INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail

Transcript

1 INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail ΠΡΟΟΡΙΖΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ Το INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail είναι σχεδιασμένο για την ποσοτική ανίχνευση της ενίσχυσης του γονιδίου HER2 με χρήση κοινού μικροσκοπίου μέσω υβριδισμού in situ (ISH) με χρωμογόνο δύο χρωμάτων σε δείγματα ιστού ανθρώπινου καρκίνου του μαστού και γαστρικού καρκίνου, συμπεριλαμβανομένης της γαστροοισοφαγικής συμβολής, μονιμοποιημένα σε φορμαλίνη και εγκλεισμένα σε παραφίνη μετά από χρώση σε αυτοματοποιημένα συστήματα χρώσης αντικειμενοφόρων Ventana. Το INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail ενδείκνυται ως βοήθημα για την αξιολόγηση ασθενών με καρκίνο του μαστού και γαστρικό καρκίνο για τους οποίους εξετάζεται το ενδεχόμενο θεραπείας με HERCEPTIN (τραστουζουμάμπη) καθώς και για ασθενείς με καρκίνο του μαστού για τους οποίους εξετάζεται το ενδεχόμενο θεραπείας με KADCYLA (τραστουζουμάμπη εμτανσίνη (T-DM1)). Το προϊόν αυτό πρέπει να ερμηνεύεται από εξειδικευμένο παθολογοανατόμο, σε συνδυασμό με ιστολογική εξέταση, σχετικές κλινικές πληροφορίες και κατάλληλους μάρτυρες. Το προϊόν αυτό προορίζεται για διαγνωστική χρήση in vitro (IVD). ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ Το HER2/neu (HER2) είναι ένα μέλος μιας οικογένειας τεσσάρων διαμεμβρανικών υποδοχέων της κινάσης της τυροσίνης που μεσολαβούν στην ανάπτυξη, διαφοροποίηση και επιβίωση των κυττάρων. 1,2 Το γονίδιο HER2 κωδικοποιεί την πρωτεΐνη HER2, 2,3 και η υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2, η ενίσχυση του γονιδίου HER2, ή και τα δύο, εμφανίζονται σε περίπου 15 έως 25 τοις εκατό των καρκίνων του μαστού και σχετίζονται με επιθετική συμπεριφορά του όγκου. 4,5 Το INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail περιέχει ένα HER2 probe (σημασμένο με το απτένιο δινιτροφαινύλιο ή DNP) και ένα Chromosome 17 probe (σημασμένο με το απτένιο διγοξιγενίνη ή DIG) διαμορφωμένο με DNA αποκλεισμού από ανθρώπινο πλακούντα σε ρυθμιστικό διάλυμα με βάση το φορμαμίδιο. Οι ιχνηθέτες (probe) είναι σχεδιασμένοι να ανιχνεύουν την ενίσχυση του γονιδίου HER2 στο καρκίνωμα του μαστού και στο γαστρικό καρκίνωμα. Το HER2 DNA probe καλύπτει περίπου ζεύγη βάσεων της γονιδιακής περιοχής που περιέχει το γονίδιο HER2 (επίσης γνωστή ως ERBB2 και NEU), η οποία βρίσκεται στο ανθρώπινο Chromosome 17 (17q11.2-q21). Το Chromosome 17 probe καλύπτει τις άλφα-δορυφορικές αλληλουχίες εντός της κεντρομερικής περιοχής, και χρησιμεύει ως αναφορά για ανευσωμία. Αριθμοί αντιγράφων και των δύο ιχνηθετών απαριθμούνται σε πυρήνες του όγκου και τα αποτελέσματα αναφέρονται ως λόγος HER2/Chromosome 17 (HER2/Chr17) για τον προσδιορισμό της κατάστασης ενίσχυσης του HER2 (ο λόγος HER2/Chr17 2,0 είναι ενισχυμένη κατάσταση, ενώ ο λόγος < 2,0 είναι μη ενισχυμένη κατάσταση). Σε πολλές κλινικές μελέτες, η ενίσχυση ή/και η υπερέκφραση του HER2 έχει καταδειχθεί ότι σχετίζεται με κακό κλινικό αποτέλεσμα για γυναίκες με διηθητικό καρκίνο του μαστού και συσχετίζεται με διάφορες αρνητικές προγνωστικές μεταβλητές, συμπεριλαμβανομένης της αρνητικής κατάστασης του estrogen receptor (ER), του υψηλού κλάσματος S-φάσης, της θετικής γαγγλιακής κατάστασης, του μεταλλαγμένου p53 και του υψηλού πυρηνικού βαθμού. 6,7 Σε αρκετές μελέτες, ασθενείς με διηθητικό καρκίνο του μαστού (τόσο θετικής γαγγλιακής όσο και αρνητικής γαγγλιακής κατάστασης) με ενισχυμένη κατάσταση του γονιδίου HER2 εμφάνισαν μειωμένη συνολική επιβίωση και υψηλότερη συχνότητα επανεμφάνισης. 1,8,9,10,11 Τα αποτελέσματα από κλινικές μελέτες που μέτρησαν την υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2 μέσω ανοσοϊστοχημείας ήταν όμοια με εκείνα που λήφθηκαν από την ενίσχυση του γονιδίου HER2. 9,11,12,13 Η γνώση της κατάστασης του γονιδίου HER2 ή/και της πρωτεΐνης σε ασθενείς με διηθητικό καρκίνο του μαστού επιτρέπει στους κλινικούς ιατρούς να λαμβάνουν ενημερωμένες αποφάσεις για τη βελτίωση της συνολικής διαχείρισης της φροντίδας για τους συγκεκριμένους ασθενείς. H trastuzumab (HERCEPTIN) είναι ένα εξανθρωπισμένο μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της εξωκυτταρικής περιοχής του HER2 και έχει καταδειχθεί ότι ωφελεί τους ασθενείς με HER2-θετικό καρκίνο του μαστού Η κατάδειξη της ενίσχυσης του γονιδίου HER2 ή/και της υπερέκφρασης πρωτεΐνης είναι ουσιώδης για την επιλογή ασθενών για θεραπεία με τραστουζουμάμπη. Οι κλινικές μελέτες έχουν καταδείξει ότι οι ασθενείς με καρκίνο του μαστού με υψηλή υπερέκφραση πρωτεΐνης ή/και ενίσχυση του γονιδίου HER2 ωφελούνται περισσότερο από την τραστουζουμάμπη. 20 Ο προσδιορισμός της ενίσχυσης του γονιδίου HER2 ή/και της υπερέκφασης πρωτεΐνης είναι απαραίτητος για τους ασθενείς με διηθητικό καρκίνο του μαστού για τους οποίους εξετάζεται και ενδείκνυται κλινικά η θεραπεία με τραστουζουμάμπη. Ένα ποσοστό ασθενών με γαστρικό καρκίνωμα παρουσιάζουν ενίσχυση του γονιδίου HER2 και μπορεί να επωφεληθούν από τη θεραπεία με HERCEPTIN. 21 Το συνιστώμενο πρωτόκολλο χρώσης, οι οδηγίες αντιμετώπισης προβλημάτων και ο αλγόριθμος βαθμολόγησης του προσδιορισμού με INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail εφαρμόζονται εξίσου σε δείγματα καρκινώματος του μαστού και σε δείγματα γαστρικού καρκινώματος. ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ Το INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail έχει διαμορφωθεί βέλτιστα για χρήση με το Ventana ultraview SISH DNP Detection Kit, το Ventana ultraview Red ISH DIG Detection Kit και τα συνοδευτικά αντιδραστήρια σε αυτοματοποιημένα συστήματα χρώσης αντικειμενοφόρων της Ventana. Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας χρώσης διπλού Dual in situ υβριδισμού (Dual ISH), ιχνηθέτες (probe) σημασμένοι με DNP και DIG συνυβριδίζονται στις αντίστοιχές τους ειδικές αλληλουχίες-στόχους DNA εντός των πυρήνων των κυττάρων. Η ανίχνευση του σημασμένου με DNP HER2 probe πραγματοποιείται πρώτα χρησιμοποιώντας το ultraview SISH DNP Detection Kit, το οποίο περιέχει τους παρακάτω διανεμητές: Rabbit anti-dnp Monoclonal Antibody, διάλυμα Multimer το οποίο περιέχει goat anti-rabbit secondary antibody συζευγμένο με horseradish peroxidase (HRP), Silver ISH DNP Chromogen A (Silver A), Silver ISH DNP Chromogen B (Silver B) και Silver ISH DNP Chromogen C (Silver C). Μετά την επώαση με πρωτοταγές Rabbit anti-dnp Antibody και στη συνέχεια με το σύζευγμα δευτεροταγούς αντισώματος goat anti-rabbit HRP, λαμβάνει χώρα η αντίδραση in situ υβριδισμού του αργύρου (SISH). Εν συντομία, αυτή η αντίδραση καθοδηγείται από τη διαδοχική προσθήκη Silver A (οξικός άργυρος), Silver B (υδροκινόνη) και Silver C (H2O2). Εδώ, τα ιόντα αργύρου (Ag+) ανάγονται από την υδροκινόνη σε άτομα μεταλλικού αργύρου (Ag0). Η αντίδραση αυτή τροφοδοτείται από το υπόστρωμα για το HRP, υπεροξείδιο του υδρογόνου (Silver C). Το κατακρήμνισμα αργύρου εναποτίθεται στους πυρήνες, και ένα μεμονωμένο αντίγραφο του γονιδίου HER2 γίνεται ορατό ως μαύρο σήμα. Το Σχήμα 1 απεικονίζει την αντίδραση SISH. Μετά την ανίχνευση SISH για HER2, ο σημασμένος με DIG ιχνηθέτης (probe) Chromosome 17 ανιχνεύεται με το ultraview Red ISH DIG Detection Kit. Αυτό το κιτ περιλαμβάνει τους ακόλουθους διανεμητές: mouse anti-dig monoclonal antibody, διάλυμα Multimer Red ISH που περιέχει goat anti-mouse IgG antibody συζευγμένο με Alkaline Phosphatase (AP), ph Enhancer, Naphthol και Fast Red. Μετά την ανάπτυξη του σήματος SISH, η αντικειμενοφόρος επωάζεται με το mouse anti-dig antibody, το οποίο προσδένεται στο DIG hapten στον ιχνηθέτη (probe) Chromosome 17. Το anti-hapten primary antibody ανιχνεύεται με το διάλυμα Multimer (goat anti-mouse IgG conjugated με ένζυμο AP). Η αντικειμενοφόρος επωάζεται με το διάλυμα ph Enhancer, το οποίο παρέχει τα σωστά συστατικά/συγκεντρώσεις αλάτων και ρυθμιστικό ph για βέλτιστη απόδοση του ενζύμου AP. Στη συνέχεια, εφαρμόζεται φωσφορική ναφθόλη, η οποία χρησιμεύει ως υπόστρωμα για το ένζυμο AP (η AP αποφωσφορυλιώνει τη ναφθόλη). Στη συνέχεια, προστίθεται Fast Red στην αντικειμενοφόρο, το οποίο συνδυάζεται με την αποφωσφορυλιωμένη ναφθόλη για να σχηματίσει ένα κατακρήμνισμα κόκκινου χρώματος, που ανιχνεύεται εύκολα με κοινό μικροσκόπιο. To Σχήμα 2 απεικονίζει την αντίδραση Red ISH. Στη συνέχεια το δείγμα αντιχρωματίζεται με Hematoxylin II για ερμηνεία με κοινό μικροσκόπιο / EL Rev C

2 Rabbit anti-dnp Antibody 17q11.2-q21 Σχήμα 1. Αντίδραση SISH για ανίχνευση HER2. Red Signal Goat anti-mouse Antibody DIG Chromosome 17 Centromere Region Black Signal DNP Σχήμα 2. Αντίδραση Red ISH για ανίχνευση Chromosome 17. HRP ph Enhancer Naphthol Fast Red Mouse anti-dig Antibody Chr17 DNA Probe (DIG-labeled) Κάθε βήμα στο πρωτόκολλο αυτοματοποιημένης χρώσης συμπεριλαμβάνει επώαση της αντικειμενοφόρου με το ειδικό αντιδραστήριο που απαιτείται για ακριβή χρόνο και θερμοκρασία. Στο τέλος κάθε βήματος επώασης, πραγματοποιείται πλύση των τομών με το αυτοματοποιημένο σύστημα χρώσης αντικειμενοφόρων πλακών Ventana για τη διακοπή της αντίδρασης και την απομάκρυνση μη δεσμευμένου υλικού. Για να ελαχιστοποιηθεί η εξάτμιση των υδατικών αντιδραστηρίων από την αντικειμενοφόρο, εφαρμόζεται στο αυτόματο σύστημα χρώσης αντικειμενοφόρων πλακών ένα διάλυμα καλυπτρίδας σε κάθε βήμα. Για λεπτομερέστερες πληροφορίες σχετικά με τη λειτουργία του οργάνου, ανατρέξτε στο αντίστοιχο εγχειρίδιο χρήσης του αυτόματου συστήματος χρώσης αντικειμενοφόρων πλακών Ventana. AP Silver A Silver B Silver C Goat anti-rabbit Antibody HER2 DNA Probe (DNP-labeled) ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΟ ΠΟΥ ΠΑΡΕΧΕΤΑΙ Το INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail περιέχει ποσότητα αντιδραστηρίων που επαρκεί για 50 εξετάσεις. Ένας διανεμητής 10 ml του INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail περιέχει περίπου 12 μg/ml ιχνηθέτη (probe) HER2 probe σημασμένου με δινιτροφαινύλιο (DNP) και 1 μg/ml ιχνηθέτη (probe) Chromosome 17 σημασμένου με διγοξιγενίνη (DIG), με διαμόρφωση DNA αποκλεισμού από ανθρώπινο πλακούντα σε ρυθμιστικό διάλυμα υβριδισμού με βάση το φορμαμίδιο. Και οι δύο ιχνηθέτες (probe) χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό της κατάστασης του γονιδίου HER2 (π.χ., λόγος HER2 / Chr17). Ανατρέξτε στο ένθετο συσκευασίας του κατάλληλου κιτ ανίχνευσης της VENTANA για λεπτομερείς περιγραφές των παρακάτω: (1) Αρχές της διαδικασίας, (2) Υλικά και αντιδραστήρια που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται, (3) Συλλογή δειγμάτων και προετοιμασία για ανάλυση, (4) Διαδικασίες ποιοτικού ελέγχου, (5) Αντιμετώπιση προβλημάτων, (6) Ερμηνεία αποτελεσμάτων και (7) Γενικοί περιορισμοί. ΥΛΙΚΑ ΠΟΥ ΑΠΑΙΤΟΥΝΤΑΙ ΑΛΛΑ ΔΕΝ ΠΑΡΕΧΟΝΤΑΙ Δεν παρέχονται αντιδραστήρια χρώσης, όπως κιτ ανίχνευσης και συμπληρωματικά στοιχεία της VENTANA. Ενδέχεται να μην είναι διαθέσιμα σε όλες τις περιοχές όλα τα προϊόντα που παρατίθενται στο ένθετο συσκευασίας. Συμβουλευτείτε τον αντιπρόσωπο υποστήριξης στην περιοχή σας. 1. VENTANA ultraview SISH DNP Detection Kit (REF ) 2. VENTANA ultraview Red ISH DIG Detection Kit (REF ) 3. VENTANA HybReady Solution (REF ) 4. VENTANA ultraview Silver Wash II (REF ή αντίστοιχο) 5. VENTANA ISH Protease 2 (REF )* 6. VENTANA ISH Protease 3 (REF )* 7. VENTANA Hematoxylin II (REF )* 8. VENTANA Bluing Reagent (REF )* 9. VENTANA Reaction Buffer Concentrate (10X) (REF ) 10. VENTANA 10X SSC (REF ) 11. VENTANA EZ Prep Concentrate (10X) (REF ) 12. VENTANA Cell Conditioning Solution (CC2) (REF ) 13. VENTANA ULTRA Cell Conditioning Solution (ULTRA CC2) (REF ) 14. VENTANA LCS (Predilute) (REF ) 15. VENTANA ULTRA LCS (Predilute) (REF ) 16. Αυτοματοποιημένο σύστημα χρώσης αντικειμενοφόρων πλακών VENTANA BenchMark Series 17. Ετικέτες γραμμικού κώδικα 18. Αντικειμενοφόροι μικροσκοπίου Superfrost Plus (VWR REF ή αντίστοιχες) 19. Ξυλόλη (κατάλληλη για επεξεργασία ιστών) 20. Απιονισμένο ή απεσταγμένο νερό 21. Μέσο μόνιμης επικάλυψης (Permount Fisher Cat. No. SP ή αντίστοιχο)** 22. Καλυπτρίδα (επαρκής για την κάλυψη του ιστού, όπως η VWR Cat. No ή αντίστοιχη) 23. Συσκευή αυτόματης επικάλυψης με καλυπτρίδες (όπως η συσκευή αυτόματης επικάλυψης με καλυπτρίδες Tissue Tek SCA) 24. Δοχεία ή λουτρά χρώσης 25. Χρονόμετρο 26. Οπτικό μικροσκόπιο 27. Οι αντικειμενοφόροι VENTANA HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides (REF ) μπορούν να χρησιμοποιηθούν για διαδικασίες αντιμετώπισης προβλημάτων, όπως απαιτείται. *Όπως απαιτείται για ειδικές εφαρμογές. **Βλ. Πίνακα 11 για τα επικαλυπτικά μέσα που είναι συμβατά με αυτόν τον προσδιορισμό / EL Rev C

3 ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ Αμέσως μετά την παραλαβή και όταν δεν χρησιμοποιείται, να φυλάσσεται σε θερμοκρασία 2-8 C. Να μην καταψύχεται. Για να διασφαλίσετε την ορθή διανομή του αντιδραστηρίου και τη σταθερότητα του ιχνηθέτη (probe), να επαναπωματίζετε το διανεμητή μετά από κάθε χρήση και να τον τοποθετείτε αμέσως μέσα στο ψυγείο σε όρθια θέση. Κάθε διανεμητής ιχνηθέτη (probe) έχει ημερομηνία λήξης. Εφόσον αποθηκεύεται σύμφωνα με τις προβλεπόμενες οδηγίες φύλαξης, το αντιδραστήριο παραμένει αναλλοίωτο μέχρι την ημερομηνία που αναγράφεται στη σήμανση. Μην χρησιμοποιείτε το αντιδραστήριο μετά την ημερομηνία λήξης. ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Ιστοί που με τις συνήθεις διαδικασίες έχουν μονιμοποιηθεί σε φορμαλίνη και εγκλεισθεί σε παραφίνη είναι κατάλληλοι για χρήση με τον παρόντα ιχνηθέτη (probe), εφόσον χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με τα όργανα BenchMark IHC/ISH. Η κάθε τομή πρέπει να κόβεται στο κατάλληλο πάχος (περίπου 4 μm) και να τοποθετείται σε υάλινη αντικειμενοφόρο Superfrost Plus (ή αντίστοιχη). Το συνιστώμενο μονιμοποιητικό ιστού ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ είναι ουδέτερο ρυθμιστικό διάλυμα φορμαλίνης (NBF) 10%. 22 Ο Πίνακα 1 παραθέτει μια λίστα με τα συνιστώμενα μονιμοποιητικά και τα μονιμοποιητικά που δεν είναι συμβατά με το συγκεκριμένο ιχνηθέτη (probe). Εάν έχετε ερωτήσεις σχετικά με τα συνιστώμενα μονιμοποιητικά, επικοινωνήστε με τον τοπικό αντιπρόσωπο υποστήριξης. Πίνακα 1. Συνιστώμενα και μη συμβατά μονιμοποιητικά. Συνιστώμενα μονιμοποιητικά Neutral Buffered Formalin (NBF) Φορμαλίνη ψευδάργυρου Αλκοολική φορμαλίνη Μονιμοποιητικό PREFER Μη συμβατά μονιμοποιητικά Bouin s Οξικό οξύ αλκοολικής φορμαλίνης (AFA) Δείγματα μονιμοποιημένα > 6 ώρες με μονιμοποιητικά AFA ή Bouin s δίνουν ασθενή ή καθόλου χρώση. 23 Εκτός από τους προσδιορισμούς Ventana, πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι η πλειοψηφία των μη οριστικών αποτελεσμάτων γονιδίου HER2 από FISH σχετίζονται με παράγοντες πριν την ανάλυση, όπως ελλιπή ή υπερβολική μονιμοποίηση, 24 καθώς και καθυστερημένη μονιμοποίηση. 25 Η αυστηρή εφαρμογή των διαδικασιών μονιμοποίησης (π.χ. αποκλειστικός επεξεργαστής για να διασφαλιστούν τουλάχιστον 6 ώρες μονιμοποίησης) είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση κατά 64% των μη οριστικών περιπτώσεων, από 10,8% αποτυχίες σε 3,4%. Στα δείγματα που μονιμοποιούνται για < 6 ώρες σε φορμαλίνη ενδέχεται να προκληθεί απώλεια σήματος και υπερβολική πυρηνική πέψη, όπως παρατηρείται από την ανοιχτή/ασθενή χρώση αιματοξυλίνης. Τομές πάχους άνω των 4 µm μπορεί να απαιτούν ισχυρότερη επεξεργασία πρωτεάσης από τη συνιστώμενη κατάσταση και ενδέχεται να παρουσιάσουν περισσότερες πυρηνικές φυσαλίδες συγκριτικά με τις λεπτότερες τομές, λόγω της υπερβολικής παραφίνης στον ιστό. Οι πυρηνικές φυσαλίδες εμφανίζονται ως μεγάλες ή μικρές φυσαλίδες ή διάφραγμα στους πυρήνες. Συχνά, όταν εμφανίζονται πυρηνικές φυσαλίδες, υπάρχει ένα φάσμα επιδράσεων στα σήματα SISH και Red ISH που χαρακτηρίζεται από 1) πυρήνες με πυρηνικές φυσαλίδες στις οποίες τα σήματα SISH και Red ISH γενικά βρίσκονται ακόμα κεντρικά στον πυρήνα και 2) πυρήνες με πυρηνικές φυσαλίδες που ωθούν τα σήματα SISH και Red ISH στην περιφέρεια. Συχνά και στις δύο περιπτώσεις, εάν τα σήματα SISH και Red ISH είναι σαφώς ευδιάκριτα, δεν είναι παραμορφωμένα με άλλον τρόπο, και είναι ακόμα απαριθμήσιμα, η περίπτωση μπορεί να βαθμολογηθεί. Ωστόσο, έντονη εμφάνιση πυρηνικών φυσαλίδων μπορεί περιστασιακά να παραμορφώσει τα σήματα SISH και Red ISH ή να τα καταστήσει μη διακριτά, έτσι ώστε η ακριβής απαρίθμηση να μην είναι δυνατή. Αυτό συμβαίνει συχνότερα όταν τα σήματα SISH και Red ISH ωθούνται στην πυρηνική περιφέρεια. Όταν συμβεί αυτό, είναι συχνά δυνατό να εντοπιστούν αλλού στο δείγμα πυρήνες που είναι απαριθμήσιμοι και η περίπτωση μπορεί να βαθμολογηθεί. Εάν η εμφάνιση πυρηνικών φυσαλίδων είναι έντονη, σε βαθμό που δεν είναι δυνατός ο εντοπισμός αρκετών πυρήνων στους οποίους τα σήματα SISH και Red ISH μπορούν να απαριθμηθούν με βεβαιότητα, το περιστατικό δεν πρέπει να βαθμολογείται. Αυτά τα δείγματα μπορεί να χρειάζεται να αποπαραφινωθούν σε λουτρά αλκοόλης και ξυλόλης προτού επαναληφθεί η χρώση στο όργανο ή ο χρήστης μπορεί να επιλέξει τη δυνατότητα παρατεταμένης αποπαραφίνωσης στη διαδικασία χρώσης (βλ. Αντιμετώπιση προβλημάτων). Πυρηνικές φυσαλίδες μπορεί επίσης να εμφανιστούν εντός του πλαισίου ελλιπούς μονιμοποίησης (1 3 ώρες με φορμαλίνη), οι οποίες μπορεί να είναι λιγότερο διακριτές πυρηνικές φυσαλίδες. Αυτή η κατάσταση μπορεί να διορθωθεί στις 3 ώρες μονιμοποίησης με αλλαγή της κυτταρικής προετοιμασίας/επεξεργασίας πρωτεάσης, αλλά στη 1 ώρα είναι πιθανώς μη αναστρέψιμη. Ο προσδιορισμός INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail αναπτύχθηκε με πρόσθετες επιλογές πριν την επεξεργασία που μπορούν να βοηθήσουν στη βελτιστοποίηση του προσδιορισμού σε διαφορετικά εργαστήρια και στην επακόλουθη αντιμετώπιση προβλημάτων συγκεκριμένων ιστών / αντικειμενοφόρων που εμφανίζουν μη βέλτιστη χρώση. Η Ventana συνιστά κάθε εργαστήριο να εκτελεί αρχικές αναλύσεις στα αντιπροσωπευτικά δείγματα μαρτύρων ιστού που έχουν παρασκευαστεί υπό πανομοιότυπες συνθήκες με αυτές που ισχύουν για τα κλινικά δείγματα προς εξέταση. Αυτό θα βοηθήσει στη βελτιστοποίηση των ειδικών συνθηκών χρώσης για μεμονωμένα εργαστήρια, τα οποία μπορεί παρουσιάζουν διαφορές όσον αφορά στις ακριβείς διαδικασίες παρασκευής δειγμάτων. Ενδέχεται να προκύψουν ποικίλα αποτελέσματα με διαφορετικούς προαναλυτικούς παράγοντες από τους συνιστώμενους. Τα δείγματα που έχουν προετοιμαστεί προαναλυτικά σε συνθήκες που δεν συνιστώνται από την Ventana ενδέχεται να μην επιτύχουν ποτέ κατάλληλη χρώση με τον προσδιορισμό. 1. Για διαγνωστική χρήση in vitro (IVD). 2. Μόνο για επαγγελματική χρήση. 3. Προειδοποίηση: το προϊόν περιέχει φορμαμίδιο. Το φορμαμίδιο είναι τοξικό όταν εισπνέεται και μέτρια τοξικό σε περίπτωση κατάποσης. Προκαλεί ερεθισμό στο δέρμα, στα μάτια και στις βλεννογόνους μεμβράνες και απορροφάται μέσω του δέρματος. Μπορεί να βλάψει το έμβρυο. Λάβετε προφυλάξεις όταν χειρίζεστε αντιδραστήρια. Χρησιμοποιείτε γάντια μίας χρήσης και φοράτε κατάλληλο προστατευτικό ρουχισμό όταν χειρίζεστε ενδεχομένως καρκινογόνα ή τοξικά υλικά. 4. Βεβαιωθείτε ότι ο περιέκτης αποβλήτων είναι κενός πριν ξεκινήσετε μια διαδικασία στο όργανο. Αν δεν ληφθεί αυτή η προφύλαξη, ενδέχεται να προκληθεί υπερχείλιση του περιέκτη αποβλήτων και ο χρήστης κινδυνεύει να γλιστρήσει και να πέσει. 5. Υλικά ανθρώπινης ή ζωικής προέλευσης πρέπει να αντιμετωπίζονται ως δυνητικά βιολογικώς επικίνδυνα και να απορρίπτονται με τις ενδεδειγμένες προφυλάξεις. 6. Αποφύγετε την επαφή των αντιδραστηρίων με τα μάτια, το δέρμα και τις βλεννογόνους μεμβράνες. Αν τα αντιδραστήρια έλθουν σε επαφή με ευαίσθητες περιοχές, ξεπλύνετε με άφθονο νερό. Αποφεύγετε την εισπνοή των αντιδραστηρίων. 7. Αποφύγετε τη μικροβιακή μόλυνση των αντιδραστηρίων, καθώς αυτό ενδέχεται να δώσει λανθασμένα αποτελέσματα. 8. Συμβουλευτείτε τις τοπικές ή/και κρατικές αρχές, για να προσδιορίσετε τη συνιστώμενη μέθοδο απόρριψης. 9. Για συμπληρωματικές πληροφορίες ασφαλείας, ανατρέξτε στο Δελτίο Δεδομένων Ασφάλειας του προϊόντος καθώς και στον οδηγό συμβόλων και κινδύνων που βρίσκεται στον ιστότοπο ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΧΡΩΣΗΣ Οι ιχνηθέτες (probe) VENTANA έχουν σχεδιαστεί για χρήση σε αυτοματοποιημένα συστήματα χρώσης αντικειμενοφόρων VENTANA σε συνδυασμό με τα κιτ ανίχνευσης και τα παρελκόμενα VENTANA. Οι παράμετροι για τις αυτοματοποιημένες διαδικασίες μπορούν να απεικονιστούν, να εκτυπωθούν και να διαμορφωθούν σύμφωνα με τη διαδικασία στο εγχειρίδιο χρήσης του οργάνου. Οι άλλες παράμετροι λειτουργίας για τα αυτοματοποιημένα συστήματα χρώσης αντικειμενοφόρων έχουν προεπιλεγεί στο εργοστάσιο. To συνιστώμενο πρωτόκολλο χρώσης για κάθε πλατφόρμα οργάνου αναφέρεται στον Πίνακα 2. Ανατρέξτε στο ένθετο συσκευασίας του κατάλληλου κιτ ανίχνευσης VENTANA για περισσότερες λεπτομέρειες σχετικά με τις διαδικασίες χρώσης in situ υβριδισμού (ISH). Πίνακα 2. Συνιστώμενο πρωτόκολλο χρώσης για το INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail σε αυτοματοποιημένα συστήματα χρώσης αντικειμενοφόρων της σειράς VENTANA BenchMark. Επιλέξιμο βήμα διαδικασίας Συνιστώμενο πρωτόκολλο χρώσης για BenchMark και BenchMark XT Συνιστώμενο πρωτόκολλο χρώσης για BenchMark ULTRA Θερμοκρασία θέρμανσης ΔΕΝ ΙΣΧΥΕΙ Επιλέξτε 63 ºC Χρόνος θέρμανσης ΔΕΝ ΙΣΧΥΕΙ 20 λεπτά Αποπαραφίνωση Επιλεγμένη Επιλέξτε 72 ºC Extended Depar* Μη επιλεγμένη Μη επιλεγμένη / EL Rev C

4 Επιλέξιμο βήμα διαδικασίας Cell Conditioning ISH-Protease 3 Συνιστώμενο πρωτόκολλο χρώσης για BenchMark και BenchMark XT Επιλεγμένη Cell Conditioning CC2 Ήπια CC2-8 λεπτά Τυπική CC2-12 λεπτά Παρατεταμένη CC2-8 λεπτά 16 min (Ιστός) 8 λεπτά (Ξενομοσχεύματα) Συνιστώμενο πρωτόκολλο χρώσης για BenchMark ULTRA Επιλεγμένη Cell Conditioning CC2 86 ºC Ήπια CC2-8 λεπτά Τυπική CC2-12 λεπτά Παρατεταμένη CC2-8 λεπτά 16 min (Ιστός) 8 λεπτά (Ξενομοσχεύματα) Μετουσίωση 20 λεπτά 20 λεπτά Υβριδισμός 6 ώρες 6 ώρες Πλύση σε συνθήκες αυστηρότητας 72 C (Ανθρώπινος ιστός) 76 C (Ξενομοσχεύματα) 72 C (Ανθρώπινος ιστός) 76 C (Ξενομοσχεύματα) SISH Multimer 16 λεπτά 32 λεπτά Silver Chromogen 4 λεπτά 4 λεπτά Red ISH Multimer 24 λεπτά 24 λεπτά Red Chromogen 8 λεπτά 8 λεπτά Αντίχρωση Hematoxylin II - 8 λεπτά Hematoxylin II - 8 λεπτά Μετά την αντίχρωση Bluing Reagent - 4 λεπτά Bluing Reagent - 4 λεπτά * Η επιλογή Extended Depar προορίζεται για να μετριαστεί ο σοβαρός σχηματισμός πυρηνικών φυσαλίδων λόγω υπερβολικής παραφίνης. Λόγω της διακύμανσης στη μονιμοποίηση ιστού και στην επεξεργασία, καθώς και στις γενικές συνθήκες εργαστηριακού οργάνου και περιβάλλοντος, μπορεί να είναι απαραίτητη η αύξηση ή μείωση του υβριδισμού του ιχνηθέτη (probe), η κυτταρική προετοιμασία ή η προεπεξεργασία της πρωτεάσης με βάση τα μεμονωμένα δείγματα, τη χρησιμοποιούμενη ανίχνευση και την προτίμηση του εξειδικευμένου προσώπου που πραγματοποιεί την ανάγνωση. Έναρξη ανάλυσης σε αυτοματοποιημένα συστήματα χρώσης αντικειμενοφόρων BenchMark Series 1. Σημάνετε την αντικειμενοφόρο πλάκα με την ετικέτα γραμμικού κώδικα που αντιστοιχεί στο πρωτόκολλο ιχνηθέτη (probe) που πρόκειται να εφαρμοστεί. Κεντράρετε την ετικέτα στην αντικειμενοφόρο ώστε να εφαρμόζει πλήρως χωρίς να κρέμεται. Αποφύγετε τη διπλή σήμανση ή την εκ νέου εφαρμογή της ετικέτας αντικειμενοφόρου. Με τις ετικέτες λύσης ροής εργασίας VENTANA VANTAGE πρέπει να χρησιμοποιείτε διάφανες ετικέτες επικάλυψης. 2. Φορτώστε το INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail, τα αντιδραστήρια από το ultraview Red ISH DIG και τα ultraview SISH DNP Detection Kits, καθώς και τα απαιτούμενα συνοδευτικά αντιδραστήρια στο(ους) δίσκο(ους) αντιδραστηρίων. Τοποθετήστε το(ους) δίσκο(ους) αντιδραστηρίων στο αυτοματοποιημένο σύστημα χρώσης αντικειμενοφόρων. Ελέγξτε τα χύδην υγρά και τα απόβλητα. 3. Οι φιάλες των χύδην ρυθμιστικών διαλυμάτων αντίδρασης πρέπει να είναι γεμάτες. 4. Το δοχείο αποβλήτων πρέπει να είναι κενό πριν από την έναρξη της διαδικασίας. 5. Τοποθετήστε τις αντικειμενοφόρους στο αυτοματοποιημένο σύστημα χρώσης αντικειμενοφόρων. 6. Ξεκινήστε τον κύκλο χρώσης. 7. Όταν ολοκληρωθεί ο κύκλος, αφαιρέστε τις αντικειμενοφόρους από το αυτοματοποιημένο σύστημα χρώσης. 8. Συνεχίστε με τη διαδικασία αφυδάτωσης. Διαδικασία αφυδάτωσης Σημείωση: Το χρωμογόνο Fast Red είναι διαλυτό σε αλκοόλη και ακετόνη. Μη χρησιμοποιείτε λουτρά αλκοόλης και ακετόνης για να αφυδατώσετε τις αντικειμενοφόρους, διότι το κόκκινο σήμα μπορεί να επηρεαστεί. 1. Για να αφαιρέσετε το διάλυμα «υγρής καλυπτρίδας», ξεπλύνετε τις αντικειμενοφόρους σε 2 διαδοχικά διαλύματα ήπιου απορρυπαντικού πιάτων (μη χρησιμοποιείτε απορρυπαντικό που είναι σχεδιασμένο για αυτόματα πλυντήρια πιάτων). 2. Ξεβγάλετε καλά τις αντικειμενοφόρους με απεσταγμένο νερό, για περίπου 1 λεπτό. Αποτινάξτε την περίσσεια νερού. 3. Τοποθετήστε τις αντικειμενοφόρους σε κλίβανο (45 60 C) για να στεγνώσουν ή αφήστε τις να στεγνώσουν στον αέρα σε θερμοκρασία δωματίου. Σε κλίβανο, οι χρόνοι στεγνώματος κυμαίνονται από 10 λεπτά έως μία ώρα. Βεβαιωθείτε ότι οι αντικειμενοφόροι είναι τελείως στεγνές πριν τη διαδικασία κάλυψης με καλυπτρίδες. 4. Μεταφέρετε τις αντικειμενοφόρους σε λουτρό ξυλόλης για περίπου 30 δευτερόλεπτα. 5. Καλύψτε την αντικειμενοφόρο. Σημειώστε ότι ορισμένα επικαλυπτικά μέσα δεν είναι συμβατά με τον προσδιορισμό (Βλ. ενότητες «Περιορισμοί» και «Αντιμετώπιση προβλημάτων»). ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΕΣ ΠΟΙΟΤΙΚΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ Δείγμα θετικού μάρτυρα Αλληλουχίες HER2 και Chromosome 17 είναι παρούσες σε κάθε κύτταρο του ανθρώπινου σώματος. Συνεπώς, λειτουργούν ως εσωτερικοί θετικοί μάρτυρες σε κάθε δείγμα ιστού και πρέπει να είναι ορατές (1 έως 2 σήματα ανά κύτταρο) σε φυσιολογικά (μη νεοπλαστικά) κύτταρα μέσα και γύρω από την περιοχή καρκινώματος-στόχου. Ωστόσο, δεν παρουσιάζουν όλα τα κύτταρα μεμονωμένο αντίγραφο του γονιδίου εξαιτίας της βιολογικής ετερογένειας και της περικοπής από τον τεμαχισμό ιστών. Ενδέχεται να εντοπιστεί ειδική πυρηνική χρώση σε διάφορα κύτταρα μεταξύ των οποίων: ινοβλάστες στρώματος, ενδοθηλιακά κύτταρα, λεμφοκύτταρα και μη νεοπλαστικά κύτταρα. Εάν οι θετικοί μάρτυρες δεν αποδείξουν θετική χρώση, αυτό ίσως δείχνει ένα πρόβλημα αντιδραστηρίου ή οργάνου. Επειδή κάθε δείγμα έχει έναν εσωτερικό θετικό μάρτυρα (π.χ. κατάλληλη χρώση SISH σε φυσιολογικά κύτταρα), αυτό δρα ως ο πραγματικός «θετικός μάρτυρας». Ένας μάρτυρας θετικού δείγματος ειδικός για το εργαστήριο μπορεί να χρησιμοποιείται σε κάθε διαδικασία χρώσης που πραγματοποιείται, εάν είναι επιθυμητό. Τα δείγματα ελέγχου μπορεί να είναι δείγματα παρασκευασμένα κατά τρόπο πανομοιότυπο με τα δείγματα ασθενών. Αυτοί οι μάρτυρες είναι χρήσιμοι για την παρακολούθηση όλων των βημάτων της διαδικασίας, από την προετοιμασία των δειγμάτων έως τη χρώση τους. Δείγμα ξενομοσχεύματος Οι αντικειμενοφόροι HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides χρησιμοποιούνται για προκαταρκτική επικύρωση και διαδικασίες αντιμετώπισης προβλημάτων που σχετίζονται με το INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail. Περιέχουν τρεις διακριτές τομές ξενομοσχεύματος μονιμοποιημένες με φορμαλίνη και εγκλεισμένες σε ένα μόνο τεμάχιο παραφίνης. Οι τομές ξενομοσχεύματος έχουν επιλεγεί λόγω του επαρκούς χαρακτηρισμού τους στην επιστημονική βιβλιογραφία για τα επίπεδα πρωτεΐνης HER2 και τους αριθμούς αντιγράφων γονιδίου. Θετικός μάρτυρας αντιδραστηρίου Κατά τη διάρκεια της επιβεβαίωσης του προσδιορισμού και των διαδικασιών αντιμετώπισης προβλημάτων πρέπει να χρησιμοποιείται θετικός μάρτυρας αντιδραστηρίου, διότι η προσβασιμότητα του DNA μπορεί να ποικίλλει ανάλογα με τη μέθοδο μονιμοποίησης και την προκατεργασία του δείγματος. Το INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως θετικός μάρτυρας για τον προσδιορισμό αυτό, δεδομένου ότι κάθε φυσιολογικό κύτταρο στο ανθρώπινο σώμα περιέχει ένα έως δύο αντίγραφα του HER2 και του Chromosome 17. Δεν απαιτείται αρνητικός μάρτυρας αντιδραστηρίου διότι οι εσωτερικοί θετικοί μάρτυρες επαρκούν. Ανεξήγητες ασυμφωνίες Ανεξήγητες ασυμφωνίες μεταξύ μαρτύρων πρέπει να γνωστοποιούνται αμέσως στον τοπικό σας αντιπρόσωπο υποστήριξης. Αν τα αποτελέσματα του ελέγχου ποιότητας δεν ανταποκρίνονται στις προδιαγραφές, τα αποτελέσματα των ασθενών είναι άκυρα. Ανατρέξτε στην ενότητα «Αντιμετώπιση προβλημάτων» στο παρόν ένθετο. Εντοπίστε και διορθώστε το πρόβλημα και ακολούθως επαναλάβετε την εξέταση των δειγμάτων των ασθενών. Επαλήθευση του προσδιορισμού Πριν την αρχική χρήση ενός αντιδραστηρίου σε διαγνωστική διαδικασία, η απόδοση του αντιδραστηρίου πρέπει να επιβεβαιωθεί με δοκιμές σε σειρές δειγμάτων με γνωστά χαρακτηριστικά απόδοσης ISH όπως Ventana HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides (ανατρέξτε στις «Διαδικασίες ελέγχου ποιότητας», που περιγράφηκαν συνοπτικά παραπάνω στην παρούσα ενότητα του ένθετου του προϊόντος). Αυτές οι διαδικασίες / EL Rev C

5 ποιοτικού ελέγχου θα πρέπει να επαναλαμβάνονται για κάθε νέα παρτίδα αντιδραστηρίων ή κάθε φορά που υπάρχει αλλαγή στις παραμέτρους του προσδιορισμού. ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Η αξιολόγηση των μαρτύρων πρέπει να γίνει από εξειδικευμένο αναγνώστη έμπειρο στη μικροσκοπική ερμηνεία δειγμάτων ανατομικής παθολογίας, τις διαδικασίες ISH και την αναγνώριση των μεμονωμένων και ενισχυμένων αντιγράφων HER2 (που απαιτεί μικροσκοπική εξέταση με χρήση αντικειμενικών φακών 20X, 40X και/ή 60X) και πρέπει να προηγηθεί της ερμηνείας των αποτελεσμάτων. Σημείωση: Η χρήση του αντικειμενικού φακού 100X δεν συνιστάται. Η επαλήθευση σχεδίου και ο έλεγχος αξιολόγησης διεξήχθησαν εξ ολοκλήρου με τη χρήση αντικειμενικών φακών 20X, 40X, και/ή 60X. Οι παρακάτω ενότητες περιγράφουν τον τρόπο ερμηνείας και βαθμολόγησης των αντικειμενοφόρων. Ο Πίνακα 3 απεικονίζει τον τρόπο απαρίθμησης διακριτών σημάτων. Ορισμοί 1. Κατάσταση γονιδίου HER2. Η κατάσταση γονιδίου HER2 είναι συνάρτηση του λόγου του μέσου αριθμού αντιγράφων του γονιδίου HER2 προς το μέσο αριθμό αντιγράφων του Chromosome 17 (Chr17), ανά κύτταρο, σε διηθητικό καρκίνωμα του μαστού ή γαστρικό καρκίνωμα. Η κατάσταση γονιδίου HER2 ταξινομείται χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες κατευθυντήριες οδηγίες: α. Λόγος HER2/Chr17 2,0 είναι ενισχυμένη κατάσταση β. Λόγος HER2/Chr17 < 2,0 είναι μη ενισχυμένη κατάσταση. 2. Επάρκεια των αντικειμενοφόρων. Μια μεμονωμένη αντικειμενοφόρος χρωματισμένη με το INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail πρέπει να ικανοποιεί δύο κριτήρια για να θεωρείται επαρκής για απαρίθμηση. Εάν η αντικειμενοφόρος δεν ικανοποιεί αυτά τα κριτήρια, τότε είναι ανεπαρκής για απαρίθμηση. α. Εσωτερικός θετικός μάρτυρας. Τα φυσιολογικά σήματα HER2 (SISH) και Chr17 (Red ISH) (1 έως 2 αντίγραφα ανά κύτταρο) δρουν ως εσωτερικοί θετικοί μάρτυρες και πρέπει να είναι ορατά εντός του δείγματος. Αυτή η πυρηνική χρώση ενδέχεται να εντοπιστεί σε διάφορα μη νεοπλαστικά κύτταρα, μεταξύ των οποίων: ινοβλάστες στρώματος, ενδοθηλιακά κύτταρα, λεμφοκύτταρα και άλλα μη νεοπλαστικά κύτταρα. Δεν θα χρωματιστεί κάθε κύτταρο στην αντικειμενοφόρο και για τους δύο ιχνηθέτες (probe), αλλά τα φυσιολογικά κύτταρα μέσα ή/και γύρω από το στόχο πρέπει να χρωματιστούν κατάλληλα. β. Κύτταρα καρκινώματος. Χρησιμοποιώντας αντικειμενικούς φακούς 20X, 40X και/ή 60X, η περιοχή-στόχος του καρκινώματος πρέπει να παρουσιάζει ένα απαριθμήσιμο πεδίο σημάτων SISH και Red ISH. 3. Περιοχές-στόχοι για την απαρίθμηση σήματος. Μια αποδεκτή στοχευόμενη περιοχή εντός του διηθητικού καρκινώματος παρουσιάζει απαριθμήσιμο πεδίο σημάτων SISH και Red ISH. Δεν πρέπει να διενεργείται απαρίθμηση σήματος σε περιοχές που περιέχουν ασθενή σήματα SISH ή/και Red ISH, συμπιεσμένους ή αλληλοεπικαλυπτόμενους πυρήνες ή νέκρωση. Πυρήνες με υπερβολικό υπόβαθρο SISH ή Red ISH που παρεμβάλλεται στη δυνατότητα απαρίθμησης ειδικών σημάτων δεν πρέπει να μετρώνται. Εάν μια περιοχή-στόχος θεωρείται ανεπαρκής για απαρίθμηση, είναι συχνά δυνατό να βρεθούν άλλες περιοχές-στόχοι στην ίδια αντικειμενοφόρο οι οποίες είναι επαρκείς. Αυτό μπορεί να καθοριστεί από την παρουσία φυσιολογικών κυττάρων που παρουσιάζουν κατάλληλη χρώση SISH ή Red ISH μέσα ή δίπλα σε αυτήν την περιοχή-στόχο. Πρόσθετες παρατηρήσεις για HER2 και Chromosome 17 Άλλες παρατηρήσεις μπορούν να σημειωθούν ως σχόλια στην έκθεση του παθολογοανατόμου. 1. Ετερογένεια: Σε ορισμένες περιπτώσεις, ο ιστός μπορεί να περιέχει περιοχές καρκινώματος οι οποίες είναι γενετικά ετερογενείς για αριθμό αντιγράφων HER2 (π.χ. μπορεί να υπάρχει ένα μίγμα μη ενισχυμένων και ενισχυμένων πυρήνων ή ένα μίγμα πυρήνων που περιέχει ποικίλα αντίγραφα HER2). Αυτό μπορεί να παρατηρηθεί μεταξύ κυττάρων καρκινωμάτων εντός της ίδιας της στοχευόμενης περιοχής ή μεταξύ δύο διαφορετικών στοχευόμενων περιοχών. 2. Η ανευσωμία είναι οποιαδήποτε κατάσταση στην οποία ένας οργανισμός έχει πρόσθετα ή λιγότερα ειδικά χρωμοσώματα από το φυσιολογικό, π.χ. ο αριθμός ενός ειδικού χρωμοσώματος (στην περίπτωση αυτή, Chromosome 17) δεν είναι διπλοειδής. Στην πολυσωμία, μπορεί να υπάρχουν τρία ή περισσότερα αντίγραφα του χρωμοσώματος αντί για τα αναμενόμενα δύο αντίγραφα. Στη μονοσωμία, τα ογκοκύτταρα μπορεί να παρουσιάζουν μόνο ένα αντίγραφο του Chromosome 17. Έχει αναφερθεί φαινομενική «ενίσχυση», ομάδες ή πολυσωμία του Chromosome 17 (με ή χωρίς ομάδες HER2 SISH). 26 Σε περιπτώσεις με ομάδες HER2 και Chromosome 17, πρέπει να δοθεί προσοχή ώστε να μην θεωρηθούν με λόγο ~1,0. Σε αυτές τις περιπτώσεις, ο αναγνώστης πρέπει να ανατρέχει στην IHC για αναλύσεις της υπερέκφρασης πρωτεΐνης HER2, καθώς η πλειοψηφία τείνει να είναι Μονοαλληλική διαγραφή: Η διαγραφή του γονιδίου HER2 από το Chromosome 17 στα ογκοκύτταρα έχει ως αποτέλεσμα λόγο HER2/Chr17 < 1,0. Εποπτική παρουσίαση σήματος και επάρκεια αντικειμενοφόρων Τα σήματα SISH και Red ISH παρουσιάζονται οπτικά ως: 1. Μεμονωμένο αντίγραφο. Ένα διακριτό μαύρο (SISH) ή κόκκινο σήμα (Red ISH) μετράται ως μεμονωμένο αντίγραφο του HER2 ή Chr17, αντίστοιχα. Για το σήμα SISH (μαύρο), τα διακριτά μεμονωμένα σήματα που απεικονίζονται στους εσωτερικούς, φυσιολογικούς πυρήνες θετικού μάρτυρα της ίδιας αντικειμενοφόρου (μη νεοπλαστικοί) αντιπροσωπεύουν το μέγεθος ενός μεμονωμένου αντιγράφου στα κύτταρα διηθητικού καρκινώματος. Για τα σήματα Red ISH, κάθε διακριτό σήμα μετράται ως ένα αντίγραφο. Πρέπει να σημειωθεί ότι το σήμα Red ISH από το Chromosome 17-DIG probe μπορεί να εμφανίζεται μεγαλύτερο από ό,τι τα σήματα SISH, μερικές φορές με επίμηκες σχήμα, και μπορεί να ποικίλλει σε μέγεθος εντός μιας περιοχής-στόχου και μεταξύ δειγμάτων. Τα σήματα SISH μπορεί να φαίνονται σημαντικά μικρότερα από τα σήματα Red ISH. Εντούτοις, δεν απαιτείται ελάχιστο μέγεθος σήματος και όλα τα διακριτά σήματα πρέπει να μετρώνται. Είναι δυνατόν να εμφανιστούν κηλίδες SISH ή κόκκινη αχλύς, τα οποία δεν πρέπει να εκληφθούν λανθασμένα ως σήμα. Τα κόκκινα σήματα που είναι πολύ ανοιχτού χρώματος σε σύγκριση με το σήμα στους πυρήνες εσωτερικού θετικού μάρτυρα και με το συνολικό πρότυπο χρώσης δεν πρέπει να απαριθμούνται, καθώς είναι μη ειδικά. Αν παρατηρηθούν κηλίδες SISH, ανατρέξτε στην ενότητα «Αντιμετώπιση προβλημάτων» για σχετικές συστάσεις. 2. Πολλαπλά αντίγραφα. Διακριτά μεμονωμένα σήματα SISH που απεικονίζονται στους πυρήνες του εσωτερικού θετικού μάρτυρα αντιπροσωπεύουν το μέγεθος ενός μεμονωμένου αντιγράφου HER2 στα κύτταρα διηθητικού καρκινώματος. Το μέγεθος των μεμονωμένων σημάτων SISH χρησιμοποιείται ως αναφορά για τον προσδιορισμό του σχετικού αριθμού των ενισχυμένων αντιγράφων στους καρκινικούς πυρήνες. Για το Red ISH, κάθε διακριτό σήμα μετράται ως ένα αντίγραφο. 3. Ομάδες. Μια ομάδα καθορίζεται ως πολυάριθμα αλληλοεπικαλυπτόμενα σήματα SISH στους πυρήνες, τα οποία δεν μπορούν να διακριθούν μεμονωμένα. Οι ομάδες HER2 μπορούν μόνο να εκτιμηθούν κατά προσέγγιση από τον αναγνώστη. Για παράδειγμα, μια μεγάλη ομάδα πολλαπλών σημάτων SISH θα μπορούσε να εκτιμηθεί ως 12 αντίγραφα, ενώ μικρότερες ομάδες μπορούν να εκτιμηθούν ως 6 αντίγραφα. Η εκτίμηση πραγματοποιείται χρησιμοποιώντας τα μεμονωμένα αντίγραφα SISH που είναι παρόντα στα κύτταρα εσωτερικού θετικού μάρτυρα ως αναφορά. Η παρουσία των ομάδων HER2 σημειώνεται στο φύλλο βαθμολόγησης. 4. Αλληλοεπικαλυπτόμενοι πυρήνες, πυρήνες με μόνο ένα παρόν χρώμα και δείγματα με μη ειδική χρώση δεν πρέπει να απαριθμούνται. Οι πυρήνες με αλληλοεπικαλυπτόμενα σήματα Red ISH και SISH που δεν μπορούν να διακριθούν πρέπει να παρουσιάζονται εποπτικά σε μεγαλύτερες μεγεθύνσεις, για να είναι δυνατή η διάκριση των δύο σημάτων, ή δεν πρέπει να μετρώνται. Οι πυρήνες που εμφανίζονται ως φυσαλίδες σε βαθμό που να επηρεάζεται η ερμηνεία του σήματος δεν πρέπει να μετρώνται. Απαρίθμηση των σημάτων SISH και Red ISH για τον προσδιορισμό της κατάστασης γονιδίου HER2 Πριν την απαρίθμηση των σημάτων HER2 και Chromosome 17 για τον προσδιορισμό της κατάστασης γονιδίου HER2, είναι κρίσιμης σημασίας να καθοριστεί το εάν η διηθητική περιοχή-στόχος (ο ιστός με τη βλάβη) είναι επαρκώς χρωματισμένη και ικανοποιεί τα κριτήρια που περιγράφονται για την επάρκεια της αντικειμενοφόρου (δείτε την ενότητα «Ορισμοί» παραπάνω, «2. Επάρκεια των αντικειμενοφόρων»). Η Ventana έχει αναπτύξει έναν αλγόριθμο βαθμολόγησης για τον προσδιορισμό, ο οποίος μεγιστοποιεί την ακρίβεια και την αποτελεσματικότητα στη μέτρηση. Πρέπει να απαριθμηθούν είκοσι πυρήνες, που ο καθένας περιέχει κόκκινα (Red ISH) και μαύρα (SISH) σήματα. Τα τελικά αποτελέσματα για την κατάσταση HER2 αναφέρονται με βάση το λόγο που προκύπτει διαιρώντας το άθροισμα των σημάτων HER2 και για τους 20 πυρήνες δια το άθροισμα των σημάτων Chromosome 17 και για τους 20 πυρήνες. Η κατάσταση ενίσχυσης καθορίζεται ως «Ενισχυμένη» εάν ο λόγος HER2/Chr17 είναι 2,0 και ως «Mη ενισχυμένη» εάν ο λόγος HER2/Chr17 είναι < 2.0. Εάν ο λόγος HER2/Chr / EL Rev C

6 πέσει μεταξύ 1,8 και 2,2 (συμπεριλαμβανομένου αυτού), πρέπει να απαριθμηθούν 20 επιπλέον πυρήνες. Ένας νέος λόγος πρέπει στη συνέχεια να δημιουργηθεί με βάση και τους 40 πυρήνες και η κατάσταση ενίσχυσης να αναφερθεί όπως περιγράφηκε ήδη. Κριτήρια επιλογής κυττάρων Μετρήστε μόνο πυρήνες με διαμέτρους που είναι αντιπροσωπευτικές του μέσου πληθυσμού των πυρήνων διηθητικού καρκινώματος στην περιοχή-στόχο. Μην μετράτε σήματα στους πυρήνες που είναι: 1. Πολύ μεγαλύτεροι σε διάμετρο από ό,τι το μέσο μέγεθος των πυρήνων του καρκινώματος 2. Πολύ μικρότεροι σε διάμετρο από ό,τι το μέσο μέγεθος των πυρήνων του καρκινώματος Εάν οι περιοχές-στόχοι είναι γενετικά ετερογενείς για αριθμό αντιγράφων HER2, μετρήστε μόνο τους πυρήνες που είναι αντιπροσωπευτικοί του πληθυσμού των πυρήνων διηθητικού καρκινώματος με τον υψηλότερο μέσο αριθμό σημάτων. Σημειώστε ότι η ετερογένεια είναι παρούσα στο φύλλο βαθμολόγησης. Πίνακα 3. Εποπτική παρουσίαση σήματος για το INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail. Μη μετράτε εάν οι πυρήνες αλληλοεπικαλύπτονται. Ένα κόκκινο σήμα κοντά σε ένα μαύρο σήμα πρέπει να μετρηθεί ως ένα κόκκινο σήμα και ένα μαύρο σήμα. Αυτό μπορεί να απαιτεί απαρίθμηση σε αντικειμενικό φακό 60x για να είναι διακριτό. Συνεπώς, μετρήστε ως 4 μαύρα σήματα και 2 κόκκινα σήματα. Εάν δεν είναι δυνατή η διάκριση αλληλοεπικαλυπτόμενων σημάτων, μην μετράτε αυτόν τον πυρήνα. Ομάδα μαύρων σημάτων επισκιάζει το(α) κόκκινο(α) σήμα(τα). Εδώ μπορεί να χρησιμοποιηθεί μεγέθυνση (60x) σε μια προσπάθεια να επιβεβαιωθεί η παρουσία ή η απουσία κόκκινου σήματος (ή σημάτων). Διαφορετικά, μην μετράτε: να μετράτε πάντοτε πυρήνες με ευκρινή κόκκινα σήματα. Σημειώστε την παρουσία ομάδων SISH στο φύλλο βαθμολόγησης. Πυρήνες με ορατούς και υψηλότερους αριθμούς κόκκινου σήματος πρέπει να βαθμολογούνται σε πυρήνες με ομάδες SISH. Εάν εμφανίζεται «σκόνη» SISH υποβάθρου στους πυρήνες, μετρήστε μόνο εάν συγκεκριμένα σήματα SISH είναι σαφώς διακριτά από το υπόβαθρο. Είναι δυνατόν να παρατηρηθεί κόκκινη αχλύς, η οποία δεν πρέπει να εκληφθεί λανθασμένα ως σήμα. Το κόκκινο σήμα μπορεί να ποικίλλει σε ένταση, αλλά είναι πάντοτε ευδιάκριτο. Η εικόνα δείχνει 2 διακριτά κόκκινα (Chr17) σήματα και 2 μαύρα (HER2) σήματα. Μην μετράτε εάν δεν υπάρχει σήμα. Μη μετράτε εάν υπάρχει παρόν σήμα ενός μόνο χρώματος. Μην μετράτε εάν τα σήματα βρίσκονται εκτός του πυρήνα. Κατάσταση γονιδίου HER2: Αλγόριθμος βαθμολόγησης για το HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Πρέπει να απαριθμηθούν είκοσι πυρήνες (που ο καθένας περιέχει κόκκινα (Chr17) και μαύρα (HER2) σήματα). Τα τελικά αποτελέσματα για την κατάσταση HER2 αναφέρονται με βάση το λόγο που προκύπτει διαιρώντας το άθροισμα των σημάτων HER2 και για τους 20 πυρήνες δια το άθροισμα των σημάτων Chromosome 17 και για τους 20 πυρήνες. Η κατάσταση ενίσχυσης καθορίζεται ως «Ενισχυμένη» εάν ο λόγος HER2/Chr17 είναι 2,0 και ως «Mη ενισχυμένη» εάν ο λόγος HER2/Chr17 είναι < 2,0. Εάν ο λόγος HER2/Chr17 πέσει μεταξύ 1,8 και 2,2, πρέπει να απαριθμηθούν 20 επιπλέον πυρήνες. Ένας νέος λόγος πρέπει στη συνέχεια να δημιουργηθεί με βάση και τους 40 πυρήνες και η κατάσταση ενίσχυσης να αναφερθεί όπως περιγράφηκε ήδη. Έναρξη Αντικειμενοφόρος χρωματισμένη με HER2/Chr17 Μετρήστε ως 1 μαύρο (HER2) και 1 κόκκινο (Chr17) σήμα. Αντικειμενοφόρος επαρκής; Όχι Ανεπαρκής Μετρήστε ως 2 μαύρα (HER2) και 2 κόκκινα (Chr17) σήματα. Ναι Αναγνωρίστε και επιλέξτε την περιοχή-στόχο Μετρήστε ως 1 μαύρο (HER2) και 2 κόκκινα (Chr17) σήματα. Το μαύρο σήμα είναι ένα «δίδυμο». Μετρήστε δύο παρακείμενα σήματα του ίδιου χρώματος μόνο εάν η απόσταση μεταξύ των σημάτων είναι ίση με ή μεγαλύτερη από τη διάμετρο ενός μεμονωμένου σήματος. Μικρές SISH ομάδες μπορούν να εκτιμηθούν μόνο κατά προσέγγιση χρησιμοποιώντας το μέγεθος μίας μεμονωμένης κουκκίδας ως αναφορά χρησιμοποιήστε τα κύτταρα του στρώματος για να εκτιμήσετε κατά προσέγγιση το μέγεθος του σήματος (μικρότερο κύτταρο στα αριστερά). Για παράδειγμα, αυτή η ομάδα θα μπορούσε να εκτιμηθεί ως 6 σήματα SISH η προσθήκη των άλλων 2 μεμονωμένων σημάτων δίνει συνολικό αριθμό 8. Μετρήστε ως 2 κόκκινα σήματα. Σημειώστε στο φύλλο βαθμολόγησης ότι υπάρχουν παρούσες ομάδες για HER2. Εκτιμήστε κατά προσέγγιση τη μεγάλη ομάδα. Εδώ, η ομάδα μπορεί να εκτιμηθεί ως 12 μαύρα σήματα η προσθήκη των άλλων 4 μεμονωμένων σημάτων δίνει συνολικό αριθμό 16. Μετρήστε τα κόκκινα σήματα ως 2 αντίγραφα του Chromosome 17. Σημειώστε στο φύλλο βαθμολόγησης ότι υπάρχουν παρούσες ομάδες για HER2. Μετρήστε τα σήματα HER2 και Chromosome 17 σε 20 πυρήνες Υπολογίστε το λόγο HER2/Chr17 διαιρώντας το συνολικό αριθμό των σημάτων HER2 από την περιοχή-στόχο 1 δια του συνολικού αριθμού των σημάτων Chr17 από την περιοχή-στόχο 1 Είναι 1,8 HER2/Chr17 2,2; Όχι Αναφέρετε τα αποτελέσματα Μη ενισχυμένη κατάσταση HER2/Chr17 < 2,0 Ενισχυμένη κατάσταση HER2/Chr17 2,0 Ναι Μετρήστε τους επιπλέον 20 πυρήνες Υπολογίστε το λόγο HER2/Chr17 διαιρώντας το συνολικό αριθμό των σημάτων HER2 από τις περιοχές-στόχους 1 και 2 δια του συνολικού αριθμού των σημάτων Chr17 από τις περιοχές-στόχους 1 και / EL Rev C

7 Μάρτυρες Η παρουσία αργυρών και κόκκινων σημάτων εντός των πυρήνων των φυσιολογικών κυττάρων αποτελεί ένδειξη θετικής αντιδραστικότητας. Οι πυρήνες των φυσιολογικών κυττάρων πρέπει να περιέχουν κατά μέσο όρο 1 2 διακριτά SISH και Red ISH σήματα, πράγμα που υποδεικνύει ότι οι ιχνηθέτες (probe) HER2 DNA και κεντρομερικού Chromosome 17 έχουν υβριδιστεί στο γονίδιο και στο χρωμόσωμά του, αντίστοιχα. Αποτυχία ανίχνευσης μεμονωμένου αντιγράφου του γονιδίου σε φυσιολογικά κύτταρα υποδεικνύει ανεπάρκεια της αντικειμενοφόρου και τα αποτελέσματα πρέπει να θεωρηθούν άκυρα. Η χρήση αντικειμενοφόρων ξενομοσχευμάτων θα βοηθήσει στην επίλυση πιθανών προβλημάτων που σχετίζονται με το όργανο και/ή το αντιδραστήριο. Δείγμα ασθενούς Τα μορφολογικά ευρήματα του ασθενούς και τα σχετικά κλινικά δεδομένα πρέπει να ερμηνεύονται από ειδικευμένο παθολογοανατόμο. ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ Γενικοί περιορισμοί 1. Η ISH είναι μια διαγνωστική μεθοδολογία πολλαπλών βημάτων που απαιτεί εξειδίκευση στην επιλογή των καταλλήλων αντιδραστηρίων, στην προετοιμασία δειγμάτων, στην επεξεργασία, στην προετοιμασία της αντικειμενοφόρου ISH, καθώς και στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων. 2. Η χρώση των ιστών εξαρτάται από τον χειρισμό και την επεξεργασία των ιστών πριν τη διαδικασία χρώσης. Ακατάλληλη μονιμοποίηση, κατάψυξη, απόψυξη, πλύση, ξήρανση, θέρμανση, κατάτμηση ή μόλυνση με άλλους ιστούς ή υγρά ενδέχεται να έχουν ως αποτέλεσμα τη δημιουργία τεχνικών σφαλμάτων (artifacts). Τυχόν διαφοροποιήσεις στις μεθόδους μονιμοποίησης και εγκλεισμού, καθώς και η ύπαρξη εγγενών ανωμαλιών εντός του ιστού ενδέχεται να επιφέρουν ασυνεπή αποτελέσματα. 3. Η υπερβολική ή ατελής αντίχρωση ενδέχεται να υποβαθμίσει την ορθή ερμηνεία των αποτελεσμάτων. 4. Η κλινική ερμηνεία της χρώσης πρέπει να αξιολογείται εντός του πλαισίου του κλινικού ιστορικού, της μορφολογίας και άλλων ιστοπαθολογικών κριτηρίων. Η χρώση του παρασκευάσματος με τη χρήση αντιδραστηρίων και καταλλήλων μεθόδων, πρέπει να γίνεται με ευθύνη έμπειρου παθολογοανατόμου. Η χρώση πρέπει να πραγματοποιείται σε πιστοποιημένο, αδειοδοτημένο εργαστήριο υπό την επίβλεψη παθολογοανατόμου ο οποίος είναι και ο υπεύθυνος για την εξέταση των κεχρωσμένων αντικειμενοφόρων καθώς και την επάρκεια των μαρτύρων. 5. Η Ventana παρέχει αντιδραστήρια σε βέλτιστη αραίωση, έτοιμα προς χρήση, όταν ακολουθούνται οι οδηγίες που παρέχονται. Περαιτέρω αραίωση ενδέχεται να προκαλέσει απώλεια της κατάλληλης χρώσης. Ο χρήστης πρέπει να επικυρώσει κάθε ενδεχόμενη τέτοια μεταβολή. Οποιαδήποτε απόκλιση από τις συνιστώμενες διαδικασίες ενδέχεται να ακυρώσει τα αναμενόμενα αποτελέσματα της δοκιμασίας. Οι χρήστες που αποκλίνουν από τις συνιστώμενες διαδικασίες της εξέτασης αναλαμβάνουν και την ευθύνη της ερμηνείας των αποτελεσμάτων των ασθενών. 6. Λόγω διαφοροποιήσεων στην επεξεργασία του δείγματος ενδέχεται να είναι απαραίτητη η αύξηση ή η μείωση του χρόνου επώασης με την πρωτεάση ISH ή η χρήση διαφορετικής πρωτεάσης ISH στα μεμονωμένα δείγματα. Ο χρήστης πρέπει να επικυρώνει τυχόν τέτοιες μεταβολές. Οι χρήστες που αποκλίνουν από τις συνιστώμενες διαδικασίες της εξέτασης, αναλαμβάνουν και την ευθύνη της ερμηνείας των αποτελεσμάτων των ασθενών υπό τις εκάστοτε συνθήκες. 7. Τα αντιδραστήρια ενδέχεται να παρουσιάσουν απροσδόκητες αντιδράσεις σε ιστούς που εξετάζονται για πρώτη φορά. Η πιθανότητα μη αναμενόμενων αντιδράσεων ακόμη και σε ομάδες ιστών που έχουν υποβληθεί σε εξέταση δεν μπορεί να αποκλειστεί πλήρως, λόγω της βιολογικής διακύμανσης των ιστών. Σε περίπτωση τεκμηριωμένων μη αναμενόμενων αντιδράσεων, επικοινωνήστε με τον αντιπρόσωπο υποστήριξης στην περιοχή σας. Ειδικοί περιορισμοί 1. Το INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail σχεδιάστηκε για να χρωματίζει τομές ιστού που είναι μονιμοποιημένες σε 10% NBF και κομμένες σε ~4 μm πάχος. 27 Ο προσδιορισμός χρωματίζει επίσης δείγματα μονιμοποιημένα σε αλκοολική φορμαλίνη, φορμαλίνη ψευδαργύρου και μονιμοποιητικό PREFER. Η μονιμοποίηση σε Bouin s ή AFA δεν συνιστάται. 2. Για να αποφύγετε τη διάλυση του σήματος Red ISH, οι κεχρωσμένες αντικειμενοφόροι δεν πρέπει να εμβυθίζονται σε λουτρά αλκοόλης ή ακετόνης για αφυδάτωση. Συνιστάται στέγνωμα στον αέρα ή στέγνωμα σε κλίβανο. 3. Το σήμα SISH είναι γνωστό ότι ξεθωριάζει μετά από έκθεση σε ορισμένα επικαλυπτικά μέσα. Ανατρέξτε στον Πίνακα 11 στην ενότητα «Αντιμετώπιση προβλημάτων» για μια λίστα των συμβατών επικαλυπτικών μέσων. ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ 1. Το INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides οι οποίες χαρακτηρίστηκαν προηγουμένως για αριθμό αντιγράφων γονιδίου HER2 από το Abbott/Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit για φθορίζοντα in situ υβριδισμό (FISH) και προσδιορίστηκε ότι έχουν όμοιους λόγους HER2/Chr17. Επιπλέον, περίπου 90 ανθρώπινα δείγματα (ένα μίγμα ενισχυμένων και μη ενισχυμένων περιπτώσεων) χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας το INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail και απαριθμήθηκαν από δύο ειδικευμένους αναγνώστες. Η ίδια πληθυσμιακή ομάδα χρωματίστηκε χρησιμοποιώντας PathVysion FISH και διαβάστηκε από έναν ειδικευμένο αναγνώστη. Για τον προσδιορισμό INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail, το ποσοστό επιτυχίας χρώσης με την πρώτη φορά ήταν > 93%. Τα αποτελέσματα που δείχνουν τα αρνητικά, θετικά και συνολικά ποσοστά συμφωνίας για τα περίπου 60 κλινικά δείγματα αυτής της πληθυσμιακής ομάδας τα οποία ήταν απαριθμήσιμα τόσο με FISH όσο και με INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail παρουσιάζονται στον Πίνακα 4 και τον Πίνακα 5. Πίνακα 4. Συμφωνία μεταξύ INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail και FISH σε μια κοόρτη δειγμάτων ανθρώπινου καρκινώματος του μαστού σε 2 αναγνώστες. Αναγνώστης HER2 Dual ISH Αναγνώστης A Αναγνώστης B Κατάσταση ενίσχυσης HER2 Dual ISH Κατάσταση ενίσχυσης FISH Ενισχυμένη Μη ενισχυμένη Ενισχυμένη 21 2 Μη ενισχυμένη 1 40 Ενισχυμένη 17 1 Μη ενισχυμένη 2 41 Πίνακα 5. Σύνοψη των αρνητικών, θετικών και συνολικών ποσοστών συμφωνίας για INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail και FISH σε δείγματα ανθρώπινου καρκινώματος του μαστού. Αναγνώστης HER2 Dual ISH Αναγνώστης A Αναγνώστης B Ποσοστό αρνητικής συμφωνίας Ανεπεξέργαστα δεδομένα/αρ. περιπτώσεων 40/42 41/42 Ποσοστό (95% βαθμολογία ΔΕ) 95,2 (84,2-98,7) 97,6 (87,7-99,6) Ποσοστό θετικής συμφωνίας Ανεπεξέργαστα δεδομένα/αρ. περιπτώσεων 21/22 17/19 Ποσοστό (95% βαθμολογία ΔΕ) 95,5 (78,2-99,2) 89,5 (68,6-97,1) Συνολικό ποσοστό συμφωνίας Ανεπεξέργαστα δεδομένα/αρ. περιπτώσεων 61/64 58/61 Ποσοστό (95% βαθμολογία ΔΕ) 95,3 (87,1-98,4) 95,1 (86,5-98,3) 2. Η αναλυτική ειδικότητα (αποτελεσματικότητα υβριδισμού) του INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail προσδιορίστηκε χρωματίζοντας φυσιολογικές ανθρώπινες μεταφασικές στρώσεις με το HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail σε όργανο BenchMark XT. Από τις 100 μεταφασικές στρώσεις που αναλύθηκαν, το 100% παρουσίασε ειδικό συνεντοπισμό τόσο του ιχνηθέτη (probe) HER2 όσο και του ιχνηθέτη (probe) Chromosome Η αναπαραγωγιμότητα του προσδιορισμού INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail ελέγχθηκε σε πέντε διαφορετικές περιπτώσεις ανθρώπινου καρκινώματος του μαστού (που αντιπροσωπεύουν το δυναμικό εύρος της κατάστασης του γονιδίου HER2) και αντικειμενοφόρους HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides, σε πέντε μη διαδοχικές ημέρες σε έξι όργανα (2 BenchMark, 2 BenchMark XT, 2 BenchMark ULTRA). Οι μέσοι αριθμοί αντιγράφων HER2 και Chromosome 17 λήφθηκαν από κάθε όργανο (και στις 3 πλατφόρμες) σε καθεμιά από τις πέντε διαδικασίες. Πάνω από το 98% όλων των αντικειμενοφόρων που χρωματίστηκαν και αξιολογήθηκαν σε αυτήν τη μελέτη (360 συνολικά) πέρασαν με επιτυχία τον έλεγχο επάρκειας αντικειμενοφόρων και έδωσαν επαναλήψιμους αριθμούς αντιγράφων HER2 και Chromosome 17 με %CV <10% σε όλες τις ημέρες, όργανα και πλατφόρμες που εξετάστηκαν / EL Rev C

8 4. Η αναπαραγωγιμότητα από παρτίδα σε παρτίδα του INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail προσδιορίστηκε εξετάζοντας καθεμιά από 3 παρτίδες του INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail με 3 παρτίδες του ultraview SISH DNP και του ultraview Red ISH DIG Detection Kits χρησιμοποιώντας εις διπλούν αντικειμενοφόρους 3 περιπτώσεων ανθρώπινου καρκινώματος του μαστού και HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides. Όλες οι αντικειμενοφόροι (100%) πέρασαν με επιτυχία τον έλεγχο επάρκειας αντικειμενοφόρων και απαριθμήθηκαν από εξειδικευμένο αναγνώστη για ακατέργαστα αντίγραφα HER2 και Chromosome 17 σε 20 πυρήνες/δείγμα. Τα δεδομένα υποβλήθηκαν σε ανάλυση συνιστώσας διασποράς με βάση ένα μοντέλο τυχαίων επιδράσεων, και τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ικανοποιήθηκαν όλα τα κριτήρια αποδοχής στη συγκεκριμένη μελέτη. Οι τιμές %CV στην παρτίδα ιχνηθέτη (probe), παρτίδα κιτ ανίχνευσης και εντός διαδικασίας ήταν όλες < 11%, υποδεικνύοντας την εξαιρετική ακρίβεια του προσδιορισμού. 5. Η συγκρισιμότητα του προσδιορισμού στα δείγματα μαστού προσδιορίστηκε από μια μελέτη που συνέκρινε τον προσδιορισμό INFORM HER2 DNA Probe, όπου οι αριθμοί αντιγράφων HER2 και Chromosome 17 προσδιορίστηκαν σε μεμονωμένες αντικειμενοφόρους χρησιμοποιώντας μεμονωμένη ανίχνευση SISH, με τον προσδιορισμό INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail, όπου οι αριθμοί αντιγράφων HER2 και Chromosome 17 προσδιορίστηκαν σε μια μεμονωμένη αντικειμενοφόρο χρησιμοποιώντας ανίχνευση SISH και Red ISH. Μια κοόρτη 213 περιπτώσεων καρκινώματος του μαστού που περιείχε ~50/50 μίγμα μη ενισχυμένης και ενισχυμένης κατάστασης του γονιδίου εξετάστηκε και με τους δύο προσδιορισμούς σε αυτοματοποιημένα όργανα χρώσης BenchMark XT ( Πίνακα 6). Το συνολικό ποσοστό συμφωνίας στα κλινικά δείγματα του INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail με τον προσδιορισμό INFORM HER2 DNA Probe παρουσιάζεται στον Πίνακα Η αναπαραγωγιμότητα του προσδιορισμού INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail ελέγχθηκε σε τέσσερις διαφορετικές περιπτώσεις ανθρώπινου γαστρικού καρκινώματος (που αντιπροσωπεύουν το δυναμικό εύρος της κατάστασης του γονιδίου HER2), σε πέντε μη διαδοχικές ημέρες σε έξι όργανα (2 BenchMark, 2 BenchMark XT, 2 BenchMark ULTRA). Οι μέσοι αριθμοί αντιγράφων HER2 και Chromosome 17 λήφθηκαν από κάθε όργανο (και στις 3 πλατφόρμες) σε καθεμιά από τις πέντε διαδικασίες. Πάνω από το 98% όλων των αντικειμενοφόρων που χρωματίστηκαν και αξιολογήθηκαν σε αυτήν τη μελέτη (240 συνολικά) πέρασαν με επιτυχία τον έλεγχο επάρκειας αντικειμενοφόρων και έδωσαν επαναλήψιμους αριθμούς αντιγράφων HER2 και Chromosome 17 με %CV < 10% σε όλες τις ημέρες, όργανα και πλατφόρμες που εξετάστηκαν. 7. Η συγκρισιμότητα του προσδιορισμού στα γαστρικά δείγματα προσδιορίστηκε συγκρίνοντας τα αποτελέσματα χρώσης του προσδιορισμού INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail που διενεργήθηκε σε όργανο BenchMark XT με το Dako HER2 FISH pharmdx Kit ( Πίνακα 8). Το συνολικό ποσοστό συμφωνίας στα κλινικά δείγματα του INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail με το Dako HER2 FISH pharmdx Kit παρουσιάζεται στον Πίνακα Η κλινική χρησιμότητα κατά την επιλογή των ασθενών για θεραπεία με KADCYLA έχει καταδειχθεί στη δοκιμή MARIANNE. Η δοκιμή MARIANNE είναι μια τυχαιοποιημένη, τριών σκελών, πολυκεντρική μελέτη Φάσης III που έχει σχεδιαστεί για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας και της ασφάλειας της τραστουζουμάμπης εμτανσίνης (T-DM1) σε συνδυασμό με pertuzumab, καθώς και της T-DM1 σε συνδυασμό με εικονικό φάρμακο, έναντι της συνδυαστικής θεραπείας με trastuzumab συν taxane, για τη θεραπεία ασθενών με HER2-θετικό (όπως ορίζεται από βαθμολογία IHC 3+ στον προσδιορισμό PATHWAY HER2 (4B5) ή/και κατάσταση ενίσχυσης «Ενισχυμένη» στον προσδιορισμό ISH INFORM HER2 Dual ISH) εξελισσόμενο ή υποτροπιάζοντα τοπικά προχωρημένο καρκίνο του μαστού (LABC) ή μεταστατικό καρκίνο του μαστού (MBC) οι οποίες δεν έχουν λάβει προηγούμενη χημειοθεραπεία για την μεταστατική τους νόσο. Συνολικά 1629 υποκείμενα υποβλήθηκαν σε διαδικασίες διαλογής για ένταξη στη δοκιμή MARIANNE και 1563 από αυτά ελέγχθηκαν με τον προσδιορισμό PATHWAY HER2 (4B5) ή/και INFORM HER2 Dual ISH. Συνολικά, στη δοκιμή φάσης III εντάχθηκαν 1093 ασθενείς με HER2-θετικό καρκίνο και 2 ασθενείς με HER2-αρνητικό καρκίνο σύμφωνα με τα κριτήρια ένταξης της δοκιμής MARIANNE. Σε 983 από αυτούς τους ασθενείς βρέθηκε δείγμα HER2-θετικό κατά την ανάλυση με τον προσδιορισμό INFORM HER2 Dual ISH. Το πρωτεύον τελικό σημείο αποτελεσματικότητας για τη μελέτη MARIANNE ήταν η επιβίωση χωρίς εξέλιξη της νόσου (PFS), με βάση την αξιολόγηση από ανεξάρτητο κέντρο ελέγχου (IRF), σε ασθενείς με HER2-θετικό εξελισσόμενο ή υποτροπιάζοντα τοπικά προχωρημένο καρκίνο του μαστού (LABC) ή μεταστατικό καρκίνο του μαστού (MBC) για τον οποίο δεν έχει χορηγηθεί προηγούμενη θεραπεία. Η μέση PFS (επιβίωση χωρίς εξέλιξη της νόσου) ήταν 13,7 μήνες για trastuzumab + taxane, 14,1 μήνες για T-DM1 + εικονικό φάρμακο και 15,2 μήνες για T-DM1 + pertuzumab. Η μελέτη κατέδειξε την μη κατωτερότητα της PFS (επιβίωση χωρίς εξέλιξη της νόσου) και για τα δύο δοσολογικά σχήματα που περιείχαν T-DM1 σε σύγκριση με την trastuzumab + taxane [οι στρωματοποιημένοι λόγοι επικινδυνότητας (HR) ήταν κάτω από το προκαθορισμένο περιθώριο μη κατωτερότητας του HR=1,1765]. Ωστόσο, κανένα από τα δοσολογικά σχήματα που περιείχαν T-DM1 δεν έδειξαν σημαντική ανωτερότητα της PFS σε σύγκριση με την trastuzumab + taxane. Για την T-DM1 + εικονικό φάρμακο: HR=0,91 (ΔΕ 95%: 0,73, 1,13). Για την T-DM1 + pertuzumab: HR=0,87 (ΔΕ 95%: 0,69, 1,08). Επιπλέον, η προσθήκη pertuzumab στην T-DM1 δεν είχε ως αποτέλεσμα στατιστικά σημαντική αύξηση της PFS (HR=0,91, ΔΕ 95%: 0,73, 1,13). Πίνακα 6. Συμφωνία μεταξύ του INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail χρησιμοποιώντας ανίχνευση Dual SISH και Red ISH Detection και του INFORM HER2 DNA Probe χρησιμοποιώντας μεμονωμένη ανίχνευση SISH, σε μια κοόρτη δειγμάτων διηθητικού καρκινώματος του μαστού. Κατάσταση ενίσχυσης HER2 Dual ISH Κατάσταση ενίσχυσης FISH Ενισχυμένη Μη ενισχυμένη Σύνολο Ενισχυμένη Μη ενισχυμένη Σύνολο Πίνακα 7. Σύνοψη του συνολικού ποσοστού συμφωνίας για INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail χρησιμοποιώντας ανίχνευση Dual SISH και Red ISH Detection σε σύγκριση με το INFORM HER2 DNA Probe χρησιμοποιώντας μεμονωμένη ανίχνευση SISH, σε δείγματα διηθητικού καρκινώματος του μαστού. Παρουσιάζονται επίσης τα διαστήματα εμπιστοσύνης 95%. Ανεπεξέργαστα δεδομένα /αρ. περιπτώσεων Συνολικό ποσοστό συμφωνίας Ποσοστό (βαθμολογία ΔΕ 95%) 193/213 90,6 (85,9-93,8) Πίνακα 8. Συμφωνία μεταξύ του προσδιορισμού INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail και της δοκιμασίας Dako FISH pharmdx σε δείγματα γαστρικού καρκινώματος. Κατάσταση ενίσχυσης HER2 Dual ISH Κατάσταση ενίσχυσης Dako FISH Ενισχυμένη Μη ενισχυμένη Σύνολο Ενισχυμένη Μη ενισχυμένη Σύνολο Πίνακα 9. Σύνοψη του συνολικού ποσοστού συμφωνίας μεταξύ του προσδιορισμού INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail και της δοκιμασίας Dako FISH για την κατάσταση του γονιδίου HER2 σε δείγματα γαστρικού καρκινώματος. Παρουσιάζονται επίσης τα διαστήματα εμπιστοσύνης 95%. Ανεπεξέργαστα δεδομένα /αρ. περιπτώσεων Συνολικό ποσοστό συμφωνίας Ποσοστό (βαθμολογία ΔΕ 95%) 138/146 94,5 (89,6-97,2) / EL Rev C