ADVANCE TM HRP. Κωδικός K4069. Έτοιµο για χρήση. Προοριζόµενη χρήση. Για In Vitro διαγνωστική χρήση.

Transcript

1 ADVANCE TM HRP Κωδικός K4067 Κωδικός K4068 Κωδικός K4069 Έτοιµο για χρήση 500 ml 110 ml 11 ml Προοριζόµενη χρήση Για In Vitro διαγνωστική χρήση. Το παρόν σύστηµα προορίζεται για χρήση µε πρωτογενή αντισώµατα από ποντικό ή κουνέλι που παρέχεται από το χρήστη για τον ποιοτικό προσδιορισµό αντιγόνων µε κοινό µικροσκόπιο σε υγιείς και παθολογικούς ιστούς µονιµοποιηµένους σε φορµαλίνη και εγκλεισµένους σε παραφίνη. Ένας κατάλογος των συνιστώµενων προϊόντων που διατίθενται από την Dako για βέλτιστη χρήση του ADVANCE TM HRP παρέχεται παρακάτω. Ανοσοϊστοχηµική Χρώση») για: (1) την Αρχή της διαδικασίας, (2) τα Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται, (3) την Αποθήκευση, (4) την Προετοιµασία δειγµάτων, (5) τη ιαδικασία χρώσης, (6) τον Ποιοτικό έλεγχο, (7) την Αντιµετώπιση προβληµάτων, (8) την Ερµηνεία της χρώσης, (9) τους Γενικούς περιορισµούς. Περίληψη και επεξήγηση Αρχή της διαδικασίας Αντιδραστήριο που παρέχεται Υλικά που απαιτούνται, αλλά δεν παρέχονται Το σύστηµα εντοπισµού ADVANCE HRP είναι µια εξαιρετικά ευαίσθητη ανοσοϊστοχηµική χρωστική τεχνική (IHC). Το σύστηµα χρησιµεύει στον εντοπισµό αντιγόνων που υπάρχουν σε χαµηλές συγκεντρώσεις. Το σύστηµα είναι ελεύθερο βιοτίνης, περιορίζοντας ή µειώνοντας σηµαντικά τη µη ειδική χρώση που προκύπτει από ενδογενή δραστηριότητα της αβιδίνης-βιοτίνης στο ήπαρ, στους νεφρούς, στους λεµφώδεις ιστούς και σε κρυοστατικές τοµές. Όλα τα αντιδραστήρια του συστήµατος ADVANCE HRP είναι έτοιµα προς χρήση. Το σύστηµα είναι µια εξαιρετικά ευαίσθητη µέθοδος, και συνεπώς, οι βέλτιστες αραιώσεις του πρωτογενούς αντισώµατος µπορούν να είναι κατά πολύ µεγαλύτερες από εκείνες των παραδοσιακών µεθόδων EnVision, ABC ή LSAB. 1-5 Οποιαδήποτε δραστηριότητα της ενδογενούς υπεροξειδάσης αναιρείται µε επώαση του δείγµατος ε κατάλληλο αντιδραστήριο φραγµού της ενδογενούς υπεροξειδάσης. Κατόπιν, το δείγµα επωάζεται µε κατάλληλα χαρακτηρισµένο και αραιωµένο πρωτογενές αντίσωµα ποντικού ή κουνελιού, και ακολούθως µε διαδοχικές επωάσεις διαρκείας 30 λεπτών µε ADVANCE HRP Link και ADVANCE HRP Enzyme. Η χρώση ολοκληρώνεται µε επώαση επί 5 30 λεπτά σε κατάλληλο υπόστρωµα χρωµογόνου. ADVANCE TM HRP Link Το αντιδραστήριο αυτό περιέχει δευτερεύοντα αντισώµατα αντι-ποντικού και αντι-κουνελιού σε ρυθµιστικό διάλυµα Tris-HCl που περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και αντιµικροβιακό παράγοντα. ADVANCE TM HRP Enzyme Το αντιδραστήριο αυτό περιέχει αντισώµατα πολυµερισµένα µε υπεροξειδάση του χρένου σε ρυθµιστικό διάλυµα Tris-HCl που περιέχει σταθεροποιητική πρωτεΐνη και αντιµικροβιακό παράγοντα. Τα αντιδραστήρια του συστήµατος εντοπισµού ADVANCE HRP είναι κατάλληλα για ανοσοϊστοχηµικές διαδικασίες. Τα αντιδραστήρια παρέχονται έτοιµα προς χρήση. Η περαιτέρω αραίωση των αντιδραστηρίων αυτών ή η αλλαγή στη θερµοκρασία επώασης ενδέχεται να δώσουν εσφαλµένα αποτελέσµατα. Απορροφητικές χαρτοπετσέτες Ιστός-µάρτυρας, θετικός και αρνητικός Αντίχρωση µε υδατική βάση, όπως Automation Hematoxylin (κωδικός S3301), Hematoxylin for IHC (κωδικός S3302) και Mayer s Hematoxylin ή Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (κωδικός S3309) Καλυπτρίδες Αποσταγµένο νερό Αιθανόλη, απόλυτη και 95% Κοινό µικροσκόπιο (20x 800x) Υλικά επικάλυψης, όπως το Glycergel Mounting Medium (κωδικός C0563) ή το Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (κωδικός S3025) ή µη υδατικό υλικό µόνιµης επικάλυψης, Ultramount (κωδικός S1964). Πρωτογενή αντισώµατα και αντιδραστήριο αρνητικού µάρτυρα Αντικειµενοφόροι, µε επίστρωση πολυ-l-λυσίνης ή Silanized Slides (κωδικός S3003) οχεία ή λουτρά χρώσης Χρονόµετρο (µε δυνατότητα µέτρησης χρονικών διαστηµάτων 3-40 λεπτών) Φιάλες πλύσης Ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης Ξυλένιο, τολουένιο ή υποκατάστατα ξυλενίου Υλικά που απαιτούνται, αλλά δεν παρέχονται Υδροξείδιο του αµµωνίου 15 mol/l αραιωµένο σε 0,037 mol/l PAP Pen (κωδικός S2002) ( ) GR_002 σελ. 1/6

2 Συνιστώµενα προϊόντα Dako Προφυλάξεις Αποθήκευση Κωδικός Dako Όνοµα προϊόντος Τύπος προϊόντος S3800 Autostainer Plus Όργανο S2001 S2003 Peroxidase Block Dual Endogenous Enzyme Block Αποκλεισµός υπεροξειδάσης Αποκλεισµός ενδογενούς υπεροξειδάσης S3006 Wash Buffer 10x Ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης For Automated and Manual IHC Use. K3461/K3469 AEC+ Ready-to-use Σύστηµα υποστρώµατος K3467/K3468 S3301 S3302 S3309 Liquid DAB+ Automation Hematoxylin Hematoxylin for IHC Mayer s Hematoxylin or Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin Αντίχρωση 1. Για επαγγελµατίες χρήστες. 2. Μη χρησιµοποιείτε αντιδραστήρια µετά την ηµεροµηνία λήξης τους για τη συνιστώµενη µέθοδο αποθήκευσης. Αν τα αντιδραστήρια φυλάσσονται σε διαφορετικές συνθήκες από εκείνες που προδιαγράφονται στο ένθετο προϊόντος, πρέπει να ελέγχονται από το χρήστη. 3. Μην αντικαθιστάτε αντιδραστήρια από άλλους αριθµούς παρτίδων ή από κιτ άλλων κατασκευαστών. 4. Τα ένζυµα και τα υποστρώµατα χρωµογόνων ενδέχεται να επηρεάζονται αρνητικά αν εκτεθούν σε έντονο φως. Μην φυλάσσετε τα εξαρτήµατα του κιτ ή µην πραγµατοποιείτε τη χρώση σε δυνατό φως, όπως το άµεσο ηλιακό φως. 5. Όταν ακολουθείτε χρόνους επώασης, θερµοκρασίες διαφορετικές από αυτές που καθορίζονται ενδέχεται να σηµειωθούν εσφαλµένα αποτελέσµατα. Οποιεσδήποτε τέτοιες διαφορές πρέπει να ελέγχονται από το χρήστη. 6. Όπως ισχύει για κάθε προϊόν βιολογικής προέλευσης, πρέπει να τηρούνται οι σωστές διαδικασίες χειρισµού. 7. Φοράτε κατάλληλο Εξοπλισµό Προσωπικής Προστασίας για να αποφύγετε την επαφή µε τα µάτια και το δέρµα. 8. Όσο διάλυµα δεν χρησιµοποιηθεί πρέπει να απορρίπτεται σύµφωνα µε τους τοπικούς, κρατικούς και οµοσπονδιακούς κανονισµούς. Αποθηκεύστε σε θερµοκρασία 2 8 C. εν υπάρχουν ορατά σηµάδια που να υποδεικνύουν έλλειψη σταθερότητας των προϊόντων αυτών. Για το λόγο αυτό, οι θετικοί και αρνητικοί µάρτυρες πρέπει να εξετάζονται ταυτόχρονα µε τα δείγµατα ασθενών. Αν παρατηρηθεί µη αναµενόµενη χρώση, που δεν µπορεί να εξηγηθεί από την ποικιλία των εργαστηριακών διαδικασιών και αν υπάρχουν υποψίες για πρόβληµα στο σύστηµα, επικοινωνήστε µε το Τµήµα Τεχνικής Υποστήριξης της Dako. Προετοιµασία αντιδραστηρίων Είναι σκόπιµο να παρασκευάζονται τα παρακάτω αντιδραστήρια πριν από τη χρώση. Ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης TBST, 0,05 mol/l Tris Buffered Saline with Tween (κωδικός S3006) είναι το συνιστώµενο ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης για αυτόµατο και χειροκίνητο εντοπισµό IHC. TBS, 0,05 mol/l Tris buffered Saline (κωδικός S1968) και PBS, 0,02 mol/l Phosphate Buffered Saline (κωδικός S3024), είναι επίσης κατάλληλα ρυθµιστικά διαλύµατα πλύσης για χειροκίνητη χρώση. εν συνιστώνται Ρυθµιστικά διαλύµατα πλύσης που περιέχουν νατραζίδιο. Το νατραζίδιο απενεργοποιεί την υπεροξειδάση του χρένου (HRP) και δίδει αρνητική χρώση. Αποθηκεύστε το µη χρησιµοποιηµένο ρυθµιστικό σε θερµοκρασία 2 8 C. Απορρίψτε το διάλυµα αν είναι νεφελώδες στην εµφάνιση. Αποσταγµένο νερό µπορεί να χρησιµοποιηθεί για την έκπλυση του αποκλεισµού υπεροξειδάσης, του υποστρώµατος και της αντίχρωσης. Πρωτογενές αντίσωµα Απαιτείται από τον χρήστη η βελτιστοποίηση των πυκνών αντισωµάτων. Πρέπει να προετοιµαστούν αραιώσεις χρησιµοποιώντας το Antibody Diluent (κωδικός S0809), ή αραιωτικό που περιέχει 0,05 mol/l ρυθµιστικό Tris- HCI µε αλβουµίνη βοείου ορού 1% (BSA). Για τα περισσότερα πρωτογενή αντισώµατα που χρησιµοποιούνται στο σύστηµα αυτό, αρκεί χρόνος επώασης 30 λεπτών. Αντιδραστήριο αρνητικός µάρτυρας Ιδανικά, αντιδραστήριο αρνητικός-µάρτυρας περιέχει ένα αντίσωµα που παρουσιάζει µη ειδική ενεργότητα µε ανθρώπινους ιστούς ή κανονικό/µη άνοσο ορό στο ίδιο διάλυµα στρώµατος/διαλύµατος όπως και το αραιωµένο πρωτογενές αντίσωµα. Το αντιδραστήριο αρνητικός-µάρτυρας πρέπει να ανήκει στην ίδια υποκλάση και είδος ζώου όπως και το πρωτογενές αντίσωµα, αραιωµένο στην ίδια συγκέντρωση ανοσοσφαιρίνης ή πρωτεΐνης όπως και το αραιωµένο πρωτογενές αντίσωµα και χρησιµοποιώντας το ίδιο αραιωτικό. Η περίοδος επώασης του αντιδραστηρίου αρνητικού µάρτυρα πρέπει να είναι αντίστοιχη µε αυτή του πρωτογενούς αντισώµατος. ( ) GR_002 σελ. 2/6

3 Αντίχρωση Το χρωµογόνο DAB παρέχει ένα τελικό προϊόν αδιάλυτο σε αλκοόλη και µπορεί να χρησιµοποιηθεί µε αιµατοξυλίνη µε βάση αλκοόλη. Όταν χρησιµοποιείται το AEC υπόστρωµα χρωµογόνου, το χρωµατισµένο τελικό προϊόν της αντίδρασης χρώσης είναι διαλυτό στην αλκοόλη και πρέπει να χρησιµοποιείται µόνο µε αντιχρώσεις µε υδατική βάση όπως το Automation Hematoxylin (κωδικ S3301), Hematoxylin for IHC (κωδικός S3302), Mayer s Hematoxylin ή Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (κωδικός S3309). Μετά την αντίχρωση της αιµατοξυλίνης ακολουθεί διεξοδικό ξέπλυµα µε αποσταγµένο νερό, και κατόπιν βύθιση των αντικειµενοφόρων µε τους ιστούς σε λουτρό που περιέχει αµµωνία 0,037 mol/l ή παρόµοιο παράγοντα bluing. Το υδατικό διάλυµα αµµωνίας 0,037 mol/l παρασκευάζεται µε ανάµιξη 2,5 ml πυκνού διαλύµατος (15 mol/l) υδροξειδίου της αµµωνίας σε 1 λίτρο νερού. Όσο από το υδατικό διάλυµα της αµµωνίας 0,037 mol/l δεν χρησιµοποιηθεί µπορεί να αποθηκευτεί σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) έως και 12 µήνες, µέσα σε µια καλά πωµατισµένη φιάλη. Συµβουλευτείτε τις οδηγίες του κατασκευαστή για εναλλακτικές διαδικασίες αντίχρωσης. Υλικό επικάλυψης Glycergel Mounting Medium (κωδικός C0563) ή Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (κωδικός S3025) συνιστάται για υδατική επικάλυψη. Το Glycergel πρέπει να θερµανθεί στους 50 C τουλάχιστον πριν από τη χρήση. Μη υδατικό µέσο µόνιµης επικάλυψης Ultramount (κωδικός S1964) µπορεί επίσης να χρησιµοποιηθεί. Προετοιµασία δειγµάτων Για χρήση µε τοµές ιστών που έχουν µονιµοποιηθεί σε φορµαλίνη και έχουν εγκλειστεί σε παραφίνη, καθώς και για κατεψυγµένες τοµές ιστών και κυτταρικά επιχρίσµατα. Πριν από τη χρώση IHC, οι ιστοί πρέπει να έχουν µονιµοποιηθεί και υποστεί κατεργασία. Η µονιµοποίηση αποτρέπει την αυτόλυση και σήψη των τεµαχισµένων ιστών, διατηρεί την αντιγονικότητα, αυξάνει το δείκτη διαθλάσεως των στοιχείων του ιστού και ενισχύει την αντίσταση των κυτταρικών στοιχείων έναντι της κατεργασίας του ιστού. Η κατεργασία του ιστού περιλαµβάνει αφυδάτωση, διαύγαση των παραγόντων αφυδάτωσης, διήθηση του µέσου έγκλεισης, έγκλειση και τεµαχισµό των ιστών. Τα πλέον κοινά µέσα µονιµοποίησης για παρασκευάσµατα ιστών IHC αναφέρονται στο «General Instructions for Immunohistochemical Staining» («Γενικές Οδηγίες για Ανοσοϊστοχηµική Χρώση»). Τα παρόντα ισχύουν µόνο ως κατευθυντήριες οδηγίες. Οι βέλτιστες διαδικασίες πρέπει να καθορίζονται και να επαληθεύονται από τον χρήστη. Χαρακτηριστικά απόδοσης ιαδικασία χρώσης Τα αντισώµατα που περιέχονται στο παρόν προϊόν έχουν απορροφηθεί σε στερεά κατάσταση ώστε να αποµακρυνθούν τα αντισώµατα που παρουσιάζουν διασταυρούµενη αντίδραση µε την ανθρώπινη ανοσοσφαιρίνη (Ig), αλλά ενδέχεται να βρεθεί χαµηλού βαθµού διασταυρούµενη αντίδραση µε την Ig άλλων ειδών. Η Ig έναντι ποντικού και έναντι κουνελιού έχουν καθαριστεί µε συγγένεια σε στήλη µε Ig ποντικού και κουνελιού αντίστοιχα. Η συνολική δραστηριότητα αφορά και τα πρωτογενή αντισώµατα ποντικού και τα πρωτογενή αντισώµατα κουνελιού και περιλαµβάνει πρόσδεση προς την IgG, όλες τις υποκλάσεις IgG, και την IgM Η HRP που υπάρχει στο πολυµερές παρασκευάστηκε από HRP υψηλής ειδικής ενεργότητας. Τα µη συζευγµένα µόρια αποµακρύνθηκαν µε χρωµατογραφία διήθησης πηκτώµατος. Σηµειώσεις διαδικασίας Πριν από τη χρήση, ο χρήστης οφείλει να διαβάσει τις οδηγίες αυτές προσεκτικά και να εξοικειωθεί µε όλα τα εξαρτήµατα. Τα αντιδραστήρια και οι οδηγίες που παρέχονται έχουν σχεδιαστεί για βέλτιστη απόδοση. Η περαιτέρω αραίωση των αντιδραστηρίων ή η αλλαγή στους χρόνους επώασης ή στις θερµοκρασίες, µπορεί να δώσουν εσφαλµένα αποτελέσµατα. Πριν από την ανοσοχρώση, όλα τα αντιδραστήρια πρέπει να έρχονται σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C). Οµοίως, όλες οι επωάσεις πρέπει να πραγµατοποιούνται σε θερµοκρασία δωµατίου. Κατά τη διαδικασία της χρώσης, µην αφήνετε τις τοµές των ιστών να στεγνώσουν. Οι στεγνές τοµές ιστών ενδέχεται να παρουσιάσουν αυξηµένη µη ειδική χρώση. Οι αντικειµενοφόροι που εκτίθενται σε ρεύµατα αέρα πρέπει να καλύπτονται. Αν χρησιµοποιούνται παρατεταµένες επωάσεις, τοποθετήστε τους ιστούς σε περιβάλλον υγρασίας. Αυτοµατοποιηµένη Προγραµµατίστε το σύστηµα Dako Autostainer / Autostainer Plus ως εξής: ΒΗΜΑ 1. Επιλέξτε το Πρόγραµµα αυτόµατης µήτρας πρωτοκόλλου. ΒΗΜΑ 2. Τοποθετήστε τα αντιδραστήρια στο στατήρα αντιδραστηρίων του οργάνου και γεµίστε τη φιάλη λύσης και τα δοχεία µε απιονισµένο νερό. ΒΗΜΑ 3. Φορτώστε τις αντικειµενοφόρους στο όργανο. ΒΗΜΑ 4. Ξεκινήστε τον κύκλο της χρώσης. ΒΗΜΑ 5. Αφαιρέστε τις αντικειµενοφόρους από το όργανο. ( ) GR_002 σελ. 3/6

4 Χειροκίνητα (Για κάθε βήµα, βλ. κατάλογο των συµβατών προϊόντων της Dako παραπάνω.) ΒΗΜΑ 1. ΑΠΟΚΛΕΙΣΜΟΣ ΕΝ ΟΓΕΝΟΥΣ ΕΝΖΥΜΟΥ Αφαιρέστε την περίσσεια ρυθµιστικού. Χρησιµοποιώντας χαρτοµάντιλα χωρίς χνούδι, σκουπίστε προσεκτικά γύρω από το δείγµα για να αφαιρέσετε τυχόν υπόλειµµα υγρού και για να διατηρήσετε τα αντιδραστήρια εντός της καθορισµένης περιοχής. Απλώστε αρκετό Dual Endogenous Enzyme Block ή Peroxidase Block για να καλύψετε το δείγµα. Επωάστε επί 5 10 λεπτά για το Dual Endogenous Enzyme Block ή το Peroxidase Block, ανάλογα ε τη συγκέντρωση του ενδογενούς ενζύµου στον υπό εξέταση ιστό. Ξεπλύνετε απαλά µε αποσταγµένο νερό ή ρυθµιστικό διάλυµα από φιάλη πλύσης (µην εστιάσετε τη ροή του υγρού κατευθείαν επάνω στον ιστό) και τοποθετήστε σε πρόσφατα προετοιµασµένο ουτρό ρυθµιστικού διαλύµατος. ΒΗΜΑ 2. ΠΡΩΤΟΓΕΝΕΣ ΑΝΤΙΣΩΜΑ Ή ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΟ ΑΡΝΗΤΙΚΟΣ-ΜΑΡΤΥΡΑΣ αντικειµενοφόρους όπως προηγουµένως. Απλώστε αρκετά βέλτιστα αραιωµένο πρωτογενές αντίσωµα ή αρνητικό αντιδραστήριο-µάρτυρα για να καλύψετε το δείγµα. Επωάστε επί 30 (±1) λεπτά. Ξεπλύνετε απαλά µε ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης από φιάλη πλύσης (µην εστιάσετε τη ροή του υγρού κατευθείαν επάνω στον ιστό) και τοποθετήστε σε πρόσφατα προετοιµασµένο λουτρό ρυθµιστικού επί 5 λεπτά. ΒΗΜΑ 3. ADVANCE TM HRP Link αντικειµενοφόρους όπως προηγουµένως. Απλώστε αρκετό ADVANCE TM HRP Link για να καλύψετε το δείγµα. Επωάστε επί 30 (±1) λεπτά. Ξεπλύνετε τις αντικειµενοφόρους όπως στο βήµα 2. ΒΗΜΑ 4. Ένζυµο ADVANCE TM HRP αντικειµενοφόρους όπως προηγουµένως. Απλώστε αρκετό ADVANCE TM HRP Enzyme για να καλύψετε το δείγµα. Επωάστε επί 30 (±1) λεπτά. Ξεπλύνετε τις αντικειµενοφόρους όπως βήµα 2. ΒΗΜΑ 5. ΧΡΩΜΟΓΟΝΟ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ αντικειµενοφόρους όπως προηγουµένως. Απλώστε αρκετό διάλυµα χρωµογόνου υποστρώµατος για να καλύψετε το δείγµα. Επωάστε επί 5 30 λεπτά (AEC+) ή επί 5 10 λεπτά (DAB+). Ξεπλύνετε τις αντικειµενοφόρους ελαφρά µε απιονισµένο νερό. Συλλέξτε τα απόβλητα υποστρώµατος χρωµογόνου σε δοχείο επικίνδυνων υλικών για σωστή απόρριψη. Τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρους σε ένα πρόσφατα προετοιµασµένο λουτρό µε απιονισµένο νερό. ΒΗΜΑ 6. ΑΝΤΙΧΡΩΗ ΑΙΜΑΤΟΞΥΛΙΝΗΣ (προαιρετικό) Βυθίστε τις αντικειµενοφόρους σε λουτρό αιµατοξυλίνης. Ο χρόνος επώασης διαφέρει ανάλογα µε την ισχύ της αιµατοξυλίνης που χρησιµοποιείτε. Ξεπλύνετε τις αντικειµενοφόρους σε υδατόλουτρο µε αποσταγµένο ή απιονισµένο νερό επί 2 5 λεπτά. * Για αυξηµένη παραγωγικότητα συνιστώνται συντοµότεροι χρόνοι επώασης µε εναλλακτική αραίωση του πρωτογενούς αντισώµατος. Οι συνιστώµενοι χρόνοι επώασης για µέγιστη ευαισθησία είναι 30 λεπτά. Ποιοτικός έλεγχος Οι αποκλίσεις του εργαστηρίου του χρήστη από τις προτεινόµενες τεχνικές διαδικασίες µονιµοποίησης του ιστού, ενδέχεται να προκαλούν σηµαντικές διακυµάνσεις στα αποτελέσµατα, επιβάλλοντας την τακτική διενέργεια εσωτερικών ελέγχων, πέραν των εξής διαδικασιών. Βλ. οδηγίες ποιοτικού ελέγχου του College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry (Πρόγραµµα πιστοποίησης για την ανοσοϊστοχηµεία του συλλόγου Αµερικανών Παθολόγων). Ανατρέξτε στο φύλλο προδιαγραφών για κάθε πρωτογενές αντίσωµα που χρησιµοποιείται για λεπτοµέρειες σχετικά µε την ευαισθησία και ανοσοδραστικότητα. Ανοσοϊστοχηµική Χρώση») για περισσότερες πληροφορίες σχετικά µε τους θετικούς και αρνητικούς µάρτυρες. Ερµηνεία χρώσης Ανοσοϊστοχηµική Χρώση») για οδηγίες ερµηνείας: ( ) GR_002 σελ. 4/6

5 Γενικοί περιορισµοί Ανοσοϊστοχηµική Χρώση») για γενικούς περιορισµούς: Η χρήση παλιών ή µη ρυθµιστικών µονιµοποιητικών, ή η έκθεση των ιστών σε υπερβολική θερµότητα (µεγαλύτερη των 60 C) κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας πιθανόν να προκαλέσει αυξηµένη ευαισθησία χρώσης. Ενεργότητα της ενδογενούς υπεροξειδάσης ή ψευδοϋπεροξειδάσης µπορεί να βρεθεί στις αιµοπρωτεΐνες όπως η αιµοσφαιρίνη, µυοσφαιρίνη, κυτόχρωµα, και καταλάση όπως και στα ηωσινόφιλα. 9,10 Η ενεργότητα αυτή µπορεί να ανασταλεί επωάζοντας τα δείγµατα µε Peroxidase Block επί 5 λεπτά, ή µε Dual Endogenous Enzyme Block επί 5 10 λεπτά πριν την εφαρµογή του πρωτογενούς αντισώµατος. Επιχρίσµατα αίµατος και µυελού των οστών και κατεψυγµένοι ιστοί µπορούν επίσης να υποβληθούν σε επεξεργασία µε το αντιδραστήριο αυτό. Ωστόσο, η διαδικασία αυτή δεν καταργεί την φαιοκόκκινη χρώση των αιµοπρωτεϊνών. Εναλλακτικά, µπορεί να χρησιµοποιηθεί διάλυα µεθανόλης-υπεροξειδίου του υδρογόνου. Μερικά αντισώµατα ενδέχεται να αποσυντίθενται µε τη διαδικασία αυτή. Ιστοί από άτοµα που έχουν µολυνθεί µε τον ιό της ηπατίτιδας Β και περιέχουν το επιφανειακό αντιγόνο της ηπατίτιδας Β (HBsAg), ενδέχεται να εµφανίζουν µη ειδική χρώση µε την υπεροξειδάση του χρένου. 11 Κανονικοί/µη άνοσοι οροί από την ίδια ζωική πηγή όπως και οι δευτερογενείς αντιοροί που χρησιµοποιούνται για τα βήµατα αποκλεισµού ενδέχεται να δώσουν ψευδώς αρνητικά ή ψευδώς θετικά αποτελέσµατα εξαιτίας των αυτοαντισωµάτων ή των φυσικών αντισωµάτων. Τα αντιδραστήρια που περιλαµβάνονται στο παρόν κιτ παρέχονται στην βέλτιστη αραίωση. Περαιτέρω αραίωση ενδέχεται να έχει ως αποτέλεσµα απώλεια εντοπισµού του αντιγόνου. Επίλυση προβληµάτων Παρατήρηση Υπερβολικά ισχυρό σήµα Υπόβαθρο στις άκρες Υπόβαθρο στις θετικές εξετάσεις Υπόβαθρο στις θετικές εξετάσεις Μη ειδική χρώση Απουσία σήµατος Εξέταση υπερβολικά µακροσκελής Σχόλιο Το ADVANCE HRP είναι σύστηµα εντοπισµού υψηλής ευαισθησίας, που επιτρέπει µεγαλύτερη αραίωση των πρωτογενών αντισωµάτων. Αν τα αντισώµατα δεν αραιωθούν επαρκώς, το σήµα εµφανίζεται υπερβολικά ισχυρό. Ετοιµάστε σειρά διαδοχικών αραιώσεων του πρωτογενούς αντισώµατος και επιλέξτε αραίωση που βρίσκεται στο οριζόντιο τµήµα της καµπύλης πριν από το σηµείο πτώσεως. Ο ιστός έχει στεγνώσει. Για χειροκίνητη χρώση, τοποθετήστε τις αντικειµενοφόρους σε θάλαµο υγρασίας. Περαιτέρω αραίωση του πρωτογενούς αντισώµατος (βλ. «Σήµα υπερβολικά ισχυρό» παραπάνω). Η συγκέντρωση του αντιδραστηρίου αρνητικού µάρτυρα πρέπει να ταιριάζει µε τη συγκέντρωση του πρωτογενούς αντισώµατος µε τον βέλτιστο τίτλο. Αν όχι, αραιώστε περαιτέρω τον αρνητικό µάρτυρα. Απαραίτητη πλύση. Αν η ορθή έκπλυση και η επακόλουθη επώαση επί 5 λεπτά δεν επαρκούν, πλύνετε δύο φορές µουσκεύοντας επί 5 λεπτά κάθε φορά. Η ακολουθία του ADVANCE TM HRP Link και ADVANCE TM HRP Enzyme είναι κρίσιµη για την ύπαρξη αντίδρασης: ελέγξτε ότι χρησιµοποιείται η ορθή ακολουθία. Το πρωτογενές αντίσωµα ήταν υπερβολικά αραιό. Ετοιµάστε σειρά διαδοχικών αραιώσεων του αντισώµατος για να προσδιορίσετε την ορθή αραίωση. Το ADVANCE HRP επιτρέπει είτε την υψηλή ευαισθησία ή µικρότερους χρόνους επώασης ή συνδυασµό των δύο. Αν είναι επιθυµητός µικρότερος συνολικός χρόνος εξέτασης, απαιτείται µεγαλύτερη συγκέντρωση του πρωτογενούς αντισώµατος. ( ) GR_002 σελ. 5/6

6 Βιβλιογραφία 1. Guesdon JL, et al. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem 1979; 27: Warnke R and Levy R. Detection of T and B cell antigens with hybridoma monoclonal antibodies. A biotin-avidin-horseradish peroxidase method. J Histochem Cytochem 1980; 28: Petrusz P and Ordronneau P. Immunohistochemistry of pituitary hormones. Polak MT and van Noorden S, eds. Immunocytochemistry: Practical applications in pathology and biology. Bristol-Wright-PSG 1983; Nagle RB, et al. Immunohistochemical demonstration of keratins in human ovarian neoplasms. A comparison of methods. J Histochem Cytochem 1983; 31: Giorno R. A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidin-biotin interaction. Diag Immunol 1984; 2: Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilber DC, Herman GE, Jaffe ES, Battifora H, Brigati DJ. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92: National Committee for Clinical Laboratory Standard. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order code C24-A:4 8. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66: Escribo LM, Gabriel LC, Villa E, Navarro JL. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35: Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1990; Omata M, Liew C-T, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73:626 Edition 06/10 ( ) GR_002 σελ. 6/6