Τασσόπουλος Δημήτρης Βιολόγος

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ Μεταπτυχιακό δίπλωμα ειδίκευσης Παράγοντες που επηρεάζουν την αλληλεπίδραση αγγειογενετικών παραγόντων με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ Τασσόπουλος Δημήτρης Βιολόγος Πάτρα, 2015

2 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: Ευαγγελία Παπαδημητρίου, Καθηγήτρια του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, επιβλέπουσα Σταύρος Τοπούζης, Επίκουρος Καθηγητήςτου Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών Αχιλλέας Θεοχάρης, Αναπληρωτής Καθηγητής του Τμήματος Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών

3 Με πολύ αγάπη στην οικογένεια μου και στη Γιάννα Πρόλογος

4 Η εκπόνηση της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας διεξήχθη στο Εργαστήριο Μοριακής Φαρμακολογίας της Φαρμακευτικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών, στα πλαίσια των Μεταπτυχιακών μου Σπουδών, υπό την επίβλεψη της Καθηγήτριας κ. Ευαγγελίας Παπαδημητρίου. Ευχαριστώ θερμά την κ. Παπαδημητρίου που δέχτηκε να με συμπεριλάβει στην ομάδα της και μου έδωσε την ευκαιρία να ασχοληθώ με ένα αρκετά ενδιαφέρον θέμα αυτά τα τρία χρόνια που ήμουν στην ερευνητική της ομάδα. Η εμπειρία που απέκτησα κατά τη διάρκεια της ερευνητικής μου πορείας αποτελεί ένα σημαντικό εφόδιο για τη ζωή μου αλλά και για την μετέπειτα ερευνητική μου σταδιοδρομία. Ακόμα θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Επίκουρο Καθηγητή του Τμήματος Φαρμακευτικής κ. Σταύρο Τοπούζη για τη συμμετοχή του στην τριμελή εξεταστική επιτροπή καθώς και για τη συνολική βοήθειά του, τις εύστοχες συμβουλές και παρατηρήσεις του. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω και τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Αχιλλέα Θεοχάρη ο οποίος ως μέλος της τριμελούς επιτροπής συμμετείχε στη διόρθωση και στην εξέταση της συγκεκριμένης εργασίας. Θα ήταν μεγάλη μου παράληψη να μην ευχαριστήσω τις κ. Ποιμενίδη Εύη, κ. Κουτσιούμπα Μαρίνα και κ. Λάμπρου Μαργαρίτα οι οποίες μου μετέδωσαν τις γνώσεις και την ερευνητική τους εμπειρία με εξαιρετική υπομονή από την πρώτη στιγμή που βρέθηκα μαζί τους στον εργαστηριακό χώρο και επίσης για το ευχάριστο και φιλικό κλίμα που δημιούργησαν αλλά και την ηθική συμπαράσταση που μου προσέφεραν. Επιπλέον ευχαριστώ και όλα τα υπόλοιπα μέλη, παλιά και καινούργια, του εργαστηρίου με τα οποία συνεργάστηκα ή απλά μοιράστηκα τις ώρες μου στο εργαστήριο και ιδιαίτερα την κ.ιωάννα Λογγοβίτη με την οποία ξεκινήσαμε μαζί αυτό το ταξίδι. Τέλος, δεν ξεχνώ ότι αυτά που έχω πετύχει όλα αυτά τα χρόνια τα οφείλω στους γονείς μου αλλά και στα αδέρφια μου, με την υλική και ηθική συμπαράσταση αλλά και τα πρότυπα που μου παρείχαν και τους ευχαριστώ πολύ.

5

6 Ι. Εισαγωγή ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. Αγγειογένεση 1.1. Γενική θεώρηση Παράγοντες που επηρεάζουν την αγγειογένεση Αγγειογενετικοί αυξητικοί παράγοντες και υποδοχείς τους VEGF και VEGFRs FGF και FGFRs Ιντεγκρίνες Στάδια της αγγειογενετικής διαδικασίας Ενεργοποίηση ενδοθηλιακών κυττάρων Αποικοδόμηση εξωκυττάριας ύλης από πρωτεολυτικά ένζυμα Σχηματισμός αυλού και ωρίμανση του αγγείου Καρκίνος, αγγειογένεση και θεραπευτική αντιμετώπιση Πλειοτροπίνη (PTN) 2.1. Εισαγωγικά Δομή του γονιδίου και της πρωτεΐνης PTN, καθώς και ρύθμιση της έκφρασης της Βιολογικές δράσεις της PTN Ο ρόλος της PTN στην αγγειογένεση και τον καρκίνο Υποδοχείς της PTN και μεταγωγή σήματος RPTPβ/ζ ΑLK Ιντεγκρίνη α ν β 3. 39

7 Πρωτεογλυκάνες θειϊκής ηπαράνης Νουκλεολίνη...44 ΙΙ. Σκοπός..48 ΙΙΙ. Υλικά & Μέθοδοι 3.1. Ανακαλλιέργεια κυττάρων Θρεπτικά μέσα των χρησιμοποιούμενων κυττάρων Μέτρηση κυττάρων σε αιματοκυτταρόμετρο Neubauer Κατάψυξη κυττάρων Απόψυξη κυττάρων Απομόνωση πρωτεϊνών από καλλιέργειες ευκαρυωτικών κυττάρων Προσδιορισμός της συγκέντρωσης ολικών πρωτεϊνών σε διάλυμα (Μέθοδος Bradford) Ανοσοκατακρήμνιση Ανάλυση πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακριλαμιδίου με αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) Ανάλυση πρωτεϊνών κατά Western Διαδικασία αποδέσμευσης αντισώματος από PVDF μεμβράνη (stripping) Ποσοτικοποίηση ανοσοαποτυπωμάτων Ανάπτυξη βακτηριακών κυττάρων σε στερεή και υγρή καλλιέργεια Κατάψυξη βακτηριακών κυττάρων...74

8 3.15. Μετασχηματισμός δεκτικών βακτηριακών κυττάρων (transformation) Μικρής κλίμακας απομόνωση πλασμιδιακού DNA Προσδιορισμός της συγκέντρωσης DNA αλλά και της καθαρότητας του Μετασχηματισμός ευκαρυωτικών κυττάρων C Διαμόλυνση κυττάρων με παρεμβαλλόμενο RNA (sirna, RNAi) Μελέτη της μετανάστευσης των κυττάρων (Transwell Migration Assay) Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων..90 ΙV. Αποτελέσματα 4.1. Επιτυχής μείωση της έκφρασης του υποδοχέα RPTPβ/ζ σε κύτταρα C Μείωση της έκφρασης του υποδοχέα RPTPβ/ζ αναστέλλει την επαγόμενη από PTN μείωση της κυτταρικής μετανάστευσης των κυττάρων C Έλεγχος έκφρασης της ιντεγκρίνης α ν β 3 στα κύτταρα C Επιτυχής υπερέκφραση της υπομονάδας β 3 σε κύτταρα C Επίδραση της έκφρασης της υπομονάδας β 3 στον αριθμό και τη μετανάστευση κυττάρων C Η PTN επάγει τη μετανάστευση των κυττάρων C6 μετά από υπερέκφραση της υπομονάδας β Ο VEGF επάγει τη μετανάστευση των κυττάρων C6 ανεξάρτητα από την έκφραση της ιντεγκρίνης β

9 4.8. Η υπερέκφραση της υπομονάδας β 3 μειώνει την αλληλεπίδραση της PTN και του VEGF με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ σε κύτταρα C Η έκφραση της υπομονάδας β 3 στα κύτταρα CHO μειώνει την αλληλεπίδραση της PTN και του VEGF με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ Επίδραση της έκφρασης της υπομονάδας β 3 στην έκφραση των RPTPβ/ζ, PTN και VEGF 105 V. Συζήτηση 107 VI. Περίληψη..111 VII.Συντμήσεις.113 VIII. Βιβλιογραφία...116

10 Ι.Εισαγωγή

11 Εισαγωγή 1.ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ 1.1. Γενική θεώρηση Όλοι οι ιστοί χρειάζονται παροχή αίματος και γι αυτόν τον λόγο τα κύτταρα των θηλαστικών πρέπει να απέχουν το πολύ μm από τα γειτονικά αγγεία για να έχουν παροχή Ο 2. Η αγγειογένεση είναι η φυσιολογική διαδικασία η οποία περιλαμβάνει την ανάπτυξη νέων αιμοφόρων αγγείων. Ο σχηματισμός των αιμοφόρων αγγείων επιτυγχάνεται μέσω δύο διαδικασιών, της νεοαγγειογένεσης και της αγγειογένεσης, ανάλογα με το στάδιο ανάπτυξης του οργανισμού. Νέοαγγειογένεση είναι η δημιουργία αιμοφόρων αγγείων de novo από αγγειοβλάστες (αδιαφοροποίητα προγονικά κύτταρα μεσοδέρματος). Παρατηρείται κυρίως κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης, όμως λαμβάνει χώρα και σε ενήλικες (Drake 2003). Ο σχηματισμός αγγείων που προκύπτουν ως διακλαδώσεις προϋπαρχόντων αγγείων καλείται αγγειογένεση και αποτελεί μια πολυσταδιακή διαδικασία που περιλαμβάνει γεγονότα όπως αποικοδόμηση της εξωκυττάριας ύλης, πολλαπλασιασμό και μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων, ωρίμανση και σταθεροποίηση του νέου αγγείου με επιστράτευση περικυττάρων και λείων μυϊκών κυττάρων (Potente et al. 2011,Phng & Gerhardt 2009). Η αγγειογένεση είναι μία φυσική και ζωτικής σημασίας διαδικασία για την αύξηση και ανάπτυξη, καθώς επίσης και για την ίαση τραυμάτων. Παρόλα αυτά, είναι και ένα βασικό βήμα για τη μετάπτωση των όγκων από κατάσταση ηρεμίας σε μία κακοήθη κατάσταση. Εδώ και καιρό έχουν προσδιοριστεί μερικοί βασικοί παράγοντες που ελέγχουν την ανάπτυξη των αγγείων, και έχει αναπτυχθεί η θεωρία ότι σε φυσιολογικούς ιστούς, η αγγειακή ηρεμία διατηρείται από την κυρίαρχη επιρροή ενδογενών αναστολέων αγγειογένεσης, ενώ κατά την ανάπτυξη του όγκου προκαλείται αυξημένη έκκριση αγγειογενετικών παραγόντων, καθώς και μια προς τα κάτω ρύθμιση των αναστολέων αγγειογένεσης (αγγειογενετικός διακόπτης) (Detmar 2000). Σε αρκετές παθολογικές καταστάσεις, διαταράσσεται η ισορροπία ανάμεσα σε αγγειογενετικούς και αντιαγγειογενετικούς παράγοντες και επάγεται παθολογικά αυξημένη αγγειογένεση. Οι νόσοι που σχετίζονται με αυξημένη αγγειογένεση είναι αρκετές, όπως φλεγμονή, διαταραχές όρασης, οστεοαρθρίτιδα, 1

12 Εισαγωγή ρευματοειδής αρθρίτιδα, ψωρίαση κ.ά., με πιο γνωστή τον καρκίνο (Carmeliet 2004) Παράγοντες που επηρεάζουν την αγγειογένεση Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, η μεταβολή στην ισορροπία ανάμεσα στους επαγωγείς (προ-αγγειογενετικοί παράγοντες) και τους αναστολείς (αντιαγγειογενετικοί παράγοντες) της αγγειογένεσης που οδηγεί σε έναρξη ή σε διακοπή της αγγειογένεσης, ορίζεται ως αγγειογενετικός διακόπτης. Αυτοί οι προκαι αντι-αγγειογενετικοί παράγοντες εκκρίνονται από τα καρκινικά κύτταρα, καθώς και από κύτταρα του μικροπεριβάλλοντος του όγκου. Ορισμένοι από αυτούς τους ρυθμιστές αγγειογένεσης είναι σηματοδοτικές πρωτεΐνες που δεσμεύονται σε διεγερτικούς ή ανασταλτικούς υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας που υπάρχουν στα ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων (Vanessa Baeriswyl 2008). Το περιβαλλοντικό στρες που μπορεί να προκληθεί από καταστάσεις όπως η υποξία, η στέρηση γλυκόζης, ο σχηματισμός δραστικών μορφών οξυγόνου (reactive oxygen species, ROS), η κυτταρική οξέωση ή η έλλειψη σιδήρου μπορεί να επάξει την έκφραση των προ-αγγειογενετικών παραγόντων, ενώ αυτό μπορεί να συμβεί και από την ενεργοποίηση των ογκογονιδίων ή την απώλεια της λειτουργίας των ογκοκατασταλτικών γονιδίων (Hanahan & Weinberg 2011). Μια ποικιλία επαγωγέων της αγγειογένεσης έχουν περιγραφεί, οι οποίοι μπορούν να διαιρεθούν σε τρεις κατηγορίες. Η πρώτη κατηγορία αποτελείται από την οικογένεια του αυξητικού παράγοντα του αγγειακού ενδοθηλίου (vascular endothelial growth factor, VEGF) και τις αγγειοποιητίνες, τα οποία δρουν ειδικά στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Ο VEGF είναι ο πιο σημαντικός προ-αγγειογενετικός παράγοντας που επάγει την αγγειογένεση μετά από αλληλεπίδραση με τον διαμεμβρανικό υποδοχέα του που έχει δράση τυροσινικής κινάσης. Ο VEGF τύπου Α (VEGF-A) αποτελεί τον κύριο ρυθμιστή της φυσιολογικής και παθολογικής αγγειογένεσης. Η δεύτερη κατηγορία περιέχει μόρια με άμεση δράση, συμπεριλαμβανομένων αρκετών κυτταροκινών, χημειοκινών και αγγειογενετικών ενζύμων, που ενεργοποιούν ένα ευρύ φάσμα κυττάρων-στόχων εκτός από ενδοθηλιακά κύτταρα. Το κύριο μέλος αυτής της ομάδας, ο αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών (fibroblast growth factor, FGF) τύπου 2 (FGF-2), 2

13 Εισαγωγή ήταν ένα από τα πρώτα αγγειογενετικά πεπτίδια που περιγράφηκαν (Folkman & Shing 1992). Η τρίτη ομάδα των αγγειογενετικών μορίων περιλαμβάνει τους παράγοντες που έχουν έμμεση δράση, των οποίων η επίδραση επί της αγγειογένεσης γίνεται μέσω απελευθέρωσης από μακροφάγα, ενδοθηλιακά ή κύτταρα όγκου παραγόντων με άμεση δράση στην αγγειογένεση. Το πιο καλά μελετημένα τέτοια μόρια είναι ο νεκρωτικός παράγοντας όγκων α (tumor necrosis factor α, TNF-α) και ο αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού β (transforming growth factor β, ΤGF-β)(Liekens et al. 2001). Οι προαγγειογενετικοί αυξητικοί παράγοντες που αναφέρθηκαν παραπάνω, όπως ο FGF-2 και ο VEGF, καθώς και άλλοι, όπως ο αυξητικός παράγοντας των αιμοπεταλίων (platelet-derived growth factor, PDGF), η Μidkine (ΜΚ) και η πλειοτροπίνη (pleiotrophin, PTN) εμφανίζουν συγγένεια δέσμευσης με την ηπαρίνη. Από την άλλη τώρα σημαντικοί αρνητικοί ρυθμιστές της αγγειογένεσης είναι διάφορα συστατικά και πρωτεολυτικά θραύσματα της εξωκυττάριας ουσίας και της βασικής μεμβράνης. Για παράδειγμα, πρωτεολυτικά θραύσματα της θρομβοσπονδίνης-1, μιας γλυκοπρωτεΐνης της εξωκυττάριας ουσίας, έχουν ταυτοποιηθεί ως ισχυροί αναστολείς της αγγειογένεσης. Άλλοι αντι-αγγειογενετικοί παράγοντες που προέρχονται από την εξωκυττάρια ουσία είναι η ενδοστατίνη, η κανστατίνη και η τουμστατίνη που είναι θραύσματα κολλαγόνου, ενώ μια άλλη κατηγορία αναστολέων περιλαμβάνει διαλυτούς παράγοντες, όπως οι ιντερφερόνες -α και β, καθώς και η αγγειοστατίνη (Hanahan & Folkman 1996). Τέλος, ο παράγοντας που προέρχεται από το μελαχρό επιθήλιο (pigmented epithelium derived factor, PEDF) είναι ένας από τους πιο ισχυρούς ενδογενείς αντι-αγγειογενετικούς μεσολαβητές, που είναι σε θέση να αναστέλλει τη μιτογόνο συμπεριφορά των ενδοθηλιακών κυττάρων, καθώς και να επάγει την απόπτωση τους (Broadhead ML 2012).. 3

14 Εισαγωγή Εικόνα 1. Η υπόθεση ισορροπίας μεταξύ προ- και αντί- αγγειογενετικών παραγόντων. Τα αγγεία που φυσιολογικά βρίσκονται σε ηρεμία μπορεί να ενεργοποιηθούν και έτσι να αρχίσουν να δημιουργούνται νέα τριχοειδή αγγεία(αγγειογένεση), μια διαδικασία που ελέγχεται από ένα μηχανισμό αγγειογενετικού διακόπτη. Τα διαφορά δεδομένα δείχνουν ότι οι αλλαγές στην ισορροπία μεταξύ των επαγωγέων και αναστολέων της αγγειογένεσης μπορεί να ενεργοποιήσουν τον διακόπτη. Σε ορισμένους ιστούς, η απουσία επαγωγέων της αγγειογένεσης μπορεί να κρατήσει τον διακόπτη κλειστό, ενώ σε άλλους η αγγειογένετικοί επαγωγείς είναι παρόντες, αλλά διατηρούνται σε έλεγχο από τα υψηλότερα επίπεδα των αναστολέων αγγειογένεσης. Έτσι, είτε η μείωση της συγκέντρωσης του αναστολέα, π.χ., της TSP-1, με την απώλεια ενός ογκοκατασταλτικού γονιδίου ή η αύξηση των επιπέδων του επαγωγέα, π.χ., του VEGF, με την υποξία, μπορεί να αλλάξει την ισορροπία και να οδηγήσει σε άνοιγμα του διακόπτη, που οδηγεί στην ανάπτυξη νέων αιμοφόρων αγγείων. Πίνακας 1.Επαγωγείς αγγειογένεσης (Liekens et al. 2001) Επαγωγέας Δράση σε ενδοθηλιακά κύτταρα Πολλαπλασιασμός Μετανάστευση Διαφοροποίηση Αυξητικοί παράγοντες με συγγένεια για την ηπαρίνη VEGF PIGF FGF-1, FGF PTN Ephrins HIV-tat PDGF HGF/SF Αυξητικοί παράγοντες χωρίς συγγένεια για την ηπαρίνη TGF-α

15 Εισαγωγή. TGF-β Αναστολή - + EGF IGF-I Ρυθμιστές φλεγμονής TNF-α Αναστολή - + IL-8 + +? IL Προσταγλανδίνη E 1, E Ένζυμα PD-ECGF/TP - +? COX Αγγειογενίνη MMP's Ορμόνες Οιστρογόνα Προλιφερίνη? +? Σάκχαρα Τμήματα υαλουρονικού οξέως Παράγοντες αιμοποίησης EPO + + G-CSF + +? GM-CSF + +? Μόρια κυτταρικής προσκόλλησης VCAM-1 - +? Ε-σελεκτίνη Ιντεγκρίνες VE-καντχερίνη - +? Άλλα μόρια NO Αγγειοποιητίνη

16 Εισαγωγή Πίνακας 2.Αναστολείς της αγγειογένεσης (Liekens et al. 2001) Αναστολείς Αγγειοστατίνη(πλασμινογόνο) Ενδοστατίνη (κολλαγόνο XVIII) aaat (αντι-θρομβίνη III) Προλακτίνη (16 kda θραύσμα) TSP-1 Τροπονίνη I IFN-α IFN-γ PEDF IP-10 PF-4 IL-12 IL-4 VEGI TIMP-1, -2 PAI-1 Retinoic acid Ang-2 2-μεθοξυοιστραδιόλη p53 VHL Βιολογική δράση Πρωτεϊνικά θραύσματα πολλαπλασιασμός και απόπτωση EC πολλαπλασιασμός και απόπτωση EC πολλαπλασιασμός και απόπτωση EC πολλαπλασιασμός EC Διαλυτοί ρυθμιστές πολλαπλασιασμός και απόπτωση EC proliferation of EC's πολλαπλασιασμός και απόπτωση EC, επαγώμενης από FGF-2 αγγειογένεσης πολλαπλασιασμός EC και ΙΡ-10 μετανάστευσης EC και επαγώμενης από FGF-2 αγγειογένεσης πολλαπλασιασμός EC, επαγωγής κυτταρικής μετανάστευσης από FGF-2 and IL-8 πολλαπλασιασμός EC, επαγωγής κυτταρικής μετανάστευσης από FGF-2 and IL-8 INF-γ και ΙΡ-10 μετανάστευσης EC πολλαπλασιασμού EC δραστικότητας ΜΜΡs' upa δραστικότητας μετανάστευσης EC, ωρίμανσης των αγγείων, ανταγωνιστής της Ang-1 πολλαπλασιασμός, μετανάστευση και Ογκοκατασταλτικά γονίδια απόπτωση των EC TSP-1 παραγωγή, VEGF παραγωγή VEGF παραγωγή 6

17 Εισαγωγή 1.3 Αγγειογενετικοί αυξητικοί παράγοντες και υποδοχείς τους VEGF και VEGFRs Η οικογένεια VEGF αποτελείται από πέντε μέλη, όπου το κάθε μέλος είναι μια γλυκοπρωτεΐνη που εμφανίζει μια δομή ομοδιμερούς συνδεδεμένη με δισουλφιδικούς δεσμούς. Τα μέλη της οικογένειας είναι: ο VEGF-A, ο VEGF-Β, ο VEGF-C, ο VEGF-D, και ο αυξητικός παράγοντας του πλακούντα (placental growth factor, PlGF). Οι VEGFs κατά προτίμηση σχηματίζουν ομοδιμερή, παρότι έχουν εντοπιστεί ετεροδιμερή για τους VEGF-A και PlGF (DiSalvo et al. 1995). Τα γονίδια που κωδικοποιούν τους πέντε αυτούς αυξητικούς παράγοντες είναι τελείως ανεξάρτητα μεταξύ τους. Οι VEGF-Α, VEGF-B και ο PIGF υπάρχουν σε διαφορετικές ισομορφές, ενώ οι VEGF-C και VEGF-D αποκτούν την ώριμη μορφή τους μετά από πρωτεόλυση. Η έκφραση των γονιδίων των VEGF ρυθμίζεται από ποικίλα ερεθίσματα όπως η υποξία, αυξητικοί παράγοντες, μετάλλαξη του p53, τα οιστρογόνα, η θυρεοειδοτρόπος ορμόνη (TSH), οι καρκινικοί υποκινητές και το μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ). Τα μέλη της οικογένειας VEGF δεσμεύονται σε διαφορετικούς υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας με διαφορετική συγγένεια και εκλεκτικότητα. Οι VEGFRs αποτελούνται από τρεις υποτύπους, τον VEGFR-1, τον VEGFR- 2, και τον VEGFR-3, και εμφανίζουν δομικές ομοιότητες με τους υποδοχείς του PDGF. Και οι τρείς αυτοί υποδοχείς διαθέτουν στο εξωκυτταρικό τους τμήμα επτά περιοχές τύπου ανοσοσφαιρίνης, καθώς επίσης και μία περιοχή με δράση κινάσης τυροσίνης στο ενδοκυτταρικό μέρος. Οι VEGFR-1 και VEGFR-2 εκφράζονται σε αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα και αιμοποιητικά βλαστοκύτταρα, ενώ και ορισμένα καρκινικά κύτταρα εκφράζουν VEGFR-1 και VEGFR-2. Επίσης, ο VEGFR-1 εκφράζεται σε μονοκύτταρα και μακροφάγα. Αντίθετα, η έκφραση του VEGFR-3 περιορίζεται σε μεγάλο βαθμό στα λεμφικά ενδοθηλιακά κύτταρα. Ο VEGF-A ασκεί την αγγειογενετική του δράση μέσω των υποδοχέων του VEGFR-1 και VEGFR-2. Οι VEGF-C και D και ο υποδοχέας τους VEGFR-3 μπορεί να ρυθμίζουν την αγγειογένεση σε πρώιμα στάδια της εμβρυογένεσης, αλλά ως επί το πλείστον λειτουργούν ως κρίσιμοι ρυθμιστές της λεμφαγγειογένεσης (Shibuya 2011). Ο VEGF-A είναι το πιο σημαντικό μέλος αυτής τη οικογένειας αυξητικών 7

18 Εισαγωγή παραγόντων και γι αυτόν τον λόγο έχει καθιερωθεί να αναφέρεται ως VEGF. Ο VEGF είναι ένα 34- με 42-kDa εκκρινόμμενο ομοδιμερές και αποτελεί τον κύριο ρυθμιστή της ανάπτυξης του αγγειακού συστήματος, της αγγειογένεσης και της διαφοροποίησης των ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων (Carmeliet & De Almodovar 2013,Takahashi 2011). Μελέτες γονιδιακής στόχευσης αποκάλυψαν τη σημασία του VEGF στην ανάπτυξη του αγγειακού συστήματος, καθώς μετάλλαξη ενός μόνο αλληλομόρφου του γονιδίου του οδηγεί σε εμβρυϊκή θνησιμότητα (Liekens et al. 2001). Το γονίδιο του ανθρώπινου VEGF-Α αποτελείται από 8 εξόνια που χωρίζονται από 7 ιντρόνια και εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 6. Υπάρχουν πολλαπλές ισομορφές του VEGF-A που προκύπτουν από εναλλακτικό μάτισμα του 8 εξονίων mrna του VEGF γονιδίου. Αυτές ταξινομούνται σε δύο ομάδες, οι οποίες αναφέρονται σύμφωνα με τη θέση ματίσματος του τερματικού εξωνίου τους (εξώνιο 8) και είναι η πλησιέστερη θέση ματίσματος (συμβολίζεται VEGFxxx) ή η απομακρυσμένη θέση ματίσματος (VEGFxxxb). Οι VEGFxxx ισομορφές έχουν προαγγειογενετική δράση, ενώ οι VEGFxxxb έχουν αντιαγγειογενετική δράση (Catena et al. 2010). Εναλλακτικό μάτισμα των εξωνίων 6 και 7 οδηγεί στη δημιουργία διαφόρων ισομορφών (VEGF 121, VEGF 145, VEGF 165, VEGF 189 και VEGF 206 ), με τον VEGF 165 να είναι η επικρατούσα ισομορφή από την άποψη της ποσότητας και της βιολογικής δράσης. Οι ισομορφές στους ποντικούς είναι ένα αμινοξύ βραχύτερες από τις αντίστοιχες ανθρώπινες. Οι ισομορφές του VEGF διακρίνονται από την παρουσία ή την απουσία των πεπτιδίων που κωδικοποιούνται από τα εξόνια 6 και 7 του γονιδίου του, τα οποία μεσολαβούν στις αλληλεπιδράσεις με τις πρωτεογλυκάνες θειϊκής ηπαράνης και με τους συνυποδοχείς (π.χ. neuropillins), αυξάνοντας την ικανότητά τους να δεσμεύονται και να ενεργοποιούν τους VEGFRs. Η ισομορφή VEGF 121 δεν περιλαμβάνει τα πεπτίδια που κωδικοποιούνται από τα εξόνια 6 και 7. Oι ισομορφές VEGF 145 και VEGF 165 περιλαμβάνουν τα κωδικοποιημένα από το 6ο και 7ο εξόνιο πεπτίδια αντίστοιχα, ενώ η ισομορφή VEGF 189 περιλαμβάνει το κωδικοποιημένo τόσο από το 6ο όσο και από το 7ο εξόνιο πεπτίδιo (Takahashi & Shibuya 2005). Οι διαφορετικές ισομορφές του VEGF διαφέρουν και ως προς την ικανότητα πρόσδεσης στην ηπαρίνη. Ο VEGF 121 ο οποίος δε φέρει ικανότητα πρόσδεσης στην ηπαρίνη και ο VEGF 145 (Poltorak et al. 1997) ο οποίος δεσμεύεται στην ηπαρίνη εκκρίνονται στο θρεπτικό μέσο κυττάρων, ενώ οι άκρως βασικές μεγάλες ισομορφές VEGF 189 και VEGF 206 προσδένονται και παραμένουν προσκολλημένες 8

19 Εισαγωγή σε θειϊκές ηπαράνες της κυτταρικής επιφάνειας. Ο VEGF 165 φαίνεται να έχει ενδιάμεσες ιδιότητες, δηλαδή και εκκρίνεται στο θρεπτικό μέσο κυττάρων και παραμένει προσκολλημένος σε θειϊκές ηπαράνες της κυτταρικής επιφάνειας (Park et al. 1993). Ο VEGF-Α, όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως, ρυθμίζει τη λειτουργία των ενδοθηλιακών κυττάρων μέσω ενεργοποίησης δύο δομικά παρόμοιων υποδοχέων με δράση κινάσης τυροσίνης, τον VEGFR-1 γνωστό επίσης ως Fmslike tyrosine kinase-1 (Flt-1) και τον VEGFR-2, επίσης γνωστό ως fetal liver kinase-1 (Flk-1), οι οποίοι είναι ενεργοί κατά την αγγειογενετική διαδικασία. Επίσης ο VEGF έχει βρεθεί ότι συνδέεται και με μόρια όπως οι πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης (HSPGs) και οι neuropilins (NRP1 και NRP2) που λειτουργούν ως συν-υποδοχείς (Olsson et al. 2006). Από τα υπόλοιπα μέλη, ο VEGF-B συνδέεται με VEGFR-1 και NRP1, όλες οι ισομορφές του PIGF δεσμεύονται με VEGFR-1 (ΡΙGF-2 ισομορφή επίσης δεσμεύεται με τις NRP2 και NRP1), ενώ οι VEGF-C και VEGF-D αλληλεπιδρούν με τους VEGFR-3, VEGFR-2, NRP1 και NRP2. Οι κυτταρικής επιφάνειας γλυκοπρωτεΐνες NRP1 και NRP2 ταυτοποιήθηκαν αρχικά ως υποδοχείς για σεμαφορίνες. Αμφότερες όμως δρουν ως συν-υποδοχείς του VEGF χωρίς να έχουν δράση κινάσης τυροσίνης, απλά ενισχύοντας τη δέσμευση του VEGF με VEGFR-1 και 2 στην περίπτωση της NRP1 και του VEGF-C για τον VEGFR-3 στην περίπτωση της NRP2 (Blanco & Gerhardt 2013). Ο VEGF έχει υψηλότερη συγγένεια δέσμευσης με τον VEGFR-1 σε σχέση με τον VEGFR-2, ωστόσο η δράση του VEGFR-1 ως κινάση τυροσίνης είναι μικρότερη. Είναι γνωστό εδώ και καιρό ότι ο VEGFR-2 είναι ο υποδοχέας που είναι κατά κύριο λόγο υπεύθυνος για τις αποκρίσεις των αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων στον VEGF, στο πλαίσιο τόσο φυσιολογικών όσο και παθολογικών καταστάσεων. Πολλές μελέτες με ποντίκια νοκ-άουτ έχουν δείξει τη σημασία του VEGFR-2, όπως φυσικά και του προσδέτη του VEGF, στη σωστή ανάπτυξη του καρδιαγγειακού, αιμοποιητικού και λεμφικού συστήματος. Η απουσία του VEGFR-2 σε μοντέλο ποντικών οδηγεί σε θνησιμότητα των πρόδρομων αιμοποιητικών και αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων (Eichmann et al. 1997). Ενώ οι περισσότεροι από τους υποδοχείς με δράση κινάσης τυροσίνης προκαλούν την ενεργοποίηση των Ras ή PI3K μονοπατιών, η δέσμευση του VEGF στον VEGFR-2 ενεργοποιεί κατά κύριο λόγο το PLCγ-PKC-MAPK 9

20 Εισαγωγή μονοπάτι, το οποίο αποτελεί κρίσιμο σηματοδοτικό μονοπάτι για τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων (Shibuya 2011). Από την άλλη, η δράση του VEGFR-1 στην αγγειογένεση είναι διφορούμενη. Έχει βρεθεί ότι η απουσία του VEGFR-1 επιτρέπει ανάπτυξη των ενδοθηλιακών κυττάρων, αλλά τα έμβρυα πεθαίνουν στα μέσα περίπου της κύησης, λόγω του υπερβολικού πολλαπλασιασμού των ενδοθηλιακών κυττάρων και την απόφραξη των αγγείων. Αυτό συμβαίνει γιατί υπάρχει αυξημένη πρόσβαση του VEGF για σύνδεση και ενεργοποίηση του VEGFR-2, αφού ο έτερος προσδέτης απουσιάζει. Συμπεραίνεται λοιπόν ότι ο VEGFR-1 είναι απαραίτητο μόριο που συμμετέχει στη ρύθμιση της διαμεσολαβούμενης από τον VEGF αύξησης των αγγείων που απαιτείται για τον σχηματισμό άρτιων αιμοφόρων αγγείων, τόσο κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη αλλά και στην ενήλικη φάση (Kearney et al. 2002). Περαιτέρω μελέτες αποκάλυψαν ότι ο VEGFR-1 ρυθμίζει αρνητικά την αγγειογένεση, δρώντας ως παγίδα του VEGF, εμποδίζοντας έτσι την πρόσδεσή του στον VEGFR-2. Επίσης, έχει ταυτοποιηθεί μια φυσικώς απαντώμενη διαλυτή μορφή του VEGFR-1 (sflt-1), από την οποία λείπουν οι διαμεμβρανικές και κυτταροπλασματικές περιοχές σηματοδότησης, η οποία ασκεί ανασταλτικές επιδράσεις στην αγγειογένεση μέσω άμεσης πρόσδεσης με τον VEGF και τον PlGF ή/και μέσω ετεροδιμερισμού με τους VEGFRs (Maynard et al. 2003). Ωστόσο, υπάρχουν και αναφορές που δείχνουν ότι o VEGFR-1 μπορεί αντιθέτως να προωθήσει τη δράση του VEGFR-2, για παράδειγμα, κατά τη διάρκεια παθολογικών καταστάσεων. Η ενεργοποίηση του VEGFR-1 από τον ΡlGF οδηγεί σε αυξημένη φωσφορυλίωση του VEGFR-2, μέσω της εκτόπισης του VEGF που είναι δεσμευμένος στον VEGFR-1, καθιστώντας τον έτσι διαθέσιμο για τον VEGFR-2 (Carmeliet 2004). Επίσης υποστηρίζεται πως ενεργοποίηση του VEGFR-1 μέσω του VEGF που εκφράζεται από μονοκύτταρα και μακροφάγα, οδηγεί δευτερογενώς σε επαγωγή της καρκινικής αγγειογένεσης. Τα κύτταρα αυτά μεταναστεύουν στις φλεγμονώδεις περιοχές και παράγουν κυτταροκίνες που συμβάλλουν στην καρκινική αγγειογένεση (Murakami et al. 2008,Shibuya 2006). Άλλοι αυξητικοί παράγοντες με δράση στην αγγειογένεση φαίνεται ότι δρουν επηρεάζοντας την έκφραση ή τη δράση του VEGF ή των υποδοχέων του. 10

21 Εισαγωγή Εικόνα 2: Σχηματικό διάγραμμα που απεικονίζει τα μέλη της οικογένειας του VEGF και την ειδικότητα των μελών της οικογένειας του VEGF όσον αφορά στην πρόσδεσή τους στους υποδοχείς (Olsson et al. 2006) FGFs & FGFRs Οι FGFs συνιστούν µία από τις µεγαλύτερες οικογένειες πολυπεπτιδικών αυξητικών παραγόντων. Ο FGF βρέθηκε πρώτη φορά στα εκχυλίσματα υπόφυσης από την ομάδα της Armelin το 1973 (Armelin 1973) και στη συνέχεια, βρέθηκε σε εκχύλισμα από τον εγκέφαλο αγελάδας από την ομάδα του Gospodarowicz, και δοκιμάστηκε σε μία βιοδοκιμασία που προκάλεσε πολλαπλασιασμό των ινοβλαστών (Gospodarowicz 1974). Η οικογένεια των FGFs απαρτίζεται από τουλάχιστον 23 εκκρινόμενες γλυκοπρωτεΐνες, από τις οποίες μόνο οι 18 αποτελούν προσδέτες και μπορούν να ενεργοποιήσουν τους υποδοχείς τους. Όλοι οι FGFs είναι πρωτεΐνες μεγέθους 18 με 30 kda. Ο αυξητικός παράγοντας FGF-2, γνωστός και ως βασικός FGF (basic FGF, bfgf), ήταν μεταξύ των πρώτων αγγειογενετικών παραγόντων που ανακαλύφθηκαν και αποτελεί το πλέον µελετηµένο µέλος της οικογένειας των FGFs. Μετά την έκκριση ή/και απελευθέρωσή τους από τα κύτταρα, οι FGFs δεσµεύονται ισχυρά σε πρωτεογλυκάνες του εξωκυτταρικού υλικού. Η αλληλεπίδραση των FGFs µε το εξωκυτταρικό υλικό έχει ως αποτέλεσµα από τη µια µεριά την αύξηση του χρόνου ηµιζωής τους, από την άλλη µεριά την εξασθένιση της βιολογικής δραστικότητας. 11

22 Εισαγωγή Οι FGFs απελευθερώνονται από την εξωκυττάρια ουσία με τη βοήθεια ενζύμων όπως οι ηπαρινάσες, αλλά και της πρωτεΐνης δέσµευσης των FGF (FGFBP). Η ηπαρίνη και οι πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης παίζουν σηµαντικό ρόλο στη µεταγωγή σήµατος από τους FGFs, δεδοµένου ότι διευκολύνουν τον σχηµατισµό του συµπλόκου FGF/ FGFR (Beenken & Mohammadi 2009). Μέχρι σήµερα έχουν αποµονωθεί 4 διαφορετικοί τύποι υποδοχέων για τους συγκεκριµένους αυξητικούς παράγοντες (FGFR1-4) καθώς και ένας πρόσθετος υποδοχέας, ο FGFR5, ο οποίος όμως στερείται δραστικότητας κινάσης, αλλά είναι σε θέση να δεσμεύσει FGFs και μπορεί να δράσει ως αρνητικός ρυθμιστής της σηματοδότησης. Οι FGFRs αποτελούνται από µια εξωκυτταρική περιοχή δέσµευσης του προσδέτη, µια διαµεµβρανική και δύο κυτταροπλασµατικές περιοχές µε ενζυµική ενεργότητα κινάσης της τυροσίνης. Η περιοχή δέσµευσης του προσδέτη, αποτελείται από τρεις διαφορετικές περιοχές που έχουν δοµή παρόµοια µε αυτήν των ανοσοσφαιρινών (immunoglobulin like domains: IgI, IgII, IgIII) (Daniele et al. 2012). Οι υποδοχείς επιδεικνύουν μεγάλη εξειδίκευση όσον αφορά στη δέσμευση του προσδέτη, κάτι που μπορεί σε μεγάλο βαθμό να αποδοθεί στο εναλλακτικό μάτισμα του δεύτερου μισού του καρβοξυ-τελικού άκρου του IgIII τομέα των FGFRs 1, -2, και -3. Η αλλαγή αυτή στην ακολουθία έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό δύο ισομορφών από κάθε υποδοχέα: IIIb και IIIc. Οι ισομορφές IIIb σε μεγάλο βαθμό εκφράζονται από τους επιθηλιακούς ιστούς και οι ισομορφές IIIc από τους μεσεγχυματικούς ιστούς. Η δεύτερη και τρίτη Igπαρόμοια περιοχή (IgII,IgIII) των υποδοχέων είναι αναγκαία και επαρκής για τη δέσμευση του προσδέτη, ενώ η πρώτη Ig-παρόμοια περιοχή πιστεύεται ότι παίζει ρόλο στην αυτο-αναστολή του υποδοχέα. Ο FGFR4 υπάρχει ως μια μονή ισομορφή (Haugsten et al. 2010,Daniele et al. 2012). Οι FGFs επηρεάζουν µια πλειάδα κυτταρικών λειτουργιών, όπως ο πολλαπλασιασµός και η διαφοροποίηση κυττάρων µεσοδερµικής και νευροεξωδερµικής προελεύσεως. Οι ιδιότητες αυτές είναι καθοριστικής σηµασίας κατά την εµβρυϊκή ανάπτυξη, ρυθµίζοντας την οργανογένεση, ιδιαίτερα στο νευρικό σύστηµα, τα άκρα και τον προστάτη. Στον ενήλικα οργανισµό, οι FGFs παίζουν σηµαντικό ρόλο σε διαδικασίες όπως η επούλωση πληγών, η αιµατοποίηση, η αγγειογένεση και η ανάπτυξη φλεγµονής. Εκτός από την αγγειογενετική τους δράση, οι FGFs διεγείρουν τη µεταναστευτική και διεισδυτική 12

23 Εισαγωγή ικανότητα μιας ποικιλίας τύπων καρκινικών κυττάρων όπως του προστάτη, των νεφρών, του µαστού και του παγκρέατος. Το ευρύ φάσµα των βιολογικών φαινοµένων στα οποία εµπλέκονται οι FGFs αντικατοπτρίζει τη σημασία τους τόσο στη διαδικασία της καρκινογένεσης, όσο και στην ανάπτυξη αλλά και τη µεταστατική ικανότητα ενός καρκινικού όγκου (Lieu et al. 2011) Ιντεγκρίνες Οι ιντεγκρίνες είναι μια ομάδα υποδοχέων κυτταρικής προσκόλλησης που αποτελούνται από μη-ομοιοπολικά συνδεδεμένες υπομονάδες α(18) και β(8), οι οποίες μπορούν να ετεροδιμερίζονται σε περισσότερους από 20(24) συνδυασμούς. Οι ιντεγκρίνες μεσολαβούν στην κυτταρική προσκόλληση και άμεσα δεσμεύουν συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας, όπως φιμπρονεκτίνη, βιτρονεκτίνη, λαμινίνη και κολλαγόνο, παρέχοντας έτσι στήριξη για την κινητικότητα των κυττάρων και την εισβολή τους. Κάθε υπομονάδα ιντεγκρίνης αποτελείται από ένα εξωκυτταρικό τμήμα, μια ενιαία διαμεμβρανική περιοχή και μια σύντομη κυτταροπλασματική περιοχή. Κατά τη σύνδεση του προσδέτη στον υποδοχέα του, μια σειρά ενδοκυτταρικών γεγονότων σηματοδότησης ξεκινά. Η σύνδεση της ιντεγκρίνης με τον προσδέτη της προωθεί την ομαδοποίηση των ιντεγκρινών και επακόλουθη διαμεσολαβούμενη από την ιντεγκρίνη ενδοκυτταρική μεταγωγή σήματος. Αυτή η σηματοδότηση ιντεγκρίνης προωθεί τη μεταναστεύση, τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των ενδοθηλιακών και λεμφικών κυττάρων. Οι διεργασίες λοιπόν της κυτταρικής εισβολής, της κυτταρικής μετανάστευσης και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού δεν εξαρτώνται μόνο από τα αγγειογενετικά πρωτεολυτικά ένζυμα, τους αυξητικούς παράγοντες και τους υποδοχείς τους, αλλά προκαλούνται και από μόρια κυτταρικής προσκόλλησης. Οι ιντεγκρίνες μπορούν να μεσολαβούν στην κυτταρική προσκόλληση στα συστατικά της εξωκυττάριας ύλης καθώς και σε άλλα κύτταρα, αλλά και να κάνουν διαμεμβρανικές συνδέσεις με το κυτταροσκελετό και να ενεργοποιούν πολλά ενδοκυττάρια μονοπάτια σηματοδότησης. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα είναι κύτταρα που εξαρτώνται από την προσκόλληση τους. Οι ιντεγκρίνες διευκολύνουν τη σύνδεση τους στην εξωκυττάρια ουσία. Έτσι, η θετική ρύθμιση των ιντεγκρινών των ενδοθηλιακών κυττάρων από προ-αγγειογενετικούς παράγοντες συντηρεί τη 13

24 Εισαγωγή βιωσιμότητα των κυττάρων, αυξάνει την ευαισθησία των κυττάρων σε παράγοντες ανάπτυξης και απαιτείται για τη μετανάστευση. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα έχουν αναφερθεί να εκφράζουν έως και δέκα διαφορετικές ιντεγκρίνες α1β1, α2β1, α3β1, α4β1, α5ν1, α6β1, α6ν4, αvβ3, αvβ5, και αvβ8. Κατά τη διάρκεια της αγγειογένεσης, οι ιντεγκρίνες α1β1 και α6β4 είναι συχνά αρνητικά ρυθμίζόμενες, ενώ οι ιντεγκρίνες α5β1 και ανβ3 θετικά. Παθολογική αγγειογένεση συχνά συνδέεται με προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης ορισμένων ιντεγκρινών, συμπεριλαμβανομένου των ιντεγκρινών αvβ5, α5β1, α6β4 και αvβ3. Οι ιντεγκρίνες αv παίζουν σημαντικό ρόλο στην αγγειογένεση. Η ιντεγκρίνη αvβ3 εκφράζεται επιλεκτικά σε αναπτυσσόμενα αγγεία. Ειδικότερα σε in vivo μοντέλα αγγειογένεσης έχει βρεθεί ότι προκαλούμενη από bfgf αγγειογένεση εξαρτάται από την αvβ3 ιντεγκρίνη, ενώ αγγειογένεση που ξεκίνησε από τον VEGF εξαρτάται από την ανβ5. Η αvβ3 είναι σχεδόν μη ανιχνεύσιμη σε ήρεμο ενδοθήλιο, αλλά είναι ιδιαίτερα αυξημένα τα επίπεδα της κατά την προκαλούμενη από κυτταροκίνες ή από όγκο αγγειογένεση. Η ιντεγκρίνη ανβ3 συνεργάζεται με τον VEGF και τον VEGFR-2 για να ενισχύσει τη δραστηριότητα τους. Έχει δειχθεί πως η σηματοδότηση που ξεκινά από τον VEGFR-2 και επάγεται από τον VEGF ρυθμίζεται, τουλάχιστον μερικά, από την αλληλεπίδρασή του με την ανβ3, και εξαρτάται από τη φωσφορυλίωση των τυροσινών 773 και 785 της υπομονάδας β3. Πρόσφατα στοιχεία έχουν δείξει πως λειτουργικός αποκλεισμός τόσο της ανβ3 όσο και του VEGFR-2, αυξάνει την αποτελεσματικότητα αντι-αγγειογενετικών θεραπειών. Πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει ότι τα αντισώματα, τα πεπτίδια ή πεπτιδομιμητές που μπλοκάρουν τις λειτουργίες προσκόλλησης της ανβ3 ιντεγκρίνης είναι ικανά να αναστείλλουν την αγγειογένεση με επιτυχία σε μια ποικιλία ζωικών μοντέλων. Ωστόσο, σε φαινομενική διαφωνία με αυτό, γονιδιακή αφαίρεση της β3 και β3 / β5 οδήγησε σε αυξημένη αγγειογένεση εμφυτευμένων όγκων σε ποντικούς. Ακόμα, η ανάπτυξη του αγγειακού συστήματος φαίνεται να είναι ελαττωματική όταν η ανβ3 απουσιάζει, όπως αποδεικνύεται από μειωμένη ωρίμανση των στεφανιαίων τριχοειδών σε αρσενικά χωρίς-β3 ποντίκια. Τα αντίθετα αποτελέσματα μεταξύ της σίγασης του γονιδίου και των παράγοντων μπλοκαρίσματος της ιντεγκρίνης μπορούν να αναφέρουν ότι υπάρχει μια πληθώρα λειτουργιών για το συγκεκριμένο γονίδιο, μερικές από τις οποίες μπορεί να έχουν αντίθετες επιδράσεις σε μια πολύπλοκη βιολογική διεργασία, όπως την 14

25 Εισαγωγή αγγειογένεση (Payaningal R. Somanath 2012,Philippe Foubert 2012,Nguyen et al. 2014,Bendas & Borsig 2012) Στάδια της αγγειογενετικής διαδικασίας Όπως αναφέρθηκε και νωρίτερα, η αγγειογένεση είναι μια πολυσταδιακή διαδικασία. Για να ξεκινήσει η ακολουθία των γεγονότων της αγγειογένεσης και να λάβει χώρα μια σειρά από μορφολογικά και βιοχημικά γεγονότα που θα οδηγήσουν στο σχηματισμό νέων αγγείων, απαιτείται η εκλεκτική ενεργοποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων από ένα αγγειογενετικό ερέθισμα. Η αγγειογένεση με εκβλάστηση είναι η πιο ευρέως διερευνημένη μέθοδος σχηματισμού νέων αγγείων σε σχέση με άλλους μηχανισμούς που δεν είναι καλά κατανοητοί. Στη συνέχεια περιγράφονται τα στάδια της διαδικασίας αγγειογένεσης Ενεργοποίηση ενδοθηλιακών κυττάρων Η ενεργοποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων αφορά γεγονότα μέσω των οποίων ένα πλήρως διαφοροποιημένο κύτταρο, το οποίο δεν κινείται και δεν πολλαπλασιάζεται, αποκτά αγγειογενετικό φαινότυπο, δηλαδή την ικανότητα μετανάστευσης, διείσδυσης και πολλαπλασιασμού. Η κατασκευή ενός αγγειακού δικτύου απαιτεί διάφορα διαδοχικά βήματα συμπεριλαμβανομένου της απελευθέρωσης των πρωτεασών από "ενεργοποιημένα" ενδοθηλιακά κύτταρα με επακόλουθη αποδόμηση της βασικής μεμβράνης που περιβάλλει το υπάρχον αγγείο, τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων στον ενδιάμεσο χώρο, τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων, και τη διαφοροποίηση τους σε ώριμα αιμοφόρα αγγεία. Ο κυριότερος ρυθμιστής της ενεργοποίησης των ενδοθηλιακών κυττάρων φαίνεται να είναι ο VEGF, ο οποίος δρα ως αγγειογενετικός παράγοντας και ως παράγοντας αγγειακής διαπερατότητας. Όταν τα ενδοθηλιακά κύτταρα τελικά ενεργοποιηθούν από διάφορους παράγοντες ώστε να ξεκινήσει η διαδικασία της αγγειογένεσης, αποκτούν δύο διαφορετικούς φαινότυπους: γίνονται είτε ακραία κύτταρα (tip cells) είτε κύτταρα υποβάθρου (stalk cells). Τα ενδοθηλιακά κύτταρα που αποτελούν την αιχμή του δόρατος των νέο-σχηματιζόμενων αγγείων είναι γνωστά ως ενδοθηλιακά ακραία κύτταρα. Τα 15

26 Εισαγωγή ακραία κύτταρα χαρακτηρίζονται από τη θέση τους, τα μακριά και δυναμικά τους νηματοπόδια καθώς και από τη μεταναστευτική συμπεριφορά τους. Τα κύτταρα αυτά ακολουθούν ελκυστικά ή αποκρουστικά ερεθίσματα κατεύθυνσης που παρουσιάζονται από το περιβάλλον και ως εκ τούτου καθορίζουν τη διαδρομή στην οποία το νέο αγγείο θα αναπτυχθεί. Επιπλέον, τα ακραία κύτταρα, είναι απαραίτητα για τη δημιουργία νέων συνδέσεων μεταξύ των διαφόρων νεοσχηματιζόμενων αγγείων, ώστε να δημιουργηθεί ένα συνδεδεμένο και λειτουργικό αγγειακό δίκτυο. Μετά τα ακραία κύτταρα ακολουθούν τα ενδοθηλιακά κύτταρα υποβάθρου, τα οποία παράγουν λιγότερα νηματοπόδια, έχουν μεγαλύτερο ρυθμό πολλαπλασιασμού, σχηματίζουν προσκολλημένες και σφιχτές συνδέσεις για να εξασφαλιστεί η σταθερότητα των νέων τριχοειδών και σχηματίζουν τον εκκολαπτόμενο αγγειακό αυλό (Phng & Gerhardt 2009,Dejana et al. 2009). Επιπρόσθετα με τις μορφολογικές και λειτουργικές διαφορές, τα ακραία κύτταρα και τα κύτταρα υποβάθρου έχουν και διακριτά προφίλ γονιδιακής έκφρασης. Αρκετές πρόσφατες προσπάθειες μελέτης του μεταγραφικού προφίλ καθιέρωσαν έναν κατάλογο των γονιδίων που εκφράζονται στα ακραία κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων υποδοχέων κυτταρικής επιφάνειας, αυξητικών παραγόντων, υποδοχέων νευρωνικής καθοδήγησης, και πρωτεϊνασών αποδόμησης εξωκυττάριας ύλης. Μελέτες σε ποντίκια και zebrafish, όσον αφορά σε διαδικασίες εκβλάστησης και αγγειογένεση των όγκων, επεξηγούν ότι τα μονοπάτια σηματοδότησης των VEGF και Notch είναι θεμελιώδους σημασίας για τον φαινότυπο που θα αποκτήσουν τα ενδοθηλιακά κύτταρα κατά τη διάρκεια της αγγειογενετικής διαδικασίας, τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε παθολογικές συνθήκες (Blanco & Gerhardt 2013,Leslie et al. 2007) Αποικοδόμηση της εξωκυττάριας ύλης από πρωτεολυτικά ένζυμα Η εξωκυττάρια ύλη (extracellular matrix, ECM) παρέχει σημαντική βοήθεια στη διαδικασία της αγγειογένεσης μέσω της δομικής στήριξης που προσφέρει, αλλά και με την παροχή μοριακών σημάτων απαραίτητων σε όλα τα στάδια σχηματισμού των αγγείων του αίματος, συμπεριλαμβανομένου της αγγειακής 16

27 Εισαγωγή εκβλάστησης, του σχηματισμού του αυλού, της ωρίμανσης του αγγείου και τελικά της σταθεροποίησής του. Επιπλέον, η ECM παρέχει ένα σταθεροποιημένο ικρίωμα για κυτταροκίνες που είναι σημαντικές για την αγγειογένεση. Η ECM αποτελείται από βιοχημικά και δομικά διαφορετικά συστατικά, συμπεριλαμβανομένων του κολλαγόνου, της φιμπρονεκτίνης και πρωτεογλυκανών (Grainger & Putnam 2013). Φυσιολογικά στους ενήλικες, η σταθερή δομή των αγγείων αποτελείται από μία μονοστοιβάδα ενδοθηλιακών κυττάρων (κύτταρα φάλαγγας) τα οποία βρίσκονται σε ηρεμία και τα οποία συνδέονται μεταξύ τους με μορία σύνδεσης όπως οι VEκαντερίνες και οι κλαυδίνες, και από τον περιβάλλοντα στηρικτικό ιστό δηλαδή τη βασική μεμβράνη, τα περικύτταρα, και τον έξω χιτώνα. Η βασική μεμβράνη είναι μια τροποποιημένη μορφή ECM. Τα κύρια δομικά και λειτουργικά συστατικά που απαρτίζουν τη βασική μεμβράνη είναι το κολλαγόνο IV, η λαμινίνη, η εντακτίνη και η πρωτεογλυκάνη θειϊκής ηπαράνης περλεκάνη (Senger & Davis 2011). Η αποικοδόμηση της εξωκυττάριας ύλης και η αναδιαμόρφωση της είναι ένας σημαντικός ρυθμιστικός μηχανισμός κατά τη διάρκεια της αγγειογένεσης του όγκου, που επιτρέπει στα ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα να μεταναστεύσουν και στα καρκινικά κύτταρα να εισβάλουν σε περιβάλλοντες ιστούς. Η διαδικασία της αγγειογένεσης ξεκινά με τη διάσπαση του στηρικτικού ιστού όταν ένα αγγείο που βρίσκεται σε ηρεμία ερεθιστεί από ένα προαγγειογενετικό σήμα, όπως ο VEGF ή ο FGF που απελευθερώνονται από υποξικά ή κύτταρα όγκου. Περικύτταρα αποσπώνται από τα τοιχώματα των αγγείων και απελευθερώνονται από τη βασική μεμβράνη με πρωτεολυτική αποικοδόμηση, ενώ τα ενδοθηλιακά κύτταρα χαλαρώνουν τις συνδέσεις τους. Ως αποτέλεσμα, το αγγείο διαστέλλεται και λόγω της επαγόμενης από τον VEGF διαπερατότητας του ενδοθηλιακού στρώματος κυττάρων, πρωτεΐνες πλάσματος εξαγγειώνονται και σχηματίζουν ένα προσωρινό ικρίωμα. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα μεταναστεύουν επάνω σε αυτό το ικρίωμα σε ανταπόκριση σημάτων ιντεγκρίνης, ενώ περαιτέρω αποικοδόμηση της ECM απελευθερώνει έναν αριθμό αγγειογενετικών μορίων, όπως VEGF και FGF, που σχηματίζουν κλίση κατά μήκος της οποίας τα ενδοθηλιακά κύτταρα μεταναστεύουν (Potente et al. 2011, Carmeliet et al. 2011,Bishop 2015). Την αποικοδόμηση μορίων της ECM αναλαμβάνουν ένζυμα, όπως πρωτεϊνάσες σερίνης (ενεργοποιητές του 17

28 Εισαγωγή πλασμινογόνου (ΡΑ) και πλασμίνη), μεταλλοπρωτεϊνάσες του στρώματος (matrix metalloproteinases, MMPs), ηπαρινάσες, χυμάσες, τρυπτάσες, καθεψίνες και καλλικρεΐνες (Carmeliet 2004). Τα ενζυμικά συστήματα δρουν συντονισμένα προκειμένου να προωθήσουν την αγγειογένεση. Χώρια από τη δημιουργία ενός μονοπατιού για τα μεταναστευόμενα ενδοθηλιακά κύτταρα με την αποικοδόμηση των συστατικών της ECM, οι πρωτεϊνάσες μπορούν να ενεργοποιήσουν την αγγειογένεση απελευθερώνοντας δεσμευμένους στην ECM αγγειογενετικούς ενεργοποιητές (bfgf, VEGF, TGFβ, TNFα, HGF, κ.λπ.), καθώς και να προκαλέσουν την πρωτεολυτική ενεργοποίηση αγγειογενετικών χημειοκινών [π.χ. ιντερλευκίνη 1 (IL-1β)]. Τα επίπεδα έκφρασής τους είναι χαμηλά ή μη ανιχνεύσιμα στο ήρεμο ενδοθήλιο, αλλά τα ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα καρκινικά εκκρίνουν έναν αριθμό αυξητικών παραγόντων που μπορούν να επάγουν την έκφραση τέτοιων ενζύμων. Οι δύο κύριες κατηγορίες ενζύμων που έχουν μελετηθεί για τις ικανότητές τους να αποικοδομούν και να αναδιαμορφώνουν την ECM είναι: το σύστημα ΡΑ/πλασμίνης και οι MMPs(Campbell et al. 2010). Μέχρι σήμερα, ένας μεγάλος αριθμός των MMPs έχει βρεθεί ότι αποικοδομεί την εξωκυττάρια ύλη, ώστε να επιτραπεί η αγγειακή εκβλάστηση. Η δραστικότητα αυτών των πρωτεϊνασών ρυθμίζεται από ενδογενείς αναστολείς των μεταλλοπρωτεϊνασών (TIMPs), οι οποίοι γενικά έχουν αντιαγγειογενετικές ιδιότητες. Οι MMPs αλλά και η πλασμίνη υπάρχουν ως πρόδρομες ουσίες που είναι ενζυμικά αδρανείς μέχρι να μετατραπούν πρωτεολυτικά σε ώριμες πρωτεϊνάσες. Οι MMPs διαιρούνται σε υποομάδες βάσει της δομής τους και των ιδιαιτεροτήτων του υποστρώματος: ματριλυσίνες (ΜΜΡ-7 και ΜΜΡ-26), κολλαγενάσες (ΜΜΡ-1, ΜΜΡ-8, ΜΜΡ-13 και ΜΜΡ-18), στρομελυσίνες (ΜΜΡ-3, ΜΜΡ-10 και ΜΜΡ-11), ζελατινάσες (ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9), εναμελυσίνες (ΜΜΡ-20) και επιλυσίνες (MMP-28), ενώ υπάρχουν και άλλες που δεν ταιριάζουν σε μία από αυτές τις υποομάδες (ΜΜΡ-19, MMP-21,ΜΜΡ-22, ΜΜΡ-23 και ΜΜΡ-27). Οι MMPs στοχεύουν σε ένα ευρύ φάσμα πρωτεϊνών της ECΜ. Οι ΜΜΡ-3 και -10, για παράδειγμα, στοχεύουν στις πρωτεογλυκάνες, φιμπρονεκτίνη και λαμινίνη ενώ από την άλλη η ΜΜΡ-1 είναι πιο εκλεκτική για κολλαγόνο τύπου III και οι ΜΜΡs 8 και 13 στοχεύουν επιλεκτικά το κολλαγόνο Ι και II αντίστοιχα. Οι ΜΜΡs 2 και 9, αποικοδομούν τους τύπους κολλαγόνου IV, V, VII, και Χ, μετουσιωμένο 18

29 Εισαγωγή κολλαγόνο (ζελατίνη), αλλά και τις φιμπρονεκτίνη και λαμινίνη (Grainger & Putnam 2013). Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι τα μέλη της οικογένειας των ΜΜΡs ασκούν διαφορετικούς ρόλους κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου. Ειδικότερα, μπορούν να προωθήσουν και να αναστείλουν την ανάπτυξη του καρκίνου, επάγοντας ή αναστέλλοντας τη διαδικασία της αγγειογένεσης. Για παράδειγμα, η πρωτεολυτική αποικοδόμηση του κολλαγόνου IV, ένα από τα κύρια συστατικά της βασικής μεμβράνης, παράγει αντι-αγγειογενετικά θραύσματα που περιλαμβάνουν τις αρεστίνη, κανστατίνη, τουμστατίνη, και μεταστατίνη (Gialeli et al. 2011). Εκτός από τις ΜΜΡs που είναι δεσμευμένες στη μεμβράνη (MT-MMPs) και τις διαλυτές ΜΜΡs, οι ADAMs (δυσιντεγκρίνη μεταλλοπρωτεϊνάση) και ADAMTSs είναι δύο άλλες σημαντικές ομάδες πρωτεϊνών που επηρεάζουν την αναδιαμόρφωση της ECM. Όπως τα ονόματά τους δείχνουν, οι ADAMs και ADAMTSs είναι ομάδες πρωτεϊνασών μοιράζονται αρκετές δομικές περιοχές, συμπεριλαμβανομένης της προπεριοχής, της περιοχής δυσιντεγκρίνης που δεσμεύεται με ιντεγκρίνες και αποτρέπει αλληλεπιδράσεις κυττάρου-κυττάρου, και της περιοχής με δράση ΜΜΡ. Σε αντίθεση με την ομάδα ADAMs, ωστόσο, η ADAMTSs δεν έχει πλούσια σε κυστεΐνη περιοχή, ούτε μια περιοχή που μοιάζει με τον επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (epidermal growth factor, EGF), ή μια κυτταροπλασματική ουρά. Αντ' αυτού, οι ADAMTSs έχουν ένα μοτίβο τύπου θρομβοσπονδίνης-1 (Lu et al. 2011). Όσον αφορά στο σύστημα ΡΑ/πλασμίνης, η πρόδρομος μορφή της πλασμίνης είναι το πλασμινογόνο, το οποίο μπορεί να υποβληθεί σε επεξεργασία και να ενεργοποιηθεί από την καλλικρεΐνη του πλάσματος, τον ενεργοποιητή πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης (uρα), και τον ενεργοποιητή πλασμινογόνου ιστικού τύπου (tpa). Καταρχάς, αν και οι δύο ΡΑ βρίσκονται σε καρκινικά κύτταρα, μόνον ο uρα εμπλέκεται συχνά στη μετανάστευση, την αγγειογένεση, την εισβολή και τη μετάσταση του όγκου. Ο uρα είναι γενικά αυτός που συμμετέχει σε εκδηλώσεις αναδιαμόρφωσης των ιστών και λειτουργεί μαζί με τον υποδοχέα του uρα (upar). Σε αντίθεση, ο tpa εκφράζεται κατά κύριο λόγο στα ενδοθηλιακά κύτταρα και σχετίζεται με την πήξη του αίματος (Lu et al. 2011). Η πρωτεόλυση της ECM είναι μια ζωτικής σημασίας διαδικασία που προηγείται της μετανάστευσης καρκινικών κυττάρων, της εισβολής και της μετάστασης. Οι upar μαζί με άλλους ειδικούς υποδοχείς συσσωρεύουν πλασμινογόνο στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων. Όταν ο uρα 19

30 Εισαγωγή συνδέεται με τον upar, καταλύει την ενεργοποίηση του πλασμινογόνου σε πλασμίνη, σχηματίζοντας έτσι ένα αποτελεσματικό πρωτεολυτικό ένζυμο στην κυτταρική επιφάνεια. Παρά το γεγονός ότι η πλασμίνη είναι μία πρωτεϊνάση σερίνης, όπως ο uρα, έχει την ικανότητα να αποικοδομεί μυελίνη, λαμινίνες, κολλαγόνο τύπου IV, φιμπρονεκτίνη και περλεκάνη. Επιπλέον, η πλασμίνη διευκολύνει την αποικοδόμηση της ECM, ενεργοποιώντας MMPs που βρίσκονται σε «ηρεμία» και αυξητικούς παράγοντες (Ahmed H. Mekkawy et al. 2014). Εικόνα 3: Διαδικασία δημιουργίας νέου αγγείου. (Α) Η δημιουργία της εκβλάστησης ελέγχεται από την ισορροπία προ- και αντι-αγγειογενετικών παραγόντων. Σε περιπτώσεις που επάγεται η αγγειογένεση, τα ακραία ενδοθηλιακά κύτταρα (tip cells), επιλέγονται και μεταναστεύουν για εκβλάστηση, ενώ παράλληλα αποικοδομείται η γειτονική εξωκυττάρια ύλη. (Β) Ο προσανατολισμός της εκβλάστησης καθορίζεται από την αύξηση της συγκέντρωσης του VEGF και εξαρτάται από την εξωκυττάρια ύλη. Στη συνέχεια, επιστρατεύονται περικύτταρα, τα οποία συμμετέχουν στο σχηματισμό των αγγείων. (Γ) Όταν δύο ακραία κύτταρα «συναντηθούν», οι μεταξύ τους αλληλεπιδράσεις καθορίζουν το εάν θα συντηχθούν για να σχηματίσουν αυλό. Ο σχηματισμός του αυλού λαμβάνει χώρα στα υποκείμενα ενδοθηλιακά κύτταρα. (Δ) Η σύντηξη στα σημεία της σύνδεσης μεταξύ των ενδοθηλιακών κυττάρων συμβάλλει στη δημιουργία ενός συνεχούς αυλού. Η ροή του αίματος βελτιώνει τη μεταφορά οξυγόνου και έτσι μειώνει τα προαγγειογενετικά σήματα που επάγονται απότηνυποξία(adams&alitalo,2007). 20

31 Εισαγωγή Σχηματισμός του αυλού και ωρίμανση του αγγείου Αρκετά βήματα απαιτούνται για τη μετατροπή των ενδοθηλιακών εκβλαστήσεων σε λειτουργικά αγγεία, τα οποία μπορούν να μεταφέρουν αίμα. Για να επιτευχθεί η σύνδεση μεταξύ δύο αγγείων, πρέπει το ενδοθηλιακό ακραίο κύτταρο της κάθε εκβλάστησης να εντοπίσει και να αναγνωρίσει κάποιο άλλο ακραίο κύτταρο. Η προσκόλληση του κυττάρου αυτού με το αντίστοιχο ακραίο κύτταρο της γειτονικής εκβλάστησης επιτυγχάνεται με τη δημιουργία συνδέσεων προσκόλλησης και διακυτταρικής επικοινωνίας μεταξύ τους. Η δημιουργία αυλών και η ροή αίματος βοηθούν στη σταθεροποίηση του νέου αγγείου. Η επιστράτευση περικυττάρων, η προσκόλληση μορίων της ECM στη βασική μεμβράνη και η μείωση του πολλαπλασιασμού των ενδοθηλιακών κυττάρων, επίσης επάγουν την ωρίμανση του αγγείου. Και σε αυτό το στάδιο της αγγειογενετικής διαδικασίας, όπως και σε όλα τα προηγούμενα, η σχετική ισορροπία ανάμεσα στους προ- και αντιαγγειογενετικούς παράγοντες παίζει σημαντικό ρόλο για τη διατήρησή του νέου αγγείου, διαφορετικά το αγγείο καταστρέφεται μέσω απόπτωσης των ενδοθηλιακών κυττάρων (Adams & Alitalo 2007). 1.6 Καρκίνος,αγγειογένεση και θεραπευτική αντιμετώπιση Ο καρκίνος είναι αποτέλεσμα μιας σειράς μοριακών γεγονότων που ουσιαστικά μεταβάλλουν τις κανονικές ιδιότητες των κυττάρων. Για να θεωρηθεί ένα κύτταρο ότι έχει αποκτήσει καρκινικό φαινότυπο θα πρέπει να έχει εμφανίσει 6 χαρακτηριστικά γνωρίσματα τα οποία είναι: 1. Η διατήρηση ικανότητας πολλαπλασιασμού επ άπειρον 2. Η αποφυγή της καταστολής της ανάπτυξης 3. Η αντίσταση στην απόπτωση 4. Η ικανότητα αντιγραφής του DNA επ άπειρον 5. Η επαγωγή της αγγειογένεσης 6. Η ικανότητα διείσδυσης σε ιστούς και η ικανότητα μετάστασης. 21

32 Εισαγωγή Τα κύτταρα που αποκτούν αυτά τα χαρακτηριστικά δεν υπόκεινται σε έλεγχο από τον οργανισμό. Καθώς αυτά τα κύτταρα μεγαλώνουν, αναπτύσσουν νέα χαρακτηριστικά, συμπεριλαμβανομένων των μεταβολών στη δομή τους, τη μειωμένη ικανότητα προσκόλλησης και την παραγωγή νέων ενζύμων. Αυτές οι κληρονομικές αλλαγές επιτρέπουν στο κύτταρο και τους απογόνους του να διαιρούνται και να αυξάνονται, ακόμη και παρουσία φυσιολογικών κυττάρων που φυσιολογικά αναστέλλουν την ανάπτυξη των γειτονικών τους κυττάρων. Τέτοιες μεταβολές επιτρέπουν στα καρκινικά κύτταρα να εξαπλωθούν και να εισβάλουν σε άλλους ιστούς. Όσο αυτά τα κύτταρα παραμένουν στην αρχική τους θέση, θεωρούνται καλοήθεις όγκοι. Όταν όμως κάποια από τα κύτταρα του πρωτογενούς όγκου αρχίζουν να μεταναστεύουν και προκαλούν μεταστάσεις, τότε ο όγκος θεωρείται κακοήθης. Οι ανωμαλίες στα καρκινικά κύτταρα συνήθως προκύπτουν από μεταλλάξεις σε γονίδια. Αυτά τα δυσλειτουργικά γονίδια μπορούν γενικά να ταξινομηθούν σε τρεις ομάδες. Η πρώτη ομάδα, που ονομάζεται πρωτο-ογκογονίδια, κωδικοποιεί πρωτεΐνες που διεγείρουν την κυτταρική διαίρεση, εμποδίζουν τη διαφοροποίηση των κυττάρων και ρυθμίζουν τον προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (απόπτωση). Όλα αυτά είναι βασικές διαδικασίες που απαιτούνται για τη φυσιολογική ανάπτυξη και διατήρηση υγιών οργάνων και ιστών. Ωστόσο, μια μεταλλαγμένη ή ελαττωματική εκδοχή του πρωτο-ογκογονιδίου (ογκογονίδιο) αυξάνει την παραγωγή των πρωτεϊνών αυτών, οδηγώντας έτσι σε ανεξέλεγκτη κυτταρική διαίρεση, ένα βραδύτερο ρυθμό κυτταρικής διαφοροποίησης και σε αυξημένη αναστολή της απόπτωσης. Η δεύτερη ομάδα περιλαμβάνει τα όγκοκατασταλτικά γονίδια, τα οποία φυσιολογικά επιβραδύνουν την κυτταρική διαίρεση, επισκευάζουν τα λάθη του DNA, ή δίνουν εντολή στα κύτταρα πότε να πεθάνουν (απόπτωση). Όταν τα όγκο-κατασταλτικά γονίδια δε λειτουργούν σωστά λόγω μετάλλαξης, τα κύτταρα μπορούν να αναπτύσσονται ανεξέλεγκτα, κάτι που μπορεί να οδηγήσει σε καρκίνο. Τέλος, η τρίτη ομάδα περιλαμβάνει τα γονίδια επιδιόρθωσης του DNA, τα οποία βοηθούν στην πρόληψη μεταλλάξεων που οδηγούν σε καρκίνο (Hanahan & Weinberg 2011,Richard R.P. Warner 2012). Όπως συμβαίνει με τους φυσιολογικούς ιστούς, έτσι και οι όγκοι για να επιβιώσουν απαιτούν τροφή με τη μορφή θρεπτικών ουσιών, καθώς επίσης και οξυγόνο, ενώ είναι απαραίτητη και η δυνατότητα να απομακρύνουν μεταβολικά 22

33 Εισαγωγή απόβλητα και το διοξείδιο του άνθρακα. Ο επαγόμενος από τον όγκο σχηματισμός νέων αγγείων που πραγματοποιείται με τη διαδικασία της αγγειογένεσης, αντιμετωπίζει όλες αυτές τις ανάγκες. Κατά την αγγειογένεση, τα καρκινικά κύτταρα παράγουν αγγειογενετικές πρωτεΐνες σε υψηλά επίπεδα ή ενεργοποιούν αγγειογενετικές πρωτεΐνες που υπάρχουν σε γειτονικούς ιστούς, ενώ μπορεί και να ενεργοποιούν άλλα είδη κυττάρων, όπως τα μακροφάγα, ώστε να απελευθερώσουν αγγειογενετικές πρωτεΐνες. Επιπλέον, η αγγειογένεση παίζει σημαντικό ρόλο και στη μετάσταση του όγκου, καθώς αποτελεί μια οδό κυκλοφορίας για τα καρκινικά κύτταρα μέσα στον οργανισμό. Ορισμένα από τα κύτταρα του αρχικού όγκου εισέρχονται σε αγγεία του αίματος ή της λέμφου που βρίσκονται σε κοντινή απόσταση από τον όγκο και έτσι μετακινούνται στο εσωτερικό του οργανισμού ενώ στη συνέχεια, ακολουθεί διαφυγή των καρκινικών κυττάρων από τα αγγεία στο παρέγχυμα των απομακρυσμένων ιστών (εξαγγείωση), ο σχηματισμός μικρών οζιδίων (μικρομεταστάσεων) και τέλος, η μετατροπή των μικρομεταστάσεων αυτών σε μακροσκοπικούς όγκους (Hanahan & Weinberg 2011). Συνεπώς, γίνεται εύκολα κατανοητό ότι μέσω της αναστολής της αγγειογενετικής διαδικασίας, είναι δυνατόν να ανασταλεί η ανάπτυξη όγκων αλλά και η εμφάνιση μεταστάσεων, λόγω διακοπής της παροχής θρεπτικών ουσιών και καταστροφής της οδού κυκλοφορίας των καρκινικών κυττάρων. Οι πρώτοι επιστήμονες που μελέτησαν την αγγειογένεση εδώ και πάνω από έναν αιώνα παρατήρησαν ότι η ανάπτυξη των ανθρώπινων όγκων είναι συνοδευόμενη από αυξημένη αγγείωση. Το 1971 έγινε η πρώτη υπόθεση ότι η αναστολή της αγγειογένεσης είναι δυνατόν να αποτελέσει μια αποτελεσματική στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου στον άνθρωπο. Η έρευνα για τη θεραπεία όγκων με αντιαγγειογενετική θεραπεία έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη φαρμάκων που αξιοποιούνται αρκετά χρόνια από την κλινική ογκολογία. Με βάση τη λειτουργικότητα τους, τα αντι-αγγειογενετικά φάρμακα μπορούν να διαιρεθούν σε τρεις κύριες ομάδες (Chan et al. 2008): 1. Φάρμακα που αναστέλλουν την ανάπτυξη των ενδοθηλιακών κυττάρων π.χ. ενδοστατίνη και κομπρεταστατίνη Α4 προκαλούν απόπτωση ενδοθηλιακών κυττάρων. 2. Τα φάρμακα που αναστέλλουν την αγγειογενετική σηματοδότηση π.χ. αντι- VEGF μονοκλωνικά αντισώματα. 23

34 Εισαγωγή 3. Τα φάρμακα που μπλοκάρουν τη διάσπαση της ECM, π.χ. αναστολείς των MMPs. Δυο ωστόσο είναι οι γενικοί μηχανισμοί των αναστολέων της καρκινικής αγγειογένεσης που έχουν ήδη εγκριθεί από την Αμερικανική Υπηρεσία Τροφίμων και Χορήγησης Φαρμάκων (FDA): 1. Μονοκλωνικά αντισώματα που κατευθύνονται έναντι ειδικών προαγγειογενετικών παραγόντων ανάπτυξης ή / και των υποδοχέων τους (μπεβασιζουμάβη, κετουξιμάβη, πανιτουμουμάβη, τρανστουζουμάβη). 2. Μικρό-μοριακοί αναστολείς των υποδοχέων κινάσης τυροσίνης πολλαπλών προ-αγγειογενετικών αυξητικών παραγόντων (ερλοτινίμπη, σοραφενίμπη, σουνιτινίμπη, γεφιτινίμπη, λαπατινίμπη, παζοπανίμπη). Εκτός από αυτούς, οι αναστολείς mtor (ανάλογα της ραπαμυκίνης), οι αναστολείς πρωτεασώματος και η θαλιδομίδη έχουν επίσης αναφερθεί να αναστέλλουν έμμεσα την αγγειογένεση μέσω μηχανισμών που δεν είναι απόλυτα κατανοητοί (Kerbel & Folkman 2002,Chan et al. 2008,Samant & Shevde 2011,Zhou et al. 2010,Crawford et al. 2011). 2.PTN(pleiotrophin) 2.1. Γενική θεώρηση Η πλειοτροπίνη (PTN), είναι ένας εκκρινόμενος αυξητικός παράγοντας με μέγεθος 18kDa, ο οποίος φέρει ικανότητα δέσμευσης στην ηπαρίνη και λαμβάνει μέρος σε πολλές διαφορετικές διαδικασίες, όπως την κυτταρική ανάπτυξη και επιβίωση, την κυτταρική μετανάστευση, την αγγειογένεση και την ανάπτυξη νευριτών (Mikelis & Papadimitriou 2008). Η PTN απαντάται και με διάφορες άλλες ονομασίες, όπως μόριο που σχετίζεται με την ανάπτυξη και έχει την ικανότητα πρόσδεσης στην ηπαρίνη (heparin binding growth associated molecule, HB-GAM) (Hampton et al. 1992,Jussi Merenmies et al. 1990), ρυθμιστικό πεπτίδιο με ικανότητα πρόσδεσης στην ηπαρίνη (heparin affin regulatory peptide, HARP) (Laaroubi et al. 1995), αυξητικός παράγοντας με ικανότητα πρόσδεσης στην ηπαρίνη 8 (heparin-binding 24

35 Εισαγωγή growth factor-8)(peter G. Milner et al.1989), νευροτροφικός παράγοντας με σύνδεση στην ηπαρίνη (heparin-binding neurotrophic factor)(imre Kovesdi et al. 1990) και ειδικός παράγοντας των οστεοβλαστών (osteoblast-specific factor)(kenichi Tezuka et al. 1990), γεγονός που οφείλεται στο ότι η απομόνωση του μορίου αυτού έγινε συγχρόνως από διάφορες ομάδες και σε διαφορετικά είδη ιστών. H ΡΤΝ εμφανίζει πολύ μεγάλη ομολογία με την midkine (ΜΚ), με την οποία έχει 45-50% αμινοξική ομοιότητα, σχηματίζοντας μια οικογένεια αυξητικών παραγόντων. Είναι άκρως συντηρημένη μεταξύ των διαφόρων ειδών: περισσότερο από 90% ομοιότητα έχει παρατηρηθεί μεταξύ των αλληλουχιών στην όρνιθα (Hampton et al. 1992), στον αρουραίο, στο ποντίκι, στα βοοειδή και στον ανθρώπο (Jun-ichiro Tsutsui et al. 1993), ενώ ομόλογα της έχουν αναφερθεί επίσης σε ψάρια, βατράχια και έντομα (Englund et al. 2006). Η ΡΤΝ εκφράζεται σε νευροεξωδερμικούς και μεσοδερμικούς ιστούς κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης. Στο νευρικό σύστημα βρίσκεται στο φλοιό της παρεγκεφαλίδας, το μεσεγκέφαλο, τον ιππόκαμπο και τον νευρωνικό φλοιό, καθώς επίσης και στο περιφερικό νευρικό σύστημα. Εκτός από το νευρικό σύστημα, εκφράζεται επίσης στο μαστικό αδένα και στο μαστικό ιστό, στη μήτρα, στον προστάτη, στο πεπτικό και αναπνευστικό σύστημα, στα αισθητήρια όργανα, στους μύες στα αναπτυσσόμενα άκρα, και στο καρδιαγγειακό και σκελετικό σύστημα (Mikelis & Papadimitriou 2008). Αυξημένα επίπεδα της ΡΤΝ παρατηρούνται σε ανθρώπινους όγκους όπως του παγκρέατος, του προστάτη, του παχέος εντέρου, του μαστού, των ωοθηκών, των πνευμόνων, σε γλοιώματα, σε μηνιγγιώματα, σε νευροβλαστώματα, σε χοριοκαρκινώματα, αλλά και σε μελανώματα. Υψηλά επίπεδα του αυξητικού παράγοντα έχουν επίσης εντοπιστεί στον ορό του αίματος ασθενών με καρκίνο του μαστού, του παχέος εντέρου, του παγκρέατος,του πνεύμονα και σε πολλαπλό μυέλωμα (Papadimitriou et al. 2009). 25

36 Εισαγωγή 2.2. Δομή του γονιδίου και της πρωτεΐνης PTN καθώς και ρύθμιση της έκφρασης της Το γονίδιο της ανθρώπινης ΡΤΝ εντοπίζεται στη θέση 7q33-34 του εβδόμου χρωμοσώματος, ενώ τα γονίδια του ποντικού και του αρουραίου εντοπίζονται στα χρωμοσώματα 4 και 6 αντίστοιχα(li et al. 1992, Peter G. Milner et al. 1989). Το γονίδιο της ΡΤΝ στον άνθρωπο και στον ποντικό έχει περιγραφεί ως μοναδικό, μεγέθους 42 kb και οργανώνεται σε πέντε εξώνια και τέσσερα εσώνια κωδικοποιώντας ένα μετάγραφο μεγέθους 1650 βάσεων (Kretschmer PJ et al. 1993). Το πεπτίδιο-σινιάλο και τα πέντε πρώτα αμινοξέα του ώριμου μορίου κωδικοποιούνται στο εξώνιο 2, ενώ η πρωτεΐνη κατά κύριο λόγο στα εξώνια 3 και 4. Η 5 UTR αλληλουχία περιλαμβάνεται στο εξώνιο 1, καθώς και σε πρόσθετες περιοχές ανοδικά του 1 ου εξωνίου (Kretschmer PJ et al. 1993). Ωστόσο, έχει εντοπισθεί στον άνθρωπο και στον ποντικό και μια επιπλέον 5 UTR αλληλουχία (Sato et al. 1997) και φαίνεται να υπάρχει αναπτυξιακή ρύθμιση του γονιδίου μέσω δύο υποκινητών. Η ανάλυση της ρυθμιστικής περιοχής του γονιδίου της ΡΤΝ στον άνθρωπο έδειξε ότι δεν υπάρχει η περιοχή ΤΑΤΑ, αλλά η περιοχή CCAAT, 91 νουκλεοτίδια ανοδικά από το σημείο έναρξης της μεταγραφής(li et al. 1992). Έχουν ανιχνευθεί επίσης στοιχεία απόκρισης στον ορό, στο ρετινοϊκό οξύ (Shoupeng Lai et al. 1992) και αλληλουχίες για περιοχές πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων: τέσσερις πιθανές περιοχές για MyoD (myogenic factor D), δύο για AP-1 (Activator Protein-1)(Polytarchou et al. 2005), μία για GT1 και μια για τον HOXA5 (Homeobox A5) που ρυθμίζει την έκφραση της PTN και ο οποίος παίζει σημαντικό ρόλο σε διαδικασίες όπως η εμβρυογένεση, η αιματοποίηση και η καρκινογένεση(chen et al. 2005). Επίσης έχει προταθεί η ύπαρξη μιας αλληλουχίας δέσμευσης (GT1) του μεταγραφικού παράγοντα Sp1, με σημαντικό ρόλο στην έκφραση της PTN στα κύτταρα χοριοκαρκινώματος. Η 3 UTR περιέχει τρεις επαναλήψεις του μοτίβου ΑΤΤΤΑ, το οποίο εμπλέκεται στη σταθερότητα του mrna και αποτελεί χαρακτηριστικό της 3 UTR πολλών ογκογονιδίων(shoupeng Lai et al. 1992). Μολονότι η ΡΤΝ φαίνεται να έχει σημαντικές βιολογικές λειτουργίες, λίγα είναι ακόμη γνωστά για τη ρύθμιση της έκφρασής της. Αυξημένη έκφραση της PTN έχει παρατηρηθεί σε ασθένειες που σχετίζονται με αυξημένη αγγειογένεση, όπως η ρευματοειδής αρθρίτιδα (Pufe et al. 2003), η οστεοαρθρίτιδα (Pufe et al. 2007, Kaspiris et al., 2013), μετά από 26

37 Εισαγωγή τραυματισμό (Ezquerra et al. 2008) και στον καρκίνο (Papadimitriou et al. 2009). Παράγοντες που επάγουν την έκφραση του γονιδίου της PTN είναι ο FGF-2 (Hatziapostolou et al. 2005), ο PDGF(Antoine et al. 2005), η κυκλική μονοφωσφορική αδενοσίνη (cyclic adenosine monophosphate, c-amp)(mourlevat et al. 2005), η υποξία (Antoine et al. 2005), ο ορός (Poimenidi et al. 2009), το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Polytarchou et al. 2005), η ενδοθηλιακή συνθάση μονοξειδίου του αζώτου (endothelial nitric oxide synthase, enos) (Polytarchou et al. 2009), τα ανδρογόνα (Orr et al. 2011) και τα οιστρογόνα (Lee et al. 2012). Απώλεια του ογκοκατασταλτικού γονιδίου PTEN (Phosphatase and Tensin Homologue) οδηγεί σε αύξηση της έκφρασης της ΡΤΝ, η οποία διαμεσολαβείται από την 3 -κινάση της φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης (phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K) (Li et al. 2006). Ακόμα, έχει παρατηρηθεί σε καρκίνο του πνεύμονα πως υπερέκφραση της μενίνης οδηγεί σε μειωμένη μεταγραφή του γονιδίου της PTN (Feng et al. 2010). Όσον αφορά σε μεταγραφικούς παράγοντες, η έκφραση του γονιδίου της PTN επηρεάζεται άμεσα από τον HOXA5 (Chen et al. 2005), τον AP- 1 (Polytarchou et al. 2005), τον Sox10 (Lee et al. 2008) μετά από σύνδεση με τα αντίστοιχα στοιχεία απόκρισης στον υποκινητή της PTN. Πρόσφατα αναφέρθηκε πως ο μεταγραφικός παράγοντας SOX2 αλληλεπιδρά με τον υποκινητή της PTN και ενεργοποιεί άμεσα την έκφρασή της σε βλαστικά κύτταρα γλοιοβλαστώματος (Koyama-Nasu et al. 2013). Όσον αφορά τώρα στο πρωτεϊνικό επίπεδο, το μοριακό βάρος της PTN, όπως προσδιορίστηκε μετά από ανάλυση σε ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE, είναι 18 kda, κάτι όμως που δεν αντικατοπτρίζει την αμινοξική σύσταση του ώριμου μορίου, αφού μετά από ανάλυση με φασματοσκοπία μάζας, το μοριακό της βάρος προσδιορίστηκε στα 15,291 kda (Hampton et al. 1992). Αυτή η διαφορά οφείλεται στο γεγονός ότι το μόριο της πλειοτροπίνης είναι πλούσιο σε κατιονικά αμινοξέα, κυρίως λυσίνες, τα οποία είναι ομαδοποιημένα τόσο στο αμινοτελικό- όσο και στο καρβοξυτελικό- άκρο. Η πρωτοταγής πρωτεϊνική δομή της PTN αποτελείται από 168 αμινοξέα, τα πρώτα 32 από τα οποία αποτελούν το πεπτίδιο-σινιάλο, μετά από πέψη του οποίου προκύπτει η ώριμη πρωτεΐνη των 136 αμινοξέων. Η πέψη του πεπτιδίου-σινιάλου μπορεί να πραγματοποιηθεί στις θέσεις -1 και -3 της πρόδρομης πρωτεΐνης (Jussi Merenmies et al. 1990). Εκτός από την πρωτεΐνη των 136 αμινοξέων εργαστηριακά αποτελέσματα έχουν αναδείξει και μια δεύτερη 27

38 Εισαγωγή περιοχή κοπής του πεπτιδίου-σινιάλο που οδηγεί σε μια ισομορφή που έχει 3 αμινοξέα παραπάνω (139) στο αμινοτελικό άκρο (Bernard-Pierrot et al. 2001). Η ώριμη πρωτεΐνη περιέχει επίσης και 10 υψηλά συντηρημένες κυστεΐνες, οι οποίες δημιουργούν πέντε δισουλφιδικούς δεσμούς: Cys15- Cys44, Cys23- Cys53, Cys30- Cys57, Cys67-Cys 99 και Cys77-Cys109 (J.D. Hulmes et al. 1993), καθώς και 3 πιθανές αλληλουχίες πυρηνικής στόχευσης K-R/K-X-R/K. Η PTN δεν περιέχει πιθανές θέσεις για Ν-γλυκοζυλίωση ή για άλλες μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, και η σύνδεσή της με την ηπαρίνη διαμεσολαβείται από τις δύο κεντρικές περιοχές που είναι ομόλογες με αλληλουχίες θρομβοσπονδίνης τύπου 1 (TSR-1) (Kilpeläinen et al. 2000). Πιο πρόσφατα δεδομένα δείχνουν πως η καρβοξυτελική αλληλουχία TSR1 της ΡΤΝ ευθύνεται για πρόσδεση στην ηπαρίνη (Ori et al. 2009). Μέχρι σήμερα δεν έχει διασαφηνιστεί η τρισδιάστατη διαμόρφωση του μορίου της ΡΤΝ και υπάρχουν πολύ λίγα δεδομένα. Ωστόσο, μελέτες με NMR έδειξαν ότι η ανασυνδυασμένη ΡΤΝ που παράχθηκε τόσο σε κύτταρα εντόμων, όσο και σε βακτήρια E.coli, αποτελείται από δύο κεντρικές περιοχές, μία προς το αμινοτελικό και μια προς το καρβοξυτελικό άκρο του μορίου, οι οποίες συνδέονται μεταξύ τους με έναν ελαστικό σύνδεσμο. Κάθε κεντρική περιοχή περιέχει τρεις αντιπαράλληλες β-πτυχώσεις, που αντιστοιχούν στα αμινοξέα 18-27, 32-39, 48-57, 70-78, και Το αμινοτελικό και καρβοξυτελικό άκρο του μορίου που είναι πλούσια σε λυσίνες, δεν έχουν μια συγκεκριμένη διαμόρφωση, αλλά σχηματίζουν τυχαίες περιελίξεις (Kilpeläinen et al. 2000). Μελέτες φασματοσκοπίας NMR έδειξαν ότι το καρβοξυτελικό άκρο της PTN, αποτελούμενο από τα αμινοξέα , χαρακτηρίζεται από ευελιξία ως προς τη δομή του σε θερμοκρασία δωματίου, ενώ το βιολογικώς δραστικό πεπτιδικό τμήμα αποτελούμενο από τα αμινοξέα φέρει μια καθορισμένη δομή σε χαμηλότερη θερμοκρασία(mikelis et al. 2011) Βιολογικές δράσεις της PTN Η PTN χαρακτηρίζεται ως πλειοτροπικό μόριο, διαδραματίζοντας σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση πολλών ειδών κυττάρων, στη διαδικασία της μίτωσης, της αγγειογένεσης και της καρκινογένεσης. Η ΡΤΝ απομονώθηκε αρχικά από 28

39 Εισαγωγή εγκέφαλο νεογέννητου αρουραίου, ως μόριο που επάγει την προέκταση νευριτών (Rauvala 1989).Στη συνέχεια όμως αποδείχτηκε και ο σημαντικός της ρόλος στην ανάπτυξη και ωρίμανση του εγκεφάλου. Η PTN έχει ικανότητα ρύθμισης της κυτταρικής κινητικότητας νευρώνων (Rauvala et al. 2000), ενώ μπορεί να τροποποιεί την πλαστικότητα των συνάψεων (Amet et al. 2001) και να συμμετέχει στη μορφογένεση των συνάψεων των κυττάρων Purkinje στην αναπτυσσόμενη παρεγκεφαλίδα (Tanaka et al. 2003). Επίσης, πρόσφατες μελέτες υποδεικνύουν ότι ο αυξητικός αυτός παράγοντας καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των πολυδύναμων κυττάρων του μετωπιαίου φλοιού, αντισταθμίζοντας τη μιτογόνο δράση του FGF-2 (Hienola et al. 2004). Επιπλέον, η PTN διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη της μνήμης, καθώς ρυθμίζει το κατωφλιαίο επίπεδο της μακροχρόνιας ρύθμισης (long-term Potentiation, LTP) των νευρώνων της C1 περιοχής του ιπποκάμπου (González-Castillo et al. 2015). Ποντίκια στα οποία έχει απαλειφθεί το γονίδιο της PTN εμφανίζουν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα LTP, φαινόμενο το οποίο αντιστρέφεται μετά τη χορήγηση εξωγενούς PTN (Amet et al. 2001). Επαγωγή της έκφρασης της PTN παρατηρείται σε νευροεκφυλιστικές νόσους, όπως τα σύνδρομα Alzheimer και Down και έχει προταθεί και ως δείκτης νευρωνικής βλάβης (Wisniewski et al. 1996). Επίσης, υπερεκφράζεται στη νόσο του Parkinson (Ferrario et al. 2008), φέρει προστατευτικές δράσεις σε ντοπαμινεργικούς νευρώνες in vitro και in vivo (Taravini et al. 2011) και φαίνεται να ρυθμίζει την επαγόμενη από μορφίνη αναλγησία σε επίμυες και τη νευροτοξικότητα λόγω λήψης αμφεταμίνης (Gramage & Herradon 2010). Η PTN εκφράζεται σε διάφορους τύπους κυττάρων, όπως επιθηλιακά, ενδοθηλιακά, ινοβλάστες και κερατινοκύτταρα ενώ εκφράζεται και σε πρόδρομα κύτταρα οστού και χόνδρου (Vanderwinden et al. 1992). Η PTN συμμετέχει στο σχηματισμό των οστών, προάγοντας την προσκόλληση, τη μετανάστευση και τη διαφοροποίηση των πρόδρομων οστικών κυττάρων (Yasuko Sato et al. 2002), στοιχείο που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανάπτυξη θεραπείας για σκελετικές επιδιορθώσεις (Yang et al. 2003). Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός πως επίμυες που υπερεκφράζουν ΡΤΝ τείνουν να έχουν αυξημένη οστική ανάπτυξη (Tare et al. 2002). Ακόμα η πρωτεΐνη αυτή παίζει σημαντικό ρόλο και στο ουρογεννητικό σύστημα, ενώ έχει την ικανότητα να ρυθμίζει τη φυσιολογία της σπερματογένεσης, αφού 29

40 Εισαγωγή καταστολή της έκφρασής της μπορεί να οδηγήσει σε στειρότητα. Όταν εμβρυικά κύτταρα ποντικών διαμολύνθηκαν με ανενεργές μορφές του μορίου, αναπτύχθηκαν μη γόνιμα άτομα. Επιπλέον, έφεραν ατροφικούς όρχεις, ενώ τα παραγόμενα σπερματοζωάρια παρουσίαζαν μεγάλο ποσοστό απόπτωσης σε όλα τα στάδια της διαφοροποίησής τους (Zhang et al. 1999). Το mrna της PTN εκφράζεται στα λεία μυϊκά κύτταρα και στα κύτταρα του μυοκαρδίου(chen et al. 2004), και αυξάνεται στην καρδιακή ανεπάρκεια(asakura & Kitakaze 2009) Ο ρόλος της PΤΝ στην αγγειογένεση και στον καρκίνο Η ανοσοϊστοχημική ανίχνευση και απομόνωση της PTN από ιστούς με υψηλή αγγείωση υπέδειξε έναν πιθανό φυσιολογικό ρόλο της στην αγγειογένεση. Πληθώρα αναφορών δείχνουν μια θετική συσχέτιση ανάμεσα στην PTN και στην in vivo και in vitro αγγειογένεση (Mikelis & Papadimitriou 2008). Ο ρόλος της PTN στη φυσιολογική αγγειογένεση προτάθηκε για πρώτη φορά όταν εντοπίσθηκε, τόσο η πρωτεΐνη όσο και το mrna της, σε ενδοθηλιακά κύτταρα από μαστικό αδένα ανθρώπου (Ledoux et al. 1997), σε ενδομήτριο αρουραίου (Milhiet et al. 1998) και σε ανθρώπινο προστάτη (Vacherot, Caruelle, et al. 1999). Ωστόσο, ακόλουθες μελέτες απέδειξαν το ρόλο της PΤΝ τόσο στην in vitro όσο και στην in vivo αγγειογένεση. Σε in vitro μελέτες, η PTN έχει την ικανότητα επαγωγής του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης των ενδοθηλιακών κυττάρων (Jose Courty et al. 1991,Souttou et al. 2001,Papadimitriou et al. 2001), ενώ η έκφρασή της επάγεται σημαντικά στα μεσαγγειακά νεφρικά κύτταρα που ενεργοποιούνται για να μεταναστεύσουν (Martin et al. 2006). Η in vivo αγγειογενετική δράση της PTN έχει διαπιστωθεί στο σύστημα της χοριοαλλαντοϊδικής μεμβράνης εμβρύου όρνιθας (Papadimitriou et al. 2001,Polytarchou et al. 2004, (Koutsioumpa et al. 2012) και σε εμφυτεύματα Matrigel σε ποντίκια (Bernard-Pierrot et al. 2002). Τέλος, μεγάλο ενδιαφέρον παρουσιάζει και η παρατήρηση της άμεσης αλληλεπίδρασης της PTN με τον VEGF 165 (Héroult et al. 2004). Η PTN ανήκει στην οικογένεια των αυξητικών παραγόντων και παρόμοια με άλλους αυξητικούς παράγοντες, η έκφραση ή η υπερέκφρασή της σχετίζεται με 30

41 Εισαγωγή την καρκινογένεση. Κλινικές μελέτες έδειξαν αυξημένα επίπεδα PTN στον ορό αίματος ασθενών με καρκίνο του στομάχου, του παγκρέατος, του στήθους, του προστάτη και των ωοθηκών(sethi et al. 2014, Souttou et al. 1998, Fang et al. 1992). Επιπρόσθετα, η PTN προάγει την έκφραση του VEGF και την αγγειογένεση όγκων του παχέος εντέρου(kong et al. 2012) και συμβάλλει στην ανάπτυξη όγκων σε επίμυες με ξενομοσχεύματα ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων προστάτη (Tsirmoula et al. 2012). Αναστολή της έκφρασης της PTN σε κύτταρα μελανώματος με τη χρήση ριβοενζύμων συνδέεται με αναστολή ανάπτυξης όγκων μελανώματος σε αθυμικούς επίμυες (Malerczyk et al. 2005). Βασικό χαρακτηριστικό της εξέλιξης ενός καρκινικού όγκου είναι και η αλλαγή του κυτταρικού μικροπεριβάλλοντος. Μελέτες σε τρία πειραματικά μοντέλα μελέτης του καρκίνου του μαστού, έδειξαν ότι η εκκρινόμενη PTN έχει την ικανότητα αλλαγής του καρκινικού μικροπεριβάλλοντος, αυξάνοντας τον αριθμό των «ενεργοποιημένων» ινοβλαστών, επάγωντας τη σύνθεση κολλαγόνου και ελαστίνης, καθώς και την έκφραση της MMP9. Επιπλέον, στη συγκεκριμένη μελέτη παρατηρήθηκε αυξημένη αγγειοβρίθεια των όγκων, με τα αγγεία να περιβάλλονται με υψηλότερες ποσότητες ελαστίνης (Chang et al. 2007). Πολλά είναι τα στοιχεία που φανερώνουν ότι εκτός από τη χαρακτηρισμένη επαγωγική δράση της η PTN έχει και έναν ανασταλτικό ρόλο στην αγγειογένεση και στην ανάπτυξη όγκων. Για παράδειγμα, η PTN δεσμεύεται άμεσα με τον VEGF 165 και αναστέλλει/μειώνει τη βιολογική δράση του τελευταίου(héroult et al. 2004). Η PTN έχει χαρακτηρισθεί ως αγγειοστατικός παράγοντας σε ένα in vivo μοντέλο νευροβλαστώματος (Calvet et al. 2006), και αναστολή της έκφρασης της στα κύτταρα γλοιώματος επίμυ C6 οδηγεί σε επαγωγή τόσο της ανάπτυξης των ίδιων των κυττάρων C6 in vitro, όσο και της αγγειογένεσης in vivo και in vitro (Parthymou et al. 2008). Τέλος, εξωγενής χορήγηση της PTN σε κύτταρα γλοιώματος M059K και C6 προκαλεί αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης (Mikelis et al. 2009). 2.5.Υποδοχείς της PTN και μεταγωγή σήματος. Παρόμοια με άλλους αυξητικούς παράγοντες η ΡΤΝ ασκεί τις βιολογικές της δράσεις μετά από αλληλεπίδραση με διαμεμβρανικούς υποδοχείς. Η 31

42 Εισαγωγή αλληλεπίδραση αυτή έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του υποδοχέα,ο οποίος επηρεάζει την ενεργότητα συγκεκριμένων ενδοκυτταρικών μορίων τελεστών, τα οποία με την σειρά τους επηρεάζουν την ενεργότητα άλλων μορίων. Η ενεργοποίηση συνήθως περιλαμβάνει φωσφορυλίωση αποφωσφορυλίωση συγκεκριμένων θέσεων των μορίων στόχων. Με τον τρόπο αυτό ξεκινά ένας καταρράκτης αντιδράσεων που ως στόχο έχει την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων και την κυτταρική απόκριση Υποδοχέας με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ (receptor protein tyrosine phosphatase β/ζ, RPTPβ/ζ) O RPTPβ/ζ, γνωστός και ως RPTPβ ή RPTPζ, είναι μια πρωτεογλυκάνη θειικής χονδροϊτίνης και μέλος της οικογένειας V των RPTPs, και αποτελεί σήμερα τον πιο καλά χαρακτηρισμένο υποδοχέα της PTN. Εκφράζεται κατά κύριο λόγο στον νευρικό ιστό ως μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη με δράση φωσφατάσης τυροσίνης. Αποτελείται από ένα πολύ μεγάλο εξωκυτταρικό τμήμα που περιέχει μια αμινοτελική αλληλουχία με δομή καρβονικής ανυδράσης, ένα διαμεμβρανικό τμήμα και ένα κυτταροπλασματικό τμήμα που περιέχει δύο επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες φωσφατάσης, από τις οποίες αυτή που είναι κοντά στην πλασματική μεμβράνη είναι η καταλυτικά ενεργή (Krueger & Saito 1992). Πέρα από τη μεγάλη διαμεμβρανική ισομορφή του υποδοχέα, έχουν επίσης χαρακτηρισθεί δύο εκκρινόμενες ισομορφές, οι οποίες απαντούν στο εξωκυτταρικό τμήμα και είναι η φωσφακάνη (Maurel et al. 1994) και η μικρή ισομορφή της φωσφακάνης ή PSI (phosphacan short isoform) (Garwood et al. 2003), καθώς επίσης και μια μικρότερη διαμεμβρανική ισομορφή που περιέχει τις ίδιες ενδοκυτταρικές περιοχές φωσφατάσης όπως η μεγάλη ισομορφή, αλλά, σε αντίθεση με τη φωσφακάνη και το μεγάλη ισομορφή του RPTPβ/ζ, διακρίνεται από την απουσία μιας ιδιαίτερα γλυκοζυλιωμένης ακολουθίας 859 αμινοξέων, η οποία διαθέτει πολλές από τις προβλεπόμενες θέσεις σύνδεσης γλυκοζαμινογλυκανών (GAG) (Levy et al. 1993). H φωσφακάνη αντιστοιχεί στο εξωκυτταρικό τμήμα της μεγάλης διαμεμβρανικής ισομορφής του RPTPβ/ζ, στο οποίο δεσμεύεται η PTN (Maeda et al. 1996), και θεωρείται ότι ρυθμίζει κυτταρικές αλληλεπιδράσεις και αναπτυξιακές διαδικασίες στο νευρικό σύστημα(maurel et al. 1994). Μεταβολές στις αλυσίδες 32

43 Εισαγωγή θειϊκής χονδροϊτίνης της φωσφακάνης καθορίζονται αναπτυξιακά και ρυθμίζουν την ικανότητα πρόσδεσης της PTN(Maeda et al. 2003). Η μικρή ισομορφή της φωσφακάνης μεγέθους 90 kda, αντιστοιχεί στην αμινοτελική περιοχή καρβονικής ανυδράσης και στην περιοχή ινονεκτίνης τύπου ΙΙΙ, δεν είναι πρωτεογλυκάνη και δεν έχει αποδειχθεί ότι αλληλεπιδρά με την ΡΤΝ (Garwood et al. 2003). Η μεγάλη διαμεμβρανική ισομορφή του υποδοχέα και η φωσφακάνη είναι έντονα γλυκοζυλιωμένες πρωτεογλυκάνες με αλυσίδες θειϊκής χονδροϊτίνης(faissner et al. 2006), ενώ η μικρή διαμεμβρανική ισομορφή του υποδοχέα και το PSI είναι γλυκοπρωτεΐνες. Εκτός από τις παραλλαγές λόγω ματίσματος του RPTPβ/ζ που εκφράζονται κανονικά κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, ο RPTPβ/ζ έχει βρεθεί ότι διασπάται από την MMP-9, το ένζυμο μετατροπής του TNFα, τη γ-σεκρετάση και την πλασμίνη (Chow et al. 2008), οδηγώντας σε εκκρινόμενες, διαμεμβρανικές, ή κυτταροπλασματικές ισομορφές της, που δεν έχει ακόμη πλήρως προσδιοριστεί η βιολογική τους σημασία (Chow et al. 2008). Εικόνα 5:Σχηματική αναπαράσταση των γνωστών ισομορφών του RPTPβ/ζ. Διακρίνονται δύο διαμεμβρανικές (RPTPβ/ζ μεγάλη και μικρή ισομορφή) και δύο εκκρινόμενες ισομορφές (φωσφακάνη και PSI)(Garwood et al. 2003). 33

44 Εισαγωγή Οι ισομορφές του RPTPβ/ζ εκφράζονται σε μεγάλο βαθμό στον εγκέφαλο (Krueger & Saito 1992,Levy et al. 1993) και η αναπτυξιακή ρύθμιση της έκφρασής του στο νευρικό σύστημα, δείχνουν το σημαντικό ρόλο που έχει στη μορφογένση και στην πλαστικότητα του συστήματος αυτού. Στα αρχικά στάδια ανάπτυξης του φλοιού, ο RPTPβ/ζ εντοπίζεται κατά μήκος ακτινικών νευρογλοιακών ινών και σε μεταναστεύοντες νευρώνες, υποδεικνύοντας ότι εμπλέκεται στη νευρωνική μετανάστευση που επάγεται από την PTN (Canoll et al. 1993,Maeda & Noda 1998), ενώ σίγαση του γονιδίου του υποδοχέα ανέστειλε τη μετανάστευση αυτή (Müller et al. 2003). Επίσης, ο υποδοχέας RPTPβ/ζ ρυθμίζει τη μορφογένεση των δενδριτικών κυττάρων Purkinje στην αναπτυσσόμενη παρεγκεφαλίδα, καθώς μια ανώμαλη μορφολογία των κυττάρων αυτών προκλήθηκε σε καλλιέργειες κυττάρων με την προσθήκη ενός πολυκλωνικού αντισώματος κατά της εξωκυτταρικής περιοχής του RΡΤΡβ/ζ, ή με την αναστολή της δραστηριότητας φωσφατάσης τυροσίνης της πρωτεΐνης, ή με την ενζυματική απομάκρυνση των αλυσίδων θειικής χονδροϊτίνης, ή με την προσθήκη εξωγενώς τέτοιων αλυσίδων (Tanaka et al. 2003). Ο RPTPβ/ζ εκφράζεται επίσης σε ολιγοδενδροκύτταρα και έχει προταθεί ότι παίζει ένα σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση των ολιγοδενδροκυττάρων αλλά και στη μυελίνωση (Lamprianou et al. 2011). Αντίθετα με τo προηγούμενο αποτέλεσμα, μια άλλη ερευνητική ομάδα προτείνει ότι ο RPTPβ/ζ ρυθμίζει αρνητικά την διαφοροποίηση των ολιγοδενδροκυττάρων και τη μυελίνωση (Kuboyama et al. 2012). Σε in vivo πειράματα από την άλλη, τα ποντίκια με ανεπάρκεια του υποδοχέα δεν εμφανίζουν προβλήματα, και η ανάπτυξη του ΚΝΣ, συμπεριλαμβανομένης και της μυελίνωσης, φαίνεται να είναι φυσιολογική (Harroch et al. 2000), κατι που μπορεί να εξηγηθεί με δύο τρόπους: είτε πως η απώλεια του RPTPβ/ζ αναπληρώνεται από την έκφραση άλλων πρωτεϊνών με δράση φωσφατάσης τυροσίνης, είτε ότι η απώλεια του εξαφανίζει τις αρνητικές του επιδράσεις. Ο υποδοχέας RPTPβ/ζ μπορεί να παίζει ρόλο στα τελικά στάδια της διαφοροποίησης των οστεοβλαστών (Schinke et al. 2008). Σε αυτήν την ιδέα οδήγησαν οι εξής παρατηρήσεις: α) Η περιοχή με δράση καρβονικής ανυδράσης που εδράζεται στο Ν-τελικό άκρο πιθανά να εμπλέκεται στον τοπικό έλεγχο του όξινου περιβάλλοντος, κάτι το οποίο μπορεί εν δυνάμει να επηρεάσει την παρουσία των αλάτων στην περιοχή, κατά το σχηματισμό του νέου οστού, β) Οι 34

45 Εισαγωγή δυο ενδοκυττάριες περιοχές με δράση φωσφατάσης τυροσίνης μπορεί να παίζουν ρόλο στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των οστεοβλαστών στα τελικά στάδια της διαφοροποίησης, και γ) Οστεοβλάστες που δεν εκφράζουν RPTPβ/ζ έχουν μειωμένη τάση διαφοροποίησης σε οστεοκύτταρα in-vitro. O RPTPβ/ζ υπερεκφράζεται κατά το στάδιο της τελικής διαφοροποίησης των οστεοβλαστών και ιστομορφομετρική ανάλυση του φαινοτύπου σκελετού από μύες που δεν εκφράζουν τον RPTPβ/ζ έδειξε μείωση του σπογγώδους όγκου του οστού, πιθανά εξαιτίας μειωμένου ρυθμού σχηματισμού του. Επίσης, υπάρχει και έμμεση εμπλοκή του RPTPβ/ζ στο σχηματισμό των οστών, αφού αποτελεί υποδοχέα της ΡΤΝ, η οποία όπως έχει ήδη αναφερθεί, παίζει ρόλο στο σχηματισμό των οστών. Επιπλέον, εκφράζεται στα χονδροκύτταρα και σε οστεοκύτταρα του υποχόνδριoυ οστού ασθενών με οστεοαρθρίτιδα δεδομένο που υποδηλώνει πιθανή συμμετοχή του στους μοριακούς μηχανισμούς που εμπλέκονται στην παθοφυσιολογία της οστεοαρθρίτιδας (Kaspiris et al. 2013,Lamprou et al. 2014). Έλεγχος διαφόρων μορίων του εξωκυττάριου χώρου έδειξε αλληλεπίδραση της φωσφακάνης με μόρια που σχετίζονται με την κυτταρική προσκόλληση, όπως η N-CAM, η Ng-CAM και η τενασκίνη, που εμπλέκονται στη γένεση του νευρικού ιστού και στην ανάπτυξή του, μέσω συνδεδεμένων με ασπαραγίνες ολιγοσακχαριτών στην περιοχή καρβονικής ανυδράσης και φιμπρονεκτίνης τύπου III του εξωκυτταρικού τμήματος του υποδοχέα(barnea et al. 1994,Milev et al. 1994). Έχει προταθεί ότι δέσμευση της ΡΤΝ στον RPTPβ/ζ επάγει το διμερισμό του υποδοχέα και την απενεργοποίηση της δράσης του ως φωσφατάση. Η απενεργοποίηση του υποδοχέα από την ΡΤΝ έχει ως αποτέλεσμα την αύξηση της φωσφορυλίωσης σε τυροσίνη υποστρωμάτων του RPTPβ/ζ, όπως η β-κατενίνη (Meng et al. 2000), η Fyn (Pariser, Ezquerra, et al. 2005) και η β-αντουσίνη (Pariser, et al. 2005). Με αυτόν τον τρόπο, ρυθμίζεται η σταθερότητα του κυτταροσκελετού, η κυτταρική πλαστικότητα, και οι μηχανισμοί προσκόλλησης κυττάρου/κυττάρου (Papadimitriou et al. 2009). Σε κύτταρα U373, η ΡΤΝ επάγει την αυξημένη φωσφορυλίωση της τυροσίνης διαφόρων υποστρωμάτων RPTPβ/ζ που απαιτούνται για τη μετάβαση από επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά κύτταρα (Perez-Pinera et al. 2006). Από την άλλη πλευρά, δέσμευση της ΡΤΝ στον RPTPβ/ζ σε ενδοθηλιακά κύτταρα έχει ως αποτέλεσμα αύξηση της 35

46 Εισαγωγή αποφωσφορυλίωσης της τυροσίνης 527 της κινάσης c-src, ενεργοποίηση της κινάσης εστιακής προσκόλλησης (focal adhesion kinase, FAK), της PI3K και κινασών που ρυθμίζονται από εξωκυτταρικά σήματα (extracellular signal regulated kinases, ERK), οδηγώντας σε κυτταρική μετανάστευση και σχηματισμό αυλών από ενδοθηλιακά κύτταρα (Polykratis et al. 2005). Επίσης, τα τελευταία χρόνια από την ερευνητική μας ομάδα έχει δειχθεί ότι για να επαχθεί η μετανάστευση μέσω του RPTPβ/ζ είναι απαραίτητη η έκφραση της ιντεγκρίνης α ν β 3 (Mikelis et al. 2009). O RPTPβ/ζ και η α ν β 3 δημιουργούν ένα λειτουργικό σύμπλοκο στην επιφάνεια ενδοθηλιακών και κυττάρων γλοιώματος και ο RPTPβ/ζ φαίνεται να είναι υπεύθυνος για τη φωσφορυλίωση της τυροσίνης στη θέση 773 στην υπομονάδα β 3, μέσω της ενεργοποίησης της c-src (Mikelis et al. 2009). Η ΡΤΝ αναστέλλει τη μετανάστευση σε κύτταρα τα οποία δεν εκφράζουν την α ν β 3 ακόμα και όταν αυτά εκφράζουν RPTPβ/ζ (Mikelis et al. 2009), αλλά ο μηχανισμός δεν είναι ακόμα εξακριβωμένος.τελευταία αποτελέσματα της ερευνητικής μας ομάδας ανέδειξαν τον RPTPβ/ζ και ως ένα πιθανό υποδοχέα για τον αυξητικό παράγοντα VEGF 165 και άρα ρυθμίζει αγγειογενετικές λειτουργίες των ενδοθηλιακών κυττάρων και οπότε είναι πολύ πιθανό να αποτελέσει στόχο για την ανάπτυξη πρόσθετων ή εναλλακτικών αντι-vegf θεραπειών (Koutsioumpa et al. 2015). Τέλος ο RPTPβ/ζ βρέθηκε να αποτελεί υποδοχέα και για την κυτοκίνη IL- 34 που έχει δειχθεί να προωθεί τη βιωσιμότητα και τον πολλαπλασιασμό των μονοκυττάρων, καθώς και τη διαφοροποίηση των κυττάρων του μυελού των οστών σε προγονικά κύτταρα μακροφάγων ενώ η συγκεκριμένη ομάδα προτείνει την εμπλοκή της στον καρκίνο και πιο συγκεκριμένα στη λευχαιμία (Booker et al. 2015) Κινάση αναπλαστικού λεμφώματος (Anaplastic Lymphoma Kinase, ALK) O υποδοχέας ALK είναι ένας διαμεμβρανικός υποδοχέας 220 kda με δράση κινάσης τυροσίνης. Μαζί με το συγγενικό του μόριο, την κινάση τυροσίνης των λευκοκυττάρων με μέγεθος 110 kda (leukocyte tyrosine kinase, LTK ), ανήκουν στην υπεροικογένεια των υποδοχέων ινσουλίνης. Ο ALK αρχικά ανακαλύφθηκε ως τμήμα μιας ογκογενετικής χιμαιρικής κινάσης τυροσίνης, της νουκλεοφοσμίνης 36

47 Εισαγωγή (nucleophosmin, NPM-ALK) που εκφράζεται στα αναπλαστικά μεγαλοκυτταρικά λεμφώματα(morris et al. 1994). Επιπλέον, μια σχετιζόμενη με τους μικροσωληνίσκους εχινόδερμων πρωτεΐνη τύπου 4 (EML4)-ALK ογκοπρωτεΐνη ταυτοποιήθηκε σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα(soda et al. 2007). Η μεγάλη ισομορφή του ALK έχει την κλασική δομή ενός υποδοχέα με δράση κινάσης τυροσίνης δηλαδή ένα μεγάλο εξωκυτταρικό, ένα λιπόφιλο διαμεμβρανικό και ένα κυτταροπλασματικό τμήμα με δομή κινάσης τυροσίνης. Αρχικά είχε χαρακτηριστεί ως ορφανός RTK ο οποίος δείχνει περιορισμένη κατανομή στους ιστούς και ρυθμίζεται κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης των οργάνων (Morris et al. 1997,Iwahara et al. 1997). Ο ΑLΚ αποτελείται από ένα 18 αμινοξικών καταλοίπων πεπτίδιο σηματοδότησης, μια μακριά εξωκυτταρική περιοχή (1020 αμινοξέων στους ανθρώπους), ένα 21-αμινοξικών καταλοίπων διαμεμβρανικό τμήμα και ένα ενδοκυτταρικό τμήμα 561 αμινοξέων (Morris et al. 1997). Το μοριακό βάρος του μη τροποποιημένου ALK είναι περίπου 176 kda. Ως αποτέλεσμα της Ν- γλυκοζυλίωσης του εξωκυτταρικού τμήματος της πρωτεΐνης, το φυσιολογικό μοριακό βάρος είναι περίπου 220 kda. Το ενδοκυτταρικό τμήμα αποτελείται από ένα παραμεμβρανικό τμήμα, ένα τμήμα πρωτεϊνικής κινάσης και την καρβοξυτελική ουρά. Η εξωκυτταρική περιοχή περιέχει δύο τμήματα ΜΑΜ, έναν τομέα LDLa, και ένα τμήμα πλούσιο σε γλυκίνη. Η ΜΑΜ περιοχή ανιχνεύεται σε πρωτεΐνες, όπως οι memprins και οι διαμεμβρανικοί υποδοχείς με ενεργότητα φωσφατάσης τυροσίνης, και φαίνεται να έχει ρόλο στις διακυτταρικές αλληλεπιδράσεις (Roskoski 2013). Δύο πρωτεΐνες, η ΜΚ και η ΡΤΝ, έχουν αναφερθεί να είναι προσδέτες ενεργοποίησης για τον ALK των θηλαστικών. Αυτοί οι παράγοντες, οι οποίοι προσδένονται στην ηπαρίνη, εμπλέκονται σε ποικίλες διαδικασίες όπως νευρική ανάπτυξη, η μετανάστευση των κυττάρων και η αγγειογένεση. Ωστόσο, ορισμένες ερευνητικές ομάδες δεν είναι σε θέση να επιβεβαιώσουν ότι οι ΜΚ και ΡΤΝ διεγείρουν τον ALK σε συνθήκες όπου μονοκλωνικά αντισώματα ειδικά για την εξωκυτταρική περιοχή του ALK ήταν σε θέση να ενεργοποιήσουν τη σηματοδότηση του (Moog-Lutz et al. 2005,Motegi et al. 2004). Η PTN δεσμεύεται στο εξωκυτταρικό τμήμα του υποδοχέα (K D =30 pm). Αντισώματα έναντι του υποδοχέα ή της PTN ανέστειλαν τη δέσμευση, τη μεταγωγή σήματος και τη βιολογική δράση της PTN (Stoica et al. 2001,Powers et al. 2002). Πρόσφατα προτάθηκε ότι η έκφραση τόσο του ALK όσο και της PTN, 37

48 Εισαγωγή είναι απαραίτητη για την αυτοανανέωση και την ογκογονικότητα βλαστικών κυττάρων γλοιοβλαστώματος (Koyama-Nasu et al. 2013) Ο ALK πιστεύεται ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και τη λειτουργία του νευρικού συστήματος, κάτι που βασίζεται στην έκφραση του mrna του σε όλο το νευρικό σύστημα κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης (Vernersson et al. 2006) (Iwahara et al. 1997,Morris et al. 1997). Επίσης, έχει αναφερθεί ότι το mrna του ALK εκφράζεται σε ανθρώπινο εγκέφαλο ενήλικα, στο λεπτό έντερο στους όρχεις, στο προστάτη, και στο παχύ έντερο, αλλά όχι σε φυσιολογικά ανθρώπινα λεμφοειδή κύτταρα, στο σπλήνα, στο θύμο αδένα, στις ωοθήκες, στη καρδιά, στο πλακούντα, στο πνεύμονα, στο ήπαρ, στο σκελετικό μυ, στο νεφρό και στο πάγκρεας(morris et al. 1994). Από την αρχική ανακάλυψη της πρωτεΐνης σύντηξης ΝΡΜ-ΑΙΚ σε ανθρώπινο κυτταρικές σειρές αναπλαστικού λεμφώματος έχουν περιγραφεί πάρα πολλές διαφορετικές πρωτεΐνες σύντηξης ALK σε διάφορες κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου του μαστού, του παχέος εντέρου, του οισοφάγου του πλακώδους κυττάρου, το μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα σε καρκινώματα νεφρικών κυττάρων, σε διάχυτα λεμφώματα μεγάλων Β-κυττάρων και φλεγμονώδεις μυοϊνοβλαστικούς όγκους(roskoski 2013). Οι ALK πρωτεΐνες σύντηξης ενεργοποιούν πολλά διαφορετικά μονοπάτια που είναι διασυνδεδεμένα και επικαλυπτόμενα. Αυτά περιλαμβάνουν το Ras / Raf / MEK / ERK1/2 μονοπάτι, το JAK / STAT (κινάση Janus / μεταγωγέας σημάτων και ενεργοποιητής της μεταγραφής) μονοπάτι, το PI3K (φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης 3- κινάση) / Akt (ΡΚΒ) μονοπάτι, και το PLC (φωσφολιπάση C) μονοπάτι. Τα ΡLC και Ras / ERK1/2 μονοπάτια συμμετέχουν στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ενώ τα JAK / STAT και ΡΙ3Κ / Akt μονοπάτια διαμεσολαβούν στη κυτταρική επιβίωση(chiarle et al. 2008). Τέλος, ιδιαίτερο ενδιαφέρον έχει το γεγονός ότι για τον ALK προτάθηκε ένας νέος μηχανισμός ενεργοποίησης υποδοχέων με ενεργότητα κινάσης τυροσίνης, μέσω του οποίου ο ALK ενεργοποιείται με έναν έμμεσο τρόπο από τη PTN. Σύμφωνα με τη συγκεκριμένη μελέτη, δεν παρατηρήθηκε καμία αλληλεπίδραση του ALK με τη PTN. Ωστόσο, βρέθηκε ότι σε κατάσταση ηρεμίας, ο RPTPβ/ζ αλληλεπιδρά και αποφωσφορυλιώνει τον ALK. Μετά από επίδραση με PTN, ο RPTPβ/ζ διμερίζεται, χάνει την ενδογενή δράση φωσφατάσης που έχει, με αποτέλεσμα την αύξηση των επιπέδων φωσφορυλίωσης του ALK και την ενεργοποίησή του (Perez-Pinera et al. 2007). 38

49 Εισαγωγή Ιντεγκρίνη α ν β 3 Μια από τις πιο μελετημένες ιντεγκρίνες που υπερεκφράζονται κατά την αγγειογένεση και παίζουν βασικό ρόλο στη ρύθμισή της, είναι η α ν β 3. Εκφράζεται σε διαφορετικά είδη κυττάρων κατά την εμβρυογένεση, αλλά η έκφρασή της περιορίζεται σε αγγειογενετικά ενδοθηλιακά, λεία μυϊκά και μερικούς πληθυσμούς αιματοποιητικών κυττάρων στον ενήλικα. Ρύθμιση της έκφρασής της πραγματοποιείται από μεταγραφικούς παράγοντες όπως ο Hox D3 (Ohta et al. 2006,Boudreau et al. 1997) ο Hif (Karen D. et al. 2005) και ο Snail (Haraguchi et al. 2008). Προκειμένου να διακριβωθεί ο ρόλος της α ν β 3, έχουν γίνει πειράματα σε ζωϊκά μοντέλα, με αναστολή της έκφρασής της ή της λειτουργικότητάς της α ν β 3 με χρήση διαφόρων αναστολέων, τα οποία έχουν οδηγήσει σε αντιφατικά συμπεράσματα. Από τη μια πλευρά, αναστολή της δράσης της με μικρά μόρια ή αντισώματα αναστέλλει τη νεοαγγειογένεση (Nemeth et al. 2003,MacDonald et al. 2001,Zhaofei Liu, et al. 2008). Από την άλλη, αποσιώπηση του γονιδίου της β 3 οδήγησε σε αυξημένη καρκινογένεση και αγγειογένεση (Taverna et al. 2004), αυξημένη επούλωση πληγών (Reynolds et al. 2005), και αυξημένη φλεγμονή και αθηροσκλήρωση (Weng et al. 2003), γεγονός που σημαίνει ότι η α ν β 3 φυσιολογικά καταστέλλει αυτές τις διαδικασίες. Πιο αναλυτικά, επαγωγή της έκφρασης της α ν β 3 σε αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα που πολλαπλασιάζονται, οδήγησε αρχικά στην υπόθεση ότι εμπλέκεται στην παθολογική αγγειογένεση (Brooks et al. 1994,Drake et al. 1995). Βάση των αρχικών αυτών παρατηρήσεων, αναπτύχθηκαν αντισώματα και μικρομοριακοί αναστολείς, που ανέστειλαν την προσκόλληση ενδοθηλιακών κυττάρων στην ινονεκτίνη και τη νεοαγγειογένεση σε μια ποικιλία in vivo μοντέλων, συμπεριλαμβανομένης της αγγειογένεσης σε όγκους και της επαγόμενης από υποξία αγγειογένεσης του αμφιβληστροειδούς (Brooks et al. 1994, Gutheil et al. 2000, Nabors et al. 2007). Παρόλα αυτά, αναστολή της έκφρασης της υπομονάδας α ν δεν επηρεάζει την αγγειογένεση κατά την ανάπτυξη (Bader et al. 1998). Επιπλέον, επίμυες που δεν εκφράζουν την υπομονάδα β 3 εμφανίζουν φυσιολογικό αγγειακό δίκτυο, χωρίς μεγάλες επιπτώσεις στην αγγειογένεση κατά την ανάπτυξη (Louise Reynolds, et al. 2002). Από την άλλη πλευρά, δεδομένα δείχνουν την επαγωγή παθολογικής 39

50 Εισαγωγή αγγειογένεσης σε επίμυες που δεν εκφράζουν την υπομονάδα β 3 (Louise Reynolds, et al. 2002, Taverna et al. 2005), υποδηλώνοντας ότι η συμμετοχή της β 3 στη ρύθμιση της αγγειογένεσης είναι αναγκαία. Μεγάλη σημασία για τη διερεύνηση του ρόλου της β 3 είχαν πειράματα σε επίμυες με μεταλλαγμένη β 3, στην οποία οι τυροσίνες 747 και 759 (αντίστοιχες των 773 και 785 στον άνθρωπο) αντικαταστάθηκαν από φαινυλαλανίνες. Οι επιμυες αυτοί, αν και ήταν βιώσιμοι και γόνιμοι, παρουσίασαν μειωμένη ανάπτυξη όγκων και παθολογική αγγειογένεση. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η φωσφορυλίωση στις τυροσίνες 747 και 759 της ιντεγκρίνης β 3 συμμετέχει στην επαγωγή της παθολογικής αγγειογένεσης (Mahabeleshwar et al. 2006). Συνολικά, φαίνεται ότι η ιντεγκρίνη α ν β 3 μπορεί να έχει θετικό ή αρνητικό ρόλο κατά την αγγειογένεση, δράση που μπορεί να καθορίζεται ανάλογα με τους προσδέτες της και το μικροπεριβάλλον (Hodivala- Dilke 2008). Η ιντεγκρίνη α ν β 3 δεσμεύεται σε μια πληθώρα παραγόντων που θεωρούνται ότι επάγουν την αγγειογένεση, συμπεριλαμβανομένων των VEGFR-2, βιτρονεκτίνης, φιμπρονεκτίνης, θρομβίνης και PTN, ενώ δεσμεύει και αρκετούς παράγοντες με αντιαγγειογενετική δράση, όπως τη θρομβοσπονδίνη, την αγγειοστατίνη και την τουμστατίνη (Hodivala-Dilke et al. 2003, Mikelis et al. 2009). Μια άλλη εξήγηση μπορεί να δοθεί αν ληφθεί υπόψιν ότι η έκφραση και η λειτουργικότητα μιας ιντεγκρίνης μπορεί να επηρεάσει την έκφραση και τη λειτουργικότητα άλλων ιντεγκρινών, ρυθμίζοντας έτσι την κυτταρική συμπεριφορά (Díaz-González et al. 1996). Έχει βρεθεί ότι ενεργοποίηση της υπομονάδας β1 των ιντεγκρινών α3β1 και α6β1, αναστέλλει τη λειτουργικότητα της ανβ3 στην προσκόλληση των κυττάρων (Gonzalez et al. 2008). Μια ακόμα εξήγηση που μπορεί να δοθεί σχετικά με τις «αντιφατικές» δράσεις της α ν β 3 είναι ότι στην περίπτωση που αναστέλλεται η έκφρασή της, κάποιες άλλες πρωτεΐνες δρουν, αναπληρώνοντας μερικώς τη δράση της. Αν και σε ενδοθηλιακά κύτταρα που είχε ανασταλλεί η έκφραση της β 3 δε φάνηκε άλλες ιντεγκρίνες να συνεισφέρουν στην προσκόλληση ή στη μετανάστευση αυτών των κυττάρων, εντούτοις η αυξημένη παθολογική αγγειογένεση σε επίμυες που δεν εκφράζουν τη β3 μπορεί να εξηγηθεί από την αύξηση της έκφρασης και της λειτουργίας του VEGFR-2 (Robinson et al. 2004, Weis et al. 2007). Μολονότι οι ιντεγκρίνες δε θεωρούνται ογκογόνα μόρια, αυξημένη έκφρασή τους συνδέεται συχνά με την ανάπτυξη όγκων και μεταστάσεων. Ορισμένες ιντεγκρίνες 40

51 Εισαγωγή εκφράζονται σε χαμηλά επίπεδα σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα, αλλά εμφανίζουν υψηλά επίπεδα έκφρασης σε ορισμένους όγκους. Για παράδειγμα, η έκφραση της α ν β 3 συνδέεται με την εξέλιξη της νόσου ή/και μεταστάσεις σε μελανώματα, πλοιόμορφα γλοιοβλαστώματα και καρκίνο του προστάτη, του μαστού, του παγκρέατος, των ωοθηκών και του τραχήλου της μήτρας (Weis & Cheresh 2011). Ακόμα, πολλά στοιχεία υποστηρίζουν ότι οι ιντεγκρίνες αλληλεπιδρούν με υποδοχείς αυξητικών παραγόντων ή επηρεάζουν μονοπάτια μεταγωγής σήματος αυξητικών παραγόντων (Streuli & Akhtar 2009). Για παράδειγμα, η α ν β 3 αλληλεπιδρά με τον PDGF και με τον VEGFR-2, ρυθμίζοντας τη δραστικότητά τους (Borges et al. 2000,Rapraeger et al. 2013,Payaningal R. Somanath,et al. 2012). Παρόλα αυτά, λίγα είναι γνωστά για το πώς η σηματοδότηση που ξεκινάει από υποδοχείς αυξητικών παραγόντων ή από ιντεγκρίνες διαπλέκεται και ολοκληρώνεται μέσα στο κύτταρο ενεργοποιώντας συγκεκριμένες λειτουργίες. Στα σημεία εστιακής προσκόλλησης, έχει διαπιστωθεί εξαρτώμενη από κλαθρίνη ενδοκυττάρωση ιντεγκρινών και ανακύκλωσή τους στην πλασματική μεμβράνη, γεγονός που συμβάλλει στη στρατολόγηση των ιντεγκρινών στα σημεία εστιακής προσκόλλησης και στην κυτταροκίνηση (Ezratty et al. 2009). Η παραπάνω διαδικασία εξαρτάται από την οικογένεια των Rab GTPασών και εμπλέκεται στην ενδοκυττάρωση υποδοχέων αυξητικών παραγόντων, όπως του υποδοχέα του EGF (EGFR) (Caswell et al. 2008) ή του VEGFR-2 (Reynolds et al. 2009). Αναφέρεται πως μέσω ταχείας ενδοκυττάρωσης των υποδοχέων EGFR και VEGFR-2, αναστέλλεται η αποικοδόμηση των τελευταίων και ενισχύεται η σηματοδότηση από τους αντίστοιχους προσδέτες. Η κινάση που έρχεται σε επαφή με ιντεγκρίνες ILK (integrin-linked kinase) συμβάλλει στην επικοινωνία μονοπατιών σηματοδότησης που επάγονται από την ινσουλίνη και την ινονεκτίνη. Η FAK ενώνει τη σηματοδότηση που προέρχεται από τις ιντεγκρίνες, τους EGFR και PDGFR (Sieg et al. 2000,Comoglio et al. 2003). Ακόμα, αποτελεί σημείο σύγκλισης ανάμεσα στον VEGFR-2 και την ανβ3, ρυθμίζοντας τη συγκρότηση των εστιών προσκόλλησης που είναι απαραίτητες για τον πολυμερισμό της ακτίνης και τη μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων. Πρόσφατα βρέθηκε ότι η ενεργοπoίηση του VEGFR-2 επάγει τη φωσφορυλίωση της FAK στη Ser732, γεγονός που οδηγεί σε αλλαγή της στερεοδιαμόρφωσής της, καθιστώντας προσβάσιμη την Tyr407 για φωσφορυλίωση από την Pyk2, που με τη σειρά της ενεργοποιείται από τη β 3 υπομονάδα (Fabrice Le Boeuf, et al. 2006). 41

52 Εισαγωγή Επιπλέον όπως αναφέρεται και παραπάνω, από αποτελέσματα της ερευνητικής μας ομάδας έγινε γνωστό πως λαμβάνει χώρα συνεργατική αλληλεπίδραση της α ν β 3 ιντεγκρίνης με τον RPTPβ/ζ υποδοχέα στην κυτταρική μεμβράνη, η οποία είναι υπεύθυνη για την επαγόμενη από PTN μεταναστευτική ικανότητα ενδοθηλιακών και καρκινικών κυττάρων (Mikelis et al. 2009) Πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης (heparan sulfate proteoglycans HSPGs) Η PTN -όπως έχει ήδη αναφερθεί- έχει υψηλή συγγένεια με την ηπαρίνη. Εκτός όμως από την ηπαρίνη, οι αλυσίδες της θειικής ηπαράνης διαφόρων πρωτεογλυκανών(pgs) της κυτταρικής επιφάνειας ή του εξωκυττάριου υλικού, παρουσιάζουν και αυτές ισχυρή ικανότητα δέσμευσης της PTN. Επιπλέον, η θειική χονροϊτίνη και η θειική δερματάνη παρουσιάζουν σε μικρότερο βαθμό συγγένεια με τη PTN, σε αντίθεση με τη θειική κερατάνη, η οποία δεν έχει συγγένεια (Vacherot, et al. 1999). Η PTN δεσμεύεται στη θειϊκή ηπαράνη (Mitsiadis et al. 1995) και παρά το γεγονός ότι συναινετικές αλληλουχίες για σύνδεση με την ηπαρίνη βρίσκονται στα πλούσια σε λυσίνη άκρα της PTN, αυτά δεν απαιτούνται για αλληλεπίδρασή της με αλυσίδες θειϊκής ηπαράνης (Raulo et al. 2005). Το αποτέλεσμα αυτό είναι σε συμφωνία με την υπόθεση πως οι περιοχές δέσμευσης στην ηπαρίνη δεν αντιστοιχούν απαραίτητα σε συγκεκριμένες αλληλουχίες (Muñoz & Linhardt 2004). Τα μόρια θειϊκής ηπαράνης στην Ν-συνδεκάνη είναι απαραίτητα για τη δέσμευση της PTN και την επαγωγή προέκτασης των νευριτών. Επώαση μεσαγγειακών κυττάρων με ηπαριτινάση απομακρύνει την PTN από τα κύτταρα, αποκαλύπτοντας τη σημασία της αλληλεπίδρασης για τη δράση της PTN σε αυτά τα κύτταρα (Martin et al. 2006). Η Ν-συνδεκάνη ή συνδεκάνη-3 (μοριακού μεγέθους περίπου 200 kda) απομονώθηκε από καλλιέργειες νευρικών κυττάρων και από εγκέφαλο αρουραίου, μέσω στήλης με καθηλωμένη ανασυνδυασμένη PTN (Erkki Raulo, et al. 1994). Aποτελείται από έναν πρωτεϊνικό κορμό 442 αμινοξέων, στον οποίο προσδένονται αλυσίδες θειϊκής ηπαράνης (Erkki Raulo, et al. 1994) και παρουσιάζει υψηλή ομολογία σε άνθρωπο, επίμυ και αρουραίο (Christine Berndt, et al. 2001). H Ν-συνδεκάνη εκφράζεται σημαντικά στον εγκέφαλο του εμβρύου 42

53 Εισαγωγή και νεογέννητου αρουραίου (Carey et al. 1992)και φαίνεται να είναι απαραίτητη για την επιβίωση αισθητηρίων νευρώνων (Paveliev et al. 2008). Η έκφραση της PTN και της Ν-συνδεκάνης συμπίπτουν χρονικά κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου και συνεντοπίζονται σε συγκεκριμένα σημεία στον εγκέφαλο αρουραίου (Nolo et al. 1995). Η PTN, σε συνδυασμό με την Ν-συνδεκάνη και τον υποδοχέα της RPTPβ/ζ, φαίνονται να ρυθμίζουν τη νευροπροστατευτική δράση της camp στους ντοπαμινεργικούς νευρώνες (Mourlevat et al. 2005). H Ν-συνδεκάνη έχει ανιχνευθεί ως υποδοχέας της PTN σε προγονικά οστεοκύτταρα και οστεοβλάστες (Imai et al. 1998), ενώ η έκφραση της PTN από τους οστεοβλάστες και ο συνεντοπισμός της με την Ν-συνδεκάνη έχουν επιβεβαιωθεί σε in vivo μοντέλα (Tare et al. 2002). Πρόσδεση της PTN στην Ν-συνδεκάνη οδηγεί στην ενεργοποίηση της c-src και της Fyn και στην αλληλεπίδρασή τους με την κορτακτίνη και την τουμπουλίνη. Τελικό επακόλουθο αυτών των αλληλεπιδράσεων είναι η αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, με αποτέλεσμα την προέκταση νευριτών (Imai et al. 1998) και τη μετανάστευση οστεοβλαστών (Kinnunen et al. 1998). Η N-συνδεκάνη μοιάζει με τους άλλους διαμεμβρανικούς υποδοχείς στην ικανότητά τους να διμερίζονται και να ολιγομερίζονται στην κυτταρική μεμβράνη. Πιθανό ενδεχόμενο αποτελεί πως η PTN που δεσμεύεται στην Ν-συνδεκάνη επάγει το διμερισμό ή τον ολιγομερισμό της N-συνδεκάνης στους νευρώνες (Asundi & Carey 1995). Πέρα από τη θειϊκή ηπαράνη, η PTN μπορεί να δεσμευθεί στη θειϊκή δερματάνη, καθώς και στη θειϊκή χονδροϊτίνη Α (Vacherot et al. 1999) και Ε (Deepa et al. 2002). Υπάρχουν ενδείξεις ότι πολλά από τα μόρια αυτά παίζουν ρόλο στη μιτογόνο δράση (Vacherot et al. 1999) και στην επαγωγή ανάπτυξης νευριτών από την PTN (Kinnunen et al. 1996). Μεταξύ των PGs, πολλές αναφορές έχουν εμπλέξει ένα ρόλο για τις πρωτεογλυκάνες θειικής χονδροϊτίνης (CS-PG) στο ΡΤΝ-μονοπάτι σηματοδότησης. Η βερσικάνη, μια CS-PG με υψηλή περιεκτικότητα σε Ε δισακχαριδικές μονάδες, βρέθηκε να δεσμεύει ισχυρά την ΡΤΝ, μια αλληλεπίδραση που καταργήθηκε με πέψη από ABC χονδροϊτινάση(zou et al. 2000). Ομοίως, η appican αλυσίδα CS από κύτταρα γλοιώματος C6 αρουραίου, όχι όμως από κύτταρα νευροβλαστώματος SH-SY5Y που δεν περιείχαν Ε δισακχαριδικές μονάδες, βρέθηκε να δεσμεύει ειδικά την 43

54 Εισαγωγή ΡΤΝ(Umehara et al. 2004). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι το μοτίβο E είναι απαραίτητο για την αλληλεπίδραση των αλυσίδων CSs με την ΡΤΝ. Ανάλυση των ολιγοσακχαριτών που απομονώθηκαν από εμβρυονικές αλυσίδες CS / θειικής δερματάνης (DS) αποκάλυψε ότι ένας οκτασακχαρίτης είναι το ελάχιστο μέγεθος ικανό να αλληλεπιδρά με ΡΤΝ σε φυσιολογική συγκέντρωση άλατος και ότι η ΡΤΝ δεσμεύεται με πολλαπλές αλληλουχίες σε εμβρυϊκές CS / DS αλυσίδες με ξεχωριστή συγγένεια Νουκλεολίνη Η νουκλεολίνη (nucleolin, NCL) είναι μια άφθονη πυρηνική πρωτεΐνη εκθετικά αυξανόμενων κυττάρων, που εντοπίζεται κυρίως στις ινώδεις και κοκκιώδεις περιοχές των πυρηνίσκων (Ochs et al. 1983,Lischwe et al. 1981,Bugler et al. 1982,Biggiogera et al. 1990,Scheer & Weisenberger 1994). Αποτελεί ιδιαίτερα σημαντική πρωτεΐνη του ευκαρυωτικού κυττάρου καθώς ρυθμίζει διάφορες πτυχές του μεταβολισμού του DNA και του RNA, τη δομή της χρωματίνης, τη μεταγραφή του rdna, την ωρίμανση του rrna, την κυτταροκίνηση, τον πολλαπλασιασμό και την ανάπτυξη κυττάρων, την απόπτωση, καθώς και τη συναρμολόγηση, αναδίπλωση και ωρίμανση των ριβοσωμάτων. Κατά πρώτον ανακαλύφθηκε σε κύτταρα ωοθήκης κινέζικου χάμστερ (CHO) και κύτταρα ηπατώματος Novikoff και αρχικά ονομάστηκε πρωτεΐνη C23 (Orrick et al. 1973)(Bugler et al. 1982). Η σταθερότητα της σχετίζεται με την κατάσταση φωσφορυλίωσης του μορίου (Warrener & Petryshyn 1991,Wang et al. 2011,Tawfic et al. 1994) και είναι αυξημένη σε πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα με την αναστολή της διαδικασίας αυτοδιάσπασης (Chen et al. 1991). Τροποποιήσεις όπως φωσφορυλίωση, αυτόαποικοδόμηση και γλυκοζυλίωση έχει συνδεθεί με τον εντοπισμό στο κύτταρο της NCL και τη ρύθμιση των βιολογικών δραστηριοτήτων της(srivastava et al. 1999,Tajrishi et al. 2011,Losfeld et al. 2009). Το γονίδιο της NCL στον άνθρωπο είναι παρόν σε ένα αντίγραφο ανά απλοειδές γονιδίωμα και αποτελείται από 14 εξόνια και 13 εσόνια επί του χρωμοσώματος 2q12-qter (Srivastava & Pollard 1990). Παρά το γεγονός ότι η NCL των θηλαστικών, που αποτελείται από 707 αμινοξέα, έχει μια προβλεπόμενη μοριακή μάζα περίπου 77 kda (Srivastava et al. 1989), η φαινομενική μοριακή μάζα είναι 44

55 Εισαγωγή μεταξύ 100 και 110 kda, λόγω της υψηλής περιεκτικότητας σε αρνητικά φορτισμένα αμινοξέα στο αμινο-τελικό τμήμα (Rao et al. 1982,Mark D. Mamrack,et al. 1979). Ανάλυση της αλληλουχίας των 707 αμινοξέων της NCL, αποκάλυψε την παρουσία τριών διαφορετικών δομικών τμημάτων (Lapeyre et al. 1987, Srivastava et al. 1989). Το αμινοτελικό τμήμα αποτελείται από εξαιρετικά όξινες περιοχές (Lischwe et al. 1982), έχει πολλαπλές θέσεις για φωσφορυλίωση από την ομόλογη πρωτεΐνη 2 ελέγχου της κύτταρικής διαίρεσης (Cdc2),τη κινάση καζεΐνης 2 (CK2) και τη πρωτεϊνική κινάση C (PKC) (Belenguer et al. 1990,Peter et al. 1990) που εμπλέκονται σε αλληλεπιδράσεις με τη χρωματίνη (Erard et al. 1988) και τις UTRs (Cong et al. 2012,Ghisolfi-Nieto et al. 1996), ρυθμίζοντας έτσι τη μεταγραφή του rdna (Egyhazi et al. 1988)(Angelov et al. 2006). Η κεντρική περιοχή περιέχει 4 RNA-δεσμευτικές περιοχές (RNA binding domains, RBDs) (Bugler et al. 1987). Η καρβοξυτελική περιοχή ονομάζεται τομέας GAR ή RGG, είναι πλούσια σε επαναλήψεις Arg-Gly-Gly, διανθίζεται με πολλά αρωματικά αμινοξέα, όπως φαινυλαλανίνη (Lapeyre et al. 1986), και φαίνεται να εμπλέκεται σε αλληλεπιδράσεις με νουκλεϊκά οξέα (Bandziulis et al. 1989), ριβοσωματικές (Bouvet et al. 1998)και άλλες πρωτεΐνες. H χρήση διαφόρων δομών στις οποίες έχει γίνει απαλοιφή συγκεκριμένων περιοχών της NCL, αποκάλυψε πως το μοτίβο RGG είναι υπεύθυνο για δέσμευση του upa και του υποδοχέα του(dumler et al. 1999)(Stepanova et al. 2008), της MK (Said et al. 2002) και της λακτοφερίνης(takayama 2012). Αυτός ο τομέας περιέχει και υψηλά επίπεδα διμεθυλοαργινινών (Lischwe et al. 1985). Παρά το γεγονός ότι η κύρια λειτουργία της NCL είναι η σύνθεση rrna και η βιογένεση ριβοσωμάτων, εμπλέκεται και σε άλλες πτυχές της κυτταρικής βιολογίας, όπως στην απόπτωση, στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και της μεταγραφής, σε ιογενείς λοιμώξεις, αυτοάνοσα νοσήματα και στην παθολογία νευροεκφυλιστικών ασθενειών(koutsioumpa & Papadimitriou 2014). Η NCL επίσης δρα ως μια πρωτεΐνη-μεταφορέας μεταξύ κυτταροπλάσματος και πυρήνα (Borer et al. 1989)(Schmidt-Zachmann & Nigg 1993) και υπερεκφράζεται στη μεμβράνη καρκινικών (Destouches et al. 2008, (Hoja-Lukowicz et al. 2009) καθώς και ενεργοποιημένων ενδοθηλιακών κυττάρων (Christian et al. 2003). Ενδιαφέρον παρουσιάζει ότι οι περισσότεροι προσδέτες της μεμβρανικής NCL παίζουν κρίσιμο ρόλο στην αγγειογένεση και στην ογκογένεση. Δεδομένα υποστηρίζουν τη λειτουργία 45

56 Εισαγωγή της NCL ως υποδοχέα χαμηλής συγγένειας για την ΡΤΝ (Take et al, 1994). H ΡΤΝ δεσμεύεται στη NCL απουσία ηπαρίνης και κατά παρόμοιο τρόπο με τη MK. Ενδείξεις για την εμπλοκή της NCL στις βιολογικές δράσεις της PTN, αποτελούν η αναστολή επαγόμενου από PTN σχηματισμού διακλαδωμένων δομών σε υπόστρωμα κολλαγόνου, καθώς και η μείωση της προκαλούμενης από την PTN μεταναστευτικής ικανότητας ενδοθηλιακών κυττάρων έπειτα από σίγαση της NCL(Koutsioumpa et al. 2012,Destouches et al. 2008). H στόχευση της NCL στη μεμβράνη καρκινικών κυττάρων, φαίνεται να είναι ένας αποτελεσματικός τρόπος αναστολής της αγγειογένεσης και της καρκινικής ανάπτυξης σε διάφορα in vitro και in vivo πειραματικά μοντέλα (Destouches et al. 2008,Krust et al. 2011). Με βάση τα πρόσφατα αποτελέσματα της ερευνητικής μας ομάδας, η έκφραση της ανβ3 και η φωσφορυλίωση της στη θέση Tyr773 καθορίζει τον επαγόμενο από την PTN- ή τον VEGF165- εντοπισμό της NCL στην κυτταρική επιφάνεια μέσω του μονοπατιού RPTPβ/ζ / c-src / PI3K (Koutsioumpa et al. 2013; Koutsioumpa et al. 2015).. Εικόνα 6: Σχηματική αναπαράσταση του μονοπατιού PTN/RPTPβ/ζ που οδηγεί στον εντοπισμό της NCL στην κυτταρική μεμβράνη. Η δέσμευση εξωγενούς ΡΤΝ στον υποδοχέα RPTPβ/ζ στην επιφάνεια ενδοθηλιακών ή καρκινικών κυττάρων, οδηγεί σε ενεργοποίηση της c-src, φωσφορυλίωση της υπομονάδας β3 στην τυροσίνη 773 και φωσφορυλίωση της ΡΙ3Κ. H ενεργοποιημένη PI3K επάγει έμμεσα ή άμεσα τη μετατόπιση της NCL από τον πυρήνα προς την κυτταρική 46

57 Εισαγωγή μεμβράνη. Η μεμβρανική NCL αλληλεπιδρά τόσο με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ, όσο και με την ανβ3 και απαιτείται για την επαγόμενη από PTN κυτταρική μετανάστευση(koutsioumpa et al. 2013). Εικόνα 7: Σχηματική αναπαράσταση του προτεινόμενου μονοπατιού που οδηγεί στον εξαρτώμενο από τον VEGF 165 εντοπισμό της NCL στην κυτταρική μεμβράνη. Η δέσμευση εξωγενούς VEGF165 στον υποδοχέα RPTPβ/ζ στην επιφάνεια ενδοθηλιακών ή καρκινικών κυττάρων οδηγεί σε ενεργοποίηση της κινάσης c-src, φωσφορυλίωση της υπομονάδας β3 στην τυροσίνη 773 και φωσφορυλίωση της ΡΙ3Κ. H ενεργοποιημένη PI3K επάγει έμμεσα ή άμεσα τη μετατόπιση της NCL από τον πυρήνα προς την κυτταρική μεμβράνη, η οποία απαιτείται για την επαγόμενη από PTN κυτταρική μετανάστευση (Koutsioumpa et al. 2015). 47

58 II.ΣΚΟΠΟΣ

59 Σκοπός Η κυτταρική μετανάστευση είναι μια κεντρική διαδικασία στην ανάπτυξη και τη διατήρηση των πολυκύτταρων οργανισμών. Mια από τις πολλές σημαντικές βιολογικές λειτουργίες όπου παίζει ρόλο η κυτταρική μετανάστευση, είναι η αγγειογένεση. Στην επαγωγή της κυτταρικής μετανάστευσης συμμετέχει μια πλειάδα αυξητικών παραγόντων, ενώ η ρύθμιση της πραγματοποιείται από αλληλεπιδράσεις μορίων της κυτταρικής μεμβράνης, τόσο μεταξύ τους όσο και με μόρια της εξωκυττάριας ύλης. Η πλειοτροπίνη (pleiotrοphin, PTN) αποτελεί έναν εκκρινόμενο αυξητικό παράγοντα μοριακής μάζας 18 kda, ο οποίος μαζί με την midkine (MK) ανήκει σε μια οικογένεια αυξητικών παραγόντων με υψηλή συγγένεια με την ηπαρίνη. Η PTN διαδραματίζει σημαντικό ρόλο σε αναπτυσσόμενους ιστούς, σε λειτουργίες του νευρικού συστήματος, στην ανάπτυξη όγκων και στην καρκινική αγγειογένεση in vivo και in vitro. Διάφοροι υποδοχείς διαμεσολαβούν τις δράσεις της ΡΤΝ, όπως ο υποδοχέας με δράση κινάσης τυροσίνης ALK (anaplastic lymphoma kinase), συνδεκάνες, ο υποδοχέας με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ (receptor protein tyrosine phosphatase beta/zeta, RPTPβ/ζ), η ιντεγκρίνη α ν β 3 και η νουκλεολίνη (Papadimitriou et al. 2009,Koutsioumpa et al. 2012). O RPTPβ/ζ αποτελεί μια πρωτεογλυκάνη θειϊκής χονδροϊτίνης. Είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη με δράση φωσφατάσης τυροσίνης, ενώ έχουν επίσης περιγραφεί μια βραχύτερη διαμεμβρανική και δύο εκκρινόμενες ισομορφές που αντιστοιχούν στα εξωκυτταρικά τμήματα της μεγάλης και μικρής διαμεμβρανικής ισομορφής (Garwood et al. 2003). Αρκετοί προσδέτες δεσμεύονται στην εξωκυτταρική περιοχή του RPTPβ/ζ, ανάμεσά τους αυξητικοί παράγοντες, μόρια εξωκυττάριας ύλης και μόρια κυτταρικής προσκόλλησης. Ο πιο γνωστός διαλυτός προσδέτης του RPTPβ/ζ είναι η PTN που οδηγεί σε ενεργοποίηση αρκετών μονοπατιών μεταγωγής σήματος που παίζουν ρόλο στην κυτταρική λειτουργία. Ακόμα, πολλές ερευνητικές εργασίες υποστηρίζουν την εμπλοκή του RPTPβ/ζ στη μεταναστευτική ικανότητα ενδοθηλιακών και καρκινικών κυττάρων, κυρίως μέσω δέσμευσης της PTN σε αυτόν αλλά και λόγω της συνεργατικής δράσης του με τον VEGF(Koutsioumpa et al. 2015,Polykratis et al. 2005,Mikelis et al. 2009). Οι ιντεγκρίνες αποτελούν ετεροδιμερείς υποδοχείς της κυτταρικής μεμβράνης, οι οποίες συμμετέχουν στην πρόσδεση του κυττάρου σε μόρια της εξωκυττάριας ύλης και παράλληλα αλληλεπιδρούν με προσδέτες ή υποδοχείς της κυτταρικής 49

60 Σκοπός μεμβράνης. Οι ιντεγκρίνες έχει βρεθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο σε διαδικασίες του κυττάρου οι οποίες είναι ζωτικής σημασίας, όπως η προσκόλληση, ο πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση, η μετανάστευση και η επιβίωση (Hodivala- Dilke et al. 2003). Μια από τις πιο μελετημένες ιντεγκρίνες που υπερεκφράζεται κατά την αγγειογένεση και παίζει βασικό ρόλο στη ρύθμισή της, είναι η α ν β 3. Τα επίπεδα της ιντεγκρίνης α ν β 3 έχουν βρεθεί αυξημένα σε διάφορους τύπους καρκίνου, σε σχέση με τα φυσιολογικά επίπεδα, ενώ αυτό σχετίζεται και με την εξέλιξη της νόσου (Jay S. Desgrosellier 2010). Σε διάφορες εργασίες αναφέρονται προσπάθειες αναστολής της δράσης της αλλά και χρήση της ως μόριο για εκλεκτική στόχευση καρκινικών και αγγειογενετικών ενδοθηλιακών κυττάρων (Gutheil et al. 2000, Mas-Moruno et al. 2010, Zhaofei Liu et al. 2008).Υπάρχουν αρκετά δεδομένα που υποστηρίζουν συνεργατική σηματοδότηση μεταξύ της α ν β 3 και υποδοχέων αυξητικών παραγόντων ή κυτταροκινών, διαμεσολαβώντας την προσκόλληση, τη μετανάστευση, τη διεισδυτικότητα, την επιβίωση καρκινικών κυττάρων, αλλά και την ενεργοποίηση των ενδοθηλιακών (Jay S. Desgrosellier 2010). Προηγούμενα αποτελέσματα της ερευνητικής μας ομάδας έδειξαν ότι η ιντεγκρίνη α ν β 3 αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ, ο οποίος μέσω ενεργοποίησης της κινάσης c-src φωσφορυλιώνει την τυροσίνη στη θέση 773 (Tyr773) της υπομονάδας β 3 και έτσι επάγεται η μετανάστευση ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων και κυττάρων γλοιοβλαστώματος από την ΡΤΝ (Mikelis et al. 2009). Σκοπός της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας ήταν η μελέτη του ρόλου του υποδοχέα RPTPβ/ζ στην επίδραση της PTΝ και του VEGF στη μετανάστευση κυττάρων που δεν εκφράζουν την ιντεγκρίνη α ν β 3, καθώς επίσης και κατά πόσον η ιντεγκρίνη α ν β 3 επηρεάζει την αλληλεπίδραση της ΡΤΝ ή του VEGF με τον RPTPβ/ζ. 50

61 III.ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

62 Υλικά και Μέθοδοι 3.1.Ανακαλλιέργεια κυττάρων Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν καλλιέργειες κυττάρων C6 (κύτταρα γλοιώματος αρουραίου), και κυττάρων CHO (Chinese hamster ovary) από ωοθήκη ινδικών χοιριδίων. Παρακάτω αναλύεται η πειραματική πορεία ανακαλλιέργειας. 1. Η ανακαλλιέργεια πραγματοποιείται όταν τα κύτταρα έχουν καλύψει το % της επιφάνειας του τρυβλίου. Αυτός ο προσδιορισμός γίνεται με παρατήρηση του τρυβλίου στο μικροσκόπιο. 2. Μεταφορά του τρυβλίου με τα κύτταρα σε θάλαμο νηματικής ροής, όπου είναι δυνατή η επεξεργασία τους σε στείρες συνθήκες. Αναρρόφηση του θρεπτικού μέσου της καλλιέργειας με τη βοήθεια κενού και ξέπλυμα των κυττάρων τρεις φορές με PBS (1X). Με την διαδικασία αυτή απομακρύνεται καλά το πλήρες θρεπτικό μέσο. 3. Προσθήκη 1ml τρυψίνης ανα τρυβλίο 100 mm. Η τρυψίνη είναι πρωτεολυτικό ένζυμο και διασπά διακυτταρικές ή κυττάρου-υποστρώματος συνδέσεις. Η πορεία αποκόλλησης των κυττάρων παρακολουθείται στο μικροσκόπιο. Τα κύτταρα διατρέχουν μεγάλο κίνδυνο αν παραμείνουν περισσότερο από 10 λεπτά στην τρυψίνη. 4. Με την ολοκλήρωση της αποκόλλησης των κυττάρων από το τρυβλίο, αναστέλλεται η δράση της τρυψίνης με την προσθήκη 2ml πλήρους θρεπτικού μέσου της εκάστοτε κυτταρικής σειράς που περιέχει 10% ορό. Ο ορός είναι αυτός που περιέχει αναστολείς πρωτεασών και άρα σταματά τη δράση της τρυψίνης έτσι ώστε τα κύτταρα να διατηρηθούν ακέραια. 5. Μεταφορά του εναιωρήματος των κυττάρων σε αποστειρωμένο falcon των 15ml. Προσθήκη PBS και συλλογή των κυττάρων που έχουν εναπομείνει μέσα σε τρυβλίο. Φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στα 500 g σε θερμοκρασία δωματίου. 6. Μετά την ολοκλήρωση της φυγοκέντρησης γίνεται απομάκρυνση του υπερκείμενου θρεπτικού μέσου με τη βοήθεια κενού και προσθήκη πλήρους θρεπτικού μέσου μέχρι τελικού όγκου 5ml. Επαναιώρηση των κυττάρων με την βοήθεια πιπέτας. 51

63 Υλικά και Μέθοδοι 7. Με τη βοήθεια πιπέτας τοποθετούνται 10μl από το εναιώρημα των κυττάρων στην ειδική θέση του αιματοκυτταρόμετρου και πραγματοποιείται μέτρηση του αριθμού των κυττάρων στο μικροσκόπιο. 8. Για κάθε ανακαλλιέργεια κυττάρων C6/CHO χρησιμοποιήθηκαν Θρεπτικά μέσα των χρησιμοποιούμενων κυττάρων Σε όλα τα θρεπτικά μέσα που χρησιμοποιήθηκαν προστέθηκαν τα ακόλουθα αντιβιοτικά: Πενικιλίνη/Στρεπτομυκίνη 100 U/ml, Γενταμυκίνη 50 μg/ml και Αμφοτερικίνη 2.5 μg/ml. Τα αντιβιοτικά πενικιλίνη/στρεπτομυκίνη και γενταμυκίνη προστατεύουν από βακτήρια ενώ η αμφοτερικίνη από μύκητες. Επίσης στα θρεπτικά προστέθηκε και L-Γλουταμίνη 2 mm ως πηγή ενέργειας αλλά και ως πηγή αζώτου. Όλες οι καλλιέργειες πραγματοποιήθηκαν σε 37 ο C, 5% CO 2 και 100% υγρασία. Υλικά και Διαλύματα Θρεπτικό μέσο Ham s F12 για κύτταρα C6: Ham s F12 Πενικιλλίνη-στρεπτοµυκίνη Γενταμυκίνη Αμφοτερικίνη L-γλουταµίνη Πλήρες θρεπτικό μέσο για τα C6: Ham s F12 Ορός βοός (fetal bovine serum) 500ml 100 ΙU/ml 50 μg/ml 2,5μg/ml 2,5mM 45ml 5ml Θρεπτικό μέσο Dulbecco s modified Eagle medium (DMEM) για κύτταρα CHO: DMEM 500ml Πενικιλλίνη-στρεπτοµυκίνη 100 ΙU/ml Γενταμυκίνη 50 μg/ml Αμφοτερικίνη 2,5μg/ml L-γλουταµίνη 2,5mM 52

64 Υλικά και Μέθοδοι Πλήρες θρεπτικό μέσο για τα CHO: Dulbecco s modified Eagle medium (DMEM) Ορός βοός(fetal bovine serum) Αποστειρωμένο PBS (1X) ph : Na 2 HPO 4 KH 2 PO 4 NaCl ΚCl 45ml 5ml 10mM 2mM 137mM 2.7mM Trypsin/EDTA solution 0.025% trypsin and 0.01% EDTA in PBS 100ml 3.3. Μέτρηση κυττάρων σε αιματοκυτταρόμετρο Neubauer Είναι η πιο άμεση, απλή και αποδοτική μέθοδος μέτρησης κυττάρων που βρίσκονται σε εναιώρημα. Το αιματοκυτταρόμετρο (Εικόνα Μ1) είναι μια τροποποιημένη και διαβαθμισμένη αντικειμενοφόρος πλάκα, που περιέχει δυο κατάλληλα επεξεργασμένες λείες επιφάνειες. Εικόνα Μ1. Πλακίδιο Neubauer. Παρουσιάζεται σχηματικά ο τρόπος υπολογισμού των κυττάρων. 53

65 Υλικά και Μέθοδοι Κάθε μια από αυτές έχει ένα τετράγωνο πλέγμα, το οποίο αποτελείται από 9 κύρια τετράγωνα με μήκος πλευράς 1mm(συνεπάγεται ότι το εμβαδόν του τετραγώνου είναι 1mm 2 ). Το κάθε ένα από αυτά τα τετράγωνα ορίζεται από τρεις παράλληλες γραμμές που απέχουν μεταξύ τους 2.5 μm, που χρησιμοποιούνται για τον καθορισμό του εάν τα κύτταρα θα θεωρηθούν ότι βρίσκονται μέσα ή έξω από πλέγμα. Επίσης κάθε ένα από τα κύρια τετράγωνα έχει επιπλέον διαβαθμίσεις για να διευκολύνεται η μέτρηση των κυττάρων. Το επίπεδο του πλέγματος βρίσκεται 0.1 mm χαμηλότερα από δύο «ράχες» στις οποίες στηρίζεται η καλυπτρίδα. Υπάρχει μια κοίλη επιφάνεια μεταξύ της εξωτερικής πλευράς κάθε τετραγωνισμένης λείας επιφάνειας και των σημείων που στηρίζεται η καλυπτρίδα. Στην κοίλη αυτή επιφάνεια μεταφέρεται το κυτταρικό εναιώρημα, το οποίο με τριχοειδικά φαινόμενα απλώνεται στην τετραγωνισμένη επιφάνεια. Ο όγκος του κυτταρικού εναιωρήματος που θα καλύπτει ένα από τα εννέα τετράγωνα είναι 0,1 mm 3 (1,0 mm 2 x 0,1 mm) ή 1 x 10-4 ml. Έτσι, η συγκέντρωση των κυττάρων στο αρχικό εναιώρημα (σε κύτταρα / ml) είναι: Ο μέσος όρος από τα 2 κεντρικά τετράγωνα Χ Κατάψυξη Κυττάρων Η κατάψυξη των ζωικών κυττάρων για μεγάλο χρονικό διάστημα είναι δυνατή με τη διατήρησή τους σε υγρό άζωτο, σε θερμοκρασίες μεταξύ C και C. Για να είναι επιτυχής η διατήρηση των κυττάρων, θα πρέπει τα κύτταρα να βρίσκονται σε καλή μεταβολική κατάσταση πριν από την ψύξη τους και για το λόγο αυτό η ψύξη των κυττάρων πραγματοποιείται όταν τα κύτταρα έχουν καλύψει 80-90% της επιφάνειας του τρυβλίου. Επιπλέον, η ψύξη των κυττάρων είναι σημαντικό να πραγματοποιηθεί βαθμιαία (περίπου 1 0 C ανά ώρα) μέχρι η θερμοκρασία τους να φτάσει ένα κρίσιμο σημείο (-20 0 C), προκειμένου να αποφευχθεί ο σχηματισμός πάγου ο οποίος μπορεί να τα καταστρέψει και να ελαχιστοποιηθεί η απώλεια νερού. Για το λόγο αυτό χρήσημοποιείται μιας συσκευή με υποδοχές, η οποία περιέχει ισοπροπανόλη, ενώ επίσης για να αποφευχθεί ο σχηματισμός πάγου στο εσωτερικό των κυττάρων, αυτά καταψύχονται παρουσία διμέθυλου-σουλφοξείδιου (DMSO) ή γλυκερόλης. Η διαδικασία της κατάψυξης έχει ως εξής: 54

66 Υλικά και Μέθοδοι 1. Αποκόλληση των κυττάρων με τρυψίνη (όπως αναφέρθηκε στη διαδικασία της ανακαλλιέργειας). 2. Φυγοκέντρηση για 5 στα 500g σε θερμοκρασία δωματίου. 3. Ενώ πραγματοποιείται η φυγοκέντρηση, προστίθενται σε ένα cryovial 50 μl DMSO. Στο cryovial σημειώνεται ο κυτταρικός τύπος, η γενιά που θα είναι τα κύτταρα όταν ξεπαγώσουν και η ημερομηνία ψύξης. 4. Μετά την ολοκλήρωση της φυγοκέντρησης αφαιρούμε το υπερκείμενο θρεπτικό μέσο και προσθέτουμε 950μl ορού για να επαναιωρήσουμε το ίζημα των κυττάρων. 5. Προσθήκη του εναιωρήματος των κυττάρων στο cryovial που περιέχει τα 50μl DMSO και στη συνέχεια ακολουθεί πολύ καλή ανάδευση για να γίνει ομοιογενές το διάλυμα. 6. Ακολουθεί άμεση μεταφορά στο δοχείο ψύξης των κυττάρων με ισοπροπανόλη. Οι κινήσεις πρέπει να είναι σύντομες, γιατί το DMSO είναι τοξικό για τα κύτταρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η τελική συγκέντρωση του DMSO δεν πρέπει να υπερβαίνει το 20% στο τελικό διάλυμα για να αποφευχθούν προβλήματα τοξικότητας. 7. Τοποθέτηση του δοχείου ψύξης των κυττάρων στους C για 24 ώρες. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται η σταδιακή μείωση της θερμοκρασίας (περίπου 1 0 C ανά ώρα). 8. Τέλος τοποθετούμε το cryovial με τα κύτταρα σε ειδικές υποδοχές στο υγρό άζωτο, έως ότου απαιτηθεί η επαναχρησιμοποίησή τους. Υλικά και διαλύματα Τα υλικά που χρησιμοποιούνται στην ανωτέρω διαδικασία είναι τα εξής: DMSO (dimethylsulfoxide, διμέθυλο-σουλφοξύδιο). Πλήρες θρεπτικό μέσο για τα εκάστοτε κύτταρα. Ορός νεογέννητου βοός (fetal bovine serum, FBS). Ειδικά φιαλίδια για την ψύξη των κυττάρων (cryovials). Δοχείο ψύξης κυττάρων με ισοπροπανόλη. Δοχείο dewar με υγρό άζωτο και ειδικές υποδοχές για την αποθήκευση των φιαλιδίων με τα κύτταρα. 55

67 Υλικά και Μέθοδοι 3.5.Απόψυξη Κυττάρων Τα κύτταρα που είναι αποθηκευμένα στο υγρό άζωτο είναι δυνατόν να επανακαλλιεργηθούν. Η διαδικασία της απόψυξης των κυττάρων, τα οποία έχουν παραμείνει παγωμένα ακόμα και για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα, γίνεται υπό άσηπτες συνθήκες και όσο το δυνατόν ταχύτερα, προκειμένου να μειωθεί χρονικά η έκθεση των κυττάρων στο DMSO, το οποίο δρα τοξικά σε θερμοκρασία δωματίου. Η διαδικασία ξεπαγώματος των κυττάρων έχει ως εξής: 1. Σε δοκιμαστικό σωλήνα των 15 ml προστίθενται 9 ml απλού θρεπτικού μέσου των συγκεκριμένων κυττάρων. 2. Αφαίρεση των κυττάρων από το υγρό άζωτο. 3. Σύντομο ξεπάγωμα με ανακίνηση σε υδατόλουτρο στους 37 0 C για 1-2 λεπτά. 4. Μεταφορά του εναιωρήματος των κυττάρων στo σωλήνα με τα 9 ml και γρήγορη ανάδευση. Το στάδιο αυτό αποσκοπεί στην αραίωση του DMSO στο θρεπτικό μέσο που βρίσκονται τα κύτταρα. 5. Φυγοκέντρηση στα 500 g για 5 λεπτά στους 26 0 C. 6. Αναρρόφηση του υπερκειμένου και προσθήκη 10ml πλήρους θρεπτικού για επαναιώρηση του ιζήματος. 7. Επανάληψη της φυγοκέντρησης. 8. Απομάκρυνση του υπερκείμενου θρεπτικού και επαναιώρηση του ιζήματος σε 10ml πλήρους θρεπτικού. 9. Μεταφορά των κυττάρων σε τρυβλίο κυτταροκαλλιέργειας. 10. Παρατήρηση στο μικροσκόπιο και μεταφορά σε θάλαμο επώασης όπου αναπτύσσονται τα κύτταρα. 11. Αλλαγή πλήρους θρεπτικού μέσου κάθε 3 ημέρες μέχρι τα κύτταρα να φθάνουν σε βαθμό επικάλυψης του τρυβλίου 80-90%. 56

68 Υλικά και Μέθοδοι Υλικά και διαλύματα Τα υλικά που χρησιμοποιούνται στην ανωτέρω διαδικασία είναι τα εξής: Θρεπτικό μέσο της κάθε κυτταρικής σειράς(περιγράφηκε νωρίτερα). Πλήρες θρεπτικό μέσο της κάθε κυτταρικής σειράς(περιγράφηκε νωρίτερα). Γυάλινες αποστειρωμένες πιπέτες Pasteur για την αναρρόφηση του θρεπτικού Απομόνωση πρωτεϊνών από καλλιέργειες ευκαρυωτικών κυττάρων Η μέθοδος αυτή της απομόνωσης των πρωτεϊνών εφαρμόζεται για την απομόνωση πρωτεϊνών από κυτταροκαλλιέργειες, παγωμένες και μη, στις περιπτώσεις που θα ακολουθήσει ανοσοκατακρήμνιση. Η διαδικασία αυτή ξεκινά με την λύση των κυττάρων με την χρήση κατάλληλου ρυθμιστικού διαλύματος. Κατά την διάρκεια της λύσης οι πρωτεΐνες μπορεί να υποστούν πρωτεόλυση, αποφωσφορυλίωση και μετουσίωση. Οι διαδικασίες αυτές που μπορούν να καταστρέψουν το πρωτεϊνικό εκχύλισμα μπορούν να επιβραδυνθούν σημαντικά αν τα δείγματα διατηρούνται σε πάγο ανά πάσα στιγμή και αν προστεθούν οι κατάλληλοι αναστολείς στο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Η διαδικασία λαμβάνει χώρα ως εξής: 1. Απομάκρυνση υπό κενό του θρεπτικού μέσου της καλλιέργειας με την βοήθεια γυάλινης πιπέτας Pasteur. 2. Έκπλυση των κυττάρων 3 φορές με PBS 1x στους 4 0 C. 3. Προσθήκη 600 μl ψυχρού διαλύματος RIPA ανά τρυβλίο 100 mm ή 300 μl ψυχρού διαλύματος RIPA ανά τρυβλίο 60 mm, στους 4 0 C. 4. Παραμονή των τρυβλίων στους 4 0 C σε οριζόντια θέση για χρόνο 10 λεπτών, ώστε να μεγιστοποιηθεί η ποσότητα των εκχυλιζόμενων πρωτεϊνών. Το διάλυμα RIPA πρέπει να καλύπτει ιδανικά το τρυβλίο αλλιώς πρέπει να πραγματοποιούνται τακτικές αναδεύσεις των τρυβλίων. 57

69 Υλικά και Μέθοδοι 5. Λύση των κυττάρων με μηχανικό τρόπο (cell scraper) σε πάγο. 6. Μεταφορά του ομογενοποιήματος σε σωληνάρια φυγοκέντρου. 7. Φυγοκέντρηση στα g για 30 λεπτά στους 4 0 C. 8. Μεταφορά του υπερκειμένου σε νέο σωληνάριο φυγοκέντρου. 9. Ακολουθεί προσδιορισμός ολικών πρωτεϊνών στο υπερκείμενο με τη μέθοδο Bradford η οποία θα αναλυθεί παρακάτω. Υλικά και διαλύματα Τα υλικά που χρησιμοποιούνται στην ανωτέρω διαδικασία είναι τα εξής: Αποστειρωμένο PBS (1X) ph : Na 2 HPO 4 KH 2 PO 4 NaCl ΚCl 10mM 2mM 137mM 2.7mM Διάλυμα RIPA (Radio Immunoprecipitation Assay buffer) NaCl 150 mm Triton X % sodium deoxycholate 0.5% SDS (sodium dodecyl sulphate) 0.1% 50 mm Tris, ph 8.0 PMSF 1 mm (αναστολέας πρωτεασών σερίνης) EDTA 5 mm (αναστολέας μεταλλοπρωτεασών) Απροτινίνη 1μg/ml (αναστολέας πρωτεασών σερίνης) Na 3 VO 4 20 nm (αναστολέας τυροσινικής φωσφατάσης) Το διάλυμα RIPA διατηρείται για καιρό στους 4 0 C και κάθε φορά προσθέτουμε τους διάφορους αναστολείς. 58

70 Υλικά και Μέθοδοι 3.7.Προσδιορισμός της συγκέντρωσης ολικών πρωτεϊνών σε διάλυμα (Μέθοδος Bradford) Η μέθοδος Bradford είναι μία από τις πολύ απλές μεθόδους που χρησιμοποιούνται συνήθως για τον προσδιορισμό της συνολικής συγκέντρωσης πρωτεΐνης ενός δείγματος. Η μέθοδος βασίζεται στην αναλογική σύνδεση της χρωστικής Coomassie G-250 στα βασικά αμινοξέα των πρωτεΐνων. Οπότε όσο περισσότερη πρωτείνη υπάρχει στο διάλυμα τόσο περισσότερη χρωστική δεσμεύεται και καθώς η μέθοδος είναι χρωματομετρική όσο αυξάνει η συγκέντρωση της πρωτεΐνης, τόσο το χρώμα του δείγματος γίνεται πιο σκούρο. Η χρωστική Coomassie G-250 απορροφά στα 595 nm. Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης ενός δείγματος προσδιορίζεται μέσω της σύγκρισης με εκείνης μιας σειράς προτύπων πρωτεΐνης που είναι γνωστό ότι παρουσιάζουν ένα γραμμικό προφίλ απορρόφησης. Αν και μπορούν να χρησιμοποιηθούν διαφορετικά πρότυπα πρωτεΐνης, επιλέγεται το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο πρότυπο που είναι η Αλβουμίνη ορού βοοειδών (BSA). Η αλβουμίνη πρέπει να είναι διαλυμένη στο ίδιο διάλυμα που είναι και οι πρωτεΐνες, των οποίων η συγκέντρωση υπολογίζεται. Η διαδικασία του προσδιορισμού είναι η εξής: 1. Προσθήκη 2 μl εκχυλίσματος κυτταροκαλλιέργειας σε 998 μl διαλύματος Bradford αντίστοιχα. 2. Έντονη ανάδευση σε αναδευτήρα τύπου vortex. 3. Επώαση των δειγμάτων για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 4. Φωτομέτρηση των δειγμάτων στα 595 nm. 5. Υπολογισμός της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών στο δείγμα, μέσω της πρότυπης καμπύλης της αλβουμίνης (BSA). 6. Μεταφορά ποσότητας πρωτεΐνης 3 mg σε σωληνάρια φυγοκέντρου για πειράματα ανοσοκατακρήμνισης με αντισώματα έναντι συγκεκριμένων πρωτεϊνών. 59

71 Υλικά και Μέθοδοι 3.8. Ανοσοκατακρήμνιση Η ανοσοκατακρήμνιση είναι μία μέθοδος που επιτρέπει τον καθαρισμό μιας πρωτεΐνης από ένα διάλυμα. Ένα αντίσωμα λοιπόν, ειδικό για την πρωτεΐνη ενδιαφέροντος, επωάζεται με ένα κυτταρικό εκχύλισμα και επιτρέπεται έτσι η σύνδεσή του με την πρωτεΐνη στο διάλυμα. Το σύμπλοκο αντισώματος / αντιγόνου στη συνέχεια μπορεί να απομονωθεί από το διάλυμα χρησιμοποιώντας σφαιρίδια αγαρόζης τα οποία είναι συζευγμένα με πρωτεΐνη Α ή G. Με τη χρήση τους δημιουργείται ένα σύμπλοκο σφαιριδίων-πρωτεΐνης Α/G-αντισώματος, στο οποίο δεσμεύεται επιλεκτικά το αντιγόνο που θέλουμε να κατακρημνίσουμε. Το σύμπλοκο αυτό απομονώνεται με φυγοκέντρηση και οι πρωτεΐνες που υπάρχουν σε αυτό αποδεσμεύονται με τη χρήση αποδιατακτικών παραγόντων. Το δείγμα μπορεί στη συνέχεια να διαχωριστεί με SDS-PAGE για ανάλυση κατά Western. Το ενδιαφέρον της μεθόδου είναι ότι και πρωτεΐνες που φυσιολογικά αλληλεπιδρούν με την αρχική, επίσης δεσμεύονται στο ίδιο σύμπλοκο. Το γεγονός αυτό καθιστά τη μέθοδο χρήσιμη για μελέτες αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών. Η διαδικασία της ανοσοκατακρήμνισης ακολουθεί: 1. Μεταφορά της ποσότητας πρωτεΐνης που θα ανοσοκατακρημνισθεί σε σωληνάρια(eppendorf) των 1.5 ml αφού προηγηθεί προσδιορισμός της συγκέντρωσης με την μέθοδο Bradford. 2. Προσθήκη του κατάλληλου αντισώματος σε ποσότητα ανάλογη με την ποσότητα της πρωτεΐνης. 3. Ψυχρό διάλυμα PBS 1x προστίθεται μέχρι ο όγκος του μίγματος να είναι ο ίδιος σε όλα τα δείγματα. Η διαδικασία αυτή γίνεται για να υπάρχει η ίδια κινητική δέσμευσης της πρωτεΐνης. 4. Ανάδευση για 16 ώρες στους 4 0 C. Στο στάδιο αυτό πραγματοποιείται η δέσμευση του αντισώματος στην αντίστοιχη πρωτεΐνη. 5. Προσθήκη στα σωληνάρια 15 μ l (για 1 μg αντισώματος) εναιωρήματος σφαιριδίων πρωτεΐνης Α και πρωτεΐνης G. 6. Επώαση των δειγμάτων για 2 ώρες στους 4 0 C υπό ανάδευση. Στο στάδιο αυτό πραγματοποιείται η δέσμευση του συμπλόκου πρωτεΐνηςαντισώματος με τα σφαιρίδια. 60

72 Υλικά και Μέθοδοι 7. Φυγοκέντρηση στα g για 5 λεπτά σ τ ους 4 0 C. 8. Απόρριψη του υπερκειμένου. 9. Προσθήκη 1 ml ψυχρού PBS 1x ανά σωληνάριο (επαναιώρηση των σφαιριδίων). 10. Η φυγοκέντρηση και η απόρριψη του υπερκειμένου επαναλαμβάνονται ακόμα 2 φορές. 11. Στο ίζημα των σφαιριδίων που έχει απομείνει προστίθενται 50 μl διαλύματος λύσης(2x) με 10% DTT ή β-μερκαπτοαιθανόλη. 12. Τα σωληνάρια θερμαίνονται στους C για 5 λεπτά. Στα στάδια 11-12, λαμβάνει χώρα η αποδέσμευση των πρωτεϊνών από τα σφαιρίδια. 13. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα g για 1 λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου. 14. Μεταφορά του υπερκειμένου σε νέα σ ωληνάρια φυγοκέντρου. Απόρριψη των σφαιριδίων. 15. Ανάλυση των δειγμάτων σε Western blot. Υλικά και διαλύματα Τα υλικά που χρησιμοποιούνται στην ανωτέρω διαδικασία είναι τα εξής: Αποστειρωμένο PBS (1X) ph : Na 2 HPO 4 KH 2 PO 4 NaCl ΚCl 10mM 2mM 137mM 2.7mM Εναιώρημα σφαιριδίων αγαρόζης με πρωτεΐνη A (Calbiochem, Cat. No. IP02) Εναιώρημα σφαιριδίων αγαρόζης με πρωτεΐνη G (Calbiochem, Cat. No. IP04) 61

73 Υλικά και Μέθοδοι (2x) διάλυμα δειγμάτων(sample loading buffer) Tris-HCl ph M SDS 0.03 M Γλυκερόλη 10% κ.ό. Κυανούν της βρωμοφαινόλης 2% κ.ό. β-μερκαπτοαιθανόλη ή DTT 10% κ.ό.(dtt ή β-μερκαπτοαιθανόλη προστίθεται λίγο πριν τη χρήση) Αντισώματα Πρωτεΐνη Εταιρία Κωδικός Ποσότητα RPTPβ/ζ Santa Cruz C-19 3 μg/3 mg πρωτεΐνης IgG Sigma I ,5μg/3 mg πρωτεΐνης Πίνακας 1. Στις στήλες από αριστερά προς τα δεξιά αναγράφεται η πρωτεΐνη έναντι της οποίας πραγματοποιήθηκε η ανοσοκατακρήμνιση, η εταιρία παραγωγής, ο κωδικός του προϊόντος και η ποσότητα του αντισώματος που χρησιμοποιήθηκε ανά mg πρωτεΐνης. 3.9.Ανάλυση πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακριλαμιδίου με αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) Η τεχνική της ηλεκτροφόρησης που βασίζεται στη δυνατότητα μετακίνησης φορτισμένων μορίων μέσα σε ηλεκτρικά πεδία, προσφέρει έναν αναλυτικό τρόπο για να διαχωριστούν πρωτεΐνες. H ταχύτητα μετακίνησης (υ) της πρωτεΐνης (ή κάθε μορίου) σε ένα ηλεκτρικό πεδίο, εξαρτάται από την ένταση του ηλεκτρικού πεδίου (Ε), το καθαρό φορτίο της πρωτεΐνης (z) και το συντελεστή τριβής (f). Ο ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός γίνεται σχεδόν πάντα σε πήκτωμα και όχι σε διάλυμα, επειδή το πήκτωμα λειτουργεί ως μοριακός ηθμός καθιστώντας έτσι ευκολότερους τους διαχωρισμούς μορίων κι επιπλέον καταστέλλει τα ρεύματα που δημιουργούνται από μικρές βαθμιδώσεις της θερμοκρασίας, προϋπόθεση απαραίτητη για σωστό διαχωρισμό μορίων. Το πήκτωμα της πολυακρυλαμίδης είναι ένα τρισδιάστατο πλέγμα από μακριές αλειφατικές αλυσίδες πολυακρυλαμίδης που ενώνονται μεταξύ τους με μόρια Ν-Ν μεθυλενο- διςακρυλαμίδης (MBA). Τα πηκτώματα πολυακρυλαμίδης είναι τα καταλληλότερα για 62

74 Υλικά και Μέθοδοι ηλεκτροφόρηση γιατί αποτελούνται από χημικά ουδέτερες ενώσεις και σχηματίζονται εύκολα. Επίσης το μέγεθος των πόρων μπορεί να ρυθμιστεί με την επιλογή διαφορετικών συγκεντρώσεων ακρυλαμίδης και MBA. Τα μικρότερα μόρια μετακινούνται πιο εύκολα διαμέσου των πόρων του πηκτώματος, ενώ τα μεγαλύτερα καθυστερούν. Μόρια ενδιαμέσου μεγέθους μετακινούνται με διαφορετικές ταχύτητες. Η πορεία που ακολουθείται έχει ως εξής: 1. Συναρμολόγηση της συσκευής του πηκτώματος. 2. Παρασκευή του πηκτώματος διαχωρισμού. Ανάλογα με το μοριακό βάρος της υπό εξέταση πρωτεΐνης, παρασκευάζεται πήκτωμα διαχωρισμού με συγκεκριμένη συγκέντρωση ακρυλαμιδίου. Η συγκέντρωση ακρυλαμιδίου αυξάνει όσο μειώνεται το μοριακό βάρος της υπό μελέτη πρωτεΐνης. Τα πηκτώματα που χρησιμοποιούνται στην παρούσα εργασία παρατίθενται στον Πίνακα Την παρασκευή του πηκτώματος και την προσθήκη του στη συσκευή ακολουθεί η προσθήκη 1-2 ml απεσταγμένου νερού. Το υπερκείμενο νερό διευκολύνει τη συμπαγή δομή του πηκτώματος και σταθεροποιεί την επάνω επιφάνειά του. 4. Μετά το πήξιμο του πηκτώματος διαχωρισμού απομακρύνεται το νερό και ακολουθεί η παρασκευή του πηκτώματος πακεταρίσματος. 5. Προσθήκη εξαρτήματος (χτενάκι) που χρησιμεύει στη δημιουργία θέσεων προσθήκης του δείγματος στο πήκτωμα πακεταρίσματος. Πυκνότητα πηκτώματος 17.5% 6.2% Απεσταγμένο H2O ml ml Ακρυλαμίδιο 30% ml 2.09 ml Tris-HCl 1.5M ph ml 2.5 ml 10% SDS 100 μl 100 μl 20% AMPS 100 μl 100 μl TEMED 10 μl 10 μl Πίνακας 2: Σύσταση των πηκτωμάτων διαχωρισμού. 63

75 Υλικά και Μέθοδοι 6. Παρασκευή του πηκτώματος πακεταρίσματος. Η συγκέντρωσή του εξαρτάται από τη συγκέντρωση του πηκτώματος διαχωρισμού. Η σύστασή του παρατίθεται στον Πίνακα Προσθήκη του πηκτώματος πακεταρίσματος στη συσκευή και αναμονή για τον πολυμερισμό του (10-20 λεπτά). 8. Σε αυτό το χρονικό διάστημα είναι εφικτή η προετοιμασία των δειγμάτων τα οποία συνήθως φυλάσσονται στους C. 9. Θέρμανση των δειγμάτων στους C για χρόνο 5 λεπτά. 10. Φυγοκέντρηση στα g για 1 λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου. Πυκνότητα πηκτώματος 3.5% 5% Απεσταγμένο H2O 2.45 ml 2.25 ml Ακρυλαμίδιο 30% ml 0.67 ml Tris-HCl 0.5M ph ml 1.0 ml 10% SDS 40 μl 40 μl 20% AMPS 40 μl 40 μl TEMED 4 μl 4 μl Πίνακας 3: Σύσταση πηκτωμάτων πακεταρίσματος. 11. Με την ολοκλήρωση του χρόνου πολυμερισμού του πηκτώματος πακεταρίσματος, απομακρύνεται το εξάρτημα (χτενάκι) και μεταφέρεται η συσκευή του πηκτώματος στη συσκευή ηλεκτροφόρησης. 12. Μεταφορά καθορισμένης ποσότητας ολικής πρωτεΐνης από κάθε δείγμα στις θέσεις-υποδοχές που έχουν σχηματισθεί στο πήκτωμα πακεταρίσματος. 13. Εφαρμογή σταθερής τάσης 100 Volt, με αποτέλεσμα τη μετακίνηση των δειγμάτων από τον αρνητικό στο θετικό πόλο του συστήματος. Η απόσταση που διανύει η κάθε πρωτεΐνη στο πήκτωμα διαχωρισμού είναι αντιστρόφως ανάλογη της μοριακής μάζας της. 64

76 Υλικά και Μέθοδοι 14. Με την ολοκλήρωση της ηλεκτροφόρησης, ακολουθεί ανάλυση κατά Western. Εικόνα Μ2:Σχηματική απεικόνιση διαδικασίας SDS-PAGE ηλεκτροφόρησης. Υλικά και διαλύματα Διάλυμα ακρυλαμιδίου 30% κ.β. Ακρυλαμίδιο Μεθυλενo-δις-ακρυλαμίδιο 30 g Προσθήκη απεσταγμένου νερού μέχρι ο τελικος όγκος να φτάσει στα 100 ml. Φιλτράρισμα του διαλύματος με την βοήθεια ειδικών φίλτρων. 1 g Tris-HCl 1.5M, ph 8.8 Tris-base g Απεσταγμένο νερό Αρχική προσθήκη 80 ml απεσταγμένου νερού, ρύθμιση του διαλύματος σε ph=8.8 και προσθήκη απεσταγμένου νερού μέχρι τελικού όγκου 100 ml. Tris-HCl 0.5M, ph 6.8 Tris-base g Απεσταγμένο νερό Αρχική προσθήκη 80 ml απεσταγμένου νερού, ρύθμιση του διαλύματος σε ph=6.8 και προσθήκη απεσταγμένου νερού μέχρι ο τελικός όγκος να φτάσει 100 ml. Διάλυμα δωδεκακυλοθειικού νατρίου (SDS) 10% κ.β. SDS 10 g Απεσταγμένο νερό Αρχική προσθήκη 80 ml απεσταγμένου νερού, θέρμανση στους 68 0 C και προσθήκη απεσταγμένου νερού μέχρι τελικού όγκου 100 ml. 65

77 Υλικά και Μέθοδοι Διάλυμα υπερθειϊκού αμμωνίου (AMPS) 20% κ.β. Υπερθειϊκό αμμώνιο 0,2g Απεσταγμένο νερό Προσθήκη 0,2g υπερθειϊκού αμμωνίου σε σωληνάριο(eppendorf) και προσθήκη απεσταγμένου νερού μέχρι το 1ml.Φύλαξη στους 4 0 C για διάστημα 1-2 εβδομάδων. Ν,Ν,Ν,Ν -Τετραμεθυλ-αιθυλεν-διαμίνη(N,N,N,N - Tetramethylenethylene-diamine, TEMED) Φύλαξη σε σκούρο μπουκάλι σε θερμοκρασία δωματίου (2x) διάλυμα δειγμάτων(sample loading buffer) Tris-HCl ph M SDS 0.03 M Γλυκερόλη 10% κ.ό. Κυανούν της βρωμοφαινόλης 2% κ.ό. β-μερκαπτοαιθανόλη ή DTT 10% κ.ό. Ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροδίων (5x) (Running Buffer) Γλυκίνη 2Μ Tris-base 0.25M SDS 0.02M Αραίωση του διαλύματος με απεσταγμένο νερό 1:5 πριν τη χρήση του Ανάλυση πρωτεϊνών κατά Western Η ανάλυση κατά Western είναι μία ευρέως χρησιμοποιούμενη τεχνική ανάλυσης που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση ειδικών πρωτεϊνών από ένα δεδομένο δείγμα ιστού ή εκχυλίσματος. Η τεχνική αυτή χρησιμοποιεί ηλεκτροφόρηση πηκτωμάτων για τον διαχωρισμό των μετουσιωμένων πρωτεϊνών με βάση το μήκος του πολυπεπτιδίου ενώ στην συνέχεια οι πρωτεΐνες μεταφέρονται σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης ή PVDF όπου και ανιχνεύονται χρησιμοποιώντας αντισώματα ειδικά για την κάθε πρωτεΐνη στόχος. Η διαδικασία λαμβάνει χώρα ως εξής: 66

78 Υλικά και Μέθοδοι 1. Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφορητικής ανάλυσης η οποία περιγράφηκε νωρίτερα, ακολουθεί τοποθέτηση του πηκτώματος διαχωρισμού σε κατάλληλη συσκευή(sandwich), για τη μεταφορά των πρωτεϊνών από το πήκτωμα σε μεμβράνη PVDF η οποία έχει προηγουμένως ενεργοποιηθεί με μεθανόλη. 2. Η μεταφορά πραγματοποιείται με εφαρμογή ομοιογενούς ηλεκτρικού πεδίου (ηλεκτρομεταφορά). Το πήκτωμα και η μεμβράνη εμβαπτίζονται σε ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς και εφαρμόζεται σταθερή ένταση ρεύματος 400 ma για χρόνο 3-4 ώρες, έτσι ώστε οι αρνητικά φορτισμένες πρωτεΐνες οι οποίες βρίσκονται στο πήκτωμα να μεταφερθούν στη μεμβράνη PVDF. Ο χρόνος της μεταφοράς είναι ανάλογος με το μοριακό μέγεθος των πρωτεϊνών που πρέπει να μεταφερθούν. Εικόνα Μ3:Σχηματική απεικόνιση της διαδικασίας μεταφοράς πρωτεϊνών σε μεμβράνη PVDF(transfer). 3. Μετά το τέλος της μεταφοράς, ακολουθεί εμβάπτιση της μεμβράνης σε ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T. Πραγματοποιούνται δύο ξεπλύματα των 5 λεπτών το καθένα υπό ανακίνηση, σε θερμοκρασία δωματίου. 4. Ακολουθεί κορεσμός των μη ειδικών θέσεων πρόσδεσης των αντισωμάτων (blocking) με επώαση της μεμβράνης σε ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T με 3% BSA ή 5% άπαχο γάλα, ανάλογα με το πρώτο αντίσωμα (Πίνακας 5). Η μεμβράνη και στις δύο περιπτώσεις επωάζεται υπό ανακίνηση για δύο ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. 5. Ακολουθεί απόχυση του παραπάνω διαλύματος και η μεμβράνη υφίσταται 3 ξεπλύματα των 5 λεπτών με διάλυμα TBS-T σε θερμοκρασία δωματίου. 67

79 Υλικά και Μέθοδοι 6. Επώαση πρώτου αντισώματος: Η μεμβράνη επωάζεται με ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T που περιέχει το πρώτο αντίσωμα σε κατάλληλη αραίωση (Πίνακας 4). Η επώαση πραγματοποιείται υπό ανακίνηση στους 4 0 C για 16 ώρες. 7. Απόχυση του διαλύματος του πρώτου αντισώματος (το διάλυμα φυλάσσεται στους C και μπορεί να επαναχρησιμοποιηθεί). Η μεμβράνη υφίσταται 3 ξεπλύματα των 5 λεπτών με διάλυμα TBS-T σε θερμοκρασία δωματίου. 8. Επώαση δευτέρου αντισώματος: Η μεμβράνη επωάζεται με ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T που περιέχει το δεύτερο αντίσωμα σε κατάλληλη αραίωση (Πίνακας 5). Η επώαση πραγματοποιείται υπό ανακίνηση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. 9. Απόχυση του διαλύματος του δευτέρου αντισώματος. Η μεμβράνη υφίσταται 5 ξεπλύματα των 5 λεπτών με TBS-T και 2 ξεπλύματα με TBS (για να απομακρυνθεί το Tween). 10. Το ανοσοαποτύπωμα της πρωτεΐνης στη μεμβράνη εμφανίζεται σε φιλμ με τη χρήση του συστήματος χημειοφωταύγειας (ECL) σε ειδικό σκοτεινό θάλαμο. Το ECL περιέχει το υπόστρωμα του ενζύμου horseradish peroxidase το οποίο είναι συζευγμένο με τα δεύτερα αντισώματα. Στην ενισχυμένη αντίδραση χημειοφωταύγειας η υπεροξειδάση καταλύει την οξείδωση της luminol σε ένα αντιδραστήριο το οποίο εκπέμπει φως όταν διασπάται παρουσία τροποποιημένων φαινολών. Υλικά και διαλύματα Ρυθμιστικό διάλυμα για τη συσκευή μεταφοράς πρωτεϊνών(transfer Buffer)(10x) Γλυκίνη 0.04 Μ Tris-base 0.05 M SDS 1 mm 68

80 Υλικά και Μέθοδοι Ρυθμιστικό διάλυμα για τη συσκευή μεταφοράς πρωτεϊνών(transfer Buffer)(1x) Transfer Buffer 10x Μεθανόλη Απεσταγμένο H 2 O 100 ml 200 ml 800 ml Ρυθμιστικό διάλυμα TBS ph 7.6 (10x) Tris-base 0.2 M NaCl 1.36 M Απεσταγμένο νερό Ρύθμιση του διαλύματος σε ph=7.6 και αραίωση του διαλύματος με απεσταγμένο νερό 1:10 πριν τη χρήση του. Ρυθμιστικό διάλυμα TBS-Tween 20, ph 7.6 (TBS-T) Ρυθμιστικό διάλυμα TBS (1x) Tween % κ.ό. Μεμβράνη PVDF (polyvinylidene fluoride) Millipore Immobilon-P Transfer Membrane Άπαχο γάλα σε σκόνη (Regilait) Αλβουμίνη ορού βοός (Bovine Serum Albumin, BSA) Σύστημα χημειοφωταύγειας Χρησιμοποιείται το ολοκληρωμένο σύστημα χημειοφωταύγειας από την Pierce (ECL detection kit) (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Πρώτα αντισώματα Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε ανάλυση πρωτεϊνών κατά Western παρατίθενται στον Πίνακα 4, ενώ στον Πίνακα 5 παρατίθενται οι συνθήκες για κάθε αντίσωμα. 69

81 Υλικά και Μέθοδοι Αντίσωμα PTN (H M01) RPTPβ/ζ (R ) αν (AB1930) β3 (N-20) VEGF(A-20) Προέλευση Μονοκλωνικό αντίσωμα, Abnova Μονοκλωνικό αντίσωμα, BD Transduction Laboratories Biosciences Πολυκλωνικό αντίσωμα, Chemicon Πολυκλωνικό αντίσωμα, Santa Cruz Πολυκλωνικό αντίσωμα, Santa Cruz Actin (2Q1055) Μονοκλωνικό αντίσωμα, Santa Cruz Πίνακας 4: Παράθεση των αντισωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση κατά Western. Στις στήλες από αριστερά αναγράφονται οι πρωτεΐνες, οι κωδικοί των αντισωμάτων και οι εταιρίες παραγωγής τους. Δεύτερα αντισώματα Τα δεύτερα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν είναι τα εξής: Anti-goat IgG (sc-2020, donkey) συνδεδεμένο με υπεροξειδάση (Santa Cruz) Anti-rabbit IgG (#7074, goat) συνδεδεμένο με υπεροξειδάση (Cell Signalling) Αnti-mouse IgG(#7074,horse) συνδεδεμένο με υπεροξειδάση(cell Signalling) Πρωτεΐνη Παρεμπόδιση μη ειδικής δέσμευσης 1ο Αντίσωμα 2ο Αντίσωμα PTN 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 1:1000 σε TBS-T a-mouse 1:5000 σε TBS-T (Cell Signalling) RPTPβ/ζ 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 1:500 σε TBS-T a-mouse 1:5000 σε TBS-T (Cell Signalling) αν 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 1:5000 σε TBS-T a-rabbit 1:2000 (Cell Signalling) β3 5% BSA σε TBS-T 1:500 σε TBS-T 2% άπαχο γάλα a-goat 1:5000 σε TBS- T 1% άπαχο γάλα (Santa Cruz) Actin 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 1:1000 σε TBS-T a-mouse 1:5000 σε TBS-T VEGF 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 1:250 σε TBS-T a-rabbit 1:2000 σε TBS-T (Cell Signalling) Πίνακας 5: Παράθεση των συνθηκών των αντισωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση κατά Western. Στις στήλες από αριστερά αναγράφονται οι πρωτεΐνες, οι συνθήκες παρεμπόδισης, της μη ειδικής δέσμευσης και επώασης του 1ου και του 2ου αντισώματος. 70

82 Υλικά και Μέθοδοι Διαδικασία αποδέσμευσης αντισώματος από PVDF μεμβράνη (stripping) Stripping είναι ο όρος που χρησιμοποιείται για να περιγράψει την απομάκρυνση του πρώτου και δεύτερου αντισώματος από μια Western blot μεμβράνη. H Διαδικασία αυτή της αποδέσμευσης είναι χρήσιμη όταν θέλει κανείς να διερευνήσει περισσότερες από μία πρωτεΐνες στην ίδια μεμβράνη, για παράδειγμα, μια πρωτεΐνη ενδιαφέροντος και ένας μάρτυρας φόρτωσης(ακτίνη). Η διαδικασία αποδέσμευσης δεν επηρεάζει τις πρωτεΐνες που βρίσκονται δεσμευμένες(με υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις) ισχυρά στην μεμβράνη. Αυτή η διαδικασία φυσικά έχει το πλεονέκτημα της εξοικονόμησης δειγμάτων, υλικών αλλά και χρόνου και έχει ως εξής: 1. Αφού ολοκληρωθεί στο σκοτεινό θάλαμο η εμφάνιση του ανοσοαποτυπώματος της πρωτεΐνης στο φιλμ ακολουθούν 3 επωάσεις των 5 λεπτών της μεμβράνης υπό ανακίνηση με ρυθμιστικό διάλυμα TBS- T. 2. Στη συνέχεια επωάζεται η μεμβράνη στο διάλυμα αποδέσμευσης των αντισωμάτων για 30 λεπτά σε θερμοκρασία C υπό ανακίνηση. 3. Ακολουθούν 6 επωάσεις των 5 λεπτών της μεμβράνης υπό ανακίνηση με ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T. 4. Τελικά πραγματοποιείται ξανά επώαση για την κάλυψη των ελεύθερων θέσεων της μεμβράνης(blocking) και επαναλαμβάνεται η διαδικασία ανάλυσης των πρωτεϊνών κατά Western. Υλικά και διαλύματα Διάλυμα αποδέσμευσης των αντισωμάτων από τη μεμβράνη 20 ml SDS 10% 12,5 ml Τris-HCΙ PΗ 6,8 0,5Μ 67,5 ml εξαιρετικά καθαρό νερό Προσθέστε 0,8 ml β-μερκαπτοαιθανόλης στον απαγωγό. 71

83 Υλικά και Μέθοδοι Ρυθμιστικό διάλυμα TBS-Tween 20, ph 7.6 (TBS-T) Ρυθμιστικό διάλυμα TBS (1x) Tween % κ.ό Ποσοτικοποίηση ανοσοαποτυπωμάτων Για να είναι δυνατή η εξαγωγή οποιονδήποτε ποσοτικών συμπερασμάτων από τα ανοσοαποτυπώματα των πρωτεϊνών, γίνεται μια επεξεργασία των film σε ειδικό πρόγραμμα του υπολογιστή. Αρχικά τα ανοσοαποτυπώματα ψηφιοποιούνται με την χρήση μηχανήματος σάρωσης και εν συνεχεία οι εικόνες επεξεργάζονται με το πρόγραμμα Scion Image(Scion Corporation). Το συγκεκριμένο λογισμικό είναι κατάλληλα προγραμματισμένο έτσι ώστε για κάθε ζώνη που περιγράφεται, να γίνεται υπολογισμός και καταγραφή αυτόματα σε ένα λογιστικό φύλλο η επιφάνεια της ζώνης και η μέση έντασή της. Το γινόμενο των δύο αυτών παραμέτρων είναι ανάλογο της ποσότητας της πρωτεΐνης που αντιστοιχεί σε κάθε ζώνη και χρησιμοποιείται περαιτέρω για ποσοτικές αναλύσεις Ανάπτυξη βακτηριακών κυττάρων σε στερεή και υγρή καλλιέργεια Μια μικροβιολογική καλλιέργεια, όπως για παράδειγμα η βακτηριακή καλλιέργεια, είναι μια μέθοδος πολλαπλασιασμού μικροβιακών οργανισμών, επιτρέποντάς τους να αναπαραχθούν σε προκαθορισμένα μέσα καλλιέργειας υπό ελεγχόμενες εργαστηριακές συνθήκες. Στο εργαστήριο συνήθως γίνεται καλλιέργεια βακτηρίων με σκοπό τελικά την παραγωγή και την απομόνωση μεγάλης ποσότητας πλασμιδιακού DNA το οποίο χρησιμοποιείται σε περαιτέρω πειράματα. Τα θρεπτικά μέσα που χρησιμοποιούνται στις βακτηριακές καλλιέργειες παρασκευάζονται κατά τέτοιο τρόπο ώστε να είναι αποστειρωμένα πριν από την χρησιμοποίησή τους έτσι ώστε να μην υπάρξει κίνδυνος ανάπτυξης μικροοργανισμών. Το μέσο ανάπτυξης θα πρέπει επίσης να παρέχει στην 72

84 Υλικά και Μέθοδοι βακτηριακή καλλιέργεια ότι είναι απαραίτητο για να ζήσει και να αναπτυχθεί. Όλα τα μέσα καλλιέργειας μπορούν να διαιρεθούν σε δύο βασικές κατηγορίες που είναι τα υγρά μέσα και τα στερεά. Η μόνη διαφορά μεταξύ αυτών των δύο κατηγοριών είναι ότι στο στερεό θρεπτικό μέσο υπάρχει το άγαρ πού το βοηθά να στερεοποιηθεί. Η διαδικασία καλλιέργειας των βακτηριακών κυττάρων σε στερεή αλλά και υγρή καλλιέργεια περιγράφεται παρακάτω: 1. Αρχικά κατασκευάζεται το θρεπτικό μέσο το οποίο περιέχει το άγαρ και τοποθετείται σε αυτόκαυστο για 20 λεπτά. 2. Αφού ολοκληρωθεί η αποστείρωση αφήνεται το θρεπτικό μέσο να φτάσει σε μια θερμοκρασία περίπου 55 0 C και προστίθεται αντιβιοτικό (αμπικιλλίνη) σε τελική συγκέντρωση 100 μg/ml. Η προσθήκη ενός αντιβιοτικού επιτρέπει την επιλογή μόνο εκείνων των βακτηρίων με την ειδική αντοχή στο αντιβιοτικό αυτό που συνήθως παρέχεται από ένα πλασμίδιο που φέρει το γονίδιο αντίστασης στο αντιβιοτικό. 3. Στην συνέχεια γίνεται απόχυση του θρεπτικού μέσου σε τρυβλία Petri με ιδιαίτερη προσοχή και αφήνονται τα τρυβλία για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου μέχρι το θρεπτικό να πήξει. 4. Στο σωληνάριο με τα παγωμένα βακτηριακά κύτταρα, εμβαπτίζεται αποστειρωμένος μικροβιολογικός κρίκος και εν συνεχεία επιστρώνονται τα βακτηριακά κύτταρα που μεταφέρει, με οφιοειδείς κινήσεις, στα τρυβλία με το στερεοποιημένο θρεπτικό μέσο. Τα τρυβλία επωάζονται ανεστραμμένα για 16 ώρες στους 37 0 C. 5. Την επόμενη ημέρα μονήρεις αποικίες βακτηρίων που αναπτύχθηκαν στη στερεή καλλιέργεια μεταφέρονται με τη βοήθεια αποστειρωμένου ακρορρυγχίου σε υγρό θρεπτικό μέσο ανάπτυξης βακτηριών (εμβολιασμός). Ο εμβολιασμός πραγματοποιείται σε αποστειρωμένα σωληνάρια των 50 ml με 20 ml υγρού θρεπτικού μέσου, παρουσία αμπικιλλίνης σε τελική συγκέντρωση 100μg/ml. Οι υγρές καλλιέργειες επωάζονται για 16 ώρες στους 37 0 C υπό συνεχή ανακίνηση. 73

85 Υλικά και Μέθοδοι Υλικά και διαλύματα Υγρό θρεπτικό μέσο για ανάπτυξη βακτηρίων LB (Luria-Bertani) medium Εκχύλισμα ζύμης 0.5% κ.β. Βακτο-τρυπτόνη 1% κ.β. NaCl 1% κ.β. Ανάδευση μέχρι να διαλυθούν. Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται με καυστικό νάτριο (NaOH) 1Μ στο 7.0 και το διάλυμα αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε C (αυτόκαυστο). Στερεό θρεπτικό μέσο για ανάπτυξη βακτηρίων LB-agar Άγαρ (bacto-agar) 1.5% κ.β. σε θρεπτικό μέσο LB Το διάλυμα αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε C (αυτόκαυστο) και αποχύνεται στα τρυβλία ανάπτυξης των βακτηρίων. Το θρεπτικό μέσο στερεοποιείται όταν η θερμοκρασία του φθάσει στους 40 0 C. Διάλυμα Αμπικιλλίνης 50 mg/ml σε απεσταγμένο νερό Το διάλυμα αποστειρώνεται με διοχέτευσή του μέσα από φίλτρο με πόρους διαμέτρου 0.2 μm Κατάψυξη βακτηριακών κυττάρων Η κατάψυξη βακτηριακών κυττάρων(glycerol stock) είναι σημαντική για τη μακροπρόθεσμη αποθήκευση των πλασμιδίων. Με αυτό τον τρόπο, όταν είναι απαραίτητη η απομόνωση περίσσοτερου πλασμιδιακού DNA, το πλασμίδιο θα είναι ήδη στο επιθυμητό βακτηριακό στέλεχος και δεν θα χρειαστεί να πραγματοποιηθεί εκ νέου μετασχηματισμός των κυττάρων. Τα βακτήρια σε ένα τρυβλίο με LB άγαρ μπορούν να αποθηκευτούν στους 4 C για μερικές εβδομάδες. Ωστόσο, για την αποθήκευση των βακτηρίων για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα, θα πρέπει να δημιουργηθούν αποθέματα γλυκερόλης. Η προσθήκη γλυκερόλης σταθεροποιεί τα κατεψυγμένα βακτήρια, εμποδίζοντας καταστροφή των μεμβρανών των κυττάρων και άρα διατήρηση των κυττάρων εν ζωή. Ένα βακτηριακό απόθεμα γλυκερόλης μπορεί να αποθηκευτεί σταθερά στους C για πολλά χρόνια. Η διαδικασία περιγράφεται παρακάτω: 74

86 Υλικά και Μέθοδοι 1. Επιστρώνεται τρυβλίο ανάπτυξης βακτηρίων με στερεό θρεπτικό μέσο (LBάγαρ) και αφήνεται σε θερμοκρασία δωματίου να στερεοποιηθεί. 2. Πραγματοποιείται εμβολιασμός του με βακτηριακά κύτταρα και επώαση στους 37 0 C για 16 ώρες, παρουσία αντιβιοτικών. 3. Πραγματοποιείται εμβολιασμός μονήρους αποικίας σε αποστειρωμένο σωληνάριο των 50 ml με 20 ml υγρού θρεπτικού μέσου και επώαση στους 37 0 C υπό ανάδευση για 16 ώρες, παρουσία αντιβιοτικών. 4. Σε κρυοφιαλίδιο των 2 ml προσθέστε 500μl από την ολονύκτια αυτή καλλιέργεια καθώς και 500μl διαλύματος γλυκερόλης (50%). 5. Έντονη ανάδευση σε αναδευτήρα τύπου vortex. 6. Άμεση κατάψυξη (-80 0 C). Υλικά και διαλύματα Στερεό θρεπτικό μέσο για ανάπτυξη βακτηρίων LB-agar Άγαρ (bacto-agar) 1.5% κ.β. σε θρεπτικό μέσο LB Το διάλυμα αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε C (αυτόκαυστο) και αποχύνεται στα τρυβλία ανάπτυξης των βακτηρίων. Το θρεπτικό μέσο στερεοποιείται όταν η θερμοκρασία του φθάσει στους 40 0 C. Υγρό θρεπτικό μέσο LB (Luria-Bertani) για ανάπτυξη βακτηρίων Εκχύλισμα ζύμης 0.5% κ.β. Βακτο-τρυπτόνη 1% κ.β. NaCl 1% κ.β. Ανάδευση μέχρι να διαλυθούν. Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται με καυστικό νάτριο (NaOH) 1Μ στο 7.0 και το διάλυμα αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε C (αυτόκαυστο). Διάλυμα αποστειρωμένης γλυκερόλης Διάλυμα γλυκερόλης αποστειρώνεται για 20 min σε C (αυτόκαυστο). 75

87 Υλικά και Μέθοδοι 3.15.Μετασχηματισμός δεκτικών βακτηριακών κυττάρων (transformation) Μετασχηματισμός (transformation) ονομάζεται η εισαγωγή του υπό μελέτη πλασμιδίου στα δεκτικά βακτήρια. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε εισαγωγή πλασμιδιών που φέρουν τη γονιδιακή αλληλουχία της β3 υπομονάδας της ιντεγκρίνης (wtβ3) καθώς και του πλασμιδίου-φορέα pcdna3.1., σε κύτταρα Escherichia coli του στελέχους BL21 που έχουν υποστεί κατάλληλες διεργασίες(επαναιώρηση σε διάλυμα CaCl 2 ) για να είναι δεκτικά στην εισαγωγή ξένου DNA. Τα πλασμίδια που φέρουν τη γονιδιακή αλληλουχία της ιντεγκρίνης β3 (wtβ3) μας δόθηκαν από την Δρ. Nelly Kieffer στο CNRS/LIA124, Shangai, China. 1. Σωληνάριο που περιέχει 350 μl δεκτικών βακτηρίων μεταφέρεται από τους C σε πάγο. Είναι σημαντικό η θερμοκρασία των βακτηριακών κυττάρων να μην υπερβεί τους 0 0 C. 2. Μεταφέρονται 50 μl των βακτηρίων σε αποστειρωμένο σωληνάριο, το οποίο έχει τοποθετηθεί στον πάγο 5 λεπτά πριν από τη χρήση του. 3. Προσθήκη 5 μl πλασμιδιακού DNA. 4. Πραγματοποιείται ήπια ανάδευση με το χέρι (flicking). 5. Το σωληνάριο επωάζεται στον πάγο για 30 λεπτά. 6. Στη συνέχεια μεταφέρεται σε υδατόλουτρο με θερμοκρασία 42 0 C. Επωάζεται εκεί για 90 δευτερόλεπτα. 7. Αμέσως μεταφέρεται στον πάγο, όπου επωάζεται για 2 λεπτά. 8. Σε αποστειρωμένο σωληνάριο των 15 ml που περιέχει 1 ml υγρού θρεπτικού μέσου SOC προστίθεται το εναιώρημα των κυττάρων. Το SOC είναι ένα μέσον μικροβιακής ανάπτυξης που χρησιμοποιείται για τον μετασχηματισμό δεκτικών κυττάρων (E.coli). Αυτό το πλούσιο σε θρεπτικά συστατικά μέσο μεγιστοποιεί την αποτελεσματικότητα του μετασχηματισμού των δεκτικών κυττάρων. 9. Ακολουθεί επώαση στους 37 0 C για 1 ώρα υπό ανάδευση. 76

88 Υλικά και Μέθοδοι 10. Παρασκευάζεται τρυβλίο με στερεό θρεπτικό μέσο για την ανάπτυξη των βακτηρίων. Στο θρεπτικό μέσο λίγο πριν αλλά και μετά τον πολυμερισμό του, προστίθεται κατάλληλο αντιβιοτικό. Στην περίπτωσή του pcdna3.1. φορέα χρησιμοποιείται αμπικιλλίνη (0.1 mg/ml). 11. Πραγματοποιείται μεταφορά των βακτηρίων σε αποστειρωμένο σωληνάριο(eppendorf). 12. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα g για 6 λεπτά, απόρριψη του υπερκειμένου και επαναιώρηση των κυττάρων σε 40 μl υγρού θρεπτικού μέσου LB. 13. Επίστρωση του εναιωρήματος των βακτηρίων στο κατάλληλο στερεό θρεπτικό μέσο και τοποθέτηση του τελευταίου ανεστραμμένο σε επωαστικό θάλαμο με θερμοκρασία 37 0 C για 16 ώρες. 14. Το τρυβλίο ελέγχεται μακροσκοπικά για την ανάπτυξη αποικιών βακτηρίων ανθεκτικών στην αμπικιλλίνη. Υλικά και διαλύματα Υγρό θρεπτικό μέσο LB (Luria-Bertani) για ανάπτυξη βακτηρίων Εκχύλισμα ζύμης 0.5% κ.β. Βακτο-τρυπτόνη 1% κ.β. NaCl 1% κ.β. Ανάδευση μέχρι να διαλυθούν. Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται με καυστικό νάτριο (NaOH) 1Μ στο 7.0 και το διάλυμα αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε C (αυτόκαυστο). Στερεό θρεπτικό μέσο για ανάπτυξη βακτηρίων LB-agar Άγαρ (bacto-agar) 1.5% κ.β. σε θρεπτικό μέσο LB Το διάλυμα αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε C (αυτόκαυστο) και αποχύνεται στα τρυβλία ανάπτυξης των βακτηρίων. Το θρεπτικό μέσο στερεοποιείται όταν η θερμοκρασία του φθάσει στους 40 0 C. Υγρό θρεπτικό μέσο SOB για ανάπτυξη βακτηρίων Βακτο-τρυπτόνη 2% κ.β. Εκχύλισμα ζύμης 0.5% κ.β. NaCl 0.05% 77

89 Υλικά και Μέθοδοι KCl 2.5 mm MgCl2 10 mm Ανάδευση όλων πλην του MgCl2 μέχρι να διαλυθούν. Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται με καυστικό νάτριο (NaOH) 1Μ στο 7.0 και το διάλυμα αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε C (αυτόκαυστο). Το διάλυμα διατηρείται στους 4 0 C και λίγο πριν τη χρήση του, γίνεται προσθήκη αποστειρωμένου διαλύματος MgCl2 μέχρι τελικής συγκέντρωσης 10 mm. Υγρό θρεπτικό μέσο SOC για ανάπτυξη βακτηρίων Γλυκόζη 1Μ SOB Προσθήκη στο SOB 20 ml αποστειρωμένου διαλύματος γλυκόζης 1Μ ανά λίτρο καλλιέργειας. Το διάλυμα της γλυκόζης αποστειρώνεται με τη χρήση βακτηριοστατικού φίλτρου και το διάλυμα SOB πρέπει να βρίσκεται σε θερμοκρασία 60 0 C κατά την προσθήκη του διαλύματος γλυκόζης. Το διάλυμα διατηρείται στους 4 0 C. Διάλυμα αμπικιλλίνης 50 mg/ml σε απεσταγμένο νερό Το διάλυμα αποστειρώνεται με διοχέτευσή του μέσα από φίλτρο με πόρους διαμέτρου 0.2 μm Μικρής κλίμακας απομόνωση πλασμιδιακού DNA Για την απομόνωση πλασμιδιακού DNA από υγρή καλλιέργεια βακτηρίων E. Coli μετασχηματισμένων με το επιθυμητό πλασμίδιο, χρησιμοποιήθηκε το ολοκληρωμένο σύστημα NucleoSpin Plasmid DNA purification kit (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG Neumann-Neander-Str Düren Germany) όπως περιγράφεται παρακάτω: 1. Από βακτηριακή καλλιέργεια 20ml μεταφέρεται 1ml σε αποστειρωμένο σωληνάριο του 1,5ml και ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g.Με την ολοκλήρωση της φυγοκέντρησης απομακρύνεται το υπερκείμενο και συνεχίζεται η ίδια διαδικασία για άλλες δύο φορές. 2. Στη συνέχεια προστίθεται ένα ΕDTA φυσιολογικό διάλυμα Α1(250μl) το οποίο περιέχει και RNAse A για να γίνει καλή επαναιώρηση του ιζήματος 78

90 Υλικά και Μέθοδοι των βακτηριακών κυττάρων. Το EDTA χρησιμεύει ως χηλικός παράγοντας των δισθενών κατιόντων Ca 2+,Mg 2+ που χρειάζονται για την λειτουργία των ενδονουκλεασών. 3. Ακολουθεί η λύση των κυττάρων με την προσθήκη ενός διαλύματος Α2(250μl). Αμέσως μετά την προσθήκη του Α2 ακολουθεί αναστροφή του σωληναρίου 8 φορές και επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά. Η ανάδευση δεν γίνεται με ανακίνηση σε ειδικό μηχάνημα(vortex) για να αποφευχθεί η μόλυνση του λύματος με χρωμοσωμικό DNA ενώ επίσης η παραμονή σε αλκαλικές συνθήκες για πάνω από 5 λεπτά μπορεί να έχει το ίδιο αποτέλεσμα αλλά και να καταστρέψει το πλασμιδιακό DNA κατά μη αναστρέψιμο τρόπο. 4. Έπειτα προστίθενται 300μl από το διάλυμα Α3 που είναι ένα διάλυμα εξουδετέρωσης(neutralization buffer) και επαναλαμβάνεται αναστροφή του σωληναρίου 8 φορές. Το διάλυμα αυτό περιέχει οξικό κάλιο το οποίο προκαλεί το SDS να καθιζάνει ως KDS και κατακρημνίζει επίσης πρωτεΐνες, χρωμοσωμικό DNA και κυτταρικά θραύσματα. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα g για 10 λεπτά ώστε να καθιζάνουν όλα τα άχρηστα συστατικά που αναφέρθηκαν. Επίσης η παρουσία υδροχλωρικής γουανιδίνης δημιουργεί το κατάλληλο περιβάλλον για την δέσμευση του πλασμιδιακού DNA στη μεμβράνη πυριτίου που βρίσκεται μέσα στη στήλη(βήμα 5). 5. Στη συνέχεια τοποθετείται η κολόνα Nucleospin Plasmid σε ένα σωληνάριο συλλογής και το υπερκείμενο από το προηγούμενο βήμα ρίχνεται μέσα στην κολόνα. Σε αυτό το στάδιο πραγματοποιείται η δέσμευση του πλασμιδιακού DNA στην στήλη. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g και απομάκρυνση του διαλύματος που συλλέχθηκε στο σωληνάριο. 6. Προσθήκη 500μl από το διάλυμα AW το οποίο είναι προθερμασμένο στους 50 0 C έτσι ώστε να γίνει έκπλυση της στήλης για την απομάκρυνση διαφόρων πρωτεϊνικών καταλοίπων με επακόλουθη φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g και απομάκρυνση του διαλύματος που συλλέχθηκε στο 79

91 Υλικά και Μέθοδοι σωληνάριο. Επίσης το διάλυμα αυτό βοηθά στην καλύτερη δέσμευση του DNA στη μεμβράνη. 7. Εν συνεχεία γίνεται προσθήκη 600μl διαλύματος Α4 που περιέχει αιθανόλη και φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g με απόχηση του διαλύματος από το σωληνάριο συλλογής. To διάλυμα Α4 απομακρύνει υπολείμματα αλάτων. 8. Μετά ακολουθεί άλλη μια φυγοκέντρηση 2 λεπτά στα g και αφήνεται η στήλη να στεγνώσει για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου ώστε να εξατμιστούν κατάλοιπα αιθανόλης. Η παρουσία αιθανόλης εμποδίζει το DNA να ενυδατωθεί και να απελευθερωθεί από τη μεμβράνη πυριτίου κατά την έκλουση. 9. Τέλος, τοποθετείται η στήλη/κολώνα σε νέο σωληνάριο 1,5ml και προστίθεται διάλυμα ΑΕ(50μl) για να γίνει έκλουση του DNA από την στήλη. Επώαση της στήλης για 3 λεπτά και φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g. Το διάλυμα περιέχει το πλασμιδιακό DNA του οποίου η συγκέντρωση και η καθαρότητα υπολογίζονται εύκολα με φωτομέτρηση όπως περιγράφεται παρακάτω. Υλικά και διαλύματα NucleoSpin Plasmid στήλες μικρής κλίμακας Διάλυμα επαναιώρησης (Α1) με RNAάση (Resuspension Buffer Α1 with RNase A) Διάλυμα λύσης (Α2) (Lysis Buffer, Α2) SDS NaOH υδροξείδιο του Νατρίου % Διάλυμα εξουδετέρωσης (A3)(Neutralization Buffer A3) Υδροχλωρική γουανιδίνη % Οξικό Κάλιο KCH 3 COO 80

92 Υλικά και Μέθοδοι Διάλυμα έκπλυσης (ΑW)(Wash Buffer AW) Guanidine hydrochloride % isopropanol % Διάλυμα έκπλυσης με αιθανόλη (Α4)(Wash Buffer A4) 80%αιθανόλη Διάλυμα έκλουσης (ΑΕ)(Elution Buffer AE) 5 mm Tris/HCl, ph Προσδιορισμός της συγκέντρωσης DNA αλλά και της καθαρότητας του. Η πιο κοινή τεχνική για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης του DNA και της καθαρότητας είναι η μέτρηση της απορρόφησης. Είναι μια απλή μέθοδος και απαιτεί συνήθως διαθέσιμο εργαστηριακό εξοπλισμό. Το μόνο που χρειάζεται για τη μέθοδο της απορρόφησης είναι ένα φασματοφωτόμετρο εξοπλισμένο με μία λυχνία UV, UV-διαφανείς κυψελίδες και το διάλυμα DNA. Οι μετρήσεις απορρόφησης πραγματοποιούνται στα 260nm (Α260) όπου το DNA απορροφά το φως πιο έντονα, και ο αριθμός που δημιουργείται επιτρέπει να εκτιμηθεί η συγκέντρωση του διαλύματος. Η συγκέντρωση DNA υπολογίζεται από τον εξής τύπο: Συγκέντρωση DNA = Α 260nm x 50 x αραίωση Η συγκέντρωση δίνεται σε μg/ml. (Ο συντελεστής 50 εξάγεται από την παρατήρηση ότι ένα διάλυμα DNA, συγκέντρωσης 50µg/ml, έχει απορρόφηση 1 στα 260 nm). Ωστόσο, το DNA δεν είναι το μόνο μόριο που μπορεί να απορροφήσει φως στα 260 nm. Καθώς το RNA έχει μεγάλη απορρόφηση στα 260 nm ενώ επίσης και τα αρωματικά αμινοξέα που υπάρχουν σε πρωτεΐνες απορροφούν στα 280 nm, οι δύο αυτές προσμείξεις, αν υπάρχουν στο διάλυμα του DNA, θα συμβάλλουν στη συνολική μέτρηση στα 260nm. Αυτό σημαίνει ότι αν ο αριθμός Α260 χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό της συγκέντρωσης, η 81

93 Υλικά και Μέθοδοι ποσότητα του DNA μπορεί να υπερεκτιμηθεί. Για αυτό το λόγο υπολογίζεται η καθαρότητα του DNA κάθε δείγματος με τον υπολογισμό του λόγου της οπτικής απορρόφησης στα 260nm ως προς την οπτική απορρόφηση στα 280nm. Καλής ποιότητας DNA θα έχουν τα δείγματα που η αναλογία Α260 / Α280 είναι μεταξύ του 1,7-2, Μετασχηματισμός ευκαρυωτικών κυττάρων C6 Ο παροδικός μετασχηματισμός ευκαρυωτικών κυττάρων αφορά στην εισαγωγή ενός κυκλικού μορίου DNA (πλασμιδίου) στο κύτταρο και την έκφρασή του για μία ή λίγες γενιές. Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε παροδικός μετασχηματισμός καρκινικών κυττάρων C6 με πλασμίδιο που φέρει τη γονιδιακή αλληλουχία της ιντεγκρίνης β3 (wtβ3), καθώς και με το πλασμίδιο-φορέα. Το πλασμίδιο-φορέας που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή την περίπτωση, ήταν το pcdna3.1. Για την παροδική διαμόλυνση των C6 κυττάρων χρησιμοποιήθηκε το αντιδραστήριο jetpei ΤΜ. Το jetpei είναι ένα αποτελεσματικό όχημα παράδοσης για ολιγονουκλεοτίδια εξασφάλίζοντας την αποτελεσματική και επαναλήψιμη διανομή ολιγονουκλεοτιδίων με χαμηλή τοξικότητα. Το jetpei σχηματίζει σταθερά σύμπλοκα με τα ολιγονουκλεοτίδια και τα θετικώς φορτισμένα σωματίδια που προκύπτουν είναι ικανά να αλληλεπιδρούν με ανιονικές πρωτεογλυκάνες στην επιφάνεια του κυττάρου και να εισέλθουν στα κύτταρα με ενδοκυττάρωση. Η διαδικασία η οποία πραγματοποιείται σε θάλαμο νηματικής ροής υπό άσηπτες συνθήκες έχει ως εξής: 1. Πραγματοποιείται η διαδικασία της ανακαλλιέργειας, όπως περιγράφηκε νωρίτερα. Χρησιμοποιούνται ή κύτταρα ανά μικροπλακίδιο 6 κελιών ή 100 mm τρυβλίο αντίστοιχα, σε πλήρες θρεπτικό μέσο και γίνεται επώαση των κυττάρων για 24 ώρες. 2. Την επόμενη ημέρα πραγματοποιείται παρατήρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο. Τα κύτταρα θα πρέπει να έχουν καλύψει το 50-60% της επιφάνειας του τρυβλίου πριν τη διαμόλυνσή τους. 82

94 Υλικά και Μέθοδοι 3. Αφαίρεση του θρεπτικού μέσου και προσθήκη 2 ml ή 9 ml πλήρους θρεπτικού μέσου προθερμασμένου στους 37 0 C, σε μικροπλακίδιο 6 κελιών ή σε 100 mm τρυβλίο, αντίστοιχα. 4. Η αποτελεσματική είσοδος στα κύτταρα απαιτεί θετικά φορτισμένα σωματίδια. Η ιοντική ισορροπία λοιπόν μεταξύ των κατιόντων του jetpei και των ανιόντων των ολιγονουκλεοτίδιων θα πρέπει να είναι υπέρ των κατιόντων. Η αναλογία Ν/Ρ είναι ένα μέτρο της ιονικής ισορροπίας των συμπλοκών. Η αναλογία Ν/Ρ αντιστοιχεί σε αναλογία του αντιδραστηρίου jetpei ΤM προς το DNA, αναφορικά με μόρια αζώτου του αντιδραστηρίου προς μόρια φωσφόρου του DNA. Περίπου ένα στα τρία άτομα αζώτου του ΡΕΙ είναι κατιόν, ως εκ τούτου η ηλεκτροουδετερότητα του συμπλόκου jetpei /ολιγονουκλεοτιδίου επιτυγχάνεται για Ν/Ρ=2-3.Τα καλύτερα αποτελέσματα μετασχηματισμού λαμβάνονται για Ν/Ρ =3-5. Υπολογισμός των συμπλόκων: Ο παροδικός μετασχηματισμός πραγματοποιήθηκε με αναλογία Ν/Ρ=5 (N/P ratio=5). Δεδομένου ότι το διάλυμα jetpei ΤΜ, έχει συγκέντρωση 7.5 mm και 1 μg DNA περιέχει 3 nmoles φωσφορικά ανιόντα, η ποσότητα jetpei ΤΜ που χρησιμοποιείται υπολογίζεται από τον τύπο: μl από jetpei TM = [(μg DNA x 3) x N/P ratio]/7.5 Στα πειράματα παροδικής διαμόλυνσης κυττάρων C6 χρησιμοποιήθηκε ποσότητα 3μg DNA ανά μικροπλακίδιο 6 κελιών ή 7,5μg DNA ανά τρυβλίο 100 mm. 5. Προσθήκη του αντιδραστηρίου jetpei ΤΜ και της ποσότητας DNA σε σωληνάρια φυγοκέντρου, κάθε ένα από τα οποία περιέχει 100 μl ή 500 μl NaCl 150 mm, ανά μικροπλακίδιο 6 κελιών ή ανά τρυβλίο 100 mm αντιστοίχως. 6. Ελαφρά ανάδευση με αναδευτήρα τύπου vortex. 7. Προσθήκη του περιεχομένου του σωληναρίου με το jetpei TM, στο σωληνάριο με το DNA. Είναι απαραίτητη η ανάμιξη των συστατικών με αυτή τη φορά. 8. Άμεση ανάδευση σε αναδευτήρα τύπου vortex. 9. Επώαση του μίγματος για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 83

95 Υλικά και Μέθοδοι 10. Προσθήκη των 200μl ή των 1000μl από το μίγμα ανά μικροπλακίδιο 6 κελιών ή ανά τρυβλίο 100 mm και εν συνεχεία ήπια ανάδευση. 11. Επώαση των κυττάρων στον επωαστικό θάλαμο για 4 ώρες. 12. Αντικατάσταση του θρεπτικού μέσου με 2ml ή 10ml προθερμασμένου πλήρους θρεπτικού μέσου, ανά μικροπλακίδιο 6 κελιών ή ανά τρυβλίο 100 mm. 13. Επώαση των κυττάρων στον επωαστικό θάλαμο για 24 ώρες. 14. Ακολουθεί λύση των κυττάρων για απομόνωση πρωτεΐνης όπως περιγράφεται στην Παράγραφο 3.6 ή αντικατάσταση θρεπτικού μέσου με νέο χωρίς ορό για περαιτέρω πειράματα. Υλικά και διαλύματα Πλήρες θρεπτικό μέσο HAM s F12 90% Ορός βοός(fetal bovine serum) 10% jetpei TM (Polyplus Transfection, #101-10N) NaCl 150 mm 3.19.Διαμόλυνση κυττάρων με παρεμβαλλόμενο RNA (sirna, RNAi) Η μέθοδος του παρεμβαλλόμενου RNA (RNAi), έχει αναγνωριστεί ως ένας ενδογενής μηχανισμός σε πολλούς οργανισμούς που χρησιμοποιείται για την σίγαση της έκφρασης γονιδίων που ελέγχουν διάφορες διεργασίες στο κύτταρο, καθώς επίσης το προστατεύουν από ιική αντιγραφή. Πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει ότι η εισαγωγή συνθετικών μικρό παρεμβαλλόμενων δίκλωνων RNAs 84

96 Υλικά και Μέθοδοι (sirna) σε κύτταρα μπορεί να προκαλέσει πολύ αποδοτική σίγαση γονιδίων μέσα από την αποικοδόμηση του ενδογενούς mrna του οποίου η αλληλουχία είναι συμπληρωματική προς την αλληλουχία της μιας αλυσίδας του sirna. Πραγματοποιήθηκε λοιπόν παροδική διαμόλυνση κυττάρων C6 με παρεμβαλλόμενο RNA που είχε στόχο το mrna του RPTPβ/ζ. Δεδομένου ότι η συγκέντρωση του παρεμβαλλόμενου RNA, καθώς και η πυκνότητα των κυττάρων που υφίστανται τη διαμόλυνση επηρεάζουν το ποσοστό μετασχηματισμού και την τοξικότητα, προηγήθηκαν πειράματα για να καθορισθούν οι συνθήκες για την αναστολή της έκφρασης του RPTPβ/ζ γονιδίου. Η διαδικασία έχει ως εξής: 1. Πραγματοποιείται η διαδικασία της ανακαλλιέργειας, όπως περιγράφεται παραπάνω. Χρησιμοποιούνται κύτταρα σε μικροπλακίδια 6 κελιών (six-well plate). 2. Επώαση των κυττάρων για 24 ώρες με πλήρες θρεπτικό μέσο χωρίς αντιβιοτικά. 3. Την επόμενη μέρα γίνεται παρατήρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο όπου τα κύτταρα πρέπει να καλύπτουν το 60-80% της επιφάνειας του τρυβλίου. Αν λοιπόν τα κύτταρα είναι υγιή και καλύπτουν αυτό το ποσοστό του τρυβλίου τότε ακολουθεί η παρασκευή των κατάλληλων διαλυμάτων. 4. Προσθήκη 1μl παρεμβαλλόμενου RNA(RPTPβ/ζ) σε σωληνάριο eppendorf και προσθήκη 99μl από ειδικό μέσο επιμόλυνσης(sirna Transfection Medium).Πραγματοποιείται καλή ανάδευση. Η τελική συγκέντρωση του παρεμβαλλόμενου RNA είναι 80nM. Αυτή η ποσότητα είναι για το ένα μόνο κελί του six well plate. 5. Προσθήκη 1,6μl Negative Control sirna σε σωληνάριο eppendorf όπου προστίθονται και 98,4μl από ειδικό μέσο επιμόλυνσης και γίνεται καλή ανάδευση. Τα αρνητικού ελέγχου sirnas σχεδιάζονται για να μην έχουν κανένα γνωστό στόχο στα κύτταρα όπου χρησιμοποιούνται. Είναι σημαντικά ώστε να γίνεται η διάκριση αν η σίγαση οφείλεται στην ειδική αλληλουχία και όχι σε μη ειδικές επιδράσεις κατά τη διάρκεια του πειράματος RNAi. 6. Επίσης γίνεται προσθήκη 8μl από το αντιδραστήριο επιμόλυνσης(sirna transfection reagent) σε σωληνάριο eppendorf όπου έχουν ήδη προστεθεί 85

97 Υλικά και Μέθοδοι 92μl από το μέσο επιμόλυνσης(transfection medium) και γίνεται καλή ανάδευση. Αυτό το επαναλαμβάνουμε και σε δεύτερο σωληνάριο eppendorf. 7. Aφού ολοκληρωθεί η παρασκευή των διαλυμάτων ακολουθεί η μίξη τους με την προσθήκη των διαλυμάτων με το sirna σε αυτά με το αντιδραστήριο και όχι ανάποδα. Γίνεται καλή ανάδευση και τελικά αφήνονται σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. 8. Μετά από τα 30 λεπτά επώασης πραγματοποιείται μια πλύση των κυττάρων με 1ml transfection medium. 9. Σε κάθε σωληνάριο που περιέχει το sirna και το αντιδραστήριο προστίθονται 800μl από το transfection medium με πολύ καλή ανάδευση. 10. Προσθήκη των διαλυμάτων στα κύτταρα και επώαση για 6 ώρες στον επωαστή. Μετά τις 6 ώρες προστίθεται 1ml θρεπτικού μέσου με διπλάσιες ποσότητες ορού και αντιβιοτικών. Επώαση των κυττάρων για ώρες. 11. Την επόμενη μέρα αφαιρείται το θρεπτικό και προστίθεται νέο πλήρες θρεπτικό μέσο για άλλες 24 ώρες. 12. Ακολουθεί λύση των κυττάρων για απομόνωση πρωτεΐνης ή αντικατάσταση θρεπτικού μέσου με νέο χωρίς ορό, για πειράματα μελέτης χημειοτακτισμού. Υλικά και διαλύματα Πλήρες θρεπτικό μέσο (χωρίς αντιβιοτικά) HAM s F12 90% Ορός βοός(fetal bovine serum) 10% Θρεπτικό μέσο επιμόλυνσης(transfection medium sc Santa Cruz Biotechnology Inc.) Αντιδραστήριο επιμόλυνσης(transfection reagent sc Santa Cruz Biotechnology Inc.) 86

98 Υλικά και Μέθοδοι Αλληλουχίες sirna για τον RPTPβ/ζ (VBC-Biotech Services, Vienna, Austria) Νοηματική αλληλουχία 5 -AAAUGCGAAUCCUAAAGCGUU-3 Αντι-νοηματική αλληλουχία 5 -AACGCUUUAGGAUUCGCAUUU-3 Silencer R Negative Control sirna (Ambion, #4635) 3.20.Μελέτη της μετανάστευσης των κυττάρων (Transwell Migration Assay ) Η κυτταρική μετανάστευση, δηλαδή η μετακίνηση των κυττάρων από μια περιοχή σε μια άλλη ως απάντηση σε ένα χημικό σινιάλο, είναι σημαντική διαδικασία για την διεκπεραίωση λειτουργιών όπως η εμβρυϊκή ανάπτυξη και η επούλωση τραυμάτων ενώ παίζει σημαντικό ρόλο και στην εξέλιξη ασθενειών όπως ο καρκίνος η αθηροσκλήρωση και η αρθρίτιδα. Στο πείραμα αυτό χρησιμοποιούνται τρυβλία 24 κελιών(24-well plate) μέσα στα οποία τοποθετούνται ειδικά ενθέματα που φέρουν στον πυθμένα τους μια πολυανθρακική μεμβράνη με μέγεθος πόρων 8μm. Με αυτό τον τρόπο το κελί διαχωρίζεται σε δύο μέρη. Η μεμβράνη χρησιμεύει ως εμπόδιο για τη διάκριση των μεταναστευτικών κυττάρων από τα μη-μεταναστευτικά κύτταρα. Τα μεταναστευτικά κύτταρα είναι σε θέση να επεκτείνουν τις προεξοχές τους προς χημειοελκυστικούς παράγοντες (μέσω αναδιοργάνωσης του κυτταροσκελετού) και τελικά να περάσουν μέσα από τους πόρους της πολυανθρακικής μεμβράνης(εικόνα 4). Η διαδικασία που ακολουθείται περιγράφεται: 1. Κατά τη μελέτη επίδρασης της PTN και του VEGF στο χημειοτακτισμό των κυττάρων C6, προηγείται επώαση των κυττάρων στους 37 0 C για 16 ώρες σε θρεπτικό μέσο με μειωμένη ποσότητα ορού. Αρχικά, πραγματοποιείται η διαδικασία της ανακαλλιέργειας, όπως αναφέρεται νωρίτερα. 2. Σε κάθε εξωτερικό κελί (κάτω μέρος της μεμβράνης) προστίθενται 600 μl θρεπτικό μέσο, αν πρόκειται για κελί αναφοράς (μάρτυρας). Στην περίπτωση μελέτης της χημειοτακτικής δράσης μιας ουσίας, η ουσία προστίθεται στο εξωτερικό κελί και σε θρεπτικό μέσο ίδιο με αυτό του κελιού-μάρτυρα. 87

99 Υλικά και Μέθοδοι 3. Στην εσωτερική μικροκυψελίδα (πάνω μέρος της μεμβράνης) προστίθενται 100μl θρεπτικού μέσου με κύτταρα. 4. Επώαση του τρυβλίου στον επωαστικό κλίβανο των κυττάρων για 4 ώρες. 5. Μονιμοποίηση των κυττάρων με εμβάπτιση των εσωτερικών μικροκυψελίδων σε μονιμοποιητικό διάλυμα Carson s για τουλάχιστον 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 6. Προσεκτική απομάκρυνση των κυττάρων που βρίσκονται στο επάνω μέρος της μεμβράνης με βαμβακοφόρο στυλεό(μπατονέτα) και έλεγχος της μεμβράνης στο μικροσκόπιο. Αν η απομάκρυνση των κυττάρων δεν είναι ικανοποιητική, επαναλαμβάνεται η διαδικασία. 7. Με ανάλογη προσοχή κόβεται η μεμβράνη με τη βοήθεια νυστεριού, ανακτώντας τη μεγαλύτερη δυνατή επιφάνεια. 8. Τοποθέτηση της μεμβράνης σε αντικειμενοφόρο πλάκα, ώστε τα κύτταρα που έχουν μεταναστεύσει να βρίσκονται στην επάνω επιφάνεια. 9. Χρώση των κυττάρων με εναπόθεση 2 σταγόνων διαλύματος της χρωστικής κυανούν της τολουϊδίνης στη μεμβράνη για 40 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 10. Αποχρωματισμός της μεμβράνης με διαδοχικές εμβαπτίσεις σε νερό. 11. Τοποθέτηση της μεμβράνης σε μικροπλακίδια 96 κελιών. Εκχύλιση του διαλύματος κυανούν της τολουϊδίνης με προσθήκη διαλύματος SDS 1% (150 μl ανά μεμβράνη). 12. Ανακίνηση για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 13. Ακολουθεί φωτομέτρηση σε μήκος κύματος 630 nm. 88

100 Υλικά και Μέθοδοι Εικόνα Μ4: Σχηματική απεικόνιση της διαδικασίας χημειοτακτισμού.το εναιώρημα των κυττάρων τοποθετείται στην εσωτερική μικροκυψελίδα, πάνω στην πορώδη μεμβράνη, ενώ η υπό μελέτη ουσία στην εξωτερική μικροκυψελίδα. Κατά την επώαση του τρυβλίου στους 37 0 C ένα ποσοστό των κυττάρων μεταναστεύει στην κάτω επιφάνεια της πορώδους μεμβράνης. Οι πόροι της μεμβράνης (8 μm) είναι αρκετά μικροί ώστε να επιτρέπουν μόνο την ενεργή διέλευση των κυττάρων. Τα κύτταρα που δε μετανάστευσαν απομακρύνονται ενώ τα κύτταρα που μετανάστευσαν βάφονται και μετριούνται. Υλικά και διαλύματα Θρεπτικό μέσο για μελέτη κυτταρικής μετανάστευσης C6 Ham s F12 98% Ορός βοός(fetal bovine serum) 2% Σύστημα μελέτης χημειοτακτισμού Transwell migration assay Μικροπλακίδια Transwell με διάμετρο πόρων μεμβράνης 8 μm (Costar, Avon, France). Διάλυμα κυανούν της τολουϊδίνης 0.33% κ.β. κυανούν της τολουϊδίνης σε PBS 1x 89

101 Υλικά και Μέθοδοι Μονιμοποιητικό διάλυμα Carson s Φορμαλδεΰδη 37% 10% κ.ό. NaH 2 PO 4.Η 2 Ο 0.1 Μ NaOH 0.1 Μ Απεσταγμένο νερό SDS 0.1% 3.21.Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων, από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα σε κάθε περίπτωση, έγινε με τη χρήση του unpaired t-test. Οι συγκρίσεις (μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα) έγιναν μεταξύ της κάθε πειραματικής ομάδας και του αντίστοιχου μάρτυρα. 90

102 IV.AΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

103 Αποτελέσματα 4.1. Επιτυχής μείωση της έκφρασης του υποδοχέα RPTPβ/ζ σε κύτταρα C6 Στην παρούσα εργασία, αρχικά αυτό που επιδιώχθηκε ήταν να γίνει επιτυχής σίγαση του υποδοχέα RPTPβ/ζ σε κύτταρα γλοιβλαστώματος C6. Μετά από δοκιμασία πολλών διαφορετικών πρωτοκόλλων με αρκετά διαφορετικά αντιδραστήρια (JetPEI από Polyplus Transfection, PEPMUTE από SignaGen Laboratories, Lullaby από OZ Biosciences, RNAiMAX από Life Technologies, HiPerfect από Qiagen και Santa-Cruz Reagent από Santa Cruz), καταλήξαμε στο πρωτόκολλο που περιγράφεται στις Μεθόδους και τη χρήση του αντιδραστηρίου Santa-Cruz Reagent. Μετά την ολοκλήρωση της επίδρασης με sirna για τον υποδοχέα RPTPβ/ζ ή με sirna για αλληλουχία που δεν εκφράζεται (αρνητικός μάρτυρας), έγινε λύση των κυττάρων και μέρος του ολικού πρωτεϊνικού εκχυλίσματος αναλύθηκε με ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE και ανάλυση κατά Western, με τη χρήση αντισώματος έναντι του RPTPβ/ζ. Στην Εικόνα Α1 φαίνεται η επιτυχής σίγαση του υποδοχέα της RPTPβ/ζ στα κύτταρα C6. 91

104 Αποτελέσματα A B P< P<0.01 % Έκφραση RPTPβ/ζ M sineg sirptpβ/ζ Εικόνα Α1. Μείωση της έκφρασης του υποδοχέα RPTPβ/ζ με χρήση sirna σε κύτταρα C6. (Α) Κύτταρα C6 διαμολύνθηκαν για 48 ώρες με sirna για τον RPTPβ/ζ (sirptpβ/ζ) ή για αλληλουχία που δεν εκφράζεται (sineg), όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Η εικόνα είναι αντιπροσωπευτική ανάλυση κατά Western ολικών πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων. Η β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο φόρτωσης των δειγμάτων. (Β) Τα επίπεδα έκφρασης του υποδοχέα RPTPβ/ζ εκτιμήθηκαν με ποσοτικοποίηση των αντίστοιχων ζωνών και υπολογισμό του λόγου RPTPβ/ζ/β-ακτίνη. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα (n=3) του ποσοστού μεταβολής του λόγου RPTPβ/ζ/βακτίνη ως προς την ομάδα των μη μετασχηματισμένων κυττάρων (μάρτυρας, Μ) Μείωση της έκφρασης του υποδοχέα RPTPβ/ζ αναστέλλει την επαγόμενη από PTN μείωση της κυτταρικής μετανάστευσης των κυττάρων C6 Είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία ότι η PTN αναστέλλει την μετανάστευση των κυττάρων C6 που εκφράζουν τον υποδοχέα RPTPβ/ζ αλλά δεν εκφράζουν την ιντεγκρίνη α ν β 3 (Mikelis et al. 2009). Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε ο ρόλος του υποδοχέα RPTPβ/ζ στην επαγόμενη από ΡΤΝ μείωση της κυτταρικής 92

105 % Kυτταρική μετανάστευση Αποτελέσματα μετανάστευσης στα κύταρα C6. Μείωση της έκφρασης του RPTPβ/ζ. ανέστειλε πλήρως την ανασταλτική δράση της PTN στη μετανάστευση των κύτταρων C6. Η συγκέντρωση ΡΤΝ που χρησιμοποιήθηκε σε όλες τις in vitro δοκιμασίες είναι 100 ng/ml, η οποία είναι γνωστό ότι προκαλεί τη μέγιστη δράση επί της κυτταρικής μετανάστευσης (Mikelis et al. 2009). 175 w/o PTN PTN(100ng/ml) P< sineg sirptpβ/ζ Εικόνα Α2. Μελέτη του ρόλου του RPTPβ/ζ στην ανασταλτική δράση της PTN στη μετανάστευση των κύτταρων C6. Κύτταρα C6 διαμολύνθηκαν για 48 ώρες με sirna για τον RPTPβ/ζ (sirptpβ/ζ) ή για αλληλουχία που δεν εκφράζεται (sineg), και η μετανάστευση των κυττάρων εκτιμήθηκε με το σύστημα Transwell, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα (n=4) του ποσοστού των κυττάρων που μετανάστευσαν, ως προς την ομάδα των μη διεγερμένων κυττάρων siνeg που θεωρείται 100% Έλεγχος έκφρασης της ιντεγκρίνης α ν β 3 στα κύτταρα C6 Παλαιότερες δημοσιεύσεις της ερευνητικής ομάδας έχουν δείξει με τη χρήση πειραμάτων ανοσοφθορισμού ότι τα κύτταρα γλοιώματος C6 δεν εκφράζουν την ιντεγκρίνη α ν β 3 στην επιφάνειά τους (Mikelis et al. 2009). Στην παρούσα εργασία ελέγξαμε την έκφραση των επιμέρους υπομονάδων της ιντεγκρίνης α ν β 3 στα κύτταρα C6. Έγινε λύση των κυττάρων C6 και μέρος του ολικού πρωτεϊνικού εκχυλίσματος χρησιμοποιήθηκε σε ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE για ανάλυση κατά 93

106 Αποτελέσματα Western με αντίσωμα έναντι των υπομονάδων β 3 ή α ν. Τα κύτταρα U87MG χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός μάρτυρας, αφού είναι γνωστό ότι εκφράζουν και τις δύο υπομονάδες (Mikelis et al. 2009)). Στην Εικόνα Α3, φαίνεται ότι τα κύτταρα C6 εκφράζουν την υπομονάδα α ν, ενώ η υπομονάδα β 3 εκφράζεται σε πολύ μικρό βαθμό. Α Β Εικόνα Α3. Διερεύνηση των υπομονάδων της ιντεγκρίνης α ν β 3 στα κύτταρα C6 και U87MG. Πραγματοποιήθηκε λύση των κυττάρων και ανάλυση κατά Western με αντίσωμα έναντι της υπομονάδας β 3 (Α) ή α ν (Β). Η β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο φόρτωσης των δειγμάτων Επιτυχής υπερέκφραση της υπομονάδας β 3 σε κύτταρα C6 Προκειμένου να επιτευχθεί η υπερέκφραση της υπομονάδας β 3 στα κύτταρα C6, έγινε παροδική διαμόλυνση των κυττάρων με την εισαγωγή ενός κυκλικού μορίου DNA (πλασμιδίου) στο κύτταρο και την έκφρασή του για μία ή λίγες γενιές. Το πλασμίδιο-φορέας που χρησιμοποιήθηκε σε αυτήν την περίπτωση ήταν το pcdna3.1 που φέρει τη γονιδιακή αλληλουχία της ιντεγκρίνης β 3 (wtβ 3 ). Για την παροδική διαμόλυνση των κυττάρων C6 χρησιμοποιήθηκε το αντιδραστήριο jetpei ΤΜ, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Στο τέλος της διαδικασίας, για τον έλεγχο της υπερέκφρασης της υπομονάδας β 3, έγινε λύση των κυττάρων C6 και μέρος του ολικού πρωτεϊνικού εκχυλίσματος χρησιμοποιήθηκε σε ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE για ανάλυση κατά Western με αντίσωμα έναντι της β 3 (Εικόνα Α4). 94

107 Αποτελέσματα Εικόνα Α4. Μελέτη της υπερέκφρασης της υπομονάδας β 3 στα κύτταρα C6. Πραγματοποιήθηκε μετασχηματισμός κυττάρων C6 για 24 ώρες με πλασμίδιο που φέρει τη γονιδιακή αλληλουχία της υπομονάδας β 3, καθώς και με το πλασμίδιο φορέα (PC), όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Η έκφραση της υπομονάδας β 3 μελετήθηκε με λύση των κυττάρων και ανάλυση κατά Western με αντίσωμα έναντι της υπομονάδας β 3. Η β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο φόρτωσης των δειγμάτων. Μ, μάρτυρας, κύτταρα που δεν έχουν υποστεί τη διαδικασία διαμόλυνσης με πλασμίδιο Επίδραση της έκφρασης της υπομονάδας β 3 στον αριθμό και τη μετανάστευση κυττάρων C6 Η υπερέκφραση της υπομονάδας β 3 στα κύτταρα C6 πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στην προηγούμενη παράγραφο. Ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε άμεσα στο αιματοκυτταρόμετρο και η μετανάστευση με το σύστημα Transwell, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α5, ο αριθμός των κυττάρων C6 που εκφράζουν την ιντεγκρίνη β 3 ήταν σημαντικά μειωμένος σε σύγκριση με τα κύτταρα που δεν εκφράζουν την ιντεγκρίνη β 3 (PC). Παρόμοια, η μετανάστευση των κυττάρων C6 που εκφράζουν την ιντεγκρίνη β 3 ήταν σημαντικά μικρότερη σε σύγκριση με αυτήν των κυττάρων PC. Και τις δύο αυτές περιπτώσεις, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία ορού (FCS) 10%. 95

108 % Κυτταρική μετανάστευση Αποτελέσματα Α 100 P<0.01 % Αριθμός κυττάρων Β PC β 3 P< PC β 3 Εικόνα Α5. Μελέτη της επίδρασης της υπερέκφρασης της υπομονάδας β 3 στον αριθμό (Α) και τη μετανάστευση (Β) των κυττάρων C6. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα (n=5) του ποσοστού των κυττάρων ως προς την ομάδα όπου έχει γίνει διαμόλυνση με το πλασμίδιο φορέα (PC), που σε κάθε περίπτωση θεωρείται 100% Η PTN επάγει τη μετανάστευση των κυττάρων C6 μετά από υπερέκφραση της υπομονάδας β 3 Παλαιότερες δημοσιεύσεις της ερευνητικής ομάδας έχουν δείξει ότι η PTN αναστέλλει τη μετανάστευση των κυττάρων C6 που εκφράζουν τον υποδοχέα RPTPβ/ζ αλλά δεν εκφράζουν την ιντεγκρίνη α ν β 3 (Mikelis et al. 2009). Στην 96

109 % Kυτταρική μετανάστευση Αποτελέσματα παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση της ΡΤΝ στη μετανάστευση των κυττάρων C6 μετά από υπερέκφραση της υπομονάδας β 3, η οποία πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στην παράγραφο 4.4. Ακολούθησε στέρηση ορού από τα κύτταρα για 16 ώρες και επίδραση με ΡΤΝ σε σύστημα Transwell για 4 ώρες, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α6, διέγερση με PTN (100 ng/ml) κυττάρων C6 που εκφράζουν την ιντεγκρίνη β 3 είχε ως αποτέλεσμα στατιστικά σημαντική επαγωγή της κυτταρικής μετανάστευσης. Σε κύτταρα που είχαν διαμολυνθεί με το πλασμίδιο-φορέα (PC), η ίδια συγκέντρωση ΡΤΝ προκάλεσε σημαντική αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης, σε συμφωνία με τη δράση της σε μη διαμολυσμένα κύτταρα C6 (Mikelis et al. 2009). 200 w/o PTN PTN (100ng/ml) P< P< PC β 3 Εικόνα Α6. Μελέτη της επίδρασης της ΡΤΝ στη μετανάστευση κυττάρων C6 που έχουν διαμολυνθεί με πλασμίδιο φορέα (PC) ή πλασμίδιο που φέρει τη γονιδιακή αλληλουχία της ιντεγκρίνης β 3. Η μετανάστευση των κυττάρων εκτιμήθηκε με το σύστημα Transwell, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα (n=3) του ποσοστού των κυττάρων που μετανάστευσαν ως προς την ομάδα των μη διεγερμένων κυττάρων PC που θεωρείται 100%. 97

110 Αποτελέσματα 4.7. Ο VEGF επάγει τη μετανάστευση των κυττάρων C6 ανεξάρτητα από την έκφραση της ιντεγκρίνης β 3 Η αμφίδρομη επικοινωνία (cross-talk) μεταξύ υποδοχέων κινασών τυροσίνης και ιντεγκρινών είναι σημαντική για έναν μεγάλο αριθμό κυτταρικών λειτουργιών. Σε ενδοθηλιακά κύτταρα, αλληλεπίδραση μεταξύ της ιντεγκρίνης α ν β 3 και του υποδοχέα VEGFR2 φαίνεται να είναι ιδιαίτερα σημαντική κατά τη διάρκεια της διαδικασίας της αγγείωσης (Payaningal R. Somanath, 2009). Έχει δειχθεί ότι η φωσφορυλίωση της τυροσίνης της θέσης 773 της κυτταροπλασματικής περιοχής της υπομονάδας β 3 ως απόκριση στη διέγερση των κυττάρων από VEGF 165 παίζει ρόλο στη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων (Mahabeleshwar, et al. 2007; Koutsioumpa et al. 2015) και διαμεσολαβείται από τον υποδοχέα RPTPβ/ζ (Koutsioumpa et al. 2015). Από την άλλη πλευρά, ο VEGF 165 επάγει τη μετανάστευση των κυττάρων C6, τα οποία δεν εκφράζουν την ιντεγκρίνη α ν β 3 (Parthymou et al. 2008). Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση του VEGF 165 στη μετανάστευση των κυττάρων C6 μετά από υπερέκφραση της υπομονάδας β 3, η οποία πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στην παράγραφο 4.4. Ακολούθησε στέρηση ορού από τα κύτταρα για 16 ώρες και επίδραση με VEGF 165 σε σύστημα Transwell για 4 ώρες, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α7, διέγερση με VEGF 165 (10 ng/ml) κυττάρων C6 που εκφράζουν την ιντεγκρίνη β 3 είχε ως αποτέλεσμα στατιστικά σημαντική επαγωγή της κυτταρικής μετανάστευσης. Σε κύτταρα που είχαν διαμολυνθεί με το πλασμίδιο-φορέα (PC), η ίδια συγκέντρωση VEGF 165 προκάλεσε επίσης σημαντική επαγωγή της κυτταρικής μετανάστευσης, σε συμφωνία με τη δράση του σε μη διαμολυσμένα κύτταρα C6 (Parthymou et al. 2008). 98

111 % Kυτταρική μετανάστευση Αποτελέσματα w/o VEGF 165 VEGF 165 (10 ng/ml) PC β 3 Εικόνα Α8. Μελέτη της επίδρασης του VEGF 165 στη μετανάστευση κυττάρων C6 που έχουν διαμολυνθεί με πλασμίδιο φορέα (PC) ή πλασμίδιο που φέρει τη γονιδιακή αλληλουχία της ιντεγκρίνης β 3. Η μετανάστευση των κυττάρων εκτιμήθηκε με το σύστημα Transwell, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα (n=2) του ποσοστού των κυττάρων που μετανάστευσαν ως προς την ομάδα των μη διεγερμένων κυττάρων PC που θεωρείται 100% Η υπερέκφραση της υπομονάδας β 3 μειώνει την αλληλεπίδραση της PTN και του VEGF με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ σε κύτταρα C6 O RPTPβ/ζ είναι μέχρι σήμερα ο πιο καλά μελετημένος υποδοχέας της ΡΤΝ (Pantazaka & Papadimitriou 2012)). Πρόσφατη δημοσίευση της ερευνητικής μας ομάδας δείχνει ότι ο υποδοχέας RPTPβ/ζ αλληλεπιδρά άμεσα και παίζει σημαντικό ρόλο στην επαγώμενο από VEGF κυτταρική μετανάστευση (Koutsioumpa et al. 2015). Θέλοντας να δούμε αν η ιντεγκρίνη α ν β 3 επηρεάζει την αλληλεπίδραση της ΡΤΝ ή του VEGF με τον RPTPβ/ζ, σε ολικό πρωτεϊνικό εκχύλισμα κυττάρων C6, τα οποία είχαν διαμολυνθεί ώστε να εκφράζουν παροδικά την ιντεγκρίνη β 3, πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση για τον RPTPβ/ζ και στη συνέχεια ακολούθησε ανάλυση κατά Western με αντίσωμα έναντι της PTN (Εικόνα Α8) ή του VEGF (Εικόνα Α9). Υπερέκφραση της β 3 στα 99

112 % Αλληλεπίδραση RPTPβ/ζ-PTN Αποτελέσματα κύτταρα C6 είχε ως αποτέλεσμα μειωμένη συγκατακρήμνιση της PTN ή του VEGF με τον RPTPβ/ζ σε σύγκριση με κύτταρα που είχαν διαμολυνθεί με το πλασμίδιο φορέα (PC) ή τα μη διαμολυσμένα κύτταρα. Α Β 100 P< M PC β 3 Εικόνα Α8. Μελέτη της αλληλεπίδρασης της PTN με τον RPTPβ/ζ σε κύτταρα C6 τα οποία εκφράζουν ή δεν εκφράζουν παροδικά την υπομονάδα της ιντεγκρίνης β 3. Πραγματοποιήθηκε μετασχηματισμός κυττάρων C6 για 24 ώρες με πλασμίδιο που φέρει τη γονιδιακή αλληλουχία της β3, καθώς και με το πλασμίδιο φορέα, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα κυττάρων C6 ανοσοκατακρημνίστηκαν με αντίσωμα έναντι του RPTPβ/ζ και ακολούθησε ανάλυση κατά Western για ΡΤΝ. (Α) Η εικόνα είναι αντιπροσωπευτική ανάλυση κατά Western. Η ανοσοσφαιρίνη IgG χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας. (Β) Η ποσότητα ΡΤΝ που συνανοσοκατακρημνίστηκε με τον RPTPβ/ζ εκτιμήθηκε με ποσοτικοποίηση των αντίστοιχων ζωνών σε μη διαμολυσμένα κύτταρα C6 (Μάρτυρας, Μ), κύτταρα διαμολυσμένα με το πλασμίδιο φορέα (PC) και κύτταρα που υπερεκφράζουν την υπομονάδα β 3 (β 3 ). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα (n=3) της % αλληλεπίδρασης σε σύγκριση με το μάρτυρα (που θεωρείται 100). 100

113 % Αλληλεπίδραση RPTPβ/ζ-VEGF Αποτελέσματα Α Β 100 P< M PC β 3 Εικόνα Α9. Μελέτη της αλληλεπίδρασης του VEGF με τον RPTPβ/ζ σε κύτταρα C6 τα οποία εκφράζουν ή δεν εκφράζουν παροδικά την υπομονάδα της ιντεγκρίνης β 3. Πραγματοποιήθηκε μετασχηματισμός κυττάρων C6 για 24 ώρες με πλασμίδιο που φέρει τη γονιδιακή αλληλουχία της β3, καθώς και με το πλασμίδιο φορέα, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα κυττάρων C6 ανοσοκατακρημνίστηκαν με αντίσωμα έναντι του RPTPβ/ζ και ακολούθησε ανάλυση κατά Western για VEGF. (Α) Η εικόνα είναι αντιπροσωπευτική ανάλυση κατά Western. Η ανοσοσφαιρίνη IgG χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας. (Β) Η ποσότητα VEGF που συνανοσοκατακρημνίστηκε με τον RPTPβ/ζ εκτιμήθηκε με ποσοτικοποίηση των αντίστοιχων ζωνών σε μη διαμολυσμένα κύτταρα C6 (Μάρτυρας, Μ), κύτταρα διαμολυσμένα με το πλασμίδιο φορέα (PC) και κύτταρα που υπερεκφράζουν την υπομονάδα β 3 (β 3 ). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα (n=3) της % αλληλεπίδρασης σε σύγκριση με το μάρτυρα (που θεωρείται 100). 101

114 Αποτελέσματα 4.9. Η έκφραση της υπομονάδας β 3 στα κύτταρα CHO μειώνει την αλληλεπίδραση της PTN και του VEGF με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ Προηγούμενες μελέτες της ερευνητικής μας ομάδας έχουν δείξει ότι τόσο η ΡΤΝ (Mikelis et al. 2009)) όσο και ο VEGF (Koutsioumpa et al. 2015) επάγουν τη μετανάστευση κυττάρων CHO τα οποία είναι σταθερά μετασχηματισμένα ώστε να εκφράζουν ιντεγκρίνη α ν β 3, αλλά όχι κυττάρων που δεν την εκφράζουν. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε εάν η έκφραση της ιντεγκρίνης α ν β 3 επηρεάζει την αλληλεπίδραση της ΡΤΝ ή του VEGF με τον RPTPβ/ζ. Σε ολικό πρωτεϊνικό εκχύλισμα κυττάρων CHO που εκφράζουν (β 3 ) ή δεν εκφράζουν (PC) ιντεγκρίνη α ν β 3, πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση για τον RPTPβ/ζ και στη συνέχεια ακολούθησε ανάλυση κατά Western με αντίσωμα έναντι της PTN (Εικόνα Α10) ή του VEGF (Εικόνα Α11). Έκφραση της α ν β 3 στα κύτταρα CHO είχε ως αποτέλεσμα μειωμένη συγκατακρήμνιση της PTN ή του VEGF με τον RPTPβ/ζ. 102

115 % Aλληλεπίδραση RPTPβ/ζ-PTN Αποτελέσματα Α Β P<0.01 PC β 3 Εικόνα Α10. Μελέτη της αλληλεπίδρασης της PTN με τον RPTPβ/ζ σε κύτταρα CHO τα οποία εκφράζουν (β 3 ) ή δεν εκφράζουν (PC) σταθερά την ιντεγκρίνη β 3. Ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα των κυττάρων ανοσοκατακρημνίστηκαν με αντίσωμα έναντι του RPTPβ/ζ και ακολούθησε ανάλυση κατά Western για ΡΤΝ. (Α) Η εικόνα είναι αντιπροσωπευτική ανάλυση κατά Western. Η ανοσοσφαιρίνη IgG χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας. (Β) Η ποσότητα ΡΤΝ που συν-ανοσοκατακρημνίστηκε με τον RPTPβ/ζ εκτιμήθηκε με ποσοτικοποίηση των αντίστοιχων ζωνών σε κύτταρα διαμολυσμένα με το πλασμίδιο φορέα (PC) και κύτταρα που υπερεκφράζουν την υπομονάδα β 3 (β 3 ). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα (n=3) της % αλληλεπίδρασης σε σύγκριση με τα κύτταρα PC (που θεωρείται 100). 103

116 % Αλληλεπίδραση RPTPβ/ζ-VEGF Αποτελέσματα Α Β P<0.01 PC β 3 Εικόνα Α11. Μελέτη της αλληλεπίδρασης του VEGF με τον RPTPβ/ζ σε κύτταρα CHO τα οποία εκφράζουν (β3) ή δεν εκφράζουν (PC) σταθερά την ιντεγκρίνη β 3. Ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα των κυττάρων ανοσοκατακρημνίστηκαν με αντίσωμα έναντι του RPTPβ/ζ και ακολούθησε ανάλυση κατά Western για VEGF. (Α) Η εικόνα είναι αντιπροσωπευτική ανάλυση κατά Western. Η ανοσοσφαιρίνη IgG χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας. (Β) Η ποσότητα του VEGF που συν-ανοσοκατακρημνίστηκε με τον RPTPβ/ζ εκτιμήθηκε με ποσοτικοποίηση των αντίστοιχων ζωνών σε κύτταρα διαμολυσμένα με το πλασμίδιο φορέα (PC) και κύτταρα που υπερεκφράζουν την υπομονάδα β 3 (β 3 ). Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα (n=3) της % αλληλεπίδρασης σε σύγκριση με τα κύτταρα PC (που θεωρείται 100). 104

117 4.10. Επίδραση της έκφρασης της υπομονάδας β 3 στην έκφραση των RPTPβ/ζ, PTN και VEGF Προκειμένου να διερευνηθεί εάν η αλλαγή του βαθμού αλληλεπίδρασης των PΤΝ και VEGF με τον RPTPβ/ζ οφείλεται σε επίδραση της έκφρασης της ιντεγκρίνης α ν β 3 στην έκφραση των μορίων αυτών, μελετήθηκε με ανάλυση κατά Western η έκφραση των RPTPβ/ζ, PTN και VEGF μετά από παροδική υπερέκφραση της β 3 στα κύτταρα C6 ή σε κύτταρα CHO τα οποία είναι σταθερά μετασχηματισμένα ώστε να εκφράζουν ιντεγκρίνη α ν β 3. Και στις δύο περιπτώσεις για τη σύγκριση χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα που είχαν διαμολυνθεί παροδικά ή σταθερά, αντίστοιχα, μόνο με το πλασμίδιο-φορέα. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α12, η έκφραση του υποδοχέα RPTPβ/ζ δεν επηρεάζεται από την έκφραση της ιντεγκρίνης α ν β 3 σε κανέναν από τους δύο τύπους κυττάρων. Α Β Εικόνα Α12. Μελέτη της επίδρασης της έκφρασης της ιντεγκρίνης β 3 στα πρωτεϊνικά επίπεδα του υποδοχέα RPTPβ/ζ σε κύτταρα C6 (A) και CHO (Β), τα οποία εκφράζουν (β3) ή δεν εκφράζουν (PC) την ιντεγκρίνη β 3. Η έκφραση του υποδοχέα RPTPβ/ζ μελετήθηκε με λύση των κυττάρων και ανάλυση κατά Western με αντίσωμα έναντι του RPTPβ/ζ. Η β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο φόρτωσης των δειγμάτων. Μ, μάρτυρας, κύτταρα που δεν έχουν υποστεί τη διαδικασία διαμόλυνσης με πλασμίδιο. 105

118 Αντίθετα, όπως φαίνεται στην Εικόνα Α13, η έκφραση και της ΡΤΝ και του VEGF μειώνονται σημαντικά από την έκφραση της ιντεγκρίνης α ν β 3 στα κύτταρα C6. Στα κύτταρα CHO, αντίθετα, δεν παρατηρείται καμία σημαντική μείωση. Α Β Εικόνα Α13. Μελέτη της επίδρασης της έκφρασης της ιντεγκρίνης β 3 στα πρωτεϊνικά επίπεδα των ΡΤΝ και VEGF σε κύτταρα C6 (A) και CHO (Β), τα οποία εκφράζουν (β3) ή δεν εκφράζουν (PC) την ιντεγκρίνη β 3. Η έκφραση των ΡΤΝ και VEGF μελετήθηκε με λύση των κυττάρων και ανάλυση κατά Western με αντισώματα έναντι των ΡΤΝ και VEGF. Η β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο φόρτωσης των δειγμάτων. Μ, μάρτυρας, κύτταρα που δεν έχουν υποστεί τη διαδικασία διαμόλυνσης με πλασμίδιο. 106