ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΓΙΑ ΤΟ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΓΙΑ ΤΟ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ «Αλληλεπίδραση του αυξητικού παράγοντα πλειοτροπίνη με υποδοχείς του και εμπλοκή στις διεγερτικές δράσεις της απροτινίνης σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά και καρκινικά κύτταρα προστάτη» ΚΟΥΤΣΙΟΥΜΠΑ ΜΑΡΙΝΑ ΧΗΜΙΚΟΣ ΠΑΤΡΑ 2008

2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1 Αγγειογένεση 1 Αγγειογένεση και αυξητικοί παράγοντες με συγγένεια για την ηπαρίνη 6 Συντονισμός ενζυμικών συστημάτων για την προώθηση της 10 αγγειογένεσης Μεταλλοπρωτεϊνάσες 10 Σύστημα ενεργοποιητών του πλασμινογόνου/πλασμίνης 13 Απροτινίνη - μόριο με πολλαπλές δράσεις 16 Πλειοτροπίνη (Pleiotrophin, PTN) Εισαγωγικά 18 Πρωτεϊνική δομή του μορίου της PTN 20 Δομή του γονιδίου της PTN 22 Έκφραση και ρύθμιση του γονιδίου της PTN 24 Βιολογικές δράσεις της PTN 28 Σχέση δομής-βιολογικής δράσης 32 Υποδοχείς 36 Ν-Συνδεκάνη 39 RPTPβ/ζ 40 ALK 44 Νουκλεολίνη 47 PTN και καρκίνος 48 PTN στην καρκινική αγγειογένεση 48 Δομή του γονιδίου της PTN στον καρκίνο 49 Έκφραση της PTN στον ανθρώπινο καρκίνο 49 Βιολογική δράση της PTN στον καρκίνο 50 Στόχευση της έκφρασης της PTN στον καρκίνο 52 Υποδοχείς της PTN στον καρκίνο 53 PTN ως διαγνωστικός δείκτης 55 ΣΚΟΠΟΣ 57 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 61

3 Απομόνωση ενδοθηλιακών κυττάρων (HUVEC) από φλέβα ομφάλιου λώρου ανθρώπου 61 Παρασκευή πλήρους θρεπτικού μέσου για HUVEC 64 Παρασκευή πλήρους θρεπτικού μέσου για κύτταρα T98G, MO59K, U87MG, LN18 65 Παρασκευή πλήρους θρεπτικού μέσου για κύτταρα C6 66 Παρασκευή πλήρους θρεπτικού μέσου για κύτταρα LNCaP 66 Μέτρηση κυττάρων σε αιματοκυτταρόμετρο Neubauer 67 Ανακαλλιέργεια κυττάρων 68 Κατάψυξη κυττάρων HUVEC, T98G, MO59K, U87MG, LN18, C6, LNCaP 70 Απόψυξη κυττάρων HUVEC, T98G, MO59K, U87MG, LN18, C6, LNCaP 72 Εκχύλιση πρωτεϊνών από κύτταρα σε καλλιέργεια 74 Κατακρήμνιση πρωτεϊνών από πρωτεϊνικό εκχύλισμα κυττάρων σε 76 καλλιέργεια με οργανικό διαλύτη Εκτίμηση της συγκέντρωσης πρωτεϊνών σε διάλυμα 77 Ανοσοκατακρήμνιση πρωτεϊνών 78 Ανάλυση πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου σε 80 αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) Ανάλυση πρωτεϊνών κατά Western 83 Διαδικασία αποδέσμευσης αντισώματος από μεμβράνη PVDF (stripping) 86 Ποσοτικοποίηση ανοσοτυπωμάτων με σύστημα ανάλυσης εικόνας 87 Σταθερή διαμόλυνση LNCaP κυττάρων (stable transfection) 88 Επίδραση απροτινίνης και απομόνωση της PTN από το θρεπτικό μέσο 92 κύτταρων HUVEC και LNCaP Ζυμογράφημα θρεπτικού μέσου κυττάρων LNCaP έπειτα από επώαση με 93 σφαιρίδια ηπαρίνης-σεφαρόζης Χρώση πηκτώματος πολυακρυλαμιδίου με Coomasie 96 Διαμόλυνση των κυττάρων HUVEC και LNCaP με παρεμβαλλόμενο RNA (sirna) 97 Πείραμα μελέτης του χημειοτακτισμού των κυττάρων (transwell) 101 Μικρής κλίμακας απομόνωση πλασμιδιακού DNA (Miniprep) 103 Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων σε πήκτωμα αγαρόζης 104 Τεχνική ανίχνευσης δραστηριότητας του γονιδίου αναφοράς της

4 λουσιφεράσης στα κύτταρα LNCaP 106 Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων 109 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 111 Α. Μελέτη της αλληλεπίδρασης της ΡΤΝ με τους υποδοχείς της RPTPβ/ζ και 111 ALΚ A.1 Οι υποδοχείς RPTPβ/ζ και ALK ανιχνεύονται σε κύτταρα HUVEC, 112 LNCaP, T98G, MO59K, U87MG, LN18 και C6. Α.2 Η PTN αλληλεπιδρά με τη βαριά γλυκοζυλιωμένη μεγάλη διαμεμβρανική ισομορφή του RPTPβ/ζ στα κύτταρα HUVEC, LNCaP, 115 T98G, MO59K, U87MG, LN18 και C6. Α.3 Η διμερισμένη μορφή της PTN αλληλεπιδρά με τους υποδοχείς 117 RPTPβ/ζ και ALK A.4 Χαρακτηρισμός σταθερά διαμολυσμένων κυττάρων LNCaP που 118 υπερεκφράζουν τροποποιημένες μορφές της PTN. Β. Εμπλοκή της πλειοτροπίνης στις διεγερτικές δράσεις της απροτινίνης σε 120 ανθρώπινα ενδοθηλιακά και καρκινικά κύτταρα προστάτη. B.1 Επίδραση της απροτινίνης στο χημειοτακτισμό των κυττάρων 120 LNCaP και HUVEC. B.2 Επίδραση της απροτινίνης στην έκκριση της PTN στο θρεπτικό μέσο 122 των κυττάρων LNCaP και HUVEC. Β.3 Αυξημένα επίπεδα της MMP-2 στο θρεπτικό μέσο των κυττάρων 124 μετά από επίδραση απροτινίνης Πιθανή αλληλεπίδραση ΜΜΡ-2-ΡΤΝ. B.4 Η μείωση της έκφρασης του RPTPβ/ζ στα κύτταρα LNCaP και HUVEC έχει ως αποτέλεσμα την απώλεια της επαγωγικής δράσης της 126 απροτινίνης στο χημειοτακτισμό των κυττάρων. B.5 Η μείωση της έκφρασης της PTN στα κύτταρα LNCaP έχει ως αποτέλεσμα την απώλεια της επαγωγικής δράσης της απροτινίνης στο χημειοτακτισμό των κυττάρων. B.6 Η απροτινίνη επάγει την έκκριση της PTN, μέσω επαγωγής της μεταγραφικής δραστηριότητας του υποκινητή του αντίστοιχου γονιδίου σε κύτταρα LNCaP. B.7 Εμπλοκή των αλληλουχιών δέσμευσης του AP-1 στον

5 υποκινητή του γονιδίου της PTN, στην επαγόμενη από απροτινίνη 130 μεταγραφική δραστηριότητα. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 131 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 139 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 167 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ 169

6 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

7 Εισαγωγή ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ Αγγειογένεση ονομάζεται η δημιουργία νέων αγγείων από προϋπάρχοντα και αποτελεί μια θεμελιώδη διαδικασία για την ανάπτυξη νέων οργάνων και για τη διαφοροποίηση κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης, της επούλωσης πληγών και της αναπαραγωγικής διαδικασίας στους ενήλικες (Folkman, 1990; 2007). Με την παραπάνω διαδικασία επιτυγχάνεται η δημιουργία βοηθητικών αιμοφόρων αγγείων σε περιπτώσεις μειωμένης παροχής οξυγόνου και θρεπτικών συστατικών σε φυσιολογικούς ιστούς. Η αγγειογένεση συμμετέχει επίσης και σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις, όπως στη ρευματοειδή αρθρίτιδα, στη δημιουργία δερματικών κηλίδων που σχετίζονται με την ηλικία, σε παθήσεις του αμφιβληστροειδή χιτώνα, σε αυτοάνοσα νοσήματα (ψωρίαση), στην ανάπτυξη όγκων και τη μετάσταση, παρέχοντας διαρκώς φλεγμονώδη κύτταρα στην φλεγμονώδη περιοχή (Carmeliet, 2003; Carmeliet, 2005; Folkman, 2007). Η αγγειογένεση αποτελεί μια πολύπλοκη βιολογική διαδικασία που απαιτεί τον ακριβή συνδυασμό πολλαπλών διαφορετικών βημάτων όπως φαίνεται στην Eικόνα E1. Όλα τους ρυθμίζονται από μια λεπτή ισορροπία μιας ποικιλίας μορίων, αγωνιστών και ανταγωνιστών. Η προοπτική για τη θεραπεία των όγκων με αντι-αγγειογενετική θεραπεία έχει πάνω από 30 χρόνια που προτάθηκε για πρώτη φορά (Folkman, 1971). Οι όγκοι απαιτούν την παροχή αίματος για να επιτύχουν την αύξησή τους και τη μετάσταση. Η δημιουργία των νέων αγγείων θα τροφοδοτήσει τον όγκο με διάφορα μικρο- και μεγαλομόρια, καθώς και με πρωτεΐνες, γνωστές ως αυξητικούς παράγοντες, απαραίτητους για την εξάπλωσή του. Για το λόγο αυτό, η νεοαγγειογένεση αποτελεί προϋπόθεση για την ανάπτυξη μικρών όγκων σε μεγαλύτερους με μεταστατική ικανότητα και η αγγειογένεση αποτελεί ένα σημαντικό πιθανό στόχο για τη θεραπεία του καρκίνου (Carmeliet, 2005; Folkman, 2007). 1

8 Εισαγωγή (Folkman, 2007) Εικόνα Ε1: Απεικόνιση της αγγειογένεσης σε όγκους: Η αγγειοποιητίνη 1 (ANGPT1), η οποία εκφράζεται σε πολλούς τύπους κυττάρων, προσδένεται στον υποδοχέα ενδοθηλιακών κυττάρων TIE2 και συμβάλλει στη σταθεροποίηση του τοιχώματος των αγγείων. Ο VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), ένας από τους σημαντικότερους αγγειογενετικούς παράγοντες, εκκρίνεται από καρκινικά κύτταρα και προσδένεται στον υποδοχέα VEGFR2 και στη neuropilin, στην επιφάνεια ενδοθηλιακών κυττάρων. Μεταλλοπρωτεϊνάσες (MMPs) απελευθερώνονται από καρκινικά κύτταρα αλλά και από διεγερμένα με VEGF ενδοθηλιακά κύτταρα. Κινητοποιούν προαγγειογενετικούς παράγοντες από το στρώμα των όγκων και πρωτεολύουν το κολλαγόνο 18 και το πλασμινογόνο προς παραγωγή ενδοστατίνης και αγγειοστατίνης αντίστοιχα. Καρκινικά κύτταρα εκκρίνουν αγγειοποιητίνη 2 (ANGPT2), η οποία ανταγωνιζόμενη την ANGPT1 για πρόσδεση στον υποδοχέα TIE2, αυξάνει την αποικοδόμηση της μεμβράνης των αγγείων, διευκολύνοντας έτσι το σχηματισμό νέων αυλών. Ο αγγειογενετικός παράγοντας PDGF (Platelet Derived Growth Factor) παράγεται από όγκους, επάγοντας την έκφραση του υποδοχέα του (PDGFR) σε ενδοθηλιακά κύτταρα. Επιπλέον ο αυξητικός παράγοντας bfgf(basic Fibroblast Growth Factor) ή FGF2 είναι αγγειογενετικό μόριο που παράγεται από κάποιους όγκους. Οι ιντεγκρίνες αποτελούν μόρια που σηματοδοτούν τον προσανατολισμό των ενδοθηλιακών κυττάρων και διευκολύνουν την επικοινωνία τους με το εξωκυττάριο υλικό. Κάποιες αγγειογενετικές πρωτεΐνες επάγουν την έκφραση ιντεγκρινών, απαραίτητων για τη μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων στην περιοχή του όγκου. Τα νεοσχηματιζόμενα ενδοθηλιακά κύτταρα δεν προέρχονται αποκλειστικά από γειτονικά προϋπάρχοντα αγγεία, καθώς κάποια φθάνουν ως πρόδρομοι ενδοθηλιακών κυττάρων από το μυελό των οστών. Παρόμοια, οι συμμετέχοντες στην αγγειογενετική διαδικασία αυξητικοί παράγοντες δεν απελευθερώνονται στο ενδοθήλιο μόνο από το στρώμα του όγκου, αλλά κάποια ρυθμιστικά μόρια στρατολογούνται από αιμοπετάλια, όπου βρίσκονται αποθηκευμένα σε κοκκία και απελευθερώνονται έπειτα από διέγερση. Πρόσφατα έγινε γνωστό πως προ- και αντι-αγγειογενετικές πρωτεΐνες αποθηκεύονται σε διαφορετικά κοκκία. 2

9 Εισαγωγή Κατά την αγγειογένεση, τα κύτταρα του όγκου φέρονται να επιστρατεύουν κάποιες ήδη υπάρχουσες αγγειογενετικές πρωτεΐνες. Τα μεταλλαγμένα καρκινικά κύτταρα παράγουν αυτές τις πρωτεΐνες σε υψηλά επίπεδα ή ενεργοποιούν αγγειογενετικές πρωτεΐνες που υπάρχουν σε γειτονικούς ιστούς, ενώ μπορεί και να επάγουν άλλα είδη κυττάρων, όπως τα μακροφάγα, να απελευθερώνουν αγγειογενετικές πρωτεΐνες. Πάντως, ακόμα και με αυτούς τους μηχανισμούς, τα κακοήθη κύτταρα μπορεί να μην καταφέρουν να επάξουν την αγγειογένεση. Έχει δειχθεί ότι συγκεκριμένα καρκινικά κύτταρα παράγουν δυο είδη πρωτεϊνών: αυτές που επάγουν την αγγειογένεση και αυτές που την αναστέλλουν. Η ισορροπία μεταξύ τους καθορίζει το εάν ο όγκος θα επάγει την αγγειογένεση και το αν θα υπάρξει αγγειογένεση φαίνεται να οφείλεται κυρίως σε μείωση της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών που την καταστέλλουν (Πίνακας 1 και 2) (Liekens et al., 2001). Στο μέλλον ίσως γίνει πιθανή η χρήση μορίων που συμμετέχουν στην αγγειογένεση ως δείκτες για τον έλεγχο της έκβασης διαφόρων τύπων καρκίνου αλλά και μη νεοπλαστικών ασθενειών (αθηροσκλήρυνση, ενδομητρίωση, ρευματοειδής αρθρίτιδα κ.ά), οι οποίες εξαρτώνται από την αγγειογενετική διαδικασία (Folkman, 2007). Η διασπορά κακοηθών κυττάρων, τα οποία μέσω της κυκλοφορίας του αίματος καταλήγουν σε διάφορα σημεία του σώματος και επάγουν δευτερογενείς όγκους, καλείται μετάσταση. Κάθε αγγείο που τροφοδοτεί έναν όγκο μπορεί να αποτελέσει δυναμικό σημείο για απελευθέρωση καρκινικών κυττάρων στην κυκλοφορία. Τα λεμφικά αγγεία μπορούν επίσης να αποτελέσουν διόδους διασποράς για τα κακοήθη κύτταρα, αλλά οι όγκοι δεν επάγουν το δικό τους λεμφικό δίκτυο. Τα περισσότερα από τα καρκινικά κύτταρα που εγκαθίστανται σε κάποιο όργανο, επίσης πεθαίνουν. Μόνο αυτά που έχουν αρχίσει να πολλαπλασιάζονται θα δώσουν νέα αποικία, η οποία θα επεκταθεί όταν η αγγειογένεση ευνοήσει τη θρέψη της. Ο πλήρως σχηματισμένος δευτερογενής όγκος θα έχει τη δική του αγγείωση και θα γίνει μια νέα «πηγή» μεταστατικών κυττάρων (Liotta, 1992). Αρκετές έρευνες είναι εκείνες οι οποίες συσχετίζουν την αγγειοβρίθεια των όγκων και της ικανότητάς τους να προκαλούν μεταστάσεις. Αυτό δε σημαίνει ότι και όλοι οι αγγειοβριθείς όγκοι είναι δυνατόν να προκαλέσουν μεταστάσεις, σε πολλές όμως περιπτώσεις, η αναστολή της αγγειογένεσης μπορεί να περιορίσει την αύξηση τόσο του κύριου, όσο και των δευτερευόντων όγκων και να μειώσει σε σημαντικό βαθμό την πιθανότητα μετάστασης (Zetter, 1998). 3

10 Εισαγωγή Πίνακας 1: Επαγωγείς της αγγειογένεσης (Liekens et al., 2001). Επαγωγείς Δράση σε ενδοθηλιακά κύτταρα Πολλαπλασιασμός Μετανάστευση Διαφοροποίηση Αυξητικοί παράγοντες με συγγένεια με την ηπαρίνη VEGF PIGF FGF-1, FGF HARP + ; ; HIV-tat PDGF HGF/SF Αυξητικοί παράγοντες χωρίς συγγένεια με την ηπαρίνη TGF-α TGF-β Αναστολή - + EGF IGF-I Ρυθμιστές φλεγμονής TNF-α Αναστολή - + IL IL Προσταγλαδίνη E 1, E Ένζυμα PD-ECGF/TP - + COX Αγγειογενίνη Ορμόνες Οιστρογόνα Προλιφερίνη ; + ; Ολιγοσακχαρίτες Τμήματα υαλουρονικού οξέος Παράγοντες αιμοποίησης Ερυθροποιητίνη + + G-CSF + + ; GM-CSF + + ; Μόρια κυτταρικής προσκόλλησης VCAM ; Ε-σελεκτίνη Άλλα μόρια NO Αγγειοποιητίνη

11 Εισαγωγή Πίνακας 2: Ενδογενείς αναστολείς της αγγειογένεσης (Liekens et al., 2001). Αναστολέας Μηχανισμός δράσης σε ενδοθηλιακά κύτταρα (endothelial cells, EC) Πρωτεϊνικά θραύσματα Αγγειοστατίνη (πλασμινογόνου) Ενδοστατίνη (κολλαγόνου XVIII) aaat (αντιθρομβίνης 3) Προλακτίνη (θραύσμα 16 kda) Διαλυτοί ρυθμιστές TSP-1 Troponin I IFN-α IFN-γ PEDF IP-10 PF-4 IL-12 IL-4 VEGI TIMP-1, -2 PAI-1 Ρετινοϊκό οξύ Ang-2 2-μεθοξυοιστραδιόλη Ογκοκατασταλτικά γονίδια p53 VHL πολλαπλασιασμού και απόπτωσης EC πολλαπλασιασμού και απόπτωσης EC πολλαπλασιασμού και απόπτωσης EC πολλαπλασιασμού EC πολλαπλασιασμού και απόπτωσης EC πολλαπλασιασμού EC πολλαπλασιασμού και απόπτωσης EC, της επαγωγής της αγγειογένεσης από τον FGF-2 πολλαπλασιασμού EC και ΙΡ-10 μετανάστευσης EC και πολλαπλασιασμού EC που επάγεται από τον FGF-2 πολλαπλασιασμού EC, μετανάστευσης EC που επάγεται από τον FGF- 2 και την IL-8 πολλαπλασιασμού EC, μετανάστευσης EC που επάγεται από τον FGF- 2 και την IL-8 INF-γ και ΙΡ-10 μετανάστευσης EC πολλαπλασιασμού EC δραστικότητας των ΜΜΡs δραστικότητας του upa μετανάστευσης EC, μεταγραφικός παράγοντας ωρίμανσης των αγγείων, ανταγωνιστής της Ang-1 πολλαπλασιασμού, μετανάστευσης EC και απόπτωσης EC σύνθεσης TSP-1, σύνθεσης VEGF σύνθεσης VEGF Το μονοκλωνικό αντίσωμα Bevacizumab το οποίο εγκρίθηκε για θεραπεία καρκίνου του κόλον το 2004, είναι χρονολογικά το πρώτο φάρμακο που εγκρίθηκε ως εκλεκτικός αναστολέας της αγγειογένεσης. Παρόλα αυτά, διάφορα είδη κυττάρων που αποικούν το στρώμα του όγκου αλλά και καρκινικά κύτταρα, εκφράζουν υποδοχείς του VEGF (Mercurio et al., 2005; Parthymou et al., 2008), αυξάνοντας την πιθανότητα να δρα το φάρμακο και ως αντικαρκινικός παράγοντας. Σήμερα, πολλά φάρμακα έχουν εγκριθεί από τις Ηνωμένες Πολιτείες και την Ευρωπαϊκή Ένωση και εφαρμόζονται στην κλινική 5

12 Εισαγωγή πράξη ως αναστολείς της αγγειογένεσης. Τέτοια φάρμακα είναι τα Thalidomide, Bevacizumab, Gefitinib, Erlotinib, Pegaptanib, Endostatin, Sorafenib, Lenalidomide, Sunitinib, Ranibizumab, στα οποία υπερισχύει η αντιαγγειογενετική τους δράση σε σχέση με άλλες θεραπευτικές δράσεις τους και στοχεύουν κυρίως στην αντιμετώπιση του καρκίνου και της σχετιζόμενης με την ηλικία εκφύλισης της ωχράς κηλίδας. Οι τρεις γενικοί μηχανισμοί των αναστολέων της αγγειογένεσης που έχουν ήδη εγκριθεί από τον FDA, είναι η αναστολή παραγωγής αυξητικών παραγόντων όπως του VEGF από τη gefitinib, η απενεργοποίηση μέσω πρόσδεσης σε αυξητικούς παράγοντες όπως του VEGF από το bevacizumab και η αδρανοποίηση υποδοχέων αυξητικών παραγόντων όπως του VEGFR από τη sunitinib. Ακόμα, πληθώρα φαρμάκων με αντιαγγειογενετική δράση βρίσκονται σε κλινικές μελέτες φάσης ΙΙΙ, στοχεύοντας στη θεραπεία διαφόρων τύπων καρκίνου. Φάρμακα που έχουν ήδη εγκριθεί για αντικαρκινική θεραπεία όπως το bortezomib, το οποίο αποτελεί αναστολέας πρωτεασώματος για την θεραπεία πολλαπλού μυελώματος, έχουν δειχθεί να φέρουν και αντιαγγειογενετικές δράσεις (Folkman, 2007). Αγγειογένεση και αυξητικοί παράγοντες με συγγένεια για την ηπαρίνη Δεδομένης της σημασίας της αγγειογένεσης σε πολλές φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις, αρκετές είναι οι εργασίες που αναφέρονται στο χαρακτηρισμό και στην απομόνωση ρυθμιστικών πεπτιδίων που μπορούν να επάγουν ή να αναστέλλουν την αγγειογένεση. Η μελέτη των μορίων αυτών αποκάλυψε την πολυπλοκότητα των μηχανισμών που εμπλέκονται στη ρύθμιση της αγγειογένεσης. Μεταξύ αυτών που ρυθμίζουν με θετικό ή αρνητικό τρόπο την ενεργοποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων είναι και πολυπεπτίδια (κυτταροκίνες) τα οποία παράγονται τόσο από φυσιολογικά, όσο και από κύτταρα του όγκου και τα οποία εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό και στη διαφοροποίηση των κυττάρων. Αυτές οι κυτταροκίνες εκκρίνονται από τα κύτταρα και μπορούν να δεσμευτούν στο εξωκυττάριο υλικό και να ενεργοποιήσουν με άμεσο ή έμμεσο τρόπο τα ενδοθηλιακά κύτταρα σε μικρές συγκεντρώσεις. Ο όρος «αυξητικός παράγοντας» περιλαμβάνει μια ομάδα πολυπεπτιδίων με μικρά σχετικά μοριακά βάρη (μικρότερα από 50 kda), που αποτελούν μόρια κυτταρικής επικοινωνίας στους ανώτερους οργανισμούς. Οι αυξητικοί παράγοντες μεταφέρονται στο σημείο δράσης τους με το κυκλοφορικό σύστημα, με τρόπο παρόμοιο με εκείνο των ορμονών. Αυτό ισχύει για τον όξινο και βασικό αυξητικό παράγοντα των ινοβλαστών 6

13 Εισαγωγή (acidic fibroblast growth factor/ afgf, basic fibroblast growth factor/ bfgf) και για τους αυξητικούς παράγοντες που μοιάζουν με την ινσουλίνη 1 και 2 (Insulin-like Growth Factors, IGF-1 και IGF-2). Για άλλους αυξητικούς παράγοντες, όπως ο αυξητικός παράγοντας των αιμοπεταλίων (platelet-derived growth factor, PDGF), ο τρόπος δράσης είναι τις περισσότερες φορές πιο εντοπισμένος και πραγματοποιείται με διάχυση στους γειτονικούς ιστούς από την περιοχή σύνθεσής τους. Επομένως, είναι ικανοί να διεγείρουν τα ίδια τα κύτταρα που τους εκκρίνουν (αυτοκρινής τρόπος δράσης) ή διαφορετικά είδη κυττάρων (παρακρινής τρόπος δράσης). Πολλοί αυξητικοί παράγοντες φέρουν μεγαλύτερη ή μικρότερη συγγένεια δέσμευσης στην ηπαρίνη, ανάμεσα αστους οποίους είναι οι παρακάτω: Αυξητικός παράγοντας των ηπατοκυττάρων (Hepatocyte Growth Factor, HGF) Αυξητικός επιδερμικός παράγοντας που μπορεί να δεσμεύεται με την ηπαρίνη (Heparin Binding Epidermal Growth Factor, HB-EGF) Aυξητικοί παράγοντες των ινοβλαστών (Fibroblast Growth Factors, FGFs) Aυξητικοί παράγοντες των αιμοπεταλίων (Platelet-Derived Growth Factors, PDGFs) Aυξητικοί παράγοντες μετασχηματισμού (Transforming Growth Factors, TGF-βs) Aυξητικοί παράγοντες των ενδοθηλιακών κυττάρων (Vascular Endothelial Growth Factors, VEGFs) Μidkine (ΜΚ) Πλειοτροπίνη (PTN) Οι παραπάνω αυξητικοί παράγοντες δεσμεύονται στους υποδοχείς τους με υψηλή ή χαμηλή συγγένεια, δημιουργώντας ένα ενδοκυτταρικό σήμα, το οποίο μπορεί να προκαλέσει πλειάδα κυτταρικών αποκρίσεων, μέσω διαφόρων μονοπατιών μεταγωγής σήματος (Liekens et al., 2001). Ο VEGF αποτελεί έναν από τους βασικούς ρυθμιστές της αγγειογένεσης, Εναλλακτικό μάτισμα του γονιδίου του οδηγεί στη δημιουργία τεσσάρων κύριων ισομορφών (VEGF 121, VEGF 165, VEGF 189 και VEGF 206 ), με τον VEGF 165 να είναι η επικρατούσα ισομορφή (Ferrara et al., 2004). Η εξωκυτταρική πρωτεόλυση μπορεί να 7

14 Εισαγωγή παίζει ένα βασικό ρόλο στη ρύθμιση της βιοδιαθεσιμότητας του VEGF. Η πλασμίνη αποικοδομεί τον VEGF 165 ή τον VEGF 189 και απελευθερώνει ένα βιοδραστικό προϊόν που αποτελείται από τα πρώτα 110 αμινοτελικά αμινοξέα (Keyt et al, 1996). Δεδομένης της σημασίας της ενεργοποίησης του πλασμινογόνου κατά τη φυσιολογική και παθολογική αγγειογένεση (Pepper, 2001), ο μηχανισμός αυτός μπορεί να είναι ειδικά σημαντικός στη ρύθμιση της δραστηριότητας και της βιοδιαθεσιμότητας του VEGF, ως ανταπόκριση σε αλλαγές στο μικροπεριβάλλον των κυττάρων. Επιπλέον, πρωτεόλυση του VEGF από την MMP-9 μπορεί να ευθύνεται για την έναρξη της αγγειογένεσης σε μερικούς όγκους (Bergers et al., 2000). Μια καλά χαρακτηρισμένη δράση του VEGF είναι να προάγει την ανάπτυξη των αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων που προέρχονται από αρτηρίες, φλέβες και λεμφαγγεία (Ferrara et al., 1997). Ο VEGF επάγει μια πιθανή αγγειογενετική ανταπόκριση σε μια ποικιλία in vivo μοντέλων (Plouet et al., 1989). Επιπλέον, όπως προαναφέρθηκε, ο VEGF επάγει την αγγειακή διαπερατότητα και αυτή η ιδιότητά του υποδηλώνει σημαντικούς ρόλους αυτού του μορίου στη φλεγμονή και σε άλλες παθολογικές καταστάσεις (Dvorak, 2002). Αξίζει να αναφερθεί ότι ο VEGF επάγει επίσης την έκφραση αρκετών μορίων προσκόλλησης στο ενδοθήλιο, τα οποία ρυθμίζουν την προσκόλληση των λευκοκυττάρων κατά τη φλεγμονή (Medler et a.l, 1996) και αναστέλλει την απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων μέσω του μονοπατιού της κινάσης 3 φωσφατιδιλοϊνοσιτόλης (PI3K)/Akt (Gerber et al., 1998). Είναι σημαντικό να αναφερθεί ότι αν και τα ενδοθηλιακά κύτταρα αποτελούν τους πρωταρχικούς στόχους του VEGF, εντούτοις, αρκετές μελέτες έχουν δείξει επίσης μιτογόνο δράση σε συγκεκριμένα, μη επιθηλιακά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των νευρικών κυττάρων (Carmeliet, 2003). Οι πρωτεογλυκάνες θειϊκής ηπαράνης μπορούν να δράσουν ως περιοχή δέσμευσης χαμηλής συγγένειας για τον VEGF. Οι ισομορφές του VEGF που δεσμεύονται στην ηπαρίνη μπορούν να δεσμευτούν στην κυτταρική επιφάνεια και στις πρωτεογλυκάνες θειϊκής ηπαράνης που σχετίζονται με τo εξωκυττάριo υλικό και μπορούν να απελευθερώσουν αγγειογενετικούς παράγοντες, όπως τον bfgf, οι οποίοι συσσωρεύονται σε θειϊκές ηπαράνες του εξωκυττάριου υλικού. Η παρατήρηση αυτή είναι σημαντική γιατί ο VEGF και ο bfgf έχουν συνεργιστική δράση, όσον άφορα στην ικανότητά τους στην επαγωγή της αγγειογένεσης. Πρωτεογλυκάνες θειϊκής ηπαράνης μπορούν επίσης να δράσουν και ως ένας χώρος εξωκυτταρικής αποθήκευσης για τις ισομορφές του VEGF 8

15 Εισαγωγή που δεσμεύονται στην θειϊκή ηπαράνη. Οι πρωτεογλυκάνες θειϊκής ηπαράνης ρυθμίζουν την αλληλεπίδραση αρκετών αυξητικών παραγόντων που δεσμεύονται στην ηπαρίνη με τους αντίστοιχους υποδοχείς τους, και επομένως της βιολογική τους δραστηριότητα (Stringer, 2006). Η οικογένεια των FGFs αποτελείται από πρωτεΐνες μοριακού βάρους 18 έως 30 kda με ηψηλή συγγένεια για την ηπαρίνη. Το ανθρώπινο γονίδιο του FGF-2 κωδικοποιεί πρωτεϊνικές ισομορφές μεγέθους 18 έως 24 kda, οι οποίες φέρουν αγγειογενετική (πλειοτροπική) δράση in vivo, επάγοντας τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την παραγωγή u-pa και του υποδοχέα του σε ενδοθηλιακά κύτταρα. Επιπλέον ο FGF-2 επάγει το σχηματισμό αυλών σε υπόστρωμα κολλαγόνου, την έκφραση ιντεγκρινών, καθώς και του VEGF και του υποδοχέα του in vitro. Εκφράζεται σε πολλούς κυτταρικούς τύπους και συσσωρεύεται στον εξωκυττάριο χώρο. Έχει διατυπωθεί πως η πρόσδεση του FGF-2 σε πρωτεογλυκάνες θειϊκής ηπαράνης οδηγεί στην προστασία του αυξητικού παράγοντα από αδρανοποίηση και αποθήκευσή του στο εξωκυττάριο υλικό. Ο αποθηκευμένος FGF-2 απελευθερώνεται έπειτα από προσθήκη ηπαρίνης, ηπαριτινάσης ή αποικοδόμησης του εξωκυταρικού υλικού. Έχει προταθεί το μοντέλο με βάση το οποίο η αλληλεπίδραση του FGF-2 με πρωτεογλυκάνες θειϊκής ηπαράνης, είναι απαραίτητη για την πρόσδεση του αυξητικού παράγοντα στον υποδοχέα του. Ο επαγόμενος από ηπαρίνη ολιγομερισμός του FGF-2 πιθανά είναι απαραίτητος για το διμερισμό και την ενεργοποίηση του υποδοχέα του. Ο FGF-2 φαίνεται να εμπλέκεται τόσο στη φυσιολογική, όσο και στην παθολογική αγγειογένεση και παράγεται από πολλές καρκινικές κυτταρικές σειρές in vitro, παίζοντας σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και την αγγείωση όγκων (Liekens et al., 2001). Σύμφωνα με τα παραπάνω, η συσσώρευση αυξητικών παραγόντων στο εξωκυττάριο υλικό εξυπηρετεί τη βιοδιαθεσιμότητα τους και για το λόγο αυτό, σε ορισμένες περιπτώσεις τροποποίησης της σύστασης του εξωκυττάριου υλικού, παρατηρείται επίσης αλλαγή σε κυτταρικές λειτουργίες. Ακόμα φαίνεται πως η αλληλεπίδραση με πρωτεογλυκάνες θειϊκής ηπαράνης, πιθανώς είναι απαραίτητη για την πρόσδεση αυξητικών παραγόντων στους υποδοχείς τους και άρα τη βιολογική τους δραστικότητα. Συνολικά, μεγάλος αριθμός αυξητικών παραγόντων δεσμεύονται στην ηπαρίνη και συμμετέχουν στην αύξηση καρκινικών όγκων και στην αγγειογένεση, μεταξύ των οποίων είναι και η PTN (Rauvala, 1989, Li et al., 1990, Courty et al., 1991). 9

16 Εισαγωγή Συντονισμός ενζυμικών συστημάτων για την προώθηση της αγγειογένεσης Κατά τη διάρκεια της αγγειογένεσης, δύο ενζυμικά συστήματα είναι υπεύθυνα για την αποικοδόμηση μορίων του εξωκυττάριου υλικού. Οι πρωτεϊνάσες σερίνης (ενεργοποιητές του πλασμινογόνου και πλασμίνη) και οι MMPs. Oι ενεργοποιητές του πλασμινογόνου μετατρέπουν το πλασμινογόνο σε πλασμίνη, η οποία μπορεί να αποικοδομεί πολλά συστατικά του εξωκυττάριου υλικού, να ενεργοποιεί αρκετές MMPs και να ενεργοποιεί ή/και να απελευθερώνει αυξητικούς παράγοντες. Τα δύο ενζυμικά συστήματα δρουν συντονισμένα προκειμένου να προωθήσουν την αγγειογένεση (Carmeliet and Collen, 1998). Ωστόσο, μερικές MMPs είναι δραστικές ως πρωτεϊνάσες του ινώδους, μέσω ενός μονοπατιού ανεξάρτητου από ενεργοποιητές του πλασμινογόνου (Ηiraoka et al., 1998), αποδεικνύοντας ότι οι δύο οικογένειες πρωτεϊνασών, σε αντίθεση με ότι ήταν παλιότερα αποδεκτό, αλληλεπικαλύπτονται λειτουργικά. Οι MMPs -1, -2 και - 3 και κυρίως η MTI-MMP, αποικοδομούν το ινώδες, διευκολύνοντας τη διείσδυση και τη μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro παρουσία αναστολέων πρωτεϊνασών σερίνης, κυστεΐνης και ασπαραγίνης (Ηiroka et al., 1998). Οι παρατηρήσεις αυτές υποδεικνύουν πως τα ενδοθηλιακά κύτταρα μεταναστεύουν στο ινώδες του εξωκυττάριου υλικού κατά ένα μη εξαρτώμενο από πλασμίνη τρόπο, και πιθανώς λόγω άμεσης ενεργοποίησης των MMPs (Hotary et al., 2000). Mεταλλοπρωτεϊνάσες Η πρώτη ένδειξη πως οι MMPs εμπλέκονται στη διαδικασία της αγγειογένεσης προέκυψε από το ότι οι TIMPs και συνθετικοί αναστολείς των MMPs μπορούν να μειώσουν σημαντικά τον in vitro σχηματισμό αυλών από τα ενδοθηλιακά κύτταρα (Schnaper et al., 1993). Τα ενδοθηλιακά κύτταρα που αναπτύσσονται in vitro παράγουν MMP-1 ή MMP-13, MMP-3, MMP-2, MMP-9 και MMP-14 (MTI-MMP) (Cornelius et al., 1995; Schnaper et al., 1993; Lewalle et al., 1995), οι οποίες έχουν συσχετιστεί με αγγειογένεση, καρκινική ανάπτυξη και μετάσταση (Nishizuka et al., 2001; Egeblad et al., 2002; McCawley and Matrisian, 2001). Ανάμεσα στις MMPs, σημαντικό ρόλο στην αγγειογένεση παίζουν οι MMP-2 και MMP-9, γνωστές και ως ζελατινάση Α και Β αντίστοιχα. Οι MMPs 2 και 9 αναγνωρίστηκαν αρχικά σε καρκινικά κύτταρα ως κολλαγενάσες τύπου IV, επειδή βρέθηκαν να αποικοδομούν το κολλαγόνο τύου IV της 10

17 Εισαγωγή βασικής μεμβράνης (Salo et al., 1985). Αργότερα βρέθηκε ότι μπορούν επίσης να αποικοδομούν κολλαγόνο τύπου Ι (ζελατίνη) (Collier et al., 1988; Goldbarg et al., 1989). Ένα μοναδικό χαρακτηριστικό αυτών των δύο MMPs είναι η παρουσία στην καταλυτική τους περιοχή, τριών επαναλήψεων της τύπου ΙΙ αλληλουχίας της ινονεκτίνης, υπεύθυνων για δέσμευση στη ζελατίνη (Strongin et al., 1993). Η διαφορά μεγέθους μεταξύ της ζελατινάσης Α (72 kda) και Β (92 kda) οφείλεται στη μεγαλύτερη, πλούσια σε προλίνες περιοχή της ζελατίνης Β. Εκτός από τις εκκρινόμενες MMPs, υπάρχουν και διαμεμβρανικού τύπου ένζυμα, όπως η ΜΤ1-ΜΜΡ. Tόσο η MMP-2 όσο και η MTI-MMP έχουν αναγνωριστεί ως μόρια κλειδιά για τη μετάσταση πολλών τύπων καρκίνου (Sato et al., 1997; Minn et al., 2005) και την αγγειογένεση (Gomis et al., 2007). Σε ενδοθηλιακά κύτταρα μικραγγείων αρουραίου, η MMP-2 παράγεται συνεχώς, αλλά όταν τα κύτταρα καλλιεργούνται σε τρισδιάστατο πήκτωμα κολλαγόνου τύπου Ι, επάγεται σημαντικά η παραγωγή MMP-2 και MTI-MMP (Haas et al., 1998). Εκτός από την αποικοδόμηση του εξωκυτταρικού υλικού (Butler et al., 2004; Chambers et al., 1997, Nagase et al., 1999), οι MMPs έχουν και άλλες δράσεις, όπως την απελευθέρωση αγγειογενετικών αυξητικών παραγόντων (Stupack et al., 2002; Colnot et al., 2003; Itoh et al., 1998; Kato et al., 2001; Vu et al., 1998; Zhou et al., 2000). Eνδογενείς ιστικοί αναστολείς των MMPs αλλά και συνθετικά φάρμακα αποτελούν ισχυρούς αναστολείς της αγγειογένεσης (Johnson et al., 1994; Lozonschi et al., 1999; Anand-Apte et al., 1997). Συνθετικοί αναστολείς των MMPs έχουν χρησιμoποιηθεί επιτυχώς στην αναστολή ανάπτυξης αγγείων σε μοντέλα ζώων, στα οποία προκαλείται αγγειογένεση από αυξητικούς παράγοντες (Galardy et al., 1994; Wojtowicz-Praga et al., 1997). Αυτοί οι αναστολείς μειώνουν την αύξηση όγκων, προφανώς λόγω των αντιαγγειογενετικών δράσεών τους (Wojtowicz-Praga et al., 1997). Δυστυχώς, οι αναστολείς αυτοί έχουν υψηλή συγγένεια για πολλές MMPs και δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη διαλεύκανση του ρόλου συγκεκριμένων MMPs στην διαδικασία της αγγειογένεσης. Ενδιαφέρον είναι ότι οι επίμυες που δεν εκφράζουν την MMP-2 αναπτύσσονται φυσιολογικά, χωρίς προφανείς ή ανιχνεύσιμες ανατομικές ή αγγειακές ανωμαλίες. Ωστόσο, η αγγειογένεση που επάγεται από όγκους σε αυτά τα ζώα είναι μειωμένης έκτασης (Ιtoh et al., 1998). Tο γονίδιο που κωδικοποιεί την MMP-2 διαφέρει σημαντικά από των άλλων MMPs, λόγω του ότι δε διαθέτει στην περιοχή του υποκινητή την αλληλουχία TATA, 11

18 Εισαγωγή ούτε θέσεις για την πρόσδεση του AP-1 μεταγραφικού παράγοντα (Huhtala et al., 1990; Harendza et al., 1995; Corcoran et al., 1996). Στα περισσότερα κυτταρικά συστήματα συμπεριλαμβανομένων και των ενδοθηλιακών κυττάρων, η MMP-2 εκφράζεται σταθερά, και η μεταγραφή δε ρυθμίζεται από ερεθίσματα αυξητικών παραγόντων. Ακόμα θεωρείται πως ο μεταγραφικός έλεχγος της MTI-MMP μπορεί να είναι σημαντικός για ενεργοποίηση της MMP-2, αντιπροσωπεύοντας ένα σημείο ελέγχου του συγκεκριμένου μονοπατιού πρωτεϊνασών. Η μεταγραφή της MTI-MMP του ανθρώπου διεγείρεται από φορβολικό εστέρα, δείχνοντας ότι εξαρτάται από μονοπάτια μεταγωγής σήματος όπoυ εμπλέκεται η PKC (Foda et al., 1996). Ωστόσο, το γονίδιο δεν ανταποκρίνεται σε αυξητικούς παράγοντες, όπως είναι ο EGF, ο bfgf και ο TGF-β1 (Lohi et al., 1996). Ανάλυση του υποκινητή της MTI-MMP στον επίμυ δείχνει ότι το γονίδιο αυτό (όπως και το γονίδιο της MMP-2), δε φέρει την αλληλουχία TATA και δεν ανταποκρίνεται σε ερέθισμα αυξητικού παράγοντα, όπως ο TGF-β1 (Haas and Madri, 1999). Μία περιοχή του υποκινητή πλούσια σε GC, απαιτείται για τη μεταγραφική δραστηριότητα και περιέχει μερικά επικαλυπτόμενες θέσεις δέσμευσης για τους μεταγραφικούς παράγοντες Sp1 (Specificity protein 1) και Erg-1. Σε ενδοθηλιακά κύτταρα αρουραίου, η περιοχή δέσμευσης του μεταγραφικού παράγοντα Erg-1 δεν είναι παρούσα στον υποκινητή της MMP-2 και φαίνεται ότι διαφορετικά μονοπάτια μεταγωγής σήματος πρέπει να διεγείρονται προκειμένου να ενεργοποιηθεί η μεταγραφή των γονιδίων των MTI-MMP και MMP-2. Στο μοντέλο της χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης (chorioallantoic membrane, CAM) τις πρώιμες φάσεις ανάπτυξης (μεταξύ έκτης και όγδοης ημέρας), όταν η ανάπτυξη των αγγείων είναι μέγιστη, βρέθηκε ότι η δραστικότητα της MMP-2 και η έκφραση της ινονεκτίνης είναι δύο σχετιζόμενες μεταξύ τους παράμετροι κατά τη διάρκεια της αγγειογένεσης in vivo (Ribatti et al., 1999). Σε ενδοθηλιακά κύτταρα αρουραίου, επαγωγή της MMP-2 και της MT1-MMP συμβαίνει όταν τα κύτταρα καλλιεργούνται μέσα ή πάνω σε κολλαγόνο τύπου Ι και όχι όταν αναπτύσσονται πάνω σε υλικό πλούσιο σε λαμινίνη (matrigel) (Haas et al., 1998). Παρόμοια αποτελέσματα έχουν αναφερθεί και για τα καρκινικά κύτταρα, τα οποία ενεργοποιούν την MMP-2 όταν καλλιεργούνται σε πήκτωμα κολλαγόνου τύπου Ι, αλλά όχι όταν καλλιεργούνται σε ινονεκτίνη, κολλαγόνο τύπου IV ή matrigel (Azzam et al., 1992). Οι παραπάνω ενδείξεις προτείνουν ότι οι υποδοχείς προσκόλλησης στο εξωκυττάριο υλικό μπορεί να είναι υπεύθυνοι για την έναρξη μεταγωγής σήματος που καταλήγει στην παραγωγή MMPs. Οι ιντεγκρίνες, που είναι οι κύριοι υποδοχείς 12

19 Εισαγωγή προσκόλλησης στο εξωκυτταρικό υλικό, φαίνεται να εμπλέκονται σ αυτή τη διαδικασία. Η επαγωγή και ενεργοποίηση των MMPs, που προκύπτει μετά από προσκόλληση σε συγκεκριμμένα συστατικά εξωκυττάριου υλικού μέσω ιντεγκρινών, φαίνεται να εξαρτάται από τον κυτταρικό τύπο. Σε ινοβλάστες, η δέσμευση της ιντεγκρίνης α 5 β 1 στην RGD αλληλουχία της ινονεκτίνης έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση παραγωγής MMP-1, ενώ η δέσμευση της α 4 β 1 στην CS1 αλληλουχία της ινονεκτίνης καταστέλλει τη μεταγραφή της MMP-1 (Huhtala et al., 1995). Θεωρείται πως η ιντεγκρίνη α 2 β 1 εμπλέκεται στην έκφραση αυξημένων ποσών ΜΜP-2 και της MTI-MMP, σε διεγερμένα ενδοθηλιακά κύτταρα αρουραίου που καλλιεργούνται σε κολλαγόνο τύπου Ι (Αzzam et al., 1992; Haas et al., 1998). Αλληλεπίδραση προσδέτη με τον υποδοχέα α ν β 3 ενισχύει τις δράσεις της MMP-2 (Seftor et al., 1993), με την οποία φαίνεται να αλληλεπιδρά άμεσα (Brooks et al., 1996). Από την άλλη πλευρά, αύξηση της επιθετικότητας κυττάρων μελανώματος, η οποία παρατηρείται έπειτα από αλληλεπίδραση του υποδοχέα με προσδέτη, λαμβάνει χώρα παράλληλα με την αύξηση προσδεδεμένου στην κυτταρική επιφάνεια συστήματος πλασμινογόνου/πλασμίνης. Η διατήρηση του συστήματος πλασμινογόνου/πλασμίνης στην κυτταρική επιφάνεια, πιθανά εξυπηρετεί τη μέγιστη διαθεσιμότητα πρωτεϊνών του εξωκυττάριου υλικού ως υποστρώματα της πρωτεολυτικής δράσης της πλασμίνης, την προστασία της πλασμίνης από κυκλοφορούντες αναστολείς πρωτεϊνασών, όπως η α2- αντιπλασμίνη (Seftor et al., 1993), ή/και τη γειτνίαση της πλασμίνης σε υποστρώματα μεταλλοπρωτεϊνασών όπως την MMP-2 και την MMP-9 (Ginestra et al., 1997; Mazzieri et al., 1997). Σύστημα ενεργοποιητών του πλασμινογόνου/πλασμίνης Το ινώδες είναι ένα προσωρινό υλικό που σχηματίζεται μετά από τραυματισμό ενός αγγείου και όταν το πλάσμα αρχίσει να διαρέει, όπως συμβαίνει συχνά σε περιοχές φλεγμονής και στους όγκους (Dvorak et al., 1992). Tο ινώδες αποτελεί φραγμό που εμποδίζει την περαιτέρω απώλεια αίματος, αλλά περιέχει και μία δομή, στην οποία νέα τριχοειδή μπορούν να διεισδύσουν κατά τη διάρκεια της επούλωσης πληγών. Ο σωστός συγχρονισμός δημιουργίας αυτών των τριχοειδών αγγείων, καθώς και η επακόλουθη εξαφάνισή τους, είναι προϋπόθεση, προκειμένου να ολοκληρωθεί η επούλωση της πληγής και να μην αλλοιωθεί ο ιστός. Είναι πλέον αποδεκτό ότι οι ενεργοποιητές του πλασμινογόνου παίζουν πρωταγωνιστικό ρόλο στη μετανάστευση και διείσδυση 13

20 Εισαγωγή λευκοκυττάρων και ενδοθηλιακών κυττάρων και στη λύση του ινώδους, μέσω επαγωγής της πλασμίνης (Koolwijk et al., 1996; Kwaan et al., 1996; Pepper et al., 1990; Van Hinsbergh et al., 1997). Στο σύστημα ενεργοποιητών πλασμινογόνου/πλασμίνης (PA) περιλαμβάνονται δύο τύποι ενεργοποιητών, ο τύπος ουροκινάσης (u-pa) και ο ιστικός τύπος (t-pa: tissuetype plasminogen activator). Είναι γενικά αποδεκτό πως ο u-pa είναι το ένζυμο που σχετίζεται περισσότερο με τη βιολογία των όγκων, ενώ ο t-pa έχει κύριο ρόλο την παραγωγή πλασμίνης για τη λύση ινώδους στα αγγεία. Υπάρχουν δύο κύριοι ενδογενείς αναστολείς των PAs, ο PAI-1 και ο PAI-2. O υποδοχέας του upa (u-par: upa receptor), είναι μία μεγάλη πρωτεΐνη ακινητοποιημένη στην κυτταρική μεμβράνη, δεσμεύει τον u- PA και με αυτόν τον τρόπο συγκεντρώνει τη δραστικότητα ενεργοποίησης του πλασμινογόνου στις επιφάνειες των κυττάρων (Mignatti et al., 1993). Tο σύστημα των PAs δεν εμπλέκεται μόνο στη μετανάστευση και διείσδυση των καρκινικών κυττάρων, αλλά και σε άλλες διαδικασίες που συνολικά χαρακτηρίζονται ως επαγόμενη από τα καρκινικά κύτταρα αναδιάρθωση του περιβάλλοντα ιστού (Hanahan et al., 1996). Επιπρόσθετα, το ενζυμικό αυτό σύστημα έχει λειτουργίες που είναι ανεξάρτητες από την πλασμίνη, αλλά που σχετίζονται με τη μεταγωγή σήματος και τις αλληλεπιδράσεις των PAI και u-par με ιντεγκρίνες και τη βιτρονεκτίνη του εξωκυττάριου υλικού (Wei et al.,1994, Mignatti et al., 1993). Ο κλασικός ρόλος του συστήματος PA/πλασμίνης στην αλληλεπίδραση κυττάρου-υποστρώματος και κυττάρου-κυττάρου, είναι η αποικοδόμηση των υποδοχέων προσκόλλησης και των αντίστοιχων προσδεμάτων τους στο εξωκυτταρικό υλικό, μέσω παραγωγής της πλασμίνης (Dano et al., 1985; Mignatti et al., 1993). Παρόλα αυτά, κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες, η δέσμευση του u-pa στον υποδοχέα του, προάγει την προσκόλληση κυττάρου στο υπόστρωμα, υποδηλώνοντας το ρόλο του u-par ως υποδοχέα προσκόλλησης. Με δεδομένο επίσης ότι u-par και ιντεγκρίνες συνυπάρχουν στις ίδιες περιοχές της κυτταρικής επιφάνειας, γίνεται φανερό ότι ο u-par και ο u-pa επιδρούν στην προσκόλληση των κυττάρων ρυθμίζοντας λειτουργίες των ιντεγκρινών, προφανώς μέσω άμεσης εξωκυτταρικής σύνδεσης u-par/ιντεγκρίνης (Simon et al., 1996). H παραγωγή ενεργοποιητών του πλασμινογόνου από ενδοθηλιακά κύτταρα παίζει σημαντικό ρόλο στην παρεμπόδιση της θρόμβωσης και επιπλέον συμβάλλει στις πρωτεολυτικές διαδικασίες που σχετίζονται με το σχηματισμό τριχοειδών αγγείων στις 14

21 Εισαγωγή πληγές. Εάν αποθηκευτεί ινώδες στον αυλό ενός αγγείου, ακολουθεί παρεμπόδιση της ροής του αίματος, με επακόλουθη ισχαιμία και θάνατο απομακρυσμένων ιστών. Το ενδοθήλιο συνεισφέρει στην ομοιόσταση ροής του αίματος εκκρίνοντας αντιπηκτικά μόρια, παρέχοντας παράγοντες που σχετίζονται με τη συνάθροιση των αιμοπεταλίων και διεγείροντας τη λύση του ινώδους. Η λύση του ενδοαγγειακού ινώδους πρέπει να πραγματοποιείται ταχύτατα, ενώ είναι απαραραίτητο να περιορίζεται σε μία συγκεκριμένη περιοχή, αφού γενικευμένη και ανεξέλεγκτη λύση του ινώδους οδηγεί σε αιμορραγία (Van Hinsbergh et al., 1992). Τα κύτταρα ανταπεξέρχονται επαρκώς σε όλες τις πολύπλοκες αυτές διαδικασίες, συντονίζοντας στο χώρο και στο χρόνο τη σύνθεση και τη δραστικότητα των δύο τύπων ενεργοποιητών του πλασμινογόνου, των αντίστοιχων αναστολέων τους καθώς και των υποδοχέων τόσο των PAs όσο και του πλασμινογόνου. H πλασμίνη έχει μέγεθος 90 kda και αποτελείται από δύο πολυπεπτιδικές αλυσίδες που συνδέονται μεταξύ τους με δύο δισουλφιδικούς δεσμούς. Η αλυσίδα Α (αμινοτελική) αποτελείται από 5 περιοχές που καλούνται δακτύλιοι (kringles), οι οποίες είναι πλούσιες σε λυσίνη και είναι υπεύθυνες για τη δέσμευση της πλασμίνης στο ινώδες. Η Β αλυσίδα της πλασμίνης περιέχει μία τυπική περιοχή πρωτεϊνάσης σερίνης που είναι υπεύθυνη για την καταλυτική δραστικότητα. Η πλασμίνη καταλύει την υδρόλυση πεπτιδικών δεσμών στην καρβοξυτελική περιοχή λυσίνης και αργινίνης (Hortin et al., 1989). Η παραγωγή πλασμίνης στην επιφάνεια του κυττάρου έχει ως αποτέλεσμα, πέραν της αποικοδόμησης τoυ ινώδους, την αποικοδόμηση και άλλων πρωτεϊνών του εξωκυττάριου υλικού, με μόνη εξαίρεση τα κολλαγόνα (Dano et al., 1985; Mignatti et al., 1993). Επίσης, καταλύει την ενεργοποίηση του πρόδρομου TGF-B (transforming growth factor) και απελευθερώνει bfgf από το εξωκυττάριο υλικό (Mignatti et al., 1993). Τέλος, η πλασμίνη συνεισφέρει στην ενεργοποίηση των ανενεργών, πρόδρομων MMPs. Πειράματα σε επίμυες, όπου είχαν κατασταλεί τα γονίδια για u-pa, t-pa και πλασμινογόνο, επιβεβαίωσαν τη σημασία του συστήματος PA/πλασμίνης στην ενεργοποίηση των MMP-3, MMP-9, και MMP-13, ενώ ανέδειξαν την ύπαρξη ενός επιπρόσθετου μηχανισμού ενεργοποίησης της MMP-2 (Lijnen et al., 1998). 15

22 Εισαγωγή Απροτινίνη - μόριο με πολλαπλές δράσεις Η απροτινίνη είναι ένα πολυπεπτίδιο μοριακού βάρους 6,5 kda, που αναστέλλει μία πλειάδα πρωτεϊνασών σερίνης όπως πλασμίνη, θρομβίνη, καλλικρεΐνες, συνθάσες ΝΟ, την ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C, τρυψίνη, χυμοτρυψίνη κ.ά. Χάρη στην ικανότητά της να αναστέλλει την πλασμίνη, χορηγείται σήμερα ως αιμοστατικό κυρίως σε εγχειρήσεις παράκαμψης της στεφανιαίας αρτηρίας (bypass) (Blauhut et al., 1991; Samama et al., 2002), θώρακος (Bedirhan et al., 2001) και πρόσφατα σε καρδιοαναπνευστικές εγχειρήσεις (Levy et al., 2006). Είναι γενικώς αποδεκτό πως σε συγκέντρωση >125 KIU/ ml, η απροτινίνη φέρει ευεργετικές δράσεις στη ρύθμιση της αιμόστασης (Lentschener et al., 1997), καθώς η δραστικότητα της πλασμίνης αναστέλλεται >90% σε αυτήν τη συγκέντρωση (Royston et al., 2001; Peters et al., 1999). Μέσω άμεσης αναστολής της πλασμίνης και της επαγόμενης από καλλικρεΐνη ενεργοποίησης του t-pa, η ινωδολυτική δράση της πλασμίνης μειώνεται κατά δοσοεξαρτώμενο τρόπο από την απροτινίνη (Engles et al., 2005). Η απροτινίνη αποτελεί ενδογενή αναστολέα που εντοπίζεται στο εσωτερικό των κυττάρων, ενώ μόρια που μοιάζουν με την απροτινίνη εντοπίζονται σε ποικιλία οργάνων, όπως είναι ο εγκέφαλος, η παρωτίδα, οι πνεύμονες, το πάγκρεας και ο σπλήνας, καθώς και σε ιστούς που διαθέτουν σε αφθονία σιτευτικά κύτταρα (Fioretti et al., 1985). Επίσης, η απροτινίνη ανιχνεύεται στο πλάσμα και άλλα βιολογικά υγρά (Fioretti et al., 1993), ενώ έχει την ικανότητα να εισέρχεται στο εσωτερικό του κυττάρου (Hill et al., 1997) και να αναστέλλει τη δράση μεταγραφικών παραγόντων, όπως του NF-kB, και επομένως την έκφραση γονιδίων (Venturini et al., 1998). O τρόπος με τον οποίο η απροτινίνη αναστέλλει πρωτεϊνάσες σερίνης, είναι μέσω δέσμευσης στο ενεργό τους κέντρο με ετεροπολικούς δεσμούς. Η σταθερότητα του μορίου οφείλεται σε τρεις δισουλφιδικούς δεσμούς, ενώ η πλούσια σε λυσίνες και αλανίνες περιοχή του βασικού πολυπεπτιδίου, αντιπροσωπεύει το ενεργό του κέντρο (Bode et al., 1992; Capasso et al., 1997). Εκτός από τις πρωτεϊνάσες σερίνης, όπως είναι η πλασμίνη, η απροτινίνη αναστέλλει επιπλέον το σύμπλοκο στρεπτοκινάσηςπλασμινογόνου, το οποίο δε διαθέτει ενζυμική δραστικότητα, αλλά έχει ως αποτέλεσμα την αλλαγή της δομής του πλασμινογόνου, ώστε να ακολουθήσει πέψη ελεύθερων μορίων πλασμινογόνου και σχηματισμός πλασμίνης (Royston et al., 1995). Πάντως, είναι γνωστό πως η απροτινίνη αφενός δεν είναι εκλεκτικός αναστολέας της πλασμίνης, αφετέρου έχει 16

23 Εισαγωγή και πολλές άλλες δράσεις άσχετες από τη δράση της ως αναστολέας πρωτεΐνασών (Venturini et al., 1998). Πολλές από αυτές θεωρούνται ότι ευθύνονται για την αντιφλεγμονώδη της δράση, όπως π.χ. η μείωση της παραγωγής ΝΟ (Ulker et al., 2001; Ulker et al., 2002), δραστικών μορφών οξυγόνου (Shimoyama et al., 2005; Eser et al., 2007), διαφόρων προ-φλεγμονωδών κυτταροκινών (Türköz et al., 2001; Isbir et al., 2001; Tassani et al., 2000) και μορίων προσκόλλησης, όπως του μορίου προσκόλλησης των αγγείων 1 (VCAM-1) αλλά όχι της E-σελεκτίνης, σε ενεργοποιημένα από TNF-a ενδοθηλιακά κύτταρα (Asimakopoulos et al., 2001). Από την άλλη πλευρά, η χορήγηση απροτινίνης σε καρδιοπνευμονικές εγχειρήσεις έχει αμφισβητηθεί λόγω πιθανής πρόκλησης νεφρικής δυσλειτουργίας (D Ambra et al., 1996; Mangano et al., 2007), ίσως μέσω αλληλεπίδρασης της απροτινίνης με αναστολείς του μετατρεπτικού ενζύμου της αγγειοτενσίνης (Kincaid et al., 2005) ή αύξησης της παραγωγής MMPs (Drewyer et al., 2007). Συνολικά, η απροτινίνη έχει δειχθεί πως αποτελεί μόριο με πολλαπλές δράσεις, ενώ οι μοριακοί μηχανισμοί που διαμεσολαβούν τις δράσεις της δεν έχουν ως τώρα διαλευκανθεί. 17

24 Εισαγωγή ΠΛΕΙΟΤΡΟΠΙΝΗ (Pleiotrophin, PTN) Εισαγωγικά H PTN είναι αυξητικός παράγοντας μεγέθους 15 kda. Παρουσιάζει 55% ομολογία στην αμινοξική αλληλουχία με τη midkine (MK) και περιέχει 10 υψηλά συντηρημένες κυστεΐνες στο μόριό του. Οι δυο αυτές πρωτεΐνες αποτελούν μια διακριτή οικογένεια αυξητικών παραγόντων που εμφανίζουν λειτουργικές, αλλά όχι δομικές, ομοιότητες με την οικογένεια των FGF (Zhang et al., 1999) και παρουσιάζουν συγγένεια με την ηπαρίνη (Ohyama et al., 1994). Εκτός από την αμινοξική τους ομολογία, η PTN και η MK χρησιμοποιούν επίσης τους ίδιους υποδοχείς και έχουν κοινές βιολογικές δράσεις, οι πιο καλά χαρακτηρισμένες από τις οποίες είναι η επαγωγή των νευριτών και η ανάπτυξη των όγκων (Papadimitriou et al., 2004). Στη βιβλιογραφία συναντάται με διαφορετικές ονομασίες, όπως PTN, HARP (heparin affin regulatory peptide) ή HB-GAM (heparin-binding growth associated molecule), γεγονός που οφείλεται στο ότι η απομόνωση του μορίου αυτού έγινε συγχρόνως σε διάφορα εργαστήρια και από διαφορετικά είδη ιστών. Στον Πίνακα 3 παρουσιάζονται οι διαφορετικές ονομασίες με τις οποίες συναντούμε τη PTN στη βιβλιογραφία, η προέλευσή της και το είδος από το οποίο απομονώθηκε. Συγκεκριμένα, η PTN έχει βρεθεί σε νευρωνικούς ιστούς, στην καρδιά, στο χόνδρο και στα οστά. Στο μαστικό αδένα, στη μήτρα και στον προστάτη το μόριο αυτό εκφράζεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα των τριχοειδών αγγείων. Υψηλά επίπεδα του γονιδίου αυτού εκφράζονται σε αρκετούς ανθρώπινους όγκους, μεταξύ των οποίων είναι το νευροβλάστωμα, το γλοιοβλάστωμα, ο καρκίνος του προστάτη και του πνεύμονα (Papadimitriou et al., 2004). 18

25 Εισαγωγή Πίνακας 3: Οι διαφορετικές ονομασίες και πηγές απομόνωσης της PTN. Σύντμηση PTN Πλήρες όνομα Heparin-Affin Regulatory Peptide Μορφή Προέλευση Είδος Παραπομπή Πρωτεΐνη Εγκέφαλος Βους Courty et al., 1991 HB-GAM Heparinbinding growthassociated molecule Πρωτεΐνη cdna Γονιδιωματικό DNA Καρδιά Εγκέφαλος Ήπαρ Όρνιθα Αρουραίος Μυς Hampton et al., 1992 Merenmies and Rauvala, 1990 Naito et al., 1992 HBGF-8 Heparinbinding growthfactor-8 p18 Protein 18 kda Πρωτεΐνη Μήτρα/ Ορός Βους Άνθρωπος Πρωτεΐνη Εγκέφαλος Αρουραίος Βους Milner et al., 1989 Novotny et al., 1993 Rauvala, 1989 Novotny et al., 1993 PTN Pleiotrophin Πρωτεΐνη cdna Καρκινικά κύτταρα από πνεύμονα Καρκινικά κύτταρα από πνεύμονα, Πλακούντας Μήτρα Άνθρωπος Άνθρωπος Βους Wellstein et al., 1992 Wellstein et al., 1992 Maier et al., 1990 Γονιδιωματικό DNA Εγκέφαλος Άνθρωπος Lai et al., 1992 Milner et al., 1992 Lai et al., 1995 HBNF Heparinbinding neurotrophic factor cdna Εγκέφαλος Αρουραίος Άνθρωπος Kovesdi et al., 1990 Kretschmer et al., 1991 Γονιδιωματικό DNA Εγκέφαλος/ Πλακούντας Άνθρωπος Pencil et al., 1993 OSF-1 Osteoblastspecific factor-1 cdna Γονιδιωματικό DNA Οστεοβλάστες Ήπαρ Μυς Μυς Tezuka et al., 1990 Lai et al., 1992 Milner et al.,

26 Εισαγωγή Πρωτεϊνική δομή του μορίου της PTN Το φαινομενικό μοριακό βάρος της PTN, όπως υπολογίστηκε από SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση, είναι 18 kda. Το νούμερο όμως αυτό δεν αντικατοπτρίζει την αμινοξική αλληλουχία στο ώριμο πολυπεπτίδιο, αφού φασματοφωτομετρικές μελέτες έδωσαν μοριακό βάρος 15,291 kda (Hampton et al., 1992). Η διαφοροποιημένη κινητικότητα του μορίου της PTN στην SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση, σε αντίθεση με την αμινοξική αλληλουχία, οφείλεται στη μεγάλη περιεκτικότητα του μορίου σε βασικά αμινοξέα (Courty et al., 1991). Η πρωτογενής δομή της PTN, όπως αποκαλύφθηκε από cdna κλώνους, αποτελείται από 168 αμινοξέα (Εικόνα Ε2), τα οποία είναι υψηλά συντηρημένα σε διαφορετικά είδη, όπως στον άνθρωπο, στον αρουραίο, στο βόδι και στην όρνιθα (Li et al., 1990). Η PTN περιέχει μια υψηλά υδρόφοβη αμινοτελική αλληλουχία 32 αμινοξέων, η οποία αντιστοιχεί στο πεπτίδιο-σινιάλο του μορίου, και ένα υδρόφιλο αμινοτελικό άκρο (Merenmies and Rauvala, 1990). Η αποκοπή του σηματοδοτικού αυτού πεπτιδίου φαίνεται να είναι εξαρτώμενη από το είδος του κυττάρου και οδηγεί στην παραγωγή δυο διαφορετικών μοριακών τύπων, οι οποίοι διαφέρουν σε μια αύξηση τριών αμινοξέων στο αμινοτελικό άκρο του μορίου, με αποτέλεσμα να προκύπτουν πρωτεΐνες 136 και 139 αμινοξέων (Bernard-Pierrot et al., 2001). Μ S S Q Q Y Q Q Q R R K F A Α A F L A L I F I L A Α V D T A E A G K Κ E K P E K Κ V K Κ S D C G E W Q W S V C V P T S G T C G L G T R E G T R T G A E C K Q T M K T Q R C K I P C N W K Κ Q F G A E C K Y Q F Q A W G E C D L N T A L K T R T G S L T R A L H N A D C Q K T V T I S K P C G K L T K P K P Q A E S K Κ K Κ K E G K Κ Q E K M L D Εικόνα Ε2: Αμινοξική αλληλουχία της PTN. Το υπογραμμισμένο τμήμα αντιστοιχεί στο πεπτίδιο-σινιάλο. Διακρίνονται έντονα βαμμένα τα τρία επιπλέον αμινοξέα της επιμηκυσμένης μορφής του μορίου. Η ώριμη πρωτεΐνη αποτελείται κατά 24% από βασικά αμινοξέα, κυρίως λυσίνες, και περιέχει 10 κυστεΐνες. Οι 28 λυσίνες οργανώνονται σε δυο αλληλουχίες στο αμινοτελικό και καρβοξυτελικό άκρο του μορίου και οι κυστεΐνες σχηματίζουν πέντε δισουλφιδικούς δεσμούς ανάμεσα στις αλυσίδες, οι οποίοι και καθορίζουν την τριτοταγή δομή του μορίου. 20

27 Εισαγωγή Έχει αναφερθεί ότι τέσσερις από αυτές παραμένουν αδέσμευτες (Hampton et al., 1992), ενώ υπάρχει και η άποψη ότι όλες συμμετέχουν στη δημιουργία δισουλφιδικών δεσμών (Fabri et al., 1992). Η πρωτογενής μορφή της PTN περιέχει επίσης τρεις περιοχές που φέρουν το μοτίβο K-R/K-X-R/K και έχουν τη δυνατότητα πυρηνικών στόχων (Chelsky et al., 1989). Έχει αναφερθεί η δέσμευση της PTN στη νουκλεολίνη, γεγονός που οδήγησε στην υπόθεση της μεταφοράς της PTN στον πυρήνα (Take et al., 1994). Επίσης, δεν περιέχει αμινοτελικά συνδεδεμένες θέσεις γλυκοζυλίωσης (Merenmies et al., 1990), κάτι που οδήγησε στην υπόθεση ότι η PTN δεν υφίσταται μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις. Υπάρχει μια αλληλουχία στο καρβοξυτελικό άκρο που είναι ομόλογη με ενεργές θέσεις αναστολέων πρωτεασών τύπου Kazal (Kazal-type), αν και η PTN δεν παρουσιάζει ενεργότητα έναντι στην τρυψίνη (Kuo et al., 1990). Η τριτοταγής δομή του μορίου της PTN οργανώνεται σε δυο β-δομές, οι οποίες συνδέονται μεταξύ τους με έναν εύκαμπτο συνδέτη, και κάθε μια από αυτές τις δομές περιέχει τρεις αντιπαράλληλες β-πτυχές. Οι καρβοξυτελική και αμινοτελική, πλούσιες σε λυσίνες περιοχές δε σχηματίζουν κάποια ανιχνεύσιμη δομή και εμφανίζονται πιθανώς να σχηματίζουν α-έλικες (Εικόνα Ε3). Κάθε μια από τις β-δομές περιέχει από μια περιοχή πρόσδεσης στην ηπαρίνη και αυτές οι περιοχές θεωρούνται ότι παρουσιάζουν ομολογία με το μοτίβο της επαναλαμβανόμενης αλληλουχίας της θρομβοσπονδίνης τύπου Ι, που εντοπίζεται στο εξωκυττάριο υλικό και σε πρωτεΐνες της κυτταρικής επιφάνειας (Kilpelainen et al., 2000). Ωστόσο, πιο πρόσφατες έρευνες έδειξαν ότι αυτές οι αντιπαράλληλες β-πτυχές της PTN παρουσιάζουν πολύ μικρή αμινοξική ομολογία με τις TSP1 (thrombospondin 1) αλληλουχίες και έχουν διαφορετική τρισδιάστατη δομή (Roszmusz et al., 2002). Η PTN υπόκειται σε δομικές αλλαγές κατά την πρόσδεσή της με την ηπαρίνη και η πρόσδεση λαμβάνει χώρα πρώτιστα μέσω των β- δομών της πρωτεΐνης. Η πρόσδεση μειώνεται δραματικά κατά την αναγωγή των δισουλφιδικών δεσμών της PTN (Kilpeainnen et al., 2000). 21

28 Εισαγωγή Εικόνα Ε3: Σχηματική αναπαράσταση της τριτοταγούς δομής της πρωτεΐνης της PTN. Οι β- πτυχές αντιπροσωπεύονται από τα βέλη και οι α-έλικες στο αμινοτελικό και καρβοξυτελικό άκρα από τους κυλίνδρους. Διακρίνονται επίσης και οι πέντε δισουλφιδικοί δεσμοί. Οι αριθμοί αντιστοιχούν στα αντίστοιχα αμινοξέα της πρωτεΐνης (Papadimitriou et al., 2004). Δομή του γονιδίου της PTN Το γονίδιο της PTN στον άνθρωπο καταλαμβάνει πάνω από 65 kb, περιέχει τουλάχιστον επτά εξόνια και το ελάχιστο μέγεθός του είναι 42 kb (Lai et al., 1992; Kretshmer et al., 1993). Το m-rna της PTN οργανώνεται σε πέντε εξόνια με συνολικό μέγεθος 1650 νουκλεοτίδια (Kretshmer et al., 1993). Το πεπτίδιο σινιάλο, καθώς και τα πρώτα πέντε αμινοξέα του ώριμου μορίου εντοπίζονται στο εξόνιο 2, ενώ το μεγαλύτερο τμήμα της κωδικής περιοχής της πρωτεΐνης εντοπίζεται στα εξόνια 3 και 4 (Kretshmer et al., 1993). Η 5 μη μεταφρασμένη περιοχή (5 -UTR) καλύπτει ολόκληρο το εξόνιο 1 (U1), ενώ στο ανθρώπινο γονίδιο και στο γονίδιο του επίμυος έχει αναφερθεί μια επιπρόσθετη 5 -UTR περιοχή (U2) (Lai et al., 1995; Sato et al., 1997). Πιθανές ερμηνείες των διαφοροποιημένων θέσεως έναρξης της μεταγραφής του γονιδίου της PTN είναι αφενός πως η μεταγραφή αποτελεί μία εξαρτώμενη από τον κυτταρικό τύπο διαδικασία και 22

29 Εισαγωγή αφετέρου πως λαμβάνει χώρα εναλλακτικό μάτισμα στο γονίδιο της PTN, όπως συμβαίνει και στην περίπτωση της ομόλογης πρωτεΐνης MK (Kretshmer et al., 1993). Οι 3 - και 5 - μη μεταφρασμένες περιοχές του γονιδίου της PTN στον άνθρωπο παρουσιάζουν υψηλή ομολογία με τα αντινοηματικά cdnas της hsp (heat shock protein) 70 και της L17 πρωτεΐνης του ριβοσώματος (Lai et al., 1992). Ανάλυση του επαγωγέα της PTN στον άνθρωπο αποκάλυψε την απουσία της TATA περιοχής και την παρουσία της CCAAT περιοχής, η οποία εντοπίστηκε 91 νουκλεοτίδια πριν (upstream) από τη θέση έναρξης τη μεταγραφής. Έχουν ανιχνευθεί επίσης στοιχεία απόκρισης σε ορό και ρετινοϊκό οξύ (Lai et al., 1992) και αλληλουχίες για περιοχές πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων: τέσσερις πιθανές περιοχές για MyoD (myogenic factor D), δυο για AP-1 (Activator protein-1), μια για GT1 (Li et al., 1992) και μία για HOXA5 (Homeobox A5) (Chen et al., 2005). Το γονίδιο της PTN στον επίμυ περιορίζεται σε πέντε εξόνια και τέσσερα ιντρόνια και δεν καταλαμβάνει περισσότερες από 32 kb (Katoh et al., 1992). Στην 5 περιοχή στο γονίδιο της PTN στον επίμυ εντοπίζονται δυο επαγωγείς (Ι και ΙΙ). Και οι δυο περιέχουν τις περιοχές CCAAT και TATA και αλληλουχίες ρυθμιστικών στοιχείων, όπως το στοιχείο απόκρισης στο cαmp (camp responsive element), την περιοχή δέσμευσης του SP-1 (Specificity protein 1) και το στοιχείο απόκρισης της θυρεοειδικής ορμόνης στον επαγωγέα Ι και το στοιχείο απόκρισης των γλυκοκορτικοειδών στον επαγωγέα ΙΙ (Sato et al., 1997). Το γονίδιο της PTN στo ψάρι zebrafish αποτελείται από 5 εξόνια και 4 ιντρόνια μεγέθους περίπου 82 kb, συγκρινόμενο με το ανθρώπινο γονίδιο της PTN μεγέθους περίπου 115 kb. Τα ιντρόνια 1 και 4 και των δύο γονιδίων είναι 60,3 kb και 14,7 kb αντίστοιχα για το γονίδιο της PTN στo zebrafish, και 88,5 kb και 23,2 kb για το ανθρώπινο γονίδιο της PTN. Oι ομοιότητες της δομής του γονιδίου της PTN στον άνθρωπο, στον επίμυ, στο zebrafish και της δομής του γονιδίου της ΜΚ, οδήγησε στην πρόταση ότι εξελίχθηκαν τους από κοινό πρόγονο (Chang et al., 2004). Το γονίδιο της PTN στον άνθρωπο εντοπίζεται στον μεγάλο βραχίονα του 7 ου χρωμοσώματος, στις περιοχές (Li et al., 1992). Όσο για τα γονίδια της PTN στα τρωκτικά αυτά έχουν βρεθεί στα χρωμοσώματα 4 και 6 στον επίμυ και στον αρουραίο αντίστοιχα (Hornum et al., 1996). Οι πρωτεΐνες Miple 1 και Miple 2 έχουν ταυτοποιηθεί στην Drosophila Melanogaster και θεωρούνται νέα μέλη της διακριτής οικογένειας της PTN και ΜΚ. Tα 23