ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών Εφαρμογές στις Βασικές Ιατρικές Επιστήμες Κατεύθυνση: Φαρμακοκινητική Τοξικολογία ιπλωματική εργασία Έκφραση και καθαρισμός του συμπλόκου Cdt1 και Geminin σε βακτηριακά κύτταρα Καραντζέλης Νικόλαος Μοριακός Βιολόγος & Γενετιστής Επιβλέπων καθηγητής: Ταραβήρας Σταύρος εκέμβριος 2006

2 Στην οικογένειά μου

3 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Πολλοί λένε ότι κάθε μεγάλο ταξίδι ξεκινά με ένα μικρό βήμα στην αρχή. Το βήμα αυτό το έκανα πριν περίπου δύο χρόνια και από εκείνη τη στιγμή μέχρι και σήμερα, το ταξίδι αυτό μου επεφύλασσε αρκετές δυσκολίες και προκλήσεις. Ωστόσο, χάρη στη συμβολή ορισμένων ανθρώπων η διαδρομή του ταξιδιού αναδείχθηκε σε μια πολύτιμη εμπειρία, την οποία και θα θυμάμαι για το υπόλοιπο της ζωής μου. Οι παρακάτω γραμμές αποτελούν μια απλή ευχαριστήρια αναφορά σε αυτούς τους ανθρώπους. Ένα πολύ μεγάλο ευχαριστώ οφείλω στον επιβλέποντα καθηγητή μου κο. Ταραβήρα Σταύρο, για την άψογη συνεργασία που είχαμε αναπτύξει αυτά τα δύο χρόνια. Υπήρξε πολύτιμος σύμβουλος και αρωγός, παρέχοντάς μου όλα εκείνα τα απαραίτητα εφόδια και τις γνώσεις που οδήγησαν στην ολοκλήρωση της παρούσας διπλωματικής εργασίας. Επίσης, με δίδαξε πάνω από όλα να αγωνίζομαι και να προσπαθώ πάντα για το καλύτερο. Πολύ σημαντικό τμήμα της παρούσας διπλωματικής πραγματοποιήθηκε στο ινστιτούτο NKI (Netherlands Cancer Institute) της Ολλανδίας υπό την επίβλεψη του κου. Αναστάσιου Περράκη (Ph.D, Group Leader), τον οποίο και ευχαριστώ θερμά. Επίσης οφείλω κι ένα μεγάλο ευχαριστώ στη μετα-διδακτορική φοιτήτρια Valeria De Marco, για την άψογη συνεργασία που είχαμε κατά τη διάρκεια της παραμονής μου στην Ολλανδία. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω τα μέλη της Τριμελούς Εξεταστικής Επιτροπής για τις πολύτιμες συμβουλές, τις υποδείξεις και την κατανόηση που επέδειξαν κατά τη συγγραφή και παρουσίαση της παρούσας διπλωματικής. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω θερμά τους μεταπτυχιακούς φοιτητές των εργαστηρίων της Φαρμακολογίας και της Γενικής Βιολογίας για το πνεύμα άριστης συνεργασίας και κατανόησης που υπήρχε ανάμεσά μας, συμβάλλοντας έτσι στη δημιουργία ενός ευχάριστου και φιλικού περιβάλλοντος εργασίας. Ασφαλώς ένα ξεχωριστό ευχαριστώ ανήκει στους φίλους μου Κώστα και Δημήτρη, η συμβολή των οποίων υπήρξε κάτι παραπάνω από ουσιαστική για την ολοκλήρωση της παρούσας διπλωματικής. Θεωρώ τον εαυτό μου τυχερό που τους γνώρισα και το ταξίδι μου δεν θα ήταν το ίδιο χωρίς τη δική τους παρουσία. Κλείνοντας, θα ήταν παράλειψη να μην αναφερθώ στον πολύτιμο ρόλο της οικογένειάς μου, χωρίς την αγάπη και την κατανόηση της οποίας, αλλά και χωρίς την κάθε

4 είδους υποστήριξή της όλα αυτά τα χρόνια, η διπλωματική μου εργασία δεν θα είχε πραγματοποιηθεί. Την ευχαριστώ θερμά. Θα ήθελα να ολοκληρώσω αυτόν τον πρόλογο με τα λόγια του Robert Frost.. The woods are lovely, Dark and deep But I have promises to keep, And miles to go before I sleep, And miles to go before I sleep. Για όσους βρίσκουν ακόμη έμπνευση στις λέξεις. Καραντζέλης Νικόλαος Πάτρα, 2006

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ 1 ABSTRACT 4 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Κυτταρικός κύκλος Φάσεις του κυτταρικού κύκλου Ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου Έναρξη & ρύθμιση της αντιγραφής του DNA Παράγοντες αδειοδότησης της αντιγραφής Παράγοντες αναγνώρισης των θέσεων έναρξης της αντιγραφής (Origin Recognition Complex, ORC) Πρωτεϊνη Cdc6/ Πρωτεϊνη Cdt1 (cdc10 dependent transcript 1) Δομική και λειτουργική περιγραφή της Cdt Ο αναστολέας του συστήματος αδειοδότησης, Geminin Δομική και λειτουργική περιγραφή της Geminin MCM πρωτεϊνικό σύμπλοκο (mini-chromosome maintenance) Αδειοδότηση της αντιγραφής Κυτταρικός κύκλος και καρκίνος Κυτταρικός κύκλος και νευροεκφυλιστικές νόσοι Geminin, Cdt1 και καρκίνος Geminin και διαφοροποίηση Δομική περιγραφή του συμπλόκου Geminin-Cdt1 στον ποντικό Σχεδιασμός και μέθοδοι δημιουργίας νέων φαρμάκων Στάδια κατά την ανακάλυψη και δημιουργία νέων φαρμάκων Μέθοδοι μαζικού ελέγχου συνθετικών συστατικών (High-Throughput Screening) Πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις ως στόχοι νέων φαρμάκων 37 ΣΤΟΧΟΣ ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Χρήση βακτηριακών συστημάτων για την έκφραση ετερόλογων πρωτεϊνών Χρωματογραφία συγγένειας 45

6 2.1.3 Χρωματογραφία διήθησης σε πηκτή SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate-PolyΑcrylamide Gel Electrophoresis) ηλεκτροφόρηση Συν-έκφραση πρωτεΐνης σε μεγάλη κλίμακα Απομόνωση πρωτεΐνης με χρήση της τεχνικής χρωματογραφίας συγγένειας Επιπλέον καθαρισμός της πρωτεΐνης με χρήση της τεχνικής χρωματογραφίας διήθησης σε πηκτή (Gel Filtration) Συν-μετασχηματισμός επιδεκτικών βακτηριακών κυττάρων Rosetta2(DE3) και Rosetta2pLysS με τη μέθοδο του θερμικού σοκ Μετασχηματισμός επιδεκτικών βακτηριακών κυττάρων DH5A με θερμικό σοκ Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) για την κλωνοποίηση των μεταλλαγμένων μορφών της CDT Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) για την κλωνοποίηση των μεταλλαγμένων μορφών της Geminin Ηλεκτροφόρηση DNA σε πήκτωμα αγαρόζης Κατάτμηση DNA με ένζυμα περιορισμού Απομόνωση πλασμιδιακού DNA από βακτηριακά κύτταρα σε μικρή κλίμακα (mini-prep) (C. Norburry) πρωτόκολλο Απομόνωση πλασμιδιακού DNA από βακτηριακά κύτταρα σε μικρή κλίμακα (mini-prep) πρωτόκολλο Καθαρισμός DNA από πήκτωμα αγαρόζης (gel extraction) Aντίδραση λιγάσης (ligation) ΥΛΙΚΑ ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Κλωνοποίηση της hgeminin Κλωνοποίηση της hcdt MiniCdt1Y170A MiniCdt1F173A & MiniCdt1L176A Συν-μετασχηματισμός & συν-έκφραση του συμπλόκου hgeminin-hcdt Έκφραση συμπλόκου NFlagΔDBGeminin/NHisMiniCdt Έκφραση συμπλόκου CFlagΔDBGeminin/NHisMiniCdt Έκφραση συμπλόκου ΔDBGeminin/NHisMiniCdt1 76

7 3.3.4 Έκφραση συμπλόκου NFlagΔDBGeminin/NHisMiniCdt1Y170A Έκφραση συμπλόκου NFlagΔDBGeminin/NHisMiniCdt1F173A Έκφραση συμπλόκου NFlagΔDBGeminin/NHisMiniCdt1L176A Καθαρισμός και απομόνωση των συμπλόκων HGEMININ-HCDT Καθαρισμός του συμπλόκου NFlagΔDBGeminin/NHisMiniCdt Καθαρισμός του συμπλόκου CFlagΔDBGeminin/NHisMiniCdt Καθαρισμός του συμπλόκου ΔDBGeminin/NHisMiniCdt Καθαρισμός του συμπλόκου NFlagΔDBGeminin/NHisMiniCdt1Υ170Α Καθαρισμός του συμπλόκου NFlagΔDBGeminin/NHisMiniCdt1F173Α Καθαρισμός του συμπλόκου NFlagΔDBGeminin/NHisMiniCdt1L176Α FRET ASSAY (FLUORESCENCE RESONANCE ENERGY TRANSFER) Αρχή λειτουργίας της μεθόδου FRET Παράμετροι για τη λειτουργικότητα της μεθόδου FRET Εφαρμογή συστήματος FRET για τη μελέτη του συμπλόκου HGEMININ-HCDT ΣΥΖΗΤΗΣΗ 98 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 107

8

9 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η ακρίβεια και η πιστότητα της διαδικασίας διπλασιασμού του γονιδιώματος είναι μείζωνος σημασίας για την κυτταρική επιβίωση. Τυχόν ανωμαλίες όπως μεταλλάξεις ή χρωμοσωμικές ανωμαλίες είναι δυνατόν να οδηγήσουν στην εμφάνιση κακοήθειας ή σε πρόωρο κυτταρικό θάνατο. Τα παραπάνω συνηγορούν στη μεγάλη σημασία που έχει η άρτια λειτουργία και ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Δύο πρωτεϊνες, οι geminin και cdt1, κατέχουν πολύ σημαντικό ρόλο κατά τη διαδικασία ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου. Πιο συγκεκριμένα, η cdt1 αποτελεί έναν βασικό παράγοντα αδειοδότησης της αντιγραφής. Δρα συνεργατικά με την πρωτεϊνη Cdc6 προκειμένου να γίνει η πρόσδεση του εξαμερούς συμπλόκου MCM2-7 στο προ-αντιγραφικό σύμπλοκο (pre-rc), διασφαλίζοντας με τον τρόπο αυτό τις απαραίτητες συνθήκες για τη διαδικασία αδειοδότησης της αντιγραφής (Maiorano D. et al., 2000). Η geminin συνιστά τον φυσικό αναστολέα της cdt1 στα μετάζωα. Προσδένεται ισχυρά στην τελευταία μετά την έναρξη της σύνθεσης του DNA, παρεμποδίζοντας με αυτόν τον τρόπο την επαναπρόσδεσή της στο προ-αντιγραφικό σύμπλοκο (Tada S. et al., 2001; Wohlschlegel J.A. et al., 2000). Η διαδικασία αδειοδότησης της αντιγραφής παρουσιάζει ανωμαλίες σε περιπτώσεις καρκινικών κυττάρων. Πιο συγκεκριμένα, έχει δειχθεί σταθερή υπερέκφραση της cdt1 σε καρκινικές κυτταρικές σειρές, τόσο σε πρωτεϊνικό όσο και σε μεταγραφικό επίπεδο (Xouri G. et al., 2004). Παρομοίως, αυξημένη έκφραση της cdt1 έχει παρατηρηθεί και σε περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου καθώς και πρώιμου καρκίνου του πνεύμονα, στον άνθρωπο (Bravou V. et al., 2005; Karakaidos P. et al., 2004). Τα παραπάνω αποτελέσματα έχουν προκύψει κατόπιν μελέτης, η οποία πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριό μας. Αναφορικά με τη geminin, αυξημένα επίπεδα έκφρασής της έχουν συσχετιστεί με καρκινώματα παχέος εντέρου καθώς και με τη διαίρεση κακοηθών κυττάρων, γενικότερα (Gonzalez M.A. et al., 2005; Wohlschlegel J.A. et al., 2002). Επιπροσθέτως, η geminin βρίσκει εφαρμογή ως ανεξάρτητος δείκτης σε περιπτώσεις επιθετικού καρκίνου του μαστού (Gonzalez M.A. et al., 2004). 1

10 Βασιζόμενοι στα παραπάνω, θεωρούμε ότι το σύμπλοκο geminin-cdt1 συνιστά έναν ιδανικό στόχο για το σχεδιασμό νέων αντικαρκινικών φαρμάκων. Το πρώτο βήμα προς αυτήν την κατεύθυνση αποτελεί ο μαζικός έλεγχος συνθετικών συστατικών, τα οποία να έχουν την ικανότητα διάσπασης του συμπλόκου. Ενδεχόμενη εύρεση τέτοιων συνθετικών συστατικών καθώς και μετέπειτα φυσικοχημική βελτιστοποίησή τους είναι δυνατόν να οδηγήσει στη δημιουργία ενός νέου αντικαρκινικού φαρμάκου. Η ολοκλήρωση της χαρτογράφησης του ανθρώπινου γονιδιώματος συνέβαλε στην ταυτοποίηση νέων πρωτεϊνικών μορίων στόχων, τα οποία εμπλέκονται στο μοριακό μηχανισμό διαφόρων ασθενειών. Με βάση τις εξελίξεις των τελευταίων χρόνων στον τομέα της φαρμακοβιομηχανίας, η αξιοποίηση αυτής της γνώσης συνδέεται με το μαζικό έλεγχο συνθετικών συστατικών έναντι αυτών των μορίων στόχων. Απώτερο στόχο αποτελεί η αναγνώριση κατάλληλων συνθετικών συστατικών τα οποία θα έχουν την ικανότητα να αλληλεπιδρούν με το μόριο-στόχος και κατ επέκταση να μεταβάλλουν τον τρόπο λειτουργίας του, προκειμένου να έχουμε το επιθυμητό φαρμακολογικό αποτέλεσμα. Αποφασιστικής σημασίας στην παραπάνω διαδικασία, αποτελεί η σωστή επιλογή της κατάλληλης μεθόδου μαζικού ελέγχου των νέων υποψήφιων φαρμάκων συνθετικών συστατικών έναντι του μορίου στόχου. Στην παρούσα διπλωματική, επιλέχθηκε προς εφαρμογή η μέθοδος FRET. Ένα από τα βασικά της πλεονεκτήματα είναι η υψηλή αναλογία σήματος-θορύβου που εμφανίζει καθώς και η υψηλή ποιότητα των δεδομένων που παρέχει. Αν και αποτελεί μία σχετικά καινούρια τεχνική, εντούτοις αποτελεί μία από τις πιο βασικές μεθόδους της σύγχρονης φαρμακοβιομηχανίας λόγω της αξιοπιστίας που την χαρακτηρίζει και επιπλέον της συμβατότητάς της με αυτοματοποιημένες τεχνικές. Ασφαλώς, απαραίτητη προϋπόθεση για την εφαρμογή της συγκεκριμένης μεθόδου αποτελεί η απομόνωση της υπό μελέτη πρωτεϊνης. Η έκφραση του πρωτεϊνικού συμπλόκου geminin-cdt1 πραγματοποιήθηκε με τη χρήση βακτηριακών συστημάτων έκφρασης ετερόλογων πρωτεϊνών. Επίσης, ο καθαρισμός του συμπλόκου υπήρξε επιτυχής και βασίστηκε στην εφαρμογή των τεχνικών της χρωματογραφίας συγγένειας και της χρωματογραφίας διήθησης σε πηκτή. Το επόμενο βήμα ήταν να διαπιστώσουμε εάν η μέθοδος FRET καθιστά δυνατή την ανίχνευση σχηματισμού του συμπλόκου. Πράγματι, κάτι τέτοιο ήταν εφικτό καθώς σε συγκέντρωση 60-80nM του συμπλόκου, 2

11 παρατηρήθηκε αύξηση του σήματος σχεδόν κατά πέντε φορές υψηλότερα από το επίπεδο θορύβου. Το αποτέλεσμα αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό καθώς συνεπάγεται ότι με τη συγκεκριμένη μέθοδο είναι εφικτός ο μαζικός έλεγχος συνθετικών συστατικών, τα οποία θα έχουν την ικανότητα διάσπασης του συμπλόκου. Οι λόγοι που συντελούν στην καταλληλότητα της μεθόδου για αυτό το σκοπό έγκεινται αφενός στην ευαισθησία την οποία εμφανίζει (αύξηση του σήματος μέχρι και πέντε φορές) και αφετέρου στην ειδικότητα και την αξιοπιστία της, όπως έχει δειχθεί και με τα αντίστοιχα πειράματα. Σημαντικό επίσης πλεονέκτημα αποτελεί και η μικρή σχετικά ποσότητα πρωτεϊνης (60-80nM), η οποία απαιτείται. Σύμφωνα με τα δεδομένα που έχουν προκύψει από την παρούσα διπλωματική, το FRET assay συνιστά μία ιδανική μέθοδο για την πραγματοποίηση μαζικού ελέγχου συνθετικών συστατικών, τα οποία θα έχουν την ικανότητα διάσπασης του συμπλόκου geminin-cdt1. Δεδομένης της πολύ ισχυρής αλληλεπίδρασης του συγκεκριμένου συμπλόκου, πραγματοποιήθηκαν μεταλλαγές σε τρία υψηλά συντηρημένα κατάλοιπα της cdt1, τα οποία κατέχουν κυρίαρχο ρόλο στην αλληλεπίδραση με τη geminin, σύμφωνα με κρυσταλλογραφικά δεδομένα (Lee C. et al., 2004). Οι μεταλλαγές αυτές ενδέχεται να συμβάλλουν σε ένα πολύ πιο εύκολα διασπάσιμο σύμπλοκο, γεγονός που μπορεί να οδηγήσει στην ευκολότερη και γρηγορότερη ταυτοποίηση υποψήφιων συνθετικών συστατικών. 3

12 ABSTRACT The accurate and timely duplication of the genome is vital for cell survival. Mutations rearrangements or loss of chromosomes can be detrimental to a single cell as well as to the whole organism, causing malignant cell growth or death. Origins of replication are licensed by a multi-subunit complex (pre-replicative complex: pre-rc) during G1 (Lei M & Tye B.K., 2001). Pre-RC assembly is an ordered, sequential process in which the Origin Recognition Complex (ORC) first binds to each replication origin and then recruits two other proteins: Cdc6 and Cdt1 (Bell S.P. & Dutta A., 2002). These two proteins function synergistically to load the six mini-chromosome maintenance helicase proteins (MCM2-7) onto the pre-rc, establishing the conditions for DNA licensing (Maiorano D. et al., 2000). The prevention of ectopically induced rereplication is accomplished by functionally redundant mechanisms, including sequestration of MCM by Crm1 (Yamaguchi R. & Newport J., 2003), inactivation and export from the nucleus of Cdc6 (Delmolino L.M. et al., 2001; Jiang W. et al., 1999; Pelizon C. et al., 2000) and degradation of Cdt1 (Nishitani H. et al., 2001). Metazoans, have evolved an additional system for preventing re-replication: Geminin, which was originally identified in Xenopus as essential factor to exit from mitosis (McGarry T.J. & Kirschner M.W., 1998), binds tightly to Cdt1 and prevents Cdt1 assembly onto pre-rc (Tada S. et al., 2001; Wohlschlegel J.A. et al., 2000). Licensing system members are misregulated in cancer cells and differential expression of licensing components could be used for the diagnosis and prognosis of cancer (Shreeram S. & Blow J.J., 2003). Over-expression of Cdt1 can predispose cells to a malignant transformation. It has been shown that Cdt1 is consistently over-expressed in cancer cell lines at both the protein and RNA level (Xouri G. et al., 2004). Moreover, Cdt1 protein is highly expressed in cases of human colon cancer and primary human lung carcinomas (Bravou V. et al., 2005; Karakaidos P. et al., 2004). Similarly, Geminin is also over-expressed in colon carcinomas and its expression levels were directly related to the cellular proliferation index in proliferating malignant cells (Gonzalez M.A. et al., 2005; Wohlschlegel J.A. et al., 2002). Furthermore, expression of Geminin is considered 4

13 as an independent indicator of adverse prognosis in cases of invasive breast cancer (Gonzalez M.A. et al., 2004). Given the crucial role of the Geminin-Cdt1 complex in cell cycle regulation and cancer, this complex could serve as target for the discovery and development of novel anti-cancer drugs. This requires the screening of compounds that are capable of disrupting the geminin-cdt1 complex. For that purpose we performed a HTP (highthroughput)-compatible assay, called FRET-assay. The acronym FRET stands for Fluorescence Resonance Energy transfer. The principle of the assay is based on the radiationless transfer of energy from an excited donor fluorophore (Europium Cryptate) to a suitable acceptor fluorophore (XL665). The first step was the expression and purification of the geminin-cdt1 complex. The complex was expressed by using E. coli bacterial cells and purified by metal affinity chromatography on a Ni +2 column. As soon as the complex was ready to use, we next tried to investigate whether the formation of the complex was detectable by using the FRET assay. Indeed, at the complex concentration of 60nM and 80nM, the signal was about 5 times above background. This was a first indication that the Geminin-Cdt1 complex can be used successfully for energy transfer based assays. Given the very high binding affinity of the two proteins (Lee C. et al., 2004), it could be quite unlikely to find a compound that can disrupt the complex. To overcome that obstacle, three single mutations were made at the highly conserved Geminincontacting residues of hcdt1, Y170, F173 and L176. The mutation of these residues to alanine can possibly provide a more easily disruptable complex, which could be of importance concerning the faster and easier identification of any candidate compounds. Our data suggest that hgeminin-cdt1 complex can be considered as a promising target for compound screening. Given the high importance of Geminin-Cdt1 balance for maintaining genomic stability integrity and that both proteins have been correlated with cases of cancer, that screening could hopefully lead to the discovery and development of lead compounds towards anti-cancer drugs. 5

14 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 6

15 ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1.1 ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΚΥΚΛΟΣ Το κύτταρο αποτελεί τη θεμελιώδη δομική και λειτουργική μονάδα από την οποία απαρτίζονται όλοι οι ζωντανοί οργανισμοί. Τα κύτταρα εμφανίζουν όλες τις λειτουργίες που είναι συνυφασμένες με τη ζωή, μεταξύ των οποίων είναι η «διαφύλαξη» των κληρονομήσιμων γενετικών πληροφοριών σε κατάλληλες γενετικές δομές (DNA) και η μεταβίβασή τους στην επόμενη γενιά κυττάρων (κληρονομικότητα). Η μεταβίβαση αυτή επιτυγχάνεται μέσω μιας διαδικασίας κατά την οποία ένα μητρικό κύτταρο δίνει γένεση σε δύο νέα θυγατρικά κύτταρα και η οποία είναι γνωστή ως κυτταρική διαίρεση. Η κυτταρική διαίρεση έχει χαρακτηριστεί ως η θεμελιώδης αρχή που διέπει την αύξηση και ανάπτυξη όλων των ζωικών και φυτικών οργανισμών και αποτελεί τη βάση της κληρονομικότητας. Η κυτταρική διαίρεση ή μίτωση αποτελεί μέρος μιας αυστηρά ελεγχόμενης διαδικασίας που ονομάζεται κυτταρικός κύκλος. Με την κυτταρική διαίρεση οι μονοκύτταροι οργανισμοί, όπως για παράδειγμα τα βακτήρια και οι μύκητες, δίνουν έναν νέο οργανισμό, επιτυγχάνοντας, έτσι, την αύξηση του ολικού αριθμού των ατόμων ενός πληθυσμού. Αντίθετα, στους πολυκύτταρους οργανισμούς με την κυτταρική διαίρεση δημιουργούνται νέα κύτταρα για την αντικατάσταση των παλαιών και «φθαρμένων» κυττάρων καθώς, επίσης, και των κυττάρων που οδηγούνται σε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (apoptosis). Ο κυτταρικός κύκλος αν και διαφέρει όσον αφορά τη διάρκεια ή το ρυθμό του από οργανισμό σε οργανισμό ή στους διάφορους κυτταρικούς τύπους, εντούτοις οι βασικές αρχές που τον διέπουν είναι παρόμοιες σε όλες τις μορφές ζωής. Έτσι, για να παραχθούν δύο νέα κύτταρα όμοια μεταξύ τους αλλά και με το μητρικό κύτταρο, πρέπει πρώτα το γενετικό υλικό στο οποίο αποθηκεύονται όλες οι γενετικές πληροφορίες για την επιβίωση και την ανάπτυξη του κυττάρου, το DNA, να διπλασιαστεί με απόλυτη ακρίβεια και πιστότητα κι εν συνεχεία να διαιρεθεί και να μοιραστεί εξίσου στους δύο απογόνους. Επιπλέον, κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου το κύτταρο διπλασιάζει τη μάζα του, 7

16 το κυτταρόπλασμά του κι όλα τα κυτταρικά οργανίδια προκειμένου να τα μεταβιβάσει στην επόμενη γενεά Φάσεις του κυτταρικού κύκλου Ο κυτταρικός κύκλος (εικ. 1) διαιρείται στις ακόλουθες φάσεις: Στη μίτωση (πυρηνική διαίρεση), η οποία ακολουθείται από την κυτταροκίνηση (κυτταροπλασματική διαίρεση), και διαρκεί ελάχιστα συγκριτικά με τον υπόλοιπο κύκλο. Μίτωση και κυτταροκίνηση συνιστούν την Μ-φάση του κυτταρικού κύκλου. Στη μεσόφαση (interphase), την περίοδο δηλαδή μεταξύ δύο διαδοχικών κυτταρικών διαιρέσεων. Καταλαμβάνει το μεγαλύτερο μέρος (~95%) του κυτταρικού κύκλου και κατά τη διάρκειά της το αναπτυσσόμενο κύτταρο προετοιμάζεται για την επερχόμενη κυτταρική διαίρεση. Η μεσόφαση είναι η περίοδος κατά την οποία συντελείται ο διπλασιασμός της γενετικής πληροφορίας, η αντιγραφή, δηλαδή, του DNA. Πιο συγκεκριμένα, η σύνθεση του DNA γίνεται κατά τη διάρκεια μιας συγκεκριμένης φάσης της μεσόφασης, η οποία και ονομάζεται S-φάση (= Synthesis). Το διάστημα που μεσολαβεί από τη στιγμή που θα «γεννηθεί» ένα κύτταρο (τέλος Μ) μέχρι τη στιγμή που θα αρχίσει να διπλασιάζει το DNA του λέγεται φάση G1 (=Gap1), ενώ το μεσοδιάστημα μεταξύ του τέλους της σύνθεσης του DNA μέχρι και την έναρξη της μίτωσης καλείται G2 (=Gap2). Τα μεσοδιαστήματα αυτά προσφέρουν στο κύτταρο τον απαιτούμενο πρόσθετο χρόνο για να αυξηθεί σε μέγεθος, ενώ ακόμα δίνουν την ευκαιρία σε αρμόδια συστήματα ελέγχου ( checkpoints,) να αποφασίσουν εάν οι συνθήκες είναι κατάλληλες για μετάβαση του κυττάρου στην επόμενη φάση. Συνοπτικά λοιπόν, η μεσόφαση διακρίνεται σε τρεις επιμέρους χρονικές περιόδους, τις G1, S και G2, οι οποίες μαζί με τη φάση Μ συνιστούν τις 4 κύριες επιμέρους φάσεις ενός τυπικού κυτταρικού κύκλου (Howard and Pelc, 1951). 8

17 Εικόνα 1: Ο κυτταρικός κύκλος ενός τυπικού κυττάρου θηλαστικού διαρκεί περίπου 24 ώρες. Οι τέσσερις φάσεις Μ, G1, S και G2 διαδέχονται συνεχώς η μία την άλλη. Κατά την μεσόφαση το κύτταρο μεγαλώνει συνεχώς σε μέγεθος, κατά την S αντιγράφει το DNA του, ενώ κατά την M διαιρείται (John Whay and Burk Inc., 2000) Εκτός όμως από τις παραπάνω κύριες φάσεις υπάρχει κατά περιπτώσεις και μία επιπλέον φάση του κυταρικού κύκλου. Κύτταρα που βρίσκονται στη φάση G1 και που δεν έχουν δεσμευθεί για αντιγραφή του DNA τους, μπορούν να σταματήσουν την εξέλιξη του κύκλου τους και να εισέλθουν σε μία κατάσταση αναστολής, εκτός κυτταρικού κύκλου, τη λεγόμενη φάση G0 (quiescence). Στη φάση G0, η οποία είναι αντιστρεπτή, μπορούν να παραμείνουν για μέρες, μήνες ή ακόμα και χρόνια, μέχρι τη στιγμή που θα δεχθούν το κατάλληλο μιτογόνο ερέθισμα για να επανέλθουν κανονικά στην G1 και στον κυτταρικό κύκλο. Τα κύτταρα στη G0 παραμένουν μεταβολικά ενεργά, αν και παρουσιάζουν μειωμένο ρυθμό πρωτεϊνοσύνθεσης (έως και 20% του κανονικού ρυθμού) και είναι απολύτως λειτουργικά. Επιπλέον, στην G0 μπορεί να εισέρχονται κύτταρα τα οποία είναι διαφοροποιημένα, με μοναδικό σκοπό να επιτελέσουν τη λειτουργία για την οποία προορίζονται μέχρι, τελικά, να πεθάνουν. 9

18 Όσον αφορά τώρα τη μίτωση, δηλαδή τη διαδικασία της πυρηνικής και ακολούθως της κυτταροπλασματικής διαίρεσης (κυτταροκίνηση), διακρίνεται και αυτή στις ακόλουθες πέντε φάσεις: Πρόφαση: Τα νημάτια της μεσοφασικής χρωματίνης αρχίζουν να συμπυκνώνονται σχηματίζοντας τα χρωμοσώματα, τα οποία διπλασιασμένα από τη φάση S συγκρατούνται με το κεντρομερίδιο. Οι μεσοφασικοί μικροσωληνίσκοι αποδιατάσσονται και σε συνεργασία με τα διπλασιασμένα κεντροσωμάτια αναδιατάσσονται, έξω από τον πυρήνα διαμορφώνοντας την πρώτη μορφή της μιτωτικής ατράκτου. Προμετάφαση: Εδώ συμβαίνει η διάρρηξη του πυρηνικού φακέλου, η είσοδος των μικροσωληνίσκων της μιτωτικής ατράκτου μέσα στον πυρήνα και η πρόσδεσή τους στην περιοχή του κινητοχώρου των κεντρομεριδίων των χρωμοσωμάτων. Μετάφαση: Οι μικροσωληνίσκοι των κινητοχώρων ασκώντας δυνάμεις στα χρωμοσώματα τα ευθυγραμμίζουν τελικά στο ισημερινό επίπεδο της μιτωτικής ατράκτου, μεταξύ των δύο πόλων. Κάθε χρωμόσωμα ισορροπεί στο κέντρο γιατί του ασκούνται δύο ίσες και αντίθετες δυνάμεις από τους μικροσωληνίσκους των δύο εκ διαμέτρου αντίθετων πόλων. Ανάφαση: Διαρκεί ελάχιστα. Διακρίνεται στην ανάφαση Α, όπου οι μικροσωληνίσκοι οι οποίοι είναι συνδεδεμένοι στους κινητοχώρους τραβούν τις αδελφές χρωματίδες (που από τώρα και στο εξής ονομάζονται χρωμοσώματα) προς τους δύο πόλους. Στην ανάφαση Β κατά τη διάρκεια της οποίας οι μικροσωληνίσκοι της ατράκτου επιμηκύνονται αυξάνοντας έτσι την απόσταση που χωρίζει τους δύο πόλους. Εδώ ξεκινά και ο σχηματισμός του συσταλτού δακτυλίου από ακτίνη/μυοσίνη. Τελόφαση: Στη φάση αυτή ολοκληρώνεται η πυρηνική διαίρεση με την άφιξη των χρωμοσωμάτων στους δύο πόλους. Οι μικροσωληνίσκοι που συγκρατούσαν τα κεντρομερίδια εξαφανίζονται σε αντίθεση με τους μικροσωληνίσκους της ατράκτου που επιμηκύνονται για να απομακρύνουν περισσότερο τον έναν πόλο από τον άλλο. Νέα πυρηνική μεμβράνη σχηματίζεται γύρω από κάθε ομάδα χρωμοσωμάτων των δύο πόλων. Τα χρωμοσώματα αρχίζουν να αποσυσπειρώνονται επιτρέποντας να ξεκινήσουν οι διαδικασίες σύνθεσης RNA και πρωτεϊνών, ενώ σχηματίζονται και οι πυρηνίσκοι. 10

19 Μετά το τέλος της πυρηνικής διαίρεσης ακολουθεί η κυτταροπλασματική διαίρεση (κυτταροκίνηση) ώστε να δημιουργηθούν τα δύο θυγατρικά κύτταρα. Η διαίρεση του κυτταροπλάσματος ξεκινά σε μία περιοχή του ισημερινού του κυττάρου, κάτω από την πλασματική μεμβράνη, στην οποία σχηματίζεται κατά την ανάφαση μία περίσφιγξη, που ονομάζεται συσταλτός δακτύλιος. Ο δακτύλιος αυτός, καθώς το κύτταρο οδηγείται προς το τέλος της μίτωσης, σφίγγει όλο και περισσότερο το κυτταρόπλασμα με αποτέλεσμα η περίσφιγξη να γίνεται όλο και βαθύτερη, μέχρι που τελικά διαιρεί το μητρικό κύτταρο στα δύο Ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου Όλοι οι οργανισμοί πρέπει να διασφαλίζουν την απρόσκοπτη και διαδοχική ενεργοποίηση των φάσεων του κυτταρικού κύκλου, ώστε να μεταβιβαστεί ακέραιο το γενετικό υλικό στα θυγατρικά κύτταρα. Σε αντίθετη περίπτωση, προκαλούνται γενετικές αλλαγές οι οποίες ενδέχεται να οδηγήσουν στον κυτταρικό θάνατο είτε σε γενετική αστάθεια και μη ελεγχόμενο κυτταρικό πολλαπλασιασμό, χαρακτηριστικό γνώρισμα των καρκινικών κυττάρων. Προκειμένου να αποφευχθούν τέτοιου είδους γενετικές αλλαγές, το κύτταρο έχει αναπτύξει μια σειρά από μηχανισμούς ελέγχου του κυτταρικού κύκλου, που εξασφαλίζουν ότι η φάση της αντιγραφής του γενετικού υλικού (φάση S) θα εναλάσσεται πάντα με τη φάση της μίτωσης και ότι κάθε τμήμα του γενετικού υλικού θα διπλασιάζεται μία και μόνο μία φορά σε κάθε κυτταρικό κύκλο (Nurse, 1994; Heichman & Roberts, 1994). 1.2 Έναρξη & ρύθμιση της αντιγραφής του DNA Η έναρξη της αντιγραφής λαμβάνει χώρα σε πολλά σημεία πάνω στα χρωμοσώματα, τα οποία ονομάζονται θέσεις έναρξης της αντιγραφής (origins of replication). Οι ευκαρυώτες διαθέτουν περίπου θέσεις έναρξης της 11

20 αντιγραφής οι οποίες απέχουν κατά μέσο όρο Kb και ενεργοποιούνται σε διαφορετικά χρονικά σημεία κατά τη διάρκεια της S-φάσης. Ο μεγάλος αριθμός των θέσεων έναρξης της αντιγραφής συνεπάγεται ότι κάθε μία από αυτές ευθύνεται για το διπλασιασμό ενός σχετικά μικρού τμήματος του συνολικού γονιδιώματος, γεγονός που συνάδει και στην αξιοπιστία του μηχανισμού αντιγραφής. Λόγω του μεγέθους του ευκαρυωτικού γενώματος, ο διπλασιασμός των χρωμοσομάτων είναι μείζωνος σημασίας για τα ευκαρυωτικά κύτταρα. Κατά τη διάρκεια των κυτταρικών διαιρέσεων η γενετική πληροφορία πρέπει να μεταβιβαστεί ακέραια και αναλλοίωτη από το μητρικό κύτταρο στα δύο θυγατρικά. Αυτό επιτυγχάνεται με την αντιγραφή του DNA κατά την S-φάση του κυτταρικού κύκλου και το διαχωρισμό των αντιγράφων των διπλασιασμένων χρωμοσωμάτων κατά την Μ-φάση. Όπως έχει αναφερθεί και προηγουμένως, η ρύθμιση της έναρξης της αντιγραφής βασίζεται στην εναλλαγή μεταξύ δύο καταστάσεων των θέσεων έναρξης της αντιγραφής. Η πρώτη κατάσταση εντοπίζεται στην G1-φάση, όπου έχουμε το σχηματισμό ενός πολυπρωτεϊνικού συμπλόκου στο σημείο της θέσης έναρξης της αντιγραφής και το οποίο ονομάζεται προ-αντιγραφικό σύμπλοκο (pre-replicative complex, pre-rc). Η δεύτερη κατάσταση χαρακτηρίζεται από την παρουσία ενός άλλου πρωτεϊνικού συμπλόκου, του μετα-αντιγραφικού (post-replicative complex, post-rc), το οποίο όμως αποτελείται από λιγότερες υπομονάδες σε σύγκριση με το προ-αντιγραφικό σύμπλοκο και παραμένει κι αυτό προσδεδεμένο στο DNA. (Nishitani & Lygerou 2002; Diffley 2001; Blow & Dutta 2005) 1.3 Παράγοντες αδειοδότησης της αντιγραφής Η κατάσταση κατά την οποία η χρωματίνη βρίσκεται σε κατάσταση δεκτική προς αντιγραφή του DNA, αναφέρεται ως κατάσταση αδειοδότησης της αντιγραφής. Η κατάσταση αυτή αδειοδότησης χαρακτήριζεται από το σχηματισμό του πολυπρωτεϊνικού προ-αντιγραφικού συμπλόκου (pre-rc) πάνω στις θέσεις έναρξης της αντιγραφής. Βιοχημικές και γενετικές μελέτες έχουν οδηγήσει στον χαρακτηρισμό των πρωτεϊνικών παραγόντων που συνιστούν το προ-αντιγραφικό σύμπλοκο. Παρακάτω ακολουθεί 12

21 συνοπτική περιγραφή αυτών των παραγόντων, οι οποίοι εμφανίζονται συντηρημένοι από τη ζύμη μέχρι και τα θηλαστικά Παράγοντες αναγνώρισης των θέσεων έναρξης της αντιγραφής (Origin Recognition Complex, ORC) Πρόκειται για ένα εξαμερές (Orc1-Orc6) πρωτεϊνικό σύμπλοκο το οποίο προσδένεται στις θέσεις έναρξης της αντιγραφής. Οι καλύτερα χαρακτηρισμένες θέσεις έναρξης της αντιγραφής είναι αυτές του S. cerevisiae, οι οποίες έχουν χαρακτηριστεί ως Αυτόνομες Αλληλουχίες Αντιγραφής (Autonomously Replicating Sequences, ARS). Με το διαχωρισμό των πρωτεϊνικών παραγόντων που προσδένονται σε αυτές τις αλληλουχίες έγινε και ο καθαρισμός του εξαμερούς ScORC συμπλόκου (Bell & Stillman 1992). Η πρόσδεση του ScORC στο DNA απαιτεί την παρουσία ATP και για το λόγο αυτό οι υπομονάδες του συμπλόκου Orc1 και Orc5 διαθέτουν θέση πρόσδεσης ATP. ORC πρωτεϊνες έχουν αναγνωριστεί και σε άλλους ευκαρυώτες, στους οποίους συμπεριλαμβάνονται οι S. pombe, Drosophila melanogaster, Xenopus laevis καθώς και ο άνθρωπος (Gavin et al. 1995; reviewed in Dutta & Bell 1997). Το γεγονός αυτό αποτέλεσε και την πρώτη ένδειξη ότι όλοι οι ευκαρυώτες διαθέτουν κοινό μηχανισμό έναρξης της αντιγραφής Πρωτεϊνη Cdc6/18 Η πρωτεϊνη Cdc6 στον S. cerevisiae και η ομόλογη της Cdc18 στον S. pombe απομονώθηκαν ως θερμοευαίσθητα μεταλλάγματα του κυτταρικού κύκλου (Hereford & Hartwell 1974; Nurse & Bisset 1976) που επηρρεάζουν την έναρξη της αντιγραφής. Οι πρωτεϊνες Cdc6/18 εμφανίζουν 28-30% ομοιότητα με την υπομονάδα Orc1 του συμπλόκου ORC και διαθέτουν και αυτές θέση πρόσδεσης ATP (Bell et al. 1995). Οι ScCdc6 και SpCdc18 συσσωρεύονται στο τέλος της μίτωσης κι εξαφανίζονται μετά την έναρξη της αντιγραφής του DNA. Ένα στέλεχος του S. pombe το οποίο είχε έλλειψη του Cdc18 δεν είχε τη δυνατότητα να πραγματοποιήσει έναρξη της αντιγραφής. Εντούτοις, μπορούσε να εισέλθει στη μίτωση κάτι όμως που οδηγούσε σε θάνατο (Kelly et al. 1993). Αυτό αποτέλεσε και την πρώτη ένδειξη ότι οι πρωτεϊνες Cdc6/18 συμβάλλουν στο 13

22 σημείο ελέγχου ( checkpoint control ), το οποίο συνδέει την S-φάση με την Μ-φάση. Επιπλέον έχει αναφερθεί ότι η ScCdc6 συμβάλλει στην απενεργοποίηση των μιτοτικών CDKs κατά τη διάρκεια της εξόδου από τη μίτοση (Calzada et al. 2001) Πρωτεϊνη Cdt1 (cdc10 dependent transcript 1) Η πρωτεϊνη Cdt1, όπως προκύπτει εξάλλου και από την ονομασία της, αναγνωρίστηκε αρχικά ως στόχος του G1/S ειδικού μεταγραφικού παράγοντα Cdc10 και λόγω της συμετοχής της στην έναρξη της αντιγραφής στον S. pombe (Hofmann & Beach 1994). Τα επίπεδα της Cdt1 στον S. pombe φτάνουν στη μέγιστη τιμή τους κατά το στάδιο G1/S του κυτταρικού κύκλου, ομοίως με την πρωτεϊνη SpCdc18. (Nishitani et al. 2000). Ομόλογα της Cdt1 έχουν αναφερθεί σε Xenopus, Drosophila, σε ανθρώπινα κύτταρα (Maiorano et al. 2000; Whittaker et al. 2000; Wohlschlegel et al. 2000; Nishitani et al. 2001) ενώ πιο πρόσφατα και σε S. cerevisiae (Tanaka & Diffley 2002). Στα ανθρώπινα κύτταρα, όπως και στον S. pombe, τα επίπεδα της HsCdt1 φτάνουν τη μέγιστη τιμή τους κατά τη G1 φάση και εξαφανίζονται με την έναρξη της S-φάσης (Wohlschlegel et al. 2000; Nishitani et al. 2001). Αντιθέτως, η ομόλογη της Cdt1 στον S. cerevisiae συσσωρεύεται στον πυρήνα κατά τη διάρκεια της G1 φάσης και στη συνέχεια εξέρχεται από αυτόν και παραμένει εκτός για το υπόλοιπο του κυτταρικού κύκλου (Tanaka & Diffley 2002). Αναφορικά με το ρόλο του παράγοντα Cdt1, έχει δειχθεί ότι αποτελεί μέλος του προ-αντιγραφικού συμπλόκου και παράλληλα είναι υπεύθυνος για την πρόσδεση του εξαμερούς συμπλόκου MCM (περιγράφεται παρακάτω) στις αφετηρίες έναρξης της αντιγραφής (Nishitani H. et al., 2000; Maiorano D. et al., 2000). Επομένως, ο παράγοντας Cdt1 δρα στο ίδιο στάδιο με τον παράγοντα Cdc6/18. Πρόσφατα πειράματα στον Xenopus υποδεικνύουν ότι ο παράγοντας Cdc6/18 πρέπει να προηγείται του παράγοντα Cdt1 κατά την αδειοδότηση (Tsuyama et al., 2005). Επιπλέον, σε κύτταρα ζύμης και θηλαστικών έχει δειχθεί ότι ο παράγοντας Cdt1 αλληλεπιδρά με τον παράγοντα Cdc6/18 (Nishitani H. et al., 2000; Cook J.G. et al., 2004) αλλά και με τις πρωτεϊνες MCM (Yanagi K. et al., 2002; Cook J.G. et al., 2004). 14

23 1.3.4 Δομική και λειτουργική περιγραφή της Cdt1 Η πρωτεϊνη Cdt1 διαδραματίζει πολύ σημαντικό ρόλο κατά τη διαδικασία αδειοδότησης της αντιγραφής. Η αλληλεπίδραση της Cdt1 με το προ-αντιγραφικό σύμπλοκο (pre-rc) εξαρτάται από το εξαμερές σύμπλοκο ORC ενώ είναι ανεξάρτητη της παρουσίας της πρωτεϊνης Cdc6 και λαμβάνει χώρα πριν την πρόσδεση του εξαμερούς ΜCM2-7 στη χρωματίνη (Nishitani H. et al., 2000; Maiorano D. et al., 2000). Ο κύριος ρόλος της Cdt1 είναι η συμβολή της στην πρόσδεση του πρωτεϊνικού συμπλόκου MCM στη χρωματίνη, προκειμένου να ακολουθήσει η αδειοδότηση της έναρξης της αντιγραφής κατά την S-φάση. Σύμφωνα με μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί στην ορθόλογη πρωτεϊνη του ποντικού, η Cdt1 χωρίζεται στις ακόλουθες τρεις περιοχές: (i) σε μία αμινοτελική περιοχή η οποία η οποία εμφανίζεται φτωχά συντηρημένη ανάμεσα στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς (ii) σε μία κεντρική περιοχή και συγκεκριμένα στα κατάλοιπα , μέσω της οποίας προσδένεται στη geminin και (iii) σε μια καρβοξυτελική περιοχή κατάλοιπα στην οποία οφείλεται η αλληλεπίδραση με το εξαμερές σύμπλοκο MCM. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι το καρβοξυτελικό τμήμα της Cdt1 εμφανίζεται συντηρημένο σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς ενώ η κεντρική περιοχή μόνο στα μετάζωα. Από αυτό προκύπτει το συμπέρασμα ότι η περιοχή της Cdt1 που ευθύνεται για την αλληλεπίδραση με το σύμπλοκο MCM είναι συντηρημένη σε όλους τους ευκαρυωτικούς ενώ η περιοχή πρόσδεσης της geminin είναι μόνο στα μετάζωα. Το τελευταίο έρχεται και σε συμφωνία με το γεγονός ότι ομόλογα της geminin έχουν βρεθεί, μέχρι στιγμής, μόνο στα μετάζωα. Επιπλέον, έχει βρεθεί ότι η ορθόλογη Cdt1 στον ποντικό διαθέτει ικανότητα πρόσδεσης στο DNA μέσω των αμινοτελικών καταλοίπων Η πρόσδεση αυτή δεν εξαρτάται ούτε από την αλληλουχία του DNA, ούτε από την αλυσίδα καθώς και ούτε από τη διαμόρφωση του μορίου. Αξίζει να σημειωθεί ότι η περιοχή πρόσδεσης του DNA αλληλεπικαλύπτεται με την περιοχή πρόσδεσης της geminin. Κατά συνέπεια, η geminin αναστέλλει την πρόσδεση της Cdt1 στο DNA. Επιπλέον η geminin αναστέλλει και την αλληλεπίδραση με το σύμπλοκο MCM, αν και οι περιοχές αλληλεπίδρασης της Cdt1 15

24 τόσο για το DNA όσο και για το εξαμερές MCM είναι διαφορετικές (Yanagi K. et al., 2002). Ορισμένα επιπλέον στοιχεία όσον αφορά τη λειτουργική περιγραφή της Cdt1, προέκυψαν από μία μελέτη που πραγματοποιήθηκε στον Xenopus. Σύμφωνα με τη συγκεκριμένη μελέτη, η μικρότερη περιοχή της Cdt1 η οποία διαθέτει ενεργότητα αδειοδότησης της αντιγραφής εντοπίζεται στα 377 καρβοξυτελικά κατάλοιπα της πρωτεϊνης. Σχετικά με την αλληλεπίδραση με τη geminin η κύρια περιοχή πρόσδεσης εντοπίζεται και πάλι στο κεντρικό τμήμα της πρωτεϊνης και συγκεκριμένα μεταξύ των καταλοίπων Επίσης αναφέρεται και μία επιπλέον περιοχή η οποία όμως εμφανίζει πολύ μικρότερη συγγένεια για τη geminin και εντοπίζεται στα πρώτα 193 αμινοτελικά κατάλοιπα. Τέλος, η αλληλεπίδραση της Cdt1 με το πρωτεϊνικό σύμπλοκο MCM επιτυγχάνεται μέσω των καταλοίπων στο καρβοξυτελικό τμήμα της πρωτεϊνης. Το εύρημα αυτό έρχεται σε συμφωνία και με το αντίστοιχο που προέκυψε από τη μελέτη του ορθολόγου στον ποντικό, όπως έχει αναφερθεί προηγουμένως (Ferenbach A. et al., 2005) Ο αναστολέας του συστήματος αδειοδότησης, Geminin Τα μετάζωα έχουν αναπτύξει έναν επιπλέον μηχανισμό αναστολής της εκτοπικής επανέναρξης της αντιγραφής; βασίζεται στη δράση της πρωτεϊνης geminin, η οποία αρχικά είχε αναγνωρισθεί στον Xenopus ως σημαντικός παράγοντας εξόδου από τη μίτωση [McGarry T.J. & Kirschner M.W., 1998]. Η geminin αποτελεί το φυσικό αναστολέα της cdt1, καθώς προσδένεται ισχυρά στην τελευταία μετά την έναρξη της σύνθεσης του DNA, παρεμποδίζοντας με αυτόν τον τρόπο την επαναπρόσδεσή της στο προ-αντιγραφικό σύμπλοκο (Tada S. et al., 2001; Wohlschlegel J.A. et al., 2000). Μέχρι στιγμής, ορθόλογα της geminin έχουν αναγνωριστεί σε οργανισμούς όπως η μύγα, το ψάρι, ο βάτραχος, ο ποντικός, ο άνθρωπος, όχι όμως και στη ζύμη. Η geminin απουσιάζει κατά τη G1-φάση και αρχίζει να εκφράζεται στην S-φάση, αμέσως μετά την έναρξη της αντιγραφής. Προσδένεται στη Cdt1, αναστέλλοντας την πρόσδεση της τελευταίας στις θέσεις έναρξης της αντιγραφής καθώς και με το εξαμερές MCM σύμπλοκο και κατά συνέπεια την εκτοπική επανέναρξη της αντιγραφής. Τα επίπεδα της geminin διατηρούνται σταθερά κατά τη διάρκεια των φάσεων G2 και Μ, μέχρις ότου 16

25 αρχίσει η διαδικασία πρωτεόλυσής της, μέσω της ουβικουϊτινοποίησής της από το πρωτεϊνικό σύμπλοκο APC (anaphase promoting complex) κατά το τέλος της μίτωσης και πιο συγκεκριμένα στο στάδιο μετάβασης από την ανάφαση στην τελόφαση. Η ουβικουϊτινοποίηση και πρωτεόλυση της geminin μέσω του APC συμπλόκου οφείλεται σε μία αλληλουχία εννέα αμινοξικών καταλοίπων, κοντά στο αμινοτελικό άκρο της πρωτεϊνης (McGarry TJ & Kirschner MW, 1998). Εκτός όμως από την πρωτεόλυση της πρωτεϊνης, υπάρχουν και άλλοι δύο μηχανισμοί απενεργοποίησής της οι οποίοι αναγνωρίστηκαν στον Xenopus. Σύμφωνα με τον ένα μηχανισμό, προς το τέλος της μίτωσης, η geminin εμφανίζεται ανενεργή καθώς δεν έχει ικανότητα αλληλεπίδρασης με τη cdt1. Μετά όμως το σχηματισμό του πυρηνικού φακέλου, ακολουθεί είσοδος της geminin στον πυρήνα, γεγονός που συμβάλλει στην ενεργοποίησή της και στην πρόσδεσή της στον παράγοντα cdt1 (Hodgson B. et al., 2002). Ο άλλος μηχανισμός απενεργοποίησης σχετίζεται με την ουβικουϊτινοποίηση της geminin μέσω του ενεργοποιημένου, από τις CDKs, συμπλόκου APC. Έχει δειχθεί ότι η ουβικουϊτινοποίηση αυτή συμβάλλει στη μετατροπή της geminin σε μία ανενεργή μορφή, χωρίς ωστόσο να συνοδεύεται από πρωτεόλυση της πρωτεϊνης (Li A. & Blow JJ, 2004). Η απενεργοποίηση της geminin είναι μείζωνος σημασίας, καθώς επιτρέπει την ελεύθερη δράση της Cdt1 και κατά συνέπεια την έναρξη του επόμενου κυταρικού κύκλου. Σύμφωνα με πειραματικά αποτελέσματα, η υπερέκφραση μιας σταθερής και μη αποικοδομήσιμης μορφής της geminin σε ανθρώπινα κύτταρα προκάλεσε συσσώρευση των κυττάρων (growth arrest) κατά τη G1-φάση του κύκλου (Wohlschlegel J.A et al., 2002). Παρομοίως, σε U2OS κύτταρα, η έκφραση μιας μορφής της geminin από την οποία είχε αφαιρεθεί το αμινοτελικό τμήμα που ευθύνεται για την αποικοδόμησή της οδήγησε τα κύτταρα σε απόπτωση (Shreeram S. et al. 2002). Επομένως, όλα τα παραπάνω συνηγορούν στο γεγονός ότι η geminin αποτελεί έναν αρνητικό ρυθμιστή της αντιγραφής του DNA κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Επιπλέον, έχει δειχθεί ότι αυτή ακριβώς η ικανότητα της geminin να αναστέλλει το σχηματισμό του προ-αντιγραφικού συμπλόκου οδηγεί στη θανάτωση καρκινικών κυττάρων (Shreeram S. et al., 2002). 17

26 1.3.6 Δομική και λειτουργική περιγραφή της Geminin Η geminin είναι μια μη σταθερή ρυθμιστική πρωτεϊνη, μοριακού βάρους περίπου 25-KDa. Εμφανίζεται συντηρημένη σε όλα τα σπονδυλωτά και και τη Drosophila ενώ δεν έχει βρεθεί κάποιο ορθόλογό της στη ζύμη και στο νηματοειδή σκώληκα Caenorhabditis elegans. Δεδομένου του μικρού της μεγέθους, η geminin παρουσιάζει μη αναμενόμενη πλειοτροπική δράση. Κατά κύριο λόγο αναστέλλει την εκτοπική επανέναρξη της αντιγραφής του γενετικού υλικού μέσω της πρόσδεσής της και αναστολής του παράγοντα αδειοδότησης της αντιγραφής, Cdt1 (McGarry T.J. & Kirschner M.W., 1998; Wohlschlegel J.A. et al., 2000, Tada S. et al., 2001). Επιπλέον, η geminin είναι απαραίτητη για τη μετάβαση από τη φάση G2 στη φάση-μ, είτε μέσω της αρνητικής ρύθμισης της κινάσης Chk1 είτε συμβάλλοντας στην αποφυγή ανωμαλιών κατά τη διαδικασία της αντιγραφής (McGarry T.J., 2002; Melixetian M. et al., 2004). Τέλος, έχει διαπιστωθεί ότι η geminin συμμετέχει στην κυτταρική διαφοροποίηση κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης, μέσω μιας πληθώρας μηχανισμών (Kroll K. et al., 1998; Del Bene F. et al., 2004; Luo L. et al., 2004). Πιθανότατα λοιπόν, η εξήγηση της τόσο πλειοτροπικής δράσης αυτού του μκρού πρωτεϊνικού μορίου να βρίσκεται στη δομή της πρωτεϊνης. Η geminin σχηματίζει ένα ομοδιμερές μέσω μιας coiled-coil περιοχής, η οποία εντοπίζεται αμινοξικά στο κεντρικό, περίπου, τμήμα του μορίου ( a.a. στον άνθρωπο). Στην ουσία, πρόκειται για δύο παράλληλες α-έλικες οι οποίες σχηματίζουν μια αριστερόστροφη υπερέλικα μέσω αλληλεπιδράσεων van der Waals, δεσμών υδρογόνου και ιοντικών αληλεπιδράσεων. Τα μέχρι τώρα, πάντως, κρυσταλλογραφικά δεδομένα συνηγορούν στο ότι το διμερές της geminin σταθεροποιείται κυρίως μέσω υδροφοβικών αλληλεπιδράσεων. Το μήκος του διμερούς κυμαίνεται γύρω στα 60Α ο ενώ η διάμετρός του γύρω στα 20Α ο (Lee C et al., 2004; Thepaut M et al., 2004). Ο ομοδιμερισμός της geminin είναι ικανή και αναγκαία προϋπόθεση για την αλληλεπίδρασή της με τη Cdt1 καθώς και για την ανασταλτική της δράση όσον αφορά την εκτοπική επανέναρξη της αντιγραφής (Saxena S. et al., 2004). Αξίζει επίσης να σημειωθεί ότι υπάρχουν ορισμένες πειραματικές ενδείξεις, σύμφωνα με τις οποίες η geminin έχει την ικανότητα σχηματισμού τετραμερούς. Πιο συγκεκριμένα, σύμφωνα με 18

27 αποτελέσματα ηλεκτρονικής μικροσκοπίας (ΕΜ) το τετραμερές της geminin αποτελείται από τα δύο διμερή coiled-coils, τα οποία είναι προσανατολισμένα παράλληλα (Okorokov A.L. et al., 2004). Στο ίδιο σχεδόν αποτέλεσμα καταλήγουν και τα δεδομένα από SAXS πειράματα, με τη μόνη διαφορά ότι στο συγκεκριμένο μοντέλο τα δύο διμερή έχουν αντιπαράλληλο προσανατολισμό (Thepaut M et al., 2004). Όπως έχει αναφερθεί και προηγουμένως, μία από τις κύριες λειτουρίες της geminin είναι η πρόσδεση και αναστολή του αδειοδοτικού παράγοντα Cdt1. Για το λόγο αυτό η geminin διαθέτει δύο περιοχές αλληλεπίδρασης με την πρωτεϊνη Cdt1. Η κύρια περιοχή, στην ανθρώπινη geminin, εντοπίζεται μεταξύ των αμινοξικών καταλοίπων Στην συγκεκριμένη περιοχή, υπάρχουν οχτώ συντηρημένα κατάλοιπα γλουταμινικού οξέος, τα οποία πιστεύεται ότι σταθεροποιούν την πρόσδεση της Cdt1 μέσω ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων. Επίσης, δεδομένης της ικανότητας της Cdt1 να προσδένεται στο DNA (Yanagi et al., 2002), πιστεύεται ότι η περιοχή αυτή της geminin λόγω των αρνητικών της φορτίων μιμείται τον αρνητικά φορτισμένο σκελετό του DNA και κατά επέκταση αναστέλλει την πρόσδεσή της στο γενετικό υλικό. Τέλος, όσον αφορά τη δεύτερη περιοχή αλληλεπίδρασης με τη Cdt1, αυτή εντοπίζεται μεταξύ των καταλοίπων της ανθρώπινης geminin και έχει δειχθεί ότι είναι απαραίτητη για την επιτυχή αναστολή της δράσης της Cdt1 (Saxena S. et al., 2004). Επιπροσθέτως, έχει αναφερθεί ότι η geminin εκτός από τη Cdt1, αλληλεπιδρά και με την καταλυτική υπομονάδα Brg1, του πρωτεϊνικού συμπλόκου αναδιάταξης της χρωματίνης SWI/SNF. Πρόκειται για μια κυρίως ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση, η οποία οφείλεται στο καρβοξυτελικό τμήμα της πρωτεϊνης και πιο συγκεκριμένα στα κατάλοιπα , στη geminin του ποντικού. Όπως προκύπτει, η περιοχή αλληλεπίδρασης με την υπομονάδα Brg1 βρίσκεται εκτός της coiled-coil περιοχής, γεγονός που συνεπάγεται ότι ο ομοδιμερισμός της geminin δεν είναι απαραίτητος για την αλληλεπίδραση με τον Brg1, σε αντίθεση με την περίπτωση της Cdt1 (Seo S. et al., 2006). Όσον αφορά το αμινοτελικό τμήμα της geminin, περιέχει αρκετά βασικά αμινοξικά κατάλοιπα τα οποία θα μπορούσαν να λειτουργήσουν ως σήμα πυρηνικού εντοπισμού (Nuclear Localization Signal, NLS) της πρωτεϊνης. Πιο συγκεκριμένα, πρόκειται για δύο συστοιχίες καταλοίπων οι οποίες εντοπίζονται στην περιοχή a.a. στον Xenopus. 19

28 Ενδιαφέρον μάλιστα παρουσιάζει και το γεγονός ότι το σήμα πυρηνικού εντοπισμού είναι απαραίτητο και για την αποικοδόμηση της πρωτεϊνης (Benjamin J.M. et al., 2004). Σύμφωνα όμως και με μεταγενέστερη μελέτη, το σήμα πυρηνικού εντοπισμού βρίσκεται στην περιοχή a.a. στην ορθόλογη πρωτεϊνη του Xenopus. Επιπλέον, σύμφωνα με την ίδια μελέτη, η ανθρώπινη geminin διαθέτει μόνο τη μία από τις αντίστοιχες δύο συστοιχίες βασικών καταλοίπων, με αποτέλεσμα η μεταφορά της στον πυρήνα να εξαρτάται και από την αλληλεπίδρασή της με τη Cdt1 (Yoshida et al., 2005). Σχετικά με την αποικοδόμηση της πρωτεϊνης, εκτός από το σήμα πυρηνικού εντοπισμού το οποίο είναι απαραίτητο, η geminin διαθέτει επίσης στο αμινοτελικό της τμήμα και την κύρια αλληλουχία αποικοδόμησης (destruction box). Πρόκειται για ένα σύνολο εννέα αμινοξέων τα οποία εντοπίζονται στην περιοχή στον Xenopus και εμφανίζουν ομολογία με την αντίστοιχη αλληλουχία που διαθέτουν και οι μιτοτικές κυκλίνες. Η συγκεκριμένη αλληλουχία αναγνωρίζεται από τη μιτοτική μορφή του συμπλόκου προώθησης της ανάφασης (Anaphase-Promoting Complex, APC) το οποίο με τη σειρά του συμβάλλει στην ουβικοϋιτινοποίηση της geminin (McGarry & Kirschner, 1998). Επιπλέον, μελέτες στο έμβρυο του ιχθύος στο είδος Medaka έχουν δείξει ότι η geminin είναι ικανή να αναστείλλει το σχηματισμό του οφθαλμού λόγω της πρόσδεσης και της ανασταλτικής της δράσης στον μεταγραφικό παράγοντα Six3. Για τη συγκεκριμένη αλληλεπίδραση έχει δειχθεί ότι απαιτείται η πλήρης αμινοξική αλλλουχία και των δύο πρωτεϊνών (Filippo Del Bene et al., 2004). Τέλος, όπως έχει αναφερθεί και προηγουμένως, η geminin συμμετέχει στη διαδικασία νευρογέννεσης. Η συμμετοχή της αυτή οφείλεται στην αμινοξική περιοχή a.a. στην ορθόλογη του Xenopus. Έχει δειχθεί ότι η συγκεκριμένη περιοχή είναι ικανή να επάγει την έκφραση νευρικού ιστού σε έμβρυα του Xenopus (Kroll et al., 1998) MCM πρωτεϊνικό σύμπλοκο (mini-chromosome maintenance) Πρόκειται για ένα εξαμερές πρωτεϊνικό σύμπλοκο (MCM2-MCM7) το οποίο αποδείχτηκε ότι διαδραματίζει και αυτό σημαντικό ρόλο κατά την έναρξη της αντιγραφής (Tye 1999). Οι έξι πρωτεϊνες του συμπλόκου εμφανίζουν υψηλή ομοιότητα 20

29 μεταξύ τους, ειδικά σε μία συντηρημένη περιοχή 240 αμινοξικών καταλοίπων όπου υπάρχει μία περιοχή πρόσδεσης ATP. To μοριακό βάρος του εξαμερούς MCM είναι περίπου 600kDa και οι υπομονάδες που το συνιστούν είναι συντηρημένες από τη ζύμη μέχρι και τα θηλαστικά (Thommes et al. 1997). Σύμφωνα με βιοχημικές μελέτες, το MCM σύμπλοκο εμφανίζει ενεργότητα ελικάσης. Μάλιστα με βάση ένα προτεινόμενο μοντέλο, οι υπομονάδες Mcm καταλύουν την υδρόλυση του ATP ενώ οι υπομονάδες Mcm είναι αυτές που ευθύνονται για την ενεργότητα ελικάσης που παρουσιάζει το σύμπλοκο (Schwacha & Bell 2001). 1.4 Αδειοδότηση της αντιγραφής Σύμφωνα με πειράματα που πραγματοποιήθηκαν στον Xenopus και στη ζύμη έχει προταθεί το ακόλουθο μοντέλο αδειοδότησης: Το εξαμερές σύμπλοκο ORC προσδένεται στις θέσεις έναρξης της αντιγραφής και τουλάχιστον στη ζύμη, η πρόσδεση αυτή διαρκεί καθόλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου (Liang & Stillman 1997; Ogawa et al. 1999; Lygerou & Nurse 1999). Σε αντίθεση με τη ζύμη, στους ανώτερους ευκαρυωτικούς το σύμπλοκο ORC δεν παραμένει προσδεδεμένο στη χρωματίνη καθ όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου αλλά υφίσταται διαφορετική ρύθμιση. Κύριο στόχο αποτελεί η υπομονάδα ORC1. Συγκεκριμένα, έχει αναφερθεί ότι σε ανθρώπινα κύτταρα CHO η υπομονάδα ORC1 αποδεσμεύεται με την έναρξη της φάσης S από τη χρωματίνη (Natale D.A. et al., 2000), ενώ σε κύτταρα HeLa η υπομονάδα υφίσταται ουβικουϊτινο-εξαρτώμενη πρωτεόλυση (Mendez J. et al., 2002; Fujita M. et al., 2002). Με την ολοκλήρωση της μίτωσης οι πρωτεϊνες Cdc6/18 και Cdt1 προσδένονται στη χρωματίνη και με τη σειρά τους συμβάλλουν στην πρόσδεση και του εξαμερούς MCM συμπλόκου. Αν και οι Cdc6/18 και Cdt1 προσδένονται στο DNA ανεξάρτητα μεταξύ τους, η πρόσδεση τους εξαρτάται από την παρουσία του ORC συμπλόκου. Επιπλέον δρουν συνεργαστικά όσον αφορά την πρόσδεση του MCM στη χρωματίνη (Coleman et al. 1996; Tanaka et al. 1997; Aparicio et al. 1997; Ogawa et al. 1999; Maiorano et al. 2000; Nishitani et al. 2000). Η διαδικασία της αδειοδότησης θεωρείται 21

30 πλήρης όταν ολοκληρωθεί και η πρόσδεση του ΜCM συμπλόκου στη χρωματίνη. Το πολυπρωτεϊνικό αυτό σύμπλοκο που προκύπτει αντιστοιχεί στο προ-αντιγραφικό σύμπλοκο (pre-rc), το οποίο έχει αναφερθεί και προηγουμένως. Στη συνέχεια το προαντιγραφικό σύμπλοκο ενεργοποιείται κατά το στάδιο G1/S και αυτό οδηγεί στην έναρξη της αντιγραφής. Η ενεργοποίηση του προ-αντιγραφικού συμπλόκου οφείλεται στη δράση των πρωτεϊνικών κινασών CDK και DDK. Οι κινάσες αυτές προκαλούν την πρόσδεση της πρωτεϊνης Cdc45 στο σύμπλοκο MCM καθώς και την πρόσδεση στις θέσεις έναρξης της αντιγραφής άλλων παραγόντων της αντιγραφικής μηχανής, όπως η αντιγραφική πρωτεϊνη Α (replication protein, RPA), η πολυμεράση α και η πολυμεράση ε (Geraghty et al. 2000; Jares & Blow 2000; Mimura et al. 2000; Walter & Newport 2000; Zou & Stillman 2000; Takisawa et al. 2000). Με την αποδέσμευση του συμπλόκου MCM από τις αφετηρίες έναρξης της αντιγραφής γίνεται η μετάβαση στην κατάσταση η οποία χαρακτηρίζεται από την παρουσία του μετα-αντιγραφικού συμπλόκου (post-rc) (Diffley J.F.X. et al., 1994). Η μετα-αντιγραφική αυτή κατάσταση αναστέλλει την επανέναρξη της αντιγραφής, μέχρι και το χρονικό σημείο ολοκλήρωσης της μίτωσης. Όλα τα παραπάνω καθώς και η ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου από την ενεργότητα των CDKs περιγράφονται συνοπτικά στην εικόνα 2 που ακολουθεί: 22

31 Εικόνα 2: ο κυτταρικός κύκλος διαιρείται σε δύο στάδια με βάση την ενεργότητα των CDKs. Το ένα στάδιο (G1-φάση) χαρακτηρίζεται από καθόλου ή χαμηλή ενεργότητα (ανοιχτό πράσινο χρώμα). Το άλλο στάδιο χαρακτηρίζεται από υψηλή ενεργότητα CDKs και περιλαμβάνει χρονικά την αρχή της S-φάσης μέχρι και το τέλος της μίτωσης (μωβ χρώμα). Η χαμηλή ενεργότητα των κινασών ευνοεί το σχηματισμό του προ-αντιγραφικού συμπλόκου. Όταν τα κύτταρα δεσμεύονται να μπουν σε νέο κυτταρικό κύκλο, οι CDKs μαζί με μία δεύτερη κινάση, την DDK, ενεργοποιούν το προ-αντιγραφικό σύμπλοκο εκκινώντας την αντιγραφή. Ακολουθεί η στρατολόγηση της αντιγραφικής μηχανής και η κίνηση αυτής μαζί με το σύμπλοκο των MCM πάνω στο DNA. Στη συνέχεια παρατηρείται αύξηση της ενεργότητας των CDKs, η οποία συμβάλλει στην αναστολή της εκτοπικής επανέναρξης της αντιγραφής. Επίσης στο τελευταίο συνάδει και η φωσφορυλίωση των παραγόντων αδειοδότησης από τις CDKs το οποίο προκαλεί είτε πρωτεόλυσή τους είτε έξοδό τους από τον πυρήνα. Στα μετάζωα η geminin προσδένεται στη Cdt1 και λειτουργεί ως φυσικός αναστολέας της. Η ολοκλήρωση της μίτωσης επιτρέπει την αποφωσφορυλίωση των πρωτεϊνών καθώς και τη συσσώρευση των παραγόντων αδειοδότησης, γεγονός που οδηγεί σε ένα νέο κύκλο αδειοδότησης. (Hideo Nishitani & Zoi Lygerou, 2002) 1.5 Κυτταρικός κύκλος και καρκίνος H σωστή λειτουργία των σημείων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου είναι απαραίτητη για την ακεραιότητα και την πιστότητα της μεταβίβασης της γενετικής πληροφορίας. Ένα από τα χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων είναι οι ανωμαλίες που εμφανίζουν όσον αφορά τη ρύθμιση του κύκλου, οι οποίες με τη σειρά τους συμβάλλουν στη συσσώρευση γενετικών μεταλλαγών. 23