Εγκρίθηκε από την τριμελή εξεταστική επιτροπή την Δευτέρα, 1 η Ιουλίου Γεωργακίλας Αλέξανδρος Τερζούδη Γεωργία Μακροπούλου Μυρσίνη 2

3 ... Λασκαράτου Δανάη-Βασιλική Διπλωματούχος Εφαρμοσμένων Μαθηματικών και Φυσικών Επιστημών Ε.Μ.Π. Copyright Λασκαράτου Δανάη-Βασιλική, Με επιφύλαξη παντός δικαιώματος. All rights reserved. Απαγορεύεται η αντιγραφή, αποθήκευση και διανομή της παρούσας εργασίας, εξ ολοκλήρου ή τμήματος αυτής, για εμπορικό σκοπό. Επιτρέπεται η ανατύπωση, αποθήκευση και διανομή για σκοπό μη κερδοσκοπικό, εκπαιδευτικής ή ερευνητικής φύσης, υπό την προϋπόθεση να αναφέρεται η πηγή προέλευσης και να διατηρείται το παρόν μήνυμα. Ερωτήματα που αφορούν στη χρήση της εργασίας για κερδοσκοπικό σκοπό πρέπει να απευθύνονται προς τον συγγραφέα. Οι απόψεις και τα συμπεράσματα που περιέχονται σε αυτό το έγγραφο εκφράζουν τον συγγραφέα και δεν πρέπει να ερμηνευθεί ότι αντιπροσωπεύουν τις επίσημες θέσεις του Εθνικού Μετσόβιου Πολυτεχνείου. 3

4 4

5 Περιεχόμενα 1 Πρόλογος Περίληψη Summary Εισαγωγή Αλληλεπίδραση φορτισμένων σωματιδίων με την ύλη Αλληλεπίδραση γ-ακτινοβολίας με την ύλη Δόση της ακτινοβολίας-γ και μονάδες μέτρησης Βιολογία του κυττάρου Γενικά Το γενετικό υλικό Ρύθμιση της γενετικής πληροφορίας: μεταγραφή γονιδίων, μετάφραση και πρωτεϊνοσύνθεση Ο κυτταρικός κύκλος των ευκαρυωτικών κυττάρων Σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου Αλληλεπίδραση ακτινοβολίας-γ και βιολογικής ύλης Επίδραση ιοντιζουσών ακτινοβολιών στα βιομόρια Σε επίπεδο DNA: Σε επίπεδο χρωμοσωμάτων: Μηχανισμοί εντοπισμού και επιδιόρθωσης των βλαβών του DNA Δράση αισθητήρων σφαλμάτων:

6 4.5.2 Επιδιόρθωση των διπλών ρήξεων του DNA Αρχές ανοσοϊστοχημείας και αντισώματα Τα καρκινικά κύτταρα MCF Ο χημικός αναστολέας NU Υλικά και μέθοδοι Καλλιέργεια κυττάρων Ψύξη και απόψυξη Δοκιμασία βιωσιμότητας με χρήση αιματοκυτταρομέτρου (trypan blue viability test) Παρασκευή διαλύματος του αναστολέα NU7026 και εισαγωγή στις καλλιέργειες Συνθήκες ακτινοβόλησης Προετοιμασία των δειγμάτων για κυτταρογενετική ανάλυση Προετοιμασία των δειγμάτων για έμμεσο ανοσοφθορισμό Αποτελέσματα Χρωμοσώματα Foci Συζήτηση Συμπεράσματα Βιβλιογραφία

7 7

8 1 Πρόλογος Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο ερευνητικό κέντρο Ε.ΚΕ.Φ.Ε. Δημόκριτος σε συνεργασία με τη Σχολή Εφαρμοσμένων Μαθηματικών και Φυσικών Επιστημών του Ε.Μ. Πολυτεχνείου, κατά το χρονικό διάστημα Νοέμβριος Απρίλιος Τα πειράματα έλαβαν χώρα στο Εργαστήριο Υγειοφυσικής του Ινστιτούτου Πυρηνικών και Ραδιολογικών Επιστημών και Τεχνολογίας, Ενέργειας και Ασφάλειας, υπό την επίβλεψη και διαρκή υποστήριξη των Δρ. Παντελιά Γαβριήλ και Δρ. Τερζούδη Γεωργίας. Θα ήθελα να τους ευχαριστήσω θερμά για την πολύτιμη βοήθεια, τις εποικοδομητικές συζητήσεις και την εμπειρία που μου πρόσφεραν για περισσότερο από ένα χρόνο. Θα ήθελα να εκφράσω επίσης τις θερμότατες ευχαριστίες προς τον καθηγητή μου, Δρ. Γεωργακίλα Αλέξανδρο, τόσο για την ανάθεση της διπλωματικής όσο και για την απεριόριστη υποστήριξη και καθοδήγηση. Τον ευχαριστώ ακόμη για την εξαιρετικά εποικοδομητική συνεργασία, τον αλτρουϊσμό, την ανεξάντλητη βοήθεια που προσέφερε, τις πολύτιμες γνώσεις που μου μετέδωσε, αλλά και για την εμπιστοσύνη που έδειξε στις δυνάμεις μου, ήδη από πολύ νωρίς. Ευχαριστώ θερμά για τις συζητήσεις μας και την κομβικής σημασίας καθοδήγηση την καθηγήτριά μου Μακροπούλου Μυρσίνη, πάντα διαθέσιμη και έτοιμη να βοηθήσει με χαρά σε οτιδήποτε είχα ανάγκη, αφιερώνοντας πολύτιμο προσωπικό χρόνο. Νιώθω την ανάγκη να εκφράσω τις ευχαριστίες μου στη Δρ. Χατζή Βασιλική, Ε.ΚΕ.Φ.Ε. Δημόκριτος, για την υπομονή, την υποστήριξη και τις αμέτρητες ώρες τις οποίες αφιέρωσε στην επίλυση όποιων προβλημάτων συναντούσα. Ακόμη, εκτιμώ βαθύτατα την υποστήριξη που έλαβα απλόχερα από τη βιολόγο Katarzyna Barszczewska και την συγκινητική προθυμία της να με βοηθήσει σε οτιδήποτε χρειαζόμουν. Επίσης αισθάνομαι βαθιά ευγνωμοσύνη προς τη Δρ. Κούμπη Δάφνη, η οποία με χαρά αφιέρωσε σημαντικό προσωπικό της χρόνο για να μου μεταδώσει πολύτιμες γνώσεις και τεχνικές. 8

9 Ευχαριστώ ιδιαιτέρως τους συναδέλφους Νικητάκη Ζαχαρένια, MSc, Μαγγέλη Αναστάσιο και Μαυραγάνη Ιφιγένεια για τη διαρκή υποστήριξή τους σε πολλά επίπεδα και για όλες τις όμορφες στιγμές που είχαμε ως ομάδα. Τέλος, θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου προς τον Νομίδη Στέφανο, του οποίου η αμέριστη ενθάρρυνση, στήριξη και πολύτιμες παρατηρήσεις έπαιξαν πρωτεύοντα ρόλο τόσο στην εκπόνηση αυτής της διπλωματικής όσο και γενικότερα στην πορεία μου στη Σχολή Εφαρμοσμένων Μαθηματικών και Φυσικών Επιστημών. 9

10 2 Περίληψη Οι βλάβες στο DNA των κυττάρων διακρίνονται από ποικιλία και κυμαινόμενη πολυπλοκότητα. Οι πιο σημαντικές από άποψη δυσκολίας επιδιόρθωσης είναι οι διπλές θραύσεις της έλικας (double strand breaks, DSBs) και τα συμπλέγματα βλαβών που δεν περιλαμβάνουν τις διπλές θραύσεις, ή αλλιώς οξειδωτικώς επαγόμενες ομαδοποιημένες βλάβες DNA (non-dsb oxidatively-induced clustered DNA lesions, OCDLs). Λόγω της πολυπλοκότητάς τους, αυτού του είδους οι ανωμαλίες στο DNA είναι εν δυνάμει προοίμια καρκίνου, αλλά παραδόξως χρησιμοποιούνται και στην αντιμετώπισή του, για την καταστροφή καρκινικών κυττάρων. Η επιδιόρθωση των DSBs συμβαίνει κατά κύριο λόγο μέσω του μηχανισμού της μη ομόλογης επιδιόρθωσης τελικής σύνδεσης (non homologous end joining, NHEJ). Θέση-κλειδί στη διαδικασία κρατάει η DNAεξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση (DNA-dependent protein kinase). Για να μελετηθεί ο ρόλος αυτής της πρωτεΐνης στην επιδιόρθωση των βλαβών σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του μαστού MCF7, χρησιμοποιήθηκε, σε συνδυασμό με ιονίζουσα ακτινοβολία (ακτίνες γ, 1 Gy), ο DNA-PK αναστολέας NU7026, ο οποίος αδρανοποιεί χημικά την DNA-PK. Η δράση του αναστολέα μελετήθηκε σε δύο επίπεδα, στο DNA με χρήση της φωσφορυλιωμένης ιστόνης γη2αχ ως σηματοδότη και στα χρωμοσώματα των κυττάρων σε συνδυασμό με την καφεΐνη, γνωστή ουσία για την κατάργηση του σημείου ελέγχου της G2/M φάσης. Για την ανίχνευση και την ποσοτικοποίηση των βλαβών χρησιμοποιήθηκε το ανοσοϊστοχημικό πρωτόκολλο σηματοδότησης της γη2αχ και κυτταρογενετική ανάλυση στο οπτικό μικροσκόπιο, αντίστοιχα. Σε κάθε περίπτωση, η παρεμπόδιση του επιδιορθωτικού μηχανισμού NHEJ μέσω της αδρανοποίησης της βασικής εμπλεκόμενης πρωτεΐνης DNA-PK, έδειξε συσσώρευση σημαντικού αριθμού βλαβών 24 ώρες μετά την ακτινοβόληση και συνδυασμένη, προσθετική δράση αναστολέα και καφεΐνης, αντίστοιχα. Οι πληροφορίες που προέκυψαν είναι σημαντικές για την κατανόηση της δράσης της DNA-PK και κατά συνέπεια του επιδιορθωτικού μονοπατιού NHEJ, τον ρόλο τους στην ανάπτυξη καρκίνου του μαστού, αλλά και στην βελτιστοποίηση της ραδιοθεραπείας και εξέλιξη νέων αντικαρκινικών φαρμάκων. 10

11 3 Summary The damage accumulated in the genome of cells is diverse and varies in complexity. From a repair difficulty point of view, the most complex types of lesions are double strand breaks (DSBs) and non-dsb oxidatively-induced clustered DNA lesions (OCDLs). Because of their complexity, these types of aberrations in DNA are potentially cancer preludes, while paradoxically they are being used in the fight against it at the same time, to kill cancer cells. The DSB repair is mediated primarily through the non-homologous end joining pathway (NHEJ). A key protein, orchestrating this repair mechanism, is the DNA-dependent protein kinase (DNA- PK). To study the role of this particular key protein in repairing complex DNA damage induced in human breast cancer cells MCF7, we used 1 Gy of γ-irradiation combined with the action of a novel DNA-PK inhibitor, NU7026, which chemically deactivates the kinase activity of DNA-PK. The effect of the inhibitor was studied at two levels, in DNA using the phosphorylated histone γ-η2αχ as a damage marker, and in chromosomes in combination with caffeine, a welldocumented abrogator of the G2/M checkpoint of the cell cycle. For the detection and the evaluation of the damage we used the immunohistochemistry protocol of γη2αχ staining and cytogenetic analysis in the optical microscope, respectively. In any case, the NHEJ pathway blocking through the inactivation of its key protein regulator DNA-PK, showed a significant accumulation of damage 24 hrs postirradiation, and an additive effect when combined with caffeine, respectively. The information resulting from the experiments bear great importance regarding the understanding of the DNA-PK function and consequently the NHEJ repair pathway, their implication in cancer development, but also the monitoring of radiotherapy and development of new anti-cancer drugs. 11

12 4 Εισαγωγή 4.1 Αλληλεπίδραση φορτισμένων σωματιδίων με την ύλη Η αλληλεπίδραση των φορτισμένων σωματιδίων με την ύλη ποικίλει ανάλογα με τη φύση τους. Τα σωμάτια-α είναι πυρήνες ηλίου (He) και φέρουν θετικό φορτίο, δηλαδή αποτελούνται από δύο πρωτόνια και δύο νετρόνια. Με μάζα περίπου 4 amu, ένα σωμάτιο-α είναι τεράστιο σε σχέση με ένα ηλεκτρόνιο και ασκεί μεγάλη ηλεκτροστατική δύναμη. Από τη στιγμή που θα εκπεμφθεί, ταξιδεύει με μεγάλη ταχύτητα μέσα στην ύλη αλλά η κινητική του ενέργεια είναι εύκολο να μεταφερθεί στα ηλεκτρόνια της εξωτερικής στιβάδας άλλων ατόμων. Επομένως ο ιονισμός είναι χαρακτηριστικό γνώρισμα της ακτινοβολίας-α και λόγω της συχνής εμφάνισής του, η ενέργεια των σωματίων-α χάνεται γρήγορα και η εμβέλειά τους στην ύλη είναι πολύ μικρή. Ενδεικτικά, στον αέρα ταξιδεύουν μέχρι 5 cm ενώ στον μαλακό ιστό μπορεί να είναι λιγότερο από 100 m.[9] Τα σωμάτια-β διαφέρουν από τα σωμάτια-α και ως προς τη μάζα και ως προς το φορτίο. Είναι ελαφρά σωματίδια με φορτίο αρνητικό ή θετικό, αν μιλάμε για ηλεκτρόνια ή ποζιτρόνια, αντίστοιχα. Κατά την εκπομπή τους διασχίζουν τον αέρα ιονίζοντας μερικές εκατοντάδες άτομα ανά εκατοστό και η εμβέλειά τους είναι Εικόνα 4.1.1: Σχηματική αναπαράσταση της εμβέλειας σωματιδίων α, β και ακτίνων-γ. 12

13 μεγαλύτερή από αυτή των σωματίων-α. Ένα σωμάτιο-β μπορεί να διασχίσει 10 έως 100 cm αέρα και περίπου 1 με 2 cm μαλακού ιστού, ανάλογα με την ενέργεια που διαθέτει. [9] Αλληλεπίδραση γ-ακτινοβολίας με την ύλη Η ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία αλληλεπιδρά με την ύλη μέσω τριών φαινομένων: του φωτοηλεκτρικού, του φαινομένου Compton και της δίδυμης γένεσης. a. Φωτοηλεκτρικό φαινόμενο Ο όρος φωτοηλεκτρικό φαινόμενο αναφέρεται στην απόσπαση δέσμιου ηλεκτρονίου από τον εσωτερικό φλοιό του ατόμου στο οποίο ανήκει. Για να λάβει χώρα η συγκεκριμένη διαδικασία, πρέπει η συχνότητα της προσπίπτουσας ακτινοβολίας να ξεπερνάει ένα συγκεκριμένο κατώφλι συχνότητας χαρακτηριστικό για κάθε υλικό. f o, Το γεγονός αυτό σχετίζεται άμεσα με την κβαντική φύση του φωτός, όπου E hf. Επομένως ενεργειακά μιλώντας, η ενέργεια του φωτονίου E πρέπει να ξεπεράσει την ενέργεια σύνδεσης του ηλεκτρονίου ηλεκτρονίων [10]. E e. Η διαφορά των δύο ενεργειών b. Φαινόμενο Compton E γίνεται κινητική ενέργεια των Στη σκέδαση Compton, φωτόνια ακτίνων-γ προσκρούουν στο υλικό του στόχου, μεταφέροντας μέρος της ενέργειάς τους στα ηλεκτρόνια της εξωτερικής στιβάδας των ατόμων του υλικού. Το φωτόνιο, με μειωμένη πλέον ενέργεια και αυξημένο μήκος κύματος, αποκλίνει από την αρχική του πορεία ενώ το ηλεκτρόνιο στο οποίο μετέφερε την ενέργειά του αποδεσμεύται. Με βάση τους νόμους διατήρησης ορμής και ενέργειας προκύπτει η ενέργεια του σκεδαζόμενου φωτονίου [10, 11]: E sc E 1 / 1 cos 2 E mec 13

14 c. Δίδυμη γένεση Κατά τη δίδυμη γένεση υπάρχει παραγωγή ενός ζεύγους: σωματίδιο και το αντισωματίδιό του. Το φωτόνιο το οποίο αλληλεπιδρά έχει υψηλή ενέργεια (μεγαλύτερη από ένα κατώφλι ίσο με 1.02MeV στην περίπτωση ηλεκτρονίουποζιτρονίου), και κατά τη διαδρομή του μέσα από το ισχυρό ηλεκτρικό πεδίο του πυρήνα δίνει τη θέση του στο ζεύγος. Η ενέργεια που υπερβαίνει το κατώφλι εμφανίζεται ως κινητική στο ζεύγος σωματίδιο-αντισωματίδιο [12]. Υπάρχουν τρεις σημαντικές ποσότητες που σχετίζονται με τη διαδρομή των φορτισμένων σωματιδίων μέσα από την ύλη: ο ειδικός ιονισμός, η γραμμική μεταβίβαση ενέργειας και η εμβέλεια. Ειδικός Ιονισμός (Specific Ionization) Ο ειδικός ιονισμός αναφέρεται στον ολικό αριθμό ζευγών ιόντων που προκύπτουν στο ίχνος της ακτινοβολίας ανά μονάδα μήκους. Τα φαινόμενα που σχετίζονται με τον ειδικό ιονισμό αυξάνουν με τη μείωση της ενέργειας του φορτισμένου σωματιδίου, εξαιτίας της αυξημένης πιθανότητας αλληλεπίδρασης στις χαμηλές ενέργειες. Κατά συνέπεια, προς το τέλος της διαδρομής το φορτισμένο σωματίδιο θα έχει προκαλέσει μια οξεία αύξηση των ιονισμών (κορυφή Bragg). Φυσικά το φαινόμενο αυτό υπερισχύει για βαρέα φορτισμένα σωματίδια και είναι αμελητέο για ηλεκτρόνια [12, 13]. Γραμμική Μεταβίβαση Ενέργειας (Linear Energy Transfer LET) Γραμμική μεταβίβαση ενέργειας είναι η γραμμική πυκνότητα ενέργειας που χάνεται από ένα ιονίζον φορτισμένο σωμάτιο καθώς αυτό ταξιδεύει μέσα στην ύλη. Η LET εκφράζεται σε μονάδες kev m και είναι πάντα θετική ποσότητα επειδή η απώλεια ενέργειας είναι μέρος του ορισμού. Πέρα από τους πρωταρχικούς ιονισμούς που προκαλούνται από την ακτινοβολία με άμεσο τρόπο, συχνά παρατηρούνται δευτερεύοντες που έχουν προκληθεί από ηλεκτρόνια μεγάλης 14

15 ενέργειας 1, αρκετής ώστε να ιονίσει [14]. Για το λόγο αυτό, έχει επικρατήσει η LET, εξαιρουμένων των δευτερευόντων ιονισμών, να συμβολίζεται μαθηματικά ως [15, 16]: L de dl Οι ακτίνες-γ και β χάνουν λίγη ενέργεια με κάθε αλληλεπίδραση με άτομα της ύλης, επομένως έχουν χαμηλή LET. Αντίθετα, οι ακτίνες-α και τα βαρέα ιόντα χάνουν ενέργεια με πολύ μεγαλύτερο ρυθμό, προκαλούν περισσότερους ιονισμούς ανά διανυόμενη απόσταση και κατά συνέπεια έχουν υψηλή LET. Εμβέλεια Στο θέμα της εμβέλειας έχει γίνει μια πρώτη αναφορά και παραπάνω, εδώ θα γίνει περισσότερο αναλυτικά. Η εμβέλεια ενός φορτισμένου σωματιδίου στην απορροφώσα ύλη ορίζεται ως η απόσταση που διανύεται σε ευθεία γραμμή από το σωματίδιο, μέχρι αυτό να χάσει (σχεδόν) όλη την ενέργειά του [17]. Η εμβέλεια είναι συνάρτηση της μάζας, του φορτίου και της κινητικής ενέργειας του σωματιδίου, καθώς επίσης και της πυκνότητας του απορροφητή. Αναλόγως τον τύπο του φορτισμένου σωματιδίου, η διαδρομή του στην ύλη μπορεί να είναι σχεδόν ευθεία (όπως στα σωματίδια-α) ή τεθλασμένη (για την ακτινοβολία β). Η διαφορά οφείλεται σε αυτή την περίπτωση στη μεγάλη μάζα των πυρήνων He και κατά συνέπεια στη μικρή απόκλισή τους από την αρχική πορεία κατά τη διάρκεια συγκρούσεων με άτομα του στόχου Δόση της ακτινοβολίας-γ και μονάδες μέτρησης Οι βιοχημικές επιδράσεις της ακτινοβολίας στους ζωντανούς οργανισμούς αποτελούν τα θεμελιώδη συμβάντα που οδηγούν σε βλάβες στους ιστούς. Τα φορτισμένα σωματίδια αλληλεπιδρούν κυρίως άμεσα με το στόχο διασπώντας 1 Συμβατικά αποκαλούνται ακτίνες δ. 15

16 μοριακούς δεσμούς και δημιουργώντας ιόντα, ενώ οι ακτίνες-χ και γ αλληλεπιδρούν μέσω του φωτοηλεκτρικού φαινομένου. Για την έκθεση στην ακτινοβολία χρησιμοποιείται η μονάδα μέτρησης Röntgen (R), όπου πρέπει να τονίσουμε ότι δε μπορεί να εφαρμοστεί για άλλο μέσο εκτός του αέρα, με R Coulomb / kg. Επομένως δεν παρέχει κάποια ένδειξη για τη βιολογική επίπτωση της ακτινοβολίας στον ιστό, καθώς μας δίνει την ένταση της αγνής ιονίζουσας ακτίνας σε κάποια απόσταση από το σημείο εκπομπής [13]. Μας ενδιαφέρει πολύ περισσότερο η δοσιμετρία ακτινοβολίας 2 και η απορροφηθείσα δόση, δηλαδή η ενέργεια (Joules) που εναποτέθηκε ανά μονάδα μάζας ιστού. Στο Système International (SI) ορίζεται το gray ως μονάδα μέτρησης, με1 Gy 1 J / kg [18]. Συχνά χρησιμοποιείται και το rad (radiation absorbed dose), το οποίο ισοδυναμεί με 0.01 Gy. Πάλι όμως, εξαιτίας της LET, κάθε τύπος ακτινοβολίας έχει διαφορετικά βιολογικά αποτελέσματα, ακόμη κι αν αναφερόμαστε σε ίσα ποσά ενέργειας ανά μονάδα μάζας [11]. Προέκυψε έτσι η ανάγκη για έναν επιπλέον όρο, τη σχετική βιολογική δραστικότητα (Relative Biological Effectiveness, RBE), ο οποίος περιγράφει τη διαφοροποίηση της δράσης στο βιολογικό ιστό, ανάλογα με την ακτινοβολία. Ειδικότερα, η RBE ορίζεται ως ο λόγος της δόσης μιας συγκεκριμένης ακτινοβολίας (σημείο αναφοράς) που προκαλεί μια ειδική βιολογική απόκριση, προς την δόση της υπό διερεύνηση ακτινοβολίας που προκαλεί ακριβώς την ίδια απόκριση [12]. Συνήθως επιλέγονται οι ακτίνες-χ ενέργειας 250 kev ως σημείο αναφοράς, λόγω της ευρέως διαδεδομένης χρήσης τους 3. Προφανώς, όσο μεγαλύτερη η τιμή της RBE για έναν τύπο ακτινοβολίας, τόσο πιο καταστροφική είναι (ανά μονάδα ενέργειας) προς τη βιολογική ύλη. 2 Είναι η μέτρηση και υπολογισμός της δόσης στην ύλη και στους ιστούς από την έμμεση και άμεση έκθεση σε ιονίζουσα ακτινοβολία. 3 Για άλλα είδη ακτινοβολίας πέραν των Χ και γ, η RBE δε θεωρείται καλώς ορισμένη φυσική ποσότητα γιατί κυμαίνεται ανάλογα με το είδος του ιστού-στόχου, αλλά και με το ακριβές σημείο απορρόφησης σε ένα κύτταρο. 16

17 Ο όρος ισοδύναμη δόση (equivalent dose) συνδυάζει την απορροφηθείσα δόση και τη σχετική βιολογική δραστικότητα μέσω της σχέσης: Ισοδύναμη δόση (Sv) = RBE x απορροφηθείσα δόση (Gy) Επίσης, ισοδύναμη και αρκετά διαδεδομένη μονάδα μέτρησης αποτελούν τα rem (Röntgen Equivalent for Man): Ισοδύναμη δόση (rem) = RBE x απορροφηθείσα δόση (rad) 17

18 4.2 Βιολογία του κυττάρου Γενικά Τα κύτταρα έχουν υπάρξει αντικείμενο έρευνας και μελέτης εδώ και αιώνες. Η πρώτη χρήση της λέξης «κύτταρο» αποδίδεται στον πολυπράγμονα βιολόγο, φυσικό και χημικό Robert Hooke [19]. Η αντίληψη που έχουμε διαμορφώσει σήμερα βασίζεται σε παρατηρήσεις και πειράματα που έγιναν από ομάδες βιολόγων ήδη από το δεύτερο μισό του 18 ου αιώνα. Σημεία καμπής της επιστημονικής προόδου σε αυτόν τον τομέα ήταν η ανακάλυψη και εξέλιξη του οπτικού μικροσκοπίου και μεταγενέστερα η χρήση συνθετικών βαφών για τη χρώση των κυττάρων. Συνοπτική περιγραφική εικόνα ενός ευκαρυωτικού κυττάρου των θηλαστικών: Εικόνα 4.2.1: Σχηματική αναπαράσταση ενός τυπικού ευκαρυωτικού κυττάρου, όπου διακρίνονται επιμέρους οργανίδια και δομές. 1) Πυρηνίσκος, 2) Πυρήνας, 3) Ριβοσώματα, 4) Κυστίδιο, 5) Αδρό ενδοπλασματικό δίκτυο, 6) Σύμπλεγμα Golgi, 7) Κυτταροσκελετός, 8) Λείο ενδοπλασματικό δίκτυο, 9) Μιτοχόνδρια, 10) Κενοτόπιο, 11) Κυτταρόπλασμα, 12) Λυσόσωμα, 13) Κεντριόλια μέσα σε κεντροσωμάτιο 18

19 Η κατανομή των πολύπλοκων κυτταρικών δομών μέσα στο κύτταρο θυμίζει τον τρόπο με τον οποίο συναρμολογούνται τα διάφορα εξαρτήματα ενός αυτοκινούμενου οχήματος. Αυτό εγγυάται τη σωστή ανάπτυξη και λειτουργία του κυττάρου [9]. Οι κυριότερες δομές του κυττάρου ονομάζονται κυτταρόπλασμα και πυρήνας. Ο πυρήνας και ιδιαιτέρως τα μοριακά συστατικά που περιέχει θα μας απασχολήσουν περισσότερο στη συνέχεια, καθώς όλη η μεταβολική δραστηριότητα λαμβάνει χώρα στο κυτταρόπλασμα υπό την καθοδήγηση του πυρήνα. Επίσης, όπως έχουν δείξει πειράματα α-ακτινοβόλησης ινοβλαστών, ο πυρήνας τυγχάνει και το πιο ευαίσθητο σε ακτινοβολία μέρος του κυττάρου, εξαιτίας του γενετικού υλικού που περικλείει [20, 21]. Εικόνα : Η διπλή έλικα του DNA και η χημική της δομή Το γενετικό υλικό Το γενετικό υλικό του κυττάρου, δηλαδή το μακρομόριο DNA (Deoxyribonucleic Acid, Δεσοξυριβονουκλεϊκό Οξύ) μαζί με μικρή ποσότητα RNA (Ribonucleic Acid, Ριβονουκλεϊ-κό Οξύ) καθώς και νερό, περιέχονται στον πυρήνα. Το DNA είναι ουσιαστικά πολυμερές το οποίο αποτελείται από μια αλληλουχία επαναλαμβανόμενων δομικών μονάδων, των νουκλεοτιδίων. Αυτά, με τη σειρά τους, συντίθενται από ένα μόριο φωσφορικού οξέος ενωμένο με μία πεντόζη (σάκχαρο με 5 άτομα άνθρακα) και μία αζωτούχο βάση. Οι οργανικές αζωτούχες βάσεις στην περίπτωση του DNA είναι τέσσερις: αδενίνη (Α), θυμίνη (Τ), γουανίνη (G), κυτοσίνη (C) και έχουν την 19

20 επωνομαζόμενη ιδιότητα της συμπληρωματικότητας, δηλαδή να συνδέονται επιλεκτικά. Συγκεκριμένα, η αδενίνη δεσμεύεται πάντα με θυμίνη και αντίστροφα, και η γουανίνη πάντα με κυτοσίνη και αντίστροφα. Με βάση αυτή τη διάταξη, ο σκελετός του μορίου διαμορφώνεται από την εναλλαγή φωσφορικής ομάδας και πεντόζης, συνδεδεμένες με ομοιοπολικό δεσμό, γνωστό ως 3-5 φωσφοδιεστερικό δεσμό. Η δομή του DNA στο χώρο έχει τη μορφή δεξιόστροφης διπλής έλικας [22, 23], η σταθερότητα της οποίας οφείλεται στους ομοιοπολικούς δεσμούς του υδρόφιλου σκελετού και στους δεσμούς υδρογόνου που αναπτύσσονται μεταξύ των υδρόφοβων αζωτούχων βάσεων. Το DNA κατά τις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου παρουσιάζεται με διαφορετικούς βαθμούς συσπείρωσης. Η συσκευασία σε χρωμοσώματα συμβαίνει κατά το στάδιο της μίτωσης, επιτρέποντας έτσι, τη μελέτη στο οπτικό μικροσκόπιο. Ήδη κατά τη μεσόφαση το γενετικό υλικό έχει τυλιχθεί γύρω από οκταμερή ιστονών (οκτώ πρωτεϊνικών μορίων), σχηματίζοντας νουκλεοσώματα, τα οποία μοιάζουν με χάντρες περασμένες σε ένα κορδόνι. Στη συνέχεια τα νουκλεοσώματα με τη σειρά τους συμπτύσσονται ακόμα περισσότερο και σε αυτή τη μορφή είναι γνωστά ως ινίδια χρωματίνης. Ακολουθούν δύο ακόμη στάδια συσπείρωσης, η αναδίπλωση των ινιδίων και ο τελικός σχηματισμός του χρωμοσώματος. Κάθε χρωμόσωμα είναι ουσιαστικά δύο αντίγραφα του ίδιου ινιδίου χρωματίνης συνδεδεμένα με μία δομή που ονομάζεται κεντρομερίδιο. Όσο τα διπλασιασμένα χρωμοσώματα παραμένουν ενωμένα στο κεντρομερίδιο, ονομάζονται αδελφές χρωματίδες. 20

21 Εικόνα : Το DNA και οι διαφορετικοί βαθμοί συσπείρωσής του. (Εικόνα από το διαδίκτυο. Πηγή: 5EeAV7a_I_XWwX0D9EZdj85aY) Τα χρωμοσώματα μελετώνται κατά προτίμηση στο στάδιο της μετάφασης, όπου εμφανίζουν το μέγιστο βαθμό συσπείρωσης και είναι αρκετά ευδιάκριτα υπό το φως του μικροσκοπίου. Η διαδικασία που ακολουθείται ώστε να επιτευχθούν τα παραπάνω περιλαμβάνει την in vitro επαγωγή της διαίρεσης με χρήση ουσιών όπως η φυτοαιμαγλουτινίνη (PHA) στην περίπτωση όπου τα ληφθέντα κύτταρα δε διαιρούνται αυθορμήτως, σύλληψη των κυττάρων στη μίτωση με τη βοήθεια της κολχικίνης, επωασμό τους σε υπότονο διάλυμα και τέλος χρώση [24]. Η διαδικασία που περιλαμβάνει την ανάλυση, την απεικόνιση και την ταξινόμηση των χρωμοσωμάτων με βάση το μέγεθος, τη θέση του κεντρομεριδίου, τις διαφορές στις ζώνες χρώσης και οποιοδήποτε άλλο φυσικό χαρακτηριστικό, ονομάζεται καρυότυπος. Κάθε είδος έχει δικό του καρυότυπο ο οποίος το ταυτοποιεί συγκριτικά με τα υπόλοιπα είδη, με ειδοποιούς διαφορές στη μορφολογία και τον αριθμό των χρωμοσωμάτων. Σε διπλοειδείς οργανισμούς τα χρωμοσώματα στα σωματικά 4 κύτταρα βρίσκονται σε ζεύγη. Συγκεκριμένα στον 4 Με εξαίρεση τα κύτταρα που ονομάζονται γαμέτες και περιέχουν μόνο ένα αντίγραφο κάθε χρωμοσώματος. 21

22 άνθρωπο έχουν παρατηρηθεί 23 ζεύγη χρωμοσωμάτων, εκ των οποίων τα 44 είναι αυτοσωμικά 5 και τα 2 φυλετικά [25]. Εικόνα : Ο καρυότυπος της γράφουσας πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Κυτταρογενετικής και Ραδιοβιολογίας του ΕΚΕΦΕ "Δημόκριτος" ως μέρος της πρακτικής εξάσκησης. 5 Τα αυτοσωμικά χρωμοσώματα είναι μορφολογικά ίδια στους άνδρες και τις γυναίκες, σε αντιδιαστολή με τα φυλετικά που εμφανίζουν διαφορές ανάλογα με το φύλο και το καθορίζουν. 22

23 4.2.3 Ρύθμιση της γενετικής πληροφορίας: μεταγραφή γονιδίων, μετάφραση και πρωτεϊνοσύνθεση Το DNA είναι οργανωμένο σε γραμμικές λειτουργικές μονάδες, οι οποίες ονομάζονται γονίδια και κωδικοποιούν μία ή περισσότερες πρωτεΐνες. Η διαδικασία έκφρασης είναι πολύπλοκη και συμβαίνει σε τρία βασικά βήματα. Το μόριο του DNA, το οποίο όπως αναφέρθηκε παραπάνω έχει τη μορφή διπλής έλικας, ξεδιπλώνεται τοπικά και σηματοδοτεί την έναρξη της μεταγραφής. Ο διαχωρισμός των δύο αλυσίδων συμβαίνει με τη βοήθεια ενός ενζύμου, της RNAπολυμεράσης. Η πολυμεράση συνδέεται με πολύ συγκεκριμένα σημεία του μορίου που ονομάζονται υποκινητές, καθότι αναγνωρίζει τους πρωτεϊνικούς μεταγραφικούς παράγοντες. Οι παράγοντες αυτοί μπορούν να ενεργοποιήσουν ή να καταστείλουν τη μεταγραφή. Οι υποκινητές βρίσκονται πάντα στην αρχή κάθε γονιδίου και μαζί με τους μεταγραφικούς παράγοντες διασφαλίζουν την ορθότητα της διαδικασίας. Με την πρόσδεση της RNA-πολυμεράσης στον υποκινητή, ξεκινάει η σύνθεση ενός μορίου αγγελιαφόρου -RNA (mrna), το οποίο αναλαμβάνει αυτό ακριβώς που υποδηλώνει το όνομά του: μεταφέρει ουσιαστικά την πληροφορία για την παραγωγή μιας πολυπεπτιδικής αλυσίδας. Η αλληλουχία των βάσεων στη μη κωδική 6 αλυσίδα του DNA υπαγορεύει την ακολουθία των ριβονουκλεοτιδίων στο RNA με βάση τον κανόνα συμπληρωματικότητας των αζωτούχων βάσεων. Στην περίπτωση του RNA, τη θέση της θυμίνης (Τ) έχει η ουρακίλη (U) και είναι αυτή που συνδέεται αποκλειστικά με την αδενίνη (Α). 6 Μη κωδική ονομάζεται η μεταγραφόμενη αλυσίδα. 23

24 Εικόνα 4.2.2: Εικόνα του γενετικού υλικού με ιδιαίτερη έμφαση στις αζωτούχες βάσεις. Μεταξύ αδενίνης και θυμίνης σχηματίζονται διπλοί δεσμοί υδρογόνου ενώ μεταξύ γουανίνης και κυτοσίνης τριπλοί. Το επόμενο στάδιο της παραγωγής πρωτεϊνών ονομάζεται μετάφραση. Κατά τη διάρκεια της μετάφρασης το mrna - το οποίο δημιουργήθηκε στον πυρήνα του κυττάρου και τώρα φέρει ένα αντίγραφο του κώδικα DNA οδηγείται στο κυτταρόπλασμα και προσδένεται προσωρινά σε μικροσκοπικές δομές, τα ριβοσώματα. Εκεί λαμβάνει χώρα και η σύνθεση μικρών μορίων, των αμινοξέων 7, Εικόνα 4.2.3: Το ριβόσωμα και η διαδικασία της μετάφρασης 7 Κάθε αμινοξύ από τα 20 υπάρχοντα παράγεται από μια τριπλέτα νουκελοτιδίων (κωδικόνιο), η οποία συνιστά κατά κάποιον τρόπο «κβάντωση» της πληροφορίας που περιέχει ο κώδικας. Για το λόγο αυτό λέμε ότι προχωράμε «με βήμα τριπλέτας». 24

25 κατευθυνόμενη από την αλληλουχία βάσεων του mrna. Η σύνθεση των αμινοξέων σε πρωτεΐνες γίνεται με τη βοήθεια του μεταφορικού-rna (t-rna), δηλαδή μικρών μορίων RNA όπου το καθένα έχει δική του τριπλέτα νουκλεοτιδίων για να μπορεί να συνδεθεί με το mrna και μεταφέρει συγκεκριμένο είδος αμινοξέως στο ριβόσωμα. Στο τρίτο και τελευταίο βήμα, τα αμινοξέα συνδέονται μεταξύ τους με χημικούς δεσμούς, σχηματίζοντας ένα πρωτεϊνικό μόριο. Με αυτόν τον τρόπο, η αλληλουχία των βάσεων στο DNA καθορίζει την αλληλουχία στο mrna, το οποίο με τη σειρά του καθορίζει τη γραμμική ακολουθία των αμινοξέων σε μια πρωτεΐνη. Ανάλογα με τη σειρά των αμινοξέων σε αυτή, μια πρωτεΐνη μπορεί να αναδιπλώνεται, να κάμπτεται, να παίρνει σπειροειδή μορφή ή να συστρέφεται ώστε να πάρει την τρισδιάστατη μορφή που την κάνει λειτουργική. Η σημασία των πρωτεϊνών στον οργανισμό είναι έκδηλη, καθώς αποτελούν την πλειονότητα των δομικών στοιχείων κυττάρων και ιστών. Επιπλέον λειτουργούν ως ένζυμα, ρυθμίζοντας όλες τις χημικές αντιδράσεις του σώματος. [26, 27] Ο κυτταρικός κύκλος των ευκαρυωτικών κυττάρων Με τον όρο κυτταρικός κύκλος εννοούμε μια σειρά γεγονότων που λαμβάνουν χώρα μέσα στο κύτταρο και οδηγούν στη διαίρεση και τον διπλασιασμό του. Η κυτταρική διαίρεση είναι μια διαδικασία ζωτικής σημασίας, καθώς χάρη σε αυτή ανανεώνονται οι ιστοί και φυσικά το γονιμοποιημένο ωάριο διαιρείται και σταδιακά σχηματίζεται σε έναν ώριμο οργανισμό. Ο κυτταρικός κύκλος περιλαμβάνει τέσσερις κύριες και διακριτές μεταξύ τους φάσεις: τη σύνθεση του DNA (φάση S), τη φάση G2 (gap 2), τη φάση Μ (μίτωση) 25

26 και τη φάση G1 (gap 1). Οι φάσεις G1, S, G2 πολλές φορές ονομάζονται συλλογικά μεσόφαση και διαρκούν περίπου 90% της συνολικής ζωής του κυττάρου. Στη μεσόφαση τα χρωμοσώματα δεν είναι ορατά στο οπτικό μικροσκόπιο, σε αντίθεση με τη φάση της μίτωσης. Κατά την G1, την πρώτη δηλαδή φάση μετά τη μίτωση, το κύτταρο αναπτύσσεται συνεχίζοντας τις πολύπλοκες βιοχημικές διαδικασίες που είχαν μπει προσωρινά σε αναμονή κατά το στάδιο της μίτωσης. Την G1 ακολουθεί η φάση της σύνθεσης, όπου το γενετικό υλικό διπλασιάζεται με εξαιρετική ακρίβεια, δημιουργώντας ένα πανομοιότυπο θυγατρικό DNA. Με το τέλος του διπλασιασμού, όλα τα χρωμοσώματα έχουν αντιγραφεί και βρίσκονται στη μορφή των αδελφών χρωματιδών. Στη συνέχεια το κύτταρο μπαίνει στην G2 φάση, η οποία αποτελεί Εικόνα : Σχηματική αναπαράσταση της κυτταρικής διαίρεσης με έμφαση στη μίτωση. μεταβατικό στάδιο μεταξύ της σύνθεσης και της μίτωσης. Στην G2 υπάρχει ένα σημαντικό σημείο ελέγχου του κυττάρου, με βάση το οποίο εξασφαλίζεται η σωστή μετάβαση στη μίτωση. Τέλος, κατά τη μίτωση το κύτταρο χωρίζει τα χρωμοσώματα του πυρήνα σε δύο εντελώς όμοιες ομάδες που εν τέλει θα αποτελέσουν το περιεχόμενο δύο θυγατρικών πυρήνων. Ακολουθεί η κυτταροκίνηση, όπου διαχωρίζονται οι πυρήνες, το κυτταρόπλασμα, τα οργανίδια και η κυτταρική μεμβράνη σε δύο αυτόνομα κύτταρα, πανομοιότυπα με το αρχικό. Συχνά γίνεται αναφορά στη φάση G0, δηλαδή σε περίοδο ανάπαυσης και ουσιαστικά έξοδο από τον κυτταρικό κύκλο. Το κύτταρο μετά τη μίτωση μπορεί να περιέλθει στη G0 αντί της G1 για μερικές μέρες, εβδομάδες, ή και χρόνια, μέχρι να 26

27 λάβει σήματα από το εξωκυττάριο περιβάλλον ότι πρέπει να ξαναμπεί στον κύκλο [2]. Η διάρκεια του κυτταρικού κύκλου μπορεί να κυμαίνεται σημαντικά μεταξύ διαφορετικών τύπων κυττάρων. Για παράδειγμα τα κύτταρα ενός πρώιμου εμβρύου προχωρούν σε συνεχείς κύκλους, με τον κάθε ένα να διαρκεί μόνο μία ώρα. Αντίθετα, τα κύτταρα ενός ενήλικα θεωρούνται ότι διαιρούνται γρήγορα όταν έχουν κύκλους 12 έως 24 ωρών, ενώ ο κύκλος ενός φυσιολογικού ηπατικού κυττάρου μπορεί να διαρκέσει περισσότερο από ένα χρόνο [2]. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζει η μίτωση, η οποία έχει χωριστεί σε πέντε περεταίρω στάδια: πρόφαση, προμετάφαση, μετάφαση, ανάφαση και τελόφαση. Με το ξεκίνημα της πρόφασης, το DNA έχει διπλασιαστεί ήδη στη σύνθεση (φάση S) και πλέον υπό τη μορφή ινιδίων χρωματίνης συσπειρώνεται σε μεγάλο βαθμό, σχηματίζοντας διακριτά χρωμοσώματα ενωμένα στο κεντρομερίδιο. Στη συνέχεια ξεκινά ο σχηματισμός της μιτωτικής ατράκτου μεταξύ των απομακρυσμένων διπλασιασμένων κεντροσωματίων. Ακολουθεί η προμετάφαση, ένα στάδιο μεταξύ του τέλους της πρόφασης και της πρώιμης μετάφασης, όπου η πυρηνική μεμβράνη αποσυντίθεται και τα χρωμοσώματα συνδέονται μέσω των κεντρομεριδίων τους με τους μικροσωληνίσκους της ατράκτου. Το κύτταρο μπαίνει στη μετάφαση και τα χρωμοσώματα διατάσσονται ακριβώς στο μέσον της κεντρικής ατράκτου, ισαπέχοντας από τα άκρα. Σε αυτή τη φάση η μελέτη των χρωμοσωμάτων με κυτταρογενετικές μεθόδους γίνεται βέλτιστη, γιατί η συσπείρωση του γενετικού υλικού είναι η καταλληλότερη για οπτική Ενδοδιπλασιασμός Συμβαίνει κατά τη διαδικασία αντιγραφής του DNA στη διάρκεια της φάσης σύνθεσης, χωρίς να ακολουθεί η ολοκλήρωση της μίτωσης ή/και της κυτταροκίνησης. Το αποτέλεσμα πολλές φορές είναι η πολυπλοειδία [2]. Ο ενδοδιπλασιασμός συναντάται φυσιολογικά σε κύτταρα φυτικών οργανισμών αλλά και θηλαστικών [4] Εικόνα ενδοδιπλασιασμένων χρωμοσωμάτων που συναντήθηκε κατά τη διάρκεια της αναζήτησης μεταφάσεων στο εργαστήριο Κυτταρογενετικής του Ε.ΚΕ.Φ.Ε. Δ για τους σκοπούς του πειράματος. Περίπου στο κέντρο φαίνεται ο σχηματισμός ενός triradial ή quadriradial. 27

28 ανάλυση. Ακολουθεί η ανάφαση, με τις αδελφές χρωματίδες να διαχωρίζονται με τη βοήθεια των μικροσωληνίσκων και να οδεύουν προς τους πόλους της ατράκτου, οι οποίο με τη σειρά τους απομακρύνονται ο ένας από τον άλλο. Τελικά, ξεκινάει η δημιουργία των πυρήνων στους πόλους και η διαίρεση του κυτταροπλάσματος που θα καταλήξει στο σχηματισμό δύο θυγατρικών κυττάρων. Κάθε πυρήνας διαθέτει από ένα πλήρες αντίγραφο της γενετικής πληροφρορίας. Η διαδικασία που περιγράφηκε τελευταία αποτελεί την τελόφαση [12]. 28

29 4.2.5 Σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου Η κυτταρική διαίρεση είναι μια πολύπλοκη διαδικασία, κατά τη διάρκεια της οποίας είναι εύκολο να συμβούν πολλά λάθη, με καταστροφικές συνέπειες για το κύτταρο και τον οργανισμό. Αδυναμία διόρθωσης των βλαβών στο DNA ή εκκίνηση κάποιας φάσης πριν τα χρωμοσώματα βρεθούν σε σωστή διάταξη μπορεί να καταλήξει σε θάνατο του κυττάρου, ανευπλοειδία ή μεταλλάξεις [28]. Για τον λόγο αυτό υπάρχουν σε διαφορετικά σημεία του κυτταρικού κύκλου τα σημεία ελέγχου, δηλαδή μηχανισμοί που επαληθεύουν στο τέλος κάθε φάσης την ορθότητα των διαδικασιών που εκτελέστηκαν, ώστε να μπορέσει το κύτταρο να προχωρήσει στο επόμενο στάδιο [29]. Τα δύο σημαντικότερα σημεία ελέγχου βρίσκονται μεταξύ των φάσεων G1 και σύνθεσης, καθώς και στο τέλος της G2-φάσης. Το σημείο ελέγχου της G1 είναι κρίσιμο για τη συνέχεια του κυττάρου στην S-φάση. Με βάση το αποτέλεσμα του ελέγχου αποφασίζεται αν το κύτταρο θα διαιρεθεί, θα καθυστερήσει τον διπλασιασμό του ή θα εξέλθει του κύκλου. Επιλέον, σε αυτή τη φάση λαμβάνει χώρα η ενεργοποίηση ή μη- του γονιδίου TP53 [30, 31], δηλαδή η πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από αυτό (p53) είναι δυνατόν να επάξει διακοπή της ανάπτυξης ή ογκοκατασταλτική, αποπτωτική απόκριση [32]. Ο ρόλος-κλειδί του γονιδίου TP53 γίνεται εμφανής όταν, μετά από μεταλλάξεις, παύει να λειτουργεί φυσιολογικά και προάγεται καρκινογένεση [33, 34]. Το δεύτερο σημείο ελέγχου, στο τέλος της G2 φάσης, εξασφαλίζει ότι το κύτταρο δε θα περάσει στη μίτωση χωρίς να έχει προηγηθεί επιδιόρθωση βλαβών του γενετικού υλικού. Αν διαπιστωθεί η ύπαρξη προβλημάτων ο κύκλος υφίσταται ανάσχεση από τη δράση της κυκλίνης 8 B/CDK1, γνωστής επίσης ως Mitosis Promoting Factor (MPF) [35]. Με αυτόν τον τρόπο το σημείο ελέγχου της φάσης G2 βοηθά στη διατήρηση της σταθερότητας του γενετικού υλικού και αποτελεί σημείο ενδιαφέροντος για την κατανόηση του καρκίνου σε μοριακό επίπεδο [36]. 8 Κυκλίνες είναι πρωτεϊνικά συμπλέγματα κατηγοριοποιημένα σε οικογένειες και ανάλογα ελέγχουν διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου. 29

30 4.3 Αλληλεπίδραση ακτινοβολίας-γ και βιολογικής ύλης Κατά την αλληλεπίδραση ιοντίζουσας ακτινοβολίας και βιολογικής ύλης διακρίνονται τα παρακάτω στάδια: 1. Φυσικό στάδιο: Η αλληλεπίδραση της ιονίζουσας ακτινοβολίας με τη βιολογική ύλη είναι ουσιαστικά μια χιονοστιβάδα συγκρούσεων με τα ηλεκτρόνια του μέσου. Ανάλογα με την ενέργεια που εναποτίθεται στο ηλεκτρόνιο, το μόριο στο οποίο ανήκει υπόκειται σε ιονισμό, διέγερση ή αύξηση της θερμικής του ενέργειας. Η τελευταία επίδραση δεν έχει επιπτώσεις 9, σε αντίθεση με τους ιονισμούς και τις διεγέρσεις, που συμβάλλουν σε καθοριστική αύξηση της εσωτερικής ενέργειας του μορίου και θέτοντας σε κίνδυνο τη σταθερότητά του. Σημαντικό ρόλο σε αυτή την περίπτωση έχει η τιμή της LET της ακτινοβολίας: υψηλή LET όπως είναι φυσικό έχει μεγαλύτερη πυκνότητα ιοντισμών από ακτινοβολία με χαμηλή LET [37]. 2. Χημικό στάδιο: Η ακτινοβολία κατά μεγάλο βαθμό απορροφάται από το νερό, και καθώς το κύτταρο αποτελείτα από ~70% HO, 2 προκύπτουν ιόντα, ελεύθερες ρίζες και διεγερμένα άτομα [38]. Με την πρόσπτωση της ακτινοβολίας στα μόρια του νερού λαμβάνει χώρα η διαδικασία της ραδιόλυσής του, σύμφωνα με τις παρακάτω εξισώσεις: * H2O H2O HO H όπου ένα μόριο νερού διεγείρεται έχοντας περίσσεια ενέργειας * ( 2 ) HO και τελικά αποσυντίθεται στις πολύ δραστικές χημικά ρίζες HO και H. Με 9 Η μεταφορά θερμικής ενέργειας δε θα μας απασχολήσει εδώ, καθώς χρειάζοναι τεράστια ποσά 4 (τάξεως 10 Gy ) ώστε να υπάρξει σημαντική άνοδος στη θερμοκρασία του μέσου και να παρατηρηθούν βιοχημικές μεταβολές στα κύτταρα [21. Nias, A.H.W., An introduction to Radiobiology1998, West Sussex, England: John Wiley & Sons. 30

31 διάφορους συνδυασμούς μπορούν να προκύψουν δευτερεύουσες ρίζες και οξειδωτικές ενώσεις (πχ. ένυδρα ηλεκτρόνια, e aq και υπεροξείδιο του υδρογόνου, HO 2 2 ). Οι ελεύθερες ρίζες αποτελούν μόρια με ένα μονήρες ηλεκτρόνιο στην εξωτερική τους στιβάδα, το οποίο τους προσδίδει μεγάλη δραστικότητα. Το υπεροξείδιο του υδρογόνου είναι επίσης τοξικό, ειδικά για το μόριο του DNA. Το σύνολο των βλαβών που προκαλούνται από τις ελεύθερες ρίζες και γενικότερα τα προϊόντα ραδιόλυσης του νερού αποτελεί την έμμεσο δράση της ακτινοβολίας, σε αντίθεση με την άμεσο δράση, όπου η ακτινοβολία χτυπά κατευθείαν το μόριο του DNA, διαταράσσοντας τη μοριακή του δομή. Οι δομικές αλλαγές μπορούν να οδηγήσουν σε βλάβες του ίδιου του κυττάρου ή ακόμη και κυτταρικό θάνατο [12]. Εικόνα 4.3.1: Η άμεσος και έμμεσος δράση της ακτινοβολίας στο μόριο του DNA. (Εικόνα από το διαδίκτυο. Πηγή: 3. Βιολογικό στάδιο: Κατά το τρίτο και τελευταίο στάδιο συμβαίνουν πολύπλοκες βιοχημικές αντιδράσεις μεταξύ των δραστικών συστατικών που προέκυψαν στο χημικό στάδιο και του μορίου DNA, καθώς και άλλων συστατικών του κυττάρου. Η κατανόηση της αλληλεπίδρασης ακτινοβολίας-κυττάρου βασίζεται στη θεωρία του στόχου, η οποία έχει ως βασική αρχή ότι ορισμένα μόρια είναι 31

32 καθοριστικά για την επιβίωση του κυττάρου 10, ενώ κάποια άλλα δεν είναι [39, 40]. Αυτό σημαίνει ότι αν η ακτινοβολία προκαλέσει βλάβη σε ένα μη σημαντικό μόριο, οι επιπτώσεις στο κύτταρο δε θα είναι θανατηφόρες απαραίτητα. Σε αντίθετη περίπτωση, αν για παράδειγμα καταστραφεί ένα γονίδιο χρωμοσώματος, το κύτταρο μπορεί να μην επιβιώσει [13]. Σε ανώτερους οργανισμούς όπως ο ανθρώπινος, ο κυτταρικός θάνατος δεν είναι τόσο εύκολο να συμβεί, καθώς χρειάζεται να απενεργοποιηθούν δύο ή και περισσότερα κρίσιμα γονίδια. Επιπλέον, κάθε κύτταρο είναι εξοπλισμένο με έναν αριθμό πολύπλοκων επιδιορθωτικών μηχανισμών που μπαίνουν σε εφαρμογή με την πρόκληση βλαβών [41]. Εκτός από το μόριο του DNA, η ακτινοβολία μπορεί να επιφέρει ρήγματα και στην κυτταρική μεμβράνη, με αποτέλεσμα το κύτταρο να γίνει διαπερατό σε εξωτερικές τοξίνες και τελικά να πεθάνει. Έρευνες στραμμένες προς αυτή την κατεύθυνση παρέχουν μια εναλλακτική θεώρηση, υποστηρίζοντας ότι κυτταρικός θάνατος επαγόμενος από την ακτινοβολία δε συμβαίνει μόνο με άμεση βλάβη στο γενετικό υλικό [42, 43]. 10 Συγκεκριμένα τους έχει αποδοθεί ο όρος μόριο-στόχος. 32

33 4.4 Επίδραση ιοντιζουσών ακτινοβολιών στα βιομόρια Σε επίπεδο DNA: Η ιονίζουσα ακτινοβολία μπορεί να επιφέρει διαφόρων ειδών βλάβες στο μόριο του DNA, ανάλογα με την περιοχή που πλήττεται: Μονή ή διπλή ρήξη της έλικας (single/double strand breaks, SSB/DSB) Εικόνα 4.4.1: Αναπαράσταση των μονών και διπλών ρήξεων στη διπλή έλικα του DNA. (εικόνα από το διαδίκτυο, πηγή: 2/12/22/how-reca-slides-in-to-therescue/dna_breaks/) Αυτού του τύπου οι βλάβες στο γενετικό υλικό είναι οι περισσότερο γνωστές. Μια μονή ρήξη μπορεί να συμβεί σε επίπεδο φωσφοδιεστερικών δεσμών, μεταξύ μιας φωσφορικής ομάδας και δεσοξυριβόζης, ή πιο συχνά, μεταξύ του δεσμού αζωτούχου βάσης και δεσοξυριβόζης. Ένα μεγάλο ποσοστό των μονών ρήξεων προκαλείται από τη δράση των ελεύθερων ριζών OH, γεγονός που αποδεικνύεται με τη χρήση χημικών ενώσεων οι οποίες παγιδεύουν επιλεκτικά τις ρίζες υδροξυλίου [44-46]. Κατόπιν της θραύσης του φωσφοδιεστερικού δεσμού οι έλικες διαχωρίζονται με τη διείσδυση μορίων νερού και επακολουθεί σπάσιμο των δεσμών υδρογόνου μεταξύ των βάσεων [21]. Μία διπλή ρήξη της έλικας του DNA περιλαμβάνει θραύση και των δύο σκελετών φωσφόρου-πεντόζης σε σημεία λιγότερο από τρία νουκλεοτίδια μακριά. Η διπλή θραύση ονομάζεται ομόλογη αν περιλαμβάνει το ίδιο ζευγάρι βάσεων και ετερόλογη σε αντίθετη περίπτωση. Διπλές ρήξεις είναι πιθανότερο να συμβούν ως αποτέλεσμα της άμεσου δράσης μάλλον παρά της έμμεσης, καθώς στη δεύτερη περίπτωση θα έπρεπε δύο διαφορετικά 33

34 μόρια να επιδράσουν σε δύο αντιδιαμετρικά σημεία της διπλής έλικας, κάτι που είναι αρκετά απίθανο [13]. Πρέπει να σημειωθεί ότι διπλές θραύσεις συμβαίνουν και φυσιολογικά, ως ενδιάμεσο κομμάτι ποικίλων κυτταρικών διεργασιών, όπως η μείωση 11 και η διαδικασία ανασυνδυασμού V(D)J 12 [47]. Οι διπλές ρήξεις έχουν ιδιαίτερη βιολογική σημασία διότι η επιδιόρθωσή τους είναι εγγενώς σημαντικά πιο δύσκολη από άλλου είδους βλάβες [48]. Μη επιδιόρθωση μπορεί να οδηγήσει σε κυτταρικό θάνατο (απόπτωση), ενώ λανθασμένη επιδιόρθωση μπορεί να προκαλέσει διαγραφές, μετατοπίσεις και συγχωνεύσεις στο DNA. OCDLs (Oxidative-induced Clustered DNA Lesions) Μαζί με τις DSBs, οι ομαδοποιημένες βλάβες OCDLs υπάγονται στην κατηγορία των πολύπλοκων βλαβών που ονομάζονται συμπλέγματα (clusters). Η σύλληψη της ιδέας του συμπλέγματος βλαβών έγινε αρχικά από τον Ward [49], υπό τον ορισμό διαφόρων κοντινών βλαβών που προκαλούνται από την ιονίζουσα ακτινοβολία σε ένα μικρό τμήμα του DNA [50]. Τα συμπλέγματα ενδέχεται να περιλαμβάνουν μονές θραύσεις κυμαινόμενης πολυπλοκότητας, οξειδωμένες βάσεις και αβασικά ή οξειδωμένα αβασικά τμήματα (AP sites) [51]. Η έννοια των clusters αναδύθηκε όταν η αυξημένη θνησιμότητα ακτινοβολημένων κυττάρων δε μπόρεσε να εξηγηθεί εντελώς από τον αριθμό DSBs που είχαν δημιουργηθεί [50, 51], παρόλο που και οι διπλές θραύσεις από μόνες τους είναι ικανές να προκαλέσουν κυτταρικό θάνατο. 11 Κατά τη μείωση ένα κύτταρο διαιρείται κατά τρόπο τέτοιο ώστε να παράγει γαμέτες, δηλαδή απλοειδή κύτταρα με ανασυνδυασμένα χρωμοσώματα (έχει γίνει τυχαία ανάμιξη των γονιδίων απο τα αρχικά ομόλογα χρωμοσώματα και κάθε γαμέτης προκύπτει με ένα διαφορετικό γενετικό συνδυασμό). 12 Πρόκειται για ένα είδος γενετικού ανασυνδυασμού σε οργανισμούς με προσαρμοστικό ανοσοποιητικό, όπου τα κύτταρα του συστήματος διαφοροποιούνται ταχύτατα για να αναγνωρίζουν και να προσαρμόζονται σε νέα παθογόνα. 34

35 Τέτοιοι τύποι βλαβών όπως οι DSBs και OCDLs, οι οποίες έχουν ως κοινό γνώρισμα τη μεγάλη πολυπλοκότητα, συναντώνται πολύ συχνά μετά από ακτινοβολία υψηλής LET, αλλά ακόμη και ακτίνες χαμηλής LET μπορούν να προκαλέσουν συμπλέγματα βλαβών σύμφωνα με θεωρητικά μοντέλα [52]. Επειδή ακριβώς τα συμπλέγματα αποτελούνται από πολύ κοντινές βλάβες σε διαστήματα 1-10 ζευγών βάσεων [51], η επιδιόρθωση αποδεικνύεται πολύ πιο απαιτητική από όσο για κάθε επιμέρους βλάβη ξεχωριστά, σε πειράματα που έγιναν in vitro [53]. Στην πραγματικότητα, η ίδια η διαδικασία της επιδιόρθωσης των συμπλεγμάτων είναι τόσο επιρρεπής σε σφάλματα που φαίνεται να δημιουργεί δευτερογενείς διπλές θραύσεις πολύ μετά την ακτινοβόληση [50, 51, 53]. Εν γένει οι OCDLs θεωρούνται βλάβες εξαιρετικά ανθεκτικές στην επιδιόρθωση ή και καθόλου επιδιορθώσιμες, εν δυνάμει μεταλλαξογόνες σε μεγάλο βαθμό [50, 51]. Έρευνες των Asaithamby et al. έχουν δείξει σύνδεση μεταξύ μη επιδιορθωμένων συμπλεγμάτων βλαβών και θραύσεων σε χρωμοσωμικό επίπεδο [54], ενώ έχουν παρατηρηθεί διάφορες χρωμοσωμικές αναδιατάξεις, αντιστροφές και διαγραφές μεγάλων τμημάτων [55]. Αλλοίωση των οργανικών βάσεων: Οι βάσεις μπορεί να καταστραφούν μερικώς ή να τροποποιηθούν χημικά. Συνήθως υπόκεινται σε οξείδωση εξαιτίας της δράσης των OH [56], χωρίς αυτό να αποκλείει την αλληλεπίδραση και με άλλες δραστικές ρίζες. Ενδεικτικά, οι επιπτώσεις αυτού του οξειδωτικού στρες γίνονται φανερές κατά τη μεταλλαξογόνο δράση του υδροξυλίου στη γουανίνη: το αποτέλεσμα που προκύπτει είναι η 8-υδροξυγουανίνη, η οποία συνδέεται επιλεκτικά με την αδενίνη αντί για την κυτοσίνη και προκαλεί μετάλλαξη τύπου αντικατάστασης [56]. 35

36 Καταστροφή των σακχάρων: Αλλοιώσεις στη δεσοξυριβόζη είναι σπάνιες και δεν έχουν ακόμη κατανοηθεί σε βάθος. Αναλογικά, σε 10 SSB αντιστοιχούν μόνο μεταβολές στα σάκχαρα [21]. Η αλλοίωση περιλαμβάνει συνήθως οξείδωση και στη συνέχεια υδρόλυση με ακόλουθη απελευθέρωση της βάσης, χωρίς απαραίτητα να διαρρηγνύονται οι φωσφοδιεστερικοί δεσμοί. Άλλου τύπου βλάβες: Άλλες πιθανές κακώσεις στο DNA είναι ενδοκλωνικές (μεταξύ δύο σημείων της μίας έλικας) και διακλωνικές ενώσεις (μεταξύ των δύο κλώνων), διαμοριακές ενώσεις μεταξύ DNA και πρωτεϊνών, ενδομοριακή σύνδεση μεταξύ DNA, λύση των δεσμών υδρογόνου και σχηματισμός διμερών [21] Σε επίπεδο χρωμοσωμάτων: Τα ινίδια χρωματίνης κατά την περίοδο πριν τη σύνθεση έχουν πολύ μεγάλο μήκος σε σύγκριση με την μετάφαση, όπου είναι οργανωμένα σε χρωμοσώματα [57]. Εξαιτίας των αυξημένων διαστάσεών τους γίνονται εύκολα στόχος της ακτινοβολίας αλλά και χημικών παραγόντων και τα αποτελέσματα των βλαβών μπορούν ενίοτε να γίνουν αντιληπτά μικροσκοπικά με τη μορφή αλλοιώσεων στα χρωμοσώματα [58]. Τα σφάλματα τύπου DSBs, λόγω της πολυπλοκότητάς τους, αποτελούν συχνά προοίμιο της διαδικασίας σχηματισμού βλαβών σε μεγαλύτερο επίπεδο, δηλαδή στα χρωμοσώματα [54, 59]. Αυτό συμβαίνει διότι η διαδικασία επιδιόρθωσης δεν είναι πάντα επιτυχής ή ολοκληρωμένη. Στις αλλοιώσεις των χρωμοσωμάτων που προκαλούνται από την ιονίζουσα ακτινοβολία περιλαμβάνονται τόσο ανωμαλίες στον αριθμό, όσο και δυσμορφίες. Αυτές οι δύο κατηγορίες μπορούν εύκολα να παρατηρηθούν στο μικροσκόπιο. Παρόλα αυτά, υπάρχουν και αλλαγές που δεν μπορούν να 36

37 γίνουν αντιληπτές καρυοτυπικά αλλά ταυτόχρονα έχουν σοβαρές λειτουργικές επιπτώσεις, όπως για παράδειγμα: μεταλλάξεις γονιδίων [21]. Ανάλογα με τη θέση των κυττάρων στο μιτωτικό κύκλο τη στιγμή της ακτινοβόλησης μπορούν να παρατηρηθούν διάφοροι τύποι αλλοιώσεων. Χρωμοσωμικές παρατηρούνται στη μετάφαση όταν το κύτταρο έχει ακτινοβοληθεί πριν την φάση S, κατά την G1 ή G0, με αποτέλεσμα η βλάβη να επηρεάζει και τις δύο αδελφές χρωματίδες, δεδομένου ότι τα σφάλματα δεν επιδιορθώθηκαν πριν τον διπλασιασμό του γενετικού υλικού. Τέτοιου τύπου αλλοιώσεις περιλαμβάνουν τα δικεντρικά χρωμοσώματα (dicentric), τελικές και ενδιάμεσες ελλείψεις (terminal and intersitial deletions), σχηματισμό δακτυλίων (ring formation), ανταλλαγές (interchanges) και άλλα. Χρωματιδικές αλλοιώσεις παράγονται κατά την ακτινοβόληση του κυττάρου μετά την S φάση, για παράδειγμα στην G2. Σε αυτή την περίπτωση η ιονίζουσα ακτινοβολία δεν επηρεάζει απαραίτητα και τις δύο αδελφές χρωματίδες και οι βλάβες που παρατηρούνται είναι διαφορετικού τύπου: χάσματα (gaps), θραύσματα (breaks), αμοιβαίες μεταθέσεις (reciprocal translocations), τριακτινικά (triradials) και άλλα. Ακόμη, υπάρχει περίπτωση να εμφανιστεί ένα μίγμα χρωμοσωμικών και χρωματιδικών αλλοιώσεων όταν το κύτταρο ακτινοβοληθεί κατά τη διάρκεια της S φάσης, όπου τα ινίδια χρωματίνης έχουν μερικώς μόνο διπλασιαστεί [21]. 37

38 Εικόνα Μια μίξη χρωμοσωμικών και χρωματιδικών αλλοιώσεων: το μεγάλο βέλος υποδεικνύει τη θέση ενός δικεντρικού χρωμοσώματος, τα μικρότερα δείχνουν "σπασίματα" στα χρωμοσώματα και το γράμμα "θ" ταυτοποιεί τα θραύσματα (double minutes). Η λήψη της φωτογραφίας έγινε κατά τη διάρκεια της ανάλυσης των πειραματικών δεδομένων στο μικροσκόπιο του εργαστηρίου Κυτταρογενετικής, Ε.ΚΕ.Φ.Ε. Δ. 38

39 Εικόνα Μια ποικιλία χρωμοσωμικών αλλοιώσεων. Η λήψη της φωτογραφίας έγινε κατά τη διάρκεια της ανάλυσης των πειραματικών δεδομένων στο μικροσκόπιο του εργαστηρίου Κυτταρογενετικής, Ε.ΚΕ.Φ.Ε. Δ. 39

40 4.5 Μηχανισμοί εντοπισμού και επιδιόρθωσης των βλαβών του DNA Πώς το κύτταρο αισθάνεται την ύπαρξη Με την επαγωγή βλαβών στο DNA το κύτταρο βλαβών στο γενετικό υλικό; ανταποκρίνεται ξεκινώντας μια διαδικασία σύνθετη και πολύ Γνωρίζοντας ότι το γενετικό καλά συντονισμένη (DDR, DNA damage repair), από την υλικό είναι πολύ πυκνά οποία θα κριθεί τελικά η έκβαση της ζημιάς που έχει συσπειρωμένο στον πυρήνα προκληθεί στο γενετικό υλικό και κατ επέκταση στο ίδιο το με τη βοήθεια ιστονών, κύτταρο. Πρέπει να σημειωθεί ότι η διαδικασία δεν αναρωτιέται κανείς πώς αποτελείται από ένα μονοπάτι, αλλά μάλλον από διάφορα, γίνονται αντιληπτές οι βλάβες αλληλένδετα σε μεγάλο βαθμό, σηματοδοτικά μονοπάτια ώστε να ξεκινήσουν οι (signaling pathways). Αυτό το δίκτυο μπορεί να διαχωριστεί δαδικασίες σήμανσης και σε δύο τμήματα, στη δράση των αισθητήρων των σφαλμάτων DNA και στην επιδιόρθωση αυτή καθ εαυτή [60]. Οι επιδιόρθωσης. Τα στοιχεία δείχνουν ότι αυτό είναι εφικτό κατά την αντιγραφή και τη αισθητήρες των σφαλμάτων δεν είναι παρά πρωτεΐνες που μεταγραφή του κώδικα, επαγρυπνούν για τον εντοπισμό βλαβών στον κώδικα και δηλαδή στις δύο περιπτώσεις σηματοδοτούν την έναρξη τριών πιθανών διεργασιών που που το DNA είναι σχετίζονται με την επιδιόρθωση: 1) προγραμματισμένος απογυμνωμένο από τις κυτταρικός θάνατος στην περίπτωση ανεπανόρθωτων ιστόνες. Υπάρχει η θεωρία κυτταρικών βλαβών (απόπτωση), 2) μονοπάτια φυσικής που υποστηρίζει ότι η επιδιόρθωσης του DNA και 3) μονοπάτια που προκαλούν αντίληψη των βλαβών συμβαίνει προσωρινή ή μόνιμη ανάσχεση του κυτταρικού κύκλου κυρίως κατά την δηλαδή τα σημεία ελέγχου όπως έχουν αναφερθεί παραπάνω. αντιγραφή για ευνόητους λόγους Δράση αισθητήρων σφαλμάτων: και πιθανότατα βασίζε- ται στο ένζυμο RNA-πολυμεράση, 1. Σχηματισμός εστιών (foci) το οποίο διαβάζει με- γάλο μέρος του κώδικα [2]. Αρχικά η κυτταρική απόκριση στις βλάβες περιλαμβάνει τη φυσική παρουσία ενός μεγάλου αριθμού πρωτεϊνών στα σημεία όπου υπάρχουν σφάλματα στο γενετικό υλικό. Με τη χρήση αντισωμάτων που προσδένονται επιλεκτικά σε αυτές τις πρωτεΐνες και την 40

41 ακόλουθη χρώση των σημείων μπορούμε να απεικονίσουμε ως φωτεινά στίγματα περιοχές του πυρήνα όπου το DNA έχει υποστεί βλάβες και κατά συνέπεια έχει συσσωρευτεί πλήθος πρωτεϊνών. Έχει αποδειχθεί ότι ένας μεγάλος αριθμός πρωτεϊνών που εμπλέκονται στον εντοπισμό σφαλμάτων σχηματίζει foci πάνω ή πολύ κοντά σε περιοχές που όντως υπάρχουν διπλές ρήξεις του DNA (DSBs) [1, 54, 61, 62]. Ένα από τα πρώτα γεγονότα που παρατηρούνται κατά το σχηματισμό foci είναι η φωσφορυλίωση της ιστόνης Η2ΑΧ (παραλλαγή της Η2Α), μίας εκ των τεσσάρων ζευγών πρωτεϊνών που αποτελούν το οκταμερές ιστονών του νουκλεοσώματος. Η ιστόνη Η2ΑΧ εκτείνεται σχεδόν σε όλο τον πυρήνα και ήδη από την αρχή του σχηματισμού των DSBs φωσφορυλιώνεται σε μια εκτεταμένη περιοχή γύρω από μη επιδορθωμένες DSBs, συγκεκριμένα στη σερίνη 139 (Ser 139) και με τρόπο άμεσα εξαρτώμενο από τη δόση [63]. Η φωσφορυλιωμένη μορφή της ιστόνης, γνωστή ως γη2αχ, αποτελεί σινιάλο για μια πληθώρα άλλων πρωτεϊνών και μια άμεση απόκριση του κυττάρου στην παρουσία των DSBs [1]. Ιστόνες και Φωσφορυλίωση Οι ιστόνες είναι μικρές βασικές πρωτεΐνες και ταξινομούνται σε πέντε κατηγορίες: Η2Α, Η2Β, Η3, Η4 και Η1 [1]. Οι τέσσερις πρώτες (ανά δύο) σχηματίζουν το οκταμερές γύρω από το οποίο τυλίγεται το DNA για να συγκροτηθεί σε νουκλεόσωμα. Η Η1 παίζει συνδετικό ρόλο, συγκρατώντας το DNA τυλιγμένο δύο φορές γύρω από το οκταμερές. Η φωσφορυλίωση γενικά είναι η προσθήκη μιας φωσφορικής 3 4 ομάδας ( PO ) σε μία πρωτεΐνη ή κάποιο άλλο οργανικό μόριο. Η διαδικασία αυτή μπορεί να ενεργοποιήσει ή να απενεργοποιήσει διάφορα ένζυμα αλλάζοντας τη δομή τους στο χώρο, μεταβάλλοντας έτσι τη λειτουργία και δραστηριότητά τους. Η διαδικασία είναι αντιστρεπτή: ένζυμα όπως οι κινάσες φωσφορυλιώνουν πρωτεΐνες, ενώ οι φωσφατάσες κάνουν την ακριβώς αντίθετη διαδικασία, δηλαδή αφαιρούν μία φωσφορική ομάδα από ένζυμα ή πρωτεΐνες. 41

42 Εικόνα 4.5.1: Αντιπροσωπευτική εικόνα από το μικροσκόπιο φθορισμού, με εμφανή foci (πράσινες κουκίδες) στους πυρήνες των κυττάρων (μπλε περιγράμματα). Η λήψη της φωτογραφίας έγινε κατά τη διάρκεια της ανάλυσης των πειραματικών δεδομένων στο μικροσκόπιο φθορισμού του εργαστηρίου Κυτταρογενετικής, Ε.ΚΕ.Φ.Ε. Δ. 2. Αισθητήρες σφαλμάτων Όπως ειπώθηκε προηγουμένως, η φωσφορυλίωση των ιστονών Η2ΑΧ είναι από τα πρώτα συμβάντα που ακολουθούν το σχηματισμό των DSBs. Αυτό υποδεικνύει ότι μια ομάδα από κινάσες ενεργοποιείται στην περιοχή και συμβάλλουν στη διαμόρφωση της γη2αχ. Τα στοιχεία δείχνουν ότι τρεις βασικές κινάσες συνδέονται με τη φωσφορυλίωση της Η2ΑΧ σε περιοχές όπου εμφανίζονται DSBs [61]: Η διαδικασία της φωσφορυλίωσης συνδέεται άμεσα με την τριφωσφορική αδενοσίνη ( adenosin tripho-sphate, ATP), γνωστή και ως ενεργειακό νόμισμα ή ενεργειακή μπαταρία των ποικίλων βιοχημικών αντιδράσεων στα κύτταρα. Η ΑΤΡ παράγεται από την πρόσθεση μιας φωσφορικής ομάδας στο μόριο της διφωσφορικής αδενοσίνης (adenosine diphosphate, ADP) και χρησιμοποιείται ως συνένζυμο από τις πρωτεΐνες. Η χημική δραστηριότητα των κινασών περιλαμβάνει τη μεταφορά μιας φωσφορικής ομάδας από την ΑΤΡ στην πρωτεΐνηστόχο, με αποτέλεσμα την αλλαγή στη λειτουργία της τελευταίας και τη μετατροπή της ΑΤΡ σε ADP. ATM-MRN Η φωσφορυλίωση της Η2ΑΧ συμβαίνει πρωτίστως μέσω της πρωτεΐνης ΑΤΜ (ataxia telangiectasia mutated) και πιθανότατα είναι από τις πρώτες κινάσες που ενεργοποιούνται κατά την κυτταρική απόκριση στις διπλές θραύσεις του DNA [64, 65]. Το γονίδιο που κωδικοποιεί αυτή την κινάση έχει μεγάλη σημασία, η οποία γίνεται εμφανής όταν αυτό μεταλλάσσεται 42

43 και οδηγεί στο αυτοσωμικά υπολειπόμενο σύνδρομο ataxia telangiectasia (AT), με χαρακτηριστικά τη γονιδιωματική αστάθεια (genomic instability), ελαττωματικά σημεία κυτταρικού ελέγχου και αυξημένη ραδιοευαισθησία, μεταξύ άλλων [66]. Το διμερές της ΑΤΜ έχει μειωμένη δραστηριότητα ως μονάδα [67], αλλά σε συνδυασμό με το πρωτεϊνικό σύμπλεγμα MRN ενεργοποιείται και είναι ικανό να αναγνωρίσει περιοχές που έχουν πληγεί από διπλές θραύσεις [67, 68]. Η εξάρτηση αυτή από την MRN γίνεται φανερή σε περιπτώσεις δυσλειτουργείας ή μετάλλαξης της τελευταίας, όπως στο σύνδρομο Nijmegen (Nijmegen Breakage Syndrome, NBS) [69], το οποίο παρουσιάζει αρκετές ομοιότητες στα συμπτώματα με την ataxia. ATR Η ATR (ataxia-telangiectasia and Rad3-related), όπως και η ΑΤΜ, ανήκει στην ευρύτερη οικογένεια κινασών PIKKs (Phosphoinositide Kinase- Related Kinases), οι οποίες αρχικοποιούν τις κυτταρικές αποκρίσεις όταν διακυβεύεται η γονιδιωματική ακεραιότητα. Η ATR παίζει σημαντικό ρόλο στην επιβίωση των κυττάρων και κατ επέκταση του οργανισμού, που σημαίνει ότι δεν αποτελεί απλώς μια πρωτεΐνη η οποία επαγρυπνεί για περιστασιακές βλάβες αλλά είναι ένα ενσωματωμένο χαρακτηριστικό της κυτταρικής φυσιολογίας [70]. Ειδικότερα, η σημασία της διαφαίνεται από την ATR-εξάρτηση των S και G2 σημείων ελέγχου [71]. Όπως και η ΑΤΜ, η ATR έχει ανάγκη από μια υποομάδα, την ATRIP (ATR interacting protein) για να συγκεντρωθεί στις περιοχές βλαβών του DNA [60]. Δρα σε συνδυασμό με την ΑΤΜ και πολλές φορές ενεργοποιείται από την ίδια της τη δράση [60]. DNA-PKcs Η DNA-dependent protein kinase catalytic subunit (DNA-PKcs) αποτελεί την καταλυτική υπομονάδα της DNA-PK, είναι δομικά συναφής με την ΑΤΜ και έχει πρωταγωνιστικό ρόλο στο μονοπάτι της μη ομόλογης επιδιόρθωσης τελικής σύνδεσης του DNA (non-homologous end joining 43

44 repair, NHEJ) [72]. Όπως συμβαίνει κατ αναλογία και με τη λειτουργία της ΑΤΜ, η DNA-PKcs παραμένει αδρανής εάν πρώτα δεν ενεργοποιηθεί η πρωτεΐνη Ku [70]. H Ku στα ευκαρυωτικά κύτταρα είναι ένα ετεροδιμερές δύο πολυπεπτιδίων, του Ku70 και του Ku80 13, με τοροειδή κρυσταλλική δομή που θυμίζει καλάθι, η οποία του επιτρέπει να αγκαλιάζει και τις δύο έλικες του DNA σε περιοχές όπου υπάρχουν DSBs [70, 73]. Μπορεί να προσδεθεί μόνο σε άκρα του DNA και από εκεί η ιδιαίτερη μορφή του δίνει τη δυνατότητα να ολισθαίνει σε εσωτερικά σημεία που δεν είναι άμεσα προσβάσιμα [3]. Στη συνέχεια η Ku επιστρατεύει την DNA-PKcs στα σημεία ενδιαφέροντος. Συγκροτημένες σε μια ελεύθερη άκρη του DNA, οι δύο πρωτεΐνες μαζί συγκροτούν το ολοένζυμο 14 DNA-εξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση (DNA-PK). Αυτή η κινάση σερίνης/θρεονίνης 15 είναι μοναδική από την άποψη ότι χρειάζεται το DNA ως συμπαράγοντα για την ενεργοποίησή της [8, 74, 75]. Η DNA-PK αυτοφωσφορυλιώνεται σε πολλά σημεία [7, 76] μετά την πρόσδεση, μια διαδικασία κομβικής σημασίας για την επιδιόρθωση NHEJ in vivo [77]. Η δράση της DNA-PK δεν περιορίζεται μόνο στην αυτοφωσφορυλίωση αλλά φωσφορυλιώνει και άλλες πρωτεΐνες όπως η Artemis, οδηγώντας στην ενεργοποίησή τους [3]. 13 Η ονομασία προκύπει από το μοριακό τους βάρος, το οποίο κυμαίνεται μεταξύ 70 και ~80 kda. 14 Η ρυθμιστική υποομάδα μαζί με την καταλυτική ενός ενζύμου αποτελούν το ολοένζυμο. 15 Οι πρωτεϊνικές κινάσες γενικά δρουν προσθέτοντας μια φωσφορική ομάδα στην ελεύθερη καρβοξυλομάδα συγκεκριμένων αμινοξέων. Οι κινάσες σερίνης/θρεονίνης φωσφορυλιώνουν επιλεκτικά τις σερίνη και θρεονίνη. 44

45 Αυτοφωσφορυλίωση Εικόνα 4.5.2: Η κρυσταλλική δομή της πρωτεΐνης Ku, μετά την πρόσδεση στη διπλή έλικα του DNA. Φανταστείτε την αλυσίδα του DNA σα να βγαίνει έξω από τη σελίδα (στο κέντρο), ενώ το πολυπεπτίδιο Ku 70 (δεξιά, πράσινο χρώμα) και το Ku80 (αριστερά, κίτρινο) την περιστοιχίζουν σχηματίζοντας ένα βρόχο. Εικόνα 4.5.3: Σχηματική παρουσίαση της χημικής αντίδρασης της φωσφορυλίωσης από πρωτεϊνικές κινάσες. Η δραστηριότητα πολλών κινασών αλλά και άλλων πρωτεϊνών φαίνεται να ενισχύεται σημαντικά από την αυτοφωσφορυλίωση. Κατά τη διάρκεια αυτής της μεταμεταφραστικής διαδικασίας η καταλυτική υποομάδα ή ενεργό κέντρο του διμερούς φωσφορυλιώνει το άλλο τμήμα της πρωτεΐνης, προσθέτοντας μια φωσφορική ομάδα στο ελεύθερο άκρο αμινοξέων όπως η σερίνη, θρεονίνη ή τυροσίνη. Συγκεκριμένα η αυτοφωσφορυλίωση της DNA-PK φαίνεται ότι προκαλεί αποσύνδεση της DNA-PKcs από το ετεροδιμερές Ku [3], πράγμα αναγκαίο για την προσβασιμότητα άλλων εξωγενών παραγόντων (για παράδειγμα παραγόντων τελικής σύνδεσης) στα ελεύθερα άκρα του DNA [7]. 45

46 4.5.2 Επιδιόρθωση των διπλών ρήξεων του DNA Οπως αναφέρθηκε προηγουμένως, οι DSBs γίνονται αντιληπτές από εξειδικευμένες πρωτεΐνες, οι οποίες ειδοποιούν το κύτταρο για τις βλάβες που έχει υποστεί. Στη συνέχεια το κύτταρο σταματά τις διάφορες διαδικασίες (όπως μεταγραφή και συνέχιση του κυτταρικού κύκλου) και βάζει σε πρώτη προτεραιότητα την επιδιόρθωση σφαλμάτων. Οι βασικές διαδικασίες επιδιόρθωσης για τα DSBs είναι ο ομόλογος ανασυνδυασμός (homologous recombination, HR) και η μη ομόλογη επιδιόρθωση τελικής σύνδεσης (nonhomologous end joining repair, NHEJ). Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας, σημαντικότερο είναι το δεύτερο μονοπάτι, επομένως ο ομόλογος ανασυνδυασμός απλώς αναφέρεται, ενώ αναπτύσσεται εκτενέστερα ο NHEJ Homologous Recombination (HR) Εικόνα 4.5.4: Η διαδικασία επιδιόρθωσης με βάση το μονοπάτι του Ομόλογου Ανασυνδυασμού (Homologous Recombination). (Εικόνα από το διαδίκτυο, πηγή: de/en/rg/biertuempfel/rese arch/) Όπως φαίνεται από το όνομά του, ο ομόλογος ανασυνδυασμός χρησιμοποιεί ομόλογες ακολουθίες βάσεων σε διάφορα μέρη στο γονιδίωμα (εκτός του σημείου διπλής θραύσης), όπως για παράδειγμα μια αδελφή χρωματίδη, ως σημείο αναφοράς για την επιδιόρθωση. Γίνεται αντιληπτό ότι ο μηχανισμός είναι εξαιρετικά ακριβής και ελεύθερος σφαλμάτων [78]. Καθοριστικό ρόλο έχει η ομάδα πρωτεϊνών RAD52 και 46

47 ιδιαίτερα η RAD51, η οποία αναλαμβάνει την αναζήτηση ομόλογων ακολουθιών DNA και τη διαμόρφωση συνδεδεμένων μορίων μεταξύ των σπασμένων άκρων και της ακολουθίας που χρησιμεύει ως μήτρα για την επιδιόρθωση [47]. Ο ομόλογος ανασυνδυασμός θα αποτελούσε ένα εξαιρετικό μηχανισμό επιδιόρθωσης DSBs αν σκεφτεί κανείς ότι παρέχει μέγιστη ακρίβεια και ότι στον άνθρωπο τα κύτταρα είναι κατά κανόνα διπλοειδή, επομένως μπορεί να εφαρμοστεί. Αντίθετα με ό,τι θα ήταν αναμενόμενο, ο HR δεν είναι ο συνήθης τρόπος αντιμετώπισης των διπλών θραύσεων, για διάφορους λόγους. Σε οργανισμούς όπως ο ανθρώπινος, όπου το DNA εμφανίζει επαναλαμβανόμενες περιοχές σε ποσοστά που φτάνουν έως και 40%, η αναζήτηση ομολογίας για θραύση που έχει συμβεί μέσα σε τέτοια περιοχή είναι σχεδόν ακατόρθωτη [8] και σωστή επιδιόρθωση μπορεί να επιτευχθεί μόνο κατά την S ή προς το τέλος της G2 φάσης [79], όπου οι αδελφές χρωματίδες έχουν τη βέλτιστη φυσική θέση. Επομένως, ο ομόλογος ανασυνδυασμός είναι πολύ αργός και ίσως επικίνδυνος για οργανισμούς με σημαντικά πολλά τμήματα επαναλαμβανόμενου DNA Non-homologous End Joining (NHEJ) Όπως υποδηλώνει και το όνομά της, η μη ομόλογη επιδιόρθωση τελικής σύνδεσης δε χρησιμοποιεί ομόλογες αλληλουχίες βάσεων ως πρότυπα, σε αντίθεση με τον ομόλογο ανασυνδυασμό. Αυτό πολλές φορές συντελεί σε απώλεια πληροφορίας και δεδομένου ότι η NHEJ αποτελεί τον κύριο επιδιορθωτικό μηχανισμό σε πολυκύτταρους ευκαρυωτικούς οργανισμούς όπως τα ποντίκια και ο άνθρωπος, θα περίμενε κανείς τη συσσώρευση σφαλμάτων λόγω επιδιόρθωσης αυτή τη φορά. Ευτυχώς, η συντριπτική πλειονότητα (~98% [80]) του γονιδιώματος είναι μη κωδική 16 και όπως είναι προφανές, οι πιθανότητες να επιδιορθωθεί από την NHEJ μια τέτοια περιοχή είναι πολύ μεγάλες. Επιπλέον, επιπτώσεις στο φαινότυπο θα είναι 16 Οι μη κωδικές περιοχές του DNA ονομάζονται έτσι διότι δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Μπορεί όμως να εκφράζονται σε μη κωδικό RNA ή να έχουν διάφορες άλλες λειτουργίες. 47

48 ελάχιστες, αν υπάρχουν, συγκριτικά με τους κινδύνους που μπορούν να προκύψουν από ένα μη επιδιορθωμένο, κατακερματισμένο χρωμόσωμα [2]. Ο μηχανισμός NHEJ είναι σημαντικά πιο γρήγορος από τον HR. Έρευνες έχουν δείξει ότι το διμερές Ku και οι DNA-PKcs σπεύδουν σε περιοχές διπλών ρήξεων που έχουν δημιουργηθεί τεχνητά μέσα σε μερικά μόνο δευτερόλεπτα από την πρόκληση της ζημιάς [81]. Σε αυτό βοηθάει η αφθονία του Ku που βρίσκεται διάχυτο στα κύτταρα [82, 83]. Η διαδικασία της επιδιόρθωσης ξεκινάει με την πρόσδεση του ετεροδιμερούς στα σημεία διπλών θραύσεων. Η δομή του είναι άμεσα συνδεδεμένη με τις βιοχημικές του ιδιότητες διαθέτει ένα δακτύλιο ακρετά μεγάλο ώστε να περικλείει το DNA στο σημείο όπου υπάρχει διπλή θραύση και δε μπορεί να συνδεθεί με άλλο τρόπο: σύμφωνα με έρευνες σε γραμμικά μόρια DNA τα οποία στη συνέχεια μετατράπηκαν σε δακτυλίους, η πρωτεΐνη Ku δε μπορούσε πλέον να απεγκλωβιστεί [84]. Η ασυνήθιστη δομή σε σχήμα γέφυρας του Ku ονομάζεται γέφυρα-β (β-bridge) και, όπως η εσωτερική επιφάνεια που ολοκληρώνει το δακτύλιο, φέρει θετικό φορτίο, συμπληρώνοντας το αρνητικό φορτίο του μορίου DNA [83]. Η πρωτεΐνη Ku έρχεται σε επαφή με τον σκελετό της έλικας χωρίς να συνδέεται ούτε με τις φωσφοσακχαρούχες ομάδες ούτε με τις αζωτούχες βάσεις. Το γεγονός αυτό της επιτρέπει να προσδένεται μη επιλεκτικά ως προς την αλληλουχία βάσεων του DNA [83]. Στη συνέχεια το ετεροδιμερές ολισθαίνει προς τα μέσα, αφήνοντας τα ελεύθερα άκρα του μορίου DNA προσβάσιμα και σε άλλες πρωτεΐνες [75]. Το επόμενο βήμα είναι η επιστράτευση των DNA-PKcs, από τις πρώτες πρωτεΐνες που εμφανίζονται στην περιοχή μετά την πρόσδεση του Ku, οι οποίες πιθανότατα αλληλεπιδρούν με την καρβοξυλομάδα στο άκρο του Ku80 [85]. Κωδικοποιούνται από το γονίδιο PRKDC και αποτελούνται από 4000 ή περισσότερα αμινοξέα, σχηματίζοντας ένα μεγάλο πολυπεπτίδιο [75]. Οι DNA-PKcs αλληλεπιδρούν με την πρωτεΐνη Ku μόνο παρουσία 48

49 DSBs [81], ενώ το σύμπλεγμα DNA-PKcs-Ku-DSBs, κυρίως χάρη στο μεγάλο μέγεθος των DNA-PKcs, βοηθάει στην προστασία των άκρων του DNA από τη δράση των εξωνουκλεασών 17 [75, 81]. Ως κινάση, η DNA-PK έχει ως στόχο τη φωσφορυλίωση και μάλιστα πρώτα από όλα του εαυτού της καθώς αυτοφωσφορυλιώνεται σε περισσότερες από 13 περιοχές [76]. Η αυτοφωσφορυλίωση της DNA-PKcs είναι κομβικό σημείο του μηχανισμού επιδιόρθωσης: η παρουσία αυτού του μεγάλου μορίου με τη μη φωσφορυλιωμένη μορφή του στα άκρα του DNA εμποδίζει αποτελεσματικά την πρόσβαση άλλων πρωτεϊνών, απαραίτητων για τη σύνδεση των DSBs [81, 85]. Η αυτοφωσφορυλίωση φαίνεται ότι αφαιρεί από την DNA-PKcs την ιδιότητα της να δρα ως κινάση και προκαλεί την απεμπλοκή της από το σύμπλεγμα Ku-DNA [75]. Επομένως η αυτοφωσφορυλίωση είναι αναγκαία για την εξέλιξη της διαδικασίας, υπό την προϋπόθεση ότι τοποθετείται κατάλληλα χρονικά και δεν αφήνει απροστάτευτα τα άκρα σε πρόωρη επεξεργασία. Σε αυτή τη φάση της επιδιόρθωσης υπάρχουν από μία Ku και μία DNA- PKcs σε κάθε άκρο της διπλής θραύσης. Τα θραύσματα παραμένουν σε φυσική εγγύτητα ώστε να επιτρέπουν τη δράση ενζύμων για την επανασύνδεση, χωρίς να γνωρίζουμε τον ακριβή μηχανισμό που τα συγκρατεί αλλά ούτε και τις πρωτεΐνες οι οποίες συμβάλλουν σε αυτό [8]. Συνήθως τα θραύσματα που προκύπτουν σε παθολογικές περιπτώσεις (όπως λόγου χάρη από την ιονίζουσα ακτινοβολία) είναι ασύμβατα μεταξύ τους. Οι θραύσεις που προκαλούνται από την ακτινοβολία διακρίνονται από μεγάλη πολυπλοκότητα και παρουσιάζουν σημαντικές διαφορές μεταξύ τους. Ανάλογα με τη φύση της θραύσης, μπορεί να απαιτείται η δράση μιας πληθώρας ενζύμων για την απομάκρυνση τελικών ομάδων (end groups) του μακρομορίου ή κατεστραμμένου DNA, καθώς και την πλήρωση κενών [3]. Κατά συνέπεια, η επανασύνδεση επιβάλλει συχνά τη 17 Είναι ειδικά ένζυμα τα οποία αποκόβουν νουκλεοτίδια, ένα κάθε φορά, από το τέλος μιας πολυνουκλεοτιδικής αλυσίδας. 49

50 συνδυαστική δράση διαφορετικών ομάδων ενζύμων. Επειδή στην NHEJ δεν υπάρχει σημείο αναφοράς, η επεξεργασία του DNA πολύ συχνά καταλήγει σε απώλεια πληροφορίας, ειδικά στις περιοχές των θραυσμάτων [86]. Σε σημεία όπου δεν υπάρχει μικροομολογία σε εκτεταμένες περιοχές γεγονός που αποτελεί και τον κανόνα,συνήθως παρουσιάζεται περίσσεια DNA η οποία πρέπει να αφαιρεθεί από νουκλεάσες. Σε αυτή τη φάση της διαδικασίας συνδράμει η πρωτεΐνη Artemis 18, δημιουργώντας ένα σύμπλοκο μαζί με την DNA-PKcs, in vitro αλλά και in vivo [3, 8]. Χωρίς την παρουσία της DNA-PKcs η Artemis έχει δράση 5-3 εξωνουκλεάσης [85, 87], αλλά βασίζεται στη φωσφορυλίωση από την ATM [85] και την DNA-PKcs για να λειτουργήσει ως ενδονουκλεάση 19 με κατεύθυνση διπλή, και προς 5 και προς 3 [82, 88]. Κατά αυτόν τον τρόπο η DNA-PKcs έχει ρυθμιστικό ρόλο στη δράση της Artemis και επιτρέπει ενζυματικές λειτουργίες καθοριστικές για το μηχανισμό του NHEJ. Πριν την τελική ένωση των δύο θραυσμάτων συχνά υπάρχουν προεξοχές ή μικρά κενά σε μη αμβλέα άκρα (non-blunt ends) 20 τα οποία πρέπει να αποκατασταθούν. Οι πολυμεράσες μ και λ φαίνεται ότι εμπλέκονται σε αυτή τη διαδικασία του μηχανισμού NHEJ [3]. Φυσικά έχουν προταθεί και μηχανιστικά μοντέλα που αντιμετωπίζουν τη δράση των πολυμερασών σε αυτή τη φάση ως μη απαραίτητη, καθώς η Artemis-DNA-PKcs θα μπορούσε πολύ απλά να αποκόπτει τις προεξοχές και έτσι να προκύπτουν 18 H Artemis αναγνωρίστηκε πρώτη φορά σε ασθενείς με βαρεία συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (Severe Combined ImmunoDeficiency, SCID), οι οποίοι αποδείχθηκε ότι έφεραν μετάλλαξη στο γονίδιο που κωδικοποιεί τη συγκεκριμένη πρωτεΐνη. 19 Οι ενδονουκλεάσες είναι ένζυμα τα οποία διασπούν τους φωσφοδιεστερικούς δεσμούς μιας πολυνουκλεοτιδικής αλυσίδας. 20 Το απλούστερο παράδειγμα ενός μη αμβλέος άκρου είναι να περισσεύει ένα νουκλεοτίδιο στη διπλή αλυσίδα: 5'-ATCTGACTA-3' 3'-TAGACTGA-5' 50

51 μόνο (συμβατά) αμβλέα άκρα (blunt ends) [8]. Παρόλα αυτά, έρευνες σε ζύμες έχουν δείξει ότι απενεργοποίηση του γονιδίου της POL4 που αντιστοιχεί στις πολυμεράσες των θηλαστικών προκάλεσε σημαντική αδυναμία επιδιόρθωσης με βάση το μονοπάτι NHEJ [89]. Πλέον η επεξεργασία στα σημεία θραύσης έχει τελειώσει και κάθε κομμάτι του μορίου DNA έχει συμβατά άκρα με τα υπόλοιπα. Το τελικό βήμα είναι η ένωση των θραυσμάτων και η αποκατάσταση της ακεραιότητας των δύο αλυσίδων με τη βοήθεια ειδικών ενζύμων, των DNA-λιγασών (DNA-ligases). Οι λιγάσες έχουν την ιδιότητα να καταλύουν την αντίδραση ένωσης δύο μεγάλων μορίων, σχηματίζοντας ένα νέο χημικό δεσμό. Πρωταρχικό ρόλο σε αυτό το μονοπάτι παίζει το σύμπλοκο XRCC4-DNA ligase IV [75]. Η DNA ligase IV βρέθηκε ότι συμμετέχει ενεργά στο μηχανισμό NHEJ μετά από πειράματα αδρανοποίησης γονιδίων, ενώ οι DNA ligases I και III 21 δεν κατάφεραν να αναπληρώσουν την απουσία της [90]. Η πρωτεΐνη XRCC4 σχηματίζει ένα ομοδιμερές 22 ή ομοτετραμερές και δε φαίνεται να έχει κάποια γνωστή ενζυματική δραστηριότητα, αλλά μάλλον η φυσική του σύνδεση με την DNA ligase IV Μικροομολογία (Microhomology) Ο μηχανισμός της NHEJ μπορεί να αξιοποιήσει την τυχαία μικροομολογία σε περιοχές διπλών ρήξεων. Γενικά η σύναψη των θραυσμάτων είναι δυνατό να συμβεί σε οποιοδήποτε ζεύγος βάσεων, αλλά υπάρχει η τάση να συμβεί σε περιοχές όπου 1-6 νουκλεοτίδια είναι κοινά στα δύο θραύσματα [5, 6]. Για παράδειγμα, έστω ότι έχουμε την αλληλουχία --GATTCGAA και taggactt--, όπου ο αστερίσκος υποδηλώνει το σημείο θραύσης και οι παύλες δείχνουν ότι ο κώδικας συνεχίζεται. Υπάρχει αυξημένη πιθανότητα να γίνει η σύνδεση στο σημείο --GATTCGActt--, δηλαδή να απομακρυνθούν οι βάσεις A,t,a,g. Η χρήση της μικροομολογίας δεν είναι απαραίτητη για την επιδιόρθωση καθώς η αλυσίδα μπορεί να ενωθεί με διάφορους τρόπους [8]. 21 Οι λιγάσες που συναντώνται στα κύτταρα θηλαστικών είναι τρεις, οι DNA ligases I, ΙΙΙ, IV. 22 Ένα διμερές που αποτελείται από δύο πανομοιότυπα μόρια. 51

52 ενισχύει τη δράση της και παράλληλα επιστρατεύει κι άλλες πρωτεΐνες σχετιζόμενες με το μηχανισμό NHEJ [8, 75]. Μια ενδιαφέρουσα ιδιότητα του συμπλόκου DNA ligase - IV/XRCC4 είναι ότι μπορεί να ενώνει κομμάτια της μίας έλικας ενώ η άλλη δεν έχει υποστεί ακόμα επεξεργασία. Αυτό δίνει τη δυνατότητα της ανεξάρτητης επεξεργασίας και ένωσης των δύο αλυσίδων του DNA [3]. 52

53 4.6 Αρχές ανοσοϊστοχημείας και αντισώματα Με τη δημιουργία των διπλών θραύσεων του DNA ξεκινάει σχεδόν αμέσως η φωσφορυλίωση της ιστόνης H2AX στη σερίνη 139, η οποία και σχηματίζει ευδιάκριτες εστίες (foci) στις περιοχές των DSBs [62, 91, 92]. Πολυάριθμες έρευνες έχουν δείξει ότι η γh2ax συνδέεται στενά με τις διπλές θραύσεις και για τον λόγο αυτό αποτελεί έναν αξιόπιστο δείκτη για την ποσοτικοποίηση των βλαβών [62, 91, 93-95]. Με αυτό το σκεπτικό, η απεικόνιση των εστιών φωσφορυλίωσης της ιστόνης παρουσιάζει εξαιρετικό ενδιαφέρον για την ανάλυση της επιδιόρθωσης βλαβών στα κύτταρα. Η απεικόνιση των foci στο μικροσκόπιο γίνεται δυνατή με χρήση προτοκόλλων ανοσοκυτταροχημείας (ανοσοφθορισμός). Οι τεχνικές βασίζονται στην ιδέα αντισωμάτων εξαιρετικά επιλεκτικών σε ορισμένες πρωτεΐνες, συνδεδεμένων με χρωμοφόρες ουσίες. Με τον τρόπο αυτόν τα πρωτεϊνικά αντιγόνα αποκτούν μια φωτεινή ετικέτα και γίνονται ορατά. Εικόνα 4.6.1: Σχηματική αναπαράσταση της άμεσης μεθόδου ανοσοϊστοχημείας. Η απεικόνιση μπορεί να γίνει με δύο βασικές μεθόδους, την άμεση και την έμμεση. Η άμεση μέθοδος περιλαμβάνει τη χρήση ενός μόνο αντισώματος, το οποίο προσδένεται επιλεκτικά στο αντιγόνο και ταυτόχρονα είναι συνδεδεμένο με ένα χρωμοφόρο μόριο. Αντίθετα, στην έμμεση μέθοδο απαιτούνται δύο αντισώματα, ένα για την πρόσδεση στο αντιγόνο και ένα που φέρει τη χρωμοφόρο ουσία και είναι επιλεκτικό στο πρώτο. Τα αντισώματα ονομάζονται πρωτεύον και δευτερεύον αντίστοιχα. Η έμμεση τεχνική είναι περισσότερο δημοφιλής, παρότι πιο πολύπλοκη και χρονοβόρος, καθότι επιτρέπει την ενίσχυση του σήματος, εφόσον υπάρχει η δυνατότητα να προσδεθούν 53

54 περισσότερα από ένα δευτερεύοντα αντισώματα σε κάθε πρωτεύον. Με τον τρόπο αυτόν αυξάνεται και η ευαισθησία της μεθόδου. Εικόνα 4.6.2: Σχηματική αναπαράσταση της έμμεσης μεθόδου. Στην παρούσα εργασία ακολουθήθηκε η δεύτερη μέθοδος, δηλαδή έμμεσος ανοσοφθορισμός. Το πρωτεύον αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε είναι μονοκλωνικό, με ισότυπο IgG και ξενιστή κόνικλο. Το δευτερεύον αντίσωμα πρέπει να έχει αντίθετο IgG σε σχέση με το είδος του ξενιστή του πρωτεύοντος, στην προκειμένη περίπτωση λοιπόν πρέπει να είναι anti-rabbit. Έχει αναπτυχθεί σε αίγα και φέρει χρωμοφόρο μόριο Rhodamine Red. Αυτή η φθορίζουσα ουσία έχει κορυφή απορρόφησης στα ~560 nm και εκπομπής στα ~580 nm, σύμφωνα με τον κατασκευαστή. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκαν τα φίλτρα εκπομπής και απορρόφησης Texas Red του μικροσκοπίου φθορισμού. Αντισώματα Τα αντισώματα γενικά έχουν μορφή που μοιάζει με Υ και αποτελούνται από 4 πολυπεπτιδικές αλυσίδες: δύο όμοιες μεγάλες βαριές (μπλε στην εικόνα) και δύο όμοιες μικρότερες που ονομάζονται ελαφριές (πράσινες). Όλες μαζί αποτελούν ως μονομερές τη βασική δομική μονάδα του αντισώματος, την ανοσοσφαιρίνη (Ig, immunoglobulin). Ο τύπος της βαριάς αλυσίδας καθορίζει και την κλάση στην οποία κατατάσσεται το αντίσωμα με βάση την Ig. Οι διάφοροι τύποι ονομάζονται ισότυπα και στον άνθρωπο συναντώνται 5 διαφορετικά: IgA, IgD, IgG, IgE, IgM. 54

55 Εικόνα 4.6.3: Τα φάσματα εκπομπής και απορρόφησης της χρωμοφόρου ουσίας Rhodamine Red. Αριστερά διακρίνεται το φάσμα απορρόφησης και δεξιά το φάσμα εκπομπής. (εικόνα από τον ιστότοπο του κατασκευαστή 55

56 4.7 Τα καρκινικά κύτταρα MCF7 Εικόνα 4.7.1: Κύτταρα MCF7 αναπτυσσόμενα σε τρυβλίο, εικόνα από ανάστροφο μικροσκόπιο. (Πηγή: primary-cell-cultures/cell-models-mcf7- cells.html) Τα MCF7 απομονώθηκαν με επιτυχία το 1970 από μία ασθενή με καρκίνο του στήθους [96]. Είναι επιθηλιακά κύτταρα τα οποία έχουν εξαχθεί από το πλευρικό εξίδρωμα 23 [96]. Συνήθως οι μεταφάσεις των MCF7 παρουσιάζουν σημαντικές διαφοροποιήσεις στον αριθμό χρωμοσωμάτων, ο οποίος κυμαίνεται από 66 έως 87 (σύμφωνα με την ATCC), σε αντιδιαστολή με τα φυσιολογικά που είναι 46. Ο καρυότυπος αυτής της σειράς κυττάρων εμφανίζει διάφορες αριθμητικές και μορφολογικές ανωμαλίες [97], μία από τις οποίες είναι τα πολλαπλά χρωμοσώματα marker 24 [97, 98]. Έχει παρατηρηθεί ότι η σειρά υποβάλλεται αυθόρμητα σε γενετικές παραλλαγές με το πέρασμα του χρόνου και των ανακαλλιεργιών, καθώς οι καρυότυποι που έχουν γίνει κατά καιρούς δείχνουν σημαντικές διαφοροποιήσεις μεταξύ τους [98]. Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι η σειρά μπορεί να διασπαστεί με βάση την πυκνότητα σε διαφορετικούς υποπληθυσμούς οι οποίοι εμφανίζουν ξεχωριστές ιδιότητες [98]. Δύο από αυτούς αναφέρεται ότι αποτελούνται από βλαστικά κύτταρα [96, ], καθώς μεγάλωναν εξαιρετικά γρήγορα και είχαν τη δυνατότητα να παράξουν όλους τους άλλους υποπληθυσμούς. 23 Περίσσεια υγρού που συσσωρεύεται μεταξύ των δύο πλευρικών στιβάδων, δηλαδή του χώρου που περιβάλλει τους πνεύμονες. 24 Μορφολογικά ανώμαλο χρωμόσωμα, το οποίο δε μπορεί να ταυτοποιηθεί με τη χρώση. Ανάλογα με το γενετικό υλικό που περιέχει, μπορεί να έχει και μικρή ή μεγάλη σημασία. 56

57 4.8 Ο χημικός αναστολέας NU7026 Ο NU7026 (2-(morpholin-4-yl)-benzo[h]chomen-4-one) είναι ένα μικρό μόριο στο Εικόνα Μοριακός τύπος: C 17 H 15 NO 3 οποίο η κυτταρική μεμβράνη είναι διαπερατή. Αναστέλλει τη λειτουργία της DNA-PKcs ανταγωνιζόμενος την πρόσδεση της ΑΤΡ στην καταλυτική υπομονάδα [101], εμποδίζοντας με αυτόν τον τρόπο την αυτοφωσφορυλίωση και στη συνέχεια την φωσφορυλίωση. Ο συγκεκριμένος αναστολέας είναι εξαιρετικά επιλεκτικός στην DNA-PK και ανενεργός στις ATM και ATR[ ], σε αντίθεση με την Wortmannin, έναν αναστολέα για όλες τις κινάσες που ανήκουν στην ομάδα των PI3Ks [101]. Εικόνα 4.8.2: Η γενική ιδέα της ανταγωνιστικής αναστολής σε σχηματική απόδοση. Στον επόμενο πίνακα παρουσιάζεται η επιλεκτική δράση του NU7026 για την DNA-PK. Το IC 50 (half maximal inhibitory concentration) αποτελεί ένα μέτρο της 57

58 αποτελεσματικότητας της ανασταλτικής ικανότητας μιας ουσίας και είναι η συγκέντρωση του αναστολέα που απαιτείται για να επιτευχθεί η μείωση της δράσης μιας βιολογικής/βιοχημικής διαδικασίας στο μισό. Πρωτεΐνες NU7026 IC 50 ( M ) 50 Wortmannin IC (μm) DNA-PK PI 3-K ATM > ATR > Πίνακας Σύγκριση Wortmannin και NU7026 όσον αφορά στην επιλεκτικότητα των πρωτεϊνών της οικογένειας ΡΙΚΚ. Πίκανας από το άρθρο των Veuger et al., Είναι εμφανές ότι η Wortmannin χρειάζεται πολύ μικρότερες συγκεντρώσεις για να αναστείλει περισσότερες πρωτεΐνες. Αντίθετα, η μεγάλη επιλεκτικότητα του NU7026 τον καθιστά κατάλληλο για συνδυασμούς με άλλους επιλεκτικούς αναστολείς, οι οποίοι παρεμποδίζουν διαφορετικά μονοπάτια επιδιορθώσεων. Συγκεκριμένα οι Veuger et al. χρησιμοποίησαν τον NU7026 μαζί με αναστολέα της PARP-1 25 με δράση η οποία φαίνεται να είναι προσθετική όσον αφορά στην επιδιόρθωση βλαβών στο DNA [101, 102]. Επομένως συνδυάζοντας την ακτινοβόληση ή όποιαν άλλη θεραπεία προκαλεί διπλές θραύσεις με DNA-PK και άλλους αναστολείς πιθανότατα θα ενισχύσει την αποτελεσματικότητα της θεραπείας απέναντι στον καρκίνο [104]. Φυσικά η επιδιόρθωση των βλαβών πιστεύεται ότι είναι πολύ πιο αποτελεσματική στα πλαίσια ενός οργανισμού, όπου τα κύτταρα βρίσκονται σε διαρκή αλληλεπίδραση με άλλα κύτταρα και ουσίες του σώματος, σε αντιδιαστολή με τα κύτταρα και τους ιστούς που μελετώνται in vitro στο εργαστήριο [105]. Η διαφορά αυτή φαίνεται έντονα σε πειράματα που έχουν 25 Η πρωτεΐνη PARP-1 (poly (ADP-ribose) polymerase-1) εμπλέκεται στην επιδιόρθωση μονόκλωνων βλαβών (SSBs) αλλά και σε συνδυασμό ή/και συμπληρωματικά με την πρωτεΐνη BRCA. 58

59 γίνει in vivo σε μυς, τα οποία δείχνουν ότι ο αναστολέας NU7026 μεταβολίζεται γρήγορα από τον οργανισμό, επομένως θα πρέπει να βρεθεί ένα διαφορετικό σύστημα χορήγησης σε σχέση με την in vitro διαδικασία [104]. 59

60 5 Υλικά και μέθοδοι 5.1 Καλλιέργεια κυττάρων Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε η καρκινική σειρά MCF7 (ευγενική παροχή του ΙΠΡΕΤΕΑ, ΕΚΕΦΕ Δημόκριτος ). Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 o C και 5% CO 2 σε επωαστικό κλίβανο (incubator ThermoForma) και καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό υλικό (medium) DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Biochrom AG). Το θρεπτικό υλικό εμπλουτίζεται με 10% FBS (Fetal Bovine Serum), 1% L-Glutamine 1% Penicillin/Streptomycin. Η ανακαλλιέργεια γινόταν σε θάλαμο κάθετης νηματικής ροής (Bioair Safemate 1.2), αφήνοντας τα κύτταρα να επωαστούν σε διάλυμα θρυψίνης/edta (Biochrom AG) στους 37 o C για ~15-20 λεπτά, αφού προηγείτο ξέπλυμα με PBS Dulbecco (Phosphate Buffered Saline με MgCl 2 και CaCl 2, liquid, sterile-filtered, Biochrom AG). Χρησιμοποιήθηκαν φιάλες Τ cm (Cellstar greiner bio-one) για την ανακαλλιέργεια κυττάρων που είχαν καλύψει ~80% της επιφάνειας. 5.2 Ψύξη και απόψυξη Για την ψύξη, τα κύτταρα συλλέγονται σε δοκιμαστικούς σωλήνες, αφού πρώτα έχουν αποκολληθεί με τη βοήθεια της τρυψίνης, και υπόκεινται σε φυγοκέντριση για 5 λεπτά στις 1300 rpm (Universal 32R Hettich). Με το πέρας της φυγοκέντρισης, τα κύτταρα βρίσκονται σε μορφή ιζήματος στον πυθμένα του σωλήνα. Αφαιρείται το θρεπτικό υλικό πάνω από το ίζημα με τη βοήθεια πιπέτας (Gilson) και στη συνέχεια προστίθεται 1 ml διαλύματος ψύξης (10% dimethylsulfoxide, DMSO σε FBS, fetal bovine serum). Κάθε ml διαλύματος (κυττάρων και DMSO) μεταφέρεται σε κρυοάντοχα φιαλίδια χωρητικότητας 2 ml (Orange Scientific). Τα φιαλίδια αποθηκεύονται αρχικά στους 4 o C μέχρι να παγώσουν, στη συνέχεια στους 20 o C για 4 ώρες, στους 80 o C για περίπου 12 ώρες και τελικά στο υγρό άζωτο επ αόριστον. 60

61 Για την απόψυξη, τα φιαλίδια με τα κύτταρα μεταφέρονται από το υγρό άζωτο στο θάλαμο επώασης για 1-2 λεπτά, μέχρι να ξεπαγώσουν εντελώς. Στη συνέχεια προστίθεται μια μικρή ποσότητα θρεπτικού υλικού και συνεχίζει κανονικά η επώαση σε φιάλες ή τρυβλία. 5.3 Δοκιμασία βιωσιμότητας με χρήση αιματοκυτταρομέτρου (trypan blue viability test) Τα κύτταρα αποκολλώνται από την επιφάνεια της φιάλης πάνω στην οποία πολλαπλασιάζονται με τον τρόπο που περιγράφηκε προηγουμένως. Γίνεται μία αραίωση 1:1 μεταξύ του διαλύματος των κυττάρων και της χρώσης trypan blue. H trypan blue χρωματίζει μπλε τα νεκρά κύτταρα επιλεκτικά, γιατί μπορεί να διαπεράσει τη μεμβράνη τους, σε αντίθεση με τα ζωντανά. Για τη μέτρηση χρησιμοποιείται μια ειδική γυάλινη πλάκα, το αιματοκυτταρόμετρο (Neubauer Improved mm 2, Marienfeld), πάνω στην οποία τοποθετείται μικρή καλυπτρίδα. Με χρήση μικροπιπέτας εισάγεται διάλυμα κυττάρων ~10 μl μεταξύ της καλυπτρίδας και της πλάκας, στα δύο ειδικά διαμερίσματα της δεύτερης. Στη συνέχεια γίνεται μέτρηση σε κάθε κάμαρα του αιματοκυτταρόμετρου και προκύπτει το ποσοστό των νεκρών κυττάρων προς το σύνολο. 5.4 Παρασκευή διαλύματος του αναστολέα NU7026 και εισαγωγή στις καλλιέργειες Ο NU7026 (Sigma-Aldrich, Inc.) διαλύθηκε σε DMSO σε αναλογία 3 mg/ml με ταυτόχρονη θέρμανση στους 60 o C σε υδατόλουτρο, σύμφωνα με τις οδηγίες του προμηθευτή. Στη συνέχεια δημιουργήθηκε ένα δεύτερο απόθεμα συγκέντρωσης 1 mμ για χρήση στις καλλιέργειες και διατηρήθηκε στους 20 o C. Η τελική συγκέντρωση στο θρεπτικό υλικό ήταν 10 μμ, η οποία έχει χαρακτηριστεί ως βέλτιστη [103, 106]. Σε κάθε φιάλη του πειράματος που δεν περιείχε τον αναστολέα προστέθηκε ο διαλύτης DMSO σε ποσοστό 1%. Τα κύτταρα 61

62 επωάστηκαν για 24 ώρες παρουσία του αναστολέα και στη συνέχεια ακτινοβολήθηκαν. 5.5 Συνθήκες ακτινοβόλησης Τα κύτταρα έλαβαν συνολική δόση 1 Gy (0.48 Gy/min) από πηγή κοβαλτίου-60 ( 60 Co) Gamma Cell 220 Irradiator (Atomic Energy of Canada Ltd, Ottawa, Canada, Ιανουαρίου 1974) σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια τα κύτταρα προετοιμάστηκαν για κυτταρογενετική ανάλυση ή ανοσοφθορισμό. 5.6 Προετοιμασία των δειγμάτων για κυτταρογενετική ανάλυση Αμέσως μετά την ακτινοβόληση προστέθηκε καφεΐνη (4 mm) σε δύο φιάλες από τις έξι συνολικά και όλα τα κύτταρα τοποθετήθηκαν στον κλίβανο για 20 λεπτά, σύμφωνα με το πρωτόκολλο των Pantelias & Terzoudi [107]. Εικόνα Σχηματική αναπαράσταση των διαφορετικών σημείων του πειράματος. Μετά την πάροδο των 20 λεπτών προστέθηκε σε όλες τις φιάλες η ουσία colcemid, η οποία συλλαμβάνει τα κύτταρα στη μετάφαση και δεν τους επιτρέπει να προχωρήσουν στον κυτταρικό κύκλο. Χρησιμοποιήθηκαν 10 μl ανά ml θρεπτικού 62

63 υλικού και τα κύτταρα αφέθηκαν στον επωαστικό κλίβανο για ~2 ώρες, ενώ ταυτόχρονα γινόταν έλεγχος των μεταφασικών κυττάρων στο ανάστροφο μικροσκόπιο ανά τακτά χρονικά διαστήματα. Όταν ο αριθμός μεταφάσεων κρίνεται ικανοποιητικός, το υπερκείμενο των φιαλών αποθηκεύεται σε δοκιμαστικούς σωλήνες που αντιστοιχούν σε κάθε σημείο του πειράματος, ώστε να συλλεχθούν και τα κύτταρα που δεν είναι προσκολλημένα. Προστίθεται PBS στις καλλιέργειες και μετά την αποθήκευση αυτού στους δοκιμαστικούς σωλήνες, ακολουθεί διάλυμα τρυψίνης/edta (0,05% / 0,02 % σε PBS χωρίς Ca 2+, Mg 2+, Biochrom AG) για ~20 λεπτά. Αφού τα κύτταρα αποκολληθούν, αναμιγνύονται με το περιεχόμενο των δοκιμαστικών σωλήνων και φυγοκεντρούνται για 7 λεπτά στις 1300 rpm. Τα κύτταρα βρίσκονται στο τέλος του σωλήνα σε μορφή ιζήματος και το υπερκείμενο απορρίπτεται. Ακολουθεί ήπια ανάδευση ώστε να διαλυθεί το δισκίο που έχει σχηματιστεί από τα κύτταρα και προστίθεται υπότονο διάλυμα KCl 0.75 M. Στη συνέχεια γίνεται δεύτερη φυγοκέντριση για άλλα 7 λεπτά, ακολουθούμενη από ήπια ανάδευση και σταδιακή προσθήκη οξικού οξέος (CH 3 COOH) και μεθανόλης (CH 3 OH) σε αναλογία 1:3 (fixative). Γίνεται τρίτη φυγοκέντριση με τις ίδιες παραμέτρους και επαναλαμβάνεται για δεύτερη φορά η διαδικασία μονιμοποίησης. Στη συνέχεια δημιουργείται πάνω σε κάθε αντικειμενοφόρο πλάκα ένα λεπτό φιλμ απεσταγμένου νερού με τη βοήθεια διηθητικού χαρτιού. Από το διάλυμα των μονιμοποιημένων κυττάρων αντλούνται για κάθε πλακάκι δύο σταγόνες ~20 μl έκαστη. Τα δείγματα αφήνονται να στεγνώσουν. Για τη χρώση παρασκευάζεται διάλυμα 1.5 ml Giemsa (Merck) σε ~50 ml του ρυθμιστικού διαλύματος Sörensen και μέσα σε αυτό εμβαπτίζονται οι πλάκες για 7 λεπτά. Κατόπιν γίνεται ξέπλυμα σε τρεχούμενο νερό και στιγμιαία εμβάπτιση σε dh 2 O. Τα πλακίδια αφήνονται να στεγνώσουν κάθετα και με κλίση. 63

64 Όταν οι αντικειμενοφόροι πλάκες έχουν στεγνώσει εντελώς, τοποθετούνται γυάλινες καλυπτρίδες (Knittel Glaser Germany) οι οποίες στερεοποιούνται στη θέση τους με δύο σταγόνες κόλλας Entellan (Merck). Τέλος τα πλακίδια μελετώνται στο οπτικό μικροσκόπιο (Zeiss Axioscope) με τη βοήθεια του λογισμικού επεξεργασίας εικόνας Ikaros (Metasystems). NU7026 IR 1 Gy Colcemid 24 h 20 min 2.5 h Caffeine μονιμοποίηση Εικόνα 5.6.2: Σχηματική αναπαράσταση της διαδικασίας που ακολουθήθηκε πριν την ανάλυση των χρωμοσωμάτων. 5.7 Προετοιμασία των δειγμάτων για έμμεσο ανοσοφθορισμό Αρχικά γίνεται προετοιμασία των γυάλινων αντικειμενοφόρων πλακών πάνω στις οποίες θα αναπτυχθούν προσκολλημένα τα κύτταρα MCF7. Με υδρόφοβο μελάνι (Liquid Blocker super pap pen) δημιουργούνται κυκλικές περιοχές στα πλακίδια, οι οποίες οριοθετούν την ανάπτυξη των κυττάρων. Στη συνέχεια τα πλακίδια αποστειρώνονται, εμβαπτιζόμενα σε 100% αιθανόλη (CH 3 CH 2 OH) για τουλάχιστον 24 ώρες. Αφού στεγνώσουν σε στείρες συνθήκες, τοποθετούνται μέσα σε τρυβλία (Cellstar greiner bio-one) και στην κεντρική περιοχή αφήνονται ~200 μl διαλύματος κυττάρων σε θρεπτικό υλικό. Μετά από αρκετές ώρες, αφού αυτά προσκολληθούν εντελώς στα πλακίδια, συμπληρώνεται θρεπτικό υλικό DMEM ~10 ml σε κάθε τρυβλίο. Τα κύτταρα αφήνονται στον κλίβανο για επώαση και είναι κατάλληλα για τη δοκιμή όταν έχουν φτάσει σε πυκνότητα 60-80%. Μετά 64