ΤΣΙΡΜΟΥΛΑ ΣΩΤΗΡΙΑ Φαρμακοποιός

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ Μελέτη της μεταγωγής σήματος από τον αυξητικό παράγοντα πλειοτροπίνη σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά και καρκινικά κύτταρα προστάτη ΤΣΙΡΜΟΥΛΑ ΣΩΤΗΡΙΑ Φαρμακοποιός ΠΑΤΡΑ, 2008

2 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Μοριακής Φαρμακολογίας του Τμήματος Φαρμακευτικής, του Πανεπιστημίου Πατρών. Ένα μεγάλο ευχαριστώ οφείλω στην Επίκουρο Καθηγήτρια του Τμήματος Φαρμακευτικής Παπαδημητρίου Ευαγγελία η οποία μου έδωσε την ευκαιρία να δοκιμαστώ στην έρευνα, με εμπιστεύτηκε και κυρίως με δίδαξε τον τρόπο σκέψης και τις αναζητήσεις που οφείλει να έχει καθημερινά ένας ερευνητής. Ακόμη, θα ήθελα να ευχαριστήσω τους Καθηγητές του Τμήματος Φαρμακευτικής Σωκράτη Τζάρτο και Παπαπετρόπουλο Ανδρέα που δέχτηκε να συμμετάσχει στην Τριμελή Εξεταστική Επιτροπή, για τις εύστοχες παρατηρήσεις και συμβουλές. Ιδιαίτερη μνεία οφείλω στο Ίδρυμα Κρατικών Υποτροφιών. Η οικονομική ενίσχυση που μου παρείχε σε όλη τη διάρκεια της διατριβής μου συνέβαλε στην απρόσκοπτη ενασχόλησή μου με το ερευνητικό μου αντικείμενο αλλά και στη συγγραφή του παρόντος κειμένου. Συμαντική ήταν η υποστήριξη από τους φίλους μου στο εργαστήριο, ιδιαίτερα θα ήθελα να πώ ένα μεγάλο ευχαριστώ στην Θεοχάρη Κατερίνα, στην Καϊσή Έλενα και στον Κουκαλίωτη Αναστάσιο γιατι ήταν δίπλα μου σε κάθε στιγμή.

3 Αφιερωμένο στον πατέρα μου Νικόλαο Τσιρμούλα

4 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

5 Εισαγωγή Εισαγωγή Ε.1 Βασικά χαρακτηριστικά της καρκινικής ανάπτυξης Η καρκινική ανάπτυξη στον άνθρωπο είναι μια πολυσταδιακή διαδικασία, κατά την οποία τα φυσιολογικά κύτταρα υφίστανται γενετικές αλλαγές που σχετίζονται με την αύξηση, τη διαφοροποίηση και την επιβίωσή τους και μετασχηματίζονται σε καρκινικά. Στα φυσιολογικά κύτταρα απαντούν δύο κατηγορίες γονιδίων, τα πρωτο-ογκογονίδια (proto-oncogenes) που μετέχουν στην κυτταρική αύξηση και τα ογκοκατασταλτικά γονίδια (tumor suppressor genes), τα οποία καταστέλλουν τη διαίρεση των κυττάρων. Τα καρκινικά κύτταρα φέρουν μεταλλάξεις στα πρωτο-ογκογονίδια ή/και στα ογκοκατασταλτικά γονίδια σε πολλαπλές θέσεις, οι οποίες επιδρούν στους ρυθμιστικούς μηχανισμούς που είναι υπεύθυνοι για το φυσιολογικό πολλαπλασιασμό και την ομοιόσταση των κυττάρων. Αν και για να καταστεί ένα κύτταρο καρκινικό απαιτούνται περισσότερες από μία γονιδιακές μεταλλαγές, έχει βρεθεί ότι οι γονότυποι των καρκινικών κυττάρων εμφανίζουν έξι μεταβολές στη φυσιολογία τους που οδηγούν συλλογικά στην ογκογένεση. Οι μεταβολές αυτές είναι η αυτονομία στην παραγωγή μηνυμάτων για αύξηση και η ικανότητα αντίστασης σε μηνύματα που αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό, η αντίσταση στην απόπτωση, η απεριόριστη δυνατότητα κυτταρικού πολλαπλασιασμού, η επιθετικότητα και η μετάσταση, και η αγγειογένεση. Οι αλλαγές αυτές απαντούν σε όλους σχεδόν τους τύπους καρκίνου στον άνθρωπο (Hanahan et al., 2000). Τα φυσιολογικά κύτταρα, προκειμένου να πολλαπλασιαστούν, δέχονται σήματα για επαγωγή του πολλαπλασιασμού τους από αυξητικούς παράγοντες, οι οποίοι δεσμεύονται σε διαμεμβρανικούς υποδοχείς που βρίσκονται στην επιφάνεια των κυττάρων. Η αντίδραση αυτή μεταβιβάζει το μήνυμα σε μια πληθώρα μορίων στο εσωτερικό του κυττάρου, όπως είναι οι πρωτεΐνες της εξωκυτταρικής ύλης, καθώς και μόρια που ρυθμίζουν την κυτταρική προσκόλληση και τις κυτταρικές αλληλεπιδράσεις. Η αλληλουχία των αντιδράσεων μεταγωγής αυξητικών 1

6 Εισαγωγή μηνυμάτων στα φυσιολογικά κύτταρα είναι αυστηρά ελεγχόμενη και υπεύθυνη για τη συμπεριφορά των διαφόρων κυτταρικών τύπων μέσα σε έναν ιστό. Τα καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν την ικανότητα να πολλαπλασιάζονται, χωρίς να δέχονται μηνύματα ενεργοποίησης από το μικροπεριβάλλον. Αυτή η ικανότητα αφορά σε αλλαγές στους εξωκυτταρικούς αυξητικούς παράγοντες, στους υποδοχείς που δεσμεύονται αυτά τα μόρια, ή στους ενδοκυτταρικούς μηχανισμούς μεταγωγής σήματος. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η εκτοπική έκφραση της ανθρώπινης καταλυτικής υπομονάδας της αντίστροφης μεταγραφάσης της τελομεράσης (human telomerase reverse transcriptase, htert), σε συνδυασμό με τα ογκογονίδια h-ras (Retrovirus Associated Sequence oncogene, ras oncogene) και το Τ αντιγόνο του ιού SV40, μπορούν να επάγουν τη μετατροπή φυσιολογικών επιθηλιακών κυττάρων και ινοβλαστών σε καρκινικά κύτταρα, διαταράσσοντας τα ενδοκυτταρικά μονοπάτια μεταγωγής σήματος που ρυθμίζονται από τα γονίδια αυτά (Lunberg et al., 2002; Liu et al., 2004). Τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να συνθέτουν αυξητικούς παράγοντες με αυτοκρινή δράση, όπως η παραγωγή του αυξητικού παράγοντα των αιμοπεταλίων (platelet derived growth factor, PDGF) στο γλοιοβλάστωμα, του αυξητικού παράγοντα μετασχηματισμού α (transforming growth factor α, TGFα) στα σαρκώματα (Hanahan et al., 2000) και της πλειοτροπίνης (pleiotrophin, PΤΝ) στα καρκινικά κύτταρα ανθρώπινου προστάτη (Hatziapostolou et al.,2005). Επιπλέον, οι υποδοχείς των αυξητικών παραγόντων, κυρίως όσοι εμφανίζουν ενεργότητα κινάσης τυροσίνης στην κυτταροπλασματική τους περιοχή, υπερεκφράζονται κατά την καρκινική ανάπτυξη, π.χ. η έκφραση του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα EGF-R/erbB είναι αυξημένη σε καρκίνο του στομάχου, του εγκεφάλου και σε όγκους του μαστού (Hanahan et al.,2000). Αυτή η υπερέκφραση των υποδοχέων, καθώς και οι δομικές αλλαγές που εμφανίζουν οι τελευταίοι, φαίνεται ότι επιτρέπουν στα καρκινικά κύτταρα να ανταποκρίνονται σε αυξημένα επίπεδα έκφρασης διαφόρων αυξητικών παραγόντων (Richter and Zhang, 2005). 2

7 Εισαγωγή Καρκινικά κύτταρα και Απόπτωση Μια από τις θεμελιώδεις λειτουργίες του κυττάρου είναι ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος ή απόπτωση. Η απόπτωση χαρακτηρίζεται από μορφολογικές αλλαγές που περιλαμβάνουν συρρίκνωση του κυττάρου και διόγκωση της κυτταρικής μεμβράνης, συμπύκνωση και κατακρήμνιση της χρωματίνης και κατάτμηση του πυρήνα, καθώς και από βιοχημικές μεταβολές, όπως ενεργοποίηση των κασπασών (Zagzag et al., 2000). Η απόπτωση ενεργοποιείται από διάφορα εξωγενή ερεθίσματα που περιλαμβάνουν: α) την ιοντίζουσα ακτινοβολία, β) τη δράση κυτταροκινών, π.χ. του καρκινικού παράγοντα νέκρωσης α (TNF- α), γ) τη μεταβίβαση σημάτων θανάτου με τη δέσμευση του μορίου FAS (FAS ligand) στον υποδοχέα του, δ) την απώλεια συνδέσεων με την εξωκυτταρική ύλη, ε) τη δημιουργία υποξίας και την παραγωγή δραστικών μορφών του οξυγόνου (Zagzag et al., 2000). Πολλά από τα σήματα που ενεργοποιούν την απόπτωση των κυττάρων συσσωρεύονται στα μιτοχόνδρια, τα οποία ανταποκρίνονται σε προ-αποπτωτικά μηνύματα, απελευθερώνοντας το κυτταρόχρωμα C (Hanahan D et al., 2000; Kim et al., 2005). Πρωτεΐνες με προ-αποπτωτική (Bax, Bak, Bid, Bim) ή αντι-αποπτωτική δράση (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-W) ρυθμίζουν τις αντιδράσεις μεταγωγής σήματος που οδηγούν στο θάνατο των μιτοχονδρίων μέσω της απελευθέρωσης του κυτταροχρώματος C (Zhang et al.,2004; Harada and Grant, 2003). Επίσης, η ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη p53 επάγει την απόπτωση, αυξάνοντας την έκφραση του προ-αποπτωτικού γονιδίου Bax, όταν υπάρχει βλάβη στο DNA. Οι βασικοί τελεστές της απόπτωσης είναι μια ομάδα ενδοκυτταρικών πρωτεϊνασών που ονομάζονται κασπάσες (Thornberry et al., 1998). Τα μόρια αυτά ενεργοποιούνται από συγκεκριμένους υποδοχείς που μεταβιβάζουν σήματα θανάτου, όπως το FAS, ή από το κυτταρόχρωμα C, και με τη σειρά τους επάγουν τη δράση άλλων μορίων που εκτελούν τη διεργασία της απόπτωσης (Kavurma and Klachigian, 2003). Κατά την καρκινική ανάπτυξη, τα κύτταρα αποκτούν την ικανότητα να ξεφεύγουν από το μηχανισμό της απόπτωσης με διάφορους τρόπους. Σε περισσότερους από το 50% των τύπων καρκίνου, έχει βρεθεί μεταλλαγμένο το 3

8 Εισαγωγή ογκοκατασταλτικό γονίδιο p53, με αποτέλεσμα να αναστέλλεται η απόπτωση (Steele and Lane, 2005; van Dillen et al., 2005). Επιπλέον, σε αρκετούς καρκινικούς όγκους, το μονοπάτι της κινάσης PI3Κ/Akt (Phosphoinosite 3- kinase/protein kinase B), που μεταβιβάζει μηνύματα για την επιβίωση των κυττάρων, ενεργοποιείται από αυξητικούς παράγοντες (όπως π.χ. ο αυξητικός παράγοντας της ινσουλίνης {Insulin Growth Factor, IGF-1/2} και η ιντερλευκίνη-3 {Interleucin-3, IL-3}), από μόρια που ανήκουν στο μονοπάτι των Ras πρωτεϊνών, καθώς και από την απώλεια του PTEN (Phosphatase and Tensin homolog), ενός σημαντικού ογκοκατασταλτικού μορίου, το οποίο φυσιολογικά διατηρεί σε χαμηλά επίπεδα το σήμα επιβίωσης της Αkt (Hu et al., 2005; Xiao et al., 2005; Soderlund et al., 2005; Komazawa et al., 2004; Hanahan et al., 2000). Καρκινικά κύτταρα και Μετάσταση Καθώς ένας όγκος αναπτύσσεται, ασκεί πίεση στον περιβάλλοντα φυσιολογικό ιστό. Τα καρκινικά κύτταρα διηθούν τον παρακείμενο φυσιολογικό ιστό και αρχίζουν να μετακινούνται στους μεσοκυττάριους χώρους και να μεταναστεύουν, μέσω των αιμοφόρων και λεμφικών αγγείων, σε απομακρυσμένες περιοχές, όπου και αρχίζουν να σχηματίζουν δευτερογενείς εστίες ογκογένεσης. Οι διεργασίες αυτές διευκολύνονται με την έκκριση πρωτεολυτικών ενζύμων, κυρίως της οικογένειας των μεταλλοπρωτεϊνασών (Matrix metalloproteinases, MMPs), τα οποία αποικοδομούν τα μόρια της εξωκυτταρικής ύλης και επιτρέπουν τη διείσδυση των κυττάρων του όγκου. Οι MMPs παρουσιάζουν αυξημένα επίπεδα έκφρασης σχεδόν σε κάθε τύπο καρκίνου στον άνθρωπο και αυτή η έκφραση συνδέεται με προχωρημένο ογκογενετικό στάδιο, αυξημένη επιθετικότητα και μετάσταση και μειωμένη επιβίωση. Η μεταβολή στην έκφραση των MMPs οφείλεται μάλλον σε μεταγραφικές τροποποιήσεις μετά από ενεργοποίηση ογκογονιδίων ή απώλεια ογκοκατασταλτικών μορίων (Crawford et al.,2001; Sun et al.,2000). 4

9 Εισαγωγή Σημαντικό ρόλο παίζουν επίσης οι αλλαγές σε μοριακό και πρωτεϊνικό επίπεδο των μορίων κυτταρικής προσκόλλησης, όπως είναι η Ε-καντερίνη και η N- CAM (cell adhesion molecule), οι οποίες καταστέλλουν την επιθετικότητα και μετάσταση διαφόρων τύπων καρκίνου. Επιπλέον, μεταβολές στην έκφραση των ιντεγκρινών (π.χ. α 3 β 1 και α ν β 3 ) που δεσμεύονται στα αποικοδομημένα συστατικά της εξωκυτταρικής ύλης ευνοούν τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων (Hanahan et al.,2000). Καρκινικά κύτταρα και αγγειογένεση Τα φυσιολογικά κύτταρα χρειάζονται οξυγόνο και θρεπτικά συστατικά για την επιβίωση και αύξησή τους, γι αυτό και βρίσκονται σε απόσταση μm από τα αγγεία του αίματος. Η διεργασία της αγγειογένεσης ρυθμίζεται με μια ισορροπία ανάμεσα στα μόρια που επάγουν το σχηματισμό αιμοφόρων αγγείων και τους αντίστοιχους αναστολείς της αγγειογένεσης (Carmeliet and Jain, 2000). Τα πιο χαρακτηριστικά αγγειογενετικά μόρια ανήκουν στις οικογένειες των αυξητικών παραγόντων των ενδοθηλιακών κυττάρων (vascular endothelial growth factors, VEGF) και των αυξητικών παραγόντων των ινοβλαστών (fibroblast growth factors, FGF). Ο καθένας δεσμεύεται σε ειδικούς διαμεμβρανικούς υποδοχείς που εκφράζονται στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Χωρίς την παρουσία αιμοφόρων αγγείων, ακόμα και ένας καρκινικός όγκος δεν μπορεί να αναπτυχθεί πέρα από ένα κρίσιμο μέγεθος ή να δημιουργήσει μεταστάσεις. Το 1971 ο Folkman πρότεινε ότι η ανάπτυξη του όγκου και η μετάσταση εξαρτώνται από την αγγειογένεση, οπότε αναστέλλοντας την αγγειογένεση θα μπορούσε να ανασταλεί και η ανάπτυξη του όγκου. Το 1976, ο Gullino έδειξε ότι κύτταρα σε προ-καρκινικό ιστό αποκτούν αγγειογενετική ικανότητα, καθώς μετατρέπονται σε καρκινικά. Σήμερα, είναι αποδεκτό ότι τα κύτταρα διαθέτουν έναν αγγειογενετικό διακόπτη, ο οποίος ρυθμίζεται με την ισορροπία ανάμεσα στους επαγωγείς της αγγειογένεσης και στους αντίστοιχους αναστολείς. Ο αγγειογενετικός διακόπτης ενεργοποιείται από διάφορα σήματα. 5

10 Εισαγωγή Αυτά περιλαμβάνουν μεταβολικό στρες (π.χ. χαμηλή τάση O 2, χαμηλό ph, υπογλυκαιμία), μηχανικό στρες που προκαλεί ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, ανοσολογικές αντιδράσεις και γενετικές μεταλλάξεις που ενεργοποιούν ογκογονίδια ή εξαλείφουν ογκοκατασταλτικά γονίδια, τα οποία ελέγχουν την παραγωγή ρυθμιστικών μορίων της αγγειογένεσης (Carmeliet and Jain, 2000). Υπάρχουν ενδείξεις ότι διαφορετικοί τύποι καρκινικών κυττάρων χρησιμοποιούν ξεχωριστούς τρόπους ενεργοποίησης της αγγειογένεσης. Επιπλέον, η καρκινική αγγειογένεση μεταβάλλεται ανάλογα με τον τύπο του καρκινικού όγκου, τη θέση που αναπτύσσεται, καθώς με τα αγγειο- και αντιαγγειο-γενετικά μόρια που παράγουν τόσο τα ίδια τα κύτταρα του όγκου, όσο και τα κύτταρα του στρώματος, τα ενδοθηλιακά κύτταρα και η εξωκυτταρική ύλη (Fukumura et al.,1998). Οι περισσότερες από τις παραπάνω ιδιότητες που εμφανίζουν τα καρκινικά κύτταρα προκύπτουν από μεταλλάξεις στα γονίδια των φυσιολογικών κυττάρων και η καθεμιά εκδηλώνεται σε διαφορετικά στάδια της καρκινικής ανάπτυξης. Η ανάπτυξη και η διασπορά ενός όγκου γίνεται σταδιακά και εξαρτάται από τις αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στα κύτταρα του όγκου και στα γειτονικά φυσιολογικά κύτταρα. Ε.2 Αγγειογένεση Υπάρχουν δύο διακριτοί μηχανισμοί σχηματισμού αιμοφόρων αγγείων, η νεοαγγειογένεση και η αγγειογένεση (Folkman, 1995). Ε.2.1. Νεοαγγειογένεση Κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη, τα αιμοφόρα αγγεία σχηματίζονται από τους αγγειοβλάστες, τα πρόδρομα κύτταρα των ενδοθηλιακών κύτταρων, με τη διαδικασία της νεοαγγειογένεσης (vasculogenesis). Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι νεοαγγειογένεση επιτελείται και σε ενήλικα άτομα, στα οποία εντοπίστηκαν 6

11 Εισαγωγή πρόδρομα κύτταρα των ενδοθηλιακών κύτταρων. Ιn vitro πειράματα δείχνουν ότι πρόδρομα κύτταρα του μυελού των οστών ενήλικων ατόμων, μπορούν να διαφοροποιήθουν σε υπόστρωμα matrigel, χωρίς την επίδραση αυξητικών παραγόντων. Φαίνεται ότι στα ενήλικα άτομα εκτός από το μηχανισμό της αγγειογένεσης παρατηρείται ο σχηματισμός αγγειακών δομών από πρόδρομα κύτταρα του μυελού των οστών (Rüger et al., 2008). Σε ασθενείς με χρόνια αρηριακή απόφραξη μελετάται ως πιθανός μηχανισμός επιδιόρθωσης των αγγείων η επιστράτευση πρόδρομων ενδοθηλιακών κυττάρων και η διαφοροποίηση τους σε κύτταρα των αγγείων (Matsuo et al., 2008). Επίσης πρόσφατες έρευνες έδειξαν ότι η μεταμόσχευση πρόδρομων ενδοθηλιακών κυττάρων σε ισχαιμικούς ιστούς συμβάλλει στην αναδόμηση του καταστραμμένου ιστού μέσω της διαδικασίας της νεοαγγειογάνασης (Sepulveda et al., 2007). Τέλος έρευνες έχουν δείξει ότι ο VEGF επάγει τον πολλαπλασιασμό και την μετανάστευση των πρόδρομων ενδοθηλιακών κυττάρων από το μυελό των οστών στην κυκλοφορία του αίματος πειραματοζώων, υποδεικνύοντας ότι η διαδικασία της νεοαγγειογένεσης λαμβάνει χώρα και στο ενήλικο άτομο (Asahara et al., 1999). Οι αγγειοβλάστες που προέρχονται από το μεσόδερμα, μεταναστεύουν, διαφοροποιούνται και πολλαπλασιάζονται in situ σε έναν μη αγγειωμένο ιστό και στη συνέχεια συνενώνονται σχηματίζοντας ένα πρώιμο αγγειακό πλέγμα. Τα πρώτα αιμοφόρα αγγεία που δημιουργούνται έχουν τη μορφή χορδών ή κυτταρικών συστάδων, τα οποία σταδιακά αναπτύσσονται και διαμορφώνουν έναν αυλό κοντά στο κέντρο της μάζας των κυττάρων. Αυτό το εμβρυϊκό πλέγμα περιλαμβάνει μερικά από τα μεγαλύτερα αγγεία του εμβρύου, όπως είναι η ραχιαία αορτή, οι πρόσθιες καρδιακές φλέβες και τα αρχικά αγγεία του λεκιθικού σάκου. Στη συνέχεια, τα ενδοθηλιακά κύτταρα διασυνδέονται με τα υποστηρικτικά κύτταρα των αγγείων, τα λεία μυϊκά κύτταρα και τα περικύτταρα, και έτσι ωριμάζει το αγγειακό τοίχωμα. 7

12 Εισαγωγή Ε.2.2 Αγγειογένεση Ο σχηματισμός αγγείων από τα ήδη υπάρχοντα επιτελείται με τη διαδικασία της αγγειογένεσης και πραγματοποιείται και στο έμβρυο και στο ενήλικο άτομο (Folkman, 1987, 1990). Στο αναπτυσσόμενο έμβρυο, ορισμένα όργανα αγγειώνονται και με το μηχανισμό της αγγειογένεσης, όπως π.χ. ο εγκέφαλος και τα νεφρά. Συγκεκριμένα στον εγκέφαλο, ο πολλαπλασιασμός των νευροεπιθηλιακών κυττάρων προκαλεί πάχυνση του νευρικού σωλήνα, ο οποίος για να συνεχίσει να αναπτύσσεται δέχεται την είσοδο τριχοειδών αγγείων που προέρχονται από το περινευρικό αγγειακό πλέγμα. Στο ενήλικο άτομο, αγγειογένεση παρατηρείται σε φυσιολογικές καταστάσεις, όπως είναι η επούλωση τραυμάτων και τα στάδια του θηλυκού αναπαραγωγικού κύκλου που περιλαμβάνουν την ανάπτυξη των ωοθυλακίων και των ωχρών σωματίων, και την εκτεταμένη αγγειογένεση που εμφανίζεται στο ενδομήτριο κατά τη διάρκεια της εμμηνορρυσίας. Επιπρόσθετα, η αγγειογένεση παρατηρείται και σε παθολογικές καταστάσεις, όπως η αθηροσκλήρωση, η ψωρίαση, η ενδομητρίωση, η διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια και ο καρκίνος. Τα νέα αγγεία στο ενήλικο άτομο σχηματίζονται με εκβλάστηση (sprouting), με δημιουργία γεφυρών ανάμεσα στα ενδοθηλιακά κύτταρα (bridging) και με διχοτόμηση ή ενδίπλωση (intussuseption). Ο μηχανισμός που έχει μελετηθεί πιο εκτεταμένα είναι η αγγειογένεση με εκβλάστηση, η οποία ρυθμίζεται από ειδικούς αγγειακούς αυξητικούς παράγοντες, όπως ο VEGF, οι αγγειοποιητίνες Ang-1 και Ang-2 και οι εφρίνες ephrin-b1/b2 (Ferrara et al., 2002, Masonpierre et al., 1997 Kuijper et al., 2007). Κατά την αγγειογένεση με εκβλάστηση, αγγειογενετικοί παράγοντες δεσμεύονται σε ειδικούς υποδοχείς των ενδοθηλιακών κυττάρων και ενεργοποιούν μονοπάτια μεταγωγής σήματος μέσα στο κύτταρο, όπως π.χ. η ενεργοποίηση των MAP κινασών (Mitogen Activator Protein Kinases, MAPKs), με τελικό στόχο την τροποποιημένη έκφραση γονιδίων. Στη συνέχεια, οι μεταλλοπρωτεϊνάσες 8

13 Εισαγωγή αποικοδομούν το εξωκυτταρικό υλικό, επιτρέποντας στα ενδοθηλιακά κύτταρα να μεταναστεύσουν από το τοίχωμα των προϋπαρχόντων αγγείων και να πολλαπλασιαστούν. Στην επιφάνεια των αγγείων υπάρχουν μόρια προσκόλλησης, τα οποία συμμετέχουν και διευκολύνουν τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Η έκφραση της ιντεγκρίνης α ν β 3 στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων επάγεται από παράγοντες που διεγείρουν την αγγειογενετική διαδικασία και διευκολύνει τη μετανάστευση και προσκόλληση των ενδοθηλιακών κυττάρων στο εξωκυτταρικό υλικό. Μετά τη μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων, οι αγγειοποιητίνες δεσμεύονται στους αντίστοιχους υποδοχείς τους, Tie 1/2, που εκφράζονται αποκλειστικά από τα ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων και σταθεροποιούν τη δομή των νεοσχηματισμένων πρώιμων αγγείων, ενεργοποιώντας την αλληλεπίδραση ενδοθηλιακών και περιενδοθηλιακών κυττάρων (Klagsbrun et al., 1999). Τα πρώιμα αγγεία αναδιαρθρώνονται με την προσέλκυση μεσεγχυματικών κυττάρων, τα οποία με την επίδραση του PDGF, που εκφράζουν τα ενδοθηλιακά κύτταρα, διαφοροποιούνται σε περικύτταρα και λεία μυϊκά κύτταρα που επενδύουν εξωτερικά τον αγγειακό αυλό, προστατεύοντας τα αγγεία από μεταβολές στην παροχή οξυγόνου ή στο ορμονικό ισοζύγιο. Η διατήρηση των νέων αγγείων εξαρτάται από την επιβίωση των ενδοθηλιακών κυττάρων, τα οποία σε φυσιολογικές συνθήκες μπορούν να επιβιώσουν για αρκετά χρόνια (Εικόνα 1.1) (Carmeliet et al., 2000). 9

14 Εισαγωγή Εικόνα Ε.1: Σχηματική αναπαράσταση του σχηματισμού αγγείων με εκβλάστηση. A) Αγγειογενετικοί παράγοντες δεσμεύονται στους ειδικούς υποδοχείς των ενδοθηλιακών κυττάρων και ενεργοποιούν μονοπάτια μεταγωγής σήματος. Β) Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες (ΜΜΡs) αποικοδομούν εξωκυτταρικό υλικό, επιτρέποντας έτσι τη μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων. Γ) Η ιντεγκρίνη α ν β 3 εκφράζεται από ενδοθηλιακά κύτταρα και διευκολύνει τη μετανάστευσή και προσκόλλησή τους στο εξωκυτταρικό υλικό. Δ) Η αγγειοποιητίνη-1 δεσμεύεται στον υποδοχέα Tie-2 των ενδοθηλιακών κυττάρων, γεγονός που διευκολύνει τη δημιουργία νέων αγγείων. Ε) Τα ενδοθηλιακά κύτταρα εκκρίνουν παράγοντες που προσελκύουν πρόδρομα περικύτταρα, τα οποία αλληλεπιδρώντας με τα ενδοθηλιακά κύτταρα διαφοροποιούνται στα περικύτταρα. Ε.Υ.: εξωκυτταρικό υλικό, Ε.Κ.: ενδοθηλιακά κύτταρα. Ε.2.3 Καρκινική αγγειογένεση Μοριακοί και κυτταρικοί μηχανισμοί δημιουργίας καρκινικών αγγείων Τα καρκινικά αγγεία σχηματίζονται με εκβλάστηση (sprouting), με διχοτόμηση (intussusception), με τη διαδικασία κατά την οποία τα καρκινικά κύτταρα περιβάλλουν τα ενδοθηλιακά κύτταρα των φυσιολογικών αγγείων (cooption) και με αγγειακό μιμητισμό (vascular mimicry) (Auguste et al., 2005). Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να επιστρατεύουν πρόδρομες μορφές ενδοθηλιακών κυττάρων από το μυελό των οστών ή το περιφερικό αίμα, τα οποία μετακινούνται μέσα στην περιοχή του όγκου, διαφοροποιούνται και επενδύουν τον αυλό των νεοσχηματισμένων καρκινικών αγγείων (Carmeliet and Jain, 2000). Η επαγωγή της αγγειογένεσης από κακοήθεις όγκους οδηγεί στο σχηματισμό αγγείων 10

15 Εισαγωγή με πολλαπλές ανωμαλίες. Μορφολογικές και ανοσοϊστοχημικές μελέτες έχουν δείξει ότι τα καρκινικά αγγεία εμφανίζουν αλλαγές στην έκφραση γονιδίων, ανεπαρκή λειτουργικότητα του φραγμού των ενδοθηλιακών κυττάρων, χαλαρή προσκόλληση των περικυττάρων και μειωμένα επίπεδα σχηματισμού της βασικής μεμβράνης του αγγειακού αυλού. In vivo μελέτες σε μύες έδειξαν ότι τα καρκινικά αγγεία αποτελούνται από μια λεπτή στιβάδα ενδοθηλιακών κυττάρων σε στενή επαφή με τα κύτταρα του όγκου, τα οποία όμως δεν εκφράζουν ούτε μόριαμάρτυρες των ενδοθηλιακών κυττάρων, όπως είναι τα PECAM-1 (plateletendothelial cell-adhesion molecule ή CD31) και endoglin (CD105), ούτε πρωτεΐνες της βασικής μεμβράνης, όπως το κολλαγόνο τύπου IV ή η λαμινίνη (di Tomaso et al., 2005). Το τοίχωμα των καρκινικών αγγείων δεν αποτελείται πάντοτε μόνο από ενδοθηλιακά κύτταρα, αλλά και από καρκινικά κύτταρα οδηγώντας στο σχηματισμό μωσαϊκών αγγείων. Μελέτες σε μοσχεύματα από καρκίνωμα του εντέρου σε ποντίκια και σε ανθρώπινες βιοψίες του ιδίου τύπου καρκίνου, έδειξαν ότι το 15% των αγγείων είναι μωσαϊκά, όπου καρκινικά κύτταρα βρίσκονται σε επαφή με τον αυλό του αγγείου, χωρίς να εμφανίζουν ενδοθηλιακό φαινότυπο (Chang et al., 2000). Δομή και λειτουργία των καρκινικών αγγείων Τα καρκινικά αγγεία εμφανίζουν δομικές και λειτουργικές ανωμαλίες σε σχέση με τα φυσιολογικά (Carmeliet and Jain, 2000) και χαρακτηρίζονται από: Χαοτική αρχιτεκτονική και αιματική ροή. Τα αγγεία έχουν ελικοειδή μορφή, είναι διευρυμένα, με άνιση διάμετρο και εκτεταμένες διακλαδώσεις. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα η αιματική ροή στα καρκινικά αγγεία να μην ακολουθεί τη φυσιολογική της πορεία και να οδηγεί στη δημιουργία υποξικών και οξικών περιοχών στους όγκους. Αυτή η διαφοροποιημένη οργάνωση των αγγείων ρυθμίζει την παραγωγή επαγωγέων και αναστολέων της αγγειογένεσης, και ενισχύει την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων με τον πιο κακοήθη και μεταστατικό φαινότυπο. 11

16 Εισαγωγή Υψηλή αγγειακή διαπερατότητα. Τα τοιχώματα των καρκινικών αγγείων εμφανίζουν διάφορα ανοίγματα, διευρυμένες διαενδοθηλιακές συνδέσεις και ασυνέχειες στη βασική μεμβράνη. Επίσης, τα ενδοθηλιακά κύτταρα έχουν ανώμαλο σχήμα, αυξάνουν το ένα πάνω στο άλλο και προβάλλουν και μέσα στον αυλό. Τα παραπάνω έχουν ως αποτέλεσμα τα αγγεία των όγκων να έχουν διαρροή, η οποία διαφέρει ανάλογα με τον τύπο του όγκου και τα αγγειο-και αντιαγγειογενετικά μόρια που εκφράζονται από τα κύτταρα του στρώματος. Μη ομοιόμορφη έκφραση μορίων κυτταρικής προσκόλλησης. Τα καρκινικά κύτταρα και τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος εκκρίνουν μόρια, τα οποία μεταβάλλουν την έκφραση των μορίων κυτταρικής προσκόλλησης, καθώς και άλλων μορίων που εκφράζονται φυσιολογικά στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων. Είναι επίσης πιθανό, τα καρκινικά αγγεία να εκφράζουν πρωτεΐνες της κυτταρικής επιφάνειας, οι οποίες είτε δεν εκφράζονται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα που επενδύουν τα καρκινικά αγγεία, είτε εκφράζονται μόνο από το ενδοθήλιο των ώριμων αγγείων. Έλλειψη λειτουργικών λεμφαγγείων. Τα λεμφαγγεία φυσιολογικά συλλέγουν το ενδιάμεσο υγρό των ιστών και βοηθούν στη μεταφορά θρεπτικών στοιχείων στους ιστούς. Μελέτες έδειξαν ότι δεν υπάρχουν λειτουργικά λεμφαγγεία μέσα στον όγκο, αλλά στην περιφέρεια του όγκου και είναι μεγεθυσμένα, ενδεχομένως λόγω αυξημένης έκφρασης του VEGF-C. Αυτά τα λεμφαγγεία επιτελώντας τη βασική τους λειτουργία, μπορούν να απορροφούν καρκινικά κύτταρα από την επιφάνεια του όγκου και έτσι να διευκολύνουν τη μετάσταση. Ε.2.4 Επαγωγείς και αναστολείς της αγγειογένεσης Η αγγειογένεση ρυθμίζεται από την ισορροπία στην έκφραση των ενδογενών προ-αγγειογενετικών και αντι-αγγειογενετικών παραγόντων. Οι επαγωγείς της αγγειογένεσης (Πίνακας E.1) δρουν επηρεάζοντας τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση ή τη διαφοροποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων. 12

17 Εισαγωγή Πίνακας E.I. Μόρια που επάγουν την αγγειογένεση. Επαγωγείς της αγγειογένεσης VEGF PIGF FGF-1, FGF-2 PTN HIV-tat PDGF HGF/SF TGF-α TGF-β EGF IGF-1 TNF-α IL-8 IL-3 Προσταγλαδίνη Ε1, Ε2 PD-ECGF/TP COX-2 Αγγειογενίνη Οιστρογόνα Προλιφερίνη Τμήματα του υαλουρονικού οξέος Ολιγοσακχαρίτες Ερυθροποιητίνη G-CSF GM-CSF E-σελεκτίνη VCAM-1 Αγγειοποιητίνη-1 ΝΟ HIV-tat: Human Immunodeficiency Virus tat, COX-2: cyclo-oxygenase-2, G-CSF: Granulocyte Colony-Stimulating Factor, GM-CSF: Granulocyte-Macrophage Colony- Stimulating Factor, VCAM 1: Vascular Cell-Adhesion Molecule-1, ΝΟ: Nitric oxide. Οι ενδογενείς αναστολείς της αγγειογένεσης (Πίνακας E.2) είτε δρουν άμεσα στοχεύοντας τα ενδοθηλιακά κύτταρα, είτε έμμεσα αναστέλλοντας τη σύνθεση αυξητικών παραγόντων από τα κύτταρα του όγκου (Kerbel and Folkman, 2002). 13

18 Εισαγωγή Πίνακας E.II. Μόρια που αναστέλλουν την αγγειογένεση (Nyberg et al.,2005). Ενδογενείς αναστολείς αγγειογένεσης Αναστολείς που προέρχονται από το εξωκυτταρικό υλικό και τη βασική μεμβράνη Αρρεστίνη Αναστολείς που δεν προέρχονται από το εξωκυτταρικό υλικό και τη βασική μεμβράνη Αυξητικοί παράγοντες και κυτταροκίνες Κουνστατίνη Παράγοντας αιμοπεταλίων -4 Θρομβοσπονδίνη-1 και -2 Τμήματα κολλαγόνου Ενδοστατίνη EFC-XV Τμήματα ινονεκτίνης PEDF PEX Αγγειοστατίνη Φιμπουλίνη Αντιθρομβίνη ΙΙΙ Ενδορεπελλίνη Plasminogen kringle 5 Τουμστατίνη Φιμπουλίνη Τμήματα προλακτίνης Μεθοξυοιστραδιόλη Chondromodulin Βασοστατίνη Ιντερφερόνες Ιντερλευκίνες TIMPs Prothrombin kringle 2 Τροπονίνη 1 PEDF: Pigment epithelium-derived factor, PEX: naturally occurring fragment of MMP-2, TIMPs: tissue inhibitors of matalloproteinases. 14

19 Εισαγωγή Ε.3 Πλειοτροπίνη (Pleiotrophin, PTN) Η πλειοτροπίνη (Pleiotrophin, PTN) είναι ένας εκκρινόμενος αυξητικός παράγοντας 18 kda, με μεγάλη συγγένεια πρόσδεσης για την ηπαρίνη. Παρουσιάζει 55% ομολογία στην αμινοξική αλληλουχία με τη Midkine, με την οποία συγκροτούν μια οικογένεια αυξητικών παραγόντων, και περιέχει 10 υψηλά συντηρημένες κυστεΐνες στο μόριό της. Εκτός από την αμινοξική τους ομολογία, η PΤΝ και η Midkine χρησιμοποιούν επίσης τους ίδιους υποδοχείς και έχουν κοινές βιολογικές δράσεις, οι πιο καλά χαρακτηρισμένες από τις οποίες είναι η επαγωγή των νευριτών και η ανάπτυξη των όγκων (Papadimitriou et al, 2004; Mikelis et al., 2007). Το μόριο της PTN απομονώθηκε παράλληλα από πολλές ερευνητικές ομάδες και από διάφορους ιστούς. Κάθε ερευνητική ομάδα, ανάλογα με τον ιστό προέλευσης ή βάσει κάποιας από τις ιδιότητες του μορίου, έδωσε στον παράγοντα διαφορετική ονομασία. Για το λόγο αυτό, απαντάται στη βιβλιογραφία με πολλές ονομασίες, από τις οποίες επικρατέστερες σήμερα είναι: HARP (Courty et al.,1991), PTN (Li et al., 1992), HB-GAM (Heparin- Binding Growth Associated Molecule) (Rauvala, 1989) και OSF-1 (Osteoblast Specific Factor-1) (Tezuka et al., 1990). Αρχικά, η PTN απομονώθηκε από τον εγκέφαλο νεογέννητων αρουραίων και ενήλικων βοών ως μόριο το οποίο μπορεί να επάγει την προέκταση νευριτών (Rauvala 1989), υποδεικνύοντας πιθανό ρόλο στη φυσιολογία του νευρικού συστήματος (Merenmies et al., 1990). Επιπλέον έρευνες έδειξαν ότι το μόριο αυτό εντοπίζεται και σε άλλους, μη νευρικούς ιστούς, όπως η καρδιά (Hampton et al., 1992), η μήτρα (Milner et al., 1989), οι χόνδροι και τα οστά (Neame et al., 1993), και η επίφυση (Azizan et al., 2000), υποδηλώνοντας ότι η βιολογική της δράση δεν περιορίζεται μόνο στο νευρικό σύστημα, όπως είχε αρχικά εικαστεί (Rauvala 1989). Υψηλά επίπεδα του γονιδίου εκφράζονται επίσης σε αρκετούς ανθρώπινους όγκους, μεταξύ των οποίων είναι το νευροβλάστωμα, το γλοιοβλάστωμα, ο καρκίνος του προστάτη και του πνεύμονα και πολλοί άλλοι, όπως θα αναφερθεί εκτενέστερα παρακάτω. 15

20 Εισαγωγή Ε.3.1 Δομή του γονιδίου της PTN Το γονίδιο της PTN έχει αναλυθεί στον άνθρωπο, τον επίμυ, το μυ, το κουνέλι και πρόσφατα στο zebrafish. Το cdna της PTN στα παραπάνω είδη παρουσιάζει παρόμοια οργάνωση. Το γονίδιο της PTN στον άνθρωπο εντοπίζεται στο μεγάλο βραχίονα του 7 ου χρωμοσώματος, στις περιοχές (Li et al, 1992). Όσο για τα γονίδια της PTN στα τρωκτικά, αυτά έχουν βρεθεί στα χρωμοσώματα 4 και 6 στο ποντίκι και στον αρουραίο αντίστοιχα (Hornum et al, 1996). Στον άνθρωπο, το γονίδιο της PTN καταλαμβάνει πάνω από 65 kb, περιέχει τουλάχιστον επτά εξόνια και το ελάχιστο μέγεθός του είναι 42 kb (Lai et al, 1992; Kretshmer et al, 1993). Το m-rna της PTN οργανώνεται σε πέντε εξόνια με συνολικό μέγεθος 1650 νουκλεοτίδια (Kretshmer et al, 1993). Το σηματοδοτικό πεπτίδιο, καθώς και τα πρώτα πέντε αμινοξέα του ώριμου μορίου, εντοπίζονται στο εξόνιο 2, ενώ το μεγαλύτερο τμήμα της κωδικής περιοχής της πρωτεΐνης εντοπίζεται στα εξόνια 3 και 4 (Kretshmer et al, 1993). Μια 5 -μη μεταφραζόμενη περιοχή (5 -UTR), η οποία καλύπτει ένα ολόκληρο εξώνιο, έχει περιγραφεί από πολλούς ερευνητές (Lai et al., 1992; Kretschmer et al., 1993). Οι 3 - και 5 - μη μεταφρασμένες περιοχές του γονιδίου της PTN στον άνθρωπο παρουσιάζουν αντίστοιχα υψηλή ομολογία με τα αντινοηματικά cdnas της hsp (heat shock protein) 70 και της L17 πρωτεΐνης του ριβοσώματος (Lai et al, 1992). Επίσης, στην 3 - μη μεταφρασμένη περιοχή έχουν εντοπιστεί 3 επαναλήψεις του μοτίβου ΑΤΤΤΑ. Η αλληλουχία αυτή, η οποία εμπλέκεται στη σταθερότητα του mrna εντοπίζεται στην 3 περιοχή αρκετών ογκογονιδίων (Lai et al, 1992). Το γονίδιο της PTN στο ποντίκι εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 6, περιορίζεται σε πέντε εξόνια και τέσσερα ιντρόνια και δεν καταλαμβάνει περισσότερo από 32 kb (Katoh et al, 1992). Στην 5 περιοχή στο γονίδιο της PTN στο ποντίκι εντοπίζονται δυο επαγωγείς (Ι και ΙΙ). Και οι δυο περιέχουν τις περιοχές CCAAT και TATA και αλληλουχίες ρυθμιστικών στοιχείων, όπως το στοιχείο απόκρισης στο cαmp (camp responsive element), την περιοχή δέσμευσης του SP-1 και το στοιχείο απόκρισης της θυρεοειδούς ορμόνης στον επαγωγέα Ι και την αλληλουχία απόκρισης των γλυκοκορτικοειδών στον επαγωγέα ΙΙ (Sato et al, 1997). 16

21 Εισαγωγή Το γονίδιο της PTN στο zebrafish αποτελείται από πέντε εξόνια, τέσσερα ιντρόνια και καταλαμβάνει 82 kb. Το πρώτο και το τέταρτο ιντρόνιο, όπως και στον άνθρωπο, είναι τα μεγαλύτερα, με μέγεθος 60,3 και 14,7 kb αντίστοιχα. Η μεγάλη ομοιότητα στις αλληλουχίες σύνδεσης των εξονίων με τα ιντρόνια στον άνθρωπο, το ποντίκι, το zebrafish και τη Midkine, πιθανά υποδεικνύει ότι εξελικτικά έχουν κοινό πρόγονο (Chang et al., 2004). Πρόσφατα ανακαλύφθηκαν στη Drosophila Melanogaster οι πρωτεΐνες Miple1 και Miple 2, οι οποίες θεωρούνται νέα μέλη της οικογένειας PTN/MK. Τα γονίδια Miple1 και Miple 2 εντοπίζονται στον αριστερό βραχίονα του τρίτου χρωμοσώματος στην περιοχή 61Β3. Αποτελούνται από πέντε εξόνια και το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης για το κάθε γονίδιο κωδικοποιείται από τα εξόνια 2-5, ενώ η 3 μη μεταφρασμένη περιοχή του Miple1 είναι αρκετά μεγαλύτερη από αυτή του Miple2. Το mrna του Miple1 έχει μέγεθος βάσεις, ενώ του Miple2 έχει συνολικό μέγεθος βάσεις (Englund et al., 2006). Ε.3.2 Ρυθμιστική περιοχή του γονιδίου Η ανάλυση του υποκινητή του γονιδίου στον άνθρωπο έδειξε ότι δεν υπάρχει η περιοχή ΤΑΤΑ, αλλά έχει εντοπιστεί η περιοχή CAAT σε μια απόσταση 91 νουκλεοτιδίων πριν από το σημείο έναρξης της μεταγραφής (Kretschmer et al., 1993; Li et al., 1992). Στην αλληλουχία αυτή δύνανται να δεσμευτούν γενικοί μεταγραφικοί παράγοντες, όπως ο C/EBP (CAAT-box/enhancer-binding protein) ή ο CTF/NF1 (CAAT-box-binding Factor/ Nuclear Factor 1). Στην αλληλουχία TATA δεσμεύεται η πρωτεΐνη δέσμευσης στην ΤΑΤΑ (ΤΑΤΑ-Βinding Protein, TBP), η οποία αποτελεί βασικό συστατικό του μεταγραφικού παράγοντα ΙΙD (Transcription Factor IID, TF II D). Η πρωτεΐνη TBP είναι απαραίτητη για τη μεταγραφή ακόμα και αν απουσιάζει η αλληλουχία ΤΑΤΑ και φαίνεται να καθορίζει το ακριβές σημείο έναρξης της μεταγραφής (Johnson and Jameson, 1998). Η αλληλουχία αυτή εκλείπει και από τη ρυθμιστική περιοχή του γονιδίου της Midkine (Matsubara et al., 1990), του γονιδίου της Wnt-2, το οποίο 17

22 Εισαγωγή ενεργοποιείται σε μύες κατά την πρώιμη ανάπτυξη (Smith et al., 1988), της p18 που εκφράζεται σε εμβρυικούς ιστούς μυός (Luo et al., 1991) και άλλων γονιδίων. Το κοινό αυτό χαρακτηριστικό μεταξύ γονιδίων που σχετίζονται με την ανάπτυξη, πιθανολογεί ένα διαφορετικό μηχανισμό ρύθμισης που ελέγχεται διαφορικά στο χρόνο και το χώρο. Στην απομακρυσμένη 5 περιοχή έχουν βρεθεί δύο αλληλουχίες δέσμευσης για τον AP-1 (Activator Protein-1), τέσσερις για το MyoD (myogenic factor D), μια αλληλουχία στοιχείου απόκρισης στον ορό (Serum Response Element, SRE) (Li et al.,1992) και μια για το μεταγραφικό παράγοντα HOXA5 (Homeobox A5) (Chen et al., 2005). Ενδιαφέρον είναι επίσης το γεγονός ότι πριν από το ανοιχτό αναγνωστικό πλαίσιο του γονιδίου βρίσκεται ενσωματωμένο στο γονίδιο της PTN ένα στοιχείο που μοιάζει με τον ανθρώπινο ενδογενή ρετροϊό (human endogenous retrovirouslike element, HERV), το οποίο πλαισιώνεται από επαναλαμβανόμενες τελικές ακολουθίες 502 και 495 νουκλεοτιδίων. Λόγω της ειδικότητάς του να δεσμεύεται στο Glu-tRNA και του γεγονότος ότι είναι ενσωματωμένο στο εσωτερικό του γονιδίου της PTN, το στοιχείο αυτό ονομάστηκε HERV-E.PTN (ή GT-1). Έχει δειχτεί επίσης ότι ο μεταγραφικός παράγοντας Sp1, ο οποίος δεσμεύεται στο HERV-E.PTN είναι πολύ σημαντικός για την έκφραση του γονιδίου σε καρκινικά κύτταρα χορίου ανθρώπου (Schulte et al., 2000). Με ανάλυση κατά Southern έγινε γνωστό ότι το HERV-E.PTN εκτός από τον άνθρωπο υπάρχει στο χιμπατζή και το γορίλα, αλλά όχι στον πίθηκο rhezus, υποδηλώνοντας ότι η ενσωμάτωση του στο γονιδίωμα πραγματοποιήθηκε μετά από τον αποχωρισμό των πιθήκων και των χιμπατζήδων, πριν από 25 περίπου εκατομμύρια χρόνια (Schulte και Wellstein 1998). PTN. Στην εικόνα Ε.2 φαίνεται η δομή της ρυθμιστικής περιοχής του γονιδίου της 18

23 Εισαγωγή Εικόνα Ε.2: Απεικόνιση της ρυθμιστικής περιοχής του γονιδίου της PTN. Διακρίνεται η περιοχή CAAT, καθώς και οι θέσεις αναγνώρισης από μεταγραφικούς παράγοντες (Papadimitrou et al., 2004). Ε.3.3 Πρωτεϊνική δομή του μορίου της PTN Η φαινομενική μοριακή μάζα της PTN, όπως υπολογίζεται από SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση, είναι 18 kda. Το νούμερο όμως αυτό δεν αντικατοπτρίζει την αμινοξική αλληλουχία στο ώριμο πολυπεπτίδιο, αφού φασματοφωτομετρικές μελέτες έδωσαν μοριακή μάζα 15,291 kda (Hampton et al, 1992). Η διαφοροποιημένη κινητικότητα του μορίου της PTN στην SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση, σε αντίθεση με την αμινοξική αλληλουχία, οφείλεται στην μεγάλη περιεκτικότητα του μορίου σε βασικά αμινοξέα (Raulais et al., 1991; Wellstein et al., 1992). Η πρωτογενής δομή της PTN (Πίνακας Ε.II), όπως αποκαλύφθηκε από cdna κλώνους, αποτελείται από 168 αμινοξέα, τα οποία είναι υψηλά συντηρημένα σε διαφορετικά είδη, όπως στον άνθρωπο, στον αρουραίο, στο βόδι και στην όρνιθα (Li et al., 1990). Η PTN περιέχει μια υψηλά υδρόφοβη αμινοτελική αλληλουχία 32 αμινοξέων, η οποία αντιστοιχεί στην αλληλουχία «σινιάλο» (signal peptide) του μορίου και ένα υδρόφιλο αμινοτελικό άκρο (Merenmies and Rauvala, 1990). Η αποκοπή του σηματοδοτικού αυτού πεπτιδίου φαίνεται να είναι εξαρτώμενη από το είδος του κυττάρου, και οδηγεί στην παραγωγή δυο διαφορετικών μορίων που διαφέρουν κατά τρία αμινοξέα στο αμινοτελικό άκρο του μορίου, με αποτέλεσμα να προκύπτουν πρωτεΐνες 136 και 139 αμινοξέων (Bernard-Pierrot et al, 2001). Η αμινοτελική αλληλουχία της ανθρώπινης, μιτογόνου, ανασυνδυασμένης PTN, η 19

24 Εισαγωγή οποία απομονώνεται από έκφραση του γονιδίου σε ευκαρυωτικό σύστημα, περιέχει τρία επιπλέον αμινοξέα στο αμινοτελικό της άκρο (Laaroubi et al, 1994). Η απομόνωση αυτής της προεκτεινόμενης μορφής του μορίου (με τα τρία αμινοξέα στο αμινοτελικό άκρο) δημιούργησε πολλά ερωτηματικά σχετικά με τις διεργασίες κατά τη διάρκεια της βιοσύνθεσης του μορίου και αναφορικά με τη μιτογόνο δραστηριότητά του. Αξιοσημείωτο είναι ότι ανάλογη μορφή του μορίου μπορεί να εμφανισθεί και στη Midkine, το άλλο μέλος της οικογένειας των αυξητικών παραγόντων στην οποία ανήκει η PTN (Muramatsu 1993). Πίνακας Ε.III:. Αμινοξική αλληλουχία της PTN. Tο υπογραμμισμένο τμήμα αντιστοιχεί στην αλληλουχία σινιάλου. Με * σημειώνονται τα δύο σημεία στα οποία μπορεί να πραγματοποιηθεί η πέψη και απομάκρυνση του πεπτιδίου αυτού. Πέψη σε διαφορετικά σημεία έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία ώριμων μορίων με διαφορετικό αμινοτελικό άκρο. Μ S S Q Q Y Q Q Q R R K F A Α A F L A L I F I L A Α V D T *A E A * G K Κ E K P E K Κ V K Κ S D C G E W Q W S V C V P T S G T C G L G T R E G T R T G A E C K Q T M K T Q R C K I P C N W K Κ Q F G A E C K Y Q F Q A W G E C D L N T A L K T R T G S L T R A L H N A D C Q K T V T I S K P C G K L T K P K P Q A E S K Κ K Κ K E G K Κ Q E K M L D Η ώριμη πρωτεΐνη αποτελείται κατά 24% από βασικά αμινοξέα, κυρίως λυσίνες, και περιέχει 10 κυστεΐνες. Οι 28 λυσίνες οργανώνονται σε δυο αλληλουχίες στο αμινοτελικό και καρβοξυτελικό άκρο του μορίου και οι κυστεΐνες σχηματίζουν πέντε δισουλφιδικούς δεσμούς ανάμεσα στις αλυσίδες, οι οποίοι και καθορίζουν την τριτοταγή δομή του μορίου. Έχει αναφερθεί ότι τέσσερις από αυτές παραμένουν αδέσμευτες (Hampton et al, 1992), ενώ σήμερα ισχύει άποψη ότι και οι πέντε συμμετέχουν στη δημιουργία δισουλφιδικών δεσμών (Kilpeainnen et al, 2000). Η πρωτογενής μορφή της PTN περιέχει επίσης τρεις περιοχές που φέρουν το μοτίβο K-R/K-X-R/K, και υποδηλώνουν πυρηνική εντόπιση (Hampton et al., 1992). Σε συμφωνία με αυτό, μέχρι τώρα υπάρχουν δύο αναφορές που υποστηρίζουν ότι η PTN δεσμεύεται στη νουκλεολίνη (Τake et al., 1994; Said et 20

25 Εισαγωγή al., 2005). Η τριτοταγής δομή του μορίου της PTN οργανώνεται σε δυο β-δομές, οι οποίες συνδέονται μεταξύ τους με έναν εύκαμπτο συνδέτη, και κάθε μια από αυτές τις δομές περιέχει τρεις αντιπαράλληλες β-πτυχές. Οι πλούσιες σε λυσίνες καρβοξυτελική και αμινοτελική περιοχές δε σχηματίζουν κάποια ανιχνεύσιμη δομή και έχουν τυχαία διαμόρφωση (Εικόνα Ε.3). Κάθε μια από τις β-δομές περιέχει από μια περιοχή πρόσδεσης στην ηπαρίνη και αυτές οι περιοχές θεωρούνται ότι παρουσιάζουν ομολογία με το μοτίβο της επαναλαμβανόμενης αλληλουχίας της θρομβοσπονδίνης τύπου Ι (throsmbospondin type I repeat, TSR), που εντοπίζεται στο εξωκυττάριο υλικό και σε πρωτεΐνες της κυτταρικής επιφάνειας (Kilpelainen et al, 2000). Ωστόσο, πιο πρόσφατες έρευνες έδειξαν ότι αυτές οι περιοχές της PTN παρουσιάζουν πολύ μικρή αμινοξική ομολογία με το μοτίβο της TSR δομής (Roszmusz et al, 2002). Εικόνα Ε.3: Σχηματική αναπαράσταση της τριτοταγούς δομής της πρωτεΐνης της PTN. Οι β-πτυχές αντιπροσωπεύονται από τα βέλη και οι τυχαίες διαμορφώσεις στο αμινοτελικό και καρβοξυτελικό άκρα από τους κυλίνδρους. Διακρίνονται επίσης και οι πέντε δισουλφιδικοί δεσμοί. Οι αριθμοί αντιστοιχούν στα αντίστοιχα αμινοξέα της πρωτεΐνης (Papadimitrou et al., 2004). 21

26 Εισαγωγή Ε.3.4 Ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της PTN Όσον αφορά στη γονιδιακή ρύθμιση της PTN, λίγα είναι τα στοιχεία που υπάρχουν στη βιβλιογραφία. Εάν κύτταρα BALB/ 3C 3T διεγερθούν με FGF-2, τότε μειώνεται η έκφραση του mrna της PTN (Menremies et al., 1992). Αντίθετα, αν σε κύτταρα ΝΙΗ 3Τ3 επιδράσει ο αυξητικός παράγοντας των αιμοπεταλίων (PDGF) ή ο FGF-2, τότε αυξάνεται η έκφραση του mrna της PTN (Li et al., 1992). Η έκφραση του mrna της PTN επάγεται και σε ηπατικά κύτταρα από τον αυξητικό παράγοντα των αιμοπεταλίων (PDGF-BB) και την υποξία (Antoine et al, 2005). Η ερευνητική μας ομάδα ανέδειξε την εμπλοκή του μεταγραφικού παράγοντα AP-1 στη μεταγραφική δραστηριότητα του γονιδίου της PTN, στην κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη. Ο FGF-2 και το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ) επάγουν τη μεταγραφή του γονιδίου της PTN μέσω ενεργοποίησης του AP-1, με αποτέλεσμα την επαγωγή του πολλαπλασιασμού και της μετανάστευσης των κυττάρων (Hatziapostolou et al., 2006; Polytarchou et al., 2005). Η δράση του FGF-2 οφείλεται σε επαγωγή της NADPH οξειδάσης και αύξηση της παραγωγής του Η 2 Ο 2, μέσω αλληλεπίδρασης με τον υποδοχέα FGFR1 (Hatziapostolou et al., 2006), ενώ απαιτούνται και οι δύο θέσεις δέσμευσης του ΑΡ-1 (Hatziapostolou et al., 2006; Polytarchou et al., 2005). Επίσης, δείξαμε ότι η ακτινοβόληση με ακτίνες-χ επάγει την έκφραση του γονιδίου της PTN στο in vivo μοντέλο της χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης εμβρύου όρνιθας (Polytarchou et al., 2004) Πρόσφατα αποδείχθηκε ότι ο HOXA5, ένας μεταγραφικός παράγοντας που ρυθμίζει την εμβρυική ανάπτυξη, επάγει άμεσα τη μεταγραφή του γονιδίου της PTN, μετά την πρόσδεση του στο αντίστοιχο στοιχείο απόκρισης στη θέση -106 του υποκινητή του γονιδίου (Chen et al, 2005). Το γεγονός αυτό ενισχύει τη θέση της PTN ως μόριο-ρυθμιστή της εμβρυικής ανάπτυξης. Αντιφατικά είναι τα αποτελέσματα όσον αφορά στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης της PTN από το ρετινοϊκό οξύ. Από πειράματα σε κύτταρα Ρ 9 και 22

27 Εισαγωγή NT 2 /D 1, τα οποία προέρχονται από τερατοκαρκίνωμα ποντικού και ανθρώπου αντίστοιχα, διατυπώθηκε η άποψη ότι το ρετινοϊκό οξύ επάγει την έκφραση της PTN (Kretschmer et al., 1991), κάτι όμως που δεν επιβεβαιώθηκε σε κύτταρα ΝΙΗ 3Τ3 (Li et al., 1992). Σε οστεοβλάστες, η έκφραση του γονιδίου της PTN μειώνεται από τη βιταμίνη D3 (Tamura et al., 1994). Αύξηση της έκφρασης του γονιδίου της PTN παρατηρείται μετά από προσθήκη του οφθαλμικού νευροτροφικού παράγοντα (Ciliary Neurotrophic Factor, CTNF) σε αμφιβληστροειδικά μοσχεύματα στον οφθαλμό ποντικού (Roger et al, 2006). Επίσης, έχει δειχθεί ότι η κυκλική AMP επάγει τα επίπεδα της PTN σε ντοπαμινεργικούς νευρώνες, χωρίς όμως να έχει διευκρινιστεί ο ακριβής μηχανισμός (Mourlevat et al., 2005). Σε εμβρυϊκούς ινοβλάστες ποντικού που τους λείπουν και τα δύο αλληλόμορφα για την PTEN (Phosphatase and Tensin homologue deleted on chromosome 10), η έκφραση της PTN επάγεται μέσω του μονοπατιού PTEN-PI3K-AKT (Li et al., 2006). Τέλος, σε ωοθήκες ποντικών, το μονοπάτι των Wnt/β-κατενίνη, αναστέλλει την έκφραση της PTN (Boerboom et al., 2006). E.3.5 Έκφραση του γονιδίου της PTN κατά την εμβρυική ανάπτυξη και την ενήλικη ζωή Η PTN απομονώθηκε το 1989 από εγκέφαλο νεογέννητου αρουραίου (Rauvala, 1989) και από μήτρα βοός (Milner et al., 1989; Li et al., 1990). Η έκφραση του γονιδίου επάγεται κυρίως κατά την όψιμη εμβρυογένεση και τη μετεμβρυϊκή ανάπτυξη (Rauvala, 1989; Li et al, 1990; Vanderwinden et al, 1992; Yeh et al, 1998). Σε παλαιότερες μελέτες έχει βρεθεί ότι το mrna της PTN ανιχνεύεται με in situ υβριδοποίηση κατά τη διάρκεια της εμβρυικής ανάπτυξης στο νευροεξώδερμα και το μεσόδερμα, φθάνοντας το μέγιστο έκφρασης λίγο μετά τη γέννηση (Vanderwinden et al, 1992). Η έκφραση της PTN ξεκινά στο νευρωνικό δίσκο την 8 η εμβρυική μέρα και στην πλευρική επιφάνεια του νευρωνικού αυλού την 9 η. Κατά το διάστημα μεταξύ 11 ης και 13 ης ημέρας 23

28 Εισαγωγή περιορίζεται στη ραχιαία κοιλιακή ζώνη και τέλος, κατά την 15 η ημέρα ανευρίσκεται στους κεντρικούς νευρώνες της φαιάς ουσίας (Fan et al., 2000). Το mrna της PTN εκφράζεται και στα πλάγια κέρατα του νωτιαίου μυελού (Fan et al., 2000), καθώς επίσης και στα πρόδρομα νευρωνικά κύτταρα του μεσεγκέφαλου (Jung et al., 2004). Επίσης εκφράζεται στους αναπτυσσόμενους άξονες εγκεφάλου ποντικού κατά τη διάρκεια της όψιμης εμβρυικής, αλλά και της πρώιμης μετεμβρυϊκής ζωής (Rauvala et al, 1994). Στο μέγιστο της έκφρασης της, ανιχνεύεται σε αστροκύτταρα, ολιγοδενδροκύτταρα και σε νευρώνες του νωτιαίου μυελού (Wang et al, 2004). Κατά τη μετεμβρυϊκή ζωή επίμυων, η PTN εκφράζεται κυρίως στον αναπτυσσόμενο φλοιό της παρεγκεφαλίδας και διατηρείται σε υψηλά επίπεδα και κατά την ενήλικη ζωή (Rauvala et al., 1994; Matsumoto et al., 1994; Bloch et al., 1992). Έχει ανευρεθεί σε μεγάλα ποσά στο νεοπάλαιο φλοιό και στο μεσεγκέφαλο μυός (Mitsiadis et al., 1995), ενώ πιθανόν εμπλέκεται στις αλληλεπιδράσεις νευρικών κυττάρων-γλοίας κατά την ανάπτυξη του οργανισμού, αφού ανιχνεύεται και στα δύο αυτά είδη κυττάρων (Wanaka et al., 1993). Στο νευρικό σύστημα του ώριμου ατόμου, η PTN εκφράζεται κυρίως στον ιππόκαμπο και σε νευρώνες του φλοιού (Vanderwinden et al., 1992; Wanaka et al., 1993). Μεγάλα ποσοστά έκφρασης της PTN έχουν αναφερθεί επίσης σε νευροεκφυλιστικές ασθένειες, όπως η νόσος Alzheimer, το σύνδρομο Down (Wisniewski et al., 1996) και η νόσος του Parkinson (Ferrario et al., 2004). Η PTN εκφράζεται και στις νευρομυϊκές συνάψεις. Εντοπίζεται στην επιφάνεια των μυών και πριν την άφιξη των αξόνων στην περιοχή που θα δημιουργηθεί η σύναψη, και πιθανόν παίζει ρόλο στην καθοδήγηση των κώνων αύξησης και τη δημιουργία της σύναψης (Szabat and Rauvala, 1996). Το mrna της PTN έχει ανιχνευτεί σε λεία μυϊκά κύτταρα επίμυος (Milhiet et al, 1998) και σε μυοκαρδιακά κύτταρα ποντικού, ενώ τα επίπεδα του μειώνονται κατά τη μετεμβρυϊκή διαφοροποίηση του μυοκαρδίου (Chen et al, 2004). 24

29 Εισαγωγή Το mrna και η πρωτεΐνη PTN ανιχνεύονται στο αναπτυσσόμενο οστό και ανευρίσκονται σε μεγάλες ποσότητες στο χόνδρο και τα χονδροκύτταρα, κυρίως κατά τη διάρκεια της εμβρυικής και πρώιμης μετεμβρυϊκής ζωής, και λιγότερο κατά την ενηλικίωση (Azizan et al., 2000). Έχει ανευρεθεί σε κυτταρικό υλικό που δρα ως υπόστρωμα για το σχηματισμό χόνδρου (Imai et al., 1998), στον οδοντικό πολφό επίμυος (Vanderwinden et al, 1992) και σε οστεοβλάστες βοός (Tezuka et al., 1990). Αυξημένα επίπεδα mrna της PTN παρατηρούνται στις επιφυσιακές πλάκες των οστών κατά την διάρκεια της επιδιόρθωσης τους (Imai et al., 199), ενώ η πρωτεΐνη ανιχνεύεται και κατά τη διάρκεια της επούλωσης του οστού μετά από κατάγματα (Petersen et al., 2004). Επίσης σε οστεοαρθρικούς χόνδρους παρατηρείται υπερέκφραση του mrna της PTN σε σχέση με το φυσιολογικό χόνδρο (Pufe et al., 2006). Κατά την κύηση, η έκφραση της PTN αυξάνεται στο μυομήτριο ενήλικα αρουραίου, ενώ έχει παρατηρηθεί και διαφορική έκφραση του mrna του μορίου κατά τη διάρκεια του έμμηνου κύκλου (Milhiet et al., 1998). Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι η PTN βρίσκεται υπό ορμονικό έλεγχο. Το mrna της PTN ανιχνεύεται στα κύτταρα Leydig όρχεων αρουραίου (Vanderwinden et al., 1992), ενώ υπερεκφράζεται στην νόσο του Peyronie και τη νόσο Dupuytren (Qian et al., 2004). Ε.3.6 Αλληλεπιδράσεις και υποδοχείς της PTN Η PTN απομονώθηκε αρχικά ως ένας αυξητικός παράγοντας των νευριτών μετά από έκλουση στήλης ηπαρίνης-σεφαρόζης από 1Μ ΝaCl (Rauvala et al., 1989). Όπως αποδείχθηκε αργότερα, παρόλο που οι άμινο- και καρβοξυτελικές ουρές είναι πλούσιες σε λυσίνη και είναι ισχυρά φορτισμένες, η πρόσδεση της PTN στην ηπαρίνη εξαρτάται από τις TSR περιοχές εντός των β-πτυχωτών δομών. Όπως αποδείχθηκε με φασματοσκοπία μαγνητικού συντονισμού (NMR), η ηπαρίνη σε διάλυμα δεσμεύεται και στις δύο β-περιοχές (Kilpelainen et al, 2000). Επίσης, παρόλο που οι τελικές, πλούσιες σε λυσίνη περιοχές περιέχουν αλληλουχίες 25

30 Εισαγωγή πρόσδεσης της ηπαρίνης, οι τελευταίες δεν απαιτούνται για την υψηλής συγγένειας πρόσδεση της PTN στην ηπαρίνη και τη θειική ηπαράνη (Raulo et al, 2005) και αλλαγές στις αλληλουχίες των πλούσιων σε λυσίνη τελικών περιοχών του μορίου, δεν επηρεάζουν την πρόσδεση (Munoz et al, 2004). Η μεγάλη συγγένεια της ηπαρίνης για την PTN χρησιμοποιείται ως αρχή απομόνωσης του μορίου από το μέσο καλλιέργειας κυττάρων και τα βιολογικά υγρά (Soulie et al, 2002). Η υψηλή συγγένεια πρόσδεσης της ηπαρίνης στην PTN οδήγησε στο σκεπτικό ότι πιθανά να δεσμεύεται σε πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης παρούσες στην κυτταρική επιφάνεια και το εξωκυτταρικό υλικό. Πράγματι, η PTN αποδείχτηκε να αλληλεπιδρά με τις παραπάνω πρωτεογλυκάνες του εξωκυττάριου τμήματος σε διάφορες κυτταρικές σειρές (Papadimitriou et al., 2000;2001; Polycratis et al., 2004; Soulie et al., 2002; Bernard-Pierrot et al., 2004; Vacherot et al., 1999). Στη συνέχεια, έγιναν αναφορές σχετικά με την πρόσδεση της PTN, με χαμηλότερη όμως συγγένεια, με διάφορες άλλες γλυκοζαμινογλυκάνες θειικής δερματάνης και θειικής χονδροϊτίνης Α, αλλά όχι με γλυκοζαμινογλυκάνες θειικής χονδροϊτίνης C και θειικής κερατάνης (Vacherot et al., 1999). Η θειική δερματάνη και η θειική χονδροϊτίνη είναι πρωτεογλυκάνες, των οποίων η γλυκοζαμινογλυκανική πλευρική αλυσίδα αποτελείται από επαναλαμβανόμενες δισακχαριδικές μονάδες -GlcUA-GalNAc- (D-γλυκουρονικό οξυ-) και IdoUA- GalNAc- (L-ιδουρονικό οξυ-) αντίστοιχα, εμφανίζουν πολλά και διαφορετικά ποσοστά θειικών και μπορούν να υπάρξουν και ως συμπολυμερή (CS/DS) (Silbert and Sugumaran, 2002; Sugahara et al., 2003). Οι τελευταίες είναι σημαντικές για την πρόσδεση αυξητικών παραγόντων, τη γένεση των νευριτών και την ανάπτυξη του εγκεφάλου (Sugahara et al., 2003; Bandtlow and Zimmermann, 2000). Έχει αποδειχθεί ότι η PTN επάγει την προέκταση των νευριτών μέσω αλληλεπιδράσεων με την πλευρική αλυσίδα θειικής ηπαράνης της συνδεκάνης-3 (Kinnunen et al., 1996), ενώ άλλες μελέτες δείχνουν ότι η PTN αλληλεπιδρά με ενδογενείς και εξωγενείς αλυσίδες θειικής χονδροϊτίνης και δερματάνης (Deepa et al, 2002; Bao et al., 2004; Nandini et al., 2004; 2005; Bao et al., 2005). 26

31 Εισαγωγή Έχει αναφερθεί ότι η πρόσδεση της PTN στην ηπαρίνη ευνοείται όταν η PTN είναι προσκολλημένη στον πυθμένα των τρυβλίων επώασης (Mitsiadis et al, 1995). Και εδώ παίζουν ρόλο οι γλυκοζαμινογλυκάνες της κυτταρικής επιφάνειας, αφού έτσι υπάρχει πιο ισχυρή πρόσδεση τους με την PTN, με αποτέλεσμα να επάγεται ο πολλαπλασιασμός σε αντίθεση με την περίπτωση που η PTN βρίσκεται διαλυμένη στο θρεπτικό μέσο (Papadimitriou et al., 2000). Οι γλυκοζαμινογλυκάνες φαίνεται να προστατεύουν τη PTN από την πρωτεολυτική δράση της πλασμίνης επί του πεπτιδικού δεσμού Κ59-Κ60, o οποίος βρίσκεται μεταξύ των δύο β-πτυχωτών δομών αλλά όχι σε άλλες θέσεις (Polykratis et al, 2004), γεγονός που οδηγεί στη σκέψη ότι πιθανόν να είναι υπεύθυνες για την παρουσίαση του μορίου στους ειδικούς υποδοχείς του. Η PTN έχει βρεθεί ότι προσδένεται και στις συνδεκάνες 1 και 3 (Raulo et al, 1994). Η τελευταία, η οποία ονομάζεται και Ν-συνδεκάνη, είναι μια 200 kda πρωτεΐνη της κυτταρικής επιφάνειας που περιέχει αλυσίδες θειικής ηπαράνης, με υψηλά ποσοστά σε 2-Ο σουλφωνικά κατάλοιπα ιδουρονικού οξέος, με αποτέλεσμα να προσδένεται εύκολα με την PTN (Kinnunen et al, 1996). H N-συνδεκάνη έχει βρεθεί ότι προσδένει τη PTN σε οστεοβλάστες και πρόδρομα οστικά κύτταρα (Imai et al, 1998). Το mrna για την Ν-συνδεκάνη και τη PTN έχει ανευρεθεί και στα πρόδρομα νευρωνικά κύτταρα επηρεάζοντας την περαιτέρω εξέλιξη τους (Furuta et al, 2004). Η PTN έχει βρεθεί να δεσμεύεται στο διαμεμβρανικό υποδοχέα με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ (Receptor-like Protein Tyrosine Phosphatase β/ζ, RPTP β/ζ) (Maeda et al., 1996). Η φαινομενική μοριακή μάζα του είναι 250 kda, ενώ οι γλυκοζυλιωμένες του μορφές αναλύονται στα 300 kda. Παρόλο που περιέχει δύο περιοχές με αλληλουχία φωσφατάσης τυροσίνης στο κυτταροπλασματικό τμήμα του, μόνο αυτή που είναι πλησιέστερη στη μεμβράνη παρουσιάζει τέτοια δράση (Krueger and Saito, 1992). Ο RPTPβ/ζ είναι η κύρια πρωτεογλυκάνη θειικής ηπαράνης στο αναπτυσσόμενο νευρικό σύστημα (Canoll et al, 1993; Krueger and Saito, 1992; Levy et al, 1993) και η εξαρτώμενη από το χώρο και τη χρονική στιγμή έκφραση του, υποδεικνύει τον πιθανό του ρόλο στη μορφογένεση και την 27