ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ Εκφραση και έκκριση της πλειοτροπίνης σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά και κύτταρα γλοιοβλαστώματος ΠΟΙΜΕΝΙΔΗ ΕΥΑΓΓΕΛΙΑ Φαρμακοποιός ΠΑΤΡΑ, 2007

2

3 Περιεχόμενα 1. Εισαγωγή Ε.1 HARP E.1.1 Εισαγωγικά Ε.1.2 Δομή του γονιδίου της HARP Ε.1.3 Ρυθμιστική περιοχή του γονιδίου Ε.1.4 Πρωτεϊνική δομή του μορίου της HARP Ε.1.5 Ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της HARP Ε.1.6 Έκφραση του γονιδίου της HARP κατά την εμβρυική ανάπτυξη και την ενήλικη ζωή E.1.7 Αλληλεπιδράσεις και υποδοχείς της HARP Ε.1.8 Μεταγωγή σήματος Ε.1.9 Βιολογικές δράσεις Ε.9.1 Ρόλος της HARP στην ανάπτυξη Ε.9.2 HARP και κυτταρικός πολλαπλασιασμός Ε.9.3 HARP και αγγειογέννεση Ε.1.10 Σχέση δομής-βιολογικής δράσης E.1.11 HARP και καρκίνος Ε.11.1 Έκφραση και ρόλος της HARP στον καρκίνο Ε.11.2 Έκφραση και ρόλος των υποδοχέων της HARP στον καρκίνο E.11.3 Στόχευση της έκφρασης της HARP στον καρκίνο E.11.4 Η HARP ως διαγνωστικός δείκτης E.2 Γλοιώματα του νευρικού συστήματος E.2.1 Γενικά Ε.2.2 Μοριακή Βιολογία γλοιωμάτων Ε.2.3 Γενετικές αλλοιώσεις σε γλοιώματα Ε.2.4 Απορύθμιση του ελέγχου του κυτταρικού κύκλου Ε.2.5 Μονοπάτια μεταγωγής σήματος Ε.2.6 Μεταστατική και διηθητική ικανότητα γλοιωμάτων

4 Ε.3 Αγγειογένεση Ε.3.1. Γενικά E.3.2 Υποξία και αγγειογέννεση Ε Γενικά Ε.3.3 HIF (Hypoxia Inducible Factor) E.4 Μονοξείδιο του αζώτου Ε.4.1 Γενικά Ε.4.2 Βιολογικές δράσεις Ε.4.3 Παθολογικές καταστάσεις σχετιζόμενες με το NO Ε.4.4 Ρόλος του ΝΟ στον καρκίνο Ε.5 Oρός και στοιχείο απόκρισης στον ορό Ε.5.1 Γενικά E.5.2. SRF (Serum Response Factor) Ε Ανακάλυψη του SRF Ε Δομή Ε Ρύθμιση και ενεργοποίηση του SRF Ε Βιολογικές δράσεις του SRF 2. Σκοπός 3. Υλικά και μέθοδοι Μ.1 Ανακαλλιέργεια κυττάρων Μ059Κ Μ.2 Μέτρηση κυττάρων σε αιμοκυτταρόμετρο Neubauer Μ.3 Κατάψυξη κυττάρων Μ059Κ Μ.4 Απόψυξη κυττάρων Μ059Κ Μ.5 Επίδραση ουσιών και απομόνωση της PTN από το θρεπτικό μέσο κύτταρων Μ059Κ Μ.6 Επίδραση της υποξίας στην έκφραση της PTN, μέσω συστήματος δημιουργίας αναερόβιας ατμόσφαιρας Μ.7 Απομόνωση πυρηνικού εκχυλίσματος από κύτταρα Μ059Κ Μ.8 Εκτίμηση της συγκέντρωσης ολικής πρωτείνης σε διάλυμα

5 Μ.9 SDS ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) M.10 Ανοσοαποτύπωμα (Western blot) Μ.11 Αποδέσμευση αντισώματος από μεμβράνη PVDF (stripping) Μ.12 Ποσοτικοποίηση ανοσοαποτυπωμάτων πρωτεϊνών με σύστημα ανάλυσης εικόνας Μ.13 Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων Μ.14 Απομόνωση κυττάρων HUVEC από φλέβα ομφάλιου λώρου ανθρώπου Μ.15 Ανακαλλιέργεια κυττάρων HUVEC M.16 Κατάψυξη και απόψυξη κυττάρων HUVEC M.17 Έλεγχος της επιδρασης ουσιών στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HUVEC M.18 Επίδραση ουσιών και απομόνωση της HARP από το θρεπτικό μέσο κύτταρων HUVEC M.19 Παροδική επιμόλυνση των κυττάρων HUVEC (transient transfection) με αντινοηματική αλληλουχία για την ενδοθηλιακή συνθάση του μονοξειδίου του αζώτου (enos) Μ.20 Απομόνωση RNA από κύτταρα Μ059Κ σε καλλιέργεια Μ.21 Προσδιορισμός της συγκέντρωσης RNA και DNA Μ.22 Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων σε πήκτωμα αγαρόζης Μ.23 Ανάλυση της έκφρασης γονιδίων με τη χρήση συνδυασμένης αντίστροφης μεταγραφής και αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (RT-PCR) Μ.24 Μικρής κλίμακας απομόνωση πλασμιδιακού DNA (Miniprep) Μ.25 Δημιουργία ελλείματος στην αλληλουχία δέσμευσης του ορού του υποκινητή της Harp Μ.26 Τεχνική ανίχνευσης δραστηριότητας του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης στα κύτταρα Μ059Κ Μ.27 Τεχνική ανίχνευσης δραστηριότητας του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης στα κύτταρα HUVEC Μ.28 Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων 4. Αποτελέσματα Α.1 Ρύθμιση της έκφρασης της HARP από το ΝΟ Α.1.1 O δότης μονοξειδίου του αζώτου, νιτροπρωσικό νάτριο (sodium nitroprusside, SNP), επάγει την έκκριση της πρωτεΐνης HARP στα κύτταρα HUVEC Α.1.2 Το SNP επάγει τη μεταγραφή του γονιδίου της HARP στα κύτταρα HUVEC

6 Α.1.3 Αναστολή της διαλυτής γουανυλικής κυκλάσης (sgc) αναστέλλει την επαγόμενη από το Η 2 Ο 2 έκκριση της HARP Α.1.4 To SB αναστέλλει την επαγόμενη από το H 2 O 2 έκκριση της πρωτείνης HARP στα κύτταρα HUVEC Α.1.5 To SP δεν αναστέλλει την επαγόμενη από το H 2 O 2 HARP στα κύτταρα HUVEC έκκριση της πρωτείνης Α.1.6 Η p38 συμμετέχει στην επαγωγική δράση του H 2 O 2 στον πολλαπλασιασμό των HUVEC Α.1.7 Η JNK δε συμμετέχει στην επαγωγική δράση του Η 2 Ο 2 στον πολλαπλασιασμό των HUVEC Α.1.8 Αναστολή της έκφρασης της enos με αντι-νοηματική αλληλουχία αναστέλλει την επαγόμενη από το Η 2 Ο 2 φωσφορυλίωση των ERK1/2 αλλά όχι της p38 Α.2 Ρύθμιση της έκφρασης και έκκρισης της HARP από τον ορό Α.2.1 O ορός επάγει την έκκριση της HARP στα κύτταρα Μ059Κ Α.2.2 O ορός επάγει την έκκριση της HARP στα κύτταρα HUVEC Α.2.3 O ορός επάγει την έκφραση της HARP στα κύτταρα Μ059Κ Α.2.4 O ορός επάγει τη μεταγραφή του γονιδίου της HARP στα κύτταρα Μ059Κ Α.2.5 O ορός επάγει τη μεταγραφή του γονιδίου της HARP στα κύτταρα HUVEC Α.2.6 Το SRE δεν είναι σημαντικό για την επαγόμενη από τον ορό μεταγραφική δραστηριότητα του γονιδίου της HARP στα κύτταρα Μ059Κ Α.2.7 Το SRE είναι σημαντικό για την επαγόμενη από τον ορό μεταγραφική δραστηριότητα του γονιδίου της HARP στα κύτταρα HUVEC A.3 Ρύθμιση της έκκρισης της HARP από υποξία Α.3.1 Η χημική υποξία με δεσφεροξαμίνη επάγει την έκκριση της πρωτεΐνης HARP στα κύτταρα Μ059Κ Α.3.2 Το χλωριούχο κοβάλτιο επάγει την έκκριση της πρωτεΐνης HARP στα κύτταρα Μ059Κ

7 Α.3.3 Το χλωριούχο κοβάλτιο επάγει τη συσσώρευση του HIF-1 α στο πυρήνα κυττάρων Μ059Κ Α.3.4 Η φυσική υποξία επάγει την έκκριση της πρωτεΐνης HARP στα κύτταρα Μ059Κ 5. Συζήτηση 6. Συντμήσεις 7. Βιβλιογραφία

8 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

9 E.1 HARP E.1.1 Εισαγωγικά Η HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide) είναι ένας εκκρινόμενος αυξητικός παράγοντας, 18 kd, με μεγάλη συγγένεια πρόσδεσης για την ηπαρίνη. Παρουσιάζει 55% ομολογία στην αμινοξική αλληλουχία με τη Midkine και περιέχει 10 υψηλά συντηρημένες κυστεΐνες στο μόριό της. Οι δυο αυτές πρωτεΐνες, μαζί με την RI-HB (retinoic acid induced heparin-binding protein) που είναι η ομόλογη πρωτεΐνη της Midkine στην όρνιθα, αποτελούν μια διακριτή οικογένεια αυξητικών παραγόντων, που εμφανίζουν λειτουργικές, αλλά όχι δομικές ομοιότητες με την οικογένεια των FGF (Zhang et al, 1999) και παρουσιάζουν συγγένεια με την ηπαρίνη (Ohyama et al, 1994). Εκτός από την αμινοξική τους ομολογία, η HARP και η Midkine χρησιμοποιούν επίσης τους ίδιους υποδοχείς και έχουν κοινές βιολογικές δράσεις, οι πιο καλά χαρακτηρισμένες από τις οποίες είναι η επαγωγή των νευριτών και η ανάπτυξη των όγκων (Papadimitriou et al, 2004; Mikelis et al., 2007). Στη βιβλιογραφία η HARP συναντάται με διαφορετικές ονομασίες, όπως PTN (pleiotropin) ή HB- GAM (heparin-binding growth associated molecule), γεγονός που οφείλεται στο ότι η απομόνωση του μορίου αυτού έγινε συγχρόνως σε διάφορα εργαστήρια και από διαφορετικά είδη ιστών. Στον Πίνακα Ε.1 παρουσιάζονται οι διαφορετικές ονομασίες με τις οποίες συναντούμε τη HARP στη βιβλιογραφία, η προέλευσή τους και το είδος από το οποίο απομονώθηκε η HARP σε κάθε περίπτωση. Αρχικά, η HARP απομονώθηκε από τον εγκέφαλο νεογέννητων αρουραίων και ενήλικων βοών ως μόριο το οποίο μπορεί να επάγει την προέκταση νευριτών (Rauvala 1989), υποδεικνύοντας πιθανό ρόλο στη φυσιολογία του νευρικού συστήματος (Merenmies et al., 1990). Επιπλέον έρευνες έδειξαν ότι το μόριο αυτό εντοπίζεται και σε άλλους, μη νευρικούς ιστούς, όπως η καρδιά (Hampton et al., 1992), η μήτρα (Milner et al., 1989), οι χόνδροι και τα οστά (Neame et al., 1993) και η επίφυση (Azizan et al., 2000), υποδηλώνοντας ότι η βιολογική της δράση δεν περιορίζεται μόνο στο νευρικό σύστημα, όπως είχε αρχικά εικαστεί (Rauvala 1989). Υψηλά επίπεδα του γονιδίου εκφράζονται επίσης σε αρκετούς ανθρώπινους όγκους, μεταξύ των οποίων είναι το νευροβλάστωμα, το γλοιοβλάστωμα, ο καρκίνος του προστάτη και του πνεύμονα και πολλοί άλλοι, όπως θα αναφερθεί εκτενέστερα παρακάτω.

10 Πίνακας Ε1: Οι διαφορετικές ονομασίες και πηγές απομόνωσης της HARP. Σύντμηση Πλήρες όνομα Μορφή Προέλευση Είδος Παραπομπή HARP HB-GAM HBGF-8 Heparin-Affin Regulatory Peptide Heparin-binding growthassociated molecule Heparin-binding growth-factor-8 Πρωτεΐνη Εγκέφαλος Βους Courty et al., 1991 Πρωτεΐνη cdna Γονιδιωματικό DNA Καρδιά Εγκέφαλος Ήπαρ Όρνιθα Αρουραίος Μυς Πρωτεΐνη Μήτρα/ Ορός Βους Άνθρωπος p18 Protein 18 kda Πρωτεΐνη Εγκέφαλος Αρουραίος Βους PTN Pleiotrophin Πρωτεΐνη Καρκινικά κύτταρα από πνεύμονα Άνθρωπος Hampton et al., 1992 Merenmies and Rauvala, 1990 Naito et al., 1992 Milner et al., 1989 Novotny et al., 1993 Rauvala, 1989 Novotny et al., 1993 Wellstein et al., 1992 cdna Καρκινικά κύτταρα από πνεύμονα, Πλακούντας, Μήτρα Άνθρωπος Βους Wellstein et al., 1992 Lai et al., 1992 Γονιδιωματικό DNA Εγκέφαλος Άνθρωπος Milner et al., 1992 Lai et al., 1995 HBNF Heparin-binding neurotrophic factor cdna Εγκέφαλος Αρουραίος Άνθρωπος Kovesdi et al., 1990 Kretschmer et al., 1991 Γονιδιωματικό DNA Εγκέφαλος/ Πλακούντας Άνθρωπος Pencil et al., 1993 OSF-1 Osteoblastspecific factor-1 cdna Οστεοβλάστες Μυς Tezuka et al., 1990 Γονιδιωματικό DNA Ήπαρ Μυς Lai et al., 1992 Milner et al., 1992

11 Ε.1.2 Δομή του γονιδίου της HARP Το γονίδιο της HARP έχει αναλυθεί στον άνθρωπο, τον επίμυ, το μυ, το κουνέλι και πρόσφατα στο zebrafish. Το cdna της HARP στα παραπάνω είδη παρουσιάζει παρόμοια οργάνωση. Το γονίδιο της HARP στον άνθρωπο εντοπίζεται στο μεγάλο βραχίονα του 7 ου χρωμοσώματος, στις περιοχές (Li et al, 1992). Όσο για τα γονίδια της HARP στα τρωκτικά, αυτά έχουν βρεθεί στα χρωμοσώματα 4 και 6 στο ποντίκι και στον αρουραίο αντίστοιχα (Hornum et al, 1996). Στον άνθρωπο, το γονίδιο της HARP καταλαμβάνει πάνω από 65 kb, περιέχει τουλάχιστον επτά εξόνια και το ελάχιστο μέγεθός του είναι 42 kb (Lai et al, 1992; Kretshmer et al, 1993). Το m-rna της HARP οργανώνεται σε πέντε εξόνια με συνολικό μέγεθος 1650 νουκλεοτίδια (Kretshmer et al, 1993). Το σηματοδοτικό πεπτίδιο, καθώς και τα πρώτα πέντε αμινοξέα του ώριμου μορίου, εντοπίζονται στο εξόνιο 2, ενώ το μεγαλύτερο τμήμα της κωδικής περιοχής της πρωτεΐνης εντοπίζεται στα εξόνια 3 και 4 (Kretshmer et al, 1993). Μια 5 -μη μεταφραζόμενη περιοχή (5 -UTR), η οποία καλύπτει ένα ολόκληρο εξώνιο, έχει περιγραφεί από πολλούς ερευνητές (Lai et al., 1992, Kretschmer et al., 1993). Οι 3 - και 5 - μη μεταφρασμένες περιοχές του γονιδίου της HARP στον άνθρωπο παρουσιάζουν αντίστοιχα υψηλή ομολογία με τα αντινοηματικά cdnas της hsp (heat shock protein) 70 και της L17 πρωτεΐνης του ριβοσώματος (Lai et al, 1992). Επίσης, στην 3 - μη μεταφρασμένη περιοχή έχουν εντοπιστεί 3 επαναλήψεις του μοτίβου ΑΤΤΤΑ. Η αλληλουχία αυτή, η οποία εμπλέκεται στη σταθερότητα του mrna εντοπίζεται στην 3 περιοχή αρκετών ογκογονιδίων (Lai et al, 1992). Το γονίδιο της HARP στο ποντίκι εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 6, περιορίζεται σε πέντε εξόνια και τέσσερα ιντρόνια και δεν καταλαμβάνει περισσότερo από 32 kb (Katoh et al, 1992). Στην 5 περιοχή στο γονίδιο της HARP στο ποντίκι εντοπίζονται δυο επαγωγείς (Ι και ΙΙ). Και οι δυο περιέχουν τις περιοχές CCAAT και TATA και αλληλουχίες ρυθμιστικών στοιχείων, όπως το στοιχείο απόκρισης στο cαmp (camp responsive element), την περιοχή δέσμευσης του SP-1 και το στοιχείο απόκρισης της θυρεοειδούς ορμόνης στον επαγωγέα Ι και την αλληλουχία απόκρισης των γλυκοκορτικοειδών στον επαγωγέα ΙΙ (Sato et al, 1997). Το γονίδιο της HARP στο zebrafish αποτελείται από πέντε εξόνια, τέσσερα ιντρόνια και καταλαμβάνει 82 kb. Το πρώτο και το τέταρτο ιντρόνιο, όπως και στον άνθρωπο, είναι τα μεγαλύτερα, με μέγεθος 60,3 και 14,7 kb αντίστοιχα. Η μεγάλη ομοιότητα στις αλληλουχίες

12 σύνδεσης των εξονίων με τα ιντρόνια στον άνθρωπο, το ποντίκι, το zebrafish και τη Midkine, πιθανά υποδεικνύει ότι εξελικτικά έχουν κοινό πρόγονο (Chang et al., 2004). Πρόσφατα ανακαλύφθηκαν στη Drosophila Melanogaster οι πρωτεΐνες Miple1 και Miple 2, οι οποίες θεωρούνται νέα μέλη της οικογένειας της PTN/MK.Τα γονίδια Miple1 και Miple 2 εντοπίζονται στον αριστερό βραχίονα του τρίτου χρωμοσώματος στην περιοχή 61Β3. Αποτελούνται από πέντε εξόνια και το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης για το κάθε γονίδιο κωδικοποιείται από τα εξόνια 2-5, ενώ η 3 μη μεταφρασμένη περιοχή του Miple1 είναι αρκετά μεγαλύτερη από αυτή του Miple2. Το mrna του Miple1 έχει μέγεθος βάσεις, ενώ του Miple2 έχει συνολικό μέγεθος βάσεις (Englund et al., 2006). Ε.1.3 Ρυθμιστική περιοχή του γονιδίου Η ανάλυση του υποκινητή του γονιδίου στον άνθρωπο έδειξε ότι δεν υπάρχει η περιοχή ΤΑΤΑ, αλλά έχει εντοπιστεί η περιοχή CAAT σε μια απόσταση 91 νουκλεοτιδίων πριν από το σημείο έναρξης της μεταγραφής (Kretschmer et al., 1993, Li et al., 1992). Στην αλληλουχία αυτή δύνανται να δεσμευτούν γενικοί μεταγραφικοί παράγοντες, όπως ο C/EBP (CAAT-box/enhancer-binding protein) ή ο CTF/NF1 (CAAT-box-binding Factor/ Nuclear Factor 1). Στην αλληλουχία TATA δεσμεύεται η πρωτεΐνη δέσμευσης στην ΤΑΤΑ (ΤΑΤΑ- Βinding Protein, TBP), η οποία αποτελεί βασικό συστατικό του μεταγραφικού παράγοντα ΙΙD (Transcription Factor IID, TF II D). Η πρωτεΐνη TBP είναι απαραίτητη για τη μεταγραφή ακόμα και αν απουσιάζει η αλληλουχία ΤΑΤΑ και φαίνεται να καθορίζει το ακριβές σημείο έναρξης της μεταγραφής (Johnson and Jameson, 1998). Η αλληλουχία αυτή εκλείπει και από τη ρυθμιστική περιοχή του γονιδίου της Midkine (Matsubara et al., 1990), του γονιδίου της Wnt-2, το οποίο ενεργοποιείται σε μύες κατά την πρώιμη ανάπτυξη (Smith et al., 1988), της p18 που εκφράζεται σε εμβρυικούς ιστούς μυός (Luo et al., 1991) και άλλων γονιδίων. Το κοινό αυτό χαρακτηριστικό μεταξύ γονιδίων που σχετίζονται με την ανάπτυξη, πιθανολογεί ένα διαφορετικό μηχανισμό ρύθμισης που ελέγχεται διαφορικά στο χρόνο και το χώρο. Στην απομακρυσμένη 5 περιοχή έχουν βρεθεί δύο αλληλουχίες δέσμευσης για τον AP-1 (Activator Protein-1), τέσσερις για το MyoD (myogenic factor D), μια αλληλουχία στοιχείου απόκρισης στον ορό (Serum Response Element, SRE) (Li et al.,1992) και μια για το μεταγραφικό παράγοντα HOXA5 (Homeobox A5) (Chen et al., 2005). Ενδιαφέρον είναι επίσης το γεγονός ότι πριν από το ανοιχτό αναγνωστικό πλαίσιο του γονιδίου βρίσκεται ενσωματωμένο στο γονίδιο της HARP ένα στοιχείο που μοιάζει με

13 τον ανθρώπινο ενδογενή ρετροϊό (human endogenous retrovirous-like element, HERV), το οποίο πλαισιώνεται από επαναλαμβανόμενες τελικές ακολουθίες 502 και 495 νουκλεοτιδίων. Λόγω της ειδικότητάς του να δεσμεύεται στο Glu-tRNA και του γεγονότος ότι είναι ενσωματωμένο στο εσωτερικό του γονιδίου της HARP, το στοιχείο αυτό ονομάστηκε HERV-E.PTN (ή GT-1). Έχει δειχτεί επίσης ότι ο μεταγραφικός παράγοντας Sp1, ο οποίος δεσμεύεται στο HERV-E.PTN είναι πολύ σημαντικός για την έκφραση του γονιδίου σε καρκινικά κύτταρα χορίου ανθρώπου (Schulte et al., 2000). Με ανάλυση κατά Southern έγινε γνωστό ότι το HERV-E.PTN εκτός από τον άνθρωπο υπάρχει στο χιμπατζή και το γορίλα, αλλά όχι στον πίθηκο rhezus, υποδηλώνοντας ότι η ενσωμάτωση του στο γονιδίωμα πραγματοποιήθηκε μετά από τον αποχωρισμό των πιθήκων και των χιμπατζήδων, πριν από 25 περίπου εκατομμύρια χρόνια (Schulte και Wellstein 1998). Στην εικόνα Ε.1 φαίνεται η δομή της ρυθμιστικής περιοχής του γονιδίου της HARP. Εικόνα Ε.1: Απεικόνιση της ρυθμιστικής περιοχής του γονιδίου της HARP. Διακρίνεται η περιοχή CAAT, καθώς και οι θέσεις αναγνώρισης από μεταγραφικούς παράγοντες. Ε.1.4 Πρωτεϊνική δομή του μορίου της HARP Το φαινομενικό μοριακό βάρος της HARP, όπως υπολογίζεται από SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση, είναι 18 kda. Το νούμερο όμως αυτό δεν αντικατοπτρίζει την αμινοξική αλληλουχία στο ώριμο πολυπεπτίδιο, αφού φασματοφωτομετρικές μελέτες έδωσαν μοριακό βάρος 15,291 kda (Hampton et al, 1992). Η διαφοροποιημένη κινητικότητα του μορίου της HARP στην SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση, σε αντίθεση με την αμινοξική αλληλουχία, οφείλεται στη μεγάλη περιεκτικότητα του μορίου σε βασικά αμινοξέα (Raulais et al., 1991; Wellstein et al., 1992). Η πρωτογενής δομή της HARP (Πίνακας Ε.2), όπως αποκαλύφθηκε από cdna κλώνους, αποτελείται από 168 αμινοξέα, τα οποία είναι υψηλά συντηρημένα σε διαφορετικά είδη, όπως στον άνθρωπο, στον αρουραίο, στο βόδι και στην όρνιθα (Li et al, 1990). Η

14 HARP περιέχει μια υψηλά υδρόφοβη αμινοτελική αλληλουχία 32 αμινοξέων, η οποία αντιστοιχεί στην αλληλουχία «σινιάλο» (signal peptide) του μορίου και ένα υδρόφιλο αμινοτελικό άκρο (Merenmies and Rauvala, 1990). Η αποκοπή του σηματοδοτικού αυτού πεπτιδίου φαίνεται να είναι εξαρτώμενη από το είδος του κυττάρου, και οδηγεί στην παραγωγή δυο διαφορετικών μορίων που διαφέρουν κατά τρία αμινοξέα στο αμινοτελικό άκρο του μορίου, με αποτέλεσμα να προκύπτουν πρωτεΐνες 136 και 139 αμινοξέων (Bernard- Pierrot et al, 2001). Η αμινοτελική αλληλουχία της ανθρώπινης, μιτογόνου, ανασυνδυασμένης HARP, η οποία απομονώνεται από έκφραση του γονιδίου σε ευκαρυωτικό σύστημα, περιέχει τρία επιπλέον αμινοξέα στο αμινοτελικό της άκρο (Laaroubi et al, 1994). Η απομόνωση αυτής της προεκτεινόμενης μορφής του μορίου (με τα τρία αμινοξέα στο αμινοτελικό άκρο) δημιούργησε πολλά ερωτηματικά σχετικά με τις διεργασίες κατά τη διάρκεια της βιοσύνθεσης του μορίου και αναφορικά με τη μιτογόνο δραστηριότητά του. Αξιοσημείωτο είναι ότι ανάλογη μορφή του μορίου μπορεί να εμφανισθεί και στη Midkine, το άλλο μέλος της οικογένειας των αυξητικών παραγόντων στην οποία ανήκει η HARP (Muramatsu 1993). Πίνακας Ε2:. Αμινοξική αλληλουχία της HARP. Tο υπογραμμισμένο τμήμα αντιστοιχεί στην αλληλουχία σινιάλου. Με * σημειώνονται τα δύο σημεία στα οποία μπορεί να πραγματοποιηθεί η πέψη και απομάκρυνση του πεπτιδίου αυτού. Πέψη σε διαφορετικά σημεία έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία ώριμων μορίων με διαφορετικό αμινοτελικό άκρο. Μ S S Q Q Y Q Q Q R R K F A Α A F L A L I F I L A Α V D T *A E A * G K Κ E K P E K Κ V K Κ S D C G E W Q W S V C V P T S G T C G L G T R E G T R T G A E C K Q T M K T Q R C K I P C N W K Κ Q F G A E C K Y Q F Q A W G E C D L N T A L K T R T G S L T R A L H N A D C Q K T V T I S K P C G K L T K P K P Q A E S K Κ K Κ K E G K Κ Q E K M L D Η ώριμη πρωτεΐνη αποτελείται κατά 24% από βασικά αμινοξέα, κυρίως λυσίνες, και περιέχει 10 κυστεΐνες. Οι 28 λυσίνες οργανώνονται σε δυο αλληλουχίες στο αμινοτελικό και καρβοξυτελικό άκρο του μορίου και οι κυστεΐνες σχηματίζουν πέντε δισουλφιδικούς δεσμούς ανάμεσα στις αλυσίδες, οι οποίοι και καθορίζουν την τριτοταγή δομή του μορίου. Έχει αναφερθεί ότι τέσσερις από αυτές παραμένουν αδέσμευτες (Hampton et al, 1992), ενώ σήμερα ισχύει άποψη ότι και οι πέντε συμμετέχουν στη δημιουργία δισουλφιδικών δεσμών (Kilpeainnen et al, 2000). Η πρωτογενής μορφή της HARP περιέχει επίσης τρεις περιοχές που φέρουν το μοτίβο K-R/K-X-R/K, και υποδηλώνουν πυρηνική εντόπιση (Hampton et al., 1992). Παρόλα αυτά, μέχρι τώρα υπάρχουν δύο αναφορές που υποστηρίζουν ότι η HARP

15 δεσμεύεται στη νουκλεολίνη (Τake et al., 1994; Said et al., 2005). Η τριτοταγής δομή του μορίου της HARP οργανώνεται σε δυο β-δομές, οι οποίες συνδέονται μεταξύ τους με έναν εύκαμπτο συνδέτη, και κάθε μια από αυτές τις δομές περιέχει τρεις αντιπαράλληλες β-πτυχές. Οι πλούσιες σε λυσίνες καρβοξυτελική και αμινοτελική περιοχές δε σχηματίζουν κάποια ανιχνεύσιμη δομή και έχουν τυχαία διαμόρφωση (Εικόνα Ε.2). Κάθε μια από τις β-δομές περιέχει από μια περιοχή πρόσδεσης στην ηπαρίνη και αυτές οι περιοχές θεωρούνται ότι παρουσιάζουν ομολογία με το μοτίβο της επαναλαμβανόμενης αλληλουχίας της θρομβοσπονδίνης τύπου Ι, που εντοπίζεται στο εξωκυττάριο υλικό και σε πρωτεΐνες της κυτταρικής επιφάνειας (Kilpelainen et al, 2000). Ωστόσο, πιο πρόσφατες έρευνες έδειξαν ότι αυτές οι περιοχές της HARP παρουσιάζουν πολύ μικρή αμινοξική ομολογία με το μοτίβο της TSR δομής (Roszmusz et al, 2002). Εικόνα Ε.2: Σχηματική αναπαράσταση της τριτοταγούς δομής της πρωτεΐνης της HARP. Οι β-πτυχές αντιπροσωπεύονται από τα βέλη και οι τυχαίες διαμορφώσεις στο αμινοτελικό και καρβοξυτελικό άκρα από τους κυλίνδρους. Διακρίνονται επίσης και οι πέντε δισουλφιδικοί δεσμοί. Οι αριθμοί αντιστοιχούν στα αντίστοιχα αμινοξέα της πρωτεΐνης (Papadimitrou et al., 2004).

16 Ε.1.5 Ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου της HARP Όσον αφορά στη γονιδιακή ρύθμιση της HARP, λίγα είναι τα στοιχεία που υπάρχουν στη βιβλιογραφία. Εάν κύτταρα BALB/ 3C 3T διεγερθούν με FGF-2, τότε μειώνεται η έκφραση του mrna της HARP (Menremies et al., 1992). Αντίθετα, αν σε κύτταρα ΝΙΗ 3Τ3 επιδράσει ο αυξητικός παράγοντας των αιμοπεταλίων (PDGF) ή ο FGF-2, τότε αυξάνεται η έκφραση του mrna της HARP (Li et al., 1992). Η έκφραση του mrna της HARP επάγεται και σε ηπατικά κύτταρα από τον αυξητικό παράγοντα των αιμοπεταλίων (PDGF-BB) και την υποξία (Antoine et al, 2005). Η ερευνητική μας ομάδα ανέδειξε την εμπλοκή του μεταγραφικού παράγοντα AP-1 στη μεταγραφική δραστηριότητα του γονιδίου της HARP, στην κυτταρική σειρά καρκίνου του προστάτη. Ο FGF-2 και το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ) επάγουν τη μεταγραφή του γονιδίου της HARP μέσω ενεργοποίησης του AP-1 με αποτέλεσμα την επαγωγή του πολλαπλασιασμού και της μετανάστευσης των κυττάρων (Hatziapostolou et al., 2006; Polytarchou et al., 2005). Η δράση του FGF-2 οφείλεται σε επαγωγή της NADPH οξειδάσης και αύξηση της παραγωγής του Η 2 Ο 2, μέσω αλληλεπίδρασης με τον υποδοχέα FGFR1 (Hatziapostolou et al., 2006), ενώ απαιτούνται και οι δύο θέσεις δέσμευσης του ΑΡ-1 (Hatziapostolou et al., 2006; Polytarchou et al., 2005). Επίσης, δείξαμε ότι η ακτινοβόληση με ακτίνες-χ επάγει την έκφραση του γονιδίου της HARP στο in vivo μοντέλο της χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης εμβρύου όρνιθας (Polytarchou et al., 2004) Πρόσφατα αποδείχθηκε ότι ο HOXA5, ένας μεταγραφικός παράγοντας που ρυθμίζει την εμβρυική ανάπτυξη, επάγει άμεσα τη μεταγραφή του γονιδίου της HARP, μετά την πρόσδεση του στο αντίστοιχο στοιχείο απόκρισης στη θέση -106 του υποκινητή του γονιδίου (Chen et al, 2005). Το γεγονός αυτό ενισχύει τη θέση της HARP ως μόριο-ρυθμιστή της εμβρυικής ανάπτυξης. Αντιφατικά είναι τα αποτελέσματα όσον αφορά στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης της HARP από το ρετινοϊκό οξύ. Από πειράματα σε κύτταρα Ρ 9 και NT 2 /D 1, τα οποία προέρχονται από τερατοκαρκίνωμα ποντικού και ανθρώπου αντίστοιχα, διατυπώθηκε η άποψη ότι το ρετινοϊκό οξύ επάγει την έκφραση της HARP (Kretschmer et al., 1991), κάτι όμως που δεν επιβεβαιώθηκε σε κύτταρα ΝΙΗ 3Τ3 (Li et al., 1992). Σε οστεοβλάστες, η έκφραση του γονιδίου της HARP μειώνεται από τη βιταμίνη D3 (Tamura et al., 1994). Αύξηση της έκφρασης του γονιδίου της HARP παρατηρείται μετά από προσθήκη του οφθαλμικού νευροτροφικού παράγοντα (Ciliary Neurotrophic Factor, CTNF)

17 σε αμφιβληστροειδικά μοσχεύματα στον οφθαλμό ποντικού (Roger et al, 2006). Επίσης, έχει δειχθεί ότι το κυκλικό AMP επάγει τα επίπεδα της HARP σε ντοπαμινεργικούς νευρώνες, χωρίς όμως να έχει διευκρινιστεί ο ακριβής μηχανισμός (Mourlevat et al., 2005). Σε εμβρυϊκούς ινοβλάστες ποντικού που τους λείπουν και τα δύο αλληλόμορφα για την PTEN (Phosphatase and Tensin homologue deleted on chromosome 10), η έκφραση της HARP επάγεται μέσω του μονοπατιού PTEN-PI3K-AKT (Li et al., 2006). Τέλος, σε ωοθήκες ποντικών, το μονοπάτι των Wnt/β-κατενίνη, αναστέλλει την έκφραση της HARP (Boerboom et al., 2006). E.1.6 Έκφραση του γονιδίου της HARP κατά την εμβρυική ανάπτυξη και την ενήλικη ζωή Η HARP απομονώθηκε το 1989 από εγκέφαλο νεογέννητου αρουραίου (Rauvala, 1989) και από μήτρα βοός (Milner et al., 1989; Li et al., 1990). Η έκφραση του γονιδίου επάγεται κυρίως κατά την όψιμη εμβρυογένεση και τη μετεμβρυϊκή ανάπτυξη (Rauvala, 1989; Li et al, 1990; Vanderwinden et al, 1992; Yeh et al, 1998). Σε παλαιότερες μελέτες έχει βρεθεί ότι το mrna της HARP ανιχνεύεται με in situ υβριδοποίηση κατά τη διάρκεια της εμβρυικής ανάπτυξης στο νευροεξώδερμα και το μεσόδερμα, φθάνοντας το μέγιστο έκφρασης λίγο μετά τη γέννηση (Vanderwinden et al, 1992). Η έκφραση της HARP ξεκινά στο νευρωνικό δίσκο την 8 η εμβρυική μέρα και στην πλευρική επιφάνεια του νευρωνικού αυλού την 9 η. Κατά το διάστημα μεταξύ 11 ης και 13 ης ημέρας περιορίζεται στη ραχιαία κοιλιακή ζώνη και τέλος, κατά την 15 η ανευρίσκεται στους κεντρικούς νευρώνες της φαιάς ουσίας (Fan et al, 2000). Το mrna της HARP εκφράζεται και στα πλάγια κέρατα του νωτιαίου μυελού (Fan et al, 2000), καθώς επίσης και στα πρόδρομα νευρωνικά κύτταρα του μεσεγκέφαλου (Jung et al, 2004). Επίσης εκφράζεται στους αναπτυσσόμενους άξονες εγκεφάλου ποντικού κατά τη διάρκεια της όψιμης εμβρυικής, αλλά και της πρώιμης μετεμβρυϊκής ζωής (Rauvala et al, 1994). Στο μέγιστο της έκφρασης της, ανιχνεύεται σε αστροκύτταρα, ολιγοδενδροκύτταρα και σε νευρώνες του νωτιαίου μυελού (Wang et al, 2004). Κατά τη μετεμβρυϊκή ζωή επίμυων, η HARP εκφράζεται κυρίως στον αναπτυσσόμενο φλοιό της παρεγκεφαλίδας και διατηρείται σε υψηλά επίπεδα και κατά την ενήλικη ζωή (Rauvala et al., 1994; Matsumoto et al., 1994; Blosch et al., 1992). Eχει ανευρεθεί σε μεγάλα ποσά στο νεοπάλαιο φλοιό και στο μεσεγκέφαλο μυός (Mitsiadis et al.,

18 1995), ενώ πιθανόν εμπλέκεται στις αλληλεπιδράσεις νευρικών κυττάρων-γλοίας κατά την ανάπτυξη του οργανισμού, αφού ανιχνεύεται και στα δύο αυτά είδη κυττάρων (Wanaka et al., 1993). Στο νευρικό σύστημα του ώριμου ατόμου, η HARP εκφράζεται κυρίως στον ιππόκαμπο και σε νευρώνες του φλοιού (Vanderwinden et al, 1992; Wanaka et al., 1993). Μεγάλα ποσοστά έκφρασης της HARP έχουν αναφερθεί επίσης σε νευροεκφυλιστικές ασθένειες, όπως η νόσος Alzheimer, το σύνδρομο Down (Wisniewski et al, 1996) και η νόσος του Parkinson (Ferrario et al, 2004). Η HARP εκφράζεται και στις νευρομυϊκές συνάψεις. Εντοπίζεται στην επιφάνεια των μυών και πριν την άφιξη των αξόνων στην περιοχή που θα δημιουργηθεί η σύναψη και πιθανόν παίζει ρόλο στην καθοδήγηση των κώνων αύξησης και τη δημιουργία της σύναψης (Szabat and Rauvala, 1996). Το mrna της HARP έχει ανιχνευτεί σε λεία μυϊκά κύτταρα επίμυος (Milhiet et al, 1998) και σε μυοκαρδιακά κύτταρα ποντικού, ενώ τα επίπεδα του μειώνονται κατά τη μετεμβρυϊκή διαφοροποίηση του μυοκαρδίου (Chen et al, 2004). Το mrna και η πρωτεΐνη HARP ανιχνεύονται στο αναπτυσσόμενο οστό και ανευρίσκονται σε μεγάλες ποσότητες στο χόνδρο και τα χονδροκύτταρα, κυρίως κατά τη διάρκεια της εμβρυικής και πρώιμης μετεμβρυϊκής ζωής, και λιγότερο κατά την ενηλικίωση (Azizan et al, 2000). Έχει ανευρεθεί σε κυτταρικό υλικό που δρα ως υπόστρωμα για το σχηματισμό χόνδρου (Imai et al, 1998), στον οδοντικό πολφό επίμυος (Vanderwinden et al, 1992) και σε οστεοβλάστες βοός (Tezuka et al, 1990). Αυξημένα επίπεδα mrna της HARP παρατηρούνται στις επιφυσιακές πλάκες των οστών κατά την διάρκεια της επιδιόρθωσης τους (Imai et al, 199), ενώ η πρωτεΐνη ανιχνεύεται και κατά τη διάρκεια της επούλωσης του οστού μετά από κατάγματα (Petersen et al, 2004). Επίσης σε οστεοαρθρικούς χόνδρους παρατηρείται υπερέκφραση του mrna της HARP σε σχέση με το φυσιολογικό χόνδρο (Pufe et al, 2006). Κατά την κύηση, η έκφραση της HARP αυξάνεται στο μυομήτριο ενήλικα αρουραίου, ενώ έχει παρατηρηθεί και διαφορική έκφραση του mrna του μορίου κατά τη διάρκεια του έμμηνου κύκλου (Milhiet et al., 1998). Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι η HARP βρίσκεται υπό ορμονικό έλεγχο. Το mrna της HARP ανιχνεύεται στα κύτταρα Leydig όρχεων αρουραίου (Vanderwinden et al, 1992), ενώ υπερεκφράζεται στην νόσο του Peyronie και τη νόσο Dupuytren (Qian et al, 2004).

19 Ε.7 Αλληλεπιδράσεις και υποδοχείς της HARP Η HARP απομονώθηκε αρχικά ως ένας αυξητικός παράγοντας των νευριτών μετά από έκλουση στήλης ηπαρίνης-σεφαρόζης από 1Μ ΝaCl (Rauvala et al., 1989). Όπως αποδείχθηκε αργότερα, παρόλο που οι άμινο- και καρβοξυτελικές ουρές είναι πλούσιες σε λυσίνη και είναι ισχυρά φορτισμένες, η πρόσδεση της HARP στην ηπαρίνη εξαρτάται από τις TSR περιοχές εντός των β-πτυχωτών δομών. Όπως αποδείχθηκε με φασματοσκοπία μαγνητικού συντονισμού (NMR), η ηπαρίνη σε διάλυμα δεσμεύεται και στις δύο β-περιοχές (Kilpelainen et al, 2000). Επίσης, παρόλο που οι τελικές, πλούσιες σε λυσίνη περιοχές περιέχουν αλληλουχίες πρόσδεσης της ηπαρίνης, οι τελευταίες δεν απαιτούνται για την υψηλής συγγένειας πρόσδεση της HARP στην ηπαρίνη και τη θειική ηπαράνη (Raulo et al, 2005) και αλλαγές στις αλληλουχίες των πλούσιων σε λυσίνη τελικών περιοχών του μορίου, δεν επηρεάζουν την πρόσδεση (Munoz et al, 2004). Η μεγάλη συγγένεια της ηπαρίνης για την HARP χρησιμοποιείται ως αρχή απομόνωσης του μορίου από το μέσο καλλιέργειας κυττάρων και τα βιολογικά υγρά (Soulie et al, 2002). Η υψηλή συγγένεια πρόσδεσης της ηπαρίνης στη HARP οδήγησε στο σκεπτικό ότι πιθανά να δεσμεύεται σε πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης παρούσες στην κυτταρική επιφάνεια και το εξωκυττάριο υλικό. Πράγματι, η HARP αποδείχτηκε να αλληλεπιδρά με τις παραπάνω πρωτεογλυκάνες του εξωκυττάριου τμήματος σε διάφορες κυτταρικές σειρές (Papadimitriou et al., 2000;2001; Polycratis et al., 2004; Soulie et al., 2002; Bernard-Pierrot et al., 2004; Vacherot et al., 1999). Στη συνέχεια, έγιναν αναφορές σχετικά με την πρόσδεση της HARP, με χαμηλότερη όμως συγγένεια, με διάφορες άλλες γλυκοζαμινογλυκάνες θειικής δερματάνης και θειικής χονδροϊτίνης Α, αλλά όχι με γλυκοζαμινογλυκάνες θειικής χονδροϊτίνης C και θειικής κερατάνης (Vacherot et al., 1999). Η θειική δερματάνη και η θειική χονδροϊτίνη είναι πρωτεογλυκάνες, των οποίων η γλυκοζαμινογλυκανική πλευρική αλυσίδα αποτελείται από επαναλαμβανόμενες δισακχαριδικές μονάδες -GlcUA-GalNAc- (Dγλυκουρονικό οξυ-) και IdoUA-GalNAc- (L-ιδουρονικό οξυ-) αντίστοιχα, εμφανίζουν πολλά και διαφορετικά ποσοστά θειικών και μπορούν να υπάρξουν και ως συμπολυμερή (CS/DS) (Silbert and Sugumaran, 2002; Sugahara et al., 2003). Οι τελευταίες είναι σημαντικές για την πρόσδεση αυξητικών παραγόντων, τη γένεση των νευριτών και την ανάπτυξη του εγκεφάλου (Sugahara et al., 2003; Bandtlow and Zimmermann, 2000). Έχει αποδειχθεί ότι η HARP επάγει την προέκταση των νευριτών μέσω αλληλεπιδράσεων με την πλευρική αλυσίδα θειικής ηπαράνης της συνδεκάνης-3 (Kinnunen et al., 1996), ενώ άλλες μελέτες δείχνουν ότι η HARP αλληλεπιδρά με ενδογενείς και εξωγενείς αλυσίδες θειικής

20 χονδροϊτίνης και δερματάνης (Deepa et al, 2002; Bao et al., 2004; Nandini et al., 2004; 2005; Bao et al., 2005). Έχει αναφερθεί ότι η πρόσδεση της HARP στην ηπαρίνη ευνοείται όταν η HARP είναι προσκολλημένη στον πυθμένα των τρυβλίων επώασης (Mitsiadis et al, 1995). Και εδώ παίζουν ρόλο οι γλυκοζαμινογλυκάνες της κυτταρικής επιφάνειας, αφού έτσι υπάρχει πιο ισχυρή πρόσδεση τους με την HARP, με αποτέλεσμα να επάγεται ο πολλαπλασιασμός σε αντίθεση με την περίπτωση που η HARP βρίσκεται διαλυμένη στο θρεπτικό μέσο (Papadimitriou et al., 2000). Οι γλυκοζαμινογλυκάνες φαίνεται να προστατεύουν τη HARP από την πρωτεολυτική δράση της πλασμίνης επί του πεπτιδικού δεσμού Κ59-Κ60, o οποίος βρίσκεται μεταξύ των δύο β-πτυχωτών δομών αλλά όχι σε άλλες θέσεις (Polykratis et al, 2004), γεγονός που οδηγεί στη σκέψη ότι πιθανόν να είναι υπεύθυνες για την παρουσίαση του μορίου στους ειδικούς υποδοχείς του. Η HARP έχει βρεθεί ότι προσδένεται και στις συνδεκάνες 1 και 3 (Raulo et al, 1994). Η τελευταία, η οποία ονομάζεται και Ν-συνδεκάνη, είναι μια 200 kda πρωτεΐνη της κυτταρικής επιφάνειας που περιέχει αλυσίδες θειικής ηπαράνης, με υψηλά ποσοστά σε 2-Ο σουλφωνικά κατάλοιπα ιδουρωνικού οξέος, με αποτέλεσμα να προσδένεται εύκολα με την HARP (Kinnunen et al, 1996). H N-συνδεκάνη έχει βρεθεί ότι προσδένει τη HARP σε οστεοβλάστες και πρόδρομα οστικά κύτταρα (Imai et al, 1998). Το mrna για την Ν- συνδεκάνη και τη HARP έχει ανευρεθεί και στα πρόδρομα νευρωνικά κύτταρα επηρεάζοντας την περαιτέρω εξέλιξη τους (Furuta et al, 2004). Η HARP έχει βρεθεί να δεσμεύεται στο διαμεμβρανικό υποδοχέα με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ (Receptor-like Protein Tyrosine Phosphatase β/ζ, RPTP β/ζ) (Maeda et al., 1996). Η φαινομενική μοριακή μάζα του είναι 250 kda, ενώ οι γλυκοζυλιωμένες του μορφές αναλύονται στα 300 kda. Παρόλο που περιέχει δύο περιοχές με αλληλουχία φωσφατάσης στο κυτταροπλασματικό τμήμα του, μόνο αυτή που είναι πλησιέστερη στη μεμβράνη παρουσιάζει τέτοια δράση (Krueger and Saito, 1992). Ο RPTPβ/ζ είναι η κύρια πρωτεογλυκάνη θειικής ηπαράνης στο αναπτυσσόμενο νευρικό σύστημα (Canoll et al, 1993; Krueger and Saito, 1992; Levy et al, 1993) και η εξαρτώμενη από το χώρο και τη χρονική στιγμή έκφραση του, υποδεικνύει τον πιθανό του ρόλο στη μορφογένεση και την πλαστικότητα του νευρικού συστήματος (Canoll et al, 1993). Σε in vitro καλλιέργειες, η μετανάστευση των νευριτών που επάγεται από τη HARP, αναστέλλεται εάν χρησιμοποιηθούν αντισώματα έναντι του εξωκυττάριου τμήματος του RPTP β/ζ (Maeda et al., 1998). Ο RPTPβ εκφράζεται σε γλοιοβλαστώματα και νευροβλαστώματα (Goldmann et al, 2000), καθώς επίσης και σε μηνιγκιώματα (Tong et al, 2006). Ωστόσο τα επίπεδα του υποδοχέα εμφανίζονται μειωμένα σε καρκίνο του ορθού (Yamakawa et al, 1999). Έχει επίσης

21 βρεθεί σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα και διαμεσολαβεί την επαγόμενη από HARP μετανάστευση αυτών (Polykratis et al., 2005). O RPTPβ/ζ έχει τέσσερεις διαφορετικές ισομορφές: δυο διαμεμβρανικές, μια τρίτη εκκρινόμενη (γνωστή και ως φωσφακάνη) και μια τελευταία γνωστή ως PSI, οι οποίες είναι αποτέλεσμα εναλλακτικής ωρίμανσης του μετάγραφου (Barnea et al, 1994; Maurel et al, 1994; Garwood et al., 2003). Οι διαμεμβρανικές μορφές του υποδοχέα εκφράζονται κυρίως στους νευρώνες του φλοιού (Canoll et al, 1996). Η έκφραση της φωσφακάνης, στην οποία λείπει η διαμεμβρανική και η κυτταροπλασματική περιοχή (Krueger and Saito, 1992; Maurel et al, 1994; Barnea et al, 1994) επάγεται κατά την εμβρυική ανάπτυξη του νευρικού συστήματος (Sakurai et al, 1997). Επίσης μετεμβρυϊκά εκφράζεται από τα κύτταρα της γλοίας ανάλογα με τη φάση ανάπτυξης του νευρικού συστήματος και συνεκφράζεται με διάφορα μόρια προσκόλλησης (Canoll et al, 1993; Milev et al, 1994; Grumet et al, 1994). Οι δύο άλλες μορφές αναφέρονται ως long και short μορφές. Η τελευταία διαφέρει από την πρώτη στο ότι της λείπει ένα μεγάλο τμήμα της εξωκυττάριας περιοχής πλησίον της μεμβράνης (Levy et al, 1993). Τέλος, η PSI (Phophacan Short Isoform) αντιστοιχεί στο μεγαλύτερο εξωκυττάριο τμήμα της short μορφής του υποδοχέα. Όπως και η φωσφακάνη, επάγει την προέκταση των νευριτών του φλοιού (Garwood et al, 2003), ενώ μετεμβρυϊκά περιορίζεται στους νευρώνες και όχι στα κύτταρα της γλοίας, όπως συμβαίνει με τη φωσφακάνη (Heck et al, 2005). Η φωσφακάνη και η long μορφή του υποδοχέα είναι ισχυρά γλυκοζυλιωμένες πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης, ενώ το PSI και η short μορφή είναι γλυκοπρωτεΐνες (Garwood et al, 2003). Η πρόσδεση της HARP στον RPTP β/ζ γίνεται μέσω των αλυσίδων θειικής χονδροϊτίνης και αναστολή αυτής έχει ως αποτέλεσμα τη δραστική μείωση της συγγένειας πρόσδεσης και της μεταγωγής σήματος από αυτόν τον υποδοχέα (Maeda et al, 1996; Maeda et al, 1998). Ο πιο πρόσφατα χαρακτηρισμένος υποδοχέας της HARP έχει δράση κινάσης τυροσίνης και ονομάζεται κινάση του αναπλαστικού λεμφώματος (Anaplastic Lymphoma Kinase, ALK). Πρόκειται για μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη με μοριακό βάρος 200 kda. O ALK ανακαλύφθηκε ως τμήμα μιας πρωτεΐνης σύντηξης με δράση κινάσης τυροσίνης, της νουκλεοφωσμίνης-alk, η οποία σχετίζεται με το αναπλαστικό λέμφωμα των μεγακαρυοκυττάρων (Morris et al, 1994). Έχουν βρεθεί δύο μορφές του ALK, με μοριακές μάζες 220 και 140 kda (Lutz et al, 2005; Iwahara et al, 1997; Morris et al, 1997). Η 140 kda μορφή προέρχεται από τμήση της 220 kda μορφής (Lutz et al, 2005). Η τελευταία έχει την τυπική δομή κινάσης τυροσίνης και αποτελείται από μια μεγάλη εξωκυττάρια περιοχή, μια λιπόφιλη διαμεμβρανική περιοχή και ένα κυτταροπλασματικό τμήμα με δράση κινάσης τυροσίνης (Iwahara et al, 1997; Morris et al, 1997).

22 Το γονίδιο για τον ALK εκφράζεται στο νευρικό σύστημα (Pulford et al, 1997), σε καλλιέργειες ινοβλαστών, ενδοθηλιακών κυττάρων καθώς επίσης και σε καρκινικές κυτταρικές σειρές παγκρέατος και μαστού (Stoica et al, 2001; 2002,), μελανώματος (Dirks et al, 2002), νευροβλαστώματος (Lamant et al., 2000;), γλοιοβλαστώματος (Powers et al, 2002) και σε non-hodgkin λεμφώματα (Delsol et al, 1997). Η HARP προσδένεται στην εξωκυτταρική περιοχή του ALK σε διάφορους τύπους κυττάρων (Stoica et al., 2002) με μεγάλη συγγένεια, ενώ αντισώματα έναντι του συγκεκριμένου τμήματος του υποδοχέα ή για την ΗΑRP παρεμποδίζουν την πρόσδεση και τη μεταγωγή σήματος (Stoica et al, 2001; Bowden et al, 2002; Powers et al, 2002; Lu et al, 2005). Η δέσμευση είναι ειδική και πιθανότατα πραγματοποιείται μέσω του καρβοξυτελικού άκρου της HARP, και πιο συγκεκριμένα με το τμήμα που περιλαμβάνει τα αμινοξέα (Bernard-Pierrot et al., 2002) Τέλος, η HARP προσδένεται και στη νουκλεολίνη, η οποία πιθανά την μεταφέρει μεταξύ κυτταροπλάσματος και πυρήνα απουσία ηπαρίνης (Said et al, 2005). Η νουκλεολίνη είναι μια πρωτεΐνη με μοριακή μάζα 100 kda, η οποία εμπλέκεται άμεσα ή έμμεσα σε πολλές διαδικασίες όπως η κυτταροκίνηση, ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η μεταφορά συστατικών του ριβοσώματος μεταξύ κυτταροπλάσματος και πυρήνα, η μεταγωγή σήματος και η αποσυμπύκνωση της χρωματίνης (Tuteja and Tuteja, 1998; Ginisty et al, 1999). Φαίνεται ότι η νουκλεολίνη της κυτταρικής επιφάνειας βοηθά στην είσοδο της HARP στο εσωτερικό του κυττάρου, ενώ οι πρωτεογλυκάνες θειικής ηπαράνης και θειικής χονδροϊτίνης υποβοηθούν την αλληλεπίδραση της HARP με τη νουκλεολίνη (Said et al, 2005). Ε.8 Μεταγωγή σήματος Tο μονοπάτι μεταγωγής σήματος που ενεργοποιείται μετά από πρόσδεση της HARP στον RPTPβ/ζ δεν έχει διασαφηνιστεί πλήρως. Πρόσδεση της HARP στον RPTPβ/ζ, έχει ως αποτέλεσμα την αλληλεπίδραση του και τη μεταγωγή σήματος μέσω διαφόρων μορίων, όπως η β-κατενίνη (Meng et al., 2000), η πρωτεϊνική κινάση C (PKC) (Pariser et al., 2005), η β- αντουσίνη (Pariser et al., 2005), η κοντακτίνη (Peles et al., 1995) και δύο μέλη της οικογένειας των Src κινασών, η Fyn (Pariser et al., 2005b) και c-src (Polykratis et al., 2004). Υπάρχουν αντικρουόμενα αποτελέσματα ως προς το εάν δέσμευση της HARP στον RPTPβ/ζ οδηγεί σε ενεργοποίηση ή απενεργοποίηση της δράσης φωσφατάσης τυροσίνης του υποδοχέα. Για παράδειγμα, στην κυτταρική σειρά HeLA, η HARP οδηγεί σε απενεργοποίηση της δράσης φωσφατάσης του υποδοχέα και ενεργοποίηση της PKC. Η PKC φωσφορυλιώνει την πρωτεΐνη β-αντουσίνη στη σερίνη των θέσεων 713 και 726. Η φωσφορυλιωμένη β-

23 αντουσίνη παρουσιάζει μειωμένη συγγένεια για τα ινίδια της ακτίνης. Τελικό αποτέλεσμα είναι η αποδέσμευση της β-αντουσίνης από τα ινίδια της ακτίνης, αποσταθεροποίηση του κυτταρικού σκελετού και συγκεκριμένα των ινιδίων ακτίνης και των συνδέσεων σπεκτρίνηςακτίνης και αποικοδόμηση και ανακατανομή της β-αντουσίνης σε διαφορετικά κυτταρικά διαμερίσματα. Το συγκεκριμένο μονοπάτι μεταγωγής σήματος ερμηνεύει την παρατηρούμενη αποδιοργάνωση και αστάθεια του κυτταροσκελετού σε καρκινικά κύτταρα, στα οποία είναι συνεχώς ενεργό το γονίδιο της HARP (Pariser et al., 2005). Επίσης δείχθηκε ότι η HARP απενεργοποιεί τον RPTPβ/ζ μέσω ολιγοδιμερισμού και επάγει τη φωσφορυλίωση σε τυροσίνη του Git1 (G protein-coupled receptor kinase-interactor 1) και της Magi1 (Membrane associated guanylate kinase 1) (Fukada et al., 2006). Από την άλλη πλευρά, στα κύτταρα HUVEC, η HARP ενεργοποιεί τη δράση φωσφατάσης του υποδοχέα με αποτέλεσμα την αποφωσφορυλίωση της κινάσης Src στη θέση Tyr 527 και τη φωσφορυλίωση της κινάσης εστιακής προσκόλλησης FAK (Focal Adhesion Kinase), της 3-κινάσης των φωσφοϊνοσιτιδίων (PI3-K) και των ERK. Το μονοπάτι αυτό οδηγεί σε επαγωγή της διαφοροποίησης και της μετανάστευσης ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC. Αποσιώπηση του υποδοχέα με χρήση παρεμβαλλόμενου RNA, είχε ως αποτέλεσμα την παρεμπόδιση της μεταγωγής σήματος και της μετανάστευσης των κυττάρων (Polykratis et al., 200υ). Πρόσφατα επίσης αναφέρθηκε ότι ο RPTPβ/ζ παίζει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της μνήμης, τροποποιώντας τη δράση της Rho GTPάσης διαμέσου αποφοσφωρυλίωσης της RhoGAP (Takamura et al., 2006). Όσον αφορά στη μεταγωγή σήματος μετά από πρόσδεση της HARP στον υποδοχέα της ALK, έχει δειχθεί ότι επάγεται η φωσφορυλίωση των IRS-1 και Shc, η φωσφολιπάση C-γ και η PI3-K (Stoica et al., 2001). Αναστολή της έκφρασης του ALK σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος ανέστειλε και τη φωσφορυλίωση της αντι-αποπτωτικής πρωτεΐνης Akt (Powers et al., 2002), ενώ σε ινοβλάστες το αντιαποπτωτικό σήμα της HARP διαμεσολαβείται από τις MAP κινάσες (Bowden et al., 2002). Σε κακοήθη Τ λεμφοκύτταρα, η ενεργοποίηση του ALK φωσφορυλιώνει την πρωτεΐνη STAT-3 με μη εξαρτώμενο από την κινάση Jak3 τρόπο (Marzec et al., 2005). Όσον αφορά στην πρόσδεση της HARP στην Ν-συνδεκάνη, αποδείχθηκε ότι ενεργοποιείται το μονοπάτι της κινάσης Src (Kinnunen et al., 1998; Rauvala et al., 2000). Εκτός από τα αποτελέσματα που αφορούν στη μεταγωγή σήματος μετά τη δέσμευση της HARP στους χαρακτηρισμένους υποδοχείς της, υπάρχουν και δεδομένα για ενεργοποίηση μορίων μεταγωγής σήματος, χωρίς να είναι γνωστός ο εμπλεκόμενος υποδοχέας. Για παράδειγμα, αναστολή της έκφρασης της HARP έχει ως αποτέλεσμα την αποφωσφορυλίωση της AKT και της GSK-3β (Li et al., 2006). Στο χολοστεάτωμα, η HARP εμπλέκεται στην

24 παθογένεια της νόσου και θεωρείται ότι στο σηματοδοτικό μονοπάτι συμμετέχουν οι PI3-K, MAPK και η Adenosine Kinase (Κim 2004). Eπίσης, μελέτες με ποντίκια που δεν εκφράζουν (HARP deficient mice) έδειξαν ότι ρυθμίζει το σύστημα ρενίνης-αγγειοτενσίνης (Herradon et al., 2004), καθώς επίσης και τη βιοσύνθεση των κατεχολαμινών (Ezquerra et al., 2004). Τέλος, η HARP αναστέλλει τη λιπογένεση μέσω του μονοπατιού PI3-K/AKT/GSK-3β/βκατενίνη, το οποίο επικοινωνεί με το μονοπάτι Wnt/Fz/GSK-3β/β-κατενίνη (Gu et al., 2007). Ε.1.9 Βιολογικές δράσεις της HARP Ε Ρόλος της HARP στην ανάπτυξη Η πρώτη αναφερθείσα δράση της HARP είναι η ικανότητα της να επάγει την προέκταση νευριτών σε νευρικά κύτταρα (Rauvala et al., 1989). Παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση και οργάνωση του εγκεφάλου (Rauvala et al., 1994). Έχει συσχετιστεί με την αναστολή του πολλαπλασιασμού των πολυδύναμων κυττάρων του μετωπιαίου φλοιού και την επαγωγή της διαφοροποίησης τους, ενώ φαίνεται να αντισταθμίζει τη μιτογόνο δράση του FGF-2 στα κύτταρα αυτά (Hienola et al., 2004). Στο νευρικό σύστημα του ενήλικα εκφράζεται από αστροκύτταρα, μακροφάγα και ενδοθηλιακά κύτταρα μετά από τραυματισμό, υποδεικνύοντας την εμπλοκή της στην ανάπλαση των τραυματισμένων ιστών (Yeh et al., 1998; Blondet et al., 2005; Wang et al., 2004). H HARP διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη της μνήμης, καθώς ρυθμίζει το κατώφλιο επίπεδο της μακροχρόνιας ρύθμισης (Long-Term Potentiation, LTP) των νευρώνων της C1 περιοχής του ιππόκαμπου. Σε μύες στους οποίους έχει απαλειφθεί το γονίδιο της HARP, εμφανίζονται σημαντικά χαμηλότερα LTP, φαινόμενο το οποίο αναστρέφεται μετά από εξωγενή χορήγηση HARP (Αμετ ετ αλ., 2001). Επιπλέον, φαίνεται να συμμετέχει στην μορφογένεση των κυττάρων Purkinje κατά την διάρκεια ανάπτυξης της παρεγκεφαλίδας (Tanaka, et al., 2003) και στην νευρομυική σύναψη, αφού σε μυϊκά κύτταρα Xenopus επάγει τη συσσώρευση των υποδοχέων ακετυλοχολίνης στην περιοχή όπου παρατηρείται η σύνδεση (Peng et al., 1995; Zhou et al., 1997). H HARP συμμετέχει επίσης στη διαδικασία της σπερματογένεσης. Όταν εμβρυικά κύτταρα μυών επιμολυνθούν με ανενεργές μορφές του μορίου, αναπτύσσονται μη γόνιμοι χιμαιρικοί μύες που φέρουν ατροφικούς όρχεις και παρουσιάζουν μεγάλο ποσοστό απόπτωσης των σπερματοζωαρίων (Zhang et al., 1999). Θηλυκά ποντίκια που δεν εκφράζουν

25 HARP και Midkine παρουσιάζουν μειωμένη περίοδο οίστρου και τα μισά από αυτά εμφανίζουν ανωμαλίες στην ανατομία του κόλπου και στειρότητα (Muramatsu et al., 2006). Επιπρόσθετα, ρυθμίζει τη δράση της πρωτεΐνης των οστών ( Bone Morphogenetic Protein, BMP) (Sato et al., 2002) και επάγει τη χονδρογένεση στα αναπτυσσόμενα άκρα της όρνιθας (Dreyfus et al., 1998), ενώ δύναται να επάγει και τη μετανάστευση των οστεοβλαστών (Imai et al., 1998). Τέλος, φαίνεται να συμμετέχει στη λειτουργία του αγγειακού συστήματος, καθώς αποτελεί ρυθμιστή του συστήματος ρενίνης-αγγειοτενσίνης. Σε αορτή από μύες στους οποίους έχει απαλειφθεί το γονίδιο της HARP, παρατηρείται πολύ μικρότερα επίπεδα του mrna του ενζύμου μετατροπής της αγγειοτενσίνης (Angiotensin Converting enzyme, ACE). Αντίθετα, παρατηρείται πολύ μεγάλη αύξηση στα ώριμα μετάγραφα των υποδοχέων της αγγειοτενσίνης ΙΙ, τύπου 1 και 2 (Herradon et al., 2004). Ε HARP και κυτταρικός πολλαπλασιασμός Έχει αποδειχθεί ότι η HARP επάγει τον πολλαπλασιασμό σε ποικιλία τύπων κυττάρων, όπως ενδοθηλιακά (Courty et al., 1991; Papadimitriou et al., 2000), επιθηλιακά (Fang et al., 1992; Vacherot et al., 1999), ινοβλάστες (Τakamatsu et al., 1992; Fang et al., 1992), λεία μυϊκά κύτταρα (Fabri et al., 1992), κερατινοκύτταρα (Florin et al., 2005) και ηπατικά κύτταρα (Antoine et al., 2005). Τα αποτελέσματα σχετικά με τη μιτογόνο δράση της HARP αμφισβητήθηκε από πολλές ερευνητικές ομάδες. Ειδικότερα, διατυπώθηκε η άποψη ότι η δράση αυτή πιθανά να οφείλεται σε αυξητικούς παράγοντες που επιμόλυναν την HARP κατά τη διάρκεια απομόνωσης της (Hampton, et al., 1992; Raulo et al., 1992). Η χρήση αντισώματος έναντι του FGF-2, σε καλλιέργειες ενδοθηλιακών κυττάρων, δεν ανέστειλε τη μιτογόνο δράση της HARP, υποδεικνύοντας ότι οι δύο αυξητικοί παράγοντες έχουν ανεξάρτητη δράση (Souttou et al., 1997). Παρόλα αυτά, τα αποτελέσματα σχετικά με τη μιτογόνο δράση της HARP είναι αντιφατικά, δεδομένου ότι εξαρτάται από το είδος της HARP που χρησιμοποιείται, το σύστημα έκφρασης και τον τύπο του κυττάρου που μελετάται. Αντίθετα, είναι γενικά αποδεκτό οι υπάρχουν διάφορες μορφές του μορίου, που σχηματίζονται από την επίδραση των εκάστοτε συστατικών του μικροπεριβάλλοντος των κυττάρων και ασκούν ποικιλία δράσεων μέσω διαφορετικών υποδοχέων (Szabat et al., 1996; Souttou et al., 1997; Polykratis et al., 2004; Lu et al., 2005).

26 Ε HARP και αγγειογένεση Ένας πιθανός ρόλος της HARP στη φυσιολογική αγγειογένεση προτάθηκε όταν ανιχνεύτηκε το mrna και απομονώθηκε η πρωτεΐνη της από αγγειοβριθείς ιστούς, όπως είναι η μήτρα βοός και η μήτρα επίμυος (Milner et al., 1989; Vanderwinden et al., 1992). Η αγγειογενετική δράση της HARP έχει διαπιστωθεί σε in vivo συστήματα μελέτης, όπως η χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη εμβρύου όρνιθας (CAM assay) και εμφυτεύματα matrigel σε μυς (Papadimitriou et al., 2000; Bernard-Pierott et al., 2002). Μέχρι σήμερα πολλές είναι οι αναφορές που εμπλέκουν τη HARP στον πολλαπλασιασμό (Bohlen et al., 1988, Courty et al., 1991, Papadimitriou et al., 2000, Souttou et al., 2001), τη διαφοροποίηση ενδοθηλιακών κυττάρων (Papadimitriou et al., 2000, Souttou et al., 2001) και το σχηματισμό αυλών σε μια ποικιλία πηκτωμάτων όπως κολλαγόνου (Laaroubi et al., 1994; Papadimitriou et al., 2001), ινώδους και matrigel (Papadimitriou et al., 2001). Ο αγγειογενετικός ρόλος της HARP μπορεί να σχετίζεται με την παθογένεση του ενδομητρίου, μια ήπια γυναικολογική διαταραχή (Chung et al., 2002). Επιπλέον, η HARP εντοπίζεται σε ενήλικα άτομα σε καταστάσεις φλεγμονής, όπως κατά τη ρευματοειδή αρθρίτιδα (Pufe et al., 2003), όπου μπορεί να δρα ως παρακρινής αγγειογενετικός παράγοντας. Τέλος, σημαντικός είναι ο ρόλος της HARP στην επάγομενη από όγκους αγγειογένεση. Ε.1.10 Σχέση δομής-βιολογικής δράσης Η πρώτη αναφερθείσα δράση της HARP είναι η ικανότητα της να επάγει την προέκταση νευριτών (Rauvala et al., 1989), ενώ συμμετέχει και στα γεγονότα που λαμβάνουν χώρα κατά τη διαφοροποίηση και την οργάνωση του εγκεφάλου (Rauvala et al., 1994). Το μεταλλαγμένο πεπτίδιο ΗΔ , παρόλο που δεν παρουσιάζει μιτογόνο δράση, διατηρεί την ικανότητα να επάγει τη διαφοροποίηση πρωτογενών νευρώνων (Bernard-Pierrot et al., 2001). Πειράματα με συνθετική ανθρώπινη HARP που παρουσιάζει έλλειμμα στην καρβοξυτελική περιοχή έδειξαν ότι η συγκεκριμένη περιοχή δεν παίζει ρόλο στην προέκταση νευριτών από εγκεφαλικά κύτταρα εμβρύου αρουραίου, σε αντίθεση με έλλειμμα στην Ν- τελική περιοχή, όπου ανεστάλη σχεδόν πλήρως αυτή η δράση (Innui et al, 1999). Έχει αποδειχθεί ότι η HARP επάγει τον πολλαπλασιασμό σε ποικιλία τύπων κυττάρων. Αρχικά, θεωρείτο ότι τα τρία τελευταία αμινοξέα στο αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης σχετίζονται με τη σταθερότητα και τη μιτογόνο δράση της (Delbe et al, 1995). Αργότερα, αποδείχθηκε ότι και οι δύο τύποι της HARP, HARP 136 και HARP 139,

27 παρουσιάζουν μιτογόνο δράση σε κύτταρα NIH-3T3 και BEL, συνεπώς τα τρία επιπλέον αμινοξέα δεν είναι σημαντικά για αυτή της τη δράση (Pierrot et al, 2001). Tα πεπτίδια της HARP 1-21 και επάγουν τον πολλαπλασιασμό κυττάρων BBC (bovine brain capillaries) και RAME (rat adrenal medulla) αλλά όχι των HUVEC (human umbilical vein endothelial cells) (Papadimitriou et al., 2000), γεγονός που υποδηλώνει ότι ο τύπος των κυττάρων παίζει σημαντικό ρόλο. Επιπλέον, δεν είναι ξεκαθαρισμένο εάν η μιτογόνος δράση της HARP και των πεπτιδίων της είναι άμεση ή οφείλεται στην απελευθέρωση άλλων αυξητικών παραγόντων από τον εξωκυττάριο χώρο, γεγονός που υποδηλώνει ότι το μικροπεριβάλλον των κυττάρων μπορεί να είναι σημαντικό. Τα αμινοξέα φαίνεται να είναι υπεύθυνα για τη μιτογόνο δράση της HARP στην καρκινική σειρά CHO-K1, αφού το μεταλλαγμένο πεπτίδιο ΗΔ δεν παρουσιάζει καμία δράση επί του πολλαπλασιασμού, ενώ το μεταλλαγμένο πεπτίδιο ΗΔ εμφανίζει παρόμοια μιτογόνο δράση με αυτή του αγρίου τύπου (Pierrot et al, 2001). Αυτό ενισχύεται από το γεγονός ότι η ενεργοποίηση του μονοπατιού των MAP κινασών αναστέλλεται από το μεταλλαγμένο πεπτίδιο ΗΔ σε κύτταρα BEL (Souttou et al, 1997). Τέλος, έχουν ανευρεθεί σε κύτταρα HEK 293T δύο μορφές της HARP, με μοριακές μάζες 18 και 15 kda, ως προϊόντα πιθανής μεταμεταφραστικής αποκοπής των 12 τελικών αμινοξέων από το καρβοξυτελικό άκρο. Η HARP15 επάγει τον πολλαπλασιασμό κυττάρων γλοιοβλαστώματος μέσω του υποδοχέα ALK, ενώ η HARP 18 προάγει στην ίδια καρκινική σειρά την μετανάστευση των κυττάρων μέσω του υποδοχέα RPTPβ/ζ (Lu et al, 2005), γεγονός που υποδηλώνει σημαντικό ρόλο του τύπου του υποδοχέα της HARP που εκφράζει ο κάθε κυτταρικός τύπος. Όσον αφορά στην αγγειογενετική δράση της HARP, έχει αποδειχθεί ότι χημικά συντιθέμενο καρβοξυτελικό άκρο της HARP, που αποτελείται από τα τελευταία 43 αμινοξέα, προάγει την δραστικότητα του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου (Plasminogen Activator, PA) και αναστέλλει τα επίπεδα του αναστολέα του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου (Plasminogen Activator Inhibitor, PAI) σε ενδοθηλιακά κύτταρα από αορτή βοός, δείχνοντας συνεπώς αγγειογενετική δράση (Kojima et al., 1995). Τα πεπτίδια της HARP ΗΔ1-21 και ΗΔ , επάγουν την in vivo αγγειογέννεση και την in vitro μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων, καθώς επίσης και το σχηματισμό αυλών σε υπόστρωμα matrigel (Papadimitriou et al., 2001). Έκτοπη έκφραση του καρβοξυτελικού άκρου της HARP σε μοσχεύματα SW-13 κυττάρων σε ανοσοκατεσταλμένα ποντίκια παρουσίασε την ίδια αγγειογεννετική δράση με ολόκληρο το μόριο της HARP, ενώ η έκφραση του αμινοτελικού άκρου δεν είχε παρόμοια αποτελέσματα (Zhang et al, 2006). Η HARP, αποτελεί υπόστρωμα για την τρυψίνη και τη χυμοτρυψίνη (Delbe et al., 1995), ενώ έχει διατυπωθεί η άποψη ότι και άλλα πρωτεολυτικά ένζυμα πιθανόν να αποικοδομούν την HARP, ρυθμίζοντας με αυτό τον τρόπο την αγγειογεννετική της δράση.

28 Πράγματι, πεπτίδια που προκύπτουν μετά από πρωτεολυτική αποικοδόμηση της HARP από την πλασμίνη εμφανίζουν διαφορετική in vivo και in vitro αγγειογενετική δράση. Τα πεπτίδια που περιέχουν μόνο τη μια από τις δύο περιοχές β-πτυχωτής έλικας επάγουν την αγγειογένεση in vitro, ενώ αυτά που περιέχουν και τις δύο περιοχές παρουσιάζουν ανασταλτική δράση. Ωστόσο, στο in vivo μοντέλο της CAM και τα πέντε αυτά πεπτίδια επάγουν την νεοαγγείωση, πιθανώς μέσω ενεργοποίησης των κυττάρων του αίματος στην CAM και όχι λόγω άμεσης αλληλεπίδρασης με τα ενδοθηλιακά κύτταρα της CAM, ενώ φαίνεται να παίζουν ρόλο και διάφορες πρωτεϊνάσες της CAM, που πρωτεολύοντας περαιτέρω το μόριο επάγουν την αγγειογεννετική του δράση (Polykratis et al., 2004 Το γεγονός ότι το γονίδιο της HARP εκφράζεται στον καρκίνο του μαστού και σε κύτταρα μελανώματος, αλλά όχι σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα μαστού και σε μελανοκύτταρα (Wellstein et al., 1992), δημιούργησε υπόνοιες ότι το συγκεκριμένο γονίδιο πιθανώς επάγεται κατά την εγκαθίδρυση καρκινικού φαινοτύπου στα κύτταρα (transformation). Πράγματι, υπερέκφραση της HARP σε κυτταρική σειρά ινοβλαστών (ΝΙΗ 3Τ3) οδήγησε σε καρκινικό φαινότυπο (Chauhan et al., 1993). Προκειμένου να διαλευκανθεί ο μηχανισμός με τον οποίο η HARP ενέχεται στο μετασχηματισμό κυττάρων, χρησιμοποιήθηκαν μια σειρά από ανασυνδιασμένα πλασμίδια, στα οποία είχαν κλωνοποιήσει διαφορετικά τμήματα του μορίου της HARP και μελετήθηκε η ικανότητα τους να προκαλούν την εξαλλαγή κυττάρων NIH 3T3. Διαπιστώθηκε ότι το τμήμα που περιέχει τα αμινοξέα 41-64, είναι απαραίτητο για τον μετασχηματισμό των κυττάρων, ενώ τα κατάλοιπα 1-64 επάγουν τον σχηματισμό αποικιών (Zhang et al., 1999). Έχει επίσης αποδειχθεί ότι η περιοχή της HARP παίζει ρόλο στο σχηματισμό όγκων (Bernard-Pierrot et al, 2001). Αποκοπή των τελευταίων 26 αμινοξέων της HARP φαίνεται να δρα αρνητικά όσον αφορά στον πολλαπλασιασμό, το μετασχηματισμό, την αγγειογενετική και την ογκογόνο της δράση σε κύτταρα MDA-MB231, μέσω ετεροδιμερισμού του συνθετικού πεπτιδίου με την αγρίου τύπου HARP. Επίσης, το συνθετικό πεπτίδιο της HARP , ανέστειλε τις in vitro δράσεις της αγρίου τύπου πρωτεΐνης, λόγω ανταγωνισμού για την πρόσδεση στον υποδοχέα ALK (Bernard-Pierrot et al, 2002). Έκφραση του τμήματος της HARP 1-40 σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος U87 οδηγεί σε τετραπλοειδία και ανευπλοειδία. Τα κύτταρα συσσωρεύονται στην G1 φάση του κυτταρικού κύκλου και πιθανώς οδηγούνται σε απόπτωση (Chang et al, 2006). Τέλος, τα αμινοξέα του μορίου της HARP φαίνεται να είναι υπεύθυνα για την in vitro αναχαίτιση της πρόσδεσης του ιού HIV στη νουκλεολίνη της επιφάνειας των κυττάρων (Said et al, 2005).

29 E.1.11 HARP και καρκίνος Η καρκινογένεση είναι μια πολυσύνθετη διαδικασία που περιλαμβάνει αρχικά τη μετατροπή φυσιολογικών κυττάρων σε καρκινικά, την απώλεια της ικανότητας διαφοροποίησης τους και τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό τους. Οι παραπάνω αντιδράσεις φαίνεται να πυροδοτούνται από αυξητικούς παράγοντες που εκκρίνονται από τα καρκινικά κύτταρα, παίζοντας καθοριστικό ρόλο στην επακόλουθη ανάπτυξη και μετάσταση των καρκινικών όγκων (Dickson and Lipman, 1987). Ε Έκφραση και ρόλος της HARP στον καρκίνο Το γονίδιο της HARP είναι πρωτο-ογκογονίδιο και βρίσκεται στη ζώνη q33-34, στο 7 ο χρωμόσωμα (Li et al., 1992). O πιθανός ρόλος της HARP στον καρκίνο, προτάθηκε μετά από απομόνωση της από το θρεπτικό μέσο της κακοήθους καρκινικής σειράς μαστού, MDA- MB-231 (Lupu et al., 1992). Έλεγχος δειγμάτων όγκων και 36 ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών διαφορετικής προέλευσης, έδειξε ότι η HARP εκφράζεται στις 18 από αυτές και μάλιστα στο 60% πρωτοπαθών καρκίνων του μαστού (Fang et al., 1992). Στον πίνακα Ε.3 αναγράφονται καρκινικές κυτταρικές σειρές και ιστοί στους οποίους ανιχνεύεται το μετάγραφο της HARP. Tα υψηλότερα επίπεδα HARP ανευρέθηκαν σε μηνιγκιώματα (Mailleux et al., 1992), νευροβλαστώματα (Nakagawara et al., 1995), διάχυτα αστροκυτώματα (Huang et al., 2000) και γλοιοβλαστώματα (Mentlein et al., 2002). Υψηλά επίπεδα ανιχνεύονται και σε ορό ασθενών με καρκίνο του μαστού, του κόλου, του παγκρέατος και του πνεύμονα καθώς επίσης και σε πολλαπλό μυέλωμα (Soulie et al., 2004; Souttou et al., 1998; Wu et al., 2005; Yeh et al., 2006). Σημαντικό είναι το γεγονός ότι η HARP ανιχνεύεται σε υψηλότερα επίπεδα σε καρκινικές σειρές από μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (Small Cell Lung Cancer, SCLC) σε σχέση με το μη μικροκυτταρικό (Non Small Cell Lung Cancer, NSCLC) (Jager et al., 1997) και συνεπώς θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως μοριακός μάρτυρας για τη διάγνωση του πρώτου. Η HARP ανιχνεύεται και σε κακοήθη καρκίνο των όρχεων (Aigner et al., 2003), του τραχήλου της μήτρας (Moon et al., 2002), σε λειομυώματα (Roth et al., 2006), σε συμπαγείς παιδιατρικούς όγκους (Barthlen et al.,2003), καθώς επίσης και στο 78% δειγμάτων ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος (Souttou et al., 1998).

30 Πίνακας Ε.3: Ανίχνευση του mrna της HARP σε καρκινικές κυτταρικές σειρές και ιστούς. Προέλευση HARP m RNA Βιβλιογραφία Ανθρώπινες κυτταρικές σειρές Καρκίνος του προστάτη Καρκίνος του μαστού LNCaP, PC-3, DU-145 T47Dco, MDA-MB-231, MDA-MB- 361, Hs-578T Fang et al., 1992; Hatziapostolou et al., Fang et al., 1992 Γλοίωμα A172, U112,U118, U138, U343, U373 Mentlein et al., 2002 Γλοιοβλάστωμα Νευροβλάστωμα Καρκίνος παγκρέατος Λευχαιμία Καρκίνος στομάχου Μελάνωμα Καρκίνος Ωοθηκών C6, U87MG SK-N-SH, IMR-32 A816-4, BXPC-3, Panc-Tul, SW- 850, Panc89, Colo357 HL-60 HGT-1, KATO III WM852, WM239A, 1205Lu A1827, PA-1 Powers et al., 2002 Berthlen et al., 2003 Weber et al., 2000 Fang et al., 1992 Fang et al., 1992 Fang et al., 1992;Souttou et al., 1998 Fang et al., 1992 Μικροκυτταρικό καρκίνωμα πνεύμονα Καρκινικοί ιστοί NCl-H526, NCl-H510,SCLC-16H, SCLC-22H, DMS-79, NCl-H69, NCl-H187, NCl-H146 Jager et al., 1997 Καρκίνος μαστού Καρκίνος παγκρέατος Καρκίνος προστάτη Fang et al., 1992 Souttou et al., 1998 Vacherot et al., 1999

31 Αστροκυττάρωμα Γλοίωμα Νευροβλάστωμα Σταδίου ΙΙ Σταδίου ΙΙΙ, ΙV Σταδίου Ι,ΙΙ,IV-S Huang et al., 2000 Mentlein et al., 2002 Nakagawara et al., 1995 Η HARP είναι σημαντικός αυτοκρινής αυξητικός παράγοντας για καρκινικά κύτταρα προστάτη και επάγει την αγγειογέννεση in vivo και in vitro (Hatziapostolou et al., 2005). Από την άλλη μεριά, υπερέκφραση της HARP σε καρκινικά κύτταρα μαστού, παρόλο που δεν επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των ίδιων των κυττάρων, προάγει την αγγειογένεση σε in vivo μοντέλα (Choundhuri et al., 1997). Επίσης η HARP που παράγεται από κύτταρα γλοιώματος, δεν επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των ίδιων των κυττάρων, αλλά διεγείρει τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση κυττάρων μικρογλοίας (Mentlein et al., 2002). Πιθανώς, η HARP να δρα ως παρακρινής αυξητικός παράγοντας για τα ενδοθηλιακά και τα κύτταρα γλοίας. Τέλος, υπάρχουν και αναφορές που αναφέρουν ότι η HARP δρα αρνητικά επί της ογκογένεσης. Για παράδειγμα, μελέτη με 149 δείγματα καρκίνου του μαστού και 32 φυσιολογικά, απέδειξε ότι τα επίπεδα της HARP είναι σημαντικά μειωμένα στην πρώτη περίπτωση, ενώ στο 60% των περιπτώσεων είχε ανασταλεί και η έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα HOXA5. Δεδομένου ότι η HARP, αποτελεί άμεσο μεταγραφικό στόχο του HOXA5, φαίνεται ότι η καταστολή του σε καρκίνο του μαστού οδηγεί στη μείωση της έκφρασης της HARP (Chen et al., 2005). Επίσης στο in vivo μοντέλο νευροβλαστώματος που είναι ανθεκτικό σε θεραπεία με ιρινοτεκάνη, η HARP φαίνεται να έχει αντι-αγγειογενετική δράση (Calvet et al., 2006). Ε Έκφραση και ρόλος των υποδοχέων της HARP στον καρκίνο Η έκφραση των υποδοχέων της HARP σε διάφορους τύπους καρκίνου φαίνεται να είναι σημαντική, δεδομένου ότι υπάρχουν πολλά βιβλιογραφικά δεδομένα που αναφέρουν

32 αυξημένη έκφραση τους σε διάφορες καρκινικές σειρές και δείγματα ανθρώπινων όγκων. Ο RPTPβ/ζ, υπερεκφράζεται σε μια πληθώρα καρκίνων, όπως γλοιοβλάστωμα (Muller et al., 2003), νευροβλάστωμα (Goldman et al., 2000), μηνιγγιώματα (Tong et al., 2006), καρκίνο του τραχήλου της μήτρας (Moon et al., 2003) και οστεοσάρκωμα, (Hausser et al., 2005), ενώ η έκφραση του στον καρκίνο του παχέος εντέρου είναι μειωμένη σε σχέση με τον παρακείμενο φυσιολογικό ιστό (Yamakawa et al., 1999). Έχει αναφερθεί ότι μια ανοσοτοξίνη έναντι του RPTPβ/ζ καθυστερεί την ανάπτυξη όγκων μετά την εμφύτευση ανθρώπινων γλοιωματικών κυττάρων U87 σε ποντίκια (Foher et al., 2006), καθώς επίσης και ότι καταστολή της έκφρασης του RPTPβ/ζ αναστέλλει τη μετανάστευση κυττάρων γλοιοβλαστώματος U251-MG (Ulbricht et al., 2006). Πολλές μελέτες έχουν δείξει την έκφραση του ALK σε μελανώματα (Dirks et al., 2002), νευροβλαστώματα (Stoica et al., 2002), γλοιοβλαστώματα (Powers et al., 2002), non- Ηodgkin λεμφώματα (Delsol et al., 1997), σε καρκίνο του παγκρέατος (Stoica et al., 2001) και του μαστού (Stoica et al., 2002). Ειδικότερα, έχει βρεθεί ότι ο ALK υπερεκφράζεται στο γλοιοβλάστωμα, στο 35% κυτταρικών σειρών καρκίνου του μαστού και στο 50 % δειγμάτων από ασθενείς με καρκίνο του μαστού (Powers et al., 2002). Καταστολή της έκφρασης του ALK έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση της ανάπτυξης όγκων μετά την εμφύτευση ανθρώπινων γλοιωματικών κυττάρων U87 σε αθυμικά ποντίκια, και την αύξηση του χρόνου επιβίωσης (Powers et al., 2002). Στην κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού Hs578T, μείωση της έκφρασης του ALK αναστέλλει και την ανάπτυξη των όγκων in vivo (Wang et al., 1997). E Στόχευση της έκφρασης της HARP στον καρκίνο Όταν σε κύτταρα μελανώματος ανθρώπου που εκφράζουν υψηλά επίπεδα του mrna της HARP, κατασταλεί η έκφραση της με χρησιμοποίηση ριβοενζύμων, μειώνεται ο αριθμός των αποικιών σε soft agar και επιβραδύνεται η ανάπτυξη όγκων σε μύες (Czubayko et al., 1994). H χρήση ριβοενζύμων σε άλλη κυτταρική σειρά μελανώματος, οδηγεί σε αναστολή αύξησης του όγκου και της αγγειογέννεσης σε αθυμικούς μύες (Czubayko et al.,1996). Σε κυτταρική σειρά καρκίνου του παγκρέατος καταστολή της έκφρασης της HARP οδηγεί σε μείωση του ρυθμού πολλαπλασιασμού, του σχηματισμού αποικιών σε soft agar και της ανάπτυξης των όγκων, δράση η οποία αναστέλλεται μερικώς μετά τη χορήγηση εξωγενούς HARP (Weber et al., 2000). Χρήση ριβοενζύμων σε xenografts κυττάρων μελανώματος σε

33 αθυμικά ποντίκια, έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση της ανάπτυξης υποδόριων μελανωμάτων (Malerzyc et al., 2005), καθώς επίσης και σε ξενομοσχεύματα κυττάρων γλοιοβλαστώματος U87 και T98G. Η καταστολή της έκφρασης της HARP οδήγεί σε αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της μεταναστευτικής ικανότητας και του σχηματισμού αποικιών σε πήκτωμα soft agar. Όταν τα διαμολυθέντα κύτταρα ενύονται σε αθυμικούς μύες, διαπιστώνεται μείωση της ανάπτυξης του όγκου, η οποία συνοδεύεται από μειωμένα επίπεδα της HARP στον ορό αίματος των ζώων. Παράλληλα ανοσοϊστοχημική ανάλυση των όγκων δείχνει μειωμένη αγγειακή πυκνότητα (Grzelinski et al., 2005;2006). Σε κύτταρα μελανώματος 1205Lu, χρησιμοποιήθηκε ως φορέας της αντινοηματικής αλληλουχίας της HARP ένας αδενοιός. Όταν τα κύτταρα τοποθετούνται σε σε sofr agar in vitro και σε ανοσοκατεσταλμένους μύες in vivo, αναστέλλεται σημαντικά η ανάπτυξη όγκου. Ταυτόχρονα, μειώνεται η έκφραση της κυκλίνης Ε (ρυθμιστικό μόριο του κυτταρικού κύκλου) και αυξάνεται η έκφραση της πρωτεΐνης p21 WAF1/Cip1 (αναστολέας του κυτταρικού κύκλου) (Satyamoorthy et al., 2000). E Η HARP ως διαγνωστικός δείκτης Πρόσφατα δεδομένα αναφέρουν αυξημένα επίπεδα της HARP στον ορό αίματος ασθενών με νευροβλάστωμα, γλοίωμα (Soulie et al., 2004) και μελάνωμα (Wu et al., 2005). Δεδομένου ότι τα επίπεδα της HARP είναι αυξημένα στα πρώιμα στάδια του καρκίνου των όρχεων, θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως νέος διαγνωστικός μάρτυρας (Aigner et al., 2003). Αυξημένα επίπεδα της HARP έχουν ανευρεθεί και στον ορό αίματος ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος και του κόλον. Τα επίπεδα αυτά μειώνονται αισθητά μετά από επιτυχή απομάκρυνση του όγκου (Souttou et al., 1998). Ανάλυση στον ιστό του παγκρέατος έδειξε ότι η έκφραση της HARP αυξάνεται σημαντικά σε περιπτώσεις φλεγμονής (35%) και καρκίνου (65%) του συγκεκριμένου ιστού. Επίσης σε ασθενείς με χρόνια παγκρεατίτιδα, μια ασθένεια που συνήθως προηγείται του καρκίνου του παγκρέατος, ανευρέθηκαν υψηλά επίπεδα της πρωτεΐνης στον ορό των ασθενών (Klomp et al., 2002). H διαφοροδιάγνωση της χρόνιας παγκρεατίτιδας από τον καρκίνο του παγκρέατος είναι δύσκολη και συνεπώς θα είχε μεγάλη κλινική αξία ένας διαγνωστικός μάρτυρας που θα επέτρεπε τη διάκριση των ασθενειών αυτών (Juhl et al., 1996).

34 E.2 Γλοιώματα του νευρικού συστήματος E.2.1 Γενικά Τα γλοιώματα είναι πρωτογενείς όγκοι του κεντρικού νευρικού συστήματος που αφορούν στη γλοία. Η πιο συχνή θέση εμφάνισης γλοιώματος είναι ο εγκέφαλος, αλλά μπορεί να εμφανιστεί και στη σπονδυλική στήλη ή σε οποιοδήποτε άλλο σημείο του ΚΝΣ, όπως το οπτικό νεύρο. Η ταξινόμηση των γλοιωμάτων γίνεται με βάση : τον κυτταρικό τύπο: τα γλοιώματα ονομάζονται με βάση την ιστολογική μορφολογία και τις ομοιότητες των κυττάρων από τα οποία αποτελούνται, με διαφοροποιημένα κύτταρα γλοίας. Για παράδειγμα αστροκυτώματα, ολιγοδενδρογλοιώματα, επενδυμώματα αποτελούνται από τα ανάλογα είδη γλοίας, ενώ τα μεικτά γλοιώματα όπως πχ. τα ολιγοαστροκυτώματα, περιέχουν κύτταρα από διαφορετικά είδη γλοίας (Kleihues et al., 2000; 2002). το βαθμό κακοήθειας: τα γλοιώματα, με βάση ιστολογικά χαρακτηριστικά, όπως η πυρηνική ατυπία, μιτωτική εικόνα, μικροαγγειακός πολλαπλασιασμός και τοπικές νεκρωτικές εστίες, κατατάσσονται σε διάφορα επίπεδα κακοήθειας. Τα χαμηλής κακοήθειας γλοιώματα είναι διαφοροποιημένα, αναπτύσσονται σχετικά αργά, είναι λιγότερο επιθετικά και συνάδουν με καλύτερη πρόγνωση για τον ασθενή. Τα υψηλής κακοήθειας γλοιώματα είναι αδιαφοροποίητα ή αναπλαστικά, αναπτύσσονται ταχέως, έχουν μεγάλη μεταστατική ικανότητα και συνεπάγονται πτωχή πρόγνωση για τον ασθενή. Το πιο κοινό σύστημα κατάταξης των γλοιωμάτων βάση της κακοήθειας είναι το κατά W.H.O (Εθνικός Οργανισμός Υγείας, World Health Organization) (Πίνακας Ε.4) το σημείο εντόπισης. Για παράδειγμα στο 70% των ενήλικων ασθενών, τα γλοιώματα εμφανίζονται πάνω από το επίπεδο του σκηνιδίου της παρεγκεφαλίδας, ενώ στα παιδιά εμφανίζονται κατά 70% κάτω από το επίπεδο της παρεγκεφαλίδας.

35 Πίνακας Ε.4: Κατάταξη γλοιωμάτων βάσει του WHO. Kάτω από κάθε τύπο αναγράφονται το προσδόκιμο επιβίωσης (σε χρόνια) και το ποσοστό ανταπόκρισης σε θεραπεία (Louis et al., 2001). WHO I WHO II Αστροκυτώματα Ολιγο-αστροκυττώματα Ολιγο-δενδρογλοιώματα (3-10 έτη;?%) (5-12 έτη;?%) (8-20 έτη;?%) WHO III αναπλαστικό αναπλαστικο ολιγο- Αναπλαστικό ολιγο- αστροκυττάρωμα αστροκύττωμα δενδρογλοίωμα (2-5 έτη;10-30%) (2-8 έτη; 20-60%) (2-10 έτη; 40-80%) WHO IV Γλοιοβλάστωμα 1-2 έτη; 10% Ε.2.2 Μοριακή Βιολογία γλοιωμάτων Τα γλοιώματα είναι υψηλής κακοήθειας όγκοι και παρουσιάζουν μεγάλη δυσκολία στη θεραπευτική τους προσέγγιση. Το χειρότερο προγνωστικά είναι το πλειόμορφο γλοιοβλάστωμα, αφού παρόλες τις θεραπευτικές μεθόδους που χρησιμοποιούνται, όπως η χειρουργική αφαίρεση, η ακτινοβόληση και η χημειοθεραπεία, έχει μέσο προσδόκιμο επιβίωσης τους 12 μήνες (Maher et al., 2001). Τα γλοιώματα χαρακτηρίζονται από ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό, αναστολή τα απόπτωσης, υψηλή μεταναστευτική και αγγειογεννετική ικανότητα, γεγονός που τα καθιστά πολύ επιθετικά και ανθεκτικά στην θεραπεία.

36 Ε.2.3 Γενετικές αλλοιώσεις σε γλοιώματα Οι κυτταρογενετικές και μοριακές μελέτες σε ανθρώπινα γλοιώματα, επικεντρώνονται κυρίως στο πλειόμορφο γλοιοβλάστωμα. Στους παρακάτω πίνακες (Ε.5 και Ε.6) φαίνονται διάφορες αλλοιώσεις στο χρωμοσωμικό και γονιδιακό προφίλ των γλοιωμάτων. Πίνακας Ε.5: Πρωτο-ογκογονίδια που εκφράζονται σε γλοιώματα (Βansal et al., 2006) Γονίδιο Θέση Αλλοίωση Λειτουργία της κωδικοποιούσας πρωτεΐνης Ανευρίσκεται σε: EGFR 7p11 Amplification και Υποδοχέας κινάσης Γλοιοβλάστωμα υπερέκφραση, γονιδιακός τυροσίνης (GBM) ανασυνδιασμός PDGF 4q12 >> >> >> MET 7q31 >> >> >> CDK4 12q13 >> Κινάση εξαρτώμενη από την κυκλίνη, >> επάγει τη μετάβαση στην G 1 /S φάση CCND1 11q13 >> Κυκλίνη D 1, >> >> CCND3 6p21 >> Κυκλίνη D 3, >> >> MDM2 12q15 >> Aναστολέας του p53 >> MDM4 1q32 >> >> >> MYCC 8q24 >> Mεταγραφικός παράγοντας >>

37 Πίνακας Ε.6 : Ογκοκατασταλτικά γονίδια και αλλοιώσεις τους σε γλοιώματα (Bansal et al., 2006). Γονίδιο Θέση Αλλοίωση Λειτουργία κωδικοποιούσας πρωτεΐνης Ανευρίσκεται σε : ΤP53 17p13 Mετάλλαξη Ρύθμιση απόπτωσης, Αναπλαστκό αστροκύτωμα, κυτταρικού κύκλου και γλοιοβλάστωμα επιδιόρθωσης του DNA (δευτεροπαθές>πρωτοπαθές) PTEN 10q23 >> Πρωτεινική και λιπιδική Γλοιοβλάστωμα φωσφατάση, αρνητικός ρυθμιστής της κινάσης της 3- φωσφατίδυλοινοσιτόλης CDKN2A 9p21 Ομόζυγος απαλοιφή Αναστολέας της εξαρτώμενης από την κυκλίνη κινάσης 4 και 6 >> RB1 13q14 Μετάλλαξη, υπερμεθυλίωση Πυρηνική φωσφοπρωτεΐνη που ρυθμίζει τον κυτταρικό >>, αναπλαστικό αστροκύτωμα κύκλο p 14 ARF 9q21 Ομόζυγος απαλοιφή, Αναστολέας του Mdm2 Αναπλαστικό αστροκύττωμα υπερμεθυλίωση

38 Ε.2.4 Απορύθμιση του ελέγχου του κυτταρικού κύκλου Γενετικές αναλύσεις ανθρώπινων πρωτοπαθών καρκίνων εγκεφάλου δείχνουν ότι υπάρχουν κοινές μεταλλάξεις σε γονίδια τα οποία κωδικοποιούν πρωτεΐνες που ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο. Αυτές οι παρατηρήσεις αποδεικνύουν τη σημαντικότητα και την ανάγκη διατήρησης του ελέγχου του κυτταρικού κύκλου. Μεταλλάξεις στην πρωτεΐνη του ρετινοβλαστώματος (Rb), ανιχνεύεται στο 60% των περιπτώσεων υψηλού βαθμού αστροκυτταρικών όγκων (Grade III) (Behin et al., 2003). Το ποσοστό μπορεί να μην είναι ιδιαίτερα υψηλό, ωστόσο έχει παρατηρηθεί ότι όγκοι οι οποίοι δεν παρουσιάζουν μετάλλαξη στην Rb, περιέχουν μεταλλάξεις σε άλλα μόρια τα οποία σχετίζονται με την Rb όπως για παράδειγμα ο αναστολέας του κυτταρικού κύκλου p16 INK4A και η εξαρτώμενη από την κυκλίνη κινάση 4. Αξιοπερίεργο είναι ότι ποντίκια που δεν εκφράζουν την Rb δεν αναπτύσσουν όγκους στον εγκέφαλο. Μάλλον, πολλαπλές γενετικές αλλαγές που περιλαμβάνουν και το Rb είναι απαραίτητες για την εμφάνιση γλοιωμάτων. Ογκολυτικοί αδενοϊοί, που επιτίθενται σε καρκινικά κύτταρα που δεν εκφράζουν Rb, έχουν χρησιμοποιηθεί σε αστροκυτώματα (Fueyo et al., 2000; 2001; 1998). Σε μελέτες στο εργαστήριο έχει αποδειχθεί ότι η υπερέκφραση του E2F1 μπορεί να επάγει το θάνατο κυττάρων γλοιώματος, χωρίς όμως να έχουν ανιχνευτεί μεταλλάξεις που προκαλούν την υπερέκφραση του σε δείγματα από ανθρώπινους όγκους (Fueyu et al., 1998; Mitlianga et al., 2002). Επιπρόσθετα, χορήγηση αυτού του παράγοντα μέσω αδενοϊών σε in vitro πειράματα, είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της ευαισθησίας στη χημειοθεραπεία (Gomez-Manzano et al., 2001; Meng et al., 1999). Έχει αποδειχθεί ότι το 60-80% των περιπτώσεων υψηλού βαθμού αστροκυτταρικών όγκων εμφανίζει έλλειμμα, μετάλλαξη ή υπερμεθυλίωση του γενετικού τόπου INK4A/ARF (Εικόνα Ε.3). Επιπλέον, στο 25% των αναπλαστικών ολιγοδενδρογλοιομάτων, ο γενετικός τόπος INK4A/ARF είναι υπερμεθυλιωμένος (Watanabe et al., 2001). Ο παράγοντας αυτός δρα ως αναστολέας της φάσης G1/S και έλλειψη του φαίνεται να συμβάλλει στην εξέλιξη του αστροκυτώματος από Grade II σε Grade III. Τέλος, in vitro μελέτες δείχνουν ότι υπερέκφραση του p15 INK4B αναστέλλει την ανάπτυξη των γλοιωμάτων (Fuxe et al., 2000)

39 Εικόνα Ε.3 : Η ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη Rb, δρα αναστέλλοντας τον κυτταρικό κύκλο. Οι εξαρτώμενες από την κυκλίνη κινάσες 4 και 6, μαζί με την κυκλίνη D1, φωσφορυλιώνουν την πρωτεΐνη Rb. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση των μεταγραφικών παραγόντων της οικογένειας E2F και την επαγωγή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού μέσω μεταγραφικής ενεργοποίησης γονιδίων. Μετάλλαξη, υπερμεθυλίωση και έλλειμμα και στα δύο αλληλόμορφα του γονιδιακού τόπου INK4A/ARF ή αναστολή του p16 INK4B, έχει ως αποτέλεσμα την ανεξέλεγκτη δράση των CDK4 και CDK6 (Βansal et al., 2006). Ε Μονοπάτια μεταγωγής σήματος Έχει βρεθεί ότι μόρια όπως ο επιδερμικός αυξητικός παράγοντας (Epidermal Growth Factor, EGF) και ο υποδοχέας του (EGFR), ο αυξητικός παράγοντας των αιμοπεταλίων (Platelet Derived Growth Factor, PDGF) -Α και Β και οι αντίστοιχοι υποδοχείς τους (PDGFR-α και β), ο TGF-α, ο αυξητικός παράγοντας που μοιάζει στην ινσουλίνη (IGF)-I και ο υποδοχέας του (IGFR-I), συμμετέχουν στην αυτοκρινή ή παρακρινή ενεργοποίηση καρκινικών κυττάρων (Ekstrand et al., 1991; Guha et al., 1995, Hermanson et al., 1992; Nister et al., 1998; Sara et al., 1986; Trojan et al., 1992). Στα γλοιώματα, λόγω μεταλλάξεων, υπερεκφράζονται πολλοί από αυτούς τους αυξητικούς παράγοντες, ενώ οι υποδοχείς τους μπορεί να βρίσκονται συνεχώς σε ενεργό μορφή (Ekstrand et al., 1994; Libermann et al., 1985; Wong et al., 1987; 1992). Oι υποδοχείς αυτοί έχουν δράση κινάσης τυροσίνης και συνδέονται με πολλά ενδοκυττάρια μονοπάτια μεταγωγής σήματος, όπως για παράδειγμα τα PI3K/AKT, RAS/MAPK και PLC-γ/PKC (Εικόνα Ε.4). Τα παραπάνω μονοπάτια μεταγωγής σήματος εμπλέκονται σε βιολογικές διαδικασίες όπως ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός και η διαφοροποίηση, η μετανάστευση, ο μεταβολισμός και η επιβίωση (Schlessinger et al., 2000). Η πρωτεΐνη PTEN έχει επίσης δειχθεί οτι εμπλέκεται στην ογκογένεση. Η PTEN αναστέλλει

40 το μονοπάτι PI3K/AKT, είναι ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη (Cantley et al., 1999; Li et al., 1997;1998; Wang et al., 1997) και σε περιπτώσεις καταστολής της έκφρασης της, επάγεται ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός και αναστέλλεται η απόπτωση (Li et al., 1998; Stambolic et al., 1998). H AKT συμμετέχει στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου μέσω της αλληλεπίδρασης της με την κυκλίνη D1 και την MDM2 (Murine Double Minute 2) (Muise- Helmericks et al., 1998; Wechsler-Reya et al., 2001). Εικόνα Ε.4 : Σηματοδοτικά μονοπάτια στα γλοιώματα. Υποδοχείς κινάσης τυροσίνης ενεργοποιούνται μετά την πρόσδεση των EGF, TGFa, IGF και PDGF-A-B και το μήνυμα μεταφέρεται στο εσωτερικό του κυττάρου. Διάφορα μονοπάτια μετάγουν το μήνυμα εντός του κυττάρου (PI3K/AKT-PKB, RAS/MAPK και PLC-γ/PKC). Η PTEN (Phosphatase TENsin homolog) αναστέλλει το μονοπάτι των PI3K/AKT. Τα μονοπάτια RAS και PI3K επάγουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση, τη μετανάστευση, το μεταβολισμό και την επιβίωση, αλληλεπιδρώντας με την κυκλίνη D1, την MD2 και το p27 (Bansal et al., 2006).

41 Ε.2.6 Μεταστατική και διηθητική ικανότητα γλοιωμάτων Τα γλοιώματα, όπως αποδεικνύεται και ιστοπαθολογικά, έχουν μεγάλη διηθητική ικανότητα η οποία οφείλεται στην υψηλή δυνατότητα για μετανάστευση και αποικοδόμηση του εξωκυττάριου υλικού (ΕCM). Το πρώτο βήμα είναι η έκκριση πρωτεϊνασών και η αλλαγή του κυτταροσκελετού του καρκινικού κυττάρου (Lefranc et al., 2005). Η αλλαγή του κυτταροσκελετού οφείλεται σε αλληλεπιδράσεις μεταξύ των ινιδίων της ακτίνης, των μικροσωληνίσκων και των ενδιάμεσων ινιδίων (Saihia et al., 2005; Maidment et al., 1997). Αυτή η δυναμική αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού είναι η κινητήριος δύναμη για την κυτταρική κίνηση και έχει ως αποτέλεσμα την προεκβολή του μπροστινού τμήματος του κυττάρου και την απόσυρση του οπίσθιου τμήματος (Maidment et al., 1997; Raftopoulou et al., 2004; Sahai et al., 2002). Το επόμενο βήμα είναι η αλληλεπίδραση του κυττάρου με το εξωκυττάριο υλικό και η ικανότητα του να κινηθεί μέσα σε αυτό. Το εξωκυττάριο υλικό του περιαγγειακού χώρου στον εγκεφάλου περιέχει πρωτεΐνες όπως η φιμπρονεκτίνη, η λαμινίνη, το κολλαγόνο, η βιτρονεκτίνη και η τενασίνη. Οι τελευταίες έχει αποδειχθεί ότι επάγουν την in vitro μετανάστευση κυττάρων γλοιώματος (Ohnishi et al., 1997). Πρόσφατα αποδείχθηκε ότι παρουσία καρκινικών κυττάρων, τα φυσιολογικά κύτταρα του εγκεφάλου παράγουν λαμινίνη, ενώ χορήγηση μονοκλωνικών αντισωμάτων για την ιντεγκρίνη αναστέλλει την επαγόμενη από τη λαμινίνη μετανάστευση των κυττάρων (Tysnes et al., 1997). Η τενασίνη ανευρίσκεται σε υψηλές συγκεντρώσεις σε υπερπλαστικά αγγεία σε γλοιώματα (Leins et al., 2003; Zagzag et al., 1995) και υπερεκφράζεται in vivo σε διηθητικά γλοιώματα (Mariani et al., 2001). Οι ιντεγκρίνες είναι γλυκοπρωτεΐνες κυτταρικής προσκόλλησης και μέχρι σήμερα έχουν αναγνωριστεί 20 από αυτές (Demuth et al., 2004). Μπορούν να αλληλεπιδράσουν με διάφορες πρωτεΐνες του εξωκυττάριου χώρου και της επιφάνειας των κυττάρων και να πυροδοτήσουν τη μεταγωγή σήματος (Demuth et al., 2004). Έχει αποδειχθεί ότι η χρήση αντισωμάτων έναντι των ιντεγκρινών έχει ως αποτέλεσμα την in vitro αναστολή της μετανάστευσης των γλοιωμάτων (Rooprai et al., 1999; Nollet 2000). Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες είναι ένζυμα που αποικοδομούν το εξωκυττάριο υλικό και δημιουργούν ελεύθερο χώρο για την κίνηση των καρκινικών κυττάρων. Πολλές μελέτες έδειξαν ότι ορισμένες μεταλλοπρωτεϊνάσες υπερεκφράζονται στα γλοιώματα σε σχέση με το

42 φυσιολογικό εγκέφαλο και ότι η χρήση αναστολέων των μεταλλοπρωτεϊνασών μειώνει και τη μετανάστευση των γλοιωματικών κυττάρων (Demuth et al., 2004; Tonn et al., 1998). Τέλος, έχει βρεθεί ότι υπερέκφραση της FAK (Focal Adhesion Kinase) επάγει τη μετανάστευση των κυττάρων τόσο in vivo όσο και in vitro (Hauck et al., 2002; Zagzag et al., 2000). Επίσης, κύτταρα με χαμηλή μεταναστευτική ικανότητα εμφανίζουν χαμηλότερα επίπεδα φωσφορυλιωμένης FAK, ενώ η έκφραση της χρησιμοποιείται και ως δείκτης σε διάφορους τύπους καρκίνου (Obara et al., 2002; Owens et al., 1995). Αναστολή της FAK οδηγεί σε αναστολή της μετανάστευσης των κυττάρων (Zagzag et al., 2000). Ε.3 Αγγειογέννεση Ε.3.1. Γενικά Ο σχηματισμός αγγείων από ήδη προϋπάρχοντα επιτελείται με τη διαδικασία της αγγειογένεσης και πραγματοποιείται και στο έμβρυο αλλά και στο ενήλικο άτομο, ως απόρροια φυσιολογικών βιολογικών μεταβολών ή παθολογικών φαινομένων. Αποτελείται από επιμέρους στάδια τα οποία βρίσκονται υπό τον έλεγχο θετικών και αρνητικών ρυθμιστικών παραγόντων. Η αγγειογένεση στους όγκους διαμεσολαβείται από την έκκριση αυξητικών παραγόντων και κυτταροκινών από τα καρκινικά κύτταρα, η οποία προάγεται από την υποξία και τις αλλαγές στο γονιδιακό προφίλ των όγκων. Μέχρι τώρα έχουν αναγνωριστεί 25 διαφορετικά μόρια με αγγειογεννετική δράση (Kieran, 2004). Το πρώτο βήμα κατά τη διαδικασία της αγγειογένεσης περιλαμβάνει τη χάλαση των προϋπαρχόντων αγγείων, την αυξημένη διαπερατότητα και την αποικοδόμηση του εξωκυττάριου υλικού (Εικόνα Ε.5). Η χάλαση των αγγείων οφείλεται κυρίως στο ΝΟ, το οποίο προάγει επίσης και τη μεταγραφή του VEGF (Kimura et al., 2000). O VEGF διαμεσολαβεί την αυξημένη αγγειακή διαπερατότητα μέσω της αναδιανομής ενδοκυττάριων μορίων προσκόλλησης, όπως τα PECAM-1 (Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1) και η VE-cadherin (Vascular Endothelial Cadherin), και τροποποίησης της δομής της κυτταρικής μεμβράνης διαμέσου ενεργοποίησης σειράς κινασών (Εliceiri et al., 1999; Gale et al., 1999). Ακολουθεί έξοδος πρωτεϊνών του πλάσματος από τα αγγεία με αποτέλεσμα τη δημιουργία προσωρινών δομών που επιτρέπουν στα ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα

43 να μεταναστεύσουν (εκβλάστηση). Επειδή όμως η αυξημένη διαπερατότητα μπορεί να οδηγήσει σε ρήξη των αγγείων, η διαπερατότητα ελέγχεται μέσω της Ang1 (Αngiopoietin-1), η οποία δεσμεύεται στον Tie2 και παρέχει προστασία αφού αποτελεί φυσικό φραγμό κατά της διαρροής πλάσματος (Thurston et al., 2000). Εικόνα Ε.5 : Τη χάλαση του αγγειακού τοιχώματος και την έξοδο πρωτεϊνών του πλάσματος ακολουθεί η αποικοδόμηση της θεμέλιου ουσίας. Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες είναι οι κυρίως πρωτεϊνάσες που σχετίζονται με τη διαδικασία. Η περαιτέρω εκβλάστηση του ενδοθηλίου επάγεται από ένα άλλο μέλος της οικογένειας των αγγειοποϊητινών, την Ang2, η οποία αναστέλλει τη σηματοδότηση του Tie2 και αποτελεί φυσικό ανταγωνιστή της Ang1. Η Ang2, που εμφανίζεται σε καταστάσεις αγγειογένεσης ή αγγειακής αναδιαμόρφωσης, σχετίζεται με την αποκόλληση λείων μυϊκών κυττάρων και την απώλεια της θεμέλιας ουσίας, προωθώντας έτσι τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων, αφού χαλαρώνουν οι ενδοθηλιακές συνδέσεις (Gale et al., 1999; Maisonpierre et al., 1997). H αποικοδόμηση του εξωκυττάριου υλικού πραγματοποιείται μέσω πλήθους πρωτεϊνασών και συνεπάγεται την απελευθέρωση αυξητικών παραγόντων, όπως οι bfgf, VEGF και IGF-1 (Insulin Growth Factor-1). Στις πρωτεϊνάσες αυτές ανήκουν και οι μεταλλοπρωτεϊνάσες (ΜΜΡs), που όπως προκύπτει από την ονομασία τους κατέχουν σημαντικό ρόλο στην αποικοδόμηση της βασικής και των εξωκυτταρικών μεμβρανών, επιτρέποντας τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Πάνω από 20 μεταλλοπρωτεϊνάσες έχουν περιγραφεί και συσχετιστεί με αγγειογένεση, καρκινογένεση και

44 κυτταρικό πολλαπλασιασμό (Nelson et al., 2000), μέσω της αποικοδομητικής τους δράσης αλλά και της ικανότητας τους να εκθέτουν κρυμμένα, υπό φυσιολογικές συνθήκες, σημεία προσκόλλησης. Φυσικοί αναστολείς των μεταλλοπρωτεϊνασών είναι οι TIMP s (Tissuelocalized Inhibitors of Metalloproteinases ). Φαίνεται ότι η Ang1 προάγει την εκβλάστηση του ενδοθηλίου μέσω ενεργοποίησης της έκκρισης των MMP-2, MMP-3 και MMP-9 και καταστολής του TIMP2 (Κim et al., 2000). Ο μηχανισμός δράσης των μεταλλοπρωτεϊνασών εξαρτάται από χωροταξικούς παράγοντες και από τη συνύπαρξη άλλων πρωτεϊνικών μορίων. Για παράδειγμα, οι MMPs 1 και 3 αναστέλλουν την καρκινική αγγειογέννεση παρεμποδίζοντας τη σύνδεση της MMP-2 στις ιντεγκρίνες (Brooks et al., 1998), ενώ οι MMPs 7 και 9 παράγουν αγγειοστατίνη από το πλασμινογόνο, παρεμποδίζοντας έτσι τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων (Pozzi et al., 2000). Η θρομβοσπονδίνη-1 καταστέλλει την ενεργοποίηση των MMPs 2 και 9 (Bein and Simons, 2000) και η MMP 9 παρουσιάζει μεγαλύτερη αγγειογενετική δράση όταν συνυπάρχει στην επιφάνεια του κυττάρου με τον TGFβ και το CD44 ( Yu and Stamenkovic, 2000). Ένα άλλο μόριο που εμπλέκεται στην αποικοδόμηση της θεμέλιας ουσίας και την επικείμενη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων είναι το u-pa (urokinase-type Plasminogen Activator). Το τελευταίο είναι απαραίτητο για την επαναγγείωση εμφραγμάτων (Heymans et al., 1999; Carmeliet and Collen, 1997), ενώ σε in vivo πειράματα, οι ανταγωνιστές του έχουν αντι-αγγειογενετική θεραπευτική δράση (Carmeliet and Collen 1998; Guo et al., 2000). Το επόμενο βήμα στην αγγειογενετική διαδικασία αποτελεί ο πολλαπλασιασμός και η μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Σε αυτό το στάδιο σημαντικές είναι οι αλληλεπιδράσεις των VEGF, αγγειοποϊητινών και FGF με τους υποδοχείς τους. Ο VEGF-B σχετίζεται με την αποικοδόμηση του εξωκυττάριου υλικού διαμέσου ενεργοποίησης του πλασμινογόνου και φαίνεται να ρυθμίζει τη λειτουργία των στεφανιαίων αγγείων (Bellomo et al., 2000; Eriksson et al., 1999). O VEGF-C έχει αποδειχθεί ότι προάγει την αγγειογένεση κατά την ενήλικη ζωή, παρόλο που ο ενδογενής του ρόλος σε παθολογικές καταστάσεις δεν έχει διαλευκανθεί (Veikkola et al., 2000). O VEGFR-3 υπερεκφράζεται κατά την εμβρυική ανάπτυξη και είναι απαραίτητος για την αγγειακή αναδιαμόρφωση και την λεμφαγγειογένεση (Veikkola et al., 2000; Dumont et al., 1998). H Ang1φωσφορυλιώνει τον Tie2 προάγοντας τον χημειοτακτισμό των ενδοθηλιακών κυττάρων και την αλληλεπίδραση μεταξύ αυτών και των περικυττάρων (Gale et al., 1999; Suri et al., 1996) Η Ang2 σε συνδυασμό με τον VEGF ευνοεί την αγγειογένεση, ενώ απουσία του προκαλεί καταστροφή του αγγειακού δικτύου (Μaissonpierre et al., 1997). Η οικογένεια του FGF ενεργοποιεί τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων και την προσέλκυση μεσεγχυματικών κυττάρων ή/και παραγόντων φλεγμονής, προάγοντας έτσι την παραγωγή εκατομμυρίων άλλων αγγειογενετικών παραγόντων (Carmeliet et al., 2000). O PDGF επίσης προάγει την εκβλάστηση μικροαγγείων

45 και την προσέλκυση λείων μυϊκών κυττάρων και περικυττάρων γύρω από το νεοσχηματιζόμενο αγγείο (Lindah et al., 1998;1999). Η enos (Βλέπε Ε.4) επίσης είναι ένα μόριο το οποίο αποδείχθηκε να έχει αγγειογενετικές ικανότητες, μετά από in vivo πειράματα σε ποντίκια, στα οποία προκλήθηκε ισχαιμία στο κάτω άκρο (Murohara et al., 1998). Για τα μέλη της οικογένειας του TGFβ, ακτιβίνη Α καi TNFa (Tumor Necrosis Factor a), έχουν αναφερθεί και επαγωγικές και ανασταλτικές δράσεις επί του πολλαπλασιασμού των ενδοθηλιακών κυττάρων σε διάφορα μοντέλα (Pepper, 1997). O TGFβ1 αναστέλλει την καρκινική αγγειογένεση (Gohongi et al., 1999), ενώ ο TNFα ρυθμίζει τον εξαρτώμενο από το VEGF πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων, μέσω φωσφορυλίωσης του VEGFR-2 (Guo et al., 2000). Η MCP-1 (Monocyte Chemiotactic Protein-1) επίσης επάγει τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων (Belperio et al., 2000). Καθώς τα ενδοθηλιακά κύτταρα πολλαπλασιάζονται και μεταναστεύουν, καθοδηγούμενα εν μέρει από τις ιντεγρίνες α v β 3 και α 5 β 1 (Elicier et al., 1999), PECAM-1 (Ilan etal., 1999) και από προσδέτες των υποδοχέων επινεφρίνης (Huynh-Do et al., 1999; Shima and Mailhos, 2000; Wilkinson, 2000), έρχονται σε επαφή με άλλα ενδοθηλιακά κύτταρα και οι μεταξύ τους συνδέσεις ενισχύονται από μέλη της οικογένειας των καντερινών και των κονεξινών (Corada et al., 1999; Knudsen et al., 1998). Τα ενδοθηλιακά κύτταρα διατάσσονται τελικά σε μια μονοστιβάδα και σχηματίζουν σωληνοειδείς δομές. Οι διάφορες ισομορφές του VEGF φαίνεται να έχουν διαφορετική δράση επί του μεγέθους του αυλού. Ο VEGF 121 και ο VGEF 165 αυξάνουν την διάμετρο του αυλού, ενώ ο VEGF 189 έχει αντίθετα αποτελέσματα. Τελικά, ο αγγειακός σωλήνας σταθεροποιείται με τη βοήθεια μεσεγχυματικών κυττάρων που βρίσκονται στον περιβάλλοντα ιστό, πολλαπλασιάζονται και μεταναστεύουν στην εξωτερική επιφάνεια των πρωταρχικών αγγείων. Επακολουθεί η διαφοροποίηση τους σε περικύτταρα ή σε αγγειακά μαλακά κύτταρα (Kurz et al., 2000). E.3.2 Υποξία και αγγειογένεση Ε Γενικά H ικανότητα των οργανισμών να διατηρούν την ομοιόσταση του οξυγόνου (21%) είναι απαραίτητη για την επιβίωση όλων των ασπόνδυλων και σπονδυλωτών ειδών. Έτσι, προκειμένου να διασφαλιστεί η καλύτερη οξυγόνωση των κυττάρων σε όλα τα μετάζωα,

46 αναπτύχθηκαν ειδικά συστήματα (Hotchanka et al., 1996; 1998). Η δραματική αύξηση της μάζας σώματος στον άνθρωπο και τα υπόλοιπα σπονδυλωτά συμπίπτει με την ανάπτυξη ενός σύνθετου συστήματος για τη μεταφορά του οξυγόνου που περιλαμβάνει τους πνεύμονες, την καρδιά, τα αγγεία και τα ερυθρά αιμοσφαίρια. Επιπρόσθετα, το σύστημα αυτό συμμετέχει στην παράδοση θρεπτικών συστατικών, τη δίοδο των ανοσοκυττάρων και την απομάκρυνση των μεταβολικών απόβλητων από και προς όλους τους ιστούς του σώματος. Στην ομοιόσταση του οξυγόνου συμμετέχουν κύτταρα χημειοϋποδοχείς που βρίσκονται στο καρωτιδικό σώμα και κύτταρα που παράγουν ερυθροποιητίνη και βρίσκονται στα νεφρά (Richalet, 1997; Gonzalez, 1998). Η μείωση της μερικής πίεσης του οξυγόνου στο αίμα γίνεται αισθητή από τα κύτταρα-χημειοϋποδοχείς, με αποτέλεσμα την έκλυση νευροδιαβιβαστών που αυξάνουν τη δραστηριότητα των αναπνευστικών μυών (Gonzalez et al., 1992;1994). Από την άλλη, διεγείρονται και τα κύτταρα που παράγουν ερυθροποιητίνη (Jelkman, 1992). Οι παραπάνω δράσεις διαμεσολαβούνται αντίστοιχα από τροποποιήσεις σε διαύλους Κ + και τον παράγοντα που επάγεται από την υποξία (Hypoxia Inducible Factor, HIF) (Gonzalez et al., 2002). Στο παραπάνω σύστημα φαίνεται να παίζουν ρόλο και τα λεία μυϊκά κύτταρα της πνευμονικής αρτηρίας, που απαντούν στην υποξία με αγγειοσύσπαση (Marshal et., 1994). Τα τρία αυτά είδη κυττάρων έχουν πολύ χαμηλό ουδό στην υποξία και ενεργοποιούνται όταν η αρτηριακή P0 2 πέσει κάτω από 70mmHg (Hochachka et a., 1997). Όλες οι παραπάνω δράσεις έχουν ως απώτερο σκοπό την επαναφορά των φυσιολογικών επιπέδων οξυγόνωσης στους ιστούς. Η υποξία (2-20 Torr ή 0,3-3% Ο 2 ) μπορεί να διακριθεί ανάλογα με την αιτία σε : Αναιμική υποξία: που οφείλεται σε μειωμένες συγκεντρώσεις λειτουργικής αιμοσφαιρίνης ή μειωμένο αριθμό ερυθρών αιμοσφαιρίων πχ. σε αναιμία ή αιμορραγία. Υποξική υποξία: οφείλεται σε ανεπαρκή αερισμό των πνευμόνων λόγω μειωμένης μερικής πίεσης σε οξυγόνο, δυσλειτουργία των αεραγωγών και σε δεξιά προς αριστερά διαφυγή. Ισχαιμική υποξία: αφορά ιστούς και χαρακτηρίζεται από ολιγαιμία και προκαλείται από αγγειοσύσπαση ή αρτηριακή απόφραξη. Υποξία που σχετίζεται με τη μειωμένη ικανότητα της αιμοσφαιρίνης να απελευθερώνει οξυγόνο. Υποξία στάσης : αφορά ιστούς και χαρακτηρίζεται από ενδοαγγειακή στασιμότητα λόγω μειωμένης φλεβικής εκροής ή μειωμένης αρτηριακής εισροής.

47 Η ρύθμιση της αγγειογένεσης από την υποξία αποτελεί σημαντική παράμετρο του ομοιοστατικού μηχανισμού που συνδέει την καρδιο-πνευμονο-αγγειακή παροχή οξυγόνου με τις μεταβολικές απαιτήσεις των ιστών (Carmeliet, 2003; Giacia et al., 2004). Στοιχεία για τη ρύθμιση της αγγειογένεσης από τα επίπεδα του οξυγόνου προέκυψαν μετά από παθοφυσιολογικές μελέτες αγγειακών και νεοπλασματικών νόσων. Για παράδειγμα, ένα είδος ρετινοπάθειας που εμφανίζεται στα πρόωρα νεογέννητα, οφείλεται σε υπεροξία λόγω μηχανικής αναπνευστικής υποστήριξης. Αρχικά, τα αυξημένα επίπεδα οξυγόνου οδηγούν σε καταστολή της αμφιβληστροειδικής κυκλοφορίας, ενώ μετά από αποσύνδεση από τη μηχανική υποστήριξη δημιουργείται σχετική υποξία, η οποία οδηγεί σε παθολογική δημιουργία αγγείων και μπορεί να σχηματίσει οπίσθια ινοπλασία του φακού και μερική ή ολική απώλεια οξύτητας όρασης (Alon et al., 1995; International Committee for the Classification of Retinopathy of Prematurity, 2005). Εντός των όγκων, η διαθεσιμότητα οξυγόνου και θρεπτικών συστατικών οριοθετείται από τον ανταγωνισμό μεταξύ των ενεργά πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων, ενώ η απομάκρυνση των μεταβολιτών εμποδίζεται από την υψηλή πίεση του ενδιάμεσου υγρού. Σε απάντηση προς την υποξία, τα καρκινικά κύτταρα επάγουν το σχηματισμό νέων αγγείων από προϋπάρχοντα, γεγονός απαραίτητο για την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων σε ευνοϊκό μικροπεριβάλλον (Folkman, 2002; Semenza et al., 2000; Richard et al., 1999). Στις πληγές, η φθορά των τριχοειδών δημιουργεί υποξικό περιβάλλον, ενώ σε πειράματα με μεταβαλλόμενα επίπεδα οξυγόνωσης η επανορθωτική αγγειογεννετική απόκριση διαφέρει (Richard et al., 1999). Συνεπώς, η υποξία είναι σημαντικό έναυσμα για τη φυσιολογική και την παθολογική αγγειογέννεση. Ε HIF (Hypoxia Inducible Factor)-1 Η επαγωγή της μεταγραφής γονιδίων από την υποξία αποδίδεται σε μεγάλο βαθμό στο μεταγραφικό παράγοντα που επάγεται από την υποξία (hypoxia inducible factor, HIF), η ονομασία του οποίου οφείλεται στους Semenza και Wang (Semenza and Wang, 1992). Το αρχικό βήμα για την ανακάλυψη του προέκυψε όταν βρέθηκε ότι σε υποξία μόνο ένας μεταγραφικός παράγοντας δεσμεύεται στο HRE (Hypoxia Response Element) του γονιδίου της ερυθροποιητίνης (Semenza, 1999). Oι ΗIF s (Ηypoxia Inducible Factors 1, 2 και 3) είναι μεταγραφικοί παράγοντες που σχηματίζονται μετά τον ετεροδιμερισμό της αντίστοιχης -α και -β υπομονάδας (Wang et al., 1995). Ο HIF-1α παραμένει η περισσότερο δραστική και μελετημένη υπομονάδα (Kaur et al.,

48 2005). Σε φυσιολογικές συγκεντρώσεις οξυγόνου η υπομονάδα α έχει μικρό χρόνο ημίσειας ζωής (<5 min) και η υδροξυλίωση της από τις προλυλ-υδροξυλάσες οδηγεί σε ουμπικουϊτινιλίωση και αποικοδόμηση από το πρωτεόσωμα (Kallio et al., 1997; Salceda et al., 1997; Huang et al., 1998). Σε μειωμένες συγκεντρώσεις οξυγόνου (υποξία) ή όταν προστίθενται χημικά ανάλογα που δρουν άμεσα ή έμμεσα ως ανταγωνιστές της αντίδρασης υδροξυλίωσης (π.χ. ανάλογα 2-οξογλουταράτης, δεσφεροξαμίνη και CoCl 2 ), τα κατάλοιπα προλίνης δεν υδροξυλιώνονται, με αποτέλεσμα η υπομονάδα α να συσσωρεύεται στο κυτταρόπλασμα (Wenger, 2002). Η υπομονάδα β, σε αντίθεση με την α, εκφράζεται συνεχώς και ανεξάρτητα από τα επίπεδα οξυγόνου στο κύτταρο (Jiang et al., 1996). Ακολουθούν τροποποιήσεις (φωσφορυλιώσεις, υδροξυλιώσεις, ακετυλιώσεις, αλληλεπίδραση με συμπαράγοντες, κλπ.) που έχουν ως στόχο την ενεργοποίηση και τον ετεροδιμερισμό των υπομονάδων και τη δημιουργία του ενεργού μεταγραφικού συμπλόκου (Lando et al., 2002; Paul et al., 2004). Ο HIF-1 δεσμεύεται στα αντίστοιχα στοιχεία απόκρισης στην υποξία (Hypoxia Response Elements, ΗREs) του υποκινητή γονιδίων που σχετίζονται με τη μεταφορά του οξυγόνου (ερυθροποιητίνη, τρανσφερίνη), την αγγειογένεση (VEGF, NOS, AP-1) και τον αναερόβιο μεταβολισμό (αλδολάση, μεταφορείς γλυκόζης), και επάγει τη μεταγραφή τους (Zagorska et al., 2004). Αποτελεί έναν από τους ισχυρότερους ενεργοποιητές της αγγειογένεσης αφού προάγει τη μεταγραφή VEGF (Forsythe et al., 1996) και πλήθος άλλων παραγόντων που δίνουν το σήμα στα ενδοθηλιακά κύτταρα για πολλαπλασιασμό, διήθηση και μετανάστευση (Kaur et al., 2005; Pugh and Ratcliffe, 2003). Απώλεια ή υπερέκφραση του HIF-1α σε ενδοθηλιακά κύτταρα επηρεάζει σημαντικές παραμέτρους της συμπεριφοράς των κυττάρων κατά την αγγειογένεση, όπως ο πολλαπλασιασμός, η χημειοταξία και η διείσδυση στο εξωκυττάριο υλικό (Manalo et al., 2005; Tang et al., 2004 ). Μετά από πειράματα σε knockout ποντίκια για τον HIF1-α (Ryan et al., 1998; Kotch et al., 1999) και για τον HIF1-β (Maltepe et al., 1997), βρέθηκε αυξημένη εμβρυική θνητότητα που οφείλεται σε δραματική καταστροφή των αγγείων λόγω καταστροφής των ενδοθηλιακών κυττάρων. Σε Hif1a -/- ποντίκια έχουν παρατηρηθεί ελαττώματα στην αγγειογενετική διαδικασία τόσο στο λεκιθικό σάκο, όσο και στο αναπτυσσόμενο έμβρυο (Kotch et al., 1999). Μύες των οποίων τα νευρικά κύτταρα δεν εκφράζουν τον HIF-1α παρουσίασαν αγγειακή ανεπάρκεια και εγκεφαλική ατροφία (Tomita et al., 2003). Επίσης, ποντίκια των οποίων τα ενδοθηλιακά κύτταρα δεν εκφράζουν τον HIF-1α εμφανίζουν σημαντικά μειωμένη αγγείωση (Tang et al., 2004). Η έκφραση του HIF εκτός των άλλων μπορεί να επηρεαστεί από την ενεργοποίηση ογκογονιδίων ή/και την απώλεια κατασταλτικών μηχανισμών. Για παράδειγμα, η

49 υπερέκφραση του EGFR σχετίζεται με φτωχή πρόγνωση σε γλοιώματα (Frederick et al., 2000). Η πιο διαδεδομένη μετάλλαξη του EGFR (EGFRvIII), είναι ένα έλλειμμα στα εξόνια 2-7, που έχει ως αποτέλεσμα την έκφραση ενός υποδοχέα συνεχώς ενεργοποιημένου (Holland et al., 1998). H επακόλουθη ενεργοποίηση του μονοπατιού PI3K/ΑKT/FRAP/mTOR οδηγεί σε υπερέκφραση του HIF-1 (Clarke et al., 2001). Τα γλοιοβλαστώματα παρουσιάζουν επίσης μεταλλάξεις του PTEN σε συχνότητα 20-40%. Απώλεια του PTEN έχει συνδυαστεί πειραματικά με αυξημένη έκφραση του HIF και νεοαγγείωση στα γλοιώματα (Zundel et al., 2000) Τέλος, σε χαμηλού βαθμού αστροκυτταρώματα έχουν αναφερθεί συχνές μεταλλάξεις του ογκοκατασταλτικού γονιδίου p53, οι οποίες οδηγούν σε αυξημένη αγγειογένεση. Το p53 αναστέλλει την αγγειογένεση, αφενός μεν λόγω της μειωμένης έκφρασης του VEGF, αφετέρου δε λόγω της αποικοδόμησης του HIF (Hunter et al., 2003; Ravi et al., 2000). Ε.4 Μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ) Ε.4.1 Γενικά Το ΝΟ είναι μια εξαιρετικά δραστική ρίζα που διαμεσολαβεί πλήθος αντιδράσεις (Blaise et al., 2005). Είναι ένα μη φορτισμένο μόριο που περιέχει ένα ασύζευκτο ζεύγος ηλεκτρονίων στην εξωτερική του στοιβάδα και μπορεί να δράσει είτε ως οξειδωτικό (δότης ηλεκτρονίων) είτε ως αντι-οξειδωτικό (δέκτης ηλεκτρονίων). Έχει την ικανότητα να αντιδρά με άλλα ανόργανα μόρια (πχ. οξυγόνο, υπεροξείδιο ή μεταβατικά μέταλλα), με βάσεις πυριμιδίνης του DNA και προσθετικές ομάδες (πχ. αίμη) (Bogdan, 2001). Έχει επίσης αποδειχθεί ότι το NO μπορεί να τροποποιεί ομοιοπολικά πρωτεΐνες ή να προκαλεί οξειδωτικές αλλαγές, χωρίς να προσδένεται άμεσα σε αυτές (Stamler, 1994; Butler et al., 1995). Σε αυτές τις αλλαγές περιλαμβάνονται μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις όπως, η S- νιτροζυλίωση/ (Koppenol, 2002), η νίτρωση πρωτεϊνών, η οξείδωση και η φωσφορυλίωση (Zhou and Brune, 2005), οι οποίες συμμετέχουν στη μεταγωγή σήματος και στην ενεργοποίηση ή καταστολή γονιδίων (Marshall et al., 2000; Bogdan et al., 2001). Επιπλέον, δρα ως αντιοξειδωτικό κατά των ROS, συγκεντρώνοντας τα στο υδρόφοβο κέντρο της χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτείνης (LDL)(Benz et al., 2002).

50 Το αμινοξύ L-αργινίνη είναι απαραίτητο για τη βιοσύνθεση του ΝΟ. Η οξείδωση της καταλύεται από μια οικογένεια ενζύμων που ονομάζονται συνθάσες του μονοξειδίου του αζώτου (NOS). Οι NOS παράγουν ΝΟ σύμφωνα με την αντίδραση: NOS L-αργινίνη κιτρουλίνη + ΝΟ χρησιμοποιώντας NADPH και O 2 ως συνένζυμα (Stuehr et al., 2004). Έχουν βρεθεί τρείς ισομορφές της συνθάσης του μονοξειδίου του αζώτου, ανάλογα με τον κυτταρικό τύπο από τον οποίο απομονώθηκαν και κλωνοποιήθηκαν. Τα ισοένζυμα αυτά ονομάστηκαν, n-nos (νευρωνική ΝΟS), e-nos (ενδοθηλιακή NOS ) και i-nos (επαγόμενη NOS). Οι δύο πρώτες εκφράζονται συστατικά και είναι υπεύθυνες για την παραγωγή και τη διατήρηση χαμηλών συγκεντρώσεων NO σε νευρικά και ενδοθηλιακά κύτταρα. Η δράση τους εξαρτάται από το Ca 2+ (Haynes et al., 2004). H enos εκφράζεται επίσης σε καρδιακά κύτταρα και στον ιππόκαμπο και σχετίζεται με την αναστολή της συσσώρευσης των αιμοπεταλίων, τη διατήρηση του τόνου των αγγείων, την αναστολή του πολλαπλασιασμού των λείων μυικών κυττάρων και την επαγωγή της αγγειογένεσης (Bonavida et al., 2006). Συμμετέχει επίσης στη διατήρηση της στύσης στους άρρενες μέσω επαγωγής του cgmp και της επακόλουθης μείωσης των κυτταροπλασματικών επιπέδων Ca 2+ (Drew and Leeeuwenburgh, 2002). Η nnos, εκφράζεται εκτός από νευρικά κύτταρα, όπου δρα ως νευροδιαβιβαστής, σε σκελετικούς μύες και στο επιθήλιο του πνεύμονα και είναι υπεύθυνη για τη χάλαση των λείων μυϊκών ινών των αγγείων. Επίσης σχετίζεται άμεσα με τη σύσπαση των σκελετικών μυών και την παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων NO κατά τη διάρκεια της σύσπασης (Drew and Leeeuwenburgh, 2002). Η inos εκφράζεται σε μακροφάγα, δενδριτικά κύτταρα, ινοβλάστες, χονδροκύτταρα, οστεοκλάστες, αστροκύτταρα, επιθηλιακά κύτταρα και σε πλειάδα καρκινικών κυττάρων (Bonavida et al., 2006). Ενεργοποιείται μετά την επίδραση κυτταροκινών (Rodriguez-Pascual, et al., 2000) και/ή μικροβιακών παραγόντων, όπως ο λιποπολυσακχαρίτης (LPS), και παράγει μεγάλες ποσότητες NO, οι οποίες χρησιμεύουν για την προστασία από τα παθογόνα (Blaise et al., 2005). Η πιο γνωστή δράση του NO είναι η ενεργοποίηση της sgc μετά από νιτροζυλίωση της προσθετικής ομάδας της αίμης (Ignarro et al., 1990). Η sgc εκφράζεται στο κυτταρόπλασμα σχεδόν όλων των κυττάρων των θηλαστικών και συμμετέχει σε δράσεις του ΝΟ που αφορούν στην αναστολή της συσσώρευσης των αιμοπεταλίων, την αγγειοδιαστολή και τη μεταγωγή σήματος στο νευρικό σύστημα (Collier and Vallance et al., 1989).

51 Η πρώτη απόδειξη ότι το NO επηρεάζει μονοπάτια μεταγωγής σήματος από κινάσες προέκυψε το 1993, όπου σε πειράματα με δότες NO σε μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος φάνηκε ότι ενεργοποιείται το μονοπάτι της Src οικογένειας με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση Τ κυττάρων (Lander et al., 1993). Σήμερα, έχει αποδειχθεί ότι το ΝΟ εμπλέκεται στην ενεργοποίηση των μονοπατιών SAPK/JNK, p38 και ERK1/2 σε πλήθος κυττάρων, συμπεριλαμβανομένου ενδοθηλιακών (Pfeilschifter and Ηuwiller, 1996; Callsen et al., 1998). Επιπλέον, οι δραστικές μορφές οξυγόνου (reactive oxygen species, ROS) και το ΝΟ ενεργοποιούν την PKC (Klann et al., 1998). Η ενεργοποίηση των μονοπατιών αυτών εξαρτάται από το είδος του κυττάρου και τις εκάστοτε συνθήκες, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση διαφόρων μεταγραφικών παραγόντων και την τροποποίηση της έκφρασης γονιδίων που αφορούν διάφορες κυτταρικές λειτουργίες. Οι μεταγραφικοί παράγοντες AP-1 και NF-k B έχει αποδειχθεί ότι ενεργοποιούνται από το NO (Matthews et al., 1996; Tabucki et al., 1994). Επιπλέον, γονίδια για διάφορες πρωτεΐνες του εξωκυττάριου υλικού (Chatziantoniou et al., 1998), πρωτεϊνάσες (Sasaki et al., 1998), αυξητικούς παράγοντες (Sasaki et al., 1998; Tsurumi et al., 1997; Chin et al., 1997), κυτταροκίνες (VanDervort et al., 1994), χημειοκίνες (Villarete and Remick, 1995; Muhl and Dinarelli, 1997), υποδοχείς (Ichiki et al., 1998), ένζυμα (Hartsfield et al., 1997; Muhl and Pfeilschifter, 1995) και ορμόνες (Wang et al., 1998) υπόκεινται σε μεταγραφική ρύθμιση από το NO. Τελευταία έχει προκύψει ότι υπάρχει αλληλεπίδραση μεταξύ του ΝΟ και των ROS. Το υπεροξείδιο του υδρογόνου επάγει τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση μέσω ενεργοποίησης της enos και της sgc στα κύτταρα HUVEC (Polytarchou and Papadimitriou, 2005), καθώς επίσης και την αγγειογένεση μέσω της inos στο in vivo μοντέλο της CAM (Polytarchou and Papadimitriou, 2004). Η ερευνητική μας ομάδα, διερευνά το ρόλο του μονοξειδίου του αζώτου στον επαγόμενο από το υπεροξείδιο του υδρογόνου πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων και την πιθανή εμπλοκή της HARP στο παραπάνω μονοπάτι (Polytarchou et al., unpublished data). Έχει επίσης ανευρεθεί και αλληλεπίδραση της NADPH οξειδάσης με την enos στην ανάπτυξη ενδοθηλιακών κυττάρων (Bayraktutan, 2004). Η AngII έχει βρεθεί οτι επάγει την δραστικότητα της NADPH οξειδάσης και αυτή με την σειρά της την παραγωγή ΝΟ από την enos σε ενδοθηλιακά κύτταρα (Cai et al., 2003). Υπερέκφραση της καταλάσης στο αγγειακό επιθήλιο μυών αναστέλλει τηn επαγόμενη από το υπεροξείδιο του υδρογόνου enos κατά τη διάρκεια σωματικής άσκησης (Lauer et al., 2005). Τέλος, η AngII επάγει την αγγειογένεση μέσω της enos σε ισχαιμικά άκρα ποντικών (Tamarat et al., 2002).

52 Ε.4.2 Βιολογικές δράσεις Το ΝΟ συμμετέχει στις φλεγμονώδεις και ανοσολογικές αποκρίσεις. Έχει βρεθεί ότι εκφράζεται σε διάφορες κυτταρικές σειρές, όπως ινοβλάστες, ενδοθηλιακά και επιθηλιακά κύτταρα, κερατινοκύτταρα, χονδροκύτταρα, μονοκύτταρα, μακροφάγα, αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (Colleman, 2001). Δρα σαν τοξικός παράγοντας έναντι μικροοργανισμών και ρυθμίζει το αν θα οδηγηθούν σε απόπτωση. Σε χαμηλές συγκεντρώσεις, έχει προ-φλεγμονώδη δράση επάγοντας την αγγειοδιαστολή και την επιστράτευση ουδετερόφιλων (Bonavida et al., 2006). Η αλληλεπίδραση του με διάφορους παράγοντες και συστήματα μεταγωγής σήματος, ρυθμίζει την έκφραση πολλών παραγόντων φλεγμονής (Coleman et al., 2001). Σημαντική είναι η δράση του και στο καρδιαγγειακό σύστημα. Συμμετέχει στη ρύθμιση του τόνου των αγγείων (αγγειοδιαστολή), της δομής των αγγείων (αναστολή του πολλαπλασιασμού των λείων μυϊκών κυττάρων) και αναστέλλει την προσκόλληση και συσσώρευση αιμοπεταλίων, καθώς και την προσκόλληση μονοκυττάρων ( Cannon, 1998). Μέσω ενεργοποίησης της sgc, το NO αναστέλλει τη δράση αυξητικών παραγόντων που απελευθερώνονται από τα κύτταρα του καρδιαγγειακού συστήματος προς το τοίχωμα των αγγείων και από τα αιμοπετάλια στο ενδοθήλιο (McNamara et al., 1993; Dubey et al., 1995). Τέλος, συνεισφέρει στην αυξητική δράση των αγγειοδιασταλτικών πεπτιδίων και του VEGF και την απόκτηση αγγειογενετικού φαινοτύπου σε απάντηση στη μεταγωγή σήματος από την sgc (Ziche and Morbidelli, 2000). Στο νευρικό σύστημα δρα ως περιφερικός νευροδιαβιβαστής και ως δεύτερο μήνυμα στη μεταγωγή σήματος μέσω των συνάψεων (Bicker, 2005). Μια σημαντική δράση του αφορά στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης των πρώιμων νευρικών κυττάρων στα σπονδυλωτά και τα έντομα (Champlin and Truman, 2000). Επιπλέον, φαίνεται να παίζει ρόλο στην κυτταρική κινητικότητα (Bonavida et al., 2006). Ε.4.3 Παθολογικές καταστάσεις σχετιζόμενες με το NO Το ΝΟ έχει βρεθεί να παίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεια του ανοσοποιητικού συστήματος και να σχετίζεται με παθολογικές καταστάσεις όπως το άσθμα, η ρευματοειδής αρθρίτιδα και η αυτοανοσία. Φυσιολογικά επίπεδα ΝΟ στους πνεύμονες σχετίζονται με

53 ρύθμιση του τόνου των αεραγωγών, των αγγείων του πνεύμονα και την έκκριση βλέννης (Van der Vliet, et al., 2000). Αύξηση των επιπέδων του έχει ως συνέπεια τη χρόνια φλεγμονή των αεραγωγών, βήχα, σφίξιμο στο στήθος και δύσπνοια (Dweik et al., 2001). Στη ρευματοειδή αρθρίτιδα το NO σχετίζεται με τον υπέρμετρο πολλαπλασιασμό της αρθρικής μεμβράνης και τη συσσώρευση ενεργοποιημένων Τ κυττάρων με αποτέλεσμα την καταστροφή της άρθρωσης (Stichtenoth and Frolich, 1998; Bhatia et al., 2004). Επιπλέον έχει σχετιστεί με την αθηροσκλήρωση (Herman and Moncada, 2005), το σακχαρώδη διαβήτη (Brune et al., 2005), τη νόσο του Alzheimer (Markesbery et al., 1997) και την πολλαπλή σκλήρυνση (Dokmeci et al., 2004). Τέλος, το ΝΟ ενοχοποιείται για την καρκινογένεση, την αύξηση και την επιβίωση των όγκων. Ε.4.4 Ρόλος του ΝΟ στον καρκίνο Το ΝΟ και τα παράγωγα του προκαλούν αλλαγές στη δομή του DNA είτε μόνα τους είτε αλληλεπιδρώντας με τις ROS (Xu et al., 2002) με αποτέλεσμα τη συσσώρευση καρκινογόνων μεταλλάξεων (Nguyen et al., 1992). Έχει βρεθεί ότι οξείδωση της γουανίνης στην θέση C8 οδηγεί σε μεταλλάξεις τύπου G:T, οι οποίες ανευρίσκονται σε μεταλλαγμένα ογκογονίδια και ογκοκατασταλτικά γονίδια (Klauning and Kamendulis, 2004). Επιπλέον, έχει δειχθεί να δημιουργεί σπασίματα στις έλικες του DNA (Tamir et al., 1996) και να καταστρέφει ανεπανόρθωτα ένζυμα επιδιόρθωσης του DNA (Wink and Laval, 1994). Προκαλεί επίσης μέσω αλληλεπίδρασης με τις ROS και δημιουργίας ελευθέρων ριζών υπεροξείδωση λιπιδίων και καταστροφή των κυτταρικών μεμβρανών (Spalding, 1988; Stone et al., 1990; Klauning and Kamendulis, 2004). Πολλοί αυξητικοί παράγοντες επάγουν την έκφραση των NOS και την παραγωγή NO. O VEGF και ο TGF επάγουν τη σύνθεση NO (Hood et al., 1998; Inoue et al., 1995) και το NO με τη σειρά του επάγει τον πολλαπλασιασμό και τη μετaνάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων (Ziche et al., 1994;, Jenkins et al., 1995; Ambs et al., 1998). Αναστολείς των NOS, αναστέλλουν in vivo την επαγόμενη από τον VEGF αγγειογένεση και in vitro τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων, καθώς επίσης και το σχηματισμό αυλών (Ziche et al., 1997; Papapetropoulos et al., 1997). To NO επάγει την αλληλεπίδραση των ενδοθηλιακών κυττάρων με το στρώμα, επάγοντας την έκφραση της ιντεγκρίνης α ν β 3 και την αποικοδόμηση του εξωκυττάριου υλικού μετά από επίδραση FGF (Ziche et al., 1997). H αυξημένη αιματική ροή που προκαλείται λόγω αγγειοδιαστολής μετά

54 από επίδραση ΝΟ επάγει τον πολλαπλασιασμό ενδοθηλιακών κυττάρων σκελετικών μυών (Hudlicka, 1998). In vivo, δύο διαφορετικοί κλώνοι καρκίνου του μαστού που εκφράζουν διαφορετικές ποσότητες enos και ΝΟ, παρουσιάζουν διαφορετικό δυναμικό μετάστασης. Μετά τη χορήγηση αναστολέα της enos παρατηρείται μειωμένη αύξηση των όγκων και από τους δύο κλώνους (Gauthier et al., 2004). Υπερέκφραση της inos σε κύτταρα ανθρώπινου αδενοκαρκινώματος του κόλου και μεταμόσχευση σε αθυμικά ποντίκια έδειξε επαγωγή της αύξησης και αγγείωσης των όγκων (Jenkins et al., 1995). Αναστολή της τελευταίας με τον αναστολέα 1400W, ανέστειλε την αύξηση και την αγγείωση όγκων (Thomsen et al., 1997). Σε καρκινικούς ιστούς μαστού η έκφραση της inos και της enos βρέθηκε αυξημένη σε σχέση με φυσιολογικούς (Vakkala et al., 2000). Στη βιβλιογραφία υπάρχουν ωστόσο αναφορές που υποδυκνείουν ότι υψηλές συγκεντρώσεις ΝΟ παρουσιάζουν αντι-ογκογόνο δράση. Υπερέκφραση της enos σε κύτταρα μελανώματος βοός έχει ως αποτέλεσμα μειωμένη ανάπτυξη και επιβίωση λόγω επαγωγής της απόπτωσης in vitro και μειωμένη ικανότητα μετάστασης in vivo (Xie et al., 1995). Επίσης, knockout ποντίκια για την enos εμφανίζουν υψηλότερη συχνότητα όγκων στο λεπτό έντερο (Scott et al., 2001). Τέλος, το NO παρουσιάζει αντιαγγειογενετικές δράσεις σε κύττταρα γλοιοβλαστώματος (Deininger et al., 2003; Roberts et al., 2007). Ε.5 Oρός και στοιχείο απόκρισης στον ορό Ε.5.1 Γενικά Ένα σημαντικό στοιχείο του υποκινητή πολλών γονιδίων είναι το στοιχείο απόκρισης στον ορό (Serum Response Element, SRE). Το SRE (ή αλλιώς CArG box) αποτελείται από δέκα βάσεις με αλληλουχία CC(A/T) 6 GG. Αρχικά αναγνωρίστηκε στον υποκινητή του c-fos (Τreisman et al., 1987), ωστόσο στη συνέχεια ανιχνεύτηκε στη ρυθμιστική περιοχή και άλλων γονιδίων πρώιμης απόκρισης πχ. Egr-1 και -2, junb, β-ακτίνη, βικουλίνη και φαίνεται να παίζει ρόλο στην ενεργοποίηση γονιδίων που επάγονται από μιτογόνα (Τreisman, 1994; Schratt et al., 2001). Ανευρίσκεται επίσης στον υποκινητή γονιδίων που εκφράζονται ειδικά στους μυς και είναι απαραίτητο στην ανάπτυξη του μυοσκελετικού συστήματος και της καρδιάς (Chen and Schwartz, 1997; Mericskay et al., 2000; Gustafson et al., 1988; Galvagni

55 et al., 1997; Parlakian et al., 2004; Miano et al., 2003). Η ενεργοποίηση του SRE και η επακόλουθη επαγωγή της μεταγραφής γίνεται μέσω της πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα SRF (Serum Response Factor) και της βοηθητικής πρωτεΐνης TCF (Ternary Complex Factor) (Treisman et al, 1986; Buchwalter et al., 2003). Στην πρόσδεση αυτή φαίνεται να παίζουν ρόλο και διάφορα μονοπάτια κινασών (Cahill et al., 1996). Ιδιαίτερα σημαντικό είναι το γεγονός ότι το SRE μπορεί να ενεργοποιηθεί απουσία αυξητικών παραγόντων από την ογκοπρωτεΐνη v-ras (Sassone-Corsi et al., 1989), v-src (Fujii et al., 1989) και την v-raf (Kaibuchi et al., 1989). E.5.2. SRF (Serum Response Factor) Ε Ανακάλυψη του SRF Το 1984, ο Greenberg ανακάλυψε ότι προσθήκη ορού σε καλλιέργεια κυττάρων ενεργοποιεί τη μεταγραφή του c-fos (Greenberg et al., 1984). Η επαγωγή ήταν μέγιστη στα 15 λεπτά, ενώ τα επίπεδα του mrna για το c-fos κορυφώθηκαν 30 λεπτά μετά την προσθήκη ορού στην καλλιέργεια. Το φαινόμενο αυτό οδήγησε σε μια σειρά πολύ σημαντικών ανακαλύψεων για τον τομέα της μεταγραφικής ρύθμισης γονιδίων. Το c-fos είναι ομόλογο του γονιδίου v-fos του ιού του οστεοσαρκώματος των τρωκτικών, το οποίο λόγω της γρήγορης ενεργοποίησης του, κατατάχθηκε στα γονίδια άμεσης απόκρισης. Είναι απαραίτητο για την επανείσοδο κυττάρων στην φάση G1 του κυτταρικού κύκλου και συνεπώς για τη μίτωση. Στη συνέχεια, ανακαλύφθηκαν και άλλοι παράγοντες που ενεργοποιούσαν το γονίδιο αυτό, όπως αυξητικοί παράγοντες και άλλα μιτογόνα (Rollis and Stiles, 1989). Tο επόμενο βήμα ήταν να ελεγχθούν τα μονοπάτια ανοδικά του c-fos και η συμμετοχή του ορού στην επαγωγή του γονιδίου. Αναγνωρίστηκαν πολλές αλληλουχίες εντός του υποκινητή του c-fos (Treisman, 1986; Prywes and Roeder, 1986; Greenberg et al., 1987), ωστόσο ιδιαίτερο ενδιαφέρον έδειξε μια αλληλουχία περίπου 300 βάσεις ανοδικά του σημείου έναρξης της μεταγραφής. Ο Treisman ονόμασε το στοιχείο αυτό Serum Response Element (Treisman, 1986). Περίπου 30 γονίδια έχουν βρεθεί να περιέχουν στον υποκινητή τους την αλληλουχία CC(A/T) 6 GG (Cahill et al., 1995; Arsenian et al., 1998). (Πίνακας Ε.7) και σε αυτά συμπεριλαμβάνεται και η HARP (Li et al., 1992).

56 Πίνακας Ε.7: Γονίδια με στοιχεία απόκρισης στον ορό (Chai and Tarnawaski, 2002) Γονίδιο Λειτουργία Αναφορά c-fos Πρωτο-ογκογονίδιο Treisman et al., 1986 FosB Πρωτο-ογκογονίδιο Lazo et al., 1992 JunB Πρωτο-ογκογονίδιο Perez-Albuerne et al., 1993 HSP70 Πρωτεΐνη θερμικού σοκ Wu et al., 1987 Egr-1 Early growth response Qureshi et al., 1991 Egr-2 Early growth response Gius et al., 1990 Cyr61 Κυτταρικός πολλαπλασιασμός Latinkic et al., 1991 Pip92 Extracellular signal response Chung et al., 1998 β- actin Όχι μυική ακτίνη Ng et al., 1989 Thrombospondin-1 Αναστολέας αγγειογέννεσης Framson and Bornstein, 1993 Vinculin Πρωτεΐνη εστιακής προσκόλλησης Moiseyeva et al., 1993 IL-2Ra Πολλαπλασιασμός Τ κυττάρων Tan et al., 1992 Nurr1 Ορφανός πυρηνικός υποδοχέας Castillo et al., 1997 Nur77 Ορφανός πυρηνικός υποδοχέας Williams and Lau, 1993 Cardiac a-actin Μυική σύσπαση Miwa and Kedes, 1987 Sceletal a-actin Μυική σύσπαση Muscat et al., 1988 Smooth muscle γ-actin Διαφοροποίηση των λείων μυών Garson et al., 2000 Smooth muscle α-actin Μυική σύσπαση Kim et al., 1994 α- ΜΗC Μυική σύσπαση Molkentin et al., 1996 β- ΜHC Μυική σύσπαση Huang et al., 1997 SmMHC Μυική σύσπαση Katoh et al., 1994 SM22a Διαφοροποίηση των λείων μυών Yamamura et al., 1997

57 Telokin Σταθεροποίηση της μυοσίνης Herring and Smith, 1997 Troponin T Σταθεροποίηση και ρύθμιση ακτίνης Tropomyosin Σταθεροποίηση και ρύθμιση ακτίνης Wang et al., 1994 Toutant et al., 1994 Calponin Δέσμευση ακτίνης Miano, 2000 ANF Ρύθμιση της ομοιόστασης νερού-ηλεκτρολυτών στον κόλπο SERCA Ρύθμιση των ενδοκυττάριων επιπέδων ασβεστίου Sprenkle et al., 1995 Baker et al., 1998 Dystrophin Μυική δυστροφία Duchenne Klamut et al., 1990 Creatin kinase M Μυική σύσπαση Vincent et al., 1993 ΗARP Αγγειογεννετικός παράγοντας Li et al., 1992 Ε Δομή Το γονίδιο για τον SRF στον άνθρωπο ανευρίσκεται στο χρωμόσωμα 6p21.1 και έχει μέγεθος ζεύγη βάσεων. Περιέχει 7 εξόνια και το mrna έχει μέγεθος 4201 ζεύγη βάσεων (Εικόνα Ε.13). Η κωδικοποιούσα περιοχή είναι η Στον άνθρωπο έχουν αναφερθεί δύο προϊόντα εναλλακτικού ματίσματος με μεγέθη 4.5kb και 2.5kb, ενώ στο ποντίκι τέσσερα, των οποίων η έκφραση εξαρτάται από τον τύπο του ιστού (Kemp et al., 2000). Στην εικόνα Ε.6 φαίνονται οι ισομορφές του SRF και τα αντίστοιχα πρωτεϊνικά προϊόντα.

58 Εικόνα Ε.6 : Δομή του γονιδίου του SRF και ισομορφές του. Το γονίδιο του SRF, περιέχει 7εξόνια. Έχουν αναγνωριστεί τέσσερις ισομορφές του SRF: η SRF-L, που περιέχει 7 εξόνια και αντιστοιχεί στο άνθρωπο στο προϊόν με μέγεθος 4.5kb, η SRF-M, που της λείπει το εξόνιo 5 και δρά σαν dominant negative mutant αναστέλλοντας την επαγόμενη από τον SRF μεταγραφή (Belaguli et al., 1999), η SRF-S, που της λείπουν τα εξόνια 4και 5 και ανιχνεύεται στην αορτή και τέλος η SRF-I, η οποία περιέχει τα εξόνια 1,2,6 και 7 και ανιχνεύεται μόνο στους εμβρυικούς ιστούς (Chai and Tarnawaski, 2002). Ο SRF αποτελείται από 508 αμινοξέα και το μοριακό του βάρος υπολογίζεται ηλεκτροφορητικά στα 67k Da. Περιέχει τρείς περιοχές : (1) μια περιοχή πρόσδεσης στο DNA (κεντρική), (2) μια ρυθμιστική περιοχή στο καρβοξυτελικό άκρο και (3) μια περιοχή φωσφορυλίωσης στο αμινοτελικό άκρο (Εικόνα Ε.7). Σε πειράματα απαλοιφής αποδείχθηκε ότι τα αμινοξέα είναι επαρκή για το διμερισμό, την πρόσδεση στο DNA και την αλληλεπίδραση με άλλους παράγοντες (Norman et al., 1988). Η πρωτεϊνική αυτή αλληλουχία είναι υψηλά συντηρημένη στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς και εμφανίζει πολλές ομοιότητες με αυτή στις ζύμες, τα ζώα και τα φυτά (Shore and Sharrocks, 1995). Είναι γνωστή με το όνομα MAD box και χαρακτηρίζει ολόκληρη οικογένεια μεταγραφικών παραγόντων, στην οποία περιλαμβάνεται και ο SRF. Εικόνα Ε.7: Δομή του SRF. Από αριστερά προς τα δεξιά απεικονίζονται η περιοχή φωσφορυλίωσης, η περιοχή διμερισμού, πρόσδεσης στο DNA και αλληλεπίδρασης με άλλους παράγοντες και τέλος, η ρυθμιστική περιοχή (Chai and Tarnawaski, 2002).

59 Ε Ρύθμιση και ενεργοποίηση του SRF Ο SRF ενεργοποιείται μετά την επίδραση ορού, λυσοφωσφατιδικού οξέος (LPA), ανισομυσίνης (Shin et al., 2006), μιτογόνων, θρομβίνης (Wu et al., 2002) λιποπολυσακχαρίτη (LPS) (Shimi et al., 2006), 12-Ο-τετρα-δεκανοικού-13-οξικού φωρβολικού εστέρα, οξειδοαναγωγής, κυτταροκινών, TNF-α, παραγόντων που αυξάνουν τα ενδοκυττάρια επίπεδα ασβεστίου (ΜcDonough et al., 1997; Misra et al., 1994), ιικές πρωτεΐνες (Avantagiiati et al., 1993, Fujii et al., 1994), ενεργοποιημένα ογκογονίδια πχ. v-src, v-fps, v-ras, c-raf (Shin et al., 2006), αντιοξειδωτικά και UV (Chai and Tarnawaski, 2002). Έχει επίσης αποδειχθεί ότι αλλαγές στην αλληλουχία του SRE επηρεάζουν την ειδικότητα πρόσδεσης του με τον SRF, καθώς επίσης και τη δράση επί της μεταγραφής (Hautmann et al., 1998; Chang et al., 2001). Γενικά μπορούμε να πούμε ότι η δράση του SRF ρυθμίζεται: α) μέσω αλληλεπίδρασης με επαγωγικούς και ανασταλτικούς συμπαράγοντες (Treisman, 1994), β) μέσω φωσφορυλίωσης (Manac and Prywes,1991), γ) μέσω εναλλακτικού ματίσματος (Kemp and Metcalfe et al., 2000; Belaguli et al., 1999) και δ) μέσω επαγωγής της μετακίνησης στον πυρήνα (Camoretti- Mercado et al., 2000, Wu et al., 2002). Μονοπάτια που σχετίζονται με την ενεργοποίηση του SRF είναι της GTPάσης RhoA (Ηill et al., 1995), της εξαρτώμενης από το Ca 2+ /καλμοδουλίνη κινάσης (Cam) (Chai and Tarnawaski, 2002) και της Rac (Ishiguro et al., 2004). Η οικογένεια των TCF μεταγραφικών παραγόντων έχει αποδειχθεί ότι αλληλεπιδρά με τον SRF και ρυθμίζει τη δράση του (Dalton and Treisman, 1992). Τα μέλη της οικογένειας πχ. Elk-1, Sap-1a και Net παρουσιάζουν κοινή δομή (Εικόνα Ε.8) (Buchwalter et al., 2004).

60 Α. Β. Εικόνα Ε.8: Δομή των TCF παραγόντων (Α) και σύμπλοκο TCF-SRF-DNA (B). (A) Τα μέλη της οικογένειας παρουσιάζουν παρόμοια δομή, η οποία περιλαμβάνει μια περιοχή Α για την πρόσδεση στο DNA μόλις λίγες βάσεις πριν το SRE, μια περιοχή Β για την αλληλεπίδραση με τον SRF και μια περιοχή C, η οποία ρυθμίζεται μέσω φωσφορυλίωσης από τις MAP κινάσες. (B) Όσον αφορά στην ενεργοποίηση των TCF παραγόντων από μονοπάτια κινασών έχει αποδειχθεί ότι συμμετέχουν τα μονοπάτια Ras/Raf/MEK/ERK (Cahill et al., 1995, Cano and Mahadevan, 1995, Shin et al., 2006), Rac/GSC/MEK/JNK (Whitmarsh et al., 1995, Shin et al., 2006) και Rac/MKK3/p38 (Cano and Mahadevan, 1995, Shin et al., 2006) (Εικόνα Ε.9).

61 Εικόνα Ε.9 : Διαγραμματική απεικόνιση των μονοπατιών μεταγωγής σήματος στη μεταγραφική ενεργοποίηση του c-fos από το σύμπλοκοsrf-tcf. Τα ερωτηματικά υποδεικνύουν άγνωστα μονοπάτια. Ε Βιολογικές δράσεις του SRF O SRF ρυθμίζει την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την κυτταρική ανάπτυξη και διαφοροποίηση (Gauthier-Rouvier et al., 1996). Διαμεσολαβεί επίσης την επαγωγική δράση νευροδιαβιβαστών και νευροτροφινών (Sheng et al., 1988) καθώς και την προστασία των νευρικών κυττάρων από ασιτία και επίδραση καμπτοθεκίνης (Brain-derived Neurotrophic Factor) (Chang et al., 2004). Μικροενέσεις με αντισώματα έναντι του SRF ή καταστολή της έκφρασης του με αντινοηματικές αλληλουχίες είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της διαφοροποίησης μυοβλαστών σε myotubes και τη μείωση της έκφρασης γονιδίων (Soulez et al., 1996; Gauthier-Rouviere et al., 1996). Επιπλέον σε έμβρυα ποντικών knockout και για τα δύο αλληλόμορφα του SRF εμφανίστηκαν ανωμαλίες στην ανάπτυξη του μεσοδέρματος (Arsenian et al., 1998). Και ενώ τα έμβρυα αναπτύσσονταν φυσιολογικά μέχρι την 6 η μέρα τελικά πέθαιναν μεταξύ 8 ης και 12 ης μέρας. Το γεγονός ότι τα έμβρυα αναπτύσσονταν φυσιολογικά μέχρι την 6 η μέρα οδήγησε στο συμπέρασμα ότι ο SRF δεν είναι sine qua non συνθήκη για το φυσιολογικό κυτταρικό πολλαπλασιασμό, γεγονός που επιβεβαιώνεται και με in vitro μελέτες σε εμβρυικά αρχέγονα (stem) κύτταρα (Schratt et al., 2002). Σε διαγονιδιακά ποντίκια που υπερεκφράζουν τον SRF στο μυοκάρδιο αποδείχθηκε ότι τα ποντίκια έπασχαν

62 από υπερτροφική καρδιομυοπάθεια και πέθαιναν από έμφραγμα στους πρώτους έξι μήνες μετά την γέννηση τους (Zhang et al., 2001). Από την άλλη πλευρά, υπερέκφραση της αντινοηματικής αλληλουχίας του SRF στα ίδια διαγονιδιακά ποντίκια είχε ως αποτέλεσμα τη βελτίωση της καρδιακής τους λειτουργίας (Chai and Tarnawski, 2000).

63 ΣΚΟΠΟΣ

64 Σκοπός Η HARP (Heparin Affin Regulatory Peptide) είναι ένας αυξητικός παράγοντας 18 kda με μεγάλη συγγένεια πρόσδεσης για την ηπαρίνη. Ανήκει σε μια σχετικά νέα οικογένεια αυξητικών παραγόντων που δεσμεύονται στην ηπαρίνη και η οποία περιλαμβάνει επιπλέον την πρωτεΐνη Midkine (MK) (Kadomatsu et al., 1988) και την ομόλογη αυτής στα πτηνά, την επαγόμενη από το ρετινοϊκό οξύ πρωτεΐνη που δεσμεύεται στην ηπαρίνη (Retinoic acid- Inducible Heparin Binding Protein, RI-HB) (Raulais et al., 1991). Το μόριο της HARP απομονώθηκε παράλληλα από πολλές ερευνητικές ομάδες και από διάφορους ιστούς και για το λόγο αυτό απαντάται στη βιβλιογραφία με πολλές ονομασίες, όπως HARP (Courty et al., 1991), πλειοτροπίνη (Li et al., 1992), HB-GAM (Heparin-Binding Growth Associated Molecule) (Rauvala et al., 1989) και ΟSF-1 (Osteoblast Specific Factor-1) (Tezuka et al., 1990). Η πρώτη αναφερθείσα δράση της HARP είναι η ικανότητα της να επάγει την προέκταση νευριτών σε νευρικά κύτταρα (Rauvala et al., 1989). Εκφράζεται με συγκεκριμένο αναπτυξιακό πρότυπο και ελέγχει την αύξηση κυττάρων του νευροεξωδέρματος και μεσοδέρματος (Vanderwinden et al., 1992). Τα επίπεδα της μειώνονται στα τελευταία στάδια της εμβρυογένεσης, ενώ η έκφραση της στον ενήλικα οργανισμό περιορίζεται στο κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα (Vanderwinden et al., 1992; Wanaka et al., 1993; Mitsiadis et al., 1995). Αυξημένη ενεργοποίηση του γονιδίου της παρατηρείται κατά την ανάπλαση νευρικού ιστού μετά από μηχανικό τραυματισμό (Blondet et al., 2005). Διαδραματίζει επίσης σημαντικό ρόλο στη διαδικασία ανάπτυξης της μνήμης (Amet et al., 2001), την οστεογένεση (Sato et al., 2002) και τη σπερματογένεση (Zhang et al., 1999). Υπάρχουν αρκετές αναφορές που υποδεικνύουν τη HARP ως μόριο που ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και τη διαφοροποίηση διαφόρων τύπων κυττάρων, όπως νευροβλάστες και ινοβλάστες, επιθηλιακά και ενδοθηλιακά κύτταρα (Laaroubi et al., 1994; Rauvala et al., 2000; Papadimitriou et al., 2000). Η ανίχνευση του mrna ή/και της πρωτείνης της HARP σε ποικίλες καρκινικές σειρές και σε όγκους διαφορετικής προέλευσης, όπως το γλοιοβλάστωμα (Powers et al., 2002; Peria et al., 2007), το μελάνωμα (Schulte and Wellstein, 1997), ο καρκίνος του προστάτη (Vacherot et al., 1999), του μαστού (Fang et al., 1992) και του παγκρέατος (Souttou et al., 1998), υποδεικνύει ένα σημαντικό ρόλο αυτού του αυξητικού παράγοντα στην αύξηση των όγκων, την αγγειογένεση και την ικανότητα μετάστασης (Papadimitriou et al., 2001; Polykratis et al., 2004; Souttou et al., 2001; Choudhouri et al., 1997; Chang et al., 2007). Παρόλο που οι βιολογικές δράσεις που αποδίδονται στη HARP είναι σημαντικές και

65 ολοένα αυξάνονται, πολύ λίγα είναι γνωστά για τη ρύθμιση της έκφρασης και έκκρισής της ως πρωτεΐνη. Είναι γνωστό ότι η υποξία και ο αυξητικός παράγοντας που προέρχεται από τα αιμοπετάλια (platelet-derived growth factor, PDGF) επάγουν την έκφραση της HARP σε ηπατικά κύτταρα (Antoine et al, 2005), αλλά ο μηχανισμός επαγωγής παραμένει αδιευκρίνιστος. Έκκριση της HARP επάγεται επίσης από την camp (Mourlevat et al., 2005), χωρίς και πάλι να είναι γνωστός ο μηχανισμός. Η έκφραση και έκκριση της HARP επάγεται επίσης από το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Polytarchou et al., 2005 και αδημοσίευτα αποτελέσματα), τον αυξητικό παράγοντα των ινοβλαστών b (fibloblast growth factor b) (Hatziapostolou et al., 2006) και το μεταγραφικό παράγοντα HOXA5 (Chen et al., 2005). Η αρχική ανάλυση του γονιδίου της HARP δεν ανέδειξε αλληλουχίες δέσμευσης για γενικούς μεταγραφικούς παράγοντες (Li et al., 1992). Ωστόσο, στην απομακρυσμένη 5 - περιοχή αναγνωρίστηκαν δύο πιθανές αλληλουχίες δέσμευσης για τον AP-1 (Activator Protein-1) (Li et al., 1992; Polytarchou et al., 2005b), τέσσερις για το MyoD, μία αλληλουχία στοιχείου απόκρισης στον ορό (Serum Response Element, SRE), μια για τον μεταγραφικό παράγοντα Sp1 (ρετροϊκής προέλευσης) (Li et al., 1992) και πρόσφατα μια αλληλουχία για τον HOXA5 (Chen et al., 2005). Η ερευνητική μας ομάδα σε προηγούμενη δημοσιευμένη μελέτη, απέδειξε ότι και οι δύο αλληλουχίες δέσμευσης του AP-1 είναι απαραίτητες για τη μεταγραφή του γονιδίου της HARP, τόσο σε βασικό επίπεδο, όσο και μετά από ενεργοποίηση με Η 2 Ο 2 ή FGFb. Οι υπομονάδες του AP-1 που εμπλέκονται στην επαγωγή της μεταγραφής είναι οι Fra-1, JunD και c-jun (Polytarchou et al., 2005b; Hatziapostolou et al., 2006). Η λειτουργικότητα του SRE στον υποκινητή της HARP δεν έχει μέχρι τώρα αξιολογηθεί. Το SRE αποτελείται από δέκα βάσεις με αλληλουχία CCATATTAGG και είναι απαραίτητο προκειμένου να θεωρείται ότι ένας υποκινητής ανταποκρίνεται στον ορό. O ορός περιέχει μακρομόρια, πρωτεΐνες-μεταφορείς, ιχνοστοιχεία, ορμόνες και αυξητικούς παράγοντες, απαραίτητους για την καλλιέργεια κυττάρων και ιστών (Gstraunthaler, 2003). Στo SRE προσδένεται ο μεταγραφικός παράγοντας Serum Respose Factor (SRF) (Treisman et al., 1986). Ο SRF ενεργοποιείται μετά την επίδραση ορού, μιτογόνων, κυτταροκινών, παραγόντων που αυξάνουν τα ενδοκυττάρια επίπεδα ασβεστίου (ΜcDonough et al., 1997; Misra et al., 1994), ιικών πρωτεϊνών (Avantagiiati et al., 1993, Fujii et al., 1994), ενεργοποιημένων ογκογονιδίων, πχ. v-src, v-fps, v-ras, c-raf (Shin et al., 2006), ανισομυσίνης (Shin et al., 2006), θρομβίνης (Wu et al., 2002), λιποπολυσακχαρίτη (Shimi et al., 2006), λυσοφωσφατιδικού οξέος, αντιοξειδωτικών και υπεριώδους ακτινοβολίας (Chai and Tarnawaski, 2002). Δεν είναι γνωστό μέχρι σήμερα αν κάποιος από τους παράγοντες αυτούς επηρεάζει την έκφραση του γονιδίου της HARP. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η ρύθμιση της έκφρασης της HARP από διάφορους παράγοντες που είναι γνωστό ότι παίζουν ρόλο στην ανάπτυξη ή/και αγγειογένεση

66 γλοιοβλαστωμάτων. Τα γλοιοβλαστώματα είναι όγκοι του κεντρικού νευρικού συστήματος με πτωχή πρόγνωση, ιδιαίτερα υποξικοί και για το λόγο αυτό με υψηλή αγγείωση, μεγάλη ικανότητα μετάστασης και ανθεκτικότητα στα συνήθη θεραπευτικά σχήματα (Salvati et al., 1998; Kaur et al., 2005; Fischer et al., 2005; Zhang and Chakravarti, 2006). Είναι γνωστό ότι η HARP ανευρίσκεται σε καρκινικές σειρές και ιστούς γλοιοβλαστώματος (Powers et al., 2002; Mentlein et al., 2002), και φαίνεται να παίζει ρόλο στην ανάπτυξη και αγγείωσή τους (Mentlein et al., 2002; Powers et al., 2002; Muller et al., 2003). Για το σκοπό της παρούσας εργασίας χρησιμοποιήθηκαν ενδοθηλιακά κύτταρα από φλέβα ανθρώπινου ομφάλιου λώρου (HUVEC) και ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα γλοιοβλαστώματος (ΜΟ59Κ) και μελετήθηκε η επίδραση παραγόντων που επηρεάζουν την καρκινική ανάπτυξη και/ή αγγειογένεση, όπως το μονοξείδιο του αζώτου, ο ορός και η υποξία (χημική και φυσική) στην έκφραση και έκκριση της HARP, καθώς και στην ανάπτυξη των καρκινικών και ενδοθηλιακών κυττάρων.

67 ΜΕΘΟΔΟΙ

68 Μ.1 Ανακαλλιέργεια κυττάρων Μ059Κ Στην παρούσα διπλωματική χρησιμοποιήθηκε η κυτταρική σειρά M059K (επιθηλιακά κύτταρα από γλοιοβλάστωμα). Ισχύει η κάτωθι πειραματική πορεία ανακαλλιέργειας. 1. Η ανακαλλιέργεια πραγματοποιείται όταν τα κύτταρα έχουν καλύψει κατά 80-90% την επιφάνεια του τρυβλίου στο οποίο καλλιεργούνται. Ο προσδιορισμός του βαθμού κάλυψης γίνεται με παρατήρηση του τρυβλίου στο μικροσκόπιο. Κύτταρα υγιή θεωρούνται αυτά τα οποία είναι προσκολλημένα στο δάπεδο του τρυβλίου. 2. Μεταφορά του τρυβλίου με τα κύτταρα σε θάλαμο νηματικής ροής, όπου είναι δυνατή η εργασία υπο στείρες συνθήκες. Αναρρόφηση υπο κενό του θρεπτικού μέσου της καλλιέργειας και ξέπλυμα των κυττάρων δύο φορές με PBS (1X). Με την διαδικασία αυτή απομακρύνονται τυχόν εναπομείναντα ίχνη ορού, τα οποία περιέχουν αναστολείς της τρυψίνης. 3. Προσθήκη 1ml τρυψίνης ανα τρυβλίο 100mm. Η πορεί αποκόλλησης των κυττάρων παρακολουθείται στο μικροσκόπιο. Η επιβίωση των κυττάρων κινδυνεύει σε περίπτωση παραμονής τους πλέον των 10 λεπτών στην τρυψίνη. 4. Με την ολοκλήρωση της αποκόλλησης των κυττάρων, η τρυψίνη αναστέλλεται με την προσθήκη 3ml πλήρους θρεπτικού μέσου DMEM-HAMS F12 που περιέχει 10% ορό για τα Μ059Κ. 5. Μεταφορά του εναιωρήματος των κυττάρων σε αποστειρωμένο σωλήνα των 15ml. Προσθήκη PBS και συλλογή των κυττάρων που έχουν εναπομείνει μέσα σε τρυβλίο. Φυγοκέντρηση για 4 λεπτά στους 26 0 C στα 500 g. 6. Απομάκρυνση του υπερκείμενου θρεπτικού μέσου και προσθήκη πλήρους θρεπτικού μέσου DMEM-HAMS F12 μέχρι τελικού όγκου 3ml. Επαναιώρηση των κυττάρων με την βοήθεια πιπέτας. 7. Προσθήκη 10μl από το εναιώρημα των κυττάρων στην ειδική υποδοχή του αιματοκυτταρόμετρου και μέτρηση του αριθμού των κυττάρων στο μικροσκόπιο. 8. Για κάθε ανακαλλιέργεια κυττάρων Μ059Κ χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα. Υλικά και Διαλύματα Θρεπτικό µέσο DMEM-HAMS F12 για τα κύτταρα Μ059Κ: DMEM-HAMS F12 500ml Πενικιλλίνη-στρεπτοµυκίνη 100 ΙU/ml

69 Γενταμυκίνη Αμφοτερικίνη L-γλουταµίνη HEPES Non essential amminoacids 15mM 50 μg/ml 2,5μg/ml 2,5mM 0,05mM Πλήρες θρεπτικό µέσο για κύτταρα Μ059Κ: DMEM-HAMS F12 Ορός βοός (fetal bovine serum, FBS) 45ml 5ml PBS (10X) ph : NaHPO 4 KH 2 PO 4 NaCl 100mM 40mM 40mM Το διάλυµα διατηρείται στους 4 0 C και αραιώνεται 10 φορές πριν από τη χρήση του, οπότε και επαναρυθμίζεται το ph του. Αποστειρώνεται στο αυτόκαυστο. Μ.2 Μέτρηση κυττάρων σε αιμοκυτταρόμετρο Neubauer Είναι η πιο άμεση, απλή και αποδοτική μέθοδος μέτρησης κυττάρων που βρίσκονται σε εναιώρημα. Το αιμοκυτταρόμετρο (εικόνα Μ.1) είναι μια τροποποιημένη και διαβαθμισμένη αντικειμενοφόρος πλάκα, που περιέχει δυο κατάλληλα επεξεργασμένες, λείες επιφάνειες. Σε κάθε μια απ αυτές διακρίνεται μια διαγράμμιση σε μορφή τετραγωνισμένου πλέγματος, το οποίο αποτελείται από 9 κύρια τετράγωνα με μήκος πλευράς 1 mm (συνεπάγεται ότι το εμβαδόν του τετραγώνου είναι 1mm 2 ).

70 1.0 mm Πρώτο τετράγωνο περι οχή βάθος όγκος = μετρήσιμα = μη μετρήσιμα Εικόνα Μ.1: Αιμοκυτταρόμετρο Neubauer. Παρουσιάζεται σχηματικά και ο τρόπος υπολογισμού των κυττάρων. Το καθένα από αυτά τα τετράγωνα ορίζεται από τρεις παράλληλες γραμμές που απέχουν μεταξύ τους μόλις 2,5 μm, που χρησιμεύουν για τον καθορισμό της θέσης των κυττάρων (το αν αυτά βρίσκονται μέσα ή έξω από το πλέγμα). Το κάθε τετράγωνο εμφανίζει διαβαθμίσεις (χωρίζεται σε μικρότερα τετράγωνα) που εξυπηρετούν την ευκολότερη μέτρηση των κυττάρων. Το αιμοκυτταρόμετρο εμφανίζει δυο ίσου μεγέθους, λείες, προεξέχουσες επιφάνειες, με επίπεδο παράλληλο με τις διαγραμμισμένες, που ονομάζονται «ράχες», και στις οποίες στηρίζεται η καλυπτρίδα. Οι διαγραμμισμένες επιφάνειες βρίσκονται 0,1 mm χαμηλότερα από τις «ράχες». Μεταξύ της εξωτερικής πλευράς κάθε τετραγωνισμένης γυαλισμένης επιφάνειας και των σημείων που στηρίζεται η καλυπτρίδα υπάρχει μια κοίλη επιφάνεια (αυλάκωση). Στην κοίλη αυτή επιφάνεια τοποθετείται το κυτταρικό εναιώρημα, το οποίο με τριχοειδικά φαινόμενα απλώνεται στην τετραγωνισμένη επιφάνεια. Ο όγκος του κυτταρικού εναιωρήματος που θα καλύπτει ένα από τα εννέα τετράγωνα είναι 0,1 mm 3 (1,0 mm 2 x 0,1 mm) ή 1 x 10-4 ml. Έτσι, η συγκέντρωση των κυττάρων στο αρχικό εναιώρημα (σε κύτταρα / ml) είναι: Μέτρηση στο ένα από τα κύρια τετράγωνα Χ

71 Μ.3 Κατάψυξη κυττάρων Μ059Κ Η διατήρηση των ζωικών κυττάρων για μεγάλο χρονικό διάστημα είναι δυνατή με την αποθήκευση τους σε υγρό άζωτο σε θερμοκρασίες μεταξύ C και C. Για την επιτυχή διατήρηση τους είναι απαραίτητο να βρίσκονται σε καλή μεταβολική κατάσταση πριν από την ψύξη τους και για το λόγο αυτό κατά γενικό κανόνα η ψύξη των κυττάρων πραγματοποιείται όταν τα κύτταρα έχουν καλύψει 80-90% της επιφάνειας του τρυβλίου. Επιπλέον, η ψύξη των κυττάρων πραγματοποιείται βαθμιαία (περίπου 1 0 C ανά ώρα) μέχρι η θερμοκρασία τους να φτάσει ένα κρίσιμο σημείο (-20 0 C), προκειμένου να αποφευχθεί ο σχηματισμός πάγου στο εσωτερικό τους και να ελαχιστοποιηθεί η απώλεια νερού. Επίσης, για να αποφευχθεί ο σχηματισμός πάγου στο εσωτερικό των κυττάρων, καταψύχονται παρουσία διμέθυλου-σουλφοξύδιου (DMSO) ή γλυκερόλης. Ακολουθείται η παρακάτω διαδικασία : 1. Αποκόλληση των κυττάρων από την επιφάνεια του τρυβλίου στο οποίο καλλιεργούνται, όπως περιγράφτηκε παραπάνω.. 2. Φυγοκέντρηση για 4 λεπτά στα 500 g και τους 26 0 C. 3. Ενώ πραγµατοποιείται η φυγοκέντρηση, προστίθενται σε ένα cryovial 50 µl DMSO. Σηµειώνουµε στο cryovial τον κυτταρικό τύπο, την ηµεροµηνία ψύξης και τον αριθµό των κυττάρων. 4. Όταν ολοκληρωθεί η φυγοκέντρηση, αφαιρείται το υπερκείµενο θρεπτικό µέσο. 5. Επαναιώρηση του ιζήµατος των κυττάρων σε 950 µl ορού. 6. Προσθήκη του εναιωρήµατος των κυττάρων στα 50 µl DMSO και πολύ γρήγορη ανάδευσή τους προκειµένου να επιτευχθεί η οµοιογενής κατανοµή του DMSO. Η τελική συγκέντρωση του DMSO είναι 10% (δεν πρέπει να υπερβαίνει το 20% καθώς αυξάνεται η τοξική του επίδραση στα κύτταρα) και χρησιµοποιείται προκειµένου να αµβλυνθεί η επίδραση της δηµιουργίας κρυστάλλων νερού στο εσωτερικό των κυττάρων. 7. Τοποθέτηση των κυττάρων σε κατάλληλες υποδοχές σε δοχείο ψύξης κυττάρων που περιέχει παγωµένη ισοπροπανόλη, στους C για ώρες. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται η σταδιακή µείωση της θερµοκρασίας των κυττάρων (περίπου 1 0 C ανά ώρα). Η σταδιακή µείωση της θερµοκρασίας συµβάλλει στη µεγαλύτερη βιωσιµότητα τους. 8. Τοποθέτηση των κυττάρων σε ειδικές υποδοχές στο υγρό άζωτο, έως ότου απαιτηθεί η επαναχρησιµοποίησή τους.

72 Υλικά και διαλύματα DMSO (dimethylsulfoxide, διμέθυλο-σουλφοξύδιο). DMEM-HAMS F12. Ορός νεογέννητου βοός (fetal calf serum, FCS). Ειδικά φιαλίδια για την ψύξη των κυττάρων (cryovials). Ειδικό δοχείο ψύξης κυττάρων µε ισοπροπανόλη. Δοχείο ψύξης κυττάρων (υγρό άζωτο) το οποίο περιέχει ισοπροπανόλη και επιτρέπει την ήπια αρχική ψύξη των κυττάρων. Μ.4 Απόψυξη κυττάρων Μ059Κ Κατά τη διαδικασία αυτή κύτταρα τα οποία έχουν παραμείνει παγωμένα ακόμα και για πολύ μεγάλο χρονικά διάστημα είναι δυνατόν να επανακαλλιεργηθούν. Η διαδικασία γίνεται και αυτή υπό άσηπτες συνθήκες και όσο το δυνατόν ταχύτερα, προκειμένου τα κύτταρα να μην εκτεθούν στο DMSO, το οποίο μπορεί να δράσει τοξικά. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε ήταν η εξής : 1. Σε αποστειρωµένο σωληνάκι των 15 ml προστίθενται 9 ml πλήρους θρεπτικού µέσου DMEM-HAMS F Αφαίρεση των κυττάρων από το υγρό άζωτο. 3. Ξεπάγωµα των κυττάρων όσο το δυνατόν πιο γρήγορα, µε ανακίνηση σε υδατόλουτρο 37 0 C. 4. Μεταφορά των κυττάρων στα 9 ml του θρεπτικού µέσου που είναι ήδη έτοιµο και ανάµιξη µε γρήγορες κινήσεις. Το στάδιο αυτό αποσκοπεί στην αραίωση του DMSO στο οποίο βρίσκονται τα κύτταρα, που σε θερµοκρασία δωµατίου είναι πολύ τοξικό για αυτά. 5. Φυγοκέντρηση για 4 λεπτά στα 500 g σε θερµοκρασία δωµατίου. 6. Αφαίρεση του υπερκείµενου µε πιπέτα Pasteur υπό κενό. 7. Επαναιώρηση του ιζήµατος των κυττάρων σε 1 ml πλήρους θρεπτικού μέσου DMEM- HAMS F12.

73 8. Προσθήκη επιπλέον πλήρους θρεπτικού µέσου µέχρι τελικού όγκου 10 ml. 9. Φυγοκέντρηση για 4 λεπτά στα 500 g και σε θερµοκρασία δωµατίου. 10.Αφαίρεση του υπερκείµενου µε πιπέτα Pasteur υπό κενό. 11.Επαναιώρηση του ιζήµατος των κυττάρων σε 1 ml πλήρους θρεπτικού µέσου. Προσθήκη επιπλέον πλήρους θρεπτικού µέσου µέχρι τελικού όγκου 10 ml. 12.Μεταφορά των κυττάρων σε τρυβλίο καλλιέργειας. 13.Παρατήρηση των κυττάρων στο µικροσκόπιο. 14.Καλλιέργεια των κυττάρων, ανανεώνοντας το θρεπτικό µέσο κάθε 3-4 ηµέρες, µέχρι να φτάσουν σε ένα βαθµό 80-90% κάλυψης του τρυβλίου. Υλικά και Διαλύματα DMEM-HAMS F12. Πλήρες θρεπτικό µέσο DMEM-HAMS F12 Μ.5 Επίδραση ουσιών και απομόνωση της PTN από το θρεπτικό μέσο κύτταρων Μ059Κ Η διαδικασία επώασης των Μ059Κ κυττάρων με τις προς μελέτη ουσίες γίνεται όταν τα κύτταρα έχουν καλύψει κατά 80-90% την επιφάνεια του τρυβλίου στο οποίο καλλιεργούνται (διαμέτρου 60 mm). Η διαδικασία που ακολουθείται έχει ως εξής: Μεταφορά των τρυβλίων σε θάλαμο νηματικής ροής για να επιτευχθούν στείρες συνθήκες για την πραγματοποίηση της διαδικασίας. 1. Αναρρόφηση του θρεπτικού μέσου της καλλιέργειας με πιπέτα Pasteur υπό κενό. 2. Ήπιο ξέπλυμα του πυθμένα του τρυβλίου (κυττάρων) δυο φορές με (2-3 ml) PBS. 3. Προσθήκη 5 ml θρεπτικού μέσου DMEM-HAMS F12 με συγκεντρώσεις ορού 10%, 5%, 2% και 0% στην περίπτωση μελέτης της επίδρασης του ορού στην έκκριση της HARP και πλήρους θρεπτικού μέσου DMEM-HAMS F12 στην περίπτωση επίδρασης δεσφεροξαμίνης ή χλωριούχου κοβαλτίου. Τα κύτταρα επωάζονται με τις ουσίες για 72 ώρες στους 37 0 C και σε ατμόσφαιρα 5% CO 2.

74 4. Με το πέρας του χρόνου επώασης συλλέγεται το θρεπτικό μέσο σε σωληνάρια των 15 ml και προστίθεται διάλυμα Α, ώστε η τελική συγκέντρωση σε NaCl να είναι 0,5Μ. 5. Ήπιο ξέπλυμα του πυθμένα του τρυβλίου (κυττάρων) δυο φορές με (2-3 ml) PBS, που περιέχει αναστολείς φωσφατασών σε αναλογία 1:20, και φύλλαξη τους στους C, προκειμένου να επακολουθήσει απομόνωση πυρηνικού εκχυλίσματος με διαδικασία που αναφέρεται παρακάτω. 6. Ακολουθεί προσθήκη 50 μl σφαιριδίων ηπαρίνης-σεφαρόζης σε κάθε σωληνάριο που περιέχει το θρεπτικό μέσο και ανακίνηση στους 4 0 C για 16 ώρες. 7. Φυγοκέντρηση στα 1.000g, στους 4 0 C, για 5 λεπτά. Απομάκρυνση του υπερκείμενου, επαναιώρηση των σφαιριδίων σε 10ml διαλύματος Β και φυγοκέντρηση στα 1.000g στους 4 0 C, για 5 λεπτά (Χ2). 8. Απομάκρυνση του υπρκείμενου, επαναιώρησητων σφαιριδίων σε 10 ml διαλύματος Γ και φυγοκέντρηση στα 1.000g, στους 4 0 C, για 5 λεπτά (Χ2). Απομάκρυνση του υπερκείμενου και προσθήκη 60μl διαλύματος δειγμάτων ηλεκτροφόρησης (loading buffer 2X). 9. Ανάλυση των πρωτεινών (30μl από κάθε δείγμα) σε SDS-PAGE (σε πήκτωμα διαχωρισμού 17,5%) και ταυτοποίηση της PTN κατά Western. Υλικά και διαλύματα PBS. DMEM HAMS-F12. Ορός. Διάλυμα Α: 20mM HEPES ph 7,4 2M NaCl 1m M PMSF 5m M EDTA 1μg/ml απροτινίνη Διάλυμα Β : 20mM HEPES ph 7,4 0,5M NaCl Διάλυμα Γ :

75 20mM HEPES ph 7,4 Σφαιρίδια ηπαρίνης-σεφαρόζης : Heparin Sepharose beads (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) Ρυθμιστικό διάλυμα δειγμάτων 2Χ (loading buffer) 4 Μ ουρία 0,03 Μ SDS 0,05 Μ Tris-base 10% κ.ο. γλυκερόλη 2% κ.β. μπλε της βρωμοφαινόλης 10% κ.ο. β-μερκαπτοαιθανόλη. Μ.6 Επίδραση της υποξίας στην έκφραση της PTN, μέσω συστήματος δημιουργίας αναερόβιας ατμόσφαιρας Για τον σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε ειδικό σύστημα (Anaerocult A mini, Merck KGaA) που δημιουργεί αναερόβιες συνθήκες και χρησιμοποιείται για την καλλιέργεια αναερόβιων οργανισμών στη Μικροβιολογία. Το σύστημα Anaerocult A mini περιέχει συστατικά τα οποία δεσμεύουν χημικά το οξυγόνο δημιουργώντας περιβάλλον ελεύθερο οξυγόνου. Κατά την επώαση των κυττάρων η ανίχνευση της αναερόβιας ατμόσφαιρας γίνεται μέσω ειδικών δεικτών (Anaerotest, Merck KGaA). Οι δείκτες αυτοί περιέχουν την χρωστική μπλέ του μεθυλενίου, η οποία σε περιβάλλον ελεύθερο οξυγόνου μετατρέπεται σε άχρωμο μπλέ του λευκομεθυλενίου. Η διαδικασία γίνεται σε κύτταρα τα οποία έχουν καλύψει το 80-90% του πυθμένα του τρυβλίου επίστρωσης με διάμετρο 60 mm και είναι η εξής : 1. Μεταφορά των τρυβλίων σε θάλαμο νηματικής ροής για να επιτευχθούν στείρες συνθήκες για την πραγματοποίηση της διαδικασίας. 2. Αναρρόφηση του θρεπτικού μέσου της καλλιέργειας με πιπέτα Pasteur υπό κενό. 3. Ήπιο ξέπλυμα του πυθμένα του τρυβλίου (κυττάρων) δυο φορές με (2-3 ml) PBS. 4. Προσθήκη 5 ml θρεπτικού μέσου DMEM-HAMS F12 με 10% ορό. 5. Ακολουθεί εφύγρανση του δείκτη Anaerotest και επικόλληση του εξωτερικά στο πάνω καπάκι του τρυβλίου. Η ζώνη αντίδρασης πρέπει να δείχνει προς τα επάνω και να προεξέχει στον ελύθερο χώρο. 6. Προστίθενται 8 ml αποστειρωμένου ύδατος στον καταλύτη Anaerocult A mini.

76 7. Τα τρυβλία,από ένα μέχρι τέσσερα, τοποθετούνται στις ειδικές σακούλες επώασης του συστήματος και επωάζονται για 2 ώρες στους 37 0 C. Σύμφωνα με καμπύλες του χρόνου επώασης σε σχέση με το ποσοστό οξυγόνου στο μικροπεριβάλλον του Anaerocult A mini, μετά από δύο ώρες το ποσοστό οξυγόνου πλησιάζει το 0%. 8. Επώαση των κυττάρων για το απαιτούμενο χρονικό διάστημα 9. Μετά το πέρας του χρόνου επώασης ακολουθείται η ίδια διαδικασία συλλογής της πλειοτροφίνης από το μέσο καλλιέργειας με πρίν (Βλέπε Μ.6). Υλικά και διαλύματα PBS DMEM HAMS-F12 Ορός νεογέννητου βοός (FBS) Anaerocult A mini (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) Anaerotest (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) Μ.7 Απομόνωση πυρηνικού εκχυλίσματος από κύτταρα Μ059Κ Χρησιμοποιήθηκε το ολοκληρωμένο σύστημα για απομόνωση πυρηνικού εκχυλίσματος Nuclear Extract Kit, της εταιρίας Active motif. Η πειραματική πορεία που ακολουθείται παρατίθεται παρακάτω και εφαρμόζεται για καλλιέργεια κυττάρων Μ059Κ, σε τρυβλίο με διάμετρο 60 mm, το οποίο μετά την επίδραση ουσιών και την συλλογή του μέσου καλλιέργειας, έχει φυλαχθεί στους C (όπως έχει προαναφερθεί στην Μ.5). 1. Έκπλυση των κυττάρων με 2,5 ml παγωμένου διαλύματος PBS. Το διάλυμα PBS περιέχει αναστολείς φωσφατασών σε αναλογία 1: Απομάκρυνση του παραπάνω διαλύματος και προσθήκη εκ νέου 1,5 ml παγωμένου διαλύματος PBS (με αναστολείς φωσφατασών). Αποκόλληση των κυττάρων από τον πυθμένα του τρυβλίου με τη χρήση ελαστικής ξύστρας (cell scraper) και μεταφορά σε παγωμένο σωληνάρριο των 15 ml.

77 3. Φυγοκέντρηση στα 500 rpm,για 5 λεπτά, στους 4 0 C. Απόχυση του υπερκείμενου και διατήρηση του ιζήματος των κυττάρων στον πάγο. 4. Προσθήκη 250 μl υποτονικού διαλύματος (1Χ) στο ίζημα των κυττάρων και ήπια ανάδευση. Στο στάδιο αυτό γίνεται λύση των κυττάρων και το εκχύλισμα μεταφέρεται σε μαγωμένο σωληνάριο μικροφυγόκεντρου. Ακολουθεί επώαση στον πάγο για 15 λεπτά. 5. Η λύση τω κυττάρων υποβοηθάται με την προσθήκη 12,5 μl απορρυπαντικού και δυνατή ανάδευση για 10 δευτερόλεπτα. Φυγοκέντρηση στα g, για 30 δευτερόλεπτα, στους 4 0 C. 6. Το υπερκείμενο, που αποτελεί το κυτταροπλασματοκό κλάσμα, φυλάσσεται στους C. Στο ίζημα, που περιέχει τους πυρήνες των κυττάρων, προστίθενται 25 μl πλήρους διαλύματος λύσης πυρήνων και ακολουθεί έντονη ανάδευση για 10 δευτερόλεπτα. Επώαση για 30 λεπτά, στους 4 0 C, υπο ανάδευση. 7. Έντονη ανάδευση για 30 δευτερόλεπτα και φυγοκέντρηση στα g, για 10 λεπτά, στους 4 0 C. Το υπερκείμενο, πυρηνικό εκχύλισμα, μεταφέρεται σε παγωμένο σωληνάριο μικροφυγοκέντρου και φυλάσσεται στους C. Πριν τη χρησιμοποίηση των δειγμάτων, πραγματοποιείταιπροσδιορισμός ολικής πρωτείνης με τη μέθοδο Bradfoerd (Ως τυφλό χρησιμοποιείται το διάλυμα λύσης των πυρήνων). Υλικά και Διαλύματα Τα αντιδραστήρια περιέχονται στο ολοκληρωμένο σύστημα Nuclear Extract Kit. Διάλυμα PBS 10 X Διάλυμα περιέχον μίγμα αναστολέων φωσφατασών Διάλυμα λύσης AM1 1 Μ Διθειοθρειτόλη (DTT) Διάλυμα περιέχον μίγμα ανστολέων πρωτεινασών Απορρυπαντικό Υποτονικό διάλυμα 10Χ Πλήρες διάλυμα λύσης πυρήνων : Διάλυμα λύσης AM1 DTT σε τελική συγκέντρωση 1 mm Αναστολείς πρωτεινασών σε αναλογία 1 :100

78 Μ.8 Εκτίμηση της συγκέντρωσης ολικής πρωτείνης σε διάλυμα (Μέθοδος Bradfoerd, Bradfoerd et al., 1976) 1. Προσθήκη 3 μl δείγματος σε 1 ml αντιδραστήριο Bradfoerd και ανάδευση σε αναδευτήρα Vortex. 2. Παραμονή για 5 λεπτά σε θερμοοκρασία δωματίου και φωτομέτρηση στα 595 nm. 3. Για την κατασκευή της πρότυπης καμπύλης χρησιμοποιείται αλβουμίνη βόιου ορού (Bovine Serm Albumin). Υλικά και Διαλύματα Διάλυμα Bradfoerd (1X) 0,1m M Coomasie G-250 5% κ.ο 95% αιθανόλη 10% κ.ο. 85% Η 3 PO 4 Διήθηση του διαλύματος 5 φορές με χρήση διηθητικού χαρτιού Φασματοφωτόμετρο Hitachi U-1100 Μ.9 SDS ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) Η ανάλυση των πρωτεϊνών έγινε με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου, παρουσία αποδιατακτικών παραγόντων (SDS, DTT). Το SDS είναι ένα ιοντικό απορρυπαντικό το οποίο δεσμεύεται στις πρωτεΐνες με σταθερή αναλογία βάρους (1,4gr SDS ανά gr πρωτεΐνης). Η επιπλέον χρήση αναγωγικών παραγόντων, όπως είναι η διθειοθρεϊτόλη (DTT) ή η β-μερκαπτοαιθανόλη, έχει ως αποτέλεσμα την αναγωγή των δισουλφιδικών δεσμών των πρωτεϊνών. Η πλήρης αποδιάταξη των πρωτεϊνών επιτυγχάνεται με θέρμανση των πρωτεϊνικών δειγμάτων για 5 λεπτά στους C, παρουσία όλων των παραπάνω

79 αποδιατακτικών παραγόντων. Εξαιτίας του SDS, οι πρωτεïνες που περιέχονται στα δείγματα έχουν φορτιστεί αρνητικά και είναι δυνατή η κίνησή τους όταν βρεθούν εντός ηλεκτρικού πεδίου. Η ηλεκτροφορητική τους κινητικότητα είναι συνάρτηση του μοριακού τους βάρους. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε είναι η εξής : 1. Διαμορφώνεται ειδική υάλινη μήτρα διαστάσεων 9,5 cm X 7,5 cm X 0,1 cm, μέσα στην οποία θα πραγματοποιηθεί ο πολυμερισμός των πηκτωμάτων διαχωρισμού και συμπυκνώσεως. 2. Πραγματοποιείται πολύ καλή και γρήγορη ανάδευση των συστατικών που απαρτίζουν το πήκτωμα διαχωρισμού. 3. Απόχυση των υγρών ακόμα συστατικών του πηκτώματος διαχωρισμού στην υάλινη μήτρα και επικάλυψη με απεσταγμένο νερό. Παρατηρούμε τον πολυμερισμό του πηκτώματος έτσι ώστε να βεβαιωθούμε ότι πραγματοποιείται φυσιολογικά (2-15 λεπτά, ανάλογα με τη σύσταση του πηκτώματος ή/και τη θερμοκρασία του περιβάλλοντος). 4. Απόχυση του απεσταγμένου νερού από την επιφάνεια του πηκτώματος. 5. Πραγματοποιείται πολύ καλή και γρήγορη ανάδευση των συστατικών που απαρτίζουν το πήκτωμα συμπυκνώσεως. 6. Απόχυση των υγρών ακόμα συστατικών του πηκτώματος συμπυκνώσεως στην υάλινη μήτρα, πάνω από την επιφάνεια του πηκτώματος διαχωρισμού. Προσθήκη κατάλληλης ελαστικής μήτρας, η οποία είναι υπεύθυνη για τη δημιουργία των φρεατίων στο πήκτωμα συμπυκνώσεως. Παρατηρούμε τον πολυμερισμό του πηκτώματος για να βεβαιωθούμε ότι πραγματοποιείται φυσιολογικά (5-15 λεπτά ανάλογα με τη θερμοκρασία του περιβάλλοντος). 7. Ανάμιξη των δειγμάτων που θα ηλεκτροφορηθούν με ρυθμιστικό διάλυμα δειγμάτων 5Χ σε αναλογία 4:1. 8. Θέρμανση των δειγμάτων για 5 λεπτά στους C. 9. Φυγοκέντρηση των δειγμάτων για 5 λεπτά στα g και σε θερμοκρασία δωματίου. 10. Προσθήκη των δειγμάτων στις ειδικές υποδοχές του πηκτώματος συμπύκνωσης. 11. Πραγματοποίηση της ηλεκτροφόρησης σε θερμοκρασία δωματίου με την εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου σταθερής έντασης 35 ma, μέχρι η χρωστική μπλε της βρωμοφαινόλης να φθάσει 0,5 cm πριν το άκρο του πηκτώματος της ηλεκτροφόρησης. 12. Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφορητικής ανάλυσης, γίνεται τοποθέτηση του πηκτώματος διαχωρισμού σε κατάλληλη συσκευή, για μεταφορά των πρωτεινών από το πήκτωμα σε μεμβράνη PVDF (Western Blot).

80 Εικόνα Μ.2: Σχηματική της συσκευής ηλεκτρομεταφοράς πρωτεϊνών. Αριστερά, σε μεγέθυνση απεικονίζεται η διάταξη που απαιτείται για τη σωστή ηλεκτρομεταφορά των πρωτεϊνών. Αυτή περιλαμβάνει σπόγγους, χαρτιά Whatman, την PVDF μεμβράνη, το πήκτωμα και την πλαστική κασετίνα ή οποία τα συμπιέζει. Η φορά της κίνησης των πρωτεϊνών είναι από τον αρνητικό στο θετικό πόλο. Υλικά και Διαλύματα 1,5 M Tris-HCl ph 8,8: Τris-base Απεσταγμένο H 2 O 45,4 g 180 ml Το διάλυμα ρυθμίζεται σε ph=8,8 με τη χρήση διαλύματος HCl 37% και συμπληρώνεται απεσταγμένο H 2 O μέχρι τελικού όγκου 250 ml. 0,5 M Tris-HCl ph 6,8: Τris-base Απεσταγμένο H 2 O 6,055 g 80 ml Το διάλυμα ρυθμίζεται σε ph=6,8 με τη χρήση διαλύματος HCl 37% και συμπληρώνεται απεσταγμένο H 2 O μέχρι τελικού όγκου 100 ml.

81 Διάλυμα ακρυλαμιδίου / μεθυλεν-δις-ακρυλαμιδίου 30% (30:1): Ακρυλαμίδιο 150 gr Μεθυλεν-δις-ακρυλαμιδίου 5 gr Απεσταγμένο H 2 O Μέχρι τελικού όγκου 500 ml Διάλυμα SDS 10% κ.β.: SDS Απεσταγμένο H 2 O 10 g 100 ml Διάλυμα υπερθεϊικού αμμωνίου 20% κ.β.: Υπερθεϊικό αμμώνιο Απεσταγμένο H 2 O 20 g Μέχρι τελικού όγκου 100 ml TEMED Ρυθμιστικό διάλυμα δειγμάτων ( 2Χ ) 4 Μ ουρία 0,03 Μ SDS 0,05 Μ Tris-base 10% κ.ο. γλυκερόλη 2% κ.β. μπλε της βρωμοφαινόλης 10% κ.ο. β-μερκαπτοαιθανόλη. Ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροδίων (5Χ) Tris-base 250 mm Γλυκίνη 2 M SDS 0,5% Απεσταγμένο H 2 O Μέχρι τελικού όγκου 1 lt. Το διάλυμα διατηρείται σε θερμοκρασία δωματίου και αραιώνεται 1:5 με απεσταγμένο Η 2 Ο πριν από τη χρήση του.

82 Πήκτωμα συμπυκνώσης (3,5%) dh 2 O Διάλυμα ακρυλαμιδίου / μεθυλεν-δις-ακρυλαμιδίου 2 ml 4,9 ml 0,5 M Tris-HCl ph 6,8 0,94 ml SDS AP TEMED 80 μl 80 μl 8 μl Πήκτωμα διαχωρισμού 17,5% 10% dh 2 O 1,34 ml 3,41 ml Διάλυμα ακρυλαμιδίου / μεθυλεν-δις-ακρυλαμιδίου 5,84 ml 3,34 ml 1,5 M Tris-HCl ph 8,8 2,5 ml 2,5 ml SDS 100 μl 100 μl AP 20% 100 μl 100 μl TEMED 10 μl 10 μl M.10 Ανοσοαποτύπωμα (Western blot) Η μέθοδος αυτή επιτρέπει την εκλεκτική ανίχνευση μιας πρωτεΐνης-αντιγόνου, με τη χρήση ειδικών αντισωμάτων που έχουν παρασκευαστεί γι αυτό. Η μέθοδος περιλαμβάνει την ηλεκτροφορητική ανάλυση ενός πρωτεϊνούχου διαλύματος σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου, την ηλεκτρομεταφορά των πρωτεϊνών σε μεμβράνες και τέλος τη δέσμευση των ειδικών αντισωμάτων στο αντιγόνο. Μετά από την κάλυψη των κενών θέσεων της μεμβράνης

83 (blocking) πραγματοποιείται επώαση της μεμβράνης με ειδικό έναντι του υπό μελέτη αντιγόνου αντίσωμα. Στη συνέχεια, η μεμβράνη επωάζεται με αντίσωμα που αναγνωρίζει την Fc περιοχή του πρώτου αντισώματος. Το δεύτερο αντίσωμα είναι σημασμένο είτε ενζυμικά είτε ραδιενεργά, οπότε είναι δυνατή η ανίχνευση του συμπλόκου αντιγόνου αντισώματος μετά από την προσθήκη κατάλληλου υποστρώματος. Στα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία, όλα τα δεύτερα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν σημασμένα ενζυμικά με την υπεροξειδάση (horse-raddish peroxidase, HRP). Η διαδικασία είναι η εξής : 1. Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφορητικής ανάλυσης, γίνεται τοποθέτηση του πηκτώματος διαχωρισμού σε κατάλληλη συσκευή, για μεταφορά των πρωτεϊνών από το πήκτωμα σε μεμβράνη PVDF. 2. Εφαρμογή σταθερής ένταση ρεύματος 400 ma για 3 ώρες. Τα δείγματα μεταφέρονται από τον αρνητικό στο θετικό πόλο. 3. H μεμβράνη υφίσταται κατάλληλη επεξεργασία ανάλογα με το είδος της πρωτεΐνης που αναλύεται, προκειμένου να πραγματοποιηθεί η παρεμποδιστεί η μη ειδική δέσμευση των αντισωμάτων (Πίνακας M.1 και Μ.2). 4. Πραγματοποιούνται 3 ξεπλύματα της μεμβράνης για 5 λεπτά με διάλυμα TBS T σε θερμοκρασία δωματίου. 5. Εμβάπτιση της μεμβράνης και επώαση σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει το πρώτο αντίσωμα σε κατάλληλη αραίωση, όπως φαίνεται στον Πίνακα M Συλλογή του πρώτου αντισώματος. 7. Πραγματοποιούνται 3 ξεπλύματα της μεμβράνης για 5 λεπτά με διάλυμα TBS T σε θερμοκρασία δωματίου. 8. Επώαση της μεμβράνης σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιέχει το δεύτερο αντίσωμα, σε θερμοκρασία δωματίου υπό ανακίνηση, όπως φαίνεται στον Πίνακα M Πραγματοποιούνται 3 ξεπλύματα της μεμβράνης για 5 λεπτά με διάλυμα TBS T σε θερμοκρασία δωματίου και ένα ξέπλυμα των 5 λεπτών με TBS. 10. Εμφάνιση του ανοσοστυπώματος της πρωτεΐνης στη μεμβράνη με σύστημα χημειοφωταύγειας. Υλικά και Διαλύματα Ρυθμιστικό διάλυμα για τη συσκευή μεταφοράς πρωτεϊνών (10Χ): Γλυκίνη 400 mm Tris base 500 mm

84 SDS 0,37% κ.β. Το διάλυμα διατηρείται σε θερμοκρασία δωματίου και αραιώνεται πριν από τη χρήση του με αναλογία ρυθμιστικού διαλύματος:απεσταγμένο Η 2 Ο:μεθανόλη ίση με 1:7:2. Ρυθμιστικό διάλυμα TBS ph 7,6 (10Χ): Tris base NaCl Απεσταγμένο Η 2 Ο 200 mμ 1,36 Μ 800 ml Ρυθμίζεται το ph του διαλύματος σε τιμή ίση με 7,6 με τη χρήση πυκνού διαλύματος HCl (37%) και συμπληρώνεται ο όγκος του μέχρι 1lt με απεσταγμένο Η 2 Ο. Το διάλυμα διατηρείται σε θερμοκρασία δωματίου και χρησιμοποιείται ως 1Χ μετά από αραίωση 1:9 με απεσταγμένο Η 2 Ο. Μεμβράνη PVDF (polyvinylidene fluoride): Millipore Immobilon-P Transfer Membrane Απαχο γάλα σε σκόνη (Regilait) Bovine Serum Albumin (Fluka) Ρυθμιστικό διάλυμα TBS Tween 20 ph 7,6 (ΤΒS-T) Σύστημα Χημειοφωταύγειας: Χρησιμοποιήθηκε το ολοκληρωμένο σύστημα χημειοφωταύγειας από την εταιρεία Chemicon (ChemiLucent TM #2600).

85 Πίνακας M.1: Αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν κατά τα πειράματα με ανοσοαποτύπωμα. Αντίσωμα HARP Phospho Erk1/2 (#9101, rabbit) Erk1/2 (#06-182, mouse) Phospho p38 (#9211, rabbit) P38 (#9212, rabbit) Endothelial nitric oxide synthase(#1006, rabbit) Hypoxia-Inducible Factor 1α(#610958, mouse) Anti-rabbit IgG (A0545, goat) Anti-goat IgG (B3148, mouse, clone GT-34) Anti-mouse IgG (A9917, goat) Προέλευση Πολυκλωνικό αντίσωμα, Lab. CRRET, France Πολυκλωνικό αντίσωμα, Cell Signaling Μονοκλωνικό αντίσωμα, Cell Signaling Πολυκλωνικό αντίσωμα, Cell Signaling Πολυκλωνικό αντίσωμα, Cell Signaling Πολυκλωνικό αντίσωμα, Santa Cruz Biotechnology Μονοκλωνικό αντίσωμα,bd Biosciences Συνδεδεμένο με υπεροξειδάση, Sigma Συνδεδεμένο με υπεροξειδάση, Sigma Συνδεδεμένο με υπεροξειδάση, Sigma Πίνακας M.2: Συνθήκες οι οποίες χρησιμοποιήθηκαν κατά τα ανοσοαποτυπώματα που πραγματοποιήθηκαν. HARP (goat) Παρεμπόδιση μη ειδικής δέσμευσης 3% BSA σε TBS-T 0,05%, 16 ώρες, 4 0 C 1 ο αντίσωμα 2 ο αντίσωμα (1 ώρα, 25 0 C) 1:5.000 σε TBS-T 0,05%, 16 ώρες, 4 0 C Anti-goat 1:7500 σε TBS-T 0,05% Phospho Erk1/2 (rabbit) 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 0,1%, 2 ώρες, 25 0 C 1:1.000 σε TBS-T 0,1% με 5% BSA,16 ώρες, 4 0 C, Anti-rabbit 1: σε TBS- T 0,1% Erk1/2 (rabbit) 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 0,1%, 2 ώρες, 25 0 C 1: σε TBS-T 0,1% με 3% άπαχο γάλα, 16 ώρες, 4 0 C Anti-rabbit 1: σε TBS- T 0,1% Phospho p38 (rabbit) 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 0,1%, 2 ώρες, 25 0 C 1: σε TBS-T 0,1% με 5% BSA,16 ώρες, 4 0 C Anti-rabbit 1:2.000 σε TBS-T 0,1% με 5% άπαχο γάλα p38 (rabbit) 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 0,1%, 2 ώρες, 25 0 C 1: σε TBS-T 0,1% με 5% BSA,16 ώρες, 4 0 C Anti-rabbit 1:2.000 σε TBS-T 0,1% με 5% άπαχο γάλα Endothelial nitric oxide synthase (rabbit) 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 0,1%, 2 ώρες, 25 0 C 1: σε TBS-T 0,1% με 3% άπαχο γάλα, 16 ώρες, 4 0 C Anti-rabbit 1:2.500 σε TBS-T 0,1% με 3% άπαχο γάλα Actin (mouse) 5% άπαχο γάλα σε TBS-T (2 ώρες) 1:1.000 σε TBS-T 0,1% με 3% άπαχο γάλα Anti-mouse 1:7.500 σε TBS- T με 3% άπαχο γάλα

86 Hypoxia- Inducible Factor 1α (mouse) 5% άπαχο γάλα σε TBS-T (2 ώρες) 1:250 σε TBS-T 0,1% Anti-mouse 1:7.500 σε TBS- T 0,1% Μ.11 Αποδέσμευση αντισώματος από μεμβράνη PVDF (stripping) Η διαδικασία αποδέσμευσης αντισώματος από την PVDF μεμβράνη συμβαίνει μόνο όταν έχει χρησιμοποιηθεί το σύστημα της χημειοφωταύγειας για το ανοσοαποτύπωμα της πρωτεΐνης. Η διαδικασία που ακολουθείται είναι η εξής: Μετά την έκθεση της μεμβράνης στο φιλμ, ακολουθεί πλύσιμο αυτής 3 φορές με διάλυμα TBS-T για 5 λεπτά υπό ανακίνηση. Επώαση της μεμβράνης με το διάλυμα αποδέσμευσης αντισωμάτων για 30 λεπτά σε θερμοκρασία ο C και με ήπια ανάδευση ανά τακτά χρονικά διαστήματα. Ακολουθούν 6 πλυσίματα της μεμβράνης με TBS-T, διάρκειας 5 λεπτών το καθένα υπό ανακίνηση. Γίνεται επώαση της μεμβράνης με κάποιο ρυθμιστικό διάλυμα παρεμπόδισης της μη ειδικής δέσμευσης, ανάλογα με το αντίσωμα με το οποίο πρόκειται η μεμβράνη να επωαστεί (αναφέρεται στην προηγούμενη παράγραφο). Υλικά και Διαλύματα Διάλυμα αποδέσμευσης αντισωμάτων: 62,5 mm Tris-HCl ph 6,8 2% SDS 100 mm β-μερκαπτοαιθανόλη Ρυθμιστικό διάλυμα TBS-Tween 20 ph 7,6 (TBS-T)

87 Μ.12 Ποσοτικοποίηση ανοσοαποτυπωμάτων πρωτεϊνών με σύστημα ανάλυσης εικόνας Προκειμένου να εξαχθούν ποσοτικά συμπεράσματα από τα ανοσοαποτυπώματα πρωτεϊνών, γίνεται ποσοτικοποίηση των ζωνών με τη χρήση συστήματος ανάλυσης εικόνας.η φωτογράφηση πραγματοποιείται με τις ψηφιακές φωτογραφικές μηχανές Olympus Camedia C-2500L και FE-5500, με τη χρήση διερχόμενου λευκού φωτός. Ακολούθως, οι φωτογραφίες μεταφέρονται σε ηλεκτρονικό υπολογιστή και αναλύονται με το πρόγραμμα Scion Image (Scion Corporation). Το λογισμικό είναι ρυθμισμένο κατάλληλα ώστε για κάθε ζώνη που περιγράφεται, να καταγράφεται αυτόματα σε ένα λογιστικό φύλλο η επιφάνεια της ζώνης και η μέση έντασή της. Το γινόμενο των δύο αυτών παραμέτρων είναι ανάλογο της ποσότητας της πρωτεΐνης που αντιστοιχεί σε κάθε ζώνη και χρησιμοποιείται περαιτέρω για τις ποσοτικές αναλύσεις. Μ.13 Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων Τα αποτελέσματα εξήχθησαν από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα μεταξύ τους πειράματα. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με τη χρήση του unpaired t-test ή του test ANOVA. Οι συγκρίσεις (μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα) έγιναν μεταξύ της κάθε πειραματικής ομάδας και του αντίστοιχου μάρτυρα. Επιπλέον, σε ορισμένες περιπτώσεις, μελετήθηκε η μεταβολή σε σχέση με συγκεκριμένη πειραματική ομάδα. Μ.14 Απομόνωση κυττάρων HUVEC από φλέβα ομφάλιου λώρου ανθρώπου (Pipili-Synetos et al., 1998) Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν ενδοθηλιακά κύτταρα τα οποία απομονώνονταν από φλέβα ομφάλιου λώρου ανθρώπου. Οι ομφάλιοι λώροι προμηθεύονταν από ιδιωτική κλινική της Πάτρας και προέρχονταν από καισαρικές επεμβάσεις, oι οποίες πραγματοποιούνταν 1-5 ώρες πριν από την έναρξη της απομόνωσης των ενδοθηλιακών κυττάρων. Μετά το τέλος της καισαρικής, κάθε ομφάλιος λώρος εμβαπτίζεται σε αποστειρωμένο ισοτονικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS 1Χ) και μεταφέρεται στον εργαστηριακό χώρο όπου και πραγματοποιείται η απομόνωση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Η πειραματική διαδικασία που ακολουθείται είναι η εξής :

88 1. Αραίωση της κολλαγενάσης με θρεπτικό μέσο μέχρι τελικής συγκέντρωσης 1%. Η αραίωση γίνεται πάντα σε θρεπτικό µέσο ή σε άλλο διάλυµα το οποίο περιέχει Ca 2+, τα οποία είναι απαραίτητα για τη δράση του ενζύµου. Το θρεπτικό µέσο που χρησιµοποιείται δεν πρέπει να περιέχει ορό, ο οποίος περιέχει αναστολείς διαφόρων ενζύµων. 2. Ο οµφάλιος λώρος έχει δύο αρτηρίες και µία φλέβα, η οποία είναι µεγαλύτερη, πιο εύκολα διακριτή και µε µαλακότερα τοιχώµατα. Σταθεροποιούµε µε αιµοστάτες τον οµφάλιο λώρο µε τέτοιο τρόπο, ώστε να είναι εύκολη η πρόσβαση στη φλέβα. 3. Ξεπλένεται η φλέβα µε PBS, ώστε να αποµακρυνθούν υπολείµµατα αίµατος και θρόµβοι. Στο σηµείο αυτό παρατηρείται εάν η φλέβα του οµφάλιου λώρου είναι ακέραια. Τυχόν αλλοιώσεις του τοιχώµατος της φλέβας καθιστούν αδύνατη την αποµόνωση κυττάρων. 4. Ερμητικό κλείσιμο με τη βοήθεια αιµοστάτη του ενός άκρου του οµφάλιου λώρου. 5. Διοχέτευση του θρεπτικού μέσου µέσο µε την κολλαγενάση από την άλλη είσοδο της φλέβας του οµφάλιου λώρου, χρησιµοποιώντας σύριγγα των 20 ml. Η φλέβα αρχίζει να διογκώνεται λόγω του εισερχοµένου διαλύµατος. 6. Ερμητικό κλείσιμο, µε τη βοήθεια αιμοστάτη αιµοστάτη, και του δεύτερου άκρου του οµφάλιου λώρου. Σε αυτό το στάδιο, αυτός είναι κλεισµένος και από τα δύο άκρα ενώ στο εσωτερικό της φλέβας βρίσκεται το διάλυµα της κολλαγενάσης. 7. O οµφάλιος λώρος τοποθετείται σε αποστειρωµένο δοχείο και επωάζεται σε υδατόλουτρο για λεπτά στους 37 o C. 8. Μετά τη συµπλήρωση της επώασης αφαιρείται ο αιµοστάτης από τη µια πλευρά του οµφάλιου λώρου. 9. Συλλογή του υπερκειµένου (θρεπτικό µέσο µε κολλαγενάση, HUVEC) σε αποστειρωµένο σωλήνα των 50 ml. 10.Αφαίρεση του αιµοστάτη και από το άλλο άκρο του οµφάλιου λώρου. 11.Έκπλυση της φλέβας µε PBS συλλέγοντας το έκλουµα στον ίδιο σωλήνα όπου βρίσκεται το θρεπτικό µέσο µε τα κύτταρα. 12.Φυγοκέντρηση των κυττάρων σε θερµοκρασία δωµατίου, στα 500 g για 4 λεπτά. 13.Απόρριψη του υπερκειµένου και επαναιώρηση των κυττάρων σε 10 ml πλήρους θρεπτικού µέσου. 14.Μεταφορά του θρεπτικού µέσου µε τα κύτταρα σε τρυβλίο κατάλληλο για την καλλιέργεια κυττάρων.

89 15.Επώαση των κυττάρων σε ολική υγρασία, στους 37 ο C και σε ατµόσφαιρα 5% CO 2 για µία ηµέρα. 16.Την επόµενη ηµέρα αφαιρείται µε πιπέτα Pasteur υπό κενό το θρεπτικό µέσο, στο οποίο περιέχονται και τα ερυθρά αιµοσφαίρια που δεν έχουν προσκολληθεί στο δάπεδο του τρυβλίου. 17.Έκπλυση των κυττάρων που έχουν προσκοληθεί στον πυθμένα του τρυβλίου δύο φορές µε PBS. 18.Προσθήκη 10 ml πλήρους θρεπτικού µέσου και παρατήρηση στο µικροσκόπιο. Εάν η αποµόνωση των κυττάρων είναι επιτυχής, διακρίνονται ομάδες κυττάρων τα οποία είναι προσκολληµένα στο δάπεδο του τρυβλίου και τα οποία αναπτύσσονται γύρω από νοητές εστίες. 19.Επώαση των κυττάρων, ανανεώνοντας το θρεπτικό µέσο κάθε 3-4 ηµέρες, µέχρι να φτάσουν σε έναν βαθµό 80-90% πλήρους κάλυψης του πυθµένα του τρυβλίου. Υλικά και διαλύματα PBS (10X) ph : NaHPO 4 KH 2 PO 4 NaCl 100mM 40 mm 40mM Το διάλυµα διατηρείται στους 4 0 C και αραιώνεται 10 φορές πριν από τη χρήση του, οπότε και επαναρυθμίζεται το ph του. Διάλυµα κολλαγενάσης 1 % 100 mg κολλαγενάσης τύπου 1Α σε 10 ml Μ199* Θρεπτικό µέσο Μ199* για τα κύτταρα HUVEC: M ml

90 Πενικιλλίνη-στρεπτοµυκίνη Γενταμυκίνη Αμφοτερικίνη Ν-ακετυλ- L αλάνυλ-l-γλουταµίνη 100 ΙU/ml 50 μg/ml 2,5μg/ml 2mM Πλήρες θρεπτικό µέσο για τα κύτταρα HUVEC M199* 85ml Ορός βοός (fetal bovine serum, FBS) 15ml Endothelial cell growth supplement (ECGS) 15mgr Hπαρίνη 5U/ml To εκχύλισµα ECGS είναι εµπλουτισµένο σε αυξητικό παράγοντα των ινοβλαστών (FGF) και είναι απαραίτητο για την ικανοποιητική ανάπτυξη των HUVEC. Η ηπαρίνη χρησιµοποιείται προκειµένου να ενεργοποιηθεί ο ECGS. Το θρεπτικό µέσο αποστειρώνεται µε διοχέτευσή του µε σύριγγα των 20 ml µέσα από φίλτρο µε πόρους που έχουν διάµετρο 0,2 µm και φυλάσσεται στους 4 ο C. Μ.15 Ανακαλλιέργεια κυττάρων HUVEC Το πειραματικό πρωτόκολλο που ακολουθείται για την ανακαλλιέργεια των κυττάρων HUVEC είναι όμοιο με αυτό που ακολουθείται για τα κύτταρα Μ059Κ με ορισμένες τροποποιήσεις : 1. Για την καλλιέργεια των κυτταρων HUVEC απαιτείται να έχει προηγηθεί επίστρωση των τρυβλίων με διάλυμα ζελατίνης 1% κ.β. 2. Το θρεπετικό μέσο που χρησιμοποιείται είναι πλήρες Μ199.

91 Υλικά και διαλύματα Διάλυμα ζελατίνης 1% κ.β. σε PBS Τρυψίνη EDTA Θρεπτικό μέσο Μ199* Πλήρες θρεπτικό μέσο Αιματοκυτταρόμετρο M.16 Κατάψυξη και απόψυξη κυττάρων HUVEC Η διαδικασία κατάψυξης των κυττάρων HUVEC είναι όμοια με αυτή για τα κύτταρα Μ059Κ (Βλέπε Μ.3 και Μ.4) με ορισμένες τροποποίησεις : 1. Στο cryovial προστίθενται 100 µl DMSO. 2. Το ίζημα των κυττάρων επαναιωρείται σε 900μl ορού. 3. Στο cryovial αναγράφεται επιπλέον η γενιά που θα είναι τα κύτταρα όταν θα ξεπαγώσουν. 4. Χρησιμοποιείται πλήρες θρεπτικό μέσο για HUVEC Υλικά και Διαλύματα DMSO (dimethylsulfoxide, διμέθυλο-σουλφοξύδιο). Μ199*. Πλήρες θρεπτικό μέσο Μ199. Ορός νεογέννητου βοός (fetal calf serum, FCS). Ειδικά φιαλίδια για την ψύξη των κυττάρων (cryovials). Ειδικό δοχείο ψύξης κυττάρων µε ισοπροπανόλη. Δοχείο ψύξης κυττάρων (υγρό άζωτο) το οποίο περιέχει ισοπροπανόλη και επιτρέπει την ήπια αρχική ψύξη των κυττάρων.

92 M.17 Έλεγχος της επιδρασης ουσιών στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HUVEC 1. Σε πλακίδιο που έχει 24 μικροκυψελίδες μεταφέρονται ανα μικροκυψελίδα κύτταρα σε τελικό όγκο 0,5 ml πλήρους θρεπτικού μέσου. Πρίν την προσθήκη των κυττάρων στο πλακίδιο, προγείται επίστρωση των πυθμένων των μικροκυψελίδων με ζελατίνη. 2. Τα κύτταρα επωάζονται για 24 ώρες ώστε να προσκολληθούν στον πυθμένα του πλακιδίου στους 37 0 C σε ατμόσφαιρα 5% CO To θρεπτικό μέσο των κυττάρων απομακρύνεται υπο κενό και αντικαθίσταται από θρεπτικό μέσο Μ199* που περιέχει 5% ορό.τα κύτταρα επωάζονται για 24 ώρες. 4. Το θρεπτικό μέσο των κυττάρων απομακρύνεται υπο κενό και αντικαθίσταται εκ νέου με θρεπτικό μέσο που περιέχει 5% ορό, στο οποίο προστίθενται οι υπο εξέταση ουσίες στις επιθυμητές συγκεντρώσεις. 5. Μετά απο 48 ώρες, προστίθεται 1/10 του όγκου του θρεπτικού μέσου (50μl) από το διάλυμα MTT 10X ανα μικροκυψελίδα. 6. Επώαση για 2 ώρες στους 37 0 C σε ατμόσφαιρα 5% CO 2 και απομάκρυνση του θρεπτικού μέσου των κυψελίδων υπο κενό. 7. Ξέπλυμα των κυττάρων 2 φορές με PBS και προσθήκη 100μl οξινισμένης ισοπροπανόλης ανα μικροκυψελίδα. Ηπια ανακίνηση ώστε να διαλυθούν οι κρύσταλλοι φορμαζάνης. 8. Μεταφορά των εκχυλισμάτων σε πλακίδιοα ELISA 96 μικροκυψελίδων και φωτομέτρηση στα 550 nm χρησιμοποιώντας φωτόμετρο ELISA. Από τις απορροφήσεις υπολογίζεται ο αριθμός των κυττάρων βάση της πρότυπης καμπύλης που έχει κατασκευαστεί. Υλικά και Διαλύματα Πλακίδια 48 μικροκυψελίδων κατάλληλα για κυτταροκαλλιέργειες (Greiner). Αιματοκυτταρόμετρο. PBS. Πλήρες θρεπτικό μέσο για κύτταρα HUVEC. Θρεπτικό μέσο M199*. SP (Biosource) σε συγκέντρωση 1μΜ

93 SB202190(Biosource) σε συγκέντρωση 10μΜ Διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου 30% κ.β. Διάλυμα MTT 10X : 5mg MTT (Sigma) ανα ml PBS. Διάλυμα οξινισμένης ισοπροπανόλης 0,33% κ.ο. Φωτόμετρο ELISA (Biorad). M.18 Επίδραση ουσιών και απομόνωση της HARP από το θρεπτικό μέσο κύτταρων HUVEC Ο έλεγχος της επίδρασης ουσιών στα HUVEC είναι όμοιος με αυτόν των κυττάρων Μ059Κ (Βλέπε Μ.6) με ορισμένες διαφορές. A. Στα πειράματα μελέτης της επίδρασης του ορού στην έκκριση της PTN οι διαφορές έγκεινται στο ότι : 1. Το θρεπτικό μέσο που χρησιμοποιείται είναι πλήρες Μ199 και Μ199* με 15%, 10%, 5%, 2% και 0% ορό. 2. Τα κύτταρα επωάζονται με τις ουσίες για 24 ώρες. 3. Για την ανάλυση των πρωτεινών σε SDS-PAGE και ταυτοποίηση της PTN κατά Western χρησιμοποιούνται 50μl από κάθε δείγμα. B. Στα πειράματα μελέτης της επίδρασης των αναστολέων των MAP κινασών, SB, SP και ODQ και του δότη μονοξειδίου του αζώτου, νιτροπρωσικό νάτριο (SNP έχει ακολουθηθεί παρόμοιο πειραματικό πειραματικό πρωτόκολλο με το παραπάνω, με τις διαφορές : 1. Πριν την επίδραση ουσιών προηγείται ένα στάδιο κατά το οποίο το πλήρες θρεπτικό μέσο απομακρύνεται υπο κενό και αντικαθίσταται από 5 ml Μ199* με 2% ορό. Ο λόγος της επώασης των κυττάρων σε συνθήκες «πείνας», δηλαδή σε θρεπτικό μέσο με μειωμένη περιεκτικότητα ορού ή χωρίς καθόλου ορό, γίνεται για να μειωθεί η συγκέντρωση των αυξητικών παραγόντων που υπάρχουν σε αυτόν, ώστε να μπορέσουν τα κύτταρα να ανταποκριθούν καλύτερα στις ουσίες με τις οποίες θα επωασθούν. Η επώαση στο νέο θρεπτικό μέσο (starvation) διαρκεί 16 ώρες σε θερμοκρασία 37 ο C και ατμόσφαιρα περιεκτικότητας 5% σε CO Οι ουσίες προστίθενται σε Μ199* με 1% ορό.

94 Υλικά και διαλύματα PBS. Πλήρες θρεπτικό μέσο για κύτταρα HUVEC. Θρεπτικό μέσο Μ199*. Ορός. SP (Biosource) SB202190(Biosource) ODQ Sodium nitroprusside (Sigma) Διάλυμα Α: 20mM HEPES ph 7,4 2M NaCl 1m M PMSF 5m M EDTA 1μg/ml απροτινίνη Διάλυμα Β : 20mM HEPES ph 7,4 0,5M NaCl Διάλυμα Γ : 20mM HEPES ph 7,4 Σφαιρίδια ηπαρίνης-σεφαρόζης : Heparin Sepharose beads (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) Ρυθμιστικό διάλυμα δειγμάτων 2Χ (loading buffer) 4 Μ ουρία 0,03 Μ SDS 0,05 Μ Tris-base 10% κ.ο. γλυκερόλη 2% κ.β. μπλε της βρωμοφαινόλης 10% κ.ο. β-μερκαπτοαιθανόλη.

95 M.19 Παροδική επιμόλυνση των κυττάρων HUVEC (transient transfection) με αντινοηματική αλληλουχία για την ενδοθηλιακή συνθάση του μονοξειδίου του αζώτου (enos) Χρησιμοποιούνται μονόκλωνα ολιγοδεόξυ-νουκλεοτίδια που φέρουν στα δύο άκρα τους νουκλεοτίδια δεσμευμένα με φωσφοριθειικούς εστέρες. Η τροποποίηση αυτή παρέχει σταθερότητα, παρεμποδίζοντας την πέψη των ολιγοδεοξυ-νουκλεοτιδίων από ενδονουκλεάσες στο εσωτερικό των κυττάρων. Οι αλληλουχίες των νοηματικών και αντινοηματικών κλώνων για την ενδοθηλιακή συνθάση του μονοξειδίου του αζώτου (enos) παρατίθενται στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας Μ.3) : Πίνακας M.3 : Αλληλουχία των ολιγοδεόξυ-νουκλεοτιδίων. Αλυσίδα Αλληλουχία sense 5 -ATG GGC AAC TTG AAG-3 antisense 5 -CTT CAA GTT GCC CAT- 3 Για την παροδική επιμόλυνση των κυττάρων HUVEC με την νοηματική και την αντινοηματική αλληλουχία, χρησιμοποιήθηκε το κατιονικό πολυμερές πολυαιθυλενιμίνη ειδικά για το συγκεκριμένο είδος κυττάρων, jet PEI TM -HUVEC (Polyplus Transfection, Qbiogene, France). Επίσης για κάθε πείραμα χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα αγρίου τύπου (wild type). Η πειραματική πορεία που ακολουθεί αναφέρεται για εφαρμογή σε καλλιέργειες κυττάρων HUVEC σε τρυβλίο διαμέτρου 60 mm. Για τα κύτταρα άγριου τύπου ακουλουθούνται ακριβώς οι ίδιες διαδικασίες αλλά παραλείπεται το στάδιο της διαμόλυνσης με το σύμπλοκο πολυμερούς-ολιγοδεόξυνουκλεοτιδίου : 1. Γίνεται επίστρωση κυττάρων P1. Τα κύτταρα καλλιεργούνται σε 5 ml πλήρoυς θρεπτικού μέσου M199 για 16 ώρες. 2. Σε σωληνάριο μικροφυγοκέντρου προστίθενται 2 μg νοηματική αλληλουχίας σε NaCl 150 mm μέχρι τελικού όγκου 250 μl. Παράλληλα, σε ένα δεύτερο σωληνάριο μεταφέρονται και 6 μg αντινοηματικής αλληλουχίας σε NaCl 150 mm πάλι μέχρι τελικού όγκου 250 μl. Σε τρίτο σωληνάριο μεταφέρονται 4λ του πολυμερούς σε NaCl 150 mm μέχρι τελικού όγκου 250 μl (για την νοηματική αλληλουχία). Τέλος σε τέταρτο σωληνάριο μεταφέρονται 12λ του πολυμερούς σε NaCl 150 mm μέχρι τελικού όγκου 250 μl (για την αντινοηματική αλληλουχία). Έπεται ανάδευση και ήπια φυγοκέντρηση. Το διάλυμα του πολυμερούς μεταβιβάζεται στο αντίστοιχο

96 διάλυμα των ολιγοδεόξυνουκλεοτιδίων. Έπεται ανάδευση, ήπια φυγοκέντρηση και επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. 3. Το θρεπτικό μέσο των κυττάρων απομακρύνεται υπό κενό και προστίθενται 3 ml θρεπτικού μέσου Μ199 με 2% ορό. Το διάλυμα του συμπλόκου (500 μl) μεταφέρεται στάγδην στα κύτταρα και ακολουθεί επώαση στον κλίβανο των κυττάρων για 2 ώρες. 4. Προστίθενται 2 ml θρεπτικού μέσου Μ199 με 5% ορό και τα κύτταρα επωάζονται στον κλίβανο για άλλες 2 ώρες. 5. Το θρεπτικό μέσο των κυττάρων ανανεώνεται από νέο θρεπτικό μέσο Μ199 χωρίς ορό που περιέχει 0,25% BSA (Bovine Serum Albumine). Επώαση για 18 ώρες. 6. Ανανέωση του θρεπτικού μέσου των κυττάρων, προσθήκη των υπό εξέταση ουσιών και επώαση στον κλίβανο των κυττάρων για επιθυμητό χρονικό διάστημα. 7. Απομάκρυνση του θρεπτικού μέσου των κυττάρων και πλύσιμο (2 φορές) με PBS (δεν πρέπει να περιέχει Ca +2 και Mg +2 ). Προσθήκη 150 μl/τρυβλίο ρυθμιστικού διαλύματος δειγμάτων που περιέχει 10% διθειθρειτόλη (DTT) και αποκόλληση των κυτάρων με ειδική ελαστική ξύστρα (cell scraper). 8. Ακολουθεί βράσιμο των δειγμάτων για 10 λεπτά και φύλαξη τους στους C. 9. Χρησιμοποιούνται 20μl, 40μl και 80μl από το κάθε δείγμα προκειμένου να ελεγχθούν αντίστοιχαμε με ανάλυση κατά Western οι enos, perk1/2 και pp38. Μ.20 Απομόνωση RNA από κύτταρα Μ059Κ σε καλλιέργεια Για την απομόνωση RNA έχει αναπτυχθεί μια πληθώρα από διαφορετικές τεχνικές. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε ολοκληρωμένο σύστημα (kit) απομόνωσης RNA της Macherey-Nagel (NucleoSpin RNA II ), με οποίο η απομόνωση του RNA πραγματοποιείται εύκολα και σε σύντομο χρονικό διάστημα, με προσρόφηση των νουκλεικών οξέων σε ειδικές χρωματογραφικές στήλες. Το σύστημα αυτό επιτρέπει επίσης την απομόνωση του RNA σε θερμοκρασία δωματίου, γεγονός που καθιστά τη διαδικασία πιο γρήγορη. Λόγω της ιδιαίτερης ευαισθησίας του RNA σε νουκλεάσες που μπορούν να το πέψουν, οι κινήσεις πρέπει να είναι ιδιαίτερα προσεκτικές και τα διαλύματα και τα υλικά που χρησιμοποιούνται σε όλα τα στάδια της απομόνωσης και χειρισμού του δείγματος γενικότερα, πρέπει να είναι αποστειρωμένα και απαλλαγμένα από RNAάσες. Η πορεία που ακολουθείται είναι η εξής : 1. Αφαίρεση του θρεπτικού υλικού των κυττάρων υπό κενό. 2. Έκπλυση των κυττάρων 2 φορές με PBS.

97 3. Προσθήκη διαλύματος τρυψίνης. Ο όγκος του διαλύματος τρυψίνης που προστίθεται εξαρτάται από τη συνολική επιφάνεια του τρυβλίου ή της μικροκυψελίδας στο οποίο περιέχονται τα κύτταρα τα οποία επιθυμούμε να συλλέξουμε. 4. Επώαση των κυττάρων με το διάλυμα τρυψίνης στους 37 0 C για περίπου 1 λεπτό. 5. Αναστολή της δράσης της τρυψίνης με ίσο όγκο θρεπτικού μέσου καλλιέργειας των κυττάρων το οποίο περιέχει ορό. 6. Μεταφορά των κυττάρων σε σωληνάριο eppendorf του 1,5 ml ή σωληνάριο των 15 ml (εξαρτάται από τον όγκο της τρυψίνης που απαιτείται για την αποκόλληση των κυττάρων από το στερεό τους υπόστρωμα και επομένως από το συνολικό όγκο στον οποίο έχουν συλλεχθεί τα κύτταρα). 7. Συλλογή των κυττάρων με φυγοκέντρηση (6.000 g, 30 δευτερόλεπτα). 8. Απόρριψη του υπερκειμένου θρεπτικού μέσου και ταχεία ψύξη των κυττάρων (ίζημα) με την εμβάπτισή τους άμεσα σε υγρό άζωτο. 9. Διατήρηση του ιζήματος των κυττάρων στους 80 0 C μέχρι να χρησιμοποιηθεί. 10. Λύση των κυττάρων με 350 μl διαλύματος λύσης το οποίο περιέχει β- μερκαπτοαιθανόλη και ομογενοποίηση του δείγματος με έντονη ανάδευση. 11. Μεταφορά του ομογενοποιήματος των κυττάρων σε στήλη με φίλτρο και συλλογή του διαλύματος των νουκλεϊκών οξέων με φυγοκέντρηση ( g, 1 λεπτό). 12. Απόρριψη της στήλης και προσθήκη 350 μl αιθανόλης (70% ό/ό) στο διάλυμα που έχει συλλεχθεί. Ανάμιξη με ήπια ανάδευση. 13. Μεταφορά του διαλύματος (~700 μl) σε νέα στήλη και φυγοκέντρηση (8.000 g, 30 δευτερόλεπτα). Σε αυτό το στάδιο τα νουκλεϊκά οξέα προσροφούνται στη στήλη και οι πρωτεϊνες διέρχονται από τη στήλη και συλλέγονται σε σωληνάριο eppendorf. 14. Αφαλάτωση της στήλης-φίλτρου στο οποίο περιέχονται τα νουκλεϊκά οξέα με τη προσθήκη 350 μl διαλύματος αφαλάτωσης (membrane desαlting solution) και φυγοκέντρηση ( g, 1 λεπτό). 15. Προσθήκη στην επιφάνεια του φίλτρου διαλύματος DNάσης και επώαση του φίλτρου σε αυτό το διάλυμα για 15 λεπτά. 16. Αναστολή της DNάσης με την προσθήκη 200 μl διαλύματος αναστολής της στην επιφάνεια του φίλτρου. 17. Φυγοκέντρηση (8.000 g, 30 δευτερόλεπτα) και μεταφορά του φίλτρου σε νέο σωληνάριο eppendorf. 18. Προσθήκη 600 μl διαλύματος έκλουσης του DNA (RA3). 19. Φυγοκέντρηση (8.000 g, 30 δυετερόλεπτα), απόρριψη του εκλούματος και προσθήκη στην επιφάνεια του φίλτρου εκ νέου 350 μl από διάλυμα έκλουσης του DNA. 20. Φυγοκέντρηση (8.000 g, 30 δευτερόλεπτα) και μεταφορά του φίλτρου σε νέο σωληνάριο eppendorf.

98 21. Έκλουση του RNA με προσθήκη 60 μl H 2 O το οποίο είναι απαλλαγμένο από RNAάσες στην επιφάνεια του φίλτρου και φυγοκέντρηση ( g, 1 λεπτό). 22. Διατήρηση του RNA στους 80 Ο C μέχρι να χρησιμοποιηθεί. Στο διάλυμα του ολικού RNA, πραγματοποιείται προσδιορισμός της συγκέντρωσης με φασματοφωτομετρική μέθοδο. Επίσης, προκειμένου να ελεγχθεί η ποιότητα του, πραγματοποιείται ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1% κ.β. (Βλέπε επόμενη παράγραφο). Μ.21 Προσδιορισμός της συγκέντρωσης RNA και DNA (Chirguinet al., 1979) 1. Σε αποστειρωμένο σωληνάριο eppendorf, τοποθετείται 1 ml αποστειρωμένο νερό και 4 μl από το διάλυμα του νουκλεινικού οξέως. 2. Το διάλυμα μεταφέρεται σε κυψελίδα φωτομέτρου κατασκευασμένη από χαλαζία. Σε δεύτερη κυψελίδα τοποθετείται 1 ml αποστειρωμένου νερού, που χρησιμοποιείται ως τυφλό για το μηδενισμό του φωτομέτρου, κάθε φορά πρίν τη φωτομέτρηση του δείγματος. Το δείγμα φωτομετρείται σε δύο διαφορετικά μήκη κύματος, στα 260 nm που απορροφούν τα νουκλεινικά οξέα και στα 280 nm που απορροφούν οι πρωτείνες. 3. Η συγκέντρωση RNA υπολογίζεται από τον τύπο : Συγκέντρωση RNA = O.A 260 nm x 40 x αραίωση 4. Η συγκέντρωση DNA υπολογίζεται από τον τύπο : Συγκέντρωση RNA = O.A 260 nm x 50 x αραίωση Η συγκέντρωση δίνεται σε ng/μl. O συντελεστής 40 για το RNA εξάγεται από την παρατήρηση ότι ένα διάλυμα RNA, συγκέντρωσης 40ng/μl έχει απορρόφηση 1 στα 260 nm. Αντίστοιχα προκύπτει και ο συντελεστής 50 για το DNA. O λόγος της οπτικής απορρόφησης στα 260 nm ως προς την οπτοκή απορρόφηση στα 280 nm αποτελεί δείκτη καθαρότητας του δείγματος. Αν ο λόγος αυτός είναι μικρότερος του 1,8, τότε

99 η περιεκτικότητα του δείγματος σε πρωτείνες είναι υψηλή και μπορεί να προκαλέσει προβλήματα στις περαιτέρω αναλύσεις. Μ.22 Ηλεκτροφόρηση νουκλεϊκών οξέων σε πήκτωμα αγαρόζης (Sellner et al., 1992; Brooke et al., 1995) Η ηλεκτροφόρηση σε πηκτώματα αγαρόζης είναι η κύρια μέθοδος που χρησιμοποιείται για την ανάλυση των νουκλεϊκών οξέων. Για να αποφευχθεί η δημιουργία δομών κατά την ηλεκτροφόρηση του RNA χρησιμοποιούνται αποδιατακτικά πηκτώματα τα οποία περιέχουν ως αποδιατακτικό παράγοντα φορμαλδεΰδη, ενώ και τα δείγματα περιέχουν φορμαμίδιο και απόδιατάσσονται με θέρμανση πριν από την ηλεκτροφόρηση. Ωστόσο, αν δεν μας ενδιαφέρει το ακριβές μέγεθος των μορίων RNA αλλά θέλουμε να ελέγξουμε την ποιότητα του τότε η ηλεκτροφόρηση μπορεί να γίνει σε ουδέτερα πηκτώματα αγαρόζης, σαν αυτά που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση δίκλωνων μορίων DNA. Στα πηκτώματα αγαρόζης, η ηλεκτροφορητική κινητικότητα γραμμικών μορίων έχει βρεθεί ότι είναι αντιστρόφως ανάλογη του λογαρίθμου του μοριακού τους βάρους. Η ηλεκτροφορητική κινητικότητα εξαρτάται επίσης και από τη συγκέντρωση της αγαρόζης στο πήκτωμα. Στον παρακάτω πίνακα φαίνονται τα μεγέθη τμημάτων DNA που είναι δυνατόν να αναλυθούν σε πηκτώματα διαφορετικού ποσοστού αγαρόζης. Πίνακας Μ.4 Οι συγκεντρώσεις αγαρόζης που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση δίκλωνων μορίων DNA διαφόρων μεγεθών. Ποσοστό αγαρόζης (%) Μέγεθος μορίων DNA (Κbp)

100 Η πειραματική πορεία που ακολουθήθηκε είναι η εξής : 1. Διαμορφώνεται κατάλληλη μήτρα διαστάσεων 13 Χ 11,5 cm. 2. Προσθήκη της κατάλληλης ποσότητας αγαρόζης σε 30 ml διαλύματος ηλεκτροφόρησης 0,5Χ ΤΒΕ. 3. Διάλυση της αγαρόζης με θέρμανση του διαλύματος σε φούρνο μικροκυμάτων (στο 50% της μέγιστης έντασης) για περίπου 2 λεπτά. 4. Ψύξη του διαλύματος αγαρόζης αργά σε θερμοκρασία C και προσθήκη σε αυτό 3 μl διαλύματος βρωμιούχου αιθιδίου από αρχικό διάλυμα συγκέντρωσης 10 mg/ml. 5. Στερεοποίηση του διαλύματος στη μήτρα. 6. Προσθήκη στα δείγματα του RNA διαλύματος δειγμάτων 6Χ σε αναλογία 1 : Προσθήκη των δειγμάτων στα κατάλληλα διαμορφωμένα φρεάτια της μήτρας. Ανάλυση των δειγμάτων σε οριζόντια συσκευή ηλεκτροφόρησης υπό σταθερή τάση ρεύματος 60 V. 5Χ ΤΒΕ Υλικά και Διαλύματα Tris-borate EDTA ph mm 5 mm Το διάλυμα διατηρειται σε θερμοκρασία δωματίου και χρησιμοποιείται σε συγκέντρωση 0,5Χ. Βρωμιούχο αιθίδιο 10 mg /ml Το διάλυμα φυλάσσεται στους 4 0 C στο σκοτάδι και ο χειρισμός του γίνεται με προσοχή γιατί είναι ισχυρό μεταλλαξιγόνο. 6Χ διάλυμα δειγμάτων Φυκόλη 20% Κυανούν της βρωμοφαινόλης 0,30% Κυανούν του ξυλενίου 0,30%

101 Μ.23 Ανάλυση της έκφρασης γονιδίων με τη χρήση συνδυασμένης αντίστροφης μεταγραφής και αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (RT-PCR) Για τη μελέτη της γονιδιακής έκφρασης έχει αναπτυχθεί μία πλειάδα τεχνικών, όπως είναι η ανάλυση κατά Southern, η in situ υβριδοποίηση, οι δοκιμές προστασίας από RNAάση (RNase protection assays) και η χρήση συνδυασμένης αντίστροφης μεταγραφής και αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (RT-PCR). Η RT-PCR αποτελεί την μέθοδο εκλογής σε πολλές περιπτώσεις σήμερα, καθώς: α) παρουσιάζει υψηλή ευαισθησία, β) είναι αρκετά απλή και γρήγορη στην εφαρμογή της και γ) σε αντίθεση με άλλες τεχνικές δεν απαιτεί την χρήση ραδιοϊσοτόπων για την εφαρμογή της. Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στη χρησιμοποίηση ειδικών εναρκτήριων αλληλουχιών για το γονίδιο του οποίου θέλουμε να μελετήσουμε την έκφραση, ώστε από το mrna του να δημιουργηθεί το συμπληρωματικό του DNA (cdna) με τη βοήθεια κατάλληλων ενζύμων. Το τμήμα του δίκλωνου DNA που δημιουργείται ενισχύεται στην συνέχεια με την τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης και αναλύεται κατάλληλα. Στην εργασία αυτή για την ανάλυση της έκφρασης των γονιδίων με την τεχνική RT-PCR χρησιμοποιήθηκε το ολοκληρωμένο σύστημα αντιδραστηρίων (kit) Access RT-PCR system της εταιρίας PROMEGA (# Α1280). Ακολουθήθηκε η κάτωθι πειραματική πορεία : ng ολικού RNA χρησιμοποιούνται για την πραγματοποίηση κάθε αντίδρασης RT- PCR. Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιούνται σε τελικό όγκο 25 μl. 2. Σε σωληνάριο κατάλληλο για την πραγματοποίηση αντιδράσεων PCR αναμειγνύονται τα αντιδραστήρια με τη σειρά και τις ποσότητες που αναγράφονται στον πίνακα Μ Οι αντιδράσεις τοποθετούνται σε μηχάνημα εκτέλεσης αντιδράσεων PCR (PCR cycler). Στον πίνακα Μ.6 παρουσιάζονται οι συνθήκες που χρησιμοποιήθηκαν στις αντιδράσεις RT- PCR. Οι εναρκτήριες αλληλουχίες που χρησιμοποιήθηκαν φαίνονται στον πίνακα Μ.7. Πίνακας Μ.5. Οι ποσότητες των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται για την πραγματοποίηση των αντιδράσεων RT-PCR. Όγκος Τελική συγκέντρωση Rnase free H 2 O μέχρι τελικού όγκου 25 μl Χ μl Ρυθμιστικό διάλυμα AMV/ Tfl 5X 5 μl 1Χ

102 Διάλυμα νουκλεοτιδίων (10 mm έκαστο) 0,5 μl 0,2 mm Νοηματική (sence) εναρκτήρια αλληλουχία 25 pmol 1 μμ Aντινοηματική (antisence) εναρκτήρια αλληλουχία 25 pmol 1 μμ 25 mm MgSO4 1 μl 1 mm AMV αντίστροφη μεταγραφάση (5u/μl) 0,5 μl 0,1 u/μl Tfl πολυμεράση (5u/μl) 0,5 μl 0,1 u/μl 250 ng RNA Υ μl Τελικός όγκος 25 μl Πίνακας Μ.6. Πρότυπο των συνθηκών που χρησιμοποιήθηκαν στις αντιδράσεις RT-PCR που πραγματοποιήθηκαν στην εργασία αυτή. hηαrp β-ακτίνη 1 κύκλος Αντίστροφη μεταγραφή 48 0 C (45 min) 48 0 C (45 min) 1 κύκλος Απενεργοποίηση της AMV αντίστροφης μεταγραφάσης αποδιάταξη cdna και εναρκτήριων αλληλουχιών 94 0 C (5 min) 94 0 C (2 min) 35 κύκλοι 1 κύκλος 1 κύκλος Σύνθεση 2 ης Αποδιάταξη 94 0 C (1min) 94 0 C (1 min) αλυσίδας cdna και Επανασύνδεση 55 0 C (1 min) 53 0 C (1 min) ενίσχυση του Επιμήκυνση 68 0 C (2 min) 68 0 C (2 min) Τελική επιμήκυνση DNA 68 0 C (10 min) 68 0 C (10 min) 4 0 C 4 0 C

103 Πίνακας Μ.7. Αλληλουχία και χαρακτηριστικά των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν κατά τις αντιδράσεις RT-PCR που πραγματοποιήθηκαν. εκκινητής αλληλουχία %GC T m ( 0 C) hharp (5 ) 5 -AGCGTCGAAAATTTGCAGC-3 47,4 53,1 hharp (3 ) 5 -TTGGTCAGTTTGCCACAGG-3 52,6 60,64 hβ-ακτίνη (5 ) 5 -GCACACTTAGCCGTGTTCTTTGCACTTTCT-3 46,7 65,2 hβ-ακτίνη (3 ) 5 -AGGCGTACAGGGATAGCACAGCCTGGATAG -3 56,7 67,3 Υλικά και Διαλύματα Ρυθμιστικό διάλυμα AMV/ Tfl 5X Διάλυμα νουκλεοτιδίων (10 mm έκαστο) 25 mm MgSO4 Νοηματική (sence) εναρκτήρια αλληλουχία Aντινοηματική (antisence) εναρκτήρια αλληλουχία AMV αντίστροφη μεταγραφάση (5u/μl) Tfl πολυμεράση (5u/μl) Rnase free H 2 O Μ.24 Μικρής κλίμακας απομόνωση πλασμιδιακού DNA (Miniprep) Για την απομόνωση πλασμιδιακού DNA από υγρή καλλιέργεια βακτηρίων Ε.coli μετασχηματισμένων με το επιθυμητό πλασμίδιο, χρησιμοποιήθηκε το ολοκληρωμένο σύστημα Nucleospin Plasmid (Macherey-Nagel, Germany). Η πειραματική πορεία που ακολουθείται είναι η εξής : 1. Από καλλιέργεια όγκου 10ml μεταφέρονται 1,5 ml σε σωληνάριο μικροφυγοκέντρου. Μετά από φυγοκέντρηση για 30 δευτερόλεπτα στα g, απορρίπτεται το υπερκείμενο (x2). 2. Προκειμένου να επιτευχθεί λύση των κυττάρων, προστίθενται 250 μl διαλύματος Α1 και έπεται ανάδευση. Προστίθενται 250 μl διαλύματος Α2 και το σωληνάριο αναστρέφεται 6-8 φορές. Επώαση για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Προστίθενται 300 μl διαλύματος Α3 και το σωληνάριο αναστρέφεται 6-8 φορές.

104 Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 10 δευτερόλεπτα στα g. 3. Το υπερκείμενο φέρεται εντός στήλης Nucleospin Plasmid, η οποία έχει προσαρμοστεί σε σωληνάριο συλλογής 2 ml. Σε αυτό το στάδιο πραγματοποιείται δέσμευση του ΟΝΑ στη μεμβράνη σίλικας της στήλης. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g και το έκλουμα απομακρύνεται. 4. Η μεμβράνη σίλικας της στήλης εκπλένεται με προσθήκη 500 μl διαλύματος AW, που έχει προθερμανθεί στους 50 0 C. Ακολουθεί επώαση για 2 λεπτά, φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g και απόρριψη του εκλούματος. 'Εκπλυση της μεμβράνης με προσθήκη 600 μl διαλύματος Α4 (που περιέχει αιθανόλη), φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g και απόρριψη του εκλούματος. 5. Η μεμβράνη ξηραίνεται με φυγοκέντρηση για 2 λεπτά στα g και η στήλη μεταφέρεται σε καθαρό σωληνάριο μικροφυγοκέντρου 1,5 ml. Προστίθενται 25 μl διαλύματος έκλουσης ΑΕ, που έχει προθερμανθεί στους 70 0 C, ακολουθεί επώαση για 2 λεπτά και φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα g (Χ2). 6. Για τον έλεγχο της καθαρότητας του πλασμιδίου, αφού έχει προηγηθεί φωτομέτρηση για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσής του, ακολουθεί ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 0,8% κ.β. Παράλληλα με το δείγμα ηλεκτροφορούνται 4 μl (1 μg) μαρτύρων μοριακού βάρους που καλύπτουν εύρος τιμών bp. Μ.25 Δημιουργία ελλείματος στην αλληλουχία δέσμευσης του ορού του υποκινητή της Harp Για τη δημιουργία σημειακών μεταλλαγών στις εν δυνάμει αλληλουχίες δέσμευσης του μεταγραφικού παράγοντα ΑΡ-1, χρησιμοποιήθηκε το σύστημα αντιδράσεων QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit της εταιρείας Stratagene. Πρόκειται για μια διαδικασία που περιλαμβάνει 4 στάδια, με απόδοση σε σωστές μεταλλαγές άνω του 80%. Η διαδικασία αναπαρίσταται σχηματικά στην Εικόνα Μ.3.

105 Εικόνα Μ.3: Σχηματική απεικόνιση της πειραματικής διαδικασίας για την εισαγωγή σημειακών μεταλλαγών σε συγκεκριμένες θέσεις του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου. Στάδιο 1 ο : Προετοιμασία του ανασυνδιασμένου πλασμιδίου Πραγματοποιείται κλωνοποίηση της επιθυμητής αλληλουχίας που πρόκειται να μεταλλαγεί, σε πλασμιδιακό φορέα. Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε κλωνοποίηση της ρυθμιστικής αλληλουχίας του γονιδίου της HARP στο πλασμίδιο pgl3 (βλέπε παράγραφο Μ.17). Η ρυθμιστική αλληλουχία του γονιδίου της HARP φέρει αλληλουχία δέσμευσης για τον ορό την οποία θέλουμε να κόψουμε.

106 Στάδιο 2 o : Αντίδραση PCR Στο στάδιο αυτό πραγματοποιείται αντίδραση PCR. Το DNA που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί ως «μήτρα» στην αντίδραση PCR, είναι το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο p GL3 που φέρει τη ρυθμιστική αλληλουχία της HARP. Το πλασμίδιο απαιτείται να έχει πολλαπλασιαστεί σε στελέχη Ε. Coli (dam+), προκειμένου να είναι μεθυλιωμένο. Στην παρούσα εργασία τα πλασμίδια πολλαπλασιάστηκαν στο στέλεχος XL-1 blue (dam+). Επιπλέον, σχεδιάζονται primers. Ο σχεδιασμός των primers πραγματοποιείται με τη βοήθεια κατάλληλου λογισμικού (mutagenesis primers) της εταιρείας Stratagene (το λογισμικό αυτό είναι διαθέσιμο στο διαδίκτυο στην ιστοσελίδα Συνοψίζονται τα κύρια κριτήρια που λαμβάνονται υπόψη κατά το σχεδιασμό των συγκεκριμένων primers: 1. Και στους δύο primers πρέπει να παραληφθεί η επιθυμητή αλληλουχία και να είναι συμπληρωματικοί για την υπόλοιπη αλληλουχία, στις αντιπαράλληλες αλυσίδες του πλασμιδιακού DNA. 2. Οι primers πρέπει να έχουν μήκος βάσεις και Tm 78 ο C. Το επιθυμητό έλλειμα πρέπει να απέχει βάσεις τουλάχιστον από τα δύο άκρα του κάθε primer. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικά ζευγάρια primers, τα οποία παρασκευάστηκαν από την εταιρεία Lab Supplies-H.Tzortzatos &CO, προκειμένου να παραληφθεί η επιθυμητή αλληλουχία. Συγκεκριμένα, το επιθυμητό έλλειμα αφορά την περιοχή -568 έως -558 (πριν από το σημείο έναρξης της μεταγραφής, Εικόνα Μ.4 ).

107 -738 CATTGCCTTAGCGTCTTTCCTGTATTGAATGAAATGACAATTCCAGAGAACGCAA -683 AGCCCAGCCTCCGAAGTTTTACAAACCTCAGAGTTTGAGCTACTTTGACGAATCC -628 TCTAAATTCTTGGGTGTCAAAGGCATGTTACTAAATAGGTTGCTAAAGGCACCAA -573 GGAAACCAAAAAAGGAAAGAGCTCTCCCAAAGGTAAGTAGCACTTAATTGGGAA C -518 TTTGAGACGTCTGTCACTCTTTGTGACAATTGAGAAAAAGTACTTTGTACATTTT -463 GTGCTTTGCAGGTGAGATGTGACTGACACCTTACTGTCTCTGTGTTTAGAGAGGG -408 CTTTCGTGGGTGGAAGAAGAGGCTGGTTTGAAGAGAGTGCTTTTCCATTCTGAAT -353 ATCATTAAAGGATTGTGGGGGGCCAAAAATGTAACCTAAAATGCCCATCAATTGT -298 CCATTTAAAATATCCTATTTGGCAAAGTGGCTTTGCACTCATCTGAAGAATAGAT -243 CATGGGTGGAGTTTGGAAAAGAAATGTTGTGTTTCGTCTCTGCTAAAAACAAAAC -188 AAGGTACCATCTCATGGCCTCTTGGTTCAAATCCGTTTTCTTCGTCCGCAGGGAG -133

108 AGACTGCCCCTGGGGTATTCTGCTTTTAATAAGCTTCCCAATCAGCTCTCGAGTG -78 CAAAGCGCTCTCCCTCCCTCGCCCAGCCTTCGTCCTCCTGGCCCGCTCCTCTCAT Έναρξη μεταγραφής -23 CCCTCCCATTCTCCATTTCCCTTCCGTTCCCTCCCTGTCAGGGCGTAATTGAGTC +32 AAAGGCAGGATCAGGTTCCCCGCCTTCCAGTCCAAAAATCCCGCCAAGAGAGCCC +87 CAGAGCAGAGGAAAATCCAAAGTGGAGAGAGGGGAAGAAAGAGACCAGTGAGT CA +142 TCCGTCCAGAAGGCGGGGAGAGCAGCAGCGGCCCAAGCAGGAGCTGCAGCGAGC C +197 GGGTACCTGGACTCAGCGGTAGCAACCTCGCCCCTTGCAACAAAGGCAGACTGA G +252 CGCCAGAGAGGACGTTTCCAACTCAAA Εικόνα M.4 : Νουκλεοτιδική αλληλουχία της ρυθμιστικής περιοχής του γονιδίου της HARP στον άνθρωπο. Οι αρνητικοί αριθμοί αντιστοιχούν στην ρυθμιστική περιοχή του γονιδίου, ενώ οι θετικοί στο εξώνιο 1. Σημειώνεται η θέση έναρξης της μεταγραφής, ενώ η αλληλουχία CCAAT είναι υπογραμμισμένη. Το στοιχείο απόκρισης στον ορό είναι μέσα σε κύκλο. Παρατίθεται η αγρίου τύπου αλληλουχία, η νοηματική και αντινοηματική αλληλουχία (sense και antisense αντίστοιχα) και τα χαρακτηριστικά των primers που χρησιμοποιήθηκαν.

109 Wild type αλληλουχία (το στοιχείο απόκκρισης στον ορό είναι υπογραμμισμένο): 5 GCT AAA GGC ACC AAG GAA ACCA AAA AAG GAA AGA GCT CTC TCC C-3 Primer, sense αλληλουχία : 5 GCT AAA GGC ACC AAG GAA AAA AGA GCT CTC TCC C-3 T m = 69,6 o C Μήκος : 34 b Primer, antisense αλληλουχία : 5 GGG AGA GAG CTC TTT TTT CCT TGG TGC CTT TAG C-3 T m = 69,6 o C Μήκος : 34 b Η σύνθεση και επέκταση των μεταλλαγμένων πλασμιδίων πραγματοποιείται με αντίδραση PCR. Τα απαραίτητα συστατικά για κάθε αντίδραση, σε κάθε σωληνάριο μικροφυγοκέντρου για την PCR, περιέχονται στον Πίνακα Μ.8. Πίνακας Μ. 8 : Oι ποσότητες των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται για την πραγματοποίηση κάθε αντίδρασης PCR. Όγκος Nuclease-free water 10X Reaction Buffer dntp Μix X μl 5 μl 1 μl

110 primer (5') primer (3') PfuTurbo DNA Polymerase Τελικός όγκος X μl (125 ng) X μl (125 ng) 1 μl 50 μl Τα αντιδραστήρια προστίθενται στο διάλυμα της αντίδρασης στους 4 ο C, και το σωληνάριο μεταφέρεται στη συσκευή της PCR. Προηγείται επώαση στους 95 ο C για 30 δευτερόλεπτα προκειμένου να αποδιαταχθεί το δίκλωνο κυκλικό DNA. Οι συνθήκες των αντιδράσεων που χρησιμοποιήθηκαν περιέχονται στον Πίνακα Μ.9 Πίνακας Μ.9: Πρότυπο των συνθηκών που χρησιμοποιήθηκαν για τις αντιδράσεις της PCR. Στάδιο Θερμοκρασία Χρόνος Αποδιάταξη 95 ο C 30 δευτερόλεπτα Σύνδεση 55 ο C 1 λεπτό Πολυμερισμός 68 ο C 8 λεπτά Η χρονική διάρκεια του τελευταίου σταδίου (που αναγράφεται στον πίνακα) καθορίζεται από το μέγεθος του πλασμιδίου (1 λεπτό / kb). Τα παραπάνω διαδοχικά στάδια (κύκλοι) επαναλαμβάνονται 18 φορές. Ο τύπος της επιθυμητής μεταλλαγής, στην παρούσα φάση έλλειμα, είναι αυτός που καθορίζει τον αριθμό των κύκλων. Τέλος ακολουθεί επώαση στους 37 ο C για 5 λεπτά, προκειμένου να προετοιμαστεί το δείγμα για το επόμενο στάδιο.

111 Στάδιο 3 ο :Αντίδραση πέψης με το ένζυμο περιορισμού Dpn 1 Από την αντίδραση της PCR έχουν προκύψει δίκλωνα, κυκλικά μόρια DΝΑ, τα οποία είναι κομμένα (nicked) στο σημείο δέσμευσης του μεταλλαγμένου primer. 1. Στο προϊόν κάθε αντίδρασης PCR προστίθεται από 1 μι ενζύμου περιορισμού Dpn I (10 U/μl) και ακολουθεί ήπια ανάδευση και φυγοκέντρηση στα g για 1 λεπτό. 2. Επώαση στους 37oC για 1 ώρα. Στο στάδιο αυτό πέπτονται οι μεθυλιωμένες, μη μεταλλαγμένες, μητρικές αλυσίδες DNA. 'Ετσι παραμένουν τα μεταλλαγμένα, θυγατρικά, κυκλικά, δίκλωνα μόρια DΝΑ, τα οποία είναι κομμένα (nicked) και μη μεθυλιωμένα. Στάδιο 4 ο :Μετασχηματισμός υπερ-δεκτικών κυττάρων Στο στάδιο αυτό τα μόρια DΝΑ τα οποία έχουν προκύψει από το στάδιο 3, εισάγονται σε υπερ-δεκτικά κύτταρα (supercompetent cells) XL-1 Blue. Μέσα στα κύτταρα, το μεταλλαγμένο πλασμιδιακό ΟΝΑ μεθυλιώνεται και επιδιορθώνεται ώστε να πάψει να είναι κομμένο. 1. Απόψυξη 50 μl υπερ-δεκτικών κυττάρων XL-1 Blue σε σωληνάριο των 15 ml, στον πάγο. Προσθήκη 2 μl του προϊόντος πέψης (στάδιο 3), ήπια-ανάδευση και επώαση στον πάγο για 30 λεπτά. 2. Επώαση στους 42 o C για 45 δευτερόλεπτα και στη συνέχεια επώαση στον πάγο για 2 λεπτά. Προσθήκη 0,5 ml διαλύματος ΝΖΥ+ broth (προθερμασμένου στους 42 o C) και επώαση στους 37 o C για 1 ώρα υπό ανάδευση. 3. Μεταφορά 250 μl του παραπάνω διαλύματος κυττάρων σε τρυβλίο επιστρωμένο με στερεό θρεπτικό μέσο (που περιέχει αμπικιλλίνη σε συγκέντρωση 0,1 mg/ml). Το τρυβλίο επωάζεται ανεστραμμένο σε επωαστικό θόλαμο στους 37 ο C για 16 ώρες και ελέγχεται μακροσκοπικά για την ανόπτυξη αποικιών βακτηρίων ανθεκτικών στην αμπικιλλίνη. 4. Μονήρεις αποικίες βακτηρίων που αναπτύσσονται στη στερεή καλλιέργεια, εμβολιόζονται εντός σωληναρίων των 50 ml που περιέχουν 10 ml υγρού θρεπτικού

112 υλικού. Στο υγρό θρεπτικό μέσο έχει προστεθεί αμπικιλλίνη, ώστε η τελική συγκέντρωση να είναι 0,1 mg/ml. Οι υγρές καλλιέργειες επωάζονται για 16 h στους 37 ο C υπό συνεχή ανάδευση. Από τα κύτταρα της υγρής καλλιέργειας απομονώνεται το πλασμιδιακό DNA. 5. Μετά από προσδιορισμό της συγκέντρωσης του πλασμιδιακού DΝΑ με φωτομέτρηση, ακολουθεί πέψη με τα ένζυμα περιορισμού ΜΙυ I και Bgl II και ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 0,8%. Με τον τρόπο αυτό ελέγχεται ότι τα βακτήρια περιέχουν το επιθυμητό πλασμίδιο. 6. Προκειμένου να ελεγχθεί ότι επιτεύχθηκαν οι επιθυμητές σημειακές μεταλλαγές στη σωστή θέση, πραγματοποιήθηκε έλεγχος της αλληλουχίας των νουκλεοτιδίων των μεταλλαγμένων πλασμιδίων (αντίδραση sequencing). Η αντίδραση αυτή πραγματοποιήθηκε από την εταιρεία Macrogen (Korea). Για τον έλεγχο της αλληλουχίας χρησιμοποιήθηκε διάλυμα του κάθε πλασμιδίου, συγκέντρωσης 100 ng/μλ. Ο primer που χρησιμοποιήθηκε είναι ο ίδιος primer (5') που χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία της ρυθμιστικής αλληλουχίας του γονιδίου της HARP με αντίδραση PCR, προκειμένου να κλωνοποιηθεί. Αντίδραση ελέγχου Προκειμένου να ελεγχθεί η απόδοση του συγκεκριμένου συστήματος αντιδράσεων, όσον αφορά στο ποσοστό τών μεταλλαγμένων πλασμιδίων που προκύπτουν, πραγματοποιήθηκε μια ακόμα αντίδραση ελέγχου. Στην αντίδραση αυτή παρακάμπτεται το πρώτο στάδιο προετοιμασίας του πλασμιδίου, εφόσον το πλασμίδιο αυτό παρέχεται από την εταιρεία. Πρόκειται για το πλασμίδιο pwhitescripttm μεγέθους 4,5 kb. Το πλασμίδιο αυτό περιέχει στο γονίδιο της β- γαλακτοσιδάσης ένα κωδικόνιο τερματισμού της μετάφρασης (ΤΑΑ) στη θέση που φυσιολογικά υπάρχει το κωδικόνιο (CAA) για το αμινοξύ γλουταμίνη (πρόκειται για το 9 ο αμινοξύ). Ώταν το πλασμίδιο αυτό εισαχθεί σε κύτταρα XL-1 Blue supercompetent και τα κύτταρα αυτά μεταφερθούν σε τρυβλία επιστρωμένα με στερεό θρεπτικό υλικό (που περιέχει αμπικιλλίνη, IPTG και X-gal) δημιουργούνται λευκές αποικίες. Το λευκό χρώμα οφείλεται στο γεγονός ότι έχει ανασταλεί η δραστικότητα της β-γαλακτοσιδάσης. Διαφορετικά, το χρώμα των αποικιών είναι μπλε. Οι primers που χρησιμοποιούνται στην αντίδραση ελέγχου φέρουν την επιθυμητή σημειακή μετάλλαξη στο γονίδιο της β- γαλακτοσιδάσης. Συγκεκριμένα, επιθυμείται να αντικατασταθεί η θυμίνη του κωδικόνιου λήξης από κυτοσίνη, προκειμένου να σχηματιστεί η β-γαλακτοσιδάση. Ώταν το μεταλλαγμένο πλασμίδιο εισαχθεί σε κύτταρα XL-1 Blue supercompetent και τα κύτταρα

113 αυτά μεταφερθούν σε τρυβλία επιστρωμένα με στερεό θρεπτικό υλικό (που περιέχει αμπικιλλίνη, IPTG και X-gal) δημιουργούνται μπλε αποικίες (φαινότυπος β- γαλακτοσιδάσης, β-gal+). Η πειραματική πορεία που ακολουθείται για την αντίδραση ελέγχου είναι κοινή με αυτή των δειγμάτων. Η μόνη διαφορά είναι ότι στα διαδοχικά στάδια (κύκλοι) της αντίδρασης PCR, το τρίτο στάδιο πολυμερισμού διαρκεί 5 λεπτά λόγω διαφορετικού μεγέθους του πλασμιδίου. Οι primers που χρησιμοποιούνται στην αντίδραση ελέγχου παρέχονται από την εταιρεία και είναι οι εξής: Primer (5'): 5 -CCATGATTACGCCAAGCGCGCAATTAACCCTCAC-3 Primer (3'): 5 -GTGAGGGTT Μ TTGCGCGCTTGGCGTAATCATGG-3 Υλικά και Διαλύματα Υγρό θρεπτικό μέσο για ανάπτυξη βακτηρίων (LΒ medium) Στερεό θρεπτικό υλικό για ανάπτυξη βακτηρίων (LB-agar): 2% κ.β. άγαρ (bacto-agar) σε LΒ medium Το διάλυμα αποστειρώνεται στο αυτόκαυστο και μεταφέρεται στα τρυβλία ανάπτυξης των βακτηρίων. Το θρεπτικό μέσο στερεοποιείται μετά από 10 λεπτά παραμονής σε θερμοκρασία δωματίου. Στο διάλυμα του θρεπτικού μέσου, όταν η θερμοκρασία είναι στους 50 ο C και πριν στερεοποιηθεί, προστίθεται ποσότητα διαλύματος αμπικιλλίνης σε τελική συγκέντρωση 0,1 mg/ml. Για την αντίδραση ελέγχου προστίθενται επιπλέον της αμπικιλλίνης X-gal και IPTG, σε τελική συγκέντρωση 80 μg/mι και 20 mm αντίστοιχα. Τα δύο αυτά αντιδραστήρια δεν πρέπει να αναμιχθούν πριν την προσθήκη τους στο διάλυμα του θρεπτικού μέσου γιατί υπάρχει κίνδυνος κατακρήμνισής τους. Διάλυμα IPTG 1,34 Μ (σε νερό)

114 Το διάλυμα αυτό διατηρείται σε συνθήκες μειωμένου φωτισμού. Διάλυμα αμπικιλλίνης 50 mg/ml (σε νερό) Υγρό θρεπτικό μέσο για ανάπτυξη βακτηρίων (ΝΖΥ+ broth medium): ΝΖ amine (casein hydrolysate) 1 % Εκχύλισμα μαγιάς 0,5% NaCI 0,5% Ρυθμίζεται το ρη στο 7,5 (με διάλυμα NaOH 1 Ν) και το διάλυμα αποστειρώνεται στο αυτόκαυστο. Πριν τη χρήση, προστίθενται ανά ml διαλύματος τα κάτωθι διαλύματα: (Τα διαλύματα αυτά πριν την προσθήκη τους, αποστειρώνονται με διαβίβασή τους μέσα από φίλτρο με πόρους διαμέτρου 0,2 μm). Διάλυμα MgCI2 1 Μ Διάλυμα MgSO4 1 Μ Διάλυμα γλυκόζης 2Μ 12,5 μl 12,5 μl 10 μl Pfu Turbo DNA πολυμεράση (2,5 U/μl) (Stratagene) Dpn I ένζυμο περιορισμού (10 U/μl) (Stratagene) pwhitescript TM 4,5 kb πλασμίδιο (5 ng/μl) (Stratagene) ΧL-1 Blu supercompetent cells (Stratagene) Falcon 2059 σωληνάρια πολυπροπυλενίου (15 ml) Μ.26 Τεχνική ανίχνευσης δραστηριότητας του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης στα κύτταρα Μ059Κ

115 (Polytarchou et al., 2005) Πρόκειται για μια ευαίσθητη και γρήγορη τεχνική που χρησιμοποιείται για τη μελέτη της γονιδιακής έκφρασης, τόσο σε ευκαρυωτικά όσο και σε προκαρυωτικά κύτταρα. Συνοπτικά, η αλληλουχία του υποκινητή (ή ρυθμιστική αλληλουχία) του γονιδίου που μελετάται, συνδέεται στο γονίδιο αναφοράς της λουσιφεράσης. Το πλασμίδιο εισάγεται στα ευκαρυωτικά κύτταρα (transfection) και ακολουθεί έκφραση της πρωτεΐνης λουσιφεράσης. Το ένζυμο της λουσιφεράσης αποτελείται από μια πολυπεπτιδική αλυσίδα μοριακού βάρους 60,7 kda και καταλύει την ΑΤΡ-εξαρτώμενη οξειδωτική αποκαρβοξυλίωση της λουσιφερίνης (luciferin). Για την πραγματοποίηση της συγκεκριμένης αντίδρασης είναι απαραίτητη η παρουσία ιόντων μαγνησίου (Mg 2+ ). Αποτέλεσμα της αντίδρασης είναι η παραγωγή οξειδωμένης λουσιφερίνης και φωτός: Luciferin + ATP + O 2 oxyluciferin + AMP + PPi + CO 2 + φως Η εκπομπή φωτός διαρκεί μέχρι 20 δευτερόλεπτα και μετράται σε φθορισμόμετρο (de Wet et al., 1985;1987). Χρησιμοποιήθηκε το πλασμίδιο hharppro2,3luc ή αλλιώς αγρίου τύπου (wild type) και η μεταλλαγμένη μορφή του (mutant) και πραγματοποιήθηκε παροδική διαμόλυνση (transient transfection) των κυττάρων με τα συγκεκριμένα πλασμίδια. Στο σημείο αυτό αξίζει να σημειωθεί ότι η λουσιφεράση έχει μικρό χρόνο ημιζωής στα ευκαρυωτικά κύτταρα συγκριτικά με άλλες πρωτεΐνες αναφοράς όπως η CAT (chloramphenicol acetyltransferase), και για αυτό το λόγο επιλέγεται η μέθοδος παροδικής διαμόλυνσης των κυττάρων (Thompson et al., 1991; Pazzagli et al., 1992). Χρησιμοποιήθηκε το σύστημα αντιδράσεων Luciferase Reporter Gene Assay high sensitivity της εταιρείας Roche και ως μέσο διαμόλυνσης, το κατιονικό πολυμερές πολυαιθυλενιμίνη.η πειραματική πορεία που ακολουθείται είναι η εξής: 1. Χρησιμοποιείται καλλιέργεια κυττάρων σε πλακίδιο των 12 μικροκυψελίδων. Επίστρωση κυττάρων M059K σε κάθε μικροκυψελίδα και επώαση των κυττάρων σε πλήρες θρεπτικό μέσο για 16 ώρες. 2. Σε σωληνάριο μικροφυγοκέντρου προστίθενται 1,5 μg πλασμιδιακού DNA σε NaCl 0,9% κ.β. μέχρι τελικού όγκου 100 μl. Παράλληλα, σε ένα δεύτερο σωληνάριο μεταφέρονται 96 μl NaCl 0,9% και προστίθενται 4 μl του πολυμερούς. Έπεται ανάδευση και ήπια φυγοκέντρηση. Το διάλυμα του πολυμερούς μεταβιβάζεται στο διάλυμα του πλασμιδίου. Έπεται ανάδευση, ήπια φυγοκέντρηση και επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά.

116 3. Το θρεπτικό μέσο των κυττάρων απομακρύνεται υπό κενό και προστίθεται 1 ml θρεπτικού μέσου χωρίς ορό. Το διάλυμα του συμπλόκου (200 μl) μεταφέρεται στάγδην στα κύτταρα και ακολουθεί επώαση στον κλίβανο των κυττάρων για 2 ώρες. 4. Προστίθεται άλλο 1ml θρεπτικού μέσου DMEM-HAMS F12 4% σε ορό και ακολουθεί επώαση των κυττάρων στον κλίβανο για άλλες 2 ώρες. 5. Το θρεπτικό μέσο των κυττάρων ανανεώνεται από νέο θρεπτικό μέσο με 0% κ.ό. ορό. Επώαση για 16 ώρες. 6. Ανανέωση του θρεπτικού μέσου των κυττάρων, προσθήκη των υπό εξέταση ουσιών και επώαση στον κλίβανο των κυττάρων για επιθυμητό χρονικό διάστημα. 7. Απομάκρυνση του θρεπτικού μέσου των κυττάρων και πλύσιμο (2 φορές) με PBS (δεν πρέπει να περιέχει Ca +2 και Mg +2 ). Προσθήκη διαλύματος λύσης (150 μl/μικροκυψελίδα) και αποκόλληση των κυτάρων με ειδική ελαστική ξύστρα (cell scraper). 8. Μεταφορά σε σωληνάριο μικροφυγοκέντρου και επώαση για 15 λεπτά σε θεμοκρασία δωματίου. Φυγοκέντρηση στα g για 10 δευτερόλεπτα και συλλογή του υπερκείμενου εκχυλίσματος των κυττάρων σε σωληνάριο μικροφυγοκέντρου. 9. Σε σωληνάριο των 5 ml, μεταφέρονται 100 μl από το εκχύλισμα των κυττάρων και προστίθενται 30 μl διαλύματος αντιδραστηρίου λουσιφεράσης (Το αντιδραστήριο λουσιφεράσης έχει προεπωαστεί σε θερμοκρασία δωματίου). Απευθείας μέτρηση (1-5 δευτερόλεπτα μετά την προσθήκη του αντιδραστηρίου λουσιφεράσης) σε β-counter (για 10 δευτερόλεπτα). 10. Τα αποτελέσματα εκφράζονται σαν CPM (Counts Per Minute) ανά mg πρωτεΐνης, και συνεπώς, πραγματοποιείται προσδιορισμός συγκέντρωσης ολικής πρωτεΐνης στα εκχυλίσματα των κυττάρων με τη μέθοδο Bradford (βλέπε παράγραφο Μ.9). 11. Παρατήρηση: Τα στάδια της πειραματικής πορείας στα οποία χρησιμοποιείται το αντιδραστήριο λουσιφεράσης, πραγματοποιούνται με ελάχιστο φωτισμό. Υλικά και Διαλύματα Από το σύστημα αντιδράσεων Luciferase Reporter Gene Assay high sensitivity, παρέχεται το διάλυμα λύσης των κυττάρων και το διάλυμα αντιδραστηρίων λουσιφεράσης. β-counter

117 Μ.27 Τεχνική ανίχνευσης δραστηριότητας του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης στα κύτταρα HUVEC Tα βήματα που ακολουθούνται είναι τα ίδια με αυτά για τα κύτταρα Μ059Κ με τις εξής διαφορές: 1. Επιστρώνονται κύτταρα HUVEC ανα μικροκυψελίδα. 2. Πρίν την προσθήκη του διαλύματος του συμπλόκου, το μέσο καλλιέργειας των κυττάρων αναναιώνεται με Μ199* με 5% ορό. 3. Μετα τις πρώτες δύο ώρες προστίθεται 1 ml πλήρες θρεπτικό μέσο Μ Στο τέλος των τεσσάρων ωρών επώασης με το διάλυμα του συμπλόκου, το θρεπτικό μέσο αναναιώνεται από 1 ml Μ199* με 5% ορό. Μ.28 Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων Τα αποτελέσματα εξήχθησαν από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα μεταξύ τους πειράματα. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με τη χρήση του test ANOVA. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως % επαγωγή της σχετικής δραστηριοτητας λουσιφεράσης σε σχέση με τον μάρτυρα. Ως σχετική δραστηριότητα λουσιφεράσης θεωρείται ο λόγος με αριθμητή τα CPM/ mgr ολικής πρωτείνης των κυττάρων στα οποία έχουμε επιδράσει με την μέγιστη συγκέντρωση ορού και με παρανομαστή τα CPM/ mgr ολικής πρωτείνης των κυττάρων στα οποία δεν έχουμε προσθέσει ορό. Οι συγκρίσεις (μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα) έγιναν μεταξύ της κάθε πειραματικής ομάδας και του αντίστοιχου μάρτυρα (σχετική δραστηριότητα λουσιφεράσης στην 0,5 ώρα για τα πειράματα σε σχέση με το χρόνο και σχετική δραστηριότητα λουσιφεράσης κυττάρων με 0% ορό για τα πειράματα σε σχέση με τη συγκέντρωση ορού ). Επιπλέον, σε ορισμένες περιπτώσεις, μελετήθηκε η μεταβολή σε σχέση με συγκεκριμένη πειραματική ομάδα.

118 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

119 Α.1 Ρύθμιση της έκφρασης της HARP από το ΝΟ Είναι γνωστό ότι το ΝΟ είναι βασικός μεσολαβητής της αγγειογένεσης, επάγοντας μεταξύ άλλων τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων (Zheng and Liu, 2007) Με δεδομένα παλαιότερα αποτελέσματα της ερευνητικής μας ομάδας ότι η HARP έχει αγγειογενετικές δράσεις in vivo και in vitro (Papadimitriou et al., 2000; 2001), στην παρούσα εργασία μελετήθηκε αν το ΝΟ επηρεάζει την έκφραση και έκκριση της HARP.

120 Α.1.1 O δότης μονοξειδίου του αζώτου, νιτροπρωσικό νάτριο (sodium nitroprusside, SNP), επάγει την έκκριση της πρωτεΐνης HARP στα κύτταρα HUVEC Αρχικά μελετήθηκε η επίδραση του δότη του ΝΟ SNP, στην έκκριση της HARP στο θρεπτικό μέσο των κυττάρων HUVEC. Όπως φαίνεται στην εικόνα Α.1.1, το SNP σε διάφορες συγκεντρώσεις, επάγει την έκκριση της πρωτεΐνης HARP από τα κύτταρα HUVEC. Α) Β) 400 % Έκκριση της HARP * 0 M Συγκέντρωση SNP (μμ) Εικόνα Α.1.1: Επίδραση του SNP στα επίπεδα της πρωτεΐνης HARP σε κύτταρα HUVEC. (Α) Αντιπροσωπευτική εικόνα ανάλυσης κατά Western για την πρωτεΐνη HARP που εκκρίνεται στο θρεπτικό μέσο των κυττάρων 24 ώρες μετά την επίδραση SNP σε διάφορες συγκεντρώσεις, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. (Β) Τα επίπεδα της πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν με σύστημα ανάλυσης εικόνας και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % μεταβολής στα επίπεδα της HARP σε σχέση με το μάρτυρα Μ (κύτταρα στα οποία δεν έχει προστεθεί SNP). Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με το μάρτυρα * P < 0,05.

121 Α.1.2 Το SNP επάγει τη μεταγραφή του γονιδίου της HARP στα κύτταρα HUVEC Στη συνέχεια μελετήθηκε εάν η παρατηρούμενη επαγωγή της έκκρισης της HARP από το SNP στα κύτταρα HUVEC οφείλεται σε μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου της. Για το σκοπό αυτό διαμολύναμε τα κύτταρα με πλασμίδιο, το οποίο φέρει το γονίδιο αναφοράς της λουσιφεράσης καθοδικά του υποκινητή της HARP, και ελέγξαμε τη δραστηριότητα της λουσιφεράσης μετά από επίδραση SNP για 3 και 6 ώρες μετά την προσθήκη του. Όπως φαίνεται και στην εικόνα Α.1.2, το SNP ξεκινά να επάγει τη μεταγραφή του γονιδίου της HARP στις 3 πρώτες ώρες, με την επαγωγή αυτή να γίνεται στατιστικά σημαντική στις 6 ώρες. Α) Β) Σχετική ενεργότητα λουσιφεράσης (%) h Μάρτυρας SNP 6h * Εικόνα Α.1.2 : Επίδραση του SNP στη μεταγραφική δραστηριότητα του γονιδίου της HARP σε κύτταρα HUVEC. (Α) Σχηματική απεικόνιση του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου που φέρει τη ρυθμιστική περιοχή (2,3 kb) του γονιδίου της ανθρώπινης HARP έμπροσθεν του γονιδίου αναφοράς λουσιφεράση (hharppro2,3luc). Β) Σχετική δραστηριότητα του γονιδίου αναφοράς 3 και 6 ώρες μετά την επίδραση SNP. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % μεταβολής στη σχετική ενεργότητα της λουσιφεράσης σε σχέση με το μάρτυρα (κύτταρα στα οποία δεν έχει προστεθεί SNP) για κάθε χρονική στιγμή. * P<0,05

122 Α.1.3 Αναστολή της διαλυτής γουανυλικής κυκλάσης (sgc) αναστέλλει την επαγόμενη από το Η 2 Ο 2 έκκριση της HARP Στη συνέχεια εξετάστηκε αν η ενδοθηλιακή συνθάση του μονοξειδίου του αζώτου (endothelial nitric oxide synthase, enos), που διαμεσολαβεί τις επαγωγικές δράσεις του Η 2 Ο 2 στον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων μέσω ενεργοποίησης της sgc (Polytarchou and Papadimitriou, 2005), εμπλέκεται στη ρύθμιση της έκφρασης της HARP. Για το σκοπό αυτό επιδράσαμε στα κύτταρα με έναν αναστολέα της sgc, τον ODQ, o οποίος αναστέλλει τον επαγόμενο από το Η 2 Ο 2 πολλαπλασιασμό των HUVEC (Polytarchou and Papadimitriou, 2005) και ελέγξαμε εάν αναστέλλεται η επαγόμενη από το Η 2 Ο 2 έκκριση της HARP στα HUVEC. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α.1.3, το Η 2 Ο 2 επάγει την έκκριση της HARP, δράση η οποία αναστέλλεται από την προ-επώαση των κυττάρων με το ODQ (5μΜ). Α) Β)

123 200 *** P<0,01 % Έκκριση της HARP M HP ODQ ODQ + HP Εικόνα Α.1.3 : Επίδραση του H 2 O 2 στα επίπεδα της πρωτεΐνης HARP, παρουσία και απουσία του ODQ. (Α) Αντιπροσωπευτική εικόνα ανάλυσης κατά Western για την πρωτεΐνη HARP που εκκρίνεται στο θρεπτικό μέσο των κυττάρων 24 ώρες μετά την επίδραση H 2 O 2 μόνο του (10 μμ) ή σε συνδυασμό με το ODQ, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. (Β) Τα επίπεδα της πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν με σύστημα ανάλυσης εικόνας και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % μεταβολής στα επίπεδα της HARP σε σχέση με το μάρτυρα (κύτταρα στα οποία δεν έχει προστεθεί ODQ). Μ: μάρτυρας, ODQ: ODQ σε συγκέντρωση 5 μμ, HP: H 2 O 2 σε συγκέντρωση 10 μμ, ODQ+HP: ODQ σε συγκέντρωση 5 μμ και H 2 O 2 σε συγκέντρωση 10 μμ. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με το μάρτυρα ** P < 0,01, n.s : μη στατιστικά σημαντικό. Α.1.4 To SB αναστέλλει την επαγόμενη από το H 2 O 2 έκκριση της πρωτείνης HARP στα κύτταρα HUVEC Σε προηγούμενες δουλειές της ερευνητικής μας ομάδας δείξαμε ότι το μονοπάτι μεταγωγής σήματος που διεγείρεται από το H 2 O 2 που παράγεται ως ανταπόκριση σε αυξητικούς παράγοντες περιλαμβάνει τις MAP κινάσες, ERK1/2 και p38, αλλά όχι την JNK (Hatziapostolou et al., 2006). Στην παρούσα εργασία θελήσαμε να διερευνήσουμε περαιτέρω το ρόλο των p38 και JNK στη ρύθμιση της έκφρασης της HARP από το H 2 O 2, καθώς και τη σχέση τους με την enos στο μονοπάτι μεταγωγής σήματος που επάγεται από το H 2 O 2 και οδηγεί στην έκκριση της HARP από τα HUVEC. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α.1.4, ο αναστολέας της p38, SB στη συγκέντρωση των 10 μμ, δεν επηρεάζει τα επίπεδα της εκκρινόμενης πρωτείνης HARP στα κύτταρα HUVEC. Ωστόσο, πρo-επώαση των κυττάρων

124 για 30 λεπτά με SB στην ίδια συγκέντρωση, αναστέλλει την επαγόμενη από το H 2 O 2 επαγωγή της έκκρισης της HARP στα κύτταρα HUVEC. Α) Β) ** P<0,01 % Έκκριση της HARP Μ HP SB SB + HP Εικόνα Α.1.4 : Επίδραση του H 2 O 2 στα επίπεδα της πρωτεΐνης HARP, παρουσία και απουσία του αναστολέα της p38 SB (Α) Αντιπροσωπευτική εικόνα ανάλυσης κατά Western για την πρωτεΐνη HARP που εκκρίνεται στο θρεπτικό μέσο των κυττάρων 24 ώρες μετά την επίδραση H 2 O 2 μόνο του (10 μμ) ή σε συνδυασμό με το SB202190, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. (Β) Τα επίπεδα της πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν με σύστημα ανάλυσης εικόνας και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % μεταβολής στα επίπεδα της HARP σε σχέση με το μάρτυρα (κύτταρα στα οποία δεν έχει προστεθεί καμία ουσία). Μ: μάρτυρας, SB: SB σε συγκέντρωση 10 μμ, HP: H 2 O 2 σε συγκέντρωση 10 μμ, SB+H : SB σε συγκέντρωση 10 μμ και H 2 O 2 σε συγκέντρωση 10 μμ. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με το μάρτυρα ** P < 0,01.

125 Α.1.5 To SP δεν αναστέλλει την επαγόμενη από το H 2 O 2 έκκριση της πρωτείνης HARP στα κύτταρα HUVEC Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α.1.5, ο αναστολέας της JNK SP στη συγκέντρωση των 10 μμ, δεν επηρεάζει τα επίπεδα της εκκρινόμενης πρωτεΐνης HARP στα κύτταρα HUVEC. Πρωεπώαση των κυττάρων για 30 λεπτά με το SP στην ίδια συγκέντρωση δεν αναστέλλει την επαγόμενη από το H 2 O 2 επαγωγή της έκκρισης της HARP στα κύτταρα HUVEC. Α) Β) *** n.s % Έκκριση της HARP M HP SP SP + HP Εικόνα Α.1.5 : Επίδραση του H 2 O 2 στα επίπεδα της πρωτεΐνης HARP, παρουσία και απουσία του SP (Α) Αντιπροσωπευτική εικόνα ανάλυσης κατά Western για την πρωτεΐνη HARP που εκκρίνεται στο θρεπτικό μέσο των κυττάρων 24 ώρες μετά την επίδραση H 2 O 2 μόνο του (10 μμ) ή σε συνδυασμό με το SP600125, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. (Β) Τα επίπεδα της πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν με σύστημα ανάλυσης εικόνας και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % μεταβολής στα επίπεδα της HARP σε σχέση με το μάρτυρα (κύτταρα στα οποία δεν έχει προστεθεί καμία ουσία). Μ: μάρτυρας, SP: SP σε συγκέντρωση 10 μμ, HP: H 2 O 2 σε συγκέντρωση 10 μμ, SP+H: SP σε συγκέντρωση 10 μμ και H 2 O 2 σε συγκέντρωση 10 μμ. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με το μάρτυρα ** P < 0,01, n.s : μη στατιστικά σημαντικό.

126 Α.1.6 Η p38 συμμετέχει στην επαγωγική δράση του H 2 O 2 στον πολλαπλασιασμό των HUVEC Στη συνέχεια μελετήθηκε η συμμετοχή της p38 στον επαγόμενο από το H 2 O 2 πολλαπλασιασμό των κυττάρων HUVEC. Για να διερευνηθεί η πιθανή εμπλοκή της p38 στη μιτογόνο δράση του υπεροξειδίου του υδρογόνου, χρησιμοποιήθηκε o αναστολέας SB Όπως φαίνεται και στην Εικόνα Α.1.6, το SB δεν επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HUVEC σε συγκέντρωση 10 μμ. Εντούτοις, προ-επώαση των κυττάρων για 30 λεπτά με τον SB στην ίδια συγκέντρωση, αναστέλλει τον επαγόμενο από το H 2 O 2 πολλαπλασιασμό των κυττάρων HUVEC *** P<0,001 % Αριθμός κυττάρων M HP SB SB + HP Εικόνα Α.1.6 : Επίδραση του SB στην επαγωγική δράση του H 2 O 2 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HUVEC. Τα κύτταρα πρo-επωάστηκαν με SB, προστέθηκε H 2 O 2 και ο αριθμός τους προσδιορίστηκε μετά από 48ώρες με τη μέθοδο MTT, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Μ: μάρτυρας, SB: SB σε συγκέντρωση 10 μμ, HP: H 2 O 2 σε συγκέντρωση 10 μμ, SB+H : SB σε συγκέντρωση 10 μμ και H 2 O 2 σε συγκέντρωση 10 μμ. Tα αποτελέσματα εκφράζονται ως % μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα του αριθμού των κυττάρων. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με το μάρτυρα *** P < 0,001.

127 Α.1.7 Η JNK δε συμμετέχει στην επαγωγική δράση του Η 2 Ο 2 στον πολλαπλασιασμό των HUVEC Μελετήθηκε η συμμετοχή και της JNK στον επαγόμενο από το Η 2 Ο 2 πολλαπλασιασμό των κυττάρων HUVEC. Για να διερευνηθεί η πιθανή εμπλοκή της JNK στη μιτογόνο δράση Η 2 Ο 2, χρησιμοποιήθηκε ο αναστολέας της JNK SP Όπως φαίνεται και στην Εικόνα Α.1.7, το Η 2 Ο 2 σε συγκέντρωση 10 μμ επάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, δράση η οποία δεν αναστέλλεται μετά την προ-επώαση των κυττάρων με το SP σε συγκέντρωση 1 μμ *** n.s % Αριθμός κυττάρων C HP SP SP + HP Εικόνα Α.1.7 : Επίδραση του SP στον επαγόμενο από το Η 2 Ο 2 πολλαπλασιασμό των κυττάρων HUVEC. Τα κύτταρα πρo-επωάστηκαν με SP, προστέθηκε Η 2 Ο 2 και ο αριθμός τους προσδιορίστηκε μετά από 48ώρες με τη μέθοδο MTT, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Μ: μάρτυρας, SP: SP σε συγκέντρωση 1 μμ, HP: Η 2 Ο 2 σε συγκέντρωση 10 μμ, SP+H : SP σε συγκέντρωση 1μΜ και Η 2 Ο 2 σε συγκέντρωση 10 μμ. Tα αποτελέσματα εκφράζονται ως % μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα του αριθμού των κυττάρων. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με το μάρτυρα *** P < 0,001, n.s : μη στατιστικά σημαντικό.

128 Α.1.8 Αναστολή της έκφρασης της enos με αντι-νοηματική αλληλουχία αναστέλλει την επαγόμενη από το Η 2 Ο 2 φωσφορυλίωση των ERK1/2 αλλά όχι της p38 Προκειμένου να μελετήσουμε τη θέση της enos στο μονοπάτι μεταγωγής σήματος που επάγεται από το H 2 O 2 και οδηγεί στην έκκριση της HARP από τα HUVEC, αναστείλαμε την enos και ελέγξαμε την ενεργοποίηση των ERK1/2 και της p38, παρουσία και απουσία Η 2 Ο 2. Όπως φαίνεται και στην εικόνα Α.1.8Α, διαμόλυνση των κυττάρων με την αντινοηματική αλληλουχία για την enos, έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή της έκφρασης της. Από την εικόνα Α.1.8Β προκύπτει ότι αναστολή της έκφρασης της enos αναστέλλει την επαγόμενη από το Η 2 Ο 2 φωσφορυλίωση των ERK1/2, ωστόσο κάτι τέτοιο δεν ισχύει για την p38. Συνεπώς, η p38 πιθανά βρίσκεται ανοδικά και οι ERK1/2 καθοδικά της enos, στο μονοπάτι μεταγωγής σήματος που ξεκινά από το H 2 O 2 και οδηγεί στην έκκριση της HARP από τα HUVEC. Α) Β) Εικόνα Α.1.8 : Επίδραση της αναστολής της έκφρασης της enos στη φωσφορυλίωση των ERK1/2 και p38. (Α) Αντιπροσωπευτική εικόνα ανάλυσης κατά Western για την enos μετά από διαμόλυνση με την αντινοηματική αλληλουχία, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Έχει χρησιμοποιηθεί ως εσωτερικός μάρτυρας η ακτίνη. Β) Αντιπροσωπευτική εικόνα ανάλυσης κατά Western για perk1/2, pp38, ERK1/2 και p38 μετά από επίδραση Η 2 Ο 2, σε συγκέντρωση 10 μμ, σε κύτταρα στα οποία έχει

129 ανασταλεί η έκφραση της enos. HP: Η 2 Ο 2, σε συγκέντρωση 10 μμ, wt: κύτταρα άγριου τύπου, S: κύτταρα τα οποία έχουν διαμολυνθεί με τη νοηματική αλληλουχία για την enos, AS: κύτταρα τα οποία έχουν διαμολυνθεί με την αντινοηματική αλληλουχία για την enos. Α.2 Ρύθμιση της έκφρασης και έκκρισης της HARP από τον ορό Είναι γνωστό ότι ο υποκινητής της HARP περιέχει ένα SRE στη θέση -568 (Li et al. 1992), ωστόσο μέχρι σήμερα δεν έχει μελετηθεί η λειτουργικότητα του. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση του ορού στην έκφραση και έκκριση της HARP, καθώς επίσης και η πιθανή εμπλοκή του SRE. Α.2.1 O ορός επάγει την έκκριση της HARP στα κύτταρα Μ059Κ Ο ορός νεογέννητου βοός περιέχει πλήθος αυξητικούς παράγοντες και είναι απαραίτητος για την καλλιέργεια κυττάρων. Με βάση το γεγονός ότι η HARP περιέχει στον υποκινητή της SRE, μελετήσαμε τη δράση του ορού στα επίπεδα της πρωτεΐνης που εκκρίνεται στο μέσο καλλιέργειας της ανθρώπινης κυτταρικής σειράς γλοιοβλαστώματος Μ059Κ. Για το σκοπό αυτό επιδράσαμε με διάφορες συγκεντρώσεις ορού και όπως φαίνεται στην εικόνα Α.2.1, o ορός επάγει με δοσοεξαρτώμενο τρόπο τα επίπεδα της HARP που εκκρίνεται από τα κύτταρα Μ059Κ. Α)

130 Β) 50 Σχετική αύξηση της έκκρισης της HARP * 2 ** 5 ** 10 % Συγκέντρωση ορού Εικόνα Α.2.1 : Επίδραση του ορού στην έκκριση της HARP από τα κύτταρα M059K. (Α) Αντιπροσωπευτική εικόνα ανάλυσης κατά Western για την πρωτεΐνη HARP που εκκρίνεται στο θρεπτικό μέσο κυττάρων Μ059Κ μετά την επίδραση ορού σε συγκεντρώσεις 10%, 5%, 2% και 0%. Στην πρώτη διαδρομή χρησιμοποιήθηκε ανασυνδυασμένη ανθρώπινη HARP ως μάρτυρας μοριακού βάρους. (Β) Τα επίπεδα της πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν με σύστημα ανάλυσης εικόνας και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % μεταβολής στα επίπεδα της HARP σε σχέση με το μάρτυρα (κύτταρα στα οποία δεν έχει προστεθεί ορός). Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με το μάρτυρα * P < 0,05 ** P < 0,01. Α.2.2 O ορός επάγει την έκκριση της HARP στα κύτταρα HUVEC Στη συνέχεια μελετήσαμε την επίδραση του ορού στα επίπεδα της πρωτεΐνης HARP που εκκρίνεται στο μέσο καλλιέργειας των κυττάρων HUVEC. Για το σκοπό αυτό επιδράσαμε με διάφορες συγκεντρώσεις ορού και όπως φαίνεται στην εικόνα Α.2.2, o ορός επάγει τα επίπεδα της πρωτεΐνης HARP που εκκρίνεται από τα κύτταρα HUVEC. Α)

131 Β) % Έκκριση της HARP ** * * * % Συγκέντρωση ορού Εικόνα Α.2.2 : Επίδραση του ορού στην έκκριση της HARP από τα κύτταρα HUVEC. (Α) Αντιπροσωπευτική εικόνα ανάλυσης κατά Western για την πρωτεΐνη HARP που εκκρίνεται στο θρεπτικό μέσο κυττάρων HUVEC μετά την επίδραση ορού σε συγκεντρώσεις 15%, 10%, 5%, 2% και 0%. (Β) Τα επίπεδα της πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκαν με σύστημα ανάλυσης εικόνας και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % μεταβολής στα επίπεδα της HARP σε σχέση με το μάρτυρα (κύτταρα στα οποία δεν έχει προστεθεί ορός). Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με το μάρτυρα * P < 0,05 ** P < 0,01. Α.2.3 O ορός επάγει την έκφραση της HARP στα κύτταρα Μ059Κ Έχοντας ως δεδομένο ότι ο ορός επάγει την έκκριση της πρωτεΐνης HARP στα κύτταρα Μ059Κ, διερευνήθηκε εάν τα αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης σε ανταπόκριση στον ορό, συσχετίζονται με αντίστοιχη αύξηση στα επίπεδα του μηνύματος. Όντως, αυξανόμενες συγκεντρώσεις ορού αυξάνουν τα επίπεδα του mrνα της HARP με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Εικόνα Α.2.3).

132 Α) Β) % Μεταβολή σε σχέση με το μάρτυρα * 2 * 5 ** 10 % Συγκέντρωση ορού Εικόνα Α.2.3 : Επίδραση του ορού στα επίπεδα mrna της HARP στα κύτταρα Μ059Κ. (Α) Ηλεκτροφορητική ανάλυση των προϊόντων της RT-PCR για HARP και β-ακτίνη, μετά την επίδραση ορού σε συγκεντρώσεις 10%, 5%, 2% και 0%, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Η β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς. Αντιπροσωπευτική εικόνα από 3 ανεξάρτητα μεταξύ τους πειράματα (Β) Τα επίπεδα του mrna της HARP ποσοτικοποιήθηκαν με σύστημα ανάλυσης εικόνας και ο λόγος των mrna HARP/β-ακτίνη υπολογίστηκε για κάθε δείγμα. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % μεταβολής των σχετικών επιπέδων του mrna της HARP στα κύτταρα που επωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις ορού σε σχέση με το μάρτυρα (κύτταρα στα οποία δεν έχει προστεθεί ορός). Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με το μάρτυρα * P < 0,05 ** P < 0,01.

133 Α.2.4 O ορός επάγει τη μεταγραφή του γονιδίου της HARP στα κύτταρα Μ059Κ Στη συνέχεια ελέγξαμε εάν η παρατηρούμενη επαγωγή της έκκρισης της HARP από τον ορό στα κύτταρα Μ059Κ οφείλεται σε μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου της. Για το σκοπό αυτό διαμολύναμε τα κύτταρα με πλασμίδιο, το οποίο φέρει το γονίδιο αναφοράς της λουσιφεράσης καθοδικά του υποκινητή της HARP και ελέγξαμε τη δραστηριότητα της λουσιφεράσης μετά από επίδραση ορού για διάφορες χρονικές στιγμές. Όπως φαίνεται στην εικόνα Α.2.4, ο ορός επάγει με χρονοεξαρτώμενο τρόπο τη μεταγραφή του γονιδίου της HARP. Α) Β) Σχετική δραστηριότητα λουσιφεράσης ,5 1 2 * 4 * 6 * 24 Χρόνος (ώρες) Εικόνα Α.2.4 : Επίδραση του ορού στη μεταγραφική δραστηριότητα του γονιδίου της HARP σε κύτταρα Μ059Κ. (Α) Σχηματική απεικόνιση του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου που φέρει τη ρυθμιστική περιοχή (2,3 kb) του γονιδίου της ανθρώπινης HARP έμπροσθεν του γονιδίου αναφοράς λουσιφεράση (hharppro2,3luc). Β) Σχετική δραστηριότητα του γονιδίου αναφοράς σε κύτταρα τα οποία επωάστηκαν με 15% ορό σε σχέση με κύτταρα τα οποία επωάστηκαν με 0% ορό. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % μεταβολής στη σχετική ενεργότητα της λουσιφεράσης σε σχέση με αυτής της 0,5 ώρας. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με το μάρτυρα * P<0,05.

134 Α.2.5 O ορός επάγει τη μεταγραφή του γονιδίου της HARP στα κύτταρα HUVEC Ελέγξαμε εάν η παρατηρούμενη επαγωγή της έκκρισης της HARP από τον ορό στα κύτταρα HUVEC οφείλεται, όπως και στα κύτταρα M059K, σε μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου της. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α.2.5, ο ορός επάγει την μεταγραφή του γονιδίου της HARP στα κύτταρα HUVEC με χρονοεξαρτώμενο τρόπο. Σχετική δραστηριότητα λουσιφεράσης ,5 1 * 2 4 * 6 *** 24 Χρόνος (ώρες) Εικόνα Α.2.5 : Επίδραση του ορού στη μεταγραφική δραστηριότητα του γονιδίου της HARP σε κύτταρα Μ059Κ. Στο σχήμα φαίνεται η σχετική δραστηριότητα του γονιδίου αναφοράς σε κύτταρα τα οποία επωάστηκαν με 15% ορό σε σχέση με κύτταρα τα οποία επωάστηκαν με 0% ορό. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα της % μεταβολής στη σχετική ενεργότητα της λουσιφεράσης σε σχέση με αυτήν της 0,5 ώρας. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με το μάρτυρα * P<0,05, *** P<0,001. Α.2.6 Το SRE δεν είναι σημαντικό για την επαγόμενη από τον ορό μεταγραφική δραστηριότητα του γονιδίου της HARP στα κύτταρα Μ059Κ Στη συνέχεια διερευνήθηκε η επίδραση διαφορετικών συγκεντρώσεων ορού στη μεταγραφική δραστηριότητα του γονιδίου της HARP στα κύτταρα Μ059Κ, καθώς επίσης και η συμβολή του SRE στην επαγωγή αυτή. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα τα

135 οποία διαμολύνθηκαν με το πλασμίδιο που φέρει τον υποκινητή της HARP ανοδικά του γονιδίου αναφοράς της λουσιφεράσης (wild type) και επωάστηκαν με συγκεντρώσεις ορού 0%, 2%, 5% και 10%. Επίσης χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα που διαμολύνθηκαν με πλασμίδιο το οποίο φέρει έλλειμμα για το SRE (SRE mutant, Εικόνα Α.2.6Α) και επωάστηκαν με 0% και 10% ορό. Όπως φαίνεται και στην εικόνα Α.2.6(Β), η δραστηριότητα της λουσιφεράσης αυξάνεται με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο και η δραστηριότητα της λουσιφεράσης του SRE mutant είναι όμοια με αυτή του αγρίου τύπου (wild type). Tα αποτελέσματα αυτά καταδεικνύουν αφενός μεν ότι ο ορός επάγει με δοσοεξαρτώμενο τρόπο τη μεταγραφή του γονιδίου της HARP, αφετέρου ότι το SRE δεν εμπλέκεται στην επαγόμενη από τον ορό μεταγραφική δραστηριότητα του γονιδίου της HARP στα κύτταρα Μ059Κ. Α) Β) Σχετική δραστηριότητα λουσιφεράσης wild type SRE mutant 2 5 * 10 n.s 0 ** 10 Συγκέντρωση ορού (%) Εικόνα Α.2.6 : Επίδραση διαφορετικών συγκεντρώσεων ορού στη μεταγραφική δραστηριότητα του γονιδίου της HARP σε κύτταρα Μ059Κ και εμπλοκή του SRE στην επαγόμενη από τον ορό