Dako LSAB2 System-HRP. Κωδικός K ml Κωδικός K ml Κωδικός K ml. Προοριζόµενη χρήση Για In Vitro διαγνωστική χρήση.

Transcript

1 Dako LSAB2 System-HRP Κωδικός K ml Κωδικός K ml Κωδικός K ml Προοριζόµενη χρήση Για In Vitro διαγνωστική χρήση. Αυτές οι οδηγίες ισχύουν για το Universal Dako Labelled Streptavidin-Biotin2 System, Horseradish Peroxidase (LSAB2 System, HRP). Το σύστηµα αυτό προορίζεται για χρήση µε πρωτοταγή αντισώµατα ποντικού ή κουνελιού που παρέχονται από το χρήστη για τον ποιοτικό προσδιορισµό αντιγόνων µε κοινό µικροσκόπιο και σε ανοσοϊστοχηµικούς ιστούς εγκλεισµένους σε παραφίνη, κρυοστατικές τοµές ιστών και κυτταρικά παρασκευάσµατα για να βοηθήσουν στην διάγνωση παθολογικών ανωµαλιών. Μπορούν να χρησιµοποιηθούν ιστοί που έχουν υποστεί κατεργασία µε διάφορα µονιµοποιητικά, µεταξύ των οποίων αιθανόλη, B-5, Bouin, φορµαλίνη ψευδαργύρου και φορµαλίνη σε ουδέτερο ρυθµιστικό διάλυµα. Ανατρέξτε στις Γενικές οδηγίες για την ανοσοϊστοχηµική χρώση της Dako ή στις οδηγίες του συστήµατος ανίχνευσης των διαδικασιών IHC για: 1) την Αρχή της διαδικασίας, 2) τα Υλικά που απαιτούνται, αλλά δεν παρέχονται, 3) την Αποθήκευση, 4) την Προετοιµασία δειγµάτων, 5) τη ιαδικασία χρώσης, 6) τον Ποιοτικό έλεγχο, 7) την Αντιµετώπιση προβληµάτων, 8) την Ερµηνεία της χρώσης, 9) τους Γενικούς περιορισµούς. Περίληψη και επεξήγηση Το LSAB2 System, HRP βασίζεται σε µια µετατροπή της τεχνικής σηµασµένης αβιδίνης-βιοτίνης (LAB) στην οποία ένα βιοτινυλιωµένο δευτεροταγές αντίσωµα σχηµατίζει ένα σύµπλοκο µε µόρια στρεπταβιδίνης που είναι συζευγµένα µε υπεροξειδάση 1. Σε σύγκριση µε την µέθοδο ABC, η µέθοδος LAB/LSAB έχει αναφερθεί ότι είναι τέσσερις έως οκτώ φορές πιο ευαίσθητη. 2 Οι Giorno, et al, 2 αποδίδουν την αυξηµένη ευαισθησίαστο µικρότερο µέγεθος των σηµασµένων-ενζύµων καθώς και του σηµασµένου µε ένζυµο συµπλόκου αβιδίνης(στρεπταβιδίνης) της µεθόδου LAB/LSAB όταν συγκρίνεται µε την µέθοδο ABC του ενζυµατικού συµπλόκου αβιδίνης-βιοτίνης. Η κλινική ερµηνεία οποιασδήποτε θετικής χρώσης ή της απουσίας της πρέπει να συµπληρώνεται από µορφολογικές και ιστολογικές µελέτες στους κατάλληλους µάρτυρες. Η αξιολόγηση πρέπει να γίνεται από εξειδικευµένο άτοµο, λαµβάνοντας υπόψη το κλινικό ιστορικό του ασθενούς και άλλες διαγνωστικές εξετάσεις. Αρχές της διαδικασίας Η LSAB2 System, HRP είναι µια ευαίσθητη και µεταβλητή διαδικασία IHC που επιτρέπει την ταυτόχρονη επεξεργασία πολυάριθµων δειγµάτων µε πρωτοταγή αντισώµατα κουνελιού ή ποντικού σε λιγότερο από µια ώρα. Η ενεργότητα της ενδογενούς υπεροξειδάσης καταστέλλεται επωάζοντας το δείγµα για 5 λεπτά µε υπεροξείδιο του υδρογόνου 3%. Στη συνέχεια, το δείγµα επωάζεται µε πρωτοταγές αντίσωµα κουνελιού ή ποντικού, το οποίο προηγουµένως έχουν χαρακτηρισθεί και αραιωθεί κατάλληλα, και µετά χρησιµοποιώντας δύο συνεχόµενες επωάσεις των 10-λεπτών µε βιοτινυλιωµένα αντισώµατα σύνδεσης (περιέχουν ανοσοσφαιρίνες αίγας έναντι ποντικού και έναντι κουνελιού) και στρεπταβιδίνης σηµασµένης µε υπεροξειδάση. Η χρώση ολοκληρώνεται µετά την επώαση µε υπόστρωµα χρωµογόνου (AEC ή DAB). Για AEC σε K0672, είναι µια επώαση επί 10 λεπτά σε 3-αµινο-9-αιθυλκαρβαζόλη (AEC) υπόστρωµα-χρωµογόνο που προκαλεί την κατακρήµνιση ενός ιζήµατος ερυθρού χρώµατος στη θέση του αντιγόνου. Για DAB σε K0673, είναι µια επώαση επί 5-10 λεπτά σε 3,3'- διαµινοβενζιδίνη (DAB) υπόστρωµα-χρωµογόνο που προκαλεί την κατακρήµνιση ενός ιζήµατος ερυθρού χρώµατος στη θέση του αντιγόνου. Αντιδραστήρια που παρέχονται Κωδικός K0672 Τα ακόλουθα υλικά, που επαρκούν για 150 τοµές ιστών, χρησιµοποιώντας 100 µl ανά τοµή, περιλαµβάνονται σε αυτό το κιτ: Ποσότητα Περιγραφή Αποκλεισµός υπεροξειδάσης Υδατικό διάλυµα υπεροξειδίου του υδρογόνου 3%. Αντίσωµα σύνδεσης Σηµασµένη βιοτίνη αποµονώνεται µε συγγένεια ανοσοσφαιρινών αίγας έναντι κουνελιού καθαρισµένες µε χρωµατογραφία συγγένειας σε αλατούχο διάλυµα ρυθµισµένο µε φωσφορικά (PBS), περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και νατραζίδιο 0,015 mol/l. Στρεπταβιδίνη -HRP Στρεπταβιδίνη συζευγµένη σε υπεροξειδάση του χρένου σε PBS που περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και αντιµικροβιακό παράγοντα. ( ) GR_001 σελ. 1/9

2 AEC υπόστρωµα χρωµογόνο AEC σε N,N-διµεθυλοφορµαµίδη (DMF) και οξικό ρυθµιστικό διάλυµα, σε ph 5,0 που περιέχει υπεροξείδιο του υδρογόνου, σταθεροποιητές, ενισχυτές και έναν αντιµικροβιακό παράγοντα. Αποθηκεύστε στους 2 8 C. Code K0673 Τα ακόλουθα υλικά, που επαρκούν για 150 τοµές ιστών, χρησιµοποιώντας 100 µl ανά τοµή, περιλαµβάνονται σε αυτό το κιτ: Ποσότητα Περιγραφή Αποκλεισµός υπεροξειδάσης Υδατικό διάλυµα υπεροξειδίου του υδρογόνου 3%. Βιοτινυλιωµένη σύνδεση Σηµασµένη βιοτίνη αποµονώνεται µε συγγένεια ανοσοσφαιρινών αίγας έναντι κουνελιού καθαρισµένες µε χρωµατογραφία συγγένειας σε αλατούχο διάλυµα ρυθµισµένο µε φωσφορικά (PBS), περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και νατραζίδιο 0,015 mol/l. Στρεπταβιδίνη -HRP Στρεπταβιδίνη συζευγµένη σε υπεροξειδάση του χρένου σε PBS που περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και αντιµικροβιακό παράγοντα. Υπόστρωµα 1x18 ml Ρυθµιστικό διάλυµα ιµιδαζόλης, ph 7,5, περιέχει υπεροξείδιο του υδρογόνου και έναν αντιµικροβιακό παράγοντα. DAB Chromogen 1x1 ml ιάλυµα 3,3'-διαµινοβενζιδίνης σε χρωµογόνο. Εξαρτήµατα 1 Βαθµονοµηµένος δοκιµαστικός σωλήνας 1 Πλαστική πιπέτα Παστέρ Κωδικός K0675(11) Τα ακόλουθα υλικά, που επαρκούν για 1100 τοµές ιστών, χρησιµοποιώντας 100 µl ανά τοµή, περιλαµβάνονται σε αυτό το κιτ: Ποσότητα 1x110 ml Περιγραφή Βιοτινυλιωµένη σύνδεση Σηµασµένη βιοτίνη αποµονώνεται µε συγγένεια ανοσοσφαιρινών αίγας έναντι κουνελιού καθαρισµένες µε χρωµατογραφία συγγένειας σε αλατούχο διάλυµα ρυθµισµένο µε φωσφορικά (PBS), περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και νατραζίδιο 0,015 mol/l. 1x110 ml Στρεπταβιδίνη -HRP Στρεπταβιδίνη συζευγµένη σε υπεροξειδάση του χρένου σε PBS που περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και αντιµικροβιακό παράγοντα. ( ) GR_001 σελ. 2/9

3 Κωδικός K0675(89) Τα ακόλουθα υλικά, είναι συσκευασµένα για χρήση µε το Dako Autostainer (code S3400), και εµπεριέχονται σε αυτό το κιτ: Ποσότητα 10x11 ml Περιγραφή Βιοτινυλιωµένη σύνδεση Σηµασµένη βιοτίνη αποµονώνεται µε συγγένεια ανοσοσφαιρινών αίγας έναντι κουνελιού καθαρισµένες µε χρωµατογραφία συγγένειας σε αλατούχο διάλυµα ρυθµισµένο µε φωσφορικά (PBS), περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και νατραζίδιο 0,015 mol/l. 10x11 ml Στρεπταβιδίνη -HRP Στρεπταβιδίνη συζευγµένη σε υπεροξειδάση του χρένου σε PBS που περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και αντιµικροβιακό παράγοντα. Υλικά που απαιτούνται, αλλά δεν παρέχονται Απορροφητικές χαρτοπετσέτες Αντισώµατα: N-Series Αντισώµατα σειράς Ν έτοιµα προς χρήση ή πυκνά αντισώµατα που αραιώνονται σε Antibody Diluent (κωδικός S0809 ή S3022) Antibody Diluent (κωδικός S0809 ή S3022) Ιστοί µάρτυρες, θετικοί και αρνητικοί Αντίχρωση, σε υδατική βάση, όπως αιµατοξυλίνη Lillie s Modified Mayer s (κωδικός S3309) Καλυπτρίδες Αποσταγµένο νερό Κλίβανος ξήρανσης, µε ικανότητα διατήρησης της θερµοκρασίας στους 60 C η χαµηλότερη. Αιθανόλη, απόλυτη και 95% Κοινό µικροσκόπιο (20x 800x) Μέσο επικάλυψης, όπως το Faramount (κωδικός S3025) ή το Glycergel (κωδικός C0563) Αντιδραστήρια αρνητικών µαρτύρων Αντικειµενοφόροι πλάκες, καλυµµένες µε πολυ-l-λυσίνη ή Silanized Slides (κωδικός S3003) οχεία ή λουτρά χρώσης Χρονόµετρο (µε δυνατότητα µέτρησης χρονικών διαστηµάτων 2 10 λεπτών) οχεία πλύσης Ρυθµιστικό διάλυµα έκπλυσης Ξυλένιο, τολουένιο ή υποκατάστατα ξυλενίου Για το σύστηµα K0675 LSAB2 (110 ml), τα ακόλουθα αντιδραστήρια απαιτούνται επιπρόσθετα µε την παραπάνω λίστα: ιάλυµα υπεροξειδίου του υδρογόνου 3% ή Peroxidase Block (κωδικός S2001) ιάλυµα υπόστρωµα-χρωµογόνο όπως AEC Substrate-Chromogen (κωδικός K3464, 110 ml, έτοιµο προς χρήση) ή Liquid DAB (κωδικός K3466) Προαιρετικά υλικά, δεν παρέχονται Ρυθµιστικά διαλύµατα: Wash buffer (κωδικός S3006) για αυτοµατοποιηµένη και χειροκίνητη χρήση Phosphate buffered saline (κωδικός S3024) Tris-buffered saline (κωδικός S3001 ή S1968) Πρωτεολυτικά Ένζυµα: Pepsin (κωδικός S3002) Proteinase K (κωδικός S3004 ή S3020) Proteolytic Enzyme, RTU (κωδικός S3007) Άλλα: Θετικοί αντικειµενοφόροι µάρτυρες (διαθέσιµοι από τη Dako) Target Retrieval Solution (κωδικός S1699 ή S1700) Target Retrieval Solution, High ph (κωδικός S3307 ή S3308). Target Retrieval Solution, ph 9 (κωδικός S2367 ή S2368). Θάλαµος υγρασίας Υδροξείδιο του αµµωνίου 15 mol/l αραιωµένο σε 0,037 mol/l Προφυλάξεις Ειδικά για το Προϊόν 1. Για επαγγελµατίες χρήστες. 2. Το προϊόν αυτό περιέχει νατραζίδιο (NaN 3), µια ιδιαίτερα τοξική χηµική ουσία σε καθαρή µορφή. Στις συγκεντρώσεις του προϊόντος, παρόλο που δεν έχει ταξινοµηθεί ως επικίνδυνο, το νατραζίδιο ενδέχεται να αντιδράσει µε τις µολύβδινες ή χάλκινες υδραυλικές σωληνώσεις και να δηµιουργήσει ιδιαίτερα εκρηκτικές εναποθέσεις µεταλλικών αζιδίων. Κατά την απόρριψη, ξεπλύνετε µε άφθονο νερό για να αποτρέψετε τον σχηµατισµό αζιδίων στις σωληνώσεις. 3,4 3. Το AEC και DAB υπόστρωµα-χρωµογόνο είναι ευαίσθητο στη µόλυνση από διάφορους οξειδωτικούς παράγοντες, όπως µέταλλα, βακτήρια, σκόνη και τα κοινά υαλικά του εργαστηρίου. Προς αποφυγήν µολύνσεως και πρόωρης λήξης του προϊόντος, αποφεύγετε την έκθεση του διαλύµατος AEC ή του DAB σε οποιαδήποτε πιθανή µολυσµατική πηγή και ποτέ µην αναρροφάτε το ( ) GR_001 σελ. 3/9

4 προϊόν απευθείας από τη φιάλη. Αδειάστε την απαιτούµενη ποσότητα σε ένα καθαρό δοχείο και αναρροφήστε το από εκεί. Μην επιστρέφετε την περίσσεια του διαλύµατος AEC ή του DAB στο αρχικό δοχείο φύλαξης. 4. Τα αντιδραστήρια που παρέχονται είναι βέλτιστα αραιωµένα. Περαιτέρω αραίωση ενδέχεται να έχει ως αποτέλεσµα την απώλεια χρώσης του αντιγόνου. Οποιεσδήποτε τέτοια αλλαγή πρέπει να εξακριβώνονται από το χρήστη. ιαφορές στην επεξεργασία ιστού και στις τεχνικές διαδικασίες στο εργαστήριο του χρήστη ενδέχεται να προκαλέσουν σηµαντικές διακυµάνσεις στα αποτελέσµατα, επιβάλλοντας την τακτική εξέταση εσωτερικών µαρτύρων σε κάθε εργαστήριο. 5. Μην υποκαθιστάτε αντιδραστήρια από άλλους αριθµούς παρτίδας ή από κιτ άλλων κατασκευαστών. 6. Χρόνοι επώασης ή θερµοκρασίες διαφορετικές από εκείνες που καθορίζονται ενδέχεται να δώσουν εσφαλµένα αποτελέσµατα. Οποιεσδήποτε τέτοιες αλλαγές πρέπει να επικυρώνονται από τον χρήστη. 7. Τα ένζυµα και τα χρωµογόνα ενδέχεται να επηρεαστούν αρνητικά αν εκτεθούν υπερβολικά στο φως. Μην φυλάσσετε τα εξαρτήµατα του κιτ ή µην πραγµατοποιείτε τη χρώση σε δυνατό φως, όπως το άµεσο ηλιακό φως. Γενικά 1. Όπως ισχύει για κάθε προϊόν βιολογικής προέλευσης, πρέπει να εφαρµόζονται οι δέουσες διαδικασίες χειρισµού. 2. Ελαχιστοποιείστε την µικροβιακή µόλυνση των αντιδραστηρίων ή λανθασµένα αποτελέσµατα µπορεί να προκύψουν. 3. Αποφύγετε τις πιτσιλιές των αντιδραστηρίων ή την δηµιουργία αερολυµάτων. 4. Ως γενικός κανόνας, δεν επιτρέπεται σε άτοµα κάτω των 18 ετών να εργάζονται µε το προϊόν αυτό. Οι χρήστες πρέπει να λαµβάνουν οδηγίες για τη σωστή διαδικασία εργασίας, τις επικίνδυνες ιδιότητες του προϊόντος και τις απαραίτητες οδηγίες ασφαλείας. 5. Πρέπει να φοράτε κατάλληλο εξοπλισµό προσωπικής προστασίας για να αποφύγετε την επαφή µε τα µάτια και το δέρµα. Οι αχρησιµοποίητες ποσότητες αντιδραστηρίου πρέπει να απορρίπτονται σύµφωνα µε τους τοπικούς, κρατικούς και οµοσπονδιακούς κανονισµούς. 6. Το Φύλλο δεδοµένων ασφαλείας διατίθεται σε επαγγελµατίες χρήστες κατόπιν αιτήµατος. ηλώσεις κινδύνου και ασφάλειας K Χρωµογόνο υπόστρωµα AEC έτοιµο προς χρήση: 1-<10% N,N-διµεθυλοφορµαµίδη / Σύµβολο κινδύνου: Τοξικό R61 S35 S45 S53 Ενδέχεται να βλάψει το αγέννητο βρέφος. Το υλικό αυτό και το δοχείο του πρέπει να απορρίπτονται µε ασφαλή τρόπο. Σε περίπτωση ατυχήµατος ή αδιαθεσίας, ζητήστε αµέσως ιατρική βοήθεια (δείξτε την ετικέτα όπου είναι αυτό εφικτό). Αποφεύγετε την έκθεση εφοδιαστείτε µε τις ειδικές οδηγίες πριν από τη χρήση. Η χρήση του επιτρέπεται µόνο σε επαγγελµατίες χρήστες. K χρωµογόνο DAB: Τετραχλωριούχο διφαινυλο-3,3,4,4 -τετραϋλτετραµµώνιο 1-5% / Σύµβολο κινδύνου: Επιβλαβές R40 Περιορισµένες ενδείξεις καρκινογόνου δράσεως. R43 Η επαφή µε το δέρµα µπορεί να προκαλέσει ευαισθητοποίηση. R68 Πιθανός κίνδυνος µη αναστρέψιµων παρενεργειών. S35 Το υλικό αυτό και το δοχείο του πρέπει να απορρίπτονται µε ασφαλή τρόπο. S36/37 Φοράτε τον κατάλληλο προστατευτικό ρουχισµό και γάντια. Αποθήκευση Τα αντιδραστήρια του LSAB2 System, HRP πρέπει να αποθηκεύονται σε 2 8 C. Μην τα καταψύχετε. Μην το χρησιµοποιείτε µετά την ηµεροµηνία λήξης που είναι τυπωµένη στα φιαλίδια των αντιδραστηρίων και στην ετικέτα του κιτ. Αν τα αντιδραστήρια αποθηκευτούν κάτω από οποιεσδήποτε άλλες συνθήκες από αυτές που έχουν οριστεί, πρέπει να επικυρωθούν από τον χρήστη. 5 Τα διαλύµατα υποστρώµατος-χρωµογόνου AEC και DAB είναι ασταθή σε θερµοκρασίες µεγαλύτερες από 8 C. Χρησιµοποιείτε και αποθηκεύστε τα διαλύµατα υποστρώµατος-χρωµογόνου AEC και DAB στο συνιστώµενο φάσµα θερµοκρασιών των 2 8 C. Αυτά τα διαλύµατα µπορεί να χρησιµοποιηθούν αµέσως µετά την αφαίρεσή τους από το ψυγείο. Αµέσως µετά από τη χρήση, αποθηκεύστε τα σε θερµοκρασία 2 8 C το γρηγορότερο. εν υπάρχουν ορατά σηµάδια που να υποδεικνύουν έλλειψη σταθερότητας των προϊόντων αυτών. Για το λόγο αυτό, οι θετικοί και αρνητικοί µάρτυρες πρέπει να εξετάζονται ταυτόχρονα µε τα δείγµατα ασθενών. Αν παρατηρηθεί µη αναµενόµενη χρώση, που δεν µπορεί να εξηγηθεί από την ποικιλία των εργαστηριακών διαδικασιών και αν υπάρχουν υποψίες για πρόβληµα στο κιτ, επικοινωνήστε µε το Τµήµα Τεχνικής Υποστήριξης της Dako. Προετοιµασία αντιδραστηρίου Είναι βολικό να προετοιµαστούν τα παρακάτω αντιδραστήρια πριν από τη χρώση. Ρυθµιστικό διάλυµα έκπλυσης Το συνιστώµενο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης για τον αυτοµατοποιηµένο και χειροκίνητο IHC εντοπισµό είναι το TBST, 0,05 mol/l Tris Buffered Saline with Tween (κωδικός S3006). Για χειροκίνητη χρώση, κατάλληλα είναι και τα TBS, 0,05 mol/l Tris Buffered Saline (κωδικός S1968), και το PBS, 0,02 mol/l Phosphate Buffered Saline (κωδικός S3024). εν συνιστώνται τα ρυθµιστικά διαλύµατα πλύσης που περιέχουν νατραζίδιο. Το νατραζίδιο αδρανοποιεί την υπεροξειδάση του χρένου (HRP) µε αποτέλεσµα να υπάρχει αρνητική χρώση. Αποθηκεύετε το αχρησιµοποίητο ρυθµιστικό διάλυµα στους 2 8 C. Απορρίψτε το ρυθµιστικό διάλυµα αν έχει νεφελώδη εµφάνιση. Για την έκπλυση του αποκλεισµού του υπεροξειδίου υδρογόνου, του υποστρώµατος και της αντίχρωσης µπορείτε να χρησιµοποιείτε αποσταγµένο νερό. ( ) GR_001 σελ. 4/9

5 Πρωτοταγές αντίσωµα Ένα ευρύ φάσµα των N-Series Ready-to-use Primary Antibodies και των Negative Control Reagents είναι διαθέσιµο για χρήση µε τα συστήµατα LSAB2. Πυκνά διαλύµατα των αντισωµάτων είναι επίσης διαθέσιµα από την Dako, ωστόσο, βέλτιστα αραιωτικά πρέπει να οριστούν µέσω πειραµάτων από τον χρήστη. Οι αραιώσεις πρέπει να προετοιµάζονται µε Antibody Diluent (κωδικός S0809) που περιέχει ή κάποιο αραιωτικό που περιέχει ρυθµιστικό διάλυµα Tris-HCl 0,05 mol/l, ph 7,2-7,6 µαζί µε αλβουµίνη βοείου ορού (BSA) 1%. Το BSA λειτουργεί ως αποκλεισµός πρωτεΐνης και εξαλείφει την ανάγκη για ξεχωριστή επώαση µε αντιδραστήριο αποκλεισµού πρωτεΐνης. Antibody Diluent with Background Reducing Components (κωδικός S3022) είναι επίσης κατάλληλο για χρήση ως αραιωτικό. Αραιωτικά χωρίς φορέα πρωτεΐνης δεν συνιστώνται. Για τα περισσότερα πρωτοταγή αντισώµατα που χρησιµοποιούνται µε τα συστήµατα LSAB2, µια επώαση των 10 λεπτών είναι επαρκής. Αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα Ιδανικά, ένα αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα περιέχει ένα αντίσωµα που εµφανίζει µη ειδική δραστικότητα µε ανθρώπινους ιστούς (µη ανθρωπίνως δραστικό) στην ίδια µήτρα/διάλυµα µε το πρωτοταγές αντίσωµα. Το µη ανθρωπίνως δραστικό αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα πρέπει να είναι της ίδιας υποκατηγορίας και είδους ζώου µε το πρωτοταγές αντίσωµα, αραιωµένο στην ίδια συγκέντρωση ανοσοσφαιρίνης ή πρωτεΐνης όπως και το αραιωµένο πρωτοταγές αντίσωµα χρησιµοποιώντας το ίδιο αραιωτικό. Ανάλογα µε τον τύπο του πρωτοταγούς αντισώµατος/ αντιορού που χρησιµοποιείται, φυσιολογικό/µη ανοσοποιηµένο ορό από τα ίδια είδη όπως σε ισοδύναµη συγκέντρωση πρωτεΐνης όπως το αραιωµένο πρωτοταγές στο ίδιο αραιωτικό µπορεί να είναι κατάλληλο για χρήση. Η περίοδος επώασης του αντιδραστηρίου αρνητικού µάρτυρα πρέπει να αντιστοιχεί σε αυτήν του πρωτοταγούς αντισώµατος/αντιορού. Όταν χρησιµοποιείτε τα Dako N-Series ready-to-use antibodies, συνιστούµε ως αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα το Universal Negative Control(s). Οι παραπάνω µάρτυρες είναι βελτιστοποιηµένοι για τη χρήση µε τα N-Series ready-to-use antibodies είτε ποντικού (κωδικός N1698) είτε κουνελιού (κωδικός N1699). ιάλυµα χρωµογόνου-υποστρώµατος Το σύστηµα K0672 LSAB2 περιέχει έτοιµο για χρήση AEC, το οποίο είναι έτοιµο να εφαρµοστεί σε ιστό ή σε κυτταρικά δείγµατα. Το σύστηµα K0673 LSAB2 περιέχει DAB το οποίο προετοιµάζεται ως εξής: Προσθέστε 1 σταγόνα (ή 20 µl) χρωµογόνου DAB σε κάθε ml ρυθµιστικού διαλύµατος υποστρώµατος. Χρησιµοποιήστε τον ογκοµετρικό δοκιµαστικό σωλήνα που παρέχεται για να µετρήσετε την ποσότητα του Substrate Buffer που χρειάζεται. Αναµείξτε και απλώστε το διάλυµα χρησιµοποιώντας την πιπέτα µεταφοράς που παρέχεται. Μετά την χρήση, ξεπλύνετε καλά τον ογκοµετρικό δοκιµαστικό σωλήνα και την πιπέτα µε αποσταγµένο νερό. Το αχρησιµοποίητο ενεργό διάλυµα DAB είναι σταθερό για µέχρι και 2 εβδοµάδες εάν αποθηκευτεί σε 2 8 C. Εάν σχηµατιστεί ίζηµα, ανακατέψτε καλά πριν την χρήση. Ready-to-use AEC Substrate-Chromogen Solution (κωδικός K3464, 110 ml) ή Liquid DAB (κωδικός K3466) συνιστώνται για χρήση µε το LSAB2 System, HRP, 110 ml (κωδικός K0675). Ακολουθήστε τις οδηγίες που παρέχονται µε κάθε σύστηµα υποστρώµατος-χρωµογόνου για προετοιµασία υποστρώµατος-χρωµογόνου. Αντίχρωση Το χρωµογόνο DAB αποδίδει ένα αδιάλυτο τελικό προϊόν αλκοόλης και µπορεί να χρησιµοποιηθεί µε µια αιµατοξυλίνη µε βάση αλκοόλης. Όταν το υπόστρωµα χρωµογόνου AEC χρησιµοποιείται, το έγχρωµο τελικό προϊόν της αντίδρασης χρώσης είναι διαλυτό στις αλκοόλες και γι αυτό πρέπει να χρησιµοποιείται µε αντιχρώσεις υδατικής βάσης µόνον, όπως η αιµατοξυλίνη του Mayer. Μετά την αντίχρωση µε αιµατοξυλίνη, ξεπλύνετε µε αποσταγµένο νερό και στη συνέχεια βυθίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες του ιστού σε λουτρό υδατικής αµµωνίας 0,037 mol/l. Το υδατικό διάλυµα αµµωνίας 0,037 mol/l παρασκευάζεται µε ανάµιξη 2,5 ml (πυκνό διάλυµα) υδροξειδίου της αµµωνίας 15 mol/l σε 1 λίτρο νερού. Το αχρησιµοποίητο υδατικό διάλυµα της αµµωνίας 0,037 mol/l µπορεί να αποθηκευτεί σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) έως και 12 µήνες, µέσα σε µια καλά πωµατισµένη φιάλη. Για τις εναλλακτικές διαδικασίες αντίχρωσης, συµβουλευτείτε τις κατευθυντήριες οδηγίες των κατασκευαστών. Υλικό επικάλυψης Το Faramount Aqueous Mounting Medium έτοιµο προς χρήση (κωδικός S3025) ή το Glycergel Mounting Medium (κωδικός C0563) συνιστάται για υδατική επικάλυψη. Πριν χρησιµοποιήσετε το Glycergel, υγροποιήστε το, ζεσταίνοντάς το στους 40 ±5 C περίπου. Προετοιµασία δειγµάτων Ανατρέξτε στις General Instructions for Immunohistochemical Staining (Γενικές οδηγίες για την ανοσοϊστοχηµική χρώση) ή/και στο φύλλο προδιαγραφών του αντισώµατος. Πριν από τη χρώση IHC, οι ιστοί πρέπει να έχουν µονιµοποιηθεί και υποστεί κατεργασία. Η µονιµοποίηση αποτρέπει την αυτόλυση και σήψη των ιστών µετά την εκτοµή τους, διατηρεί την αντιγονικότητα, αυξάνει τον δείκτη διαθλάσεως των συστατικών του ιστού και ενισχύει την αντίσταση των κυτταρικών στοιχείων στην κατεργασία του ιστού. Η κατεργασία του ιστού περιλαµβάνει αφυδάτωση, διαύγαση των παραγόντων αφυδάτωσης, διήθηση στο µέσον έγκλεισης, έγκλειση και κοπή των ιστών. Τα πλέον κοινά µέσα µονιµοποίησης για παρασκευάσµατα ιστών IHC αναφέρονται στο General Instructions for Immunohistochemical Staining (Γενικές οδηγίες για ανοσοϊστοχηµική χρώση). Τα παρόντα ισχύουν µόνο ως κατευθυντήριες οδηγίες. Οι βέλτιστες διαδικασίες πρέπει να καθορίζονται και να επαληθεύονται από τον χρήστη. ιαδικασία χρώσης Σηµειώσεις διαδικασίας Πριν από τη χρήση, ο χρήστης οφείλει να διαβάσει τις οδηγίες αυτές προσεκτικά και να εξοικειωθεί µε τα περιεχόµενα του συστήµατος. Τα αντιδραστήρια και οι οδηγίες που παρέχονται στο σύστηµα αυτό έχουν σχεδιαστεί για βέλτιστη απόδοση. Η περαιτέρω αραίωση των αντιδραστηρίων του συστήµατος ή η αλλαγή των χρόνων επώασης ή θερµοκρασιών, µπορεί να δώσουν εσφαλµένα αποτελέσµατα. Πριν από την ανοσοχρώση, όλα τα αντιδραστήρια του συστήµατος εκτός του υποστρώµατος χρωµογόνου AEC πρέπει να ισορροπούν σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). Οµοίως, όλες οι επωάσεις πρέπει να πραγµατοποιούνται σε θερµοκρασία δωµατίου. Για λόγους ευκολίας, το AEC υπόστρωµα χρωµογόνου µπορεί να χρησιµοποιηθεί αµέσως µετά την αφαίρεσή του από το ( ) GR_001 σελ. 5/9

6 ψυγείο χωρίς να χρειάζεται να επανέλθει σε θερµοκρασία δωµατίου πριν τη χρήση. Επαναφέρετέ το σε θερµοκρασία 2 8 C µετά την χρήση. Η φύλαξη σε θερµοκρασίες άνω των 8 C επηρεάζει αρνητικά τη σταθερότητα του AEC υποστρώµατος-χρωµογόνου. Κατά τη διαδικασία της χρώσης, µην αφήνετε τις τοµές των ιστών να στεγνώσουν. Οι στεγνές τοµές ιστών ενδέχεται να παρουσιάσουν αυξηµένη µη ειδική χρώση. Καλύψτε τις αντικειµενοφόρους που είναι εκτεθειµένες σε ρεύµατα αέρος. Σε περίπτωση που εφαρµόζετε παρατεταµένους χρόνους επώασης, τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρους σε περιβάλλον µε υγρασία. Εάν πρέπει να διακόψετε τη διαδικασία χρώσης, µπορείτε µετά την επώαση του πρωτοταγούς αντισώµατος (βήµα 3) να φυλάξετε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε λουτρό ρυθµιστικού διαλύµατος επί µια ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) χωρίς να επηρεαστεί η απόδοση της χρώσης. Η ευαισθησία του LSAB2 System, HRP µπορεί να αυξηθεί και άλλο, παρατείνοντας τους χρόνους των βηµάτων 2, 3 και 4 για 30 ±5 λεπτά στο καθένα. Πρωτόκολλο χρώσης ΒΗΜΑ 1 ΑΠΟΚΛΕΙΣΜΟΣ ΥΠΕΡΟΞΕΙ ΑΣΗΣ Κτυπήστε για να αφαιρεθεί η περίσσεια του υγρού. Χρησιµοποιώντας ύφασµα χωρίς χνούδι (όπως το Kimwipe ή γάζα), σκουπίστε προσεκτικά γύρω από το δείγµα για να αφαιρέσετε τυχόν υπόλειµµα νερού και για να διατηρήσετε τα αντιδραστήρια εντός της καθορισµένης περιοχής. Προσθέστε αρκετό από το διάλυµα αποκλεισµού υπεροξειδάσης ώστε να καλυφθεί το δείγµα. Επωάστε επί 5 (±1) λεπτά. Ξεπλύνετε ήπια µε αποσταγµένο νερό ή µε ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης από υδροβολέα (µην εστιάζετε τη ροή του υγρού ακριβώς πάνω στον ιστό) και τοποθετήστε το σε λουτρό µε πρόσφατα παρασκευασµένο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης. ΒΗΜΑ 2 ΠΡΩΤΟΤΑΓΕΣ ΑΝΤΙΣΩΜΑ Ή ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΟ ΑΡΝΗΤΙΚΟΥ ΜΑΡΤΥΡΑ Κτυπήστε ελαφρά για να αποµακρύνετε την περίσσεια του υγρού και σκουπίστε τις αντικειµενοφόρους όπως παραπάνω. Χρησιµοποιείστε επαρκή ποσότητα πρωτογενούς αντισώµατος ή αντιδραστηρίου αρνητικού µάρτυρα ώστε να καλύψετε το δείγµα. Επωάστε επί 10 (±1) λεπτά. Ξεπλύνετε ήπια µε ρυθµιστικό διάλυµα από υδροβολέα (µην εστιάζετε τη ροή του υγρού ακριβώς πάνω στον ιστό) και τοποθετήστε το σε λουτρό µε πρόσφατα παρασκευασµένο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης. ΒΗΜΑ 3 ΒΙΟΤΙΝΥΛΙΩΜΕΝΗ ΣΥΝ ΕΣΗ Κτυπήστε ελαφρά αµέσως για να αποµακρύνετε την περίσσεια ρυθµιστικού διαλύµατος και σκουπίστε τις αντικειµενοφόρους όπως προηγουµένως. Εφαρµόστε επαρκείς σταγόνες YELLOW από το αντίσωµα σύνδεσης για να καλύψουν το δείγµα. Επωάστε επί 10 (±1) λεπτά. Ξεπλύνετε τις αντικειµενοφόρους όπως στο βήµα 2. Εάν πρέπει να διακόψετε τη διαδικασία χρώσης, µπορείτε µετά την επώαση του πρωτοταγούς αντισώµατος (βήµα 3) να φυλάξετε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε λουτρό ρυθµιστικού διαλύµατος επί µια ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) χωρίς να επηρεαστεί η απόδοση της χρώσης. ΒΗΜΑ 4 Στρεπταβιδίνη -HRP Σκουπίστε τις αντικειµενοφόρους όπως παραπάνω. Εφαρµόστε επαρκείς σταγόνες RED από την στρεπταβιδίνη για να καλύψουν το δείγµα. Επωάστε επί 10 (±1) λεπτά. Ξεπλύνετε την αντικειµενοφόρο όπως παραπάνω ΒΗΜΑ 5 ΙΑΛΥΜΑ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ-ΧΡΩΜΟΓΟΝΟΥ Αφαιρέστε τα διαλύµατα υποστρώµατος AEC ή DAB - χρωµογόνου από την αποθήκευση 2 8 C. Για προετοιµασία του DAB, ανατρέξτε στην ενότητα Reagent Preparation. Σκουπίστε την αντικειµενοφόρο όπως παραπάνω. Απλώστε επαρκές διάλυµα υποστρώµατος AEC ή DAB - χρωµογόνου για να καλύψει το δείγµα. Επιστρέψτε το υπόστρωµα AEC ή DAB - χρωµογόνου σε κατάψυξη. Επωάστε επί 10 (±1) λεπτά για AEC και 5 10 λεπτά για DAB. Ξεπλύνετε απαλά µε αποσταγµένο νερό από υδροβολέα (µην εστιάσετε τη ροή του υγρού κατευθείαν επάνω στον ιστό). Συλλέξτε τα απόβλητα υποστρώµατος χρωµογόνου AEC ή DAB σε δοχείο επικίνδυνων υλικών για σωστή απόρριψη. ΒΗΜΑ 6 ΑΝΤΙΧΡΩΣΗ ΑΙΜΑΤΟΞΥΛΙΝΗΣ (ΠΡΟΑΙΡΕΤΙΚΗ) Βυθίστε τις αντικειµενοφόρους σε λουτρό αιµατοξυλίνης. Επωάστε για δυο έως πέντε ( 2 5) λεπτά, ανάλογα µε την περιεκτικότητα της αιµατοξυλίνης που χρησιµοποιείτε. Ξεπλύνετε ήπια σε λουτρό αποσταγµένου νερού. Βυθίστε 10 φορές τις αντικειµενοφόρους µέσα σε λουτρό µε υδατικό διάλυµα αµµωνίας(προαιρετικό) 0,037 mol/l. Ξεπλύνετε τις αντικειµενοφόρους σε λουτρό µε αποσταγµένο ή απιονισµένο νερό, για δυο έως πέντε ( 2 5) λεπτά. ΒΗΜΑ 7 ΕΠΙΚΑΛΥΨΗ Τα δείγµατα µπορούν να επικαλυφθούν και να καλυφθούν µε καλυπτρίδα µε υδατικό µέσο επικάλυψης, όπως το Faramount (κωδικός S3025), ή το Glycergel (κωδικός C0563). Σηµείωση: Το προϊόν της αντίδρασης του AEC είναι διαλυτό στους οργανικούς διαλύτες και ως εκ τούτου δεν είναι συµβατό µε υλικά µόνιµης επικάλυψης που έχουν ως βάση το τολουένιο ή το ξυλένιο. Σηµείωση: Το DAB µπορεί να τοποθετείται µε οποιαδήποτε µέσα µόνιµης επικάλυψης. Σηµείωση: Οι αντικειµενοφόροι µπορούν να παρατηρηθούν όποτε χρειάζεται. Ωστόσο, αν οι αντικειµενοφόροι εκτεθούν σε δυνατό φως για περίοδο µεγαλύτερη από µία εβδοµάδα, µπορεί να υπάρξει µικρός αποχρωµατισµός. Για να ελαχιστοποιήσετε τον αποχρωµατισµό, αποθηκεύστε τις αντικειµενοφόρους στο σκοτάδι και σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). ( ) GR_001 σελ. 6/9

7 Ποιοτικός έλεγχος ιαφορές στην επεξεργασία ιστού και στις τεχνικές διαδικασίες στο εργαστήριο του χρήστη ενδέχεται να προκαλέσουν σηµαντικές διακυµάνσεις στα αποτελέσµατα, επιβάλλοντας την τακτική εξέταση εσωτερικών µαρτύρων σε κάθε εργαστήριο. Για επιπλέον πληροφορίες, συµβουλευτείτε τις κατευθυντήριες οδηγίες του College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry και τις βιβλιογραφικές αναφορές 6 8. Ανατρέξτε στο ένθετο συσκευασίας του εκάστοτε πρωτοταγούς αντισώµατος για πληροφορίες σχετικά µε την ευαισθησία και την ανοσοδραστικότητα. Ανατρέξτε στις General Instructions for Immunohistochemical Staining για περαιτέρω πληροφορίες σχετικά µε τους θετικούς και αρνητικούς µάρτυρες. Ερµηνεία της χρώσης Ανατρέξτε στις General Instructions for Immunohistochemical Staining για τις κατευθυντήριες οδηγίες ερµηνείας. Γενικοί περιορισµοί Ανατρέξτε στις General Instructions for Immunohistochemical Staining για τους γενικούς περιορισµούς. Ειδικοί περιορισµοί προϊόντος Η Dako παρέχει αντιδραστήρια συστήµατος LSAB2 µε βέλτιστη αραίωση για χρήση ακολουθώντας της οδηγίες που παρέχονται για IHC ε τοµές ιστών µονιµοποιηµένες σε φορµαλίνη και εγκλεισµένες σε παραφίνη, κρυοστατικές και επιχρίσµατα αίµατος. Κάθε απόκλιση από προτεινόµενες διαδικασίες ελέγχου µπορεί να ακυρώσει αναµενόµενα αποτελέσµατα. Κατάλληλοι µάρτυρες µπορούν να χρησιµοποιηθούν και να τεκµηριωθούν. Χρήστες που αποκλίνουν από τις προτεινόµενες διαδικασίες ελέγχου πρέπει να αναλάβουν την ευθύνη της ερµηνείας των αποτελεσµάτων των ασθενών κάτω από αυτές τις συνθήκες. Ενδογενής ενεργότητα δέσµευσης αβιδίνης (EABA) έχει παρατηρηθεί σε κατεψυγµένες τοµές του ήπατος (ολικό ηπατικό οζίδιο) και νεφρών (σωληνώδους επιθηλίου) όπως επίσης και σε κατεψυγµένα και σε λεµφικούς ιστούς που έχουν µονιµοποιηθεί σε φορµαλίνη (παραφλοιϊκά ιστιοκύτταρα) Η EABA µπορεί να κατασταλεί µε 20-λεπτη επώαση, αρχικά µε αβιδίνη 0,1% και µετά µε βιοτίνη 0,01% σε ρυθµιστικό διάλυµα Tris-HCl 0,05 M, ph 7,2 7,6, πριν την χρώση ή την χρήση του Biotin Blocking System (κωδικός X0590). Ενεργότητα ενδογενούς υπεροξειδάσης ή ψευδοϋπεροξειδάσης µπορεί να βρεθεί σε αιµοπρωτεΐνες όπως αιµοσφαιρίνη, µυοσφαιρίνη, κυτόχρωµα και καταλάση, καθώς και στα ηωσινόφιλα. 13,14 Η ενεργότητα αυτή µπορεί να ανασταλεί επωάζοντας τα δείγµατα σε υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% επί πέντε λεπτά πριν από την εφαρµογή του πρωτογενούς αντισώµατος. Επιχρίσµατα αίµατος και µυελού των οστών και κατεψυγµένοι ιστοί είναι δυνατόν να υποστούν επεξεργασία µε Peroxidase Blocking Reagent (κωδικός S2001). Ωστόσο, η παραπάνω διαδικασία δεν εξαλείφει την κοκκινωπή-καφέ χρώση των αιµοπρωτεΐνών. Εναλλακτικά µπορεί να χρησιµοποιηθεί ένα διάλυµα µεθανόληςυπεροξειδίου του υδρογόνου. Με την παραπάνω διαδικασία υπάρχει το ενδεχόµενο µετουσίωσης ορισµένων αντιγόνων. Τα αντιδραστήρια µπορεί να παρουσιάσουν µη αναµενόµενες αντιδράσεις σε ιστούς που δεν έχουν ποτέ εξεταστεί. Η πιθανότητα µη αναµενόµενων αντιδράσεων, ακόµα και σε οµάδες ιστών που έχουν εξεταστεί προηγουµένως, δεν µπορεί να εξαλειφθεί πλήρως λόγω της βιολογικής διακύµανσης που εµφανίζουν οι νεοπλασίες ή άλλοι παθολογικοί ιστοί στην έκφραση των αντιγόνων. 8 Επικοινωνήστε µε την τεχνική υποστήριξη της Dako µε πιστοποιηµένες µη αναµενόµενες αντιδράσεις. Ιστοί από άτοµα που έχουν µολυνθεί µε τον ιό της ηπατίτιδας Β και περιέχουν το επιφανειακό αντιγόνο της ηπατίτιδας Β (HBsAg) ενδέχεται να εµφανίζουν µη ειδική χρώση µε την υπεροξειδάση του χρένου. 15 Επίλυση προβληµάτων Πρόβληµα Πιθανή αιτία Προτεινόµενη αντιµετώπιση 1. Καµία χρώση 1a. Τα αντιδραστήρια δεν 1a. Επανεξετάστε την χορήγηση οποιασδήποτε αντικειµενοφόρου. χρησιµοποιήθηκαν µε τη σωστή σειρά. αντιδραστηρίων. 2. Ασθενής χρώση όλων των αντικειµενοφόρων. 1b. Νατραζίδιο στο λουτρό µε το ρυθµιστικό διάλυµα. 1c. Αντιδραστήριο υποστρώµατοςχρωµογόνου αναµίχθηκε λανθασµένα. 2a. Οι τοµές κατακρατούν πάρα πολύ διάλυµα µετά το λουτρό πλύσης. 2b. Οι αντικειµενοφόροι δεν επωάστηκαν αρκετά µε τα αντιδραστήρια. 2c. Ασύµβατη αντίχρωση ή µέσο επικάλυψης που διαλύει το προϊόν αντίδρασης. 1b. Χρησιµοποιήστε νωπό ρυθµιστικό διάλυµα χωρίς νατραζίδιο. 1c. Φτιάξτε ένα νέο διάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου σύµφωνα µε το πρωτόκολλο του κιτ 2a. Κτυπήστε ελαφρά για να αποµακρυνθεί η περίσσεια διαλύµατος πριν σκουπίσετε γύρω από την τοµή. 2b. Επανεξετάστε τους προτεινόµενους χρόνους επώασης. 2c. Για αντικειµενοφόρους ανοσοχρωµατισµένες µε AEC, χρησιµοποιήστε µόνο αντιχρώσεις και υλικά µόνιµης επικάλυψης µε υδατική βάση. ( ) GR_001 σελ. 7/9

8 3. Υπερβολική χρώση υποβάθρου όλων των αντικειµενοφόρων, συµπεριλαµβανο- µένων των αρνητικών αντικειµενοφόρων- µαρτύρων. 4. Οι τοµές του ιστού αποκολλήθηκαν από τις αντικειµενοφόρους. 5. Υπερβολικά ισχυρή ειδική χρώση. 3a. Τα δείγµατα εµφανίζουν υψηλή ενεργότητα ενδογενούς υπεροξειδάσης. 3b. Η παραφίνη δεν έχει αφαιρεθεί πλήρως. 3c. Οι αντικειµενοφόροι δεν ξεπλύθηκαν σωστά. 3d. Αντίδραση υποστρώµατος ταχύτερη από το κανονικό λόγω υπερβολικά υψηλής θερµοκρασίας δωµατίου. 3e. Οι τοµές στέγνωσαν κατά τη διάρκεια της διαδικασίας χρώσης. 3f. εν υπάρχει ειδική πρόσδεση των αντιδραστηρίων στην τοµή του ιστού. 3g. Πολύ πυκνό διάλυµα πρωτοταγούς αντισώµατος. 4a. Χρήση λάθος τύπου αντικειµενοφόρων. 5a. Πολύ πυκνό διάλυµα πρωτοταγούς αντισώµατος. 5b. Η επώαση για πρωτοταγές αντίσωµα, η βιοτινυλιωµένη σύνδεση ή η στρεπταβιδίνη HRP διαρκεί πολύ. 3a. Επωάστε τις αντικειµενοφόρους µε ένα νωπό υπεροξείδιο του υδρογόνου. 3b. Χρησιµοποιήστε λουτρό µε πρόσφατα παρασκευασµένο διάλυµα ξυλενίου ή τολουενίου. 3c. Χρησιµοποιήστε πρόσφατα διαλύµατα σε λουτρά ρυθµιστικού διαλύµατος και λουτρά πλύσης. 3d. Χρησιµοποιήστε µικρότερους χρόνους επώασης µε το διάλυµα υποστρώµατος-χρωµογόνου. 3e. Χρησιµοποιήστε θάλαµο υγρασίας. Σκουπίστε µόνο τρεις έως τέσσερις αντικειµενοφόρους κάθε φορά πριν χορηγήσετε το αντιδραστήριο 3f. Χρησιµοποιήστε αραιωτικά αντισωµάτων Dako ή προσθέστε BSA 1% στο αραιωτικό αντισωµάτων Εναλλακτικά, Tris 0,05 mol/l που περιέχουν NaCl 0,3 mol/l και Tween 20 0,1%, ph 7,2-7,6 (κωδικός S3306) µπορούν να χρησιµοποιηθούν ως ρυθµιστικό διάλυµα έκπλυσης. Η επώαση ενός ξεχωριστού αντιδραστηρίου αποκλεισµού πρωτεΐνης (κωδικός X0909) πριν από την εφαρµογή του πρωτοταγούς αντισώµατος µπορεί να είναι απαραίτητη. 3g. Χρησιµοποιήστε µεγαλύτερη αραίωση για το πρωτοταγές αντίσωµα. 4a. Χρησιµοποιήστε αντικειµενοφόρους πολυ-l-λυσίνης για µέγιστη χρώση. Για πρωτοταγή αντισώµατα που απαιτούν τεχνικές ανάκτησης στόχου, χρησιµοποιήστε Silanized Slides 5a. Προβείτε σε σειριακή αραίωση των πρωτοταγών αντισωµάτων για να καθορίσετε την βέλτιστη αραίωση. 5b. Καθορίστε το κατάλληλο πρωτόκολλο χρώσης για το αντίσωµα, π.χ. διάρκεια της πρώτης επώασης του αντισώµατος, ή τη διάρκεια επώασης της βιοτινυλιωµένη σύνδεσης ή της στρεπταβιδίνη HRP. Σηµείωση: Αν το πρόβληµα δεν µπορεί να αποδοθεί σε οποιαδήποτε από τις παραπάνω αιτίες, ή αν η προτεινόµενη επανορθωτική δράση δεν επιλύσει το πρόβληµα, καλέστε το Τµήµα Τεχνικής Υποστήριξης της Dako για περαιτέρω βοήθεια. Επιπρόσθετες πληροφορίες σχετικά µε τις τεχνικές χρώσης και την προετοιµασία δείγµατος µπορούν να βρεθούν στα Immunohistochemical Staining Methods 10 (διαθέσιµο από τη Dako), Atlas of Immunohistology 16 και στο Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis 17 ( ) GR_001 σελ. 8/9

9 Βιβλιογραφία 1. Guesdon JL, Ternynck T, Avrameas S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem 1979;27(8): Giorno R. A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction. Diag Immunol 1984;2(3): Center for Disease Control Manual Guide Safety Management, No. CDC-22. Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts. Atlanta, Georgia. April 30, Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ. No , Current 13. August 16, Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final rule, 57FR7163. February 18, Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe S, Battifora H, Brigati DJ. Quality control in immunohistochemistry. Report of a workshop sponsored by the Biological Stain Commission. Amer J Clin Pathol 1989;92(6): National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: Principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA. 1991; 4: Order code C24-A 8. Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991;66(4): Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press 1981: Key M (ed). Immunohistochemical Staining Methods. 4th Edition. Dako Wood GS, Warnke R. Suppression of endogenous avidin-binding activity in tissues and its relevance to biotin-avidin detection systems. J Histochem Cytochem 1981;29(10): Banerjee D, Pettit S. Endogenous avidin-binding activity in human lymphoid tissue. J Clin Pathol 1984;37(2): Escribano LM, Gabriel LC, Villa E, Navarro JL. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987;35(2): Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: American Society of Clinical Pathologists Press 1990; Omata M, Liew CT, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Am J Path 1980;73(5): Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: ASCP Press Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques, A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: ASCP Press 1986 Έκδοση 05/07 ( ) GR_001 σελ. 9/9