«Δομική και λειτουργική μελέτη του συμπλόκου Geminin/Cdt1 και μελέτη συνθετικών ενώσεων που το τροποποιούν»

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΒΑΣΙΚΩΝ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ» ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ «Δομική και λειτουργική μελέτη του συμπλόκου Geminin/Cdt1 και μελέτη συνθετικών ενώσεων που το τροποποιούν» ΚΑΡΑΝΤΖΕΛΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΜΟΡΙΑΚΟΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ & ΓΕΝΕΤΙΣΤΗΣ ΠΑΤΡΑ 2011

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΩΝ ΒΑΣΙΚΩΝ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ» ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ «Δομική και λειτουργική μελέτη του συμπλόκου Geminin/Cdt1 και μελέτη συνθετικών ενώσεων που το τροποποιούν» ΚΑΡΑΝΤΖΕΛΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΜΟΡΙΑΚΟΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ & ΓΕΝΕΤΙΣΤΗΣ Επιβλέπων Καθηγητής: Ταραβήρας Σταύρος Επίκουρος Καθηγητής Εργαστήριο Φυσιολογίας Τμήμα Ιατρικής ΠΑΤΡΑ

3 Τριμελής συμβουλευτική επιτροπή κος Ταραβήρας Σταύρος κος Φλωρδέλλης Χριστόδουλος κος Περράκης Αναστάσιος Επίκουρος Καθηγητής, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Καθηγητής, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Group Leader, Division of Biochemistry, Netherlands Cancer Institute (NKI-AVL) Επταμελής εξεταστική επιτροπή κος Ταραβήρας Σταύρος κος Φλωρδέλλης Χριστόδουλος κος Περράκης Αναστάσιος κος Καλόφωνος Χαράλαμπος κος Σταθόπουλος Κωνσταντίνος κος Καραμάνος Νικόλαος κος Χριστόπουλος Θεόδωρος Επίκουρος Καθηγητής, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Καθηγητής, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Group Leader, Division of Biochemistry, Netherlands Cancer Institute (NKI-AVL) Καθηγητής Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Αναπληρωτής Καθηγητής, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών Καθηγητής, Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Πατρών Καθηγητής, Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Πατρών 3

4 ΠΡΟΛΟΓΟΣ And now the end is near; and so I face the final curtain Όπως εύστοχα αναφέρουν και οι στίχοι του τραγουδιού, η παρούσα διδακτορική διατριβή, η οποία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Φυσιολογίας του τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών, έφτασε αισίως στην ολοκλήρωσή της. Με την ευκαιρία θα ήθελα να εκφράσω τις ειλικρινείς μου ευχαριστίες σε ορισμένα πρόσωπα, τα οποία συνέβαλαν ο καθένας με διαφορετικό αλλά εξίσου σημαντικό τρόπο, στην ολοκλήρωση της συγκεκριμένης προσπάθειας. Πρωτίστως, θα ήθελα να απευθήνω ένα μεγάλο ευχαριστώ στον επιβλέποντα καθηγητή μου κ. Ταραβήρα Σταύρο για την άψογη συνεργασία που έχουμε αναπτύξει όλα αυτά τα χρόνια. Υπήρξε πολύτιμος σύμβουλος και αρωγός σε κάθε μου βήμα. Επίσης, με δίδαξε την αφοσίωση στην εργασία και τη συνεχή προσπάθεια για το καλύτερο, αρχές οι οποίες αποτελούν πολύτιμα εφόδια για τη μελλοντική μου σταδιοδρομία. Πολύ σημαντικό τμήμα της παρούσας διδακτορικής διατριβής πραγματοποιήθηκε στο Netherlands Cancer Institute (NKI-AVL) της Ολλανδίας, υπό την επίβλεψη του κ. Περράκη Αναστάσιου (Group Leader, Ph.D.). Θα ήθελα να τον ευχαριστήσω θερμά για την αμέριστη συμπαράστασή του καθώς και για την κατανόηση που υπέδειξε απέναντί μου. Η παρουσία του υπήρξε πραγματικά καθοριστική κατά τη διάρκεια της παραμονής μου στην Ολλανδία. Επιπλέον, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον κ. Καθηγητή Φλωρδέλλη Χριστόδουλο για τις εύστοχες παρατηρήσεις και σχόλια που έκανε κατά τις μεταξύ μας συζητήσεις, με σκοπό τη βελτίωση της παρούσας διατριβής. Ευχαριστώ επίσης τα υπόλοιπα μέλη της επταμελούς εξεταστικής μου επιτροπής, κ. Καθηγητές Καλόφωνο Χαράλαμπο, Καραμάνο Νικόλαο, Χριστόπουλο Θεόδωρο και τον κ. Αναπληρωτή Καθηγητή Σταθόπουλο Κωνσταντίνο για την τιμή που μου έκαναν να συμμετέχουν σε αυτήν. Θα ήθελα επίσης να εκφράσω τις θερμές μου ευχαριστίες στην κα. Λυγερού Ζωή, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια του Τμήματος Ιατρικής, για τις ανεκτίμητες συμβουλές και την εμπιστοσύνη της. Ασφαλώς θα ήταν παράλειψη να μην αναφερθώ στους φοιτητές των εργαστηριών Φυσιολογίας και Γενικής Βιολογίας, Σαράντη Κωνσταντίνο, Καραμήτρο Δημήτρη, Σπέλλα Μάγδα, Σταθοπούλου Νάνσυ, Κυρούση Χριστίνα, Κανέλλου Αλεξάνδρα, Ρούκο Βασίλη, Δημάκη Μαρία, Ηλιού Μαρία, Κωτσαντή Παναγιώτη, Πεφάνη Δάφνη και Συμεωνίδου Ελεάννα. Ήταν αυτοί οι οποίοι συνέβαλαν στη δημιουργία ενός εξαιρετικά ευχάριστου και δημιουργικού περιβάλλοντος εργασίας. Πάνω απ όλα όμως τους ευχαριστώ, για την ξεχωριστή σχέση που αναπτύξαμε καθώς και για όλες τις στιγμές που περάσαμε μαζί και οι οποίες θα μου μείνουν σίγουρα αξέχαστες...! Τέλος, θα ήθελα να κάνω μια ξεχωριστή αναφορά στους γονείς μου και την αδερφή μου, οι οποίοι είναι πάντα δίπλα μου όλα αυτά τα χρόνια. Χωρίς τη δική τους αγάπη και κατανόηση δεν θα μπορούσα να προχωρήσω... Τους ευχαριστώ ειλικρινά. 4

5 Κλείνοντας, θα ήθελα να ολοκληρώσω αυτόν τον πρόλογο με τους παρακάτω στίχους τραγουδιού, οι οποίοι πιστεύω ότι αποτυπώνουν με γλαφυρό τρόπο τα συναισθήματα και τα βιώματα αυτού του ταξιδιού... And now the end is near; and so I face the final curtain ( ) Regrets, I ve had a few; but then again, too few to mention. I did what I had to do, and saw it through without exemption ( ) I face it all and I stood tall; and did it my way. I ve ( ) laughed and cried. I ve had my fill; my share of losing. And now, as tears subside, I find it all so amusing. To think I did all that; and may I say not in a shy way, Oh no, oh no not me, I did it my way. ( ) The record shows, I took the blows- And did it my way! Καραντζέλης Νικόλαος Ιούνιος 2011 Πάτρα 5

6 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 7 Α.1.1 Ο κυτταρικός κύκλος... 8 Α.1.2 Αντιγραφή του DNA... 8 Α Ο ρόλος των κυκλινο-εξαρτώμενων κινασών (Cyclin Dependent Kinases, CDKs) στη ρύθμιση της αντιγραφής... 8 Α.1.3 Το μοντέλο αδειοδότησης της αντιγραφής (licensing)... 9 Α Η συγκρότηση του προ-αντιγραφικού συμπλόκου (pre-rc) και η διαδικασία αδειοδότησης της αντιγραφής (licensing) Α.1.4 Ενεργοποίηση των αδειοδοτημένων (Licensed) αφετηριών αντιγραφής Α.1.5 Ρύθμιση της αδειοδότησης της αντιγραφής Α Αναστολή εκτοπικής επανέναρξης της αντιγραφής μέσω της δράσης των κυκλινο-εξαρτώμενων κινασών (CDKs) Α Αρνητική ρύθμιση του παράγοντα αδειοδότησης Cdt Α (i) Ρύθμιση του Cdt1 μέσω αποικοδόμησης Α (ii) Geminin: αρνητικός ρυθμιστής του Cdt Α.1.6 Ρύθμιση της Geminin κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου Α Ρύθμιση της Geminin σε μεταγραφικό επίπεδο Α Ρύθμιση της Geminin σε μετα-μεταφραστικό επίπεδο Α Ρύθμιση της Geminin σε επίπεδο υποκυτταρικού εντοπισμού Α.1.7 Ο ρόλος της Geminin στην κυτταρική διαφοροποίηση Α.1.8 Η λειτουργική σημασία της αλληλεπίδρασης Geminin-Cdt Α Δομική και λειτουργική περιγραφή της πρωτεΐνης Geminin Α Δομική και λειτουργική περιγραφή του παράγοντα αδειοδότησης Cdt Α Δομική και λειτουργική περιγραφή του συμπλόκου Geminin/Cdt Α Προτεινόμενοι μηχανισμοί για το ρόλο του συμπλόκου Geminin/Cdt1 στη ρύθμιση αδειοδότησης της αντιγραφής Α.1.9 Ο ρόλος των κύριων ρυθμιστών του κυτταρικού κύκλου, Cdt1 και Geminin, στη διατήρηση της γονιδιωματικής ακεραιότητας και στην κακοήθη εξαλλαγή Α Η απορρύθμιση των Cdt1 ή Geminin προκαλεί γονιδιωματική αστάθεια.. 30 Α Η αύξηση των επιπέδων του Cdt1 σχετίζεται με την κακοήθη εξαλλαγή των κυττάρων Α.1.10 Η απορρύθμιση της έκφρασης των Cdt1 και Geminin ως προσέγγιση στην αντιμετώπιση του καρκίνου Α Η σημασία της απορρύθμισης του συστήματος αδειοδότησης της αντιγραφής στην καρκινογένεση Α Η απορρύθμιση του Cdt1 εμφανίζει διαφορετική απόκριση μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων Α Ο ρόλος της απορρύθμισης της Geminin στην αντιμετώπιση του καρκίνου Β.1.1 Ανάπτυξη νέων φαρμάκων (α) Εύρεση μορίου-στόχου (β) Επιλογή της κατάλληλης μεθόδου μαζικού ελέγχου υψηλής κλίμακας (High- Throughput Screening, HTS) (γ) Αναγνώριση των ελπιδοφόρων δειγμάτων (Hit Identification)

7 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 7

8 Α.1.1 Ο κυτταρικός κύκλος Το κύτταρο αναπαράγεται διεκπεραιώνοντας μια ιεραρχική ακολουθία γεγονότων κατά τη διάρκεια των οποίων διπλασιάζει το γενετικό του υλικό και το διανέμει σε δύο θυγατρικά κύτταρα. Η διαδικασία αυτή αποκαλείται κυτταρικός κύκλος (cell cycle) και συνιστά το βασικό μηχανισμό αναπαραγωγής για όλα τα έμβια όντα. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, ο κυτταρικός κύκλος διακρίνεται στη φάση Μ και στη μεσόφαση (interphase). Η φάση Μ περιλαμβάνει τη διαίρεση του πυρήνα (μίτωση) καθώς και τη διαίρεση του κυτταροπλάσματος (κυτταροκίνηση). Η περίοδος που παρεμβάλλεται ανάμεσα σε δύο διαδοχικές κυτταρικές διαιρέσεις (φάσεις Μ) αποκαλείται μεσόφαση. Κατά τη διάρκεια μιας συγκεκριμένης χρονικής περιόδου της μεσόφασης, η οποία ονομάζεται φάση S, πραγματοποιείται η αντιγραφή του DNA. Η φάση S του κυτταρικού κύκλου πλαισιώνεται από τις φάσεις G1 και G2, οι οποίες παρέχουν στο κύτταρο τον απαιτούμενο χρόνο για να αυξηθεί σε μέγεθος. Η φάση G1 είναι το μεσοδιάστημα ανάμεσα στο τέλος της φάσης Μ και την έναρξη της φάσης S, ενώ η φάση G2 είναι το μεσοδιάστημα ανάμεσα στο τέλος της σύνθεσης του DNA (φάση S) και την έναρξη της μίτωσης (φάση Μ) (Alberts, 2000). Α.1.2 Αντιγραφή του DNA Η αντιγραφή του DNA στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς είναι μια συντηρημένη διαδικασία. Η αλληλουχία των γεγονότων καθώς και οι πρωτεΐνες που συμμετέχουν στη συγκεκριμένη διαδικασία εμφανίζουν σημαντική ομοιότητα εξελικτικά, από το ζυμομύκητα μέχρι και τους ανώτερους οργανισμούς. Η ακριβής και πλήρης αντιγραφή του γενετικού υλικού είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας. Για το λόγο αυτό, το κύτταρο έχει αναπτύξει μηχανισμούς ελέγχου, οι οποίοι βεβαιώνουν ότι κάθε τμήμα DNA αντιγράφεται πλήρως και μία μόνο φορά σε κάθε κυτταρικό κύκλο (DePamphilis, 2006). Α Ο ρόλος των κυκλινο-εξαρτώμενων κινασών (Cyclin Dependent Kinases, CDKs) στη ρύθμιση της αντιγραφής Η ρύθμιση της αντιγραφής του DNA εξαρτάται σε σημαντικό βαθμό από την ενεργότητα των κυκλινο-εξαρτώμενων κινασών (CDKs). Πρόκειται για οικογένεια κινασών σερίνηςθρεονίνης που ετεροδιμερίζονται με μέλη της οικογένειας των κυκλινών και ενεργοποιούνται σε συγκεκριμένα σημεία του κυτταρικού κύκλου. Στο σύμπλοκο που σχηματίζεται η κυκλίνη έχει ρυθμιστικό ρόλο ενώ η κινάση εμφανίζει καταλυτική ενεργότητα (Harper and Adams, 2001). 8

9 Κατά το τέλος της φάσης Μ του κυτταρικού κύκλου, η ελάττωση του επιπέδου ενεργότητας των CDKs προάγει την έναρξη ενός νέου κύκλου αντιγραφής του γενετικού υλικού. Κατά την είσοδο στη φάση S, η παρατηρούμενη αύξηση του επιπέδου ενεργότητας των CDKs πυροδοτεί την έναρξη της αντιγραφής ενώ ταυτόχρονα παρεμποδίζει την εκτοπική επανέναρξή της. Σύμφωνα με το παραπάνω μοντέλο, η έναρξη της αντιγραφής λαμβάνει χώρα μία και μόνο φορά σε κάθε κυτταρικό κύκλο και με την προϋπόθεση ότι έχει ολοκληρωθεί προηγουμένως, η φάση Μ. Το γεγονός αυτό οφείλεται στην περιοδική διακύμανση της ενεργότητας των CDKs κατά τη διάρκεια κάθε κυτταρικού κύκλου (Wuarin and Nurse, 1996). Διαφορετικά σύμπλοκα CDKs απαιτούνται για τη μετάβαση μεταξύ των διαφορετικών φάσεων του κυτταρικού κύκλου (εικ. 1.1). Στα μετάζωα, οι κυκλίνες της οικογένειας D (κυκλίνες D1, D2, D3) ενεργοποιούν τις κινάσες Cdk4/6 και είναι απαραίτητες για την είσοδο στη φάση G1. Οι κυκλίνες της οικογένειας Ε (κυκλίνες Ε1, Ε2) ενεργοποιούν την κινάση Cdk2, ρυθμίζοντας έτσι τη μετάβαση G1/S. Επίσης, οι κυκλίνες Α (κυκλίνες Α1, Α2) προσδένονται στην κινάση Cdk2 και το σύμπλοκο αυτό είναι απαραίτητο για την είσοδο στη φάση S. Τέλος, η είσοδος στη φάση Μ προάγεται από τα σύμπλοκα κυκλίνης A-Cdk1 και κυκλίνης Β-Cdk1 [ανασκόπησηη σε (Vermeulen et al., 2003)]. Εικόνα 1.1: Σχηματική αναπαράσταση της δραστηριότητας των συμπλόκων κυκλινο- εξαρτώμενων κινασών, κατά τα διαφορετικά στάδια της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου, στα μετάζωα (τροποποίηση από van den Heuvel, 2005). Α.1.3 Το μοντέλο αδειοδότησης της αντιγραφής (licensing) Η μεταβολή της ενεργότητας των CDKs διασφαλίζει την αυστηρή εναλλαγή των φάσεων S και Μ και την ορθή χρονικά έναρξη της αντιγραφής. 9

10 Οι Blow και Laskey το 1988 διετύπωσαν το μοντέλο αδειοδότησης της αντιγραφής (licensing). Σύμφωνα με το συγκεκριμένο μοντέλο, η αντιγραφική διαδικασία διαχωρίζεται σε δύο επιμέρους, μη επικαλυπτόμενες φάσεις. Η πρώτη φάση οριοθετείται από το τέλος της μίτωσης μέχρι και την αρχή της G1 και κατά τη διάρκειά της επιτελείται η αδειοδότηση των αφετηριών της αντιγραφής, χωρίς όμως να είναι δυνατή η αντιγραφή του DNA. Στη δεύτερη φάση (φάση S) πραγματοποιείται η αντιγραφή του γενετικού υλικού από τις ήδη αδειοδοτημένες αφετηρίες, χωρίς ωστόσο να μπορούν αυτές να αδειοδοτηθούν εκ νέου (Blow and Laskey, 1988). Επιπλέον, πειράματα μελέτης της δομής της χρωματίνης στο ζυμομύκητα S. Cerevisiae (Diffley et al., 1994) έδειξαν ότι οι αφετηριές της αντιγραφής εναλλάσσονται μεταξύ δύο διακριτών καταστάσεων. Οι καταστάσεις αυτές χαρακτηρίζονται από την παρουσία αντίστοιχων πολυπρωτεϊνικών συμπλόκων στα σημεία έναρξης της αντιγραφής. Καθ όλη τη διάρκεια της φάσης G1 και πριν την έναρξη της αντιγραφής, σχηματίζεται στις αφετηρίες της αντιγραφής (origins of replication) το πολυπρωτεϊνικό προ-αντιγραφικό σύμπλοκο (pre-replicative complex, pre-rc), το οποίο αδειοδοτεί τις αφετηρίες (licensed state). Ακολούθως, από την έναρξη της φάσης S μέχρι και το τέλος της μίτωσης, σχηματίζεται στις αφετηρίες της αντιγραφής το πολυπρωτεϊνικό μετα-αντιγραφικό σύμπλοκο (postreplicative complex, post-rc), το οποίο αποτελείται από λιγότερες υπομονάδες συγκριτικά με το προ-αντιγραφικό σύμπλοκο. Η χρωματίνη σε αυτήν την κατάσταση δεν μπορεί να υποστηρίξει εκ νέου την αντιγραφή και αποτρέπει την επαναπυροδότηση των αφετηριών (unlicensed state). Α Η συγκρότηση του προ-αντιγραφικού συμπλόκου (pre-rc) και η διαδικασία αδειοδότησης της αντιγραφής (licensing) H αδειοδότηση της αντιγραφής του DNA αποτελεί συντηρημένη διαδικασία από τους κατώτερους έως τους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς και προϋποθέτει το σχηματισμό του πολυπρωτεϊνικού προ-αντιγραφικού συμπλόκου (pre-rc) στις αφετηρίες της αντιγραφής, κατά τη φάση G1 του κυτταρικού κύκλου. Η διαδικασία αυτή περιλαμβάνει τη διαδοχική στρατολόγηση πρωτεϊνικών παραγόντων αδειοδότησης της αντιγραφής (εικ. 1.2). Αρχικά, πραγματοποιείται η πρόσδεση του εξαμερούς συμπλόκου ORC (Origin Recognition Complex) στις θέσεις έναρξης της αντιγραφής (Fujita et al., 2002). Μετά την ολοκλήρωση της μίτωσης, στρατολογούνται στη χρωματίνη οι πρωτεΐνες Cdc6 και Cdt1, οι οποίες προσδένονται ανεξάρτητα μεταξύ τους. Οι παραπάνω πρωτεϊνικοί παράγοντες δρουν συνεργατικά για τη στρατολόγηση του εξαμερούς συμπλόκου MCM2-7 (Mini-Chromosome- Maintenance proteins) στη χρωματίνη (Bell and Dutta, 2002; Gillespie et al., 2001; Nishitani and Lygerou, 2002). Η παρουσία των ORC, Cdc6 και Cdt1 είναι απαραίτητη μόνο για την αρχική προσέλκυση των MCMs στις αφετηρίες αντιγραφής, αλλά όχι για τη μετέπειτα πρόσδεση και συνεχή παρουσία του συμπλόκου στη χρωματίνη (Donovan et al., 1997; Hua 10

11 and Newport, 1998; Maiorano et al., 2000; Rowles et al., 1999). Το εξαμερές σύμπλοκο MCM2-7 έχει δειχθεί in vitro ότι διαθέτει ενεργότητα ελικάσης και πιθανόνν να προκαλεί ξετύλιγμα της δίκλωνης έλικας του DNA, μπροστά από τη διχάλα της αντιγραφής (Bochman and Schwacha, 2008; Ishimi, 1997; Labib and Diffley, 2001; Moyer et al., 2006). Με τη στρατολόγηση των MCMs, ολοκληρώνεται η συγκρότηση του προ-αντιγραφικοδιαδικασία της αδειοδότησης συμπλόκου και κατ επέκταση η (licensing). πρόσδεση των ORC στις αφετηρίες αντιγραφής πρόσδεση των Cdc6 και Cdt1 στρατολόγηση του συμπλόκου MCM2-7 στη χρωματίνη και αδειοδότηση της αντιγραφής Εικόνα 1.2: Μοντέλο αδειοδότησης (licensing) της αντιγραφής του DNA. Η αδειοδότηση της αντιγραφής ξεκινά κατά το τέλος της μίτωσης και περιλαμβάνει τη διαδοχική πρόσδεση επί των αφετηριών: του πολυπρωτεϊνικού συμπλόκου ORC, του Cdc6, του Cdt1 και του ετεροεξαμερούς συμπλόκου MCM2-7. Με τη στρατολόγηση του συμπλόκου των πρωτεϊνών MCM στη χρωματίνη ολοκληρώνεται ο σχηματισμός του προ-αντιγραφικού συμπλόκου και κατ επέκταση η διαδικασία της αδειοδότησης [τροποποίηση από (Dutta, 2007)]. Α.1.4 Ενεργοποίηση των αδειοδοτημένων (Licensed) αφετηριών αντιγραφής Η ενεργοποίηση του προ-αντιγραφικού συμπλόκου, κατά τη μετάβαση από τη G1 στη φάση S του κυτταρικού κύκλου, συνεπάγεται την έναρξη της αντιγραφής του DNA. Η ενεργοποίηση αυτή απαιτεί τη δράση δύο κατηγοριών κινασών: των κυκλινο-εξαρτώμενωκαι της κινάσης DDK (Dbf4-dependent kinase) (Johnston et κινασών της φάσης S (S-Cdks) al., 1999). Η δράση αυτών συμβάλλει στη στρατολόγηση επί των αφετηριών πρόσθετων βασικών παραγόντων για την έναρξη της αντιγραφής, όπως η πρωτεΐνη Cdc45 (Jares and Blow, 2000; Masuda et al., 2003; Wohlschlegel et al., 2000; Zou and Stillman, 2000) και το πολυπρωτεϊνικό σύμπλοκο GINS (Lei and Tye, 2001). Η πρωτεΐνη Cdc45 προκαλεί ξετύλιγμα της δίκλωνης έλικας του DNA (Nedelcheva et al., 2005; Pacek and Walter, 2004) και επίσης προσελκύει άλλες πρωτεΐνες απαραίτητες για την αντιγραφή, όπως την αντιγραφική πρωτεΐνη Α (replication protein, RPA), τις DNA πολυμεράσες α και ε και το PCNA (Mimura and Takisawa, 1998; Miyake and Yamashita, 1998; Owens et al., 1997; Takisawa et al., 2000; Tercero et al., 2000; Walter and Newport, 2000). Το πολυπρωτεϊνικό σύμπλοκο GINS συμβάλλει στη σταθεροποίηση των Cdc45 και DNA πολυμεράσης α στις αφετηρίες, στο ξετύλιγμα της δίκλωνης έλικας του DNA καθώς και στην προσέλκυση 11

12 άλλων πρωτεϊνικών παραγόντων της αντιγραφής, όπως η RPA, η MCM10 και η τοποϊσομεράση Ι (Aparicio et al., 1997; Gambus et al., 2006; Kanemaki et al., 2003; Tercero et al., 2000). Μετά την πυροδότηση της αντιγραφής, τα συστατικά του προ-αντιγραφικού συμπλόκου απομακρύνονται από τις αφετηρίες και η χρωματίνη μεταβαίνει στην κατάσταση η οποία χαρακτηρίζεται από την παρουσία του μετα-αντιγραφικού συμπλόκου (post-rc) (Diffley et al., 1994). Στην κατάσταση αυτή (unlicensed state) είναι αδύνατη η επανέναρξη της αντιγραφής, μέχρι και την ολοκλήρωση της μίτωσης. Α.1.5 Ρύθμιση της αδειοδότησης της αντιγραφής Α Αναστολή εκτοπικής επανέναρξης της αντιγραφής μέσω της κυκλινο-εξαρτώμενων κινασών (CDKs) δράσης των Η αυστηρή ρύθμιση της αδειοδότησης της αντιγραφής διασφαλίζει τη γονιδιωματική ακεραιότητα του κυττάρου. Σε αυτή τη διαδικασία σημαντικό ρόλο διαδραματίζουν οι κυκλινο-εξαρτώμενες κινάσες (CDKs), όπως αναφέρθηκε και παραπάνω. Το επίπεδο ενεργότητας των CDKs καθορίζει τη χρονική στιγμή συγκρότησης του προ-αντιγραφικού συμπλόκου στις αφετηρίες αντιγραφής καθώς και την ενεργοποίηση του συστήματος αδειοδότησης (εικ. 1.3). Εικόνα 1.3: Ο ρόλος της ενεργότητας των CDKs στη ρύθμιση του συστήματος αδειοδότησης της αντιγραφής (Replication Licensing System, RLS). Το προ-αντιγραφικό σύμπλοκο συγκροτείται στο τέλος της φάσης Μ, όταν η ενεργότητα των CDKs είναι χαμηλή (πράσινο χρώμα). Η ενεργοποίηση του RLS, για την έναρξη της αντιγραφής, πραγματοποιείται στο τέλος της G1 φάσης, λόγω αύξησης της ενεργότητας των CDKs (ροζ χρώμα). [τροποποίηση από (Blow and Hodgson, 2002)]. 12

13 Οι ευκαρυωτικοί οργανισμοί διαθέτουν διάφορους μηχανισμούς οι οποίοι παρεμποδίζουν την εκτοπική επανέναρξη της αντιγραφής. Η λειτουργία των συγκεκριμένων μηχανισμών εξαρτάται από την αυξημένη ενεργότητα των CDKs, η οποία αναστέλλει τον εκ νέου σχηματισμό προ-αντιγραφικών συμπλόκων. Μάλιστα, διάφορες μελέτες υποδεικνύουν ότι η αναστολή αυτή βασίζεται στη φωσφορυλίωση, μέσω των CDKs, τριών τουλάχιστων συστατικών του προ-αντιγραφικού συμπλόκου (ORC, Cdc6 και MCMs). Σε ανθρώπινα κύτταρα, η φωσφορυλίωση της υπομονάδας Orc1 από τις CDKs προκαλεί την αποικοδόμησή της, μέσω του συμπλόκου SCF Skp2 (Mendez et al., 2002). Αντίστοιχες μελέτες σε εκχυλίσματα από ωοκύτταρα του Xenopus προτείνουν ότι η δράση των CDKs οδηγεί σε αποδέσμευση του συμπλόκου ORC από τη χρωματίνη, χωρίς ωστόσο να αποδεικνύουν άμεσα ότι η αποδέσμευση αυτή οφείλεται στη φωσφορυλίωση του ORC (Hua and Newport, 1998; Rowles et al., 1999). Προτείνεται ότι η φωσφορυλίωση του συμπλόκου ORC από τις CDKs ενδέχεται να το αποσταθεροποιεί, ή να αναστέλλει την πρόσδεσή του στο DNA, ή ακόμη να παρεμποδίζει την αλληλεπίδρασή του με τα υπόλοιπα συστατικά του pre-rc (Bell and Dutta, 2002). Όσον αφορά τον παράγοντα αδειοδότησης Cdc6, έχει δειχθεί η φωσφορυλίωσή του από τις CDKs τόσο in vitro όσο και in vivo (Dutta and Bell, 1997). Η φωσφορυλίωση αυτή προκαλεί την αποικοδόμηση της πρωτεΐνης στους ζυμομύκητες S. Pombe και S. Cerevisiae, ενώ στα μετάζωα έχει ως αποτέλεσμα την έξοδο από τον πυρήνα του κλάσματος της πρωτεΐνης, το οποίο δεν είναι δεσμευμένο στη χρωματίνη. Ωστόσο, πειράματα μεταλλάξεων στις θέσεις φωσφορυλίωσης του Cdc6 από τις CDKs δεν έχουν δείξει υπερδιπλασιασμό του γονιδιώματος, υποδεικνύοντας έτσι ότι ο συγκεκριμένος μηχανισμός ρύθμισης του Cdc6 δεν συμβάλλει άμεσα στην αποτροπή της εκτοπικής επανέναρξης της αντιγραφής (Alexandrow and Hamlin, 2004; Calzada et al., 2000; Delmolino et al., 2001; Drury et al., 1997; Herbig et al., 2000; Perkins et al., 2001; Petersen et al., 1999; Saha et al., 1998; Vaziri et al., 2003). Σχετικά με τη ρύθμιση των MCMs, φαίνεται επίσης να εξαρτάται από τη δράση των CDKs μολονότι ο μηχανισμός αυτής της ρύθμισης δεν έχει πλήρως χαρακτηριστεί. Μελέτες έχουν δείξει ότι οι υπομονάδες Mcm2 και Mcm4 φωσφορυλιώνονται από τις CDKs τόσο in vitro όσο και in vivo (Findeisen et al., 1999; Fujita et al., 1998; Hendrickson et al., 1996; Ishimi and Komamura-Kohno, 2001; Pereverzeva et al., 2000). Όσον αφορά την επίδραση αυτών των φωσφορυλιώσεων στη λειτουργικότητα των MCMs έχουν προταθεί διάφοροι μηχανισμοί. Ένας από αυτούς αναφέρεται στην in vitro αναστολή της ενεργότητας ελικάσης του ορθολόγου MCM4/6/7 στον ποντικό (Ishimi and Komamura-Kohno, 2001). Επίσης έχει προταθεί ότι η φωσφορυλίωση από τις CDKs επηρεάζει τον πυρηνικό εντοπισμό των MCMs. Συγκεκριμένα, μελέτες στο ζυμομύκητα S. Cerevisiae έχουν δείξει ότι οι MCMs εμφανίζουν πυρηνικό εντοπισμό κατά τη διάρκεια των φάσεων G1 και S του κυτταρικού κύκλου, ενώ κατά τις φάσεις G2 και Μ παρατηρείται έξοδός τους από τον πυρήνα. Απενεργοποίηση των CDKs προκαλεί παραμονή των MCMs στον πυρήνα (Hennessy et al., 1990; Labib et al., 1999; Nguyen et al., 2000). Επιλέον, ένας τρίτος πιθανός μηχανισμός ρύθμισης των MCMs αφορά την αποδέσμευση του συμπλόκου από τη χρωματίνη και την αναστολή 13

14 επαναπρόσδεσής του σε αυτήν, λόγω της δράσης των CDKs. Μελέτες στο Xenopus laevis έχουν δείξει ότι η υπερφωσφορυλίωση της υπομονάδας XlMcm4 σχετίζεται με αποδέσμευση των MCMs από τη χρωματίνη (Coue et al., 1996; Findeisen et al., 1999; Hendrickson et al., 1996; Pereverzeva et al., 2000). Επιπροσθέτως, σύμφωνα με βιοχημικές μελέτες τα υπερφωσφορυλιωμένα MCM σύμπλοκα δεν είναι ικανά να προσδεθούν στη χρωματίνη (Pereverzeva et al., 2000). Εκτός από τη δράση των CDKs, o βασικός μηχανισμός μέσω του οποίου οι ανώτεροι ευκαρυωτικοί οργανισμοί διασφαλίζουν την παρεμπόδιση του επαναδιπλασιασμού του DNA, κατά τη διάρκεια του ίδιου κυτταρικού κύκλου, αφορά την αρνητική ρύθμιση του παράγοντα αδειοδότησης Cdt1. Ο συγκεκριμένος μηχανισμός θα συζητηθεί παρακάτω. Α Αρνητική ρύθμιση του παράγοντα αδειοδότησης Cdt1 Ο παράγοντας Cdt1 διαδραματίζει πολύ σημαντικό ρόλο στη διαδικασία αδειοδότησης της αντιγραφής και για το λόγο αυτό υφίσταται πολύ αυστηρή ρύθμιση, προκειμένου η δράση του να περιορίζεται αποκλειστικά και μόνο κατά τη διάρκεια της φάσης G1 του κυτταρικού κύκλου. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης αυξάνονται κατά τη φάση G1 (Nishitani et al., 2001), ενώ με την έναρξη της αντιγραφής, το μόριο υφίσταται αρνητική ρύθμιση, κυρίως μέσω δύο διαφορετικών μηχανισμών: (α) της ουβικουϊτινο-εξαρτώμενης πρωτεόλυσης της πρωτεΐνης (Arias and Walter, 2006; Li et al., 2003; Nishitani et al., 2004; Senga et al., 2006) και (β) της αλληλεπίδρασής της με την πρωτεΐνη Geminin, η οποία συνιστά το φυσικό αναστολέα του Cdt1 (McGarry and Kirschner, 1998; Tada et al., 2001; Wohlschlegel et al., 2000). Α (i) Ρύθμιση του Cdt1 μέσω αποικοδόμησης Στα ανθρώπινα κύτταρα, η σηματοδότηση του Cdt1 για αποικοδόμηση πραγματοποιείται μέσω της δράσης των λιγασών ουβικουϊτίνης SCF-Skp2 και DDB1-Cul4-Cdt2. Η πρωτεόλυση του Cdt1 μέσω SCF-Skp2 προϋποθέτει τη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης από τις CDKs (Li et al., 2003; Liu et al., 2004; Nishitani et al., 2004; Sugimoto et al., 2004), ενώ ο μηχανισμός αποικοδόμησης μέσω DDB1-Cul4-Cdt2 βασίζεται στην αλληλεπίδραση του Cdt1 με την πρωτεΐνη PCNA (Hu and Xiong, 2006; Nishitani et al., 2006; Senga et al., 2006). Επιπλέον, έχει δειχθεί ότι το μονοπάτι πρωτεόλυσης του Cdt1 μέσω DDB1-Cul4-Cdt2 ενεργοποιείται ως απόκριση σε βλάβη του DNA, γεγονός που επιβεβαιώνει τη σημασία αυστηρής ρύθμισης της πρωτεΐνης (Higa et al., 2003; Hu et al., 2004; Kondo et al., 2004). Α (ii) Geminin: αρνητικός ρυθμιστής του Cdt1 Τα μετάζωα έχουν αναπτύξει έναν επιπλέον μηχανισμό για την παρεμπόδιση της εκτοπικής επανέναρξης της αντιγραφής, ο οποίος βασίζεται στη δράση της πρωτεΐνης Geminin. Πρόκειται για μια πρωτεΐνη μικρού μοριακού μεγέθους (25 kda περίπου), που 14

15 ανακαλύφθηκε αρχικά στο Xenopus laevis ως υπόστρωμα του πρωτεολυτικού συμπλόκου APC (Anaphase Promoting Complex), το οποίο συμβάλλει στη μετάβαση από τη μετάφαση στην ανάφαση (McGarry and Kirschner, 1998). Η Geminin έχει ταυτοποιηθεί στον άνθρωπο, στο Xenopus (McGarry and Kirschner, 1998), στη Drosophila (Quinn et al., 2001), στον ποντικό (Yanagi et al., 2002), στο C. Elegans (Yanagi et al., 2005), ενώ ακόμα δεν έχει υπάρξει κάποια ένδειξη για ομόλογό της στο ζυμομύκητα. H Geminin συνιστά το φυσικό αναστολέα του παράγοντα Cdt1, καθώς προσδένεται ισχυρά στον τελευταίο μετά την έναρξη της αντιγραφής. Η μεταξύ τους αλληλεπίδραση και η δημιουργία του συμπλόκου Geminin/Cdt1 αναστέλλει τη συγκρότηση του προ-αντιγραφικού συμπλόκου και αποτελεί έναν επιπλέον μηχανισμό αρνητικής ρύθμισης της αδειοδότησης (Cook et al., 2004; McGarry and Kirschner, 1998; Tada et al., 2001; Wohlschlegel et al., 2000). Α.1.6 Ρύθμιση της Geminin κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου Με την έναρξη της φάσης S του κυτταρικού κύκλου παρατηρείται συσσώρευση της Geminin στον πυρήνα, όπου και παραμένει μέχρι το τέλος της μίτωσης (McGarry and Kirschner, 1998; Tada et al., 2001; Wohlschlegel et al., 2000). Η επακόλουθη απενεργοποίηση της Geminin είναι απαραίτητη για την έναρξη ενός νέου κύκλου αντιγραφής του DNA και πραγματοποιείται μέσω των παρακάτω μηχανισμών. Α Ρύθμιση της Geminin σε μεταγραφικό επίπεδο Η ρύθμιση της Geminin σε μεταγραφικό επίπεδο πραγματοποιείται μέσω του μονοπατιού Rb/E2F. Οι μεταγραφικοί παράγοντες της οικογένειας E2F επάγουν την έκφραση των γονιδίων στόχων τους όταν δεν βρίσκονται σε σύμπλοκο με την πρωτεΐνη του ρετινοβλαστώματος (Rb). Σε κύτταρα με ανενεργό Rb παρατηρήθηκε συστατική (constitutive) αύξηση των επιπέδων της Geminin. Δεδομένου ότι η πρωτεΐνη Rb εμφανίζεται ανενεργή κατά το στάδιο μετάβασης G1/S και ενεργή κατά το τέλος της μίτωσης, το μονοπάτι Rb/E2F συμβάλλει στη ρύθμιση των επιπέδων της Geminin κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου (Markey et al., 2004; Yoshida and Inoue, 2004). Α Ρύθμιση της Geminin σε μετα-μεταφραστικό επίπεδο Κατά το τέλος της μίτωσης, παρατηρείται ελάττωση των πρωτεϊνικών επιπέδων της Geminin, λόγω αποικοδόμησης. Η αποικοδόμηση αυτή βασίζεται στη δράση του συμπλόκου APC, το οποίο σηματοδοτεί τη Geminin για πρωτεόλυση μέσω ουβικουϊτινυλίωσης (McGarry and Kirschner, 1998). Σε εκχυλίσματα από ωοκύτταρα του Xenopus έχει δειχθεί ότι η ενδογενής Geminin δεν πρωτεολύεται πλήρως και το υπόλοιπο ποσοστό αυτής υφίσταται μη-πρωτεολυτική απενεργοποίηση. Ο συγκεκριμένος μηχανισμός ρύθμισης απαιτεί τη CDK-εξαρτώμενη πολυουβικουϊτινυλίωση της πρωτεΐνης. Πρόκειται για μία παροδική μετα-μεταφραστική 15

16 τροποποίηση, η οποία καθιστά τη Geminin ανενεργή. Αν και η φύση της απενεργοποίησης δεν είναι πλήρως τεκμηριωμένη, έχει προταθεί ότι η πολυ-ουβικουϊτινυλίωση ενδέχεται να οδηγεί το μόριο σε ανενεργή στερεοδιάταξη (Li and Blow, 2004). Α Ρύθμιση της Geminin σε επίπεδο υποκυτταρικού εντοπισμού Η πρώτη ένδειξη για τη ρύθμιση της Geminin μέσω αλλαγής της ενδοκυτταρικής της κατανομής προέκυψε από μελέτη στο Xenopus, η οποία έδειξε ότι το ποσοστό της ενδογενούς Geminin που δεν έχει αποικοδομηθεί κατά το τέλος της μετάφασης, δεν έχει την ικανότητα αλληλεπίδρασης με τον παράγοντα Cdt1. Η ικανότητα αυτή επανακτάται μόνο μετά από τη μεταφορά της Geminin στον πυρήνα του κυττάρου (Hodgson et al., 2002). Επόμενες μελέτες έδειξαν ότι ο πυρηνικός εντοπισμός της Xgeminin είναι απαραίτητος για την παρεμπόδιση του επαναδιπλασιασμού του DNA καθώς και για την επαγωγή της νευρωνικής διαφοροποίησης, παρέχοντας έτσι ενδείξεις για τη λειτουργική σημασία του συγκεκριμένου μηχανισμού ρύθμισης (Yoshida et al., 2005). Η αμινοξική περιοχή της Xgeminin, η οποία είναι υπεύθυνη για τη μεταφορά της στον πυρήνα, εντοπίζεται στο αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης και περιλαμβάνει τα κατάλοιπα 59-79, τα οποία έχουν δράση σήματος πυρηνικού εντοπισμού (Nuclear Localization Signal, NLS) (Benjamin et al., 2004; Boos et al., 2006; Yoshida et al., 2005). Εκτός από το σύστημα του Xenopus, παρόμοια αποτελέσματα προέκυψαν και στην όρνιθα. Πρόσφατη μελέτη στο συγκεκριμένο είδος έδειξε ότι η ενδοκυτταρική κατανομή της Geminin καθορίζεται από την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου. Επιπλέον, ο πυρηνικός εντοπισμός της πρωτεΐνης είναι απαραίτητος για την αναστολή της στρατολόγησης των MCMs στη χρωματίνη, καθώς και για τη ρύθμιση της έκφρασης των Hox γονιδίων (Luo et al., 2007). Σχετική μελέτη πραγματοποιήθηκε και στο εργαστήριό μας και αφορούσε τη ρύθμιση του μορίου της Geminin σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα, μέσω αλλαγής του ενδοκυτταρικού του εντοπισμού. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο ενδοκυτταρικός εντοπισμός της εξωγενούς hgeminin σχετίζεται με τη φάση του κυτταρικού κύκλου. Συγκεκριμένα, πυρηνικός αποκλεισμός της πρωτεΐνης εμφανίζεται μόνο σε κύτταρα που βρίσκονται στη G1 φάση. Επίσης, σύμφωνα με τη συγκεκριμένη μελέτη, η μετατόπιση της hgeminin από το κυτταρόπλασμα στον πυρήνα απαιτεί την άμεση αλληλεπίδρασή της με τον παράγοντα hcdt1 (Δημάκη Μ., διδακτορική διατριβή, 2008). Η σημασία της αλληλεπίδρασης Cdt1-Geminin όσον αφορά τον πυρηνικό εντοπισμό της τελευταίας έχει επισημανθεί και σε προηγούμενες μελέτες. Συγκεκριμένα, χρησιμοποιώντας εκχυλίσματα από ωοκύτταρα του Xenopus και HEK-293 κύτταρα, έχει δειχθεί ότι ο παράγοντας Cdt1 είναι απαραίτητος για τον πυρηνικό εντοπισμό της hgeminin, όπως επίσης και μεταλλαγμένων μορφών της Xgeminin, οι οποίες δε φέρουν NLS αλληλουχία (Boos et al., 2006; Yoshida et al., 2005). 16

17 Α.1.7 Ο ρόλος της Geminin στην κυτταρική διαφοροποίηση Εκτός από το ρόλο της Geminin, όσον αφορά την αδρανοποίηση του Cdt1 από την S φάση έως τη μίτωση, η πρωτεΐνη συμμετέχει επίσης στη ρύθμιση της κυτταρικής διαφοροποίησης, μέσω της αλληλεπίδρασής της με άλλα πρωτεϊνικά μόρια. Συγκεκριμένα, έχει δειχθεί ότι η Geminin προσδένεται άμεσα σε μεταγραφικούς παράγοντες και πρωτεϊνικά σύμπλοκα με ενεργότητα αναδιοργάνωσης της χρωματινικής δομής, όπως: οι μεταγραφικοί παράγοντες Homeobox (Luo et al., 2004) και Six3 (Del Bene et al., 2004), μέλη της οικογένειας των Polycomb (Luo et al., 2004) και οι καταλυτικές υπομονάδες Brahma και Brg1 του συμπλόκου αναδιοργάνωσης της χρωματινικής δομής SWI/SNF (Seo et al., 2005b). Τα μέλη της οικογένειας των Hox γονιδίων δρουν ως μεταγραφικοί παράγοντες και κατέχουν πολύ σημαντικό ρόλο κατά τη διαδικασία της εμβρυονικής ανάπτυξης, συμβάλοντας στην ταυτοποίηση των διάφορων αναπτυσσόμενων τμημάτων κατά μήκος του εμπρόσθιου-οπίσθιου άξονα (Krumlauf, 1994). Μελέτες στην όρνιθα έχουν δείξει ότι, η αλληλεπίδραση της Geminin με τις πρωτεΐνες Hox παρεμποδίζει την πρόσδεση των τελευταίων στο DNA, με συνέπεια την αναστολή της εξαρτώμενης από τις Hox πρωτεΐνες μεταγραφικής ενεργοποίησης των γονιδίων-στόχων (Luo et al., 2004). Επιπλέον, η Geminin μπορεί να αποτρέψει έμμεσα τη δράση των Hox πρωτεϊνών, αλληλεπιδρώντας με πρωτεΐνες της οικογένειας των Polycomb, οι οποίες καταστέλλουν τη μεταγραφή των Hox γονιδίων. Η αμινοξική περιοχή της Geminin η οποία είναι υπεύθυνη για την αλληλεπίδραση με τις Hox πρωτεΐνες αλληλοεπικαλύπτεται με την περιοχή πρόσδεσης του Cdt1. Το γεγονός αυτό έχει προταθεί για τη δημιουργία ενός ανταγωνισμού, όσον αφορά την αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών Hox και Cdt1 με τη Geminin. Σε περίπτωση που η Geminin είναι προσδεδεμένη στον παράγοντα Cdt1, τότε οι Hox πρωτεΐνες είναι ελεύθερες να δράσουν, επάγοντας τη μεταγραφή των γονιδίων-στόχων και κατ επέκταση τη διαφοροποίηση. Στην αντίθετη περίπτωση, η πρωτεϊνική αλληλεπίδραση Geminin-Hox αναστέλλει τη διαφοροποίηση και ο παράγοντας Cdt1-όντας πλέον ελεύθερος-επάγει την αδειοδότηση της αντιγραφής και κατ επέκταση τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό (Luo and Kessel, 2004). Μελέτες στον ιχθύ Oryzias latipes έδειξαν ότι η Geminin αλληλεπιδρά άμεσα με το μεταγραφικό παράγοντα Six3 (Del Bene et al., 2004). Με τον τρόπο αυτόν η Geminin ανταγωνίζεται τη μεταγραφική ενεργότητα του Six3, χωρίς ωστόσο να επηρεάζει την ικανότητα πρόσδεσής του στο DNA. Ο μεταγραφικός παράγοντας Six3 κατέχει σημαντικό ρόλο κατά τη διαδικασία πολλαπλασιασμού των πρόδρομων κυττάρων στην ίριδα του ματιού (Carl et al., 2002). Αυξημένες δόσεις της Geminin στο έμβρυο προκαλούν ελάττωση του μεγέθους των οφθαλμών, εμφάνιση κυκλωπίας και απώλεια του εμπρόσθιου τμήματος του εγκεφάλου. Επιπλέον, η ίδια μελέτη έδειξε in vitro ότι υπάρχει ανταγωνισμός μεταξύ των πρωτεϊνών Six3 και Cdt1 για πρόσδεση στη Geminin (Del Bene et al., 2004). Ιδιαίτερα σημαντικός είναι ο ρόλος της Geminin και κατά τη διαδικασία της νευρογένεσης. Μελέτες στο Xenopus έχουν δείξει ότι η υπερέκφραση του γονιδίου της 17

18 Geminin προκαλεί επέκταση της νευρικής πλάκας εις βάρος της παρακείμενης νευρικής ακρολοφίας και επιδερμίδας (Kroll et al., 1998). Υπερέκφραση της Geminin στη Drosophila προκαλεί εκτοπική γένεση νευρικού ιστού, ενώ έμβρυα που φέρουν μεταλλάγματα της πρωτεΐνης εμφανίζουν ανωμαλίες στο νευρικό τους σύστημα (Quinn et al., 2001). Επιλέον, έχει δειχθεί ότι η Geminin ελέγχει τη μεταγραφή γονιδίων που καθορίζουν τη νευρική διαφοροποίηση, μέσω της αλληλεπίδρασής της με την πρωτεΐνη Brg1. Η τελευταία αποτελεί καταλυτική υπομονάδα του συμπλόκου αναδιοργάνωσης της χρωματινικής δομής SWI/SNF και αλληλεπιδρά άμεσα με τους μεταγραφικούς παράγοντες NeuroD και Neurogenin, επάγοντας έτσι τη νευρογέννεση. Η Geminin αλληλεπιδρά επίσης άμεσα με την πρωτεΐνη Brg1, αποτρέπει την αλληλεπίδρασή της με τους μεταγραφικούς παράγοντες της οικογένειας bhlh (basic Helix-Loop-Helix) και κατ επέκταση αναστέλλει τη νευρική διαφοροποίηση των κυττάρων (Seo et al., 2005b). Επιπλέον, έχει προταθεί ότι η Geminin προσδένεται στο μεταγραφικό παράγοντα AP4, καταστέλοντας την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων-στόχων σε μη νευρικά κύτταρα. Ενδεχομένως, με το συγκεκριμένο τρόπο, να συμβάλλει στην καταστολή της έκφρασης πρώιμων γονιδίων-στόχων στον εμβρυϊκό εγκέφαλο (Kim et al., 2006). Από τα παραπάνω δεδομένα προκύπτει ότι, η πρωτεΐνη Geminin συμμετέχει στη ρύθμιση της ισορροπίας μεταξύ του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της κυτταρικής διαφοροποίησης. Η ρύθμιση αυτή βασίζεται -τουλάχιστον εν μέρει- στην ανταγωνιστική σχέση μεταξύ μεταγραφικών παραγόντων και του παράγοντα αδειοδότησης Cdt1, για πρόσδεση στη Geminin (εικ. 1.4). Εικόνα 1.4: Ο ρόλος της Geminin ως ρυθμιστής της ισορροπίας μεταξύ του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της κυτταρικής διαφοροποίησης. (a) η πρωτεΐνη Cdt1 αποτελεί υπομονάδα του προ-αντιγραφικού συμπλόκου, επάγοντας έτσι τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. (b) η αλληλεπίδραση Geminin-Cdt1 αναστέλλει το σχηματισμό του προ-αντιγραφικού συμπλόκου και κατά συνέπεια τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. (c) ο ανταγωνισμός μεταξύ των πρωτεϊνών Hox και Cdt1 για πρόσδεση στη Geminin ευνοεί τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Η Geminin αλληλεπιδρώντας με τους Hox μεταγραφικούς παράγοντες αναστέλλει την ενεργοποίηση των γονιδίων-στόχων τους. (d) η αλληλεπίδραση μεταξύ του μεταγραφικού παράγοντα Six και της Geminin επάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, μέσω της δράσης του παράγοντα αδειοδότησης Cdt1. Η Geminin αλληλεπιδρώντας άμεσα με το μεταγραφικό παράγοντα Six αναστέλλει τη μεταγραφική του ικανότητα (Li and Rosenfeld, 2004). 18

19 Α.1.8 Η λειτουργική σημασία της αλληλεπίδρασης Geminin-Cdt1 Η πρωτεΐνη Cdt1 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο κατά τη διαδικασία αδειοδότησης της αντιγραφής, ενώ η πρωτεΐνη Geminin εμφανίζει διττό ρόλο, συμμετέχοντας στη ρύθμιση της αντιγραφής του DNA και της κυτταρικής διαφοροποίησης. Προκειμένου να κατανοηθεί πλήρως ο μηχανισμός δράσης των δύο πρωτεϊνών, έχουν πραγματοποιηθεί μελέτες με σκοπό το δομικό και λειτουργικό χαρακτηρισμό τους. Επίσης, παρόμοιες μελέτες που αφορούσαν το σύμπλοκο Geminin/Cdt1 ανέδειξαν σημαντικές πληροφορίες για τον τρόπο αλληλεπίδρασης των δύο πρωτεϊνών καθώς και για το μηχανισμό μέσω του οποίου ρυθμίζουν την αδειοδότηση της αντιγραφής. Α Δομική και λειτουργική περιγραφή της πρωτεΐνης Geminin Η δομή της πρωτεΐνης Geminin περιέχει μία κεντρική περιοχή με μοτίβο σπειροειδούς σπειράματος (coiled-coil) (αμινοξέα στον άνθρωπο), η οποία είναι απαραίτητη για τον ομοδιμερισμό της (εικ. 1.5). Πρόκειται για δύο παράλληλες α-έλικες οι οποίες σχηματίζουν μια αριστερόστροφη υπερέλικα μέσω αλληλεπιδράσεων van der Waals, δεσμών υδρογόνου και ιοντικών αληλεπιδράσεων. Το μήκος του διμερούς κυμαίνεται στα 60Å, η διάμετρός του στα 20Å και η σταθεροποίησή του εξαρτάται κυρίως από υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις (Lee et al., 2004; Thepaut et al., 2004). Ο ομοδιμερισμός της Geminin είναι ικανή και αναγκαία προϋπόθεση για την αλληλεπίδρασή της με τον παράγοντα αδειοδότησης Cdt1 καθώς και για την ανασταλτική της δράση όσον αφορά την αδειοδότηση της αντιγραφής (Saxena et al., 2004). Αξίζει επίσης να σημειωθεί ότι έχουν πραγματοποιηθεί και άλλες μελέτες σχετικά με την κατάσταση ολιγομερισμού της Geminin. Συγκεκριμένα, σύμφωνα με ανάλυση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας (ΕΜ) η Geminin εμφανίζει την ικανότητα σχηματισμού ομοτετραμερούς, το οποίο αποτελείται από δύο διμερή coiled-coils σε παράλληλο προσανατολισμό (Okorokov et al., 2004). Παρόμοιο αποτέλεσμα προκύπει και από τα δεδομένα ανάλυσης SAXS, με μόνη διαφορά ότι στη συγκεκριμένη μελέτη τα δύο διμερή εμφανίζονται να έχουν αντιπαράλληλο προσανατολισμό (Thepaut et al., 2004). Μία από τις κύριες λειτουρίες της Geminin είναι η αναστολή του παράγοντα αδειοδότησης Cdt1, μέσω της μεταξύ τους άμεσης αλληλεπίδρασης. Για το λόγο αυτό η Geminin διαθέτει τρεις περιοχές αλληλεπίδρασης με την πρωτεΐνη Cdt1 (εικ. 1.5). Η πρώτη περιοχή εντοπίζεται μεταξύ των αμινοξικών καταλοίπων στο ανθρώπινο ορθόλογο. Στη συγκεκριμένη περιοχή υπάρχουν οχτώ συντηρημένα κατάλοιπα γλουταμινικού οξέος, τα οποία πιστεύεται ότι σταθεροποιούν την πρόσδεση του Cdt1 μέσω ηλεκτροστατικών αλληλεπιδράσεων. Δεδομένης της ικανότητας του Cdt1 να προσδένεται στο DNA, προτείνεται ότι η περιοχή αυτή της Geminin μιμείται τον αρνητικά φορτισμένο σκελετό του DNA (λόγω των αρνητικών της φορτίων) και κατ επέκταση αναστέλει την πρόσδεση του Cdt1 στη χρωματίνη. Η δεύτερη περιοχή αλληλεπίδρασης με το Cdt1 εντοπίζεται μεταξύ των καταλοίπων της ανθρώπινης Geminin και έχει δειχθεί ότι απαιτείται για την αναστολή της δράσης του Cdt1 (Saxena et al., 2004; Yanagi et al., 2002). Τέλος, η τρίτη περιοχή 19

20 αλληλεπίδρασης περιλαμβάνει τα ανθρώπινα αμινοξικά κατάλοιπα και έχει δειχθεί ότι συμβάλλει στο σχηματισμό ενός ετεροεξαμερούς συμπλόκου (2x[Cdt1:2xGeminin]), το οποίο αναστέλλει την αδειοδότηση της αντιγραφής (βλ ) (De Marco et al., 2009). Εκτός από την πρωτεΐνη Cdt1, η Geminin αλληλεπιδρά επίσης με την καταλυτική υπομονάδα Brg1 του πρωτεϊνικού συμπλόκου αναδιάταξης της χρωματίνης SWI/SNF. Πρόκειται για μια κυρίως ηλεκτροστατική αλληλεπίδραση, η οποία βασίζεται στο καρβοξυτελικό τμήμα της Geminin και συγκεκριμένα στα αμινοξικά κατάλοιπα , στο ορθόλογο του ποντικού (εικ. 1.5). Όπως προκύπτει, η περιοχή αλληλεπίδρασης με την υπομονάδα Brg1 βρίσκεται εκτός της coiled-coil περιοχής, γεγονός που υποδεικνύει ότι ο ομοδιμερισμός της Geminin δεν είναι απαραίτητος για την αλληλεπίδραση με την πρωτεΐνη Brg1, σε αντίθεση με την περίπτωση του Cdt1 (Seo et al., 2005b). Μεταξύ των αμινοξέων στην ανθρώπινη Geminin βρίσκονται αρκετά βασικά αμινοξικά κατάλοιπα για τα οποία έχει διατυπωθεί η άποψη ότι θα μπορούσαν να έχουν δράση σήματος πυρηνικού εντοπισμού (Nuclear Localization Signal, NLS) ή να αποτελούν θέσεις πρόσδεσης της ουβικουϊτίνης (McGarry and Kirschner, 1998). Πειράματα στο Xenopus επιβεβαίωσαν την παρουσία NLS ενεργότητας στις αμινοξικές περιοχές και της Xgeminin (εικ. 1.5). Ενδιαφέρον παρουσιάζει και το γεγονός ότι η αλληλουχία του σήματος πυρηνικού εντοπισμού είναι απαραίτητη και για την αποικοδόμηση της πρωτεΐνης (Benjamin et al., 2004; Yoshida et al., 2005). Σχετικά με την αποικοδόμηση της πρωτεΐνης, η Geminin διαθέτει επίσης στο αμινοτελικό της τμήμα μια αλληλουχία αμινοξέων η οποία αποτελεί το ειδικό μοτίβο αποικοδόμησης (destruction box). Πρόκειται για ένα σύνολο εννέα αμινοξέων τα οποία εντοπίζονται στην περιοχή στο Xenopus (εικ. 1.5) και εμφανίζουν ομολογία με την αντίστοιχη αλληλουχία που διαθέτουν και οι μιτωτικές κυκλίνες. Η συγκεκριμένη αλληλουχία αναγνωρίζεται από το σύμπλοκο προαγωγής της ανάφασης (Anaphase-Promoting Complex, APC) και είναι απαραίτητη για την ουβικουϊτινο-εξαρτώμενη πρωτεόλυση της Geminin (McGarry and Kirschner, 1998). Mελέτες στο έμβρυο του ιχθύος στο είδος Medaka έχουν δείξει ότι η Geminin αναστέλλει το σχηματισμό του οφθαλμού λόγω της πρόσδεσης και της ανασταλτικής της δράσης στο μεταγραφικό παράγοντα Six3. Για τη συγκεκριμένη αλληλεπίδραση έχει δειχθεί ότι απαιτείται η πλήρης αμινοξική αλληλουχία και των δύο πρωτεϊνών (Del Bene et al., 2004). Τέλος, όπως έχει αναφερθεί και προηγουμένως, η Geminin συμμετέχει στη διαδικασία νευρογένεσης. Ο ρόλος της αυτός βασίζεται στην αμινοξική περιοχή στο ορθόλογο του Xenopus (εικ. 1.5). Μελέτες έχουν δείξει ότι η συγκεκριμένη περιοχή είναι ικανή να επάγει τη δημιουργία νευρικού ιστού σε έμβρυα Xenopus (Kroll et al., 1998). 20

21 Εικόνα 1.5: Λειτουργική οργάνωση του ορθολόγου της Geminin στον άνθρωπο. Α Δομική και λειτουργική περιγραφή του παράγοντα αδειοδότησης Cdt1 Η ανάλυση της κρυσταλλικής δομής του συμπλόκου Cdt :Geminin (mtcdt1:mtgem) στον ποντικό έδειξε ότι η πρωτεΐνη Cdt1 εμφανίζει α/β δομή, αποτελούμενη από έξι α-έλικες και δύο β-φύλλα (Lee et al., 2004). Επίσης, πρόσφατη NMR μελέτη της δομής του καρβοξυτελικού τμήματος του Cdt1 στον ποντικό (κατάλοιπα ) έδειξε ότι και το συγκεκριμένο τμήμα εμφανίζει α/β δομή, αποτελούμενη από τέσσερις α-έλικες και τρία β-φύλλα (Jee et al., 2010). Η κύρια λειτουργία του Cdt1 είναι η προσέλκυση του πρωτεϊνικού συμπλόκου MCM2-7 στη χρωματίνη, προκειμένου να oλοκληρωθεί ο σχηματισμός του προ-αντιγραφικού συμπλόκου και να πραγματοποιηθεί η αδειοδότηση της αντιγραφής του DNA (Bell and Dutta, 2002). Η αμινοξική περιοχή του Cdt1 η οποία εμφανίζει ενεργότητα αδειοδότησης της αντιγραφής εντοπίζεται στο καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης (εικ. 1.6) και συγκεκριμένα μεταξύ των καταλοίπων στο ορθόλογο του Xenopus (Ferenbach et al., 2005). Ο σχηματισμός του προ-αντιγραφικού συμπλόκου περιλαμβάνει την άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ των Cdt1 και MCM2-7, η οποία έχει δειχθεί ότι λαμβάνει χώρα τόσο in vitro όσο και in vivo (Cook et al., 2004; Ferenbach et al., 2005; Tanaka and Diffley, 2002; Yanagi et al., 2002). Συγκεκριμένα, μελέτη στο Xenopus έχει δείξει ότι η αμινοξική περιοχή στο καρβοξυτελικό τμήμα του Cdt1 είναι απαραίτητη για την αλληλεπίδραση με το σύμπλοκο MCM2/4/6/7 (εικ. 1.6) (Ferenbach et al., 2005). Παρόμοια μελέτη στον ποντικό έδειξε ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ των Cdt1 και Mcm6 βασίζεται στην αμινοξική περιοχή στο καρβοξυτελικό άκρο του mcdt1 (Yanagi et al., 2002). Αντίστοιχη μελέτη πραγματοποιήθηκε και στον άνθρωπο, σύμφωνα με τα αποτελέσματα της οποίας η καρβοξυτελική αμινοξική 21

22 hcdt1 περιοχή συμβάλει στην αλληλεπίδραση με την hmcm6 (Teer and Dutta, 2008). Πειράματα μεταλλάξεων έδειξαν ότι τα hcdt1 κατάλοιπα R471, R474, V478 και R481 διαδραματίζουν πολύ σημαντικό ρόλο στην αλληλεπίδραση με το σύμπλοκο MCM4/6/7 (Jee et al., 2010). Μία επιπλέον λειτουργία του Cdt1 αφορά την ικανότητα πρόσδεσής του στο DNA. Η ικανότητα αυτή βασίζεται στην αμινοτελική περιοχή της πρωτεΐνης (κατάλοιπα στον ποντικό) και είναι ανεξάρτητη από την αλληλουχία, την αλυσίδα και τη διαμόρφωση του μορίου DNA. Αξίζει επίσης να σημειωθεί ότι η Cdt1 περιοχή πρόσδεσης στο DNA αλληλοεπικαλύπτεται με την αντίστοιχη περιοχή για τη Geminin (εικ. 1.6). In vitro πειράματα έχουν δείξει ότι η Geminin αναστέλλει την αλληλεπίδραση του Cdt1 με δίκλωνο DNA (Yanagi et al., 2002). Η κεντρική αμινοξική περιοχή του Cdt1 είναι υπεύθυνη για την αλληλεπίδραση με τη Geminin (εικ. 1.6). Μελέτες έχουν δείξει ότι η συγκεκριμένη Cdt1 περιοχή περιλαμβάνει τα κατάλοιπα και στον ποντικό και στο Xenopus αντίστοιχα (Ferenbach et al., 2005; Yanagi et al., 2002). Επίσης, παρόμοια μελέτη στον άνθρωπο έδειξε ότι τα hcdt1 κατάλοιπα είναι απαραίτητα για την αλληλεπίδραση με τη Geminin. Μάλιστα, η μεταλλαγή των καταλοίπων K166, Q171 και R172 προς αλανίνη κατέστησε αδύνατη την αλληλεπίδραση Geminin-Cdt1 (Saxena et al., 2004). Εικόνα 1.6: Λειτουργική οργάνωση του ορθολόγου του Cdt1 στον άνθρωπο. 22

23 Α Δομική και λειτουργική περιγραφή του συμπλόκου Geminin/Cdt1 Η ανάλυση της κρυσταλλικής δομής του συμπλόκου Cdt :Geminin (mtcdt1:mtgem) στον ποντικό έδειξε ότι πρόκειται για ένα ετεροτριμερές, αποτελούμενο από δύο μόρια Geminin και ένα μόριο Cdt1. Η Geminin σχηματίζει ένα παράλληλο ομοδιμερές με δομή σπειροειδούς σπειράματος (coiled-coil). Οι δύο α-έλικες της πρωτεΐνης σχηματίζουν μια αριστερόστροφη υπερέλικα μέσω αλληλεπιδράσεων van der Waals, δεσμών υδρογόνου και ιοντικών αλληλεπιδράσεων. Αναφορικά με τον παράγοντα Cdt1, εμφανίζει α/β δομή με έξι α-έλικες και δύο β-φύλλα (εικ. 1.7). Οι αμινοξικές περιοχές των mcdt1 και mgeminin που επιλέχθηκαν για την κρυστάλλωση του συμπλόκου εμφανίζουν υψηλό βαθμό συντήρησης μεταξύ των ομολόγων (Lee et al., 2004). Η συνολική επιφάνεια επαφής των δύο πρωτεϊνών είναι κυρίως υδροφοβική, καταλαμβάνει εμβαδό 2.400Å 2 και αποτελείται από μία πρωτεύουσα (primary interface) και μία δευτερεύουσα περιοχή αλληλεπίδρασης (secondary interface). Η πρωτεύουσα περιοχή αλληλεπίδρασης περιλαμβάνει τις έλικες Η1, Η2 και τη θηλειά L1 του Cdt1 καθώς και το αμινοτελικό τμήμα του σπειροειδούς σπειράματος της Geminin (εικ. 1.7). Βιοχημικά πειράματα έδειξαν ότι ο ρόλος των υψηλά συντηρημένων mcdt1 καταλοίπων της τυροσίνης (Tyr, Y) 183, φαινυλαλανίνης (Phe, F) 186 και λευκίνης (Leu, L) 189 είναι πολύ σημαντικός για την αλληλεπίδραση των δύο πρωτεϊνών. Συγκεκριμένα, με εφαρμογή της μεθόδου ITC (Isothermal Titration Calorimetry) μελετήθηκε η επίδραση της μεταλλαγής των παραπάνω καταλοίπων προς αλανίνη, όσον αφορά την ισχύ της αλληλεπίδρασης μεταξύ Cdt1 και Geminin. Ο προσδιορισμός της σταθεράς ισορροπίας διάσπασης (K D ) έδειξε ότι η υψηλή συγγένεια πρόσδεσης των δύο πρωτεϊνών (K D = 4.4±2.2 nm) ελαττώνεται κατά 30 περίπου φορές, στην περίπτωση της μεταλλαγής Υ183Α (K D = 127.7±35.9). Επιπλέον, η ταυτόχρονη διπλή μεταλλαγή F186A & L189A κατέστησε αδύνατη την ανίχνευση σχηματισμού του συμπλόκου Cdt1:Geminin, μέσω της συγκεκριμένης μεθόδου (Lee et al., 2004). Η δευτερεύουσα περιοχή αλληλεπίδρασης (secondary interface) περιλαμβάνει την έλικα Η6 και τη θηλειά L2 του Cdt1, καθώς και τα δέκα κατάλοιπα (79-88 a.a) που βρίσκονται στην αμινοτελική θηλειά του μονομερούς της Geminin (εικ. 1.7). Η απαλοιφή των συγκεκριμένων καταλοίπων της Geminin προκάλεσε ελάττωση της ισχύος αλληλεπίδρασης των δύο πρωτεϊνών, σύμφωνα με τη μέθοδο ITC. Ωστόσο, η ελάττωση αυτή ήταν μικρότερη (κατά δύο περίπου φορές) σε σύγκριση με την αντίστοιχη που παρατηρήθηκε στα πειράματα μεταλλαγής των καταλοίπων της πρωτεύουσας περιοχής αλληλεπίδρασης (Lee et al., 2004). 23

24 Εικόνα 1.7: Δομή του συμπλόκου mtcdt1:mtgem. Τα μόρια Cdt1 και Geminin παριστάνονται με κίτρινο και πράσινο χρώμα, αντίστοιχα. Η πρωτεύουσα και η δευτερεύουσα περιοχή αλληλεπίδρασης επισημαίνονται με τον κόκκινο και μπλε κύκλο, αντίστοιχα [τροποποίηση από (Lee et al., 2004)]. Όπως φαίνεται στη δομή του συμπλόκου mtcdt1:mtgem (εικ. 1.7), το καρβοξυτελικό τμήμα του σπειροειδούς σπειράματος της Geminin δεν βρίσκεται σε επαφή με το μόριο του Cdt1. Ωστόσο, έχει δειχθεί ότι το καρβοξυτελικό τμήμα του σπειροειδούς σπειράματος της Geminin είναι υπεύθυνο για την αναστολή της δράσης του Cdt1 (Benjamin et al., 2004; McGarry and Kirschner, 1998; Thepaut et al., 2004). Προκειμένου λοιπόν οι Lee et al. (2004) να εξηγήσουν την ανασταλτική δράση της Geminin στο Cdt1, πραγματοποίησαν μια σειρά από πειράματα. Αρχικά, η απαλοιφή καταλοίπων από το καρβοξυτελικό τμήμα της tgeminin έδειξε ότι το μήκος του τμήματος καθορίζει την ικανότητα της πρωτεΐνης να αναστέλλει την αδειοδότηση της αντιγραφής καθώς και την αλληλεπίδραση του Cdt1 με τις MCMs. Έπειτα, χρησιμοποίησαν μία χιμαιρική μορφή της tgeminin, όπου τμήμα της αλληλουχίας του σπειροειδούς σπειράματος της πρωτεΐνης αντικαταστάθηκε από τμήμα της πρωτεΐνης GCN4 ( a.a), η οποία είναι γνωστό ότι εμφανίζει ελικοειδή δομή (O Shea et al., 1991). Η συγκεκριμένη μορφή της tgeminin δείχθηκε ότι ήταν εξίσου αποτελεσματική με την αγρίου τύπου tgeminin, όσον αφορά την αναστολή της αδειοδότησης καθώς και της αλληλεπίδρασης Cdt1-MCMs. Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα, προτάθηκε ότι η αναστολή της δράσης αδειοδότησης του Cdt1 γίνεται μέσω στερικής παρεμπόδισης από το καρβοξυτελικό τμήμα του ελικοειδούς σπειράματος της Geminin (Lee et al., 2004). Τα αποτελέσματα μεταγενέστερης μελέτης (De Marco et al., 2009), η οποία αφορούσε το δομικό και λειτουργικό χαρακτηρισμό του συμπλόκου Cdt :Geminin (htcdt1:htgem) στον άνθρωπο, έδειξαν ότι το ετεροτριμερές σύμπλοκο Cdt1:2xGeminin, που περιγράφηκε από τους Lee et al. (2004), σχηματίζει ετεροεξαμερές σύμπλοκο με στοιχειομετρική αναλογία (2x[Cdt1:2xGeminin]) (εικ. 1.9). Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι 24

25 το σύμπλοκο Cdt1:Geminin μπορεί να υπάρξει σε δύο τουλάχιστον διαφορετικές στοιχειομετρικές αναλογίες. Οι αμινοξικές περιοχές των htcdt1 και htgeminin που επιλέχθηκαν για την κρυστάλλωση του συμπλόκου αντιστοιχούν-βάσει αμινοξικής στοίχισης-στις περιοχές των mtcdt1 και mtgeminin των Lee et al. (2004) (εικ. 1.8). Η πρωτεύουσα (primary interface) και η δευτερεύουσα περιοχή αλληλεπίδρασης (secondary interface) των δύο πρωτεϊνών (Lee et al., 2004) εμφανίζονται συντηρημένες και στον άνθρωπο. Ωστόσο, με βάση την κρυσταλλική δομή των De Marco et al. (2009), το καρβοξυτελικό τμήμα του σπειροειδούς σπειράματος της Geminin είναι ευθύγραμμο και όχι λοξό και περιστραμμένο, όπως περιγράφηκε από τους Lee et al. (2004) (εικ. 1.8). Η συγκεκριμένη παρατήρηση των De Marco et al. επιβεβαιώνεται επιπλέον από προηγούμενες δομικές μελέτες, που αφορούσαν μόνο το μόριο της Geminin (και όχι το σύμπλοκο) (Saxena et al., 2004; Thepaut et al., 2004). Τα παραπάνω υποδηλώνουν ότι η δομή του καρβοξυτελικού τμήματος της mtgeminin (Lee et al., 2004) ήταν αποτέλεσμα τεχνητής αλλοίωσης (artifact), κατά τη διαδικασία κρυστάλλωσης του συμπλόκου. Προκειμένου οι De Marco et al. να αποκλείσουν αντίστοιχο ενδεχόμενο, πραγματοποίησαν περαιτέρω δομική ανάλυση του συμπλόκου htcdt1:htgem εφαρμόζοντας την τεχνική SAXS (small-angle X-ray scattering). Με τη συγκεκριμένη τεχνική είναι δυνατή η δομική μελέτη του μορίου υπό διαλυτή μορφή και όχι πακεταρισμένου σε κρυσταλλική μορφή, όπως απαιτεί η τεχνική της κρυσταλλογραφίας ακτίνων-χ. Τα πειραματικά δεδομένα που προέκυψαν συμφωνούν πράγματι με τα χαρακτηριστικά του ετεροεξαμερούς πρωτεϊνικού συμπλόκου και όχι με τα αντίστοιχα του ετεροτριμερούς των Lee et al. (2004). Εικόνα 1.8: Σύγκριση των δομών του συμπλόκου tcdt1:tgeminin στον ποντικό (γκρι χρώμα) και στον άνθρωπο (Cdt1: πορτοκαλί χρώμα, Geminin: πράσινο χρώμα). Με τα 25