ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΝΕΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΝΟΥΚΛΕΪΚΩΝ ΟΞΕΩΝ ΙΩΑΝΝΗΣ Α. ΤΡΑΝΤΑΚΗΣ ΧΗΜΙΚΟΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΝΕΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΝΟΥΚΛΕΪΚΩΝ ΟΞΕΩΝ ΙΩΑΝΝΗΣ Α. ΤΡΑΝΤΑΚΗΣ ΧΗΜΙΚΟΣ ΠΑΤΡΑ 2009

2 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διδακτορική διατριβή εκπονήθηκε στο Τµήµα Χηµείας του Πανεπιστηµίου Πατρών, υπό την επίβλεψη του Καθηγητή κ. Θεόδωρου Χριστόπουλου. Κατά τη διάρκεια του διδακτορικού µου, εκτός από την ενασχόλησή µου µε την επιστήµη της Χηµείας, είχα την ευκαιρία να γνωρίσω και αρκετούς ανθρώπους. Μερικοί απ αυτούς έπαιξαν καθοριστικό ρόλο στη διαµόρφωσή µου ως επιστήµονα αλλά και µε βοήθησαν ποικιλοτρόπως όλα αυτά τα χρόνια. Ειλικρινά θεωρώ ότι η γνωριµία µου µε κάποιους από αυτούς είναι πολυτιµότερη και από τον τίτλο που απέκτησα. Αυτούς τους ανθρώπους αισθάνοµαι την ανάγκη να ευχαριστήσω στις σελίδες αυτές: Πρώτα απ όλα τον επιβλέποντα της διατριβής, Καθηγητή κ. Θεόδωρο Χριστόπουλο για την εµπιστοσύνη που µου έδειξε, την υπόδειξη των ερευνητικών θεµάτων της διατριβής αλλά και τη βοήθειά του όποτε αυτή χρειάστηκε σε επιστηµονικά ή προσωπικά ζητήµατα. Η κριτική του σκέψη, οι καίριες παρατηρήσεις του, το πάθος και ο ενθουσιασµός του για την έρευνα έκαναν πολλές φορές τις µεταξύ µας συζητήσεις πηγή έµπνευσης και προβληµατισµού για εµένα. Την Καθηγήτρια κ. Πηνελόπη Ιωάννου του Τµήµατος Χηµείας του Πανεπιστηµίου Αθηνών, µέλος της τριµελούς συµβουλευτικής επιτροπής, για τη φιλοξενία στο εργαστήριό της, όποτε χρειάστηκε, και τις εποικοδοµητικές συζητήσεις στις διάφορες συναντήσεις µας. Τον Καθηγητή κ. Εµµανουήλ Καναβάκη της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστηµίου Αθηνών, που µου έκανε την τιµή να είναι µέλος της τριµελούς συµβουλευτικής επιτροπής. Τον Καθηγητή κ. Πέτρο Περσεφόνη του Τµήµατος Φυσικής του Πανεπιστηµίου Πατρών για τη συνεργασία µας και τη φιλοξενία του στο Εργαστήριο Laser καθώς και για τη συµµετοχή του στην επταµελή εξεταστική επιτροπή. Τον Αναπληρωτή Καθηγητή του Τµήµατος Χηµείας του Πανεπιστηµίου Πατρών κ. Αλέξιο Αλετρά, την Επίκ. Καθηγήτρια κ. Κων/να Κονιδάρη και τον Λέκτορα κ. Χρήστο Νάνο του Τµήµατος Χηµείας του Πανεπιστηµίου Ιωαννίνων που δέχθηκαν πρόθυµα να αξιολογήσουν το σύγγραµµα αυτό και να παραστούν στην παρουσίαση της παρούσας διδακτορικής διατριβής. i

3 Τον Ερευνητή ρ. Παναγιώτη Καλαϊτζή και τον ρ. Στέλιο Σπανιόλα από το Μεσογειακό Αγρονοµικό Ινστιτούτο Χανίων ευχαριστώ για τη συνεργασία µας και την παροχή δειγµάτων για την ανάπτυξη των µεθόδων ταυτοποίησης των ποικιλιών του καφέ. Τον Λέκτορα του Τµήµατος Φυσικής του Πανεπιστηµίου Πατρών κ. Μιχάλη Φακή ευχαριστώ για την πολύ καλή συνεργασία που είχαµε και τη βοήθειά του στη συγγραφή της παρούσας διατριβής. Ελπίζω αυτή η συνεργασία να συνεχιστεί και στο µέλλον. Την ερευνητική οµάδα της κ. Ιωάννου στο Εργαστήριο Αναλυτικής Χηµείας του Πανεπιστηµίου Αθηνών και ιδιαίτερα τους υποψήφιους διδάκτορες κ. ηµήτριο Ελένη και κ. Αλεξάνδρα Ηλιάδη ευχαριστώ για τη βοήθειά τους, τη φιλοξενία τους στο εργαστήριο και τις χρήσιµες συµβουλές τους. Τους διδάκτορες κ. έσποινα Καλογιάννη, κ. ήµητρα Τουµπανάκη, κ. Χαρά ηµοπούλου, κ. Ευάγγελο Πετράκη και κ. Σωτήρη Τραγουλιά ευχαριστώ για τη βοήθεια και συµπαράστασή τους όλα αυτά τα χρόνια, τις συµβουλές και τις υποδείξεις τους, µα πάνω απ όλα για την πραγµατική φιλία που αναπτύχθηκε ανάµεσα µας και το εξαιρετικό κλίµα που υπήρχε µέσα και έξω από το εργαστήριο. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω το Βαγγέλη ο οποίος υπήρξε αληθινός δάσκαλος για µένα και µε βοήθησε καθοριστικά στα πρώτα µου βήµατα στην έρευνα. Είχα την τύχη να γνωρίσω αξιόλογους επιστήµονες και ακόµα πιο αξιόλογους ανθρώπους. Νιώθω πραγµατικά τυχερός που σας γνώρισα. Το Ίδρυµα Μποδοσάκη για την οικονοµική του στήριξη κατά τη διάρκεια του τελευταίου έτους του διδακτορικού µου. Χωρίς αυτήν δε θα βρισκόµουν σε θέση να γράφω σήµερα αυτές τις γραµµές. Η παρούσα διατριβή είναι αποτέλεσµα της στήριξης και της εµπιστοσύνης που µου έδειξαν οι γονείς µου. Τους ευχαριστώ που πιστεύουν σε µένα, ξεπερνούν τις δυσκολίες και τα εµπόδια που συναντάµε όλα αυτά τα χρόνια, είναι πάντα δίπλα µου όταν τους χρειάζοµαι και µου δίνουν δύναµη να συνεχίσω. ii

4 ΝΕΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ ΝΟΥΚΛΕΪΚΩΝ ΟΞΈΩΝ Ιωάννης Α. Τραντάκης ιδακτορική ιατριβή Τµήµα Χηµείας, Πανεπιστήµιο Πατρών ΠΕΡΙΛΗΨΗ Το δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ (DNA) είναι ένα νουκλεϊκό οξύ που περιέχει τις γενετικές πληροφορίες που καθορίζουν τη βιολογική ανάπτυξη και λειτουργία όλων των γνωστών ζωντανών οργανισµών. Το σύνολο των µορίων DNA που υπάρχουν σε ένα κύτταρο αποτελούν το γενετικό υλικό του. To DNA είναι ο φορέας των γενετικών πληροφοριών του κυττάρου, όχι µόνον µε την έννοια της µεταβίβασης χαρακτηριστικών, αναλλοίωτων από γενιά σε γενιά, αλλά και της ρύθµισης της φυσιογνωµίας εξειδίκευσης κάθε κυττάρου για την επιτέλεση των ιδιαίτερων λειτουργιών του. Επίσης, το DNA επιτρέπει τη δηµιουργία γενετικής ποικιλότητας, υφιστάµενο µεταλλάξεις. Έτσι το DNA είναι ουσιαστικά το µόριο-ταυτότητα για κάθε άτοµο και κάθε οργανισµό. Στόχος της παρούσας διατριβής είναι η ανάπτυξη νέων τεχνικών ανάλυσης νουκλεϊκών οξέων. To µεγαλύτερο µέρος της διατριβής αφορά την ανάπτυξη νέων µεθόδων γονοτύπησης µονονουκλεοτιδικών πολυµορφισµών (SNP), οι οποίες είναι ιδιαίτερα απλές στην εκτέλεση, έχουν χαµηλό κόστος και εκτελούνται σε σύντοµο χρονικό διάστηµα. Οι µέθοδοι βασίζονται (α) σε βιοαισθητήρα DNA τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων, ο οποίος καθιστά εφικτή την άµεση οπτική ανίχνευση του προϊόντος της γονοτυπικής αντίδρασης χωρίς τη χρήση οργάνων ή (β) στη βιοφωταυγειοµετρική ανίχνευση του προϊόντος της γονοτυπικής αντίδρασης σε φρεάτια µικροτιτλοδότησης. Στις µεθόδους ανίχνευσης µε το βιοαισθητήρα αξιοποιούνται οι οπτικές ιδιότητες νανοσωµατιδίων χρυσού ενώ στη βιοφωταυγειοµετρική µέθοδο χρησιµοποιείται ως ιχνηθέτης η φωτοπρωτεΐνη αικουορίνη. Οι µέθοδοι αυτές εφαρµόζονται στη ταυτοποίηση ποικιλιών καφέ. Οι ποικιλίες καφέ επιλέχθηκαν ως µοντέλο εφαρµογής των µεθόδων στοχεύοντας στη διείσδυση των µοριακών τεχνικών στην ταυτοποίηση τροφίµων. iii

5 Στην παρούσα διατριβή µελετώνται επίσης οι φωτοχηµικές ιδιότητες µιας χρωστικής, της SYBR Green I, η οποία φθορίζει όταν συµπλέκεται µε διάφορους τύπους DNA. H µελέτη αυτή γίνεται τόσο µε κλασσική φθορισµοµετρία όσο και µε φασµατοσκοπία φθορισµού χρονικής ανάλυσης η οποία επιτρέπει την εξέταση υπερταχέων φαινοµένων που συµβαίνουν στη φύση και εντάσσονται στη χρονική κλίµακα των fs και ps. Το σχετικό µε την Ανασκόπηση Πεδίου µέρος της διατριβής αποτελείται από έξι κεφάλαια. Στο Κεφάλαιο 1 γίνεται αναφορά στη δοµή του DNA και στη συνέχεια περιγράφεται η αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR), µια τεχνική που επιτρέπει τον εκθετικό πολλαπλασιασµό του DNA. Στο Κεφάλαιο 2 περιγράφονται διάφορες τεχνικές ανάλυσης των προϊόντων της PCR. Στη συνέχεια (Κεφάλαιο 3) παρουσιάζονται µέθοδοι ανίχνευσης µονονουκλεοτιδικών πολυµορφισµών. ίνεται έµφαση στη γονοτύπηση, τη διάκριση δηλαδή µεταξύ των διαφόρων αλληλίων και τις αντιδράσεις µε τις οποίες αυτή επιτυγχάνεται. Στο Κεφάλαιο 4 περιγράφεται ο ρόλος των νανοσωµατιδίων χρυσού στις αναλύσεις DNA. Γίνεται αναφορά στον τρόπο σύνθεσης των νανοσωµατιδίων, στις οπτικές ιδιότητές τους και στους διάφορους τρόπους λειτουργικής τους τροποποίησης. Στο επόµενο κεφάλαιο (Κεφάλαιο 5) παρουσιάζονται τα φαινόµενα της χηµειοφωταύγειας και της βιοφωταύγειας και αναφέρονται οι συνηθέστεροι ιχνηθέτες σε αναλύσεις DNA. Στο Κεφάλαιο 6 γίνεται αναφορά στη δυναµική των διεγερµένων καταστάσεων σε µετρήσεις φθορισµού. Αρχικά γίνεται παρουσίαση της φασµατοσκοπίας χρονικής ανάλυσης και ακολουθεί η περιγραφή του laser παλµών femtoseconds καθώς επίσης και περιγραφή της πειραµατικής διάταξης της φασµατοσκοπίας χρονικής ανάλυσης που χρησιµοποιήθηκε στα πειράµατά µας. Το Πρωτότυπο µέρος της διατριβής αποτελείται από τέσσερα κεφάλαια. Στο Κεφάλαιο 7 παρατίθενται τα όργανα και τα αντιδραστήρια που χρησιµοποιήθηκαν κατά τη διάρκεια της πειραµατικής εργασίας. Στο Κεφάλαιο 8 περιγράφεται η ανάπτυξη µεθόδου η οποία συνδυάζει αντίδραση επέκτασης εκκινητή µε τον προαναφερθέντα βιοαισθητήρα DNA για τη γονοτύπηση ποικιλιών καφέ. Σε αντίθεση µε τις άλλες υπάρχουσες µεθόδους γονοτύπησης η προτεινόµενη µέθοδος επιτρέπει την οπτική ανίχνευση των προϊόντων της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή, µέσα σε µερικά λεπτά, χωρίς τη χρήση ειδικής οργανολογίας. Στη συνέχεια (Κεφάλαιο 9), περιγράφεται µια ταχεία, χαµηλού κόστους, µέθοδος για τον ποσοτικό προσδιορισµό των ποικιλιών καφέ η οποία συνδυάζει µια αντίδραση επέκτασης εκκινητή µε µια iv

6 βιοφωταυγειοµετρική δοκιµασία υβριδοποίησης. Ως ιχνηθέτης χρησιµοποιείται η φωτοπρωτεΐνη αικουορίνη. Στο Κεφάλαιο 10 πραγµατοποιείται µελέτη των φωτοφυσικών ιδιοτήτων της χρωστικής SYBR green I σε ελεύθερη µορφή αλλά και συνδεδεµένη µε µονόκλωνο (ssdna), δίκλωνο (dsdna) και τρίκλωνο DNA (tsdna). Παρουσιάζονται µετρήσεις φασµατοσκοπίας σταθερής κατάστασης αλλά και µετρήσεις φασµατοσκοπίας χρονικής ανάλυσης. Η αποδιέγερση φθορισµού µελετάται στην περιοχή των femtoseconds παρέχοντας τη χρονική ανάλυση που απαιτείται για τη µελέτη υπερταχέων φαινοµένων στη SYBR green I. v

7 NEW TECHNIQUES IN NUCLEIC ACID ANALYSIS Ioannis A. Trantakis Ph. D. Thesis University of Patras, Department of Chemistry SUMMARY Deoxyribonucleic acid (DNA) is a nucleic acid that contains all the genetic instructions used in the development and functioning of all known living organisms. The DNA molecules that are present within a cell constitute its genetic material. This genetic information does not only serve as the hereditary material but also regulates the specialization of each cell on the realization of its particular operations. DNA also enables genetic variation as a result of various mutational events. Thus DNA is in fact the identity-molecule for each individual and each organism. The present dissertation aims at the development of novel techniques in nucleic acid analysis. The thesis is mainly focused on the development of novel methods for genotyping single nucleotide polymorphisms (SNPs). The methods are rapid, simple, reliable and of low cost. These methods are based: (a) on a dry reagent DNA biosensor, which enables visual detection of allele specific products, without instrumentation, and (b) on bioluminometric assay of allele specific products in microtiter wells. Detection by the DNA biosensor exploits the unique optical properties of gold nanoparticles as reporters whereas the bioluminometric method is based on the photoprotein aequorin that serves as a reporter molecule. These methods are applied in the authentication of coffee species. The photophysical properties of the DNA fluorescent dye SYBR Green I are also studied. SYBR Green I exhibits a large fluorescence enhancement upon binding with DNA. Steady state as well as time-resolved measurements have been made. The time-resolved dynamics were studied using femtosecond time-resolved up-conversion spectroscopy. This technique provides a resolution in the fs regime, allowing the examination of ultrafast phenomena. vi

8 The theoretical background of this dissertation is outlined in the first six chapters. Chapter 1 describes the structure of DNA and the polymerase chain reaction (PCR), a technique that allows the exponential amplification of DNA. Chapter 2 presents various techniques for the detection of PCR products. Chapter 3 focuses on genotyping methods for single nucleotide polymorphisms. Emphasis is given in the allele discrimination reactions. Chapter 4 describes the role of gold nanoparticles in DNA analysis. The synthetic methods, the optical properties of gold nanoparticles, as well as the functionalization methods of gold surface are presented. In chapter 5, bioluminesence and chemiluminescence are described. The usual chemiluminescent and bioluminescent probes, as well as their applications in DNA analysis are discussed. In Chapter 6 the ultrafast fluorescence dynamics are discussed. Description of the femtosecond time-resolved up-conversion spectroscopy, the femtosecond laser and the experimental set up, are reported. The experimental part of this dissertation consists of four chapters. Instrumentation and reagents that were used during the experimental work are described in Chapter 7. Chapter 8 focuses on the development of a novel method for visual genotyping of SNPs by primer extension reaction (PEXT) coupled with a dryreagent DNA biosensor. In contrary to other genotyping methods, the proposed method allows visual detection of the PEXT products, within a few minutes, without any instrumentation. The objective of Chapter 9 is the development of a rapid and low-cost method for the quantitative determination of coffee species. This method combines a PEXT reaction with a bioluminometric hybridization assay. The photoprotein aequorin is used as a reporter molecule. In Chapter 10 the photophysical properties of SYBR Green I in free form and bound to single-stranded DNA (ssdna), double-stranded DNA (dsdna) and triplestranded DNA (tsdna) are studied. Steady state as well as time-resolved measurements are presented. The fluorescence decay is studied, for the first time, in the fs to ps scale. vii

9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πρόλογος...i Περίληψη.iii Summary..vi Περιεχόµενα...viii Ανασκόπηση Πεδίου...1 Κεφάλαιο 1 Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυµεράσης (PCR) Εισαγωγή DNA: Το µόριο της ζωής οµή του DNA Η διπλή έλικα του DNA Αρχή της PCR Συστατικά της PCR Στάδια της PCR...5 Κεφάλαιο 2 Μέθοδοι ανίχνευσης των προϊόντων της PCR Εισαγωγή Μη ειδικές ετερογενείς µέθοδοι ανίχνευσης προϊόντων της PCR Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης Χρήση ραδιενεργών ιχνηθετών Χρήση µη ραδιενεργών ιχνηθετών Υγρή χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) Τριχοειδής ηλεκτροφόρηση Εξειδικευµένες ετερογενείς µέθοδοι Οµογενείς µέθοδοι ανίχνευσης των προϊόντων της PCR PCR πραγµατικού χρόνου Μοριακοί πυρσοί (molecular beacons)..12 viii

10 Κεφάλαιο 3 Μέθοδοι ανίχνευσης µονονουκλεοτιδικών πολυµορφισµών Εισαγωγή Μέθοδοι ανίχνευσης µονονουκλεοτιδικών πολυµορφισµών Πολυµορφισµός µεγέθους περιοριστικού τµήµατος (RFLP) Αλληλόµορφο-ειδική υβριδοποίηση Αντίδραση επέκετασης εκκινητή (PEXT) Αντίδραση λιγάσης Αλληλόµορφο-ειδική διάσπαση εισβολέα (Invader assay)...22 Κεφάλαιο 4 Νανοσωµατίδια Χρυσού Ιστορική αναδροµή Παρασκευή νανοσωµατιδίων χρυσού Αναγωγή µε κιτρικά Μέθοδος Brust Schiffrin: Σύνθεση δύο φάσεων και σταθεροποίηση µε θειόλες Φυσικές µέθοδοι Οπτικές ιδιότητες οµή των νανοσωµατιδίων Au Λειτουργική τροποποίηση της επιφάνειας των νανοσωµατιδίων Au Προσρόφηση µορίων στην επιφάνεια των νανοσωµατιδίων Au Οµοιοπολική σύνδεση µορίων στην επιφάνεια των νανοσωµατιδίων Au Εξειδικευµένη µοριακή αναγνώριση Παράγοντες που επηρεάζουν τροποποιηµένα νανοσωµατίδια Au...37 Κεφάλαιο 5 Χηµειοφωταύγεια και Βιοφωταύγεια Εισαγωγή Το φαινόµενο της χηµειο(βιο)φωταύγειας Ηλεκτρονιακές µεταπτώσεις Κβαντική απόδοση Αντιπροσωπευτικά συστήµατα χηµειοφωταυγών ιχνηθετών Λουµινόλη Εστέρες της ακριδίνης Ενζυµικοί ιχνηθέτες µε χηµειοφωταυγειογόνα υποστρώµατα Αλκαλική φωσφατάση...48 ix

11 Υπεροξειδάση Βιοφωταυγείς ιχνηθέτες Η φωτοπρωτεΐνη αικουορίνη οµή και λειτουργία της αικουορίνης Εφαρµογές της αικουορίνης...52 Κεφάλαιο 6 Η δυναµική των διεγερµένων καταστάσεων σε µετρήσεις φθορισµού Εισαγωγή Φασµατοσκοποία χρονικής ανάλυσης Περιγραφή του laser παλµών femtoseconds Περιγραφή της πειραµατικής διάταξης της φασµατοσκοπίας χρονικής ανάλυσης...56 Πρωτότυπο Μέρος...60 Κεφάλαιο 7 Συσκευές και υλικά Οργανολογία Αντιδραστήρια Υλικά Ένζυµα και άλλες πρωτεΐνες Τυποποιηµένες συσκευασίες εργαστηριακών διεργασιών Ολιγονουκλεοτίδια...64 Κεφάλαιο 8 Ανάπτυξη ταχείας µεθόδου γονοτύπησης µονονουκλεοτιδικών πολυµορφισµών µε συνδυασµό αντίδρασης επέκτασης εκκινητή και οπτικής ανίχνευσης σε βιοαισθητήρα ξηρών αντιδραστηρίων Εισαγωγή Μεθοδολογία Προσθήκη πολυθυµιδυλικής ουράς (πολυ-dt) στο ολιγονουκλεοτίδιο SH- (dt) Καθαρισµός του ολιγονουκλεοτιδίου SH-dT (30) - πολυ-dt Σύζευξη του ολιγονουκλεοτιδίου SH-dT (30) - πολυ-dt µε νανοσωµατίδια Au...70 x

12 8.2.4 Προσθήκη πολυαδενυλικής ουράς (πολυ-dα) στα ολιγονουκλεοτίδια ανιχνευτές Αποµόνωση DNA από δείγµατα καφέ Πολλαπλασιασµός τµήµατος της διαγονιδιακής ενδιάµεσης χλωροπλαστικής περιοχής trnl (UAA)-trnF(GAA) µε PCR Αντίδραση επέκτασης εκκινητή (PEXT reaction) Κατασκευή βιοαισθητήρα DNA µε νανοσωµατίδια χρυσού Οπτική ανίχνευση των προϊόντων επέκτασης εκκινητή Αποτελέσµατα Συζήτηση Αρχή της µεθόδου Πολλαπλασιασµός τµήµατος της χλωροπλαστικής περιοχής trnl (UAA)-trnF(GAA) µε PCR Βελτιστοποίηση της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή Μελέτη της επίδρασης της ποσότητας του PCR προϊόντος Μελέτη της επίδρασης της θερµοκρασίας υβριδοποίησης εκκινητή Ανάλυση µοριακών µιγµάτων καφέ Ανάλυση µιγµάτων σκόνης καφέ Μελέτη επαναληψιµότητας της οπτικής ανίχνευσης των προϊόντων της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή Συµπεράσµατα...84 Κεφάλαιο 9 Ανάπτυξη ταχείας ποσοτικής µεθόδου γονοτύπησης µονονουκλεοτιδικών πολυµορφισµών µε συνδυασµό αντίδρασης επέκτασης εκκινητή και βιοφωταυγειοµετρικής ανίχνευσης Εισαγωγή Μεθοδολογία Αποµόνωση DNA από δείγµατα καφέ Πολλαπλασιασµός τµήµατος της διαγονιδιακής ενδιάµεσης χλωροπλαστικής περιοχής trnl (UAA)-trnF(GAA) µε PCR Αντίδραση επέκτασης εκκινητή (PEXT reaction) Ανάλυση µε µέτρηση βιοφωταύγειας σε φρεάτια µικροτιτλοδότησης Αποτελέµατα Συζήτηση Αρχή Μεθόδου...90 xi

13 9.3.2 Πολλαπλασιασµός τµήµατος της χλωροπλαστικής περιοχής trnl (UAA)- trnf(gaa) µε PCR Βελτιστοποίηση της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή Ανάλυση µοριακών µιγµάτων Ανάλυση δειγµάτων πράσινων (χλωρών) κόκκων καφέ Μελέτες επαναληψιµότητας Μελέτη επαναληψιµότητας της βιοφωταυγειοµετρικής δοκιµασίας υβριδοποίησης Ανάλυση µιγµάτων σκόνης καφέ Συµπεράσµατα Κεφάλαιο 10 Μελέτη των φωτοφυσικών ιδιοτήτων της χρωστικής SYBR Green I σε ελεύθερη µορφή αλλά και συνδεδεµένη µε µονόκλωνο, δίκλωνο και τρίκλωνο DNA Εισαγωγή Μεθοδολογία Παρασκευή του πλασµιδίου pt7obe Πέψη του πλασµιδίου µε την περιοριστική ενδονουκλεάση BamHI Παρασκευή δειγµάτων για µετρήσεις φθορισµού Αποτελέσµατα Συζήτηση Συµπεράσµατα Παράρτηµα Ι. Αλληλουχίες Γονιδίων Ι.1 Γονίδιο coffea arabica trna-leu (trnl) και διαγονιδιακή χλωροπλαστική trnl-trnf περιοχή Ι.2 Coffea arabica χλωροπλαστική trnl(uaa)-trnf(gaa) διαγονιδιακή περιοχή Ι.3 Coffea canephora χλωροπλαστική trnl(uaa)-trnf(gaa) διαγονιδιακή περιοχή Βιβλιογραφία xii

14 ΑΝΑΣΚΟΠΗΣΗ ΠΕ ΙΟΥ

15 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυµεράσης (PCR) 1.1 Εισαγωγή Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (Polymerase Chain Reaction - PCR) είναι µια τεχνική µε τεράστια συµβολή στην τεχνολογία του ανασυνδυασµένου DNA και γενικότερα σε κάθε πεδίο της έρευνας που σχετίζεται µε την ανάλυση νουκλεϊκών οξέων. Η PCR είναι µια µέθοδος που αυξάνει εκθετικά τη συγκέντρωση ενός συγκεκριµένου τµήµατος της αλληλουχίας ενός νουκλεϊκού οξέος σε ένα µίγµα αντίδρασης. Η µέθοδος αυτή αναπτύχθηκε το 1983 από τον Kary Mullis και είναι πλέον µια αναντικατάστατη µέθοδος σε κάθε βιολογικό και ιατρικό εργαστήριο. Ο Mullis για τη δουλειά του πάνω στην PCR τιµήθηκε το 1993 µε το βραβείο Nobel Χηµείας. 1.2 DNA: Το µόριο της ζωής Το δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ (DNA) είναι ένα νουκλεϊκό οξύ που περιέχει τις γενετικές πληροφορίες που καθορίζουν τη βιολογική ανάπτυξη και λειτουργία όλων των γνωστών ζωντανών οργανισµών και των περισσότερων ιών οµή του DNA Το DNA είναι πολυµερές που οι δοµικές του µονάδες είναι τα δεοξυριβονουκλεοτίδια. Ένα νουκλεοτίδιο αποτελείται από µια αζωτούχα βάση, ένα σάκχαρο και µία ή περισσότερες φωσφορικές οµάδες. Οι βάσεις του DNA µεταφέρουν τη γενετική πληροφορία. Το σάκχαρο στο δεοξυριβονουκλεοτίδιο είναι η δεοξυριβόζη. Η αζωτούχα βάση είναι παράγωγο πυριµιδίνης ή πουρίνης. Οι πουρίνες του DNA είναι η αδενίνη (Α) και η γουανίνη (G), και οι πυριµιδίνες, η θυµίνη (Τ) και η κυτοσίνη (C) (Stryer 1988). 2

16 Ο κορµός του DNA, ο οποίος δεν αλλάζει κατά µήκος του µορίου, αποτελείται από δεοξυριβόζες συνδεδεµένες µε φωσφορικές οµάδες µέσω φωσφοδιεστερικών δεσµών. Η αλυσίδα του DNA έχει πολικότητα. Το ένα άκρο της αλυσίδας έχει µια 5 - φωσφορική οµάδα και το άλλο µια οµάδα 3 -ΟΗ που δεν είναι συνδεδεµένη σε άλλο νουκλεοτίδιο. Κατά σύµβαση, η αλληλουχία των βάσεων γράφεται προς την κατεύθυνση 5 3. Αδενίνη (Α) Θυµίνη (Τ) Κυτοσίνη (C) Γουανίνη (G) Σχήµα 1.1: Οι τέσσερις αζωτούχες βάσεις του DNA που µεταφέρουν τη γενετική πληροφορία Η διπλή έλικα του DNA Tο 1953 οι Watson και Crick παρουσίασαν ένα "µοντέλο" της δοµής του DNA, που ονοµάσθηκε "µοντέλο της διπλής έλικας". Σύµφωνα µε το µοντέλο αυτό το µόριο του DNA αποτελείται από δύο πολυνουκλεοτιδικές αλυσίδες σε µορφή δύο αντιπαράλληλων κλώνων που σχηµατίζουν δεξιόστροφη διπλή έλικα. Οι δύο δηµιουργούµενοι κλώνοι συγκρατούνται µεταξύ τους µε δεσµούς υδρογόνου και µέσω επιστοίβασης π ηλεκτρονίων. Τα ζευγάρια των αζωτούχων βάσεων όπου αναπτύσσονται µεταξύ τους δεσµοί υδρογόνου είναι καθορισµένα: η αδενίνη µε τη θυµίνη και η γουανίνη µε την κυτοσίνη. Η αλληλουχία των βάσεων κατά µήκος της πολυνουκλεοτιδικής αλυσίδας δεν έχει κανέναν περιορισµό. Η ακριβής αλληλουχία των βάσεων είναι αυτή που µεταφέρει τις γενετικές πληροφορίες. 3

17 Οι Watson και Crick συµπέραναν ότι η αδενίνη πρέπει να ζευγαρώνει µε τη θυµίνη και η γουανίνη µε την κυτοσίνη, λόγω στερικών παραγόντων και της ικανότητας σχηµατισµού δεσµών υδρογόνου. Οι βάσεις αυτές θεωρούνται συµπληρωµατικές µεταξύ τους. Ανάµεσα στην αδενίνη και τη θυµίνη σχηµατίζονται 2 δεσµοί υδρογόνου, ενώ ανάµεσα στην κυτοσίνη και τη γουανίνη σχηµατίζονται 3 δεσµοί υδρογόνου (Stryer 1988). Σχήµα 1.2: Οι δύο έλικες του DNA συνδέονται µεταξύ τους µε δεσµούς υδρογόνου µε καθορισµένο και µοναδικό τρόπο. 1.3 Αρχή της PCR ίκλωνο DNA Αποδιάταξη (95 C) Υβριδοποίηση εκκινητών (40 72 C) Επιµήκυνση εκκινητών (72 C) Σχήµα 1.3: Σχηµατική παρουσίαση ενός θερµικού κύκλου της PCR. 4

18 1.3.1 Συστατικά της PCR Για µια τυπική αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης απαιτούνται: Ένα εκµαγείο DNA που περιέχει την περιοχή (DNA-στόχος) που θέλουµε να πολλαπλασιάσουµε. ύο ολιγονουκλεοτίδια-εκκινητές που είναι συµπληρωµατικά µε το 3 -άκρο κάθε µίας από τις δύο αλυσίδες του DNA-στόχος. Μια θερµοανθεκτική DNA πολυµεράση. Τριφωσφορικοί δεοξυνουκλεοσίτες (dntps). Mg 2+. Ρυθµιστικό διάλυµα που παρέχει το κατάλληλο χηµικό περιβάλλον για βέλτιστη δραστικότητα και σταθερότητα της DNA πολυµεράσης Στάδια της PCR Η PCR αποτελείται από επαναλαµβανόµενους θερµικούς κύκλους. Ένας πλήρης κύκλος (σχήµα 1.3) µιας PCR αντίδρασης περιλαµβάνει τρία στάδια: Αποδιάταξη του DNA Υβριδοποίηση των εκκινητών στο DNA εκµαγείο Επιµήκυνση των εκκινητών Η επώαση των δειγµάτων σε τρεις διαφορετικές θερµοκρασίες γίνεται αυτόµατα από ειδικά µηχανήµατα, τους θερµοκυκλoποιητές. Η αλληλουχία που ενισχύεται µέσω της PCR καθορίζεται από τη θέση πρόσδεσης των εκκινητών. Στο πρώτο στάδιο θέρµανσης (~95 C), το δίκλωνο µόριο DNA αποδιατάσσεται σχηµατίζοντας δύο µονές αλυσίδες λόγω διάσπασης των δεσµών υδρογόνου. Στη συνέχεια η θερµοκρασία µειώνεται στους C επιτρέποντας την πρόσδεση των δύο εκκινητών, οι οποίοι βρίσκονται σε περίσσεια, στις αντίστοιχες συµπληρωµατικές αλληλουχίες των δύο αλυσίδων. Ακολουθεί επώαση στους 72 C για την επιµήκυνση των εκκινητών η οποία καταλύεται από τη θερµοανθεκτική πολυµεράση, παρουσία των τεσσάρων νουκλεοτιδίων. Μετά τη συµπλήρωση ενός θερµικού κύκλου έχουν δηµιουργηθεί 2 αντίγραφα που περιέχουν την αλληλουχία-στόχο. Καθώς η διαδικασία επαναλαµβάνεται οι νεοσύστατοι κλώνοι µε τη σειρά τους χρησιµοποιούνται ως εκµαγεία για την in vitro σύνθεση του DNA. Μετά από µερικούς κύκλους το κύριο προϊόν είναι ένα DNA το µέγεθος του οποίου αντιστοιχεί στην µεταξύ των δύο αρχικών εκκινητών απόσταση 5

19 (σχήµα 1.4). Αν θεωρήσουµε ότι η αντίδρασή µας έχει 100% απόδοση τότε ο τελικός αριθµός αντιγράφων που θα έχουν δηµιουργηθεί θα είναι 2 n όπου n ο αριθµός των κύκλων. Εκθετική ενίσχυση DNA Σχήµα 1.4: Σχηµατική αναπαράσταση των θερµικών κύκλων της PCR. Θεωρητικά έπειτα από 36 κύκλους έχουν σχηµατισθεί 2 36 = 68 δισεκατοµµύρια αντίγραφα. Στην πράξη 20 µε 30 κύκλοι της αντίδρασης είναι αρκετοί για την αποτελεσµατική ενίσχυση του DNA. 6

20 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Μέθοδοι ανίχνευσης των προϊόντων της PCR 2.1 Εισαγωγή Παραδοσιακά, η αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR) εκτελείται σε έναν κλειστό σωλήνα και τα προϊόντα της αντίδρασης αναλύονται µετά το πέρας αυτής µε διάφορους τρόπους (ετερογενείς µέθοδοι). Έχουν αναπτυχθεί όµως και οµογενείς µέθοδοι ανίχνευσης των προϊόντων της PCR. Σε αυτή την περίπτωση η ανάλυση των προϊόντων γίνεται ενώ η αντίδραση βρίσκεται σε εξέλιξη. 2.2 Μη ειδικές ετερογενείς µέθοδοι ανίχνευσης προϊόντων της PCR Έχουν αναπτυχθεί διάφορες ετερογενείς µέθοδοι που ανιχνεύουν όλα τα προϊόντα της PCR, τόσο τα ειδικά όσο και τα µη ειδικά Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης Η πιο συχνά χρησιµοποιούµενη µέθοδος ανάλυσης των PCR προϊόντων βασίζεται στον ηλεκτροφορητικό διαχωρισµό του DNA σε πηκτή αγαρόζης ακολουθούµενη από χρώση µε τη φθορίζουσα χρωστική βρωµιούχο αιθίδιο που παρεµβάλλεται ανάµεσα στις βάσεις του DNΑ και φθορίζει όταν εκτεθεί σε UV ακτινοβολία. Ο διαχωρισµός γίνεται µε βάση το µέγεθος και τα διάφορα προϊόντα εµφανίζονται στην πηκτή ως ζώνες. Σχήµα 2.1: Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης. Τα προϊόντα διαχωρίζονται µε βάση το µέγεθος και εµφανίζονται µε τη µορφή διάκριτων ζωνών. 7

21 Για να εκτιµηθεί το µέγεθος του προϊόντος που αντιστοιχεί σε κάθε ζώνη ηλεκτροφορούνται π,αράλληλα, µόρια DNA γνωστού µεγέθους και γνωστής συγκέντρωσης τα οποία χρησιµεύουν ως δείκτες. Η χρήση των δεικτών αυτών επιτρέπει και τον ποσοτικό προσδιορισµό των προϊόντων ως εξής: µετράται µε ειδικό λογισµικό η οπτική πυκνότητα της κάθε ζώνης και κατασκευάζεται πρότυπη καµπύλη µε τις τιµές που αντιστοιχούν στους δείκτες. Σηµαντικό µειονέκτηµα της συγκεκριµένης µεθόδου είναι η περιορισµένη ανιχνευσιµότητα καθώς µπορεί να ανιχνεύσει µέχρι 10 ng DNA (Sambrook 1989) Χρήση ραδιενεργών ιχνηθετών Μια πιο ευαίσθητη µέθοδος βασίζεται στην εισαγωγή ραδιενεργών dntps (σηµασµένα µε 32 Ρ) απευθείας στα προϊόντα της αντίδρασης και ανίχνευση µέσω αυτοραδιογραφίας σε αποξηραµένες πηκτές ή µετά τη µεταφορά σε µεµβράνες νιτροκυτταρίνης (αποτύπωση κατά Southern). Η διαδικασία αυτή είναι κοπιαστική και χρονοβόρα. Επίσης, µειονέκτηµα αποτελεί ο τρόπος χειρισµού και απόρριψης των αντιδραστηρίων λόγω των κινδύνων από τη ραδιενέργεια για το χρήστη αλλά και το περιβάλλον. Ένα άλλο πρόβληµα είναι ο µικρός χρόνος ζωής των ραδιοϊσοτόπων (14.7 ηµέρες για τον 32 Ρ) (Christopoulos 2000) Χρήση µη ραδιενεργών ιχνηθετών Σήµερα, υπάρχει ποικιλία µη ραδιενεργών ιχνηθετών οι οποίοι εισάγονται στο ενισχυόµενο DNA κατά τη διάρκεια της PCR. Τέτοιοι ιχνηθέτες είναι η βιοτίνη, η διγοξιγενίνη και η φλουορεσκεΐνη (Jenkins 1994). Το σηµαντικότερο πλεονέκτηµα αυτών των ιχνηθετών είναι το ότι δεν έχουν µικρό χρόνο ηµιζωής, όπως οι ραδιενεργοί, και είναι φιλικοί προς το χρήστη και το περιβάλλον. Κάποιοι από τους ιχνηθέτες αυτούς, όπως η φλουορεσκεΐνη, έχουν περιορισµένη ευαισθησία ενώ άλλοι όπως η βιοτίνη και η διγοξιγενίνη έχουν µεγαλύτερη ευαισθησία από τους ραδιοϊσοτοπικούς (Jenkins 1994). Σε µια άλλη παραλλαγή της µεθόδου χρησιµοποιείται το φαινόµενο της χηµειοφωταύγειας. Η διεργασία αυτή συνδυάζει τη µη ραδιοϊσοτοπική σήµανση µε την αυτοραδιογραφία µέσω της προσθήκης ενός εξειδικευµένου υποστρώµατος στο σηµασµένο ανιχνευτή. Η προσθήκη αυτή έχει ως αποτέλεσµα την εκποµπή φωτός, η οποία µπορεί να οπτικοποιηθεί µε έκθεση σε φιλµ ακτίνων-χ. Χηµειοφωταυγειογόνα υποστρώµατα είναι διαθέσιµα για αντισώµατα συζευγµένα τόσο µε την αλκαλική 8

22 φωσφατάση όσο και µε την υπεροξειδάση των αγριοραφανιδών. Οι µέθοδοι αυτές παρουσιάζουν αυξηµένη ευαισθησία έναντι των συµβατικών µη ραδιοϊσοτοπικών ιχνηθετών Υγρή χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) Η υγρή χρωµατογραφία υψηλής απόδοσης µε ανιονανταλλακτικές στήλες και καταγραφή της απορρόφησης στα 260 nm έχει χρησιµοποιηθεί µε επιτυχία για το διαχωρισµό και τον προσδιορισµό των προϊόντων της PCR (Christopoulos 2000). Το µίγµα της PCR εισάγεται στη στήλη δίχως να καθαριστεί προηγουµένως Ηλεκτροφόρηση σε τριχοειδές Η τριχοειδής ηλεκτροφόρηση έχει καθιερωθεί ως µια αποτελεσµατική µέθοδος ποιοτικής και ποσοτικής ανάλυσης των προϊόντων της PCR. 2.3 Εξειδικευµένες ετερογενείς µέθοδοι Οι διεργασίες που αναφέρθηκαν προηγουµένως δεν επιτρέπουν την επιβεβαίωση της αλληλουχίας των προϊόντων της PCR. Πολλές φορές, προϊόντα PCR από κλινικά δείγµατα εµφανίζονται στην πηκτή ως µια οµάδα ζωνών, κάνοντας δύσκολο τον προσδιορισµό του σωστού µεγέθους. Εποµένως, απαιτείται επιβεβαίωση της αλληλουχίας του ειδικού προϊόντος. Αυτό επιτυγχάνεται µέσω υβριδοποίησης του ενισχυµένου DNA µε συµπληρωµατικά ολιγονουκλεοτίδια ανιχνευτές. Σε µια τυπική δοκιµασία υβριδοποίησης DNA τα προϊόντα της αντίδρασης διαχωρίζονται ηλεκτροφορητικά, ακολουθεί αποτύπωση κατά Southern και υβριδοποίηση των ανιχνευτών πάνω στη µεµβράνη. Σήµερα, ως ιχνηθέτες χρησιµοποιούνται κυρίως µη ραδιενεργά παράγωγα. Οι ιχνηθέτες εισάγονται στους ανιχνευτές είτε ενζυµικά είτε µέσω κάποιας χηµικής αντίδρασης. Η ανίχνευση βασίζεται κυρίως στα φαινόµενα του φθορισµού και της χηµειοφωταύγειας. Τέτοια συστήµατα θα περιγραφούν αναλυτικότερα σε επόµενα κεφάλαια της διατριβής. 2.4 Οµογενείς µέθοδοι ανίχνευσης προϊόντων της PCR Εκτός από τις ετερογενείς µεθόδους προσδιορισµού υπάρχουν και εκείνες που επιτρέπουν την ανίχνευση των προϊόντων κατά τη διάρκεια της αντίδρασης (οµογενείς µέθοδοι). 9

23 2.4.1 PCR πραγµατικού χρόνου (real-time PCR) Μια τέτοια µέθοδος είναι η PCR πραγµατικού χρόνου. Σε αυτήν γίνεται χρήση διάφορων φθοριζουσών χρωστικών οι οποίες αντιδρούν µε το προϊόν ενίσχυσης και µπορούν να ανιχνευτούν φθορισµοµετρικά. Αυτό διευκολύνει επίσης τον ποσοτικό προσδιορισµό του DNA (ποσοτική PCR). Η µέθοδος αυτή µπορεί να χρησιµοποιηθεί για τον ποσοτικό προσδιορισµό των αρχικών ποσοτήτων DNA, cdna ή RNA. Η ανάπτυξη φθορισµοµετρικών µεθόδων για µια αλυσιδωτή αντίδραση «κλειστού σωλήνα» έχει απλοποιήσει σηµαντικά τη διαδικασία της ποσοτικοποίησης. Οι φθορίζοντες ανιχνευτές που αλληλεπιδρούν µε τα προϊόντα ενίσχυσης κατά τη διάρκεια της PCR επιτρέπουν τη µέτρηση κινητικών παραµέτρων της δηµιουργίας του προϊόντος. Οι ανιχνευτές αυτοί είναι ουσίες που φθορίζουν αφού προσδεθούν στο DNA. Ένα χαρακτηριστικό παράδειγµα είναι η χρωστική SYBR Green I της οποίας ο φθορισµός αυξάνει έπειτα από την πρόσδεσή της σε δίκλωνο DNA. Ένας περιορισµός αυτής της µεθόδου είναι η ταυτόχρονη ανίχνευση και των µη ειδικών προϊόντων. Υπάρχουν επίσης και ειδικοί ανιχνευτές που χρησιµοποιούν το φαινόµενο µεταφοράς ενέργειας φθορισµού (σχήµα 2.2). Σε αυτή την περίπτωση ένα ολιγονουκλεοτίδιο-ανιχνευτής σηµαίνεται στο 5 -άκρο του µε φθορίζον µόριο δότη (6-καρβοξυ-φλουορεσκεΐνη) και µε ένα µόριο δέκτη (6-καρβοξυ-τετραµεθυλροδαµίνη) προς το 3 -άκρο σε µικρή απόσταση. Ο ανιχνευτής είναι τροποποιηµένος στο 3 -άκρο του έτσι ώστε να αποτραπεί η επιµήκυνσή του από την πολυµεράση. Η εγγύτητα ανάµεσα στο δότη και το δέκτη επιτρέπει τη µεταφορά ενέργειας από το ένα στο άλλο και, εποµένως, δεν παράγεται φθορισµός από το δότη. Κατα τη διάρκεια της πρόσδεσης του εκκινητή το ολιγονουκλεοτίδιο υβριδοποιείται στο εκµαγείο DNA σε µια περιοχή του που καθορίζεται από την αλληλουχία των εκκινητών. Ωστόσο, λόγω της δράσης 5 3 εξωνουκλεάσης που παρουσιάζει η θερµοανθεκτική (Taq) DNA πολυµεράση ο υβριδοποιηµένος ανιχνευτής υδρολύεται στο στάδιο επιµήκυνσης κάθε κύκλου και έτσι ο φθορισµός αυξάνεται (Kwok 2001). 10

24 Αποδιάταξη. Υβριδοποίηση Επιµήκυνση Σχήµα 2.2: Το ολιγονουκλεοτίδιο-ανιχνευτής είναι τροποποιηµένο στα δύο άκρα του. Στο 5 -άκρο του φέρει ένα φθορίζον µόριο-δότη και στο 3 -άκρο του ένα µόριοδέκτη. Τα µόρια αυτά βρίσκονται σε µικρή απόσταση µεταξύ τους µε αποτέλεσµα να γίνεται µεταφορά ενέργειας, οπότε το µόριο δότης δεν φθορίζει. Μετά την υβριδοποίηση του ανιχνευτή στην αλληλουχία-στόχο ακολουθεί επιµήκυνσή του. Η DNA πολυµεράση όµως παρουσιάζει και δράση 5 3 εξωνουκλεάσης, υδρολύοντας το 5 -άκρο του ανιχνευτή. Έτσι το µόριο-δότης απελευθερώνεται στο διάλυµα και φθορίζει. Η ανάπτυξη οργάνων που επιτρέπουν την καταγραφή του φθορισµού σε πραγµατικό χρόνο µέσα στα δοχεία όπου γίνεται η αντίδραση αποτέλεσε πολύ σηµαντική πρόοδο στην τεχνολογία της PCR. H τεχνολογία αυτή είναι πολύ ευέλικτη καθώς πολλά εναλλακτικά όργανα και συστήµατα φθορίζοντων ανιχνευτών είναι σήµερα διαθέσιµα. Οι δοκιµασίες PCR πραγµατικού χρόνου ολοκληρώνονται σε πολύ µικρό χρονικό διάστηµα εφόσον δεν απαιτείται κανένας χειρισµός των δειγµάτων µετά την ενίσχυση. Ο προσδιορισµός των προϊόντων της PCR µέσω ανιχνευτών σε πραγµατικό χρόνο είναι πολύ πιο ακριβής σε σύγκριση µε την ανάλυση σε πηκτή. Επίσης, η ανάλυση της προόδου της αντίδρασης επιτρέπει τον ακριβή ποσοτικό προσδιορισµό της αλληλουχίας-στόχος σε µια ευρεία δυναµική περιοχή. Περαιτέρω µελέτη των προϊόντων της PCR πραγµατικού χρόνου µέσα στο ίδιο το µίγµα της αντίδρασης µε τη χρήση ανιχνευτών και µε ανάλυση της καµπύλης θερµικής αποδιάταξης µπορεί να 11

25 οδηγήσει στην ανίχνευση παραλλαγών στην αλληλουχία ακόµα και σε µία µόνο βάση (Kwok 2001) Μοριακοί πυρσοί (molecular beacons) Οι µοριακοί πυρσοί έχουν χρησιµοποιηθεί για την καταγραφή του σχηµατισµού του προϊόντος PCR οµογενώς είτε κατά τη διάρκεια της αντίδρασης είτε µετά το πέρας αυτής. Οι µοριακοί πυρσοί είναι µονόκλωνα ολιγονουκλεοτίδια-ανιχνευτές σχεδιασµένα έτσι ώστε να υβριδοποιούνται ειδικά σε συγκεκριµένα προϊόντα ενίσχυσης. Σχήµα 2.3: Όταν ο ανιχνευτής βρίσκεται ελεύθερος στο διάλυµα το µόριο-δότης και το µόριο-δέκτης βρίσκονται πολύ κοντά µεταξύ τους οπότε έχουµε απόσβεση του φθορισµού. Όταν ο ανιχνευτής και η συµπληρωµατική αλυσίδα DNA υβριδοποιούνται το µόριο-δότης αποµακρύνεται από το µόριο-δέκτης και έτσι έχουµε εκποµπή φθορισµού. Περιλαµβάνουν δύο µέρη: το ένα αποτελεί τον κορµό του ανιχνευτή και αποτελείται από µια αλληλουχία συµπληρωµατική προς το DNA-στόχο ενώ το άλλο περιέχει µια αναδίπλωση φουρκέτας η οποία προκύπτει από δύο επιµηκύνσεις του κορµού συµπληρωµατικές µεταξύ τους (η φουρκέτα είναι δίκλωνη έλικα) αλλά άσχετες µε το DNA-στόχο. Στο άκρο της µίας επιµήκυνσης υπάρχει µια φθορίζουσα χρωστική (δότης) και στο άκρο της άλλης επιµήκυνσης ένα µόριο αποσβέστης (δέκτης). Ο δότης και ο δέκτης βρίσκονται σε εγγύτητα στην αναδίπλωση φουρκέτας 12

26 µε αποτέλεσµα να υπάρχει µεταφορά ενέργειας, οπότε δεν παρατηρείται φθορισµός από το δότη. Μετά την υβριδοποίηση του κορµού µε την αλληλουχία-στόχο, η δίκλωνη αναδίπλωση φουρκέτας υφίσταται µια δοµική αναδιοργάνωση (διαχωρισµός κλώνων) οπότε η φθορίζουσα ουσία αποµακρύνεται από τον αποσβέστη µε αποτέλεσµα να φθορίζει ο µοριακός πυρσός. Ο διαχωρισµός των δύο κλώνων της αναδίπλωσης φουρκέτας οφείλεται στο ότι το υβρίδιο του ανιχνευτή µε την αλληλουχία-στόχο είναι µακρύτερο και πιο σταθερό από το υβρίδιο της αναδίπλωσης (Kwok 2001). 13

27 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 Μέθοδοι ανίχνευσης µονονουκλεοτιδικών πολυµορφισµών 3.1 Εισαγωγή Η αποκωδικοποίηση του ανθρώπινου γονιδιώµατος είχε ως αποτέλεσµα την ανακάλυψη εκατοµµυρίων παραλλαγών στην αλληλουχία του DNA. Οι µικρές παραλλαγές στην αλληλουχία των βάσεων του DNA οφείλονται σε παρεµβολή ή απαλοιφή νουκλεοτιδίων, σε επεκτάσεις αλληλουχιών ή σε αντικατάσταση µονονουκλεοτιδίων. Η πλειοψηφία αυτών των παραλλαγών αφορά αντικατάσταση µονονουκλεοτιδίων. Οι παραλλαγές αυτές ονοµάζονται µονονουκλεοτιδικοί πολυµορφισµοί (Single Nucleotide Polymorphisms - SNPs). Οι µονονουκλεοτιδικοί πολυµορφισµοί αφορούν διαφοροποίηση της αλληλουχίας του DNA σε µία µόνο βάση. Η διαφοροποίηση αυτή προκύπτει µε αντικατάσταση µιας από τις 4 βάσεις (Α, Τ, C, G) µε κάποια άλλη. Σχήµα 3.1: Οι µονονουκλεοτιδικοί πολυµορφισµοί (SNPs) προκύπτουν µε αντικατάσταση µιας βάσης µε κάποια άλλη. Οι SNPs αποτελούν το 90 % όλων των παραλλαγών του ανθρώπινου γονιδιώµατος και εκτιµάται ότι εµφανίζεται ένας ανά 1000 βάσεις στο ανθρώπινο 14

28 γονιδίωµα (Sachidanandam 2001, Venter 2001). Οι συνέπειες ενός SNP στο φαινότυπο ενός ατόµου εξαρτώνται από την περιοχή του γονιδιώµατος στην οποία αυτός εµφανίζεται.οι SNPs µπορεί να βρίσκονται στις κωδικοποιούσες ή στις µη κωδικοποιούσες περιοχές των γονιδίων ή στις περιοχές µεταξύ των γονιδίων. Οι SNPs που βρίσκονται στην κωδικοποιούσα περιοχή γονιδίων δεν θα αλλάξουν απαραίτητα την αλληλουχία των αµινοξέων της παραγόµενης πρωτεΐνης λόγω του εκφυλισµού του γενετικού κώδικα. Οι SNPs όµως που έχουν ως αποτέλεσµα την αλλαγή στην αλληλουχία των αµινοξέων προκαλούν αλλαγές στη δοµή ή τη λειτουργία των αντίστοιχων πρωτεϊνών και είναι η αιτία για πολλές από τις γνωστές κληρονοµούµενες διαταραχές. Επίσης, πολλοί είναι οι SNPs που αλλάζουν την πρωτοταγή δοµή πρωτεϊνών που επηρεάζουν τον τρόπο µε τον οποίο αναπτύσσουν οι άνθρωποι διάφορες κοινές ασθένειες, καθώς και το πως αντιδρούν απέναντι σε διάφορα παθογόνα, χηµικά, φάρµακα, εµβόλια και άλλους παράγοντες. Τέλος, η µελέτη των µονονουκλεοτιδικών πολυµορφισµών είναι πολύ σηµαντική στα προγράµµατα αναπαραγωγής φυτικών καλλιεργειών και ζωικού κεφαλαίου. Στις µέρες µας υπάρχει τεράστιο ενδιαφέρον για τους SNPs. Αυτό οφείλεται στην ελπίδα των ερευνητών πως οι SNPs θα µπορούσαν να χρησιµοποιηθούν ως δείκτες για την ανίχνευση γονιδίων που προδιαθέτουν κάποια άτοµα για την εµφάνιση κοινών διαταραχών αλλά και ως εργαλεία για την ανάπτυξη της εξατοµικευµένης θεραπείας (Syvanen 2001). 3.2 Μέθοδοι ανίχνευσης µονονουκλεοτιδικών πολυµορφισµών (SNPs) Οι SNPs µπορούν να ανιχνευθούν µε ειδικό ή µη ειδικό προς την αλληλουχία τρόπο. Η µη ειδική ως προς την αλληλουχία ανίχνευση αφορά τις µεθόδους ανακάλυψης νέων πολυµορφισµών. Οι µέθοδοι αυτοί όµως δεν είναι αποδεκτές για την περίπτωση γνωστών πολυµορφισµών γιατί δεν επιβεβαιώνουν την ταυτότητα του υπό ανάλυση γονότυπου. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων ετών, έχει αναπτυχθεί πληθώρα διαφορετικών µεθόδων για την ανίχνευση των SNPs. Η πλειοψηφία των µεθόδων γονοτύπησης SNPs µπορούν να ταξινοµηθούν σε τέσσερις οµάδες µε βάση το µοριακό µηχανισµό της αντίδρασης διάκρισης αλληλίων: Αλληλόµορφο-ειδική υβριδοποίηση, επέκταση εκκινητή, σύνδεση ολιγονουκλεοτιδίων µέσω λιγάσης και ανάλυση διάσπασης εισβολέα. Υπάρχουν διάφορες µέθοδοι ανάλυσης των 15

29 προϊόντων κάθε τύπου αντίδρασης (φθορισµός, χηµειο(βιο)φωταύγεια, φασµατοµετρία µάζας, ηλεκτροφόρηση κ.ά.) (Sobrino 2005). Επίσης, υπάρχουν δύο διαφορετικές κατηγορίες µεθόδων αναφορικά µε την ανίχνευση: οµογενείς µέθοδοι, όταν αυτές λαµβάνουν χώρα σε διάλυµα και ετερογενείς µέθοδοι όπου πραγµατοποιείται ακινητοποίηση σε στερεό υπόστρωµα (πλακίδιο µικροτιτλοδότησης, αντικειµενοφόρο πλακίδιο, σφαιρίδια κ.ά.) Γενικά, οι οµογενείς µέθοδοι µπορούν να αυτοµατοποιηθούν ευκολότερα καθώς δεν απαιτούνται στάδια διαχωρισµού ή καθαρισµού µετά την αντίδραση διάκρισης των αλληλίων. Ωστόσο, το µεγαλύτερο µειονέκτηµα είναι η περιορισµένη δυνατότητα πολλαπλής ανίχνευσης. Αντίθετα, οι αντιδράσεις που λαµβάνουν χώρα σε στερεό υπόστρωµα έχουν µεγαλύτερη δυνατότητα πολλαπλής ανίχνευσης (Sobrino 2005). Σε αυτό το κεφάλαιο της διατριβής θα περιοριστούµε στην αναφορά των κυριότερων µεθόδων που αφορούν στη διάκριση αλληλίων γνωστών πολυµορφισµών Πολυµορφισµός µεγέθους περιοριστικού τµήµατος (RFLP) Η πρώτη µέθοδος που χρησιµοποιήθηκε για τη γονοτύπηση SNPs ονοµάζεται πολυµορφισµός µεγέθους περιοριστικού τµήµατος (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP). Η µεθόδος βασίζεται στην αποικοδόµηση των προϊόντων PCR µε περιοριστικές ενδονουκλεάσες και ανάλυση των θραυσµάτων που προκύπτουν µε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης. Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες είναι ένζυµα που αναγνωρίζουν συγκεκριµένες ακολουθίες (4-6 νουκλεοτίδια) δίκλωνου DNA και τις διασπούν σε συγκεκριµένη θέση, η οποία ονοµάζεται θέση περιορισµού. Για παράδειγµα (σχήµα 3.2) η περιοριστική ενδονουκλεάση EcoRI αναγνωρίζει την αλληλουχία GAATTC και τη διασπά ανάµεσα στο G και το Α. Τα θραύσµατα DNA που προκύπτουν διαχωρίζονται στη συνέχεια µε ηλεκτροφόρηση. Η ύπαρξη ενός SNP µπορεί να εισάγει ή να καταργήσει κάποια θέση περιορισµού. Αυτό συνεπάγεται αλλαγή στον αριθµό και το µέγεθος των θραυσµάτων που προκύπτουν από τη δράση της περιοριστικής ενδονουκλεάσης. Συνεπώς οι ενδονουκλεάσες µπορούν να αναγνωρίσουν ειδικά το σηµείο αλλαγής των βάσεων, οδηγώντας στο χαρακτηρισµό του DNA-στόχου (Gut 2001). 16

30 ιάσπαση Θραύσµατα Σχήµα 3.2: Σχηµατική αναπαράσταση της πέψης µε την περιοριστική ενδονουκλεάση EcoRI Αλληλόµορφο-ειδική υβριδοποίηση Η υβριδοποίηση αλληλόµορφο-ειδικού ολιγονουκλεοτιδίου (allele specific oligonucleotide hybridization - ASO), βασίζεται στη διάκριση µέσω υβριδοποίησης µεταξύ δύο DNA-στόχων τα οποία διαφέρουν σε ένα µόνο νουκλεοτίδιο (Wallace 1979). Σχεδιάζονται δύο αλληλόµορφο-ειδικά ολιγονουκλεοτίδια-ανιχνευτές, ένα για κάθε ποικιλόµορφο, µε την πολυµορφική βάση να βρίσκεται συνήθως στο µέσο της αλληλουχίας του ανιχνευτή. Υπό κατάλληλες συνθήκες, µόνο τα πλήρως συµπληρωµατικά υβρίδια ανιχνευτή-στόχου είναι σταθερά ενώ αυτά µε τη µη πλήρη σύζευξη είναι ασταθή (σχήµα 3.3). Υπάρχουν δύο προσεγγίσεις για την ανίχνευση SNP µε υβριδοποίηση: 1) Ακινητοποίηση των ολιγονουκλεοτιδίων-ανιχνευτών σε στερεό υπόστρωµα. Στη συνέχεια τα σηµασµένα µε κάποιον ιχνηθέτη δείγµατα DNA-στόχου δεσµεύονται, εκπλένονται και αποµακρύνεται η περίσσεια αυτών που δεν έχουν δεσµευθεί. Ακολουθεί ανίχνευση του ιχνηθέτη. 2) Ακινητοποίηση του DNA-στόχου (π.χ. οµοιοπολικά ή µέσω αλληλεπίδρασης βιοτίνης-στρεπταβιδίνης) πάνω στο στερεό υπόστρωµα. Προστίθενται στη συνέχεια τα ολιγονουκλεοτίδια-ανιχνευτές τα οποία είναι επισηµασµένα. Ακολουθεί έκπλυση για την αποµάκρυνση της περίσσειας των ανιχνευτών και ανίχνευση του ιχνηθέτη µε τον οποίο έχουν σηµανθεί (Kwok 2001). 17

31 Ολιγονουκλεοτίδιο -ανιχνευτής DNA-στόχος Υβριδοποίηση Σταθερη σύνδεση Μη σταθερή σύνδεση Σχήµα 3.3: Σχηµατική αναπαράσταση της αλληλόµορφο-ειδικής υβριδοποίησης. Υπό κατάλληλες συνθήκες, µόνο το πλήρως συµπληρωµατικό υβρίδιο είναι σταθερό. Η υβριδοποίηση αποτελεί την απλούστερη µέθοδο γονοτύπησης καθώς δεν περιλαµβάνει τη χρήση ενζύµων κατά τη διάκριση µεταξύ των αλληλίων. Η πρόκληση για να εξασφαλιστεί αξιόπιστη ανίχνευση βρίσκεται στο σχεδιασµό του ανιχνευτή και τη βελτιστοποίηση των συνθηκών υβριδοποίησης. Με τη χρήση περίπλοκων αλγορίθµων σχεδιασµού µπορεί να εξασφαλιστεί υψηλό ποσοστό επιτυχίας Αντίδραση επέκτασης εκκινητή Οι µέθοδοι στις οποίες χρησιµοποιείται DNA πολυµεράση για την αλληλοµορφο-ειδική εισαγωγή νουκλεοτιδίου ονοµάζονται γενικά µέθοδοι επέκτασης ολιγονουκλεοτιδίου-εκκινητή (Primer Extension - PEXT). Η αντίδραση επέκτασης εκκινητή βασίζεται στην υψηλή εξειδίκευση της DNA πολυµεράσης η οποία εισάγει δεοξυριβονουκλεοτίδια µόνο όταν αυτά είναι πλήρως συµπληρωµατικά 18

32 µε την αλληλουχία του εκµαγείου-dna. Η ιδιότητα αυτή της DNA πολυµεράσης αποτελεί τη βάση διάκρισης µεταξύ των διαφορετικών αλληλίων. Υπάρχουν διάφορες παραλλαγές της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή, ωστόσο µπορούν να ταξινοµηθούν σε δύο κύριους τύπους αντίδρασης (Sobrino 2005). Στον πρώτο τύπο αντίδρασης (σχήµα 3.4), που ονοµάζεται αντίδραση µινι-αλληλούχησης (minisequencinq) ή µονονουκλεοτιδική επέκταση εκκινητή (single nucleotide primer extension), η ταυτότητα της πολυµορφικής βάσης προσδιορίζεται από την προσθήκη του συµπληρωµατικού προς τη βάση ddntp από την DNA πολυµεράση. Εκκινητής Εκκινητής DNA πολυµεράση Επέκταση εκκινητή Μη επέκταση εκκινητή Σχήµα 3.4: Σχηµατική αναπαράσταση της µονονουκλεοτιδικής επέκτασης εκκινητή. Η DNA πολυµεράση προσθέτει µόνο το συµπληρωµατικό προς την πολυµορφική βάση ddntp. Στο δεύτερο τύπο αντίδρασης (σχήµα 3.5) γίνεται αλληλόµορφο-ειδική επέκταση και η DNA πολυµεράση επιµηκύνει τον εκκινητή µόνο αν αυτός είναι πλήρως συµπληρωµατικός µε το εκµαγείο. Σε αυτή την περίπτωση απαιτούνται δύο εκκινητές: ένας συµπληρωµατικός προς κάθε αλληλόµορφη βάση του υπό µελέτη SNP. Tο προϊόν PCR που περιέχει την πολυµορφική βάση λειτουργεί ως εκµαγείο και το 3 -άκρο του εκκινητή περιέχει την αλληλική βάση. Η ταυτότητα του αλληλίου στο DNA-στόχο προσδιορίζεται απλά από το εαν σχηµατίστηκε προϊόν επέκτασης εκκινητή. 19

33 Αλληλοµορφο ειδικός εκκινητής Μη ειδικός εκκινητής DNA πολυµεράση Επέκταση εκκινητή Μη επέκταση εκκινητή Σχήµα 3.5: Σχηµατική αναπαράσταση της αλληλόµορφο-ειδικής επέκτασης εκκινητή. Η DNA πολυµεράση επιµηκύνει µόνο τον πλήρως συµπληρωµατικό προς την πολυµορφική βάση εκκινητή Αντίδραση λιγάσης Η DNA λιγάση είναι ένα ένζυµο που καταλύει το σχηµατισµό ενός φωσφοδιεστερικού δεσµού ανάµεσα στη φωσφορική οµάδα που βρίσκεται στο 5 - άκρο µιας αλυσίδας δίκλωνου DNA και στην υδροξυλοµάδα που βρίσκεται στο 3 - άκρο µιας άλλης αλυσίδας δίκλωνου DNA (σχήµα 3.6). H DNA λιγάση παρουσιάζει µεγάλη εξειδίκευση στην επιδιόρθωση τοµών στο µόριο του DNA. DNA λιγάση Σχήµα 3.6: Η DNA λιγάση συνδέει δύο αλυσίδες DNA καταλύoντας το σχηµατισµό φωσφοδιεστερικού δεσµού ανάµεσα στο 5 -άκρο της µίας και το 3 -άκρο της άλλης αλυσίδας. 20

34 Όταν δύο ολιγονουκλεοτίδια υβριδοποιηθούν σε ένα εκµαγείο DNA σε παρακείµενες θέσεις, µπορούν να συνδεθούν οµοιοπολικά µεταξύ τους µέσω λιγάσης µόνο αν είναι πλήρως συµπληρωµατικά µε το εκµαγείο στο σηµείο της σύνδεσης. Συνεπώς, αλληλόµορφο-ειδικά ολιγονουκλεοτίδια µπορούν να χρησιµοποιηθούν για την ταυτοποίηση της βάσης στο πολυµορφικό σηµείο. Το αν θα γίνει σύνδεση µέσω λιγάσης είναι ενδεικτικό για το πιο αλλήλιο υπάρχει στο υπό µελέτη δείγµα. Η πιο απλή µέθοδος ανίχνευσης SNP µέσω λιγάσης ονοµάζεται αντίδραση σύνδεσης ολιγονουκλεοτιδίων µέσω λιγάσης (Oligonucleotide Ligation Assay OLA / Oligonucleotide Ligation Reaction - OLR) και συνδυάζει την ιδιότητα δύο ολιγονουκλεοτιδίων-ανιχνευτών να υβριδοποιούνται σε γειτονικά σηµεία στην αλληλουχία-στόχο, µε την ικανότητα της λιγάσης να τα συνδέει µόνο εάν είναι πλήρως συµπληρωµατικά προς την αλληλουχία-στόχο. Η µέθοδος αυτή απαιτεί το σχεδιασµό τριών ολιγονουκλεοτιδίων, ενός κοινού και δύο αλληλόµορφο-ειδικών. Αναλυτικότερα, το DNA-στόχος αποδιατάσσεται και δύο ολιγονουκλεοτίδιαανιχνευτές υβριδοποιούνται σε αυτό, έτσι ώστε το 3 -άκρο του πρώτου ολιγονουκλεοτιδίου να είναι ακριβώς δίπλα στο 5 -άκρο του δεύτερου. Η λιγάση θα συνδέσει τα δύο ολιγονουκλεοτίδια, µε τη δηµιουργία φωσφοδιεστερικού δεσµού, εάν είναι πλήρως συµπληρωµατικά στην αλληλουχία-στόχο. Εποµένως, η χρήση ενός κοινού ολιγονουκλεοτιδίου και δύο αλληλοµορφο-ειδικών ολιγονουκλεοτιδίων θα οδηγήσει στην ανίχνευση του παρόντος αλληλίου, ανάλογα µε το σχηµατιζόµενο προϊόν (σχήµα 3.7) (Landegren 1988). Η χρήση θερµοανθεκτικής DNA λιγάσης επιτρέπει τη διεξαγωγή επαναλαµβανόµενων θερµικών κύκλων, µε αποτέλεσµα µια γραµµική αύξηση των προϊόντων λιγάσης. Αν και οι δύο αλυσίδες του γενωµικού DNA χρησιµοποιηθούν ως στόχοι για την υβριδοποίηση των ολιγονουκλεοτιδίων τότε η αύξηση των προϊόντων της αντίδρασης λιγάσης µπορεί να γίνει εκθετική. Η αντίδραση αυτή ονοµάζεται αλυσιδωτή αντίδραση λιγάσης (Ligase Chain Reaction - LCR) (Landegren 1988). 21

35 Αλληλοµορφοειδικός ανιχνευτής Κοινός ανιχνευτής Μη ειδικός ανιχνευτής Λιγάση Σύνδεση ολιγονουκλεοτιδίων Μη σύνδεση ολιγονουκλεοτιδίων Σχήµα 3.7: Η DNA λιγάση συνδέει δύο αλυσίδες DNA καταλύoντας το σχηµατισµό φωσφοδιεστερικού δεσµού ανάµεσα στο 5 -άκρο της µίας και το 3 -άκρο της άλλης αλυσίδας Αλληλοµορφο-ειδική διάσπαση εισβολέα (Invader assay) Εκτός από τα ένζυµα που διασπούν αλυσίδες DNA µε βάση την αλληλουχία τους, υπάρχουν και κάποια που είναι ειδικά προς την τρισδιάστατη δοµή µορίων. Τα ένζυµα αυτά αποκόπτουν το 5 άκρο των αλυσίδων και καλούνται Flap ενδονουκλεάσες. Τα µέλη αυτής της οικογένειας ενζύµων διασπούν σύµπλοκα που δηµιουργούνται από την υβριδοποίηση αλληλοεπικαλυπτόµενων ολιγονουκλεοτιδίων -ανιχνευτών. Όταν οι ανιχνευτές σχεδιάζονται έτσι ώστε το πολυµορφικό σηµείο να ταυτίζεται µε το σηµείο αλληλεπικάλυψής τους, η ορθή τρισδιάστατη δοµή σχηµατίζεται µόνο εάν το ολιγονουκλεοτίδιο-ανιχνευτής είναι πλήρως συµπληρωµατικό στην αλληλουχία-στόχο. Η ανάλυση µε τη χρήση Flap ενδονουκλεάσης, που ονοµάζεται ανάλυση διάσπασης εισβολέα (Invasive Cleavage), χρησιµοποιεί δύο ολιγονουκλεοτίδιαανιχνευτές. Το ολιγονουκλεοτίδιο-ανιχνευτής, που είναι ειδικό προς το DNA-στόχο, έχει µία 5 περιοχή µη συµπληρωµατική στην αλληλουχία του στόχου ακριβώς πριν τη βάση που αντιστοιχεί στο SNP. Αντίθετα, το ολιγονουκλεοτίδιο- εισβολέας είναι συµπληρωµατικό µε την 5 περιοχή πριν την πολυµορφική βάση. Όταν ο ανιχνευτής είναι συµπληρωµατικός του αλληλίου, τα δύο ολιγονουκλεοτίδια και η αλληλουχίαστόχος δηµιουργούν µια τρισδιάστατη δοµή, που αναγνωρίζεται και διασπάται από 22

36 Flap ενδονουκλεάση, ειδική για τη συγκεκριµένη δοµή DNA. Η διάσπαση ελευθερώνει την 5 αλληλουχία του ολιγονουκλεοτιδίου- εισβολέα, που δρα ως ιχνηθέτης και ανιχνεύεται µε διάφορους τρόπους. Ολιγονουκλεοτίδιοανιχνευτής Ολιγονουκλεοτίδιοεισβολέας Ενδονουκλεάση ιάσπαση Μη διάσπαση Σχήµα 3.7: Η flap ενδονουκλεάση αναγνωρίζει και διασπά µόνο πλήρως συµπληρωµατικές τρισδιάστατες δοµές. Σε µία παραλλαγή της µεθόδου, οι διασπασµένοι ανιχνευτές- εισβολείς χρησιµοποιούνται σε µία δεύτερη αντίδραση, όπου διασπάται ένα δεύτερο, σηµασµένο ολιγονουκλεοτίδιο-ανιχνευτής. Έτσι επιτυγχάνεται ενίσχυση του σήµατος, επιτρέποντας την ανίχνευση πολυµορφισµών, χωρίς να χρειάζεται προηγούµενος πολλαπλασιασµός µε PCR. Ωστόσο απαιτείται µεγάλη ποσότητα του DNA-στόχος (Lyamichev 1999, Ryan 1999, Hall 2000). 23

37 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Νανοσωµατίδια Χρυσού 4.1 Ιστορική αναδροµή Αν και ο χρυσός αποτελεί ένα από τα αρχαιότερα θέµατα µελέτης της επιστήµης, η αναγέννηση του στις µέρες µας οδηγεί σε ένα εκθετικά αυξανόµενο αριθµό δηµοσιεύσεων, ιδιαίτερα στα αναδυόµενα πεδία της νανοεπιστήµης και της νανοτεχνολογίας. Η αναζωπύρωση αυτή του ενδιαφέροντος για το χρυσό οφείλεται στις µοναδικές ιδιότητες των νανοσωµατιδίων του. Τα νανοσωµατίδια χρυσου ή αλλιώς κολλοειδής χρυσός, είναι τα πιο σταθερά µεταλλικά νανοσωµατίδια και παρουσιάζουν πολλές ενδιαφέρουσες πτυχές όπως η συµπεριφορά τους ως ξεχωριστά σωµατίδια και ηλεκτρονικές, µαγνητικές και οπτικές ιδιότητες που σχετίζονται µε το µέγεθός τους, καθώς επίσης και εφαρµογές στην κατάλυση και τη βιολογία. Εικόνα 4.1: Τα πρώτα αντικείµενα από χρυσό βρέθηκαν στη Βάρνα της Βουλγαρίας. Χρονολογούνται από την 5 η χιλιετία π.χ. Η εξόρυξη του χρυσού ξεκίνησε την πέµπτη χιλιετία π.χ. στην περιοχή της Βάρνα (Βουλγαρία). Ο διαλυτός χρυσός εµφανίστηκε για πρώτη φορά τον 4 ο µε 5 ο αιώνα π.χ. στην Αίγυπτο και την Κίνα. Στην αρχαιότητα, τα διάφορα υλικά χρησιµοποιούνταν τόσο για αισθητικούς όσο και για θεραπευτικούς σκοπούς. Ο κολλοειδής χρυσός χρησιµοποιούνταν για την κατασκευή γυαλιού µε ροδοκόκκινο χρώµα και για το χρωµατισµό των κεραµικών. Το πιο χαρακτηριστικό ίσως παράδειγµα είναι το κύπελλο του Λυκούργου, έργο του 5 ου αιώνα π.χ., το οποίο είναι 24

38 ροδοκόκκινο όταν φως διέρχεται µέσα από αυτό και πράσινο στο ανακλώµενο φως, λόγω της παρουσίας κολλοειδών χρυσού (Daniel 2004). Εικόνα 4.2: Το κύπελλο του Λυκούργου χρονολογείται από τον 5 ο αιώνα π.χ. Είναι ροδοκόκκινο όταν το φως διέρχεται µέσα από αυτό και πράσινο στο ανακλώµενο φως. Μέχρι την εποχή του Μεσαίωνα ο διαλυτός χρυσός απέκτησε πολύ µεγάλη φήµη για τις θεραπευτικές του ιδιότητες έναντι διαφόρων ασθενειών, όπως καρδιακές παθήσεις και αφροδίσια νοσήµατα, δυσεντερία, επιληψία και όγκοι. Στην αρχαία Ρώµη απέδιδαν τις θεραπευτικές ιδιότητες του διαλυτού χρυσού στο ότι το χρώµα του έµοιαζε µε αυτό του αίµατος. Το 1676 ο Γερµανός χηµικός Johann Kunckels σε ένα βιβλίο του κάνει αναφορά σε πόσιµο χρυσό που περιέχει µεταλλικό χρυσό σε ένα ουδέτερο, ελαφρώς ροζ διάλυµα µε θεραπευτικές ιδιότητες έναντι διαφόρων ασθενειών. Το 1857 ο Faraday ανέφερε το σχηµατισµό βαθυκόκκινων διαλυµάτων κολλοειδούς χρυσού έπειτα από αναγωγή υδατικού διαλύµατος χλωροχρυσικού οξέος (AuCl - 4 ) µε φωσφόρο σε ένα σύστηµα δύο φάσεων (Daniel 2004). Τον 20 ο αιώνα έχουν αναφερθεί διάφορες µέθοδοι για την παρασκευή κολλοειδών χρυσού. Κατά την τελευταία δεκαπενταετία, τα νανοσωµατίδια Au έχουν γίνει αντικείµενο εντατικής έρευνας λόγω των µοναδικών οπτικών και ηλεκτρικών ιδιοτήτων τους οι οποίες σχετίζονται µε το µέγεθος, το σχήµα και το περιβάλλον τους. 25

39 4.2 Παρασκευή νανοσωµατιδίων χρυσού Αναγωγή µε κιτρικά Μια συχνά χρησιµοποιούµενη µέθοδος για τη σύνθεση νανοσωµατιδίων Au είναι αυτή της αναγωγής χλωροχρυσικού οξέος (HAuCl 4 ) µε κιτρικά σε υδατικό διάλυµα (Turkevitch 1951). Τα ιόντα Au 3+ ανάγονται σε άτοµα µεταλλικού Au µε την προσθήκη κιτρικών αλάτων (συνήθως κιτρικό νάτριο) υπό ανάδευση. Σχήµα 4.1: Αντίδραση παρασκευής νανοσωµατιδίων Au µε αναγωγή HAuCl4 σε υδατικό διαλύτη. Τα σωµατίδια που παράγονται αρχικά δεν είναι οµοιόµορφα. Όσο αυξάνεται ο αριθµός των ατόµων που σχηµατίζονται, το διάλυµα καθίσταται υπέρκορο και ο Au αρχίζει να κατακρηµνίζεται σχηµατίζοντας µεταλλικούς πυρήνες µε διάµετρο µικρότερη του nm (σχήµα 4.2). Οι πυρήνες αυτοί αποτελούνται από 11 άτοµα Au και έχουν εικοσαεδρική δοµή. Τα υπόλοιπα άτοµα Au που παράγονται συνενώνονται µε τα ήδη υπάρχοντα σχηµατίζοντας µεγαλύτερα και περίπου όµοια (ανάλογα την ανάδευση) σωµατίδια. Ο αριθµός των πυρήνων που σχηµατίζονται αρχικά καθορίζει και τον τελικό αριθµό των σωµατιδίων στο διάλυµα. Για δεδοµένη συγκέντρωση HAuCl 4 σε ένα διάλυµα, όσο αυξάνεται η συγκέντρωση του αναγωγικού τόσο µεγαλύτερος και ο αριθµός των πυρήνων που σχηµατίζονται. Όσο περισσότεροι οι πυρήνες, τόσο µικρότερα τα σωµατίδια που σχηµατίζονται. 26

40 Σχήµα 4.2: Γραφική αναπαράσταση του σχηµατισµού των νανοσωµατιδίων Au σε συνάρτηση µε το χρόνο. Τα κιτρικά ιόντα, που δρουν ως αναγωγικός παράγοντας, στη συνέχεια προσροφώνται στην επιφάνεια των νανοσωµατιδίων προσδίδοντάς τους επιπλέον αρνητικό επιφανειακό φορτίο. Το αρνητικό φορτίο τα αναγκάζει να απωθούνται, προλαµβάνοντας περαιτέρω συσσωµάτωσή τους. Τα νανοσωµατίδια Au που προκύπτουν µε αυτή τη µέθοδο είναι περίπου σφαιρικά µε µεγέθη nm (Turkevich 1953, Hayat 1989). Σε µια πρώτη προσπάθεια να παραχθούν νανοσωµατίδια Au µε προεπιλεγµένο µέγεθος προτάθηκε µια µέθοδος ελεγχόµενου σχηµατισµού (Frens 1973), όπου ο λόγος µεταξύ των αναγωγικών και σταθεροποιητικών παραγόντων (λόγος κιτρικά ιόντα / χρυσός) ποικίλει. Σε αυτή την περίπτωση, για να αποτραπεί η συσσωµάτωση των νανοσωµατιδίων, προστίθεται συχνά και κάποιο είδος σταθεροποιητή ο οποίος συνδέεται στην επιφάνειά τους. Οι σταθεροποιητές αυτοί είναι αµφίφιλα επιφανειοδραστικά µόρια και προστίθενται ταυτόχρονα µε το κιτρικό άλας Μέθοδος Brust Schiffrin: Σύνθεση δύο φάσεων και σταθεροποίηση µε θειόλες Σε µια προσπάθεια σταθεροποίησης των νανοσωµατιδίων Au προτάθηκε (Giersig 1993) η χρήση θειολών µε ανθρακικές αλυσίδες ποικίλου µήκους. Η µέθοδος Brust Schiffrin (Brust 1994), επέτρεψε για πρώτη φορά τη σύνθεση θερµικά σταθερών νανοσωµατιδίων µε οµοιόµορφο και ελεγχόµενο µέγεθος (µε διάµετρο από 1.5 έως 5.2 nm). Η σύνθεση αυτή γίνεται σε ένα σύστηµα δύο φάσεων, εµπνευσµένη 27

41 από τη σύνθεση του Faraday, και χρησιµοποιεί ως υποκαταστάτες θειόλες οι οποίες συνδέονται ισχυρά στο χρυσό (σχήµα 4.3). Για την παρασκευή των νανοσωµατιδίων Αu χρησιµοποιούνται οργανικοί διαλύτες, όπως το τολουόλιο. Για τη µεταφορά του AuCl - 4 από την υδατική στην οργανική φάση χρησιµοποιείται τετραοκτυλαµµώνιοβρωµίδιο (ΤΟΑΒ). Η αναγωγή γίνεται από NaBH 4 παρουσία δωδεκανο-θειόλης. Η οργανική φάση αλλάζει χρώµα από πορτοκαλί σε σκούρο καφέ µέσα σε λίγα δευτερόλεπτα. Μεγαλύτερες αναλογίες µορίων θειόλης προς µόρια Au δίνουν σωµατίδια µε µικρότερο µέσο µέγεθος, ενώ η ταχεία προσθήκη του αναγωγικού σε συνδυασµό µε ψύξη του διαλύµατος παράγει µικρότερα και πιο οµοιόµορφα σωµατίδια. Σχήµα 4.3: Αντίδραση παρασκευής νανοσωµατιδίων Au µε αναγωγή HAuCl4 σε οργανικό διαλύτη. 28

42 4.2.3 Φυσικές µέθοδοι Εκτός από τις χηµικές µεθόδους που αναφέρθηκαν παραπάνω έχουν αναπτυχθεί και αρκετές φυσικές µέθοδοι παρασκευής νανοσωµατιδίων χρυσού. Αυτές βασίζονται στη φωτοχηµεία µε χρήση υπεριώδους και εγγύς υπερύθρου ακτινοβολίας (Mossmer 2000, Sau 2001, Meltzer 2001, Mallick 2001), στη χρήση υπερήχων (Zhou 1999,Niidome 2000, Reed 2003, Chen 2001a, Chen 2001b, Pol 2003) στη ραδιόλυση (Henglein 1998, Dawson 2000, Gachard 1998) και στη θερµόλυση (Khomutov 2002, Nakamoto 2002, Shimizu 2003, Bronstein 1999). Οι παραπάνω µέθοδοι παρασκευής θεωρούνται «πράσινες» µέθοδοι καθώς είναι φιλικές προς το περιβάλλον. Χαρακτηριστικό παράδειγµα αποτελεί µια µέθοδος παρασκευής που βασίζεται στην παραγωγή ελεύθερων ριζών σε υδατικό διάλυµα HAuCl4 που περιέχει κυκλοδεξτρίνη ή γλυκόζη, µετά από την εφαρµογή υπερήχων. Ως αναγωγικοί παράγοντες δρουν οι σχηµατιζόµενες ρίζες υδροξυλίου και σακχάρων. Η προσθήκη κυκλοδεξτρίνης έχει ως αποτέλεσµα το σχηµατισµό σφαιρικών σωµατιδίων ενώ η γλυκόζη αποδίδει ευλύγιστες νανοταινίες πάχους nm και µήκους µερικών µικροµέτρων (Zhang 2006). 4.3 Οπτικές ιδιότητες Γενικά, οι οπτικές ιδιότητες των µικρών µεταλλικών νανοσωµατιδίων καθορίζονται από τη συλλογική ταλάντωση των αγώγιµων ηλεκτρονίων στις επιφάνειες (γνωστή ως συντονισµός πλασµονίων επιφανείας, Surface Plasmon Resonance - SPR ή εντοπισµένος συντονισµός πλασµονίων επιφανείας, Localised Surface Plasmon Resonance - LSPR) τα οποία βρίσκονται σε συντονισµό µε τη συναφή ηλεκτροµαγνητική ακτινοβολία (Liz-Marzan 2004, Katz 2004, Myroschnychenko 2008, El-Sayed 2001). Η θέση της ζώνης αυτής στο φάσµα της ηλεκτροµαγνητικής ακτινοβολίας εξαρτάται σε µεγάλο βαθµό από το µέγεθος του σωµατιδίου. Για το χρυσό, η συχνότητα συντονισµού αυτής της ταλάντωσης, που εξαρτάται επίσης από το υλικό σύνθεσης και το διηλεκτρικό περιβάλλον (την απόσταση δηλαδή από άλλα σωµατίδια), βρίσκεται στην ορατή περιοχή του ηλεκτροµαγνητικού φάσµατος, ανάµεσα στα 510 και τα 550 nm. 29

43 Σχήµα 4.4: Νανοσωµατίδια Au µε διάµετρο 40 nm. Με αύξηση του µεγέθους των σωµατιδίων παρατηρείται µετατόπιση της κορυφής σε µεγαλύτερα µήκη κύµατος. Έτσι τα σφαιρικά νανοσωµατίδια Au µε διάµετρο nm είναι κόκκινα, ακανόνιστα διαµορφωµένα, ενώ τα µεγαλύτερα σωµατίδια γίνονται µπλε (σχήµα 4.5). Σχήµα 4.5: Το χρώµα των νανοσωµατιδίων Au αλλάζει µε την αύξηση του µεγέθους τους. Το έντονο χρώµα των σωµατιδίων των ευγενών µετάλλων, που αποτελεί τη βάση για τη χρήση τους ως ιχνηθέτες, οφείλεται στην παρουσία της ζώνης απορρόφησης πλασµονίου. Ο εντοπισµένος συντονισµός πλασµονίων επιφανείας έχει ως αποτέλεσµα έναν εξαιρετικά υψηλό συντελεστή µοριακής απορροφητικότητας 30

44 ( M 1 cm 1 ), και ενισχυµένα τοπικά ηλεκτροµαγνητικά πεδία κοντά στην επιφάνεια του σωµατιδίου (Haes 2004). Η συχνότητα συντονισµού των πλασµονίων είναι εξαιρετικά ευαίσθητη στη διηλεκτρική φύση (δείκτης διάθλασης) της διεπιφάνειάς της µε το τοπικό µέσο. Αυτό οφείλεται στο µεγάλο λόγο της επιφάνειας προς τον όγκο που διακρίνει τα νανοσωµατίδια. Οποιαδήποτε αλλαγή στο περιβάλλον αυτών των σωµατιδίων οδηγεί σε χρωµατοµετρικές αλλαγές των πληθυσµών τους. Λόγω του συντονισµού των πλασµονίων οι συζεύξεις ή οι συσσωµατώσεις των νανοσωµατιδίων Au συνοδεύονται συχνά από ευδιάκριτες χρωµατικές αλλαγές (Rosi 2005, Murphy 2002, Kelly 2003, Burda 2005, Yguerabide 1998a, Yguerabide 1998b, Niemeyer 2005). Χρωµατοµετρικοί αισθητήρες που χρησιµοποιούν νανοσωµατίδια Au έχουν εξερευνηθεί ευρέως και παρουσιάζουν πλήθος εφαρµογών. Το φως δεν απορροφάται µόνο ισχυρά από τα πλασµόνια, αλλά σκεδάζεται κιόλας ελαστικά (σκέδαση Rayleigh) από αυτά. Όσο το µέγεθος του σωµατιδίου αυξάνει, τόσο µεγαλύτερο είναι το ποσοστό του φωτός που σκεδάζεται σε σύγκριση µε αυτό που απορροφάται (Murphy 2008, Kelly 2003). Επειδή το φως που σκεδάζεται από τα νανοσωµατίδια Au είναι στην ορατή περιοχή του ηλεκτροµαγνητικού φάσµατος σε συµφωνία µε τις ζώνες των πλασµονίων τους, είναι δυνατό να ακολουθηθεί οπτικά η θέση των µεµονωµένων νανοσωµατιδίων, προετοιµάζοντας το έδαφος για τις εφαρµογές απεικόνισης (Yguerabide 1998a, Yguerabide 1998b, Yguerabide 2001). Οι κατασκεύασιµες σύµφωνα µε τις προδιαγραφές του εκάστοτε χρήστη φυσικές ιδιότητες των νανοσωµατιδίων Au επηρεάζουν τη συλλογική ταλάντωση των ηλεκτρονίων τους προσφέροντας τη δυνατότητα ρύθµισης των οπτικών ιδιοτήτων τους. Αυτό έχει διευκολύνει περαιτέρω την εφαρµογή τους στην ανίχνευση διαφόρων µορίων µε πληθώρα µεθόδων ανίχνευσης. 4.4 οµή των νανοσωµατιδίων Au Τα κολλοειδή διαλύµατα χρυσού αποτελούνται από έναν εσωτερικό πυρήνα µεταλλικού Au ο οποίος περιβάλλεται από ένα επιφανειακό στρώµα προσροφηµένων - ιόντων AuCl 2 (σχήµα 4.6). Αυτά τα αρνητικά φορτισµένα ιόντα προσδίδουν αρνητικό φορτίο στον κολλοειδή χρυσό και αποτρέπουν, λόγω ηλεκτροστατικής άπωσης, τη δηµιουργία συσσωµατωµάτων. Όλα τα διαλύµατα κολλοειδούς Au είναι ευαίσθητα στους ηλεκτρολύτες. Οι ηλεκτρολύτες συµπιέζουν αυτό το διπλό επιφανειακό στρώµα µειώνοντας εποµένως την ηλεκτροστατική άπωση. Αυτή η 31

45 αποσταθεροποιητική επίδραση οδηγεί σε συσσωµάτωση, η οποία συνοδεύεται από µια χρωµατική αλλαγή και ενδεχόµενη κατακρήµνιση του χρυσού. Σχήµα 4.6: ιαγραµµατική απεικόνιση κολλοειδούς νανοσωµατιδίου Au, που αποτελείται από πυρήνα Au, επικαλυµµένο µε επιφανειακό στρώµα ιόντων AuCl - 2. Τα αντισταθµιστικά ιόντα Η + + προέρχονται από το διαλύτη. 4.5 Λειτουργική τροποποίηση της επιφάνειας των νανοσωµατιδίων Au Οι εξαιρετικές οπτικές ιδιότητες των AuNPs είχαν ως αποτέλεσµα την αξιοποίησή τους ως ιχνηθετών σε πληθώρα εφαρµογών. Η σύζευξη λειτουργικών οµάδων σε επιφάνεια Au γίνεται µε ποικίλες µεθόδους. Καθοριστικό ρόλο παίζει ο τρόπος παρασκευής των νανοσωµατιδίων, γιατί οι παράγοντες σταθεροποίησης προσδίδουν διαφορετικές επιφανειακές ιδιότητες. Οι ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις, η οµοιοπολική σύζευξη (π.χ. οµοιοπολικός δεσµός Au-S) και η εξειδικευµένη µοριακή ανάγνωριση (αντίσωµα - αντιγόνο, βιοτίνη-στρεπταβιδίνη, κλπ) είναι τρία είδη ευρέως χρησιµοποιούµενων µεθόδων για τη λειτουργική τροποποίηση των AuNPs (Daniel 2004) Προσρόφηση µορίων στην επιφάνεια των νανοσωµατιδίων Au Η προσρόφηση ουσιών προκύπτει από συνδέσεις µεταξύ ενός στερεού προσροφητή και των συστατικών του διαλύµατος, που είναι ενεργειακά ευνοϊκές. Οι δυνάµεις Van der Waals και οι ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις είναι κυρίως 32

46 υπεύθυνες για την φυσική προσρόφηση. Η επιφάνεια των νανοσωµατιδίων αποτελεί ιδανικό προσροφητή, καθώς είναι σχετικά οµοιόµορφη, έχει µεγάλο λόγο επιφάνειας προς όγκο, προσφέροντας αρκετές θέσεις προσρόφησης και διαθέτει επιφανειακό φορτίο. Οι ηλεκτροστατικές αλληλεπιδράσεις και η φυσική προσρόφηση αποτελούν δύο πολύ απλές και γρήγορες διεργασίες ακινητοποίησης υποκαταστατών για τη δηµιουργία AuNP ανιχνευτών. Πλεονεκτούν έναντι των πιο περίπλοκων µεθόδων οµοιοπολικής σύνδεσης ως προς την απλότητα αλλά υστερούν ως προς την ισχύ της σύνδεσης. Πολλές φορές, ειδικά σε βιολογικές µελέτες, είναι απαραίτητα διάφορα στάδια έκπλυσης ή επώασης υπό ακραίες συνθήκες, όπως µεγάλοι χρόνοι επώασης µε ρυθµιστικά διαλύµατα που περιέχουν δραστικά µόρια όπως η διθειοθρεϊτόλη (µικρό, αφόρτιστο µόριο που περιέχει δύο οµάδες θειόλης και χρησιµοποιείται για την προστασία πρωτεϊνών από την οξείδωση) ή υψηλές συγκεντρώσεις άλατος (χρησιµοποιούνται σε πειράµατα υβριδοποίησης DNA). Η ισχύς της σύνδεσης που πετυχαίνεται µε τους παραπάνω τρόπους δεν είναι αρκετή για να παραµείνουν σταθεροί οι ανιχνευτές υπό αυτές τις συνθήκες, µε αποτέλεσµα να αναπτύσσονται ισχυρές µη-ειδικές αλληλεπιδράσεις ανάµεσα στους AuNP ανιχνευτές και τους αναλύτες προκαλώντας µειωµένη εξειδίκευση στην ανίχνευση Οµοιοπολική σύνδεση µορίων στην επιφάνεια των νανοσωµατιδίων Au Οι περισσότερες από τις τεχνικές που έχουν αναφερθεί για την ακινητοποίηση υποκαταστατών στην επιφάνεια των νανοσωµατιδίων Au βασίζονται στη δηµιουργία οµοιοπολικού δεσµού Au-S ανάµεσα στους υποκαταστάτες και τα άτοµα Au στην επιφάνεια των σωµατιδίων. Τα άτοµα του Au έχουν µηδενικό σθένος και γενικά δεν σχηµατίζουν δεσµούς µε άλλα άτοµα. Ωστόσο, τα κολλοειδή σωµατίδια χρυσού εµφανίζουν ιδιαίτερα ισχυρή συγγένεια µε άτοµα θείου, σχηµατίζοντας αυθόρµητα πολύ ισχυρούς δεσµούς. Η φύση της αλληλεπίδρασης Au-S και η δοµή των παραγόµενων συζευγµάτων δεν έχει διαλευκανθεί, ωστόσο η δηµιουργία του δεσµού τους έχει εφαρµοστεί σε πλήθος τεχνικών τροποποίησης των νανοσωµατιδίων µε λειτουργικές οµάδες που φέρουν S όπως θειόλες, δισουλφίδια και θειολ-εστέρες. Πρόσφατα, µια οµάδα καθοδηγούµενη από τον Robert Kornberg στο Πανεπιστήµιο του Stanford παρουσίασε µια µελέτη (Jadzinsky 2007) όπου αναφέρεται η ατοµική δοµή και η γεωµετρία νανοσωµατιδίων Au επικαλυµµένων µε π-µερκαπτο-βενζοϊκό οξύ. Η επίλυση της δοµής έγινε µε κρυσταλλογραφία ακτίνων- 33

47 Χ και αποκάλυψε τη φύση του δεσµού Au-S µε πρωτοφανή λεπτοµέρεια. Κάθε νανοσωµατίδιο αποτελείται από 102 άτοµα Au, 23 από τα οποία συνδέονται µε το S των θειολών στα µόρια του οξέος (σχήµα 4.7). Σχήµα 4.7: Χάρτης ηλεκτρονιακής πυκνότητας του νανοσωµατιδίου Au102(p-MBA)44 µε κρυσταλλογραφία ακτίνων-χ. Με κόκκινο απεικονίζεται το πλέγµα ηλεκτρονίων, µε κίτρινο τα άτοµα Au, µε γαλάζιο τα άτοµα S, µε γκρι τα άτοµα C και µε κόκκινο τα άτοµα O. Όµως ο ακριβής τρόπος µε τον οποίο αυτά τα σύµπλοκα Au-S συνδέονται µε το µεταλλικό χρυσό δεν είναι ξεκάθαρος. Η απόσταση του δεσµού είναι µεγαλύτερη απ ότι αυτή ανάµεσα σε άλλα άτοµα χρυσού στο νανοσωµατίδιο, υποδηλώνοντας µια σχετικά ασθενή αλληλεπίδραση η οποία όµως είναι αρκετά ισχυρή για να αποτρέψει την αποµάκρυνση των ατόµων. Βρέθηκε επίσης ότι τα νανοσωµατίδια είναι χειρόµορφα, αποτελούµενα από µικρότερες δοµές που έχουν σχέση ειδώλου-αντικειµένου µεταξύ τους (σχήµα 4.8). 34

48 Σχήµα 4.8: Τα νανοσωµατίδια αποδείχθηκε ότι είναι χειρόµορφα, αποτελούµενα από µικρότερες δοµές που έχουν σχέση ειδώλου-αντικειµένου µεταξύ του Εξειδικευµένη µοριακή αναγνώριση Ένας άλλος τρόπος λειτουργικής τροποποίησης της επιφάνειας των νανοσωµατιδίων Au είναι µέσω συστηµάτων εξειδικευµένης µοριακής αναγνώρισης. Χαρακτηριστικά παραδείγµατα αποτελούν το σύστηµα αντιγόνου-αντισώµατος και το σύστηµα βιοτίνης-στρεπταβιδίνης (Diamandis 1999). Το σύστηµα αντιγόνου - αντισώµατος έχει σταθερά διαστάσεως και χρησιµοποιείται σε τεχνικές διαχωρισµού, ανίχνευσης και ποιοτικού προσδιορισµού (Diamandis 1991). Η βιοτίνη (βιταµίνη H) (σχήµα 4.8), είναι ένα µικρό µόριο µοριακής µάζας Da, µε χηµικό τύπο C 10 H 16 N 2 O 3 S. Χρησιµεύει ως προσθετική οµάδα της καρβοξυλάσης του πυροσταφυλικού και λειτουργεί ως φορέας του ενεργοποιηµένου CO 2. Εµπλέκεται στην κατάλυση µεταβολικών αντιδράσεων που λαµβάνουν µέρος στη σύνθεση λιπαρών οξέων, στη γλυκονεογένεση και το µεταβολισµό της λευκίνης. Η στρεπταβιδίνη είναι µια πρωτεΐνη µοριακού βάρους Da, µε ισοηλεκτρικό σηµείο (pi) 5-6 και αποµονώνεται από το βακτήριο Streptomyces avidinii. Αποτελείται από τέσσερις πανοµοιότυπες υποµονάδες, καθεµία από τις οποίες περιέχει µια θέση δέσµευσης της βιοτίνης (σχήµα 4.8). (A) Σχήµα 4.9: (Α) Χηµική δοµή και τρισδιάστατη απεικόνιση της βιοτίνης. (Β) Απεικόνιση της τριτοταγούς δοµής της στρεπταβιδίνης. (B) 35

49 Η αλληλεπίδραση της βιοτίνης µε τη στρεπταβιδίνη είναι µια από τις ισχυρότερες που απαντώνται στη φύση, µε σταθερά διάστασης Μ. Λόγω της υψηλής συγγένειας, το σύστηµα βιοτίνης - στρεπταβιδίνης µένει σταθερό σε µεγάλο εύρος τιµών ph και παρουσία χαοτροπικών διαλυµάτων (Diamandis 1991). Αναφέρονται ενδεικτικά κάποιες εφαρµογές των παραπάνω συστηµάτων στην ανίχνευση πρωτεϊνών και DNA: 1)Τροποποιηµένα νανοσωµατίδια Au µε στρεπταβιδίνη έχουν χρησιµοποιηθεί για την ανίχνευση βιοτινυλιωµένων πρωτεϊνών (π.χ. ανοσοσφαιρίνες και αλβουµίνες του πλάσµατος) ή βιοτινυλιωµένων ολιγονουκλεοτιδίων (Gestwicki 2000). 2) Συζεύγµατα της πρωτεΐνης Α συνδεδεµένα µε νανοσωµατίδια Au χρησιµοποιήθηκαν για την ειδική σύζευξη µε διάφορες ανοσοσφαιρίνες (Sergeev 2003). 3) Νανοσωµατίδια Au τροποποιηµένα µε υδατάνθρακες χρησιµοποιήθηκαν για την αναγνώριση αντίστοιχων πρωτεϊνών που δεσµεύονται ειδικά σε αυτούς (Hernxiz 2002). 4.6 Παράγοντες που επηρεάζουν τροποποιηµένα νανοσωµατίδια Au Τα νανοσωµατίδια Au που παρασκευάζονται µε τη βοήθεια κιτρικών ιόντων, συσσωµατώνονται µη αντιστρεπτά, ακόµα και σε διαλύµατα χαµηλής ιοντικής ισχύος. Εποµένως, τα σωµατίδια δεν είναι συµβατά µε άλατα και πολυανιόντα, όπως τα ολιγονουκλεοτίδια. Η σταδιακή προσθήκη ηλεκτρολυτών, όπως το NaCl, προκαλεί τη γήρανση των σωµατιδίων, που επιτρέπει την αύξηση της ιοντικής ισχύος, χωρίς να παρατηρείται συσσωµάτωση. Η διαδικασία γήρανσης είναι απαραίτητη για την παρασκευή σταθερών νανοσωµατιδίων µε ολιγονουκλεοτίδια. Τα σωµατίδια αντιδρούν µε θειολ-ολιγονουκλεοτίδια σε νερό και στη συνέχεια αυξάνεται σταδιακά η ιοντική ισχύς του διαλύµατος. Είναι πιθανόν τα ολιγονουκλεοτίδια να βρίσκονται επίπεδα, συνδεδεµένα µέσω αλληλεπιδράσεων των βάσεων µε το Au. Κατά τη γήρανση η υψηλή ιοντική ισχύς του µέσου εµποδίζει την άπωση των γειτονικών ολιγονουκλεοτιδίων λόγω αρνητικών φορτίων και βοηθά την έλξη µεταξύ των πολυανιονικών ολιγονουκλεοτιδίων και της επιφάνειας του Au (Demers 2000). Επίσης, τα νανοσωµατίδια Au µπορούν να σταθεροποιηθούν έναντι της συσσωµάτωσης µε την προσθήκη πρωτεϊνών, όπως η BSA (Xie 2003). Η ποσότητα της πρωτεΐνης που χρειάζεται συνήθως αντιστοιχεί σε µονό στρώµα επικάλυψης της επιφάνειας (Niemeyer 2001). Στην περίπτωση της προσρόφησης πρωτεϊνών στην επιφάνεια Au, το ph των διαλυµάτων, πριν την ανάµιξή τους, πρέπει να είναι µεγαλύτερο από το ισοηλεκτρικό 36

50 σηµείο της προσροφούµενης ουσίας. Εάν η προσρόφηση επιχειρηθεί µε ph αντιδρώντων µικρότερο του pι της ουσίας, θα προκληθεί συσσωµάτωση. Εάν το ph είναι πολύ µεγαλύτερο από το pι θα έχουµε περιορισµένη προσρόφηση λόγω απωστικών δυνάµεων οµοειδών φορτίων της ουσίας και του σωµατιδίου. Η ρύθµιση του ph σε φυσιολογικές τιµές µετά τη διαδικασία της προσρόφησης δεν επηρεάζει την ήδη προσροφηµένη ουσία (Hayat 1989). 37

51 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Χηµειοφωταύγεια και Βιοφωταύγεια 5.1 Εισαγωγή Ο όρος φωταύγεια χρησιµοποιείται για να περιγράψει την εκποµπή ακτινοβολίας που συµβαίνει όταν ένα µόριο αποδιεγείρεται και µεταπίπτει από µια διεγερµένη κατάσταση πίσω στη θεµελιώδη. Υπάρχουν διάφοροι τύποι φωταύγειας ανάλογα µε την πηγή ενέργειας που προκαλεί τη διέγερση του µορίου. Αυτή η ενέργεια µπορεί να προέρχεται από ηλεκτροµαγνητική ακτινοβολία (φωτοφωταύγεια, η οποία διακρίνεται σε φθορισµό και φωσφορισµό), από θερµότητα (πυροφωταύγεια), από δυνάµεις τριβής (τριβοφωταύγεια), από ηλεκτρικό ρεύµα (καθοδοφωταύγεια) ή από κρυστάλλωση (κρυσταλλοφωταύγεια) (Dodeigne 2000). Στη χηµειοφωταύγεια η ενέργεια προέρχεται από µια χηµική αντίδραση (Weeks 1992). εδοµένου ότι δεν απαιτείται ακτινοβολία για τη διέγερση του δείγµατος, αποφεύγονται προβλήµατα που προκύπτουν συχνά στη φωτοφωταύγεια, όπως η σκέδαση του φωτός, η µη ειδική φωτοδιέγερση και η αστάθεια της πηγής. Για τη µέτρηση της χηµειοφωταύγειας αρκεί µια κυψελίδα και ένας φωτοπολλαπλασιαστής. Συνήθως, δεν απαιτείται σύστηµα επιλογής µήκους κύµατος επειδή η µόνη πηγή ακτινοβολίας είναι η χηµική αντίδραση µεταξύ του αναλύτη και του αντιδραστηρίου. Οι µέθοδοι χηµειοφωταύγειας παρουσιάζουν υψηλή ευαισθησία, επειδή το φως µπορεί να µετρηθεί πολύ εύκολα σε πολύ χαµηλά επίπεδα λόγω της απουσιάς θορύβων. Επιπλέον, αποφεύγεται οποιαδήποτε εξασθένηση της ακτινοβολίας µε φίλτρο ή µονοχρωµάτορα. Στην πράξη, τα όρια ανίχνευσης καθορίζονται συνήθως από την καθαρότητα των αντιδραστηρίων. 5.2 Το φαινόµενο της χηµειο(βιο)φωταύγειας Η χηµειοφωταύγεια είναι το φαινόµενο που παρατηρείται όταν µια χηµική αντίδραση παράγει ένα ηλεκτρονιακά διεγερµένο σωµάτιο, το οποίο εκπέµπει φως κατά την επιστροφή του στη βασική κατάσταση ή όταν µεταφέρει την ενέργειά του σε ένα άλλο σωµάτιο, το οποίο εκπέµπει φωτός. Αντιδράσεις φωταύγειας 38

52 συναντώνται σε µεγάλο αριθµό βιολογικών συστηµάτων, όπου το φαινόµενο καλείται βιοφωταύγεια. Παραδείγµατα οργανισµών που παρουσιάζουν βιοφωταύγεια είναι η πυγολαµπίδα, ο θαλάσσιος πανσές, ορισµένες µέδουσες, βακτήρια, πρωτόζωα και οστρακόδερµα. Η χηµεία των διαφόρων τύπων φυσικής φωταύγειας δεν έχει γίνει πλήρως κατανοητή. Σχήµα 5.1: Το βιοφωταυγάζον είδος γαρίδας Antarctic krill. Σχήµα 5.2: Βιοφωταυγάζουσα πυγολαµπίδα του είδους Lampyris noctiluca. 39

53 Πριν από ένα αιώνα ανακαλύφθηκε ότι αρκετές και σχετικά απλές οργανικές ενώσεις παρουσιάζουν χηµειοφωταύγεια. Ο απλούστερος τύπος αντίδρασης των ενώσεων αυτών για παραγωγή χηµειοφωταύγειας είναι ο εξής: A + B C* + D C* C + hν Όπου µε C* συµβολίζεται η διεγερµένη κατάσταση του σωµατιδίου C. Το φάσµα φωταύγειας είναι αυτό του προϊόντος της αντίδρασης C. Οι περισσότερες αντίδράσεις χηµειοφωταύγειας είναι πολυπλοκότερες από το σχήµα που δόθηκε πιο πάνω (Skoog 2002). 5.3 Ηλεκτρονιακές µεταπτώσεις Κάθε µόριο κατέχει µία σειρά ενεργειακών σταθµών και µπορεί να µεταβεί από µία χαµηλότερη σε µία υψηλότερη στάθµη µε την απορρόφηση κβάντων φωτεινής ακτινοβολίας, ίσης ενέργειας µε τη διαφορά των δύο ενεργειακών επιπέδων. Σε κάθε ηλεκτρονιακή στάθµη αντιστοιχεί επίσης ένα πλήθος δονητικών επιπέδων. Η πολλαπλότητα Μ µιας στάθµης, που εκφράζει την τροχιακή στροφορµή, σχετίζεται µε το συνολικό spin της στάθµης S µέσω της σχέσης M=2S+1. Έτσι στην περίπτωση ενός πολυατοµικού µορίου του οποίου τα ηλεκτρόνια βρίσκονται σε ζεύγη µε αντιπαράλληλα spin το συνολικό spin είναι 0 και η πολλαπλότητά του είναι ίση µε 1. Αυτή η κατάσταση ονοµάζεται απλή (singlet). Όταν το spin ενός ηλεκτρονίου αντιστραφεί, τότε στην κατάσταση αυτή υπάρχουν δύο ασύζευκτα ηλεκτρόνια µε παράλληλα spin και ολικό spin 1 άρα η πολλαπλότητα της στάθµης είναι 3. Αυτή η ηλεκτρονιακή στάθµη καλείται τριπλή (triplet) (Valeur 2001). Στη σταθερή τους κατάσταση τα περισσότερα µόρια βρίσκονται στην απλή κατάσταση S 0. Η βασική αυτή στάθµη χαρακτηρίζεται από τη µικρότερη δυνατή ενέργεια που µπορεί να έχει το µόριο. Αυτό επιτυγχάνεται όταν όλα τα ηλεκτρόνια είναι συζευγµένα και έχουν αντιπαράλληλα spins. εν υπάρχει δηλαδή ασύζευκτο ηλεκτρόνιο. Η τριπλή κατάσταση είναι για τα περισσότερα µόρια µία ασταθής κατάσταση στην οποία µεταβαίνουν όταν διεγερθούν και η οποία χαρακτηρίζεται από δύο ασύζευκτα ηλεκτρόνια τα οποία έχουν παράλληλα spins. Το οξυγόνο αποτελεί εξαίρεση των παραπάνω, όντας µία από τις σπάνιες ενώσεις οι οποίες στη βασική 40

54 τους κατάσταση βρίσκονται στην τριπλή στάθµη, ενώ όταν διεγερθούν µεταβαίνουν στην πολύ σηµαντική για τη φωτοδυναµική θεραπεία απλή κατάσταση (Valeur 2001). Όπως φαίνεται και στο διάγραµµα Jablonski (σχήµα 6.3), µετά την απορρόφηση ενός φωτονίου από το µόριο του χρωµοφόρου (διαδικασία που ολοκληρώνεται σε χρόνο της τάξεως των s), το µόριο µεταβαίνει σε διεγερµένη στάθµη. Κατά τη διάρκεια παραµονής του µορίου στην κατάσταση αυτή, η πλεονάζουσα ενέργεια σε σχέση µε την ενέργεια του χαµηλότερου δονητικού επιπέδου της στάθµης διοχετεύεται µέσω δονήσεων ή συγκρούσεων µε άλλα µόρια. Με τη διαδικασία αυτή το µόριο καταλαµβάνει το χαµηλότερο δονητικό επίπεδο της διεγερµένης στάθµης. Ο χρόνος ζωής αυτής της στάθµης είναι πολύ µικρός, της τάξεως του ps. Το µόριο µπορεί να επιστρέψει στη βασική του στάθµη ακολουθώντας κάποιον από τους παρακάτω µηχανισµούς (Valeur 2001): Σχήµα 5.3: ιάγραµµα Jablonski ενδοµοριακών διεργασιών µε βάση την απορρόφηση φωτός. 41

55 Εσωτερική µετατροπή: το µόριο µπορεί από την διεγερµένη κατάσταση, να µεταπηδήσει σε ένα κοντινό δονητικό επίπεδο της βασικής ενεργειακής κατάστασης. Η ενέργεια χάνεται χωρίς εκποµπή ακτινοβολίας µέσω δονητικής αποδιέγερσης. Εκποµπή φθορισµού: το διεγερµένο µόριο που βρίσκεται σε κάποιο δονητικό επίπεδο της απλής στάθµης µπορεί να µεταβεί σε ένα δονητικό επίπεδο της βασικής απλής κατάστασης, µε εκποµπή ενός φωτονίου. Η ενέργεια του φωτονίου και άρα το µήκος κύµατος της ακτινοβολίας, καθορίζεται από την ενεργειακή διαφορά µεταξύ της διεγερµένης και του δονητικού επιπέδου της βασικής ηλεκτρονιακής κατάστασης. Η διάρκεια ζωής του φθορισµού είναι της τάξης των ns. Κατόπιν, µέσω απόσβεσης και χωρίς εκποµπή ακτινοβολίας, το µόριο επιστρέφει στο χαµηλότερο δονητικό επίπεδο της βασικής κατάστασης. Εξαιτίας της απώλειας ενέργειας κατά την παραµονή του µορίου στη διεγερµένη κατάσταση, η εκπεµπόµενη ενέργεια (φθορισµός) είναι µεγαλύτερου µήκους κύµατος σε σχέση µε την απορροφηθείσα ενέργεια. Το φάσµα φθορισµού (η κατανοµή της έντασης της ακτινοβολίας φθορισµού για κάθε µήκος κύµατος), εκφράζει τις διαφορετικές πιθανές µεταβάσεις από την διεγερµένη κατάσταση στα διάφορα δονητικά επίπεδα της βασικής ηλεκτρονιακής κατάστασης. Η σχετική πιθανότητα να συµβεί κάποια από τις πιθανές διαδροµές διαφέρει από µόριο σε µόριο και εξαρτάται, όχι µόνο από τη δοµή του, αλλά και από το τοπικό του περιβάλλον. ιασυστηµατική διασταύρωση S* T*: το διεγερµένο µόριο µπορεί να µεταβεί από τη απλή διεγερµένη (S*) στην πρώτη τριπλή διεγερµένη στάθµη (Τ*). Η µετάβαση από τη βασική S 0 στην τριπλή διεγερµένη είναι απαγορευµένη (πολύ απίθανη). Σε αντιδιαστολή, η µετάπτωση από την απλή στην τριπλή διεγερµένη στάθµη είναι περισσότερο πιθανή, αφού η ενέργεια του χαµηλότερου δονητικού επιπέδου της Τ* είναι µικρότερη αυτής της S*. Η άµεση επιστροφή στην βασική κατάσταση µπορεί να πραγµατοποιηθεί είτε χωρίς εκποµπή ακτινοβολίας είτε µε εκποµπή ακτινοβολίας, οπότε και έχουµε το φαινόµενο του φωσφορισµού. Εφόσον η πιθανότητα αντίστροφης µετάβασης από τη διεγερµένη τριπλή στη διεγερµένη απλή στάθµη είναι µικρή, η διεγερµένη τριπλή στάθµη είναι συνήθως µεγάλης διάρκειας ζωής (της τάξεως των ms). Επίσης η σχετικά µεγάλη παραµονή των µορίων σε αυτή 42

56 την κατάσταση τα καθιστά πιο επιρρεπή σε διαδικασίες αποδιέγερσης χωρίς εκποµπή ακτινοβολίας. Καθυστερηµένος φθορισµός: Το διεγερµένο µόριο το οποίο βρίσκεται στην τριπλή διεγερµένη κατάσταση Τ* µπορεί εκτός από άµεσα να επιστρέψει και έµµεσα στη βασική απλή κατάσταση S 0 µέσω της S 1. Η µετάβαση από την τριπλή διεγερµένη στη απλή διεγερµένη προϋποθέτει απορρόφηση ενέργειας από το περιβάλλον. Από την απλή διεγερµένη το µόριο θα µεταβεί στη βασική απλή εκπέµποντας φωτεινή ενέργεια ίση µε τη ενεργειακή διαφορά των δύο σταθµών. Μεταφορά ενέργειας µέσω κρούσεων: αν το διεγερµένο µόριο συγκρουστεί µε άλλο µόριο που βρίσκεται σε χαµηλότερο ενεργειακό επίπεδο, τότε η ενέργεια µπορεί να µεταφερθεί σε αυτό το µόριο χωρίς εκποµπή ακτινοβολίας. Η διαδικασία αυτή είναι γνωστή ως απόσβεση φθορισµού. Μεταφορά ενέργειας µέσω συντονισµού: η ενέργεια αυτή µπορεί να µεταφερθεί σε άλλο µόριο χωρίς επαφή µέσω µιας σύζευξης διπόλου-διπόλου ανάµεσα στα µόρια. Οι παραπάνω µηχανισµοί που περιγράφουν την αποδιέγερση για το φθορισµό και το φωσφορισµό ισχύουν και στην περίπτωση της χηµειοφωταύγειας. Η διαφορά έγκειται στον τρόπο διέγερσης. Στη χηµειοφωταύγεια η χηµική αντίδραση παράγει αρκετή ενέργεια (περίπου 300 kj mol -1 για εκποµπή µπλε φωτός και 150 kj mol -1 για εκποµπή ερυθρού φωτός) ώστε να προκαλέσει µετάπτωση ενός ηλεκτρονίου από τη βασική σε µια διεγερµένη ηλεκτρονιακή κατάσταση. Αυτή η ηλεκτρονιακή µετάπτωση συνοδεύεται πολλές φορές από δονητικές και περιστροφικές αλλαγές στο µόριο. Στα οργανικά µόρια συνήθως έχουµε µεταπτώσεις από από ένα π δεσµικό σε ένα π* αντιδεσµικό τροχιακό (π π*) ή από ένα n µη δεσµικό σε ένα π* αντιδεσµικό τροχιακό (n π*) (Rongen 1994). 5.4 Κβαντική απόδοση Κβαντική απόδοση είναι ο λόγος των µορίων που εκπέµπουν φωτόνιο κατά την επιστροφή τους στη βασική κατάσταση προς το ολικό αριθµό των διεγερµένων µορίων. Η κβαντική απόδοση χηµειοφωταύγειας Φ CL υπολογίζεται µε βάση τη σχέση: Φ CL = Φ CE Φ F Φ R 43

57 Όπου Φ CE το κλάσµα των αντιδρώντων µορίων που παράγουν διεγερµένα µόρια, Φ F το κλάσµα των διεγερµένων µορίων που εκπέµπουν κάποιο φωτόνιο µέσω φθορισµού παρά µέσω κάποιου άλλου µηχανισµού αποδιέγερσης και Φ R είναι το κλάσµα των αρχικών µορίων που συµµετέχουν στην αντίδραση φωταύγειας παρά σε κάποια παράπλευρη αντίδραση (Rongen 1994). Η κβαντική απόδοση χηµειοφωταύγειας είναι συχνά πολύ χαµηλή, συνήθως < 1%. Συστήµατα χηµειοφωταύγειας που µπορούν να χρησιµοποιηθούν στην ανάλυση έχουν τιµές Φ CL στην περιοχή 0.01 έως Αντιπροσωπευτικά συστήµατα χηµειοφωταυγών ιχνηθετών Η πλειοψηφία των χηµειοφωταυγαζουσών αντιδράσεων είναι αντιδράσεις οξείδωσης οι οποίες παρέχουν τη σχετικά υψηλή ενέργεια που απαιτείται για τη διέγερση. Οι πιο κοινοί χηµειοφωταυγείς ιχνηθέτες είναι παράγωγα της λουµινόλης και των εστέρων της ακριδίνης. Επίσης, τα µόρια ενώσεων που ανήκουν στις οικογένειες των πυριδοπυριδαζινών και των 1,2 - διοξετανίων παράγουν χηµειοφωταύγεια µέσω αντιδράσεων ενεργοποίησης ενδιαµέσων ουσιών (Diamandis 1996) Λουµινόλη H λουµινόλη (5-αµινο-2,3-διυδρο-1,4-φθαλαζινοδιόνη) (σχήµα 5.4) και η ισολουµινόλη είναι τα πρώτα µόρια που χρησιµοποιήθηκαν σε ανοσοχηµικό προσδιορισµό και η οξείδωσή τους είναι η καλύτερα µελετηµένη χηµειοφωταυγάζουσα αντίδραση (Diamandis 1996). Η λουµινόλη όταν αναµιχθεί µε κατάλληλο οξειδωτικό παράγοντα παράγει µπλε φως. Σχήµα 5.4: Η χηµική δοµή της λουµινόλης (C 8 H 7 N 3 O 2 ). 44

58 Για να εµφανίσει χηµειοφωταύγεια η λουµινόλη πρέπει πρώτα να ενεργοποιηθεί µε ένα οξειδωτικό. Συνήθως ένα διάλυµα υπεροξειδίου του υδρογόνου (H 2 O 2 ) και ένα άλας υδροξειδίου σε νερό χρησιµοποιούνται ως ενεργοποιητές. Παρουσία κάποιου καταλύτη, όπως µια ένωση του σιδήρου, το υπεροξείδιο του υδρογόνου διασπάται σε οξυγόνο και νερό: 2 H 2 O 2 O H 2 O Όταν η λουµινόλη αντιδρά µε το άλας υδροξειδίου σχηµατίζεται ένα διανιόν. Ο µηχανισµός της αντίδρασης φαίνεται στο σχήµα 5.5. Το οξυγόνο που παράγεται από H 2 O 2 αντιδρά στη συνέχεια µε το διανιόν της λουµινόλης. Το προϊόν αυτής της αντίδρασης, ένα οργανικό υπεροξείδιο, είναι πολύ ασταθές και διασπάται ταχύτατα µε την απώλεια αζώτου παράγοντας 3-αµινοφθαλικό οξύ στη διεγερµένη κατάσταση. Η µετάπτωση από τη διεγερµένη στη βασική κατάσταση συνοδεύεται από εκποµπή στο ορατό (µπλέ). Λουµινόλη ιανιόν ιανιόν ιασυστηµατική διασταύρωση Η αντίδραση µε το O 2 παράγει ασταθές υπεροξείδιο Βασική (S 0 ) κατάσταση Απλή (S 1 ) διεγερµένη κατάσταση Τριπλή (Τ 1 ) διεγερµένη κατάσταση Σχήµα 5.5: Ο µηχανισµός της αντίδρασης οξείδωσης της λουµινόλης. 45

59 5.5.2 Εστέρες της ακριδίνης Η σύνθεση και η εφαρµογή σε αναλυτικές µεθόδους των εστέρων της ακριδίνης αναφέρθηκε για πρώτη φορά το Οι ενώσεις αυτές ήταν οι πρώτοι εµπορικά διαθέσιµοι χηµειοφωταυγείς ιχνηθέτες. Η φωταυγάζουσα αντίδραση λαµβάνει χώρα µετά από ανάµιξη των εστέρων µε υπεροξείδιο του υδρογόνου σε αλκαλικό περιβάλλον. Ο µηχανισµός της χηµειοφωταυγούς διάσπασης ενός εστέρα ακριδίνης (σχήµα 5.6) περιλαµβάνει προσβολή του C-9 από ένα ανιόν υπεροξειδίου προς σχηµατισµό ενός υδροϋπεροξειδίου. Ακολουθεί απώλεια µιας αλκοολικής οµάδας και σχηµατισµός µιας ασταθούς διοξετάνης. Το µόριο αυτό διασπάται σε διοξείδιο του άνθρακα και Ν- µεθυλ-ακριδόνη, σε ηλεκτρονικά διεγερµένη κατάσταση. Η επιστροφή αυτού του µορίου στη θεµελιώδη κατάσταση συνοδεύεται από εκποµπή φωτός στα 430 nm (Diamandis 1996). ιοξετανόνη Εστέρας ακριδίνης + hν + CO 2 Ν-µεθυλ-ακριδόνη Σχήµα 5.6: Ο µηχανισµός της χηµειοφωταυγούς διάσπασης ενός εστέρα ακριδίνης Ενζυµικοί ιχνηθέτες µε χηµειοφωταυγειογόνα υποστρώµατα Μια ενδιαφέρουσα οµάδα ιχνηθετών για την ανάλυση DNA αποτελείται από ένζυµα που έχουν αποµονωθεί από διάφορα βιολογικά συστήµατα και εκπέµπουν φως µε τα κατάλληλα χρωµογόνα, φθορισµογόνα και χηµειοφωταυγειογόνα υποστρώµατα. Η χρήση των τελευταίων επιτρέπει την αύξηση της ευαισθησίας στην ανίχνευση των επιθυµητών µορίων. Τα πλέον χρησιµοποιούµενα ένζυµα είναι η αλκαλική φωσφατάση και η υπεροξειδάση των αγριοραφανιδών. Έχουν επίσης µελετηθεί τα ένζυµα β-γαλακτοσιδάση, οξειδάση της γλυκόζης, αφυδρογονάση της 6-46

60 φωσφορικής γλυκόζης, β-ν-ακετυλ-γλυκοζαµινιδάση, ιµβερτάση και οξειδάση της ξανθίνης (Diamandis 1996) Αλκαλική φωσφατάση Η αλκαλική φωσφατάση (alkaline phosphatase-alp) καταλύει την υδρόλυση φωσφορικών µονοεστέρων σε αλκαλικό περιβάλλον.τα χηµειοφωταυγειογόνα υποστρώµατά της βασίζονται στα αδαµαντυλ 1,2-αρυλ-φωσφορικά διοξετάνια. Η φωσφατάση αποφωσφορυλιώνει τα διοξετάνια, προς παραγωγή φαινοξειδικών ενδιαµέσων, που µεταπίπτουν στη θεµελιώδη κατάσταση, εκπέµποντας φως στα 470 nm για µεγάλο χρονικό διάστηµα (> 1 hr) (σχήµα 5.7). Το όριο ανίχνευσης του ενζύµου είναι 1 zmol (10-21 mol) (Diamandis 1996). Υπόστρωµα ALP / ph 9 hν Σχήµα 5.7: Φωταυγάζουσα αντίδραση της αλκαλικής φωσφατάσης (ALP) σε υπόστρωµα 1,2 διοξετάνιο Υπεροξειδάση Η υπεροξειδάση των αγριοραφανιδών (horseradish peroxidase- HRP) είναι µια αιµοπρωτεΐνη η οποία καταλύει την οξείδωση διαφόρων ενώσεων χρησιµοποιώντας ως υπόστρωµα το υπεροξείδιο του υδρογόνου. Η ενζυµική της δραστικότητα οφείλεται στην αναγωγή και την οξείδωση του ατόµου σιδήρου της αίµης. ιάφορα µόρια, όπως η λουµινόλη, έχουν χρησιµοποιηθεί ως χηµειοφωταυγειογόνα της HRP. Όπως αναφέρθηκε προηγουµένως, η λουµινόλη οξειδώνεται από το υπεροξείδιο, προς παραγωγή 3-αµινοφθαλικού σε διεγερµένη κατάσταση (σχήµα 5.5). Η αντίδραση αυτή παρουσιάζει χαµηλή κβαντική απόδοση απουσία της υπεροξειδάσης. 47

61 Οι εστέρες ακριδίνης και τα παράγωγά τους έχουν επίσης χρησιµοποιηθεί ως υποστρώµατα του ενζύµου (σχήµα 5.6) (Diamandis 1996) Βιοφωταυγείς ιχνηθέτες Η βιοφωταύγεια είναι ένα φυσικό φαινόµενο που απαντάται σε πολλές κατώτερες µορφές ζωής. Για να προκύψει βιοφωταύγεια απαιτούνται τουλάχιστον δύο διαφορετικοί χηµικοί παράγοντες (Haddock 2000). Ο γενικός όρος φωτοφερίνη (luciferin) αναφέρεται στο χηµικό παράγοντα που παράγει το φως, ενώ ο όρος φωτοφεράση (luciferase) αναφέρεται στο ένζυµο που λειτουργεί σαν καταλύτης για την πραγµατοποίηση της αντίδρασης. Τα φυσικά βιοφωταυγή συστήµατα διαφέρουν µεταξύ τους στο µηχανισµό παραγωγής φωτός, ωστόσο σε κάθε περίπτωση περιλαµβάνεται αντίδραση οξειδωτικής αποκαρβοξυλίωσης µε κάποιο διεγερµένο ενδιάµεσο. Για την παραγωγή βιοφωταύγειας η φωτοφεράση καταλύει την οξείδωση της φωτοφερίνης. Οι φωτοπρωτεΐνες είναι πρωτεΐνες που απαρτίζονται τόσο από τη φωτοφερίνη όσο και από τη φωτοφεράση, µαζί µε κάποιον άλλο συµπαράγοντα όπως το οξυγόνο. Οι περισσότερες από τις φωτοπρωτεΐνες που έχουν µελετηθεί διεγείρονται για την παραγωγή φωτός από ιόντα Ca 2+ ή άλλα ανόργανα ιόντα. 5.6 Η φωτοπρωτεΐνη αικουορίνη Η αικουορίνη είναι µια φωτοπρωτεΐνη η οποία αποµονώθηκε (Shimomura 1962) από το βιοφωταυγές είδος µέδουσας Aequoria victoria (Σχήµα 5.8). Το είδος αυτό ζει στον Ειρηνικό ωκεανό κοντά στις δυτικές ακτές της Βόρειας Αµερικής. Για να βιοφωταυγάσει αυτή η µέδουσα απελευθερώνει ιόντα Ca 2+. Τα ιόντα αυτά δεσµεύονται στην αικουορίνη, η οποία εκπέµπει µπλε φως. Το φως αυτό απορροφάται από την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (Green Fluorescent Protein - GFP), η οποία µε τη σειρά της εκπέµπει πράσινο φως (σχήµα 5.9). H GFP ανακαλύφθηκε από τον Osamu Shimomura ο οποίος µαζί µε τους Martin Chalfie και Roger Y. Tsien τιµήθηκαν το 2008 µε το βραβείο Nobel Χηµείας για την ανακάλυψη της GFP και την ανάπτυξή της ως ένα σηµαντικό βιολογικό εργαλείο. 48

62 Σχήµα 5.8: Η βιοφωταυγάζουσα µέδουσα Aequoria victoria ζει στον Ειρηνικό ωκεανό κοντά στις δυτικές ακτές της Βόρειας Αµερικής. Σχήµα 5.9: Σχηµατική αναπαράσταση της δοµής της GFP στο χώρο. Το µπλε φως που εκπέµπεται από την αικουορίνη απορροφάται από τη GFP η οποία µε τη σειρά της εκπέµπει πράσινο φως. 49

63 5.6.1 οµή και λειτουργία της αικουορίνης Η αικουορίνη αποτελείται από δύο διακριτές µονάδες, την αποπρωτεΐνη αποαικουορίνη και την προσθετική οµάδα της σελεντεραζίνης. Η αποαικουορίνη είναι µια πολυπεπτιδική αλυσίδα 189 αµινοξέων µε µοριακή µάζα 22 kda περίπου. Η σελεντεραζίνη είναι µια ιµιδαζοπυραζίνη µε µοριακό βάρος 472 που ανήκει στην οικογένεια των φωτοφερινών. Η αικουορίνη περιέχει επίσης µοριακό οξυγόνο το οποίο είναι συνδεδεµένο σε ειδικές θέσεις της αποαικουορίνης µε τη µορφή υπεροξειδίου (Jones 1999). Οι παραπάνω µονάδες συνδέονται αυθόρµητα σχηµατίζοντας τη λειτουργική πρωτεΐνη. Σχήµα 5.10: Σχηµατική αναπαράσταση του συµπλόκου αικουορίνης/ σελεντεραζίνης όπου φαίνονται τα δοµικά στοιχεία της δευτεροταγούς δοµής της πρωτεΐνης. Η πρωτεΐνη περιέχει 3 ειδικές κοιλότητες δέσµευσης Ca 2+ (EF-hand περιοχές) (Head 2000). Η δέσµευση του Ca 2+ προκαλεί µια αλλαγή στη διαµόρφωση της πρωτεΐνης η οποία καταλύει την οξειδωτική αποκαρβοξυλίωση της σελεντεραζίνης από το δεσµευµένο οξυγόνο, παράγοντας το διεγερµένο ενδιάµεσο του σελεντεραµιδίου και CO 2 (Σχήµα 5.11). Η αποδιέγερση του σελεντεραµιδίου συνοδεύεται από εκποµπή φωτός στα 469 nm (Shimomura 1978). Η αποαικουορίνη µπορεί να αναγεννηθεί προς σχηµατισµό αικουορίνης έπειτα από επώαση µε σελεντεραζίνη και διαλυµένο οξυγόνο παρουσία µερκάπτο-αιθανόλης (Shimomura 1993). 50

64 Σχήµα 5.11: Ο µηχανισµός της επαγόµενης από την αικουορίνη αντίδρασης οξειδωτικής αποκαρβοξυλίωσης της σελεντεραζίνης προς σελεντεραµίδιο Εφαρµογές της αικουορίνης Η αικουορίνη είναι ανιχνεύσιµη σε επίπεδο attomole (10-18 mole) µε απλή εγχυση περίσσειας ιόντων Ca 2+, ενώ η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3 µόλις δευτερόλεπτα (Kendall 1998). Η αικουορίνη έχει χρησιµοποιηθεί εκτεταµένα ως δείκτης για τη µέτρηση του ενδοκυτταρικού Ca 2+. Για πολλά χρόνια η χρήση της αικουορίνης απαιτούσε την αποµόνωσή της από τη µέδουσα Aequoria Victoria µε επίπονες και µη αποδοτικές διαδικασίες, καθώς για την παραγωγή µερικών mg φωτοπρωτεΐνης απαιτούνταν ένας τόνος µέδουσας. Η κλωνοποίηση του cdna της αποαικουορίνης (Inouye 1985, Prasher 1985) επέτρεψε την έκφραση της ανασυνδυασµένης αικουορίνης σε βακτήρια και τη χρησιµοποίησή της ως µόριο αναφοράς σε ανοσοπροσδιορισµούς (Stults 1992, Sgoutas 1995) και δοκιµασίες υβριδοποίησης (Stults 1992, Galvan 1996, Verhaegen 1998, Laios 2001, Actor 2000). 51

65 Σε αυτές τις µελέτες παρατηρήθηκε ότι αν και η αντίδραση της αικουορίνης δεν περιλαµβάνει τη µετατροπή κάποιου υποστρώµατος, παρουσιάζει πολύ υψηλή ανιχνευσιµότητα η οποία είναι συγκρίσιµη µε ενζυµικά µόρια αναφοράς (π.χ. αλκαλική φωσφατάση) που χρησιµοποιούν χηµειοφωταυγειογόνα υποστρώµατα. Οι βιοφωταυγειοµετρικές δοκιµασίες υβριδοποίησης που βασίζονται στην αικουορίνη µπορούν να εκτελεστούν ακολουθώντας δύο γενικές στρατηγικές ιχνηθέτησης. Στην πρώτη περίπτωση ( έµµεση ιχνηθέτηση ), ένας υποκαταστάτης (όπως η βιοτίνη ή το απτένιο διγοξιγενίνη) συνδέεται µε τον ανιχνευτή DNA και τα υβρίδια ανιχνεύονται µε µια ειδική πρωτεΐνη δέσµευσης η οποία είναι συζευγµένη η συµπλεγµένη µε τη φωτοπρωτεΐνη. Έτσι, το απτένιο διγοξιγενίνη έχει συνδεθεί µε τον ανιχνευτή και το σύζευγµα αικουορίνης-αντιδιγοξιγενίνης έχει χρησιµοποιηθεί για ανιχνευση (Verhaegen 1998). Εναλλακτικά, η βιοτίνη έχει χρησιµοποιηθεί ως υποκαταστάτης και τα υβρίδια ανιχνεύονται από ένα σύζευγµα αικουορίνηςστρεπταβιδίνης ή από ένα σύµπλοκο στρεπταβιδίνης-βιοτινυλιωµένης αικουορίνης (Galvan 1996, Verhaegen 2002). Στην περίπτωση της άµεσης ιχνηθέτησης η αικουορίνη συζεύγνυται µε τον DNA ανιχνευτή (Stults 1997). Με αυτό τον τρόπο αποφεύγεται ένα στάδιο επώασης και ένα στάδιο έκπλυσης, µειώνοντας σηµαντικά τον απαιτούµενο χρόνο για την ολοκλήρωση της δοκιµασίας.. 52

66 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 Η δυναµική των διεγερµένων καταστάσεων σε µετρήσεις φθορισµού 6.1 Εισαγωγή Η ύλη µπορεί να µελετηθεί είτε ως προς τη δοµή της είτε ως προς τη δυναµική της συµπεριφορά. Με τον όρο µελέτη της δοµής εννοούµε τη χρονικά ανεξάρτητη πληροφορία για την κατάσταση και τη σύσταση ενός συστήµατος σε µια µορφή ισορροπίας. Η δοµή απετέλεσε τον κύριο προσανατολισµό των χηµικών τις προηγούµενες δεκαετίες. Όµως, η φύση δεν βρίσκεται σε ισορροπία και εποµένως είναι πολύ σηµαντική η κατανόηση της δυναµικής συµπεριφοράς της ύλης, δηλαδή πώς ένα σύστηµα κινείται από µια κατάσταση ισορροπίας σε µια άλλη µεταβάλλοντας προσωρινά τις ιδιότητες του ή ακόµα και τη σύστασή του. 6.2 Φασµατοσκοπία χρονικής ανάλυσης Η µελέτη της δυναµικής της ύλης γίνεται µε µια τεχνική που ονοµάζεται φασµατοσκοπία χρονικής ανάλυσης και διακρίνεται ανάλογα µε τη χρονική κλίµακα. Τα τελευταία χρόνια το ερευνητικό ενδιαφέρον εστιάζεται στην εξέταση υπερταχέων φαινοµένων που συµβαίνουν στη φύση και εντάσσονται στη χρονική κλίµακα των fs και ps. Στη χρονική κλίµακα αυτή πραγµατοποιούνται οι χηµικές αντιδράσεις και η κίνηση των ηλεκτρονίων και των πυρήνων στα µόρια. Πιο συγκεκριµένα, ο σχηµατισµός ή η διάσπαση χηµικών δεσµών κατά τη διεξαγωγή µιας χηµικής αντίδρασης, η αναδιάταξη των µορίων προς σχηµατισµό νέων µορίων, η µεταφορά ενέργειας από ένα µόριο σε ένα άλλο είναι φαινόµενα που συµβαίνουν στη χρονική κλίµακα των fs και ps. Για τη µελέτη τέτοιων φαινοµένων η χρονική διακριτική ικανότητα που προσφέρουν τα σύγχρονα ηλεκτρονικά συστήµατα συχνά δεν είναι αρκετή. Έτσι, το πιο πολύτιµο εργαλείο για την εξέταση των υπερταχέων φαινοµένων στην ύλη είναι το laser παλµών χρονικής διάρκειας µερικών fs. Ειδικά τη δεκαετία του 1990, η πρόοδος στον τοµέα των laser αυτών και ιδιαίτερα η κατασκευή laser στερεάς κατάστασης παλµών fs αντλούµενου επίσης από laser στερεάς κατάστασης έδωσε τεράστια ώθηση στον τοµέα της φασµατοσκοπίας χρονικής ανάλυσης υπερταχέων φαινοµένων. Σηµειώνεται πως το Nobel Χηµείας το 1999 δόθηκε στον 53

67 καθηγητή κ. A. Zewail για τις µελέτες του πάνω στη χρονική εξέλιξη των χηµικών αντιδράσεων µέσω φασµατοσκοπίας χρονικής ανάλυσης στην περιοχή των fs. Η φασµατοσκοπία φθορισµού χρονικής ανάλυσης στην περιοχή των fs βασίζεται στο φαινόµενο της µίξης συχνοτήτων και παρουσιάζει την καλύτερη χρονική διακριτική ικανότητα που έχει αναφερθεί µέχρι σήµερα. Αυτή η τεχνική παρέχει τη δυνατότητα καταγραφής τόσο του χρόνου ζωής ενός υλικού στη διεγερµένη κατάσταση όσο και της χρονικής εξέλιξης του φάσµατος εκποµπής του. Η βασική ιδέα στη συγκεκριµένη τεχνική είναι η εξής: ο φθορισµός του υπό µελέτη υλικού που έχει διεγερθεί από έναν υπερταχύ παλµό laser µαζί µε την κύρια δέσµη laser, η οποία προηγουµένως έχει διέλθει από γραµµή ελεγχόµενης χρονικής καθυστέρησης, εστιάζεται σε ένα µη γραµµικό κρύσταλλο όπου πραγµατοποιείται µίξη συχνοτήτων. Η µίξη συχνοτήτων πραγµατοποιείται µόνο κατά τη διάρκεια που ο παλµός του laser διέρχεται από τον κρύσταλλο δίνοντας έτσι χρονική διακριτική ικανότητα της τάξης της διάρκειας του παλµού laser (Mahr 1975, Shah 1988). Τα συµπεράσµατα που εξάγονται είναι άµεσα και αφορούν την χρονική εξέλιξη της αποδιέγερσης της διεγερµένης κατάστασης στη βασική. Η συγκεκριµένη τεχνική πλεονεκτεί σε σχέση µε τεχνικές φασµατοσκοπίας χρονικής ανάλυσης που βασίζονται στην απορρόφηση αφού στις τελευταίες καταγράφεται συχνά η απορρόφηση της διεγερµένης κατάστασης περιπλέκοντας έτσι τα αποτελέσµατα. 6.3 Περιγραφή του laser παλµών femtoseconds Το σύστηµα laser παλµών fs που χρησιµοποιήθηκε στα πειράµατα δυναµικής της αποδιέγερσης φθορισµού αποτελείται από ένα laser στερεάς κατάστασης εγκλειδωµένου ρυθµού Ti:Sapphire (TSUNAMI, Spectra Physics) και το laser άντλησής του που είναι ένα laser Nd:YVO 4 διπλασιασµένης συχνότητας (MILLENNIA Vs, Spectra Physics). To ΜΙLLΕΝΝΙΑ είναι ένα laser συνεχούς λειτουργίας όπου ο κρύσταλλος Nd:YVO 4 αντλείται από ένα διοδικό laser ισχύος 40 W. Στη συνέχεια εκπέµπει συνεχή ακτινοβολία laser στα 1064 nm η οποία µέσω κρυστάλλου LBO διπλασιάζεται σε συχνότητα δίνοντας δέσµη laser στα 532 nm µε τελική ισχύ ίση µε 5 W. Το TSUNAMI του είναι ένα laser παλµικής λειτουργίας που περιέχει κρύσταλλο Ti:Sapphire ο οποίος αντλείται από τη δέσµη εξόδου του ΜΙLLΕΝΝΙΑ (532 nm, 5 W). Το TSUNAMI έχει δυνατότητα συντονισµού από τα 740 εώς τα 850 nm και η επαναληπτικότητα των παλµών είναι 82 MHz. 54

68 Σχήµα 6.1: Μέρος του laser Tsunami που περιέχει κρύσταλλο Ti:Sapphire ο οποίος αντλείται από τη δέσµη εξόδου του ΜΙLLΕΝΝΙΑ στα 532 nm. Το έντονο κόκκινο χρώµα στα αριστερά είναι από τον κρύσταλλο Ti:sapphire. Το κόκκινο χρώµα στα δεξιά είναι ανακλώµενο φως από έναν καθρέπτη.το φως από το laser των 800 nm δεν είναι ορατό καθώς είναι στην υπέρυθρη περιοχή. 6.4 Περιγραφή της πειραµατικής διάταξης της φασµατοσκοπίας χρονικής ανάλυσης Η πειραµατική διάταξη της φασµατοσκοπίας φθορισµού χρονικής ανάλυσης που χρησιµοποιήθηκε για τα πειράµατα δυναµικής φθορισµού φαίνεται στο σχήµα 6.2. (Fakis, PhD Thesis, Παν/µιο Πατρών, 2004). Η βασική δέσµη του laser Ti:Sapphire ω IR µε µέση ισχύ 900 mw, µήκος κύµατος 760 nm και διάρκεια παλµών ~ 80 fs εστιάζεται σε µη γραµµικό κρύσταλλο πάχους 1 mm (β-barium borate ΒΒΟ1, Fujian Castech) όπου παράγεται δέσµη παλµών laser διπλασιασµένης συχνότητας ω pump (λ=380 nm). Από το µη γραµµικό κρύσταλλο εξέρχεται η δέσµη διπλασιασµένης συχνότητας ω pump και η εναποµένουσα αρχική δέσµη ω IR. Στη συνέχεια οι δύο παλµικές δέσµες laser ω IR και ω pump ευθυγραµµίζονται και διαχωρίζονται µέσω ενός πρίσµατος. Τα υπό µελέτη δείγµατα στη συνέχεια εκπέµπουν αυθόρµητη ακτινοβολία στο ορατό τµήµα του φάσµατος ω SP. Η αυθόρµητη αυτή ακτινοβολία συλλέγεται και ευθυγραµµίζεται µέσω ενός σφαιρικού φακού εστιακής απόστασης 4 cm. Στη συνέχεια µέσω ενός κατόπτρου και ενός δεύτερου φακού εστιακής απόστασης 12.5 cm εστιάζεται σε δεύτερο µη γραµµικό κρύσταλλο πάχους 1.5 mm (ΒΒΟ2, Fujian Castech). 55

69 Nd:YVO 4 CW 532nm Ti:Sapphire Παλµοί 80fs 760 nm 80fs ΒΒΟ 1 ω ΙR ω pump ω ΙR Μονοχρωµάτορας ω SIGNAL είγµα ω pump Γραµµής χρονικής Καθυστέρησης τ ΒΒΟ 2 ω SP ω ΙR Φωτοπολλαπλασιαστής Φίλτρα Σχήµα 6.2: Σχηµατική απεικόνιση της τεχνικής φασµατοσκοπίας φθορισµού χρονικής ανάλυσης (Fakis, PhD Thesis, Παν/µιο Πατρών, 2004). 56

70 Στον ίδιο κρύσταλλο εστιάζεται και η βασική δέσµη laser ω IR ισχύος ~ 400 mw η οποία προηγουµένως είχε διέλθει από γραµµή χρονικής καθυστέρησης τ. Η τελευταία αποτελείται από σύστηµα οριζόντιας µετατόπισης (Newport 850 G linear actuator που οδηγείται από Newport ESP 300 driver) µε χωρική ακρίβεια 0.1 µm. Οι δύο δέσµες ω SP και ω IR προσπίπτουν στον κρύσταλλο µη συγραµµικά και η γωνία ανάµεσά τους ήταν ~ Στον κρύσταλλο ΒΒΟ2 κάτω από κατάλληλες συνθήκες συµφωνίας φάσης µεταξύ των δεσµών που συµµετέχουν δηµιουργείται µίξη συχνοτήτων. H δέσµη ω SIGNAL βρίσκεται στο υπεριώδες και για το διαχωρισµό της από τις υπόλοιπες δέσµες (ω SP και ω IR ) διέρχεται από ένα σύστηµα φίλτρων (Schott glass filters, UG11) και µία σχισµή. Τέλος, διέρχεται από µονοχρωµάτορα (ORIEL Instruments 77200) και ανιχνεύεται από φωτοπολλαπλασιαστή µε µέγιστη απόκριση στο υπεριώδες (Becker-Hickle PMH-100-3) συνδεδεµένο µε photon counter (Becker- Hickle PMS-400). Ο χρόνος έκθεσης του φωτοπολλαπλασιαστή ήταν 1s. Η καταγραφή της ω SIGNAL σαν συνάρτηση της χρονικής καθυστέρησης τ µεταξύ των δεσµών ω SP και ω IR δίνει έµµεσα τη χρονική εξέλιξη του παλµού αυθόρµητης ακτινοβολίας δηλαδή τη δυναµική της διεγερµένης κατάστασης της χρωστικής. Η καταγραφή της δυναµικής αυτής για όλα τα µήκη κύµατος που περιλαµβάνονται στην αυθόρµητη ακτινοβολία της χρωστικής δίνει τη χρονική εξέλιξη του συνολικού φάσµατος εκποµπής. Για την καταγραφή της δυναµικής διαφορετικών µηκών κύµατος απαιτείται η στροφή της γωνίας του κρυστάλλου BBO2 ώστε να επιτευχθεί κάθε φορά ταίριασµα φάσης και επίσης ανάλογος συντονισµός του µήκους κύµατος του µονοχρωµάτορα. Έτσι, ανιχνεύονται µε πολύ καλή διακριτική ικανότητα, οι διαφορετικές καταστάσεις από τις οποίες περνάει το σύστηµα µέχρι να καταλήξει στην ισορροπία δηλαδή στη βασική στάθµη. Τα αποτελέσµατα των µετρήσεων συλλέγονται σε Η/Υ ο οποίος ελέγχει και το σύστηµα οριζόντιας µετατόπισης µέσω του προγράµµατος LabView 5.1. Κατά τη διάρκεια των µετρήσεων η χρονική διάρκεια των παλµών laser καταγράφεται συνέχεια µέσω ενός αυτοσυσχετιστή (Femtochrome Research FR-103 XL) συνδεδεµένου µε ψηφιακό παλµογράφο (LeCroy 9362). Το φάσµα των παλµών laser καταγράφεται επίσης καθ όλη τη διάρκεια των πειραµάτων µέσω ενός µονοχρωµάτορα (ORIEL Instruments 77200) συνδεδεµένου µε συστοιχία φωτοδιόδων (ORIEL Instruments 77101) ώστε να αποφευχθεί η ύπαρξη συνεχούς ακτινοβολίας laser από το TSUNAMI ταυτόχρονα µε την παλµική ακτινοβολία. Η χρονική διακριτική ικανότητα της τεχνικής που περιγράφηκε βρέθηκε µέσω της 57

71 χρονικής διάρκειας (FWHM) της µίξης συχνοτήτων µεταξύ της δέσµης ω IR και της σκεδαζόµενης από το δείγµα δέσµης ω pump και ήταν ~160 fs. Τέλος, η φασµατική διακριτική ικανότητα ήταν 2.5 nm. Η µίξη συχνοτήτων στη συγκεκριµένη φασµατοσκοπία λειτουργεί ως «οπτική πύλη» αφού επιτρέπει την ανίχνευση της ακτινοβολίας φθορισµού µόνο για το χρονικό διάστηµα που ο παλµός laser ω IR διέρχεται από τον κρύσταλλο ΒΒΟ2 προσφέροντας έτσι διακριτική ικανότητα συγκρίσιµη της διάρκειας του παλµού (σχήµα 6.3). 0 Παλµός διέγερσης (ω pump ) λ=380 nm t Αυθόρµητη ακτινοβολία (ω SP ) t Στο χρονικό σηµείο σύµπτωσης των παλµών δηµιουργείται η µίξη συχνοτήτων Χρονική καθυστέρηση (τ) Καθυστερηµένος παλµός laser λ=760 nm (ω IR ) 0 t Σχήµα 6.3: Σχηµατική αναπαράσταση της διαδικασίας της χρονικής ανάλυσης. Η µίξη συχνοτήτων πραγµατοποιείται στον µη γραµµικό κρύσταλλο µόνο για το διάστηµα που η αυθόρµητη ακτινοβολία και ο παλµός laser συµπίπτουν χρονικά δηλαδή µόνο για το γραµµοσκιασµένο τµήµα. 58

72 ΠΡΩΤΟΤΥΠΟ ΜΕΡΟΣ 59

73 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 Συσκευές και υλικά 7.1 Οργανολογία Επιτραπέζιος σαρωτής ειδώλου ScanJet 4300C, Hewlett Packard (Palo Alto, CA) Επιτραπέζια φυγόκεντρος Centrifuge 5415 D, Eppendorf (Hamburg, Germany) Επωαστήρας / αναδευτήρας πλακών µικροτιτλοδότησης SH26, Ingenieurburo CAT M. Zipperer GmbH (Staufen, Germany) Επωαστήρας / αναδευτήρας βακτηριακών καλλιεργειών Heidolph incubator 1000 (Kelheim, Germany) Ζυγός ακριβείας ΑΒ104-S, Mettler Toledo (Greifensee, Switzerland) Θερµικός κυκλοποιητής PTC-0150 MiniCycler, MJ Research (Watertown, MA) Λογισµικό απόθεσης αντιδραστηρίων σε TLC πλάκες WinCats, Camag (Mutttenz, Switzerland) Λογισµικό ποσοτικοποίησης DNA Gel Analyzer, Kodak (New York, NY) Λογισµικό ποσοτικοποίησης Strip Color Densitometer, προσφορά Καθ. Κ. Ευσταθίου (Εργαστήριο Ενόργανης Ανάλυσης, Τµήµα Χηµείας, Πανεπιστήµιο Αθηνών) Μαγνητικός αναδευτήρας SMT, Bioline Scientific (Αθήνα, Ελλάδα) Πεχάµετρο 692 ph / Ion Meter, Ωmetrohm (Herisau, Switzerland) Πιππέτες Nichiryo (Tokyo, Japan) Συσκευή απόθεσης αντιδραστηρίων σε TLC πλάκες Linomat 5, Camag (Mutttenz, Switzerland) Συσκευή έκπλυσης πλακών µικροτιτλοδότησης Nunc Immuno Wash 8, Nalge Nunc International (Roskilde, Denmark) Συσκευή ηλεκτροφόρησης Sub-cell GT, BIO-RAD (New York, ΝΥ) Συσκευή περιδίνησης (Vortex) Labnet International (Edison, NJ) Συσκευή υπερκάθαρου H 2 O αντίστροφης ώσµωσης RiOs, Millipore (Billerica, MA) 60

74 Υδατόλουτρο, Bioline Scientific (Αθήνα, Ελλάδα) Φασµατοφθορισµόµετρο RF-1501, Shimadzu (Kyoto, Japan) Φασµατοφωτόµετρο UV-Vis Cary 1E, Varian Inc. Corporate Headquartes (Palo Alto, CA) Χηµειοφωταυγειόµετρο πλακών µικροτιτλοδότησης, Mediators Diagnostics Systems (Vienna, Austria) Ψηφιακή κάµερα Dynax 5D, Konica Minolta (Tokyo, Japan) Ψηφιακή κάµερα Kodak DC 120, Kodak (New York, NY) 7.2 Αντιδραστήρια Υλικά Αγαρόζη, HT Biotechnology (Cambridge, UK) Αιθανόλη, Sigma (St. Louis, MO) Απορροφητικό υλικό, Schleicher & Schuell (Dassel, Germany) Βακτηριακά κύτταρα E. coli JM109, Promega (Madison, WI) Biotin-21-dUTP, Clontech Laboratories (Palo Alto, CA) Βόρακας, Sigma (St. Louis, MO) Βρωµιούχο αιθίδιο, Research Organics (Cleveland, Canada) Γλυκερόλη, Carlo Erba Analyticals (Milano, Italy) είκτης µοριακού µεγέθους DNA φx174 DNA HaeIII digest, HT Biotechnology (Cambridge, UK) EDTA, Merck (Darmstadt, Germany) Ισοπροπανόλη, Sigma (St. Louis, MO) Μεθανόλη, Sigma (St. Louis, MO) Μεµβράνη νιτροκυτταρίνης, Immunopore FP Whatman, Schleicher & Schuell (Dassel, Germany) Νανοσωµατίδια Au, British Biocell BBInternational (Cardiff, UK) NaN 3, Merck (Darmstadt, Germany) NaOH, Carlo Erba Analyticals (Milano, Italy) Σακχαρόζη, Sigma (St. Louis, MO) SDS (δωδεκυλο-θειϊκό νάτριο), Sigma (St. Louis, MO) Sephadex G-25, Sigma (St. Louis, MO) SYBR Green I, Molecular Probes (Leiden, Netherlands) 61

75 Τριφωσφορικοί δεοξυνουκλεοζίτες (dntps datp, dctp, dgtp, dttp), HT Biotechnology (Cambridge, UK) Tween-20, Sigma (St. Louis, MO) Υλικό εµβάπτισης, Schleicher & Schuell (Dassel, Germany) Υλικό απόθεσης, Schleicher & Schuell (Dassel, Germany) Φρεάτια µικροτιτλοδότησης Microlite 2+, λευκά µε επίπεδο πυθµένα, Thermo Labsystems (Franklin, MA) Το πλασµίδιο pt7obe-1 προσφορά του Καθηγητή E. Vysotski, (Photobiology Lab, Institute of Biophysics, Russian Academy of Sciences, Siberian Branch, Krasnoyarsk, Russia) Όλα τα κοινά αντιδραστήρια αγοράστηκαν από τη Sigma (St. Louis, MO) 7.3 Ένζυµα και άλλες πρωτεΐνες Ακροτελική δεοξυνουκλεοτιδυλο τρανσφεράση (TdT), New England Biolabs (Ipswich, MA) Ακροτελική δεοξυνουκλεοτιδυλο τρανσφεράση (TdT), MBI Fermentas (Vilnius, Lithuania) Αλβουµίνη βόεϊου ορού (BSA), Sigma (St. Louis, MO) Θερµοανθεκτική DNA πολυµεράση Vent(exo-), New England Biolabs (Ipswich, MA) Περιοριστικό ένζυµο BamHI, New England Biolabs (Ipswich, MA) Phusion High Fidelity DNA πολυµεράση, Finnzymes (Espoo, Finland) Στρεπταβιδίνη, Roche Molecular Biochemicals (Mannheim, Germany) Σύζευγµα Ακουορίνης - (dt)30 προσφορά Καθηγήτρια Π. Ιωάννου (Εργαστήριο Αναλυτικής Χηµείας, Τµήµα Χηµείας, Πανεπιστήµιο Αθηνών) 7.4 Τυποποιηµένες συσκευασίες εργαστηριακών διεργασιών GeneSpin DNA extraction kit, Genescan Analytics GmbH (Freiburg, Germany) High Pure PCR Product Purification Kit, Roche Diagnostics (Mannheim, Germany) Wizard Plus Maxipreps DNA Purification System, Promega (Lyon, France) 62

76 7.5 Ολιγονουκλεοτίδια Τα ολιγονουκλεοτίδια που χρησιµοποιήθηκαν στην παρούσα µελέτη συντέθηκαν από την VBC-Genomics (Wien, Austria). Ο σχεδιασµός τους έγινε µε το λογισµικό Omiga (Oxford Molecular Group της Accelrys/ San Diego, SA) και το λογισµικό OligoTech (Oligos Etc./ Wilsonville, OR). Οι αλληλουχίες όλων των ολιγονουκλεοτιδίων παρουσιάζονται στον πίνακα 7.1. Πίνακας 7.1: Πίνακας ολιγονουκλεοτιδίων που χρησιµοποιήθηκαν στην παρούσα µελέτη. Όνοµα Αλληλουχία (5-3 ) Ucoffee Coffea1-F Coffea1-R Usnp4arab Usnp4rob 31Y 31R 14GGA Tab-e GGTTCAAGTCCCTCTATCCC AATCGATCTGGACGGAAAAGC AGCATCCTCATTTTATGAGAAAAGG (da) 30 TTCTAGTACCTAGATAAAAT (da) 30 TTCTAGTACCTAGATAAAAC TGCGCCCACCTCCTCCTCCTCCTGTGCGCGT ACGCGCACAGGAGGAGGAGGAGGTGGGCGCA GGAGGAGGAGGAGG GGTTCAAGTCCCTCTATCCC 63

77 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8 Ανάπτυξη ταχείας µεθόδου γονοτύπησης µονονουκλεοτιδικών πολυµορφισµών µε συνδυασµό αντίδρασης επέκτασης εκκινητή και οπτικής ανίχνευσης σε βιοαισθητήρα ξηρών αντιδραστηρίων 8.1 Εισαγωγή Η αυξηµένη συνειδητοποίηση των καταναλωτών σχετικά µε τη σύσταση των τροφίµων έχει προκαλέσει τα τελευταία χρόνια ολοένα αυξανόµενο ενδιαφέρον για την ανάπτυξη αναλυτικών µεθόδων για τον έλεγχο και την πιστοποίηση της ποιότητας των τροφίµων, ειδικά αυτών που επιτυγχάνουν υψηλές τιµές στην αγορά. Η ανακριβής σήµανση των τροφίµων αντιπροσωπεύει µια εµπορική απάτη, η οποία πλήττει τους καταναλωτές. Είναι πολύ σηµαντικό να πιστοποιηθεί ότι τα είδη υψηλής εµπορικής αξίας δεν είναι υποκατάστατο, µερικό ή εξ ολοκλήρου, από άλλα χαµηλότερης αξίας είδη. Ο καφές είναι ένα πολύ σηµαντικό εµπορικό αγαθό. Είναι ίσως το πιο δηµοφιλές ρόφηµα, παράγεται σε τεράστιες ποσότητες και καταναλώνεται σε παγκόσµια κλίµακα. Υπολογίζεται ότι η διαδικασία ετοιµασίας του ροφήµατος επαναλαµβάνεται παγκοσµίως πάνω από 400 δισεκατοµµύρια φορές το χρόνο. Ο καφές είναι το δεύτερο φυσικό αγαθό σε πωλήσεις, µετά το πετρέλαιο. Αποτελεί ένα σηµαντικό αγροτικό εξαγώγιµο προϊόν για περισσότερες από 50 αναπτυσσόµενες χώρες στην Αφρική, την Ασία και τη Λατινική Αµερική. Ο καφές είναι ένα ρόφηµα, το οποίο παρασκευάζεται από τα καβουρδισµένα και αλεσµένα σπέρµατα της καφέας ή καφεόδεντρου. Το φυτό απ' το οποίο προέρχεται ο καφές (κόκκοι) είναι ένας αειθαλής κορµώδης θάµνος που µοιάζει πολύ µε την κερασιά. Τα καφεόδενδρα ζουν περίπου χρόνια και ευδοκιµούν κυρίως σε τροπικά κλίµατα. Τα καφεόδεντρα ανήκουν στην οικογένεια των Rubiaceae και κατατάσσονται σε δύο γένη, το γένος Coffea L. και το γένος Psilanthus. Το γένος Coffea L. είναι αυτό που παρουσιάζει οικονοµικό ενδιαφέρον και αποτελείται από περίπου 100 είδη τα οποία έχουν αναγνωριστεί µέχρι στιγµής. Τα σηµαντικότερα από αυτά, από εµπορικής άποψης, είναι τα είδη Coffe arabica L. και Coffea canephora Pierre (Coffea robusta). Υπάρχουν γενετικές ενδείξεις (Lashermes 1999) ότι το είδος 64

78 C. Arabica προέκυψε από υβριδοποίηση µεταξύ των ειδών C. eugenoides και C. Canephora µε το πρώτο να είναι ο µητρικός γονέας (Cros 1998). Α Β Γ Εικόνα 8.1: Α) Οι καρποί του καφεόδεντρου µοιάζουν πάρα πολύ µε αυτούς της κερασιάς. Β) Τα σπέρµατα του καρπού του καφεόδεντρου. Γ) Καβουρδισµένα σπέρµατα του καρπού του καφεόδεντρου από τα οποία παρασκευάζεται το ρόφηµα του καφέ. Η ποικιλία arabica είναι η αρχαιότερη από τις δύο ποικιλίες. Πιστεύεται ότι προέρχεται από την Αιθιοπία αλλά, όπως δηλώνει και η ονοµασία της, καλλιεργήθηκε για πρώτη φορά στην Αραβική Χερσόνησο. Το 70 % της παγκόσµιας παραγωγής καφέ είναι της ποικιλίας arabica. Είναι ο µοναδικός καφές που πίνεται χωρίς να αναµιγνύεται µε άλλες ποικιλίες. Είναι αρωµατικός και πολύ καλής ποιότητας. Ευδοκιµεί καλύτερα σε µεγάλα υψόµετρα, χρειάζεται δυνατές βροχοπτώσεις και σκιά, διαθέτει µία πολύ εξευγενισµένη γεύση σε σύγκριση µε τα υπόλοιπα είδη καφέ και περιέχει 1 % καφεΐνη. Η ποικιλία arabica στις µέρες µας παράγεται κυρίως σε χώρες της Κεντρικής και Νότιας Αµερικής. Από την υψηλής ποιότητας ποικιλία arabica παρασκευάζονται οι διάφοροι τύποι ελαφρού καφέ (mild coffees). Η ποικιλία robusta είναι ανθεκτικότερη στις ασθένειες του φυτού από την arabica, λόγω της σχεδόν διπλάσιας ποσότητας καφεΐνης που περιέχει (η καφεΐνη µπορεί να παραλύσει και σκοτώσει ορισµένα από τα έντοµα που απειλούν το καφεόδεντρο). Είναι ένα "εύρωστο" είδος µε υψηλή παραγωγή ανά φυτό. Μπορεί να καλλιεργηθεί σε χαµηλότερο υψόµετρο και να επιβιώσει µε λιγότερες βροχοπτώσεις. Έχει τη δυνατότητα να προσαρµόζεται στα θερµά-υγρά κλίµατα, στα οποία η arabica δεν ευδοκιµεί. Ο καρπός του δεν έχει τόσο πλούσια γεύση, είναι φθηνότερος στην 65

79 Εικόνα 8.2: Οι δύο κύριες εµπορικές ποικιλίες καφέ είναι η Coffea Arabica και η Coffea Robusta. αγορά και πλουσιότερος σε καφεΐνη. Είναι κατάλληλος για χαρµάνια και για την παραγωγή στιγµιαίου καφέ και διαθέτει µία πιο δριµεία, σκληρή γεύση. Παρά την περισσότερο ουδέτερη γεύση του σε σχέση µε την arabica, η ποικιλία robusta έχει αυξηµένη δηµοτικότητα, ιδιαίτερα στη µορφή του διαλυτού καφέ. Εικόνα 8.3: Χάρτης που απεικονίζει τις χώρες παραγωγής καφέ. Με ροζ χρώµα φαίνονται οι χώρες που παράγουν την ποικιλία Arabica, µε σκούρο καφέ φαίνονται οι χώρες που παράγουν την ποικιλία Robusta ενώ µε καφέ χρώµα φαίνονται οι χώρες που παράγουν και τις δύο ποικιλίες. Οι τιµές των προϊόντων που προέρχονται από αrabica είναι 2-3 φορές υψηλότερες από αυτές των robusta ενώ κάποια αrabica από διαφορετικές γεωγραφικές περιοχές πωλούνται ακόµα και 10 φορές ακριβότερα. Πολύ συχνά παρατηρείται νοθεία του Arabica µε Robusta. Αποτέλεσµα όλων των παραπάνω είναι η συχνή εξαπάτηση των καταναλωτών των προϊόντων καφέ, αλλά πολλές φορές και των ίδιων των εταιρειών που τα παράγουν από τους καλλιεργητές. 66

80 Είναι προφανές, µε βάση τα παραπάνω, ότι υπάρχουν πολύ σηµαντικοί οικονοµικοί λόγοι για την πιστοποίηση της γνησιότητας του καφέ. Η νοθεία του καφέ µπορεί να γίνει σε διάφορα στάδια της παραγωγικής διαδικασίας, από τη συλλογή µέχρι το τελικό προϊόν να φτάσει στα χέρια του καταναλωτή, οπότε απαιτείται πιστοποίηση τόσο του χλωρού, όσο του ψηµένου αλλά και του αλεσµένου καφέ. Οι εταιρείες παραγωγής καφέ απαιτούν γνήσιες πρώτες ύλες δεδοµένου ότι και οι λιανοπωλητές αναζητούν την πιστοποίση των τελικών προϊόντων που προµηθεύονται. Αναλύτες όπως, διτερπεν-16-o-µεθυλ-καφεστόλη (Clifford 1985, Speer 1991), ολικά ελεύθερα αµινοξέα (Casal 2003), τριγονελλίνη (Casal 2000), τριγλυκερίδια (Gonzalez 2001), λιπαρά οξέα (Μartin 2001), στερόλες (Carrera 1998) και diterpene kahweol (Rubayiza 2005) έχουν χρησιµοποιηθεί για το χαρακτηρισµό των καθαρών ποικιλιών. Για τον ποσοτικό προσδιορισµό µιγµάτων έχουν χρησιµοποιηθεί επιτυχώς τεχνικές όπως η υπέρυθρη φασµατοσκοπία µετασχηµατισµού Fourier (FT-IR) σε συνδυασµό µε την ανάλυση κύριου συστατικού (Principal Component Analysis - PCA), την κλασσική διακρίνουσα ανάλυση (Classical Discriminant Analysis - CDA) και την ανάλυση περιεχόµενου µετάλλου. Γενετικές, βασισµένες στο DNA, µέθοδοι όπως αυτή των µικροδορυφόρων και η ανάλυση τυχαία ενισχυόµενων πολυµορφικών DNA (Randomly Amplified Polymorphic DNA - RAPD) έχουν χρησιµοποιηθεί µόνο για βασική γενετική έρευνα. Πρόσφατα (Spaniolas 2006), αναπτύχθηκε µια µέθοδος ανίχνευσης µονονουκλεοτιδικών πολυµορφισµών που συνδυάζει την PCR µε την ανάλυση πολυµορφισµού µεγέθους περιοριστικού τµήµατος (PCR-RFLP) χρησιµοποιώντας ως σύστηµα ανίχνευσης µια µικρορροϊκή συσκευή ηλεκτροφόρησης σε τριχοειδές (Lab-on-a-Chip capillary electrophoresis) για τον ποιοτικό και ποσοτικό προσδιορισµό µιγµάτων Coffea Arabica και Coffea Robusta. Σε αυτό το κεφάλαιο, παρουσιάζουµε την ανάπτυξη µεθόδου ανίχνευσης πρόσµιξης δειγµάτων καφέ του είδους Arabica µε Robusta, η οποία βασίζεται στη γονοτύπηση µονονουκλεοτιδικών πολυµορφισµών µέσω αντίδρασης επέκτασης εκκινητή σε συνδυασµό µε βιοαισθητήρα DNA τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων. Σε αντίθεση µε τις άλλες υπάρχουσες µεθόδους γονοτύπησης, η προτεινόµενη µέθοδος επιτρέπει την οπτική ανίχνευση των προϊόντων (µε γυµνό µάτι), µέσα σε µερικά λεπτά, χωρίς τη χρήση ειδικής οργανολογίας. Τα προϊόντα επέκτασης αποτίθενται απευθείας πάνω στο βιοαισθητήρα χωρίς να έχει προηγηθεί κανένα 67

81 στάδιο καθαρισµού. Ως ιχνηθέτες, χρησιµοποιούνται νανοσωµατίδια Au τα οποία έχουν στην επιφάνειά τους συνδεδεµένες πολυθυµιδυλικές αλυσίδες. Η επιλογή της αλληλουχίας-στόχος βασίστηκε σε µια φυλογενετική µελέτη, αποτέλεσµα της οποίας ήταν η εύρεση αρκετών SNPs ανάµεσα σε διάφορα είδη Coffea, υποδεικνύοντας την ύπαρξη διαφορετικών χλωρότυπων ανάµεσα στα είδη Arabica και Robusta. H περιοχή DNA που επιλέχθηκε ήταν η διαγονιδιακή ενδιάµεση χλωροπλαστική trnl(uaa)-trnf(gaa) περιοχή, η οποία παρουσιάζει τρεις αντικαταστάσεις βάσης οι οποίες οδηγούν στους διαφορετικούς χλωρότυπους για τα είδη C. arabica και C. Canephora. Ένας από αυτούς τους SNPs οδηγεί στη δηµιουργία µιας θέσης περιορισµού για την περιοριστική ενδονουκλεάση PsuI. Η θέση αυτή υπάρχει στο Robusta ενώ δεν εµφανίζεται στο Arabica. Σκοπός της παρούσας µελέτης ήταν να διερευνήσουµε αν αυτός ο SNP θα µπορούσε να αξιοποιηθεί για την ηµιποσοτική ανίχνευση της πρόσµιξης του Αrabica µε Robusta χρησιµοποιώντας µια αντίδραση επέκτασης εκκινητή σε συνδυασµό µε µια διάταξη τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων. Η πρόκληση για τον αναλυτικό χηµικό είναι η ανίχνευση και ταυτοποίηση δύο αλληλουχίων, οι οποίες διαφέρουν σε µια µόνο βάση, µέσα από ένα περίπλοκο µίγµα όπως είναι το µίγµα του γενωµικού DNA που αποµονώνεται από τον καφέ. 8.2 Μεθοδολογία Προσθήκη πολυθυµιδυλικής ουράς (πολυ-dt) στο ολιγονουκλεοτίδιο SH- (dt) 30 Το ολιγονουκλεοτίδιο SH-(dT) 30 επιµηκύνθηκε µε προσθήκη dttp στο 3 άκρο του πριν τη σύζευξη µε τα νανοσωµατίδια Au. Η επιµήκυνση γίνεται µε το ένζυµο ακροτελική δεοξυνουκλεοτιδυλο-τρανσφεράση (TdT). Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν σε τελικό όγκο 20 µl και περιείχαν 0,2 Μ κακοδυλικό κάλιο (ph 7.2), 0.1 mμ διθειοθρεϊτόλη, 0,1 ml/l Triton X-100, 1 mm CoCl 2, 3.5 mm dttp, 30 U TdT και 700 pmol του ολιγονουκλεοτιδίου (SH-(dT )30 ). Το µίγµα της αντίδρασης επωάστηκε στους 37 C για 60 min και η αντίδραση τερµατίστηκε µε την προσθήκη 2 µl 0.5 M EDTA (ph 8.0). 68

82 8.2.2 Καθαρισµός του ολιγονουκλεοτιδίου SH-dT (30) - πολυ-dt Ο καθαρισµός του ολιγονουκλεοτιδίου SH-dT (30) - πολυ-dt έγινε χρησιµοποιώντας την τεχνική της χρωµατογραφίας πηκτής. Σε στήλες που περιείχαν ως υλικό πλήρωσης τον πολυσακχαρίτη Sephadex G-25, ο οποίος έχει επωαστεί προηγουµένως ολονύκτια µε ddh 2 O, προστέθηκε το προϊόν της αντίδρασης προσθήκης πολυθυµιδιλικής ουράς και η στήλη φυγοκεντρήθηκε για 2 min στις 3000 rpm. Η έκλουση των νουκλεοτιδίων (dttp), του ολιγονουκλεοτιδίου SH-dT (30) και τα υπόλοιπων συστατικών της αντίδρασης καθυστερεί, λόγω του µικρού τους µεγέθους, ενώ εκλούεται πρώτα το ολιγονουκλεοτιδίο SH-dT (30) -πολυ-dt. Τα προϊόντα του καθαρισµού αποθηκεύονται στους -20 C Σύζευξη του ολιγονουκλεοτιδίου SH-dT (30) - πολυ-dt µε νανοσωµατίδια Au Τα νανοσωµατίδια Au τοποθετήθηκαν σε σωλήνες µε σιλανοποιηµένη επιφάνεια. Σε ποσότητα 1 ml νανοσωµατιδίων (0.15 pmol/ml) προστέθηκαν ~176 pmol (5 µl) του καθαρισµένου ολιγονουκλεοτιδίου SH-dT (30) -πολυ-dt και 0.8 µl πυριδίνης. Το µίγµα επωάστηκε 24 h στους 4 C. Ακολούθησε η διαδικασία γήρανσης των σωµατιδίων µε την προσθήκη 16.7 µl διαλύµατος 900 mm NaCl, 6 φορές, και ενδιάµεση επώαση 2 h στους 4 C. Μετά το πέρας της διαδικασίας γήρανσης το µίγµα αφέθηκε 24 h στους 4 C. Στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε 45 min στις 4500 rpm, αποχύθηκε το υπερκείµενο και τα νανοσωµατίδια διαλύθηκαν σε 100 µl διαλύµατος ανασύστασης νανοσωµατιδίων Au-πολυ-dT. Τα σωµατίδια αποθηκεύτηκαν στους 4 C. Η επώαση και η φύλαξη των νανοσωµατιδίων γίνεται στο σκοτάδι (Glynou 2003) Προσθήκη πολυαδενυλικής ουράς (πολυ-dα) στα ολιγονουκλεοτίδια ανιχνευτές Τα ολιγονουκλεοτίδια-ανιχνευτές επιµηκύνθηκαν στο 3 άκρο τους µε προσθήκη dαtp. Οι αντιδράσεις προσθήκης πολυαδενυλικής ουράς διεξήχθησαν σε συνολικό όγκο 20 µl και περιείχαν από 20 mm Tris-CH 3 COOH, 50 mm CH 3 COOK, 10 mm (CH3COO) 2 Mg, 1 mm DTT (ph 7.9), 0.25 mm CoCl 2, 2 mm datp, 400 pmol του ολιγονουκλεοτιδίου-ανιχνευτή και 10 U TdT. Το µίγµα της αντίδρασης επωάστηκε στους 37 C για 1 hr και η δράση του ενζύµου τερµατίστηκε µε προσθήκη 2 µl 0.5 M EDTA, ph

83 8.2.5 Αποµόνωση DNA από δείγµατα καφέ Πράσινοι (χλωροί) κόκκοι καφέ (20 g) αλέστηκαν σε ένα µηχάνηµα άλεσης χρησιµοποιώντας ένα πλέγµα των 2.0 mm. Για την ανάλυση των µιγµάτων, σκόνη από πράσινους κόκκους καφέ του είδους Arabica αναµίχθηκε µε σκόνη από πράσινους κόκκους καφέ του είδους Robusta έτσι ώστε κάθε µίγµα να περιέχει 1, 5, 10, 30 και 50 % Robusta αντίστοιχα. Το DNA αποµονώθηκε από ένα δείγµα σκόνης 150 mg χρησιµοποιώντας το GeneSpin DNA extraction kit ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή Πολλαπλασιασµός τµήµατος της διαγονιδιακής ενδιάµεσης χλωροπλαστικής περιοχής trnl (UAA)-trnF(GAA) µε PCR Για τον πολλαπλασιασµό ενός τµήµατος της διαγονιδιακής ενδιάµεσης χλωροπλαστικής περιοχής trnl (UAA)-trnF(GAA) µεγέθους 251 bp, γενωµικό DNA, που αποµονώθηκε από δείγµατα καφέ, υποβλήθηκε σε αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (PCR). Το µίγµα της PCR περιείχε 1 Phusion HF reaction buffer, 2 mm MgCl 2, 250 µm από κάθε dntp, 0.25 µm από κάθε έναν από τους εκκινητές Coffea1-F και Coffea1-R, 0.5 U Phusion High Fidelity DNA πολυµεράσης και 1 µl ολικού γενωµικού DNA, σε συνολικό όγκο 25 µl. Το πρόγραµµα θερµικών κύκλων ήταν το εξής: αποδιάταξη στους 98 C για 40 s, ακολουθούµενη από 35 κύκλους αποδιάταξης στους 98 C για 15 s, υβριδοποίησης των εκκινητών στους 56 C για 30 s και επιµήκυνσης στους 72 C για 90 s. Στη συνέχεια το µίγµα επωάστηκε στους 72 C για 7 min και ψύχθηκε στους 4 C. Κάθε PCR προϊόν καθαρίστηκε χρησιµοποιώντας το High Pure PCR Product Purification Kit για αποµάκρυνση των υπολειµµάτων της PCR. Η συγκέντρωση των προϊόντων της PCR προσδιορίστηκε µε ηλεκτροφόρηση σε 2 % πηκτή αγαρόζης και χρώση µε βρωµιούχο αιθίδιο ακολουθούµενη από πυκνοµετρική ανάλυση της φωτογραφίας της πηκτής, η λήψη της οποίας έγινε µε ψηφιακή κάµερα. Η πυκνοµετρική ανάλυση έγινε σε ηλεκτρονικό υπολογιστή µε τη χρήση ειδικού λογισµικού Αντίδραση επέκτασης εκκινητή (PEXT reaction) Όλα τα προϊόντα της PCR υποβλήθηκαν σε αντίδραση επέκτασης εκκινητή. Για τις αντιδράσεις αυτές χρησιµοποιήθηκαν δύο ειδικά σχεδιασµένοι εκκινητές. Ο κάθε ένας από αυτούς ήταν ειδικός για το κάθε είδος καφέ. Όλες οι αντιδράσεις είχαν 70

84 συνολικό όγκο 20 µl και περιείχαν 20 mm Tris-HCl, ph 8.8, 10 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 10 mm KCl, 1 ml/l Triton X-100, 1 mm MgSO 4, 0.25 U Vent (exo-) DNA πολυµεράσης, 0.1 pmol του PCR προϊόντος, 1 pmol από τον κατάλληλο εκκινητή (ειδικό ως προς Arabica ή Robusta, Usnp4arab και Usnp4rob αντίστοιχα), 2.5 µm από κάθε ένα από τα datp, dctp και dgtp, µm dttp, και µm biotin- 21-dUTP. Για την ανάλυση των µοριακών µιγµάτων, ετοιµάστηκαν µίγµατα πολλαπλασιασµένου DNA από Arabica που περιείχαν 1,5,10,30 και 50 % πολλαπλασιασµένο DNA από Robusta. Το πρόγραµµα θερµικών κύκλων ήταν: αποδιάταξη στους 95 C για 5 min, ακολουθούµενη από 3 κύκλους αποδιάταξης στους 95 C για 15 s, υβριδοποίησης των εκκινητών στους 65 C για 10 s και επιµήκυνσης στους 72 C για 15 s. Όλα τα προϊόντα των αντιδράσεων επέκτασης υποβλήθηκαν σε ένα τελικό στάδιο αποδιάταξης στους 95 C για 5 min και τοποθετήθηκαν αµέσως σε πάγο Κατασκευή βιοαισθητήρα DNA µε νανοσωµατίδια χρυσού Ο βιοαισθητήρας DNA τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων αποτελείται από τέσσερα διακριτά µέρη: το υλικό εµβάπτισης, το υλικό απόθεσης, το απορροφητικό υλικό και τη µεµβράνη ακινητοποίησης, τα οποία είναι τοποθετηµένα σε συγκολλητική ταινία. Τα τέσσερα µέρη τοποθετούνται µε τέτοιο τρόπο, ώστε τα άκρα τους να επικαλύπτονται και να επιτυγχάνεται διαρκής ροή του διαλύµατος ανάπτυξης από το υλικό εµβάπτισης έως το υλικό απορρόφησης, λόγω τριχοειδών δυνάµεων. Στο συγκεκριµένο βιοαισθητήρα το υλικό κατασκευής της µεµβράνης ακινητοποίησης είναι η νιτροκυτταρίνη, η οποία παρασκευάζεται µε νίτρωση της κυτταρίνης µε νιτρικό οξύ (σχήµα 8.1). Η µεµβράνη νιτροκυτταρίνης είναι κολλώδης µεµβράνη που αρχικά δοκιµάστηκε για την ακινητοποίηση νουκλεϊκών οξέων στις µεθόδους αποτύπωσης Southern και Northern αλλά και πρωτεϊνών στις µεθόδους αποτύπωσης Western λόγω της µη ειδικής συγγένειας που παρουσιάζει για τα αµινοξέα. Χρησιµοποιείται επίσης ευρέως σε διαγνωστικές δοκιµασίες όπου λαµβάνουν χώρα αλληλεπιδράσεις αντιγόνου - αντισώµατος όπως οι δοκιµασίες κυήσεως και η δοκιµασία αλβουµίνης στα ούρα. Tο υλικό απόθεσης των αντιδραστηρίων αποτελείται από ίνες υάλου (σχήµα 8.2) ενώ το υλικό εµβάπτισης και το απορροφητικό υλικό από κυτταρίνη, σε διαφορετικό πάχος (µεγαλύτερο για το απορροφητικό υλικό). Τέλος, το υλικό στήριξης είναι πλαστικό. 71

85 Σχήµα 8.1: Xηµική δοµή νιτροκυτταρίνης. Στη µεµβράνη ακινητοποιείται στρεπταβιδίνη (SA), που αποτελεί τη ζώνη δοκιµασίας, ενώ η ζώνη ελέγχου αποτελείται από ακινητοποιηµένο πολυ-da (Glynou 2003). Στο υλικό απόθεσης του βιοαισθητήρα τοποθετούνται 5 µl τροποποιηµένων νανοσωµατιδίων Au µε πολυ-dt ουρά. Σχήµα 8.2: Φωτογραφίες SEM υλικού απόθεσης βιοαισθητήρα DNA, από ίνες υάλου. Στη µεγαλύτερη µεγέθυνση είναι ορατά νανοσωµατίδια Au, που έχουν αποτεθεί στο υλικό (Kalogianni 2007). Για την κατασκευή των βιοαισθητήρων, ένα διάλυµα το οποίο περιείχε 4 g/l στρεπταβιδίνης, 150 ml/l µεθανόλης, και 20 g/l σουκρόζης επιστρώθηκε στη µεµβράνη σε πυκνότητα 1,6 µg (~27 pmol) /4-mm µεµβράνης χρησιµοποιώντας το σύστηµα απόθεσης αντιδραστηρίων σε TLC πλάκες. Ένα διάλυµα το οποίο αποτελούνταν από 4 µμ πολυ-(da)- επιµηκυµένους εκκινητές, 500 ml/l µεθανόλης και 20 g/l σουκρόζης επιστρώθηκε στη µεµβράνη σε πυκνότητα 2.4 pmol/4mm- µεµβράνης όπως προηγουµένως. Οι µεµβράνες στη συνέχεια τοποθετήθηκαν για 60 min στους 80 C προς ξήρανση. Μετά την ξήρανση έγινε η συναρµολόγηση των 72

86 βιοαισθητήρων. Οι βιοαισθητήρες µετά την κατασκευή τους αποθηκεύονται σε θερµοκρασία δωµατίου, όπου παραµένουν σταθεροί για µεγάλο χρονικό διάστηµα Οπτική ανίχνευση των προϊόντων επέκτασης εκκινητή Για την ανίχνευση των προϊόντων επέκτασης εκκινητή, 5 µl διαλύµατος προϊόντων, τα οποία έχουν αποδιαταχθεί θερµικά, τοποθετούνται στο υλικό απόθεσης του βιοαισθητήρα δίπλα στα ακινητοποιηµένα νανοσωµατιδία Au µε πολυ-dt ουρά. Στη συνέχεια, ο βιοαισθητήρας εµβαπτίζεται σε 200 µl διαλύµατος ανάπτυξης (10 mm ρυθµιστικό διάλυµα φωσφορικών, ph 7.4, 75 mm NaCl, 40 ml/l γλυκερόλης, και 10 g/l SDS). Η οπτική ανίχνευση των προϊόντων της αντίδρασης ολοκληρώνεται σε 10 min. Μετά την ολοκλήρωση της ανάλυσης, οι βιοαισθητήρες σαρώνονται µε επιτραπέζιο σαρωτή και οι εικόνες αναλύονται µε οπτική πυκνοµετρία. Εποµένως, κάθε ζώνη δοκιµασίας µπορεί να εκφραστεί και ως ένα σήµα οπτικής πυκνότητας. 8.3 Αποτελέσµατα Συζήτηση Αρχή της µεθόδου Η επιλογή της αλληλουχίας-στόχου που χρησιµοποιήθηκε για την ανάπτυξη της προτεινόµενης µεθόδου βασίστηκε σε µια φυλογενετική µελέτη. Η µελέτη αυτή είχε ως αποτέλεσµα την εύρεση αρκετών µονονουκλεοτιδικών πολυµορφισµών µεταξύ των διαφόρων ειδών καφέ. Αυτοί οι πολυµορφισµοί δικαιολογούν και τους διαφορετικούς χλωρότυπους µεταξύ του Coffea Arabica και του Coffea Robusta (Cros 1998). Η αλληλουχία που επιλέχθηκε τελικά για την ανάλυση είναι η διαγονιδιακή ενδιάµεση χλωροπλαστική trnl(uaa)-trnf(gaa) περιοχή, η οποία παρουσιάζει 3 µονονουκλεοτιδικούς πολυµορφισµούς (πίνακας 8.1). Ένας από αυτούς, ο SNP 3, επιλέχθηκε για την ανάπτυξη της µεθόδου. 73

87 trnl - trnf SNP No. Arabica Robusta 1 C T 2 A C 3 T C Πίνακας 8.1: Οι τρεις µονονουκλεοτιδικοί πολυµορφισµοί που απαντώνται στη διαγονιδιακη ενδιάµεση χλωροπλαστική trnl(uaa)-trnf(gaa) περιοχή για τους Coffea Arabica και Coffea Robusta. Αρχικά, γίνεται αποµόνωση του γενωµικού DNA από τα δείγµατα καφέ. Στη συνέχεια, ένα τµήµα µεγέθους 251 bp της χλωροπλαστικής trnl(uaa)-trnf(gaa) περιοχής ενισχύεται µε PCR. Κάθε PCR προϊόν, έπειτα από καθαρισµό, υποβάλλεται σε δύο ξεχωριστές αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή (σχήµατα 8.4 και 8.5), παρουσία βιοτινυλιωµένου dutp. Χρησιµοποιούνται δύο εκκινητές ειδικοί για κάθε αλληλόµορφο. Οι εκκινητές αυτοί αποτελούνται 1) από µια αλληλουχία συµπληρωµατική µε την περιοχή δίπλα στο πολυµορφικό σηµείο, µε το 3 -τελικό νουκλεοτίδιο να είναι συµπληρωµατικό µε το ποικιλόµορφο αλλήλιο και 2) από µια πολυαδενυλική ουρά στο 5 - άκρο. TTGGTATGGAAACCCACTAAGTGATAACTTTCAAATTCAGAGAAACCCTGGAATTAATAAAAAGGGGCAA TCCTGAGCCAAATCCCGTTTTCCGAAACCAAAGGAAAGGTTCAGAAAGTGAAAAAAGGATAGGTGCAGAG ACTCAACGGAAGCTGTTCTAACAAATGGAGTTGGCTGCGTTAGTAGAGAAATCTTTCCATCTAAAATTCC GAAAGGATAAAGTGAAGGATAAACGTATATACGTATTGAATACTATATTAAATGATTAATGACGACTCAA CTGAATCTGTATTTTTTATATAAAAATGGAAGAATTGGTGTGAATAGATTCCACATTGAAGAAAGAATCG AATATTCATTGATCAAATGATTCACTCCATAGTCTGATAGATCTTTTCAAGAATTGATTAATCGGACGAG AATAAAGATAGAGTCCCGTTCTACATGTCAATGTCGGCAACAATGAAATTTATAGTAAGAGGAAAATCCG TCGACTTTAAAAATCGTGAGGGTTCAAGTCCCTCTATCCCCAAAAAACATATTTGATCCCCCAACTATTT ATCCTATCCCCCTTTCGTTAGCGGTTCAAAAAACCTTATTCATTTACTCTATTCTCTTAGAAATCGATCT GGACGGAAAAGCCCTTTTCTTATCACAAATCTTGTGTTATTTATGATATACATATAAATGAACATCTTTG AGCAAGAAATACCCATTTGAATGGTTTACAATCGATATAACTATTCATACTGAAACTTACAAAGTACTCT TTTTTAAGATACAAGAAATTCTAGTACCTAGATAAAATTTTGTAATCCCCTTTCCTTCTTTTAATTGACA TAGCCCCCCTTTTCTCATAAAATGAGGATGCTACATTGGGACTGGTCGGGATAGCTCAGATGGTAGAGCA GAGGACTGAAAATCCTCGTGTCACCAGTTCAAAT Σχήµα 8.3: Αλληλουχία της χλωροπλαστικής trnl(uaa)-trnf(gaa) περιοχής. Με κίτρινο χρώµα φαίνονται οι περιοχές στις οποίες υβριδοποιούνται οι εκκινητές της PCR. Με κόκκινο χρώµα φαίνεται η θέση του SNP3. 74

88 Η DNA πολυµεράση που χρησιµοποιείται κατά την αντίδραση επέκτασης εκκινητή στερείται δράσης 3 5 εξωνουκλεάσης. Η προσθήκη των νουκλεοτιδίων γίνεται ταχύτατα και µε πολύ υψηλή πιστότητα, καθώς η επέκταση του εκκινητή γίνεται µόνο αν αυτός υβριδοποιείται πλήρως µε την αλληλουχία-στόχο. Στην αντίθετη περίπτωση δεν παράγεται προϊόν. 5 T Arabica 3 5 (da) 30 3 T B B B B 5 5 T Arabica 3 5 (da) 30 3 C 5 Σχήµα 8.4: Σχηµατική απεικόνιση της προτεινόµενης µεθόδου για τη γονοτύπηση της ποικιλίας Coffea Arabica. 5 C Robusta 3 5 (da) 30 3 C B B B B 5 5 C Robusta 3 5 (da) 30 3 Σχήµα 8.5: Σχηµατική απεικόνιση της προτεινόµενης µεθόδου για τη γονοτύπηση του είδους Coffea Robusta. T 5 75

89 Κατά την αντίδραση επέκτασης γίνεται εισαγωγή βιοτινυλιωµένου dutp στον εκκινητή που έχει επεκταθεί. Στη συνέχεια, το προϊόν επέκτασης αποδιατάσσεται και αποτίθεται στον βιοαισθητήρα. Η οπτική ανίχνευση των προϊόντων της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή βασίζεται στη συσσώρευση µεγάλου αριθµού νανοσωµατιδίων στη ζώνη δοκιµασίας, ως αποτέλεσµα της υβριδοποίησης του τµήµατος πολυ-dt των σωµατιδίων µε το τµήµα πολυ-dα των ολιγονουκλεοτιδίων-ανιχνευτών, που έχουν συνδεθεί στα βιοτινυλιωµένα προϊόντα της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή. Τα προϊόντα επέκτασης ακινητοποιούνται στη ζώνη δοκιµασίας λόγω αλληλεπίδρασης βιοτίνης-στρεπταβιδίνης (σχήµα 8.6). TTT TTT TTT TTT AAA TTT AAA AAA TTT TTT Ζώνη ελέγχου Ζώνη δοκιµασίας TTT TTT TTT είγµα TTT TTT AAA AAA TTT B TTT TTT SA B SA ιάλυµα ιάλυµα ανάπτυξης ανάπτυξης Σχήµα 8.6: Σχηµατική απεικόνιση βιοαισθητήρα DNA µε µέσο ανίχνευσης νανοσωµατί-δια Au τροποποιηµένα µε ολιγονουκλεοτίδια. Mε κόκκινο συµβολίζονται τα Au NPs. 76

90 Αναλυτικότερα, τα τροποποιηµένα νανοσωµατίδια εναποτίθενται στο υλικό τοποθέτησης. ίπλα στα νανοσωµατίδια εναποτίθεται το αποδιαταγµένο προϊόν επέκτασης εκκινητή και ο βιοαισθητήρας εµβαπτίζεται σε σωλήνα που περιέχει το διάλυµα ανάπτυξης. Η ροή του διαλύµατος παρασύρει τα νανοσωµατίδια Au και το προς ανάλυση δείγµα µετακινώντας τα κατά µήκος του βιοαισθητήρα µέσω τριχοειδών δυνάµεων. Όταν τα τροποποιηµένα νανοσωµατίδια έρθουν σε επαφή, η πολυθυµιδιλική τους ουρά υβριδοποιείται µε την πολυαδενυλική ουρά του εκκινητή. Αν έχει γίνει επέκταση του εκκινητή, τότε έχουν εισαχθεί µόρια βιοτίνης (µέσω του βιοτινυλιωµένου-dutp) στο προϊόν της αντίδρασης. Τα συζευγµένα υβρίδια δεσµεύονται στη ζώνη δοκιµασίας, όπου υπάρχει ακινητοποιηµένη στρεπταβιδίνη, µέσω της αλληλεπίδρασης βιοτίνης-στρεπταβιδίνης. Λόγω της συσσώρευσης των νανοσωµατιδίων δηµιουργείται µια διακριτή κόκκινη ζώνη στην περιοχή αυτή του βιοαισθητήρα η οποία οφείλεται στην κορυφή συντονισµού πλασµονίου των νανοσωµατιδίων Au στα 520 nm. Τα νανοσωµατίδια που δεν υβριδοποιήθηκαν συνεχίζουν µε τη ροή του διαλύµατος και δεσµεύονται στη ζώνη ελέγχου από τις ακινητοποιηµένες αλυσίδες πολυ-dα, σχηµατίζοντας µία δεύτερη κόκκινη ζώνη, ενδεικτική της καλής λειτουργίας του βιοαισθητήρα. Στην περίπτωση που δεν έχει γίνει επέκταση του εκκινητή, η υβριδοποίηση εξακολουθεί να γίνεται, όµως τα υβρίδια δεν ακινητοποιούνται στη ζώνη δοκιµασίας, καθώς δεν έχει γίνει εισαγωγή βιοτίνης, και έτσι δεν σχηµατίζεται εκεί κόκκινη ζώνη. Σχηµατίζεται κόκκινη ζώνη µόνο στη ζώνη ελέγχου του βιοαισθητήρα. η οποία οφείλεται στην περίσσεια των νανοσωµατιδίων που δεν έχουν υβριδοποιηθεί µε το δείγµα Πολλαπλασιασµός τµήµατος της χλωροπλαστικής περιοχής trnl (UAA)- trnf(gaa) µε PCR Μετά την αποµόνωση του γενωµικού DNA από τα δείγµατα καφέ ακολούθησε πολλαπλασιασµός τµήµατος της χλωροπλαστικής περιοχής trnl (UAA)-trnF(GAA) µέσω PCR. Tα προϊόντα της αντίδρασης µεγέθους 251 bp καθαρίστηκαν για αποµάκρυνση της περίσσειας των αντιδραστηρίων της PCR. Στη συνέχεια προσδιορίστηκαν µε ηλεκτροφόρηση σε 2 % πηκτή αγαρόζης και χρώση µε βρωµιούχο αιθίδιο. Η συγκέντρωση των προϊόντων προσδιορίστηκε µε πυκνοµετρική ανάλυση της φωτογραφίας του ηλεκτροφορήµατος. Τα ηλεκτροφορήµατα των PCR προϊόντων φαίνονται στο σχήµα

91 M Ar Rob M 50% 30% 10% 5% 1% 271/ / A B Σχήµα 8.7: Ηλεκτροφορήµατα των PCR προϊόντων για δείγµατα που περιέχουν Α) 100 % Arabica και 100 % Robusta και Β) Αrabica µε 50, 30, 10, 5 και 1 % Robusta Βελτιστοποίηση της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή Έγιναν αρκετές µελέτες βελτιστοποίησης της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή για την ανίχνευση του υπό εξέταση µονονουκλεοτιδικού πολυµορφισµού. Σκοπός των µελετών αυτών ήταν η εύρεση των συνθηκών που επιτρέπουν την υψηλή ένταση χρώµατος ζώνης (µεγαλύτερη απόδοση της αντίδρασης επέκτασης) και εξειδίκευση στην επέκταση µόνο των πλήρως συµπληρωµατικών εκκινητών. Οι παράµετροι που εξετάστηκαν περιλαµβάνουν τη θερµοκρασία υβριδοποίησης εκκινητή και την ποσότητα της αλληλουχίας-στόχος. Ο αριθµός των θερµικών κύκλων της αντίδρασης επέκτασης και η αναλογία βιοτινυλιωµένου-dutp / dttp είχαν βελτιστοποιηθεί σε προηγούµενη εργασία (Litos 2007). Πραγµατοποιήθηκαν µόνο τρεις θερµικοί κύκλοι ως ένας συµβιβασµός ανάµεσα στην υψηλή ένταση ζώνης και το χρόνο που απαιτείται για να ολοκληρωθεί ο προσδιορισµός. Η βέλτιστη αναλογία βιοτινυλιωµένου-dutp / dttp που επιλέχθηκε ήταν 1: Μελέτη της επίδρασης της ποσότητας του PCR προϊόντος Έγινε διερεύνηση της ικανότητας της προτεινόµενης µεθόδου να διακρίνει τα δύο είδη καφέ ως συνάρτηση της ποσότητας της αλληλουχίας-στόχου και της αναλογίας ανάµεσα στην ποσότητα της αλληλουχίας-στόχου και την ποσότητα του 78

92 εκκινητή που χρησιµοποιούνται στην αντίδραση επέκτασης εκκινητή. Η µελέτη αυτή έγινε πραγµατοποιώντας µια σειρά αντιδράσεων επέκτασης όπου ως αλληλουχίαστόχος χρησιµοποιήθηκε προϊόν PCR από δείγµα Coffea Arabica. Χρησιµοποιήθηκε µια σταθερή ποσότητα των δύο εκκινητών και διάφορες ποσότητες της αλληλουχίαςστόχος από 0 έως 200 fmol. Αντιπροσωπευτικά αποτελέσµατα φαίνονται στο σχήµα 8.8. Arab Rob Arab Rob Arab Rob 0 fmol 10 fmol 30 fmol Arab Rob Arab Rob 100 fmol 200 fmol Σχήµα 8.8: Μελέτη της επίδρασης της ποσότητας της αλληλουχίας-στόχου και της αναλογίας (αλληλουχία-στόχος) / (ποσότητα εκκινητή) στην αντίδραση επέκτασης εκκινητή. Χρησιµοποιήθηκε ποσότητα 1 pmol από κάθε εκκινητή και fmol της αλληλουχίας-στόχος. Όπως φαίνεται η ένταση της ζώνης δοκιµασίας αυξάνεται µε αύξηση της ποσότητας της αλληλουχίας-στόχου στην αντίδραση επέκτασης εκκινητή. Όταν χρησιµοποιούνται 200 fmol της αλληλουχίας-στόχου εµφανίζεται µια δυσδιάκριτη ζώνη (ορατή δια γυµνού οφθαλµού αλλά δεν φαίνεται στη φωτογραφία) που οφείλεται σε µη ειδικό προϊόν. Εποµένως, η ποσότητα των 100 fmol της αλληλουχίας-στόχος και της αναλογίας (αλληλουχίας-στόχου) / (ποσότητα εκκινητή) 1: 10 επιλέχθηκαν ως οι βέλτιστες για το διαχωρισµό των δύο ειδών. 79

93 Μελέτη της επίδρασης της θερµοκρασίας υβριδοποίησης εκκινητή Η µελέτη αυτή έγινε πραγµατοποιώντας µια σειρά αντιδράσεων επέκτασης όπου ως αλληλουχία-στόχος χρησιµοποιήθηκε προϊόν PCR από δείγµα Coffea Arabica. Μελετήθηκε η ειδική ή µη ειδική επέκταση εκκινητή σε ένα εύρος θερµοκρασιών υβριδοποίησης του εκκινητή από 55 έως 65 C. Τα αποτελέσµατα αυτής της µελέτης φαίνονται στο σχήµα 8.9. Arab Rob Arab Rob Arab Rob 55 C 60 C 65 C Σχήµα 8.9: Μελέτη της επίδρασης της θερµοκρασίας υβριδοποίησης εκκινητή. Χρησιµοποιήθηκε ποσότητα 1 pmol από κάθε εκκινητή και 100 fmol της αλληλουχίας-στόχου. Οι θερµοκρασίες που εξετάστηκαν ήταν 55, 60 και 65 C. Παρατηρείται ότι η εξειδίκευση της αντίδρασης αυξάνεται όσο αυξάνεται η θερµοκρασία υβριδοποίησης. Στις χαµηλότερες θερµοκρασίες εµφανίζονται δυσδιάκριτες ζώνες (ορατές δια γυµνού οφθαλµού αλλά δεν φαίνονται στη φωτογραφία) που οφείλονται σε µη ειδικό προϊόν. Συνεπώς, ως βέλτιστη θερµοκρασία υβριδοποίησης επιλέχθηκε η 65 C Ανάλυση µοριακών µιγµάτων καφέ Μετά την εύρεση των βέλτιστων συνθηκών της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή έγινε ανάλυση µοριακών µιγµάτων καφέ. Προϊόντα PCR τα οποία προήλθαν από γενωµικό DNA των Coffea Arabica ή Coffea Robusta αναµίχθηκαν σε 80

94 διάφορες µοριακές αναλογίες από 50:50 έως 99:1 (Arabica/Robusta). Τα µίγµατα αυτά υποβλήθηκαν στη συνέχεια σε δύο ξεχωριστές αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή χρησιµοποιώντας τους δυο αλληλόµορφο-ειδικούς εκκινητές. Τα προϊόντα της επέκτασης αναλύθηκαν µε το βιοαισθητήρα τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων που προτείνεται. Τα αποτελέσµατα φαίνονται στο σχήµα Arab Rob Arab Rob Arab Rob 100:0 99:1 95:5 Arab Rob Arab Rob Arab Rob 90:10 70:30 50:50 Σχήµα 8.10: Aνάλυση µοριακών µιγµάτων προϊόντων PCR από καφέ Coffea Arabica και Coffea Robusta σε διάφορες αναλογίες (Arabica/Robusta). Από τα παραπάνω αποτελέσµατα φαίνεται ότι η προτεινόµενη µέθοδος είναι αποτελεσµατική για την ανίχνευση πρόσµιξης σε χαµηλό επίπεδο (από 5 %) και ότι θα µπορούσε να χρησιµοποιηθεί για την πιστοποίηση µιγµάτων καφέ Ανάλυση µιγµάτων σκόνης καφέ είγµατα από πράσινους (χλωρούς) κόκκους καφέ των Coffea Arabica και Coffea Robusta χρησιµοποιήθηκαν για τη δηµιουργία σκόνης. Στη συνέχεια παρασκευάστηκαν µίγµατα σκόνης Arabica/Robusta σε αναλογίες 50:50, 70:30, 90:10, 95:5, και 99:1. Ακολούθησε αποµόνωση του γενωµικού DNA από τα µίγµατα αυτά και πολλαπλασιασµός της αλληλουχίας-στόχου µε PCR. Τα προϊόντα PCR υποβλήθηκαν σε δύο ξεχωριστές αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή και αναλύθηκαν µε τον προτεινόµενο βιοαισθητήρα. Τα αποτελέσµατα φαίνονται στο σχήµα Και στη µελέτη αυτή ήταν εφικτή η ανίχνευση πρόσµιξης Robusta από επίπεδο 5 %. 81

95 Arab Rob Arab Rob Arab Rob 100:0 Arab Rob 99:1 95:5 Arab Rob Arab Rob 90:10 70:30 50:50 Σχήµα 8.11: Ανάλυση µιγµάτων σκόνης καφέ που περιείχαν Coffea Arabica και Coffea Robusta σε διάφορες αναλογίες (Arabica/Robusta) Μελέτη επαναληψιµότητας της οπτικής ανίχνευσης των προϊόντων της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή Η διερεύνηση της επαναληψιµότητας της οπτικής ανίχνευσης των προϊόντων της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή έγινε για τα ακόλουθα µοριακά µίγµατα: A) 90:10 και B) 50:50 (Arabica/Robusta). Η κάθε ανάλυση επαναλήφθηκε τρεις φορές. Τα µίγµατα αυτά υποβλήθηκαν σε ξεχωριστές αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή χρησιµοποιώντας τους δυο αλληλόµορφο-ειδικούς εκκινητές. Τα αποτελέσµατα παρουσιάζονται στο σχήµα Η επαναληψιµότητα της προτεινόµενης µεθόδου οπτικής ανίχνευσης, όπως αυτή προέκυψε από τον υπολογισµό της σταθερά διακύµανσης (CV) έπειτα από την πυκνοµετρική ανάλυση της έντασης της ζώνης δοκιµασίας του βιοαισθητήρα για ένα προϊόν αντίδρασης PEXT που έχει επεκταθεί, κυµάνθηκε από 8.5 έως 16.3 % για τα µοριακά µίγµατα A και από 0.25 έως 10.6 % για τα µοριακά µίγµατα B. Συνεπώς, ο βιοαισθητήρας παρουσιάζει πολύ καλή επαναληψιµότητα. 82

96 Arab Arab Arab Rob Rob Rob Arab 90:10 CV: 8.5% 90:10 CV: 16.3% Arab Arab Rob Rob Rob 50:50 50:50 CV: 0.25% CV: 10.6% Σχήµα 8.12: Μελέτη της επαναληψιµότητας της οπτικής ανίχνευσης των προϊόντων της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή. Έγινε ανάλυση µοριακών µιγµάτων Arabica και Robusta. Κάθε µίγµα αναλύθηκε εις τριπλούν χρησιµοποιώντας και τους δύο αλληλόµορφο-ειδικούς εκκινητές. Η σταθερά διακύµανσης της µεθόδου προέκυψε έπειτα από πυκνοµετρική ανάλυση της έντασης της ζώνης δοκιµασίας κάθε βιοαισθητήρα Συµπεράσµατα Η αντίδραση επέκτασης εκκινητή σε συνδυασµό µε βιοαισθητήρα DNA προτείνεται ως µέθοδος γονοτύπησης, που συνδυάζει τα πλεονεκτήµατα της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή και της ανίχνευσης σε βιοαισθητήρα τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων µε χρήση νανοσωµατιδίων Au, για την οπτική ανίχνευση του γονότυπου κάθε δείγµατος. Η προτεινόµενη µέθοδος µπορεί να χρησιµοποιηθεί για την ηµιποσοτική ανίχνευση της νοθείας σε πράσινους(χλωρούς) κόκκους καφέ. Η χλωροπλαστική αλληλουχία-στόχος που επιλέχθηκε βρέθηκε ότι µπορεί να αξιοποιηθεί για τη διάκριση και την πιστοποίηση όλων των ποικιλιών Arabica και Robusta που χρησιµοποιήθηκαν σε αυτή τη µελέτη. Η προτεινόµενη µέθοδος προσφέρει τα ακόλουθα πλεονεκτήµατα: Εύκολη ερµηνεία αποτελεσµάτων Ο γονότυπος ενός δείγµατος εξάγεται από την εικόνα ζεύγους βιοαισθητήρων που προκύπτουν από την ανάλυση του προϊόντος επέκτασης εκκινητή µε τους δύο ειδικά σχεδιασµένους αλληλόµορφο-ειδικούς εκκινητές. Η χρήση των νανοσωµατιδίων Au 83

97 οπτικοποιεί τα αποτελέσµατα των υβριδοποιήσεων µε το σχηµατισµό ή όχι κόκκινης ζώνης. Εποµένως, η ερµηνεία του αποτελέσµατος γίνεται άµεσα µε το χαρακτηρισµό (απουσία ή παρουσία ή ένταση στην περίπτωση µιγµάτων) των ζωνών δοκιµασίας των δύο βιοαισθητήρων. Επιβεβαίωση της αλληλουχίας-στόχου Ο βιοαισθητήρας επιτρέπει την επιβεβαίωση της αλληλουχίας-στόχου µέσω υβριδοποίησης µε έναν ειδικό εκκινητή, σε αντίθεση µε τις ηλεκτροφορητικές µεθόδους που δίνουν πληροφορίες µόνο για το µέγεθος των προϊόντων οπότε όσα παραπροϊόντα έχουν παρόµοιο µέγεθος µε το επιθυµητό προϊόν θα εκληφθούν ως θετικό σήµα. Στην προτεινόµενη µέθοδο, η απαίτηση για υβριδοποίηση των ολιγονουκλεοτιδίων-ανιχνευτών στην αλληλουχία-στόχο αποτελεί βήµα ελέγχου για την ορθή ανίχνευση των ειδικών προϊόντων και τη διάκρισή τους από τα παραπροϊόντα. Εύκολη και γρήγορη ανίχνευση γνωστών SNP Η εφαρµογή της µεθόδου για την ανίχνευση πολυµορφισµού, ο οποίος έχει επιβεβαιωµένη αλληλουχία, απαιτεί µόνο το σχεδιασµό τεσσάρων ολιγονουκλεοτιδίων (δύο εκκινητών για την PCR και δύο για την αντίδραση επέκτασης). Η χρήση ειδικών λογισµικών σχεδίασης ολιγονουκλεοτιδίων επιτρέπει την άµεση και γρήγορη εφαρµογή της µεθόδου. Χαµηλό κόστος αντιδραστηρίων και οργανολογίας Μετά τη βελτιστοποίηση της µεθόδου, το κόστος ανάλυσης ανά δείγµα είναι µικρό καθώς συνδυάζει τη χρήση κοινών αντιδραστηρίων µε το βιοαισθητήρα DNA. Ωστόσο, το µεγαλύτερο πλεονέκτηµα της συγκεκριµένης µεθόδου όσον αφορά το κόστος, είναι η οργανολογία της. Η µόνη συσκευή που απαιτείται είναι ένας κλασσικός θερµικός κυκλοποιητής, χωρίς ιδιαίτερα χαρακτηριστικά, για τη διεξαγωγή της PCR και της αντίδρασης επέκτασης. εν απαιτείται εξειδικευµένο προσωπικό Η προτεινόµενη µέθοδος ελαχιστοποιεί τις ανάγκες για εξειδικευµένο τεχνικό προσωπικό. 84

98 Καλή επαναληψιµότητα της µεθόδου Όλοι οι συντελεστές µεταβλητότητας (CVs) των σηµάτων των αλληλίων µε τον αντίστοιχο εκκινητή τους είναι µικρότεροι του 16,7 %. υνατότητα ανάλυσης µεγάλου αριθµού δειγµάτων σε µικρό χρόνο Ο πολλαπλασιασµός µε PCR είναι αναγκαίος σε όλες, σχεδόν, τις µεθόδους γονοτύπησης. Η αντίδραση επέκτασης εκκινητή ολοκληρώνεται σε 3 µόνο θερµικούς κύκλους και διαρκεί συνολικά λιγότερο από 10 min. Επιπλέον, η αποδιάταξη των προϊόντων επέκτασης και η ανίχνευσή τους έχει ολοκληρωθεί σε 25 min. Ανίχνευσης χαµηλών επιπέδων νοθείας στην ανάλυση µιγµάτων καφέ Η προτεινόµενη µέθοδος χρησιµοποιήθηκε επιτυχώς για την πιστοποίηση µιγµάτων καφέ µε νοθεία της τάξης του 5 %. 85

99 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 9 Ανάπτυξη ταχείας ποσοτικής µεθόδου γονοτύπησης µονονουκλεοτιδικών πολυµορφισµών µε συνδυασµό αντίδρασης επέκτασης εκκινητή και βιοφωταυγειοµετρικής ανίχνευσης 9.1 Εισαγωγή Σε αυτό το κεφάλαιο περιγράφεται µια ταχεία, χαµηλού κόστους, βιοφωταυγειοµετρική µέθοδος για τον ποσοτικό προσδιορισµό των ποικιλιών καφέ. Η επιλογή της αλληλουχίας-στόχου βασίστηκε στην ίδια φυλογενετική µελέτη που αναφέρθηκε στο προηγούµενο κεφάλαιο. Η πρόκληση σε αυτή την περίπτωση εκτός από την ανίχνευση και ταυτοποίηση των δύο αλληλουχιών, οι οποίες διαφέρουν σε µία µόνο βάση, βρίσκεται στον ποσοτικό προσδιορισµό τους µέσα στο περίπλοκο µίγµα του γενωµικού DNA που αποµονώνεται από τον καφέ. Η µέθοδος αποτελείται από ένα στάδιο πολλαπλασιασµού της περιοχής του DNA στην οποία βρίσκεται ο υπό µελέτη SNP και µια αντίδραση επέκτασης εκκινητή για κάθε αλλήλιο. Ένα βιοτινυλιωµένο νουκλεοτίδιο εισάγεται στον εκκινητή που επεκτείνεται, ο οποίος διαθέτει στο 5 - άκρο του ένα τµήµα (da) 30. Τα προϊόντα επέκτασης δεσµεύονται σε φρεάτια µικροτιτλοδότησης τα οποία είναι επιστρωµένα µε στρεπταβιδίνη και ανιχνεύονται χρησιµοποιώντας ένα σύζευγµα (dt) 30 - αικουορίνης. Η χρήση της ανασυνδυασµένης αικουορίνης ως ιχνηθέτη προσφέρει στη µέθοδό µας υψηλή ευαισθησία (ανίχνευση σε επίπεδα attomole), ευκολία στη χρήση (απλή προσθήκη περίσσειας ιόντων Ca 2+ ), ταχύτητα (η αντίδραση ολοκληρώνεται 3 s µετά την προσθήκη του Ca 2+ ) ενώ δεν απαιτείται κανένα στάδιο επώασης µε κάποιο ακριβό υπόστρωµα. 9.2 Μεθοδολογία Αποµόνωση DNA από δείγµατα καφέ Πράσινοι (χλωροί) κόκκοι καφέ (20 g) (πίνακας 9.1) αλέστηκαν σε ένα µηχάνηµα άλεσης χρησιµοποιώντας ένα πλέγµα των 2.0 mm. Για την ανάλυση των µιγµάτων, σκόνη από πράσινους κόκκους καφέ του είδους Arabica αναµίχθηκε µε σκόνη από πράσινους κόκκους καφέ του είδους Robusta έτσι ώστε κάθε µίγµα να 86

100 περιέχει 1, 5, 10, 30 και 50 % Robusta αντίστοιχα (πίνακας 9.2). Το DNA αποµονώθηκε από ένα δείγµα σκόνης 150 mg χρησιµοποιώντας το GeneSpin DNA extraction kit ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. είγµα χλωρού καφέ, Προέλευση Είδος 1 Café de Cuba, Cuba C. Arabica 2 Mysore A, India C. Arabica 3 Sumatra Lintung C. Arabica 4 Jacaranda organic coffee, Brazil C. Arabica 5 El Salvador, El Carmen Estate (Icatu) C. Arabica 6 Robusta, Rwanda C. canephora 7 Maragogype, Nicaragua, Finca el Platanillo C. Arabica 8 Mondo Novo, Natural Sertarzinho farm C. Arabica 9 Yellow bourbon, Brazil, Cachoeira farm C. Arabica 10 India Robusta Mysore C. canephora 11 Coopronaranjo Bandola Costa Rica C. Arabica 12 Dominican Republic, Montana Verde C. Arabica 13 Accession 1S/2, Uganda C. canephora 14 Kalosi Indonesia C. Arabica Πίνακας 9.1: είγµατα χλωρού καφέ που χρησιµοποιήθηκαν σε αυτή τη µελέτη. είγµα Σύσταση (Arabica / Robusta) είγµα Σύσταση (Arabica / Robusta) 1M 50 : 50 9M 90 : 10 2M 50 : 50 10M 95 : 5 3M 50 : 50 11M 95 : 5 4M 70 : 30 12M 95 : 5 5M 70 : 30 13M 99 : 1 6M 70 : 30 14M 99 : 1 7M 90 : 10 15M 99 : 1 8M 90 : 10 Πίνακας 9.2: Μίγµατα σκόνης καφέ που παρασκευάστηκαν από πράσινους (χλωρούς) κόκκους καφέ. 87

101 9.2.2 Πολλαπλασιασµός τµήµατος της διαγονιδιακής ενδιάµεσης χλωροπλαστικής περιοχής trnl (UAA)-trnF(GAA) µε PCR Για τον πολλαπλασιασµό ενός τµήµατος της διαγονιδιακής ενδιάµεσης χλωροπλαστικής περιοχής trnl (UAA)-trnF(GAA) µεγέθους 362 bp, γενωµικό DNA που αποµονώθηκε από δείγµατα καφέ υποβλήθηκε σε PCR. Το µίγµα της PCR περιείχε 1 Phusion HF reaction buffer, 2 mm MgCl 2, 250 µm από κάθε dntp, 0.25 µm από κάθε εκκινητή Ucoffee και Coffea1-R, 0.5 U Phusion High Fidelity DNA πολυµεράσης και 0.5 µl ολικού γενωµικού DNA, σε συνολικό όγκο 25 µl. Το πρόγραµµα θερµικών κύκλων που χρησιµοποιήθηκε ήταν: αποδιάταξη στους 98 C για 40 s, ακολουθούµενη από 35 κύκλους αποδιάταξης στους 98 C για 15 s, υβριδοποίησης των εκκινητών στους 60 C για 30 s και επιµήκυνσης στους 72 C για 90 s. Στη συνέχεια, το µίγµα επωάστηκε στους 72 C για 7 min και ψύχθηκε στους 4 C. Μίγµατα αντιδράσεων που περιείχαν νερό αντί γενωµικού DNA συµπεριελήφθησαν σε κάθε σειρά PCR για να επιβεβαιωθεί η απουσία επιµόλυνσης. Η συγκέντρωση των προϊόντων της PCR προσδιορίστηκε µε ηλεκτροφόρηση σε 2 % πηκτή αγαρόζης και χρώση µε βρωµιούχο αιθίδιο ακολουθούµενη από πυκνοµετρική ανάλυση της φωτογραφίας της πηκτής, η λήψη της οποίας έγινε µε ψηφιακή κάµερα. Η πυκνοµετρική ανάλυση έγινε σε ηλεκτρονικό υπολογιστή µε τη χρήση ειδικού λογισµικού Αντίδραση επέκτασης εκκινητή (PEXT reaction) Όλα τα προϊόντα της PCR υποβλήθηκαν σε αντίδραση επέκτασης εκκινητή. Για τις αντιδράσεις αυτές χρησιµοποιήθηκαν δύο ειδικά σχεδιασµένοι εκκινητές. Ο κάθε ένας ήταν ειδικός για το κάθε είδος καφέ. Όλες οι αντιδράσεις είχαν συνολικό όγκο 20 µl και περιείχαν 20 mm Tris-HCl, ph 8.8, 10 mm (NH 4 ) 2 SO 4, 10 mm KCl, 1 ml/l Triton X-100, 1 mm MgSO 4, 0.25 U Vent (exo-) DNA πολυµεράσης, 0.1 pmol του PCR προϊόντος, 1 pmol από τον κατάλληλο εκκινητή (ειδικό ως προς Arabica ή Robusta, Usnp4arab και Usnp4rob αντίστοιχα), 2.5 µm από κάθε ένα από τα datp, dctp και dgtp, µm dttp, και µm biotin-21-dutp. Για την ανάλυση των µοριακών µιγµάτων, ετοιµάστηκαν µίγµατα πολλαπλασιασµένου DNA από Arabica που περιείχαν 1,5,10,30 και 50% πολλαπλασιασµένο DNA από Robusta. Το πρόγραµµα θερµικών κύκλων που χρησιµοποιήθηκε στις αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή ήταν: αποδιάταξη στους 95 C για 5 min, ακολουθούµενη από 3 88

102 κύκλους αποδιάταξης στους 95 C για 15 s, υβριδοποίησης των εκκινητών στους 65 C για 10 s και επιµήκυνσης στους 72 C για 15 s Βιοφωταυγειοµετρικός προσδιορισµός σε φρεάτια µικροτιτλοδότησης Αδιαφανή φρεάτια πολυστυρενίου επιστρώθηκαν µε 50 µl διαλύµατος 1.4 mg/l SA σε PBS και επωάστηκαν στους 4 C όλη τη νύχτα. Πριν τη χρήση τους, τα φρεάτια εκπλύθηκαν τρεις φορές µε διάλυµα έκπλυσης (50 mm Tris HCl, 150 mm NaCl, 2 mm EDTA, 0.2 ml/l Tween 20, ph 7.5). Ένα δείγµα 10 µl από τα προϊόντα της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή µαζί µε 40 µl διαλύµατος αραίωσης (150 mm NaCl, 15 mm NaCitrate, 0.01 g/ml BSA and 2 mm EDTA, ph 7.0) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 30 min σε θερµοκρασία δωµατίου, µε ήπια ανακίνηση έτσι ώστε να δεσµευθούν τα βιοτινυλιωµένα προϊόντα επέκτασης εκκινητή. Τα φρεάτια εκπλύθηκαν τρεις φορές και προστέθηκαν σε αυτά 50 µl διαλύµατος 100 mm NaOH, για να αποδιαταχθούν τα ακινητοποιηµένα προϊόντα επέκτασης εκκινητή. Μετά από επώαση 5 min σε θερµοκρασία δωµατίου, µε ήπια ανακίνηση, ο µη βιοτινυλιωµένος κλώνος DNA αποµακρύνθηκε µε έκπλυση. Στη συνέχεια, προστέθηκαν στα φρεάτια 50 µl του συζεύγµατος 22 nmol/l αικουορίνη- (dt) 30 διαλυµένα σε διάλυµα ανασύστασης (0.15 M NaCl, 15 mm NaCitrate, 0.01 g/ml BSA, 2 mm EDTA και 0.5 ml/l Tween 20 ph 7.0). Ακολούθησε επώαση για 30 min σε θερµοκρασία δωµατίου, µε ήπια ανακίνηση, έτσι ώστε να υβριδοποιηθούν τα ακινητοποιηµένα µονόκλωνα προϊόντα επέκτασης µε το σύζευγµα της αικουορίνης. Τα φρεάτια εκπλύθηκαν στη συνέχεια και η ενεργότητα της δεσµευµένης αικουορίνης προσδιορίστηκε έπειτα από έγχυση 50 µl διαλύµατος πυροδότησης (25 mm CaCl 2, 20 mm Tris HCl, ph 7.5). Η µέτρηση της βιοφωταύγειας έγινε µε καταγραφή της παραγόµενης ακτινοβολίας για 3 s. 9.3 Αποτελέµατα Συζήτηση Αρχή Μεθόδου Η επιλογή της αλληλουχίας-στόχου που χρησιµοποιήθηκε για την ανάπτυξη της προτεινόµενης µεθόδου βασίστηκε σε µια φυλογενετική µελέτη. Η µελέτη αυτή είχε ως αποτέλεσµα την εύρεση αρκετών µονονουκλεοτιδικών πολυµορφισµών µεταξύ των διαφόρων ειδών καφέ. Αυτοί οι πολυµορφισµοί δικαιολογούν και τους διαφορετικούς χλωρότυπους µεταξύ του Coffea Arabica και του Coffea Robusta 89

103 (Cros 1998). Η αλληλουχία που επιλέχθηκε τελικά για την ανάλυση είναι η διαγονιδιακή ενδιάµεση χλωροπλαστική trnl(uaa)-trnf(gaa) περιοχή, η οποία παρουσιάζει 3 µονονουκλεοτιδικούς πολυµορφισµούς (πίνακας 8.1). Ένας από αυτούς, ο SNP 3, επιλέχθηκε για την ανάπτυξη της µεθόδου. Αρχικά, γίνεται αποµόνωση του γενωµικού DNA από τα δείγµατα καφέ. Στη συνέχεια, ένα τµήµα µεγέθους 362 bp της διαγονιδιακής ενδιάµεσης χλωροπλαστικής trnl(uaa)-trnf(gaa) περιοχής ενισχύεται µε PCR. Επιλέχθηκε να ενισχυθεί διαφορετικό τµήµα της συγκεκριµένης αλληλουχίας (σχήµα 9.1), απ ότι στη µέθοδο που αναφέρθηκε στο προηγούµενο κεφάλαιο, για αποφυγή τυχόν επιµολύνσεων. Κάθε προϊόν PCR υποβάλλεται σε δύο ξεχωριστές αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή (σχήµατα 8.4 και 8.5), παρουσία βιοτινυλιωµένου dutp. Χρησιµοποιούνται δύο εκκινητές ειδικοί για κάθε αλληλόµορφο. Οι εκκινητές αυτοί αποτελούνται: 1) από µια αλληλουχία συµπληρωµατική µε την περιοχή δίπλα στο πολυµορφικό σηµείο, µε το 3 -τελικό νουκλεοτίδιο να είναι συµπληρωµατικό µε το ποικιλόµορφο αλλήλιο και 2) από µια πολυαδενυλική ουρά στο 5 - άκρο. TTGGTATGGAAACCCACTAAGTGATAACTTTCAAATTCAGAGAAACCCTGGAATTAATAAAAAGGGGCAA TCCTGAGCCAAATCCCGTTTTCCGAAACCAAAGGAAAGGTTCAGAAAGTGAAAAAAGGATAGGTGCAGAG ACTCAACGGAAGCTGTTCTAACAAATGGAGTTGGCTGCGTTAGTAGAGAAATCTTTCCATCTAAAATTCC GAAAGGATAAAGTGAAGGATAAACGTATATACGTATTGAATACTATATTAAATGATTAATGACGACTCAA CTGAATCTGTATTTTTTATATAAAAATGGAAGAATTGGTGTGAATAGATTCCACATTGAAGAAAGAATCG AATATTCATTGATCAAATGATTCACTCCATAGTCTGATAGATCTTTTCAAGAATTGATTAATCGGACGAG AATAAAGATAGAGTCCCGTTCTACATGTCAATGTCGGCAACAATGAAATTTATAGTAAGAGGAAAATCCG TCGACTTTAAAAATCGTGAGGGTTCAAGTCCCTCTATCCCCAAAAAACATATTTGATCCCCCAACTATTT ATCCTATCCCCCTTTCGTTAGCGGTTCAAAAAACCTTATTCATTTACTCTATTCTCTTAGAAATCGATCT GGACGGAAAAGCCCTTTTCTTATCACAAATCTTGTGTTATTTATGATATACATATAAATGAACATCTTTG AGCAAGAAATACCCATTTGAATGGTTTACAATCGATATAACTATTCATACTGAAACTTACAAAGTACTCT TTTTTAAGATACAAGAAATTCTAGTACCTAGATAAAATTTTGTAATCCCCTTTCCTTCTTTTAATTGACA TAGCCCCCCTTTTCTCATAAAATGAGGATGCTACATTGGGACTGGTCGGGATAGCTCAGATGGTAGAGCA GAGGACTGAAAATCCTCGTGTCACCAGTTCAAAT Σχήµα 9.1: Αλληλουχία της χλωροπλαστικής trnl(uaa)-trnf(gaa) περιοχής. Με πράσινο χρώµα φαίνονται οι περιοχές στις οποίες υβριδοποιούνται οι εκκινητές της PCR ενώ µε κίτρινο χρώµα φαίνονται οι περιοχές στις οποίες υβριδοποιούνται οι εκκινητές που χρησιµοποιήθηκαν στη µέθοδο που περιγράφθηκε στο προηγούµενο κεφάλαιο. Με κόκκινο χρώµα φαίνεται η θέση του SNP3. 90

104 Η DNA πολυµεράση που χρησιµοποιείται κατά την αντίδραση επέκτασης εκκινητή στερείται δράσης εξωνουκλεάσης. Η προσθήκη των νουκλεοτιδίων γίνεται ταχύτατα και µε πολύ υψηλή πιστότητα, καθώς η επέκταση του εκκινητή γίνεται µόνο αν αυτός υβριδοποιείται πλήρως µε την αλληλουχία-στόχο. Στην αντίθετη περίπτωση δεν παράγεται προϊόν. Κατά την αντίδραση επέκτασης γίνεται εισαγωγή βιοτινυλιωµένου dutp στον εκκινητή που έχει επεκταθεί. Η βιοτίνη χρησιµοποιείται για την ακινητοποίηση των προϊόντων επέκτασης εκκινητή σε φρεάτια µικροτιτλοδότησης τα οποία είναι επιστρωµένα µε στρεπταβιδίνη. Οι δύο αλληλόµορφο-ειδικοί εκκινητές έχουν στο 5 -άκρο τους ένα τµήµα (da) 30 το οποίο επιτρέπει την υβριδοποίηση των ακινητοποιηµένων προϊόντων επέκτασης µε το σύζευγµα αικουορίνης-(dt) 30. Η µέτρηση της φωταύγειας της δεσµευµένης αικουορίνης γίνεται µέσα σε 3 s, έπειτα από προσθήκη περίσσειας ιόντων Ca 2+. Σε όσα δείγµατα δεν έχει γίνει επέκταση εκκινητή, δεν ανιχνεύεται σήµα (σχήµα 9.2). 5 Ca +2 hv Aequorin AAAA AAAA AAAA TTTT A T SA B SA B SA B SA Σχήµα 9.2: Γραφική απεικόνιση της βιοφωταυγειοµετρικής δοκιµασίας υβριδοποίησης. 1) Τα φρεάτια µικροτιτλοδότησης επιστρώνονται µε στρεπταβιδίνη. 2) Τα δίκλωνα προϊόντα της ΡΕΧΤ ακινητοποιούνται µέσω της αλληλεπίδρασης βιοτίνης-στρεπταβιδίνης. 3) Γίνεται αποδιάταξη των δίκλωνων προϊόντων της ΡΕΧΤ. 4) Προσθήκη και ακινητοποίηση του συζεύγµατος αικουορίνης-(dt) 30 µέσω υβριδοποίησης µε την (da)30 ουράς του προϊόντος της ΡΕΧΤ. 5) Προσθήκη περίσσειας ιόντων Ca 2+ και µέτρηση φωταύγειας. 91

105 Η περιεκτικότητα του δείγµατος (ποσοστό) σε Arabica, υπολογίζεται από τη σχέση AR = LA / (LA+LR), και για τη Robusta από τη σχέση RO = LR / (LA+LR) όπου LA and LR είναι τα σήµατα βιοφωταύγειας που προκύπτουν από την ανάλυση των προϊόντων της αντίδρασης επέκτασης χρησιµοποιώντας τους αλληλόµορφο-ειδικούς εκκινητές για Arabica και Robusta αντίστοιχα Πολλαπλασιασµός τµήµατος της χλωροπλαστικής περιοχής trnl (UAA)trnF(GAA) µε PCR Μετά την αποµόνωση του γενωµικού DNA από τα δείγµατα καφέ ακολούθησε πολλαπλασιασµός τµήµατος της χλωροπλαστικής περιοχής trnl (UAA)-trnF(GAA) µέσω PCR. Tα προϊόντα της αντίδρασης µεγέθους 362 bp προσδιορίστηκαν µε ηλεκτροφόρηση σε 2 % πηκτή αγαρόζης και χρώση µε βρωµιούχο αιθίδιο. Η συγκέντρωση των προϊόντων προσδιορίστηκε µε πυκνοµετρική ανάλυση της φωτογραφίας του ηλεκτροφορήµατος. Τα ηλεκτροφορήµατα των PCR προϊόντων φαίνονται στα σχήµατα M -ve Ar Rob M 1M 2M 3M 4M 5M 6M 7M B A Σχήµα 9.3: Ηλεκτροφορήµατα των PCR προϊόντων για δείγµατα που περιέχουν Α) 100 % Arabica και 100% Robusta και νερό Β) Μίγµατα σκόνης καφέ που περιέχουν Αrabica µε 50 % (1Μ, 2Μ, 3Μ), 30 % (4Μ, 5Μ, 6Μ) και 10 % (7Μ) Robusta. 92

106 M 8M 9M 10M 11M 12M 13M 14M Σχήµα 9.4: Ηλεκτροφορήµατα των PCR προϊόντων για δείγµατα από µίγµατα σκόνης καφέ που περιέχουν Αrabica µε 10 % (8Μ, 9Μ,), 5 % (10Μ, 11Μ, 12Μ) και 1 % (13Μ, 14Μ) Robusta. M 1G 2G 3G 4G 5G M 7G 8G 9G 10G 11G 12G 13G 6G Σχήµα 9.5: Ηλεκτροφορήµατα των PCR προϊόντων για δείγµατα από πράσινους / χλωρούς κόκκους καφέ (1G, 2G, 3G, 4G, 5G, 6G, 7G, 8G, 9G, 10G, 11G, 12G, 13G). 93

107 9.3.3 Βελτιστοποίηση της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή Οι µελέτες που έγιναν για τη βελτιστοποίηση της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή για την ανίχνευση του υπό εξέταση µονονουκλεοτιδικού πολυµορφισµού αναφέρονται στο κεφάλαιο 8 (παράγραφος 8.3.3). Σκοπός των µελετών αυτών ήταν να βρεθούν οι συνθήκες αυτές της αντίδρασης που εξασφαλίζουν υψηλή απόδοση και εξειδίκευση στην επέκταση µόνο των πλήρως συµπληρωµατικών εκκινητών. Επιλέχθηκε να διεξαχθούν 3 µόνο θερµικοί κύκλοι της αντίδρασης ως ένας συµβιβασµός ανάµεσα στο υψηλό σήµα και στο συνολικό χρόνο της αντίδρασης. Η αναλογία βιοτινυλιωµένου-dutp:dttp 1:3 επιλέχθηκε ως βέλτιστη. Η ποσότητα του προϊόντος PCR που εισάγεται στην αντίδραση επέκτασης και η µοριακή αναλογία εκκινητή προς DNA-στόχο είναι πολύ σηµαντικοί παράγοντες καθώς επιδρούν στην κινητική της αντίδρασης, εποµένως και στην ποσότητα του προϊόντος επέκτασης. Η βέλτιστη ποσότητα του DNA-στόχου βρέθηκε ότι ήταν 100 fmol, χρησιµοποιώντας 1 pmol του κατάλληλου εκκινητή. Εποµένως ο βέλτιστος λόγος εκκινητή/dna-στόχο στην αντίδραση επέκτασης ήταν 10. Η επιλογή της θερµοκρασίας υβριδοποίησης του εκκινητή είναι καθοριστική για την ειδική ή µη ειδική του επέκταση. Η εξειδίκευση της αντίδρασης βελτιώνεται µε αύξηση της θερµοκρασίας υβριδοποίησης. Η θερµοκρασία που επιλέχθηκε τελικά ήταν 65 C Ανάλυση µιγµάτων προϊόντων PCR Προϊόντα της PCR, τα οποία προήλθαν από πρότυπα δείγµατα είτε καθαρού Arabica είτε καθαρού Robusta, αναµίχθηκαν σε διάφορες αναλογίες από 10:90 έως 90:10 (Arabica/Robusta). Τα µίγµατα αυτά, µαζί µε καθαρά δείγµατα DNA από Arabica και Robusta, υποβλήθηκαν σε 2 ξεχωριστές αντιδράσεις επέκτασης χρησιµοποιώντας και τους δύο αλληλόµορφο-ειδικούς εκκινητές. Τα προϊόντα της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή αναλύθηκαν στη συνέχεια βιοφωταυγειοµετρικά. Προσδιορίστηκε πειραµατικά το ποσοστό κάθε ποικιλίας και στη συνέχεια έγινε γραφική παράσταση αυτού έναντι των θεωρητικών τιµών (σχήµατα 9.6, 9.7). Από την ανάλυση των αποτελεσµάτων προέκυψε µια γραµµική σχέση (R 2 = 0,98741). 94

108 100 Y = * X R 2 = * L A / (L A + L R ) Θεωρητική τιµή Arabica (%) Σχήµα 9.6: Ανάλυση καθαρού Arabica και καθαρού Robusta, καθώς και µιγµάτων σε διάφορες αναλογίες από 10:90 έως 90:10 (Arabica/Robusta). Η ανάλυση έγινε µε τον αλληλόµορφο-ειδικό εκκινητή για Arabica. 100 Y = * X R 2 = * L R / (L A +L R ) Θεωρητική τιµή Robusta (% ) Σχήµα 9.7: Ανάλυση καθαρού Arabica και καθαρού Robusta, καθώς και µιγµάτων σε διάφορες αναλογίες από 10:90 έως 90:10 (Arabica/Robusta). Η ανάλυση έγινε µε τον αλληλόµορφο-ειδικό εκκινητή για Robusta. 95

109 9.3.5 Ανάλυση δειγµάτων πράσινων (χλωρών) κόκκων καφέ DNA που αποµονώθηκε από πράσινους (χλωρούς) κόκκους καφέ υποβλήθηκε σε PCR για πολλαπλασιασµό της περιοχής που περιλαµβάνει τον υπό ανάλυση SNP. Κάθε PCR προϊόν υποβλήθηκε σε δύο ξεχωριστές αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή χρησιµοποιώντας και τους δύο αλληλόµορφο-ειδικούς εκκινητές. Τα προϊόντα επέκτασης αναλύθηκαν στη συνέχεια βιοφωταυγειοµετρικά και από την επεξεργασία των αποτελεσµάτων προέκυψε το πειραµατικά προσδιοριζόµενο % ποσοστό κάθε είδους. 120 είγµατα χλωρού καφέ * L A / (L A +L R ) Αριθµός δείγµατος Σχήµα 9.8: Ανάλυση δειγµάτων χλωρού καφέ. Η ανάλυση έγινε µε τον αλληλόµορφο-ειδικό εκκινητή για Arabica. Από την ανάλυση που έγινε µε τον αλληλόµορφο-ειδικό εκκινητή για Arabica προέκυψε (σχήµα 9.8) ότι 3 από τα δείγµατα που αναλύθηκαν είχαν µηδενική περιεκτικότητα σε Arabica ενώ τα υπόλοιπα 11 περιείχαν Arabica. Από την ανάλυση που έγινε µε τον αλληλόµορφο-ειδικό εκκινητή για Robusta προέκυψε (σχήµα 9.9) ότι 11 από τα δείγµατα που αναλύθηκαν είχαν µηδενική περιεκτικότητα σε Robusta ενώ τα υπόλοιπα 3 περιείχαν τη συγκεκριµένη ποικιλία. 96

110 είγµατα χλωρού καφέ * L R / (L A +L R ) Αριθµός δείγµατος Σχήµα 9.9: Ανάλυση δειγµάτων χλωρού καφέ. Η ανάλυση έγινε µε τον αλληλόµορφο-ειδικό εκκινητή για Robusta. Τα παραπάνω αποτελέσµατα έρχονται σε πλήρη συµφωνία µεταξύ τους. Συµπερασµατικά, από τα 14 δείγµατα χλωρού καφέ που αναλύθηκαν προέκυψε ότι τα 11 από αυτά περιέιχαν µόνο Arabica και τα άλλα 3 µόνο Robusta Μελέτες επαναληψιµότητας Μελέτη επαναληψιµότητας της βιοφωταυγειοµετρικής δοκιµασίας υβριδοποίησης Η επαναληψιµότητα της βιοφωταυγειοµετρικής δοκιµασίας υβριδοποίησης εκτιµήθηκε αναλύοντας µίγµατα προϊόντων PCR από τις δύο ποικιλίες. Τα µίγµατα αυτά προέκυψαν έπειτα από ανάµιξη προϊόντων PCR από καθαρά δείγµατα Arabica και Robusta. Η ανάµιξη έγινε σε διάφορες αναλογίες, από 10:90 έως 90:10 (Arabica/Robusta). Τα µίγµατα, µαζί µε PCR προϊόντα από καθαρά δείγµατα Arabica και Robusta, υποβλήθηκαν σε αντίδραση επέκτασης εκκινητή χρησιµοποιώντας τον αλληλόµορφο-ειδικό εκκινητή για Arabica. Τα προϊόντα της επέκτασης εκκινητή αναλύθηκαν εις τριπλούν µε την προτεινόµενη βιοφωταυγειοµετρική δοκιµασία υβριδοποίησης. Στη συνέχεια, υπολογίστηκε το πειραµατικά προσδιοριζόµενο ποσοστό κάθε είδους (σχήµατα 9.10 και 9.11, πίνακας 9.3). 97

111 100 * L A / (L A + L R ) :100 10:90 25:75 50:50 75:25 90:10 100: Θεωρητική τιµή Arabica (%) Σχήµα 9.10: Μελέτη επαναληψιµότητας της βιοφωταυγειοµετρικής δοκιµασίας υβριδοποίησης. Η ανάλυση έγινε µε τον αλληλόµορφο-ειδικό εκκινητή για Arabica, σε καθαρά δείγµατα Arabica και Robusta καθώς και σε µοριακά µίγµατα προϊόντων PCR σε διάφορες αναλογίες, από 10:90 έως 90:10 (Arabica/Robusta). Η βιοφωταυγειοµετρική δοκιµασία υβριδοποίησης έγινε εις τριπλούν. 110 Μέση τιµή 3 επαναλήψεων * L A / (L A + L R ) Θεωρητική τιµή Arabica (%) Σχήµα 9.11: Μελέτη επαναληψιµότητας της βιοφωταυγειοµετρικής δοκιµασίας υβριδοποίησης. Η ανάλυση έγινε µε τον αλληλόµορφο-ειδικό εκκινητή για Arabica, σε καθαρά δείγµατα Arabica και Robusta καθώς και σε µοριακά µίγµατα προϊόντων PCR σε διάφορες αναλογίες, από 10:90 έως 90:10 (Arabica/Robusta). Η βιοφωταυγειοµετρική δοκιµασία υβριδοποίησης έγινε εις τριπλούν. Η σταθερά διακύµανσης εµφανίζεται µε τη µορφή φραγµού σφάλµατος. 98

112 Θεωρητική Πειραµατικά τιµή (%) προσδιοριζόµενη τιµή 0 0 ± ± ± ± ± ± ± 0.2 Πίνακας 9.3: Περιέχει τη θεωρητική τιµή του ποσοστού Arabica στα µοριακά µίγµατα και την αντίστοιχη πειραµατικά προσδιοριζόµενη τιµή. H σταθερά διακύµανσης (% CV) των σηµάτων βιοφωταύγειας της αικουορίνης δεν υπερβαίνει το 3.1 %. Εποµένως η προτεινόµενη µέθοδος παρουσιάζει πολύ καλή επαναληψιµότητα Ανάλυση µιγµάτων σκόνης καφέ Η συνολική επαναληψιµότητα της προτεινόµενης µεθόδου εκτιµήθηκε αναλύοντας µίγµατα σκόνης καφέ. Χρησιµοποιήθηκαν δείγµατα χλωρών κόκκων καφέ Arabica και Robusta τα οποία κονιοποιήθηκαν. Έπειτα αναµίχθηκαν έτσι ώστε να προκύψουν µίγµατα σκόνης Arabica/Robusta µε αναλογίες 50:50, 70:30, 90:10, 95:5, και 99:1. Κάθε µίγµα παρασκευάστηκε εις τριπλούν. Ακολούθησε αποµόνωση του DNA και PCR. Τα προϊόντα PCR υποβλήθηκαν στη συνέχεια σε δύο ξεχωριστές αντιδράσεις επέκτασης εκκινητή χρησιµοποιώντας και τους δύο αλληλόµορφοειδικούς εκκινητές. Τα PEXT προϊόντα αναλύθηκαν στη συνέχεια µε την προτεινόµενη βιοφωταυγειοµετρική δοκιµασία υβριδοποίησης. Το πειραµατικά προσδιοριζόµενο ποσοστό κάθε είδους υπολογίστηκε για κάθε µίγµα και έγινε γραφική παράσταση αυτού έναντι του αντίστοιχου θεωρητικού (σχήµατα 9.12, 9.13). 99

113 100 * L A / (L A + L R ) Αριθµός δείγµατος 50:50 70:30 90:10 95:5 99:1 Σχήµα 9.12: Μελέτη επαναληψιµότητας της προτεινόµενης µεθόδου. Η ανάλυση έγινε µε τον αλληλόµορφο-ειδικό εκκινητή για Arabica, σε µίγµατα σκόνης Arabica/ Robusta µε αναλογίες 50:50, 70:30, 90:10, 95:5, και 99: * L R / (L A +L R ) Αριθµός δείγµατος 50:50 70:30 90:10 95:5 99:1 Σχήµα 9.13: Μελέτη επαναληψιµότητας της προτεινόµενης µεθόδου. Η ανάλυση έγινε µε τον αλληλόµορφο-ειδικό εκκινητή για Robusta, σε µίγµατα σκόνης Arabica/ Robusta µε αναλογίες 50:50, 70:30, 90:10, 95:5, και 99:1. 100

114 Οι πειραµατικά προσδιοριζόµενες τιµές έδειξαν πολύ µεγάλη συµφωνία µε τις θεωρητικές τιµές (πίνακας 9.4). Η σταθερά διακύµανσης (% CV) των σηµάτων βιοφωταύγειας της αικουορίνης δεν βρέθηκε να υπερβαίνει σε καµία περίπτωση το 3.1 % (σχήµατα 9.14, 9.15). Εποµένως η προτεινόµενη µέθοδος παρουσιάζει πολύ καλή επαναληψιµότητα. 100 Μέση τιµή 3 επαναλήψεων * L A / (L A +L R ) Θεωρητική τιµή Arabica (%) Σχήµα 9.14: Μελέτη επαναληψιµότητας της προτεινόµενης µεθόδου. Η ανάλυση έγινε µε τον αλληλόµορφο-ειδικό εκκινητή για Arabica, σε µίγµατα σκόνης Arabica/ Robusta µε αναλογίες 50:50, 70:30, 90:10, 95:5, και 99:1. Η σταθερά διακύµανσης εµφανίζεται µε τη µορφή φραγµού σφάλµατος. 101

115 70 Μέση τιµή 3 επαναλήψεων * L R / (L A + L R ) Θεωρητική τιµή Robusta (%) Σχήµα 9.15: Μελέτη επαναληψιµότητας της προτεινόµενης µεθόδου. Η ανάλυση έγινε µε τον αλληλόµορφο-ειδικό εκκινητή για Robusta, σε µίγµατα σκόνης Arabica/ Robusta µε αναλογίες 50:50, 70:30, 90:10, 95:5, και 99:1. Η σταθερά διακύµανσηςς εµφανίζεται µε τη µορφή φραγµού σφάλµατος. Robusta Arabica Θεωρητική τιµή (%) Πειραµατικά προσδιοριζόµενη τιµή Θεωρητική τιµή (%) Πειραµατικά προσδιοριζόµενη τιµή ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 1 Πίνακας 9.4: Περιέχει τη θεωρητική τιµή του ποσοστού κάθε είδους στα µίγµατα σκόνης και την αντίστοιχη πειραµατικά προσδιοριζόµενη τιµή. 102

116 9.4. Συµπεράσµατα Η προτεινόµενη βιοφωταυγειοµετρική µέθοδος συνδυάζει τα πλεονεκτήµατα της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή και τις µοναδικές ιδιότητες της φωτοπρωτεΐνης αικουορίνης. Η µέθοδος µπορεί να χρησιµοποιηθεί για την ποσοτική ανάλυση νοθείας σε πράσινους (χλωρούς) κόκκους καφέ. Η χλωροπλαστική αλληλουχίαστόχος που επιλέχθηκε -η ενδιάµεση διαγονιδιακή trnl(uaa)-trnf(gaa) περιοχήβρέθηκε ότι µπορεί να αξιοποιηθεί για τη διάκριση και την πιστοποίηση όλων των ποικιλιών Arabica και Robusta που χρησιµοποιήθηκαν σε αυτή τη µελέτη. Η προτεινόµενη µέθοδος προσφέρει τα ακόλουθα πλεονεκτήµατα: Σταθερότητα αναλύτη Η χρήση του DNA ως αναλύτη πλεονεκτεί έναντι άλλων αναλυτών (π.χ. πρωτεΐνες που έχουν χρησιµοποιηθεί ευρέως για την ταυτοποίηση τροφίµων) καθώς είναι πολύ σταθερό θερµοανθεκτικό µόριο, οπότε οι αναλύσεις που στηρίζονται σε νουκλεϊκά οξέα είναι λιγότερο πιθανό να επηρεαστούν από την κατεργασία των τροφίµων. Επιπλέον, το DNA βρίσκεται στην πλειοψηφία των κυττάρων ενός οργανισµού επιτρέποντας, ενδεχοµένως, να ληφθούν οι ίδιες πληροφορίες από οποιοδήποτε κατάλληλο δείγµα από την ίδια πηγή, ανεξάρτητα από τον ιστό προέλευσης. Επιβεβαίωση της αλληλουχίας-στόχος Η αντίδραση επέκτασης εκκινητή επιτρέπει την επιβεβαίωση της αλληλουχίας-στόχος µέσω υβριδοποίησης µε έναν ειδικό εκκινητή, σε αντίθεση µε τις ηλεκτροφορητικές µεθόδους που δίνουν πληροφορίες µόνο για το µέγεθος των προϊόντων οπότε όσα παραπροϊόντα έχουν παρόµοιο µέγεθος µε το επιθυµητό προϊόν θα εκληφθούν ως θετικό σήµα. Στην προτεινόµενη µέθοδο, η απαίτηση για υβριδοποίηση των ολιγονουκλεοτιδίων-ανιχνευτών στην αλληλουχία-στόχο αποτελεί βήµα ελέγχου για την ορθή ανίχνευση των ειδικών προϊόντων και τη διάκρισή τους από τα παραπροϊόντα. Εύκολη και γρήγορη ανίχνευση γνωστών SNP Η εφαρµογή της µεθόδου για την ανίχνευση πολυµορφισµού, ο οποίος έχει επιβεβαιωµένη αλληλουχία, απαιτεί µόνο το σχεδιασµό τεσσάρων ολιγονουκλεοτιδίων (δύο εκκινητών για την PCR και δύο για την αντίδραση PEXT). 103

117 Η χρήση ειδικών λογισµικών σχεδίασης ολιγονουκλεοτιδίων επιτρέπει την άµεση και γρήγορη εφαρµογή της µεθόδου. Ταχεία και αξιόπιστη ποσοτική ανάλυση Οι µέθοδοι γονοτύπησης που βασίζονται στη χρήση ενζύµων, όπως η PEXT, έχουν αποδειχθεί πιο αξιόπιστες, ταχύτερες και πιο ειδικές από τις απλές δοκιµασίες υβριδοποίησης. Η προτεινόµενη µέθοδος συνδυάζει τη χρήση µιας ενζυµικής µεθόδου γονοτύπησης, της ΡΕΧΤ, µε την ανίχνευση µέσω µιας βιοφωταυγειοµετρικής δοκιµασίας υβριδοποίησης. Η αντίδραση ΡΕΧΤ ολοκληρώνεται έπειτα από 3 µόνο θερµικούς κύκλους (µέσα σε 10 min) σε αντίθεση µε τις χρονοβόρες δοκιµασίες υβριδοποίησης. Η χρήση της αικουορίνης επιτρέπει την γρήγορη ανίχνευση των ΡΕΧΤ προϊόντων καθώς η αντίδραση ολοκληρώνεται σε 3 s έπειτα από την έγχυση περίσσειας ιόντων Ca 2+, σε αντίθεση µε τα ένζυµα που χρησιµοποιούνται ως µόρια αναφοράς τα οποία απαιτούν µεγάλους χρόνους επώασης µε υποστρώµατα. εν απαιτείται καθαρισµός των προϊόντων πριν την ανίχνευση Μετά το τέλος της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή, στο µίγµα της περιλαµβάνονται, εκτός από τα προϊόντα των ολιγονουκλεοτιδίων-ανιχνευτών που έχουν επεκταθεί από τη DNA πολυµεράση, το DNA-στόχος και τα ολιγονουκλεοτίδια-ανιχνευτές, που δεν έχουν επεκταθεί. Επειδή στα φρεάτια µικροτιτλοδότησης ακινητοποιούνται µόνο τα ολιγονουκλεοτίδια που φέρουν βιοτίνη, ενώ όλα τα υπόλοιπα αποµακρύνονται µε την πρώτη έκπλυση, δεν απαιτείται καθαρισµός του µίγµατος της αντίδρασης πριν την προσθήκη του στα φρεάτια. Υψηλή εξειδίκευση Η εισαγωγή των νουκλεοτιδίων από τη DNA πολυµεράση που χρησιµοποιείται στην αντίδραση επέκτασης γίνεται µε πολύ µεγάλη ακρίβεια. Η επιµήκυνση γίνεται µόνο αν ο εκκινητής είναι πλήρως συµπληρωµατικός µε το DNA-στόχο. Έτσι επιτυγχάνεται η ξεκάθαρη διάκριση των δύο αλληλίων. 104

118 Μεγάλη ευαισθησία Η αικουορίνη ανιχνεύεται σε επίπεδο amol (10-18 moles). Η χρήση της αικουορίνης για την ανίχνευση των προϊόντων επέκτασης σε συνδυασµό µε την PCR επιτρέπει την ανίχνευση νοθείας ακόµα και σε επίπεδο 1 % Robusta. υνατότητα ανάλυσης µεγάλου αριθµού δειγµάτων σε µικρό χρόνο Ο πολλαπλασιασµός µε PCR είναι αναγκαίος σε όλες, σχεδόν, τις µεθόδους γονοτύπησης. Η αντίδραση επέκτασης εκκινητή ολοκληρώνεται σε 3 µόνο θερµικούς κύκλους και διαρκεί συνολικά λιγότερο από 10 min. Η ανίχνευση γίνεται σε φρεάτια µικροτιτλοδότησης γεγονός που επιτρέπει την παράλληλη ανάλυση µεγάλου αριθµού δειγµάτων και ολοκληρώνεται σε 1 hr. υνατότητα αυτοµατοποίησης της µεθόδου Η ανάπτυξη αυτοµατοποιηµένων µεθόδων διεξαγωγής PCR (Obeid 2003), σε συνδυασµό µε ήδη υπάρχοντα ρoµποτικά συστήµατα επεξεργασίας πλακιδίων µικροτιτλοδότησης, µπορεί να oδηγήσει σε πλήρη αυτοµατοποίηση της προτεινόµενης µεθόδου (Gut 2001). 105

119 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 10 Μελέτη των φωτοφυσικών ιδιοτήτων της χρωστικής SYBR Green I σε ελεύθερη µορφή αλλά και συνδεδεµένη µε µονόκλωνο, δίκλωνο και τρίκλωνο DNA 10.1 Εισαγωγή Οι χρωστικές κυανίνης χρησιµοποιούνται ευρέως ως φωτοευαισθητοποιητές, υλικά laser, µέσα αποθήκευσης σε οπτικούς δίσκους και ως φθορίζοντες ανιχνευτές και χρωστικές για την απεικόνιση και ανίχνευση βιοµορίων. Οι χρωστικές κυανίνης αποτελούνται από δύο ετεροκυκλικούς δακτυλίους οι οποίοι περιέχουν άτοµα αζώτου και συνδέονται µεταξύ τους µε περιττό αριθµό δεσµών µεθινίου, οι οποίοι βρίσκονται φυσιολογικά στην trans διαµόρφωση, έτσι ώστε να προκύπτει συντονισµός µέσω του υποκατεστηµένου συστήµατος ανάµεσα στα τριτοταγή και τα τεταρτοταγή άτοµα αζώτου. Τα άτοµα άνθρακα των οµάδων µεθινίου µπορεί να είναι συνδεδεµένα και µε άλλες οµάδες εκτός από υδρογόνο, ή µπορεί να αποτελούν µέρος καρβοκυκλικών ή ετεροκυκλικών δακτυλίων. Οι κυανίνες µπορούν να ταξινοµηθούν σε δύο οµάδες, στις συµµετρικές και στις ασύµµετρες χρωστικές. Οι συµµετρικές χρωστικές κυανίνης περιλαµβάνουν δύο πανοµοιότυπους ετεροκυκλικούς δακτυλίους (π.χ. Σχήµα 10.1, αριστερά), ενώ οι ασύµµετρες περιέχουν δύο διαφορετικούς ετεροκυκλικούς δακτυλίους (π.χ. Σχήµα 1, δεξιά) (Yarmoluk 2001, El-Shishtawy 2007). Σχήµα 10.1: Παραδείγµατα συµµετρικών (αριστερά) και ασύµµετρων (δεξιά) χρωστικών κυανίνης. Το Y αντιστοιχεί σε κάποιο αντισταθµιστικό ιόν, n = 0, 1, 2, 3. Εξαιτίας των εξαιρετικών χρωστικών ιδιοτήτων τους, οι χρωστικές κυανίνης έχουν χρησιµοποιηθεί σε πολλές βιολογικές εφαρµογές όπως η κυτταροµετρία ροής (Hirons 1994), η ανάλυση DNA µε βάση το µέγεθος (Marrone 1999), η χρήση ως 106

120 ιχνηθέτες σε δοκιµασίες υβριδοποίησης (Svanvik 2000, Ishiguro 1996, Seitz 1999), η µικροσκοπία φθορισµού (Gurrieri 1997), η χρώση πηκτών (Rye 1992) και η PCR πραγµατικού χρόνου (Bengtsson 2003, Yin 2001, Svanvik 2000). Από τη δεκαετία του 1990, οι ασύµµετρες χρωστικές ενός δεσµού µεθινίου (µονοµεθινικές) έχουν βρει πολλές εφαρµογές στην απεικόνιση και ποσοτικοποίηση του DNA σε τεχνικές όπως η ηλεκτροφόρηση σε τριχοειδές, η ηλεκτροφόρηση πηκτής και η µικροσκοπία φθορισµού (Haughland 2002). Οι φασµατικές ιδιότητες αυτών των χρωστικών είναι καλύτερες από χρωστικές όπως το 4, 6-διαµιδινο-2- φαινυλινδόλιο (4, 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI), το βρωµιούχο αιθίδιο και η οικογένεια των χρωστικών Hoechst. Οι κυανίνες έχουν υψηλούς συντελεστές γραµµοµοριακής απορροφητικότητας στην περιοχή του ορατού φάσµατος (Haughland 2002) και χαµηλή ένταση ενδογενούς φθορισµού, ενώ όταν συµπλέκονται µε DNA ή RNA η ένταση εκποµπής τους αυξάνεται περισσότερο από 100 φορές (Haughland 2002). Αυτή η αύξηση στην ένταση της εκπεµπόµενης ακτινοβολίας έχει ως αποτέλεσµα ένα µεγάλο λόγο σήµατος προς υπόβαθρο επιτρέποντας την ανάπτυξη οµογενών µεθόδων ανάλυσης νουκλεϊκών οξέων, δηλαδή µεθόδων που δεν απαιτούν αποµάκρυνση των ελεύθερων (µη συµπλοκοποιηµένων) µορίων της χρωστικής. Τέτοιου είδους οµογενείς µέθοδοι απαιτούν λιγότερο κόπο και χρόνο σε σύγκριση µε τις παραδοσιακές µεθόδους ανάλυσης που απαιτούν την αποµάκρυνση των µη συνδεδεµένων µορίων-ανιχνευτών για να µειωθεί η ένταση του φθορισµού υποβάθρου. Η αύξηση της έντασης φθορισµού των συµπλόκων των χρωστικών κυανίνης µε τα νουκλεϊκά οξέα οφείλεται κυρίως στον περιορισµό της εσωτερικής κίνησης της κυανίνης µετά την πρόσδεσή της στο DNA. Αυτές οι εσωτερικές κινήσεις αποτελούν σηµαντικές µη ακτινοβολητικές οδούς αποδιέγερσης των χρωστικών στην ελεύθερή τους µορφή. Πρόσφατα, µελετήθηκαν οι φωτοφυσικές ιδιότητες µιας σειράς χρωστικών κυανίνης τόσο στην ελεύθερή τους µορφή όσο και συνδεδεµένες µε DNA (Furstenberg 2007). Οι µελέτες αυτές έδειξαν ότι η κίνηση γύρω από τη γέφυρα µεθινίου, η οποία λαµβάνει χώρα σε µερικα ps, αποτελεί τον κύριο µηχανισµό µη ακτινοβολητικής αποδιέγερσης των χρωστικών κυανίνης. Μια από τις πλέον ευαίσθητες µονοµεθινικές χρωστικές, η SYBR Green I (SG), επιτρέπει την ανίχνευση περίπου 60 pg δίκλωνου DNA µετά από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης και είναι πιο ευαίσθητη από το βρωµιούχο αιθίδιο που 107

121 χρησιµοποιείται παραδοσιακά για την ανίχνευση DNA µετά από ηλεκτροφόρηση (Haughland 2002). N N N N + S Σχήµα 10.2: Η δοµή της µονοµεθινικής χρωστικής SYBR Green I. Από τότε που πρωτοεµφανίστηκε στις αρχές της προηγούµενης δεκαετίας (Haughland 2002), η SG έχει χρησιµοποιηθεί µε επιτυχία στην ανίχνευση νουκλεϊκών οξέων σε πηκτές (Schneeberger 1995, Jin 1996, Kiltie 1997, Diggle 2003), σε διάλυµα (Vitzthum 1999, Rengarajan 2002), στον προσδιορισµό των ιδιοτήτων DNάσης ή τελοµεράσης (Iida 1998, Wege 2003), σε τεχνικές απεικόνισης φθορισµού (Iwabuchi 1997), στην κυτταροµετρία ροής (Barbesti 2000, Brussaard 2000), στην PCR πραγµατικού χρόνου (Wittwer 1997, Bengtsson 2003, Giglio 2003, Pattyn 2003), σε εφαρµογές µικρορροϊκών συσκετών (Webster 2001), και πιο πρόσφατα στην τεχνικά απαιτητική ποσοτικοποίηση του δίκλωνου DNA σε ακατέργαστα εκχυλίσµατα περιβαλλοντικών δειγµάτων (Zipper 2003). Το µεγάλο εύρος των εφαρµογών της SG και η συνολική απόδοσή της στις διάφορες εφαρµογές οφείλονται στις εξαιρετικές ιδιότητές της. Αυτές περιλαµβάνουν επιθυµητές φωτοφυσικές ιδιότητες, θερµική σταθερότητα, εξειδίκευση για δίκλωνο DNA και υψηλή ευαισθησία (Haughland 2002, Schneeberger 1995). Επιπλέον, οι δοκιµασίες για την ποσοτικοποίηση του δίκλωνου DNA σε διάλυµα µπορούν να βελτιστοποιηθούν έτσι ώστε να προκύψουν εύκολες και αξιόπιστες µέθοδοι που παρουσιάζουν µια δυναµική γραµµική περιοχή έως και τεσσάρων τάξεων µεγέθους χρησιµοποιώντας ένα µόνο διάλυµα χρωστικής (Vitzthum 1999, Bachoon 2001). 108

122 Είναι γνωστό ότι τα µικρά µόρια συνδέονται µε το DNA µέσω δύο βασικών µηχανισµών: της παρεµβολής (σχήµα 10.3) (Jensen 1998, Petersen 1999, Sovenyhazy 2003, Zipper 2004) και της σύνδεσης αύλακος (σχήµα 10.4) (Sovenyhazy 2003, Kumar 1993, Karlsson 2003). Έχει προταθεί επίσης ένα µοντέλο ηµι-παρεµβολής για τις ασύµµετρες µονοµεθινικές χρωστικές κυανίνης (Yarmoluk 2001, Yarmoluk 1999). Τα µόρια που δρούν µέσω παρεµβολής (παρεµβολείς) είναι επίπεδα, συνήθως θετικά φορτισµένα αρωµατικά ή ετεροαρωµατικά µόρια που εισάγονται και πακτώνονται ανάµεσα στα ζεύγη βάσεων των δίκλωνων µορίων του DNA. Τα µόρια που δρουν µέσω σύνδεσης αύλακος συχνά σχηµατίζουν δεσµούς υδρογόνου µε τα ζεύγη βάσεων του DNA που σταθεροποιούν το σύµπλοκο (Mikheikin 2000). Στους ηµιπαρεµβολείς, το ένα ετεροκυκλικό κατάλοιπο παρεµβάλλεται µεταξύ των ζευγών βάσεων των νουκλεοτιδίων, ενώ το άλλο βρίσκεται στην περιοχή της αύλακας του DNA (Yarmoluk 2001, Yarmoluk 1999). Α Β Σχήµα 10.3: Α) Το βρωµιούχο αιθίδιο παρεµβάλλεται ανάµεσα σε δύο ζεύγη βάσεων αδενίνης ουρακίλης. Β) Η παρεµβολή προκαλεί δοµικές παραµορφώσεις. Αριστερά: Η αλυσίδα DNA στη φυσική της µορφή. εξιά: Η αλυσίδα DNA έχει υποστεί παρεµβολή σε τρεις θέσεις (κόκκινες περιοχές). Για τη µονοµεθινική χρωστική, SYBR Green I, έχει δειχθεί ότι τόσο η παρεµβολή όσο και η σύζευξη αύλακος µπορεί να συµβούν. Το είδος της αλληλεπίδρασης εξαρτάται από το λόγο ζεύγη βάσεων DNA / µόρια χρωστικής. Σε 109

123 λόγους µεγαλύτερους από έξι ζεύγη βάσεων ανά µόριο χρωστικής, επικρατεί η παρεµβολή, ενώ σε µικρότερους λόγους κυριαρχεί η σύζευξη αύλακος (Zipper 2004). netropsin A T G C Σχήµα 10.4: Παράδειγµα σύζευξης αύλακος. Το αντικαρκινικό φάρµακο netropsin εισχωρεί στην αύλακα της διπλής έλικας και συνδέεται µε το DNA. Η ικανότητα των νουκλεϊκών οξέων να σχηµατίζουν τριπλή έλικα ανακαλύφθηκε µόλις τέσσερα χρόνια µετά την παρουσίαση του "µοντέλου της διπλής έλικας" των Watson και Crick (Felsenfeld 1957). Βρέθηκε ότι η σύνδεση της τριπλής έλικας ήταν ασθενής σε σύγκριση µε τη σύνδεση της διπλής έλικας, ήταν όµως και αυτή εξειδικευµένη ως προς την αλληλουχία και σταθεροποιούνταν παρουσία δισθενών κατιόντων. Η δυνατότητα εξειδικευµένης σύνδεσης οδήγησε σε εκτεταµένη µελέτη των µορίων που µπορούν να σχηµατίσουν τριπλές έλικες και διερεύνηση της ικανότητας τους ως προς την εξειδικευµένη στόχευση γονιδίων. Τα ολιγονουκλεοτίδια που σχηµατίζουν τριπλή έλικα DNA (triplex forming oligonucleotides - TFOs) συνδέονται στη µεγάλη αύλακα του δίκλωνου DNA µέσω δεσµών υδρογόνου του τύπου Hoogsteen. Ένα ζεύγος βάσεων του τύπου Hoogsteen είναι µια παραλλαγή του κλασσικού Watson-Crick ζεύγους βάσεων που συναντάται στα νουκλεϊκά οξέα. Σε αυτή την περίπτωση το Ν7 της πουρινικής βάσης (ως δέκτης 110