Διάκριση ποικιλιών ελαιολάδου μέσω μεθόδου γονοτύπησης βασιζόμενης σε φθορίζοντα μικροσφαιρίδια

Transcript

1 Διάκριση ποικιλιών ελαιολάδου μέσω μεθόδου γονοτύπησης βασιζόμενης σε φθορίζοντα μικροσφαιρίδια Δέσποινα Π. Καλογιάννη Τμήμα Χημείας Πανεπιστήμιο Πατρών

2 Ανάπτυξη μεθόδου ελέγχου αυθεντικότητας του ελαιολάδου με βάση ειδικούς δείκτες DNA Στο γονιδίωμα των διαφόρων ποικιλιών ελιών έχουν εντοπιστεί διάφοροι μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί (SNPs) αλλαγή μιας βάσης Το προφίλ αυτών των πολυμορφισμών αποτελεί δείκτη για τον χαρακτηρισμό της ποικιλίας της ελιάς και τoν έλεγχο της αυθεντικότητας του ελαιολάδου Kalogianni et al., J Agric Food Chem. 215

3 Ανάπτυξη μεθόδου ελέγχου αυθεντικότητας του ελαιολάδου με βάση ειδικούς δείκτες DNA Ανάπτυξη μεθόδου διάκρισης της ποικιλίας ελαιολάδου βασισμένη σε δοκιμασίες υβριδοποίησης στην επιφάνεια φασματικά διακριτών μικροσφαιριδίων πολυστυρενίου. Kalogianni et al., J Agric Food Chem. 215

4 Η πρόκληση Ανίχνευση σημειακών μεταλλάξεων Change of a single base atggcgtcagggagctatatgccagggctacctacctcccagggctcagtcggcaggtgccagaacgttccctgggaaggccccatggaa gcccaggactgagccaccaccctcagcctcgtcacctcaccacaggactggctacctctctgggccctcagggatgctgctgtacagacccc tgaccagtgacgagttcgcactcagggccaggctggcgctggaggaggacacttgtttggctccaaccctaggtaccatcctcccagtagg among all bases of the gatcaggcagggcccacaggcctgccctagggacaggagtcaaccttggacccataaggcactggggcgggcagagaaggaggaggtg plant genome gcatgggcagctgagagccagagaccctgaccctagtccttgctctgccattaccccgtgtgaccccgggcccacccttccccacccttcccc accccgggcttctgtttccttctgccaacgagaaggctgcttcacctgccccgagtcctgtcttcctgctctgccttctggggctgtggcccttg ctggcctggagccccaaccaagggcagggactgctgtcctccacgtctgtcctcaccgacataatgggctgggctgggcacacaggcagtg cccaagagtttctaatgagcatatgattacctgagtcctgggcagaccttcttagggaacagcctgggacagagaaccacagacactctga ggagccaccctgaggcctcttttgccagaggaccctacagcctccctggcagcagttccgccagcatttctgtaaatgccctcatgccagggt gcggcccggctgtcagcacgagagggacgttggtctgtcccctggcaccgagtcagtcagaagggtggccagggcccccttgggcccctcc agagacaatccactgtggtcacacggctcggtggcaggaagtgctgttcctgcagctgtggggacagggagtgtggatgaagccaggctg ggtttgtctgaagacggaggccccgaaaggtggcagcctggcctatagcagcagcaactcttggatttattggaaagattttcttcacggttc tgagtcttgggggtgttagaggctcagaaccagtccagccagagctctgtcatgggcacgtagacccggtcccagggcctttgctctttgctg tcctcagaggcctctgcaaagtagaaacaggcagccttgtgagtcccctcctgggagcaaccaaccctccctctgagatgccccggggcca ggtcagctgtggtgaaaggtagggatgcagccagctcagggagtggcccagagttcctgcccacccaaggaggctcccaggaaggtcaag gcacctgactcctgggctgcttccctcccctcccctccccaggtcaggaaggtgggaaagggctggggtgtctgtgaccctggcagtcactg agaagcagggtggaagcagccccctgcagcacgctgggtcagtggtcttaccagatggatacgcagcaacttccttttgaacctttttatttt cctggcaggaagaagagggatccagcagtgagatcaggcaggttctgtgttgcacagacagggaaacaggctctgtccacacaaagtcgg tggggccaggatgaggcccagtctgttcacacatggctatgatgctag

5 Ανάπτυξη μεθόδου για τη διάκριση ποικιλιών ελαιολάδου Αντίδραση πολλαπλασιασμού (PCR) των τμημάτων DNA του γονιδιώματος του φυτού που φέρει τον υπό εξέταση μονονουκλεοτιδικό πολυμορφισμό (SNP) Αντίδραση επέκτασης εκκινητή (PEXT) για τη διάκριση των δύο αλληλίων Ανίχνευση των προϊόντων επέκτασης εκκινητή Δοκιμασία υβριδοποίησης στην επιφάνεια μικροσφαιριδίων

6 Αντίδραση ενίσχυσης των τμημάτων DNA του που φέρει τον υπό εξέταση μονονουκλεοτιδικό πολυμορφισμό (SNP) Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)

7 Αντίδραση επέκτασης εκκινητή (PEXT) A Allele A A T B B B Allele A A C

8 Ανάπτυξη μεθόδου για τη διάκριση ποικιλιών ελαιολάδου Δοκιμασίες υβριδοποίησης στην επιφάνεια φασματικά διακριτών ομάδων σφαιριδίων πολυστυρενίου Μικροσφαιρίδια πολυστυρενίου, διαμέτρου 5.6 μm. Τα μικροσφαιρίδια περιέχουν δυο φασματικά διακριτές φθορίζουσες χρωστικές σε διάφορες αναλογίες. Υπάρχουν διαθέσιμοι διαφορετικοί πληθυσμοί μικροσφαιριδίων. Μεγέθυνση 4x Μεγέθυνση 16x Μεγέθυνση 16x

9 A Allele A A T B B B Allele A A C anti-tag 1A Allele A anti-tag 1B Allele B SNP1 tag 1A B B B SA tag 1B B B B SA SNP2 B B B B B B SA SA SNP3 B B B B B B SA SA

10 Ανάλυση των μικροσφαιριδίων με κυτταρομετρητή ροής Η ανάλυση των μικροσφαιριδίων γίνεται με δυο λέιζερ: ένα λέιζερ (635 nm) ταξινόμησης των διαφορετικών πληθυσμών μικροσφαιριδίων με βάση την αναλογία των 2 φθοριζουσών χρωστικών που περιέχουν. ένα λέιζερ αναφοράς (532 nm) για τον προσδιορισμό μιας τρίτης φθορίζουσας χρωστικής, της φυκοερυθρίνης, για την ανίχνευση των υβριδίων. Laser beam 635 nm Laser beam 532 nm

11 Προφίλ γονοτύπησης διαφόρων ποικιλιών ελιών Genotypes for SNPs 2, 3 & 4 Adramytini (AD) Chondrolia (CH) Kalamon (KA) Koroneiki (KO) Valanolia (VA)

12 A R 4A R 3A Πρότυπες ποικιλίες B Genotypes for SNPs 2, 3 & Adramytini (AD) Chondrolia (CH) Kalamon (KA) R 2A AD CH KA KO VA Variety Koroneiki (KO) Valanolia (VA) Kalogianni et al., J Agric Food Chem. 215

13 Δείγματα φύλλων ελιάς και ελαιολάδου R 4A R 4A R 3A R 3A R 2A R 2A AD CH KA KO VA AD CH KA KO VA Variety Variety

14 Ταυτόχρονη ενίσχυση και ανίχνευση και των 3 αλληλουχιών DNA 3 SNPs Δείγματα φύλλων ελιάς και ελαιολάδου R 4A R 3A R 2A AD CH KA KO VA Variety

15 Κλείνοντας... Αναπτύχθηκε μία νέα μέθοδος για τη διάκριση των διαφόρων ποικιλιών ελαιολάδου και τον έλεγχο της αυθεντικότητας του ελαιολάδου. Η μέθοδος βασίζεται στο διαφορετικό γονότυπο που εμφανίζουν οι διάφορες ποικιλίες μεταξύ τους (SNPs). Ως μοντέλο χρησιμοποιήθηκε η ταυτόχρονη ανίχνευση 3 SNPs σε 5 ελληνικές ποικιλίες. Η μέθοδος συμβάλλει στην αύξηση της πολλαπλότητας της ανάλυσης (ο αριθμός των SNPs που αναλύονται ταυτόχρονα).

16 Ευχαριστώ πολύ!!!