Reaction Buffer Concentrate (10X)

Transcript

1 Reaction Buffer Concentrate (10X) Αρ. καταλόγου ΕΝΔΕΙΞΕΙΣ ΚΑΙ ΧΡΗΣΗ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Αντιδραστήρια που Παρέχονται 1 - Φιάλη 2 L με Reaction Buffer Concentrate (10X), περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα με βάση το τρις και συντηρητικό Ανασύσταση, Ανάμιξη, Αραίωση, Τιτλοδότηση Το Reaction Buffer Concentrate (10X) πρέπει να αραιωθεί με εννέα μέρη αποσταγμένου ή απιονισμένου νερού πριν χρησιμοποιηθεί σε automated slide stainer. Βλ. ενότητα Οδηγίες Χρήσης. Υλικά και Αντιδραστήρια που Απαιτούνται αλλά δεν Παρέχονται Τα παρακάτω αντιδραστήρια και υλικά απαιτούνται, αλλά δεν παρέχονται με το κιτ αυτό: 1. Ventana Negative Control Reagent ή Rabbit Negative Control* 2. Ventana Control Probes* 3. Αντικειμενοφόροι πλάκες, θετικά φορτισμένες 4. Θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες (ιστοί) 5. Κλίβανος ξήρανσης με ικανότητα διατήρησης της θερμοκρασίας στους 70 C ± 5 C 6. Ετικέτες γραμμικού κώδικα (κατάλληλες για αρνητικό μάρτυρα και για το πρωτοταγές αντίσωμα ή τον ιχνηθέτη που εξετάζεται) 7. Ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα φορμόλης 10% 8. Δοχεία ή λουτρά χρώσης 9. Χρονόμετρο 10. Ξυλόλη 11. Αιθανόλη ή αλκοόλη 12. Απιονισμένο ή αποσταγμένο νερό 13. BenchMark ή BenchMark XT automated slide stainers 14. Ventana ISH iview Blue Detection Kit* 15. Ventana ISH Signal Clarifier* 16. Probe* 17. Ventana ISH Protease 1, 2 ή 3* 18. Ventana ISH Red Counterstain* 19. Ventana iview TM DAB (προτιμάται), AEC, V Red (ALK PHOS) ή Enhanced V Red detection kits* 20. Ventana Endogenous Biotin Blocking Kit* 21. Primary antibody* 22. Διάλυμα Ventana EZ Prep 23. Ventana LCS, διάλυμα καλυπτρίδας 24. Ventana Cell Conditioning 1 (CC1) ή Cell Conditioning 2 (CC2)* 25. Ventana Protease I, II ή III* 26. Ventana Hematoxylin counterstain* 27. Ventana Bluing Reagent* 28. Επικαλυπτικό μέσο 29. Καλυπτρίδες 30. Κοινό μικροσκόπιο (20-80X) 31. μπιτόνι 20 λίτρων * Όπως χρειάζεται για ειδικές εφαρμογές. Προοριζόμενη Χρήση Το αντιδραστήριο αυτό προορίζεται για in vitro διαγνωστική χρήση (IVD). Το Reaction Buffer Concentrate (10X) του οίκου Ventana Medical Systems' (Ventana) είναι ένα ρυθμιστικό διάλυμα που βασίζεται σε Tris (ph 7,6 ± 0,2) και χρησιμοποιείται για την έκπλυση αντικειμενοφόρων μεταξύ των βημάτων της χρώσης παρέχοντας ένα σταθερό υδατικό περιβάλλον για τις αντιδράσεις ανοσοϊστοχημείας (IHC) ή in situ υβριδισμού (ISH) που πραγματοποιούνται στα αυτόματα συστήματα χρώσης BenchMark και BenchMark XT. Περίληψη και επεξήγηση Το Reaction Buffer Concentrate (10X) είναι ένα ρυθμιστικό διάλυμα με βάση το tris το οποίο πρέπει να αραιωθεί πριν από τη χρήση. Αφού αραιωθεί, το διάλυμα Reaction Buffer (1X) διοχετεύεται στη φιάλη του οργάνου Reaction Buffer και τοποθετείται στην κατάλληλη θέση στην αυτοματοποιημένη υπομονάδα ρευστών του automated slide stainer. Το όργανο εφαρμόζει το διάλυμα Reaction Buffer (1X) αυτόματα όπως απαιτείται από τη διαδικασία που ακολουθείται. Για περισσότερες πληροφορίες, ανατρέξτε στις Οδηγίες Χρήσης του αυτοματοποιημένου συστήματος χρώσης. Αρχές λειτουργίας και διαδικασίες Το Reaction Buffer του οίκου Ventana χρησιμοποιείται ως βασικό στοιχείο για τη διατήρηση ενός κατάλληλου υδατικού περιβάλλοντος για την πραγματοποίηση πολλών αντιδράσεων κατά τη διάρκεια IHC και ISH, όπως είναι η γενική πλύση, η επώαση αντισωμάτων, ενζύμων και άλλων επικουρικών, όταν χρησιμοποιούνται στον automated slide stainer. Φύλαξη και Χειρισμός Γενικά, η χρώση του in situ υβριδισμού (ISH) επιτρέπει την εποπτική παρουσίαση των αλληλουχιών-στόχων DNA ή RNA με διαδοχική σύνδεση ενός σημασμένου ιχνηθέτη DNA ή RNA με το στόχο, ενός πρωτοταγούς αντισώματος έναντι του σημασμένου ιχνηθέτη και ενός δευτεροταγούς αντισώματος στο πρωτοταγές αντίσωμα, ενός ενζυμικού συμπλόκου και ενός χρωμογόνου υποστρώματος με παρεμβαλλόμενα βήματα έκπλυσης. Η ενζυμική ενεργοποίηση του χρωμογόνου έχει ως αποτέλεσμα ένα ορατό προϊόν αντίδρασης στον τόπο στόχο. Η αντίδραση IHC περιλαμβάνει ένα ειδικό αντίσωμα που εντοπίζεται από έναν τύπο δευτεροταγούς αντισώματος συζευγμένο σε βιοτίνη, που αναγνωρίζει τις ανοσοσφαιρίνες του κουνελιού και του ποντικού. Το βήμα αυτό ακολουθείται από την προσθήκη συζεύγματος ενζύμου στρεπταβιδίνης/αβιδίνης, το οποίο δεσμεύεται με τη βιοτίνη που υπάρχει στο δευτεροταγές αντίσωμα. Κατόπιν το σύμπλοκο του ειδικού αντισώματος, του Συλλογή Δειγμάτων και Προετοιμασία προς Ανάλυση δευτεροταγούς αντισώματος και του ενζύμου στρεπταβιδίνης παρουσιάζεται εποπτικά με κατακρήμνιση του προϊόντος του ενζύμου. Σε κάθε βήμα προβλέπεται επώαση για συγκεκριμένο χρόνο και σε συγκεκριμένη θερμοκρασία. Στο τέλος κάθε φάσης επώασης, ο automated slide stainer του οίκου Ventana ξεπλένει τις τομές με Reaction Buffer, έτσι ώστε να διακοπεί η αντίδραση και να απομακρυνθεί το αδέσμευτο υλικό που θα μπορούσε να δυσχεράνει την επιθυμητή αντίδραση κατά τα επόμενα βήματα. Αποθηκεύστε το συμπυκνωμένο αντιδραστήριο σε θερμοκρασία δωματίου (15 ως 30 C) αποφεύγοντας την απευθείας έκθεση σε ηλιακή ακτινοβολία. Το αραιωμένο αντιδραστήριο (1X) μπορεί να αποθηκευτεί σε θερμοκρασία δωματίου (15 C έως 30 C) μακριά από ηλιακό φως μέχρι τη χρήση του στο όργανο. Ο χρήστης πρέπει να εξακριβώνει αν υπάρχουν άλλες συνθήκες αποθήκευσης διαφορετικές από εκείνες που προβλέπονται από τις Οδηγίες Χρήσης. Το αντιδραστήριο αυτό έχει ημερομηνία λήξεως. Εφόσον αποθηκεύεται σύμφωνα με τις προβλεπόμενες οδηγίες φύλαξης, το αντιδραστήριο παραμένει αναλλοίωτο μέχρι την ημερομηνία που αναγράφεται στην ετικέτα. Μην χρησιμοποιείτε το αντιδραστήριο πέραν της ημερομηνίας λήξης, για την ενδεικνυόμενη μέθοδο φύλαξης. Οι ιστοί που έχουν μονιμοποιηθεί σε φορμαλίνη και έχουν εγκλεισθεί σε παραφίνη, είναι κατάλληλοι για χρήση με αυτό το αντιδραστήριο, μετά τη συνήθη επεξεργασία και εφόσον χρησιμοποιούνται μαζί με τα detection Kits και ένα automated slide stainer του οίκου Ventana (βλ. ενότητα Υλικά και αντιδραστήρια που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται). Το συνιστώμενο μονιμοποιητικό ιστών είναι ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης 10 %. Ποικίλα αποτελέσματα ενδέχεται να προκύψουν, ως αποτέλεσμα μακροχρόνιας μονιμοποίησης ή μετά από ειδικές διαδικασίες, όπως η αφαλάτωση παρασκευασμάτων μυελού των οστών. Η κάθε τομή πρέπει να κόβεται στο κατάλληλο πάχος και να τοποθετείται σε αντικειμενοφόρο πλάκα που είναι θετικά φορτισμένη. Οι αντικειμενοφόροι πλάκες που φέρουν τομές ιστών μπορούν να θερμαίνονται επί τουλάχιστον 2 ώρες (αλλά όχι περισσότερο από 24 ώρες) σε κλίβανο με θερμοκρασία 70 C ± 5 C. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ 1. Λάβετε τις δέουσες προφυλάξεις όταν χειρίζεστε αντιδραστήρια. Χρησιμοποιείτε γάντια μιας χρήσης όταν χειρίζεστε ενδεχομένως καρκινογόνα ή τοξικά υλικά. 2. Αποφύγετε επαφή των αντιδραστηρίων με τα μάτια και τις βλεννογόνους μεμβράνες. Αν τα αντιδραστήρια έλθουν σε επαφή με ευαίσθητες περιοχές, ξεπλύνετε με άφθονο νερό. 3. Μην καπνίζετε, τρώτε ή πίνετε στους χώρους όπου χειρίζεστε δείγματα ή αντιδραστήρια. 4. Τα δείγματα που προέρχονται από ασθενείς, καθώς και όλα τα υλικά που έρχονται σε επαφή με ασθενείς, πρέπει να αντιμετωπίζονται ως υλικά βιολογικώς επικίνδυνα και να απορρίπτονται με τις ενδεδειγμένες προφυλάξεις. Κατά την αναρρόφηση των υγρών με πιπέττα, μην χρησιμοποιείτε το στόμα σας Σελίδα 1 από EL Rev C

2 5. Αποφύγετε τη μικροβιακή μόλυνση των αντιδραστηρίων, καθώς τούτο μπορούσε να επιφέρει εσφαλμένα αποτελέσματα. 6. Αυτό το αντιδραστήριο έχει διαμορφωθεί καταλλήλως για αραίωση 1:10. Περαιτέρω αραίωση ενδέχεται να προκαλέσει κακή λειτουργία του οργάνου και απώλεια χρώσης του αντιγόνου. Κάθε τέτοια μεταβολή πρέπει να επικυρώνεται από το χρήστη. 7. Όταν χρησιμοποιείται σύμφωνα με τις οδηγίες, το προϊόν αυτό δεν θεωρείται επιβλαβές. Το αντιδραστήριο περιέχει ProClin 300 ως συντηρητικό. Συμπτώματα υπερβολικής έκθεσης σε αυτό περιλαμβάνουν ερεθισμό του δέρματος και των ματιών και ερεθισμό των βλεννογόνων μεμβρανών και των άνω αναπνευστικών οδών. Η συγκέντρωση του ProClin 300 στο προϊόν αυτό είναι 0,05 % και δεν ικανοποιεί τα κριτήρια του OSHA για επικίνδυνες ουσίες. Συστημικές αλλεργικές αντιδράσεις είναι πιθανές σε ευαίσθητα άτομα. 8. Συμβουλευτείτε τις τοπικές ή κρατικές αρχές σχετικά με την συνιστώμενη μέθοδο απόρριψης. 2. Τοποθετήστε τον ιχνηθέτη ή το αντίσωμα, το κατάλληλο κιτ ανίχνευσης και τα απαιτούμενα συνοδευτικά αντιδραστήρια στο δίσκο αντιδραστηρίων και τοποθετήστε τον στον automated slide stainer. Ελέγξτε τα ειδικά διαλύματα (bulk fluids) και τα απόβλητα. 3. Τοποθετήστε τις αντικειμενοφόρους πάνω στο automated slide stainer. 4. Ξεκινήστε τη διαδικασία χρώσης. 5. Με την ολοκλήρωση της διαδικασίας, αφαιρέστε τις αντικειμενοφόρους πλακες από το automated slide stainer. 6. Για τα χρωμογόνα iview DAB και Ventana Red κιτ, ξεπλύνετε σε ένα διάλυμα ήπιου απορρυπαντικού πιάτων ή αλκοόλη για να απομακρύνετε το διάλυμα καλυπτρίδας, αφυδατώστε, διαυγάστε και καλύψτε με κοινό επικαλυπτικό μέσο και τέλος, με την καλυπτρίδα, κατά τον συνήθη τρόπο. 7. Για το χρωμογόνο AEC, μην αφυδατώσετε και μη διαυγάσετε. Καλύψτε το AEC με επικαλυπτικό μέσο υδατικής βάσης. Οι χρωματισμένες αντικειμενοφόροι πλάκες πρέπει να εξετασθούν μέσα σε δύο έως τρεις ημέρες από τη χρώση, παραμένουν δε αναλλοίωτες για τουλάχιστον δύο χρόνια, εφόσον αποθηκευθούν σε θερμοκρασία δωματίου (20 έως 28 C). 8. Για το ISH iview Blue detection kit, ξεπλύνετε σε ένα ήπιο απορρυπαντικό πιάτων ή αλκοόλη για να απομακρύνετε το διάλυμα καλυπτρίδας. 9. Μεταφέρετε τις αντικειμενοφόρους πλάκες σε δοχείο αποσταγμένου νερού για περίπου 1 ως 3 λεπτά. Αποτινάξτε την περίσσεια νερού. 10. Επιθεωρήστε το επίπεδο αυτού και όλων των επόμενων δοχείων. Βεβαιωθείτε πως τα διαλύματα θα καλύψουν πλήρως τις αντικειμενοφόρους πλάκες στο στατώ. Προσθέστε νέο αντιδραστήριο σε κάθε δοχείο σε επαρκή ποσότητα για να καλύπτει τις αντικειμενοφόρους πλάκες ανά πάσα στιγμή. Βεβαιωθείτε πως απομακρύνατε την περίσσεια υγρού μετά από κάθε βήμα. 11. Μεταφέρετε τις αντικειμενοφόρους πλάκες σε αιθανόλη 90 % για 1 ως 3 λεπτά περίπου. 12. Μεταφέρετε τις αντικειμενοφόρους πλάκες σε αιθανόλη 100 % για 1 ως 3 λεπτά περίπου. 13. Μεταφέρετε τις αντικειμενοφόρους πλάκες σε ένα δεύτερο δοχείο αιθανόλης 100 % για 1 ως 3 λεπτά περίπου. 14. Μεταφέρετε τις αντικειμενοφόρους πλάκες στο πρώτο δοχείο ξυλόλης για 1 ως 3 λεπτά περίπου. 15. Μεταφέρετε τις αντικειμενοφόρους πλάκες σε ένα δεύτερο δοχείο ξυλόλης για περίπου 1 ως 3 λεπτά. Οι αντικειμενοφόροι πλάκες μπορούν να παραμείνουν σε αυτό το δοχείο ξυλόλης μέχρι να καλυφθούν με καλυπτρίδα. 16. Επιστρέψτε όλα τα καλύμματα στα σκεύη και απενεργοποιήστε τον απαγωγό ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ Ανατρέξτε στις Οδηγίες Χρήσης του automated slide stainer για πιο λεπτομερείς πληροφορίες. Για να παρασκευάσετε το αραιωμένο διάλυμα από τη φιάλη 2 λίτρων του Reaction Buffer Concentrate (10Χ): 1. Βεβαιωθείτε ότι η κάνουλα του ογκομετρικού δοχείου 20 λίτρων (παρέχεται με το automated slide stainer) είναι στη θέση OFF πριν το γέμισμα. 2. Γεμίστε το άδειο δοχείο 20 λίτρων περίπου στο 75% με απιονισμένο ή αποσταγμένο νερό. 3. Χύστε το περιεχόμενο της φιάλης 2 λίτρων Reaction Buffer Concentrate (10X) μέσα στο νερό του δοχείου. Περιδινείστε για να αναμίξετε. 4. Γεμίστε το δοχείο μέχρι τη γραμμή πλήρωσης των 20 λίτρων με απιονισμένο ή αποσταγμένο νερό. Ενώ προσθέτετε νερό, περιδινείστε το διάλυμα για να βεβαιωθείτε ότι το συμπύκνωμα αναμιγνύεται πλήρως. Αν παραχθούν μεγάλες ποσότητες φυσαλίδων κατά τη διαδικασία γεμίσματος, αφήστε το διάλυμα έκπλυσης να ηρεμήσει. Αφού ηρεμίσουν οι φυσαλίδες, προσθέστε τον υπόλοιπο όγκο νερού που απαιτείται για την παρασκευή 20 λίτρων διαλύματος έκπλυσης. 5. Βιδώστε χαλαρά το καπάκι στο δοχείο. Αν το καπάκι είναι πολύ σφιχτό, το διάλυμα δεν διοχετεύεται σωστά από την κάνουλα. Το διάλυμα πλύσης είναι τώρα έτοιμο για χρήση με το Ventana automated slide stainer. Το αραιωμένο διάλυμα Reaction Buffer (1X) προστίθεται στην κατάλληλη θέση (φιάλη Reaction Buffer)της αυτοματοποιημένης υπομονάδας ρευστών στο automated slide Διαδικασίες ελέγχου ποιότητας stainer του οίκου Ventana. Το διάλυμα Reaction Buffer (1X) εφαρμόζεται αυτόματα, σύμφωνα με τις απαιτήσεις της διαδικασίας στον automated slide stainer του οίκου Έλεγχος θετικού μάρτυρα (Ιστός) Ventana που εκτελείται για την έκπλυση των αντικειμενοφόρων ανάμεσα στα βήματα της Σε κάθε κύκλο χρώσεων πρέπει να χρησιμοποιείται και ένας θετικός μάρτυρας (ιστός). χρώσης και παρέχει ένα σταθερό υδατικό περιβάλλον επί της αντικειμενοφόρου. Τα συστατικά του ιστού με θετική χρώση επιβεβαιώνουν την εφαρμογή των Πριν από την αρχική χρήση του διαλύματος Reaction Buffer (1X) στο εργαστήριο του αντιδραστηρίων και την ορθή λειτουργία του συστήματος. Ο ιστός αυτός μπορεί να χρήστη, πρέπει να επιβεβαιωθεί η κατάλληλη χρώση υποβάλλοντας σε χρώση έναν περιέχει κύτταρα και συστατικά στοιχεία, τόσο θετικής όσο και αρνητικής χρώσης, τα αριθμό θετικών και αρνητικών μαρτύρων. Ο οίκος Ventana συνιστά την τοποθέτηση των οποία λειτουργούν ως θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες. Οι πρότυποι ιστοί ελέγχου πρέπει θετικών μαρτύρων στην ίδια αντικειμενοφόρο πλάκα με το δείγμα ιστού του ασθενούς. να είναι δείγματα χειρουργικά ή να προέρχονται από πρόσφατη νεκροψία, βιοψία, και να Ποικίλα αποτελέσματα ενδέχεται να προκύψουν εξαιτίας της μονιμοποίησης του ιστού. Η έχουν παρασκευασθεί και μονιμοποιηθεί άμεσα, κατά τρόπο πανομοιότυπο με τις προς κλινική ερμηνεία οποιασδήποτε χρώσης ή της απουσίας χρώσης πρέπει να εξέταση τομές ιστών. Αυτοί οι ιστοί πρέπει να υποβάλλονται σε όλα τα βήματα της συμπληρώνεται από μορφολογικές μελέτες και αξιολόγηση με κατάλληλα πρότυπα εξέτασης, από την προετοιμασία των ιστών έως την χρώση τους. Η χρήση τομής ιστού ελέγχου. Η αξιολόγηση πρέπει να πραγματοποιείται από πεπειραμένο που έχει υποστεί επεξεργασία με διαφορετικό τρόπο από αυτόν του προς εξέταση παθολογοανατόμο, λαμβάνοντας υπόψη το κλινικό ιστορικό του ασθενούς και τις λοιπές δείγματος, επιτρέπει τον έλεγχο όλων των αντιδραστηρίων και των βημάτων της μεθόδου, διαγνωστικές εξετάσεις. πλην αυτών της μονιμοποίησης και επεξεργασίας του ιστού. Διαδικασία Βήμα-προς-Βήμα Η χρήση ιστού με ασθενή θετική χρώση παρέχει τον βέλτιστο έλεγχο της ποιότητας και Τα αντιδραστήρια του οίκου Ventana έχουν σχεδιασθεί για χρήση με το Ventana ενδείκνυται για την ανίχνευση ελασσόνων αλλοιώσεων των αντιδραστηρίων. automated slide staining system σε συνδυασμό με τα detection Kits του οίκου Ventana Η χρήση γνωστών θετικών μαρτύρων ενδείκνυται μόνο για την απεικόνιση της σωστής και τα παρελκόμενά τους. Συνιστώμενα πρωτόκολλα χρώσης για τους automated slide απόδοσης των επεξεργασμένων ιστοτεμαχίων και των αντιδραστηρίων εξέτασης και όχι stainers περιγράφονται στο ένθετο συσκευασίας του πρωτοταγούς αντισώματος ή επικουρικά, για τον καθορισμό συγκεκριμένης διάγνωσης σε δείγματα ασθενών. Αν οι ιχνηθέτη που σας ενδιαφέρει. Οι παράμετροι για τις αυτοματοποιημένες διαδικασίες θετικοί μάρτυρες δεν εμφανίσουν θετική χρώση, τα αποτελέσματα της εξέτασης των μπορούν να απεικονιστούν, να εκτυπωθούν και να διαμορφωθούν σύμφωνα με τη δειγμάτων πρέπει να θεωρούνται άκυρα. διαδικασία στις Οδηγίες Χρήσης. Οι άλλες παράμετροι λειτουργίας για τους automated Αρνητικός Μάρτυρας (Ιστός) slide stainers, έχουν ρυθμιστεί εργοστασιακά. Για περισσότερες λεπτομέρειες και επιπλέον επιλογές πρωτοκόλλου ανατρέξτε στο Εγχειρίδιο χρήσης για το σύστημα Ως αρνητικός μάρτυρας μπορεί να χρησιμοποιηθεί ο ιστός που χρησιμοποιήθηκε ως χρώσης. θετικός μάρτυρας. Η ποικιλία των κυτταρικών τύπων, που παρουσιάζουν οι τομές των ιστών προσφέρει εσωτερικά σημεία που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως αρνητικοί BenchMark ή BenchMark XT Automated Slide Stainer μάρτυρες, κάτι όμως που, πρέπει να εξακριβώνεται από τον χρήστη. Τα συστατικά στα 1. Σημάνετε την αντικειμενοφόρο πλάκα με την ετικέτα γραμμικού κώδικα που οποία δεν παρουσιάζεται χρώση, δεν πρέπει να εμφανίζουν ειδική χρώση, και έτσι αντιστοιχεί στο πρωτόκολλο αντισώματος ή ιχνηθέτη που πρόκειται να αποτελούν ένδειξη ειδικής χρώσης στο υπόβαθρο (φόντο) Αν παρατηρηθεί ειδική χρώση εφαρμοσθεί. στα σημεία αυτά, που χρησιμοποιούνται ως αρνητικοί μάρτυρες, τα αποτελέσματα των δειγμάτων των ασθενών πρέπει να θεωρηθούν άκυρα Σελίδα 2 από EL Rev C

3 Ανεξήγητες Ασυμφωνίες Ανεξήγητες ασυμφωνίες στους μάρτυρες πρέπει να γνωστοποιούνται αμέσως στον τοπικό αντιπρόσωπο του οίκου Ventana. Αν τα αποτελέσματα του ελέγχου ποιότητας δεν ανταποκρίνονται στις προδιαγραφές, τα αποτελέσματα για τους ασθενείς είναι άκυρα. Βλ. ενότητα Αντιμετώπιση Προβλημάτων, στο παρόν ένθετο. Εντοπίστε και διορθώστε το πρόβλημα και ακολούθως επαναλάβετε την εξέταση των δειγμάτων των ασθενών. Αρνητικός Μάρτυρας (Αντιδραστήριο) Για την ανοσοϊστοχημεία, μαζί με κάθε δείγμα πρέπει να χρησιμοποιείται και ένας αρνητικός μάρτυρας (αντιδραστήριο), για την διευκόλυνση της ερμηνείας των Ο αρνητικός μάρτυρας (αντιδραστήριο) χρησιμοποιείται στην θέση του πρωτοταγούς αντισώματος, για την αξιολόγηση της μη-ειδικής χρώσης. Η χρώση της αντικειμενοφόρου πλάκας πρέπει να γίνεται με το Negative Control Reagent (ποντικού) ή με το Rabbit Negative Control, κατά περίπτωση. Σε περίπτωση χρήσης διαφορετικού αντιδραστηρίου στη θέση αρνητικού μάρτυρα, αυτό πρέπει να αραιωθεί με το Antibody Diluent του οίκου Ventana στην ίδια συγκέντρωση που έχει το πρωτοταγές αντίσωμα/αντιορός. Το ίδιο το αραιωτικό μπορεί να χρησιμοποιηθεί από μόνο του ως αρνητικός μάρτυρας. Ο χρόνος επώασης του αρνητικού μάρτυρα (αντιδραστήριο) πρέπει να ισούται με τον χρόνο επώασης του πρωτοταγούς αντισώματος. Όταν χρησιμοποιείται σειρά (panel) διαφόρων αντισωμάτων σε διαδοχικές τομές, ο αρνητικός μάρτυρας (αντιδραστήριο) σε μία αντικειμενοφόρο πλάκα μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως αρνητικός μάρτυρας ή μάρτυρας μη ειδικής χρώσης υποβάθρου (φόντου) για άλλα αντισώματα. Για in situ υβριδισμό πρέπει να χρησιμοποιηθεί αρνητικός μάρτυρας. Ο οίκος Ventana σας συνιστά να ακολουθήσετε τις συστάσεις ποιοτικού ελέγχου του College of American Pathologists Laboratory Accreditation Program, Anatomic Pathology Checklist. Επιβεβαίωση Δοκιμασίας Πριν την αρχική χρήση αντισώματος στη διαγνωστική διαδικασία, η ειδικότητα του συστήματος πρέπει να επιβεβαιωθεί με δοκιμές σε σειρές δειγμάτων με γνωστά χαρακτηριστικά απόδοσης χρώσης που αντιπροσωπεύουν γνωστά θετικές κι αρνητικά δείγματα (ανατρέξτε στις Διαδικασίες ελέγχου ποιότητας, που περιέχονται συνοπτικά παραπάνω στην παρούσα ενότητα και στις Συστάσεις ποιοτικού ελέγχου του College of American Pathologists Laboratory Accreditation Program, Anatomic Pathology Checklist και στο NCCLS Approved Guideline). Αυτές οι διαδικασίες ελέγχου ποιότητας πρέπει να επαναλαμβάνονται για κάθε καινούργια παρτίδα πρωτοταγούς αντισώματος ή ιχνηθέτη ή οποτεδήποτε υπάρχει μεταβολή στις παραμέτρους της δοκιμασίας. Ερμηνεία των αποτελεσμάτων Οι διαδικασίες αυτοματοποιημένης χρώσης του οίκου Ventana προκαλούν έγχρωμα προϊόντα αντίδρασης. Ανατρέξτε στο ένθετο της συσκευασίας του κατάλληλου detection kit για αναμενόμενες χρωματικές αντιδράσεις. Έμπειρος παθολογοανατόμος πρέπει να αξιολογήσει τους θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες πριν την ερμηνεία των Έλεγχος θετικού μάρτυρα (Ιστός) Για την επιβεβαίωση της ορθής λειτουργίας των αντιδραστηρίων, πρέπει κατ' αρχήν να εξετάζεται ο θετικός μάρτυρας (Ιστός), που έχει υποβληθεί στην διαδικασία χρώσεως. Η παρουσία μέσα στα κύτταρα-στόχους ενός προϊόντος αντίδρασης που έχει χρωματισθεί κατά τα αναμενόμενα, αποτελεί ένδειξη θετικής δραστικότητας. Ανατρέξτε στο ένθετο συσκευασίας του χρησιμοποιούμενου detection kit για αναμενόμενες χρωματικές αντιδράσεις. Η ένταση της αντίχρωσης εξαρτάται από το χρόνο επώασης που επιλέχθηκε. Για αντίχρωση ανοσοϊστοχημείας, η διάρκεια της επώασης και η αποτελεσματικότητα της αιματοξυλίνης που χρησιμοποιούνται δίνουν κυτταρικούς πυρήνες με χρώμα που κυμαίνεται από ανοιχτό έως σκούρο μπλε. Για αντίχρωση in situ υβριδισμού η διάρκεια της επώασης και η αποτελεσματικότητα της ISH Red που χρησιμοποιείται οδηγούν σε διακύμανση από ανοιχτό έως σκούρο ροζ χρωματισμό των κυτταρικών πυρήνων. Υπερβολική ή ατελής αντίχρωση ενδέχεται να υποβαθμίσει την ορθή ερμηνεία των Αν ο θετικός μάρτυρας (ιστός) δεν εμφανίσει θετική χρώση, όλα τα αποτελέσματα της εξέτασης των δειγμάτων πρέπει να θεωρούνται άκυρα. Αρνητικός Μάρτυρας (Ιστός) Ο αρνητικός μάρτυρας πρέπει να εξετάζεται μετά το θετικό μάρτυρα για να επαληθεύει την ειδικότητα της αντίδρασης. Δεν πρέπει να υπάρχει ειδική χρώση στον αρνητικό μάρτυρα. Αν υπάρξει χρώση, μπορεί να αποτελεί ένδειξη μη ειδικής διασταυρούμενης αντίδρασης με κύτταρα ή κυτταρικά συστατικά. Για την ερμηνεία των αποτελεσμάτων της χρώσης πρέπει να χρησιμοποιούνται τα άθικτα κύτταρα αφού τα νεκρωτικά ή αλλοιωμένα κύτταρα συχνά υπόκεινται σε μη ειδική χρώση. Ιστός Ασθενούς Τα δείγματα των ασθενών πρέπει να εξετάζονται τελευταία. Η ένταση θετικής χρώσης πρέπει να αξιολογείται, λαμβάνοντας υπόψη τυχόν χρώση υποβάθρου του αρνητικού μάρτυρα (αντιδραστηρίου). Για ανοσοϊστοχημικές εξετάσεις, τυχόν αρνητικό αποτέλεσμα σημαίνει ότι το εν λόγω αντιγόνο απλώς δεν ανιχνεύθηκε, και όχι ότι το αντιγόνο απουσιάζει από τα κύτταρα ή τους ιστούς που εξετάσθηκαν. Εφόσον είναι απαραίτητο, χρησιμοποιήστε σειρά (panel) αντισωμάτων, επικουρικά για τον εντοπισμό των ψευδώς αρνητικών αντιδράσεων (βλ. Ενότητα Περίληψη Αναμενόμενων Αποτελεσμάτων). Για ελέγχους in situ υβριδισμού, ένα αρνητικό αποτέλεσμα σημαίνει πως η αλληλουχία στόχος του RNA ή DNAείτε δεν ανιχνεύθηκε, είτε ο αριθμός αντιγράφων ήταν κάτω από το επίπεδο ευαισθησίας του κιτ, όχι πως η αλληλουχία απουσιάζει από τα κύτταρα που εξετάστηκαν. Κατά την ερμηνεία οποιουδήποτε αποτελέσματος, πρέπει να εξετάζεται και η μορφολογία κάθε δείγματος, με χρήση τομής χρωματισμένης με αιματοξυλίνη και εωσίνη. Τα μορφολογικά ευρήματα του ασθενούς και οποιαδήποτε συναφή κλινικά δεδομένα πρέπει να ερμηνεύονται από έμπειρο παθολογοανατόμο. ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ Γενικοί περιορισμοί 1. Το προϊόν αυτό προορίζεται για in vitro διαγνωστική χρήση. 2. Η ανοσοϊστοχημεία και η εξέταση in situ υβριδισμού είναι διαγνωστικές διαδικασίες πολλαπλών βημάτων που απαιτούν εξειδίκευση στην επιλογή των καταλλήλων αντιδραστηρίων και δειγμάτων, στην μονιμοποίηση, επεξεργασία, προετοιμασία της αντικεμενοφόρου πλάκας, καθώς και στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων χρώσης. 3. Για την ανοσοϊστοχημική εξέταση, ενδέχεται να παρουσιαστούν ψευδώς θετικά αποτελέσματα λόγω μη ανοσολογικής σύνδεσης των πρωτεϊνών ή λόγω εμφάνισης αντιδρώντων προϊόντων υποστρώματος (χρωμογόνου). Ψευδώς θετικά αποτελέσματα ενδέχεται επίσης να προκληθούν από δραστηριότητα ψευδουπεροξειδάσης (ερυθροκύτταρα), δραστηριότητα ενδογενούς υπεροξειδάσης (κυτόχρωμα C), της ενδογενούς αλκαλικής φωσφατάσης ή της ενδογενούς βιοτίνης (π.χ.: ήπαρ, εγκέφαλος, μαστός, νεφρός), ανάλογα με τον τύπο της ανοσοχρωστικής ουσίας που χρησιμοποιείται. 4. Η χρώση των ιστών εξαρτάται από το χειρισμό και επεξεργασία των ιστών πριν την διαδικασία χρώσης. Ακατάλληλη μονιμοποίηση, κατάψυξη, απόψυξη, πλύση, στέγνωμα, θέρμανση, κατάτμηση των ιστών ή μόλυνση με άλλους ιστούς ή υγρά, ενδέχεται να έχουν ως αποτέλεσμα την δημιουργία μορφωμάτων, την παγίδευση του αντισώματος, ή την παραγωγή ψευδώς αρνητικών Τυχόν διαφοροποιήσεις στις μεθόδους μονιμοποίησης και έγκλεισης, καθώς και η ύπαρξη εγγενών ανωμαλιών εντός του ιστού ενδέχεται να επιφέρουν ασυνεπή αποτελέσματα. 5. Υπερβολική ή ατελής αντίχρωση ενδέχεται να υποβαθμίσει την ορθή ερμηνεία των 6. Η κλινική ερμηνεία οποιασδήποτε θετικής χρώσης, ή της απουσίας της, πρέπει να αξιολογείται εντός του πλαισίου του κλινικού ιστορικού, της μορφολογίας και άλλων ιστοπαθολογικών κριτηρίων. Η κλινική ερμηνεία οποιασδήποτε χρώσης, ή της απουσίας της, πρέπει να συμπληρώνεται από μορφολογικές μελέτες και κατάλληλους ελέγχους, καθώς και από άλλες διαγνωστικές εξετάσεις. Η χρώση του παρασκευάσματος με τη χρήση αντιδραστηρίων και καταλλήλων μεθόδων, πρέπει να γίνεται με ευθύνη έμπειρου παθολογοανατόμου. Η χρώση πρέπει να πραγματοποιείται σε πιστοποιημένο εργαστήριο υπό την επίβλεψη παθολογοανατόμου ο οποίος είναι και ο υπεύθυνος για την εξέταση των χρωματισμένων αντικειμενοφόρων πλακών καθώς και την επάρκεια των θετικών και των αρνητικών μαρτύρων. 7. Ο οίκος Ventana παρέχει αντισώματα, ιχνηθέτες και αντιδραστήρια σε βέλτιστη αραίωση, έτοιμα προς χρήση, όταν ακολουθούνται οι οδηγίες που παρέχονται. Οποιαδήποτε απόκλιση από τις συνιστώμενες διαδικασίες της δοκιμασίας ενδέχεται να ακυρώσει τα αναμενόμενα αποτελέσματα. Κατάλληλοι έλεγχοι πρέπει να διεξάγονται και να τεκμηριώνονται. Οι χρήστες που αποκλίνουν από τις συνιστώμενες διαδικασίες της εξέτασης, αναλαμβάνουν και την ευθύνη της ερμηνείας των αποτελεσμάτων των ασθενών. 8. Τα αντιδραστήρια ενδέχεται να παρουσιάσουν μη αναμενόμενες αντιδράσεις σε ιστούς που εξετάζονται για πρώτη φορά. Η πιθανότητα εμφάνισης μη αναμενόμενων αντιδράσεων ακόμα και στις εξεταζόμενες ομάδες ιστών δεν μπορεί να αποκλειστεί τελείως, λόγω της βιολογικής διακύμανσης της έκφρασης του αντιγόνου σε νεοπλασίες ή σε άλλους παθολογικούς ιστούς. Επικοινωνήστε με τον Σελίδα 3 από EL Rev C

4 τοπικό αντιπρόσωπο του οίκου Ventana τεκμηριώνοντας κάθε μη αναμενόμενη αντίδραση. Ειδικοί περιορισμοί 1. Το Διάλυμα Reaction Buffer Concentrate (10X) πρέπει να εξετάζεται για μικροβιακή μόλυνση πριν από τη χρήση. Τα σημάδια που υποδεικνύουν μόλυνση ή αστάθεια του προϊόντος αυτού είναι: θολερότητα του διαλύματος, ανάπτυξη οσμής ή κατακρήμνιση ιζήματος. Στο πρώτο σημάδι πιθανής μόλυνσης του αντιδραστηρίου ή αστάθειας, καλέστε τον τοπικό αντιπρόσωπο της Ventana. 2. Αυτό το αντιδραστήριο έχει διαμορφωθεί καταλλήλως για αραίωση 1:10. Περαιτέρω αραίωση ενδέχεται να προκαλέσει κακή λειτουργία του οργάνου και απώλεια χρώσης του αντιγόνου. Κάθε τέτοια μεταβολή πρέπει να επικυρώνεται από το χρήστη. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΑΝΑΜΕΝΟΜΕΝΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 1. Τα αναμενόμενα αποτελέσματα είναι ποσοτικά, μόνο όταν εξετάζεται η ευαισθησία και η ειδικότητα κάθε ειδικού αντιγόνου ή η αλληλουχία-στόχος των νουκλεϊκών οξέων. Ως μεμονωμένο αντιδραστήριο, το προϊόν αυτό δεν μπορεί να υποβληθεί σε έλεγχο ευαισθησίας και ειδικότητας. 2. Η επαναληψιμότητα εντός και μεταξύ κύκλων εξετάστηκε σε 5 παρτίδες Reaction Buffer Solution Concentrate (10X). Όλα τα δείγματα βρέθηκαν να είναι σύμφωνα μέσα στο εύρος προδιαγραφών για όλες τις ιδιότητες των αντιδραστηρίων που εξετάστηκαν. ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΩΝ 1. Αν ο θετικός μάρτυρας (ιστός) παρουσιάζει ασθενέστερη χρώση από την αναμενόμενη, πρέπει να ελεγχθούν και άλλοι θετικοί μάρτυρες, που χρησιμοποιούνται στον ίδιο κύκλο χρώσεων, για να προσδιοριστεί εάν η ασθενής χρώση οφείλεται στο πρωτοταγές αντίσωμα, στον ιχνηθέτη ή σε ένα από τα κοινά δευτερεύοντα αντιδραστήρια. 2. Αν ο θετικός μάρτυρας δώσει αρνητικό αποτέλεσμα, πρέπει να επιβεβαιωθεί ότι η αντικειμενοφόρος πλάκα φέρει την σωστή ετικέτα γραμμικού κώδικα. Αν η αντικειμενοφόρος έχει τη σωστή σήμανση, άλλοι θετικοί μάρτυρες που εξετάζονται κατά τον ίδιο κύκλο χρώσεων, πρέπει να ελεγχθούν, για να προσδιοριστεί εάν η ασθενής χρώση οφείλεται στο πρωτοταγές αντίσωμα, σε ιχνηθέτη ή σε ένα από τα κοινά δευτερεύοντα αντιδραστήρια. Η συλλογή, μονιμοποίηση ή αποπαραφίνωση των δειγμάτων ενδέχεται να έχει γίνει πλημμελώς. 3. Κατά την IHC, αν παρατηρηθεί υπερβολική χρώση υποβάθρου (φόντου), ενδέχεται να υπάρχουν υψηλά επίπεδα ενδογενούς βιοτίνης. Πρέπει να συμπεριληφθεί ένα βήμα φραγμού της βιοτίνης. Για τους ιχνηθέτες, επικοινωνήστε με τον τοπικό αντιπρόσωπο Ventana. 4. Για την IHC, αν δεν έχει απομακρυνθεί όλη η παραφίνη, η αποπαραφίνωση πρέπει να επαναληφθεί. 5. Αν η ειδική χρώση με το αντίσωμα είναι υπερβολικά έντονη, η διαδικασία πρέπει να επαναληφθεί με το χρόνο επώασης συντομευμένο κατά 4 λεπτά, όσες φορές χρειάζεται, μέχρι να επιτευχθεί η επιθυμητή ένταση χρώσης. 6. Προς αποφυγήν αποκόλλησης των τομών από τις αντικειμενοφόρους, πρέπει να χρησιμοποιούνται αντικειμενοφόροι θετικά φορτισμένες. 7. Για τις ενδεικνυόμενες διορθωτικές ενέργειες, ανατρέξτε στην ενότητα Διαδικασία Βήμα-προς-Βήμα, στις Οδηγίες Χρήσης του automated slide stainer ή επικοινωνήστε με τον τοπικό αντιπρόσωπο του οίκου Ventana. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology, 2nd Edition. The C.V. Mosby Company, St. Louis, College of American Pathologists Laboratory Accreditation Program, Anatomic Pathology Checklist, NCCLS. Quality Assurance for Immunocytochemistry: Approved Guideline. NCCLS document MM4-A- (ISBN ). NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA USA, Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: the new era of quality control. Biotech Histochem 66(4): , ΠΝΕΥΜΑΤΙΚΗ ΙΔΙΟΚΤΗΣΙΑ Τα iview TM και Liquid Coverslip TM αποτελούν εμπορικά σήματα της Ventana Medical Systems, Inc., τα BenchMark and Ventana αποτελούν σήματα κατατεθέντα της Ventana Medical Systems, Inc. Καλύπτεται από τις εξής ευρεσιτεχνίες: Αρ. Ευρεσιτ. ΗΠΑ , B1, B1 και αντίστοιχα άλλων χωρών Σελίδα 4 από EL Rev C

5 ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΕΠΙΚΟΙΝΩΝΙΑΣ Ventana Medical Systems, Inc E. Innovation Park Drive Tucson, Arizona USA (USA) Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Strasse 116 D Mannheim Germany Σελίδα 5 από EL Rev C