Transcript

1 ΜΕΤΑ Ι ΟΜΕΝΑ ΜΕ ΤΟ ΑΙΜΑ ΠΑΘΟΓΟΝΑ ΥΠΟΧΡΕΩΤΙΚΑ ΕΛΕΓΧΟΜΕΝΑ ΠΑΘΟΓΟΝΑ ΧΑΙΚΑΛΗ ΑΝΑΣΤΑΣΙΑ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΑΙΜΟ ΟΣΙΑ - ΚΑΤ

2 ΓΕΝΙΚΑ Είναι γνωστό πιά ότι η µετάγγιση αίµατος και παραγώγων σώζει ζωές και βελτιώνει την υγεία όσων την έχουν ανάγκη. Χιλιάδες όµως είναι οι ασθενείς ανά τον κόσµο που δεν έχουν έγκαιρη πρόσβαση σε ασφαλές αίµα. Για τις προηγµένες χώρες η ασφαλής µετάγγιση είναι κύρια προτεραιότητα και εξαρτάται εξ ίσου από τον αιµοδότη, την υποδοµή των Υπηρεσιών αιµοδοσίας και όλους τους εµπλεκόµενους σε αυτή παράγοντες.

3 ΓΕΝΙΚΑ Σηµαντικές ανακαλύψεις του 20 ου αιώνα που αφορούσαν στη ποιότητα του µεταγγιζόµενου αίµατος (συµβατότητα, αντιπηκτικά, ψύξη, συντηρητικά διαλύµατα κ.α) ενίσχυσαν τη χρήση του αίµατος ως θεραπευτικού µέσου. Σύντοµα όµως ήρθε στο προσκήνιο το πρόβληµα µετάδοσης, µε τη µετάγγιση, ασθενειών οφειλόµενων σε γνωστά ή άγνωστα παθογόνα, που ευθύνονταν τόσο για τη διασπορά τους στο πληθυσµό όσο και για την ασθένεια ή το θάνατο πολλών ληπτών.

4 ΠΑΘΟΓΟΝΑ Υπάρχουν πολλά παθογόνα που απειλούν τη ασφάλεια του προς µετάγγιση αίµατος και προϊόντων του, ιστών και άλλων βιολογικών υλικών: υπάρχοντα αναδυόµενα επανεµφανιζόµενα Αδύνατος ο έλεγχος των πάντων, ζητούµενο: ο προσανατολισµός σε συγκεκριµένα και αποδεδειγµένα επικίνδυνα για τον άνθρωπο παθογόνα.

5 ΠΑΘΟΓΟΝΑ Τα παθογόνα που αποτελούσαν και εξακολουθούν να αποτελούν απειλή για τους µεταγγιζόµενους ασθενείς, αφού µεταδίδονται µε το αίµα και εντάσσονται στα υποχρεωτικά ελεγχόµενα παθογόνα στην Αιµοδοσία, είναι: - HBV - HCV - HIV HTLV I/II - Σύφιλη (Treponema pallidum)

6 ΙΑΓΝΩΣΗ Η ορολογική διάγνωση των Ηπατίτιδων B και C, HIV και HTLV, στηρίζεται στον έλεγχο των αντιγόνων κάθε ιού και των αντίστοιχων αντισωµάτων που αναπτύσσει το άτοµο έναντι αυτών. Για την ορολογική ανίχνευση των παραπάνω δεικτών αναπτύχθηκαν διάφορες µέθοδοι.

7 ΕΞΕΛΙΞΗ Η εξέλιξη µέσα στα τελευταία 35 χρόνια είναι µεγάλη

8 ΕΞΕΛΙΞΗ Το ταξίδι της εξέλιξης είναι ενδιαφέρον και περιλαµβάνει αλλαγές σε πολλά πεδία: αιµοδότες συνθήκες αιµοδοσίας δέκτες µολυσµατικοί παράγοντες µέθοδοι ελέγχου

9 ΜΕΘΟ ΟΙ Η πρώτη µέθοδος που χρησιµοποιήθηκε για την ανίχνευση του αυστραλιανού αντιγόνου και µετέπειτα και για άλλους δείκτες, ήταν η διπλή ανοσοδιάχυση. Ο χρόνος, που απαιτείτο για την έκδοση εργαστηριακών αποτελεσµάτων µε την µέθοδο αυτή, κυµαινόταν από ώρες.

10 ΜΕΘΟ ΟΙ Ακολούθησαν άλλες βελτιωµένες µέθοδοι µε χαρακτηριστικά που αφορούν γενιές (1 η, 2 η, 3 η ) είδη (competitive, sandwich, capture) µονοκλωνικά, πολυκλωνικά αντισώµατα ανασυνδυασµένα πεπτίδια Ag, Ab, συνδυασµένα Ag/Ab ευχρηστία αυτοµατισµό αυξηµένη ευαισθησία αυξηµένη ειδικότητα αυξηµένη αξιοπιστία σε όλα τα επίπεδα

11 ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ Η ανάπτυξη και η αναβάθµιση του υλικο-τεχνικού εξοπλισµού είναι επίσης µεγάλη: - Μηχανικές, ηλεκτρονικές, µεγάλης ακρίβειας αναλώσιµου ρύγχους, (πολυκάναλες ή µη) πιππέτες - Ανοικτά ανοσολογικά συστήµατα (robotic pippeting, washer, reader) - Αυτόµατα ανοσολογικά συστήµατα (combining incubation, washing and reading) - Πλήρως αυτοµατοποιηµένα συστήµατα

12 ΥΝΑΤΟΤΗΤΕΣ ΣΥΓΧΡΟΝΟΥ ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΥ Μεγάλος αριθµός δειγµάτων Ασφάλεια και Ακρίβεια Επαναληψιµότητα και αξιοπιστία Εκτυπώσιµα αποτελέσµατα Επεξεργασία αποτελεσµάτων Ηλεκτρονική µεταφορά δεδοµένων Παραγωγή QMS αποτελεσµάτων

13 ΣΥΓΧΡΟΝΕΣ ΜΕΘΟ ΟΙ ELISΑ MEIΑ CMIA ECLIA WESTERN BLOT RIBA LIA NAT

14 ELISA Τεχνική που χρησιµοποιείται για να ανιχνεύσει ειδικά µόρια (π.χ. πρωτεΐνες και υδρογονάνθρακες) στα προς εξέταση δείγµατα. Συνήθης η χρήση της στην ιατρική διαγνωστική και στην επιστηµονική έρευνα. Ανοσολογική τεχνική: χρησιµοποιεί αντισώµατα. Μπορεί να είναι ποιοτική ή ποσοτική. Χαρακτηρίζεται από µεγάλη ευαισθησία.

15 ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ Πρωτεΐνες που εκκρίνονται από τα B- λεµφοκύτταρα (είδος λευκοκυττάρων), στα πρωτεύοντα. Αναγνωρίζουν και συνδέονται µε µόρια (αντιγόνα) που βρίσκονται στην επιφάνεια ξένων σωµατιδίων, σηµαίνοντάς τα για καταστροφή από τα Τ- λεµφοκύτταρα. Κάθε αντιγόνο µπορεί να εγείρει διαφορετικά αντισώµατα για διαφορετικές θέσεις του (επίτοποι). IgG molecule Fab fragments Fc fragments

16 Παραγωγή µονοκλωνικού αντισώµατος (hybridoma technology) Inject mouse with antigen Obtain Mouse spleen B-lymphocytes Grow mouse myeloma (tumour) cells in culture Fuse B-lymphocytes with myeloma cells Antibody-producing hybridoma cells

17 ευτερογενής παραγωγή αντισώµατος Mouse serum injected into a different species, e.g. rabbit, goat. Polyclonal antibodies which can recognise any mouse antibody Animal makes various antibodies against the different antigens in serum Select anti-mouse antibodies from plasma Take blood from animal

18 ΑΡΧΗ ΤΗΣ ELISA Enzyme Linked Immunosorbent orbent Assay 1. Το προς εξέταση αντιγόνο προσκολλάται σε πλαστική επιφάνεια ( sorbent ). 2. Το αντιγόνο αναγνωρίζεται από το ειδικό προς αυτό αντίσωµα ( immuno ). 3. Το αντίσωµα αυτό µε τη σειρά του αναγνωρίζεται από δεύτερο αντίσωµα ( immuno ) το οποίο είναι συνδεδεµένο µε ένζυµο ( enzyme-linked ). 4. Υπόστρωµα αντιδρά µε το ένζυµο για να παράγει προϊόν, συνήθως έγχρωµο. Χρώµα = µέτρηση (assay) του υπάρχοντος αντιγόνου

19 Substrate Secondary antibody Coloured product Primary antibody Different antigens in sample

20 ΤΥΠΟΙ ELISA Άµεση ELISA (direct ELISA) 2. σηµασµένο αντίσωµα 1. αντιγόνο για τον ποσοτικό προσδιορισµό Abs στον ορό Έµµεση ELISA (indirect ELISA) A 3. σηµασµένο αντι-αντίσωµα 2. αντίσωµα 1. αντιγόνο για τον προσδιορισµό αντιγονο-ειδικών Abs στον ορό B 4. σηµασµένο αντι-αντίσωµα 3. aντι-ισότυπου Αb 2. αντίσωµα 1. αντιγόνο για τον προσδιορισµό του ισότυπου του αντιγονο-ειδικού Ab στον ορό

21 Όσο µεγαλύτερη η αλυσίδα των προσδέσεων τόσο µεγαλύτερη η εξειδίκευση! Sandwich ELISΑ single sandwich double sandwich ή µεγάλη ευαισθησία! 3. σηµασµένο µονοκλωνικό Ab 2. αντιγόνο 1. πολυκλωνικό Ab για τον προσδιορισµό διαλυτού αντιγόνου, π.χ. κυτταροκινών 4. σηµασµένο πολυκλωνικό Ab 3. µονοκλωνικό Ab 2. αντιγόνο για τον προσδιορισµό διαλυτού αντιγόνου 1. πολυκλωνικό Ab 4. σηµασµένο Ab 3. αντιγόνο 2. µονοκλωνικό Ab 1. πολυκλωνικό Ab για τον προσδιορισµό διαλυτού αντισώµατος (διαθέσιµο ειδικό αντίσωµα αλλά όχι καθαρό αντιγόνο)

22 Άµεση ανταγωνιστική ELISA (direct competitive ELISA) Α µε ανταγωνιστικό αντιγόνο χωρίς ανταγωνιστικό αντιγόνο Β 3. σηµασµένο αντίσωµα 2. σηµασµένο αντίσωµα 2. ανταγωνιστικό αντιγόνο 1. αντιγόνο 1. αντιγόνο για τον γρήγορο προσδιορισµό διαλυτού αντιγόνου (εξειδίκευση) (άριστη στον προσδιορισµό αντιγονικής διασταυρούµενης αντίδρασης) µε ανταγωνιστικό αντίσωµα χωρίς ανταγωνιστικό αντίσωµα (µη σηµασµένο) 3. σηµασµένο αντίσωµα 2. ανταγωνιστικό αντίσωµα 1. αντιγόνο 2. σηµασµένο αντίσωµα 1. αντιγόνο για τον προσδιορισµό της εξειδίκευσης του αντισώµατος

23 MEIA Microparticle Enzyme Immuno Assay Είναι µία κλασσική µέθοδος ELISA (τύπου sandwich) Εκτελείται σε αυτόµατους αναλυτές Χρησιµοποιεί µικροσφαιρίδια (microparticles) αντί µικροπλάκας Τα µικροσφαιρίδια είναι επικαλλυµένα µε ανασυνδυασµένα αντιγόνα ή µε πολυκλωνικά / µονοκλωνικά αντισώµατα Η σήµανση γίνεται µε βιοτίνη και Το αποτέλεσµα ελέγχεται µέσω του σχηµατισµού φθορίζοντος προϊόντος

24 CMIA: Chemiluminescent microparticle Immuno Assay ECLIA: Electro Chemiluminescent Immuno Assay

25 CMIA: Chemiluminescent Μicroparticle Immuno Assay Είναι µία ανοσολογική µέθοδος που χρησιµοποιείται για την ανίχνευση αντιγόνων, αντισωµάτων και άλλων ουσιών. Περιλαµβάνει: - Μαγνητικά µικροσφαιρίδια (paramagnetic microparticles) επικαλλυµένα µε ειδικά αντιγόνα ή αντισώµατα - Αντίσωµα συνδεδεµένο µε ακριδίνιο (acridinium) - Ειδικά διαλύµατα (Η2Ο2, 2, NaOH) για την οξείδωση του ακριδινίου που έχει σαν αποτέλεσµα την εκποµπή φωτονίων. Η χηµική ένωση που δηµιουργείται επελευθερώνει ενέργεια µε τη µορφή φωτός

26 CMIA TECHNOLOGY 18 Minutes Source: Architect Operator Manual

27 CMIA TECHNOLOGY 18 Minutes Source: Architect Operator Manual

28 CMIA TECHNOLOGY

29 CMIA TECHNOLOGY 4 Minutes

30 CMIA TECHNOLOGY H 2 O 2

31 CMIA TECHNOLOGY NaOH H 2 O 2

32 ECLIA: Electro Chemiluminescent Immuno Assay Η ηλεκτροχηµειοφωταύγεια αποτελεί την πιο πρόσφατη εξέλιξη στις ανοσολογικές µεθόδους που χρησιµοποιούται για την ανίχνευση αντιγόνων, αντισωµάτων και άλλων ουσιών. ύο ηλεκτρικά ενεργές ουσίες το ρουθήνιο και η τρι- προπυλαµίνη, συµµετέχουν σε µια σειρά οξειδο- αναγωγικών αντιδράσεων που οδηγούν στην εκποµπή φωτονίων. Η εκποµπή φωτός ενεργοποιείται ηλεκτρικά µε την εφαρµογή ηλεκτρικού δυναµικού και όχι χηµικά.

33 ECLIA: Electro Chemiluminescent Immuno Assay Περιλαµβάνει: - Μαγνητικά µικροσφαιρίδια (paramagnetic microparticles) επικαλλυµένα µε στρεπταβιδίνη - Αντίσωµατα συνδεδεµένα µε βιοτίνη και ρουθίνιο (ruthenium) - Προσάρτηση συµπλόκων σε σταθερό ηλεκτρόδιο - Εφαρµογή τάσης για την εκκίνηση της αντίδρασης, την παραγωγή και ενίσχυση του µετρούµενου σήµατος Πραγµατοποιείται ως εξής:

34 ECLIA TECHNOLOGY Σύµπλεξη Ruthenium Ανάµιξη/ Επώαση Προσάρτηση στο Σύµπλεξη ηλεκτροδίο Παρα µαγνητικών Αποµάκρυνση µικροσφαιριδίων ECL Technology αδέσµευτων ενώσεων Εφαρµογή Τάσης Εκκίνηση Αντίδρασης Ενίσχυση & Μέτρηση Σήµατος

35 Βασική Αρχή Μεθόδου Ανοσοανάλυσης Antigen Streptavidin Biotin Antibody Paramagnetic Microbead

36 Σχηµατισµός δεσµού Βιοτίνης-Στρεπταβιδίνης Microbeads

37 έσµευση επί της στερεάς φάσης (Μαγνητική Αλλ/ση)

38 Εφαρµογή Τάσης Stable

39 Αποµάκρυνση µη δεσµευµένων ουσιών!

40 Ανίχνευση µέσω Φωτοπολλαπλασιαστή!

41 WESTERN BLOT RIBA - LIA

42 WESTERN BLOT Τα ανοσοαποτυπώµατα τύπου Western Blot περιλαµβάνουν ταινίες νιτροκυτταρίνης µε ακινητοποιηµένες πάνω τους αντιγονικές πρωτεΐνες, οι οποίες προκύπτουν από λύση του ιού και µεταφορά µετά από ηλεκτροφόρηση. Αντισώµατα ή αντιγόνα που βρίσκονται στο προς εξέταση δείγµα προσδένονται στις αντίστοιχες θέσεις της ταινίας και µέσω ανοσοενζυµικής διαδικασίας γίνονται εµφανή τα αποτελέσµατα. Κάθε ταινία φέρει ζώνες ελέγχου. Ακολουθεί αξιολόγηση των αποτελεσµάτων.

43 RIBA - LIA Οι µέθοδοι RIBA και LIA χρησιµοποιούν καλά καθορισµένα αντιγόνα (αποκλειστικά συνθετικά πεπτίδια ή/και ανασυνδυασµένες πρωτεΐνες), από συγκεκριµένες αντιγονικές περιοχές, υψηλής καθαρότητας, σταθεροποιηµένα σε νάϋλον µεµβράνη. Επιπλέον το στριπ περιλαµβάνει 4 ζώνες ελέγχου: µία ζώνη στρεπταβιδίνης, ασθενή και ενδιάµεση θετική ζώνη ελέγχου (human IgG), και µία ισχυρά θετική (anti-human IgG) ζώνη, που ελέγχει επίσης και τη προσθήκη του δείγµατος.

44 NAT TECHNOLOGY Ο έλεγχος του αίµατος και των παραγώγων του, για τα µεταδιδόµενα µε το αίµα παθογόνα, µέχρι πρόσφατα γινόταν αποκλειστικά µε τις, µεγάλης ευαισθησίας και ειδικότητας, ορολογικές δοκιµασίες που αναφέρθηκαν. Περιοριστικοί παράγοντες: - το παράθυρο οροµετατροπής που µεσολαβεί από τη στιγµή της µόλυνσης µέχρι την εµφάνιση στον ορό ανιχνεύσιµων αντιγόνων ή αντισωµάτων - αδυναµία ανάπτυξης αντισωµάτων - µεταλλαγµένα στελέχη ιών - χαµηλά κ µη ανιχνεύσιµα επίπεδα αντιγόνων

45 NAT TECHNOLOGY Η περίοδος παραθύρου ποικίλλει ανάλογα µε το είδος του παθογόνου: HBV: 10-12ηµ. 12ηµ. HBsAg HCV: 60-90ηµ. anti-hcv ηµ. HCVAg HIV: 20-30ηµ. anti-hiv1+2 15ηµ. HIVAg Απάντηση στο πρόβληµα παραθύρου έδωσε η εφαρµογή του Μοριακού Ελέγχου που περιλαµβάνει τεχνικές ανίχνευσης νουκλεϊνικών οξέων (NAT),, οι οποίες µειώνουν δραστικά το χρόνο ανίχνευσης.

46 ΜΟΡΙΑΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ Στην επιτακτική ανάγκη παροχής ασφαλέστερου αίµατος αποφασίστηκε η εφαρµογή του Μοριακού Ελέγχου σε όλες τις µονάδες αίµατος αρχικά στις ΗΠΑ και Ευρώπη και µεταγενέστερα στην Ελλάδα (2008). Οι τεχνικές NAT συµπληρώνουν τον ορολογικό έλεγχο για τα τρία βασικά παθογόνα HBV, HCV, HIV και εκτελούνται σε καθορισµένα από το Υπουργείο Κέντρα Μοριακού Ελέγχου (9).

47 ΚΜΕ Αλεξανδρούπολη ΚΜΕ Ιωάννινα ΚΜΕ Λάρισα ΚΜΕ Θεσσαλονίκη Πληθυσµός : Αιµοληψίες : Εγχώριες αιµοληψίες: 617,462 Εισαγόµενες αιµοληψίες από Ελβετικό ΕΡ.Σταυρό: οθείσες αιµοληψίες (µεταγγίσεις) : 618,047 Κέντρα Μοριακού Ελέγχου (ΚΜΕ) : 9 ΚΜΕ Πάτρα Αθήνα Χ 3 ΚΜΕ»ΛΑΙΚΟ» ΚΜΕ «ΓΕΝΝΗΜΑΤΑΣ» ΚΜΕ «ΕΚΕΑ» ΚΜΕ Κρήτη

48 ΜΟΡΙΑΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ Την έγκριση για την εκτέλεση του Μοριακού Ελέγχου του αίµατος στην Ελλάδα έχουν πάρει τα συστήµατα ΝΑΤ δύο συγκεκριµένων εταιρειών: - ROCHE DIAGNOSTICS (COBAS AMPLISCREEN, COBAS s201 SYSTEM, COBAS TaqScreen MPX) - CHIRON INC. (PROCLEIX ULTRIO TIGRIS) Οι τεχνικές NAT που χρησιµοποιούν τα παραπάνω συστήµατα στηρίζονται στις µεθόδους της Αλυσιδωτής Αντίδρασης της Πολυµεράσης (Polymerase Chain Reaction - PCR),, της Real-Time PCR (RT-PCR) και της Τranscription Mediated Amplification (TMA TMA) και ανιχνεύουν ταυτόχρονα τους ιούς HIV, HBV, HCV.

49 Η κλασσική PCR Η «κλασσική» PCR αποτελεί από το 1983 µέθοδο-κλειδί στην Έρευνα µε πάνω από δηµοσιεύσεις. Από τότε έχει καθιερωθεί σαν µέθοδος αναφοράς στην Μοριακή ιάγνωση σε τοµείς όπως η ιολογία, η µοριακή µικροβιολογία, η ογκολογία, η γενετική και ο µοριακός έλεγχος του µεταγγιζόµενου αίµατος

50 Η κλασσική PCR Η PCR είναι µία εξαιρετικά ευαίσθητη µέθοδος που επιτρέπει: - την ανίχνευση ακόµη και ενός κυττάρου - την παραγωγή, µε κατάλληλες συνθήκες, µεγάλης ποσότητας από την αλληλουχία στόχο µέσω της επανάληψης µίας σειράς γεγονότων (PCR κύκλων) Πραγµατοποιείται µε το ένζυµο Taq Polymerase (Thermus aquaticus Polymerase) που αποµονώθηκε από το οµώνυµο βακτήριο.

51 Thermus aquaticus The bacterium Thermus aquaticus was first discovered in several springs in the Great Fountain area of the Lower Geyser Basin at Yellowstone National Park

52 Ένας PCR κύκλος συγκροτείται από 3 επιµέρους φάσεις: 1. Αποδιάταξης (Denaturation) 2. Επανασύνδεσης (Annealing) 3. Επιµήκυνσης (Elongation) Ένα τυπικό PCR περιλαµβάνει κύκλους

53 ΣΤΑ ΙΑ PCR step 1 - Denaturation (optimal temperature is 94 C) By heating the DNA, the double strand melts and open to single stranded DNA.

54 ΣΤΑ ΙΑ PCR step 2 - Annealing (optimal temperature is 60 C) The single-stranded stranded primers bind to their complementary single-stranded stranded bases on the denaturated DNA.

55 ΣΤΑ ΙΑ PCR step 3 - Extension 72 C is the ideal temperature for the Taq polymerase to attach and start copying the template. The result is two new helixes in place of the first.

56 Αρχικό δίκλωνο µόριο (DNA template) Τέλος ενός κύκλου PCR Αλληλουχία- στόχος 2 νέες αλυσίδες DNA... 2 ν αντίγραφα της αλληλουχίας στόχου, έπειτα από ν κύκλους

57 Η Real-Time PCR Στην Real Time PCR έχουµε ένα πολύ σηµαντικό πλεονέκτηµα : εκτός των εκκινητών (primers) χρησιµοποιούνται διαφορετικά ζευγάρια ιχνηθετών (Probes), σηµασµένα µε διαφορετικές φθορίζουσες χρωστικές Έτσι µπορούµε να µετράµε ταυτόχρονα στο ίδιο σωληνάριο αντίδρασης διαφορετικές παραµέτρους (Multiplexing PCR). Επίσης, µπορούµε να διακρίνουµε την αλληλουχία στόχο από την αλληλουχία του εσωτερικό µάρτυρα (Internal Control), εκτιµώντας έτσι την απόδοση της ανάλυσης (διάκριση ψευδώς θετικών).

58 Η Real-Time PCR Οι διαφορετικές χρωστικές µετρούνται σε κανάλια µέτρησης φθορισµού σχεδιασµένα για να µετρούν φθορισµό που εκπέµπεται σε διαφορετικά µήκη κύµατος. (π.χ. 530nm, 640nm, 705nm)

59 ΣΤΑ ΙΑ ΤΗΣ Real-Time PCR diagram taken from TaqMan Gold RT-PCR kit protocol (PE Applied Biosystems)

60 ΤΜΑ Η µέθοδος ΤΜΑ δίνει τη δυνατότητα ταυτόχρονης ανίχνευσης των ιών HIV, HCV και HBV µέσα σε ένα σωληνάριο. Περιλαµβάνει τα παρακάτω βήµατα: 1) Απελευθέρωση του γενετικού υλικού του ιού ή των ιών που υπάρχουν στο δείγµα, δέσµευση του γενετικού υλικού τους πάνω σε µαγνητικά µικροσφαιρίδια και αποµάκρυνση όλων των υπόλοιπων συστατικών του αίµατος. 2) Ενίσχυση του αποµονωµένου γενετικού υλικού, έτσι ώστε να παραχθούν έως και δισεκατοµµύρια αντίγραφα. 3) Σήµανση των προϊόντων της ενίσχυσης και ανίχνευσή τους.

61 ΤΜΑ Για την πιστοποίηση της σωστής εκτέλεσης κάθε βήµατος το σύστηµα χρησιµοποιεί έναν εσωτερικό µάρτυρα (Internal Control, IC) ο οποίος είναι ένα συνθετικό ολιγονουκλεοτίδιο, που υφίσταται την ίδια επεξεργασία µε τα νουκλεϊκά οξέα του ιού. Οι δοκιµασίες Procleix, όπως η οκιµασία Procleix HIV/ HCV/ HBV, χρησιµοποιούν την τεχνολογία Ενίσχυσης Μέσω της Μεταγραφής (TMA) για να απλοποιήσουν τη διαδικασία του Μοριακού Ελέγχου κάνοντας δυνατή την ταυτόχρονη ανίχνευση πολλών ιών µέσα σε ένα σωληνάριο.

62 ΕΛΕΓΧΟΜΕΝΑ ΠΑΘΟΓΟΝΑ HBV HCV HIV 1+2 HTLV I/II ΣΥΦΙΛΗ

63 Ο ΙΟΣ HBV Ανακαλύφθηκε το 1965 και συνεχίζει έκτοτε να αποτελεί ένα πολύ σοβαρό πρόβληµα στη δηµόσια υγεία. Υπολογίζεται ότι παγκόσµια >2 δισ. άτοµα έχουν µολυνθεί από τον ιό και περίπου 350 εκ. είναι χρόνιοι φορείς. Κάθε χρόνο καταγράφονται περίπου 4 εκ. νέες περιπτώσεις οξείας ηπατίτιδας Β και εκ. θάνατοι από κίρρωση, ηπατοκυτταρικό καρκίνο ή κεραυνοβόλο ηπατίτιδα

64 Η ΟΜΗ ΤΟΥ Είναι το πρωτότυπο και πιο σηµαντικό µέλος, παρότι ο µικρότερος σε µέγεθος ιός, µιας οικογένειας ζωικών ιών παρόµοιας δοµής και βιολογίας, των Hepadna- ιών. Κύρια χαρακτηριστικά του είναι: - η ειδικότητα ως προς το είδος του ξενιστή (άνθρωπος και ανώτερα θηλαστικά) - ο ηπατοτροπισµός - ο χρόνος επώασης: περίπου ηµέρες - η ασυπτωµατική νόσος

65 Η ΟΜΗ ΤΟΥ Μετά από παρατήρηση σε ηλεκτρονικό µικροσκόπιο αποµονωµένων ιών από ανθρώπινο ορό, διαπιστώνεται η ύπαρξη τριών ειδών σωµατιδίων: - σωµατίδια διπλού τοιχώµατος µε διάµετρο 43nm τα οποία ονοµάζονται «σωµατίδια Dane», από το όνοµα αυτού που τα πρωτοανακάλυψε, και αφορούν τους πλήρεις ιούς. - σωµατίδια σφαιρικού σχήµατος µε διάµετρο 20nm, τα οποία απαριθµούνται κατά φορές περισσότερο από τους πλήρεις ιούς. - σωµατίδια σωληνοειδούς σχήµατος µε διάµετρο 20nm και ποικίλο µήκος.

66 Η ΟΜΗ ΤΟΥ Κοινό τους: µία αντιγονική γλυκοπρωτείνη µεγέθους 24kd στην εξωτερική τους πλευρά, γνωστή ως αντιγόνο επιφανείας του ιού της ηπατίτιδας Β (HbsAg) ή Αυστραλιανό αντιγόνο. Σωµατίδια Dane (ιός): α. εξωτερικό λιπιδικό τοίχωµα (envelope) πάχους 7 nm, που φέρει τις αντιγονικές γλυκοπρωτείνες και β. εσωτερικό πρωτεινικό πυρήνα (core) πάχους 27nm, που περιέχει το γενετικό υλικό και την ενδογενή DNA πολυµεράση.

67 Hepatitis B Virion, Dane particle and HBsAG

68 ΓΟΝΙ ΙΩΜΑ Το γενετικό υλικό του ιού είναι ένα µερικά δίκλωνο, κυκλικό µόριο DNA. - Αποτελείται από δύο επιµέρους αλυσίδες (L & S) µε διαφορές ως προς το µήκος και την πολικότητα. Το µήκος της µεγάλης αλυσίδας φθάνει στα νουκλεοτίδια. Ο ιός κωδικοποιεί και µεταφέρει µια Αντίστροφη Μεταγραφάση (Reverse Transcriptase) καθώς και διάφορες αντιγονικά και κλινικά σηµαντικές πρωτεΐνες. Η αντιγραφή του επιτυγχάνεται µέσω ενός ενδιάµεσου RNA µετάγραφου. Το ιικό DNA ενσωµατώνεται στο DNA του ξενιστή

69 ΓΟΝΙ ΙΩΜΑ Στο γονιδίωµα του ιού βρίσκονται 4 γονίδια γνωστά ως C, X, P και S που κωδικοποιούν τις αντιγονικές πρωτείνες του ιού: - Η πρωτεΐνη του πυρήνα (HBcAg) κωδικοποιείται από το γονίδιο C - Η πρωτεΐνη του φακέλου (HBeAg) παράγεται από πρωτεόλυση της pre-core πρωτεΐνης - Η DNA polymerase κωδικοποιείται από το γονίδιο P - Το αντιγόνο επιφανείας (HBsAg) κωδικοποιείται από το γονίδιο S - Η λειτουργία της πρωτείνης που κωδικοποιείται από το γονίδιο X δεν έχει πλήρως διευκρινιστεί

70 Ο κύκλος ζωής του ιού της Ηπατίτιδας Β

71 ΟΡΟΛΟΓΙΚΟΙ ΥΠΟΤΥΠΟΙ & ΓΟΝΟΤΥΠΟΙ Ο ιός, µε βάση τους αντιγονικούς επιτόπους των πρωτεΐνών του φακέλου, χωρίζεται σε 9 υπότυπους: adrq+/q-, adw, adw4, ayr, ayw1-4 και µε βάση τη γενετική του ποικιλότητα σε 8 γονότυπους: A-H Ο γονότυποι έχουν συγκεκριµένη γεωγραφική κατανοµή και χρησιµοποιούνται στην καταγραφή της εξέλιξης και µετάδοσης του ιού. ιαφορές ανάµεσα στους γονότυπους επηρεάζουν τη διαφορικότητα της νόσου, τη διάρκεια και τις επιπλοκές της, την ανταπόκριση στη θεραπεία και πιθανά στον εµβολιασµό.

72 ΓΕΩΓΡΑΦΙΚΗ ΚΑΤΑΝΟΜΗ ΓΟΝΟΤΥΠΟΙ A B C D E F G H ΟΡΟΛΟΓΙΚΟΙ ΥΠΟΤΥΠΟΙ adw2 ayw1 adw2 ayw1 adw2 adrq+ adrq- ayr ayw2 ayw3 ayw4 adw4q adw2 ΠΕΡΙΟΧΗ ΠΟΥ ΕΝ ΗΜΕΙ Β. &. Ευρώπη Κεντρ. Αφρική Ινδονησία, Κίνα Βιετνάµ, ΗΠΑ Ανατολική Ασία Κορέα, Κίνα, Ιαπωνία Πολυνησία Βιετνάµ Μεσογειακές Χώρες, ΗΠΑ Ινδία. & Ν. Αφρική Ν. Αµερική, πολυνησία Ευρώπη, ΗΠΑ Κ.& Ν. Αµερική

73 ΕΠΙ ΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ HBV ΛΟΙΜΩΞΗΣ Figure Worldwide prevalence of hepatitis B carriers and primary hepatocellular carcinoma. (Courtesy Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta.) From Murray et. al., Medical Microbiology 5 th edition, 2005, Chapter 66, published by Mosby Philadelphia,,

74 ΤΡΟΠΟΙ ΜΕΤΑ ΟΣΗΣ Η µετάδοση του ιού γίνεται µέσω έκθεσης σε µολυσµένο αίµα ή σωµατικά υγρά. Αναλυτικά: - µετάγγιση αίµατος & παραγώγων του - σεξουαλική επαφή - χρήση µη αποστειρωµένων ιατρικών ειδών - κάθετη µετάδοση από τη µητέρα στο παιδί κατά το τοκετό (20%-90%) - άλλες αιτίες (30%)

75 ΠΟΡΕΙΑ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ From Murray et. al., Medical Microbiology 5 th edition, 2005, Chapter 62, published by Mosby Philadelphia,,

76 ΟΞΕΙΑ ΗΠΑΤΙΤΙ Α Β Note: Pattern of serological markers varies depending on whether the infection if acute or chronic CDC website:

77 Notes: In patients with chronic HBV infection, both HBsAg and IgG anti- HBc remain persistently detectable, generally for life. HBeAg is variably present in these patients. The presence of HBsAg for 6 months or more is generally indicative of chronic infection. In addition, a negative test for IgM anti-hbc together with a positive test for HBsAg in a single serum specimen usually indicates that an individual has chronic HBV infection. ΧΡΟΝΙΑ ΗΠΑΤΙΤΙ Α Β

78 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΙΑΓΝΩΣΗ Η εργαστηριακή διάγνωση της Ηπατίτιδας Β περιλαµβάνει: Ορολογικό έλεγχο Μοριακό έλεγχο (ΝΑΤ) Οι ορολογικές δοκιµασίες ελέγχου της HBV λοίµωξης (ELISA, MEIA, CMIA, ECLIA) ελέγχουν είτε τα αντιγόνα του ιού είτε τα αντισώµατα που παράγει ο οργανισµός έναντι αυτού.

79 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΙΑΓΝΩΣΗ Ορολογικός έλεγχος Το πρώτο ανιχνεύσιµο ιικό αντιγόνο που εµφανίζεται µετά τη µόλυνση είναι το HBsAg. Ο έλεγχός του ξεκίνησε το 1975 και έκτοτε όλες οι εγκεκριµένες δοκιµασίες ελέγχου που εφαρµόζονται σήµερα στην Αιµοδοσία είναι ικανές να ανιχνεύουν συγκεντρώσεις του <0.5IU/ml. Εν τούτοις, κατά την αρχική φάση το HBsAg µπορεί να µην είναι ανιχνεύσιµο παρότι παρόν. Κατά τη διάρκεια αυτής της φάσης, γνωστής ως περίοδος παραθύρου, το άτοµο, ενώ αποβάλλει επιτυχώς τον ιό, παραµένει µολυσµατικό.

80 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΙΑΓΝΩΣΗ Ορολογικός έλεγχος Το µόνο ορολογικό στοιχείο της λοίµωξης που ανιχνεύεται στη φάση αυτή είναι τα IgM-abs έναντι του αντιγόνου core (HBcAg). Αµέσως µετά το HBsAg εµφανίζεται το αντιγόνο e (HBeAg), το οποίο ανιχνεύεται νωρίς στη διάρκεια της οξείας αλλά και της χρόνιας λοίµωξης και συνδέεται µε ενεργό πολλαπλασιασµό του ιού και υψηλή µολυσµατικότητα. Στη πορεία της λοίµωξης το HBeAg εξουδετερώνεται και αναπτύσσονται αντισώµατα έναντι αυτού (anti- HBe)

81 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΙΑΓΝΩΣΗ Ορολογικός έλεγχος Στην αποδροµή της νόσου το HBsAg σταδιακά εξαφανίζεται και αναπτύσσονται IgG αντισώµατα anti- HBs και anti-hbc HBc. Το διάστηµα που µεσολαβεί µέχρι την εµφάνιση του anti-hbs ονοµάζεται επίσης περίοδος παραθύρου. H πλήρης ίαση συνδέεται µε την απώλεια της ιαιµίας κ της µολυσµατικότητας. Λανθάνουσα Ηπατίτιδα Β : φάση χαµηλής ιαιµίας και χαµηλών έως και µη ανιχνεύσιµων επιπέδων HBsAg.

82 ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ-ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ Εξετάσεις Αποτελέσµατα Ερµηνεία HBsAg,anti-Hbc,anti-HbsHbs HBsAg, anti-hbc,anti-hbshbs HBsAg,anti-HbcHbc anti-hbs HBsAg,anti-Hbc,IgManti- HBc anti-hbs HBsAg,anti-HbcHbc IgM anti-hbc HBsAg, anti-hbs anti-hbc αρνητικά αρνητικό θετικά αρνητικά θετικά θετικά αρνητικό θετικά αρνητικά αρνητικά Θετικό Επίνοσος, συνιστάται εµβόλιασµός Φυσική ανοσία όχι επανέλεγχος - εµβολισµός Ανοσία µετά από εµβολιασµό Οξεία λοίµωξη-αυξηµένη µεταδοτικότητα Χρόνια λοίµωξη Παράθυρο σε οξ. Λοίµωξη Φυσική ανοσία µε µη ανιχνεύσιµο anti-hbs Ψευδώς θετικό anti-hbc Χρόνιοι φορείς µε µη ανιχνεύσιµο HBsAg DNA

83 ΜΕΝΟΥ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ-ΑΙΜΟ ΟΣΙΑΑΙΜΟ ΟΣΙΑ HBsAg: υποχρεωτικός έλεγχος όλων των αιµοδοτών Επί επαναλαµβανόµενα θετικού αποτελέσµατος εφαρµογή δοκιµασίας εξουδετέρωσης από το αντίστοιχο ειδικό αντίσωµα (ανταγωνιστική elisa). Επιπρόσθετη επιβεβαίωση και καθορισµός σταδίου λοίµωξης του θετικού δότη µε έλεγχο των υπόλοιπων δεικτών anti-hbc, HBeAg και anti-hbe HBe. Ο έλεγχος ρουτίνας του anti-hbc δεν είναι υποχρεωτικός µπορεί όµως να εφαρµόζεται κατ επιλογή σε συγκεκριµένους δότες. HBV-DNA στα Κέντρα Μοριακού Ελέγχου

84 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΙΚΑ Παρότι το πρόβληµα δεν φαίνεται να εξαλείφεται, ο σύγχρονος εργαστηριακός έλεγχος της Ηπατίτιδας Β, µε τη χρήση υψηλής ευαισθησίας και ειδικότητας µεθόδων (ΕΙΑs & NAT) σε συνδυασµό µε το µαζικό εµβολιασµό, που εφαρµόζεται από το 1982 στις περισσότερες χώρες, στέκεται δυνατά απέναντι σε νέες προκλήσεις όπως είναι οι µεταναστεύσεις από χώρες υψηλής ενδηµικότητας, οι µεταλλάξεις του ιού, η λανθάνουσα ηπατίτιδα κ.ά.

85 ΕΛΕΓΧΟΜΕΝΑ ΠΑΘΟΓΟΝΑ HBV HCV HIV 1+2 HTLV I/II ΣΥΦΙΛΗ

86 Ο ΙΟΣ HCV Αποµονώθηκε το 1989 και θεωρήθηκε υπεύθυνος για το 90% των ΜΑ-ΜΒ ΜΒ περιπτώσεων ηπατίτιδας οφειλόµενης σε µετάγγιση και για σποραδικές λοιµώξεις άγνωστης προέλευσης. Απασχολεί σε σηµαντικό βαθµό τον παγκόσµιο τοµέα υγείας, όπου υπολογίζεται ότι περίπου 200 εκ. άνθρωποι είναι χρόνιοι φορείς του ιού. Μεταδίδεται αποκλειστικά µε αίµα. Στις ανεπτυγµένες χώρες το 90% των χρόνιων φορέων έχουν µολυνθεί κύρια µε µετάγγιση ή ενδοφλέβια χρήση ουσιών. Στις αναπτυσσόµενες χώρες η µόλυνση κύρια προέρχεται από χρήση µολυσµένων ιατρικών ειδών ή µετάγγιση ελλειπώς ελεγµένου αίµατος και προϊόντων του.

87 Ο ΙΟΣ Ο ιός της Ηπατίτιδας C ανήκει στην οικογένεια των Flavi-ιών (Flaviviridae) που έχουν τη δυνατότητα να προκαλούν είτε οξείες, είτε χρόνιες λοιµώξεις. Παρουσιάζει µεγάλη ετερογένεια. Μέχρι στιγµής έχουν χαρακτηριστεί 6 βασικοί γονότυποι (1-6) µε πάνω από 20 υπότυπους και πολλαπλά οµοειδή. Ο χρόνος ηµιζωής του είναι 8 ώρες, ενώ κατά τον πολλαπλασιασµό του µπορούν να παραχθούν 3.7*1011 ιικά σωµατίδια ανά ηµέρα.

88 Η ΟΜΗ ΤΟΥ Αποτελείται από ένα περίβληµα λιποπρωτεινικής σύστασης και ένα πυρήνα στο εσωτερικό του. Το µέγεθός του δεν ξεπερνά τα 60nm. Το γενετικό του υλικό είναι RNA, µονόκλωνο, θετικής κατεύθυνσης, µήκους περίπου 1000 νουκλεοτιδίων, µε ένα πλαίσιο ανάγνωσης και µεγάλη µεταλλακτικότητα.

89 Η ΟΜΗ ΤΟΥ

90 5 UTR ORF C E1 E2 p7 NS2 Core protein (nucleocapsid) Envelope glycoprotein-1 HVR-1 Envelope glycoprotein-2 HVR-2 Viroporin? Zn-dependent proteinase NS3 Zn-dependent proteinase, serine protease, helicase NS4A NS4B NS3 cofactor ER-derived membranous web formation 3 UTR NS5A NS5B Unknown function; component of replicase? RNA dependent RNA polymerase

91 Diagram of HCV RNA genome with encoded proteins (reviewed in Ahmad and Alvarez, 2004; Penin et al, 2004). E2 contains two hypervariable regions (HVRs) and is the most genetically variable region of the HCV genome. This allows for evasion of host immune responses by the virus. p7 is thought to belong to the viroporin family and may aid in viral maturation and release. Expression of NS4B leads to the formation of a membranous web derived from the host cell endoplasmic reticulum. This is thought to act as a scaffold with which viral RNA and proteins can associate during viral replication. All of these proteins are possible drug targets; however, the envelope glycoproteins may be less effective targets as they are so variable. NS5B, the RNA polymerase, is the target of polymerase inhibitors in development, and NS3 is the target of a promising protease inhibitor (see Novel Drug Therapies ).

92 Ο ΚΥΚΛΟΣ ΖΩΗΣ ΤΟΥ

93 Steps in the HCV life cycle: 1. HCV virus infects human 2. Binding to unidentified cell surface receptor and internalization into host liver cell (CD81 receptor is essential but not sufficient for viral binding; CD81 is present on the surface of almost all nucleated cells as a complex with a variety of other cell-surface receptors) 3. Cytoplasmic release and uncoating of RNA genome 4. IRES-mediated translation and polyprotein processing by cellular and viral proteases 5. RNA replication (creation of minus strand template followed by production of plus strand RNA copies) 6. Packaging and assembly 7. Virion maturation 8. Release from host cell (Moradpour et al, 2001) The details of the life cycle are largely unknown and have been hypothesized based on the life cycle of closely related viruses.

94 Η ΛΟΙΜΩΞΗ Η Ηπατίτιδα C είναι αυστηρά ανθρώπινη ασθένεια. εν µπορεί να µεταδοθεί από κ πρός τα ζώα, γεγονός που κάνει και την έρευνα πιό δύσκολη. εν υπάρχει εµβόλιο για την πρόληψή της. Η οξεία Ηπατίτιδα C (πρώτοι 6 µήνες) είναι σε ποσοστό 60-70% ασυµπτωµατική και η κεραυνοβόλος είναι εξαιρετικά σπάνια. Ο ιός προκαλεί χρόνια ηπατίτιδα (>6 µήνες), συνήθως ασυµπτωµατική, σε ποσοστό 70%-80% των προσβεβληµένων ατόµων και κατά µεγάλο ποσοστό οδηγεί σε σοβαρή ηπατοπάθεια και κίρρωση ήπατος.

95 ΠΟΡΕΙΑ ΤΗΣ ΝΟΣΟΥ Initial HCV Infection Acute Phase Elevated Enzyme Levels Six Months Post Infection Naturally Clear Virus Normal Enzyme Levels 15% Six Months Post Infection Chronic Hepatitis C Inflammation 85% Slow or No Progression To Fibrosis 80% Possible Liver Transplant and/or Death* Liver Failure Liver Cancer 4% per year Cirrhosis Death of Liver Cells Compensated Decompensated 20% *The CDC estimates that hepatitis C is responsible for 8,000 to 10,000 deaths per year and could increase to 38,000 by the year 2010, surpassing annual HIV/AIDS deaths. No Adverse Effect

96 ΕΠΙ ΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ HCV ΛΟΙΜΩΞΗΣ Ο επιπολασµός της HCV λοίµωξης είναι χαµηλός στη Βόρεια Ευρώπη και στις Ηνωµένες Πολιτείες, ελαφρώς υψηλότερος στη Νότια Ευρώπη και στην Ασία και πολύ υψηλότερος στην Αφρική, όπου σε µερικές περιοχές όπως η Αίγυπτος φθάνουν και το 20%. Η συχνότητα στην Ελλάδα, δεν ξεπερνά το 2%.

97 ΕΠΙ ΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ HCV ΛΟΙΜΩΞΗΣ 0.3% 1% 0,8 % 1,2 % 1,4 % 6,8 % 13 % 0,3-0,7 % 2,5 % 0,6 % 1-5% % 1,8 % 6,5 % 1 % 0,3 % 1,5 % 0,6 % 2 % 10,6 % 2,1 % 1,8 % 10% 2,1 % Παγκόσµιος Χάρτης επιπολασµού Ηπατίτιδας C από τον Π.Ο.Υ. για το 2005

98 ΕΠΙ ΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΤΗΣ HCV ΛΟΙΜΩΞΗΣ Η µεγαλύτερη διακύµανση του επιπολασµού της HCV λοίµωξης απαντά κυρίως ανάµεσα σε οµάδες ατόµων µε διαφορετικούς παράγοντες κινδύνου µόλυνσης. Τα µεγαλύτερα ποσοστά απαντούν σε: - χρήστες ενδοφλεβίως χορηγούµενων ουσιών - αιµορροφιλικούς που χρησιµοποίησαν παράγοντες πήξης ετών πριν το άτοµα που µεταγγίσθηκαν µε αίµα και παράγωγα πριν το ασθενείς που κάνουν αιµοδιάλυση - ένα 5% µετά από τρύπηµα βελόνας - ένα 3-5% των βρεφών που γεννιούνται από θετικές µητέρες

99 ΤΡΟΠΟΙ ΜΕΤΑ ΟΣΗΣ Οι κύριες αιτίες µετάδοσης του ιού είναι: 1. µετάγγιση αίµατος και παραγώγων του (10%) 2. ενδοφλέβια χρήση ουσιών (60%) 3. εργασία σε χώρους έκθεσης σε µολυσµατικούς παράγοντες π.χ. νοσοκοµεία 4. πολλαπλοί σεξουαλικοί σύντροφοι 5. σύντροφος µε ιστορικό ηπατίτιδας και υιοθέτηση πρακτικών υψηλού κινδύνου 6. χαµηλό κοινωνικοοικονοµικό επίπεδο (10%) 7. κατά 5%-6% από HCV (+) θετική µητέρα κατά το τοκετό (14-17% 17% σε συνλοίµωξη µε HIV)

100

101 ΤΡΟΠΟΙ ΜΕΤΑ ΟΣΗΣ Παράγωγα πλάσµατος όπως η αλβουµίνη και η ανοσο σφαιρίνη για ενδοµυική χρήση δεν έχουν σχετισθεί µε τη µετάδοση της ηπατίτιδας C. Αντίθετα η ανοσοσφαιρίνη για ενδοφλέβια χρήση που δεν είχε υποστεί επεξεργασία αδρανοποίησης θεωρήθηκε υπεύθυνη για τη µεγάλη έκρηξη ηπατίτιδας C το Ανάλογα ίσχυσαν και για τους συµπυκνωµένους παράγοντες πήξης που παρασκευάζονταν από µεγάλες δεξαµενές πλάσµατος.

102 ΤΡΟΠΟΙ ΜΕΤΑ ΟΣΗΣ Η µεταµόσχευση οργάνων αποτελούσε επίσης µια σηµαντική πηγή µόλυνσης πριν τη καθιέρωση του ελέγχου στους δότες όπως και στους αιµοδότες. Στη περίοδο τα κρούσµατα ΜΑ-ΜΒ ΜΒ ηπατίτιδας µετά από µετάγγιση µειώθηκαν κατά 50% λόγω του αποκλεισµού HIV θετικών δοτών ή δοτών µε ορολογικούς δείκτες για ΜΑ-ΜΗ ΜΗ ηπατίτιδα. Από το 1992 και µετά, η µετάδοση του ιού της Ηπατίτιδας C µε τη µετάγγιση έγινε εξαιρετικά σπάνια.

103 ΤΡΟΠΟΙ ΜΕΤΑ ΟΣΗΣ Ο Ο ιός δε µεταδίδεται µε: 1. έκθεση σε ιατρικές, χειρουργικές, οδοντιατρικές επεµβάσεις και αιµοδοσία 2. τατουάζ, βελονισµό, τρύπηµα αυτιών 3. ταξίδια 4. σεξουαλική επαφή (χωρίς επαφή µε αίµα) 5. θηλασµό (χωρίς τραυµατισµό)

104 ΟΡΟΛΟΓΙΚΟ ΠΡΟΦΙΛ

105 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΙΑΓΝΩΣΗ Το Μάιο του 1990 ξεκίνησε ο έλεγχος ρουτίνας των αιµοδοτών για anti-hcv και Τον Ιούλιο του 1992 κυκλοφόρησαν στο εµπόριο δοκιµασίες µεγαλύτερης ευαισθησίας που κατάφεραν να µειώσουν το κίνδυνο µετάδοσης του ιού σε ποσοστό 0.001% / µονάδα µετάγγισης. Η εργαστηριακή διάγνωση της Ηπατίτιδας C περιλαµβάνει: Ορολογικό έλεγχο Επιβεβαιωτική δοκιµασία (RIBA, LIA) Μοριακό έλεγχο (ΝΑΤ)

106 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΙΑΓΝΩΣΗ Ορολογικές δοκιµασίες (anti HCV test) Είναι ανοσολογικές δοκιµασίες (ELISA, CMIA, ECLIA) που ανιχνεύουν τα anti-hcv HCV, 2 ης και 3 ης γενιάς, µε ανασυνδυασµένες πρωτείνες ή/και συνθετικά πεπτίδια σαν επιστρωµένα αντιγόνα. Ανιχνεύουν αντισώµατα µετά από ηµέρες σε ποσοστό >97% των µολυσµένων ατόµων, δεν µπορούν όµως να κάνουν διάκριση ανάµεσα σε παρελθούσα ή παρούσα λοίµωξη. Συνήθως το αποτέλεσµα είναι θετικό ή αρνητικό. Ένα ασθενώς θετικό αποτέλεσµα µπορεί να είναι και ψευδώς θετικό. Σε θετικό ή αµφίβολο αποτέλεσµα εφαρµόζεται επιβεβαιωτική δοκιµασία.

107 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΙΑΓΝΩΣΗ Ορολογικές δοκιµασίες (HCVAg test) Είναι ανοσολογικές δοκιµασίες (ELISA, CMIA) που ανιχνεύουν στον ορό το αντιγόνο του πυρήνα του ιού (HCV core Ag). To HCVAg ανιχνεύεται νωρίτερα από τα HCV αντισώµατα (20 ηµέρες µετά τη µόλυνση) µειώνοντας κατά πολύ τη περίοδο παραθύρου. Το αποτέλεσµα είναι θετικό ή αρνητικό και µπορεί να επιβεβαιωθεί. Η χρήση της δοκιµασίας περιορίστηκε από την καθολική εφαρµογή του Μοριακού Ελέγχου.

108 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΙΑΓΝΩΣΗ Επιβεβαιωτικές δοκιµασίες Είναι δοκιµασίες που βασίζονται στη τεχνική Western Blot και µπορεί να είναι τύπου RIBA ή LIA και χρησιµοποιούνται για την επιβεβαίωση των HCV αντισωµάτων. Συνήθως, µπορούν να διευκρινίσουν ένα πραγµατικά θετικό (θετική RIBA, LIA) ή ένα ψευδώς θετικό αποτέλεσµα (αρνητική RIBA, LIA) Σε µερικές περιπτώσεις τα αποτελέσµατα µπορεί να είναι αδιευκρίνιστα (indeterminate RIBA, LIA). Όπως και η EIAS δεν µπορούν να κάνουν διαχωρισµό σε οξεία, χρόνια ή αποδραµούσα λοίµωξη.

109 Η µέθοδος INNO-LIA HCV Score χρησιµοποιεί αντιγόνα που προέρχονται από αντιγονικές περιοχές του ιού όπως: - η περιοχή core (C1,C2) - η µεταβλητή (HVR) περιοχή Ε2 - η περιοχή της ελικάσης NS3 - οι περιοχές NS4A και NS4B - η περιοχή NS5 της RNA-πολυµεράσης Το αποτέλεσµα εκτιµάται: θετικό όταν υπάρχει (>1+) ένδειξη σε τουλάχιστον δύο διαφορετικούς επιτόπους αρνητικό όταν δεν υπάρχει καµµία ένδειξη, µόνο οι ζώνες ελέγχου απροσδιόριστο όταν δεν καλύπτει τους όρους θετικότητας

110 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΙΑΓΝΩΣΗ Μοριακός έλεγχος (ΝΑΤ) Χρησιµοποιείται για τη διάγνωση παρούσας λοίµωξης και για τον προσδιορισµό-έλεγχο της θεραπείας. Είδη: - HCV RNA test ποιοτικό,, θετικό ή αρνητικό ανάλογα αν ανιχνεύει ή δεν ανιχνεύει το RNA του ιού. Είναι το τεστ που χρησιµοποιείται για τον έλεγχο των αιµοδοτών - HCV RNA test ποσοτικό (µετρά το ιικό φορτίο) και - Γονοτυπική ανάλυση (προσδιορίζει το γονότυπο), που χρησιµοποιούνται για τον προσδιορισµό και τη παρακολούθηση της θεραπείας

111 ΜΕΝΟΥ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ-ΑΙΜΟ ΟΣΙΑΑΙΜΟ ΟΣΙΑ Anti-HCV: υποχρεωτικός έλεγχος όλων των αιµοδοτών HCV-RNA: στα Κέντρα Μοριακού Ελέγχου Επί επαναλαµβανόµενα θετικού ή αµφίβολου αποτελέσµατος εφαρµογή RIBA / LIA. Ο έλεγχος του HCV Ag δεν είναι υποχρεωτικός.

112 ΕΛΕΓΧΟΜΕΝΑ ΠΑΘΟΓΟΝΑ HBV HCV HIV 1+2 HTLV I/II ΣΥΦΙΛΗ

113 Ο ΙΟΣ HIV O ιός HIV,, είναι ο ιός που προκαλεί τη νόσο του AIDS (Acquired ImmunoDeficiency Syndrome), γνωστής ως το Σύνδροµο της Επίκτητης Ανοσολογικής Ανεπάρκειας. Η αρχική πηγή του ιού φαίνεται ότι είναι ο χιµπαντζής. Οι χιµπαντζήδες, παρά τη µεγάλη τους γενετική οµοιότητα µε τον άνθρωπο, δεν εµφανίζουν τη νόσο.

114 Η ΟΜΗ ΤΟΥ Ο HIV ανήκει στην κατηγορία των ρετροϊών, έχει δηλαδή γενετικό υλικό RNA, το οποίο µε τη δράση ενός ενζύµου µετατρέπεται σε DNA για να ενσωµατωθεί στο γονιδίωµα του ανθρώπου. Περιβάλλεται από λιπιδική µεµβράνη, η οποία φέρει δύο κύριες γλυκοπρωτεΐνες, τη gp120 και τη gp41. Στο εσωτερικό του υπάρχει ο πυρήνας που περικλείει το RNA και τη Reverse Transcriptase. Κύριο χαρακτηριστικό του η µεγάλη µεταλλακτικότητά του (µέσα στο αίµα ενός και µόνο ασθενή µπορούν να δηµιουργηθούν αρκετά διαφορετικά στελέχη).

115 Η ΟΜΗ ΤΟΥ

116 ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ Η εξάπλωση του HIV έχει πάρει το χαρακτήρα πανδηµίας, καθώς έχουν πεθάνει από AIDS περίπου 25 εκ. άτοµα, ενώ άλλα 40 εκ. υπολογίζεται ότι είναι φορείς. Το µεγαλύτερο πλήγµα έχει υποστεί η υπο-σαχάρια Αφρική, όπου σε ορισµένες περιοχές το προσδόκιµο ζωής έχει ξεπεράσει προς τα κάτω αυτό της προ-hiv εποχής. Ο HIV εµφανίστηκε στην Ελλάδα τέλος του Το 2007 δηλώθηκαν 60 νέες περιπτώσεις (44 Α & 16 Γ). Έχουν αναγνωριστεί δυο είδη του ιού: ο ιός HIV-1 και ιός HIV-2.

117 ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ HIV-1: : ευθύνεται για τη πλειοψηφία των µολύνσεων παγκόσµια (περίπου 90%) και χαρακτηρίζεται από τις περισσότερες µεταλλάξεις και γενετικούς υπότυπους. ΗIV-2: : αναγνωρίστηκε το 1986 και θεωρείται προγενέστερος τύπος από τον HIV-1. - Έχει ίδια µορφολογία, γενετική οργάνωση, συµπεριφορά, µετάδοση και δυνατότητα να προκαλεί AIDS. - Τείνει όµως να µεταδίδεται σχετικά δυσκολότερα από τον HIV-1, ενώ η εξέλιξη της νόσου στους φορείς του είναι πιο αργή.

118 HIV-1 ΥΠΟΤΥΠΟΙ - Ο HIV-1 έχει αρκετούς γνωστούς υπότυπους και µπορεί να αναπτύξει ανθεκτικότητα στα αντιρετροϊκά φάρµακα που χορηγούνται σε έναν ασθενή. - Ταξινοµείται σε 3 κύριες οµάδες: M(major), N(non-M, non-o) και O(outler). - Η οµάδα M περιλαµβάνει τους γενετικούς υπότυπους A,B,C,D,F,G,H,J και K καθώς και άλλες ανασυνδυασµένες µορφές (CRFs) CRFs). HIV-2 - Ταξινοµείται σε 6 γενετικούς υπότυπους A-G, µε συχνότερους τους A και B

119 HIV-1 ΓΕΩΓΡΑΦΙΚΗ ΚΑΤΑΝΟΜΗ - Η οµάδα Μ έχει παγκόσµια εξάπλωση προκαλώντας την πανδηµία του AIDS. - Αντίθετα οι οµάδες Ν και Ο είναι σχετικά σπάνιες και ενδηµούν στη υτική και κεντρική Αφρική. Λοιµώξεις από HIV-1 ιό της οµάδας Ο έχουν διαγνωστεί και στην Ευρώπη και ΗΠΑ. ΗIV-2 Ενδηµεί σχεδόν αποκλειστικά στη. Αφρική. Ανιχνεύεται περιστασιακά στις ΗΠΑ, Ευρώπη, Ασία και άλλες περιοχές της Αφρικής.

120 Η ΛΟΙΜΩΞΗ Η µόλυνση µε τον HIV ακολουθεί τρία διακριτά στάδια: Α στάδιο: : στιγµή της µόλυνσης µέχρι και µερικές βδοµάδες µετά από αυτή. Χαρακτηρίζεται από έντονη παραγωγή αντιγράφων του ιού στο αίµα, µαζί µε κάποια κλινικά συµπτώµατα. Ο ιός προσβάλλει κυρίως τα CD4+ λεµφοκύτταρα. Β στάδιο: : διαρκεί από µερικές εβδοµάδες έως και χρόνια και χαρακτηρίζεται από αναπαραγωγή του ιού και πτώση της συγκέντρωσης των CD4+ κυττάρων.

121 Η ΛΟΙΜΩΞΗ Γ στάδιο: χαρακτηρίζεται από µεγάλη πτώση των CD4+ και ο οργανισµός γίνεται ευάλωτος σε λοιµώξεις, σε νεοπλασίες, ασθένειες του νευρικού συστήµατος κ.ά. Αυτή είναι η νόσος του AIDS, που οδηγεί τελικά τον ασθενή στο θάνατο.

122 ΤΡΟΠΟΙ ΜΕΤΑ ΟΣΗΣ Ο ιός µεταδίδεται: 1) µε τη µετάγγιση µολυσµένου αίµατος 2) κατά τη διάρκεια της σεξουαλικής επαφής, µέσω της απευθείας επαφής µε µολυσµένο αίµα 3) από τη µολυσµένη µητέρα στο έµβρυο. Τα σωµατικά υγρά που περιέχουν HIV είναι: 1)Αίµα (και αυτό της περιόδου) 2)Σπέρµα και πιθανώς προσπερµατικά υγρά 3)Κολπικά υγρά 4)Μητρικό γάλα Άλλοι τρόποι µετάδοσης είναι: 1)Κοινή χρήση βελόνων για ναρκωτικές ουσίες 2)Μη επαγγελµατικό τατουάζ και τρύπηµα αυτιών

123 ΜΕΤΑ ΟΣΗ ΤΟΥ HIV Ο ιός δε µεταδίδεται µε: 1) Σάλιο, δάκρυα, ιδρώτα, κόπρανα ή ούρα 2) Αγκαλιά 3) Φιλί 4) Μασάζ 5) Χειραψία 6) Τσιµπήµατα εντόµων 7) Συγκατοίκηση µε κάποιον οροθετικό 8) Κοινή χρήση τουαλέτας ή ντους

124 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΙΑΓΝΩΣΗ Ορολογικός έλεγχος Οι δοκιµασίες ελέγχου που χρησιµοποιούνται στον έλεγχο των αιµοδοτών για την ανίχνευση του HIV πρέπει να διακρίνονται από υψηλή ειδικότητα και ευαισθησία. Στοιχεία του Παγκόσµιου Οργανισµού Υγείας που αφορούσαν το 2000, αναφέρουν ότι ανεπαρκής έλεγχος του µεταγγιζόµενου αίµατος είχε σαν αποτέλεσµα την εµφάνιση 1 εκ. νέων λοιµώξεων παγκόσµια.

125 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΙΑΓΝΩΣΗ Ορολογικός έλεγχος Ο εργαστηριακός έλεγχος στην Ελλάδα ξεκίνησε το 1985 για τον HIV-1 και το 1992 συµπεριέλαβε και τον HIV-2. Οι υπάρχουσες ορολογικές µέθοδοι (EIA, CMIA, ECLIA), που ανιχνεύουν αντισώµατα έναντι των HIV1+2 και των υποτύπων τους, θετικοποιούνται περίπου 20 ηµέρες µετά τη µόλυνση. Η ανάπτυξη ορολογικής µεθόδου για την ανίχνευση του αντιγόνου p24 (πρωτεΐνη του πυρήνα) συντόµευσε το χρόνο ανίχνευσης της λοίµωξης και µείωσε τη περίοδο παραθύρου οροµετατρπής.

126 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΙΑΓΝΩΣΗ Ορολογικός έλεγχος Οι περισσότερες διαθέσιµες δοκιµασίες ελέγχου ανιχνεύουν ταυτόχρονα Ag και Ab. Το αποτέλεσµα µπορεί να είναι θετικό ή αρνητικό συγκρινόµενο πάντα µε το καθοριζόµενο από τη µέθοδο cut-off. Αµφίβολα και θετικά αποτελέσµατα διευκρινίζονται µε τη χρήση εναλλακτικών µεθόδων (EIAs HIV1+2, EIA HIVAg, Western Blot, LIA)

127 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΙΑΓΝΩΣΗ WESTERN BLOT - RIBA - LIA HIV Western Blot Lane1: Positive Control Lane 2: Negative Control Sample A: Negative Sample B: Indeterminate Sample C: Positive Το αποτέλεσµα εκτιµάται: θετικό όταν υπάρχει (>1+) ένδειξη σε τουλάχιστον δύο διαφορετικούς επιτόπους αρνητικό όταν δεν υπάρχει καµµία ένδειξη, µόνο οι ζώνες ελέγχου απροσδιόριστο όταν δεν καλύπτει τους όρους θετικότητας

128 ΜΕΝΟΥ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ - ΑΙΜΟ ΟΣΙΑ Anti-HIV 1+2 (group O): υποχρεωτικός έλεγχος όλων των αιµοδοτών µε εγκεκριµένες ανοσολογικές µεθόδους HIV Ag/Ab: εναλλακτικά και κατά προτίµηση NAT-HIV: στα Κέντρα Μοριακού Ελέγχου HIV WBLOT-LIA LIA / HIV Ag: επιβεβαίωση θετικού αποτελέσµατος ή διευκρίνιση αµφίβολου στα Κέντρα Αναφοράς Ρετροϊών

129 ΕΛΕΓΧΟΜΕΝΑ ΠΑΘΟΓΟΝΑ HBV HCV HIV 1+2 HTLV I/II ΣΥΦΙΛΗ

130 Ο ΙΟΣ HTLV Ο HTLV (Human T-lymphotropic virus) ανήκει στην υποοικογένεια onco-rna rna-virus της οικογένειας των Retroviridae και είναι λεµφοτρόπος και νευροτρόπος. Ανακαλύφθηκε το 1977 στην Ιαπωνία. Υπάρχουν δύο είδη ιών: ο HTLV I και ο HTLV II. Οι ανθρώπινοι Τ-λεµφοτρόποι ιοί τύπου Ι και ΙΙ (HTLV I/II) είναι οι πρώτοι ανθρώπινοι ρετροϊοί που ταυτοποιήθηκαν το 1980 και το 1982 αντίστοιχα. Kαι για τους δύο τύπους ιών (Ι/ΙΙ) η µόλυνση παραµένει δια βίου, όπως και τα ειδικά προς αυτόν αντισώµατα που αναπτύσσει ο φορέας.

131 Ο ΙΟΣ HTLV-I : - αποδείχθηκε ότι είναι ο αιτιολογικός παράγοντας δύο πολύ καλά καθορισµένων ασθενειών: - της λευχαιµίας ενηλίκων από τα Τ-κύτταρα (ATLL ATLL) - µίας χρόνιας νευρολογικής πάθησης γνωστής σαν HTLV-I συνδεόµενη µυελοπάθεια ή τροπική σπαστική παραπάρεση (HAM-TSP) Οι δύο αυτές ασθένειες απαντούν σε µικρό ποσοστό (όχι περισσότερο από 2% - 4%) των ατόµων που έχουν µολυνθεί από τον ιό και εκδηλώνονται µετά από πολλά χρόνια φορίας του ιού (15 έως 20).

132 HTLV-IΙ: Ο ΙΟΣ - Μέχρι πρόσφατα δεν έχει αποδειχθεί ότι συνδέεται µε κάποια συγκεκριµένη ασθένεια, παρότι για πρώτη φορά ανιχνεύθηκε σε ασθενή µε λευχαιµία εκ τριχωτών κυττάρων. - Υπάρχουν επίσης ενδείξεις ότι και αυτός σχετίζεται µε την ασθένεια HAM-TSP TSP. - εν έχει διαπιστωθεί µέχρι σήµερα η µετάδοσή του µε την µετάγγιση.

133 Η ΟΜΗ ΤΟΥ Αποτελείται από έναν εξωτερικό γλυκοπρωτεϊνικό φάκελο που περιβάλλει τον πυρήνα, ο οποίος περιλαµβάνει τις αντιγονικές gag-πρωτεΐνες, δύο αντίγραφα µονόκλωνου RNA και το ένζυµο αντίστροφη µεταγραφάση. Το RNA του ιού φέρει 3 κύρια γονίδια τα gag, pol και env, τα οποία µαζί µε άλλα ρυθµιστικά είναι απαραίτητα για την επιβίωση και αναπαραγωγή του στο κύτταρο ξενιστή.

134 Η ΟΜΗ ΤΟΥ Στον HTLV-Ι, το γονίδιο gag κωδικοποιεί τις αντιγονικές πρωτείνες p55/24/19, το pol κωδικοποιεί το ένζυµο αντίστροφη µεταγραφάση και το env κωδικοποιεί τις γλυκοπρωτείνες του φακέλου gp61/46/21. Στον HTLV-ΙΙ, µε 65% οµοιότητα σε επίπεδο νουκλεοτιδίων µε τον Ι, το γονίδιο gag κωδικοποιεί τις αντιγονικές πρωτείνες p53/24/19, το pol και το env τις ίδιες µε τον ιό Ι.

135 ΕΠΙ ΗΜΙΟΛΟΓΙΑ Ο HTLV-I ενδηµεί στη Ν. Ιαπωνία, στη Καραϊβική, σε τµήµατα της Ν. και Κ. Αµερικής, στην Κ. και. Αφρική µε συχνότητα που αγγίζει το 15% του πληθυσµού, στην Μελανησία και σε µερικούς αποµονωµένους πληθυσµούς. Ο HTLV-II ενδηµεί σε οµάδες Ινδιάνων της Αµερικής, σε φυλές Πυγµαίων της Κ. Αφρικής και είναι πολύ συχνό φαινόµενο σε χρήστες ενδοφλεβίων ναρκωτικών, κυρίως στην Αµερική σε ποσοστό1%- 2%.

136 HTLV 1 & 2

137 ΤΡΟΠΟΙ ΜΕΤΑ ΟΣΗΣ Ο ιός HTLV µεταδίδεται µέσω σωµατικών υγρών µε: - µετάγγιση µολυσµένων κυτταρικών στοιχείων αίµατος - µολυσµένες µητέρες: κατά το θηλασµό σε ποσοστό 20% µέσω των προσβεβληµένων λεµφοκυττάρων ή µέσω του πλακούντα, όπως διαπιστώθηκε µετά από µελέτες σε καλλιέργειες λεµφοκυττάρων οµφάλιου λώρου - σεξουαλική επαφή (από άνδρα σε γυναίκα, από άνδρα σε άνδρα µέσω των µολυσµένων κυττάρων του σπέρµατος - κοινή χρήση µολυσµένης σύριγγας σε χρήστες ενδοφλεβίων ναρκωτικών

138 ΤΡΟΠΟΙ ΜΕΤΑ ΟΣΗΣ Σύµφωνα µε µελέτες που έγιναν στην Ιαπωνία, αίµα συντηρηµένο και όχι πρόσφατο είχε µειωµένη δυνατότητα µετάδοσης του ιού. Η πιθανότητα µετάδοσης σχετιζόταν µε την αύξηση του χρόνου συντήρησης των κυτταρικών στοιχείων αίµατος (79.2% για χρόνο συντήρησης 1-5 ηµέρες, 63.6% για 6-10 ηµέρες και 55% για ηµέρες). Η µετάδοση του ιού δεν έχει σχετιστεί µε την µετάγγιση µη κυτταρικών στοιχείων, όπως το πλάσµα και τα παράγωγά του.

139 Η ΛΟΙΜΩΞΗ Τα αντισώµατα συνήθως ανιχνεύονται ηµέρες µετά την µετάγγιση, παρότι ο χρόνος οροµετατροπής µπορεί να φθάσει και τις 98 ηµέρες. IgM αντισώµατα ανιχνεύονται στην πρώιµη φάση της λοίµωξης, ενώ τα IgG παραµένουν σε υψηλούς τίτλους κατά τη διάρκεια της λοίµωξης.

140 ΕΠΙΠΟΛΑΣΜΟΣ ΤΗΣ HTLV ΛΟΙΜΩΞΗΣ Με την εφαρµογή του εργαστηριακού ελέγχου στις ΗΠΑ, ποσοστό 0.043% των αιµοδοτών βρέθηκαν θετικοί και 52% αυτών βρέθηκαν να είναι µολυσµένοι µε τον ιό τύπου ΙΙ Στις ευρωπαϊκές χώρες τα ποσοστά µόλυνσης ήταν γενικά χαµηλότερα και η πλειονότητα των περιπτώσεων ήταν τύπου Ι. - Γαλλία: 0.004% µε το 99% των περιπτώσεων τύπου Ι και 1% τύπου ΙΙ. - Ολλανδία: 0.002%. - Ισπανία και Σουηδία: 0.002% - ανία: 0.003% - UK: 0.005%, - Γερµανία: κυµαινόµενο από 0.001% µέχρι 0.004%. - Ελλάδα: 0.02% (δεδοµένα του 2000)

141 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΙΑΓΝΩΣΗ Ο εργαστηριακός έλεγχος των αιµοδοτών ανά τον κόσµο ξεκίνησε: στην Ιαπωνία στην Αµερική (0.043% των αιµοδοτών θετικοί, 52% αυτών µολυσµένοι µε τον ιό τύπου ΙΙ) στο Καναδά στην Γαλλική Καραϊβική και το 1991 σε ολόκληρη την γαλλική επικράτεια (0.004% µε το 99% των περιπτώσεων τύπου Ι και 1% τύπου ΙΙ) στην Ολλανδία (0.002% των αιµοδοτών θετικοί) στην Σουηδία, Ισπανία (0.002% των αιµοδοτών θετικοί) και ανία (0.003%) - >1995 στην Ελλάδα (<0.001%)

142 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΙΑΓΝΩΣΗ Στηρίζεται στην ανίχνευση αντισωµάτων έναντι και των δύο ιών HTLV I/II. Λόγω της µεγάλης οµολογίας µεταξύ των δύο τύπων Ι και ΙΙ, τα αντιγόνα που είναι ειδικά για τον ιό τύπου Ι µπορούν µέσω διασταυρούµενων αντιδράσεων να ανιχνεύουν και αντισώµατα για τον ιό τύπου ΙΙ. Οι ανοσολογικές µέθοδοι (EIAs, CMIA) που χρησιµοποιούνται βασίζονται σε τεχνική sandwich και ανιχνεύουν όλα τα είδη αντισωµάτων (IgM,IgG,IgA). Στις µεθόδους αυτές χρησιµοποιούνται µόνο ανασυνδυασµένες πρωτεΐνες ή συνθετικά πεπτίδια και όχι ιικό εκχύλισµα, γεγονός που βελτιώνει την ειδικότητα και την ευαισθησία της µεθόδου.

143 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΙΑΓΝΩΣΗ είγµατα που αντιδρούν θετικά σε µία τέτοια διαγνωστική δοκιµασία υποβάλλονται σε συµπληρωµατικό έλεγχο µε µία από τις διαθέσιµες στο εµπόριο συµπληρωµατικές-επιβεβαιωτικές δοκιµασίες όπως: - Western Blot - LIA & RIBA - PCR Σηµαντικός αριθµός δειγµάτων επαναλαµβανόµενα θετικών στον αρχικό έλεγχο, είτε δεν επιβεβαιώνονται ως θετικά είτε επιβεβαιώνονται ως θετικά αλλά δεν µπορούν µε σαφήνεια να ταυτοποιηθούν σαν HTLV-I ή HTLV-II II.

144 ΜΕΝΟΥ ΕΞΕΤΑΣΕΩΝ - ΑΙΜΟ ΟΣΙΑ Anti-HTLV I/II: υποχρεωτικός έλεγχος των αιµοδοτών Επανέλεγχος σε περίπτωση θετικού ή αµφίβολου αποτελέσµατος µε την ίδια ή άλλη µέθοδο Επιβεβαιωτική δοκιµασία Western Blot / LIA / RIBA ή PCR σε εξειδικευµένα εργαστήρια ή σε Κέντρα Αναφοράς Ρετροϊών

145 ΕΛΕΓΧΟΜΕΝΑ ΠΑΘΟΓΟΝΑ HBV HCV HIV 1+2 HTLV I/II ΣΥΦΙΛΗ

146 TREPONEMA PALLIDUM - SYPHILIS

147 TREPONEMA PALLIDUM Το Treponema pallidum είναι είδος σπειροχαίτης µε υποείδη που προκαλούν διάφορα αφροδίσια νοσήµατα όπως η σύφιλη. εν ανιχνεύεται µε χρώση κατά Gram γιατί είναι πολύ µικρός οργανισµός Καταστρέφεται ραγδαία εκτός της κυκλοφορίας του αίµατος, κάτω από συνθήκες θερµότητας, ξηρασίας, αλλαγών στο ph ή σε επαφή µε σαπούνι και νερό. Απαιτεί αναερόβιο περιβάλλον και η βιωσιµότητά του µειώνεται ραγδαία παρουσία οξυγόνου.

148 ΣΥΦΙΛΗ Η µεταδιδόµενη µε την µετάγγιση σύφιλη ήταν ένα καλά αναγνωρισµένο σύνδροµο που περιγράφηκε για πρώτη φορά το Αργότερα αναγνωρίσθηκαν και περιγράφηκαν αρκετές ακόµα περιπτώσεις : 1940: αποκλεισµός χρήσης αίµατος από νεκρό δότη. Τέλος της δεκαετίας του '50, στις ανεπτυγµένες χώρες, µετά από έξαρση της σύφιλης κατά το Β Παγκόσµιο Πόλεµο, παρατηρήθηκε αισθητή µείωση των αναφερόµενων περιπτώσεων σύφιλης, ενώ στις δεκαετίες του '60 και '70 διαπιστώθηκε πάλι αύξηση.

149 ΣΥΦΙΛΗ Κατά τη δεκαετία του '80 παρατηρήθηκε µία τροµακτική αύξηση στις ΗΠΑ, που έφτασε το 1989 στον υψηλότερο αριθµό κρουσµάτων που είχαν αναφερθεί από το Στη σύγχρονη εποχή, τα κρούσµατα είναι αρκετά σπάνια στις χώρες του υτικού Κόσµου, ενώ τα επίπεδα στις Αφρικανικές κυρίως χώρες παραµένουν υψηλά. Τυχαίες εξάρσεις συνδέονται λόγω της µετανάστευσης από ενδηµικές χώρες.

150 Η ΛΟΙΜΩΞΗ Η φάση της σπειροχαιταιµίας είναι πολύ σύντοµη και οι σπειροχαίτες επιζούν µόνο για λίγες ηµέρες στους 4 ο C. Για το λόγο αυτό ενώ η µετάδοση της σύφιλης µε την µετάγγιση είναι γεγονός, συµβαίνει αρκετά σπάνια. Μελέτες έδειξαν ότι ο χρόνος επώασης της µετα- µετάγγιση σύφιλης ποικίλει από 4 εβδοµάδες έως 4.5 µήνες µε ένα ενδιάµεσο 9-10 εβδοµάδων και ότι ο λήπτης συνήθως εκδηλώνει µία τυπική δευτερογενή έξαρση. Επίσης έδειξαν ότι ακόµα και δότες που έχουν σύφιλη σε λανθάνουσα κατάσταση είναι δυνατό να τη µεταδώσουν στο δέκτη.

151 ΤΡΟΠΟΙ ΜΕΤΑ ΟΣΗΣ Η σύφιλη µεταδίδεται : - µέσω της µετάγγισης, εφόσον το αίµα είναι πρόσφατο και δεν έχει συντηρηθεί σε ψύξη (4 ο C) Μελέτες έδειξαν ότι υπάρχει µεγάλη σχέση ανάµεσα στον αριθµό των σπειροχαιτών ανά µονάδα αίµατος και στην βιοσιµώτητά τους (σε συγκέντρώσεις 1.3 Χ 10 6 και 2.5 Χ 10 7 / ml αίµατος η βιωσιµότητά τους έφθασε τις 120 ώρες. Αίµα αποθηκευµένο για 48 έως 72 ώρες σε θερµοκρασία 4 ο C, δεν περιέχει ζωντανές σπειροχαίτες. - µέσω της σεξουαλικής επαφής - από την µητέρα στο έµβρυο µέσω του πλακούντα

152 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ Ο λοιµογόνος παράγοντας Treponema pallidum ανιχνεύεται µε ορολογικές µεθόδους οι οποίες είναι: - µη ειδικές (nontreponemal) VDRL (venereal disease research lab slide technique) ποσοτική και RPR (rapid plasma reagin test) Ανιχνεύουν αντισώµατα έναντι των προϊόντων λύσης κυττάρων εξαιτίας της σύφιλης, έχουν χαµηλό κόστος, χαµηλή ειδικότητα, υψηλή όµως ευαισθησία στη διάγνωση µολυσµατικής σύφιλης.

153 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ - ειδικές (anti-treponemal) treponemal) δοκιµασίες TPHA: Treponema pallidum haemaglutination assay FTA-ABS: : fluorescent treponema abs absorption test Elisa Ανιχνεύουν ειδικά αντισώµατα, χαρακτηρίζονται από υψηλή ειδικότητα και ευαισθησία, αλλά είναι συχνά πολύπλοκες και αρκετά ακριβές για να αποτελέσουν µέθοδο ελέγχου ρουτίνας.

154 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ Σε ποσοστό περίπου 80% θετικά αποτελέσµατα των µη-ειδικών ορολογικών δοκιµασιών δεν επαληθεύονται και δεν αποδεικνύεται η µόλυνση από το Treponema pallidum. Τέτοια αποτέλεσµα µπορεί να σχετίζονται µε συχνή χρήση φαρµάκων, παραπρωτεϊναιµία ή αυτοάνοσες ασθένειες όπως ο ερυθηµατώδης λύκος. Κάθε δείγµα αίµατος που βρίσκεται να δίνει θετική αντίδραση στην αρχική δοκιµασία ελέγχου (VDRL, RPR) απαραίτητα επανελέγχεται και µετά από επαναλαµβανόµενα θετικό αποτέλεσµα προχωρά για έλεγχο µε κάποια από τις ειδικές δοκιµασίες.