της φοιτήτριας του Τµήµατος Ηλεκτρολόγων Μηχανικών και Τεχνολογίας Υπολογιστών της Πολυτεχνικής Σχολής του Πανεπιστηµίου Πατρών

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΗΛΕΚΤΡΟΛΟΓΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΥΠΟΛΟΓΙΣΤΩΝ ΤΟΜΕΑΣ: ΤΗΛΕΠΙΚΟΙΝΩΝΙΩΝ ΚΑΙ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΕΝΣΥΡΜΑΤΗΣ ΤΗΛΕΠΙΚΟΙΝΩΝΙΑΣ ιπλωµατική Εργασία της φοιτήτριας του Τµήµατος Ηλεκτρολόγων Μηχανικών και Τεχνολογίας Υπολογιστών της Πολυτεχνικής Σχολής του Πανεπιστηµίου Πατρών Ντάλλα Μαρίας του Χαραλάµπους Αριθµός Μητρώου: 6333 Θέµα «Εφαρµογή του αλγορίθµου BLAST στην αναγνώριση µεταλλάξεων γονιδιακών ακολουθιών» Επιβλέπων Αναπληρωτής Καθηγητής κ. Ευάγγελος ερµατάς Αριθµός ιπλωµατικής Εργασίας: Πάτρα, Ιούνιος

2 2

3 ΠΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ Πιστοποιείται ότι η ιπλωµατική Εργασία µε θέµα «Εφαρµογή του αλγορίθµου BLAST στην αναγνώριση µεταλλάξεων γονιδιακών ακολουθιών» Της φοιτήτριας του Τµήµατος Ηλεκτρολόγων Μηχανικών και Τεχνολογίας Υπολογιστών Ντάλλα Μαρίας του Χαραλάµπους Αριθµός Μητρώου: 6333 Παρουσιάστηκε δηµόσια και εξετάστηκε στο Τµήµα Ηλεκτρολόγων Μηχανικών και Τεχνολογίας Υπολογιστών στις.../../ Ο Επιβλέπων Ο ιευθυντής του Τοµέα Ε. ερµατάς Ν. Φακωτάκης Αναπληρωτής Καθηγητής Καθηγητής 3

4 4

5 Αριθµός ιπλωµατικής Εργασίας: Θέµα: «Εφαρμογή του αλγορίθμου BLAST στην αναγνώριση μεταλλάξεων γονιδιακών ακολουθιών» Φοιτήτρια: Ντάλλα Μαρία Επιβλέπων: ερµατάς Ευάγγελος Περίληψη Το πρόβληµα της ευθυγράµµισης βιολογικών ακολουθιών, δηλαδή πρωτεϊνών και γονιδιακών ακολουθιών, είναι από τα πιο απαιτητικά στην επίλυση και ταυτόχρονα πιο εφαρµόσιµα προβλήµατα που σχετίζονται µε την επιστήµη της βιοπληροφορικής. Από την ευθυγράµµιση βιολογικών ακολουθιών προκύπτει ένας σηµαντικός όγκος πληροφορίας που δίνει απαντήσεις σε εξελικτικά ερωτήµατα αλλά, κυρίως, βρίσκει εφαρµογή σε πληθώρα τοµέων, όπως η διάγνωση και η θεραπεία ασθενειών. Πρόκειται για ένα θέµα που τράβηξε την προσοχή της παγκόσµιας κοινότητας της πληροφορικής µόλις στο δεύτερο µισό του περασµένου αιώνα, εποµένως είναι ένα πεδίο µε αρκετό χώρο για έρευνα. Στην παρούσα εργασία, αφού δοθεί το απαραίτητο βιολογικό υπόβαθρο, παρουσιάζονται αρχικά οι βασικότεροι αλγόριθµοι που έχουν παρουσιαστεί µέχρι τώρα ως προτάσεις για την εκτέλεση ευθυγραµµίσεων, εξηγούνται οι βασικές δοµικές και λειτουργικές διαφορές τους και δίνεται µια πρώτη εκτίµηση της αποτελεσµατικότητάς τους, όπως αυτή αντλείται από τη βιβλιογραφία. Στη συνέχεια, το ενδιαφέρον επικεντρώνεται στον αλγόριθµο τοπικής ευθυγράµµισης BLAST. Αναλύεται η λειτουργία του βήµα προς βήµα, παρουσιάζονται οι κυριότερες εκδόσεις του, οι είσοδοι και οι έξοδοί του καθώς και το µαθηµατικό υπόβαθρο στο οποίο βασίζεται η υλοποίησή του. Στόχος του πειραµατικού τµήµατος της εργασίας είναι να εξετάσει κατά πόσο ο BLAST επιτυγχάνει να ταυτοποιήσει, και µε τι σφάλµα, µια µεταλλαγµένη ακολουθία, τόσο ως προς το γονίδιο από το οποίο προέρχεται όσο και ως προς το είδος της και τις πιθανές 5

6 της συνέπειες στον οργανισµό στον οποίο εκφράζεται. Με βάση το γονίδιο BRCA1 του Homo Sapiens, παράγεται µια σειρά µεταλλάξεων, οι οποίες µεταφράζονται. Το σύνολο των παραγοµένων βιολογικών ακολουθιών, νουκλεοτιδιακών και αµινοξεϊκών, τίθεται προς αναζήτηση µε χρήση του BLAST σε κατάλληλες βάσεις δεδοµένων, προκειµένου να ελεγχθεί η ευαισθησία του σε µεταλλάξεις διαφορετικού τύπου και έκτασης. Αποδεικνύεται ότι παρότι ο BLAST επιτυγχάνει µε πολύ µικρό σφάλµα την ταυτοποίηση του γονιδίου, ακόµα και σε περιπτώσεις έντονης µετάλλαξης της αρχικής ακολουθίας, ωστόσο η κατανοµή των αποτελεσµάτων είναι πολύ πιο ασαφής ως προς την ταυτοποίηση του είδους της µετάλλαξης. 6

7 Thesis Title «Application of the BLAST Algorithm in the Recognition of Mutations in Biological Sequences» Student Ntalla Maria Supervisor Dermatas Evangelos Abstract The goal of the present thesis is the examination of the sensitivity of the local alignment algorithm BLAST, on a set of mutated biological sequences. The algorithm's sensitivity is to be measured with regard to three basic criteria: identification of the relation to the original gene identification of the mutation type prediction of possible influence of the organism in question In the first, theoretical part of the thesis, a general biological background is offered, followed by a sufficient presentation on both the history and the latest achievements in the field of sequence alignment. The main topic introduced is the structure and functionality of BLAST, together with its principal editions, its inputs and outputs and the mathematical foundation standing below it. In the experimental part of the thesis, the BRCA1 gene is picked out of the Homo Sapiens Genome; its sequence suffers a number of mutations of different type and extent. Each produced mutation is translated into the corresponding protein. The entire set of biological sequences produced is going through a BLAST Search to test the sensitivity of the algorithm according to the mutation under examination. Analyzing the results, it is safe to claim that BLAST succeeds to recognize the gene from which the mutated sequences are produced, including extremely low error in the process. On the other hand, the identification of the mutation type is certainly of significantly lower sensitivity. Thus the main proposal extracted is the implementation of a patterns recognition system, which will integrate artificial intelligence methods to connect patterns encountered within the input sequence, with diseases reported in the appropriate documentation. 7

8 8

9 Ευχαριστίες Το κείµενο που κρατάτε στα χέρια σας δεν αποτελεί µόνο την τεκµηρίωση της διπλωµατικής µου εργασίας, αλλά και το τελευταίο µου βήµα στην πορεία των σπουδών µου, γεγονός που µου δηµιουργεί έντονη την ανάγκη να ευχαριστήσω ορισµένους ανθρώπους µε τους οποίους έχω συνδέσει τα τελευταία 6 χρόνια. Θα ήθελα να ευχαριστήσω ειλικρινά τον επιβλέποντά µου, κ. Ευάγγελο ερµατά, για την ευκαιρία που µου έδωσε να ασχοληθώ µε ένα αντικείµενο του άµεσου ενδιαφέροντός µου, υποστηρίζοντας και καθοδηγώντας µε καθ' όλη τη διάρκεια εκπόνησης της εργασίας. Οι συµβουλές του σε θέµατα τόσο ακαδηµαϊκά όσο και γενικότερης φύσεως, κυρίως στάσης και φιλοσοφίας απέναντι στα µεγάλα επόµενα βήµατα, ήταν παραπάνω από πολύτιµες. Ευχαριστώ πολύ τους φίλους µου από το BEST, τόσο Έλληνες όσο και από το εξωτερικό, για µια συναρπαστική πορεία 4 χρόνων γεµάτη συγκινήσεις, µεγάλα µαθήµατα, σκληρή δουλειά και αξέχαστες στιγµές 4 χρόνια γεµάτα από εµπειρίες ζωής. εν θα µπορούσα να µην ευχαριστήσω τα αδέλφια µου τους αγαπηµένους µου φίλους, χωρίς τους οποίους τα τελευταία 6 χρόνια σίγουρα δεν θα ήταν τα ίδια. Η πορεία µας ήταν γεµάτη από γέλιο, λύπη, όµορφες και δύσκολες στιγµές όµως ήταν πάντα κοινή και αυτό έδινε και θα δίνει δύναµη σε όλους µας. Τέλος, δεν µπορώ να µην απευθύνω το µεγαλύτερο ευχαριστώ, από τα βάθη της καρδιάς µου, στην αγαπηµένη µου οικογένεια, που που όχι µόνο µε στήριξε σε όλη αυτήν την πορεία ανιδιοτελώς αλλά κυρίως αποτέλεσε για µένα πρότυπο, βάση για κάθε µου ξεκίνηµα και θερµό υποστηρικτή κάθε µου ιδέας και προσπάθειας. 9

10 10

11 Πίνακας Περιεχομένων Κεφάλαιο 1 Βιολογικό Υπόβαθρο οµή, Οργάνωση και Έκφραση της Γονιδιακής Πληροφορίας Μεταλλάξεις Κεφάλαιο 2 Υπολογιστικό Υπόβαθρο Το πρόβληµα της ευθυγράµµισης βιολογικών ακολουθιών Ευθυγράµµιση - οι πρώτες προτάσεις Ευριστικές µέθοδοι : FASTA, BLAST Ο αλγόριθµος FASTA Ο αλγόριθµος BLAST Στατιστικές Παράµετροι και Παράµετροι Αναζήτησης Εκδόσεις του BLAST Basic BLAST Specialized BLAST Accelerated Versions Σύνοψη Κεφάλαιο 3 Πειραµατικά εδοµένα Βάσεις δεδοµένων βιολογικών ακολουθιών Βάσεις εδοµένων Γονιδιακών Ακολουθιών Βάσεις εδοµένων Γονιδιωµάτων Οργανισµών Βάσεις εδοµένων Πρωτεϊνικών Ακολουθιών Η µηχανή αναζήτησης Entrez Βάσεις δεδοµένων µεταλλαγµένων γονιδιακών ακολουθιών Το γονίδιο BRCA Κεφάλαιο 4 Εφαρµογή του BLAST σε δεδοµένα Εκτέλεση του BLAST και Έξοδοι Το Πρόβληµα της Αναγνώρισης Μεταλλάξεων: Βασικά Ζητήµατα Πειραµατική ιαδικασία Σειρά Πειραµάτων Αποτελέσµατα Ερµηνεία

12 4.4 Σύνοψη - Προτάσεις για µελλοντική έρευνα Βιβλιογραφία Παράρτηµα Α Πειραµατικά Αποτελέσµατα Παράρτηµα Β Κώδικας

13 1 Βιολογικό Υπόβαθρο Η δοµή και η λειτουργία οποιασδήποτε βιολογικής δοµής βρίσκεται ισχυρά χαραγµένη στο γενετικό του υλικό. Το γενετικό υλικό µπορεί να είναι είτε DNA είτε RNA και περιέχει κωδικοποιηµένη όλη την απαραίτητη πληροφορία που απαιτείται για τον σχηµατισµό των χαρακτηριστικών του οργανισµού, καθώς και την παραγωγή των ουσιών που του είναι απαραίτητες για την επιβίωση και τις επιµέρους απαραίτητες λειτουργίες του. 1.1 Δομή, Οργάνωση και Έκφραση της Γονιδιακής Πληροφορίας Παρά την τεράστια σηµασία που φέρει για τη ζωή, η γενετική πληροφορία κωδικοποιείται µέσω ενός αλφαβήτου που περιέχει µόλις 4 γράµµατα: τις αζωτούχες βάσεις αδενίνη (Α), θυµίνη (Τ) (στο RNA αντικαθίσταται από την ουρακίλη U), γουανίνη (G) και κυτοσίνη (C). Το DNA έχει τη µορφή της διπλής έλικας, για τον σχηµατισµό της οποίας οι βάσεις ζευγαρώνουν ως εξής: η Α µε την Τ και η G µε την C. Τo RNA, σε αντίθεση µε το DNA σχηµατίζει µονή έλικα, ωστόσο η συµπληρωµατικότητα ισχύει (µε την U να αντικαθιστά την Τ του DNA), για τις λειτουργίες στις οποίες συµµετέχει το γενετικό υλικό (αντιγραφή, µεταγραφή και µετάφραση). Οι αλληλουχίες των αζωτούχων βάσεων που κωδικοποιούν κάποια πρωτεΐνη ονοµάζονται γονίδια. Το σύνολο των γονιδίων ενός οργανισµού αποτελεί το γονιδίωµά του. Το γενετικό υλικό, το οποίο αποτελείται σε ένα ποσοστό από γονίδια και σε ένα 13

14 πολύ µεγαλύτερο ποσοστό από αλληλουχίες βάσεων που, έως σήµερα τουλάχιστον, δεν φέρουν κάποια αποδεδειγµένη λειτουργικότητα 1, εµφανίζεται στους ευκαρυωτικούς οργανισµούς σε µορφή διπλής έλικας, η οποία περιστρέφεται γύρω από τον εαυτό της και συµπιέζεται προκειµένου να εξοικονοµηθεί χώρος κατά την αποθήκευσή της. Το γενετικό υλικό δοµείται περαιτέρω σε χρωµοσώµατα, ο αριθµός και το µέγεθος των οποίων ποικίλει, ανάλογα µε την πολυπλοκότητα του οργανισµού. Συναντώνται σε ζεύγη σε κάθε ζεύγος, τα 2 χρωµοσώµατα (καθένα προερχόµενο από έναν γονέα) περιέχουν στις ίδιες θέσεις γονίδια που ρυθµίζουν το ίδιο χαρακτηριστικό ή λειτουργία, και ονοµάζονται άλληλα. Τα άλληλα γονίδια δεν ρυθµίζουν απαραίτητα µε τον ίδιο τρόπο το χαρακτηριστικό στο οποίο αντιστοιχούν. Επιπλέον, σύµφωνα µε τον Mendel, δεν επιδρούν εξίσου στη ρύθµιση, καθώς υπάρχουν σχέσεις επικράτειας µεταξύ αλλήλων γονιδίων. "Προβληµατικά" γονίδια που επικρατούν µερικώς ή ολικώς απέναντι σε "υγιή" άλληλά τους, είναι η αιτία των ασθενειών που οφείλονται σε γενετικά αίτια. Εικόνα 1: Οργάνωση του γενετικού υλικού σε γονίδια και χρωµοσώµατα 1 Το µήκος που καλύπτουν τα γονίδια, δηλαδή το "χρήσιµο" γενετικό υλικό, είναι ελάχιστο συγκριτικά µε το συνολικό µέγεθος του γενετικού υλικού ενός οργανισµού. Περίπου το 95% του ανθρώπινου DNA δεν κωδικοποιεί τίποτα απολύτως και είναι γνωστό ως trash DNA. Πιθανολογείται ότι πρόκειται για υλικό που σε παλαιότερα στάδια της εξέλιξης εµφάνιζε λειτουργικότητα, µε την πάροδο όµως των αιώνων αχρηστεύθηκε. Πηγή: 14

15 Αντιγραφή: Η αναπαραγωγή των γίνεται µε διαίρεσή τους, κατά την οποία καθένα από τα 2 νέα κύτταρα που προκύπτουν έχει πανοµοιότυπο γενετικό υλικό µε το άλλο. Για την αντιγραφή γίνεται αρχικά διάνοιξη της διπλής έλικας και έπειτα ειδικά ένζυµα προσκολλούνται στην µία πλευρά και σχηµατίζουν την απέναντί της, βάζοντας απέναντι σε κάθε βάση την αντίστοιχή της συµπληρωµατική. Έτσι τελικά, έχουµε 2 πανοµοιότυπες διπλές αλυσίδες, καθεµία από τις οποίες θα µεταβιβαστεί σε ένα από τα 2 κύτταρα που θα προκύψουν µετά την διαίρεση. Μεταγραφή: Στο γενετικό υλικό βρίσκεται κωδικοποιηµένη η πληροφορία για τον σχηµατισµό όλων των απαραίτητων πρωτεϊνών που µπορεί να παράγει το κύτταρο µόνο του. Καθώς όµως οι παραγωγικές µονάδες βρίσκονται έξω από την πυρήνα και το DNA δεν µπορεί να βγει από αυτόν, µεταγράφεται σε µια µονή αλυσίδα RNA, µε διαδικασία παρόµοια της αντιγραφής: η διπλή έλικα ανοίγει και ειδικά ένζυµα σχηµατίζουν την συµπληρωµατική RNA (δηλ. µε U στην θέση της Τ) της µίας πλευράς. Αφού η µεταγραφή ολοκληρωθεί, η έλικα ξανακλείνει και το µόριο RNA είναι έτοιµο να ταξιδέψει στις παραγωγικές µονάδες του κυττάρου, όπου θα µεταφραστεί σε πρωτεΐνη. Μετάφραση: Οι πρωτεΐνες είναι βιολογικά µακροµόρια που σχηµατίζονται από µικρότερες δοµικές µονάδες, ωστόσο εδώ το αλφάβητο αλλάζει, αποτελούµενο από 24 πιθανούς χαρακτήρες. Η µετάφραση είναι ακριβώς η διαδικασία αντιστοίχισης της σειράς αζωτούχων βάσεων (RNA) σε σειρά αµινοξέων (πρωτεΐνη) και γίνεται βάσει του γενετικού κώδικα. Ο γενετικός κώδικας, κοινός για σχεδόν όλους τους µέχρι τώρα γνωστούς οργανισµούς, αντιστοιχεί κάθε 3 νουκλεοτίδια µε 1 αµινοξύ. Το πρωτεϊνικό αλφάβητο αποτελείται από 23 αµινοξέα και τα κωδώνια τερµατισµού (δεν κωδικοποιούν αµινοξύ αλλά σηµαίνουν τον τερµατισµό της διαδικασίας µετάφρασης), σχηµατίζοντας έτσι το σύνολο των 24 χαρακτήρων. Καθώς από το αλφάβητο των νουκλεοτιδίων µπορούν να σχηµατιστούν 64 πιθανές 3άδες αλλά έχουµε µόλις 24 πιθανούς χαρακτήρες, είναι φανερό ότι ο κώδικας είναι πλεονάζων (δηλαδή ένα αµινοξύ / κωδώνιο τερµατισµού είναι δυνατόν να κωδικοποιείται από περισσότερες της µίας πιθανές 3άδες). Εικόνα 2: Η διαδικασία της γονιδιακής έκφρασης 15

16 1.2 Μεταλλάξεις Με τον όρο µετάλλαξη εννοούµε οποιαδήποτε µεταβολή στην αρχική ακολουθία του γενετικού υλικού. Πρόκειται ουσιαστικά για ένα λάθος στη διαδικασία της αντιγραφής, που σαν αποτέλεσµα έχει ένα από τα δύο κύτταρα που προκύπτουν µετά την διαίρεση (και συνεπώς και όλοι του οι απόγονοι), να έχει διαφορετικό γενετικό υλικό από το άλλο. Παρόµοια λάθη µπορούν σαφώς να εµφανιστούν και στις διαδικασίες της µεταγραφής και της µετάφρασης, ωστόσο σε αυτές τις περιπτώσεις οι συνέπειες είναι κατά κανόνα αµελητέες, εφόσον τροποποιούν µόνο τη συγκεκριµένη αλληλουχία RNA ή πρωτεΐνης που παράγεται. Ως προς την έκταση της µετάλλαξης, διακρίνουµε 2 βασικές κατηγορίες: - µεταλλάξεις που αφορούν σε ένα µόνο νουκλεοτίδιο (αναφέρονται και ως Single Nucleotide Polymorphisms - SNPs) - µεταλλάξεις που αφορούν έκταση αρκετών διαδοχικών νουκλεοτιδίων Ουσιαστικά η διάκριση που µας ενδιαφέρει, από υπολογιστική άποψη, είναι πιο λεπτοµερής. Έτσι, στη διεθνή βιβλιογραφία αναφέρονται οι εξής κατηγορίες: - missense / nonsense: αντικαταστάσεις ενός µόνο νουκλεοτιδίου στην αλληλουχία του DNA, που έχουν ως συνέπεια την αντικατάσταση ενός αµινοξέος από άλλο στο τελικό προϊόν της µετάφρασης - splicing: µεταλλάξεις που αναφέρονται στο στάδιο της περικοπής της αρχικής αλυσίδας RNA προς τον τελικό σχηµατισµό του. - regulatory: µεταλλάξεις εκτός του κυρίως σώµατος του γονιδίου, που σχετίζονται µε τα τµήµατα πριν / µετά από αυτό, µε τα οποία ρυθµίζεται η διαδικασία της γονιδιακής έκφρασης - small deletions / insertions: διαγραφές ή εισαγωγές τµηµάτων µικρής έκτασης (µέχρι περίπου 20 bps) - small indels: περιπτώσεις συνδυασµού εισαγωγής(ών) και διαγραφής(ών) τµηµάτων, συνήθως µικρής σχετικά έκτασης - gross deletions / insertions: διαγραφές ή εισαγωγές τµηµάτων µεγάλης έκτασης (µήκους µέχρι και χιλιάδων βάσεων) - complex rearrangements: πολύπλοκες ανακατανοµές εσωτερικά της ακολουθίας αποκοπή από ένα σηµείο και επικόλληση σε άλλο - repeat variations: φαινόµενα επανάληψης τµήµατος της ακολουθίας Ως προς τις συνέπειες, διακρίνουµε τις εξής περιπτώσεις: - µεταλλάξεις που δεν γίνονται καν αντιληπτές, είτε επειδή το νέο κωδώνιο κωδικοποιεί και πάλι το ίδιο αµινοξύ λόγω πλεονασµού του γενετικού κώδικα (σιωπηλές µεταλλάξεις) είτε επειδή γίνονται σε περιοχές του υλικού που δεν µεταφράζονται - µεταλλάξεις που γίνονται αντιληπτές και επηρεάζουν είτε την διαδικασία της µετάφρασης, (δίνουν πολύ µικρή ή πολύ µεγάλη πρωτεΐνη, η οποία δεν είναι πλέον λειτουργική) είτε το ίδιο το προϊόν (αρνητικές µεταλλάξεις) - µεταλλάξεις που µεταβάλλουν την παραγόµενη πρωτεΐνη, αλλά η νέα υπερτερεί σε λειτουργικότητα από την προηγούµενη (θετικές µεταλλάξεις) - µεταλλάξεις που µεταβάλλουν τυπικά την ακολουθία αµινοξέων της πρωτεΐνης, ουσιαστικά όµως η λειτουργικότητά της δεν αλλάζει σηµαντικά (ουδέτερες µεταλλάξεις) εδοµένου ότι κάποιες από τις πρωτεΐνες αποτελούν ρυθµιστικούς παράγοντες για τις ζωτικές λειτουργίες του κυττάρου, όπως η αναπαραγωγή και η αναπνοή του, είναι 16

17 φανερό ότι µια τέτοια µετάλλαξη έχει µεγάλες πιθανότητες να επηρεάσει σε πολύ µεγάλο βαθµό την ίδια την επιβίωση του κυττάρου. Για παράδειγµα, αν έχουµε µια µετάλλαξη στο γονίδιο που κωδικοποιεί τον ρυθµιστικό παράγοντα αναπαραγωγής ενός κυττάρου τέτοια ώστε η µετάφραση να τερµατίζει πιο πριν απ' ότι προηγουµένως, ο ρυθµιστικός παράγοντας που παράγεται δεν λειτουργεί πλέον όπως πριν, µε αποτέλεσµα την υπερπαραγωγή του κυττάρου και την ανάπτυξη καρκινικού όγκου. Υπάρχει πληθώρα αιτιών που µπορεί να προκαλέσουν µια µετάλλαξη, µεταξύ αυτών περιβαλλοντικές συνθήκες (ακτινοβολίες, µεταλλαξιογόνες χηµικές ουσίες κτλ), ιοί, αλλά και απλά (τυχαία) λάθη που συµβαίνουν κατά τη διάρκεια της µείωσης ή της διαδικασίας της έκφρασης της γονιδιακής πληροφορίας. 17

18 18

19 2 Υπολογιστικό Υπόβαθρο 2.1 Το πρόβλημα της ευθυγράμμισης βιολογικών ακολουθιών Η σύγκριση µεταξύ βιολογικών ακολουθιών, οι οποίες µπορεί να είναι είτε ακολουθίες αµινοξέων που σχηµατίζουν πρωτεΐνες, είτε ακολουθίες νουκλεοτιδίων που σχηµατίζουν µόρια γενετικού υλικού, αποτελεί ένα από τα βασικότερα ζητήµατα της υπολογιστικής βιολογίας. Η σύγκριση αυτή αποτελεί βάση για την διαδικασία αναγνώρισης / ταυτοποίησης ειδών, τον εντοπισµό πεδίων ενδιαφέροντος σε βιολογικές ακολουθίες (εδώ εµπίπτουν και οι µεταλλάξεις, που αποτελούν το άµεσο ενδιαφέρον αυτής της εργασίας), την δηµιουργία φυλογενετικών δένδρων και τη χαρτογράφηση γονιδιώµατος. Υπολογιστικά, το παραπάνω πρόβληµα ανάγεται σε αυτό της ευθυγράµµισης (alignment) συµβολοσειρών. Η ευθυγράµµιση συνίσταται στην τοποθέτηση µε κατάλληλο τρόπο δύο ακολουθιών συµβόλων, µε σκοπό να ανιχνευθούν σε τι ποσοστό εµφανίζουν οµοιότητα. Η διαδικασία επεκτείνεται στην αναζήτηση µιας βάσης δεδοµένων ήδη καταχωρηµένων (πρότυπων) ακολουθιών µε βάση την προς ταυτοποίηση ακολουθία (query sequence). 19

20 Οι βιολογικές ακολουθίες, γενετικές και πρωτεϊνικές, αποτελούν µια ειδική κατηγορία συµβολοσειρών. Για τις ακολουθίες γενετικού υλικού περιοριζόµαστε στο αλφάβητο των αζωτούχων βάσεων: A, T, G, C, U ενώ για τις πρωτεϊνικές ακολουθίες στο αλφάβητο των 23 αµινοξέων και του σήµατος τερµατισµού. Σε βιολογικές εφαρµογές, η εύρεση οµοιότητας µεταξύ ακολουθιών έχει µεγάλη σηµασία, καθώς πιθανώς συνεπάγεται παρόµοια δοµή και λειτουργικότητα των πρωτεϊνών, ή ακόµα και εξελικτική σχέση ανάµεσα στους οργανισµούς. Εικόνα 3: Ο γενετικός κώδικας Παρά την βολική του οµοιότητα µε το γενικότερο πρόβληµα της σύγκρισης συµβολοσειρών, το πρόβληµα την ευθυγράµµισης βιολογικών ακολουθιών περιορίζεται από τον ίδιο τον γενετικό κώδικα. Η πιθανότητα αντικατάστασης µίας βάσης από άλλη κατά την διάρκεια της µεταγραφής ή της µετάφρασης (ή αντίστοιχα αµινοξέων κατά την διάρκεια της µετάφρασης) δεν κατανέµεται ισόποσα ανάµεσα στα πιθανά ζεύγη, αλλά αντιθέτως εξαρτάται από τα συγκεκριµένα ζεύγη που συµµετέχουν στην αντικατάσταση. Για τον λόγο αυτό βάση όλων των αλγορίθµων που έχουν προταθεί αποτελούν οι πίνακες αντικατάστασης (substitution matrices), στους οποίους συγκεντρώνονται οι πιθανότητες αντικατάστασης συγκεκριµένου νουκλεοτιδίου/αµινοξέος από άλλο (συγκεκριµένο) νουκλεοτίδιο/αµινοξύ. Οι πίνακες αντικατάστασης είναι προφανώς συµµετρικοί και φέρουν τις µεγαλύτερες τιµές τους ανά γραµµή και στήλη πάνω στην κύρια διαγώνιο. Παρότι οι αντικαταστάσεις µεταξύ βάσεων µπορούν προσεγγιστικά να θεωρηθούν ισοπίθανες, µε αποτέλεσµα στην πλειονότητα των περιπτώσεων να µην χρησιµοποιούνται πίνακες αντικατάστασης για τέτοιου είδους εφαρµογές, η χρήση πινάκων αντικατάστασης είναι απαραίτητη στην περίπτωση των αµινοξέων. Οι πίνακες που συνήθως χρησιµοποιούνται είναι οι PAM (Point Accepted Mutation) και BLOSUM (BLOcks of Amino Acid SUbstitution Matrix), καθένας από τους οποίους έχει 20

21 δηµιουργηθεί βασιζόµενος σε διαφορετικό εξελικτικό (και κατά συνέπεια µαθηµατικό) µοντέλο. PAM Οι πίνακες της οµάδας PAM υπολογίζονται παρατηρώντας τις διαφορές µεταξύ πρωτεϊνών που είναι πολύ κοντινοί συγγενείς. Είναι πίνακες τετραγωνικοί (συνήθως 20x20, συµπεριλαµβάνοντας τα 20 βασικά αµινοξέα) και συµµετρικοί, ενώ κάθε στοιχείο τους εκφράζει την πιθανότητα αντικατάστασης µεταξύ των δύο αµινοξέων (σηµειακές αντικαταστάσεις - point mutations), που είναι οι δείκτες θέσης του (γραµµή, στήλη). Ο αρχικός πίνακας, PAM1, εκτιµά τον αναµενόµενο ρυθµό αντικαταστάσεων σε µια αµινοξεϊκή ακολουθία µε την υπόθεση ότι αντικαθίσταται το 1% των αρχικών αµινοξέων. Με άλλα λόγια, κάθε στοιχείο του PAM1 υπολογίζει την πιθανότητα αντικατάστασης µεταξύ των 2 αµινοξέων που συνδέει, µε την υπόθεση ότι µεταξύ των 2 ακολουθιών που χρησιµοποιήθηκαν για τον υπολογισµό του, ισχύει η εξής σχέση: η δεύτερη προκύπτει από την πρώτη µε µία αντικατάσταση αµινοξέος για κάθε 100 αµινοξέα. Οι επόµενοι πίνακες PAM, προκύπτουν µε ύψωση του PAM1 στην αντίστοιχη δύναµη. Η διαδικασία βασίζεται στην υπόθεση ότι επαναλαµβανόµενες µεταλλάξεις είναι λογικό να ακολουθήσουν, ως προς την πιθανότητα εµφάνισής τους, τα πρότυπα που καθορίζονται στον PAM1. Ο PAM2, για παράδειγµα, προκύπτει µε ύψωση στο τετράγωνο του PAM1, και υπολογίζει τους συντελεστές οµοιότητας µεταξύ πρωτεϊνικών ακολουθιών, µε την προϋπόθεση τώρα να εντοπίζονται 2 αντικαταστάσεις για κάθε 100 αµινοξέα. Η δηµιουργός των πινάκων PAM, Margaret Dayhoff (1978), κατόρθωσε να υπολογίσει µέχρι και τον PAM250. Ο πίνακας αυτός, που ισοδυναµεί µε 250 αντικαταστάσεις για κάθε 100 αµινοξέα, καλύπτει την ανάγκη εξέτασης πολλαπλών αντικαταστάσεων που αφορούν σε ένα µόνο αµινοξύ,ή αντικαταστάσεων µεγάλου µήκους που αλληλοεπικαλύπτονται. Η διαδικασία κατασκευής των πινάκων PAM αποτελεί υλοποίηση ενός κρυφού µοντέλου Markov. Στην πράξη, οι PAM Που χρησιµοποιούνται περισσότερο είναι οι PAM30 και PAM70. BLOSUM Η φιλοσοφία πίσω από την κατασκευή των πινάκων PAM δεν τους καθιστά ιδιαίτερα αποτελεσµατικούς σε περιπτώσεις πρωτεϊνών που εµφανίζουν σηµαντικές διαφορές και δεν σχετίζονται εξελικτικά. Οι πίνακες αντικατάστασης της οικογένειας BLOSUM, αντίθετα µε τους PAM, βασίζονται στην τοπική ευθυγράµµιση αµινοξεϊκών ακολουθιών. Για την κατασκευή τους, οι Henikoff και Henikoff (1992) σάρωσαν τη βάση BLOCKS και εντόπισαν ισχυρά διατηρηµένες περιοχές, που χαρακτήριζαν ευρύτερες οικογένειες πρωτεϊνών. Χρησιµοποιώντας ως δεδοµένα αυτές τις περιοχές, υπολόγισαν τις συχνότητες εµφάνισης κάθε αµινοξέος και εκτίµησαν τις πιθανότητες αντικατάστασης για τα 20 βασικά αµινοξέα. Προκειµένου να εξαλειφθεί η επίδραση του φαινοµένου έντονης οµοιότητας ακολουθιών που σχετίζονται εξελικτικά, τµήµατα ακολουθιών µε οµοιότητα πάνω από ένα ορισµένο όριο, οµαδοποιούνται σε clusters και συµµετέχουν µε συγκεκριµένο συντελεστή 21

22 στάθµισης στον υπολογισµό των πιθανοτήτων αντικατάστασης. Έτσι, οι συχνότητες αντικατάστασης για κάθε ζεύγος αµινοξέων υπολογίζονται κατά βάση από τα τµήµατα που εµφανίζουν ποσοστό οµοιότητας µικρότερο από το παραπάνω όριο, το οποίο είναι υψηλότερο σε πειράµατα ευθυγράµµισης συγγενών ακολουθιών και χαµηλότερο στις ευθυγραµµίσεις ακολουθιών µε εντονότερες αποκλίσεις. Στον BLOSUM62, που είναι ο πίνακας που συχνότερα χρησιµοποιείται σε πειράµατα όπου απαιτείται υπολογισµός πιθανοτήτων αντικατάστασης, το οριακό ποσοστό είναι 62%. Επί της ουσίας, οι πίνακες BLOSUM διαφέρουν από τους PAM σε 4 βασικά σηµεία: - στο εξελικτικό µοντέλο: οι PAM βασίζουν ευθέως τον υπολογισµό τους στην απόσταση κλάδων στα φυλογενετικά δένδρα, ενώ η σχέση των BLOSUM µε υπαρκτά εξελικτικά µοντέλα είναι πιο αφηρηµένη - στο είδος της ευθυγράµµισης: οι PAM εφαρµόζουν ολική ευθυγράµµιση, λαµβάνοντας υπόψιν διατηρηµένες και µεταλλαγµένες περιοχές, ενώ αντίθετα οι BLOSUM ενδιαφέρονται για τοπικές ευθυγραµµίσεις που αφορούν στις διατηρηµένες περιοχές των ακολουθιών - στη µέθοδο καταµέτρησης αντικαταστάσεων: σε αντίθεση µε τους PAM, που προσµετρούν αντικαταστάσεις µε την ίδια βαρύτητα στις ακολουθίες που χρησιµοποιούν για τον υπολογισµό των στοιχείων τους, οι BLOSUM δίνουν διαφορετική βαρύτητα στα ζεύγη ακολουθιών, ανάλογα µε την γενική συγγένεια που εµφανίζουν - στην ονοµατολογία: στην οικογένεια PAM, µεγαλύτερος αριθµός στην ονοµασία ενός πίνακα ισοδυναµεί µε περισσότερες µεταλλάξεις ανά µήκος ακολουθίας, άρα µεγαλύτερη εξελικτική απόσταση µεταξύ των ακολουθιών που χρησιµοποιήθηκαν. Αντίθετα στους BLOSUM, όσο µεγαλύτερος ο αριθµός που περιέχεται στο όνοµα του πίνακα, τόσο µεγαλύτερο είναι το όριο οµοιότητας που χρησιµοποιήθηκε κατά τον υπολογισµό του πίνακα, εποµένως ο πίνακας προσφέρεται για την σύγκριση εξελικτικά συγγενών ακολουθιών. Άλλες οικογένειες πινάκων αντικατάστασης που χρησιµοποιούνται σε εφαρµογές όπου απαιτείται ευθυγράµµιση αµινοξεϊκών ακολουθιών είναι οι GONNET. Για εφαρµογές σύγκρισης ακολουθιών νουκλεοτιδίων, χρησιµοποιούνται οι DNA Identity Matrix (πρακτικά αποδίδει +1 για αντιστοιχία και αφαιρεί για αναντιστοιχία) και ο DNA PUPY Matrix, του οποίου οι βαθµολογίες αντιστοιχιών / αναντιστοιχιών εξαρτώνται από τις βιολογικές αρχές που διέπουν την αλληλεπίδραση µεταξύ των αζωτούχων βάσεων και δεν είναι ίδιες για κάθε ζεύγος αντικατάστασης. 2.2 Ευθυγράμμιση - οι πρώτες προτάσεις Η προφανέστερη προσέγγιση για το πρόβληµα της ευθυγράµµισης ακολουθιών, είναι ο υπολογισµός όλων των πιθανών ευθυγραµµίσεων και η επιλογή εκείνης που δίνει την µεγαλύτερη οµοιότητα. Ωστόσο, καθώς η λίστα των πιθανών ευθυγραµµίσεων αυξάνεται εκθετικά µε το µέγεθος των ακολουθιών και καθώς τυπικά µιλάµε για γονίδια 22

23 µήκους µερικών δεκάδων χιλιάδων ζευγών βάσεων, γίνεται αµέσως φανερό ότι η προσέγγιση είναι απαγορευτικά αργή και απαιτητική σε χρόνο και πόρους. Οι Needleman - Wunsch εισήγαγαν τον δυναµικό προγραµµατισµό στον αλγόριθµό τους, που εκτελούσε ευθυγράµµιση αµινοξεϊκών ακολουθιών (1970). Η βάση της διαδικασίας είναι ο πίνακας οµοιότητας (similarity matrix), ο οποίος καθορίζει τις θετικές τιµές αντιστοιχιών και τις αρνητικές τιµές αναντιστοιχιών, καθώς και µια αρνητική τιµή κενού. Οι δύο ακολουθίες, πρότυπη και προς σύγκριση, τοποθετούνται ως στήλες και σειρές, αντίστοιχα, ενός πίνακα 2x2 και έπειτα υπολογίζονται οι τιµές ευθυγράµµισής τους µε βάση τον πίνακα οµοιότητας. Η διαδροµή ελάχιστου κόστους δίνει και την βέλτιστη ευθυγράµµιση των ακολουθιών. Εικόνα 4: Πίνακας βαθµονόµησης ολικής ευθυγράµµισης µε την µέθοδο NW Συγκεκριµένα, ο πίνακας του δυναµικού προγραµµατισµού συµπληρώνεται ως εξής: Αρχικά συµπληρώνεται η πρώτη γραµµή και η πρώτη στήλη, ξεκινώντας από τα σηµεία εκκίνησης των ακολουθιών (στο σχήµα το σηµείο αυτό αντιστοιχεί στο άνω αριστερά άκρο). Η συµπλήρωση κατευθύνεται προς το τέλος (εδώ δεξιά στην πρώτη γραµµή και προς τα κάτω στην πρώτη στήλη), προσθέτοντας σε κάθε βήµα την ποινή εισαγωγής και διαγραφής χαρακτήρα αντίστοιχα (η οποία είναι σταθερή και συνήθως ίση µε -1). Για κάθε άλλο κελί πλην αυτών που ανήκουν στην πρώτη γραµµή ή στήλη, το περιεχόµενό του υπολογίζεται ως το ελάχιστο τριών ποσοτήτων: 23

24 1, +, = 1, 1 +,, 1 + Προκύπτει από την τελευταία σχέση ότι η τιµή κάθε κελιού υπολογίζεται από τα 3 γειτονικά του που προηγουµένως έχουν υπολογιστεί. Στο επάνω και το ακριβώς αριστερά του προστίθενται αντίστοιχα οι ποινές εισαγωγής και διαγραφής, ενώ στο διαγώνια επάνω και αριστερά του η τιµή της ποινής αντικατάστασης µεταξύ των 2 χαρακτήρων που συνδέει (η οποία και είναι µηδενική εάν οι χαρακτήρες ταυτίζονται). Το ελάχιστο των τριών αυτών τιµών αποτελεί την τιµή του κελιού (i,j). Όταν συµπληρωθούν όλα τα κελιά, ο αλγόριθµος ξεκινά το τελευταίο στάδιο της ολικής ευθυγράµµισης: την ιχνηλάτηση προς τα πίσω (traceback). Ξεκινώντας από το τελευταίο κελί που συµπληρώθηκε (εδώ το κάτω δεξιά), µετακινείται σε κάθε βήµα σε εκείνο το γειτονικό του που έχει τη µεγαλύτερη τιµή. Η µετακίνηση γίνεται πάντοντε µε φορά προς την αρχή, εποµένως από κάθε κελί µπορούµε να µετακινηθούµε στο ακριβώς επάνω του, το ακριβώς αριστερά του ή το διαγώνια επάνω και αριστερά από αυτό. Η ιχνηλάτηση προς τα πίσω καταλήγει στο πρώτο κελί. Ο NW είναι αλγόριθµος ολικής ευθυγράµµισης (full alignment), δηλαδή προσανατολίζεται στην ταυτοποίηση των δύο ακολουθιών σε όλο τους το µήκος. Στην περίπτωση που το πείραµα δεν αφορά σε 2 πανοµοιότυπες ακολουθίες αλλά αντίθετα σε συγγενείς πρωτεΐνες που φέρουν οµοιότητα σε κάποια σηµεία και συνεπώς παρόµοια δοµή/λειτουργικότητα, ο αλγόριθµος αυτός δεν δίνει αξιοποιήσιµα αποτελέσµατα. Το πρόβληµα αυτό έλυσαν οι Smith-Waterman το 1981, προτείνοντας µια παραλλαγή του NW που υιοθετεί την φιλοσοφία της τοπικής ευθυγράµµισης (local alignment), δηλαδή της ταυτοποίησης περιοχών των ακολουθιών και έπειτα επέκτασής τους προκειµένου να εξαχθεί µια όχι πλήρης, αλλά σε ικανοποιητικό βαθµό υπαρκτή, ολική ευθυγράµµιση. Οι Smith - Waterman αντικατέστησαν τις αρνητικές τιµές για τα κενά µε µηδενικές, αποκόπτοντας έτσι επιτρέποντας έτσι να γίνουν ορατές πιθανές τοπικές ευθυγραµµίσεις. Αντίθετα µε τον N-W, η οπισθοχώρηση δεν ξεκινά από το τελευταίο κελί που συµπληρώνεται αλλά από το κελί µε την υψηλότερη βαθµολογία και συνεχίζεται έως ότου συναντηθεί κελί µε µηδενική βαθµολογία. Ο αλγόριθµος αποτελεί µέχρι και σήµερα την βέλτιστη λύση στο πρόβληµα της ευθυγράµµισης γενετικών ακολουθιών, από την άποψη της ποιότητας των αποτελεσµάτων. 24

25 Εικόνα 5: Ο πίνακας βαθµονόµησης για τον αλγόριθµο Smith - Waterman Γίνονται αντιληπτές οι βασικές διαφορές του από τον NW: οι µη αρνητικές τιµές και η εκκίνηση της οπισθοχώρησης από το κελί µε τη µεγαλύτερη τιµή. 25

26 2.3 Ευριστικές μέθοδοι : FASTA, BLAST Ο αλγόριθμος FASTA Ο αλγόριθµος FASTA (Lipman & Pearson, 1985) ήταν το πρώτο πρόγραµµα που υιοθέτησε ευριστικές µεθόδους σε προβλήµατα συγκρίσεων ακολουθιών. Βασίζεται στον ακριβή υπολογισµό στατιστικών µεγεθών µε τα οποία εκφράζεται η οµοιότητα µεταξύ των συγκρινόµενων ακολουθιών, ώστε να µπορεί να εξαχθούν ασφαλή συµπεράσµατα ως προς το αν η οµοιότητα δύο βιολογικών ακολουθιών υπονοεί όντως εξελικτική σχέση (οµολογία) µεταξύ τους, ή αν οφείλεται σε καθαρή τύχη, παράγοντας καθοριστικός σε στοχαστικές µεθόδους. Η εκτέλεσή του πραγµατοποιείται σε 4 βασικά βήµατα: Βήµα 1ο: Σχηµατίζονται δύο λίστες λέξεων µήκους k (k-mers), οι οποίες προκύπτουν αντίστοιχα από την προς αναζήτηση (query) και από την πρότυπη ακολουθία ξεκινώντας από την αρχή και µετατοπίζοντας κάθε φορά το πλαίσιο ανάγνωσης κατά 1 χαρακτήρα. Βήµα 2ο: Γίνεται ακριβής αναζήτηση για τις παραπάνω λέξεις στην πρότυπη ακολουθία. Η έννοια "ακριβής" χρησιµοποιείται σχετικά ευρέως, αφού πρακτικά µας ενδιαφέρουν ακολουθίες που εµφανίζουν ένα υψηλό ποσοστό οµοιότητας, το οποίο µε την σειρά του υπολογίζεται βάσει πινάκων αντιστοίχισης. Οι αντιστοιχίσεις απεικονίζονται µε τη µορφή διαγωνίων (βλ. Εικόνα 1). Μόνο οι καλύτερες 10 αντιστοιχίσεις επιλέγονται για περαιτέρω εξέταση. Βήµα 3ο: Ελέγχεται αν κάποιες από τα τµήµατα της query ακολουθίας που ευθυγραµµίστηκαν µε την πρότυπη µπορούν να συνενωθούν για να σχηµατίσουν µεγαλύτερες ευθυγραµµίσεις, έστω προσεγγιστικές. Σε αυτό το στάδιο επιτρέπεται και η εισαγωγή κενών, ωστόσο κάθε τέτοια κίνηση αντιστοιχεί σε αρνητικό score. Τελικά υπολογίζονται τα scores των νέων (µεγαλύτερων σε µήκος) ευθυγραµµίσεων και οι ευθυγραµµίσεις µε τα υψηλότερα scores αποθηκεύονται για τη συνέχεια. Βήµα 4ο: Χρησιµοποιείται ο Smith - Waterman (δυναµικός προγραµµατισµός) για να υπολογιστούν οι βέλτιστες τιµές οµοιότητας (scores) για κάθε ευθυγράµµιση. Οι ευθυγραµµίσεις αξιολογούνται µε κριτήριο την αναµενόµενη κατανοµή τυχαίων οµοιοτήτων, εξάγεται δηλαδή συµπέρασµα ως προς το κατά πόσο η οµοιότητα βασίζεται σε πραγµατική σχέση µεταξύ των ακολουθιών ή έχει προέλθει τυχαία. 26

27 Εικόνα 6: Ο αλγόριθµος FASTA Πηγή: Protein Structure Prediction: A Practical Approach Το ακρωνύµιο FASTA αναφέρεται σε ένα σύνολο προγραµµάτων, καθένα από τα οποία εξειδικεύεται ως προς τον τύπο της πρότυπης και της προς αναζήτηση ακολουθίας. Ωστόσο, όλα τα προγράµµατα της οικογένειας FASTA υλοποιούν τον ίδιο αλγόριθµο. Οι διαφορές εντοπίζονται περισσότερο στην παραµετροποίηση, καθώς διαφέρουν οι τιµές του µήκους λέξεων, οι πίνακες βαθµολογιών, τα αποδεκτά ποσοστά οµοιότητας. Εκτός από τα προγράµµατα ευθυγραµµίσεων γενικής χρήσης, έχουν υλοποιηθεί και πιο εξειδικευµένες εφαρµογές, αποδοτικότερες σε προβλήµατα µε συγκεκριµένα χαρακτηριστικά. Για παράδειγµα, το πρόγραµµα ssearch ενσωµατώνει τον αλγόριθµο 27

28 SW για αναζήτηση protein - protein ενώ αντίστοιχα το ggsearch ενσωµατώνει τον NW. Στον Πίνακα 1 συνοψίζονται τα βασικότερα µέλη της οικογένειας FASTA. Πρόγραµµα Query Database FASTA Nucleotide Nucleotide Protein Protein FASTX / FASTY Translated DNA Protein TFASTX / TFASTY Protein Translated DNA Πίνακας 1: Αλγόριθµοι FASTA Πηγή: Ο αλγόριθμος BLAST Μακράν η πιο χρησιµοποιηµένη τεχνική στο πεδίο της σύγκρισης βιολογικών αλληλουχιών, είναι αυτή που υιοθετεί ο αλγόριθµος BLAST (Altschul, Gish, Miller, Myers, Lipman ). Ο BLAST βασίστηκε σε µεγάλο βαθµό στην φιλοσοφία του FASTA, εποµένως είναι κατά βάση µια ευριστική µέθοδος ευθυγράµµισης. Ωστόσο οι δηµιουργοί του κατόρθωσαν να επιτύχουν µεγάλη επιτάχυνση της διαδικασίας αναζήτησης, χαρακτηριστικό πολύ σηµαντικό αν λάβουµε υπόψιν την τεράστια και συνεχή αύξηση του µεγέθους των βάσεων δεδοµένων στις οποίες εκτελούνται οι αναζητήσεις, χρόνο µε τον χρόνο. Η ταχύτητα δεν έρχεται αναίµακτα: θυσιάζεται µέρος της ακρίβειας των αποτελεσµάτων, τα οποία ωστόσο παραµένουν σε ικανοποιητικά επίπεδα όµοια µε τα εξαγόµενα από τους πιο ακριβείς αλγορίθµους ολικής ευθυγράµµισης (SW και ΝW). Ο αλγόριθµος αποτελείται από 4 βήµατα, τα οποία εµφανίζουν σαφείς οµοιότητες µε τον FASTA. Βήµα 1ο: Η διαδικασία ξεκινά µε τροφοδότηση (seeding) της αναζήτησης. Η query ακολουθία χωρίζεται σε τµήµατα µήκους w, τα οποία ονοµάζονται w-µερή (w-mers), ξεκινώντας από την αρχή και µετακινώντας το πλαίσιο ανάγνωσης κατά µία θέση για κάθε επόµενη ανάγνωση, έως ότου συναντηθεί το τέλος της ακολουθίας. Έτσι αρχικά σχηµατίζεται η λίστα µε όλα τα w-µερή που εξάγονται από την query ακολουθία. Για παράδειγµα, θεωρούµε την query ακολουθία: ABCDEFGHIJKLMNOPQ, από την οποία αν υποθέσουµε w=3, εξάγονται τα w-mers: ABC, BCD, CDE, DEF κοκ. Για κάθε w-µερές του πρώτου βήµατος πραγµατοποιείται αναζήτηση για ακριβείς αντιστοιχίες στη βάση δεδοµένων. Η έννοια της ακρίβειας δεν χρησιµοποιείται µε απόλυτο τρόπο σε αυτήν την περίπτωση, καθώς δεν επιστρέφονται µόνο ακολουθίες που συµφωνούν χαρακτήρα προς χαρακτήρα, αλλά και ακολουθίες που συµφωνούν σε ένα ικανοποιητικό ποσοστό, το οποίο καθορίζεται από την παράµετρο Τ. Κάθε τέτοια ακριβής αντιστοιχία έχει πιθανότητα να είναι ζεύγος υψηλής βαθµολογίας (high scoring pair, HSP). Μόλις ολοκληρωθεί η παραπάνω διαδικασία, σχηµατίζεται ο lookup table της query ακολουθίας, ο οποίος περιέχει ένα κελί για κάθε w-mer που αντλήθηκε, ενώ συνδέει σε 28

29 κάθε κελί του την λίστα µε τις θέσεις της πρότυπης (subject) ακολουθίας στις οποίες εντοπίστηκε ακριβής αντιστοίχιση (µε βάση το κριτήριο που αναφέρθηκε προηγουµένως) µε το αντίστοιχο w-mer της query ακολουθίας. Ο lookup table σχηµατίζεται µε χρήση της query ακολουθίας και του scoring / substitution matrix, ο οποίος περιέχει τα κέρδη/κόστη αντιστοιχιών/αναντιστοιχιών για κάθε δυνατό συνδυασµό χαρακτήρων του αλφαβήτου και συµµετέχει στον υπολογισµό του score κάθε προσπάθειας τοπικής ευθυγράµµισης. Εικόνα 7: Ο lookup table για µια συγκεκριµένη ακολουθία. Βήµα 2ο: Για κάθε ακριβή αντιστοιχία, ελέγχεται η διαγώνιός της d=j-i, δηλαδή η απόσταση µεταξύ των θέσεών της στην query (j) και στην πρότυπη (i) ακολουθία. Εάν 2 αντιστοιχίσεις βρίσκονται στην ίδια διαγώνιο, και οι θέσεις τους στην πρότυπη ακολουθία δεν απέχουν περισσότερο από µία maximum τιµή Α, τότε ξεκινά µία επέκταση του ζεύγους και προς τις δύο κατευθύνσεις. Αρχικά η επέκταση γίνεται προς τα µέσα. Η αναζήτηση προχωρά προσθέτοντας χαρακτήρες της query, χωρίς να επιτρέπει εισαγωγές ή διαγραφές χαρακτήρων (ungapped extension) και υπολογίζοντας µε κάθε βήµα τη νέα βαθµολογία της ευθυγράµµισης. Όταν ολοκληρωθεί η ένωση των δύο αντιστοιχιών, ξεκινά η προς τα έξω επέκταση, και από τα 2 άκρα της ενιαίας πλέον ακολουθίας ταυτόχρονα, και προχωρά έως ότου η βαθµολογία της πέσει κάτω από ένα προκαθορισµένο όριο. Οι ευθυγραµµίσεις µε βαθµολογία υψηλότερη από το κατώφλι S1, προχωρούν στο επόµενο βήµα. Βήµα 3ο: Επιχειρείται η συνένωση µικρότερων (τοπικών) ευθυγραµµίσεων ώστε να σχηµατίσουν πιθανές ολικές. Σε αυτό το σηµείο χρησιµοποιείται δυναµικός προγραµµατισµός, σε µια προσπάθεια να ενσωµατωθούν πιθανές ευθυγραµµίσεις µε κενά (gapped alignments). Η προσπάθεια συνένωσης σταµατάει όταν το συνολικό σκορ (της ολικής ευθυγράµµισης) πέσει κάτω από µια παράµετρο απόρριψης (dropoff) Χ, και 29

30 ξαναξεκινά, µετακινώντας το πλαίσιο ανάγνωσης κατά µία θέση, ώστε να εξεταστεί η επόµενη περίπτωση διαγραφής / εισαγωγής. Τέλος εάν µια ολική ευθυγράµµιση έχει Χ>S2 (η τιµή S2 καθορίζεται από την παράµετρο Ε) τότε περνά στο 4ο και τελευταίο βήµα. Βήµα 4ο: Ο αλγόριθµος "ξανατρέχει" τις ολικές ευθυγραµµίσεις που ικανοποίησαν τα κριτήρια του προηγούµενου βήµατος, ώστε να είναι διαθέσιµα όχι µόνο τα scores αλλά και η πορεία που οδήγησε σε αυτήν. Επιπλέον, γίνεται ένας νέος κύκλος των βηµάτων 1-3 για τις ευθυγραµµίσεις που "πέρασαν" από το 3ο στάδιο, προκειµένου να προκύψουν ακριβέστερα στατιστικά αποτελέσµατα, τα οποία και επιστρέφονται στον χρήστη. Εικόνα 8: Ο αλγόριθµος BLAST 30

31 Εικόνα 9: Σχηµατική αναπαράσταση µιας αναζήτησης µέσω BLAST Πηγή: BLAST+: Architecture and Applications. Στην Εικόνα 8 απεικονίζεται το διάγραµµα ροής του BLAST. Το πρώτο στάδιο είναι η προετοιµασία της ακολουθίας: συµπεριλαµβάνει ανάγνωση, αφαίρεση περιοχών χαµηλής πολυπλοκότητας, όποιο άλλο φιλτράρισµα επιλέγει να εφαρµόσει ο χρήστης και σχηµατισµό του lookup table. Στο βρόχο του δεύτερου σταδίου, αναζητούνται ακριβείς αντιστοιχίες σε κάθε υποακολουθία, οι οποίες επεξεργάζονται, επεκτείνονται βαθµολογούνται από αλγορίθµους ευθυγράµµισης µε και χωρίς εισαγωγή κενών και, εφόσον δίνουν τελικό score πάνω από το ελάχιστο αποδεκτό, αποθηκεύονται για τη συνέχεια. Το τρίτο στάδιο, η "ιχνηλάτηση προς τα πίσω" ("trace - back"), εντοπίζει τις θέσεις εισαγωγών και διαγραφών τµηµάτων για τις υποακολουθίες που πέρασαν µε επιτυχία το δεύτερο στάδιο, σε µια προσπάθεια να γεφυρώσει τις τοπικές ευθυγραµµίσεις και να σχηµατίσει τη βέλτιστη ολική. 31

32 Στατιστικές Παράμετροι και Παράμετροι Αναζήτησης 1. EXPECT VALUE (E-Value) Πρόκειται για τη µία από τις δυο βασικές εξόδους του BLAST. Ορίζεται ως το κατώφλι στατιστικής σηµασίας στην ταυτοποίηση ακολουθιών. Ισούται µε τον αριθµό των ακριβών αντιστοιχιών (βάσεων/αµινοξέων ανά ακολουθία) που αναµένουµε να εντοπίσουµε στη δεδοµένη βάση λόγω καθαρής τύχης (και όχι βιολογικής σχέσης µεταξύ των ακολουθιών). Υπολογίζεται βάσει του στοχαστικού µοντέλου που πρότειναν οι Karlin, Altschul (1990) και συγκεκριµένα ως φθίνουσα εκθετική συνάρτηση του score αντιστοιχίας S. Η τιµή της εξαρτάται επίσης από το µήκος της query ακολουθίας, εφόσον σε µία βάση είναι προφανώς πιθανότερο να βρούµε ακριβείς αντιστοιχίες για µικρότερου παρά για µεγαλύτερου µήκους ακολουθίες. Εικόνα 10: Η εξίσωση υπολογισµού της E-value K, λ = παραµετρικές µεταβλητές, Ν = length(query) * length(database sequence) Όπως προκύπτει από τον ορισµό της, η Ε λαµβάνει τιµές όχι µόνο ακέραιες αλλά και κλασµατικές. Η e-value µπορεί επίσης να εκφράζει όχι µόνο αναµενόµενο απόλυτο αριθµό τυχαίων επιτυχιών, αλλά και ποσοστό. Για παράδειγµα, τιµή ίση µε 0.05 σηµαίνει ότι η ευθυγράµµιση στην οποία αναφέρεται έχει πιθανότητα 5% να προκύψει τυχαία. Η τιµή της παραµέτρου είναι εξ' ορισµού (by default) ίση µε 10, δηλαδή αναµένουµε να βρούµε 10 αντιστοιχίες καθαρά από τύχη µπορεί όµως να µεταβληθεί, καθορίζοντας την ανταλλαγή ταχύτητας - ευαισθησίας του αλγορίθµου. Για παράδειγµα, εάν θεωρήσουµε E=1, σηµαίνει ότι για την δεδοµένη βάση δεδοµένων, ο αναµενόµενος αριθµός αντιστοιχιών που περιµένουµε να βρούµε από καθαρή τύχη είναι µόλις ίσος µε 1. Γενικότερα, όσο πιο µικρή (κοντινότερη στο 0) είναι η τιµή της Ε, τόσο εγκυρότερη είναι η βιολογική σηµασία των αποτελεσµάτων που προκύπτουν. Κατά τη διάρκεια της αναζήτησης, τα hits στα οποία αποδίδεται τιµή στατιστικής σηµασίας µεγαλύτερη από την τιµή της Ε, δεν εµφανίζονται ως αποτελέσµατα. 2. BIT SCORE Το bit score αποτελεί µαζί µε την e-value τη βασική έξοδο κάθε εκτέλεσης του αλγορίθµου. Η τιµή του αποτελεί ένδειξη της ποιότητας της ευθυγράµµισης στην οποία αναφέρεται όσο µεγαλύτερο το bit score, τόσο ακριβέστερη η ευθυγράµµιση. Η εξίσωση υπολογισµού του λαµβάνει υπόψιν τις τοπικές ευθυγραµµίσεις παρόµοιων ή πανοµοιότυπων τµηµάτων, καθώς και τα πιθανά κενά που χρειάστηκε να εισαχθούν κατά την εκτέλεση προκειµένου να βελτιωθεί η ευθυγράµµιση. Στις αµινοξεϊκές ευθυγραµµίσεις, σηµαντικό ρόλο στον υπολογισµό του bit score παίζει ο πίνακας κατάστασης που χρησιµοποιείται (για τα περισσότερα προγράµµατα της οικογένειας BLAST ο default πίνακας είναι ο BLOSUM62). Η τιµή της µεταβλητής (S') προκύπτει από την κανονικοποίηση του απόλυτου score S, ώστε να είναι δυνατή η σύγκριση της ποιότητας διαφορετικών 32

33 ευθυγραµµίσεων, ακόµα και αν σε αυτές έχουν χρησιµοποιηθεί διαφορετικές e- values και πίνακες αντικατάστασης. Σε αντίθεση µε το bit score, το απόλυτο score της ευθυγράµµισης εξαρτάται από τις παραµέτρους εισόδου k και λ, εποµένως µπορεί να αποτελέσει κριτήριο µόνο εάν έχουν χρησιµοποιηθεί οι ίδιες τιµές για τις παραµέτρους αυτές κατά την εκτέλεση όλων των συγκρινόµενων ευθυγραµµίσεων. Εικόνα 11: Κανονικοποίηση του score, υπολογισµός του bit score 3. CUTOFF SCORE Ορίζεται ως το κατώτερο αποδεκτό score που θα πρέπει να φέρει µια ευθυγράµµιση προκειµένου να εµφανίζεται ως αποτέλεσµα. Η τιµή του υπολογίζεται βάσει της E-value. Αύξηση της τιµής του cutoff score (τιµής αποκοπής) συνεπάγεται αύξηση της ευαισθησίας του αλγορίθµου, κάνοντάς τον "αυστηρότερο" απέναντι στις αντιστοιχίες που εντοπίζονται στην βάση δεδοµένων. 4. WORD SIZE Το µήκος της λέξης που χρησιµοποιείται κατά την εκτέλεση του BLAST, καθορίζει σε µεγάλο βαθµό την ακρίβεια των αποτελεσµάτων του. Όσο η τιµή αυξάνεται, τα αποτελέσµατα είναι ακριβέστερα αλλά λιγότερα, µε κίνδυνο να µην εµφανίζονται ευθυγραµµίσεις µε υπαρκτή βιολογική σηµασία. Από την άλλη, µικρότερες τιµές του µήκος λέξεως επιστρέφουν περισσότερα αποτελέσµατα (συµπεριλαµβανοµένων αυτών που επιστρέφουν οι µεγαλύτερές τους) στα οποία όµως συµπεριλαµβάνονται ευθυγραµµίσεις µε ελάχιστη ή αδιάφορη βιολογική σηµασία. 5. ALIGNMENTS (parameter B) Καθορίζει τον µέγιστο αριθµό ευθυγραµµίσεων που θα εµφανιστεί στην έξοδο. Σε περίπτωση που πολυάριθµες ευθυγραµµίσεις περνούν το όριο του cutoff score, αυτή η παράµετρος καθορίζει ότι µόνο οι Β µε το υψηλότερο score θα εµφανιστούν στην έξοδο. 6. MATRIX Αφορά στις εκδόσεις που πραγµατοποιούν αναζητήσεις p-p, και δίνει την δυνατότητα χρήσης εναλλακτικού πίνακα αντικατάστασης από τον BLOSUM62, ο οποίος χρησιµοποιείται by default από τον BLAST. 7. FILTER Η FILTER είναι boolean µεταβλητή που επιτρέπει το φιλτράρισµα περιοχών της query ακολουθίας οι οποίες εµφανίζουν χαµηλή πολυπλοκότητα (µεγάλες περιοχές της ίδιας βάσης ή επαναλήψεις τµηµάτων για µεγάλο µήκος). Έτσι αφαιρούνται από την έξοδο τοπικές ευθυγραµµίσεις που αυξάνουν µεν τα scores των αντίστοιχων ολικών, δεν φέρουν όµως ιδιαίτερο βιολογικό ενδιαφέρον. 33

34 2.4 Εκδόσεις του BLAST Η κατ' αρχήν φιλοσοφία του αλγορίθµου δεν έχει αλλάξει σηµαντικά από την παρουσίασή του, το Ωστόσο έκτοτε έχει προταθεί ένα πλήθος παραλλαγών του, καθεµία από τις οποίες προσαρµόζεται στα δεδοµένα ενός εξειδικευµένου προβλήµατος. Σε γενικές γραµµές, στην πλειοψηφία των εφαρµογών όπου απαιτείται ευθυγράµµιση ακολουθιών, τα προγράµµατα της οικογένειας Basic BLAST. Παρόλ' αυτά, υπάρχουν εξειδικευµένα αλλά συνήθη προβλήµατα, όπως αυτά που περιγράφονται στην ενότητα του Specialized BLAST, για τα οποία αναπτύχθηκαν εξειδικευµένες, βελτιστοποιηµένες εκδόσεις του αλγορίθµου. Στη συνέχεια αναλύονται οι σηµαντικότερες εκδόσεις του αλγορίθµου Basic BLAST 1. Nucleotide BLAST BLASTn Πρόκειται για την γενική έκδοση του BLAST για αναζήτηση n-n. Αποτελεί τη βέλτιστη επιλογή για τον εντοπισµό παρόµοιων, αλλά όχι πανοµοιότυπων ακολουθιών. BLASTn - short Εκδοχή του blastn, βελτιστοποιηµένη για περιπτώσεις όπου που αφορούν µήκος ακολουθίας µικρότερο των 30 βάσεων. MEGABLAST Έχει ως βάση του έναν greedy αλγόριθµο (Webb Miller et al) τον οποίο χρησιµοποιεί προκειµένου να αναζητήσει οµοιότητες µεταξύ της query και της βάσης. Συνενώνει επιµέρους αναζητήσεις προκειµένου να εξοικονοµήσει χρόνο στην αναζήτηση της βάσης, υστερώντας έτσι σε ευαισθησία έναντι του BLASTn. Επιπλέον, προσφέρει την επιλογή ρύθµισης του αποδεκτού ορίου επί τοις εκατό οµοιότητας των ακολουθιών. Ο MEGABLAST αποδίδει βέλτιστα στο πρόβληµα της ευθυγράµµισης ακολουθιών που διαφέρουν σε πολύ µικρό ποσοστό. Έχει αποδειχτεί ότι µε χρήση µεγαλύτερης τιµής για το µήκος k των k-mers, µπορεί να γίνει έως και 10 φορές ταχύτερος από τα υπόλοιπα προγράµµατα ευθυγράµµισης ακολουθιών. Επιπλέον, έχει την δυνατότητα να χειρίζεται πολύ ακολουθίες πολύ µεγαλύτερου µήκους σε σύγκριση µε τον κλασικό blastn. Ωστόσο, εξαιτίας της µειωµένης ευαισθησίας του, δεν προτείνεται για εφαρµογές σχετικές µε τη διαπίστωση οµολογίας πρωτεϊνών ανάµεσα σε διαφορετικά είδη, και εν γένει εφαρµογές που συµπεριλαµβάνουν συσχέτιση σχετικά παρόµοιων γονιδίων. discontiguous MEGABLAST (dc - MEGABLAST) Αποδίδει βέλτιστα στην ευθυγράµµιση ακολουθιών που φέρουν µεν οµοιότητες σε ένα ποσοστό, αλλά δεν ταυτίζονται απόλυτα, όπως συµβαίνει στην περίπτωση των gapped alignments. Έτσι, είναι αποτελεσµατικότερος σε προβλήµατα όπως η σύγκριση γονιδιωµάτων διαφορετικών ειδών (crossspecies comparison), όπου αναζητούνται µακρινοί συγγενείς των προς εξέταση ακολουθιών. 34

35 2. Protein BLAST BLASTp Η βασική έκδοση του BLAST για σύγκριση πρωτεϊνών. Όπως και οι υπόλοιποι αλγόριθµοι της οικογένειας, έχει σχεδιαστεί για να εντοπίζει τοπικές ευθυγραµµίσεις. Ωστόσο στην περίπτωση που η ευθυγράµµιση εκτείνεται σε ολόκληρο το µήκος της ακολουθίας, ο BLASTp θα επιστρέψει πλήρη ευθυγράµµιση. BLASTp - short Ο κλασικός BLASTp, οµοίως µε τον αντίστοιχο BLASTn, συνήθως δεν θα επιστρέψει σηµαντικές αντιστοιχίες για ακολουθίες εισόδου µικρού µήκους (της τάξης των αµινοξέων). Ο BLASTp - short, εξειδικευµένος για αναζητήσεις ακολουθιών µικρού µήκους, δεν είναι παρά ο κλασικός BLASTp, µε ελαστικότερο αποδεκτό όριο για την E value και µικρότερο µήκος λέξης. Επίσης, ο πίνακας BLOSUM62 του κλασικού BLASTp αντικαθίσταται από τον πιο περιοριστικό PAM30 για αύξηση της ακρίβειας, καθώς για µικρού µήκους ακολουθίες είναι πιθανότερο να βρεθούν περίπου ακριβείς αντιστοιχίες στη βάση. PSI - BLAST (Position - Specific Iterated BLAST) Έχει σχεδιαστεί για πιο ευαίσθητες αναζητήσεις οµοιότητας πρωτεϊνικών ακολουθιών. Στην πραγµατικότητα είναι ο πιο ευαίσθητος BLAST, και συνεπώς χρησιµοποιείται στη συσχέτιση πρωτεϊνών µε µικρό ποσοστό οµοιότητας. Στην πρώτη ολοκλήρωση, ο PSI-BLAST πραγµατοποιεί µια κλασική p-p αναζήτηση. Κατασκευάζεται ένας position - specific scoring matrix (PSSM), ο οποίος είναι ένας πίνακας αναπαράστασης προτύπων, αναπαριστά οµάδα ακολουθιών και συγκεκριµένα προκύπτει από την ευθυγράµµιση των ακολουθιών που έχουν αποδεκτές τιµές E value, δηλαδή χαµηλότερες από το αντίστοιχο ανώτατο όριο (0,005 by default). Η κατασκευή του γίνεται ως εξής: Προβλέπεται µία σειρά για κάθε γράµµα του χρησιµοποιούµενου αλφαβήτου και µία στήλη για κάθε θέση στο πρότυπο που αναγνωρίστηκε ως κοινό µεταξύ των ακολουθιών. Κάθε στοιχείο του πίνακα αποτελεί απλά την συχνότητα εµφάνισης του αντίστοιχου χαρακτήρα (αµινοξέος) στην αντίστοιχη θέση του προτύπου, βάσει του πειραµατικού συνόλου της οµάδας των ακολουθιών που συγκεντρώθηκαν. Ο τελικός PSSM προκύπτει µε λογαριθµικό µετασχηµατισµό του πίνακα των συχνοτήτων. Στη δεύτερη ολοκλήρωση, η αναζήτηση επαναλαµβάνεται ωστόσο τώρα ο ίδιος ο PSSM εισάγεται ως query sequence. Οι αντιστοιχίες µε αποδεκτή E value που προκύπτουν από αυτή την αναζήτηση, συγκεντρώνονται σε ένα νέο PSSM, και η διαδικασία επαναλαµβάνεται. Ο αλγόριθµος συγκλίνει όταν κατά τη µεταβίβαση από µια ολοκλήρωση σε 35

36 επόµενη, δεν προστίθενται άλλες ακολουθίες. RPS - BLAST (Reverse Position Specific BLAST) Ο RPS - BLAST χρησιµοποιείται για την ανίχνευση διατηρηµένων τµηµάτων (conserved domains). Συγκρίνει την ακολουθία εισόδου σε µία βάση από PSSM (βλ. PSI - BLAST). CS BLAST Ο αλγόριθµος διαφέρει από τον κλασικό BLAST, καθώς εξετάζει την ακολουθία όχι αµινοξύ προς αµινοξύ, αλλά σε δωδεκάδες αµινοξέων (6 πριν και 6 µετά από κάθε συγκεκριµένη θέση). Οι πιθανότητες µετάλλαξης στον CS BLAST δεν ορίζονται µεταξύ αµινοξέων, αλλά µεταξύ δωδεκάδων. Ο αλγόριθµος είναι εξαιρετικά ευαίσθητος, και επιστρέφει σχεδόν διπλάσιο αριθµό συγγενών πρωτεϊνών συγκριτικά µε τον BLASTp, στην ίδια ταχύτητα και ποσοστό σφάλµατος. PHI BLAST (Pattern - Hit Initiated BLAST) Ο PHI - BLAST δέχεται δύο βασικές εισόδους: την query ακολουθία και ένα πρότυπο, το οποίο καθορίζει ο χρήστης. Ο αλγόριθµος αναζητά ακολουθίες που ικανοποιούν ταυτόχρονα δύο συνθήκες: περιέχουν το πρότυπο εισόδου και εµφανίζουν οµοιότητα µε την query ακολουθία ως προς τη σχέση µε το πρότυπο. Η δεύτερη συνθήκη είναι απαραίτητη προκειµένου να αφαιρεθούν από το σύνολο ακολουθίες που περιέχουν µεν το πρότυπο, ωστόσο δεν εµφανίζουν όντως οµολογία µε την query πρωτεϊνική ακολουθία. 3. BLASTx έχεται ως είσοδο νουκλεοτιδιακή ακολουθία, εξάγει το προϊόν της µετάφρασης και των δύο (συµπληρωµατικών) κλάδων της και αναζητά την πρωτεϊνική ακολουθία που παρήγαγε σε βάση αµινοξεϊκών ακολουθιών. Βασικό στοιχείο της διαδικασίας είναι το γεγονός ότι η µετάφραση γίνεται και µε τα 6 πιθανά πλαίσια 2 µε τα οποία µπορεί να γίνει (3 για κάθε αλυσίδα). 4. tblastn έχεται ως είσοδο αµινοξεϊκή ακολουθία και την αναζητά σε νουκλεοτιδιακή βάση δεδοµένων, την οποία πρωτίστως έχει µεταφράσει µε δυναµικό τρόπο. Η µετάφραση γίνεται και µε τα 6 δυνατά πλαίσια (δηλαδή ως προς και τις 2 συµπληρωµατικές αλυσίδες, καθεµία από τις οποίες µεταφράζεται και µε τα 3 δυνατά πλαίσια). Η µετάφραση της ακολουθίας και µε τα 6 δυνατά πλαίσια είναι ιδιαίτερα χρήσιµη στις περιπτώσεις όπου το πλαίσιο ανάγνωσης δεν είναι γνωστό ή έχει καταστραφεί λόγω λαθών που έχουν οδηγήσει σε µετατόπισή του. Η βασική του ουσιαστική διαφορά ως προς τον κλασικό BLASTp είναι το γεγονός ότι συχνά χρησιµοποιούνται βάσεις που περιέχουν νουκλεοτιδιακές ακολουθίες (expressed sequence tags, draft genome records) πέρα από αυτές που 2 Το πλαίσιο ανάγνωσης μιας ακολουθίας καθορίζεται κατά βάση από το σημείο εκκίνησης ανάγνωσης. Εφόσον κάθε αμινοξύ κωδικοποιείται από 3 νουκλεοτίδια, γίνεται φανερό ότι υπάρχουν μέχρι 3 δυνατά πλαίσια μετάφρασης για μια νουκλεοτιδιακή ακολουθία, εφόσον η μετάφραση βάσει ενός τετάρτου πλαισίου θα ήταν ταυτόσημη με αυτή του πρώτου, μείον το πρώτο αμινοξύ (το οποίο παραλείπεται). 36