ΣΥΣΤΟΙΧΙΕΣ ΜΙΚΡΟΚΗΛΙ ΩΝ ΟΛΙΓΟΝΟΥΚΛΕΟΤΙ ΙΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ

Transcript

1 ΣΥΣΤΟΙΧΙΕΣ ΜΙΚΡΟΚΗΛΙ ΩΝ ΟΛΙΓΟΝΟΥΚΛΕΟΤΙ ΙΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ρ. Παναγιώτα Πέτρου Εργαστήριο Ανοσοαναλύσεων/Ανοσοαισθητήρων Ινστιτούτο Ραδιοϊσοτόπων Ραδιοδιαγνωστικών Προϊόντων ΕΚΕΦΕ «ηµόκριτος»

2 Περιεχόµενο διάλεξης Το µόριο του DNA Aλλαγές στην αλληλουχία του DNA Μέθοδοι ανάλυσης DNA Συστοιχίες µικροκηλίδων DNA ή ψηφίδες DNA Κατασκευή µικροκηλίδων Επισήµανση γονιδίου στόχου Υβριδισµός Ανίχνευση Περιορισµοί Εφαρµογές Τεχνολογίες κατασκευής µικροκηλίδων ολιγονουκλεοτιδίων που αναπτύσσονται στο ΕΚΕΦΕ «ηµόκριτος» Εφαρµογή στην ανίχνευση µεταλλάξεων στο γονίδιο BRCA1

3 DNA: το αθάνατο σπείραµα

4 Αλλαγές στην αλληλουχία του DNA Ανακατανοµές γονιδίων Αλλαγές µονήρων νουκλεοτιδίων: Απόµάκρυνση Ένθεση Μετάθεση Αντικατάσταση Πολυµορφισµοί: Αλλαγές µονήρων νουκλεοτιδίων που έχουν κληρονοµηθεί Σηµειακές µεταλλάξεις: Αλλαγές µονήρων νουκλεοτιδίων που συνέβησαν σε κάποιο στάδιο της ζωής ενός οργανισµού Όταν οι αλλαγές αυτές εντοπίζονται σε περιοχή του γονιδιώµατος που κωδικοποιεί κάποια πρωτεΐνη οι επιπτώσεις στην υγεία του ατόµου που φέρει την µετάλλαξη µπορεί να είναι πολύ σοβαρές.

5 Ανάλυση αλληλουχίας DNA 1. Λήψη δείγµατος αίµατος από τον ασθενή 2. Καθαρισµός γενοµικού DNA 3. Ενίσχυση των εξονίων του γονιδίου µε PCR 1.0 kb 0.5 kb 4. (Ανάλυση αλληλουχίας DNA) 100 bp

6 Συστοιχίες µικροκηλίδων DNA: Ορισµός Οι µικροκηλίδες DNA απαρτίζονται από πολλαπλούς «ανιχνευτές» DNA ακινητοποιηµένους σε µια στερεά επιφάνεια. Κάθε κηλίδα (διαµέτρου 50 έως 150 µm) αποτελείται από µεγάλο αριθµό όµοιων ολιγονουκλεοτιδίων που είναι συµπληρωµατικά µε το γονίδιο που µας ενδιαφέρει (DNA στόχος). Κατά την διάρκεια του υδριδισµού το DNA «στόχος» συνδέεται µε το συµπληρωµατικό τµήµα στην στερεά επιφάνεια σχηµατίζοντας διπλή έλικα. Τα υβριδισµένα γονίδια στόχοι ανιχνεύονται στην συνέχεια χρησιµοποιώντας κάποιο κατάλληλο σύστηµα δηµιουργίας σήµατος.

7 Ανάλυση DNA µε την τεχνική Southern Blotting Μικροκηλίδες DNA Ίδια ιδέα Καλύτερη χρήση

8 Μικροκηλίδες DNA ή ψηφίδες DNA Μικροκηλίδες: ΕΝΑΠΟΘΕΣΗ Οι ανιχνευτές είναι : Α) προϊόντα της PCR µήκους 300 εώς 1000 βάσεων για την ανίχνευση της παρουσίας ή της απουσίας γονιδίων. Β) Ολιγονουκλεοτίδια 9 εώς 50 βάσεων για την διάκριση µικρών αλλαγών στην αλληλουχία (σηµειακές µεταλλάξεις, πολυµορφισµοί µονήρους ολιγονουκλεοτιδίου). Οι συστοιχίες περιλαµβάνουν περίπου κηλίδες σε µια αντικειµενοφόρο πλάκα. Ψηφίδες DNA: ΣΥΝΘΕΣΗ Οι ανιχνευτές είναι ολιγονουκλεοτίδια βάσεων τα οποία συντίθενται πάνω σε ένα στερεό υπόστρωµα. Οι εµπορικά διαθέσιµες ψηφίδες περιλαµβάνουν έως και διαφορετικά µόρια σε µια επιφάνεια 1,28x1,28cm. Οι πειραµάτικες ψηφίδες µπορεί να περιλαµβάνουν και περισσότερα από διαφορετικά µόρια ανά συστοιχία.

9 Ψηφίδες DNA: φωτολιθογραφία ιαδικασία πολλαπλών σταδίων: Κάλυψη του υποστρώµατος µε φωτοενεργοποιούµενο υµένιο. Έκθεση συγκεκριµένων περιοχών της επιφάνειας σε µια πηγή φωτός. Οµοιπολική σύνδεση στις περιοχές που ακτινοβολήθηκαν. ιαδοχική προσθήκη των A, T, G και C ώστε να επιτευχθεί η επιθυµητή αλληλουχία. Η διαδικασία επαναλάµβανεται.

10 Ψηφίδες DNA: φωτολιθογραφία

11 Κατασκευή µικροκηλίδων ολιγονουκλεοτιδίων µε συστήµατα κατάνοµης µικροποσοτήτων υγρών Επαφή µε την επιφάνεια Μετακίνηση ακροφυσίου Επάναληψη Συστοιχία κηλίδων Κατανοµή σταγόνας Μετακίνηση ακροφυσίου Επάναληψη Συστοιχία κηλίδων

12 Κατασκευή µικροκηλίδων ολιγονουκλεοτιδίων

13 Ακινητοποίηση µορίων ανίχνευσης Οµοιοπολική σύνδεση ολιγονουκλεοτιδίων τροποποιηµένων στο ένα τους άκρο µε µια δραστική χηµική οµάδα όπως άµινο- καρβόξυ- ή θειολοµάδα τα οποία µπορεί να ακινητοποιηθούν σε στερεές επιφάνειες που φέρουν κατάλληλες δραστικές οµάδες όπως υποστρώµατα από γυαλί ή πυρίτιο στο οποίο έχει εναποτεθεί εποξυ-, αµινο- ή θειολο-σιλάνιο.

14 Ακινητοποίηση µορίων ανίχνευσης Χρήση βιοτινυλιωµένων µορίων ολιγονουκλεοτιδίων για ακινητοποίηση στο στερεό υπόστρωµα µέσω αβιδίνης ή στρεπταβιδίνης. Χρήση δεντριµερών για την ακινητοποίηση πολλαπλών µορίων ολιγονουκλεοτιδίων. Nucleic Acid Res. 31,, 68, 2003

15 Η αλυσωτή αντίδραση της πολυµεράσης Polymerase Chain Reaction (PCR) Η αλυσωτή αντίδραση της πολυµεράσης (PCR) επιτρέπει την ενίσχυση πολύ µικρών ποσοτήτων DNA. Η ανάπτυξη αυτής της τεχνικής οδήγησε σε µια έκρηξη νέων τεχνικών στην µοριακή βιολογία και χάρισε το βραβείο Nobel στον Kary Mullins το 1993 καθώς γινόταν όλο και πιο εµφανής η σπουδαιότητα της µεθόδου. Η τεχνική της PCR βασίζεται στην ανακάλυψη της DNA πολυµεράσης Taq, η οποία προέρχεται από το βακτήριο Thermus auquaticus που αναπτύσσεται κοντά σε θερµές πηγές. Αυτή η DNA πολυµεράση είναι σταθερή στις υψηλές θερµοκρασίες που απαιτούνται προκειµένου να πραγµατοποιηθεί η ενίσχυση του στόχου DNA, ενώ στις ίδιες συνθήκες οι υπόλοιπες πολυµεράσες απενεργοποιούνται.

16 Αλυσωτή αντίδραση της πολυµεράσης (PCR) icycler, BioRad Eppendorf cyclers Ouantica, Techne

17 Επισήµανση ολιγονουκλεοτιδίου στόχου Κύτταρα

18 Επισήµανση ολιγονουκλεοτιδίου στόχου Κύτταρα Αποµόνωση RNA

19 Επισήµανση ολιγονουκλεοτιδίου στόχου Κύτταρα mrna A A A A

20 Επισήµανση ολιγονουκλεοτιδίου στόχου Κύτταρα mrna Απαρχητής (dt) 24 AAAA TTTT

21 Επισήµανση ολιγονουκλεοτιδίου στόχου Κύτταρα mrna Αντίστροφη Μεταγραφή AAAA TTTT

22 Επισήµανση ολιγονουκλεοτιδίου στόχου Κύτταρα mrna cdna AAAA AAAA T T T T Πρώτη αλυσίδα

23 Επισήµανση ολιγονουκλεοτιδίου στόχου Κύτταρα mrna cdna AAAA AAAA T T T T Η RΝΑση κόβει την αλυσίδα RNA

24 Επισήµανση ολιγονουκλεοτιδίου στόχου Κύτταρα mrna T T T T cdna AAAA T T T T Η DNA πολυµεράση αναπαράγει την αλληλουχία από το σηµείο κοπής

25 Επισήµανση ολιγονουκλεοτιδίου στόχου Κύτταρα mrna cdna F F AAAA T T T T AAAA T T T T Η DNA πολυµεράση αναπαράγει την αλληλουχία από το σηµείο κοπής

26 Επισήµανση ολιγονουκλεοτιδίου στόχου Κύτταρα mrna cdna F F AAAA T T T T AAAA T T T T F Η DNA πολυµεράση αναπαράγει την αλληλουχία από το σηµείο κοπής

27 Επισήµανση ολιγονουκλεοτιδίου στόχου Κύτταρα mrna cdna F F F AAAA T T T T AAAA T T T T F Η DNA πολυµεράση αναπαράγει την αλληλουχία από το σηµείο κοπής

28 Επισήµανση ολιγονουκλεοτιδίου στόχου Κύτταρα mrna cdna F F F AAAA T T T T AAAA T T T T F εύτερη αλυσίδα

29 Υβριδισµός B B B B B Το επισηµασµένο ολιγονουκλεοτίδιο στόχος δεσµεύεται εκλεκτικά στο ακινητοποιηµένο συµπληρωµατικό ολιγονουκλεοτίδιο Οι συνθήκες υβριδισµού (θερµοκρασία και συγκέντρωση αλάτων) µπορεί να ποικίλουν ώστε να επιτευχθεί ειδικότητα για το συγκεκριµένο σύνολο ολιγονουκλεοτιδίων.

30 Ανταγωνιστικός Υβριδισµός Ασθενής Υγειής

31 Τρόποι ενίσχυσης σήµατος φθορισµού Clin. Chem. 2004; 50, 1955 Nucleic Acids Res., 2003; 31, 115

32 Ενζυµική ενίσχυση του σήµατος To σύστηµα ενίσχυσης µε βιοτινυλοτυραµίδιο 100-φορές µεγαλύτερη ευαισθησία σε σχέση µε τα απευθείας επισηµασµένα µε φθορίζουσες ουσίες ολιγονουκλεοτίδια. Το σύστηµα ενίσχυσης µε χρήση αδιάλυτου υποστρώµατος αλκαλικής φωσφατάσης 2000-φορές µεγαλύτερη ευαισθησία σε σχέση µε τα απευθείας επισηµασµένα µε φθορίζουσες ουσίες ολιγονουκλεοτίδια.

33 Ανίχνευση φθορισµού στις συστοιχίες µικροκηλίδων ολιγονουκλεοτιδίων Η ανίχνευση πραγµατοποιείται χρησιµοποιώντας ειδικούς σαρωτές φθορισµού (scanner). Προσδιορίζεται για κάθε κηλίδα η ένταση του φθορισµού σε δύο µήκη κύµατος και ο λόγος των δύο σηµάτων αντιπροσωπεύει την αναλογία έκφρασης του γονιδίου µεταξύ των δύο δειγµάτων. Ανάλυση Αξιολόγηση αποτελεσµάτων

34 Άλλοι τρόποι ανίχνευσης Χρωµατοµετρική ανίχνευση Ηλεκτροχηµική ανίχνευση NanoChip, Nanogen Science 289, , 2000

35 Περιορισµοί Η έκφραση του RNA µπορεί να µην σχετίζεται µε την ενεργότητα της πρωτεΐνης. Η έναρξη της αναπαραγωγής του cdna από το RNA µπορεί να γίνει σε άλλα σηµεία από το επιθυµητό σηµείο σύνδεσης του εκκινητή. Η ενσωµάτωση των επισηµασµένων ολιγονουκλεοτιδίων µπορεί να ποικίλει ανάλογα µε το µήκος και την σύσταση σε νουκλεοτίδια του ολιγονουκλεοτιδίου στόχου. Η ποσοτική σύγκριση των αποτελεσµάτων που λαµβάνονται από διαφορετικά δείγµατα προϋποθέτει ότι η ποσότητα RNA είναι ίδια σε αυτά τα δείγµατα. Η ποσοτικοποίηση του σήµατος εξαρτάται από το σχήµα της κηλίδας, την σκόνη, τον µη ειδικό υβριδισµό, κλπ. Το σήµα φθορισµού µπορεί να µην είναι οµοιόµορφο σε όλη την επιφάνεια του πλακιδίου. Η ποιότητα των ακινητοποιηµένων ανιχνευτών DNA µπορεί να επηρεάζεται κατά την ακινητοποίηση. Η πυκνότητα των ολιγονουκλεοτιδίων στην επιφάνεια (10 picomoles/mm 2 )µπορεί να έχει ως αποτέλεσµα στερεοχηµική παρεµπόδιση.

36 Παραδείγµατα εφαρµογών o o o o o o o Γενετική πλυθυσµού: µελέτη της ποικιλότητας των ειδών. Χαρτογράφηση πολυµορφισµών µονήρους νουκλεοτιδίου. Πρόγνωση και πρόληψη εκδήλωσης ασθενειών. Ταυτοποίηση νέων θεραπευτικών στόχων και αξιολόγηση νέων φαρµάκων. Έκφραση γονιδίων σε παθογόνους µικροοργανισµούς. Έκφραση ιϊκών γονιδίων κατά την διάρκεια µόλυνσης. Βελτίωση της αγροτικής και κτηνοτροφικής παραγωγής.

37 Σπουδαιότητα της ανίχνευσης µεταλλάξεων στα γονίδια BRCA1/BRCA2 BRCA2 Ο καρκίνος του µαστού είναι η πιο συχνή κακοήθεια στις γυναίκες (~ περιστατικά ανά χρόνο στην Ελλάδα) Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η έκτη κατά σειρά πιο συχνή κακοήθεια σε γυναίκες (~400 περιστατικά ανά χρόνο στην Ελλάδα) 88% των οικογενειών µε 4 περιστατικά καρκίνου του µαστού σε ηλικίες <60 χρονών σε συνδυασµό µε 1 περίπτωση καρκίνου των ωοθηκών σχετίζονται µε µεταλλάξεις στα γονίδια BRCA1 και BRCA2 100% των οικογενειών µε 4 περιστατικά καρκίνου του µαστού σε ηλικίες <60 χρονών σε συνδυασµό µε 2 περιπτώσεις καρκίνου των ωοθηκών σχετίζονται µε µεταλλάξεις στα γονίδια BRCA1 και BRCA2 Μεταλλάξεις ανιχνεύονται στο 63% των ασθενών. Στους υπόλοιπους η εκδήλωση της ασθένειας σχετίζεται πιθανώς µε ανακατανοµές στα γονίδια.

38 Κατανοµή των µεταλλάξεων στο BRCA1 στον ευρωπαϊκό χώρο Ειδικές για τη χώρα µεταλλάξεις 3452del4 3875del4 Cys61Gly 5382insC 185delAG 4446CtoT Άλλες 4184del4 Armakolas et al., Human Mutation 2002 Ladopoulou et al., Cancer Genetics Cytogenetics 2002

39 Προτεινόµενη µεθοδολογία Συστοιχία µικροκηλίδων που αντιστοιχούν σε αλληλουχίες ολιγονουκλεοτιδίων που φέρουν ή οχι την µετάλλαξη 1. Λήψη δείγµατος αίµατος από τον ασθενή 2. Καθαρισµός γενωµικού DNA 3. Ενίσχυση των εξονίων του BRCA1 µε PCR Υβριδισµός Φυσιολογικό Μεταλλαγµένο 6. Ανίχνευση Εκπλύσεις

40 Φωτολιθογραφική διαδικασία δηµιουργίας συστοιχιών µικροκηλίδων βιοµορίων Έκθεση µέσα από µάσκα Έκθεση µέσα από µάσκα Φωτοπολυµερικό Εκθεση Υπόστρωµα Ακινητοποίηση Εµφάνιση υλικό βιοµορίου Εµφάνιση όλης της 2ου επιφάνειας βιοµορίου

41 Φωτοπολυµερικό υλικό και µηχανισµός εµφάνισης - F Sb 6 + S S S S S SbF 6 - SbF6 hv >300 nm H + - SbF6 Φωτοευαισθητοποιητής: εξαφθοροαντιµονικό άλας τριαρυλοσουλφωνίου Εµφανιστής: υδροξείδιο τετραµεθυλοαµµωνίου CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 H + [ CH2 C ] [ CH2 C ] [ CH2 C ] [ CH2 C ] [ x y z H [ CH2 C ] [ CH2 w x C ] y CH2 C ] [ CH2 z CH ] w O O O O O O O OH O O O O O OH O OH OH OH + C (CH3)2 CH2 + + H

42 Εφαρµογή της φωτολιθογραφικής διαδικασίας για την κατασκευή συστοιχιών µικροκηλίδων πρωτεϊνών ηµιουργία συστοιχίας κηλίδων πρωτεϊνικών µορίων µε 12 διαδοχικές φωτολιθογραφικές διαδικασίες ηµιουργία κηλίδων βιοµορίων µε διάµετρο µικρότερη από 1 µm.

43 Μεθοδολογία «εκτύπωσης» βιοµορίων σε επίπεδα υποστρώµατα

44 Συστοιχίες µικροκηλίδων DNA για την ανίχνευση µεταλλάξεων στο γονίδιο BRCA I Μετάλλαξη 3099 del T Φυσιολογικό 5 -aaa act aaa tgt aag aaa aat-3 Μεταλλαγµένο 5 -aaa act aaa gta aga aaa atc ins C 5 -gca aga gaa tcc cag gac aga-3 5 -gca aga gaa tcc cca gga cag-3 R1751X 5 -ggt cca aag cga gca aga gaa-3 5 -ggt cca aag tga gca aga gaa del5 5 -aca aat aaa tta aag cgt aaa agg-3 5 -aca aat aaa gcg taa aag gag acc-3 G1738R 5 -gaa gtc aga gga gat gtg gtc-3 5 -gaa gtc aga aga gat gtg gtc-3

45 Κριτήρια ποιότητας µιας συστοιχίας µικροκηλίδων ολιγονουκλεοτιδίων Ακινητοποίηση ολιγονουκλεοτιδίων ανιχνευτών Οµοιογένεια Σταθερότητα Επαναληψιµότητα Πυκνότητα ακινητοποιηµένου ολιγονουκλεοτιδίου Υβριδισµός µε ολιγονουκλεοτίδια στόχους Εκλεκτικότητα Ευαισθησία υναµική περιοχή

46 Ακινητοποίηση ολιγονουκλεοτιδίων στην επιφάνεια ψηφίδων πυριτίου Βιοτινυλιωµένο ολιγονουκλεοτίδιο Στρεπταβιδίνη Πρωτεΐνη κάλυψης των κενών θέσεων του στερεού φορέα Φθορισµοεπισηµασµένο συµπληρωµατικό ολιγονουκλεοτίδιο

47 Βελτιστοποίηση ακινητοποίησης ολιγονουκλεοτιδίων ανιχνευτών Υπόστρωµα Υψηλή οµοιογένεια Χαµηλός αυτοφθορισµός Ολιγονουκλεοτίδιο ανίχνευσης Καθαρότητα Ευαισθησία Μήκος Χηµεία σύνδεσης Σταθερότητακατάταεπόµενα στάδια υβριδισµού και έκπλυσης (θερµοκρασίες 4 C έως 95 C, τιµές ph 1 έως 10, ιονική ισχύ σε NaCl από 0 έως 4 M). Ικανή συγκέντρωση στην επιφάνεια ώστε να έχουµε υψηλό σήµα χωρίς στερεοχηµική παρεµπόδιση

48 Βελτιστοποίηση ακινητοποίησης ολιγονουκλεοτιδίων ανιχνευτών Υπόστρωµα Υψηλή οµοιογένεια Χαµηλός αυτοφθορισµός Ολιγονουκλεοτίδιο ανίχνευσης Καθαρότητα Ευαισθησία Μήκος Χηµεία σύνδεσης Σταθερότητακατάταεπόµενα στάδια υβριδισµού και έκπλυσης (θερµοκρασίες 4 C έως 95 C, τιµές ph 1 έως 10, ιονική ισχύ σε NaCl από 0 έως 4 M). Ικανή συγκέντρωση στην επιφάνεια ώστε να έχουµε υψηλό σήµα χωρίς στερεοχηµική παρεµπόδιση

49 Βελτιστοποίηση του µήκους των ακινητοποιηµένων ολιγονουκλεοτιδίων Φθορισµός (α.µ.) A Φθορισµός (α.µ.) B Μήκος ακινητοπ οιηµένου ολιγονουκλεοτιδίου Μήκος ακινητοπ οιηµένου ολιγονουκλεοτιδίου Σήµα φθορισµού που λαµβάνεται για υβριδισµό µε την πλήρως συµπληρωµατική ( ) ή τη µη συµπληρωµατική αλληλουχία ( ). A) της φυσιολογικής αλληλουχίας, B) της µεταλλαγµένης αλληλουχίας.

50 Βελτιστοποίηση ακινητοποίησης ολιγονουκλεοτιδίων ανιχνευτών Υπόστρωµα Υψηλή οµοιογένεια Χαµηλός αυτοφθορισµός Ολιγονουκλεοτίδιο ανίχνευσης Καθαρότητα Ευαισθησία Μήκος Χηµεία σύνδεσης Σταθερότητακατάταεπόµενα στάδια υβριδισµού και έκπλυσης (θερµοκρασίες 4 C έως 95 C, τιµές ph 1 έως 10, ιονική ισχύ σε NaCl από 0 έως 4 M). Ικανή συγκέντρωση στην επιφάνεια ώστε να έχουµε υψηλό σήµα χωρίς στερεοχηµική παρεµπόδιση

51 Βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης των ολιγονουκλεοτιδίων για ακινητοποίηση και υβριδισµό Φθορισµός (α.µ.) Συγκέντρωση ολιγονουκλεοτιδίου (µm) Επίδραση της συγκέντρωσης του ακινητοποιηµένου ( ) και του υβριδιζόµενου ολιγονουκλεοτιδίου ( ) στην ένταση του σήµατος φθορισµού.

52 Βελτιστοποίηση υβριδισµού ολιγονουκλεοτιδίων στόχων Επαρκής ενσωµάτωση µορίων σηµατοδότησης (ιχνηθετών) κατά την PCR. Σύσταση του διαλύµατος υβριδισµού: ιονική ισχύς, αποδιατακτικοί παράγοντες, κλπ. Θερµοκρασία υβριδισµού T m θερµοκρασία στην οποία τα πλήρως συµπληρωµατικά ολιγονουκλεοτίδια βρίσκονται συµπλεγµένα κατά 50% T d θερµοκρασία σε µια συγκεκριµένη συγκέντρωση άλατος και ολιγονουκλεοτιδίων στην οποία το 50% ενός ολιγονουκλεοτιδίου είναι συµπλεγµένο µε το πλήρως συµπληρωµατικό του T d = 2 C(A+T) + 4 C(G+C) Η θερµοκρασία υβριδισµού και το µήκος του ακινητοποιηµένου ολιγονουκλεοτίδιου είναι καθοριστικοί παράγοντες της ειδικότητας του υβριδισµού. Εκπλύση µε διαλύµατα µειούµενης ιονικής ισχύος. Μείωση σήµατος φθορισµού Αύξηση ειδικότητας

53 Βελτιστοποίηση της θερµοκρασίας υβριδισµού Φθορισµός (α.µ.) Θερµοκρασία υβριδισµού Σήµα φθορισµού που λαµβάνεναι όταν η φυσιολογική αλληλουχία για την µεταλλάξη 3099delT ( ) ή την µετάλλαξη R1751X ( ) υβριδίζεται µε την πλήρως συµπληρωµατική αλληλουχία σε διαφορετικές θερµοκρασίες.

54 Κηλίδες ολιγονουκλεοτιδίων σε υπόστρωµα πυριτίου Φθορισµός (α.µ.) Συγκέντρωση ακινητοποιηµένου ολιγονουκλεοτιδίου (µm)

55 Κηλίδες ολιγονουκλεοτιδίων σε υπόστρωµα πυριτίου µετά τον υβριδισµό Φθορισµός (α.µ.) Συγκέντρωση ακινητοποιηµένου ολιγονουκλεοτιδίου (µm)

56 Εναλακτική µέθοδος ακινητοποίησης ολιγονουκλεοτιδίων σε ψηφίδες πυριτίου Σύζευγµα βιοτινυλιωµένου ολιγονουκλεοτίδιου µε στρεπταβιδίνη Φθορισµοεπισηµασµένο συµπληρωµατικό ολιγονουκλεοτίδιο

57 Σύγκριση των δύο µεθόδων ακινητοποίησης των ολιγονουκλεοτιδίων Μέσω ακινητοποιηµένης στρεπταβιδίνης a) Ανιχνευτής β) Υβριδισµός Ακινητοποίηση συµπλέγµατος α) Ανιχνευτής β) Υβριδισµός

58 Συµπεράσµατα Οι συστοιχίες µικροκηλίδων ολιγονουκλεοτιδίων παρέχουν ένα σηµαντικό εργαλείο για την ταυτόχρονη ανίχνευση πολλαπλών µεταλλάξεων σε γονίδια. Πλεονεκτούν έναντι των κλασσικών µεθόδων ανάλυσης του DNA ως προς την ταχύτητα, την απλότητα και το κόστος της ανάλυσης. Απαιτείται προσεκτική ρύθµιση των σύνθηκών ακινητοποίησης των ολιγονουκλεοτιδίων ανιχνευτών καθώς και των συνθηκών υβριδισµού και έκπλυσης ώστε να επιτευχθεί επαρκές σήµα φθορισµού και υψηλή ειδικότητα. Είναι ιδανικές για µελέτες σε επίπεδο πλυθησµού, για πρόγνωση ασθενειών, ανακάλυψη νέων πολυµορφισµών που µπορεί να σχετίζονται µε έναν συγκεκριµένο γονότυπο.