Dako EnVision+ System- HRP Labelled Polymer Anti-mouse. Κωδικός Κ mL Κωδικός Κ ml. Χρήση για την οποία προορίζεται

Transcript

1 Dako EnVision+ System- HRP Labelled Polymer Anti-mouse Κωδικός Κ mL Κωδικός Κ ml Χρήση για την οποία προορίζεται Για in vitro διαγνωστική χρήση. Αυτές οι οδηγίες ισχύουν για το προϊόν Dako EnVision+, Peroxidase (Dako EnVision+, HRP). Το παρόν προϊόν προορίζεται για χρήση µε πρωτογενή αντισώµατα από ποντικό που παρέχονται από το χρήστη για την ποιοτική ταυτοποίηση αντιγόνων µέσω µικροσκοπίας φωτός σε φυσιολογικούς και παθολογικούς ιστούς ενσωµατωµένους σε παραφίνη, ιστούς κρυοστάτη ή κυτταρικά παρασκευάσµατα. Μπορούν να χρησιµοποιηθούν ιστοί που έχουν υποστεί επεξεργασία µε ποικίλα καθηλωτικά µεταξύ των οποίων αιθανόλη, Β-5, καθηλωτικό του Bouin, φορµαλίνη ψευδαργύρου, και ουδέτερο ρυθµιστικό διάλυµα φορµαλίνης. Ανατρέξτε στις «Γενικές οδηγίες για ανοσοϊστοχηµική χρώση» ή στις «Οδηγίες» του συστήµατος ανίχνευσης ανοσοϊστοχηµικών (IHC) διαδικασιών για: (1) Αρχή της διαδικασίας, (2) Υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται, (3) Φύλαξη, (4) Παρασκευή Προετοιµασία του δείγµατος, (5) ιαδικασία χρώσης, (6) Ποιοτικό έλεγχο, (7) Αντιµετώπιση προβληµάτων, (8) Ερµηνεία χρώσης, (9) Γενικούς περιορισµούς Περίληψη και επεξήγηση Το EnVision+ System, HRP είναι µια IHC τεχνική χρώσης δύο βηµάτων. Το σύστηµα αυτό βασίζεται σε ένα πολυµερές σηµασµένο µε HRP το οποίο είναι συζευγµένο µε δευτερογενή αντισώµατα. Το σηµασµένο πολυµερές δεν περιέχει αβιδίνη ή βιοτίνη. Συνεπώς, εξαλείφεται ή µειώνεται αισθητά µη ειδική χρώση που προκύπτει από τη δραστικότητα ενδογενούς αβιδίνης-βιοτίνης στο ήπαρ, στο νεφρό, σε λεµφοειδείς ιστούς και τοµές κρυοστάτη. Το αντιδραστήριο στο Dako EnVision+, HRP είναι έτοιµο προς χρήση. Το σύστηµα αυτό είναι µια εξαιρετικά ευαίσθητη µέθοδος και, ως αποτέλεσµα, οι βέλτιστες αραιώσεις του πρωτογενούς αντισώµατος είναι έως 20 φορές υψηλότερες από εκείνες που χρησιµοποιούνται για την παραδοσιακή τεχνική PAP, και αρκετές φορές µεγαλύτερες από εκείνες που χρησιµοποιούνται για τις παραδοσιακές µεθόδους ABC ή LSAB. Το πρωτόκολλο αυτό παρέχει ένα σύστηµα παραγωγής ενισχυµένου σήµατος για την ανίχνευση αντιγόνων παρόντων σε χαµηλές συγκεντρώσεις ή για χαµηλό τίτλο πρωτογενών αντισωµάτων. Πρωτογενή αντισώµατα που παράγονται σε ποντικό αντιδρούν καλά µε το σηµασµένο πολυµερές. Η ερµηνεία οποιασδήποτε θετικής χρώσης ή απουσία αυτής θα πρέπει να συµπληρώνεται από µορφολογικές και ιστολογικές µελέτες µε κατάλληλα υλικά ελέγχου. Αρχές της διαδικασίας Παρεχόµενα αντιδραστήρια Κάθε δραστικότητα της ενδογενούς υπεροξειδάσης καταστέλλεται µέσω επώασης του δείγµατος µε ένα κατάλληλο αντιδραστήριο αποκλεισµού ενδογενούς υπεροξειδάσης. Κατόπιν, το δείγµα επωάζεται µε ένα κατάλληλα χαρακτηρισµένο και αραιωµένο πρωτογενές αντίσωµα ποντικού, και ακολουθεί επώαση µε το σηµασµένο πολυµερές χρησιµοποιώντας δύο διαδοχικές επωάσεις 30 λεπτών. Θα πρέπει να σηµειωθεί ότι για αντισώµατα που χρειάζονται ενζυµική πέψη ή ανάκτηση στόχου, ενδέχεται να απαιτείται αύξηση των χρόνων επώασης του πρωτογενούς αντισώµατος και του σηµασµένου πολυµερούς κατά 5 έως 10 λεπτά. Η χρώση ολοκληρώνεται µε επώαση 5 30 λεπτών µε ένα κατάλληλο χρωµογόνο υποστρώµατος. Κωδικός Κ4000: Το ακόλουθο υλικό είναι επαρκές για 150 τοµές ιστών, βάσει 100 µl ανά τοµή: Ποσότητα 1x15 ml Περιγραφή Σηµασµένο πολυµερές Πολυµερές σηµασµένο µε υπεροξειδάση, συζευγµένο µε ανοσοσφαιρίνες αντι-ποντικού αίγας σε ρυθµιστικό διάλυµα Tris που περιέχει πρωτεΐνη σταθεροποίησης και έναν αντιµικροβιακό παράγοντα. Κωδικός Κ4001: Το ακόλουθο υλικό είναι επαρκές για 1100 τοµές ιστών, βάσει 100 µl ανά τοµή: Ποσότητα 1x110 ml Περιγραφή Σηµασµένο πολυµερές Πολυµερές σηµασµένο µε υπεροξειδάση, συζευγµένο µε ανοσοσφαιρίνες αντι-ποντικού αίγας σε ρυθµιστικό διάλυµα Tris που περιέχει πρωτεΐνη σταθεροποίησης και έναν αντιµικροβιακό παράγοντα. ( ) GR_003 σελ. 1/6

2 Υλικά που απαιτούνται, αλλά δεν παρέχονται Απορροφητικά χαρτιά Ιστοί ελέγχου, θετικοί και αρνητικοί Επίχρωση, υδατικής βάσης, όπως οι Mayer s Hematoxylin ή Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (κωδικός S3309) Καλυπτρίδες Απεσταγµένο νερό Αιθανόλη, απόλυτη και 95% Μικροσκόπιο φωτός (20x-800x) Μέσα στερέωσης, όπως τα εξής: Glycergel Mounting Medium (κωδικός C0563) ή Faramount, Aqueous Mounting medium, Ready-to-use (κωδικός S3025) ή µη υδατικό µόνιµο µέσο στερέωσης, Ultramont (κωδικός S1964) Πρωτογενή αντισώµατα και αντιδραστήριο αρνητικού ελέγχου Αντικειµενοφόροι πλάκες, επικαλυµµένες µε πολύ-l-λυσίνη ή Silanized Slides (κωδικός S3003) Βάζα ή λουτρά χρώσης Χρονόµετρο (ικανό για διαστήµατα 3 40 λεπτών) Φιάλες πλύσης Ρυθµισµένο διάλυµα πλύσης Ξυλένιο, τολουένιο ή υποκατάστατα ξυλενίου Για το σύστηµα K4000 ή K4001 EnVision+, Peroxidase, τα ακόλουθα αντιδραστήρια απαιτούνται επιπρόσθετα µε την παραπάνω λίστα: Αντιδραστήριο δέσµευσης ενδογενούς υπεροξειδάσης, όπως Dual Endogenous Enzyme Block (κωδικός S2003) ιάλυµα υποστρώµατος χρωµογόνου, όπως AEC+ Substrate-Chromogen (κωδικός K3469) 110 ml, έτοιµο προς χρήση ή Liquid DAB+ (κωδικός S2002) Προαιρετικά υλικά που απαιτούνται αλλά δεν παρέχονται Υδροξείδιο του αµµωνίου, 15 mol/l αραιωµένο σε 0,037 mol/l PAP Pen (κωδικός S 2002) Προφυλάξεις Παρασκευή αντιδραστηρίων 1. Για επαγγελµατίες χρήστες. 2. Μην χρησιµοποιείτε αντιδραστήρια πέραν της ηµεροµηνίας λήξης για καθορισµένη µέθοδο φύλαξης. Εάν τα αντιδραστήρια φυλάσσονται υπό οποιεσδήποτε συνθήκες εκτός από εκείνες που καθορίζονται στο ένθετο προϊόντος, οι συνθήκες πρέπει να επαληθεύονται από το χρήστη. 3. Μην υποκαθιστάτε αντιδραστήρια από άλλους αριθµούς παρτίδων ή από κιτ άλλων κατασκευαστών. 4. Ένζυµα και χρωµογόνα υποστρώµατος ενδέχεται να επηρεαστούν δυσµενώς εάν εκτεθούν σε υπερβολικά επίπεδα φωτός. Μην φυλάσσετε τα συστατικά του κιτ ή µην πραγµατοποιείτε χρώση σε ισχυρό φως, όπως το άµεσο ηλιακό φως. 5. Χρόνοι ή θερµοκρασίες επώασης άλλες από εκείνες που καθορίζονται ενδέχεται να δώσουν λανθασµένα αποτελέσµατα. Οποιαδήποτε τέτοια αλλαγή πρέπει να επαληθεύεται από το χρήστη. 6. Όπως συµβαίνει µε οποιοδήποτε προϊόν που προέρχεται από βιολογικές πηγές, θα πρέπει να χρησιµοποιούνται σωστές διαδικασίες χειρισµού. 7. Να φοράτε προσωπικό προστατευτικό εξοπλισµό προκειµένου να αποφευχθεί επαφή µε τα µάτια και το δέρµα. 8. Τυχόν µη χρησιµοποιηµένο διάλυµα θα πρέπει να απορρίπτεται σύµφωνα µε τους τοπικούς, εθνικούς και Κοινοτικούς κανονισµούς. Είναι βολικό να παρασκευάζονται τα ακόλουθα αντιδραστήρια πριν από τη χρώση. Ρυθµιστικό διάλυµα πλύσης Το TBST, 0,05 mol/l Tris Buffered Saline with Tween (κωδικός S3006) είναι το συνιστώµενο ρυθµιστικό διάλυµα για αυτοµατοποιηµένη και χειροκίνητη IHC ανίχνευση. Το TBS, 0,05 mol/l Tris Buffered Saline (κωδικός S1968) και το PBS, 0,02 mol/l Phospahte Buffered Saline (κωδικός S3024) είναι επίσης κατάλληλα ρυθµιστικά διαλύµατα πλύσης για χειροκίνητη χρώση. Ρυθµιστικά διαλύµατα πλύσης που περιέχουν αζίδιο του νατρίου δεν συνιστώνται. Το αζίδιο του νατρίου θα αδρανοποιήσει την υπεροξειδάση (HRP) µε αποτέλεσµα να εµφανιστεί αρνητική χρώση. Φυλάσσετε τυχόν µη χρησιµοποιηµένο ρυθµιστικό διάλυµα στους 2 8 C. Απορρίψτε το ρυθµιστικό διάλυµα εάν είναι θολό. Μπορεί να χρησιµοποιηθεί απεσταγµένο νερό για έκπλυση της υπεροξειδάσης αποκλεισµού, του υποστρώµατος και της επίχρωσης. Πρωτογενές αντίσωµα Έτοιµα προς χρήση αντισώµατα σειρών NP Plus είναι βελτιστοποιηµένα και συνιστώνται για χρήση µε συστήµατα ανίχνευσης υψηλής ευαισθησίας Dako Plus. Συµπυκνωµένα αντισώµατα είναι επίσης διαθέσιµα από την Dako. Απαιτείται βελτιστοποίηση συµπυκνωµένων αντισωµάτων από τον τελικό χρήστη. Οι αραιώσεις θα πρέπει να προετοιµάζονται χρησιµοποιώντας Antibody Diluent (κωδικός S0809) ή ένα αραιωτικό που περιέχει 0,05 mol/l ρυθµιστικό διάλυµα Tris-HCI µε 1% βόεια αλβουµίνη ορού (BSA). Τα έτοιµα προς χρήση αντισώµατα σειρών Ν της Dako δεν είναι βελτιστοποιηµένα για χρήση µε συστήµατα ανίχνευσης Dako plus. Για τα περισσότερα πρωτογενή αντισώµατα που χρησιµοποιούνται µε αυτό το κιτ, χρόνος επώασης 30 λεπτών είναι επαρκής. ( ) GR_003 σελ. 2/6

3 Αντιδραστήριο αρνητικού ελέγχου Όταν χρησιµοποιείτε έτοιµα προς χρήση αντισώµατα σειρών NP Plus της Dako, το Universal Negative Control+ βελτιστοποιηµένο για χρήση µε έτοιµα προς χρήση αντισώµατα ποντικού (κωδικός NP015) σειρών NP Plus, συνιστάται ως αντιδραστήριο αρνητικού ελέγχου. Ιδανικά, ένα αντιδραστήριο αρνητικού ελέγχου περιέχει ένα αντίσωµα το οποίο παρουσιάζει µη ειδική αντιδραστικότητα µε ανθρώπινους ιστούς ή µε φυσιολογικό/µη άνοσο ορό στην ίδια θεµέλια ουσία/διάλυµα όπως και το αραιωµένο πρωτογενές αντίσωµα. Το αντιδραστήριο αρνητικού ελέγχου θα πρέπει να ανήκει στην ίδια υποτάξη και το ζωικό είδος µε το πρωτογενές αντίσωµα, αραιωµένο στην ίδια συγκέντρωση ανοσοσφαιρίνης ή πρωτεΐνης µε εκείνη του αραιωµένου πρωτογενούς αντισώµατος χρησιµοποιώντας το ίδιο αραιωτικό. Η περίοδος επώασης για το αντιδραστήριο αρνητικού ελέγχου θα πρέπει να αντιστοιχεί στο πρωτογενές αντίσωµα. Επίχρωση Το κεχρωσµένο τελικό προϊόν της αντίδρασης χρώσης είναι διαλυτό σε αλκοόλη και θα πρέπει να χρησιµοποιείται µόνο µε επιχρώσεις υδατικής βάσης όπως οι Mayer s hematoxylin ή Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (κωδικός S3309). Έπειτα από την επίχρωση αιµατοξυλίνης πραγµατοποιήστε σχολαστική έκπλυση µε απεσταγµένο νερό, και κατόπιν εµβαπτίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες ιστών σε ένα λουτρό µε 0,037 mol/l αµµωνία ή παρόµοιο παράγοντα κυανής χρώσης. Η παρασκευή 0,037 mol/l νερού αµµωνίας πραγµατοποιείται µέσω µίξης 2,5 ml από 15 mol/l (συµπυκνωµένο) υδροξείδιο αµµωνίου µε 1 λίτρο νερό. Μη χρησιµοποιηµένη ποσότητα 0,037 mol/l αµµωνίας µπορεί να φυλαχτεί σε θερµοκρασία δωµατίου (20-25 C) εντός µιας ερµητικά σφραγισµένης φιάλης για έως 12 µήνες. Συµβουλευτείτε τις κατευθυντήριες οδηγίες του κατασκευαστή για εναλλακτικές διαδικασίες επίχρωσης. Μέσα στερέωσης Για υδατική στερέωση συνιστάται η χρήση του Glycergel Mounting Medium (κωδικός C0563) ή του Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (κωδικός S3025). Το Glycergel πρέπει να θερµαίνεται τουλάχιστον στους 50 C αµέσως πριν από τη χρήση. Μπορεί να χρησιµοποιηθεί επίσης το µη υδατικό µόνιµο µέσο στερέωσης Ultramount (κωδικός S1964). Φύλαξη Το EnVision+, HRP φυλάσσεται στους 2 8 C. Μην καταψύχετε. Μην χρησιµοποιείτε µετά την ηµεροµηνία λήξης που είναι τυπωµένη στα φιαλίδια αντιδραστηρίου και στην ετικέτα του προϊόντος. Μεταβολή στην εµφάνιση κάποιου αντιδραστηρίου, όπως καθίζηση, ενδέχεται να υποδεικνύει αστάθεια ή αλλοίωση. Σε αυτές τις περιπτώσεις, δεν πρέπει να χρησιµοποιείτε το(τα) αντιδραστήριο(α). εν υπάρχουν εµφανείς ενδείξεις που να υποδεικνύουν αστάθεια αυτού του προϊόντος. Εποµένως, θα πρέπει να αναλύονται θετικά και αρνητικά υλικά ελέγχου ταυτόχρονα µε τα δείγµατα των ασθενών. Εάν παρατηρείται µη αναµενόµενη χρώση που δεν είναι δυνατό να επεξηγηθεί από διαφορές στις εργαστηριακές διαδικασίες και υποψιάζεστε πρόβληµα µε το κιτ, επικοινωνήστε µε την Τεχνική Υποστήριξη της Dako. Παρασκευή δείγµατος Ιστοί ενσωµατωµένοι σε παραφίνη Ανατρέξτε στις «Γενικές οδηγίες για ανοσοϊστοχηµική χρώση» ή/και στο δελτίο προδιαγραφών αντισωµάτων. Πριν από τη χρώσης IHC, οι ιστοί πρέπει να καθηλωθούν και να επεξεργαστούν. Η καθήλωση αποτρέπει την αυτόλυση και τη σήψη των εκτεµνόµενων ιστών, διαφυλάσσει την αντιγονικότητα, ενισχύει το δείκτη διάθλασης των συστατικών των ιστών και αυξάνει την αντίσταση των κυτταρικών στοιχείων στην επεξεργασία ιστών. Η επεξεργασία ιστών περιλαµβάνει αφυδάτωση, απαλλαγή από παράγοντες αφυδάτωσης, διήθηση µέσων ενσωµάτωσης, ενσωµάτωση και τµήση ιστών. Τα πιο συνηθισµένα καθηλωτικά για παρασκευάσµατα ιστών IHC αναλύονται στις «Γενικές οδηγίες για ανοσοϊστοχηµική χρώση». Αυτές είναι µόνο οδηγίες. Οι βέλτιστες διαδικασίες πρέπει να προσδιοριστούν και να επαληθευτούν από το χρήστη. (Για ειδικές πληροφορίες σχετικά µε καθήλωση και επεξεργασία ιστών, βλ. αναφορές 1 και 2). ιαδικασία χρώσης Σηµειώσεις σχετικά µε τη διαδικασία Ο χρήστης θα πρέπει να διαβάσει προσεκτικά αυτές τις οδηγίες και να εξοικειωθεί µε το περιεχόµενο του προϊόντος πριν από τη χρήση. Το αντιδραστήριο και οι οδηγίες που παρέχονται έχουν σχεδιαστεί για βέλτιστη απόδοση. Περαιτέρω αραίωση του αντιδραστηρίου ή µεταβολή των χρόνων ή των θερµοκρασιών επώασης ενδέχεται να δώσουν λανθασµένα αποτελέσµατα. Όλα τα αντιδραστήρια θα πρέπει να εξισορροπούνται σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) πριν από την ανοσοχρώση. Οµοίως, όλες οι επωάσεις θα πρέπει να πραγµατοποιούνται σε θερµοκρασία δωµατίου. Μην αφήνετε τις τοµές ιστών να στεγνώσουν κατά τη διάρκεια της διαδικασίας χρώσης. Οι ξηραµένες τοµές ιστών ενδέχεται να παρουσιάσουν αυξηµένη µη ειδική χρώση. Καλύψτε τις αντικειµενοφόρους πλάκες που είναι εκτεθειµένες σε ρεύµατα αέρα. Εάν χρησιµοποιούνται παρατεταµένες επωάσεις, τοποθετήστε τους ιστούς σε υγρό περιβάλλον. ( ) GR_003 σελ. 3/6

4 Η ευαισθησία του EnVision+, HRP µπορεί να αυξηθεί περισσότερο µέσω παράτασης των χρόνων επώασης των βηµάτων 2 και 3 για 5 10 λεπτά. Πρωτόκολλο χρώσης ΒΗΜΑ 1 ΥΠΕΡΟΞΕΙ ΑΣΗ ΑΠΟΚΛΕΙΣΜΟΥ Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρέσετε την περίσσεια του ρυθµιστικού διαλύµατος. Χρησιµοποιώντας πανί χωρίς χνούδι (όπως Kimwipe ή γάζα) σκουπίστε προσεκτικά γύρω από το δείγµα ώστε να αφαιρέσετε οποιοδήποτε εναποµείναν υγρό και να διατηρήσετε το αντιδραστήριο εντός της καθορισµένης περιοχής. Εφαρµόστε επαρκή ποσότητα Peroxidase Block ώστε να καλυφτεί το δείγµα. Επωάστε για 5 (±1) λεπτά. Εκπλύνετε ελαφρά µε απεσταγµένο νερό ή ρυθµιστικό διάλυµα από µια φιάλη πλύσης (µην εστιάσετε τη ροή απευθείας πάνω στον ιστό) και τοποθετήστε σε ένα λουτρό φρέσκου ρυθµιστικού. ΒΗΜΑ 2 ΠΡΩΤΟΓΕΝΕΣ ΑΝΤΙΣΩΜΑ Ή ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΟ ΑΡΝΗΤΙΚΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρέσετε τη περίσσεια του ρυθµιστικού διαλύµατος και σκουπίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες όπως προηγουµένως. Εφαρµόστε επαρκή ποσότητα βέλτιστα αραιωµένου πρωτογενούς αντισώµατος ή αντιδραστηρίου αρνητικού ελέγχου ώστε να καλυφτεί το δείγµα. Επωάστε για 30 (±1) λεπτά. Εκπλύνετε ελαφρά µε ρυθµιστικό διάλυµα από µια φιάλη πλύσης (µην εστιάσετε τη ροή απευθείας πάνω στον ιστό) και τοποθετήστε σε ένα λουτρό φρέσκου ρυθµιστικού. Εάν πρέπει να διακοπεί η διαδικασία χρώσης, οι αντικειµενοφόροι πλάκες µπορούν να διατηρηθούν σε ένα ρυθµιστικό λουτρό έπειτα από επώαση του πρωτογενούς αντισώµατος (Βήµα 2) για έως µία ώρα σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C) χωρίς να επηρεαστεί η απόδοση της χρώσης. ΒΗΜΑ 3 ΣΗΜΑΣΜΕΝΟ ΠΟΛΥΜΕΡΕΣ-HRP ΑΝΤΙ-ΠΟΝΤΙΚΟΥ Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρέσετε τη περίσσεια του ρυθµιστικού διαλύµατος και σκουπίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες όπως προηγουµένως. Εφαρµόστε επαρκή ποσότητα σηµασµένου πολυµερούς ώστε να καλυφτεί το δείγµα. Επωάστε για 30 (±1) λεπτά. Εκπλύνετε τις αντικειµενοφόρους πλάκες όπως στο Βήµα 2. ΒΗΜΑ 4 ΧΡΩΜΟΓΟΝΟ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΟΣ Σκουπίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες όπως προηγουµένως. Εφαρµόστε επαρκή ποσότητα διαλύµατος χρωµογόνου υποστρώµατος ώστε να καλυφτεί το δείγµα. Επωάστε για 5 30 λεπτά. Εκπλύνετε ελαφρά µε απεσταγµένο νερό από µια φιάλη πλύσης (µην εστιάσετε τη ροή απευθείας πάνω στον ιστό). Συλλέξτε τα απόβλητα του χρωµογόνου υποστρώµατος σε ένα δοχείο για επικίνδυνα υλικά ώστε να γίνει σωστή απόρριψη. ΒΗΜΑ 5 ΕΠΙΧΡΩΣΗ ΑΙΜΑΤΟΞΥΛΙΝΗΣ (προαιρετικό) Εµβαπτίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε ένα λουτρό υδατικής αιµατοξυλίνης (κωδικός S3309). Ο χρόνος της επώασης εξαρτάται από την ισχύ της αιµατοξυλίνης που χρησιµοποιείται. Εκπλύνετε ελαφρά σε λουτρό απεσταγµένου νερού. Βυθίστε τις αντικειµενοφόρους πλάκες 10 φορές εντός ενός λουτρού µε 0,037 mol/l αµµωνία ή παρόµοιο παράγοντα κυανής χρώσης. Εκπλύνετε τις αντικειµενοφόρους πλάκες σε ένα λουτρό απεσταγµένου ή απιονισµένου νερού για 2-5 λεπτά. ΒΗΜΑ 6 ΣΤΕΡΕΩΣΗ Τα δείγµατα µπορούν να στερεωθούν και να τοποθετηθεί σε αυτά µια καλυπτρίδα µε ένα µέσο στερέωσης υδατικής βάσης όπως το Glycergel Mounting Medium (κωδικός C0563) ή το Faramount (κωδικός S3025) ή το µη υδατικό µόνιµο µέσο στερέωσης Ultramount (κωδικός S1964). Σηµείωση: Η ανάγνωση των αντικειµενοφόρων πλακών µπορεί να γίνει όποτε είναι βολικό. Ωστόσο, ενδέχεται να παρουσιαστεί κάποιος αποχρωµατισµός εάν οι αντικειµενοφόροι πλάκες είναι εκτεθειµένες σε έντονο φως για διάστηµα µιας εβδοµάδας. Προκειµένου να ελαχιστοποιηθεί ο αποχρωµατισµός, φυλάσσετε τις αντικειµενοφόρους πλάκες στο σκότος σε θερµοκρασία δωµατίου (20 25 C). Ποιοτικός έλεγχος ιαφορές στην επεξεργασία ιστών και σε τεχνικές διαδικασίες στο εργαστήριο του χρήστη ενδέχεται να προκαλέσουν σηµαντική µεταβλητότητα στα αποτελέσµατα, καθιστώντας απαραίτητη την τακτική πραγµατοποίηση εσωτερικών ελέγχων πέραν των ακόλουθων διαδικασιών. Για επιπλέον πληροφορίες, ανατρέξτε στις κατευθυντήριες οδηγίες ποιοτικού ελέγχου του Προγράµµατος πιστοποίησης του Κολεγίου Αµερικανών Παθολόγων (CAP) για ανοσοϊστοχηµεία και στις αναφορές 3 έως 5. Για πληροφορίες σχετικά µε την ευαισθησία και την ανοσοαντιδραστικότητα, ανατρέξτε στο δελτίο προδιαγραφών κάθε πρωτογενούς αντισώµατος που χρησιµοποιείται. Για περαιτέρω πληροφορίες σχετικά µε θετικά και αρνητικά υλικά ελέγχου, ανατρέξτε στις «Γενικές οδηγίες για ανοσοϊστοχηµική χρώση». ( ) GR_003 σελ. 4/6

5 Ερµηνεία χρώσης Περιορισµοί Για οδηγίες ερµηνείας, ανατρέξτε στις «Γενικές οδηγίες για ανοσοϊστοχηµική χρώση». Για γενικούς περιορισµούς, ανατρέξτε στις «Γενικές οδηγίες για ανοσοϊστοχηµική χρώση». Χρήση παλαιών ή µη ρυθµισµένων καθηλωτικών, ή έκθεση ιστών σε υπερβολική θερµοκρασία (µεγαλύτερη των 60 ο C) κατά τη διάρκεια της επεξεργασίας ενδέχεται να έχει ως αποτέλεσµα µειωµένη ευαισθησία χρώσης. Η δραστικότητα της ενδογενούς υπεροξειδάσης ή ψευδοϋπεροξειδάσης µπορεί να βρεθεί σε αιµοπρωτεΐνες όπως η αιµοσφαιρίνη, η µυοσφαιρίνη, το κυτόχρωµα, και η καταλάση καθώς και σε ηωσινόφιλα. 6,7 Αυτή η δραστικότητα µπορεί να ανασταλεί µέσω επώασης των δειγµάτων µε Peroxidase Block για πέντε λεπτά πριν από την εφαρµογή του πρωτογενούς αντισώµατος. Επιχρίσµατα αίµατος και µυελού των οστών και κατεψυγµένοι ιστοί µπορούν επίσης να επεξεργαστούµε µε αυτό το αντιδραστήριο. Ωστόσο, η διαδικασία αυτή δεν εξαλείφει το κοκκινωπό-καφέ χρώµα των αιµοπρωτεϊνών. Εναλλακτικά, µπορεί να χρησιµοποιηθεί ένα διάλυµα υπεροξειδίου του υδρογόνου-µεθανόλης. Ορισµένα αντιγόνα µπορούν να µετουσιωθούν µε αυτή τη διαδικασία. Ιστοί από άτοµα που έχουν µολυνθεί από τον ιό της ηπατίτιδας Β και περιέχουν το επιφανειακό αντιγόνο της ηπατίτιδας Β (HBsAg) ενδέχεται να παρουσιάσουν µη ειδική χρώση µε υπεροξειδάση του χρένου. 8 Φυσιολογικοί/µη άνοσοι οροί από την ίδια ζωική πηγή µε τους δευτερογενείς αντιορούς που χρησιµοποιήθηκαν σε βήµατα αποκλεισµού ενδέχεται να προκαλέσουν ψευδώς αρνητικά ή ψευδώς θετικά αποτελέσµατα λόγω των αυτοαντισωµάτων ή των φυσικών αντισωµάτων. Τα αντιδραστήρια που παρέχονται σε αυτό το κιτ είναι βέλτιστα αραιωµένα. Περαιτέρω αραίωση ενδέχεται να καταλήξει σε απώλεια της ανίχνευσης του αντιγόνου. Αντιµετώπιση προβληµάτων Πρόβληµα Πιθανή αιτία Προτεινόµενη ενέργεια 1. εν παρατηρείται χρώση σε καµία αντικειµενοφόρο πλάκα. 2. Ασθενής χρώση σε όλες τις αντικειµενοφόρους πλάκες. 3. Υπερβολική χρώση υποβάθρου σε όλες τις αντικειµενοφόρους πλάκες. 1α. Τα αντιδραστήρια δεν χρησιµοποιούνται µε σωστή σειρά 1β. Αζίδιο του νατρίου. 2α. Στις τοµές κατακρατείται υπερβολική ποσότητα διαλύµατος µετά το λουτρό πλύσης. 2β. Οι αντικειµενοφόροι πλάκες δεν έχουν επωαστεί αρκετά. 3α. Τα δείγµατα περιέχουν υψηλή δραστικότητα ενδογενούς υπεροξειδάσης. 3β. Η παραφίνη δεν έχει αφαιρεθεί πλήρως. 3γ. Οι αντικειµενοφόροι πλάκες δεν έχουν εκπλυθεί σωστά. 3δ. Αντίδραση υποστρώµατος ταχύτερη από το φυσιολογικό λόγω π.χ. υπερβολικής θερµοκρασίας δωµατίου. 3ε. Οι τοµές έχουν στεγνώσει κατά τη διάρκεια της διαδικασίας χρώσης. 3στ. Μη ειδική δέσµευση αντιδραστηρίων σε τοµές ιστών. 3ζ. Το αντίσωµα είναι υπερβολικά συµπυκνωµένο. 1α. Ανασκοπήστε την εφαρµογή των αντιδραστηρίων. 1β. Χρησιµοποιήστε φρέσκο ρυθµιστικό διάλυµα απαλλαγµένο από αζίδιο. 2α. Κτυπήστε ελαφρά για να αφαιρέσετε περίσσεια διαλύµατος προτού σκουπίσετε γύρω από την τοµή. 2β. Ανασκοπήστε τους συνιστώµενους χρόνους επώασης. 3α. Χρησιµοποιήστε µεγαλύτερο χρόνο επώασης της υπεροξειδάσης αποκλεισµού. 3b. Χρησιµοποιήστε φρέσκα λουτρά ξυλενίου ή τολουενίου. Εάν αρκετές αντικειµενοφόροι πλάκες χρωµατίζονται ταυτόχρονα, το δεύτερο λουτρό ξυλενίου θα πρέπει να περιέχει φρέσκο ξυλένιο. 3γ. Χρησιµοποιήστε φρέσκα διαλύµατα σε ρυθµιστικά λουτρά κα φιάλες πλύσης. 3δ. Χρησιµοποιήστε µικρότερο χρόνο επώασης µε διάλυµα χρωµογόνου υποστρώµατος. 3ε. Χρησιµοποιήστε θάλαµο υγρασίας. Να σκουπίζετε µόνο τρεις µε τέσσερις αντικειµενοφόρους πλάκες τη φορά προτού εφαρµόσετε το αντιδραστήριο. 3στ. Εφαρµόστε ένα διάλυµα αποκλεισµού που περιέχει µια άσχετη πρωτεΐνη. 3ζ. Χρησιµοποιήστε µεγαλύτερη αραίωση για το πρωτοταγές αντίσωµα. ( ) GR_003 σελ. 5/6

6 Σηµείωση: Εάν το πρόβληµα δεν µπορεί να αποδοθεί σε κάποιες από τις παραπάνω αιτίες, ή εάν η ενδεικτική διορθωτική ενέργεια δεν µπορεί να επιλύσει το πρόβληµα, παρακαλούµε επικοινωνήστε µε την Τεχνική Υποστήριξη της Dako για περαιτέρω βοήθεια. Αναφορές Μπορείτε να βρείτε επιπλέον πληροφορίες σχετικά µε τεχνικές χρώσης και παρασκευή δειγµάτων στο Handbook -Immunochemical Staining Methods 2 (διαθέσιµο από την Dako), στο Atlas of Immunohistology 9 και στο Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press 1981; Naish SJ (ed). Handbook immunochemical staining methods. Carpinteria: Dako Elias JM, et al. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92: National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order code C24 A:4 5. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66: Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35: Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol Press 1990; Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73: Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 Επιπλέον αναφορές Cartun RW. Immunohistochemistry of infectious diseases. J Histotechnol 1995; 18(3):195 Heras A, et al. Enhanced labelled-polymer system for immunohistochemistry. XVth Eur Cong Pathol. Copenhagen, Denmark 1995; Sept 3 8 Bisgaard K and Pluzek K-P. Use of polymer conjugates in immunohistochemistry: A comparative study of a traditional staining method to a staining method utilizing polymer conjugates. Abstract. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct Pileri SA, et al. EnVision Plus: A new powerful tool for diagnosis and research. Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct Bisgaard K. EnVision Plus Introduction to a new technology. Abstract. Dako Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct Edition 11/12 ( ) GR_003 σελ. 6/6