Hematoxylin. Αρ. καταλόγου

Transcript

1 Hematoxylin Αρ. καταλόγου ΕΝΔΕΙΞΕΙΣ ΚΑΙ ΧΡΗΣΗ Προοριζόμενη Χρήση Το αντιδραστήριο αυτό προορίζεται για in vitro διαγνωστική χρήση. Το αντιδραστήριο αντίχρωσης Ventana Medical Systems Hematoxylin είναι μια τροποποιημένη αιματοξυλίνη Gill και προορίζεται για χρώση κυτταρικών πυρήνων σε αντικειμενοφόρους πλάκες που περιέχουν κύτταρα από κατεψυγμένο ιστό, ιστού που έχει μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη και έχει εγκλεισθεί σε παραφίνη ή κυτταρολογικών παρασκευασμάτων. Η κλινική ερμηνεία οποιασδήποτε χρώσης, ή η απουσία χρώσης, πρέπει να συμπληρώνεται από μορφολογικές μελέτες και αξιολόγηση των κατάλληλων μαρτύρων. Η αξιολόγηση πρέπει να πραγματοποιείται από πεπειραμένο παθολογοανατόμο, λαμβάνοντας υπόψη το κλινικό ιστορικό του ασθενούς και τις λοιπές διαγνωστικές εξετάσεις. Caution: U.S. Federal law restricts this device to sale by or on the order of a physician. Περίληψη και επεξήγηση Η Hematoxylin προκαλεί χρώση διαφόρων συστατικών των ιστών συμπεριλαμβανομένων πυρήνων, μιτοχονδρίων, βλεννίνης, αιμοσφαιρίνης, ελαστικών ινών και κολλαγόνου. Το συστατικό της χρωστικής, αιματίνη, δεσμεύεται στον ιστό έμμεσα μέσω ενός στερεωτικού, του θειικού αργιλίου. Αρχές λειτουργίας και διαδικασίες Γενικότερα, η ανοσοϊστοχημική χρώση επιτρέπει την απεικόνιση των αντιγόνων μέσω διαδοχικής σύνδεσης του ειδικού αντισώματος (πρωτοταγές αντίσωμα) στο αντιγόνο, ενός δευτεροταγούς αντισώματος (αντίσωμα σύνδεσης) στο πρωτοταγές αντίσωμα, ενός ενζυμικού συμπλόκου και ενός χρωμογονικού υποστρώματος, με ενδιάμεσα βήματα έκπλυσης. Η ενζυματική ενεργοποίηση του χρωμογόνου έχει ως αποτέλεσμα ένα ορατό προϊόν αντίδρασης στον τόπο του αντιγόνου. Τα δείγματα μπορούν κατόπιν να υποβληθούν σε αντίχρωση με διάλυμα Hematoxylin, το οποίο εφαρμόζεται στην αντικειμενοφόρο πλάκα και αναμιγνύεται σε ολόκληρη την επιφάνεια του δείγματος. Η Hematoxylin προκαλεί μπλε χρώση τους πυρήνες μέσω της δέσμευσης του συμπλόκου στερεωτικού χρωστικής στα νουκλεϊκά οξέα και στις πρωτεΐνες ιστόνης της ετεροχρωματίνης. Στο τέλος του βήματος επώασης, το Ventana automated slide stainer ξεπλένει τις αντικειμενοφόρους πλάκες για να σταματήσει η αντίδραση και να απομακρυνθεί το αδέσμευτο υλικό. Το δείγμα μπορεί κατόπιν να υποβληθεί σε μετα αντίχρωση και να καλυφθεί με καλυπτρίδα. Τα αποτελέσματα ερμηνεύονται με χρήση κοινού μικροσκοπίου και βοηθούν την διαφορική διάγνωση παθοφυσιολογικών διαδικασιών, οι οποίες είναι δυνατόν να συνδέονται με κάποιο συγκεκριμένο αντιγόνο. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Αντιδραστήρια που Παρέχονται 1 Φιαλίδιο 25 ml Hematoxylin ( 48%), περιέχει σταθεροποιητικό διάλυμα γλυκόλης και οξικού οξέος. Ανασύσταση, Ανάμιξη, Αραίωση, Τιτλοδότηση Δεν απαιτείται ανασύσταση, ανάμιξη, αραίωση ή τιτλοδότηση. Το αντιδραστήριο αυτό έχει βελτιστοποιηθεί για χρήση στο automated slide stainer (αυτοματοποιημένο σύστημα χρώσεως αντικειμενοφόρων πλακών) του οίκου Ventana σε συνδυασμό με τα primary antibodies, τα detection kits και τα επικουρικά αντιδραστήρια του οίκου Ventana. Υλικά και Αντιδραστήρια που Απαιτούνται αλλά δεν Παρέχονται Τα παρακάτω αντιδραστήρια και υλικά ενδέχεται να απαιτούνται για τη χρώση, αλλά δεν παρέχονται: 1. Θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες (ιστοί) 2. Ventana Negative Control Reagent* 3. Ventana Rabbit Negative Control* 4. Primary Antibody 5. Αντικειμενοφόροι πλάκες θετικά φορτισμένες 6. Κλίβανος ξήρανσης, με ικανότητα διατήρησης της θερμοκρασίας σε 70 C ± 5 C 7. Ετικέτες γραμμικού κώδικα (κατάλληλες για αρνητικό μάρτυρα ή για το εξεταζόμενο πρωτοταγές αντίσωμα) 8. Ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης 10% 9. Δοχεία ή λουτρά χρώσης 10. Χρονόμετρο 11. Ξυλόλη 12. Αιθανόλη ή αλκοόλη 13. Απιονισμένο ή απεσταγμένο νερό 14. Decloaking Chamber* της Biocare Medical (ES και NexES IHC automated slide stainers) 15. ES, NexES IHC, BenchMark και BenchMark XT automated slide stainers 16. iview TM DAB, AEC, V Red (ALK PHOS) ή Enhanced V Red detection kits 17. Endogenous Biotin Blocking Kit* 18. Εξειδικευμένο λογισμικό Detection Kit (μόνο για ES automated slide stainer ) 19. APK Wash Solution* (ES και NexES IHC automated slide stainers) 20. Διάλυμα Liquid Coverslip TM (ES και NexES IHC automated slide stainers) 21. Διάλυμα EZ Prep TM * (BenchMark και BenchMark XT automated slide stainers) 22. Reaction Buffer* (BenchMark και BenchMark XT automated slide stainers) 23. LCS (BenchMark και BenchMark XT automated slide stainers) 24. Cell Conditioning 1 (CC1), Cell Conditioning 2 (CC2) ή Cell Conditioning 3 (CC3) (BenchMark και BenchMark XT automated slide stainers)* 25. Protease I, II, ή III* 26. Bluing Reagent 27. Επικαλυπτικό μέσο 28. Καλυπτρίδες 29. Κοινό μικροσκόπιο (20-80X) * Όπως χρειάζεται για ειδικές εφαρμογές. Φύλαξη και Χειρισμός Αποθηκεύεται στους 2-8 C. Να μην καταψύχεται. Ο χρήστης πρέπει να εξακριβώνει εάν υπάρχουν άλλες συνθήκες αποθήκευσης διαφορετικές από εκείνες που προβλέπονται από τις Οδηγίες Χρήσης. Για να εξασφαλίσετε την σωστή διανομή και σταθερότητα του αντιδραστηρίου, μετά από κάθε χρήση, ο διανεμητής πρέπει να επαναπωματίζεται και να τοποθετείται σε όρθια θέση, μέσα στο ψυγείο. Κάθε διανεμητής αντιδραστηρίου έχει ημερομηνία λήξεως. Εφόσον αποθηκεύεται σύμφωνα με τις προβλεπόμενες οδηγίες φύλαξης, το αντιδραστήριο παραμένει αναλλοίωτο μέχρι την ημερομηνία που αναγράφεται στην ετικέτα. Μην χρησιμοποιείτε το αντιδραστήριο πέραν της ημερομηνίας λήξης, για την ενδεικνυόμενη μέθοδο φύλαξης. Τα σημάδια που υποδεικνύουν αλλοίωση του προϊόντος αυτού είναι η κατακρήμνιση του αντιδραστηρίου με διαύγαση του διαλύματος. Στο πρώτο σημάδι πιθανής αλλοίωσης του αντιδραστηρίου, επικοινωνήστε με τον τοπικό αντιπρόσωπο της Ventana. Συλλογή Δειγμάτων και Προετοιμασία προς Ανάλυση Κατεψυγμένες Τομές Η προτεινόμενη διαδικασία είναι η τοποθέτηση νωπού ιστού σε μέσο μονιμοποίησης OCT και η ταχεία ψύξη του σε υγρό άζωτο ή σε ισοπεντάνιο, το οποίο είχε προηγουμένως ψυχθεί με ξηρό πάγο. Ο κατεψυγμένος ιστός πρέπει να φυλαχτεί στους - 80 C έως ότου πραγματοποιηθεί η τμήση του. Η τμήση των βιοψιών γίνεται με τομές πάχους 4 έως 6 µm, αυτές συλλέγονται σε καθαρές υάλινες αντικειμενοφόρους πλάκες και αμέσως τοποθετούνται σε κρύα ακετόνη (0-8 C) για 10 με 30 λεπτά. Μετά την αφαίρεση από την ακετόνη, οι αντικειμενοφόροι πλάκες αφήνονται να στεγνώσουν στον αέρα για 10 λεπτά ως 1 ώρα. Κυτταρολογικά Δείγματα Τα παρασκευάσματα Cytospin και τα επιχρίσματα αίματος πρέπει να παρασκευάζονται σύμφωνα με τις πρότυπες εργαστηριακές διαδικασίες: 1. Στεγνώστε στον αέρα τις αντικειμενοφόρους πλάκες για 30 λεπτά. 2. Μονιμοποιήστε σε κρύα ακετόνη (0 ως 8 C) για 10 ως 30 λεπτά. 3. Αφαιρέστε από την ακετόνη και στεγνώστε στον αέρα για 10 λεπτά ως 1 ώρα. 4. Τοποθετήστε σε ξηραντήρα με ξηραντικό υλικό για 10 ημέρες κατά μέγιστο. Αν οι τομές πρόκειται να αποθηκευθούν για περισσότερο από 10 ημέρες, τυλίξτε σφιχτά σε φύλλο αλουμινίου και αποθηκεύστε στους -80 C. 5. Αφήστε τις αντικειμενοφόρους πλάκες να έρθουν σε θερμοκρασία δωματίου μετά την απομάκρυνση από τους -80 C, (για αντικειμενοφόρους πλάκες που έχουν τυλιχτεί με φύλλο αλουμινίου, αφήστε να έρθουν σε θερμοκρασία δωματίου πριν αφαιρέσετε το φύλλο αλουμινίου για να αποφευχθεί συμπύκνωση υγρασίας πάνω στο δείγμα). 6. Τοποθετήστε γραμμικό κώδικα στις αντικειμενοφόρους πλάκες και φορτώστε τις στο automated slide stainer Σελίδα 1 από EL Rev B

2 Μονιμοποίηση σε Φορμαλίνη και Έγκλιση σε Παραφίνη ΟΔΗΓΙΕΣ ΧΡΗΣΗΣ Οι ιστοί που έχουν μονιμοποιηθεί σε φορμαλίνη και έχουν εγκλεισθεί σε παραφίνη, είναι Διαδικασία Βήμα-προς-Βήμα κατάλληλοι για χρήση με αυτό το αντιδραστήριο, μετά τη συνήθη επεξεργασία και εφόσον χρησιμοποιούνται μαζί με τα primary antibodies, detection kits (κιτ ανίχνευσης), τα επικουρικά αντιδραστήρια και automated slide stainer (αυτοματοποιημένο σύστημα χρώσεως αντικειμενοφόρων πλακών) του οίκου Ventana (βλ. ενότητα Υλικά και Αντιδραστήρια που Απαιτούνται αλλά Δεν Παρέχονται). Για την μονιμοποίηση των ιστών συνιστάται η χρήση ουδέτερου ρυθμιστικού διαλύματος φορμόλης 10%. 1 Παραλλαγμένα αποτελέσματα ενδέχεται να προκύψουν λόγω παρατεταμένης μονιμοποίησης ή εφαρμογής ειδικών διαδικασιών, όπως για παράδειγμα αφαλάτωση παρασκευασμάτων μυελού των οστών. Η κάθε τομή πρέπει να κόβεται στο κατάλληλο πάχος και να τοποθετείται σε αντικειμενοφόρο πλάκα που είναι θετικά φορτισμένη. Οι αντικειμενοφόροι πλάκες που φέρουν τομές ιστών, μπορούν να θερμανθούν επί τουλάχιστον 2 ώρες (αλλά όχι περισσότερο από 24 ώρες), σε κλίβανο με θερμοκρασία 70 C ±5 C. Χειροκίνητη Διαδικασία Αποπαραφίνωσης ES και NexES IHC Automated slide stainers Απαιτείται όταν χρησιμοποιείτε τα ES ή NexES IHC automated slide stainers ή αν η αποπαραφίνωση δεν επιλέχθηκε στα BenchMark ή τα BenchMark XT automated slide stainer: 1. Για οδηγίες σχετικά με το πότε να σημάνετε τις αντικειμενοφόρους πλάκες με ετικέτες γραμμικού κώδικα, ανατρέξτε στις Οδηγίες Χρήσης του συγκεκριμένου automated slide stainer. 2. Εμβαπτίστε τις αντικειμενοφόρους πλάκες, διαδοχικά στα 3 δοχεία ξυλόλης, επί 5 ± 1 λεπτό στο κάθε ένα από αυτά. 3. Μεταφέρετε τις αντικειμενοφόρους πλάκες σε αιθανόλη 100% και εμβαπτίστε τες διαδοχικά σε 2 λουτρά επί 3 ± 1 λεπτά στο κάθε ένα από αυτά. 4. Μεταφέρετε τις αντικειμενοφόρους πλάκες σε δοχείο με διάλυμα αιθανόλης 95% και βυθίστε τες επί 3 ± 1 λεπτά. 5. Μεταφέρετε τις αντικειμενοφόρους πλάκες και εμβαπτίστε τες σε δοχείο αιθανόλης 80% επί 3 ± 1 λεπτά. 6. Μεταφέρετε τις αντικειμενοφόρους πλάκες σε δοχείο απιονισμένου ή απεσταγμένου νερού και εμβαπτίστε τες 10 φορές τουλάχιστον. 7. Μεταφέρετε τις αντικειμενοφόρους πλάκες στο κατάλληλο APK Wash (1X) ή ρυθμιστικό διάλυμα. Για το διάλυμα APK Wash, οι αντικειμενοφόροι πλάκες πρέπει να παραμείνουν έως ότου είστε έτοιμοι να πραγματοποιήσετε τη διαδικασία χρώσης. Για το ρυθμιστικό διάλυμα, οι αντικειμενοφόροι πλάκες πρέπει να παραμείνουν έως ότου είστε έτοιμοι να πραγματοποιήσετε τη διαδικασία αποκάλυψης του αντιγόνου. Μην αφήνετε τις αντικειμενοφόρους πλάκες να στεγνώσουν. Οι αντικειμενοφόροι πλάκες που έχουν χρωματιστεί στα BenchMark ή BenchMark XT automated slide stainers μπορούν να αποπαραφινωθούν πάνω στο όργανο. Αν επιλέξετε την επιλογή αυτή, τοποθετήστε στις αντικειμενοφόρους γραμμικό κώδικα και τοποθετήστε τις πάνω στο όργανο. Αν δεν επιλέξετε αυτή την διαδικασία, ακολουθήστε τη Χειροκίνητη Διαδικασία Αποπαραφίνωσης, όπως αναφέρεται παραπάνω. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ 1. Λάβετε τις δέουσες προφυλάξεις όταν χειρίζεστε αντιδραστήρια. Χρησιμοποιείτε γάντια μιας χρήσης όταν χειρίζεστε ενδεχομένως καρκινογόνα ή τοξικά υλικά (π.χ.: ξυλόλη ή φορμαλδεΰδη). 2. Αποφύγετε επαφή των αντιδραστηρίων με τα μάτια και τις βλεννογόνους μεμβράνες. Αν τα αντιδραστήρια έλθουν σε επαφή με ευαίσθητες περιοχές, ξεπλύνετε με άφθονο νερό. 3. Τα δείγματα που προέρχονται από ασθενείς, καθώς και όλα τα υλικά που έρχονται σε επαφή με ασθενείς, πρέπει να αντιμετωπίζονται ως υλικά βιολογικώς επικίνδυνα και να απορρίπτονται με τις ενδεδειγμένες προφυλάξεις. Κατά την αναρρόφηση των υγρών με πιπέττα, μην χρησιμοποιείτε το στόμα σας. 4. Αποφύγετε τη μικροβιακή επιμόλυνση των αντιδραστηρίων, καθώς τούτο θα μπορούσε να επιφέρει εσφαλμένα αποτελέσματα. 5. Η εφαρμογή χρόνων και θερμοκρασιών επώασης διαφορετικών από τα προβλεπόμενα, ενδέχεται να δώσουν εσφαλμένα αποτελέσματα. Ο χρήστης πρέπει να εξασφαλίσει ότι δεν έχει επέλθει οποιαδήποτε τέτοια μεταβολή. 6. Τα αντιδραστήρια έχουν αραιωθεί καταλλήλως και περαιτέρω αραίωση πιθανόν να προκαλέσει απώλεια χρώσης του αντιγόνου. Ο χρήστης πρέπει να εξασφαλίσει ότι δεν έχει επέλθει οποιαδήποτε τέτοια μεταβολή. 7. Τα συμπτώματα υπερέκθεσης ενδέχεται να περιλαμβάνουν ερεθισμό του δέρματος και των ματιών, καθώς και ερεθισμό των βλεννογόνων μεμβρανών και των άνω αναπνευστικών οδών. ACGIH (TLV): καμία. OSHA (PEL): Δεν ισχύει, IARC: δεν έχει καταγραφεί, NTP: δεν έχει καταγραφεί. H Hematoxylin έχει βελτιστοποιηθεί ώστε να παρέχει σταθερή πυρηνική χρώση όταν εφαρμόζεται για τέσσερα λεπτά και χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με τα primary antibodies, detection kits και τα επικουρικά αντιδραστήρια του οίκου Ventana σε ένα Ventana automated slide stainer. Οι διεργασίες που πραγματοποιούνται από τον automated slide stainer εξαρτώνται από τις επιλογές που γίνονται για κάθε διαδικασία που ακολουθείται. Για την ακριβή ακολουθία των γεγονότων συμβουλευτείτε τις Οδηγίες Χρήσης σας. Οι παράμετροι για τις αυτοματοποιημένες διαδικασίες μπορούν να απεικονιστούν, να εκτυπωθούν και να διαμορφωθούν σύμφωνα με τη διαδικασία στις Οδηγίες Χρήσης. Οι άλλες παράμετροι λειτουργίας για τα automated slide stainers, έχουν ρυθμιστεί εργοστασιακά. Οι διαδικασίες για χρώση στους Ventana automated slide stainers είναι οι εξής (για λεπτομερέστερες οδηγίες και πρόσθετες επιλογές πρωτοκόλλων ανατρέξτε στις Οδηγίες Χρήσης). Απαιτείται Αποκάλυψη Αντιγόνου: 1. Πραγματοποιήστε αποπαραφίνωση των αντικειμενοφόρων πλακών, εμβαπτίζοντάς τες διαδοχικά μέσα σε δοχεία που περιέχουν ξυλόλη και κατόπιν σε σειρά δοχείων που περιέχουν αλκοόλη σε κατιούσα πυκνότητα και τέλος, σε νερό και στο κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα. Πραγματοποιήστε τη διαδικασία αποκάλυψης του αντιγόνου και μεταφέρετε τις αντικειμενοφόρους πλάκες στο APK Wash (1X). 2. Τοποθετήστε τους διανεμητές του πρωτοταγούς αντισώματος, του detection kit καθώς και των απαιτούμενων συνοδευτικών αντιδραστηρίων, επάνω στο δίσκο αντιδραστηρίων και τοποθετήστε τον στο automated slide stainer. Ελέγξτε τα ειδικά διαλύματα (bulk fluids) και τα απόβλητα. 3. Στεγνώστε το άκρο της αντικειμενοφόρου πλάκας και μετά εφαρμόστε την ετικέτα γραμμικού κώδικα της αντικειμενοφόρου πλάκας, η οποία αντιστοιχεί με το πρωτόκολλο του αντισώματος που πρόκειται να εφαρμοσθεί. 4. Απομακρύνετε από το διάλυμα APK Wash (1X) τις αντικειμενοφόρους πλάκες, που φέρουν τις αποπαραφινωμένες τομές που έχουν υποβληθεί σε διαδικασία αποκάλυψης αντιγόνου και τοποθετήστε τες στο αυτοματοποιημένο σύστημα χρώσης. Προσοχή: οι αντικειμενοφόροι πλάκες δεν πρέπει να στεγνώσουν. Δεν Απαιτείται Αποκάλυψη Αντιγόνου: 1. Σημάνετε την αντικειμενοφόρο πλάκα με την ετικέτα γραμμικού κώδικα. Κατόπιν, πραγματοποιήστε αποπαραφίνωση των αντικειμενοφόρων, εμβαπτίζοντάς τες διαδοχικά μέσα σε δοχεία που περιέχουν ξυλόλη και δοχεία που περιέχουν αλκοόλη σε κατιούσα πυκνότητα, και μετά σε APK Wash (1X). 2. Τοποθετήστε τους διανεμητές του πρωτοταγούς αντισώματος, του detection kit καθώς και των απαιτούμενων συνοδευτικών αντιδραστηρίων, επάνω στο δίσκο αντιδραστηρίων και τοποθετήστε τον στο automated slide stainer. 3. Απομακρύνετε στο σύστημα τις αντικειμενοφόρους με τις ετικέτες που έχουν υποστεί αποπαραφίνωση από το APK Wash (1X). Προσοχή: οι αντικειμενοφόροι πλάκες δεν πρέπει να στεγνώσουν. BenchMark ή BenchMark XT Automated slide stainers 1. Σημάνετε την αντικειμενοφόρο πλάκα με την ετικέτα γραμμικού κώδικα που αντιστοιχεί στο πρωτόκολλο αντισώματος που πρόκειται να εφαρμοσθεί. 2. Τοποθετήστε τους διανεμητές του primary antibody, του detection kit καθώς και των απαιτούμενων συνοδευτικών αντιδραστηρίων, επάνω στο δίσκο αντιδραστηρίων και τοποθετήστε τον στο automated slide stainer. Ελέγξτε τα ειδικά διαλύματα (bulk fluids) και τα απόβλητα. 3. Τοποθετήστε τις αντικειμενοφόρους πάνω στο automated slide stainer. Για όλα τα Όργανα 1. Ξεκινήστε τη διαδικασία χρώσης. 2. Με την ολοκλήρωση της διαδικασίας, αφαιρέστε τις αντικειμενοφόρους πλακες από το automated slide stainer. 3. Για τα χρωμογόνα iview DAB και Ventana Red kit, ξεπλύνετε σε ένα διάλυμα ήπιου απορρυπαντικού πιάτων ή αλκοόλης για να απομακρύνετε το διάλυμα καλυπτρίδας, αφυδατώστε, διαυγάστε και καλύψτε με κοινό επικαλυπτικό μέσο και τέλος, με την καλυπτρίδα, κατά τον συνήθη τρόπο. 4. Για το χρωμογόνο AEC, μην αφυδατώσετε και μη διαυγάσετε. Καλύψτε το AEC με επικαλυπτικό μέσο υδατικής βάσης. Οι χρωματισμένες αντικειμενοφόρες πλάκες πρέπει να εξετασθούν μέσα σε δύο έως τρεις ημέρες από τη χρώση, παραμένουν δε αναλλοίωτες για τουλάχιστον δύο χρόνια, εφόσον αποθηκευθούν σε θερμοκρασία δωματίου (15 έως 25 C) Σελίδα 2 από EL Rev B

3 Διαδικασίες ελέγχου ποιότητας Ερμηνεία των αποτελεσμάτων Έλεγχος θετικού μάρτυρα (Ιστός) Σε κάθε κύκλο χρώσεων πρέπει να χρησιμοποιείται και ένας θετικός μάρτυρας (ιστός). Για παραδείγματα υλικού θετικού μάρτυρα, ανατρέξτε στο ένθετο συσκευασίας του Ventana primary antibody που σας ενδιαφέρει. Χρησιμοποιούνται θετικοί μάρτυρες για επιβεβαίωση της προσθήκης του αντισώματος και της ορθής λειτουργίας του συστήματος. Ο ιστός αυτός μπορεί να περιέχει κύτταρα και συστατικά στοιχεία, τόσο θετικής όσο και αρνητικής χρώσης, τα οποία λειτουργούν ως θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες. Οι πρότυποι ιστοί ελέγχου πρέπει να είναι δείγματα Έλεγχος θετικού μάρτυρα (Ιστός) χειρουργικά ή να προέρχονται από πρόσφατη νεκροψία, βιοψία, και να έχουν παρασκευασθεί και μονιμοποιηθεί άμεσα, κατά τρόπο πανομοιότυπο με τις προς εξέταση τομές ιστών. Αυτοί οι ιστοί πρέπει να υποβάλλονται σε όλα τα βήματα της εξέτασης, από την προετοιμασία των ιστών έως την χρώση τους. Η χρήση τομής ιστού που έχει υποστεί επεξεργασία με διαφορετικό τρόπο από αυτόν του προς εξέταση δείγματος, επιτρέπει τον έλεγχο όλων των αντιδραστηρίων και των βημάτων της μεθόδου, πλην αυτών της μονιμοποίησης και επεξεργασίας του ιστού. Η χρήση ιστού με ασθενή θετική χρώση παρέχει τον βέλτιστο έλεγχο της ποιότητας και ενδείκνυται για την ανίχνευση ελασσόνων αλλοιώσεων των αντιδραστηρίων. Η χρήση γνωστών θετικών μαρτύρων ενδείκνυται μόνο για την απεικόνιση της σωστής απόδοσης των επεξεργασμένων ιστοτεμαχίων και των αντιδραστηρίων εξέτασης και όχι επικουρικά, για τον καθορισμό συγκεκριμένης διάγνωσης σε δείγματα ασθενών. Αν οι θετικοί μάρτυρες δεν εμφανίσουν θετική χρώση, τα αποτελέσματα της εξέτασης των Αρνητικός Μάρτυρας (Ιστός) δειγμάτων πρέπει να θεωρούνται άκυρα. Αρνητικός Μάρτυρας (Ιστός) Ως αρνητικός μάρτυρας μπορεί να χρησιμοποιηθεί ο ιστός που χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας. Η ποικιλία των κυτταρικών τύπων, που παρουσιάζουν οι τομές των ιστών προσφέρει εσωτερικά σημεία που μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως αρνητικοί μάρτυρες, κάτι όμως που, πρέπει να εξακριβώνεται από τον χρήστη. Τα συστατικά στα οποία δεν παρουσιάζεται χρώση, δεν πρέπει να εμφανίζουν ειδική χρώση, και έτσι αποτελούν ένδειξη ειδικής χρώσης στο υπόβαθρο (φόντο) Αν παρατηρηθεί ειδική χρώση στα σημεία αυτά, που χρησιμοποιούνται ως αρνητικοί μάρτυρες, τα αποτελέσματα των δειγμάτων των ασθενών πρέπει να θεωρηθούν άκυρα. Ανεξήγητες Ασυμφωνίες Ιστός Ασθενούς Ανεξήγητες ασυμφωνίες στους μάρτυρες πρέπει να γνωστοποιούνται αμέσως στον τοπικό αντιπρόσωπο του οίκου Ventana. Αν τα αποτελέσματα του ελέγχου ποιότητας δεν ανταποκρίνονται στις προδιαγραφές, τα αποτελέσματα για τους ασθενείς είναι άκυρα. Βλ.την ενότητα Αντιμετώπιση Προβλημάτων, στο παρόν ένθετο. Εντοπίστε και διορθώστε το πρόβλημα και ακολούθως επαναλάβετε την εξέταση των δειγμάτων των ασθενών. Αρνητικός Μάρτυρας (Αντιδραστήριο) Μαζί με κάθε ένα δείγμα, πρέπει να χρησιμοποιείται και ένας αρνητικός μάρτυρας (αντιδραστήριο), για την διευκόλυνση της ερμηνείας των αποτελεσμάτων. Ο αρνητικός μάρτυρας (αντιδραστήριο) χρησιμοποιείται στην θέση του πρωτοταγούς αντισώματος, για την αξιολόγηση της μη-ειδικής χρώσης. Η χρώση της αντικειμενοφόρου πλάκας πρέπει να γίνεται με το Negative Control Reagent (mouse) ή με το Rabbit Negative Control, κατά περίπτωση. Σε περίπτωση χρήσης διαφορετικού αντιδραστηρίου στη θέση αρνητικού μάρτυρα, αυτό πρέπει να αραιωθεί με το Ventana Antibody Diluent (αραιωτικό ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ αντισωμάτων) στην ίδια συγκέντρωση που έχει το πρωτοταγές αντίσωμα/αντιορός. Το ίδιο το αραιωτικό μπορεί να χρησιμοποιηθεί από μόνο του ως αρνητικός μάρτυρας. Ο χρόνος επώασης του αρνητικού μάρτυρα (αντιδραστήριο) πρέπει να ισούται με τον χρόνο επώασης του πρωτοταγούς αντισώματος. Όταν χρησιμοποιείται σειρά (panel) διαφόρων αντισωμάτων σε διαδοχικές τομές, ο αρνητικός μάρτυρας (αντιδραστήριο) σε μία αντικειμενοφόρο πλάκα μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως αρνητικός μάρτυρας ή μάρτυρας μη ειδικής χρώσης υποβάθρου (φόντου) για άλλα αντισώματα. Επιβεβαίωση Δοκιμασίας Πριν την αρχική χρήση αντισώματος ή συστήματος χρώσης στη διαγνωστική διαδικασία, η ειδικότητα του αντισώματος πρέπει να επιβεβαιωθεί με δοκιμές σε σειρές ιστών που αντιπροσωπεύουν γνωστούς θετικούς και αρνητικούς ιστούς, με γνωστά χαρακτηριστικά απόδοσης σε ανοσοϊστοχημεία (ανατρέξτε στην ενότητα Διαδικασίες ελέγχου ποιότητας που περιέχεται στο ένθετο της συσκευασίας του Ventana primary antibody της επιλογής σας, στις Quality Control recommendations of the College of American Pathologists Laboratory Accreditation Program, Anatomic Pathology Checklist, 2 και το NCCLS Approved Guideline 3 ). Αυτές οι διαδικασίες ελέγχου ποιότητας πρέπει να επαναλαμβάνονται για κάθε καινούργια παρτίδα αντισώματος, ή οποτεδήποτε υπάρχει μεταβολή στις παραμέτρους της δοκιμασίας. Η αυτοματοποιημένη ανοσοχρωστική διαδικασία του οίκου Ventana προκαλεί την επικάθηση ενός χρωματισμένου προϊόντος αντίδρασης στις θέσεις αντιγόνου που εντοπίζονται από το πρωτοταγές αντίσωμα. Ανατρέξτε στο ένθετο της συσκευασίας του κατάλληλου detection kit για αναμενόμενες χρωματικές αντιδράσεις. Εφαρμογή της Hematoxylin ως αντίχρωσης προκαλεί μπλε χρώση της ετεροχρωματίνης στους κυτταρικούς πυρήνες. Η αξιολόγηση των μαρτύρων πρέπει να γίνει από έμπειρο παθολογοανατόμο, εξοικειωμένο με τις διαδικασίες ανοσοϊστοχημείας και πρέπει να προηγηθεί της ερμηνείας των αποτελεσμάτων. Για την επιβεβαίωση της ορθής λειτουργίας των αντιδραστηρίων, πρέπει κατ' αρχήν να εξετάζεται ο θετικός μάρτυρας (Ιστός), που έχει υποβληθεί στην διαδικασία χρώσεως. Η παρουσία μέσα στα κύτταρα-στόχους ενός προϊόντος αντίδρασης που έχει χρωματισθεί κατά τα αναμενόμενα, αποτελεί ένδειξη θετικής αντιδραστικότητας. Ανατρέξτε στις Οδηγίες Χρήσης του χρησιμοποιούμενου Detection Kit για αναμενόμενες χρωματικές αντιδράσεις. Ανάλογα με τη διάρκεια της επώασης και την αποτελεσματικότητα της αιματοξυλίνης που χρησιμοποιείται, η αντίχρωση δημιουργεί ανοιχτό έως σκούρο μπλε χρωματισμό των κυτταρικών πυρήνων. Υπερβολική ή ατελής αντίχρωση ενδέχεται να υποβαθμίσει την ορθή ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Αν ο θετικός μάρτυρας (ιστός) δεν εμφανίσει θετική χρώση, όλα τα αποτελέσματα της εξέτασης των δειγμάτων πρέπει να θεωρούνται άκυρα. Η εξέταση του αρνητικού μάρτυρα (ιστός) πρέπει να έπεται αυτής του θετικού μάρτυρα, για να επιβεβαιώνεται η ειδική σήμανση του αντιγόνου-στόχου, από το πρωτοταγές αντίσωμα. Η απουσία ειδικής χρώσης στον αρνητικό μάρτυρα (ιστό) επιβεβαιώνει την μη-ύπαρξη διασταυρούμενης αντιδραστικότητας του αντισώματος προς τα κύτταρα ή τα κυτταρικά συστατικά. Αν παρατηρηθεί ειδική χρώση στον αρνητικό μάρτυρα (ιστό), τα αποτελέσματα στα δείγματα των ασθενών πρέπει να θεωρούνται άκυρα. Εάν υπάρχει μη-ειδική χρώση, έχει διάχυτο παρουσιαστικό. Σποραδική ελαφρά χρώση του συνδετικού ιστού ενδέχεται επίσης να παρατηρηθεί σε τομές, που έχουν υποστεί υπερβολική μονιμοποίηση σε φορμόλη. Για την ερμηνεία των αποτελεσμάτων πρέπει να χρησιμοποιούνται τα άθικτα κύτταρα. Νεκρωτικά ή αλλοιωμένα κύτταρα, συχνά παρουσιάζουν μη-ειδική χρώση. Τα δείγματα των ασθενών πρέπει να εξετάζονται τελευταία. Η ένταση θετικής χρώσης πρέπει να αξιολογείται, λαμβάνοντας υπ'όψιν τυχόν χρώση φόντου του αρνητικού μάρτυρα (αντιδραστηρίου). Όπως συμβαίνει και σε κάθε ανοσοϊστοχημική εξέταση, τυχόν αρνητικό αποτέλεσμα σημαίνει ότι το εν λόγω αντιγόνο απλώς δεν ανιχνεύθηκε, και όχι ότι το αντιγόνο απουσιάζει από τα κύτταρα ή τους ιστούς που έχουν εξετασθεί. Εφόσον είναι απαραίτητο, χρησιμοποιήστε σειρά (panel) αντισωμάτων, επικουρικά για τον εντοπισμό των ψευδώς αρνητικών. Κατά την ερμηνεία οποιουδήποτε ανοσοϊστοχημικού αποτελέσματος, πρέπει να εξετάζεται και η μορφολογία κάθε δείγματος ιστού, με την χρήση μίας τομής χρωματισμένης με αιματοξυλίνη και εωσίνη. Τα μορφολογικά ευρήματα του ασθενούς και οποιαδήποτε συναφή κλινικά δεδομένα πρέπει να ερμηνεύονται από έμπειρο παθολογοανατόμο. 1. Η ανοσοϊστοχημεία είναι μια διαγνωστική διαδικασία πολλαπλών βημάτων που απαιτεί εξειδίκευση στην επιλογή των καταλλήλων αντιδραστηρίων και ιστών, στην μονιμοποίηση, την επεξεργασία, την προετοιμασία της αντικειμενοφόρου πλάκας για ανοσοϊστοχημεία, καθώς και στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων χρώσης. 2. Η χρώση των ιστών εξαρτάται από το χειρισμό και επεξεργασία των ιστών πριν την διαδικασία χρώσης. Ακατάλληλη μονιμοποίηση, κατάψυξη, απόψυξη, πλύση, στέγνωμα, θέρμανση, κατάτμηση των ιστών ή επιμόλυνση με άλλους ιστούς ή υγρά, ενδέχεται να έχουν ως αποτέλεσμα την δημιουργία μορφωμάτων, την παγίδευση του αντισώματος, ή την παραγωγή ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων. Τυχόν διαφοροποιήσεις στις μεθόδους μονιμοποίησης και έγκλησης, καθώς και η ύπαρξη εγγενών ανωμαλιών εντός του ιστού ενδέχεται να επιφέρουν ασυνεπή αποτελέσματα. 3. Υπερβολική ή ατελής αντίχρωση ενδέχεται να υποβαθμίσει την ορθή ερμηνεία των αποτελεσμάτων. 4. Η κλινική ερμηνεία οποιασδήποτε θετικής χρώσης, ή της απουσίας της, πρέπει να αξιολογείται εντός του πλαισίου του κλινικού ιστορικού, της μορφολογίας και άλλων ιστοπαθολογικών κριτηρίων. Η κλινική ερμηνεία οποιασδήποτε χρώσης, ή της απουσίας της, πρέπει να συμπληρώνεται από μορφολογικές μελέτες και κατάλληλους ελέγχους, καθώς και από άλλες διαγνωστικές εξετάσεις. Το αντίσωμα αυτό προορίζεται για χρήση μέσα σε σειρά (panel)αντισωμάτων. Η χρώση του Σελίδα 3 από EL Rev B

4 παρασκευάσματος με τη χρήση αντισωμάτων, αντιδραστηρίων και καταλλήλων μεθόδων, πρέπει να γίνεται με ευθύνη έμπειρου παθολογοανατόμου. Η χρώση πρέπει να πραγματοποιείται σε πιστοποιημένο εργαστήριο υπό την επίβλεψη παθολογοανατόμου ο οποίος είναι και ο υπεύθυνος για την εξέταση των χρωματισμένων αντικειμενοφόρων πλακών καθώς και την επάρκεια των θετικών και των αρνητικών μαρτύρων. 5. Ο οίκος Ventana παρέχει αντισώματα και αντιδραστήρια σε προ-αραιωμένα καταλλήλως και έτοιμα προς χρήση, σύμφωνα με τις παρεχόμενες οδηγίες. Οποιαδήποτε απόκλιση από τις συνιστώμενες διαδικασίες της δοκιμασίας ενδέχεται να ακυρώσει τα αναμενόμενα αποτελέσματα. Κατάλληλοι έλεγχοι πρέπει να διεξάγονται και να τεκμηριώνονται. Οι χρήστες που αποκλίνουν από τις συνιστώμενες διαδικασίες της εξέτασης, αναλαμβάνουν και την ευθύνη της ερμηνείας των αποτελεσμάτων των ασθενών. 6. Τα αντιδραστήρια ενδέχεται να παρουσιάσουν μη αναμενόμενες αντιδράσεις σε ιστούς που εξετάζονται για πρώτη φορά. Η πιθανότητα απροσδόκητων αντιδράσεων ακόμη και σε δοκιμασμένες ομάδες ιστών δεν μπορεί να αποκλειστεί εντελώς, εξαιτίας βιολογικής μεταβλητότητας της έκφρασης του αντιγόνου σε νεοπλασίες, ή άλλους παθολογικούς ιστούς. 4 Επικοινωνήστε με τον τοπικό αντιπρόσωπο του οίκου Ventana, τεκμηριώνοντας κάθε απροσδόκητο αποτέλεσμα. 7. Ιστοί από άτομα μολυσμένα με ιό ηπατίτιδας B που περιέχουν επιφανειακό αντιγόνο ηπατίτιδας B (HBsAg), ενδέχεται να παρουσιάσουν μη ειδική χρώση με υπεροξειδάση του χρένου (horseradish) Όταν χρησιμοποιείται σε βήματα φραγμού (blocking), ο φυσιολογικός ορός, που έχει την ίδια ζωική προέλευση με τον δευτεροταγή αντιορό ενδέχεται να επιφέρει ψευδώς αρνητικά ή ψευδώς θετικές αποτελέσματα, εξαιτίας αυτοαντισωμάτων ή των φυσικών αντισωμάτων. 9. Ψευδώς θετικές αποτελέσματα ενδέχεται να παρουσιαστούν λόγω μη ανοσολογικής σύνδεσης των πρωτεϊνών ή λόγω εμφάνισης αντιδρώντων προϊόντων υποστρώματος (χρωμογόνου). Ψευδώς θετικά αποτελέσματα ενδέχεται επίσης να προκληθούν από δραστηριότητα ψευδο-υπεροξειδάσης (ερυθροκύτταρα), δραστηριότητα ενδογενούς υπεροξειδάσης (κυτόχρωμα C), αλκαλικής φωσφατάσης ή ενδογενούς βιοτίνης (π.χ.: ήπαρ, εγκέφαλος, μαστός, νεφρός) ανάλογα με τον τύπο της ανοσοχρωστικής ουσίας που χρησιμοποιείται Όπως συμβαίνει και με οποιαδήποτε ανοσοϊστοχημική εξέταση, τυχόν αρνητικό αποτέλεσμα σημαίνει ότι το εν λόγω αντιγόνο απλώς δεν ανιχνεύθηκε, και όχι ότι το αντιγόνο απουσιάζει από τα κύτταρα ή τους ιστούς που έχουν εξετασθεί. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΑΝΑΜΕΝΟΜΕΝΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 1. Εφαρμογή της Hematoxylin χρησιμοποιώντας το Ventana automated slide stainer προκαλεί μπλε χρώση της ετεροχρωματίνης στους κυτταρικούς πυρήνες. Ανατρέξτε στο κατάλληλο ένθετο συσκευασίας του Ventana primary antibody για αναμενόμενα αποτελέσματα δειγμάτων ασθενών. Κατάλληλα αποτελέσματα από δείγματαμάρτυρες επαληθεύουν πως τα αντιδραστήρια και το σύστημα λειτουργούν σωστά. 2. Η ευαισθησία εξαρτάται από τη διατήρηση του αντιγόνου. Εάν, κατά την μονιμοποίηση, την τομή, την έγκληση ή την φύλαξη, ο χειρισμός του ιστού δεν είναι ο κατάλληλος και μεταβληθεί η αντιγονικότητά του, η ανίχνευση του με το πρωτοταγές αντίσωμα εξασθενεί και ενδέχεται να επέλθουν ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα. 3. Η επαναληψιμότητα κατά την διεξαγωγή ενός κύκλου οδήγησε σε μπλε χρώση της ετεροχρωματίνης των κυτταρικών πυρήνων στο 100% των περιπτώσεων, στις οποίες εφαρμόστηκε. 4. Η επαναληψιμότητα κατά την διεξαγωγή διαφορετικών κύκλων οδήγησε σε μπλε χρώση της ετεροχρωματίνης των κυτταρικών πυρήνων στο 100% των περιπτώσεων, στις οποίες εφαρμόστηκε. ΑΝΤΙΜΕΤΩΠΙΣΗ ΠΡΟΒΛΗΜΑΤΩΝ 1. Αν ο θετικός μάρτυρας (ιστός) παρουσιάζει ασθενέστερη χρώση από την αναμενόμενη, πρέπει να ελεγχθούν και άλλοι θετικοί μάρτυρες, που χρησιμοποιούνται στον ίδιο κύκλο χρώσεων, για να προσδιοριστεί εάν η ασθενής χρώση οφείλεται στο πρωτοταγές αντίσωμα ή σε ένα από τα κοινά δευτερεύοντα αντιδραστήρια. 2. Αν ο θετικός μάρτυρας δώσει αρνητικό αποτέλεσμα, πρέπει να επιβεβαιωθεί ότι η αντικειμενοφόρος πλάκα φέρει την σωστή ετικέτα γραμμικού κώδικα. Αν η αντικειμενοφόρος έχει τη σωστή σήμανση, άλλοι θετικοί μάρτυρες που εξετάζονται κατά τον ίδιο κύκλο χρώσεων, πρέπει να ελεγχθούν, για να προσδιοριστεί εάν η ασθενής χρώση οφείλεται στο πρωτογενές αντίσωμα ή σε ένα από τα κοινά δευτερεύοντα αντιδραστήρια. Η συλλογή, μονιμοποίηση ή αποπαραφίνωση των ιστών ενδέχεται να έχει γίνει πλημμελώς. Η ορθή διαδικασία πρέπει να ακολουθείται για τη συλλογή, φύλαξη και μονιμοποίηση των ιστών. 1. Αν παρατηρηθεί υπερβολική χρώση υποβάθρου (φόντου), ενδέχεται να υπάρχουν υψηλά επίπεδα ενδογενούς βιοτίνης. Πρέπει να συμπεριληφθεί ένα βήμα φραγμού της βιοτίνης. 2. Αν δεν έχει απομακρυνθεί όλη η παραφίνη, η αποπαραφίνωση πρέπει να επαναληφθεί. 3. Αν η ειδική χρώση με το αντίσωμα είναι υπερβολικά έντονη, η διαδικασία πρέπει να επαναληφθεί με το χρόνο επώασης συντομευμένο κατά 4 λεπτά, όσες φορές χρειάζεται, μέχρι να επιτευχθεί η επιθυμητή ένταση χρώσης. 4. Προς αποφυγήν αποκόλλησης των τομών από τις αντικειμενοφόρους, πρέπει να χρησιμοποιούνται αντικειμενοφόροι θετικά φορτισμένες. 5. Για τις ενδεικνυόμενες διορθωτικές ενέργειες, ανατρέξτε στην ενότητα Διαδικασία Βήμα-προς-Βήμα, στις Οδηγίες Χρήσης του automated slide stainer, ή επικοινωνήστε με τον τοπικό αντιπρόσωπο του οίκου Ventana. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology, 2nd Edition. The C.V. Mosby Company, St. Louis, College of American Pathologists Laboratory Accreditation Program, Anatomic Pathology Checklist, NCCLS. Quality Assurance for Immunocytochemistry: Approved Guideline. NCCLS document MM4-A- (ISBN ). NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA USA, Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: the new era of quality control. Biotech Histochem 66 (4): , Omata M, Liew CT, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen. A possible source of error in immunohistochemistry. Am J Clin Pathol 73 (5): , Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase: part 1. The technique and its pitfalls. Lab Med 14: 767, Gill GW, Frost JK, Miller KA. A new formula for a half-oxidized hematoxylin that neither overstains nor requires differentiation. Acta Cytol 18(4): , ΠΝΕΥΜΑΤΙΚΗ ΙΔΙΟΚΤΗΣΙΑ CONFIRM TM, EZ Prep TM, iview TM και Liquid Coverslip TM αποτελούν εμπορικά σήματα της Ventana Medical Systems, Inc.; BenchMark, ES, Gen II, NexES και Ventana αποτελούν σήματα κατατεθέντα της Ventana Medical Systems, Inc. Καλύπτεται από τις εξής ευρεσιτεχνίες: Αρ. Ευρεσιτ. ΗΠΑ , B1, B1 και αντίστοιχα άλλων χωρών Σελίδα 4 από EL Rev B

5 ΠΛΗΡΟΦΟΡΙΕΣ ΕΠΙΚΟΙΝΩΝΙΑΣ Ventana Medical Systems, Inc E. Innovation Park Drive Tucson, Arizona USA (USA) Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Strasse 116 D Mannheim Germany Σελίδα 5 από EL Rev B