Ταυτοποίηση πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με τον αυξητικό παράγοντα πλειοτροπίνη και διερεύνηση του λειτουργικού τους ρόλου

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ Ταυτοποίηση πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με τον αυξητικό παράγοντα πλειοτροπίνη και διερεύνηση του λειτουργικού τους ρόλου ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΜΑΡΙΝΑ ΚΟΥΤΣΙΟΥΜΠΑ ΧΗΜΙΚΟΣ, ΦΑΡΜΑΚΟΠΟΙΟΣ, MSc ΠΑΤΡΑ 2013

2

3 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ Ταυτοποίηση πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με τον αυξητικό παράγοντα πλειοτροπίνη και διερεύνηση του λειτουργικού τους ρόλου ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΜΑΡΙΝΑ ΚΟΥΤΣΙΟΥΜΠΑ ΧΗΜΙΚΟΣ, ΦΑΡΜΑΚΟΠΟΙΟΣ, MSc ΠΑΤΡΑ 2013 H παρούσα έρευνα έχει συγχρηματοδοτηθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο - ΕΚΤ) και από εθνικούς πόρους μέσω του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» του Εθνικού Στρατηγικού Πλαισίου Αναφοράς (ΕΣΠΑ) Ερευνητικό Χρηματοδοτούμενο Έργο: Ηράκλειτος ΙΙ. Επένδυση στην κοινωνία της γνώσης μέσω του Ευρωπαϊκού Κοινωνικού Ταμείου.

4

5 ΜΑΡΙΝΑ ΚΟΥΤΣΙΟΥΜΠΑ ΧΗΜΙΚΟΣ, ΦΑΡΜΑΚΟΠΟΙΟΣ, MSc Ταυτοποίηση πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με τον αυξητικό παράγοντα πλειοτροπίνη και διερεύνηση του λειτουργικού τους ρόλου ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Ε. ΠΑΠΑΔΗΜΗΤΡΙΟΥ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΡΙΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Ν. ΚΑΡΑΜΑΝΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΛΟΣ ΤΡΙΜΕΛΟΥΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Α. ΠΑΠΑΠΕΤΡΟΠΟΥΛΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΜΕΛΟΣ ΤΡΙΜΕΛΟΥΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Χ. ΚΑΛΟΦΩΝΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΜΕΛΟΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Γ. ΣΤΑΘΟΠΟΥΛΟΣ ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΜΕΛΟΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Δ. ΚΛΕΤΣΑΣ ΕΡΕΥΝΗΤΗΣ Α ΣΤΟ ΕΚΕΦΕ ΔΗΜΟΚΡΙΤΟΣ ΜΕΛΟΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Β. ΚΟΣΤΟΥΡΟΥ ΕΡΕΥΝΗΤΡΙΑ Γ ΣΤΟ ΕΚΕΒΕ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ ΦΛΕΜΙΝΓΚ ΜΕΛΟΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ

6

7 Στην οικογένειά μου και στον Γιώργο

8

9 Πρόλογος Ολοκληρώνοντας τη διατριβή αυτή, θα ήθελα να αναφερθώ σε όσους συνέβαλαν στην ολοκλήρωση της. Αρχικά θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα την επιβλέπουσα Αναπληρώτρια Καθηγήτρια κ. Ευαγγελία Παπαδημητρίου, η οποία με εμπιστεύτηκε στα πρώτα μου βήματα ως ερευνήτρια και μου έδωσε τη δυνατότητα να εκτεθώ σε πολλά ερευνητικά θέματα και να εξελιχθώ μέσα από την ενασχόλησή μου με την επιστήμη. Πέρα από το μόνιμο ενδιαφέρον της γύρω από την εξέλιξη της παρούσας εργασίας, η άριστη συνεργασία, η αμέριστη βοήθεια και η συμπαράσταση που μου έδειξε συνέβαλαν ώστε η περίοδος αυτή να είναι ευχάριστη κι ιδιαίτερα εποικοδομητική, ειδικά σε αυτούς τους δύσκολους καιρούς. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Καθηγητή του Τμήματος Φαρμακευτικής κ. Ανδρέα Παπαπετρόπουλο για τη συμμετοχή του στην τριμελή συμβουλευτική επιτροπή καθώς και για τη συνολική βοήθειά του, τις εύστοχες συμβουλές και παρατηρήσεις του καθώς και για την παρότρυνσή του να ασχοληθώ περαιτέρω με την έρευνα. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Καθηγητή του Τμήματος Χημείας κ. Νικόλαο Καραμάνο πριν από όλα για τις βασικές γνώσεις που μου μετέδωσε ως προπτυχιακή φοιτήτρια του Τμήματος Χημείας, για τη συμμετοχή του στην τριμελή συμβουλευτική επιτροπή, καθώς και για την εμπιστοσύνη και την ηθική του συμπαράσταση από την αρχή της πορείας μου. Ευχαριστώ θερμά τον Καθηγητή του Τμήματος Ιατρικής κ. Χαράλαμπο Καλόφωνο, τον Επίκουρο Καθηγητή του Τμήματος Ιατρικής κ. Γεώργιο Σταθόπουλο, τον Ερευνητή Α Βαθμίδας κ. Δημήτριο Κλέτσα στο ΕΚΕΦΕ ΔΗΜΟΚΡΙΤΟΣ και την Ερευνήτρια Γ Βαθμίδας κ. Βασιλική Κοστούρου ΣΤΟ ΕΚΕΒΕ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ ΦΛΕΜΙΝΓΚ για την τιμή που μου έκαναν να συμμετάσχουν στην επταμελή εξεταστική επιτροπή και για την ιδιαίτερα φιλική αντιμετώπισή τους. Ιδιαίτερα ευχαριστώ την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια του Τμήματος Ιατρικής κ. Ζωή Λυγερού και την ερευνητική της ομάδα στο Εργαστήριο Γενικής Βιολογίας του Τμήματος Ιατρικής, για τη δυνατότητα χρήσης του μικροσκοπίου συνεστιακής σάρωσης και για την φιλοξενία τους. Τις μεταδιδακτορικές ερευνήτριες κ. Σπέλλα Μάγδα και κ. Αλεξάνδρα Πατμανίδη θα ήθελα ειδικά να ευχαριστήσω για τη συμβολή τους στην εκπαίδευσή μου στη μικροσκοπία φθορισμού. Ακόμα θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τη Δρ. Ευσταθία Γιαννοπούλου για την αμέριστη βοήθειά της για την εκτέλεση διαφόρων πειραμάτων, αλλά και για την ηθική της συμπαράσταση. Οφείλω ένα πολύ μεγάλο ευχαριστώ στους μεταπτυχιακούς φοιτητές με τους οποίους είχα τη χαρά να

10 συνεργαστώ όλα τα χρόνια παραμονής μου στο Εργαστήριο Μοριακής Φαρμακολογίας. Ιδιαίτερα να ευχαριστήσω τη Δρ. Μαρίζα Χατζιαποστόλου και το Δρ. Χρίστο Πολυτάρχου για την κρίσιμη συμβολή τους σε σχέση με την ενασχόλησή μου με την έρευνα καθώς και για την πολύτιμη βοήθειά τους στην εκτέλεση σημαντικών πειραμάτων για την εξέλιξη της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής. Ειδικά ευχαριστώ τον Δρ. Κωνσταντίνο Μικέλη με τον οποίο συνεργαστήκαμε για μεγάλο χρονικό διάστημα, ο οποίος μου μετέδωσε τις γνώσεις και την ερευνητική του εμπειρία με εξαιρετική υπομονή. Επίσης ευχαριστώ τους υποψήφιους διδάκτορες κ.παναγιώτη Μπουντούρη και κ. Μαργαρίτα Λάμπρου για την σημαντική τους βοήθεια στην επίλυση ζητημάτων της καθημερινότητας, για το ευχάριστο και φιλικό κλίμα που δημιούργησαν αλλά και την ηθική συμπαράσταση που μου προσέφεραν. Όμως ιδιαίτερα ευχαριστώ την Υποψήφια Διδάκτορα κ. Ευαγγελία Ποιμενίδη, μία άψογη συνεργάτιδα αλλά και πραγματική φίλη. Την ευχαριστώ γιατί ήταν πάντα δίπλα μου στα εύκολα και στα δύσκολα... Κλείνοντας το μικρό αυτό πρόλογο, θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους τους φίλους που στάθηκαν αρωγοί σε αυτή τη προσπάθεια μου και ειδικά την κ. Αθηνά Δημητρέλλη και τον κ. Πέτρο Ματσώκη. Χωρίς αμφιβολία ευχαριστώ τον φίλο μου κ. Γιώργο Φουντούλη για την υπομονή και την υποστήριξη όλα αυτά τα χρόνια. Φυσικά, ευχαριστώ όλους τους δασκάλους μου στους οποίους οφείλω το κυριότερο μέρος της παιδείας μου μέχρι σήμερα. Τέλος, δεν ξεχνώ ότι αυτά που πέτυχα τα τελευταία χρόνια τα οφείλω στην υλική και ηθική συμπαράσταση αλλά και στα πρότυπα που είχα από τους γονείς μου και τον αδερφό μου Αλέξανδρο και τους ευχαριστώ.

11 Περιεχόμενα Εισαγωγή 1 1. Αγγειογένεση Γενική θεώρηση Μόρια που συμμετέχουν στην αγγειογένεση Στάδια της αγγειογενετικής διαδικασίας Ενεργοποίηση ενδοθηλιακών κυττάρων και εκβλάστηση νέων αγγείων Αποικοδόμηση της εξωκυττάριας ύλης από πρωτεολυτικά ένζυμα Μετατροπή των εκβλαστήσεων σε αγγεία και δημιουργία ώριμου αυλού Μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων κατά την αγγειογένεση Καρκινική αγγειογένεση και θεραπευτική αντιμετώπιση PTN (pleiotrophin, PTN) Εισαγωγικά Δομή του γονιδίου της PTN Έκφραση του γονιδίου και βιολογικές δράσεις της PTN Πρωτεϊνική δομή της PTN Ο ρόλος της PTN στην αγγειογένεση και στον καρκίνο Βιολογικά ενεργά τμήματα της PTN Μόρια που αλληλεπιδρούν με την PTN Γλυκοζαμινογλυκάνες Ν-Συνδεκάνη Κινάση αναπλαστικού λεμφώματος (Anaplastic Lymphoma Kinase, ALK) Υποδοχέας με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ (receptor protein tyrosine phosphatase β/ζ, RPTPβ/ζ) Ιντεγκρίνη α ν β Άλλα μόρια Νουκλεολίνη (nucleolin, NCL) Εισαγωγικά Σχέση δομής-δράσης της NCL Σταθερότητα και ρύθμιση της NCL Φωσφορυλίωση της NCL Γλυκοζυλίωση της NCL Βιολογικές δράσεις της NCL Έκφραση της NCL στην κυτταρική μεμβράνη Προσδέτες της μεμβρανικής NCL Ο ρόλος της μεμβρανικής NCL στη μεταγωγή σήματος Στρατηγικές στόχευσης της μεμβρανικής NCL 64 Σκοπός 71 Μέθοδοι Θρεπτικά μέσα των χρησιμοποιούμενων κυττάρων 77

12 2. Απομόνωση ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC από φλέβα ομφάλιου λώρου ανθρώπου Ανακαλλιέργεια κυττάρων Μέτρηση κυττάρων σε αιματοκυτταρόμετρο Neubauer Κατάψυξη κυττάρων Απόψυξη κυττάρων Απομόνωση πρωτεϊνών από καλλιέργειες ευκαρυωτικών κυττάρων Προσδιορισμός της συγκέντρωσης ολικών πρωτεϊνών σε διάλυμα (Μέθοδος Bradford) Ανοσοκατακρήμνιση Ανάλυση πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακριλαμιδίου με αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) Ανάλυση πρωτεϊνών κατά Western Διαδικασία αποδέσμευσης αντισώματος από PVDF μεμβράνη (stripping) Ποσοτικοποίηση ανοσοαποτυπωμάτων με σύστημα ανάλυσης εικόνας Διαμόλυνση κυττάρων με παρεμβαλλόμενο RNA (sirna, RNAi) Μετασχηματισμός ευκαρυωτικών κυττάρων M059K και U87MG Μελέτη του χημειοτακτισμού των κυττάρων (Transfilter assay) Επώαση κυττάρων με παράγοντες για μελέτες φωσφορυλίωσης ή έκφρασης πρωτεϊνών, πειράματα ELISA ή για μελέτες ανοσοφθορισμού Λύση κυττάρων μετά από ενεργοποίηση για μελέτες φωσφορυλίωσης ή έκφρασης πρωτεϊνών, πειράματα ELISA ή για μελέτες ανοσοφθορισμού Ανίχνευση και ποσοτικός προσδιορισμός των επιπέδων ενεργοποίησης της PI3K p85 με τη μέθοδο ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) Βιοτινυλίωση πρωτεϊνών κυτταρικής μεμβράνης ευκαρυωτικών κυττάρων και ανάλυσή τους Κλασμάτωση ευκαρυωτικών κυττάρων Ανοσοφθορισμός Προρδιορισμός αλληλεπίδρασης λόγω εγγύτητας (Proximity Ligation Assay) Ανάπτυξη βακτηριακών κυττάρων σε στερεή καλλιέργεια Ανάπτυξη βακτηριακών κυττάρων σε υγρή καλλιέργεια Κατάψυξη βακτηριακών κυττάρων Παρασκευή επιδεκτικών κυττάρων για μετασχηματισμό (competent cells) Μετασχηματισμός δεκτικών βακτηριακών κυττάρων (transformation) Μεγάλης κλίμακας απομόνωση πλασμιδιακού DNA (Midiprep) Προσδιορισμός της συγκέντρωσης DNA Αντίδραση πέψης με ένζυμα περιορισμού Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊνικών οξέων σε πήκτωμα αγαρόζης Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων Αντιδραστήρια 149

13 Αποτελέσματα Η PTN συνανοσοκατακρημνίζεται με τη NCL σε ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC Συνεντοπισμός της PTN με τη NCL σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC Η PTN συνανοσοκατακρημνίζεται με τη NCL στον πυρήνα, στο κυτταρόπλασμα και στην πλασματική μεμβράνη U87MG κυττάρων Η PTN αλληλεπιδρά άμεσα με τη NCL σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC και καρκινικά κύτταρα U87MG Η PTN αλληλεπιδρά με το κεντρικό τμήμα και πιθανώς με το καρβοξυτελικό άκρο της NCL Η περιοχή TSR1 του αμινοτελικού άκρου της PTN εμπλέκεται στην αλληλεπίδραση με τη NCL Μείωση των επιπέδων της πρωτεϊνικής έκφρασης της NCL αναστέλλει την επαγόμενη από PTN μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC Λειτουργικός αποκλεισμός της μεμβρανικής NCL αναστέλλει την επαγόμενη από PTN μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC H NCL εντοπίζεται στην επιφάνεια κυττάρων που εκφράζουν την ιντεγκρίνη α ν β Η έκφραση της ιντεγκρίνης α ν β 3 είναι απαραίτητη για τον εντοπισμό της NCL στην κυτταρική μεμβράνη Η τυροσίνη της θέσης 773 της υπομονάδας β 3 απαιτείται για το μεμβρανικό εντοπισμό της NCL H ΡΤΝ επάγει το μεμβρανικό εντοπισμό της NCL σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC H επαγόμενη από ΡΤΝ μετακίνηση της NCL στην κυτταρική μεμβράνη εξαρτάται από τη φωσφορυλίωση της τυροσίνης 773 της υπομονάδας β Ο RPTPβ/ζ είναι απαραίτητος για την επαγόμενη από PTN μετακίνηση της NCL στην κυτταρική μεμβράνη Οι κινάσες c-src και PI3K εμπλέκονται στην επαγόμενη από PTN μετακίνηση της NCL στην κυτταρική μεμβράνη Ενεργοποίηση της κινάσης c-src λαμβάνει χώρα ανοδικά, ενώ της κινάσης PI3K καθοδικά από την επαγόμενη από PTN φωσφορυλίωση της 179 υπομονάδας β Πεπτίδιο που αντιστοιχεί στο καρβοξυτελικό άκρο της PTN (PTN ) δεν επηρεάζει τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό της NCL Ο RPTPβ/ζ και η α ν β 3 εμπλέκονται στην επαγόμενη από VEGF 165 μετακίνηση της NCL στην κυτταρική μεμβράνη Οι κινάσες c-src, PI3K και p38 απαιτούνται για την επαγόμενη από VEGF 165 μετακίνηση της NCL στην επιφάνεια ενδοθηλιακών κυττάρων Ενεργοποίηση των κινασών c-src, PI3K και p38 από τον VEGF Η NCL συνανοσοκατακρημνίζεται με τον RPTPβ/ζ και την ιντεγκρίνη α ν β 3 σε ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC 22. Συνεντοπισμός της NCL με τον RPTPβ/ζ και την α ν β 3 σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC 23. Η NCL συνανοσοκατακρημνίζεται με τον RPTPβ/ζ και την α ν β 3 σε διαφορετικά κυτταρικά κλάσματα

14 24. Η NCL αλληλεπιδρά άμεσα με τον RPTPβ/ζ και με την ιντεγκρίνη α ν β Ο RPTPβ/ζ και η α ν β 3 αλληλεπιδρούν με το κεντρικό τμήμα και πιθανώς με το καρβοξυτελικό άκρο της NCL Η NCL εμπλέκεται στον ενδοκυτταρικό εντοπισμό της PTN και του RPTPβ/ζ Η έκφραση της α ν β 3 καθορίζει τη βιολογική δραστικότητα παραγόντων που στοχεύουν τη μεμβρανική NCL επί της μετανάστευσης ενδοθηλιακών και 208 καρκινικών κυττάρων Συζήτηση 215 Παράρτημα Αποτελεσμάτων Ανίχνευση προσδετών της α ν β 3 με φασματοσκοπία μάζας Συσχέτιση του μεμβρανικού εντοπισμού της NCL με την έκφραση της α ν β 3 σε μικροσυστοιχίες ιστών από ανθρώπινους όγκους εγκεφάλου 232 Βιβλιογραφία Συντμήσεις Περίληψη Summary Βιογραφικό σημείωμα

15 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

16

17 Εισαγωγή 1. Αγγειογένεση 1.1. Γενική θεώρηση Η συνεχής παροχή οξυγόνου καθώς και η φυσιολογική αγγείωση, είναι απαραίτητα στοιχεία για την επιβίωση όλων των θηλαστικών. Η ανάπτυξη του αγγειακού συστήματος απαιτεί το συντονισμό διαφόρων κυτταρικών διαδικασιών, όπως του πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης, της μετανάστευσης, της προσκόλλησης σε υπόστρωμα και της διακυτταρικής μεταγωγής σήματος κατά τη μορφογένεση των ιστών (Adams and Alitalo, 2007). Η διαδικασία δημιουργίας του αγγειακού συστήματος ξεκινάει με τη νεοαγγειογένεση, η οποία πραγματοποιείται κατά την εμβρυϊκή ζωή, περιλαμβάνει το σχηματισμό του πρωτογενούς αγγειακού πλέγματος από τα μεσοδερμικά προγεννητικά κύτταρα (Risau, 1997) και συνεχίζεται κατά την ενήλικη ζωή με τη διαδικασία της αγγειογένεσης. Ο κλασικός ορισμός της αγγειογένεσης είναι η δημιουργία νέων αγγείων από προϋπάρχοντα (Folkman, 1990) και αποτελεί μια πολυσταδιακή διαδικασία που περιλαμβάνει γεγονότα όπως αποικοδόμηση της εξωκυττάριας ύλης, πολλαπλασιασμό και μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων, ωρίμανση και σταθεροποίηση του νέου αγγείου με επιστράτευση περικυττάρων και λείων μυϊκών κυττάρων (Tirziu and Simons, 2005). Συνεισφέρει στην ανάπτυξη νέων οργάνων, στη διαφοροποίηση κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης, στην επούλωση πληγών και στην αναπαραγωγική διαδικασία στους ενήλικες (Folkman, 1990; 2007). Με την αγγειογένεση επιτυγχάνεται η δημιουργία βοηθητικών αιμοφόρων αγγείων σε περιπτώσεις μειωμένης παροχής οξυγόνου και θρεπτικών συστατικών σε φυσιολογικούς ιστούς, καθώς τα ενδοθηλιακά κύτταρα διατηρούν την ικανότητά τους να πολλαπλασιάζονται άμεσα ως απόκριση σε φυσιολογικά ερεθίσματα, όπως η υποξία. Σε αρκετές διαταραχές, τα ερεθίσματα αυτά είναι έντονα, με αποτέλεσμα να διαταράσσεται η ισορροπία ανάμεσα σε αγγειογενετικούς και αντιαγγειογενετικούς παράγοντες και να επάγεται παθολογικά αυξημένη αγγειογένεση. Οι νόσοι που σχετίζονται με αυξημένη αγγειογένεση είναι αρκετές, όπως φλεγμονή, διαταραχές όρασης, οστεοαρθρίτιδα, ρευματοειδής αρθρίτιδα, ψωρίαση κ.ά., με πιο γνωστή τον καρκίνο (Carmeliet, 2005). 1

18 Εισαγωγή 1.2. Μόρια που συμμετέχουν στην αγγειογένεση Η μεταβολή στην ισορροπία ανάμεσα στους επαγωγείς της αγγειογένεσης και στους αντίστοιχους αναστολείς ορίζεται ως αγγειογενετικός διακόπτης, ο οποίος ενεργοποιείται από διάφορα σήματα. Αυτά περιλαμβάνουν μεταβολικό στρες (όπως χαμηλή τάση O 2, χαμηλό ph, υπογλυκαιμία) ή μηχανικό στρες, τα οποία οδηγούν σε πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ανοσολογικές αντιδράσεις και γενετικές μεταλλάξεις που ενεργοποιούν ογκογονίδια ή εξαλείφουν/αναστέλλουν ογκοκατασταλτικά γονίδια, τα οποία ελέγχουν την παραγωγή ρυθμιστικών μορίων της αγγειογένεσης (Carmeliet and Jain, 2000). Παρακάτω παρατίθενται πίνακες (Ε1 και Ε2) με τους κυριότερους επαγωγείς και αναστολείς της αγγειογένεσης. Μεταξύ των παραγόντων που ρυθμίζουν με θετικό ή αρνητικό τρόπο την ενεργοποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων είναι οι αυξητικοί παράγοντες, πολυπεπτίδια μικρής σχετικά μοριακής μάζας, τα οποία παράγονται τόσο από φυσιολογικά, όσο και από κύτταρα του όγκου και μπορούν να δεσμευτούν στην εξωκυττάρια ύλη και να ενεργοποιήσουν, με άμεσο ή έμμεσο τρόπο, τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Οι αυξητικοί παράγοντες μεταφέρονται στο σημείο δράσης τους με το κυκλοφορικό σύστημα ή με διάχυση στους ιστούς γύρω από την περιοχή σύνθεσής τους. Διεγείρουν τα ίδια τα κύτταρα που τους εκκρίνουν (αυτοκρινής δράση) ή διαφορετικά είδη κυττάρων (παρακρινής δράση). Πολλοί αυξητικοί παράγοντες έχουν συγγένεια δέσμευσης με την ηπαρίνη, όπως για παράδειγμα, ο αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών (fibroblast growth factor, FGF), ο αυξητικός παράγοντας των αιμοπεταλίων (platelet-derived growth factor, PDGF), ο αυξητικός παράγοντας του αγγειακού ενδοθηλίου (vascular endothelial growth factor, VEGF), η Μidkine (ΜΚ), η πλειοτροπίνη (pleiotrophin, PTN) κ.ά. 2

19 Εισαγωγή Πίνακας Ε1: Ενδογενείς επαγωγείς της αγγειογένεσης (Liekens et al, 2001; Zachary and Gliki, 2001; Cheng et al, 2002; Haas, 2005). Επαγωγέας Δράση σε ενδοθηλιακά κύτταρα Πολλαπλασιασμός Μετανάστευση Διαφοροποίηση Αυξητικοί παράγοντες με συγγένεια για την ηπαρίνη VEGF PIGF FGF-1, FGF PTN Ephrins HIV-tat PDGF HGF/SF Αυξητικοί παράγοντες χωρίς συγγένεια για την ηπαρίνη TGF-α TGF-β Αναστολή - + EGF IGF-I Ρυθμιστές φλεγμονής TNF-α Αναστολή - + IL-8 + +? IL Προσταγλαδίνη E 1, E Ένζυμα PD-ECGF/TP - +? COX Αγγειογενίνη Μεταλλοπρωτεϊνάσες στρώματος (MMPs) Ορμόνες Οιστρογόνα Προλιφερίνη? +? Ολιγοσακχαρίτες Τμήματα υαλουρονικού οξέος Παράγοντες αιμοποίησης Ερυθροποιητίνη + + G-CSF + +? GM-CSF + +? Μόρια κυτταρικής προσκόλλησης VCAM-1 - +? Ε-σελεκτίνη Ιντεγκρίνες VE-καντχερίνη - +? Άλλα μόρια NO Αγγειοποιητίνη

20 Εισαγωγή Πίνακας Ε2: Ενδογενείς αναστολείς της αγγειογένεσης (Liekens et al, 2001). Αναστολέας Αγγειοστατίνη (πλασμινογόνου) Ενδοστατίνη (κολλαγόνου XVIII) aaat (αντιθρομβίνης 3) Προλακτίνη (θραύσμα 16 kda) TSP-1 Troponin I IFN-α IFN-γ PEDF IP-10 PF-4 IL-12 IL-4 VEGI TIMP-1, -2 PAI-1 Ρετινοϊκό οξύ Ang-2 2-μεθοξυοιστραδιόλη p53 VHL Μηχανισμός δράσης σε ενδοθηλιακά κύτταρα Πρωτεϊνικά θραύσματα πολλαπλασιασμού και απόπτωσης EC πολλαπλασιασμού και απόπτωσης EC πολλαπλασιασμού και απόπτωσης EC Διαλυτοί ρυθμιστές πολλαπλασιασμού EC πολλαπλασιασμού και απόπτωσης EC πολλαπλασιασμού EC πολλαπλασιασμού και απόπτωσης EC, της επαγωγής της αγγειογένεσης από τον FGF-2 πολλαπλασιασμού EC και ΙΡ-10 μετανάστευσης EC και πολλαπλασιασμού EC που επάγεται από τον FGF-2 πολλαπλασιασμού EC, μετανάστευσης EC που επάγεται από τον FGF-2 και την IL-8 πολλαπλασιασμού EC, μετανάστευσης EC που επάγεται από τον FGF-2 και την IL-8 INF-γ και ΙΡ-10 μετανάστευσης EC πολλαπλασιασμού EC δραστικότητας των ΜΜΡs δραστικότητας του upa μετανάστευσης EC, μεταγραφικός παράγοντας ωρίμανσης των αγγείων, ανταγωνιστής της Ang-1 πολλαπλασιασμού, μετανάστευσης EC και Ογκοκατασταλτικά γονίδια απόπτωσης EC σύνθεσης TSP-1, σύνθεσης VEGF σύνθεσης VEGF 1.3. Στάδια της αγγειογενετικής διαδικασίας Η έναρξη της ακολουθίας των γεγονότων της αγγειογένεσης απαιτεί την εκλεκτική ενεργοποίηση και αποχώρηση ενδοθηλιακών κυττάρων από το προϋπάρχον δίκτυο διαφοροποιημένων τριχοειδών. Αυτή η διαδικασία χαρακτηρίζεται από την 4

21 Εισαγωγή ενεργοποίηση συγκεκριμένων μονοπατιών μεταγωγής σήματος, τα οποία καθιστούν τα κύτταρα ικανά να εισβάλλουν στην εξωκυττάρια ύλη και να ξεκινούν μια νέα αγγειακή εκβλάστηση (Εικόνα Ε1). Εικόνα Ε1: Διαδικασία δημιουργίας νέου αγγείου. (Α) Η δημιουργία της εκβλάστησης ελέγχεται από την ισορροπία προ- και αντι-αγγειογενετικών παραγόντων. Σε περιπτώσεις που επάγεται η αγγειογένεση, τα ακραία ενδοθηλιακά κύτταρα (tip cells), επιλέγονται και μεταναστεύουν για εκβλάστηση, ενώ παράλληλα αποικοδομείται η γειτονική εξωκυττάρια ύλη. (Β) Ο προσανατολισμός της εκβλάστησης καθορίζεται από την αύξηση της συγκέντρωσης του VEGF και εξαρτάται από την εξωκυττάρια ύλη. Στη συνέχεια, επιστρατεύονται περικύτταρα, τα οποία συμμετέχουν στο σχηματισμό των αγγείων. (Γ) Όταν δύο ακραία κύτταρα «συναντηθούν», οι μεταξύ τους αλληλεπιδράσεις καθορίζουν το εάν θα συντηχθούν για να σχηματίσουν αυλό. Ο σχηματισμός του αυλού λαμβάνει χώρα στα υποκείμενα ενδοθηλιακά κύτταρα. (Δ) Η σύντηξη στα σημεία της σύνδεσης μεταξύ των ενδοθηλιακών κυττάρων συμβάλλει στη δημιουργία ενός συνεχούς αυλού. Η ροή του αίματος βελτιώνει τη μεταφορά οξυγόνου και έτσι μειώνει τα προαγγειογενετικά σήματα που επάγονται από την υποξεία. Τυχόν διάχυση επάγει διαδικασίες ωρίμανσης του αγγείου, όπως η σταθεροποίηση των συνδέσεων μεταξύ των ενδοθηλιακών κυττάρων, η εναπόθεση εξωκυττάριας ύλης και η στενή σύνδεση των περικυττάρων. Η απουσία αυξητικών παραγόντων μπορεί να οδηγήσει σε συρρίκνωση του νέου αγγείου και απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων (Adams and Alitalo, 2007). 5

22 Εισαγωγή Ενεργοποίηση ενδοθηλιακών κυττάρων και εκβλάστηση νέων αγγείων Η ενεργοποίηση ενδοθηλιακών κυττάρων αφορά γεγονότα μέσω των οποίων ένα πλήρως διαφοροποιημένο κύτταρο, το οποίο δεν κινείται και δεν πολλαπλασιάζεται, αποκτά αγγειογενετικό φαινότυπο, δηλαδή την ικανότητα μετανάστευσης, δυείσδυσης και πολλαπλασιασμού. Ο κυριότερος ρυθμιστής της ενεργοποίησης των ενδοθηλιακών κυττάρων φαίνεται να είναι ο VEGF, ο οποίος δρα ως αγγειογενετικός παράγοντας (Ferrara and Henzel, 1989; Leung et al, 1989) και ως παράγοντας αγγειακής διαπερατότητας (Keck et al, 1989). Μελέτες γονιδιακής στόχευσης αποκάλυψαν τη σημασία του VEGF στην ανάπτυξη του αγγειακού συστήματος, καθώς μετάλλαξη ενός μόνο αλληλομόρφου του γονιδίου του οδηγεί σε εμβρυϊκή θνησιμότητα (Carmeliet et al, 1996; Ferrara et al, 1996). Αποτελεί έναν από τους βασικούς ρυθμιστές της αγγειογένεσης, προάγοντας την ανάπτυξη αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων που προέρχονται από αρτηρίες, φλέβες και λεμφαγγεία και επάγοντας αγγειογενετικές αποκρίσεις σε μια ποικιλία in vivo μοντέλων (Zachary, 2003). Εναλλακτικό μάτισμα του γονιδίου του οδηγεί στη δημιουργία διαφόρων ισομορφών (VEGF 121, VEGF 145, VEGF 165, VEGF 189 και VEGF 206 ), με τον VEGF 165 να είναι η επικρατούσα ισομορφή από την άποψη της ποσότητας και της βιολογικής δράσης (Houck et al, 1992). Οι ισομορφές του VEGF διακρίνονται από την παρουσία ή την απουσία των πεπτιδίων που κωδικοποιούνται από τα εξόνια 6 και 7 του γονιδίου του. Η ισομορφή VEGF 121 δεν περιλαμβάνει τα πεπτίδια που κωδικοποιούνται από τα εξόνια 6 και 7. Oι ισομορφές VEGF 145 και VEGF 165 περιλαμβάνουν τα κωδικοποιημένα από το 6 ο και 7 ο εξόνιο πεπτίδια αντίστοιχα, ενώ η ισομορφή VEGF 189 περιλαμβάνει το κωδικοποιημένo τόσο από το 6 ο όσο και από το 7 ο εξόνιο πεπτίδιo (Houck et al, 1992; Park et al, 1993; Neufeld et al, 1996; Poltorak et al, 1997). Οι διαφορετικές ισομορφές του VEGF διαφέρουν και ως προς την ικανότητα πρόσδεσης στην ηπαρίνη, η οποία θεωρείται πως οφείλεται στην ύπαρξη του 7 ου εξονίου στην περίπτωση του VEGF 165 (Keyt et al, 1996) και ίσως του 6 ου εξονίου για τους VEGF 189 (Houck et al, 1992) και VEGF 145 (Poltorak et al, 1997). Ο VEGF 121 ο οποίος δε φέρει ικανότητα πρόσδεσης στην ηπαρίνη και ο VEGF 145 εκκρίνονται στο θρεπτικό μέσο κυττάρων, ενώ οι άκρως βασικές μεγάλες ισομορφές VEGF 189 και VEGF 206 προσδένονται και παραμένουν 6

23 Εισαγωγή προσκολλημένες σε θειϊκές ηπαράνες της κυτταρικής επιφάνειας. Ο VEGF 165 φαίνεται να έχει ενδιάμεσες ιδιότητες, δηλαδή και εκκρίνεται στο θρεπτικό μέσο κυττάρων και παραμένει προσκολλημένος σε θειϊκές ηπαράνες της κυτταρικής επιφάνειας (Park et al, 1993; Harper and Bates, 2008). Ο VEGF ρυθμίζει τη λειτουργία ενδοθηλιακών κυττάρων μέσω ενεργοποίησης δύο δομικά παρόμοιων υποδοχέων με δράση κινάσης τυροσίνης, τον VEGFR-1 γνωστό επίσης ως Fms-like tyrosine kinase- 1 (Flt-1) και τον VEGFR-2, επίσης γνωστό ως fetal liver kinase-1 (Flk-1) και στους ανθρώπους ως kinase insert domain containing receptor (KDR), οι οποίοι είναι ενεργοί κατά την αγγειογενετική διαδικασία (Zachary, 2001; Ruhrberg et al, 2002; Olsson et al, 2006). Αν και ο ακριβής ρόλος του VEGFR-1 στην αγγειογένεση δεν είναι πλήρως γνωστός, η παρουσία του είναι απαραίτητη για τη φυσιολογική ανάπτυξη του αγγειακού δικτύου, καθώς εξάλειψη του γονιδίου του οδηγεί σε πρώϊμη εμβρυϊκή θνησιμότητα που οφείλεται σε υπερ-ανάπτυξη των ενδοθηλιακών κυττάρων (Fong et al, 1999). Εκτός του ότι εκφράζεται στο αγγειακό ενδοθήλιο, ο VEGFR-1 εκφράζεται επίσης από διάφορους άλλους τύπους κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των ουδετεροφίλων, μονοκυττάρων, μακροφάγων και ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων (Takahashi and Shibuya, 2005). Περαιτέρω μελέτες αποκάλυψαν ότι ο VEGFR-1 ρυθμίζει αρνητικά την αγγειογένεση, δρώντας ως παγίδα του VEGF, εμποδίζοντας έτσι την πρόσδεσή του στον VEGFR-2 (Rahimi, et al, 2000), ενώ διέγερση του VEGFR-1 ανταγωνίζεται το διαμεσολαβούμενο από τον VEGFR-2 πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων (Rahimi et al, 2000; Zeng et al, 2001). Επίσης, έχει ταυτοποιηθεί μια φυσικώς απαντώμενη διαλυτή μορφή του VEGFR-1, από την οποία λείπουν οι διαμεμβρανικές και κυτταροπλασματικές περιοχές σηματοδότησης, η οποία ασκεί ανασταλτικές επιδράσεις στην αγγειογένεση μέσω άμεσης πρόσδεσης με τον VEGF (Ahmad and Ahmed, 2004) ή/και μέσω ετεροδιμερισμού με τους VEGFRs (Kendall et al, 1996). Αντίθετα, υπάρχουν αναφορές που υποστηρίζουν τη θετική ρύθμιση της αγγειογένεσης από τον VEGFR-1, καθώς σηματοδότηση από τον VEGFR-1 έχει συσχετιστεί με την νεοαγγείωση του οφθαλμού (Kami et al, 2008), την ανάπτυξη όγκων και τη μετάσταση (Hiratsuka et al, 2001). Υποστηρίζεται πως ενεργοποίηση του VEGFR-1 που εκφράζεται από μονοκύτταρα και μακροφάγα, οδηγεί δευτερογενώς σε επαγωγή της καρκινικής αγγειογένεσης. Τα κύτταρα αυτά μεταναστεύουν στις φλεγμονώδεις περιοχές και παράγουν κυτταροκίνες που 7

24 Εισαγωγή συμβάλλουν στην καρκινική αγγειογένεση μέσω του VEGFR-2 (Lin et al, 2006). Μεγάλος αριθμός μελετών αποδεικνύει ότι ο VEGFR-2 είναι ο υποδοχέας που είναι κατά κύριο λόγο υπεύθυνος για τις αποκρίσεις των αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων στον VEGF, στο πλαίσιο τόσο φυσιολογικών όσο και παθολογικών καταστάσεων. Φέρει ισχυρότερη δράση κινάσης τυροσίνης από ότι ο VEGFR-1, παρά τη χαμηλότερη συγγένειά του για τον VEGF. Η διέγερση του VEGFR-2 προάγει την ανάπτυξη, τη μετανάστευση, το σχηματισμό αυλών ενδοθηλιακών κυττάρων και ενισχύει την αγγειακή διαπερατότητα (Takahashi and Shibuya, 2005). Εξάλειψη του γονιδίου του VEGFR-2 σε επίμυες οδηγεί σε αποτυχία σχηματισμού αιμοφόρων αγγείων και εμβρυϊκή θνησιμότητα (Shalaby et al, 1995). Ακόμα, λειτουργικό αντίσωμα έναντι του VEGFR-2 αναστέλλει την ανάπτυξη πρωτογενών και μεταστατικών όγκων σε μοντέλα επίμυων, υποδηλώνοντας τον κρίσιμο ρόλο του VEGFR-2 στην καρκινική αγγειογένεση (Hicklin and Ellis, 2005). Η neuropilin-1 (NRP-1) αποτελεί μια διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη, η οποία αλληλεπιδρά εκλεκτικά με ισομορφές του VEGF που περιλαμβάνουν το 7 ο εξόνιο, εκφράζεται σε ενδοθηλιακά κύτταρα και δρα ως συνυποδοχέας του VEGF (Soker et al, 1996; 1998). Ωστόσο, πιο πρόσφατα δεδομένα υποδεικνύουν την ανάμειξη του 8 ου εξονίου του γονιδίου του VEGF στην πρόσδεση με NRP-1, καθώς και την άμεση αλληλεπίδραση του VEGF 121 με την NRP-1 (Appleton et al, 2007; Pan et al, 2007). Στοχευμένη απενεργοποίηση του γονιδίου της NRP-1 οδηγεί σε ελαττωματική ανάπτυξη αγγείων και νεύρων (Kawasaki et al, 1999). Δρα ως ενισχυτής των δράσεων του VEGF 165 μέσω του VEGFR-2 (Soker et al, 2002), ή ως ανεξάρτητος υποδοχέας του VEGF 165 (Wang et al, 2003; Murga et al, 2005). Η ενισχυτική δράση της στη μεταγωγή σήματος από τον VEGFR-2 υποστηρίζεται πως είναι το αποτέλεσμα του σχηματισμού συμπλόκων VEGFR-2/NRP-1 (Whitaker et al, 2001; Soker et al, 2002; Robinson et al, 2009). Πεπτίδια και αντισώματα που εμποδίζουν τη σύνδεση του VEGF με τη NRP-1 μπορούν να ενισχύσουν την αποτελεσματικότητα θεραπειών έναντι του VEGF 165 και να αναστείλουν την ανάπτυξη όγκων (Jia et al, 2006; Starzec et al, 2006; Pan et al, 2007). Πρωτεογλυκάνες θειϊκής ηπαράνης μπορούν να δράσουν ως θέσεις δέσμευσης χαμηλής συγγένειας για τον VEGF στην κυτταρική επιφάνεια ή στην εξωκυττάρια ύλη και: (α) να απελευθερώσουν άλλους αγγειογενετικούς παράγοντες, όπως ο FGF, ρυθμίζοντας έτσι τη διαθεσιμότητα και επομένως, τη βιολογική τους 8

25 Εισαγωγή δραστηριότητα (Stringer, 2006) ή (β) να αποθηκεύσουν τις διάφορες ισομορφές του VEGF, ρυθμίζοντας έτσι τη βιοδιαθεσιμότητά τους. Έχει αναφερθεί πως ο τρόπος παρουσίασης του VEGF από πρωτεογλυκάνες θειϊκής ηπαράνης στον υποδοχέα του, πιθανώς να ελέγχει τη διάρκεια της σηματοδότησης από τον VEGFR-2 (Jakobsson et al, 2006). Σύμφωνα με τα παραπάνω, η συσσώρευση αυξητικών παραγόντων στην εξωκυττάρια ύλη εξυπηρετεί τη βιοδιαθεσιμότητα τους και για το λόγο αυτό, σε ορισμένες περιπτώσεις τροποποίησης της σύστασης της εξωκυττάριας ύλης παρατηρείται αλλαγή σε κυτταρικές λειτουργίες. Ακόμα, φαίνεται πως η αλληλεπίδραση με πρωτεογλυκάνες θειϊκής ηπαράνης, πιθανώς είναι απαραίτητη για την πρόσδεση αυξητικών παραγόντων στους υποδοχείς τους και άρα για τη βιολογική τους δραστικότητα. Συνολικά, μεγάλος αριθμός αυξητικών παραγόντων δεσμεύεται στην ηπαρίνη και συμμετέχει στην ογκογένεση και στην αγγειογένεση, μεταξύ των οποίων και η PTN (Rauvala, 1989; Li et al, 1990; Courty et al, 1991). Η δράση του VEGF ρυθμίζεται με διάφορους μηχανισμούς. Είναι γνωστό για παράδειγμα ότι εναλλακτικό μάτισμα του VEGF μπορεί να οδηγήσει στην έκφραση μιας σειράς ισομορφών που ονομάζονται b ή VEGFxxxb, στις οποίες το 8 ο εξόνιο υποκαθίσταται από ένα εναλλακτικά ματισμένο εξόνιο του ίδιου μεγέθους (εξόνιο 8b) (Ladomery et al, 2007). Οι ισομορφές αυτές διαφέρουν στα τελευταία έξι αμινοξέα με τις κλασσικές και πιθανώς φέρουν αντιαγγειογενετικές ιδιότητες (Woolard et al, 2004; Rennel et al, 2009) ή έχουν πολύ ασθενή αγγειογενετική δράση (Catena et al, 2010). Η σχετική ισορροπία μεταξύ των ισομορφών του VEGF σε κάθε περίπτωση, καθορίζει και την ένταση της αγγειογενετικής διαδικασίας (Qiu et al, 2009). Άλλοι αυξητικοί παράγοντες με δράση στην αγγειογένεση φαίνεται ότι δρουν επηρεάζοντας την έκφραση ή τη δράση του VEGF ή των υποδοχέων του. Μερικοί από τους παράγοντες που μπορούν να επάξουν την παραγωγή του VEGF περιλαμβάνουν τους FGF-2 (Seghezzi et al, 1998), PDGF (Finkenzeller et al, 1997), τον παράγοντα νέκρωσης των όγκων-άλφα (tumor necrosis factor-alpha, TNF-α) (Ryuto et al, 1996), και τις ιντερλευκίνες 1β και 7 (Cohen et al, 1996). Άλλες κυτταροκίνες, όπως οι ιντερλευκίνες 10 και 13, μπορούν να αναστέλλουν την απελευθέρωση του VEGF (Matsumoto et al, 1997). Η PTN προάγει την έκφραση του VEGF (Kong et al, 2012), μεταβάλλει την έκφραση των υποδοχέων του (Kokolakis et al, 2006) και δεσμεύεται σε αυτόν αναστέλλοντας τη βιολογική 9

26 Εισαγωγή του δράση (Heroult et al, 2004) (βλέπε Παραγράφους 2.5 και 2.6). Η απελευθέρωση του VEGF από ανασταλτικά πρωτεϊνικά σύμπλοκα, π.χ. μέσω πρωτεολυτικής δράσης της μεταλλοπρωτεϊνάσης του στρώματος 2 (matrix metalloproteinase-2, MMP-2) επί της PTN, θεωρείται ένας πιθανός μηχανισμός ελέγχου της ισορροπίας κυτταροκινών κατά την αγγειογενετική διαδικασία (Dean et al, 2007). Εκτός από τους αυξητικούς, και άλλοι παράγοντες φαίνονται να επηρεάζουν τη διαδικασία της αγγειογένεσης. Σημαντική είναι η σύνθεση της εξωκυττάριας ύλης που περιβάλλει το αγγείο και μπορεί να επηρεάσει την αγγειογένεση, θετικά ή αρνητικά (Nyberg et al, 2005). Επίσης, η πρωτεολυτική (από πλασμίνη ή μεταλλοπρωτεϊνάση του στρώματος 9 (matrix metalloproteinase-9, MMP-9)) απελευθέρωση των ισομορφών του VEGF και άλλων αυξητικών παραγόντων που δεσμεύονται στην εξωκυττάρια ύλη, αποτελεί βασικό ρυθμιστή της βιοδιαθεσιμότητας των παραγόντων αυτών και του προσανατολισμού των νεοσχηματισθέντων αγγείων (Lee et al, 2005). Βασικοί ρυθμιστές των δράσεων του VEGF είναι και οι ιντεγκρίνες. Πιο συγκεκριμένα, η ιντεγκρίνη α ν β 3 δεσμεύεται άμεσα με τον VEGF (Hutchings et al, 2003) και, πιθανώς μέσω του εξωκυτταρικού τμήματος της υπομονάδας β 3, με τον υποδοχέα VEGFR-2 (Soldi et al, 1999; Somanath et al, 2009). Έχει δειχθεί πως η σηματοδότηση που ξεκινά από τον VEGFR-2 ρυθμίζεται, τουλάχιστον μερικά, από την αλληλεπίδρασή του με την α ν β 3, που επάγεται από τον VEGF και εξαρτάται από τη φωσφορυλίωση των τυροσινών 773 και 785 της υπομονάδας β 3 (Soldi et al, 1999; Mahabeleshwar et al, 2006). Πρόσφατα στοιχεία έχουν δείξει πως λειτουργικός αποκλεισμός τόσο της α ν β 3 όσο και του VEGFR-2, αυξάνει την αποτελεσματικότητα αντι-αγγειογενετικών θεραπειών in vivo (Hynes, 2002). Από την άλλη πλευρά, απουσία της ιντεγκρίνης β 3 ή λειτουργική αναστολή της, οδηγεί σε αποκρίσεις ενδοθηλιακών κυττάρων στον VEGF που δεν εξαρτώνται από τον VEGFR-2, αλλά από τη NRP-1. Προτάθηκε πως η β 3 ρυθμίζει την επαγόμενη από VEGF αγγειογένεση μέσω περιορισμού της αλληλεπίδρασης της NRP-1 με τον VEGFR-2. Ακόμα, συνδυασμένη αναστολή της β 3 και της NRP-1 μείωσε σε μεγαλύτερο βαθμό τις αγγειογενετικές δράσεις του VEGF in vitro, σε σχέση με την επίδραση του κάθε μορίου χωριστά (Robinson et al, 2009). 10

27 Εισαγωγή Ο VEGF επάγει το χημειοτακτισμό και τη διαφοροποίηση προγονικών ενδοθηλιακών κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό ενδοθηλιακών κυττάρων, την άμεση επιστράτευσή τους σε αγγειακές δομές (νεοαγγειογένεση) και την εκβλάστηση νέων αγγείων (Shibuya, 2006). Κάποιοι από αυτούς τους ρόλους είναι σημαντικοί, τόσο στην ανάπτυξη νέων αγγείων στην ενήλικη ζωή, όσο και στον καρκίνο (Adams and Alitalo, 2007). Συγκεκριμένα, η επαγόμενη από VEGF ενεργοποίηση του VEGFR-2, οδηγεί σε έντονες κυτταροσκελετικές αλλαγές και στην έκφραση ενός μεταναστευτικού φαινοτύπου (Lamalice et al, 2006). Κατά τα πρώτα στάδια δημιουργίας του νέου αγγείου, διακρίνονται 2 τύποι κυττάρων: τα ακραία κύτταρα (tip cells) και τα κύτταρα υποβάθρου (stalk cells). Τα ακραία κύτταρα παρέχουν συγκεκριμένη κατεύθυνση στη μεταναστευτική διαδικασία, ενώ τα κύτταρα υποβάθρου συνθέτουν τη βάση του ταχέως εκτεινόμενου τριχοειδούς. Παρόλο που και τα δύο είδη κυττάρων αποκρίνονται στον VEGF, τα ακραία κύτταρα μεταναστεύουν και δεν πολλαπλασιάζονται, ενώ τα κύτταρα υποβάθρου κυρίως πολλαπλασιάζονται μετά την επίδραση του VEGF Αποικοδόμηση της εξωκυττάριας ύλης από πρωτεολυτικά ένζυμα Την αποικοδόμηση μορίων της εξωκυττάριας ύλης αναλαμβάνουν ένζυμα όπως πρωτεϊνάσες σερίνης (ενεργοποιητές του πλασμινογόνου και πλασμίνη) και οι μεταλλοπρωτεϊνάσες του στρώματος (matrix metalloproteinases, MMPs). Τα δύο ενζυμικά συστήματα δρουν συντονισμένα προκειμένου να προωθήσουν την αγγειογένεση (Rundhaug, 2005). Αποικοδομούν συστατικά της εξωκυττάριας ύλης και απελευθερώνουν αυξητικούς παράγοντες, ενεργοποιούν άλλα ένζυμα ή/και αποικοδομούν αυξητικούς παράγοντες οδηγώντας στην παραγωγή πρωτεολυτικών τμημάτων με διαφορετικές βιολογικές δράσεις. Οι δύο οικογένειες πρωτεϊνασών αλληλεπικαλύπτονται λειτουργικά. Για παράδειγμα, μερικές MMPs είναι δραστικές ως πρωτεϊνάσες ινώδους, μέσω ενός μονοπατιού ανεξάρτητου από ενεργοποιητές του πλασμινογόνου (Ηiraoka et al, 1998). Στο σύστημα ενεργοποιητών πλασμινογόνου/πλασμίνης (plasminogen activators, PA) περιλαμβάνονται δύο τύποι ενεργοποιητών, ο τύπος ουροκινάσης (upa: urokinase type plasminogen activator) και ο ιστικός τύπος (tpa: tissue type 11

28 Εισαγωγή plasminogen activator). Είναι γενικά αποδεκτό πως ο upa είναι το ένζυμο που σχετίζεται περισσότερο με τη βιολογία των όγκων, ενώ ο t-pa έχει κύριο ρόλο την παραγωγή πλασμίνης για τη λύση ινώδους στα αγγεία. Δύο είναι οι κύριοι ενδογενείς αναστολείς των PAs, ο PAI-1 και ο PAI-2. O υποδοχέας του upa (upar: upa receptor) είναι μια μεγάλη πρωτεΐνη ακινητοποιημένη στην κυτταρική μεμβράνη, δεσμεύει τον upa και με αυτόν τον τρόπο, συγκεντρώνει τη δραστικότητα ενεργοποίησης του πλασμινογόνου στις επιφάνειες των κυττάρων (Mignatti and Rifkin, 1993). Επιπρόσθετα, το ενζυμικό αυτό σύστημα έχει λειτουργίες που είναι ανεξάρτητες από την πλασμίνη, αλλά που σχετίζονται με τη μεταγωγή σήματος και τις αλληλεπιδράσεις των PAI και u-par με τις ιντεγκρίνες και τη βιτρονεκτίνη της εξωκυττάριας ύλης (Wei et al, 1994). Ο κλασικός ρόλος του συστήματος PA/πλασμίνης στην αλληλεπίδραση κυττάρου-υποστρώματος και κυττάρου-κυττάρου είναι η αποικοδόμηση των υποδοχέων προσκόλλησης και των αντίστοιχων προσδεμάτων τους στην εξωκυττάρια ύλη, μέσω παραγωγής της πλασμίνης (Pepper, 2001). Παρόλα αυτά, κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες, η δέσμευση του upa στον υποδοχέα του προάγει την προσκόλληση των κυττάρων στο υπόστρωμα, υποδηλώνοντας το ρόλο του upar ως υποδοχέα προσκόλλησης. Με δεδομένο επίσης ότι upar και ιντεγκρίνες συνυπάρχουν στις ίδιες περιοχές της κυτταρικής επιφάνειας, γίνεται φανερό ότι ο upar και ο upa επιδρούν στην προσκόλληση κυττάρων, ρυθμίζοντας λειτουργίες των ιντεγκρινών μέσω άμεσης εξωκυτταρικής σύνδεσης upar/ιντεγκρινών (Ossowski and Aguirre- Ghiso, 2000). Η πρώτη ένδειξη πως οι MMPs εμπλέκονται στη διαδικασία της αγγειογένεσης, προέκυψε από το ότι οι ιστικοί αναστολείς των μεταλλοπρωτεϊνασών (tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMPs) και συνθετικοί αναστολείς των MMPs μπορούν να μειώσουν σημαντικά τον in vitro σχηματισμό αυλών από τα ενδοθηλιακά κύτταρα (Schnaper et al, 1993). Συνθετικοί αναστολείς των MMPs έχουν χρησιμoποιηθεί επιτυχώς στην αναστολή ανάπτυξης αγγείων σε μοντέλα ζώων, στα οποία προκαλείται αγγειογένεση από αυξητικούς παράγοντες (Nyberg et al, 2013). Ενδιαφέρον παρουσιάζει ότι επίμυες που δεν εκφράζουν την MMP-2, αναπτύσσονται φυσιολογικά, χωρίς προφανείς ή ανιχνεύσιμες ανατομικές ή αγγειακές ανωμαλίες. Ωστόσο, η αγγειογένεση που επάγεται από όγκους σε αυτά τα ζώα είναι μειωμένης έκτασης (Ιtoh et al, 1998). Εκτός από τις εκκρινόμενες MMPs, υπάρχουν και διαμεμβρανικού τύπου ένζυμα, όπως η μεμβρανικού τύπου 12

29 Εισαγωγή 1 μεταλλοπρωτεϊνάση του στρώματος (membrane-type 1 matrix metalloproteinase, ΜΤ1-ΜΜΡ). Η MMP-2 και η MT1-MMP έχουν αναγνωριστεί ως μόρια κλειδιά για την αγγειογένεση και τη μετάσταση διαφόρων τύπων καρκίνου (Minn et al, 2005). Στα περισσότερα κυτταρικά συστήματα, η MMP-2 εκφράζεται σταθερά και η μεταγραφή της δε ρυθμίζεται από ερεθίσματα αυξητικών παραγόντων, ενώ θεωρείται πως ο μεταγραφικός έλεγχος της MT1-MMP μπορεί να είναι σημαντικός για την ενεργοποίησή της. Πολλές ενδείξεις προτείνουν ότι οι ιντεγκρίνες (βλέπε κεφάλαιο 3.5) μπορεί να είναι υπεύθυνες για τη μεταγωγή σήματος που καταλήγει στην παραγωγή και ενεργοποίηση των MMPs. Η επαγωγή και ενεργοποίηση των MMPs που προκύπτει μετά από προσκόλληση μέσω ιντεγκρινών σε συγκεκριμμένα συστατικά της εξωκυττάριας ύλης, φαίνεται να είναι κυτταροειδική. Θεωρείται πως η ιντεγκρίνη α 2 β 1 εμπλέκεται στην αύξηση της έκφρασης των ΜΜP-2 και MT1-MMP σε διεγερμένα ενδοθηλιακά κύτταρα αρουραίου που καλλιεργούνται σε κολλαγόνο τύπου Ι (Haas et al, 1998), ενώ αλληλεπίδραση προσδέτη με την ιντεγκρίνη α ν β 3 ενισχύει τις δράσεις της MMP-2 (Seftor et al, 1992). Η MMP-2 αλληλεπιδρά άμεσα με την α ν β 3 στην κυτταρική μεμβράνη, διευκολύνοντας έτσι την εντοπισμένη αποικοδόμηση της εξωκυττάριας ύλης (Brooks et al, 1996). Ενδεχομένως, η ΜΤ1-ΜΜΡ η οποία βρίσκεται σε στενή γειτνίαση με την α ν β 3 εμπλέκεται στη διαδικασία ενεργοποίησης της MMP-2 (Hofmann et al, 2000) Μετατροπή των εκβλαστήσεων σε αγγεία και δημιουργία ώριμου αυλού Μια σημαντική διαδικασία που λαμβάνει χώρα κατά την αγγειογένεση είναι η μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων στη βάση των εκβλαστήσεων πίσω από τα ακραία κύτταρα, η οποία έχει παρατηρηθεί στο σχηματισμό αγγείων στο θώρακα εμβρύων zebrafish (Siekmann and Lawson, 2007). Εναλλακτικά, ο τοπικός πολλαπλασιασμός των ενδοθηλιακών κυττάρων επίσης μπορεί να οδηγήσει σε προέκταση των εκβλαστήσεων, όπως συμβαίνει στον αναπτυσσόμενο αμφιβληστροειδή επίμυων, όπου πολλαπλασιάζονται τα ενδοθηλιακά κύτταρα υποβάθρου και όχι τα ακραία κύτταρα (Gerhardt et al, 2003). 13

30 Εισαγωγή Για να επιτευχθεί η σύνδεση μεταξύ δύο αγγείων, πρέπει το ενδοθηλιακό ακραίο κύτταρο της κάθε εκβλάστησης να εντοπίσει και να αναγνωρίσει κάποιο άλλο αγγείο. Η προσκόλληση του κυττάρου αυτού με το αντίστοιχο κορυφαίο ή άλλο κύτταρο της γειτονικής εκβλάστησης, επιτυγχάνεται με τη δημιουργία συνδέσεων προσκόλλησης και διακυτταρικής επικοινωνίας μεταξύ τους. Η δημιουργία αυλών και η ροή αίματος βοηθούν στη σταθεροποίηση του νέου αγγείου. Η επιστράτευση περικυττάρων, η προσκόλληση μορίων της εξωκυττάριας ύλης στη βασική μεμβράνη και η μείωση του πολλαπλασιασμού των ενδοθηλιακών κυττάρων, επίσης επάγουν την ωρίμανση του αγγείου. Και σε αυτό το στάδιο της αγγειογενετικής διαδικασίας, όπως και σε όλα τα προηγούμενα, η σχετική ισορροπία ανάμεσα στους προ- και αντι-αγγειογενετικούς παράγοντες παίζει σημαντικό ρόλο για τη διατήρησή του νέου αγγείου, διαφορετικά το αγγείο καταστρέφεται μέσω απόπτωσης των ενδοθηλιακών κυττάρων (Adams and Alitalo, 2007) Μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων κατά την αγγειογένεση Η διαδικασία της μετανάστευσης κατευθύνεται από χημειοτακτικά και άλλα ερεθίσματα, συνήθως περιλαμβάνει την αποικοδόμηση της εξωκυττάριας ύλης, ενώ απαιτεί και την ενεργοποίηση διαφόρων μονοπατιών μεταγωγής σήματος που οδηγούν σε αναδιαμόρφωση του κυτταροσκελετού. Η διαρκής αναδιαμόρφωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης οδηγεί σε δομές που ονομάζονται φιλοπόδια, λαμελλιπόδια και ινίδια στρες, τα οποία είναι απαραίτητα για την κυτταρική μετανάστευση. Η μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων περιλαμβάνει τρείς μηχανισμούς: α) το χημειοτακτισμό, που είναι η κατευθυνόμενη μετανάστευση κατά μήκος διαβάθμισης της συγκέντρωσης διαλυτού παράγοντα, β) τον απτοτακτισμό, που είναι η κατευθυνόμενη μετανάστευση κατά μήκος διαβάθμισης καθηλωμένου προσδέτη, και γ) το μηχανοτακτισμό, που είναι η κατευθυνόμενη μετανάστευση που επάγεται από μηχανικά ερεθίσματα (Li et al, 2005). Η μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων κατά την αγγειογένεση αποτελεί απόρροια και των τριών μηχανισμών. Τυπικά, ο χημειοτακτισμός των ενδοθηλιακών κυττάρων επάγεται 14

31 Εισαγωγή από αυξητικούς παράγοντες, ενώ ο απτοτακτισμός ενεργοποιείται ως ανταπόκριση στις ιντεγκρίνες που δεσμεύονται σε μόρια εξωκυττάριας ύλης (Klemke et al, 1997) Καρκινική αγγειογένεση και θεραπευτική αντιμετώπιση Η στρατηγική μείωσης της καρκινικής ανάπτυξης και των μεταστάσεων μέσω αναστολής της αγγειογένεσης στο περιβάλλον του όγκου, προτάθηκε από τον Folkman (1971) σχεδόν τέσσερις δεκαετίες πριν. Ένας όγκος διεγείρει την αγγειογένεση ώστε να παρέχει οξυγόνο και θρεπτικές ουσίες για την επιβίωση και την ανάπτυξή του και για να σχηματίσει μια διαδρομή για την έξοδο καρκινικών κυττάρων από αυτόν. Συνεπώς, μέσω αναστολής της αγγειογενετικής διαδικασίας, θα μπορούσε να ανασταλεί η ανάπτυξη όγκων και μεταστάσεων, λόγω διακοπής της παροχής καυσίμων και καταστροφής της οδού κυκλοφορίας των καρκινικών κυττάρων. Κατά την αγγειογένεση, τα καρκινικά κύτταρα παράγουν αγγειογενετικές πρωτεΐνες σε υψηλά επίπεδα ή ενεργοποιούν αγγειογενετικές πρωτεΐνες που υπάρχουν σε γειτονικούς ιστούς, ενώ μπορεί και να ενεργοποιούν άλλα είδη κυττάρων, όπως τα μακροφάγα, ώστε να απελευθερώσουν αγγειογενετικές πρωτεΐνες. Πάντως, ακόμα κι αν ενεργοποιηθούν όλοι αυτοί οι μηχανισμοί, τα κακοήθη κύτταρα μπορεί να μην καταφέρουν να επάξουν την αγγειογένεση, εάν η συγκέντρωση πρωτεϊνών που την καταστέλλουν παραμένει μεγάλη σε σχέση με αυτήν των αγγειογενετικών πρωτεϊνών σε κάθε περίπτωση (Bergers, 2003). Η έρευνα για τη θεραπεία όγκων με αντιαγγειογενετική θεραπεία έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη φαρμάκων που αξιοποιούνται αρκετά χρόνια από την κλινική ογκολογία. Το μονοκλωνικό αντίσωμα μπεβασιζουμάβη, το οποίο εγκρίθηκε για θεραπεία καρκίνου του κόλον το 2004, είναι χρονολογικά το πρώτο φάρμακο που εγκρίθηκε ως εκλεκτικός αναστολέας της αγγειογένεσης. Σήμερα, πολλά φάρμακα έχουν εγκριθεί στις Ηνωμένες Πολιτείες και την Ευρωπαϊκή Ένωση και εφαρμόζονται στην κλινική πράξη ως αναστολείς της αγγειογένεσης. Τέτοια φάρμακα είναι τα μπεβασιζουμάβη, κετουξιμάβη, πανιτουμουμάβη, τρανστουζουμάβη (μονοκλωνικά αντισώματα), ερλοτινίμπη, σοραφενίμπη, σουνιτινίμπη, γεφιτινίμπη, λαπατινίμπη, παζοπανίμπη (μικρομοριακοί αναστολείς 15

32 Εισαγωγή κινασών τυροσίνης), τεμσιρολίμη, εβερολίμη (αναστολείς mtor), θαλιδομίδη (αγνώστου μηχανισμού), στα οποία υπερισχύει η αντιαγγειογενετική δράση σε σχέση με άλλες θεραπευτικές δράσεις και στοχεύουν κυρίως στην αντιμετώπιση του καρκίνου. Οι τρείς γενικοί μηχανισμοί των αναστολέων της καρκινικής αγγειογένεσης που έχουν ήδη εγκριθεί, είναι: α) η αναστολή παραγωγής αυξητικών παραγόντων, όπως του VEGF από τη γεφιτινίμπη, β) η δέσμευση σε αυξητικούς παράγοντες που οδηγεί σε παρεμπόδιση της αλληλεπίδρασής τους στους ειδικούς κυτταρικούς υποδοχείς τους, όπως της μπεβασιζουμάβης στον VEGF και γ) η αδρανοποίηση υποδοχέων αυξητικών παραγόντων, όπως των VEGFRs από τη σουνιτινίμπη. Πληθώρα φαρμάκων με αντιαγγειογενετική δράση βρίσκονται σε κλινικές μελέτες φάσης ΙΙΙ, στοχεύοντας στη θεραπεία διαφόρων τύπων καρκίνου (Kerbel, 2000; Gotink and Verheul, 2010; Shojaei, 2012). 2. PTN (pleiotrophin, PTN) 2.1. Εισαγωγικά H PTN είναι αυξητικός παράγοντας μεγέθους 18 kda. Παρουσιάζει 55% ομολογία με τη midkine (MK) και περιέχει 10 υψηλά συντηρημένες κυστεΐνες. Οι δύο αυτές πρωτεΐνες αποτελούν μια διακριτή οικογένεια αυξητικών παραγόντων που έχουν την ιδιότητα να δεσμεύονται στην ηπαρίνη. Πρόσφατα, αυτή η οικογένεια εμπλουτίστηκε με ακόμα δύο μέλη που εντοπίσθηκαν στη Drosophila, τις Miple 1 και 2, οι οποίες εκφράζονται κατά την εμβρυογένεση στο νευρικό σύστημα και στο ενδόδερμα αντίστοιχα (Englund et al, 2006). Εκτός από την αμινοξική τους ομολογία, η PTN και η MK χρησιμοποιούν μερικώς τους ίδιους υποδοχείς και έχουν κοινές βιολογικές δράσεις, οι πιο καλά χαρακτηρισμένες από τις οποίες είναι η επαγωγή νευριτών και η ανάπτυξη όγκων (Papadimitriou et al, 2004). H PTN συναντάται στη βιβλιογραφία με πολλές διαφορετικές ονομασίες, οι κυριότερες των οποίων είναι πλειοτροπίνη (pleiotrophin, PTN), ρυθμιστικό πεπτίδιο με ικανότητα πρόσδεσης στην ηπαρίνη (heparin affin regulatory peptide, HARP) και μόριο που σχετίζεται με την ανάπτυξη και έχει την ικανότητα πρόσδεσης στην ηπαρίνη (heparin binding growth associated molecule, HB-GAM) (Mikelis et al, 2007), γεγονός που οφείλεται στο ότι η απομόνωση του μορίου 16

33 Εισαγωγή αυτού έγινε συγχρόνως από διάφορες ομάδες και σε διαφορετικά είδη ιστών. Η PTN εντοπίζεται σε νευρωνικούς ιστούς, στην καρδιά, σε χόνδρους, στα οστά και στον πνεύμονα. Στο μαστικό αδένα, στη μήτρα και στον προστάτη, η ΡΤΝ εκφράζεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα των τριχοειδών αγγείων. Υψηλά επίπεδα του γονιδίου της εκφράζονται σε αρκετούς ανθρώπινους όγκους, μεταξύ των οποίων είναι γλοιοβλαστώματα, νευροβλαστώματα, μελανώματα, λευχαιμίες, καρκίνος παγκρέατος, προστάτη, παχέως εντέρου, μαστού, ωοθηκών και πνευμόνων (Papadimitriou et al, 2009) Δομή του γονιδίου της PTN Το γονίδιο της PTN στον άνθρωπο καταλαμβάνει πάνω από 65 kb, περιέχει τουλάχιστον επτά εξόνια και το ελάχιστο μέγεθός του είναι 42 kb (Lai et al, 1992; Kretschmer et al, 1993). Το γονίδιο της PTN στον άνθρωπο εντοπίζεται στο μεγάλο βραχίονα του 7 ου χρωμοσώματος, στις περιοχές (Li et al, 1992). Το mrna της PTN οργανώνεται σε πέντε εξόνια με συνολικό μέγεθος 1650 νουκλεοτίδια. Το πεπτίδιο-σινιάλο και τα πρώτα πέντε αμινοξέα του ώριμου μορίου εντοπίζονται στο εξόνιο 2, ενώ το μεγαλύτερο τμήμα της κωδικής περιοχής της πρωτεΐνης εντοπίζεται στα εξόνια 3 και 4. Οι 3 - και 5 - μη μεταγραφόμενες περιοχές (untranslated regions, UTRs) του γονιδίου της PTN στον άνθρωπο, παρουσιάζουν υψηλή ομολογία με τα αντινοηματικά cdnas της πρωτεΐνης θερμικού σοκ 70 (heat shock protein 70, HSP70) και της πρωτεΐνης L17 του ριβοσώματος. Ανάλυση του υποκινητή της PTN στον άνθρωπο αποκάλυψε την απουσία της περιοχής TATA και την παρουσία της περιοχής CCAAT, η οποία εντοπίστηκε 91 νουκλεοτίδια πριν από τη θέση έναρξης τη μεταγραφής. Έχουν ανιχνευθεί επίσης στοιχεία απόκρισης σε ορό, ρετινοϊκό οξύ (Lai et al, 1992) και αλληλουχίες για περιοχές πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων: τέσσερις πιθανές περιοχές για MyoD (myogenic factor D), δύο για AP-1 (Activator Protein-1) (Li et al, 1992; Polytarchou et al, 2005, μία για GT1 (Li et al, 1992), μία για HOXA5 (Homeobox A5) (Chen et al, 2005) και μία για Sox10, η ακριβής θέση της οποίας δεν έχει προσδιοριστεί (Lee et al, 2008). Επίσης, πιθανές θέσεις δέσμευσης έχουν προταθεί για τους μεταγραφικούς παράγοντες EGR-1 (early growth response factor-1) και SP-1 17

34 Εισαγωγή (specificity protein-1) (Liedert et al, 2009). Πρόσφατα αναφέρθηκε πως ο μεταγραφικός παράγοντας SOX2 αλληλεπιδρά με τον υποκινητή της PTN και ενεργοποιεί άμεσα την έκφρασή της σε βλαστικά κύτταρα γλοιοβλαστώματος (Koyama-Nasu et al, 2013) Έκφραση του γονιδίου και βιολογικές δράσεις της PTN Η PTN απομονώθηκε για πρώτη φορά το 1989 από εγκέφαλο νεογέννητου αρουραίου (Rauvala, 1989) και από μήτρα βοός (Milner et al, 1989). Η έκφραση του γονιδίου της υπάγεται σε αυστηρούς χρονικούς περιορισμούς και επάγεται προς το τέλος της εμβρυογένεσης, μέχρι και την πρώϊμη μετεμβρυϊκή περίοδο (Rauvala, 1989; Rauvala et al, 1994; Li et al, 1990). Η παρουσία του mrna της ΡΤΝ σε αρκετούς ενήλικους ιστούς, δείχνει ότι η PTN συμμετέχει σε φυσιολογικές διαδικασίες και κατά την ενήλικη ζωή (Vanderwinden et al, 1992). Λόγω της ευρείας κατανομής της και των ποικίλλων δράσεών της, πήρε το όνομα πλειοτροπίνη (Li et al, 1990). Στο αναπτυσσόμενο νευρικό σύστημα, το mrna της PTN εντοπίζεται στο νευροεξώδερμα και μεσόδερμα (Vanderwinden et al, 1992), στα νευρικά εμβρυϊκά κύτταρα (Furuta et al, 2004; Jung et al, 2004), στα μονοπάτια των αναπτυσσόμενων νευρώνων (Rauvala et al, 1994), στους πυραμιδικούς νευρώνες CA1 στον ιππόκαμπο, και σε μη νευρωνικούς κυτταρικούς τύπους, όπως αστροκύτταρα και κύτταρα Schwann (Vanderwinden et al, 1992). Σε τραυματισμό της σπονδυλικής στήλης στον αρουραίο, επάγεται η έκφραση του mrna και της πρωτεΐνης στο σημείο της βλάβης και η έκφραση της PTN εντοπίζεται σε αστροκύτταρα, ολιγοδενδροκύτταρα και σε νευρώνες (Wang et al, 2004a). Επαγωγή της έκφρασης της PTN παρατηρείται σε νευροεκφυλιστικές νόσους, όπως τα σύνδρομα Alzheimer και Down και έχει προταθεί και ως δείκτης νευρωνικής βλάβης (Wisniewski et al, 1996). Επίσης, υπερεκφράζεται στη νόσο του Parkinson (Ferrario et al, 2004), φέρει προστατευτικές δράσεις σε ντοπαμινεργικούς νευρώνες in vitro και in vivo (Taravini et al, 2011) και φαίνεται να ρυθμίζει την επαγόμενη από μορφίνη αναλγησία σε επίμυες και την νευροτοξικότητα λόγω λήψης αμφεταμίνης (Gramage et al, 2010). 18

35 Εισαγωγή Η PTN εκφράζεται σε πρόδρομα κύτταρα οστού και χόνδρου (Vanderwinden et al, 1992), κατά την οδοντογένεση (Erlandsen et al, 2012), την επούλωση οστών (Imai et al, 1998) και στα κατάγματα (Petersen et al, 2004). Προωθεί τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, την ορθή προσκόλληση οστεοβλαστών (Zhou et al, 1992; Imai et al, 1998), επάγει τη χημειοταξία, τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση ανθρώπινων οστεοπρογονικών κυττάρων, αλλά και το σχηματισμό οστών και χόνδρων σε αθυμικούς επίμυες. Ακόμα, έχει παρατηρηθεί σχετιζόμενη με PTN οστεοβλαστική δραστηριότητα σε επίμυες κατά τη διάρκεια διαστημικών πτήσεων (Tavella et al, 2012). Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός πως επίμυες που υπερεκφράζουν ΡΤΝ τείνουν να έχουν αυξημένη οστική ανάπτυξη (Tare et al, 2002). Μολονότι ελλιπής έκφραση της PTN δεν επηρεάζει το φυσιολογικό σχηματισμό οστών επίμυων (Lehmann et al, 2004), φαίνεται να οδηγεί σε οστεοπενία κατά την ενηλικίωσή τους (Imai et al, 2009). Ο πολυμορφισμός -1227C>T στον υποκινητή της PTN σχετίζεται με τη μείωση της οστικής πυκνότητας σε μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες (Mencej-Bedrac et al, 2011). Το mrna της PTN εκφράζεται στα λεία μυϊκά κύτταρα (Milhiet et al, 1998) και στα κύτταρα του μυοκαρδίου (Chen et al, 2004), και αυξάνεται στην καρδιακή ανεπάρκεια (Asakura and Kitakaze, 2009). Επιπλέον, φαίνεται να συμμετέχει σε αλληλεπιδράσεις επιθηλίου-μεσεγχύματος κατά την οργανογένεση, και ανιχνεύεται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του πνεύμονα σε εμβρυϊκά βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (Mitsiadis et al, 1995), ρυθμίζοντας τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίησή τους (Weng et al, 2009). Η απομόνωσή της PTN από μήτρα βοός (Milner et al, 1989; Li et al, 1990) και η ανίχνευση της έκφρασής της στο αναπαραγωγικό σύστημα, υποδηλώνουν το βασικό της ρόλο στη ρύθμιση του αναπαραγωγικού κύκλου (Fan et al, 2000). H ανίχνευσή της στο μαστικό αδένα (Ledoux et al, 1997), η σημασία της στη μορφογένεσή του (Kouros-Mehr and Werb, 2006), η ταυτοποίησή της στα κύτταρα Leydig των όρχεων (Vanderwinden et al, 1992), η στειρότητα και οι μορφολογικές ανωμαλίες στους όρχεις επίμυων που δεν εκφράζουν την PTN (Zhang et al, 1999), ολοκληρώνουν τον πολύπλευρο ρόλο της στην αναπαραγωγική διαδικασία. Αποτελεί εκκρινόμενο συστατικό του μυελού των οστών, απαραίτητο για την ανανέωση και τη διατήρηση αιματοποιητικών κυττάρων (Himburg et al, 2012). Η PTN επάγει τον πολλαπλασιασμό του ανθρώπινου ιού ανοσοανεπάρκειας τύπου 1 (human 19

36 Εισαγωγή immunodeficiency virus-1, HIV-1) (M'Bika et al, 2010), διαμεσολαβώντας την αύξηση της έκφρασης κυτταροκινών, σχετιζόμενων με φλεγμονώδεις διαδικασίες, από μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (Achour et al, 2008). Τέλος, πρόσφατα αναφέρθηκε η πιθανότητα αντιβακτηριδιακής δράσης τόσο της PTΝ όσο και της ΜΚ, μέσω διαφύλαξης της ακεραιότητας των βακτηριακών κυτταρικών μεμβρανών (Svensson et al, 2010). Μολονότι η ΡΤΝ φαίνεται να έχει σημαντικές βιολογικές λειτουργίες, λίγα είναι ακόμη γνωστά για τη ρύθμιση της έκφρασής της. Αυξημένη έκφραση της PTN έχει παρατηρηθεί σε ασθένειες που σχετίζονται με αυξημένη αγγειογένεση, όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα (Pufe et al, 2003a), η οστεοαρθρίτιδα (Pufe et al, 2007; Kaspiris et al, 2013), μετά από τραυματισμό (Ezquerra et al, 2008) και στον καρκίνο (Papadimitriou et al, 2009). Παράγοντες που επάγουν την έκφραση του γονιδίου της PTN είναι ο ακτινοειδής νευροτροφικός παράγοντας (ciliary neurotrophic factor, CNTF) (Roger et al, 2006), ο FGF-2 (Hatziapostolou et al, 2006), o υποδοχέας του PDGF (PDGF receptor, PDGFR) (Li et al, 1992; Antoine et al, 2005), η κυκλική μονοφωσφορική αδενοσίνη (cyclic adenosine monophosphate, c-amp) (Mourlevat et al, 2005), η υποξία (Antoine et al, 2005), ο ορός (Poimenidi et al, 2009), το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Polytarchou et al, 2005), η ενδοθηλιακή συνθάση μονοξειδίου του αζώτου (endothelial nitric oxide synthase, enos) (Polytarchou et al, 2009), τα ανδρογόνα (Orr et al, 2011), τα οιστρογόνα (Lee et al, 2012) και η ιντερφερόνη-γ (Li et al, 2010). Ακόμα, το mir- 143, το οποίο αλληλεπιδρά με την κωδικοποιούσα περιοχή της PTN, μειώνει την έκφραση της τελευταίας κατά τη λιπογένεση (Yi et al, 2011). Η πρωτεϊνική έκφραση της PTN φαίνεται να αναστέλλεται σε εντερικά επιθηλιακά κύτταρα έπειτα από επίδραση μη στεροειδών αντιφλεγμονωδών φαρμάκων (Silver et al, 2012). Αντιφατικά αποτελέσματα έχουν δημοσιευθεί για το ρετινοϊκό οξύ, το οποίο επάγει την έκφραση της ΡΤΝ σε ορισμένα κύτταρα (Kretchmer et al, 1991; Brunetde Carvalho et al, 2003) ή ιστούς (Mitsiadis et al, 2008), αλλά δεν έχει καμία επίδραση σε άλλους τύπους κυττάρων (Li et al, 1992). Απώλεια του ογκοκατασταλτικού γονιδίου PTEN (Phosphatase and Tensin Homologue) οδηγεί σε αύξηση της έκφρασης της ΡΤΝ, η οποία διαμεσολαβείται από την 3 -κινάση της φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης (phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K) (Li et al, 2006). Ακόμα, έχει παρατηρηθεί σε καρκίνο του πνεύμονα πως υπερέκφραση της μενίνης οδηγεί σε μειωμένη μεταγραφή του γονιδίου της PTN (Feng et al, 2010). 20

37 Εισαγωγή Όσον αφορά σε μεταγραφικούς παράγοντες, η έκφραση του γονιδίου της PTN επηρεάζεται άμεσα από τον HOXA5 (Chen et al, 2005), τον AP-1 (Polytarchou et al, 2005), τον Sox10 (Lee et al, 2008) και τον SOX2 (Koyama-Nasu et al, 2013), μετά από σύνδεση με τα αντίστοιχα στοιχεία απόκρισης στον υποκινητή της PTN Πρωτεϊνική δομή της PTN Η πρωτοταγής πρωτεϊνική δομή της PTN αποτελείται από 168 αμινοξέα, τα πρώτα 32 από τα οποία αποτελούν το πεπτίδιο-σινιάλο, μετά από πέψη του οποίου προκύπτει η ώριμη πρωτεΐνη των 136 αμινοξέων. Η πέψη του πεπτιδίουσινιάλου μπορεί να πραγματοποιηθεί στις θέσεις -1 και -3 της πρόδρομης πρωτεΐνης (Merenmies and Rauvala, 1990), γεγονός που καθορίζεται από τον κυτταρικό τύπο. Το αποτέλεσμα των διαφορικών πέψεων οδηγεί σε δύο ισομορφές της ώριμης πρωτεΐνης που η μία έχει 3 αμινοξέα παραπάνω (139) στο αμινοτελικό άκρο (Bernard-Pierrot et al, 2001). Η ώριμη πρωτεΐνη περιέχει μεγάλο ποσοστό (24%) κατιονικών αμινοξέων που είναι κυρίως λυσίνες, εντοπισμένες στα άκρα του μορίου. Περιέχει επίσης και 10 υψηλά συντηρημένες κυστεΐνες (Merenmies and Rauvala, 1990), οι οποίες δημιουργούν πέντε (Kuo et al, 1990) ή τρείς δισουλφιδικούς δεσμούς, καθώς και 3 πιθανές αλληλουχίες πυρηνικής στόχευσης K-R/K-X-R/K. Η απουσία κλασικών θέσεων Ν-γλυκοζυλίωσης (Hampton et al, 1992) οδηγεί στο συμπέρασμα ότι το μόριο δεν υφίσταται μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις, κάτι που επιβεβαιώνεται και με φασματομετρικές μεθόδους (Kuo et al, 1990). Σχετικά με την τριτοταγή διάταξη της πρωτεΐνης, δεν υπάρχουν μέχρι σήμερα πολλά δεδομένα (Εικόνα Ε2). Υποστηρίζεται ότι αποτελείται από δύο β-δομές, καθεμιά από τις οποίες περιέχει τρείς αντιπαράλληλες β-πτυχές και έχει αλληλουχίες αμινοξέων που είναι ομόλογες με αλληλουχίες θρομβοσπονδίνης τύπου 1 (thrombospondin type 1 repeat, TSR1). Τα αμινο- και καρβοξυ-τελικά άκρα δεν έχουν συγκεκριμένη δομή και φαίνονται να δημιουργούν α-έλικα (Kilpelainen et al, 2000). Μελέτες φασματοσκοπίας NMR έδειξαν ότι το καρβοξυτελικό άκρο της PTN, αποτελούμενο από τα αμινοξέα , χαρακτηρίζεται από ευελιξία ως προς τη δομή του σε θερμοκρασία δωματίου, ενώ το βιολογικώς δραστικό πεπτιδικό τμήμα αποτελούμενο από τα αμινοξέα

38 Εισαγωγή φέρει μια καθορισμένη δομή σε χαμηλότερη θερμοκρασία (Mikelis et al, 2011). Υποστηρίζεται πως κατά τη δέσμευση της PTN στην ηπαρίνη, που γίνεται μέσω των β-δομών, πραγματοποιείται αλλαγή της στερεοδιαμόρφωσης, ενώ αναγωγή του δισουλφιδικών δεσμών αναστέλλει σημαντικά την ικανότητα δέσμευσης στην ηπαρίνη (Kilpelainen et al, 2000). Πιο πρόσφατα δεδομένα δείχνουν πως η καρβοξυτελική αλληλουχία TSR1 ευθύνεται για πρόσδεση στην ηπαρίνη (Ori et al, 2009). Εικόνα Ε2: Σχηματική αναπαράσταση της πιθανής τριτοταγούς δομής της PTN. Οι β- πτυχές αντιπροσωπεύονται από τα βέλη και οι α-έλικες στο αμινο- και καρβοξυ-τελικό άκρο από τους κυλίνδρους. Διακρίνονται επίσης οι δισουλφιδικοί δεσμοί (εδώ υιοθετείται το μοντέλο με τους πέντε δισουλφιδικούς δεσμούς). Οι αριθμοί αντιστοιχούν στα αντίστοιχα αμινοξέα της πρωτεΐνης (Papadimitriou et al, 2004) Ο ρόλος της PTN στην αγγειογένεση και στον καρκίνο Η ανοσοϊστοχημική ανίχνευση και απομόνωση της PTN από ιστούς με υψηλή αγγείωση υπέδειξε έναν πιθανό φυσιολογικό ρόλο της στην αγγειογένεση. Πληθώρα αναφορών δείχνουν μια θετική συσχέτιση ανάμεσα στην PTN και στην in vivo και in vitro αγγειογένεση (Mikelis et al, 2007; Mikelis and Papadimitriou, 2008). H PTN επάγει τη μετανάστευση ενδοθηλιακών (Papadimitriou et al, 2001; 22

39 Εισαγωγή Polykratis et al, 2005) και προγονικών ενδοθηλιακών κυττάρων (Heiss et al, 2008), ενώ η έκφρασή της επάγεται σημαντικά στα μεσαγγειακά νεφρικά κύτταρα που ενεργοποιούνται για να μεταναστεύσουν (Martin et al, 2006). Επιπλέον, φαίνεται να επάγει τη διαφοροποίηση μονοκυττάρων σε λειτουργικά ενδοθηλιακά κύτταρα (Sharifi et al, 2006). Σε εμβρυϊκά σωμάτια που δεν εκφράζουν τον FGFR- 1, αυξάνεται η αγγείωσή τους μέσω επαγωγής της έκφρασης της PTN (Magnusson et al, 2007). Παρόμοια, μηχανική φόρτιση στον ανθρώπινο μεσοσπονδύλιο δίσκο οδηγεί σε αυξημένη έκφραση της PTN, γεγονός που σχετίζεται με την αγγείωσή του (Neidlinger-Wilke et al, 2009). Αναφορικά με τα in vivo συστήματα της αγγειογένεσης, η PTN επάγει την αγγειογένεση στο μοντέλο της χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης εμβρύου όρνιθας (chorioallantoic membrane, CAM) (Papadimitriou et al, 2001; Polytarchou et al, 2004) και σε ενθέσεις υποστρώματος matrigel σε επίμυες (Bernard-Pierrot et al, 2002). Εκτός όμως από το ρόλο της PTN στη φυσιολογική αγγειογένεση, θεωρείται και παράγοντας που επάγει την παθολογική αγγειογένεση και την ανάπτυξη όγκων. Πιο συγκεκριμένα, υπερέκφρασή της σε φυσιολογικά κύτταρα οδηγεί σε αύξηση του πολλαπλασιασμού τους, σε ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη και δημιουργία όγκων σε επίμυες (Fang et al, 1992; Chauhan et al, 1993). Αύξηση της έκφρασης της PTN επάγει την ανάπτυξη καρκίνου του μαστού σε επίμυες, πιθανότατα μέσω ενεργοποίησης του μικροπεριβάλλοντος των κυττάρων του στρώματος (Chang et al, 2007). Στην ίδια λογική, αναστολή της έκφρασης της PTN σε κύτταρα χοριοκαρκινώματος, ανέστειλε την ανάπτυξη όγκων και την εξάπλωση μεταστάσεων σε αθυμικούς επίμυες (Schulte et al, 1996). Επιπρόσθετα, η PTN προάγει την έκφραση του VEGF και την αγγειογένεση ορθοκολικών όγκων (Kong et al, 2012) και συμβάλλει στην ανάπτυξη όγκων σε επίμυες με αλλομοσχεύματα ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων προστάτη (Tsirmoula et al, 2012). Χρήση ριβοενζύμων που αναστέλλουν την έκφραση της PTN σε ανθρώπινα κύτταρα μελανώματος ανέστειλε τη δημιουργία αποικιών, την ανάπτυξη όγκων και την αγγειογένεση σε αθυμικούς επίμυες (Czubayko et al, 1996). Αναστολή της έκφρασης της PTN σε κύτταρα μελανώματος συνάδει με αναστολή έκφρασης της κυκλίνης Ε, παράλληλη αύξηση της έκφρασης του αναστολέα του κυτταρικού κύκλου p21 WAF1/Cip1 (Satyamoorthy et al, 2000) και με αναστολή ανάπτυξης όγκων μελανώματος σε αθυμικούς επίμυες (Malerczyk et al, 2005). Η αναστολή 23

40 Εισαγωγή έκφρασης της PTN με ριβοένζυμα αποκαλύπτει το ρυθμιστικό ρόλο της PTN και στα γλοιοβλαστώματα (Grzelinski et al, 2006). Στην περίπτωση αυτή, το γεγονός ότι η PTN δεν επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων αυτών καθαυτών, αλλά επάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων της μικρογλοίας οδηγεί στην υπόθεση ότι η PTN μπορεί να δρα ως ένας παρακρινής αυξητικός/αγγειογενετικός παράγοντας, ο οποίος παράγεται από τα γλοιώματα και συμβάλλει στην κακοήθειά τους στοχεύοντας ενδοθηλιακά και μικρογλοιακά κύτταρα (Mikelis et al, 2007). Βέβαια, σήμερα έχει αποδειχθεί ότι η PTN δρα και ως αυτοκρινής και ως παρακρινής αυξητικός παράγοντας. Αναστολή της έκφρασης της PTN στα ανθρώπινα κύτταρα από καρκίνο προστάτη LNCaP, μειώνει την ανάπτυξη και τη μετανάστευσή τους καθώς και τη δυνατότητα να επάγουν αγγειογένεση in vitro και in vivo (Hatziapostolou et al, 2005; Tsirmoula et al, 2012). Πέρα από τη χαρακτηρισμένη επαγωγική δράση της PTN, υπάρχουν και δεδομένα που της αποδίδουν ανασταλτικό ρόλο στην αγγειογένεση και στην ανάπτυξη όγκων. Για παράδειγμα, η έκφρασή της αυξάνεται σε κυτταρικές καλλιέργειες όταν τα κύτταρα δεν πολλαπλασιάζονται (Papadimitriou et al, 2004). Επίσης, η PTN δεσμεύεται άμεσα με τον VEGF 165 και αναστέλλει/μειώνει τη βιολογική δράση του τελευταίου (Heroult et al, 2004). Η PTN έχει χαρακτηρισθεί ως αγγειοστατικός παράγοντας σε ένα in vivo μοντέλο νευροβλαστώματος (Calvet et al, 2006), και αναστολή της έκφρασης της στα κύτταρα γλοιώματος επίμυ C6 οδηγεί σε επαγωγή τόσο της ανάπτυξης των ίδιων των κυττάρων C6 in vitro, όσο και της αγγειογένεσης in vivo και in vitro (Parthymou et al, 2008). Τέλος, εξωγενής χορήγηση της PTN σε κύτταρα γλοιώματος M059K και C6 προκαλεί αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης (Mikelis et al, 2009). Καθοριστικός παράγοντας για τουλάχιστον κάποιες από τις ανασταλτικές δράσεις της ΡΤΝ φαίνεται να είναι η έκφραση της ιντεγκρίνης α ν β 3 (βλέπε παράγραφο 3.5) Βιολογικά ενεργά τμήματα της PTN Παρά το γεγονός ότι πολλές μελέτες που αφορούν στη σχέση δομής-δράσης τμημάτων της PTN έχουν διεξαχθεί ως σήμερα, δεν είναι ακόμα ξεκάθαρο ποιο τμήμα είναι υπεύθυνο για κάθε βιολογική της δράση. Έχει δειχθεί πως το καρβοξυτελικό άκρο της PTN επάγει την προέκταση νευριτών στα πρότυπα 24

41 Εισαγωγή ολόκληρου του μορίου, ενώ το αμινοτελικό δε φαίνεται να έχει καμία δράση (Inui et al, 2000). Τα αμινοξέα του καρβοξυτελικού άκρου της PTN θεωρούνται το ενεργό της τμήμα όσον αφορά στη μιτογόνο δράση της στα κύτταρα CHO-K1 (Bernard-Pierrot et al, 2001) και την ενεργοποίηση του μονοπατιού των ενεργοποιημένων από μιτογόνα πρωτεϊνικών κινασών (mitogen-activated protein kinases, MAPKs) στα κύτταρα BEL (Souttou et al, 1997). Τα αμινοξέα φαίνεται να συμμετέχουν και στην ογκογενετική δράση της PTN (Bernard-Pierrot et al, 2001). Υπερέκφραση του καρβοξυτελικού άκρου της PTN (αμινοξέα ) στα κύτταρα SW13 οδηγεί στην επαγωγή της καρκινικής αγγειογένεσης in vivo παρόμοια με αυτήν που παρατηρείται με ολόκληρο το μόριο της PTN. Αντίθετα, υπερέκφραση του αμινοτελικού άκρου της ΡΤΝ οδηγεί σε ανάπτυξη όγκων in vivo, αλλά όχι σε αυξημένη καρκινική αγγειογένεση (Zhang et al, 2006). Έκφραση ΡΤΝ από την οποία λείπουν τα 26 τελευταία αμινοξέα του καρβοξυτελικού άκρου: α) δρα ως ενδογενής αναστολέας της μιτογόνου, αγγειογενετικής και ογκογενετικής δράσης της PTN στα κύτταρα MDA-MB231, δημιουργώντας μη λειτουργικό ετεροδιμερές με το μόριο της ακέραιας ΡΤΝ (Bernard-Pierrot et al, 2002), β) μειώνει τον επαγόμενο από PTN πολλαπλασιασμό καρκινικών και ενδοθηλιακών κυττάρων, μειώνει τα επίπεδα έκφρασης του VEGF, και αναστέλλει την ανάπτυξη όγκων και την αγγειογένεση in vivo (Duces et al, 2008; Dos Santos et al, 2010), γ) αναστέλλει σημαντικά τη μιτογόνο δράση ολόκληρου του μορίου στην in vitro και in vivo ανάπτυξη κυττάρων καρκίνου του προστάτη (Hamma-Kourbali et al, 2011). Σε συμφωνία με αυτά τα αποτελέσματα, συνθετικό πεπτίδιο που αντιστοιχεί στα 25 τελευταία αμινοξέα του καρβοξυτελικού άκρου της PTN αναστέλλει την επαγόμενη από PTN αγγειογένεση στο in vivo σύστημα της CAM, καθώς και την επαγόμενη από PTN μετανάστευση και τον σχηματισμό αυλών ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro, μέσω αναστολής της αλληλεπίδρασης ολόκληρου του μορίου με την ιντεγκρίνη α ν β 3 (Mikelis et al, 2011). Καθήλωση των πεπτιδίων που αντιστοιχούν στα αμινοξέα 1-21 και στην επιφάνεια καλλιέργειας επάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε διάφορα είδη ενδοθηλιακών κυττάρων, σε αντίθεση με τα διαλυτά πεπτίδια που δεν έχουν δράση (Papadimitriou et al, 2000). Τα ίδια πεπτίδια επάγουν την αγγειογένεση in vivo στο μoντέλο της CAM, καθώς και τη μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων και το σχηματισμό ψευδαγγείων σε υπόστρωμα matrigel in vitro (Papadimitriou et al, 2001). Το συνθετικό πεπτίδιο που αντιστοιχεί στα αμινοξέα ανέστειλε τη 25

42 Εισαγωγή μιτογόνο, αγγειογενετική και ογκογενετική δράση τόσο της PTN όσο και του FGF- 2, μέσω αλληλεπίδρασής του με την ηπαρίνη (Hamma-Kourbali et al, 2008). Από την άλλη πλευρά, το συνθετικό πεπτίδιο που αντιστοιχεί στα αμινοξέα ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την προσκόλληση καρκινικών κυττάρων προστάτη in vitro και την αγγειογένεση στο in vivo μoντέλο της CAM, μέσω αλληλεπίδρασης με τον υποδοχέα με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ (receptor protein tyrosine phosphatase β/ζ, RPTPβ/ζ) ή/και ανταγωνισμού με την Ν-συνδεκάνη (Diamantopoulou et al, 2010). Διάφορα πεπτίδια που προκύπτουν από πρωτεόλυση της PTN μπορεί να έχουν διαφοροποιημένη ή και αντίθετη βιολογική δράση. Πέψη της PTN από την πλασμίνη οδηγεί στην παραγωγή πέντε πεπτιδίων που αντιστοιχούν σε διαφορετικές περιοχές του μορίου. Τα πεπτίδια που περιέχουν μία από τις β- δομές επάγουν την αγγειογένεση in vitro, κάτι που δε φαίνεται να συμβαίνει σε πεπτίδια που περιέχουν και τις δύο β-δομές (Polykratis et al, 2004). Θεωρείται πως οι β-δομές απαιτούνται για την αλληλεπίδραση PTN-VEGF 165 (Heroult et al, 2004), κάτι που δικαιολογεί την ανασταλτική δράση των πεπτιδίων μέσω αλληλεπίδρασης με τον VEGF 165 και αναστολής της δράσης του. Παρόλα αυτά, χορήγηση των πεπτιδίων αυτών in vivo προκαλεί επαγωγή της αγγειογένεσης, με μηχανισμούς που δεν είναι απόλυτα διευκρινισμένοι (Polykratis et al, 2004). 3. Μόρια που αλληλεπιδρούν με την PTN 3.1. Γλυκοζαμινογλυκάνες Η δυνατότητά της PTN να προσδένεται στην ηπαρίνη αποτελεί βασικό χαρακτηριστικό του μορίου και βρίσκει εφαρμογή στην ταυτοποίηση και στην απομόνωση του αυξητικού παράγοντα (Soulie et al, 2002; Bernard-Pierrot et al, 2004). Η αλληλεπίδραση της PTN με την ηπαρίνη λαμβάνει χώρα σε διάλυμα (K D =460 nm), έχει στοιχειομετρία 3:1 (Fath et al, 1999), πραγματοποιείται μέσω των β-δομών της PTN και οδηγεί σε αλλαγή της στερεοδιαμόρφωσής της (Kilpelainen et al, 2000). Από την άλλη πλευρά, μετρήσεις κινητικής πρόσδεσης ακινητοποιημένης PTN με την ηπαρίνη έδειξαν ισχυρότερη αλληλεπίδραση των δύο μορίων (K D =4 nm) (Fath et al, 1999). Καθεμία β-δομή μόνη της παρουσιάζει 26

43 Εισαγωγή μικρή ικανότητα δέσμευσης στην ηπαρίνη, κάτι που αλλάζει με την συνεργιστική δράση των δύο β-δομών (Raulo et al, 2005). Σε λειτουργικό επίπεδο, προσθήκη ηπαρίνης αναστέλλει τον επαγόμενο από PTN κυτταρικό πολλαπλασιασμό (Vacherot et al, 1999). Η PTN δεσμεύεται στη θειϊκή ηπαράνη (Mitsiadis et al, 1995) και παρά το γεγονός ότι συναινετικές αλληλουχίες για σύνδεση με την ηπαρίνη βρίσκονται στα πλούσια σε λυσίνη άκρα της PTN, αυτά δεν απαιτούνται για αλληλεπίδρασή της με αλυσίδες θειϊκής ηπαράνης (Raulo et al, 2005). Το αποτέλεσμα αυτό είναι σε συμφωνία με την υπόθεση πως οι περιοχές δέσμευσης στην ηπαρίνη δεν αντιστοιχούν απαραίτητα σε συγκεκριμένες αλληλουχίες (Munoz and Linhardt, 2004). Τα μόρια θειϊκής ηπαράνης στην Ν-συνδεκάνη είναι απαραίτητα για τη δέσμευση της PTN και την επαγωγή προέκτασης των νευριτών. Επώαση μεσαγγειακών κυττάρων με ηπαριτινάση απομακρύνει την PTN από τα κύτταρα, αποκαλύπτοντας τη σημασία της αλληλεπίδρασης για τη δράση της PTN σε αυτά τα κύτταρα (Martin et al, 2006). Πέρα από τη θειϊκή ηπαράνη, η PTN μπορεί να δεσμευθεί στη θειϊκή δερματάνη, καθώς και στη θειϊκή χονδροϊτίνη Α (Vacherot et al, 1999) και Ε (Deepa et al, 2002). Υπάρχουν ενδείξεις ότι πολλά από τα μόρια αυτά παίζουν ρόλο στη μιτογόνο δράση (Vacherot et al, 1999) και στην επαγωγή ανάπτυξης νευριτών από την PTN (Kinnunen et al, 1996). Στα αρχικά στάδια της εμβρυογένεσης επιμύων έχει ανιχνευθεί αλληλεπίδραση της PTN με την πρωτεογλυκάνη M ή βερσικάνη, μια πρωτεογλυκάνη θειϊκής χονδροϊτίνης (Zou et al, 2000). Πρόσφατα δημοσιεύτηκε ότι τα επίπεδα του mrna της ειδικής σουλφοτρανσφεράσης για παραγωγή θειϊκής χονδροϊτίνης Ε, GalNAc4S-6ST, είναι αυξημένα σε αστροκύτταρα όγκων και συνδέονται με κακή πρόγνωση των ασθενών. Πιθανολογείται πως η έκφραση της σουλφοτρανσφεράσης ενισχύει τη διαμεσολαβούμενη από αλυσίδες θειϊκής χονδροϊτίνης Ε κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων παρουσία ΡΤΝ ή/και ΜΚ, με τις οποίες αλληλεπιδρούν (Kobayashi et al, 2013). Το ιδουρονικό οξύ (iduronic acid, IdoUA) θεωρείται βασικό στοιχείο για τη δέσμευση της PTN σε αλυσίδες θειϊκής δερματάνης/θειϊκής χονδροϊτίνης σε έμβρυα θηλαστικών και για την ανάπτυξη νευριτών στα αρχικά στάδια ανάπτυξης του εγκεφάλου (Bao et al, 2004; Nandini et al, 2004; 2005). Ανάλυση των ολιγοσακχαριτών αυτών αποκάλυψε ότι οι οκτασακχαρίτες αποτελούν τη μικρότερη δυνατή δομή για αλληλεπίδραση με την PTN σε φυσιολογικές συνθήκες 27

44 Εισαγωγή άλατος, καθώς και ότι η PTN δεσμεύεται σε αυτούς σε διαφορετικές αλληλουχίες και με διαφορικές συγγένειες (Bao et al, 2005). Η ηπαρίνη και άλλες θειωμένες γλυκοζαμινογλυκάνες, όπως η θειϊκή δερματάνη και η θειϊκή χονδροϊτίνη-c, θεωρείται πως επάγουν το διμερισμό της PTN, βήμα απαραίτητο για τη βιολογική της δράση (Bernard-Pierrot et al, 1999). Ακόμα, η ηπαρίνη, η θειϊκή ηπαράνη και η θειϊκή δερματάνη προστατεύουν μερικά την PTN από την πρωτεολυτική δράση της πλασμίνης (Polykratis et al, 2004). Καθώς οι γλυκοζαμινογλυκάνες δεσμεύουν την PTN με διαφορετικές συγγένειες και κινητική, η σχετική κατανομή τους σε μεσέγχυμα, βασική μεμβράνη και επιθηλιακά κύτταρα σε συγκεκριμένα στάδια της ανάπτυξης ιστών, θα μπορούσε να παίζει βασικό ρόλο στη στρατολόγηση της ΡΤΝ και στη στοχευμένη διάχυσή της (Vacherot et al,1999; Shah et al, 2011). Πρόσφατα, ταυτοποιήθηκε η αλληλεπίδραση της PTN με μια δομική πρωτεΐνη του εξωκυττάριου χώρου, την οστεοποντίνη, η οποία φέρει νευροπροστατευτικές δράσεις (Long et al, 2012) Ν-Συνδεκάνη Η Ν-συνδεκάνη ή συνδεκάνη-3 (μοριακού μεγέθους περίπου 200 kda) απομονώθηκε από καλλιέργειες νευρικών κυττάρων και από εγκέφαλο αρουραίου, μέσω στήλης με καθηλωμένη ανασυνδυασμένη PTN (Raulo et al, 1994). Aποτελείται από έναν πρωτεϊνικό κορμό 442 αμινοξέων, στον οποίο προσδένονται αλυσίδες θειϊκής ηπαράνης (Raulo et al, 1994) και παρουσιάζει υψηλή ομολογία σε άνθρωπο, επίμυ και αρουραίο (Berndt et al, 2001). H Ν- συνδεκάνη εκφράζεται σημαντικά στον εγκέφαλο του εμβρύου και νεογέννητου αρουραίου (Carey et al, 1992) και φαίνεται να είναι απαραίτητη για την επιβίωση αισθητηρίων νευρώνων (Paveliev et al, 2008). Η έκφραση της PTN και της Ν- συνδεκάνης συμπίπτουν χρονικά κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου και συνεντοπίζονται σε συγκεκριμένα σημεία στον εγκέφαλο αρουραίου (Nolo et al, 1995). Έκφραση και συνεντοπισμός PTN/Ν-συνδεκάνης παρατηρείται και στη νευρόσφαιρα, γεγονός που υποδηλώνει τη συμμετοχή της PTN στη ρύθμιση και τη διαφοροποίηση εμβρυϊκών νευρικών κυττάρων (Furuta et al, 2004). Έχει προταθεί ότι οι συνδεκάνες εκφράζονται πρωταρχικά στα αστροκύτταρα και μαζί 28

45 Εισαγωγή με την PTN, μπορούν να προσδώσουν ένα υποστηρικτικό περιβάλλον για την επαναδημιουργία νευραξόνων σε τραύματα του εγκεφάλου (Iseki et al, 2002). Η PTN, σε συνδυασμό με την Ν-συνδεκάνη και τον υποδοχέα της RPTPβ/ζ, φαίνονται να ρυθμίζουν τη νευροπροστατευτική δράση της camp στους ντοπαμινεργικούς νευρώνες (Mourlevat et al, 2005). H συμμετοχή της Ν- συνδεκάνης στη ρύθμιση της μακροχρόνιας ενίσχυσης (long term potentiation, LTP) προκύπτει από το γεγονός ότι η PTN δεν την επηρεάζει σε επίμυες που δεν εκφράζουν Ν-συνδεκάνη (Kaksonen et al, 2002). Αυτή η ρύθμιση της πλαστικότητας από την αλληλεπίδραση της PTN με την Ν-συνδεκάνη, φαίνεται να είναι σημαντική για τη μάθηση και τη μνήμη (Pavlov et al, 2002). H Ν-συνδεκάνη έχει ανιχνευθεί ως υποδοχέας της PTN σε προγονικά οστεοκύτταρα και οστεοβλάστες (Imai et al, 1998), ενώ η έκφραση της PTN από τους οστεοβλάστες και ο συνεντοπισμός της με την Ν-συνδεκάνη έχουν επιβεβαιωθεί σε in vivo μοντέλα (Tare et al, 2002). Η Ν-συνδεκάνη εκφράζεται στην κνήμη μετά από κατάγματα (Song et al, 2006) και πιθανότατα δρα ως υποδοχέας της PTN και στα ηπατικά κύτταρα (Asahina et al, 2002). Πρόσδεση της PTN στην Ν-συνδεκάνη οδηγεί στην ενεργοποίηση της c-src και της Fyn και στην αλληλεπίδρασή τους με την κορτακτίνη και την τουμπουλίνη. Τελικό επακόλουθο αυτών των αλληλεπιδράσεων είναι η αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, με αποτέλεσμα την προέκταση νευριτών (Imai et al, 1998) και τη μετανάστευση οστεοβλαστών (Kinnunen et al, 1998). Η N-συνδεκάνη μοιάζει με τους άλλους διαμεμβρανικούς υποδοχείς στην ικανότητά τους να διμερίζονται και να ολιγομερίζονται στην κυτταρική μεμβράνη. Πιθανό ενδεχόμενο αποτελεί πως η PTN που δεσμεύεται στην Ν-συνδεκάνη επάγει το διμερισμό ή τον ολιγομερισμό της N-συνδεκάνης στους νευρώνες (Asundi and Carey, 1995) Κινάση αναπλαστικού λεμφώματος (Anaplastic Lymphoma Kinase, ALK) O υποδοχέας ALK είναι ένας διαμεμβρανικός υποδοχέας 220 kda με δράση κινάσης τυροσίνης. Μαζί με το συγγενικό του μόριο, την κινάση τυροσίνης των λευκοκυττάρων με μέγεθος 110 kda (leukocyte tyrosine kinase, LTK ), ανήκουν στην υπεροικογένεια των υποδοχέων ινσουλίνης. Ο ALK αρχικά ανακαλύφθηκε 29

46 Εισαγωγή ως τμήμα μιας ογκογενετικής χιμαιρικής κινάσης τυροσίνης, της νουκλεοφοσμίνης (nucleophosmin, NPM-ALK) που εκφράζεται στα αναπλαστικά μεγαλοκυτταρικά λεμφώματα (Morris et al, 1994). Έχει υποστηριχθεί ότι το τμήμα της νουκλεοφοσμίνης που είναι υπεύθυνο για το διμερισμό της χιμαιρικής πρωτεΐνης, οδηγεί στη συνεχή ενεργοποίηση της κινάσης και στη δράση επαγωγής του κυτταρικού μετασχηματισμού (Bischof et al, 1997). Έχουν ανιχνευθεί δύο ισομορφές του ALK, 220 και 140 kda, σε μετασχηματισμένα ανθρώπινα εμβρυονικά κύτταρα νεφρού (Moog-Lutz et al, 2005) και σε εκχυλίσματα εγκεφάλου. Η μεγάλη ισομορφή του ALK έχει την κλασική δομή ενός υποδοχέα με δράση κινάσης τυροσίνης, δηλαδή ένα μεγάλο εξωκυτταρικό, ένα λιπόφιλο διαμεμβρανικό και ένα κυτταροπλασματικό τμήμα με δομή κινάσης τυροσίνης (Iwahara et al, 1997; Morris et al, 1997). Ο ALK εκφράζεται κυρίως στο νευρικό σύστημα (Pulford et al, 1997). Εντονότερη έκφρασή του παρατηρείται στον εγκέφαλο νεογέννητων θηλαστικών, υποδηλώνοντας πιθανή συμμετοχή του στην ανάπτυξη του νευρικού συστήματος και πιθανόν στο σχηματισμό των συνάψεων και στη διατήρησή τους (Morris et al, 1997). Έκφραση του ALK στον ανθρώπινο πλακούντα υποδηλώνει την εμπλοκή του στον κύκλο ζωής τροφοβλαστών και στην αγγειογένεση (Ball et al, 2009). Αρκετές μελέτες αναφέρουν έκφραση της μεγάλης ισομορφής του ALΚ σε ινοβλάστες, ενδοθηλιακά κύτταρα, καθώς και σε κυτταρικές σειρές που προέρχονται από καρκίνο παγκρέατος, μαστού (Stoica et al, 2001; 2002), μελανώματα (Dirks et al, 2002) και λεμφώματα (Delsol et al, 1997). Παρατηρείται αυξημένη έκφραση του ALK σε νευροβλαστώματα (Lamant et al, 2000; Stoica et al, 2002; Chen et al, 2008) και γλοιώματα (Powers et al, 2002; Grzelinski et al, 2009), η οποία έχει συσχετιστεί και με αυξημένη έκφραση του mrna της PTN (Stylianou et al, 2009; Wellstein, 2012). Μια ποικιλία μαλακών όγκων, σε αντίθεση με τους φλεγμονώδεις μυοϊνοβλαστικούς όγκους, εκφράζουν τον ALK (Li et al, 2004a). Ο ALK εκφράζεται επίσης σε οστεοβλαστικά κύτταρα (Hausser and Brenner, 2005) και σε χονδροκύτταρα, επαγόμενος από τον ίδιο τον προσδέτη του (Pufe et al, 2007). Η PTN δεσμεύεται στο εξωκυτταρικό τμήμα του υποδοχέα (K D =30 pm). Αντισώματα έναντι του υποδοχέα ή της PTN ανέστειλαν τη δέσμευση, τη μεταγωγή σήματος και τη βιολογική δράση της PTN (Stoica et al, 2001; Bowden et al, 2002; Powers et al, 2002). Επιπλέον, η ισομορφή 15 kda της PTN επάγει τη 30

47 Εισαγωγή φωσφορυλίωση του ALK και τη μεταγωγή σήματος σε γλοιώματα (Lu et al, 2005). Στα κύτταρα U87MG, αναστολή της έκφρασης του ALK από ριβοένζυμα, ανέστειλε την ανάπτυξη όγκων σε επίμυες και παρέτεινε την επιβίωσή τους, λόγω αυξημένης απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων (Powers et al, 2002). Τα αποτελέσματα της στόχευσης του ALK ενισχύονται σημαντικά από ταυτόχρονη εξουδετέρωση του γονιδίου της PTN (Grzelinski et al, 2009). Πρόσφατα προτάθηκε ότι η έκφραση τόσο του ALK και όσο και της PTN, είναι απαραίτητη για την αυτοανανέωση και την ογκογονικότητα βλαστικών κυττάρων γλοιοβλαστώματος (Koyama-Nasu et al, 2013). Επίσης, αναστολή της έκφρασης του ALK ή της PTN στα Hs578T κύτταρα καρκίνου του μαστού, τα οποία υπερεκφράζουν ALK, είχε σαν αποτέλεσμα τη μείωση του μεγέθους όγκων σε επίμυες (Wang et al, 1997). Σε αντίθεση με τα παραπάνω αποτελέσματα, αρκετές μελέτες υποστηρίζουν την άποψη ότι ο ALK είναι «ορφανός» υποδοχέας, γιατί δεν ανιχνεύουν τη δέσμευσή του με την PTN (Dirks et al, 2002; Miyake et al, 2002; Motegi et al, 2004; Mathivet et al, 2007). Έχει επίσης προταθεί πως η επαγόμενη από την PTN φωσφορυλίωση του ALK πραγματοποιείται ανεξάρτητα από την πρόσδεση της PTN σε αυτόν, αλλά εξαρτάται από την ενεργοποίηση του RPTPβ/ζ από την PTN, με τελικό αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του ALK (Perez-Pinera et al, 2007b). Παρά την ανίχνευση του ALK ως λειτουργικού υποδοχέα για την PTN, λίγα είναι γνωστά για τη μεταγωγή σήματος από αυτόν. Μετά την πρόσδεση της PTN στον ALK ακολουθεί αλληλεπίδραση και ενεργοποίηση των Shc και insulin receptor substrate-1 (IRS-1) (Fujimoto et al, 1996; Stoica et al, 2001), ενώ η Grb2 (growth factor receptor-bound protein-2) δεσμεύεται έμμεσα στον υποδοχέα, μέσω συμπλόκων που μπορεί να περιλαμβάνουν και άλλες πρωτεΐνες πέρα από την Shc (Piccinini et al, 2002). Η σημασία του μονοπατιού της PI3K για τη μιτογόνο δράση του ALK επιβεβαιώνεται από αναφορές που δείχνουν ότι η PI3K είναι απαραίτητη για τη δράση της χιμαιρικής πρωτεΐνης NPM-ALK (Bai et al, 1998; Slupianek et al, 2001) και βασική για τη μιτογόνο και αγγειογενετική δράση της PTN (Souttou et al, 2001b; Polykratis et al, 2005). Η διαφοροποίηση των νευριτών μετά από πρόσδεση της PTN στον ALK μπορεί να επιτευχθεί και μέσω του μονοπατιού των MAPK (Souttou et al, 2001a), οι οποίες είναι υπεύθυνες και για αντιαποπτωτική σηματοδότηση στους ινοβλάστες (Bowden et al, 2002). Σε αδενοκαρκίνωμα πνευμόνων, η διαμεσολαβούμενη από μενίνη μείωση της 31

48 Εισαγωγή έκφρασης της PTN, προτάθηκε ως επιγενετικός μηχανισμός που ρυθμίζει τη μεταγωγή σήματος από το μονοπάτι PTN/ALK, οδηγώντας τελικά σε καταστολή της καρκινικής ανάπτυξης (Gao et al, 2009). Τέλος, η PTN επάγει την ανάπτυξη νευριτών και αυξάνει την έκφραση του mrna της GAP-43 (growth-associated protein-43), μέσω του μονοπατιού μεταγωγής ALK/β-κατενίνης σε αναπτυσσόμενους νευρώνες επιμύων (Yanagisawa et al, 2010) Υποδοχέας με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ (receptor protein tyrosine phosphatase β/ζ, RPTPβ/ζ) O RPTPβ/ζ (γνωστός και ως RPTPβ ή RPTPζ, μέλος της οικογένειας V των RPTPs) είναι μια πρωτεΐνη με δράση φωσφατάσης τυροσίνης και αποτελεί σήμερα τον πιο καλά χαρακτηρισμένο υποδοχέα της PTN. Αρχικά απομονώθηκε από το νευρικό ιστό ως μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη με δράση φωσφατάσης τυροσίνης. Αποτελείται από ένα πολύ μεγάλο εξωκυτταρικό τμήμα που περιέχει μια αμινοτελική αλληλουχία με δομή καρβονικής ανυδράσης, ένα διαμεμβρανικό τμήμα και ένα κυτταροπλασματικό τμήμα που περιέχει δύο επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες φωσφατάσης, από τις οποίες αυτή που είναι κοντά στην πλασματική μεμβράνη είναι η καταλυτικά ενεργή (Krueger and Saito, 1992). Πέρα από τη μεγάλη διαμεμβρανική ισομορφή του υποδοχέα, έχει χαρακτηρισθεί μια μικρότερη διαμεμβρανική ισομορφή που υπολείπεται ενός τμήματος 859 αμινοξέων από το εξωκυτταρικό τμήμα (Levy et al, 1993) και δύο εκκρινόμενες ισομορφές (Εικόνα Ε3), οι οποίες απαντούν στο εξωκυτταρικό τμήμα και είναι η φωσφακάνη (Maurel et al, 1994) και η μικρή ισομορφή της φωσφακάνης ή PSI (phosphacan short isoform) (Garwood et al, 2003). H φωσφακάνη αντιστοιχεί στο εξωκυτταρικό τμήμα της μεγάλης διαμεμβρανικής ισομορφής του RPTPβ/ζ, στο οποίο δεσμεύεται η PTN (Maeda et al, 1996), και θεωρείται ότι ρυθμίζει κυτταρικές αλληλεπιδράσεις και αναπτυξιακές διαδικασίες στο νευρικό σύστημα (Maurel et al, 1994). Μεταβολές στις αλυσίδες θειϊκής χονδροϊτίνης της φωσφακάνης καθορίζονται αναπτυξιακά και ρυθμίζουν την ικανότητα πρόσδεσης της PTN (Maeda et al, 2003). Η μικρή ισομορφή της φωσφακάνης μεγέθους 90 kda, αντιστοιχεί στην αμινοτελική περιοχή καρβονικής ανυδράσης και στην περιοχή ινονεκτίνης τύπου ΙΙΙ. Η μεγάλη διαμεμβρανική ισομορφή του υποδοχέα και η 32

49 Εισαγωγή φωσφακάνη είναι βαριά γλυκοζυλιωμένες πρωτεογλυκάνες αποτελούμενες από αλυσίδες θειϊκής χονδροϊτίνης, ενώ η μικρή διαμεμβρανική ισομορφή του υποδοχέα και το PSI είναι γλυκοπρωτεΐνες (Koutsioumpa and Papadimitriou, 2012). Παρόλα αυτά, η μεγάλη διαμεμβρανική ισομορφή έχει ανιχνευθεί και ως γλυκοπρωτεΐνη σε κάποιους ιστούς (Fujikawa et al, 2003). Αναλύσεις απομονωμένων γλυκοπεπτιδίων του υποδοχέα έδειξαν την παρουσία περίπλοκης δομής σιαλυλιωμένων ολιγοσακχαριτών συνδεδεμένων με ασπαραγίνες (complex type N-linked sialo-glycans) (Milev et al, 1994), ενώ η ακετυλ-γλυκοζαμινυλοτρανσφεράση γνωστή ως GnT-Vb, η οποία χαρακτηρίζεται από έντονη έκφραση στον εγκέφαλο, έχει συσχετιστεί με O-γλυκοζυλίωση του RPTPβ/ζ (Abbott et al, 2008). Εικόνα Ε3: Σχηματική αναπαράσταση των γνωστών ισομορφών του RPTPβ/ζ. Διακρίνονται δύο διαμεμβρανικές (RPTPβ/ζ μεγάλη και μικρή ισομορφή) και δύο εκκρινόμενες ισομορφές (φωσφακάνη και PSI) (Garwood et al, 2003). Σε φυσιολογικές συνθήκες, ο RPTPβ/ζ μπορεί να αποικοδομηθεί από την MMP-9, το μετατρεπτικό ένζυμο του TNF (Tumor Necrosis Factor Converting Enzyme, TACE), την πλασμίνη (Chow et al, 2008a) και την πρεσενιλίνη/γ-σεκρετάση 33

50 Εισαγωγή (Chow et al, 2008b). Έχει προταθεί ότι πρωτεολυτικά τμήματα του RPTPβ/ζ συμμετέχουν σε λειτουργικές διαδικασίες των συνάψεων (Chow et al, 2008a). Γενικά, η πρωτεολυτική αποικοδόμηση του RPTPβ/ζ οδηγεί σε διαμεμβρανικές ή κυτταροπλασματικές μορφές, των οποίων όμως οι βιολογικές λειτουργίες δεν έχουν διαλευκανθεί. Η αρχική απομόνωση των ισομορφών του RPTPβ/ζ στον εγκέφαλο (Krueger and Saito, 1992; Levy et al, 1993; Maurel et al, 1994) και η αναπτυξιακή ρύθμιση της έκφρασής του στο νευρικό σύστημα (Nishiwaki et al, 1997), δείχνουν το σημαντικό ρόλο που έχει στη μορφογένση και στην πλαστικότητα του συστήματος αυτού. Ο RPTPβ/ζ έχει φανεί ότι συμμετέχει στην επαγόμενη από PTN μετανάστευση νευρικών κυττάρων (Maeda and Noda, 1998), ενώ αναστολή της έκφρασής του, την καταστέλλει πλήρως (Muller et al, 2003). Επίσης αναστολή της έκφρασης του RPTPβ/ζ αλλοιώνει τη μορφολογία των κυττάρων Purkinje, δείχνοντας τη σημασία του υποδοχέα στη ρύθμιση της μορφογένεσης δενδριτών (Tanaka et al, 2003). Σε αντίθεση με τα αποτελέσματα in vitro πειραμάτων, η φυσιολογική ανάπτυξη των νευρώνων και της γλοίας σε επίμυες όπου έχει γίνει απαλοιφή του γονιδίου του RPTPβ/ζ, δείχνει πως είτε η δράση του υποδοχέα δεν είναι απαραίτητη για τέτοιες διαδικασίες, είτε πως η απώλεια του RPTPβ/ζ αναπληρώνεται από την έκφραση άλλων πρωτεϊνών με δράση φωσφατάσης τυροσίνης (Harroch et al, 2000). Ωστόσο, μελέτες σε επίμυες που δεν εκφράζουν τον RPTPβ/ζ, προσδιόρισαν ένα νέο ρόλο του υποδοχέα στο συντονισμό των νευρώνων και στην αλγαισθησία (Lafont et al, 2009), ενώ παράλληλα συζητείται η εμπλοκή του στις πλαστικές αλλαγές που προκαλούνται από την L-ντοπαμίνη, καθώς και στη νόσο του Parkinson (Ferrario et al, 2008). Οι διαφοροποιημένοι οστεοβλάστες, σε αντίθεση με τα νευρικά κύτταρα, εκφράζουν ειδικά τη μικρή διαμεμβρανική ισομορφή του RPTPβ/ζ (Schinke et al, 2008). Επίμυες που δεν εκφράζουν RPTPβ/ζ, αν και δεν παρουσιάζουν εμφανείς ανωμαλίες, εντούτοις εμφανίζουν μικρότερο πυρήνα αναγέννησης οστών και μικρότερο ρυθμό σύνθεσης νέων οστών (Harroch et al, 2000). Οι οστεοβλάστες που δεν εκφράζουν τον RPTPβ/ζ παρουσιάζουν μικρότερη έκφραση δεικτών οστεοβλαστών και έχουν μειωμένη ικανότητα δημιουργίας κυτταρικών προεκβολών σε υπόστρωμα matrigel (Schinke et al, 2008). Τα παραπάνω αποτελούν τις πρώτες ενδείξεις για το φυσιολογικό ρόλο του RPTPβ/ζ στην αναγέννηση των οστών. 34

51 Εισαγωγή Έλεγχος διαφόρων μορίων του εξωκυττάριου χώρου έδειξε αλληλεπίδραση της φωσφακάνης με μόρια που σχετίζονται με την κυτταρική προσκόλληση, όπως η N-CAM, η Ng-CAM και η τενασκίνη, που εμπλέκονται στη γένεση του νευρικού ιστού και στην ανάπτυξή του, μέσω συνδεδεμένων με ασπαραγίνες ολιγοσακχαριτών στην περιοχή καρβονικής ανυδράσης και φιμπρονεκτίνης τύπου III του εξωκυτταρικού τμήματος του υποδοχέα (Milev et al, 1994; Barnea et al, 1994). Στο αναπτυσσόμενο νευρικό σύστημα, η αμφοτερίνη συνεντοπίζεται με τη φωσφακάνη μέσω της περιοχής της καρβονικής ανυδράσης και επάγει την αλληλεπίδρασή της με την κοντακτίνη (Peles et al, 1995; Milev et al, 1998). Επιπρόσθετα, ο RPTPβ/ζ θεωρείται υποδοχέας του αντιγόνου F3, το οποίο σχετίζεται με την κυτταρική προσκόλληση στα κύτταρα Swann (Thomaidou et al, 2001), αλλά και της βακτηριακής κυτταροτοξίνης Vac A, επάγοντας τη δημιουργία γαστρικού έλκους έπειτα από ενεργοποίηση του υποδοχέα (Fujikawa et al, 2003). Αλληλεπίδραση του RPTPβ/ζ με την DNER (Delta/Notch-like EGF-related Receptor), διαμεμβρανική πρωτεΐνη που εκφράζεται έντονα στα κύτταρα Purkinje της παρεγκεφαλίδας, ρυθμίζει τη δημιουργία νευριτών (Fukazawa et al, 2008). H μεγάλη διαμεμβρανική ισομορφή του υποδοχέα και η φωσφακάνη, αποτελούν υποδοχείς της PTN παίζοντας βασικό ρόλο στην νευρωνική μετανάστευση, όπως και στην περίπτωση της MK (Maeda et al, 1996). Είναι γνωστό πως η αλληλεπίδραση της PTN και της MK με τον RPTPβ/ζ, διαμεσολαβείται τόσο από τον πρωτεϊνικό κορμό του υποδοχέα (χαμηλής συγγένειας), όσο και από τις αλυσίδες θειϊκής χονδροϊτίνης (υψηλής συγγένειας), ενώ αναστέλλεται από εξωγενή προσθήκη θειϊκής χονδροϊτίνης (Maeda et al, 1999; Qi et al, 2001; Maeda et al, 2003). Πρόσδεση της PTN στον RPTPβ/ζ οδηγεί σε ενεργοποίηση αρκετών μονοπατιών μεταγωγής σήματος. Ο RPTPβ/ζ παίζει σημαντικό ρόλο στη δημιουργία της μνήμης, τροποποιώντας τη δράση της Rho GTPάσης (Tamura et al, 2006). Το μονοπάτι PTN/RPTPβ/ζ επάγει τη φωσφορυλίωση της β-κατενίνης, καταστρέφει την αλληλεπίδρασή της με την κυτταροπλασματική περιοχή των καντερινών, αποσταθεροποιεί τα σημεία προσκόλλησης και μειώνει τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των κυττάρων (Meng et al, 2000; Deuel et al, 2002). Πρόσδεση της PTN στον RPTPβ/ζ ενεργοποιεί την πρωτεϊνική κινάση C (PKC, protein kinase C), επάγει τη φωσφορυλίωση της β-αντουσίνης (β-adducin) από την PKC και τη μεταφορά της τελευταίας είτε στον πυρήνα είτε στη μεμβράνη, συμβάλλοντας στην 35

52 Εισαγωγή αποικοδόμηση συμπλόκων του κυτταροσκελετού (Pariser et al, 2005a). Η πρωτεΐνη Fyn έχει βρεθεί ότι δεσμεύεται στο κυτταροπλασματικό τμήμα του RPTPβ/ζ, ρυθμίζοντας πιθανά το φαινότυπο του κυτταροσκελετού (Pariser et al, 2005b). Η κινάση c-src επίσης αλληλεπιδρά άμεσα με τον RPTPβ/ζ και μετά από ενεργοποίησή του από την PTN, ενεργοποιείται η κινάση εστιακής προσκόλλησης (focal adhesion kinase, FAK), η PI3K και κινάσες που ρυθμίζονται από εξωκυτταρικά σήματα (extracellular signal regulated kinases, ERK), οδηγώντας σε κυτταρική μετανάστευση και σχηματισμό αυλών από ενδοθηλιακά κύτταρα (Polykratis et al, 2005). Επίσης, έχει δειχθεί ότι πρόσδεση της PTN στον RPTPβ/ζ επάγει τη φωσφορυλίωση του υποδοχέα 1, που αλληλεπιδρά με κινάσες και είναι δεσμευμένος με τον G υποδοχέα (G protein coupled receptor kinase-interactor 1) και αυξάνει την αλληλεπίδραση του τελευταίου του με τις Magi1 (Fukada et al, 2005) και Magi3 (Adamsky et al, 2003). Οι τελευταίες μπορούν να χρησιμεύσουν ως σημείο στρατολόγησης διαφόρων υποστρωμάτων του RPTPβ/ζ στην κυτταρική μεμβράνη. Από την άλλη πλευρά, υπερέκφραση του RPTPβ/ζ συνάδει με αυξημένη έκφραση των ρυθμιστών του, όπως της PTN, N-CAM, τενασκίνης και της θειϊκής χονδροϊτίνης, υπογραμμίζοντας τη σημαντικότητα της σηματοδότησης από τον RPTPβ/ζ, σε ενήλικα ανθρώπινα λευκά προγονικά κύτταρα (Sim et al, 2006). Πρόσφατα, έγινε γνωστό από την ερευνητική μας ομάδα πως η παρουσία της ιντεγκρίνης α ν β 3, είναι απαραίτητη για τη διαμεσολαβούμενη από τον RPTPβ/ζ μετανάστευση ενδοθηλιακών και καρκινικών κυττάρων γλοιoβλαστώματος. Συγκεκριμένα, ο RPTPβ/ζ σχηματίζει λειτουργικό σύπλοκο με την α ν β 3 στην κυτταρική μεμβράνη και είναι υπεύθυνος για την φωσφορυλίωση της υπομονάδας β 3 στην τυροσίνη 773, μέσω ενεργοποίησης της c-src (Mikelis et al, 2009). Η εμπλοκή του RPTPβ/ζ στην κυτταρική μετανάστευση που διεγείρεται από την PTN (όπως αναφέρεται παραπάνω), το μονοξείδιο του αζώτου (Nitrc Oxide, NO) (Polytarchou et al, 2009) και την απροτινίνη (αναστολέας παγκρεατικής τρυψίνης βοοειδών, που χρησιμοποιείτο ως αιμοστατικό σε εγχειρήσεις) (Koutsioumpa et al, 2009), υποδηλώνουν το ρόλο του υποδοχέα στην αγγειογένεση. Επιπλέον, η έκφραση της ΡΤΝ και του RPTPβ/ζ στον ανθρώπινο πλακούντα συσχετίζει το μονοπάτι αυτό με τον κύκλο ζωής τροφοβλαστών και την αγγειογένεση (Ball et al, 2009). O υποδοχέας RPTPβ/ζ εκφράζεται σε ανθρώπινα πρωτογενή και μεταστατικά μελανώματα (Goldmann et al, 2000), ανθρώπινα κύτταρα οστεοσαρκώματος 36

53 Εισαγωγή (Hausser και Brenner, 2005), μηνιγγιώματα (Tong et al, 2007), γλοιοβλαστώματα και νευροβλαστώματα (Goldmann et al, 2000). Επιπλέον, εντοπίζεται όχι μόνο στην κυτταρική μεμβράνη, αλλά στο κυτταρόπλασμα και στον πυρήνα σε διάφορα κύτταρα καρκίνου του μαστού, και στην περίπτωση πορογενών διηθητικών καρκινωμάτων. Η ενδοκυτταρική κατανομή του υποδοχέα αλλάζει ανάλογα με το στάδιο της κακοήθειας (Perez-Pinera et al, 2007a). Από την άλλη πλευρά, έχει δειχθεί πως μειώνεται το mrna του υποδοχέα σε καρκίνο παχέος εντέρου, σε σύγκριση με εκείνο από γειτονικό φυσιολογικό βλεννογόνο (Yamakawa et al, 1999). Όσον αφορά στη ρύθμιση του RPTPβ/ζ, έχει αποδειχθεί ότι χρόνιο οξειδωτικό στρες μπορεί να επάξει τη γονιδιακή έκφραση του υποδοχέα μέσω ενεργοποίησης της β-κατενίνης (Liu et al, 2007). Επιπλέον, ο υποδοχέας ενεργοποιείται από τον επαγόμενο από υποξία παράγοντα-2 (hypoxia inducible factor-2, HIF-2) σε νεφρικά κύτταρα (Wang et al, 2010a). Πολλές αναφορές αναδεικνύουν το σημαντικό ρόλο του RPTPβ/ζ στη ρύθμιση της κινητικότητας κυττάρων γλοιοβλαστώματος (Muller et al, 2003). Ο απτοτακτισμός των κυττάρων γλοιοβλαστώματος που επάγεται από την PTN, αναστέλλεται μέσω μείωσης της έκφρασης του RPTPβ/ζ, γεγονός που οδηγεί στο συμπέρασμα ότι αυξημένη έκφραση της PTN και του RPTPβ/ζ στα ανθρώπινα καρκινικά αστροκύτταρα, πιθανόν να δημιουργεί μια αυτοκρινή δράση η οποία είναι σημαντική για την κυτταρική μετανάστευση (Ulbricht et al, 2003). Ο αρνητικός ρυθμιστής του RPTPβ/ζ, LRRC4, δείχθηκε να αναστέλλει τη διεισδυτικότητα κυττάρων γλοιοβλαστώματος (Wu et al, 2006), ενώ καθηλωμένη PTN επάγει τη μεταναστευτική ικανότητα των ίδιων κυττάρων με τρόπο εξαρτώμενο από τον υποδοχέα (Lu et al, 2005). Σε ένα in vivo μοντέλο ογκογένεσης, εντεροκύτταρα παρουσίασαν μειωμένη σύνδεση μεταξύ β-κατενίνης και RPTPβ/ζ και παράλληλα μειωμένη κυτταρική μετανάστευση (Carothers et al, 2001). Μελέτες αποκάλυψαν επίσης ότι η μενίνη ρυθμίζει τη μετανάστευση καρκινικών κυττάρων πνεύμονα μέσω του μονοπατιού σηματοδότητσης PTN/RPTPβ/ζ, σε συνδυασμό με την ιντεγκρίνη α ν β 3, και τις κινάσες FAK και PI3K (Feng et al, 2010). Επιπλέον, σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος, αναφέρεται πως η ΡΤΝ οδηγεί σε αυξημένη φωσφορυλίωση διαφόρων υποστρωμάτων που απαιτούνται για τη μετάβαση επιθηλιακών προς μεσεγχυματικά κύτταρα, μέσω πρόσδεσης και απενεργοποίησης του RPTPβ/ζ (Perez-Pinera et al, 2006). Τέλος, καταστολή της έκφρασης του RPTPβ/ζ οδηγεί 37

54 Εισαγωγή σε μειωμένη μετανάστευση, προσκόλληση και σχηματισμό αποικιών των κυττάρων καρκίνου του προστάτη DU145 (Diamantopoulou et al, 2010). Οι στρατηγικές στόχευσης του RPTPβ/ζ μέχρι σήμερα είναι περιορισμένες. Ωστόσο, μονοκλωνικά αντισώματα έναντι του RPTPβ/ζ (Ulbricht et al, 2006), καθώς και αναστολή της έκφρασής του με sirna (Foehr et al, 2006), αναστέλλουν την ανάπυξη γλοιωμάτων in vitro και in vivo Ιντεγκρίνη α ν β 3 Οι ιντεγκρίνες είναι ετεροδιμερείς διαμεμβρανικοί υποδοχείς που αποτελούνται από μία α και μία β αλυσίδα. Ρυθμίζουν την πρόσδεση του κυττάρου σε μόρια της εξωκυττάριας ύλης και παράλληλα αλληλεπιδρούν με διαλυτούς προσδέτες ή προσδέτες της κυτταρικής μεμβράνης. Τη δημιουργία των αλυσίδων α και β ακολουθεί η σύνδεσή τους στο ενδοπλασματικό δίκτυο σε λειτουργικό ετεροδιμερές, το οποίο στη συνέχεια μεταφέρεται στην κυτταρική μεμβράνη (Cheresh, 1992). Αν και υπάρχουν τουλάχιστον 18 διαφορετικές α και 8 β αλυσίδες, εντούτοις μόνο 24 διαφορετικοί α/β συνδυασμοί έχουν ανιχνευθεί. Κάθε ετεροδιμερές α/β έχει τους δικούς του προσδέτες και τη δική του εξειδίκευση. Πέρα από την ιδιότητα που προσδίδουν στα κύτταρα να προσκολλώνται στην εξωκυττάρια ύλη, οι ιντεγκρίνες αποτελούν σημαντικούς ρυθμιστές σηματοδότησης, και το σύνολο των ιντεγκρινών που εντοπίζονται σε ένα κύτταρο καθορίζει τη βιολογική απόκριση του κυττάρου σε ερεθίσματα από την εξωκυττάρια ύλη και το μικροπεριβάλλον (Giancotti and Ruoslahti, 1999). Το εξωκυτταρικό τμήμα των υπομονάδων α και β συνήθως αποτελείται από αμινοξέα, ενώ οι κυτταροπλασματικές περιοχές είναι όλες σχετικά μικρές (20-50 αμινοξέα). Οι αλυσίδες α περιέχουν τέσσερις ή πέντε εξωκυτταρικές δομές και μια μικρή κυτταροπλασματική δομή, ενώ οι υπομονάδες β περιέχουν 8 εξωκυτταρικές περιοχές και μια κυτταροπλασματική περιοχή ποικίλου μεγέθους (Takada et al, 2007). Επειδή στερούνται δραστικότητας κινάσης, η συμβολή τους στην κυτταρική σηματοδότηση συχνά περιλαμβάνει τη στρατολόγηση, μέσω των κυτταροπλασματικών περιοχών τους, σηματοδοτικών μορίων όπως η FAK (Hauck et al, 2002), η c-src (Parsons and Parsons, 1997), η PI3K (Franke et al, 1997), καθώς και πρωτεϊνών του κυτταροσκελετού. 38

55 Εισαγωγή Η ικανότητα πρόσδεσης συγκεκριμένων ιντεγκρινών στους προσδέτες τους στα θηλαστικά ρυθμίζεται αυστηρά από τη δομή του ετεροδιμερούς και από την κυτταροπλασματική μεταγωγή σήματος στο ίδιο το κύτταρο (inside-out signaling). Οι ιντεγκρίνες μπορούν να ενεργοποιηθούν ενδοκυτταρικά με σηματοδότηση από άλλους υποδοχείς, που οδηγεί σε φωσφορυλίωση της κυτταροπλασματικής περιοχής των β υπομονάδων. Η αλληλεπίδραση των κυτταροπλασματικών περιοχών ανάμεσα στην υπομονάδα α και β φαίνεται απαραίτητη προκειμένου να διατηρηθεί η ιντεγκρίνη σε ανενεργή κατάσταση. Από την άλλη πλευρά, έχει προταθεί ότι με τη δέσμευση εξωκυτταρικών προσδετών, οι ιντεγκρίνες συσσωματώνονται στην κυτταρική μεμβράνη και μετάγουν σηματοδότηση στο εσωτερικό του κυττάρου (outside-in signaling). Η πρόσδεση εξωκυτταρικών προσδετών επάγει διαμορφωτικές αλλαγές που οδηγούν σε αλληλεπίδραση της κυτταροπλασματικής περιοχής της ιντεγκρίνης με ενδοκυτταρικά μόρια μεταγωγής σήματος. Με τους παραπάνω τρόπους, οι ιντεγκρίνες λειτουργούν ως διαμεμβρανικές συνδέσεις ανάμεσα στους εξωκυτταρικούς προσδέτες (άλλα κύτταρα ή εξωκυττάρια ύλη) και στα ινίδια του κυτταροσκελετού της ακτίνης, του οποίου τη λειτουργία επίσης ρυθμίζουν. Εκτός από τις πρωτεΐνες σηματοδότησης που αναφέραμε παραπάνω, πολλές άλλες πρωτεΐνες δεσμεύονται στο κυτταροπλασματικό τμήμα των ιντεγκρινών, όπως η ταλίνη, η βινκουλίνη, η εζρίνη, η ραντιξίνη και η μοεζίνη, οι οποίες προσδένονται στην ακτίνη και ενώνουν τις ιντεγκρίνες με τον κυτταροσκελετό, δημιουργώντας μεγάλα πρωτεϊνικά συμπλέγματα (Hynes, 2002). Οι ιντεγκρίνες έχουν τη δυνατότητα να τροποποιούν τη μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων, ρυθμίζοντας την προσκόλλησή τους στην εξωκυττάρια ύλη. Η ενεργοποίησή τους επιτρέπει τη λειτουργική σύνδεση των εστιών προσκόλλησης με τον κυτταροσκελετό της ακτίνης (Giancotti, 2000), ενώ ο ρόλος τους είναι ιδιαίτερα σημαντικός για τον απτοτακτισμό των ενδοθηλιακών κυττάρων (Lamalice et al, 2007; Weis and Cheresh, 2011). Επιπλέον, η ενεργοποίηση των ιντεγκρινών είναι απαραίτητη για την έναρξη και τη ρύθμιση της σηματοδότησης κατά την αγγειογένεση. Ο ολιγομερισμός τους και η αλληλεπίδραση με τους προσδέτες τους, λαμβάνει χώρα στα σημεία εστιακής προσκόλλησης. Ενεργοποίηση των ιντεγκρινών στα σημεία αυτά, οδηγεί τις κινάσες Rac και Cdc42 να επάγουν την αναδιαμόρφωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης, μέσω δημιουργίας συμπλόκων με την Arp2/3 πρωτεΐνη και την επαγωγή σχηματισμού 39

56 Εισαγωγή των ινιδίων ακτίνης μέσω της WASP. Εναλλακτικά, ανοδικά των Rho GTPασών ενεργοποιούνται οι πρωτεΐνες DOCK180 και ELMO (Chodniewicz and Klemke, 2004), ενώ καθοδικά ενεργοποιείται η PAK, η οποία αυξάνει τα επίπεδα της πολυμερισμένης ακτίνης. Επιπλέον, η ενεργοποίηση της RhoA (GTPάσης) ρυθμίζει τη συναρμολόγηση και τη συστολή των ινιδίων ακτομυοσίνης, που παίζει ρόλο στην κατεύθυνση της μετανάστευσης. Η διαδικασία περιλαμβάνει αύξηση της φωσφορυλίωσης της ελαφριάς αλυσίδας της μυοσίνης (Guo and Giancotti, 2004), η οποία μπορεί να επιτευχθεί και μέσω ενεργοποίησης των ERK (Klemke et al, 1997). Μια από τις πιο μελετημένες ιντεγκρίνες που υπερεκφράζονται κατά την αγγειογένεση και παίζουν βασικό ρόλο στη ρύθμισή της, είναι η α ν β 3. Εκφράζεται σε διαφορετικά είδη κυττάρων κατά την εμβρυογένεση, αλλά η έκφρασή της περιορίζεται σε αγγειογενετικά ενδοθηλιακά, λεία μυϊκά και μερικούς πληθυσμούς αιματοποιητικών κυττάρων στον ενήλικα. Ρύθμιση της έκφρασής της πραγματοποιείται από μεταγραφικούς παράγοντες όπως ο Hox D3 (Boudreau et al, 1997) και ο Snail (Haraguchi et al, 2008). Προκειμένου να διακριβωθεί ο ρόλος της α ν β 3, έχουν γίνει πειράματα σε ζωϊκά μοντέλα, με αναστολή της έκφρασής της ή της λειτουργικότητάς της α ν β 3 με χρήση διαφόρων αναστολέων, τα οποία έχουν οδηγήσει σε αντιφατικά συμπεράσματα. Από τη μια πλευρά, αναστολή της δράσης της με μικρά μόρια ή αντισώματα αναστέλλει τη νεοαγγειογένεση (MacDonald et al, 2001; Nemeth et al, 2003). Από την άλλη, αποσιώπηση του γονιδίου της β 3 οδήγησε σε αυξημένη καρκινογένεση και αγγειογένεση (Taverna et al, 2004), αυξημένη επούλωση πληγών (Reynolds et al, 2005), και αυξημένη φλεγμονή και αθηροσκλήρωση (Weng et al, 2003), γεγονός που σημαίνει ότι η α ν β 3 φυσιολογικά καταστέλλει αυτές τις διαδικασίες. Πιο αναλυτικά, επαγωγή της έκφρασης της α ν β 3 σε αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα που πολλαπλασιάζονται, οδήγησε αρχικά στην υπόθεση ότι εμπλέκεται στην παθολογική αγγειογένεση (Brooks et al, 1994; Drake et al, 1995). Βάση των αρχικών αυτών παρατηρήσεων, αναπτύχθηκαν αντισώματα και μικρομοριακοί αναστολείς, που ανέστειλαν την προσκόλληση ενδοθηλιακών κυττάρων στην ινονεκτίνη και τη νεοαγγειογένεση σε μια ποικιλία in vivo μοντέλων, συμπεριλαμβανομένης της αγγειογένεσης σε όγκους και της επαγόμενης από υποξία αγγειογένεσης του αμφιβληστροειδούς (Brooks et al, 1994; Gutheil et al, 2000; Nabors et al, 2007). 40

57 Εισαγωγή Παρόλα αυτά, αναστολή της έκφρασης της υπομονάδας α ν δεν επηρεάζει την αγγειογένεση κατά την ανάπτυξη (Bader et al, 1998). Επιπλέον, επίμυες που δεν εκφράζουν την υπομονάδα β 3 εμφανίζουν φυσιολογικό αγγειακό δίκτυο, χωρίς μεγάλες επιπτώσεις στην αγγειογένεση κατά την ανάπτυξη (Huang et al, 2000; Reynolds et al, 2002). Από την άλλη πλευρά, δεδομένα δείχνουν την επαγωγή παθολογικής αγγειογένεσης σε επίμυες που δεν εκφράζουν την υπομονάδα β 3 (Reynolds et al, 2002; Taverna et al, 2005), υποδηλώνοντας ότι η συμμετοχή της β 3 στη ρύθμιση της αγγειογένεσης είναι αναγκαία. Μεγάλη σημασία για τη διερεύνηση του ρόλου της β 3 είχαν πειράματα σε επίμυες με μεταλλαγμένη β 3, στην οποία οι τυροσίνες 747 και 759 (αντίστοιχες των 773 και 785 στον άνθρωπο) αντικαταστάθηκαν από φαινυλαλανίνες. Οι επιμυες αυτοί, αν και ήταν βιώσιμοι και γόνιμοι, παρουσίασαν μειωμένη ανάπτυξη όγκων και παθολογική αγγειογένεση. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η φωσφορυλίωση στις τυροσίνες 747 και 759 της ιντεγκρίνης β 3 συμμετέχει στην επαγωγή της παθολογικής αγγειογένεσης (Mahabeleshwar et al, 2006). Συνολικά, φαίνεται ότι η ιντεγκρίνη α ν β 3 μπορεί να έχει θετικό ή αρνητικό ρόλο κατά την αγγειογένεση, δράση που μπορεί να καθορίζεται ανάλογα με τους προσδέτες της και το μικροπεριβάλλον (Hodivala-Dilke, 2008). Η ιντεγκρίνη α ν β 3 δεσμεύεται σε μια πληθώρα παραγόντων που θεωρούνται ότι επάγουν την αγγειογένεση, συμπεριλαμβανομένων των VEGFR-2, βιτρονεκτίνης, ινονεκτίνης, θρομβίνης και PTN, ενώ δεσμεύει και αρκετούς παράγοντες με αντιαγγειογενετική δράση, όπως τη θρομβοσπονδίνη, την αγγειοστατίνη και την τουμστατίνη (Hodivala-Dilke et al, 2003; Mikelis et al, 2009). Μια άλλη εξήγηση μπορεί να δοθεί αν ληφθεί υπόψιν ότι η έκφραση και η λειτουργικότητα μιας ιντεγκρίνης μπορεί να επηρεάσει την έκφραση και τη λειτουργικότητα άλλων ιντεγκρινών, ρυθμίζοντας έτσι την κυτταρική συμπεριφορά (Diaz-Gonzalez et al, 1996). Έχει βρεθεί ότι ενεργοποίηση της υπομονάδας β 1 των ιντεγκρινών α 3 β 1 και α 6 β 1, αναστέλλει τη λειτουργικότητα της α ν β 3 στην προσκόλληση των κυττάρων (Gonzalez et al, 2008). Μια ακόμα εξήγηση που μπορεί να δοθεί σχετικά με τις «αντιφατικές» δράσεις της α ν β 3 είναι ότι στην περίπτωση που αναστέλλεται η έκφρασή της, κάποιες άλλες πρωτεΐνες δρουν, αναπληρώνοντας μερικώς τη δράση της. Αν και σε ενδοθηλιακά κύτταρα που είχε ανασταλλεί η έκφραση της β 3 δε φάνηκε άλλες ιντεγκρίνες να συνεισφέρουν στην προσκόλληση ή στη μετανάστευση αυτών των κυττάρων, εντούτοις η αυξημένη παθολογική 41

58 Εισαγωγή αγγειογένεση σε επίμυες που δεν εκφράζουν τη β 3 μπορεί να εξηγηθεί από την αύξηση της έκφρασης και της λειτουργίας του VEGFR-2 (Robinson et al, 2004; Weis et al, 2007). Μολονότι οι ιντεγκρίνες δε θεωρούνται ογκογόνα μόρια, αυξημένη έκφρασή τους συνδέεται συχνά με την ανάπτυξη όγκων και μεταστάσεων. Ορισμένες ιντεγκρίνες εκφράζονται σε χαμηλά επίπεδα σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα, αλλά εμφανίζουν υψηλά επίπεδα έκφρασης σε ορισμένους όγκους. Για παράδειγμα, η έκφραση της α ν β 3 συνδέεται με την εξέλιξη της νόσου ή/και μεταστάσεις σε μελανώματα, πλοιόμορφα γλοιοβλαστώματα και καρκίνο του προστάτη, του μαστού, του παγκρέατος, των ωοθηκών και του τραχήλου της μήτρας (Weis and Cheresh, 2011). Ακόμα, πολλά στοιχεία υποστηρίζουν ότι οι ιντεγκρίνες αλληλεπιδρούν με υποδοχείς αυξητικών παραγόντων ή επηρεάζουν μονοπάτια μεταγωγής σήματος αυξητικών παραγόντων (Streuli and Akhtar, 2009). Για παράδειγμα, η α ν β 3 αλληλεπιδρά με τον PDGF και με τον VEGFR-2, ρυθμίζοντας τη δραστικότητά τους (Borges et al, 2000; Somanath et al, 2009), οι α 4 β 1 και α 6 β 1 με τη MK και με τη σχετιζόμενη με τον υποδοχέα των λιποπρωτεϊνών χαμηλής πυκνότητας πρωτεΐνη (low density lipoprotein receptor related protein, LRP) (Muramatsu et al, 2004), οι α 9 β 1, α 3 β 1 και α ν β 3 με ισομορφές του VEGF (Hutchings et al, 2003; Rahman et al, 2005) και η α 5 β 1 με τον υποδοχέα Tie-2 της αγγειοποιητίνης (Cascone et al, 2005). Παρόλα αυτά, λίγα είναι γνωστά για το πώς η σηματοδότηση που ξεκινάει από υποδοχείς αυξητικών παραγόντων ή από ιντεγκρίνες διαπλέκεται και ολοκληρώνεται μέσα στο κύτταρο ενεργοποιώντας συγκεκριμένες λειτουργίες. Στα σημεία εστιακής προσκόλλησης, έχει διαπιστωθεί εξαρτώμενη από κλαθρίνη ενδοκυττάρωση ιντεγκρινών και ανακύκλωσή τους στην πλασματική μεμβράνη, γεγονός που συμβάλλει στη στρατολόγηση των ιντεγκρινών στα σημεία εστιακής προσκόλλησης και στην κυτταροκίνηση (Ezratty et al, 2009). Η παραπάνω διαδικασία εξαρτάται από την οικογένεια των Rab GTPασών και εμπλέκεται στην ενδοκυττάρωση υποδοχέων αυξητικών παραγόντων, όπως του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (epidermal growth factor receptor, EGFR) (Caswell et al, 2008) ή του VEGFR-2 (Reynolds et al, 2009). Αναφέρεται πως μέσω ταχείας ενδοκυττάρωσης των υποδοχέων EGFR και VEGFR-2, αναστέλλεται η αποικοδόμηση των τελευταίων και ενισχύεται η σηματοδότηση από τους αντίστοιχους προσδέτες. Η κινάση που έρχεται σε επαφή με ιντεγκρίνες ILK (integrin-linked kinase) συμβάλλει στην 42

59 Εισαγωγή επικοινωνία μονοπατιών σηματοδότησης που επάγονται από την ινσουλίνη και την ινονεκτίνη. Η FAK ενώνει τη σηματοδότηση που προέρχεται από τις ιντεγκρίνες, τους υποδοχείς του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (epidermal growth factor, EGF) και του PDGF (Sieg et al, 2000). Ακόμα, αποτελεί σημείο σύγκλισης ανάμεσα στον VEGFR-2 και την α ν β 3, ρυθμίζοντας τη συγκρότηση των εστιών προσκόλλησης που είναι απαραίτητες για τον πολυμερισμό της ακτίνης και τη μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων. Πρόσφατα βρέθηκε ότι η ενεργοπoίηση του VEGFR-2 επάγει τη φωσφορυλίωση της FAK στη Ser732, γεγονός που οδηγεί σε αλλαγή της στερεοδιαμόρφωσής της, καθιστώντας προσβάσιμη την Tyr407 για φωσφορυλίωση από την Pyk2, που με τη σειρά της ενεργοποιείται από τη β 3 υπομονάδα (Le Boeuf et al, 2006). Ακόμα, φαίνεται ότι η c-src μπορεί να ρυθμίζει μονοπάτια μεταγωγής σήματος αυξητικών παραγόντων και μορίων εξωκυττάριας ύλης, επιστρατεύοντας την α 5 β 1 σε πρωτεϊνικά σύμπλοκα με τη FAK (Eliceiri et al, 2002). Επιπλέον όπως αναφέρεται και παραπάνω, από αποτελέσματα της ερευνητικής μας ομάδας έγινε γνωστό πως λαμβάνει χώρα συνεργατική αλληλεπίδραση της α ν β 3 ιντεγκρίνης με τον RPTPβ/ζ υποδοχέα στην κυτταρική μεμβράνη, η οποία είναι υπεύθυνη για την επαγόμενη από PTN μεταναστευτική ικανότητα ενδοθηλιακών και καρκινικών κυττάρων (Mikelis et al, 2009) Άλλα μόρια Η PTN αλληλεπιδρά πέρα από τον εαυτό της (διμερισμός) και με άλλους αυξητικούς παράγοντες. Πιο συγκεκριμένα, δεσμεύεται άμεσα με τον VEGF 165 (Κ D =1.38 nm) (Heroult et al, 2004) και αναστέλλει τη βιολογική του δράση (Heroult et al, 2004; Parthymou et al, 2008). Για την αλληλεπίδραση αυτή, σημαντικό ρόλο φαίνεται να παίζουν οι περιοχές TSR1 της PTN (Heroult et al, 2004). Η PTN αλληλεπιδρά με το Υ-Ρ30, ένα πολυπεπτίδιο που παράγεται από τα μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος του ανοσοποιητικού συστήματος της μητέρας κατά την εγκυμοσύνη και αποτελεί μηχανισμό επικοινωνίας του νευρικού με το ανοσοποιητικό σύστημα. Προτάθηκε πως αυτή η αλληλεπίδραση είναι σημαντική για την επαγωγή των νευριτών από το πεπτίδιο Υ-Ρ30 κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου (Landgraf et al, 2008). 43

60 Εισαγωγή Μια αλληλεπίδραση στην οποία δεν έχει αποδοθεί κάποιος λειτουργικός ρόλος μέχρι σήμερα, είναι η αλληλεπίδραση της ΡΤΝ με το παθογόνο βακτήριο Haemophilus influenza (Virkola et al, 2000). Στη βιβλιογραφία προτείνεται επίσης ο πιθανός ρόλος της νουκλεολίνης ως υποδοχέας χαμηλής συγγένειας της PTN (Take et al, 1994; Said et al, 2005). Η αλληλεπίδραση της PTN με τη NCL (K D = μμ) (Said et al, 2005) αναστέλλεται έντονα από την παρουσία ηπαρίνης, αν και δεν έχει αποσαφηνιστεί όπως και στην περίπτωση της MK, κατά πόσον η αναστολή που προκαλείται οφείλεται στην πρόσδεση της ηπαρίνης με την ΡΤΝ ή τη NCL (Take et al, 1994). 4. Νουκλεολίνη (nucleolin, NCL) 4.1. Εισαγωγικά Η νουκλεολίνη (nucleolin, NCL) είναι μια άφθονη πυρηνική πρωτεΐνη εκθετικά αυξανόμενων κυττάρων, που εντοπίζεται κυρίως στις ινώδεις και κοκκιώδεις περιοχές των πυρηνίσκων (Lischwe et al, 1981; Bugler et al, 1982; Biggiogera et al, 1990; Shaw and Jordan, 1995). Αποτελεί ιδιαίτερα σημαντική πρωτεΐνη του ευκαρυωτικού κυττάρου καθώς ρυθμίζει διάφορες πτυχές του μεταβολισμού του DNA και του RNA, τη δομή της χρωματίνης, τη μεταγραφή του rdna, την ωρίμανση του rrna, την κυτταροκίνηση, τον πολλαπλασιασμό και την ανάπτυξη κυττάρων, την απόπτωση, καθώς και τη συναρμολόγηση, αναδίπλωση και ωρίμανση των ριβοσωμάτων (Tuteja and Tuteja, 1998; Srivastava and Pollard, 1999; Mongelard and Bouvet, 2007). Αρχικά, ταυτοποιήθηκε σε CHO και κύτταρα ήπατος (Orrick et al, 1973; Bugler et al, 1982) και ονομάστηκε πρωτεΐνη C23 (Orrick et al,1973). Χαρακτηρίζεται ως πολυλειτουργική φωσφοπρωτεΐνη, η οποία είναι υψηλά συντηρημένη κατά την εξέλιξη (Srivastava and Pollard, 1999) και αντιπροσωπεύει το 5% του συνόλου των πρωτεϊνών του πυρηνίσκου ενεργά διαιρούμενων ευκαρυωτικών κυττάρων (Lapeyre et al, 1987). Υπάρχουν ενδείξεις ότι οι πολλαπλές δραστηριότητες της NCL μπορεί να ρυθμίζονται μέσω ομοιοπολικών τροποποιήσεων, όπως φωσφορυλίωσης, πρωτεόλυσης, αυτοαποικοδόμησης και ADP-ριβοζυλίωσης (Srivastava and Pollard, 1999). Επιπλέον, η NCL παίζει το ρόλο της πρωτεΐνης μεταφορέα άλλων πρωτεϊνών 44

61 Εισαγωγή μεταξύ πυρήνα/κυτταροπλάσματος. Στο κυτταρόπλασμα παρέχει μεταμεταγραφική ρύθμιση στρατηγικών mrnas. Πιο πρόσφατα δεδομένα δείχνουν το ρόλο της ως προσδέτη διαφόρων παραγόντων στην κυτταρική μεμβράνη, όπως ιϊκών σωματίων και συστατικών του εξωκυττάριου χώρου με κρίσιμο ρόλο στην αγγειογένεση και στην καρκινογένεση. Αυξημένη έκφρασή της έχει ταυτοποιηθεί σε πολλούς τύπους καρκινικών κυττάρων, μεταξύ των οποίων λευχαιμικών (Mi et al, 2003; Krust et al, 2011a), νεφρικών (Krust et al, 2001), πνευμονικών (Joo et al, 2005; Shi et al, 2007), προστατικών κυττάρων (Tate et al, 2006; Hamma-Kourbali et al, 2011; Krust et al, 2011a), του γαστρεντερικού σωλήνα (Turck et al, 2006) καθώς και σε καρκινικά κύτταρα μελανώματος (Shi et al, 2007; Hoja-Lukowicz et al, 2009; El Khoury et al, 2010; Krust et al, 2011a; Destouches et al, 2012), μαστού (Christian et al, 2003; Legrand et al, 2004; Shi et al, 2007; Destouches et al, 2008; Krust et al, 2011a), καρκίνου της μήτρας (Jordan et al, 1994; Shi et al, 2007; Krust et al, 2011a), καρκίνου του κόλον (Reyes-Reyes and Akiyama, 2008; Shi et al, 2007), ηπατοκαρκινώματος (Semenkovich et al, 1990; Deng et al, 1996; Meng et al, 2011) και γλοιοβλαστώματος (Galzio et al, 2012). Στρατηγικές στόχευσης της μεμβρανικής NCL αναπτύσσονται και επιβεβαιώνουν το ρυθμιστικό της ρόλο σε διάφορα σηματοδοτικά μονοπάτια (Nisole et al, 2002a; Destouches et al, 2008; Bates et al, 2009; El Khoury et al, 2010; Krust et al, 2011b). Παρόλα αυτά, λίγες πληροφορίες υπάρχουν σε σχέση με τη φυσιολογική λειτουργία της NCL στην κυτταρική μεμβράνη και με τους μηχανισμούς που ευθύνονται για την ανακατανομή της εντός του κυττάρου Σχέση δομής-δράσης της NCL Το γονίδιο της NCL στον άνθρωπο είναι παρόν σε ένα αντίγραφο ανά απλοειδές γονιδίωμα και αποτελείται από 14 εξόνια και 13 εσόνια επί του χρωμοσώματος 2q12-qter (Srivastava et al, 1990). Ένα ενδιαφέρον γνώρισμα του γονιδίου της NCL είναι ότι δύο μικρά πυρηνικά RNAs (small nucleolar RNAs, snornas), τα U20 και U23 (που ευθύνονται για νουκλεοτιδικές μετατροπές όπως το σχηματισμό ψευδοουριδίνης και τη μεθυλίωση σε ριβόζη) κωδικοποιούνται από τα ιντρόνια 11 και 12, αντιστοίχως (Nicoloso et al, 1994). Ανάλυση της αλληλουχίας των

62 Εισαγωγή αμινοξέων της NCL, αποκάλυψε την παρουσία τριών διαφορετικών δομικών τμημάτων (Εικόνα Ε4) (Lapeyre et al, 1987; Srivastava et al, 1989). Το αμινοτελικό τμήμα αποτελείται από εξαιρετικά όξινες περιοχές (Lischwe et al, 1982), πολλαπλές θέσεις φωσφορυλίωσης και πολλά TPXKK μοτίβα (Belenguer et al, 1990; Peter et al, 1990) που εμπλέκονται σε αλληλεπιδράσεις με την ιστόνη 1 και τη χρωματίνη (Erard et al, 1988). Η κεντρική περιοχή περιέχει RNAδεσμευτικές περιοχές (RNA binding domains, RBDs). Η NCL των θηλαστικών διαθέτει τέσσερις RBDs (Bugler et al, 1987), ενώ η NCL στη ζύμη και τα φυτά κατέχει μόνο δύο (Tajrishi et al, 2011). Η καρβοξυτελική περιοχή ονομάζεται τομέας GAR ή RGG, είναι πλούσιος σε επαναλήψεις Arg-Gly-Gly, διανθίζεται με πολλά αρωματικά αμινοξέα, όπως φαινυλαλανίνη (Lapeyre et al, 1986), και φαίνεται να εμπλέκεται σε αλληλεπιδράσεις με νουκλεϊκά οξέα (Bandziulis et al, 1989), ριβοσωματικές (Bouvet et al, 1998) και άλλες πρωτεΐνες. H χρήση διαφόρων δομών στις οποίες έχει γίνει απαλοιφή συγκεκριμένων περιοχών της NCL, αποκάλυψε πως το μοτίβο RGG είναι υπεύθυνο για δέσμευση του upa και του υποδοχέα του, της MK και της λακτοφερίνης (Dumler et al, 1999; Said et al, 2002; Legrand et al, 2004; Stepanova et al, 2008). Αυτός ο τομέας περιέχει και υψηλά επίπεδα διμεθυλοαργινινών (Lischwe et al, 1985). Λόγω του υψηλού σε περιεχόμενο αρνητικού φορτίου στο αμινοτελικό άκρο της, η NCL έχει φαινόμενη μοριακή μάζα 105 kda σε ανάλυση SDS-PAGE, μολονότι η πραγματική υπολογισμένη μάζα από την αλληλουχία cdna της είναι 77 kda (Lapeyre et al, 1987; Srivastava et al, 1989). Τα τέσσερα όξινα τμήματα του αμινοτελικού άκρου της NCL κείνται στα εξόνια 2 έως 4 και το σήμα πυρηνικού εντοπισμού (nuclear localization signal, NLS) στο εξόνιο 5. Καθεμία από τις RNA-δεσμευτικές περιοχές κωδικοποιείται από δύο ανεξάρτητα και διαδοχικά εξόνια (Bourbon and Amalric, 1990). Αρκετές πυρηνικές πρωτεΐνες εμφανίζουν μια παρόμοια τριμερή δομική οργάνωση. Αυτό δε σημαίνει ότι είναι όλες ορθόλογα της NCL στα διάφορα είδη (ζύμη, φυτά και θηλαστικά), ωστόσο πολλές από αυτές φαίνεται να εμπλέκονται σε παρόμοιες κυτταρικές λειτουργίες (Ginisty et al, 1999). Ακόμα, πρόσφατα αναφέρθηκε ότι η NCL υφίσταται Ν- και O-γλυκοζυλίωση (Carpentier et al, 2005). Γενικώς, η συμμετοχή της NCL σε διαδικασίες όπως η rdna μεταγραφή, η επεξεργασία του rrna, η συναρμολόγηση του ριβοσώματος και η ωρίμανση αυτού, διαμεσολαβείται από την αλληλεπίδραση της NCL με UTRs, rdna, το 45S rrna, την RNA πολυμεράση 1, τα rrnas 18S και 28S, καθώς και πολλές 46

63 Εισαγωγή ριβοσωματικές πρωτεΐνες (Srivastava and Pollard, 1999). Σημαντική παρατήρηση αποτελεί πως απαλοιφή του γονιδίου της NCL ή τμημάτων αυτής (αμινοτελικό άκρο ή RBDs 1-4 ή GAR) οδηγεί σε καταστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού λεμφοκυττάρων DT40, που ουσιαστικά διαμεσολαβείται από τη συμμετοχή της στην παραγωγή του rrna (Storck et al, 2009). Οι όξινες περιοχές του αμινοτελικού άκρου, οι οποίες είναι μεταβλητές και λιγότερο συντηρημένες στα διαφορετικά είδη, συνδέονται με UTRs στο DNA και την ιστόνη H1 (Ghisolfi-Nieto et al, 1996; Cong et al, 2012). Η σύνδεση αυτή συμβάλλει στην οργάνωση της πυρηνικής χρωματίνης, κατά τρόπο που προσδίδει εξειδίκευση για τη μεταγραφή του rdna από την RNA πολυμεράση 1 (Bouche et al, 1984; Angelov et al, 2006). Μελέτες μείωσης της έκφρασης της NCL in vivo, έδειξαν τη σημαντικότητα της τελευταίας στη λειτουργία της RNA πολυμεράσης ως προς τη μεταγραφή της πυρηνικής χρωματίνης (Rickards et al, 2007). Το αμινοτελικό άκρο της NCL περιέχει επίσης θέσεις φωσφορυλίωσης για την κινάση καζεΐνης II (casein kinase II, CKII), την εξαρτώμενη από τον κυτταρικό κύκλο κινάση 2 (Cyclin-dependent kinase 2, cdc2), γνωστή επίσης ως CDK1 στους ανθρώπους, και την πρωτεΐνική κινάση PKC, οι οποίες εναλλάσονται με βασικά κατάλοιπα λυσίνης, ευπαθή σε πρωτεόλυση (Belenguer et al, 1990; Peter et al, 1990). Η λειτουργική σημασία αυτών των θέσεων έγκειται στο γεγονός ότι η μεταγραφή rdna γονιδίων ξεκινάει μόνο όταν φωσφορυλιώνονται τα ανάλογα κατάλοιπα σερίνης από την CKII και παράλληλα η NCL υφίσταται πρωτόλυση (Bouche et al, 1984). Η φωσφορυλίωση της NCL φαίνεται να ενισχύει την αποικοδόμησή της από πρωτεϊνάσες, υποδηλώνοντας ότι η σταθερότητά της εξαρτάται από τη φωσφορυλίωσή της (Warrener and Petryshyn, 1991). Επιπλέον, στο αμινοτελικό άκρο της NCL εδράζεται το NLS μοτίβο (Xue et al, 1993) μεταξύ της λυσίνης 279 και της βαλίνης 298, το οποίο μοιάζει με εκείνο του Simian virus- 40 καρκινικού αντιγόνου. Αν και χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση για να καθοριστούν τα ακριβή όρια και ο ρόλος των μεμονωμένων αμινοξέων στον πυρηνικό εντοπισμό της NCL, στοιχεία δείχνουν ότι δύο διακριτές βασικές αλληλουχίες απαιτούνται, όπως και στην περίπτωση της νουκλεοπλασμίνης (Robbins et al, 1991). Τέτοιες αλληλουχίες αποτελούνται από δύο αλληλένδετες ομάδες βασικών αμινοξέων, οι οποίες χωρίζονται από 11 αμινοξικά κατάλοιπα. Γεγονός αποτελεί πως αμφότερα τα βασικά τμήματα είναι απαραίτητα για την πυρηνική στόχευση της NCL (Creancier et al, 1993). 47

64 Εισαγωγή H κεντρική περιοχή της NCL περιέχει εναλλασσόμενες υδρόφοβες και υδρόφιλες περιοχές και τέσσερεις RBDs (Bugler et al, 1987; Ghisolfi et al, 1992a) που αποτελούνται από 80 αμινοξέα η καθεμία, με δύο εξαιρετικά συντηρημένες περιοχές, τα αποκαλούμενα μοτίβα RNP (Query et al, 1989). Η NCL αλληλεπιδρά ειδικά με μια δομή βρόχου σε RNAs που περιέχουν την αλληλουχία UCCCGA, μέσω των δύο πρώτων RBDs (Ghisolfi-Nieto et al, 1996; Bouvet et al, 1997). Έχει δειχθεί ότι οι δύο RBDs δεσμεύονται στις αντίθετες πλευρές του RNA βρόχου, σχηματίζοντας ένα μοριακό σφιγκτήρα που φέρνει τα 5' και 3' άκρα της στενής αλληλουχίας αναγνώρισης σε στενή γειτνίαση, σταθεροποιώντας έτσι το βρόγχο. Σε αυτό το πλαίσιο, η αλληλεπίδραση της NCL με το RNA υποδηλώνει ότι η τελευταία μπορεί να ενεργεί ως μια πρωτεΐνη chaperone που παρεμποδίζει την κακή αναδίπλωσή rrnas εν τη γενέσει (Allain et al, 2000). Το τμήμα της NCL που περιέχει το κεντρικό και καρβοξυτελικό άκρο της NCL (εξόνιο 5-14) συνδέεται ισχυρά με πλούσιο σε γουανίνη DNA και ΑΤΡ. Η πρόσδεση σε ΑΤΡ είναι σημαντική για τη δραστικότητα ΑΤΡάσης της NCL. Περαιτέρω, αυτή η περιοχή δεσμεύει άμεσα GTP, datp και dgtp αλλά όχι dctp, dττρ, ή dutp (Miranda et al, 1995). Επιπλέον, το ανάλογο αδενοσίνης DRB, ένας αναστολέας σύνθεσης ετερογενούς πυρηνικού RNA (heterogeneous nuclear RNA, hnrna), τροποποιεί τη σταθερότητα και την ποσότητα της NCL, με αποτέλεσμα την αλλαγή της μορφολογίας των πυρηνίσκων (Noaillac-Depeyre et al, 1989). Η πληροφορία αυτή υποστηρίζει το ρόλο της NCL ως βασικού παράγοντα διατήρησης της δομής και λειτουργίας των πυρηνίσκων. Η εκτεταμένη καρβοξυτελική περιοχή της NCL είναι πλούσια σε κατάλοιπα γλυκίνης, με διεσπαρμένα κατάλοιπα διμεθυλοαργινίνης και φαινυλαλανίνης, και ελέγχει το ξεδίπλωμα των βάσεων και της δευτερεύουσας δομής του RNA (Ghisolfi et al, 1992b; Heine et al, 1993). Έτσι, είναι δυνατή η πρόσβαση των RNAs στα RNA-δεσμευτικά μοτίβα της κεντρικής περιοχής της NCL (Ghisolfi et al, 1992a). Η εγγενής δραστικότητα πρωτεϊνάσης της NCL για αυτοαποικοδόμηση έχει χαρτογραφηθεί σε αυτήν την περιοχή του μορίου (Fang and Yeh, 1993). Ακόμα, αλληλεπίδραση μεταξύ της RBD 4 και του καρβοξυτελικού άκρου της NCL με την τελομεράση, οδηγεί στην πυρηνική στόχευση της τελευταίας (Khurts et al, 2004). Παρόλο που δεν υπάρχει συναινετική αλληλουχία σήματος για στόχευση της NCL στους πυρηνίσκους, προτείνεται ότι η τοπική συσσώρευση προκύπτει από την ειδική πρόσδεση της NCL σε άλλα στοιχεία, όπως rrna και δομικά 48

65 Εισαγωγή συστατικά των πυρηνίσκων. Η πρόσδεση αυτή λαμβάνει χώρα μέσω της συνεργατικής δράσης των RNA δεσμευτικών περιοχών του κεντρικού τμήματος της ΝCL με τις πλούσιες σε γλυκίνη περιοχές του καρβοξυτελικού της άκρου. Η ύπαρξη και των τεσσάρων RBDs ή μίας RBD μαζί με την περιοχή GAR, αποτελούν επαρκή συνθήκη για τον εντοπισμό της NCL στους πυρηνίσκους. Θεωρείται πως το αμινοτελικό άκρο είτε δε σχετίζεται, είτε παίζει δευτερεύοντα ρόλο στη συσσώρευση της NCL στους πυρηνίσκους (Creancier et al, 1993; Schmidt-Zachmann et al, 1993). Η NCL αλληλεπιδρά με 18 ριβοσωματικές πρωτεΐνες του επίμυ, 14 της μεγάλης και 4 της μικρής ριβοσωματικής υπομονάδας, που ανήκουν στον «σκληρό» πυρήνα του ριβοσώματος (Bouvet et al, 1998; Roger et al, 2003). Αύξηση της συγκέντρωσης της NCL οδηγεί σε λανθασμένο πακετάρισμα της πρόδρομης ριβοσωματικής υπομονάδας 40S. Η ποιότητα του πακεταρίσματος, που γίνεται με τη βοήθεια της NCL, καθορίζει το κατά πόσον το πρόδρομο 40S θα ωριμάσει ή θα αποικοδομηθεί (Roger et al, 2003). Εικόνα Ε4: Σχηματική απεικόνιση της δομής της ανθρώπινης NCL. Διακρίνονται τέσσερις όξινες περιοχές (Α1-4), το NLS, τέσσερις RNA δεσμευτικές περιοχές (RBDs 1-4) και η RGG περιοχή που περιμβάνει 9 επαναλήψεις Arg-Gly-Gly. Το αμινοτελικό άκρο της NCL αντιστοιχεί στα αμινοξέα 1-275, ενώ η κεντρική σφαιροειδής περιοχή και το καρβοξυτελικό της άκρο αντιστοιχούν στα αμινοξέα Σταθερότητα και ρύθμιση της NCL Η NCL είναι πιο σταθερή σε ενεργά διαιρούμενα κύτταρα σε σχέση με κύτταρα σε ηρεμία, όπου αυτοκαταλύει την αποικοδόμησή της. Η διαδικασία αυτοαποικοδόμησης μπορεί να ανασταλεί με επίδραση πυρηνικών εκχυλισμάτων πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων, λόγω πιθανής έκφρασης ενός αναστολέα της πρωτεολυτικής δράσης της NCL. Τα παραπάνω δείχνουν ότι η σταθερότητα του μορίου εξαρτάται από τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Το γεγονός ότι ο 49

66 Εισαγωγή κατακερματισμός της NCL συνήθως παρατηρείται κατά τη διαδικασία εκχύλισης με απορρυπαντικά, οδήγησε στην υπόθεση ότι η πέψη πιθανώς δεν οφείλεται σε άλλες κυτταρικές πρωτεϊνάσες, αλλά στον εαυτό της (Chen et al, 1991). Ακόμα, ο Tawfic και οι συνεργάτες του (1994) παρατήρησαν πως η φωσφορυλίωση και η αποικοδόμηση της NCL συμβαδίζουν, γεγονός που υποδηλώνει ότι η σταθερότητά της εξαρτάται από τα επίπεδα φωσφορυλίωσής της. Επιπλέον, η ικανότητα πρόσδεσης της NCL σε DNA και ΑΤΡ αυξάνεται μετά από μιτογόνο διέγερση σπληνοκυττάρων επίμυ με βακτηριακό λιποπολυσακχαρίτη, λόγω αυξημένης σταθερότητας του μορίου (Miranda et al, 1995). Αποτελέσματα δείχνουν ότι η σταθερότητα της NCL διατηρείται μέσω φωσφορυλίωσής της σε κατάλοιπα θρεονίνης από την CDK1 κατά τη διάρκεια της μίτωσης με HSP90- εξαρτώμενο τρόπο (Wang et al, 2011a). Έχει προταθεί ένα μοντέλο αυτoρρύθμισης της NCL, το οποίο ελέγχει τη μετάφρασή της με τρόπο κατά τον οποίο, σε καταστάσεις αφθονίας της πρωτεΐνης, η μετάφρασή της αναστέλλεται μέσω άμεσης πρόσδεσης της πρωτεΐνης στο δικό της mrna (Kim and Srivastava, 2003). Αντίθετα, διατυπώθηκε η υπόθεση πως η μετάφραση του mrna της NCL απαιτεί την πρόσδεση της πρωτεΐνης σε αυτό. Το μοντέλο αυτό θα μπορούσε να εξηγήσει το γεγονός πως ο αναστολέας της μεμβρανικής NCL, HB-19, οδηγεί σε αύξηση του mrna της που όμως δεν μπορεί να μεταφραστεί, λόγω παράλληλης μείωσης των πρωτεϊνικών επιπέδων της κυτταροπλασματικής NCL (Hovanessian et al, 2010). Πιο πρόσφατα προτάθηκε πως τα πρωτεϊνικά επίπεδα της NCL ελέγχονται μεταμεταγραφικά, μέσω παραγόντων που συνδέονται σε UTRs του μορίου. Η RNA-δεσμευτική πρωτεΐνη HuR βρέθηκε να αλληλεπιδρά με τη NCL στην 3'UTR και χωρίς να επηρεάζει τα επίπεδα του mrna της, επάγει τη μετάφρασή της. Παράλληλα, ανταγωνισμός της HuR με το mir-494, οδηγεί σε μείωση της έκφρασης της NCL (Tominaga et al, 2011). Επιπλέον, ενισχυμένη έκφραση του mrna της NCL παρατηρήθηκε ως άμεση κυτταρική απόκριση σε περιβαλλοντολογικές αλλαγές, όπως το θερμό ή το ψυχρό σοκ (Hovanessian et al, 2010). Σχετικά με την έκφραση της πρωτεΐνης, τα μειωμένα επίπεδα mrna της NCL σε κύτταρα όπου έχει γίνει επίδραση ακτινομυκίνης D, συνοδεύονται από σημαντική μείωση της επιφανειακής/κυτταροπλασματικής αλλά όχι της πυρηνικής NCL. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν πως η έκφραση επιφανειακής και 50

67 Εισαγωγή κυτταροπλασματικής NCL εξαρτάται από τη σταθερή επαγωγή του mrna της. Μετάφραση του επαγόμενου mrna είναι αναγκαία για την έκφραση επιφανειακής/κυτταροπλασματικής NCL, δεδομένου ότι επεξεργασία κυττάρων με κυκλοεξιμίδιο προκαλεί μείωση αυτών των μορφών, χωρίς εμφανή επίδραση επί του mrna της NCL. Ακόμα, ο χρόνος ημίσειας ζωής του mrna εκτιμάται ότι είναι περίπου 90 λεπτά, ενώ της πρωτεΐνης λιγότερο από μία ώρα. Από την άλλη πλευρά, καμία εμφανής επίδραση δεν παρατηρείται στα επίπεδα της πυρηνικής NCL υπό επίδραση κυκλοεξιμιδίου για 8 ώρες, όταν υπάρχει σχεδόν πλήρης εξαφάνιση της επιφανειακής/κυτταροπλασματικής NCL (Hovanessian et al, 2010). Τέτοιες παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι η NCL που εδράζεται στο κυτταρόπλασμα και την κυτταρική μεμβράνη αντιπροσωπεύει την πλειοψηφία της νεοσυντιθέμενης πρωτεΐνης ανιχνεύσιμη σε μια δεδομένη στιγμή, το ποσοστό της οποίας σε διάφορους τύπους κυττάρων αντιστοιχεί σε λιγότερο από το 10% της πυρηνικής NCL (Hovanessian et al, 2000; Carpentier et al, 2005) Φωσφορυλίωση της NCL Η NCL είναι εξαιρετικά φωσφορυλιωμένη και η φωσφορυλίωσή της ρυθμίζεται κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου σε κατάλοιπα σερίνης από την CKΙΙ στη μεσόφαση και σε κατάλοιπα θρεονίνης από την CDΚ1 στα μοτίβα TPKK του αμινοτελικού άκρου της κατά τη μίτωση (Schneider and Isiinger, 1988; Peter et al, 1990). Η ενεργή μεταγραφή του rdna συσχετίζεται με την κατάσταση φωσφορυλίωσής της (Caizergues-Ferrer et al, 1987; Belenguer et al, 1990), υποδηλώνοντας ότι η φωσφορυλίωση της NCL είναι συζευγμένη με τον έλεγχο της κυτταρικής ανάπτυξης. Ο κυτταροπλασματικός εντοπισμός της NCL συνάδει με φωσφορυλίωσή της από τις κινάσες CDΚ1 ή CKΙΙ, ενώ η πυρηνική της μετατόπιση συνάδει με αποφωσφορυλίωσή της (Schwab and Dreyer, 1997). Ακόμα υποστηρίζεται πως ενώ η φωσφορυλίωση σε κατάλοιπα σερίνης σχετίζεται με το ρόλο της NCL στην rdna μεταγραφή, η φωσφορυλίωση σε κατάλοιπα θρεονίνης σχετίζεται με την αναδιοργάνωση της πυρηνικής χρωματίνης και κυτταροσκελετικές αλλαγές. Η ινσουλίνη έχει αναφερθεί ότι ρυθμίζει τη φωσφορυλίωση/αποφωσφορυλίωση της NCL μέσω διέγερσης της CKΙΙ, γεγονός που δυνητικά παίζει ρόλο στη ρύθμιση της εκροής RNAs από των πυρήνα 51

68 Εισαγωγή (Csermely et al, 1993). Φωσφορυλίωση από την CKII ενισχύει επίσης την ιδιότητα της NCL ως υπόστρωμα πρωτεϊνάσης, προς παραγωγή δραστικών τμημάτων μεγέθους 30 και 72 kda, τα οποία πιθανώς εμπλέκονται στην rdna μεταγραφή (Warrener and Petryshyn, 1991). Τόσο η δραστηριότητα της CKII, όσο και η φωσφορυλίωση της NCL, ενισχύονται την 12 η ημέρα της κύησης (Schneider et al, 1986), μετά από διέγερση με μιτογόνα (Bachellerie et al, 1995), στην αναγέννηση ήπατος αρουραίου μετά από μερική ηπατεκτομή (Ballal et al, 1975) και στην καρκινογένεση (Schneider et al, 1986). Επιπρόσθετα, η εξαρτώμενη από CKII φωσφορυλίωση της NCL και η σύνθεση του rrna έχουν αναφερθεί να εξαρτώνται από δεξαμεθαζόνη (Suzuki et al, 1987), ανδρογόνα (Tawfic et al, 1994) και αυξητικούς παράγοντες, όπως ο EGF (Suzuki et al, 1992) και ο σχετιζόμενος με ινσουλίνη αυξητικός παράγοντας (insulin-like growth factor, IGF) (Bouche et al, 1994). Από την άλλη πλευρά, η εξαρτώμενη από cαμρ πρωτεϊνική κινάση Α επηρεάζει τη φωσφορυλίωση της NCL κατά τη μετάβαση από την G1 προς τη φάση S του κυτταρικού κύκλου (Hoffmann and Schwoch, 1989). Πιο πρόσφατα αναφέρθηκε ότι η εξαρτώμενη από PKC φωσφορυλίωση της NCL απαιτείται για την επαγόμενη από τον παράγοντα νευρικής ανάπτυξης (neuronal growth factor, NGF) διαφοροποίηση κυττάρων PC12. Έτσι, διατυπώθηκε η άποψη ότι η NCL θα μπορούσε να αποτελεί διαμεσολαβητή σημάτων του NGF από την κυτταρική επιφάνεια προς τον πυρήνα (Zhou et al, 1997). Επίδραση ανθρώπινων ινοβλαστών και κερατινοκυττάρων με καλυκουλίνη Α, οκαδαϊκό οξύ (Suganuma et al, 1990; Guy et al, 1992), πολυαμίνες, ή ιστόνες επάγει υπερφωσφορυλίωση του πρωτεολυτικού τμήματος της NCL μεγέθους 60kDa (Suzuki et al, 1993). Τέλος, φωσφορυλίωση της NCL σε κατάλοιπα τυροσίνης έχει αναφερθεί έπειτα από ενεργοποίηση της γλυκοπρωτεΐνης CR2 (υποδοχέα του ιού Epstein Barr) στη μεμβράνη ανθρώπινων Β κυττάρων λεμφώματος (Barel et al, 2001), και στην περίπτωση συμπλοκοποίησης της NCL με την σελεκτίνη P στη μεμβράνη καρκινικών κυττάρων παχέος εντέρου (Reyes-Reyes and Akiyama, 2008) Γλυκοζυλίωση της NCL Πρόσφατα, η NCL που εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα και στην κυτταρική μεμβράνη χαρακτηρίστηκε ως γλυκοπρωτεΐνη. Γλυκάνες βρέθηκαν να συνδέονται 52

69 Εισαγωγή στη NCL µέσω ατόµων αζώτου (N-σύνδεση) και οξυγόνου (Ο-σύνδεση). Συγκεκριμένα, αναλύσεις απομονωμένων γλυκοπεπτιδίων της NCL έδειξαν ότι δύο λακτοζαμινικές Ν-γλυκάνες εντοπίζονται στις ασπαραγίνες 317 και 492 και η δομή τους ορίζεται ως περίπλοκη, διπλής διακλάδωσης και εκλείπουσα σιαλικών οξέων (complex asialo-biantennary glycans) (Carpentier et al, 2005). Από την άλλη πλευρά, έχει προβλεφθεί με τη χρήση εργαλείων βιοπληροφορικής η ύπαρξη 5 πιθανών θέσεων γλυκοζυλίωσης μέσω Ο-σύνδεσης στις θρεονίνες 84, 92, 105, 106 και 113 (Lapeyre et al, 1987; Carpentier et al, 2005). Αξίζει να αναφερθεί πως σε μια πιο πρόσφατη μελέτη έχει παρατηρηθεί η ύπαρξη Ο- γλυκοζυλιωμένης NCL, τόσο εκτός όσο και εντός του πυρήνα των κυττάρων, με κύριο χαρακτηριστικό την ύπαρξη φουκοζυλομάδων (Aldi et al, 2009) Βιολογικές δράσεις της NCL Παρά το γεγονός ότι η κύρια λειτουργία της NCL είναι η σύνθεση rrna και η βιογένεση ριβοσωμάτων, εμπλέκεται και σε άλλες πτυχές της κυτταρικής βιολογίας, όπως στην απόπτωση, στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και της μεταγραφής, σε ιογενείς λοιμώξεις, αυτοάνοσα νοσήματα και στην παθολογία νευροεκφυλιστικών ασθενειών. Οι πρώτες παρατηρήσεις πως η NCL είναι πρωτεΐνη σχετιζόμενη με την απόπτωση έγιναν σε ανθρώπινο λέμφωμα Burkitt (Brockstedt et al, 1998). Στη συνέχεια βρέθηκε ότι η επαγόμενη από all trans-ρετινοϊκό οξύ απόπτωση συνοδεύεται από μείωση της έκφρασης της NCL, καθώς και της σταθερότητας του mrna της Bcl-2 (Otake et al, 2005). Εξωγενής προσθήκη ανασυνδυασμένης NCL σε εκχυλίσματα φυσιολογικών Β κυττάρων, αύξησε σημαντικά το χρόνο ημιζωής του mrna της Bcl-2 αντιαποπτωτικής πρωτεΐνης (Otake et al, 2007). Φαίνεται πως η NCL αυξάνει την έκφραση της Bcl-2 μέσω πρόσδεσης στην 3'-UTR και σταθεροποίησης του mrna της (Willimott and Wagner, 2010), και το απταμερές AS1411 έναντι της NCL οδηγεί σε αποικοδόμηση του mrna της Βcl-2 (Ishimaru et al, 2010). Ανάλογα, η NCL προστατεύει το mrna της αντιαποπτωτικής πρωτεΐνης Bcl-X(L) (B-Cell Lymphoma-Extra Large) από αποικοδόμηση από νουκλεάσες, ενισχύοντας τη σταθερότητα της ριβονουκλεοπρωτεΐνης (Zhang et al, 2008). Η αγγειογενίνη II επάγει την καταστολή της Bcl-x(L) και την απόπτωση 53

70 Εισαγωγή ενδοθηλιακών κυττάρων πνεύμονα, μέσω καταστολής της πρόσδεσης της NCL στο mrna της Bcl-X(L) (Lee et al, 2010a). Ευρήματα δείχνουν πως επώαση λευχαιμικών κυττάρων U937 με ακτινοβολία UV ή καμπτοθεσίνη, επάγει την απόπτωση με παράλληλη μείωση των πρωτεϊνικών επιπέδων της NCL, τόσο από τον πυρήνα όσο και από την κυτταρική μεμβράνη. Ο συνεντοπισμός της NCL με την πολυμεράση της πολυ-adp ριβόζης (poly(adpribose) polymerase-1, PARP-1) σε αποπτωτικά σωμάτια, υποδηλώνει την πιθανή συμμετοχή της NCL στην απομάκρυνση της PARP-1 από τα κύτταρα (Mi et al, 2003). Επώαση ενδοθηλιακών κυττάρων με αντίσωμα έναντι της NCL οδηγεί σε μείωση των επιπέδων mrna της Bcl-2 και απόπτωση των κυττάρων, όπως αποδεικνύεται από τη διάσπαση της πρωτεΐνης PARP-1 (Fogal et al, 2009). Υπερέκφρασή της NCL ανέστειλε την επαγόμενη από οξειδωτικό στρες απόπτωση ενδοθηλιακών κυττάρων και οδήγησε σε μείωση της έκφρασης του αποπτωτικού γονιδίου Bax, γεγονός που την καθιστά σημαντικό αρνητικό ρυθμιστή της απόπτωσης (Ζhang et al, 2010). Η NCL διαμεσολαβεί τη δράση της HSP70 ως προς την προστασία καρδιομυοκυττάρων σε επαγόμενη από οξειδωτικό στρες απόπτωση, αναδεικνύοντας έναν ουσιαστικό ρόλο της NCL στην αντιαποπτωτική δράση της HSP70 (Jiang et al, 2010). Πρόσφατα αποτελέσματα έδειξαν πως το οξειδωτικό στρες επάγει τον κατακερματισμό των πυρήνων, γεγονός που αναστέλλεται από την HSP70, η οποία συσσωρεύεται στον πυρήνα, όπου αλληλεπιδρά με τη NCL και παρεμποδίζει την αποικοδόμησή της (Wang et al, 2010b; 2012). Λειτουργικός αποκλεισμός της NCL στην κυτταρική μεμβράνη μακροφάγων, παρεμποδίζει την πρόσδεση και φαγοκυττάρωση πρώϊμων αποπτωτικών κυττάρων (Hirano et al, 2005). Πρόσφατα προτάθηκε πως τα μακροφάγα απομακρύνουν κατεστραμμένα λόγω αυξημένης συγκέντρωσης ασβεστίου κύτταρα, μέσω πρόσδεσης της μεμβρανικής NCL σε πολυ-ν-ακετυλλακτοζαμινικές αλυσίδες της γλυκοπρωτεΐνης CD43 των τελευταίων (Miki et al, 2013). Η ποσότητα της NCL είναι χαμηλή σε κύτταρα που καλλιεργούνται άνευ ορού, ενώ η έκφρασή της επάγεται στα μέσα και στα τέλη της φάσης G1, καταδεικνύοντας την αναγκαιότητα της NCL για την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου (Gillet et al, 1993). Καταστολή της έκφρασης της NCL με τεχνολογία RNAi σε 54

71 Εισαγωγή ανθρώπινα κύτταρα προκαλεί αναστολή του κυτταρικού κύκλου και ελαττωματικό διπλασιασμό των κεντροσωμάτων, και φαίνεται να επηρεάζει τη συναρμολόγηση και την ακεραιότητα της μιτωτικής ατράκτου, υποδηλώνοντας το ρόλο της στην κυτταροκίνηση. Συγκεκριμένα, μια από τις πιο αξιοσημείωτες συνέπειες καταστολής της NCL είναι η στασιμότητα των κυττάρων στη φάση G2, η σημαντική αύξηση πολυπύρηνων και κυττάρων με μικροπυρήνες, ενώ ο αριθμός των μιτωτικών κυττάρων μειώνεται δραστικά (Ugrinova et al, 2007; Ma et al, 2007; Xu et al, 2012). Η NCL δημιουργεί σύμπλοκο με την πρωτεΐνη Rad51 σε πυρηνικά εκχυλίσματα σωματικών κυττάρων θηλαστικών, ρυθμίζοντας έτσι τη δραστικότητα επισκευής DNA από την Rad51 (De et al, 2006). Η NCL διαθέτει δραστηριότητα DNA ελικάσης και αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη αναδιπλασιασμού Α (replication protein A, RPA), γεγονός που υποδηλώνει ότι συμμετέχει στο ξεδίπλωμα και στην αντιγραφή του DNA (Tuteja et al, 1995; Kim et al, 2005). Η αλληλεπίδραση της NCL με την ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη ρετινοβλαστώματος (retinoblastoma protein, Rb) λαμβάνει χώρα στη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου και έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή πρόσδεσης της NCL στον ενισχυτή του HPV18 και άρα, την Rb-διαμεσολαβούμενη καταστολή των ογκογονίδιων του HPV18. Επίσης, η ενδοκυτταρική κατανομή της NCL σε επιθηλιακά κύτταρα είναι Rb-εξαρτώμενη, ενώ φαίνεται πως η απορρυθμισμένη δραστηριότητα της NCL λόγω απώλειας της Rb, συμβάλλει στην ανάπτυξη όγκων (Grinstein et al, 2006). Καταστολή της NCL σε εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα προκαλεί δραστική μείωση στο ρυθμό πολλαπλασιασμού, αυξημένη απόπτωση και συσσώρευση των κυττάρων στη φάση G1. Ως αποτέλεσμα, η NCL αδυνατεί να ελέγξει πλέον την ικανότητα αυτοαναέωσης των βλαστοκυττάρων (Yang et al, 2011). Πολλές αναφορές συσχετίζουν τη NCL με τη ρύθμιση της μεταγραφής διαφόρων παραγόντων. Η NCL αναστέλλει τη μεταγραφική δραστικότητα του c-myb (Ying et al, 2000), αποτελεί συστατικό του Β κύτταροειδικού παράγοντα μεταγραφής LR1 (Hanakahi et al, 1997) και φαίνεται να αλληλεπιδρά με τους μεταγραφικούς παράγοντες IRF-2 (Masumi et al, 2006) και KLF2 (Huddleson et al, 2006). Σε μια πρόσφατη μελέτη, αποδείχθηκε ότι οι περιοχές της NCL RBD3, RBD4 και RGG, απαιτούνται για την πρόσδεση του μορίου στον υποκινητή του c-myc και την αναστολή της μεταγραφής του (Gonzalez and Hurley, 2010). Ομοδιμερή NCL προσδένονται μέσω των RNA δεσμευτικών περιοχών της στο mrna της πρωτεΐνης p53 και αναστέλλουν τη μετάφραση της τελευταίας (Chen et al, 2012). 55

72 Εισαγωγή Παράλληλα, η NCL αναστέλλει την ουβικουϊτινιλίωση της p53, συμβάλλοντας έτσι στην αύξηση της σταθερότητάς της (Bhatt et al, 2012). Περαιτέρω μελέτες έδειξαν πως η κινάση JNK2 ρυθμίζει την έκφραση της ΝCL, η οποία πιθανώς ευθύνεται για τη σταθεροποίηση του mrna του επαγόμενου από υποξία παράγοντα-1α (hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α) (Zhang et al, 2012). Η NCL ευθύνεται για την αρνητική μεταγραφική ρύθμιση του γονιδίου της AGP (alpha-1 acid glycoprotein) (Yang et al, 1994). Ακόμα, αλληλεπιδρώντας με το στοιχείο απόκρισης του AP-1 μεταγραφικού παράγοντα εντός του υποκινητή του γονιδίου της MMP-13, αναστέλλει τη μεταγραφική δραστηριότητά του (Samuel et al, 2008). Αντίθετα, η μεταγραφή των γονιδίων της MMP-9 (Fahling et al, 2005) και του υποδοχέα της ιντερλευκίνης 9 (Shang et al, 2012), ρυθμίζεται θετικά από υπερέκφραση της NCL. Χρησιμοποιώντας την έκφραση δομικών τμημάτων της NCL, βρέθηκε ότι το NLS τμήμα της είναι υπεύθυνο για την πυρηνική μετατόπιση του μεταγραφικού παράγοντα Stat1 (signal transducer and activator of transcription 1). O μηχανισμός αυτός χρησιμοποιείται κατά τη διαφοροποίηση των μυελοειδών κυττάρων, είναι ειδικός για το στάδιο της διαφοροποίησης από μονοκύτταρα σε μακροφάγα και οδηγεί σε επαγωγή της έκφρασης του υποδοχέα CD36 των μακροφάγων από τον Stat 1 (Jerke et al, 2009). Τέλος, ταυτοποιήθηκε η πρόσδεση της NCL σε άτυπες δευτεροταγείς δομές DNA του υποκινητή του VEGF, καθώς και η δράση της NCL ως μεταγραφικού επαγωγέα του γονιδίου του VEGF (Uribe et al, 2011). Έχει επίσης αναφερθεί η ύπαρξη μονοπατιού, με βάση το οποίο ο uρα μετατοπίζεται ταχέως προς τον πυρήνα από τη NCL, με την οποία συνεργάζεται για τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης της alpha-sma (alphasmooth muscle actin) (Stepanova et al, 2008). Η NCL προάγει την αναπαραγωγή ιών, όπως των HDV (hepatitis delta virus) (Lee et al, 1998), HCV (hepatitis C virus) (Kusakawa et al, 2007), HSV-1 (herpes simplex virus type-1) (Calle et al, 2008), cytomegalovirus (Strang et al, 2010) και feline calicivirus (Cancio-Lonches et al, 2011). Ακόμα, έχει χαρακτηριστεί ως υποδοχέας προσκόλλησης για το εντεροαιμορραγικό βακτήριο Escherichia coli (Sinclair and O Brien, 2002) και ως παράγοντας εισόδου μέσω της κυτταρικής μεμβράνης του ξενιστή διαφόρων ιών, όπως των coxsackie B (Carson et al, 1997), HIV-1 (Nisole et al, 2002b), HPIV-3 (human parainfluenza virus type-3) (Bose et al, 2004), RSV (human respiratory syncytial virus) (Tayyari et al, 2011), CCHFV (Crimean-Congo hemorrhagic fever virus) (Xiao et al, 2011), JEV 56

73 Εισαγωγή (Japanese encephalitis virus) (Thongtan et al, 2012) και για την πρωτεΐνη Tipalpha (TNF-alpha Inducing Protein) που απελευθερώνεται από το Helicobacter pylori (Watanabe et al, 2010a; Suganuma et al, 2012). Επιπλέον, η μεμβρανική NCL συμμετέχει στη ρύθμιση της επαγόμενης από το λιποπολυσακχαρίτη (LPS) φλεγμονής που προκαλείται από τα μακροφάγα, γεγονός που καθιστά τη NCL ως πολλά υποσχόμενο παράγοντα για τη θεραπεία βακτηριακών λοιμώξεων (Wang et al, 2011b). Αντισώματα έναντι της NCL βρέθηκαν σε πολλούς ασθενείς με αλλομοσχεύματα, τα οποία φάνηκε να σχετίζονται με την απόρριψη μοσχευμάτων νεφρού και με τη στεφανιαία νόσο σε λήπτες μοσχεύματος καρδιάς (Qin et al, 2011). Η γρήγορη εμφάνιση αντισωμάτων έναντι της NCL είναι, επίσης, ένα από τα βασικά χαρακτηριστικά του αυτοάνοσου νοσήματος συστηματικός ερυθηματώδης λύκος (Minota et al, 1991; Hirata et al, 2000). Σε ασθενείς που πάσχουν από καρδιακή ανεπάρκεια παρατηρείται αυξημένη έκφραση του mrna της NCL σε σχέση με φυσιολογικά άτομα (Rosello-Lleti et al, 2012). Σε ασθενείς που πάσχουν από Πάρκινσον, η έκφραση της NCL βρέθηκε εξαιρετικά μειωμένη σε σχέση με φυσιολογικά άτομα (Caudle et al 2009). Παράλληλα, έχει παρατηρηθεί άμεση αλληλεπίδραση της NCL με τις κρίσιμες για την εξέλιξη της ασθένειας πρωτεΐνες, άλφα-σινουκλεΐνη (Jin et al, 2007) και DJ-1 (Caudle et al 2009). Στη νόσο του Αλτσχάϊμερ παρατηρείται φωσφορυλίωση της NCL από την CDK1, γεγονός που οριοθετεί τα στάδια της μίτωσης (Dranovsky et al, 2001). Τα παραπάνω συνηγορούν σε πιθανό ρόλο της NCL στην παθογένεια νευροεκφυλιστικών ασθενειών. Τέλος έχει παρατηρηθεί αυξημένη έκφρασή της σε κυτταρικές σειρές ανθεκτικές στη δράση κυτταροτοξικών φαρμάκων, όπως στην περίπτωση καρκινικών κυττάρων μαστού (Fu and Fenselau, 2005) Έκφραση της NCL στην κυτταρική μεμβράνη Η NCL δρα ως μια πρωτεΐνη-μεταφορέας μεταξύ κυτταροπλάσματος και πυρήνα (Borer et al, 1989) και υπερεκφράζεται επί της μεμβράνης καρκινικών (Destouches et al, 2008; Di Segni et al, 2008; Hoja-Lukowicz et al, 2009), καθώς και ενεργοποιημένων ενδοθηλιακών κυττάρων (Christian et al, 2003; Huang et al, 2006; Shi et al, 2007; Fogal et al, 2009). Λειτουργικός αποκλεισμός ή μείωση της 57

74 Εισαγωγή έκφρασής της μεμβρανικής NCL, αναστέλλουν τη μετανάστευση, το σχηματισμό αυλών (Huang et al, 2006; Destouches et al, 2008) και προκαλούν απόπτωση ενδοθηλιακών κυττάρων (Fogal et al, 2009). H στόχευση της NCL στη μεμβράνη καρκινικών κυττάρων, φαίνεται να είναι ένας αποτελεσματικός τρόπος αναστολής της αγγειογένεσης και της καρκινικής ανάπτυξης σε διάφορα in vitro και in vivo πειραματικά μοντέλα (Destouches et al, 2008; El Khoury et al, 2010; Krust et al, 2011a). Τα σήματα ωστόσο που κινητοποιούν τη NCL από τον πυρήνα προς την επιφάνεια των κυττάρων δεν έχεουν διακριβωθεί. Παρά το γεγονός ότι η NCL δεν περιλαμβάνει κάποια υδρόφοβη διαμεμβρανική περιοχή για αγκύστρωση στην κυτταρική επιφάνεια, διασύνδεσή της με ένα ειδικό μονοκλωνικό αντίσωμα οδηγεί στη συσταδοποίησή της στην κυτταρική μεμβράνη. Αυτή η συσταδοποίηση εμφανίζεται στην εξωτερική πλευρά της κυτταρικής μεμβράνης και εξαρτάται από τη σύνδεση της NCL με τον κυτταροσκελετό της ακτίνης (Hovanessian et al, 2000). Η βαριά αλυσίδα της μυoσίνης 9, μια κινούμενη πρωτεΐνη βασιζόμενη στην ακτίνη, θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως φυσικός διασυνδέτης μεταξύ της επιφανειακής NCL και της ακτίνης (Huang et al, 2006). Κατά τη διέγερση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού υπό την επίδραση ορού, η κυτταροπλασματική NCL μετακινείται μέσω μικρών κυστιδίων στην επιφάνεια, μέσω μιας εξαρτώμενης από τη θερμοκρασία μη συμβατικής εκκριτικής οδού, δεδομένου ότι μια τέτοια μετατόπιση δεν επηρεάζεται από αναστολείς της κλασσικής οδού για έκκριση μέσω του ενδοπλασμικού δικτύου και του συμπλέγματος Golgi, αλλά ούτε και από αναστολείς της εξαρτώμενης από ασβέστιο εξωκυττάρωσης (Hovanessian et al, 2000). Επιπλέον, η NCL δε διαθέτει αμινοτερματική αλληλουχία οδηγό (Lapeyre et al, 1987), συνηγορώντας στην άποψη πως η μετακίνησή της λαμβάνει χώρα μέσω ενός μη συμβατικού μονοπατιού έκκρισης. Ένα υποθετικό μοντέλο προτείνει πως η NCL μεταφέρει την πρωτεΐνη θερμικού σοκ Α1Α (heat shock protein A1A, HSPA1A) από τον πυρήνα προς την κυτταρική μεμβράνη είτε μέσω της οδού: ενδοπλασματικό δίκτυο - πρώϊμα ενδοσώματα - ενδοσώματα ανακύκλωσης - πλασματική μεμβράνη - έκκριση ως ελεύθερες πρωτεΐνες, είτε μέσω της οδού ενδοπλασματικό δίκτυο - ώριμα ενδοσώματατα - πολυκυστιδιακοί φορείς - συγχώνευση με την πλασματική μεμβράνη (λιπιδικές δομές, lipid rafts) - έκκριση ως εξωσώματα (Kaur et al, 2012). Ενδιαφέρον ακόμα παρουσιάζει πως η Ν-γλυκοζυλίωση της κυτταροπλασματικής 58

75 Εισαγωγή NCL, φαίνεται να είναι απαραίτητη προϋπόθεση για την έκφρασή της επί της επιφανείας διαφόρων τύπων κυττάρων (Losfeld et al, 2009). Η εμφάνιση της NCL στην κυτταρική μεμβράνη οφείλεται είτε σε ενδοκυτταρική ανακατανομή είτε σε μεταβολή της πρωτεϊνικής της έκφρασης. Μόρια που επηρεάζουν την αγγειογένεση και την καρκινική ανάπτυξη και παράλληλα επάγουν αυξημένη μετατόπιση ή έκφραση της NCL στην κυτταρική μεμβράνη είναι η λαμινίνη-1 (Turck et al, 2006), η LRP (Krust et al, 2011b) και ο VEGF 165 (Huang et al, 2006). Η λαμινίνη-1 επάγει την πρώϊμη διαφοροποίηση ανθρώπινων εντερικών επιθηλιακών κυττάρων με ταυτόχρονη κινητοποίηση της NCL προς την κυτταρική μεμβράνη, μέσω ενός μονοπατιού που εξαρτάται από την υπομονάδα β 1 και την καθοδική ενεργοποίηση της κινάσης p38 (Turck et al, 2006). Η μεμβρανική έκφραση της NCL φαίνεται να εξαρτάται και από την ενδογενή έκφραση της LRP. Σε κύτταρα CHO που δεν εκφράζουν την LRP, η NCL εντοπίζεται στον πυρήνα και το κυτταρόπλασμα, αλλά όχι στην κυτταρική μεμβράνη. Η LRP έχει προταθεί ως ένας πιθανός διαμεμβρανικός προσδέτης που επιτρέπει την αγκυροβόληση της NCL στην κυτταρική μεμβράνη (Krust et al, 2011b). Ποσοτική αύξηση του εντοπισμού της NCL στην πλασματική μεμβράνη ενδοθηλιακών κυττάρων επιστρωμένων σε φιμπρονεκτίνη, κολλαγόνο ή πολυλυσίνη έπειτα από επίδραση του VEGF 165 για 6 ώρες δε συνοδεύεται από αύξηση των ολικών πρωτεϊνικών επιπέδων της NCL, τα οποία παρέμειναν αμετάβλητα (Huang et al, 2006). Από την άλλη πλευρά, η έκφραση της μεμβρανικής NCL έχει συνδεθεί με επαγωγή του mrna της σε ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα. Συγκεκριμένα, επίδραση ακτινομυκίνης D για μερικές ώρες προκάλεσε σημαντική μείωση τόσο του mrna, όσο και των πρωτεϊνικών επιπέδων της μεμβρανικής NCL. Ακόμα, σε ενδοθηλιακά κύτταρα που αναπτύσσονται απουσία ορού επί 24 ώρες, παρατηρείται μείωση του mrna της NCL, κατάσταση που αναστρέφεται με την προσθήκη πλήρους θρεπτικού μέσου καλλιέργειας. Ενδιαφέρον παρουσιάζει πως η προσθήκη του VEGF 165 είναι επίσης επαρκής για να διεγείρει τα επίπεδα mrna της NCL, σε ενδοθηλιακά κύτταρα που αναπτύσσονται απουσία ορού, υποδεικνύοντας έτσι ότι η επαγωγή του mrna της NCL πιθανώς συσχετίζεται με την επαγόμενη από VEGF 165 ανακατανομή της NCL από τον πυρήνα προς την κυτταρική μεμβράνη ενδοθηλιακών κυττάρων (Hovanessian et al, 2010). 59

76 Εισαγωγή Έκφραση του αυξητικού παράγοντα ηπατώματος (hepatoma-derived growth factor, HDGF) που εμπλέκεται στην οργανογένεση και αποτελεί προγνωστικό μάρτυρα ευρέως φάσματος καρκινωμάτων, σχετίζεται με κυτταροπλασματική μετατόπιση της NCL (Bremer et al, 2013). Έχει βρεθεί πως ο HGF αναστέλλει την επαγόμενη από αγγειογενίνη μετακίνηση της NCL στον πυρήνα, διατηρώντας υψηλά τα επίπεδα κυτταροπλασματικής NCL (Lee et al, 2010a). Η έκφραση της πρωτεΐνης heat shock cognate 70 (HSC70) αποτελεί προϋπόθεση για τη μετατόπιση στην κυτταρική επιφάνεια και την αγγειογενετική λειτουργία της NCL. Πιο αναλυτικά, αλληλεπίδραση της HSC70 με τις RNA δεσμευτικές περιοχές της NCL σε ενδοθηλιακά κύτταρα, διαμεσολαβείται από φωσφορυλίωση της NCL από την CKII ή την PKC. Η επαγόμενη από HSC70 μετακίνηση της NCL στην κυτταρική μεμβράνη οφείλεται σε σταθεροποίηση της NCL, καθώς και στην ενισχυμένη αλληλεπίδρασή της με τη βαριά αλυσίδα της μυoσίνης 9. Η λειτουργική συσχέτιση της HSC70 με τη NCL βασίζεται σε αποτελέσματα που δείχνουν ότι η μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων, ο σχηματισμός αυλών in vitro και η ανάπτυξη όγκων αλλομοσχευμάτων in vivo που επάγονται από τη NCL, εξαρτώνται από τη ενεργότητα της HSC70. Ακόμα, ανάλυση μιας σειράς ιστών αποκάλυψε ότι τα επίπεδα έκφρασης των δύο αυτών μορίων, συσχετίζονται στενά σε ανθρώπινα αδενοκαρκινώματα πνεύμονα (Ding et al, 2012). Επώαση κυττάρων ανθρώπινου μαστικού αδενοκαρκινώματος με αραχιδονικό οξύ, επάγει την εξαρτώμενη από την κινάση ROCK φωσφορυλίωση της NCL, και ανακατανομή της τελευταίας από τον πυρήνα στην κυτταρική μεμβράνη. Η μεμβρανική NCL συνεντοπίζεται με την RhoA, η οποία σχετίζεται με καρκινική μετάσταση (Garcia et al, 2011). Μετατόπιση της NCL από τους πυρηνίσκους προς το πυρηνόπλασμα έχει παρατηρηθεί υπό την επίδραση θερμικού σοκ, υπεροσμωτικού στρες, ιονίζουσας ακτινοβολίας και καμπτοθεσίνης, που διαμεσολαβείται από το σχηματισμό συμπλόκου της NCL με το καρβοξυτελικό άκρο της p53 σε κύτταρα οστεοσαρκώματος (Daniely et al, 2002; Yang et al, 2008). Το οξειδωτικό στρες που προκαλείται μέσω επίδρασης υπεροξειδίου του υδρογόνου, οδηγεί σε ανακατανομή της NCL από τον πυρήνα προς την κυτταρική μεμβράνη ενδοθηλιακών κυττάρων (Wang et al, 2008). Τέλος, μόλυνση κυττάρων από αδενοϊό δείχθηκε να οδηγεί σε αναδιανομή της NCL από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα, μόνο σε κύτταρα που υπερεκφράζουν την πρωτεΐνη V του αδενοϊού (Matthews, 2001). 60

77 Εισαγωγή 4.8. Προσδέτες της μεμβρανικής NCL Ενδιαφέρον παρουσιάζει ότι οι περισσότεροι προσδέτες της μεμβρανικής NCL παίζουν κρίσιμο ρόλο στην αγγειογένεση και στην ογκογένεση. Δεδομένα υποστηρίζουν τη λειτουργία της NCL ως υποδοχέα χαμηλής συγγένειας για την ΡΤΝ (Take et al, 1994). H ΡΤΝ δεσμεύεται στη NCL (K D =1.3x10-6 Μ) απουσία ηπαρίνης και κατά παρόμοιο τρόπο με τη MK (Said et al, 2005). Η πρόσδεση αυτή αναστέλλεται έντονα από την ηπαρίνη, χωρίς όμως να έχει αποσαφηνιστεί όπως στην περίπτωση της MK, εάν η αναστολή προκαλείται από πρόσδεση της ηπαρίνης στην ΡΤΝ ή στη NCL (Take et al, 1994). Επιπλέον, η ΡΤΝ αναστέλλει τη μόλυνση από HIV-1, μέσω καταστολής της ικανότητας προσκόλλησης των σωματιδίων του ιού στην επιφάνεια ευκαρυωτικών κυττάρων. Η β-δομή που βρίσκεται στο καρβοξυτελικό άκρο της ΡΤΝ (αμινοξέα ), φαίνεται να είναι υπεύθυνη για αυτό το ανασταλτικό αποτέλεσμα, αν και ο συνδυασμός των δύο β- δομών (αμινοξέα 9-110) φαίνεται να είναι πιο δραστικός στην αναστολή της HIV-1 λοίμωξης, πιθανότατα λόγω συνεργιστικής δράσης ή πιο αποτελεσματικής στερεοδιαμόρφωσης που ευνοεί την πρόσδεση με τη NCL. Μετά τη δέσμευση στη μεμβρανική NCL, η ΡΤΝ ενδοκυτταρώνεται από έναν ευαίσθητο στη θερμοκρασία μηχανισμό, που είναι ανεξάρτητος από πρωτεογλυκάνες θεϊικής ηπαράνης και θεϊικής χονδροϊτίνης (Said et al, 2005). Ενδείξεις για την εμπλοκή της NCL στις βιολογικές δράσεις της PTN, αποτελούν η αναστολή επαγόμενου από PTN σχηματισμού διακλαδωμένων δομών σε υπόστρωμα κολλαγόνου, καθώς και η μειωμένη διείσδυση ενδοθηλιακών κυττάρων σε matrigel που περιείχε ΡΤΝ και είχε ενεθεί υποδόρια σε επίμυες, έπειτα από επίδραση αναστολέων της NCL (Destouches et al, 2008). Πρόσφατα αναφέρθηκε πως η PTN που στερείται τα 26 τελευταία αμινοξέα του καρβοξυτελικού άκρου, αναστέλλει σημαντικά τη μιτογόνο δράση ολόκληρου του μορίου στην in vitro και in vivo ανάπτυξη κυττάρων καρκίνου του προστάτη, μέσω έμμεσης ή άμεσης πρόσδεσης και άρα ανταγωνισμού με τους υποδοχείς της PTN, μεταξύ των οποίων πιθανώς και η NCL (Hamma-Kourbali et al, 2011). Η ομόλογη της PTN πρωτεΐνη MK, έπειτα από αλληλεπίδρασή της με την κυτταρική μεμβράνη, συνεντοπίζεται με τη NCL και ενδοκυτταρώνεται μέσω μιας ενεργού διαδικασίας, διαμέσου λιπιδικών δομών (lipid rafts). Η ΜΚ αναστέλλει τη μόλυνση από τον HIV-1 μέσω αναστολής της προσκόλλησης σωματιδίων του ιού στην κυτταρική μεμβράνη, μηχανισμός που μοιάζει απόλυτα με τη δράση του 61

78 Εισαγωγή αναστολέα μεμβρανικής NCL, HB-19 (Callebaut et al, 2001; Hovanessian, 2006). Η NCL δεσμεύεται στην επιφάνεια των κυττάρων με τη γλυκοζαμινογλυκάνη acharan sulfate, η οποία έχει δομική ομοιότητα με την ηπαρίνη και φέρει αντικαρκινική δράση in vitro και in vivo. Προτάθηκε πως το σύμπλοκο αυτό θα μπορούσε να εμποδίσει την καρκινική ανάπτυξη που επάγεται από τη MK (Joo et al, 2005). Η ουροκινάση που εμπλέκεται σε μηχανισμούς ρύθμισης περικυτταρικής πρωτεόλυσης, κυτταρικής προσκόλλησης και μιτογένεσης προκαλεί το σχηματισμό και την ενεργοποίηση ενός συμπλόκου σηματοδότησης που περιλαβάνει τον upar, τη NCL και την CKΙΙ, το οποίο είναι υπεύθυνο για την μιτογόνο δράση που σχετίζεται με το uρα (Dumler et al, 1999). Άλλες πρωτεΐνες που δεσμεύονται στη μεμβρανική NCL όπως η λαμινίνη-1 (Kleinman et al, 1991; Turck et al, 2006), ο παράγοντας J (Larrucea et al, 1998), οι σελεκτίνες L και Ρ (Harms et al, 2001; Reyes-Reyes and Akiyama, 2008), η κινάση της εκτοπρωτεΐνης (Jordan et al, 1994), οι απολιπορωτεΐνες Β και Ε (Semenkovich et al, 1990) και ο HGF (Tate et al, 2006) εμπλέκονται στην ανάπτυξη όγκων, επάγουν την κυτταρική διαφοροποίηση, τη ρύθμιση της κυτταρικής προσκόλλησης, το συνωστισμό των λευκοκυττάρων, τη φλεγμονή και την αγγειογένεση. Πρόσφατα, ταυτοποιήθηκε ένα μεμβρανικό σύμπλοκο μοριακού μεγέθους 500 kda που αποτελείται από παράγοντες, όπως οι σχετιζόμενες με Wnt πρωτεΐνες, το αυτοαντιγόνο Ku86, η ριβονουκλεοπρωτεΐνη signal recognition particle (SRP), ο παράγοντας του συμπληρώματος gc1q-r, οι ριβοσωμικές πρωτεΐνες S4/S6 και η NCL (Krust et al, 2011a). Κατά τα τελευταία έτη, πολλοί αυξητικοί παράγοντες που σχετίζονται με την ανάπτυξη και την αγγειογένεση όγκων, καθώς επίσης και οι υποδοχείς τους, έχουν βρεθεί στον πυρήνα των κυττάρων (Re and Cook, 2006). Παράλληλα, φαινόμενα ενδοκυττάρωσης προσδέτη-υποδοχέα έχουν συσχετιστεί με διάφορα γεγονότα κυτταρικής σηματοδότησης (Santos et al, 2007; De Donatis et al, 2008; Caswell and Norman, 2008; Sadowski et al, 2009). Ειδικά αντισώματα που προσδένονται στη μεμβρανική NCL ενδοκυτταρώνονται (Deng et al, 1996; Hovanessian et al, 2000), παρατήρηση που οδήγησε στην υπόθεση ότι η μεμβρανική NCL εμπλέκεται στην ενδοκυττάρωση προσδετών της και ίσως στη μεταφορά τους στον πυρήνα. Για παράδειγμα, είναι γνωστό πως τo πεπτίδιο F3 συνδέεται εκλεκτικά σε ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά και καρκινικά κύτταρα, αλλά και σε αγγεία όγκων. Το μόριο της κυτταρικής επιφάνειας που αναγνωρίζεται από 62

79 Εισαγωγή το F3 είναι η NCL, η οποία το ενδοκυτταρώνει (Christian et al, 2003). Οι αντιαγγειογενετικές και αντικαρκινικές δράσεις της ενδοστατίνης, δείχθηκε πως διαμεσολαβούνται από την αλληλεπίδρασή της με τη NCL. Συγκεκριμένα, η ενδοστατίνη ενδοκυτταρώνεται από τη μεμβρανική NCL και μεταφέρεται στον πυρήνα, όπου αναστέλλει την κρίσιμης σημασίας για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, φωσφορυλίωση της NCL (Shi et al, 2007). Πιο πρόσφατα βρέθηκε πως η ενδοκυττάρωση της ενδοστατίνης πραγματοποείται μέσω κυστιδίων κλαθρίνης και διαμεσολαβείται από το συμπλόκο NCL/α 5 β 1 /upar. Έπειτα από τη μετατόπιση της ενδοστατίνης στο πρώϊμο ενδόσωμα, η ιμπορτίνη α 1 β 1 αναγνωρίζει την περιοχή NLS της NCL και μεταφέρει το σύμπλοκο NCL/ενδοστατίνη εντός του πυρήνα (Song et al, 2012). Ακόμα, η NCL έχει χαρακτηριστεί ως ένας πιθανός υποδοχέας της μεταλλοπρωτεϊνάσης ADAMTS-2, διαμεσολαβώντας τις αντιαγγειογενετικές της δράσεις (Dubail et al, 2010). Η μεμβρανική NCL αλληλεπιδρά και με τη λακτοφερίνη, πρωτεΐνη που συμμετέχει στην αντιϊική άμυνα έναντι του HIV-1 και έχει αντικαρκινικές δράσεις. Η αλληλεπίδραση αυτή οδηγεί στην ενδοκυττάρωση και στόχευση της λακτοφερίνης στον πυρήνα (Legrand et al, 2004). Επίσης, η NCL δρα ως υποδοχέας για το λιποπολυσακχαρίτη LPS στην επιφάνεια μακροφάγων και είναι απαραίτητη για την ενδοκυττάρωσή του (Wang et al, 2011b). Ενδιαφέρον επίσης παρουσιάζει το γεγονός πως αυξημένες συγκεντρώσεις εξωκυτταρικού ασβεστίου ενισχύουν την ενδοκυττάρωση μεμβρανικών προσδετών της NCL (Hovanessian et al, 2010) Ο ρόλος της μεμβρανικής NCL στη μεταγωγή σήματος Η NCL εμπλέκεται άμεσα ή έμμεσα σε γεγονότα μεταγωγής σήματος, μετά από αλληλεπίδρασή της με διάφορους προσδέτες στην κυτταρική επιφανεία. Πρόσδεση της NCL με τον υποδοχέα φωσφατάσης τυροσίνης σ (protein tyrosine receptor σ, PTPσ), ο οποίος εμπλέκεται στην ανάπτυξη, στην καθοδήγηση και στην επισκευή νευραξόνων, έχει παρατηρηθεί στους σκελετικούς μύες (Alete et al, 2006). Οι υποδοχείς με δράση κινάσης τυροσίνης Erb διμερίζονται, φωσφορυλιώνονται και οδηγούν σε ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη, έπειτα από συμπλοκοποίηση με το καρβοξυτελικό άκρο της NCL στη μεμβράνη καρκινικών κυττάρων (Di Segni et al, 2008; Farin et al, 2009). Επιπρόσθετα, 63

80 Εισαγωγή πρόσδεση της σελεκτίνης Ρ σε καρκινικά κύτταρα παχέος εντέρου επάγει τη φωσφορυλίωση της NCL σε κατάλοιπα τυροσίνης και τον επακόλουθο σχηματισμό ενός συμπλόκου σηματοδότησης που περιλαμβάνει τη NCL και τις κινάσες PI3K και p38, ρυθμίζοντας έτσι την κυτταρική προσκόλληση (Reyes- Reyes and Akiyama, 2008). Επίδραση του ψευδοπεπτιδίου HB-19 (αναστολέα της μεμβρανικής NCL) σε καρκινικά κύτταρα προστάτη ή λευχαιμικά κύτταρα προκαλεί την ταχεία και έντονη είσοδο ιόντων ασβεστίου εντός των κυττάρων, διαμέσου των διαύλων SOC της κυτταρικής μεμβράνης (Losfeld et al, 2009). Τέλος, υποστηρίζεται πως η NCL που εντοπίζεται στην εσωτερική πλευρά της κυτταρικής μεμβράνης αλληλεπιδρά με την K-Ras GTPάση, αλλά όχι με άλλες ισομορφές Ras (Inder et al, 2010). Σταθεροποίηση αυτού του συμπλόκου, ενισχύει με τη σειρά του το μονοπάτι μεταγωγής σήματος των ΜΑΡΚs (Inder et al, 2009). Πιο πρόσφατα, δείχθηκε πως όλες οι ισομορφές Ras (H-, K- και N-Ras) αλληλεπιδρούν με τη NCL στην κυτταρική μεμβράνη, μέσω του καρβοξυτελικού της άκρου. Επιπλέον, GTP-συνδεδεμένη Ras ενισχύει το σχηματισμό του συμπλόκου NCL/Erb που εμπλέκεται στο σχηματισμό αποικιών σε μαλακό άγαρ και την αύξηση όγκων σε αθυμικούς επίμυες (Farin et al, 2011). Ενισχυτικά, αξίζει να αναφερθεί πως η κυτταροπλασματική NCL αποτελεί στόχο κινασών όπως της CKII (Li et al, 1996; Bonnet et al, 1996) και της PKC (Zhou et al, 1997), ως απόκριση στην ενεργοποίηση των κυττάρων από τον FGF-2 και τον NGF, αντιστοίχως. Επιπλέον, η NCL συνδέεται με τα κυτταροπλασματικά άκρα των CD3 epsilon (Gil et al, 2001) και CD28 (Matsumoto et al, 2003), μόρια που εμπλέκονται στην ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων Στρατηγικές στόχευσης της NCL Πολλές μελέτες που αφορούν στη στόχευση της NCL επισημαίνουν τον πιθανό της ρόλο ως στόχου για τη θεραπεία του καρκίνου. Το ψευδoπεπτίδιο HB-19 προσδένεται στην περιοχή RGG του καρβοξυτελικού άκρου της NCL (Destouches et al, 2008) και αναστέλλει τη λειτουργία της ως υποδοχέα χαμηλής συγγένειας διαφόρων προσδετών της (Nisole et al, 1999; Nisole et al, 2002a; Said et al, 2002; Legrand et al, 2004; Said et al, 2005). Αποτελεί συνθετικό ευθύγραμμο πεπτίδιο που αποτελείται από ένα κεντρικό κορμό εννέα αμινοξέων: H 2 N-Lys-Lys- 64

81 Εισαγωγή Lys-Gly-Pro-Lys-Glu-Lys-Ahx-CONH 2, όπου το Ahx αντιπροσωπεύει το αμινοεξανικό οξύ, ενώ το CONH 2 αντιπροσωπεύει ένα τροποποιημένο καρβοξυτελικό άκρο, στο οποίο η υδροξυλομάδα αντικαθίσταται από μία αμινομάδα. Στον κεντρικό αυτό κορμό συνδέονται 5 τριπεπτίδια (Lys-Pro-Arg), στα οποία ο πεπτιδικός δεσμός μεταξύ λυσίνης και προλίνης είναι ανηγμένος, έτσι ώστε να προστατεύεται το πεπτίδιο από τη δράση πρωτεϊνασών. Σχηματίζει ένα σταθερό σύμπλοκο με τη NCL της κυτταρικής επιφάνειας και ενδοκυτταρώνεται από μια ενεργή διαδικασία, οδηγώντας τη μεμβρανική NCL προς αποικοδόμηση. Αντίθετα, δεν προκαλείται καμία μεταβολή στην πυρηνική NCL, καθώς το ψευδοπεπτίδιο δεν είναι ικανό να διαπεράσει την κυτταρική μεμβράνη. Ασκεί ανασταλτική δράση στην ανάπτυξη όγκων και στη διαδικασία νεοαγγείωσης σε μια ποικιλία από πειραματικά μοντέλα, όπως αποδεικνύεται από μελέτες που δείχνουν ότι επίδραση του ΗΒ-19 καταστέλλει σημαντικά, έως και ολοκληρωτικά, την εξέλιξη ξενομοσχευμάτων από ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα μαστού σε επίμυες, χωρίς να εμφανίζει τοξικότητα σε φυσιολογικούς ιστούς (Destouches et al, 2008). Χορήγησή του για αρκετούς μήνες, καθυστέρησε σημαντικά την έναρξη και τη συχνότητα δημιουργίας μελανώματος και σπλαχνικών μεταστατικών οζιδίων σε in vivo μοντέλο επιμύων, χωρίς πάλι να εμφανίζει τοξικότητα σε φυσιολογικούς ιστούς (El Khoury et al, 2010). Πρόσφατα έγινε γνωστό πως οι δράσεις του HB-19 και των δομικά σχετιζόμενων πεπτιδίων Nucant (συνθετικά ανάλογα του HB-19, με τη διαφορά ότι στον κεντρικό κορμό συνδέονται 6 τριπεπτίδια Lys-Pro-Arg), είναι κυτταροειδικές. Προτάθηκε πως η απόκριση των κυττάρων του όγκου σε αυτά τα πολυδύναμα ψευδοπεπτίδια θα πρέπει να σχετίζεται με τα επίπεδα έκφρασης της μεμβρανικής NCL ή/και των διαφορετικών προσδετών της σε κάθε περίπτωση (Krust et al 2011b). Η αντιαγγειογενετική δραστικότητα του ΗΒ-19 επιβεβαιώθηκε στο in vivo μοντέλο της CAM, όπου ελάττωσε σημαντικά τη δημιουργία διακλαδώσεων αιμοφόρων αγγείων και την ανάπτυξη με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Στην ίδια κατεύθυνση, επίδρασή του ανέστειλλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση, τη διείσδυση σε matrigel, καθώς και τη διαφοροποίηση σε μια τρισδιάστατη πηκτή κολλαγόνου ενδοθηλιακών κυττάρων που επάγεται από VEGF ή ΡΤΝ ή FGF-2 (Destouches et al, 2008). Επίσης, το πλέον αποτελεσματικό ψευδοπεπτίδιο Nucant (N6L), ανέστειλε την in vitro προσκόλληση, τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων, χωρίς να επηρεάσει την απόπτωση τους, μέσω 65

82 Εισαγωγή αδρανοποίησης των κινασών c-src, ERK1/2, ΑΚΤ και FAK (Birmpas et al, 2012). Τα αποτελέσματα αυτά τονίζουν την ισχυρή αντιαγγειογενετική δράση των πεπτιδίων στόχευσης της μεμβρανικής NCL και επιβεβαιώνουν τη λειτουργία της τελευταίας στην ανάπτυξη των αγγείων (Christian et al, 2003; Huang et al, 2006; Shi et al, 2007; Fogal et al; 2009). Σύντομα μετά την ταυτοποίηση των πλούσιων σε γουανίνη ολιγονουκλεοτιδίων (G-rich Oligonucleotides, GROs) ως αντιπολλαπλασιαστικούς παράγοντες, η NCL στη συνέχεια ταυτοποιήθηκε ως πρωταρχικός μοριακός τους στόχος. Ένα παράγωγο φθοροκινολόνης με την ονομασία CX-3543, το οποίο αρχικά σχεδιάστηκε για να στοχεύει quadruplexes στον υποκινητή του γονιδίου c-myc, βρέθηκε να φέρει ισχυρή και εκλεκτική αντικαρκινική δράση σε in vitro και in vivo μοντέλα. Παρόλα αυτά, δεν έδειξε ανασταλτική δράση στην έκφραση του c-myc, υποδηλώνοντας έτσι την ύπαρξη εναλλακτικού μηχανισμού δράσης (Bates et al, 2007). Στη συνέχεια, έγινε γνωστό πως τo CX-3543 διαταράσσει το σχηματισμό συμπλόκων μεταξύ rdna quadruplexes και NCL, επάγει την ανακατανομή της NCL, αναστέλλει τη βιογένεση ριβοσωμάτων μέσω αναστολής της πολυμεράσης Ι και επάγει την απόπτωση καρκινικών κυττάρων. Ενδιαφέρον είναι το γεγονός ότι το CX-3543 δε βρέθηκε να συσσωρεύεται στους πυρηνίσκους φυσιολογικών κυττάρων, φαινόμενο που πιθανώς συμβάλλει, στην εκλεκτική του δράση έναντι του καρκίνου. Σήμερα, τo CX-3543 βρίσκεται σε μελέτες φάσης II για ασθενείς με νευροενδοκρινικούς όγκους (Drygin et al, 2009). Η αποτελεσματικότητα στόχευσης της μεμβρανικής NCL αποδεικνύεται περαιτέρω από το γεγονός ότι το πλούσιο σε γουανοσίνη ολιγοδεοξυνουκλεοτίδιο AS1411 (αποτελούμενο από 26 νουκλεοτίδια), το οποίο αλληλεπιδρά με τη μεμβρανική NCL, δοκιμάζεται σήμερα σε φάσης II κλινικές δοκιμές σε ασθενείς με νεφροκυτταρικό καρκίνωμα ή οξεία μυελογενή λευχαιμία (Destouches et al, 2008; Bates et al, 2009; Soundararajan et al, 2009; Destouches et al, 2012). Η δράση του απταμερούς AS1411 εξαρτάται αποκλειστικά από τη δέσμευσή του στη NCL και σε αντίθεση με το CX-3543, δεν επηρεάζει τη βιογένεση των ριβοσωμάτων. Το προτεινόμενο μοντέλο για τo μηχανισμό δράσης του AS1411 περιλαμβάνει τη μεταβολή της λειτουργικότητας ή/και του εντοπισμού συμπλόκων της NCL. Σε κύτταρα όπου έχει γίνει επίδραση με το απταμερές AS1411, παρατηρείται ενίσχυση της αλληλεπίδρασης της NCL με το ρυθμιστή του μεταγραφικού παράγοντα NFκΒ (ΝΕΜΟ, επίσης γνωστό και ως IKKc), η οποία οδηγεί σε 66

83 Εισαγωγή απενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα (Girvan et al, 2006). Ακόμα έχει δειχθεί πως επίδραση του AS1411 προκαλεί μετατόπιση της μεθυλοτρανσφεράσης 5 της αργινίνης (arginine methyltransferase 5, RPMT5) από τον πυρήνα προς το κυτταρόπλασμα. Η RPMT5 είναι υπεύθυνη για τη μεταγραφική καταστολή πολλών γονιδίων που αναστέλλουν την καρκινική ανάπτυξη. Το μοντέλο καταστολής ογκοκατασταλτικών γονίδιων από την εξαρτώμενη από NCL μετατόπιση της RPMT5 στο κυτταρόπλασμα, επιβεβαιώθηκε στην περίπτωση των γονιδίων ST7 και κυκλίνης Ε2 (Teng et al, 2007). Η επαγωγή αστάθειας του mrna της Βcl-2, θεωρείται ένας ακόμα πιθανός μηχανισμός δράσης του AS1411 (Ishimaru et al, 2010). Η διαδικασία πρόσληψης νανοσωματιδίων ή άλλων μορίων με εκλεκτικό τρόπο από τη μεμβράνη καρκινικών κυττάρων που διαμεσολαβείται από τη NCL έχει αξιοποιηθεί από πολλές ομάδες μέχρι στιγμής (Chen et al, 2008). Εφαρμόζοντας διάφορα in vivo και in vitro μοντέλα, δείχθηκε ότι το απταμερές AS1411 καθώς και συζευγμένα με τον F3 παράγοντα νανοσωματίδια, στοχεύουν εκλεκτικά τα καρκινικά κύτταρα που υπερεκφράζουν NCL στην κυτταρική τους μεμβράνη. Απώτερος σκοπός αποτελεί η χρήση τέτοιων μεθοδολογιών ως μη επεμβατικά εργαλεία απεικόνισης για τη διάγνωση νεοπλασιών, καθώς και η διευκόλυνση απελευθέρωσης χημειοθεραπευτικών φαρμάκων εκλεκτικά στους καρκινικόυς όγκους (Ireson and Kelland, 2006; Soundararajan et al, 2009; Bates et al, 2009; Ko et al, 2009; Orringer et al, 2009; Drecoll et al, 2009; Lee et al, 2010b; Shieh et al, 2010; Watanabe et al, 2010b; Mongelard and Bouvet, 2010; Hwang do et al, 2010; Reyes-Reyes et al, 2010; Guo et al, 2011; Li et al, 2012; Lian et al, 2012; Ai et al, 2012; Dam et al, 2012; Kotula et al, 2012; Aravind et al, 2012; Kim et al, 2012; Moura et al, 2012; Hu et al, 2013). Δεδομένου ότι το AS1411 ενδοκυτταρώνεται σε πολύ χαμηλότερες συγκεντρώσεις από αυτές που απαιτούνται για την ανασταλτική του δράση στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό (Soundararajan et al, 2008), θα μπορούσε δυνητικά να αποτελέσει ιδιαίτερα υποσχόμενο παράγοντα στοχευμένης θεραπείας. 67

84 Εισαγωγή 68

85 ΣΚΟΠΟΣ

86

87 Σκοπός Σκοπός της εργασίας Η κυτταρική μετανάστευση αποτελεί μια δυναμική διαδικασία που είναι συνιστώσα πολλών σημαντικών βιολογικών λειτουργιών, ανάμεσα στις οποίες η αγγειογένεση. Η κυτταρική μετανάστευση επάγεται από αυξητικούς παράγοντες και ρυθμίζεται από αλληλεπιδράσεις μορίων της κυτταρικής μεμβράνης μεταξύ τους, καθώς και με μόρια της εξωκυττάριας ύλης. Η πλειοτροπίνη (pleiotrοphin, PTN) αποτελεί εκκρινόμενο αυξητικό παράγοντα μεγέθους 18 kda, που επάγει τη μετανάστευση αρκετών τύπων κυττάρων, ανάμεσα στους οποίους είναι και τα ενδοθηλιακά. Παρουσιάζει υψηλή συγγένεια με την ηπαρίνη και διαδραματίζει σημαντικό ρόλο σε αναπτυσσόμενους ιστούς, σε λειτουργίες του νευρικού συστήματος, στην ανάπτυξη όγκων και στην καρκινική αγγειογένεση in vivo και in vitro. Διάφοροι υποδοχείς διαμεσολαβούν τις δράσεις της ΡΤΝ, όπως οι συνδεκάνες, ο υποδοχέας με δράση κινάσης τυροσίνης ALK (anaplastic lymphoma kinase), ο υποδοχέας με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ (receptor protein tyrosine phosphatase beta/zeta, RPTPβ/ζ), η ιντεγκρίνη α ν β 3 και η νουκλεολίνη (Mikelis et al, 2007; Papadimitriou et al, 2009). O RPTPβ/ζ αποτελεί πρωτεογλυκάνη θειϊκής χονδροϊτίνης και εκφράζεται σε τέσσερις ισομορφές, δύο διαμεμβρανικές και δύο εκκρινόμενες. Αρκετοί προσδέτες δεσμεύονται στην εξωκυτταρική περιοχή του RPTPβ/ζ, ανάμεσά τους αυξητικοί παράγοντες, μόρια εξωκυττάριας ύλης και μόρια κυτταρικής προσκόλλησης (Garwood et al, 2003). Πρόσδεση της PTN στον RPTPβ/ζ οδηγεί σε ενεργοποίηση αρκετών μονοπατιών μεταγωγής σήματος, που συμβάλλουν σε διαδικασίες όπως δημιουργία μνήμης, αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, αποσταθεροποίηση των σημείων προσκόλλησης με επακόλουθη μείωση των κυτταρικών αλληλεπιδράσεων, καθώς και στρατολόγηση πολλών υποστρωμάτων του υποδοχέα στην κυτταρική μεμβράνη. Ακόμα, πολλές ερευνητικές εργασίες υποστηρίζουν την εμπλοκή του RPTPβ/ζ στη μεταναστευτική ικανότητα ενδοθηλιακών και καρκινικών κυττάρων (Koutsioumpa and Papadimitriou, 2012), κυρίως μέσω δέσμευσης της PTN σε αυτόν. Οι ιντεγκρίνες είναι ετεροδιμερείς υποδοχείς της κυτταρικής μεμβράνης, οι οποίες ρυθμίζουν την πρόσδεση του κυττάρου σε μόρια της εξωκυττάριας ύλης και παράλληλα αλληλεπιδρούν με διαλυτούς προσδέτες ή υποδοχείς της κυτταρικής 71

88 Σκοπός μεμβράνης. Οι αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στις ιντεγκρίνες και στους προσδέτες τους είναι σημαντικές για έναν αριθμό κυτταρικών διαδικασιών, όπως προσκόλληση, μετανάστευση, πολλαπλασιασμός, διαφοροποίηση και επιβίωση (Hodivala-Dilke et al, 2003; Bridgewater et al, 2012). Μια από τις πιο μελετημένες ιντεγκρίνες που υπερεκφράζονται κατά την αγγειογένεση και παίζουν βασικό ρόλο στη ρύθμισή της, είναι η α ν β 3. Εκφράζεται σε διαφορετικά είδη κυττάρων κατά την εμβρυογένεση, αλλά η έκφρασή της περιορίζεται σε αγγειογενετικά ενδοθηλιακά, λεία μυϊκά και μερικούς πληθυσμούς αιματοποιητικών κυττάρων στον ενήλικα. Η εξέλιξη της νόσου σε διάφορους τύπους καρκίνου συνάδει με αυξημένη έκφρασή της και πλήθος εργασιών αναφέρονται είτε σε προσπάθειες αναστολής της δράσης της, είτε στη χρήση της ως μόριο για εκλεκτική στόχευση καρκινικών και αγγειογενετικών ενδοθηλιακών κυττάρων (Bader et al, 1998; Gutheil et al, 2000; Reynolds et al, 2002; Taverna et al, 2005; Nabors et al, 2007; Weis and Cheresh, 2011). Υπάρχουν αρκετά δεδομένα που υποστηρίζουν συνεργατική σηματοδότηση μεταξύ της α ν β 3 και υποδοχέων αυξητικών παραγόντων, διαμεσολαβώντας την προσκόλληση, τη μετανάστευση, τη διεισδυτικότητα, την επιβίωση καρκινικών, αλλά και την ενεργοποίηση ενδοθηλιακών κυττάρων (Desgrosellier and Cheresh, 2010). Προηγούμενες μελέτες της ερευνητικής μας ομάδας έδειξαν ότι η ιντεγκρίνη α ν β 3 αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ, ο οποίος μέσω ενεργοποίησης της κινάσης c-src φωσφορυλιώνει την τυροσίνη στη θέση 773 (Tyr773) της ανθρώπινης β 3 και έτσι επάγεται η μετανάστευση ανθρώπινων ενδοθηλιακών και κυττάρων γλοιοβλαστώματος από την ΡΤΝ (Mikelis et al, 2009). Η νουκλεολίνη (nucleolin, NCL) έχει χαρακτηριστεί ως χαμηλής συγγένειας υποδοχέας της PTN (Take et al, 1994; Said et al, 2005), χωρίς να έχει διαλευκανθεί αν και σε ποια ή ποιες δράσεις της ΡΤΝ εμπλέκεται. Προηγούμενες μελέτες της ερευνητικής μας ομάδας είχαν δείξει ότι η ΡΤΝ εντοπίζεται στον πυρήνα ενδοθηλιακών κυττάρων της χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης εμβρύου όρνιθας τις ημέρες της αγγειογένεσης στον ιστό, και συνεντοπίζεται με τη NCL (Drosou et al, 2008). Η NCL είναι πολυλειτουργική πρωτεΐνη μεγέθους 100 kda, η οποία εντοπίζεται κυρίως στον πυρήνα των κυττάρων και φαίνεται να παίζει το ρόλο πρωτεΐνης-μεταφορέα άλλων πρωτεϊνών μεταξύ πυρήνα, κυτταροπλάσματος και κυτταρικής μεμβράνης (Srivastava and Pollard, 1999). Παρουσιάζει αυξημένη έκφραση στην επιφάνεια αγγειογενετικών ενδοθηλιακών 72

89 Σκοπός (Christian et al, 2003; Huang et al, 2006; Shi et al, 2007; Fogal et al, 2009) και καρκινικών (Destouches et al, 2008; Di Segni et al, 2008; Hoja-Lukowicz et al, 2009) κυττάρων, αλληλεπιδρώντας με διάφορους προσδέτες του εξωκυττάριου χώρου που παίζουν σημαντικό ρόλο στην αγγειογένεση και στην καρκινογένεση, πολλούς από τους οποίους ενδοκυτταρώνει (Kibbey et al, 1995; Said et al, 2002; Christian et al, 2003; Legrand et al, 2004; Tate et al, 2006; Shi et al, 2007; Di Segni et al, 2008; Reyes-Reyes and Akiyama, 2008). H στόχευση της μεμβρανικής NCL φαίνεται να αποτελεί έναν αποτελεσματικό τρόπο αναστολής της αγγειογένεσης και της καρκινικής ανάπτυξης σε διάφορα in vitro και in vivo πειραματικά μοντέλα (Destouches et al, 2010; Khoury et al, 2010; Krust et al, 2011a). Παρόλα αυτά, λίγες πληροφορίες υπάρχουν σε σχέση με τη φυσιολογική λειτουργία της μεμβρανικής NCL, το μηχανισμό που επάγει τη μετακίνησή της από τον πυρήνα προς την κυτταρική μεμβράνη και το ρόλο της εκεί. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η επιβεβαίωση και ο χαρακτηρισμός της αλληλεπίδρασης της NCL με την ΡΤΝ, η διερεύνηση του πιθανού ρόλου της NCL στην επαγόμενη από ΡΤΝ κυτταρική μετανάστευση, καθώς και η διερεύνηση τυχόν αλληλεπίδρασης της NCL με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ και την ιντεγκρίνη α ν β 3, μόρια που συγκροτούν σύμπλοκο στην πλασματική μεμβράνη που ρυθμίζει την ικανότητα επαγωγής της κυτταρικής μετανάστευσης από την PTN. Στόχος είναι η διαλεύκανση των δράσεων της ΡΤΝ, καθώς και των μορίων μέσω των οποίων ασκούνται αυτές οι δράσεις, σε μια προσπάθεια ανάδειξης νέων στόχων που θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν για τη θεραπευτική αντιμετώπιση διαφόρων τύπων καρκίνου που χαρακτηρίζονται από αυξημένη αγγειογένεση, όπως το γλοιοβλάστωμα. 73

90 Σκοπός 74

91 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

92

93 Υλικά και Μέθοδοι 1. Θρεπτικά μέσα των χρησιμοποιούμενων κυττάρων (Maciag et al, 1982; Schaffner-Reckinger et al, 1998; Parthymou et al, 2008; Mikelis et al, 2009) Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν καλλιέργειες ενδοθηλιακών κυττάρων από φλέβα ανθρώπινου ομφάλιου λώρου (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC), U87MG (ανθρώπινων κυττάρων γλοιώματος), Μ059Κ (ανθρώπινων κυττάρων γλοιώματος), C6 (κυττάρων γλοιώματος αρουραίου), και κυττάρων από ωοθήκη Κινέζικων χάμστερ (Chinese hamster ovary, CHO). Σε όλα τα θρεπτικά μέσα που χρησιμοποιήθηκαν προστέθηκαν τα ακόλουθα αντιβιοτικά: Πενικιλίνη/Στρεπτομυκίνη 100 U/ml, Γενταμυκίνη 50 μg/ml, Αμφοτερικίνη 2.5 μg/ml και L-Γλουταμίνη 2 mm. Τα αντιβιοτικά πενικιλίνη/στρεπτομυκίνη και γενταμυκίνη προστατεύουν από βακτήρια και η αμφοτερικίνη από μύκητες. Στη συνέχεια του κειμένου, όταν αναφέρονται θρεπτικά υλικά για κυτταροκαλλιέργειες, θα θεωρούνται ότι περιέχουν τα παραπάνω αντιβιοτικά. Οποιαδήποτε τροποποίηση θα αναφέρεται. Όλες οι καλλιέργειες πραγματοποιήθηκαν σε 37 ο C, 5% CO 2 και 100% υγρασία. Το πλήρες θρεπτικό μέσο για κάθε σειρά έχει ως εξής: HUVEC Μ199 85% κ.ό. Ορός εμβρύου βοός (FBS, Fetal Bovine Serum) 15% κ.ό. ECGS (Endothelial Cell Growth Supplement) 150 μg/ml Ηπαρίνη (Heparin) 5 U/ml Το εκχύλισμα ECGS είναι εμπλουτισμένο σε FGF και είναι απαραίτητο για την ικανοποιητική ανάπτυξη των HUVEC. Η ηπαρίνη χρησιμοποιείται για να ενεργοποιηθεί ο ECGS. M059K, U87MG Dulbecco s modified Eagle medium (DMEM)/Ham s F12 90% κ.ό. FBS 10% κ.ό. 77

94 Υλικά και Μέθοδοι C6 Ham s F12 90% κ.ό. FBS 10% κ.ό. CHO Dulbecco s modified Eagle medium (DMEM) 90% κ.ό. FBS 10% κ.ό. 2. Απομόνωση ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC από φλέβα ομφάλιου λώρου ανθρώπου (Pipili-Synetos et al, 1998; Papadimitriou et al, 2000) Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν ενδοθηλιακά κύτταρα που απομονώνονταν από φλέβα ομφάλιου λώρου ανθρώπου. Οι ομφάλιοι λώροι προέρχονταν από την ιδιωτική μαιευτική κλινική της Πάτρας και τη μαιευτική κλινική του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου του Ρίου, από επεμβάσεις καισαρικής τομής. Μετά το τέλος κάθε επέμβασης, ο ομφάλιος λώρος εμβαπτίζεται σε αποστειρωμένο, ισότονο ρυθμιστικό διάλυμα PBS 1x και μεταφέρεται στον εργαστηριακό χώρο για την περαιτέρω διαδικασία απομόνωσης των ενδοθηλιακών κυττάρων. Υλικά και διαλύματα PBS (10x) Na 2 HPO M KH 2 PO M NaCl 0.2 M Αραιώνεται σε dh 2 O 10 φορές πριν τη χρήση (PBS 1x, ph 7.4) και αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Διάλυμα κολλαγενάσης 1% κ.β. 100 mg κολλαγενάσης τύπου 1Α σε 10 ml θρεπτικού μέσου Μ199 Το διάλυμα μοιράζεται σε ποσότητες μικρότερου όγκου και φυλάσσεται στους - 20 ο C μέχρι να χρησιμοποιηθεί. Για την απομόνωση των κυττάρων η κολλαγενάση χρησιμοποιείται σε τελική συγκέντρωση 0.01%. 78

95 Υλικά και Μέθοδοι Πλήρες θρεπτικό μέσο Μ199 (αναφέρεται αναλυτικά στην Παράγραφο 1 ως πλήρες θρεπτικό μέσο για τα κύτταρα HUVEC) Πειραματική πορεία 1. Η κολλαγενάση αραιώνεται σε θρεπτικό μέσο μέχρι τελικής συγκέντρωσης 0.01%. Η αραίωση πραγματοποιείται πάντα σε θρεπτικό μέσο ή σε άλλο διάλυμα που περιέχει Ca +2, τα οποία είναι απαραίτητα για τη δράση του ενζύμου. Το θρεπτικό μέσο που χρησιμοποιείται δεν πρέπει να περιέχει ορό, ο οποίος περιέχει αναστολείς διαφόρων ενζύμων, μεταξύ των οποίων και της κολλαγενάσης. Από τη στιγμή της αραίωσής της, η κολλαγενάση δε διατηρείται για μεγάλο χρονικό διάστημα (λιγότερο από 1 εβδομάδα στους 4 ο C). Ιδανικά, πρέπει να αραιώνεται αμέσως πριν χρησιμοποιηθεί. Η τελική συγκέντρωση της κολλαγενάσης αποτελεί ένα από τα πιο κρίσιμα στάδια για την απομόνωση των κυττάρων. 2. Ο ομφάλιος λώρος έχει δύο αρτηρίες και μία φλέβα, η οποία είναι μεγαλύτερη, πιο εύκολα διακριτή και με μαλακότερα τοιχώματα. Ξεπλένεται η φλέβα με PBS 1x (με σύριγγα των 20 ml), ώστε να απομακρυνθούν υπολείμματα αίματος και θρόμβοι. Ελέγχεται εάν η φλέβα του ομφάλιου λώρου είναι ακέραια. Πριν την προσθήκη της κολλαγενάσης πρέπει να διασφαλιστεί ότι το τμήμα του λώρου που χρησιμοποιείται είναι ακέραιο. Τυχόν αλλοιώσεις του τοιχώματος της φλέβας καθιστούν αδύνατη την απομόνωση των κυττάρων. 3. Κλείσιμο με τη βοήθεια αιμοστάτη του ενός άκρου του ομφάλιου λώρου. 4. Από το άλλο άκρο του ομφάλιου λώρου διοχετεύεται μέσα στη φλέβα το θρεπτικό μέσο με την κολλαγενάση. Η φλέβα αρχίζει να διογκώνεται λόγω του εισερχόμενου διαλύματος. 5. Με αιμοστάτη φράσσεται και το άλλο άκρο του ομφάλιου λώρου. 6. Ο ομφάλιος λώρος τοποθετείται σε αποστειρωμένο δοχείο και επωάζεται στους 37 ο C για λεπτά. 7. Αφαιρείται ο ένας αιμοστάτης και το διάλυμα που περιέχεται στη φλέβα του ομφάλιου λώρου (θρεπτικό μέσο με κολλαγενάση και αποκολλημένα κύτταρα HUVEC) συλλέγεται σε αποστειρωμένο σωληνάριο των 50 ml. 8. Αφαιρείται ο αιμοστάτης και από το άλλο άκρο του ομφάλιου λώρου. 79

96 Υλικά και Μέθοδοι 9. Διοχετεύεται PBS 1x, ξεπλένοντας τη φλέβα του ομφάλιου λώρου και το έκλουσμα συλλέγεται στο ίδιο αποστειρωμένο σωληνάριο. 10. Πραγματοποιείται φυγοκέντρηση των κυττάρων στα 500 g για 4 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το υπερκείμενο απορρίπτεται και τα κύτταρα επαναιωρούνται σε 10 ml πλήρους θρεπτικού μέσου. 11. Το εναιώρημα των κυττάρων μεταφέρεται σε τρυβλίο κατάλληλο για την καλλιέργεια κυττάρων. 12. Επώαση των κυττάρων σε 37 ο C, 5% CO 2 και 100% υγρασία. 13. Μία ημέρα αργότερα ακολουθεί αφαίρεση του θρεπτικού μέσου από το τρυβλίο, δύο ήπιες πλύσεις με PBS 1x και αντικατάσταση με 10 ml νέου πλήρους θρεπτικού μέσου. Η διαδικασία πραγματοποιείται για να απομακρυνθούν τα ερυθρά αιμοσφαίρια και άλλα κύτταρα που δεν έχουν προσκολληθεί στον πυθμένα του τρυβλίου και τα οποία είναι τοξικά για τα ζωντανά κύτταρα. 14. Παρατήρηση της καλλιέργειας σε μικροσκόπιο. Εάν η απομόνωση είναι επιτυχής, διακρίνονται συσσωματώματα κυττάρων τα οποία είναι προσκολλημένα στον πυθμένα του τρυβλίου. 15. Η επώαση των κυττάρων γίνεται με ανανέωση του θρεπτικού μέσου των κυττάρων κάθε 3 ημέρες, έως ότου φθάσουν σε βαθμό κάλυψης 80-90% του πυθμένα του τρυβλίου (πλήρης κάλυψη). 3. Ανακαλλιέργεια κυττάρων (Schaffner-Reckinger et al, 1998; Papadimitriou et al, 2000; Parthymou et al, 2008) Εκτός από τα κύτταρα που αναφέρθηκαν παραπάνω, στην παρούσα διδακτορική διατριβή χρησιμοποιήθηκαν και κύτταρα CHO σταθερά μετασχηματισμένα με πλασμίδιο, στο οποίο έχει κλωνοποιηθεί η αλληλουχία για την έκφραση της υπομονάδας β 3, τόσο αγρίου τύπου (wild type) (wtβ 3 ), όσο και με αντικατάσταση των τυροσινών 773 και 785 από φαινυλαλανίνες (β 3 Y773F και β 3 Y785F, αντίστοιχα), καθώς και το διπλό μετάλλαγμα αυτών (β 3 Y773F/Y785F). Το συγκεκριμένο πλασμίδιο, φέρει επιπλέον γονίδιο για ανθεκτικότητα έναντι της νεομυκίνης. Ως μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα CHO σταθερά 80

97 Υλικά και Μέθοδοι μετασχηματισμένα μόνο με το πλασμίδιο φορέα (χωρίς την κωδικοποιούσα αλληλουχία για την έκφραση της ιντεγκρίνης β 3 ) (vector). Για όλα τα κύτταρα ισχύει η κάτωθι πειραματική πορεία ανακαλλιέργειας, με κάποιες τροποποιήσεις που θα αναφερθούν. Υλικά και διαλύματα PBS (10x) Na 2 HPO M KH 2 PO M NaCl 0.2 M Αραιώνεται σε dh 2 O 10 φορές πριν τη χρήση (PBS 1x, ph 7.4) και αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Θρεπτικό μέσο της κάθε κυτταρικής σειράς (αναφέρεται αναλυτικά στην Παράγραφο 1) Πλήρες θρεπτικό μέσο της κάθε κυτταρικής σειράς (αναφέρεται αναλυτικά στην Παράγραφο 1) Τρυψίνη EDTA ( % σε PBS χωρίς Ca +2 ) Αιματοκυτταρόμετρο Πιπέτες Pasteur (αποστειρωμένες) Αποστειρώνονται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Διάλυμα Νεομυκίνης G mg/ml (σε αποστειρωμένο νερό) Χρησιμοποιείται μόνο στην περίπτωση των σταθερά μετασχηματισμένων κυττάρων CHO. Διάλυμα ζελατίνης Διάλυμα ζελατίνης 2%, το οποίο αραιώνεται πριν από τη χρήση του σε τελική συγκέντρωση 1% με PBS 1x. Διατηρείται στους 4 ο C. Χρησιμοποιείται μόνο στην περίπτωση των HUVEC. 81

98 Υλικά και Μέθοδοι Πειραματική πορεία Στην περίπτωση των κυττάρων HUVEC, πριν ξεκινήσει η ανακαλλιέργεια πραγματοποιείται επίστρωση των τρυβλίων που θα χρησιμοποιηθούν με διάλυμα ζελατίνης. Μετά την επίστρωση του διαλύματος ζελατίνης, τα τρυβλία μεταφέρονται στον επωαστικό θάλαμο, όπου επωάζονται για χρόνο τουλάχιστον 20 λεπτά, ώστε η ζελατίνη να δεσμευθεί στον πυθμένα των τρυβλίων. Η ζελατίνη βελτιώνει τη δέσμευση των HUVEC στο τρυβλίο και την κατάστασή τους σε πειράματα που απαιτείται επώαση σε θρεπτικό μέσο μειωμένης περιεκτικότητας σε ορό. Την επώαση ακολουθεί μία πλύση με διάλυμα PBS 1x για την απομάκρυνση της περίσσειας ζελατίνης και ξεκινάει η διαδικασία της ανακαλλιέργειας. 1. Παρατήρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο. Η μορφολογία των κυττάρων είναι ενδεικτική της κατάστασής τους. Η ανακαλλιέργεια πραγματοποιείται όταν τα κύτταρα έχουν καλύψει το 80-90% της επιφάνειας του τρυβλίου στο οποίο καλλιεργούνται. Ο προσδιορισμός του βαθμού κάλυψης γίνεται με παρατήρηση του τρυβλίου στο μικροσκόπιο. Κύτταρα υγιή θεωρούνται αυτά που είναι προσκολλημένα στον πυθμένα του τρυβλίου χωρίς να έχει αλλάξει η μορφολογία τους. 2. Μεταφορά του τρυβλίου σε θάλαμο νηματικής ροής, όπου είναι δυνατή η εργασία υπό στείρες συνθήκες. 3. Αναρρόφηση του θρεπτικού μέσου της καλλιέργειας με πιπέτα Pasteur υπό κενό. 4. Έκπλυση των κυττάρων δύο φορές με PBS 1x. Με τη διαδικασία αυτή απομακρύνονται τυχόν εναπομείναντα ίχνη ορού, τα οποία περιέχουν αναστολείς τρυψίνης. 5. Προσθήκη 1 ml τρυψίνης ανά τρυβλίο διαμέτρου 100 mm ή 0.5 ml τρυψίνης ανά τρυβλίο διαμέτρου 60 mm. 6. Παρατήρηση της αποκόλλησης των κυττάρων στο μικροσκόπιο. Υπό την επίδραση της τρυψίνης, τα κύτταρα αποκτούν σφαιρική μορφή και αποκολλώνται από το υπόστρωμα. Η επιβίωση των κυττάρων κινδυνεύει σε περίπτωση παραμονής τους πλέον των 10 λεπτών στη τρυψίνη (ο χρόνος αυτός μειώνεται στα 5 λεπτά στην περίπτωση των HUVEC). 82

99 Υλικά και Μέθοδοι 7. Με την ολοκλήρωση της αποκόλλησης των κυττάρων η τρυψίνη αναστέλλεται με την προσθήκη 2 ml πλήρους θρεπτικού μέσου. 8. Μεταφορά του εναιωρήματος των κυττάρων σε αποστειρωμένο σωλήνα των 15 ml. Ακολουθεί ήπιο ξέπλυμα με διάλυμα PBS 1x και μεταφορά των κυττάρων που έχουν απομείνει στο τρυβλίο. 9. Φυγοκέντρηση στα 500 g για 4 λεπτά σε θερμοκρασία 26 ο C (ή θερμοκρασία δωματίου). 10. Μετά την ολοκλήρωση της φυγοκέντρησης, ακολουθεί μεταφορά του σωλήνα στο θάλαμο νηματικής ροής και αναρρόφηση του υπερκειμένου με πιπέτα Pasteur υπό κενό. 11. Επαναιώρηση των κυττάρων σε 3 ml πλήρους θρεπτικού μέσου (στην περίπτωση ανακαλλιέργειας) ή σε 3 ml αντίστοιχου θρεπτικού μέσου χωρίς ορό (στην περίπτωση πειράματος κυτταρικής μετανάστευσης). 12. Επαναιώρηση των κυττάρων με τη βοήθεια πιπέτας. 13. Προσθήκη 10 μl από το εναιώρημα των κυττάρων στην ειδική υποδοχή του αιματοκυτταρόμετρου και μέτρηση του αριθμού των κυττάρων. 14. Υπολογισμός του αριθμού των κυττάρων. 15. Για κάθε ανακαλλιέργεια χρησιμοποιούνται κύτταρα ανά ml πλήρους θρεπτικού μέσου, εκτός από τις περιπτώσεις που τα κύτταρα θα χρησιμοποιηθούν σε ειδικά πειράματα. Σημείωση: Τα κύτταρα HUVEC που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη ανακαλλιεργήθηκαν μέχρι γενιάς P4. 4. Μέτρηση κυττάρων σε αιματοκυτταρόμετρο Neubauer Η μέτρηση κυττάρων σε αιματοκυτταρόμετρο (Eικόνα Μ1) είναι η πιο άμεση, απλή και αποδοτική μέθοδος μέτρησης κυττάρων που βρίσκονται σε εναιώρημα. Το αιματοκυτταρόμετρο είναι μια τροποποιημένη αντικειμενοφόρος πλάκα που έχει δύο κατάλληλα επεξεργασμένες λείες επιφάνειες. Σε κάθε μία από αυτές διακρίνεται μία διαγράμμιση σε μορφή τετραγωνισμένου πλέγματος, το οποίο αποτελείται από 9 κύρια τετράγωνα με μήκος πλευράς 1 mm (εμβαδόν 83

100 Υλικά και Μέθοδοι τετραγώνου 1 mm 2 ). Το κάθε τετράγωνο ορίζεται από τρείς παράλληλες γραμμές που απέχουν μεταξύ τους 2.5 μm, και οι οποίες χρησιμεύουν για τον καθορισμό της θέσης των κυττάρων εντός ή εκτός του πλέγματος. Σε κάθε ένα από τα αρχικά τετράγωνα περιέχονται επιπλέον διαβαθμίσεις για διευκόλυνση της μέτρησης των κυττάρων. Το αιματοκυτταρόμετρο εμφανίζει δύο ίσου μεγέθους, λείες, προεξέχουσες επιφάνειες, με επίπεδο παράλληλο με τις διαγραμμισμένες, που ονομάζονται «ράχες» και στις οποίες στηρίζεται η καλυπτρίδα. Οι διαγραμμισμένες επιφάνειες βρίσκονται 0.1 mm χαμηλότερα από τις «ράχες». Μεταξύ της εξωτερικής πλευράς κάθε τετραγωνισμένης επιφάνειας και των σημείων που στηρίζεται η καλυπτρίδα, υπάρχει μία κοίλη επιφάνεια. Στην κοίλη αυτή επιφάνεια τοποθετείται το κυτταρικό εναιώρημα, το οποίο με τριχοειδικά φαινόμενα απλώνεται στην τετραγωνισμένη επιφάνεια. Εικόνα Μ1: Αιματοκυτταρόμετρο Neubauer. Παρουσιάζεται σχηματικά και ο τρόπος υπολογισμού των κυττάρων. Ο όγκος του κυτταρικού εναιωρήματος που θα καλύπτει ένα από τα εννέα τετράγωνα είναι 0.1 mm 3 (1 mm 2 x 0.1 mm) ή 10-4 ml. Έτσι η συγκέντρωση των κυττάρων στο κυτταρικό εναιώρημα (κύτταρα/ml) είναι: Αριθμός κυττάρων στο ένα από τα κύρια τετράγωνα x

101 Υλικά και Μέθοδοι 5. Κατάψυξη κυττάρων Η διατήρηση των κυττάρων για μεγάλο διάστημα είναι δυνατή με την αποθήκευσή τους σε υγρό άζωτο, σε θερμοκρασίες μεταξύ -195 ο C και -210 ο C. Για μικρότερο χρονικό διάστημα (λίγους μήνες), μπορεί να διατηρηθεί και σε θερμοκρασίες - 80 ο C. Για την επιτυχή διατήρησή τους, είναι απαραίτητη η καλή μεταβολική τους κατάσταση πριν την ψύξη, για το λόγο αυτό και η διαδικασία κατάψυξης των κυττάρων πραγματοποιείται όταν αυτά έχουν καλύψει το 80-90% της επιφάνειας του τρυβλίου. Για την επιτυχή κατάψυξή τους, είναι απαραίτητη και η βαθμίαία ψύξη τους (περίπου 1 ο C ανά ώρα), μέχρι ένα κρίσιμο σημείο θερμοκρασίας, - 20 ο C. Η βαθμιαία ψύξη επιτυγχάνεται με τη χρήση μιας συσκευής με υποδοχές, η οποία περιέχει ισοπροπανόλη, λόγω της οποίας γίνεται και η σταδιακή ψύξη. Προκειμένου να αποφευχθεί ο σχηματισμός πάγου στο εσωτερικό τους και να ελαχιστοποιηθεί η απώλεια νερού, χρησιμοποιείται διμεθυλο-σουλφοξείδιο (dimethyl-sulfoxide, DMSO) ή γλυκερόλη. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή χρησιμοποιήθηκε μόνο DMSO για την ψύξη ευκαρυωτικών κυττάρων. Υλικά και διαλύματα Διμεθυλο-σουλφοξείδιο (DMSO) Πρέπει να είναι ειδικό για κυτταροκαλλιέργειες (cell culture grade). Πλήρες θρεπτικό μέσο (αναφέρεται αναλυτικά στην Παράγραφο 1) FBS Ειδικά φιαλίδια για την ψύξη των κυττάρων (cryovials) Δοχείο ψύξης κυττάρων με ισοπροπανόλη Δοχείο Dewar με υγρό άζωτο και ειδικές υποδοχές για την αποθήκευση των φιαλιδίων με τα κύτταρα 85

102 Υλικά και Μέθοδοι Πειραματική πορεία 1. Αποκόλληση των κυττάρων με τρυψίνη (όπως αναφέρθηκε στη διαδικασία της ανακαλλιέργειας). Τα κύτταρα από 1 τρυβλίο 100 mm αποθηκεύονται σε ένα φιαλίδιο. 2. Φυγοκέντρηση στα 500 g για 4 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 3. Σημειώνονται στο φιαλίδιο το όνομα της κυτταρικής σειράς, η ημερομηνία κατάψυξης και η γενιά των κυττάρων. 4. Αφαιρείται το υπερκείμενο θρεπτικό μέσο. 5. Το ίζημα των κυττάρων επαναιωρείται σε 900 μl ορού (στην περίπτωση των HUVEC). Εναλλακτικά μπορεί να επαναιωρείται σε 950 μl πλήρους θρεπτικού μέσου (στην περίπτωση των U87MG, M059K, C6, CHO). 6. Μεταφορά του εναιωρήματος των κυττάρων στο ειδικό φιαλίδιο για την ψύξη των κυττάρων. 7. Προσθήκη της ποσότητας DMSO που απαιτείται (100 μl στα HUVEC και 50 μl στα U87MG, M059K, C6, CHO κύτταρα). Την προσθήκη του DMSO ακολουθεί γρήγορη ανάδευση με πιπέτα και άμεση μεταφορά στο δοχείο ψύξης των κυττάρων με ισοπροπανόλη. Οι κινήσεις πρέπει να είναι σύντομες, γιατί το DMSO είναι τοξικό για τα κύτταρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η τελική συγκέντρωση του DMSO δεν πρέπει να υπερβαίνει το 20% στο τελικό διάλυμα για να αποφευχθούν προβλήματα τοξικότητας, ενώ η προσθήκη του μειώνει τη δημιουργία κρυστάλλων νερού στο εσωτερικό των κυττάρων. 8. Τοποθέτηση του δοχείου ψύξης των κυττάρων στους -80 ο C για 24 ώρες. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται η σταδιακή μείωση της θερμοκρασίας (περίπου 1 ο C ανά ώρα). 9. Τοποθέτηση του φιαλιδίου για την ψύξη των κυττάρων σε ειδική υποδοχή βυθισμένη σε υγρό άζωτο στο δοχείο Dewar. 10. Καταγραφή στο τετράδιο του δοχείου Dewar της θέσης που βρίσκεται το φιαλίδιο, του είδους των κυττάρων, της ημερομηνίας και της γενιάς που θα έχουν τα κύτταρα όταν ξεπαγώσουν. 86

103 Υλικά και Μέθοδοι 6. Απόψυξη κυττάρων Με τη διαδικασία αυτή, κύτταρα που βρίσκονται παγωμένα ακόμα και για μεγάλο χρονικό διάστημα, είναι δυνατό να οδηγηθούν σε καλλιέργεια. Λόγω της τοξικότητας του DMSO, οι κινήσεις στη διαδικασία αυτή, όπως και στην κατάψυξη, πρέπει να είναι γρήγορες. Υλικά και διαλύματα Θρεπτικό μέσο της κάθε κυτταρικής σειράς (αναφέρεται αναλυτικά στην Παράγραφο 1) Πλήρες θρεπτικό μέσο της κάθε κυτταρικής σειράς (αναφέρεται αναλυτικά στην Παράγραφο 1) Πιπέτες Pasteur (αποστειρωμένες) Αποστειρώνονται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Πειραματική πορεία 1. Σε δοκιμαστικό σωλήνα των 15 ml προστίθενται 9 ml απλού θρεπτικού μέσου των συγκεκριμένων κυττάρων. 2. Αφαίρεση των κυττάρων από το υγρό άζωτο. 3. Σύντομο ξεπάγωμα με ανακίνηση σε υδατόλουτρο στους 37 ο C. 4. Μεταφορά των κυττάρων στo σωλήνα με τα 9 ml και γρήγορη ανάδευση. Το στάδιο αυτό αποσκοπεί στην αραίωση του DMSO στο θρεπτικό μέσο που βρίσκονται τα κύτταρα. 5. Φυγοκέντρηση στα 500 g για 4 λεπτά στους 26 ο C. 6. Απόρριψη του υπερκειμένου με πιπέτα Pasteur υπό κενό. 7. Επαναιώρηση του ιζήματος των κυττάρων σε 3 ml θρεπτικού μέσου στο δοκιμαστικό σωλήνα. Προσθήκη θρεπτικού μέσου μέχρι όγκου 10 ml. 8. Φυγοκέντρηση στα 500 g για 4 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 9. Απόρριψη του υπερκειμένου με πιπέτα Pasteur υπό κενό. 87

104 Υλικά και Μέθοδοι 10. Επαναιώρηση του ιζήματος των κυττάρων σε 3 ml πλήρους θρεπτικού μέσου στο δοκιμαστικό σωλήνα. Προσθήκη πλήρους θρεπτικού μέσου μέχρι όγκου 10 ml. 11. Μεταφορά των κυττάρων σε τρυβλίο καλλιέργειας. Στην περίπτωση των HUVEC το τρυβλίο πρέπει να έχει επωασθεί με ζελατίνη (Παράγραφος 3). 12. Παρατήρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο. 13. Μεταφορά του τρυβλίου στον επωαστικό θάλαμο. 14. Αλλαγή πλήρους θρεπτικού μέσου κάθε 3 ημέρες μέχρι τα κύτταρα να φθάνουν σε βαθμό επικάλυψης του τρυβλίου 80-90%. 7. Απομόνωση πρωτεϊνών από καλλιέργειες ευκαρυωτικών κυττάρων Η μέθοδος αυτή της απομόνωσης των πρωτεϊνών εφαρμόζεται για την απομόνωση πρωτεϊνών από κυτταροκαλλιέργειες, παγωμένες και μη, στις περιπτώσεις που θα ακολουθήσει ανοσοκατακρήμνιση. Υλικά και διαλύματα PBS (10x) Na 2 HPO M KH 2 PO M NaCl 0.2 M Αραιώνεται σε dh 2 O 10 φορές πριν τη χρήση (PBS 1x, ph 7.4). Διάλυμα RIPA (RIPA buffer) (ph 7.4) PBS 1x Δωδεκακυλοθειϊκό Νάτριο (sodium dodecyl sulfate SDS) 0.1% Triton X-100 1% PMSF 1 mm EDTA 5 mm Απροτινίνη 1μg/ml Na 3 VO 4 20 nm 88

105 Υλικά και Μέθοδοι Πειραματική πορεία 1. Απομάκρυνση υπό κενό του θρεπτικού μέσου της καλλιέργειας. 2. Έκπλυση των κυττάρων 3 φορές με PBS 1x στους 4 ο C. 3. Προσθήκη 600 μl ψυχρού διαλύματος RIPA ανά τρυβλίο 100 mm ή 300 μl ψυχρού διαλύματος RIPA ανά τρυβλίο 60 mm, στους 4 ο C. 4. Παραμονή των τρυβλίων στους 4 ο C σε οριζόντια θέση για χρόνο 10 λεπτά, ώστε να μεγιστοποιηθεί η ποσότητα των εκχυλιζόμενων πρωτεϊνών. Το διάλυμα RIPA πρέπει να καλύπτει ιδανικά το τρυβλίο. Εάν όχι, πρέπει να πραγματοποιούνται τακτικές αναδεύσεις των τρυβλίων. 5. Λύση των κυττάρων με μηχανικό τρόπο (cell scraper) σε πάγο. 6. Μεταφορά του ομογενοποιήματος σε σωληνάρια φυγοκέντρου. 7. Φυγοκέντρηση στα g για 30 λεπτά στους 4 ο C. 8. Μεταφορά του υπερκειμένου σε νέο σωληνάριο φυγοκέντρου. 9. Ακολουθεί προσδιορισμός ολικών πρωτεϊνών στο υπερκείμενο με τη μέθοδο Bradford (ακολουθεί). 8. Προσδιορισμός της συγκέντρωσης ολικών πρωτεϊνών σε διάλυμα (Μέθοδος Bradford) (Bradford, 1976) Η συγκέντρωση των πρωτεϊνών σε ένα διάλυμα προσδιορίζεται εύκολα με χρωματομετρικές μεθόδους ή με μέτρηση της οπτικής απορρόφησης των δειγμάτων σε μήκος κύματος Α=280 nm. Από τις πιο σύντομες και αξιόπιστες μεθόδους για προσδιορισμό μικροποσοτήτων πρωτεϊνών είναι η μέθοδος Bradford. Βασίζεται στην ικανότητα δέσμευσης της χρωστικής Coomasie G-250 σε βασικά αμινοξέα των πρωτεϊνών, αλλάζοντας ταυτόχρονα το μήκος κύματος της μέγιστης απορρόφησής τους. Η μεταβολή της απορρόφησης είναι ανάλογη της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών στο διάλυμα. Για τον ακριβή υπολογισμό της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης με βάση την οπτική απορρόφηση, κατασκευάζεται πρότυπη καμπύλη με γνωστές συγκεντρώσεις αλβουμίνης ορού βοός (bovine 89

106 Υλικά και Μέθοδοι serum albumin BSA). Η αλβουμίνη πρέπει να είναι διαλυμένη στο ίδιο διάλυμα που είναι και οι πρωτεΐνες, των οποίων η συγκέντρωση υπολογίζεται. Υλικά και διαλύματα Διάλυμα Bradford (1x) Coomasie G mm 95% αιθανόλη 5% κ.ό. 85% H 3 PO 4 10% κ.ό. Διήθηση του διαλύματος 3 φορές με χρήση διηθητικού χαρτιού. Πειραματική πορεία 1. Προσθήκη 2 μl εκχυλίσματος κυτταροκαλλιέργειας σε 998 μl διαλύματος Bradford αντίστοιχα. 2. Έντονη ανάδευση σε αναδευτήρα τύπου vortex. 3. Επώαση των δειγμάτων για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 4. Φωτομέτρηση των δειγμάτων στα 595 nm. 5. Υπολογισμός της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών στο δείγμα, μέσω της πρότυπης καμπύλης της αλβουμίνης (BSA). 6. Μεταφορά ποσότητας πρωτεΐνης 3 mg σε σωληνάρια φυγοκέντρου για πειράματα ανοσοκατακρήμνισης με αντισώματα έναντι συγκεκριμένων πρωτεϊνών. 9. Ανοσοκατακρήμνιση (Polykratis et al, 2005) Η ανοσοκατακρήμνιση είναι μια μέθοδος που χρησιμοποιείται για την απομόνωση πρωτεϊνών που είναι σε χαμηλή συγκέντρωση σε κάποιο διάλυμα, εκμεταλλευόμενη τη συγγένεια δέσμευσης που παρουσιάζουν σε ένα ειδικό γι αυτές αντίσωμα. Συγκεκριμένα, η πρωτεΐνη που θέλουμε να απομονώσουμε σχηματίζει σύμπλοκο με αντίσωμα έναντι αυτής, που προσθέτουμε στο διάλυμα. Το ενδιαφέρον της μεθόδου είναι ότι και πρωτεΐνες που φυσιολογικά 90

107 Υλικά και Μέθοδοι αλληλεπιδρούν με την αρχική, επίσης δεσμεύονται στο ίδιο σύμπλοκο. Το γεγονός αυτό καθιστά τη μέθοδο χρήσιμη για μελέτες αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών. Στη συνέχεια, στο διάλυμα προστίθενται σφαιρίδια αγαρόζης που φέρουν στην επιφάνειά τους ομοιοπολικά δεσμευμένη πρωτεΐνη Α ή πρωτεΐνη G. Οι πρωτεΐνες A και G είναι βακτηριακής προέλευσης και δεσμεύουν με μεγάλη συγγένεια την Fc περιοχή ορισμένων τύπων IgG ανοσοσφαιρινών. Με τη χρήση τους δημιουργείται ένα σύμπλοκο σφαιριδίων-πρωτεΐνης Α/G-αντισώματος, στο οποίο δεσμεύεται επιλεκτικά το αντιγόνο που θέλουμε να κατακρημνίσουμε. Το σύμπλοκο αυτό απομονώνεται με φυγοκέντρηση και οι πρωτεΐνες που υπάρχουν σε αυτό αποδεσμεύονται με τη χρήση αποδιατακτικών παραγόντων. Υλικά και διαλύματα PBS (10x) Na 2 HPO M KH 2 PO M NaCl 0.2 M Αραιώνεται σε dh 2 O 10 φορές πριν τη χρήση (PBS 1x, ph 7.4) Εναιώρημα σφαιριδίων αγαρόζης με πρωτεΐνη A (Calbiochem, Cat. No. IP02) Εναιώρημα σφαιριδίων αγαρόζης με πρωτεΐνη G (Calbiochem, Cat. No. IP04) Ρυθμιστικό διάλυμα δειγμάτων (2x) Tris-HCl ph M SDS 0.03 M Γλυκερόλη 10% κ.ό. Κυανούν της βρωμοφαινόλης 2% κ.ό. β-μερκαπτοαιθανόλη 10% κ.ό. Αντισώματα Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν παρατίθενται στον Πίνακα Μ1. 91

108 Υλικά και Μέθοδοι Πειραματική πορεία Έχει προηγηθεί ο υπολογισμός της συγκέντρωσης της ολικής πρωτεΐνης με τη μέθοδο Bradford (Παράγραφος 8) και η μεταφορά της ποσότητας πρωτεΐνης που θα ανοσοκατακρημνισθεί σε νέα σωληνάρια των 1.5 ml. Στη συνέχεια πραγματοποιείται η ακόλουθη πορεία: 1. Προσθήκη σε κάθε σωληνάριο ψυχρού διαλύματος PBS 1x μέχρι ο όγκος του μίγματος να είναι ο ίδιος σε όλα τα δείγματα. Αυτό πραγματοποιείται προκειμένου να επιτευχθεί η ίδια κινητική δέσμευσης των πρωτεϊνών σε όλα τα σωληνάρια. 2. Προσθήκη του κατάλληλου αντισώματος (Πίνακας Μ1) σε ποσότητα ανάλογη με την ποσότητα της πρωτεΐνης. 3. Ανάδευση για 16 ώρες στους 4 ο C. Στο στάδιο αυτό πραγματοποιείται η δέσμευση του αντισώματος στην αντίστοιχη πρωτεΐνη. 4. Προσθήκη στα σωληνάρια 15 μl (για 3 mg ολικής πρωτεΐνης) εναιωρήματος σφαιριδίων πρωτεΐνης Α και πρωτεΐνης G. 5. Ανάδευση για 2 ώρες στους 4 o C. Στο στάδιο αυτό πραγματοποιείται η δέσμευση του συμπλόκου πρωτεΐνης-αντισώματος με τα σφαιρίδια. 6. Φυγοκέντρηση στα g για 5 λεπτά στους 4 ο C. 7. Απόρριψη του υπερκειμένου. 8. Προσθήκη 1 ml ψυχρού PBS 1x ανά σωληνάριο (επαναιώρηση των σφαιριδίων). 9. Η φυγοκέντρηση και η απόρριψη του υπερκειμένου επαναλαμβάνονται ακόμα 2 φορές. 10. Στο ίζημα των σφαιριδίων που έχει απομείνει προστίθενται 50 μl ρυθμιστικού διαλύματος δειγμάτων (2x). 11. Τα σωληνάρια θερμαίνονται στους 100 ο C για χρόνο 5 λεπτά. Στα στάδια 10-11, λαμβάνει χώρα η αποδέσμευση των πρωτεϊνών από τα σφαιρίδια. 12. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα g για 1 λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου. 13. Μεταφορά του υπερκειμένου σε νέα σωληνάρια φυγοκέντρου. Απόρριψη των σφαιριδίων. 92

109 Υλικά και Μέθοδοι 14. Αποθήκευση των σωληναρίων στους -20 ο C μέχρι την πραγματοποίηση ηλεκτροφόρησης SDS-PAGE (Παράγραφος 10) και ανάλυση κατά Western (Παράγραφος 11). Πίνακας Μ1: Παράθεση των αντισωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοκατακρήμνιση στην παρούσα εργασία. Στις στήλες από αριστερά αναγράφεται η πρωτεΐνη έναντι της οποίας πραγματοποιήθηκε η ανοσοκατακρήμνιση, η εταιρία παραγωγής, ο κωδικός του προϊόντος και η ποσότητα του αντισώματος που χρησιμοποιήθηκε ανά mg πρωτεΐνης. Πρωτεΐνη Εταιρία Κωδικός Ποσότητα α ν β 3 Chemicon MAB1976Z 3 μg/3 mg πρωτεΐνης α ν Chemicon AB1930 5μl/3 mg πρωτεΐνης β 3 Chemicon CBL479 1,5 μg/3 mg πρωτεΐνης PTN Santa Cruz H-75 1 μg/3 mg πρωτεΐνης NCL Santa Cruz MS-3 6 μg/3 mg πρωτεΐνης RPTPβ/ζ Santa Cruz C-19 3 μg/3 mg πρωτεΐνης IgG Sigma I 2511 Αντίστοιχη ποσότητα με αυτήν των αντισωμάτων έναντι των υπό μελέτη αντιγόνων GFP Invitrogen G μg/3 mg πρωτεΐνης GFP Santa Cruz B-2 6 μg/3 mg πρωτεΐνης 10. Ανάλυση πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακριλαμιδίου με αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) (Laemmli, 1970; Neville, 1971) Υλικά και διαλύματα Διάλυμα ακρυλαμιδίου 30% κ.β. (ακρυλαμίδιο/μεθυλεν-δις-ακρυλαμίδιο 30/1) Ακρυλαμίδιο 30 g Μεθυλεν-δις-ακρυλαμίδιο 1 g Απεσταγμένο νερό μέχρι τελικού όγκου 100 ml 93

110 Υλικά και Μέθοδοι Tris-HCl 1.5M, ph 8.8 Tris-base g Απεσταγμένο νερό Αρχική προσθήκη 80 ml απεσταγμένου νερού, ρύθμιση του διαλύματος σε ph=8.8 και προσθήκη απεσταγμένου νερού μέχρι τελικού όγκου 100 ml. Tris-HCl 0.5M, ph 6.8 Tris-base g Απεσταγμένο νερό Αρχική προσθήκη 80 ml απεσταγμένου νερού, ρύθμιση του διαλύματος σε ph=6.8 και προσθήκη απεσταγμένου νερού μέχρι τελικού όγκου 100 ml. Διάλυμα δωδεκακυλοθειικού νατρίου (SDS) 10% κ.β. SDS 10 g Απεσταγμένο νερό Αρχική προσθήκη 90 ml απεσταγμένου νερού, θέρμανση στους 68 ο C, ρύθμιση του διαλύματος σε ph=7.9 και προσθήκη απεσταγμένου νερού μέχρι τελικού όγκου 100 ml. Διάλυμα υπερθειικού αμμωνίου (AMPS) 20% κ.β. (N,N,N,N -Tetramethylenethylene- Ν,Ν,Ν,Ν -Τετραμεθυλ-αιθυλεν-διαμίνη diamine, TEMED) Ρυθμιστικό διάλυμα δειγμάτων (2x) Tris-HCl ph M SDS 0.03 M Γλυκερόλη 10% κ.ό. Κυανούν της βρωμοφαινόλης 2% κ.ό. β-μερκαπτοαιθανόλη 10% κ.ό. Ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροδίων (5x) (Running Buffer) Γλυκίνη 2Μ Tris-base 0.25M SDS 0.02M Αραίωση του διαλύματος με απεσταγμένο νερό 1:5 πριν τη χρήση του. 94

111 Υλικά και Μέθοδοι Πειραματική πορεία Στην παρούσα εργασία η ανάλυση των πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου πραγματοποιήθηκε παρουσία αποδιατακτικών παραγόντων. Η πορεία που ακολουθείται έχει ως εξής: 1. Συναρμολόγηση της συσκευής του πηκτώματος. 2. Παρασκευή του πηκτώματος διαχωρισμού. Ανάλογα με το μοριακό βάρος της υπό εξέταση πρωτεΐνης, παρασκευάζεται πήκτωμα διαχωρισμού με συγκεκριμένη συγκέντρωση ακρυλαμιδίου. Η συγκέντρωση ακρυλαμιδίου αυξάνει όσο μειώνεται το μοριακό βάρος της υπό μελέτη πρωτεΐνης. Τα πηκτώματα που χρησιμοποιούνται στην παρούσα εργασία παρατίθενται στον Πίνακα Μ2. 3. Την παρασκευή του πηκτώματος και την προσθήκη του στη συσκευή ακολουθεί η προσθήκη 1-2 ml απεσταγμένου νερού. Το υπερκείμενο νερό διευκολύνει τη συμπαγή δομή του πηκτώματος και σταθεροποιεί την επάνω επιφάνειά του. Απομακρύνεται μετά τον πολυμερισμό του πηκτώματος και πριν την παρασκευή του πηκτώματος συμπύκνωσης. 4. Προσθήκη εξαρτήματος (χτενάκι) που χρησιμεύει στη δημιουργία θέσεων προσθήκης του δείγματος στο πήκτωμα συμπύκνωσης. Πίνακας Μ2: Σύσταση των πηκτωμάτων διαχωρισμού. Πυκνότητα πηκτώματος 17.5% 12% 7.5% 6.2% 5% Απεσταγμένο H 2 O ml 3.29 ml 4.68 ml ml 5.08 ml Ακρυλαμίδιο 30% ml 5.0 ml 2.51 ml 2.09 ml 1.67 ml Tris-HCl 1.5M ph ml 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml 10% SDS 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 20% AMPS 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl TEMED 10 μl 10 μl 10 μl 10 μl 10 μl 95

112 Υλικά και Μέθοδοι 5. Παρασκευή του πηκτώματος συμπύκνωσης. Η συγκέντρωσή του εξαρτάται από τη συγκέντρωση του πηκτώματος διαχωρισμού. Η σύστασή του παρατίθεται στον Πίνακα Μ3. 6. Προσθήκη του πηκτώματος συμπύκνωσης στη συσκευή και αναμονή για τον πολυμερισμό του (10-20 λεπτά). 7. Σε αυτό το χρονικό διάστημα είναι εφικτή η προετοιμασία των δειγμάτων. Τα δείγματα συνήθως φυλάσσονται στους -20 o C. 8. Θέρμανση των δειγμάτων στους 100 ο C για χρόνο 5 λεπτά. 9. Φυγοκέντρηση στα g για 1 λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου. Πίνακας Μ3: Σύσταση πηκτωμάτων συμπύκνωσης. Πυκνότητα πηκτώματος 3.5% 5% Απεσταγμένο H 2 O 2.45 ml 2.25 ml Ακρυλαμίδιο 30% ml 0.67 ml Tris-HCl 0.5M ph ml 1.0 ml 10% SDS 40 μl 40 μl 20% AMPS 40 μl 40 μl TEMED 4 μl 4 μl 10. Με την ολοκλήρωση του χρόνου πολυμερισμού του πηκτώματος συμπύκνωσης, απομακρύνεται το εξάρτημα (χτενάκι) και μεταφέρεται η συσκευή του πηκτώματος στη συσκευή ηλεκτροφόρησης. 11. Μεταφορά καθορισμένης ποσότητας ολικής πρωτεΐνης από κάθε δείγμα στις θέσεις-υποδοχές που έχουν σχηματισθεί στο πήκτωμα πακεταρίσματος. 12. Εφαρμογή σταθερής τάσης 100 Volt (120 Volt για δύο πηκτώματα), με αποτέλεσμα τη μετακίνηση των δειγμάτων από τον αρνητικό στο θετικό πόλο του συστήματος. Η απόσταση που διανύει η κάθε πρωτεΐνη στο πήκτωμα διαχωρισμού είναι αντιστρόφως ανάλογη της μοριακής μάζας της. 13. Με την ολοκλήρωση της ηλεκτροφόρησης, ακολουθεί ανάλυση κατά Western. 96

113 Υλικά και Μέθοδοι 11. Ανάλυση πρωτεϊνών κατά Western (Towbin et al, 1979) Υλικά και διαλύματα Ρυθμιστικό διάλυμα για τη συσκευή μεταφοράς πρωτεϊνών Γλυκίνη 0.04 Μ Tris-base 0.05 M SDS 1 mm Μεθανόλη (απόλυτη) 20% κ.ό. Ρυθμιστικό διάλυμα TBS ph 7.6 (10x) Tris-base 0.2 M NaCl 1.36 M Απεσταγμένο νερό Ρύθμιση του διαλύματος σε ph=7.6 και αραίωση του διαλύματος με απεσταγμένο νερό 1:10 πριν τη χρήση του. Ρυθμιστικό διάλυμα TBS-Tween 20, ph 7.6 (TBS-T) Ρυθμιστικό διάλυμα TBS (1x) Tween % κ.ό. Μεμβράνη PVDF (polyvinylidene fluoride) Millipore Immobilon-P Transfer Membrane Μεμβράνη PVDF (polyvinylidene fluoride) Transfer Membrane (Macherey-Nagel). Χρησιμοποιήθηκε μόνο στην περίπτωση κατά Western Analysis ολικής ή φωσφορυλιωμένης στη θέση Y773 ιντεγρίνης β 3. Άπαχο γάλα σε σκόνη (Regilait) Αλβουμίνη ορού βοός (Bovine Serum Albumin, BSA) Σύστημα χημειοφωταύγειας Χρησιμοποιείται το ολοκληρωμένο σύστημα χημειοφωταύγειας από την Pierce (ECL detection kit) (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). 97

114 Υλικά και Μέθοδοι Πρώτα αντισώματα Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε ανάλυση πρωτεϊνών κατά Western παρατίθενται στον Πίνακα Μ4, ενώ στον Πίνακα Μ5 παρατίθενται οι συνθήκες για κάθε αντίσωμα. Πίνακας Μ4: Παράθεση των αντισωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση κατά Western. Στις στήλες από αριστερά αναγράφονται οι πρωτεΐνες, οι κωδικοί των αντισωμάτων και οι εταιρίες παραγωγής τους. Αντίσωμα PTN (H M01) RPTPβ/ζ (R ) α ν (AB1930) β 3 (N-20) β 3 Υ747 (sc ) p38 MAPK #9212 Phospho-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) (D3F9) #4511 SAPK/JNK (56G8) #9258 Phospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) #9251 Anti-Src Antibody, clone GD Non-phospho-Src (Tyr527) Antibody #2107 Actin (2Q1055) NCL (MS-3) GFP (A11122) Προέλευση Μονοκλωνικό αντίσωμα, Abnova Μονοκλωνικό αντίσωμα, BD Transduction Laboratories Biosciences Πολυκλωνικό αντίσωμα, Chemicon Πολυκλωνικό αντίσωμα, Santa Cruz Πολυκλωνικό αντίσωμα, Santa Cruz Πολυκλωνικό αντίσωμα, Cell Signalling Technology Πολυκλωνικό αντίσωμα, Cell Signalling Technology Πολυκλωνικό αντίσωμα, Cell Signalling Technology Πολυκλωνικό αντίσωμα, Cell Signalling Technology Μονοκλωνικό αντίσωμα, Upstate (Millipore) Πολυκλωνικό αντίσωμα, Cell Signalling Technology Μονοκλωνικό αντίσωμα, Santa Cruz Μονοκλωνικό αντίσωμα, Santa Cruz Πολυκλωνικό αντίσωμα, Invitrogen Δεύτερα αντισώματα Τα δεύτερα αντισώματα, των οποίων οι συνθήκες αναφέρονται στον Πίνακα Μ5, είναι τα ακόλουθα: Anti-mouse IgG (A3682, goat, Fab-specific) συνδεδεμένο με υπεροξειδάση (Sigma) Anti-rabbit IgG (A0545, goat, whole molecule) συνδεδεμένο με υπεροξειδάση (Sigma) 98

115 Υλικά και Μέθοδοι Anti-goat IgG (B3148, mouse, clone GT-34) συνδεδεμένο με υπεροξειδάση (Sigma) Στρεπταβιδίνη (S2438) συνδεδεμένη με υπεροξειδάση (Streptavidin-peroxidase polymer) (Sigma) Anti-rabbit IgG (#7074, goat) συνδεδεμένο με υπεροξειδάση (Cell Signalling) Anti-mouse IgG (#7074, horse) συνδεδεμένο με υπεροξειδάση (Cell Signalling) Anti-goat IgG (sc-2020, donkey) συνδεδεμένο με υπεροξειδάση (Santa Cruz) Πίνακας Μ5: Παράθεση των συνθηκών των αντισωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση κατά Western. Στις στήλες από αριστερά αναγράφονται οι πρωτεΐνες, οι συνθήκες παρεμπόδισης της μη ειδικής δέσμευσης και επώασης του 1 ου και του 2 ου αντισώματος. Πρωτεΐνη Παρεμπόδιση μη ειδικής δέσμευσης 1 ο Αντίσωμα 2 ο Αντίσωμα PTN 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 1:1000 σε TBS-T a-mouse 1:5000 σε TBS-T (Sigma) RPTPβ/ζ 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 1:500 σε TBS-T a-mouse 1:5000 σε TBS-T (Sigma ή Cell Signalling) α ν 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 1:5000 σε TBS-T a-rabbit 1:12500 σε TBS-T (Sigma) ή 1:2000 (Cell Signalling) β 3 5% BSA σε TBS-T 1:500 σε TBS-T 2% άπαχο γάλα β 3 Υ747 3% BSA σε TBS-T 1:1000 σε TBS-T p38 MAPK Phospho-p38 MAPK SAPK/JNK Phospho- SAPK/JNK c-src 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 1:1000 σε TBS-T 5% BSA 1:500 σε TBS-T 5% BSA 1:500 σε TBS-T 5% BSA 1:500 σε TBS-T 5% BSA 1:500 σε TBS-T a-goat 1:5000 σε TBS- T 1% άπαχο γάλα (Sigma ή Santa Cruz) a-rabbit 1:2000 σε TBS-T (Cell Signalling) a-rabbit 1:2000 σε TBS-T (Cell Signalling) a-rabbit 1:2000 σε TBS-T (Cell Signalling) a-rabbit 1:2000 σε TBS-T (Cell Signalling) a-rabbit 1:2000 σε TBS-T (Cell Signalling) a-mouse 1:5000 σε TBS-T (Cell Signalling) 99

116 Υλικά και Μέθοδοι Non-phospho-Src 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 1:1000 σε TBS-T a-rabbit 1:2000 σε TBS-T (Cell Signalling) Actin 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 1:1000 σε TBS-T a-mouse 1:5000 σε TBS-T (Sigma) NCL 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 1:200 σε TBS-T a-mouse 1:5000 σε TBS-T (Sigma or Cell Signalling) Βιοτινυλι- ωμένες πρωτεΐνες 3% BSA σε TBS-T _ Αντίσωμα στρεπταβιδίνης συζευγμένο με υπεροξειδάση (Streptavidin- Peroxidase Polymer) 1:5000 σε TBS- T(Sigma) GFP 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 1:1000 σε TBS-T a-rabbit 1:2000 σε TBS-T (Cell Signalling) Πειραματική πορεία 1. Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφορητικής ανάλυσης ακολουθεί τοποθέτηση του πηκτώματος διαχωρισμού σε κατάλληλη συσκευή, για τη μεταφορά των πρωτεϊνών από το πήκτωμα σε μεμβράνη PVDF. 2. Η μεταφορά πραγματοποιείται με εφαρμογή ομοιογενούς ηλεκτρικού πεδίου (ηλεκτρομεταφορά). Το πήκτωμα και η μεμβράνη εμβαπτίζονται σε ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς και εφαρμόζεται σταθερή ένταση ρεύματος 400 ma για χρόνο 3-4 ώρες, έτσι ώστε οι αρνητικά φορτισμένες πρωτεΐνες οι οποίες βρίσκονται στο πήκτωμα να μεταφερθούν στη μεμβράνη PVDF. Ο χρόνος της μεταφοράς είναι ανάλογος με το μοριακό μέγεθος των πρωτεϊνών που είναι να μεταφερθούν. 3. Μετά το τέλος της μεταφοράς, ακολουθεί εμβάπτιση της μεμβράνης σε ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T. Πραγματοποιούνται δύο ξεπλύματα των 5 λεπτών το καθένα υπό ανακίνηση, σε θερμοκρασία δωματίου. 4. Ακολουθεί κορεσμός των μη ειδικών θέσεων πρόσδεσης των αντισωμάτων (blocking) με επώαση της μεμβράνης σε ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T με 3% BSA ή 5% άπαχο γάλα, ανάλογα με το πρώτο αντίσωμα (Πίνακας Μ5). Η μεμβράνη και 100

117 Υλικά και Μέθοδοι στις δύο περιπτώσεις επωάζεται υπό ανακίνηση για δύο ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Εξαίρεση παρουσιάζεται στην περίπτωση βιοτινυλιωμένων πρωτεϊνών, όπου η επώαση (με 3% BSA) διαρκεί 16 ώρες στους 4 ο C. 5. Ακολουθεί απόχυση του παραπάνω διαλύματος και η μεμβράνη υφίσταται 3 ξεπλύματα των 5 λεπτών με διάλυμα TBS-T σε θερμοκρασία δωματίου. 6. Επώαση πρώτου αντισώματος: Η μεμβράνη επωάζεται με ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T που περιέχει το πρώτο αντίσωμα σε κατάλληλη αραίωση (Πίνακας Μ5). Η επώαση πραγματοποιείται υπό ανακίνηση στους 4 ο C για 16 ώρες. 7. Απόχυση του διαλύματος του πρώτου αντισώματος (το διάλυμα φυλάσσεται στους -20 ο C και μπορεί να επαναχρησιμοποιηθεί). Η μεμβράνη υφίσταται 3 ξεπλύματα των 5 λεπτών με διάλυμα TBS-T σε θερμοκρασία δωματίου. 8. Επώαση δευτέρου αντισώματος: Η μεμβράνη επωάζεται με ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T που περιέχει το δεύτερο αντίσωμα σε κατάλληλη αραίωση (Πίνακας Μ5). Η επώαση πραγματοποιείται υπό ανακίνηση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. 9. Απόχυση του διαλύματος του δευτέρου αντισώματος. Η μεμβράνη υφίσταται 5 ξεπλύματα των 5 λεπτών με TBS-T και 2 ξεπλύματα με TBS (για να απομακρυνθεί το Tween). 10. Το ανοσοαποτύπωμα της πρωτεΐνης στη μεμβράνη εμφανίζεται στο φιλμ με τη χρήση του συστήματος χημειοφωταύγειας (ECL). 12. Διαδικασία αποδέσμευσης αντισώματος από PVDF μεμβράνη (stripping) (Kain et al, 1994) Η διαδικασία της ανάλυσης των πρωτεϊνών κατά Western παρέχει τη δυνατότητα επαναχρησιμοποίησης των μεμβρανών με επώαση με διαφορετικά αντισώματα. Με τη διαδικασία της αποδέσμευσης των αντισωμάτων (stripping) πραγματοποιείται αποκόλληση από τη μεμβράνη των συμπλόκων πρώτου και δεύτερου αντισώματος, ενώ παραμένουν προσκολλημένες στη μεμβράνη οι 101

118 Υλικά και Μέθοδοι ισχυρά δεσμευμένες (με υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις) σε αυτήν πρωτεΐνες από την ηλεκτρομεταφορά. Υλικά και διαλύματα Διάλυμα αποδέσμευσης των αντισωμάτων από τη μεμβράνη Tris-HCl 62.5 mm, ph 6.8 SDS 2% κ.β. β-μερκαπτοαιθανόλη 100 mm Ρυθμιστικό διάλυμα TBS-Tween 20, ph 7.6 (TBS-T) Ρυθμιστικό διάλυμα TBS (1x) Tween % κ.ό. Πειραματική πορεία 1. Μετά την έκθεση της μεμβράνης στο φιλμ ακολουθούν 3 επωάσεις των 5 λεπτών στη μεμβράνη υπό ανακίνηση με ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T. 2. Επώαση της μεμβράνης στο διάλυμα αποδέσμευσης των αντισωμάτων για 30 λεπτά σε θερμοκρασία ο C υπό ανακίνηση. 3. Ακολουθούν 6 επωάσεις των 5 λεπτών στη μεμβράνη υπό ανακίνηση με ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T. 4. Πραγματοποιείται επώαση για την κάλυψη των ελεύθερων θέσεων της μεμβράνης και επαναλαμβάνεται η διαδικασία ανάλυσης των πρωτεϊνών κατά Western. 13. Ποσοτικοποίηση ανοσοαποτυπωμάτων με σύστημα ανάλυσης εικόνας Προκειμένου να εξαχθούν ποσοτικά συμπεράσματα από ανοσοαποτυπώματα, έγινε ποσοτικοποίηση των ζωνών με τη χρήση συστήματος ανάλυσης εικόνας. Τα ανοσοαποτυπώματα ψηφιοποιούνται με χρήση σαρωτή (Epson Stylous SX300) και οι ψηφιακές φωτογραφίες αναλύονται με το πρόγραμμα Scion Image (Scion Corporation). Το λογισμικό είναι ρυθμισμένο κατάλληλα, ώστε για κάθε ζώνη που 102

119 Υλικά και Μέθοδοι περιγράφεται, να καταγράφεται αυτόματα σε ένα λογιστικό φύλλο η επιφάνεια της ζώνης και η μέση έντασή της. Το γινόμενο των δύο αυτών παραμέτρων είναι ανάλογο της ποσότητας της πρωτεΐνης που αντιστοιχεί σε κάθε ζώνη και χρησιμοποιείται περαιτέρω για ποσοτικές αναλύσεις. 14. Διαμόλυνση κυττάρων με παρεμβαλλόμενο RNA (sirna, RNAi) Σε αυτήν την πειραματική διαδικασία πραγματοποιήθηκε παροδική διαμόλυνση κυττάρων με παρεμβαλλόμενο RNA που είχε στόχο το mrna της NCL ή του RPTPβ/ζ ή των α ν ή β 3 υπομονάδων ιντεγκρινών. Ως φορέας για τη μεταφορά του παρεμβαλλόμενου RNA στο εσωτερικό των κυττάρων χρησιμοποιήθηκε ανιονική αμίνη. Δεδομένου ότι η συγκέντρωση του παρεμβαλλόμενου RNA, καθώς και η πυκνότητα των κυττάρων που υφίστανται τη διαμόλυνση επηρεάζουν το ποσοστό μετασχηματισμού και την τοξικότητα, προηγήθηκαν πειράματα για να καθορισθούν οι συνθήκες για την αναστολή της έκφρασης των υπό μελέτη πρωτεϊνών (Polykratis et al, 2005; Mikelis et al, 2009). Υλικά και διαλύματα Θρεπτικό μέσο (χωρίς αντιβιοτικά) Μ199 85% κ.ό. Dulbecco s modified Eagle medium (DMEM)/Ham s F12 90% κ.ό. Πλήρες θρεπτικό μέσο (χωρίς αντιβιοτικά) Μ199 (αναφέρεται αναλυτικά στην Παράγραφο 1) Dulbecco s modified Eagle medium (DMEM)/Ham s F12 90% κ.ό., με 10% FBS Jet SI TM -ENDO (402-04, Polyplus Transfection, Illkirch, France) Αλληλουχίες sirna για τη NCL (InVitrogen, Carlsbad, CA, USA) Νοηματική αλληλουχία Αντι-νοηματική αλληλουχία 5 -GGAAGGUCAGCAGUCUUCCAUGAGA-3 5 -UCUCAUGGAAGACUGCUGACCUUCC-3 103

120 Υλικά και Μέθοδοι Αλληλουχίες sirna για τον RPTPβ/ζ (VBC-Biotech Services, Vienna, Austria) Νοηματική αλληλουχία Αντι-νοηματική αλληλουχία 5 -AAAUGCGAAUCCUAAAGCGUU-3 5 -AACGCUUUAGGAUUCGCAUUU-3 Duplex αλληλουχίες sirna για την α ν και β 3 υπομονάδα ιντεγκρινών (sc και sc-29375, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, USA) Silencer R Negative Control sirna (Ambion, #4635) Πειραματική πορεία 1. Πραγματοποιείται η διαδικασία της ανακαλλιέργειας, όπως περιγράφεται στην Παράγραφο 3. Χρησιμοποιούνται κύτταρα σε τρυβλία των 7.5 mm, κύτταρα σε μικροπλακίδια 6 κελιών (six-well plate), κύτταρα σε τρυβλία των 60 mm και κύτταρα σε τρυβλία των 100 mm. Στην περίπτωση των HUVEC, τα τρυβλία πρέπει να έχουν επωασθεί με διάλυμα ζελατίνης 1% σε PBS 1x. 2. Επώαση των κυττάρων για 24 ώρες με πλήρες θρεπτικό μέσο χωρίς αντιβιοτικά. 3. Παρατήρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο. Tα κύτταρα κάλυπταν περίπου το 40% της επιφάνειας του τρυβλίου. 4. Προσθήκη 13 μl/150 μl/150 μl/300 μl (για 7.5 mm/μικροπλακίδια 6 κελιών/60 mm/100 mm τρυβλία, αντίστοιχα) σκέτου θρεπτικού μέσου χωρίς αντιβιοτικά σε σωληνάρια φυγοκέντρου (2 σωληνάρια ανά τρυβλίο). 5. Προσθήκη 0.8 μl/6.3 μl/9.6 μl/12.8 μl διαλύματος jetsi ΤΜ -ENDO για 7.5 mm/μικροπλακίδια 6 κελιών/60 mm/100 mm τρυβλία αντίστοιχα, σε ένα από τα δύο σωληνάρια φυγοκέντρου ανά τρυβλίο. 6. Άμεση και έντονη ανάδευση σε αναδευτήρα τύπου vortex. 7. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. 8. Στο διάστημα της επώασης πραγματοποιείται προσθήκη της αναγκαίας ποσότητας του παρεμβαλλόμενου RNA στο άλλο σωληνάριο (για το κάθε τρυβλίο). Η τελική συγκέντρωση του παρεμβαλλόμενου RNA είναι 60 nm για την 104

121 Υλικά και Μέθοδοι περίπτωση του RPTPβ/ζ, 68 nm για την περίπτωση της NCL και 33 nm για την περίπτωση των α ν και β 3 υπομονάδων ιντεγκρινών. 9. Ήπια ανάδευση του μίγματος RNA-θρεπτικού μέσου σε αναδευτήρα τύπου vortex. 10. Με την ολοκλήρωση της επώασης, ακολουθεί προσθήκη του μίγματος jetsi ΤΜ - ENDO-θρεπτικό μέσο στο μίγμα RNA-θρεπτικό μέσο (26 μl/200 μl/300 μl και 500 μl) για 7.5 mm/μικροπλακίδια 6 κελιών/60 mm και 100 mm τρυβλία αντίστοιχα. Είναι απαραίτητη η ανάμιξη των συστατικών με αυτή τη φορά. 11. Άμεση ανάδευση του μίγματος σε αναδευτήρα τύπου vortex για 10 δευτερόλεπτα. 12. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. 13. Στη διάρκεια αυτής της επώασης αφαιρείται το θρεπτικό μέσο από τα τρυβλία και προστίθεται σε αυτά νέο πλήρες θρεπτικό μέσο χωρίς αντιβιοτικά, προθερμασμένο στους 37 ο C. Η ποσότητα του θρεπτικού μέσου που προστίθεται είναι 200 μl/2 ml/3ml και 6 ml σε τρυβλία 7.5 mm/μικροπλακίδια 6 κελιών/60 mm και 100 mm, αντίστοιχα. 14. Με το πέρας της επώασης ακολουθεί προσθήκη του μίγματος στα τρυβλία και ήπια ανάδευση. 15. Πραγματοποιείται επώαση των κυττάρων για 4 ώρες στον επωαστικό θάλαμο. 16. Προσθήκη ποσότητας (100 μl/2 ml/3 ml και 6 ml) προθερμασμένου πλήρους θρεπτικού μέσου χωρίς αντιβιοτικά στο κάθε τρυβλίο. 17. Επώαση των κυττάρων στον επωαστικό θάλαμο για 24 ώρες (για την περίπτωση της NCL ή των α ν και β 3 υπομονάδων) ή 48 ώρες (για την περίπτωση του RPTPβ/ζ). 18. Ακολουθεί λύση των κυττάρων για απομόνωση πρωτεΐνης (Παράγραφος 7) ή αντικατάσταση θρεπτικού μέσου με νέο χωρίς ορό, για πειράματα μελέτης χημειοτακτισμού (Παράγραφος 16) ή για μελέτες ανοσοφθορισμού (Παράγραφος 22). 105

122 Υλικά και Μέθοδοι 15. Μετασχηματισμός ευκαρυωτικών κυττάρων M059K και U87MG Ο παροδικός μετασχηματισμός ευκαρυωτικών κυττάρων αφορά στην εισαγωγή ενός κυκλικού μορίου DNA (πλασμιδίου) στο κύτταρο και την έκφρασή του για μία ή λίγες γενιές. Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε παροδικός μετασχηματισμός καρκινικών κυττάρων Μ059Κ με πλασμίδια που φέρουν τη γονιδιακή αλληλουχία της ιντεγκρίνης β 3 (wtβ 3 ), της μεταλλαγμένης β 3, με αντικατάσταση των τυροσινών 773 είτε 785 με φαινυλαλανίνες (β 3 Υ773F και β 3 Y785F, αντίστοιχα), της διπλά μεταλλαγμένης β 3 (β 3 Y773F/Y785F) καθώς και με το πλασμίδιο-φορέα. Το πλασμίδιο-φορέας που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή την περίπτωση, ήταν το pcdna3.1. Ακόμα, στην παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε παροδικός μετασχηματισμός καρκινικών κυττάρων U87MG με πλασμίδια που φέρουν τη γονιδιακή αλληλουχία της NCL συζευγμένης με GFP (GFP-NCL), τμήματα της γονιδιακής αλληλουχίας της NCL που κωδικοποιούν τα αμινοξέα 1-275, , , συζευγμένα με GFP (Μ1, Μ2 και Μ3 αντιστοίχως) (Εικόνα Μ2), καθώς και με το πλασμίδιο-φορέα (το οποίο εκφράζει την GFP πρωτεΐνη). Το πλασμίδιο-φορέας που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή την περίπτωση, ήταν pegfpc1. Για την παρασκευή και τον έλεγχο κλωνοποίησης των pegfp-c1 πλασμιδίων, βλέπε Εικόνα Μ4. Υλικά και διαλύματα Θρεπτικό μέσο Dulbecco s modified Eagle medium (DMEM)/Ham s F12 90% κ.ό. Πλήρες θρεπτικό μέσο Dulbecco s modified Eagle medium (DMEM)/Ham s F12 90% κ.ό., με 10% FBS jetpei TM -HUVEC (Polyplus Transfection, #108-01N) jetpei TM (Polyplus Transfection, #101-10N) NaCl 150 mm (αποστειρωμένο) 106

123 Υλικά και Μέθοδοι Εικόνα Μ2: Σχηματική αναπαράσταση πεπτιδικών τμημάτων της NCL έπειτα από απαλοιφή συγκεκριμένων περιοχών του γονιδίου της, συζευγμένα με τη GFP-πρωτεΐνη, η οποία εδράζεται στο αμινοτελικό άκρο των χιμαιρικών πρωτεϊνών σε κάθε περίπτωση. Η αγρίου τύπου NCL αναφέρεται ως GFP-NCL, το αμινοτελικό άκρο (αμινοξέα 1-275) αναφέρεται ως Μ1, οι RNA δεσμευτικές περιοχές (αμινοξέα ) αναφέρονται ως Μ2 και οι RNA δεσμευτικές περιοχές μαζί με την RGG περιοχή του καρβοξυτελικού άκρου (αμινοξέα ) αναφέρονται ως Μ3. Πειραματική πορεία Η διαδικασία πραγματοποιείται σε θάλαμο νηματικής ροής σε στείρες συνθήκες. Τα πειράματα παροδικού μετασχηματισμού των κυττάρων Μ059Κ πραγματοποιήθηκαν σε τρυβλία των 60 mm και μικροπλακίδια 6 κελιών, ενώ για τα κύτταρα U87MG, τα πειράματα παροδικού μετασχηματισμού πραγματοποιήθηκαν σε τρυβλία των 60 mm. 1. Πραγματοποιείται η διαδικασία της ανακαλλιέργειας, όπως περιγράφεται στην Παράγραφο 3. Χρησιμοποιούνται ή κύτταρα ανά μικροπλακίδιο 6 κελιών ή 60 mm τρυβλίο αντίστοιχα, σε πλήρες θρεπτικό μέσο. 2. Επώαση των κυττάρων για 24 ώρες. 3. Παρατήρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο. Τα κύτταρα θα πρέπει να έχουν καλύψει το 50-60% της επιφάνειας του τρυβλίου πριν τη διαμόλυνσή τους. 4. Αφαίρεση του θρεπτικού μέσου και προσθήκη 2 ml ή 4 ml πλήρους θρεπτικού μέσου προθερμασμένου στους 37 ο C, σε μικροπλακίδιο 6 κελιών ή 60 mm τρυβλίο, αντίστοιχα. 5. Υπολογισμός των συμπλόκων: Ο παροδικός μετασχηματισμός πραγματοποιήθηκε με αναλογία Ν/Ρ=5 (N/P ratio=5). Στην περίπτωση παροδικής 107

124 Υλικά και Μέθοδοι διαμόλυνσης των κυττάρων Μ059Κ χρησιμοποιήθηκε το αντιδραστήριο jetpei ΤΜ - HUVEC, ενώ στην περίπτωση παροδικής διαμόλυνσης των κυττάρων U87MG χρησιμοποιήθηκε το αντιδραστήριο jetpei ΤΜ. Η αναλογία Ν/Ρ αντιστοιχεί σε αναλογία του αντιδραστηρίου jetpei ΤΜ -HUVEC ή jetpei ΤΜ προς το DNA, αναφορικά με μόρια αζώτου του αντιδραστηρίου προς μόρια φωσφόρου του DNA. Δεδομένου ότι το διάλυμα jetpei TM -HUVEC ή jetpei ΤΜ, έχει συγκέντρωση 7.5 mm και 1 μg DNA περιέχει 3 nmoles φωσφορικά ανιόντα, η ποσότητα jetpei TM - HUVEC ή jetpei ΤΜ που χρησιμοποιείται υπολογίζεται από τον τύπο: μl από jetpei TM -HUVEC ή jetpei ΤΜ = [(μg DNA x 3) x N/P ratio]/7.5 Στα πειράματα παροδικής διαμόλυνσης κυττάρων Μ059Κ χρησιμοποιήθηκε ποσότητα 6 μg DNA ανά μικροπλακίδιο 6 κελιών ή 10 μg DNA ανά τρυβλίο 60 mm, ενώ στα πειράματα παροδικής διαμόλυνσης κυττάρων U87MG χρησιμοποιήθηκε ποσότητα 5μg DNA ανά τρυβλίο 60 mm. 6. Προσθήκη αντιδραστηρίου jetpei TM -HUVEC ή jetpei ΤΜ και DNA σε σωληνάρια φυγοκέντρου, κάθε ένα από τα οποία περιέχει 120 μl ή 300 μl NaCl 150 mm, ανά μικροπλακίδιο 6 κελιών ή ανά τρυβλίο 60 mm αντιστοίχως. 7. Ελαφρά ανάδευση με αναδευτήρα τύπου vortex. 8. Προσθήκη του περιεχομένου του σωληναρίου με το jetpei TM -HUVEC είτε το jetpei TM, στο σωληνάριο με το DNA. Είναι απαραίτητη η ανάμιξη των συστατικών με αυτή τη φορά. 9. Άμεση ανάδευση σε αναδευτήρα τύπου vortex. 10. Επώαση του μίγματος για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 11. Προσθήκη 200 μl ή 500 μl από το μίγμα ανά μικροπλακίδιο 6 κελιών ή ανά τρυβλίο 60 mm και ακολουθεί ήπια ανάδευση. 12. Επώαση των κυττάρων στον επωαστικό θάλαμο για 4 ώρες. 13. Αντικατάσταση του θρεπτικού μέσου με 2 ml ή 5 ml προθερμασμένου πλήρους θρεπτικού μέσου, ανά μικροπλακίδιο 6 κελιών ή ανά τρυβλίο 60 mm. 14. Επώαση των κυττάρων στον επωαστικό θάλαμο για 24 ώρες. 15. Ακολουθεί λύση των κυττάρων για απομόνωση πρωτεΐνης όπως περιγράφεται στην Παράγραφο 7, αντικατάσταση θρεπτικού μέσου με νέο χωρίς 108

125 Υλικά και Μέθοδοι ορό όπως περιγράφεται στην Παράγραφο 17, ή μονιμοποίηση των κυττάρων όπως περιγράφεται στην Παράγραφο 22, ανάλογα με το είδος του πειράματος που ακολουθεί. 16. Μελέτη του χημειοτακτισμού των κυττάρων (Transfilter assay) (Polytarchou et al, 2005) Με το πείραμα αυτό μελετάται η επίδραση μιας ουσίας στο χημειοτακτισμό των κυττάρων. Η χρησιμοποιούμενη διάταξη αποτελείται από μικροπλακίδια (Transwell Costar) που έχουν την ακόλουθη διαμόρφωση (Εικόνα Μ3). Στην επάνω επιφάνεια κάθε μικροκυψελίδας στερεώνεται μια ένθεση που διαμερισματοποιεί το κελί σε δύο μέρη. Ο μερικός διαχωρισμός της εσωτερικής μικροκυψελίδας από την εξωτερική επιτυγχάνεται μέσω μιας πολυμερούς κινητής μεμβράνης ανθρακικών με μέγεθος πόρων 8 μm, που αποτελεί και τον πυθμένα της εσωτερικής μικροκυψελίδας. Υλικά και διαλύματα Θρεπτικά μέσα για μελέτες κυτταρικής μετανάστευσης HUVEC: Στην περίπτωση μελέτης της επίδρασης της PTN στον χημειοτακτισμό των HUVEC, χρησιμοποιήθηκε Μ199 με 0.25% BSA. Μετά τη διάλυση του BSA στο θρεπτικό μέσο, ακολουθεί διήθηση με βακτηριοστατικό φίλτρο. Στην περίπτωση μελέτης της επίδρασης είτε λειτουργικού αντισώματος είτε πεπτιδίων που στοχεύουν στη μεβρανική NCL στο χημειοτακτισμό των HUVEC, χρησιμοποιήθηκε πλήρες Μ199 (Παράγραφος 1). C6: Ham s F12 90% κ.ό. με 10% FBS Μ059Κ, U87MG: Dulbecco s modified Eagle medium (DMEM)/Ham s F12 90% κ.ό. με 10% FBS CHO: Dulbecco s modified Eagle medium (DMEM) 90% κ.ό. με 10% FBS Σύστημα μελέτης χημειοτακτισμού Transfilter assay Μικροπλακίδια Transwell με διάμετρο πόρων μεμβράνης 8 μm (Costar, Avon, France). 109

126 Υλικά και Μέθοδοι Διάλυμα κυανούν της τολουϊδίνης 0.33% κ.β. κυανούν της τολουϊδίνης σε PBS 1x Μονιμοποιητικό διάλυμα Carson s Φορμαλδεΰδη 37% 10% κ.ό. NaH 2 PO 4.Η 2 Ο 0.1 Μ NaOH 0.1 Μ Απεσταγμένο νερό SDS 0.1% Εικόνα Μ3: Σχηματική απεικόνιση μικροκυψελίδας Transwell Costar. (Α) Το εναιώρημα των κυττάρων τοποθετείται στην εσωτερική μικροκυψελίδα, πάνω στην πορώδη μεμβράνη, ενώ η υπό μελέτη ουσία στην εξωτερική μικροκυψελίδα. (Β) Κατά την επώαση του μικροπλακιδίου στους 37 ο C ένα ποσοστό των κυττάρων μεταναστεύει στην κάτω επιφάνεια της πορώδους μεμβράνης. Οι πόροι της μεμβράνης (8 μm) είναι αρκετά μικροί ώστε να επιτρέπουν μόνο την ενεργή διέλευση των κυττάρων. (Γ) Τα κύτταρα που δε μετανάστευσαν απομακρύνονται. (Δ, Ε) Ακολουθεί μονιμοποίηση και χρώση των κυττάρων. (Δ) Αντιπροσωπευτική εικόνα πορώδους φίλτρου με κύτταρα που έχουν μεταναστεύσει. (Ε) Μεγαλύτερη μεγέθυνση ίδιας εικόνας. Διακρίνονται οι πόροι της μεμβράνης (μικρά βέλη) και τα κύτταρα μετά από μονιμοποίηση και χρώση (μεγάλα βέλη) (Polytarchou et al, 2007). Πειραματική πορεία Κατά τη μελέτη επίδρασης της PTN στο χημειοτακτισμό των κυττάρων HUVEC, προηγείται επώαση των κυττάρων στους 37 ο C για 16 ώρες σε θρεπτικό μέσο που 110

127 Υλικά και Μέθοδοι στερείται ορού. Στην περίπτωση μελέτης της επίδρασης λειτουργικού αντισώματος ή πεπτιδίων που στοχεύουν στη μεμβρανική NCL στο χημειοτακτισμό των κυττάρων, χρησιμοποιήθηκαν πλήρη θρεπτικά μέσα. Αρχικά, πραγματοποιείται η διαδικασία της ανακαλλιέργειας, όπως αναφέρεται στην Παράγραφο Σε κάθε εξωτερική μικροκυψελίδα (κάτω μέρος της μεμβράνης) προστίθενται 600 μl θρεπτικό μέσο, αν πρόκειται για κελίο αναφοράς (μάρτυρας). Στην περίπτωση μελέτης της χημειοτακτικής δράσης μιας ουσίας, η ουσία προστίθεται στην εξωτερική μικροκυψελίδα και σε θρεπτικό μέσο ίδιο με αυτό του κελιούμάρτυρα. 2. Στην εσωτερική μικροκυψελίδα (πάνω μέρος της μεμβράνης) προστίθεται 100 μl θρεπτικού μέσου με κύτταρα. 3. Επώαση του μικροπλακιδίου στον επωαστικό κλίβανο των κυττάρων για 4 ώρες. 4. Μονιμοποίηση των κυττάρων με εμβάπτιση των εσωτερικών μικροκυψελίδων σε μονιμοποιητικό διάλυμα Carson s για τουλάχιστον 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 5. Προσεκτική απομάκρυνση των κυττάρων που βρίσκονται στο επάνω μέρος της μεμβράνης με βαμβακοφόρο στυλεό και έλεγχος της μεμβράνης στο μικροσκόπιο. Αν η απομάκρυνση των κυττάρων δεν είναι ικανοποιητική επαναλαμβάνεται η διαδικασία. 6. Με ανάλογη προσοχή κόβεται η μεμβράνη με τη βοήθεια νυστεριού, ανακτώντας τη μεγαλύτερη δυνατή επιφάνεια. 7. Τοποθέτηση της μεμβράνης σε αντικειμενοφόρο πλάκα, ώστε τα κύτταρα που έχουν μεταναστεύσει να βρίσκονται στην επάνω επιφάνεια. 8. Χρώση των κυττάρων με εναπόθεση 2 σταγόνων διαλύματος της χρωστικής κυανούν της τολουϊδίνης στη μεμβράνη για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 9. Αποχρωματισμός της μεμβράνης με διαδοχικές εμβαπτίσεις σε νερό. 111

128 Υλικά και Μέθοδοι Για πειράματα που πραγματοποιήθηκαν απουσία ορού πραγματοποιήθηκαν τα βήματα Τοποθέτηση της μεμβράνης σε αντικειμενοφόρο πλάκα με τα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια. 11. Εναπόθεση 2 σταγόνων νερού πάνω στη μεμβράνη και έγκλεισή της με καλυπτρίδα. 12. Μέτρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο, σε όλη την επιφάνεια της μεμβράνης, με τη βοήθεια βαθμονομημένου πλέγματος. Για πειράματα που πραγματοποιήθηκαν παρουσία ορού πραγματοποιήθηκαν τα βήματα Τοποθέτηση της μεμβράνης σε μικροπλακίδια 96 κελιών. 14. Εκχύλιση του διαλύματος κυανούν της τολουϊδίνης με προσθήκη διαλύματος SDS 1% (150 μl ανά μεμβράνη). 15. Ανακίνηση για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 16. Ακολουθεί φωτομέτρηση σε μήκος κύματος 630 nm. 17. Επώαση κυττάρων με παράγοντες για μελέτες φωσφορυλίωσης ή έκφρασης πρωτεϊνών, πειράματα ELISA ή για μελέτες ανοσοφθορισμού (Polykratis et al, 2005) Υλικά και διαλύματα PBS (10x) Na 2 HPO M KH 2 PO M NaCl 0.2 M Αραιώνεται σε dh 2 O 10 φορές πριν τη χρήση (PBS 1x, ph 7.4) και αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). 112

129 Υλικά και Μέθοδοι Θρεπτικό μέσο Μ199 με BSA Μ199 με 0.25% BSA. Μετά τη διάλυση του BSA στο θρεπτικό ακολουθεί διήθηση με βακτηριοστατικό φίλτρο. Πιπέτες Pasteur (αποστειρωμένες) Αποστειρώνονται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Πειραματική πορεία 1. Παρατήρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο. Η πειραματική πορεία ξεκινά όταν τα κύτταρα είχαν καλύψει το 80-90% της επιφάνειας του τρυβλίου. 2. Μεταφορά του τρυβλίου σε θάλαμο νηματικής ροής, όπου είναι δυνατή η εργασία υπό στείρες συνθήκες. 3. Αναρρόφηση του θρεπτικού μέσου της καλλιέργειας με πιπέτα Pasteur υπό κενό. 4. Έκπλυση των κυττάρων δύο φορές με PBS 1x. 5. Προσθήκη θρεπτικού μέσου Μ199 με 0.25% BSA. 6. Επώαση για 16 ώρες στον επωαστικό θάλαμο. 7. Ανανέωση του θρεπτικού μέσου με νέο, προθερμασμένο στους 37 ο C, 1 ml (λιγότερο από τον κανονικό όγκο). 8. Επώαση για 1 ώρα στον επωαστικό θάλαμο. 9. Προσθήκη της υπό μελέτη ουσίας αραιωμένης σε 1 ml του ίδιου θρεπτικού μέσου. 10. Επώαση στον επωαστικό θάλαμο για χρόνο όσο απαιτούν οι συνθήκες του πειράματος. Ακολουθεί λύση των κυττάρων σύμφωνα με το πρωτόκολλο που ακολουθεί στην Παράγραφο

130 Υλικά και Μέθοδοι 18. Λύση κυττάρων μετά από ενεργοποίηση για μελέτες φωσφορυλίωσης ή έκφρασης πρωτεϊνών, πειράματα ELISA ή για μελέτες ανοσοφθορισμού (Polykratis et al, 2005) Η λύση των κυττάρων και η απομόνωση των πρωτεϊνών με τη μέθοδο αυτή διαφοροποιείται από τη μέθοδο της απομόνωσης των πρωτεϊνών που περιγράφηκε προηγουμένως (Παράγραφος 7). Χρησιμοποιείται σε περιπτώσεις που μελετάται η επίδραση ενός παράγοντα είτε στην κατάσταση φωσφορυλίωσης είτε στα επίπεδα έκφρασης κάποιας πρωτεΐνης. Στα πειράματα πραγματοποιείται επώαση των κυττάρων με τον παράγοντα για τον απαιτούμενο χρόνο και είναι απαραίτητη η άμεση λύση τους μετά την αλλαγή του θρεπτικού μέσου, ώστε να μην προλάβουν να επέλθουν σε κατάσταση «stress». Υλικά και διαλύματα PBS (10x) Na 2 HPO M KH 2 PO M NaCl 0.2 M Αραιώνεται σε dh 2 O 10 φορές πριν τη χρήση (PBS 1x, ph 7.4). Ρυθμιστικό διάλυμα δειγμάτων (2x) Tris-HCl ph M SDS 0.03 M Γλυκερόλη 10% κ.ό. Κυανούν της βρωμοφαινόλης 2% κ.ό. Διθειοθρεϊτόλη (dithiothreitol, DTT) 0.1 Μ Πειραματική πορεία Έχει προηγηθεί επώαση των κυττάρων (όπου απαιτείται) με τον υπό μελέτη παράγοντα για το ανάλογο χρονικό διάστημα. Με την ολοκλήρωση της επώασης, πραγματοποιείται η ακόλουθη διαδικασία: 114

131 Υλικά και Μέθοδοι 1. Προσθήκη σε σωληνάριο φυγοκέντρου 500 μl ρυθμιστικού διαλύματος δειγμάτων. Παρασκευή ενός σωληναρίου ανά δείγμα. 2. Θέρμανση των σωληναρίων στους 100 ο C μέχρι τη μεταφορά τους στο θάλαμο νηματικής ροής. Η μεταφορά πραγματοποιείται αμέσως πριν εξέλθει το τρυβλίο από το θάλαμο νηματικής ροής (βήμα 3). 3. Μεταφορά του τρυβλίου της κυτταροκαλλιέργειας από τον επωαστικό θάλαμο στο θάλαμο νηματικής ροής. 4. Αναρρόφηση του θρεπτικού μέσου της κυτταροκαλλιέργειας με πιπέτα Pasteur υπό κενό. 5. Ακολουθούν δύο σύντομα και ήπια ξεπλύματα του τρυβλίου με PBS 1 x (2-3 ml). 6. Μεταφορά 150μl ή 300 μl θερμού ρυθμιστικού διαλύματος δειγμάτων σε όλη την επιφάνεια 60 mm ή 100 mm τρυβλίων στάγδην. 7. Ανάδευση του ρυθμιστικού διαλύματος με το ακρορρύγχιο της πιπέτας σε όλη την επιφάνεια των τρυβλίων. Στο στάδιο αυτό το ρυθμιστικό διάλυμα έχει μεγάλο ιξώδεις λόγω του DNA των κυττάρων που λύονται. 8. Μεταφορά του μίγματος πλέον ρυθμιστικού διαλύματος-λύματος κυττάρων σε σωληνάριο φυγοκέντρου. 9. Θέρμανση των σωληναρίων για 5 λεπτά σε 100 ο C. 10. Φυγοκέντρηση στα g για 4 λεπτά. 11. Αποθήκευση των σωληναρίων στους -20 ο C μέχρι την πραγματοποίηση ηλεκτροφόρησης SDS-PAGE (Παράγραφος 10) και ανάλυσης κατά Western (Παράγραφος 11). 19. Ανίχνευση και ποσοτικός προσδιορισμός των επιπέδων ενεργοποίησης της PI3K p85 με τη μέθοδο ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) Χρησιμοποιήθηκε το ολοκληρωμένο σύστημα Fast Activated Cell-based ELISA (FACE ), της εταιρείας Active Motif. Πρόκειται για ένα σύστημα, το οποίο 115

132 Υλικά και Μέθοδοι βασίζεται στην αρχή της τεχνικής ELISA. Παρέχεται πλακίδιο που αποτελείται από 96 μικροκυψελίδες, στον πυθμένα των οποίων επιστρώνονται κύτταρα. Έπειτα από τα επιθυμητά ερεθίσματα, τα κύτταρα μονιμοποιούνται και επωάζονται είτε με αντίσωμα έναντι της φωσφορυλιωμένης PI3K p85, το οποίο εκλεκτικά αναγνωρίζει πεπτίδια και πρωτεΐνες που περιέχουν φωσφοτυροσίνη στο συνεκτικό μοτίβο YXXM, είτε της ολικής PI3K p85, ανεξάρτητα από τα επίπεδα φωσφορυλίωσής της. Με την προσθήκη 2 ων αντισωμάτων που φέρουν δεσμευμένη υπεροξειδάση, επιτυγχάνεται παραγωγή χρώματος και ποσοτικός προσδιορισμός με φασματοφωτομετρία. Μετά τον προσδιορισμό του αριθμού των κυττάρων, με την χρωστική crystal violet, πραγματοποιείται σύγκριση των ομαλοποιημένων μετρήσεων της φωσφορυλιωμένης PI3K p85 προς την ολική. Με τη μέθοδο αυτή διαπιστώνεται οποιαδήποτε μεταβολή των επιπέδων φωσφορυλίωσης της PI3K p85, μετά από κάποιο ερέθισμα. Υλικά και διαλύματα Πλακίδιο 96 μικροκυψελίδων PBS (10x) Na 2 HPO M KH 2 PO M NaCl 0.2 M Αραιώνεται σε dh 2 O 10 φορές πριν τη χρήση (PBS 1x, ph 7.4) και αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Διάλυμα 4% PFA Φορμαλδεΰδη 37% 10% κ.ό. Ρυθμιστικό διάλυμα PBS 1x Ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης Ρυθμιστικό διάλυμα απόσβεσης 10% H 2 O 2 10% Αζίδιο Αραίωση σε ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης 116

133 Υλικά και Μέθοδοι Άπαχο γάλα σε σκόνη (Regilait) Ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης αντισώματος 1 ο Αντίσωμα έναντι της φωσφορυλιωμένης PI3K p85 1 ο Αντίσωμα έναντι της ολικής PI3K 2 ο Αντίσωμα συνδεδεμένο με υπεροξειδάση (HRP-conjugated) Μονωτική ζελατίνη τύπου Parafilm Διάλυμα ανάπτυξης της χρωμογόνου αντίδρασης Διάλυμα αναστολής της χρωμογόνου αντίδρασης Crystal Violet 0.1% κ.β. SDS 0.1% Διαλύεται σε ρυθμιστικό διάλυμα PBS 1x Πειραματική πορεία Η διαδικασία μπορεί να διακριθεί στα ακόλουθα 4 στάδια: 1 ο Στάδιο: Καλλιέργεια, μονιμοποίηση των κυττάρων και κορεσμός των μη ειδικών θέσεων πρόσδεσης των αντισωμάτων. Πραγματοποιείται η διαδικασία της ανακαλλιέργειας και επίστρωσης των κυττάρων στο μικροπλακίδιο. Επιστρώνονται κύτταρα ανά μικροκυψελίδα. Ο τελικός όγκος θρεπτικού μέσου ανά μικροκυψελίδα είναι 150 μl. Στα επιστρωμένα κύτταρα που έχουν υποστεί κατάλληλη επεξεργασία, αφαιρείται το υπερκείμενο και μονιμοποιούνται με διάλυμα 4% PFA (100μl/ μικροκυψελίδα) για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου σε ηρεμία. Ακολουθεί έκπλυση των κυττάρων 3 φορές με διάλυμα έκπλυσης για 5 λεπτά και επώαση με διάλυμα απόσβεσης 117

134 Υλικά και Μέθοδοι (100μl/μικροκυψελίδα) για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και σκοτεινό περιβάλλον, ώστε να ελαχιστοποιηθεί η ενδογενής δραστικότητα υπεροξειδάσης. Τα κύτταρα εκπλένονται 2 φορές με διάλυμα έκπλυσης και επωάζονται με διάλυμα κορεσμού των μη ειδικών θέσεων πρόσδεσης των αντισωμάτων (100μl 5% άπαχο γάλα/μικροκυψελίδα) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Κατά τη διάρκεια αυτής της επώασης, το διάλυμα ανάπτυξης χρώματος φέρεται σε θερμοκρασία δωματίου. 2 ο Στάδιο: Πρόσδεση 1 ων και 2 ων αντισωμάτων στα κύτταρα. Γίνεται έκπλυση των κυττάρων 3 φορές με διάλυμα έκπλυσης για 5 λεπτά και προσθήκη των 1 ων αντισωμάτων (100μl/μικροκυψελίδα) για 16 ώρες στους 4 0 C σε ηρεμία, αφότου το μικροπλακίδιο των 96 κελιών καλυφθεί στο επάνω μέρος με μονωτική ζελατίνη τύπου Parafilm. Η αραίωση των αντισωμάτων πραγματοποιείται με διάλυμα αραίωσης αντισωμάτων 1x. Για το αντίσωμα έναντι της φωσφορυλιωμένης PI3K p85 η αραίωση είναι 1:500, ενώ για το αντίσωμα έναντι της ολικής PI3K η αραίωση είναι 1:1000. Στις μικροκυψελίδες που χρησιμοποιούνται ως τυφλό, δεν πραγματοποιείται προσθήκη 1 ων αντισωμάτων. Εν συνεχεία, γίνεται έκπλυση των κυττάρων 3 φορές με διάλυμα έκπλυσης για 5 λεπτά και προσθήκη των 2 ων αντισωμάτων (100μl/μικροκυψελίδα) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η αραίωση των 2 ων αντισωμάτων είναι 1:1000, με διάλυμα διάλυσης αντισωμάτων 1x. 3 ο Στάδιο: Χρωμογόνος αντίδραση. Από την έναρξη της χρωμογόνου αντίδρασης έως το τέλος της πειραματικής διαδικασίας, το μικροπλακίδιο βρίσκεται σε σκοτεινό περιβάλλον. Έπειτα από 3 διαδοχικές εκπλύσεις των κυττάρων με διάλυμα έκπλυσης και PBS 1x, προστίθενται 80 μl διαλύματος ανάπτυξης χρώματος ανά μικροκυψελίδα. Η επώαση διαρκεί μέχρι την ανάπτυξη κίτρινου χρώματος στα δείγματα (περίπου 17 λεπτά). Η χρωμογόνος αντίδραση σταματά με την προσθήκη 80 μl διαλύματος αναστολής της αντίδρασης, κατά την οποία παρατηρείται η εμφάνιση κυανού χρώματος. Στα επόμενα 5 λεπτά, ακολουθεί φωτομέτρηση σε μήκος κύματος 450 nm, με μήκος κύματος αναφοράς τα 630 nm. 118

135 Υλικά και Μέθοδοι 4 ο Στάδιο: Χρώση των κυττάρων. 3 διαδοχικές εκπλύσεις των κυττάρων με διάλυμα έκπλυσης και PBS 1x, ακολουθούνται από ξήρανση των κυττάρων για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Προστίθενται 100 μl χρωστικής crystal violet ανά μικροκυψελίδα για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου σε ηρεμία. Γίνεται έκπλυση των κυττάρων 3 φορές με PBS 1x και εκχύλιση της χρωστικής επωάζοντας τα κύτταρα με SDS 1% (100μl/μικροκυψελίδα) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολουθεί φωτομέτρηση σε μήκος κύματος 630 nm. Σημειώσεις: Ο όγκος των διαλυμάτων έκπλυσης είναι 150μl/μικροκυψελίδα. Ακόμα, η αφαίρεση του υπερκείμενου υγρού από τις μικροκυψελίδες λαμβάνει χώρα με τη χρήση αυτόματης πιπέτας, με σκοπό την ελαχιστοποιήση της απώλειας των επιστρωμένων κυττάρων. Τέλος, όλες οι επωάσεις πραγματοποιούνται υπό ανάδευση εκτός από τις περιπτώσεις όπου αναγράφονται άλλες συνθήκες. 20. Βιοτινυλίωση πρωτεϊνών της κυτταρικής μεμβράνης ευκαρυωτικών κυττάρων και ανάλυσή τους Η συγκεκριμένη πειραματική διαδικασία πραγματοποιήθηκε όταν τα κύτταρα κάλυπταν το 80-90% της επιφάνειας του τρυβλίου. Υλικά και διαλύματα PBS (10x) Na 2 HPO M KH 2 PO M NaCl 0.2 M Αραιώνεται σε dh 2 O 10 φορές πριν τη χρήση (PBS 1x, ph 7.4), αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο) και διατηρείται στους 4 ο C. 119

136 Υλικά και Μέθοδοι N-υδροξυσουξινιμιδοβιοτίνη/NHS-D-βιοτίνη NHS-D-biotin, Sigma, H1759) (N-hydroxysuccinimidobiotin, Διαλύεται σε DMSO μέχρι συγκέντρωσης 30 mg/ml. Στη συνέχεια αραιώνεται σε PBS 1x. Μαγνητικά Σφαιρίδια Στρεπταβιδίνης (Streptavidin Magnetic Particles, Roche Applied Science, ) Πραγματοποιείται ανάδευση έως ότου το εναιώρημα των σφαιδίων στρεπταβιδίνης γίνει ομοιογενές. Όγκος εναιωρήματος 50 μl, ξεπλένεται 3 φορές με 200 μl PBS 1x και το ίζημα των σφαιριδίων συγκεντρώνεται κάθε φορά με τη χρήση κατάλληλου μαγνήτη. Ακολουθεί επαναιώρηση ιζήματος σφαιριδίων σε 50 μl PBS 1x, ώστε να επιτευχθεί εναιώρημα αρχικής συγκέντρωσης (10 mg/ml). Αλβουμίνη ορού βοός (Bovine Serum Albumin, BSA) Πειραματική πορεία 1. Μεταφορά του τρυβλίου από τον επωαστικό θάλαμο σε πάγο. 2. Αναρρόφηση του θρεπτικού μέσου της καλλιέργειας υπό κενό. 3. Έκπλυση των κυττάρων 2 φορές με PBS 1x στους 4 ο C. 4. Επώαση των κυττάρων με 0.5 mg/ml NHS-D-βιοτίνη για 40 λεπτά στους 4 ο C. 5. Ακολούθησαν εκτεταμένες πλύσεις με ψυχρό PBS 1x (τουλάχιστον 6 φορές), για να απομακρυνθεί η περίσσεια της NHS-D-βιοτίνης πριν τη λύση των κυττάρων. 6. Ακολουθείται το πρωτόκολλο της λύσης των κυττάρων όπως περιγράφεται στην Παράγραφο 7, της μέτρησης πρωτεϊνών με τη μέθοδο Bradford όπως περιγράφεται στην Παράγραφο 8, και της ανοσοκατακρήμνισης όπως περιγράφεται στην Παράγραφο 9. Οι ανοσοκατακρημνίσεις πραγματοποιήθηκαν σε 3 mg πρωτεΐνης με μαγνητικά σφαιρίδια στρεπταβιδίνης (0.5 mg), είτε με αντίσωμα έναντι της NCL. Πραγματοποιείται ανάλυση των πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακριλαμιδίου με αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) (Παράγραφος 10) και ανάλυσή τους κατά Western (Παράγραφος 11). 120

137 Υλικά και Μέθοδοι 21. Κλασμάτωση ευκαρυωτικών κυττάρων (Nisole et al, 2002b) Η συγκεκριμένη πειραματική διαδικασία πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα U87MG σε καλλιέργεια, όταν τα κύτταρα κάλυπταν το 80-90% της επιφάνειας του τρυβλίου. PBS (10x) Na 2 HPO M KH 2 PO M NaCl 0.2 M Υλικά και διαλύματα Αραιώνεται σε dh 2 O 10 φορές πριν τη χρήση (PBS 1x, ph 7.4), αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο) και διατηρείται στους 4 ο C. Υποτονικό διάλυμα Hepes 10mM (ph 6.9) KCl 10 mm MgCl 2 2 Mm Διάλυμα εκχύλισης πυρήνων Tris-HCl 10mM (ph 7.6) NaCl 400 mm EDTA 1 mm Triton X-100 1% Διάλυμα εκχύλισης μεμβρανών Tris-HCl 10mM (ph 7.6) NaCl 150 mm EDTA 1 mm Triton X-100 1% 121

138 Υλικά και Μέθοδοι Πειραματική πορεία 1. Απομάκρυνση υπό κενό του θρεπτικού μέσου της καλλιέργειας. 2. Έκπλυση των κυττάρων 3 φορές με PBS 1x στους 4 ο C. 3. Προσθήκη 250 μl ψυχρού υποτονικού διαλύματος ανά τρυβλίο 100 mm στους 4 ο C. 4. Λύση των κυττάρων με μηχανικό τρόπο (cell scraper) σε πάγο. 5. Μεταφορά του λύματος σε σωληνάρια φυγοκέντρου. Παραμονή των σωληναρίων στους 4 ο C για χρόνο 10 λεπτά, ώστε να μεγιστοποιηθεί η ποσότητα των εκχυλιζόμενων πρωτεϊνών. Πραγματοποιούνται τακτικές αναδεύσεις των σωληναρίων. 6. Φυγοκέντρηση σε 400 g για 5 λεπτά στους 4 ο C. 7. Μεταφορά του υπερκειμένου σε νέο σωληνάριο φυγοκέντρου. Το υπερκείμενο του βήματος 7 περιλαμβάνει το κυτταρόπλασμα, την κυτταρική μεμβράνη και τον κυτταροσκελετό, ενώ το ίζημα αποτελείται από τους πυρήνες των κυττάρων U87MG. Τα βήματα 8-13 αφορούν στην εκχύλιση πυρηνικών πρωτεϊνών. 8. Το ίζημα που προέκυψε από το βήμα 6, επαναιωρείται σε 1ml ψυχρού PBS 1x. 9. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα 400 g για 5 λεπτά στους 4 ο C. 10. Απόρριψη του υπερκειμένου. 11. Επαναιώρηση του ιζήματος σε 100 μl διαλύματος εκχύλισης πυρήνων και ανάδευση για 1 ώρα στους 4 ο C. 12. Φυγοκέντρηση στα g για 10 λεπτά στους 4 ο C. 13. Το υπερκείμενο υγρό αποτελεί το εκχύλισμα πρωτεϊνών από τους πυρήνες (πυρηνικό κλάσμα), μεταφέρεται σε νέο σωληνάριο φυγοκέντρου και φυλάσσεται στους 4 ο C. Τα βήματα αφορούν στην εκχύλιση μεμβρανικών πρωτεϊνών από το υπερκείμενο του βήματος

139 Υλικά και Μέθοδοι 14. Το υπερκείμενο που προέκυψε από το βήμα 7 φυγοκεντρείται στα g για 30 λεπτά στους 4 ο C. 15. Το υπερκείμενο αυτής της φυγοκέντρησης, που αποτελεί το εκχύλισμα πρωτεϊνών από το κυτταρόπλασμα (κυτταροπλασματικό κλάσμα), μεταφέρεται σε νέο σωληνάριο φυγοκέντρου και φυλάσσεται στους 4 ο C. 16. Επαναιώρηση του ιζήματος με 100 μl διαλύματος εκχύλισης μεμβρανών και ανάδευση για 1 ώρα στους 4 ο C. 17. Φυγοκέντρηση στα g για 30 λεπτά στους 4 ο C. 18. To ίζημα που προκύπτει, αποτελεί το εκχύλισμα πρωτεϊνών από τον κυτταροσκελετό (κυτταροσκελετικό κλάσμα), το οποίο δε χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα εργασία. 19. Το υπερκείμενο υγρό αποτελεί το εκχύλισμα πρωτεϊνών από τις κυτταρικές μεμβράνες (μεμβρανικό κλάσμα), μεταφέρεται σε νέο σωληνάριο φυγοκέντρου και φυλάσσεται στους 4 ο C. 20. Ακολουθείται το πρωτόκολλο της μέτρησης πρωτεϊνών με τη μέθοδο Bradford όπως περιγράφεται στην Παράγραφο 8, και της ανοσοκατακρήμνισης όπως περιγράφεται στην Παράγραφο 9. Οι ανοσοκατακρημνίσεις πραγματοποιήθηκαν σε 3 mg εκχυλίσματος πρωτεϊνών από το πυρηνικό, το κυτταροπλασματικό και το μεμβρανικό κλάσμα. (Για την εκχύλιση 3 mg μεμβρανικών πρωτεϊνών από καλλιέργειες U87MG κυττάτων, απαιτούνται ~ κύτταρα). Πραγματοποιείται ανάλυση των πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακριλαμιδίου με αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) (Παράγραφος 10) και ανάλυσή τους κατά Western (Παράγραφος 11). 22. Ανοσοφθορισμός (Huang et al, 2006) Υλικά και διαλύματα Καλυπτρίδες μικρές Αποστειρώνονται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). 123

140 Υλικά και Μέθοδοι Λαβίδα με λεπτά άκρα Αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Μονωτική ζελατίνη τύπου Parafilm PBS (10x) Na 2 HPO M KH 2 PO M NaCl 0.2 M Αραιώνεται σε dh 2 O 10 φορές πριν τη χρήση (PBS 1x, ph 7.4), αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο) και διατηρείται στους 4 ο C. Ρυθμιστικό διάλυμα PBS-Tween 20 Ρυθμιστικό διάλυμα PBS 1x Tween % κ.ό. Διάλυμα 4% PFA Φορμαλδεΰδη 37% 10% κ.ό. Ρυθμιστικό διάλυμα PBS 1x Αλβουμίνη ορού βοός (Bovine Serum Albumin, BSA) FBS Χρωστική Draq5 (Biostatus Limited, Leicestershire, UK) Χρησιμοποιείται σε τελική συγκέντρωση 3.3 μm σε PBS 1x. Χρωστική TΟΤΟ-3 (InVitrogen, Carlsbad, CA, USA) Χρησιμοποιείται σε 1:2000 αραίωση σε PBS 1x. Mowiol 4-88 (Calbiochem, San Diego, CA, USA) Πρώτα αντισώματα Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε μελέτες ανοσοφθορισμού, παρατίθενται στον Πίνακα Μ6. 124

141 Υλικά και Μέθοδοι Πίνακας Μ6: Παράθεση των αντισωμάτων και των συνθηκών τους, όπως χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα ανοσοφθορισμού. Στις στήλες από αριστερά αναγράφονται οι πρωτεΐνες, οι εταιρίες παραγωγής των αντισωμάτων, οι συνθήκες παρεμπόδισης της μη ειδικής δέσμευσης και οι συνθήκες επώασης του 1 ου και του 2 ου αντισώματος. Πρωτεΐνη Εταιρία Παρεμπόδιση μη ειδικής δέσμευσης 1 ο Αντίσωμα 2 ο Αντίσωμα PTN Lab. CRRET 3% BSA, 10% FBS σε PBS 1:500 σε 3% BSA / PBS a-goat 1:500 σε 3% BSA / PBS PTN (H M01) Abnova 3% BSA, 10% FBS σε PBS 1:500 σε 3% BSA / PBS a-mouse 1:500 σε 3% BSA / PBS RPTPβ/ζ (R ) BD Transduction Laboratories 3% BSA, 10% FBS σε PBS 1:250 σε 3% BSA / PBS a-mouse 1:500 σε 3% BSA / PBS RPTPβ/ζ (H- 300) Santa Cruz 3% BSA, 10% FBS σε PBS 1:250 σε 3% BSA / PBS a-rabbit 1:500 σε 3% BSA / PBS α ν β 3 (MAB1976Z) Chemicon 3% BSA, 10% FBS σε PBS 1:500 σε 3% BSA / PBS a-mouse 1:500 σε 3% BSA / PBS NCL Atto 488 (N6288) Sigma 3% BSA, 10% FBS σε PBS 1:1000 σε 3% BSA / PBS - VEGF (A-20) Santa Cruz 3% BSA, 10% FBS σε PBS 1:250 σε 3% BSA / PBS a-rabbit 1:500 σε 3% BSA / PBS Δεύτερα αντισώματα Τα δεύτερα αντισώματα, των οποίων οι συνθήκες αναφέρονται στον Πίνακα Μ6, είναι τα ακόλουθα: Alexa Fluor 594 chicken anti-mouse IgG (H+L) (A-21201, Molecular Probes, Invitrogen) Alexa Fluor 488 chicken anti-goat IgG (H+L) (A-21467, Molecular Probes, Invitrogen) Alexa Fluor 488 chicken anti-rabbit IgG (H+L) (A-21467, Molecular Probes, Invitrogen) Alexa Fluor 594 chicken anti-rabbit IgG (H+L) (A-21201, Molecular Probes, Invitrogen) 125

142 Υλικά και Μέθοδοι Πειραματική πορεία Στην περίπτωση των HUVEC, πριν την έναρξη της πειραματικής πορείας του ανοσοφθορισμού πραγματοποιείται η ακόλουθη πορεία: Εναπόθεση μίας αποστειρωμένης καλυπτρίδας σε κάθε μικροκυψελίδα μικροπλακιδίου 6 κελίων. Επίστρωση των κελίων (με τις καλυπτρίδες) με διάλυμα ζελατίνης 1%, όπως περιγράφεται στην Παράγραφο 3. Χρειάζεται προσοχή ώστε να καλυφθεί με ζελατίνη το σύνολο της επιφάνειας της καλυπτρίδας. Επώαση για τουλάχιστον 20 λεπτά στον επωαστικό θάλαμο. Μία πλύση με διάλυμα PBS 1x. Στα υπόλοιπα είδη κυττάρων πραγματοποιείται η εναπόθεση της καλυπτρίδας σε κάθε μικροκυψελίδα του μικροπλακιδίου και ακολουθούν τα εξής βήματα: 1. Πραγματοποιείται η διαδικασία της ανακαλλιέργειας και επίστρωσης των κυττάρων στο μικροπλακίδιο. Ο αριθμός των κυττάρων διαφοροποιείται ανάλογα με την καλλιέργεια. 2. Παρατήρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο. Τα κύτταρα θα πρέπει να έχουν καλύψει επιφάνεια μικρότερη του 70% της επιφάνειας της μικροκυψελίδας πριν την πραγματοποίηση του πειράματος. 3. Απομάκρυνση του μικροπλακιδίου από τον επωαστικό θάλαμο. 4. Απορρίπτεται το θρεπτικό μέσο και ακολουθούν 3 σύντομες πλύσεις με PBS 1x σε θερμοκρασία δωματίου. 5. Μονιμοποίηση των κυττάρων με διάλυμα 4% PFA για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 6. Ακολουθούν 3 πλύσεις των 5 λεπτών η καθεμιά, με PBS-T υπό ανάδευση, με σκοπό την ήπια διάνοιξη πόρων στην κυτταρική μεμβράνη. 7. Ακολουθεί κορεσμός των μη ειδικών θέσεων πρόσδεσης των αντισωμάτων (blocking) με επώαση με διάλυμα 3% BSA/10% FBS σε PBS 1x για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου υπό ανάδευση. 126

143 Υλικά και Μέθοδοι 8. Μεταφορά των καλυπτρίδων (που περιέχουν τα κύτταρα) σε τρυβλία 60 mm των οποίων ο πυθμένας είναι καλυμμένος με μονωτική ζελατίνη τύπου Parafilm. Αυτό εμποδίζει τη διάχυση των αντισωμάτων από την καλυπτρίδα. 9. Πραγματοποιείται επώαση του 1 ου ή 1 ων αντισωμάτων, στις συγκεντρώσεις και στο διάλυμα που αναφέρονται παραπάνω (Πίνακας Μ6), για 16 ώρες στους 4 ο C. Στην περίπτωση προσθήκης anti-ncl Atto 488 αντισώματος, η διαδικασία πραγματοποιείται σε σκοτεινό περιβάλλον. 10. Ακολουθούν 3 πλύσεις των 5 λεπτών η καθεμιά, με ρυθμιστικό διάλυμα PBS 1x υπό ανάδευση. 11. Πραγματοποιείται επώαση του δεύτερου αντισώματος (όπου ήταν απαραίτητο), στην συγκέντρωση και στο διάλυμα που αναφέρονται παραπάνω (Πίνακας Μ6) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Από την προσθήκη του δεύτερου αντισώματος και μετά η διαδικασία πραγματοποιείται σε σκοτεινό περιβάλλον. 12. Ακολουθούν 3 πλύσεις των 5 λεπτών η καθεμιά, με PBS 1x υπό ανάδευση. Σε περίπτωση που απαιτείται επώαση και με άλλο δεύτερο αντίσωμα επαναλαμβάνονται τα βήματα 11 και 12 και με το δεύτερο αντίσωμα του άλλου αντισώματος. Η χρώση των πυρήνων με τη χρωστική Draq5, πραγματοποιείται ανάμεσα στις δύο πρώτες πλύσεις με PBS 1x για 5 λεπτά στους 37 0 C. 13. Οι καλυπτρίδες υφίστανται μία ταχεία πλύση με αποστειρωμένο νερό. 14. Εναπόθεση 18 μl Mowiol (2x φορές σε κοντινές περιοχές) πάνω σε αντικειμενοφόρο πλάκα. 15. Τοποθέτηση των καλυπτρίδων στην αντικειμενοφόρο πλάκα, με την επιφάνεια των κυττάρων προς τα κάτω, στο σημείο ακριβώς όπου έχει τοποθετηθεί η σταγόνα του διαλύματος Mowiol. 16. Επώαση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Το διάλυμα Mowiol στερεοποιείται και δεν απαιτείται προσθήκη βερνικιού στην περιφέρεια. 17. Φύλαξη των δειγμάτων στους 4 0 C μέχρι παρατήρησής τους, σε μικροσκόπιο φθορισμού συνεστιακής σάρωσης Leica SP5. 127

144 Υλικά και Μέθοδοι 23. Προσδιορισμός αλληλεπίδρασης λόγω εγγύτητας (Proximity Ligation Assay, PLA) Ο προσδιορισμός αλληλεπίδρασης λόγω εγγύτητας αποτελεί μέθοδος για την ταυτοποίηση της άμεσης αλληλεπίδρασης δύο πρωτεϊνών και όχι απλά του συνεντοπισμού τους. Βασίζεται στην ικανότητα υβριδοποίησης DNA ιχνηλατών και παραγωγής φθορίζοντος προϊόντος, μόνον όταν βρίσκονται σε στενή γειτνίαση. Συγκεκριμένα, δύο 1 α αντισώματα που εγείρονται σε διαφορετικά είδη αναγνωρίζουν τα υπό μελέτη αντιγόνα. Εκλεκτικά για τα χρησιμοποιούμενα είδη 2 α αντισώματα, που ονομάζονται ΡLA ιχνηλάτες, ο καθένας με μία μοναδική DNA αλληλουχία που είναι συζευγμένη σε αυτόν, δεσμεύονται με τα 1 α αντισώματα. Όταν οι PLA ιχνηλάτες βρίσκονται σε στενή γειτνίαση (<40 nm), οι κλώνοι του DNA μπορούν να υβριδοποιηθούν ενζυμικά με την προσθήκη λιγάσης, δίνοντας έτσι φθορίζον προϊόν. Η μετέπειτα προσθήκη πολυμεράσης στην αντίδραση, οδηγεί σε πολλαπλασιασμό των αντιγράφων των συμπληρωματικών ολιγονουκλεοτιδίων, με αποτέλεσμα την ενίσχυση του προϊόντος φθορισμού, το οποίο είναι εύκολα ορατό ως διακριτή κόκκινη κουκίδα όταν παρατηρείται με ένα μικροσκόπιο φθορισμού. Υλικά και διαλύματα Ibidi μ-chamber 12 well on glass slides (Ibidi μ-chamber 12 σε γυάλινες αντικειμενοφόρες πλάκες, Martinsried, Germany) PBS (10x) Na 2 HPO M KH 2 PO M NaCl 0.2 M Αραιώνεται σε dh 2 O 10 φορές πριν τη χρήση (PBS 1x, ph 7.4), αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο) και διατηρείται στους 4 ο C. Πριν από την χρήση του φέρεται σε θερμοκρασία δωματίου. Ρυθμιστικό διάλυμα PBS-Tween 20 Ρυθμιστικό διάλυμα PBS 1x Tween % κ.ό. 128

145 Υλικά και Μέθοδοι Διάλυμα 4% PFA Φορμαλδεΰδη 37% 10% κ.ό. Ρυθμιστικό διάλυμα PBS 1x Αλβουμίνη ορού βοός (Bovine Serum Albumin, BSA) FBS ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen (H-4000, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, U.S.A.) Χρωστική Draq5 (Biostatus Limited, Leicestershire, UK) Χρησιμοποιείται σε τελική συγκέντρωση 3.3 μm σε PBS 1x. Mowiol 4-88 (Calbiochem, San Diego, CA, USΑ) Πρώτα αντισώματα Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε μελέτες προσδιορισμού αλληλεπίδρασης λόγω εγγύτητας παρατίθενται στον Πίνακα Μ7. Διάλυμα έκπλυσης A 1x (PH 7.4) Tris 0.01 M NaCl 0.15 M Tween % κ.ό. Αραιώνεται σε Milli-Q Η 2 Ο, αποστειρώνεται μέσω διέλευσής του από φίλτρο με μέγεθος πόρων 0.2 μm και φυλάσσεται στους 4 0 C. Πριν από την χρήση του φέρεται σε θερμοκρασία δωματίου. Διάλυμα έκπλυσης Β 1x (PH 7.5) Tris 0.2 M NaCl 0.1 M Αραιώνεται σε Milli-Q Η 2 Ο, αποστειρώνεται μέσω διέλευσής του από φίλτρο με μέγεθος πόρων 0.2 μm και φυλάσσεται στους 4 0 C. Πριν από την χρήση του φέρεται σε θερμοκρασία δωματίου. 129

146 Υλικά και Μέθοδοι Διάλυμα έκπλυσης Β 0.01x Το διάλυμα έκπλυσης Β 1x αραιώνεται 100 φορές σε Milli-Q Η 2 Ο και φυλάσσεται στους 4 0 C. Πριν από την χρήση του φέρεται σε θερμοκρασία δωματίου. Πίνακας Μ7: Παράθεση των 1 ων αντισωμάτων και των συνθηκών τους όπως χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα προσδιορισμού αλληλεπίδρασης λόγω εγγύτητας. Στις στήλες από αριστερά αναγράφονται οι πρωτεΐνες, οι εταιρίες παραγωγής των αντισωμάτων, οι συνθήκες παρεμπόδισης της μη ειδικής δέσμευσης και οι συνθήκες επώασης των 1 ων αντισωμάτων. Πρωτεΐνη Εταιρία Παρεμπόδιση μη ειδικής δέσμευσης PTN Lab. CRRET 3% BSA, 10% FBS σε PBS 1 ο Αντίσωμα 1:500 σε 3% BSA / PBS PTN (H M01) Abnova 3% BSA, 10% FBS σε PBS 1:500 σε 3% BSA / PBS RPTPβ/ζ (R ) BD Transduction Laboratories 3% BSA, 10% FBS σε PBS 1:250 σε 3% BSA / PBS RPTPβ/ζ (H- 300) Santa Cruz 3% BSA, 10% FBS σε PBS 1:250 σε 3% BSA / PBS α ν β 3 (MAB1976Z) Chemicon 3% BSA, 10% FBS σε PBS 1:500 σε 3% BSA / PBS α ν (AB1930) Chemicon 3% BSA, 10% FBS σε PBS 1:500 σε 3% BSA / PBS β 3 (N-20) Santa Cruz 3% BSA, 10% FBS σε PBS NCL (MS-3) Santa Cruz 3% BSA, 10% FBS σε PBS 1:50 σε 3% BSA / PBS 1:50 σε 3% BSA / PBS VEGF (A-20) Santa Cruz 3% BSA, 10% FBS σε PBS 1:250 σε 3% BSA / PBS neuropilin-1 (H-286) Santa Cruz 3% BSA, 10% FBS σε PBS 1:100 σε 3% BSA / PBS 130

147 Υλικά και Μέθοδοι Χρησιμοποιήθηκαν τα παρακάτω αντιδραστήρια της εταιρείας Olink (Bioscience Uppsala, Sweden). Διαλύτης αντισωμάτων (Antibody Diluent) Αναδεύεται πολύ έντονα πριν από τη χρήση του. Χρησιμοποιείται ως διαλύτης των PLA ιχνηλατών. Φυλάσσεται στους 4 0 C. PLA Ιχνηλάτες (5x) (PLA probes 5x) Αποτελούν τα 2 α αντισώματα που είναι συζευγμένα με μοναδικές DNA αλληλουχίες. Αραιώνονται 5 φορές με διαλύτη αντισωμάτων, αναδεύονται πολύ έντονα και επωάζονται σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά πριν από τη χρήση τους. Φυλάσσονται στους 4 0 C. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν οι παρακάτω συνδυασμοί PLA ιχνηλατών προς ταυτοποίηση πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων: Αnti-mouse PLA plus probe με anti-rabbit PLA minus probe ή με anti-goat PLA minus probe. Duolink II Detection Reagents Orange Διαλύτης λιγάσης (5x) (Ligation 5x) Πριν από τη χρήση του φέρεται σε θερμοκρασία δωματίου, αναδεύεται πολύ έντονα (ώστε να διαλυθεί το SDS που περιέχει) και αραιώνεται 5x φορές με Milli-Q Η 2 Ο. Φυλάσσεται στους C. Λιγάση (1 U/μl) Πριν από τη χρήση της (λίγο πριν την προσθήκη στο δείγμα), ξεπαγώνει σταδιακά σε δοχείο ψύξης κυττάρων με ισοπροπανόλη, αναδεύεται πολύ έντονα και αραιώνεται 40x φορές με διαλύτη λιγάσης. Φυλάσσεται στους C. Διαλύτης ενίσχυσης σήματος (5x) (Amplification, 5x) Πριν από τη χρήση του φέρεται σε θερμοκρασία δωματίου, αναδεύεται πολύ έντονα και αραιώνεται 5x φορές με Milli-Q Η 2 Ο. Χρησιμοποιείται σε σκοτεινό περιβάλλον. Φυλάσσεται στους C. Πολυμεράση (10 U/μl) Πριν από τη χρήση της (λίγο πριν την προσθήκη στο δείγμα), ξεπαγώνει σταδιακά σε δοχείο ψύξης κυττάρων με ισοπροπανόλη, αναδεύεται πολύ έντονα και αραιώνεται 80x φορές με διαλύτη ενίσχυσης σήματος. Χρησιμοποιείται σε σκοτεινό περιβάλλον. Φυλάσσεται στους C. 131

148 Υλικά και Μέθοδοι Πειραματική πορεία Στην περίπτωση των HUVEC, πριν την έναρξη της πειραματικής πορείας του προσδιορισμού αλληλεπίδρασης λόγω εγγύτητας πραγματοποιείται η ακόλουθη πορεία: Επίστρωση των κελίων Ibidi μ-chamber 12 στις γυάλινες αντικειμενοφόρες πλάκες, με διάλυμα ζελατίνης 1%, όπως περιγράφεται στην Παράγραφο 3. Χρειάζεται προσοχή ώστε να καλυφθεί με ζελατίνη το σύνολο της επιφάνειας. Επώαση για τουλάχιστον 20 λεπτά στον επωαστικό θάλαμο. Μία πλύση με διάλυμα PBS 1x. Στα υπόλοιπα είδη κυττάρων ακολουθούν τα εξής βήματα: 1. Πραγματοποιείται η διαδικασία της ανακαλλιέργειας και επίστρωσης των κυττάρων στο μικροπλακίδιο. Ο αριθμός των κυττάρων διαφοροποιείται ανάλογα με την καλλιέργεια. Ο τελικός όγκος θρεπτικού μέσου ανά μικροκυψελίδα είναι 225 μl. 2. Παρατήρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο. Τα κύτταρα θα πρέπει να έχουν καλύψει περίπου το 60-70% της επιφάνειας της μικροκυψελίδας πριν την πραγματοποίηση του πειράματος. 3. Απομάκρυνση του μικροπλακιδίου από τον επωαστικό θάλαμο. 4. Απορρίπτεται το θρεπτικό μέσο και ακολουθούν 3 σύντομες πλύσεις με PBS 1x σε θερμοκρασία δωματίου. 5. Μονιμοποίηση των κυττάρων με διάλυμα 4% PFA (200 μl/μικροκυψελίδα) για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 6. Ακολουθούν 3 πλύσεις των 5 λεπτών η καθεμιά, με PBS-T υπό ανάδευση (200 μl/μικροκυψελίδα), με σκοπό την ήπια διάνοιξη πόρων στην κυτταρική μεμβράνη. 7. Απομάκρυνση του υγρού από το μικροπλακίδιο, τα οποίο στεγνώνει για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 8. Αφαιρείται η σιλικόνη που οριοθετεί τις μικροκυψελίδες. 9. Τοποθέτηση των ορίων μεταξύ των μικροκυψελίδων με τη χρήση υδρόφοβου φραγμού, που δημιουργείται από το ειδικό στυλό. 132

149 Υλικά και Μέθοδοι 10. Αναμονή για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, προς στερεοποίηση του υδρόφοβου φραγμού. 11. Ακολουθεί κορεσμός των μη ειδικών θέσεων πρόσδεσης των αντισωμάτων (blocking) επωάζοντας με διάλυμα 3% BSA/10% FBS (40 μl/μικροκυψελίδα) σε PBS 1x για 1 ώρα σε 37 0 C. Σημείωση: Οι επωάσεις στους 37 0 C πραγματοποιούνται σε δοχείο πλαστικό, επιστρωμένο με βρεγμένο wetex και του οποίου το καπάκι σφραγίζει, εντός επωαστικού θαλάμου κορεσμένου με υγρασία, ώστε να αποφευχθεί πιθανή εξάτμιση των μικροποσοτήτων υγρού. Πριν από τη χρήση του δοχείου, το τελευταίο τοποθετείται τουλάχιστον 1 ώρα νωρίτερα στον κορεσμένο με υγρασία επωαστικό θάλαμο. 12. Απομάκρυνση του υγρού από το μικροπλακίδιο. Ακολουθούν 2 πλύσεις των 5 λεπτών η καθεμιά, με 200 ml PBS 1x υπό ανάδευση σε ειδικό βάζο (staining jar). 13. Μεταφορά του μικροπλακιδίου σε τρυβλίο 100 mm επιστρωμένο με βρεγμένο wetex και προσθήκη των 1 ων αντισωμάτων (40 μl/ μικροκυψελίδα) στις συγκεντρώσεις και στο διάλυμα που αναφέρονται παραπάνω (Πίνακας Μ7). 14. Περιτύλιξη του τρυβλίου με μονωτική ζελατίνη τύπου Parafilm (ώστε να παρεμποδιστεί πιθανή εξάτμιση των μικροποσοτήτων υγρού) και επώαση για 16 ώρες στους 4 ο C. 15. Μεταφορά του μικροπλακιδίου σε θερμοκρασία δωματίου και απομάκρυνση του υγρού. 16. Ακολουθούν 2 πλύσεις των 5 λεπτών η καθεμιά, με 200 ml PBS 1x υπό ανάδευση. 17. Προσθήκη των PLA ιχνηλατών στις συγκεντρώσεις και στο διάλυμα που αναφέρονται παραπάνω (40 μl/μικροκυψελίδα) και επώαση για 1 ώρα στους 37 0 C. 18. Μεταφορά του μικροπλακιδίου σε θερμοκρασία δωματίου και απομάκρυνση του υγρού. 19. Ακολουθούν 2 πλύσεις των 5 λεπτών η καθεμιά, με 200 ml διαλύματος έκπλυσης Α 1x υπό ανάδευση. 133

150 Υλικά και Μέθοδοι 20. Προσθήκη της λιγάσης στη συγκέντρωση και στο διάλυμα που αναφέρονται παραπάνω (40 μl/μικροκυψελίδα) και επώαση για 30 λεπτά στους 37 0 C. 21. Μεταφορά του μικροπλακιδίου σε θερμοκρασία δωματίου και απομάκρυνση του υγρού. 22. Ακολουθούν 2 πλύσεις των 2 λεπτών η καθεμιά, με 200 ml διαλύματος έκπλυσης Α 1x υπό ανάδευση. 23. Προσθήκη της πολυμεράσης στη συγκέντρωση και στο διάλυμα που αναφέρονται παραπάνω (40 μl/μικροκυψελίδα) και επώαση για 100 λεπτά στους 37 0 C. Από την προσθήκη της πολυμεράσης και μετά η διαδικασία πραγματοποιείται σε σκοτεινό περιβάλλον. 24. Μεταφορά του μικροπλακιδίου σε θερμοκρασία δωματίου και απομάκρυνση του υγρού. 25. Ακολουθούν 2 πλύσεις των 10 λεπτών η καθεμιά, με 200 ml διαλύματος έκπλυσης Β 1x υπό ανάδευση. 26. Πραγματοποείται χρώση των πυρήνων με τη χρωστική Draq5 για 5 λεπτά στους 37 0 C. 27. Ακολουθεί 1 πλύση για 1 λεπτό με 200 ml διαλύματος έκπλυσης Β 0.01x υπό ανάδευση. 28. Εναπόθεση 15 μl Mowiol ανά μικροκυψελίδα, τοποθέτηση μεγάλης καλυπτρίδας στο πάνω μέρος του μικροπλακιδίου και επώαση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Φύλαξη του δείγματος στους 4 0 C μέχρι παρατήρησής του, σε μικροσκόπιο φθορισμού συνεστιακής σάρωσης Leica SP5. 134

151 Υλικά και Μέθοδοι 24. Ανάπτυξη βακτηριακών κυττάρων σε στερεή καλλιέργεια (Hanahan, 1983) Υλικά και διαλύματα Στερεό θρεπτικό μέσο για ανάπτυξη βακτηρίων LB-agar Άγαρ (bacto-agar) 1.5% κ.β. σε θρεπτικό μέσο LB Το διάλυμα αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο) και αποχύνεται στα τρυβλία ανάπτυξης των βακτηρίων. Το θρεπτικό μέσο στερεοποιείται όταν η θερμοκρασία του φθάσει στους 40 o C. Διάλυμα Αμπικιλλίνης 50 mg/ml (σε απεσταγμένο νερό) Το διάλυμα αποστειρώνεται με διοχέτευσή του μέσα από φίλτρο με πόρους διαμέτρου 0.2 μm. Διάλυμα Καναμυκίνης 50 mg/ml (σε απεσταγμένο νερό) Το διάλυμα αποστειρώνεται με διοχέτευσή του μέσα από φίλτρο με πόρους διαμέτρου 0.2 μm. Πειραματική πορεία Όταν το θρεπτικό μέσο βρίσκεται σε θερμοκρασία περίπου 60 ο C και πριν στερεοποιηθεί, προστίθενται αντιβιοτικά (αμπικιλλίνη ή καναμυκίνη) σε τελική συγκέντρωση 0.1 mg/ml ή 0.05 mg/ml, αντιστοίχως. Σε σωληνάριο με παγωμένα βακτηριακά κύτταρα, εμβαπτίζεται αποστειρωμένος μικροβιολογικός κρίκος και επιστρώνονται τα βακτηριακά κύτταρα που μεταφέρει, με οφιοειδείς κινήσεις, σε τρυβλία με στερεοποιημένο θρεπτικό μέσο. Τα τρυβλία επωάζονται ανεστραμμένα για 16 ώρες στους 37 ο C. 135

152 Υλικά και Μέθοδοι 25. Ανάπτυξη βακτηριακών κυττάρων σε υγρή καλλιέργεια (Hanahan, 1983) Υλικά και διαλύματα Υγρό θρεπτικό μέσο για ανάπτυξη βακτηρίων LB (Luria-Bertani) medium Εκχύλισμα ζύμης 0.5% κ.β. Βακτο-τρυπτόνη 1% κ.β. NaCl 1% κ.β. Ανάδευση μέχρι να διαλυθούν. Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται με καυστικό νάτριο (NaOH) 1Μ στο 7.0 και το διάλυμα αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Διάλυμα Αμπικιλλίνης 50 mg/ml (σε απεσταγμένο νερό) Το διάλυμα αποστειρώνεται με διοχέτευσή του μέσα από φίλτρο με πόρους διαμέτρου 0.2 μm. Διάλυμα Καναμυκίνης 50 mg/ml (σε απεσταγμένο νερό) Το διάλυμα αποστειρώνεται με διοχέτευσή του μέσα από φίλτρο με πόρους διαμέτρου 0.2 μm. Πειραματική πορεία Μονήρεις αποικίες βακτηρίων που αναπτύσσονται σε στερεή καλλιέργεια μεταφέρονται (με τη βοήθεια αποστειρωμένου ακρορρυγχίου) σε υγρό θρεπτικό μέσο ανάπτυξης βακτηριών (εμβολιασμός). Ο εμβολιασμός πραγματοποιείται σε αποστειρωμένα σωληνάρια των 50 ml με 10 ml υγρού θρεπτικού μέσου, παρουσία αμπικιλλίνης ή καναμυκίνης σε τελική συγκέντρωση 0.1 mg/ml ή 0.05 mg/ml, αντιστοίχως. Οι υγρές καλλιέργειες επωάζονται για 16 ώρες στους 37 ο C υπό συνεχή ανακίνηση. 136

153 Υλικά και Μέθοδοι 26. Κατάψυξη βακτηριακών κυττάρων (Hanahan, 1983) Υλικά και διαλύματα Στερεό θρεπτικό μέσο για ανάπτυξη βακτηρίων LB-agar Άγαρ (bacto-agar) 1.5% κ.β. σε θρεπτικό μέσο LB Το διάλυμα αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο) και αποχύνεται στα τρυβλία ανάπτυξης των βακτηρίων. Το θρεπτικό μέσο στερεοποιείται όταν η θερμοκρασία του φθάσει στους 40 o C. Υγρό θρεπτικό μέσο LB (Luria-Bertani) για ανάπτυξη βακτηρίων Εκχύλισμα ζύμης 0.5% κ.β. Βακτο-τρυπτόνη 1% κ.β. NaCl 1% κ.β. Ανάδευση μέχρι να διαλυθούν. Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται με καυστικό νάτριο (NaOH) 1Μ στο 7.0 και το διάλυμα αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Διάλυμα αποστειρωμένης γλυκερόλης Διάλυμα γλυκερόλης αποστειρώνεται για 20 min σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Πειραματική πορεία 1. Επιστρώνεται τρυβλίο ανάπτυξης βακτηρίων με στερεό θρεπτικό μέσο (LBάγαρ) και αφήνεται σε θερμοκρασία δωματίου να στερεοποιηθεί. 2. Πραγματοποιείται εμβολιασμός του με βακτηριακά κύτταρα και επώαση στους 37 ο C για 16 ώρες, παρουσία αντιβιοτικών. 3. Πραγματοποιείται εμβολιασμός μονήρους αποικίας σε αποστειρωμένο σωληνάριο των 50 ml με 10 ml υγρού θρεπτικού μέσου και επώαση στους 37 ο C υπό ανάδευση για 16 ώρες, παρουσία αντιβιοτικών. 4. Μεταφορά υπό άσηπτες συνθήκες 100 μl από την υγρή καλλιέργεια σε αποστειρωμένο σωληνάριο των 50 ml με 10 ml υγρού θρεπτικού μέσου και επώαση στους 37 ο C υπό ανάδευση με παρακολούθηση της οπτικής απορρόφησης, παρουσία αντιβιοτικών. 137

154 Υλικά και Μέθοδοι 5. Όταν η οπτική απορρόφηση της καλλιέργειας (Α=600 nm) γίνει 0.4 πραγματοποιείται μεταφορά, υπό άσηπτες συνθήκες, 0.8 ml υγρής καλλιέργειας σε αποστειρωμένα σωληνάρια φυγοκέντρου. 6. Προσθήκη 0.2 ml διαλύματος αποστειρωμένης γλυκερόλης ανά σωληνάριο. 7. Έντονη ανάδευση σε αναδευτήρα τύπου vortex. 8. Άμεση κατάψυξη (-80 ο C). 27. Παρασκευή επιδεκτικών κυττάρων για μετασχηματισμό (competent cells) Υλικά και διαλύματα Βακτήρια Escherichia Coli DH5A (InVitrogen, Carlsbad, CA, USA) Υγρό θρεπτικό μέσο LB (Luria-Bertani) για ανάπτυξη βακτηρίων Εκχύλισμα ζύμης 0.5% κ.β. Βακτο-τρυπτόνη 1% κ.β. NaCl 1% κ.β. Ανάδευση μέχρι να διαλυθούν. Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται με καυστικό νάτριο (NaOH) 1Μ στο 7.0 και το διάλυμα αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). CaCl Μ Διάλυμα αποστειρωμένης γλυκερόλης Αποστειρώνεται για 20 min σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Πειραματική διαδικασία 1. Σε αποστειρωμένο σωληνάριο με 10 ml υγρό θρεπτικό μέσο, προστίθενται 2 μl παγωμένων κυττάρων Escherichia coli του στελέχους DH5A υπό άσηπτες συνθήκες καλλιέργειας βακτηρίων και επωάζεται υπό ανάδευση στους 37 ο C για 16 ώρες. 138

155 Υλικά και Μέθοδοι 2. Αποστειρωμένη κωνική φιάλη με 100 ml υγρού θρεπτικού μέσου, εμβολιάζεται με 2 ml από την υγρή καλλιέργεια και ακολουθεί επώαση υπό ανάδευση στους 37 ο C, μέχρι η οπτική απορρόφηση της καλλιέργειας να φθάσει στα 600 nm. Η πειραματική διαδικασία συνεχίζεται στους 4 0 C. 3. Η υγρή καλλιέργεια χωρίζεται σε 2 αποστειρωμένα σωληνάρια των 50 ml και φυγοκεντρείται στα rpm για 10 λεπτά στους 4 0 C. 4. Απομάκρυνση του υπερκείμενου υγρού. 5. Σταδιακή επαναιώρηση του ιζήματος βακτηρίων με 20 ml ψυχρού αποστειρωμένου διαλύματος CaCl Μ, σε κάθε σωληνάριο. 6. Επώαση για 30 λεπτά στους 4 0 C. 7. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα rpm για 10 λεπτά στους 4 0 C. 8. Επαναιώρηση του ιζήματος βακτηρίων με 1.5 ml ψυχρού αποστειρωμένου διαλύματος CaCl Μ, με γλυκερόλη σε τελική συγκέντρωση 15%, σε κάθε σωληνάριο. 9. Ακολουθεί έντονη ανάδευση του εναιωρήματος των κυττάρων, σε αναδευτήρα τύπου vortex, τα οποία χωρίζονται σε κλάσματα των 350 μl και φυλάσσονται άμεσα στους C. 28. Μετασχηματισμός δεκτικών βακτηριακών κυττάρων (transformation) (Hanahan, 1983) Μετασχηματισμός (transformation) ονομάζεται η εισαγωγή του υπό μελέτη πλασμιδίου στα δεκτικά βακτήρια. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε εισαγωγή πλασμιδιών που φέρουν τη γονιδιακή αλληλουχία της ιντεγκρίνης α ν (wtα ν ) ή β 3 (wtβ 3 ) καθώς και του πλασμιδίου-φορέα pcdna3.1., σε κύτταρα Escherichia coli του στελέχους BL21. Ακόμα πραγματοποιήθηκε εισαγωγή πλασμιδιών που φέρουν τη γονιδιακή αλληλουχία της NCL συζευγμένης με GFP (GFP-NCL), τμήματα της γονιδιακής αλληλουχίας της NCL που κωδικοποιούν τα αμινοξέα 1-275, , , συζευγμένα με GFP (Μ1, Μ2 139

156 Υλικά και Μέθοδοι και Μ3 αντιστοίχως), καθώς και του πλασμιδίου-φορέα pegfp-c1 (το οποίο εκφράζει την πρωτεΐνη GFP), σε κύτταρα Escherichia coli του στελέχους DH5A. Τα πλασμίδια που φέρουν τη γονιδιακή αλληλουχία της ιντεγκρίνης α ν (wtα ν ) ή β 3 (wtβ 3 ) μας δόθηκαν από την Δρ. Nelly Kieffer στο CNRS/LIA124, Shangai, China. Το πλασμίδιο GFP-Nucleolin που περιλαμβάνει ολόκληρη τη γονιδιακή αλληλουχία της NCL συζευγμένης με GFP ήταν της εταιρείας Αddgene (Cambridge, USA, #28176) και τα πλασμίδια που φέρουν τμήματα της γονιδιακής αλληλουχίας της NCL, συζευγμένα με GFP παρασκευάστηκαν από τον Δρ. Χρήστο Πολυτάρχου στο Dana Farber Cancer Institute, Department of Cancer Immunology & AIDS, Boston, USA και Harvard Medical School, Department of Immunobiology and Microbiology, Boston, USA. Υλικά και διαλύματα Υγρό θρεπτικό μέσο LB (Luria-Bertani) για ανάπτυξη βακτηρίων Εκχύλισμα ζύμης 0.5% κ.β. Βακτο-τρυπτόνη 1% κ.β. NaCl 1% κ.β. Ανάδευση μέχρι να διαλυθούν. Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται με καυστικό νάτριο (NaOH) 1Μ στο 7.0 και το διάλυμα αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Στερεό θρεπτικό μέσο για ανάπτυξη βακτηρίων LB-agar Άγαρ (bacto-agar) 1.5% κ.β. σε θρεπτικό μέσο LB Το διάλυμα αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο) και αποχύνεται στα τρυβλία ανάπτυξης των βακτηρίων. Το θρεπτικό μέσο στερεοποιείται όταν η θερμοκρασία του φθάσει στους 40 o C. Υγρό θρεπτικό μέσο SOB για ανάπτυξη βακτηρίων Βακτο-τρυπτόνη 2% κ.β. Εκχύλισμα ζύμης 0.5% κ.β. NaCl 0.05% KCl 2.5 mm MgCl 2 10 mm Ανάδευση όλων πλην του MgCl 2 μέχρι να διαλυθούν. Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται με καυστικό νάτριο (NaOH) 1Μ στο 7.0 και το διάλυμα αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Το διάλυμα διατηρείται στους 4 ο C και λίγο 140

157 Υλικά και Μέθοδοι πριν τη χρήση του, γίνεται προσθήκη αποστειρωμένου διαλύματος MgCl 2 μέχρι τελικής συγκέντρωσης 10 mm. Υγρό θρεπτικό μέσο SOC για ανάπτυξη βακτηρίων Γλυκόζη 1Μ Προσθήκη στο SOB 20 ml αποστειρωμένου διαλύματος γλυκόζης 1Μ ανά λίτρο καλλιέργειας. Το διάλυμα της γλυκόζης αποστειρώνεται με τη χρήση βακτηριοστατικού φίλτρου και το διάλυμα SOB πρέπει να βρίσκεται σε θερμοκρασία 60 ο C κατά την προσθήκη του διαλύματος γλυκόζης. Το διάλυμα διατηρείται στους 4 ο C. Διάλυμα αμπικιλλίνης 50 mg/ml (σε απεσταγμένο νερό) Το διάλυμα αποστειρώνεται με διοχέτευσή του μέσα από φίλτρο με πόρους διαμέτρου 0.2 μm. Διάλυμα Καναμυκίνης 50 mg/ml (σε απεσταγμένο νερό) Το διάλυμα αποστειρώνεται με διοχέτευσή του μέσα από φίλτρο με πόρους διαμέτρου 0.2 μm. Πειραματική πορεία 1. Σωληνάριο που περιέχει 350 μl δεκτικών βακτηρίων μεταφέρεται από τους - 80 ο C σε πάγο. Είναι σημαντικό η θερμοκρασία των βακτηριακών κυττάρων να μην υπερβεί τους 0 ο C. 2. Μεταφέρονται 50 μl των βακτηρίων σε αποστειρωμένο σωληνάριο, το οποίο έχει τοποθετηθεί στον πάγο 5 λεπτά πριν από τη χρήση του. 3. Προσθήκη 5 μl πλασμιδιακού DNA. 4. Πραγματοποιείται ήπια ανάδευση με το χέρι (flicking). 5. Το σωληνάριο επωάζεται στον πάγο για 30 λεπτά. 6. Στη συνέχεια μεταφέρεται σε υδατόλουτρο με θερμοκρασία 42 ο C. Επωάζεται εκεί για 90 δευτερόλεπτα. 7. Αμέσως μεταφέρεται στον πάγο, όπου επωάζεται για 2 λεπτά. 8. Σε αποστειρωμένο σωληνάριο των 15 ml που περιέχει 1 ml υγρού θρεπτικού μέσου SOC προστίθεται το εναιώρημα των κυττάρων. 9. Ακολουθεί επώαση στους 37 ο C για 1 ώρα υπό ανάδευση. 141

158 Υλικά και Μέθοδοι 10. Παρασκευάζεται τρυβλίο με στερεό θρεπτικό μέσο για την ανάπτυξη των βακτηρίων. Στο θρεπτικό μέσο λίγο πριν (όταν η θερμοκρασία είναι ανεκτή από το χέρι) αλλά και μετά τον πολυμερισμό του, προστίθεται κατάλληλο αντιβιοτικό. Στην περίπτωσή του pcdna3.1. φορέα χρησιμοποιείται αμπικιλλίνη (0.1 mg/ml), ενώ στην περίπτωσή του pegfp-c1 φορέα χρησιμοποιείται καναμυκίνη (0.05 mg/ml). 11. Πραγματοποιείται μεταφορά των βακτηρίων σε αποστειρωμένο σωληνάριο τύπου Eppendorf. 12. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα g για 6 λεπτά, απόρριψη του υπερκειμένου και επαναιώρηση των κυττάρων σε 40 μl υγρού θρεπτικού μέσου LB. 13. Επίστρωση του εναιωρήματος των βακτηρίων στο κατάλληλο στερεό θρεπτικό μέσο και τοποθέτηση του τελευταίου ανεστραμμένο σε επωαστικό θάλαμο με θερμοκρασία 37 ο C για 16 ώρες. 14. Το τρυβλίο ελέγχεται μακροσκοπικά για την ανάπτυξη αποικιών βακτηρίων ανθεκτικών σε αμπικιλλίνη ή καναμυκίνη. 29. Μεγάλης κλίμακας απομόνωση πλασμιδιακού DNA (Midiprep) Για την απομόνωση πλασμιδιακού DNA από υγρή καλλιέργεια βακτηρίων E. Coli μετασχηματισμένων με το επιθυμητό πλασμίδιο, χρησιμοποιήθηκε το ολοκληρωμένο σύστημα PureLink TM HiPure Plasmid Purification Kit-Invitrogen (InVitrogen, Carlsbad, CA, USA). Υλικά και διαλύματα PureLinkTM HiPure στήλες μεγάλης κλίμακας (PureLinkTM HiPure Midi Columns) Διάλυμα επαναιώρησης (R3) με RNAάση (Resuspension Buffer R3 with RNase A) 142

159 Υλικά και Μέθοδοι Διάλυμα λύσης (L7) (Lysis Buffer, L7) Διάλυμα κατακρήμνισης (N3) (Precipitation Buffer, N3) Διάλυμα εξισορρόπησης (EQ1) (Equilibration Buffer, EQ1) Διάλυμα έκπλυσης (W8) (Wash Buffer, W8) Διάλυμα έκλουσης (E4) (Elution Buffer, E4) TE Buffer (TE) Ισοπροπανόλη 30% αιθανόλη Πειραματική πορεία 1. Από καλλιέργεια όγκου 100 ml μεταφέρονται 25 ml σε σωληνάριο των 50 ml. Μετά από φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στα g, απορρίπτεται το υπερκείμενο (x2). 2. Προκειμένου να επιτευχθεί λύση των κυττάρων, προστίθενται 4 ml διαλύματος R3 (στο οποίο έχει προστεθεί RNAάση) και έπεται επαναιώρηση του ιζήματος των κυττάρων, μέχρι να προκύψει ομοιογενές εναιώρημα. 3. Προστίθενται 4 ml διαλύματος L7 και το σωληνάριο αναστρέφεται 5 φορές. Επώαση για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 4. Προστίθενται 4 ml διαλύματος N3 και το σωληνάριο αναστρέφεται, μέχρις ότου το μίγμα γίνει ομοιογενές. 5. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στα g σε θερμοκρασία δωματίου. 6. Το υπερκείμενο του βήματος 5, φέρεται εντός της στήλης PureLinkTM HiPure. Σε αυτό το στάδιο πραγματοποιείται δέσμευση του DNA στην πακεταρισμένη στήλη ανταλλαγής ιόντων, την οποία έχουμε εξισορροπήσει με 10 ml διαλύματος 143

160 Υλικά και Μέθοδοι EQ1 (x2). Τα εκλούσματα απομακρύνονται από την στήλη με τη ροή της βαρύτητας. 7. Ακολουθεί έκπλυση της στήλης 2 φορές με 10 ml διαλύματος έκπλυσης. 8. Προσαρμόζεται σωληνάριο συλλογής 15 ml στο κάτω μέρος της στήλης. 9. Προσθήκη διαλύματος Ε4 στη στήλη, προς έκλουση του δεσμευμένου πλασμιδιακού DNA. Το έκλουσμα απομακρύνεται από την στήλη με τη ροή της βαρύτητας. 10. Προσθήκη 3.5 ml ισοπροπανόλης στο έκλουσμα και ανάδευση του μίγματος. 11. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 30 λεπτά στα g στους 4 0 C. 12. Το υπερκείμενο απομακρύνεται προσεκτικά και το ίζημα επαναιωρείται σε 3 ml αιθανόλης 70%. 13. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στα g στους 4 0 C. 14. Το υπερκείμενο απομακρύνεται προσεκτικά και το ίζημα ξηραίνεται σε θερμοκρασία δωματίου για 3 ώρες. 15. Επαναιώρηση του ιζήμος, το οποίο περιλαμβάνει καθαρό πλασμιδιακό DNA, σε 150 μl διαλύματος ΤΕ. 16. Για τον έλεγχο της καθαρότητας του πλασμιδίου, αφού έχει προηγηθεί φωτομέτρηση για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσής του (βλέπε Παράγραφο 30), ακολουθούν ενζυμικές πέψεις και ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1.5% κ.β. (βλέπε παραγράφους 31 και 32). 30. Προσδιορισμός της συγκέντρωσης DNA (Chirgwin et al, 1979) Η συγκέντρωση DNA υπολογίζεται από τον εξής τύπο: Συγκέντρωση DNA = Α 260nm x 50 x αραίωση Η συγκέντρωση δίνεται σε ng/μl. (Ο συντελεστής 50 εξάγεται από την παρατήρηση ότι ένα διάλυμα DNA, συγκέντρωσης 50 ng/μl, έχει απορρόφηση 1 στα 260 nm). Ο λόγος της οπτικής απορρόφησης στα 260nm ως προς την οπτική απορρόφηση στα 280nm αποτελεί δείκτη της καθαρότητας του δείγματος. Αν ο 144

161 Υλικά και Μέθοδοι λόγος αυτός είναι μικρότερος του 1.8, τότε η περιεκτικότητα του δείγματος σε πρωτεΐνες είναι υψηλή και αυτό δύναται να προκαλέσει προβλήματα στις περαιτέρω αναλύσεις. 31. Αντίδραση πέψης με ένζυμα περιορισμού Στην παρούσα διδαστορική διατριβή πραγματοποιήθηκαν διαδοχικές πέψεις των pegfp-c1 πλασμιδίων που περιέχουν αλληλουχίες είτε ολόκληρου του γονιδίου της NCL, είτε τμημάτων αυτής. Όλη η διαδικασία πραγματοποιήθηκε στους 4 0 C. Η ποσότητα του πλασμιδιακού DNA που χρησιμοποιείται ανά αντίδραση είναι 200 ng. Υλικά και διαλύματα Ένζυμο περιορισμού KpnI (Biolabs Inc., New England) Συγκέντρωση 10 Units/μl Διάλυμα αποθήκευσης: 10 mm Tris-HCl, ph mm KCl 0.1 mm EDTA 1 mm 200 µg/ml BSA 50% Γλυκερόλη PH 7.4 Θερμοκρασία πέψης 37 0 C Ένζυμο περιορισμού BamHI (Takara Bio Inc., Japan) Συγκέντρωση 10 Units/μl Διάλυμα αποθήκευσης: 10 mm Tris-HCl, ph mm NaCl 0.1 mm EDTA 1 mm DTT 200 µg/ml BSA 50% Γλυκερόλη 0.15% Triton X-100 Θερμοκρασία πέψης 37 0 C 145

162 Υλικά και Μέθοδοι Ρυθμιστικό διάλυμα πέψης 10x του περιοριστικού ενζύμου KpnI (Biolabs Inc., New England): 10 mm Βis-Tris-Propane-HCl, 10 mm MgCl2 1 mm DTT ph 7.0 BSA 10x (Biolabs Inc., New England) KCl 1M Ρυθμιστικό διάλυμα δειγμάτων ηλεκτροφόρησης 10x: 1% κ.β. SDS 50% κ.ό. Γλυκερόλη 0.05% κ.β. Κυανούν της βρωμοφαινόλης Πειραματική πορεία 1. Σε αποστειρωμένο σωληνάριο μικροφυγοκέντρου προστίθεται το διάλυμα DNA και ο κατάλληλος όγκος αποστειρωμένου νερού μέχρι τελικού όγκου 13.5 μl. 2. Προσθήκη 1.35 μl του ρυθμιστικού διαλύματος πέψης του ενζύμου KpnI (10x). 3. Προσθήκη 1.35 μl διαλύματος BSA (1μg/ml). 4. Προσθήκη 10 units (1 μl) ενζύμoυ περιορισμού KpnI. 5. Ήπια ανάδευση των συστατικών της αντίδρασης και επώαση στους 37 0 C για 1 ώρα. 6. Ακολουθεί φυγοκέντρηση των δειγμάτων για 5 δευτερόλεπτα στα g. 7. Προσθήκη 1.6 μl διαλύματος KCl (1M). 8. Προσθήκη 10 units (1 μl) ενζύμoυ περιορισμού BamHI. 9. Ήπια ανάδευση των συστατικών της αντίδρασης και επώαση στους 37 0 C για 1 ώρα. Ακολουθεί φυγοκέντρηση των δειγμάτων για 5 δευτερόλεπτα στα g και προσθήκη 1.9 μl διαλύματος δειγμάτων ηλεκτροφόρησης 10x. 10. Ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων σε πήκτωμα αγαρόζης 1.5% κ.β. και παρατήρηση με τη διέλευση υπεριώδους φωτός. 146

163 Υλικά και Μέθοδοι 32. Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊνικών οξέων σε πήκτωμα αγαρόζης (Sellner et al, 1992; Brooks et al, 1995) Η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης είναι η κύρια μέθοδος που χρησιμοποιείται για την ανάλυση νουκλεϊνικών οξέων. Στα πηκτώματα αγαρόζης, η ηλεκτροφορητική κινητικότητα γραμμικών μορίων είναι αντιστρόφως ανάλογη του λογάριθμου του μοριακού τους βάρους. Η ηλεκτροφορητική κινητικότητα εξαρτάται επίσης και από τη συγκέντρωση της αγαρόζης στο πήκτωμα. Πηκτώματα διαφορετικού ποσοστού αγαρόζης, χρησιμοποιούνται για την ανάλυση συγκεκριμένων μεγεθών τμημάτων νουκλεϊνικών οξέων. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, τα προϊόντα διαδοχικών πέψεων των pegfp-c1 ανασυνδυασμένων πλασμιδίων που περιέχουν αλληλουχίες είτε ολόκληρου του γονιδίου της NCL, είτε τμημάτων αυτής (βλέπε Εικόνα Μ2), αναλύθηκαν ηλεκτροφορητικά σε πήκτωμα αγαρόζης, για τον έλεγχο της επιτυχούς κλωνοποίησης των πλασμιδίων (Εικόνα Μ4). 5x TBE 0.45 M Tris-base 0.45 M Βορικό οξύ 0.01 Μ EDTA ph 8,0 Υλικά και διαλύματα Διάλυμα βρωμιούχου αιθίδιου 10 mg/ml (σε απεσταγμένο νερό) 10x διάλυμα δειγμάτων 0.25% κ.β. κυανούν της βρωμοφαινόλης 50% κ.ό. γλυκερόλη σε Η 2 Ο Μάρτυρας μοριακού βάρους 100 bp (DongSheng Biotech co.,ltd, China) Πειραματική πορεία Παρασκευή του πηκτώματος αγαρόζης 1.5% κ.β. σε ρυθμιστικό διάλυμα Τrisβορικού (ΤΒΕ): 147

164 Υλικά και Μέθοδοι 1. Σε μια μικρή κωνική φιάλη προστίθεται προζυγισμένη ποσότητα αγαρόζης, σε συγκεκριμένο όγκο διαλύματος ηλεκτροφόρησης 0.5x TBE. Το διάλυμα θερμαίνεται σε φούρνο μικροκυμάτων μέχρι να διαλυθεί όλη η ποσότητα της αγαρόζης. 2. Όταν η θερμοκρασία του διαλύματος της αγαρόζης φτάσει στους 50 0 C, προστίθεται βρωμιούχο αιθίδιο σε τελική συγκέντρωση 1 μg/ml. Το διάλυμα αγαρόζης αποχύνεται στον ειδικό φορέα. Στα δείγματα των νουκλεϊνικών οξέων προστίθεται διάλυμα δειγμάτων 10x σε αναλογία 1:9. 3. Όταν στερεοποιηθεί η αγαρόζη, τα προς ανάλυση δείγματα φέρονται στις ειδικές εγκοπές του πηκτώματος. 4. Παράλληλα με τα δείγματα ηλεκτροφορούνται 2 μl (200 ng) μαρτύρων μοριακού βάρους που καλύπτουν εύρος τιμών bp. 5. Υπό σταθερή τάση ρεύματος (50 V) τα νουκλεϊνικά οξέα αναλύονται με βάση το μέγεθος τους. Η ανάλυση των δειγμάτων γίνεται σε οριζόντια συσκευή ηλεκτροφόρησης. Η παρατήρηση των πηκτωμάτων γίνεται με χρήση διερχόμενου υπεριώδους φωτός. Εικόνα Μ4: Έλεγχος κλωνοποίησης των pegfp-c1 πλασμιδίων με την αγρίου τύπου NCL καθώς και με τμήματα του γονιδίου της. Τα προϊόντα μετά από πέψη των ανασυνδυασμέων πλασμιδίων με τα ένζυμα περιορισμού, αναλύονται ηλεκτροφορητικά. Στη διαδρομή 1 αναλύονται οι μάρτυρες μοριακού βάρους ενώ στις 2, 3, 4, 5 και 6 διαδρομές, αναλύονται τα προϊόντα πέψης του pegfp-c1 και των ανασυνδυασμένων πλασμιδίων αντίστοιχα. Τα αναμενόμενα μεγέθη των προϊόντων πέψης είναι τα εξής: GFP-NCL: 2121 bp/m1: 825 bp/m2: 1290 bp/m3: 1521 bp. 148

165 Υλικά και Μέθοδοι 33. Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων, από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα σε κάθε περίπτωση, έγινε με τη χρήση του unpaired t-test ή του test ANOVA. Οι συγκρίσεις (μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα) έγιναν μεταξύ της κάθε πειραματικής ομάδας και του αντίστοιχου μάρτυρα. 34. Αντιδραστήρια Στην παρούσα διδακτορική διατριβή χρησιμοποιήθηκαν επιπλέον τα παρακάτω αντιδραστήρια, στις τελικές συγκεντρώσεις που αναγράφονται: PTN (100 ng/ml): Βακτηριακής προέλευσης, απομονωμένη με χρωματογραφία συγγένειας (Lab. CRRET, France). PTN 1-5 : NH 2 -GKKEK-COOH (1 μg/ml) PTN : NH 2 -GEWQWSVCV-COOH (1 μg/ml) PTN : NH 2 -FQAWGEC-COOH (1 μg/ml) PTN : NH 2 -KLTKPKPQAESKKKKKEGKKQEKMLD-COOH (1 μg/ml) Η σύνθεση των πεπτιδίων της PTN που αντιστοιχούν στα αμινοξέα 1-5, 16-24, και πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών από την Δρ. Κατερίνα Ζώμπρα με την επίβλεψη του καθηγητή Παύλου Κορδοπάτη. Χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος στερεάς φάσης και η Fmoc/tBu χημεία, με τη χρήση 2-χλωροτριτυλ-χλωριδίου ρεζίνης ως στερεά φάση. Τα τελικά προϊόντα διέθεταν καθαρότητα τουλάχιστον 97%, όπως βρέθηκε μετά από HPLC ανάλυση και οι μοριακές τους μάζες ταυτοποιήθηκαν με ESI-MS. PTN : NH 2 -CQKTVTISKPC-COOH (1 μg/ml): Η σύνθεση του πεπτιδίου αυτού έγινε από τον Δρ. Θεόδωρο Τσέλιο με τη χρήση microwave. VEGF 165 (10 ng/ml): Ανθρώπινος ανασυνδυασμένος VEGF 165 εκφράστηκε σε κύτταρα εντόμου. Ο καθαρισμός του προϊόντος πραγματοποιήθηκε με ανταλλαγή κατιόντων και χρωματογραφία συγγένειας με ηπαρίνη (Heroult et al, 2004). VEGF 121 (10 ng/ml): Ανθρώπινος ανασυνδυασμένος VEGF 121 που εκφράστηκε σε κύτταρα εντόμου (RELIA Tech GmbH, Wolfenbüttel, Germany). 5(KPR)TASP πεπτίδιο (1μM): Συνθετικό πεπτίδιο έναντι της μεμβρανικής NCL (Συντέθηκε από τον Δρ. Πέτρο Χρίστου, με την επίβλεψη της επίκουρης καθηγήτριας Βασιλικής Μαγκαφά, στο εργαστήριο Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών). HB-19 πεπτίδιο (10μg/ml): Συνθετικό πεπτίδιο έναντι της μεμβρανικής NCL (Lab. CRRET, France). NUCANT 6L πεπτίδιο (10μg/ml): Συνθετικό πεπτίδιο έναντι της μεμβρανικής NCL (Lab. CRRET, France). 149

166 Υλικά και Μέθοδοι LM609 (MAB1976Z) (10 ng/ml): Λειτουργικό αντίσωμα έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3 (Chemicon). PP1 (10μM): Ειδικός αναστολέας της κινάσης c-src (TOCRIS, Minneapolis, USA). SU6656 (10μM): Ειδικός αναστολέας της κινάσης c-src (Calbiochem). Wortmannin (100 nm): Ειδικός αναστολέας της κινάσης PI3K (TOCRIS, Minneapolis, USA). U0126 (20 nm): Ειδικός αναστολέας της κινάσης ERK½ (TOCRIS, Minneapolis, USA). SB (10μΜ): Ειδικός αναστολέας της κινάσης p38 (BioSource Europe, Nivelles, Belgium). SP (20nM): Ειδικός αναστολέας της κινάσης JNK (BioSource Europe, Nivelles, Belgium). Bevacizumab (250μg/ml): Ανθρωποποιημένο μονοκλωνικό αντίσωμα που προσδένει τον VEGF 165 και δεν επιτρέπει τη δέσμευση του τελευταίου στους VEGFRs (Roche Applied Science, Indianapolis, USA). 150

167 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

168

169 Αποτελέσματα 1. Η PTN συνανοσοκατακρημνίζεται με τη NCL σε ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC Στη βιβλιογραφία προτείνεται ο πιθανός ρόλος της NCL ως χαμηλής συγγένειας υποδοχέας της PTN (Take et al, 1994; Said et al, 2005). Επιπλέον, από προηγούμενη μελέτη της ερευνητικής μας ομάδας, γνωρίζουμε πως η PTN συνανοσοκατακρημνίζεται με τη NCL σε ολικό πρωτεϊνικό εκχύλισμα της χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης εμβρύου όρνιθας (Drosou et al, 2008). Στην παρούσα διατριβή, αρχικά διερευνήσαμε την αλληλεπίδραση PTN-NCL σε καλλιέργειες ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων. Σε ολικό πρωτεϊνικό εκχύλισμα κυττάρων HUVEC πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση με αντίσωμα έναντι της NCL ή της ΡΤΝ. Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE και ανάλυση κατά Western με αντίσωμα έναντι της PTN ή της NCL αντίστοιχα. Στην Εικόνα Α1, φαίνεται ότι η PTN συνανοσοκατακρημνίζεται με τη NCL στα κύτταρα HUVEC. Εικόνα Α1: Μελέτη της αλληλεπίδρασης ανάμεσα στην PTN και στη NCL σε ολικό πρωτεϊνικό εκχύλισμα κυττάρων HUVEC. (Α) Η αλληλεπίδραση μελετήθηκε με ανοσοκατακρήμνιση έναντι της NCL και τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν με αντίσωμα έναντι της PTN, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. (Β) Η αλληλεπίδραση μελετήθηκε με ανοσοκατακρήμνιση έναντι της PTN και τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν με αντίσωμα έναντι της NCL, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Προς επιβεβαίωση της εκλεκτικότητας των υπό μελέτη αλληλεπιδράσεων, σε κάθε περίπτωση πραγματοποιήθηκε και ανοσοκατακρήμνιση με ανοσοσφαιρίνη IgG. 153

170 Αποτελέσματα 2. Συνεντοπισμός της PTN με τη NCL σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC Σε περιπτώσεις αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών, τα πειράματα διπλού ανοσοφθορισμού μπορούν να προσδώσουν πρόσθετες πληροφορίες για τις περιοχές του κυττάρου όπου λαμβάνει χώρα η αλληλεπίδραση αυτή. Για το λόγο αυτό, πραγματοποιήθηκε πείραμα διπλού ανοσοφθορισμού για την PTN και τη NCL σε κύτταρα HUVEC. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α2, η PTN και η NCL συνεντοπίζονται στην κυτταρική μεμβράνη, στο κυτταρόπλασμα και στους πυρήνες/πυρηνίσκους των HUVEC. Εικόνα Α2: Συνεντοπισμός της PTN και της NCL σε κύτταρα HUVEC. Πραγματοποιήθηκε διπλός ανοσοφθορισμός με αντισώματα έναντι της NCL (πράσινο) και της PTN (κόκκινο), όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Η σήμανση των πυρήνων έγινε με τη χρωστική Draq5 (μπλε). Στις περιοχές συνεντοπισμού παρατηρούνται σημεία κίτρινου χρώματος. H ράβδος κλίμακας αντιστοιχεί σε 10 μm. Επιπρόσθετα, για επιβεβαίωση του εντοπισμού της NCL στην κυτταρική επιφάνεια, πραγματοποιήθηκε πείραμα βιοτινυλίωσης πρωτεϊνών κυττάρων. Η βιοτίνη δεν έχει την ικανότητα να διαπερνά την κυτταρική μεμβράνη (Eickmann et al, 2005; Whitaker et al, 2007), ενώ ως αρνητικά φορτισμένο μόριο έχει τη δυνατότητα να δεσμεύεται σε θετικά φορτισμένα αμινοξέα πρωτεϊνών και για το 154

171 Αποτελέσματα λόγο αυτό, χρησιμοποιείται για να σημανθούν οι πρωτεΐνες που εντοπίζονται στην κυτταρική μεμβράνη. Συγκεκριμένα, κύτταρα HUVEC σε καλλιέργεια επωάσθηκαν με NHS-βιοτίνη και στο πρωτεϊνικό εκχύλισμα πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση με αντίσωμα έναντι της NCL. Ακολούθησε ανάλυση κατά Western με αντίσωμα στρεπταβιδίνης συζευγμένο με υπεροξειδάση. Η στρεπταβιδίνη είναι μόριο που εκλεκτικά δεσμεύεται στη βιοτίνη και η όλη διαδικασία οδηγεί στην εμφάνιση τόσο της μεμβρανικής NCL, όσο και όλων των πρωτεϊνών που δεσμεύονται στην τελευταία και εντοπίζονται στην κυτταρική μεμβράνη. Σε πρωτεϊνικό εκχύλισμα αντίστοιχης καλλιέργειας κυττάρων HUVEC ίδιας γενιάς, πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση με σφαιρίδια στρεπταβιδίνης και ανοσοαποτύπωμα με αντίσωμα έναντι της NCL (Εικόνα Α3). Σε κάθε περίπτωση, επιβεβαιώνεται η έκφραση της NCL στην επιφάνεια των κυττάρων HUVEC. Εικόνα Α3: H NCL εντοπίζεται στην πλασματική μεμβράνη κυττάρων HUVEC. Για ανίχνευση της επιφανειακής NCL, κύτταρα HUVEC επωάστηκαν με NHS-βιοτίνη. Στα πρωτεϊνικά εκχυλίσματα έγινε ανοσοκατακρήμνιση με αντίσωμα έναντι της NCL (αριστερό πλαίσιο) και με μαγνητικά σφαιρίδια στρεπταβιδίνης (streptavidin beads, s.b.) ή με ανοσοσφαιρίνη IgG (δεξί πλαίσιο). Tα ανοσοϊζήματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση κατά Western με αντίσωμα έναντι της NCL (αριστερό πλαίσιο) ή για βιοτινυλιωμένες πρωτεΐνες (χρησιμοποιώντας αντίσωμα στρεπταβιδίνης συζευγμένο με υπεροξειδάση (streptavidin- HRP, strep, δεξί πλαίσιο). Τα βέλη στις δύο ομάδες δείχνουν τη μεμβρανική NCL. Οι πειραματικές διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφονται στις Μεθόδους. 155

172 Αποτελέσματα 3. Η PTN συνανοσοκατακρημνίζεται με τη NCL στον πυρήνα, στο κυτταρόπλασμα και στην πλασματική μεμβράνη κυττάρων U87MG Με τη διαδικασία του ανοσοφθορισμού που προαναφέρθηκε, παρατηρήθηκε συνεντοπισμός της PTN με τη NCL σε διάφορα υποκυτταρικά διαμερίσματα. Με σκοπό να επιβεβαιώσουμε ότι πρόκειται για αλληλεπίδραση των δύο μορίων, πραγματοποιήθηκαν πειράματα κλασμάτωσης ανθρώπινων κυττάρων γλοιβλαστώματος U87MG, από τα οποία απομονώθηκαν το μεμβρανικό, το κυτταροπλασματικό και το πυρηνικό κλάσμα, όπως περιγράφεται στις Mεθόδους. Δεν πραγματοποιήθηκαν κλασματώσεις σε κύτταρα HUVEC, λόγω του πολύ μεγάλου αριθμού απαιτούμενων για την κλασμάτωση κυττάρων. Αρχικά, ελέγχθηκε η ενδογενής έκφραση των υπό μελέτη πρωτεϊνών σε ίσες ποσότητες ολικής πρωτεΐνης από τα προαναφερόμενα κυτταρικά κλάσματα, πραγματοποιώντας ανοσοκατακρήμνιση με αντισώματα για την PTN ή τη NCL και ανοσοαποτύπωμα για τα ίδια μόρια, αντίστοιχα. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α4, τόσο η PTN όσο και η NCL εκφράζονται σε πυρηνικά, κυτταροπλασματικά και σε πολύ μικρότερο ποσοστό σε μεμβρανικά εκχυλίσματα κυττάρων U87MG. Το παρατηρούμενο μοριακό μέγεθος της NCL στα πυρηνικά εκχυλίσματα είναι μικρότερο από αυτό των άλλων κλασμάτων. Το φαινόμενο αυτό πιθανόν οφείλεται σε έλλειψη γλυκοζυλίωσης της πυρηνικής NCL, όπως περιγράφεται βιβλιογραφικά (Losfeld et al, 2009). Για να διερευνήσουμε σε ποιες περιοχές των κυττάρων εντοπίζεται το σύμπλοκο PTN-NCL, πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση με αντίσωμα έναντι της PTN ή της NCL, και ανάλυση κατά Western για τη NCL ή την ΡΤΝ αντίστοιχα, σε πρωτεϊνικά εκχυλίσματα πυρήνα, κυτταροπλάσματος και πλασματικής μεμβράνης, προερχόμενα από κύτταρα U87MG. Στην Εικόνα Α5, παρατηρείται αλληλεπίδραση των δύο πρωτεϊνών και στα τρία υποκυτταρικά διαμερίσματα. Το πρότυπο εντοπισμού της αλληλεπίδρασης της PTN με τη NCL στα κύτταρα U87MG (Εικόνα Α5) είναι παρόμοιο με αυτό που διαπιστώθηκε στα κύτταρα HUVEC (Εικόνα Α2), γεγονός που υποδηλώνει ότι το μοτίβο αλληλεπίδρασης των δύο μορίων είναι κοινό σε διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους. 156

173 Αποτελέσματα Εικόνα Α4: Μελέτη της ενδογενούς έκφρασης της PTN και της NCL σε πυρηνικό, κυτταροπλασματικό και μεμβρανικό εκχύλισμα πρωτεϊνών κυττάρων U87MG. Απομονώθηκαν το πυρηνικό, το κυτταροπλασματικό και το μεμβρανικό πρωτεϊνικό κλάσμα, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους, και ακολούθησε ανοσοκατακρήμνιση με αντισώματα έναντι της PTN (Α) ή της NCL (Β) και ανοσοαποτύπωμα για τα ίδια μόρια, αντίστοιχα. Εικόνα Α5: Μελέτη του υποκυτταρικού εντοπισμού της αλληλεπίδρασης ανάμεσα στην PTN και στη NCL σε κύτταρα U87MG. Απομονώθηκαν το πυρηνικό, το κυτταροπλασματικό και το μεμβρανικό κλάσμα πρωτεϊνών κυττάρων U87MG, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Ακολούθησε ανοσοκατακρήμνιση με αντίσωμα έναντι της PTN (Α) ή της NCL (Β) και ανοσοαποτύπωμα για τη NCL και την PTΝ αντίστοιχα. 157

174 Αποτελέσματα 4. Η PTN αλληλεπιδρά άμεσα με τη NCL σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC και καρκινικά κύτταρα U87MG Με σκοπό να διαλευκάνουμε κατά πόσον η αλληλεπίδραση μεταξύ PTN-NCL είναι άμεση ή έμμεση, εφαρμόσαμε τη μέθοδο προσδιορισμού αλληλεπίδρασης λόγω εγγύτητας (Proximity Ligation Assay, PLA). Το PLA βασίζεται στην ικανότητα υβριδοποίησης DNA ιχνηλατών συζευγμένων με αντισώματα και παραγωγής φθορίζοντος προϊόντος, μόνον όταν τα υπό μελέτη αντιγόνα βρίσκονται σε απόσταση μικρότερη των 40 nm. Στην Εικόνα Α6 παρατίθενται αντιπροσωπευτικές εικόνες από κύτταρα HUVEC και U87MG, όπου η ύπαρξη των κόκκινων κουκίδων αποδεικνύει την άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ PTN και NCL. Ως θετικός βιολογικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε η αλληλεπίδραση της PTN με τον υποδοχέα της RPTPβ/ζ, ενώ η έλλειψη προσθήκης 1 ων αντισωμάτων χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας. Εικόνα Α6: Μελέτη της άμεσης αλληλεπίδρασης ανάμεσα στην PTN και στη NCL. Πραγματοποιήθηκε πείραμα PLA σε κύτταρα HUVEC και U87MG, με συνδυασμούς αντισωμάτων έναντι των PTN-RPTPβ/ζ και PTN-NCL, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Η σήμανση των πυρήνων έγινε με τη χρωστική Draq5 (μπλε). Οι ράβδοι κλίμακας αντιστοιχούν σε 10 μm. 158

175 Αποτελέσματα 5. Η PTN αλληλεπιδρά με το κεντρικό τμήμα και πιθανώς με το καρβοξυτελικό άκρο της NCL Ως επόμενο βήμα, θελήσαμε να διερευνήσουμε ποιο δομικό τμήμα της NCL είναι υπεύθυνο για δέσμευση της PTN. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκε μετασχηματισμός κυττάρων U87MG με πλασμίδια που κωδικοποιούν την αγρίου τύπου NCL, το αμινοτελικό της άκρο, το κεντρικό τμήμα, καθώς και το συνδυασμό του κεντρικού με το καρβοξυτελικό τμήμα της πρωτεΐνης, συζευγμένα με το πεπτίδιο GFP, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους (Εικόνα Μ2 από Υλικά και Μέθοδοι). Αρχικά, έγινε έλεγχος των επιπέδων έκφρασης των χιμαιρικών πρωτεϊνών. Κύτταρα U87MG λύθηκαν και στο πρωτεϊνικό εκχύλισμα πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση έναντι του πεπτιδίου GFP. Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE και ανοσοαποτύπωμα για το ίδιο μόριο. Στην Εικόνα Α7, φαίνεται η επιτυχημένη υπερέκφραση των συζευγμένων με GFP τμημάτων της NCL. Λόγω της παρουσίας υψηλού περιεχομένου αρνητικά φορτισμένων αμινοξέων στο αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης, η ηλεκτροφορητική κινητικότητα είναι αργή και υπάρχει σημαντική διαφορά μεταξύ της πραγματικής (προερχόμενης από την αλληλουχία) και της υποφαινόμενης (μετά την SDS- PAGE ηλεκτροφόρηση) μοριακής μάζας, τόσο της αγρίου τύπου πρωτεΐνης, όσο και του δομικού της τμήματος Μ1. Εικόνα Α7: Μελέτη της υπερέκφρασης των συζευγμένων με GFP τμημάτων της NCL σε κύτταρα U87MG. Πραγματοποιήθηκε μετασχηματισμός κυττάρων U87MG για 24 ώρες με πλασμίδια που φέρουν τη γονιδιακή αλληλουχία της NCL συζευγμένης με GFP (GFP- NCL), τμήματα της γονιδιακής αλληλουχίας τμημάτων της NCL που κωδικοποιούν τα αμινοξέα 1-275, και συζευγμένα με GFP (Μ1, Μ2 και Μ3 αντίστοιχα), καθώς και με το πλασμίδιο-φορέα (Μάρτυρας), όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Η έκφραση των χιμαιρικών πρωτεϊνών μελετήθηκε με λύση των κυττάρων, ανοσοκατακρήμνιση με αντίσωμα έναντι του πεπτιδίου GFP και ανοσοαποτύπωμα για το ίδιο μόριο. 159

176 Αποτελέσματα Σε επόμενη φάση, πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση με αντίσωμα έναντι της PTN και ανοσοαποτύπωμα για GFP, σε ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από κύτταρα U87MG μετασχηματισμένα με τα προαναφερόμενα πλασμίδια. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α8Α, η PTN δεσμεύεται στο κεντρικό τμήμα Μ2 της NCL, το οποίο περιλαμβάνει RNA δεσμευτικές περιοχές. Το αποτέλεσμα αυτό επιβεβαιώνεται και με την αντίστροφη διαδικασία. Σε ίσες ποσότητες πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων μετασχηματισμένων κυττάρων U87MG, έγινε ανοσοκατακρήμνιση με αντίσωμα έναντι του GFP και ανάλυση κατά Western για PTN (Εικόνα Α8Β). Από την άλλη πλευρά, τo αμινοτελικό άκρο της NCL δεν εμπλέκεται στη δέσμευση της PTN. Η αλληλεπίδραση που παρατηρείται μεταξύ της PTN και του τμήματος Μ3 της NCL δε γνωρίζουμε εάν οφείλεται αποκλειστικά στα αμινοξέα που αντιστοιχούν στο κεντρικό τμήμα της NCL ή και στα αμινοξέα του καρβοξυτελικού άκρου της. Εικόνα Α8: Διερεύνηση των δομικών τμημάτων της NCL που αλληλεπιδρούν με την PTN. Πραγματοποιήθηκε μετασχηματισμός κυττάρων U87MG για 24 ώρες με πλασμίδια που φέρουν τη γονιδιακή αλληλουχία της NCL συζευγμένης με GFP (GFP-NCL), τμήματα της γονιδιακής αλληλουχίας της NCL που κωδικοποιούν τα αμινοξέα 1-275, , συζευγμένα με GFP (Μ1, Μ2 και Μ3 αντίστοιχα), καθώς και με το πλασμίδιοφορέα (Μάρτυρας), όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Ακολούθησε λύση των κυττάρων, ανοσοκατακρήμνιση με αντίσωμα έναντι της PTN (Α) ή του GFP (Β) και ανάλυση κατά Western με αντίσωμα έναντι του GFP ή της PTN αντίστοιχα. 160

177 Αποτελέσματα 6. Η περιοχή TSR1 του αμινοτελικού άκρου της PTN εμπλέκεται στην αλληλεπίδραση με τη NCL Στη συνέχεια, θελήσαμε να διερευνήσουμε ποιο τμήμα της ΡΤΝ είναι υπεύθυνο για αλληλεπίδραση με τη NCL. Μια σειρά από συνθετικά πεπτίδια που αντιστοιχούν σε διαφορετικά τμήματα του μορίου, δοκιμάστηκαν ως προς την ικανότητά τους να αλληλεπιδρούν με τη NCL, προκειμένου να κατανοήσουμε το μηχανισμό αυτής της αλληλεπίδρασης. Συγκεκριμένα, έγινε επίδραση περίσσειας συνθετικών πεπτιδίων της PTN που αντιστοιχούν στα αμινοξέα 1-5, 16-24, 71-77, και σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος U87MG για 24 ώρες υπό την παρουσία ορού. Τα δύο πρώτα αντιστοιχούν στην αμινοτελική περιοχή του μορίου, ενώ τα τρία τελευταία στην καρβοξυτελική. Τα πεπτίδια ΡΤΝ και PTN αντιστοιχούν σε περιοχές της PTN με θεωρούμενη ομολογία με το μοτίβο της επαναλαμβανόμενης αλληλουχίας της θρομβοσπονδίνης τύπου 1 (TSR1) (Kilpelainen et al, 2000), ενώ το πεπτίδιο ΡΤΝ αντιστοιχεί σε περιοχή της PTN με θεωρούμενη ομολογία με το μοτίβο Kazal αναστολέων πεπτιδασών (Kuo et al, 1990). Ακολούθησε λύση των κυττάρων, ανοσοκατακρήμνιση με αντίσωμα έναντι της NCL και ανάλυση κατά Western για την PTN. Η εκλεκτικότητα των παρατηρούμενων αλληλεπιδράσεων εξασφαλίστηκε από τη χρήση ανοσοσφαιρίνης IgG για την ανοσοκατακρήμνιση. Ως μάρτυρας μοριακού μεγέθους χρησιμοποιήθηκε ανασυνδυασμένη ανθρώπινη PTN. Φαίνεται πως περίσσεια συνθετικού πεπτιδίου που αντιστοιχεί στα αμινοξέα 16-24, ανταγωνίζεται την πρόσδεση της PTN στη NCL. Κανένα από τα υπόλοιπα πεπτίδια που δοκιμάστηκαν δεν είχε ανάλογη επίδραση (Εικόνα Α9). Το αποτέλεσμα αυτό υποδηλώνει πως η περιοχή TSR1 του αμινοτελικού άκρου της ΡΤΝ, ίσως εμπλέκεται στην αλληλεπίδραση με τη NCL. 161

178 Αποτελέσματα Εικόνα Α9: Διερεύνηση των δομικών τμημάτων της PTN που αλληλεπιδρούν με τη NCL. Πραγματοποιήθηκε επώαση κυττάρων U87MG για 24 ώρες με περίσσεια συνθετικών πεπτιδίων της PTN (σε τελική συγκέντρωση 1 μg/ml) που αντιστοιχούν στα αμινοξέα 1-5, 71-77, και (διαλυμένων σε H 2 O) (Α) και (διαλυμένου σε DMSO) (Β), υπό την παρουσία ορού. Ακολούθησε λύση των κυττάρων, ανοσοκατακρήμνιση με αντίσωμα έναντι της NCL ή με ανοσοσφαιρίνη IgG και ανοσοαποτύπωμα για την PTN, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Ως μάρτυρας ίσης ποσότητας ολικών πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων, 50 μg των αντίστοιχων πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων υποβλήθηκαν σε ανάλυση κατά Western με αντίσωμα έναντι της ακτίνης. 7. Μείωση των επιπέδων της πρωτεϊνικής έκφρασης της NCL αναστέλλει την επαγόμενη από PTN μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC Παρόλο που η NCL αλληλεπιδρά με την ΡΤΝ, δεν είναι γνωστό με ποιον τρόπο εμπλέκεται στις αγγειογενετικές της δράσεις. Μέχρι σήμερα, έχει δειχθεί πως επίδραση αναστολέων της NCL σε ενδοθηλιακά κύτταρα, οδηγεί σε μείωση της αγγειογενετικής ικανότητας της PTN επί του σχηματισμού αυλών σε υπόστρωμα κολλαγόνου ή υπόστρωμα matrigel (Destouches et al, 2008). Στην παρούσα διατριβή, μελετήθηκε η πιθανή εμπλοκή της NCL στην επαγόμενη από PTN μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων. Για το σκοπό αυτό, αρχικά έγινε μείωση των πρωτεϊνικών επιπέδων της NCL, χρησιμοποιώντας εκλεκτικό για τη NCL 162

179 Αποτελέσματα sirna. Σε καλλιέργεια κυττάρων HUVEC πραγματοποιήθηκε διαμόλυνση με παρεμβαλλόμενο sirna έναντι της NCL (sincl) και αλληλουχίας που δεν εκφράζεται (sineg). Ακολούθησε είτε λύση των κυττάρων, ηλεκτροφόρηση SDS- PAGE και ανοσοαποτύπωμα με αντίσωμα έναντι της NCL (Εικόνα Α10Α), είτε ανοσοφθορισμός με αντίσωμα έναντι της NCL (Εικόνα Α10Β). Σημαντική αναστολή της έκφρασης της NCL επιτυγχάνεται εντός 24 ωρών από την έναρξη της διαμόλυνσης, σε όλα τα υποκυτταρικά διαμερίσματα. Εικόνα Α10: Μείωση της έκφρασης των πρωτεϊνικών επιπέδων της NCL. Κύτταρα HUVEC διαμολύνθηκαν για 24 ώρες με sirna για τη NCL (sincl) ή για αλληλουχία που δεν εκφράζεται (sineg), όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. (A) Η έκφραση της NCL μελετήθηκε με λύση των κυττάρων, ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE και ανοσοαποτύπωμα για τη NCL. (Β) Πραγματοποιήθηκαν πειράματα απλού ανοσοφθορισμού με αντίσωμα έναντι της NCL (πράσινο), όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Η σήμανση των πυρήνων έγινε με τη χρωστική TOTO-3 (μπλε). H ράβδος κλίμακας αντιστοιχεί σε 10 μm. 163

180 Αποτελέσματα Στη συνέχεια, διαπιστώθηκε πως μείωση της έκφρασης της NCL οδηγεί σε πλήρη καταστολή της επαγόμενης από ΡΤΝ μετανάστευσης κυττάρων HUVEC (Εικόνα Α11). Η συγκέντρωση ΡΤΝ που χρησιμοποιήθηκε σε όλες τις in vitro δοκιμασίες είναι 100 ng/ml, η οποία είναι γνωστό ότι προκαλεί τη μέγιστη δράση επί της κυτταρικής μετανάστευσης (Polykratis et al, 2005). % Μετανάστευση % * 0 Μη μετασχηματισμένα κύτταρα +36% ** sineg Μάρτυρας PTN (100 ng/ml) -13% sincl Εικόνα Α11: Μελέτη επίδρασης της μείωσης της έκφρασης της NCL στην επαγόμενη από PTN μετανάστευση κυττάρων HUVEC. Η μετανάστευση των κυττάρων εκτιμήθηκε με το σύστημα χημειοτακτισμού Transwell, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα του ποσοστού των κυττάρων που μετανάστευσαν, ως προς την ομάδα των μη διεγερμένων κυττάρων (Μάρτυρας) που θεωρείται 100% σε κάθε περίπτωση. *Ρ<0.05, **Ρ< Λειτουργικός αποκλεισμός της μεμβρανικής NCL αναστέλλει την επαγόμενη από PTN μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC Μελετήθηκε περαιτέρω η επαγόμενη από PTN μετανάστευση κυττάρων HUVEC υπό την παρουσία του πεπτιδίου 5(KPR)TASP, που είναι γνωστό ότι δεσμεύει την περιοχή RGG και αναστέλλει τη λειτουργία της μεμβρανικής NCL (Callebaut et al, 1997). Στην ίδια κατεύθυνση με τα αποτελέσματα της Παραγράφου 7, επίδραση με πεπτίδιο 5(KPR)TASP καταστέλλει πλήρως την επαγόμενη από PTN μετανάστευση των κυττάρων HUVEC (Εικόνα Α12), υποδηλώνοντας την εμπλοκή της μεμβρανικής NCL στις αγγειογενετικές λειτουργίες της ΡΤΝ. 164

181 Αποτελέσματα % Μετανάστευση % * -20% 0 - PTN 5(KPR) 5(KPR) TASP TASP+PTN Εικόνα Α12: Μελέτη επίδρασης του πεπτιδίου 5(KPR)TASP στην επαγόμενη από PTN μετανάστευση κυττάρων HUVEC. Η μετανάστευση των κυττάρων εκτιμήθηκε με το σύστημα χημειοτακτισμού Transwell, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα του ποσοστού των κυττάρων που μετανάστευσαν, ως προς την ομάδα των μη διεγερμένων με αυξητικό παράγοντα κυττάρων που θεωρείται 100% σε κάθε περίπτωση. *Ρ< H NCL εντοπίζεται στην επιφάνεια κυττάρων που εκφράζουν την ιντεγκρίνη α ν β 3 Δεδομένου ότι τόσο η ιντεγκρίνη α ν β 3 (Mikelis et al, 2009), όσο και η μεμβρανική NCL (παρούσα εργασία) απαιτούνται για την επαγόμενη από PTN κυτταρική μετανάστευση, θελήσαμε να διερευνήσουμε την πιθανή διάδραση των δύο μορίων, που ρυθμίζει τη μετανάστευση ανθρώπινων ενδοθηλιακών και καρκινικών κυττάρων. Αφού η ιντεγκρίνη α ν β 3 δεν εκφράζεται σε όλα τα καρκινικά κύτταρα (Mikelis et al, 2009), αρχικά μελετήθηκε ο εντοπισμός της NCL στην επιφάνεια τύπων κυττάρων που εκφράζουν ή δεν εκφράζουν α ν β 3. Η μελέτη έγινε με ανοσοφθορισμό με αντίσωμα έναντι της NCL σε κύτταρα HUVEC και κύτταρα γλοιοβλαστώματος M059K, C6 και U87MG. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α13, η NCL δεν ανιχνεύεται σε εξωπυρηνικά διαμερίσματα κυττάρων M059K και C6 που δεν εκφράζουν α ν β 3 (Mikelis et al, 2009), ενώ εντοπίζεται στην κυτταρική μεμβράνη των HUVEC και U87MG, τα οποία εκφράζουν α ν β 3 (Mikelis et al, 2009). 165

182 Αποτελέσματα Εικόνα Α13: Μελέτη του υποκυτταρικού εντοπισμού της NCL. Πραγματοποιήθηκε ανοσοφθορισμός με αντίσωμα έναντι της NCL (πράσινο) σε κύτταρα M059K, C6, HUVEC και U87MG. Η σήμανση των πυρήνων έγινε με τη χρωστική Draq5 (μπλε). H ράβδος κλίμακας αντιστοιχεί σε 10 μm. 10. Η έκφραση της ιντεγκρίνης α ν β 3 είναι απαραίτητη για τον εντοπισμό της NCL στην κυτταρική μεμβράνη Στην προηγούμενη παράγραφο φάνηκε ότι η έκφραση της ιντεγκρίνης α ν β 3 συνάδει με το μεμβρανικό εντοπισμό της NCL. Προκειμένου να επιβεβαιωθεί η άποψη αυτή, έγινε υπερέκφραση των υπομονάδων β 3 (wtβ 3 ) ή α ν (wtα ν ) σε κύτταρα M059K, στα οποία η α ν β 3 δεν εκφράζεται σε ανιχνεύσιμα επίπεδα, καθώς και μείωση της έκφρασης των υπομονάδων β 3 (siβ 3 ) ή α ν (siα ν ) σε κύτταρα U87MG, που έχουν υψηλά επίπεδα έκφρασης α ν β 3. Έλεγχος της επιτυχούς μείωσης της έκφρασης ή της υπερέκφρασης των υπομονάδων α ν και β 3, πραγματοποιήθηκε είτε με ανοσοφθορισμό για την α ν β 3 (Εικόνα Α14Α), είτε με ανάλυση κατά Western στα κυτταρικά λύματα, χρησιμοποιώντας εκλεκτικά αντισώματα για την κάθε υπομονάδα της ιντεγκρίνης (Εικόνα Α14Β). Στη συνέχεια, στα γενετικά τροποποιημένα κύτταρα M059K και U87MG πραγματοποιήθηκαν τόσο πειράματα ανοσοφθορισμού με αντίσωμα έναντι της NCL, όσο και βιοτυνιλίωσης των κυττάρων, ανοσοκατακρήμνισης με σφαιρίδια 166

183 Αποτελέσματα στρεπταβιδίνης και ανάλυση κατά Western, χρησιμοποιώντας εκλεκτικό αντίσωμα για τη NCL. Όπως φαίνεται στις Εικόνες Α14Β και Γ, υπερέκφραση της υπομονάδας β 3 (wtβ 3 ) αλλά όχι της α ν (wtα ν ), έχει ως αποτέλεσμα ανακατανομή της NCL από τον πυρήνα προς το κυτταρόπλασμα και την κυτταρική μεμβράνη. Στην ίδια κατεύθυνση, μείωση της έκφρασης της υπομονάδας β 3 (siβ 3 ) αλλά όχι της α ν (siα ν ), οδηγεί σε μείωση του μεμβρανικού εντοπισμού της NCL. Σε όλες τις περιπτώσεις, τα πρωτεϊνικά επίπεδα έκφρασης της NCL δεν επηρεάστηκαν από την έκφραση της α ν β 3 (Εικόνα Α14Γ). 167

184 Αποτελέσματα Εικόνα Α14: Μελέτη του ενδοκυτταρικού εντοπισμού της NCL σε σχέση με την έκφραση της α ν β 3. (Α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες διπλού ανοσοφθορισμού με αντισώματα έναντι της NCL (πράσινο) και της α ν β 3 (κόκκινο), κυττάρων M059K παροδικά μετασχηματισμέvων με το πλασμίδιο-φορέα (Μάρτυρας) ή με πλασμίδια που κωδικοποιούν τις υπομονάδες α ν (wtα ν ) ή β 3 (wtβ 3 ), καθώς και κυττάρων U87MG παροδικά διαμολυσμένων με sirna για αλληλουχία που δεν εκφράζεται (sineg) ή sirnas για τις υπομονάδες α ν (siα ν ) ή β 3 (siβ 3 ). Η σήμανση των πυρήνων έγινε με τη χρωστική Draq5 (μπλε). Οι ράβδοι κλίμακας αντιστοιχούν σε 10 μm. (Β) Στα λύματα των υπό μελέτη κυττάρων πραγματοποιήθηκε ανάλυση κατά Western με αντισώματα έναντι των υπομονάδων α ν ή β 3, καθώς και έναντι της ακτίνης. (Γ) Για ανίχνευση της επιφανειακής NCL, παροδικώς γενετικά τροποποιημένα κύτταρα M059K και U87MG επωάστηκαν με NHS-βιοτίνη. Στα πρωτεϊνικά εκχυλίσματα έγινε ανοσοκατακρήμνιση με μαγνητικά σφαιρίδια στρεπταβιδίνης και τα ανοσοϊζήματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση κατά Western με αντίσωμα έναντι της NCL. Για τον έλεγχο φόρτωσης των δειγμάτων, αντίστοιχα κυτταρικά λύματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση κατά Western με αντίσωμα έναντι της NCL ή της ακτίνης. Οι πειραματικές διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφονται στις Μεθόδους. 168

185 Αποτελέσματα 11. Η τυροσίνη της θέσης 773 της υπομονάδας β 3 απαιτείται για το μεμβρανικό εντοπισμό της NCL Για να διαπιστωθεί εάν η ενεργοποίηση της β 3 επηρεάζει το μεμβρανικό εντοπισμό της NCL, πραγματοποιήθηκαν πειράματα ανοσοφθορισμού και βιοτυνιλίωσης κυττάρων CHO που δεν εκφράζουν την υπομονάδα β 3 και: α) είναι σταθερά διαμολυσμένα με το πλασμίδιο-φορέα (Μάρτυρας), β) εκφράζουν την αγρίου τύπου β 3 (wtβ 3 ), γ) εκφράζουν τη μεταλλαγμένη β 3 στην οποία η τυροσίνη 773 έχει αντικατασταθεί με φαινυλαλανίνη (β 3 Y773F), δ) εκφράζουν τη μεταλλαγμένη β 3 στην οποία η τυροσίνη 785 έχει αντικατασταθεί με φαινυλαλανίνη (β 3 Y785F), ή ε) εκφράζουν τη μεταλλαγμένη β 3 στην οποία και οι δύο τυροσίνες 773 και 785 έχουν αντικατασταθεί με φαινυλαλανίνες (β 3 Y773F/Υ785F). Στα κύτταρα αυτά, έγινε έλεγχος των επιπέδων έκφρασης των υπομονάδων α ν και β 3 με ανάλυση κατά Western στα κυτταρικά λύματα (Εικόνα Α15Β), καθώς και με ανοσοφθορισμό για την α ν β 3 (Εικόνα Α15Α). Στη συνέχεια, στα ίδια κύτταρα πραγματοποιήθηκαν μελέτες υποκυτταρικού εντοπισμού της NCL (Εικόνα Α15Α) και ελέχθησαν τα επίπεδα έκφρασης της NCL στα μεμβρανικά κλάσματα (Εικόνα Α15Γ). Βρέθηκε πως σε κύτταρα που απουσιάζει η υπομονάδα β 3 (Μάρτυρας), ή σε κύτταρα που εκφράζεται μεταλλαγμένη β 3 στην τυροσίνη 773 (όπως στην περίπτωση των κυττάρων β 3 Υ773F και β 3 Υ773F/Y785F), ο εντοπισμός της NCL περιορίζεται στον πυρήνα. Σε όλες τις περιπτώσεις, τα πρωτεϊνικά επίπεδα έκφρασης της NCL δεν επηρεάστηκαν από την παρουσία ή την απουσία της αγρίου τύπου ή της μεταλλαγμένης β 3 (Εικόνα Α15Γ). Από τα παραπάνω προκύπτει πως η τυροσίνη 773 της υπομονάδας β 3 απαιτείται για τον εντοπισμό της NCL στην κυτταρική επιφάνεια. 169

186 Αποτελέσματα 170

187 Αποτελέσματα Εικόνα Α15: Μελέτη του ενδοκυτταρικού εντοπισμού της NCL σε σχέση με την ύπαρξη των τυροσινών 773 και 785 της υπομονάδας β 3. (Α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες διπλού ανοσοφθορισμού με αντισώματα έναντι της NCL (πράσινο) και της α ν β 3 (κόκκινο), κυττάρων CHO που δεν εκφράζουν την υπομονάδα β 3 και είναι σταθερά διαμολυσμένα με το πλασμίδιο-φορέα (Μάρτυρας), ή με πλασμίδιο που φέρει την αγρίου τύπου β 3 (wtβ 3 ), τη μεταλλαγμένη β 3 με αλλαγμένη την τυροσίνη 773 σε φαινυλαλανίνη (β 3 Υ773F), τη μεταλλαγμένη β 3 με αλλαγμένη την τυροσίνη 785 σε φαινυλαλανίνη (β 3 Υ785F) ή τη μεταλλαγμένη β 3 με αλλαγμένες και τις δύο τυροσίνες 773 και 785 σε φαινυλαλανίνες (β 3 Υ773F/Y785F). Η σήμανση των πυρήνων έγινε με τη χρωστική Draq5 (μπλε). Η ράβδος κλίμακας αντιστοιχεί σε 10 μm. (Β) Στα λύματα των υπό μελέτη κυττάρων, πραγματοποιήθηκε ανάλυση κατά Western με αντισώματα έναντι των υπομονάδων α ν ή β 3, καθώς και έναντι της ακτίνης. (Γ) Για ανίχνευση της επιφανειακής NCL, τα σταθερά διαμολυσμένα κύτταρα CHO επωάστηκαν με NHS-βιοτίνη. Στα πρωτεϊνικά εκχυλίσματα έγινε ανοσοκατακρήμνιση με μαγνητικά σφαιρίδια στρεπταβιδίνης και τα ανοσοϊζήματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση κατά Western με αντίσωμα έναντι της NCL. Για τον έλεγχο φόρτωσης των δειγμάτων, αντίστοιχα κυτταρικά λύματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση κατά Western με αντίσωμα έναντι της NCL ή της ακτίνης. Οι πειραματικές διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφονται στις Μεθόδους. 171

188 Αποτελέσματα 12. H ΡΤΝ επάγει το μεμβρανικό εντοπισμό της NCL σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC Δεδομένου ότι αγγειογενετικοί αυξητικοί παράγοντες, όπως ο VEGF 165, επάγουν τη μετακίνηση της NCL προς την κυτταρική μεμβράνη (Huang et al, 2006), θελήσαμε να διερευνήσουμε εάν η PTN έχει κάποια επίδραση σε αυτήν τη διαδικασία. Διέγερση κυττάρων HUVEC με PTN για 5 ώρες οδήγησε σε αυξημένα επίπεδα μεμβρανικής NCL, τα οποία δεν οφείλονται σε αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης (Εικόνα Α16Α και Β). Ως θετικός βιολογικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε η επίδραση VEGF 165 και ορού, που είναι γνωστό ότι επάγουν τη μετακίνηση της NCL στην κυτταρική μεμβράνη (Hovanessian et al, 2000; Huang et al, 2006). Παρατηρείται πως η PTN επάγει σε μικρότερο βαθμό τη μετακίνηση της NCL προς την κυτταρική επιφάνεια συγκριτικά με τον VEGF 165. Η συγκέντρωση VEGF 165 που χρησιμοποιήθηκε σε όλες τις in vitro δοκιμασίες είναι 10 ng/ml. 172

189 Αποτελέσματα Εικόνα Α16: Η PTN επάγει τη μετακίνηση της NCL από τον πυρήνα προς την επιφάνεια κυττάρων HUVEC. Κύτταρα HUVEC που στερούνταν ορού για 16 ώρες, επωάστηκαν με ορό (FBS 15%) ή VEGF 165 ή PTN για 5 ώρες. (Α) Σε ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα έγινε ανοσοκατακρήμνιση με μαγνητικά σφαιρίδια στρεπταβιδίνης και τα ανοσοϊζήματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση κατά Western με αντίσωμα έναντι της NCL. Σε αντίστοιχα ολικά κυτταρικά λύματα έγινε ανάλυση κατά Western με αντίσωμα έναντι της NCL. Για τον έλεγχο φόρτωσης των δειγμάτων, 50 μg των πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων ή κυτταρικά λύματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση κατά Western με αντίσωμα έναντι της ακτίνης. (Β) Πραγματοποιήθηκαν πειράματα απλού ανοσοφθορισμού με αντίσωμα έναντι της NCL (πράσινο). Η σήμανση των πυρήνων έγινε με τη χρωστική Draq5 (μπλε). H ράβδος κλίμακας αντιστοιχεί σε 10 μm. 13. H επαγόμενη από ΡΤΝ μετακίνηση της NCL στην κυτταρική μεμβράνη εξαρτάται από την τυροσίνη 773 της υπομονάδας β 3 Από προηγούμενη δουλειά της ερευνητικής μας ομάδας είναι γνωστό πως η φωσφορυλίωση της τυροσίνης 773 της υπομονάδας β 3 που επάγεται από την ΡΤΝ, είναι καθοριστική για την επαγωγική δράση της PTN στην κυτταρική μετανάστευση (Mikelis et al, 2009). Στην παρούσα διατριβή ελέγχθηκε κατά πόσον η επίδραση της PTN στον υποκυτταρικό εντοπισμό της NCL εξαρτάται από 173

190 Αποτελέσματα την υπομονάδα β 3. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκαν πειράματα ανοσοφθορισμού για τη NCL έπειτα από επίδραση PTN σε σταθερά διαμολυσμένα κύτταρα CHO που εκφράζουν την αγρίου τύπου ή τις μεταλλαγμένες υπομονάδες β 3, όπως περιγράφηκε παραπάνω. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α17Α, η ΡΤΝ χάνει την ικανότητα επαγωγής του μεμβρανικού εντοπισμού της NCL σε κύτταρα CHO που υπερεκφράζουν β 3 στην οποία η τυροσίνη 773 έχει μεταλλαγεί σε φαινυλαλανίνη, ενώ η αντίστοιχη μετάλλαξη στην τυροσίνη 785 δεν επηρεάζει τη δράση της ΡΤΝ. Στα ίδια κύτταρα παρατηρείται και απώλεια της επαγωγικής δράσης της PTN στην κυτταρική μετανάστευση (Εικόνα Α17Β), υποδηλώνοντας ότι η τυροσίνη 773 της υπομονάδας β 3 αποτελεί καθοριστικό βήμα για την επαγόμενη από PTN μετακίνηση της NCL στην κυτταρική μεμβράνη, παρόμοια με την επαγόμενη από PTN κυτταρική μετανάστευση. 174

191 Αποτελέσματα Β %Μετανάστευση ** wtβ3 Mάρτυρας PTN (100 ng/ml) ** β3υ773f β3υ785f Εικόνα Α17: Μελέτη επίδρασης της PTN στον ενδοκυτταρικό εντοπισμό της NCL και στην κυτταρική μετανάστευση σε σχέση με την παρουσία των τυροσινών 773 και 785 της υπομονάδας β 3. (Α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες απλού ανοσοφθορισμού με αντίσωμα έναντι της NCL (πράσινο) σταθερά διαμολυσμένων κυττάρων CHO που εκφράζουν την αγρίου τύπου β 3 (wtβ 3 ), τη μεταλλαγμένη β 3 με αλλαγμένη την τυροσίνη 773 σε φαινυλαλανίνη (β 3 Υ773F) ή τη μεταλλαγμένη β 3 με αλλαγμένη την τυροσίνη 785 σε φαινυλαλανίνη (β 3 Υ785F), όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Σε όλες τις περιπτώσεις, τα κύτταρα στερούνταν ορού για 16 ώρες και η επίδραση της PTN διήρκησε 5 ώρες στους 37 0 C. Η σήμανση των πυρήνων έγινε με τη χρωστική Draq5 (μπλε). Οι ράβδοι κλίμακας αντιστοιχούν σε 10 μm. (Β) Η μετανάστευση σταθερά διαμολυσμένων κυττάρων CHO εκτιμήθηκε με το σύστημα χημειοτακτισμού Transwell, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα του ποσοστού των κυττάρων που μετανάστευσαν, ως προς την ομάδα των μη διεγερμένων κυττάρων (Μάρτυρας) που θεωρείται 100% σε κάθε περίπτωση. **Ρ< Ο RPTPβ/ζ είναι απαραίτητος για την επαγόμενη από PTN μετακίνηση της NCL στην κυτταρική μεμβράνη Δεδομένου του ρόλου του RPTPβ/ζ στη φωσφορυλίωση της τυροσίνης 773 της υπομονάδας β 3 υπό την επίδραση PTN (Mikelis et al, 2009; 2011), στην παρούσα διατριβή διερευνήθηκε η εμπλοκή του στον επαγόμενo από PTN μεμβρανικό εντοπισμό της NCL. Για το λόγο αυτό, προχωρήσαμε σε μείωση των πρωτεϊνικών επιπέδων του RPTPβ/ζ. Σε καλλιέργεια κυττάρων HUVEC πραγματοποιήθηκε διαμόλυνση με παρεμβαλλόμενο sirna έναντι του RPTPβ/ζ (sirptpβ/ζ) και έναντι αλληλουχίας που δεν εκφράζεται (sineg). Ακολούθησε διπλός ανοσοφθορισμός με αντισώματα έναντι του RPTPβ/ζ και της NCL. Σημαντική 175

192 Αποτελέσματα αναστολή της έκφρασης του RPTPβ/ζ επιτυγχάνεται εντός 48 ωρών από την έναρξη της διαμόλυνσης, η οποία προκαλεί καταστολή της επαγόμενης από PTN ανακατανομής της NCL (Εικόνα Α18). 176

193 Αποτελέσματα Εικόνα Α18: Μείωση της έκφρασης των πρωτεϊνικών επιπέδων του RPTPβ/ζ αναστέλλει τον επαγόμενο από PTN μεμβρανικό εντοπισμό της NCL. Κύτταρα HUVEC διαμολύνθηκαν για 48 ώρες με sirna για τον RPTPβ/ζ (sirptpβ/ζ) ή για αλληλουχία που δεν εκφράζεται (sineg). Πραγματοποιήθηκαν πειράματα διπλού ανοσοφθορισμού με αντισώματα έναντι της NCL (πράσινο) και του RPTPβ/ζ (κόκκινο). Η σήμανση των πυρήνων έγινε με τη χρωστική Draq5 (μπλε). H ράβδος κλίμακας αντιστοιχεί σε 10 μm. Σε όλες τις περιπτώσεις, τα κύτταρα στερούνταν ορού για 16 ώρες και η επίδραση της PTN διήρκησε 5 ώρες στους 37 0 C. 15. Οι κινάσες c-src και PI3K εμπλέκονται στην επαγόμενη από PTN μετακίνηση της NCL στην κυτταρική μεμβράνη Περαιτέρω, μελετήθηκε η συμμετοχή μορίων μεταγωγής σήματος στον επαγόμενο από PTN μεμβρανικό εντοπισμό της NCL. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκαν αναστολείς διαφόρων μορίων σηματοδότησης, με καθιερωμένο ρόλο στην επαγόμενη από ΡΤΝ κυτταρική μετανάστευση, όπως οι κινάσες c-src, ΡΙ3Κ και ERK½ (Polykratis et al, 2005). Συγκεκριμένα, κύτταρα HUVEC επωάστηκαν με PTN για 5 ώρες, παρουσία ή απουσία μικρομοριακών αναστολέων για τις κινάσες c-src, PI3K, ERK½, p38 και JNK ή λειτουργικού αντισώματος έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3 LM609. Στις χαρακτηριστικές φωτογραφίες από πειράματα ανοσοφθορισμού, παρατηρείται πως αναστολή της ενεργότητας των κινασών c-src και PI3K, αναστέλλει τον εξωπυρηνικό εντοπισμό της NCL που επάγεται από την PTN. Αντίθετα, αναστολή των κινασών ERK½, καθώς και επίδραση με το λειτουργικό αντίσωμα έναντι της ενεργοποιημένης α ν β 3 LM609, δεν είχαν καμία επίδραση (Εικόνα Α19). Αναμενόμενη ήταν η απουσία συμμετοχής των κινασών p38 και JNK στην ανακατανομή της NCL που επάγεται από PTN (Εικόνα Α19), καθώς η τελευταία δε φαίνεται να επηρεάζει την ενεργοποίησή τους (Εικόνα Α20). Εικόνα Α19: Διερεύνηση των σηματοδoτικών μορίων που εμπλέκονται στον επαγόμενο από PTN μεμβρανικό εντοπισμό της NCL. Σε κύτταρα HUVEC που στερούνταν ορού για 16 ώρες, πραγματοποιήθηκε επίδραση PTN για 5 ώρες, απουσία ή παρουσία ειδικών αναστολέων για τις κινάσες c-src (PP1 10μΜ, SU μΜ), PI3K (wortmannin 100 nm), p38 (SB μΜ), JNK (SP nM) και ERK½ (U nm) αντίστοιχα, ή λειτουργικού αντισώματος έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3 LM609 (10 ng/ml). Προηγήθηκε επώαση των κυττάρων με τους αναστολείς ή το λειτουργικό αντίσωμα για 15 λεπτά στους 37 0 C, πριν από την προσθήκη ΡΤΝ. Ακολούθησαν πειράματα απλού ανοσοφθορισμού με αντίσωμα έναντι της NCL (πράσινο). Η σήμανση των πυρήνων έγινε με τη χρωστική Draq5 (μπλε). Οι ράβδοι κλίμακας αντιστοιχούν σε 10 μm. (επόμενη σελίδα) 177

194 Αποτελέσματα 178

195 Αποτελέσματα Εικόνα Α20: Μελέτη επίδρασης της ΡΤΝ στην ενεργοποίηση των κινασών p38 και JNK. Πραγματοποιήθηκε επώαση κυττάρων HUVEC με PTN ή VEGF 165 (ο τελευταίος χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας) για 10 λεπτά στους 37 0 C. Ακολούθησε λύση των κυττάρων, ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE και ανάλυση κατά Western με αντισώματα έναντι της φωσφορυλιωμένης ή της ολικής SAPK/JNK, καθώς και έναντι της φωσφορυλιωμένης ή της ολικής p38. Οι αριθμοί υποδηλώνουν τη μέση τιμή των λόγων φωσφο- SAPK/JNK:ολική SAPK/JNK ή φωσφο-p38:ολική p38, σε σχέση με τα μη διεγερμένα κύτταρα (στα οποία ο λόγος θεωρείται 1 σε κάθε περίπτωση). Οι πειραματικές διαδικασίες και η ποσοτικοποίηση των ζωνών των ανοσοαποτυπωμάτων πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφονται στις Μεθόδους. 16. Ενεργοποίηση της κινάσης c-src λαμβάνει χώρα ανοδικά, ενώ της κινάσης PI3K καθοδικά από την επαγόμενη από PTN φωσφορυλίωση της υπομονάδας β 3 Το μοντέλο ενεργοποίησης της υπομονάδας β 3 υπό την επίδραση PTN, περιλαμβάνει πρόσδεση του αυξητικού παράγοντα ΡΤΝ στον υποδοχέα RPTPβ/ζ, τον οποίο και ενεργοποιεί. Ακολούθως, ο RPTPβ/ζ οδηγεί σε αποφωσφορυλίωση της τυροσίνης της θέσης 527 της κινάσης c-src και άρα ενεργοποίηση της τελευταίας (Polykratis et al, 2005), που στη συνέχεια οδηγεί σε φωσφορυλίωση της υπομονάδας β 3 στην τυροσίνη της θέσης 773 (Mikelis et al, 2009). Δεδομένης της συμμετοχής των κινασών c-src και PI3K στο σηματοδοτικό μονοπάτι της PTN που ευθύνεται για τη μετακίνηση της NCL στην κυτταρική μεμβράνη (Εικόνα Α19), θελήσαμε να διαλευκάνουμε εάν η ενεργοποίηση των προαναφερόμενων κινασών 179

196 Αποτελέσματα προηγείται ή έπεται της φωσφορυλίωσης της β 3. Για το λόγο αυτό, μελετήθηκε η επίδραση εκλεκτικών αναστολέων για τις c-src και PI3K στην επαγόμενη από PTN φωσφορυλίωση της υπομονάδας β 3. Η επίδραση του αναστολέα της κινάσης p38 SB χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας, καθώς η PTN δεν επάγει την ενεργοποίηση της p38 (Εικόνα Α20). Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α21Α, αναστολή της c-src από τους αναστολείς PP1 ή SU6656 κατέστειλε την επαγόμενη από PTN φωσφορυλίωση της β 3 στην τυροσίνη της θέσης 773, επιβεβαιώνοντας πως η c-src εδράζεται ανοδικά της α ν β 3 (Mikelis et al, 2011). Από την άλλη πλευρά, η επίδραση του αναστολέα της κινάσης ΡΙ3Κ wortmannin δεν επηρέασε την επαγόμενη από ΡΤΝ φωσφορυλίωση της β 3, υποδεικνύοντας πως η PI3K βρίσκεται καθοδικά από την ενεργοποιημένη α ν β 3. Η ιδέα αυτή επιβεβαιώθηκε με πειράματα ELISA για ανίχνευση ενεργοποιημένης PI3K, σε σταθερά μετασχηματισμένα κύτταρα CHO που εκφράζουν την αγρίου τύπου β 3, τη μεταλλαγμένη β 3 με αλλαγμένη την τυροσίνη 773 σε φαινυλαλανίνη ή τη μεταλλαγμένη β 3 με αλλαγμένη την τυροσίνη 785 σε φαινυλαλανίνη, υπό την επίδραση PTN. Στην εικόνα Α21Β, παρατηρούμε πως η ενεργοποίηση της PI3Κ επάγεται σημαντικά από την PTN μόνο σε κύτταρα που υπερεκφράζουν την αγρίου τύπου ή τη μεταλλαγμένη στην τυροσίνη 785 υπομονάδα β 3, αλλά όχι σε κύτταρα που υπερεκφράζουν τη μεταλλαγμένη στην τυροσίνη 773 υπομονάδα β 3. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι η ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ έπεται της φωσφορυλίωσης της υπομονάδας β 3 στην τυροσίνη της θέσης

197 Αποτελέσματα B % Μεταβολή της Ο.Α. στα 450nm φωσφο-pi3k * wtβ3 * β3υ773f β3υ785f ολική PI3K wtβ3 β3υ773f β3υ785f Μάρτυρας PTN (100 ng/ml) Μάρτυρας PTN (100 ng/ml) Μάρτυρας PTN (100 ng/ml) Εικόνα Α21: Διερεύνηση των σηματοδοτικών μορίων που ενεργοποιούνται από την PTN σε κύτταρα HUVEC. (Α) Πραγματοποιήθηκε προεπώαση κυττάρων HUVEC που στερούνταν ορού για 16 ώρες, με ειδικούς αναστολείς για τις κινάσες PI3K (wortmannin 100 nm), p38 (SB μΜ), c-src (PP1 10μΜ) και SU6656 (10μM) για 15 λεπτά και επακόλουθη διέγερση με PTN για 10 λεπτά στους 37 0 C. Έγινε λύση των κυττάρων, ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE και ανάλυση κατά Western με αντισώματα έναντι της φωσφορυλιωμένης στην τυροσίνη 773 ή της ολικής β 3. Οι αριθμοί υποδηλώνουν τη μέση μεταβολή των λόγων φωσφο-β 3 :ολική β 3, σε σχέση με το λόγο στα μη διεγερμένα κύτταρα (στα οποία θεωρείται 1). (Β) Τα επίπεδα ενεργοποίησης της PI3K αξιολογήθηκαν με τη μέθοδο της ELISA σε κλώνους σταθερά διαμολυσμένων κυττάρων CHO που εκφράζουν την αγρίου τύπου β 3 (wtβ 3 ), τη μεταλλαγμένη β 3 με αλλαγμένη την τυροσίνη 773 σε φαινυλαλανίνη (β 3 Υ773F) ή τη μεταλλαγμένη β 3 με αλλαγμένη την τυροσίνη 785 σε φαινυλαλανίνη (β 3 Υ785F). Τα κύτταρα στερούνταν ορού για 16 ώρες και επωάστηκαν με PTN για 10 λεπτά στους 37 0 C. Τα αποτελέσματα, εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα του ποσοστού μεταβολής της φωσφορυλιωμένης PI3K, ως προς την ομάδα των μη διεγερμένων κυττάρων (Μάρτυρας) που θεωρείται 100% σε κάθε περίπτωση. *Ρ<0.05. Οι πειραματικές διαδικασίες, η ποσοτικοποίηση των ζωνών των ανοσοαποτυπωμάτων και η στατιστική επεξεργασία πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφονται στις Μεθόδους. 17. Πεπτίδιο που αντιστοιχεί στο καρβοξυτελικό άκρο της PTN (PTN ) δεν επηρεάζει τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό της NCL Σε προηγούμενες μελέτες διαπιστώθηκε ότι ένα πεπτίδιο που αντιστοιχεί στα 26 τελευταία αμινοξέα του καρβοξυτελικού άκρου της PTN (PTN ), αναστέλλει αγγειογενετικές της δράσεις μέσω πρόσδεσης στην ιντεγκρίνη α ν β 3, ενώ επάγει τη φωσφορυλίωση της τυροσίνης 773 της υπομονάδας β 3 μέσω ενεργοποίησης του υποδοχέα RPTPβ/ζ (Mikelis et al, 2009; 2011). Στην παρούσα διδακτορική 181

198 Αποτελέσματα διατριβή, διερευνήθηκε ο πιθανός ρόλος του πεπτιδίου PTN στον ενδοκυτταρικό εντοπισμό της NCL παρουσία είτε απουσία PTN. Διέγερση κυττάρων HUVEC με το πεπτίδιο PTN ή σε συνδυασμό με την PTN για 5 ώρες στους 37 0 C, δεν προκάλεσε μεταβολή στην ενδοκυτταρική κατανομή της NCL (Εικόνα Α22). Εικόνα Α22: Διερεύνηση της δράσης του πεπτιδίου PTN , επί του ενδοκυτταρικού εντοπισμού της NCL παρουσία είτε απουσία PTN. Σε κύτταρα HUVEC που στερούνταν ορού για 16 ώρες, πραγματοποιήθηκε επίδραση PTN ή PTN ή συνδυασμού αυτών για 5 ώρες στους 37 0 C. Ακολούθησαν πειράματα απλού ανοσοφθορισμού με αντίσωμα έναντι της NCL (πράσινο). Η σήμανση των πυρήνων έγινε με τη χρωστική Draq5 (μπλε). Οι ράβδοι κλίμακας αντιστοιχούν σε 10 μm. 18. Ο RPTPβ/ζ και η α ν β 3 εμπλέκονται στην επαγόμενη από VEGF 165 μετακίνηση της NCL στην κυτταρική μεμβράνη Όπως προαναφέρθηκε και φαίνεται στην Εικόνα Α16, ο VEGF 165 επάγει τη μετακίνηση της NCL από τον πυρήνα προς το κυτταρόπλασμα και την κυτταρική μεμβράνη ενδοθηλιακών κυττάρων. Δεδομένου του ρόλου της ενεργοποιημένης α ν β 3 στην ανακατανομή της NCL (παρούσα εργασία) και του ρόλου της στην επαγόμενη από VEGF 165 κυτταρική μετανάστευση (Hodivala-Dilke et al, 2003; 182

199 Αποτελέσματα Bridgewater et al, 2012), διερευνήθηκε εάν η επαγόμενη από VEGF 165 μετατόπιση της NCL εκτός του πυρήνα διαμεσολαβείται από το σηματοδοτικό μονοπάτι RPTPβ/ζ/c-src/α ν β 3. Από προηγούμενες μελέτες της ερευνητικής μας ομάδας ήταν γνωστό πως ο VEGF 165 συνανοσοκατακρημνίζεται με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ σε κύτταρα U87MG (Theodoropoulou and Papadimitriou, 2010) και πως μέσω του RPTPβ/ζ, ο VEGF 165 διεγείρει τη φωσφορυλίωση της υπομονάδας β 3 στην τυροσίνη 773 (Papadimitriou et al, 2011). Τα κύτταρα HUVEC εκφράζουν μη ανιχνεύσιμα επίπεδα VEGF 165, σε αντίθεση με τα κύτταρα U87MG που εκφράζουν ενδογενή VEGF 165 (Εικόνα Α23). Στην παρούσα μελέτη, με διπλό ανοσοφθορισμό και με τη μέθοδο του PLA διαπιστώθηκε συνεντοπισμός, καθώς και άμεση αλληλεπίδραση του VEGF 165 με τον RPTPβ/ζ σε κύτταρα U87MG (Εικόνα Α24Α και Β), η οποία αναστέλλεται από την προσθήκη PTN ή πεπτιδίου PTN (Εικόνα Α24Γ). Η ποσοτικοποίηση των ολικών αριθμών κουκίδων ανά κύτταρο σε εικόνες από πειράματα PLA, πραγματοποιήθηκε σε συνεργασία με την ομάδα του καθηγητή Βασιλείου Μεγαλοοικονόμου, από την υποψήφια διδάκτορα Αγγελική Σκούρα, στο Τμήμα Μηχανικών Ηλεκτρονικών Υπολογιστών και Πληροφορικής του Πανεπιστημίου Πατρών. Εικόνα Α23: Έλεγχος της έκφρασης του VEGF 165 σε κύτταρα HUVEC και U87MG. Πραγματοποιήθηκε απλός ανοσοφθορισμός με αντίσωμα έναντι του VEGF 165 (πράσινο) σε κύτταρα HUVEC και U87MG, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Η σήμανση των πυρήνων έγινε με τη χρωστική Draq5 (μπλε). Οι ράβδοι κλίμακας αντιστοιχούν σε 10 μm. 183

200 Αποτελέσματα 184

201 Αποτελέσματα Αριθμός κουκίδων ανά κύτταρο *** 80 *** PTN PTN Εικόνα Α24: Μελέτη της αλληλεπίδρασης ανάμεσα στον VEGF 165 και τον RPTPβ/ζ. (Α) Πραγματοποιήθηκε διπλός ανοσοφθορισμός με αντισώματα έναντι του VEGF 165 (πράσινο) και του RPTPβ/ζ (κόκκινο) σε κύτταρα U87MG, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Στις περιοχές συνεντοπισμού παρατηρούνται σημεία κίτρινου χρώματος. (Β) Πραγματοποιήθηκε πείραμα PLA με συνδυασμό αντισωμάτων έναντι των VEGF 165 και RPTPβ/ζ σε κύτταρα HUVEC και U87MG που καλλιεργούνται υπό την παρουσία ορού (10%FBS), όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Η επώαση των κυττάρων με PTN ή το πεπτίδιο PTN (σε τελική συγκέντρωση 100 ng/ml και 1 μg/ml αντίστοιχα) έγινε για 24 ώρες. Η σήμανση των πυρήνων έγινε με τη χρωστική Draq5 (μπλε). Οι ράβδοι κλίμακας αντιστοιχούν σε 10 μm. (Γ) Παρατίθεται η ποσοτικοποίηση του ολικού αριθμού κουκίδων ανά κύτταρο. Τα τεμάχια δείχνουν τη μέση τιμή αλλά και το εύρος των τιμών των κουκίδων που εντοπίστηκαν. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων προέκυψε αξιοποιώντας 6 έως 8 πεδία εικόνας με 5 κύτταρα ανά εικόνα ανά τύπο δείγματος, δύο ανεξάρτητων μεταξύ τους πειραμάτων. ***Ρ< Με μελέτες ανοσοφθορισμού, βρέθηκε ότι υπό την επίδραση VEGF 165 η έκφραση της NCL στην κυτταρική επιφάνεια παρατηρείται μόνο σε κύτταρα CHO που εκφράζουν την αγρίου τύπου β 3 ή τη μεταλλαγμένη β 3 με αλλαγμένη την τυροσίνη 785 σε φαινυλαλανίνη, ενώ σε κύτταρα CHO που εκφράζουν τη μεταλλαγμένη β 3 με αλλαγμένη την τυροσίνη 773 σε φαινυλαλανίνη, η NCL περιορίζεται στον πυρήνα (Εικόνα Α25). Το αποτέλεσμα αυτό υποδηλώνει ότι η τυροσίνη 773 της υπομονάδας β 3, είναι σημαντική για την επαγόμενη από VEGF 165 μετατόπιση της NCL στην κυτταρική επιφάνεια. 185

202 Αποτελέσματα Εικόνα Α25: Μελέτη επίδρασης του VEGF 165 στον ενδοκυτταρικό εντοπισμό της NCL σε σχέση με την παρουσία των τυροσινών 773 και 785 της υπομονάδας β 3. Αντιπροσωπευτικές εικόνες απλού ανοσοφθορισμού με αντίσωμα έναντι της NCL (πράσινο) σταθερά διαμολυσμένων κυττάρων CHO που εκφράζουν την αγρίου τύπου β 3 (wtβ 3 ), τη μεταλλαγμένη β 3 με αλλαγμένη την τυροσίνη 773 σε φαινυλαλανίνη (β 3 Υ773F) ή τη μεταλλαγμένη β 3 με αλλαγμένη την τυροσίνη 785 σε φαινυλαλανίνη (β 3 Υ785F), όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Σε όλες τις περιπτώσεις, τα κύτταρα στερούνταν ορού για 16 ώρες και η επίδραση του VEGF 165 διήρκησε 5 ώρες στους 37 0 C. Η σήμανση των πυρήνων έγινε με τη χρωστική Draq5 (μπλε). Οι ράβδοι κλίμακας αντιστοιχούν σε 10 μm. Προκειμένου να διερευνηθεί ο ρόλος του RPTPβ/ζ στην επαγόμενη από VEGF 165 μετατόπιση της NCL στην κυτταρική επιφάνεια, τα πρωτεϊνικά επίπεδα του RPTPβ/ζ μειώθηκαν με τη χρήση sirna και ακολούθησε διπλός ανοσοφθορισμός με αντισώματα έναντι του RPTPβ/ζ και της NCL σε κύτταρα HUVEC. Στην Εικόνα Α26, φαίνεται ότι η μείωση της έκφρασης του RPTPβ/ζ προκαλεί δραστική αναστολή της επαγόμενης από VEGF 165 ανακατανομής της NCL. 186

203 Αποτελέσματα Εικόνα Α26: Μείωση της έκφρασης των πρωτεϊνικών επιπέδων του RPTPβ/ζ αναστέλλει τον επαγόμενο από VEGF 165 μεμβρανικό εντοπισμό της NCL. Kύτταρα HUVEC διαμολύνθηκαν για 48 ώρες με sirna για τον RPTPβ/ζ (sirptpβ/ζ) ή για αλληλουχία που δεν εκφράζεται (sineg). Πραγματοποιήθηκαν πειράματα διπλού ανοσοφθορισμού με αντισώματα έναντι της NCL (πράσινο) και του RPTPβ/ζ (κόκκινο). Η σήμανση των πυρήνων έγινε με τη χρωστική Draq5 (μπλε). H ράβδος κλίμακας αντιστοιχεί σε 10 μm. Σε όλες τις περιπτώσεις, τα κύτταρα στερούνταν ορού για 16 ώρες και η επίδραση του VEGF 165 διήρκησε 5 ώρες στους 37 0 C. 187

204 Αποτελέσματα Ο ενδοκυτταρικός εντοπισμός της NCL φαίνεται να είναι ανεξάρτητος από την ενεργοποίηση του υποδοχέα VEGFR-2 υπό την επίδραση VEGF 165, καθώς η μπεβασιζουμάβη (αναστολέας πρόσδεσης του VEGF στους VEGFRs) δεν επηρέασε την επαγόμενη από VEGF 165 ανακατανομή της NCL σε κύτταρα HUVEC (Εικόνα Α27). Εικόνα Α27: Μελέτη της επίδρασης της μπεβασιζουμάβης στον επαγόμενο από VEGF 165 ενδοκυτταρικό εντοπισμό της NCL. Αντιπροσωπευτικές εικόνες απλού ανοσοφθορισμού με αντίσωμα έναντι της NCL (πράσινο) σε κύτταρα HUVEC. Προηγήθηκε επώαση των κυττάρων με το αντίσωμα μπεβασιζουμάβη (250 μg/ml) για 15 λεπτά στους 37 0 C, πριν από την προσθήκη του VEGF 165 για 5 ώρες στους 37 0 C. Η σήμανση των πυρήνων έγινε με τη χρωστική Draq5 (μπλε). Η ράβδος κλίμακας αντιστοιχεί σε 10 μm. Ακόμα, ελέγχθηκε ο ενδοκυτταρικός εντοπισμός της NCL υπό την επίδραση του VEGF 121, ο οποίος στερείται των αμινοξέων που κωδικοποιούνται από τα εξόνια 6 και 7 του γονιδίου του VEGF-Α (Tischer et al, 1991), δεν προσδένεται στην ηπαρίνη (Park et al, 1993) και επάγει τη μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων (Pan et al, 2007 και μη δημοσιευμένη παρατήρηση της ερευνητικής μας ομάδας). Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α28, ο VEGF 121 επίσης επάγει τη μετατόπιση της NCL στην κυτταρική επιφάνεια, υποδηλώνοντας ότι οι περιοχές δέσμευσης της ηπαρίνης του VEGF 165 δεν εμπλέκονται στο μεμβρανικό εντοπισμό της NCL σε κύτταρα HUVEC. 188

205 Αποτελέσματα Εικόνα Α28: Μελέτη του ενδοκυτταρικού εντοπισμού της NCL υπό την επίδραση VEGF 121. Αντιπροσωπευτικές εικόνες απλού ανοσοφθορισμού με αντίσωμα έναντι της NCL (πράσινο) σε κύτταρα HUVEC. Η σήμανση των πυρήνων έγινε με τη χρωστική Draq5 (μπλε). Τα κύτταρα στερούνταν ορού για 16 ώρες και η επίδραση των VEGF 165 ή VEGF 121 διήρκησε 5 ώρες στους 37 0 C. Η ράβδος κλίμακας αντιστοιχεί σε 10 μm. 19. Οι κινάσες c-src, PI3K και p38 απαιτούνται για την επαγόμενη από VEGF 165 μετακίνηση της NCL στην επιφάνεια ενδοθηλιακών κυττάρων Για την περαιτέρω διαλεύκανση των σηματοδοτικών μορίων που επηρεάζουν τον επαγόμενο από VEGF 165 μεμβρανικό εντοπισμό της NCL, χρησιμοποιήθηκαν αναστολείς διαφόρων μορίων σηματοδότησης που εμπλέκονται στην επαγόμενη από VEGF 165 κυτταρική μετανάστευση, όπως οι κινάσες c-src, PI3K, ERK½, p38 και JNK (Zachary and Gliki, 2001; Abu-Ghazaleh et al, 2001). Συγκεκριμένα, κύτταρα HUVEC επωάστηκαν με VEGF 165 για 5 ώρες, παρουσία ή απουσία μικρομοριακών αναστολέων για τις κινάσες c-src, PI3K, ERK½, p38 και JNK ή λειτουργικού αντισώματος έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3 LM609. Στις χαρακτηριστικές φωτογραφίες από πειράματα ανοσοφθορισμού παρατηρείται πως αναστολή της ενεργότητας των κινασών c-src, PI3K και p38 αναστέλλει τον εξωπυρηνικό εντοπισμό της NCL που επάγεται από τον VEGF 165. Αντίθετα, αναστολή των κινασών JNK και ERK½, καθώς και επίδραση με το λειτουργικό αντίσωμα έναντι της ενεργοποιημένης α ν β 3 LM609, δεν είχαν καμία επίδραση (Εικόνα Α29). 189

206 Αποτελέσματα Εικόνα Α29: Διερεύνηση των σηματοδoτικών μορίων που εμπλέκονται στον επαγόμενο από VEGF 165 μεμβρανικό εντοπισμό της NCL. Σε κύτταρα HUVEC που στερούνταν ορού για 16 ώρες, πραγματοποιήθηκε επίδραση VEGF 165 για 5 ώρεςστους 37 0 C, απουσία ή παρουσία ειδικών αναστολέων για τις κινάσες c-src (PP1 10μΜ), PI3K (wortmannin 100 nm), p38 (SB μΜ), JNK (SP nM) και ERK½ (U nm) αντίστοιχα, ή λειτουργικού αντισώματος έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3 LM609 (10 ng/ml). Προηγήθηκε επώαση των κυττάρων με τους αναστολείς ή το λειτουργικό αντίσωμα για 15 λεπτά στους 37 0 C, πριν από την προσθήκη του VEGF 165. Ακολούθησαν πειράματα απλού ανοσοφθορισμού με αντίσωμα έναντι της NCL (πράσινο). Η σήμανση των πυρήνων έγινε με τη χρωστική Draq5 (μπλε). Η ράβδος κλίμακας αντιστοιχεί σε 10 μm. 190

207 Αποτελέσματα 20. Ενεργοποίηση των κινασών c-src, PI3K και p38 από τον VEGF 165 Δεδομένης της συμμετοχής των κινασών c-src, PI3K και p38 στο σηματοδοτικό μονοπάτι του VEGF 165 που ευθύνεται για τη μετακίνηση της NCL στην κυτταρική μεμβράνη, θελήσαμε να διαλευκάνουμε εάν η ενεργοποίηση των προαναφερόμενων κινασών προηγείται ή έπεται της ενεργοποίησης της α ν β 3. Για το λόγο αυτό, μελετήθηκε η επίδραση ειδικών αναστολέων για τις κινάσες c-src, PI3K και p38 στην επαγόμενη από VEGF 165 φωσφορυλίωση της υπομονάδας β 3 στην τυροσίνη 773. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α30, η επίδραση του αναστολέα της κινάσης c-src PP1, ανέστειλε την επαγόμενη από VEGF 165 φωσφορυλίωση της β 3 στην τυροσίνη 773. Το αποτέλεσμα αυτό είναι σε συμφωνία με αποτελέσματα που δείχνουν πως η c-src φωσφορυλιώνει άμεσα τις κυτταροπλασματικές τυροσίνες της υπομονάδας β 3 υπό την επίδραση VEGF 165 (Mahabeleshwar et al, 2007). Ακόμα, η επίδραση αναστολέων των κινασών ΡΙ3Κ και p38, wortmannin και SB αντίστοιχα, δεν επηρέασε την επαγόμενη από VEGF 165 φωσφορυλίωση της β 3, υποδεικνύοντας πως οι προαναφερόμενες κινάσες βρίσκονται είτε καθοδικά από τη φωσφορυλιωμένη α ν β 3 ή ανήκουν σε ανεξάρτητα σηματοδοτικά μονοπάτια. Εικόνα Α30: Διερεύνηση των σηματοδοτικών μορίων που ενεργοποιούνται από τον VEGF 165 σε κύτταρα HUVEC. Πραγματοποιήθηκε προεπώαση κυττάρων HUVEC που στερούνταν ορού για 16 ώρες, με ειδικούς αναστολείς για τις κινάσες PI3K (wortmannin 100 nm), p38 (SB μΜ) και c-src (PP1 10μΜ) για 15 λεπτά και επακόλουθη διέγερση με VEGF 165 για 10 λεπτά στους 37 0 C. Έγινε λύση των κυττάρων, ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE και ανάλυση κατά Western με αντισώματα έναντι της φωσφορυλιωμένης στην τυροσίνη 773 ή της ολικής β 3. Οι αριθμοί υποδηλώνουν τη μέση μεταβολή των λόγων φωσφο-β 3 :ολική β 3, σε σχέση με το λόγο στα μη διεγερμένα κύτταρα (στα οποία θεωρείται 1). 191

208 Αποτελέσματα Η ιδέα πως η PI3K βρίσκεται καθοδικά της ενεργοποιημένης α ν β 3 επιβεβαιώθηκε με πειράματα ELISA για ανίχνευση ενεργοποιημένης PI3K, σε σταθερά μετασχηματισμένα κύτταρα CHO που εκφράζουν την αγρίου τύπου β 3, τη μεταλλαγμένη β 3 με αλλαγμένη την τυροσίνη 773 σε φαινυλαλανίνη ή τη μεταλλαγμένη β 3 με αλλαγμένη την τυροσίνη 785 σε φαινυλαλανίνη, υπό την επίδραση VEGF 165. Στην Εικόνα Α31 παρατηρούμε πως η ενεργοποίηση της PI3Κ επάγεται σημαντικά από τον VEGF 165 μόνο σε κύτταρα που υπερεκφράζουν την αγρίου τύπου ή τη μεταλλαγμένη στην τυροσίνη 785 υπομονάδα β 3, αλλά όχι σε κύτταρα που υπερεκφράζουν τη μεταλλαγμένη στην τυροσίνη 773 υπομονάδα β 3. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι η ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ, έπεται της φωσφορυλίωσης της υπομονάδας β 3 στην τυροσίνη της θέσης 773. % Μεταβολή της Ο.Α. στα 450nm φωσφο-pi3k ** * * ολική PI3K wtβ 3 β 3 Υ773F β 3 Υ785F wtβ 3 β 3 Υ773F β 3 Υ785F Μάρτυρας VEGF 165 (100 ng/ml) Μάρτυρας VEGF 165 (100 ng/ml) Μάρτυρας VEGF 165 (100 ng/ml) Εικόνα Α31: Μελέτη των επιπέδων ενεργοποίησης της PI3K υπό την επίδραση VEGF 165 σε σχέση με την παρουσία των τυροσινών 773 και 785 της υπομονάδας β 3. Τα επίπεδα ενεργοποίησης της PI3K αξιολογήθηκαν με τη μέθοδο της ELISA σε κλώνους CHO σταθερά διαμολυσμένων κυττάρων που εκφράζουν την αγρίου τύπου β 3 (wtβ 3 ), τη μεταλλαγμένη β 3 με αλλαγμένη την τυροσίνη 773 σε φαινυλαλανίνη (β 3 Υ773F) ή τη μεταλλαγμένη β 3 με αλλαγμένη την τυροσίνη 785 σε φαινυλαλανίνη (β 3 Υ785F). Τα κύτταρα στερούνταν ορού για 16 ώρες και επωάστηκαν με VEGF 165 για 10 λεπτά. Τα αποτελέσματα, εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα του ποσοστού μεταβολής της φωσφορυλιωμένης PI3K, ως προς την ομάδα των μη διεγερμένων κυττάρων (Μάρτυρας) που θεωρείται 100% σε κάθε περίπτωση. *Ρ<0.05, **Ρ<0.01. Η πειραματική διαδικασία και η στατιστική επεξεργασία πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφονται στις Μεθόδους. 192

209 Αποτελέσματα Σε συμφωνία με τα παραπάνω αποτελέσματα, αναστολή της κινάσης c-src από τον αναστολέα ΡΡ1 ανέστειλε πλήρως την επαγόμενη από VEGF 165 ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ, ενώ η τελευταία δεν επηρεάστηκε από την επίδραση του αναστολέα της p38 SB (Εικόνα Α32). % Μεταβολή της Ο.Α. στα 450 nm *** * φωσφο-pi3k Μάρτυρας VEGF 165 SB VEGF 165 +SB PP1 VEGF 165 +PP1 ολική PI3K Εικόνα Α32: Μελέτη των επιπέδων ενεργοποίησης της PI3K υπό την επίδραση VEGF 165 παρουσία αναστολέων των κινασών c-src και p38. Πραγματοποιήθηκε προεπώαση κυττάρων HUVEC που στερούνταν ορού για 16 ώρες, με ειδικούς αναστολείς για τις κινάσες c-src (PP1 10 μm) και p38 (SB μΜ) για 15 λεπτά και ακόλουθη διέγερση με VEGF 165 για 10 λεπτά στους 37 0 C. Τα επίπεδα ενεργοποίησης της PI3K αξιολογήθηκαν με τη μέθοδο ELISΑ. Τα αποτελέσματα, εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα του ποσοστού μεταβολής της φωσφορυλιωμένης PI3K ως προς την ομάδα των μη διεγερμένων κυττάρων (Μάρτυρας) που θεωρείται 100%. *P<0.05, ***P< Η πειραματική διαδικασία και η στατιστική επεξεργασία πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφονται στις Μεθόδους. Προκειμένου να διαλευκανθεί εάν η p38 βρίσκεται καθοδικά της ΡΙ3Κ, μελετήθηκε η επίδραση του αναστολέα της ΡΙ3Κ wortmanin στη φωσφορυλίωση της p38. Η wortmanin δε βρέθηκε να μεταβάλλει σημαντικά τη φωσφορυλίωση της p38, όπως φαίνεται στο χαρακτηριστικό ανοσοαποτύπωμα και την ποσοτικοποίηση αυτού (Εικόνα Α33). Tα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν πως η κινάση p38 ανήκει σε ξεχωριστό σε σχέση με την ΡΙ3Κ μονοπάτι σηματοδότησης που ενεργοποιείται υπό την επίδραση VEGF

210 Αποτελέσματα % p38 φωσφορυλίωση ** - VEGF 165 VEGF wortmannin * Εικόνα A33: Μελέτη των επιπέδων φωσφορυλίωσης της p38 υπό την επίδραση VEGF 165 παρουσία αναστολέα της κινάσης PI3K. Πραγματοποιήθηκε προεπώαση κυττάρων HUVEC που στερούνταν ορού για 16 ώρες, με ειδικό αναστολέα για την PI3K (wortmannin 100 nm) για 15 λεπτά και διέγερση με VEGF 165 για 10 λεπτά στους 37 0 C. Ακολούθησε λύση των κυττάρων, ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE και ανάλυση κατά Western με αντισώματα έναντι της φωσφορυλιωμένης ή της ολικής p38. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα του ποσοστού μεταβολής της φωσφορυλιωμένης p38, ως προς την ομάδα των μη διεγερμένων κυττάρων που θεωρείται 100%.*P<0.05, **Ρ<0.01. Για να διακριβωθεί η ιδέα πως η ενεργοποίηση της κινάσης p38 είναι ανεξάρτητη από την ενεργοποίηση της ιντεγκρίνης α ν β 3, πραγματοποιήθηκαν πειράματα για τον ελέγχο φωσφορυλίωσης της p38 υπό την επίδραση VEGF 165 σε σταθερά διαμολυσμένα κύτταρα CHO που εκφράζουν την αγρίου τύπου ή τις μεταλλαγμένες υπομονάδες β 3, όπως περιγράφηκε παραπάνω. Βρέθηκε πως η φωσφορυλίωσή της υπομονάδας β 3 στις τυροσίνες των θέσεων 773 και 785 δε σχετίζεται με την ενεργοποίηση της κινάσης p38 (Εικόνα Α34). 194

211 Αποτελέσματα Εικόνα Α34: Μελέτη επίδρασης του VEGF 165 στην ενεργοποίηση της κινάσης p38 σε σχέση με την παρουσία των τυροσινών 773 και 785 της υπομονάδας β 3. Σε κύτταρα CHO που δεν εκφράζουν την υπομονάδα β 3 και είναι σταθερά διαμολυσμένα με το πλασμίδιοφορέα (Μάρτυρας), ή με πλασμίδιο που φέρει την αγρίου τύπου β 3 (wtβ 3 ), τη μεταλλαγμένη β 3 με αλλαγμένη την τυροσίνη 773 σε φαινυλαλανίνη (β 3 Υ773F), τη μεταλλαγμένη β 3 με αλλαγμένη την τυροσίνη 785 σε φαινυλαλανίνη (β 3 Υ785F) ή τη μεταλλαγμένη β 3 με αλλαγμένες και τις δύο τυροσίνες 773 και 785 σε φαινυλαλανίνες (β 3 Υ773F/Y785F) έγινε επίδραση με VEGF 165 για 10 λεπτά στους 37 0 C. Στα λύματα των υπό μελέτη κυττάρων πραγματοποιήθηκε ανάλυση κατά Western με αντισώματα έναντι της φωσφορυλιωμένης ή της ολικής p38. Οι αριθμοί υποδηλώνουν τη μέση μεταβολή των λόγων φωσφο-p38:ολική p38, σε σχέση με το λόγο στα μη διεγερμένα κύτταρα (στα οποία θεωρείται 1 σε κάθε περίπτωση). Η πειραματική διαδικασία και η ποσοτικοποίηση των ζωνών των ανοσοαποτυπωμάτων πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφονται στις Μεθόδους. Επιπλέον, όπως φαίνεται στην Εικόνα Α35, μείωση της έκφρασης του RPTPβ/ζ αναστέλλει σημαντικά την επαγόμενη από VEGF 165 ενεργοποίηση της c-src, ενώ δεν επηρεάζει την ενεργοποίηση της p38. Εικόνα Α35: Μελέτη επίδρασης της μείωσης της έκφρασης του RPTPβ/ζ στα επίπεδα φωσφορυλίωσης των κινασών c-src και p38. Κύτταρα HUVEC διαμολύνθηκαν για 48 ώρες με sirna για τον RPTPβ/ζ (sirptpβ/ζ) ή για αλληλουχία που δεν εκφράζεται (sineg). Ακολούθησε στέρηση ορού για 16 ώρες και διέγερση των κυττάρων με VEGF 165 (V, VEGF 165 ) για 10 λεπτά στους 37 0 C. Πραγματοποιήθηκε λύση των κυττάρων, ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE και ανάλυση κατά Western με αντίσωμα έναντι της αποφωσφορυλιωμένης στην τυροσίνη 527 ή της ολικής c-src (A), ή με αντίσωμα έναντι της φωσφορυλιωμένης ή της ολικής p38 (B). Οι πειραματικές διαδικασίες και η ποσοτικοποίηση των ζωνών των ανοσοαποτυπωμάτων πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφονται στις Μεθόδους. (επόμενη σελίδα) 195

212 Αποτελέσματα 21. Η NCL συνανοσοκατακρημνίζεται με τον RPTPβ/ζ και την ιντεγκρίνη α ν β 3 σε ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC Από τα μέχρι τώρα αποτελέσματα διαπιστώθηκε o ρόλος του σηματοδοτικού μονοπατιού RPTPβ/ζ/α ν β 3 /PI3K στο μεμβρανικό εντοπισμό της NCL, γεγονός απαραίτητο για την επαγόμενη από PTN και VEGF 165 κυτταρική μετανάστευση. Στη συνέχεια, διερευνήσαμε την πιθανότητα αλληλεπίδρασης της NCL με το μεμβρανικό σύμπλοκο RPTPβ/ζ-α ν β 3, που ευθύνεται για την ικανότητα της PTN (Mikelis et al, 2009) και του VEGF 165 (Theodoropoulou and Papadimitriou, 2010) να επάγουν την κυτταρική μετανάστευση. Αρχική ένδειξη αλληλεπίδρασης μεταξύ της NCL με την α ν β 3, προέκυψε από πειράματα φασματοσκοπίας μάζας, σε 196

213 Αποτελέσματα συνεργασία με την ερευνητική ομάδα του καθηγητή Ulf Hellman, τα οποία πραγματοποιήθηκαν από το Δρ. Σπύρο Σκανδάλη στο Ludwig Institute for Cancer Research (Πίνακας Π1 από Παράρτημα). Ανάμεσα στις πρωτεΐνες που συνανοσοκατακρημνίστηκαν με την α ν β 3, η NCL ταυτοποιήθηκε ως προσδέτης, με ελάχιστη επικάλυψη αλληλουχίας 19% (Koutsioumpa et al, 2013). Ακολούθως, προχωρήσαμε σε λύση κυττάρων HUVEC και ανοσοκατακρήμνιση με αντίσωμα έναντι της NCL στα πρωτεϊνικά εκχυλίσματα. Τα ανοσοϊζήματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση κατά Western για τον RPTPβ/ζ ή τις υπομονάδες α ν ή β 3 (Εικόνα Α36Α). Επίσης, πραγματοποιήθηκε και η αντίστροφη διαδικασία. Σε εκχύλισμα κυττάρων HUVEC ίδιας ποσότητας ολικών πρωτεϊνών, έλαβε χώρα ανοσοκατακρήμνιση με αντισώματα έναντι των RPTPβ/ζ, α ν και β 3 και ανοσοαποτύπωμα για τη NCL (Εικόνα Α36B). Σε όλες τις περιπτώσεις, παρατηρείται συνανοσοκατακρήμνιση των υπό μελέτη πρωτεϊνών. 197

214 Αποτελέσματα Εικόνα Α36: Μελέτη αλληλεπίδρασης ανάμεσα στη NCL και τον RPTPβ/ζ ή την α ν β 3 σε ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα κυττάρων HUVEC. (Α) Οι πιθανές αλληλεπιδράσεις μελετήθηκαν με ανοσοκατακρήμνιση έναντι της NCL και τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν με αντισώματα έναντι του RPTPβ/ζ (αριστερό πλαίσιο) ή της υπομονάδας α ν (μεσαίο πλαίσιο) ή της υπομονάδας β 3 (δεξί πλαίσιο), όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. (Β) Οι αλληλεπιδράσεις μελετήθηκαν με ανοσοκατακρήμνιση με αντισώματα έναντι των RPTPβ/ζ, PTN, α ν και β 3 και τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν με αντίσωμα έναντι της NCL, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Σε κάθε περίπτωση, προς επιβεβαίωση της εκλεκτικότητας των υπό μελέτη αλληλεπιδράσεων, πραγματοποιήθηκαν ανοσοκατακρημνίσεις με ανοσοσφαιρίνη IgG. 22. Συνεντοπισμός της NCL με τον RPTPβ/ζ και την α ν β 3 σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC Πραγματοποιώντας πειράματα διπλού ανοσοφθορισμού για τη NCL σε συνδυασμό με τον RPTPβ/ζ ή την α ν β 3, προκύπτει ότι η NCL συνεντοπίζεται με τον RPTPβ/ζ όχι μόνο στην περιφέρεια, αλλά στο κυτταρόπλασμα και στους πυρήνες/πυρηνίσκους κυττάρων HUVEC. Αντίθετα, ο συνεντοπισμός της NCL με την α ν β 3, ανιχνεύεται αποκλειστικά στην κυτταρική μεμβράνη (Εικόνα Α37). 198

215 Αποτελέσματα Εικόνα Α37: Συνεντοπισμός της NCL με τον RPTPβ/ζ και την α ν β 3 σε κύτταρα HUVEC. Πραγματοποιήθηκε διπλός ανοσοφθορισμός με αντισώματα έναντι της NCL (πράσινο) και του RPTPβ/ζ (κόκκινο) ή της α ν β 3 (κόκκινο), όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Η σήμανση των πυρήνων έγινε με τη χρωστική Draq5 (μπλε). Στις περιοχές συνεντοπισμού παρατηρούνται σημεία κίτρινου χρώματος. Οι ράβδοι κλίμακας αντιστοιχούν σε 10 μm. 23. Η NCL συνανοσοκατακρημνίζεται με τον RPTPβ/ζ και την α ν β 3 σε διαφορετικά κυτταρικά κλάσματα Για να διερευνήσουμε σε ποιες περιοχές του κυττάρου εντοπίζονται τα σύμπλοκα NCL-RPTPβ/ζ και NCL-α ν β 3, πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση με αντίσωμα έναντι του RPTPβ/ζ ή της α ν β 3 και ανοσοαποτύπωμα για τη NCL σε 199

216 Αποτελέσματα εκχυλίσματα πρωτεϊνών από πυρήνα, κυτταρόπλασμα και πλασματική μεμβράνη, προερχόμενα από κύτταρα U87MG. Στην Εικόνα Α38 παρατηρείται αλληλεπίδραση μεταξύ του RPTPβ/ζ και της NCL και στα τρία υποκυτταρικά διαμερίσματα. Αντίθετα, η αλληλεπίδραση της α ν β 3 με τη NCL περιορίζεται αποκλειστικά στο μεμβρανικό κλάσμα. Το πρότυπο εντοπισμού των υπό μελέτη αλληλεπιδράσεων στα κύτταρα U87MG (Εικόνα Α38), είναι παρόμοιο με αυτό που διαπιστώθηκε στα κύτταρα HUVEC (Εικόνα Α36), γεγονός που υποδηλώνει ότι το μοτίβο αλληλεπίδρασης των συμπλόκων NCL-RPTPβ/ζ και NCL-α ν β 3, είναι κοινό σε διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους. Εικόνα Α38: Μελέτη του υποκυτταρικού εντοπισμού της αλληλεπίδρασης ανάμεσα στη NCL και τον RPTPβ/ζ ή την α ν β 3 σε κύτταρα U87MG. Πραγματοποιήθηκε πείραμα κλασμάτωσης σε κύτταρα U87MG, από τα οποία απομονώθηκαν το πυρηνικό, το κυτταροπλασματικό και το μεμβρανικό πρωτεϊνικό κλάσμα, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Ακολούθησε ανοσοκατακρήμνιση με αντίσωμα έναντι του RPTPβ/ζ (αριστερό πλαίσιο) ή της α ν β 3 (δεξί πλαίσιο) και ανοσοαποτύπωμα για τη NCL. Στην προσπάθεια να επιβεβαιώσουμε πως η αλληλεπίδραση της NCL με τον RPTPβ/ζ και την ιντεγκρίνη α ν β 3 λαμβάνει χώρα στην κυτταρική μεμβράνη, πραγματοποιήθηκε πείραμα βιοτινυλίωσης. Συγκεκριμένα, κύτταρα U87MG σε καλλιέργεια επωάσθηκαν με NHS-βιοτίνη και στο πρωτεϊνικό εκχύλισμα πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση με αντισώματα έναντι των PTN, RPTPβ/ζ, α ν, NCL ή β 3, καθώς και με μαγνητικά σφαιρίδια στρεπταβιδίνης. Ακολούθησε ανάλυση κατά Western με αντίσωμα στρεπταβιδίνης συζευγμένο με υπεροξειδάση, η οποία επιβεβαιώνει πως η μεμβρανική NCL αλληλεπιδρά με τις υπό μελέτη πρωτεΐνες στην επιφάνεια των κυττάρων U87MG (Εικόνα Α39). 200

217 Αποτελέσματα Εικόνα Α39: Η NCL αλληλεπιδρά στην επιφάνεια κυττάρων U87MG με την PTN, τον RPTPβ/ζ και την α ν β 3. Kύτταρα U87MG επωάστηκαν με NHS-βιοτίνη. Στα πρωτεϊνικά εκχυλίσματα έγινε ανοσοκατακρήμνιση με αντισώματα έναντι των PTN, RPTPβ/ζ, α ν, NCL, β 3 και IgG, καθώς και με μαγνητικά σφαιρίδια στρεπταβιδίνης (streptavidin beads, s.b.). Tα ανοσοϊζήματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση κατά Western με αντίσωμα έναντι της NCL (αριστερό πλαίσιο) ή βιοτινυλιωμένες πρωτεΐνες (χρησιμοποιώντας αντίσωμα στρεπταβιδίνης συζευγμένο με υπεροξειδάση, streptavidin-hrp, strep) (δεξί πλαίσιο). Τα βέλη στις δύο ομάδες δείχνουν τη NCL. Οι πειραματικές διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφονται στις Μεθόδους. 24. Η NCL αλληλεπιδρά άμεσα με τον RPTPβ/ζ και την ιντεγκρίνη α ν β 3 Με σκοπό να διαλευκάνουμε κατά πόσο οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ NCL-RPTPβ/ζ και NCL-α ν β 3 είναι άμεσες ή έμμεσες, εφαρμόσαμε τη μέθοδο του PLA. Στην Εικόνα Α40, παρατίθενται αντιπροσωπευτικές εικόνες από κύτταρα HUVEC και κύτταρα γλοιοβλαστώματος U87MG και M059K, όπου η ύπαρξη των κόκκινων κουκίδων αποδεικνύει την αμεσότητα των υπό μελέτη αλληλεπιδράσεων. Θα πρέπει να σημειωθεί πως με την παρούσα πειραματική προσέγγιση, δεν μπορούμε να εξάγουμε ασφαλές συμπέρασμα σε σχέση με το ποια υπομονάδα της ιντεγκρίνης α ν β 3 αλληλεπιδρά άμεσα με τη NCL, καθώς η απόσταση των υπομονάδων α ν και β 3 είναι μικρότερη από 40 nm στο ετεροδιμερές. Ως θετικός βιολογικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε η αλληλεπίδραση της PTN με τον RPTPβ/ζ υποδοχέα της, ενώ η έλλειψη προσθήκης 1 ων αντισωμάτων χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας. Όπως ήταν αναμενόμενο, στα κύτταρα M059K τα οποία δεν εκφράζουν α ν β 3, δεν παρατηρείται σχηματισμός συμπλόκων μεταξύ της NCL και των υπομονάδων της α ν β 3. Ακόμα, ενδιαφέρουσα αποτελεί η παρατήρηση της πολύ ασθενούς αλληλεπίδρασης μεταξύ της PTN με τον 201

218 Αποτελέσματα υποδοχέα RPTPβ/ζ στα κύτταρα M059K. Το αποτέλεσμα αυτό χρίζει περαιτέρω διερεύνησης. 202

219 Αποτελέσματα Εικόνα Α40: Μελέτη της άμεσης αλληλεπίδρασης ανάμεσα στη NCL και τον RPTPβ/ζ και τις α ν ή β 3 υπομονάδες σε διάφορους κυτταρικούς τύπους. Πραγματοποιήθηκε πείραμα PLA με συνδυασμούς αντισωμάτων έναντι των PTN-RPTPβ/ζ, NCL-RPTPβ/ζ, NCL-α ν ή NCL-β 3, σε κύτταρα HUVEC, καθώς και σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος U87MG και Μ059Κ, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Η σήμανση των πυρήνων έγινε με τη χρωστική Draq5 (μπλε). Οι ράβδοι κλίμακας αντιστοιχούν σε 10 μm. 25. Ο RPTPβ/ζ και η α ν β 3 αλληλεπιδρούν με το κεντρικό και πιθανώς με το καρβοξυτελικό τμήμα της NCL Θελήσαμε να διερευνήσουμε ποιο δομικό τμήμα της NCL είναι υπεύθυνο για δέσμευση του RPTPβ/ζ και της α ν β 3. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκε μετασχηματισμός κυττάρων U87MG με πλασμίδια που κωδικοποιούν την αγρίου τύπου NCL, το αμινοτελικό της άκρο, το κεντρικό τμήμα, καθώς και το συνδυασμό του κεντρικού με το καρβοξυτελικό τμήμα της πρωτεΐνης, συζευγμένα με το πεπτίδιο GFP, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους (Εικόνα Μ2 από Υλικά και Μέθοδοι). Ακολουθήθηκαν οι ίδιες πειραματικές προσεγγίσεις της Παραγράφου 5, με αντισώματα έναντι του RPTPβ/ζ και των υπομονάδων α ν ή β 3. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α41Α και Β, τόσο ο RPTPβ/ζ, όσο και η α ν δεσμεύονται στο κεντρικό τμήμα Μ2 της NCL. Οι αλληλεπιδράσεις που παρατηρούνται με το τμήμα Μ3, δε γνωρίζουμε εάν οφείλονται αποκλειστικά στα αμινοξέα που αντιστοιχούν στο κεντρικό τμήμα της NCL ή και στα αμινοξέα του καρβοξυτελικού άκρου της. Έλεγχος της υπερέκφρασης των δομικών τμημάτων της NCL, με ανοσοκατακρήμνιση για GFP και κατά Western ανάλυση για το ίδιο μόριο, έδειξε πως τα τελευταία δεν εκφράστηκαν στον ίδιο βαθμό από τα κύτταρα U87MG μεταξύ των διαφορετικών πειραμάτων (αποτελέσματα που δεν παρουσιάζονται). Η παρατήρηση αυτή πιθανά ερμηνεύει τη λιγότερο έντονη αλληλεπίδραση του δομικού τμήματος Μ3 με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ ή/και την υπομονάδα α ν, σε σχέση με τις παρατηρούμενες αλληλεπιδράσεις του δομικού τμήματος Μ2. Στην περίπτωση της υπομονάδας β 3 δεν ανιχνεύθηκε αλληλεπίδραση με τη NCL ή τμημάτων της, με βάση την παρούσα πειραματική προσέγγιση (αποτελέσματα που δεν παρουσιάζονται). Από την άλλη πλευρά, τo αμινοτελικό άκρο της NCL δεν εμπλέκεται στη δέσμευση του RPTPβ/ζ, αλλά ούτε και της υπομονάδας α ν. 203

220 Αποτελέσματα Εικόνα Α41: Διερεύνηση των δομικών τμημάτων της NCL που αλληλεπιδρούν με τον RPTPβ/ζ και την α ν β 3. Πραγματοποιήθηκε μετασχηματισμός κυττάρων U87MG για 24 ώρες με πλασμίδια που φέρουν τη γονιδιακή αλληλουχία της NCL συζευγμένης με GFP (GFP-NCL), τμήματα της γονιδιακής αλληλουχίας της NCL που κωδικοποιούν τα αμινοξέα 1-275, , συζευγμένα με GFP (Μ1, Μ2 και Μ3 αντίστοιχα), καθώς και με το πλασμίδιο-φορέα (μάρτυρας). (Α) Ακολούθησε λύση των κυττάρων, ανοσοκατακρήμνιση με αντίσωμα έναντι του RPTPβ/ζ (αριστερό πλαίσιο) ή του πεπτιδίου GFP (δεξί πλαίσιο) και ανάλυση κατά Western με αντίσωμα έναντι του GFP ή του RPTPβ/ζ, αντίστοιχα. (Β) Έγινε λύση των κυττάρων, ανοσοκατακρήμνιση με αντίσωμα έναντι της α ν (αριστερό πλαίσιο) ή του GFP (δεξί πλαίσιο) και ανάλυση κατά Western με αντίσωμα έναντι του GFP ή της α ν, αντίστοιχα. Οι πειραματικές διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφονται στις Μεθόδους. 26. Η NCL εμπλέκεται στον ενδοκυτταρικό εντοπισμό της PTN και του RPTPβ/ζ Δεδομένου του καθιερωμένου ρόλου της NCL στην ενδοκυττάρωση μεμβρανικών προσδετών της και μεταφοράς τους στον πυρήνα (Kibbey et al, 1995; Said et al, 2002; Christian et al, 2003; Legrand et al, 2004; Tate et al, 2006; Shi et al, 2008; Di Segni et al, 2008; Reyes-Reyes and Akiyama, 2008), αναρωτηθήκαμε εάν η NCL παίζει κάποιο τέτοιο ρόλο στην περίπτωση της PTN ή του RPTPβ/ζ. Για να 204

221 Αποτελέσματα εξεταστεί αυτή η πιθανότητα, προχωρήσαμε σε μείωση των πρωτεϊνικών επιπέδων της NCL και έλεγχο του υποκυτταρικού εντοπισμού της ΡΤΝ και του RPTPβ/ζ με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού. Όπως φαίνεται στις Εικόνες Α42 και Α43, μείωση της έκφρασης της NCL προκάλεσε σημαντική αναστολή του πυρηνικού εντοπισμού τόσο της PTN όσο και του RPTPβ/ζ. Η λειτουργική σημασία αυτής της παρατήρησης χρίζει περαιτέρω διερεύνησης. Εικόνα Α42: Μελέτη του ενδοκυτταρικού εντοπισμού της PTN σε κύτταρα HUVEC έπειτα από μείωση της έκφρασης της NCL. Κύτταρα HUVEC διαμολύνθηκαν για 24 ώρες με sirna για τη NCL (sincl) ή για αλληλουχία που δεν εκφράζεται (sineg). Πραγματοποιήθηκαν πειράματα απλού ανοσοφθορισμού με αντίσωμα έναντι της PTN (πράσινο), όπως περιγράφεται στις Mεθόδους. Η σήμανση των πυρήνων έγινε με τη χρωστική Draq5 (μπλε). Οι ράβδοι κλίμακας αντιστοιχούν σε 10 μm. 205

222 Αποτελέσματα Εικόνα Α43: Μελέτη του ενδοκυτταρικού εντοπισμού του RPTPβ/ζ σε κύτταρα HUVEC έπειτα από μείωση της έκφρασης της NCL. Κύτταρα HUVEC διαμολύνθηκαν για 24 ώρες με sirna για τη NCL (sincl) ή για αλληλουχία που δεν εκφράζεται (sineg). Πραγματοποιήθηκαν πειράματα απλού ανοσοφθορισμού με αντίσωμα έναντι του RPTPβ/ζ (κόκκινο), όπως περιγράφεται στις Mεθόδους. Η σήμανση των πυρήνων έγινε με τη χρωστική Draq5 (μπλε). Οι ράβδοι κλίμακας αντιστοιχούν σε 10 μm. Από την άλλη πλευρά, λόγω των άμεσων αλληλεπιδράσεων που βρέθηκαν μεταξύ NCL-VEGF 165 και NCL-VEGFR-2 σε κύτταρα U87MG (Εικόνα Α44Α), διερευνήσαμε την πιθανότητα ρόλου της NCL στην ενδοκυττάρωση τόσο του VEGF 165 όσο και του υποδοχέα του VEGFR-2. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α44B, ο ενδοκυτταρικός εντοπισμός των υπό μελέτη μορίων δε μεταβάλλεται ούτε έπειτα από μείωση της έκφρασης της NCL, αλλά ούτε και υπό την επίδραση ενός μεμβρανικού αναστολέα της NCL, του HB-19, σε κύτταρα U87MG. Στην περίπτωση του VEGFR-2, ίδια παρατήρηση έγινε και σε κύτταρα HUVEC. 206

223 Αποτελέσματα 207

224 Αποτελέσματα Εικόνα Α44: Η NCL αλληλεπιδρά με τον VEGF 165 και τον VEGFR-2, αλλά δεν εμπλέκεται στον ενδοκυτταρικό εντοπισμό τους. (A) Πραγματοποιήθηκε πείραμα PLA με συνδυασμούς αντισωμάτων έναντι των NCL-VEGF 165 και NCL-VEGFR-2, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. (B) Κύτταρα HUVEC διαμολύνθηκαν με sirna για τη NCL (sincl) ή για αλληλουχία που δεν εκφράζεται (sineg), είτε επωάστηκαν με το ψευδοπεπτίδιο ΗΒ-19 (10 μg/ml) για 24 ώρες υπό την παρουσία ορού (15% FBS). Πραγματοποιήθηκαν πειράματα απλού ανοσοφθορισμού με αντισώματα έναντι των VEGF 165 ή VEGFR-2 (πράσινο) όπως περιγράφεται στις Mεθόδους. Η σήμανση των πυρήνων έγινε με τη χρωστική Draq5 (μπλε). Οι ράβδοι κλίμακας αντιστοιχούν σε 10 μm. 27. Η έκφραση της α ν β 3 καθορίζει τη βιολογική δραστικότητα παραγόντων που στοχεύουν τη μεμβρανική NCL επί της μετανάστευσης ενδοθηλιακών και καρκινικών κυττάρων Τόσο από πειράματα ανοσοφθορισμού σε διάφορους κυτταρικούς τύπους (Εικόνα Α13), όσο και από πειράματα ανοσοϊστοχημείας σε μικροσυστοιχίες ιστών προερχόμενων από ανθρώπινους όγκους του εγκεφάλου, τα οποία πραγματοποιήθηκαν σε συνεργασία με την ομάδα του καθηγητή Δημήτρη Ηλιόπουλου από τον Δρ. Χρήστο Πολυτάρχου στο Dana Farber Cancer Institute και Harvard Medical School (Εικόνα Π1 από Παράρτημα) (Koutsioumpa et al, 2013), διαπιστώθηκε πως η NCL εντοπίζεται κατά προτίμηση στην επιφάνεια κυττάρων που εκφράζουν α ν β 3. Βάση αυτών των παρατηρήσεων, θελήσαμε να αξιολογήσουμε την αποτελεσματικότητα μορίων που στοχεύουν τη μεμβρανική NCL σε σχέση με την έκφραση της α ν β 3. Για το σκοπό αυτό, το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-c23, καθώς και τα ψευδοπεπτίδια 5(KPR)TASP, ΗΒ-19 και Nucant 6L, ελέγχθηκαν για την επίδρασή τους στη μετανάστευση κυττάρων που διαφορικά εκφράζουν α ν β 3. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε μελέτη εύρεσης της βέλτιστης δραστικής συγκέντρωσης του αντισώματος anti-c23 επί της κυτταρικής μετανάστευσης. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α45, το αντίσωμα anti-c23 προκάλεσε μια εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση αναστολή της μετανάστευσης κυττάρων U87MG, η οποία ήταν μέγιστη σε συγκέντρωση 10 μg/ml. Στη συνέχεια, διαπιστώθηκε πως το αντίσωμα anti-c23 (σε συγκέντρωση 10 μg/ml) ανέστειλε σημαντικά τη μετανάστευση όλων των υπό μελέτη κυτταρικών τύπων που εκφράζουν α ν β 3, όπως τα U87MG, HUVEC, CHO wtβ 3 και β 3 Y785F, ενώ δεν επηρέασε ή επηρέασε σε μικρό βαθμό τη μετανάστευση των κυττάρων M059K, C6 και CHO β 3 Y773F που δεν εκφράζουν α ν β 3 ή εκφράζουν μεταλλαγμένη β 3 στη 208

225 Αποτελέσματα θέση τυροσίνης 773 (Εικόνα Α46). Στα κύτταρα της ομάδας του μάρτυρα στην περίπτωση που μελετήθηκε το αντίσωμα anti-c23, έγινε επίδραση με ανοσοσφαιρίνη IgG σε συγκέντρωση 10 μg/ml. Παρόμοια με το αντίσωμα anti- C23, τα πεπτίδια 5(KPR)TASP, ΗΒ-19 και Nucant 6L ανέστειλαν σημαντικά τη μετανάστευση κυττάρων U87MG και HUVEC, ενώ είχαν μικρή ή καθόλου επίδραση στη μετανάστευση κυττάρων M059K και C6 (Εικόνες Α47-Α49) % Μετανάστευση ** ** IgG anti-c23 (μg/ml) Εικόνα Α45: Δοσοεξαρτώμενη μελέτη επίδρασης του μονοκλωνικού αντισώματος anti- C23 στη μετανάστευση κυττάρων U87MG. Κύτταρα U87MG επωάστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις μονοκλωνικού αντισώματος anti-c23 ή με ανοσοσφαιρίνη IgG σε μία υψηλή συγκέντρωση (20 μg/ml). Η μετανάστευση των κυττάρων πραγματοποιήθηκε υπό την παρουσία ορού και εκτιμήθηκε με το σύστημα χημειοτακτισμού Transwell, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα του ποσοστού των κυττάρων που μετανάστευσαν, ως προς την ομάδα των μη διεγερμένων κυττάρων που θεωρείται 100%. **Ρ<

226 Αποτελέσματα *** ** *** IgG (10 μg/ml) anti C-23 (10 μg/ml) *** % Μετανάστευση M059K HUVEC C6 wtβ 3 β 3 Υ773F β 3 Υ785F Εικόνα Α46: Mελέτη επίδρασης του μονοκλωνικού αντισώματος anti-c23 στην κυτταρική μετανάστευση σε σχέση με την έκφραση της ιντεγκρίνης α ν β 3. Διαφορετικοί τύποι κυττάρων που εκφράζουν ή δεν εκφράζουν α ν β 3, επωάστηκαν με το anti-c23 αντίσωμα (10 μg/ml). Η μετανάστευση των κυττάρων πραγματοποιήθηκε υπό την παρουσία ορού και εκτιμήθηκε με το σύστημα χημειοτακτισμού Transwell, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα του ποσοστού των κυττάρων που μετανάστευσαν, ως προς την ομάδα των κυττάρων όπου είχε γίνει επίδραση με IgG που θεωρείται 100% σε κάθε περίπτωση. **Ρ<0.01, ***P< % Μετανάστευση * *** Μάρτυρας 5(KPR)TASP (1 μm) *** 0 C6 M059K U87MG HUVEC Εικόνα Α47: Mελέτη επίδρασης του πεπτιδίου 5(KPR)TASP στην κυτταρική μετανάστευση σε σχέση με την έκφραση της ιντεγκρίνης α ν β 3. Διαφορετικοί τύποι κυττάρων που εκφράζουν ή δεν εκφράζουν α ν β 3, επωάστηκαν με το πεπτίδιο 5(KPR)TASP (1 μμ). Η μετανάστευση των κυττάρων πραγματοποιήθηκε υπό την παρουσία ορού και εκτιμήθηκε με το σύστημα χημειοτακτισμού Transwell, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα του ποσοστού των κυττάρων που μετανάστευσαν, ως προς την ομάδα των μη διεγερμένων κυττάρων που θεωρείται 100% σε κάθε περίπτωση. *Ρ<0.05, ***P<

227 Αποτελέσματα % Μετανάστευση C6 M059K *** U87MG Μάρτυρας HB-19 (10 μg/ml) ** HUVEC Εικόνα Α48: Mελέτη επίδρασης του πεπτιδίου HB-19 στην κυτταρική μετανάστευση σε σχέση με την έκφραση της ιντεγκρίνης α ν β 3. Διαφορετικοί τύποι κυττάρων που εκφράζουν ή δεν εκφράζουν α ν β 3, επωάστηκαν με το πεπτίδιο HB-19 (10 μg/ml). Η μετανάστευση των κυττάρων πραγματοποιήθηκε υπό την παρουσία ορού και εκτιμήθηκε με το σύστημα χημειοτακτισμού Transwell, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα του ποσοστού των κυττάρων που μετανάστευσαν, ως προς την ομάδα των μη διεγερμένων κυττάρων που θεωρείται 100% σε κάθε περίπτωση. **Ρ<0.01, ***P< % Μετανάστευση C6 *** M059K *** U87MG Μάρτυρας Nucant 6L (10 μg/ml) *** HUVEC Εικόνα Α49: Mελέτη επίδρασης του πεπτιδίου Nucant 6L στην κυτταρική μετανάστευση σε σχέση με την έκφραση της ιντεγκρίνης α ν β 3. Διαφορετικοί τύποι κυττάρων που εκφράζουν ή δεν εκφράζουν α ν β 3, επωάστηκαν με το πεπτίδιο Nucant 6L (10 μg/ml). Η μετανάστευση των κυττάρων πραγματοποιήθηκε υπό την παρουσία ορού και εκτιμήθηκε με το σύστημα χημειοτακτισμού Transwell, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα του ποσοστού των κυττάρων που μετανάστευσαν, ως προς την ομάδα των μη διεγερμένων κυττάρων που θεωρείται 100% σε κάθε περίπτωση. ***P<

228 Αποτελέσματα 212

229 ΣΥΖΗΤΗΣΗ

230

231 Συζήτηση Ο αυξητικός παράγοντας ΡΤΝ εκφράζεται σε μια ποικιλία πρωτογενών ανθρώπινων όγκων και έχει συσχετιστεί με αυξημένη καρκινική ανάπτυξη και αγγειακή πυκνότητα (Papadimitriou et al, 2009; Tsirmoula et al, 2012). Φέρει αγγειογενετικές δράσεις σε διάφορα in vitro μοντέλα, καθώς και στο in vivo μοντέλο της CAM (Papadimitriou et al, 2001; Koutsioumpa et al, 2012). Προηγούμενα, έχουμε δείξει ότι ο υποδοχέας RPTPβ/ζ, είναι υπεύθυνος για την επαγόμενη από ΡΤΝ μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων (Polykratis et al, 2005). Επιπρόσθετα, η ιντεγκρίνη α ν β 3 φαίνεται να αποτελεί κρίσιμο μόριο για τη διεγερτική δράση της ΡΤΝ στην κυτταρική μετανάστευση, μέσω σχηματισμού ενός λειτουργικού συμπλόκου με τον RPTPβ/ζ στην επιφάνεια ενδοθηλιακών κυττάρων (Mikelis et al, 2009). Σε αυτή την κατεύθυνση, η α ν β 3 αλληλεπιδρά άμεσα με τον RPTPβ/ζ κατά την ενεργή αγγειογένεση στο μοντέλο της CAM, ενώ η αλληλεπίδραση αυτή μειώνεται όταν παύει η δημιουργία νέων αγγείων στον ιστό (Koutsioumpa et al, 2012). Ξεκινώντας με την παρατήρηση ότι η ενδογενής ΡΤΝ επίσης εντοπίζεται στον πυρήνα ενδοθηλιακών κυττάρων της CAM (Drosou et al, 2008), διαπιστώσαμε ότι βρίσκεται και στον πυρήνα ανθρώπινων ενδοθηλιακών και κυττάρων γλοιοβλαστώματος, σε συμφωνία με τον πυρηνικό εντοπισμό της σε νεογνικά καρδιομυοκύτταρα (Li et al, 2007). Κατά τα τελευταία χρόνια, έχουν συσσωρευτεί δεδομένα πως διάφοροι αυξητικοί παράγοντες που σχετίζονται με την αγγειογένεση και την ανάπτυξη όγκων, καθώς και οι υποδοχείς τους, ανιχνεύονται στον πυρήνα των κυττάρων. Χαρακτηριστικά παραδείγματα αποτελούν ο VEGF 165 (Li and Keller, 2000; Lejbkowicz et al, 2005) και ο υποδοχέας VEGFR-2 (Blazquez et al, 2006; Domingues et al, 2011). Αν και αυτός ο πυρηνικός εντοπισμός μπορεί να σχετίζεται με μεταγραφική ενεργοποίηση γονιδίων που εμπλέκονται στην αγγειογένεση, μέχρι σήμερα η λειτουργική σημασία αυτής της διαδικασίας παραμένει εντελώς άγνωστη (Re and Cook, 2006). Πυρηνική εντόπιση της ΡΤΝ έχει προηγουμένως συζητηθεί με βάση τις παρατηρήσεις ότι η πρωταγής δομή της περιέχει τρείς πιθανές πυρηνικές αλληλουχίες στόχευσης (Hampton et al, 1992) και συνδέεται με τη NCL (Take et al, 1994), η οποία συμμετέχει στην πυρηνική μετατόπιση της MK, που είναι το άλλο μέλος της ίδιας οικογένειας αυξητικών παραγόντων (Take et al, 1994; Shibata et al, 2002). Μολονότι αλληλεπίδραση της ΡΤΝ με τη NCL έχει ήδη αναφερθεί (Take et al, 1994), αυτή είναι η πρώτη μελέτη που παρέχει στοιχεία εξαρτώμενου από την έκφραση της NCL πυρηνικού εντοπισμού της PTN. Μια 215

232 Συζήτηση πιθανότητα για το ρόλο της πυρηνικής ΡΤΝ αποτελεί η συμμετοχή της στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Έχει δειχθεί προηγούμενα ότι μείωση της έκφρασης της ΡΤΝ, επάγει τετραπλοειδία και ανευπλοειδία σε κύτταρα γλοιβλαστώματος U87MG και μπορεί να συμβάλει στην αναστροφή του κακοήθους φαινοτύπου τους (Chang et al, 2006). Μια άλλη πιθανότητα θα μπορούσε να είναι η συμμετοχή της PTN στην απόπτωση. Πολλές μελέτες υποστηρίζουν την αντιαποπτωτική δράση τόσο της ΡΤΝ (Zhang et al, 1999; Bowden et al, 2002; Soh et al, 2007; Park et al, 2008; Tsirmoula et al, 2012), όσο και της NCL (Fogal et al, 2009; Ishimaru et al, 2010; Destouches et al, 2011). Ωστόσο, δεν είναι σαφές εάν η προαναφερόμενη αντιαποπτωτική δράση της PTN οφείλεται στον πυρηνικό εντοπισμό της. Περαιτέρω μελέτες απαιτούνται για να διαφωτίσουν αυτό το σημείο. Επιπλέον, έχει πρόσφατα δειχθεί ότι η NCL αλληλεπιδρά με τις πλούσιες σε γουανίνη περιοχές (ppu/ppy) του υποκινητή του VEGF 165, δρώντας ως μεταγραφικός ενεργοποιητής του γονιδίου του (Uribe et al, 2011), και ακόμα ότι η ΡΤΝ προωθεί την έκφραση του VEGF 165 (Kong et al, 2012). Το ενδεχόμενο, η ΡΤΝ και η NCL να συνεργάζονται για τη ρύθμιση της έκφρασης διαφόρων μορίων είναι ενδιαφέρον και απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση. Εκτός από την πυρηνική μετατόπιση της PTN που διαμεσολαβείται από τη NCL, η τελευταία φαίνεται να συμμετέχει και στην επαγόμενη από ΡΤΝ μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων. Η παραπάνω διαδικασία εξαρτάται από τη NCL που εδράζεται στην κυτταρική μεμβράνη. Από όσα είναι γνωστά μέχρι σήμερα, αυτή είναι η πρώτη μελέτη που δείχνει την άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο μορίων στην κυτταρική επιφάνεια και την εμπλοκή της NCL στις διεγερτικές δράσεις της PTN επί της κυτταρικής μετανάστευσης. Η ανακατανομή της NCL από τον πυρήνα προς την κυτταρική μεμβράνη έχει παρατηρηθεί τόσο σε ενδοθηλιακά (Huang et al, 2006), όσο και σε καρκινικά (Di Segni et al, 2008; Destouches et al, 2008; Hoja-Lukowicz et al, 2009) κύτταρα, και δεδομένα δείχνουν πως παίζει σημαντικό ρόλο σε λειτουργίες που οδηγούν στην αγγειογένεση και στην ανάπτυξη όγκων, μέσω άγνωστων ακόμα μηχανισμών. Ο ειδικός ανταγωνιστής HB-19, ο οποίος σχηματίζει ένα σταθερό σύμπλοκο με τη NCL δεσμεύοντας το καρβοξυτελικό άκρο της, προκαλεί σημαντική μείωση του σχηματισμού διακλαδώσεων των αιμοφόρων αγγείων στο μοντέλο της CAM (Destouches et al, 2008), αναδεικνύοντας τη συμμετοχή της NCL στην αγγειογενετική διαδικασία. Επιπλέον, μια σειρά από μελέτες δείχνει ότι πολλά 216

233 Συζήτηση μόρια επηρεάζουν την αγγειογένεση και την καρκινική ανάπτυξη μέσω της μεμβρανικής NCL, όπως ο HGF (Τate et al, 2006), ο VEGF 165 (Huang et al, 2006), η ενδοστατίνη (Shi et al, 2007; Zhuo et al, 2010) και η πρωτεΐνη που επάγει τον παράγοντα νέκρωσης όγκων-άλφα (tumour necrosis factor-alpha inducing protein, Tipalpha) (Watanabe et al, 2010a). Ωστόσο, η NCL δεν εκφράζεται στη μεμβράνη όλων των καρκινικών κυττάρων και οι εμπλεκόμενοι μηχανισμοί παραμένουν ασαφείς. Το σημείο αυτό θα συζητηθεί παρακάτω. Η συμβολή του καρβοξυτελικού τμήματος της PTN στις αγγειογενετικές και καρκινικές της δράσεις, έχει μελετηθεί αρκετά. Η PTN φαίνεται πως αλληλεπιδρά μέσω του καρβοξυτελικού της άκρου με τους υποδοχείς ALK (Bernard-Pierrot et al, 2002) και RPTPβ/ζ (Lu et al, 2005; Bermek et al, 2007 και αδημοσίευτα αποτελέσματα). Πρόσφατα αποτελέσματα της ερευνητικής μας ομάδας έδειξαν πως και η ιντεγκρίνη α ν β 3 δεσμεύεται μέσω της κυστεϊνικής θηλιάς της υπομονάδας β 3, στο καρβοξυτελικό άκρο της PTN. Στην παρούσα διατριβή, συνδυασμός διαφορετικών πειραματικών προσεγγίσεων για τη μελέτη πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων, δείχνει πως η NCL αλληλεπιδρά άμεσα με την PTN και το καρβοξυτελικό τμήμα της ΡΤΝ δε φαίνεται να εμπλέκεται στην αλληλεπίδραση αυτή. Με τη χρήση πεπτιδίων που αντιστοιχούν σε διάφορες περιοχές του μορίου βρέθηκε ότι η περιοχή TSR1 του αμινοτελικού τμήματος της ΡΤΝ (αμινοξέα: 16-24) είναι υπεύθυνη για την αλληλεπίδραση με τη NCL. Το αποτέλεσμα αυτό, αν και πρέπει να επιβεβαιωθεί και με άλλες προσεγγίσεις πειραματικά, είναι σε συμφωνία με δεδομένα που υποδεικνύουν ότι τόσο η καρβοξυτελική όσο και η αμινοτελική περιοχή της ΡΤΝ επάγουν τη δημιουργία όγκων in vivo, αλλά οι διάφορες δομικές περιοχές σηματοδοτούν πιθανά μέσω διαφορετικών υποδοχέων (Zhang et al, 2006). Όσον αφορά στα τμήματα της NCL που παίζουν ρόλο στην αλληλεπίδραση με την ΡΤΝ, υπερέκφραση GFPσυζευγμένων δομικών τμημάτων της NCL έδειξε το κεντρικό και πιθανώς το καρβοξυτελικό της άκρο να εμπλέκονται. Αξίζει να σημειωθεί ότι αγγειογενετικά ή/και ογκογενετικά μόρια, όπως ο ορός (Hovanessian et al, 2000), o VEGF 165 (Huang et al, 2006), η λαμινίνη-1 (Turck et al, 2006) και η LRP (Krust et al, 2011a), έχουν συσχετιστεί με αυξημένα επίπεδα της μεμβρανικής NCL. Στην παρούσα μελέτη διαπιστώθηκε πως η έκφραση της α ν β 3 και η φωσφορυλίωση της υπομονάδας β 3 στην τυροσίνη 773, απαιτούνται για την ανακατανομή της NCL από τον πυρήνα προς την κυτταρική μεμβράνη. 217

234 Συζήτηση Επίσης, η επαγόμενη από λαμινίνη-1 αύξηση του εντοπισμού της NCL στην κυτταρική επιφάνεια, εξαρτάται από διαμεσολαβούμενο από την ιντεγκρίνη β 1 σηματοδοτικό μονοπάτι (Turck et al, 2006), ενισχύοντας την ιδέα ότι οι ιντεγκρίνες ρυθμίζουν τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό της NCL. Στo πλαίσιo αυτό, δεδομένα δείχνουν ότι πολλά από τα μόρια που έχουν περιγραφεί να δεσμεύουν και να ασκούν τις δράσεις τους μέσω της μεμβρανικής NCL, έχουν επίσης περιγραφεί να ενεργούν μέσω ιντεγκρινών, και ειδικά μέσω της α ν β 3. Αυτό συμβαίνει στην περίπτωση του VEGF 165 (Senger et al, 1996; Somanath et al, 2009), των λαμινινών (Kibbey et al, 1995; Lian et al, 2006; Oikawa et al, 2011), του HGF (Rahman et al, 2005; Tate et al, 2006), της ενδοστατίνης (Rehn et al, 2001; Shi et al, 2007) και της ΡΤΝ (Mikelis et al, 2009). Ενδιαφέρον παρουσιάζει η παρατήρηση ότι η β 3 φαίνεται να είναι η υπομονάδα που είναι υπεύθυνη για τον εντοπισμό της NCL στην κυτταρική επιφάνεια, γεγονός που συνάδει με την εξαρτώμενη από την υπομονάδα β 3, αλλά όχι την α ν, επαγωγική δράση της PTN στην κυτταρική μετανάστευση (Mikelis et al, 2009). Μεμβρανικός εντοπισμός της NCL παρατηρείται μόνο σε κύτταρα CHO και M059K που υπερεκφράζουν την υπομονάδα β 3, αλλά όχι σε κύτταρα που υπερεκφράζουν την υπομονάδα α ν. Στην ίδια κατεύθυνση, μείωση της έκφρασης της υπομονάδας β 3 καταργεί τον εντοπισμό της NCL στη μεμβράνη κυττάρων U87MG. Αντίθετα, μείωση της έκφρασης της υπομονάδας α ν δεν έχει κάποια τέτοια επίδραση. Το τελευταίο αποτέλεσμα θα μπορούσε να αποδοθεί στο σχηματισμό ενός λειτουργικού συμπλόκου της υπομονάδας β 3 με την έτερη υπομονάδα αiib, η οποία έχει δειχθεί ότι εκφράζεται έκτοπα σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές σειρές (Chen et al, 1997). Επιπλέον, με βάση τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την πιθανότητα εμπλοκής και άλλων ιντεγκρινών, πέραν της α ν β 3, στον ενδοκυτταρικό εντοπισμό της NCL. Όπως διαπιστώθηκε, ο μεμβρανικός εντοπισμός της NCL εξαρτάται από τη φωσφορυλίωση της υπομονάδας β 3 στην τυροσίνη 773. Τόσο ο VEGF 165, όσο και η ΡΤΝ επάγουν τη διαμεσολαβούμενη από την κινάση c-src φωσφορυλίωση της β 3 στην τυροσίνη 773 (Mikelis et al, 2009 και παρούσα διατριβή). Mείωση της έκφρασης του υποδοχέα RPTPβ/ζ (Mikelis et al, 2009 και Papadimitriou et al, 2011) ή φαρμακολογική αναστολή της κινάσης c-src, ανέστειλαν σημαντικά την επαγόμενη από PTN ή VEGF 165 φωσφορυλίωση της υπομονάδας β 3 στην 218

235 Συζήτηση τυροσίνη 773, καθώς και το μεμβρανικό εντοπισμό της NCL. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν πως τόσο ο RPTPβ/ζ, όσο και η κινάση c-src εδράζονται ανοδικά της α ν β 3. Παρόλο που είναι γνωστό πως η κινάση c-src είναι υπεύθυνη για την επαγόμενη από PTN (Mikelis et al, 2009) και VEGF 165 (Somanath et al, 2009) φωσφορυλίωση της α ν β 3, στην παρούσα μελέτη καταδεικνύεται για πρώτη φορά η εμπλοκή του RPTPβ/ζ στις δράσεις του VEGF 165. Αν και έχει γίνει γνωστό εδώ και αρκετά χρόνια ότι o VEGF 165 επάγει το μεμβρανικό εντοπισμό της NCL (Huang et al, 2006), το μονοπάτι μεταγωγής σήματος και ο εμπλεκόμενος υποδοχέας, δεν έχουν διαλευκανθεί μέχρι σήμερα. Ο VEGFR-2 και η περιοχή πρόσδεσης στην ηπαρίνη δε φαίνεται να σχετίζονται με αυτήν τη διαδικασία, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αλληλεπίδραση του VEGF 165 με τον RPTPβ/ζ περιλαμβάνει ένα ξεχωριστό τμήμα του μορίου, όπως έχει περιγραφεί και στην περίπτωση της αλληλεπίδρασης με την NRP-1 (Djordjevic and Driscoll, 2013). Επιπλέον, η αλληλεπίδραση του VEGF 165 με τον RPTPβ/ζ αναστέλλεται από την ΡΤΝ και από πεπτίδιο που αντιστοιχεί στο καρβοξυτελικό άκρο της ΡΤΝ, το οποίο, όπως αναφέρθηκε παραπάνω, είναι υπεύθυνο για την αλληλεπίδραση της ΡΤΝ με τον RPTPβ/ζ. Φαίνεται λοιπόν ότι ΡΤΝ και VEGF 165 αλληλεπιδρούν με την ίδια περιοχή δέσμευσης στον RPTPβ/ζ. Ο ρόλος της ιντεγκρίνης α ν β 3 στη ρύθμιση του ενδοκυτταρικού εντοπισμού της NCL στον καρκίνο εξετάστηκε και με πειράματα ανοσοϊστοχημείας σε μικροσυστοιχείες ιστών, που περιελάμβαναν δείγματα από φυσιολογικούς εγκεφάλους, αστροκυτταρώματα βαθμού 2 και γλοιοβλαστώματα βαθμού 4. Αυξημένη έκφραση της α ν β 3 παρατηρήθηκε σε γλοιοβλαστώματα βαθμού 4, σε σύγκριση με αστροκυτταρώματα βαθμού 2 και δείγματα από φυσιολογικούς εγκεφάλους, σε συμφωνία με προηγούμενα δεδομένα που δείχνουν ότι η έκφραση της α ν β 3 είναι σημαντικά αυξημένη σε προχωρημένου σταδίου γλοιοβλαστώματα (Schnell et al, 2008). Η έκφραση της μεμβρανικής NCL βρέθηκε επίσης αυξημένη σε γλοιοβλαστώματα βαθμoύ 4 και σε όλες τις περιπτώσεις παρατηρήθηκε θετική συσχέτιση με την έκφραση της α ν β 3. Τα παραπάνω ενισχύουν περαιτέρω την ιδέα ότι η α ν β 3 αποτελεί μόριο κλειδί για τη ρύθμιση του ενδοκυτταρικού εντοπισμού της NCL. Πρόσφατα δείχθηκε ότι η φωσφορυλίωση της NCL από τις κινάσες CKII και PKC διαμεσολαβεί τη μετατόπιση της NCL από τον πυρήνα προς την κυτταρική μεμβράνη, μέσω ρύθμισης της αλληλεπίδρασης της τελευταίας με την HSC70 219

236 Συζήτηση (Ding et al, 2012). Μολονότι μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις της NCL και συγκεκριμένα η φωσφορυλίωση (Srivastava and Pollard, 1999; Barel et al, 2003; Garcia et al, 2011) και η γλυκοζυλίωσή της (Losfeld et al, 2009) έχουν αναφερθεί ότι ρυθμίζουν τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό της, οι εμπλεκόμενοι μηχανισμοί παραμένουν επί το πλείστον άγνωστοι. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής έγιναν προσπάθειες ανίχνευσης των επιπέδων φωσφορυλίωσης της NCL τόσο σε κύτταρα που καλλιεργήθηκαν παρουσία είτε απουσία ορού, όσο κι έπειτα από διέγερση με αυξητικούς παράγοντες ή ορό. Σε κάθε περίπτωση δεν κατέστη δυνατή η ανίχνευση φωσφορυλιωμένης NCL σε κατάλοιπα σερίνης/θρεονίνης ή τυροσίνης. Παρόλα αυτά διαπιστώθηκε πως η φωσφορυλίωση της υπομονάδας β 3 στην τυροσίνη 773 απαιτείται για το μεμβρανικό εντοπισμό της NCL. Δεδομένα υποστηρίζουν πως η α ν β 3 σχηματίζει λειτουργικό σύμπλοκο με την HSC70 σε λιπιδικές δομές της κυτταροπλασματικής μεμβράνης (lipid rafts) ευπαθών εντερικών επιθηλιακών κυττάρων, και τα δύο μόρια δρουν ως υποδοχείς για την είσοδο εντεροϊών (rotaviruses) (Guerrero et al, 2012). Συνεπώς, πιθανή υπόθεση αποτελεί ότι η α ν β 3 και η HSC70 συνεργάζονται για την ανακατανομή της NCL και στην περίπτωση αυτή, άμεση ή έμμεση φωσφορυλίωση της NCL από τις κινάσες CKII και PKC δυνητικά συμβάλλει σε αυτή τη διαδικασία. Είναι ενδιαφέρουσα η παρατήρηση ότι το συνθετικό πεπτίδιο PTN που αντιστοιχεί στo καρβοξυτελικό άκρο της PTN, ενώ επάγει τη διαμεσολαβούμενη από τον RPTPβ/ζ και την κινάση c-src φωσφορυλίωση της υπομονάδας β 3 στην τυροσίνη 773 σε παρόμοιο βαθμό με την ΡΤΝ (Mikelis et al, 2011), δε διεγείρει την αναδιανομή της NCL από τον πυρήνα προς την κυτταρική μεμβράνη, σε συμφωνία με την ανικανότητά του να διεγείρει την κυτταρική μετανάστευση (Mikelis et al, 2011). Τα δεδομένα αυτά υποστηρίζουν την ιδέα ότι η σηματοδότηση μέσω του RPTPβ/ζ είναι απαραίτητη, αλλά δεν επαρκεί για το μεμβρανικό εντοπισμό της NCL (παρούσα εργασία) ή την κυτταρική μετανάστευση (Mikelis et al, 2009; 2011). Ωστόσο, σε αντίθεση με την ανασταλτική δράση του πεπτιδίου PTN επί της επαγόμενης από PTN (Mikelis et al, 2011) κυτταρικής μετανάστευσης, το πεπτίδιο PTN δεν επηρέασε τη μεταβολή του ενδοκυτταρικού εντοπισμού της NCL από την PTN, πιθανά αναστέλλοντας ή αναιρώντας την ενεργοποίηση κάποιου σταδίου που λαμβάνει χώρα καθοδικά ή παράλληλα με τον εντοπισμό της NCL επί της κυτταρικής επιφάνειας. Το ενδεχόμενο ύπαρξης μιας παράλληλης οδού 220

237 Συζήτηση υποστηρίζεται επίσης από την παρατήρηση ότι το λειτουργικό αντίσωμα έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3 (LM609) δεν επηρέασε το μεμβρανικό εντοπισμό της NCL, παρόλο που ανέστειλε πλήρως την κυτταρική μετανάστευση που διεγείρεται από ΡΤΝ ή VEGF 165 (Mikelis et al, 2009). Καθοδικά της φωσφορυλίωσης της ιντεγκρίνης α ν β 3, η μετατόπιση της NCL από τον πυρήνα προς την κυτταρική μεμβράνη υπό την επίδραση PTN ή VEGF 165, διαμεσολαβείται από την ενεργοποίηση της κινάσης PI3K. Η κινάση PI3K έχει σημαντικούς ρόλους στην κυτταρική μετανάστευση (Cain and Ridley, 2009), στην αναδιαμόρφωση των ινιδίων της ακτίνης που επάγεται από αυξητικούς παράγοντες (Wennstrom et al, 1994) και ιντεγκρίνες (Mercurio and Rabinovitz, 2001), και συμμετέχει στην επαγόμενη από PTN μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων (Polykratis et al, 2005). Δεδομένου ότι η μετακίνηση της NCL μεταξύ πυρήνα και κυτταροπλάσματος ρυθμίζεται από τα επίπεδα φωσφορυλίωσής της σε κατάλοιπα σερίνης/θρεονίνης (Ginisty et al, 1999), μια πιθανότητα αποτελεί η άμεση φωσφορυλίωση της NCL από την PI3K. Εναλλακτικά, η κινάση PI3K οδηγεί στην έξοδο της NCL από τον πυρήνα προς την κυτταρική μεμβράνη μέσω δευτερογενούς ρύθμισης άλλων κινασών που φωσφορυλιώνουν τη NCL, είτε άλλων μορίων που αλληλεπιδρούν με αυτή. Για παράδειγμα, έχει δειχθεί ότι πρωτεΐνες που περιέχουν περιοχές ομολογίας πλεκστρίνης (pleckstrin homology domains) στρατολογούνται στην κυτταρική μεμβράνη μετά την ενεργοποίηση της ΡΙ3Κ, ως απόκριση σε διάφορους αυξητικούς παράγοντες (Lemmon and Ferguson, 2000). Μολονότι η NCL δε διαθέτει σχετικές αλληλουχίες, έχει προταθεί ως πιθανός προσδέτης για τέτοιες πρωτεΐνες μέσω του αμινοτελικού της άκρου (Burks et al, 1998). Από την άλλη πλευρά, γενετικές και φαρμακολογικές αναλύσεις έχουν δείξει ότι η κινάση ΡΙ3Κ εμπλέκεται στη ρύθμιση της διαδικασίας της ενδοκυττάρωσης ή/και εξωκυττάρωσης σε ευκαρυωτικά και κύτταρα ζύμης (Lindmo and Stenmark, 2006; Grant and Donaldson, 2009). Συγκεκριμένα, λειτουργική αναστολή της PI3K έχει δειχθεί πως διαταράσσει διαδικασίες όπως: α) σύντηξη επικαλυμμένων με κλαθρίνη κυστιδίων με πρώϊμα ενδοσώματα ή σύντηξη πρώϊμων ενδοσωμάτων μεταξύ τους (Jones and Clague, 1995; Li et al, 1995; Spiro et al, 1996; Christoforidis et al, 1999; Nielsen et al, 2000), β) μορφογένεση πολυκυστιδιακών σωματίων (multivesicular bodies, MVBs), τα οποία είναι απαραίτητα για τη δημιουργία εξωσωμάτων (exosomes) (Denzer et al, 2000), γ) κινητικότητα των 221

238 Συζήτηση ενδοσωμάτων βασισμένων επί του κυτταροσκελετού της ακτίνης (Nielsen et al, 1999), δ) ανακύκλωση πρωτεϊνών από τα πρώϊμα ενδοσώματα προς το σύμπλεγμα Golgi (Burda et al, 2002) ή προς την κυτταρική μεμβράνη, συμπεριλαμβανομένων των υποδοχέων τρανσφερίνης (Spiro et al, 1996) και της ιντεγκρίνης β 1 (Abe et al, 2009), ε) είσοδος πρωτεϊνών στο μονοπάτι της λυσοσσωμικής αποικοδόμησης (Reaves et al, 1996; Katzmann et al, 2002; Petiot et al, 2003), στ) αποκοκκίωση ιστιοκυττάρων και βασεόφιλων (Ito et al, 2002; Ali et al, 2004), ζ) προκαλούμενη από ινσουλίνη μεμβρανική μετατόπιση των μεταφορέων GLUT4 της γλυκόζης (Thong et al, 2005), και η) εξωκυττάρωση εκκριτικών κοκκίων νευρικών κυττάρων (Meunier et al, 2005). Οι κυτταροσκελετικές πρωτεΐνες πιθανώς παίζουν κάποιο ρόλο στις διαδικασίες αυτές και φαρμακολογική αναστολή της κινάσης PI3K έχει συσχετιστεί με διαταραχές πολικότητας και χημειοταξείας των κυττάρων, λόγω απορρύθμισης του κυτταροσκελετού της ακτίνης/μυοσίνης (Chung et al, 2001). Στην ίδια κατέυθυνση, η MyH9, μια μετακυλιόμενη πρωτεΐνη βασισμένη στην ακτίνη, χρησιμεύει ως φυσικός διασυνδέτης μεταξύ NCL και κυτταροσκελετού, ρυθμίζοντας έτσι τη μετατόπιση της NCL (Hovanessian et al, 2000; Huang et al, 2006; Ding et al, 2012). Με βάση τα παραπάνω, καθώς και του ρόλου της NCL ως πρωτεΐνης μεταφορέα μεταξύ πυρήνα/κυτταροπλάσματος και της συμμετοχής της σε γεγονότα ενδοκυττάρωσης πολλών προσδετών της (Kibbey et al, 1995; Said et al, 2002; Christian et al, 2003; Legrand et al, 2004; Tate et al, 2006; Shi et al, 2007; Di Segni et al, 2008; Reyes-Reyes and Akiyama, 2008), αλλά και ανίχνευσής της σε πρώϊμα ενδοσώματα (Legrand et al, 2004) και κυτταροπλασματικά κυστίδια που συγχωνεύονται με την κυτταρική μεμβράνη (Hovanessian et al, 2000), υπάρχει πιθανότητα η NCL να συμμετέχει στις δράσεις της κινάσης PI3K που αφορούν στις διαδικασίες ενδοκυττάρωσης και εξωκυττάρωσης, αν και το ενδεχόμενο αυτό δεν έχει διευρευνηθεί στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής. Η κινάση p38 συμμετέχει στην επαγόμενη από VEGF 165 κυτταρική μετανάστευση (McMullen et al, 2004; Umigai et al, 2012; Pin et al, 2012) και στη μετακίνηση της NCL προς την κυτταρική μεμβράνη που διεγείρεται από τον VEGF 165 (παρούσα διατριβή). Συμμετοχή της p38 στο μεμβρανικό εντοπισμό της NCL έχει αναφερθεί και όταν ως διεγέρτης χρησιμοποιείται η λαμινίνη-1 (Turck et al., 2006). Η ενεργοποίηση της p38 δεν επηρεάζεται από τη μείωση της έκφρασης του 222

239 Συζήτηση RPTPβ/ζ και από τη φωσφορυλίωση της υπομονάδας β 3 στις τυροσίνες 773 και 785, ενώ αναφορές δείχνουν να σχετίζεται με την NRP-1 (Kawamura et al, 2008; Robinson et al, 2009). Από την άλλη πλευρά, η PTN που επίσης αυξάνει το μεμβρανικό εντοπισμό της NCL μέσω της διαμεσολαβούμενης από τον RPTPβ/ζ φωσφορυλίωσης της υπομονάδας β 3 στην τυροσίνη 773, δεν ενεργοποιεί την κινάση p38. Από προηγούμενα αποτελέσματα της ερευνητικής μας ομάδας προκύπτει πως η ενεργοποίηση του άξονα σηματοδότησης RPTPβ/ζ/c-src/β 3 είναι απαραίτητη αλλά όχι μοναδική προϋπόθεση για την επαγόμενη από PTN κυτταρική μετανάστευση, καθώς τόσο η MK (Mikelis et al, 2009), όσο και το συνθετικό πεπτίδιο PTN (Mikelis et al, 2011) ενεργοποιούν τον RPTPβ/ζ και επάγουν τη φωσφορυλίωση της β 3 στον ίδιο βαθμό με την PTN, χωρίς όμως να διεγείρουν την κυτταρική μετανάστευση. Ακόμα όπως προαναφέρθηκε, επίδραση του πεπτιδίου PTN δεν σχετίζεται με την ενδοκυτταρική ανακατανομή της NCL (παρούσα διατριβή). Με βάση τα παραπάνω, η συμμετοχή και άλλων παραγόντων οι οποίοι πιθανά εμπλέκονται στη μετακίνηση της NCL προς την κυτταρική μεμβράνη και στην κυτταρική μετανάστευση που επάγονται από PTN, χρίζει περαιτέρω διερεύνησης. Δεδομένα δείχνουν πως οι κινάσες ERK½ ενεργοποιούνται από την α ν β 3 και συμμετέχουν στη διαμεσολαβούμενη από ιντεγκρίνες κυτταρική μετανάστευση (Eliceiri et al, 1998). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής, οι ERK½ δεν εμπλέκονται στην επαγόμενη από PTN ή VEGF 165 ανακατανομή της NCL, και μείωση της έκφρασης του RPTPβ/ζ δεν επηρεάζει την επαγόμενη από VEGF 165 ενεργοποίηση των ERK½ (Theodoropoulou and Papadimitriou, 2010). Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι οι ERK½ ενεργοποιούνται ανεξάρτητα από το μονοπάτι σηματοδότησης του RPTPβ/ζ και πιθανά βρίσκονται καθοδικά της μεταφοράς της NCL στην κυτταρική μεμβράνη. Παρόλο που υπάρχουν λίγα στοιχεία σχετικά με τη συμμετοχή της μεμβρανικής NCL στην ενεργοποίηση μονοπατιών μεταγωγής σήματος, έχει αποδειχθεί ότι η τελευταία προκαλεί ενισχυμένη σηματοδότηση μέσω της ενεργοποιημένης από μιτογόνα πρωτεϊνικής κινάσης ΜΑΡΚ (Inder et al, 2010). Αξιοσημείωτη είναι η παρατήρηση πως η NCL που εντοπίζεται στην κυτταρική επιφάνεια αλληλεπιδρά άμεσα με την ιντεγκρίνη α ν β 3 και τον υποδοχέα RPTPβ/ζ. Αυτό είναι σύμφωνο με την αντίληψη ότι η μεμβρανική NCL συμμετέχει στη δημιουργία λειτουργικών συμπλόκων με άλλους υποδοχείς, όπως στην 223

240 Συζήτηση περίπτωση των upar (Dumler et al, 1999) και ErbB υποδοχέων (Di Segni et al, 2008). Αλληλεπίδραση της NCL με την α ν β 3 έχει προηγουμένως παρατηρηθεί σε καρκινικά κύτταρα MDA-MB-231 και HeLa, με τη μέθοδο των ημιαγώγιμων κβαντικών τελείων συζευγμένων με βιομόρια. Ωστόσο, η παρατηρούμενη αλληλεπίδραση θεωρήθηκε ως ψευδώς θετικό αποτέλεσμα που οφείλεται στην εφαρμοζόμενη μεθοδολογία (Ko et al, 2009). Στην παρούσα διατριβή εξακριβώθηκε ο σχηματισμός συμπλόκων NCL-α ν β 3 και NCL-RPTPβ/ζ με τη χρήση πολλών διαφορετικών τεχνικών. Η ανίχνευση αλληλεπίδρασης της NCL με τη β 3 με τη μέθοδο της ανοσοκατακρήμνισης των ενδογενώς εκφραζόμενων μορίων, αλλά όχι έπειτα από υπερέκφραση GFP-συζευγμένων δομικών τμημάτων της NCL, υποδηλώνει πως η παρατηρούμενη αλληλεπίδραση ίσως να είναι έμμεση, μέσω της υπομονάδας α ν. Η ανίχνευση συμπλόκων NCL-β 3 με τη μέθοδο του PLA οφείλεται πιθανότατα στο γεγονός ότι η απόσταση των υπομονάδων α ν και β 3 είναι μικρότερη από 40 nm στο ετεροδιμερές. Επίσης, σε αυτό το σημείο αξίζει να αναφερθεί πως από πολλές διαφορετικές ερευνητικές ομάδες αλλά και στην παρούσα διατριβή, ανιχνεύεται η ύπαρξη πρωτεολυτικών τμημάτων της NCL, οι βιολογικές δράσεις των οποίων δεν έχουν διευκρινιστεί. Συγκεκριμένα, έχει διαπιστωθεί η πρωτεολυτική αποικοδόμηση της NCL προς παραγωγή πεπτιδίων μεγέθους 30, 50, 60 και 72 kda. Πιθανολογείται πως η αποικοδόμηση της αγρίου τύπου NCL λαμβάνει χώρα έπειτα από την φωσφορυλίωσή της από την κινάση CKII, αλληλεπίδρασή της με πολυαμίνες και ιστόνες, είτε λόγω αυτοαποικοδόμησής της ή αποικοδόμησης του μορίου από ενδογενείς πρωτεάσες (Warrener and Petryshyn, 1991; Chen et al, 1991; Suzuki et al, 1993; Fang and Yeh, 1993). Μια πιθανότητα για τη λειτουργική σημασία των προαναφερόμενων αλληλεπιδράσεων είναι η ενεργοποίηση κυτταρικών μονοπατιών σηματοδότησης από τη μεμβρανική NCL. Εκτός από την ενεργοποίηση των MAPKs (Inder et al, 2009), η NCL της κυτταρικής επιφάνειας έχει αποδειχθεί ότι αυξάνει τα κυτταροπλασματικά επίπεδα Ca 2+ (Losfeld et al, 2009) ή ενεργοποιεί την κινάση ΡΙ3Κ (Barel et al, 2003). Από την άλλη πλευρά, στοιχεία υποδηλώνουν ότι γεγονότα μεταγωγής σήματος που σχετίζονται με την κυτταρική μετανάστευση προϋποθέτουν την ενδοκυττάρωση προσδέματος/υποδοχέα (Sadowski et al, 2009). Eνδοκυττάρωση των VEGF 165 και VEGFR-2 απαιτείται για την αποκατάσταση των ενδοθηλιακών κυττάρων κατά την επούλωση τραύματος 224

241 Συζήτηση (Santos et al, 2007), ενώ χαμηλές συγκεντρώσεις PDGF επάγουν την κυτταρική μετανάστευση μέσω εξαρτώμενης από κλαθρίνη ενδοκυττάρωσης του PDGFR (De Donatis et al, 2008). Επιπλέον, οι λειτουργίες και η σηματοδότηση των ιντεγκρινών που οδηγεί σε κυτταρική μετανάστευση, ελέγχονται αυστηρά από την ενδοκυτταρική διακίνησή τους (Caswell and Norman, 2008). O καθορισμένος ρόλος της NCL στην εσωτερίκευση των προσδετών της και μεταφοράς τους στον πυρήνα των κυττάρων (Said et al, 2002; Christian et al, 2003; Legrand, et al, 2004; Shi et al, 2007), προτρέπει σε εικασίες ότι η NCL προκαλεί τη μετατόπιση της ΡΤΝ ή/και του υποδοχέα RPTPβ/ζ στο εσωτερικό των κυττάρων, προκαλώντας έτσι ή ενισχύοντας την κυτταρική σηματοδότηση. Η υπόθεση αυτή ενισχύεται από το γεγονός ότι τόσο η ΡΤΝ, όσο και ο υποδοχέας RPTPβ/ζ συνεντοπίζονται με τη NCL στον πυρήνα ενδοθηλιακών και κυττάρων γλοιβλαστώματος, ενώ μείωση της έκφρασης της NCL προκαλεί σημαντική μείωση του πυρηνικού εντοπισμού τους. Η λειτουργική σημασία αυτής της παρατήρησης βρίσκεται υπό περαιτέρω διερεύνηση. Από την άλλη πλευρά, η άμεση αλληλεπίδραση της NCL με τον VEGF 165 και τον VEGFR-2, δεν φαίνεται να συσχετίζεται με τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό τους. Με βάση την παρατήρηση ότι η NCL εντοπίζεται κατά προτίμηση στην επιφάνεια των κυττάρων που εκφράζουν α ν β 3, αξιολογήσαμε την αποτελεσματικότητα στρατηγικών που στοχεύουν τη μεμβρανική NCL συμπεριλαμβανομένων των πεπτιδίων 5(TASP)KPR, HB-19 και Nucant 6L, καθώς και του λειτουργικού αντισώματος έναντι της NCL (anti-c23), σε σχέση με την έκφραση της α ν β 3 σε πολλές διαφορετικές κυτταρικές σειρές. Τα προαναφερόμενα πειράματα πραγματοποιήθηκαν υπό την παρουσία ορού, ο οποίος αυξάνει τα επίπεδα της μεμβρανικής NCL σε κύτταρα που εκφράζουν α ν β 3. Σημαντική μείωση της κυτταρικής μετανάστευσης παρατηρήθηκε μόνο σε κύτταρα που εκφράζουν α ν β 3. Αυτό είναι σύμφωνο με δεδομένα που δείχνουν ότι πεπτίδια τα οποία δεσμεύονται στην καρβοξυτερματική περιοχή RGG της μεμβρανικής NCL, εξασκούν διαφορετικές ανασταλτικές επιδράσεις σε διαφορετικούς τύπους καρκινικών κυττάρων. Οι διαφορικές αυτές κυτταρικές αποκρίσεις έχουν αποδοθεί στα επίπεδα της NCL ή/και των διαφόρων προσδετών της επί της επιφάνειας των καρκινικών κυττάρων (Krust et al, 2011a), χωρίς όμως μέχρι σήμερα να υπάρχουν συγκεκριμένα αποτελέσματα που να αφορούν στην ταυτοποίηση μορίων που εμπλέκονται. Τα δεδομένα της παρούσας διατριβής δείχνουν σαφώς 225

242 Συζήτηση ότι η α ν β 3 θα μπορούσε να αποτελέσει βιοδείκτη για την πρόβλεψη της βιολογικής αποτελεσματικότητας των αναστολέων της μεμβρανικής NCL. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής δείχνουν ότι (Εικόνες Σ1 και Σ2): 1. Η NCL αλληλεπιδρά άμεσα με την PTN και τον RPTPβ/ζ, και εμπλέκεται στον πυρηνικό εντοπισμό τους. Στις αλληλεπιδράσεις αυτές φαίνεται να εμπλέκονται το κεντρικό και πιθανά το καρβοξυτελικό τμήμα της NCL και τα αμινοξέα της PTN. 2. Η NCL αλληλεπιδρά άμεσα με τον VEGF 165 και τον VEGFR-2, αλλά δεν εμπλέκεται στον ενδοκυτταρικό εντοπισμό τους. 3. Η μεμβρανική NCL εμπλέκεται στην επαγόμενη από ΡΤΝ κυτταρική μετανάστευση. 4. Μέσω αλληλεπίδρασης με τον RPTPβ/ζ, η ΡΤΝ και ο VEGF 165 επάγουν την ενεργοποίηση της κινάσης c-src, τη φωσφορυλίωση της τυροσίνης 773 της ιντεγκρίνης β 3 και τη μεταφορά της NCL στην κυτταρική μεμβράνη. Η ΡΤΝ και ο VEGF 165 φαίνεται να αλληλεπιδρούν με την ίδια θέση δέσμευσης στον RPTPβ/ζ. 5. Καθοδικά της α ν β 3, η ΡΙ3Κ διαμεσολαβεί τη μεταφορά της NCL στην κυτταρική μεμβράνη που επάγεται και από ΡΤΝ και από VEGF 165, ενώ η κινάση p38 εμπλέκεται μόνο στην ενεργοποίηση από VEGF 165 και η ενεργοποίησή της είναι ανεξάρτητη από τον RPTPβ/ζ και από τη φωσφορυλίωση της β 3 υπομονάδας στις θέσεις 773 και 785. Οι κινάσες ERK½ και JNKs δεν εμπλέκονται στη μεταφορά της NCL στην κυτταρική μεμβράνη σε καμία περίπτωση. 6. Η μεμβρανική NCL αλληλεπιδρά άμεσα με την α ν β 3 και ο συνεντοπισμός των δύο μορίων παρατηρείται τόσο σε καλλιέργειες κυττάρων in vitro, όσο και σε ιστούς από αστροκυτταρώματα διαφόρων σταδίων in vivo. 7. H έκφραση της ιντεγκρίνης α ν β 3 θα μπορούσε να αποτελέσει χρήσιμο βιοδείκτη για τη στόχευση της μεμβρανικής NCL, ως θεραπευτική στρατηγική κατά των γλοιοβλαστωμάτων ή/και άλλων εξαρτώμενων από την αγγειογένεση τύπων καρκίνου. 8. Το σηματοδοτικό μονοπάτι που ξεκινάει από τον RPTPβ/ζ είναι κοινό μεταξύ ΡΤΝ και VEGF 165, και έχει ρυθμιστικό ρόλο στις δράσεις του VEGF

243 Συζήτηση Τα αποτελέσματα αυτά αναμένεται να συμβάλλουν στην ανάπτυξη μορίων που στοχεύουν τόσο στις δράσεις της ΡΤΝ, όσο και σε αυτές του VEGF 165, ως εναλλακτικές ή συμπληρωματικές αντιαγγειογενετικές θεραπείες. Εικόνα Σ1: Σχηματική αναπαράσταση του προτεινόμενου μηχανισμού που οδηγεί στον εξαρτώμενο από α ν β 3 εντοπισμό της NCL στην κυτταρική μεμβράνη υπό την επίδραση ΡΤΝ. Η δέσμευση εξωγενούς ΡΤΝ στον υποδοχέα RPTPβ/ζ στην επιφάνεια ενδοθηλιακών ή καρκινικών κυττάρων, οδηγεί σε ενεργοποίηση της c-src, φωσφορυλίωση της υπομονάδας β 3 στην τυροσίνη 773 και φωσφορυλίωση της ΡΙ3Κ. H ενεργοποιημένη PI3K επάγει έμμεσα ή άμεσα τη μετατόπιση της NCL από τον πυρήνα προς την κυτταρική μεμβράνη. Η μεμβρανική NCL αλληλεπιδρά τόσο με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ, όσο και με την α ν β 3 και απαιτείται για την επαγόμενη από PTN κυτταρική μετανάστευση. 227

244 Συζήτηση Εικόνα Σ2: Σχηματική αναπαράσταση του προτεινόμενου μηχανισμού που οδηγεί στον εξαρτώμενο από α ν β 3 εντοπισμό της NCL στην κυτταρική μεμβράνη υπό την επίδραση VEGF 165. Η δέσμευση εξωγενούς VEGF 165 στον υποδοχέα RPTPβ/ζ στην επιφάνεια ενδοθηλιακών ή καρκινικών κυττάρων, οδηγεί σε ενεργοποίηση της κινάσης c-src, φωσφορυλίωση της υπομονάδας β 3 στην τυροσίνη 773 και φωσφορυλίωση της ΡΙ3Κ. Παράλληλα, παρατηρείται ενεργοποίηση της p38, πιθανά καθοδικά του μονοπατιού μεταγωγής σήματος της NRP-1, παρόλο που το σημείο αυτό χρίζει περαιτέρω διερεύνησης. Οι ενεργοποιημένες PI3K και p38, επάγουν έμμεσα ή άμεσα τη μετατόπιση της NCL από τον πυρήνα προς την κυτταρική μεμβράνη, η οποία απαιτείται για την επαγόμενη από PTN κυτταρική μετανάστευση. 228

245 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ

246

247 Παράρτημα Αποτελεσμάτων 1. Ανίχνευση προσδετών της α ν β 3 με φασματοσκοπία μάζας Πρωτεϊνικά εκχυλίσματα ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC, υποβλήθηκαν σε ανοσοκατακρήμνιση με αντίσωμα έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3 και αναγωγή μέσω προεπώασης με διθειοθρεϊτόλη. Έπειτα από SDS-PAGE ανάλυση, οι πρωτεΐνες έγιναν ορατές με χρώση αργύρου. Οι σχετικές ζώνες αποκόπηκαν και κατεργάστηκαν για πέψη. Για τον αποχρωματισμό του πηκτώματος χρησιμοποιήθηκε αντιδραστήριο Farmer s. Ακολούθησε επώαση ξηρών τεμαχίων του πηκτώματος με τρυψίνη (Porcine, modified, sequence grade, Promega, Madison, WI, USA). Μετά από ολονύκτια πέψη, τα πεπτίδια δεσμεύονται σε μια C18 μziptip και μετά από πλύσιμο, εκλούονται με ακετονιτρίλιο. Η λίστα μάζας παρήχθη με φασματομετρία μάζας MALDI-TOF σε ένα Ultraflex TOF/TOF από την Bruker Daltonics. Η ταυτοποίηση ακολουθιών πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της μηχανής αναζήτησης ProFound ( cgi / ProFound), σαρώνοντας την τρέχουσα έκδοση της βάσης δεδομένων NCBI. Όπως φαίνεται στον Πίνακα Π1, η NCL ταυτοποιήθηκε ως αλληλεπιδρώσα πρωτεΐνη της α ν β 3, με ελάχιστη επικάλυψη αλληλουχίας 19%. Το χαμηλό αυτό ποσοστό πιθανώς εξηγείται από την ιδιαίτερη πρωτεϊνική δομή της NCL, από την οποία προκύπτουν πολύ μικρά τμήματα προς ανάλυση (Lapeyre et al, 1986). Πίνακας Π1: Ταυτοποίηση της NCL (accession No: AAA59954) ως προσδέτης της α ν β 3 με MALDI-TOF ανάλυση. Μονοϊσοτοπικές αφόρτιστες μάζες περιλαμβάνονται στον παρακάτω πίνακα. Measured Mass Computed Mass Error (Da) Residues Start Residues To Missed Cut Peptide Sequence LELQGPR GIAYIEFK NDLAVVDVR SISLYYTGEK GFGFVDFNSEEDAK GYAFIEFASFEDAK KFGYVDFESAEDLEK VTQDELKEVFEDAAEIR GLSEDTTEETLKESFDGS VR EAMEDGEIDGNKVTLDW AKPK 231

248 Παράρτημα Αποτελεσμάτων 2. Συσχέτιση του μεμβρανικού εντοπισμού της NCL με την έκφραση της α ν β 3 σε μικροσυστοιχίες ιστών από ανθρώπινους όγκους εγκεφάλου Για την περαιτέρω επιβεβαίωση ότι η έκφραση της α ν β 3 αποτελεί προϋπόθεση για τον εντοπισμό της NCL στην κυτταρική επιφάνεια, πραγματοποιήθηκαν πειράματα ανοσοϊστοχημείας σε μικροσυστοιχίες ιστών προερχόμενων από ανθρώπινους όγκους εγκεφάλου (USBiomax Inc, Rockville, MD, USA). Οι συστοιχίες περιλαμβάνουν δείγματα από φυσιολογικούς εγκεφάλους, βαθμού 2 αστροκυτταρώματα και βαθμού 4 γλοιοβλαστώματα. Οι τομές αποπαραφινώθηκαν με ξυλόλιο και ακολούθησε κατεργασία με σειριακές αραιώσεις αιθανόλης (100%, 100%, 95% και 95%, 10 λεπτά κάθε φορά) και δύο πλυσίματα με διασαπεσταγμένο (double deionized, ddh 2 O). Η διαδικασία αποκάλυψης αντιγόνου (antigen unmasking) επιτεύχθηκε με βρασμό των αντικειμενοφόρων πλακών επί 10 λεπτά σε 10 mm κιτρικό νάτριο, PΗ: 6.0. Οι τομές ξεπλύθηκαν τρείς φορές με ddh 2 O, εμβαπτίστηκαν σε 3% Η 2 Ο 2 επί 20 λεπτά, πλύθηκαν δύο φορές με ddh 2 O και μία φορά με TBS-T (TBS, 0.1% Tween-20) και ακολούθησε κορεσμός των μη ειδικών θέσεων πρόσδεσης των αντισωμάτων (blocking) για 30 λεπτά με Image-iT FX signal enhancer (InVitrogen, Carlsbad, CA, USA). Οι τομές επωάστηκαν για 16 ώρες με τα αντισώματα mouse anti-cd51/cd61 και rabbit anti-ncl (Abcam, Cambridge, MA, USA), σε αραιώσεις 1:50 και 1:100 αντιστοίχως, σε διάλυμα αποκλεισμού (TBS-T, 5% φυσιολογικό ορό αίγας, Cell Signaling Technology, Inc Beverly, ΜΑ, USA). Μετά την επώαση με τα 1 α αντισώματα, οι τομές πλύθηκαν τρείς φορές με TBS-T και επωάστηκαν για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με τα αντίστοιχα φθορίζοντα 2 α αντισώματα Alexa, τα οποία αραιώνονται σε διάλυμα αποκλεισμού (σε τελικές συγκεντρώσεις 1 μg/ml). Τέλος, οι τομές πλύθηκαν τρείς φορές για 5 λεπτά με TBS-T και τοποθετήθηκαν σε Vectashield υλικό συγκόλλησης (Vector Labs, Burlingame, CA, USA). Εικόνες λήφθησαν με τις ίδιες ρυθμίσεις, με την κάμερα Nikon Digital Sight DS-Fi1, χρησιμοποιώντας το λογισμικό Metamorph για την ανάκτηση εικόνας. Σύμφωνα με προηγούμενες αναφορές, φαίνεται πως η έκφραση της α ν β 3 αυξάνεται σημαντικά σε προχωρημένου βαθμού γλοιοβλαστώματα (Schnell et al, 2008). Το πρότυπο εντοπισμού τόσο της NCL, όσο και της α ν β 3 φαίνεται να συμπίπτει σε όλες τις περιπτώσεις, αν και η ποικιλομορφία μεταξύ των δειγμάτων είναι εμφανής (Εικόνα Π1A). Η ανάλυση 232

249 Παράρτημα Αποτελεσμάτων συσχέτισης έντασης έδειξε αυξημένο συνεντοπισμό μεταξύ της NCL και της α ν β 3 σε αστροκυτταρώματα και ακόμα υψηλότερο συνεντοπισμό σε γλοιοβλαστώματα, σε σύγκριση με τους φυσιολογικούς εγκεφάλους (Εικόνα Π1B). 233

250 Παράρτημα Αποτελεσμάτων 234

251 Παράρτημα Αποτελεσμάτων 235