Εξελίξεις στην Προεμφυτευτική Γενετική Ανάλυσητο μέλλον

Transcript

1 1 ο Επιμορφωτικό Σεμινάριο Γενετικής ΤΙ ΝΕΟΤΕΡΟ ΣΤΗΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Εξελίξεις στην Προεμφυτευτική Γενετική Ανάλυσητο μέλλον Γεωργία Κάκουρου, PhD ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ, ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, Διευθύντρια καθηγήτρια Σ.Κίτσιου-Τζέλη

2 Σύντομη αναδρομή εξωσωματική γονιμοποίηση: > μωρά (3% των γεννήσεων στην Ευρώπη από IVF) προεμφυτευτική γενετική ανάλυση: > μωρά

3 Σύντομη αναδρομή

4 Στόχοι/Προβληματισμοί Καταλληλότερο στάδιο βιοψίας Γενικευμένη προσέγγιση, ταυτόχρονη ανάλυση χρωμοσωμάτων και μονογονιδιακών νοσημάτων Μη επεμβατικές τεχνικές Μεταφορά ενός εμβρύου (SingleEmbryo Transfer) Γέννηση ενός υγιούς παιδιού

5 Μελλοντικές προοπτικές: τεχνολογίες-omics Gen-omics: γενετική-επιγενετική ανάλυση Transcript-omics: μελέτη μεταγράφων Prote-omics: μελέτη πρωτεϊνών Metabol-omics: μελέτη κυτταρικών μεταβολιτών

6 Μελλοντικές προοπτικές: τεχνολογίες-omics Gen-omics: ένα κύτταρο: ~6pg DNA γενετική ανάλυση acgh Single Nucleotide Polymorphism (SNP) arrays Next Generation Sequencing Transcript-omics: μελέτη μεταγράφων Prote-omics: μελέτη πρωτεϊνών Metabol-omics: μελέτη κυτταρικών μεταβολιτών

7 Τεχνικές ενίσχυσης του γονιδιώματος- Whole Genome Amplification (WGA) acgh acgh: Αριθμός χρωμοσωμάτων WGA SNP Επεξεργασία δεδομένων SNP: Αριθμός Χρωμοσωμάτων SNPs (LOH) Απλότυπος NGS Υψηλή απόδοση Πιστή απεικόνιση Πλήρης κάλυψη Εύκολη και ταχεία εκτέλεση NGS: Αριθμός Χρωμοσωμάτων SNPs (LOH) Απλότυπος Γονιδιακή μετάλλαξη Δομικές ανακατατάξεις

8 Μέθοδοι ενίσχυσης του γονιδιώματος Πρωτόκολλα PCR Multiple Displacement Amplification Whole Genome Amplification (WGA) Ισοθερμική μέθοδος ενίσχυσης- MALBAC- Multiple Annealing and Looping- Based Amplification Cycle DOP-PCR PEP LA-PCR DOP PEP 5 -CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3 εκκινητές 15 νουκλεοτιδίων LA-PCR πέψη και χρήση προσαρμοστών Treff et al (2011), Mol Hum Reprod;17: de Bourcy et al (2014) PLOS One; 9:e απόδοση κάλυψη ADO Μη ειδικά προϊόντα

9 Single Nucleotide Polymorphism arrays WGA acgh SNP Επεξεργασία δεδομένων acgh: Αριθμός χρωμοσωμάτων SNP: Αριθμός Χρωμοσωμάτων SNPs (LOH) Απλότυπος NGS NGS: Αριθμός Χρωμοσωμάτων SNPs (LOH) Απλότυπος Γονιδιακή μετάλλαξη Δομικές ανακατατάξεις

10 Μεθοδολογίες ανάλυσης SNP arrays 1) Brezina et al. (2011), Fertil Steril;95(5):1786.e5-8 2) Treff et al. (2010), Fertil Steril;94(6): ) Johnson et al. (2010), Hum Reprod; 25(4): ) Handyside et al. (2010), J Med Genet; 47(10):651-8 SNP-arrays/copy number analysis (αριθμός αντιγράφων χρωμοσωμάτων) Treff et al (2011), Fertil Steril; 95: e1-2 Schoolcraft et al (2011), Fertil Steril; 96: van Uum et al (2012), Eur J Hum Genet.;20: Tan et al (2013), Hum Reprod; 28: Tobler et al (2014), J Assist Reprod Genet; 31:843-50

11 Karyomapping ADO?

12 Κaryomapping/μονογονιδιακό νόσημα Natesan et al (2014), Genet Med.;16: αξιολόγηση τεχνικής Natesan et al (2014), Reprod Biomed Online;29:600-5 Thornhill et al (2015), J Assist Reprod Genet; epub ahead of print

13 Αποτελέσματα karyomapping Πάσχον παιδί Έμβρυο 1 φορέας Έμβρυο 2 φορέας Έμβρυο 3 Φυσιολογικό Έμβρυο 4 Παθολογικό Έμβρυο 5 Φυσιολογικό 2Mb Natesan et al (2014), Reprod Biomed Online;29(5):600-5

14 Karyomapping +/- Δεν απαιτείται ανάπτυξη πρωτοκόλλου (σύγκριση με απλή PCR- επιμόλυνση,ado, ανασυνδυασμοί) Αναγνώριση γονεϊκής προέλευσης κάθε χρωμοσώματος + - Ανίχνευση χρωμοσωμικών ανωμαλιών (μονογονεϊκής δισωμίας (UPD), τρισωμίας, μονοσωμίας, απώλεια ετεροζυγωτίας (LOH)), μικρών τμηματικών ανωμαλιών Ανίχνευση ισοζυγισμένης μετάθεσης Μονογονιδιακά νοσήματα/ Εφαρμογή για >1 ενδείξεις, πχ. SGD+HLA Χρόνος για διάγνωση: 24h Έμμεσος τρόπος διάγνωσης Παράλληλος έλεγχος γενετικού υλικού των υποψήφιων γονέων- και δείγμα πρώτου βαθμού συγγενείας Δυσκολία εφαρμογής για μεταλλάξεις de novo (ανάλυση μεμονωμένων σπερματοζωαρίων) Δυσκολίες όταν υπάρχει συγγένεια γονιών

15 Αλληλούχιση επόμενης γενιάς Next Generation Sequencing WGA acgh SNP Επεξεργασία δεδομένων acgh: Αριθμός χρωμοσωμάτων SNP: Αριθμός Χρωμοσωμάτων SNPs (LOH) Απλότυπος NGS NGS: Αριθμός Χρωμοσωμάτων SNPs (LOH) Απλότυπος Γονιδιακή μετάλλαξη Δομικές ανακατατάξεις

16 Next Generation Sequencing WGA Στοίχιση με το γονιδίωμα αναφοράς, σύγκριση και αξιολόγηση A T A G T C A G C T G T A T C H + A T A G T C A G C T G T A T C Φθορισμός Sequence depth, read depth, π.χ. 100x, 20

17 NGS/copy number analysis Yin et al (2013), Biol Reprod; 88:69 Fiorentino et al (2014), Fertil Steril; 101: Fiorentino et al (2014), Hum Reprod; 29: Wang et al (2014), Biol Reprod; 90:95 NGS/μονογονιδιακό νόσημα Wells et al (2014), J Med Genet; 51: Treff et al (2013), Fertil Steril ; 99:

18 Αποτελέσματα NGS/SGD Treff et al (2013), Fertil Steril; 99:

19 Αποτελέσματα NGS/copy number Wells et al (2014), J Med Genet; 51:553-62

20 Αποτελέσματα NGS/mtDNA Wells et al (2014), J Med Genet; 51:553-62

21 NGS +/- Δυνατότητα για μεγαλύτερη ανάλυση και ακρίβεια Κληρονομούμενες και de novo μεταλλάξεις και CNV Εφαρμογή για πληθώρα ενδείξεων + - Κόστος Σύνθετη ανάλυση αποτελεσμάτων (WGA) Πλήθος δεδομένων, ευρήματα (SNP, disease mutations, CNVs) Ανάλυση μιτοχονδριακού DNA Ισοζυγισμένες μεταθέσεις Χρειάζεται αξιολόγηση (accuracy, read depth etc) Δυνατότητα άμεσης και έμμεσης ανίχνευσης

22 Σύγκριση μεθοδολογιών Ενδείξεις PCR FISH acgh SNP arrays NGS Επιλογή φύλου Προεμφυτευτικός Γενετικός Έλεγχος (PGS) Εντοπισμός ισοζυγισμένων μεταθέσεων Μονογονιδιακά νοσήματα Τμηματικές de novo ανακατατάξεις Μεταλλάξεις de novo Μεταλλάξεις μιτοχονδριακού DNA

23 Στόχοι/Προβληματισμοί Καταλληλότερο στάδιο βιοψίας Γενικευμένη προσέγγιση, ταυτόχρονη ανάλυση χρωμοσωμάτων και μονογονιδιακών νοσημάτων Μη επεμβατικές τεχνικές Μεταφορά ενός εμβρύου (SingleEmbryo Transfer) Γέννηση ενός υγιούς παιδιού

24 Μη επεμβατικές τεχνικές Εντοπισμός εμβρύων με μεγαλύτερη πιθανότητα εμφύτευσης Μορφολογία εμβρύου, ανάλυση χρωμοσωμάτων Fragouli et al. (2013), Hum Genet;132: , Yang et al. (2012), Mol Cytogenet; 5:24, Forman et al., (2013), Fertil Steril; 100:718-24, Scott et al. (2013), Fertil Steril; 100: ΠΓΔ : διάγνωση από καινούριες πηγές εμβρυϊκού DNA, αναζήτηση ασφαλέστερου και πιο οικονομικού τρόπου Βιοψία ωαρίου/εμβρύου Levin et al. (2012), Fertil Steril; 97: βιοψία πολικού σωματίου Scott et al. (2013), Fertil Steril; 100: βιοψία 3η vs. 5η ημέρα Gardner et al. (2015), Hum Reprod Update, epub

25 Μη επεμβατικές τεχνικές Ανάλυση έκφρασης κοκκιωδών κυττάρων Fragouli et al. (2014), Hum Reprod Update; 20:1-11 Παρακολούθηση εμβρύων με μικρο-κάμερες: Time-lapse imaging Kirkegaard et al.,(2014) Fertil Steril ; epub Day 1 RNA-seq Macaulay and Voet (2014), PLOS ;10:e Day 3-4 Day 2 Ανάλυση cfdna από blastocoel fluid Pallini et al. (2013), Reprod Biomed Online; 26: Ελεύθερο DNA- cfdna, Μιτοχονδριακό DNA, Προσδιορισμός μεταβολιτών, πρωτεϊνών Assou et al. (2014), Stigliani et al. (2014), Katz- Jaffe and McReynolds (2013), Uyar and Seli (2014)

26 Επιπλέον εξελίξεις /δεδομένα που θα αλλάξουν τις μελλοντικές εφαρμογές Φάση κυτταρικού κύκλου κυττάρου που υπέστη βιοψία Dimitriadou et al. (2014), Mol Cytogenetics;7:46 Αυτοματοποίηση διαδικασιών υποβοηθούμενης αναπαραγωγής (robotics) Βελτίωση τεχνικών Καινούριες πλατφόρμες για προεμφυτευτική ανάλυση και διάγνωση Konstantinidis et al. (2014), Fertil Steril, epub, Okae et al (2014), PLOS Genet ;10 Βελτίωση εργαλείων βιοπληροφορικής

27 Στόχος: Μην ξεχνάμε! Μεταφορά ενός εμβρύου (Single Embryo Transfer) Γέννηση ενός υγιούς παιδιού