ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΒΑΣΙΚΩΝ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ»

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΒΑΣΙΚΩΝ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ» ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ «Μελέτη του συμπλόκου αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA με μεθόδους λειτουργικής απεικόνισης βιομορίων σε ανθρώπινα κύτταρα και της εμπλοκής αυτού στην καρκινογένεση» ΙΩΑΝΝΑ ΕΛΕΝΗ ΣΥΜΕΩΝΙΔΟΥ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ 2012

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΒΑΣΙΚΩΝ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ» ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ «Μελέτη του συμπλόκου αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA με μεθόδους λειτουργικής απεικόνισης βιομορίων σε ανθρώπινα κύτταρα και της εμπλοκής αυτού στην καρκινογένεση» ΙΩΑΝΝΑ ΕΛΕΝΗ ΣΥΜΕΩΝΙΔΟΥ ΒΙΟΛΟΓΟΣ Επιβλέπουσα Καθηγήτρια: Λυγερού Ζωή Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Εργαστήριο Γενικής Βιολογίας Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών - 2 -

3 Τριμελής συμβουλευτική επιτροπή κα Λυγερού Ζωή κος Ταραβήρας Σταύρος κα Παπαδάκη Πέτρου Ελένη Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τμήμα Ιατρικής, Επίκουρος Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τμήμα Ιατρικής, Επταμελής συμβουλευτική επιτροπή κα Λυγερού Ζωή κος Ταραβήρας Σταύρος κα Παπαδάκη Πέτρου Ελένη κος Καλόφωνος Χαράλαμπος κος Μακατσώρης Θωμάς κα Μπράβου Βασιλική κος Φλυτζάνης Κωνσταντίνος Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τμήμα Ιατρικής, Επίκουρος Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τμήμα Ιατρικής, Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής, Λέκτορας Τμήμα Ιατρικής, Επίκουρη Καθηγήτρια Τμήμα Ιατρικής Αναπληρωτής Καθηγητής Τμήμα Βιολογίας - 3 -

4 Αντί προλόγου... Θα ήθελα να ευχαριστήσω από καρδιάς την επιβλέπουσα καθηγήτριά μου κ. Ζωή Λυγερού για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε αναθέτοντάς μου αυτή τη διδακτορική διατριβή. Η πολύτιμη καθοδήγησή της κατά τη διεξαγωγή των πειραμάτων, καθώς και η κατανόηση και η ενθάρρυνσή της όταν ανέκυπταν δυσκολίες ήταν καθοριστικοί παράγοντες για την ολοκλήρωση της συγκεκριμένης εργασίας. Επιπλέον, ευχαριστώ ιδιαίτερα τον καθηγητή μου κ. Σταύρο Ταραβήρα, μέλος της τριμελούς επιτροπής, για το ειλικρινές ενδιαφέρον και την υποστήριξή του, καθώς και για την πολύτιμη βοήθειά του καθ όλη τη διάρκεια αυτών των χρόνων. Πολλές ευχαριστίες οφείλω στην καθηγήτριά μου κ. Ελένη Παπαδάκη Πέτρου για το ουσιαστικό ενδιαφέρον της και για την ανεκτίμητη συνεισφορά της τόσο κατά την αξιολόγηση των πειραμάτων με τα κλινικά δείγματα όσο και κατά τη συγγραφή της εργασίας. Επίσης θα ήθελα να ευχαριστήσω τα υπόλοιπα μέλη της επταμελούς επιτροπής, τον καθηγητή κ. Χαράλαμπο Καλόφωνο, τον λέκτορα κ. Θωμά Μακατσώρη, τον αναπληρωτή καθηγητή κ. Κωνσταντίνο Φλυτζάνη και την επίκουρη καθηγήτρια κ. Βασιλική Μπράβου για την πρόθυμη συμμετοχή τους στην επιτροπή και για την πολύτιμη συμβολή τους. Για την καλοπροαίρετη κριτική και τις εύστοχες παρατηρήσεις τους κατά τη διάρκεια των κοινών συναντήσεων του εργαστηρίου Γενικής Βιολογίας, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τα υπόλοιπα μέλη ΔΕΠ του εργαστηρίου, κ. Ν. Μοσχονά, κ. Α. Αθανασιάδου, κ. Ι. Ζαρκάδη, κ. Δ. Σπάθα και κ. Α. Παπαχατζοπούλου. Ιδιαίτερα ευχαριστώ τους συναδέλφους και φίλους στο εργαστήριο: Βασίλη Ρούκο, Μαρία Δημάκη, Μαρία Ηλιού, Χαρούλα Σιρινιάν, Παναγιώτη Κωτσαντή, Δάφνη Πεφάνη, Νίκο Γιακουμάκη, Μαρίνα Αρμπή, Θοδωρή Γιαβρίδη, Μαριάννα Ραψομανίκη, Μάγδα Σπέλλα, Νικόλα Καραντζέλη, Νάνσυ Σταθοπούλου, Δημήτρη Καραμήτρο, Χριστίνα Κυρούση, Αλεξάνδρα Κανέλλου, Αλεξάνδρα Πατμανίδη, Τάσο Παπαναστασίου και Ελεάνα Σταύρου. Τους ευχαριστώ θερμά για το ευχάριστο κλίμα συνεργασίας, για την πολύτιμη βοήθειά τους κατά τη διάρκεια των πειραμάτων καθώς και για την παρότρυνσή τους στις δύσκολες στιγμές. Θα τους θυμάμαι πάντα με εκτίμηση και αγάπη. Ένας επιπλέον λόγος που είμαι ευγνώμων στην καθηγήτριά μου κ. Ζωή Λυγερού είναι η δυνατότητα που μου έδωσε να εργαστώ και να αποκομίσω πολύτιμη εμπειρία δουλεύοντας σε αξιόλογα εργαστήρια του εξωτερικού. Ευχαριστώ θερμά τον Prof. Piet Borst και τον Prof. Αναστάσιο Περράκη για τη φιλοξενία στα εργαστήρια τους στο ινστιτούτο NKI-AVL, στο Άμστερνταμ, καθώς και για τις πολύτιμες συμβουλές τους. Επίσης ευχαριστώ τον Prof. Philippe Bastiaens και τον Hernan E. Grecco για τη φιλοξενία στο εργαστήριό τους στο Max Planck Institute, στο Dortmund, καθώς και για την πολύτιμη συμβολή τους στα πειράματα λειτουργικής μικροσκοπίας

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Αντιγραφή του DNA Καθορισμός του χρόνου πυροδότησης των αφετηριών αντιγραφής του DNA Οργάνωση της αντιγραφής του DNA στον πυρήνα Αδειοδότηση των αφετηριών της αντιγραφής του DNA Χαρακτηριστικά και ρύθμιση παραγόντων αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA Το σύμπλοκο ORC Η πρωτεΐνη Cdc Οι πρωτεΐνες MCM Η πρωτεΐνη Cdt Η πρωτεΐνη Geminin κατέχει διττό ρόλο: ρυθμίζει τον κυτταρικό κύκλο και τη νευρονική διαφοροποίηση Η υπεροικογένεια των πρωτεϊνών MCM Δομικά χαρακτηριστικά των πρωτεϊνών MCM Συγκρότηση συμπλόκων των πρωτεϊνών MCM Οι πρωτεΐνες MCM2-7 θεωρούνται οι αντιγραφικές ελικάσες του DNA Μηχανισμός αποδιάταξης του δίκλωνου DNA από το σύμπλοκο MCM Ενεργοποίηση των προαντιγραφικών συμπλόκων Παράγοντες προεναρκτήριου συμπλόκου Συγκρότηση προεναρκτήριου συμπλόκου Φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών MCM Γονιδιωματική αστάθεια και καρκινογένεση Η διατήρηση των επιπέδων έκφρασης των παραγόντων Cdt1 και Geminin είναι απαραίτητη για την εξασφάλιση της γονιδωματικής σταθερότητας Ο παράγοντας Cdt1 διαθέτει ογκογόνο δράση Η υπεραδειοδότηση των αφετηριών αντιγραφής του DNA αποτελεί αιτία αντιγραφικού στρες Η ενεργοποίηση των σηματοδοτικών μονοπατιών απόκρισης σε βλάβη στο DNA περιορίζει την πρόοδο της καρκινογένεσης Βιοδείκτες των όγκων Οι παράγοντες αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA ως βιοδείκτες Ο παράγοντας Cdt1 ως βιοδείκτης σε όγκους Η πρωτεΐνη Geminin ως βιοδείκτης σε όγκους Οι πρωτεΐνες MCM2-7 ως βιοδείκτες σε όγκους ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ

6 3. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Κυτταροκαλλιέργεια Κυτταρικές σειρές, διατήρηση και διαχωρισμός κυττάρων (split) Παροδική διαμόλυνση κυττάρων με πλασμιδιακό DNA Δημιουργία σταθερά διαμολυσμένων κυτταρικών σειρών Αποσιώπηση της γονιδιακής έκφρασης με την τεχνολογία RNAi (RNAi interference) Συγχρονισμός ευκαρυωτικών κυττάρων στη μίτωση, στο τέλος της G1 και στην αρχή της S φάσης Έξοδος κυττάρων από κυτταρικό κύκλο Σήμανση κυττάρων με BrdU Μονιμοποίηση και χρώση κυτταρικών αποικιών Ανάλυση πρωτεϊνών Απομόνωση ολικών πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων Ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE Ανοσοαποτύπωμα western Ανοσοκατακρήμνιση Μέθοδοι κυτταρικής βιολογίας Ανοσοφθορισμός Πρωτόκολλο ανοσοφθορισμού Απομάκρυνση διαλυτού κλάσματος πρωτεϊνών (pre-extraction) Ποσοτικοποίηση εικόνων ανοσοφθορισμού Προσδιορισμός των φάσεων του κυτταρικού κύκλου μέσω ανάλυσης του περιεχόμενου DNA με κυτταρομετρία ροής (FACS, Fluorescence Activated Cell Sorting) Ανοσοϊστοχημεία Πρωτόκολλο ανοσοϊστοχημείας Αξιολόγηση ανοσοϊστοχημικής χρώσης Στατιστική ανάλυση Μέθοδοι ανασυνδυασμένου DNA Κλωνοποίηση Ηλεκτροφόρηση DNA σε πήκτωμα αγαρόζης Καθαρισμός DNA από πήκτωμα αγαρόζης Απομόνωση πλασμιδιακού DNA μικρής κλίμακας (Minipreps) Απομόνωση πλασμιδιακού DNA μεσαίας κλίμακας (Midipreps) Κατάτμηση πλασμιδιακού DNA με ένζυμα περιορισμού Αντίδραση συνδετάσης (Ligation) Μετασχηματισμός DH5A βακτηριακών δεκτικών κυττάρων με πλασμιδιακό DNA Κλωνοποίηση για τη δημιουργία του υβριδικού μορίου GFP-MCM Μέθοδοι λειτουργικής μικροσκοπίας ζωντανών κυττάρων Μικροσκοπία time lapse Πειράματα Επαναφοράς Φθορισμού μετά από Φωτολεύκανση - 6 -

7 (Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP) Πειράματα Απώλειας Φθορισμού μετά από Φωτολεύκανση (Fluorescence Loss In Photobleaching, FLIP) Ποσοτική ανάλυση των εικόνων μετά το FLIP Διαλύματα Υλικά ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Μελέτη της έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 σε κλινικά δείγματα καρκίνου μαστού καθώς και της πιθανής συμβολής του παράγοντα στην κακοήθη εξαλλαγή των κυττάρων Έλεγχος ειδικότητας anti-hcdt1 αντισώματος Ανάλυση της έκφρασης της πρωτεΐνης hcdt1 σε κλινικά δείγματα καρκίνου μαστού Η πρωτεΐνη Cdt1 υπερεκφράζεται στον όγκο μαστού σε σύγκριση με τον παρακείμενο φυσιολογικό ιστό και συσχετίζεται με την κατάσταση των στεροειδικών υποδοχέων Η υπερέκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 συσχετίζεται με υψηλή ταχύτητα πολλαπλασιασμού των κυττάρων στον όγκο μαστού Διερεύνηση της συσχέτισης της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 με τα επίπεδα έκφρασης του υποδοχέα HER2/neu Η υπερέκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 συσχετίζεται με την κατάσταση του υποδοχέα HER2/neu στον όγκο μαστού Η έκφραση του παράγοντα Cdt1 συσχετίζεται πιο ισχυρά με την κατάσταση του υποδοχέα HER2/neu σε περιπτώσεις καρκίνου μαστού με χαμηλά επίπεδα έκφρασης της κυκλίνης Α ή με φυσιολογικό P Η υπερέκφραση των παραγόντων αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA Cdt1 και Cdc6 συμβάλλει στην ανάπτυξη γονιδιακής ενίσχυσης Μελέτη της αλληλεπίδρασης των MCM πρωτεϊνών με τη χρωματίνη κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου σε ζωντανά ανθρώπινα κύτταρα Ανάπτυξη ενός συστήματος μελέτης της αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA σε ζωντανά κύτταρα Κλωνοποίηση της GFP-MCM2 αλληλουχίας Δημιουργία σταθερά διαμολυσμένης κυτταρικής σειράς με το υβριδικό μόριο GFP-MCM2 και λειτουργικός έλεγχος αυτής Οι πρωτεΐνες GFP-MCM2 και GFP-MCM4 προσδένονται στη χρωματίνη Η πρόσδεση των πρωτεϊνών GFP-MCM2 και GFP-MCM4 στη χρωματίνη εξαρτάται από την παρουσία του παράγοντα Cdt Μελέτη της κινητικής των πρωτεϊνών GFP-MCM2 και GFP-MCM4 κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου Η αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης GFP-MCM2 με τη χρωματίνη - 7 -

8 διαφοροποιείται κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου Οι πρωτεΐνες GFP-MCM2 και GFP-MCM4 προσδένονται σταδιακά στη χρωματίνη με την πρόοδο της φάσης G Οι πρωτεΐνες GFP-MCM2 και GFP-MCM4 παρουσιάζουν μέγιστο βαθμό πρόσδεσης στη χρωματίνη στο τέλος της φάσης G Μελέτη της κινητικής των πρωτεϊνών GFP-MCM2 και GFP-MCM4 κατά την επανείσοδο των κυττάρων στον κυτταρικό κύκλο από τη φάση G Σταδιακή πρόσδεση της ενδογενούς πρωτεΐνης MCM2 στη χρωματίνη με την πρόοδο της φάσης G Εντοπισμός των υποπυρηνικών περιοχών αλληλεπίδρασης της πρωτεΐνης GFP-MCM2 με τη χρωματίνη κατά τη φάση G Οι περιοχές αλληλεπίδρασης της πρωτεΐνης GFP-MCM2 με τη χρωματίνη δεν συμπίπτουν με τις περιοχές σύνθεσης του DNA Εκτίμηση του χρονικού διαστήματος για το οποίο η πρωτεΐνη GFP-MCM2 παραμένει προσδεδεμένη στη χρωματίνη Διερεύνηση της επίδρασης της πρωτεΐνης Geminin στην κινητική των πρωτεϊνών GFP-MCM2 και GFP-MCM Η απουσία της πρωτεΐνης Geminin περιορίζει την πρόσδεση των πρωτεϊνών GFP-MCM2 και GFP-MCM4 στη χρωματίνη Η πρωτεΐνη Geminin συμβάλλει στην σταθεροποίηση της πρωτεΐνης GFP-MCM4 στη χρωματίνη κατά τη φάση G Η πρωτεΐνη Geminin συμβάλλει στη σταθεροποίηση της ενδογενούς πρωτεΐνης MCM2 στη χρωματίνη κατά τη φάση G Η παρουσία της πρωτεΐνης Geminin είναι απαραίτητη για τη διατήρηση του υψηλού ποσοστού πρόσδεσης των πρωτεϊνών GFP-MCM2 και GFP-MCM4 στη χρωματίνη στο τέλος της φάσης G Τα κύτταρα αδυνατούν να εισέλθουν στη φάση S απουσία της πρωτεΐνης Geminin ΣΥΖΗΤΗΣΗ Μελέτη του παράγοντα Cdt1 ως βιοδείκτη στον όγκο μαστού και της πιθανής εμπλοκής αυτού στην καρκινογένεση Ο παράγοντας Cdt1 υπερεκφράζεται στον όγκο μαστού Ο παράγοντας Cdt1 ως προγνωστικός βιοδείκτης στον όγκο μαστού Πιθανή η συμβολή του παράγοντα Cdt1 στη δημιουργία γονιδιακής ενίσχυσης Μελέτη της κινητικής συμπεριφοράς των πρωτεϊνών MCM2-7 με μεθόδους λειτουργικής μικροσκοπίας σε ζωντανά ανθρώπινα κύτταρα Ανάπτυξη συστήματος μελέτης για την ποσοτική χωροχρονική εκτίμηση της αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA in vivo Μελέτη της κινητικής συμπεριφοράς των πρωτεϊνών MCM2-7 κατά τη - 8 -

9 διάρκεια του κυτταρικού κύκλου Μελέτη των υποπυρηνικών περιοχών αλληλεπίδρασης των πρωτεϊνών MCM2-7 με τη χρωματίνη Πιθανός θετικός ρόλος της πρωτεΐνης Geminin για τη πρόσδεση των πρωτεϊνών MCM2-7 στη χρωματίνη και τη μετάβαση των κυττάρων από τη φάση G1 στη φάση S ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ - ABSTRACT

10 1. Εισαγωγή 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

11 1. Εισαγωγή 1.1 Αντιγραφή του DNA Η αντιγραφή του DNA, η οποία λαμβάνει χώρα κατά τη φάση S του κυτταρικού κύκλου, αποτελεί μια διαδικασία μέσω της οποίας το κύτταρο δημιουργεί ακριβές αντίγραφο του γονιδιώματός του. Η διπλασιασμένη γενετική πληροφορία θα μεταβιβαστεί κατόπιν εξίσου στα δύο θυγατρικά κύτταρα που προκύπτουν μετά την ολοκλήρωση κάθε κυτταρικής διαίρεσης. Η ακριβής χωροχρονική ρύθμιση της αντιγραφής του DNA είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της γονιδωματικής σταθερότητας των κυττάρων. Η πλήρης αντιγραφή ολόκληρου του γονιδιώματος σε κάθε κυτταρικό κύκλο διασφαλίζεται μέσω ποικίλων μηχανισμών ελέγχου. Έναν τέτοιο σημαντικό μηχανισμό ελέγχου αποτελεί η διάκριση της αντιγραφής του DNA σε δύο μη αλληλοεπικαλυπτόμενα στάδια. Στο πρώτο στάδιο, το οποίο αφορά το τέλος της μίτωσης και τη φάση G1, πραγματοποιείται η αδειοδότηση των αφετηριών της αντιγραφής του DNA. Η διαδικασία αυτή περιλαμβάνει τη συγκρότηση των προαντιγραφικών συμπλόκων (Pre-Replicative Complexes, Pre-RCs) στη χρωματίνη, που έχουν ως αποτέλεσμα τη στρατολόγηση των ελικασών MCM2-7 στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA. Στο δεύτερο στάδιο, το οποίο αφορά τη φάση S, οι ελικάσες MCM2-7 ενεργοποιούνται με αποτέλεσμα την πυροδότηση της αντιγραφής του DNA. Η ρύθμιση της σωστής διαδοχής των δύο αυτών σταδίων επιτυγχάνεται μέσω της ενεργότητας των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών (CDKs). Μετά την ολοκλήρωση της μίτωσης η ενεργότητα των CDKs είναι χαμηλή, κατάσταση η οποία επιτρέπει τη συγκρότηση των προαντιγραφικών συμπλόκων στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA. Κατά τη μετάβαση από τη φάση G1 στη φάση S παρατηρείται αύξηση της ενεργότητας των CDKs, γεγονός που ευνοεί την ενεργοποίηση των προαντιγραφικών συμπλόκων και κατ επέκταση την πυροδότηση των αφετηριών της αντιγραφής, ενώ παράλληλα δεν επιτρέπει την εκ νέου συγκρότηση προαντιγραφικών συμπλόκων στη χρωματίνη. Συνεπώς η περιοδική ενεργοποίηση και απενεργοποίηση των CDKs διασφαλίζει την πλήρη αντιγραφή του γονιδιώματος μία μόνο φορά κατά τη διάρκεια κάθε κυτταρικού κύκλου (De Pamphilis 2006, (Blow and Dutta, 2005)). Εικόνα 1.1: Η ενεργότητα των CDKs ρυθμίζει το χρόνο συγκρότησης και ενεργοποίησης των προαντιγραφικών συμπλόκων. Η αδειοδότηση των αφετηριών αντιγραφής πραγματοποιείται στο τέλος της μίτωσης και κατά τη φάση G1, οπότε οι CDKs είναι ανενεργές, ενώ η ενεργοποίηση των προαντιγραφικών συμπλόκων λαμβάνει χώρα κατά τη μετάβαση από τη φάση G1 στη φάση S, οπότε παρατηρείται αύξηση της ενεργότητας των CDKs (Blow et al.; Blow and Gillespie, 2008)

12 1. Εισαγωγή Καθορισμός του χρόνου πυροδότησης των αφετηριών αντιγραφής του DNA Η αντιγραφή του DNA εκκινεί από συγκεκριμένες θέσεις στο γονιδίωμα, τις αφετηρίες της αντιγραφής (origins), οι οποίες καθορίζονται με διαφορετικό τρόπο στους διαφορετικούς ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Στον Saccharomyces cerevisiae οι αφετηρίες της αντιγραφής του DNA είναι συγκεκριμένες και περιλαμβάνουν μια αλληλουχία 11 ή 17 βάσεων. Αντίθετα στον Schizosaccharomyces pombe οι αφετηρίες της αντιγραφής του DNA παρουσιάζουν υψηλή περιεκτικότητα στις βάσεις αδενίνη και θυμίνη, όμως η αλληλουχία τους δεν είναι συντηρημένη. Αντίστοιχα στα μετάζωα οι αφετηρίες της αντιγραφής του DNA δεν καθορίζονται βάσει νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (De Pamphilis 2006). Κατά τη διαδικασία αδειοδότησης των αφετηριών της αντιγραφής του DNA συγκροτούνται πολύ περισσότερα προαντιγραφικά σύμπλοκα από αυτά που πρόκειται να ενεργοποιηθούν κατά τη φάση S (Bowers et al., 2004; Burkhart et al., 1995; Donovan et al., 1997; Kimura et al., 1994; Lei et al., 1996; Richter and Knippers, 1997). Έχει δειχθεί από μελέτες του γενετικού τόπου του γονιδίου της αναγωγάσης του διυδροφολικού (dihydrofolate reductase, DHFR) ότι η επιλογή των αφετηριών της αντιγραφής του DNA πραγματοποιείται σε συγκεκριμένο χρονικό σημείο κατά τη φάση G1 (ODP, Origin Decision Point), μετά τη συγκρότηση των προαντιγραφικών συμπλόκων αλλά πριν την ενεργοποίηση των CDKs. Στο χρονικό αυτό σημείο επιλέγονται οι αφετηρίες της αντιγραφής του πρόκειται να πυροδοτηθούν στην ερχόμενη φάση S (Li et al., 2003a; Wu and Gilbert, 1996). Οι παράγοντες που καθορίζουν ποιες από τις αδειοδοτημένες αφετηρίες της αντιγραφής και πότε κατά τη διάρκεια της φάσης S θα πυροδοτηθούν δεν έχουν διαλευκανθεί. Παρ όλ αυτά έχει δειχθεί ότι διάφορα δομικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά του γονιδιώματος επηρεάζουν αυτή την απόφαση του κυττάρου. Για παράδειγμα, η μεταγραφική ενεργότητα κάθε γονιδιωματικής περιοχής σχετίζεται άμεσα με τον χρόνο έναρξης της αντιγραφής της. Πράγματι έχει δειχθεί ότι οι περιοχές του γονιδιώματος που αντιγράφονται νωρίς κατά τη φάση S παρουσιάζουν υψηλή περιεκτικότητα σε γουανίνη και κυτοσίνη και είναι μεταγραφικά ενεργές (Jeon et al., 2005; Schubeler et al., 2002; Woodfine et al., 2004). Επιπλέον έχει παρατηρηθεί ότι η μεταγραφή του γονιδιώματος ενεργοποιεί την πυροδότηση παρακείμενων αφετηριών αντιγραφής (Muller et al., 2000). Παρ όλ αυτά δεν έχει αποσαφηνιστεί αν αυτό αποτελεί άμεση επίδραση της διαδικασίας της μεταγραφής ή αν οφείλεται στην διαφορετική και πιο ανοιχτή δομή της χρωματίνης γύρω από την περιοχή του υποκινητή. Η τελευταία υπόθεση συμφωνεί με αρκετές μελέτες που έχουν καταδείξει ότι η δομή της χρωματίνης επηρεάζει την αποτελεσματικότητα με την οποία πυροδοτούνται οι αφετηρίες της αντιγραφής. Στη Drosophila και στο Xenopus έχει δειχθεί ότι η ακετυλίωση των ιστονών επηρεάζει τον καθορισμό των αφετηριών αντιγραφής (Aggarwal and Calvi, 2004; Danis et al., 2004). Στη ζύμη η ενεργότητα των ενζύμων που είναι υπεύθυνα για την ακετυλίωση και την αποακετυλίωση των ιστονών επηρεάζουν το χρόνο πυροδότησης των αφετηριών (Aparicio et al., 2004)

13 1. Εισαγωγή Ο μηχανισμός της επιλογής και της πυροδότησης των αφετηριών της αντιγραφής του DNA ακολουθεί στοχαστικό μοντέλο (Patel et al., 2006). Σε κάθε κυτταρικό κύκλο διαφορετικές αφετηρίες της αντιγραφής ενεργοποιούνται κατά τη διάρκεια της φάσης S. Επιπλέον, ο χρόνος πυροδότησης κάθε αφετηρίας της αντιγραφής δεν είναι συγκεκριμένος αλλά ενδέχεται να διαφέρει από κύτταρο σε κύτταρο. Έχει δειχθεί ότι καθώς εξελίσσεται η φάση S, αυξάνεται η πιθανότητα πυροδότησης ανά αφετηρία που δεν έχει αντιγραφεί (Eshaghi et al., 2007). Η παρατήρηση αυτή έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη του «μοντέλου αυξανόμενης απόδοσης των αφετηριών της αντιγραφής», το οποίο υποστηρίζει ότι καθώς εξελίσσεται η φάση S αυξάνεται η συνολική αποδοτικότητα πυροδότησης των αφετηριών της αντιγραφής που έχουν απομείνει (Hyrien et al., 2003; Lucas et al., 2000). Η ισχύς του μοντέλου αυτού μπορεί να εξηγηθεί με την ύπαρξη κάποιου περιοριστικού παράγοντα που είναι απαραίτητος για την έναρξη της αντιγραφής του DNA. Ο παράγοντας αυτός ενδέχεται να ανακυκλώνεται στις αφετηρίες που πυροδοτούνται στην προχωρημένη φάση S με αποτέλεσμα φαινομενικά να αυξάνεται η αποδοτικότητά τους (Lygeros et al., 2008). Ένας στοχαστικός τρόπος σε σύγκριση με έναν πιο αυστηρά καθορισμένο τρόπο επιλογής και πυροδότησης των αφετηριών της αντιγραφής του DNA ενδέχεται να εξασφαλίζει σταθερότητα (Legouras et al., 2006). Οι αφετηρίες που είναι αδειοδοτημένες ανά πάσα στιγμή είναι πολύ περισσότερες από όσες πρόκειται να ενεργοποιηθούν κατά τη φάση S. Οι αφετηρίες αυτές είναι έτοιμες να πυροδοτηθούν υπό συνθήκες ανάγκης. Για παράδειγμα η εκδήλωση βλάβης το DNA έχει ως αποτέλεσμα την ακινητοποίηση των αντιγραφικών διχάλων και την διακοπή της αντιγραφής του DNA. Στην περίπτωση αυτή η πυροδότηση των γειτονικών ανενεργών αφετηριών συμβάλλει στην πλήρη αντιγραφή του γονιδιώματος (Blow et al., 2011) Οργάνωση της αντιγραφής του DNA στον πυρήνα Η αντιγραφή του DNA πραγματοποιείται σε συγκεκριμένες υποπυρηνικές περιοχές (replication foci). Στις περιοχές αυτές συγκεντρώνονται πρωτεΐνες που συμμετέχουν στην αντιγραφή του DNA όπως είναι οι DNA πολυμεράσες, ο παράγοντας PCNA, λιγάσες και το σύμπλοκο Cdk2-κυκλίνης Α (Frouin et al., 2003; Meister et al., 2005). Στα κύτταρα των θηλαστικών υπολογίζεται ότι η αντιγραφή του DNA πραγματοποιείται σε αντιγραφικές υποπυρηνικές περιοχές, σε κάθε μια από τις οποίες η διαδικασία της αντιγραφής ολοκληρώνεται σε περίπου λεπτά (Berezney, 2002; Berezney et al., 2000). Οι υποπυρηνικές περιοχές στις οποίες συντίθεται το DNA παρουσιάζουν διαφορετικό πρότυπο ενδοκυτταρικού εντοπισμού ανάλογα με το στάδιο της φάσης S που βρίσκονται τα κύτταρα. Στην αρχή της φάσης S τα αντιγραφικά εργοστάσια κατανέμονται σε όλη την έκταση του πυρήνα. Στο μέσο της φάσης αυτής διαπιστώνεται η ύπαρξη μεγαλύτερων υποπυρηνικών περιοχών σύνθεσης του DNA στην περιφέρεια του πυρήνα και περιφερειακά των πυρηνίσκων, ενώ στο τέλος της φάσης S τα αντιγραφικά εργοστάσια είναι σαφώς μεγαλύτερα και λιγότερα (Koberna et al., 2005). Επιπλέον, βάσει του μεγέθους του γονιδιώματος, της διάρκειας της φάσης S και της ταχύτητας προόδου των

14 1. Εισαγωγή αντιγραφικών διχάλων υπολογίζεται ότι κάθε περιοχή σύνθεσης DNA περιλαμβάνει 1Mb DNA, το οποίο είναι οργανωμένο σε 6-12 αντιγραφικές μονάδες (replicons) (Berezney, 2002; Ma et al., 1998). Η ανάπτυξη της λειτουργικής μικροσκοπίας ζωντανών κυττάρων έχει επιτρέψει την παρακολούθηση και εκτίμηση της δυναμικής συμπεριφοράς των υποπυρηνικών περιοχών σύνθεσης του DNA και κατ επέκταση της προόδου της αντιγραφής του DNA στο ενδοκυτταρικό επίπεδο. Έχει δειχθεί ότι οι περιοχές σύνθεσης του DNA δεν διαιρούνται, δεν ενώνονται και δεν κινούνται μέσα στον πυρήνα. Αντιθέτως η ολοκλήρωση της αντιγραφής του DNA μιας περιοχής έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση και εκ νέου δημιουργία μιας γειτονικής περιοχής σύνθεσης. Συνεπώς η αντιγραφή μιας συγκεκριμένης γονιδιωματικής περιοχής διευκολύνει την προσέλκυση αντιγραφικών παραγόντων σε γειτονικές περιοχές. Θεωρείται πιθανό ότι η αντιγραφή του DNA έχει ως αποτέλεσμα την αποσυμπύκνωση της χρωματίνης στην ευρύτερη περιοχή, κατάσταση που ευνοεί την πρόσδεση των παραγόντων της αντιγραφής του DNA. Με βάση αυτή την παρατήρηση έχει προταθεί ότι η αντιγραφή του DNA ακολουθεί ένα μοντέλο ντόμινο (domino model), σύμφωνα με το οποίο η αντιγραφή μια περιοχής του DNA επάγει την έναρξη της αντιγραφής των γειτονικών περιοχών (Chagin et al., 2010). Εικόνα 1.2: Προτεινόμενο μοντέλο-ντόμινο (domino model) για τον τρόπο προόδου της αντιγραφής του DNA κατά μήκος του γονιδιώματος. Η αντιγραφή ξεκινάει στην αρχή της φάσης S από συγκεκριμένες περιοχές του γονιδιώματος (κόκκινες διχάλες). Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση γειτονικών αφετηριών αντιγραφής (μπλε διχάλες), οι οποίες με τη σειρά τους επάγουν την πυροδότηση παρακείμενών τους αφετηριών (πράσινες διχάλες). Με τον τρόπο αυτό εξασφαλίζεται η πλήρης αντιγραφή ολόκληρου του γονιδιώματος (Chagin et al., 2010) Αδειοδότηση των αφετηριών της αντιγραφής του DNA Σημαντικό μηχανισμό ελέγχου του κυτταρικού κύκλου αποτελεί η αδειοδότηση της αντιγραφής του DNA, η οποία λαμβάνει χώρα στο τέλος της μίτωσης και κατά τη φάση G1. Η διαδικασία αυτή περιλαμβάνει τη συγκρότηση των προαντιγραφικών συμπλόκων

15 1. Εισαγωγή (Pre-Replicative complex, Pre-RC) στις αφετηρίες της αντιγραφής. Συγκεκριμένα, αρχικά προσδένεται στις αφετηρίες το σύμπλοκο αναγνώρισης αφετηριών (Origin Recognition Complex, ORC), το οποίο αποτελείται από έξι υπομονάδες (ORC1-6). Η αλληλεπίδραση του συμπλόκου ORC1-6 με τη χρωματίνη επάγει την επακόλουθη δέσμευση της πρωτεΐνης Cdc6 σε αυτό, η οποία ταυτόχρονα δεσμεύει ATP. Ακολουθεί η προσέλκυση του παράγοντα Cdt1 στη χρωματίνη, ο οποίος σε συνεργασία με την πρωτεΐνη Cdc6 στρατολογεί τις πρωτεΐνες MCM2-7 στις αφετηρίες της αντιγραφής. Η υδρόλυση του ATP από την πρωτεΐνη Cdc6 έχει ως αποτέλεσμα τη σύγκλιση του δακτυλίου του εξαμερούς MCM2-7 γύρω από τη χρωματίνη και την ταυτόχρονη απελευθέρωση των παραγόντων Cdt1 και Cdc6 (De Pamphilis 2006). Εικόνα 1.3: Διαδικασία συγκρότησης των προαντιγραφικών συμπλόκων στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA. Στο τέλος της μίτωσης και κατά τη φάση G1 οι πρωτεΐνες Cdt1 και Cdc6 προσδένονται στις αφετηρίες της αντιγραφής, όπου είναι ήδη προσδεδεμένο το σύμπλοκο ORC. Στη συνέχεια οι πρωτεΐνες MCM2-7 προσελκύονται στη χρωματίνη από τις πρωτεΐνες Cdt1 και Cdc6. Η υδρόλυση του ATP από τις πρωτεΐνες ORC και Cdc6 έχει ως αποτέλεσμα την σταθεροποίηση των MCM2-7 στη χρωματίνη και την απελευθέρωση των πρωτεϊνών Cdt1 και Cdc6 (Stephen Bell). Απαραίτητη για τη στρατολόγηση των πρωτεϊνών MCM2-7 στη χρωματίνη είναι η αλληλεπίδρασή τους με τον παράγοντα Cdt1. Ο παράγοντας αυτός έχει δειχθεί in vitro ότι αλληλεπιδρά με διαφορετικές υπομονάδες του συμπλόκου MCM2-7, ενώ στο καρβοξυτελικό του άκρο εντοπίζεται μια συντηρημένη περιοχή μέσω της οποίας προσδένεται στην πρωτεΐνη MCM6 (Cook et al., 2004; Ferenbach et al., 2005; Jee et al.; Lee et al., 2004; Teer and Dutta, 2008; Yanagi et al., 2002). Επιπλέον μελέτη στο Xenopus κατέδειξε τη σημασία της πρωτεΐνης MCM9 στη συγκρότηση του προαντιγραφικού

16 1. Εισαγωγή συμπλόκου. Η πρωτεΐνη αυτή αλληλεπιδρά με τον παράγοντα Cdt1 και επάγει την αλληλεπίδραση μεταξύ αυτού και των πρωτεϊνών MCM2-7 (Lutzmann and Mechali, 2008). Πρόσφατες μελέτες στο S. cerevisiae κατέδειξαν ότι λαμβάνει χώρα ταυτόχρονη πρόσδεση δύο εξαμερών συμπλόκων MCM2-7 στη χρωματίνη. Τα δύο εξαμερή στρατολογούνται σε δίκλωνο DNA με αντίθετη κατεύθυνση το ένα ως προς το άλλο και συνδέονται μέσω των αμινοτελικών δακτυλίων τους (Evrin et al., 2009; Remus et al., 2009). Επιπλέον έχουν διαπιστωθεί από πειράματα in vitro ότι η στρατολόγηση των πρωτεϊνών MCM2-7 στη χρωματίνη πραγματοποιείται σε δύο διακριτά στάδια. Το πρώτο στάδιο περιλαμβάνει τη χαλαρή αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών MCM2-7 με τη χρωματίνη. Στο δεύτερο στάδιο η πρόσδεση του συμπλόκου MCM2-7 στη χρωματίνη σταθεροποιείται. Για τη σταθεροποίηση αυτή είναι απαραίτητη η υδρόλυση του ATP από τους παράγοντες ORC και Cdc6, η οποία έχει ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση των παραγόντων ORC, Cdt1 και Cdc6 από τη χρωματίνη (Edwards et al., 2002; Evrin et al., 2009; Francis et al., 2009; Remus et al., 2009; Tsakraklides and Bell, 2010) Χαρακτηριστικά και ρύθμιση παραγόντων αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA Η σωστή ρύθμιση των παραγόντων αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA είναι απαραίτητη για την εξασφάλιση της χωροχρονικής ακρίβειας της αντιγραφής του γονιδιώματος Το σύμπλοκο ORC Το σύμπλοκο ORC αποτελεί τον πρώτο παράγοντα που προσδένεται στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA κατά τη διαδικασία αδειοδότησης της αντιγραφής. Πρόκειται για ετεροεξαμερές σύμπλοκο συντηρημένο μεταξύ των διαφορετικών οργανισμών που απαρτίζεται από τις υπομονάδες ORC 1-6. Πέντε από τις έξι υπομονάδες (ORC 1-5) ανήκουν στην οικογένεια των AAA+ ATPασών (Duncker et al., 2009). Μελέτη στον S. cerevisiae κατέδειξε ότι η δέσμευση ATP από την υπομονάδα ORC1 είναι απαραίτητη για την πρόσδεση του συμπλόκου ORC στις αφετηρίες της αντιγραφής (Klemm et al., 1997). Επιπλέον έχει δειχθεί ότι η υπομονάδα ORC1 αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη Cdc6 με αποτέλεσμα τη σταθεροποίηση του συμπλόκου στη χρωματίνη (Saha et al., 1998; Semple et al., 2006), ενώ η πρωτεΐνη ORC6 αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη Cdt1 και συμβάλλει στην προσέλκυση των πρωτεϊνών MCM2-7 στις αφετηρίες της αντιγραφής (Chen et al., 2007; Semple et al., 2006). Η ρύθμιση της λειτουργίας του συμπλόκου ORC διαφοροποιείται μεταξύ των οργανισμών. Στον S. cerevisiae και στον S. pombe, οι πρωτεΐνες ORC1-6 παραμένουν προσδεδεμένες στη χρωματίνη καθ όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Παρ όλ αυτά η ενεργότητα των πρωτεϊνών ORC ρυθμίζεται μέσω φωσφορυλίωσής τους από το

17 1. Εισαγωγή σύμπλοκο Cdk1/κυκλίνη B, η οποία έχει ως αποτέλεσμα την αποφυγή επανέναρξης της αντιγραφής του DNA πριν την ολοκλήρωση της μίτωσης (DePamphilis, 2005). Στα μετάζωα η πρόσδεση της πρωτεΐνης ORC1 στη χρωματίνη ρυθμίζεται κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Στη Drosophila, η πρωτεΐνη ORC1 ουβικουιτινυλιώνεται και αποικοδομείται μέσω του APC στο τέλος της μίτωσης και επανασυντίθεται και προσδένεται στη χρωματίνη στο τέλος της φάσης G1 (Araki et al., 2003). Επιπλέον έχει δειχθεί ότι στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά HeLa η πρωτεΐνη ORC1 αποδεσμεύεται από το σύμπλοκο ORC κατά τη διάρκεια της φάσης S και επαναπροσδένεται στη χρωματίνη στο τέλος της μίτωσης (Natale et al., 2000). Έχουν προταθεί δύο μηχανισμοί παρεμπόδισης της πρόσδεσης της υπομονάδας ORC1 στη χρωματίνη στο χρονικό διάστημα από την φάση S έως τo τέλος την μίτωσης. Σύμφωνα με τον πρώτο μηχανισμό η πρωτεΐνη ORC1 ουβικουιτινυλιώνεται και αποικοδομείται μέσω του SCF-Skp2 μονοπατιού κατά την διάρκεια της φάσης S (Mendez et al., 2002; Tatsumi et al., 2003). Ο δεύτερος τρόπος αρνητικής ρύθμισης της ενεργότητας της πρωτεΐνης ORC1 έγκειται στην φωσφορυλίωσή της από το σύμπλοκο Cdk1/κυκλίνη Α κατά τη μετάβαση από την φάση G2 στη μίτωση (Li et al., 2004) Η πρωτεΐνη Cdc6 Η πρωτεΐνη Cdc6 πρωτοανακαλύφθηκε στον S. cerevisiae κατά τη διάρκεια γενετικών ελέγχων για την εύρεση μεταλλάξεων που είναι υπεύθυνες για τη διακοπή του κυτταρικού κύκλου (Hartwell, 1976). Η πρωτεΐνη Cdc6 ανήκει στην οικογένεια των AAA+ ATPασών. Η ενεργότητα ATPάσης του παράγοντα Cdc6 συμβάλλει στην ειδική δέσμευση του συμπλόκου ORC στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA (Mizushima et al., 2000), ενώ παράλληλα είναι απαραίτητη για την πρόσδεση των πρωτεϊνών MCM2-7 στη χρωματίνη (Arias and Walter, 2007; Blow and Dutta, 2005). Η απουσία της πρωτεΐνης Cdc6 στον S. cerevisiae και στον S. pombe αναστέλλει την έναρξη της αντιγραφής του DNA (Nishitani and Lygerou, 2002). Αντίστοιχα, μεταλλάξεις στο γονίδιο cdc6 του ανθρώπου που επηρεάζουν την υδρόλυση του ATP έχουν ως αποτέλεσμα την αδυναμία των κυττάρων να προοδεύσουν στη φάση S (Herbig et al., 1999). Η ρύθμιση της δράσης της πρωτεΐνης Cdc6 έγκειται στην φωσφορυλίωσή της από τις κινάσες Cdk. Στον S. cerevisiae και στον S. pombe η φωσφορυλίωση της Cdc6 αμέσως μετά την συγκρότηση των προαντιγραφικών συμπλόκων έχει ως αποτέλεσμα την ουβικουιτινυλίωσή της και την αποικοδόμησή της μέσω του συστήματος SCF-Skp2 (Borlado and Mendez, 2008). Στα θηλαστικά δεν έχει διευκρινιστεί ο τρόπος με τον οποίο ρυθμίζεται η ενεργότητα της πρωτεΐνης Cdc6. Αρχικές μελέτες κατέδειξαν ότι η εκτοπικά εκφραζόμενη πρωτεΐνη Cdc6 φωσφορυλιώνεται από το σύμπλοκο Cdk2/κυκλίνη Α κατά τη διάρκεια της φάσης S με αποτέλεσμα την έξοδό της από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα (Jiang et al., 1999; Petersen et al., 1999; Saha et al., 1998). Παρ όλ αυτά η ενδογενής πρωτεΐνη Cdc6 δεν εξέρχεται από τον πυρήνα στον ίδιο βαθμό με την εξωγενή, ενώ σημαντικό κλάσμα της πρωτεΐνης παραμένει προσδεδεμένο στη χρωματίνη

18 1. Εισαγωγή καθ όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου (Alexandrow and Hamlin, 2004; Coverley et al., 2000; Fujita et al., 1999; Mendez and Stillman, 2000) Οι πρωτεΐνες MCM2-7 Οι πρωτεΐνες MCM2-7 συγκροτούν ένα εξαμερές σύμπλοκο, το οποίο αποτελεί τον τελευταίο παράγοντα που προσδένεται στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA κατά την συγκρότηση του προαντιγραφικού συμπλόκου. Οι ιδιότητες και τα χαρακτηριστικά των πρωτεϊνών MCM2-7 περιγράφονται στο κεφάλαιο Τα πρωτεϊνικά επίπεδα των πρωτεϊνών MCM2-7 παραμένουν σταθερά καθ όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Η ενεργότητα του συμπλόκου MCM2-7 ρυθμίζεται μέσω φωσφορυλίωσης από τις CDKs. Στον άνθρωπο έχει δειχθεί ότι οι πρωτεΐνες MCM2, MCM3 και MCM4 φωσφορυλιώνονται από τις CDKs. Οι υπερφωσφορυλιωμένες μορφές των συγκεκριμένων πρωτεϊνών δεν παρουσιάζουν ικανότητα πρόσδεσης στη χρωματίνη, γεγονός που καταδεικνύει ότι η φωσφορυλίωσή τους έχει ανασταλτικό αποτέλεσμα (Fujita et al., 1998; Ishimi et al., 2000). Στον S. cerevisiae, η φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών MCM2-7 από τις CDKs κατά τη φάση S οδηγεί στην έξοδο των πρωτεϊνών αυτών από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα (Labib et al., 1999; Nguyen et al., 2000) Η πρωτεΐνη Cdt1 Η πρωτεΐνη Cdt1 ταυτοποιήθηκε για πρώτη φορά στον S. pombe κατά τη διάρκεια γενετικών ελέγχων για τον προσδιορισμό γονιδίων των οποίων η έκφραση ρυθμίζεται από τον μεταγραφικό παράγοντα Cdc10 (Hofmann and Beach, 1994). Η πρόσδεση της πρωτεΐνης Cdt1 στη χρωματίνη εξαρτάται από το σύμπλοκο ORC (Maiorano et al., 2000). Έχει δειχθεί ότι η πρωτεΐνη Cdt1 σε συνεργασία με την πρωτεΐνη Cdc6 είναι απαραίτητες για την συγκρότηση του προαντιγραφικού συμπλόκου στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA (Nishitani et al., 2000). Επιπλέον, άμεση αλληλεπίδραση του παράγοντα Cdt1 με το σύμπλοκο MCM2-7 έχει δειχθεί από διαφορετικές ερευνητικές ομάδες (Ferenbach et al., 2005; Jee et al., 2010; Teer and Dutta, 2008; Yanagi et al., 2002). Πρόσφατη μελέτη κατέδειξε ότι ο παράγοντας Cdt1 συμμετέχει, εκτός από την αδειοδότηση της αντιγραφής του DNA, στην ενεργοποίηση του συμπλόκου MCM2-7 κατά τη μετάβαση από τη φάση G1 στη φάση S αλληλεπιδρώντας με την υπομονάδα Dbf4 του συμπλόκου Cdc7-Dbf4 και προσελκύοντας με αυτό τον τρόπο την πρωτεΐνη Cdc45 στη χρωματίνη (Ballabeni et al., 2009). Επίσης πειράματα in vitro προτείνουν ότι ο παράγοντας Cdt1 συμβάλλει στην επαγωγή της ενεργότητας ελικάσης του συμπλόκου MCM2-7 (You and Masai, 2008). Η πρωτεΐνη Cdt1 υφίσταται αυστηρή ρύθμιση έτσι ώστε να αποτρέπεται η δράση της κατά τις φάσεις S και G2. Στον S. cerevisiae η αναστολή της πρωτεΐνης Cdt1 επιτυγχάνεται μέσω φωσφορυλίωσής της από τις Cdks και επακόλουθη έξοδό της από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα μαζί με τις πρωτεΐνες MCM2-7 (Arias and Walter, 2007; Nguyen et al., 2000; Nguyen et al., 2001). Στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς

19 1. Εισαγωγή τα επίπεδα της πρωτεΐνης Cdt1 υφίστανται αρνητική ρύθμιση κατά τις φάσεις S και G2 μέσω πρωτεόλυσης. Έχουν ταυτοποιηθεί δύο διαφορετικά μοριακά μονοπάτια μέσω των οποίων επιτελείται η αποικοδόμηση της πρωτεΐνης Cdt1 από δύο Ε3 λιγάσες της ουβικουιτίνης. Σύμφωνα με το πρώτο μονοπάτι η φωσφορυλίωση της θρεονίνης Th-29 του παράγοντα Cdt1 από τα σύμπλοκα CDK-κυκλίνης Α/Ε έχει ως αποτέλεσμα την προσέλκυση του συμπλόκου SCF-Skp2 και την επακόλουθη αποικοδόμηση της πρωτεΐνης Cdt1 (Li et al., 2003b; Nishitani et al., 2006; Sugimoto et al., 2004). Στο δεύτερο μοριακό μονοπάτι που είναι υπεύθυνο για την πρωτεόλυση του παράγοντα Cdt1 συμμετέχει το σύμπλοκο Cul4-DDB1-Cdt2. Στην περίπτωση αυτή, η αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης PCNA με τον παράγοντα Cdt1 επάγει την προσέλκυση του συμπλόκου Cul4-DDB1-Cdt2 και την πρωτεόλυση της πρωτεΐνης Cdt1 (Arias and Walter, 2006; Higa et al., 2006; Hu and Xiong, 2006; Nishitani et al., 2006; Senga et al., 2006). Τα δύο αυτά μονοπάτια αποικοδόμησης της πρωτεΐνης Cdt1 δρουν ανεξάρτητα και έχει προταθεί ότι η ενεργότητα του συμπλόκου Cul4-DDB1-Cdt2 λαμβάνει χώρα αποκλειστικά κατά τη φάση S ενώ το σύμπλοκο SCF-Skp2 δρα τόσο κατά την S όσο και κατά τη φάση G2 (Nishitani et al., 2006). Πρόσφατη μελέτη κατέδειξε την ύπαρξη και τρίτου μοριακού μηχανισμού αποικόδομησης της πρωτεΐνης Cdt1 ο οποίος διαμεσολαβείται από το σύμπλοκο APC/C Cdh1 (Sugimoto et al., 2008). Επιπλέον στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς ο παράγοντας Cdt1 υφίσταται αρνητική ρύθμιση μέσω της αλληλεπίδρασής του με την πρωτεΐνη Geminin. Εικόνα 1.4: Η αποικοδόμηση του παράγοντα Cdt1 εξασφαλίζεται μέσω δύο διαφορετικών μοριακών μονοπατιών (Α, Β). Στο πρώτο μοριακό μονοπάτι, ο παράγοντας Cdt1 στοχεύεται για πρωτεόλυση ύστερα από την πρόσδεση της πρωτεΐνης PCNA σε αυτόν, η οποία προσελκύει το σύμπλοκο Cul4-DDB1-Cdt2 (Α). Στη δεύτερη περίπτωση, η φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης Cdt1 από τις κινάσες CDK συμβάλλει στην προσέλκυση του συμπλόκου SCF-Skp2 με αποτέλεσμα την αποικοδόμησή της (Kim and Kipreos, 2007) Η πρωτεΐνη Geminin κατέχει διττό ρόλο: ρυθμίζει τον κυτταρικό κύκλο και τη νευρονική διαφοροποίηση Η πρωτεΐνη Geminin ταυτοποιήθηκε για πρώτη φορά στο Xenopus ως μοριακός στόχος του συμπλόκου APC (McGarry and Kirschner, 1998). Πρόκειται για συντηρημένο μόριο που εκφράζεται μόνο στα μετάζωα. Ορθόλογα της πρωτεΐνης Geminin έχουν

20 1. Εισαγωγή ταυτοποιηθεί στον ποντικό (McGarry and Kirschner, 1998), στη Drosophila (Quinn et al., 2001), στο κοτόπουλο (Luo et al., 2007) και στο Ceanorhabditis elegans (Yanagi et al., 2005). Χαρακτηριστική δομή της πρωτεΐνης Geminin αποτελεί μια κεντρική περιοχή σπειροειδούς σπειράματος (coiled-coil), η οποία είναι υπεύθυνη αφενός για την αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης με τον παράγοντα Cdt1 και αφετέρου για τον ομοδιμερισμό του μορίου (Saxena et al., 2004). Η πρωτεΐνη Geminin εκφράζεται κατά τις φάσεις S, G2 και Μ του κυτταρικού κύκλου, ενώ δεν ανιχνεύονται επίπεδα έκφρασής της κατά τη φάση G1. Κατά τη μίτωση και συγκεκριμένα κατά τη μετάβαση από τη μετάφαση στην ανάφαση, η πρωτεΐνη Geminin αποικοδομείται μέσω του συστήματος προώθησης της ανάφασης - κυκλόσωμα (Anaphase Promoting Complex - Cyclosome, APC/C). Το APC αναγνωρίζει ένα συγκεκριμένο μοτίβο 9 αμινοξέων στο αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης Geminin (destruction box), με αποτέλεσμα την ουβικουϊτινυλίωση και πρωτεόλυσή της (McGarry and Kirschner, 1998). Εκτός από την πρωτεόλυση μέσω του APC, έχουν διαπιστωθεί δύο επιπλέον μηχανισμοί αρνητικής ρύθμισης της πρωτεΐνης Geminin στο Xenopus (Hodgson et al., 2002; Li and Blow, 2004). Συγκεκριμένα έχει δειχθεί ότι ένα ποσοστό της ενδογενούς Geminin δεν πρωτεολύεται κατά τη μετάφαση και παραμένει σταθερό κατά τη φάση G1. Παρ όλ αυτά η Geminin δεν είναι ενεργή και αδυνατεί να αλληλεπιδράσει με τον παράγοντα Cdt1. Η εκ νέου επανενεργοποίησή της επιτυγχάνεται ύστερα από μετακίνησή της στον πυρήνα (Hodgson et al., 2002). Επιπλέον έχει δειχθεί ότι η πρωτεΐνη Geminin απενεργοποιείται κατά το τέλος της μίτωσης μέσω πολυουβικουιτινυλίωσης από το σύμπλοκο APC, η οποία εξαρτάται από την ενεργότητα των κινασών CDK αλλά δεν ακολουθείται από πρωτεόλυση (Li and Blow, 2004). Η πρωτεΐνη Geminin αποτελεί αρνητικό ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου. Η δράση της έγκειται στην αλληλεπίδρασή της με τον παράγοντα αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA Cdt1, η οποία έχει ως αποτέλεσμα την παρεμπόδιση της στρατολόγησης των πρωτεϊνών MCΜ2-7 στη χρωματίνη και συνεπώς την αναστολή της συγκρότησης των προαντιγραφικών συμπλοκών (Tada et al., 2001; Wohlschlegel et al., 2000). Μελέτη στο Xenopus κατέδειξε ότι η μετακίνηση της πρωτεΐνης Geminin στον πυρήνα στο τέλος της φάσης G1 είναι απαραίτητη για την πρόσδεσή της στον παράγοντα Cdt1 (Hodgson et al., 2002). Η ανάλυση της κρυσταλλικής δομής του συμπλόκου Cdt1- Geminin αποκάλυψε την ύπαρξη δύο περιοχών στο μόριο της Geminin μέσω των οποίων επιτελείται η αλληλεπίδραση με τον παράγοντα Cdt1. Η πρώτη περιοχή, η οποία είναι και η πιο σημαντική, αφορά τα αμινοξέα της Geminin του ποντικού που αντιστοιχούν στο αμινοτελικό άκρο του σπειροειδούς σπειράματος ενώ η δεύτερη περιοχή αφορά δέκα αμινοξέα που εντοπίζονται ακριβώς αμινοτελικά του σπειροειδούς σπειράματος (Lee et al., 2004). Παρά την αποδεδειγμένη αρνητική δράση της πρωτεΐνης Geminin στη ρύθμιση της αντιγραφής του DNA, αρκετές μελέτες υποστηρίζουν ένα θετικό ρόλο του παράγοντα αυτού ως προς την αδειοδότηση της αντιγραφής του DNA και την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου. Καταρχάς, μελέτη σε ανθρώπινα κύτταρα αποκάλυψε ότι η πρωτεΐνη Geminin προσδένεται στον παράγοντα Cdt1 κατά τη μίτωση. Η αλληλεπίδραση αυτή έχει ως αποτέλεσμα την προστασία του παράγοντα Cdt1, καθώς δεν δύναται να πρωτεολυθεί, και συνεπώς τη σταθεροποίηση των επιπέδων του, που είναι απαραίτητα για την αδειοδότηση

21 1. Εισαγωγή των αφετηριών της αντιγραφής του DNA κατά τον επόμενο κυτταρικό κύκλο (Ballabeni et al., 2004). Επιπλέον, έχει δειχθεί στο Xenopus ότι η πρωτεΐνη Geminin δεν αναστέλλει απαραίτητα την αδειοδότηση της αντιγραφής του DNA. Συγκεκριμένα αποκαλύφθηκε ότι το σύμπλοκο Cdt1-Geminin δύναται να αδειοδοτήσει τις αφετηρίες της αντιγραφής στρατολογώντας τις πρωτεΐνες MCM2-7 στη χρωματίνη. Καθοριστική για τη δυνατότητα ή μη αδειοδότησης των αφετηριών της αντιγραφής του DNA από το σύμπλοκο Cdt1- Geminin φαίνεται ότι είναι η στοιχειομετρία των δύο πρωτεϊνών του συμπλόκου, καθώς διαπιστώθηκε ότι η προσθήκη περίσσειας Geminin έχει ως αποτέλεσμα την αδυναμία στρατολόγησης των πρωτεϊνών MCM2-7 στη χρωματίνη (Lutzmann et al., 2006). Σε συμφωνία με το μοντέλο αυτό πρόσφατη μελέτη της κρυσταλλικής δομής του συμπλόκου Cdt1-Geminin αποκάλυψε την ύπαρξη δύο διαφορετικών συμπλόκων των δύο πρωτεϊνών. Συγκεκριμένα οι πρωτεΐνες Cdt1 και Geminin συγκροτούν είτε ετεροτριμερές είτε ετεροεξαμερές σύμπλοκο. Το τριμερές σύμπλοκο επιτρέπει την αδειοδότηση των αφετηριών της αντιγραφής του DNA. Αντίθετα το ετεροεξαμερές εμφανίζει ανασταλτική δράση καθώς στη διαμόρφωση αυτή καλύπτεται η περιοχή του παράγοντα Cdt1 που είναι υπεύθυνη για την στρατολόγηση ων πρωτεϊνών MCM2-7 στη χρωματίνη. Συνεπώς προτείνεται ότι η ισορροπία μεταξύ των δύο διαφορετικών συμπλόκων Cdt1-Geminin καθορίζει τη δυνατότητα ή μη αδειοδότησης των αφετηριών της αντιγραφής του DNA (De Marco et al., 2009). Εικόνα 1.5: Προτεινόμενο μοντέλο δράσης του συμπλόκου Cdt1-Geminin κατά την αδειοδότηση των αφετηριών της αντιγραφής του DNA. Οι πρωτεΐνες Cdt1 και Geminin συγκροτούν είτε ετεροτριμερές σύμπλοκο, το οποίο επιτρέπει τη στρατολόγηση των πρωτεϊνών MCΜ2-7 στη χρωματίνη, είτε ετεροεξαμερές σύμπλοκο, το οποίο δρα ανασταλτικά ως προς την αδειοδότηση των αφετηριών της αντιγραφής του DNA (De Marco et al., 2009). Εκτός από τη δράση της ως ρυθμιστής της έναρξης της αντιγραφής του DNA, η πρωτεΐνη Geminin συμμετέχει στη ρύθμιση της ανάπτυξης του νευρικού συστήματος κατά την εμβρυονική ανάπτυξη. Καταρχάς, μελέτες στο Xenopus και στη Drosophila έχουν καταδείξει ότι η εκτοπική έκφραση της πρωτεΐνης Geminin έχει ως αποτέλεσμα την επαγωγή της νευρικής διαφοροποίησης των κυττάρων (Kroll et al., 1998; Quinn et al., 2001). Επίσης η αποσιώπηση της έκφρασης της Geminin στον εγκέφαλο εμβρύων ποντικού είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση του πληθυσμού των πρόγονων νευρικών κυττάρων στην κοιλιακή και υποκοιλιακή ζώνη του αναπτυσσόμενου εγκεφαλικού φλοιού. Τα κύτταρα αυτά αδυνατούν να διαφοροποιηθούν προς ώριμους νευρώνες. Οι παρατηρήσεις αυτές καταδεικνύουν τη σημασία της πρωτεΐνης Geminin στη ρύθμιση της

22 1. Εισαγωγή ανάπτυξης του εγκεφαλικού φλοιού (Spella et al., 2011). Επιπλέον, έχει δειχθεί ότι η πρωτεΐνη Geminin αλληλεπιδρά με τις καταλυτικές υπομονάδες Brg1 και Brm του συμπλόκου αναδιοργάνωσης της χρωματίνης SWI/SNF. Ο παράγοντας Brg1 αλληλεπιδρά με μεταγραφικούς παράγοντες όπως είναι οι Neurogenin και NeuroD, οι οποίοι επάγουν την έκφραση γονιδίων που ελέγχουν τη νευρική διαφοροποίηση των κυττάρων. Η πρόσδεση της πρωτεΐνης Geminin στον παράγοντα Brg1 παρεμποδίζει την αλληλεπίδρασή του με τους μεταγραφικούς παράγοντες στόχους του, αναστέλλοντας τη νευρογένεση (Seo et al., 2005b). Παράλληλα, μελέτη στο Medaka έχει καταδείξει την αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης Geminin με τον μεταγραφικό παράγοντα Six3, ο οποίος ελέγχει την ανάπτυξη του αμφιβληστροειδούς (Del Bene et al., 2004). Επιπλέον η πρωτεΐνη Geminin προσδένεται σε μέλη της οικογένειας των μεταγραφικών παραγόντων Hox, οι οποίοι καθορίζουν την ανάπτυξη του προσθιο-οπίσθιου άξονα κατά την εμβρυονική ανάπτυξη (Luo and Kessel, 2004). Έχει προταθεί ότι οι παράγοντες Hox/Six3 ανταγωνίζονται την πρωτεΐνη Cdt1 ως προς την πρόσδεσή τους στην πρωτεΐνη Geminin. Ο ανταγωνισμός αυτός θεωρείται ότι δρα ως μοριακός διακόπτης για τη διατήρηση της ισορροπίας μεταξύ των διαδικασιών του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της κυτταρικής διαφοροποίησης κατά την εμβρυονική ανάπτυξη. Η πρωτεΐνη Geminin δύναται να ελέγχει την ενεργότητα των πρωτεϊνών Hox με έμμεσο τρόπο, ρυθμίζοντας αρνητικά τη μεταγραφή τους. Η ρύθμιση αυτή επιτυγχάνεται μέσω της αλληλεπίδρασης της πρωτεΐνης Geminin με το σύμπλοκο αναδιοργάνωσης της χρωματίνης Polycomb και συγκεκριμένα με την υπομονάδα Scmh1 του συμπλόκου αυτού (Kroll, 2007; Seo and Kroll, 2006). Εικόνα 1.6: Η απόφαση του κυττάρου σχετικά με το αν θα πολλαπλασιαστεί ή αν θα οδηγηθεί προς διαφοροποίηση καθορίζεται από την αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης Geminin με τους παράγοντες Cdt1, SWI/SNF και Polycomb. Η πρόσδεση της πρωτεΐνης Geminin στον παράγοντα Cdt1 έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή της αντιγραφής του DNA. Η αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης Geminin με τον παράγοντα Brg1, ο οποίος αποτελεί την καταλυτική υπομονάδα του συμπλόκου SWI/SNF, έχει ως αποτέλεσμα τη διατήρηση των πρόδρομων νευρικών κυττάρων σε αδιαφοροποίητη κατάσταση. Τέλος, η αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης Geminin με το σύμπλοκο αναδιοργάνωσης της χρωματίνης Polycomb ελέγχει την έκφραση των πρωτεϊνών Hox κατά την εμβρυονική ανάπτυξη (Karamitros et al., 2010)

23 1. Εισαγωγή Η υπεροικογένεια των πρωτεϊνών MCM Στην υπεροικογένεια των πρωτεϊνών MCM εντάσσονται έξι πρωτεΐνες (MCM2- MCM7) σημαντικά συντηρημένες σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Τα γονίδια των MCM πρωτεϊνών αρχικά ταυτοποιήθηκαν και απομονώθηκαν από τον ζυμομύκητα S. cerevisiae κατά τη διάρκεια γενετικών ελέγχων για τον προσδιορισμό μεταλλαγμένων γονιδίων που ευθύνονται για την αδυναμία διατήρησης των μινιχρωμοσωμάτων (Minichromosome Maintainance) (Maine et al., 1984; Sinha et al., 1986). Βιοχημικός και γενετικός χαρακτηρισμός των πρωτεϊνών MCM2-7 υποστηρίζουν τη συμμετοχή τους στην αντιγραφή του DNA αποδίδοντάς τους ρόλο αντιγραφικών ελικασών. Εκτός από τις MCM2-7 έχουν ταυτοποιηθεί επιπλέον πρωτεΐνες MCM, όπως είναι οι πρωτεΐνες MCM8, MCM9, MCM10 και MCM1. Σημαντική ομολογία ως προς την αλληλουχία τους παρουσιάζουν οι πρωτεΐνες MCM8 και MCM9 με τις πρωτεΐνες MCM2-7. Η πρωτεΐνη MCM8 έχει ταυτοποιηθεί στον άνθρωπο, στο Xenopus και στη Drosophila (Blanton et al., 2005; Crevel et al., 2007; Gozuacik et al., 2003; Kinoshita et al., 2008; Maiorano et al., 2005; Volkening and Hoffmann, 2005). Αν και ο αρχικός χαρακτηρισμός του μορίου στον άνθρωπο και στο Xenopus είχε προτείνει ότι η πρωτεΐνη MCM8 απαιτείται για την πρόοδο της αντιγραφής του DNA μετά την έναρξή της (Maiorano et al., 2005), πρόσφατες μελέτες σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καταδεικνύουν την αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης MCM8 με την πρωτεΐνη Cdc6 και προτείνουν τη συμμετοχή του μορίου MCM8 στη συγκρότηση του προαντιγραφικού συμπλόκου (Kinoshita et al., 2008; Volkening and Hoffmann, 2005). Επιπλέον έχει δειχθεί ότι η πρωτεΐνη MCM8 διαθέτει ενεργότητα ελικάσης in vitro ανεξάρτητα από το σύμπλοκο MCM2-7. Η πρωτεΐνη MCM9 έχει ταυτοποιηθεί στον άνθρωπο, στο Xenopus και στον ποντικό (Lutzmann et al., 2005; Yoshida, 2005). Ο λειτουργικός χαρακτηρισμός της πρωτεΐνης MCM9 στο Xenopus κατέδειξε ότι αλληλεπιδρά με τον παράγοντα Cdt1 και ότι απαιτείται για τη στρατολόγηση των πρωτεϊνών MCM2-7 στη χρωματίνη, παρατήρηση που της αποδίδει ρόλο στη συγκρότηση του προαντιγραφικού συμπλόκου (Lutzmann and Mechali, 2008). Παρ όλ αυτά πρόσφατη μελέτη στον ποντικό υποστηρίζει ότι η απουσία της πρωτεΐνης MCM9 καθιστά ευάλωτα τα κύτταρα στο αντιγραφικό στρες, προδιαθέτοντας για κακοήθη εξαλλαγή, ενώ δεν εμπλέκεται στην αδειοδότηση της αντιγραφής του DNA (Hartford et al., 2011). Η πρωτεΐνη MCM10 απαιτείται για την έναρξη και την πρόοδο της αντιγραφής του DNA. Συγκεκριμένα, συμβάλλει στην ενεργοποίηση του συμπλόκου Cdc45-GINS-MCM2-7 και στην προσέλκυση της DNA πολυμεράσης α στις αντιγραφικές διχάλες, στην αρχή της φάσης S (Gregan et al., 2003; Ricke and Bielinsky, 2004; Sawyer et al., 2004; van Deursen et al., 2012; Watase et al., 2012; Wohlschlegel et al., 2002). Η πρωτεΐνη MCM1 αποτελεί μεταγραφικό παράγοντα, ο οποίος εμπλέκεται έμμεσα στην αντιγραφή του DNA ελέγχοντας την έκφραση παραγόντων που είναι απαραίτητοι γι αυτή (Tye, 1999)

24 1. Εισαγωγή Δομικά χαρακτηριστικά των πρωτεϊνών MCM2-7 Οι πρωτεΐνες MCM2-7 ανήκουν στην οικογένεια των ΑΑΑ + ATPασών. Κάθε μια από τις πρωτεΐνες συνιστά ξεχωριστή οικογένεια, με ορθόλογα σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Παρ όλ αυτά και οι έξι πρωτεΐνες διαθέτουν ένα κοινό και συντηρημένο δομικό χαρακτηριστικό στοιχείο, το οποίο εντοπίζεται προς το καρβοξυτελικό άκρο των μορίων και καλείται «MCM κουτί» (MCM box). Η περιοχή αυτή, η οποία καλύπτει περίπου 200 αμινοξέα, κωδικοποιεί το ενεργό κέντρο του ενζύμου ATPάσης και απαρτίζεται από τρεις διαφορετικές υποπεριοχές: το μοτίβο Walker A, το οποίο περιλαμβάνει την P-θηλιά (P-loop) του ενεργού κέντρου, το μοτίβο Walker B, το οποίο συμβάλλει στην υδρόλυση του ATP και αποτελεί τμήμα της αλληλουχίας IDEFDKM που είναι συντηρημένη σε όλες τις πρωτεΐνες MCM και καθορίζει τη συγκεκριμένη οικογένεια, καθώς και από το μοτίβο SRFD, το οποίο εντοπίζεται 70 αμινοξέα καρβοξυτελικά του Walker B και καθορίζει τη δομή δακτύλου αργινίνης (arginine finger), μέσω του οποίου επιτυγχάνεται η συγκρότηση των συμπλόκων. Τα ενεργά κέντρα του εξαμερούς των πρωτεϊνών MCM2-7 εντοπίζονται στη διεπιφάνεια αλληλεπίδρασης δύο διαδοχικών υπομονάδων κατά τέτοιο τρόπο, ώστε η μια υπομονάδα να παρέχει την P-θηλιά και η άλλη τον δάκτυλο αργινίνης (Forsburg, 2004). Εκτός από το «MCM κουτί», όλες οι πρωτεΐνες MCM φέρουν μοτίβα δακτύλου ψευδαργύρου (zinc binding motifs) προς το αμινοτελικό τους άκρο, τα οποία είναι απαραίτητα για την επιβίωση και θεωρείται ότι συμβάλλουν στη σταθεροποίηση της δομής του αμινοτελικού άκρου των πρωτεϊνών και κατ επέκταση στη συγκρότηση των πρωτεϊνικών συμπλόκων και στην ενεργότητα ATPάσης των μορίων. Επιπλέον, μόνο οι πρωτεΐνες MCM2 και MCM3 διαθέτουν σήμα πυρηνικού εντοπισμού (Nuclear Localization Signal, NLS) και συνεπώς θεωρείται ότι είναι υπεύθυνες για την είσοδο του εξαμερούς MCM2-7 στον πυρήνα. Η πρωτεΐνη MCM2 διαθέτει στο αμινοτελικό της άκρο αλληλουχία πολλών καταλοίπων σερίνης, ενώ η πρωτεΐνη MCM4 φέρει αλληλουχία αναγνώρισης και φωσφορυλίωσης από τις πρωτεΐνες CDK (Costa and Onesti, 2008; Forsburg, 2004). Εικόνα 1.7: Δομικά χαρακτηριστικά της οικογένειας των πρωτεϊνών MCM. Όλες οι πρωτεΐνες MCM διαθέτουν μια συντηρημένη αλληλουχία που καλείται «MCM κουτί» και περιλαμβάνει τα μοτίβα Walker A και Walker B καθώς και μια αλληλουχία που καθορίζει τη δομή δακτύλου αργινίνης (R finger) (Forsburg, 2004)

25 1. Εισαγωγή Συγκρότηση συμπλόκων των πρωτεϊνών MCM2-7 Μελέτες στη ζύμη αλλά και στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς έχουν καταδείξει τη δυνατότητα αλληλεπίδρασης και το σχηματισμό συμπλόκων από τις πρωτεΐνες MCM2-7. Παρ όλο που ως βασικό σύμπλοκο in vivo έχει δειχθεί το εξαμερές MCM2-7, θεωρείται πολύ πιθανή η ύπαρξη και ελεύθερων μονομερών ή μικρότερων υποσυμπλόκων των πρωτεϊνών MCM2-7 μέσα στο κύτταρο. Η ανάλυση της λειτουργικής επίπτωσης μεταλλαγμάτων των MCM2-7 πρωτεϊνών στη ζύμη έχει προτείνει ότι η συγκρότηση του εξαμερούς MCM2-7 αποτελεί αναγκαία αλλά όχι ικανή συνθήκη για την εκδήλωση της λειτουργίας του συμπλόκου και την επιβίωση των κυττάρων (Gomez et al., 2002; Lei et al., 2002; Schwacha and Bell, 2001; Sherman et al., 1998). Επιπλέον, πειράματα στον S. pombe στα οποία χρησιμοποιήθηκαν μεταλλάγματα της πρωτεΐνης MCM2 έχουν προτείνει ότι η συγκρότηση του συμπλόκου των πρωτεϊνών MCM πραγματοποιείται στο κυτταρόπλασμα και πως αυτό είναι απαραίτητο για τον εντοπισμό του εξαμερούς στον πυρήνα καθώς και για τη διατήρησή του μέσα σε αυτόν (Pasion and Forsburg, 1999). Η παρατήρηση αυτή συμφωνεί με την ύπαρξη σήματος ενδοκυτταρικού εντοπισμού (NLS) μόνο στις πρωτεΐνες MCM2 και MCM3, γεγονός που τις καθιστά υπεύθυνες για τον εντοπισμό του εξαμερούς MCM2-7 στον πυρήνα. Μελέτες στη ζύμη, στον ποντικό και στο Xenopus έχουν καταδείξει διαφορετική συγγένεια αλληλεπίδρασης μεταξύ των διαφορετικών υπομονάδων του εξαμερούς MCM2-7 (Coue et al., 1998; Davey et al., 2003; Holthoff et al., 1998; Ishimi et al., 1996; Lee and Hurwitz, 2000; Lei et al., 1996; Musahl et al., 1995; Prokhorova and Blow, 2000; Schwacha and Bell, 2001; Sherman et al., 1998). Οι πρωτεΐνες MCM4, MCM6 και MCM7 αλληλεπιδρούν ισχυρά μεταξύ τους σχηματίζοντας τριμερές (MCM4,6,7). Η πρωτεΐνη MCM2 προσδένεται στο τριμερές MCM4,6,7 με μικρότερη συγγένεια αλληλεπίδρασης, ενώ το διμερές MCM3,5 αλληλεπιδρά και δεσμεύεται στις υπόλοιπες MCM με ακόμη χαμηλότερη συγγένεια αλληλεπίδρασης. In vitro μελέτες έχουν δείξει ότι απουσία των υπόλοιπων πρωτεϊνών MCM, το υποσύμπλοκο MCM4,6,7 διμερίζεται με αποτέλεσμα να προκύπτει το σύμπλοκο (MCM4,6,7) 2, το οποίο έχει ενεργότητα ελικάσης (Ishimi, 1997; Lee and Hurwitz, 2000; Prokhorova and Blow, 2000) Οι πρωτεΐνες MCM2-7 θεωρούνται οι αντιγραφικές ελικάσες του DNA Την τελευταία δεκαετία υπάρχουν αρκετά πειραματικά δεδομένα που υποδεικνύουν έμμεσα πως οι πρωτεΐνες MCΜ2-7 αποτελούν τις αντιγραφικές ελικάσες των ευκαρυωτικών οργανισμών. Καταρχάς, οι πρωτεΐνες MCM2-7 διαθέτουν δομικά χαρακτηριστικά παρόμοια με άλλες αντιγραφικές ελικάσες του DNA: κάθε πρωτεΐνη MCM φέρει μοτίβο AAA+ ATPάσης (Koonin, 1993; Neuwald et al., 1999; Tye and Sawyer, 2000), ενώ η ανάλυση του εξαμερούς με ηλεκτρονική μικροσκοπία αποκάλυψε τη διαμόρφωσή του σε δομή δακτυλίου (Adachi et al., 1997; Bochman and Schwacha, 2007; Sato et al., 2000). Επιπλέον, παρ όλο που δεν έχει δειχθεί ενεργότητα ελικάσης του ολοενζύμου MCM2-7, βιοχημικές μελέτες έχουν δείξει ότι το υποσύμπλοκο MCM4/6/7-25 -

26 1. Εισαγωγή που απομονώθηκε από την ανθρώπινη κυτταρική σειρά HeLa διαθέτει ενεργότητα ελικάσης in vitrο (Ishimi, 1997). Η παρατήρηση αυτή επιβεβαιώθηκε και σε μεταγενέστερες μελέτες στις οποίες χρησιμοποιήθηκαν ανασυνδυασμένα υποσύμπλοκα MCM4/6/7 του ποντικού, του S. cerevisiae του S. pombe και του Xenopus (Kaplan et al., 2003; Lee and Hurwitz, 2000; Schwacha and Bell, 2001; Ying and Gautier, 2005; You et al., 2002). Η προσθήκη είτε της πρωτεΐνης MCM2 είτε του διμερούς MCM3/5 στο υποσύμπλοκο MCM4/6/7 έχει ως αποτέλεσμα την αδρανοποίησή του και την απώλεια της ενεργότητάς του ως ελικάσης (Sato et al., 2000). Για να εξηγηθεί η παρατήρηση αυτή προτάθηκε ένα μοντέλο βάσει του οποίου το υποσύμπλοκο MCM4/6/7 αποτελεί το καταλυτικό τμήμα του εξαμερούς MCM2-7, ενώ το τριμερές MCM2/3/5 δρα ως αρνητικός ρυθμιστής της ενεργότητας ελικάσης (Schwacha and Bell, 2001). Παρ όλ αυτά δεν έχει δειχθεί η ύπαρξη του υποσυμπλόκου MCM4,6,7 in vivo. Επίσης, πειράματα στα οποία χρησιμοποιήθηκαν degron μεταλλάγματα των πρωτεϊνών MCM του S. cerevisiae έδειξαν ότι και οι έξι πρωτεΐνες MCM2-7 είναι απαραίτητες τόσο για την έναρξη όσο και για την πρόοδο της αντιγραφής του DNA, παρατήρηση που πιθανώς υποδηλώνει την παραμονή ολόκληρου του εξαμερούς στις αντιγραφικές διχάλες μέχρι τον τερματισμό της διαδικασίας της αντιγραφής (Labib et al., 2000). Παρομοίως, στο Xenopus η αδρανοποίηση του εξαμερούς MCM2-7 σε οποιοδήποτε χρονικό σημείο μετά την έναρξη της αντιγραφής έχει ως αποτέλεσμα τη διακοπή της αντιγραφής του DNA και την αναστολή της αποδιάταξης του DNA στις αντιγραφικές διχάλες (Pacek and Walter, 2004; Shechter et al., 2004). Μέχρι σήμερα, τα μόνα δεδομένα που θέτουν υπό μερική αμφισβήτηση την υπόθεση ότι οι πρωτεΐνες MCM2-7 αποτελούν τις αντιγραφικές ελικάσες των ευκαρυωτικών οργανισμών προέρχονται από πειράματα ανοσοφθορισμού σε κύτταρα θηλαστικών και σε εκχυλίσματα ωοκυττάρων του Xenopus στα οποία δεν διαπιστώνεται συνεντοπισμός του εξαμερούς MCM2-7 και των περιοχών σύνθεσης του DNA (Dimitrova et al., 1999; Krude et al., 1996; Romanowski et al., 1996; Todorov et al., 1995). Επιπλέον, έχει δειχθεί ότι ο αριθμός των συμπλόκων MCM2-7 που δεσμεύονται στη χρωματίνη είναι πολύ μεγαλύτερος του αριθμού των ενεργών αφετηριών της αντιγραφής του DNA. Συγκεκριμένα, υπολογίζεται ότι στο Xenopus αναλογούν περίπου εξαμερή MCM2-7 ανά αφετηρία αντιγραφής (Mahbubani et al., 1997; Walter and Newport, 1997), ενώ αντιστοίχως υψηλή προσδιορίζεται η αναλογία στο S. cerevisiae και στον άνθρωπο (Bowers et al., 2004; Burkhart et al., 1995; Donovan et al., 1997; Kimura et al., 1994; Lei et al., 1996; Richter and Knippers, 1997). Τα πειραματικά αυτά δεδομένα συνιστούν το «παράδοξο των MCM πρωτεϊνών» (MCM paradox). Υπάρχουν διάφορες υποθέσεις και θεωρίες που προσπαθούν να εξηγήσουν το παράδοξο των πρωτεϊνών MCM. Όσον αφορά τον μη συνεντοπισμό των πρωτεϊνών MCM2-7 με τις αντιγραφικές μηχανές του DNA, ένα μοντέλο που έχει προταθεί και μπορεί να τον εξηγεί υποστηρίζει πως τα εξαμερή MCM2-7 αποδιατάσσουν τους δύο κλώνους του DNA αφού προσδεθούν στη χρωματίνη σε απόσταση από τις αντιγραφικές διχάλες (Laskey and Madine, 2003). Επιπλέον, υπάρχει το ενδεχόμενο η παρατηρούμενη απουσία των πρωτεϊνών MCM από τις περιοχές σύνθεσης του DNA να είναι φαινομενική και όχι πραγματική και να οφείλεται στον ασθενέστερο φθορισμό που ενδέχεται να διαθέτουν τα ενεργά εξαμερή MCM2-7 που εντοπίζονται στις

27 1. Εισαγωγή διχάλες της αντιγραφής σε σύγκριση με τον αντίστοιχο φθορισμό των ανενεργών συμπλόκων MCM2-7 που είναι δεσμευμένα στην υπόλοιπη χρωματίνη (Dimitrova et al., 1999). Αναφορικά με την περίσσεια των δεσμευμένων πρωτεϊνών MCM2-7 που διαπιστώνονται στη χρωματίνη σε σύγκριση με τον αριθμό των ενεργών αφετηριών της αντιγραφής του DNA, πρόσφατες μελέτες τόσο σε ανθρώπινα κύτταρα όσο και στο Xenopus καταδεικνύουν ότι τα πλεονάζοντα σύμπλοκα λειτουργούν ως δικλείδα ασφαλείας. Συγκεκριμένα, αν και υπό φυσιολογικές συνθήκες τα περισσότερα σύμπλοκα MCM2-7 παραμένουν ανενεργά, σε περίπτωση αντιγραφικού στρες ενεργοποιούνται συμβάλλοντας στην πυροδότηση ανενεργών αφετηριών της αντιγραφής του DNA (dormant origins) και διασφαλίζοντας με αυτό τον τρόπο την ολοκλήρωση της αντιγραφής του γονιδιώματος και κατ επέκταση τη γονιδιωματική σταθερότητα των κυττάρων (Edwards et al., 2002; Ibarra et al., 2008; Lucas et al., 2000; Woodward et al., 2006). Εικόνα 1.8: Η πρωτεΐνη MCM2 δεν εντοπίζεται στις περιοχές σύνθεσης του DNA, όπως διαπιστώνεται από την απουσία συνεντοπισμού των υποπυρηνικών υποδομών των πρωτεϊνών MCM2 και PCNA. Κύτταρα CHO συγχρονίστηκαν στην αρχή, στο μέσο ή στο τέλος της φάσης S και υποβλήθηκαν σε διπλό ανοσοφθορισμό με χρήση αντισωμάτων έναντι των πρωτεϊνών PCNA (κόκκινη χρώση) και MCM2 (πράσινη χρώση) (Dimitrova et al., 1999). Οι πειραματικές προσπάθειες για τον εντοπισμό ενεργότητας ελικάσης του ολοενζύμου MCM2-7 σε διάφορους οργανισμούς δεν έχουν οδηγήσει σε θετικά αποτελέσματα. Πρόσφατη μελέτη στο S. cerevisiae αποκάλυψε ότι το σύμπλοκο MCM2-7 δύναται να αποδιατάξει δίκλωνο DNA in vitro αν διαθέτει ελεύθερα μονόκλωνα άκρα, μόνο υπό συγκεκριμένες συνθήκες αλατότητας. Θεωρείται πιθανό οι συγκεκριμένες αυτές συνθήκες αντίδρασης να προκαλούν αναδιαμόρφωση της δομής δακτυλίου του εξαμερούς συμπλόκου και να ενεργοποιούν τις πρωτεΐνες MCM2-7, τροποποίηση που υπό φυσιολογικές συνθήκες ενδέχεται να προκαλείται είτε μέσω μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων των πρωτεϊνών MCM2-7 είτε μέσω της αλληλεπίδρασής τους με άλλους πρωτεϊνικούς παράγοντες (Bochman and Schwacha, 2008). Πράγματι, μελέτες για τον εντοπισμό πρωτεϊνών με τις οποίες αλληλεπιδρά το σύμπλοκο MCM2-7 κατέδειξαν την ύπαρξη ενός μεγαλομοριακού συμπλόκου το οποίο απαρτίζεται από τις πρωτεΐνες MCM2-7, Cdc45 και από το τετραμερές GINS. Το σύμπλοκο αυτό, το οποίο ονομάστηκε CMG (Cdc45/MCM2-7/GINS), πρωτοαπομονώθηκε από εκχυλίσματα ωοκυττάρων του Xenopus (Kubota et al., 2003), ενώ στη συνέχεια η ύπαρξή του επιβεβαιώθηκε στη Drosophila (Moyer et al., 2006), στο S. cerevisiae (Gambus et al., 2006) και σε ανθρώπινες κυτταρικές

28 1. Εισαγωγή σειρές (Aparicio et al., 2009; Ilves et al., 2010; Im et al., 2009). Επιπλέον έχει δειχθεί ότι τόσο η πρωτεΐνη Cdc45 όσο και το τετραμερές GINS είναι απαραίτητα για την έναρξη και την πρόοδο της αντιγραφής του DNA (Aparicio et al., 1997; Aparicio et al., 2009; Kubota et al., 2003; Pacek and Walter, 2004; Takayama et al., 2003; Tercero et al., 2000), ενώ παράλληλα το σύμπλοκο CMG διαθέτει ενεργότητα ελικάσης in vitro (Ilves et al., 2010; Moyer et al., 2006). Οι παρατηρήσεις αυτές υποδεικνύουν ότι οι παράγοντες Cdc45 και GINS δρουν ως συμπαράγοντες των πρωτεϊνών MCM2-7 ενεργοποιώντας τες ως ελικάσες. Αν και ο ακριβής τρόπος με τον οποίο επιτελείται αυτή η ενεργοποίηση δεν έχει διαλευκανθεί, θεωρείται πιθανό ότι οι πρωτεΐνες Cdc45 και GINS συμβάλλουν στην τροποποίηση της δομής του εξαμερούς MCM2-7, με αποτέλεσμα τη βελτίωση της αλληλεπίδρασής του με το DNA, τη μεγαλύτερη ταχύτητα μετακίνησής του κατά μήκος αυτού ή την ενισχυμένη ικανότητα αποδιάταξης των δύο κλώνων (Aparicio et al., 2006). Πράγματι η μελέτη της δομής του εξαμερούς MCM2-7 με ηλεκτρονική μικροσκοπία αποκάλυψε την ύπαρξη δύο διαφορετικών διαμορφώσεων του συμπλόκου: μιας επίπεδης δακτυλιοειδούς δομής και μιας σπειροειδούς δομής με εμφανή εγκοπή μεταξύ των υπομονάδων MCM2 και MCM5. Αντίθετα διαπιστώθηκε μια μόνο επίπεδη διαμόρφωση του συμπλόκου CMG, στην οποία οι παράγοντες Cdc45 και GINS καλύπτουν το κενό μεταξύ των πρωτεϊνών MCM2 και MCM5 (Costa et al., 2011). Επιπλέον έχει δειχθεί ότι η υψηλή συγκέντρωση ATP σταθεροποιεί τον δακτύλιο του συμπλόκου MCM2-7, γεγονός που προτείνει ότι το άνοιγμα μεταξύ των πρωτεϊνών MCM2 και MCM5 ενδέχεται να κλείνει ύστερα από την πρόσδεση και την υδρόλυση του ATP (Bochman et al., 2008; Bochman and Schwacha, 2007). Το σύμπλοκο CMG διαθέτει υψηλότερη ταχύτητα υδρόλυσης του ATP σε σύγκριση με το εξαμερές MCM2-7 (Ilves et al., 2010). Οι παρατηρήσεις αυτές υποδεικνύουν ότι πιθανώς οι παράγοντες Cdc45 και GINS ενεργοποιούν τις πρωτεΐνες MCM2-7 προκαλώντας την σύγκλιση της εγκοπής μεταξύ των υπομονάδων MCM2 και MCM5, τροποποίηση που πιθανώς επηρεάζει τα ενεργά κέντρα των ATPασών. Εικόνα 1.9: Οι παράγοντες MCM2-7, Cdc45 και GINS συγκροτούν το σύμπλοκο CMG, το οποίο παρουσιάζει ενεργότητα ελικάσης. Οι πρωτεΐνες GINS (μπλε δακτύλιος) και Cdc45 (κόκκινο χρώμα) ενεργοποιούν τις πρωτεΐνες MCM2-7 (πορτοκαλί εξαμερές), πιθανώς προκαλώντας τροποποίηση της δομής του εξαμερούς MCM2-7, με αποτέλεσμα τη βελτίωση της αλληλεπίδρασής του με το DNA (Aparicio et al., 2006) Μηχανισμός αποδιάταξης του δίκλωνου DNA από το σύμπλοκο MCM2-7 Διάφορες εργαστηριακές ομάδες έχουν προσπαθήσει να προσεγγίσουν και να διαλευκάνουν το μηχανισμό μέσω του οποίου οι πρωτεΐνες MCM2-7 αποδιατάσσουν το

29 1. Εισαγωγή δίκλωνο DNA. Από τις μελέτες αυτές έχoυν προκύψει τέσσερα διαφορετικά πιθανά μοντέλα δράσης των συμπλόκων MCM2-7. In vitro μελέτες έχουν καταδείξει ότι τα εξαμερή MCM2-7 προσδένονται και περικλείουν μονόκλωνο DNA και μετακινούνται κατά μήκος αυτού, απομακρύνοντας το συμπληρωματικό κλώνο μέσω αποκλεισμού του από τον κεντρικό αυλό που δημιουργούν (Bochman and Schwacha, 2008). Ο προτεινόμενος αυτός τρόπος αποδιάταξης του DNA συνιστά το μοντέλο «στερικού αποκλεισμού» (steric exclusion). Η μετακίνηση των συμπλόκων MCM2-7 κατά μήκος του μονόκλωνου DNA επιτελείται με κατεύθυνση 3 προς 5 και με τις περιοχές που αντιστοιχούν στην AAA+ περιοχές ATPάσης να πρόσκεινται προς τη μη αποδιαταγμένη πλευρά του δίκλωνου DNA (McGeoch et al., 2005). Πρόσφατη βιοχημική ανάλυση και παρατήρηση με ηλεκτρονική μικροσκοπία των πρωτεϊνών MCM2-7 στο S. cerevisiae αποκάλυψαν την ταυτόχρονη πρόσδεση δύο εξαμερών συμπλόκων MCM2-7 σε δίκλωνο DNA (Evrin et al., 2009; Remus et al., 2009). Η παρατήρηση αυτή υποστηρίζει την πιθανή ισχύ τριών επιπλέον μηχανισμών για τον τρόπο αποδιάταξης της διπλής έλικας του DNA από το εξαμερές MCM2-7. Σύμφωνα με το μοντέλο του «υνίου» (ploughshare) η αποδιάταξη των δύο κλώνων του DNA επιτυγχάνεται καθώς τα σύμπλοκα MCM2-7, μετακινούμενα κατά μήκος του DNA προς αντίθετες κατευθύνσεις, παρασύρουν μαζί τους μια άλλη πρωτεΐνη η οποία παρεμβάλλεται μεταξύ των δύο κλώνων του DNA και τους διαχωρίζει (Takahashi et al., 2005). Για να καταστεί εφικτή η πρόσδεση της πρωτεΐνης-σφήνας μεταξύ των δύο κλώνων του DNA θεωρείται απαραίτητη μια αρχική και τοπική αποδιάταξη του DNA. Η πρωτεΐνη που παρεμβάλλεται μεταξύ των δύο κλώνων του DNA δεν έχει ταυτοποιηθεί. Η συγκρότηση του συμπλόκου CMG (Cdc45/MCM2-7/GINS), το οποίο έχει ενεργότητα ελικάσης (Moyer et al., 2006), στην αρχή της φάσης S σε συνδυασμό με πειραματικά δεδομένα που καταδεικνύουν την προτιμητέα πρόσδεση του τετραμερούς GINS σε μονόκλωνο παρά σε δίκλωνο DNA (Boskovic et al., 2007) προτείνουν το σύμπλοκο GINS ως την πιθανή πρωτεΐνη-σφήνα. Στην περίπτωση που τα δύο εξαμερή MCM2-7 παραμένουν προσδεδεμένα κατά την αποδιάταξη των δύο κλώνων του DNA ένας επιπλέον μηχανισμός δράσης των συμπλόκων MCM2-7 είναι πιθανός. Σύμφωνα με το μοντέλο του «Τ αντιγόνου» (T antigen model) κάθε εξαμερές MCM2-7 προάγει το διαχωρισμό των δύο κλώνων του DNA μέσω της ταυτόχρονης άντλησης δίκλωνου DNA κατά μήκος της διεπιφάνειας των δύο εξαμερών, με αποτέλεσμα την εξαγωγή μονόκλωνου DNA (Takahashi et al., 2005). Το μοντέλο αυτό βασίζεται στον τρόπο δράσης του μεγάλου Τ αντιγόνου, το οποίο έχει δράση ελικάσης και αποδιατάσσει το DNA του ιού SV40 κατά την αντιγραφή του. Πράγματι εικόνες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας έχουν αποκαλύψει την πρόσδεση του T αντιγόνου σε δίκλωνο DNA από το οποίο προεκβάλλουν δύο θηλιές μονόκλωνου DNA (Seinsoth et al., 2003; Wessel et al., 1992). Τέλος έχει προταθεί η πιθανή ισχύς ενός ακόμη μηχανισμού αποδιάταξης των δύο κλώνων του DNA από τις πρωτεΐνες MCM2-7. Σύμφωνα με το μοντέλο της «περιστρεφόμενης αντλίας» (roraty pump model), τα δύο εξαμερή MCM2-7 μετακινούνται κατά μήκος δίκλωνου DNA προς αντίθετες κατευθύνσεις και αφού ακινητοποιηθούν σε απόσταση από την αντιγραφική

30 1. Εισαγωγή διχάλα προκαλούν περιστροφή του DNA προς αντίθετη φορά με αποτέλεσμα την αποδιάταξή του (Takahashi et al., 2005). Εικόνα 1.10: Πιθανά μοντέλα δράσης των πρωτεϊνών MCM2-7 κατά τη διαδικασία αποδιάταξης του δίκλωνου DNA. (a) Κατά το μοντέλο στερικού αποκλεισμού (steric exclusion), οι πρωτεΐνες MCM2-7 προσδένονται στον ένα κλώνο του DNA και καθώς κινούνται κατά μήκος αυτού απομακρύνουν το συμπληρωματικό κλώνο. (b) Σύμφωνα με το μοντέλο της «περιστρεφόμενης αντλίας» (rotary pump), τα δύο εξαμερή MCM2-7 προσδένονται σε δίκλωνο DNA, κινούνται προς αντίθετες κατευθύνσεις και επάγουν την αποδιάταξη του DNA προκαλώντας την περιστροφή του προς αντίθετη φορά. (c) Σύμφωνα με το μοντέλο του «Τ αντιγόνου» (T antigen model), η ενεργότητα των πρωτεϊνών MCM2-7 ως ελικάσες έγκειται στην ταυτόχρονη άντληση δίκλωνου DNA κατά μήκος της διεπιφάνειας των δύο εξαμερών, με αποτέλεσμα την εξαγωγή μονόκλωνου DNA. (d) Τέλος, το μοντέλο του «υνίου» (ploughshare) υποστηρίζει ότι η αποδιάταξη του δίκλωνου DNA οφείλεται στην παρεμβολή μιας πρωτεΐνης-σφήνας μεταξύ των δύο κλώνων, την οποία παρασύρουν τα σύμπλοκα MCM2-7 καθώς μετακινούνται κατά μήκος του DNA προς αντίθετες κατευθύνσεις (Takahashi et al., 2005) Ενεργοποίηση των προαντιγραφικών συμπλόκων Η πυροδότηση της αντιγραφής του DNA πραγματοποιείται κατά τη μετάβαση από τη φάση G1 στη φάση S του κυτταρικού κύκλου και περιλαμβάνει μια αυστηρώς ρυθμιζόμενη αλληλουχία γεγονότων και μοριακών αλληλεπιδράσεων που έχει ως τελικό αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του συμπλόκου MCM2-7 και την προσέλκυση των DNA πολυμερασών στις αφετηρίες της αντιγραφής. Η ενεργοποίηση των πρωτεϊνών MCM2-7 πραγματοποιείται στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA in situ, μέσω μιας διαδικασίας που περιλαμβάνει την αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών MCM2-7 με τους παράγοντες Cdc45 και GINS και τη συγκρότηση του συμπλόκου CMG (Cdc45/MCM2-7/GINS). Μεταβατικό στάδιο από τη συγκρότηση του προαντιγραφικού συμπλόκου έως την

31 1. Εισαγωγή ενεργοποίηση του συμπλόκου CMG και τη στρατολόγηση των DNA πολυμερασών αποτελεί το προεναρκτήριο σύμπλοκο (Pre-Ιnitiation Complex, Pre-IC), το οποίο απαρτίζεται από τις πρωτεΐνες MCM10, Dpb11, Sld2, GINS, Cdc45 και Sld3. Η συγκρότηση του προεναρκτήριου συμπλόκου εξαρτάται και ρυθμίζεται από τη δράση της κινάσης Cdc7 (cell division cycle 7) και των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών S-CDK (Cyclin-dependent kinase), οι οποίες ενεργοποιούνται κατά τη μετάβαση από τη φάση G1 στη φάση S του κυτταρικού κύκλου (De Pamphilis, 2006) Παράγοντες προεναρκτήριου συμπλόκου Το προεναρκτήριο σύμπλοκο της αντιγραφής του DNA συγκροτείται στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA στο στάδιο της μετάβασης από τη φάση G1 στη φάση S. Τα μόρια που συμμετέχουν στο προεναρκτήριο σύμπλοκο είναι συντηρημένα μεταξύ των διαφορετικών οργανισμών στους οποίους έχουν ταυτοποιηθεί. Η πρωτεΐνη MCM10 αποτελεί τον πρώτο παράγοντα που προσδένεται στο προαντιγραφικό σύμπλοκο κατά τη μετάβαση από τη φάση G1 στη φάση S. Η πρόσδεσή της στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA εξαρτάται από την ύπαρξη του εξαμερούς MCM2-7. Μελέτες στον S. cerevisiae (Gambus et al., 2006), στον S. pombe (Hart et al., 2002; Lee et al., 2003), στη Drosophila (Apger et al., 2010), στο Xenopus (Zhu et al., 2007) αλλά και στον άνθρωπο (Zhu et al., 2007) έχουν καταδείξει την αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης MCM10 με τις πρωτεΐνες MCM2 και MCM6. Όσον αφορά το ρόλο της, έχει προταθεί ότι αφενός απαιτείται για την προσέλκυση της πολυμεράσης α στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA (Zhu et al., 2007) και ότι αφετέρου σταθεροποιεί την καταλυτική υπομονάδα της DNA πολυμεράσης α τόσο στον S. cerevisiae όσο και στον άνθρωπο (Chattopadhyay and Bielinsky, 2007; Ricke and Bielinsky, 2004). Επιπλέον, αν και έχει προταθεί ότι η πρωτεΐνη MCM10 χρειάζεται για την προσέλκυση του παράγοντα Cdc45 στις αφετηρίες της αντιγραφής, καθώς και για την ενεργοποίηση των πρωτεϊνών MCM2-7 (Wohlschlegel et al., 2002), πρόσφατες μελέτες στον S. pombe (Kanke et al., 2012) και στον S. cerevisiae (van Deursen et al., 2012) αποκαλύπτoυν ότι η πρωτεΐνη MCM10 δεν εμπλέκεται στη συγκρότηση του συμπλόκου CMG αλλά απαιτείται για την αποδιάταξη των δύο κλώνων του DNA στις αφετηρίες της αντιγραφής. Σημαντικό παράγοντα του προεναρκτήριου συμπλόκου αποτελεί η πρωτεΐνη Dpb11, η οποία πρωτοανακαλύφθηκε στον S. cerevisiae (Araki et al., 1995). Πρόκειται για πρωτεΐνη που φέρει επαναλήψεις του μοτίβου BRCT, μέσω του οποίου αλληλεπιδρά με φωσφορυλιωμένα μόρια (Manke et al., 2003). Ορθόλογα της Dpb11 έχουν ταυτοποιηθεί στο Xenopus (Cut5/Mus101), στον S. pombe (Rad4/Cut5), στη Drosophila (Mus101) και στον άνθρωπο (TopBp1) (Garcia et al., 2005). Μελέτες στο Xenopus έχουν καταδείξει ότι η πρόσδεση του Cut5/Mus101 στη χρωματίνη λαμβάνει χώρα στην αρχή της φάσης S και απαιτεί την ύπαρξη του ORC αλλά δεν εξαρτάται από τις πρωτεΐνες MCM2-7 (Hashimoto and Takisawa, 2003; Van Hatten et al., 2002). Αντίθετα, στη ζύμη η δέσμευση της πρωτεΐνης Dpb11 στη χρωματίνη είναι εξαρτώμενη από τους παράγοντες Sld2, GINS, Cdc45 και DNA πολυμεράση ε. Ο παράγοντας Dpb11 είναι απαραίτητος για την έναρξη

32 1. Εισαγωγή της αντιγραφής του DNA καθώς απαιτείται για την πρόσδεση των πρωτεϊνών GINS και Cdc45 στις αφετηρίες της αντιγραφής (De Pamphilis 2006). Η πρωτεΐνη Sld2 αποτελεί παράγοντα με άγνωστη μοριακή λειτουργία, ο οποίος αλληλεπιδρά και προσδένεται στην πρωτεΐνη Dpb11 μέσω των BRCT επαναλήψεων (Masumoto et al., 2002; Tak et al., 2006). Η συγκρότηση του συμπλόκου Dpb11-Sld2 είναι απαραίτητη για την πρόσδεση και των δύο πρωτεϊνών στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA και υφίσταται θετική ρύθμιση από την S-CDK, η οποία φωσφορυλιώνει την πρωτεΐνη Sld2 καθιστώντας δυνατή την αλληλεπίδρασή της με τον παράγοντα Dpb11 (Masumoto et al., 2002). Ορθόλογο μόριο της πρωτεΐνη Sld2 έχει ταυτοποιηθεί στο Xenopus και στον άνθρωπο. Πρόκειται για την ελικάση RecQ4, η οποία παρ όλο που εμφανίζει ομολογία με την Sld2 στο αμινοτελικό της άκρο (Matsuno et al., 2006; Sangrithi et al., 2005), παρουσιάζει σημαντικές λειτουργικές διαφορές σε σύγκριση με την Sld2. Καταρχάς έχει δειχθεί στο Xenopus ότι, αν και ο παράγοντας RecQ4 απαιτείται για την έναρξη της αντιγραφής του DNA δεν επηρεάζει την συγκρότηση του συμπλόκου CMG (Matsuno et al., 2006; Sangrithi et al., 2005), σε αντίθεση με την πρωτεΐνη Sld2 στον S. cerevisiae. Επιπλέον, η διερεύνηση των μορίων με τις οποίες αλληλεπιδρά ο παράγοντας RecQ4 στην κυτταρική σειρά του ανθρώπου 293 αποκάλυψε ότι η πρωτεΐνη RecQ4 προσδένεται στο σύμπλοκο CMG που είναι δεσμευμένο στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA και στην πρωτεΐνη MCM10 (Xu et al., 2009). Οι παρατηρήσεις αυτές προτείνουν ότι η δράση του μορίου RecQ4 εκδηλώνεται μετά τη συγκρότηση του συμπλόκου CMG, σε αντίθεση με την πρωτεΐνη Sld2 στο S. cerevisiae. Το σύμπλοκο GINS απαρτίζεται από τέσσερις υπομονάδες (Sld5, Psf1, Psf2 και Psf3). Μελέτες στη ζύμη έχουν καταδείξει ότι το ετεροτετραμερές GINS είναι απαραίτητο για την έναρξη αλλά και για την πρόοδο της αντιγραφής του DNA, καθώς και ότι η πρόσδεσή του στις αφετηρίες της αντιγραφής απαιτεί την ύπαρξη του προαντιγραφικού συμπλόκου και εξαρτάται από τους παράγοντες Dpb11/Cut5, Sld3 (μόνο στη ζύμη) καθώς και από την ενεργότητα της S-CDK (Kubota et al., 2003; Takayama et al., 2003). Επιπλέον έχει δειχθεί ότι το GINS αλληλεπιδρά και συμμετέχει σε σύμπλοκο με τον παράγοντα Cdc45 και το σύμπλοκο MCM2-7 στο Xenopus (Kubota et al., 2003). Επίσης, μελέτες τόσο στη Drosophila όσο και σε ανθρώπινα κύτταρα αποκάλυψαν ότι το τετραμερές GINS μαζί με τον παράγοντα Cdc45 συμβάλλουν στην ενεργοποίηση των πρωτεϊνών MCM2-7, καθώς αλληλεπιδρούν και συγκροτούν το σύμπλοκο CMG το οποίο εμφανίζει ενεργότητα ελικάσης (Ilves et al., 2010; Moyer et al., 2006). Σημαντικοί παράγοντες του προεναρκτήριου συμπλόκου είναι οι πρωτεΐνες Sld3 και Cdc45. Η πρωτεΐνη Cdc45 συμμετέχει στο σύμπλοκο CMG, το οποίο παρουσιάζει ενεργότητα ελικάσης. Η πρόσδεσή της στη χρωματίνη απαιτεί την ύπαρξη των παραγόντων MCM10 (Sawyer et al., 2004; Wohlschlegel et al., 2002), GINS (Takayama et al., 2003) καθώς και ενεργότητα της CDK (Zou and Stillman, 1998). Απουσία του παράγοντα Cdc45 καθίσταται αδύνατη η πρόσδεση του τετραμερούς GINS (Kubota et al., 2003; Takayama et al., 2003), της πρωτεΐνης RPA καθώς και η προσέλκυση των DNA πολυμερασών στη χρωματίνη (Mimura et al., 2000; Walter and Newport, 2000). Η πρωτεΐνη Sld3 είναι απαραίτητη για την έναρξη της αντιγραφής του DNA αλλά δεν χρειάζεται για την πρόοδο αυτής (Kamimura et al., 2001; Kanemaki and Labib, 2006)

33 1. Εισαγωγή Επίσης, μελέτες στον S. cerevisiae έχουν καταδείξει την αλληλεπίδραση μεταξύ των παραγόντων Sld3 και Cdc45 καθώς και την αμοιβαία εξαρτώμενη πρόσδεση των παραγόντων αυτών στη χρωματίνη (Kamimura et al., 2001). Οι παρατηρήσεις αυτές υποδεικνύουν ότι ο ρόλος της πρωτεΐνη Sld3 είναι η στρατολόγηση του παράγοντα Cdc45 στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA. Επιπλέον η πρωτεΐνη Sld3 αποτελεί μοριακό στόχο της S-CDK. Η φωσφορυλίωσή της στην αρχή της φάσης S επάγει την αλληλεπίδρασή της και την πρόσδεσή της στην πρωτεΐνη Dpb11 (Tanaka et al., 2007; Zegerman and Diffley, 2007). Σε πρόσφατη μελέτη ταυτοποιήθηκε στο Xenopus μια πρωτεΐνη η οποία θεωρείται ορθόλογο της Sld3. Πρόκειται για την πρωτεΐνη Treslin, η οποία αλληλεπιδρά με τον παράγοντα TopBP1 και είναι απαραίτητη για την πρόσδεση του παράγοντα Cdc45 στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA (Kumagai et al., 2010) Συγκρότηση προεναρκτήριου συμπλόκου Ο τρόπος με τον οποίο επιτελείται η συγκρότηση του προεναρκτήριου συμπλόκου στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA διαφέρει μεταξύ του Xenopus και του S. cerevisiae. Στο Xenopus η πρόσδεση των παραγόντων στη χρωματίνη συνιστά μια σταδιακή διαδικασία με σαφώς διαχωρισμένα και ανεξάρτητα στάδια. Αντίθετα στο S. cerevisiae η συγκρότηση του προεναρκτήριου συμπλόκου εμφανίζεται πιο συνεργιστική και περιλαμβάνει την αλληλένδετη και αμοιβαία εξαρτώμενη δέσμευση των παραγόντων στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA. Στον S. cerevisiae η συγκρότηση του προεναρκτήριου συμπλόκου εξαρτάται από τη φωσφορυλίωση των παραγόντων Sld2 και Sld3 από την S-CDK, η οποία έχει ως αποτέλεσμα την αλληλεπίδραση και πρόσδεση των παραγόντων στην πρωτεΐνη Dpb11 (Tanaka and Araki, 2010; Tanaka et al., 2007; Zegerman and Diffley, 2007). Η φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης Sld2 επάγει τη συγκρότηση ενός προ-δεσμευόμενου συμπλόκου (Pre-Loading Complex), το οποίο απαρτίζεται από τις πρωτεΐνες Sld2, Dpb11, GINS και την πολυμεράση ε. Η συγκρότηση του συγκεκριμένου συμπλόκου είναι απαραίτητη για την πρόσδεση των παραγόντων αυτών στη χρωματίνη, καθώς έχει δειχθεί ότι η στατολόγησή τους στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA είναι αμοιβαίως εξαρτώμενη και αλληλένδετη (Masumoto et al., 2002; Takayama et al., 2003). Πρόσφατη μελέτη καταδεικνύει ότι ο σχηματισμός του προ-δεσμευόμενου συμπλόκου είναι ανεξάρτητος από την ύπαρξη του προαντιγραφικού συμπλόκου (Muramatsu et al., 2010). Επίσης έχει δειχθεί ότι το ετεροτετραμερές GINS ανταγωνίζεται τον παράγοντα Sld3 ως προς την πρόσδεσή του στις πρωτεΐνες Cdc45 και MCM2-7 (Bruck and Kaplan, 2011). Βάσει των παρατηρήσεων αυτών προτείνεται ένα μοντέλο κατά το οποίο το σύμπλοκο Cdc45-Sld3 προσδένεται στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA. Η φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών Sld2 και Sld3 οδηγεί αφενός στη συγκρότηση του προ-δεσμευόμενου συμπλόκου και αφετέρου στη πρόσδεση του συμπλόκου αυτού στο σύμπλοκο Cdc45-Sld3 στη χρωματίνη, μέσω της αλληλεπίδρασης των παραγόντων Sld3-Dpb11 (Muramatsu et al., 2010), με τελικό αποτέλεσμα τη συγκρότηση του προεναρκτήριου συμπλόκου. Θεωρείται πιθανό ο ανταγωνισμός του ετεροτετραμερούς GINS με την πρωτεΐνη Sld3 για

34 1. Εισαγωγή την πρόσδεση στις πρωτεΐνες MCM2-7 και Cdc45 να συμβάλλει στην απομάκρυνση του παράγοντα Sld3 και συνεπώς στη συγκρότηση του συμπλόκου CMG στις αφετηρίες της αντιγραφής στην αρχή της φάσης S (Bruck and Kaplan, 2011). Εικόνα 1.11: Διαδικασία συγκρότησης του προεναρκτήριου συμπλόκου στον S. cerevisiae. Κατά τη μετάβαση από τη φάση G1 στη φάση S, η φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών Sld2 και Sld3 από τις κινάσες CDK έχει ως αποτέλεσμα την πρόσδεσή τους στην πρωτεΐνη Dpb11 και την προσέλκυση παραγόντων, όπως είναι οι πρωτεΐνες Cdc45, GINS και η πολυμεράση ε. Επιπλέον, η στρατολόγηση των παραγόντων αυτών στη χρωματίνη απαιτεί τη φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών MCM2-7 από την κινάση Cdc7. Συνεπώς η συνδυασμένη δράση των κινασών CDK και Cdc7 προάγει τη συγκρότηση του προεναρκτήριου συμπλόκου στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA και την ενεργοποίηση των πρωτεϊνών MCM2-7 (Labib and Gambus, 2007). Η διαδικασία συγκρότησης του προεναρκτήριου συμπλόκου στο Xenopus είναι διαφορετική σε σύγκριση με το S. cerevisiae. Η πρωτεΐνη TopBP1 (ορθόλογο της Dbp11) θεωρείται ότι είναι από τους πρώτους παράγοντες του προεναρκτήριου συμπλόκου που προσδένεται στη χρωματίνη καθώς, σε συνδυασμό με τη φωσφορυλίωση κάποιων πρωτεϊνών που δεν είναι γνωστές από το σύμπλοκο Cdk2 Κυκλίνη Ε, απαιτείται για την πρόσδεση της πρωτεΐνη Cdc45 (και πιθανώς του GINS) (Hashimoto and Takisawa, 2003); (Van Hatten et al., 2002). Η πρωτεΐνη Treslin (πιθανό ορθόλογο της Sld3) αποτελεί παράγοντα επίσης απαραίτητο για την πρόσδεση του Cdc45 στις αφετηρίες της αντιγραφής. Αν και έχει δειχθεί ότι η Treslin αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη TopBP1 θεωρείται πιθανό ότι τα δύο αυτά μόρια δεσμεύονται ανεξάρτητα στη χρωματίνη και ακολουθεί η συμπλοκοποίησή τους πάνω σε αυτή. Βάσει του προτεινόμενου μοντέλου η

35 1. Εισαγωγή συγκρότηση του συμπλόκου Treslin-TopBP1 στη χρωματίνη προσελκύει τον παράγοντα Cdc45 (Kumagai et al., 2010). Η πρόσδεση της πρωτεΐνη RecQ4 (ορθόλογο της Sdl2) αναμένεται ότι προσδένεται στις αφετηρίες της αντιγραφής στο τέλος, μετά τους παράγοντες Cdc45 και GINS, καθώς δεν απαιτείται για τη στρατολόγησή τους (Matsuno et al., 2006; Sangrithi et al., 2005) Φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών MCM2-7 Η ενεργοποίηση των πρωτεϊνών MCM2-7 προϋποθέτει την φωσφορυλίωσή τους από την κινάση Cdc7. Πρόκειται για μια κινάση σερίνης/θρεονίνης της οποίας η δράση ενεργοποιείται ύστερα από τη συμπλοκοποίησή της με τη ρυθμιστική υπομονάδα Dbf4 (Jares et al., 2000). Η απουσία της Cdc7-Dbf4 δεν επηρεάζει τη συγκρότηση των προαντιγραφικών συμπλόκων ούτε τη στρατολόγηση της πρωτεΐνης MCM10 στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA (Wohlschlegel et al., 2002), όμως παρεμποδίζει την προσέλκυση του παράγοντα Cdc45 (Jares and Blow, 2000; Zou and Stillman, 2000). Η ενεργότητα της Cdc7-Dbf4 είναι περιορισμένη μέσα στα κύτταρα. Η φωσφορυλίωση των μορίων-στόχων της επιτελείται in situ στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA μετά από αλληλεπίδρασή τους με το σύμπλοκο Cdc7-Dbf4. Σε συμφωνία με αυτόν τον τρόπο δράσης, μελέτες in vivo και in vitro αποκαλύπτουν ότι η κινάση Cdc7-Dbf4 φωσφορυλιώνει τις πρωτεΐνες MCM2-7 που είναι δεσμευμένες στη χρωματίνη (Francis et al., 2009; Sheu and Stillman, 2006). Επιπλέον, μελέτες στη ζύμη και στο Xenopus προτείνουν ότι η προσέλκυση του συμπλόκου Cdc7-Dbf4 στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA εξαρτάται από την ύπαρξη των προαντιγραφικών συμπλόκων και επιτυγχάνεται μέσω της αλληλεπίδρασης της υπομονάδας Dbf4 με τους παράγοντες του προαντιγραφικού συμπλόκου MCM2, MCM4, ORC3 και ORC4 (Duncker et al., 2002; Sheu and Stillman, 2006; Varrin et al., 2005). Μελέτη στο S. cerevisiae κατέδειξε ότι η υπερφωσφορυλιωμένη μορφή της πρωτεΐνης MCM4, η οποία εξαρτάται από την ενεργότητα της Cdc7-Dbf4, εντοπίζεται κυρίως στο σύμπλοκο Cdc45-MCM4 (Sheu and Stillman, 2006). Συνεπώς οι παρατηρήσεις που προαναφέρθηκαν υποδεικνύουν ότι η Cdc7-Dbf4 ενεργοποιείται μετά τη συγκρότηση των προαντιγραφικών συμπλόκων ενώ θεωρείται πιθανό ότι συμβάλλει στη συγκρότηση του συμπλόκου CMG. Γενετικές και βιοχημικές μελέτες καταδεικνύουν ότι η Cdc7-Dbf4 φωσφορυλιώνει in vitro τις πρωτεΐνες MCM2-7 (Kihara et al., 2000; Weinreich and Stillman, 1999), την πρωτεΐνη Cdc45 (Nougarede et al., 2000) και την πολυμεράση α (Weinreich and Stillman, 1999). Παρ όλ αυτά, μελέτες τόσο in vivo όσο και in vitro προτείνουν ότι πρωταρχικό στόχο της κινάσης Cdc7-Dbf4 αποτελούν οι πρωτεΐνες MCM2-7 (Cho et al., 2006; Hardy et al., 1997; Lei et al., 1997; Masai and Arai, 2002; Masai et al., 2006). Έχει δειχθεί ότι η Cdc7 δύναται να φωσφορυλιώσει in vitro τις υπομονάδες MCM2, MCM3, MCM4, MCM6 και MCM7 (Lei et al., 1997; Weinreich and Stillman, 1999). Επιπλέον μια συγκεκριμένη μετάλλαξη της MCM5 (mcm5-bob1) αντικαθιστά μερικώς τη δράση της Cdc7-Dbf4 στο S. cerevisiae (Hardy et al., 1997)

36 1. Εισαγωγή Οι αμινοτελικές περιοχές των πρωτεϊνών MCM2, MCM4 και MCM6 αποτελούν τα κύρια υποστρώματα της Cdc7-Dbf4, ενώ παράλληλα έχει δειχθεί ότι διαθέτουν θέσεις αναγνώρισης και άλλων κινασών στις οποίες συμπεριλαμβάνονται οι CDK (Labib, 2010). Ο χαρακτηρισμός του αμινοτελικού άκρου της πρωτεΐνης MCM4 του S. cerevisiae ανέδειξε την ύπαρξη αρκετών μοτίβων-στόχων της Cdc7-Dbf4 (Devault et al., 2008; Sheu and Stillman, 2006). Μεταξύ αυτών συμπεριλαμβάνονται μοτίβα SSP των οποίων η πρώτη σερίνη φωσφορυλιώνεται από την κινάση Cdc7-Dbf4 αφού προηγηθεί φωσφορυλίωση της δεύτερης σερίνης από την κινάση CDK (Devault et al., 2008; Masai et al., 2000; Montagnoli et al., 2006). Επιπλέον, έχει ταυτοποιηθεί θέση πρόσδεσης του συμπλόκου Cdc7-Dbf4 στo αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης MCM4 (Sheu and Stillman, 2006). Πρόσφατη μελέτη στο S. cerevisiae αποκάλυψε την ύπαρξη μιας περιοχής στο αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης MCM4 η οποία εμφανίζει ανασταλτική ενεργότητα ως προς την έναρξη της αντιγραφής του DNΑ (Sheu and Stillman, 2010). Η φωσφορυλίωση της συγκεκριμένης περιοχής από την κινάση Cdc7-Dbf4 έχει ως αποτέλεσμα την άρση της αναστολής. Η αφαίρεση της περιοχής στην πρωτεΐνη MCM4 που εμφανίζει την ανασταλτική ενεργότητα επιτρέπει την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων απουσία της κινάσης Cdc7-Dbf4. Παρ όλ αυτά, η πρόοδος του κυτταρικού κύκλου παρουσιάζει πολύ χαμηλότερη ταχύτητα στα κύτταρα αυτά, γεγονός που υποδεικνύει την ύπαρξη κι άλλων μορίων στόχων του συμπλόκου Cdc7-Dbf4, η φωσφορυλίωση των οποίων είναι απαραίτητη για την ορθή εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου (Sheu and Stillman, 2010). Κατ αναλογία, η συγκρότηση του συμπλόκου CMG σε ανθρώπινα κύτταρα προϋποθέτει τη φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών MCM2-7 από τις κινάσες Cdc7-Dbf4 και CDK (Im et al., 2009). Όσον αφορά την πρωτεΐνη MCM2, πρόσφατη μελέτη στο S. cerevisiae κατέδειξε τη σημασία της φωσφορυλίωσής της από την κινάση Cdc7-Dbf4 για την αντιγραφή του DNA και την επιβίωση των κυττάρων (Bruck and Kaplan, 2009). Ο μοριακός μηχανισμός βάσει του οποίου η φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών MCM2-7 προάγει την ενεργοποίησή τους και τη συγκρότηση του συμπλόκου CMG δεν έχει διαλευκανθεί. Πιθανολογείται ότι η φωσφορυλίωση του συμπλόκου MCM2-7 από την Cdc7-Dbf4 έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία θέσεων αλληλεπίδρασης ή πρόσδεσης των παραγόντων Cdc45 και GINS ή εναλλακτικά ενδέχεται να προκαλεί τροποποίηση της δομής του συμπλόκου κατά τέτοιο τρόπο ώστε να επάγεται η ενεργότητα ελικάσης. Η τελευταία υπόθεση υποστηρίζεται από την ταυτοποίηση της μετάλλαξης bob 1 (bypass of block 1) του mcm5 γονιδίου, η ύπαρξη της οποίας καθιστά τη δράση της κινάσης Cdc7 μη αναγκαία για την πρόοδο της αντιγραφής του DNA (Hardy et al., 1997; Jackson et al., 1993). Παρ όλο που ο μοριακός μηχανισμός της επίδρασης αυτής δεν είναι γνωστός, μελέτη με το σύμπλοκο MCM στα αρχαία προτείνει ότι το αλληλόμορφο mcm5-bob1 προκαλεί αλλαγή στη δομή του εξαμερούς MCM2-7 ανάλογη με εκείνη που φυσιολογικά δημιουργείται λόγω της φωσφορυλίωσης των υπόλοιπων υπομονάδων του συμπλόκου από την κινάση Cdc7-Dbf4 (Fletcher et al., 2003)

37 1. Εισαγωγή 1.2 Γονιδιωματική αστάθεια και καρκινογένεση Ο όρος γονοδιωματική αστάθεια αναφέρεται στο σύνολο των γεγονότων και των χαρακτηριστικών που δύνανται να συμβάλλουν στην πρόκληση μη προγραμματιζόμενων τροποποιήσεων στο γονιδίωμα. Η γονιδιωματική αστάθεια περιγράφει δύο ειδών γενετικές αλλαγές: αυτές που αφορούν το νουκλεοτιδικό επίπεδο και αυτές που αφορούν ολόκληρες χρωμοσωματικές περιοχές. Στην πρώτη κατηγορία εντάσσονται οι νουκλεοτιδικές μεταλλάξεις καθώς και η γονιδιωματική αστάθεια των δορυφορικών αλληλουχιών. Η δεύτερη κατηγορία περιλαμβάνει εκτεταμένες δομικές ή αριθμητικές χρωμοσωματικές ανωμαλίες, όπως είναι η απόκτηση ή η απώλεια ολόκληρων χρωμοσωμάτων, καθώς και η αναστροφή, η απώλεια, ο διπλασιασμός ή η μετατόπιση μεγάλων χρωμοσωματικών τμημάτων. Η γονιδιωματική αστάθεια αποτελεί χαρακτηριστικό γνώρισμα των καρκινικών κυττάρων. Παρ όλ αυτά δεν έχει διευκρινιστεί σε ποιο στάδιο κατά την ανάπτυξη του όγκου αποκτώνται οι αλλαγές στο γονιδίωμα καθώς και ποια είναι η μοριακή βάση της δημιουργίας τους (Negrini et al., 2010; Shen, 2011). Η πορεία της κακοήθους εξαλλαγής των κυττάρων και της ανάπτυξης του όγκου μπορεί να θεωρηθεί ως μια διαδικασία σταδιακής συσσώρευσης γονιδιωματικών αλλαγών με την πρόοδο των κυτταρικών διαιρέσεων (Hanahan and Weinberg, 2011). Οι τροποποιήσεις σε σημαντικά γονίδια, όπως είναι για παράδειγμα οι μεταλλάξεις που ενεργοποιούν ογκογονίδια ή οι μεταλλάξεις που έχουν ως αποτέλεσμα την αδρανοποίηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων, οδηγούν στην εξαλλαγή ενός κυττάρου από τη φυσιολογική σε μια προκαρκινική κατάσταση. Η συσσώρευση επιπλέον γονιδιωματικών αλλαγών ενδέχεται να παρέχει στα κύτταρα πλεονέκτημα επιλογής και ανάπτυξης, με αποτέλεσμα τον συνεχή πολλαπλασιασμό τους, την ενεργοποίηση της ικανότητας τους για διήθηση και μετάσταση, την επαγωγή αγγειογένεσης και τελικά τη δημιουργία του όγκου. Η απόκτηση περαιτέρω γενετικών τροποποιήσεων μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη υποπληθυσμών καρκινικών κυττάρων με διαφορετικές ιδιότητες και χαρακτηριστικά, κατάσταση η οποία εξηγεί την ετερογένεια ως προς το γενετικό υπόβαθρο που παρουσιάζουν πολλοί όγκοι. Συνεπώς η γονιδιωματική αστάθεια μπορεί να θεωρηθεί ως κινητήριος δύναμη για την εξέλιξη της καρκινογένεσης (Shen, 2011). Εικόνα 1.12: Η καρκινογένεση ως μια διαδικασία συνεχούς συσσώρευσης αλλαγών στο γονιδίωμα (Shen, 2011)

38 1. Εισαγωγή Η διατήρηση των επιπέδων έκφρασης των παραγόντων Cdt1 και Geminin είναι απαραίτητη για την εξασφάλιση της γονιδωματικής σταθερότητας Μια σειρά από διαφορετικές μελέτες έχουν εστιάσει την έρευνά τους στις πιθανές επιπτώσεις που ενδέχεται να παρουσιάζει η απορρύθμιση του συστήματος αδειοδότησης των αφετηριών αντιγραφής του DNA στη γονιδιωματική σταθερότητα. Η διερεύνηση της επίδρασης της απορρύθμισης της έκφρασης κάποιου παράγοντα αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA πραγματοποιήθηκε αρχικά στον S. pombe (Nishitani et al., 2000; Nishitani and Nurse, 1995; Yanow et al., 2001). Συγκεκριμένα διαπιστώθηκε ότι η υπερέκφραση της πρωτεΐνης Cdc6/Cdc18 προκαλούσε συνεχή σύνθεση του DNA χωρίς να παρεμβάλλεται η μίτωση (Nishitani and Nurse, 1995). Στον ίδιο οργανισμό, η υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1, αν και από μόνη της δεν επηρέαζε την αντιγραφή του DNA, σε συνδυασμό με την εκτοπική έκφραση του παράγοντα Cdc6/Cdc18 οδηγούσε σε ακόμα πιο έντονο και εκτεταμένο υπερδιπλασιασμό του γονιδιώματος (Nishitani et al., 2000). Επίσης έχει δειχθεί ότι η υπερέκφραση των παραγόντων Cdt1 και Cdc6/Cdc18 δύναται να προκαλέσει επανέναρξη της αντιγραφής του DNA λόγω επαναπυροδότησης των αφετηριών αντιγραφής, ακόμα και σε κύτταρα που είναι συγκεντρωμένα στη φάση G2, παρακάμπτοντας τους φυσιολογικούς ανασταλτικούς φραγμούς (Yanow et al., 2001). Στα μετάζωα η υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 οδηγεί σε υπερδιπλασιασμό του γονιδιώματος, ανεξάρτητα από την πρωτεΐνη Cdc6. Επανέναρξη της αντιγραφής του DNA λόγω εκτοπικής έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 έχει δειχθεί στο Xenopus (Arias and Walter, 2005; Li and Blow, 2005), στο C. elegans (Zhong et al., 2003), στη Drosophila (Thomer et al., 2004) καθώς και σε κύτταρα του ανθρώπου (Vaziri et al., 2003). Στην τελευταία περίπτωση, η υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 στην καρκινική κυτταρική σειρά του πνεύμονα H1299 είχε ως αποτέλεσμα την επαναπυροδότηση της αντιγραφής του DNA 2-4 ώρες μετά την έναρξη της φάσης S (Vaziri et al., 2003). Ο παρατηρούμενος υπερδιπλασιασμός του γονιδιώματος δεν οφείλεται σε ανωμαλίες κατά τη μίτωση, καθώς διαπιστώθηκε ότι τα κύτταρα δεν εισέρχονται στη μίτωση αφού δεν εμφανίζουν θετική χρώση για την φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη H3, η οποία αποτελεί δείκτη της μίτωσης. Οι παρατηρήσεις αυτές υποδεικνύουν ότι η εκτοπική έκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 προκαλεί επαναπυροδότηση των αφετηριών αντιγραφής του DNA, κατά τη διάρκεια του ίδιου κυτταρικού κύκλου. Επιπλέον διαπιστώθηκε ότι υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 επηρεάζει κυρίως τις αφετηρίες αντιγραφής που πυροδοτούνται στην πρώιμη φάση S (Vaziri et al., 2003). Η επαναντιγραφή του γονιδιώματος, που προκαλούν τα υψηλά επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1, θεωρείται ότι οφείλεται στην επαναδειοδότηση των αφετηριών της αντιγραφής του DNA. Παρ όλ αυτά, πρόσφατη μελέτη αποκάλυψε ότι η εξωγενής υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 δύναται να προκαλέσει επανέναρξη της αντιγραφής του DNA και με έμμεσο τρόπο οδηγώντας στη σταθεροποίηση των επιπέδων έκφρασης του ενδογενούς παράγοντα στη φάση S (Teer and Dutta, 2008). Συγκεκριμένα, η διαμόλυνση κυττάρων με μεταλλάγματα της πρωτεΐνης Cdt1, τα οποία δεν αλληλεπιδρούν με τις πρωτεΐνες MCM, οδηγεί σε επαναντιγραφή του γονιδιώματος. Θεωρείται πιθανό ότι η εξωγενής πρωτεΐνη Cdt1 αλληλεπιδρά και δεσμεύει τον παράγοντα PCNA και τις CDKs

39 1. Εισαγωγή με αποτέλεσμα η ενδογενής Cdt1 να παραμένει ενεργή και να προκαλεί επανέναρξη της αντιγραφής του DNA (Teer and Dutta, 2008). Εκτός από την υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1, αντίστοιχο ερευνητικό ενδιαφέρον παρουσιάζει η διερεύνηση της επίδρασης της καταστολής της έκφρασης της Geminin, η οποία αποτελεί αναστολέα της πρωτεΐνης Cdt1 στα μετάζωα. Η αποσιώπηση της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin στη Drosophila οδηγεί στην εμφάνιση μεγάλων κυττάρων με γενετικό υλικό περισσότερο από 4n λόγω επαναπυροδότησης των αφετηριών της αντιγραφής (Ding and MacAlpine, 2010; Mihaylov et al., 2002). Η διερεύνηση πιθανών γονιδιωματικών αλληλουχιών με μεγαλύτερη ευαισθησία ως προς την επανέναρξη της αντιγραφής του DNA αποκάλυψε ότι η απουσία της Geminin έχει ως αποτέλεσμα την επαναπυροδότηση αφετηριών της αντιγραφής που βρίσκονται σε ετεροχρωματινικές περιοχές (Ding and MacAlpine, 2010). Αντίστοιχος υπερδιπλασιασμός του γονιδιώματος μετά από αποσιώπηση της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin καταδείχτηκε και στις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές HCT116 και U2OS (Melixetian et al., 2004; Zhu et al., 2004). Ο μερικός υπερδιπλασιασμός του γονιδιώματος, που παρατηρείται απουσία της Geminin, συμβαίνει ανεξάρτητα από την ύπαρξη λειτουργικού ή μη p53 και έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του σημείου ελέγχου της G2/M και την διακοπή του κυτταρικού κύκλου πριν τη μίτωση (Lin and Dutta, 2007; Melixetian et al., 2004; Zhu et al., 2004). Επίσης, σε αντίθεση με τα πειράματα στη Drosophila, στις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές δεν διαπιστώθηκε μεγαλύτερη ευαισθησία κάποιων χρωμοσωματικών περιοχών στην απουσία της Geminin καθώς η επαναντιγραφή του γονιδιώματος αφορούσε εξίσου γονιδιωματικές περιοχές που αντιγράφονται στην πρώιμη και στην προχωρημένη φάση S (Klotz-Noack et al., 2012). Επιπλέον η επανέναρξη της αντιγραφής του DNA απουσία της πρωτεΐνης Geminin απαιτεί την ύπαρξη των παραγόντων Cdt1 και Cdc6, καθώς ταυτόχρονη αποσιώπηση είτε των πρωτεϊνών Cdt1 και Geminin είτε των Cdc6 και Geminin δεν οδηγεί σε υπερδιπλασιασμό του γονιδιώματος (Melixetian et al., 2004; Zhu et al., 2004). Πρόσφατη μελέτη στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά U2OS προσδιόρισε τον μοριακό μηχανισμό, βάσει του οποίου η καταστολή της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin οδηγεί σε υπερδιπλασιασμό του γονιδιώματος (Klotz-Noack et al., 2012). Συγκεκριμένα, διαπιστώθηκε ότι η επαναντιγραφή του DNA απουσία της Geminin συμβαίνει στη φάση G2. Προτείνεται ότι φυσιολογικά στη φάση αυτή η παρουσία της Geminin είναι σημαντική για να διατηρεί ανενεργή την πρωτεΐνη Cdt1, της οποίας τα επίπεδα ξεκινούν να αυξάνονται. Η καταστολή της έκφρασης της Geminin οδηγεί στην απελευθέρωση του παράγοντα Cdt1 και την μικρού βαθμού επαναντιγραφή του γονιδιώματος, η οποία προκαλεί την ενεργοποίηση του σημείου ελέγχου στη G2/M. Η επακόλουθη διακοπή του κυτταρικού κύκλου και συσσώρευση των κυττάρων στη φάση G2 έχει ως αποτέλεσμα τη μαζική επαναντιγραφή του DNA μέσω του παράγοντα Cdt1 και την επιδείνωση του υπερδιπλασιασμού του γονιδιώματος (Klotz-Noack et al., 2012). Επιπλέον η αποσιώπηση της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin έχει ως αποτέλεσμα τον υπερδιπλασιασμό των κεντροσωμάτων. Ο μοριακός μηχανισμός αυτής της παρατήρησης δεν έχει αποσαφηνιστεί. Ενδέχεται να οφείλεται στη συσσώρευση των κυττάρων στη φάση G2 λόγω της ενεργοποίησης του σημείου ελέγχου της G2/M που προκαλεί η απουσία της πρωτεΐνης Geminin (Tachibana et al., 2005b)

40 1. Εισαγωγή Συμπερασματικά, η απορρύθμιση του λόγου των επιπέδων έκφρασης των παραγόντων Cdt1 και Geminin, είτε μέσω υπερέκφρασης του παράγοντα Cdt1 είτε μέσω καταστολής της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin, έχει ως αποτέλεσμα τον υπερδιπλασιασμό του γονιδιώματος λόγω επαναπυροδότησης των αφετηριών αντιγραφής του DNA. Ενδιαφέρουσα παρατήρηση αποτελεί ο ενδογενής μηχανισμός που διαφαίνεται ότι έχουν αναπτύξει τα κύτταρα προκειμένου να αντιμετωπίσουν την πιθανή διαταραχή της ισορροπίας των επιπέδων των πρωτεϊνών Cdt1 και Geminin. Έχει δειχθεί ότι η εξωγενής υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 στην ανθρώπινη κυτταρική σειρά H1299 είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση των επιπέδων της ενδογενούς πρωτεΐνης Geminin (Vaziri et al., 2003). Αντιστοίχως, η καταστολή της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin στη Drosophila οδηγεί σε μείωση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 (Mihaylov et al., 2002) Ο παράγοντας Cdt1 διαθέτει ογκογόνο δράση Δεδομένου ότι η υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 συνεπάγεται γονιδιωματική αστάθεια, η οποία αποτελεί βασικό χαρακτηριστικό της ογκογένεσης, θεωρήθηκε πιθανή η άμεση συμβολή του παράγοντα Cdt1 στην κακοήθη εξαλλαγή των κυττάρων. Η υπόθεση αυτή έχει διερευνηθεί σε αρκετές μελέτες τόσο σε κυτταρικό επίπεδο όσο και σε ζωντανούς οργανισμούς (Petropoulou et al., 2008). Καταρχάς, αυξημένα επίπεδα έκφρασης του παράγοντα Cdt1 έχουν διαπιστωθεί σε διάφορες ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές (Xouri et al., 2004). Η πρώτη ένδειξη για την ογκογόνο δυνατότητα του παράγοντα Cdt1 προήλθε από παρατήρηση της ενεργοποίησης του αντίστοιχου γονιδίου μετά από τυχαία ενσωμάτωση ρετροϊικού DNA στο γονιδίωμα της αθανατοποιημένης ερυθροειδικής κυτταρικής σειράς EB-PE. Η ογκογόνος δράση της πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε, όταν διαπιστώθηκε η ανάπτυξη όγκων σε ανοσοκατασταλμένους ποντικούς που είχαν διαμολυνθεί με κύτταρα NIH3T3 που εκφράζουν σταθερά τον παράγοντα Cdt1 (Arentson et al., 2002). Η ίδια ερευνητική ομάδα διερεύνησε περαιτέρω την άμεση λειτουργική επίπτωση της απορρύθμισης της έκφρασης του παράγοντα Cdt1 δημιουργώντας διαγονιδιακούς ποντικούς που εξέφραζαν ιστοειδικά την πρωτεΐνη Cdt1 στα T κύτταρα (Seo et al., 2005a). Αν και η παρατήρηση των θύμων αδένων των ζώων αυτών δεν κατέδειξε κάποιου είδους πρόβλημα, η διασταύρωσή τους με ποντικούς χωρίς λειτουργικό p53 οδήγησε στην απόκτηση απογόνων με λεμφοβλαστικό λέμφωμα. Τα θυμοκύτταρα των ζώων αυτών παρουσίαζαν πολλαπλές και έντονες χρωμοσωματικές ανωμαλίες. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι η υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 απουσία λειτουργικού p53 έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση γονιδιωματικής αστάθειας και πιθανώς συμβάλλει με αυτό τον τρόπο στην κακοήθη εξαλλαγή των κυττάρων (Seo et al., 2005a). Η in vivo ογκογόνος ενεργότητα της πρωτεΐνης Cdt1 επιβεβαιώθηκε μέσω της αξιολόγησης της διηθητικής ικανότητας κυττάρων που υπερεκφράζουν τον παράγοντα αυτό (Liontos et al., 2007). Συγκεκριμένα, στη μελέτη αυτή αρχικά πραγματοποιήθηκε διαμόλυνση κυττάρων U2OS με τις πρωτεΐνες Cdt1 ή Cdc6, η οποία είχε ως αποτέλεσμα τον υπερδιπλασιασμό του γονιδιώματος. Η επαναντιγραφή του γονιδιώματος που προκαλούν τα αυξημένα επίπεδα έκφρασης των

41 1. Εισαγωγή παραγόντων Cdt1 και Cdc6 διαπιστώθηκε ότι επάγει την ενεργοποίηση του μηχανισμού απόκρισης σε βλάβη στο DNA και την καθοδήγηση των κυττάρων προς γήρανση ή απόπτωση. Ακολούθησε μελέτη των επιπτώσεων της παρατεταμένης υπερέκφρασης του παράγοντα Cdt1 στην ίδια κυτταρική σειρά. Η παρακολούθηση των κυττάρων μετά από 30 ημέρες συνεχούς υπερέκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 οδήγησε στην εμφάνιση ανθεκτικών κυτταρικών πληθυσμών, οι οποίοι διέφυγαν των μηχανισμών απόπτωσης και γήρανσης. Τα κύτταρα αυτά παρουσιάζουν μεγαλύτερη διηθητική ικανότητα σε σύγκριση με τον πατρικό κλώνο. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι η γονιδιωματική αστάθεια που προκαλεί η υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 ενδέχεται να οδηγεί στην ανάπτυξη κλώνων με πλεονέκτημα επιλογής. Επιπλέον η διαμόλυνση ανοσοκατασταλμένων ποντικών με τους κυτταρικούς αυτούς κλώνους είχε ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη όγκων στα ζώα αυτά (Liontos et al., 2007). Η πιθανή συμβολή της υπερέκφρασης του παράγοντα Cdt1 στην κακοήθη εξαλλαγή των κυττάρων έχει μελετηθεί και σε περιπτώσεις ανθρώπινων όγκων. Συγκεκριμένα, αυξημένα επίπεδα έκφρασης των παραγόντων Cdt1 και Cdc6 στην περιοχή του όγκου σε σύγκριση με τον παρακείμενο μη νεοπλασματικό ιστό έχουν διαπιστωθεί σε κλινικά δείγματα μη-μικροκυτταρικού όγκου του πνεύμονα (Karakaidos et al., 2004). Επιπλέον στα ίδια δείγματα διαπιστώθηκε υπερέκφραση του μεταγραφικού παράγοντα E2F-1, η οποία συσχετίστηκε στατιστικώς σημαντικά με την αντίστοιχη υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1. Η παρατήρηση αυτή υποδεικνύει ότι πιθανώς η παρατηρούμενη υπερέκφραση του Cdt1 οφείλεται εν μέρει στα αυξημένα επίπεδα έκφρασης του παράγοντα E2F-1. Ακολούθησε υποκατηγοριοποίηση των κλινικών δειγμάτων με βάση την κατάσταση του γονιδίου του p53. Η στατιστική ανάλυση αποκάλυψε την ύπαρξη σημαντικής συσχέτισης των επιπέδων έκφρασης του παράγοντα Cdt1 με την αυξημένη ικανότητα πολλαπλασιασμού των κυττάρων των όγκων καθώς και με την κατάσταση πολυπλοειδίας μόνο στις περιπτώσεις που είχαν μεταλλαγμένο p53. Επιπλέον, σε αυτή την κατηγορία των δειγμάτων, η υπερέκφραση των παραγόντων Cdt1 και Cdc6 αποτελεί δείκτη άσχημης πρόγνωσης (Karakaidos et al., 2004). Η παρατήρηση αυτή έρχεται σε συμφωνία με προηγούμενη μελέτη (Vaziri et al., 2003) και καταδεικνύει ότι η απορρύθμιση της έκφρασης των παραγόντων αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA Cdt1 και Cdc6 επάγει την ενεργοποίηση του σηματοδοτικού μονοπατιού του p53. Στην περίπτωση που το p53 είναι μεταλλαγμένο, τα κύτταρα δεν οδηγούνται προς απόπτωση αλλά συνεχίζουν να πολλαπλασιάζονται με αποτέλεσμα την επεκταμένη υπεραντιγραφή του γονιδιώματος και την εμφάνιση χρωμοσωματικής αστάθειας, η οποία θεωρείται πιθανό ότι συμβάλλει στην ογκογένεση. Τα επίπεδα έκφρασης των παραγόντων Cdt1 και Cdc6 έχουν προσδιορισθεί και σε περιπτώσεις όγκων πνεύμονα, παχέος εντέρου και λάρυγγα (Liontos et al., 2007). Από τη μελέτη αυτή προέκυψε ότι η υπερέκφραση των Cdt1 και Cdc6 αποτελεί πρώιμο γεγονός κατά την εξέλιξη της καρκινογένεσης, καθώς διαπιστώνεται από το στάδιο της δυσπλασίας. Η παρατήρηση αυτή ενισχύει περαιτέρω την υπόθεση της ογκογόνου δυνατότητας του παράγοντα Cdt1 και υποδεικνύει ότι πιθανώς η εξέλιξη της δυσπλασίας σε κακοήθεια αποτελεί λειτουργική επίπτωση της απορρύθμισης της έκφρασης των παραγόντων αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA (Liontos et al., 2007)

42 1. Εισαγωγή Εικόνα 1.13: Η υπερέκφραση των παραγόντων αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA Cdt1 και Cdc6 αποτελεί πρώιμο γεγονός κατά την εξέλιξη της καρκινογένεσης. Ο ανοσοϊστοχημικός προσδιορισμός της έκφρασης των Cdt1 και Cdc6 σε φυσιολογικό ιστό, σε προκαρκικινές αλλοιώσεις (υπερπλασία και δυσπλασία) καθώς και στην περιοχή του όγκου δειγμάτων καρκίνου πνεύμονα και λάρυγγα αποκάλυψε την ύπαρξη αυξημένων επιπέδων έκφρασης των παραγόντων αυτών από το στάδιο της δυσπλασίας (Liontos et al., 2007) Η υπεραδειοδότηση των αφετηριών αντιγραφής του DNA αποτελεί αιτία αντιγραφικού στρες Το αντιγραφικό στρες μπορεί να προκύψει από μια σειρά διαφορετικών παραγόντων, οι οποίοι οδηγούν στην αναστολή της εξέλιξης της αντιγραφής του DNA. Μεταξύ των παραγόντων αυτών συμπεριλαμβάνονται η μη επαρκής έκφραση ή η παρεμπόδιση της ενεργότητας πρωτεϊνών που απαιτούνται για την σύνθεση των dntps, η υποαδειοδότηση των αφετηριών αντιγραφής του DNA, η υπεραντιγραφή του γονιδιώματος λόγω της επαναπυροδότησης των αφετηριών της αντιγραφής του DNA περισσότερες από μία φορές στη φάση S του ίδιου κυτταρικού κύκλου, η ενεργοποίηση ογκογονιδίων που οδηγούν σε γρήγορη εξέλιξη των κυτταρικών κύκλων, η μειωμένη ταχύτητα εξέλιξης της αντιγραφής του DNA, η διακοπή της αντιγραφής λόγω χημικών, καθώς και η δημιουργία βλάβης στο DNA. Επιπλέον, διακοπή της εξέλιξης της αντιγραφής του DNA ενδέχεται να προκληθεί σε περίπτωση ύπαρξης δευτεροταγών δομών ή σταθερά προσδεδεμένων πρωτεϊνών σε αυτό, τα οποία έχουν ως αποτέλεσμα την αδυναμία προόδου των αντιγραφικών διχάλων (Burhans and Weinberger, 2007). Σημαντική αιτία εκδήλωσης αντιγραφικού στρες αποτελεί η επαναντιγραφή του γονιδιώματος λόγω συνεχούς επαναπυροδότησης των αφετηριών αντιγραφής του DNA κατά τη φάση S. Αρκετές μελέτες έχουν καταδείξει ότι η υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 ή η αποσιώπηση της έκφρασης της Geminin έχουν ως αποτέλεσμα την επαναδειοδότηση και συνεπώς την επανενεργοποίηση των αφετηριών και την επανέναρξη της αντιγραφής του DNA (Arias and Walter, 2005; Ding and MacAlpine, 2010; Li and Blow, 2005; Melixetian et al., 2004; Mihaylov et al., 2002; Vaziri et al., 2003; Zhu et al., 2004). Το αποτέλεσμα της επαναντιγραφής του DNA εξαρτάται από τη συχνότητα επαναπυροδότησης των αφετηριών της αντιγραφής (Blow and Gillespie, 2008). Σε περίπτωση που οι αφετηρίες δεν επανενεργοποιούνται συχνά, αναμένεται η επαναντιγραφή σε μικρό βαθμό, μικρών και περιορισμένων τμημάτων DNA. Η

43 1. Εισαγωγή επαναπυροδότηση των ίδιων αφετηριών αντιγραφής έχει ως αποτέλεσμα τη δημιουργία νέων αντιγραφικών διχάλων, η κίνηση των οποίων μετά από λίγο σταματάει, με αποτέλεσμα τη διακοπή της αντιγραφής. Στην περίπτωση που η επαναπυροδότηση των αφετηριών αντιγραφής πραγματοποιείται πολύ συχνά, ενδέχεται να προκληθεί επαναλαμβανόμενη και εκτεταμένη αντιγραφή των αντίστοιχων γονιδιωματικών περιοχών. Οι καινούργιες αντιγραφικές διχάλες που δημιουργούνται με κάθε νέα πυροδότηση των αφετηριών πορεύονται πίσω από τις υπάρχουσες διχάλες (Blow and Gillespie, 2008). Μελέτη στο Xenopus προτείνει ότι οι νέες διχάλες μετακινούνται κατά μήκος του DNA και συγκρούονται με τις προπορευόμενες διχάλες, με αποτέλεσμα τη διακοπή της κίνησής τους και την αναστολή της εξέλιξης της αντιγραφής του DNA (Davidson et al., 2006). Στην επικείμενη σύγκρουση των διχάλων θεωρείται ότι συμβάλλουν τα χαρακτηριστικά του νεοσυντιθέμενου DNA. Συγκεκριμένα, έχει δειχθεί ότι το νεοαντιγραφόμενο DNA παρουσιάζει πιο χαλαρή δομή σε σύγκριση με την συμπυκνωμένη χρωματίνη (Milutinovic et al., 2002). Εικόνα 1.14: Πιθανές συνέπειες της επανέναρξης της αντιγραφής του DNA. Η επαναπυροδότηση των αφετηριών αντιγραφής του DNA οδηγεί στη δημιουργία νέων διχάλων μέσα στις ήδη υπάρχουσες διχάλες αντιγραφής (a). Στην περίπτωση που η συχνότητα επανενεργοποίησης των αφετηριών είναι μεγάλη, οι νέες διχάλες αναμένεται να συγκρουστούν με τις προϋπάρχουσές τους με αποτέλεσμα τη διακοπή εξέλιξης της αντιγραφής του DNA (b,c). Το επαναντιγραμμένο τμήμα του DNA (d) ενδέχεται να ανασυνδυαστεί με αποτέλεσμα τη δημιουργία είτε κυκλικών εξωχρωμοσωματικών μορίων (e) είτε ενδοχρωμοσωματικών διπλασιασμών (f) (Blow and Gillespie, 2008)

44 1. Εισαγωγή Η φύση αυτή του νεοσυντιθέμενου DNA θεωρείται ότι ευνοεί τη γρήγορη μετακίνηση των διχάλων κατά μήκος του, γεγονός που διευκολύνει τη σύγκρουσή τους με τις προπορευόμενες διχάλες αντιγραφής. Αποτέλεσμα της σύγκρουσης των διχάλων είναι η πρόκληση διπλών κατατμήσεων στο DNA και η δημιουργία μη φυσιολογικών γραμμικών δομών DNA. Θεωρείται πιθανό ότι οι ανώμαλες αυτές δομές του DNA αναγνωρίζονται από το σύστημα απόκρισης σε βλάβη στο DNA. Τα επαναντιγραμμένα αυτά τμήματα του DNA ενδέχεται είτε να αποκοπούν και να δώσουν γένεση σε εξωχρωμοσωματικά κυκλικά μόρια είτε να ανασυνδυαστούν με αποτέλεσμα τη δημιουργία περιορισμένου ενδοχρωμοσωματικού διπλασιασμού. Η συνέχιση αυτού του είδους χρωμοσωματικής ενίσχυσης στις επόμενες κυτταρικές γενεές μπορεί να οδηγήσει σε σημαντική γονιδιωματική αστάθεια (Blow and Gillespie, 2008). Η πρόκληση βλάβης στο DNA έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση συγκεκριμένων σηματοδοτικών μονοπατιών. Συγκεκριμένα, ενεργοποιούνται παράλληλα δύο διαφορετικά σηματοδοτικά μονοπάτια, κάθε ένα από τα οποία επάγεται από διαφορετικού τύπου βλάβη στο DNA. Παρ όλ αυτά και τα δύο έχουν ως κοινό αποτέλεσμα την αναστολή της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου, την επαγωγή των μηχανισμών επιδιόρθωσης των βλαβών του DNA και, σε περίπτωση εκτεταμένης βλάβης, την απόπτωση των κυττάρων. Πιο αναλυτικά, η ιονίζουσα ακτινοβολία καθώς και οποιοσδήποτε παράγοντας προκαλεί διπλές θραύσεις στο DNA, επάγουν την κινάση ATM, η οποία φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί την κινάση Chk2. Η υπεριώδης ακτινοβολία καθώς και μια σειρά άλλων παραγόντων επάγουν την κινάση ATR, η οποία με τη σειρά της φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί την κινάση Chk2 (Cook, 2009). Η διακοπή της κίνησης των αντιγραφικών διχάλων που προκαλεί η επανενεργοποίηση της αντιγραφής του DNA συνήθως συνοδεύεται από τη συσσώρευση μονόκλωνων τμημάτων DNA λόγω του αποσυντονισμού της δράσης των αντιγραφικών ελικασών και της DNA πολυμεράσης. Η πρωτεΐνη RPA αναγνωρίζει και προσδένεται στο μονόκλωνο DNA και διαμεσολαβεί την ενεργοποίηση μιας σειράς διαφορετικών παραγόντων, με στόχο την επιδιόρθωση του προβλήματος και την ενεργοποίηση των αντίστοιχων σηματοδοτικών μονοπατιών και σημείων ελέγχου, μεταξύ των οποίων και το αντίστοιχο της κινάσης ATR (Byun et al., 2005; MacDougall et al., 2007). Στην περίπτωση που οι αντιγραφικές διχάλες που έχουν ακινητοποιηθεί δεν ξαναξεκινήσουν, ενδέχεται να δημιουργηθούν ασυνήθιστες δομές DNA με τελικό αποτέλεσμα την πρόκληση διπλών κατατμήσεων στο DNA. Συνεπώς, η ακινητοποίηση των αντιγραφικών διχάλων που προκαλεί η επαναπυροδότηση των αφετηριών αντιγραφής και η συνεχής επανέναρξη της αντιγραφής του DNA έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των σηματοδοτικών μονοπατιών των κινασών ATM και ATR. Η ενεργοποίηση των κινασών ATM και ATR, καθώς και των στόχων τους Chk1 και Chk2, οδηγεί στην φωσφορυλίωση του μεταγραφικού παράγοντα p53 και στην σταθεροποίηση των επιπέδων του. Ο μεταγραφικός παράγοντας p53 ελέγχει την έκφραση μιας σειράς διαφορετικών πρωτεϊνών που συμμετέχουν σε κυτταρικές διεργασίες, όπως είναι ο κυτταρικός κύκλος, η απόπτωση και η επιδιόρθωση βλαβών του DNA. Επίσης, ο παράγοντας p53 επάγει την έκφραση του παράγοντα p21, ο οποίος αποτελεί αναστολέα των CDKs (Zhao et al., 2000). Οι κινάσες Chk1 και Chk2 φωσφορυλιώνουν και

45 1. Εισαγωγή αναστέλλουν τις φωσφατάσες της οικογένειας Cdc25, των οποίων η δράση έγκειται στην αποφωσφορυλίωση και συνεπώς στην ενεργοποίηση των κινασών Cdk2 και Cdk1. Η αναστολή της ενεργότητας της Cdk1 αποτρέπει την είσοδο των κυττάρων στη μίτωση. Η παρεμπόδιση της Cdk2 αναστέλλει την πρόσδεση των παραγόντων Cdc45 και GINS στη χρωματίνη και κατ επέκταση την έναρξη της αντιγραφής του DNA. Η πρόσδεση του παράγοντα Cdc45 στις αφετηρίες της αντιγραφής του DNA παρεμποδίζεται περαιτέρω, λόγω της αναστολής του συμπλόκου κινάσης Cdc7-Dbf4 που προκαλούν οι κινάσες Chk1 και Chk2 (Costanzo et al., 2003; Heffernan et al., 2007; Liu et al., 2006). Επιπλέον η κινάση Chk1 φωσφορυλιώνει και αδρανοποιεί την κινάση Tlk1, η οποία φυσιολογικά φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί τον παράγοντα Asf1, που απαιτείται για τη συγκρότηση της χρωματίνης (Sillje and Nigg, 2001). Θεωρείται πιθανό ότι η αναστολή της κινάσης Tlk1 από την Chk1 έχει ως αποτέλεσμα την παρεμπόδιση της οργάνωσης της χρωματίνης στα σημεία που βρίσκονται οι αντιγραφικές διχάλες με αποτέλεσμα την καθυστέρηση της προόδου τους και την παρεμπόδιση της εξέλιξης της αντιγραφής του DNA (Groth et al., 2003; Krause et al., 2003). Εικόνα 1.15: Η πρόκληση βλάβης στο DNA οδηγεί στην ενεργοποίηση δύο παράλληλων σηματοδοτικών μονοπατιών, των ATM-Chk1 και ATR-Chk2, με αποτέλεσμα την αναστολή της έναρξης της αντιγραφής του DNA και της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου. Η ενεργότητα των κινασών Cdks αναστέλλεται είτε μέσω της ενεργοποίησης του p21 από τον παράγοντα p53 είτε μέσω της αδρανοποίησης της φωσφατάσης Cdc25. Επιπλέον, η έναρξη της αντιγραφής του DNA παρεμποδίζεται περαιτέρω μέσω της αδρανοποίησης του συμπλόκου κινάσης Cdc7-Dbf4. Τέλος, η κινάση Chk1 αναστέλλει την κινάση Tkl1, η οποία απαιτείται για την ενεργοποίηση του παράγοντα συγκρότησης της χρωματίνης Asf1, με αποτέλεσμα την παρεμπόδιση της προόδου της αντιγραφής του DNA (Cook, 2009)

46 1. Εισαγωγή Η ενεργοποίηση των σηματοδοτικών μονοπατιών απόκρισης σε βλάβη στο DNA περιορίζει την πρόοδο της καρκινογένεσης Η πρόκληση βλάβης στο DNA έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση πολλών διαφορετικών σηματοδοτικών μονοπατιών (DNA Damage Response, DDR), μέσω των οποίων επιτυγχάνεται ο εντοπισμός της βλάβης και η προσέλκυση μιας σειράς διαφορετικών παραγόντων, με στόχο την επιδιόρθωσή της. Παράλληλα ενεργοποιούνται τα αντίστοιχα σημεία ελέγχου, τα οποία αναστέλλουν την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου μέχρι να ολοκληρωθεί η αποκατάσταση της βλάβης. Στην περίπτωση που η βλάβη είναι εκτεταμένη και δεν επιδέχεται επιδιόρθωσης, η εξάπλωσή της περιορίζεται καθώς το σύστημα DDR οδηγεί τα αντίστοιχα κύτταρα είτε σε γήρανση, με αποτέλεσμα να αναστέλλεται μόνιμα ο πολλαπλασιασμός τους, είτε σε απόπτωση. Η σημασία των σηματοδοτικών μονοπατιών του συστήματος DDR καταδεικνύεται από το γεγονός ότι η απορρύθμιση της λειτουργίας τους σχετίζεται με εμφάνιση διαφόρων γενετικών ασθενειών, μεταξύ των οποίων συμπεριλαμβάνονται η σοβαρή ανοσοανεπάρκεια, νευροεκφυλιστικά σύνδρομα και ο καρκίνος (Bartek et al., 2007). Τα τελευταία χρόνια μια σειρά από ερευνητικά δεδομένα προτείνουν την αξία της ενεργοποίησης του συστήματος DDR ως μοριακό φραγμό στην εξέλιξη της καρκινογένεσης. Η πρώτη ένδειξη για την υπόθεση αυτή προήλθε από την παρατήρηση ότι πολλές καρκινικές κυτταρικές σειρές, ιδιαίτερα κάποιες με μη λειτουργικό p53, καθώς και κάποια κλινικά δείγματα όγκων μαστού και πνεύμονα παρουσιάζουν συνεχή ενεργοποίηση των σηματοδοτικών μονοπατιών απόκρισης σε βλάβη στο DNA (DiTullio et al., 2002). Σημειώνεται ότι τα κλινικά δείγματα προέκυψαν από βιοψίες των όγκων που λήφθησαν πριν την υποβολή των ασθενών σε χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία, γεγονός που υποδεικνύει ότι η επαγωγή των μοριακών μονοπατιών απόκρισης σε βλάβη στο DNA δεν οφείλεται στη δημιουργία βλάβης λόγω της θεραπείας (DiTullio et al., 2002). Ακολούθησε μια σειρά από διαφορετικές μελέτες, οι οποίες αποκάλυψαν ότι σε αρκετές περιπτώσεις κλινικών καρκινικών δειγμάτων διαπιστώνεται συνεχής ενεργοποίηση του συστήματος DDR στην περιοχή του όγκου αλλά όχι στον παρακείμενο φυσιολογικό ιστό. Αυτό διαπιστώθηκε από την παρουσία υψηλού ποσοστού θετικών κυττάρων ως προς την έκφραση παραγόντων που συμμετέχουν στα αντίστοιχα σηματοδοτικά μονοπάτια, όπως είναι οι κινάσες ATM, Chk1, Chk2, η φωσφορυλιωμένη ιστόνη H2AX, το μόριο p53, καθώς και οι χαρακτηριστικές υποκυτταρικές υποδομές που δημιουργεί η πρωτεΐνη 53BP1 (Bartkova et al., 2005a; Bartkova et al., 2005b; Bartkova et al., 2006; Di Micco et al., 2006; Gorgoulis et al., 2005). Ο μέγιστος βαθμός ενεργοποίησης των μηχανισμών απόκρισης σε βλάβη στο DNA εντοπίζεται ήδη από τα πρώιμα στάδια της κακοήθους εξαλλαγής των κυττάρων. Καθώς προχωρεί η πορεία της καρκινογένεσης, η ενεργοποίηση του DDR, αν και σε μερικές περιπτώσεις παρέμενε, στα περισσότερα δείγματα διαπιστώθηκε ότι ήταν ασθενέστερη, γεγονός που συμφωνεί με την υπόθεση ότι η απορρύθμιση και η μη σωστή λειτουργία του συστήματος DDR συμβάλλει στην εξέλιξη της καρκινογένεσης (Bartkova et al., 2005b; Bartkova et al., 2006; Di Micco et al., 2006; Fan et al., 2006; Gorgoulis et al., 2005; Nuciforo et al., 2007). Επιπλέον, από τις μελέτες αυτές, καταδείχθηκε ότι η ενεργοποίηση του συστήματος DDR στις προκαρκινικές

47 1. Εισαγωγή προδιηθητικές αλλοιώσεις προϋπάρχει της διαπίστωσης μεταλλάξεων ή της απουσίας έκφρασης παραγόντων που συμμετέχουν στα σηματοδοτικά μονοπάτια του DDR, όπως είναι τα μόρια ATM, Chk2 και p53. Η παρατήρηση αυτή υποδεικνύει ότι η ενεργοποίηση του DDR στα αρχικά στάδια της κακοήθους εξαλλαγής των κυττάρων ασκεί πίεση επιλογής ως προς την ύπαρξη μεταλλάξεων των παραγόντων του DDR που συμβάλλουν στην παράκαμψη του φραγμού που επιβάλλει το σύστημα DDR και συνεπώς στην συνέχιση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Bartkova et al., 2005b; Gorgoulis et al., 2005). Επίσης έχει δειχθεί ότι η υπερέκφραση ογκογονιδίων όπως των ras, mos, Cdc6, κυκλίνη Ε και Stat3 επάγει την κυτταρική γήρανση (Bartkova et al., 2006; Di Micco et al., 2006). Στα πειράματα αυτά η αποσιώπηση της έκφρασης της κινάσης ATM είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της εμφάνισης του φαινοτύπου γήρανσης, γεγονός που υποδηλώνει ότι η επαγόμενη από την υπερέκφραση των ογκογονιδίων γήρανση απαιτεί τη σωστή λειτουργία των σηματοδοτικών μονοπατιών του συστήματος DDR. Επιπλέον, έχει διαπιστωθεί συσχέτιση της έκφρασης παραγόντων που συμμετέχουν στο μηχανισμό του DDR με την εμφάνιση δεικτών ετεροχρωματινοποίησης, που είναι χαρακτηριστικοί της κυτταρικής γήρανσης, σε προκαρκινικές αλλοιώσεις κλινικών δειγμάτων όγκων ουροδόχου κύστης και εντέρου (Bartkova et al., 2006). Ενδιαφέρον ερώτημα για αρκετές ερευνητικές ομάδες αποτέλεσε η αιτία ενεργοποίησης του συστήματος DDR στις προκαρκινικές αλλοιώσεις. Σημαντικό παράγοντα πρόκλησης του συστήματος DDR διαπιστώθηκε ότι συνιστά το αντιγραφικό στρες, στο οποίο συμπεριλαμβάνονται η διακοπή της κίνησης των αντιγραφικών διχάλων και η δημιουργία διπλών κατατμήσεων στο DNA, που οφείλεται στην ενεργοποίηση ογκογονιδίων. Αρχικά η υπόθεση αυτή διατυπώθηκε λόγω της παρατήρησης ότι η υπερέκφραση ογκογονιδίων σε κυτταρικές σειρές είχε ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση των σηματοδοτικών μονοπατιών των κινασών ATM και ATR, την ανίχνευση μονόκλωνων τμημάτων DNA στα οποία δεσμευόταν η πρωτεΐνη RPA καθώς και την καθυστέρηση της εξέλιξης της φάσης S του κυτταρικού κύκλου (Bartkova et al., 2005b; Gorgoulis et al., 2005). Ακολούθησαν ερευνητικές μελέτες, οι οποίες επιβεβαίωσαν τη συμβολή του αντιγραφικού στρες στην ενεργοποίηση του συστήματος DDR (Bartkova et al., 2006; Di Micco et al., 2006). Συγκεκριμένα, διαπιστώθηκε ότι η υπερέκφραση ογκογονιδίων είχε ως αποτέλεσμα την εμφάνιση χαρακτηριστικών υποκυτταρικών υποδομών, που σχετίζονται με την ενεργοποίηση του DDR, τα οποία συνεντοπίζονταν με τις υποπεριοχές σύνθεσης του DNA σε κύτταρα που διήνυαν την φάση S του κυτταρικού κύκλου. Επίσης οι μελέτες αυτές κατέδειξαν ότι προαπαιτούμενη προϋπόθεση της δημιουργίας διπλών κατατμήσεων στο DNA λόγω της υπερέκφρασης των ογκογονιδίων ήταν η παρουσία των κυττάρων στη φάση S (Bartkova et al., 2006; Di Micco et al., 2006). Εκτός από το αντιγραφικό στρες θεωρείται πιθανή η συμβολή κι άλλων παραγόντων στην ενεργοποίηση του DDR στα πρώιμα στάδια της κακοήθους εξαλλαγής των κυττάρων. Μεταξύ αυτών συγκαταλέγεται η μείωση του μήκους των τελομερών, η οποία έχει δειχθεί ότι γίνεται αντιληπτή από τα κύτταρα σαν διπλές κατατμήσεις στο DNA (d'adda di Fagagna et al., 2003; Takai et al., 2003), καθώς και το οξειδωτικό στρες, το οποίο επάγεται τόσο από την υπερέκφραση ογκογονιδίων όσο και σε κύτταρα που βρίσκονται σε γήρανση (Mallette and Ferbeyre, 2007)

48 1. Εισαγωγή Τα παραπάνω δεδομένα προτείνουν ένα μοντέλο εξέλιξης της καρκινογένεσης από τις πρώιμες προκαρκινικές αλλοιώσεις. Βάσει του μοντέλου αυτού, στα αρχικά στάδια της κακοήθους εξαλλαγής των κυττάρων η απορρύθμιση της έκφρασης ογκογονιδίων οδηγεί στην εμφάνιση αντιγραφικού στρες. Το αντιγραφικό στρες, είτε απευθείας είτε μέσω της δημιουργίας διπλών κατατμήσεων στο DNA, ενεργοποιεί τα σηματοδοτικά μονοπάτια απόκρισης σε βλάβη στο DNΑ, με αποτέλεσμα είτε την παροδική αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων είτε την ώθησή τους προς απόπτωση ή γήρανση. Παράλληλα θεωρείται πιθανό ότι η μείωση του μήκους των τελομερών καθώς και η υποξία μπορεί να συμβάλλουν περαιτέρω στην εμφάνιση γονιδιωματικής αστάθειας και στην ενεργοποίηση του συστήματος DDR. Η συνεχής άσκηση επιλογικής πίεσης στα κύτταρα ενδέχεται να οδηγήσει στην ανάπτυξη ανθεκτικών κλώνων κυττάρων που παρουσιάζουν απορρύθμιση του συστήματος DDR με αποτέλεσμα τη συνέχιση του πολλαπλασιασμού τους και τη δημιουργία του όγκου (Bartkova et al., 2005b; Gorgoulis et al., 2005; Halazonetis et al., 2008). Εικόνα 1.16: Προτεινόμενο μοντέλο της ενεργοποίησης και λειτουργίας του συστήματος DDR ως φραγμού στην εξέλιξη της καρκινογένεσης. Η πρόκληση αντιγραφικού στρες λόγω της υπερέκφρασης ογκογονιδίων στα πρώιμα προδιηθητικά στάδια της καρκινογένεσης έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση διπλών κατατμήσεων στο DNA, τη γονιδιωματική αστάθεια και την ενεργοποίηση του συστήματος DDR, μέσω του οποίου τα κύτταρα οδηγούνται προς απόπτωση ή γήρανση. Η μείωση του μήκους των τελομερών και η υποξία μπορεί να συμβάλλουν περαιτέρω στη γονιδιωματική αστάθεια, στη δημιουργία διπλών κατατμήσεων στο DNA και στην ενεργοποίηση του DDR. Η πίεση επιλογής που εφαρμόζεται στα κύτταρα ως προς την απορρύθμιση του συστήματος DDR ενδέχεται να οδηγήσει την ανάπτυξη κλώνων κυττάρων που παρουσιάζουν μεταλλάξεις σε παράγοντες του DDR με τελικό αποτέλεσμα την υπερπήδηση των φραγμών της απόπτωσης και της γήρανσης και τελικά την εξέλιξη και ανάπτυξη του όγκου (Gorgoulis et al., 2005)

49 1. Εισαγωγή 1.3 Βιοδείκτες των όγκων Οι βιοδείκτες αποτελούν μόρια τα οποία ανιχνεύονται σε βιολογικά δείγματα και συσχετίζονται με την ύπαρξη και την εξέλιξη συγκεκριμένης νόσου. Η χρησιμότητά τους στην καθημερινή κλινική πράξη είναι ιδιαίτερα σημαντική, καθώς συμβάλλουν στη διάγνωση και στη σταδιοποίηση της νόσου, στην επιλογή της κατάλληλης θεραπείας, στην παρακολούθηση της απόκρισης στη θεραπεία καθώς και στην εκτίμηση της πρόγνωσης (Ludwig and Weinstein, 2005). Σημαντική κατηγορία βιοδεικτών συνιστούν οι δείκτες κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Οι βιοδείκτες αυτοί χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό του ποσοστού των κυττάρων που πολλαπλασιάζονται, παρέχοντας σημαντικές πληροφορίες για την επιθετικότητα των όγκων και κατ επέκταση για την εκτίμηση του προσδόκιμου επιβίωσης. Επιπλέον οι βιοδείκτες κυτταρικού πολλαπλασιασμού είναι χρήσιμοι, καθώς μπορούν να συμβάλλουν στην εκτίμηση της ανταπόκρισης των όγκων στην εκάστοτε θεραπεία. Οι παράγοντες Ki67 και PCNA συνιστούν δείκτες κυτταρικού πολλαπλασιασμού με ευρεία εφαρμογή στην καθημερινή κλινική πράξη. Παρ όλ αυτά οι συγκεκριμένοι βιοδείκτες παρουσιάζουν μερικά μειονεκτήματα που καθιστούν τη χρήση τους περιοριστική. Καταρχάς, η πρωτεΐνη Ki67 δεν εκφράζεται στην αρχή της φάσης G1 και συνεπώς δεν δύναται να ταυτοποιήσει κύτταρα τα οποία επανεισέρχονται στον κυτταρικό κύκλο από τη φάση G0 στη φάση G1. Επιπλέον, η λειτουργία του παράγοντα Ki67 δεν έχει διευκρινιστεί, ενώ έχει προταθεί ότι ενδέχεται να συμμετέχει σε κυτταρικές διεργασίες που δεν σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο, όπως είναι η βιοσύνθεση των ριβοσωμάτων. Όσον αφορά την πρωτεΐνη PCNA, θεωρείται πιθανό ότι μπορεί να ταυτοποιεί και κύτταρα τα οποία δεν πολλαπλασιάζονται, καθώς έχει δειχθεί ότι, εκτός από την αντιγραφή, ο παράγοντας αυτός συμμετέχει και στην επιδιόρθωση του DNA (Gonzalez et al., 2005; Tachibana et al., 2005a) (De Pamphilis 2006) Οι παράγοντες αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA ως βιοδείκτες Τα τελευταία χρόνια αρκετές μελέτες έχουν προτείνει την αξία των παραγόντων αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA ως βιοδείκτες κυτταρικού πολλαπλασιασμού με μεγαλύτερη ευαισθησία και ειδικότητα από τους παράγοντες Ki67 και PCNA. Σημαντικό πλεονέκτημα των παραγόντων αυτών αποτελεί το γεγονός ότι η έκφρασή τους ρυθμίζεται αρνητικά σε κύτταρα τα οποία βρίσκονται εκτός κυτταρικού κύκλου (Xouri et al., 2004). Οι πρωτεΐνες MCM2-7 διαθέτουν μεγαλύτερη ευαισθησία από τον δείκτη Ki67. Η έκφρασή τους διατηρείται καθ όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου και ταυτοποιεί, εκτός από τον ενεργώς πολλαπλασιαζόμενο κυτταρικό πληθυσμό, τα κύτταρα τα οποία διαθέτουν αδειοδοτημένες αφετηρίες αντιγραφής του DNA και συνεπώς δύνανται ανά πάσα στιγμή να πολλαπλασιαστούν (Gonzalez et al., 2005). Όσον αφορά την πρωτεΐνη Geminin, το γεγονός ότι εκφράζεται στις φάσεις S-G2-M την καθιστά αξιόπιστο βιοδείκτη για τον προσδιορισμό του ενεργώς πολλαπλασιαζόμενου κυτταρικού κλάσματος (Gonzalez et al., 2005). Η αξιολόγηση του συνδυασμού της έκφρασης των πρωτεϊνών

50 1. Εισαγωγή MCM2-7, Geminin και Ki67 παρέχει πιο ακριβείς πληροφορίες σχετικά με την ικανότητα πολλαπλασιασμού των κυττάρων των όγκων. Συγκεκριμένα ο προσδιορισμός του λόγου του αριθμού των κυττάρων που εκφράζουν τις πρωτεΐνες MCM προς τον αριθμό των κυττάρων που εκφράζουν τον παράγοντα Ki67 (MCM/Ki67) επιτρέπει τον υπολογισμό του ποσοστού των κυττάρων που είναι αδειοδοτημένα αλλά δεν είναι ενεργώς πολλαπλασιαζόμενα. Επιπλέον, η εκτίμηση του λόγου της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin προς την αντίστοιχη έκφραση του παράγοντα Ki67 (Geminin/Ki67) μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως έμμεση ένδειξη της διάρκειας της φάσης G1 και κατ επέκταση της ταχύτητας εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου (Gonzalez et al., 2005; Tachibana et al., 2005a; Williams and Stoeber, 2007) (De Pamphilis 2006) Ο παράγοντας Cdt1 ως βιοδείκτης σε όγκους Περιορισμένος αριθμός μελετών υπάρχει σχετικά με τη διερεύνηση της πιθανής αξίας του παράγοντα Cdt1 ως βιοδείκτη στους όγκους, κυρίως λόγω της έλλειψης εμπορικά διαθέσιμου κατάλληλου αντισώματος που να αναγνωρίζει την πρωτεΐνη σε ιστικές τομές εγκλεισμένες σε παραφίνη. Τα επίπεδα έκφρασης του mrna του παράγοντα Cdt1 έχουν μελετηθεί σε κλινικά δείγματα μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (Karakaidos et al., 2004). Υπερέκφραση του παράγοντα αυτού στην περιοχή του όγκου σε σύγκριση με τον παρακείμενο μη νεοπλασματικό ιστό διαπιστώθηκε στο 43% των περιστατικών που αναλύθηκαν. Τα επίπεδα έκφρασης του mrna του Cdt1 δεν συσχετίζονταν με κλινικοπαθολογικές παραμέτρους της νόσου, όπως είναι το στάδιο της κακοήθειας, η παρουσία ή μη λεμφαδενικής μετάστασης και ο ιστολογικός τύπος. Επίσης δεν διαπιστώθηκε συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του παράγοντα Cdt1 και του πολλαπλασιασμού ή της απόπτωσης των κυττάρων. Παρ όλ αυτά, η υποκατηγοριοποίηση των περιστατικών με βάση την κατάσταση του μορίου p53 είχε ως αποτέλεσμα τη διαπίστωση στατιστικώς σημαντικής συσχέτισης μεταξύ των επιπέδων έκφρασης του mrna του Cdt1 και του μεγέθους του όγκου, της ύπαρξης ανευπλοειδίας καθώς και της χειρότερης πρόγνωσης, μόνο στα περιστατικά που το p53 ήταν μεταλλαγμένο (Karakaidos et al., 2004). Αυξημένα επίπεδα έκφρασης του mrna του παράγοντα Cdt1 στην περιοχή του όγκου σε σύγκριση με τον παρακείμενο φυσιολογικό ιστό έχει διαπιστωθεί και σε περιστατικά λεμφωμάτων του μανδύα (Pinyol et al., 2006). Στις περιπτώσεις αυτές, η υπερέκφραση του Cdt1 συσχετιζόταν με την αντίστοιχη έκφραση της πρωτεΐνης Ki67, γεγονός που καταδεικνύει την αξία του παράγοντα Cdt1 ως δείκτη πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Επίσης στις περισσότερες περιπτώσεις διαπιστώθηκε εξισορρόπηση της υπερέκφρασης του παράγοντα Cdt1 μέσω της ταυτόχρονης υπερέκφασης της Geminin. Τα περιστατικά αυτά δεν παρουσίαζαν σημαντικές χρωμοσωματικές ανωμαλίες, σε αντίθεση με τα δείγματα όπου η υπερέκφραση του Cdt1 δεν συνοδευόταν από αντίστοιχη υπερέκφραση της Geminin. Επιπλέον η εμφάνιση γονιδιωματικής αστάθειας ήταν ακόμα πιο έντονη στα περιστατικά που παρουσίαζαν μεταλλαγμένο p53 (Pinyol et al., 2006)

51 1. Εισαγωγή Η πιθανή αξία του παράγοντα Cdt1 ως βιοδείκτη στους όγκους έχει προταθεί και από μελέτη της έκφρασής του σε περιστατικά διηθητικών καρκινωμάτων του παχέος εντέρου (Bravou et al., 2005). Από την ανάλυση των δειγμάτων διαπιστώθηκε ότι στο φυσιολογικό ιστό η έκφραση του παράγοντα Cdt1 είναι περιορισμένη και εντοπίζεται σε κύτταρα που βρίσκονται στη βάση των κρυπτών του εντέρου. Αντίθετα, παρατηρήθηκε σημαντική υπερέκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 στην περιοχή του όγκου (Bravou et al., 2005). Αντίστοιχη υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 στην περιοχή του όγκου σε σύγκριση με τον παρακείμενο φυσιολογικό επιθηλιακό ιστό έχει διαπιστωθεί και στην περίπτωση διηθητικών όγκων του πνεύμονα, του παχέος εντέρου και του λάρυγγα (Liontos et al., 2007). Η έκφραση του παράγοντα Cdt1 έχει μελετηθεί και σε κλινικά δείγματα καρκινωμάτων εκ πλακώδους επιθηλίου της γλώσσας (Li et al., 2008). Η ανάλυση αποκάλυψε σημαντικά αυξημένα επίπεδα έκφρασης του mrna του Cdt1 στις περιπτώσεις σοβαρής δυσπλασίας σε σύγκριση με τις περιπτώσεις ήπιας ή ενδιάμεσης δυσπλασίας. Επιπλέον η υπερέκφραση του Cdt1 συσχετιζόταν στατιστικώς σημαντικά με την αντίστοιχη έκφραση του mrna της πρωτεΐνης Cdc6. Τα αυξημένα επίπεδα έκφρασης των παραγόντων Cdt1 και Cdc6 διαπιστώθηκε ότι συσχετίζονταν με αυξημένη επιθετικότητα του όγκου (Li et al., 2008) Η πρωτεΐνη Geminin ως βιοδείκτης σε όγκους Η πιθανή αξία της πρωτεΐνης Geminin ως προγνωστικού και διαγνωστικού βιοδείκτη έχει μελετηθεί σε αρκετές περιπτώσεις όγκων, μεταξύ των οποίων περιλαμβάνονται όγκοι του κεντρικού νευρικού συστήματος, της στοματικής κοιλότητας, του παχέος εντέρου, του μαστού, σε λεμφώματα Β κυτταρικής προέλευσης, σε αδενοκαρκινώματα του πνεύμονα καθώς και στον καρκίνο του νεφρού. Η προγνωστική σημασία της Geminin έχει καταδειχθεί σε αστροκυττώματα (Shrestha et al., 2007) και σε ολιγοδενδρογλοιώματα (Wharton et al., 2004). Στην περίπτωση των αστροκυττωμάτων διαπιστώθηκε ότι τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin συσχετίζονται στατιστικώς σημαντικά με το βαθμό διαφοροποίησης των όγκων (grade). Ενδιαφέρον εύρημα στη μελέτη αυτή αποτέλεσε η παρατήρηση ότι η έκφραση της Geminin συσχετίζεται στατιστικώς σημαντικά και αντίστροφα με το χρόνο επιβίωσης, γεγονός που υποδεικνύει την αξία της πρωτεΐνης αυτής ως θετικού προγνωστικού βιοδείκτη στους συγκεκριμένους όγκους (Shrestha et al., 2007). Στατιστικώς σημαντική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης της Geminin και του βαθμού διαφοροποίησης (grade) διαπιστώθηκε και στην περίπτωση των ολιγοδενδρογλοιωμάτων. Επίσης τα επίπεδα έκφρασης της Geminin συσχετίζονταν με τα αντίστοιχα του δείκτη πολλαπλασιασμού Ki67 (Wharton et al., 2004). Η έκφραση της πρωτεΐνης Geminin έχει αναλυθεί και σε κακοήθειες της στοματικής κοιλότητας. Σημαντική προγνωστική και διαγνωστική αξία διαφαίνεται ότι έχει η Geminin στους όγκους των σιελογόνων αδένων (Vargas et al., 2008; Yamazaki et al., 2010). Πράγματι, διαπιστώθηκε ότι τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης συσχετίζονται

52 1. Εισαγωγή με την επιθετικότητα των όγκων και τον βαθμό κακοήθειας. Επίσης η υπερέκφραση της Geminin συσχετίζεται με μειωμένο χρόνο ελεύθερο νόσου και μειωμένο συνολικό χρόνο επιβίωσης καθώς και με έντονο πολλαπλασιασμό των κυττάρων, όπως καταδεικνύει η συσχέτισή της με τον δείκτη πολλαπλασιασμού Ki67 (Yamazaki et al., 2010). Υπερέκφραση της πρωτεΐνης Geminin έχει διαπιστωθεί σε καρκινώματα εκ πλακώδους επιθηλίου του στόματος σε σύγκριση με το φυσιολογικό ενδοστοματικό βλεννογόνο (Torres-Rendon et al., 2009), καθώς και στο ενδοστοματικό μελάνωμα σε σύγκριση με τους καλοήθεις μελαγχρωματικούς σπίλους (de Andrade et al., 2012). Επιπλέον, τα αυξημένα επίπεδα έκφρασης της Geminin συσχετίζοναι με καλύτερη επιβίωση σε περιστατικά όγκων εκ πλακώδους επιθηλίου του στόματος, παρατήρηση που καθιστά την πρωτεΐνη αυτή βιοδείκτη καλής πρόγνωσης στους συγκεκριμένους όγκους (Tamura et al., 2010). Εικόνα 1.17: Η έκφραση της πρωτεΐνης Geminin αυξάνεται αναλόγως του βαθμού κακοήθειας των νεοπλασμάτων των σιελογόνων αδένων και συσχετίζεται με την έκφραση του δείκτη πολλαπλασιασμού Ki67. Κυψελιδικό αδενοκαρκίνωμα σιελεγόνων αδένων (A-C), αδενοκυστικό καρκίνωμα (D-F), κακοήθης μεικτός όγκος (G-I) και καρκίνωμα εκφορητικών πόρων (J-L) των σιελογόνων αδένων. Χρώση δειγμάτων με ηωσίνη και αιματοξυλίνη (A,D,GJ). Ανοσοϊστοχημική ανίχνευση των πρωτεϊνών Geminin (Β,Ε,Η,Κ) και Ki67 (C,F,I,L) (Yamazaki et al., 2010)

53 1. Εισαγωγή Η πιθανή αξία της πρωτεΐνης Geminin ως βιοδείκτη έχει επίσης διερευνηθεί σε όγκους του παχέος εντέρου και του μαστού. Στην πρώτη περίπτωση, τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης διαπιστώθηκε ότι συσχετίζονταν με το στάδιο της νόσου και το βαθμό διήθησης του όγκου (Bravou et al., 2005). Τα υψηλά επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin ήταν στατιστικώς σημαντικά υψηλότερα στους καλά διαφοροποιημένους όγκους σε σύγκριση με τα δείγματα όγκων μη καλής διαφοροποίησης. Επίσης η ταυτόχρονη υπερέκφραση των πρωτεϊνών Geminin και MCM7 διαπιστώθηκε ότι αποτελεί ανεξάρτητο δείκτη κακής πρόγνωσης (Nishihara et al., 2009). Σημαντική υπερέκφραση της πρωτεΐνης Geminin στην περιοχή του όγκου σε σύγκριση με τον παρακείμενο φυσιολογικό ιστό έχει παρατηρηθεί και σε όγκους μαστού (Gonzalez et al., 2004; Shetty et al., 2005). Τα υψηλά επίπεδα έκφρασης της Geminin συσχετίζονταν στατιστικώς σημαντικά με το μέγεθος του όγκου, το βαθμό διαφοροποίησης (grade), την εμφάνιση μετάστασης και αντίστροφα με το συνολικό χρόνο επιβίωσης (Gonzalez et al., 2004; Shetty et al., 2005). Επιπλέον διαπιστώθηκε ότι η αύξηση του βαθμού διαφοροποίησης των όγκων συνοδευόταν με αντίστοιχη αύξηση του λόγου της έκφρασης των πρωτεϊνών Geminin/Ki67, γεγονός που υποδεικνύει τη μείωση της διάρκειας της φάσης G1 και κατ επέκταση την αύξηση της ταχύτητας πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Shetty et al., 2005). Από τη μελέτη της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin σε λεμφώματα B κυτταρικής προέλευσης (Obermann et al., 2005) διαπιστώθηκε σημαντική υπερέκφραση της πρωτεΐνης στα λεμφώματα υψηλού κλάσματος αύξησης σε σύγκριση με τα λεμφώματα χαμηλού κλάσματος αύξησης. Επιπλέον τα επίπεδα έκφρασης της Geminin ήταν σαφώς υψηλότερα στα λεμφώματα Burkitt σε σύγκριση με τα διάχυτα B λεμφώματα, παρατήρηση που υποδεικνύει την πιθανή αξία του συγκεκριμένου μορίου για τη διαφοροδιάγνωση των δύο τύπων λεμφωμάτων (Obermann et al., 2005). Εικόνα 1.18: Η πρωτεΐνη Geminin αποτελεί βιοδείκτη διαφορικής διάγνωσης στα λεμφώματα B κυτταρικής προέλευσης. Τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών MCM2 και Ki67 είναι υψηλά τόσο στο διάχυτο λέμφωμα Β κυτταρικής προέλευσης (A) όσο και στο λέμφωμα Burkitt (B). Αντίθετα η έκφραση της πρωτεΐνης Geminin παρουσιάζεται σημαντικά υψηλότερη στο λέμφωμα Burkitt (B) σε σύγκριση με το διάχυτο λέμφωμα Β κυτταρικής προέλευσης (A) (Obermann et al., 2005). Η Geminin έχει δειχθεί ότι ενδέχεται να αποτελεί σημαντικό διαγνωστικό και προγνωστικό βιοδείκτη σε αδενοκαρκινώματα του πνεύμονα (Haruki et al., 2011), σε

54 1. Εισαγωγή όγκους του στομάχου (Shomori et al., 2010) καθώς και σε όγκους του νεφρού (Dudderidge et al., 2005). Από την ανοσοϊστοχημική ανάλυση της έκφρασης της πρωτεΐνης σε κλινικά δείγματα αδενοκαρκινωμάτων του πνεύμονα καθώς και σε καρκινώματα του στομάχου διαπιστώθηκε σταδιακή αύξηση των επιπέδων έκφρασης της Geminin με το βαθμό κακοήθειας, την επιθετικότητα και το βαθμό διαφοροποίησης των όγκων (Haruki et al., 2011; Shomori et al., 2010). Στον όγκο του νεφρού διαπιστώθηκε ότι η Geminin παρουσιάζει υψηλά επίπεδα έκφρασης στην περιοχή του όγκου, τα οποία αυξάνονται με την πρόοδο του βαθμού διαφοροποίησης (Dudderidge et al., 2005). Αντίθετα στον παρακείμενο φυσιολογικό ιστό δεν ανιχνεύεται έκφραση των πρωτεϊνών Geminin, Κi67 και MCM2, γεγονός που καταδεικνύει τον χαμηλό βαθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Στη συγκεκριμένη εργασία προσδιορίστηκε επιπλέον το κλάσμα των κυττάρων που εξέφραζαν την πρωτεΐνη MCM2 αλλά δεν εξέφραζαν τον παράγοντα Ki67, το οποίο είναι ενδεικτικό του ποσοστού των κυττάρων τα οποία, αν και δεν είναι ενεργώς πολλαπλασιαζόμενα, είναι αδειοδοτημένα και έχουν τη δυνατότητα πολλαπλασιασμού. Τόσο το συγκεκριμένο κλάσμα όσο και η έκφραση της Geminin διαπιστώθηκε ότι διαθέτουν προγνωστική σημασία καθώς συσχετίζονταν αντίστροφα με το χρόνο ελεύθερο νόσου (Dudderidge et al., 2005) Οι πρωτεΐνες MCM2-7 ως βιοδείκτες σε όγκους Η πρώτη ένδειξη για την πιθανή διαγνωστική αξία των πρωτεϊνών MCΜ2-7 προέκυψε από την ανάλυση της έκφρασής τους σε φυσιολογικούς, προκαρκινικούς και κακοήθεις επιθηλιακούς ιστούς. Συγκεκριμένα, στους φυσιολογικούς ιστούς η έκφραση των πρωτεϊνών αυτών περιορίζεται στα κύτταρα που εντοπίζονται στη βάση του επιθηλίου, που συνιστά το τμήμα του ιστού με δυνατότητα αυτοανανέωσης. Αντιθέτως, δεν διαπιστώνεται θετική ανοσοεντόπιση των πρωτεϊνών MCM2-7 στα ώριμα και διαφοροποιημένα κύτταρα που βρίσκονται στις επιφανειακές στιβάδες του επιθηλίου (Freeman et al., 1999). Στην περίπτωση της δυσπλασίας παρατηρείται αύξηση του αριθμού των θετικών κυττάρων για τις πρωτεΐνες MCM2-7, τα οποία εκτείνονται και στις ανώτερες στιβάδες του επιθηλιακού ιστού, ενώ ακόμη πιο έντονη και εκτεταμένη έκφραση διαπιστώνεται στις περιοχές του όγκου (Freeman et al., 1999). Το συγκεκριμένο πρότυπο ανοσοθετικότητας των πρωτεϊνών MCM2-7 έχει εντοπιστεί σε μια σειρά διαφορετικών ιστών μεταξύ των οποίων στο λάρυγγα (Chatrath et al., 2003), στο ενδομήτριο (Baldwin et al., 2003; Williams et al., 1998), στο παχύ έντερο (Scott et al., 2003), καθώς και στο μη δυσπλαστικό πλακώδες επιθήλιο του οισοφάγου (Going et al., 2002). Η πιο έντονη έκφραση των πρωτεϊνών MCM2-7 στις δυσπλασίες σε σύγκριση με το φυσιολογικό επιθηλιακό ιστό τις καθιστά πιθανούς χρήσιμους δείκτες για την έγκαιρη διάγνωση της κακοήθους εξαλλαγής των κυττάρων. Επιπλέον η έκφραση των πρωτεϊνών MCM2-7 διαπιστώθηκε ότι συσχετίζεται αντίστροφα με το βαθμό διαφοροποίησης των όγκων, καθώς οι καλά διαφοροποιημένοι όγκοι παρουσιάζουν χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης σε σύγκριση με τους μη διαφοροποιημένους (Freeman et al., 1999). Συνεπώς οι παρατηρήσεις

55 1. Εισαγωγή αυτές υποδεικνύουν την πιθανή κλινική σημασία των πρωτεϊνών MCM2-7 για τη διάγνωση των όγκων (Williams and Stoeber, 2007). Αρκετές μελέτες έχουν καταδείξει την προγνωστική και διαγνωστική αξία των πρωτεϊνών MCM2-7 σε διάφορες κακοήθειες. Στον καρκίνο του προστάτη η υπερέκφραση της πρωτεΐνης MCM2 διαπιστώθηκε ότι αποτελεί ανεξάρτητο προγνωστικό βιοδείκτη καθώς συσχετίζεται αντίστροφα με το χρόνο ελεύθερο νόσου (Meng et al., 2001). Αντίστοιχα, στον καρκίνο του νεφρού (Dudderidge et al., 2005) τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης MCM2 συσχετίζονται με το βαθμό διαφοροποίησης και το μέγεθος του όγκου. Στην ίδια κακοήθεια ο υπολογισμός των θετικών κυττάρων για την πρωτεΐνη MCM2 μείον τον αριθμό των κυττάρων που ήταν θετικά για τον παράγοντα Ki67 (MCM2-Ki67), που καταδεικνύει το κλάσμα των κυττάρων που είναι αδειοδοτημένα αλλά δεν πολλαπλασιάζονται, παρουσιάζει αρνητική συσχέτιση με το χρονικό διάστημα ελεύθερο νόσου (Dudderidge et al., 2005). Επιπλέον, οι πρωτεΐνες MCM2-7 έχει δειχθεί ότι αποτελούν χρήσιμους βιοδείκτες σε όγκους της στοματικής κοιλότητας (Kodani et al., 2003; Vargas et al., 2008), του πεπτικού συστήματος (Shomori et al., 2010) και σε αδενοκαρκινώματα του πνεύμονα (Hashimoto et al., 2004). Εικόνα 1.19: Η έκφραση της πρωτεΐνης MCM5 είναι αυξημένη σε κακοήθεις βλάβες του ενδομητρίου. Τα κύτταρα που εκφράζουν την πρωτεΐνη MCM5 εντοπίζονται στη βάση του φυσιολογικού επιθηλίου του ενδομητρίου και αντιπροσωπεύουν το κλάσμα των κυττάρων που πολλαπλασιάζεται (a). Τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης MCM5 αυξάνονται σταδιακά από τους καλά διαφοροποιημένους (b) στους αδιαφοροποίητους όγκους (c) (Blow and Gillespie, 2008). Η προγνωστική και διαγνωστική αξία των πρωτεϊνών MCM2-7 έχει πιστοποιηθεί και στον όγκο μαστού (Gonzalez et al., 2003; Loddo et al., 2009; Shetty et al., 2005). Και σε αυτή την περίπτωση η πρωτεΐνη MCM2 διαπιστώθηκε ότι αποτελεί ανεξάρτητο και ισχυρό προγνωστικό βιοδείκτη, καθώς τα επίπεδα έκφρασής της παρουσιάζουν αρνητική συσχέτιση με το συνολικό χρόνο επιβίωσης (Gonzalez et al., 2003). Η ανάλυση και σύγκριση της έκφρασης της πρωτεΐνης MCM2 σε φυσιολογικό μαστό και σε όγκο μαστού

56 1. Εισαγωγή αποκάλυψε σημαντικά στοιχεία όσον αφορά τις κινητικές ιδιότητες των κυττάρων. Συγκεκριμένα, διαπιστώθηκε ότι τα κύτταρα του φυσιολογικού επιθηλιακού ιστού, αν και παρουσιάζουν χαμηλή έκφραση των πρωτεϊνών Ki67 και Geminin, εμφανίζουν έντονη ανοσοθετικότητα για την πρωτεΐνη MCM2. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι τα λοβιακά επιθηλιακά κύτταρα στον φυσιολογικό μαστό βρίσκονται σε μια αδειοδοτημένη αλλά μη ενεργώς πολλαπλασιαζόμενη κατάσταση. Θεωρείται πιθανό ότι αυτό το χαρακτηριστικό των φυσιολογικών επιθηλιακών κυττάρων, παρέχει τη δυνατότητα άμεσης απόκρισής τους σε περίπτωση εγκυμοσύνης, κατάσταση κατά την οποία απαιτείται γρήγορη είσοδός τους στον κυτταρικό κύκλο και έντονος πολλαπλασιασμός τους. Σε αντίθεση με το φυσιολογικό επιθήλιο, τα καρκινικά κύτταρα του μαστού βρίσκονται σε ενεργό πολλαπλασιαστική κατάσταση όπως διαπιστώνεται από την ανοσοθετικότητά τους για τις πρωτεΐνες Ki67, MCM2 και Geminin (Shetty et al., 2005; Stoeber et al., 2001). Πιο πρόσφατη μελέτη κατέδειξε ότι η πρωτεΐνη MCM2, σε συνδυασμό με τις πρωτεΐνες Geminin, Ki67, τις μιτωτικές κινάσες Aurora A και B, Plk1 και την φωσφορυλιωμένη ιστόνη H3, συμβάλλει στην κατηγοριοποίηση των όγκων μαστού σε τρεις υποτύπους με διαφορετική βιοπαθολογία και συμπεριφορά. Στην πρώτη κατηγορία των όγκων τα κύτταρα βρίσκονται εκτός κυτταρικού κύκλου καθώς είναι αρνητικά για την πρωτεΐνη MCM2. Στη δεύτερη κατηγορία τα κύτταρα παρουσιάζουν θετική έκφραση της πρωτεΐνης MCM2, αλλά δεν εκφράζουν τους υπόλοιπους δείκτες των φάσεων S-G2-M, γεγονός που υποδεικνύει ότι τα κύτταρα είναι αδειοδοτημένα και συσσωρευμένα στη φάση G1. Τέλος, στον τρίτο υποτύπο ανήκουν όγκοι με έντονο κυτταρικό πολλαπλασιασμό, όπως διαπιστώνεται από την έντονη έκφραση της πρωτεΐνης MCM2 καθώς και των δεικτών των φάσεων S-G2-M που παρουσιάζουν τα κύτταρα. Σημειώνεται ότι οι διαφορετικοί υπότυποι όγκων μαστού παρουσιάζουν διαφορετική επιθετικότητα, πρόγνωση και απόκριση σε χημειοθεραπεία (Loddo et al., 2009). Η υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα των πρωτεϊνών MCM2-7 ως προς την ταυτοποίηση των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων, τις καθιστούν χρήσιμες για την έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου σε κυτταρολογικά δείγματα (Gonzalez et al., 2005). Πράγματι έχει προταθεί ότι ο προσδιορισμός της έκφρασης των πρωτεϊνών MCM2-7 στο τραχηλικό επίχρισμα μπορεί να συμβάλλει στον έγκαιρο εντοπισμό των προκαρκινικών αλλοιώσεων. Επιπλέον, η παρατήρηση της έκφρασης των πρωτεϊνών MCM2-7 στο τραχηλικό δείγμα θεωρείται πιο αξιόπιστη και πιο ακριβής μέθοδος για το διαχωρισμό των καρκινικών ή δυσπλαστικών κυττάρων από τα φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα, σε σύγκριση με την κλασική αξιολόγηση (χρώση κατά Παπανικολάου) που βασίζεται αποκλειστικά σε μορφολογικά χαρακτηριστικά (Mukherjee et al., 2007). Κατά αναλογία, ο προσδιορισμός της έκφρασης των συγκεκριμένων πρωτεϊνών μπορεί να αξιοποιηθεί για τη μη επεμβατική και έγκαιρη διάγνωση κακοηθειών της αναπνευστικής οδού ή του ουρογεννητικού συστήματος, όπου είναι δυνατή η απομόνωση κυτταρικών δειγμάτων από βιολογικά υγρά (Gonzalez et al., 2005)

57 2. Σκοπός της εργασίας 2. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ

58 2. Σκοπός της εργασίας Η διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας προϋποθέτει την ακριβή αντιγραφή ολόκληρου του γονιδιώματος μία μόνο φορά κατά τη διάρκεια κάθε κυτταρικού κύκλου. Η ρύθμιση αυτή εξασφαλίζεται με τη διαδικασία αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA, η οποία περιλαμβάνει τη συγκρότηση πολυπρωτεϊνικών συμπλόκων στις αφετηρίες της αντιγραφής. Τα σύμπλοκα αυτά απαρτίζονται από τις πρωτεΐνες MCM2-7 (Minichromosome Maintainance), που έχουν δράση ελικάσης. Οι παράγοντες Cdt1 και Cdc6 είναι απαραίτητοι για τη στρατολόγηση των πρωτεϊνών MCM2-7 στη χρωματίνη. Η απορρύθμιση των συμπλόκων αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA έχει δειχθεί ότι προκαλεί επανέναρξη της αντιγραφής του γονιδιώματος με αποτέλεσμα τη γονιδιωματική αστάθεια και την κακοήθη εξαλλαγή των κυττάρων. Οι περισσότερες μελέτες που αφορούν την αδειοδότηση της αντιγραφής του DNA, είτε έχουν πραγματοποιηθεί στη ζύμη είτε έχουν βασιστεί σε βιοχημικά και in vitro συστήματα. Συνεπώς, κρίθηκε ενδιαφέρουσα η μελέτη της διαδικασίας της αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA και η διερεύνηση της χωροχρονικής ρύθμισης αυτής σε ζωντανά ανθρώπινα κύτταρα. Επιπλέον, δεδομένης της συμμετοχής της απορρύθμισης του συστήματος αδειοδότησης στην κακοήθη εξαλλαγή των κυττάρων, θεωρήθηκε ενδιαφέρουσα η μελέτη της πιθανής αξίας του παράγοντα Cdt1 ως βιοδείκτη στον όγκο μαστού καθώς και του μοριακού μηχανισμού μέσω του οποίου ο συγκεκριμένος παράγοντας δύναται να συμβάλλει στην καρκινογένεση. Σκοπός του πρώτου μέρους της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της πιθανής απορρύθμισης του συστήματος αδειοδότησης στον καρκίνο και η πιθανή σύνδεση αυτής με την καρκινογένεση. Για να απαντηθεί αυτό το ερώτημα συγκεντρώθηκαν κλινικά δείγματα όγκου μαστού τα οποία αναλύθηκαν ως προς τα επίπεδα έκφρασης του παράγοντα Cdt1. Πιο αναλυτικά επιμέρους στόχοι της μελέτης ήταν: η διερεύνηση της πιθανής υπερέκφρασης του παράγοντα Cdt1 στον όγκο μαστού σε σύγκριση με τον παρακείμενο φυσιολογικό ιστό και η πιθανή χρησιμότητά του ως μοριακού βιοδείκτη, η διερεύνηση της συσχέτισης των επιπέδων έκφρασης του παράγοντα Cdt1 στον όγκο μαστού με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους της νόσου καθώς και με άλλους γνωστούς βιοδείκτες όπως είναι οι στεροειδικοί υποδοχείς, η πρωτεΐνη Ki67 και ο υποδοχέας HER2/neu, η μελέτη της συσχέτισης των επιπέδων έκφρασης του παράγοντα Cdt1 με τη γονιδιακή ενίσχυση του υποδοχέα HER2/neu, καθώς και στην περίπτωση που αυτό ισχύει η διερεύνηση της συμβολής της υπερέκφρασης του παράγοντα Cdt1 στην εκδήλωση γονιδιακής ενίσχυσης. Σκοπός του δεύτερου μέρους της εργασίας ήταν η μελέτη της δυναμικής συμπεριφοράς των συμπλόκων αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA σε ζωντανά ανθρώπινα κύτταρα με μεθόδους λειτουργικής μικροσκοπίας. Επιμέρους στόχοι της μελέτης ήταν: η ανάπτυξη ενός συστήματος μελέτης για τη χωροχρονική ποσοτική εκτίμηση της αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA in vivo σε ζωντανά ανθρώπινα κύτταρα,

59 2. Σκοπός της εργασίας η μελέτη της δυναμικής αλληλεπίδρασης των πρωτεϊνών MCM με τη χρωματίνη κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου και της πιθανής διαφοροποίησης αυτής καθώς εξελίσσεται ο κυτταρικός κύκλος, η μελέτη του υποκυτταρικού εντοπισμού των περιοχών αλληλεπίδρασης των MCM πρωτεϊνών με τη χρωματίνη και ο συσχετισμός αυτών με συγκεκριμένες ενδοκυτταρικές υποδομές όπως είναι οι περιοχές σύνθεσης του DNA, η διερεύνηση της επίδρασης της πρωτεΐνης Geminin στην αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών MCM με τη χρωματίνη

60 3. Υλικά και Μέθοδοι 3. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

61 3. Υλικά και Μέθοδοι 3.1. Κυτταροκαλλιέργεια Κυτταρικές σειρές, διατήρηση και διαχωρισμός κυττάρων (split) Στη συγκεκριμένη εργασία χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες κυτταρικές σειρές: HeLa (κύτταρα από καρκίνο τραχήλου μήτρας) και οι σειρές από επιθηλιακά κύτταρα αδενοκαρκινώματος μαστού MCF7, MDAMB231, MDAMB468 και SKBR3. Η καλλιέργεια των κυτταρικών σειρών διατηρείται σε επωαστή με σταθερή θερμοκρασία 37 C και 5% CO 2. Τα HeLa, MDA MB 231, MDA MB 468 και SKBR3 κύτταρα καλλιεργούνται με χρήση του θρεπτικού μέσου DMEM + 10% FBS, ενώ τα MCF7 καλλιεργούνται σε DMEM + 20% FBS. Η αλλαγή του θρεπτικού μέσου πραγματοποιείται κάθε δύο ημέρες. Ο διαχωρισμός των κυττάρων επιτελείται όταν αυτά καλύπτουν το 80-90% της επιφάνειας του τρυβλίου στο οποίο αναπτύσσονται. Η χρήση της τρυψίνης επιτρέπει τη διάσπαση των συνδέσεων μεταξύ των κυττάρων αλλά και μεταξύ κυττάρων και υποστρώματος. Η συνήθης αναλογία διαχωρισμού των κυττάρων είναι 1: Παροδική διαμόλυνση κυττάρων με πλασμιδιακό DNA Η παροδική διαμόλυνση των MCF7 κυττάρων πραγματοποιείται με χρήση του αντιδραστηρίου Turbofect (Fermentas) ως εξής: Τα κύτταρα καλλιεργούνται σε τρυβλία διαμέτρου 35 mm παρουσία DMEM + 20% FBS αλλά απουσία αντιβιοτικών (πενικιλλίνης/στρεπτομυκίνης). Η διαμόλυνση πραγματοποιείται όταν τα κύτταρα καλύπτουν το 70 90% της επιφάνειας του τρυβλίου. Σε θρεπτικό μέσο optimem προστίθενται 3 μl αντιδραστηρίου Turbofect και 1μg πλασμιδιακού DNA έτσι ώστε ο συνολικός όγκος του διαλύματος να είναι 100 μl. Το διάλυμα επωάζεται σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά. Στη συνέχεια, αφαιρείται το υπερκείμενο θρεπτικό μέσο των κυττάρων, πραγματοποιούνται 2 γρήγορες πλύσεις με PBS (1x) και προστίθενται 900 μl optimem. Ακολούθως, τα 100 μl του διαλύματος διαμόλυνσης προστίθενται στα κύτταρα τα οποία καλλιεργούνται στον επωαστικό θάλαμο για 5 ώρες. Μετά την πάροδο των 5 ωρών, το υπερκείμενο θρεπτικό μέσο των κυττάρων αναρροφάται και αντικαθίσταται από φρέσκο θρεπτικό μέσο DMEM (20% FBS + πενικιλίνη/στρεπτομυκίνη). Η παρατήρηση των κυττάρων πραγματοποιείται ώρες μετά τη διαμόλυνση

62 3. Υλικά και Μέθοδοι Δημιουργία σταθερά διαμολυσμένων κυτταρικών σειρών H δημιουργία MCF7 κυτταρικής σειράς που εκφράζει σταθερά την πρωτεΐνη GFP- MCM2 πραγματοποιείται με την ακόλουθη διαδικασία: MCF7 κύτταρα διαμολύνονται παροδικά με το πλασμίδιο pcdna3.1 το οποίο φέρει κλωνοποιημένο το υβριδικό μόριο GFP-MCM2. Η διαμόλυνση πραγματοποιείται με χρήση του αντιδραστηρίου Turbofect (Fermentas). Μετά από 24 ώρες τα κύτταρα αραιώνονται και επιστρώνονται σε νέα τρυβλία διαμέτρου 100 mm σε αναλογία 1:10. Για την καλλιέργεια των κυττάρων χρησιμοποιείται θρεπτικό μέσο DMEM (20% FBS, + πενικιλίνη/στρεπτομυκίνη) που περιέχει το αντιβιοτικό επιλογής G418 (Invitrogen) σε τελική συγκέντρωση 500 μg/μl. Η παρουσία του αντιβιοτικού επιλογής επιτρέπει την ανάπτυξη των κυττάρων στα οποία έχει επιτευχθεί ενσωμάτωση του πλασμιδίου στο γονιδίωμά τους. Μετά την πάροδο ημερών αρχίζουν να σχηματίζονται αποικίες ανθεκτικές στο αντιβιοτικό επιλογής. Όταν οι αποικίες έχουν μέγεθος κυττάρων απομονώνονται και μεταφέρονται σε νέα τρυβλία για περαιτέρω καλλιέργεια. Ο έλεγχος της θετικότητας των κλώνων καθώς και ο προσδιορισμός των επιπέδων έκφρασης της GFP-MCM2 πρωτεΐνης σε σύγκριση με τα αντίστοιχα του ενδογενούς μορίου πραγματοποιείται με ανοσοφθορισμό ή με ανοσοαποτύπωση western χρησιμοποιώντας αντισώματα anti-gfp και anti-mcm Αποσιώπηση της γονιδιακής έκφρασης με την τεχνολογία RNAi (RNAi interference) Η καταστολή της έκφρασης των γονιδίων Cdt1 και Geminin επετεύχθη με χρήση της τεχνολογίας του small interfering RNA (sirna). Ως αρνητικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε sirna έναντι του γονιδίου της λουσιφεράσης στην ίδια τελική συγκέντρωση. Τα δίκλωνα RNA ολιγονουκλεοτίδια παρήχθησαν από την εταιρεία MWG. Γονίδιο - στόχος Αλληλουχία RNA ολιγονουκλεοτιδίου Cdt1 5 AACGUGGAUGAAGUACCCGAC 3 Geminin 5 CUGGCAGAAGUAGCAGAAC 3 Luciferase 5 CGUACGCGGAAUACUUCGA 3 Η διαμόλυνση των MCF7 κυττάρων με τα sirnas πραγματοποιήθηκε με τα αντιδραστήρια Lipofectamine RNAi max και Lipofectamine 2000 ως ακολούθως: Αποσιώπηση γονιδιακής έκφρασης Cdt1 και Geminin με διπλή διαμόλυνση sirna Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν δύο φορές με μεσοδιάστημα 24 ωρών με το sirna έναντι του Cdt1 ή της Geminin χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η τελική συγκέντρωση του sirna ήταν 200 nm, ενώ η παρατήρηση των κυττάρων πραγματοποιήθηκε 48 ώρες μετά την πρώτη διαμόλυνση

63 3. Υλικά και Μέθοδοι Αποσιώπηση γονιδιακής έκφρασης της Geminin με μονή διαμόλυνση sirna Πραγματοποιήθηκε διαμόλυνση των κυττάρων με το sirna έναντι του γονιδίου της Geminin με το αντιδραστήριο Lipofectamine RNAi max σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η τελική συγκέντρωση του sirna ήταν 400 nm ενώ η ανάλυση των κυττάρων έλαβε χώρα 24 ώρες μετά τη διαμόλυνση Συγχρονισμός ευκαρυωτικών κυττάρων στη μίτωση, στο τέλος της G1 και στην αρχή της S φάσης Ο συγχρονισμός των κυττάρων στη μίτωση πραγματοποιήθηκε με χρήση του νοκοδαζολίου, το οποίο αποτελεί αναστολέα πολυμερισμού των μικροσωληνίσκων, σύμφωνα με την ακόλουθη διαδικασία: Κύτταρα που καλλιεργούνται σε τρυβλίο διαμέτρου 100 mm και καλύπτουν το 70-80% της επιφάνειάς του, επωάζονται με θρεπτικό μέσο DMEM (20% FBS, + πενικιλίνη/στρεπτομυκίνη) το οποίο περιέχει νοκοδαζόλιο σε τελική συγκέντρωση 40 ng/ml για 12 ώρες. Μετά το πέρας των 12 ωρών, το υπερκείμενο θρεπτικό μέσο αφαιρείται και τα κύτταρα εκπλένονται 3-4 φορές με διάλυμα PBS (1x). Ακολουθεί προσθήκη 3 ml διαλύματος PBS (1x) και έντονη ανακίνηση του τρυβλίου με σκοπό να αποκολληθούν τα μιτωτικά κύτταρα (mitotic shake off). Το υπερκείμενο συλλέγεται και φυγοκεντρείται στις 1000 rpm για 5 λεπτά. Στη συνέχεια, απομακρύνεται το υπερκείμενο και τα κύτταρα επαναδιαλύονται σε 5 ml θρεπτικού μέσου και επιστρώνονται σε καινούργια τρυβλία. Ο συγχρονισμός των κυττάρων στο τέλος της G1 φάσης πραγματοποιήθηκε με χρήση του αντιδραστηρίου mimosine ως εξής: Κύτταρα που καλλιεργούνται είτε σε τρυβλία διαμέτρου 35 mm είτε σε mattek (στην περίπτωση που προορίζονται για ανάλυση με FRAP ή FLIP) επωάζονται με θρεπτικό μέσο DMEM (20% FBS, + πενικιλίνη/στρεπτομυκίνη) το οποίο περιέχει mimosine σε τελική συγκέντρωση 0,5 mm για 24 ώρες. Ο συγχρονισμός των κυττάρων στην αρχή της S φάσης με υδροξυουρία (Hydroxyurea, HU) πραγματοποιήθηκε ως εξής: Κύτταρα που καλλιεργούνται είτε σε τρυβλία διαμέτρου 35 mm είτε σε mattek (στην περίπτωση που προορίζονται για ανάλυση με FRAP ή FLIP) επωάζονται με θρεπτικό μέσο DMEM (20% FBS, + πενικιλίνη/στρεπτομυκίνη) το οποίο περιέχει υδροξυουρία σε τελική συγκέντρωση 5 mm για 24 ώρες. Ο συγχρονισμός των κυττάρων στην αρχή της S φάσης με θυμιδίνη πραγματοποιήθηκε ως εξής: Κύτταρα που καλλιεργούνται είτε σε τρυβλία διαμέτρου 35 mm είτε σε mattek (στην περίπτωση που προορίζονται για ανάλυση με FRAP ή FLIP) επωάζονται με θρεπτικό

64 3. Υλικά και Μέθοδοι μέσο DMEM (20% FBS, + πενικιλίνη/στρεπτομυκίνη) το οποίο περιέχει θυμιδίνη σε τελική συγκέντρωση 2,5 mm για 16 ώρες. Στη συνέχεια, το υπερκείμενο θρεπτικό μέσο αφαιρείται και τα κύτταρα εκπλένονται 3-4 φορές με διάλυμα PBS (1x). Ακολουθεί προσθήκη 2 ml θρεπτικού μέσου DMEM (20% FBS, + πενικιλίνη/στρεπτομυκίνη) και επώαση των κυττάρων για 12 ώρες. Μετά την πάροδο των 12 ωρών, το υπερκείμενο θρεπτικό μέσο αφαιρείται και προστίθεται εκ νέου στα κύτταρα DMEM (20% FBS, + πενικιλίνη/στρεπτομυκίνη) με θυμιδίνη σε τελική συγκέντρωση 2,5 mm. Τα κύτταρα καλλιεργούνται για 20 ώρες Έξοδος κυττάρων από κυτταρικό κύκλο Τα MCF7 αποτελούν ορμονοεξαρτώμενη κυτταρική σειρά και η έξοδός τους από τον κυτταρικό κύκλο καθίσταται δυνατή με χρήση της ταμοξιφαίνης, η οποία αποτελεί ανταγωνιστή των οιστρογόνων. Η πρόσδεση του φαρμάκου αυτού στους οιστρογονικούς υποδοχείς έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Το πρωτόκολλο που ακολουθήθηκε είναι το ακόλουθο: Τα κύτταρα καλλιεργούνται σε DMEM με 3% FBS απουσία αντιβιοτικών (πενικιλίνης, στρεπτομυκίνης) για 24 ώρες. Ακολουθεί προσθήκη θρεπτικού μέσου DMEM (3% FBS χωρίς αντιβιοτικά), το οποίο περιέχει ταμοξιφαίνη σε τελική συγκέντρωση 5 μm. Τα κύτταρα επωάζονται για 48 ώρες. Στη συνέχεια, απομακρύνεται το θρεπτικό μέσο και τα κύτταρα εκπλένονται 3-4 φορές με διάλυμα PBS (1x). Ακολουθεί προσθήκη θρεπτικού μέσου DMEM (20% FBS, + πενικιλίνη/στρεπτομυκίνη). Η λήψη δειγμάτων σε συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα επιτρέπει την παρακολούθηση της προόδου του κυτταρικού κύκλου κατά την επανείσοδο των κυττάρων σε αυτόν Σήμανση κυττάρων με BrdU Η διαδικασία σήμανσης των κυττάρων με BrdU έχει ως εξής: Κύτταρα που καλλιεργούνται πάνω σε καλυπτρίδες επιστρωμένες με poly-d-λυσίνη σε τρυβλία διαμέτρου 35 mm επωάζονται με θρεπτικό μέσο DMEM (20% FBS, + πενικιλίνη/στρεπτομυκίνη) το οποίο περιέχει BrdU σε τελική συγκέντρωση 20 μμ, για 30 λεπτά. Στη συνέχεια το υπερκείμενο αφαιρείται και τα κύτταρα εκπλένονται 2 φορές με κρύο διάλυμα PBS (1x)

65 3. Υλικά και Μέθοδοι Τα κύτταρα μονιμοποιούνται με διάλυμα 4% παραφορμαλδεΰδης για 10 λεπτά και ακολουθεί η διαδικασία του ανοσοφθορισμού, όπως περιγράφεται σε επόμενο κεφάλαιο Μονιμοποίηση και χρώση κυτταρικών αποικιών Η μονιμοποίηση των αποικιών των κυττάρων πραγματοποιείται με διάλυμα methylene blue ως εξής: Το υπερκείμενο θρεπτικό μέσο των κυττάρων αφαιρείται και τα κύτταρα εκπλένονται 1 φορά με διάλυμα PBS (1x). Ακολουθεί προσθήκη 5 ml διαλύματος methylene blue. Τα κύτταρα επωάζονται για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, απομακρύνεται το διάλυμα methylene blue και τα κύτταρα εκπλένονται προσεκτικά με νερό βρύσης. Το νερό απομακρύνεται και τα τρυβλία τοποθετούνται ανοιχτά και ανάποδα σε διηθητικό χαρτί και αφήνονται να στεγνώσουν. 3.2 Ανάλυση πρωτεϊνών Απομόνωση ολικών πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων Η διαδικασία που ακολουθείται για την απομόνωση ολικών πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων από κύτταρα που καλλιεργούνται σε τρυβλία διαμέτρου 100 mm είναι η ακόλουθη: Τα τρυβλία με τα κύτταρα τοποθετούνται πάνω σε πάγο. Το υπερκείμενο θρεπτικό μέσο αφαιρείται και τα κύτταρα εκπλένονται 2 φορές με κρύο διάλυμα PBS (1x). Ακολουθεί προσθήκη 1 ml κρύου διαλύματος PBS (1x) και αποκόλληση των κυττάρων με χρήση scraper. To εναιώρημα των κυττάρων τοποθετείται σε eppendorf. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις 5000 rpm για 5 λεπτά στους 4 o C. Το υπερκείμενο διάλυμα αφαιρείται και το ίζημα των κυττάρων αναδιαλύεται σε μl διαλύματος 1x FSB+DTT. Ακολουθεί βρασμός των δειγμάτων στους 95 o C για 5 λεπτά. Τα δείγματα φυλάσσονται στους -20 o C Ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE Η SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται ως εξής: Αρχικά πραγματοποιείται η παρασκευή του πηκτώματος διαχωρισμού των πρωτεϊνών το οποίο φορτώνεται στη συσκευή ηλεκτροφόρησης καλύπτοντας περίπου τα 3:4-65 -

66 3. Υλικά και Μέθοδοι αυτής. Για να μη στεγνώσει το πήκτωμα, προστίθεται από πάνω μια μικρή ποσότητα ισοπροπανόλης. Ακολουθεί η παρασκευή του διαλύματος πακεταρίσματος. Από την επιφάνεια του πηκτώματος διαχωρισμού απομακρύνεται η ισοπροπανόλη και πραγματοποιούνται πλύσεις με ddh 2 O. Στη συνέχεια φορτώνεται πάνω στο πήκτωμα διαχωρισμού το διάλυμα του πηκτώματος πακεταρίσματος, ενώ αμέσως τοποθετείται στη συσκευή το χτενάκι για τη δημιουργία των θέσεων φόρτωσης των δειγμάτων. Τα δείγματα που πρόκειται να αναλυθούν βράζονται στους 95 ο C για 5 λεπτά και έπειτα φυγοκεντρούνται στις rpm για 5λεπτά. Όταν πήξει το πήκτωμα, αφαιρείται το χτενάκι και η συσκευή τοποθετείται μέσα στο δοχείο της ηλεκτροφόρησης που περιέχει το διάλυμα Laemmli (1x). Τα δείγματα φορτώνονται στις θέσεις που έχουν σχηματιστεί στο πήκτωμα πακεταρίσματος. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται αρχικά στα 100 V μέχρι η χρωστική να εισέλθει στο πήκτωμα διαχωρισμού οπότε η τάση αυξάνεται στα 140 V. Μετά το πέρας της ηλεκτροφόρησης το πήκτωμα βάφεται με τη χρωστική Coomasie Ανοσοαπoτύπωμα western Αρχικά τα δείγματα αναλύονται με SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση. Στη συνέχεια πραγματοποιείται η μεταφορά των αναλυμένων δειγμάτων σε μεμβράνη PVDF, σε ρυθμιστικό διάλυμα 10 mm CAPS με 10% μεθανόλη, υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου τάσης 42 V, για 1,5 ώρα. Μετά το πέρας της μεταφοράς, η μεμβράνη PVDF πλένεται με ddh 2 O και βάφεται με τη χρωστική Ponceau S για 5 λεπτά. Απομακρύνεται η Ponceau S και σημειώνονται πάνω στη μεμβράνη οι ζώνες του μάρτυρα μοριακών μεγεθών. Η απομάκρυνση της χρωστικής επιτυγχάνεται με χρήση του διαλύματος PBS (1x), 0,1% Tween (PBS- Tween). Παράλληλα το πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου, στο οποίο αναλύθηκαν οι πρωτεΐνες κατά την SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση, βάφεται με τη χρωστική Coomasie Brilliant Blue και ελέγχεται η επιτυχία της μεταφοράς των πολυπεπτιδικών αλυσίδων στη μεμβράνη. Η κάλυψη των μη ειδικών θέσεων δέσμευσης του αντισώματος στη μεμβράνη πραγματοποιείται με διάλυμα 5% γάλακτος σε PBS (1x), 0,1% Tween (PBS-Tween) (διάλυμα blocking), για 1 ώρα, σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολουθεί η επώαση της μεμβράνης με το πρώτο αντίσωμα σε περιστρεφόμενη ρόδα, σε θερμοκρασία δωματίου, για όλη τη νύχτα. Το αντίσωμα διαλύεται σε διάλυμα blocking στο οποίο προστίθεται επιπλέον 0,02% NaN3. Την επόμενη ημέρα η μεμβράνη ξεπλένεται 2 φορές γρήγορα με PBS (1x), 0,1% Tween (PBS-Tween). Ακολουθούν μια 15λεπτη και τρεις 5λεπτες πλύσεις με PBS (1x), 0,1% Tween (PBS-Tween). Ακολουθεί η επώαση της μεμβράνης με το κατάλληλο δεύτερο αντίσωμα, σε περιστρεφόμενη ρόδα, για μια ώρα, σε θερμοκρασία δωματίου

67 3. Υλικά και Μέθοδοι Η περίσσεια του δεύτερου αντισώματος απομακρύνεται με 2 γρήγορες πλύσεις, καθώς και μια 15λεπτη και τρεις 5λεπτες με διάλυμα PBS (1x), 0,1% Tween (PBS-Tween). Το σήμα ανιχνεύεται με τη χρήση του αντιδραστηρίου ECL και αποτυπώνεται σε φωτογραφικό φιλμ, σε σκοτεινό δωμάτιο. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν στις αναλύσεις western τα εξής αντισώματα: Πρωτογενή αντισώματα Α-Cdt1 σε αραίωση 1:3000 (μεταπτυχιακή εργασία Ι.Ε.Συμεωνίδου, πολυκλωνικό) Α-MCM2 σε αραίωση 1:1000 (BD Pharmingen, μονοκλωνικό) Α-MCM4 σε αραίωση 1:6000 (BD Pharmingen, πολυκλωνικό) A-MCM7 σε αραίωση 1:500 (Santa Cruz, μονοκλωνικό) Α-GFP σε αραίωση 1:500 (Roche, μονοκλωνικό) Δευτερογενή αντισώματα Α-rabbit-HRP σε αραίωση 1:4000 1:6000 (Chemicon) Α-mouse-HRP σε αραίωση 1:4000 1:6000 (Chemicon) Ανοσοκατακρήμνιση Η διαδικασία της ανοσοκατακρήμνισης περιλαμβάνει την προετοιμασία των σφαιριδίων, την πρόσδεση του αντισώματος στα σφαιρίδια και την επώαση του κυτταρικού εκχυλίσματος με τα σφαιρίδια. Προετοιμασία σφαιριδίων Για κάθε αντίδραση χρησιμοποιούμε 50 μl διαλύματος 50% σφαιριδίων. Αρχικά το διάλυμα με τα σφαιρίδια φυγοκεντρείται στις 5000 rpm για 5 λεπτά. Στη συνέχεια το υπερκείμενο αφαιρείται και τα σφαιρίδια αναδιαλύονται σε 1 ml διαλύματος λύσης, ανακινούνται για 3 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και φυγοκεντρούνται στις 4000 rpm για 5 λεπτά. Ακολουθούν ακόμα 2 πλύσεις των σφαιριδίων με διάλυμα λύσης. Τα σφαιρίδια αναδιαλύονται σε διάλυμα λύσης έτσι ώστε ο συνολικός τους όγκος να είναι ίσος με τον αρχικό όγκο των σφαιριδίων που χρησιμοποιήθηκαν. Πρόσδεση αντισώματος στα σφαιρίδια Για κάθε αντίδραση ανοσοκατακρήμνισης (50 μl διαλύματος 50% σφαιριδίων) χρησιμοποιήθηκαν 2 μg αντισώματος anti-gfp (mouse, Roche). Κατάλληλη ποσότητα anti-gfp αντισώματος προστίθεται στο διάλυμα με τα σφαιρίδια. Ακολουθεί επώαση υπό ανακίνηση, για 2 ώρες στους 4 o C. Στη συνέχεια πραγματοποιούνται 3 πλύσεις των σφαιριδίων με διάλυμα λύσης, με στόχο να απομακρυνθεί η περίσσεια του αντισώματος που δεν έχει προσδεθεί σε αυτά. Για κάθε πλύση, 1 ml διαλύματος λύσης προστίθεται στα σφαιρίδια. Ακολουθεί

68 3. Υλικά και Μέθοδοι ανακίνηση για 5 λεπτά, φυγοκέντρηση στις 4000 rpm για 5 λεπτά στους 4 o C και απόρριψη του υπερκειμένου. Μετά την ολοκλήρωση της τρίτης πλύσης, τα σφαιρίδια αναδιαλύονται σε διάλυμα λύσης έτσι ώστε ο συνολικός τους όγκος να είναι ίσος με τον αρχικό όγκο των σφαιριδίων που χρησιμοποιήθηκαν (50 μl /αντίδραση ανοσοκατακρήμνισης). Απομόνωση κυτταρικού εκχυλίσματος Επώαση κυτταρικού εκχυλίσματος με σφαιρίδια Για κάθε αντίδραση ανοσοκατακρήμνισης χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα που καλλιεργούνταν σε τρυβλίο διαμέτρου 100 mm και κάλυπταν το % της επιφάνειάς του. Η διαδικασία προετοιμασίας των κυττάρων και της επώασής τους με τα σφαιρίδια είναι η ακόλουθη: Τα τρυβλία με τα κύτταρα τοποθετούνται σε πάγο. Αφαιρείται το υπερκείμενο θρεπτικό μέσο και πραγματοποιούνται 2 πλύσεις των κυττάρων με κρύο διάλυμα PBS (1x). Ακολουθεί προσθήκη 500 μl διαλύματος λύσης σε κάθε τρυβλίο. Τα τρυβλία παραμένουν πάνω στον πάγο για 10 λεπτά. Στη συνέχεια, τα κύτταρα αποκολλώνται με χρήση scraper και το κυτταρικό εκχύλισμα διέρχεται από σύριγγα για να κατακερματιστεί το DNA. Το κυτταρικό εκχύλισμα φυγοκεντρείται στις rpm για 10 λεπτά. Από το υπερκείμενο φυλάσσεται ένα τμήμα (50 μl) ως δείγμα ολικού κυτταρικού εκχυλίσματος. Σε αυτό προστίθενται 50 μl 1xFSB+DTT, βράζεται στους 95 o C για 5 λεπτά και φυλάσσεται στους -20 o C. Το υπόλοιπο υπερκείμενο τοποθετείται στο eppendorf με τα σφαιρίδια στα οποία είναι προσδεδεμένο το αντίσωμα. Η επώαση πραγματοποιείται για 3 ώρες στους 4 o C, υπό ανακίνηση. Μετα το πέρας των 3 ωρών, πραγματοποιείται φυγοκέντρηση στις 4000 rpm για 5 λεπτά. Από το υπερκείμενο φυλάσσεται ένα τμήμα (50 μl) ως δείγμα πρωτεϊνών που δεν προσδέθηκαν στα σφαιρίδια. Σε αυτό προστίθενται 50 μl 2xFSB+DTT, βράζεται στους 95 o C για 5 λεπτά και φυλάσσεται στους -20 o C. Το υπόλοιπο υπερκείμενο απορρίπτεται. Ακολουθούν 3 πλύσεις των σφαιριδίων. Κάθε πλύση πραγματοποιείται με 1 ml διαλύματος λύσης, για 2 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου υπό ανακίνηση. Στη συνέχεια το δείγμα φυγοκεντρείται στις 4000 rpm για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο απορρίπτεται και επαναλαμβάνεται η ίδια διαδικασία ακόμα 2 φορές. Στα σφαιρίδια προστίθενται 25 μl διαλύματος 1xFSB+DTT. Το δείγμα βράζεται στους 95 o C για 5 λεπτά και φυλάσσεται στους -20 o C

69 3. Υλικά και Μέθοδοι 3.3 Μέθοδοι κυτταρικής βιολογίας Ανοσοφθορισμός Πρωτόκολλο ανοσοφθορισμού Ο ανοσοφθορισμός πραγματοποιείται σε κύτταρα που αναπτύσσονται πάνω σε καλυπτρίδες επιστρωμένες με poly-d-λυσίνη ως εξής: Τα τρυβλία στα οποία καλλιεργούνται τα κύτταρα πάνω στις καλυπτρίδες τοποθετούνται σε πάγο. Αφαιρείται το υπερκείμενο θρεπτικό μέσο και γίνονται 2 γρήγορες πλύσεις με κρύο διάλυμα PBS (1x). Η μονιμοποίηση των κυττάρων πραγματοποιείται με χρήση του διαλύματος 4% PFA (παραφορμαλδεΰδη), για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολουθούν δύο πλύσεις (5 λεπτά η κάθε μία) με διάλυμα PBS (1x). Έπειτα οι καλυπτρίδες με τα κύτταρα επωάζονται για 5 λεπτά με διάλυμα 0,3% Triton σε PBS (1x), σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολουθούν τρεις 5λεπτες πλύσεις με διάλυμα PBS (1x). Στη συνέχεια πραγματοποιείται κάλυψη των μη ειδικών θέσεων δέσμευσης του αντισώματος με διάλυμα (blocking) 3% BSA, 10% FBS σε PBS (1x), για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την πάροδο της μιας ώρας, περίπου 40 μl πρώτου αντισώματος διαλυμένου σε διάλυμα blocking προστίθενται σε κάθε καλυπτρίδα. Οι καλυπτρίδες επωάζονται με το πρωτογενές αντίσωμα για όλη τη νύχτα, σε υγρό περιβάλλον, στους 4 o C. Την επόμενη ημέρα πραγματοποιούνται τρεις πλύσεις (5 λεπτά η κάθε μία) με διάλυμα PBS (1x), 0,1% Tween (PBS-Tween). Στη συνέχεια οι καλυπτρίδες επωάζονται με το δεύτερο αντίσωμα, το οποίο είναι διαλυμένο σε διάλυμα blocking. Η επώαση διαρκεί 1 ώρα, σε θερμοκρασία δωματίου και σε σκοτεινό μέρος. Ακολουθούν τρεις πλύσεις (5 λεπτά η κάθε μία) με διάλυμα PBS (1x), 0,1% Tween (PBS-Tween). Οι καλυπτρίδες με τα κύτταρα επωάζονται με τη χρωστική Hoechst (1 μg/ml) σε διάλυμα PBS (1x), η οποία προσδένεται στο DNA. Η επώαση πραγματοποιείται σε θερμοκρασία δωματίου για 2 λεπτά. Η περίσσεια της χρωστικής απομακρύνεται με 2 πλύσεις (2 λεπτά η κάθε μία) με διάλυμα PBS (1x). Έπειτα οι καλυπτρίδες ξεπλένονται γρήγορα με ddh 2 O και τοποθετούνται ανάποδα σε αντικειμενοφόρους πλάκες στις οποίες έχει τοποθετηθεί mowoil. Η παρατήρησή τους πραγματοποιείται είτε σε μικροσκόπιο φθορισμού (Eclipse TE 2000U, Nikon) είτε σε συνεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού (SP5, Leica). Τροποποίηση ανοσοφθορισμού για BrdU Η διαδικασία του ανοσοφθορισμού πραγματοποιείται κανονικά σύμφωνα με το παραπάνω πρωτόκολλο μέχρι και το στάδιο επώασης των κυττάρων με διάλυμα 0,3% Triton σε PBS (1x). Στη συνέχεια ακολουθείται η εξής διαδικασία:

70 3. Υλικά και Μέθοδοι Οι καλυπτρίδες με τα κύτταρα εκπλένονται 3 φορές (5 λεπτά η κάθε μία) με διάλυμα PBS (1x). Έπειτα οι καλυπτρίδες με τα κύτταρα επωάζονται με διάλυμα 2Ν HCl για μία ώρα, σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολουθεί μία 5λεπτη πλύση με διάλυμα Tris-HCl ph 8,8 και μία 5λεπτη πλύση με διάλυμα PBS (1x), 0,1% Tween (PBS-Tween). Στη συνέχεια, πραγματοποιείται κάλυψη των μη ειδικών θέσεων δέσμευσης του αντισώματος με διάλυμα (blocking) 3% BSA, 10% FBS σε PBS (1x), για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Από αυτό το σημείο και έπειτα ακολουθείται η διαδικασία του ανοσοφθορισμού όπως περιγράφεται πιο πάνω. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα ανοσοφθορισμού τα εξής αντισώματα: Πρωτογενή αντισώματα Α-κυκλίνη Α σε αραίωση 1:80 (Neomarkers, Μονοκλωνικό) Α-Cdt1 σε αραίωση 1:500 (μεταπτυχιακή εργασία Ι.Ε.Συμεωνίδου, πολυκλωνικό) A-Geminin σε αραίωση 1:2000 (Xouri et al.,2004, πολυκλωνικό) Α-MCM2 σε αραίωση 1:500 (BD Pharmingen, μονοκλωνικό) A-PCNA σε αραίωση 1:100 (Sanra-cruz, μονοκλωνικό) Α-BrdU σε αραίωση 1:80 (AbD Serotec) Δευτερογενή αντισώματα Goat anti-mouse 488 σε αραίωση 1:500 (Molecular Probes) Goat anti-mouse 568 σε αραίωση 1:500 (Molecular Probes) Goat anti-rabbit 488 σε αραίωση 1:500 (Molecular Probes) Goat anti-rabbit 568 σε αραίωση 1:500 (Molecular Probes) Goat anti-rabbit 647 σε αραίωση 1:500 (Molecular Probes) Goat anti-rat 568 σε αραίωση 1:600 (Molecular Probes) Απομάκρυνση διαλυτού κλάσματος πρωτεϊνών (pre-extraction) Τα κύτταρα αναπτύσσονται πάνω σε καλυπτρίδες επιστρωμένες με poly-d-λυσίνη. Τα τρυβλία με τα κύτταρα τοποθετούνται πάνω σε πάγο. Το υπερκείμενο θρεπτικό μέσο αφαιρείται και πραγματοποιούνται 2 πλύσεις με κρύο διάλυμα PBS (1x). Ακολουθεί προσθήκη στα κύτταρα διαλύματος CSK στα κύτταρα. Η επώαση διαρκεί 1 λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου υπό ανακίνηση. Στη συνέχεια τα κύτταρα επωάζονται με διάλυμα CSK+TritonX-100 για 1 λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου υπό ανακίνηση. Αφαιρείται το υπερκείμενο διάλυμα και πραγματοποιείται μονιμοποίηση των κυττάρων με χρήση του διαλύματος 4% PFA (παραφορμαλδεΰδη), για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου

71 3. Υλικά και Μέθοδοι Ακολουθούν 3 πλύσεις (5 λεπτά η κάθε μία) με διάλυμα PBS (1x). Έπειτα οι καλυπτρίδες με τα κύτταρα επωάζονται για 5 λεπτά με διάλυμα 0,5% NP-40 σε PBS (1x), σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολουθούν τρεις 5λεπτες πλύσεις με διάλυμα PBS (1x). Η κάλυψη των μη ειδικών θέσεων δέσμευσης του αντισώματος πραγματοποιείται με διάλυμα (blocking) 3% BSA, 10% FBS σε PBS (1x), για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Από αυτό το στάδιο και έπειτα συνεχίζεται η διαδικασία του ανοσοφθορισμού όπως περιγράφεται στο προηγούμενο κεφάλαιο Ποσοτικοποίηση εικόνων ανοσοφθορισμού Η ποσοτικοποίηση των εικόνων ανοσοφθορισμού πραγματοποιήθηκε με χρήση του προγράμματος Image J. Συγκεκριμένα, οι εικόνες με τους πυρήνες των κυττάρων (χρώση με Hoecst) χρησιμοποιήθηκαν ως μάσκες για τον προσδιορισμό της μέσης έντασης φθορισμού των πυρήνων των εικόνων που επρόκειτο να ποσοτικοποιηθούν Προσδιορισμός των φάσεων του κυτταρικού κύκλου μέσω ανάλυσης του περιεχόμενου DNA με κυτταρομετρία ροής (FACS, Fluorescence Activated Cell Sorting) Η ανάλυση με κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε ως εξής: Κύτταρα που καλλιεργούνται σε τρυβλίο διαμέτρου 100 mm και καλύπτουν το 80-90% της επιφάνειάς του πλένονται 2 φορές με διάλυμα PBS (1x). Στη συνέχεια προστίθενται 800 μl διαλύματος τρυψίνης (1x). Το τρυβλίο τοποθετείται στον επωαστή των 37 o C για 1 λεπτό. Έπειτα προστίθενται στο τρυβλίο 10 ml θρεπτικού μέσου ώστε να αδρανοποιηθεί η τρυψίνη. Ακολουθεί καλή ανάμειξη των κυττάρων με την πιπέτα, έτσι ώστε να ανασηκωθούν όλα τα κύτταρα και να σπάσουν τυχόν συσσωματώματα. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις 1000 rpm για 5 λεπτά. Τα κύτταρα μονιμοποιούνται με χρήση παγωμένης 70% αιθανόλης και τοποθετούνται για 16 ώρες στους -20 o C. Ακολουθούν 2 πλύσεις των κυττάρων με διάλυμα PBS (1x). Ενδιαμέσως τα κύτταρα φυγοκεντρούνται στις 1000 rpm για 5λεπτά. Στα κύτταρα προστίθενται 100 μg/ml RNAse A (Sigma) και 2 μg/ml ιωδιούχου προπιδίου σε διάλυμα PBS (1x). Τα κύτταρα επωάζονται στους 37 o C για 30 λεπτά. Η ανάλυση πραγματοποιείται σε κυτταρομετρητή ροής Becton Dickinson. Για την επεξεργασία των αποτελεσμάτων χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα WinMDi

72 3. Υλικά και Μέθοδοι Ανοσοϊστοχημεία Πρωτόκολλο ανοσοϊστοχημείας Η ανοσοϊστοχημεία πραγματοποιείται σε τομές παραφίνης πάχους 5 μm. Η διαδικασία που ακολουθείται είναι η εξής: Οι τομές τοποθετούνται σε συρμάτινο καλαθάκι και μπαίνουν στον κλίβανο (60 o C) από το προηγούμενο βράδυ, μαζί με τρία μπανάκια με ξυλόλη. Την επόμενη ημέρα το συρμάτινο καλαθάκι τοποθετείται στο πρώτο μπανάκι με την ξυλόλη, για 5 λεπτά. Ακολουθούν ακόμη δύο 5λεπτες επωάσεις στα υπόλοιπα μπανάκια με την ξυλόλη. Οι τομές μεταφέρονται σε μπανάκι με κρύα ξυλόλη, όπου παραμένουν για 5 λεπτά. Στη συνέχεια περνούν από τα ακόλουθα διαλύματα: αιθανόλη:ξυλόλη 1:1, αιθανόλη 100% και αιθανόλη 96%. Οι τομές παραμένουν για 5 λεπτά σε κάθε διάλυμα. Οι τομές ξεπλένονται γρήγορα με dh 2 O και μεταφέρονται σε μπανάκι με διάλυμα TBS (1x), για 5 λεπτά. Στη συνέχεια οι τομές μεταφέρονται σε πλαστικό καλαθάκι και ακολούθως σε πλαστικό μπανάκι, το οποίο περιέχει διάλυμα κιτρικού οξέος. Ακολουθεί ανάδειξη των αντιγονικών επιτόπων, η οποία επιτυγχάνεται με επώαση στο φούρνο μικροκυμάτων, στα 800 Watt για 2 λεπτά και στα 300 Watt για 7 λεπτά. Το μπανάκι αφήνεται να κρυώσει σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά. Έπειτα αφαιρείται το μισό από το κιτρικό οξύ και αντικαθίσταται με dh 2 O. Αφήνεται ακόμη 10 λεπτά και στη συνέχεια οι τομές ξεπλένονται με dh 2 O. Ακολουθούν δύο 5λεπτες πλύσεις με TBS (1x). Η εξουδετέρωση της ενδογενούς υπεροξειδάσης πραγματοποιείται με την τοποθέτηση του καλαθιού με τις τομές σε μπανάκι με διάλυμα 3% Η 2 Ο 2 σε dh 2 O, για 10 λεπτά, σε σκοτεινό μέρος. Μετά το πέρας του χρόνου επώασης, οι τομές ξεπλένονται γρήγορα με dh 2 O. Έπειτα γίνονται δύο πλύσεις (5 λεπτά η κάθε μια) με TBS (1x). Ακολουθεί κάλυψη των μη ειδικών θέσεων δέσμευσης του αντισώματος (blocking), με διάλυμα 5% γάλα σε TBS (1x) ή με 3% BSA σε TBS (1x), ανάλογα με το πρώτο αντίσωμα που θα χρησιμοποιηθεί. Σε κάθε τομή αποτίθενται μl αυτού του διαλύματος. Η επώαση διαρκεί λεπτά (ανάλογα με το πρώτο αντίσωμα) και πραγματοποιείται σε θερμοκρασία δωματίου. Η περίσσεια του διαλύματος απομακρύνεται ύστερα από δύο 5λεπτες πλύσεις των τομών με TBS (1x). Το πρώτο αντίσωμα αραιώνεται στο antibody diluent (DAKO). Για κάθε τομή χρησιμοποιούνται μl. Η επώαση με το πρώτο αντίσωμα πραγματοποιείται σε υγρό περιβάλλον, στους 4 o C για όλη τη νύχτα ή σε θερμοκρασία δωματίου (RT) για μία ώρα. Ακολουθούν δύο πλύσεις (5 λεπτά η κάθε μια) με TBS (1x). Στη συνέχεια το καλαθάκι με τις τομές τοποθετείται σε μπανάκι με διάλυμα 3% Η 2 Ο 2 σε dh 2 O, για 5 λεπτά, σε σκοτεινό μέρος

73 3. Υλικά και Μέθοδοι Ακολουθούν δύο 5λεπτες πλύσεις με TBS (1x). Σε κάθε τομή προστίθενται 2-3 σταγόνες από το Envision kit (DAKO), το οποίο περιέχει το δευτερογενές αντίσωμα που φέρει τα μόρια υπεροξειδάσης. Η επώαση πραγματοποιείται σε υγρό περιβάλλον, σε θερμοκρασία δωματίου, για 30 λεπτά. Ακολουθούν δύο 5λεπτες πλύσεις με TBS (1x). Στη συνέχεια, σε κάθε τομή προστίθενται 2-3 σταγόνες διαλύματος DAB (χρωμογόνο υπόστρωμα). Η επώαση με το DAB πραγματοποιείται στον απαγωγό και διαρκεί 2-5 λεπτά. Ακολουθούν δύο 5λεπτες πλύσεις με TBS (1x). Το καλαθάκι με τις τομές εμβαπτίζεται σε μπανάκι που περιέχει διάλυμα αιματοξυλίνης 50% σε dh 2 O. Οι τομές παραμένουν σε αυτό το διάλυμα για 3 λεπτά. Η περίσσεια της αιματοξυλίνης απομακρύνεται από τις τομές με μια γρήγορη πλύση με dh 2 O. Η αφυδάτωση των τομών πραγματοποιείται περνώντας το καλαθάκι από τα ακόλουθα διαλύματα: 70% αιθανόλη, 80% αιθανόλη, 96% αιθανόλη και 2 φορές 100% αιθανόλη. Σε κάθε διάλυμα το καλαθάκι με τις τομές παραμένει για 5 λεπτά. Τέλος, οι τομές τοποθετούνται σε 3 μπανάκια με διάλυμα ξυλόλης. Σε κάθε μπανάκι παραμένουν για 5 λεπτά. Πάνω στις αντικειμενοφόρους πλάκες με τις τομές επικολλώνται καλυπτρίδες χρησιμοποιώντας κόλλα (Entellan, Merck). Ακολουθεί μικροσκοπική παρατήρηση σε φωτονικό μικροσκόπιο. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία καθώς και οι συνθήκες επώασης παρατίθενται στον παρακάτω πίνακα: Αντίσωμα Τύπος Προέλευση Αραίωση Επώαση Blocking Cdt1 Πολυκλωνικό Μεταπτυχική εργασία Ι.Ε. Συμεωνίδου 1:30 O/n, 4 o C Ki67 Μονοκλωνικό MIB-1, DAKO 1:80 1 h, RT HER2/neu Μονοκλωνικό CB11-Novocastra 1:60 1 h, RT P53 Μονοκλωνικό DO7 - DAKO 1:50 O/n, 4 o C Κυκλίνη A Μονοκλωνικό 6E6, Neomarkers 1:80 O/n, 4 o C TBS - 5% γάλα, 30 TBS - 3% BSA, 15 TBS - 3% BSA, 15 TBS 3% BSA, 30 TBS 3% BSA,

74 3. Υλικά και Μέθοδοι Αξιολόγηση ανοσοϊστοχημικής χρώσης Η αξιολόγηση της ανοσοϊστοχημικής χρώσης πραγματοποιήθηκε σε φωτονικό μικροσκόπιο. Αναφορικά με την εκτίμηση της χρώσης των Cdt1 και κυκλίνης Α λήφθηκαν υπόψιν τόσο η ένταση της χρώσης όσο και η κατανομή των θετικών κυττάρων. Πιο αναλυτικά, η διαβάθμιση της έντασης αποτυπώθηκε με χρήση κλίμακας 4 βαθμών: 0 (μη ανιχνεύσιμη χρώση), 1 (ασθενής ένταση χρώσης), 2 (ενδιάμεση ένταση χρώσης) και 3 (ισχυρή ένταση χρώσης). Επίσης, η κατανομή των θετικών κυττάρων κατηγοριοποιήθηκε ως εξής: score 0 (<1% θετικά κύτταρα), score 1 (1-35% θετικά κύτταρα), score 2 (35-75% θετικά κύτταρα) και score 3 (>75% θετικά κύτταρα). Οι δύο βαθμοί (έντασης και κατανομής) πολλαπλασιάστηκαν και το score που προέκυψε (τιμές από 0-9) κατηγοριοποιήθηκε ως εξής στα τελικά scores: score 0 (αρνητικό), score 1 (ασθενώς θετική χρώση, τιμές πολλαπλασιασμού 1 και 2), score 2 (μέτρια θετική χρώση, τιμές πολλαπλασιασμού 3 και 4) και score 3 (έντονα θετική χρώση, τιμές πολλαπλασιασμού 6 και 9). Ο τρόπος κατηγοριοποίησης περιγράφεται στον παρακάτω πίνακα: Κατανομή Ένταση 0 (μη ανιχνεύσιμη χρώση) 1 (ασθενής ένταση χρώσης) 2 (ενδιάμεση ένταση χρώσης) 3 (ισχυρή ένταση χρώσης) 0 (<1 % θετικά κύτταρα) 1 (1-35% θετικά κύτταρα) 2 (35-75% θετικά κύτταρα) 3 (>75% θετικά κύτταρα) Για την εκτίμηση της χρώσης των δεικτών P53 και Ki67 λήφθηκε υπόψιν το ποσοστό των θετικών κυττάρων. Θετική θεωρήθηκε η χρώση για το P53 όταν παρατηρήθηκε σε ποσοστό κυττάρων > 10%. Ο προσδιορισμός του score έκφρασης του HER2/neu πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες της Αμερικανικής Εταιρείας Κλινικής Ογκολογίας (ASCO) και του Κολεγίου των Αμερικανών Παθολογοανατόμων (CAP). Τέλος, οι δείκτες ER (Oestrogen Receptor) και PR (Progesterone Receptor) θεωρήθηκαν θετικοί όταν διαπιστώθηκε πυρηνική χρώση σε ποσοστό καρκινικών κυττάρων 1%

75 3. Υλικά και Μέθοδοι Στατιστική ανάλυση Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων της ανοσοϊστοχημείας πραγματοποιήθηκε με χρήση του προγράμματος SPSS (έκδοση 17). Η σημαντικότητα των διαφορών μεταξύ των διαφορετικών ομάδων κλινικοπαθολογικών παραμέτρων ελέγχθηκε με τις μη παραμετρικές δοκιμασίες Kruskal-Wallis (στις περιπτώσεις ν ανεξάρτητων δειγμάτων) ή Mann-Whitney (στις περιπτώσεις 2 ανεξάρτητων δειγμάτων). Οι συσχετίσεις μεταξύ των διαφορετικών πρωτεϊνικών δεικτών αξιολογήθηκαν με το τεστ Spearman rankorder. Σε όλες τις περιπτώσεις, στατιστικώς σημαντικές θεωρήθηκαν οι συσχετίσεις όταν p < Μέθοδοι ανασυνδυασμένου DNA Κλωνοποίηση Ηλεκτροφόρηση DNA σε πήκτωμα αγαρόζης Η διαδικασία ηλεκτροφόρησης δειγμάτων DNA σε πήκτωμα αγαρόζης πραγματοποιήθηκε ως εξής: Αρχικά παρασκευάζεται το πήκτωμα αγαρόζης σε διάλυμα 0,5x TBE. Η πυκνότητα του gel αγαρόζης που χρησιμοποιείται εξαρτάται από το μέγεθος των μορίων DNA που θα αναλυθούν. Στη συγκεκριμένη εργασία χρησιμοποιήθηκαν gel αγαρόζης 1%. Επιπλέον στο gel αγαρόζης προστίθεται βρωμιούχο αιθίδιο (EtBr), το οποίο ενσωματώνεται στο DNA και επιτρέπει την παρατήρησή του σε υπεριώδη λυχνία UV. Στα δείγματα DNA που πρόκειται να ηλεκτροφορηθούν προστίθεται χρωστική αγαρόζης σε αναλογία 1:10. Τα δείγματα φορτώνονται στο πήκτωμα αγαρόζης. Παράλληλα με τα προς ανάλυση δείγματα, στο πήκτωμα φορτώνεται δείγμα μοριακού μάρτυρα 1 Kb (DNA ladder 1 Kb, Gibco). Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιείται σε διάλυμα 0,5x TBE υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου τάσης 100 V. Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφόρησης, ακολουθεί παρατήρηση του πηκτώματος σε τράπεζα υπεριώδους λυχνίας UV και φωτογράφησή του με κάμερα KODAK digital science 1D με το λογισμικό EDAS 120 1D Καθαρισμός DNA από πήκτωμα αγαρόζης Για τον καθαρισμό του DNA από πήκτωμα αγαρόζης χρησιμοποιήθηκε το QIAquick Gel extraction kit (Qiagen), σύμφωνα με τις οδηγίες της εταιρίας

76 3. Υλικά και Μέθοδοι Απομόνωση πλασμιδιακού DNA μικρής κλίμακας (Minipreps) Η απομόνωση πλασμιδιακού DNA μικρής κλίμακας πραγματοποιήθηκε με το αντίστοιχο kit της εταιρίας Macherey Nagel, σύμφωνα με τις οδηγίες της εταιρίας Απομόνωση πλασμιδιακού DNA μεσαίας κλίμακας (Midipreps) Η απομόνωση πλασμιδιακού DNA μεσαίας κλίμακας πραγματοποιήθηκε με το αντίστοιχο kit της εταιρίας Macherey Nagel, σύμφωνα με τις οδηγίες της εταιρίας Κατάτμηση πλασμιδιακού DNA με ένζυμα περιορισμού Η αντίδραση κατάτμησης πραγματοποιείται σε eppendorfs σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα: Συγκέντρωση stock διαλύματος Αντίδραση στα 20 μl Αντίδραση στα 100 μl DNA - 1 μg 5-10 μg Ρυθμιστικό διάλυμα ενζύμων 10x 2 μl 10 μl Ένζυμο 1 (EcoR I) 20 U/μl 0,5 μl 3 μl Ένζυμο 2 (XhO I) 20 U/μl 0,5 μl 3 μl Η 2 Ο - Μέχρι τελικό Μέχρι τελικό όγκο όγκο 20 μl 100 μl Σημειώνεται ότι η αντίδραση στα 20 μl πραγματοποιείται με επώαση στους 37 o C για 1 ώρα, ενώ η αντίδραση τελικού όγκου 100 μl πραγματοποιείται στους 37 o C για 3 ώρες Αντίδραση συνδετάσης (Ligation) Για τις αντιδράσεις συνδετάσης χρησιμοποιήθηκε το ένζυμο T4 λιγάση της εταιρίας Takara. Για κάθε αντίδραση χρησιμοποιήθηκαν δύο τμήματα DNA: ο πλασμιδιακός φορέας και το ένθεμα σε αναλογία 1:3, σε τελικό όγκο 5 μl. Το DNA αναμειγνύεται με 5 μl διαλύματος Τ4 συνδετάσης συγκέντρωσης 0,1 U/μl. Η αντίδραση πραγματοποιείται στους 16 o C για 2 ώρες. Παράλληλα με την αντίδραση συνδετάσης πραγματοποιείται και μια αντίδραση αρνητικού μάρτυρα, στην οποία αναμειγνύεται ο πλασμιδιακός φορέας με διάλυμα Τ4 συνδετάσης. Με την αντίδραση αυτή καθίσταται δυνατή η διαπίστωση πιθανής επανακυκλοποίησης του πλασμιδιακού φορέα

77 3. Υλικά και Μέθοδοι Μετασχηματισμός DH5A βακτηριακών δεκτικών κυττάρων με πλασμιδιακό DNA Ο μετασχηματισμός των DH5A βακτηριακών κυττάρων με πλασμιδιακό DNA πραγματοποιείται ως εξής: Τα κύτταρα τοποθετούνται σε πάγο και αφήνονται να ξεπαγώσουν. Για κάθε αντίδραση μετασχηματισμού χρησιμοποιούνται 50 μl κυττάρων. Σε αυτά προστίθενται ng πλασμιδιακού DNA. Ακολουθεί επώαση στον πάγο για 20 λεπτά. Στη συνέχεια τα κύτταρα υφίστανται θερμικό σοκ στους 42 o C για 45 δευτερόλεπτα. Αμέσως μετά το θερμικό σοκ, τα κύτταρα τοποθετούνται στον πάγο για 2 λεπτά. Ακολουθεί προσθήκη θρεπτικού μέσου LB και επώαση των κυττάρων στους 37 o C για 1 ώρα. Μετά το πέρας της μιας ώρας, 200 μl κυττάρων επιστρώνονται σε τρυβλία με θρεπτικό μέσο LB-άγαρ με το κατάλληλο αντιβιοτικό επιλογής. Τα τρυβλία με τα κύτταρα επωάζονται στους 37 o C για 16 ώρες Κλωνοποίηση για τη δημιουργία του υβριδικού μορίου GFP-MCM2 Για τη δημιουργία του πλασμιδίου GFP-MCM2, το cdna της πρωτεΐνης MCM2, το οποίο ήταν κλωνοποιημένο στον πλασμιδιακό φορέα potb7, υποκλωνοποιήθηκε στον πλασμιδιακό φορέα έκφρασης σε ευκαρυωτικά κύτταρα pcdna3.1-gfp (Invitrogen). Για την υποκλωνοποίηση χρησιμοποιήθηκαν τα ένζυμα περιορισμού EcoR I (Takara) και XhO I (Takara). 3.5 Μέθοδοι λειτουργικής μικροσκοπίας ζωντανών κυττάρων Μικροσκοπία time lapse Η απεικόνιση ζωντανών κυττάρων σε δύο ή τρεις διαστάσεις (z-stacking) πραγματοποιήθηκε σε συνεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού SP5 της εταιρίας Leica, το οποίο είναι εξοπλισμένο με ειδικό θερμαινόμενο θάλαμο (37 o C) στον οποίο παρέχεται συνεχώς διοξείδιο του άνθρακα (5% CO 2 ) μέσω αντλίας. Τα κύτταρα καλλιεργούνται σε τρυβλία ειδικού τύπου, με διάμετρο 35 mm, τα οποία στον πυθμένα τους έχουν ενσωματωμένη στρογγυλή καλυπτρίδα που επιτρέπει την εστίαση. Κατά τη διάρκεια των πειραμάτων τα κύτταρα διατηρούνται σε θρεπτικό μέσο DMEM με 25 mm Hepes, ph 7,4, χωρίς ερυθρό της φαινόλης

78 3. Υλικά και Μέθοδοι Πειράματα Επαναφοράς Φθορισμού μετά από Φωτολεύκανση (Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP) Στη συγκεκριμένη εργασία η τεχνική FRAP εφαρμόστηκε για τη μελέτη της κινητικής συμπεριφοράς των υβριδικών μορίων GFP-MCM2, GFP-MCM4 και GFP-Cdt1 σε ζωντανά κύτταρα. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε είναι η ακόλουθη: Επιλέγεται ένα κύτταρο το οποίο φέρεται στο κέντρο του πεδίου. Επιλέγεται μια στρογγυλή περιοχή (Region of Interest 1, ROI 1) διαμέτρου 2 μm εντός του πυρήνα του κυττάρου, στην οποία πρόκειται να πραγματοποιηθεί η φωτολεύκανση. Λαμβάνονται 50 εικόνες (διάρκειας 0,066 sec η κάθε μια) πριν από τη φωτολεύκανση (pre bleach images), έπειτα πραγματοποιείται η φωτολεύκανση (bleach) για 0,132 sec και ακολουθεί η λήψη επιπλέον 250 εικόνων (διάρκειας 0,066 sec η κάθε μια) (post bleach images). Εκτός από τη ROI 1, επιλέγονται δύο επιπλέον ROIs, μια περιοχή (ROI 2) που περιβάλλει τον πυρήνα του κυττάρου (δηλαδή όλη την περιοχή στην οποία κατανέμεται η πρωτεΐνη που μελετάται) και μια περιοχή (ROI 3) εκτός του κυττάρου για την εκτίμηση του θορύβου (background) κατά τη διάρκεια του πειράματος. Σημειώνεται ότι για τη λήψη των εικόνων πριν και μετά τη φωτολεύκανση χρησιμοποιήθηκε η 488 nm γραμμή του Argon laser (με ένταση 4%), ενώ για τη φωτολεύκανση ενεργοποιήθηκαν και οι τέσσερις γραμμές του Argon laser (456, 476, 488 και 496) στο 100% της έντασης. Επίσης, η λήψη των εικόνων πραγματοποιήθηκε με καταδυτικό φακό λαδιού 63x1,4NA. Η ταχύτητα σάρωσης του laser ήταν μέγιστη (1400 Hz, και προς τις δύο κατευθύνσεις), η μεγέθυνση της σάρωσης ήταν 10x, το pinhole είχε τη μέγιστη διάμετρο και η ανάλυση της εικόνας ορίστηκε στα 128x128 εικονοστοιχεία. Η επαναφορά του φθορισμού στη ROI 1 μετά τη φωτολεύκανση ποσοτικοποιήθηκε σύμφωνα με τον τύπο (Rabut G. and Ellenberg J., 2005): I = (I ROI(x) - I bg(x) ) / (I TOT(x) - I bg(x) ) / (Ī ROI(1-50) - Ī bg(1-50)) / (Ī TOT(1-50) - Ī bg(1-50)) I (x) = (I I bleach ) / (1- I bleach ) όπου: I ROI(x) : η ένταση φθορισμού περιοχής που πραγματοποιήθηκε η φωτολεύκανση (ROI 1) κάθε δεδομένη χρονική στιγμή t I bg(x) : η ένταση φθορισμού περιοχής εκτός του κυττάρου (ROI 3) τη δεδομένη χρονική στιγμή t I TOT(x) : η ένταση φθορισμού όλου του πυρήνα (ROI 2) κάθε δεδομένη χρονική στιγμή Ī ROI(1-50) : ο μέσος όρος της έντασης φθορισμού περιοχής που έγινε η φωτολεύκανση (ROI 1) των πρώτων 50 εικόνων πριν τη φωτολεύκανση

79 3. Υλικά και Μέθοδοι Ī bg(1-50)): ο μέσος όρος της έντασης φθορισμού περιοχής εκτός του κυττάρου (ROI 3) των πρώτων 50 εικόνων πριν τη φωτολεύκανση Ī TOT(1-50) : ο μέσος όρος της έντασης φθορισμού περιοχής εκτός του κυττάρου (ROI 3) των πρώτων 50 εικόνων πριν τη φωτολεύκανση I bleach : η ένταση φθορισμού της περιοχής ROI 1 την πρώτη στιγμή που καταγράφεται μετά την φωτολεύκανση Πειράματα Απώλειας Φθορισμού μετά από Φωτολεύκανση (Fluorescence Loss In Photobleaching, FLIP) Η μελέτη του υποκυτταρικού εντοπισμού των αλληλεπιδράσεων της GFP-MCM2 με την χρωματίνη επετεύχθη με εφαρμογή της μεθόδου FLIP. Η διαδικασία που ακολουθήθηκε είναι η εξής: Επιλέγεται ένα κύτταρο το οποίο φέρεται στο κέντρο του πεδίου. Επιλέγεται μια στρογγυλή περιοχή διαμέτρου 3 μm εντός του πυρήνα του κυττάρου, στην οποία πρόκειται να πραγματοποιηθεί η φωτολεύκανση. Λαμβάνονται 5 εικόνες (διάρκειας 0,066 sec η κάθε μια) πριν από τη φωτολεύκανση (pre bleach images), έπειτα πραγματοποιείται παρατεταμένη φωτολεύκανση (bleach) για 3,96 sec (60 x 0,066 sec) και ακολουθεί η λήψη επιπλέον 5 εικόνων (διάρκειας 0,066 sec η κάθε μια) (post bleach images). Όπως και στα FRAP πειράματα, η λήψη των εικόνων πριν και μετά τη φωτολεύκανση πραγματοποιήθηκε με την 488 nm γραμμή του Argon laser (με ένταση 4%), ενώ για τη φωτολεύκανση ενεργοποιήθηκαν και οι τέσσερις γραμμές του Argon laser (456, 476, 488 και 496) στο 100% της έντασης. Επίσης, η λήψη των εικόνων πραγματοποιήθηκε με καταδυτικό φακό λαδιού 63x1,4NA, με ταχύτητα σάρωσης 1400 Hz και προς τις δύο κατευθύνσεις και ανάλυση εικόνας 128x128 εικονοστοιχεία. Η μεγέθυνση της σάρωσης ήταν 10x και το pinhole είχε τη μέγιστη διάμετρο. Σημειώνεται ότι πριν και μετά το FLIP πραγματοποιήθηκε λήψη εικόνων με μικρή ταχύτητα σάρωσης (100 Hz ή 200 Hz) και μεγάλη ανάλυση εικόνας (512x512 ή 1024x1024) για να είναι πιο εμφανείς και ευκρινείς οι περιοχές αλληλεπίδρασης της GFP- MCM2 πρωτεΐνης με τη χρωματίνη. Επίσης, στα πειράματα που μελετήθηκε το χρονικό διάστημα παραμονής της GFP-MCM2 στην χρωματίνη, μετά το FLIP, λήφθησαν 10 εικόνες κατά μήκος του z άξονα (z-stacking), ανά 5 λεπτά για 2 ώρες Ποσοτική ανάλυση των εικόνων μετά το FLIP Η ποσοτικοποίηση των εικόνων που ελήφθησαν κατά μήκος του z άξονα, μετά το FLIP πραγματοποιήθηκε από τη μεταπτυχιακή φοιτήτρια Μαριάννα Ραψομανίκη με χρήση του προγράμματος MATLAB R2007b. Συνοπτικά, για κάθε κύτταρο που υποβλήθηκε σε FLIP ανάλυση, δημιουργήθηκε η μέγιστη προβολή των 10 εικόνων κατά μήκος του z

80 3. Υλικά και Μέθοδοι άξονα, σε κάθε χρονική στιγμή. Στην εικόνα αυτή εφαρμόστηκε φίλτρο μέσης τιμής το οποίο συμβάλλει στην εξάλειψη του θορύβου. Με το φίλτρο αυτό, η τιμή της έντασης κάθε εικονοστοιχείου ορίζεται ίση με τη μέση τιμή των εντάσεων των γειτονικών του 6x6 εικονοστοιχείων. Τα δεδομένα που προέκυψαν αποτυπώθηκαν σε τρισδιάστατα διαγράμματα (mesh plots). Σε κάθε κύτταρο επιλέχθηκε μια συγκεκριμένη υποπυρηνική περιοχή η οποία περιείχε υποδομές δεσμευμένων μορίων της πρωτεΐνης GFP-MCM2 στη χρωματίνη. Ακολούθησε προσδιορισμός της μέσης έντασης φθορισμού και της τυπικής απόκλισης αυτής καθ όλη τη διάρκεια του πειράματος. Η ελάττωση της τυπικής απόκλισης με την πάροδο του χρόνου χρησιμοποιήθηκε ως μέτρο της αποδέσμευσης των μορίων της πρωτεΐνης GFP-MCM2 από τη χρωματίνη

81 3. Υλικά και Μέθοδοι 3.6 Διαλύματα Υλικά Για την καλλιέργεια και επεξεργασία των ευκαρυωτικών καρκινικών κυτταρικών σειρών χρησιμοποιήθηκαν τα εξής διαλύματα και χημικά: Θρεπτικό μέσο καλλιέργειας ευκαρυωτικών καρκινικών κυττάρων: Για την καλλιέργεια των ευκαρυωτικών κυτταρικών σειρών χρησιμοποιήθηκε το θρεπτικό μέσο DMEM (Gibco Cat.No ) εμπλουτισμένο με FBS (fetal bovine serum, Gibco Cat. No ) και παρουσία αντιβιοτικών πενικιλίνης και στρεπτομυκίνης (P/S, Gibco, Cat. No ) σε τελική συγκέντρωση 1%. Το θρεπτικό μέσο αποστειρώνεται με τη χρήση φίλτρου (Corning, Cat. No ) και στη συνέχεια φυλάσσεται στους 4 ο C. Διάλυμα τρυψίνης (συγκέντρωση διαλύματος εργασίας, 1x) Για την παρασκευή διαλύματος εργασίας 1x τρυψίνης, ποσότητα 1 ml stock διαλύματος 10x τρυψίνης (Biochrom AG, L2153) αραιώνεται υπό άσηπτες συνθήκες σε τελικό όγκο 10 ml αποστειρωμένου διαλύματος (1x) PBS. Χημικές ουσίες Οι χημικές ουσίες που χρησιμοποιήθηκαν για την κατεργασία των κυττάρων παρατίθενται στον παρακάτω πίνακα: Χημική Ουσία Συγκέντρωση stock διαλύματος Τελική συγκέντρωση Νοκοδαζόλιο 2 mg/ml 40 ng/ml Mimosine 40 mm 0,5 mm Υδροξυουρία 1 M 5 mm Θυμιδίνη 2 Μ 2,5 mm MG mm 20 μm Ταμοξιφαίνη 10 mm 5 μm Μεθοτρεξάτη 5 mm 30 nm 320 nm BrdU 20 mm 20 μμ Διάλυμα μονιμοποίησης και χρώσης αποικιών methylene blue Για την παρασκευή του διαλύματος methylene blue, 2 gr methylene blue αναδιαλύονται σε 1 l διαλύματος μεθανόλης : ddh 2 O σε αναλογία 1:1 (500 ml μεθανόλης ml ddh 2 O). Το διάλυμα αναδεύεται για 5-6 ώρες

82 3. Υλικά και Μέθοδοι Για τα πειράματα ανάλυσης πρωτεϊνών χρησιμοποιήθηκαν τα παρακάτω διαλύματα: Tris ph = 6,8 / 8 / 8,8 (1 M stock) Για την παρασκευή 1 Μ Tris διαλύματος, 24,22 gr Trizma-base αναδιαλύονται σε τελικό όγκο 200 ml ddh 2 O. Η τιμή του ph προσαρμόζεται στην επιθυμητή τιμή με χρήση διαλύματος 5 Ν ΗCl. HCl (5 Ν stock) Για την παρασκευή 5 Ν HCl διαλύματος, 86,2 ml πυκνού HCl (~11,6 N) αραιώνονται με ddh 2 O σε τελικό όγκο 200 ml διαλύματος. Διάλυμα 1% (w/v) bromophenol blue Για την παρασκευή 1% (w/v) bromophenol blue διαλύματος, 0,25 gr Bromophenol blue χρωστικής αναδιαλύονται σε τελικό όγκο 25 ml ddh 2 O. Το διάλυμα φυλάσσεται στους 4 ο C. FSB/DTT (συγκέντρωση stock διαλύματος φόρτωσης των πρωτεϊνικών δειγμάτων, 2x) Η σύσταση του διαλύματος (2x) FSB-DTT έχει ως εξής: γλυκερόλη τελικής συγκέντρωσης 20%, Tris ph 6,8 τελικής συγκέντρωσης 160 mm, SDS τελικής συγκέντρωσης 4%, Bromophenol blue τελικής συγκέντρωσης 0,01% και DTT τελικής συγκέντρωσης 0,2 M. Το DTT προστίθεται τελευταίο και μόνο στον όγκο διαλύματος που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί. Το διάλυμα (2x) FSB (-DTT) φυλάσσεται σε θερμοκρασία δωματίου, ενώ μετά την προσθήκη DTT φυλάσσεται στους 20 ο C. FSB/DTT (συγκέντρωση εργασίας διαλύματος φόρτωσης των πρωτεϊνικών δειγμάτων, 1x) Για την παρασκευή διαλύματος εργασίας 1Χ FSB (+DTT), ποσότητα του stock διαλύματος 2x FSB (+DTT) αραιώνεται σε αναλογία 1:1, με ίση ποσότητα πρωτεϊνικού δείγματος. PBS (συγκέντρωση stock ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών, 10x) Για την παρασκευή stock διαλύματος (10x) PBS, 80 gr NaCl, 2 gr KCl, 2,4 gr KH 2 PO 4 και 14,4 gr Na 2 HPO 4 αναδιαλύονται σε τελικό όγκο 1 l ddh 2 O. Ακολουθεί αποστείρωση. PBS (συγκέντρωση ρυθμιστικού διαλύματος εργασίας φωσφορικών, 1x) Για την παρασκευή διαλύματος εργασίας (1x) PBS, ποσότητα του stock διαλύματος 10X PBS αραιώνεται σε αναλογία αρχικού:τελικού όγκου, 1:10. Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται με προσθήκη μικρής ποσότητας 5 Ν HCl, έτσι ώστε η τιμή του να κυμαίνεται μεταξύ 7,2 και 7,4. Ακολουθεί αποστείρωση

83 3. Υλικά και Μέθοδοι PBS (1x) - 0.1%Tween (PBS-Tween) Για την παρασκευή 0,1% PBS-Tween διαλύματος, 1 ml 50% Tween-20 διαλύματος προστίθεται σε τελικό όγκο 500 ml (1x) PBS. DTT (1 M stock) Για την παρασκευή 1Μ DTT διαλύματος, 2,66 gr ουσίας αναδιαλύονται σε τελικό όγκο 17,24 ml ddh 2 O. Το διάλυμα αποστειρώνεται με φίλτρο μίας χρήσης (διαμέτρου 0,22 μm) και μοιράζεται σε aliquots τα οποία φυλάσσονται στους -20 ο C. 10% SDS Για την παρασκευή 10% SDS διαλύματος, 10 gr ουσίας αναδιαλύονται σε τελικό όγκο 100 ml ddh 2 O. Acrylamide/bis-Acrylamide 30% Solution, Electrophoresis reagent (A3574, Sigma) CAPS (συγκέντρωση stock διαλύματος, 100mM / (10x) Για την παρασκευή 10x stock διαλύματος υγρής ηλεκτρομεταφοράς πρωτεϊνών, 22,13g ουσίας CAPS αναδιαλύονται σε τελικό όγκο 1 l ddh 2 O. Το ph προσαρμόζεται στην τιμή 11 με προσθήκη διαλύματος NaOH (10N). Το διάλυμα φυλάσσεται στο σκοτάδι, σε θερμοκρασία δωματίου. CAPS (συγκέντρωση διαλύματος εργασίας, 10 mm (1x) Για την παρασκευή διαλύματος εργασίας (1x) CAPS, ποσότητα του stock διαλύματος (10x) CAPS αραιώνεται σε αναλογία αρχικού:τελικού όγκου, 1:10. Επιπλέον, στον τελικό όγκο προστίθεται διάλυμα μεθανόλης (100%) σε τελική αναλογία όγκου 10%. Ponceau S Για την παρασκευή διαλύματος χρωστικής Ponceau S, 0,2 gr Ponceau (Sigma P-3504) και 3 gr (ή 3 ml) 100% TCA αναδιαλύονται σε τελικό όγκο 100 ml ddh 2 O. 10% APS Για την παρασκευή 10% APS διαλύματος, 2 gr ουσίας αναδιαλύονται σε τελικό όγκο 20 ml ddh 2 O. Το διάλυμα αποστειρώνεται με φίλτρο μίας χρήσης (διαμέτρου 0,22 μm) και μοιράζεται σε aliquots τα οποία φυλάσσονται στους -20 ο C. Coomassie Brilliant Blue R-250 Για την παρασκευή διαλύματος χρωστικής Coomassie Brilliant Blue R-250, 0,25gr χρωστικής (Sigma B-0630) αναδιαλύονται σε 90 ml διαλύματος μεθανόλης:h 2 O (1:1, v/v) ενώ επίσης προστίθενται 10 ml glacial οξικού οξέος. Το διάλυμα φιλτράρεται με χαρτί Whatmann No.1 και φυλάσσεται σε θερμοκρασία δωματίου

84 3. Υλικά και Μέθοδοι Διάλυμα αποχρωματισμού της χρωστικής Coomassie Για την παρασκευή διαλύματος αποχρωματισμού της χρωστικής Coomassie, οξικό οξύ και απόλυτη αιθανόλη αραιώνονται σε ddh 2 O σε αναλογίες 10% και 20% αντίστοιχα, επί του τελικού όγκου. Ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης Laemmli (συγκέντρωση stock διαλύματος, 10x) Για την παρασκευή ρυθμιστικού διαλύματος ηλεκτροφόρησης Laemmli 10x αναδιαλύονται 30,3 gr Tris-base, 144,2 gr γλυκίνης και 10 gr SDS σε τελικό όγκο 1 l ddh 2 O. Το διάλυμα φυλάσσεται σε θερμοκρασία δωματίου. Ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροφόρησης Laemmli (συγκέντρωση διαλύματος εργασίας, 1x) Για την παρασκευή ρυθμιστικού διαλύματος ηλεκτροφόρησης Laemmli 1x ποσότητα του stock διαλύματος 10x Laemmli αραιώνεται σε αναλογία αρχικού:τελικού όγκου, 1:10. BIORAD SDS-PAGE protein marker (μάρτυρας μοριακών μεγεθών πρωτεϊνών): Ο πρωτεϊνικός μάρτυρας της BIORAD (Cat. No ) αραιώνεται σε αναλογία αρχικού:τελικού όγκου 1:10, με διάλυμα 1XFSB+DTT. Διάλυμα μπλοκαρίσματος μη ειδικών θέσεων στην PVDF μεμβράνη: Για την παρασκευή διαλύματος μπλοκαρίσματος των μη ειδικών θέσεων στην PVDF μεμβράνη, ποσότητα γάλακτος σε σκόνη εμπορίου (Regilait αποβουτυρωμένο) αναδιαλύεται σε διάλυμα (1x) PBS, 0,1% Tween (PBS-Tween), σε τελική συγκέντρωση 5%. Διάλυμα λύσης κυττάρων για τα πειράματα ανοσοκατακρήμνισης Για την παρασκευή 50 ml διαλύματος λύσης χρησιμοποιούνται τα διαλύματα που περιγράφονται στον ακόλουθο πίνακα: Συγκέντρωση stock διαλύματος Τελική συγκέντρωση Ποσότητα για την παρασκευή 50 ml διαλύματος Tris-HCl, ph 7,6 1 M 50 mm 2,5 ml NaCl 5 M 150 mm 1,5 ml EDTA 0,5 M 5 mm 0,5 ml MgCl 2 1 M 5 mm 250 μl Triton X % 0,5% 2,5 ml PMSF 0,1 M 1 mm 0,5 ml Complete, EDTA-free, Protease Inhibitor Cocktail ταμπλέτα Tablets (50 ml, Roche) ddh 2 O 42,25 ml

85 3. Υλικά και Μέθοδοι Διάλυμα Tris-HCl ph 7,6 (1M stock) Για την παρασκευή διαλύματος 1 Μ Tris-HCl ph 7,6, 121,1 gr Tris base αναδιαλύονται σε τελικό όγκο 1 l ddη 2 Ο. Το ph προσαρμόζεται στην τιμή 7,6 με χρήση διαλύματος HCl. Διάλυμα NaCl (5 M stock) Για την παρασκευή διαλύματος 5 Μ NaCl, 14,61 gr NaCl αναδιαλύονται σε τελικό όγκο 50 ml ddη 2 Ο. Διάλυμα EDTA (0,5 mm stock) Για την παρασκευή διαλύματος 0,5 mμ EDTA, 27,9 gr EDTA αναδιαλύονται σε 120 ml ddη 2 Ο. Στο διάλυμα προστίθεται στερεό NaOH μέχρι το ph να φτάσει την τιμή 8. Ακολουθεί ογκομέτρηση του διαλύματος στα 150 ml. PMSF (Phenylmethylsulfonyl fluoride) (100 mm stock) Για την παρασκευή διαλύματος 100 mm PMSF, 17,4 mg PMSF (Sigma P-7626) αναδιαλύονται σε τελικό όγκο 1 ml ισοπροπανόλης (100%). Ο αναστολέας χρησιμοποιείται σε τελική συγκέντρωση 0,5 mm και φυλάσσεται στους -20 ο C. Διάλυμα MgCl 2 (1 M stock) Για την παρασκευή διαλύματος 1 Μ MgCl 2, 10,165 gr MgCl 2 αναδιαλύονται σε τελικό όγκο 50 ml ddη 2 Ο. Για τη διεξαγωγή των πειραμάτων κυτταρικής βιολογίας χρησιμοποιήθηκαν τα παρακάτω διαλύματα: Διάλυμα επικάλυψης καλυπτρίδων poly-d-lysine (συγκέντρωση stock διαλύματος, 50 mg/ml, 500x) Για την παρασκευή stock διαλύματος επικάλυψης καλυπτρίδων, 100 mg λυσίνης (Sigma, Cat. No. P-1399) αναδιαλύονται σε τελικό όγκο 2 ml αποστειρωμένου ddh 2 O. Το διάλυμα μοιράζεται σε aliquots και φυλάσσεται στους -20 ο C. Διάλυμα επικάλυψης καλυπτρίδων poly-d-lysine (συγκέντρωση διαλύματος εργασίας, 0,1mg/ml, 1x) Για την παρασκευή διαλύματος εργασίας (1x) poly-d-lysine ποσότητα του stock διαλύματος (500x) poly-d-lysine αραιώνεται σε αποστειρωμένο διάλυμα (1x) PBS, σε αναλογία αρχικού:τελικού όγκου 1:500. Το διάλυμα αποστειρώνεται με φίλτρο μίας χρήσεως 0,22 μm και φυλάσσεται στους 4 ο C

86 3. Υλικά και Μέθοδοι Διάλυμα παραφολμαδεΰδης 4% (PFA) Για την παρασκευή διαλύματος παραφορμαλδεΰδης τελικής συγκέντρωσης 4%, 20 gr PFA (MERCK, Art 4005) αναδιαλύονται σε τελικό όγκο 500 ml διαλύματος (1x) PBS. Η ανάδευση πραγματοποιείται σε θερμοκρασία 65 ο C και για αρκετή ώρα, μέχρις να διαλυτοποιηθεί πλήρως η ουσία. Διάλυμα 0,3% Triton X-100 Για την παρασκευή διαλύματος 0,3% Triton X-100, 150 μl διαλύματος 100% Triton X- 100 αραιώνονται σε τελικό όγκο 50 ml διαλύματος (1x) PBS. Διάλυμα μπλοκαρίσματος μη ειδικών θέσεων στον ανοσοφθορισμό Η σύσταση του διαλύματος που χρησιμοποιείται για το μπλοκάρισμα των μη ειδικών θέσεων στον ανοσοφθορισμό έχει ως εξής: σε διάλυμα (1x) PBS προστίθεται BSA (Bovine Serum Albumin, Sigma Cat. No. Α-9418) σε τελική συγκέντρωση 3% και FBS σε τελική συγκέντρωση 10%. CSK διάλυμα Για την παρασκευή 10 ml CSK διαλύματος χρησιμοποιούνται τα διαλύματα που περιγράφονται στον ακόλουθο πίνακα: Συγκέντρωση stock διαλύματος Τελική συγκέντρωση Ποσότητα για την παρασκευή 10 ml διαλύματος PIPES 0,5 M 10 mm 200 μl Sucrose 1 M 300 mm 3 ml NaCl 5 M 100 mm 200 μl MgCl 2 1 M 3 mm 30 μl ddh 2 O - - 6,57 ml CSK + Triton διάλυμα Για την παρασκευή 10 ml CSK+ Triton διαλύματος χρησιμοποιούνται τα διαλύματα που περιγράφονται στον ακόλουθο πίνακα: Συγκέντρωση stock διαλύματος Τελική συγκέντρωση Ποσότητα για την παρασκευή 10 ml διαλύματος Triton X % 0,5% 500 μl PMSF 0,1 M 1 mm 100 μl Complete, EDTA-free, Protease Inhibitor Cocktail ταμπλέτα Tablets (10 ml, Roche) CSK διάλυμα - - 9,4 ml

87 3. Υλικά και Μέθοδοι Διάλυμα PIPES (0,1 M stock) Για την παρασκευή διαλύματος PIPES συγκέντρωσης 0,1 Μ, 0,9072 gr PIPES αναδιαλύονται σε 30 ml ddh 2 O. Διάλυμα κιτρικού οξέος (συγκέντρωση διαλύματος εργασίας, 1x) Για την παρασκευή διαλύματος κιτρικού οξέος συγκέντρωσης 1x, 2,1gr κιτρικού οξέος αναδιαλύονται σε τελικό όγκο 1 l ddh 2 O. Η τιμή του ph του διαλύματος προσαρμόζεται στην τιμή 6, με χρήση διαλύματος ΗCl. Διάλυμα Tris ph 7,6 (συγκέντρωση stock διαλύματος εργασίας, 5 mm/ 10x) Για την παρασκευή stock διαλύματος 5 mm Tris, 6,1gr ουσίας αναδιαλύονται σε τελικό όγκο 1 lt ddh 2 O. Η τιμή του ph του διαλύματος προσαρμόζεται στην τιμή 7,6, με χρήση διαλύματος ΗCl. Διάλυμα H 2 O 2 (συγκέντρωση διαλύματος εργασίας, 0,9%) Για την παρασκευή διαλύματος H 2 O 2 συγκέντρωσης 0,9%, 6 ml stock διαλύματος H 2 O 2 συγκέντρωσης 30% αραιώνονται σε τελικό όγκο 200 ml ddh 2 O. Διάλυμα TBS (συγκέντρωση διαλύματος εργασίας, 1x) Για την παρασκευή διαλύματος TBS συγκέντρωσης 1x, 8,1gr NaCl αναδιαλύονται σε τελικό όγκο 1 lt ddh 2 O ενώ στον τελικό όγκο προστίθενται επίσης 100 ml stock διαλύματος Tris ph 7,6, συγκέντρωσης 10x. Διάλυμα μπλοκαρίσματος των μη ειδικών αντιγονικών θέσεων στην ανοσοϊστοχημεία Για την παρασκευή διαλύματος μπλοκαρίσματος των μη ειδικών αντιγονικών θέσεων, ποσότητα γάλακτος σε σκόνη εμπορίου σε τελική συγκέντρωση 5% (CARNATION αποβουτυρωμένο) ή BSA (Bovine Serum Albumin, Sigma Cat. No. Α-9418) σε τελική συγκέντρωση 3%, αναδιαλύονται σε διάλυμα (1x) TBS. Κατά την εφαρμογή μεθόδων ανασυνδυασμένου DNA χρησιμοποιήθηκαν τα παρακάτω διαλύματα: LB medium: Για την παρασκευή 1 l αναμειγνύονται 10 gr bacto-tryptone, 5 gr bacto-yeast extract και 10 gr NaCl. Το ph ρυθμίζεται στην τιμή 7 με προσθήκη διαλύματος 5 N NaOH. Ακολουθεί ογκομέτρηση και αποστείρωση. LB medium-άγαρ: Για την παρασκευή 1 l LB-άγαρ παρασκευάζεται αρχικά LB medium αντίστοιχης ποσότητας και στη συνέχεια προστίθενται 15 gr άγαρ. Ακολουθεί ογκομέτρηση και αποστείρωση

88 3. Υλικά και Μέθοδοι Αντιβιοτικά επιλογής βακτηριακών αποικιών: Τα αντιβιοτικά που χρησιμοποιήθηκαν για τις υγρές και τις στερεές καλλιέργειες βακτηρίων ήταν τα εξής: Χλωραμφαινικόλη (συγκέντρωση stock διαλύματος 34 mg/ml) Για την παρασκευή stock διαλύματος χλωραμφαινικόλης συγκέντρωσης 34 mg/ml, χρησιμοποιούνται 340 mg αντιβιοτικού (Sigma Cat. No. C-0378), τα οποία αναδιαλύονται σε τελικό όγκο 10ml αιθανόλης. Το αντιβιοτικό χρησιμοποιείται σε τελική συγκέντρωση 34 μg/ml φυλάσσεται στους -20 ο C. Αμπικιλίνη (συγκέντρωση stock διαλύματος 50 mg/ml) Για την παρασκευή stock διαλύματος αμπικιλίνης συγκέντρωσης 50 mg/ml, χρησιμοποιείται 0.3 mg αντιβιοτικού, το οποίο αναδιαλύεται σε τελικό όγκο 6 ml 70% EtOH. Το αντιβιοτικό χρησιμοποιείται σε τελική συγκέντρωση 50 μg/ml φυλάσσεται στους -20 ο C

89 4. Αποτελέσματα 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Μέρος Α

90 4. Αποτελέσματα 4.1 Μελέτη της έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 σε κλινικά δείγματα καρκίνου μαστού καθώς και της πιθανής συμβολής του παράγοντα στην κακοήθη εξαλλαγή των κυττάρων Η πρωτεΐνη Cdt1 αποτελεί βασικό και απαραίτητο παράγοντα για τη συγκρότηση των συμπλόκων αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA. Πρόσφατες μελέτες έχουν αναδείξει τη σημασία της σωστής ρύθμισης του συστήματος αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA για τη διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας (Petropoulou et al., 2008). Η εκτοπική έκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 προάγει την επανεκκίνηση της αντιγραφής του DNA με αποτέλεσμα τον υπερδιπλασιασμό του γονιδιώματος και την εμφάνιση ανευπλοειδίας (Nishitani et al., 2000; Vaziri et al., 2003). Επιπλέον, η υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 σε ποντικούς είτε ανοσοκατεσταλμένους (Arentson et al., 2002) είτε με μη λειτουργικό p53 (Seo et al., 2005a) οδηγεί σε ανάπτυξη όγκων και σοβαρές χρωμοσωματικές ανωμαλίες. Επίσης αυξημένα επίπεδα έκφρασης του παράγοντα Cdt1 έχουν διαπιστωθεί αφενός σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές (Xouri et al., 2004) και αφετέρου σε κλινικά δείγματα μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (Karakaidos et al., 2004). Παρά την αποδεδειγμένη ογκογόνο δράση της πρωτεΐνης Cdt1, περιορισμένα δεδομένα υπάρχουν στη βιβλιογραφία σχετικά με την πιθανή χρήση του παράγοντα Cdt1 ως βιοδείκτη σε περιπτώσεις καρκίνου του ανθρώπου, κυρίως λόγω έλλειψης εμπορικά διαθέσιμου κατάλληλου αντισώματος έναντι της πρωτεΐνης Cdt1. Επιπλέον, παρ' όλο που έχει δειχθεί ότι η υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 προάγει την εμφάνιση ανευπλοειδίας, αυτή δεν έχει συσχετιστεί με συγκεκριμένες γονιδιωματικές ανωμαλίες. Σε προηγούμενη εργασία του εργαστηρίου μας (Διπλωματική Εργασία για την απόκτηση μεταπτυχιακού διπλώματος ειδίκευσης στις Βασικές Ιατρικές Επιστήμες, Ιωάννα-Ελένη Συμεωνίδου, 2008) πραγματοποιήθηκε έκφραση της υβριδικής πρωτεΐνης GST-Cdt1 σε ετερόλογο βακτηριακό σύστημα, ανοσοποίηση κουνελιών με την πρωτεΐνη και απομόνωση antihcdt1 αντισώματος από τον αντιορρό των ζώων. Η λειτουργικότητα και η ειδικότητα του αντισώματος επιβεβαιώθηκαν τόσο σε ανθρώπινα κύτταρα σε καλλιέργεια όσο και σε τομές παραφίνης από κλινικά δείγματα καρκίνου μαστού. Επίσης, προκαταρκτικά πειράματα έδειξαν υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 στην περιοχή του όγκου σε σύγκριση με τον παρακείμενο μη νεοπλασματικό ιστό. Στο παρόν κεφάλαιο, πραγματοποιήθηκε ανάλυση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 σε 85 δείγματα καρκίνου μαστού και ελέγχθηκε η πιθανή συσχέτισή τους με το στάδιο της νόσου, με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους καθώς και με άλλους ανεξάρτητους δείκτες κακοήθειας. Επιπλέον, διερευνήθηκε κατά πόσο οι παρατηρούμενες συσχετίσεις μπορεί να αντανακλούν λειτουργική επίπτωση της απορρύθμισης της έκφρασης του παράγοντα Cdt Έλεγχος ειδικότητας anti-hcdt1 αντισώματος Η ευαισθησία και η ειδικότητα του αντισώματος που είχε αναπτυχθεί σε προηγούμενη εργασία έναντι της πρωτεΐνης Cdt1 ελέγχθηκαν με μεθόδους

91 4. Αποτελέσματα ανοσοεντόπισης χρησιμοποιώντας είτε κύτταρα είτε πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές σε καλλιέργεια. Συγκεκριμένα, απομονώθηκαν πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από τις κυτταρικές σειρές MDA-MB-231, MDA-MB-468, SKBR3 και MCF7, οι οποίες προέρχονται από καρκίνο μαστού. Παράλληλα συλλέχθηκαν πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από MCF7 κύτταρα τα οποία είτε είχαν διαμολυνθεί με sirna ειδικό έναντι του mrna της πρωτεΐνης Cdt1 για 72 ώρες με στόχο την αποσιώπηση της έκφρασής του, είτε είχαν επωαστεί με τον αναστολέα του πρωτεασώματος MG132 για 3 ώρες, ώστε να αποτραπεί η πρωτεόλυση της πρωτεΐνης Cdt1 και συνεπώς να σταθεροποιηθούν τα επίπεδά της. Τα πρωτεϊνικά δείγματα αναλύθηκαν με western (εικόνα Α) χρησιμοποιώντας το αντίσωμα που αναπτύχθηκε έναντι της hcdt1 πρωτεΐνης. Όπως φαίνεται στην εικόνα Α, το αντίσωμα αναγνωρίζει μια πρωτεΐνη με μοριακό μέγεθος που αντιστοιχεί σε αυτό της hcdt1, σε όλες τις κυτταρικές σειρές που αναλύθηκαν (στήλες 5-8). Επιπλέον, η ζώνη που αντιστοιχεί στην hcdt1 πρωτεΐνη είναι πιο έντονη στο δείγμα των MCF7 κυττάρων που έχουν επωαστεί με τον αναστολέα του πρωτεασώματος MG132 (στήλη 2), σε σύγκριση με τo δείγμα MCF7 κυττάρων που δεν έχουν επωαστεί με τον αναστολέα (στήλη 1). Εικόνα 4.1.1: Το anti-hcdt1 αντίσωμα αναγνωρίζει ειδικά την πρωτεΐνη hcdt1. (Α) Η ειδικότητα του anti-hcdt1 αντισώματος ελέγχθηκε με ανοσοαποτύπωμα western. Για την ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν κυτταρικά εκχυλίσματα από MCF7 κύτταρα τα οποία είχαν επωαστεί είτε με τον αναστολέα του πρωτεασώματος MG132 είτε με sirna έναντι του hcdt1, καθώς και κυτταρικά εκχυλίσματα από τέσσερις διαφορετικές κυτταρικές σειρές καρκίνου μαστού του ανθρώπου. Στήλες 1-8: MCF7, MCF7 που έχουν επωαστεί με MG132, MCF7 που έχουν επωαστεί με Cdt1 RNAi, MCF7 που έχουν επωαστεί με RNAi έναντι της λουσιφεράσης (αρνητικός μάρτυρας), MDA MB 468, MDA MB 231, SKBR3 και MCF7, αντίστοιχα. (Β) Ανοσοφθορισμός με anti-cdt1 αντίσωμα σε MCF7 κύτταρα, σε MCF7 που έχουν επωαστεί με MG132 και σε MCF7 που έχουν επωαστεί είτε με sirna έναντι του Cdt1 είτε με sirna έναντι της λουσιφεράσης. Η χρώση του DNA πραγματοποιήθηκε με Dapi

92 4. Αποτελέσματα Επίσης, η διαμόλυνση των MCF7 κυττάρων με sirna έναντι του mrna της hcdt1 πρωτεΐνης είχε ως αποτέλεσμα την εμφάνιση μιας πολύ πιο ασθενούς ζώνης που αντιστοιχεί στην πρωτεΐνη Cdt1 (στήλη 3), σε σύγκριση με το δείγμα από τα MCF7 κύτταρα που διαμολύνθηκαν με μη στοχευμένο sirna έναντι του mrna της λουσιφεράσης (στήλη 4). Η ευαισθησία του αντισώματος έναντι της hcdt1 πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε με ανοσοφθορισμό σε ασύγχρονα MCF7 κύτταρα, τα οποία είχαν επωαστεί είτε με MG132 είτε με sirna έναντι του mrna της πρωτεΐνης Cdt1. Όπως φαίνεται στην εικόνα Β, παρατηρείται υψηλότερο ποσοστό θετικών κυττάρων και πιο έντονη χρώση για την πρωτεΐνη Cdt1 στα κύτταρα που έχουν επωαστεί με τον αναστολέα του πρωτεασώματος MG132. Αντίθετα, διαπιστώνεται πολύ ασθενής χρώση για την πρωτεΐνη Cdt1 στα MCF7 κύτταρα που διαμολύνθηκαν με sirna έναντι του mrna της πρωτεΐνης Cdt1 συγκριτικά με τα κύτταρα που διαμολύθηκαν με μη στοχευμένο sirna έναντι της λουσιφεράσης. Συμπερασματικά, το πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης hcdt1 αποτελεί ειδικό και ευαίσθητο μοριακό αντιδραστήριο και συνεπώς μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανοσοϊστοχημική ανάλυση της έκφρασης της πρωτεΐνης hcdt1 σε τομές παραφίνης από κλινικά δείγματα καρκίνου μαστού Ανάλυση της έκφρασης της πρωτεΐνης hcdt1 σε κλινικά δείγματα καρκίνου μαστού Με στόχο τον προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 στον καρκίνο μαστού με ανοσοϊστοχημεία, συνελέγησαν ιστικές τομές μονιμοποιημένες σε διάλυμα 10% φορμόλης και εγκλεισμένες σε παραφίνη από χειρουργικά παρασκευάσματα 85 ασθενών με πρωτοπαθή καρκίνο μαστού. Τα δείγματα αυτά προέρχονται από το αρχείο του τμήματος Παθολογικής Ανατομικής του γενικού νοσοκομείου Πατρών «Άγιος Ανδρέας». Σημειώνεται ότι οι πειραματικές διεργασίες πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τους κανόνες ηθικής και δεοντολογίας και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Έρευνας, Ηθικής και Δεοντολογίας καθώς και από την Επιστημονική Επιτροπή του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών. Τα κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά και η έκφραση του προγεστερονικών (progesterone receptor, PR) και οιστρογονικών υποδοχέων (oestrogen receptor, ER) των περιστατικών που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη λήφθησαν από τις ιστοπαθολογικές εκθέσεις των παρασκευασμάτων (εικόνα 4.1.2). Αναφορικά με τον ιστολογικό τύπο, 79 (92.9%) καρκινώματα ήταν πορογενή διηθητικά, 5 (5.9%) ήταν λοβιακά διηθητικά και 1 (1.2%) ήταν βλεννώδες. Η ταξινόμηση των δειγμάτων βάσει του μεγέθους της πρωτοπαθούς εστίας του όγκου, η οποία βασίστηκε στην σταδιοποίηση σύμφωνα με το ΤΝΜ σύστημα, ανέδειξε 17 (20%) Τ1, 41 (48.2%) Τ2, 12 (14.1%) Τ3 και 2 (2.4%) Τ4 όγκους. Ο βαθμός διαφοροποίησης των όγκων ήταν γνωστός για 82 από τα 85 δείγματα, εκ των οποίων 5 (5.9%) όγκοι ήταν χαμηλού, 35 (41.2%) όγκοι ήταν μέσου και 42 (49.4%) όγκοι ήταν υψηλού βαθμού διαφοροποίησης. Αναφορικά με την κατάσταση των

93 4. Αποτελέσματα λεμφαδένων, διαθέσιμα στοιχεία υπήρχαν για 72 από τα 85 δείγματα. Από αυτά τα περιστατικά, στα 42 (49,4%) είχε διαπιστωθεί λεμφαδενική μετάσταση. Επίσης, πληροφορίες για την κατάσταση των στεροειδικών υποδοχέων παρέχοντο για 73 από τα 85 περιστατικά που αναλύθηκαν, εκ των οποίων 45 (52.9%) ήταν θετικά για οιστρογονικούς υποδοχείς και 38 (44.7%) ήταν θετικά για προγεστερονικούς υποδοχείς. Ιστολογικός τύπος Τ Grade Πορογενές Λοβιακό Βλεννώδες T1 T2 T3 T N (%) 79 (92.9) 5 (5.9) 1 (1.2) 17 (20) 41 (48.2) 12 (14.1) 2 (2.4) 5 (5.9) 35 (41.2) 42 (49.4) LN μετάσταση ER status PR status Όχι Ναι N (%) 30 (35.3) 42 (49.4) 28 (32.9) 45 (52.9) 35 (41.2) 38 (44.7) Εικόνα 4.1.2: Κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά των περιστατικών καρκίνου μαστού που αναλύθηκαν. Τ: μέγεθος πρωτοπαθούς εστίας όγκου σύμφωνα με ΤΝΜ σταδιοποίηση, Grade: Βαθμός διαφοροποίησης, LN μετάσταση: λεμφαδενική μετάσταση, ER status: παρουσία ή μη οιστρογονικών υποδοχέων, PR status: παρουσία ή μη προγεστερονικών υποδοχέων. Η έκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 προσδιορίστηκε στα 85 κλινικά δείγματα καρκίνου μαστού με ανοσοϊστοχημεία και χρήση ειδικού αντισώματος έναντι της πρωτεΐνης Cdt1. Σε όλες τις περιπτώσεις η χρώση περιορίζεται στον πυρήνα, ενώ παρουσιάζεται σημαντικά ετερογενής, τόσο ως προς την ένταση όσο και ως προς το ποσοστό των θετικών κυττάρων, μεταξύ των διαφορετικών δειγμάτων που αναλύθηκαν (εικόνα Α-Δ). Πυρηνική χρώση για την πρωτεΐνη Cdt1 ανιχνεύτηκε σε 83 από τα 85 (97.6%) δείγματα. Σημειώνεται ότι η εκτίμηση της ανοσοϊστοχημικής χρώσης βασίστηκε στην ένταση και στο ποσοστό των θετικών κυττάρων, όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο «Υλικά και Μέθοδοι». Από τους 85 όγκους, 2 (2.4%) ήταν αρνητικοί (score 0) ως προς την έκφραση της πρωτεΐνης Cdt1, 16 (18.8%) εξέφραζαν την πρωτεΐνη σε χαμηλά επίπεδα (score 1), 20 (23.5%) δείγματα εμφάνιζαν ενδιάμεση ανοσοθετικότητα για την πρωτεΐνη (score 2) και 47 (55.3%) περιστατικά παρουσίαζαν υψηλά επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 (score 3) (εικόνα Ε). Στην εικόνα παρατίθενται αντιπροσωπευτικές εικόνες από περιστατικά με διαφορετικό βαθμό έκφρασης (score) της πρωτεΐνης Cdt

94 4. Αποτελέσματα Εικόνα 4.1.3: Ετερογένεια στην ανοσοϊστοχημική χρώση του Cdt1 μεταξύ των διαφορετικών δειγμάτων καρκίνου μαστού. (A) Αρνητική (score 0), (B) ασθενής (score 1), (Γ) ενδιάμεση (score 2) και (Δ) έντονη (score 3) πυρηνική έκφραση του Cdt1 (x400). (E) Διαγραμματική απεικόνιση της κατανομής των περιστατικών καρκίνου μαστού που αναλύθηκαν ως προς την έκφραση του Cdt

95 4. Αποτελέσματα Η πρωτεΐνη Cdt1 υπερεκφράζεται στον όγκο μαστού σε σύγκριση με τον παρακείμενο φυσιολογικό ιστό και συσχετίζεται με την κατάσταση των στεροειδικών υποδοχέων Σε προηγούμενη μελέτη του εργαστηρίου μας (Διπλωματική Εργασία για την απόκτηση μεταπτυχιακού διπλώματος ειδίκευσης στις Βασικές Ιατρικές Επιστήμες, Ιωάννα Ελένη Συμεωνίδου), προκαταρκτικά πειράματα μελέτης της έκφρασης του παράγοντα Cdt1 σε 10 κλινικά δείγματα καρκίνου μαστού είχαν καταδείξει υπερέκφραση της πρωτεΐνης στην περιοχή του όγκου σε σύγκριση με τον παρακείμενο φυσιολογικό ιστό. Με στόχο τη διερεύνηση της πιθανής χρήσης του παράγοντα Cdt1 ως διαγνωστικού βιοδείκτη, κρίθηκε αναγκαία η διεύρυνση της μελέτης σε μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων. Για το σκοπό αυτό ελέγχθηκαν τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 σε 85 περιστατικά καρκίνου μαστού και συγκρίθηκαν με τα αντίστοιχα επίπεδα των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών. Στοιχεία μη νεοπλασματικού ιστού εντοπίστηκαν σε 74 από τα 85 δείγματα που αναλύθηκαν (εικόνα 4.1.4). Στην εικόνα παρατίθενται εικόνες από αντιπροσωπευτικό κλινικό δείγμα καρκίνου μαστού, το οποίο παρουσιάζει Εικόνα 4.1.4: Η πρωτεΐνη Cdt1 υπερεκφράζεται στον καρκίνο μαστού. Αντιπροσωπευτικό δείγμα πορογενούς διηθητικού όγκου μαστού όπου παρατηρείται ανοσοϊστοχημικά (Β) έντονη υπερέκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 στην περιοχή του όγκου σε σύγκριση (Α) με τον παρακείμενο φυσιολογικό ιστό (μεγέθυνση x400). (Γ) Διαγραμματική απεικόνιση της κατανομής των δειγμάτων καρκίνου μαστού ως προς την ανοσοϊστοχημική έκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 στην περιοχή του όγκου σε σχέση με την αντίστοιχη στον παρακείμενο μη νεοπλασματικό ιστό

96 4. Αποτελέσματα υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 στην περιοχή του όγκου (Β) σε σύγκριση με τον παρακείμενο μη νεοπλασματικό ιστό (Α). Από τα 74 δείγματα που αναλύθηκαν, σε 70 (95%) δείγματα παρατηρήθηκε υπερέκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 στην περιοχή του όγκου σε σύγκριση με τον παρακείμενο μη νεοπλασματικό ιστό, ενώ στα υπόλοιπα 4 (5%) δείγματα, η έκφραση του παράγοντα Cdt1 κυμάνθηκε σε παρόμοια επίπεδα μεταξύ των δύο διαφορετικών τύπων ιστών (εικόνα Γ). Σε κανένα δείγμα δεν διαπιστώθηκαν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 στο φυσιολογικό ιστό σε σχέση με τον όγκο. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έδειξε ότι η διαφορά στην έκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 μεταξύ όγκων και παρακείμενων φυσιολογικών ιστών είναι στατιστικώς σημαντική (p<0.001). Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε έλεγχος της πιθανής συσχέτισης της έκφρασης του παράγοντα Cdt1 στα δείγματα καρκίνου μαστού που αναλύθηκαν, με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους της νόσου (εικόνα 4.1.5). Αναφορικά με τον ιστολογικό τύπο, από τα 79 πορογενή διηθητικά καρκινώματα, 2 (2.5%) ήταν αρνητικά για την έκφραση της πρωτεΐνης Cdt1, ενώ 16 (20.3%) την εξέφραζαν σε χαμηλά, 19 (29.1%) σε ενδιάμεσα και 42 (53.2%) σε υψηλά επίπεδα. Και στα 5 (100%) λοβιακά διηθητικά καρκινώματα η έκφραση του παράγοντα Cdt1 ήταν έντονη, ενώ το βλεννώδες καρκίνωμα παρουσίαζε ενδιάμεσα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης. Όσο αφορά το μέγεθος της πρωτοπαθούς εστίας, από τα 17 Τ1 δείγματα, 3 (17.6%) παρουσίαζαν ασθενή, 4 (23.3%) μέτρια και 10 (58.8%) έντονη έκφραση του παράγοντα Cdt1. Από τα 41 Τ2 δείγματα, σε 2 (4.9%) δεν διαπιστώθηκε έκφραση της πρωτεΐνης Cdt1, ενώ σε 9 (22%), 7 (17.1%) και 23 (56.1%) δείγματα τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης ήταν χαμηλά, ενδιάμεσα και υψηλά, αντίστοιχα. Από τα 12 Τ3 περιστατικά, 5 (41.7%) εξέφραζαν την πρωτεΐνη Cdt1 σε ενδιάμεσα και 7 (58.3%) σε υψηλά επίπεδα. Τέλος, από τα 2 Τ4 δείγματα, 1 (50%) παρουσίαζε μέτρια και 1 (50%) έντονη έκφραση του παράγοντα Cdt1. Αναφορικά με το βαθμό διαφοροποίησης, και οι 5 (100%) ασθενώς διαφοροποιημένοι όγκοι εξέφραζαν την πρωτεΐνη Cdt1 σε υψηλά επίπεδα. Από τους 35 όγκους με μέσου βαθμού διαφοροποίηση, 1 (2.9%) ήταν αρνητικός ως προς την έκφραση της πρωτεΐνης Cdt1, ενώ 9 (25.7%), 7 (20%) και 18 (51.4%) όγκοι παρουσίαζαν ασθενή, μέτρια και έντονη έκφραση του παράγοντα. Από τα 42 δείγματα με υψηλού βαθμού διαφοροποίηση, 1 (2.4%) δεν εξέφραζε την πρωτεΐνη Cdt1, ενώ σε 5 (11.9%), 12 (28.6%) και 24 (57.1%) δείγματα διαπιστώθηκε ασθενής, ενδιάμεση και έντονη έκφραση της πρωτεΐνης, αντίστοιχα. Όσον αφορά την παρουσία λεμφαδενικής μετάστασης, από τα 30 περιστατικά χωρίς μετάσταση, σε 2 (6.7%) δεν αναδείχθηκε θετική χρώση για την πρωτεΐνη Cdt1, ενώ σε 5 (16.7%), 8 (26.7%) και 15 (50%) δείγματα τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης ήταν χαμηλά, ενδιάμεσα και υψηλά, αντίστοιχα. Από τους 42 όγκους στους οποίους είχε διαπιστωθεί μετάσταση στους λεμφαδένες, αναδείχθηκε ασθενής, μέτρια και έντονη ανοσοθετικότητα για τον παράγοντα Cdt1 σε 7 (16.7%), 10 (23.8%) και 25 (59.5%) δείγματα, αντίστοιχα. Τέλος, αναφορικά με την κατάσταση των στεροειδικών υποδοχέων, από τους 28 όγκους που ήταν αρνητικοί για οιστρογονικούς υποδοχείς, 1 (3.6%) εξέφραζε ασθενώς, 7 (25%) μετρίως και 20 (71.4%) έντονα την πρωτεΐνη Cdt1. Από τους 45 όγκους που ήταν θετικοί για οιστρογονικούς υποδοχείς, 2 (4.4%) δεν εξέφραζαν τον παράγοντα Cdt1, ενώ 10 (22.2%), 9 (20%) και 24 (53.3%) παρουσίαζαν χαμηλά, ενδιάμεσα και υψηλά επίπεδα έκφρασης. Επίσης, από τους 35 όγκους που ήταν αρνητικοί για προγεστερονικούς

97 4. Αποτελέσματα υποδοχείς, διαπιστώθηκε ασθενής, μέτρια και έντονη έκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 σε 2 (5.7%), 8 (22.9%) και 25 (71.4%) δείγματα, αντίστοιχα. Από τα υπόλοιπα 38 περιστατικά που ήταν θετικά για προγεστερονικούς υποδοχείς, 2 (5.3%) δείγματα ήταν αρνητικά ως προς την έκφραση του παράγοντα Cdt1, ενώ σε 9 (23.7%), 8 (21.1%) και 19 (50%) δείγματα η έκφραση της πρωτεΐνης παρουσιάστηκε ασθενής, ενδιάμεση και έντονη, αντίστοιχα. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων δεν ανέδειξε συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του παράγοντα Cdt1 και του ιστολογικού τύπου, του μεγέθους του πρωτοπαθούς όγκου, του βαθμού διαφοροποίησης και της παρουσίας ή μη λεμφαδενικής μετάστασης. Αντίθετα, διαπιστώθηκε στατιστικώς σημαντική και αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 και της κατάστασης των οιστρογονικών (p=0.048) και προγεστερονικών (p=0.023) υποδοχέων. Συμπερασματικά ο παράγοντας Cdt1 υπερεκφράζεται στατιστικώς σημαντικά στον όγκο μαστού σε σύγκριση με τον παρακείμενο φυσιολογικό ιστό, γεγονός που του προσδίδει πιθανή διαγνωστική αξία σε αυτούς τους όγκους. Επιπλέον η αντίστροφη συσχέτιση που παρατηρείται μεταξύ των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 και της έκφρασης των προγεστερονικών (PR) και οιστρογονικών υποδοχέων (ER) καταδεικνύει την πιθανή αξία του παράγοντα ως προγνωστικού βιοδείκτη στο διηθητικό καρκίνο μαστού

98 4. Αποτελέσματα Καρκίνοι μαστού n Score 0 n (%) Έκφραση Cdt1 α Score 1 Score 2 n (%) n (%) Score 3 n (%) 85 2 (2.4) 16 (18.8) 20 (23.5) 47 (55.3) p Value β Ιστολογικός Τύπος Πορογενές 79 2 (2.5) 16 (20.3) 19 (24.1) 42 (53.2) Λοβιακό 5 0 (0) 0 (0) 0 (0) 5 (100) Βλεννώδες 1 0 (0) 0 (0) 1 (100) 0 (0) T γ T (0) 3 (17.6) 4 (23.5) 10 (58.8) T (4.9) 9 (22) 7 (17.1) 23 (56.1) T (0) 0 (0) 5 (41.7) 7 (58.3) Τ4 2 0 (0) 0 (0) 1 (50) 1 (50) Grade Grade (0) 0 (0) 0 (0) 5 (100) Grade (2.9) 9 (25.7) 7 (20) 18 (51.4) Grade (2.4) 5 (11.9) 12 (28.6) 24 (57.1) Παρουσία LN δ μετάστασης Όχι 30 2 (6.7) 5 (16.7) 8 (26.7) 15 (50) Ναι 42 0 (0) 7 (16.7) 10 (23.8) 25 (59.5) ER ε status (0) 1 (3.6) 7 (25) 20 (71.4) (4.4) 10 (22.2) 9 (20) 24 (53.3) PR στ status (0) 2 (5.7) 8 (22.9) 25 (71.4) (5.3) 9 (23.7) 8 (21.1) 19 (50) Εικόνα 4.1.5: Έκφραση του Cdt1 σε κακοήθη νεοπλάσματα του μαστού: συσχέτιση με κλινικοπαθολογικές παραμέτρους και στεροειδικούς υποδοχείς. α: Η αξιολόγηση της ανοσοϊστοχημικής χρώσης του Cdt1 πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο «Μέθοδοι και Υλικά», β: Στατιστικώς σημαντικές θεωρήθηκαν οι συσχετίσεις όταν p<0.05 (Kruskal-Wallis ή Mann-Whitney tests) γ: Σύμφωνα με την ΤΝΜ σταδιοποίηση, δ: Lymph node, λεμφαδένας, ε: Oestrogen receptor, οιστρογονικός υποδοχέας, στ: Progesterone receptor, προγεστερονικός υποδοχέας

99 4. Αποτελέσματα Η υπερέκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 συσχετίζεται με υψηλή ταχύτητα πολλαπλασιασμού των κυττάρων στον όγκο μαστού Με στόχο τη μελέτη της πιθανής αξίας του παράγοντα Cdt1 ως μοριακού προγνωστικού βιοδείκτη στον καρκίνο του μαστού, διερευνήθηκε η πιθανή συσχέτιση της έκφρασης του παράγοντα με τους γνωστούς βιοδείκτες Ki67 και p53. Η πρωτεΐνη Ki67 αποτελεί τον πιο διαδεδομένο δείκτη πολλαπλασιασμού των κυττάρων στον καρκίνο του μαστού (de Azambuja et al., 2007). Αρκετές μελέτες έχουν καταδείξει ότι ο προσδιορισμός της ταχύτητας πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων ενδέχεται να είναι κλινικά χρήσιμος, καθώς συμβάλλει στην πρόγνωση, στην επιλογή κατάλληλης θεραπείας, καθώς και στην εκτίμηση της απόκρισης στο θεραπευτικό σχήμα που ακολουθείται. Εκτός από το δείκτη Ki67, ελέγχθηκε επιπλέον η πιθανή συσχέτιση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 με τα αντίστοιχα επίπεδα του μεταγραφικού παράγοντα p53. Πρέπει να σημειωθεί ότι η θετική ανοσοϊστοχημική χρώση για την πρωτεΐνη P53 συσχετίζεται με την παρουσία μεταλλάξεων στο γονίδιο του μορίου (Greenblatt et al., 1994). Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι η ύπαρξη μεταλλάξεων στο γονίδιο TP53 έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή πρωτεϊνικών μορίων με αυξημένο χρόνο ημιζωής, τα οποία κατά συνέπεια συσσωρεύονται στον πυρήνα. Ο προσδιορισμός των επιπέδων έκφρασης του δείκτη πολλαπλασιασμού Κi67 στα 85 περιστατικά καρκίνου μαστού πραγματοποιήθηκε με ανοσοϊστοχημεία και χρήση ειδικού αντισώματος έναντι της πρωτεΐνης Κi67. Για την εκτίμηση της έκφρασης ελήφθη υπόψιν το ποσοστό των καρκινικών κυττάρων που ήταν θετικά για την πρωτεΐνη. Η μικροσκοπική παρατήρηση των 85 δειγμάτων ανέδειξε πυρηνική χρώση για την πρωτεΐνη Ki67, ενώ το ποσοστό θετικότητας κυμαινόταν από 0% έως 85%, με μέση τιμή 23.64% ± 21.87%. Στην εικόνα παρατίθενται αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες από 4 δείγματα καρκίνου μαστού με διαφορετικού βαθμού έκφραση της πρωτεΐνης Ki67. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων δεν ανέδειξε σημαντική συσχέτιση των επιπέδων έκφρασης του δείκτη Ki67 με τις κλινικοπαθολογικές παραμέτρους ή με την κατάσταση των στεροειδικών υποδοχέων των όγκων. Ακολούθως πραγματοποιήθηκε ανοσοϊστοχημική ανάλυση της έκφρασης του ογκοκατασταλτικής πρωτεΐνης p53 σε 79 από τα 85 ιστικά δείγματα καρκίνου μαστού. Θετική πυρηνική χρώση για την πρωτεΐνη P53 ανιχνεύθηκε σε 58 από τα 79 (73,42%) δείγματα. Στα θετικά δείγματα παρατηρήθηκε διακύμανση του ποσοστού θετικότητας από 10% έως 100%, με μέση τιμή 54.5% ± 26.93%. Στην εικόνα παρατίθενται αντιπροσωπευτικές φωτογραφίες από 4 ιστικά δείγματα καρκίνου μαστού που παρουσιάζουν διαφορετικού βαθμού ανοσοθετικότητα για την πρωτεΐνη P53. Όπως φαίνεται στην εικόνα 4.1.8, δεν διαπιστώθηκε στατιστικώς σημαντική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης p53 και των κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικών ή της κατάστασης των οιστρογονικών και προγεστερονικών υποδοχέων των όγκων

100 4. Αποτελέσματα Εικόνα 4.1.6: Ανοσοϊστοχημική έκφραση της πρωτεΐνης Ki67 σε δείγματα καρκίνου μαστού. (Α-Δ) Αντιπροσωπευτικά δείγματα καρκίνου μαστού με ετερογενή έκφραση της πρωτεΐνης Ki67 (μεγέθυνση x 400). (Α) Αρνητική (0%), (B) ασθενής (10%), (Γ) ενδιάμεση (20%) και (Δ) έντονη (60%) πυρηνική χρώση για την πρωτεΐνη Ki67. (Ε) Γράφημα στο οποίο απεικονίζεται η κατανομή των περιστατικών καρκίνου μαστού που εξετάστηκαν ως προς την ανοσοϊστοχημική έκφραση της πρωτεΐνης Κi

101 4. Αποτελέσματα Εικόνα 4.1.7: Ανοσοϊστοχημική έκφραση της πρωτεΐνης p53 σε δείγματα καρκίνου μαστού. (Α-Δ) Αντιπροσωπευτικά δείγματα καρκίνου μαστού με διαφορετική έκφραση της πρωτεΐνης P53 (μεγέθυνση x 400). (Α) Αρνητική (0%), (B) ασθενής (30%), (Γ) ενδιάμεση (50%) και (Δ) έντονη (100%) ανοσοϊστοχημική χρώση για την πρωτεΐνη p53. (Ε) Γράφημα στο οποίο απεικονίζεται η κατανομή των περιστατικών καρκίνου μαστού που εξετάστηκαν ως προς την ανοσοϊστοχημική έκφραση της πρωτεΐνης p

102 4. Αποτελέσματα n Mean (%) Ki67 α Καρκίνοι μαστού Ιστολογικός τύπος P53 β St St dev Mean p dev (%) n (%) Value γ (%) Πορογενές p Value β Λοβιακό Βλεννώδες T δ T T T Τ Grade Grade Grade Grade Παρουσία LN ε μετάστασης Όχι Ναι ER στ status PR ζ status Εικόνα 4.1.8: Έκφραση των πρωτεϊνών Ki67 και P53 σε περιστατικά καρκίνου μαστού: συσχέτιση με κλινικοπαθολογικές παραμέτρους και με την έκφραση στεροειδικών υποδοχέων. α,β: Η εκτίμηση της ανοσοϊστοχημικής χρώσης των πρωτεϊνών Ki67 και P53 πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στις μεθόδους, γ: Στατιστικώς σημαντικές θεωρήθηκαν οι συσχετίσεις όταν p<0.05 (Kruskal-Wallis ή Mann- Whitney tests), δ: Σύμφωνα με την ΤΝΜ σταδιοποίηση, ε: Lymph node, λεμφαδένας, στ: Oestrogen receptor, οιστρογονικός υποδοχέας, ζ: Progesterone receptor, προγεστερονικός υποδοχέας. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων κατέδειξε σημαντική θετική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης του παράγοντα Cdt1 και του ποσοστού έκφρασης του δείκτη πολλαπλασιασμού Ki67 (p=0.002, Spearman s r value = 0.328) (εικόνα 4.1.9). Όπως απεικονίζεται και στο διάγραμμα Ε, η μέση τιμή του ποσοστού θετικότητας για το δείκτη Ki67 ήταν 5% ± 7.07% για τα περιστατικά με αρνητική έκφραση (score 0) της πρωτεΐνης Cdt1, 12.63% ± 12.22% για τα δείγματα με ασθενή έκφραση (score 1) του παράγοντα Cdt1, 17.5% ± 26.93%13,23% για τους όγκους με ενδιάμεσα επίπεδα έκφρασης (score 2) της πρωτεΐνης Cdt1 και 30.7% ± 25% για τα δείγματα με έντονη ανοσοθετικότητα (score 3) για την πρωτεΐνη Cdt1. Αντιθέτως δεν ανευρέθη στατιστικώς σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 και της αντίστοιχης του της πρωτεΐνης p53 (p=0.623, Spearman s r value = 0.054)

103 4. Αποτελέσματα Εικόνα 4.1.9: Η υπερέκφραση του Cdt1 συσχετίζεται με την έκφραση του δείκτη κυτταρικού πολλαπλασιασμού Ki67 σε δείγματα καρκίνου μαστού. (A,B) Διηθητικό καρκίνωμα μαστού το οποίο παρουσιάζει αρνητική ανοσοϊστοχημική χρώση για τις πρωτεΐνες (A) Cdt1 και (B) Ki67. (Γ, Δ) Αντιπροσωπευτικό δείγμα λοβιακού διηθητικού καρκινώματος μαστού στο οποίο παρατηρούνται υψηλά επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών (Γ) Cdt1 και (Δ) Ki67 (μεγέθυνση x 400). (Ε) Διάγραμμα πλαισίου και απολήξεων (box plot) στο οποίο αναπαρίσταται η κατανομή των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης Ki67 ως προς το βαθμό υπερέκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 (score 0 score 3), στα περιστατικά καρκίνου μαστού που αναλύθηκαν

104 4. Αποτελέσματα Διερεύνηση της συσχέτισης της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 με τα επίπεδα έκφρασης του υποδοχέα HER2/neu Στη συνέχεια διερευνήθηκε αν η υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 συσχετίζεται με τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης HER2/neu στον καρκίνο μαστού. Ο προσδιορισμός της έκφρασης της πρωτεΐνης HER2/neu κατέχει ιδιαίτερη σημασία στην καθημερινή κλινική πράξη καθώς η υπερέκφρασή της συσχετίζεται με άσχημη πρόγνωση, ενώ παράλληλα συμβάλλει στην πρόβλεψη της απόκρισης του όγκου σε συγκεκριμένη στοχευμένη θεραπεία. Γονιδιακή ενίσχυση του HER2/neu πρωτο-ογκογονιδίου και συνεπώς υπερέκφραση της πρωτεΐνης διαπιστώνεται στο 25-30% των διηθητικών όγκων μαστού και συσχετίζεται με μειωμένο χρόνο ελεύθερο νόσου και μειωμένο συνολικό χρόνο επιβίωσης (Masood and Bui, 2002; Ross et al., 2004) Η υπερέκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 συσχετίζεται με την κατάσταση του υποδοχέα HER2/neu στον όγκο μαστού Η ανίχνευση των επιπέδων έκφρασης του υποδοχέα HER2/neu στα 85 κλινικά δείγματα καρκίνου μαστού πραγματοποιήθηκε με ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας ειδικό αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης HER2/neu. Η αξιολόγηση της ανοσοϊστοχημικής χρώσης πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες της Αμερικανικής Εταιρείας Κλινικής Ογκολογίας (ASCO) και του Κολεγίου των Αμερικανών Παθολογοανατόμων (CAP). Από τα 85 περιστατικά που αναλύθηκαν (εικόνα ), σε 15 (17.6%) δείγματα διαπιστώθηκε αχνή (score 1+), σε 20 (23.5%) δείγματα μέση (score 2+) και σε 23 (27.1%) δείγματα έντονη κυτταρομεμβρανική χρώση για την πρωτεΐνη HER2/neu. Σε 27/85 (31.8%) περιστατικά δεν καταδείχθηκε ανοσοθετικότητα για τον υποδοχέα HER2/neu. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων της ανοσοϊστοχημικής έκφρασης της πρωτεΐνης HER2/neu δεν αποκάλυψε σημαντική συσχέτιση μεταξύ του βαθμού έκφρασης του υποδοχέα και του ιστολογικού τύπου, του μεγέθους του πρωτοπαθούς όγκου, του βαθμού διαφοροποίησης και της παρουσίας η μη λεμφαδενικής μετάστασης (εικόνα ). Αντίθετα, διαπιστώθηκε στατιστικώς σημαντική αρνητική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης HER2/neu και της κατάστασης των οιστρογονικών (p=0.003) και προγεστερονικών υποδοχέων (p<0.001) (εικόνα ). Συγκεκριμένα, αναφορικά με τους οιστρογονικούς υποδοχείς, από τα 28 περιστατικά που ήταν αρνητικά, 6 (21.4%) δεν εξέφραζαν τον υποδοχέα HER2/neu (score 0), ενώ 1 (3.6%), 7 (25%) και 14 (50%) παρουσίαζαν ασθενή (score 1+), ενδιάμεση (score 2+) και έντονη (score 3+) κυτταρομεμβρανική χρώση για την πρωτεΐνη HER2/neu, αντίστοιχα. Από τα 45 δείγματα που ήταν θετικά για οιστρογονικούς υποδοχείς, 16 (35.6%) ήταν αρνητικά (score 0), 13 (28.9%) ήταν ασθενώς (score 1+), 9 (20%) ενδιαμέσως (score 2+) και 7 (15.6%) έντονα (score 3+) θετικά για την πρωτεΐνη HER2/neu. Όσο αφορά τους προγεστερονικούς υποδοχείς, από τους 35 όγκους που ήταν αρνητικοί, σε 16 (17.1%) δεν διαπιστώθηκε θετική χρώση για την πρωτεΐνη HER2/neu, ενώ σε 2 (5.7%), 10 (28.6%) και 17 (48.6%) όγκους τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης ήταν χαμηλά (score 1+), ενδιάμεσα (score 2+)

105 4. Αποτελέσματα Εικόνα : Ανοσοϊστοχημικός προσδιορισμός της έκφρασης της πρωτεΐνης HER2/neu στα δείγματα καρκίνου μαστού που αναλύθηκαν. (Α) Αρνητική (Score 0), (B) αχνή (Score 1+), (Γ) ενδιάμεση (Score 2+) και (Δ) έντονη και συνεχής (Score 3+) κυτταρομεμβρανική χρώση για την πρωτεΐνη HER2/neu (μεγέθυνση x 400). (E) Γράφημα στο οποίο απεικονίζεται το ποσοστό των περιστατικών καρκίνου μαστού για κάθε βαθμό (Score) κυτταρομεμβρανικής χρώσης της πρωτεΐνης HER2/neu

106 4. Αποτελέσματα α HER2/neu N n (%) n (%) n (%) n (%) P value β Καρκίνοι μαστού (31.8) (17.6) (23.5) (27.1) Ιστολογικός τύπος Πορογενές (32.9) 13 (16.5) 18 (22.8) 22 (27.8) Λοβιακό 5 1 (20%) 1 (20) 2 (40) 1 (20) Βλεννώδες 1 0 (0) 1 (100) 0 (0) 0 (0) T γ T (23.5) 3 (17.6) 6 (35.3) 4 (23.5) T (29.3) 9 (22) 9 (22) 11 (26.8) T (33.3) 3 (25) 2 (16.7) 3 (25) Τ4 2 1 (50) 0 (0) 0 (0) 1 (50) Grade Grade (20) 3 (60) 0 (0) 1 (20) Grade (34.3) 5 (14.3) 12 (34.3) 6 (17.1) Grade (31) 6 (14.3) 7 (16.7) 16 (38.1) Παρουσία LN δ μετάστασης Όχι (33.3) 7 (23.3) 6 (20) 7 (23.3) Ναι (28.6) 7 (16.7) 10 (23.8) 13 (31) ER ε status (21.4) 1 (3.6) 7 (25) 14 (50) (35.6) 13 (28.9) 9 (20) 7 (15.6) PR στ status < (17.1) 2 (5.7) 10 (28.6) 17 (48.6) (42.1) 12 (31.6) 6 (15.8) 4 (10.5) Εικόνα : Έκφραση του υποδοχέα HER2/neu στα περιστατικά καρκίνου μαστού που αναλύθηκαν: συσχέτιση με κλινικοπαθολογικές παραμέτρους και με την έκφραση στεροειδικών υποδοχέων. α: Η εκτίμηση της ανοσοϊστοχημικής χρώσης της πρωτεΐνης HER2/neu πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες της CAP-ASCO, β: Στατιστικώς σημαντικές θεωρήθηκαν οι συσχετίσεις όταν p<0.05 (Kruskal- Wallis ή Mann-Whitney tests), γ: Σύμφωνα με την ΤΝΜ σταδιοποίηση, δ: Lymph node, λεμφαδένας, ε: Oestrogen receptor, οιστρογονικός υποδοχέας, στ: Progesterone receptor, προγεστερονικός υποδοχέας

107 4. Αποτελέσματα Εικόνα : Η υπερέκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 συσχετίζεται με τα πρωτεϊνικά επίπεδα έκφρασης του υποδοχέα HER2/neu. Παρακείμενες τομές από τρία αντιπροσωπευτικά δείγματα καρκίνου μαστού στα οποία διαπιστώνεται: ασθενής χρώση για τις πρωτεΐνες Cdt1 (score 1) (A) και HER2/neu (score 0) (Δ), ενδιάμεσα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών Cdt1 (score 2) (B) και HER2/neu (score 2+) (E) και έντονη ανοσοϊστοχημική χρώση για τις πρωτεΐνες Cdt1 (score 3) (Γ) και HER2/neu (score 3+)(ΣΤ) (μεγέθυνση x 400). (E) Ιστόγραμμα στο οποίο αναπαρίσταται η κατανομή των πρωτεϊνικών επιπέδων (scores) έκφρασης του υποδοχέα HER2/neu ως προς τα επίπεδα έκφρασης (scores) της πρωτεΐνης Cdt1 στα καρκινώματα μαστού που μελετήθηκαν. Οι αριθμοί στις στήλες υποδηλώνουν το σύνολο των περιστατικών που εντάσσονται σε κάθε κατηγορία βαθμού έκφρασης (score) του υποδοχέα HER2/neu. Λευκή στήλη: HER2/neu score 0, γκρι στήλη: HER2/neu score 1+, σκούρα γκρι στήλη: HER2/neu score 2+ και μαύρη στήλη: HER2/neu score

108 4. Αποτελέσματα και υψηλά (score 3+), αντίστοιχα. Τέλος, από τα 38 δείγματα που ήταν θετικά για προγεστερονικούς υποδοχείς, 16 (42.1%) δεν εξέφραζαν την πρωτεΐνη HER2/neu, ενώ σε 12 (31.6%), 6 (15.8%) και 4 (10.5%) δείγματα διαπιστώθηκε ασθενής (score 1+), ενδιάμεση (score 2+) και έντονη (score 3+) έκφραση της πρωτεΐνης, αντίστοιχα. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων της ανοσοϊστοχημικής ανάλυσης των όγκων ως προς την έκφραση των πρωτεϊνών Cdt1 και HER2/neu κατέδειξε σημαντική θετική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης των δύο μορίων στον καρκίνο του μαστού (p=0.006, Spearman s r value = 0.295) (εικόνα ). Όπως φαίνεται στο διάγραμμα Ε, τα 2 δείγματα που ήταν αρνητικά για πρωτεΐνη Cdt1 ήταν αρνητικά και για τον υποδοχέα HER2/neu. Από τους 16 όγκους που εξέφραζαν ασθενώς (score 1) την πρωτεΐνη Cdt1, 8 (50%) ήταν αρνητικοί (score 0) για τον υποδοχέα HER2/neu, ενώ σε 2 (12.5%) όγκους διαπιστώθηκε ασθενής (Score 1+), σε 4 (25%) μέση (score 2+) και σε 2 (12.5%) έντονη (score 3+) έκφραση του υποδοχέα. Επίσης, από τα 20 δείγματα με ασθενή (score 1) έκφραση της πρωτεΐνης Cdt1, σε 7 (35%) δεν καταδείχθηκε θετική χρώση (score 0) για την πρωτεΐνη HER2/neu, ενώ 5 (25%) όγκοι εξέφραζαν την πρωτεΐνη σε χαμηλά (score 1+), 3 (15%) σε ενδιάμεσα και 5 (25%) σε υψηλά επίπεδα. Τέλος, από τα 47 περιστατικά με έντονη έκφραση της πρωτεΐνης Cdt1, 10 (21.3%) ήταν αρνητικά ως προς την έκφραση του υποδοχέα HER2/neu (score 0), ενώ σε 8 (17%), 13 (27.7%) και 16 (34%) όγκους διαπιστώθηκε ασθενής (score 1+), μέση (score 2+) και έντονη (score 3+) κυτταρομεμβρανική χρώση του υποδοχέα, αντίστοιχα. Με στόχο τη διερεύνηση της πιθανής συσχέτισης της υπερέκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 με τη γονιδιακή ενίσχυση του μορίου HER2/neu στον όγκο μαστού, τα καρκινώματα μαστού που αναλύθηκαν κατηγοριοποιήθηκαν σε δύο ομάδες, ανάλογα με τα επίπεδα έκφρασης του υποδοχέα HER2/neu. Η μια κατηγορία αφορούσε τα δείγματα με έντονη (score 3+) έκφραση του υποδοχέα, ενώ στη δεύτερη κατηγορία εντάχθηκαν οι όγκοι που σύμφωνα με τα ανοσοϊστοχημικά αποτελέσματα ήταν είτε αρνητικοί (score 0) είτε εξέφραζαν τον υποδοχέα σε χαμηλά επίπεδα (score 1+). Στην ανάλυση δεν συμπεριελήφθησαν οι όγκοι που παρουσίαζαν ενδιάμεσα επίπεδα έκφρασης (score 2+) της πρωτεΐνης HER2/neu. Σημειώνεται ότι βιβλιογραφικά έχει δειχθεί πως σε περιστατικά με έντονη έκφραση (score 3+) του υποδοχέα HER2/neu παρουσιάζεται γονιδιακή ενίσχυση σε ποσοστό 95%, ενώ στους όγκους με χαμηλή ανοσοϊστοχημική έκφραση της πρωτεΐνης HER2/neu (scores 0/1+) διαπιστώνεται ενίσχυση του γονιδίου HER2/neu σε ποσοστό 0-7%. Ακολούθησε έλεγχος και σύγκριση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 μεταξύ των δειγμάτων των δύο κατηγοριών (εικόνα ). Από τα 42 δείγματα που ήταν αρνητικά για γονιδιακή ενίσχυση του HER2/neu (ανοσοϊστοχημική έκφραση scores 0/1+), 2 (4.8%) δεν εξέφραζαν την πρωτεΐνη Cdt1, ενώ 10 (23.8%), 12 (28.6%) και 18 (42.8%) δείγματα παρουσίαζαν ασθενή (score 1), ενδιάμεση (score 2) και έντονη (score 3) έκφραση του παράγοντα, αντίστοιχα. Όσον αφορά τους 23 όγκους με γονιδιακή ενίσχυση του υποδοχέα HER2/neu (ανοσοϊστοχημική έκφραση score 3+), σε 2 (8.7%) διαπιστώθηκε ασθενής (score 1), σε 5 (21.7%) μέση (score 2) και σε 16 (69.6%) έντονη (score 3) έκφραση της πρωτεΐνης Cdt1. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έδειξε ότι η παρατηρούμενη διαφορά μεταξύ των δύο

109 4. Αποτελέσματα κατηγοριών των όγκων ως προς την έκφραση του παράγοντα Cdt1 είναι σημαντική (p=0.025) (εικόνα ). Εικόνα : Τα επίπεδα του Cdt1 είναι στατιστικώς σημαντικά υψηλότερα στους όγκους μαστού που εμφανίζουν έντονη έκφραση του υποδοχέα HER2/neu (score 3+) σε σύγκριση με τα δείγματα που παρουσιάζουν ασθενή ανοσοϊστοχημική χρώση για τον HER2/neu (score0/1+) Η έκφραση του παράγοντα Cdt1 συσχετίζεται πιο ισχυρά με την κατάσταση του υποδοχέα HER2/neu σε περιπτώσεις καρκίνου μαστού με χαμηλά επίπεδα έκφρασης της κυκλίνης Α ή με φυσιολογικό P53 Στη συνέχεια διερευνήθηκε κατά πόσο η παρατηρούμενη συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 και του υποδοχέα HER2/neu επηρεάζεται από την έκφραση της πρωτεΐνης κυκλίνη Α ή από την κατάσταση (φυσιολογικό ή μεταλλαγμένο) του ογκοκατασταλτικής πρωτεΐνης p53. Ο βασικότερος τρόπος ρύθμισης της πρωτεΐνης Cdt1 κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου είναι η πρωτεόλυση (Kim and Kipreos, 2007). Η πρωτεΐνη κυκλίνη Α κατέχει σημαντικό ρόλο στην αρνητική ρύθμιση των επιπέδων έκφρασης του παράγοντα Cdt1 καθώς απαιτείται για τη φωσφορυλίωσή του, η οποία είναι απαραίτητη για την αναγνώριση του μορίου από το σύμπλοκο SCF skp2 και κατ επέκταση για την αποικοδόμησή του (Li et al., 2003b; Nishitani et al., 2006; Sugimoto et al., 2004). Αναφορικά με την ογκογόνο δράση του παράγοντα Cdt1 και την ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη P53, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η υπερέκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 επάγει γονιδιωματική αστάθεια ή συσχετίζεται με την εμφάνιση ανευπλοειδίας, σε περιπτώσεις όγκων με μη λειτουργική P53 πρωτεΐνη (Karakaidos et al., 2004; Seo et al., 2005a; Vaziri et al., 2003). Για τον προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης κυκλίνης Α στα 85 κλινικά δείγματα καρκίνου μαστού, πραγματοποιήθηκε ανοσοϊστοχημική ανάλυση των όγκων με χρήση αντισώματος ειδικού έναντι της πρωτεΐνης κυκλίνης Α. Η μικροσκοπική παρατήρηση αποκάλυψε πυρηνική χρώση για την πρωτεΐνη με σημαντική ετερογένεια

110 4. Αποτελέσματα τόσο ως προς την ένταση όσο και ως προς το ποσοστό των θετικών κυττάρων, μεταξύ των διαφορετικών δειγμάτων που αναλύθηκαν (εικόνα Α-Δ). Για την εκτίμηση της ανοσοϊστοχημικής χρώσης ελήφθη υπόψιν η ένταση και το ποσοστό των θετικών κυττάρων, όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο «Υλικά και Μέθοδοι». Θετική ανοσοεντόπιση για την κυκλίνη Α διαπιστώθηκε σε 66 (77.6%) από τους 85 όγκους. Από αυτούς, 18 (21.2%) εξέφραζαν την πρωτεΐνη σε χαμηλά επίπεδα (score 1), 18 (21.2%) εμφάνιζαν ενδιάμεση ανοσοθετικότητα για την πρωτεΐνη (score 2) και 30 (35.3%) όγκοι παρουσίαζαν υψηλά επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης κυκλίνης Α (score 3) (εικόνα Ε). Στην εικόνα παρατίθενται αντιπροσωπευτικές εικόνες από περιστατικά με διαφορετικού βαθμού έκφραση (score) της πρωτεΐνης κυκλίνης Α. Ακολούθως πραγματοποιήθηκε έλεγχος της πιθανής συσχέτισης της έκφρασης της κυκλίνης Α με τις κλινικοπαθολογικές παραμέτρους των όγκων. Όπως φαίνεται στην εικόνα δεν διαπιστώθηκε στατιστικώς σημαντική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης της κυκλίνης Α και του ιστολογικού τύπου, του βαθμού διαφοροποίησης, του μεγέθους της πρωτοπαθούς εστίας, του βαθμού διαφοροποίησης, της παρουσίας ή μη λεμφαδενικής μετάστασης ή της κατάστασης των οιστρογονικών και προγεστερονικών υποδοχέων των όγκων. Επιπλέον, δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση μεταξύ του βαθμού έκφρασης της κυκλίνης Α και των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 (p=0.108, Spearman s r value = 0.182)

111 4. Αποτελέσματα Εικόνα : Ανοσοϊστοχημική έκφραση της πρωτεΐνης κυκλίνης Α σε δείγματα καρκίνου μαστού. (Α-Δ) Αντιπροσωπευτικά δείγματα καρκίνου μαστού με ετερογενή έκφραση της πρωτεΐνης κυκλίνης Α (μεγέθυνση x 400). (Α) Αρνητική (score 0), (B) ασθενής (score 1), (Γ) ενδιάμεση (score 2) και (Δ) έντονη (score 3) πυρηνική χρώση για την πρωτεΐνη κυκλίνη Α. (Ε) Γράφημα στο οποίο απεικονίζεται η κατανομή των περιστατικών καρκίνου μαστού που εξετάστηκαν ως προς την ανοσοϊστοχημική έκφραση της πρωτεΐνης κυκλίνης Α

112 4. Αποτελέσματα Κυκλίνη Α α N n n n n (%) (%) (%) (%) P value β Καρκίνοι μαστού (22.4) 18 (21.2) 18 (21.2) 30 (35.3) Ιστολογικός τύπος Πορογενές (22.8) 17 (21.5) 16 (20.3) 28 (35.4) Λοβιακό 5 1 (20) 1 (20) 1 (20) 2 (40) Βλεννώδες 1 0 (0) 0 (0) 1 (100) 0 (0) T γ T (23.5) 3 (17.6) 6 (35.3) 4 (23.5) T (17.1) 12 (29.3) 9 (22) 13 (31.7) T (33.3) 1 (8.3) 1 (8.3) 6 (50) Τ (0) (0) (0) (100) Grade Grade (60) 1 (20) 0 (0) 1 (20) Grade (20) 10 (28.6) 9 (25.7) 9 (25.7) Grade (21.4) (16.7) (16.7) (45.2) Παρουσία LN δ Μετάστασης Όχι 30 6 (20) 10 (33.3) 8 (26.7) 6 (20) Ναι (26.2) 5 (11.9) 6 (14.3) 20 (47.6) ER ε status (21.4) 4 (14.3) 5 (17.9) 13 (46.4) (22.2) (26.7) (20) (31.1) PR στ status (20) 4 (11.4) 8 (22.9) 16 (45.7) (23.7) 12 (31.6) 6 (15.8) 11 (28.9) Εικόνα : Έκφραση της κυκλίνης Α στα καρκινώματα μαστού που μελετήθηκαν: συσχέτιση με κλινικοπαθολογικές παραμέτρους και με την έκφραση στεροειδικών υποδοχέων. α: Η εκτίμηση της ανοσοϊστοχημικής χρώσης της κυκλίνης Α πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στις μεθόδους, β: Στατιστικώς σημαντικές θεωρήθηκαν οι συσχετίσεις όταν p<0.05 (Kruskal-Wallis ή Mann-Whitney tests), γ: Σύμφωνα με την ΤΝΜ σταδιοποίηση, δ: Lymph node, λεμφαδένας, ε: Oestrogen receptor, οιστρογονικός υποδοχέας, στ: Progesterone receptor, προγεστερονικός υποδοχέας

113 4. Αποτελέσματα Δεδομένης της συμμετοχής της πρωτεΐνης κυκλίνης Α στην αρνητική ρύθμιση του παράγοντα Cdt1 κατά την S φάση (Kim and Kipreos, 2007), διερευνήθηκε κατά πόσο τα επίπεδα της κυκλίνης Α θα μπορούσαν να επηρεάζουν την παρατηρούμενη συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης των πρωτεϊνών Cdt1 και HER2/neu στον όγκο μαστού. Για το σκοπό αυτό, τα 85 καρκινώματα που αναλύθηκαν, διακρίθηκαν σε δύο ομάδες, ανάλογα με το βαθμό έκφρασης (score) της πρωτεΐνης κυκλίνης Α. Στην πρώτη κατηγορία εντάχθηκαν οι όγκοι που παρουσίαζαν αρνητική (score 0) ή χαμηλή (score 1) έκφραση της κυκλίνης Α και στη δεύτερη κατηγορία οι όγκοι με ενδιάμεση (score 2) ή έντονη (score 3) έκφραση της πρωτεΐνης. Ακολούθησε έλεγχος της συσχέτισης της έκφρασης των μορίων Cdt1 και HER2/neu στα περιστατικά με χαμηλά (score 0/1) ή υψηλά (score 2/3) επίπεδα έκφρασης της κυκλίνης Α (εικόνα ). Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων κατέδειξε θετική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης των Cdt1 και HER2/neu μόνο στους όγκους που παρουσίαζαν χαμηλή έκφραση της κυκλίνης Α (p=0.007, Spearman s r value=0.438) (εικόνα Α-Ε). Αντίθετα, δεν διαπιστώθηκε στατιστικώς σημαντική συσχέτιση μεταξύ των μορίων Cdt1 και HER2/neu στα περιστατικά με έντονη έκφραση της κυκλίνης Α (p=0.331, Spearman s r value = 0.143) (εικόνα Α). Στη συνέχεια, λαμβάνοντας υπόψιν ότι η ογκογόνος δράση του παράγοντα Cdt1 έχει συσχετιστεί με την απουσία της λειτουργικότητας της πρωτεΐνης p53 (Karakaidos et al., 2004; Seo et al., 2005a; Vaziri et al., 2003), διερευνήθηκε κατά πόσο η κατάσταση του γονιδίου (φυσιολογικό ή μεταλλαγμένο) της πρωτεΐνης p53 επηρεάζει τη συσχέτιση που παρατηρείται μεταξύ των πρωτεϊνών Cdt1 και HER2/neu στον όγκο μαστού. Υπενθυμίζεται ότι έχει δειχθεί βιβλιογραφικά πως η ανοσοϊστοχημική πυρηνική υπερέκφραση της πρωτεΐνης p53 συσχετίζεται με την ύπαρξη μεταλλαγμένης μορφής του γονιδίου (Greenblatt et al., 1994). Λαμβάνοντας υπόψιν την παρατήρηση αυτή, οι 79 όγκοι μαστού που αναλύθηκαν ανοσοϊστοχημικά για την έκφραση της πρωτεΐνης p53 υποκατηγοριοποιήθηκαν ανάλογα με τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης. Από τους 79 όγκους, οι 55 (69.62%) ήταν θετικοί ως προς την έκφραση της πρωτεΐνης p53 (>10% θετικά κύτταρα), ενώ οι υπόλοιποι 24 όγκοι (30.38%) δεν εξέφραζαν την πρωτεΐνη p53 (<10% θετικά κύτταρα). Ακολούθως ελέγχθηκε η πιθανή συσχέτιση της έκφρασης των πρωτεϊνών Cdt1 και HER2/neu στις δύο κατηγορίες καρκινωμάτων μαστού με θετική ή αρνητική έκφραση της πρωτεΐνης p53. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έδειξε θετική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης των μορίων Cdt1 και HER2/neu μόνο στα περιστατικά που ήταν αρνητικά ως προς την έκφραση της πρωτεΐνης p53 (p<0.001, Spearman s r value = 0.707). Αντίθετα, δεν διαπιστώθηκε στατιστικώς σημαντική συσχέτιση μεταξύ των Cdt1 και HER2/neu στην κατηγορία δειγμάτων με θετική έκφραση της πρωτεΐνης p53 (p<0.338, Spearman s r value = 0.132). Συμπερασματικά η υπερέκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 συσχετίζεται με τα επίπεδα έκφρασης του υποδοχέα HER2/neu στον όγκο μαστού, σε περιπτώσεις με χαμηλά επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης κυκλίνη Α ή σε δείγματα με χαμηλά επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης p

114 4. Αποτελέσματα Εικόνα : Η υπερέκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 συσχετίζεται με τα πρωτεϊνικά επίπεδα έκφρασης του υποδοχέα HER2/neu στα δείγματα καρκίνου μαστού που εμφανίζουν χαμηλά επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης κυκλίνης Α. (Α) Πίνακας με τη συσχέτιση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 με τα αντίστοιχα του υποδοχέα HER2/neu. Τα περιστατικά καρκίνου μαστού που μελετήθηκαν υποκατηγοριοποιήθηκαν ανάλογα με το βαθμό έκφρασης της πρωτεΐνης κυκλίνη Α (scores 0/1 και 2/3). (Β-Δ) Παρακείμενες τομές αντιπροσωπευτικού δείγματος λοβιακού διηθητικού καρκινώματος μαστού το οποίο παρουσιάζει (Β) ασθενή ανοσοαντίδραση στην πρωτεΐνη κυκλίνη Α, (Γ) έντονη ανοσοϊστοχημική έκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 και (Δ) υψηλά επίπεδα έκφρασης του υποδοχέα HER2/neu (μεγέθυνση x 400). (E) Γράφημα στο οποίο απεικονίζεται η κατανομή των πρωτεϊνικών επιπέδων (scores) έκφρασης του υποδοχέα HER2/neu ως προς τα επίπεδα έκφρασης (scores) της πρωτεΐνης Cdt1 στα καρκινώματα μαστού με ασθενή έκφραση της πρωτεΐνης κυκλίνη Α. Οι αριθμοί στις στήλες υποδηλώνουν το σύνολο των περιστατικών που εντάσσονται σε κάθε κατηγορία βαθμού έκφρασης (score) του υποδοχέα HER2/neu. Λευκή στήλη: HER2/neu score 0, γκρι στήλη: HER2/neu score 1+, σκούρα γκρι στήλη: HER2/neu score 2+ και μαύρη στήλη: HER2/neu score

115 4. Αποτελέσματα Εικόνα : Η υπερέκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 συσχετίζεται με τα πρωτεϊνικά επίπεδα έκφρασης του υποδοχέα HER2/neu στα καρκινώματα μαστού που εμφανίζουν χαμηλά επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης p53. (Α) Πίνακας με τη συσχέτιση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 με τα αντίστοιχα του υποδοχέα HER2/neu. Τα καρκινώματα μαστού που αναλύθηκαν υποκατηγοριοποιήθηκαν σε δύο ομάδες ανάλογα με τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης p53 (θετική χρώση σε 10% ή σε > 10% του συνόλου των καρκινικών κυττάρων). (Β- Δ) Παρακείμενες τομές αντιπροσωπευτικού δείγματος καρκινώματος μαστού το οποίο παρουσιάζει (Β) αρνητική ανοσοϊστοχημική χρώση για την πρωτεΐνη p53, (Γ) έντονη ανοσοϊστοχημική έκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 και (Δ) υψηλά επίπεδα έκφρασης του υποδοχέα HER2/neu (μεγέθυνση x 400). (E) Ιστόγραμμα στο οποίο απεικονίζεται η κατανομή των πρωτεϊνικών επιπέδων (scores) έκφρασης του υποδοχέα HER2/neu ως προς τα επίπεδα έκφρασης (scores) της πρωτεΐνης Cdt1 στα καρκινώματα μαστού με αρνητική έκφραση της πρωτεΐνης p53. Οι αριθμοί στις στήλες υποδηλώνουν το σύνολο των περιστατικών που εντάσσονται σε κάθε κατηγορία βαθμού έκφρασης (score) του υποδοχέα HER2/neu. Λευκή στήλη: HER2/neu score 0, γκρι στήλη: HER2/neu score 1+, σκούρα γκρι στήλη: HER2/neu score 2+ και μαύρη στήλη: HER2/neu score

116 4. Αποτελέσματα Η υπερέκφραση των παραγόντων αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA Cdt1 και Cdc6 συμβάλλει στην ανάπτυξη γονιδιακής ενίσχυσης Στη συνέχεια, λαμβάνοντας υπόψιν τη συσχέτιση που παρατηρείται μεταξύ των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 και της γονιδιακής ενίσχυσης του HER2/neu, διερευνήθηκε κατά πόσο η γονιδιακή ενίσχυση θα μπορούσε να αποτελεί άμεση λειτουργική επίπτωση της απορρύθμισης της έκφρασης των παραγόντων αδειοδότησης Cdt1 και Cdc6. Για να προσεγγιστεί αυτή η υπόθεση πραγματοποιήθηκε διπλή παροδική διαμόλυνση MCF7 και HeLa κυττάρων με πλασμίδια που φέρουν τα μόρια Cdt1-GFP και Cdc6. Ακολούθησε καλλιέργεια των κυττάρων παρουσία μεθοτρεξάτης και έλεγχος της πιθανής ανθεκτικότητάς τους στο φάρμακο αυτό. Σημαντικό μοριακό μηχανισμό εκδήλωσης ανθεκτικότητας των κυττάρων στη μεθοτρεξάτη αποτελεί η αυξημένη ενεργότητα του ενζύμου διυδροφολική αναγωγάση (dihydrofolate reductase, DHFR) λόγω ενίσχυσης του αντίστοιχου γονιδίου (Johnston et al., 1983). Το ένζυμο αυτό είναι απαραίτητο για την αναγωγή του διυδροφολικού σε τετραϋδροφολικό οξύ. Η μεθοτρεξάτη (methotrexate) αποτελεί αντιμεταβολίτη ο οποίος προσδένεται ειδικά στο DHFR και το αναστέλλει με αποτέλεσμα τη μείωση των ενδοκυτταρικών επιπέδων των τετραϋδροφολικών συνενζύμων και κατ επέκταση την παρεμπόδιση της βιοσύνθεσης των πουρινών, των πυριμιδών και συνεπώς του DNA στο κύτταρο (Johnston et al., 1983). Αρχικά εκτιμήθηκε η τοξικότητα της μεθοτρεξάτης στις κυτταρικές σειρές HeLa και MCF7 που χρησιμοποιήθηκαν στο πείραμα, μέσω προσδιορισμού της ανασταλτικής επίδρασης του φαρμάκου στην ανάπτυξη των κυττάρων. Για το σκοπό αυτό, συγκεκριμένος αριθμός HeLa και MCF7 κυττάρων επιστρώθηκε σε τρυβλία (3x10 5 κύτταρα/τρυβλίο). Ακολούθησε καλλιέργεια των κυττάρων σε θρεπτικό μέσο παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων μεθοτρεξάτης, για 96 ώρες (εικόνα Α). Οι συγκεντρώσεις μεθοτρεξάτης που ελέγχθηκαν ήταν 0 nm (αρνητικός μάρτυρας), 2 nm, 4 nm, 12 nm, 16 nm και 32 nm. Σημειώνεται ότι με κάθε συγκέντρωση μεθοτρεξάτης επωάστηκαν 2 τρυβλία με κύτταρα. Μετά το πέρας των 96 ωρών, το κυτταρικό ίζημα από κάθε τρυβλίο συλλέχθηκε και αναδιαλύθηκε σε διάλυμα 0.1 mm ΝαΟΗ. Ακολούθησε έμμεση εκτίμηση του αριθμού των κυττάρων κάθε τρυβλίου μέσω προσδιορισμού της οπτικής απορρόφησης των δειγμάτων στα 260 nm. Η σύγκριση των οπτικών απορροφήσεων των διαφορετικών δειγμάτων με την αντίστοιχη του αρνητικού μάρτυρα αποκάλυψε ότι η μισή θανατηφόρος δόση (lethal dose 50%, LD50) της μεθοτρεξάτης, δηλαδή η συγκέντρωση της ουσίας που αναστέλλει την κυτταρική ανάπτυξη κατά 50%, είναι περίπου 6 nm για τα HeLa και 20 nm για τα MCF7 (εικόνα Β). Στη συνέχεια διερευνήθηκε αν η υπερέκφραση των παραγόντων αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA Cdt1 και Cdc6 συμβάλλει στη δημιουργία γονιδιακής ενίσχυσης στην κυτταρική σειρά HeLa (εικόνα ). Για το σκοπό αυτό, HeLa κύτταρα διαμολύνθηκαν παροδικά με πλασμιδιακούς φορείς που εκφράζουν τις πρωτεΐνες Cdt1- GFP και Cdc6. Παράλληλα, ως αρνητικός μάρτυρας στο πείραμα χρησιμοποιήθηκαν HeLa κύτταρα τα οποία διαμολύνθηκαν παροδικά με πλασμίδιο που φέρει το μόριο GFP. Μετά

117 4. Αποτελέσματα το πέρας 48 ωρών από τη διαμόλυνση, πραγματοποιήθηκε επίστρωση 10 5 κυττάρων σε κάθε τρυβλίο διαμέτρου 100 mm. Ακολούθησε καλλιέργεια των κυττάρων σε θρεπτικό Εικόνα : Προσδιορισμός της συγκέντρωσης της μεθοτρεξάτης που έχει ως αποτέλεσμα το θάνατο του 50% των κυττάρων (Lethal dose 50, LD50). (Α) Πειραματική διαδικασία που ακολουθήθηκε. Συγκεκριμένος αριθμός HeLa και MCF7 κυττάρων επιστρώθηκε σε τρυβλία διαμέτρου 100 mm (3x10 5 κύτταρα/τρυβλίο) και επωάστηκαν με θρεπτικό μέσο το οποίο περιείχε διαφορετικές συγκεντρώσεις μεθοτρεξάτης, για 96 ώρες. Χρησιμοποιήθηκαν δύο τρυβλία με κύτταρα για κάθε συγκέντρωση μεθοτρεξάτης. Το κυτταρικό ίζημα από κάθε τρυβλίο συλλέχθηκε, αναδιαλύθηκε σε 0.1 mm ΝαΟΗ και φωτομετρήθηκε στα 260 nm. (B) Ιστόγραμμα στο οποίο απεικονίζεται ο μέσος όρος της οπτικής απορρόφησης στα 260 nm του κυτταρικού εκχυλίσματος των δύο τρυβλίων που επωάστηκαν με κάθε συγκέντρωση μεθοτρεξάτης

118 4. Αποτελέσματα Εικόνα : Η υπερέκφραση των παραγόντων αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA Cdt1 και Cdc6 στα HeLa κύτταρα έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση ανθεκτικότητας των κυττάρων στην μεθοτρεξάτη. (Α) Διαγραμματική απεικόνιση της πειραματικής διαδικασίας που ακολουθήθηκε. HeLa κύτταρα διαμολύνθηκαν παροδικά με πλασμιδιακούς φορείς που εκφράζουν είτε τις πρωτεΐνες Cdt1-GFP και Cdc6 είτε την πρωτεΐνη GFP (χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας). 48 ώρες μετά τη διαμόλυνση ακολούθησε επίστρωση 10 5 κυττάρων σε κάθε τρυβλίο διαμέτρου 100 mm στα οποία προστέθηκε θρεπτικό μέσο με μεθοτρεξάτη. Χρησιμοποιήθηκαν τρεις συγκεντρώσεις μεθοτρεξάτης (30 nm, 39 nm και 48 nm), ενώ για κάθε συγκέντρωση μεθοτρεξάτης επιστρώθηκαν πέντε τρυβλία. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία μεθοτρεξάτης για 20 γενιές. Ακολούθησε μονιμοποίηση και καταμέτρηση των αποικιών που αναπτύχθηκαν. (Β) Ιστόγραμμα στο οποίο απεικονίζεται ο μέσος όρος του αριθμού των κυτταρικών αποικών που αναπτύχθηκαν υπό τις διαφορετικές συγκεντρώσεις μεθοτρεξάτης

119 4. Αποτελέσματα μέσο παρουσία μεθοτρεξάτης για 20 ημέρες (20 γενιές). Δοκιμάστηκαν τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις μεθοτρεξάτης: 5xLD50, 6.5xLD50 και 8xLD50 (30 nm, 39 nm και 48 nm, αντίστοιχα), ενώ για κάθε συγκέντρωση μεθοτρεξάτης επιστρώθηκαν πέντε τρυβλία με κύτταρα. Ακολούθησε μονιμοποίηση των κυττάρων και καταμέτρηση των αποικιών που αναπτύχθηκαν. Όπως φαίνεται στην εικόνα Β, διαπιστώθηκε σημαντικά αυξημένος αριθμός ανθεκτικών αποικιών στη μεθοτρεξάτη στα τρυβλία στα οποία είχαν επιστρωθεί HeLa κύτταρα που υπερεξέφραζαν τους παράγοντες Cdt1-GFP και Cdc6 σε σύγκριση με τα τρυβλία στα οποία είχαν επιστρωθεί HeLa κύτταρα που υπερεξέφραζαν την πρωτεΐνη GFP. Για να επιβεβαιωθεί ότι η υπερέκφραση των παραγόντων Cdt1 και Cdc6 επάγει την εμφάνιση γονιδιακής ενίσχυσης, πραγματοποιήθηκε μια σειρά ανεξάρτητων επαναλήψεων της πειραματικής διαδικασίας που περιγράφηκε προηγουμένως. Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκαν τρεις ανεξάρτητες παροδικές διαμολύνσεις HeLa κυττάρων με πλασμίδια που φέρουν τις πρωτεΐνες Cdt1-GFP και Cdc6 ή την πρωτεΐνη GFP (αρνητικός μάρτυρας). Ακολούθησε επίστρωση 10 5 κυττάρων σε κάθε τρυβλίο και καλλιέργεια των κυττάρων για 20 ημέρες σε θρεπτικό μέσο παρουσία μεθοτρεξάτης. Κύτταρα και από τις τρεις διαφορετικές διαμολύνσεις καλλιεργήθηκαν παρουσία μεθοτρεξάτης τελικής συγκέντρωσης 39 nm και 48 nm (5 τρυβλία κυττάρων ανά συγκέντρωση μεθοτρεξάτης). Η ανθεκτικότητα των κυττάρων στη μεθοτρεξάτη τελικής συγκέντρωσης 30 nm ελέγχθηκε σε κύτταρα από μία διαμόλυνση (5 τρυβλία κυττάρων). Όπως φαίνεται στην εικόνα , η καταμέτρηση των ανθεκτικών αποικιών αποκάλυψε μεγαλύτερο αριθμό αποικιών από τα HeLa κύτταρα που υπερεξέφραζαν τις πρωτεΐνες Cdt1-GFP και Cdc6 σε σύγκριση με τα κύτταρα που υπερεξέφραζαν την πρωτεΐνη GFP και στις τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις μεθοτρεξάτης. Επιπλέον η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων με student t-test έδειξε ότι οι παρατηρούμενες διαφορές στον αριθμό των αποικιών μεταξύ των κυττάρων που είχαν διαμολυνθεί με τους παράγοντες Cdt1-GFP και Cdc6 και των κυττάρων που είχαν διαμολυνθεί με το μόριο GFP είναι στατιστικώς σημαντικές (p<0.001) (Εικόνα ). Ακολούθως διερευνήθηκε αν η υπερέκφραση των παραγόντων Cdt1 και Cdc6 οδηγεί στην εκδήλωση γονιδιακής ενίσχυσης και κατ επέκταση στην εμφάνιση ανθεκτικών αποικιών στην μεθοτρεξάτη στην κυτταρική σειρά MCF7 (εικόνα ). Για το σκοπό αυτό, MCF7 κύτταρα διαμολύνθηκαν παροδικά με πλασμίδια τα οποία έφεραν είτε τα μόρια Cdt1-GFP και Cdc6 είτε το μόριο GFP (αρνητικός μάρτυρας). Μετά το πέρας 48 ωρών από τη διαμόλυνση επιστρώθηκαν 10 5 κύτταρα ανά τρυβλίο διαμέτρου 100 mm. Ακολούθησε καλλιέργεια των κυττάρων για 10 ημέρες σε θρεπτικό μέσο παρουσία μεθοτρεξάτης. Χρησιμοποιήθηκαν τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις μεθοτρεξάτης 5xLD50, 6.5xLD50 και 8xLD50 (100 nm, 130 nm και 160 nm, αντίστοιχα). Επίσης, για κάθε συγκέντρωση μεθοτρεξάτης επιστρώθηκαν πέντε τρυβλία με κύτταρα που υπερεξέφραζαν τις πρωτεΐνες Cdt1-GFP και Cdc6 και πέντε τρυβλία με κύτταρα που υπερεξέφραζαν την πρωτεΐνη GFP. Με στόχο την αύξηση της επιλογικής πίεσης και συνεπώς την επιβίωση των πιο ανθεκτικών αποικιών, μετά το πέρας των 10 ημερών, η συγκέντρωση της μεθοτρεξάτης διπλασιάστηκε (από 100 nm σε 200 nm, από 130 nm σε

120 4. Αποτελέσματα Εικόνα : Ο αριθμός των ανθεκτικών αποικιών στη μεθοτρεξάτη είναι στατιστικώς σημαντικά υψηλότερος στα HeLa κύτταρα που διαμολύνθηκαν με τις πρωτεΐνες Cdt1-GFP και Cdc6 σε σύγκριση με τα κύτταρα που διαμολύνθηκαν με την πρωτεΐνη GFP (αρνητικός μάρτυρας). (Α-Γ) Ιστογράμματα στα οποία απεικονίζεται ο αριθμός των ανθεκτικών αποικιών που καταμετρήθηκαν στις διαφορετικές συγκεντρώσεις μεθοτρεξάτης. Αριθμός ανθεκτικών αποικών σε (Α) 30 nμ μεθοτρεξάτης, (Β) 39 nm μεθοτρεξάτης από τρία διαφορετικά πειράματα (1,2,3) και (Γ) 48 nm μεθοτρεξάτης από τρεις ανεξάρτητες πειραματικές επαναλήψεις (1,2,3). (Δ) Ιστόγραμμα στο οποίο εμφανίζεται ο μέσος όρος των ανθεκτικών αποικιών από τα διαφορετικά πειράματα ανά συγκέντρωση μεθοτρεξάτης. 260 nm και από 160 nm σε 320 nm) και η καλλιέργεια των κυττάρων συνεχίστηκε για επιπλέον 10 ημέρες. Ακολούθησε μονιμοποίηση και καταμέτρηση των αποικιών που είχαν αναπτυχθεί. Όπως φαίνεται στην εικόνα Β, παρατηρήθηκε μεγαλύτερος αριθμός αποικιών από τα MCF7 κύτταρα που είχαν διαμολυνθεί με τους παράγοντες Cdt1-GFP και Cdc6 σε σύγκριση με τα κύτταρα που είχαν διαμολυνθεί με το μόριο GFP, και στις τρεις συνθήκες επώασης των κυττάρων με τις διαφορετικές συγκεντρώσεις μεθοτρεξάτης. Συμπερασματικά, η υπερέκφραση των παραγόντων αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA Cdt1 και Cdc6 έχει ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη ανθεκτικών κυττάρων στη μεθοτρεξάτη. Βασικό μηχανισμό εκδήλωσης ανθεκτικότητας στον αντιμεταβολίτη αυτό αποτελεί η γονιδιακή ενίσχυση και κατ επέκταση τα αυξημένα επίπεδα έκφρασης του ενζύμου DHFR. Συνεπώς η απορρύθμιση της έκφρασης των παραγόντων Cdt1 και Cdc6 ενδέχεται να αποτελεί τη γενεσιουργό μοριακή αιτία της δημιουργίας γονιδιακής ενίσχυσης

121 4. Αποτελέσματα Εικόνα : Η υπερέκφραση των παραγόντων Cdt1 και Cdc6 στα MCF7 κύτταρα οδηγεί στην εμφάνιση ανθεκτικότητας των κυττάρων στην μεθοτρεξάτη. (Α) Διαγραμματική απεικόνιση της πειραματικής διαδικασίας που ακολουθήθηκε. MCF7 κύτταρα διαμολύνθηκαν παροδικά με πλασμιδιακούς φορείς που εκφράζουν είτε τις πρωτεΐνες Cdt1-GFP και Cdc6 είτε την πρωτεΐνη GFP (χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας). 48 ώρες μετά τη διαμόλυνση ακολούθησε επίστρωση 10 5 κυττάρων σε κάθε τρυβλίο διαμέτρου 100 mm στα οποία προστέθηκε θρεπτικό μέσο με μεθοτρεξάτη. Χρησιμοποιήθηκαν τρεις συγκεντρώσεις μεθοτρεξάτης (100 nm, 130 nm και 160 nm), ενώ για κάθε συγκέντρωση μεθοτρεξάτης επιστρώθηκαν πέντε τρυβλία. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία μεθοτρεξάτης για 10 γενιές. Ακολούθησε διπλασιασμός της συγκέντρωσης της μεθοτρεξάτης και περαιτέρω καλλιέργεια των κυττάρων για επιπλέον 10 γενιές. Έπειτα τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν και καταμετρήθηκαν οι αποικίες που αναπτύχθηκαν. (Β) Ιστόγραμμα στο οποίο απεικονίζεται ο μέσος όρος του αριθμού των κυτταρικών αποικών που αναπτύχθηκαν υπό τις διαφορετικές συγκεντρώσεις μεθοτρεξάτης

122 4. Αποτελέσματα Mέρος Β

123 4. Αποτελέσματα 4.2 Μελέτη της αλληλεπίδρασης των MCM πρωτεϊνών με τη χρωματίνη κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου σε ζωντανά ανθρώπινα κύτταρα Για τη διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας είναι απαραίτητη η εξασφάλιση της αντιγραφής ολόκληρου του γονιδιώματος μια φορά κατά τη διάρκεια κάθε κυτταρικού κύκλου. Αυτό επιτυγχάνεται με τη διαδικασία της αδειοδότησης των αφετηριών της αντιγραφής του DNA, η οποία περιλαμβάνει τη συγκρότηση πολυπρωτεϊνικών συμπλόκων. Τα σύμπλοκα αυτά απαρτίζονται από τις πρωτεΐνες MCM οι οποίες θεωρούνται οι αντιγραφικές ελικάσες του DNA. Σημαντικό παράγοντα στρατολόγησης των MCM πρωτεϊνών στη χρωματίνη αποτελεί η πρωτεΐνη Cdt1. Μέχρι τώρα, οι περισσότερες ερευνητικές εργασίες που αφορούν τη διαδικασία αδειοδότησης των αφετηριών της αντιγραφής του DNA έχουν βασιστεί σε βιοχημικά και σε in vitro συστήματα μελέτης. Από τις μελέτες αυτές προκύπτει μια στατική εικόνα της διαδικασίας της αδειοδότησης, κατά την οποία οι πρωτεΐνες MCM στρατολογούνται στη χρωματίνη από τους παράγοντες Cdt1 και Cdc6 στο τέλος της μίτωσης και κατά τη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου και παραμένουν προσδεδεμένες σε αυτή μέχρι την αρχή της φάσης S. Παρ όλ αυτά πρόσφατες μελέτες σε ζωντανά κύτταρα έχουν καταδείξει δυναμική συμπεριφορά μορίων που συμμετέχουν στην αδειοδότηση της αντιγραφής του DNA, όπως είναι το πρωτεϊνικό σύμπλοκο ORC (McNairn et al., 2005) καθώς και ο παράγοντας Cdt1 (Xouri et al., 2007b). Όσο αφορά τις πρωτεΐνες MCM2-7, η μελέτη της δυναμικής συμπεριφοράς τους έχει βασιστεί σε in vitro πειράματα. Το γεγονός αυτό εγείρει προβληματισμό ως προς την αξιοπιστία και την ακεραιότητα των αποτελεσμάτων καθώς οι πειραματικές συνθήκες είναι δύσκολο να αναπαράγουν τις φυσιολογικές ενδοκυτταρικές συνθήκες αλληλεπίδρασης των MCM πρωτεϊνών με την χρωματίνη. Στο παρόν κεφάλαιο διερευνήθηκε η κινητική των πρωτεϊνών MCM2-7 στο χώρο και στο χρόνο σε ζωντανά ανθρώπινα κύτταρα με μεθόδους λειτουργικής απεικόνισης βιομορίων. Αρχικά αναπτύχθηκαν τα μοριακά εργαλεία και εισήχθη ένα νέο σύστημα μελέτης για την in vivo ποσοτική εκτίμηση της αλληλεπίδρασης των πρωτεϊνών MCM2-7 με τη χρωματίνη σε ζωντανά κύτταρα, το οποίο βασίζεται στην αξιολόγηση της πρόσδεσης των πρωτεϊνών MCM2-7 στη χρωματίνη, με τη μέθοδο FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching). Στη συνέχεια μελετήθηκε η δυναμική αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών MCM2-7 με τη χρωματίνη και η πιθανή διαφοροποίησή της κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Επιπλέον διερευνήθηκε ο υποκυτταρικός εντοπισμός των περιοχών αλληλεπίδρασης των πρωτεϊνών MCM2-7 με τη χρωματίνη κατά τη διάρκεια των φάσεων G1 και S καθώς και ο συσχετισμός αυτών με τις περιοχές σύνθεσης του DNA, με τη μέθοδο FLIP (Fluorescence Loss In Photobleaching). Τέλος, μελετήθηκε κατά πόσο και πώς η αποσιώπηση της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin επηρεάζει την κινητική των πρωτεϊνών MCM2-7 και τη μετάβαση των κυττάρων από τη G1 στη φάση S του κυτταρικού κύκλου. Συνολικά η ανάλυση της αδειοδότησης κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου αποκαλύπτει επιπρόσθετα επίπεδα ρύθμισης της πρόσδεσης των πρωτεϊνών MCM2-7 στη χρωματίνη στα ανθρώπινα κύτταρα

124 4. Αποτελέσματα Ανάπτυξη ενός συστήματος μελέτης της αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA σε ζωντανά κύτταρα Με στόχο την ποσοτική εκτίμηση της αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA μέσω της μελέτης της δυναμικής συμπεριφοράς των πρωτεϊνών MCM2-7 αναπτύχθηκαν τα απαραίτητα μοριακά εργαλεία για την εισαγωγή κατάλληλου συστήματος μελέτης που επιτρέπει την in vivo μελέτη της αλληλεπίδρασης των πρωτεϊνών MCM2-7 με τη χρωματίνη σε ζωντανά ανθρώπινα κύτταρα. Αρχικά πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη σταθερά διαμολυσμένης κυτταρικής σειράς που εκφράζει την υβριδική πρωτεΐνη GFP-MCM2 και λειτουργική ανάλυση αυτής για την πιστοποίηση της λειτουργικότητας και της σωστής ρύθμισης του εξωγενούς υβριδικού μορίου. Ακολούθως εφαρμόστηκε η μέθοδος FRAP για τον προσδιορισμό της φύσης και του βαθμού αλληλεπίδρασης της πρωτεΐνης GFP- MCM2 με τη χρωματίνη. Τέλος, ελέγχθηκε αν και με ποιό τρόπο η αποσιώπηση της έκφρασης του παράγοντα στρατολόγησης των πρωτεϊνών MCM2-7 στη χρωματίνη Cdt1 επηρεάζει την κινητική των πρωτεϊνών MCM2-7 στον πυρήνα των κυττάρων Κλωνοποίηση της GFP-MCM2 αλληλουχίας Για την κλωνοποίηση της GFP-MCM2 αλληλουχίας πραγματοποιήθηκε υποκλωνοποίηση του cdna της MCM2 πρωτεΐνης στον πλασμιδιακό φορέα έκφρασης pcdna3.1egfp, που φέρει την πράσινη (GFP) φθορίζουσα πρωτεΐνη. Εικόνα 4.2.1: Διαδικασία κλωνοποίησης της GFP-MCM2 αλληλουχίας. Αρχικά πραγματοποιήθηκε διπλή κατάτμηση του πλασμιδίου pcdna3.1 egfp που φέρει το μόριο GFP και του πλασμιδίου potb7 που φέρει το cdna της MCM2 πρωτεΐνης με τα περιοριστικά ένζυμα EcoR I και Xho I. Τα προϊόντα των κατατμήσεων αναλύθηκαν ηλεκτροφορητικά σε πήκτωμα αγαρόζης από το οποίο απομονώθηκαν. Ακολούθησε αντίδραση λιγάσης των δύο προϊόντων των κατατμήσεων και μετασχηματισμός δεκτικών βακτηριακών κυττάρων με το προϊόν της αντίδρασης

125 4. Αποτελέσματα Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε διπλή κατάτμηση των πλασμιδίων potb7 (στο οποίο ήταν κλωνοποιημένο το cdna της πρωτεΐνης MCM2) και pcdna3.1egfp με τα ένζυμα περιορισμού EcoR I και Xho I (εικόνα 4.2.1). Ακολούθησε απομόνωση του προϊόντος που αντιστοιχεί στο cdna της πρωτεΐνης MCM2 καθώς και του προϊόντος που αντιστοιχεί στον γραμμικό πλασμιδιακό φορέα pcdna3.1egfp και σύνδεσή τους με αντίδραση λιγάσης. Μετά την ολοκλήρωση της αντίδρασης πραγματοποιήθηκε μετασχηματισμός δεκτικών βακτηριακών κυττάρων με το προϊόν της αντίδρασης. Στη συνέχεια απομονώθηκε και ελέγχθηκε το πλασμιδιακό DNA με δοκιμαστικές κατατμήσεις από διαφορετικές ανθεκτικές βακτηριακές αποικίες Δημιουργία σταθερά διαμολυσμένης κυτταρικής σειράς με το υβριδικό μόριο GFP-MCM2 και λειτουργικός έλεγχος αυτής Ακολούθως πραγματοποιήθηκε η ανάπτυξη σταθερά διαμολυσμένων MCF7 κυτταρικών σειρών που εκφράζουν την υβριδική μορφή της πρωτεΐνης MCM2 (GFP- MCM2). Για το σκοπό αυτό, MCF7 κύτταρα διαμολύνθηκαν παροδικά με το υβριδικό μόριο GFP-MCM2. Ακολούθησε καλλιέργεια των διαμολυσμένων κυττάρων σε θρεπτικό μέσο παρουσία του αντιβιοτικού Geneticin, όπως περιγράφεται το κεφάλαιο «Μέθοδοι και Υλικά». Σημειώνεται ότι το πλασμίδιο στο οποίο είναι υποκλωνοποιημένο το υβριδικό μόριο GFP-MCM2 φέρει το γονίδιο που προσδίδει ανθεκτικότητα στο αντιβιοτικό Geneticin. Συνεπώς επιτρέπεται η ανάπτυξη μόνο των κυττάρων στων οποίων το γενετικό υλικό έχει ενσωματωθεί το πλασμίδιο. Μετά το πέρας της διαδικασίας αυτής προέκυψαν τέσσερις ανθεκτικοί κλώνοι, οι οποίοι απομονώθηκαν και ελέγχθηκαν ως προς την έκφραση της εξωγενούς πρωτεΐνης GFP-MCM2. Επιπλέον πραγματοποιήθηκε έλεγχος της λειτουργικότητας και σύγκριση της συμπεριφοράς της εξωγενούς πρωτεΐνης με την αντίστοιχη της ενδογενούς. Παράλληλα ελέγχθηκε η λειτουργικότητα σταθερά διαμολυσμένων MCF7 κυτταρικών σειρών με τα υβριδικά μόρια GFP-MCM4 και GFP- NLS, οι οποίες είχαν δημιουργηθεί σε προηγούμενη εργασία του εργαστηρίου μας (Διδακτορική Διατριβή Παναγιώτη Κωτσαντή). Για τον προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης GFP-MCM2 και τη σύγκριση με την αντίστοιχη της ενδογενούς, πραγματοποιήθηκε ανάλυση western. Συγκεκριμένα, απομονώθηκαν κυτταρικά εκχυλίσματα από τους τέσσερις διαφορετικούς κλώνους κυττάρων και υποβλήθηκαν σε ανάλυση western χρησιμοποιώντας αντισώματα ειδικά έναντι των πρωτεϊνών GFP και MCM2. Όπως φαίνεται στην εικόνα Α, στον κλώνο 31 τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης GFP-MCM2 είναι παρόμοια με τα επίπεδα του ενδογενούς μορίου. Συνεπώς ο κλώνος αυτός επιλέχθηκε και χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω χαρακτηρισμό. Στη συνέχεια, ελέγχθηκε το πρότυπο ενδοκυτταρικού εντοπισμού της πρωτεΐνης GFP-MCM2 σε σύγκριση με το αντίστοιχο της ενδογενούς πρωτεΐνης MCM2. Για το σκοπό αυτό, MCF7 κύτταρα του πατρικού κλώνου υποβλήθηκαν σε ανοσοφθορισμό με χρήση αντισώματος έναντι της πρωτεΐνης MCM2. Παράλληλα MCF7 κύτταρα του κλώνου 31 που εκφράζουν σταθερά την πρωτεΐνη GFP-MCM2 μονιμοποιήθηκαν. Όπως

126 4. Αποτελέσματα φαίνεται στην εικόνα Β, η σύγκριση της εξωγενούς GFP-MCM2 με την ενδογενή πρωτεΐνη αποκάλυψε ότι η εξωγενής πρωτεΐνη παρουσιάζει το σωστό πρότυπο ενδοκυτταρικού εντοπισμού και συγκεκριμένα είναι πυρηνική και αποκλειόμενη από τους πυρηνίσκους, πρότυπο ίδιο με αυτό του ενδογενούς μορίου. Ακολούθως πραγματοποιήθηκε ανάλυση του προφίλ κυτταρικού κύκλου των κυτταρικών σειρών που εκφράζουν σταθερά τις πρωτεΐνες GFP-MCM2, GFP-MCM4 ή GFP-NLS. Συγκεκριμένα, κύτταρα από τις διαφορετικές κυτταρικές σειρές μονιμοποιήθηκαν, πραγματοποιήθηκε χρώση του DNA τους με ιωδιούχο προπίδιο και υποβλήθηκαν σε ανάλυση με κυτταρομετρία ροής (FACS), κατά την οποία τα κύτταρα διαχωρίστηκαν βάσει του μεγέθους τους και του περιεχόμενου σε αυτά γενετικού υλικού. Από τη σύγκριση των προτύπων κυτταρικού κύκλου της GFP-MCM2, της GFP-MCM4 και της GFP-NLS κυτταρικής σειράς με το αντίστοιχο του πατρικού κλώνου των MCF7 κυττάρων διαπιστώθηκε ότι τόσο τα προφίλ όσο και τα ποσοστά των κυτταρικών πληθυσμών κάθε φάσης του κυτταρικού κύκλου είναι παρόμοια (εικόνα Γ). Συνεπώς η σταθερή και συνεχής έκφραση των εξωγενών μορίων GFP-MCM2, GFP-MCM4 και GFP-NLS δεν παρεμποδίζει τη φυσιολογική εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Τέλος, διεξάγοντας πειράματα ανοσοκατακρήμνισης ελέγχθηκε αν οι πρωτεΐνες GFP-MCM2 και GFP-MCM4 αλληλεπιδρούν με τις υπόλοιπες ενδογενείς MCM υπομονάδες. Συγκεκριμένα, απομονώθηκαν πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από τις σταθερά διαμολυσμένες κυτταρικές σειρές με τα υβριδικά μόρια GFP-MCM2 και GFP-MCM4. Ως αρνητικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από τη σταθερά διαμολυσμένη κυτταρική σειρά με το μόριο GFP-NLS, καθώς και από τον πατρικό MCF7 κυτταρικό κλώνο. Τα πρωτεϊνικά εκχυλίσματα επωάστηκαν με αντίσωμα έναντι της GFP πρωτεΐνης. Έπειτα τα ανοσοκατακρημνίσματα που προέκυψαν καθώς και τα ολικά εκχυλίσματα αναλύθηκαν με ανοσοαποτύπωμα western χρησιμοποιώντας αντισώματα ειδικά έναντι των πρωτεϊνών MCM2, MCM4 και MCM7. Όπως φαίνεται στην εικόνα Δ, στα ανοσοκατακρημνίσματα της GFP-MCM2 πρωτεΐνης, διαπιστώθηκαν οι ενδογενείς πρωτεΐνες MCM4 και MCM7, ενώ στα ανοσοκατακρημνίσματα της GFP- MCM4 πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν οι ενδογενείς MCM2 και MCM7 πρωτεΐνες. Αντιθέτως, δεν παρατηρήθηκε συγκατακρήμνιση των ενδογενών MCM2, MCM4 και MCM7 πρωτεϊνών στα ανοσοκατακρημνίσματα που προέκυψαν από τα πρωτεϊνικά εκχυλίσματα της MCF7 και της GFP-NLS κυτταρικής σειράς. Συνεπώς οι εξωγενώς εκφρασμένες πρωτεΐνες GFP-MCM2 και GFP-MCM4 λειτουργούν και ρυθμίζονται φυσιολογικά στα κύτταρα και δύνανται να αλληλεπιδρούν και να συμμετέχουν σε σύμπλοκα με τις υπόλοιπες ενδογενείς MCM πρωτεΐνες Συμπερασματικά, ο λειτουργικός έλεγχος των σταθερά διαμολυσμένων κυτταρικών σειρών έδειξε ότι οι εξωγενώς εκφρασμένες πρωτεΐνες GFP-MCM2 και GFP-MCM4 ρυθμίζονται σωστά και εμφανίζουν παρόμοια συμπεριφορά με τις αντίστοιχες ενδογενείς υπομονάδες, γεγονός που καθιστά δυνατή τη μελέτη τους για τη διερεύνηση της κινητικής των MCM πρωτεϊνών σε ζωντανά κύτταρα

127 4. Αποτελέσματα Εικόνα 4.2.2: Χαρακτηρισμός MCF7 κυττάρων που εκφράζουν σταθερά τις υβριδικές πρωτεΐνες GFP-MCM2, GFP-MCM4 και GFP-NLS. (A) Η πρωτεΐνη GFP-MCM2 εκφράζεται σε παρόμοια επίπεδα με την ενδογενή MCM2 πρωτεΐνη. Πρωτεϊνικά εκχυλίσματα διαφορετικών κλώνων MCF7 κυττάρων που εκφράζουν σταθερά την πρωτεΐνη GFP-MCM2 αναλύθηκαν με ανοσοαποτύπωμα western με χρήση αντισωμάτων έναντι των πρωτεϊνών GFP και MCM2. (Β) Ο ενδοκυτταρικός εντοπισμός της πρωτεΐνης GFP-MCM2 είναι πυρηνικός και αποκλειόμενος από τους πυρηνίσκους, όμοιος με του ενδογενούς μορίου. ΜCF7 πατρικά κύτταρα και MCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά την GFP-MCM2 πρωτεΐνη μονιμοποιήθηκαν. Τα MCF7 κύτταρα του πατρικού κλώνου υποβλήθηκαν σε ανοσοφθορισμό με χρήση αντισώματος έναντι της MCM2 πρωτεΐνης. O ενδοκυτταρικός εντοπισμός της ενδογενούς MCM2 πρωτεΐνης συγκρίθηκε με τον εντοπισμό της εξωγενούς GFP-MCM2 (χρώση DNA με DAPI). (Γ) Τα ποσοστά των κυτταρικών πληθυσμών κάθε φάσης του κυτταρικού κύκλου είναι παρόμοια μεταξύ των MCF7 πατρικών κυττάρων και των κυτταρικών σειρών που εκφράζουν σταθερά τις πρωτεΐνες GFP-MCM2, GFP- MCM4 και GFP-NLS. Τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν, πραγματοποιήθηκε χρώση του DNA τους με ιωδιούχο προπίδιο και υποβλήθηκαν σε ανάλυση με κυτταρομετρία ροής. (Δ) Οι εξωγενείς πρωτεΐνες GFP-MCM2 και GFP-MCM4 αλληλεπιδρούν και συμμετέχουν σε σύμπλοκα με τις ενδογενείς πρωτεΐνες MCM2, MCM4 και MCM7. Πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από τις κυτταρικές σειρές MCF7, GFP-MCM2, GFP-MCM4 και GFP-NLS επωάστηκαν με αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης GFP. Τα ανοσοκατακρημνίσματα και τα ολικά εκχυλίσματα αναλύθηκαν με ανοσοαποτύπωμα western με χρήση αντισωμάτων έναντι των MCM2, MCM4 και MCM7 πρωτεϊνών

128 4. Αποτελέσματα Οι πρωτεΐνες GFP-MCM2 και GFP-MCM4 προσδένονται στη χρωματίνη Για τη μελέτη της κινητικής συμπεριφοράς των πρωτεϊνών MCM σε ζωντανά κύτταρα χρησιμοποιήθηκε in vivo και σε πραγματικό χρόνο λειτουργική συνεστιακή μικροσκοπία φθορισμού. Αρχικά διερευνήθηκε η φύση της αλληλεπίδρασης των πρωτεϊνών MCM με τη χρωματίνη. Για το σκοπό αυτό εφαρμόστηκε η μέθοδος FRAP σε ασύγχρονα MCF7 κύτταρα, τα οποία εκφράζουν σταθερά τις υβριδικές πρωτεΐνες GFP- MCM2, GFP-MCM4 ή GFP-NLS (αρνητικός μάρτυρας), όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο «Μέθοδοι και Υλικά». Επίσης, MCF7 κύτταρα του πατρικού κλώνου διαμολύνθηκαν παροδικά με το υβριδικό μόριο Cdt1-GFP και υποβλήθηκαν παράλληλα σε ανάλυση με τη μέθοδο FRAP για σύγκριση. Οι κινητικές ιδιότητες των πρωτεϊνών MCM2, MCM4 και Cdt1 προσδιορίστηκαν μετά από φωτολεύκανση της πρωτεΐνης GFP μιας κυκλικής περιοχής συγκεκριμένης ακτίνας (2μm) μέσα στον πυρήνα, ακολουθούμενη από την καταγραφή της επαναφοράς του φθορισμού στην περιοχή αυτή συν τω χρόνω. Οι καμπύλες επαναφοράς του φθορισμού χρησιμοποιήθηκαν για την εξαγωγή του χρόνου που απαιτείται για την ανάκτηση του φθορισμού στο 50% της τελικής έντασης (t 1/2 ) καθώς και του ποσοστού των μορίων των πρωτεϊνών GFP-MCM2, GFP-MCM4, GFP-NLS και Cdt1-GFP που είναι σταθερά δεσμευμένα στη χρωματίνη. Όπως φαίνεται στην εικόνα 4.2.3, τόσο η πρωτεΐνη GFP-MCM2 όσο και η GFP-MCM4 παρουσιάζουν μια γρήγορη αρχική επαναφορά του φθορισμού όπως υποδεικνύει ο μικρός χρόνος t 1/2 (GFP-MCM2 t 1/2 = 0.23 ± 0.07 sec και GFP-MCM4 t 1/2 = 0.23 ± 0.07 sec) που είναι αντίστοιχος του t 1/2 της πρωτεΐνης GFP-NLS (GFP-NLS t 1/2 = 0.29 ± 0.08 sec). Η παρατήρηση αυτή υποδηλώνει ότι ένα κλάσμα μορίων GFP-MCM2 και GFP-MCM4 διαχέονται ελεύθερα στον πυρήνα των ζωντανών κυττάρων. Επιπλέον, σε αντίθεση με την πρωτεΐνη GFP-NLS, οι πρωτεΐνες GFP-MCM2 και GFP-MCM4 παρουσιάζουν σημαντικά αυξημένο δεσμευμένο κλάσμα στη χρωματίνη (GFP-MCM2 Δεσμ.Κλ. = 0.16 ± 0.15 και GFP- MCM4 Δεσμ.Κλ. = 0.23 ± 0.2), το οποίο παραμένει σταθερό για το χρονικό διάστημα εξέλιξης του πειράματος. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε σύγκριση των κινητικών ιδιοτήτων των πρωτεϊνών GFP-MCM2 και GFP-MCM4 με την αντίστοιχη της πρωτεΐνης Cdt1-GFP (εικόνα 4.2.3). Η παρατήρηση των καμπυλών επαναφοράς του φθορισμού των πρωτεϊνών αποκάλυψε διαφορετική συμπεριφορά των πρωτεϊνών GFP-MCM2 και GFP-MCM4 σε σύγκριση με την πρωτεΐνη Cdt1-GFP, ως προς τον τρόπο με τον οποίο αλληλεπιδρούν με τη χρωματίνη. Συγκεκριμένα, οι πρωτεΐνες GFP-MCM2 και GFP-MCM4 παρουσιάζουν μικρότερο χρόνο t 1/2 (GFP-MCM2 t 1/2 = 0.23 ± 0.07 sec και GFP-MCM4 t 1/2 = 0.23 ± 0.07 sec) σε σχέση με την πρωτεΐνη Cdt1-GFP (Cdt1-GFP t 1/2 = 0.57 ± 0.09 sec). Η παρατήρηση αυτή υποδεικνύει τη γρήγορη αρχική επαναφορά του φθορισμού των πρωτεϊνών GFP-MCM2 και GFP-MCM4 και συνεπώς την ελεύθερη διάχυσή τους μέσα στον πυρήνα. Επιπλέον, οι πρωτεΐνες GFP-MCM2 και GFP-MCM4 (GFP-MCM2 Δεσμ.Κλ. = 0.16 ± 0.15 και GFP-MCM4 Δεσμ.Κλ. = 0.23 ± 0.2) παρουσιάζουν μεγαλύτερο δεσμευμένο κλάσμα στη χρωματίνη σε σύγκριση με την Cdt1-GFP (Cdt1-GFP Δεσμ.Κλ. = 0.03 ± 0.03), γεγονός που καταδεικνύει τον στατικό τρόπο αλληλεπίδρασης των πρωτεϊνών MCM με τη χρωματίνη. Η παρατηρούμενη αργή αρχική επαναφορά του φθορισμού και το μικρό

129 4. Αποτελέσματα δεσμευμένο κλάσμα στη χρωματίνη που παρουσιάζει ο παράγοντας αδειοδότησης Cdt1 έρχεται σε συμφωνία με προηγούμενη μελέτη του εργαστηρίου μας (Xouri et al., 2007b) και καταδεικνύουν το δυναμικό τρόπο αλληλεπίδρασης του παράγοντα αυτού με τη χρωματίνη. Εικόνα 4.2.3: Οι πρωτεΐνες GFP-MCM2 και GFP-MCM4 εμφανίζουν διαφορετική κινητική συμπεριφορά από την πρωτεΐνη Cdt1-GFP, παρουσιάζοντας πιο γρήγορη επαναφορά στις περιοχές που υπέστησαν φωτολεύκανση και μεγαλύτερο δεσμευμένο κλάσμα στη χρωματίνη. (Α) Ασύγχρονα MCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά τις πρωτεΐνες GFP-MCM2, GFP-MCM4, GFP-NLS ή Cdt1-GFP υποβλήθηκαν σε FRAP ανάλυση. Η καμπύλη επαναφοράς του φθορισμού κάθε πειραματικής συνθήκης αναπαριστά το μέσο όρο των κανονικοποιημένων μέσων εντάσεων φθορισμού κυττάρων που αναλύθηκαν. (Β) Πίνακας στον οποίο απεικονίζεται ο χρόνος που απαιτείται για την επαναφορά του φθορισμού στο 50% της τελικής έντασης (t 1/2 ), το δεσμευμένο κλάσμα μορίων (Δεσμ. Κλ.) στη χρωματίνη και ο αριθμός (Ν) των κυττάρων που αναλύθηκαν με FRAP. Συμπερασματικά, οι πρωτεΐνες GFP-MCM2 και GFP-MCM4 εμφανίζουν γρήγορη αρχική επαναφορά του φθορισμού και σημαντικά αυξημένο δεσμευμένο κλάσμα στη χρωματίνη, ενώ ο παράγοντας Cdt1 παρουσιάζει πιο αργή αρχική επαναφορά και μικρότερο σταθερά δεσμευμένο κλάσμα στη χρωματίνη. Η διαφορετική κινητική συμπεριφορά των MCM μορίων σε σύγκριση με το Cdt1 υποδηλώνει ότι η πλειονότητα των GFP-MCM2 και GFP-MCM4 μορίων δεν μετακινούνται στα ζωντανά κύτταρα ως σύμπλοκα με τον παράγοντα Cdt Η πρόσδεση των πρωτεϊνών GFP-MCM2 και GFP-MCM4 στη χρωματίνη εξαρτάται από την παρουσία του παράγοντα Cdt1 Λαμβάνοντας υπ όψιν ότι ο παράγοντας Cdt1 είναι απαραίτητος για την προσέλκυση και πρόσδεση των πρωτεϊνών MCM στη χρωματίνη, ελέγχθηκε κατά πόσο το δεσμευμένο κλάσμα MCM μορίων που παρατηρείται με την ανάλυση FRAP εξαρτάται από την παρουσία του Cdt1. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκε αποσιώπηση της έκφρασης του παράγοντα Cdt1 με χρήση της τεχνολογίας sirna. Συγκεκριμένα,

130 4. Αποτελέσματα ασύγχρονα MCF7 κύτταρα που είναι σταθερά διαμολυσμένα με τα μόρια GFP-MCM2 και GFP-MCM4 διαμολύνθηκαν είτε με sirna ειδικό έναντι του mrna της πρωτεΐνης Cdt1 είτε με μη στοχευμένο sirna έναντι του mrna της λουσιφεράσης (αρνητικός μάρτυρας), για 72 ώρες. Η επιτυχία της αποσιώπησης της έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 ελέγχθηκε με ανοσοφθορισμό και χρήση ειδικού αντισώματος έναντι της πρωτεΐνης Cdt1 σε MCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά την πρωτεΐνη GFP-MCM2. Εικόνα 4.2.4: Επιτυχής αποσιώπηση της έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 με χρήση ειδικού sirna στην MCF7 κυτταρική σειρά πoυ εκφράζει σταθερά την πρωτεΐνη GFP-MCM2. (A-B) Ασύγχρονα MCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά την πρωτεΐνη GFP-MCM2 διαμολύνθηκαν είτε (Α) με μη στοχευμένο sirna έναντι του mrna της λουσιφεράσης (αρνητικός μάρτυρας) είτε (Β) με sirna ειδικό έναντι του mrna της πρωτεΐνης Cdt1, για 72 ώρες. Ακολούθησε μονιμοποίηση των κυττάρων και ανοσοφθορισμός με χρήση αντισώματος ειδικού έναντι της πρωτεΐνης Cdt1. (Γ-Δ) Ποσοτικοποίηση της αποσιώπησης της έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 ύστερα από διαμόλυνση των κυττάρων με (Γ) μη στοχευμένο sirna ή με (Δ) sirna έναντι του mrna της πρωτεΐνης Cdt1. Στα ιστογράμματα απεικονίζονται τα ποσοστά των θετικών κυττάρων για την πρωτεΐνη Cdt1 στα διαφορετικά εύρη έντασης φθορισμού. Η παρατηρούμενη αύξηση του ποσοστού των κυττάρων που παρουσιάζουν ασθενή ένταση φθορισμού (από 0 έως 20 αυθαίρετες μονάδες φθορισμού) και που έχουν διαμολυνθεί με sirna έναντι του mrna της πρωτεΐνης Cdt1, σε σύγκριση με τα αντίστοιχο ποσοστό των κυττάρων που έχουν διαμολυνθεί με sirna έναντι του mrna της λουσιφεράσης, υποδεικνύει την ελαττωμένη έκφραση της πρωτεΐνης Cdt1 και συνεπώς την επιτυχή έκφραση της αποσιώπησης της έκφρασης της πρωτεΐνης μετά τη διαμόλυνση με το sirna. Η ποσοτικοποίηση πραγματοποιήθηκε με χρήση του προγράμματος Image J

131 4. Αποτελέσματα Ακολούθησε λήψη αντιπροσωπευτικών εικόνων και ποσοτική εκτίμηση της έντασης και του ποσοστού των θετικών κυττάρων για την πρωτεΐνη Cdt1 με το πρόγραμμα Image J. Η διαμόλυνση των κυττάρων με το sirna που είναι ειδικό έναντι του mrna της πρωτεΐνης Cdt1 έχει ως αποτέλεσμα τη σημαντική αποσιώπηση της έκφρασης της πρωτεΐνης. Όπως φαίνεται στην εικόνα 4.2.4, τόσο η ένταση όσο και το ποσοστό των θετικών κυττάρων για την πρωτεΐνη Cdt1 είναι σημαντικά μειωμένα σε σύγκριση με τα αντίστοιχα των κυττάρων που είχαν διαμολυνθεί με μη στοχευμένο sirna. Στη συνέχεια ελέγχθηκε η επίδραση της αποσιώπησης της έκφρασης του παράγοντα Cdt1 στην κινητική των πρωτεϊνών GFP-MCM2 και GFP-MCM4. Για το σκοπό αυτό, ασύγχρονα MCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά την πρωτεΐνη GFP- MCM2 ή την πρωτεΐνη GFP-MCM4 διαμολύνθηκαν είτε με sirna ειδικό έναντι του mrna της πρωτεΐνης Cdt1 είτε με μη στοχευμένο sirna έναντι του mrna της λουσιφεράσης (αρνητικός μάρτυρας), για 72 ώρες. Ακολούθησε ανάλυση των κυττάρων με FRAP. Όπως φαίνεται στην εικόνα 4.2.5, η αποσιώπηση της έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση του σταθερά δεσμευμένου κλάσματος στη χρωματίνη των GFP-MCM2 (GFP-MCM2 Δεσμ.Κλ. = 0.06 ± 0.09) και GFP-MCM4 (GFP-MCM4 Δεσμ.Κλ. = 0.09 ± 0.15) μορίων, σε σύγκριση με τα κύτταρα που είχαν διαμολυνθεί με μη στοχευμένο sirna (GFP-MCM2 Δεσμ.Κλ. = 0.19 ± 0.2 και GFP-MCM4 Δεσμ.Κλ. = 0.2 ± 0.2).. Εικόνα 4.2.5: Η πρόσδεση των πρωτεϊνών GFP-MCM2 και GFP-MCM4 στη χρωματίνη εξαρτάται από την πρωτεΐνη Cdt1. (A) Ασύγχρονα MCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά τις πρωτεΐνες GFP-MCM2, GFP-MCM4 ή GFP-NLS διαμολύνθηκαν με μη στοχευμένο sirna έναντι του mrna της λουσιφεράσης (siluc) ή με sirna ειδικό έναντι του mrna της πρωτεΐνης Cdt1 (sicdt1), για 72 ώρες. Ακολούθησε FRAP ανάλυση των κυττάρων. Η καμπύλη επαναφοράς του φθορισμού κάθε πειραματικής συνθήκης αναπαριστά το μέσο όρο των κανονικοποιημένων μέσων εντάσεων φθορισμού κυττάρων που αναλύθηκαν. (Β) Πίνακας στον οποίο απεικονίζεται ο χρόνος που απαιτείται για την επαναφορά του φθορισμού στο 50% της τελικής έντασης (t 1/2 ), το δεσμευμένο κλάσμα μορίων (Δεσμ. Κλ.) στη χρωματίνη και ο αριθμός (Ν) των κυττάρων που αναλύθηκαν με FRAP. Συνεπώς, οι πρωτεΐνες GFP-MCM2 και GFP-MCM4 αδυνατούν να προσδεθούν στη χρωματίνη απουσία της πρωτεΐνης Cdt1. Η παρατήρηση αυτή, δηλαδή η εξάρτηση της πρόσδεσης των πρωτεϊνών MCM στη χρωματίνη από την παρουσία του παράγοντα Cdt1,

132 4. Αποτελέσματα επιβεβαιώνει περαιτέρω την αξιοπιστία του συγκεκριμένου συστήματος μελέτης για την ποσοτική εκτίμηση της αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA σε ζωντανά κύτταρα Μελέτη της κινητικής των πρωτεϊνών GFP-MCM2 και GFP-MCM4 κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου In vitro πειράματα έχουν προτείνει ότι η πρόσδεση των πρωτεϊνών MCM στη χρωματίνη πραγματοποιείται στο τέλος της μίτωσης και κατά τη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου. Στόχος του παρόντος κεφαλαίου ήταν η χωροχρονική μελέτη της αλληλεπίδρασης των πρωτεϊνών MCM με τη χρωματίνη κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Αρχικά χρησιμοποιήθηκαν μέθοδοι συγχρονισμού των κυττάρων σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου και ακολούθησε ανάλυση της κινητικής των πρωτεϊνών MCM με τη μέθοδο FRAP. Η κινητική συμπεριφορά των εξωγενών πρωτεϊνών MCM συγκρίθηκε με την αντίστοιχη συμπεριφορά των ενδογενών μορίων. Επιπλέον διερευνήθηκαν οι υποπυρηνικές περιοχές αλληλεπίδρασης των πρωτεϊνών MCM με τη χρωματίνη κατά τις φάσεις G1 και S του κυτταρικού κύκλου, με τη μέθοδο FLIP. Παράλληλα μελετήθηκε η πιθανή συσχέτιση των περιοχών αυτών με τα εργοστάσια αντιγραφής του DNA κατά τη διάρκεια της φάσης S. Τέλος εκτιμήθηκε το σχετικό χρονικό διάστημα για το οποίο οι πρωτεΐνες MCM παραμένουν σταθερά προσδεδεμένες στη χρωματίνη Η αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης GFP-MCM2 με τη χρωματίνη διαφοροποιείται κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου Αρχικά διερευνήθηκε κατά πόσο η κινητική συμπεριφορά των πρωτεϊνών MCM διαφοροποιείται κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, σύμφωνα με την αναμενόμενη πρόσδεσή τους στη χρωματίνη κατά την διάρκεια της αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA. Ως δείκτης φάσεων του κυτταρικού κύκλου χρησιμοποιήθηκε το υβριδικό μόριο PCNA-RFP, το οποίο έχει την ιδιότητα να εμφανίζει διαφορετικό πρότυπο ενδοκυτταρικού εντοπισμού ανάλογα με τη φάση του κυτταρικού κύκλου στην οποία βρίσκονται τα κύτταρα που το εκφράζουν. Συγκεκριμένα, η πρωτεΐνη PCNA παρουσιάζει διάχυτη πυρηνική κατανομή σε κύτταρα που δεν βρίσκονται σε φάση S, ενώ εμφανίζει χαρακτηριστικό στικτώδες πρότυπο σε κύτταρα που διανύουν τη φάση S, το οποίο διαφοροποιείται ανάλογα με το αν τα κύτταρα βρίσκονται στην αρχή, στο μέσο ή στο τέλος της φάσης αυτής (εικόνα Α) (ref). Αξιοποιώντας αυτή την ιδιότητα του PCNA- RFP, MCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά την πρωτεΐνη GFP-MCM2 διαμολύνθηκαν παροδικά με πλασμίδιο που φέρει το PCNA-RFP. Μετά το πέρας 24 ωρών από τη διαμόλυνση τα κύτταρα διακρίθηκαν σύμφωνα με το πρότυπο του PCNA-RFP σε αυτά που δεν βρίσκονταν στη φάση S και σε αυτά που βρίσκονταν στην αρχή, στο μέσο ή στο τέλος της φάσης S. Ακολούθησε ανάλυση των κυττάρων με FRAP. Όπως φαίνεται στην εικόνα 4.2.6, το ελεύθερο κλάσμα της πρωτεΐνης GFP-MCM2 παρουσιάζει την ίδια ταχύτητα διάχυσης στον πυρήνα των κυττάρων καθ όλη τη διάρκεια

133 4. Αποτελέσματα του κυτταρικού κύκλου, όπως καταδεικνύει η παρόμοια τιμή στον χρόνο t 1/2 των κυττάρων που βρίσκονταν σε διαφορετικές φάσεις. Αντίθετα διαπιστώνεται σημαντική διαφοροποίηση στο ποσοστό των μορίων της πρωτεΐνης GFP-MCM2 που είναι σταθερά δεσμευμένα στη χρωματίνη, μεταξύ των κυττάρων που διήνυαν διαφορετική φάση του κυτταρικού κύκλου. Συγκεκριμένα, το δεσμευμένο κλάσμα στη χρωματίνη της πρωτεΐνης GFP-MCM2 ήταν 0.22 ± 0.14 σε κύτταρα που δεν βρίσκονταν στη φάση S, ενώ ήταν αυξημένο σε 0.30 ± 0.11 σε κύτταρα που βρίσκονταν στην αρχή της φάσης S. Επιπλέον, παρατηρήθηκε σταδιακή μείωση του δεσμευμένου κλάσματος της πρωτεΐνης GFP-MCM2 στα κύτταρα που βρίσκονταν στο μέσο (GFP-MCM2 Δεσμ.Κλ. = 0.07 ± 0.04) ή στο τέλος (GFP-MCM2 Δεσμ.Κλ. = 0.02 ± 0.02) της φάσης S. Εικόνα 4.2.6: Η κινητική της πρωτεΐνης GFP-MCM2 αλλάζει με την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου. (A) Το ενδοκυτταρικό πρότυπο κατανομής της υβριδικής πρωτεΐνης PCNA-RFP διαφοροποιείται ανάλογα με τη φάση του κυτταρικού κύκλου στην οποία βρίσκονται τα κύτταρα. (Β) Ασύγχρονα MCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά τις πρωτεΐνες GFP-MCM2 ή GFP-NLS (αρνητικός μάρτυρας) διαμολύνθηκαν παροδικά με πλασμίδιο έκφρασης που φέρει το μόριο PCNA-RFP, για 24 ώρες. Ακολούθως τα κύτταρα διαχωρίστηκαν και υποκατηγοριοποιήθηκαν σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου ανάλογα με το πρότυπο του PCNA-RFP και υποβλήθηκαν σε ανάλυση με FRAP. Η καμπύλη επαναφοράς του φθορισμού κάθε πειραματικής συνθήκης αναπαριστά το μέσο όρο των κανονικοποιημένων μέσων εντάσεων φθορισμού 3 25 κυττάρων που αναλύθηκαν. (Γ) Πίνακας στον οποίο απεικονίζεται ο χρόνος που απαιτείται για την επαναφορά του φθορισμού στο 50% της τελικής έντασης (t 1/2 ), το δεσμευμένο κλάσμα μορίων (Δεσμ. Κλ.) στη χρωματίνη και ο αριθμός (Ν) των κυττάρων που αναλύθηκαν με FRAP. Συμπερασματικά, ανάλυση των FRAP πειραμάτων έδειξε ότι η πρωτεΐνη GFP- MCM2 εμφανίζει σταθερό και μεγαλύτερο δεσμευμένο κλάσμα στη χρωματίνη στην αρχή της φάσης S, κατά την έναρξη δηλαδή της αντιγραφής του DNA. Το δεσμευμένο αυτό κλάσμα μειώνεται σταδιακά καθώς τα κύτταρα προοδεύουν προς το τέλος της φάσης

134 4. Αποτελέσματα αυτής, παρατήρηση που είναι σε συμφωνία με την απώλεια της αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA κατά τη φάση S Οι πρωτεΐνες GFP-MCM2 και GFP-MCM4 προσδένονται σταδιακά στη χρωματίνη με την πρόοδο της φάσης G1 Στη συνέχεια, λαμβάνοντας υπ όψιν ότι τα κύτταρα που βρίσκονται εκτός της φάσης S, τα οποία όπως αναφέρθηκε προηγουμένως παρουσιάζουν σημαντικό δεσμευμένο κλάσμα GFP-MCM2 μορίων στη χρωματίνη (GFP-MCM2 Δεσμ.Κλ. = 0.22 ± 0.14), αντιπροσωπεύουν έναν ετερογενή πληθυσμό που απαρτίζεται από κύτταρα που βρίσκονται σε διαφορετικά στάδια της φάσης G1 καθώς και στη φάση G2, κρίθηκε σκόπιμη η μελέτη της κινητικής των πρωτεϊνών MCM αποκλειστικά κατά τη διάρκεια της φάσης G1, οπότε και λαμβάνει χώρα η αδειοδότηση των αφετηριών της αντιγραφής του DNA. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκε συγχρονισμός MCF7 κυττάρων που εκφράζουν σταθερά την πρωτεΐνη GFP-MCM2 ή GFP-MCM4 στη φάση G2/M με νοκοδαζόλιο, όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο («Μέθοδοι και Υλικά»). Ακολούθησε απομάκρυνση του θρεπτικού μέσου με το νοκοδαζόλιο, μηχανική ανακίνηση του τρυβλίου, συλλογή των μιτωτικών κυττάρων και εκ νέου επίστρωσή τους σε καινούριο θρεπτικό μέσο (απουσία νοκοδαζολίου) έτσι ώστε να εισέλθουν στη φάση G1. Έπειτα πραγματοποιήθηκε λήψη δειγμάτων στην αρχή (3 ώρες μετά την απομάκρυνση του νοκοδαζολίου) και στην προχωρημένη (9 ώρες μετά την απομάκρυνση του νοκοδαζολίου) φάση G1. Εικόνα 4.2.7: Συγχρονισμός MCF7 κυττάρων που εκφράζουν σταθερά την πρωτεΐνη GFP- MCM2 στη μίτωση με νοκοδαζόλιο. MCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά την πρωτεΐνη GFP- MCM2 καλλιεργήθηκαν παρουσία νοκοδαζολίου τελικής συγκέντρωσης 40 ng/ml, για 12 ώρες. Στη συνέχεια τα μιτωτικά κύτταρα ανασηκώθηκαν με μηχανική ανακίνηση των τρυβλίων (shakeoff) και επιστρώθηκαν σε καλυπτρίδες. Ακολούθησε λήψη δειγμάτων 3 και 9 ώρες μετά την επίστρωση και μονιμοποίηση των κυττάρων. Η επιτυχία του συγχρονισμού ελέγχθηκε με ανοσοφθορισμό και χρήση αντισωμάτων έναντι των πρωτεϊνών Cdt1 και κυκλίνης Α

135 4. Αποτελέσματα Για τη μελέτη της κινητικής των πρωτεϊνών GFP-MCM2 και GFP-MCM4 κατά τη φάση G1, MCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά την πρωτεΐνη GFP-MCM2 ή GFP- MCM4 και βρίσκονταν είτε στην αρχή (3 ώρες μετά την απομάκρυνση του νοκοδαζολίου) είτε σε προχωρημένη (9 ώρες μετά την απομάκρυνση του νοκοδαζολίου) φάση G1 υποβλήθηκαν σε ανάλυση με FRAP. Επίσης, ασύγχρονα MCF7 κύτταρα σταθερά διαμολυσμένα με την πρωτεΐνη Cdt1-GFP υποβλήθηκαν παράλληλα σε ανάλυση με FRAP για σύγκριση. Ως αρνητικός μάρτυρας για την αλληλεπίδραση με τη χρωματίνη χρησιμοποιήθηκε η κινητική της πρωτεΐνης GFP-NLS. Όπως φαίνεται στην εικόνα 4.2.8, η ανάλυση των καμπυλών επαναφοράς του φθορισμού μετά τη φωτολεύκανση έδειξε ότι τόσο η GFP-MCM2 όσο και η GFP-MCM4 πρωτεΐνη παρουσιάζουν μικρό δεσμευμένο κλάσμα στην χρωματίνη ήδη από την αρχή της G1 φάσης (GFP-MCM2 Δεσμ.Κλ. = 0.08 ± 0.06 και GFP-MCM4 Δεσμ.Κλ. = 0.09 ± 0.01). Επίσης, καθώς εξελίσσεται η φάση αυτή (προχωρημένη G1 φάση) διαπιστώθηκε αύξηση του δεσμευμένου κλάσματος μορίων GFP-MCM2 και GFP-MCM4 στη χρωματίνη (GFP-MCM2 Δεσμ.Κλ. = 0.12 ± 0.13 και GFP- MCM4 Δεσμ.Κλ. = 0.19 ± 0.15). Εικόνα 4.2.8: Οι πρωτεΐνες GFP-MCM2 και GFP-MCM4 παρουσιάζουν μεγαλύτερο δεσμευμένο κλάσμα στη χρωματίνη με την πρόοδο της G1 φάσης. (Α, Γ) MCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά τις πρωτεΐνες (Α) GFP-MCM2 ή (Γ) GFP-MCM4 καλλιεργήθηκαν παρουσία νοκοδαζολίου (40 ng/ml) για 12 ώρες. Στη συνέχεια τα μιτωτικά κύτταρα ανασηκώθηκαν με μηχανική ανακίνηση (mitotic shake-off) και επιστρώθηκαν σε τρυβλία τύπου mattek. 3 και 9 ώρες μετά την επίστρωση ελήφθησαν δείγματα τα οποία υποβλήθηκαν σε ανάλυση με FRAP. Παράλληλα αναλύθηκαν MCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά είτε την πρωτεΐνη Cdt1-GFP είτε την GFP-NLS για σύγκριση. Η καμπύλη επαναφοράς του φθορισμού κάθε πειραματικής συνθήκης αναπαριστά το μέσο όρο των κανονικοποιημένων μέσων εντάσεων φθορισμού κυττάρων που αναλύθηκαν. (Β,Δ) Πίνακες στους οποίους απεικονίζεται ο χρόνος που απαιτείται για την επαναφορά του φθορισμού στο 50% της τελικής έντασης (t 1/2 ), το δεσμευμένο κλάσμα μορίων (Δεσμ. Κλ.) στη χρωματίνη και ο αριθμός (Ν) των κυττάρων που αναλύθηκαν με FRAP

136 4. Αποτελέσματα Συμπερασματικά, η ανάλυση της κινητικής των GFP-MCM2 και GFP-MCM4 πρωτεϊνών κατά τη G1 φάση καταδεικνύει την σταδιακή πρόσδεση των MCM πρωτεϊνών στη χρωματίνη με την πρόοδο της φάσης αυτής Οι πρωτεΐνες GFP-MCM2 και GFP-MCM4 παρουσιάζουν μέγιστο βαθμό πρόσδεσης στη χρωματίνη στο τέλος της φάσης G1 Στη συνέχεια, λαμβάνοντας υπ όψιν τη σταδιακή πρόσδεση των MCM πρωτεϊνών στη χρωματίνη κατά τη φάση G1 καθώς και το αυξημένο δεσμευμένο κλάσμα MCM μορίων που παρατηρείται στην αρχή της φάσης S, κρίθηκε ενδιαφέρουσα η άμεση σύγκριση της κινητικής των MCM πρωτεϊνών στο τέλος της φάσης G1 με την αντίστοιχη στην αρχή της φάσης S. Για να προσεγγιστεί η απάντηση σε αυτό το ερώτημα, MCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά την πρωτεΐνη GFP-MCΜ2 ή GFP-MCM4 συγχρονίστηκαν είτε στο τέλος της φάσης G1 με mimosine, είτε στην αρχή της φάσης S με «απλό αποκλεισμό με υδροξυουρία» (single hydroxyurea block) ή με «διπλό αποκλεισμό με θυμιδίνη» (double thymidine block) (όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο «Μέθοδοι και Υλικά»). Η επιτυχία του συγχρονισμού ελέγχθηκε με ανοσοφθορισμό και χρήση αντισωμάτων έναντι των πρωτεϊνών PCNA, Geminin και κυκλίνης Α (εικόνα 4.2.9). Έχει δειχθεί βιβλιογραφικά ότι η καλλιέργεια των κυττάρων παρουσία 0.5 mm mimosine για 24 ώρες αναστέλλει την έναρξη της αντιγραφής του DNA και προκαλεί συγκέντρωση του κυτταρικού πληθυσμού στο τέλος της φάσης G1 πριν από την πυροδότηση των αφετηριών της αντιγραφής του DNA (Krude, 1999). Σε συμφωνία με την παρατήρηση αυτή, η ανάλυση των εικόνων ανοσοφθορισμού MCF7 κυττάρων που είχαν επωαστεί με mimosine ως προς το φαινότυπο του PCNA έδειξε ότι το 95% του κυτταρικού πληθυσμού εμφάνιζε ομοιογενή πυρηνική χρώση, πρότυπο χαρακτηριστικό κυττάρων που βρίσκονται στη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου. Παρ όλ αυτά τα κύτταρα αυτά εμφάνιζαν σε αρκετά υψηλό ποσοστό θετική χρώση για τις πρωτεΐνες Geminin και κυκλίνη Α, των οποίων τα επίπεδα ξεκινούν να αυξάνονται κατά τη φάση S του κυτταρικού κύκλου. Συνεπώς η επώαση των κυττάρων με mimosine προκαλεί τον αποκλεισμό της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου στο τέλος της φάσης G1, κοντά στο σημείο μετάβασης από τη φάση G1 στη φάση S. Αναφορικά με την υδροξυουρία και την περίσσεια θυμιδίνης, τα φάρμακα αυτά αναστέλλουν το ένζυμο ριβονουκλεοτιδική αναγωγάση, το οποίο είναι υπεύθυνο για τη μετατροπή των ριβονουκλεοτιδίων σε τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια (dntps) που είναι απαραίτητα για τη σύνθεση του DNA. Η επώαση των κυττάρων με θρεπτικό μέσο παρουσία υδροξυουρίας ή περίσσειας θυμιδίνης έχει ως αποτέλεσμα την διακοπή της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου και την συσσώρευση των κυττάρων στην αρχή της φάσης S. Όπως φαίνεται στην εικόνα η καλλιέργεια των κυττάρων παρουσία υδροξυουρίας έχει ως αποτέλεσμα περίπου το 70% του κυτταρικού πληθυσμού να εμφανίζει αφενός θετική χρώση για τις πρωτεΐνες Geminin και κυκλίνη Α και αφετέρου πρότυπο χρώσης του PCNA χαρακτηριστικό κυττάρων που βρίσκονται στην αρχή της φάσης S, παρατηρήσεις που υποδεικνύουν τη συσσώρευση των κυττάρων στη φάση αυτή. Η ανάλυση με ανοσοφθορισμό κυττάρων που είχαν

137 4. Αποτελέσματα καλλιεργηθεί με περίσσεια θυμιδίνης δύο φορές (διπλός αποκλεισμός θυμιδίνης) κατέδειξε παρόμοιο πρότυπο όσο αφορά τόσο τη χρώση για το PCNA όσο και το ποσοστό των κυττάρων που είναι θετικά για τις πρωτεΐνες Geminin και κυκλίνη Α με το αντίστοιχο των κυττάρων που είχαν καλλιεργηθεί σε θρεπτικό μέσο παρουσία mimosine. Παρ όλ αυτά βιβλιογραφικές μελέτες έχουν δείξει ότι η επώαση των κυττάρων σε θρεπτικό μέσο με περίσσεια θυμιδίνης οδηγεί σε διακοπή της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου στην αρχή της φάσης S, ακριβώς μετά την πυροδότηση των αφετηριών αντιγραφής του DNA, μετά δηλαδή από το χρονικό σημείο διακοπής του κυτταρικού κύκλου που προκαλεί το mimosine. Εικόνα 4.2.9: Συγχρονισμός κυττάρων στην προχωρημένη G1 και στην αρχή της φάσης S του κυτταρικού κύκλου. ΜCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά την πρωτεΐνη GFP-MCM2 συγχρονίστηκαν είτε στο τέλος της φάσης G1 με χρήση mimosine είτε στην αρχή της φάσης S με χρήση θυμιδίνης (thymidine) ή υδροξυουρίας (Hydroxyurea, HU), όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο «Μέθοδοι και Υλικά». Η επιτυχία του συγχρονισμού και η πρόοδος των κυττάρων στον κυτταρικό κύκλο ελέγχθηκαν με λήψη δειγμάτων ανά συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα και εφαρμογή ανοσοφθορισμού με χρήση αντισωμάτων έναντι των πρωτεϊνών PCNA, Geminin και κυκλίνης Α. Ακολούθησε ανάλυση της κινητικής των πρωτεϊνών GFP-MCM2 και GFP-MCM4 με FRAP. Όπως φαίνεται στην εικόνα τόσο η πρωτεΐνη GFP-MCM2 όσο και η πρωτεΐνη GFP-MCM4 παρουσιάζουν σαφώς διαφορετική κινητική στα κύτταρα που είχαν επωαστεί με mimosine σε σύγκριση με τα κύτταρα που είχαν επωαστεί με θυμιδίνη, γεγονός που επιβεβαιώνει ότι τα δύο χημικά προκαλούν διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε διαφορετική φάση. Επιπλέον από τις καμπύλες επαναφοράς του φθορισμού μετά τη φωτολεύκανση, οι πρωτεΐνες GFP-MCM2 και GFP-MCM4 εμφανίζουν μεγαλύτερο

138 4. Αποτελέσματα δεσμευμένο κλάσμα στη χρωματίνη στο τέλος της φάσης G1 (GFP-MCM2 Δεσμ.Κλ. = 0.26 ± 0.11 και GFP-MCM4 Δεσμ.Κλ. = 0.3 ± 0.15) σε σύγκριση με το αντίστοιχο στην αρχή της φάσης S (GFP-MCM2 Δεσμ.Κλ. = 0.13 ± 0.11 και GFP-MCM4 Δεσμ.Κλ. = 0.25 ± 0.12 στο block θυμιδίνης και GFP-MCM2 Δεσμ.Κλ. = 0.18 ± 0.11 και GFP-MCM4 Δεσμ.Κλ. = 0.2 ± 0.14 στο block υδροξυουρίας). Συμπερασματικά, οι πρωτεΐνες MCM εμφανίζουν μέγιστο βαθμό πρόσδεσης στη χρωματίνη στο τέλος της φάσης G1, πριν από την έναρξη της αντιγραφής του DNA. Εικόνα : Μέγιστη πρόσδεση των πρωτεϊνών GFP-MCM2 και GFP-MCM4 στη χρωματίνη στο τέλος της φάσης G1. (Α, Γ) MCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά τις πρωτεΐνες (Α) GFP-MCM2 ή (Γ) GFP-MCM4 συγχρονίστηκαν είτε στο τέλος της φάσης G1 με χρήση mimosine είτε στην αρχή της φάσης S με χρήση θυμιδίνης ή υδροξυουρίας. Η κινητική των πρωτεϊνών GFP-MCM2 και GFP-MCM4 στο τέλος της G1 και στην αρχή της φάσης S προσδιορίστηκε με πειράματα FRAP. Κατά τη διάρκεια του πειράματος τα κύτταρα καλλιεργούνταν σε θρεπτικό μέσο παρουσία του εκάστοτε χημικού. Παράλληλα αναλύθηκαν ασύγχρονα MCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά είτε τις πρωτεΐνες GFP-MCM2 ή GFP-MCM4 είτε την πρωτεΐνη GFP-NLS (αρνητικός μάρτυρας) για σύγκριση. Η καμπύλη επαναφοράς του φθορισμού κάθε πειραματικής συνθήκης αναπαριστά το μέσο όρο των κανονικοποιημένων μέσων εντάσεων φθορισμού κυττάρων που αναλύθηκαν. (Β,Δ) Πίνακες στους οποίους απεικονίζεται ο χρό-νος που απαιτείται για την επαναφορά του φθορισμού στο 50% της τελικής έντασης (t 1/2 ), το δεσμευμένο κλάσμα μορίων (Δεσμ. Κλ.) στη χρωματίνη, ο αριθμός (Ν) των κυττάρων που αναλύθηκαν με FRAP

139 4. Αποτελέσματα Μελέτη της κινητικής των πρωτεϊνών GFP-MCM2 και GFP-MCM4 κατά την επανείσοδο των κυττάρων στον κυτταρικό κύκλο από τη φάση G0 Δεδομένου ότι έχει δειχθεί βιβλιογραφικά πως η χρήση του φαρμάκου mimosine προκαλεί βλάβη στα κύτταρα (Mikhailov et al., 2000), και προκειμένου να εξακριβωθεί ότι η παρατηρούμενη μέγιστη πρόσδεση των πρωτεϊνών MCM στη χρωματίνη που παρατηρήθηκε σε κύτταρα που είναι συγχρονισμένα στο τέλος της φάσης G1 με το φάρμακο αυτό δεν οφείλεται σε πιθανή βλάβη του DNA, κρίθηκε απαραίτητη η εκ νέου διερεύνηση της κινητικής των πρωτεϊνών MCM στο τέλος της φάσης G1 με διαφορετικό τρόπο. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε η ιδιότητα των MCF7 κυττάρων να είναι θετικά για οιστρογονικούς υποδοχείς. Η χρήση του φαρμάκου ταμοξιφαίνη στα κύτταρα αυτά, το οποίο αποτελεί ανταγωνιστή των οιστρογόνων και προσδένεται στους οιστρογονικούς υποδοχείς, έχει ως αποτέλεσμα την έξοδο των κυττάρων από τον κυτταρικό κύκλο στη φάση G0. Αρχικά ελέγχθηκε η επιτυχία του συγχρονισμού και της εξόδου των MCF7 κυττάρων από τον κυτταρικό κύκλο με το φάρμακο ταμοξιφαίνη. Για το σκοπό αυτό, MCF7 κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία ταμοξιφαίνης για 48 ώρες, όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο «Μέθοδοι και Υλικά». Μετά το πέρας των 48 ωρών, απομακρύνθηκε το θρεπτικό μέσο με το φάρμακο και αντικαταστάθηκε με καινούριο, έτσι ώστε τα κύτταρα να μπορέσουν να επανεισέλθουν στον κυτταρικό κύκλο. Ακολούθησε λήψη δειγμάτων ανά 3 ώρες για συνολικά 24 ώρες. Ως μάρτυρας χρησιμοποιήθηκαν ασύγχρονα MCF7 κύτταρα, τα οποία καλλιεργούνταν απουσία ταμοξιφαίνης. Η επιτυχία του συγχρονισμού καθώς και η φάση στην οποία βρίσκονταν σε κάθε χρονικό σημείο τα κύτταρα μετά την απομάκρυνση της ταμοξιφαίνης, προσδιορίστηκαν με ανοσοφθορισμό και χρήση αντισωμάτων έναντι των πρωτεϊνών-δεικτών του κυτταρικού κύκλου Cdt1, Geminin και κυκλίνης Α. Παράλληλα, σε κάθε χρονικό σημείο και ακριβώς πριν τη μονιμοποίησή τους, τα κύτταρα επωάστηκαν για μισή ώρα παρουσία του αναλόγου θυμιδίνης BrdU (βρωμο-2- δέοξυουριδίνη), το οποίο ενσωματώνεται στο DNA κατά τη φάση S. Συνεπώς, η χρήση αντισώματος έναντι του BrdU επιτρέπει τον ακριβή προσδιορισμό του κυτταρικού πληθυσμού που διανύει τη φάση S τη δεδομένη στιγμή. Όπως φαίνεται στην εικόνα , αμέσως μετά την απομάκρυνση της ταμοξιφαίνης, τα κύτταρα στην πλειονότητά τους βρίσκονται εκτός κυτταρικού κύκλου, όπως καταδεικνύει η πτώση των επιπέδων έκφρασης των παραγόντων Cdt1, Geminin, κυκλίνης Α καθώς και η ενσωμάτωση του BrdU από μικρό αριθμό κυττάρων (~10%). Τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 παραμένουν χαμηλά για περίπου 9 ώρες μετά την απομάκρυνση της ταμοξιφαίνης, ενώ αρχίζουν σταδιακά να αυξάνονται από τις 9-12 ώρες και μετά, γεγονός που υποδεικνύει την είσοδο των κυττάρων σε ενεργό φάση G1. Όσον αφορά τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών Geminin και κυκλίνης A, αυτά αρχίζουν να αυξάνονται παράλληλα με την ενσωμάτωση BrdU, 21 ώρες μετά την αφαίρεση της ταμοξιφαίνης από τα κύτταρα, παρατήρηση που καταδεικνύει την είσοδο των κυττάρων στη φάση S (εικόνα )

140 4. Αποτελέσματα Εικόνα : Έξοδος MCF7 κυττάρων από τον κυτταρικό κύκλο με χρήση ταμοξιφαίνης και επανείσοδός τους μετά από απομάκρυνση του φαρμάκου. MCF7 κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία ταμοξιφαίνης για 48 ώρες. Στη συνέχεια απομακρύνθηκε το φάρμακο και στα κύτταρα προστέθηκε καινούριο θρεπτικό μέσο ώστε να επανεισέλθουν στον κυτταρικό κύκλο. Η επιτυχία της εξόδου καθώς και η πρόοδος των κυττάρων στον κυτταρικό κύκλο μετά την απομάκρυνση της ταμοξιφαίνης ελέγχθηκαν με λήψη δειγμάτων ανά συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα και εφαρμογή ανοσοφθορισμού με χρήση αντισωμάτων έναντι των πρωτεϊνών Cdt1, Geminin, κυκλίνης Α και BrdU. Με στόχο τη μελέτη της κινητικής των πρωτεϊνών MCM κατά τη φάση G1, MCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά την πρωτεΐνη GFP-MCM4 καλλιεργήθηκαν παρουσία ταμοξιφαίνης για 48 ώρες, όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο «Μέθοδοι και Υλικά». Στη συνέχεια απομακρύνθηκε το θρεπτικό μέσο με το φάρμακο και αντικαταστάθηκε με καινούριο θρεπτικό μέσο (απουσία ταμοξιφαίνης), έτσι ώστε τα κύτταρα να εισέλθουν στον κυτταρικό κύκλο. Ακολούθησε λήψη δειγμάτων ανά 6 ώρες για συνολικά 24 ώρες και ανάλυση της κινητικής της πρωτεΐνης GFP-MCM4 με FRAP. Όπως φαίνεται στην εικόνα , 6 ώρες μετά την απομάκρυνση της ταμοξιφαίνης, παρατηρείται μικρό δεσμευμένο κλάσμα μορίων της πρωτεΐνης GFP-MCM4 στη χρωματίνη (GFP- MCM4 Δεσμ.Κλ. = 0.07 ± 0.09). Η παρατήρηση αυτή είναι λογική καθώς στο συγκεκριμένο χρονικό σημείο τα κύτταρα δεν έχουν αρχίσει ακόμα να εκφράζουν τον παράγοντα Cdt1 (εικόνα ), ο οποίος είναι υπεύθυνος για την προσέλκυση των MCM πρωτεϊνών στη χρωματίνη. Στις 12 ώρες μετά την αφαίρεση της ταμοξιφαίνης, οπότε διαπιστώνεται έκφραση του παράγοντα Cdt1, παρατηρείται μεγαλύτερο κλάσμα δεσμευμένων μορίων της πρωτεΐνης GFP-MCM4 στη χρωματίνη (GFP-MCM4 Δεσμ.Κλ. = ± 0.17), το οποίο γίνεται μέγιστο 18 ώρες μετά την απομάκρυνση της ταμοξιφαίνης (GFP-MCM4 Δεσμ.Κλ. = 0.41 ± 0.19). Στο χρονικό αυτό σημείο τα κύτταρα εκφράζουν ακόμα την πρωτεΐνη Cdt1 αλλά δεν έχουν αρχίσει να εκφράζουν τις πρωτεΐνες Geminin και κυκλίνη Α (εικόνα ), γεγονός που υποδηλώνει ότι βρίσκονται ακόμα στη φάση G1. Στις 24 ώρες μετά την απελευθέρωση των κυττάρων σε θρεπτικό μέσο απουσία ταμοξιφαίνης, διαπιστώνεται

141 4. Αποτελέσματα μικρότερο δεσμευμένο κλάσμα της πρωτεΐνης GFP-MCM4 στη χρωματίνη (GFP- MCM4 Δεσμ.Κλ. = 0.22 ± 0.21), σε σύγκριση με τις 18 ώρες. Στο χρονικό αυτό σημείο παρατηρείται ελάττωση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 και αύξηση των αντίστοιχων επιπέδων των πρωτεϊνών Geminin, κυκλίνης Α καθώς και αυξημένη ενσωμάτωση BrdU (εικόνα ), γεγονός που υποδεικνύει ότι τα κύτταρα τη δεδομένη χρονική στιγμή διανύουν τη φάση S. Συνεπώς η ελαττωμένη πρόσδεση της πρωτεΐνης GFP-MCM4 στη χρωματίνη στο χρονικό σημείο αυτό συμφωνεί με την αποδέσμευση των μορίων της πρωτεΐνης GFP-MCM4 από τη χρωματίνη κατά τη φάση S. Εικόνα : Αύξηση της πρόσδεσης της πρωτεΐνης GFP-MCM4 στη χρωματίνη με την πρόοδο της φάσης G1 και αποδέσμευσή της στη φάση S. (Α) MCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά την πρωτεΐνη GFP-MCM4 καλλιεργήθηκαν παρουσία ταμοξιφαίνης για 48 ώρες και εξήλθαν από τον κυτταρικό κύκλο. Ακολούθησε απομάκρυνση του φαρμάκου και προσθήκη καινούριου θρεπτικού μέσου ώστε τα κύτταρα να επανεισέλθουν στον κυτταρικό κύκλο. Η κινητική της πρωτεΐνης GFP-MCM4 προσδιορίστηκε με πειράματα FRAP σε δείγματα κυττάρων που λαμβάνονταν ανά 6 ώρες μετά την επανείσοδο των κυττάρων στον κυτταρικό κύκλο. Η καμπύλη επαναφοράς του φθορισμού κάθε πειραματικής συνθήκης αναπαριστά το μέσο όρο των κανονικοποιημένων μέσων εντάσεων φθορισμού κυττάρων που αναλύθηκαν. (Β) Πίνακας στον οποίο απεικονίζεται ο χρόνος που απαιτείται για την επαναφορά του φθορισμού στο 50% της τελικής έντασης (t 1/2 ), το δεσμευμένο κλάσμα (Δεσμ. Κλ.) μορίων στη χρωματίνη και ο αριθμός (Ν) των κυττάρων που αναλύθηκαν με FRAP. Για να μελετηθεί καλύτερα η κινητική των πρωτεϊνών MCM κατά τη φάση G1 και για να διαπιστωθεί αν όντως η μέγιστη πρόσδεσή τους στη χρωματίνη παρατηρείται 18 ώρες μετά την επανείσοδο των κυττάρων στον κυτταρικό κύκλο από τη φάση G0, επαναλήφθηκε το πείραμα FRAP σε δείγματα κυττάρων που ελήφθησαν πιο συχνά κατά την διάρκεια της φάσης G1. Συγκεκριμένα MCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά την πρωτεΐνη GFP-MCM2 ή την πρωτεΐνη GFP-MCM4 καλλιεργήθηκαν παρουσία ταμοξιφαίνης για 48 ώρες. Στη συνέχεια απομακρύνθηκε το φάρμακο και προστέθηκε καινούριο θρεπτικό μέσο στα κύτταρα. Ακολούθησε λήψη δειγμάτων ανά 2 ώρες στο χρονικό διάστημα από 12 έως 22 ώρες μετά την απομάκρυνση της ταμοξιφαίνης και ανάλυση με FRAP. Παράλληλα, στα αντίστοιχα χρονικά σημεία πραγματοποιήθηκε

142 4. Αποτελέσματα μονιμοποίηση και ανάλυση με ανοσοφθορισμό κυτταρικών δειγμάτων για τον ακριβή προσδιορισμό της φάσης του κυτταρικού κύκλου στην οποία βρίσκονταν τα κύτταρα. Εικόνα : Οι πρωτεΐνες GFP-MCM2 και GFP-MCM4 προσδένονται σταδιακά στη χρωματίνη με την πρόοδο της φάσης G1, εμφανίζοντας μέγιστο βαθμό πρόσδεσης στο τέλος της G1, ενώ αποδεσμεύονται σταδιακά κατά την εξέλιξη της φάσης S. (Α,Γ) MCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά τις πρωτεΐνες GFP-MCM2 ή GFP-MCM4 εξήλθαν από τον κυτταρικό κύκλο ύστερα από καλλιέργειά τους παρουσία ταμοξιφαίνης για 48 ώρες. Η κινητική των πρωτεϊνών (Α) GFP-MCM2 και (Γ) GFP-MCM4 κατά την πρόοδο των κυττάρων από τη G1 στη φάση S προσδιορίστηκε με πειράματα FRAP. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε κυτταρικά δείγματα που λαμβάνονταν ανά 2 ώρες στο χρονικό διάστημα από 12 έως 22 ώρες μετά την αφαίρεση της ταμοξιφαίνης και την επανείσοδο των κυττάρων στον κυτταρικό κύκλο. Η καμπύλη επαναφοράς του φθορισμού κάθε πειραματικής συνθήκης αναπαριστά το μέσο όρο των κανονικοποιημένων μέσων εντάσεων φθορισμού κυττάρων που αναλύθηκαν. (Β, Δ) Πίνακες στους οποίους απεικονίζεται ο χρόνος που απαιτείται για την επαναφορά του φθορισμού στο 50% της τελικής έντασης (t 1/2 ), το δεσμευμένο κλάσμα μορίων (Δεσμ. Κλ.) στη χρωματίνη και ο αριθμός (Ν) των κυττάρων που αναλύθηκαν με FRAP. Όπως φαίνεται στην εικόνα , τόσο η πρωτεΐνη GFP-MCM2 όσο και η GFP- MCM4 παρουσιάζουν μικρό δεσμευμένο κλάσμα στη χρωματίνη 12 ώρες μετά την απομάκρυνση της ταμοξιφαίνης (GFP-MCM2 Δεσμ.Κλ. = 0.09 ± 0.14 και GFP-MCM4 Δεσμ.Κλ. = 0.16 ± 0.18), το οποίο αυξάνεται σταδιακά στις 14 και 16 ώρες μετά την αφαίρεση του φαρμάκου (στις 14 ώρες: GFP-MCM2 Δεσμ.Κλ. = 0.19 ± 0.21 και GFP-MCM4 Δεσμ.Κλ. = 0.28 ± 0.22, στις 16 ώρες: GFP-MCM2 Δεσμ.Κλ. = 0.24 ± 0.17 και GFP-MCM4 Δεσμ.Κλ. = 0.25 ±

143 4. Αποτελέσματα 0.16). Σε αυτό το χρονικό σημείο, παρατηρείται σταδιακή αύξηση στα επίπεδα έκφρασης του παράγοντα Cdt1 (εικόνα ), γεγονός που καταδεικνύει την πρόοδο των κυττάρων στη φάση G1. Στις 18 ώρες μετά την απελευθέρωση των κυττάρων σε θρεπτικό μέσο απουσία ταμοξιφαίνης διαπιστώνεται μέγιστος βαθμός πρόσδεσης των πρωτεϊνών GFP- MCM2 και GFP-MCM4 στη χρωματίνη (GFP-MCM2 Δεσμ.Κλ. = 0.29 ± 0.20 και GFP- MCM4 Δεσμ.Κλ. = 0.44 ± 0.20). Στο χρονικό αυτό σημείο παρατηρείται πτώση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 και μικρή αύξηση της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin (εικόνα ), παρατήρηση που υποδηλώνει ότι τα κύτταρα βρίσκονται στο τέλος της φάσης G1 και οδεύουν προς τη φάση S. Στις 20 και 22 ώρες μετά την αφαίρεση της ταμοξιφαίνης, οπότε τα κύτταρα διανύουν τη φάση S, διαπιστώνεται ελάττωση του δεσμευμένου κλάσματος των πρωτεϊνών GFP-MCM2 και GFP-MCM4 στη χρωματίνη (στις 20 ώρες: GFP-MCM2 Δεσμ.Κλ. = 0.27 ± 0.15 και GFP-MCM4 Δεσμ.Κλ. = 0.38 ± 0.19, στις 22 ώρες: GFP-MCM2 Δεσμ.Κλ. = 0.23 ± 0.18 και GFP-MCM4 Δεσμ.Κλ. = 0.19 ± 0.16). Εικόνα : Έξοδος MCF7 κυττάρων που εκφράζουν σταθερά την πρωτεΐνη GFP-MCM2 από τον κυτταρικό κύκλο με χρήση ταμοξιφαίνης και παρακολούθηση της προόδου τους από τη φάση G1 στη φάση S, μετά την απομάκρυνση του φαρμάκου και την επακόλουθη επανείσοδό τους στον κυτταρικό κύκλο. MCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά την πρωτεΐνη GFP-MCM2 καλλιεργήθηκαν παρουσία ταμοξιφαίνης για 48 ώρες. Στη συνέχεια αφαιρέθηκε το φάρμακο και στα κύτταρα προστέθηκε καινούριο θρεπτικό μέσο ώστε να επανεισέλθουν στον κυτταρικό κύκλο. Η πρόοδος των κυττάρων από τη φάση G1 στην S προσδιορίστηκε με ανοσοφθορισμό και με χρήση αντισωμάτων έναντι των πρωτεϊνών Cdt1, Geminin, κυκλίνης Α και BrdU, σε κυτταρικά δείγματα που λαμβάνονταν ανά 2 ώρες στο χρονικό διάστημα από 12 έως 22 ώρες μετά την επανείσοδο των κυττάρων στον κυτταρικό κύκλο. Συμπερασματικά, οι πρωτεΐνες GFP-MCM2 και GFP-MCM4 προσδένονται σταδιακά στη χρωματίνη κατά τη φάση G1, εμφανίζουν μέγιστο βαθμό πρόσδεσης στο τέλος της φάσης αυτής, ενώ αποδεσμεύονται σταδιακά από τη χρωματίνη καθώς εξελίσσεται η φάση S

144 4. Αποτελέσματα Σταδιακή πρόσδεση της ενδογενούς πρωτεΐνης MCM2 στη χρωματίνη με την πρόοδο της φάσης G1 Έχοντας επιβεβαιώσει τη σταδιακή πρόσδεση των πρωτεϊνών GFP-MCM2 και GFP-MCM4 στη χρωματίνη κατά τη διάρκεια της φάσης G1 και τη σταδιακή αποδέσμευσή τους από αυτή κατά τη φάση S, κρίθηκε ενδιαφέρουσα η διερεύνηση της αντίστοιχης συμπεριφοράς των ενδογενών μορίων. Για το σκοπό αυτό, MCF7 κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία ταμοξιφαίνης για 48 ώρες, με στόχο την έξοδό τους από τον ενεργό κυτταρικό κύκλο σε φάση G0. Μετά το πέρας των 48 ωρών, αφαιρέθηκε από τα κύτταρα το φάρμακο με αποτέλεσμα την επανείσοδό τους στον κυτταρικό κύκλο. Ακολούθησε λήψη κυτταρικών δειγμάτων ανά 6 ώρες για συνολικά 24 ώρες. Τα κύτταρα σε κάθε χρονικό σημείο μονιμοποιούνταν αφού πρώτα υποβάλλονταν σε διαδικασία προεκχύλισης, όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο «Μέθοδοι και Υλικά», κατά την οποία απομακρύνεται το διαλυτό κλάσμα των πρωτεϊνών του κυττάρου και επιτρέπεται ο εντοπισμός των πρωτεϊνών που είναι σταθερά δεσμευμένες στη χρωματίνη. Ο εντοπισμός της πρωτεΐνης MCM2 που ήταν δεσμευμένη στη χρωματίνη επετεύχθη με ανοσοφθορισμό και χρήση ειδικού αντισώματος. Ακολούθησε λήψη φωτογραφιών και ποσοτικοποίηση του ποσοστού των θετικών κυττάρων καθώς και της έντασης φθορισμού, με το πρόγραμμα Image J (βλ. κεφάλαιο «Μέθοδοι και Υλικά»). Όπως φαίνεται στην εικόνα , αμέσως μετά την απομάκρυνση της ταμοξιφαίνης (t=0h) διαπιστώνεται ότι τα περισσότερα κύτταρα είναι αρνητικά ενώ πολύ λίγα κύτταρα παρουσιάζουν ασθενή ένταση φθορισμού (~73% των κυττάρων παρουσιάζουν ένταση μικρότερη από 4000 αυθαίρετες μονάδες φθορισμού), γεγονός που υποδηλώνει ότι στο συγκεκριμένο χρονικό σημείο πολύ λίγα μόρια της ενδογενούς πρωτεΐνης MCM2 είναι δεσμευμένα στη χρωματίνη. Αντίστοιχη εικόνα παρατηρείται και στις 6 ώρες μετά την απομάκρυνση του φαρμάκου (~58% των κυττάρων παρουσιάζουν ένταση μικρότερη από 4000 αυθαίρετες μονάδες φθορισμού). Αντίθετα, διαπιστώνεται πιο έντονη χρώση της MCM2 πρωτεΐνης στα χρονικά σημεία των 12, 18 και 24 ωρών μετά την αφαίρεση της ταμοξιφαίνης. Συγκεκριμένα, στις 12 ώρες μετά την επανείσοδο των κυττάρων στον κυτταρικό κύκλο παρατηρείται αύξηση του ποσοστού των κυττάρων που παρουσιάζουν υψηλότερη ένταση φθορισμού (~55% των κυττάρων παρουσιάζουν ένταση μεγαλύτερη από 4000 αυθαίρετες μονάδες φθορισμού). Το ποσοστό των κυττάρων με υψηλή ένταση φθορισμού γίνεται μέγιστο στις 18 ώρες μετά την αφαίρεση της ταμοξιφαίνης (~68% των κυττάρων παρουσιάζουν ένταση μεγαλύτερη από 4000 αυθαίρετες μονάδες φθορισμού), οπότε τα κύτταρα βρίσκονται στο τέλος της φάσης G1, όπως προκύπτει από τον χαρακτηρισμό τους με ανοσοφθορισμό για πρωτεϊνικούς δείκτες των φάσεων του κυτταρικού κύκλου (εικόνα ). Επίσης, όπως απεικονίζεται στην εικόνα , στο χρονικό σημείο των 18 ωρών διαπιστώνεται η ύπαρξη κυττάρων με ακόμα πιο έντονη χρώση της MCM2 πρωτεΐνης (υψηλότερη ένταση από αυθαίρετες μονάδες φθορισμού) σε σύγκριση με προηγούμενα χρονικά σημεία, γεγονός που καταδεικνύει την πρόσδεση μεγαλύτερου ποσοστού μορίων της πρωτεΐνης MCM2 στη χρωματίνη τη δεδομένη χρονική στιγμή. Στις 24 ώρες μετά την απομάκρυνση της

145 4. Αποτελέσματα Εικόνα : Η ενδογενής πρωτεΐνη MCM2 προσδένεται σταδιακά στη χρωματίνη με την πρόοδο της φάσης G1. MCF7 κύτταρα εξήλθαν από τον κυτταρικό κύκλο ύστερα από καλλιέργειά τους παρουσία ταμοξιφαίνης. Στη συνέχεια το φάρμακο απομακρύνθηκε και στα κύτταρα προστέθηκε καινούριο θρεπτικό μέσο ώστε να επανεισέλθουν στον κυτταρικό κύκλο. Ακολούθησε λήψη κυτταρικών δειγμάτων ανά 6 ώρες μετά την αφαίρεση της ταμοξιφαίνης. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε διαδικασία προεκχύλισης και μονιμοποιήθηκαν. Ο εντοπισμός της

146 4. Αποτελέσματα ενδογενούς πρωτεΐνης MCM2 επετεύχθη με ανοσοφθορισμό χρησιμοποιώντας αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης MCM2 (χρώση του DNA με Hoechst). Η ποσοτικοποίηση της έντασης φθορισμού των κυττάρων πραγματοποιήθηκε με το πρόγραμμα Image J. Στα ιστογράμματα απεικονίζεται το ποσοστό των κυττάρων ανά εύρος έντασης φθορισμού. ταμοξιφαίνης, οπότε τα κύτταρα διανύουν τη φάση S, παρατηρείται μείωση του ποσοστού των κυττάρων με υψηλή ένταση φθορισμού (ελάττωση του ποσοστού των κυττάρων με υψηλότερη ένταση από αυθαίρετες μονάδες φθορισμού) και αύξηση του ποσοστού των κυττάρων με πιο ασθενείς εντάσεις φθορισμού (~38% των κυττάρων παρουσιάζουν ένταση μικρότερη από 4000 αυθαίρετες μονάδες φθορισμού) συγκριτικά με τις 18 ώρες. Η παρατήρηση αυτή υποδεικνύει την ελάττωση του ποσοστού των μορίων της πρωτεΐνης MCM2 που είναι σταθερά δεσμευμένα στη χρωματίνη, γεγονός που συμφωνεί με τη σταδιακή αποδέσμευση των πρωτεϊνών MCM από τη χρωματίνη με την εξέλιξη της φάσης S. Συμπερασματικά, η μελέτη της δέσμευσης της ενδογενούς πρωτεΐνης MCM2 στη χρωματίνη κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου υποδεικνύει την σταδιακή πρόσδεσή της κατά τη φάση G1, τη μέγιστη πρόσδεσή της στο τέλος της φάσης αυτής και τη σταδιακή αποδέσμευσή της με την πρόοδο της φάσης S, συμπεριφορά που συμφωνεί με την κινητική των εξωγενών MCM μορίων όπως είχε καταδείξει η ανάλυση FRAP Εντοπισμός των υποπυρηνικών περιοχών αλληλεπίδρασης της πρωτεΐνης GFP-MCM2 με τη χρωματίνη κατά τη φάση G1 Με στόχο τη μελέτη του υποκυτταρικού εντοπισμού των περιοχών αλληλεπίδρασης των πρωτεϊνών MCM με τη χρωματίνη καθώς και των πιθανών αλλαγών αυτού κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, εφαρμόστηκε η μέθοδος FLIP (Fluorescence Loss In Photobleaching). Συγκεκριμένα, MCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά την πρωτεΐνη GFP-MCM2 είτε συγχρονίστηκαν στη μίτωση με νοκοδαζόλιο και στη συνέχεια απελευθερώθηκαν να εισέλθουν στη φάση G1, είτε συγχρονίστηκαν στο τέλος της φάσης G1 με mimosine. Ακολούθως κύτταρα τα οποία βρίσκονταν στην αρχή (3h μετά την απομάκρυνση του νοκοδαζολίου), στο μέσο (7h μετά την απομάκρυνση του νοκοδαζολίου) ή στο τέλος της φάσης G1 (mimosine block) υποβλήθηκαν σε ανάλυση με FLIP. Κατά τη διαδικασία αυτή, μια υποπυρηνική κυκλική περιοχή ακτίνας 3 μm υπέστη παρατεταμένη ακτινοβόληση με δέσμη laser υψηλής έντασης με αποτέλεσμα την φωτολεύκανση όλων των μορίων της πρωτεΐνης GFP-MCM2 τα οποία κινούνταν ελεύθερα στον πυρήνα. Μετά την ολοκλήρωση των παλμών φωτολεύκανσης, ακολούθησε λήψη φωτογραφιών των κυττάρων και διερεύνηση πιθανών υποπυρηνικών περιοχών στις οποίες παρέμεναν προσδεδεμένα μόρια της πρωτεΐνης GFP-MCM2. Η παρατήρηση των κυττάρων μετά το FLIP, όπως φαίνεται στην εικόνα , καταδεικνύει την ύπαρξη συγκεκριμένων υποπυρηνικών περιοχών στις οποίες παραμένουν προσδεδεμένα μόρια της πρωτεΐνης GFP-MCM2. Συγκεκριμένα, στην αρχή της φάσης G1 παρατηρείται συσσώρευση των μορίων της πρωτεΐνης GFP-MCM2 κυρίως σε

147 4. Αποτελέσματα ετεροχρωματινικές περιοχές (γύρω από τους πυρηνίσκους και γύρω από τον πυρήνα), οι οποίες γίνονται πιο πολλές και πιο έντονες στο μέσο της φάσης αυτής. Στο τέλος της φάσης G1 διαπιστώνονται περισσότερες υποπυρηνικές περιοχές στις οποίες εντοπίζονται δεσμευμένα MCM μόρια, οι οποίες καλύπτουν όλο το πυρηνόπλασμα. Η παρατήρηση αυτή, δηλαδή η σταδιακή αύξηση της πρόσδεσης των MCM μορίων στη χρωματίνη με την πρόοδο της φάσης G1 καθώς και η μέγιστη πρόσδεσή τους στη χρωματίνη στο τέλος της φάσης αυτής, έρχεται σε συμφωνία με τα αποτελέσματα από τις αναλύσεις με FRAP. Εικόνα : Ενδοκυτταρικός εντοπισμός της δεσμευμένης πρωτεΐνης GFP-MCM2 στη χρωματίνη στη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου. MCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά την πρωτεΐνη GFP-MCM2 καλλιεργήθηκαν είτε παρουσία νοκοδαζολίου για να συγχρονιστούν στη μίτωση είτε παρουσία mimosine για να συγχρονιστούν στο τέλος της φάσης G1. Τα μιτωτικά κύτταρα ανασηκώθηκαν με μηχανική ανακίνηση των τρυβλίων και επιστρώθηκαν σε τρυβλία τύπου mattek παρουσία καινούριου θρεπτικού μέσου για να προχωρήσουν στη φάση G1. Ακολούθησε FLIP ανάλυση κυττάρων που βρίσκονταν στην αρχή της φάσης G1 (3 ώρες μετά την απομάκρυνση του νοκοδαζολίου), στο μέσο της φάσης G1 (7 ώρες μετά την απομάκρυνση του νοκοδαζολίου) ή στο τέλος της φάσης G1 (mimosine block). Αντιπροσωπευτικές εικόνες ελήφθησαν πριν και αμέσως μετά τη φωτολεύκανση. Συμπερασματικά, οι αλληλεπιδράσεις της πρωτεΐνης GFP-MCM2 με τη χρωματίνη δεν λαμβάνουν χώρα ομοιογενώς σε όλο τον πυρήνα, αλλά είναι εντοπισμένες σε συγκεκριμένες υποπυρηνικές περιοχές, οι οποίες διαφοροποιούνται και πληθαίνουν συνεχώς καθώς εξελίσσεται η φάση G

148 4. Αποτελέσματα Οι περιοχές αλληλεπίδρασης της πρωτεΐνης GFP-MCM2 με τη χρωματίνη δεν συμπίπτουν με τις περιοχές σύνθεσης του DNA Στη συνέχεια διερευνήθηκαν οι πιθανές αλλαγές σε υποπυρηνικό επίπεδο των αλληλεπιδράσεων της πρωτεΐνης GFP-MCM2 με τη χρωματίνη κατά τη φάση S. Για το σκοπό αυτό MCF7 κύτταρα σταθερά διαμολυσμένα με το υβριδικό μόριο GFP-MCM2 διαμολύνθηκαν παροδικά με το μόριο PCNA-RFP, το οποίο επισημαίνει τις περιοχές σύνθεσης του DNA και επιτρέπει τον εντοπισμό των κυττάρων που βρίσκονται σε διαφορετικά στάδια της φάσης S. Χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο διάκρισης, μετά το πέρας 24 ωρών από τη διαμόλυνση, προσδιορίστηκαν κύτταρα τα οποία βρίσκονταν είτε εκτός φάσης S είτε στην αρχή, στο μέσο ή στο τέλος της φάσης S και υποβλήθηκαν σε ανάλυση με FLIP, όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο «Μέθοδοι και Υλικά». Μετά την ολοκλήρωση της φωτολεύκανσης, επετεύχθη η αναστολή του φθορισμού του κινητού κλάσματος μορίων της πρωτεΐνης GFP-MCM2, ενώ παρέμεινε ανιχνεύσιμος ο φθορισμός των μορίων της πρωτεΐνης που ήταν σταθερά δεσμευμένα στις υπόλοιπες περιοχές του πυρήνα. Ακολούθησε λήψη και παρατήρηση εικόνων των κυττάρων μετά το FLIP (εικόνα ). Η ανάλυση αποκάλυψε την ύπαρξη υποπυρηνικών υποδομών της πρωτεΐνης GFP- MCM2 κυρίως σε κύτταρα που βρίσκονται στην αρχή της φάσης S και σε πολύ μικρότερο βαθμό σε κύτταρα που βρίσκονται στο μέσο της φάσης αυτής. Στην αρχή της φάσης S, οι υποδομές της πρωτεΐνης GFP-MCM2 είναι έντονες και εντοπίζονται σε ετεροχρωματινικές περιοχές του κυττάρου, κυρίως γύρω από τους πυρηνίσκους και στην περιφέρεια του πυρήνα. Στο μέσο της φάσης S, παρ όλο που οι σχηματισμοί της πρωτεΐνης GFP-MCM2 διατηρούν την ίδια υποπυρηνική εντόπιση, είναι σαφώς λιγότεροι και μικρότεροι σε μέγεθος. Αντίθετα δεν ανιχνεύονται υποδομές δεσμευμένων μορίων της πρωτεΐνης GFP- MCM2 στη χρωματίνη, σε κύτταρα που βρίσκονται στο τέλος της φάσης S. Οι παρατηρήσεις αυτές είναι σε συμφωνία με τα αποτελέσματα των πειραμάτων FRAP που υποστήριζαν τη σταδιακή απώλεια του δεσμευμένου κλάσματος των MCM μορίων στη χρωματίνη με την πρόοδο της φάσης S. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι οι πρωτεΐνες MCM δεν συνεντοπίζονται ενδοκυτταρικά με τις αντιγραφικές μηχανές του DNA (Dimitrova et al., 1999; Krude et al., 1996; Romanowski et al., 1996). Καθώς οι εργασίες αυτές βασίζονται σε in vitro συστήματα μελέτης και κάνουν χρήση μονιμοποιημένων κυττάρων, κρίθηκε σκόπιμη η διερεύνηση της ισχύος της παρατήρησης αυτής σε ζωντανά κύτταρα. Ο έλεγχος αυτός κατέστη δυνατός μέσω της άμεσης σύγκρισης του εντοπισμού των υποδομών της πρωτεΐνης GFP-MCM2 με τις αντίστοιχες του PCNA-RFP, μετά την ολοκλήρωση του πειράματος FLIP. Όπως φαίνεται στην εικόνα , δεν διαπιστώθηκε συνεντοπισμός των δεσμευμένων μορίων της πρωτεΐνης GFP-MCM2 με το PCNA-RFP, το οποίο εντοπίζεται στις περιοχές σύνθεσης του DNA. Επιπλέον, τόσο στην αρχή όσο και στο μέσο της φάσης S, οι υποδομές του PCNA-RFP βρίσκονται εξωτερικά και περιβάλλουν τις αντίστοιχες δομές της πρωτεΐνης GFP-MCM2. Συνεπώς, η ανάλυση FLIP που διεξήχθη σε κύτταρα που βρίσκονταν στη φάση S συμφωνεί με τις αναλύσεις FRAP και επιβεβαιώνει περαιτέρω τη σταδιακή αποδέσμευση των πρωτεϊνών MCM από τη χρωματίνη με την πρόοδο της φάσης S. Επιπλέον,

149 4. Αποτελέσματα διαπιστώθηκε ότι οι υποπυρηνικές υποδομές των δεσμευμένων πρωτεϊνών MCM στη χρωματίνη δεν συνεντοπίζονται με τις αντιγραφικές μηχανές του DNA, κατά τη φάση S. Εικόνα : Η πρωτεΐνη GFP-MCM2 δεν συνεντοπίζεται με τις υποδομές της πρωτεΐνης PCNA κατά τη διάρκεια της φάσης S. ΜCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά την πρωτεΐνη GFP-MCM2 διαμολύνθηκαν παροδικά με πλασμίδιο που εκφράζει την υβριδική πρωτεΐνη PCNA- RFP. Ο προσδιορισμός της φάσης του κυτταρικού κύκλου στην οποία βρισκόταν κάθε κύτταρο (μη S, αρχή S, μέσο S ή τέλος φάσης S) πραγματοποιήθηκε βάσει του προτύπου κατανομής της πρωτεΐνης PCNA-RFP. Ακολούθησε FLIP ανάλυση των κυττάρων και λήψη αντιπροσωπευτικών εικόνων πριν και αμέσως μετά τη φωτολεύκανση Εκτίμηση του χρονικού διαστήματος για το οποίο η πρωτεΐνη GFP-MCM2 παραμένει προσδεδεμένη στη χρωματίνη Με στόχο τον προσδιορισμό του σχετικού χρονικού διαστήματος για το οποίο οι πρωτεΐνες MCM παραμένουν σταθερά προσδεδεμένες στη χρωματίνη, MCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά την πρωτεΐνη GFP-MCM2 διαμολύνθηκαν παροδικά με πλασμίδιο έκφρασης του υβριδικού μορίου PCNA-RFP. Ακολούθως, κύτταρα που βρίσκονταν στην αρχή ή στο μέσο της φάσης S ή εκτός φάσης S επιλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση με FLIP. Σημειώνεται ότι τα κύτταρα που είναι εκτός φάσης S, αναμένεται να βρίσκονται κυρίως στη φάση G1, καθώς η φάση αυτή κατέχει πολύ μεγαλύτερη διάρκεια (40-50% της διάρκειας του κυτταρικού κύκλου) σε σύγκριση με τη φάση G2 (5% της διάρκειας του κυτταρικού κύκλου). Η ανάλυση FLIP που πραγματοποιήθηκε απεικονίζεται στην εικόνα Συνοπτικά, εφαρμόστηκαν 50 παλμοί laser υψηλής έντασης σε συγκεκριμένου

150 4. Αποτελέσματα μεγέθους (ακτίνας 3 μm) υποπυρηνική περιοχή κάθε κυττάρου, με αποτέλεσμα την φωτολεύκανση όλων των μορίων του κινητού κλάσματος μορίων της πρωτεΐνης GFP- MCM2. Μετά την ολοκλήρωση της φωτολεύκανσης πραγματοποιήθηκε λήψη 10 φωτογραφιών κατά μήκος του z-άξονα, σε διαφορετικό εστιακό σημείο η καθεμία, έτσι ώστε να καλύπτεται ολόκληρο το κύτταρο. Η διαδικασία λήψης φωτογραφιών επαναλαμβανόταν κάθε 5 λεπτά και διήρκεσε συνολικά 2 ώρες. Στη συνέχεια, εξήχθη η μέγιστη δυνατή προβολή των 10 φωτογραφιών κάθε χρονικού σημείου (εικόνα ). Εικόνα : Απεικόνιση της πειραματικής πορείας που ακολουθήθηκε για τον προσδιορισμό του χρονικού διαστήματος για το οποίο η πρωτεΐνη GFP-MCM2 παραμένει προσδεδεμένη στη χρωματίνη. MCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά την πρωτεΐνη GFP- MCM2 διαμολύνθηκαν παροδικά με πλασμίδιο έκφρασης του μορίου PCNA-RFP. Κύτταρα που βρίσκονταν στην αρχή της φάσης S, στο μέσο της φάσης S ή στη φάση G1 επιλέχθηκαν βάσει του προτύπου κατανομής της πρωτεΐνης PCNA-RFP και υποβλήθηκαν σε ανάλυση με FLIP. Αρχικά ελήφθησαν 5 εικόνες και στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε η φωτολεύκανση. Μετά την ολοκλήρωση της φωτολεύκανσης λαμβάνονταν 10 εικόνες κατά μήκος του z άξονα (z-stacks) έτσι ώστε να καλύπτεται όλο το κύτταρο, κάθε 5 λεπτά για 2 ώρες. Η μέγιστη δυνατή προβολή των 10 εικόνων κατά μήκος του z άξονα κάθε χρονικού σημείου χρησιμοποιήθηκε για την παρακολούθηση και ποσοτικοποίηση της μεταβολής της έντασης φθορισμού κατά τη διάρκεια του πειράματος

151 4. Αποτελέσματα Οι μέγιστες δυνατές προβολές των φωτογραφιών χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτική αξιολόγηση της αλλαγής των υποδομών της πρωτεΐνης GFP-MCM2 συν τω χρόνω. Αυτό πραγματοποιήθηκε μέσω ποσοτικοποίησης της μεταβολής της έντασης φθορισμού κατά τη διάρκεια του πειράματος. Συγκεκριμένα, αρχικά χρησιμοποιώντας τις δισδιάστατες εικόνες των μέγιστων δυνατών προβολών των κυττάρων ποσοτικοποιήθηκε η ένταση φθορισμού των διαφορετικών ενδοκυτταρικών περιοχών, η οποία απεικονίστηκε σε τρισδιάστατα γραφήματα (mesh plots) (εικόνα Α). Ακολούθως επιλέχθηκε μια συγκεκριμένη υποπυρηνική περιοχή (κόκκινο κουτί, εικόνα Α) σε κάθε κύτταρο, η οποία περιέβαλλε υποδομές της πρωτεΐνης GFP-MCM2. Η τυπική απόκλιση της έντασης φθορισμού ανά pixel εκτιμήθηκε και χρησιμοποιήθηκε ως μέτρο πρόσδεσης της πρωτεΐνης GFP-MCM2 στη χρωματίνη. Επιπλέον προσδιορίστηκε η μέση ένταση φθορισμού κάθε επιλεγμένης υποπυρηνικής περιοχής καθ όλη τη διάρκεια του πειράματος, για να εξακριβωθεί ότι η συνολική ένταση φθορισμού της περιοχής παραμένει σχετικά σταθερή και ότι δεν παρατηρείται σημαντική φωτολεύκανση των μορίων της πρωτεΐνης GFP- MCM2 λόγω της πειραματικής διαδικασίας (recording bleaching) (εικόνα Β). Για να προσδιοριστεί ο χρόνος για τον οποίο τα μόρια της πρωτεΐνης GFP-MCM2 παραμένουν δεσμευμένα στη χρωματίνη, κατασκευάστηκε γράφημα που αποτυπώνει την τυπική απόκλιση της έντασης φθορισμού της υποπυρηνικής περιοχής ενδιαφέροντος ως προς το χρόνο του πειράματος (εικόνα Γ). Όπως φαίνεται στην εικόνα Γ, αμέσως μετά τη φωτολεύκανση παρατηρείται έντονη τυπική απόκλιση της έντασης φθορισμού των GFP μορίων, η οποία προκύπτει από την ύπαρξη σταθερά δεσμευμένου κλάσματος μορίων της πρωτεΐνης GFP-MCM2 σε συγκεκριμένες υποπυρηνικές περιοχές. Η τυπική απόκλιση ελαττώνεται με την πάροδο του χρόνου, γεγονός που καταδεικνύει τη σταδιακή αποδέσμευση των μορίων της πρωτεΐνης GFP-MCM2 από τη χρωματίνη, τα οποία κινούνται και διαχέονται στον πυρήνα. Η τυπική απόκλιση της έντασης φθορισμού προσεγγίζει την κατώτερη τιμή της περίπου 60 λεπτά μετά το FLIP (εικόνα Γ). Η παρατήρηση αυτή υποδηλώνει ότι ο χρόνος για τον οποίο οι πρωτεΐνες MCM παραμένουν προσδεδεμένες στη χρωματίνη είναι περίπου λεπτά. Επιπλέον αξίζει να σημειωθεί ότι δεν διαπιστώθηκε διαφορά όσον αφορά το χρόνο παραμονής των μορίων της πρωτεΐνης GFP-MCM2 στη χρωματίνη, μεταξύ των κυττάρων που βρίσκονταν στη φάση G1, στην αρχή ή στο τέλος της φάσης S (εικόνα Γ)

152 4. Αποτελέσματα Εικόνα : Η πρωτεΐνη GFP-MCM2 παραμένει προσδεδεμένη στη χρωματίνη για περίπου 60 λεπτά. (A) MCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά την πρωτεΐνη GFP-MCM2 διαμολύνθηκαν παροδικά με το μόριο PCNA-RFP. Κύτταρα στην αρχή ή στο μέσο της φάσης S, ή στη φάση G1 επιλέχθηκαν βάσει του φαινοτύπου του PCNA-RFP και υποβλήθηκαν σε ανάλυση με FLIP, όπως περιγράφεται στην εικόνα Για την παρατήρηση και ποσοτικοποίηση των υποδομών της πρωτεΐνης GFP-MCM2 χρησιμοποιήθηκαν οι μέγιστες δυνατές προβολές των εικόνων που ελήφθησαν μετά το FLIP. Η ένταση φθορισμού στις διαφορετικές ενδοκυτταρικές περιοχές απεικονίστηκε σε τρισδιάστατα γραφήματα (mesh plots) (βλ. «Μέθοδοι και Υλικά»). Για κάθε κύτταρο που αναλύθηκε, επιλέχθηκε μια υποπυρηνική περιοχή (κόκκινο κουτί), στην οποία παρατηρούνταν υποδομές της πρωτεΐνης GFP-MCM2 και υπολογίστηκαν (Β) η ένταση φθορισμού και (Γ) η αντίστοιχη τυπική απόκλιση καθ όλη τη διάρκεια του πειράματος

153 4. Αποτελέσματα Διερεύνηση της επίδρασης της πρωτεΐνης Geminin στην κινητική των πρωτεϊνών GFP-MCM2 και GFP-MCM4 Στα μετάζωα η πρωτεΐνη Geminin αναστέλλει τη δράση του παράγοντα στρατολόγησης των πρωτεϊνών MCM στη χρωματίνη, Cdt1 (Tada et al., 2001; Wohlschlegel et al., 2000). Στα κύτταρα των θηλαστικών η πρωτεΐνη Geminin συσσωρεύεται κατά τη φάση S και πρωτεολύεται κατά τη μίτωση με αποτέλεσμα την απουσία της κατά τη φάση G1 και την δυνατότητα αδειοδότησης των αφετηριών της αντιγραφής του DNA από τον παράγοντα Cdt1 (McGarry and Kirschner, 1998). Παρ όλα αυτά στα πρώιμα εμβρυονικά κύτταρα τα επίπεδα της πρωτεΐνης Geminin παραμένουν σταθερά καθ όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου χωρίς να παρεμποδίζουν την αδειοδότηση της αντιγραφής κατά τη φάση G1 (Yang et al., 2011). Επιπλέον μελέτη στο Xenopus laevis έχει προτείνει ότι ήδη από τη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου ο παράγοντας Cdt1 βρίσκεται σε σύμπλοκο με την πρωτεΐνη Geminin χωρίς να παρεμποδίζεται η ενεργότητά του (Lutzmann et al., 2006). Επίσης κρυσταλλογραφικές μελέτες έχουν προτείνει την ύπαρξη δυο διαφορετικών συμπλόκων Cdt1:Geminin με διαφορετική στοιχειομετρία των μορίων, εκ των οποίων το ένα αναστέλλει ενώ το άλλο επιτρέπει την αδειοδότηση των αφετηριών της αντιγραφής του DNA (De Marco et al., 2009). Στόχος του παρόντος κεφαλαίου ήταν η διαλεύκανση της επίδρασης της πρωτεΐνης Geminin στην αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών MCM με τη χρωματίνη και κατ επέκταση στην αδειοδότηση της αντιγραφής του DNA σε ζωντανά ανθρώπινα κύτταρα. Αρχικά διερευνήθηκε αν και πώς η αποσιώπηση της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin σε ασύγχρονα κύτταρα επηρεάζει την κινητική των πρωτεϊνών MCM. Επιπλέον μελετήθηκε πώς η αποσιώπηση της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin επιδρά στην αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών MCM με τη χρωματίνη κατά τη φάση G1 καθώς και στη διατήρηση του μέγιστου δεσμευμένου κλάσματος των πρωτεϊνών MCM, που παρατηρείται στο τέλος της φάσης αυτής. Τέλος ελέγχθηκε αν η αναστολή της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin κατά τη φάση G1 επηρεάζει την είσοδο και την πρόοδο των κυττάρων στη φάση S του κυτταρικού κύκλου Η απουσία της πρωτεΐνης Geminin περιορίζει την πρόσδεση των πρωτεϊνών GFP-MCM2 και GFP-MCM4 στη χρωματίνη Με στόχο τη διερεύνηση της πιθανής επίδρασης της πρωτεΐνης Geminin στην κινητική των πρωτεϊνών MCM, πραγματοποιήθηκε αποσιώπηση της έκφρασης της πρωτεΐνης με χρήση της τεχνολογίας sirna και μελέτη της κινητικής των πρωτεϊνών GFP-MCM2 και GFP-MCM4. Συγκεκριμένα, ασύγχρονα MCF7 κύτταρα που είναι σταθερά διαμολυσμένα με τα μόρια GFP-MCM2 ή GFP-MCM4 διαμολύνθηκαν είτε με sirna ειδικό έναντι του mrna της πρωτεΐνης Geminin είτε με μη στοχευμένο sirna έναντι του mrna της λουσιφεράσης (αρνητικός μάρτυρας), για 72 ώρες. Η επιτυχία της αποσιώπησης της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin επιβεβαιώθηκε με ανοσοαποτύπωμα western και χρήση ειδικού αντισώματος έναντι της πρωτεΐνης Geminin σε πρωτεϊνικά

154 4. Αποτελέσματα εκχυλίσματα από MCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά την πρωτεΐνη GFP-MCM2. Όπως φαίνεται στην εικόνα Β, η διαμόλυνση των κυττάρων με το sirna που είναι ειδικό έναντι του mrna της πρωτεΐνης Geminin, επέφερε σημαντική μείωση στην έκφραση της πρωτεΐνης, καθώς στα πρωτεϊνικά εκχυλίσματα των κυττάρων αυτών διαπιστώνεται μια πολύ πιο ασθενής ζώνη που αντιστοιχεί στην πρωτεΐνη Geminin σε σύγκριση με την αντίστοιχη ζώνη των κυττάρων που είχαν διαμολυνθεί με μη στοχευμένο sirna. Ως μάρτυρας ισοφόρτωσης των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε η έκφραση της πρωτεΐνης τουμπουλίνης. Ακολούθως ελέγχθηκε η επίδραση της αποσιώπησης της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin στην κινητική των πρωτεϊνών GFP-MCM2 και GFP-MCM4. Για το σκοπό αυτό, Εικόνα : Η απουσία της πρωτεΐνης Geminin περιορίζει την πρόσδεση των GFP-MCM2 και GFP-MCM4 πρωτεϊνών στη χρωματίνη. (Α, Δ) Ασύγχρονα MCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά τις πρωτεΐνες GFP-MCM2 και GFP-MCM4 διαμολύνθηκαν είτε με μη στοχευμένο sirna έναντι του mrna της λουσιφεράσης είτε με sirna έναντι του mrna της πρωτεΐνης Geminin. Μετά το πέρας 72 ωρών από την διαμόλυνση τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε ανάλυση με FRAP. Η καμπύλη επαναφοράς του φθορισμού κάθε πειραματικής συνθήκης αναπαριστά το μέσο όρο των κανονικοποιημένων μέσων εντάσεων φθορισμού κυττάρων που αναλύθηκαν. (Β) Για την επιβεβαίωση της αποσιώπησης της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin, συλλέχθηκαν πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από GFP-MCM2 σταθερά διαμολυσμένα κύτταρα που είχαν υποστεί διαμόλυνση είτε με sirna έναντι του mrna της Geminin είτε με μη στοχευμένο sirna έναντι του mrna της λουσιφεράσης. Τα δείγματα αναλύθηκαν με western και χρήση ειδικού αντισώματος έναντι της πρωτεΐνης Geminin. Ως μάρτυρας ισοφόρτωσης χρησιμοποιήθηκε η έκφραση της τουμπουλίνης. (Γ, Ε) Πίνακες στους οποίους απεικονίζεται ο χρόνος που απαιτείται για την επαναφορά του φθορισμού στο 50% της τελικής έντασης (t 1/2 ), το δεσμευμένο κλάσμα μορίων (Δεσμ. Κλ.) στη χρωματίνη και ο αριθμός (Ν) των κυττάρων που αναλύθηκαν με FRAP

155 4. Αποτελέσματα ασύγχρονα MCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά την πρωτεΐνη GFP-MCM2 ή GFP- MCM4 διαμολύνθηκαν είτε με sirna ειδικό έναντι του mrna της πρωτεΐνης Geminin είτε με μη στοχευμένο sirna έναντι του mrna της λουσιφεράσης (αρνητικός μάρτυρας), για 72 ώρες. Ακολούθησε ανάλυση των κυττάρων με FRAP (εικόνα ). Όπως φαίνεται στην εικόνα , οι πρωτεΐνες GFP-MCM2 και GFP-MCM4 παρουσίαζαν παρόμοιο χρόνο t 1/2 τόσο στα κύτταρα που είχαν διαμολυνθεί με sirna έναντι του mrna της Geminin όσο και σε αυτά που είχαν διαμολυνθεί με sirna έναντι της λουσιφεράσης. Η παρατήρηση αυτή υποδηλώνει ότι η αποσιώπηση της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin δεν επηρεάζει την ταχύτητα επαναφοράς του ελεύθερα κινούμενου κλάσματος μορίων των πρωτεϊνών GFP-MCM2 και GFP-MCM4. Παρ όλα αυτά, η απουσία της πρωτεΐνης Geminin είχε ως αποτέλεσμα τη μείωση του σταθερά δεσμευμένου κλάσματος στη χρωματίνη των GFP-MCM4 μορίων (GFP-MCM4 Δεσμ.Κλ. = 0.13 ± 0.13) σε σύγκριση με τα κύτταρα που είχαν διαμολυνθεί με μη στοχευμένο sirna (GFP- MCM4 Δεσμ.Κλ. = 0.23 ± 0.21). Αναφορικά με την πρωτεΐνη GFP-MCM2, η διαφορά του δεσμευμένου κλάσματος στη χρωματίνη μεταξύ των κυττάρων που είχαν διαμολυνθεί με sirna έναντι του mrna της Geminin (GFP-MCM2 Δεσμ.Κλ. = 0.11 ± 0.08) και των κυττάρων που είχαν διαμολυνθεί με sirna έναντι της λουσιφεράσης (GFP-MCM2 Δεσμ.Κλ. = 0.14 ± 0.14) ήταν μικρότερη (εικόνα ). Αυτό πιθανώς οφείλεται στο γενικά μικρότερο κλάσμα δεσμευμένων μορίων στη χρωματίνη που εμφανίζει η πρωτεΐνη GFP- MCM2 σε σύγκριση με την πρωτεΐνη GFP-MCM4. Παρ όλ αυτά η μικρή διαφοροποίηση στο κλάσμα δεσμευμένων μορίων της πρωτεΐνης GFP-MCM2 στη χρωματίνη διαπιστώθηκε σε τρία ανεξάρτητα πειράματα, γεγονός που επιβεβαιώνει το αποτέλεσμα. Συνεπώς, η απουσία της πρωτεΐνης Geminin περιορίζει τη δέσμευση των πρωτεϊνών MCM στη χρωματίνη Η πρωτεΐνη Geminin συμβάλλει στην σταθεροποίηση της πρωτεΐνης GFP- MCM4 στη χρωματίνη κατά τη φάση G1 Λαμβάνοντας υπ όψιν ότι η αδειοδότηση των αφετηριών της αντιγραφής του DNA και η πρόσδεση των πρωτεϊνών MCM στη χρωματίνη λαμβάνουν χώρα κατά τη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου, θεωρήθηκε ενδιαφέρουσα η μελέτη της πιθανής επίδρασης της πρωτεΐνης Geminin στην κινητική των πρωτεϊνών MCM κατά τη φάση αυτή. Για το σκοπό αυτό αρχικά πραγματοποιήθηκε αποσιώπηση της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin σε κύτταρα τα οποία εκφράζουν σταθερά την πρωτεΐνη GFP-MCM4 και βρίσκονται εκτός κυτταρικού κύκλου σε φάση G0 και ακολούθησε μελέτη της κινητικής της πρωτεΐνης GFP-MCM4 κατά την πρόοδο των κυττάρων στη φάση G1 μετά την επανείσοδό τους στον κυτταρικό κύκλο. Η πειραματική διαδικασία που ακολουθήθηκε περιγράφεται στην εικόνα Συγκεκριμένα τα κύτταρα αρχικά επιστρώθηκαν και καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό μέσο χαμηλής περιεκτικότητας σε ορό (1% FBS) για 24 ώρες, με στόχο την αναστολή της προόδου του κυτταρικού κύκλου και τη συγκέντρωσή τους στη φάση G1-G0. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε διαμόλυνση των κυττάρων με

156 4. Αποτελέσματα sirna έναντι του mrna της πρωτεΐνης Geminin και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό μέσο παρουσία ταμοξιφαίνης για 48 ώρες, με στόχο την έξοδό τους από τον ενεργό κυτταρικό κύκλο σε φάση G0. Μετά το πέρας 48 ωρών πραγματοποιήθηκε δεύτερη διαμόλυνση των κυττάρων με sirna έναντι του mrna της Geminin, απομάκρυνση της ταμοξιφαίνης και απελευθέρωση των κυττάρων σε καινούριο θρεπτικό μέσο, έτσι ώστε να μπορέσουν να επανεισέλθουν στη φάση G1. Ακολούθησε μελέτη της κινητικής της πρωτεΐνης GFP-MCM4 με FRAP σε δείγματα κυττάρων που ελήφθησαν 12 και 18 ώρες μετά την αφαίρεση της ταμοξιφαίνης. Εικόνα : Περιγραφή της πειραματικής διαδικασίας που ακολουθήθηκε για τα πειράματα αποσιώπησης της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin κατά την έξοδο και επανείσοδο MCF7 κυττάρων από τον κυτταρικό κύκλο. MCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά την πρωτεΐνη GFP-MCM4 καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό μέσο χαμηλής περιεκτικότητας (1%) FBS, για 24 ώρες. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε διαμόλυνση των κυττάρων με sirna ειδικό έναντι του mrna της πρωτεΐνης Geminin και 5 ώρες αργότερα ακολούθησε προσθήκη ταμοξιφαίνης. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία του φαρμάκου για 48 ώρες με στόχο να εξέλθουν από τον κυτταρικό κύκλο. Ακολούθησε αφαίρεση του φαρμάκου, δεύτερη διαμόλυνση των κυττάρων με sirna έναντι του mrna της Geminin και προσθήκη καινούριου θρεπτικού μέσου ώστε τα κύτταρα να επανεισέλθουν στον κυτταρικό κύκλο. Δείγματα κυττάρων ελήφθησαν 12 και 18 ώρες μετά την αφαίρεση της ταμοξιφαίνης και υποβλήθηκαν σε ανάλυση με FRAP. Όπως φαίνεται στην εικόνα , η απουσία της πρωτεΐνης Geminin έχει ως αποτέλεσμα την ελάττωση του δεσμευμένου κλάσματος των μορίων της GFP-MCM4 πρωτεΐνης στη χρωματίνη. Συγκεκριμένα, 12 ώρες μετά την απομάκρυνση της ταμοξιφαίνης, οπότε τα κύτταρα βρίσκονται στο μέσο της φάσης G1, παρατηρείται μειωμένο δεσμευμένο κλάσμα της πρωτεΐνης GFP-MCM4 στα κύτταρα που έχουν διαμολυνθεί με sirna έναντι του mrna της Geminin (GFP-MCM4 Δεσμ.Κλ. = 0.09 ± 0.10) σε σύγκριση με τα κύτταρα που έχουν διαμολυνθεί με μη στοχευμένο sirna έναντι του mrna της λουσιφεράσης (GFP-MCM4 Δεσμ.Κλ. = 0.21 ± 0.22). Παρόμοια τάση ελάττωσης του δεσμευμένου κλάσματος μορίων της πρωτεΐνης GFP-MCM4 απουσία της πρωτεΐνης Geminin, αν και σε μικρότερο βαθμό, διαπιστώνεται και στο τέλος της G1 φάσης (18 ώρες μετά την απομάκρυνση της ταμοξιφαίνης), οπότε φυσιολογικά οι πρωτεΐνες MCM εμφανίζουν μέγιστο βαθμό πρόσδεσης στη χρωματίνη. Και σε αυτή την περίπτωση η πρωτεΐνη GFP-MCM4 παρουσιάζει μικρότερο δεσμευμένο κλάσμα στη χρωματίνη στα κύτταρα στα οποία έχει πραγματοποιηθεί η αποσιώπηση της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin (GFP-MCM4 Δεσμ.Κλ. = 0.21 ± 0.19) σε σύγκριση με τα κύτταρα που έχουν

157 4. Αποτελέσματα διαμολυνθεί με sirna έναντι του mrna της λουσιφεράσης (GFP-MCM4 Δεσμ.Κλ. = 0.28 ± 0.24). Αν και η διαφορά στην κινητική της πρωτεΐνης GFP-MCM4 στο τέλος της φάσης G1 παρουσία και απουσία της πρωτεΐνης Geminin είναι μικρή, διαπιστώθηκε σε τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα, γεγονός που την καθιστά αξιόπιστη. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα από τις αναλύσεις της κινητικής της πρωτεΐνης GFP-MCM4 με FRAP προτείνουν ότι η πρωτεΐνη Geminin συμβάλλει στην σταθεροποίηση των πρωτεϊνών MCM στη χρωματίνη κατά τη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου. Επιπλέον διαπιστώνεται ότι η επίδραση της πρωτεΐνης Geminin στη σταθεροποίηση των πρωτεϊνών MCM εμφανίζεται πιο έντονη στην αρχή μέσο της φάσης G1 σε σύγκριση με το τέλος της φάσης αυτής. Η παρατήρηση αυτή πιθανώς καταδεικνύει το σημαντικό ρόλο της πρωτεΐνης Geminin ως προς την πρόσδεση των πρωτεϊνών MCM στη χρωματίνη στην αρχή και στο μέσο της φάση G1, παρά το γεγονός ότι τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης δεν είναι ανιχνεύσιμα στη φάση αυτή. Εικόνα : Η πρωτεΐνη Geminin συμβάλλει στην σταθεροποίηση της πρωτεΐνης GFP- MCM4 στη χρωματίνη κατά την G1 φάση του κυτταρικού κύκλου. (Α, Γ) MCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά την πρωτεΐνη GFP-MCM4 εξήλθαν από τον κυτταρικό κύκλο σε φάση G0 και διαμολύνθηκαν είτε με μη στοχευμένο sirna έναντι του mrna της λουσιφεράσης είτε με sirna έναντι του mrna της πρωτεΐνης Geminin, όπως περιγράφεται στην εικόνα Στη συνέχεια ελήφθησαν δείγματα κυττάρων 12 και 18 ώρες μετά την επανείσοδό τους στον κυτταρικό κύκλο και υποβλήθηκαν σε ανάλυση με FRAP. Η καμπύλη επαναφοράς του φθορισμού κάθε πειραματικής συνθήκης αναπαριστά το μέσο όρο των κανονικοποιημένων μέσων εντάσεων φθορισμού κυττάρων που αναλύθηκαν. (Β, Δ) Πίνακες στους οποίους απεικονίζεται ο χρόνος που απαιτείται για την επαναφορά του φθορισμού στο 50% της τελικής έντασης (t 1/2 ), το δεσμευμένο κλάσμα μορίων (Δεσμ. Κλ.) στη χρωματίνη και ο αριθμός (Ν) των κυττάρων που αναλύθηκαν με FRAP

158 4. Αποτελέσματα Η πρωτεΐνη Geminin συμβάλλει στη σταθεροποίηση της ενδογενούς πρωτεΐνης MCM2 στη χρωματίνη κατά τη φάση G1 Στη συνέχεια λαμβάνοντας υπόψιν τη μικρή επίδραση της αποσιώπησης της πρωτεΐνης Geminin στη σταθεροποίηση των πρωτεϊνών MCM στη χρωματίνη στο τέλος της φάσης G1 που παρατηρήθηκε με την ανάλυση FRAP, κρίθηκε ενδιαφέρουσα η διερεύνηση του ίδιου ερωτήματος με διαφορετικό τρόπο. Συγκεκριμένα αξιολογήθηκε η επίδραση της πρωτεΐνης Geminin στη σταθεροποίηση της ενδογενούς πρωτεΐνης MCM2 στη χρωματίνη σε μονιμοποιημένα κύτταρα με ανοσοφθορισμό. Αρχικά επαναλήφθηκε η πειραματική διαδικασία που περιγράφεται στην εικόνα χρησιμοποιώντας MCF7 κύτταρα. Συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε καλλιέργεια των κυττάρων σε θρεπτικό μέσο με 1% FBS για 24 ώρες και ακολούθησε διαμόλυνση των κυττάρων είτε με sirna έναντι του mrna της πρωτεΐνης Geminin είτε με μη στοχευμένο sirna έναντι του mrna της λουσιφεράσης (αρνητικός μάρτυρας). Έπειτα προστέθηκε ταμοξιφαίνη στα κύτταρα για 48 ώρες, έτσι ώστε αυτά να εξέλθουν από τον κυτταρικό κύκλο σε φάση G0. Στη συνέχεια τα κύτταρα διαμολύνθηκαν εκ νέου είτε με sirna έναντι του mrna της Geminin είτε με sirna έναντι της λουσιφεράσης. Παράλληλα, αφαιρέθηκε η ταμοξιφαίνη και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε καινούριο θρεπτικό μέσο έτσι ώστε να επιτραπεί η επανείσοδός τους στη φάση G1. Στις 18 ώρες μετά την αφαίρεση της ταμοξιφαίνης τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε διαδικασία προεκχύλισης, με στόχο την απομάκρυνση του διαλυτού πρωτεϊνικού κλάσματος, και ακολούθως μονιμοποιήθηκαν. Ακολούθησε ανοσοφθορισμός με χρήση αντισώματος ειδικού έναντι της πρωτεΐνης MCM2. Για τη σύγκριση της πρόσδεσης της πρωτεΐνης MCM2 στη χρωματίνη στα κύτταρα που είχε πραγματοποιηθεί αποσιώπηση της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin και σε αυτά που είχαν διαμολυνθεί με μη στοχευμένο sirna, ελήφθησαν φωτογραφίες και ποσοτικοποιήθηκε η ένταση του φθορισμού των κυττάρων με το πρόγραμμα Image J. Όπως φαίνεται στην εικόνα , η πρόσδεση της πρωτεΐνης MCM2 στη χρωματίνη παρουσιάζεται σημαντικά μειωμένη στα κύτταρα στα οποία έχει πραγματοποιηθεί η αποσιώπηση της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin. Συγκεκριμένα, η ποσοτικοποίηση της έντασης φθορισμού των κυττάρων έδειξε ότι απουσία της πρωτεΐνης Geminin, μεγαλύτερο ποσοστό κυττάρων εμφανίζει ασθενή χρώση για την δεσμευμένη πρωτεΐνη MCM2 στη χρωματίνη (εικόνα Β, Δ) σε σύγκριση με τα κύτταρα στα οποία έχει πραγματοποιηθεί διαμόλυνση με μη στοχευμένο sirna και συνεπώς η πρωτεΐνη Geminin εκφράζεται κανονικά (εικόνα Α, Γ). Για την πιο άμεση σύγκριση της πρόσδεσης της MCM2 πρωτεΐνης στη χρωματίνη παρουσία και απουσία της πρωτεΐνης Geminin, τα κύτταρα διαχωρίστηκαν σε δύο κατηγορίες ανάλογα με την ένταση φθορισμού τους σε αυτά με χαμηλή ένταση (αν ήταν μικρότερη από αυθαίρετες μονάδες φθορισμού) και σε αυτά με υψηλή ένταση (αν ήταν μεγαλύτερη από αυθαίρετες μονάδες φθορισμού). Όπως φαίνεται στο διάγραμμα Ε, η αποσιώπηση της πρωτεΐνης Geminin έχει ως αποτέλεσμα την ελάττωση του ποσοστού των κυττάρων με υψηλή ένταση φθορισμού (~46%) της MCM2 πρωτεΐνης που είναι σταθερά προσδεδεμένη στη χρωματίνη σε σύγκριση με τα κύτταρα που έχουν διαμολυνθεί με το μη στοχευμένο sirna (~65%). Όσον αφορά την κατηγορία χαμηλής έντασης φθορισμού, διαπιστώνεται

159 4. Αποτελέσματα Εικόνα : Η αποσιώπηση της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin περιορίζει την πρόσδεση της ενδογενούς πρωτεΐνης MCM2 στη χρωματίνη. (Α, Β) MCF7 κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία ταμοξιφαίνης για να εξέλθουν από τον κυτταρικό κύκλο και διαμολύνθηκαν είτε με μη στοχευμένο sirna έναντι του mrna της λουσιφεράσης (αρνητικός μάρτυρας) είτε με sirna έναντι του mrna της πρωτεΐνης Geminin, όπως περιγράφεται στην εικόνα Μετά το πέρας 18 ωρών από την επανείσοδο στον κυτταρικό κύκλο, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε διαδικασία προεκχύλισης και μονιμοποιήθηκαν. Η πρωτεΐνη MCM2 που ήταν προσδεδεμένη στη χρωματίνη εντοπίστηκε με ανοσοφθορισμό χρησιμοποιώντας αντίσωμα έναντι της πρωτεΐνης MCM2 (χρώση του DNA με Hoechst). (Γ, Δ) Ακολούθησε ποσοτικοποίηση της έντασης φθορισμού των κυττάρων με το πρόγραμμα Image J. Ιστογράμματα στα οποία απεικονίζεται το ποσοστό των κυττάρων ανά εύρος έντασης φθορισμού. (Ε) Η ένταση φθορισμού των κυττάρων που διαμολύνθηκαν είτε με sirna έναντι της λουσιφεράσης είτε με sirna έναντι της πρωτεΐνης Geminin κατηγοριοποιήθηκε σε χαμηλή (< αυθαίρετες μονάδες έντασης φθορισμού) και υψηλή (> αυθαίρετες μονάδες έντασης φθορισμού). Στο διάγραμμα απεικονίζεται το ποσοστό των κυττάρων που παρουσιάζουν χαμηλή και υψηλή ένταση φθορισμού

160 4. Αποτελέσματα αύξηση του ποσοστού των κυττάρων (~54%) στα οποία έχει αποσιωπηθεί η έκφραση της πρωτεΐνης Geminin σε σχέση με το ποσοστό των κυττάρων (~35%) που έχουν διαμολυνθεί με sirna έναντι του mrna της λουσιφεράσης. Έχει δειχθεί βιβλιογραφικά ότι η αποσιώπηση της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin ενδέχεται να οδηγεί σε ελάττωση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 κατά τη μίτωση (Ballabeni et al., 2004). Λαμβάνοντας υπ όψιν την παρατήρηση αυτή κρίθηκε αναγκαίος ο έλεγχος των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 στα κύτταρα τα οποία είχαν διαμολυνθεί με sirna έναντι του mrna της πρωτεΐνης Geminin, για να διευκρινιστεί αν η περιορισμένη πρόσδεση της πρωτεΐνης MCM2 στη χρωματίνη οφείλεται όντως στην αποσιώπηση της έκφρασης της Geminin ή αποτελεί έμμεσο αποτέλεσμα αυτής μέσω της αρνητικής ρύθμισης των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1. Για το σκοπό αυτό, MCF7 κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία ταμοξιφαίνης και εξήλθαν από τον κυτταρικό κύκλο, όπως περιγράφεται στην εικόνα Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε διαμόλυνση των κυττάρων είτε με sirna έναντι του mrna της Geminin είτε με sirna έναντι του mrna της λουσιφεράσης. Ακολούθησε αφαίρεση της ταμοξιφαίνης με στόχο την επανείσοδο των κυττάρων στον κυτταρικό κύκλο. Ο προσδιορισμός των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 πραγματοποιήθηκε σε δείγματα κυττάρων που ελήφθησαν δώδεκα ώρες μετά την απομάκρυνση της ταμοξιφαίνης, με ανοσοφθορισμό και χρήση αντισώματος ειδικού έναντι της πρωτεΐνης Cdt1. Όπως φαίνεται στην εικόνα , η μικροσκοπική παρατήρηση των κυττάρων αποκάλυψε παρόμοιο ποσοστό θετικών κυττάρων για την πρωτεΐνη Cdt1 στα κύτταρα που είχαν διαμολυνθεί με sirna έναντι του mrna της Geminin και στα κύτταρα που είχαν διαμολυνθεί με sirna έναντι του mrna της λουσιφεράσης. Εικόνα : Η αποσιώπηση της πρωτεΐνης Geminin κατά τη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου δεν επηρεάζει τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1. MCF7 κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία ταμοξιφαίνης και εξήλθαν από τον κυτταρικό κύκλο. Παράλληλα διαμολύνθηκαν είτε με μη στοχευμένο sirna έναντι του mrna της λουσιφεράσης (αρνητικός μάρτυρας) είτε με sirna έναντι του mrna της πρωτεΐνης Geminin, όπως περιγράφεται στην εικόνα Δώδεκα ώρες μετά την αφαίρεση της ταμοξιφαίνης και την επανείσοδο των κυττάρων στον κυτταρικό κύκλο τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν. Ακολούθησε ανοσοφθορισμός με χρήση αντισώματος έναντι της πρωτεΐνης Cdt1 και καταμέτρηση του ποσοστού των θετικών κυττάρων

161 4. Αποτελέσματα Συνεπώς, στη συγκεκριμένη κυτταρική σειρά, η αποσιώπηση της έκφρασης της Geminin δεν επηρεάζει την έκφραση του παράγοντα Cdt1. Συμπερασματικά, η αποσιώπηση της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin οδηγεί σε περιορισμό της πρόσδεσης της ενδογενούς πρωτεΐνης MCM2 στη χρωματίνη στο τέλος της φάσης G1. Η ελαττωμένη δέσμευση της πρωτεΐνης MCΜ2 στη χρωματίνη αποτελεί άμεση επίπτωση της απουσίας της Geminin και δεν οφείλεται σε μειωμένα επίπεδα έκφρασης του παράγοντα Cdt Η παρουσία της πρωτεΐνης Geminin είναι απαραίτητη για τη διατήρηση του υψηλού ποσοστού πρόσδεσης των πρωτεϊνών GFP-MCM2 και GFP-MCM4 στη χρωματίνη στο τέλος της φάσης G1 Έχοντας διαπιστώσει ότι η πρωτεΐνη Geminin συμβάλλει στην πρόσδεση των πρωτεϊνών MCM στη χρωματίνη κατά τη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου, θεωρήθηκε ενδιαφέρουσα η διερεύνηση της επίδρασης της πρωτεΐνης Geminin στην κινητική των σταθεροποιημένων πρωτεϊνών MCM στη χρωματίνη στο τέλος της φάσης G1. Για να προσεγγισθεί η απάντηση σε αυτό το ερώτημα πραγματοποιήθηκε συγχρονισμός MCF7 κυττάρων που εκφράζουν σταθερά την πρωτεΐνη GFP-MCM2 ή GFP-MCM4 στο τέλος της φάσης G1 με mimosine για 24 ώρες. Ακολούθησε διαμόλυνση των κυττάρων είτε με sirna έναντι του mrna της πρωτεΐνης Geminin είτε με sirna έναντι του mrna της λουσιφεράσης (αρνητικός μάρτυρας). Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε διαμόλυνση κυττάρων και με sirna έναντι του mrna της πρωτεΐνης Cdt1, για να διαπιστωθεί αν η πιθανή επίδραση της Geminin στη διατήρηση της σταθεροποίησης των πρωτεϊνών MCM στη χρωματίνη στο τέλος της φάσης G1 οφείλεται στην αλληλεπίδρασή της με τον παράγοντα Cdt1 ή είναι ανεξάρτητη από αυτή. Σημειώνεται ότι καθ όλη τη διάρκεια του πειράματος και της διαμόλυνσης με τα sirna τα κύτταρα καλλιεργούνταν σε θρεπτικό μέσο με mimosine έτσι ώστε να διατηρούνται συγχρονισμένα στο τέλος της φάσης G1. Μετά το πέρας 24 ωρών από τη διαμόλυνση πραγματοποιήθηκε ανάλυση της κινητικής των πρωτεϊνών GFP-MCM2 και GFP-MCM4 με FRAP (εικόνα ). Όπως φαίνεται στην εικόνα , η αποσιώπηση της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin είχε ως αποτέλεσμα την αποσταθεροποίηση των πρωτεϊνών MCM και την απώλεια του υψηλού ποσοστού δέσμευσής τους στη χρωματίνη. Συγκεκριμένα, στα κύτταρα που είχαν διαμολυνθεί με sirna έναντι του mrna της Geminin διαπιστώθηκε μικρότερο δεσμευμένο κλάσμα στη χρωματίνη τόσο της πρωτεΐνης GFP-MCM2 (GFP- MCM2 Δεσμ.Κλ. = 0.20 ± 0.12) όσο και της GFP-MCM4 (GFP-MCM4 Δεσμ.Κλ. = 0.25 ± 0.16) σε σύγκριση με τα αντίστοιχα κλάσματα των ακινητοποιημένων πρωτεϊνών των κυττάρων που είχαν διαμολυνθεί με μη στοχευμένο sirna έναντι του mrna της λουσιφεράσης (GFP-MCM2 Δεσμ.Κλ. = 0.30 ± 0.14 και GFP-MCM4 Δεσμ.Κλ. = 0.36 ± 0.13). Επιπλέον η αναστολή της έκφρασης του παράγοντα Cdt1 είχε επίσης ως αποτέλεσμα τη μείωση του σταθερά δεσμευμένου κλάσματος των πρωτεϊνών GFP-MCM2 (GFP-MCM2 Δεσμ.Κλ. = 0.25 ± 0.13) και GFP-MCM4 (GFP-MCM4 Δεσμ.Κλ. = 0.32 ± 0.14) στη χρωματίνη, ωστόσο σε μικρότερο βαθμό συγκριτικά με την αποσιώπηση της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin

162 4. Αποτελέσματα Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της ανάλυσης FRAP καταδεικνύουν ότι η πρωτεΐνη Geminin είναι απαραίτητη για τη διατήρηση του σταθερά προσδεδεμένου κλάσματος των MCM μορίων στη χρωματίνη στο τέλος της φάσης G1. Επιπλέον, το γεγονός ότι η επίδραση της πρωτεΐνης Geminin είναι πιο έντονη από την αντίστοιχη του παράγοντα Cdt1, υποδηλώνει ότι η δράση της δεν οφείλεται, τουλάχιστον αποκλειστικά, στην αλληλεπίδρασή της με τον παράγοντα αυτό. Εικόνα : Η απουσία της Geminin οδηγεί σε αποσταθεροποίηση των δεσμευμένων πρωτεϊνών GFP-MCM2 και GFP-MCM4 στη χρωματίνη στο τέλος της φάσης G1. (Α, Γ) MCF7 κύτταρα που εκφράζουν σταθερά τις πρωτεΐνες GFP-MCM2 ή GFP-MCM4 καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες παρουσία mimosine και συγχρονίστηκαν στο τέλος της φάσης G1. Ακολούθησε διαμόλυνση των κυττάρων είτε με sirna ειδικό έναντι του mrna της πρωτεΐνης Geminin, είτε με sirna έναντι του mrna της πρωτεΐνης Cdt1, είτε με sirna έναντι του mrna της λουσιφεράσης (αρνητικός μάρτυρας). Οι διαμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν παρουσία mimosine. Ακολούθησε ανάλυση των κυττάρων με FRAP. Η καμπύλη επαναφοράς του φθορισμού κάθε πειραματικής συνθήκης αναπαριστά το μέσο όρο των κανονικοποιημένων μέσων εντάσεων φθορισμού κυττάρων που αναλύθηκαν. (Β, Δ) Πίνακες στους οποίους απεικονίζεται ο χρόνος που απαιτείται για την επαναφορά του φθορισμού στο 50% της τελικής έντασης (t 1/2 ), το δεσμευμένο κλάσμα μορίων (Δεσμ. Κλ.) στη χρωματίνη και ο αριθμός (Ν) των κυττάρων που αναλύθηκαν με FRAP Τα κύτταρα αδυνατούν να εισέλθουν στη φάση S απουσία της πρωτεΐνης Geminin Λαμβάνοντας υπ όψιν τη σημασία της παρουσίας της πρωτεΐνης Geminin για τη διατήρηση του σταθερά δεσμευμένου κλάσματος των πρωτεϊνών MCM στη χρωματίνη

163 4. Αποτελέσματα στο τέλος της φάσης G1 και δεδομένου ότι η σταθερή πρόσδεση των πρωτεϊνών MCM στη χρωματίνη είναι απαραίτητη για τη συγκρότηση των προεναρκτήριων συμπλόκων κατά τη μετάβαση από τη φάση G1 στη φάση S του κυτταρικού κύκλου, θεωρήθηκε ενδιαφέρουσα η διερεύνηση της επίδρασης της αποσιώπησης της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin στην ικανότητα των κυττάρων να εισέρχονται και να προοδεύουν στη φάση S. Για το σκοπό αυτό, MCF7 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό μέσο με χαμηλή περιεκτικότητα σε ορό (1% FBS) για 24 ώρες, έτσι ώστε να παρεμποδίζεται η εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και τα κύτταρα να συγκεντρώνονται στη φάση G1-G0. Ακολούθησε διαμόλυνση των κυττάρων είτε με sirna έναντι του mrna της πρωτεΐνης Geminin είτε με μη στοχευμένο sirna έναντι του mrna της λουσιφεράσης (αρνητικός μάρτυρας) και καλλιέργειά τους σε θρεπτικό μέσο με ταμοξιφαίνη για 48 ώρες με στόχο την έξοδό τους από τον κυτταρικό κύκλο στη φάση G0. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε δεύτερη διαμόλυνση των κυττάρων με τα αντίστοιχα sirnas, αφαίρεση της ταμοξιφαίνης και καλλιέργεια των κυττάρων σε καινούριο θρεπτικό μέσο ώστε να επανεισέλθουν στη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου. Στις 18, 21 και 24 ώρες μετά την απομάκρυνση της ταμοξιφαίνης ελήφθησαν δείγματα κυττάρων, τα οποία μονιμοποιήθηκαν και ακολούθως ελέγχθηκε το ποσοστό των κυττάρων που διήνυαν τη φάση S τις δεδομένες χρονικές στιγμές. Για να εντοπιστούν τα κύτταρα που βρίσκονταν στη φάση S, σε κάθε χρονικό σημείο και ακριβώς πριν την μονιμοποίησή τους, τα κύτταρα επωάστηκαν για μισή ώρα παρουσία του αναλόγου θυμιδίνης BrdU (βρωμο-2-δέοξυουριδίνη), το οποίο ενσωματώνεται στο DNA κατά τη διάρκεια της αντιγραφής του. Ακολούθησε ανοσοφθορισμός με χρήση αντισώματος ειδικού έναντι του BrdU και καταμέτρηση των θετικών κυττάρων. Η μικροσκοπική ανάλυση των εικόνων μετά τον φθορισμό κατέδειξε σημαντική διαφορά ως προς το ποσοστό θετικότητας για BrdU μεταξύ των κυττάρων στα οποία είχε αποσιωπηθεί η έκφραση της πρωτεΐνης Geminin και των κυττάρων που είχαν διαμολυνθεί με το μη στοχευμένο sirna (εικόνα ). Πιο αναλυτικά, στις 18 ώρες μετά την απομάκρυνση της ταμοξιφαίνης περίπου το 11% του πληθυσμού των κυττάρων που είχαν διαμολυνθεί με sirna έναντι της λουσιφεράσης είχε εισέλθει στη φάση S, ενώ μόνο το 5% των κυττάρων στα οποία είχε αποσιωπηθεί η έκφραση της πρωτεΐνης Geminin βρίσκονταν στη φάση S στο συγκεκριμένο χρονικό σημείο. Η αδυναμία των κυττάρων να εισέλθουν στη φάση S απουσία της πρωτεΐνης Geminin γίνεται πιο εμφανής στα επόμενα χρονικά σημεία που αναλύθηκαν. Συγκεκριμένα στις 21 και στις 24 ώρες μετά την αφαίρεση της ταμοξιφαίνης το ποσοστό των κυττάρων που εξέφραζαν κανονικά την πρωτεΐνη Geminin και διήνυαν τη φάση S ήταν 14% και 20%, αντίστοιχα. Αντίθετα, παρατηρήθηκε μείωση στα ποσοστά των κυττάρων που είχαν διαμολυνθεί με sirna έναντι του mrna της Geminin και βρίσκονταν στη φάση S στα αντίστοιχα χρονικά σημεία των 21 και 24 ωρών (5% και 7%, αντίστοιχα) (εικόνα ). Συμπερασματικά, η απουσία της πρωτεΐνης Geminin έχει ως αποτέλεσμα την αδυναμία των κυττάρων να εισέλθουν και να προοδεύσουν στη φάση S του κυτταρικού κύκλου

164 4. Αποτελέσματα Εικόνα : Τα κύτταρα αδυνατούν να εισέλθουν στη φάση S απουσία της πρωτεΐνης Geminin. MCF7 κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία ταμοξιφαίνης για 48 ώρες για να εξέλθουν από τον κυτταρικό κύκλο και διαμολύνθηκαν είτε με μη στοχευμένο sirna έναντι του mrna της λουσιφεράσης (αρνητικός μάρτυρας) είτε με sirna έναντι του mrna της πρωτεΐνης Geminin, όπως περιγράφεται στην εικόνα Στη συνέχεια ελήφθησαν δείγματα κυττάρων 18, 21 και 24 ώρες μετά την επανείσοδό τους στον κυτταρικό κύκλο. Σε αυτά τα χρονικά σημεία, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία BrdU για μισή ώρα. Ακολούθησε μονιμοποίηση των κυττάρων και ανοσοφθορισμός με χρήση αντισώματος έναντι του BrdU και καταμέτρηση του ποσοστού των θετικών κυττάρων. (A) Αντιπροσωπευτικές εικόνες κυττάρων μετά από ανοσφθορισμό με χρήση αντισώματος έναντι του BrdU (χρώση DNA με Hoechst). (Β) Ιστόγραμμα στο οποίο απεικονίζεται η επίδραση της απαλοιφής της Geminin στο ποσοστό των θετικών κυττάρων για BrdU στα χρονικά σημεία 18, 21 και 24 ωρών μετά την επανείσοδο στον κυτταρικό κύκλο

165 5. Συζήτηση 5. ΣΥΖΗΤΗΣΗ

166 5. Συζήτηση 5.1 Μελέτη του παράγοντα Cdt1 ως βιοδείκτη στον όγκο μαστού και της πιθανής εμπλοκής αυτού στην καρκινογένεση Σημαντικό μηχανισμό ελέγχου του κυτταρικού κύκλου αποτελεί η αδειοδότηση της αντιγραφής του DNA, διαδικασία που εξασφαλίζει την πλήρη αντιγραφή του γονιδιώματος και μόνο μια φορά κατά τη διάρκεια κάθε κυτταρικού κύκλου. Αρκετές μελέτες έχουν προτείνει ότι η απορρύθμιση της έκφρασης των παραγόντων αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA, όπως είναι ο παράγοντας Cdt1 και ο αρνητικός του ρυθμιστής Geminin, συμβάλλει στη δημιουργία γονιδιωματικής αστάθειας και στην κακοήθη εξαλλαγή των κυττάρων. Παρά την εδραιωμένη ογκογόνο δράση του παράγοντα Cdt1 δεν υπάρχουν αρκετές μελέτες στη βιβλιογραφία σχετικά με την έκφρασή του σε πρωτεϊνικό επίπεδο σε ανθρώπινους όγκους, πιθανώς λόγω της απουσίας εμπορικά διαθέσιμου κατάλληλου αντισώματος για ιστικές τομές παραφίνης. Στην παρούσα μελέτη προσδιορίστηκαν ανοσοϊστοχημικά τα επίπεδα έκφρασης του παράγοντα αδειοδότησης Cdt1 σε 85 κλινικά δείγματα όγκου μαστού, με χρήση ειδικού αντισώματος έναντι της συγκεκριμένης πρωτεΐνης, το οποίο αναπτύχθηκε και χαρακτηρίστηκε σε προηγούμενη εργασία του εργαστηρίου μας (Διπλωματική Εργασία για την απόκτηση μεταπτυχιακού διπλώματος ειδίκευσης στις Βασικές Ιατρικές Επιστήμες, Ιωάννα-Ελένη Συμεωνίδου, 2008). Ακολούθησε έλεγχος της πιθανής συσχέτισης της έκφρασης του παράγοντα Cdt1 με κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους της νόσου καθώς και με ευρέως χρησιμοποιούμενους προγνωστικούς βιοδείκτες. Επίσης, διερευνήθηκε αν οι παρατηρούμενες συσχετίσεις μπορεί να αντανακλούν λειτουργική επίπτωση της απορρύθμισης της έκφρασης του παράγοντα Cdt Ο παράγοντας Cdt1 υπερεκφράζεται στον όγκο μαστού Από την ανάλυση της έκφρασης του παράγοντα Cdt1 σε 85 κλινικά δείγματα όγκου μαστού καταδείχθηκε στατιστικώς σημαντική υπερέκφραση της πρωτεΐνης στην περιοχή του διηθητικού όγκου σε σύγκριση με τον παρακείμενο μη νεοπλασματικό ιστό. Η παρατήρηση αυτή έρχεται σε συμφωνία με μια σειρά μελετών in vitro και in vivo που αποδίδουν στον παράγοντα Cdt1 ογκογόνο ρόλο. Υψηλά επίπεδα έκφρασης του παράγοντα Cdt1 έχουν διαπιστωθεί σε πολλές διαφορετικές καρκινικές κυτταρικές σειρές (Xouri et al., 2004). Η πρώτη ένδειξη για την ογκογόνο δυνατότητα του Cdt1 in vivo προέκυψε από τη διαπίστωση ανάπτυξης όγκων από ανοσοκατασταλμένους ποντικούς, όταν αυτοί διαμολύνθηκαν με κύτταρα που υπερεξέφραζαν τον παράγοντα Cdt1 (Arentson et al., 2002). Επιπλέον, η ιστοειδική υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 σε T κύτταρα ποντικών, σε συνδυασμό με απώλεια λειτουργικού p53 είχε ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη λεμφοβλαστικού λεμφώματος από τα ζώα αυτά (Seo et al., 2005a). Υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 έχει καταδειχθεί και σε ανθρώπινους όγκους. Σε προηγούμενη εργασία του εργαστηρίου μας, η ανάλυση της έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 σε ιστικές τομές δειγμάτων καρκίνου παχέος εντέρου αποκάλυψε σημαντική υπερέκφραση της πρωτεΐνης

167 5. Συζήτηση στην περιοχή του όγκου σε σύγκριση με τον παρακείμενο φυσιολογικό ιστό (Bravou et al., 2005). Επιπλέον, υψηλά επίπεδα έκφρασης του mrna του παράγοντα Cdt1 έχουν διαπιστωθεί σε κλινικά δείγματα μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (Karakaidos et al., 2004), σε δείγματα λεμφωμάτων του μανδύα (Pinyol et al., 2006) καθώς και σε καρκινώματα εκ πλακώδους επιθηλίου της γλώσσας (Li et al., 2008). Σε όλες τις περιπτώσεις, η έκφραση του mrna του Cdt1 ήταν σημαντικά υψηλότερη σε σχέση με τον παρακείμενο μη νεοπλασματικό ιστό. Η μελέτη της έκφρασης του παράγοντα Cdt1 σε κλινικά δείγματα όγκων λάρυγγα, παχέος εντέρου και πνεύμονα, καθώς και σε προκαρκινικές ιστικές αλλοιώσεις (υπερπλασία και δυσπλασία) παρακείμενες στον όγκο, κατέδειξε ότι τα αυξημένα επίπεδα έκφρασης του Cdt1 ανιχνεύονται από το στάδιο της δυσπλασίας. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι η απορρύθμιση της έκφρασης του παράγοντα Cdt1 αποτελεί πρώιμο συμβάν κατά την εξέλιξη της καρκινογένεσης, παρατήρηση που ενισχύει την υπόθεση ότι η υπερέκφρασή του ενδέχεται να προάγει την κακοήθη εξαλλαγή των κυττάρων (Liontos et al., 2007). Συνεπώς, η υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 είναι πιθανό να εμπλέκεται στην εξέλιξη της ογκογένεσης του μαστού Ο παράγοντας Cdt1 ως προγνωστικός βιοδείκτης στον όγκο μαστού Η διερεύνηση της πιθανής συσχέτισης μεταξύ των επιπέδων έκφρασης του παράγοντα Cdt1 και άλλων γνωστών βιοδεικτών του όγκου μαστού αποκάλυψε ότι η υψηλή έκφραση του παράγοντα αυτού συσχετίζεται στατιστικώς σημαντικά με την απουσία έκφρασης των παραγόντων ER και PR, και με έντονη έκφραση του δείκτη πολλαπλασιασμού Ki67 και του διαμεμβρανικού υποδοχέα HER2/neu. Η κατάσταση των οιστρογονικών και προγεστερονικών υποδοχέων (θετική ή αρνητική έκφραση) παρέχει σημαντικές πληροφορίες σχετικά με την πρόγνωση και την απόκριση των ασθενών σε ορμονική θεραπεία (Harris et al., 2007). Η απουσία έκφρασης του υποδοχέα ER συνήθως ταυτοποιεί χαμηλού βαθμού ιστικής διαφοροποίησης και ανθεκτικούς σε ορμονική θεραπεία όγκους, ενώ παράλληλα συσχετίζεται με μικρότερο χρόνο ελεύθερο νόσου και συνολικής επιβίωσης. Ο δείκτης πολλαπλασιασμού Ki67 χρησιμοποιείται στην κλινική πρακτική για τον προσδιορισμό της ταχύτητας ανάπτυξης του όγκου. Έχει δειχθεί ότι το υψηλό ποσοστό θετικότητας για το δείκτη Ki67 συσχετίζεται με μειωμένο χρόνο ελεύθερο νόσου και συνολικής επιβίωσης (de Azambuja et al., 2007). Η πρωτεΐνη HER2/neu αποτελεί διαμεμβρανικό υποδοχέα αυξητικού παράγοντα με ενεργότητα κινάσης τυροσίνης. Υπερέκφραση του HER2/neu παρατηρείται στο % των όγκων μαστού και συσχετίζεται με άσχημη πρόγνωση, ενώ παράλληλα αποτελεί δείκτη απόκρισης σε συγκεκριμένη θεραπεία με χρήση του μονοκλωνικού αντισώματος trastuzumab (Masood and Bui, 2002; Ross et al., 2004). Παρ όλο που θεωρείται απαραίτητη η διεύρυνση της μελέτης της έκφρασης του παράγοντα Cdt1 σε μεγαλύτερο αριθμό κλινικών δειγμάτων όγκων μαστού καθώς και η διερεύνηση της συσχέτισής της με δείκτες που αφορούν την επιβίωση καθώς και την απόκριση των ασθενών στη θεραπεία, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης υποδεικνύουν τον παράγοντα Cdt1 ως πιθανό χρήσιμο προγνωστικό βιοδείκτη για τον όγκο μαστού

168 5. Συζήτηση Η παρατηρούμενη συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης του παράγοντα Cdt1 και του ποσοστού θετικότητας για το δείκτη Ki67 υποδεικνύει την πιθανή αξία του Cdt1 ως βιοδείκτη κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Ο δείκτης Ki67 παρουσιάζει ορισμένα μειονεκτήματα καθώς δεν εκφράζεται στη φάση G1 και επιπλέον ο ακριβής μοριακός του ρόλος δεν έχει ταυτοποιηθεί (Tachibana et al., 2005a). Συνεπώς είναι αναγκαία η εύρεση νέων πιο ευαίσθητων και αξιόπιστων δεικτών κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Έχει προταθεί βιβλιογραφικά ότι οι παράγοντες αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA ενδέχεται να αποτελούν χρήσιμους βιοδείκτες όσον αφορά την ταυτοποίηση των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (Tachibana et al., 2005a). Οι πρωτεΐνες MCM2-7 εκφράζονται καθ όλη τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου και ταυτοποιούν, εκτός από τον κυτταρικό πληθυσμό που πολλαπλασιάζεται, κύτταρα τα οποία δεν είναι ενεργώς πολλαπλασιαζόμενα αλλά διαθέτουν αδειοδοτημένες αφετηρίες αντιγραφής και συνεπώς έχουν τη δυνατότητα ανά πάσα στιγμή να πολλαπλασιαστούν. Συνεπώς, οι πρωτεΐνες MCM2-7 μπορεί να αποτελούν καλύτερους βιοδείκτες κυτταρικού πολλαπλασιασμού καθώς μπορούν να διακρίνουν τα κύτταρα που εν δυνάμει μπορούν να πολλαπλασιαστούν από τα κύτταρα που βρίσκονται εκτός κυτταρικού κύκλου. Αντίστοιχα, οι πρωτεΐνες Cdt1 και Geminin, οι οποίες δεν εκφράζονται από κύτταρα που βρίσκονται εκτός κυτταρικού κύκλου (Xouri et al., 2004), είναι πολύ πιθανό να αποτελούν χρήσιμους βιοδείκτες για τον προσδιορισμό της κατάστασης πολλαπλασιασμού των κυττάρων των όγκων. Πράγματι έχει δειχθεί ότι ο παράγοντας Cdt1 ταυτοποιεί κύτταρα που βρίσκονται σε ενεργώς πολλαπλασιαζόμενα τμήματα των ιστών (Bravou et al., 2005). Επιπλέον, λαμβάνοντας υπόψιν ότι ο παράγοντας Cdt1 εκφράζεται μόνο κατά τη φάση G1, η εκτίμηση της έκφρασής του ενδέχεται να είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για τον προσδιορισμό της ταχύτητας του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων Πιθανή η συμβολή του παράγοντα Cdt1 στη δημιουργία γονιδιακής ενίσχυσης Ενδιαφέρον εύρημα της συγκεκριμένης μελέτης αποτελεί η διαπίστωση ότι η υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 είναι στατιστικώς σημαντικά υψηλότερη στα δείγματα που είναι θετικά ως προς την έκφραση του υποδοχέα HER2/neu σε σύγκριση με τους όγκους που δεν εκφράζουν τον υποδοχέα αυτό. Έχει δειχθεί ότι η θετική ανοσοϊστοχημική εντόπιση και κατ επέκταση η υπερέκφραση της πρωτεΐνης HER2/neu στον όγκο μαστού οφείλεται, στο 95% των περιπτώσεων, σε ενίσχυση του γονιδίου HER2/neu (Pauletti et al., 1996). Η συσχέτιση αυτή έρχεται σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες που έχουν δείξει ότι η υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 συσχετίζεται άμεσα με την εμφάνιση γονιδιωματικής αστάθειας. Συγκεκριμένα, έχει δειχθεί ότι η υπερέκφραση του Cdt1 σε κύτταρα ποντικών με μη λειτουργικό p53 είχε ως αποτέλεσμα την εμφάνιση χρωμοσωματικών ανωμαλιών και την ανάπτυξη όγκων από τα ζώα αυτά (Seo et al., 2005a). Επιπλέον, τα αυξημένα επίπεδα έκφρασης του mrna του παράγοντα Cdt1 συσχετίζονταν στατιστικώς σημαντικά με την εμφάνιση χρωμοσωματικών ανωμαλιών σε κλινικά δείγματα μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (Karakaidos et al., 2004). Συνεπώς, είναι πιθανό η γονιδιακή ενίσχυση να αποτελεί μια επιπλέον γονιδιωματική

169 5. Συζήτηση ανωμαλία, η οποία προκαλείται λόγω της επαναντιγραφής του γονιδιώματος που επάγει η υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1. Η γονιδιακή ενίσχυση αποτελεί κύριο μηχανισμό ενεργοποίησης ογκογονιδίων και προαγωγής της καρκινογένεσης. Σε συμφωνία με την παρατήρηση αυτή, έχουν ταυτοποιηθεί αρκετά ογκογονίδια τα οποία παρουσιάζουν γονιδιακή ενίσχυση σε διαφορετικές περιπτώσεις όγκων του ανθρώπου, μεταξύ των οποίων συγκαταλέγονται τα ογκογονίδια AKT2 στον καρκίνο των ωοθηκών, HER2/neu στους όγκους μαστού και ωοθηκών, MYCL1 στο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, MYCN στο νευροβλάστωμα, REL στο λέμφωμα Hodgkin, EGFR σε γλοιώματα και σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα και το MYC σε μια σειρά διαφορετικών όγκων (Futreal et al., 2004). Επιπλέον, έχει δειχθεί ότι η γονιδιακή ενίσχυση ογκογονιδίων συμβαίνει νωρίς κατά την εξέλιξη της καρκινογένεσης καθώς διαπιστώνεται σε δυσπλαστικές ιστικές αλλοιώσεις παρακείμενες στους όγκους (Mottolese et al., 2005; Roh et al., 2000) ή ακόμα και σε φυσιολογικά μελανοκύτταρα που εντοπίζονται δίπλα από μελάνωμα in situ (Bastian et al., 2000). Η παρατήρηση αυτή ενισχύει την προτεινόμενη συμβολή της γονιδιακής ενίσχυσης των ογκογονιδίων στην προαγωγή της κακοήθους εξαλλαγής των κυττάρων. Συνεπώς, η ογκογόνος δυνατότητα του παράγοντα Cdt1 ενδέχεται να εκδηλώνεται εν μέρει μέσω της πρόκλησης γονιδιακής ενίσχυσης ογκογονιδίων. Επιπλέον ένδειξη για την πιθανή συμμετοχή της απορρύθμισης της έκφρασης της πρωτεΐνης Cdt1 στη δημιουργία γονιδιακής ενίσχυσης προέκυψε από την παρατήρηση ότι η υπερέκφραση των παραγόντων αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA Cdt1 και Cdc6 στις καρκινικές κυτταρικές σειρές HeLa και MCF7 είχε ως αποτέλεσμα την εμφάνιση αποικιών ανθεκτικών στο φάρμακο μεθοτρεξάτη. Η μεθοτρεξάτη, η οποία χορηγείται ως φαρμακευτική αγωγή σε μια σειρά διαφορετικών κακοηθειών, αναστέλλει το ένζυμο διυδροφολική αναγωγάση (dihydrofolate reductase, DHFR), με αποτέλεσμα την παρεμπόδιση της βιοσύνθεσης των πουρινών και των πυριμιδών και κατ επέκταση την αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Έχει δειχθεί ότι η εκδήλωση ανθεκτικότητας των κυττάρων στη μεθοτρεξάτη λόγω της αυξημένης ενεργότητας του ενζύμου DHFR οφείλεται κατά κύριο λόγο στην ενίσχυση του αντίστοιχου γονιδίου (Johnston et al., 1983). Παρ όλ αυτά, για την εξαγωγή ασφαλών συμπερασμάτων ως προς την άμεση συμβολή της υπερέκφρασης των παραγόντων Cdt1 και Cdc6 στη δημιουργία της γονιδιακής ενίσχυσης, κρίνεται απαραίτητη η πιστοποίηση της αύξησης των αντιγράφων του γονιδίου του DHFR στις ανθεκτικές αποικίες στη μεθοτρεξάτη που προέκυψαν μετά από την υπερέκφραση των παραγόντων αυτών. Αντίστοιχα, έχουν ταυτοποιηθεί κι άλλοι παράγοντες των οποίων η υπερέκφραση λόγω γονιδιακής ενίσχυσης έχει ως αποτέλεσμα την εκδήλωση ανθεκτικότητας σε συγκεκριμένα φάρμακα. Χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελεί το υβριδικό γονίδιο BCR-ABL, το οποίο κωδικοποιεί μια κινάση τυροσίνης και συμβάλλει στην παθογένεια της χρόνιας μυελογενούς λευχαιμίας. Το imatinib (Glivec) αποτελεί ειδικό αναστολέα της υβριδικής πρωτεΐνης. Σημαντικό παράγοντα ανθεκτικότητας στο συγκεκριμένο φαρμακευτικό παράγοντα έχει δειχθεί ότι συνιστά η ενίσχυση του υβριδικού γονιδίου BCR-ABL (Shannon, 2002). Συνεπώς, είναι πιθανό η υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1, εκτός από τη γονιδιακή ενίσχυση ογκογονιδίων, να

170 5. Συζήτηση συμβάλλει στην εξέλιξη της καρκινογένεσης μέσω ενίσχυσης γονιδίων που παρέχουν ανθεκτικότητα σε συγκεκριμένες θεραπείες. Αρκετές μελέτες έχουν καταδείξει ότι σημαντικό ρόλο στο μηχανισμό εκδήλωσης γονιδιακής ενίσχυσης διαδραματίζει η δημιουργία διπλών θραύσεων στο DNA. Η παρατήρηση αυτή πρωτοδιαπιστώθηκε από πειράματα κατά τα οποία η επεξεργασία κυτταρικών καλλιεργειών με παράγοντες που επάγουν διπλές θραύσεις στο DNA είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση της συχνότητας εμφάνισης γονιδιακής ενίσχυσης (Schimke, 1988). Επιπλέον, η ακτινοβόληση κυττάρων με γ ακτινοβολία ή η επώασή τους με υπεροξείδιο του υδρογόνου οδηγεί σε έντονη γονιδιακή ενίσχυση, ιδίως στις περιπτώσεις που δεν είναι λειτουργικό το σύστημα επιδιόρθωσης βλάβης με μη ομόλογη συνένωση των άκρων (non homologous end joining, NHEJ), γεγονός που υποδεικνύει ότι η μη επιδιόρθωση των διπλών θραύσεων του DNA ενδέχεται να συμβάλλει στην παρατηρούμενη γονιδιακή ενίσχυση (Mondello et al., 2002). Ιδιαίτερα σημαντική θεωρείται η συμβολή των εύθραυστων θέσεων στο γονιδίωμα (fragile sites), οι οποίες συνιστούν γονιδιωματικές περιοχές επιρρεπείς στις διπλές κατατμήσεις του DNA, στη δημιουργία γονιδιακής ενίσχυσης (Kuo et al., 1994). Πράγματι, έχει δειχθεί ότι η παρατηρούμενη αύξηση της συχνότητας γονιδιακής ενίσχυσης σε περίπτωση καλλιέργειας των κυττάρων υπό υποξία συσχετίζεται άμεσα με την ικανότητα της συνθήκης αυτής να ενεργοποιεί συχνά απαντώμενες εύθραυστες θέσεις (common fragile sites) παρακείμενες στο γονίδιο που ενισχύεται (Coquelle et al., 1997). Επίσης έχει παρατηρηθεί ότι αρκετά συχνά τα όρια των γονιδιωματικών περιοχών που ενισχύονται εντοπίζονται σε εύθραυστες γονιδιωματικές θέσεις (Debatisse et al., 1998). Συνεπώς, θεωρείται πολύ πιθανό ότι εναρκτήριο γεγονός του μηχανισμού δημιουργίας γονιδιακής ενίσχυσης συνιστά η πρόκληση διπλών κατατμήσεων στο DNA, ιδιαίτερα σε συχνά απαντώμενες εύθραυστες γονιδιωματικές θέσεις. Η συμβολή των διπλών κατατμήσεων του DNA στην επαγωγή της γονιδιακής ενίσχυσης μπορεί να εξηγηθεί βάσει του μοντέλου «θραύσης ένωσης γεφυρώματος» (breakage-fusion-bridge, BFB), το οποίο περιγράφει ένα συχνό μηχανισμό ανάπτυξης της συγκεκριμένης γονιδιωματικής ανωμαλίας (Myllykangas and Knuutila, 2006). Σύμφωνα με το μοντέλο αυτό, οι δύο αδελφές χρωματίδες που προκύπτουν μετά από την αντιγραφή ενός μορίου DNA που έχει υποστεί διπλή θραύση σε κάποιο σημείο του, ενδέχεται να ενωθούν μέσω των άκρων τους με αποτέλεσμα τη δημιουργία δικεντρικού χρωμοσώματος. Η ένωση αυτή πιθανώς αποτελεί συνέπεια της ενεργοποίησης του μηχανισμού επιδιόρθωσης βλάβης στο DNA. Κατά τη μίτωση, τα δύο κεντρομερίδια κατευθύνονται αντίθετα, προς τους δύο πόλους της μιτωτικής ατράκτου. Η έντονη μηχανική πίεση που ασκείται στο δικεντρικό χρωμόσωμα οδηγεί στην πρόκληση νέας θραύσης σε αυτό. Στην περίπτωση που η θραύση δεν είναι συμμετρική, το ένα θυγατρικό κύτταρο αναμένεται να αποκτήσει ένα χρωμόσωμα με έλλειμμα, ενώ στο άλλο θυγατρικό κύτταρο θα μεταφερθεί ένα χρωμόσωμα με ένα διπλασιασμό. Η ενδεχόμενη συνεχής επανάληψη των κύκλων «θραύσης ένωσης γεφυρώματος» οδηγεί στη δημιουργία πολλών αντιγράφων και συνεπώς στην ενίσχυση της γονιδιωματικής περιοχής που είναι παρακείμενη στο σημείο της διπλής θραύσης. Αν η συγκεκριμένη γονιδιακή ενίσχυση προσδίδει εξελικτικό πλεονέκτημα στα κύτταρα, τότε τα κύτταρα που τη φέρουν αναμένεται ότι θα

171 5. Συζήτηση υπερισχύσουν και θα πολλαπλασιαστούν εις βάρος των υπολοίπων (Myllykangas and Knuutila, 2006). Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η απορρύθμιση του συστήματος αδειοδότησης της αντιγραφής του DNA αποτελεί σημαντική αιτία εκδήλωσης αντιγραφικού στρες. Πράγματι, η υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 ή η αποσιώπηση της έκφρασης της πρωτεΐνης Geminin έχει δειχθεί ότι οδηγούν σε επαναπυροδότηση των ήδη ενεργοποιημένων αφετηριών αντιγραφής στον ίδιο κυτταρικό κύκλο, με αποτέλεσμα την επανέναρξη της αντιγραφής του DNA και την επαναντιγραφή του γονιδιώματος (Arias and Walter, 2005; Ding and MacAlpine, 2010; Li and Blow, 2005; Melixetian et al., 2004; Mihaylov et al., 2002; Vaziri et al., 2003; Zhu et al., 2004). Η εκτεταμένη επαναδειοδότηση των αφετηριών αντιγραφής επάγει τη δημιουργία νέων αντιγραφικών διχάλων μέσα στις ήδη υπάρχουσες διχάλες. Όπως καταδεικνύει μελέτη στο Xenopus (Davidson et al., 2006), η μετακίνηση των νέων αντιγραφικών διχάλων κατά μήκος του DNA ενδέχεται να οδηγήσει στη σύγκρουσή τους με τις προπορευόμενες διχάλες, με αποτέλεσμα τη δημιουργία διπλών κατατμήσεων στο DNA. Εναλλακτικά, διπλές θραύσεις στο DNA μπορεί να προκύψουν όταν οι νέες διχάλες συναντήσουν τμήματα Okazaki των προπορευόμενων διχάλων (Liu et al., 2007). Τα τμήματα του DNA που έχουν επαναντιγραφεί είναι πιθανό να αποκοπούν και να αποτελέσουν εξωχρωμοσωματικά κυκλικά μόρια είτε να ενσωματωθούν στο γονιδίωμα μέσω ανασυνδυασμού (Blow and Gillespie, 2008). Επιπλέον, οι διπλές κατατμήσεις στο DNA ενδέχεται να οδηγήσουν σε κύκλους «θραύσης ένωσης γεφυρώματος» με αποτέλεσμα τη δημιουργία γονιδιακής ενίσχυσης. Συνεπώς, η υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 πιθανώς συμβάλλει στη δημιουργία γονιδιακής ενίσχυσης μέσω της συνεχούς επαναντιγραφής του γονιδιώματος που προκαλεί διπλές κατατμήσεις στο DNA. Ενδιαφέρουσα παρατήρηση της συγκεκριμένης μελέτης αποτελεί η ισχυρότερη συσχέτιση που διαπιστώθηκε μεταξύ της έκφρασης του παράγοντα Cdt1 και της γονιδιακής ενίσχυσης του υποδοχέα HER2/neu σε περιπτώσεις με χαμηλή έκφραση του p53. Σημειώνεται ότι αρκετές εργασίες έχουν δείξει ότι η θετική ανοσοϊστοχημική εντόπιση της πρωτεΐνης p53 συσχετίζεται στατιστικώς σημαντικά με την παρουσία μεταλλάξεων στο αντίστοιχο γονίδιο (Greenblatt et al., 1994). Αυτό οφείλεται στο ότι η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη παρουσιάζει μεγαλύτερο χρόνο ημιζωής σε σύγκριση με τη φυσιολογική, με αποτέλεσμα να συσσωρεύεται στα κύτταρα. Η συσχέτιση της έκφρασης του παράγοντα Cdt1 με τη γονιδιακή ενίσχυση του υποδοχέα HER2/neu στα περιστατικά με χαμηλά επίπεδα έκφρασης, άρα με φυσιολογική πρωτεΐνη p53, έρχεται σε αντίθεση με προηγούμενες μελέτες που έχουν καταδείξει ότι η υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 συσχετίζεται με χρωμοσωματικές ανωμαλίες κυρίως στις περιπτώσεις που το p53 δεν είναι λειτουργικό (Karakaidos et al., 2004; Seo et al., 2005a; Vaziri et al., 2003). Το διαφορετικό αυτό αποτέλεσμα ενδέχεται να οφείλεται στους διαφορετικούς τύπους γονιδιωματικών αλλαγών που εξετάζονται στις διαφορετικές μελέτες. Πράγματι, οι προαναφερθείσες μελέτες εξετάζουν έντονες χρωμοσωματικές ανωμαλίες, ενώ στην παρούσα μελέτη εξετάζεται μια πιο περιορισμένη γονιδιωματική αλλαγή, η γονιδιακή ενίσχυση. Το αποτέλεσμα της επαναντιγραφής του γονιδιώματος λόγω της υπερέκφρασης του παράγοντα Cdt1 ενδέχεται να εξαρτάται από την κατάσταση του p53. Σε περίπτωση

172 5. Συζήτηση που το p53 είναι μεταλλαγμένο, τα σηματοδοτικά μονοπάτια απόκρισης σε βλάβη στο DNA υπολειτουργούν, τα κύτταρα συνεχίζουν τον κυτταρικό κύκλο και δεν οδηγούνται προς απόπτωση, με αποτέλεσμα τη συνέχιση του υπερδιπλασιασμού του γονιδιώματος και την ανάπτυξη έντονων χρωμοσωματικών ανωμαλιών. Αντίθετα, στην περίπτωση που το p53 είναι φυσιολογικό, τα κύτταρα που εμφανίζουν γονιδιωματική βλάβη αναμένεται να οδηγηθούν σε παύση του κυτταρικού κύκλου και σε προσπάθεια επιδιόρθωσης του προβλήματος. Αν η βλάβη είναι έντονη, τα κύτταρα είναι πιθανό να οδηγηθούν προς απόπτωση. Η ύπαρξη περιορισμένης γονιδιωματικής βλάβης, όπως είναι ο υπερδιπλασιασμός συγκεκριμένων περιοχών του γονιδιώματος, ενδέχεται να μπορεί να επιδιορθωθεί οδηγώντας σε γονιδιακή ενίσχυση. Εικόνα 5.1: Προτεινόμενη συμβολή της έκφρασης της πρωτεΐνης p53 στη δημιουργία γονιδιακής ενίσχυσης λόγω της υπερέκφρασης του παράγοντα Cdt1. Η υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 έχει ως αποτέλεσμα την επαναπυροδότηση των αφετηριών αντιγραφής, την πρόκληση βλάβης στο DNA και τον υπερδιπλασιασμό του γονιδιώματος. Αν το p53 είναι μεταλλαγμένο, τα σηματοδοτικά μονοπάτια απόκρισης σε βλάβη στο DNA υπολειτουργούν, οπότε τα κύτταρα συνεχίζουν να διαιρούνται και δεν οδηγούνται προς απόπτωση, με αποτέλεσμα την ανάπτυξη έντονων χρωμοσωματικών ανωμαλιών. Στην περίπτωση που το p53 είναι φυσιολογικό, τα σηματοδοτικά μονοπάτια ενεργοποιούνται με αποτέλεσμα τη διακοπή της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου και την προσπάθεια επιδιόρθωσης της βλάβης. Αν η βλάβη είναι έντονη, τα κύτταρα αναμένεται να οδηγηθούν προς απόπτωση. Αντίθετα, αν η βλάβη είναι περιορισμένη, όπως είναι ο υπερδιπλασιασμός συγκεκριμένων γονιδιωματικών περιοχών, είναι πιθανό να μπορεί να επιδιορθωθεί με αποτέλεσμα τη δημιουργία γονιδιακής ενίσχυσης. Επίσης στην παρούσα μελέτη διαπιστώθηκε ότι η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του παράγοντα Cdt1 και της γονιδιακής ενίσχυσης της πρωτεΐνης HER2/neu αφορά τα δείγματα με χαμηλά επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης κυκλίνης Α. Έχει δειχθεί ότι τα επίπεδα έκφρασης του παράγοντα Cdt1 ρυθμίζονται αρνητικά μέσω αποικοδόμησης κατά

173 5. Συζήτηση τις φάσεις S και G2. Η φωσφορυλίωση του μορίου από το σύμπλοκο CDK-κυκλίνης Α είναι απαραίτητη για την αναγνώρισή του από το σύμπλοκο SCF-Skp2 και την επακόλουθη πρωτεόλυσή του (Li et al., 2003b; Nishitani et al., 2006; Sugimoto et al., 2004). Η απουσία συσχέτισης μεταξύ των επιπέδων έκφρασης του παράγοντα Cdt1 και της γονιδιακής ενίσχυσης του HER2/neu στα περιστατικά με υψηλά επίπεδα έκφρασης της κυκλίνης Α, μπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι η υπερέκφραση της κυκλίνης Α επαρκεί και εξισορροπεί την περίσσεια των μορίων Cdt1 που παραμένουν κατά τη φάση S, με αποτέλεσμα τον περιορισμό της επαναντιγραφής του γονιδιώματος και των επακόλουθων γονιδιωματικών ανωμαλιών. Με την υπόθεση αυτή συμφωνεί και το γεγονός ότι η υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 γίνεται επιβλαβής και προκαλεί υπερδιπλασιασμό του γονιδιώματος όταν λαμβάνει χώρα εκτός της φάσης G1. Πράγματι, το σύστημα πρωτεόλυσης της πρωτεΐνης Cdt1 κατά τις φάσεις S και G2 είναι αξιόπιστο και δύναται να ρυθμίσει αρνητικά ακόμα και περίσσεια εξωγενώς εκφραζόμενων μορίων Cdt1, περιορίζοντας την έκφραση τους αποκλειστικά στη φάση G1 (Xouri et al., 2007b). Εικόνα 5.2: Προτεινόμενη συμβολή της έκφρασης της πρωτεΐνης κυκλίνης Α στη δημιουργία γονιδιακής ενίσχυσης λόγω της υπερέκφρασης του παράγοντα Cdt1. Η ταυτόχρονη υπερέκφραση των παραγόντων Cdt1 και κυκλίνης Α ενδέχεται να έχει πιο ήπιες συνέπειες ως προς την εμφάνιση γονιδιωματικής αστάθειας σε σύγκριση με την υπερέκφραση μόνο του παράγοντα Cdt1. Αυτό μπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι τα υψηλά επίπεδα κυκλίνης Α επαρκούν για τη φωσφορυλίωση της περίσσειας των μορίων του παράγοντα Cdt1 και την επακόλουθη πρωτεόλυσή του κατά τη φάση S. Συνεπώς, η υπερέκφραση της κυκλίνης Α μπορεί να εξουδετερώνει εν μέρει τη γονιδιωματική αστάθεια που προκαλεί η υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1. Σε προηγούμενη μελέτη διαπιστώθηκε ότι η υπερέκφραση του παράγοντα Cdt1 σε δείγματα μη μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα συσχετίζεται στατιστικώς σημαντικά με τα επίπεδα έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα E2F1, ο οποίος έχει δειχθεί ότι ελέγχει την έκφραση του Cdt1 και άλλων παραγόντων αδειοδότησης