πρωτεινοσύνθεσης που έχουν χρησιμοποιηθεί σε μεγάλη έκταση είναι

Transcript

1 Για τον εντοπισμό των μεταβολών πού επισυμβαίνουν στις διάφορες παραμέτρους της πρωτεινοσύνθεσης υπό την επίδραση διαφόρων παραγόντων χρησιμοποιούνται τα In vitro συστήματα Με τον ορο In vitro συστήματα εννοούνται 1. Τα διαφόρων τυπων συστήματα ελευθέρων κυττάρων 2.Τα εξατομικευμένα κύτταρα στα οποία δίνεται η δυνατότητα να μεταφράσουν ένα συγκεκριμένο μήνυμα πού προστίθεται εξωγενώς υπό συγκεκριμένας συνθήκας 3. Τα πολυσωμικά συστήματα στα οποία επιχειρείται η συμπλήρωση των αρτιγενών πολυπεπτιδικών αλυσίδων πού υπάρχουν στα πολυσώματα. Όπως είναι αυτονόητο στα συστήματα αυτά μπορεί κανείς να παρακολουθήσει τις ρυθμίσεις πού επισυμβαίνουν σε όλα τα στάδια εκτός από εκείνο της έναρξης

2 Τα κυριότερα ελεύθερα κυττάρων συστήματα πρωτεινοσύνθεσης που έχουν χρησιμοποιηθεί σε μεγάλη έκταση είναι Το σύστημα που επιμηκύνει τις προϋπάρχουσες πολυπεπτιδικές αλυσίδες στα πολυσώματα Το σύστημα που παρασκευάζεται από δικτυοκύτταρα κουνελιού το σύστημα αυτό είναι εκείνο που χρησιμοποιείται σήμερα στην μεγαλύτερη έκταση Το σύστημα πού παρασκευάζεται από καρκινικά κύτταρα Το σύστημα που παρασκευάζεται από αρχέφυτρα σιταριού Το σύστημα πού κατασκευάζεται από ανασυνδυασμό των επί μέρους συστατικών έχει το πλεονέκτημα της ελάχιστης ενδογενούς ενεργότητος και το μειονέκτημα της πολυπλοκου συγκροτήσεως

3 Γιά να είναι δυνατόν να λειτουργήσει ενα πολυσωμικό in vitro σύστημα πρωτεινοσύνθεσης απαραίτητες προυποθέσεις είναι Να διατηρούνται οι αρτιγενείς πολυπεπτιδικές αλυσίδες διασυνδεδεμένες επάνω στα πολύσώματα Να ευρεθούν οι κατάλληλες ιονικές συνθήκες (κοντά στις φυσιολογικές ) στις οποίες κινείται τό πολύσωμα και γινεται η συμπληρωση των πολυπεπτιδικών αλυσίδων. Να προστεθούν εξωγενώς τα απαραίτητα συστατικά τα οποία απαιτούνται για την λειτουργία της πρωτεινοσύνθεσης οπως Ενεργεια και σύστημα αναγεννήσεως της ενεργείας,παράγοντες επιμήκυνσης λήξης καθώς και τα κατάλληλα t-rna με τις αντιστοιχες συνθετάσες, και βεβαίως σημασμένο μείγμα αμινοξέων

4 Σύστημα από Δικτυοκύτταρα Πλεονεκτήματα Υψηλή μεταφραστική ενεργότητα τα μηνύματα μπορούν να μεταφραστούν περισσότερο από 50 φορές Μπορεί να κατεργασθεί με ριβονουκλεάση ώστε να απομακρυνθεί το ενδογενές mrna αλλά να διατηρείται μια υψηλή μεταφραστική ενεργότητα Μπορούν να κλασματωθούν για να απομακρυνθούν τα ενδογενή αμινοξέα και να δώσουν υψηλής ειδικής ραδιενέργειας πρωτεΐνες Δεν περιέχει DNA Είναι ικανό να συνθέτει μεγάλες πρωτεΐνες μοριακού βάρους μέχρι ενώ το ποσοστό πού δεν είναι πλήρεις είναι πολύ μικρό Έχει την ικανότητα να μεταφράζει μηνύματα από ιούς προκαρυωτικά και ευκαρυωτικά κύτταρα Μειονέκτημα Είναι απαραίτητο να γίνονται πολύ συχνά ποιοτικοί έλεγχοι

5 Σύστημα από τα Αρχέφυτρα Σιταριού Πλεονεκτήματα Πολύ χαμηλό κόστος Μικρή ενδογενής δεξαμενή αμινοξέων με αποτέλεσμα να συντίθενται πρωτεΐνες υψηλής ειδικής ενεργότητος Περιέχει μικρές ποσότητες Mg και Κ με αποτέλεσμα να είναι εύκολος ο προσδιορισμός των αρίστων τιμών Μειονεκτήματα Η μεταφραστική ενεργότητα είναι χαμηλή και τα προστιθέμενα μηνύματα μεταφράζονται 1-5 φορές Υπήρξαν σοβαρές ενδείξεις για σύνθεση ατελών πρωτεινών

6 Το σύστημα δικτυοκυττάρων πού έχει κατεργασθεί με Νουκλεάση θεωρείται το καλύτερο για τον έλεγχο της μεταφραστικής ικανότητος του mrna για τους παρακάτω λόγους Είναι πολύ απλό στην χρησιμοποίηση του Περιέχει όλα τα ουσιώδη αμινοξέα Δίδει υψηλή ενσωμάτωση για τα αμινοξέα για τα οποία υπάρχουν χαμηλές δεξαμενές όπως π.χ για την Λευκίνη και την Μεθειονίνη Είναι ιδιαίτερα χρήσιμο για τα mrna τα οποία έχουν άριστο Mg γύρω στα mm και άριστο K γύρω στα 120 mm

7 Για να είναι ένα σύστημα πρωτεινοσύνθεσης πού κατασκευάζεται από In vitro επανασυνδυασμό των επιμέρους συστατικών κατάλληλο για μελέτες πρωτεινοσύνθεσης θα πρέπει να ισχύουν οι εξής προϋποθέσεις Το σύστημα θα πρέπει να εξαρτάται από τα επι μέρους συστατικά π,χ παράγοντες έναρξης mrna κ.λπ Τα πλήρες σύστημα θα πρέπει να μεταφράζει ποσοτικά διάφορα μηνύματα Οι μέθοδοι πού χρησιμοποιούνται για την Παρασκευή των επί μέρους συστατικών θα πρέπει να είναι δυνατόν να εφαρμοσθούν σε διάφορους ιστούς όργανα και είδη

8 Πλεονεκτήματα συστημάτων Πρωτεινοσύνθεσης τα οποία κατασκευάζονται από In vitro επανασυνδυασμό των επί μέρους συστατικών Τα διάφορα επί μέρους στοιχεία μπορούν να μελετηθούν ανεξάρτητα και να προσδιορισθούν οι άριστες συνθήκες ανασυνδυασμού των Τα συστήματα αυτά εξαρτώνται απόλυτα από την προσθήκη εξωγενούς mrna Στα συστήματα αυτά είναι δυνατόν με συναγωνιστικές μεθόδους να γίνει σύγκριση της μεταφραστικής ικανότητος διαφόρων εξωγενών mrna

9

10

11

12

13 Ρύθμιση της Πρωτεινοσύνθεσης από Αίμη Γύρω στο 1970 δείχνεται για πρώτη φορά οτι τα ερυθροκύτταρα χρειαζονται σίδηρο για να κατασκευάσουν την γλοβίνη. Γύρω στο 1975 δείχνεται οτι η πρόσθεση της Αίμης στα κύτταρα προκαλεί ρύθμιση της πρωτεινοσύνθεσης και εν συνεχεία κατασκευάζονται τα πρώτα ελεύθερα κυτταρων συστήματα πού αντιδρούσαν στην πρόσθεση της Αίμης Οι Maxwell & Rabinovitz εδειξαν οτι η αναστολή στο σύστημα πρωτεινοσύνθεσης πού παρετηρείτο απουσία Αίμης δεν οφειλόταν στο οτι κάποιος παράγοντας εναρξης απαιτούσε αίμη ως προσθετική ομάδα για να λειτιυργήσει αλλά στο οτιενεργοποιείτο ενας αναστολέας της πρωτεινοσύνθεσης

14 Η έναρξη της Πρωτεινοσύνθεσης στο αιμόλυμμα των ερυθροκυττάρων αναστέλλεται υπό τας ακολούθους συνθήκες Οταν δεν προστεθεί αίμη εξωτερικά Παρουσία οξειδωμένης Γλουταθειόνης Παρουσία μικρής ποσότητος δίκλωνου RNA Σε αιμόλυμμα που παρασκευάζεται από δικτυοκύτταρα πού έχουν επωασθεί υπό αναερόβιους συνθήκες ή παρουσία αναστολέων της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης Σε αιμόλυμμα από το οποίο έχουν απομακρυνθεί τα συστατικά μικρού μοριακού βάρους μετά σπό μοριακή διήθηση Όταν το αιμόλυμμα ή τα δικτυοκύτταρα έχουν εκτεθεί σε υψηλές θερμοκρασίες

15 Χαρακτηριστικα του HCR Ο αναστολέας είναι μια πρωτεϊνη η οποία δρά καταλυτικά.ενα μόριο από την πρωτεινη μπορεί να αναστέλλει πάνω από 100 ριβοσώματα Ο αναστολέας ενεργοποιείται με συγκεκριμένο τρόπο από προυπάρχοντα προαναστολέα Ενεργοποίηση του απροαναστολέα μπορεί να γίνει με σύντομη επώαση του συστήματος με Ν-εθυλμαλειμιδιο η με αλλα αντιδραστήρια τα οποία αντιδρουν με τις σουλφυδρυλομάδες Στα αρχικά στάδια ενεργοποίησης φαίνεται να είναι δυνατή η αντίστροφη αποενεργοποιηση μετά από προσθήκη αίμης κατι τετοιο ομως φαίνεται να μην είναι δυνατόν οταν η ενεργοποίηση του αναστολέα βρίσκεται σε ππροχωρημένο στάδιο

16 Αν και ο HRI είναι γνωστός εδώ και 30 χρόνια και ηταν γνωστό οτι ενεργοποιείται από ελλειψη αίμης Ο μοριακός μηχανισμός εξακολουθεί να παραμένει με πολλά ερωτηματικά Στον μηχανισμό πού σημερα είναι αποδεκτός φαίνεται να υπάρχουν πολλά σταδια και να επισυμβαίνουν πολλαπλές φωσφορυλιώσης που εχουν σαν συνέπεια ο HRI να βρίσκεται υπό περισσοτερες της μιας μορφής που εκτείνονται από την μορφή του πληρους ανενεργού προαναστολέα μεχρι τον πληρους αντιστρεπτoού ενεργού αναστολέα

17 Χαρακτηριστικά τού HRI Ο HRI είναι ενα ομοδιμερές το οποίο κρατείται με μη ομοιοπολικές αντεπιδράσεις Σε σταθερή μορφή εχει δεσμευμένη μία ομάδα αίμης στην αμινοτελική περιοχή Οι θέσεις φωσφορυλιωσης ειναι στην σερίνη και την θρεονίνη Στο σχημα η αιμη παρουσιάζεται με κοκκινο εξάγωνο και η αμινοτελική πριοχή με Ν

18

19

20 Σχηματικό Μοντελλο για την ρυθμιση του HRI σε δυο στάδια μέσω αίμης και αυτοφωσφορυλίωσης Στο πρωτο σταδιο Κατά την διάρκεια της βιοσύνθεσης του HRI σε σύστημα δικτυοκυττάρων στα οποία εχει προστεθεί αίμη συνδεονται με τον αναστολέα κατα την διάρκεια της μετάφρασης δύο πρωτεινες η Hsp 90 και η Hsc 70.Αυτές οι δυο πρωτεινες οι οποίες λειτουργούν ως κιαπερωνεια είναι απαραίτητες για την κατάλληλη πτυχωση και την διατηρηση του ΗRI σε μια αδρανή μορφή

21 Κατα το δευτερο σταδιο Χαμηλή συγκεντρωση αιμης ο HRI μετατρέπεται σε σταθερό και ενεργό HRI (είδος Ι) με απομακρυνση της αιμης από το Kinase Insert (KI) και επακολουθη αυτοφωσφορυλίωση. Παρουσία υψηλης συγκεντρωσης αίμης αυτή δεσμευεται στο ΚΙ και προωθεί την δημιουργία δισουλφιδικών δεσμών στο διμερες και αναστέλει την ενεργοτητα του (ειδος ΙΙ) Σε χαμηλες συγκεντρωσεις αίμης το ειδος Ι μπορεί να μετατραπεί σε (ειδος ΙΙΙ) με το να υποστεί πολλαπλές φωσφορυλιώσεις και φωσφορυλιώνει τον παραγοντα eif-2a Eάν η πολλαπλή φωσφορθλίωση είναι απαραίτητη για την ενεργότητα κινάσης δεν εχει προσδιορισθεί

22 Κοινά χαρακτηριστικά ως προς τον τρόπο δράσεως των διαφόρων αναστολέων της πρωτεϊνοσυνθέσεως Η πρωτεινοσύνθεση σε όλες τις περιπτώσεις είναι διφασική.στην αρχή εχωμε γραμμική ενσωμάτωση για μερικά λεπτά η οποία στην συνέχεια ακολουθείται από κατακόρυφη ελάττωση της ταχύτητας συνθέσεως Κατά την μεταβολή της κινητικής της πρωτεϊνοσυνθέσεως παρατηρείται μετατροπή των πολυσωμάτων σε ενεργά 80S ριβοσώματα. Η μετατροπή αυτή παρεμποδίζεται από αναστολείς της πρωτεϊνοσυνθέσεως που δρουν στο επίπεδο της επιμηκύνσεως Σε όλες τις περιπτώσεις λίγο πριν την μετατροπή το σύμπλεγμα ενάρξεως 40SMet-tRNA trna GTP εξαφανίζεται παρ όλο πού η 40S ριβοσωμική υπομονάδα και το φορμυλιωμένο μεταφορικό RNA της μεθειονίνης και το GTP υπάρχουν ακόμη σε κανονικά επίπεδα

23 Αναστέλλεται με τους διάφορους αναστολείς η σύνθεση όλων των πρωτεινών τόσο της γλοβίνης όσο και των πρωτεινών πού προγραμματίζονται από τα προστιθέμενα mrnα Η αναστολή σε όλες τις περιπτώσεις μπορεί να παρεμποδιστεί ή και να αναστραφεί προσθέτοντας ή τον παράγοντα ενάρξεως eif-2 ή μερικούς άλλους παράγοντες ενάρξεως που προς το παρόν δεν έχουν χαρακτηρισθεί πλήρως Σε όλες τις περιπτώσεις ενώσεις όπως camp, αμινοπουρίνη καφεΐνη θεοφυλίνη αδενίνη σε μια συγκέντρωση 5-10 mm μπορούν να παρεμποδίσουν ή και να αναστρέψουν την αναστολή Όλες οι αναστολές παρεμποδίζονται παρουσία υψηλών ποσοτήτων GTP αλλά ενισχύονται παρουσία υψηλών ποσοτητων ΑΤΡ

24 Ενδείξεις πού υποστηρίζουν την άποψη ότι ο HCR και ο DAI είναι δύο διαφορετικές πρωτεΐνες Ο HCR και DAI εκλούονται σε διαφορετικές θέσεις κατά την μοριακή διήθηση Η ειδικότητα των δύο αναστολέων ως προς το υπόστρωμα είναι διακριτή.ενώ ο HCR φαίνεται να είναι απολύτως ειδικός για τον eif-2 ο DAI μπορεί να φωσφορυλιώνει και άλλες πρωτεΐνες όπως ιστόνες Οι δύο παράγοντες περιέχουν διαφορετικά συστατικά κινασών Ο τρόπος ενεργοποιήσεως των δύο προαναστολέων είναι διαφορετικός.ο DAI χρειάζεται για ενεργοποίηση ds RNA και ΑΤΡ και δεν επηρεάζεται από την αίμη ενώ η ενεργοποίηση Τού HCR δεν απαιτεί ΑΤΡ και παρεμποδίζεται από αίμη Υψηλές ποσότητες του camp και άλλων πουρνών επηρεάζουν διαφορετικά την ενεργοποίηση και την ενεργότητα τού DAI και Αντισώματα τα οποία HCR οποία αναστέλλουν τον HCR δεν επηρεάζουν τον DAI

25 Τα δεδομένα τα οποία υποστηρίζουν την υπόθεση ότι ό HCR και ο DAI αναστέλλουν την πρωτεινοσύνθεση φωσφορυλιώνοντας τον παράγοντα έναρξης είναι τα παρακάτω Η ενζυμική ενεργότητα της πρωτεϊνικής κινάσης καθαρίζεται μαζί με την ανασταλτική ενεργότητα του παράγοντος αναστολής Τόσο ή ενεργότητα της κινάσης όσο και η ανασταλτική ικανότητα του HCR δείχνουν ίδιες κινητικές ανενεργοποιήσεως με την θερμοκρασία Κατα την διάρκεια της ενεργοποιήσεως του HCR και DAI οι ενεργοτητες της κινάσης και η ικανότητα αναστολής εμφανίζονται να πηγαίνουν παράλληλα Αντιδραστήρια όπως οι πουρίνες τα οποία βρέθηκε οτι παρεμποδίζουν τους αναστολείς να εργάζονται είναι γνωστό ότι αναστέλλουν και τις ενεργότητες των κινασών Οι αναστολείς απαιτούν και αυτοί ΑΤΡ ως συμπαραγοντα Η αναστολή εξαφανίζεται προσθέτοντας καθαρισμένο παράγοντα ενάρξεως eif-2 Αντισώματα έναντι του HCR μπορούν να αναστέλλουν τόσο την ενεργότητα της κινάσης όσο και την ικανότητα αναστολής