Επίδραση ορισμένων ριβοσωματικών συστατικών επί της πρωτεϊνοσύνθεσης και επί εξωριβοσωματικών λειτουργιών του ευκαρυωτικού κυττάρου

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ - ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Ι ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ Επίδραση ορισμένων ριβοσωματικών συστατικών επί της πρωτεϊνοσύνθεσης και επί εξωριβοσωματικών λειτουργιών του ευκαρυωτικού κυττάρου ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΟΔΩΡΟΣ ΧΡ. ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΙΔΗΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ 2007

2 Ευχαριστούμε το Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο (ΕΚΤ), το Επιχειρησιακό Πρόγραμμα Εκπαίδευσης και Αρχικής Επαγγελματικής Κατάρτισης ΙΙ (ΕΠΕΑΕΚ ΙΙ) και συγκεκριμένα το Πρόγραμμα ΗΡΑΚΛΕΙΤΟΣ για την χρηματοδότηση του ανωτέρω έργου

3 Τριμελής Συμβουλευτική Επιτροπή 1. Καθηγητής Διονύσιος Συνετός (Επιβλέπων καθηγητής Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) 2. Καθηγητής Χριστόδουλος Φλωρδέλλης (Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) 3. Καθηγητής Δημήτριος Καλπαξής (Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) Επταμελής Εξεταστική Επιτροπή 1. Καθηγητής Διονύσιος Συνετός (Σχολή Επιστημών Υγείας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) 2. Καθηγητής Χριστόδουλος Φλωρδέλλης (Σχολή Επιστημών Υγείας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) 3. Καθηγητής Δημήτριος Καλπαξής (Σχολή Επιστημών Υγείας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) 4. Καθηγητής Διονύσιος Δραΐνας (Σχολή Επιστημών Υγείας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) 5. Καθηγητής Νικόλαος Μοσχονάς (Σχολή Επιστημών Υγείας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Πατρών) 6. Αναπληρωτής Καθηγητής Αναστάσιος Μίντζας (Σχολή Θετικών Επιστημών, Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών) 7. Αναπληρωτής Καθηγητής Χρήστος Γεωργίου (Σχολή Θετικών Επιστημών, Τμήμα Βιολογίας, Πανεπιστήμιο Πατρών) Η παρουσίαση της διδακτορικής διατριβής έγινε στις 18 Απριλίου 2007 ενώπιον της παραπάνω Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής. Η έγκριση της διδακτορικής διατριβής από το Τμήμα Ιατρικής δεν υποδηλώνει την αποδοχή των γνωμών του συγγραφέα (Νόμος 5343/32, άρθρο 202 2).

4 «Στους γονείς μου οφείλω το ζην, στους δασκάλους μου το ευ ζην» Μέγας Αλέξανδρος Αφιερωμένη στους γονείς μου Χρήστο και Μάρθα και στους δασκάλους μου

5 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ - ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΑΣΙΚΩΝ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ Ι ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΙΣ ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ Επίδραση ορισμένων ριβοσωματικών συστατικών επί της πρωτεϊνοσύνθεσης και επί εξωριβοσωματικών λειτουργιών του ευκαρυωτικού κυττάρου ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΟΔΩΡΟΣ ΧΡ. ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΙΔΗΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ Ευχαριστούμε το Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο (ΕΚΤ), το Επιχειρησιακό Πρόγραμμα Εκπαίδευσης και Αρχικής Επαγγελματικής Κατάρτισης ΙΙ (ΕΠΕΑΕΚ ΙΙ) και συγκεκριμένα το Πρόγραμμα ΗΡΑΚΛΕΙΤΟΣ για την χρηματοδότηση του ανωτέρω έργου. ΠΑΤΡΑ 2007

6 Πρόλογος Είναι ορισμένες στιγμές που η συναισθηματική φόρτιση σε ωθεί να πάρεις ένα χαρτί κι ένα μολύβι και να αποτυπώσεις μέσα σε λίγες προτάσεις γεγονότα και καταστάσεις που έχουν σημαδέψει ένα κομμάτι της ζωής σου. Η εκπόνηση μιας διδακτορικής διατριβής είναι μια συγκλονιστική εμπειρία. Η έναρξή της μοιάζει σαν ένα ταξίδι προς άγνωστο προορισμό, η πορεία της είναι γεμάτη εκπλήξεις που συνοδεύονται πότε από προβληματισμό και πότε από ενθουσιασμό, το δε τέλος της αν και αναγκαίο σου αφήνει μια γλυκόπικρη γεύση καθώς φαίνεται να εγκαταλείπεις μια δημιουργική πορεία από την απλή επιστημονική επάρκεια προς την επιστημονική εμπειρία. Η παρούσα διδακτορική διατριβή εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Πατρών, ενός Ιδρύματος που με φιλοξένησε για μια δεκαετία περίπου. Κατά τη διάρκεια της παραμονής μου στους κόλπους της επιστημονικής κοινότητας γνώρισα ανθρώπους που σημάδεψαν τη ζωή μου και διαμόρφωσαν ως κάποιο βαθμό το χαρακτήρα μου και θεωρώ σκόπιμο να αναφερθώ σε αυτούς. Η εκπόνηση της διατριβής έγινε υπό την καθοδήγηση και επίβλεψη του Καθηγητού Βιοχημείας κυρίου Διονυσίου Συνετού. Πολλές φορές έρχεται στη σκέψη μου η πρώτη μας συνάντηση, περίπου τον Απρίλιο του 2001, όταν ως τελειόφοιτος του Τμήματος Βιολογίας αναζητούσα ένα διέξοδο στην ενίσχυση των γνώσεων που απέκτησα από τις προπτυχιακές σπουδές μου. Τον ευχαριστώ θερμά που με δέχτηκε στο Εργαστήριο του και με θεώρησε μέλος αυτού προτού καν επιλεγώ από το Πρόγραμμα Μεταπτυχιακών Σπουδών του Τμήματος Ιατρικής. Επί πλέον, τον ευχαριστώ καθώς με την ανάθεση του θέματος της διατριβής μου έδωσε τη δυνατότητα να εκτεθώ σε πάρα πολλές τεχνικές και ταυτόχρονα να περιπλανηθώ σε ένα συναρπαστικό ερευνητικό ταξίδι. Το σημαντικότερο για μένα είναι ότι στάθηκε ακούραστα στο πλάι μου μέχρι και το τελευταίο πείραμα προσφέροντας μου με μεγάλη προθυμία τις γνώσεις του και την επιστημονική του επάρκεια, εμψυχώνοντας το ηθικό μου όταν η έκβαση των πειραμάτων δεν ήταν η αναμενόμενη και μεταδίδοντας τον ενθουσιασμό του προς εμένα δίνοντας μου έτσι κίνητρο να συνεχίσω με μεγαλύτερη όρεξη τη δουλειά μου. Ιδιαιτέρως τον ευχαριστώ διότι δεν

7 στάθηκε δίπλα μου μόνο ως δάσκαλος αλλά ως φίλος δίνοντας έμφαση όχι μόνο στην επαγγελματική μας σχέση αλλά και στην προσωπική μας σχέση μέσα από τις συμβουλές και τις παροτρύνσεις του. Με ιδιαίτερη συγκίνηση θέλω να αναφερθώ και στον Καθηγητή Βιοχημείας κύριο Δημήτριο Καλπαξή, μέλος της Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής. Τον ευχαριστώ θερμά για τις πολύ χρήσιμες και εποικοδομητικές παρατηρήσεις του κατά τη διόρθωση του κειμένου της διατριβής. Επίσης, τον ευχαριστώ διότι με την επιστημονική του επάρκεια με βοήθησε σε αρκετά στάδια της εκπόνησης της διατριβής. Επί πλέον, είναι σημαντικό για μένα το γεγονός ότι δεν με αντιμετώπισε μόνο ως μαθητή αλλά μου έκανε τη τιμή να με θεωρεί φίλο του και θέλω να τον ευχαριστήσω για τις καλές στιγμές που έχουμε περάσει εντός και εκτός Εργαστηρίου. Με μεγάλη χαρά θέλω να αναφερθώ και στο τρίτο μέλος της Συμβουλευτικής Επιτροπής στον Καθηγητή Φαρμακολογίας κύριο Χριστόδουλο Φλωρδέλλη. Τον ευχαριστώ θερμά για τις ωφέλιμες παρατηρήσεις και υποδείξεις του για την άρτια παρουσίαση του τελικού κειμένου. Πάνω απ όλα τον ευχαριστώ γιατί μου μετέδωσε δυο βασικά χαρακτηριστικά που πρέπει να διέπουν τον χαρακτήρα ενός επιστήμονα, το ήθος και την ευγένεια. Τον Καθηγητή Βιοχημείας κύριο Διονύσιο Δραΐνα ευχαριστώ θερμά για την τιμή που μου έκανε να συμμετέχει ως μέλος της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής. Τον ευχαριστώ ιδιαίτερα για την σημαντική μετάδοση γνώσεων κατά τη διάρκεια της μεταπτυχιακής μου εκπαίδευσης αλλά και γιατί με τις οξυδερκείς παρατηρήσεις του βελτιώθηκε αισθητά το τελικό κείμενο. Επίσης, θέλω να ευχαριστήσω τον Καθηγητή Μοριακής Ιατρικής και Γενετικής κύριο Νικόλαο Μοσχονά για τις σημαντικές και χρήσιμες υποδείξεις του κατά την έναρξη της συγγραφής του δοκιμίου της διατριβής. Τον ευχαριστώ ιδιαίτερα για το κύρος που προσέδωσε με την συμμετοχή του στην επταμελή εξεταστική επιτροπή. Με ιδιαίτερη χαρά θέλω να αναφερθώ στον Αναπληρωτή Καθηγητή Βιοχημείας κύριο Χρήστο Γεωργίου. Είναι η πρώτη φορά που θέλω να τον ευχαριστήσω γιατί είναι ο πρώτος δάσκαλος που μου μετάδωσε το ενδιαφέρον και την αγάπη για την Βιοχημεία. Επί πλέον, τον ευχαριστώ

8 θερμά για την συνεργασία που αναπτύξαμε κατά την εκτέλεση ενός μέρους αυτής της διατριβής αλλά και για την συμμετοχή του στην αξιολόγηση αυτής. Με την ίδια χαρά θα αναφερθώ και στον Αναπληρωτή Καθηγητή Μοριακής Βιολογίας κύριο Αναστάσιο Μίντζα, έναν ακόμα δάσκαλο από τις προπτυχιακές μου σπουδές. Τον ευχαριστώ ιδιαίτερα για τις γνώσεις που μου μετάδωσε κατά τη διάρκεια της προπτυχιακής μου εκπαίδευσης οι οποίες αποτέλεσαν για μένα σημαντικό υπόβαθρο ώστε να μπορέσω να ανταποκριθώ στις απαιτήσεις της μεταπτυχιακής εκαπίδευσης. Με μεγάλη χαρά και συγκίνηση θα αναφερθώ στα μέλη της ερευνητικής ομάδας του κ. Συνετού με τα οποία συνεργαστήκαμε μέσα σε απόλυτο κλίμα σύμπνοιας και ανιδιοτέλειας. Τον διδάκτορα Παναγιώτη Πανόπουλο που με μύησε στις τεχνικές του εργαστηρίου ένα απλό «ευχαριστώ» είναι λίγο. Το σημαντικότερο είναι η στενή φιλική σχέση που αναπτύξαμε μέσα στα πέντε χρόνια συνεργασίας μας δουλεύοντας κυριολεκτικά σαν ένα ζευγάρι χέρια. Τον υποψήφιο διδάκτορα Μάριο Ζουριδάκη ευχαριστώ θερμά όχι μόνο για την σημαντική συμβολή του σε ένα τμήμα αυτής της διατριβής αλλά πολύ περισσότερο για την αγνή φιλία που αναπτύχθηκε μεταξύ μας. Την υποψήφια διδάκτορα Σμαράγδα Τσελίκα ευχαριστώ θερμά για τις πολύ χρήσιμες συζητήσεις που είχαν ως αποτέλεσμα την ανελλιπή και επαρκή ενημέρωση και των δυο μας στην διεθνή βιβλιογραφία. Τους συναδέλφους βιολόγους Γεώργιο Μπελιμπασάκη και Κατερίνα Γουδέβενου, με τους οποίους συνεργαστήκαμε σε ορισμένες ενότητες της παρούσας διατριβής,ευχαριστώ θερμά για την πολύτιμη βοήθεια που μου προσέφεραν. Την διδάκτορα του Τμήματος Βιολογίας Κατερίνα Κωνσταντίνου ευχαριστώ θερμά για τις πολύτιμες συμβουλές της στον τρόπο συγγραφής της διατριβής αλλά και για την ψυχολογική υποστήριξη. Τόσο στην ίδια όσο και στον Παναγιώτη Πανόπουλο εύχομαι να επιτύχουν όλα όσα επιθυμούν διότι το αξίζουν. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα τον διδάκτορα του Τμήματος Βιολογίας Νικόλαο Πατσούκη και τον υποψήφιο διδάκτορα Γιάννη Παπαποστόλου, μέλη της ερευνητικής ομάδας του κ. Χρήστου Γεωργίου, για τον χρόνο που αφιέρωσαν στην εκτέλεση των πειραμάτων ενός τμήματος της παρούσας διατριβής.

9 Τα μέλη ΔΕΠ του Εργαστηρίου Βιολογικής Χημείας Γεώργιο Ντίνο, Μαρία Μιχεληνάκη, Σοφία Καλλία-Ραυτοπούλου, Μαργαρίτα Ιωάννου και Πέτρο Μάμο ευχαριστώ για την συνεργασία που αναπτύξαμε όλα αυτά τα χρόνια. Την συνάδελφο βιολόγο Δήμητρα Σταθάτου ευχαριστώ από τα βάθη της ψυχής μου για το κουράγιο που μου έδωσε, για την υπομονή της και για την στήριξη της ιδιαίτερα στις δύσκολες στιγμές της συγγραφής της διατριβής. Η παρουσία και η συντροφιά της ήταν καταλυτική ώστε να ανταποκριθώ με όλες τις δυνάμεις μου στην επιτυχή ολοκλήρωση της διατριβής. Ιδιαίτερα σημαντική ήταν η συμβολή των συναδέλφων βιολόγων Αντώνη Πέτσα, Νίκου Γιαννάκα και Ιάκωβου Σωφρονίου. Η παρέα τους αποτέλεσε για μένα πηγή άντλησης δύναμης και αισιοδοξίας. Τους ευχαριστώ για τη φιλία τους και εύχομαι να επιτύχουν τους στόχους τους γιατί το αξίζουν. Φυσικά, δεν θα μπορούσα να παραλείψω να ευχαριστήσω τους αγαπημένους μου γονείς, Χρήστο και Μάρθα, οι οποίοι στηρίζουν τις επιλογές μου και διαμορφώνουν το κατάλληλο περιβάλλον ώστε να μπορέσω να ανταποκριθώ με επάρκεια και επιτυχία σε αυτές. Είναι οι άνθρωποι που έχουν συμβάλλει τα μέγιστα για την ανατροφή μου, για την διαπαιδαγώγηση μου και για τη διαμόρφωση του χαρακτήρα μου. Είναι, τουλάχιστον, χρέος μου να αισθάνομαι ευγνώμων απέναντι τους και να μνημονεύω ότι χωρίς αυτούς δεν θα είχα φτάσει ως εδώ. Τελειώνοντας, θα ήθελα να ευχαριστήσω το Πρόγραμμα Βασικής Έρευνας «Ηράκλειτος» για την οικονομική ενίσχυση που μου προσέφερε κατά τη διάρκεια της εκπόνησης της διατριβής αλλά και την εντεταλμένη υπάλληλο της Επιτροπής Ερευνών του Πανεπιστημίου Πατρών Χρύσα Πυλή για την προθυμία και την φιλικότητα που επέδειξε κατά τη συνεργασία μας. Να είστε όλοι καλά!!! Σας ευχαριστώ!!! Θοδωρής Πάτρα, Απρίλιος 2007

10 Περιεχόμενα Σελίδα I. Εισαγωγή 1 1. Το ριβόσωμα και η μετάφραση του mrna Ορισμός της μετάφρασης Δομή και βιογένεση του ριβοσώματος Τα δομικά συστατικά του ευκαρυωτικού ριβοσώματος Βιογένεση του ριβοσώματος Δομικές μελέτες ριβοσωμάτων Γέφυρες επικοινωνίας μεταξύ της 40S και της 60S υπομονάδας Οι λειτουργικές περιοχές του ριβοσώματος Το κέντρο της αποκωδικοποίησης Το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης Η περιοχή εξόδου (E-site) Η πορεία της μετάφρασης στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς Πιστότητα της μετάφρασης Το ριβοσωματικό RNA και οι ριβοσωματικές πρωτεΐνες του κέντρου αποκωδικοποίησης Αμινοάκυλο-tRNA συνθετάσες Παράγοντας επιμήκυνσης eef1 (EF-Tu των προκαρυωτικών) Αντιβιοτικά-αναστολείς της ριβοσωματικής λειτουργίας Αντιβιοτικά που επηρεάζουν την ακρίβεια της μετάφρασης Το αμινογλυκοζιτικό αντιβιοτικό στρεπτομυκίνη Το αμινογλυκοζιτικό αντιβιοτικό παρομομυκίνη Αντιβιοτικά-αναστολείς της μετατόπισης (translocation) Το γλουταριμιδικό αντιβιοτικό κυκλοεξιμίδιο Γενικοί αναστολείς της πρωτεϊνοσύνθεσης Το αντιβιοτικό πουρομυκίνη Περιοχές του rrna της μικρής ριβοσωματικής υπομονάδας που επηρεάζουν τη μεταφραστική πιστότητα Η θηλιά 530 της έλικας 18 του 18S rrna Η μετάπτωση G517A Η μεταστροφή C526A Η έλικα 34 του 18S rrna Οι υποκαταστάσεις της βάσης C Η έλικα 44 του 18S rrna Η υποκατάσταση U1495C Άλλες περιοχές του 18S rrna που συμμετέχουν στη ρύθμιση της μεταφραστικής πιστότητας Περιοχές rrna της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας που επηρεάζουν τη μεταφραστική πιστότητα Η έλικα 90 του 23S rrna Η υποκατάσταση C2658U Η υποκατάσταση C1057G Μεταλλάξεις σε εξωριβοσωματικά συστατικά που επηρεάζουν τη ριβοσωματική λειτουργία Η μετάλλαξη sup45 του παράγοντα τερματισμού erf Η φωσφορυλίωση ως ρυθμιστής της μετάφρασης Η φωσφατάση σερίνης/θρεονίνης SAL6 52

11 6.2.2 H αντικατασταλτική μετάλλαξη asu H οξειδωτική ισορροπία του κυττάρου Η παραγωγή των δραστικών ριζών οξυγόνου (ROS) Η κυτταρική άμυνα έναντι των δραστικών ριζών οξυγόνου Η υπόθεση του «μεταβολικού ρυθμού» Μεταφραστική πιστότητα και οξειδωτικές τροποποιήσεις Ο σακχαρομύκητας Saccharomyces cerevisiae ως πειραματικό σύστημα 60 II. Σκοπός της διατριβής 61 III. Υλικά & Μέθοδοι Υλικά Μέθοδοι Καλλιέργεια και συντήρηση των κυττάρων του Saccharomyces cerevisiae Καλλιέργεια των κυττάρων του Saccharomyces cerevisiae Συντήρηση των κυττάρων του Saccharomyces cerevisiae Προσδιορισμός χρόνου διπλασιασμού κυττάρων ζύμης Κατασκευή μεταλλαγμένων στελεχών του Saccharomyces cerevisiae Κατασκευή στελέχους ζύμης που φέρει σημειακή μετάλλαξη σε περιοχή του 18S rrna ή του 25S rrna Κατασκευή στελέχους ζύμης που φέρει μετάλλαξη σε εξωριβοσωματικά συστατικά Παρασκευή συστήματος ελεύθερου κυττάρων In vitro δοκιμασίες μετάφρασης In vitro μετάφραση μηνύματος poly(u) In vitro δοκιμασία ενσωμάτωσης φαινυλαλανίνης Επίδραση κυκλοεξιμιδίου επί της ικανότητας της πρωτεϊνοσύνθεσης Ανθεκτικότητα των κυττάρων στην παρομομυκίνη Πειράματα σε υγρές κυτταρικές καλλιέργειες (θρεπτικό μέσο YPD) Πειράματα σε στερεές καλλιέργειες (θρεπτικό μέσο YPAD) Ανθεκτικότητα των κυττάρων στο κυκλοεξιμίδιο Απομόνωση ριβοσωμάτων και διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων Απομόνωση «άπλυτων» ριβοσωμάτων Παρασκευή μικτού κλάσματος διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων (SPF) Απομόνωση «πλυμένων» ριβοσωμάτων Παρασκευή Ν-Ac-[ 3 H]-L-Phe-tRNA από ζύμη Παρασκευή του [ 3 H]-L-Phe-tRNA Ακετυλίωση του [ 3 H]-L-Phe-tRNA Πειράματα πρόσδεσης υποστρωμάτων στις A και P ριβοσωματικές περιοχές Πρόσδεση του Ac-[ 3 H]-Phe-tRNA στην P περιοχή του ριβοσώματος Πρόσδεση του [ 3 H]-Phe-tRNA στην Α περιοχή του ριβοσώματος Παρασκευή σπινθηριστικού υγρού Bray s Ανάλυση πολυσωμάτων και ριβοσωμάτων επί γραμμικής

12 βαθμίδωσης σακχαρόζης Aντίδραση πουρομυκίνης Στάδιο πρόσδεσης. Σχηματισμός και απομόνωση του τριμερούς συμπλόκου C Στάδιο κατάλυσης. Αντίδραση πουρομυκίνης σε ομοιογενές σύστημα Κινητική ανάλυση της αντίδρασης πουρομυκίνης In vitro δοκιμασία μετατόπισης (in vitro translocation assay) Παρασκευή κυττάρων ζύμης για μελέτη δεικτών οξειδωτικού στρες Προετοιμασία των γυάλινων σφαιριδίων 102 IV. Αποτελέσματα Μελέτη της επίδρασης μεταλλάξεων σε εξωριβοσωματικά συστατικά επί της λειτουργίας και της δομής του ριβοσώματος της ζύμης Τα στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν Καμπύλες ανάπτυξης αγρίου τύπου και μεταλλαγμένων στελεχών Πρωτεϊνοσυνθετική ενεργότητα των μεταλλαγμένων ριβοσωμάτων Σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης των αγρίου τύπου και των μεταλλαγμένων ριβοσωμάτων Κινητική ενσωμάτωσης φαινυλαλανίνης Επίδραση εξωριβοσωματικών συστατικών επί της πιστότητας της μετάφρασης, απουσία και παρουσία παρομομυκίνης Προσδιορισμός επιπέδων μεταφραστικής πιστότητας απουσία παρομομυκίνης Προσδιορισμός επιπέδων μεταφραστικής πιστότητας παρουσία παρομομυκίνης Ανθεκτικότητα των κυττάρων έναντι παρομομυκίνης in vivo Δοκιμασία ανθεκτικότητας έναντι αντιβιοτικού επί φίλτρου Αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων παρομομυκίνης in vivo Επίδραση των εξωριβοσωματικών μετάλλαξεων στην ικανότητα πρόσδεσης του trna στις περιοχές Α και P του ριβοσώματος Ικανότητα πρόσδεσης στην Α ριβοσωματική περιοχή Ικανότητα πρόσδεσης στην Ρ ριβοσωματική περιοχή Επίδραση των εξωριβοσωματικών μετάλλαξεων επί της καταλυτικής ενεργότητας του ριβοσώματος Ανθεκτικότητα των κυττάρων έναντι του κυκλοεξιμιδίου in vivo Δοκιμασία ανθεκτικότητας έναντι αντιβιοτικού επί φίλτρου Αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων κυκλοεξιμιδίου in vivo Πρωτεϊνοσυνθετική ενεργότητα των ριβοσωμάτων παρουσία κυκλοεξιμιδίου Επίδραση των εξωριβοσωματικών μεταλλάξεων στο στάδιο μετατόπισης της μετάφρασης Εξάρτηση της αντίδρασης μετατόπισης των ριβοσωμάτων των μεταλλαγμένων στελεχών από τη συγκέντρωση του κλάσματος των 128 διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων Επίδραση του κυκλοεξιμιδίου στο στάδιο της μετατόπισης της μετάφρασης Επίδραση μεταλλάξεων σε εξωριβοσωματικά συστατικά επί της

13 δομής του ευκαρυωτικού ριβοσώματος Μελέτη της επίδρασης των μεταλλάξεων rdn1a και rdn1t της έλικας 34 και της μετάλλαξης rdn2 της έλικας 18 του 18S rrna της ζύμης επί της καταλυτικής ενεργότητας του ριβοσώματος και επί του σταδίου της μετατόπισης Χρησιμοποιηθέντα στελέχη Τα προηγηθέντα πειράματα και αποτελέσματα Επίδραση των ελίκων 18 και 34 του 18S rrna επί της καταλυτικής ενεργότητας του ριβοσώματος Ανθεκτικότητα των κυττάρων έναντι του κυκλοεξιμιδίου in vivo Πειράματα σε υγρές καλλιέργειες Δοκιμασία ανθεκτικότητας έναντι κυκλοεξιμιδίου επί φίλτρου Επίδραση κυκλοεξιμιδίου στην ικανότητα σύνθεσης πολυφαινυλαλανίνης in vitro Επίδραση των μεταλλάξεων rdn1a, rdn1t και rdn2 στο στάδιο της μετατόπισης Εξάρτηση της αντίδρασης μετατόπισης των ριβοσωμάτων των μεταλλαγμένων στελεχών από τη συγκέντρωση του κλάσματος των 141 διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων Επίδραση του κυκλοεξιμιδίου στο στάδιο της μετατόπισης της μετάφρασης Μελέτη της επίδρασης μεταλλάξεων στις έλικες 12, 18 και 34 του 18S rrna της ζύμης επί της καταλυτικής ενεργότητας του ριβοσώματος και επί του σταδίου της μετατόπισης Χρησιμοποιηθέντα στελέχη Τα προηγηθέντα πειράματα και αποτελέσματα Επίδραση των ελίκων 12, 18 και 34 του 18S rrna στην καταλυτική ενεργότητα του ριβοσώματος Ανθεκτικότητα των κυττάρων έναντι του κυκλοεξιμιδίου in vivo Πειράματα σε υγρές καλλιέργειες Δοκιμασία ανθεκτικότητας έναντι κυκλοεξιμιδίου επί φίλτρου Επίδραση των μεταλλάξεων com1, rdn2 και com6 επί του σταδίου της μετατόπισης Εξάρτηση της αντίδρασης μετατόπισης των ριβοσωμάτων των μεταλλαγμένων στελεχών από τη συγκέντρωση του κλάσματος των διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων Επίδραση του κυκλοεξιμιδίου στο στάδιο της μετατόπισης της μετάφρασης Μελέτη της επίδρασης της σημειακής μετάλλαξης rdn12a στη θηλιά 530 της έλικας 18 του 18S rrna της ζύμης επί της καταλυτικής ενεργότητας του ριβοσώματος και επί του σταδίου της μετατόπισης Χρησιμοποιηθέντα στελέχη Τα προηγηθέντα πειράματα και αποτελέσματα Επίδραση της μετάλλαξης rdn12α της έλικας 18 του 18S rrna επί της ικανότητας πρόσδεσης στην Ρ ριβοσωματική περιοχή και επί της καταλυτικής ενεργότητας του ριβοσώματος της ζύμης Ανθεκτικότητα των κυττάρων έναντι του κυκλοεξιμιδίου in vivo Πειράματα σε υγρές καλλιέργειες Δοκιμασία ανθεκτικότητας έναντι κυκλοεξιμιδίου επί φίλτρου Πρωτεϊνοσυνθετική ενεργότητα των ριβοσωμάτων παρουσία

14 κυκλοεξιμιδίου Επίδραση της μετάλλαξης rdn12α της έλικας 18 του 18S rrna επί του σταδίου της μετατόπισης της πρωτεϊνοσύνθεσης Εξάρτηση της αντίδρασης μετατόπισης των ριβοσωμάτων των μεταλλαγμένων στελεχών από τη συγκέντρωση του κλάσματος των διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων Επίδραση του κυκλοεξιμιδίου επί του σταδίου της μετατόπισης της μετάφρασης Μελέτη της επίδρασης της σημειακής μετάλλαξης com3 του 25S rrna της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας της ζύμης επί χαρακτηριστικών λειτουργιών του ριβοσώματος Χρησιμοποιηθέντα στελέχη Τα προηγηθέντα πειράματα και αποτελέσματα Πρωτεϊνοσυνθετική ενεργότητα των μεταλλαγμένων ριβοσωμάτων Σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης των αγρίου τύπου και μεταλλαγμένων ριβοσωμάτων Κινητική ενσωμάτωσης φαινυλαλανίνης Επίδραση της μετάλλαξης com3 του 25S rrna επί της ικανότητας πρόσδεσης στην Ρ ριβοσωματική περιοχή και επί της καταλυτικής ενεργότητας του ριβοσώματος της ζύμης Ανθεκτικότητα των κυττάρων έναντι του κυκλοεξιμιδίου in vivo Πειράματα σε υγρές καλλιέργειες Δοκιμασία ανθεκτικότητας έναντι κυκλοεξιμιδίου επί φίλτρου Συσχέτιση μεταφραστικής πιστότητας και οξειδωτικής κατάστασης του ευκαρυωτικού κυττάρου με τη βοήθεια μεταλλάξεων 175 Παράρτημα Ι Επίπεδα των μη πρωτεϊνικών δισουλφιδίων (NPSSR) Επίπεδα της υπεροξείδωσης των λιπιδίων Επίπεδα των ανηγμένων (PSH) και των οξειδωμένων πρωτεϊνικών θειολών (PSSP) Επίπεδα της οξειδωμένης γλουταθειόνης (GSSG) 185 V. Συζήτηση-Συμπεράσματα 187 VI. Περιλήψεις Ελληνική-Αγγλική 209 Ελληνική περίληψη 211 Αγγλική περίληψη (Summary) 216 VII. Βιβλιογραφία 221 VIII. Παράρτημα ΙΙ 245

15 Εισαγωγή

16 Εισαγωγή 1. Το ριβόσωμα και η μετάφραση του mrna 1.1 Ορισμός της μετάφρασης Η μετάφραση είναι η διαδικασία ανάγνωσης των κωδικίων του mrna σε αμινοξέα και η διαδοχική σύνδεση των τελευταίων σε μια πολυπεπτιδική αλυσίδα. Πρόκειται για μια σημαντική λειτουργία του κυττάρου κατά την οποία το αλφάβητο των τεσσάρων «γραμμάτων» των νουκλεϊνικών οξέων μεταφράζεται στο τελείως διαφορετικό αλφάβητο των είκοσι «γραμμάτων» των πρωτεϊνών. Με αυτόν τον τρόπο, δηλαδή μέσω της μετάφρασης της γενετικής πληροφορίας, ο γονότυπος κάθε οργανισμού συνδέεται με τον φαινότυπο του. Η μετάφραση πραγματοποιείται με τη βοήθεια των ριβοσωμάτων, τα οποία αποτελούν τις μοριακές μηχανές οι οποίες συντονίζουν τις αλληλεπιδράσεις πολλών και διακριτών μεταξύ τους μορίων. Για την επιτυχή διεκπεραίωση της μετάφρασης απαιτούνται επιπλέον: α) το μόριο-αγγελιοφόρος RNA (mrna) που μεταφέρει τη γενετική πληροφορία, β) μόρια μεταφορικού RNA (trna) που μεταφέρουν τα ενεργοποιημένα αμινοξέα υπό την μορφή των αμινοακυλο-trna, γ) πρωτεΐνες (συνθετάσες και μεταφραστικοί παράγοντες) και ε) ενέργεια υπό μορφή κυρίως του GTP. 1.2 Δομή και βιογένεση του ριβοσώματος Οι περισσότερες πληροφορίες για τη δομή του ριβοσώματος έχουν προκύψει από μελέτες σε προκαρυωτικά κύτταρα. Αντιθέτως, οι πληροφορίες που υπάρχουν για το ευκαρυωτικό ριβόσωμα είναι πιο περιορισμένες λόγω και του πολυπλοκότερου βαθμού οργάνωσης των ευκαρυωτικών κυττάρων. Αν και στα ριβοσώματα των ευκαρυωτικών κυττάρων εντοπίζονται επιπλέον τμήματα βάσεων (expansion segments) και επιπλέον πρωτεΐνες, εντούτοις η βασική δομή των ριβοσωμάτων των προκαρυωτικών και των ευκαρυωτικών οργανισμών είναι σε μεγάλο ποσοστό συντηρημένη, υποδηλώνοντας ότι ο μηχανισμός βιοσύνθεσης των πρωτεϊνών είναι παρόμοιος μεταξύ των εξελικτικά διαφορετικών οργανισμών. Στις παραγράφους που ακολουθούν θα περιγραφούν δεδομένα που έχουν προκύψει από τη μελέτη τόσο του ευκαρυωτικού όσο και του προκαρυωτικού ριβοσώματος. 3

17 Εισαγωγή Τα δομικά συστατικά του ευκαρυωτικού ριβοσώματος Το ριβόσωμα είναι ένα αρχέγονο ριβονουκλεοπρωτεϊνικό σύμπλοκο και απαρτίζεται από μόρια ριβοσωματικού RNA (rrna) και από μόρια ριβοσωματικών πρωτεϊνών (r-proteins). Ο αριθμός και η αλληλουχία των βάσεων του rrna, ο αριθμός των ριβοσωματικών πρωτεϊνών και κατ επέκταση η αναλογία νουκλεϊνικού οξέος πρωτεΐνης παρουσιάζουν σημαντικές διαφοροποιήσεις μεταξύ ριβοσωμάτων προκαρυωτικών κυττάρων, ευκαρυωτικών κυττάρων και υποκυτταρικών οργανιδίων. Το ριβόσωμα απαρτίζεται από δυο υπομονάδες, τη μεγάλη (LSU, Large Subunit) και τη μικρή (SSU, Small Subunit), κάθε μια από τις οποίες αποτελείται από rrna και από έναν αριθμό πρωτεϊνών. Ο Πίνακας 1 παρουσιάζει συγκεντρωτικά δεδομένα ριβοσωμάτων διαφόρων οργανισμών. Το ποσοστό κατά μάζα του RNA στο ριβόσωμα ως «όλον» είναι περίπου 60%. Στις παραγράφους που ακολουθούν παρουσιάζονται εν συντομία ορισμένα βασικά χαρακτηριστικά των συστατικών του ευκαρυωτικού ριβοσώματος του ζυμομύκητα Saccharomyces cerevisiae. Πίνακας 1. Συστατικά ριβοσωμάτων διαφόρων οργανισμών. Εμφανίζονται οι συντελεστές καθίζησης του ριβοσώματος και των υπομονάδων του. Επίσης, αναφέρονται ο αριθμός των βάσεων των διαφόρων μορίων rrna καθώς ο αριθμός των πρωτεϊνών των δυο υπομονάδων. S: sedimentation coefficient (Συντελεστής Καθίζησης) Οργανισμός Μικρή υπομονάδα Μεγάλη υπομονάδα Escherichia coli 70S ριβόσωμα 30S 16S rrna (1542 nt) 21 πρωτεΐνες 50S 23S rrna (2904 nt), 5S rrna (120 nt) 31 πρωτεΐνες Saccharomyces cerevisiae 80S ριβόσωμα 40S 18S rrna (1798 nt) 32 πρωτεΐνες 60S 25S rrna (3392 nt), 5S rrna (121 nt), 5.8S rrna (158 nt) 45 πρωτεΐνες Θηλαστικά 80S ριβόσωμα 40S 18S rrna (1874 nt) 33 πρωτεΐνες 60S 28S rrna (4718 nt), 5S rrna (120 nt), 5.8S rrna (160 nt) 49 πρωτεΐνες 4

18 Εισαγωγή Τo 18S rrna της 40S υπομονάδας καθώς επίσης τα 25S και 5.8S rrna της 60S υπομονάδας προκύπτουν από ένα κοινό πρόδρομο μόριο 35S. Το 5S rrna της 60S υπομονάδας μεταγράφεται ξεχωριστά από τα υπόλοιπα μόρια rrna. Οι δομές όλων αυτών των μορίων έχουν περιγραφεί λεπτομερώς (Hogan et al. 1984a,b). Παρότι η πρωτοταγής δομή των rrna μορίων της ζύμης είναι μοναδική σε σύγκριση με εκείνη άλλων οργανισμών, εντούτοις η δευτεροταγής και πιθανώς η τριτοταγής δομή είναι ουσιαστικά ταυτόσημες με τις αντίστοιχες των βακτηρίων και των ανώτερων ευκαρυωτικών οργανισμών (Dams et al. 1988, Gutell et al. 1990). Tα rrna γονίδια του S. cerevisiae εντοπίζονται στο χρωμόσωμα XII και είναι οργανωμένα σε μία διαδοχική ακολουθία επαναλαμβανόμενων μονάδων (Petes & Botstein 1977). Η επαναλαμβανόμενη μονάδα του DNA έχει μέγεθος 9,1-kb και απεικονίζεται στην Εικόνα 1 (Philippsen et al. 1978). Ο αριθμός των επαναλαμβανόμενων μονάδων ποικίλλει από 100 μέχρι 200 και εξαρτάται από το στέλεχος. Όμως, ακόμη και στο ίδιο στέλεχος παρουσιάζεται μία διακύμανση του αριθμού των αντιγράφων, που αποδίδεται μάλλον στην άνιση ανταλλαγή γενετικού υλικού μεταξύ των αδελφών χρωματίδων (Olson 1991). Εικόνα 1. Οργάνωση rrna γονιδίων του Saccharomyces cerevisiae. Αναπαρίστανται δυο επαναλαμβανόμενες μονάδες rdna. Επίσης, φαίνονται οι περιοχές που αντιστοιχούν στο ώριμο rrna και στα μετάγραφα. Οι κλειστοί κύκλοι υποδηλώνουν τη θέση του ενισχυτή. Στο κάτω μέρος της εικόνας παρουσιάζεται η αλληλουχία που περιστοιχίζει την περιοχή έναρξης της μεταγραφής του 35S rrna. Το ασυνήθιστο με αυτή τη μονάδα είναι ότι τα γονίδια τόσο για το πρόδρομο 35S rrna όσο και για το 5S rrna, αν και βρίσκονται στην ίδια μεταγραφική μονάδα, 5

19 Εισαγωγή μεταγράφονται προς αντίθετες κατευθύνσεις και από διαφορετικούς ενισχυτές (Raue & Planta 1990), όπως φαίνεται στην Εικόνα 1. Στα κύτταρα της ζύμης, το μεγαλύτερο τμήμα της επαναλαμβανόμενης rdna ακολουθίας οργανώνεται σε μια μοναδική μεταγραφική μονάδα, η οποία κάτω από την δράση της RNA πολυμεράσης I, οδηγεί στην παραγωγή ενός προδρόμου μορίου 35S rrna (μεγέθους 6.6 Kb), το οποίο κατόπιν ωρίμανσης δίνει το 18S rrna της 40S υπομονάδας καθώς και τα 5.8S και 25S rrna της 60S υπομονάδας (Sollner-Webb & Tower 1986). Έχει προταθεί ότι η διαμόρφωση του DNA παίζει σημαντικό ρόλο στην μεταγραφή του πρόδρομου 35S rrna καθώς η ταυτόχρονη απενεργοποίηση των τοποϊσομερασών Ι και ΙΙ προκαλεί ειδική αναστολή της μεταγραφής του τελευταίου (Brill et al. 1987). Σε ότι αφορά το 5S rrna, η μεταγραφή αυτού πραγματοποιείται από την RNA πολυμεράση ΙΙΙ. Παρά το γεγονός ότι το γονίδιο του 5S rrna ευρίσκεται μεταξύ του ενισχυτή και του σημείου έναρξης της μεταγραφής του 35S rrna (Εικόνα 1), εντούτοις ο ενισχυτής αυτός δεν επηρεάζει τη μεταγραφή του 5S rrna (Neigeborn & Warner 1990) υποδηλώνοντας ότι αυτή πραγματοποιείται από διαφορετικό ενισχυτή. Επί πλέον, έχει παρατηρηθεί μια έμμεση ισορροπία μεταξύ της μεταγραφής του 35S rrna και του 5S rrna μέσω μιας ριβοσωματικής πρωτεΐνης που δεσμεύει το 5S rrna (Brow & Geiduschek 1987). Τέλος, η μεταγραφή του 35S rrna και του 5S rrna οδηγεί στην παραγωγή ισομοριακών ποσοτήτων των 18S, 25S, 5.8S και 5S rrna μορίων (Neigeborn & Warner 1990). Ο αριθμός των ριβοσωματικών πρωτεϊνών διευκρινίστηκε με πειράματα ηλεκτροφόρησης δύο διαστάσεων. Έτσι, ταυτοποιήθηκαν 45 πρωτεΐνες στην 60S ριβοσωματική υπομονάδα και 32 πρωτεΐνες στην 40S υπομονάδα. Η σάρωση του γονιδιώματος του ζυμομύκητα έδειξε ότι αυτό περιέχει 137 γονίδια που κωδικοποιούν το σύνολο των 77 αυτών διαφορετικών ριβοσωματικών πρωτεϊνών, ενώ 59 από αυτά τα γονίδια βρίσκονται σε διπλά αντίγραφα (Planta 1997). Οι ριβοσωματικές πρωτεΐνες υπόκεινται σε μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις όπως φωσφορυλίωση, μεθυλίωση ή ακετυλίωση χωρίς, ωστόσο, να έχει διαλευκανθεί πλήρως η σημασία αυτών των αλλαγών (Lee 1990). Επίσης, όλες οι ριβοσωματικές πρωτεΐνες του S. cerevisiae έχουν τις αντίστοιχές τους στα θηλαστικά. Γενικά, οι ριβοσωματικές πρωτεΐνες του S. cerevisiae και των θηλαστικών είναι 75% ταυτόσημες. Αντίθετα, μόνο λίγες ριβοσωματικές πρωτεΐνες των βακτηρίων είναι ομόλογες με ορισμένες της ζύμης. Παρά ταύτα, πιστεύεται ότι οι περισσότερες ριβοσωματικές πρωτεΐνες των ευκαρυωτικών έχουν αντίστοιχες στα 6

20 Εισαγωγή προκαρυωτικά ριβοσώματα, αν και η σχέση αυτή είναι περισσότερο φανερή από τη λειτουργία της πρωτεΐνης παρά από την αλληλουχία του γονιδίου της. Φερ ειπείν, η πρωτεΐνη L25 της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας της ζύμης προσδένεται στην ίδια περιοχή του rrna όπως και η L23 του E. coli, παρά το γεγονός ότι έχουν ελάχιστη ομοιότητα ως προς την αλληλουχία τους (El-Baradi et al. 1985). Το γεγονός ότι το ριβόσωμα περιέχει μεγάλο αριθμό ριβοσωματικών πρωτεϊνών και μάλιστα συντηρημένων μεταξύ οργανισμών που απέχουν μεταξύ τους εξελικτικά κατά μερικά δισεκατομμύρια έτη, δείχνει ότι εκτός από το rrna και οι ριβοσωματικές πρωτεΐνες έχουν σημαντικούς και διακριτούς ρόλους κατά τη μετάφραση. Οι ριβοσωματικές πρωτεΐνες και των δυο υπομονάδων αποτελούν τις δομικές μονάδες οι οποίες οργανώνουν τις καταλυτικές ιδιότητες των συστατικών του rrna, όπως υποστηρίζουν οι Noller, Woese και άλλοι (Noller 1984, Woese 1987). Οι ριβοσωματικές πρωτεΐνες συμμετέχουν στη στήριξη, στη σταθεροποίηση και στον προσανατολισμό του χαλαρού ριβοσωματικού RNA, δίνοντας του ειδική και ενεργή δομή-διαμόρφωση. Έτσι, έχει αποδειχθεί ότι οι ριβοσωματικές πρωτεΐνες S12, S4 και η S5 της 30S υπομονάδας του E. coli εμπλέκονται στο κέντρο ακρίβειας του ριβοσώματος (Alksne & Warner 1993), ενώ πρόσφατα αποδείχθηκε η συμμετοχή των ομόλογών τους ριβοσωματικών πρωτεϊνών S23, S9 και S2 στο κέντρο ακρίβειας της μετάφρασης στη ζύμη (All-Robyn et al. 1990a,b, Alksne et al. 1993, Anthony & Liebman 1995, Synetos et al. 1996). Επίσης, είναι γνωστό πως η πλήρης αποπρωτεΐνωση του ριβοσώματος αναιρεί την ενεργότητα του Βιογένεση του ριβοσώματος Η συγκρότηση του ριβοσώματος της ζύμης πραγματοποιείται στον πυρηνίσκο ο οποίος περιέχει το πρόδρομο rrna. Παλαιότερες μελέτες έχουν δείξει ότι ο πυρηνίσκος των κυττάρων της ζύμης δεν είναι ακριβώς παρόμοιος με τους πυρηνίσκους μεγαλύτερων ευκαρυωτικών κυττάρων (Sillevis-Smitt et al. 1973). Επίσης, έχει βρεθεί ότι μόρια RNA του πυρηνίσκου (small nucleolar RNAs, snrnas) δεσμεύονται στα πρόδρομα μόρια rrna και επηρεάζουν την ωρίμανση τους. Έτσι, η απάλειψη του γονιδίου του snr10 προκαλεί αργή και ανακριβή ωρίμανση του 35S rrna (Tollervey 1987). Η απάλειψη του γονιδίου του snr128 προκαλεί ανεπαρκή παραγωγή μορίων του 18S rrna και κατ επέκταση σημαντική μείωση των διαθέσιμων 40S υπομονάδων (Li et al. 1990). 7

21 Εισαγωγή Το 35S rrna μεταγράφεται ως ένα μεμονωμένο μόριο μήκους 6587 νουκλεοτιδίων. Το πολυνουκλεοτίδιο αυτό υπόκειται α) σε μεθυλίωση των μορίων της ριβόζης και των βάσεων του, β) σε ψευδοουριδυλίωση και γ) σε διάσπαση τόσο από εξωνουκλεάσες όσο και από ενδονουκλεάσες προκειμένου να ληφθούν τα μόρια 18S rrna της 40S υπομονάδας καθώς επίσης τα 25S rrna και 5.8S rrna της 60S υπομονάδας. Πειράματα στη ζύμη έχουν δείξει ότι αρχικά σχηματίζεται ένα 90S προριβοσωματικό μόριο περιέχον το 35S rrna και το οποίο διασπώμενο σχηματίζει ένα πυρηνικό 66S μόριο περιέχον το 27S rrna και ένα κυτταροπλασματικό 43S μόριο περιέχον το 20S rrna (Trapman et al. 1975). Τo 35S πρόδρομο rrna διασπάται σε δυο κομμάτια, το 20S που περιέχει το 18S rrna και το 27S που περιέχει το 25S rrna και το 5.8S rrna. Τα τελικά βήματα ωρίμανσης της 40S υπομονάδας περιλαμβάνουν τη διάσπαση του 20S rrna προς σχηματισμό του 18S rrna, μια διαδικασία η οποία πραγματοποιείται στο κυτταρόπλασμα (Udem & Warner 1973). Το 27S μόριο διασπάται, κατ αρχήν σε δυο σημεία για να προκύψει ένα ενδιάμεσο μόριο 27Β το οποίο με τη σειρά του διασπάται σε άλλα δυο σημεία για να προκύψει αφενός το 25S rrna και αφετέρου το 7S rrna. Το τελευταίο διασπάται σε ένα σημείο και προκύπτει κατ αυτόν τον τρόπο το 5.8S rrna. Η προαναφερθείσα διαδικασία της ωρίμανσης του πρόδρομου 35S rrna έχει προταθεί από τους Veldman et al. (1981). Οι ριβοσωματικές πρωτεΐνες συντίθενται στο κυτταρόπλασμα και μεταφέρονται στον πυρηνίσκο διαμέσου της πυρηνικής μεμβράνης. Ορισμένες ριβοσωματικές πρωτεΐνες όπως η L3 (Moreland et al. 1985), η L25 (Schaap et al. 1991) και η L29 (Underwood & Fried 1990) διαθέτουν πυρηνικά σήματα διαμετακίνησης (Nuclear Localization Signals, NLS) προκειμένου να διαπεράσουν την πυρηνική μεμβράνη. Όσες ριβοσωματικές πρωτεΐνες δεν διαθέτουν τέτοιου είδους σήματα είναι πιθανόν ότι εισέρχονται στον πυρήνα μέσω σύνδεσης τους με άλλες ριβοσωματικές πρωτεΐνες που διαθέτουν τις σηματοδοτικές αλληλουχίες. Παλαιότερα πειράματα έχουν διαχωρίσει τις ριβοσωματικές πρωτεΐνες σε εκείνες που δεσμεύονται πρώιμα και σε εκείνες που δεσμεύονται όψιμα κατά τη βιοσύνθεση του ριβοσώματος (Kruiswijk et al. 1978). Ας σημειωθεί, επίσης, ότι οι ριβοσωματικές πρωτεΐνες διαδραματίζουν ουσιαστικό ρόλο κατά τη διαδικασία ωρίμανσης του πρόδρομου rrna (Warner & Udem 1972, Warner & Gorenstein 1977). Συγκεκριμένα, οι ριβοσωματικές πρωτεΐνες δεσμεύονται στο νεοσχηματισμένο μετάγραφο (Trapman et al. 1975) και το σύμπλοκο πρόδρομου rrna και ριβοσωματικών πρωτεΐνών αποτελεί το υπόστρωμα πάνω στο οποίο θα διεξαχθεί η διαδικασία της ωρίμανσης. Στο τέλος της ωρίμανσης οι 8

22 Εισαγωγή συγκροτημένες ριβοσωματικές υπομονάδες εξέρχονται διαμέσου των πόρων της πυρηνικής μεμβράνης και εγκαθίστανται στο κυτταρόπλασμα Δομικές μελέτες ριβοσωμάτων Το ριβόσωμα διαθέτει τρεις περιοχές αλληλεπίδρασης με τρία διαφορετικά μόρια trna, οι οποίες παρουσιάζονται στην Εικόνα 2. Η Α περιοχή (A-site) δέχεται το αμινοάκυλο-trna που φέρει προσδεδεμένο το αμινοξύ που πρόκειται να προστεθεί στην αυξανόμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα. Η Ρ περιοχή (P-site) δέχεται το πεπτιδυλοtrna, το trna δηλαδή που φέρει την συντιθέμενη σε κάθε χρονική στιγμή αλυσίδα αμινοξέων. Η Ε περιοχή (E-site) φέρει το αποακυλιωμένο trna, δηλαδή το μόριο του trna που έχει προκύψει έπειτα από την απομάκρυνση του αρτιγέννητου πεπτιδίου από το πεπτιδυλο- trna. Εικόνα 2. Παρουσιάζει τις θέσεις δέσμευσης των trnas από την πλευρά της 30S υπομονάδας (αριστερά) και από την πλευρά της 50S υπομονάδας (δεξιά). Με πράσινο χρώμα αποδίδεται η Α περιοχή, με σκούρο μπλε αποδίδεται η P περιοχή και με πορτοκαλί αποδίδεται η Ε περιοχή. Επίσης, με υποδηλώνεται το 3 -CCA άκρο του trna που δεσμεύεται στην Α περιοχή ενώ με υποδηλώνεται το 3 -CCA άκρο του trna που δεσμεύεται στην Ρ περιοχή και το οποίο στη συνέχεια μετατοπίζεται στην Ε-περιοχή. Αρχικά, το σχήμα του ριβοσώματος διευκρινίστηκε σε προκαρυωτικούς οργανισμούς με τη βοήθεια της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας (Lake 1976). Η ανάπτυξη 9

23 Εισαγωγή της κρυο-ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, επέτρεψε την τρισδιάστατη απεικόνιση του προκαρυωτικού ριβοσώματος αλλά και των επιμέρους υπομονάδων του εφ όσον με την τεχνική αυτή καθίσταται δυνατή η παρατήρηση ενυδατωμένων μορίων χωρίς την πρόκληση παραμορφώσεων της τρισδιάστατης δομής τους (Frank et al. 1995). Έτσι έγινε γνωστό ότι η μεγάλη υπομονάδα του προκαρυωτικού ριβοσώματος, έχει διάμετρο περίπου 250 Å. Οι περιοχές του 23S rrna διαπλέκονται ισχυρά μεταξύ τους με αποτέλεσμα η μεγάλη ριβοσωματική υπομονάδα να παρουσιάζει μία συμπαγή μορφή, το σώμα. Όταν ο παρατηρητής βλέπει την επιφάνεια επαφής, το σώμα σχηματίζει τρεις προεξοχές α) την κεντρική που αποτελείται από το 5S rrna, μέρος του 23S rrna, και τις πρωτεΐνες L5, L18, L25 και L33, β) την αριστερή που αποτελείται από την πρωτεΐνη L1 και γ) την δεξιά που αποτελείται από τις πρωτεΐνες L7/L12. Η μικρή ριβοσωματική υπομονάδα αποτελείται από μία κεφαλή ενωμένη μέσω του λαιμού στο σώμα. Το τελευταίο παρουσιάζει δύο προεξοχές: την ωμοπλάτη και την πλατφόρμα. Όσον αφορά το 16S rrna της μικρής ριβοσωματικής υπομονάδας, οι περιοχές της δευτεροταγούς δομής αντιστοιχούν σε διακριτές περιοχές της τριτοταγούς διάταξης, οι οποίες είναι αυτόνομες δομικά, επιτρέποντας με αυτόν τον τρόπο τη σχετική ευλυγισία των περιοχών αυτών κατά την πρωτεϊνοσύνθεση. Έτσι η 5 περιοχή σχηματίζει το σώμα της μικρής υπομονάδας, η κεντρική την πλατφόρμα και η 3 μεγάλη περιοχή την κεφαλή. Αξίζει να σημειωθεί ότι η διαμόρφωση που έχει το 16S rrna στο 70S ριβόσωμα διαφέρει από αυτή που έχει στην ελεύθερη 30S υπομονάδα (Carter et al. 2000) υποδεικνύοντας ότι κατά την ανασύσταση του ριβοσώματος από τις υπομονάδες του συμβαίνουν διαμορφωτικές αλλαγές μεταξύ των διαφόρων συστατικών των υπομονάδων του, οι οποίες προφανώς οφείλονται στις μεταξύ τους αλληλεπιδράσεις. Η πρώτη κρυσταλλογραφική δομή που δημοσιεύθηκε ήταν της μεγάλης 50S ριβοσωματικής υπομονάδας του αρχαιοβακτηρίου Haloarcula marismortui με ευκρίνεια ανάλυσης 9 Å (Ban et al. 1998). Ένα χρόνο αργότερα δημοσιεύτηκαν κρυσταλλογραφικές δομές της ίδιας υπομονάδας αυτού του αρχαιοβακτηρίου σε ανάλυση 5 Å (Ban et al. 1999), ενώ το 2000 σε ανάλυση 2.4 Å, όπου πλέον διακρίνονταν οι δομές διαφόρων πρωτεϊνών και rrna (Ban et al. 2000). Η κρυσταλλική δομή του 70S προκαρυωτικού ριβοσώματος του θερμοφιλικού ευβακτηρίου Thermus thermophilus με ευκρίνεια ανάλυσης 7.8 Å και προσδεδεμένα μόρια mrna και trna στις A, P και E περιοχές του ριβοσώματος πραγματοποιήθηκε το 1999 (Cate et al. 1999). Ένα χρόνο αργότερα δημοσιεύτηκε κρυσταλλογραφική 10

24 Εισαγωγή δομή της 30S υπομονάδας του ίδιου βακτηρίου, στην οποία ήταν προσδεδεμένα μόρια mrna καθώς και trna στις A, P και E περιοχές του ριβοσώματος (Εικόνα 3Α) ή/και προσδεδεμένα διάφορα αντιβιοτικά που επηρεάζουν την πρωτεϊνοσύνθεση, σε ανάλυση 3 Å (Carter et al. 2000). Χαρακτηριστικό της κρυσταλλογραφικής αυτής μελέτης ήταν ότι οι λειτουργικές περιοχές της μικρής ριβοσωματικής υπομονάδας δομούνται κατά κύριο λόγο από συστατικά του 16S rrna (Εικόνα 3Β). A Β Εικόνα 3. Α. Κρυσταλλογραφική δομή της 30S υπομονάδας του Thermus thermophilus, στην οποία διακρίνονται οι θηλιές των αντικωδικίων των μορίων trna που έχουν προσδεθεί στις A, P και E περιοχές του ριβοσώματος, Β. Δευτεροταγής δομή του 16S rrna,όπου οι διαφορετικά χρωματιζόμενες περιοχές δείχνουν την Α περιοχή (ροζ), την P περιοχή (κόκκινο) και την E περιοχή (κίτρινο). Στη συνέχεια, δημοσιεύτηκε η κρυσταλλογραφική δομή ολόκληρου του 70S ριβοσώματος του Thermus thermophilus με προσδεδεμένα μόρια mrna και trna στις A, P και E περιοχές αυτού, με ευκρίνεια ανάλυσης 5.5 Å (Yusupov et al. 2001) (Εικόνα 4). Στη μελέτη αυτή χαρακτηρίστηκαν οι περιοχές του 23S rrna της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας που αλληλεπιδρούν με αντίστοιχες περιοχές του 16S rrna της μικρής ριβοσωματικής υπομονάδας. Επί πλέον, εντοπίστηκαν οι περιοχές αλληλεπιδράσεων μεταξύ διαφόρων ριβοσωματικών πρωτεϊνών. Μάλιστα, οι αλληλεπιδράσεις RNA-RNA εντοπίζονται στις θέσεις πρόσδεσης των μορίων trna 11

25 Εισαγωγή στο ριβόσωμα, ενώ οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ ριβοσωματικών πρωτεϊνών εντοπίζονται στην περιφέρεια, μακριά από τις λειτουργικές περιοχές του ριβοσώματος. Επί πλέον, βρέθηκε ότι οι σχετικές θέσεις των A, P και E περιοχών του ριβοσώματος είναι διαδοχικές στο ριβόσωμα ενώ τα τρία μόρια αμινοάκυλο-trna κατανέμονται μεταξύ των δύο υπομονάδων του ριβοσώματος κατά τον ίδιο τρόπο. Δηλαδή, οι θηλιές των αντικωδικίων τους δεσμεύονται στην 30S υπομονάδα, ενώ οι υπόλοιπες περιοχές τους αλληλεπιδρούν με την 50S υπομονάδα, όπου εντοπίζεται το κέντρο κατάλυσης των πεπτιδικών δεσμών. Κατέστη σαφές ότι η P περιοχή του ριβοσώματος βρίσκεται «ασφαλισμένη» ανάμεσα στις δύο υπομονάδες, ενώ η Α περιοχή έχει πολύ περισσότερο χώρο στη διάθεσή της, τόσο από την P, όσο και από την E περιοχή, έτσι ώστε το αμινοάκυλο-trna που προσδένεται σε αυτή να μπορεί να λάβει την κατάλληλη διαμόρφωση για το σχηματισμό πεπτιδικού δεσμού ύστερα από την απελευθέρωση του GTP (Schuwirth et al. 2005). Εικόνα 4. Κρυσταλλογραφικές δομές του 70S ριβοσώματος του Thermus thermophilus από μπροστά (A), δεξιά (B), πίσω (C) και αριστερά (D). Τα μόρια που αντιστοιχούν στα διάφορα χρώματα είναι: 16S rrna (κυανό), 23S rrna (γκρί), 5S rrna (ανοικτό μπλέ), πρωτεΐνες της 30S υπομονάδας (βαθύ μπλέ), πρωτεΐνες της 50S υπομονάδας (πορφυρό). 12

26 Εισαγωγή Πρόσφατα, με τη βοήθεια της κρυο-ηλεκτρονικής μικροσκοπίας επετράπη η δημιουργία χαρτών για την ζύμη και το 80S ριβόσωμα του ανθρώπου (Spahn et al. 2001, Spahn et al. 2004) προσφέροντας έτσι νέα δεδομένα για το ευκαρυωτικό ριβόσωμα. Τα ευκαρυωτικά ριβοσώματα είναι μεγαλύτερα από τα αντίστοιχα προκαρυωτικά, λόγω της ύπαρξης επιπλέον τμημάτων (βάσεων) στα μόρια του rrna (Gerbi 1996), τα οποία αναφέρονται ως τμήματα επέκτασης (expansion segments) καθώς και της παρουσίας 20 ως 30 παραπάνω πρωτεϊνών (Wittmann-Liebold 1986, Wool et al. 1990, Planta & Mager, 1988), όπως φαίνεται στην Εικόνα 5. Συνεπώς, η κατανόηση της βιοσύνθεσης των πρωτεϊνών καθώς και άλλων ριβοσωματικών λειτουργιών των ευκαρυωτικών οργανισμών θα εξαρτηθεί από τις πληροφορίες που προέρχονται από δομικές μελέτες του 80S ριβοσώματος. Η πολυπλοκότητα του ευκαρυωτικού ριβοσώματος δεν έχει επιτρέψει μέχρι στιγμής την ύπαρξη κρυσταλλογραφικών μελετών μεγάλης ανάλυσης συγκριτικά με ανάλογες μελέτες στα προκαρυωτικά ριβοσώματα. Εικόνα 5. Σύγκριση κρυο-ηλεκτρονικής μικροσκοπίας του 80S ριβοσώματος του S. cerevisiae και του 70S ριβοσώματος της E. coli. Ο χάρτης του 80S ριβοσώματος της ζύμης (a, c) εμφανίζεται σε αντιπαράθεση με τον χάρτη του 70S ριβοσώματος της E. coli (b, d). Τα ριβοσώματα εμφανίζονται από την πλευρά των πρωτεϊνών L7/L12 (a και b) και από την πλευρά της πρωτεΐνης L1 (c και d). Οι εικόνες e, f αντιπροσωπεύουν τις μικρές υπομονάδες και οι εικόνες g, h τις μεγάλες υπομονάδες. Οι μικρές υπομονάδες εμφανίζονται με κίτρινο, οι μεγάλες με μπλε και το trna προσδεδεμένο στην P περιοχή με πράσινο. Επί πλέον μέρη του ευκαρυωτικού ριβοσώματος που οφείλονται στο επιπλέον rrna και στις μη-ομόλογες πρωτεΐνες φαίνονται με χρυσαφί (40S υπομονάδα) και μωβ (60S υπομονάδα). Οροθέσια σημεία της 40S υπομονάδας: b:σώμα, bk: ράμφος, h: κεφαλή, If: αριστερό άκρο, rf: δεξί άκρο, pt: πλατφόρμα, sh: ώμος, sp:σπιρούνι. Οροθέσια σημεία της 60S υπομονάδας: CP: κεντρική προεξοχή, L1: L1 προεξοχή, SΒ: βάση μίσχου, St: μίσχος L7/L12, H34: έλικα 34, H38: έλικα 38, SRL: θηλιά σαρκίνης/ρισίνης. 13

27 Εισαγωγή Γέφυρες επικοινωνίας μεταξύ της 40S και της 60S υπομονάδας Η πρωτεϊνοσύνθεση απαιτεί την επικοινωνία μεταξύ των δυο ριβοσωματικών υπομονάδων. Επί παραδείγματι, σήματα προερχόμενα από το κέντρο αποκωδικοποίησης της μικρής υπομονάδας μπορούν να μεταδοθούν στο κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης της μεγάλης υπομονάδας με δυο τρόπους: είτε με τη μεσολάβηση μορίων που έρχονται σε επαφή με αυτές τις δυο περιοχές, όπως είναι τα μόρια των trna, είτε με τις γέφυρες επικοινωνίας που ενώνουν τις δυο υπομονάδες (intersubunit bridges). Η ανάλυση των δομών και των λειτουργιών αυτών των γεφυρών επικοινωνίας έχει πολλά να προσφέρει στην καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού της πρωτεϊνοσύνθεσης. Στο 70S ριβόσωμα του E. coli χαρτογραφήθηκαν, με χαμηλής ευκρίνειας τεχνικές, έξι γέφυρες επικοινωνίας που συμβολίζονται ως Β1-Β6 (Frank et al. 1995, Lata et al. 1996). H ίδια σημειολογία εφαρμόστηκε αργότερα κατά τη χαρτογράφηση α) με κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ του 70S ριβοσώματος του Thermus thermophilus με ανάλυση ευκρίνειας 7.8 Å (Cate et al. 1999) και β) με κρυο-ηλεκτρονική μικροσκοπία του 70S ριβοσώματος του E. coli με ανάλυση ευκρίνειας 11.5 Å (Gabashvili et al. 2000). Το 2001, δημοσιεύτηκε ο χάρτης του 80S ριβοσώματος της ζύμης με τη βοήθεια της κρυο-ηλεκτρονικής μικροσκοπίας και με ανάλυση ευκρίνειας 15.4 Å (Spahn et al. 2001) και πολλές από τις πληροφορίες που παρατίθεται πιο κάτω προέρχονται από αυτή τη μελέτη. Οι περισσότερες από τις γέφυρες επικοινωνίας περιλαμβάνουν αλληλεπιδράσεις μεταξύ των μορίων RNA των δυο υπομονάδων (Mitchell et al. 1992, Merryman et al. 1999a, 1999b, Yusupov et al. 2001). Ωστόσο, έχουν προσδιορισθεί και αλληλεπιδράσεις μεταξύ RNA και πρωτεϊνών καθώς επίσης αλληλεπιδράσεις μεταξύ ριβοσωματικών πρωτεϊνών. Ας σημειωθεί, τέλος, πως έχει διατηρηθεί ο συμβολισμός των γεφυρών επικοινωνίας από Β1 έως Β6 ενώ οι επιπλέον γέφυρες που έχουν προσδιορισθεί στο ευκαρυωτικό ριβόσωμα φέρουν το διακριτικό e (eukaryotic) και συμβολίζονται ως eb8-eb11. Οι θέσεις στις οποίες εντοπίζονται οι γέφυρες επικοινωνίας (Εικόνα 6) διακρίνονται σε τρεις γραμμές την πρώτη (άνω), την δεύτερη (κεντρική) και την τρίτη (κάτω). Η γέφυρα Β1a ενώνει την ακραία θηλιά της έλικας 38 του 25S rrna με την πρωτεΐνη S15 της μικρής υπομονάδας. Η B1b δεν περιλαμβάνει αλληλεπιδράσεις μεταξύ μορίων rrna καθώς συνδέει την πρωτεΐνη S18 της μικρής υπομονάδας με την 14

28 Εισαγωγή πρωτεΐνη L11 της μεγάλης. Οι γέφυρες B2a, B3 και B5b συνδέουν τμήματα της μικρής αύλακας της έλικας 44 του 18S rrna με τμήματα της μικρής αύλακας των ελίκων της περιοχής IV του 25S rrna. Κάτω από τη γέφυρα B5b βρίσκεται η γέφυρα Β7 η οποία φέρνει σε επαφή την έλικα 44 του 18S rrna με την πρωτεΐνη L24 της μεγάλης υπομονάδας. Η Β7 παρατηρήθηκε αρχικά στο 70S ριβόσωμα του Thermus thermophilus όπου είχε πρωτοαναφερθεί ως Β6 (Cate et al. 1999). Οι γέφυρες B2b, B2c και B4 εντοπίζονται στη δεύτερη (κεντρική) γραμμή. Η B2b περιλαμβάνει την αλληλεπίδραση της έλικας 24 του 18S rrna με την έλικα 45 του 25S rrna. Η B2c περιστοιχίζει την έλικα «μεταστροφής» (switch helix) 27 του 18S rrna. Η γέφυρα Β4 περιλαμβάνει αφενός την αλληλεπίδραση της έλικας 34 του 25S rrna με τις έλικες 10 και 11 του 18S rrna, αφετέρου την αλληλεπίδραση της έλικας 34 του 25S rrna με την πρωτεΐνη S13 της μικρής υπομονάδας. Στο Thermus thermophilus, η ίδια γέφυρα ενώνει την έλικα 34 του 23S rrna με την S15 της μικρής υπομονάδας (Culver et al. 1999). Η γέφυρα Β6 βρίσκεται στην εξωτερική πλευρά της επιφάνειας αλληλεπίδρασης των δυο υπομονάδων και φέρνει σε επαφή την έλικα 14 του 18S rrna με την πρωτεΐνη L23 της μεγάλης υπομονάδας. Επίσης, η γέφυρα eb8 σχηματίζεται από την αλληλεπίδραση μιας άγνωστης πρωτεΐνης της μικρής υπομονάδας με το τμήμα επέκτασης 31 της έλικας 79 του 25S rrna. Μάλιστα, έχει προταθεί πως η γέφυρα eb8 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση της μεγάλης υπομονάδας καθώς επηρεάζει τη τοποθέτηση της προεξοχής της πρωτεΐνης L1 (L1 protuberance) στο ακέραιο 80S ριβόσωμα. H τρίτη γραμμή γεφυρών περιλαμβάνει τις γέφυρες B2d, B2e και eb9 οι οποίες βρίσκονται προς την πλευρά της πρωτεΐνης L1 της μεγάλης υπομονάδας. Η B2d φέρνει σε επαφή την έλικα 23 του 18S rrna με τη μικρή αύλακα της έλικας 68 του 25S rrna. Η γέφυρα B2e περιλαμβάνει τις αλληλεπιδράσεις της πρωτεΐνης L2 της μεγάλης υπομονάδας με τις έλικες 22 και 23 του18s rrna. Στο E. coli, η παρουσία της L2 κρίνεται απαραίτητη για την ικανότητα σύνδεσης της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας με τη μικρή (Diedrich et al. 2000). Η γέφυρα eb9 απαρτίζεται από συστατικά που δεν συναντώνται στο προκαρυωτικό ριβόσωμα. Περιλαμβάνει είτε την αλληλεπίδραση μεταξύ άγνωστων προς το παρόν- πρωτεϊνών των δυο υπομονάδων είτε την αλληλεπίδραση της έλικας 21 του 18S rrna με μια άγνωστη πρωτεΐνη της μεγάλης υπομονάδας. Η γέφυρα B5a φέρνει σε επαφή την έλικα 44 του 18S rrna με την πρωτεΐνη L23 της μεγάλης υπομονάδας. 15

29 Εισαγωγή Οι επιπλέον γέφυρες eb10 και eb11 περιλαμβάνουν τις ισχυρότερες αλληλεπιδράσεις στο 80S ριβόσωμα. Συγκεκριμένα, η eb10 συνδέει την έλικα 11 του 18S rrna με την έλικα 63 του25s rrna. Μάλιστα, η συμμετοχή στη διαμόρφωση της eb10 μιας ευκαρυωτικής ριβοσωματικής πρωτεΐνης, μη ομόλογης με κάποια προκαρυωτική, εξηγεί την παρουσία της εν λόγω γέφυρας μόνο στο 80S ριβόσωμα. Η eb11 φέρνει σε επαφή την έλικα 9 του 18S rrna με τμήμα επέκτασης της έλικας 101 του 25S rrna. Στη διαμόρφωση της eb11 συμμετέχει, επίσης μια άγνωστη πρωτεΐνη της 40S υπομονάδας. Εικόνα 6. Θέσεις των γεφυρών επικοινωνίας των δυο υπομονάδων του ριβοσώματος της ζύμης. Η μικρή υπομονάδα αποδίδεται με κίτρινο και η μεγάλη υπομονάδα με γαλάζιο. Οι γέφυρες επικοινωνίας αποδίδονται με κόκκινο. Οι γέφυρες που παρατηρούνται και στο προκαρυωτικό ριβόσωμα συμβολίζονται με Β1-Β7. Οι επιπρόσθετες γέφυρες επικοινωνίας που παρατηρούνται στο ριβόσωμα της ζύμης συμβολίζονται με eb8-eb Οι λειτουργικές περιοχές του ριβοσώματος Ο μηχανισμός της δράσης των ριβοσωμάτων, σε αντίθεση με άλλες κυτταρικές πολυμεράσες βασίζεται κυρίως στο rrna και για αυτό συχνά τα ριβοσώματα αναφέρονται στη βιβλιογραφία ως ριβοένζυμα (Noller et al. 1992, Nissen et al. 2000). Η αναλυτική περιγραφή της λειτουργίας των επιμέρους συστατικών του ριβοσώματος κρίνεται απαραίτητη προκειμένου να γίνει αντιληπτός ο λόγος για τον οποίο αυτό το αρχέγονο κυτταρικό οργανίδιο χρησιμοποιεί RNA αντί για πρωτεΐνες προκειμένου να φέρει εις πέρας την πολύ κρίσιμη για το κύτταρο διεργασία της μετάφρασης. 16

30 Εισαγωγή Στην παρούσα ενότητα παρουσιάζονται αναλυτικά οι περιοχές του ριβοσώματος που προσδιορίζουν τις δυο κύριες λειτουργίες αυτού, δηλαδή την πιστότητα της μετάφρασης και τον σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού. Οι περισσότερες πληροφορίες για τις περιοχές αυτές προέρχονται από μελέτες σε προκαρυωτικά κύτταρα (αρχαιο- και ευβακτήρια), καθώς οι πρώτες γενετικές, βιοχημικές και μοριακές μελέτες εφαρμόστηκαν σε αυτά τα κύτταρα. Οι δυο κύριες «ενεργές» περιοχές του ριβοσώματος είναι : Το κέντρο αποκωδικοποίησης της γενετικής πληροφορίας το οποίο εστιάζεται στη μικρή ριβοσωματική υπομονάδα Το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης το οποίο εδράζεται στη μεγάλη ριβοσωματική υπομονάδα Ωστόσο, σχετικά πρόσφατα, έχει προσελκύσει το ενδιαφέρον της επιστημονικής κοινότητας και το κανάλι εξόδου της νεοσυντιθέμενης πολυπεπτιδικής αλυσίδας (Ε περιοχή). Τα δυο κύρια υποστρώματα του ριβοσώματος, όταν αυτό συμμετέχει στη διαδικασία της μετάφρασης είναι α) το mrna που φέρει κωδικοποιημένη τη γενετική πληροφορία για τη σύνθεση ενός πολυπεπτιδίου και β) τα αμινοάκυλο-trna που φέρουν τα «ενεργοποιημένα» αμινοξέα στην Α περιοχή του ριβοσώματος. Τέλος, αξίζει να αναφερθεί πως το ριβόσωμα πραγματοποιεί τη διαδικασία της μετάφρασης με δυο κύρια κριτήρια : πρώτον την σωστή επιλογή του αμινοάκυλοtrna, άρα τη σωστή επιλογή αμινοξέος και δεύτερον την παραγωγή των πρωτεϊνικών μορίων σε εύλογο χρονικό διάστημα. Μάλιστα, είναι γνωστό ότι κατά την επιλογή του αμινοάκυλο-trna, υπάρχει μια δυναμική ισορροπία μεταξύ ρυθμού (ταχύτητας) και πιστότητας (Kurland et al. 1990). Η προαναφερθείσα ισορροπία επηρεάζεται, επίσης, από τις ριβοσωματικές πρωτεΐνες (Davies et al. 1964). Περισσότερα, όμως, για αυτές τις δράσεις του ριβοσώματος θα αναφερθούν παρακάτω Το κέντρο αποκωδικοποίησης Στη διαδικασία αποκωδικοποίησης του mrna, που αποτελεί ευθύνη της μικρής ριβοσωματικής υπομονάδας, συμμετέχουν τόσο το ριβοσωματικό RNA όσο και οι πρωτεΐνες της μικρής υπομονάδας. Η Εικόνα 7 δίνει μια διαγραμματική απεικόνιση του 16S rrna ενός προκαρυωτικού κυττάρου και του 18S rrna ενός ευκαρυωτικού κυττάρου. 17

31 Εισαγωγή Εικόνα 7. Δευτεροταγής δομή του 16S rrna (αριστερά) και του 18S rrna (δεξιά). Διακρίνονται οι τέσσερις κύριες περιοχές στις οποίες υποδιαιρείται το 16S rrna (αριστερά) καθώς επίσης τα τμήματα επέκτασης (expansion segments), δηλαδή οι επιπλέον περιοχές rrna, στο 18S rrna (δεξιά). Επίσης, και στις δυο εικόνες παρουσιάζονται οι έλικες που συγκροτούν τα δυο είδη rrna. Ένας αξιοσημείωτος όγκος πληροφοριών σχετικών με το κέντρο αποκωδικοποίησης της γενετικής πληροφορίας έχει προκύψει από κρυσταλλικές δομές της μικρής ριβοσωματικής υπομονάδας. Όπως δείχνει η Εικόνα 8, η 30S υπομονάδα του Thermus thermophilus έχει μια δομή «προεκβολής», αποκαλούμενη «πλήκτρο», η οποία θυμίζει τη διαμόρφωση της θηλιάς του αντικωδικίου ενός μορίου trna. Το κέντρο αποκωδικοποίησης εντοπίζεται στην περιοχή όπου η «κεφαλή» της μικρής υπομονάδας συναντά το «σώμα» αυτής και αποτελεί την κυριότερη περιοχή (μαζί με τα συστατικά που την απαρτίζουν) αλληλεπίδρασης με το mrna. Τα νουκλεοτίδια της έλικας 44 του προκαρυωτικού 16S rrna συμμετέχουν αδιαμφισβήτητα στο κέντρο αποκωδικοποίησης (Zimmermann 1995), ενώ με πειράματα θεσηκατευθυνόμενης σταυροσύνδεσης (site-directed crosslinking) προτάθηκε η παρουσία νουκλεοτιδίων της θηλιάς 530 της έλικας 18 και της έλικας 34 σε αυτό (Brimacombe 1995). Το κέντρο αποκωδικοποίησης απαρτίζεται από δυο υποπεριοχές : την Α περιοχή και την Ρ περιοχή. 18

32 Εισαγωγή Η μικρή αύλακα του «στελέχους» του αντικωδικίου του trna που είναι προσδεμένο στην Ρ περιοχή, έρχεται σε επαφή τόσο με νουκλεοτίδια της ελάσσονος 3 περιοχής (3 -minor domain) όσο και της κεντρικής περιοχής (central domain) του 16S rrna όσο και με αμινοξικά κατάλοιπα που ανήκουν στις πρωτεΐνες της μικρής υπομονάδας S13 και S9. Το αντικωδίκιο του trna που είναι προσδεμένο στην προαναφερθείσα περιοχή αλληλεπιδρά επίσης με το κωδίκιο του mrna καθώς επίσης με νουκλεοτίδια της έλικας 44. Εικόνα 8. Κρυσταλλική δομή της 30S ριβοσωματικής υπομονάδας του Thermus thermophilus. Οι περιοχές του κέντρου αποκωδικοποίησης και άλλων δομικών συστατικών αυτής, υποδεικνύονται με τα βέλη. Οι διάφορες περιοχές του 16S rrna αποδίδονται ως εξής : κόκκινο-5 περιοχή, πράσινο-κεντρική περιοχή, πορτοκαλί-3 μείζων περιοχή, κυανό- 3 ελάσσων περιοχή. Οι ριβοσωματικές πρωτεϊνες αποδίδονται με ποικίλους χρωματισμούς. Σε αντιστοιχία με την Ρ περιοχή και η Α περιοχή είναι μια υβριδική δομή (Ogle et al. 2001). Την Α περιοχή πλαισιώνουν η θηλιά 530 (530 loop), η έλικα 44 και η μείζων 3 περιοχή του 16S rrna καθώς και κατάλοιπα των ριβοσωματικών πρωτεϊνών S12 και S13. Καθώς ένα μόριο mrna έρχεται σε επαφή με την 3 πλευρά της Α περιοχής, περνά μέσα από ένα «τούνελ» το οποίο σχηματίζουν οι πρωτεΐνες S3, S4 και S5. Αυτός ο σχηματισμός ενδέχεται να λειτουργεί ως ελικάση ξεδιπλώνοντας τις δίκλωνες δομές του mrna, καθώς αυτό εισέρχεται στην περιοχή του κέντρου αποκωδικοποίησης (Yusupova et al. 2001). Παρά τις προαναφερθείσες αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών και trna, το κέντρο αποκωδικοποίησης απαρτίζεται κυρίως από ριβοσωματικό RNA. Θα μπορούσε να διατυπωθεί χωρίς υπερβολή πως εάν κάποιος αφαιρούσε τις πρωτεΐνες της μικρής υπομονάδας και διατηρούσε μόνο το ριβοσωματικό RNA, το ριβόσωμα θα εξακολουθούσε να λειτουργεί κανονικά. Όταν ένα νοηματικό αμινοάκυλο-trna εισέρχεται στην Α περιοχή, οι βάσεις Α1492 και Α1493 αλλάζουν θέσεις ώστε να μπορέσουν να αλληλεπιδράσουν με τη 19

33 Εισαγωγή μικρή αύλακα των δυο πρώτων ζευγών βάσεων της έλικας κωδικίου-αντικωδικίου (Εικόνα 8 και Εικόνα 16). Οι αλληλεπιδράσεις αυτές δεν είναι εφικτές εάν οι βάσεις στη δεύτερη και στη τρίτη θέση του αντικωδικίου δεν υπακούουν στον κατά Watson- Crick κανόνα της συμπληρωματικότητας των βάσεων, και δεν σχηματίζουν σωστά ζεύγη με τις βάσεις στην πρώτη και στην δεύτερη θέση του κωδικίου. Ο μηχανισμός με τον οποίον το ριβόσωμα έχει την δυνατότητα να διακρίνει μεταξύ νοηματικών (cognate) και περίπου νοηματικών μορίων (near cognate) αμινοάκυλο-trna αναφέρεται ως μηχανισμός επαγόμενης προσαρμογής (induced fit mechanism) (Ogle et al. 2001, Ogle et al. 2002). Σύμφωνα με αυτό τον μηχανισμό, τα ακριβώς συμπληρωματικά ζεύγη κωδικίου αντικωδικίου επάγουν μία περιορισμένη «κλειστής μορφής» χωροταξική διαμόρφωση στην Α περιοχή του ριβοσώματος σε αντίθεση με τα περίπου ή τα καθόλου συμπληρωματικά ζεύγη. Κατά το προτεινόμενο αυτό μοντέλο, το ριβόσωμα λαμβάνει δύο διαμορφώσεις: Α. Τη στερεοδομή δέσμευσης (ανοικτή μορφή), κατά την οποία το ριβόσωμα αρχικά δέχεται ή απορρίπτει τα νεοεισερχόμενα στην Α περιοχή αμινοάκυλο-trna και Β. Την παραγωγική στερεοδομή (κλειστή μορφή). Σε αυτή την περίπτωση, που ισχύει μόνο για τα νοηματικά αμινοάκυλο-trna, με τη δέσμευσή τους στο mrna σχηματίζεται μία διπλή έλικα α-τύπου και επάγεται η αλλαγή της διαμόρφωσης της Α περιοχής του ριβοσώματος από την «ανοικτή» στην «κλειστή» μορφή. Η αλλαγή αυτή στη διαμόρφωση της Α περιοχής μεταφέρεται εν συνεχεία στην 50S υπομονάδα, όπου βρίσκεται το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, το οποίο δέχεται έτσι το σήμα για την κατάλυση του πεπτιδικού δεσμού μεταξύ του σωστού νεοεισερχόμενου αμινοάκυλο-trna και του πεπτιδυλο-trna που βρίσκεται στην P περιοχή. Δεδομένα ηλεκτρονικής μικροσκοπίας αποδεικνύουν ότι ο προσανατολισμός των αμινοάκυλο-trnas στο ριβόσωμα, αλλάζει δραματικά στο χρονικό διάστημα που μεσολαβεί από τη στιγμή της άφιξης ενός μορίου αμινοάκυλο-trna στο ριβόσωμα μέχρι τη στιγμή του σχηματισμού του πεπτιδικού δεσμού. Τη στιγμή της άφιξης, η θηλιά του αντικωδικίου βρίσκεται στην Α περιοχή του κέντρου αποκωδικοποίησης, ενώ η αλληλουχία CCA στο 3 άκρο του trna που φέρει το αμινοξύ βρίσκεται κοντά στο κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης. Ακολουθεί ο επαναπροσανατολισμός του trna, κατά τον οποίο τοποθετείται η περιοχή που φέρει το αμινοξύ στην Α περιοχή του κέντρου της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, ώστε να καταστεί εφικτή η δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού. Οι προαναφερθείσες διαδικασίες λαμβάνουν χώρα, μόνο εφόσον τα 20

34 Εισαγωγή μεταφερόμενα trna είναι νοηματικά ή περίπου νοηματικά με την αλληλουχία του mrna που βρίσκεται στην Α ριβοσωματική περιοχή. Δεδομένα κινητικής ανάλυσης της ικανότητας πρόσδεσης υποστρώματος στη ριβοσωματική Α περιοχή απέδειξαν ότι η πρόσδεση ενός νοηματικού μορίου αμινοάκυλο-trna προχωρά ταχύτατα και επαρκώς με ελάχιστη πιθανότητα απόρριψης από την Α περιοχή. Αντίθετα, τα περισσότερα από τα μη νοηματικά μόρια αμινοάκυλοtrna απορρίπτονται εξαιτίας της χαμηλής συγγένειας πρόσδεσης και του χαμηλότερου χρόνου παραμονής στην Α περιοχή (Rodnina et al. 2005). Επειδή η πρόσδεση στην Α περιοχή είναι μια διαδικασία που καθορίζεται από τις επερχόμενες αντιδράσεις της υδρόλυσης του GTP και του σχηματισμού του πεπτιδικού δεσμού, οι προαναφερθείσες διαφορές στην ικανότητα πρόσδεσης μεταξύ νοηματικών και μη νοηματικών μορίων αμινοάκυλο-trna φαίνεται πως απορρέουν από αλλαγές στην τριτοταγή διαμόρφωση του κέντρου της αποκωδικοποίησης (Gromadski & Rodnina 2004) Το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης Όπως αναφέρθηκε για το κέντρο αποκωδικοποίησης, έτσι και οι γνώσεις που κατέχουμε σήμερα για τη δομή του κέντρου της πεπτιδυλοτρανσφεράσης έχουν προέλθει από κρυστάλλους απομονωμένων υπομονάδων. Στη διαμόρφωση του κέντρου της πεπτιδυλοτρανσφεράσης συμμετέχουν τόσο το rrna όσο και οι πρωτεΐνες της μεγάλης υπομονάδας. Η Εικόνα 9 απεικονίζει τις δευτεροταγείς δομές του προκαρυωτικού 23S rrna και του ευκαρυωτικού 25S rrna. Οι κρυσταλλικές δομές που έχουν προκύψει έπειτα από πρόσδεση υποστρωμάτων ή αναλόγων αυτών στη μεγάλη ριβοσωματική υπομονάδα έχουν δείξει ότι το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης εντοπίζεται στον πυθμένα μιας μεγάλης εσοχής η οποία βρίσκεται στην επιφάνεια αλληλεπίδρασης των δυο υπομονάδων (Nissen et al. 2000). Η ίδια πληροφορία προέκυψε και με μελέτες κρυοηλεκτρονικής μικροσκοπίας (Frank et al. 1995, Beckmann et al. 1997). Το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης υποδιαιρείται σε δυο περιοχές : την Α και την Ρ περιοχή. Όπως αποκαλύπτεται στην Εικόνα 10, οι τερματικές CCA αλληλουχίες του 3 άκρου των trnas (που είναι προσδεμένα στις περιοχές Α και Ρ του κέντρου της πεπτιδυλοτρανσφεράσης) αλληλεπιδρούν κατά τη διάρκεια σχηματισμού του πεπτιδικού δεσμού. 21

35 Εισαγωγή Εικόνα 9. Δευτεροταγής δομή του 23S rrna (αριστερά) και του 5.8S/25S rrna (δεξιά). To κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (PΤase center) περικλείεται από τις μπλε διακεκομμένες γραμμές. Αριστερά, οι σημειωμένες με κόκκινο χρώμα περιοχές υποδηλώνουν τις θέσεις αλληλεπίδρασης του 23S rrna με τις πρωτεΐνες της μεγάλης υπομονάδας. Δεξιά, οι περικλειόμενες με κόκκινο χρώμα περιοχές υποδηλώνουν τα τμήματα επέκτασης (expansion segments), δηλαδή τις επιπλέον περιοχές rrna, του 25S rrna. Βιοχημικές μελέτες έδειξαν ότι το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης αποτελείται από νουκλεοτίδια της περιοχής V (domain V) του 23S rrna της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας (Εικόνα 9), εκ των οποίων τα περισσότερα είναι συστατικά της κεντρικής θηλιάς της τελευταίας (Noller 1984). Έτσι αποκαλύπτεται με τον πιο σαφή τρόπο ότι μια από τις βασικές ενεργότητες του ριβοσώματος, αυτή του σχηματισμού του πεπτιδικού δεσμού, καταλύεται από μια δομή που απαρτίζεται αποκλειστικά από ριβοσωματικό RNA (Nissen et al. 2000). Έτσι, σήμερα όλοι παραδέχονται πως το ριβόσωμα είναι ένα ριβοένζυμο (Cech 2000). Κατά τον σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού, παρατηρούνται αλληλεπιδράσεις μεταξύ της CCA αλληλουχίας του 3 άκρου των trnas που είναι προσδεμένα στις περιοχές Α και Ρ με νουκλεοτίδια των αποκαλούμενων Α και Ρ θηλιών, αντίστοιχα. Η Α θηλιά (A loop) περιλαμβάνει νουκλεοτίδια της έλικας 92 του 23S rrna (Kim & Green 1999), ενώ η Ρ θηλιά (P loop) απαρτίζεται από νουκλεοτίδια της έλικας 80 του 23S rrna (Samaha et al. 1995). Αποτέλεσμα αυτών των αλληλεπιδράσεων είναι η τοποθέτηση της α- αμινοομάδας του αμινοάκυλο-trna της Α περιοχής και της εστεροποιημένης καρβονυλομάδας του τελευταίου αμινοξέος της αρτιγέννητης πολυπεπτιδικής αλυσίδας (προσδεμένης υπό μορφή πεπτιδυλο-trna) της Ρ περιοχής, με τέτοιο προσανατολισμό 22

36 Εισαγωγή ώστε να καταστεί δυνατή η δημιουργία του πεπτιδικού δεσμού (Εικόνα 10). Έτσι, το αμινοάκυλο-trna είναι ο δότης της αμινομάδας και το πεπτιδυλο-trna είναι ο δότης της καρβονυλομάδας. Εικόνα 10. (a) Αλληλεπιδράσεις των trnas με τις περιοχές Α και Ρ της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας, του αρχαιοβακτηρίου Haloarcula marismortui. Το 23S rrna αποδίδεται με λευκό χρωματισμό και οι ριβοσωματικές πρωτεΐνες με κίτρινο. Το αμινοάκυλοtrna δεσμευμένο στην Α περιοχή απεικονίζεται με πράσινο χρώμα, το πεπτιδυλο-trna με μωβ και το αποακυλιωμένο-trna με καφέ, (b) Αλληλεπιδράσεις της αλληλουχίας CCA του 3 ακρου των προσδεμένων στις περιοχές Α και Ρ trnas με νουκλεοτίδια του 23S rrna. Στην Ρ περιοχή είναι δεσμευμένο το αποακυλιωμένο-trna (μωβ χρώμα) ενώ στην Α περιοχή είναι δεσμευμένο ολιγοπεπτιδικό ανάλογο σημασμένο με βιοτίνη (πράσινο χρώμα). Οι χρωματισμένες με μπλε χρώμα βάσεις ανήκουν στα νουκλεοτίδια της έλικας 80 του 23S rrna (θηλιά Ρ) και οι χρωματισμένες με καφέ χρώμα βάσεις ανήκουν στα νουκλεοτίδια της έλικας 92 του 23S rrna (θηλιά Α). Τα κυανά και ερυθρά χρωματισμένα νουκλεοτίδια παριστάνουν διάφορα άλλα συστατικά του κέντρου της πεπτιδυλοτρανσφεράσης. Οι βάσεις Α2486 και U2620 που βρίσκονται πολύ κοντά στον νεοσχηματισθέντα πεπτιδικό δεσμό, αντιστοιχούν στις βάσεις Α2451 και U2585 του εντεροβακτηρίου E. coli, αντίστοιχα. Αρχικές μελέτες που πραγματοποιήθηκαν στο εντεροβακτήριο E. coli, υπέδειξαν την συντηρημένη σε όλους τους οργανισμούς- Α2451 του 23S rrna ως κρίσιμου νουκλεοτιδίου για τη λειτουργία του ριβοσώματος (Muth et al. 2000, Polacek et al. 2001). Η Ν3 της Α2451 συνδέεται με δεσμό υδρογόνου με την α-αμινοομάδα του αμινοξέος που είναι προσδεμένο στην Α περιοχή υπό μορφή αμινοάκυλο-trna (Steiner et al. 1988, Moazed & Noller, 1989, Bocchetta et al. 1998, Nissen et al. 2000). Αυτή η αλληλεπίδραση βοηθά στον σωστό προσανατολισμό της εν λόγω ομάδας, αλλά 23

37 Εισαγωγή επιπλέον ενισχύει την ταχύτητα σχηματισμού του πεπτιδικού δεσμού συμβάλλοντας στην αποπρωτονίωση αυτής της ομάδας. Η Α2451 εκδηλώνει την καταλυτική της δράση αφαιρώντας ένα πρωτόνιο από την πυρηνόφιλη αμίνη, η οποία «προσβάλλει» την καρβονυλομάδα του πεπτιδυλο-trna. Ότι ορισμένες βάσεις του rrna εκδηλώνουν τέτοια καταλυτική ενεργότητα ανακαλύφθηκε σχετικά πρόσφατα (Perrota et al. 1999, Nakano et al. 2000). Ωστόσο, ο επικρατέστερος μηχανισμός σχηματισμού πεπτιδικού δεσμού υποστηρίζει την μετατόπιση ενός πρωτονίου μέσω της 2 υδροξυλομάδας της Α76 του πεπτιδυλο-trna, η οποία ακολουθεί την «επίθεση» της α- αμινοομάδας του αμινοάκυλο-trna στον εστερικό δεσμό που συνδέει το αμινοξύ στο πεπτιδυλο-trna (Trobro & Aqvist 2005) όπως φαίνεται στην Εικόνα 11. Ο μηχανισμός αυτός δεν περιλαμβάνει κανενός είδους χημική κατάλυση εκ μέρους των ριβοσωματικών συστατικών. Τα τελευταία παρέχουν το κατάλληλο ηλεκτροστατικό περιβάλλον μέσω της ελάττωσης της ελεύθερης ενέργειας. Εικόνα 11. Ενορχηστρωμένος μηχανισμός μετατόπισης πρωτονίου κατά το σχηματισμό πεπτιδικού δεσμού. Κατά την επίθεση της α- αμινοομάδας του αμινοάκυλο-trna (κόκκινο) στον εστερικό δεσμό που συνδέει το αμινοξύ στο πεπτιδυλοtrna (μπλε), η 2 υδροξυλομάδα της Α76 του πεπτιδυλο-trna δωρίζει το πρωτόνιο της στο γειτονικό 3 οξυγόνο ενώ ταυτόχρονα δέχεται το πρωτόνιο της «επιτιθέμενης» α-αμινοομάδας. Επίσης, με πράσινο χρώμα αποδίδονται ορισμένα νουκλεοτίδια της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας και με γκρι χρώμα τα μόρια του νερού τα οποία σταθεροποιούν τις μεταβατικές καταστάσεις που προκύπτουν από τις αλλαγές του φορτίου. Η υψηλής ευκρίνειας κρυσταλλική δομή της Haloarcula marismortui παρέχει ένα πλαίσιο κατανόησης της κατάλυσης μέσα στο κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (Ban et al. 2000, Nissen et al. 2000). Παρόλο που οι απομονωμένες 50S υπομονάδες είναι ενεργές κατά το σχηματισμό πεπτιδικού δεσμού, η ταχύτητα κατάλυσης στις 50S 24

38 Εισαγωγή υπομονάδες είναι μικρότερη από εκείνη των 70S ριβοσωμάτων κατά περίπου 1000 φορές (Katunin et al. 2002). Ο μηχανισμός που χρησιμοποιείται από το ριβόσωμα για να επιταχύνει το σχηματισμό πεπτιδικού δεσμού φαίνεται να οφείλεται σχεδόν ολοκληρωτικά στην τοποθέτηση των υποστρωμάτων εντός της ενεργούς περιοχής (Sievers et al. 2004, Youngman et al. 2004, Rodnina et al. 2007) σε συνδυασμό με την κατάλυση η οποία υποβοηθείται από τα υποστρώματα (Weinger et al. 2004). Αυτό υποδηλώνει ότι οι διαφορές που παρατηρούνται στη διαμόρφωση του 70S ριβοσώματος, σε σύγκριση με τις απομονωμένες 50S υπομονάδες, μπορεί να είναι υπεύθυνες σε μεγάλο βαθμό για τις διαφορές που παρατηρούνται στις ταχύτητες της πεπτιδυλο-μεταφοράς. Το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης της 50S υπομονάδας τόσο στο Haloarcula marismortui όσο και στο E. coli λαμβάνει μια πιο «κλειστή» διαμόρφωση σε σύγκριση με εκείνο του 70S ριβοσώματος (Nissen et al. 2000, Harms et al. 2001, Hansen et al. 2002, Schmeing et al. 2003). Η ελαστικότητα που παρουσιάζει το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης του 70S ριβοσώματος σε συνδυασμό με την πιο «ανοιχτή» διαμόρφωση που εμφανίζει, μπορεί να συμβάλλει σε μια πιο ραγδαία δημιουργία πεπτιδικού δεσμού (Schuwirth et al. 2005). Τέλος, αξίζει να σημειωθεί πως οι πρωτεΐνες της μεγάλης υπομονάδας συνεπικουρούν στην εκδήλωση της δράσης της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, καθώς διαπιστώθηκε πως μερική αποπρωτεΐνωση της υπομονάδας δεν εξαφανίζει την ενεργότητα της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, ενώ η πλήρης αποπρωτεΐνωση, την εξαφανίζει (Noller et al. 1992) Η περιοχή εξόδου (E-site) Η περιοχή εξόδου (exit site, E-site) είναι πιο πλούσια σε πρωτεΐνες σε σύγκριση με τις Α και Ρ περιοχές. Τα αμινοάκυλο-trnas που προσδένονται σε αυτή τη περιοχή παρουσιάζουν ποικίλες αλληλεπιδράσεις τόσο με περιοχές του 16S rrna όσο και με περιοχές 23S rrna. Επίσης, η περιοχή του αντικωδικίου τους αλληλεπιδρά σε μεγάλη έκταση με την πρωτεΐνη S7 της μικρής υπομονάδας, ενώ το στέλεχος Τ και η θηλιά Τ έρχονται σε επαφή με την πρωτεΐνη L1 της μεγάλης υπομονάδας. Ακόμη, υπάρχουν ενδείξεις για επιπρόσθετες αλληλεπιδράσεις που περιλαμβάνουν την πρωτεΐνη L33 (Yusupov et al. 2001) καθώς και για αλλοστερική αλληλεπίδραση της περιοχής εξόδου με την Α περιοχή (Rheinberger et al. 1990). Επί πλέον, η παρουσία του νοηματικού trna στην περιοχή εξόδου είναι μια στοιχειώδης προϋπόθεση για τη διατήρηση του 25

39 Εισαγωγή σωστού πλαισίου ανάγνωσης κατά τη διαδικασία της αποκωδικοποίησης της γενετικής πληροφορίας (Nierhaus 2006) Η πορεία της μετάφρασης στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς Η διαδικασία της πρωτεϊνικής σύνθεσης χωρίζεται, τόσο στα προκαρυωτικά όσο και στα ευκαρυωτικά κύτταρα, σε τρία διακριτά στάδια τα οποία παρουσιάζονται στην Εικόνα 12. Αξίζει να σημειωθεί ότι παρατηρούνται χαρακτηριστικές λειτουργικές διαφορές, κυρίως στον μηχανισμό της έναρξης ο οποίος είναι περισσότερο πολύπλοκος στα ευκαρυωτικά (Sachs et al. 1997), αλλά και στο στάδιο της επιμήκυνσης, και τερματισμού (Triana-Alonso et al. 1995). Επίσης, έχουν βρεθεί αρκετά αντιβιοτικάαναστολείς της πρωτεϊνοσύνθεσης τα οποία είναι ειδικά για τα προκαρυωτικά ή τα ευκαρυωτικά ριβοσώματα (Spahn & Prescott 1996). Εικόνα 12. Η διαδικασία της μετάφρασης χωρίζεται σε τρία στάδια. (Α) Έναρξη: οι παράγοντες έναρξης (eifs) δεσμεύονται στο mrna, φέρουν το εναρκτήριο MettRNA i Met στο εναρκτήριο AUG κωδίκιο και συναθροίζονται για να δημιουργήσουν ένα ολοκληρωμένο 80S ριβόσωμα, (Β) Επιμήκυνση: Είναι η επαναλαμβανόμενη μεταφορά κάθε επακόλουθου αμινοάκυλο-trna στο ριβόσωμα, η δημιουργία πεπτιδικού δεσμού, η μετατόπιση του mrna και του αυξανόμενου πεπτιδυλοtrna σε μια διαδικασία που χρησιμοποιούνται τόσο οι παράγοντες επιμήκυνσης (eefs) όσο και η ενεργότητα του ίδιου του ριβοσώματος., (C) Τερματισμός: Όταν συναντάται ένα κωδίκιο λήξης, οι παράγοντες απελευθέρωσης (erfs) διευκολύνουν την υδρόλυση του πεπτιδίου από το trna και τελικά την απελευθέρωση του. Στην Εικόνα φαίνονται επίσης εκείνα τα συστατικά της μετάφρασης που σχετίζονται με τη μεταφραστική πιστότητα στη ζύμη. Τα στάδια της μετάφρασης είναι: I. Η έναρξη (initiation), η οποία περιλαμβάνει τις αντιδράσεις που προηγούνται του σχηματισμού του πρώτου πεπτιδικού δεσμού μεταξύ των δυο πρώτων αμινοξέων. 26

40 Εισαγωγή Απαιτεί την πρόσδεση του ριβοσώματος επί του mrna, έτσι ώστε να καθίσταται δυνατή η πρόσδεση του πρώτου αμινοάκυλο-trna. Αποτελεί το πλέον αργό βήμα της πρωτεϊνοσύνθεσης και καθορίζει το ρυθμό με τον οποίο μεταφράζεται ένα μόριο mrna. Η θέση έναρξης της μετάφρασης περιλαμβάνει μια αρκετά συντηρημένη αλληλουχία (GCCRCCAUGG) η οποία απαρτίζεται από τα τελευταία έξι νουκλεοτίδια της 5 μη μεταφραζόμενης περιοχής του mrna (UTR), την τριπλέτα έναρξης της μετάφρασης (AUG) και ακόμη ένα νουκλεοτίδιο. Αρχικά, σχηματίζεται ένα τριμερές σύμπλοκο αποτελούμενο από το εναρκτήριο μεθειόνυλο-trna, τον παράγοντα έναρξης eif2 και ένα μόριο GTP. Το σύμπλοκο αυτό συνδέεται αυθόρμητα στην Ρ περιοχή της 40S υπομονάδας, η δε παρουσία του είναι απαραίτητη για την πρόσδεση της υπομονάδας στο mrna. Η «ενεργοποιημένη» 40S υπομονάδα, αυτή δηλαδή που φέρει προσδεδεμένο το mrna, μετακινείται προς τα δεξιά έως ότου συναντήσει τη θέση έναρξης της μετάφρασης οπότε και συνδέεται με την 60S υπομονάδα προκειμένου να σχηματιστεί το σύμπλοκο έναρξης 80S στο οποίο η Ρ περιοχή είναι κατειλημμένη από το εναρκτήριο μεθειόνυλο-trna ενώ η Α περιοχή είναι ελεύθερη. Στην πορεία συγκρότησης του 80S συμπλόκου έναρξης συμμετέχουν και άλλοι ευκαρυωτικοί παράγοντες έναρξης. II. Η επιμήκυνση (elongation), περιλαμβάνει όλη τη σειρά αντιδράσεων από το σχηματισμό του πρώτου πεπτιδικού δεσμού μέχρι την προσθήκη του τελευταίου αμινοξέος. Η προσθήκη των αμινοξέων στην αυξανόμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα γίνεται με ρυθμό ενός αμινοξέος ανά κύκλο και αποτελεί πιο γρήγορο βήμα κατά τη μετάφραση (σε σχέση με την έναρξη). Οι πρωτεϊνικοί παράγοντες που συνεπικουρούν στη διεκπεραίωση αυτού του σταδίου είναι οι eef1 και eef2 και έχουν ανάλογη δράση με τους προκαρυωτικούς παράγοντες επιμήκυνσης EF-Tu και EF-G, αντίστοιχα. Η φάση της επιμήκυνσης περιλαμβάνει τρία στάδια : 1. Τη δέσμευση του νεοεισερχόμενου αμινοάκυλο-trna στην Α περιοχή του ριβοσώματος αφού το εναρκτήριο μεθειόνυλο-trna καταλαμβάνει την Ρ περιοχή. Ο παράγοντας eef1 είναι απαραίτητος για την GTP-εξαρτώμενη δέσμευση του αμινοάκυλο-trna στην Α περιοχή του ριβοσώματος καθώς και για την διορθωτική ανάγνωση (proofreading) του ζεύγους κωδικίου-αντικωδικίου. 2. Το σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού. Η διαδικασία αυτή αποτελεί κύρια ενεργότητα της μεγάλης υπομονάδας του ριβοσώματος και δεν απαιτεί πρωτεϊνικούς παράγοντες του κυτταροπλάσματος. 27

41 Εισαγωγή 3. Τη μετατόπιση (translocation) του πεπτιδυλο-trna από την Α στην Ρ περιοχή του ριβοσώματος. Η διαδικασία αυτή απαιτεί την παρουσία του eef2 και συνδέεται με την υδρόλυση του GTP η οποία προκαλεί αλλαγή της διαμόρφωσης στο χώρο του τελευταίου παράγοντα, η οποία κρίνεται απαραίτητη για την απομάκρυνση του αποακυλιωμένου-trna, που καταλάμβανε την Ρ περιοχή, από το ριβόσωμα. Είναι πλέον γνωστό ότι το πεπτιδυλο-trna και το αποακυλιωμένο-trna που καταλαμβάνουν, αντίστοιχα, τις ριβοσωματικές Α και Ρ περιοχές μετά το σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού και πριν τη μετατόπιση (PRE state) μετακινούνται έπειτα από την πρόσδεση του eef2 στο ριβόσωμα στις υβριδικές θέσεις Α/Ρ και Ρ/Ε. Η μετατόπιση των αντίστοιχων υποστρωμάτων από τις υβριδικές θέσεις στις ριβοσωματικές περιοχές Ρ και Ε (POST state) ολοκληρώνεται με την υδρόλυση του GTP το οποίο είχε ήδη δεσμευθεί στον παράγοντα eef2 (Wilson & Nierhaus 2006). ΙΙΙ. Ο τερματισμός (termination), περιλαμβάνει την απελευθέρωση της ολοκληρωμένης πολυπετιδικής αλυσίδας από το ριβόσωμα και την διάσταση του τελευταίου στις υπομονάδες του Αρχικά, πραγματοποιείται η αναγνώριση των μη νοηματικών κωδικίων (κωδικίων λήξης) της πρωτεϊνοσύνθεσης (UAA, UAG και UGA) από τους πρωτεϊνικούς παράγοντες τερματισμού erf1 και erf3 (Craigen & Caskey 1987, Ma & Nussinov 2004) οι οποίοι κωδικοποιούνται από τα γονίδια SUP45 και SUP35, αντίστοιχα (Stansfield et al. 1997). Οι δυο αυτοί παράγοντες τερματισμού αλληλεπιδρούν in vivo και in vitro σχηματίζοντας ένα λειτουργικό σύμπλοκο (Stansfield et al. 1995, Frolova et al. 1998, Merkulova et al. 1999). Ο erf1 αναγνωρίζει και τα τρια κωδίκια λήξης, ενώ έχει προταθεί μια άμεση αλληλεπίδραση του τόσο με το mrna όσο και με το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης (Frolova et al. 1996, 1999). Ο erf3 έχει δραστικότητα GTPάσης η οποία επάγεται από την κωδικο-εξαρτώμενη δέσμευση του συμπλόκου erf1/erf3 στο ριβόσωμα (Zhouravleva et al. 1995, Frolova et al. 1996). Ας σημειωθεί, επίσης, ότι τα κωδίκια λήξης της πρωτεϊνοσύνθεσης είναι συντηρημένα μεταξύ των οργανισμών (Marshall et al. 1967). Στη ζύμη έχει εξακριβωθεί η παρουσία ενός τρίτου, του eef3 (Skogerson & Wakatama 1976), που είναι υπεύθυνος για την απελευθέρωση του αποακυλιωμένουtrna από την Ε περιοχή του ριβοσώματος, όταν ένα νέο αμινοάκυλο-trna προσδεθεί στην Α περιοχή. Η δράση αυτή απαιτεί την υδρόλυση του ATP (Triana-Alonso et al. 1995, Chakraburtty 1999). Λόγω της απελευθέρωσης του αποακυλιωμένου-trna από την Ε περιοχή, ο eef3 διεγείρει την αντίδραση πρόσδεσης του αμινοάκυλο-trna στην Α περιοχή. Η συγγένεια πρόσδεσης είναι μεγαλύτερη για τα νοηματικά μόρια 28

42 Εισαγωγή αμινοάκυλο-trna, αυξάνοντας με αυτόν τον τρόπο την πιστότητα της μετάφρασης (Uritani & Miyazaki 1988). 2. Πιστότητα της μετάφρασης Η διαδικασία της μετάφρασης, όπως άλλωστε συμβαίνει και με τις διαδικασίες της αντιγραφής και της μεταγραφής, χαρακτηρίζεται από ένα ορισμένο επίπεδο ακρίβειας. Και όπως ακριβώς συμβαίνει με τις δυο τελευταίες λειτουργίες, έτσι και κατά τη μετάφραση επεμβαίνουν, όποτε αυτό κρίνεται απαραίτητο, οι κατάλληλοι επιδιορθωτικοί μηχανισμοί οι οποίοι διατηρούν την ακρίβεια στα επιθυμητά επίπεδα. Η διατήρηση ενός ορισμένου επιπέδου μεταφραστικής πιστότητας είναι απαραίτητο για την επιβίωση του κυττάρου. Η ακρίβεια κατά τη μετάφραση είναι συνυφασμένη με την επιλογή του σωστού αμινοάκυλο-trna, και όπως έχει αναφερθεί η διαδικασία αυτή αποτελεί κύρια λειτουργία της μικρής ριβοσωματικής υπομονάδας. Εκτεταμένες δομικές, βιοχημικές και γενετικές μελέτες έχουν δείξει ότι η ακρίβεια κατά την επιλογή των trnas διασφαλίζεται με ένα πολύπλοκο δίκτυο αλληλεπιδράσεων μεταξύ πρωτεϊνών και rrna (Giege et al. 1998). Κατά την εξέλιξη, έχει υιοθετηθεί η συχνότητα εισαγωγής ενός λάθος κωδικίου ανά δέκα χιλιάδες μεταφραζόμενα κωδίκια (0,0001) ως το ανώτατο όριο μεταφραστικής ακρίβειας (Yarus 1979, Kurland 1992) όπως φαίνεται στον Πίνακα 1α. Πίνακας 1α. Πιθανότητες σύνθεσης μιας πρωτεΐνης χωρίς σφάλματα. Η πιθανότητα p εξαρτάται από τον αριθμό των καταλοίπων αμινοξέων n και από τη συχνότητα λάθους e (error frequency). Δίνεται δε από τον τύπο p=(1-e) n Πιθανότητα σύνθεσης πρωτεΐνης χωρίς σφάλματα (p) Συχνότητα λάθους (e) Αριθμός καταλοίπων αμινοξέων (n) ,364 0,049 0, ,915 0,840 0, ,990 0,970 0, ,999 0,997 0,990 Για τη διασφάλιση της ακρίβειας της μετάφρασης σημαντική είναι η συμβολή των εξής παραγόντων: 29

43 Εισαγωγή 1. Του ριβοσωματικού RNA και των ριβοσωματικών πρωτεϊνών του κέντρου αποκωδικοποίησης. 2. Των αμινοάκυλο-trna συνθετασών 3. Του πρωτεϊνικού παράγοντα επιμήκυνσης eef1 (EF-Tu στα προκαρυωτικά) Ο ρόλος που διαδραματίζει καθένας από τους παραπάνω παράγοντες για την εξασφάλιση της ακρίβειας της μετάφρασης περιγράφεται παρακάτω. 2.1 Το ριβοσωματικό RNA και οι ριβοσωματικές πρωτεΐνες του κέντρου αποκωδικοποίησης Παρουσία μηνύματος mrna και trna στην Α ριβοσωματική περιοχή, οι βάσεις Α1492 και Α1493 καταλαμβάνουν την εξωτερική πλευρά της έλικας 44 του 16S rrna προκειμένου να παρακολουθήσουν τις αλληλεπιδράσεις κωδικίου-αντικωδικίου. Επίσης, η βάση G530 αλλάζει την syn διαμόρφωση και καταλαμβάνει την anti, προκειμένου να αλληλεπιδράσει με την Α1492, με τη δεύτερη βάση του αντικωδικίου και με την τρίτη βάση του κωδικίου (βλέπε Εικόνα 16). Όπως δείχνει η Εικόνα 13, η αλληλεπίδραση του κωδικίου του mrna με το αντικωδίκιο του trna, δημιουργεί μια α-έλικα. Όταν το ζεύγος κωδικίου-αντικωδικίου είναι ακριβώς συμπληρωματικό, τότε οι μοριακές αλληλεπιδράσεις των Α1492 και Α1493 με τις δυο πρώτες βάσεις του κωδικίου, ελαττώνουν την πιθανότητα διάστασης του νοηματικού trna. Ακόμα, προκαλούν επιπρόσθετες χωροταξικές μεταβολές της θηλιάς 530 της έλικας 18 (βάση G530) αλλά και σε άλλες έλικες του 16S rrna (όπως οι 24, 27 και 34) οι οποίες μεταδίδονται και στην μεγάλη ριβοσωματική υπομονάδα (Pape et al. 1998). Στην περίπτωση, όμως, που η τριπλέτα του αντικωδικίου δεν είναι ακριβώς συμπληρωματική με την τριπλέτα του κωδικίου στις πρώτες δυο θέσεις των αλληλεπιδράσεων αυτών, τότε διαταράσσεται η γεωμετρία της α-έλικας όπως επίσης και οι θέσεις αλληλεπίδρασης των δυο πρώτων βάσεων του κωδικίου με τις Α1492 και Α1493, όπως φαίνεται στην Εικόνα 13. Η διαταραχή των αλληλεπιδράσεων μεταξύ rrna και του ζευγαριού κωδικίου-αντικωδικίου αυξάνει την σταθερά διάστασης των περίπου νοηματικών αμινοάκυλο-trnas. Με αυτόν τον τρόπο το ριβόσωμα μπορεί και διακρίνει μεταξύ διαφορετικών διαμορφώσεων της α-έλικας οι οποίες σχηματίζονται από σωστά ή από λανθασμένα σύμπλοκα κωδικίου-αντικωδικίου, κατά τη διάρκεια της αποκωδικοποίησης της γενετικής πληροφορίας. 30

44 Εισαγωγή A1493 mrna A S rrna cognate trna near cognate trna Εικόνα 13. Σχηματική αναπαράσταση της αλληλεπίδρασης του ζεύγους mrna-trna με την Α περιοχή του ριβοσώματος. (Α) Το Ν στη θέση 1 των Α1492 και Α1493 του 16S rrna έρχεται σε επαφή με δυο άτομα υδροξυλίου (-ΟΗ) των δυο βάσεων του κωδικίου του mrna. Η αλληλεπίδραση μεταξύ νοηματικού trna και mrna, τοποθετεί το κωδίκιο με τον σωστό προσανατολισμό ώστε να αλληλεπιδράσει με την ριβοσωματική Α περιοχή του 16S rrna. (Β) Η αλληλεπίδραση μεταξύ περίπου νοηματικού trna και mrna, οδηγεί σε λάθος ζευγάρωμα των πρώτων δυο θέσεων της έλικας κωδικίου-αντικωδικίου, το οποίο αλλοιώνει τη δομή του, αποτρέποντας τη δημιουργία δεσμών με τις θέσεις Ν1 των Α1492 και Α1493. Εκτός από τον καθοριστικό ρόλο του rrna, σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της μεταφραστικής πιστότητας διαδραματίζουν και οι ριβοσωματικές πρωτεΐνες. Συγκεκριμένα, στο σακχαρομύκητα η πρωτεΐνη S23 της μικρής υπομονάδας αλληλεπιδρά με τις S2 και S9 για να καθορίσουν την ακρίβεια κατά τη μετάφραση, σε αντιστοιχία με την S12 (ομόλογη της S23) που αλληλεπιδρά με τις S4 (ομόλογη της S9) και S5 (ομόλογη της S2), για να ρυθμίσουν τη μεταφραστική πιστότητα στο εντεροβακτήριο E. coli. Πράγματι, η απάλειψη του ενός από τα δυο γονίδια που κωδικοποιούν την S23 προκαλεί ελαφρά απώλεια της μεταφραστικής πιστότητας, ενώ η μετάλλαξη sup44, η οποία αναφέρεται στην αντικατάσταση ενός κωδικίου σερίνης από ένα κωδίκιο τυροσίνης στην θέση του αμινοξέος 200 της ριβοσωματικής πρωτεΐνης S2, προκαλεί σημαντική απώλεια της μεταφραστικής πιστότητας (Synetos et al. 1996). Επί πλέον, η ολοδύναμη κατασταλτική μετάλλαξη sup46, στη συντηρημένη περιοχή της S9 με την οποία γίνεται η δέσμευση αυτής στο 18S rrna, προκαλεί απώλεια της μεταφραστικής πιστότητας (Alksne et al. 1993). Αυτή η λειτουργική αλληλεπίδραση έχει συντηρηθεί, παρά την εξελικτική απόσταση των δυο δισεκατομμυρίων ετών που 31

45 Εισαγωγή χωρίζει τους δυο οργανισμούς και υποστηρίζει την συντήρηση της δευτεροταγούς και πιθανώς της τριτοταγούς δομής αυτών των πρωτεϊνών (Woese 1987). Εκτός όμως από τις πρωτεΐνες της μικρής υπομονάδας που συμμετέχουν στη ρύθμιση της μεταφραστικής πιστότητας, έχει βρεθεί παρόμοια δράση και για πρωτεΐνες της μεγάλης υπομονάδας. Πράγματι, έχει βρεθεί ότι η απάλειψη των δυο γονιδίων που κωδικοποιούν την πρωτεΐνη L24 της ζύμης προκαλεί ελαφρά απώλεια της μεταφραστικής πιστότητας ενώ μεγαλύτερη απώλεια της μεταφραστικής πιστότητας παρατηρήθηκε σε στέλεχος ζύμης από το οποίο απουσιάζει η πρωτεΐνη L39 (Dresios et al. 2000). Επιπρόσθετα, η ταυτόχρονη απάλειψη των δυο γονιδίων που κωδικοποιούν την πρωτεΐνη L41 κατέστησε τα ριβοσώματα της ζύμης ελαφρώς πιο υπερακριβή (Dresios et al. 2003). 2.2 Αμινοακυλο-tRNA συνθετάσες Ο σχηματισμός πεπτιδικού δεσμού μεταξύ της αμινομάδας ενός αμινοξέoς και της καρβοξυλομάδας ενός άλλου είναι από θερμοδυναμικής πλευράς ανέφικτος. Επί πλέον, τα αμινοξέα δεν μπορούν από μόνα τους να αναγνωρίσουν τα κωδίκια του mrna.το διπλό αυτό εμπόδιο αυτό παρακάμπτεται με την ενεργοποίηση της καρβοξυλομάδας των πρόδρομων αμινοξέων. Τα ενεργοποιημένα ενδιάμεσα μόρια στη σύνθεση των πρωτεϊνών είναι εστέρες αμινοξέων, στους οποίους η καρβοξυλομάδα ενός αμινοξέος συνδέεται με ένα trna. Το ενεργοποιημένο ενδιάμεσο αυτό μόριο καλείται αμινοάκυλο-trna. Η αντίδραση αυτή καταλύεται από μία ειδική αμινοάκυλο-trna συνθετάση (Εικόνα 14Α). Οι συνθετάσες των αμινοάκυλο-trna είναι εξαιρετικά επιλεκτικά ένζυμα ως προς την αναγνώριση τόσο του αμινοξέος που πρόκειται να ενεργοποιηθεί, όσο και του προσδοκόμενου δέκτη trna. Η ακρίβεια της επιλογής trna ενισχύεται μέσω του ανταγωνισμού μεταξύ των συνθετασών για τα συμπληρωματικά trnas καθώς επίσης από τη συμβολή ορισμένων βοηθητικών πρωτεϊνών που ενισχύουν την δέσμευση. Η δυσκολία διάκρισης μεταξύ παρόμοιων αμινοξέων φαίνεται να παρακάμπτεται καθώς είναι γνωστό ότι οι αμινοάκυλο-trna συνθετάσες διαθέτουν την λεγόμενη διορθωτική ικανότητα ανάγνωσης (proofreading) (Baldwin & Berg 1966). Αυτή η ενεργότητα των συνθετασών λειτουργεί σε δυο επίπεδα : α) το μη νοηματικό αμινοακυλο-αμρ υδρολύεται προτού μεταφερθεί στο trna και σχηματιστεί το αμινοάκυλο-trna (Εικόνα 14Β, πρώτο μισό) και β) το μη νοηματικό αμινοακυλο-αμρ μεταφέρεται στο 32

46 Εισαγωγή trna και το σχηματιζόμενο αμινοάκυλο-trna υδρολύεται προτού καν αλληλεπιδράσει με το mrna (Εικόνα 14Β, δεύτερο μισό). Αυτή η λειτουργία συμβαίνει λιγότερο συχνά σε σχέση με την πρώτη. Αξίζει, να διευκρινιστεί, ότι ο μηχανισμός της διορθωτικής ικανότητας ανάγνωσης ισχύει για τα μη νοηματικά αμινοξέα τα οποία προσδένονται σε συμπληρωματικά trnas. Εικόνα 14. Επιδιορθωτικοί μηχανισμοί κατά τη σύνθεση των αμινοάκυλο-trna. (Α) Μηχανισμός σύνθεσης νοηματικού αμινοάκυλο-trna από την αντίστοιχη συνθετάση αυτού. AA c : νοηματικό αμινοξύ, AARS c : συνθετάση του νοηματικού αμινοάκυλο-trna, trna c : νοηματικό μόριο trna., AARS c -AA c -AMP : αμινοακυλο-αμρ, AA c -trna c : αμινοάκυλο-trna, (Β) Μηχανισμός διορθωτικής ικανότητας ανάγνωσης (proofreading) μη νοηματικών αμινοξέων (AA NC ) από την νοηματική αμινοακυλο- trna συνθετάση (AARS c ). Το μη νοηματικό αμινοξύ ενεργοποιείται παρουσία της νοηματικής αμινοάκυλο-trna συνθετάσης, σχηματίζοντας αμινοακυλο-αμρ (AARS c -AA NC -ΑΜΡ). Το τελευταίο δύναται να διασπαστεί αμέσως στα συστατικά από τα οποία προήλθε, απελευθερώνοντας το μη νοηματικό αμινοξύ ή να μεταφέρει την μη νοηματική αμινοακυλοπεριοχή του στο 3 άκρο ενός νοηματικού trna (trna c ). Το σχηματισθέν μη νοηματικό αμινοάκυλο-trna (AA NC - trna c ), δεν απελευθερώνεται προς αξιοποίηση αλλά υπόκεινται σε διόρθωση από την νοηματική αμινοάκυλο-trna συνθετάση. (C) Μηχανισμός editing των μη νοηματικών μορίων αμινοάκυλο-trna. Μετά το σχηματισμό αμινοακυλο-αμρ (AARS c -AA c - ΑΜΡ) μεταξύ νοηματικού αμινοξέος (AA c )και της αντίστοιχης αμινοάκυλο-trna συνθετάσης (AARS c ), ακολουθεί η μεταφορά της αμινοακυλο- περιοχής του τελευταίου στο 3 άκρο ενός μη νοηματικού trna (trna NC ). Το αμινοάκυλο-trna που προκύπτει (AA c - trna NC ) απελευθερώνεται και χρησιμοποιείται ως υπόστρωμα σε μια διορθωτική αντίδραση κατά την οποία το λάθος αμινοξύ αντικαθίσταται από το σωστό ώστε να σχηματιστεί το σωστό αμινοάκυλο-trna (AA NC -trna NC ). 33

47 Εισαγωγή Οι μοριακοί μηχανισμοί που εξηγούν την διορθωτική ικανότητα ανάγνωσης έχουν προκύψει από την ανάλυση της ισολευκινυλο-trna συνθετάσης. Το ένζυμο αυτό έχει δυο καταλυτικές περιοχές (Schmidt & Schimmel 1994, Nureki et al. 1998). Την περιοχή ακυλίωσης, στην οποία λαμβάνει χώρα η αντίδραση ακυλίωσης τόσο της ισολευκίνης, όσο και αμινοξέων μικρότερου μεγέθους από αυτή ενώ τα μεγαλύτερου μεγέθους αμινοξέα αποβάλλονται. Την περιοχή υδρόλυσης όπου λαμβάνει χώρα η υδρόλυση των λάθος σχηματισμένων aa-αμρ. Έτσι, ορισμένες φορές, αντί της ισολευκίνης, μπορεί να ακυλιωθεί η βαλίνη, ένα αμινοξύ που διαφέρει ελάχιστα από την ισολευκίνη. Το βαλινυλο-αμρ που σχηματίζεται, όμως, δεν μετατρέπεται σε βαλινυλο-trna, διότι πραγματοποιείται η υδρόλυση του, στο κέντρο υδρόλυσης της ισολευκινυλο-trna συνθετάσης. Επίσης, είναι γνωστό ότι πολλές αμινοάκυλο-trna συνθετάσες πρέπει πρώτα να προσδέσουν το σωστό αμινοξύ σε μη νοηματικά μόρια trnas και αυτή η διαδικασία αποτελεί σημαντικό στάδιο κατά τη μετάφραση (Ibba et al. 1997). Η παρουσία των λάθος ακυλιωμένων trnas δεν επηρεάζει αρνητικά τη διαδικασία της μετάφρασης, καθώς δεν αποτελούν υποστρώματα των παραγόντων επιμήκυνσης και έτσι δεν παρουσιάζουν κανενός είδους αλληλεπίδραση με το ριβόσωμα (Becker & Kern 1998). Το λάθος ενσωματωμένο στο αμινοάκυλο-trna- αμινοξύ υποκαθίσταται με τη μεσολάβηση κατάλληλων ενζυμικών αντιδράσεων ώστε να σχηματιστεί το σωστό αμινοάκυλο-trna (Εικόνα 14C). Η διαδικασία αυτή ονομάζεται διεθνώς εκδοτικός μηχανισμός επιδιόρθωσης και με αυτή πραγματοποιείται η απομάκρυνση του λανθασμένου aa-aμρ από το κέντρο υδρόλυσης της αμινοάκυλο-trna συνθετάσης Παράγοντας επιμήκυνσης eef-1 (EF-Tu των προκαρυωτικών) Κατά το στάδιο της επιμήκυνσης, ο παράγοντας επιμήκυνσης eef-1 βοηθάει την GTP-εξαρτώμενη σύνδεση του νεοεισερχόμενου αμινοάκυλο-trna στην Α περιοχή του ριβοσώματος καθώς και στον επανέλεγχο κωδικού αντικωδικού (proofreading). Ο eef-1 αποτελείται από τρείς υπομονάδες (α, β και γ). Ο eef-1 δημιουργεί τριμερές σύμπλοκο με το GTP και το αμινοάκυλο-trna (αμινοάκυλο-trna eef-1α GTP), το οποίο δεσμεύεται αντιστρεπτά με το ριβόσωμα. Η πιστότητα της μετάφρασης εξαρτάται από το να βρίσκεται στην Α περιοχή το σωστό αμινοάκυλο-trna όταν σχηματίζεται ο πεπτιδικός δεσμός. Αυτό είναι ένα βήμα χωρίς επιστροφή, διότι τα 34

48 Εισαγωγή κύτταρα δεν διαθέτουν μηχανισμό εξαγωγής ενός λανθασμένου αμινοξέος μετά από τη σύνθεση του πεπτιδικού δεσμού. Όταν το αντικωδίκιο του νεοεισερχόμενου αμινοάκυλο-trna είναι πλήρως νοηματικό (cognate) προς το κωδίκιο του mrna που βρίσκεται στην Α περιοχή του ριβοσώματος, τότε σταθεροποιείται το σύμπλοκο αμινοάκυλο-trna eef1α GTP πάνω στο ριβόσωμα και ο πρωτεϊνικός παράγοντας επιμήκυνσης eef1 (αντίστοιχος του EF-Tu στα προκαρυωτικά) αλλάζει διαμόρφωση, ώστε να ευνοείται η υδρόλυση του GTP. Μετά την υδρόλυση του GTP, ο eef1 υπό τη μοργή GDP χάνει τη συγγένεια με το αμινοάκυλο-trna και απομακρύνεται από αυτό. Τότε το αμινοτελικό άκρο του αμινοάκυλο-trna είναι ελεύθερο να μετακινηθεί στο κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης που εδράζεται στην 60S υπομονάδα, όπου καταλύεται ο σχηματισμός του πεπτιδικού δεσμού με την ενεργοποιημένη καρβοξυλομάδα του αμινοξέος που βρίσκεται στην P περιοχή του ριβοσώματος (Εικόνα 10). Στην περίπτωση των μορίων αμινοάκυλο-trna που φέρουν μη νοηματικά κωδίκια (non cognate) το τριμερές σύμπλοκο αποδεσμεύεται από το ριβόσωμα πρίν την υδρόλυση του GTP κατά τη λεγόμενη φάση της αρχικής επιλογής (initial selection). Στην περίπτωση των μορίων αμινοάκυλο-trna που φέρουν περίπου νοηματικά κωδίκια (near cognate), όπου δηλαδή μία ή δύο βάσεις του αντικωδικίου τους είναι συμπληρωματικές με τη τριπλέτα των βάσεων του mrna που βρίσκεται στην Α περιοχή, το τριμερές σύμπλοκο σταθεροποιείται μεν στην Α περιοχή, αλλά σε μικρότερο βαθμό από την περίπτωση της απόλυτης συμπληρωματικότητας κωδικίουαντικωδικίου. Η σταθεροποίηση αυτή του τριμερούς συμπλόκου αν και σε μικρότερο βαθμό, επάγει την υδρόλυση του GTP. Σε αυτή τη περίπτωση όμως παρατηρείται μειωμένη κινητική σταθερά στην εγκατάσταση του αμινοάκυλο-trna στην 60S υπομονάδα του ριβοσώματος σε σχέση με την κινητική αποδέσμευσής του από την Α περιοχή, με αποτέλεσμα να απορρίπτονται και τα σχεδόν νοηματικά μόρια αμινοάκυλοtrna πρίν το σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού (Rodnina & Wintermeyer 2001). Συνοπτικά, ο παράγοντας επιμήκυνσης eef1 (EF-Tu) διασφαλίζει την ένταξη του σωστού αμινοάκυλο-trna στην Α περιοχή του ριβοσώματος πρίν από το σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού σε δύο φάσεις: Α. Τη φάση της αρχικής επιλογής (initial selection) πριν από την υδρόλυση του GTP, κατά την οποία απορρίπτονται τα μη νοηματικά αμινοάκυλο-trna Β. Τη φάση της διορθωτικής ανάγνωσης (proofreading) μετά την υδρόλυση του GTP, κατά την οποία απορρίπτονται τα περίπου νοηματικά αμινοάκυλο-trna. 35

49 Εισαγωγή 3. Αντιβιοτικά-αναστολείς της ριβοσωματικής λειτουργίας Το ριβόσωμα, όπως κατέστη φανερό από τη δομική περιγραφή του, αποτελεί στόχο πολλών εν δυνάμει λειτουργικών αλληλεπιδράσεων με αντιβιοτικά. Ο μηχανισμός δράσης πολλών αντιβιοτικών είναι εξειδικευμένος έτσι ώστε άλλα αντιβιοτικά να επηρεάζουν τη λειτουργία της μικρής και άλλα της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας. Επί πλέον, τα αντιβιοτικά έχουν χρησιμοποιηθεί ως εργαλεία διερεύνησης του μεταφραστικού κύκλου δίνοντας έτσι την ευκαιρία να εξετασθούν περαιτέρω τα πολλαπλά στάδια που εμπλέκονται στη μετάφραση. Η κατανόηση της δράσης των αντιβιοτικών ενισχύθηκε από την όλο και καλύτερη κατανόηση της λειτουργίας του ριβοσώματος. Η δομική ανάλυση σε ατομικό επίπεδο της μικρής και της μεγάλης υπομονάδας αποκάλυψε ότι τα λειτουργικά κέντρα και στις δύο υπομονάδες αποτελούνται κυρίως από rrna (Moore & Steitz 2002, Ramakrishnan 2002, Wilson et al. 2002, Yonath 2002, Moore & Steitz 2003), αναδεικνύοντάς το έτσι σε υψίστης σπουδαιότητας συστατικό για τη ριβοσωματική λειτουργία, ενώ οι ριβοσωματικές πρωτεΐνες φαίνεται να παίζουν ρόλο στη λεπτή ρύθμιση (fine-tuning) της ριβοσωματικής λειτουργίας και στη διατήρηση της δομής των μορίων rrna. Επί πλέον, έχει αποδειχθεί ότι το rrna αποτελεί πρωταρχικό στόχο αντιβιοτικών που επηρεάζουν τη διαδικασία της μετάφρασης (Cundliffe 1990). Το γεγονός αυτό επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με τη δομική ανάλυση συμπλόκων μεταξύ αντιβιοτικών και της μικρής ή της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας (Auerbach et al. 2002, Harms et al. 2003), η οποία αποκάλυψε ότι οι θέσεις δέσμευσης των αντιβιοτικών που έχουν στόχο το ριβόσωμα αποτελούνται εξ ολοκλήρου από rrna, ενώ η συμμετοχή των ριβοσωματικών πρωτεϊνών είναι μικρή ή ανύπαρκτη. Αυτό είναι σε συμφωνία με την παραδοχή ότι τα αντιβιοτικά γενικά έχουν σαν στόχο τα λειτουργικά κέντρα του ριβοσώματος, δηλαδή το κέντρο της αποκωδικοποίησης και το κέντρο της πεπτιδυλοτρανσφεράσης. Η παρούσα ενότητα έχει σκοπό να παρουσιάσει επιλεγμένα αντιβιοτικά, καθένα τα οποία επηρεάζει συγκεκριμένο στάδιο της πρωτεϊνοσύνθεσης. 3.1 Αντιβιοτικά που επηρεάζουν την ακρίβεια της μετάφρασης Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η σωστή αποκωδικοποίηση της γενετικής πληροφορίας αποτελεί ευθύνη της μικρής ριβοσωματικής υπομονάδας. Μια μεγάλη οικογένεια 36

50 Εισαγωγή αντιβιοτικών που επηρεάζουν την ακρίβεια της μετάφρασης είναι τα αμινογλυκοζιτικά αντιβιοτικά. Ονομάζονται αμινογλυκοζιτικά γιατί φέρουν αρκετές αμινομάδες (-ΝΗ 2 ) σε σακχαριτικά υπολείματα. Τα αμινογλυκοζιτικά αντιβιοτικά προσδένονται ειδικά στην 30S ή στην 40S υπομονάδα του ριβοσώματος και εκτός από την ακρίβεια της μετάφρασης επηρεάζουν την κυτταρική ανάπτυξη και τον αριθμό των ζώντων κυττάρων. Επίσης, παρουσία αυτών των αντιβιοτικών παρατηρείται μια εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση αναστολή της συγκρότησης της μικρής ριβοσωματικής υπομονάδας (Champney 2001). Στις παραγράφους που ακολουθούν περιγράφονται χαρακτηριστικοί εκπρόσωποι της οικογένειας των αμινογλυκοζιτικών αντιβιοτικών Το αμινογλυκοζιτικό αντιβιοτικό στρεπτομυκίνη Ένα αμινογλυκοζιτικό αντιβιοτικό που αλληλεπιδρά με την 30S υπομονάδα των προκαρυωτικών κυττάρων είναι η στρεπτομυκίνη. Μεταλλάξεις ριβοσωματικής ασάφειας (ram μεταλλάξεις, ribosomal ambiguity mutations) στα δομικά γονίδια των ριβοσωματικών πρωτεϊνών S4 και S5 του E. coli, προκαλούν απώλεια της μεταφραστικής ακρίβειας και αυξημένη ευαισθησία στην στρεπτομυκίνη. Αντίθετα, μεταλλάξεις στα γονίδια που κωδικοποιούν τις ριβοσωματικές πρωτεΐνες S12, S17 και L6 περιορίζουν τη ριβοσωμική ασάφεια και αυξάνουν την ανθεκτικότητα στην στρεπτομυκίνη. Σε αναλογία με τους προκαρυωτικούς οργανισμούς, αναμένεται και η εμπλοκή ορισμένων ευκαρυωτικών ριβοσωματικών πρωτεϊνών στην αλληλεπίδραση με τη στρεπτομυκίνη. Η επιλογή και ο χαρακτηρισμός μεταλλάξεων ανθεκτικών ή ευαίσθητων στην στρεπτομυκίνη έχει αποβεί ένα χρήσιμο εργαλείο στη μελέτη της λειτουργίας του προκαρυωτικού ριβοσώματος (Garvin et al. 1974) Το αμινογλυκοζιτικό αντιβιοτικό παρομομυκίνη Δυο ακόμη εκπρόσωποι της οικογένειας των αμινογλυκοζιτών είναι η παρομομυκίνη και η νεομυκίνη, οι δομές των οποίων παρουσιάζονται στην Εικόνα 15. Και τα δυο αντιβιοτικά διαθέτουν κοινές δομικές και λειτουργικές ιδιότητες. Χημικά αποτελούνται από τέσσερις δακτυλίους, συστατικά των οποίων είναι ο δακτύλιος της 2- δεοξυστρεπταμίνης που συνδέεται με αμινοσάκχαρα και με λειτουργικές υδροξυλομάδες (Kotra et al. 2000). Η μεν παρομομυκίνη διαθέτει μια υδροξυλομάδα στον άνθρακα 6 (C-6 ), ενώ η υγρομυκίνη στην ίδια θέση διαθέτει μια αμινομάδα (Kotra et al. 2000). Επί πλέον, είναι γνωστό από μελέτες που πραγματοποιήθηκαν σε 37

51 Εισαγωγή κύτταρα ζύμης, ότι η παρομομυκίνη προκαλεί φαινοτυπική καταστολή, δηλαδή αύξηση των λαθών κατά την μετάφραση (Palmer et al. 1979, Singh et al. 1979). Εικόνα 15. Παρουσιάζει τις χημικές δομές των αμινογλυκοσιδικών αντιβιοτικών, παρομομυκίνη (αριστερά) και νεομυκίνη (δεξιά). Παρά την πολικότητα και την υδροφιλικότητα τους, τα αμινογλυκοζιτικά αντιβιοτικά μπορούν να διαπεράσουν την κυτταρική μεμβράνη, ώστε να μπορέσουν να εκδηλώσουν τις αντιμικροβιακές τους ιδιότητες (Mingeot-Leclercq et al. 1999). Η παρομομυκίνη και η νεομυκίνη προσδένονται ειδικά στη 30S ριβοσωματική υπομονάδα (Vazquez 1979) καθώς επίσης στη 40S υπομονάδα. Το υψηλό θετικό φορτίο που φέρουν αυξάνει τη χημική συγγένεια πρόσδεσης τους στο αρνητικό φορτίο που φέρει το rrna (Fourmy et al. 1998, Mingeot-Leclercq et al. 1999). Η αλληλεπίδραση τους με το rrna της μικρής υπομονάδας (16S ή/και 18S) προκαλεί αλλαγή της στερεοδιαμόρφωσης της τελευταίας, με προφανείς συνέπειες στην διορθωτική ικανότητα ανάγνωσης, στην μετατόπιση (translocation) και στην συγκρότηση της μικρής υπομονάδας (Moazed & Noller 1987, Recht et al. 1999, Schroeder et al. 2000, Ogle et al. 2001). Συγκεκριμένα, προσδένονται στην Α περιοχή της περιοχής αποκωδικοποίησης και επάγουν αλλαγές σε συντηρημένες βάσεις της περιοχής αυτής. Οι επαγόμενες αλλαγές αυξάνουν τη συγγένεια δέσμευσης μεταξύ των δακτυλίων Ι και ΙΙ των προαναφερόμενων αντιβιοτικών με το 16S rrna (Fourmy et al. 1996, Fourmy et al. 1998, Schroeder et al. 2000, Ogle et al. 2001). Η ισχυρή αυτή δέσμευση επηρεάζει την ακρίβεια της διορθωτικής ικανότητας ανάγνωσης και της επιλογής, αυξάνοντας τα λάθη κατά τη μετάφραση του mrna. Επίσης, αξίζει να σημειωθεί πως η δέσμευση αυτών των αντιβιοτικών στο 16S rrna, ελαττώνει τον αριθμό των ριβοσωματικών πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με το 38

52 Εισαγωγή τελευταίο, προκειμένου να συγκροτήσουν μια λειτουργική 30S υπομονάδα. Αποτέλεσμα αυτού του γεγονότος είναι αδρανοποίηση του 21S πρόδρομου μορίου, το οποίο αποτελεί την «προγονική» μορφή της 30S υπομονάδας, σε μια μη λειτουργική στερεοδιαμόρφωση. Η τελευταία αποτρέπει την μετάπτωση του 21S σωματιδίου στην ώριμη 30S υπομονάδα, με άμεσο επακόλουθο την παρεμπόδιση της σύνθεσης και της ωρίμανσης της 30S υπομονάδας (Champney 2001). Πράγματι, σε υψηλές συγκεντρώσεις των αμινογλυκοσιδικών αντιβιοτικών έχει παρατηρηθεί αναστολή του σχηματισμού των 50S υπομονάδων, παρόλο που τα αντιβιοτικά αυτά αναστέλλουν ειδικά την συγκρότηση της 30S υπομονάδας. Η Εικόνα 16 παρουσιάζει την επίδραση της παρομομυκίνης στην στερεοδιαμόρφωση του κέντρου αποκωδικοποίησης. Απουσία του αντιβιοτικού, οι βάσεις Α1492 και Α1493 καταλαμβάνουν την θέση εσωτερικά της έλικας 44 και η γουανίνη στη θέση 530 (G530) της θηλιάς 530 της έλικας 18 βρίσκεται στην syn διαμόρφωση (Εικόνα 16Α). Αξίζει να παρατηρηθεί πως πολύ κοντά στην περιοχή του κέντρου αποκωδικοποίησης βρίσκεται και η βάση C1054 της έλικας 34, η οποία αποτελεί αντικείμενο μελέτης της παρούσας διατριβής. Η παρατήρηση αυτή υποδηλώνει την πιθανή συμμετοχή της βάσης αυτής στη ρύθμιση της μεταφραστικής πιστότητας. Εκτός από αυτή τη βάση, στην ίδια περιοχή βρίσκεται και η ριβοσωματική πρωτεΐνη S12, για την οποία υπάρχουν πληροφορίες που την εμπλέκουν στην προαναφερθείσα διαδικασία. Η παρουσία του αντιβιοτικού ωθεί προς το εξωτερικό της έλικας 44 τις βάσεις Α1492 και Α1493, ενώ η G530 παραμένει στην syn διαμόρφωση. Η παρουσία, όμως, μηνύματος (mrna) και πολύ περισσότερο αμινοάκυλο-trna στην Α περιοχή του ριβοσώματος προκαλεί αφενός την κατάληψη της εξωτερικής πλευράς της έλικας 44 από τις προαναφερθείσες βάσεις, αφετέρου την αλλαγή της διαμόρφωσης της G530 από την syn στην anti (Εικόνα 16C). Με μια προσεκτικότερη παρατήρηση, ο αναγνώστης μπορεί να διαπιστώσει πως είναι διαφορετική η διαμόρφωση στο χώρο των βάσεων Α1492 και Α1493, απουσία και παρουσία trna (Εικόνα 16, B και C). Η διαφοροποίηση αυτή οφείλεται στις αλληλεπιδράσεις των παραπάνω βάσεων με το ζεύγος κωδικίου-αντικωδικίου, όπως αυτές παρουσιάζονται στην Εικόνα 13. Κατά την παρουσία αμινοάκυλο-trna στην Α περιοχή του ριβοσώματος, η επιπλέον παρουσία της παρομομυκίνης δεν προκαλεί περαιτέρω αλλαγές στην διαμόρφωση των παραπάνω βάσεων. Η παρουσία του αντιβιοτικού έχει επίσης ως αποτέλεσμα την απώλεια της 39

53 Εισαγωγή ικανότητας διαχωρισμού μεταξύ συμπληρωματικού ή περίπου συμπληρωματικού αμινοάκυλο-trna. Εικόνα 16. Κρυσταλλικές δομές της Α περιοχής της μικρής (30S) υπομονάδας του ριβοσώματος. Απεικονίζονται η θηλιά του αντικωδικίου (ASL, Anticodon Stem Loop) του trna με χρυσό χρώμα, το mrna που καταλαμβάνει την Α περιοχή με μωβ χρώμα, το mrna που καταλαμβάνει την Ρ περιοχή με πράσινο χρώμα, η ριβοσωματική πρωτεΐνη της μικρής υπομονάδας S12 με πορτοκαλί χρώμα και ορισμένες σημαντικές βάσεις με κόκκινο χρώμα. Επίσης, απεικονίζονται οι έλικες 44 (κάτω δεξιά), 34 (επάνω αριστερά) καθώς και η θηλία 530 (μέση και κάτω αριστερά) του 16S rrna. (Α) Η φυσιολογική 30S υπομονάδα. Οι βάσεις Α1492 και Α1493 προσανατολισμένες προς το εσωτερικό της έλικας 44. Η βάση G530 βρίσκεται στην syn διαμόρφωση, (Β) Παρουσία παρομομυκίνης, οι βάσεις Α1492 και Α1493 εκτοπίζονται από το εσωτερικό της έλικας 44 προς την Α περιοχή, λόγω πρόσδεσης του αντιβιοτικού (κίτρινο χρώμα) στο εσωτερικό της έλικας 44, (C) Παρουσία μηνύματος (mrna) και trna στην Α περιοχή, οι βάσεις Α1492 και Α1493 καταλαμβάνουν την εξωτερική πλευρά της έλικας 44 προκειμένου να παρακολουθήσουν τις αλληλεπιδράσεις κωδικίου-αντικωδικίου. Η βάση G530 αλλάζει διαμόρφωση και καταλαμβάνει την anti, προκειμένου να αλληλεπιδράσει με την Α1492, με τη δεύτερη βάση του αντικωδικίου και με την τρίτη βάση του κωδικίου. Δυο ιόντα μαγνησίου (Mg 2+ ) καταλαμβάνουν τη θέση των Α1492 και Α1493 στο εσωτερικό της έλικας 44 και ένα εντοπίζεται κοντά στη ριβόζη της «θέσης wobble» του κωδικίου, (D) Παρουσία παρομομυκίνης, mrna και trna στην Α περιοχή, η δομή είναι ίδια με εκείνη της (C), με τη διαφορά ότι απουσιάζουν τα ιόντα μαγνησίου. Η παρομομυκίνη έχει την ικανότητα να επάγει τις ίδιες αλλαγές στην τριτοταγή δομή του κέντρου της αποκωδικοποίησης ακόμα και απουσία του συμπληρωματικού ζεύγους κωδικίου-αντικωδικίου. Πράγματι, το αντιβιοτικό σταθεροποιεί την πρόσδεση στην Α περιοχή οποιουδήποτε μορίου αμινοάκυλο-trna ενώ παράλληλα επιταχύνει 40

54 Εισαγωγή την υδρόλυση του GTP και τον σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού (Pape et al. 2000). Κινητικά δεδομένα υποστηρίζουν ότι η παρομομυκίνη ελαττώνει την ταχύτητα αναγνώρισης του κωδικίου (Rodnina & Wintermeyer 2001). Αυτό πρακτικά ερμηνεύεται ως αποτέλεσμα της αλλαγής της διαμόρφωσης του ριβοσώματος, από τη στερεοδομή πρόσδεσης στην παραγωγική στερεοδομή, η οποία επάγεται από την πρόσδεση του αντιβιοτικού στο ριβόσωμα (Rodnina & Wintermeyer 2001). 3.2 Αντιβιοτικά-αναστολείς της μετατόπισης (translocation) Το γλουταριμιδικό αντιβιοτικό κυκλοεξιμίδιο Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, εκτός από τα αντιβιοτικά που προσδένονται ειδικά στο rrna της μικρής ριβοσωματικής υπομονάδας, υπάρχουν και αντίστοιχα που προσδένονται στο 23S ή/και στο 25S rrna (μεγάλη ριβοσωματική υπομονάδα). Παρακάτω, γίνεται αναφορά στην επίδραση επί της μετατόπισης ενός αντιβιοτικούαναστολέα αυτού του σταδίου, του κυκλοεξιμιδίου. Αξίζει να σημειωθεί πως αναστολείς της μετάφρασης εξειδικευμένοι για τη μεγάλη ριβοσωματική υπομονάδα αναστέλλουν τη συγκρότηση αυτής (50S ή 60S), ενώ δεν φαίνεται να επηρεάζουν την σύνθεση της μικρής υπομονάδας (30S ή 40S) (Champney 2001). Αυτό συμβαίνει επειδή η μεταγραφή του 16S rrna προηγείται της μεταγραφής του 23S rrna, επομένως και η σύνθεση της 30S υπομονάδας προηγείται της σύνθεσης της 50S (Nomura 1973, Nierhaus 1982). Με αυτόν τον τρόπο, η αναστολή του σχηματισμού της 30S υπομονάδας έχει άμεση επίδραση ελαττώνοντας τον σχηματισμό της 50S υπομονάδας. Tο κυκλοεξιμίδιο (Εικόνα 17) είναι ένα γλουταριμιδικό αντιβιοτικό το οποίο αναστέλλει την πρωτεϊνοσύνθεση, δεσμευόμενο επιλεκτικά στα ευκαρυωτικά 80S ριβοσώματα. Το εν λόγω αντιβιοτικό αναστέλλει τη μετατόπιση του πεπτιδύλο-trna από την περιοχή-δότης (δηλαδή την Α περιοχή του ριβοσώματος) στην περιοχή-δέκτης (δηλαδή την Ρ περιοχή του ριβοσώματος), προκαλώντας την αναστολή της δράσης του παράγοντα επιμήκυνσης eef-2 (Cannon et al. 1994). Η θέση πρόσδεσης του κυκλοεξιμιδίου εντοπίζεται στη μεγάλη ριβοσωματική υπομονάδα και μάλιστα η αλληλεπίδραση του γίνεται με το rrna, όπως άλλωστε συμβαίνει με τα περισσότερα αντιβιοτικά. 41

55 Εισαγωγή Εικόνα 17. Χημική δομή των γλουταριμιδικών αντιβιοτικών. Ένα εξ αυτών είναι και το κυκλοεξιμίδιο το οποίο στη θέση της πλευρικής ομάδας R περιέχει ένα άτομο υδρογόνου (Η). Ορισμένοι ερευνητές έχουν εμπλέξει και την ριβοσωματική πρωτεΐνη L41 στην αλληλεπίδραση με το αντιβιοτικό (Dehoux et al. 1993). Σε ότι αφορά τον S. cerevisiae, πιστεύεται πως η πρωτεΐνη L41 εμπλέκεται στον σχηματισμό της περιοχής πρόσδεσης του κυκλοεξιμιδίου (Dresios et al. 2003). Έχει βρεθεί επίσης ότι τουλάχιστον άλλες δυο ριβοσωματικές πρωτεΐνες παίζουν σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση της περιοχής πρόσδεσης του κυκλοεξιμιδίου στη μεγάλη ριβοσωματική υπομονάδα (Stevens et al. 2001). Μεταλλάξεις στην L28 (Kawai et al. 1992) και στην L42 (Stevens et al. 2001), βρέθηκε ότι επηρεάζουν την αντίσταση έναντι κυκλοεξιμιδίου. 3.3 Γενικοί αναστολείς της πρωτεϊνοσύνθεσης Το αντιβιοτικό πουρομυκίνη Η δημιουργία του νέου πεπτιδικού δεσμού δεν απαιτεί την πλήρη κάλυψη της Α περιοχής του ριβοσώματος από το σωστό αμινοάκυλο-trna. Η παραπάνω διαπίστωση αποδείχθηκε με in vitro πειράματα με τη χρήση της πουρομυκίνης, η οποία αναστέλλει τη μετάφραση. Η πουρομυκίνη μιμείται τη δομή του αμινοτελικού άκρου ενός αμινοάκυλο-trna, όπως δείχνει η Εικόνα 18, όπoυ φαίνεται ότι η πουρομυκίνη έχει ένα άτομο Ν αντί για ένα άτομο Ο, στο σημείο που γίνεται η πρόσδεση του αμινοξέος στο μεταφορικό RNA. Το αντιβιοτικό αντιμετωπίζεται από το ριβόσωμα σαν να είναι ένα νεοεισερχόμενο αμινοάκυλο-trna, έτσι προσδένεται στο ριβόσωμα καταλαμβάνοντας το «επάνω» μέρος της Α ριβοσωματικής περιοχής και όχι το «κάτω», εκεί δηλαδή που βρίσκεται η τριπλέτα του κωδικίου. Η συντιθέμενη μέχρι εκείνη τη χρονική στιγμή πολυπεπτιδική αλυσίδα (υπό τη μορφή πεπτιδυλο-trna) προσδένεται 42

56 Εισαγωγή στην αμινομάδα που φέρει η πουρομυκίνη (σχηματισμός πεπτιδικού δεσμού) και σχηματίζεται η πεπτιδυλο-πουρομυκίνη, η οποία καταλαμβάνει την Α περιοχή της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας. Δεν παραμένει, όμως, για πολλή ώρα σε αυτή τη θέση, διότι δεν μπορεί να συγκρατηθεί σωστά από το ριβόσωμα ένεκα του ότι στερείται των υπόλοιπων αλληλεπιδράσων που παρέχει το trna. Η πεπτιδυλο-πουρομυκίνη απελευθερώνεται στο κυτταρόπλασμα, γεγονός που συνεπάγεται τον πρόωρο τερματισμό της μετάφρασης και το θάνατο του κυττάρου. Αυτή την ιδιότητα της πουρομυκίνης χρησιμοποιούμε στην λεγόμενη αντίδραση πουρομυκίνης την οποία εφαρμόζουμε για τον καθορισμό της ταχύτητας σχηματισμού πεπτιδικών δεσμών in vitro, όπως περιγράφεται στην ενότητα Υλικά & Μέθοδοι. Εικόνα 18. Χημική δομή του αμινοάκυλο-trna (επάνω) και της πουρομυκίνης (κάτω). Η πουρομυκίνη μοιάζει με το 3 άκρο του αμινοάκυλο-trna. Η αμινοομάδα της ενώνεται με τη καρβοξυλομάδα του αυξανόμενου πολυπεπτιδίου σχηματίζοντας την πεπτιδυλοπουρομυκίνη, η οποία δεν συγκρατείται ισχυρά στην Α περιοχή του ριβοσώματος και αποδεσμεύεται από αυτό. 4. Περιοχές του rrna της μικρής ριβοσωματικής υπομονάδας που επηρεάζουν τη μεταφραστική πιστότητα Μια πολύ χρήσιμη προσέγγιση στην μελέτη του ελέγχου της μεταφραστικής πιστότητας είναι η κατασκευή κατασταλτικών και αντικατασταλτικών μεταλλάξεων, οι οποίες μειώνουν και αυξάνουν την πιστότητα, αντίστοιχα. Αρκετές από τις μεταλλάξεις επηρεάζουν και την ανθεκτικότητα έναντι των αντιβιοτικών που αναστέλλουν τη μετάφραση. Αυτές οι μελέτες έχουν υποδείξει αρκετές περιοχές του 16S rrna, καθώς επίσης ριβοσωματικές πρωτεϊνες και διαλυτούς παράγοντες της πρωτεϊνοσύνθεσης στη ρύθμιση των επιπέδων της ακρίβειας κατά τη μετάφραση, τόσο σε προκαρυωτικά κύτταρα (Garvin et al. 1974, Vijgenboom et al. 1985), όσο και σε ευκαρυωτικά (Vincent & Liebman 1992, Alksne et al. 1993, Hinnebusch & Liebman 1991). 43

57 Εισαγωγή Όπως έχει ήδη αναφερθεί η κύρια λειτουργία της μικρής ριβοσωματικής υπομονάδας είναι η σωστή επιλογή του αμινοάκυλο-trna. Η ακρίβεια αυτής της επιλογής ρυθμίζεται σε μεγάλο βαθμό από τις λειτουργικές αλληλεπιδράσεις του 16S (ή 18S) rrna με τρεις γειτονικές ριβοσωματικές πρωτεΐνες της μικρής υπομονάδας τις S4, S5 και S12 (αρίθμηση E. coli) (Ozaki et al. 1969, Biswas & Gorini 1972, Cabezon et al. 1976, Allen et al. 1989). Η σύγκριση των αλληλουχιών των rrnas της μικρής υπομονάδας πολλών οργανισμών, προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών, οδήγησε στο συμπέρασμα πως υπάρχει υψηλός βαθμός συντήρησης της δευτεροταγούς και πιθανώς της τριτοταγούς δομής αυτών, κατά τη διάρκεια της εξέλιξης (Woese 1987). Με αυτόν τον τρόπο κατέστη σαφές ότι το κέντρο ακρίβειας είναι συντηρημένο παρά την εξελικτική απόσταση των ευκαρυωτικών κυττάρων από τα προκαρυωτικά. Η διαπίστωση αυτή δημιούργησε το κατάλληλο στήριγμα για την εδραίωση της πεποίθησης ότι η ακρίβεια κατά τη μετάφραση ρυθμίζεται κυρίως από το rrna, και ότι οι ριβοσωματικές πρωτεΐνες που πλαισιώνουν αυτό συνεπικουρούν στη λειτουργία του rrna. Αξίζει να σημειωθεί, ότι μεταλλάξεις σε βάσεις του rrna είτε σε ριβοσωματικές πρωτεΐνες της μικρής υπομονάδας, που επηρεάζουν την μεταφραστική πιστότητα των ευκαρυωτικών κυττάρων έχουν πρώτα ταυτοποιηθεί και χαρακτηριστεί σε προκαρυωτικά κύτταρα. Εάν βρεθούν ομόλογες βάσεις ή πρωτεΐνες στα ευκαρυωτικά κύτταρα, τότε γίνεται χαρακτηρισμός των ιδίων μεταλλάξεων και σε αυτά, προκειμένου να διαπιστωθεί εάν παρατηρείται διαφοροποίηση της λειτουργίας τους σε σχέση με τα προκαρυωτικά κύτταρα. Στις παραγράφους που ακολουθούν, θα περιγραφούν οι υποκαταστάσεις βάσεων οι οποίες αποτελούν αντικείμενο έρευνας της παρούσας διατριβής. Αξίζει, τέλος, να σημειωθεί ότι για λόγους άμεσης σύγκρισης, μεταξύ του ριβοσώματος της ζύμης και του προκαρυωτικού ριβοσώματος, έχει υιοθετηθεί η αρίθμηση των βάσεων του rrna κατά Escherichia coli. 4.1 Η θηλιά 530 της έλικας 18 του 18S rrna Η θηλιά 530 (530 stem loop) αποτελεί μια από τις πιο συντηρημένες περιοχές του 16S rrna τόσο στην αλληλουχία της όσο και στη δευτεροταγή της δομή (Woese et al. 1975, Gutell et al. 1985), γεγονός που αντανακλά τη σημασία που έχει στη λειτουργία του ριβοσώματος. Πειράματα σταυροσύνδεσης (cross-linking) έχουν δείξει ότι η θηλιά 44

58 Εισαγωγή 530 βρίσκεται κοντά στην περιοχή αλληλεπίδρασης κωδικίου-αντικωδικίου (Noller 1991, Dontsova et al. 1992). Ανήκει δηλαδή στο κέντρο αποκωδικοποίησης της γενετικής πληροφορίας όπου μαζί με τις βάσεις Α1492 και Α1493 της έλικας 44, με νουκλεοτίδια από τις έλικες 24, 27, 34 του 16S rrna καθώς επίσης με τις πρωτεΐνες της μικρής υπομονάδας S4, S5, S12 και S17 (αρίθμηση E. coli) συμμετέχει ενεργά στη ρύθμιση της μεταφραστικής πιστότητας. Έχει προταθεί στη βιβλιογραφία (Woese & Gutell 1989) μια ασυνήθιστη υψηλής οργάνωσης δομική αλληλεπίδραση η οποία περιλαμβάνει τη θηλιά 530 και βασίζεται σε συγκριτική ανάλυση αλληλουχίας. Η αλληλεπίδραση αυτή περιλαμβάνει τα νουκλεοτίδια και στο 16S rrna. Οι κατά Watson-Crick αλληλεπιδράσεις μεταξύ των καταλοίπων και στο 16S rrna είναι απαραίτητες για τη λειτουργία του ριβοσώματος. Σημειακές μεταλλάξεις σε κάποια από αυτές τις βάσεις, προκαλούν διαταραχή των κατά Watson-Crick αλληλεπιδράσεων και είναι γενικώς επιβλαβείς όταν εκφράζονταν στα κύτταρα E. coli. Επί πλέον, μεταλλάξεις σε αυτή την περιοχή, που πραγματοποιήθηκαν στο E. coli, μετέβαλαν την αλληλεπίδραση μεταξύ rrna και αντιβιοτικών (Moazed & Noller 1987, Leclerck et al. 1991, Powers & Noller 1991) Η μετάπτωση G517A Η βάση G517 ανήκει στη λεγόμενη θηλιά 530 (530 loop) της έλικας 18 του προκαρυωτικού 16S rrna (Πίνακας 2). Η βάση G517 συμμετέχει ενεργά στην διορθωτική ικανότητα ανάγνωσης (proofreading) σε μελέτες που πραγματοποιήθηκαν σε προκαρυωτικά κύτταρα (Brimacombe et al. 1993, Noller 1991), ενώ με άλλες μελέτες αποδείχθηκε ότι αλληλεπιδρά με τον παράγοντα επιμήκυνσης EF-Tu (Powers & Noller 1991). Η υποκατάσταση της γουανίνης στη θέση 517 προς αδενίνη (G517Α) έχει βρεθεί ότι προκαλεί καταστολή της μετάφρασης τόσο σε ριβοσώματα του εντεροβακτηρίου (O Connor et al. 1992), όσο και σε μιτοχόνδρια του σακχαρομύκητα (Shen & Fox 1989). Η συγκεκριμένη μετάλλαξη, που συμβολικά αναφέρεται ως rdn2, προκαλεί φαινότυπο αντικαταστολής σε ριβοσώματα του σακχαρομύκητα S. cerevisiae (Liebman et al. 1995), καθώς επίσης ανθεκτικότητα έναντι των αντιβιοτικών παρομομυκίνη και G418, φαινότυπο βραδείας κυτταρικής ανάπτυξης και ανεπαρκή ικανότητα σύνθεσης πολυφαινυλαλανίνης σε poly(u)-κατευθυνόμενο in vitro σύστημα μετάφρασης. 45

59 Εισαγωγή Πίνακας 2. Νουκλεοσίδια (βάσεις) της μικρής και της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας που εμπλέκονται στη ρύθμιση της μεταφραστικής πιστότητας.. Βάσεις μικρής ριβοσωματικής υπομονάδας Βάση E. coli (16S rrna) Έλικα 16S rrna Βάση S. cerevisiae (18S rrna) G C G G C C C C C C G G U U Βάσεις μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας Βάση E. coli (23S rrna) Έλικα 23S rrna Βάση S. cerevisiae (25S rrna) G C C C Η μεταστροφή C526A Η κυτοσίνη στη θέση 526 (C526) ανήκει στη θηλιά 530 (530 loop) της έλικας 18 του προκαρυωτικού 16S rrna (Πίνακας 2). Χρησιμοποιώντας έναν ραδιενεργό ολιγοδεοξυριβονουκλεοτιδικό ανιχνευτή συμπληρωματικό με τα νουκλεοτίδια του 16S rrna, βρέθηκε ότι η C526 βρίσκεται σε απόσταση 24Å από τις πρωτεΐνες S3, S4, S7 και S12 καθώς και από το 3 άκρο του 16S rrna (Alexander et al. 1994). Περαιτέρω ανάλυση αποκάλυψε ότι τα νουκλεοτίδια C526 της έλικας 18 και G1405 της έλικας 44 βρίσκονται αρκετά κοντά. Τα αποτελέσματα αυτά συνηγορούν προς την προαναφερθείσα άποψη (Dontsova et al. 1992) ότι η θηλιά 530 ανήκει στο κέντρο αποκωδικοποίησης της 30S υπομονάδας. Όσον αφορά τη μετάλλαξη C526A, η αδυναμία αλληλεπίδρασης μεταξύ των βάσεων G505-A526 (G-Α λάθος ζευγάρωμα) φάνηκε να επηρεάζει δυσμενώς τη ριβοσωμική λειτουργία καθιστώντας τη συγκεκριμένη μετάλλαξη επιβλαβή για τα κύτταρα (Powers & Noller 1991). 46

60 Εισαγωγή Στον S. cerevisiae, η βάση C526 του18s rrna είναι ομόλογη σε πρωτοταγή και δευτεροταγή δομή με την αντίστοιχη βάση του 16S rrna του E. coli. Μελέτες της υποκατάστασης C526A στο 18S rrna του S. cerevisiae, που συμβολικά αναφέρεται ως rdn12a, δείχνουν ότι η συγκεκριμένη μετάλλαξη έχει επίδραση στη διαδικασία τερματισμού της πρωτεϊνοσύνθεσης. Η μετάλλαξη rdn12a επιδεικνύει μια ισχυρή αναστολή της μεσολαβούμενης από το sup45-r2 ts, μιας μετάλλαξης επί του παράγοντα τερματισμού erf1, καταστολής χωρίς νόημα. 4.2 Η έλικα 34 του 18S rrna Η έλικα 34 του 16S rrna του εντεροβακτηρίου Escherichia coli, περιλαμβάνει τα νουκλεοτίδια και (Maly & Brimacombe 1983). Πειράματα σταυροσύνδεσης (cross-linking) έδειξαν ότι τόσο η έλικα 34 όσο και η θηλιά 530 του προκαρυωτικού 16S rrna βρίσκονται πολύ κοντά, όταν το ριβόσωμα λαμβάνει την τριτοταγή του διαμόρφωση (Dontsova et al. 1992, McCarthy & Brimacombe 1994). Οι παραπάνω περιοχές όπως επίσης και η περιοχή πρόσδεσης των παραγόντων τερματισμού εντοπίζονται στον «αυχένα» του ριβοσώματος (Moffat et al. 1991) Οι υποκαταστάσεις της βάσης C1054 Η πρώτη αναφορά στο ρόλο της βάσης C1054 (Πίνακας 2) έγινε το 1988, όταν δημοσιεύτηκε ότι μια μετάλλαξη αυτής προκαλεί καταστολή των UGA αλλά όχι των UAA και UAG κωδικίων λήξης (Murgola et al. 1988). Επίσης μια σημαντική διαφοροποίηση μεταξύ προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών οργανισμών είναι η παρουσία μόνο στους προκαρυωτικούς της επαναλαμβανόμενης αλληλουχίας UCAUCA στις θέσεις η οποία βρίσκεται απέναντι από την C1054 (Neefs et al. 1991). Η αλληλουχία αυτή είναι συμπληρωματική προς το κωδίκιο λήξης UGA και οδήγησε στην υπόθεση πως το ζευγάρωμα μεταξύ mrna (5 -UGA-3 ) και rrna (5 - UCA-3 ) κρίνεται απαραίτητο για τον επιτυχή τερματισμό της μετάφρασης στο UGA κωδίκιο. Οι μεταλλάξεις στη θέση C1054 του 16S rrna προκαλούν μεταφραστική καταστολή (δηλαδή μη ανάγνωση των κωδικίων λήξης και συνέχιση της μετάφρασης) σε πειράματα που πραγματοποιήθηκαν στο εντεροβακτήριο (Murgola et al. 1988, Prescott et al. 1991, Moine & Dahlberg 1994). Η επίδραση των μεταλλάξεων της ίδιας βάσης εξετάστηκαν και στο ευκαρυωτικό κύτταρο και συγκεκριμένα στο 47

61 Εισαγωγή σακχαρομύκητα Saccharomyces cerevisiae (Chernoff et al. 1996). Έτσι, οι υποκαταστάσεις C1054A (rdn1a) και C1054G (rdn1g) προκαλούν επικρατή μη νοηματική καταστολή. Επί πλέον, για την υποκατάσταση (rdn1α) υπάρχει η πληροφόρηση ότι προκαλεί φαινότυπο βραδείας κυτταρικής ανάπτυξης, ευαισθησία στη δράση του αμινογλυκοζιτικού αντιβιοτικού παρομομυκίνη και καταστολή των γενετικών δεικτών ade1-14 (UGA) και his7-1 (UAA). Η υποκατάσταση C1054U (rdn1t) προκαλεί φαινότυπο υπολειπόμενης αντικαταστολής, ενώ δεν φαίνεται να επηρεάζει σημαντικά την ανάπτυξη των μεταλλαγμένων στελεχών. Τέλος, η απάλειψη της βάσης C1054Δ (rdn1δ) δεν είναι βιώσιμος. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν την εμπλοκή της συγκεκριμένης βάσης στη διαδικασία του τερματισμού της πρωτεϊνικής σύνθεσης, καθώς επίσης την εξελικτική διατήρηση της λειτουργίας της παρά τις όποιες διαφοροποιήσεις των γειτονικών νουκλεοτιδικών αλληλουχιών (Neefs et al. 1991). Τέλος, στην ίδια έλικα ανήκει και η βάση G1206 (Πίνακας 2), για την οποία ωστόσο δεν υπάρχουν πληροφορίες μέχρι στιγμής για την επίδραση της επί της μεταφραστικής πιστότητας. 4.3 Η έλικα 44 του 18S rrna Η πιο σημαντική από λειτουργικής άποψης έλικα του προκαρυωτικού 16S rrna είναι, αδιαμφισβήτητα, η έλικα 44 καθώς τα νουκλεοτίδια που την απαρτίζουν συγκροτούν τον πυρήνα του κέντρου της αποκωδικοποίησης. Η έλικα 44 περιλαμβάνει τα νουκλεοτίδια (Zimmermann 1995). Όπως προκύπτει από την περιγραφή του κέντρου αποκωδικοποίησης (παράγραφος 1.3.1), στην έλικα αυτή ανήκουν οι συντηρημένες βάσεις Α1492 και Α1493 οι οποίες διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο κατά την επιλογή του αμινοάκυλο-trna Η υποκατάσταση U1495C Πολύ κοντά στις βάσεις Α1492 και Α1493 της έλικας 44 βρίσκεται η βάση U1495 (Πίνακας 2). Οι Morgan και Kaplan ήταν οι πρώτοι που κατασκεύασαν σημειακή μετάλλαξη επί του 16S rrna της E. coli την οποία εν συνεχεία εισήγαγαν σε ευκαρυωτικό μικροοργανισμό (Morgan & Kaplan 1976). Η μετάλλαξη αυτή (U1495C) αφορούσε την ίδια υποκατάσταση βάσης με εκείνη που προκαλούσε ανθεκτικότητα στην υγρομυκίνη στην Tetrahymena (Spangler & Blackburn 1985) και ονομάστηκε 48

62 Εισαγωγή rdnhyg1. Το στέλεχος rdnhyg1 που φέρει αυτή την υπολειπόμενη σημειακή μετάλλαξη χρησιμοποιήθηκε για την επιλογή ανθεκτικών στην υγρομυκίνη στελεχών ζύμης, στα οποία στη συνέχεια έγινε εισαγωγή πλασμιδίων που φέρουν σημειακές μεταλλάξεις σε περιοχές του 18S rrna ή του 26S rrna (για περισσότερες πληροφορίες βλέπε το κεφάλαιο Υλικά & Μέθοδοι). 4.4 Άλλες περιοχές του 18S rrna που συμμετέχουν στη ρύθμιση της μεταφραστικής πιστότητας Η βάση G310 ανήκει στην έλικα 12 του 16S rrna (Πίνακας 2) για την οποία ωστόσο δεν υπάρχουν πληροφορίες στη βιβλιογραφία μέχρι στιγμής για την επίδραση της επί της μεταφραστικής πιστότητας. Ωστόσο, στην αντίστοιχη περιοχή του 18S rrna της ζύμης υπάρχει κυτοσίνη αντί για γουανίνη, γεγονός που μαρτυρά ότι κατά τη διάρκεια της εξέλιξης πραγματοποιήθηκαν αλλαγές στην πρωτοταγή δομή του 18S rrna. 5. Περιοχές rrna της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας που επηρεάζουν τη μεταφραστική πιστότητα Εκτός από το rrna της μικρής ριβοσωματικής υπομονάδας (16S και 18S rrna), τo οποίo συμμετέχει καθοριστικά στη ρύθμιση των επιπέδων της μεταφραστικής πιστότητας, έχει αποδειχθεί ότι παρόμοιο ρόλο επιτελούν και αρκετά συστατικά της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει τη διαρκή επικοινωνία που υφίσταται μεταξύ των δυο ριβοσωματικών υπομονάδων. Εκτός από τις ριβοσωματικές πρωτεΐνες της μεγάλης υπομονάδας για τις οποίες έγινε λόγος σε προηγούμενες παραγράφους, αρκετές περιοχές του rrna αυτής (23S και 25S rrna) έχει βρεθεί ότι επηρεάζουν τη μεταφραστική πιστότητα. 5.1 Η έλικα 90 του 23S rrna Η έλικα 90 αποτελεί τμήμα της VI περιοχής του 23S rrna της μεγάλης υπομονάδας του προκαρυωτικού ριβοσώματος που αντιστοιχεί στην περιοχή VII του 28S rrna των ευκαρυωτικών ριβοσωμάτων. Στην έλικα αυτή ανήκει η περιοχή σαρκίνης/ρισίνης, η οποία ονομάστηκε έτσι καθώς αποτελεί στόχο των ριβοτοξινών 49

63 Εισαγωγή σαρκίνης και ρισίνης. Στην E. coli η περιοχή αυτή έχει μήκος 28 βάσεις (C2646 έως G2674) και συγκροτείται από το στέλεχος το οποίο αποτελείται από επτά (7) ζεύγη βάσεων και τη θηλιά που αποτελείται από δεκαπέντε (15) νουκλεοτίδια στα οποία συμπεριλαμβάνεται η αλληλουχία GAGA (Marchant &Hartley 1994). Στερεοχημικά, οι δύο βάσεις Α2660 και G2661 της GAGA τετραθηλιάς (GAGA tetraloop) είναι εκτιθέμενες προς τα έξω και προσβάσιμες για πιθανές αλληλεπιδράσεις με παράγοντες επιμήκυνσης ή ριβοτοξίνες Η υποκατάσταση C2658U Η μετάλλαξη C2658U (rdn5) δημιουργήθηκρ στο ζεύγος των βάσεων που κλείνει τη θηλιά των τεσσάρων βάσεων (GAGA tetraloop) (Liu & Liebman 1996). Η μετάλλαξη αυτή προκαλεί αλλαγή του ζεύγους C:G στο λιγότερο σταθερό U:G. Κύτταρα που περιέχουν την rdn-5 μετάλλαξη παρουσιάζουν καταστολή των κωδικίων λήξης (nonsense suppression) καθώς και μετατόπιση του αναγνωστικού πλαισίου (frameshift suppression). Η ακρίβεια της μετάφρασης και η ανθεκτικότητα στα αμινογλυκοζιτικά αντιβιοτικά είχε συνδεθεί μόνο με τη 40S υπομονάδα (Moazed & Noller 1987, Chernoff et al. 1994). Για την rdn5 μετάλλαξη είναι η πρώτη φορά που αλλαγή στη μεγάλη ριβοσωματική υπομονάδα προκαλεί μεταβολή της πιστότητας και ανθεκτικότητα στα αμινογλυκοζιτικά αντιβιοτικά (Liu & Liebman 1996, Panopoulos et al. 2004). 5.2 Η υποκατάσταση C1057G Η βάση G1057 ανήκει στην έλικα 42 του 23S rrna (Πίνακας 2) για την οποία ωστόσο δεν υπάρχουν βιβλιογραφικές πληροφορίες μέχρι στιγμής για τυχόν εμπλοκή της στη ρύθμιση της μεταφραστικής πιστότητας. Ωστόσο, στην αντίστοιχη περιοχή στο 25S rrna της ζύμης υπάρχει κυτοσίνη αντί για γουανίνη, γεγονός που μαρτυρά ότι κατά την εξέλιξη πραγματοποιήθηκαν αλλαγές στην πρωτοταγή δομή του 25S rrna. 50

64 Εισαγωγή 6. Μεταλλάξεις σε εξωριβοσωματικά συστατικά που επηρεάζουν τη ριβοσωματική λειτουργία 6.1 Η μετάλλαξη sup45 του παράγοντα τερματισμού erf1 Όπως προαναφέρθηκε, ο ευκαρυωτικός παράγοντας τερματισμού erf1 κωδικοποιείται από το γονίδιο SUP45. Οι μεταλλάξεις στους παράγοντες τερματισμού έχουν ως αποτέλεσμα την προσπέλαση κατά τη μετάφραση- των μη νοηματικών κωδικίων (κωδικίων λήξης), ένα φαινόμενο που ορίζεται ως μη νοηματική καταστολή (Inge-Vechtomov et al. 1993). Η αντικατάσταση της κυτοσίνης από γουανίνη στη θέση 256 του γονιδίου SUP45 προκαλεί την υποκατάσταση της προλίνης από αλανίνη στην αμινοξική θέση 86 της περιοχής Ι της πολυπεπτιδικής αλυσίδας του erf1 (Velichutina et al. 2001). Η μετάλλαξη αυτή ονομάστηκε sup45 και βρέθηκε ότι προκαλεί επαρκή καταστολή των γενετικών δεικτών ade1-14 UGA και his7-1 UAA (Chernoff et al. 1996), δηλαδή καταστολή των κωδικίων λήξης UGA και UAA. Επί πλέον, η μετάλλαξη sup45 προκαλεί λάθη και κατά την ανάγνωση των νοηματικών κωδικίων, όπως διαπιστώθηκε από την αυξημένη συχνότητα λαθών που παρατηρήθηκε σε in vitro δοκιμασία μετάφρασης (Velichutina et al. 2000). 6.2 Η φωσφορυλίωση ως ρυθμιστής της μετάφρασης Η αντιστρεπτή φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών λειτουργεί ως ρυθμιστής πολλών κυτταρικών διαδικασιών, όπως της κυτταρικής διαίρεσης, του μεταβολισμού του γλυκογόνου, της μεταγραφής, της μετάφρασης, της μεταγωγής σήματος, της ωσμωτικής σταθερότητας κ.α (Cohen 1989). Τα επίπεδα φωσφορυλίωσης μιας πρωτεΐνης-στόχου καθορίζονται από τις ενεργότητες των κινασών που την φωσφορυλιώνουν και των φωσφατασών που την αποφωσφορυλιώνουν. Οι πρώτες ενδείξεις ότι αρκετοί μεταφραστικοί παράγοντες φωσφορυλιώνονται έγιναν γνωστές πριν τέσσερις δεκαετίες περίπου, όταν παρατηρήθηκε φωσφορυλίωση των 40S υπομονάδων (Kabat 1970, Loeb & Blat 1970). Από τότε μέχρι σήμερα, αρκετοί παράγοντες έναρξης και επιμήκυνσης καθώς και αμινοάκυλο-trna συνθετάσες έχουν προταθεί ως στόχοι φωσφορυλίωσης. Επί παραδείγματι, στη διαδικασία φωσφορυλίωσης/αποφωσφορυλίωσης υπόκεινται οι παράγοντες έναρξης eif2 (Rowlands et al. 1988), eif2b (Dholakia & Wahba 1988), eif4b (Dunkan & 51

65 Εισαγωγή Hershey 1987), eif4f (Rychlik et al. 1987, Morley & Traugh 1989) και πολλοί άλλοι, όπως επίσης οι παράγοντες επιμήκυνσης eef1 (Davydova et al. 1984, Janssen et al. 1988) και eef2 (Ryazanov 1987, Ryazanov et al. 1988). Επί πλέον, μεταξύ των φωσφοπρωτεϊνών συμπεριλαμβάνεται και η S6 (Palen & Traugh 1987). Τέλος, πολλές αμινοάκυλο-trna συνθετάσες, όπως της ασπαραγίνης, της γλουταμίνης, της γλυκίνης, της ιστιδίνης, της λυσίνης, της μεθειονίνης, της σερίνης και της θρεονίνης έχει βρεθεί ότι φωσφορυλιώνονται (Hershey 1989) Η φωσφατάση σερίνης/θρεονίνης SAL6 Οι φωσφατάσες σερίνης/θρεονίνης των θηλαστικών ταξινομούνται σε τέσσερις ομάδες τις PP1, PP2A, PP2B και PP2C με βασικό κριτήριο τις ενζυμικές τους ιδιότητες. Στη ζύμη, η φωσφατάση SAL6 μοιάζει αρκετά με τις PP1 φωσφατάσες σερίνης/θρεονίνης των θηλαστικών και ανιχνεύθηκε με βάση το ρόλο που διαδραματίζει στη ρύθμιση της μεταφραστικής πιστότητας (Vincent et al. 1994). Η συγκεκριμένη φωσφατάση κωδικοποιείται από το γονίδιο SAL6 το οποίο εντοπίζεται στο χρωμόσωμα XVI του σακχαρομύκητα Saccharomyces cerevisiae. Το πλαίσιο ανάγνωσης του γονιδίου έχει μήκος 1648 ζευγών βάσεων και κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 549 αμινοξέων με μοριακό βάρος 61,4 kd. To αμινοτελικό άκρο της SAL6 αποτελείται από 235 αμινοξέα και είναι πλούσιο σε κατάλοιπα σερίνης (57 κατάλοιπα σερίνης ή 24% επί του συνόλου των αμινοξέων του αμινοτελικού άκρου). Με τη βοήθεια του προγράμματος PROSITE του PCGENE (Bairoch 1991) ανιχνεύθηκαν 20 πιθανές θέσεις φωσφορυλίωσης καταλοίπων σερίνης και θρεονίνης σε αυτό το άκρο. Το καρβοξυτελικό άκρο της SAL6 παρουσιάζει ομολογία σε ποσοστό 62-63% σε σχέση με τις PP1 φωσφατάσες σερίνης/θρεονίνης των θηλαστικών. Επί πλέον, περιέχει και την καταλυτική περιοχή της φωσφατάσης. Με έκπληξη διαπιστώθηκε πως ενώ οι καταλυτικές περιοχές όλων των φωσφατασών σερίνης/θρεονίνης είναι όξινες, η περιοχή με την ενεργότητα φωσφατάσης της SAL6 είναι βασική (pi 9,78 για την αμινοξική περιοχή ). Στο Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας του Τμήματος Βιολογικών Επιστημών του Πανεπιστημίου Illinois στο Σικάγο (Καθηγήτρια Susan W. Liebman) κατασκευάστηκε η μετάλλαξη sal6-1 στο γονίδιο που κωδικοποιεί τη φωσφατάση SAL6. Ανάλυση της αλληλουχίας DNA της μετάλλαξη sal6-1 αποκάλυψε α) την αντικατάσταση ενός καταλοίπου γουανίνης προς θυμίνη, που προκαλεί την αντικατάσταση ενός κωδικίου 52

66 Εισαγωγή τρυπτοφάνης (TGG) προς λευκίνη (TTG) στην θέση του αμινοξέος 270 και β) την προσθήκη ενός καταλοίπου αδενίνης σε απόσταση τριών ζευγών βάσεων από την προαναφερθείσα αντικατάσταση και με κατεύθυνση το 3 άκρο. Η τελευταία ένθεση προκαλεί αλλαγή του πλαισίου ανάγνωσης (frameshift) του γονιδίου της SAL6 στη θέση 271, γεγονός που αντανακλά στην παρεμπόδιση της σύνθεσης της καταλυτικής περιοχής της φωσφατάσης χωρίς να υπάρχει επίδραση στη σύνθεση του αμινοτελικού της άκρου (Vincent et al. 1994). Η μετάλλαξη sal6-1 ενσωματώθηκε στη συνέχεια σε στέλεχος ζύμης φέροντα μια σημειακή μετάλλαξη στο γονίδιο SUP45 το οποίο κωδικοποιεί τον ευκαρυωτικό παράγοντα απελευθέρωσης erf1. Ας σημειωθεί πως η μετάλλαξη sup45 είναι μια ολοδύναμη κατασταλτική μετάλλαξη (omnipotent suppressor) που προκαλεί λάθος ανάγνωση των κωδικίων λήξης (stop codon readthrough) κατά τη μετάφραση δηλαδή τα κωδίκια λήξης αναγνωρίζονται ως νοηματικά. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα τη συνέχιση της διαδικασίας της μετάφρασης με συνέπεια το στέλεχος που φέρει τη μετάλλαξη sup45 να εμφανίζεται επιρρεπές σε λάθη κατά τη μετάφραση (Velichutina et al. 2000). H παρουσία της μετάλλαξης sal6-1 στο στέλεχος που φέρει τη μετάλλαξη sup45 ενίσχυσε περαιτέρω το κατασταλτικό χαρακτήρα της μετάλλαξης sup45, δηλαδή η μετάλλαξη sal6-1 συμπεριφέρεται ως επιρρεπής σε λάθη κατά τη μετάφραση. Επί πλέον, εμφανίζει και ευαισθησία έναντι της παρομομυκίνης (Vincent et al. 1994). Ο λόγος για τον οποίο η μετάλλαξη sal6-1 συνεκφράστηκε με τη μετάλλαξη sup45 έγκειται στο γεγονός ότι απουσία ολοδύναμων καταστολέων η μετάλλαξη sal6-1 δεν μπορεί να εκδηλώσει την κατασταλτική της ιδιότητα (Song & Liebman 1987). Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής μελετήθηκε η επίδραση της μετάλλαξης sal6-1, παρουσία της ολοδύναμης κατασταλτικής μετάλλαξης sup45, επί διαφόρων παραμέτρων της πρωτεϊνοσύνθεσης H αντικατασταλτική μετάλλαξη asu9-1 Η μετάλλαξη asu9-1 απομονώθηκε από κύτταρα ζύμης μαζί με άλλες πέντε μεταλλάξεις για τις οποίες βρέθηκε ότι ελαττώνουν την ικανότητα δυο ολοδύναμων κατασταλτικών μεταλλάξεων, των sup35 και sup45. Κάθε μια από αυτές τις έξι μεταλλάξεις διαπιστώθηκε ότι ανήκουν στον ίδιο γενετικό τόπο και για αυτό το λόγο πήραν την ονομασία asu9, διαχωρίστηκαν δε μεταξύ τους με αριθμούς δηλαδή από asu9-1 έως asu9-6 (Liebman & Cavenagh 1979). Οι asu9 μεταλλάξεις βρέθηκε ότι 53

67 Εισαγωγή είναι μερικώς επικρατείς κι ότι είναι ειδικές για τους ολοδύναμους καταστολείς, δηλαδή δεν έχουν καμία επίδραση επί των επικρατών καταστολέων των ειδικών για μόρια trna. Επί πλέον, η αντικατασταλτική τους δράση εκδηλώνεται μόνο παρουσία κατασταλτικών μεταλλάξεων. Πράγματι, παρουσία ορισμένων asu9 αλληλόμορφων η μετάλλαξη sup45 χάνει την ικανότητα της να καταστέλλει (δηλαδή να μην αναγνωρίζει) τα μη νοηματικά κωδίκια; το ίδιο συμβαίνει και με την επίσης κατασταλτική μετάλλαξη sup35. Επίσης, τα sup45 μεταλλαγμένα στελέχη που φέρουν και τη μετάλλαξη asu9 παρουσιάζουν μεγαλύτερη ανθεκτικότητα έναντι παρομομυκίνης, ενώ μεταλλαγμένα στελέχη που φέρουν μεμονωμένα τη sup45 ή την asu9 μετάλλαξη εμφανίζουν ευαισθησία στην παρομομυκίνη (Liebman & Cavenagh 1979). Ο μηχανισμός δράσης της μετάλλαξης asu9 παραμένει ακόμη και σήμερα άγνωστος. Ωστόσο, είχε προταθεί πως η εν λόγω μετάλλαξη μπορεί να συμμετέχει στην τροποποίηση, άμεση ή έμμεση, είτε μιας ριβοσωματικής πρωτεΐνης είτε ενός μεταφραστικού παράγοντα, επηρεάζοντας κατ αυτόν τον τρόπο τη ριβοσωματική λειτουργία. Η δεύτερη υπόθεση είναι και η πιο πιθανή αφού η κατασταλτική μετάλλαξη sup45 αφορά σε τροποποίηση του γονιδίου που κωδικοποιεί τον ευκαρυωτικό παράγοντα απελευθέρωσης erf1. Τέλος, ας σημειωθεί πως ένας άλλος αντικαταστολέας έχει απομονωθεί επίσης στη ζύμη. Ο ASU10 είναι επικρατής κι επιπλέον ελαττώνει τη δράση της κατασταλτικής μετάλλαξης sup35 (μετάλλαξη στο γονίδιο που κωδικοποιεί τον ευκαρυωτικό παράγοντα απελευθέρωσης erf3) ενώ δεν έχει καμία επίδραση επί της μετάλλαξης sup45 (Liebman et al. 1980). Ο μηχανισμός δράσης της ASU10 είναι άγνωστος, αν και πιστεύεται πως επηρεάζει τη ριβοσωματική λειτουργία όπως ακριβώς και η asu9. 7. H οξειδωτική ισορροπία του κυττάρου 7.1 Η παραγωγή των δραστικών ριζών οξυγόνου (ROS) Το οξυγόνο αποτελεί αδιαμφισβήτητα το πιο απαραίτητο συστατικό για τη ζωή. Η πλειοψηφία των ενδοκυτταρικών οξειδώσεων καταλήγει στη μεταφορά ενός ζεύγους ηλεκτρονίων σε κατάλληλα μόρια όπως είναι το NAD + ή/και το FAD, τα οποία στη συνέχεια οξειδώνονται από την αλυσίδα μεταφοράς ηλεκτρονίων. Η τελική αντίδραση αναγωγής του μοριακού οξυγόνου προς νερό καταλύεται από την οξειδάση του 54

68 Εισαγωγή κυτοχρώματος c, με τέτοιο τρόπο ώστε να μην παράγονται ενδιάμεσα μόρια κατά τη διαδικασία της οξείδωσης. Η ηλεκτρονική δομή του οξυγόνου, ωστόσο, επιτρέπει ορισμένες φορές την αναγωγή του με την προσθήκη ενός μόνο ηλεκτρονίου, γεγονός που οδηγεί στην παραγωγή των λεγόμενων ριζών οξυγόνου οι οποίες είναι επιβλαβείς για το κύτταρο. Οι δραστικές μορφές οξυγόνου (Reactive Oxygen Species) παράγονται στα μιτοχόνδρια και είναι οι ακόλουθες: το ανιόν του σουπεροξειδίου (Ο - 2 ), η υδρόξυλο ρίζα (ΟΗ ) και το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ). Από τα προαναφερθέντα ενδιάμεσα κατά τη διαδικασία αναγωγής του οξυγόνου προς νερό, η πιο τοξική μορφή είναι η υδρόξυλο ρίζα καθώς συμμετέχει σε αντιδράσεις όπως επί παραδείγματι στην υπεροξείδωση των λιπιδίων και στην παραγωγή άλλων τοξικών ριζών. Όπως προαναφέρθηκε, ένας μικρός αριθμός τοξικών ριζών οξυγόνου παράγεται ως αποτέλεσμα «δυσλειτουργίας» της μιτοχονδριακής αλυσίδας μεταφοράς ηλεκτρονίων. Ωστόσο, τοξικές ρίζες οξυγόνου παράγονται κι από άλλες πηγές. Τα υπεροξυσωμάτια παράγουν την υδρόξυλο ρίζα κατά την οξείδωση λιπαρών οξέων και άλλων μορίων. Το κυτόχρωμα Ρ450 που εντοπίζεται στο ενδοπλασματικό δίκτυο παράγει, επίσης, τοξικές ρίζες οξυγόνου. Τα φαγοκύτταρα του οργανισμού εκκρίνουν ρίζες οξυγόνου για να καταπολεμήσουν παθογόνα βακτήρια. Σε περιπτώσεις παρατεταμένης μόλυνσης, ο θάνατος των φαγοκυττάρων έχει ως αποτέλεσμα την απελευθέρωση των τοξικών ριζών οξυγόνου στο κυτταρόπλασμα. Επί πλέον, η κοσμική ακτινοβολία, η κατάποση χημικών και ναρκωτικών όπως επίσης και η περιβαλλοντική ρύπανση μπορούν να οδηγήσουν στο σχηματισμό δραστικών ριζών οξυγόνου. 7.2 Η κυτταρική άμυνα έναντι των δραστικών ριζών οξυγόνου Οι δραστικές ρίζες οξυγόνου προκαλούν βλάβες σε πολλές κατηγορίες μακρομορίων όπως τα λιπίδια, τα νουκλεϊνικά οξέα και οι πρωτεΐνες. Τα φωσφολιπίδια υπόκεινται στην υπεροξείδωση των λιπιδίων. Η απομάκρυνση ατόμου υδρογόνου ενός πολυακόρεστου λιπαρού οξέος από την υδρόξυλο ρίζα οδηγεί στο σχηματισμό ριζών λιπιδίων. Τα τελευταία αντιδρούν με το μοριακό οξυγόνο και σχηματίζουν τις λιπιδικές υπερόξυλο-ρίζες, υπεροξείδια λιπιδίων και μαλονική διαλδεϋδη η οποία είναι υδατοδιαλυτή και ανιχνεύεται στο αίμα. Ένα παράδειγμα υπεροξείδωσης των λιπιδίων στους ανθρώπους αποτελούν τα καφέ στίγματα που παρατηρούνται στα χέρια των ηλικιωμένων. Επίσης, πολλά αμινοξέα όπως η προλίνη, η ιστιδίνη, η αργινίνη, η κυστεϊνη και η μεθειονίνη είναι ευάλωτες και προσβάλλονται από την υδρόξυλο-ρίζα. 55

69 Εισαγωγή Αποτέλεσμα αυτών των τροποποιήσεων είναι είτε η κατάτμηση των πρωτεϊνών είτε η δημιουργία πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων. Τέλος, τόσο το πυρηνικό όσο και το μιτοχονδριακό DNA μπορούν να καταστραφούν από τις δραστικές ρίζες οξυγόνου. Οι τελευταίες προσβάλλουν μεμονωμένες βάσεις και προκαλούν σπάσιμο των κλώνων. Μάλιστα, το μιτοχοδριακό DNA είναι πιο ευάλωτο στη δράση των ελευθέρων ριζών καθώς το μιτοχόνδριο αποτελεί τη κύρια πηγή παραγωγής ριζών οξυγόνου. Το αποτέλεσμα αυτής της δράσης αντικατοπτρίζεται στην ικανότητα παραγωγής ενέργειας από το κύτταρο. Η προσβολή του πυρηνικού DNA είναι πιο σπάνια καθώς προστατεύεται από τις ιστόνες κι επιπλέον διαθέτει μηχανισμούς επιδιόρθωσης. Πειράματα που πραγματοποιήθηκαν σε ευκαρυωτικούς οργανισμούς όπως στην Drosophila melanogaster (Yan et al. 1998), αλλά και σε προκαρυωτικούς όπως στο εντεροβακτήριο E. coli, έδειξαν ότι στόχοι των οξειδωτικών τροποποιήσεων αποτελούν ένζυμα του κύκλου του Κrebs, η παγκόσμια πρωτεΐνη του στρες uspa η οποία μειώνει την κυτταρική ανάπτυξη σε περιοριστικά θρεπτικά μέσα, προκαλεί ποιοτικές μεταβολές της πρωτεϊνοσύνθεσης και αλλαγή του ισοηλεκτρικού συμείου ορισμένων πρωτεϊνών (Nystrom & Neidhardt 1992, 1994, 1996), οι συνοδοί-πρωτεΐνες (chaperones), οι παράγοντες επιμήκυνσης της μετάφρασης και οι πρωτεΐνες τύπου ιστονών (Dukan & Nystrom 1998, 1999). Τα κύτταρα όμως διαθέτουν μηχανισμούς θωράκισης τους έναντι των δραστικών ριζών οξυγόνου. Τα θηλαστικά διαθέτουν τρεις ισομορφές της δισμουτάσης του σουπεροξειδίου κατανεμημένες σε διαφορετικά κυτταρικά διαμερίσματα- με τις οποίες καταλύουν τη μετατροπή του σουπεροξειδίου στο λιγότερο τοξικό υπεροξείδιο του υδρογόνου. Το υπεροξείδιο του υδρογόνου με τη σειρά του απομακρύνεται με τη δράση της καταλάσης η οποία βρίσκεται σε υψηλές συγκεντρώσεις στα υπεροξυσώματια και σε μικρότερες στα μιτοχόνδρια και στο κυτταρόπλασμα. Η υπεροξειδάση της γλουταθειόνης καταλύει την αναγωγή του υπεροξειδίου του υδρογόνου και των υπεροξειδίων των λιπιδίων. Η αναγωγάση της γλουταθειόνης μετατρέπει τα δισουλφίδια της γλουταθειόνης (GSSG) σε μονομερή (GSH) χρησιμοποιώντας το NADPH ως δότη ηλεκτρονίων. Τέλος, η προστασία έναντι των δραστικών ριζών οξυγόνου επιτυγχάνεται με τη δράση πρωτεϊνών-καταστροφέων, των βιταμινών C και E, με το β-καροτένιο (Temple et al. 2005) αλλά και άλλων μεταβολιτών (π.χ. ουρικό οξύ). 56

70 Εισαγωγή 7.3 Η υπόθεση του «μεταβολικού ρυθμού» Η προοδευτική μείωση των λειτουργικών ικανοτήτων των γερασμένων κυττάρων ή/και οργανισμών, είναι απόρροια της παραγωγής ελευθέρων ριζών μέσω φυσιολογικών αντιδράσεων του κυτταρικού μεταβολισμού (Stadtman 1992, Sohal et al. 1993). Όλοι οι αερόβιοι οργανισμοί εκτίθενται στις δραστικές μορφές οξυγόνου, αποτέλεσμα της δράσης των οποίων είναι η αύξηση των οξειδωτικών τροποποιήσεων των μακρομορίων τους που οδηγεί στο κυτταρικό θάνατο (Harman 1956). Πειραματικά ευρήματα οδήγησαν στο συμπέρασμα πως τα επίπεδα των οξειδωτικά τροποποιημένων μορίων αυξάνονται με την ηλικία (Rosenberger 1991, Gracy et al. 1985), καθώς επίσης και ότι η διάρκεια ζωής των οργανισμών μπορεί να παραταθεί εάν ενισχυθεί η παραγωγή αντιοξειδωτικών μορίων (Stadtman 1992, Sohal et al. 1993, Orr & Sohal 1994, Parkes et al. 1998, Murakami 1998, Lin 1998). Οι προσπάθειες που κατεβλήθησαν προκειμένου να τεκμηριωθεί η σχέση μεταξύ της οξείδωσης των γερασμένων κυττάρων και της εξασθενημένης ενεργότητας των μηχανισμών άμυνας και επιδιόρθωσης αυτών, δεν βρήκαν πρόσφορο έδαφος λόγω αντικρουόμενων αποτελεσμάτων. Π.χ., οι καταλάσες έδειξαν μια ιστο-εξαρτώμενη τάση ρύθμισης των επιπέδων της συγκέντρωσης τους (Sohal et al. 1995), ενώ τα επίπεδα ορισμένων πρωτεϊνών των μηχανισμών αντιοξειδωτικής άμυνας έδειξαν να αυξάνονται και άλλων να ελαττώνονται με την ηλικία, ακόμα και μέσα στον ίδιο ιστό (Ji et al. 1990). Μια πιθανή εξήγηση στην οποία φαίνεται να συγκλίνουν οι περισσότεροι από τους ερευνητές που ασχολούνται με αυτό το ερευνητικό αντικείμενο, είναι ότι πρέπει να υπάρχει μια σχέση μεταξύ κυτταρικού μεταβολισμού και διάρκειας ζωής. Έτσι, αναπτύχθηκε η υπόθεση του «μεταβολικού ρυθμού» (Dukan & Nystrom 1999). Ο ρυθμός του κυτταρικού μεταβολισμού συνδέεται άρρηκτα με το ρυθμό παραγωγής και κατανάλωσης ενέργειας. Έτσι αυξημένος ρυθμός μεταβολισμού συνεπάγεται μεγάλη κατανάλωση ενέργειας. Ο ρυθμός της κατανάλωσης της ενέργειας καθορίζει ως κάποιο βαθμό και τη διαδικασία της κυτταρικής γήρανσης (Sohal 1976). Με αυτόν τον τρόπο, σε κύτταρα που παρουσιάζουν αυξημένο ρυθμό κυτταρικής αναπνοής (άρα και κατανάλωσης ενέργειας), παρατηρείται επιτάχυνση της διαδικασίας της γήρανσης λόγω αυξημένης παραγωγής δραστικών ριζών οξυγόνου. Η παραγωγή των τελευταίων συντελεί στην αύξηση των οξειδωτικών τροποποιήσεων, στις οποίες περιλαμβάνονται 57

71 Εισαγωγή μεταξύ άλλων η καρβονυλίωση των πρωτεϊνών και ο σχηματισμός δισουλφιδικών δεσμών (Dukan & Nystrom 1998). Τέλος, ας σημειωθεί ότι η γήρανση κατά μια εκδοχή ορίζεται ως η περίοδος που εκτείνεται χρονικά πέρα από το τέλος της ουσιώδους διάρκειας της ζωής (Rattan 2005). Ως ουσιώδης διάρκεια ζωής (ELS, essential lifespan) ορίζεται το χρονικό διάστημα μέσα στο οποίο κάθε οργανισμός εκπληρώνει το σκοπό της ύπαρξης του που δεν είναι άλλος από τη διαιώνιση του είδους του σύμφωνα με το Δαρβίνο (Rattan 2000). Έτσι, είδη στα οποία παρατηρείται γρήγορη ωρίμανση, πρώιμη αναπαραγωγική δραστηριότητα και υψηλό αναπαραγωγικό δυναμικό (όπως π.χ. συμβαίνει στη Drosophila) παρουσιάζουν μικρή ουσιώδη διάρκεια ζωής. Αντίθετα, είδη στα οποία παρατηρείται αργή ωρίμανση, όψιμη αναπαραγωγική δραστηριότητα και χαμηλό αναπαραγωγικό δυναμικό (όπως π.χ. συμβαίνει στον άνθρωπο) παρουσιάζουν μεγάλη ουσιώδη διάρκεια ζωής. 7.4 Μεταφραστική πιστότητα και οξειδωτικές τροποποιήσεις Η συσχέτιση της οξειδωτικής κατάστασης του κυττάρου με τον κυτταρικό μεταβολισμό και τη διαδικασία της μετάφρασης, παρουσιάζεται συνοπτικά στην Εικόνα 19. Μέσω της διαδικασίας της κυτταρικής αναπνοής είναι πιθανή η παραγωγή δραστικών ριζών οξυγόνου, οι οποίες μετατρέπονται στη δραστική μεν αλλά λιγότερο τοξική μορφή του υπεροξειδίου του υδρογόνου. Επίσης, κατά τη μετάφραση παράγονται τόσο οι λειτουργικές πρωτεΐνες όσο και ένας αριθμός μη λειτουργικών πρωτεϊνών. Οι τελευταίες έχουν μεγάλη πιθανότητα να υποστούν τροποποιήσεις παρουσία των δραστικών ριζών οξυγόνου και έτσι να καταστούν τοξικές για το κύτταρο. Το κύτταρο, ωστόσο, απαλλάσεται από τις οξειδωτικά τροποποιημένες πρωτεΐνες οι οποίες οδηγούνται προς αποικοδόμηση μέσω πρωτεόλυσης. Όσο αυξάνεται η ηλικία του κυττάρου, όμως, παρατηρείται εξασθένηση των μηχανισμών άμυνας και επιδιόρθωσης, όπως έχει ήδη αναφερθεί. Τελευταία, κερδίζει ολοένα και περισσότερο έδαφος η υπόθεση πως η αύξηση των οξειδώσεων των πρωτεϊνών από δραστικές ρίζες οξυγόνου, οφείλεται στην δομή των ίδιων των πρωτεϊνών. Πρόκειται για την πρώτη απόπειρα συσχέτισης της πιστότητας κατά την διαδικασία της μετάφρασης με την αύξηση των οξειδωτικών τροποποιήσεων. Είναι αποδεκτό πως η ελάττωση της μεταφραστικής πιστότητας οδηγεί στην παραγωγή είτε λάθος πτυχωμένων είτε λάθος μεταφρασμένων (με διαφορετική 58

72 Εισαγωγή αλληλουχία από την αναμενόμενη) πρωτεϊνών, οι οποίες καθίσταται πιο επιρρεπείς στην οξείδωση. Δεδομένου ότι, αυξανομένης της ηλικίας παρατηρείται ελάττωση της μεταφραστικής πιστότητας αυξάνονται τα επίπεδα των μη φυσιολογικών πρωτεϊνών και επομένως αυξάνονται οι πιθανότητες οξειδωτικής τροποποίησής τους. Αναπνοή 1 2 ROS H 2 O + O 2 Μετάφραση 4 P N /P A P A ΑΑ 3 Εικόνα 19. Σχηματική αναπαράσταση των αντιδράσεων που εμπλέκονται στην αύξηση των οξειδωτικών τροποποιήσεων κατά την γήρανση των κυττάρων. 1. Η κυτταρική αναπνοή παράγει δραστικές ρίζες οξυγόνου, 2. Οι μηχανισμοί αντιοξειδωτικής άμυνας των κυττάρων μετατρέπουν τις δραστικές ρίζες σε νερό και οξυγόνο, μέσω της δράσης ενζύμων όπως οι καταλάσες, οι δισμουτάσες και οι περοξειδάσες, 3. Η πρωτεολυτική μηχανή του κυττάρου ενεργοποιείται και αποικοδομεί τις οξειδωτικά τροποποιημένες πρωτεΐνες (P A ), που έχουν προκύψει λόγω της αύξησης των δραστικών ελευθέρων ριζών, σε ελεύθερα αμινοξέα, 4. Η πρωτεϊνοσυνθετική μηχανή παράγει ένα αριθμό φυσιολογικών πρωτεϊνών (P N ) και ένα αριθμό μη λειτουργικών πρωτεϊνών (P A ), οι πληθυσμοί των οποίων βρίσκονται σε μια ισορροπία. Οι μη φυσιολογικές πρωτεΐνες είναι περισσότερο ευάλωτες στις οξειδωτικές τροποποιήσεις. Σχετικά πρόσφατα βρέθηκε ότι στελέχη E. coli με μεταλλαγμένα ριβοσώματα που επιτελούν τη μετάφραση με υψηλή πιστότητα παρουσιάζουν δραστική ελάττωση των επιπέδων της πρωτεϊνικής οξείδωσης ενώ στελέχη με μεταλλαγμένα ριβοσώματα που είναι επιρρεπή σε λάθη κατά τη μετάφραση παρουσιάζουν αύξηση των επιπέδων της πρωτεϊνικής οξείδωσης (Ballesteros et al. 2001). Ωστόσο, οι ίδιοι ερευνητές άφησαν ανοιχτό το ενδεχόμενο η πρωτεϊνική οξείδωση να σχετίζεται με τους αυξημένους ρυθμούς επιμήκυνσης κι όχι με τη μεταφραστική πιστότητα. Επίσης, κύτταρα ζύμης τα 59

73 Εισαγωγή οποία αναπτύχθηκαν παρουσία υπεροξειδίου του υδρογόνου παρουσίασαν αναστολή της έναρξης της μετάφρασης (Shenton et al. 2006). Η αναστολή αυτή βρέθηκε να σχετίζεται άμεσα με την φωσφορυλίωση της α-υπομονάδας του eif-2 από την κινάση Gcn2. Επί πλέον, το υπεροξείδιο του υδρογόνου προκάλεσε ελάττωση του ρυθμού της ροής των ριβοσωμάτων, υποδηλώνοντας την επίδραση του στις διαδικασίες επιμήκυνσης και τερματισμού της μετάφρασης. 8. Ο σακχαρομύκητας Saccharomyces cerevisiae ως πειραματικό σύστημα Ως πειραματικό σύστημα στην παρούσα διατριβή χρησιμοποιήθηκε ο ευκαρυωτικός μονοκύτταρος μικροοργανισμός Saccharomyces cerevisiae (ζυμομύκητας). Είναι ένας οργανισμός με εύκολη και ταχεία ανάπτυξη, έχει γνωστή γενετική και έχει αναλυθεί βιοχημικά. Πολλά από τα γονίδια του S. cerevisiae που κωδικοποιούν τις ριβοσωματικές πρωτεΐνες, το ριβοσωματικό RNA και τους διαλυτούς πρωτεϊνικούς παράγοντες της πρωτεϊνοσύνθεσης έχουν κλωνοποιηθεί επιτρέποντας τη χρήση αυτού ως κατάλληλου εργαλείου μελέτης της διαδικασίας της μετάφρασης. Επίσης έχουν αναπτυχθεί in vitro συστήματα μετάφρασης ελεύθερα κυττάρων, ενώ έχουν απομονωθεί στελέχη που φέρουν μεταλλάξεις ή/και απαλείψεις σε γονίδια που κωδικοποιούν είτε ριβοσωματικές πρωτεΐνες είτε ριβοσωματικό RNA. Εκτός από τα προαναφερθέντα πλεονεκτήματα, πολλά από τα γονίδια που κωδικοποιούν για ριβοσωματικές πρωτεΐνες, κυρίως, παρουσιάζουν ομοιότητα η οποία ξεπερνάει το 80%, με τα αντίστοιχα γονίδια των θηλαστικών και του ανθρώπου. Επομένως, είναι αρκετά πιθανό τα συμπεράσματα που προκύπτουν από τις μελέτες στο ζυμομύκητα να ισχύουν και για τα ριβοσώματα των θηλαστικών. 60

74 Σκοπός

75 Σκοπός Ο σκοπός της παρούσας διατριβής εστιάζεται στη διερεύνηση πρωτίστως της λειτουργίας και δευτερευόντως της δομής του ευκαρυωτικού ριβοσώματος. Πιο συγκεκριμένα, ερευνά τις πιο σημαντικές λειτουργίες του ριβοσώματος, όπως είναι η πιστή αποκωδικοποίηση της γενετικής πληροφορίας, η ικανότητα κατάλυσης του σχηματισμού πεπτιδικού δεσμού, αλλά και η μετατόπιση του πεπτιδυλο-trna από την Α στην Ρ ριβοσωματική περιοχή έτσι ώστε να μπορεί να επιμηκυνθεί η πολυπεπτιδική αλυσίδα. Η αποκωδικοποίηση της γενετικής πληροφορίας αποτελεί κύρια ευθύνη της μικρής ριβοσωματικής υπομονάδας, ενώ η κατάλυση του σχηματισμού πεπτιδικού δεσμού αποτελεί κύρια ενεργότητα της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας. Και στις δυο λειτουργίες τον πρωτεύοντα ρόλο διαδραματίζει το ριβοσωματικό RNA της μικρής ή της μεγάλης υπομονάδας του ριβοσώματος, αντίστοιχα. Η συμμετοχή ορισμένων πρωτεϊνών των δυο υπομονάδων στις δυο αυτές λειτουργίες αποσκοπεί στην βελτιστοποίηση της δράσης του ριβοσωματικού RNA μέσω της ειδικής διαμόρφωσης που λαμβάνει το τελευταίο κατά τη διαδικασία της μετάφρασης. Για την βέλτιστη ριβοσωματική λειτουργία είναι απαραίτητη η συμμετοχή στοιχείων και των δυο υπομονάδων. Επίσης, στοιχεία της μιας υπομονάδας ενδέχεται να συνεισφέρουν στη ρύθμιση της λειτουργίας της άλλης υπομονάδας. Οι παρατηρήσεις αυτές, αναμφίβολα, θεμελιώνουν την κοινώς αποδεκτή άποψη της θεώρησης του ριβοσώματος ως ενός «ενιαίου συνόλου». Ως πειραματικό εργαλείο στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε ο μονοκύτταρος ευκαρυωτικός μικροοργανισμός Saccharomyces cerevisiae λόγω των πολλών πλεονεκτημάτων που προσφέρει η επιλογή του. Πρώτον, είναι ένας οργανισμός με σχετικά εύκολη ανάπτυξη που έχει μελετηθεί και αναλυθεί τόσο γενετικά όσο και βιοχημικά. Και δεύτερον, τα συμπεράσματα που εξάγονται από μελέτες σε αυτόν τον οργανισμό ενδέχεται να ισχύουν και για άλλους πολυκύτταρους οργανισμούς, ακόμα δε και για τον άνθρωπο, αφού υπάρχει υψηλή ομολογία, που σε ορισμένες περιπτώσεις φθάνει το 80%, των γονιδίων των ριβοσωματικών πρωτεϊνών και του ριβοσωματικού RNA μεταξύ Saccharomyces cerevisiae και θηλαστικών. Το αντικείμενο της έρευνας στην παρούσα διατριβή μπορεί να χωριστεί σε τρεις διακριτές ενότητες: α) στην πρώτη ενότητα εξετάζεται η επίδραση ορισμένων εξωριβοσωματικών συστατικών επί χαρακτηριστικών παραμέτρων της μετάφρασης. Πρόκειται για την πρώτη απόπειρα που γίνεται προκειμένου να διερευνηθεί αν οι σημαντικότερες 63

76 Σκοπός λειτουργίες του ριβοσώματος, όπως είναι η αποκωδικοποίηση της γενετικής πληροφορίας, η κατάλυση του σχηματισμού πεπτιδικού δεσμού και η μετατόπιση από την Α στην Ρ ριβοσωματική περιοχή επηρεάζονται και από μη ριβοσωματικά συστατικά ή μόρια. Είναι γνωστό πως οι παραπάνω λειτουργίες διεκπεραιώνονται κυρίως από το rrna και δευτερευόντως από τις ριβοσωματικές πρωτεΐνες. Στην παρούσα εργασία, εξετάζεται η επίδραση μιας εξωριβοσωματικής διπλής μετάλλαξης, της sal6, επί του γονιδίου που κωδικοποιεί την φωσφατάση σερίνης/θρεονίνης SAL6. Είναι γνωστό ότι πολλές κινάσες και φωσφατάσες συμμετέχουν στη ρύθμιση κυτταρικών διεργασιών και μεταξύ αυτών συμπεριλαμβάνεται και η μετάφραση. Επιπλέον, έχει ήδη προταθεί ότι η φωσφατάση σερίνης/θρεονίνης SAL6 επηρεάζει τη διαδικασία της μετάφρασης ρυθμίζοντας τα επίπεδα φωσφορυλίωσης του στόχου ή των στόχων της. Παρουσιάζει συνεπώς μεγάλο ενδιαφέρον η πιθανότητα έμμεσης εμπλοκής της φωσφατάσης αυτής στη διαδικασία της μετάφρασης, όπως αυτή ελέγχεται και για ριβοσωματικές μεταλλάξεις στο Εργαστήριο μας με μια σειρά in vivo και in vitro δοκιμασιών. Ας σημειωθεί, ότι η μετάλλαξη sal6 μελετήθηκε σε συνδυασμό με δυο ακόμη μεταλλάξεις, την asu9 και την sup45. Η asu9 φαίνεται να επηρεάζει και αυτή με τη σειρά της κάποιες ριβοσωματικές λειτουργίες. Η sup45 είναι μια ολοδύναμη κατασταλτική μετάλλαξη επί του γονιδίου που κωδικοποιεί τον ευκαρυωτικό παράγοντα τερματισμού της πρωτεϊνοσύνθεσης erf1. Η παρουσία της μετάλλαξης sup45 είναι απαραίτητη για την εκδήλωση δράσης εκ μέρους των μεταλλάξεων sal6 και asu9. Οι παράμετροι για τις οποίες εξετάστηκε η επίδραση των παραπάνω μεταλλάξεων είναι οι ακόλουθοι : i. Η πιστότητα της μετάφρασης, η οποία υπολογίζεται με τη συχνότητα λάθους (E.F) in vitro ii. Η επίδραση ορισμένων αμινογλυκοζιτικών αντιβιοτικών, κυρίως της παρομομυκίνης, επί της κυτταρικής ανάπτυξης in vivo, και επί της πιστότητας της μετάφρασης in vitro iii. Η πρωτεϊνοσυνθετική ικανότητα των στελεχών που φέρουν τις μεταλλάξεις iv. Η ικανότητα πρόσδεσης των αμινοακυλο-trna και πεπτιδυλο-trna, στις περιοχές Α και Ρ του ριβοσώματος, αντίστοιχα 64

77 Σκοπός v. Η καταλυτική ενεργότητα της πεπτιδυλοτρανσφεράσης, η οποία αντικατοπτρίζει την ικανότητα της κατάλυσης του σχηματισμού πεπτιδικού δεσμού vi. Η επίδραση ορισμένων γλουταριμιδικών αντιβιοτικών, κυρίως του αναστολέα του σταδίου της μετατόπισης κυκλοεξιμιδίου, επί της κυτταρικής ανάπτυξης in vivo και επί της ικανότητας της πρωτεϊνοσύνθεσης in vitro vii. Η εξάρτηση της μετατόπισης του πεπτιδυλο-trna από την Α στην Ρ ριβοσωματική περιοχή από την συγκέντρωση των διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων και του κυκλοεξιμιδίου viii. Η ικανότητα συγκρότησης των ριβοσωματικών υπομονάδων, των ακέραιων ριβοσωμάτων και των πολυσωμάτων. β) στην δεύτερη ενότητα εξετάζεται η επίδραση μονοσημειακών μεταλλάξεων του 18S rrna της μικρής και του 25S rrna της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας του ζυμομύκητα επί χαρακτηριστικών παραμέτρων της μετάφρασης, όπως επί της αποκωδικοποίησης, επί της καταλυτικής ενεργότητας του ριβοσώματος και επί της μετατόπισης του πεπτιδυλο-trna. Οι μεταλλάξεις αυτές είναι ανάλογες προς τις μεταλλάξεις που αρχικά κατασκευάστηκαν και μελετήθηκαν στον προκαρυωτικό μικροοργανισμό Escherichia coli, για ευνόητους δε λόγους έχει υιοθετηθεί η ονοματολογία και η αριθμολογία αυτού του μικροοργανισμού και στην παρούσα μελέτη. Οι μεταλλάξεις στο rrna των δυο υπομονάδων αφορούν τις παρακάτω υποκαταστάσεις: i. την αντικατάσταση C310 G στην έλικα 12 του 18S rrna, ii. την μετάπτωση G517 A στην θηλιά 530 της έλικας 18 του 18S rrna. Στο Escherichia coli, η εν λόγω μετάλλαξη προκαλεί καταστολή των μη νοηματικών κωδικίων, iii. την μεταστροφή C526 A στην θηλιά 530 του 18S rrna, iv. την μεταστροφή C1054 A και την μετάπτωση C1054 U της έλικας 34 του 18S rrna. Στο Escherichia coli, η υποκατάσταση C1054 A προκαλεί καταστολή των μη νοηματικών κωδικίων ενώ η μετάλλαξη C1054 U δεν προκαλεί ούτε καταστολή ούτε αντικαταστολή των μη νοηματικών κωδικίων, v. την υποκατάσταση C1206 G της έλικας 34 του 18S rrna, 65

78 Σκοπός vi. την υποκατάσταση C1057 G της έλικας 42 του 25S rrna. γ) στην τρίτη ενότητα εξετάζεται η επίδραση ορισμένων ριβοσωματικών συστατικών, κυρίως του rrna, επί της οξειδωτικής ισορροπίας του ευκαρυωτικού κυττάρου. Πιο συγκεκριμένα, διερευνάται η πιθανότητα συσχέτισης της μεταφραστικής πιστότητας με την οξειδωτική κατάσταση του ευκαρυωτικού κυττάρου. Το σκεπτικό στο οποίο βασίστηκε η ανάπτυξη της έρευνας προς αυτή την κατεύθυνση έχει ως εξής : Ορισμένες από τις υπό μελέτη μεταλλάξεις επηρεάζουν την πιστότητα της μετάφρασης. Μεταβολή της μεταφραστικής πιστότητας σε επίπεδα διαφορετικά από τα φυσιολογικά παρατηρείται και σε ορισμένες στρεσογόνες καταστάσεις που επηρεάζουν την οξειδωτική ισορροπία του κυττάρου όπως είναι η γήρανση, ορισμένες ασθένειες κλπ. Για τη διερεύνηση της παραπάνω υπόθεσης προσδιορίστηκαν χαρακτηριστικοί δείκτες οξειδωτικού στρες και οξειδωτικής προστασίας σε συνεργασία με το Εργαστήριο Βιοχημείας του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών. 66

79 Υλικά και Μέθοδοι

80 Υλικά και Μέθοδοι 1. Υλικά Όλα τα υλικά που χρησιμοποιήθηκαν ήταν καθαρότητας αναλυτικού βαθμού και ήταν τα ακόλουθα : Α Άγαρ (agar, japanese grade) από Sigma Αδενοσίνη 5 τριφωσφορική (μετά νατρίου άλας) [ATP, adenosine triphosphate, sodium salt] από Sigma Αιθανόλη (ethanol) 98% από Merck Αιθυλενογλυκόλη (ethylenglycol) από Merck Αμινοξέα (μεθειονίνη, λευκίνη, φαινυλαλανίνη, τρυπτοφάνη, ιστιδίνη, κ.α) από Serva Αμπικιλλίνη (ampicillin) από Sigma Β Βουτυλιωμένη υδροξυανισόλη (BHA, Butylated Hydroxyl Anisol) Βόειος αλβουμίνη (BSA, Bovine Serum Albumine) Γ Γουανοσίνη 5 τριφωσφορική (μετά νατρίου άλας) [GTP, guanosine triphosphate, sodium salt] από Sigma Γλυκερόλη (glycerol) από Merck Γυάλινα σφαιρίδια (glass beads) διαμέτρου 0,45-0,65 mm από Sigma Δ Διάλυμα Bradford από Sigma Διθειοθρεϊτόλη (DTT) από Serva Διοξάνιο (dioxanne) από Carlo Erba Διϋδροχλωρική πουρομυκίνη (puromycin dihydrochloride) από Sigma Ε Εκχύλισμα ζύμης (yeast extract) από Serva Ζ Zwittergent 3-12 [3(Ν-δωδεκυλο-Ν, Ν διμέθυλο-αμμώνιο)-1-σουλφονυλοπροπάνιο] από Calbiochem 69

81 Υλικά και Μέθοδοι Η Ηπαρίνη (heparin sulfate) από Sigma Hepes [N-(2-hydroxyethyl) piperazine-n -(2-ethanesulfonic acid)] από Serva Κ Κυκλοεξιμίδιο (cycloheximide) από Serva Κινάση της φωσφορικής κρετίνης (CPK, phosphocreatine kinase) από Sigma Μ Μαννιτόλη (mannitol) από Serva Μεθανόλη (methanol) από Merck β-μερκαπτοαιθανόλη (β-mercaptoethanol) από Serva Μεμβράνες διαπίδυσης από Serva Μονόϋδρη γλυκόζη (D-glucose monohydrate) από Merck Ν Νατραζίδιο (natrium azide) από Merck Ναφθαλένιο (naphthalene) από Merck Ο Οξικό κάλιο (potassium acetate) από Merck Οξικό μαγνήσιο (magnesium acetate) από Merck Οξικό οξύ (acetic acid) από Carlo Erba Οξικός αιθυλεστέρας από Carlo Erba Οξικός ανυδρίτης από Carlo Erba Όξινο ανθρακικό νάτριο (sodium hydrogen carbonate) από Merck Π, P Πεπτόνη (peptone from meat, pancreatic) από Serva Παρομομυκίνη θειική (paromomycin sulfate) από Sigma PPO (2,5-διφαινυλο-οξαζόλιο) από Serva POPOP [1,4 bis 2-(5-φαινυλο-οξαζολυλο) βενζόλιο από Serva Πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG) από Merck Ρ, R Ραδιενεργός λευκίνη, L-[4,5-H 3 ]Leucine ( Ci/mmol) από Amersham 70

82 Υλικά και Μέθοδοι Ραδιενεργός φαινυλαλανίνη, L-[2,3,4,5,6-H 3 ]Phenylalanine ( Ci/mmol) από Amersham Σ, S Σακχαρόζη (sucrose) από Applichem Σπερμιδίνη (spermidine) από Sigma Σπερμίνη (spermine) από Sigma Στρεπτομυκίνη (streptomycin) από Sigma Sephadex G-10 από Amersham Τ Τριχλωροξικό οξύ (TCA, trichloroacetic acid) από Merck trna ζύμης (yeast trna) από Sigma Tris αμινο-μεθάνιο (Tris-aminomethane) από Merck Υ Υγρό σπινθηρισμού Optifluor από Perkin Elmer Υγρό σπινθηρισμού Safefluor από Lumac-LSc Υδροχλωρικό οξύ (hydrochloric acid) από Merck Υδροξείδιο του καλίου (ΚΟΗ, potassium hydroxide) από Merck Υδροξείδιο του νατρίου (NaOH, sodium hydroxide) από Merck Φ Φαινόλη (phenol) από Sigma Φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο (PMSF, Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride) από Sigma Φίλτρα νιτρικής κυτταρίνης (τύπος ΗΑ, διαμέτρου 24mm, μέγεθος πόρων 0,45μΜ) από Millipore Corporation Φωσφορική κρεατίνη (CP, phosphocreatine) από Sigma Χ Χλωριούχο αμμώνιο (ammonium chloride)από Merck Χλωριούχο κάλιο (potassium chloride) από Merck Χλωριούχο μαγνήσιο (magnesium chloride) από Merck Χλωριούχο νάτριο (sodium chloride) από Merck 71

83 Υλικά και Μέθοδοι 2. Μέθοδοι 2.1 Καλλιέργεια και συντήρηση των κυττάρων του Saccharomyces cerevisiae Καλλιέργεια των κυττάρων του Saccharomyces cerevisiae Όλες οι καλλιέργειες των κυττάρων ζύμης πραγματοποιήθηκαν στους 30 ºC σε θρεπτικό μέσο που περιέχει τα παρακάτω συστατικά στις εξής αναλογίες: Εκχύλισμα ζύμης (yeast extract) 1% Πεπτόνη (peptone from meat) 2% Μονόϋδρη D-γλυκόζη (D-glucose monohydrate) 2% Άγαρ (agar) * 2% * Το άγαρ χρησιμοποιείται για την παρασκευή στερεών θρεπτικών μέσων. Το υγρό θρεπτικό υλικό συμβολίζεται χάριν συντομίας ως YPD (από τα αρχικά των Yeast extract, Peptone, D-glucose) ενώ το στερεό θρεπτικό μέσο συμβολίζεται ως YPΑD (από τα αρχικά των προηγούμενων υλικών καθώς επίσης και του Agar). Για την εξασφάλιση άσηπτων συνθηκών, και τα δυο είδη θρεπτικού υλικού αποστειρώνονται σε αυτόκαυστο (1 Atm, 120 ºC, 30 min). Επί πλέον, μετά το τέλος της υγρής αποστείρωσης, το YPΑD θρεπτικό υλικό παραμένει σε θερμοκρασία δωματίου έως ότου η θερμοκρασία του προσεγγίσει τους ºC οπότε και μοιράζεται σε τρυβλία Petri (συνολικός όγκος θρεπτικού υλικού ανά τρυβλίο ml). Τα τρυβλία παραμένουν εντός θαλάμου νηματικής ροής υπό την επίδραση υπεριώδους ακτινοβολίας έως ότου το θρεπτικό υλικό στερεοποιηθεί πλήρως και κατόπιν φυλάσσονται σε θερμοκρασία 4-8 ºC μέχρι να χρησιμοποιηθούν Συντήρηση των κυττάρων του Saccharomyces cerevisiae Κύτταρα ζύμης που έχουν αναπτυχθεί σε θρεπτικό μέσο YPD μπορούν να διατηρηθούν σε θερμοκρασία 4-8 ºC για χρονικό διάστημα ενός τριμήνου. Μετά την παρέλευση του ως άνω χρονικού διαστήματος συνίσταται είτε η ανακαλλιέργεια των κυττάρων είτε η δημιουργία νέας κυτταρικής καλλιέργειας προερχόμενης από κύτταρα τα οποία φυλάσσονται στους 80 ºC σε διάλυμα γλυκερόλης. Για την 72

84 Υλικά και Μέθοδοι παρασκευή κυτταρικών αποθεμάτων στους 80 ºC, 200 μl κυτταρικής καλλιέργειας προστίθενται σε 800 μl γλυκερόλης. 2.2 Προσδιορισμός χρόνου διπλασιασμού κυττάρων ζύμης Κύτταρα ζύμης (αγρίου τύπου και μεταλλαγμένων στελεχών) σε αρχική συγκέντρωση 10 4 κύτταρα/ml εμβολιάζονται σε 200 ml θρεπτικού υλικού YPD. Η ανάπτυξη των κυττάρων πραγματοποιείται στους 30 ºC υπό συνεχή ανάδευση, ενώ ανά τακτά χρονικά διαστήματα (2 h) μετράται ο αριθμός των κυττάρων με τη βοήθεια του αιμοκυτταρόμετρου. Με αυτόν τον τρόπο προσδιορίζεται ο αριθμός των κυττάρων ανά κυβικό εκατοστό (κύτταρα/ml) καλλιέργειας. Η ανάπτυξη των κυττάρων ζύμης ακολουθεί τις τυπικές φάσεις ανάπτυξης των μικροοργανισμών, δηλαδή διακρίνεται στη λανθάνουσα φάση, στη λογαριθμική φάση ανάπτυξης και στη φάση στασιμότητας. Ο χρόνος διπλασιασμού προσδιορίζεται από την κλίση της ευθείας της λογαριθμικής φάσης ανάπτυξης. 2.3 Κατασκευή μεταλλαγμένων στελεχών του Saccharomyces cerevisiae Κατασκευή στελέχους ζύμης που φέρει σημειακή μετάλλαξη σε περιοχή του 18S rrna ή του 25S rrna Μέχρι πρόσφατα δεν ήταν εφικτή η κατασκευή και η μελέτη μεταλλάξεων επί του rrna των ευκαρυωτικών μικροοργανισμών διότι τα γονίδια που κωδικοποιούν τους διάφορους τύπους rrna βρίσκονται σε υψηλό αριθμό επαναλαμβανόμενων αντιτύπων ( ) στον γενετικό τόπο RDN του χρωμοσώματος ΧΙΙ του ζυμομύκητα S. cerevisiae. Το πρόβλημα που δημιουργεί ο μεγάλος αριθμός αντιτύπων ξεπεράσθηκε με την ανάπτυξη ενός νέου πλασμιδιακού συστήματος (Chernoff et al. 1994). Το σύστημα αυτό χρησιμοποιεί ένα πλασμίδιο υψηλού αριθμού αντιτύπων (high-copy plasmid), το οποίο κωδικοποιεί μια και μοναδική αλληλουχία των rdna γονιδίων από τον φυσιολογικό υποκινητή rdna. Η αλληλουχία αυτή περιλαμβάνει τόσο τις ρυθμιστικές όσο και τις κωδικοποιούσες αλληλουχίες όλων των μορίων ριβοσωματικού RNA, δηλαδή του 18S, του 5S, του 5.8S και του 25S. Παρουσία αυτών των πλασμιδίων έχουν ληφθεί μεγάλες, σταθερές και ταυτόχρονα βιώσιμες χρωμοσωματικές απαλείψεις του γενετικού τόπου RDN του χρωμοσώματος ΧΙΙ. 73

85 Υλικά και Μέθοδοι Τα πλασμίδια αυτά περιέχουν μια υπολειπόμενη, ανθεκτική στο κατάλληλο αντιβιοτικό, μετάλλαξη στην κωδικοποιούσα περιοχή του 18S rrna (rdnhyg1). Αυτή η μετάλλαξη περιέχει την αλλαγή του ιδίου ζεύγους βάσεων (U1495C) που προκαλεί αντίσταση στο αντιβιοτικό υγρομυκίνη (Hg) τόσο στην Tetrahymena (Spangler & Blackburn 1985) όσο και στο Halobacterium (Hummel & Bock 1987). Ακολουθεί η επιλογή εκείνων των στελεχών του ζυμομύκητα στα οποία όλα τα μόρια του 18S rrna που κωδικοποιούνται από το πλασμίδιο φέρουν την rdnhyg1 υπολειπόμενη σημειακή μετάλλαξη. Το μέγεθος των rdna απαλείψεων μπορεί να υπολογιστεί με ανάλυση κατά Southern. Αρχικά πραγματοποιείται πέψη με το ένζυμο περιορισμού MluI το οποίο κόβει μόνο μια φορά κάθε χρωμοσωματική rdna αλληλουχία (μήκους 9 kb) καθώς επίσης μια φορά το μήκους 15 kb πλασμίδιο υψηλού αριθμού αντιτύπων που περιέχει την rdna αλληλουχία. Τα δείγματα ηλεκτροφορούνται, μεταφέρονται σε μεμβράνη και ιχνηθετούνται χρησιμοποιώντας rdna ζύμης. Το δείγμα που προέρχεται από αποικίες ανθεκτικές στην υγρομυκίνη εμφανίζει μειωμένα ποσά της ζώνης μήκους 9kb έναντι αυτής των 15kb. Aφού γίνει η επιλογή των κυττάρων ως προς την ανθεκτικότητα τους έναντι της υγρομυκίνης, μεταφέρονται σε θρεπτικό μέσο που περιέχει 5 -FOA (φθοροοροτικό οξύ), προκειμένου να επιλεγούν ως προς την απώλεια του URA3 πλασμιδίου. Το 5 -FOA είναι μέσο επιλογής στελεχών που στερούνται του URA3 πλασμιδίου, έτσι σε αυτό το μέσο αναπτύσσονται στελέχη που έχουν χάσει το πλασμίδιο και η παραγωγή των rdna αλληλουχιών πραγματοποιείται από το χρωμοσωματικό rdna. Στελέχη που δεν μεγαλώνουν σε 5 -FOA θρεπτικό μέσο έχει αποδειχθεί με ανάλυση κατά Southern πως περιέχουν μεγαλύτερες απαλείψεις των χρωμοσωματικών rdna αλληλουχιών. Τα κύτταρα αναπτύσσονται αρχικά σε -Ura, κατόπιν σε Leu και τελικά σε +Hyg θρεπτικό μέσο. Ο δείκτης LEU-2d χρησιμοποιείται για την επιλογή στελεχών που φέρουν το πλασμίδιο υψηλού αριθμού αντιτύπων καθώς μόνο τα στελέχη που περιέχουν αντίγραφα του LEU-2d μπορούν να μεγαλώσουν σε Leu θρεπτικό μέσο (Εικόνα 20). Εναλλακτικά, το πλασμίδιο υψηλού αριθμού αντιτύπων μπορεί να έχει υποστεί την επίδραση U.V. ακτινοβολίας (τυχαία μεταλλαξιγένεση) ή την εισαγωγή σημειακών μεταλλάξεων η οποία κατευθύνεται από τα κατάλληλα ολιγονουκλεοτίδια που περιέχουν τη συγκεκριμένη μετάλλαξη, Το χρώμα που λαμβάνουν οι κυτταρικές αποικίες οι οποίες αναπτύσσονται σε θρεπτικό μέσο YPAD οφείλεται στη καταστολή ή στην αντικαταστολή της σημειακής 74

86 Υλικά και Μέθοδοι μετάλλαξης ade1-14. Η μετάλλαξη αυτή φέρει το κωδίκιο τερματισμού (stop codon) της πρωτεϊνοσύνθεσης UGA εντός του γονιδίου που κωδικοποιεί τη βιοσύνθεση ενός ενζύμου που συμμετέχει στην πορεία βιοσύνθεσης της αδενίνης. Το γονίδιο δε αυτό περιέχεται με τη σειρά του εντός του υψηλού αριθμού αντιτύπων πλασμιδίου. Αν η μετάλλαξη στο rdna επιδρά επί της ακρίβειας της μετάφρασης και συγκεκριμένα αν προκαλεί ελάττωσή της, τότε αναμένεται η καταστολή (suppression) του κωδικίου λήξης (UGA), δηλαδή η μη αναγνώρισή του από την πρωτεϊνοσυνθετική μηχανή. Αυτό πρακτικά συνεπάγεται τη συνέχιση της διαδικασίας της μετάφρασης του mrna του γονιδίου με αποτέλεσμα τη σύνθεση του ενζύμου και φυσικά τη σύνθεση αδενίνης. Η βιοσύνθεση της αδενίνης υποδηλώνεται από το λευκό χρώμα που λαμβάνουν οι κυτταρικές αποικίες. Αντίθετα, αν η μετάλλαξη επί του rdna προκαλεί αύξηση της ακρίβειας της μετάφρασης, τότε αναμένεται η αναγνώρισή του κωδικίου λήξης (UGA), δηλαδή παρατηρείται αντικαταστολή (antisuppression) του κωδικίου λήξης. Ως αποτέλεσμα της αναγνώρισης, η μετάφραση του mrna του γονιδίου τερματίζεται με αποτέλεσμα να μη συντίθεται το ένζυμο και φυσικά δεν συντίθεται αδενίνη. Η αδυναμία βιοσύνθεσης της αδενίνης υποδηλώνεται από το σκούρο κόκκινο χρώμα που λαμβάνουν οι κυτταρικές αποικίες. Με τη βοήθεια του νέου πλασμιδιακού συστήματος κατασκευάσθηκαν στο εργαστήριο της Καθηγήτριας Susan W. Liebman (University of Illinois at Chicago), μεταλλαγμένα στελέχη ζύμης τα οποία φέρουν μία ή περισσότερες υποκαταστάσεις βάσεων σε περιοχές του 18S rrna ή του 25S rrna. Οι περιοχές των σημειακών μεταλλάξεων είναι αντίστοιχες προς εκείνες του ριβοσώματος της E. coli, η αριθμολογία της οποίας έχει διατηρηθεί προκειμένου να υπάρχει δυνατότητα άμεσης σύγκρισης. Πρόκειται, μάλιστα, για περιοχές που αποδεδειγμένα έχουν «ενοχοποιηθεί» όσον αφορά στη συμμετοχή τους σε σημαντικές ριβοσωματικές λειτουργίες όπως η ακριβής αποκωδικοποίηση και η ενεργότητα πεπτιδυλομεταφοράσης. Οι γονότυποι των στελεχών της ζύμης που φέρουν μετάλλαξη ή συνδυασμό μεταλλάξεων επί του rrna παρουσιάζονται στον Πίνακα 3. 75

87 Υλικά και Μέθοδοι Εικόνα 20. Σχηματική αναπαράσταση της πορείας παρασκευής και απομόνωσης στελέχους του Saccharomyces cerevisiae που φέρει μετάλλαξη σε γονίδιο του ριβοσωματικού RNA Κατασκευή στελέχους ζύμης που φέρει μετάλλαξη σε εξωριβοσωματικά συστατικά Επιπλέον, με τη βοήθεια του νέου πλασμιδιακού συστήματος κατασκευάστηκε στέλεχος ζύμης από το οποίο έγινε απάλειψη των χρωμοσωματικών rdna επαναλήψεων και εισαγωγή του πλασμιδίου rdna-ura3 το οποίο περιέχει σημειακή μετάλλαξη επί του γονιδίου που κωδικοποιεί τον ευκαρυωτικό παράγοντα τερματισμού erf1. Η σημειακή μετάλλαξη, ονομαζόμενη sup45, αφορά την 76

88 Υλικά και Μέθοδοι αντικατάσταση της κυτοσίνης από γουανίνη στη θέση 256 του γονιδίου SUP45 που προκαλεί την υποκατάσταση της προλίνης από αλανίνη στην αμινοξική θέση 86 της περιοχής Ι της πολυπεπτιδικής αλυσίδας του erf1 (Velichutina et al. 2001). Εντός του πλασμιδίου rdna-ura3 περιέχονται συγκεκριμένοι γενετικοί δείκτες οι οποίοι επιτρέπουν τον άμεσο χαρακτηρισμό της μετάλλαξης ως κατασταλτικής ή ως αντικατασταλτικής Έτσι, το στέλεχος που φέρει την sup45 σημειακή μετάλλαξη προκαλεί καταστολή των γενετικών δεικτών ade1-14 UGA και his7-1 UAA (Chernoff et al. 1996), δηλαδή καταστολή των κωδικίων λήξης UGA και UAA, αντίστοιχα.. Ας σημειωθεί επίσης, ότι το πλασμίδιο στο οποίο εισήχθη η sup45 μετάλλαξη και το οποίο αντικατέστησε το πλασμίδιο rdna-wt-ura3, επιτρέπει στα κύτταρα ζύμης που το φέρουν να αναπτυχθούν στους 30 ºC και δεν τους επιτρέπει να αναπτυχθούν στους 37 ºC. Σε κύτταρα ζύμης που φέρουν την sup45 μετάλλαξη έγινε εισαγωγή πλασμιδίου το οποίο κωδικοποιεί μια μεταλλαγμένη μορφή της φωσφατάσης σερίνης/θρεονίνης SAL6. Η μετάλλαξη sal6 προέκυψε από δυο τροποποιήσεις του γονιδίου SAL6 και συγκεκριμένα την αντικατάσταση ενός καταλοίπου γουανίνης προς θυμίνη, που προκαλεί την αντικατάσταση ενός κωδικίου τρυπτοφάνης (TGG) προς λευκίνη (TTG) στην θέση του αμινοξέος 270, όπως επίσης την προσθήκη ενός καταλοίπου αδενίνης σε απόσταση τριών ζευγών βάσεων από την προαναφερθείσα αντικατάσταση και με κατεύθυνση το 3 άκρο, η οποία προκαλεί αλλαγή του πλαισίου ανάγνωσης της SAL6 (Vincent et al. 1994). Με τον τρόπο αυτό κατασκευάστηκε ένα διπλά μεταλλαγμένο στέλεχος το οποίο συμβολίζεται ως sal6sup45 (Πίνακας 3). Επίσης, με τον ίδιο τρόπο έγινε εισαγωγή σε sup45 στελέχη ενός πλασμιδίου το οποίο φέρει τη μετάλλαξη asu9 για την οποία δεν υπάρχουν πληροφορίες ως προς το τι είδους μετάλλαξη είναι, ούτε για το προϊόν που κωδικοποιεί το φυσιολογικό ASU9 γονίδιο. Παρόλα αυτά είναι γνωστό πως η μετάλλαξη asu9 έχει επίδραση επί της διαδικασίας της μετάφρασης (Liebman and Cavenagh, 1979) και για αυτό το λόγο εξετάστηκε η επίδραση της επί διαφόρων παραμέτρων της μετάφρασης. Το στέλεχος που φέρει την μετάλλαξη asu9 συμβολίζεται ως asu9sup45 (Πίνακας 3). Τέλος, στα διπλά μεταλλαγμένα στελέχη sal6sup45 έγινε εισαγωγή της μετάλλαξη asu9 και τα κύτταρα που προέκυψαν συμβολίζονται ως sal6asu9sup45 (Πίνακας 3). Στην παρούσα διατριβή εξετάστηκε η ταυτόχρονη επίδραση και των τριών μεταλλάξεων επί χαρακτηριστικών λειτουργιών του ευκαρυωτικού ριβοσώματος. 77

89 Υλικά και Μέθοδοι Πίνακας 3. Γονότυποι των στελεχών του Saccharomyces cerevisiae Στέλεχος Γονότυπος Μετάλλαξη L1489 MATa ade1-14(uga) his7-1(uaa) leu2-3, 112 lys2- καμία L864(UAG) trp1-δ1 ura3-52 L1491 Παράγωγο του L 1489 φέρον το πλασμίδιο prdn-hyg1 rdnhyg1 [URA3 LEU2d rdn-hyg1 rdn ani1] L1494 Παράγωγο του L 1491 φέρον το πλασμίδιο prdn-wt καμία (rdnwt) [TRP1 LEU2d rdna] L1583 (rdn1a) Παράγωγο του L 1494 φέρον το πλασμίδιο prdn-1α [TRP1 LEU2d rdn1a] αντί του prdn-wt C1054A, h34, 18S rrna L1597 (rdn1t) Παράγωγο του L 1494 φέρον το πλασμίδιο prdn-1t [TRP1 LEU2d rdn1t] αντί του prdn-wt C1054U, h34, 18S rrna L1522 (rdn2) Παράγωγο του L 1494 φέρον το πλασμίδιο prdn-2-u [rdn2 URA3] αντί του prdn-wt G517A, h18, 18S rrna L1887 (com1) Παράγωγο του L 1494 φέρον το πλασμίδιο prdn-com1 [TRP1 LEU2d com1] αντί του prdn-wt C310G, h12, 18S rrna L1888 (com1rdn2) Παράγωγο του L 1494 φέρον το πλασμίδιο prdnrdn2com1 [TRP1 LEU2d rdn2com1] αντί του prdn-wt C310G, h12 και G517A, h18, 18S rrna L1893 (com6rdn2) Παράγωγο του L 1494 φέρον το πλασμίδιο prdnrdn2com6 [TRP1 LEU2d rdn2com6] αντί του prdn-wt G1206C, h34, και G517A, h18, 18S rrna L1912 Παράγωγο του L 1491 φέρον το πλασμίδιο prdn-wt καμία (rdnwt) [TRP1 LEU2d rdna] L1922 (rdn12a) Παράγωγο του L 1912 φέρον το πλασμίδιο prdnrdn12a [TRP1 LEU2d rdn12a] αντί του prdn-wt C526A, h18, 18S rrna L1895 (com3) Παράγωγο του L 1494 φέρον το πλασμίδιο prdn-com3 [TRP1 LEU2d com3] αντί του prdn-wt C1057G, Η42, 25S rrna SL870-1B (sup45) MATa sup45 ura3-52 ade3-26 his5-2 ilv1-1 can1-132 lys2-1 leu2-1 met8-1 trp1-1 tyr7-1 cyc1-76 C256G, SUP45 (erf1) SL870-1A (sal6sup45) MATα sal6 sup45 ura3-52 ade3-26 his5-2 ilv1-1 can1-132 lys2-1 leu2-1 met8-1 trp1-1 tyr7-1 cyc1-76 G809T, +A812, SAL6 SL680-9C MATα asu9 sup45 ura3-52 ade3-26 his5-2 ilv1-1 can1-132 άγνωστη (asu9sup45) lys2-1 leu2-1 met8-1 trp1-1 tyr7-1 cyc1-76 L1520 (sal6asu9sup45) MATα sal6 asu9 sup45 ura3-52 ade3-26 his5-2 ilv1-1 can1-132 lys2-1 leu2-1 met8-1 trp1-1 tyr7-1 cyc1-76 συνδυασμός των παραπάνω Με αστερίσκο σημειώνονται τα στελέχη που μελετήθηκαν στην παρούσα διατριβή 78

90 Υλικά και Μέθοδοι 2.4 Παρασκευή συστήματος ελεύθερου κυττάρων Κατά την παρούσα διατριβή χρησιμοποιήθηκε με ορισμένες τροποποιήσεις το ήδη αναπτυχθέν σύστημα ελεύθερο κυττάρων (cell-free system) με το οποίο καθίσταται εφικτή η μελέτη μεταλλάξεων γονιδίων ριβοσωματικού RNA ή ριβοσωματικών πρωτεϊνών (Synetos et al. 1996). Αγρίου τύπου ή μεταλλαγμένα στελέχη του S. cerevisiae αναπτύσσονται μέχρι οπτικής απορρόφησης 0,8 στα 660 nm σε θρεπτικό υλικό YPD. Ακολουθεί συλλογή των κυττάρων με φυγοκέντρηση (5000 rpm, 10 min, 4 ºC) και πλύσιμο δυο φορές με αποστειρωμένο νερό και δυο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα ομογενοποίησης της παρακάτω σύστασης : Hepes-KOH, ph mm Οξικό κάλιο 100 mm Οξικό μαγνήσιο 2 mm Διθειοθρεϊτόλη (DTT) 2 mm Μαννιτόλη 8.5% Για την παρασκευή του συστήματος ελεύθερου κυττάρων τα κύτταρα επαναδιαλυτοποιούνται στο ίδιο με πριν ρυθμιστικό διάλυμα (2-3 ml διαλύματος / g κυττάρων) το οποίο περιέχει επιπλέον 0,5 mm φαινυλ-μεθυλ-σουλφονυλ-φθορίδιο (PMSF) για την αναστολή της δράσης των πρωτεασών. Ακολουθεί η λύση των κυττάρων, η οποία πραγματοποιείται μηχανικά με τη χρήση γυάλινων σφαιριδίων (glass beads) διαμέτρου 0,45 mm (σε αναλογία 3-4 g σφαιριδίων ανά ml κυτταρικού εναιωρήματος). Ο σωλήνας φυγοκέντρησης SS34 ανεβοκατεβαίνει κατακόρυφα επί αποστάσεως 50 cm για 3 περιόδους του ενός λεπτού με συχνότητα 2 πλήρεις διαδρομές / δευτερόλεπτο και με ενδιάμεσα διαλείμματα ενός λεπτού αναμονής των κυττάρων σε πάγο. Η απομάκρυνση των γυάλινων σφαιριδίων και των κυτταρικών μεμβρανών γίνεται με φυγοκέντρηση σε κεφαλή SS34 στις rpm (30000g), για 22 min στους 4 ºC. Έπεται η συλλογή του υπερκείμενου κλάσματος το οποίο επωάζεται παρουσία πουρομυκίνης (τελική συγκέντρωση 10-4 Μ) και GTP (τελική συγκέντρωση 10-4 Μ) σε υδατόλουτρο (30 ºC) υπό ανάδευση για 20 min. Η πουρομυκίνη προκαλεί τον τερματισμό της μετάφρασης και με την παρουσία της επιτυγχάνεται η απομάκρυνση των «εν τω γεννάσθαι» πολυπεπτιδικών αλυσίδων. Στη συνέχεια το δείγμα υφίσταται χρωματογραφία μοριακής διήθησης σε στήλη 79

91 Υλικά και Μέθοδοι χρωματογραφίας (διαστάσεων 30 cm x 1.2 cm) που έχει πακεταριστεί με υλικό Sephadex G-10, εξισορροπημένης με ρυθμιστικό διάλυμα ομογενοποίησης μη περιέχον μαννιτόλη. Με αυτόν τον τρόπο λαμβάνει χώρα ο διαχωρισμός των συστατικών του δείγματος και η απομάκρυνση ενδογενών αμινοξέων και άλλων μικρών μορίων. Όσο χρόνο διαρκεί η χρωματογραφία γίνεται συλλογή κλασμάτων όγκου 1 ml που εκλούονται, έτσι ώστε να συλλεχθούν τα κλάσματα με τη μεγαλύτερη οπτική απορρόφηση στα 260 nm (Σχήμα 1). 60 Α260 / ml κλάσμα έκλουσης Σχήμα 1. Οπτικές απορροφήσεις κλασμάτων S30 στα 260 nm ανά ml κλάσματος έκλουσης. Τα κλάσματα με τις μεγαλύτερες οπτικές απορροφήσεις αναμιγνύονται για να προκύψει το τελικό εκχύλισμα S30. Συνήθως, συλλέγονται 3-4 κλάσματα S30 τα οποία στη συνέχεια αναμιγνύονται προκειμένου να προκύψει ένα τελικό εκχύλισμα S30 το οποίο περιέχει ριβοσώματα, αμινοακυλο-trna συνθετάσες και μεταφραστικούς παράγοντες. Με τη μέθοδο αυτή λαμβάνονται εκχυλίσματα S30 που περιέχουν περίπου 50 Α 260 ριβοσωμάτων/ml και 6-10 mg πρωτεΐνης/ml. Τα εκχυλίσματα S30 χωρίζονται σε μικρότερα κλάσματα, υφίσταται απαέρωση με διοχέτευση αερίου αζώτου και αποθηκεύονται στους -80 ºC όπου διατηρούνται ενεργά έως και 6 μήνες. 2.5 In vitro δοκιμασίες μετάφρασης In vitro μετάφραση μηνύματος poly(u) Η αντίδραση πραγματοποιείται σε μίγματα τελικού όγκου 100 μl τα οποία περιέχουν τα ακόλουθα συστατικά : 80

92 Υλικά και Μέθοδοι Hepes-KOH ph mm Χλωριούχο κάλιο 22 mm Χλωριούχο αμμώνιο 50 mm Οξικό μαγνήσιο 11 mm Διθειοθρεϊτόλη (DTT) 2 mm Μονόξινο φωσφορικό κάλιο 5 mm ATP 1 mm GTP 0.5 mm Φωσφορική κρεατίνη 40 μg/ml Κινάση της φωσφορικής κρεατίνης 40 μg/ml trna ζύμης 250 μg/l 3 Η-φαινυλαλανίνη 3.0 μμ (33,6 Ci/mmol) L-φαινυλαλανίνη 2.2 μμ L-λευκίνη 2.3 μμ 3 Η -λευκίνη 3.0 μμ (33,6 Ci/mmol) poly(u) Εκχύλισμα S μg/ml 11 Α 260 /ml Για κάθε εκχύλισμα S30 που χρησιμοποιείται, λαμβάνουν χώρα τέσσερις ανεξάρτητοι μεταξύ τους πειραματικοί χειρισμοί : i.επώαση με 3 Η -φαινυλαλανίνη και poly(u) ii.επώαση με 3 Η -φαινυλαλανίνη χωρίς poly(u) iii.επώαση με 3 Η -λευκίνη και poly(u) iv.επώαση με 3 Η -λευκίνη χωρίς poly(u) Τα μίγματα αντίδρασης επωάζονται στους 30 ºC για μια ώρα. Το τέλος της αντίδρασης επιτυγχάνεται με την τοποθέτηση 45 μl από το μίγμα επώασης σε φίλτρο Whatman 3MM. Τα φίλτρα στεγνώνουν με παροχή αέρα και έπειτα ακολουθεί κατακρήμνιση με τριχλωροξικό οξύ (TCA), με το οποίο επιτυγχάνεται η απομάκρυνση από τα φίλτρα αμινοξέων, δι- και τριπεπτιδίων, ως εξής : Ψυχρό TCA για 3 min Θερμό TCA για 4 min Ψυχρό TCA για 3 min Ψυχρό TCA για 3 min Ψυχρή αιθανόλη για 2 min 81

93 Υλικά και Μέθοδοι Ακολουθεί στέγνωμα των φίλτρων και τοποθέτηση τους σε κατάλληλο σπινθηριστικό μίγμα τολουολίου περιέχον : 1 l τολουόλιο 4 g PPO 0.1 g POPOP Ακολουθεί μέτρηση της ραδιενέργειας σε μετρητή υγρού σπινθηρισμού (beta counter). Το σπινθηριστικό υγρό χρησιμοποιείται για την «παγίδευση» και την μετατροπή της εκπεμπόμενης β-ακτινοβολίας σε ακτινοβολία φωτονίων η οποία προσδιορίζεται σε μετρητή υγρού σπινθηρισμού. Η μετρούμενη ακτινοβολία αντικατοπτρίζει την ενσωμάτωση της φαινυλαλανίνης ή τη λανθασμένη ενσωμάτωση της λευκίνης στην αυξανόμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα. Για τα πειράματα προσδιορισμού της επίδρασης της παρομομυκίνης στην ακρίβεια της μετάφρασης in vitro, στο μίγμα επώασης προστίθεται το αντιβιοτικό είτε σε τελική συγκέντρωση 50 μμ είτε σε αυξανόμενες τελικές συγκεντρώσεις (dose response experiments). Η ακρίβεια της μετάφρασης καθορίζεται από την συχνότητα λάθους (error frequency, E.F). Η συχνότητα λάθους είναι ο λόγος της λανθασμένης ενσωμάτωσης ραδιενεργού λευκίνης προς το άθροισμα της ενσωμάτωσης ραδιενεργού φαινυλαλανίνης και (λανθασμένης) ενσωμάτωσης ραδιενεργού λευκίνης. Εκφράζει δηλαδή τον αριθμό των λαθών ανά μεταφραζόμενο κωδίκιο. Είθισται δε, να εκφράζεται σε αριθμό λανθασμένων κωδικίων ανά μεταφραζόμενα κωδίκια. Για τη μελέτη της επίδρασης της παρομομυκίνης στην ικανότητα σχηματισμού πολυφαινυλαλανίνης in vitro, στο μίγμα της αντίδρασης προστίθεται το αντιβιοτικό στις κατάλληλες συγκεντρώσεις In vitro δοκιμασία ενσωμάτωσης φαινυλαλανίνης Για τα πειράματα της κινητικής της ενσωμάτωσης της πολυφαινυλαλανίνης, τα μίγματα της αντίδρασης (τελικού όγκου 100 μl) περιέχουν τα συστατικά που αναφέρθηκαν στην παράγραφο εκτός από 3 Η-φαινυλαλανίνη, 3 Η-λευκίνη και trna ζύμης. Επί πλέον, προστίθεται φαινυλαλάνυλο-trna ([ 3 H]Phe-tRNA) σε τελική συγκέντρωση 26 Α 260 /ml. Για κάθε εκχύλισμα S30 που χρησιμοποιείται, λαμβάνουν χώρα δυο ανεξάρτητοι μεταξύ τους πειραματικοί χειρισμοί : 82

94 Υλικά και Μέθοδοι i. Επώαση με poly(u) ii. Επώαση χωρίς poly(u) Κάθε μίγμα αντίδρασης επωάζεται στους 30º C για τον απαιτούμενο χρόνο (π.χ. 1 min, 2 min, κ.ο.κ.). Η αντίδραση σταματά με την προσθήκη στο μίγμα της αντίδρασης ισοδύναμου όγκου 1Ν ΚΟΗ (100 μl). Ακολουθεί μέτρηση της ραδιενέργειας σε μετρητή υγρού σπινθηρισμού Επίδραση κυκλοεξιμιδίου επί της ικανότητας της πρωτεϊνοσύνθεσης Η αντίδραση πραγματοποιείται σε μίγματα τελικού όγκου 100 μl τα οποία περιέχουν όλα τα συστατικά που αναφέρονται στην παράγραφο εκτός από 3 Η- λευκίνη. Επί πλέον, κάθε μίγμα αντίδρασης περιέχει συγκεκριμένο όγκο διαλύματος κυκλοεξιμιδίου γνωστής συγκέντρωσης. Για κάθε εκχύλισμα S30 που χρησιμοποιείται, λαμβάνουν χώρα δυο ανεξάρτητοι μεταξύ τους πειραματικοί χειρισμοί : i. Επώαση με poly(u) ii. Επώαση χωρίς poly(u) Ακολουθεί μέτρηση της ραδιενέργειας σε μετρητή υγρού σπινθηρισμού. Χρησιμοποιώντας μια ευρεία κλίμακα συγκεντρώσεων κυκλοεξιμιδίου είναι εφικτός ο προσδιορισμός εκείνης της συγκέντρωσης του αντιβιοτικού που προκαλεί αναστολή της ικανότητας σύνθεσης πολυφαινυλαλανίνης κατά 50 %. 2.6 Ανθεκτικότητα των κυττάρων στην παρομομυκίνη Πειράματα σε υγρές κυτταρικές καλλιέργειες (θρεπτικό μέσο YPD) Η αναστολή της ανάπτυξης κυττάρων ζύμης του αγρίου τύπου και των μεταλλαγμένων στελεχών παρουσία του αμινογλυκοζιτικού αντιβιοτικού παρομομυκίνη προσδιορίστηκε ως εξής : Σε φιάλες Corning που περιέχουν 10 ml θρεπτικού υλικού YPD προστίθεται το αντιβιοτικό στις κατάλληλες συγκεντρώσεις και ακολουθεί ο εμβολιασμός με κύτταρα που προέρχονται από πρόσφατα αναπτυγμένες καλλιέργειες του σακχαρομύκητα. Η αναλογία του όγκου του θρεπτικού υλικού προς τον όγκο κάθε κυτταρικής καλλιέργειας είναι ίση προς 1000:1, που αντιστοιχεί περίπου προς

95 Υλικά και Μέθοδοι κύτταρα/ml σε 10 ml θρεπτικού υλικού. Οι καλλιέργειες των κυττάρων υφίσταται ανάδευση σε θάλαμο θερμοκρασίας 30 ºC για ένα περίπου 24ωρο και κατόπιν λαμβάνεται η τιμή της οπτικής απορρόφησης στα 660 nm (A 660 ) της φιάλης που περιέχει την καλλιέργεια των κυττάρων που έχει αναπτυχθεί απουσία παρομομυκίνης και αναφέρεται ως «μάρτυρας». Η τιμή της A 660 της καλλιέργειας «μάρτυρα» ίσης προς 1 αντιστοιχεί στο 100 % της ανάπτυξης και έτσι σταματά η ανάδευση και των υπολοίπων φιαλών και ακολουθεί η μέτρηση της οπτικής απορρόφησης τους για όλες τις συγκεντρώσεις του αντιβιοτικού. Η ελάττωση της οπτικής απορρόφησης που παρατηρείται αυξανομένης της συγκέντρωσης του αντιβιοτικού αντικατοπτρίζει την αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων. Τελικά, μέσω της αναγωγής των τιμών της A 660 όλων των φιαλών ως επί τοις εκατό (%) της φιάλης «μάρτυρα» προσδιορίζεται η συγκέντρωση της παρομομυκίνης στην οποία παρατηρείται το 50 % της αναστολής της ανάπτυξης των κυττάρων Πειράματα σε στερεές καλλιέργειες (θρεπτικό μέσο YPAD) Εναλλακτικά, η αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων αγρίου τύπου και των μεταλλαγμένων στελεχών μελετήθηκε και σε στερεές καλλιέργειες YPΑD, ως εξής: Πρόσφατα αναπτυγμένες καλλιέργειες των κυττάρων της ζύμης εμβολιάζονται σε τρυβλία Petri ξεκινώντας από μια αρχική συγκέντρωση κυττάρων 10 7 κύτταρα/ml. Τα κύτταρα απλώνονται ομοιόμορφα στην επιφάνεια του θρεπτικού υλικού με τη βοήθεια είτε γυάλινων σφαιριδίων είτε πιπέττας Pasteur και αφού επωασθούν για 1-2 h σε θάλαμο θερμοκρασίας 30 ºC ακολουθεί η τοποθέτηση στην επιφάνεια της καλλιέργειας φίλτρων διαμέτρου 1 cm τα οποία εμποτίζονται με κατάλληλες συγκεντρώσεις του αντιβιοτικού καθώς και με αποστειρωμένο νερό (φίλτρο «μάρτυρας»). Η ανθεκτικότητα ή η ευαισθησία κάθε στελέχους στην παρομομυκίνη προσδιορίζεται από την ακτίνα των κυττάρων που δημιουργείται γύρω από κάθε φίλτρο. Έτσι μικρή ακτίνα σημαίνει αυξημένη ανθεκτικότητα ή μειωμένη ευαισθησία στο αντιβιοτικό και το αντίθετο. 2.7 Ανθεκτικότητα των κυττάρων στο κυκλοεξιμίδιο Παρόμοιες μελέτες με αυτές που πραγματοποιήθηκαν για την επίδραση της παρομομυκίνης στην ικανότητα ανάπτυξης των κυττάρων έλαβαν χώρα παρουσία ενός γλουταριμιδικού αντιβιοτικού, του κυκλοεξιμιδίου. Οι μελέτες 84

96 Υλικά και Μέθοδοι πραγματοποιήθηκαν τόσο σε υγρές όσο και σε στερεές καλλιέργειες και ακολουθήθηκαν τα ίδια στάδια, όπως αυτά αναφέρθηκαν στην προηγούμενη ενότητα με τις εξής διαφορές: i. οι τελικές συγκεντρώσεις του κυκλοεξιμιδίου στις υγρές καλλιέργειες είναι της τάξεως των μg/ml. ii. οι τελικές ποσότητες του αντιβιοτικού στις στερεές καλλιέργειες είναι της τάξεως των μg. 2.8 Απομόνωση ριβοσωμάτων και διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων Απομόνωση «άπλυτων» ριβοσωμάτων Κύτταρα του S. cerevisiae αγρίου τύπου ή των μεταλλαγμένων στελεχών αναπτύσσονται σε υγρό θρεπτικό μέσο YPD έως οπτικής απορρόφησης 0,9 στα 660 nm. Ακολουθεί συλλογή των κυττάρων με φυγοκέντρηση (5000 rpm, 10 min, 4 ºC) και πλύσιμο δυο φορές με αποστειρωμένο νερό και δυο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα ομογενοποίησης χαμηλής αλατότητας, της παρακάτω σύστασης : Tris-HCl, ph 7.4 KCl Οξικό μαγνήσιο β-μερκαπτοαιθανόλη PMSF 10 mm 10 mm 5 mm 10 mm 1 mm Τα κύτταρα επαναδιαλυτοποιούνται στο ίδιο με πριν ρυθμιστικό διάλυμα. Ακολουθεί η λύση των κυττάρων με την ίδια διαδικασία όπως αυτή περιγράφηκε στην παράγραφο 2.3 (Παρασκευή συστήματος ελεύθερου κυττάρων). Η απομάκρυνση των γυάλινων σφαιριδίων και των κυτταρικών μεμβρανών γίνεται με φυγοκέντρηση σε κεφαλή SS34 στις rpm (30000g), για 22 min στους 4 ºC. Έπεται η συλλογή του υπερκείμενου κλάσματος το οποίο τοποθετείται σε σωλήνα υπερφυγοκέντρησης η οποία λαμβάνει χώρα σε ψυχόμενη υπερφυγόκεντρο Beckman, για 3 h 40 min στις rpm (ή g) και σε θερμοκρασία 4 ºC. Μετά το πέρας της υπερφυγοκέντρησης το ίζημα αναδιαλύεται σε μικρή ποσότητα ( 1000 μl) του ίδιου με πριν ρυθμιστικού διαλύματος. Ακολουθούν τουλάχιστον δυο αναδιαλύσεις του υπάρχοντος διαλύματος ριβοσωμάτων και έπεται φυγοκέντρηση σε επιτραπέζια φυγόκεντρο στις rpm για 20 min σε 85

97 Υλικά και Μέθοδοι θερμοκρασία 4 ºC, για την απομάκρυνση των αδιάλυτων συστατικών. Το υπερκείμενο συλλέγεται και μετράται η οπτική του απορρόφηση στα 260 nm. Με τη μέθοδο αυτή λαμβάνονται περίπου 200 Α 260 ριβοσωμάτων/ml. Ακολουθεί διοχέτευση αερίου αζώτου για την απομάκρυνση του ατμοσφαιρικού οξυγόνου και αποθήκευση μικρότερων κλασμάτων ριβοσωμάτων στους -70 ºC Παρασκευή μικτού κλάσματος διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων (SPF) Εναλλακτικά, μετά το τέλος της υπερφυγοκέντρησης στις rpm (125000g) συλλέγονται τα 2/3 από το υπερκείμενο κλάσμα (S125) και το μικτό κλάσμα διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων (το οποίο χάριν συντομίας αναφέρεται ως SPF) υφίσταται κατακρήμνιση με θειικό αμμώνιο σε αναλογία 0,474g [ΝΗ 4 ] 2 SO 4 /ml υπερκείμενου κλάσματος. Ακολουθεί φυγοκέντρηση σε κεφαλή SS34 στις rpm για 10 min σε θερμοκρασία 4 ºC. Μετά το τέλος της φυγοκέντρησης απορρίπτεται το υπερκείμενο και το ίζημα αναδιαλύεται με 1-2 ml ρυθμιστικού διαλύματος της ακόλουθης σύστασης: Hepes-KOH ph 7.4 Οξικό κάλιο Οξικό μαγνήσιο Διθειοθρεϊτόλη 30 mm 100 mm 5 mm 2 mm Ακολούθως, οι περιεχόμενες στο ίζημα πρωτεΐνες υποβάλλονται σε διαπίδυση στο προηγούμενο διάλυμα ομογενοποίησης σε θερμοκρασία 4 ºC για 12 h με μια επιπλέον αλλαγή του διαλύματος ομογενοποίησης. Με τη διαδικασία αυτή επιτυγχάνεται η απομάκρυνση του θειικού αμμωνίου από το μίγμα. Με αυτή τη μέθοδο λαμβάνονται περίπου 20 mg πρωτεΐνης/ml. Ακολουθεί διοχέτευση αερίου αζώτου για την απομάκρυνση του ατμοσφαιρικού οξυγόνου και αποθήκευση μικρότερων πρωτεϊνικών κλασμάτων στους -70 ºC. Τα κλάσματα αυτά περιέχουν τους παράγοντες έναρξης, επιμήκυνσης και τερματισμού της μετάφρασης, τις συνθετάσες κ.λ.π. Αξίζει, τέλος, να σημειωθεί πως για τη λήψη του κλάσματος των διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων χρησιμοποιούνται ριβοσώματα αγρίου τύπου (που προέρχονται από κύτταρα αγρίου τύπου) έτσι ώστε να διασφαλισθεί η παρουσία όλων 86

98 Υλικά και Μέθοδοι των απαραίτητων παραγόντων που απαιτούνται για την πραγματοποίηση της διαδικασίας της μετάφρασης Απομόνωση «πλυμένων» ριβοσωμάτων Το πρώτο στάδιο κατά την παρασκευή των «πλυμένων» ριβοσωμάτων είναι παρόμοιο με τη διαδικασία που αναφέρθηκε στην παράγραφο 2.8.1, με τη μόνη διαφορά ότι το ρυθμιστικό διάλυμα ομογενοποίησης χαμηλής αλατότητας είναι της παρακάτω σύστασης : Tris-HCl, ph 7.4 ΝΗ 4 Cl Οξικό μαγνήσιο β-μερκαπτοαιθανόλη PMSF 10 mm 50 mm 5 mm 5 mm 1 mm Εν συνεχεία, τα ριβοσώματα που έχουν ληφθεί αναδιαλύονται σε ρυθμιστικό διάλυμα υψηλής αλατότητας της παρακάτω σύστασης : Tris-HCl, ph 7.4 ΝΗ 4 Cl Οξικό μαγνήσιο β-μερκαπτοαιθανόλη PMSF 10 mm 500 mm 100 mm 5 mm 1 mm Μετά την απομάκρυνση των διαφόρων αδιάλυτων συστατικών με φυγοκέντρηση (10000 rpm, 20 min, 4 ºC) τα ριβοσώματα τοποθετούνται επί κλίσης σουκρόζης 5-20% στο ίδιο με πριν ρυθμιστικό διάλυμα υψηλής αλατότητας και ακολουθεί υπερφυγοκέντρηση σε ψυχόμενη υπερφυγόκεντρο Beckman, για 9 h στις rpm και σε θερμοκρασία 4 ºC. Τα «πλυμένα» ριβοσώματα που προκύπτουν με αυτόν τον τρόπο, έχουν απαλλαχθεί από τους διάφορους μεταφραστικούς παράγοντες (έναρξης, επιμήκυνσης και τερματισμού) που είναι προσδεδεμένοι στα ριβοσώματα, αναδιαλύονται στο προαναφερθέν ρυθμιστικό διάλυμα χαμηλής αλατότητας και μοιράζονται σε μικρότερα κλάσματα τα οποία αποθηκεύονται στους -70 ºC. Τα «πλυμένα» ριβοσώματα χρησιμοποιούνται στα in vitro πειράματα μετατόπισης (βλέπε παράγραφο 2.13). 87

99 Υλικά και Μέθοδοι 2.9 Παρασκευή Ν-Ac-[ 3 H]-L-Phe-tRNA από ζύμη Η παρασκευή του Ν-Ac-[ 3 H]-L-Phenylalanyl(Phe)-tRNA περιλαμβάνει δυο στάδια : 1. την αμινοακυλίωση του trna με ραδιενεργό φαινυλαλανίνη και την παρασκευή κατ αυτό τον τρόπο του [ 3 H]-L-Phenylalanyl(Phe)-tRNA και 2. την ακετυλίωση του προϊόντος του πρώτου σταδίου Παρασκευή του [ 3 H]-L-Phe-tRNA Η αμινοακυλίωση του trna της ζύμης με ραδιενεργό φαινυλαλανίνη επιτυγχάνεται με τη βοήθεια του μικτού κλάσματος των διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων (SPF) στο οποίο περιέχονται μεταξύ των άλλων και οι αμινοάκυλοtrna συνθετάσες. Το μίγμα της αντίδρασης παρασκευάζεται στους 4 ºC και περιέχει τα εξής : Hepes-KOH ph mm Οξικό μαγνήσιο 10 mm β-μερκαπτοαιθανόλη 6 mm ΑΤΡ 5 mm [ 3 H]-L-Phe και L-Phe 4.5 μμ trna ζύμης 140 A 260 /ml Κλάσμα συνθετασών 1.5 mg/ml Το μίγμα της αντίδρασης επωάζεται σε υδατόλουτρο στους 37 ºC για 45 min. Για να ελεγχθεί η ενεργότητα των συνθετασών γίνεται λήψη μικρής ποσότητας μίγματος (10 μl) και τοποθέτηση του σε χαρτί Whatman 3ΜΜ. Το χαρτί στεγνώνεται και ακολουθεί πλύσιμο 3 φορές με ψυχρό διάλυμα TCA 5 %. Ο υπολογισμός της προσδεδεμένης στο χαρτί ραδιενέργειας πραγματοποιείται μετά από εμβάπτιση του σε σπινθηριστικό υγρό τολουολίου και μέτρηση αυτής σε μετρητή υγρού σπινθηρισμού. Η ολική ραδιενέργεια του μίγματος υπολογίζεται με προσθήκη μικρής ποσότητας (20 μl) από το μίγμα της επώασης σε 15 ml σπινθηριστικού υγρού Bray s και μέτρηση αυτής σε μετρητή υγρού σπινθηρισμού. Ο υπολογισμός της απόδοσης της ανάληψης [ 3 H]-L-Phe-tRNA προσδιορίζεται από το λόγο της μετρούμενης ραδιενέργειας που έχει προσδεθεί στο trna προς την ολική ραδιενέργεια του μίγματος, ως το επί τοις εκατό ποσοστό της τελευταίας. 88

100 Υλικά και Μέθοδοι Το [ 3 H]-L-Phe-tRNA που έχει σχηματισθεί εκχυλίζεται με την προσθήκη ίσου όγκου φαινόλης. Ακολουθεί έντονη ανακίνηση του εκχυλιζόμενου μίγματος για 3 min σε θερμοκρασία δωματίου και έπειτα φυγοκέντρηση σε κεφαλή SS34 στις 2500 rpm, σε θερμοκρασία δωματίου για χρόνο ίσο με 10 min. Μετά το τέλος της φυγοκέντρησης συλλέγεται η υδατική φάση και φυλάσσεται σε πάγο (0 ºC). Στην απομένουσα φαινολική φάση προστίθεται μικρός όγκος ψυχρού απεσταγμένου ύδατος και ακολουθεί πάλι έντονη ανακίνηση του εκχυλιζόμενου μίγματος για 3 min σε θερμοκρασία δωματίου και έπειτα φυγοκέντρηση. Η επανεκχύλιση λαμβάνει χώρα άλλες δυο φορές (συνολικά τέσσερις). Στις υδατικές φάσεις που έχουν συλλεχθεί προστίθεται διάλυμα οξικού καλίου 25 %, ph 5.8 σε όγκο ίσο με το 1/12.5 του όγκου της ολικής υδατικής φάσης καθώς και προσθήκη διπλάσιου προς τον όγκο της ολικής υδατικής φάσης- όγκου απόλυτης αιθανόλης 95 % και το τελευταίο μίγμα παραμένει για 16 h σε θερμοκρασία -20 ºC, προκειμένου να λάβει χώρα η κατακρήμνιση του [ 3 H]-L-Phe trna. Το [ 3 H]-L-Phe trna που έχει καταβυθιστεί ως ίζημα συλλέγεται με φυγοκέντρηση στις rpm, για 10 min σε θερμοκρασία 4 ºC. Στο ίζημα προστίθεται μικρός όγκος 70 % απόλυτης αιθανόλης και επαναλαμβάνεται η ίδια με πριν φυγοκέντρηση. Μετά το τέλος της φυγοκέντρησης το ίζημα διαλυτοποιείται σε μικρό όγκο ψυχρού απεσταγμένου ύδατος και υποβάλλεται σε διαπίδυση έναντι 4l ψυχρού απεσταγμένου ύδατος για 12 h σε θερμοκρασία 4 ºC με μια αλλαγή του απεσταγμένου ύδατος μετά από 6 h. Με τη διαδικασία αυτή επιτυγχάνεται η απομάκρυνση της φαινόλης από το μίγμα. Το τελικό παρασκεύασμα που αποτελείται από [ 3 H]-L-Phe trna και μη αμινοακυλιωμένο trna συλλέγεται και προσδιορίζονται τόσο η οπτική του απορρόφηση στα 260 nm όσο και η περιεχόμενη ραδιενέργεια (με προσθήκη 20μl μίγματος σε 15 ml σπινθηριστικού υγρού Bray s). Έτσι λαμβάνονται περίπου 250 A 260 /ml (ή cpm/ A 260 ) [ 3 H]-L- Phe-tRNA. H απόδοση της ανάληψης του ραδιενεργά σημασμένου φαινυλαλανυλοtrna ([ 3 H]-L-Phe-tRNA) υπολογίζεται από το λόγο της οπτικής απορρόφησης του προς την οπτική απορρόφηση του trna που χρησιμοποιήθηκε στο αρχικό μίγμα επώασης Ακετυλίωση του [ 3 H]-L-Phe-tRNA Η ακετυλίωση του [ 3 H]-L-Phe-tRNA πραγματοποιείται στους 0 ºC. Γίνεται ανάμειξη 2,6 ml [ 3 H]-L-Phe-tRNA με 2,5 ml ψυχρού απεσταγμένου ύδατος και 5,1 89

101 Υλικά και Μέθοδοι ml κορεσμένου διαλύματος οξικού καλίου-οξικού οξέος ph 4,7. Ακολουθεί προσθήκη 5 δόσεων οξικού ανυδρίτη (0,147 ml ανά δόση) διαδοχικά κάθε 15 min υπό συνεχή ανάδευση. Κατόπιν προστίθεται 6,96 ml ψυχρού απεσταγμένου νερού όπως επίσης 12,74 ml απόλυτης αιθανόλης 95 %. Το παρασκεύασμα διατηρείται στους -20 ºC για 16 h ώστε να κατακρημνισθεί το Ν-Ac-[ 3 H]-L-Phe-tRNA. Το ίζημα συλλέγεται με φυγοκέντρηση στις rpm, για 5 min σε θερμοκρασία 4 ºC. Ακολούθως διαλυτοποιείται σε μικρή ποσότητα ψυχρού απεσταγμένου ύδατος και έπειτα υποβάλλεται σε διαπίδυση έναντι 4l ψυχρού απεσταγμένου ύδατος για 12 h σε θερμοκρασία 4 ºC με μια αλλαγή μετά το πέρας των πρώτων έξι ωρών. Το τελικό παρασκεύασμα που αποτελείται από Ν-Ac-[ [ 3 H]-L-Phe-tRNA συλλέγεται και προσδιορίζονται τόσο η οπτική του απορρόφηση στα 260 nm όσο και η περιεχόμενη ραδιενέργεια (με προσθήκη 20 μl μίγματος σε 15 ml σπινθηριστικό υγρό Bray s). Με αυτόν τον τρόπο λαμβάνονται περίπου 200 A 260 /ml (ή cpm/ A 260 ) Ν-Ac- [ 3 H]- L-Phe-tRNA Πειράματα πρόσδεσης υποστρωμάτων στις A και P ριβοσωματικές περιοχές Πρόσδεση του Ac-[ 3 H]-Phe-tRNA στην P περιοχή του ριβοσώματος Το διάλυμα της αντίδρασης, τελικού όγκου 50 μl, περιέχει: Tris-HCl, ph 7.4 Χλωριούχο αμμώνιο Οξικό μαγνήσιο GTP Σπερμιδίνη Ριβοσώματα poly(u) Ac[ 3 H]-L-Phe trna ζύμης β-μερκαπτοαιθανόλη 80 mm 160 mm 9 mm 0.4 mm 4 mm 30 Α 260 /ml 400 μg/ml 13 Α 260 /ml 6 mm Ακολουθεί επώαση σε υδατόλουτρο στους 30 ºC για 16 min προκειμένου να σχηματιστεί το τριμερές σύμπλοκο C, δηλαδή το Ac[ 3 H]-L-Phe-tRNA poly(u) 80S ριβόσωμα το οποίο καταλαμβάνει την P περιοχή του ριβοσώματος. Το μίγμα της 90

102 Υλικά και Μέθοδοι αντίδρασης μετά την επώαση αραιώνεται με 4 ml ψυχρού ρυθμιστικού διαλύματος που περιέχει τα εξής συστατικά: Tris-HCl, ph 7.4 Χλωριούχο αμμώνιο Οξικό μαγνήσιο Σπερμιδίνη β-μερκαπτοαιθανόλη 80 mm 160 mm 9 mm 2 mm 6 mm Το αραιωμένο μίγμα υφίσταται διήθηση υπό κενό διαμέσου δίσκου νιτρικής κυτταρίνης. Ακολούθως, ο δίσκος πάνω στον οποίο είναι προσροφημένο το τριμερές σύμπλοκο πλένεται άλλες τρεις φορές με 4 ml ψυχρού ρυθμιστικού διαλύματος. Το ποσοστό του Ac[ 3 H]-L-Phe-tRNA που έχει προσδεθεί στην Ρ-περιοχή του ριβοσώματος, υπό μορφή τριμερούς συμπλόκου, προσδιορίζεται μετά από εμβάπτιση του δίσκου νιτρικής κυτταρίνης σε 15 ml διαλύματος Bray s και μέτρηση της περιεχόμενης ραδιενέργειας σε μετρητή υγρού σπινθηρισμού Πρόσδεση του [ 3 H]-Phe-tRNA στην Α περιοχή του ριβοσώματος Αρχικά, πραγματοποιείται κατάληψη της P περιοχής του ριβοσώματος από trna σε μια αναλογία trna Phe /ριβόσωμα = 4/1. Το μίγμα της αντίδρασης τελικού όγκου 50 μl περιέχει τα ακόλουθα συστατικά: Tris-HCl, ph 7.4 Χλωριούχο αμμώνιο Οξικό μαγνήσιο GTP Σπερμιδίνη poly(u) Ριβοσώματα trna ζύμης β-μερκαπτοαιθανόλη 80 mm 160 mm 5 mm 0.4 mm 4 mm 400 μg/ml 30 Α 260 /ml 30 Α 260 /ml 6 mm Το μίγμα επωάζεται για 30 min σε θερμοκρασία 30 ºC. Ακολούθως, η συγκέντρωση των ιόντων μαγνησίου αυξάνεται στα 15 mm και επίσης προστίθεται 1,3 Α 260 [ 3 H]-L-Phe-tRNA ζύμης μαζί με το μικτό κλάσμα των διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων της μετάφρασης (SPF) σε τελική συγκέντρωση 1 mg/ml. Έπεται επώαση στην ίδια με την προαναφερόμενη θερμοκρασία για 10 min, οπότε λαμβάνει χώρα ο 91

103 Υλικά και Μέθοδοι σχηματισμός του τριμερούς συμπλόκου, ήτοι του [ 3 H]-L-Phe-tRNA poly(u) 80S ριβόσωμα. Το αραιωμένο μίγμα υφίσταται διήθηση υπό κενό διαμέσου δίσκου νιτρικής κυτταρίνης. Ακολούθως, ο δίσκος πάνω στον οποίο είναι προσροφημένο το τριμερές σύμπλοκο πλένεται άλλες τρεις φορές με 4 ml ψυχρού ρυθμιστικού διαλύματος, της ίδιας σύστασης με εκείνης της παραγράφου Το ποσοστό του [ 3 H]-L-PhetRNA που έχει προσδεθεί στην Α περιοχή του ριβοσώματος, υπό μορφή [ 3 H]-L-PhetRNA poly(u) 80S ριβόσωμα, προσδιορίζεται μετά από εμβάπτιση του δίσκου νιτρικής κυτταρίνης σε 15 ml διαλύματος Bray s και μέτρηση της περιεχόμενης ραδιενέργειας σε μετρητή υγρού σπινθηρισμού Παρασκευή σπινθηριστικού υγρού Bray s Η αναλογία των περιεχομένων συστατικών σε 2 l σπινθηριστικού υγρού είναι η ακόλουθη: Διοξάνιο 1760 ml Ναφθαλίνη 120 gr Αιθυλενογλυκόλη 40 ml Μεθανόλη 200 ml PPO 8 gr POPOP 0.4 gr Το σπινθηριστικό υγρό Bray s χρησιμοποιείται για την «παγίδευση» της εκπεμπόμενης β-ακτινοβολίας και για την μετατροπή της σε ακτινοβολία φωτονίων η οποία προσδιορίζεται σε μετρητή υγρού σπινθηρισμού (beta counter) Ανάλυση πολυσωμάτων και ριβοσωμάτων επί γραμμικής βαθμίδωσης σακχαρόζης Σε 200 ml καλλιεργειών κυττάρων αγρίου τύπου και μεταλλαγμένων στελεχών του S. cerevisiae που βρίσκονται στη μεσολογαριθμική φάση ανάπτυξης (Α 660 0,5) προστίθεται 100 μg/ml κυκλοεξιμιδίου και έπεται ταχεία ανακίνηση της καλλιέργειας για σύντομο χρονικό διάστημα. Τα κύτταρα συλλέγονται με φυγοκέντρηση στις 5000 rpm για 10 min σε θερμοκρασία 4 ºC και πλένονται δυο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα. Tα πλυμένα κύτταρα αναδιαλύονται σε 1,2 ml του ίδιου ρυθμιστικού 92

104 Υλικά και Μέθοδοι διαλύματος που περιέχει τα παρακάτω συστατικά και υπόκεινται σε μηχανικό σπάσιμο με τη χρήση γυάλινων σφαιριδίων. Hepes-KOH, ph 7.4 Χλωριούχο νάτριο Χλωριούχο μαγνήσιο Ηπαρίνη Κυκλοεξιμίδιο 10 mm 100 mm 30 mm 200 μg/ml 100 μg/ml Έπεται η προσθήκη 1,5 ml του ίδιου ρυθμιστικού διαλύματος και το δείγμα φυγοκεντρείται δυο φορές στα 5000g ( rpm) για 5 min σε θερμοκρασία 4 ºC. Το υπερκείμενο των δυο φυγοκεντρήσεων ενώνεται και τοποθετείται επί γραμμικής κλίσης σακχαρόζης 15-40% που περιέχει επίσης : Hepes-KOH, ph 7.4 Χλωριούχο αμμώνιο Χλωριούχο μαγνήσιο DTT 50 mm 50 mm 12 mm 1 mm Ακολουθεί υπερυφυγοκέντρηση του δείγματος σε κεφαλή Beckman SW28 επί 5,5 h στα g ( rpm) σε θερμοκρασία 4 ºC. Η εικόνα των πολυσωμάτων και των ριβοσωμάτων λαμβάνεται με μέτρηση στα 260nm με καταγραφικό συνεχούς ροής Aντίδραση πουρομυκίνης Η καταλυτική ενεργότητα των ριβοσωμάτων, δηλαδή η ικανότητα της κατάλυσης σχηματισμού πεπτιδικών δεσμών προσδιορίστηκε με τη βοήθεια της αντίδρασης πουρομυκίνης. Στο σύστημα αυτό αντί του πεπτιδυλο-trna χρησιμοποιείται το Ac-Phe-tRNA και αντί του εισερχόμενου αμινοάκυλο-trna χρησιμοποιείται το αντιβιοτικό πουρομυκίνη (Σχήμα 2). Όπως περιγράφηκε στην Εισαγωγή, η πουρομυκίνη είναι ένα ανάλογο του ακραίου CCA τμήματος των αμινοάκυλο-trna, προσδένεται στο ριβόσωμα στην Α περιοχή και αναστέλλει την είσοδο ενός αμινοάκυλο-trna. Επιπλέον, η πουρομυκίνη περιέχει μία α-αμινομάδα η οποία προσβάλλει την καρβονυλομάδα του Ac-Phe-tRNA σχηματίζοντας ένα προϊόν (Ac-[ 3 H]Phe-puromycin) το οποίο αποδεσμεύεται από το ριβόσωμα, δηλαδή δρα ως ψευδοϋπόστρωμα της ριβοσωματικής πεπτιδυλοτρανσφεράσης. 93

105 Υλικά και Μέθοδοι Η αντίδραση μεταξύ του τριμερούς συμπλόκου C και της πουρομυκίνης διεξάγεται σε δυο στάδια, όπως έχει ήδη προταθεί (Synetos & Coutsogeorgopoulos 1987). Το πρώτο στάδιο ή στάδιο πρόσδεσης περιλαμβάνει την αντίδραση που οδηγεί στο σχηματισμό του τριμερούς συμπλόκου C, ήτοι του Ac-[ 3 H]PhetRNA poly(u) 80S. Το δεύτερο στάδιο ή στάδιο κατάλυσης (κυρίως αντίδραση πουρομυκίνης) περιλαμβάνει το σχηματισμό του τελικού προϊόντος Ac-[ 3 H]Phepuromycin, προερχόμενου από την αντίδραση μεταξύ του ήδη σχηματισμένου τριμερούς συμπλόκου C με περίσσεια πουρομυκίνης. To τελικό προϊόν περιέχει ένα πεπτιδικό δεσμό την ταχύτητα σχηματισμού του οποίου μπορούμε να προσδιορίσουμε από την κινητική ανάλυση της αντίδρασης. Στις παραγράφους που έπονται αναλύονται τα δυο στάδια της αντίδρασης πουρομυκίνης. Τριμερές σύμπλοκο C: Ac-[ 3 H]-Phe-tRNA 80S poly(u) + Πουρομυκίνη (S) x = ποσοστό επί τις εκατό προσδεδεμένου Ac-[ 3 H]-PhetRNA (C 0 ) που έχει αντιδράσει με πουρομυκίνη Ac-[ 3 H]-Phe πουρομυκίνη (P) Σχήμα 2. Διαγραμματική αναπαράσταση της αντίδρασης πουρομυκίνης. Στην αντίδραση χρησιμοποιείται το Ac-Phe-tRNA αντί του πεπτιδυλο-trna και αντί του αμινοάκυλο-trna το αντιβιοτικό πουρομυκίνη. Ο σχηματισμός πεπτιδικού δεσμού μεταξύ Ac-Phe-tRNA και πουρομυκίνης οδηγεί στο σχηματισμό του προϊόντος Ac-[ 3 H]Phe-puromycin. 94

106 Υλικά και Μέθοδοι Στάδιο πρόσδεσης. Σχηματισμός και απομόνωση του τριμερούς συμπλόκου C Η αντίδραση σχηματισμού του τριμερούς συμπλόκου είναι όμοια με εκείνη που περιγράφηκε στην παράγραφο για την αντίδραση πρόσδεσης του Ac-[ 3 H]Phe-tRNA στη ριβοσωματική Ρ περιοχή (2.11.1) με τη μόνη διαφορά ότι ο όγκος του μίγματος της αντίδρασης είναι κατά πολύ μεγαλύτερος και καθορίζεται από τον αριθμό των δίσκων νιτρικής κυτταρίνης που απαιτούνται, δηλαδή τον αριθμό των υπό ανάλυση δειγμάτων την κάθε φορά. Το τριμερές σύμπλοκο C διαχωρίζεται από τα υπόλοιπα συστατικά του μίγματος επώασης έπειτα από προσρόφηση του σε δίσκο νιτρικής κυτταρίνης. Κατ αυτόν τον τρόπο, ο δίσκος πάνω στον οποίο έχει προσροφηθεί το τριμερές σύμπλοκο πλένεται συνολικά τέσσερις φορές με 4 ml ψυχρού ρυθμιστικού διαλύματος ίδιας σύστασης με εκείνου της παραγράφου Το ποσό του Ac-[ 3 H]Phe-tRNA που έχει προσδεθεί στην Ρ περιοχή του ριβοσώματος, υπό μορφή Ac-[ 3 H]PhetRNA poly(u) 80S ριβόσωμα, προσδιορίζεται μετά από εμβάπτιση του δίσκου νιτρικής κυτταρίνης σε 15 ml διαλύματος Bray s και μέτρηση της περιεχόμενης ραδιενέργειας σε μετρητή υγρού σπινθηρισμού. Ακολούθως, το προσροφημένο επί των δίσκων σύμπλοκο C αποπροσροφάται με την εμβάπτιση των δίσκων σε διάλυμα που περιέχει τα ακόλουθα συστατικά: Tris-HCl, ph mm Χλωριούχο αμμώνιο 160 mm Οξικό μαγνήσιο 9 mm Σπερμιδίνη 2 mm β-μερκαπτοαιθανόλη 6 mm Zwittergent % H διαδικασία αποπροσρόφησης του τριμερούς συμπλόκου από την επιφάνεια του δίσκου νιτρικής κυτταρίνης επιτυγχάνεται σε υδατόλουτρο υπό συνεχή ανάδευση στους 4 ºC για 45 min. Η εξασφάλιση όσο το δυνατόν χαμηλότερης θερμοκρασίας αποσκοπεί στην διατήρηση της ενεργότητας και της σταθερότητας του εκχυλιζόμενου τριμερούς συμπλόκου C (Theocharis & Coutsogeorgopoulos 1989). Η αποπροσρόφηση τερματίζεται με την απομάκρυνση των δίσκων από το διάλυμα εκχύλισης και το εκχύλισμα, που περιέχει το τριμερές σύμπλοκο σε σταθερή μορφή, 95

107 Υλικά και Μέθοδοι διατηρείται στους 0 ºC μέχρι να χρησιμοποιηθεί στο δεύτερο στάδιο της αντίδρασης πουρομυκίνης ως πηγή καθαρού συμπλόκου C Στάδιο κατάλυσης. Αντίδραση πουρομυκίνης σε ομογενές σύστημα Η αντίδραση πουρομυκίνης ξεκινά με την προσθήκη σε δοχείο αντίδρασης 0,9 ml εκχυλίσματος το οποίο όπως προαναφέρθηκε περιέχει το αποπροσροφημένο σύμπλοκο C. Η επαναφορά του εκχυλίσματος από τη θερμοκρασία των 0 ºC στις φυσιολογικές συνθήκες αντίδρασης πραγματοποιείται με εξισορρόπηση του επί 2 min στους 30 ºC. Μετά την παρέλευση του ως άνω χρονικού διαστήματος ακολουθεί η προσθήκη 0,1 ml διαλύματος πουρομυκίνης προεπιλεγμένης συγκέντρωσης. Η επώαση του τριμερούς συμπλόκου C με την πουρομυκίνη, η οποία σημειωτέον βρίσκεται σε περίσσεια, διεξάγεται υπό συνεχή ανάδευση στους 30 ºC και για χρονικά διαστήματα που καθορίζονται από τη συγκέντρωση της. Ενδεικτικά αναφέρεται, πως για τη μέγιστη αρχική συγκέντρωση πουρομυκίνης, δηλαδή τα 20 mm, η επώαση διεξάγεται σε σύντομα χρονικά διαστήματα επί παραδείγματι σε 15 και σε 30 sec, ενώ για την ελάχιστη αρχική συγκέντρωση πουρομυκίνης, δηλαδή τα 0,625 mm, η επώαση διεξάγεται σε μεγαλύτερα χρονικά διαστήματα επί παραδείγματι σε 4, σε 6 και σε 8 min. Μια πλήρης αντίδραση πουρομυκίνης απαιτεί τη χρήση τουλάχιστον τεσσάρων, συνήθως πέντε, διαφορετικών συγκεντρώσεων πουρομυκίνης κάθε μια από τις οποίες επωάζεται με το τριμερές σύμπλοκο C για τουλάχιστον τρεις διαφορετικούς χρόνους. Η επώαση του τριμερούς συμπλόκου C με την πουρομυκίνη τερματίζεται με την προσθήκη 1 ml διαλύματος 1Ν NaOH. Η ανακίνηση του αλκαλικού μίγματος (συνολικού τελικού όγκου 2 ml) συνεχίζεται για ακόμα μισή ώρα στους 30 ºC. Μετά την παρέλευση του ως άνω χρονικού διαστήματος, 0,8 ml του αλκαλικού μίγματος της αντίδρασης αναμιγνύονται με 10 ml διαλύματος σπινθηριστικού υγρού Safefluor ή με 7 ml διαλύματος σπινθηριστικού υγρού Optifluor και η περιεχόμενη ραδιενέργεια καταγράφεται σε μετρητή β-ακτινοβολίας. Και τα δυο σπινθηριστικά υγρά περιέχουν δις-(2-αιθυλέξυλ)-σουλφοηλεκτρικό νάτριο, αιθοξυ-αλκυλφαινόλη, τριβουτυλεστέρα του φωσφορικού οξέος, αλκυλιωμένα παράγωγα του βενζολίου, PPO και 1,4-δις-(4-μέθυλο)-βενζόλιο. Η τιμή της προσδιοριζόμενης ραδιενέργειας συμβολίζεται χάριν συντομίας ως Ν ο και αντιστοιχεί στο προϊόν της αντίδρασης (Ρ), δηλαδή του Ac-[ 3 H]Phe-puromycin, καθώς επίσης στο ποσό του Ac-[ 3 H]Phe-tRNA 96

108 Υλικά και Μέθοδοι το οποίο αν και έχει οδεύσει προς σχηματισμό τριμερούς συμπλόκου C εντούτοις δεν έχει αντιδράσει με πουρομυκίνη. Άλλα 0,8 ml του αλκαλικού μίγματος της αντίδρασης μεταγγίστηκαν σε σωλήνα φυγοκέντρησης στον οποίο προστέθηκαν επίσης 2 ml διαλύματος οξικού αιθυλεστέρα. Ακολούθησε έντονη ανάδευση του μίγματος για 1 min, ανά διαστήματα των 5 δευτερολέπτων με ενδιάμεσες παύσεις. Ακολούθησε φυγοκέντρηση του μίγματος σε επιτραπέζια φυγόκεντρο στις 3500 rpm για 1 min. Με αυτόν τον τρόπο διαχωρίζεται η ραδιενέργεια που περιέχεται στο μίγμα υπό μορφή τριμερούς συμπλόκου από την ραδιενέργεια του προϊόντος της αντίδρασης (Leder & Bursztyn 1966). Στη συνέχεια, 1,5 ml από την οργανική φάση αναμίχθηκαν με 10 ml διαλύματος σπινθηριστικού υγρού Safefluor ή με 7 ml διαλύματος σπινθηριστικού υγρού Optifluor και η περιεχόμενη ραδιενέργεια καταγράφεται σε μετρητή β- ακτινοβολίας. Η τιμή της προσδιοριζόμενης ραδιενέργειας αντιστοιχεί στο προϊόν της αντίδρασης (Ρ), δηλαδή του Ac-[ 3 H]Phe-puromycin. Εφ όσον το 100% του προσδεδεμένου δότη (Ν ο ), μετατρέπεται σε προϊόν πουρομυκίνης, τότε η αρχική συγκέντρωση του συμπλόκου C (C ο ) λαμβάνεται ως αριθμητικά ίση προς Ν ο. Επειδή στην πράξη αυτό συμβαίνει δύσκολα και το C ο είναι διαφορετικό από το Ν ο, χρησιμοποιείται ο συντελεστής διόρθωσης (extent factor) α, όπου C ο =α Ν ο. Το ποσοστό x του προσδεδεμένου στο ριβόσωμα Ac-[ 3 H]-Phe-tRNA, το οποίο αντέδρασε με πουρομυκίνη και σχημάτισε το προϊόν Ac-[ 3 H]-Phepuromycin (Ρ), υπολογίζεται από το λόγο (Ρ/Ν ο )x100. Η τιμή του εκατοστιαίου ποσοστού x απουσία πουρομυκίνης, που προέρχεται από επώαση του τριμερούς συμπλόκου με αποστειρωμένο νερό, προσδιορίζεται σε κάθε πείραμα και αφαιρείται από τις υπόλοιπες τιμές του x. Το τελικό σημείο της καμπύλης προόδου της αντίδρασης προσδιορίζεται η έκταση της αντίδρασης (final extent), δηλαδή το ποσοστό του δότη (Ac[ 3 H]PhetRNA) που έχει προσδεθεί στην Ρ-περιοχή του ριβοσώματος και αντιδρά ποσοτικά με την πουρομυκίνη μέχρι εξαντλήσεως του συμπλόκου C. Από την κλίση της καμπύλης προόδου προσδιορίζεται η δραστικότητα του δότη ως προς το υπόστρωμα S (πουρομυκίνη) και η οποία για κάθε συγκέντρωση πουρομυκίνης σχετίζεται με τη φαινομενική σταθερά ταχύτητας k obs. 97

109 Υλικά και Μέθοδοι Κινητική ανάλυση της αντίδρασης πουρομυκίνης Η αντίδραση του συμπλόκου C με περίσσεια πουρομυκίνης (S) προς παραγωγή προϊόντος Ac-Phe-puromycin (P) και συμπλόκου (C ) είτε επί του δίσκου, είτε στο διάλυμα, ακολουθεί κινητική ψευδοπρώτης τάξης επειδή ακριβώς το σύστημα βρίσκεται σε συνθήκες κορεσμού σε υπόστρωμα (πουρομυκίνη). Το απλούστερο κινητικό σχήμα το οποίο μπορεί να περιγράψει την αντίδραση αυτή είναι το εξής: K s k 3 C + S CS C + P k 3 είναι η καταλυτική σταθερά της πεπτιδυλοτρανσφεράσης K s είναι η σταθερά διάστασης του συμπλόκου CS όπου K S = [ C][ S ] [ CS ] όπου C είναι η μορφή του συμπλόκου C το οποίο φέρει προσδεδεμένο το αποακυλιωμένο-trna και δεν μπορεί να επανέλθει στην ενεργό μορφή αυτού C όπως συμβαίνει στις κλασσικές ενζυμικές αντιδράσεις. Η ολική συγκέντρωση του συμπλόκου C δίνεται από τη σχέση: C 0 = C+CS+C Επειδή C = Ρ προκύπτει ότι C 0 = C+CS+Ρ ή C 0 -P=C+CS (1) Θεωρώντας ότι αποκαθίσταται ταχέως η ισορροπία μεταξύ των C, S και CS πριν σχηματισθεί το προϊόν Ρ, η ταχύτητα της αντίδρασης δίνεται από τη σχέση: V= d[p] = [CS ] k 3 dt Έτσι, προκύπτει: Επίσης: V C 0 -P = [CS] k 3 [C]+[CS] K s = [C][S] [CS] [CS] = [C][S] K s Άρα: 98

110 Υλικά και Μέθοδοι V C 0 -P [C][S] [S] [S] k 3 k 3 K s = k V K s 3 = V K s = [C] [C][S] C 0 -P [S] C 0 -P + K 1+ s + [S] K s K s K s V C 0 -P [S] k 3 = V = K s + [S] (C 0 -P)[S] k 3 K s + [S] Με ολοκλήρωση της παραπάνω εξίσωσης προκύπτει ο ολοκληρωμένος κινητικός νόμος: d[p] V = = dt (C 0 -P)[S] k 3 d[p] [S] k = 3 d[p] dt = K s + [S] C 0 -P Ks + [S] C 0 -P [S] k 3 dt K s + [S] C ln C0 -P [S]k 3 = Ks + [S] = k obs t Η τιμή της φαινομενικής σταθεράς ψευδοπρώτης τάξης k obs δίνεται από τη σχέση: k obs [S] k 3 = K s +[S] Έτσι: C 0 ln = k obs t ln C 0 -P 1 1 = k obs t P C ln 100P 100 C 0 = k obs t Εάν x είναι το ποσοστό μετατροπής του C 0 σε P τότε: xc 0 P = P x = C0 Άρα: 100 ln = k obs t 100-x Η εξίσωση αυτή προβλέπει ότι για ορισμένη συγκέντρωση υποστρώματος (S), η γραφική παράσταση του ln[100/(100-x)] έναντι του χρόνου t θα είναι μία ευθεία γραμμή με κλίση ίση προς την τιμή της k obs. 99

111 } k obs t Υλικά και Μέθοδοι ln x Υπολογίζοντας την τιμή της k obs σε διάφορες συγκεντρώσεις πουρομυκίνης, καθίσταται δυνατόν να υπολογισθούν οι τιμές των κινητικών σταθερών k 3 και K s. Ετσι, από την εξίσωση: K s + [S] K 1 s 1 1 = = + k obs k 3 [S] k 3 [ S] k 3 προκύπτει το διάγραμμα του διπλού αντιστρόφου (double reciprocal plot, DR-plot): 1/k obs 1/k 3 1/K s 1/[S] 2.13 In vitro δοκιμασία μετατόπισης (in vitro translocation assay) Το μίγμα αντίδρασης για την μετατόπιση (100 μl) είναι το ίδιο με το διάλυμα που χρησιμοποιήθηκε για τον σχηματισμό του τριμερούς συμπλόκου C στην αντίδραση πουρομυκίνης (Παράγραφος ). Επιπλέον, περιείχε GTP, poly(u) και trna phe. Η αναλογία trna phe προς ριβοσώματα ήταν 4:1, έτσι ώστε, όλες οι P- περιοχές να καταληφθούν με trna. Ακολούθησε επώαση του μίγματος για 30 min στους 30 ο C και κατόπιν προσθήκη Ac[ 3 H]Phe-tRNA, ενώ η συγκέντρωση των ιόντων μαγνησίου αυξάνεται στα 15 mm. Μετά από επώαση 10 min στους 30 ο C όλες οι P-περιοχές είχαν καταληφθεί με trna και οι Α-περιοχές με Ac[ 3 H]Phe-tRNA. Η αντίδραση σχηματισμού του PRE-ριβοσωματικού συμπλόκου τερματίστηκε τοποθετώντας το μίγμα αντίδρασης στον πάγο. Ακολούθησε διήθηση και αποπροσρόφηση του ριβοσωμικού συμπλόκου, όπως και στην αντίδραση 100

112 Υλικά και Μέθοδοι πουρομυκίνης. Η αντίδραση μετατόπισης άρχισε με την προσθήκη EF2 ή μικτού κλάσματος διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων (SPF) από ζύμη στο προεπωασμένο για 2 min στους 30 ο C μίγμα προμετατόπισης. Μετά την πάροδο συγκεκριμένων χρονικών περιόδων προστέθηκαν 2 mm πουρομυκίνης για 4 min. Με τον τρόπο αυτό κατέστη δυνατή η μέτρηση της μετατόπισης για κάθε μια από της χρονικές περιόδους. Στο διάλυμα πουρομυκίνης υπήρχε και κυκλοεξιμίδιο σε τελική συγκέντρωση 100 μμ για να αποκλειστεί η πιθανότητα μετατόπισης κατά τη διάρκεια της αντίδρασης πουρομυκίνης. Επιπλέον, προσδιορίστηκε η ευαισθησία των διαφόρων στελεχών έναντι του κυκλοεξιμιδίου, όταν αυτό προστίθεται μαζί με τον EF2 ή τους SPF κατά την διάρκεια της αντίδρασης μετατόπισης για συγκεκριμένο χρόνο (1min). Ακολούθησε προσδιορισμός του προϊόντος Ac-[ 3 H]Phe-πουρομυκίνης όπως περιγράφηκε προηγουμένως Παρασκευή κυττάρων ζύμης για μελέτη δεικτών οξειδωτικού στρες Αγρίου τύπου και μεταλλαγμένα κύτταρα του ζυμομύκητα S. cerevisiae αναπτύσσονται σε θρεπτικό υλικό YPD, απουσία ή παρουσία παρομομυκίνης, έως ότου προσεγγίσουν ένα πληθυσμό μεγαλύτερο ή τουλάχιστον ίσο προς 10 8 κύτταρα/ml, που αντιστοιχεί στην όψιμη λογαριθμική φάση ανάπτυξης (late log phase). Ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε σε αιμοκυτταρόμετρο, ώστε να διασφαλιστεί ότι όλες οι καλλιέργειες σταμάτησαν στην ίδια φάση ανάπτυξης. Ακολούθησε η συλλογή των κυττάρων με φυγοκέντρηση (5000 rpm, 10 min, 4 ºC) και πλύσιμό τους δυο φορές με αποστειρωμένο νερό και δυο φορές με ρυθμιστικό διάλυμα ομογενοποίησης της παρακάτω σύστασης : Tris-HCl ph 7.4 KCl Οξικό μαγνήσιο BHA PMSF 10 mm 10 mm 5 mm 1 mm 1 mm Τα κύτταρα επαναδιαλυτοποιούνται στο ίδιο με πριν ρυθμιστικό διάλυμα (2-3 ml διαλύματος / g κυττάρων). Ακολουθεί η λύση των κυττάρων με την ίδια διαδικασία όπως αυτή περιγράφηκε στην παράγραφο 2.4 (Παρασκευή συστήματος ελεύθερου κυττάρων). Η απομάκρυνση των γυάλινων σφαιριδίων και των άθικτων κυττάρων γίνεται με φυγοκέντρηση σε κεφαλή SS34 στα 4000g ( 6000 rpm), για 5 101

113 Υλικά και Μέθοδοι min στους 4 ºC. Έπεται η συλλογή του υπερκείμενου κλάσματος το οποίο υφίσταται απαέρωση με διοχέτευση αερίου αζώτου και τα δείγματα αποθηκεύονται στους -70º C. Τα πειράματα προσδιορισμού των διαφόρων δεικτών οξειδωτικού στρες πραγματοποιήθηκαν από την ερευνητική ομάδα του Αναπλ. Καθηγητή Βιοχημείας του Τμήματος Βιολογίας του Πανεπιστημίου Πατρών κ. Χρ. Γεωργίου Προετοιμασία των γυάλινων σφαιριδίων Για την αλλαγή του χρώματός τους, από πράσινο σε λευκό, τα σφαιρίδια επωάστηκαν με 2 % διττανθρακικό νάτριο στους 100 ο C, για 10 min. Ακολούθησε προσθήκη πυκνού υδροχλωρικού οξέος και ολονύχτια επώασή τους σε θερμοκρασία δωματίου. Τα σφαιρίδια πριν τη χρήση τους, ξεπλύθηκαν από το υδροχλωρικό οξύ δέκα φορές με νερό βρύσης και άλλες δέκα φορές με απιονισμένο νερό. Ακολούθως στέγνωσαν και αποστειρώθηκαν σε κλίβανο ξηρής αποστείρωσης για 1,5 h στους 180 C. 102

114 Αποτελέσματα

115 Αποτελέσματα Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής μπορούν να χωρισθούν σε έξι ενότητες: Στην πρώτη ενότητα μελετήθηκε ο ρόλος της εξωριβοσωματικής μετάλλαξης sal6 καθώς επίσης και της μετάλλαξης asu9 επί διαφόρων παραμέτρων της ριβοσωματικής λειτουργίας στη ζύμη. Η μελέτη αυτή εστιάστηκε στον προσδιορισμό των επιπέδων της μεταφραστικής πιστότητας, στην διαλεύκανση της επίδρασης επί της καταλυτικής ενεργότητας δηλαδή στην ταχύτητα σχηματισμού πεπτιδικών δεσμών αλλά και στην μετατόπιση του πεπτιδύλοtrna από την Α στην P ριβοσωματική περιοχή. Επίσης, εξετάστηκε η επίδραση των αντιβιοτικών παρομομυκίνης και κυκλοεξιμιδίου τόσο επί της κυτταρικής ανάπτυξης όσο και επί των προαναφερθεισών ριβοσωματικών λειτουργιών. Επί πλέον, επιχειρήθηκε η μελέτη της επίδρασης αυτών των μεταλλάξεων επί της δομής του ριβοσώματος της ζύμης. Στην δεύτερη ενότητα επιχειρήθηκε η πλήρης διαλεύκανση του ρόλου των μεταλλάξεων rdn1a και rdn1t της έλικας 34 και της rdn2 της έλικας 18 του 18S rrna της ζύμης. Στόχος της μελέτης αυτής ήταν η επίδραση των μεταλλάξεων στην καταλυτική ενεργότητα του ριβοσώματος καθώς και η πιθανή επίδρασή τους επί του σταδίου μετατόπισης της μετάφρασης. Μέρος των αποτελεσμάτων αυτών έχουν δημοσιευθεί στο διεθνές περιοδικό με κριτές Biochemistry. Η πλήρης αναφορά είναι: Konstantinidis, T. C., Patsoukis, N., Georgiou, C. D. & Synetos, D. (2006) Translational fidelity mutations in 18S rrna affect the catalytic activity of ribosomes and the oxidative balance of yeast cells. Biochemistry 45, Στην τρίτη ενότητα μελετήθηκε ο ρόλος της μετάλλαξης com1 της έλικας 12 και της μετάλλαξης com6 της έλικας 34 του 18S rrna της ζύμης στη ριβοσωματική λειτουργία. Για το σκοπό αυτό μελετήθηκε η επίδραση των παραπάνω μεταλλάξεων σε συνδυασμό με τη μετάλλαξη rdn2 της έλικας 18 του 18S rrna της ζύμης. Στόχος της μελέτης αυτής ήταν η επίδραση των μεταλλάξεων επί της καταλυτικής ενεργότητας του ριβοσώματος, επί του σταδίου μετατόπισης της μετάφρασης και επί της ανθεκτικότητας έναντι αντιβιοτικών. 105

116 Αποτελέσματα Στόχος της τέταρτης ενότητας ήταν η διερεύνηση της επίδρασης της μετάλλαξης rdn12α στη συντηρημένη θηλιά 530 της έλικας 18 του 18S rrna της ζύμης επί της ενεργότητας της πεπτιδυλοτρανσφεράσης και επί του σταδίου μετατόπισης του πεπτιδύλο-trna από την Α στην P ριβοσωματική περιοχή. Η ερευνητική προσέγγιση αποσκοπεί στη διαλεύκανση της εξελικτικής συντήρησης κρίσιμων για τη ριβοσωματική λειτουργία περιοχών της μικρής ριβοσωματικής υπομονάδας. Στην πέμπτη ενότητα μελετήθηκε ο ρόλος μιας μετάλλαξης του 25S rrna, της com3, στη μεγάλη ριβοσωματική υπομονάδα. Ως γνωστόν, η κύρια ενεργότητα της μεγάλης υπομονάδας είναι η κατάλυση του σχηματισμού πεπτιδικών δεσμών. Εκτός, από την επίδραση της com3 επί της ενεργότητας της πεπτιδυλοτρανσφεράσης εξετάστηκε η επίδραση της επί της μεταφραστικής πιστότητας ο καθορισμός της οποίας ελέγχεται κατεξοχήν από το rrna της μικρής ριβοσωματικής υπομονάδας. Στην τελευταία ενότητα της παρούσας διατριβής εξετάζεται η πιθανότητα συσχέτισης της πιστότητας με την οποία επιτελούν τη μετάφραση τα κύτταρα προς την οξειδωτική τους κατάσταση. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν οι μεταλλάξεις μεταφραστικής πιστότητας rdn1a, rdn1t και rdn2 του 18S rrna της ζύμης. Σε εκχυλίσματα κυττάρων των προαναφερθέντων στελεχών προσδιορίστηκαν χαρακτηριστικοί δείκτες της οξειδωτικής κατάστασης. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν από την ερευνητική ομάδα του Αναπληρωτή Καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας κου Χρήστου Γεωργίου. Μέρος των αποτελεσμάτων αυτών έχουν δημοσιευθεί στο διεθνές περιοδικό με κριτές Biochemistry. Η πλήρης αναφορά είναι: Konstantinidis, T. C., Patsoukis, N., Georgiou, C. D. & Synetos, D. (2006) Translational fidelity mutations in 18S rrna affect the catalytic activity of ribosomes and the oxidative balance of yeast cells. Biochemistry 45,

117 Αποτελέσματα 1. ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ΣΕ ΕΞΩΡΙΒΟΣΩΜΑΤΙΚΑ ΣΥΣΤΑΤΙΚΑ ΕΠΙ ΤΗΣ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΑΣ ΚΑΙ ΤΗΣ ΔΟΜΗΣ ΤΟΥ ΡΙΒΟΣΩΜΑΤΟΣ ΤΗΣ ΖΥΜΗΣ 1.1 Τα στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν Εκτός από την διασαφήνιση του ρόλου ορισμένων συστατικών του ριβοσωματικού RNA επί χαρακτηριστικών παραμέτρων της πρωτεϊνοσύνθεσης, το ενδιαφέρον της παρούσας διατριβής στράφηκε επίσης στην διερεύνηση της ανάμειξης εξωριβοσωματικών συστατικών στη ριβοσωματική λειτουργία και κατ επέκταση στην ίδια τη διαδικασία της μετάφρασης. Τα συστατικά αυτά δεν αφορούν το rrna ή τις ριβοσωματικές πρωτεΐνες, που είναι τα κατεξοχήν αρμόδια και υπεύθυνα μόρια για την προώθηση της ριβοσωματικής λειτουργίας, αλλά παράγοντες που ενδεχομένως επηρεάζουν τη ριβοσωματική λειτουργία είτε άμεσα είτε έμμεσα. Τα στελέχη ζύμης που χρησιμοποιήθηκαν στη συγκεκριμένη φάση είναι τα ακόλουθα: Το στέλεχος SL870-1B, που φέρει τη σημειακή μετάλλαξη sup45 η οποία αφορά την αντικατάσταση της κυτοσίνης από γουανίνη στη θέση 256 του γονιδίου SUP45 και η οποία προκαλεί την υποκατάσταση της προλίνης από αλανίνη στην αμινοξική θέση 86 της περιοχής Ι της πολυπεπτιδικής αλυσίδας του ευκαρυωτικού παράγοντα τερματισμού erf1 (Velichutina et al. 2001). Χρησιμοποιήθηκε ως το στέλεχος-μάρτυρας και στο εξής θα αναφέρεται ως sup45. Το στέλεχος SL870-1Α, το οποίο φέρει δυο μεταλλάξεις στο γονίδιο που κωδικοποιεί την φωσφατάση σερίνης/θρεονίνης SAL6. Η πρώτη μετάλλαξη αφορά την αντικατάσταση ενός καταλοίπου γουανίνης προς θυμίνη, που προκαλεί την αντικατάσταση ενός κωδικίου τρυπτοφάνης (TGG) προς λευκίνη (TTG) στην θέση του αμινοξέος 270. Η δεύτερη μετάλλαξη προκαλεί αλλαγή του πλαισίου ανάγνωσης της φωσφατάσης με την προσθήκη ενός καταλοίπου αδενίνης σε απόσταση τριών ζευγών βάσεων προς το 3 άκρο από την προαναφερθείσα υποκατάσταση (Vincent et al. 1994).Το στέλεχος που φέρει τη μετάλλαξη sal6 θα αναφέρεται ως sal6sup45. Το στέλεχος SL980-9C, το οποίο στη μελέτη μας θα αναφέρεται ως asu9sup45. Ωστόσο, δεν υπάρχουν πληροφορίες ως προς το τι είδους μετάλλαξη είναι η asu9 ούτε για το προϊόν που κωδικοποιεί το φυσιολογικό ASU9 γονίδιο. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι επηρεάζει τη ριβοσωματική λειτουργία τροποποιώντας τη δράση κάποιου ριβοσωματικού παράγοντα (Liebman and Cavenagh 1979). 107

118 Αποτελέσματα Το στέλεχος L1520, το οποίο φέρει και τις τρεις προαναφερθείσες μεταλλάξεις και το οποίο θα αναφέρεται στο εξής ως το τριπλά μεταλλαγμένο στέλεχος sal6asu9sup45. Ας σημειωθεί, τέλος, πως η ταυτόχρονη παρουσία της σημειακής μετάλλαξης sup45 στα στελέχη SL870-1Α και SL980-9C είναι απαραίτητη για την εκδήλωση της δράσης των μεταλλάξεων sal6 (Song & Liebman 1987) και asu9 (Liebman & Cavenagh 1979), αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα που παρατίθενται έχουν παρουσιαστεί στις ανακοινώσεις 4 και 11 του Παραρτήματος ΙΙ. 1.2 Καμπύλες ανάπτυξης αγρίου τύπου και μεταλλαγμένων στελεχών Η ανάπτυξη των κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε 200 ml θρεπτικού μέσου YPD ξεκινώντας από μια αρχική συγκέντρωση 10 5 κυττάρων/ml. Ο αριθμός των κυττάρων μετρήθηκε ανά χρονικά διαστήματα δυο ωρών μέχρις ότου κάθε καλλιέργεια σταθεροποιηθεί στην όψιμη λογαριθμική φάση ανάπτυξης. Από τις καμπύλες ανάπτυξης που παρουσιάζονται στο Σχήμα 3, δεν εμφανίζονται σημαντικές διαφορές στην ανάπτυξη των κυττάρων των στελεχών sup45 και sal6sup45, καθώς ο χρόνος διπλασιασμού τους προσδιορίστηκε στα 173 και 172 min, αντίστοιχα. Με άλλα λόγια, η επιπλέον παρουσία της μετάλλαξης sal6 δεν επηρέασε τον φαινότυπο ανάπτυξης του διπλά μεταλλαγμένου στελέχους. Αντίθετα, η παρουσία της μετάλλαξης asu9 ευνόησε την ανάπτυξη των κυττάρων του asu9sup45 στελέχους, παρουσιάζοντας ελάττωση κατά 22% του χρόνου διπλασιασμού (135 min) σε σύγκριση με το στέλεχος-μάρτυρα sup45. Τέλος, η ταυτόχρονη παρουσία των μεταλλάξεων sal6 και asu9 σε στέλεχος με υπόστρωμα sup45 αύξησε έτι περαιτέρω το χρόνο διπλασιασμού του τελευταίου. Πράγματι, η ανάπτυξη των κυττάρων του τριπλά μεταλλαγμένου στελέχους, sal6asu9sup45, μειώθηκε κατά 11% περίπου και διαμορφώθηκε στα 191 min. 108

119 Αποτελέσματα 1000 Αριθμός κυττάρων (x 10 6 /ml) , Χρόνος (ώρες) Σχήμα 3. Καμπύλες ανάπτυξης κυττάρων ζύμης. Τα κύτταρα (αρχική συγκέντρωση 10 5 κύτταρα/ml) αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό υλικό YPD στους 30 ºC. Στελέχη: ( ) sup45, μάρτυρας, ( ) sal6sup45, ( ) asu9sup45, ( ) sal6asu9sup Πρωτεϊνοσυνθετική ενεργότητα των μεταλλαγμένων ριβοσωμάτων Σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης των αγρίου τύπου και των μεταλλαγμένων ριβοσωμάτων Η ενεργότητα των ριβοσωμάτων του στελέχους-μάρτυρα και των μεταλλαγμένων στελεχών, δηλαδή η ικανότητα τους για πρωτεϊνοσύνθεση, προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την in vitro poly(u) δοκιμασία για τη σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης. Η πρωτεϊνοσυνθετική ικανότητα των ριβοσωμάτων εξαρτάται από την παρουσία διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων της μετάφρασης οι οποίοι περιέχονται ούτως ή άλλως στο ακάθαρτο εκχύλισμα S30 που προκύπτει κατά την παρασκευή του συστήματος ελεύθερο κυττάρων. Στο Σχήμα 4 φαίνεται ότι η σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης των sup45 ριβοσωμάτων προσδιορίστηκε στα 46 pmol φαινυλαλανίνης για κάθε pmol ριβοσώματος. Στο ίδιο Σχήμα φαίνεται ότι η ενεργότητα των asu9sup45 μεταλλαγμένων ριβοσωμάτων κυμαίνεται στα ίδια περίπου επίπεδα με εκείνα των sup45 ριβοσωμάτων. Αντίθετα, η ικανότητα των sal6sup45 ριβοσωμάτων μειώθηκε σε σχέση με την αντίστοιχη των sup45 ριβοσωμάτων από 46 στα 36 pmol φαινυλαλανίνης για κάθε pmol ριβοσώματος. Επιπλέον, η ικανότητα σύνθεσης 109

120 Αποτελέσματα πολυφαινυλαλανίνης των sal6asu9sup45 ριβοσωμάτων παρουσίασε μια αύξηση της τάξης του 50% σε σχέση με εκείνη των sup45 ριβοσωμάτων, προσδιοριζόμενη στα 70 pmol φαινυλαλανίνης για κάθε pmol ριβοσώματος. 200 Σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης (pmol Phe/pmol ribs) * Σχήμα 4. Έκταση σύνθεσης πολυφαινυλαλανίνης στους 30 ºC μετά από επώαση 64 min για τα ριβοσώματα του στελέχους-μάρτυρα και των μεταλλαγμένων στελεχών, απουσία (λευκές στήλες) και παρουσία 50 μμ παρομομυκίνης (μαύρες στήλες). Η σειρά των στελεχών είναι από αριστερά προς δεξιά: sup45, sal6sup45, asu9sup45 και sal6asu9sup45. Με αστερίσκο υποδηλώνεται η στατιστικώς σημαντική διαφορά σε σύγκριση με τα sup45 ριβοσώματα (στελέχους-μάρτυρα). Όταν στο in vitro poly(u) σύστημα για τη σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης προστεθεί το αμινογλυκοζιτικό αντιβιοτικό παρομομυκίνη σε τελική συγκέντρωση 50 μμ, τότε παρατηρείται μία αύξηση στη σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης κατά 3 έως 4 φορές σε όλα τα στελέχη (Σχήμα 4), χωρίς, ωστόσο, να διαταράσσεται η καταγραφείσα τάση. Έτσι, τα ριβοσώματα των στελεχών sup45 και asu9sup45 εμφανίζουν σχεδόν ίδια ενεργότητα, με τις τιμές ενσωμάτωσης φαινυλαλανίνης να προσδιορίζονται στα 152 και 163 pmol φαινυλαλανίνης για κάθε pmol ριβοσώματος, αντίστοιχα. Όπως παρατηρήθηκε απουσία παρομομυκίνης, η ικανότητα των sal6sup45 ριβοσωμάτων ήταν ελαφρώς μικρότερη σε σχέση με εκείνη του sup45 στελέχους (ενσωμάτωση 137 pmol φαινυλαλανίνης για κάθε pmol ριβοσώματος). Η πρωτεϊνοσυνθετική ικανότητα των sal6asu9sup45 ριβοσωμάτων προσδιορίστηκε στα 172 pmol φαινυλαλανίνης για κάθε pmol ριβοσώματος, ήταν δηλαδή ελαφρώς μεγαλύτερη σε σύγκριση με την αντίστοιχη των sup45 ριβοσωμάτων. 110

121 Αποτελέσματα Κινητική ενσωμάτωσης φαινυλαλανίνης Ένα επί πλέον κριτήριο της πρωτεϊνοσυνθετικής ενεργότητας των ριβοσωμάτων του στελέχους-μάρτυρα και των μεταλλαγμένων στελεχών προέρχεται από τις in vitro δοκιμασίες της κινητικής της αντίδρασης σχηματισμού πολυφαινυλαλανίνης, με τις οποίες προσδιορίζεται σε κάθε χρονική στιγμή η σχηματιζόμενη πολυφαινυλαλανίνη. Από το σχηματισμό των καμπυλών που έδωσε η κινητική ανάλυση (Σχήμα 5), παρατηρήθηκε ότι τα ριβοσώματα όλων ανεξαιρέτως των στελεχών παρουσιάζουν, με ασήμαντες διαφοροποιήσεις, την ίδια έκταση της πρωτεϊνοσυνθετικής τους ικανότητας δηλαδή παρόμοια μέγιστη ικανότητα σχηματισμού πολυφαινυλαλανίνης. Επί πλέον, τα ριβοσώματα όλων των μεταλλαγμένων στελεχών εμφανίζουν ελαφρώς υψηλότερους αρχικούς ρυθμούς πρωτεϊνοσύνθεσης σε σύγκριση με τα ριβοσώματα του στελέχους-μάρτυρα, sup45. Αυτό υποδηλώνουν οι ελαφρώς μεγαλύτερες κλίσεις των ευθειών των συγκεκριμένων καμπυλών. 50 Πολυφαινυλαλανίνη (cpm x 10 4 /A260 ribs) Χρόνος (min) Σχήμα 5. Κινητική του σχηματισμού της πολυφαινυλαλανίνης στους 30 ºC για τα ριβοσώματα από κύτταρα του στελέχους-μάρτυρα και από κύτταρα των μεταλλαγμένων στελεχών. Καμπύλες: ( ) sup45, μάρτυρας, ( ) sal6sup45, ( ) asu9sup45, ( ) sal6asu9sup Επίδραση εξωριβοσωματικών συστατικών επί της πιστότητας της μετάφρασης, απουσία και παρουσία παρομομυκίνης 111

122 Αποτελέσματα Προσδιορισμός επιπέδων μεταφραστικής πιστότητας απουσία παρομομυκίνης Η πιστότητα της μετάφρασης προσδιορίζεται από τη συχνότητα λάθους (Error Frequency). Η συχνότητα λάθους, στην in vitro δοκιμασία μετάφρασης η οποία εφαρμόζεται στο Εργαστήριο Βιολογικής Χημείας, ορίζεται ως ο λόγος της λανθασμένης ενσωμάτωσης ραδιενεργού λευκίνης προς το άθροισμα των ενσωματώσεων ραδιενεργού φαινυλαλανίνης και λευκίνης, χρησιμοποιώντας ως τεχνητό μήνυμα (mrna) την επαναλαμβανόμενη αλληλουχία UUU η οποία κωδικοποιεί τη σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης. Από τα δεδομένα του Πίνακα 4 προκύπτει ότι στη διαμόρφωση των βέλτιστων για τη ριβοσωματική λειτουργία- επιπέδων μεταφραστικών λαθών συμμετέχουν και εξωριβοσωματικά συστατικά. Πρόκειται για τις πρώτες ενδείξεις ότι η πιστότητα της μετάφρασης δεν επηρεάζεται μόνο από αμιγώς ριβοσωματικά συστατικά, δηλαδή από το rrna και από τις πρωτεΐνες των δυο υπομονάδων. Παρατηρείται, λοιπόν, πως η μετάλλαξη sup45 στο γονίδιο που κωδικοποιεί τον παράγοντα απελευθέρωσης erf1 προκαλεί σημαντική απώλεια της μεταφραστικής πιστότητας σε σύγκριση με ένα φυσιολογικό στέλεχος ζύμης. Πράγματι, ενώ η in vitro συχνότητα λάθους για τα φυσιολογικά κύτταρα έχει προσδιοριστεί στα 16 λάθη ανά 10 4 μεταφραζόμενα κωδίκια (Loftfield & Vanderjagt 1972, Bouadloun et al. 1983), η μετάλλαξη sup45 πολλαπλασίασε σε τη συχνότητα λάθους κατά 9 φορές στις 144 λανθασμένες ενσωματώσεις ανά 10 4 μεταφραζόμενα κωδίκια. Επειδή δε η μετάλλαξη αυτή δεν αναγνωρίζει τα κωδίκια λήξης κατά τη μετάφραση αναφέρεται και ως κατασταλτική μετάλλαξη. Η μετάλλαξη sal6 του γονιδίου που κωδικοποιεί την φωσφατάση σερίνης/θρεονίνης SAL6 ενίσχυσε περαιτέρω τον φαινότυπο μεταφραστικής καταστολής που προκαλεί η μετάλλαξη sup45. Η συχνότητα λάθους των sal6sup45 ριβοσωμάτων αυξήθηκε κατά 202 επιπλέον λανθασμένες ενσωματώσεις λευκίνης ανά 10 4 κωδίκια, από 0,0144 για το στέλεχος-μάρτυρα sup45 σε 0,0346 (Πίνακας 4). Αντίθετα, η μετάλλαξη asu9, περιόρισε τον κατασταλτικό χαρακτήρα της μετάλλαξης sup45. Τα asu9sup45 ριβοσώματα επιτελούν τη μετάφραση με μεγαλύτερη ακρίβεια σε σχέση με τα sup45 ριβοσώματα, αφού ελάττωσαν τη μεταφραστική συχνότητα λάθους των τελευταίων κατά 5 φορές, σε μόλις 28 λανθασμένες ενσωματώσεις λευκίνης. Τέλος, η παρουσία της μετάλλαξης sal6 στο διπλά μεταλλαγμένο στέλεχος 112

123 Αποτελέσματα asu9sup45 προκάλεσε διπλασιασμό της συχνότητας λάθους του τελευταίου, ενισχύοντας τον επιρρεπή σε λάθη χαρακτήρα της μετάλλαξης sal6. Ωστόσο, η απόλυτη τιμή της συχνότητας λάθους που παρουσιάζουν τα sal6asu9sup45 ριβοσώματα έναντι των sup45 ριβοσωμάτων επιτρέπει τον χαρακτηρισμό του τριπλά μεταλλαγμένου στελέχους ως υπερακριβούς κατά τη μετάφραση. Πίνακας 4. Χαρακτηριστικές ιδιότητες των ριβοσωμάτων των στελεχών sup45, sal6sup45, asu9sup45 και sal6asu9sup45 επί της πιστότητας της μετάφρασης. Παρουσιάζονται οι συχνότητες λάθους των ριβοσωμάτων απουσία και παρουσία 50 μμ παρομομυκίνης. Οι τιμές που παρουσιάζονται αφορούν την Μέση Τιμή ± Τυπικό Σφάλμα. Στέλεχος Αριθμός πειραμάτων Συχνότητα λάθους E.F. ± S.E Μεταβολή E.F. απουσία παρομομυκίνης sup45 6 0,0144 ± 0, sal6sup45 6 0,0346 ± 0,0017* + 0,0202 asu9sup45 6 0,0028 ± 0,0004* - 0,0116 sal6asu9sup45 6 0,0058 ± 0,0004* -0, μμ παρομομυκίνης sup45 6 0,0542 ± 0, sal6sup45 6 0,1691 ± 0,0158* + 0,1149 asu9sup45 6 0,0154 ± 0,0024* - 0,0388 sal6asu9sup45 6 0,0452 ± 0,0036* - 0,0090 * Στατιστικώς σημαντική διαφορά (one-way analysis of variance, F-Scheffè test, p < 0.05) σε σύγκριση με τα ριβοσώματα του στελέχους-μάρτυρα sup Προσδιορισμός επιπέδων μεταφραστικής πιστότητας παρουσία παρομομυκίνης Τα ίδια πειράματα προσδιορισμού της μεταφραστικής πιστότητας επαναλήφθηκαν χρησιμοποιώντας το αμινογλυκοζιτικό αντιβιοτικό παρομομυκίνη σε τελική συγκέντρωση 50 μμ. Ως γνωστόν η παρομομυκίνη προσδένεται στην Α- περιοχή του 16S rrna της E. coli επηρεάζοντας την μεταφραστική πιστότητα (Puglisi et al. 2000). Παρουσία του αντιβιοτικού αναμένεται αύξηση της συχνότητας λάθους εξ αιτίας της απώλειας της ικανότητας ορθής ανάγνωσης των αντικωδικίων που φέρονται στα μόρια των trnas. Πρόκειται, λοιπόν, για έναν εξειδικευμένο για 113

124 Αποτελέσματα τα προκαρυωτικά κύτταρα- επαγωγέα λαθών. Ωστόσο, η παρομομυκίνη έχει δειχθεί ότι προκαλεί απώλεια της πιστότητας της μετάφρασης και σε στελέχη ζύμης (Palmer et al. 1979, Velichutina et al. 2000). Πράγματι, το αντιβιοτικό αύξησε τις μεταφραστικές συχνότητες λάθους όλων των υπό μελέτη στελεχών (Πίνακας 4). Ωστόσο, η τάση που καταγράφηκε από τις δοκιμασίες μετάφρασης άνευ παρομομυκίνης παρέμεινε αναλλοίωτη. Έτσι, η μεγαλύτερη αύξηση παρατηρήθηκε στα ριβοσώματα του στελέχους sal6sup45, καθώς η συχνότητα λάθους διαμορφώθηκε στις 1691 λάθος ενσωματώσεις λευκίνης ανά 10 4 κωδίκια σε σύγκριση με τις 542 των sup45 ριβοσωμάτων. Η μικρότερη αύξηση στη συχνότητα λάθους παρατηρήθηκε στα ριβοσώματα του στελέχους asu9sup45, η οποία διαμορφώθηκε στις 154 λάθος ενσωματώσεις λευκίνης ανά 10 4 κωδίκια. Η παρουσία της μετάλλαξης sal6 στο διπλά μεταλλαγμένο στέλεχος asu9sup45 προκάλεσε επιπλέον αύξηση της συχνότητας λάθους του τελευταίου κατά 298 λάθος ενσωματώσεις λευκίνης ανά 10 4 κωδίκια (0,0452 έναντι 0,0154). Συνοψίζοντας τα αποτελέσματα του προσδιορισμού των μεταφραστικών συχνοτήτων λάθους απουσία και παρουσία παρομομυκίνης, παρατηρούμε ότι η μετάλλαξη sal6 ευθύνεται για την απώλεια της μεταφραστικής πιστότητας ενώ η μετάλλαξη asu9 προκαλεί υπερακριβή μετάφραση. 1.5 Ανθεκτικότητα των κυττάρων έναντι παρομομυκίνης in vivo Δοκιμασία ανθεκτικότητας έναντι αντιβιοτικού επί φίλτρου Η απώλεια της μεταφραστικής πιστότητας που παρατηρείται παρουσία της παρομομυκίνης πιθανόν να οφείλεται στην υπερευαισθησία που παρουσιάζουν ορισμένα μεταλλαγμένα στελέχη προς αυτό το αντιβιοτικό. Πράγματι, προηγούμενες μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί τόσο στο εργαστήριο μας όσο και σε άλλα εργαστήρια, έχουν δείξει ότι μεταλλάξεις σε γονίδια του rrna ή ριβοσωματικών πρωτεϊνών που ελαττώνουν τη μεταφραστική πιστότητα προσδίδουν ευαισθησία των στελεχών που τις φέρουν έναντι παρομομυκίνης ενώ οι μεταλλάξεις που αυξάνουν τα επίπεδα της μεταφραστικής πιστότητας προκαλούν ανθεκτικότητα των στελεχών που τις φέρουν έναντι παρομομυκίνης. Κύτταρα του στελέχους-μάρτυρα και των μεταλλαγμένων στελεχών ζύμης επιστρώθηκαν σε στερεές YPD καλλιέργειες στις οποίες είχαν προστεθεί φίλτρα που 114

125 Αποτελέσματα είχαν εμποτισθεί με διαφορετικές συγκεντρώσεις παρομομυκίνης. Ακολούθησε επώαση 3-4 ημερών. Η ανθεκτικότητα των κυττάρων έναντι της παρομομυκίνης προσδιορίστηκε, από την περιοχή ελεύθερη κυττάρων γύρω από το φίλτρο το οποίο ήταν εμποτισμένο με τις κατάλληλες συγκεντρώσεις του αντιβιοτικού. Στην Εικόνα 21, το στέλεχος sal6sup45 που φέρει μετάλλαξη στο γονίδιο που κωδικοποιεί τη φωσφατάση σερίνης/θρεονίνης SAL6 φαίνεται να είναι ελαφρώς πιο ανθεκτικό στην παρομομυκίνη από το στέλεχος-μάρτυρας sup45, αφού η περιοχή ελεύθερη κυττάρων και στις δύο συγκεντρώσεις παρομομυκίνης είναι ελαφρώς μικρότερη από αυτή του στελέχους-μάρτυρα. Ωστόσο, τα sal6sup45 ριβοσώματα επιτελούν τη μετάφραση με μειωμένη πιστότητα (Πίνακας 4). Όμως, είναι γνωστό ότι αντιβιοτικά που προκαλούν ελάττωση της μεταφραστικής πιστότητας, προκαλούν συνήθως και ευαισθησία των διαφόρων στελεχών απέναντί τους. Τα δυο αυτά αποτελέσματα φανερώνουν ότι η μετάλλαξη sal6 διαχωρίζει τη διττή επίδραση της παρομομυκίνης, δηλαδή στην καταστολή και απώλεια της μεταφραστικής πιστότητας από τη μια και στη θανατογόνο δράση της από την άλλη sup45 sal6sup45 asu9sup45 sal6asu9sup45 Εικόνα 21. Αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης του στελέχους-μάρτυρα και των μεταλλαγμένων στελεχών ζύμης. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε στερεές YPΑD καλλιέργειες στις οποίες είχαν προστεθεί φίλτρα που είχαν εμποτιστεί με τις υποφαινόμενες συγκεντρώσεις παρομομυκίνης (εκφρασμένες σε mg/ml). H επώαση των κυττάρων έγινε στους 30 ºC για χρονικό διάστημα 3-4 ημερών. Η ανθεκτικότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε από την περιοχή ελεύθερη κυττάρων γύρω από το εμποτισμένο με παρομομυκίνη φίλτρο. Αντίθετα, το υπερακριβές στέλεχος asu9sup45 παρουσιάζει τη μεγαλύτερη ανθεκτικότητα προς την παρομομυκίνη σε σύγκριση με όλα τα υπό μελέτη στελέχη. Πράγματι, όπως φαίνεται στην Εικόνα 21 οι αποικίες των asu9sup45 κυττάρων πλησιάζουν πιο κοντά προς τα εμποτισμένα με παρομομυκίνη φίλτρα. Έτσι, ο 115

126 Αποτελέσματα υπερακριβής και αντικατασταλτικός χαρακτήρας της μετάλλαξης asu9 συνάδει με το πρότυπο ανθεκτικότητας της στην παρομομυκίνη. Το τριπλά μεταλλαγμένο στέλεχος sal6asu9sup45 φαίνεται να είναι επίσης ανθεκτικό στην παρομομυκίνη σε σχέση με το στέλεχος-μάρτυρα και ελαφρώς πιο ευαίσθητο σε σύγκριση με το στέλεχος asu9sup45. Το αποτέλεσμα αυτό συνάδει με το φαινότυπο μεταφραστικής πιστότητας που εμφανίζει το τριπλά μεταλλαγμένο στέλεχος καθώς είναι πιο υπερακριβές σε σχέση με το sup45 στελέχος αλλά λιγότερο υπερακριβές σε σύγκριση με το asu9sup45 στέλεχος Αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων παρομομυκίνης in vivo Ακολούθησε μια ακόμη μέθοδος προσδιορισμού της ανθεκτικότητας έναντι παρομομυκίνης. Κύτταρα του στελέχους-μάρτυρα και μεταλλαγμένων στελεχών αναπτύχθηκαν έναντι αυξανόμενων συγκεντρώσεων παρομομυκίνης και προσδιορίσθηκε η συγκέντρωση εκείνη του αντιβιοτικού που αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων κατά 50%. Βρέθηκε ότι το 50% αναστολής της ανάπτυξης των κυττάρων του στελέχους sal6sup45 επιτυγχάνεται σε συγκέντρωση 40 μm παρομομυκίνης, ενώ του στελέχους-μάρτυρα σε συγκέντρωση 36 μμ παρομομυκίνης (Σχήμα 6). Δηλαδή, η μετάλλαξη sal6 παρουσιάζει παρόμοια επίπεδα ανθεκτικότητας έναντι παρομομυκίνης με το στέλεχος-μάρτυρα. Τα στελέχη asu9sup45 και sal6asu9sup45 παρουσιάζουν αυξημένη ανθεκτικότητα στην παρομομυκίνη με το 50% της αναστολής της ανάπτυξης των κυττάρων να παρατηρείται στα 70 μμ και στα 61 μμ του αντιβιοτικού (Σχήμα 6), αντίστοιχα. Η συμπεριφορά των στελεχών έναντι της παρομομυκίνης συνάδει με το φαινότυπο μεταφραστικής αντικαταστολής που παρουσιάζουν τα συγκεκριμένα στελέχη (Πίνακας 4). 116

127 Αποτελέσματα Πυκνότητα κυττάρων Α660 (%) [Παρομομυκίνη] (μμ) Σχήμα 6. Αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων του στελέχους-μάρτυρα και μεταλλαγμένων στελεχών παρουσία παρομομυκίνης. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε YPD στους 30 ο C. Οι καλλιέργειες διεκόπησαν, όταν η Α 660 για την καλλιέργεια μάρτυρα (στέλεχος που αναπτύσσεται απουσία αντιβιοτικού) έφθασε την τιμή 0,9, η οποία ελήφθη ως 100%. Καμπύλες: ( ) sup45, μάρτυρας, ( ) sal6sup45, ( ) asu9sup45, ( ) sal6asu9sup Επίδραση των εξωριβοσωματικών μετάλλαξεων στην ικανότητα πρόσδεσης του trna στις περιοχές Α και P του ριβοσώματος Ικανότητα πρόσδεσης στην Α ριβοσωματική περιοχή Για την πρόσδεση του trna στην Α περιοχή του ριβοσώματος (βλέπε Υλικά & Μέθοδοι), είναι απαραίτητη η κάλυψη όλων των P-θέσεων με αποακυλιωμένο trna Phe. Έχοντας εξασφαλίσει την τελευταία προϋπόθεση, η πρόσδεση στην Α- περιοχή προσδιορίζεται προσθέτοντας [ 3 H]Phe-tRNA έτσι ώστε να σχηματιστεί το τριμερές σύμπλοκο [ 3 H]Phe-tRNA poly(u) 80S ριβόσωμα. Το σχηματιζόμενο σύμπλοκο ακινητοποιήθηκε σε δίσκους φίλτρων νιτρικής κυτταρίνης και στη συνέχεια μετρήθηκε η περιεχόμενη σε αυτό ραδιενέργεια σε μετρητή υγρού σπινθηρισμού. Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε αύξηση στην πρόσδεση του [ 3 H]PhetRNA στη Α- περιοχή του ριβοσώματος από 100% στο sup45 στέλεχος σε 143% στο sal6sup45 στέλεχος, επιβεβαιώνοντας έτσι και την αύξηση των λαθών κατά την μετάφραση που παρατηρείται στο sal6sup45 στέλεχος (Σχήμα 7). Στο ίδιο Σχήμα φαίνεται ότι η ικανότητα πρόσδεσης του [ 3 H]Phe-tRNA στις Α ριβοσωματικές περιοχές των μεταλλαγμένων στελεχών asu9sup45 και sal6asu9sup45 ελαττώθηκε 117

128 Αποτελέσματα κατά 13% και 29%, αντίστοιχα, σε σύγκριση με το στέλεχος sup45. Η ελάττωση αυτή αποτελεί μια επιπλέον επιβεβαίωση του φαινοτύπου αυξημένης μεταφραστικής πιστότητας που παρουσιάζουν τα συγκεκριμένα στελέχη Ικανότητα πρόσδεσης στην Ρ ριβοσωματική περιοχή Η πρόσδεση του trna στην P περιοχή του ριβοσώματος επιτεύχθηκε κατόπιν αντίδρασης των ριβοσωμάτων των του στελέχους-μάρτυρα και των μεταλλαγμένων στελεχών με Ac-[ 3 H]Phe-tRNA (βλέπε Υλικά & Μέθοδοι). Το σχηματιζόμενο σύμπλοκο Ac-[ 3 H]Phe-tRNA poly(u) 80S ριβόσωμα ακινητοποιήθηκε σε δίσκους φίλτρων νιτρικής κυτταρίνης και το ποσό του προσδιορίστηκε από το ραδιενεργά σημασμένο Ac-[ 3 H]Phe-tRNA. Κάτω από αυτές τις συνθήκες το Ac-Phe-tRNA προσδένεται στην P περιοχή, όπως έχει επιβεβαιωθεί από προηγούμενες μελέτες (Dresios et al. 2000). Στην παρούσα μελέτη, παρατηρήθηκε ελάττωση στην ικανότητα πρόσδεσης του Ac-[ 3 H]-Phe-tRNA στη P περιοχή των ριβοσωμάτων των στελεχών sal6sup45, asu9sup45 και sal6asu9sup45 από 100% για το στέλεχος sup45 σε 61%, 67% και 77%, αντίστοιχα (Σχήμα 7). 200 Ικανότητα πρόσδεσης (% του αγρίου τύπου) * * * * * * 0 Σχήμα 7. Παρουσιάζει την ικανότητα δέσμευσης του [ 3 H]Phe-tRNA στην περιοχή Α (λευκές στήλες) και του Ac-[ 3 H]Phe-tRNA στην περιοχή P (μαύρες στήλες) των ριβοσωμάτων του στελέχους-μάρτυρα και των μεταλλαγμένων στελεχών. Η ικανότητα πρόσδεσης εκφράζεται ως ποσοστό (%) επί του στελέχους-μάρτυρα. Η σειρά των στελεχών είναι sup45 (μάρτυρας), sal6sup45, asu9sup45, sal6asu9sup45. * Στατιστικώς σημαντική διαφορά (one-way analysis of variance, F-Scheffè test, p < 0.05) σε σύγκριση με τα ριβοσώματα του στελέχους-μάρτυρα sup

129 Αποτελέσματα 1.7 Επίδραση των εξωριβοσωματικών μετάλλαξεων επί της καταλυτικής ενεργότητας του ριβοσώματος Για τον προσδιορισμό της καταλυτικής ενεργότητας των ριβοσωμάτων του στελέχους-μάρτυρα και των μεταλλαγμένων στελεχών, δηλαδή του ρυθμού με τον οποίο σχηματίζουν τους πεπτιδικούς δεσμούς μεταξύ των αμινοξέων, χρησιμοποιήθηκε η αντίδραση πουρομυκίνης. Στην αντίδραση αυτή αντί του πεπτιδυλο-trna χρησιμοποιείται το Ac-Phe-tRNA το οποίο καταλαμβάνει την Ρ ριβοσωματική περιοχή και αντί του νεοεισερχόμενου αμινοάκυλο-trna χρησιμοποιείται το αντιβιοτικό πουρομυκίνη. Η αντίδραση μεταξύ του δότη Ac-Phe-tRNA και της πουρομυκίνης λαμβάνει χώρα σε δύο στάδια κατά τρόπο ώστε όλα τα βήματα που υπεισέρχονται στην πρόσδεση του δότη στο ριβόσωμα (Στάδιο 1) να έχουν παρακαμφθεί (Synetos & Coutsogeorgopoulos, 1987). Έτσι στο δεύτερο στάδιο, το προσροφημένο επί φίλτρου νιτρικής κυτταρίνης τριμερές σύμπλοκο C [Ac-Phe-tRNA 80S ριβόσωμα poly(u)] αποπροσροφάται με τη βοήθεια απορρυπαντικού Zwittergent και το εκχύλισμα αντιδρά με πουρομυκίνη (S) σε περίσσεια. Το προϊόν (Ρ), Ac-Phe-πουρομυκίνη, απομονώνεται έπειτα από εκχύλιση με οξικό αιθυλεστέρα. Ο δότης μετατρέπεται σε μια μορφή (trna) που δεν μπορεί να επαναχρησιμοποιηθεί για τον σχηματισμό νέου τριμερούς συμπλόκου C. Έτσι κάθε καταλυτικό κέντρο της ριβοσωματικής πεπτιδυλοτρανσφεράσης δρα μία μόνο φορά. Το απλούστερο κινητικό σχήμα το οποίο μπορεί να περιγράψει την αντίδραση πουρομυκίνης είναι το εξής: K s k 3 C + S CS C + P Πειραματικά αποδεικνύεται ότι σε συνθήκες κορεσμού σε πουρομυκίνη (S) η αντίδραση ακολουθεί κινητική ψευδοπρώτης τάξης τύπου Michaelis-Menten. Στο σχήμα που περιγράφεται παραπάνω C είναι η μορφή του συμπλόκου C το οποίο φέρει το αποακυλιωμένο-trna και δεν μπορεί να επανέλθει στην ενεργό μορφή C αυτού όπως συμβαίνει στις κλασσικές ενζυμικές αντιδράσεις. Επίσης, K s είναι η σταθερά διάστασης του συμπλόκου CS και k 3 η καταλυτική σταθερά ταχύτητας για τον σχηματισμό προϊόντος P και είναι μέτρο της k cat της πεπτιδυλοτρανσφεράσης. 119

130 Αποτελέσματα Η κινητική ανάλυση της αντίδρασης πουρομυκίνης (βλέπε Υλικά & Μέθοδοι) οδηγεί στην τελική εξίσωση: 100 ln = k obs t 100-x Από την εξίσωση αυτή προκύπτει η γραφική παράσταση του ln[100/(100-x)] έναντι του χρόνου (t), θα είναι μια ευθεία γραμμή η κλίση της οποίας θα είναι αριθμητικά ίση προς την τιμή της k obs. Έτσι, η τιμή της φαινομενικής σταθεράς ψευδοπρώτης τάξης k obs για κάθε συγκέντρωση πουρομυκίνης δίνεται από την παρακάτω εξίσωση: k obs k 3 [S] = K s +[S] Στο Σχήμα 8 απεικονίζονται οι ημιλογαριθμικές χρονοκαμπύλες για το στέλεχος sup45. Οι κλίσεις τους αντιστοιχούν στις φαινομενικές σταθερές ψευδοπρώτης τάξης k obs για τον σχηματισμό προϊόντος Ac-[ 3 H]Phe-πουρομυκίνη παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων πουρομυκίνης. Η αντίδραση βρέθηκε πειραματικά ότι ακολουθεί κινητική πρώτης τάξης μέχρι και την ολοκλήρωση του 90% της αντίδρασης για όλες τις συγκεντρώσεις πουρομυκίνης. Η κλίση της κάθε ευθείας δίνει το k obs για κάθε μία από τις συγκεντρώσεις πουρομυκίνης. Τα αποτελέσματα αυτά καθώς και τα k obs για όλα τα υπό μελέτη στελέχη συνοψίζονται στον Πίνακα 5. Η εξίσωση που προσδιορίζει τη τιμή της φαινομενικής σταθεράς ψευδοπρώτης τάξης προβλέπει ότι το αντίστροφο των πειραματικών k obs (1/k obs ) έναντι του αντιστρόφου των συγκεντρώσεων πουρομυκίνης (1/[S]) θα είναι γραμμικό. Οι τομές της ευθείας αυτής γραμμής με τους άξονες 1/[S] και 1/k οbs δίνουν, αντίστοιχα, τις τιμές των 1/Κ s και 1/k 3. Υψηλή τιμή της k 3 υποδηλώνει ταχύτερη κατάλυση του σχηματισμού του πεπτιδικού δεσμού και το αντίθετο. Επίσης, χαμηλή τιμή της Κ s υποδηλώνει μεγαλύτερη συγγένεια των ριβοσωμάτων για το υπόστρωμα και το αντίθετο. Συνεπώς, το σημαντικό πλεονέκτημα που προσφέρει η κινητική ανάλυση της αντίδρασης πουρομυκίνης είναι ότι με τη χρήση της φαινομενικής σταθεράς k obs αποφεύγουμε να προσδιορίσουμε την αρχική ταχύτητα (V) της αντίδρασης. Κι αυτό διότι η μεν k obs είναι ανεξάρτητη της αρχικής συγκέντρωσης του συμπλόκου C ενώ η αρχική ταχύτητα της αντίδρασης εξαρτάται από την αρχική συγκέντρωση του 120

131 Αποτελέσματα συμπλόκου C. Πράγματι, όπως έχει ήδη περιγραφεί στο Κεφάλαιο Υλικά & Μέθοδοι, η (αρχική) ταχύτητα της αντίδρασης ισούται με V= (C 0 -P) x [S] x k 3 / K s + [S], όπου C 0 -P=C+CS. 2 ln[100/(100-x)] Χρόνος (min) Σχήμα 8. Κινητική πρώτης τάξεως για τον σχηματισμό Ac-[ 3 H]Phe-πουρομυκίνης. Το τριμερές σύμπλοκο C αντιδρά στα προκαθορισμένα χρονικά διαστήματα με πουρομυκίνη στις ακόλουθες συγκεντρώσεις: ( ) 2 mm, ( ) 1 mm, ( ) 0,4 mm, ( ) 0,2 mm, ( ) 0,1 mμ και ( ) 0,0625 mμ. Η κλίση κάθε ευθείας δίνει το αντίστοιχο k obs. Οι τιμές των x έχουν διορθωθεί με τους παράγοντες Α και α που αντιπροσωπεύουν την διάσπαση του συμπλόκου C και την έκταση της αντίδρασης, αντίστοιχα. Πίνακας 5. Τιμές k obs των ριβοσωμάτων του στελέχους-μάρτυρα και των μεταλλαγμένων στελεχών για όλες τις συγκεντρώσεις πουρομυκίνης. [πουρομυκίνη] (mm) k obs (min -1 ) sup45 sal6sup45 asu9sup45 sal6asu9sup45 2 1,15 2,56 1,71 1,79 1 1,00 1,95 1,35 1,51 0,4 0,50 1,22 0,83 0,92 0,2 0,30 0,72 0,50 0,50 0,1 0,19 0,39 0,26 0,25 0,0625 0,12 0,27 0,18 0,20 121

132 Αποτελέσματα Όπως φαίνεται στο Σχήμα 9, όλα τα μεταλλαγμένα στελέχη παρουσιάζουν υψηλότερες τιμές της καταλυτικής σταθεράς k 3 σε σύγκριση με το στέλεχος sup45, δηλαδή σχηματίζουν ταχύτερα τους πεπτιδικούς δεσμούς σε σχέση με το στέλεχοςμάρτυρας sup45. Συγκεκριμένα, το στέλεχος που φέρει τη μετάλλαξη στο γονίδιο που κωδικοποιεί τη φωσφατάση SAL6 σχηματίζει τους πεπτιδικούς δεσμούς δυο φορές πιο γρήγορα, όπως υποδηλώνει ο διπλασιασμός της k 3. Επίσης, το στέλεχος asu9sup45, καθώς επίσης και το τριπλά μεταλλαγμένο στέλεχος sal6asu9sup45 παρουσιάζουν αύξηση κατά 50% της καταλυτικής σταθεράς k 3. Τέλος, από το διάγραμμα είναι φανερό ότι η K s είναι περίπου ίδια για όλα τα στελέχη, γεγονός που σημαίνει ότι δεν αλλάζει η συγγένεια της πουρομυκίνης προς το ριβόσωμα /kobs (min) (1/[πουρομυκίνη]) x 10 3 M -1 Σχήμα 9. Διαγράμματα διπλού αντιστρόφου (1/k obs έναντι 1/[πουρομυκίνη]) για την αντίδραση πουρομυκίνης του συμπλόκου C από ριβοσώματα του στελέχους-μάρτυρα και των μεταλλαγμένων στελεχών: Ευθείες: ( ) sup45, μάρτυρας, ( ) sal6sup45, ( ) asu9sup45, ( ) sal6asu9sup45. Από τα παραπάνω διαγράμματα μπορούν να υπολογιστούν οι τιμές των K s και k 3 για κάθε ένα από τα στελέχη. Οι τομές των ευθειών με τον άξονα 1/k obs δίνουν το 1/k 3, άρα με αντιστροφή το k 3 ενώ οι τομές των ευθειών με τον άξονα 1/[πουρομυκίνη] δίνουν το 1/K s άρα με αντιστροφή το K s. Τα παραπάνω αποτελέσματα παρουσιάζονται συνοπτικά και στον Πίνακα 6, όπου φαίνονται η καταλυτική σταθερά k 3 και η σταθερά ισορροπίας K s για κάθε ένα από τα υπό μελέτη στελέχη. Η τελευταία στήλη του Πίνακα 6 παρουσιάζει το λόγο 122

133 Αποτελέσματα k 3 /K s, ο οποίος αποτελεί μια κινητική σταθερά δευτέρας τάξης. Επί πλέον, ο λόγος k 3 /K s αποτελεί ένα ακριβές μέτρο της καταλυτικής ενεργότητας των ριβοσωμάτων. Συγκεκριμένα, το στέλεχος sal6sup45 από το οποίο απουσιάζει η λειτουργική μορφή της φωσφατάσης SAL6 παρουσιάζει 2 φορές υψηλότερη ενζυμική ενεργότητα από αυτή του στελέχους-μάρτυρα. Δηλαδή, η απουσία της SAL6 βελτιώνει τη καταλυτική ενεργότητα των ριβοσωμάτων του στελέχους sup45. Το ίδιο αποτέλεσμα, δηλαδή βελτίωση της δράσης της ριβοσωματικής πεπτιδυλοτρανσφεράσης, επιφέρει και η μετάλλαξη asu9 είτε μεμονωμένα (στέλεχος asu9sup45) είτε σε συνδυασμό με τη μετάλλαξη sal6 (στέλεχος sal6asu9sup45). Ωστόσο, τα τελευταία στελέχη παρουσιάζουν βελτίωση της καταλυτικής ενεργότητας των ριβοσωμάτων τους κατά 50% σε σχέση με το στέλεχος sup45. Πίνακας 6. Κινητικές παράμετροι ριβοσωμάτων του στελέχους-μάρτυρα και των μεταλλαγμένων στελεχών Στέλεχος k 3 (min -1 ) K s (mm) k 3 /K s (min -1. mm -1 ) sup45 1,46 ± 0,07 0,70 2,09 sal6sup45 3,40 ± 0,10* 0,74 4,59 asu9sup45 2,31 ± 0,09* 0,74 3,12 sal6asu9sup45 2,27 ± 0,15* 0,70 3,24 * Στατιστικώς σημαντική διαφορά (one-way analysis of variance, F-Scheffè test, p < 0.05) σε σύγκριση με τα ριβοσώματα του στελέχους-μάρτυρα sup Ανθεκτικότητα των κυττάρων έναντι του κυκλοεξιμιδίου in vivo Το αντιβιοτικό κυκλοεξιμίδιο δεσμεύεται στην μεγάλη ριβοσωματική υπομονάδα και αναστέλλει τη μετατόπιση του πεπτιδύλο-trna από την Α στην P περιοχή του ριβοσώματος (Gale et al. 1981). Στην παρούσα ενότητα προσδιορίστηκε η επίδραση όλων των εξωριβοσωματικών μεταλλάξεων στην ανθεκτικότητα έναντι του κυκλοεξιμιδίου με τη βοήθεια των δυο in vivo δοκιμασιών που αναφέρθηκαν προηγουμένως για την παρομομυκίνη Δοκιμασία ανθεκτικότητας έναντι αντιβιοτικού επί φίλτρου Κύτταρα του στελέχους-μάρτυρα sup45 και των μεταλλαγμένων στελεχών αναπτύχθηκαν σε στερεές YPΑD καλλιέργειες στις οποίες είχαν προστεθεί φίλτρα 123

134 Αποτελέσματα που είχαν εμποτισθεί με διαφορετικές συγκεντρώσεις τoυ κυκλοεξιμιδίου. Η ακτίνα που δημιουργείται γύρω από κάθε εμποτισμένο με αντιβιοτικό φίλτρο, πέρα από την οποία είναι ευδιάκριτος ο σχηματισμός κυτταρικών αποικιών ορίζει την αντίσταση των αντίστοιχων κυττάρων επί του αντιβιοτικού και είναι ενδεικτικός της ευαισθησίας ή της ανθεκτικότητας τους έναντι αυτού. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 22, την μεγαλύτερη ευαισθησία στο αντιβιοτικό παρουσιάζει το στέλεχος sal6asu9sup45, που φέρει τις μεταλλάξεις sal6 και asu9 πλέον της μετάλλαξης sup45 στον παράγοντα απελευθέρωσης erf1. Πράγματι, η απόσταση των κυτταρικών αποικιών του τριπλά μεταλλαγμένου στελέχους, από το εμποτισμένο -με 5 μl διαλύματος κυκλοεξιμιδίου συγκέντρωσης 1mg/ml- φίλτρο ήταν 27 mm έναντι 7 mm για το ισογονιδιακό στέλεχος-μάρτυρα. Εξάλλου, τα διπλά μεταλλαγμένα στελέχη sal6sup45 και asu9sup45 είναι επίσης ευαίσθητα έναντι του κυκλοεξιμιδίου σε σύγκριση με το στέλεχος sup45, αν και η αντίστοιχη απόσταση από το φίλτρο που είχε εμποτισθεί με κυκλοεξιμίδιο διαμορφώθηκε στα 13 mm και για τα δυο στελέχη. Φαίνεται, λοιπόν, πως οι μεταλλάξεις sal6 και asu9 παρουσιάζουν αθροιστική δράση σε ότι αφορά την εκδήλωση ευαισθησίας έναντι κυκλοεξιμιδίου του στελέχους sal6asu9sup45. 2 μg 0 5 μg Εικόνα 22. Αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης του στελέχους-μάρτυρα sup45 και των λοιπών μεταλλαγμένων στελεχών ζύμης. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε στερεές YPΑD καλλιέργειες στις οποίες είχαν προστεθεί φίλτρα που είχαν εμποτιστεί με τις υποφαινόμενες ποσότητες διαλύματος κυκλοεξιμιδίου 1 mg/ml. H επώαση των κυττάρων έγινε στους 30 ºC για χρονικό διάστημα 3-4 ημερών. Η ανθεκτικότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε από την περιοχή ελεύθερη κυττάρων γύρω από το εμποτισμένο με κυκλοεξιμίδιο φίλτρο. Εμφάνιση στελεχών από αριστερά προς δεξιά : sup45, sal6sup45, asu9sup45, sal6asu9sup

135 Αποτελέσματα Αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων κυκλοεξιμιδίου in vivo Η επαλήθευση των προαναφερομένων αποτελεσμάτων εξακριβώθηκε έπειτα από ανάπτυξη των κυττάρων του στελέχους-μάρτυρα και των μεταλλαγμένων στελεχών έναντι αυξανόμενων συγκεντρώσεων κυκλοεξιμιδίου. Ακολούθως, προσδιορίσθηκε η συγκέντρωση εκείνη του αντιβιοτικού που αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων κατά 50%. Στο Σχήμα 10 φαίνεται ότι η συγκέντρωση του κυκλοεξιμιδίου που απαιτείται για το 50% αναστολής της κυτταρικής ανάπτυξης του στελέχους-μάρτυρα sup45 ήταν 190 μg/l, 33 μg/l για το στέλεχος sal6sup45, 32 μg/l για στέλεχος asu9sup45 και 7 μg/l για το τριπλά μεταλλαγμένο στέλεχος sal6asu9sup45. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το στέλεχος από το οποίο απουσιάζει η δραστική μορφή της φωσφατάσης σερίνης/θρεονίνης SAL6 εμφανίζει ευαισθησία στο κυκλοεξιμίδιο σε σύγκριση με το στέλεχος μάρτυρας. Παρόμοια προς την ευαισθησία του στελέχους sal6sup45 είναι και η ευαισθησία του στελέχους asu9sup45. Επί πλέον, η ταυτόχρονη παρουσία των μεταλλάξεων sal6 και asu9 σε στέλεχος με υπόστρωμα sup45 εξαφανίζει πλήρως την ομολογουμένως υψηλή αντίσταση του τελευταίου έναντι του κυκλοεξιμιδίου [Κυκλοεξιμίδιο] (μg/l) Σχήμα 10. Αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων του στελέχους-μάρτυρα και Πυκνότητα κυττάρων Α660 (%) μεταλλαγμένων στελεχών παρουσία κυκλοεξιμιδίου. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε YPD στους 30 ο C. Οι καλλιέργειες διεκόπησαν, όταν η Α 660 για κάθε καλλιέργεια μάρτυρα (στέλεχος που αναπτύσσεται απουσία αντιβιοτικού) φθάνει την τιμή 0,9, η οποία λαμβάνεται ως 100%. Καμπύλες: ( ) sup45, μάρτυρας, ( ) sal6sup45, ( ) asu9sup45, ( ) sal6asu9sup

136 Αποτελέσματα 1.9 Πρωτεϊνοσυνθετική ενεργότητα των ριβοσωμάτων παρουσία κυκλοεξιμιδίου Η διαφορετική συμπεριφορά των διπλά μεταλλαγμένων στελεχών και του τριπλά μεταλλαγμένου στελέχους έναντι του κυκλοεξιμιδίου, ώθησε στη διερεύνηση της επίδρασης του αντιβιοτικού επί της πρωτεϊνοσυνθετικής ενεργότητας των μεταλλαγμένων ριβοσωμάτων. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε η in vitro poly(u) δοκιμασία μετάφρασης και μια ευρεία κλίμακα συγκεντρώσεων κυκλοεξιμιδίου προκειμένου να προσδιοριστεί η συγκέντρωση εκείνη που προκαλεί αναστολή της πρωτεϊνοσυνθετικής ενεργότητας των ριβοσωμάτων στο ήμισυ της μέγιστης (50%) που παρατηρείται απουσία του αντιβιοτικού. Όπως παρατηρείται στο Σχήμα 11, τα ριβοσώματα του στελέχους που φέρει τη μετάλλαξη sal6 παρουσίασαν ελάττωση της πρωτεϊνοσυνθετικής τους ενεργότητας σε σχέση με τα ριβοσώματα του στελέχους-μάρτυρα. Πράγματι, η συγκέντρωση του κυκλοεξιμιδίου που απαιτήθηκε για την αναστολή της σύνθεσης πολυφαινυλαλανίνης κατά 50% υπολογίστηκε στα 0,3 μμ για τα ριβοσώματα του στελέχους sal6sup45 έναντι 0,8 μμ για τα ριβοσώματα του στελέχους sup45. Στο ίδιο Σχήμα φαίνεται ότι η παρουσία της μετάλλαξης asu9, τόσο σε στέλεχος με υπόστρωμα sup45 όσο και σε στέλεχος με υπόστρωμα sal6sup45, ελάττωσε έτι περαιτέρω την πρωτεϊνοσυνθετική ενεργότητα των αντίστοιχων υποστρωμάτων, καθώς λιγότερο από 0,2 μμ κυκλοεξιμιδίου προκάλεσαν αναστολή της σύνθεσης πολυφαινυλαλανίνης κατά 50% Επίδραση των εξωριβοσωματικών μεταλλάξεων στο στάδιο μετατόπισης της μετάφρασης Το γεγονός ότι τα κύτταρα από τα οποία απουσιάζει η λειτουργική μορφή της φωσφατάσης SAL6 παρουσιάζονται ευαίσθητα έναντι του κυκλοεξιμιδίου, ενός αντιβιοτικού που αναστέλλει το στάδιο της μετατόπισης, υποδεικνύει ότι η φωσφατάση SAL6 πιθανώς επηρεάζει το στάδιο της μετατόπισης. Η πιθανότητα αυτή εξετάσθηκε με την αντίδραση μετατόπισης, η οποία ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας την αντίδραση πουρομυκίνης ως αντίδραση παρακολούθησης (monitoring reaction), δηλαδή χρησιμοποιώντας 1 mm πουρομυκίνης για 10 min στους 30 ο C. 126

137 Αποτελέσματα Σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης (%) ,01 0, [Κυκλοεξιμίδιο] (μμ) Σχήμα 11. Αναστολή της πρωτεϊνοσυνθετικής ενεργότητας των ριβοσωμάτων του στελέχους-μάρτυρα και των μεταλλαγμένων στελεχών παρουσία κυκλοεξιμιδίου. Ως 100% ορίζεται η ποσότητα της πολυφαινυλαλανίνης που σχηματίζεται όταν τα ριβοσώματα επωάζονται απουσία κυκλοεξιμιδίου. Καμπύλες: ( ) sup45, μάρτυρας, ( ) sal6sup45, ( ) asu9sup45, ( ) sal6asu9sup45. Το κυκλοεξιμίδιο χρησιμοποιήθηκε κατά την διάρκεια της μετατόπισης και πριν την αντίδραση πουρομυκίνης σε διαφορετικές συγκεντρώσεις με σκοπό την εύρεση της συγκέντρωσης του αντιβιοτικού που προκαλεί αναστολή της μετατόπισης στα ριβοσώματα του στελέχους-μάρτυρα αλλά και των μεταλλαγμένων στελεχών. Επίσης, χρησιμοποιήθηκε κατά την διάρκεια της αντίδρασης πουρομυκίνης σε υψηλή συγκέντρωση (100 μμ) για να αποκλειστεί η πιθανότητα μετατόπισης κατά την αντίδραση πουρομυκίνης. Παρουσία ευκαρυωτικών παραγόντων επιμήκυνσης (ενζυμική μετατόπιση) και κάτω από συνθήκες ενός κύκλου μετατόπισης, η μετατόπιση του Ac-Phe-tRNA από την Α στην Ρ ριβοσωματική περιοχή ολοκληρώνεται πολύ γρήγορα, σε λιγότερο από 20 sec, όπως μετρήθηκε με την αντίδραση πουρομυκίνης σε προηγούμενες μελέτες (Dresios et al. 2001). Ας σημειωθεί, τέλος, πως στα πειράματα μετατόπισης χρησιμοποιήθηκαν «πλυμένα» ριβοσώματα, δηλαδή ριβοσώματα από τα οποία έχουν αποδεσμευτεί οι ευκαρυωτικοί παράγοντες της μετάφρασης. 127

138 Αποτελέσματα Εξάρτηση της αντίδρασης μετατόπισης των ριβοσωμάτων των μεταλλαγμένων στελεχών από τη συγκέντρωση του κλάσματος των διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων Η ικανότητα μετατόπισης των «πλυμένων» ριβοσωμάτων του στελέχους sup45 και των μεταλλαγμένων στελεχών εξετάσθηκε με έλεγχο της εξάρτησης του κάθε στελέχους για μετατόπιση σε διαφορετικές συγκεντρώσεις του κλάσματος των διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων (soluble protein factors, SPF) οι οποίοι απομονώνονται κατά την παρασκευή του συστήματος ελεύθερο κυττάρων (βλέπε Υλικά & Μέθοδοι). Στους παράγοντες αυτούς συμπεριλαμβάνονται, εκτός των άλλων, οι ευκαρυωτικοί παράγοντες επιμήκυνσης. Αρχικά, σε μία σταθερή ποσότητα του συμπλόκου προμετατόπισης, προστέθηκαν αυξανόμενες συγκεντρώσεις SPF και η μετατόπιση πραγματοποιήθηκε για 1 min στους 30 ο C. Στη συνέχεια προστέθηκε πουρομυκίνη και η αντίδραση τερματίστηκε με προσθήκη NaOH μετά από 10 min. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 12 η έκταση της αντίδρασης μετατόπισης αυξήθηκε αναλογικά με τις αυξανόμενες συγκεντρώσεις του SPF, φτάνοντας σε πλατώ όταν όλο το πεπτιδύλο-trna μετατοπίζεται από την Α στην P περιοχή σε όλα τα ενεργά ριβοσώματα στο μίγμα αντίδρασης. Επίσης, όπως φαίνεται στο ίδιο Σχήμα, η συγκέντρωση των SPF που απαιτείται για να επιτευχθεί το 50% της μετατόπισης κυμαίνεται στα ίδια επίπεδα για όλα τα υπό μελέτη στελέχη και υπολογίζεται στα 0,2 mg/ml SPF. Αξίζει, επίσης, να αναφερθεί ότι η μετατόπιση απουσία ευκαρυωτικών παραγόντων επιμήκυνσης (αυθόρμητη μετατόπιση, spontaneous translocation) ποσοτικοποιήθηκε και κυμάνθηκε σε επίπεδα της τάξης του 25-30% για όλα τα υπό μελέτη στελέχη. Δηλαδή, η μετατόπιση μπορεί να πραγματοποιηθεί και απουσία ευκαρυωτικών παραγόντων επιμήκυνσης, αλλά με λιγότερη απόδοση. Έτσι, το πραγματικό ποσοστό μετατόπισης παρουσία SPF αντικατοπτρίζει το 70-75% της αντίδρασης μετατόπισης. Το 100% δηλώνει την έκταση της αντίδρασης παρουσία παραγόντων επιμήκυνσης, έχοντας αφαιρέσει το ποσοστό που αντιστοιχεί στην αυθόρμητη αντίδραση μετατόπισης (Σχήμα 12). 128

139 Αποτελέσματα 100 Ενζυμική μετατόπιση (%) ,2 0,4 0,6 0,8 1 [SPF] (mg/ml) Σχήμα 12. Εξάρτηση του σταδίου της μετατόπισης του πεπτιδυλο-trna από την συγκέντρωση των ευκαρυωτικών παραγόντων επιμήκυνσης που περιέχονται στο κλάσμα των διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων (SPF). Οι συγκεντρώσεις του SPF στις οποίες επιτεύχθηκε 50% μετατόπιση ήταν περίπου 0,2 mg/ml για όλα τα υπό μελέτη στελέχη. Καμπύλες: ( ) sup45, μάρτυρας, ( ) sal6sup45, ( ) asu9sup45, ( ) sal6asu9sup Επίδραση του κυκλοεξιμιδίου στο στάδιο της μετατόπισης της μετάφρασης Στο επόμενο στάδιο, μελετήθηκε η αναστολή της ενζυμικής μετατόπισης παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων κυκλοεξιμιδίου. Η τελική συγκέντρωση των διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων που χρησιμοποιήθηκε ήταν τουλάχιστον ίση προς 0,2 mg/ml SPF όση δηλαδή απαιτείται για να επιτευχθεί το 50% της μέγιστης ικανότητας μετατόπισης. Στο Σχήμα 13 φαίνεται ότι το 50% αναστολής της μετατόπισης επιτυγχάνεται στα 160, 110, 90 and 70 μμ κυκλοεξιμιδίου για τα ριβοσώματα των στελεχών sup45, sal6sup45, asu9sup45 και sal6asu9sup45, αντίστοιχα. Δηλαδή, παρουσία κυκλοεξιμιδίου τόσο η μεμονωμένη παρουσία όσο και ο συνδυασμός των μεταλλάξεων sal6 και asu9 σε στέλεχος με υπόστρωμα sup45 έχουν ως αποτέλεσμα τη μείωση της ικανότητας μετατόπισης του τελευταίου. Τα αποτελέσματα αυτά έρχονται σε συμφωνία με αυτά που αναφέρθηκαν έως τώρα σχετικά με την αντίσταση των στελεχών στο κυκλοεξιμίδιο in vivo αλλά και με την αναστολή της σύνθεσης πολυφαινυλαλανίνης από το κυκλοεξιμίδιο in vitro. 129

140 Αποτελέσματα 100 Ενζυμική μετατόπιση (%) [Κυκλοεξιμίδιο] (μμ) Σχήμα 13. Αναστολή της ενζυμικής μετατόπισης παρουσία κυκλοεξιμιδίου. Το ποσοστό του Ac-Phe-tRNA που μετατοπίστηκε από την Α στην P ριβοσωματική περιοχή προσδιορίσθηκε με 1 mm πουρομυκίνης για 10 min στους 30 ο C. 100% ήταν η έκταση της μετατόπισης απουσία του αντιβιοτικού. Καμπύλες: ( ) sup45, μάρτυρας, ( ) sal6sup45, ( ) asu9sup45, ( ) sal6asu9sup45. Ας σημειωθεί επίσης πως τα παραπάνω πειράματα πραγματοποιήθηκαν, χρησιμοποιώντας, επί πλέον, πολλαπλάσια συγκέντρωση των διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων (τελική συγκέντρωση στο μίγμα της αντίδρασης 1 mg/ml). Τα αποτελέσματα που προέκυψαν ήταν παρόμοια προς τα παρουσιαζόμενα στο Σχήμα 13. Με τον τρόπο αυτό επιβεβαιώθηκε η αξιοπιστία των πειραμάτων που πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας εκείνη τη συγκέντρωση πρωτεΐνης του κλάσματος SPF που απαιτείται για να επιτευχθεί το 50% της μέγιστης ικανότητας μετατόπισης Επίδραση μεταλλάξεων σε εξωριβοσωματικά συστατικά επί της δομής του ευκαρυωτικού ριβοσώματος Ένας από τους στόχους της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση της δομής των ριβοσωμάτων των κυττάρων του στελέχους-μάρτυρα αλλά και των κυττάρων που φέρουν μεταλλάξεις σε εξωριβοσωματικά συστατικά. Η διερεύνηση αυτή παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον καθώς οι μεταλλάξεις που εξετάζουμε δεν αφορούν σε τροποποίηση συστατικών του ριβοσώματος, άρα θα μπορούσε να υποθέσει κανείς ότι δεν αναμένονται σημαντικές διαφοροποιήσεις. Η δομική μελέτη 130

141 Αποτελέσματα καθίσταται εφικτή με την ανάλυση των πολυσωμάτων και των ριβοσωμάτων σε γραμμική βαθμίδωση σουκρόζης. Από την ανάλυση των ριβοσωματικών προφίλ (Πίνακας 7) προέκυψε, κατ αρχήν, μια μείωση του ποσοστού των πολυσωμάτων όλων των μεταλλαγμένων στελεχών σε σχέση με τα πολυσώματα του στελέχους sup45. Κατά τα άλλα, υπάρχει σημαντική αύξηση, κατά 50%, του ποσοστού των ελεύθερων 60S υπομονάδων στο στέλεχος που φέρει τη μετάλλαξη asu9 αλλά και στο τριπλά μεταλλαγμένο στέλεχος sal6asu9sup45 σε σύγκριση με το στέλεχος sup45. Λιγότερο σημαντική ήταν η αύξηση κατά 20% του ποσοστού των ελεύθερων 60S υπομονάδων στο στέλεχος που φέρει τη μετάλλαξη sal6. Η διαθεσιμότητα περισσότερων ελεύθερων 60S υπομονάδων συνοδεύτηκε και από μια μέτρια αύξηση του ποσοστού των 80S ριβοσωμάτων σε αυτά τα στελέχη, όπως ήταν αναμενόμενο. Αντίθετα, η κατανομή των ελεύθερων 40S υπομονάδων δεν παρουσίασε διαφοροποιήσεις μεταξύ των στελεχών. Από την παραπάνω ανάλυση καθίσταται φανερό πως οι μεταλλάξεις sal6 και asu9 προκαλούν αλλαγές στα ριβοσωματικά προφίλ, υποδηλώνοντας μια έμμεση παρεμβολή των εξωριβοσωματικών συστατικών στη λειτουργία της ριβοσωματικής μηχανής. Πίνακας 7. Κατανομή πολυσωμάτων και ριβοσωματικών υπομονάδων του στελέχουςμάρτυρα και των μεταλλαγμένων στελεχών Στέλεχος sup45 sal6sup45 asu9sup45 sal6asu9sup45 πολυσώματα S ριβοσώματα (%) S υπομονάδες (%) S υπομονάδες (%) S/40S

142 Αποτελέσματα 2. ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ rdn1a ΚΑΙ rdn1t ΤΗΣ ΕΛΙΚΑΣ 34 ΚΑΙ ΤΗΣ ΜΕΤΑΛΛΑΞΗΣ rdn2 ΤΗΣ ΕΛΙΚΑΣ 18 ΤΟΥ 18S rrna ΤΗΣ ΖΥΜΗΣ ΕΠΙ ΤΗΣ ΚΑΤΑΛΥΤΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΡΙΒΟΣΩΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΕΠΙ ΤΟΥ ΣΤΑΔΙΟΥ ΤΗΣ ΜΕΤΑΤΟΠΙΣΗΣ Όπως προαναφέρθηκε, η δεύτερη πειραματική ενότητα της διατριβής διαπραγματεύεται την επίδραση ορισμένων ριβοσωματικών συστατικών, δηλαδή μορίων που ανήκουν στο ριβόσωμα και κυρίως του ριβοσωματικού RNA, επί χαρακτηριστικών παραμέτρων της πρωτεϊνοσύνθεσης. Το ενδιαφέρον στράφηκε προς συγκεκριμένες έλικες του rrna της μικρής ριβοσωματικής υπομονάδας οι οποίες έχει αποδειχθεί με μελέτες σε προκαρυωτικούς οργανισμούς ότι επηρεάζουν τη ριβοσωματική λειτουργία. Στόχος της μελέτης αυτής είναι να αναδειχθούν οι όποιες εξελικτικές ομοιότητες ή διαφοροποιήσεις στο ρόλο των συγκεκριμένων συστατικών μεταξύ προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών κυττάρων Χρησιμοποιηθέντα στελέχη Η μελέτη του ρόλου των ελίκων 18 και 34 του 18S rrna της ζύμης επί διαφόρων παραμέτρων της ριβοσωματικής λειτουργίας παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον για δυο λόγους. Πρώτον, διότι κρυσταλλογραφικές μελέτες σε προκαρυωτικούς οργανισμούς τοποθετούν τις έλικες 18 και 34 στον πυρήνα του ριβοσωματικού κέντρου αποκωδικοποίησης. Δεύτερον, διότι οι μεταλλάξεις που θα εξεταστούν έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζουν την αποκωδικοποίηση και την ανθεκτικότητα έναντι αντιβιοτικών σε κύτταρα E. coli. Τα στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα φάση για την εύρεση του ρόλου των ελίκων 18 και 34 του 18S rrna είναι τα εξής: Το στέλεχος L1494 το οποίο φέρει απάλειψη του μεγαλύτερου μέρους των χρωμοσωματικών RDN αλληλουχιών και στο οποίο όλα τα μόρια του rrna κωδικοποιούνται από ένα υψηλού αριθμού αντιτύπων πλασμίδιο prdn-wt (βλέπε Κεφάλαιο Υλικά & Μέθοδοι). Χρησιμοποιήθηκε ως το αγρίου τύπου στέλεχος και θα αναφέρεται ως rdnwt. Το μεταλλαγμένο στέλεχος L1583 το οποίο αντί του πλασμιδίου prdn-wt φέρει το πλασμίδιο prdn-rdn1a στο οποίο έχει εισαχθεί η υποκατάσταση C1054A. 132

143 Αποτελέσματα Πρόκειται για μια σημειακή μετάλλαξη στην έλικα 34 και το στέλεχος που τη φέρει θα αναφέρεται ως rdn1a. Το μεταλλαγμένο στέλεχος L1597 το οποίο φέρει το πλασμίδιο prdn-rdn1τ αντί του πλασμιδίου prdn-wt. Στο πλασμίδιο prdn-rdn1τ έχει εισαχθεί η υποκατάσταση C1054U στην έλικα 34 και το στέλεχος, φέρον το πλασμίδιο αυτό, θα αναφέρεται ως rdn1t. Το μεταλλαγμένο στέλεχος L1522 το οποίο φέρει το πλασμίδιο prdn-rdn2 αντί του prdn-wt. Το στέλεχος που φέρει αυτό το πλασμίδιο περιέχει τη σημειακή μετάλλαξη G517A στη θηλειά 530 της έλικας 18 και στην παρούσα μελέτη θα αναφέρεται ως rdn2. Τα αποτελέσματα που παρατίθενται στις παραγράφους που ακολουθούν έχουν παρουσιαστεί στις ανακοινώσεις 1, 3, 7 και 8 που καταγράφονται στο Παράρτημα ΙΙ Τα προηγηθέντα πειράματα και αποτελέσματα Οι υποκαταστάσεις C1054A και C1054U της έλικας 34 και η υποκατάσταση G517A στη θηλιά 530 της έλικας 18 του 16S rrna κατασκευάστηκαν και μελετήθηκαν για πρώτη φορά στον προκαρυωτικό μικροοργανισμό E. coli. Συγκεκριμένα, οι υποκαταστάσεις C1054A και G517A βρέθηκε ότι συμπεριφέρονται ως μεταφραστικοί καταστολείς δηλαδή δεν αναγνωρίζουν τα μη νοηματικά κωδίκια (κωδίκια λήξης). Αντίθετα, η υποκατάσταση C1054U δεν βρέθηκε να έχει κάποια επίδραση (Murgola et al. 1988, O Connor et al. 1992, Murgola et al. 1995). Επί πλέον, τα μεταλλαγμένα ριβοσώματα από τα οποία έχει γίνει απάλειψη της βάσης C1054 δεν αναγνωρίζουν τα κωδίκια λήξης, υποδηλώνοντας την πιθανή επίδραση της βάσης αυτής στον τερματισμό της μετάφρασης (Prescott et al. 1991). Στο Εργαστήριο μας μελετήθηκε η επίδραση των παραπάνω μεταλλάξεων επί διαφόρων παραμέτρων της λειτουργίας των ριβοσωμάτων της ζύμης. Τα αποτελέσματα που αναφέρονται στην παρούσα ενότητα (2.2) περιλαμβάνονται στη διατριβή για την απόκτηση Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης (Θ. Χ. Κωνσταντινίδης, 2003) ενώ μαζί με τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται παρακάτω έχουν δημοσιευθεί στο διεθνές περιοδικό με κριτές Biochemistry (Konstantinidis et al. 2006). Ο τίτλος της δημοσίευσης καταγράφεται στο Παράρτημα ΙΙ. Τα ριβοσώματα του μεταλλαγμένου στελέχους rdn1a παρουσίασαν εντυπωσιακή ελάττωση της μεταφραστικής πιστότητας των νοηματικών κωδικίων, η 133

144 Αποτελέσματα συχνότητα λάθους αυξήθηκε σχεδόν 8 φορές σε σχέση με την αντίστοιχη των ριβοσωμάτων του στελέχους rdnwt. Η απώλεια της πιστότητας συνοδεύτηκε από αυξημένη ευαισθησία των rdn1a κυττάρων στην παρομομυκίνη σε σύγκριση με τα κύτταρα του στελέχους rdnwt (Πίνακας 8). Σε συμφωνία με τον επιρρεπή σε μεταφραστικά λάθη χαρακτήρα της μετάλλαξης rdn1a ήταν η καταστολή των μη νοηματικών κωδικίων αλλά και η αύξηση της ικανότητας πρόσδεσης του Phe-tRNA στην ριβοσωματική Α περιοχή. Επίσης, τα rdn1a ριβοσώματα επέδειξαν υψηλότερη αρχική ταχύτητα πρωτεϊνοσύνθεσης. Τέλος, η ανάλυση των πολυσωμάτων έδειξε ότι η μετάλλαξη rdn1a προκάλεσε ελάττωση του ποσοστού των ελεύθερων 40S υπομονάδων, υποδηλώνοντας μια πιθανή αδυναμία στη συγκρότηση των ακέραιων 80S ριβοσωμάτων η οποία ενδεχομένως να αντανακλάται στον εξαιρετικά βραδύ φαινότυπο ανάπτυξης των rdn1a κυττάρων. Επομένως, η μετάλλαξη rdn1a στη ζύμη παρουσιάζει ίδιο φαινότυπο κατά τη μετάφραση με την ομόλογη της (C1054A) σε κύτταρα E. coli. Αντίθετα προς την μετάλλαξη rdn1a, η μετάλλαξη rdn1τ προκάλεσε φαινότυπο μεταφραστικής υπερακρίβειας. Συγκεκριμένα, τα ριβοσώματα του στελέχους rdn1τ επιτελούν τη μετάφραση με ελαφρώς υψηλότερη πιστότητα σε σύγκριση με τα ριβοσώματα του στελέχους rdnwt (Πίνακας 8). Η αύξηση της μεταφραστικής πιστότητας συνοδεύτηκε από μια αναμενόμενη ελάττωση της ικανότητας πρόσδεσης του Phe-tRNA στην Α περιοχή καθώς επίσης από ελαφρώς αυξημένη ανθεκτικότητα έναντι παρομομυκίνης, δυο αποτελέσματα που συνάδουν με τον χαρακτηρισμό της μετάλλαξης rdn1τ ως υπερακριβούς μετάλλαξης που προκαλεί αντικαταστολή. Ο χαρακτήρας της μετάλλαξης rdn1τ στη ζύμη εμφανίζεται διαφοροποιημένος σε σχέση με την E. coli, αφού σε κύτταρα E. coli η μετάλλαξη C1054U δεν προκάλεσε κανενός είδους μεταφραστικό φαινότυπο (Murgola et al. 1988). Τέλος, η υποκατάσταση G517A στη θηλειά 530 της έλικας 18 του 18S rrna (μετάλλαξη rdn2) κατέστησε τα κύτταρα που την φέρουν εξαιρετικά υπερακριβή κατά την διαδικασία της αποκωδικοποίησης της γενετικής πληροφορίας. Πράγματι, η μεταφραστική συχνότητα λάθους των ριβοσωμάτων του στελέχους rdn2 προσδιορίστηκε κοντά στο μηδέν (Πίνακας 8). Εκτός από τον εντυπωσιακό μεταφραστικό φαινότυπο της μετάλλαξης, εξίσου εντυπωσιακή ήταν και η ανθεκτικότητα των rdn2 κυττάρων έναντι της παρομομυκίνης. Πράγματι, η αναστολή της ανάπτυξης των rdn2 κυττάρων κατά 50% επιτεύχθηκε σε συγκέντρωση παρομομυκίνης 10πλάσια προς την συγκέντρωση που απαιτήθηκε για την αναστολή 134

145 Αποτελέσματα της ανάπτυξης των rdnwt κυττάρων. Σε αντίθεση προς την E. coli, όπου η μετάλλαξη G517A προκαλεί καταστολή, στη ζύμη η αντίστοιχη υποκατάσταση ενισχύει την αξιοπιστία των ριβοσωμάτων και της πρωτεϊνοσυνθετικής μηχανής γενικότερα. Πίνακας 8. Χαρακτηριστικές ιδιότητες των μεταλλάξεων rdn1a, rdn1t και rdn2 επί της ανάπτυξης των κυττάρων και επί της λειτουργίας των εξ αυτών ριβοσωμάτων. Παρουσιάζονται α) οι μεταφραστικές συχνότητες λάθους των ριβοσωμάτων του αγρίου τύπου και των μεταλλαγμένων στελεχών, απουσία και παρουσία 50 μμ παρομομυκίνης (ΠΜ), β) οι συγκεντρώσεις της παρομομυκίνης οι οποίες προκαλούν αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων κατά 50% σε σχέση με τα κύτταρα αγρίου τύπου, και γ) η ικανότητα δέσμευσης του [ 3 H]-Phe-tRNA στην Α περιοχή των ριβοσωμάτων του αγρίου τύπου και των μεταλλαγμένων στελεχών. Οι τιμές που παρουσιάζονται αφορούν την Μέση Τιμή ± Τυπικό Σφάλμα. Στέλεχος Συχνότητα λάθους απουσία ΠΜ Συχνότητα λάθους + 50 μμ ΠΜ rdnwt ± ± rdn1a ± * ± * rdn1t ± ± * rdn2 ~0 * ± * [ΠΜ] για 50% αναστολή ανάπτυξης (μμ) Ικανότητα δέσμευσης στην Α περιοχή (% του rdnwt) rdnwt 47 ± rdn1a 16 ± 2 * 175 ± 14 * rdn1t 57 ± 5 87 ± 8 rdn2 508 ± 94 * 86 ± 7 * Στατιστικώς σημαντική διαφορά (one-way analysis of variance, F-Scheffè test, p < 0.05) σε σύγκριση με τα ριβοσώματα του στελέχους αγρίου τύπου rdnwt 2.3 Επίδραση των ελίκων 18 και 34 του 18S rrna επί της καταλυτικής ενεργότητας του ριβοσώματος Η καταλυτική ενεργότητα πεπτιδυλοτρανσφεράσης των ριβοσωμάτων του αγρίου τύπου και των μεταλλαγμένων στελεχών προσδιορίστηκε, όπως περιγράφηκε νωρίτερα, με την αντίδραση πουρομυκίνης η οποία έλαβε χώρα στους 30 ºC παρουσία 9 mm Mg 2+. Πιο συγκεκριμένα, το τριμερές ριβοσωματικό σύμπλοκο C, δηλαδή το [Ac-Phe-tRNA 80S ριβόσωμα poly(u)] σύμπλοκο, αντιδρά με 135

146 Αποτελέσματα πουρομυκίνη και η αντίδραση αυτή ακολουθεί κινητική ψευδοπρώτης τάξεως διότι το υπόστρωμα (πουρομυκίνη) βρίσκεται σε περίσσεια. Για κάθε χρησιμοποιούμενη συγκέντρωση πουρομυκίνης, η φαινομενική σταθερά πρώτης τάξης k obs προσδιορίζεται από τις ημιλογαριθμικές χρονοκαμπύλες και υπακούει στην παρακάτω εξίσωση: k obs k 3 [S] = K s +[S] Η εξίσωση αυτή προβλέπει ότι το αντίστροφο των πειραματικών k obs (1/k obs ) έναντι του αντιστρόφου των συγκεντρώσεων πουρομυκίνης (1/S) θα είναι γραμμικό. Στο διάγραμμα διπλού αντιστρόφου που προκύπτει, οι τομές της ευθείας αυτής γραμμής με τους άξονες 1/S και 1/k οbs δίνουν αντίστοιχα τις τιμές των Κ s και k 3. Στο Σχήμα 14, παρουσιάζονται τα διαγράμματα διπλού αντιστρόφου για όλα τα μεταλλαγμένα στελέχη. Παρατηρούμε ότι η μετάλλαξη rdn1α μειώνει την καταλυτική κινητική σταθερά πρώτης τάξεως k 3 σε 0,82 min -1 από 1,46 min -1 στο στέλεχος rdnwt (Πίνακας 9). Ο λόγος k 3 /K s που είναι ο ακριβέστερος δείκτης της ενεργότητας του ριβοσώματος ως ριβοενζύμου είναι και αυτός μειωμένος από το 1,72 στο rdnwt στο 1,04 στο rdn1α στέλεχος. Οι άλλες δυο μεταλλάξεις, ήτοι οι rdn1t και rdn2, δεν επηρέασαν σημαντικά την καταλυτική ενεργότητα του ριβοσώματος αφού οι κινητικές τους σταθερές ήταν περίπου ίδιες με την αντίστοιχη του στελέχους rdnwt. Η σταθερά διάστασης του συμπλόκου CS, δηλαδή η Κ s, δεν παρουσίασε διαφοροποιήσεις μεταξύ των στελεχών, δείχνοντας ότι η συγγένεια της πουρομυκίνης για τα διάφορα ριβοσώματα δεν επηρεάστηκε σημαντικά από τις μεταλλάξεις. 2.4 Ανθεκτικότητα των κυττάρων έναντι του κυκλοεξιμιδίου in vivo Η επίδραση ορισμένων αντιβιοτικών επί της λειτουργίας ή/και των λειτουργιών του ριβοσώματος αποτελεί χαρακτηριστική πειραματική πρακτική στα πλαίσια της διαλεύκανσης της δομής και της λειτουργίας αυτού του υποκυτταρικού οργανιδίου. Στην παρούσα ενότητα παρουσιάζονται τα αποτελέσματα της επίδρασης του κυκλοεξιμιδίου ενός αντιβιοτικού-αναστολέα του σταδίου της μετατόπισης. 136

147 Αποτελέσματα 16 1/kobs (min) (1/[πουρομυκίνη]) x 10 3 M -1 Σχήμα 14. Διαγράμματα διπλού αντιστρόφου (1/k obs έναντι 1/[πουρομυκίνη]) για την αντίδραση πουρομυκίνης του συμπλόκου C από ριβοσώματα του στελέχους αγρίου τύπου και των μεταλλαγμένων στελεχών: Ευθείες: ( ) rdnwt, ( ) rdn1a, ( ) rdn1t, ( ) rdn2. Από τα παραπάνω διαγράμματα μπορούν να υπολογιστούν οι τιμές των K s και k 3 των στελεχών. Πίνακας 9. Κινητικές παράμετροι ριβοσωμάτων του στελέχους αγρίου τύπου και των μεταλλαγμένων στελεχών. Στέλεχος Πρόσδεση στην Ρ περιοχή k 3 K s k 3 /K s (% του rdnwt) (min -1 ) (mm) (min -1. mm -1 ) rdnwt 100 1,46 ± 0,04 0,85 1,72 rdn1a 105 ± 5 0,82 ± 0,07 * 0,79 1,04 rdn1t 97 ± 9 1,32 ± 0,08 0,80 1,65 rdn2 99 ± 7 1,25 ± 0,06 0,75 1,67 * Στατιστικώς σημαντική διαφορά (one-way analysis of variance, F-Scheffè test, p < 0.05) σε σύγκριση με τα ριβοσώματα του στελέχους αγρίου τύπου rdnwt Πειράματα σε υγρές καλλιέργειες Κύτταρα των αγρίου τύπου και μεταλλαγμένων στελεχών αναπτύχθηκαν στους 30 ºC έναντι αυξανόμενων συγκεντρώσεων κυκλοεξιμιδίου. Όταν η εκάστοτε κυτταρική καλλιέργεια απουσία κυκλοεξιμιδίου προσέγγισε τιμή οπτικής 137

148 Αποτελέσματα απορρόφησης Α 660 ίση προς 0,9 τότε σταμάτησε η επώαση και των υπολοίπων, παρουσία κυκλοεξιμιδίου, κυτταρικών καλλιεργειών. Ακολούθως, προσδιορίσθηκε η συγκέντρωση εκείνη του αντιβιοτικού που αναστέλλει την ανάπτυξη των κυτταρικών καλλιεργειών κατά 50% σε σχέση με την ανάπτυξη της καλλιέργειας απουσία κυκλοεξιμιδίου. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την επίδραση του αντιβιοτικού σε υγρές καλλιέργειες in vivo, δείχνουν (Σχήμα 15) πως η μετάλλαξη rdn1t παρουσιάζει μια ελαφρώς μεγαλύτερη αντίσταση στην επίδραση του κυκλοεξιμιδίου, αφού το 50% της αναστολής της κυτταρικής ανάπτυξης εκδηλώνεται στα 38 μg/l κυκλοεξιμιδίου έναντι 30 μg/l κυκλοεξιμιδίου για το στέλεχος rdnwt. Tα στελέχη rdn1a και rdn2 παρουσιάζουν περίπου ίδια επίπεδα αντίστασης προς εκείνα του στελέχους αγρίου τύπου. 100 Πυκνότητα κυττάρων Α660 (%) [Κυκλοεξιμίδιο] (μg/l) Σχήμα 15. Αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων του στελέχους αγρίου τύπου και μεταλλαγμένων στελεχών παρουσία κυκλοεξιμιδίου. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε YPD στους 30 ο C. Οι καλλιέργειες διεκόπησαν, όταν η Α 660 για την καλλιέργεια μάρτυρα (στέλεχος που αναπτύσσεται απουσία αντιβιοτικού) έφθασε την τιμή 0,9 η οποία ελήφθη ως 100%. Καμπύλες: ( ) rdnwt, ( ) rdn1a, ( ) rdn1t, ( ) rdn Δοκιμασία ανθεκτικότητας έναντι κυκλοεξιμιδίου επί φίλτρου Η επαλήθευση των προαναφερθέντων αποτελεσμάτων εξακριβώθηκε έπειτα από ανάπτυξη των κυττάρων αγρίου τύπου και των μεταλλαγμένων στελεχών σε στερεές YPAD καλλιέργειες στις οποίες είχαν προστεθεί φίλτρα που είχαν εμποτισθεί 138

149 Αποτελέσματα με διαφορετικούς όγκους (2 και 5 μl) διαλύματος κυκλοεξιμιδίου αρχικής συγκέντρωσης 1 mg/ml. Στην Εικόνα 23 βλέπουμε ότι το rdn2 στέλεχος παρουσιάζει την μεγαλύτερη ευαισθησία στο αντιβιοτικό, καθώς εμφανίζεται σημαντική αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων του. Αντίθετα, το στέλεχος rdn1τ φαίνεται να είναι πιο ανθεκτικό στις ίδιες ποσότητες του αντιβιοτικού. Η συμπεριφορά αυτή των στελεχών rdn2 και rdn1τ ευρίσκεται σε συμφωνία με τα προαναφερθέντα πειραματικά ευρήματα. Το στέλεχος rdn1α φαίνεται ότι παρουσιάζει επίπεδα ευαισθησίας στο κυκλοεξιμίδιο παρόμοια με αυτά του στελέχους αγρίου τύπου rdnwt, κάτι το οποίο έρχεται επίσης σε συμφωνία με τα πειράματα ανθεκτικότητας έναντι κυκλοεξιμιδίου σε υγρές καλλιέργειες. 2 μg H 2 O 5 μg rdnwt rdn1a rdn1t rdn2 Εικόνα 23. Αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης του στελέχους αγρίου τύπου και των μεταλλαγμένων στελεχών ζύμης. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε στερεές YPΑD καλλιέργειες στις οποίες είχαν προστεθεί φίλτρα που είχαν εμποτιστεί με διαφορετικούς όγκους διαλύματος κυκλοεξιμιδίου συγκέντρωσης 1 mg/ml. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 30 ºC για χρονικό διάστημα 3-4 ημερών. Η ανθεκτικότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε από την περιοχή ελεύθερη κυττάρων γύρω από το εμποτισμένο με κυκλοεξιμίδιο φίλτρο. Στην ίδια Εικόνα, εκτός από την ανθεκτικότητα προς το κυκλοεξιμίδιο, έχουμε και διάγνωση, με την βοήθεια της έντασης του χρώματος των αποικιών, σχετικά με το κατά πόσο οι μεταλλάξεις που μελετάμε παρουσιάζουν κατασταλτική ή αντικατασταλτική δράση. Όπως προαναφέρθηκε στο Κεφάλαιο Υλικά & Μέθοδοι, τα υπό μελέτη στελέχη φέρουν τη σημειακή μετάλλαξη ade1-14, η οποία φέρει το κωδίκιο τερματισμού της πρωτεϊνοσύνθεσης UGA εντός ενός γονιδίου που κωδικοποιεί τη βιοσύνθεση ενζύμου που συμμετέχει στην πορεία σύνθεσης της αδενίνης. Η σύνθεση της αδενίνης είναι υπεύθυνη για την απουσία του χρώματος στις αποικίες των κυττάρων και το αντίθετο. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 23, οι αποικίες του rdn1α στελέχους είναι άχρωμες. Αυτό σημαίνει ότι η μετάλλαξη rdn1α προκαλεί καταστολή του κωδικίου λήξης UGA. Αντίθετα, η μετάλλαξη rdn2 εμφανίζεται ως 139

150 Αποτελέσματα ισχυρά αντικατασταλτική και μάλιστα σε μεγαλύτερο βαθμό από την μετάλλαξη rdn1τ, αφού παρατηρείται έντονο σκούρο χρώμα στις αποικίες των κυττάρων που τη φέρουν. Το ενδιάμεσο χρώμα που εμφανίζουν τα κύτταρα του στελέχους rdn1τ, υποδηλώνει ότι η συγκεκριμένη μετάλλαξη προκαλεί μεν αντικαταστολή η οποία, ωστόσο, δεν είναι τόσο έντονη όσο του στελέχους rdn2. Άλλωστε, από τον Πίνακα 8 προκύπτει ότι η μετάλλαξη rdn2 προκαλεί υψηλότερη μεταφραστική πιστότητα συγκριτικά προς τη μετάλλαξη rdn1τ. 2.5 Επίδραση κυκλοεξιμιδίου στην ικανότητα σύνθεσης πολυφαινυλαλανίνης in vitro Από τα παραπάνω αποτελέσματα κατέστη φανερό ότι οι μεταλλάξεις rdn1a, rdn1t και rdn2 παρουσιάζουν διαφορετική ανθεκτικότητα έναντι του κυκλοεξιμιδίου. Επίσης, όπως αναφέρθηκε σε προηγούμενη παράγραφο, το κυκλοεξιμίδιο προκαλεί αναστολή της σύνθεσης πολυφαινυλαλανίνης. Χρησιμοποιώντας μια ευρεία κλίμακα συγκεντρώσεων κυκλοεξιμιδίου στις in vitro δοκιμασίες μετάφρασης, προσδιορίστηκε η συγκέντρωση του αντιβιοτικού που προκαλεί αναστολή της πρωτεϊνοσυνθετικής ενεργότητας των μεταλλαγμένων ριβοσωμάτων στο ήμισυ της μέγιστης (50%) που παρατηρείται απουσία του αντιβιοτικού. Σε συμφωνία με τις in vivo δοκιμασίες (Σχήμα 15 και Εικόνα 23), τα ριβοσώματα του στελέχους rdn1τ παρουσίασαν αυξημένη ανθεκτικότητα έναντι του κυκλοεξιμιδίου καθώς η πρωτεϊνοσυνθετική τους ενεργότητα ήταν πιο αυξημένη σε σχέση με τα ριβοσώματα του στελέχους αγρίου τύπου. Πράγματι, η συγκέντρωση του κυκλοεξιμιδίου που απαιτήθηκε για την αναστολή της σύνθεσης πολυφαινυλαλανίνης κατά 50% υπολογίστηκε στα 2 μμ του αντιβιοτικού για τα ριβοσώματα του στελέχους rdn1τ έναντι 1 μμ περίπου που απαιτήθηκε για τα ριβοσώματα του στελέχους rdnwt (Σχήμα 16). Αντιθέτως, η μετάλλαξη rdn2 προκάλεσε ελάττωση της πρωτεϊνοσυνθετικής ενεργότητας των αντίστοιχων ριβοσωμάτων καθώς μόλις 0,4 μμ κυκλοεξιμιδίου προκάλεσαν αναστολή της σύνθεσης πολυφαινυλαλανίνης κατά 50%. Το αποτέλεσμα αυτό έρχεται σε συμφωνία με τα αντίστοιχα in vivo πειράματα. Τέλος, η μετάλλαξη rdn1α επέδειξε ίδιο προφίλ πρωτεϊνοσυνθετικής ενεργότητας με τα ριβοσώματα του στελέχους αγρίου τύπου. 140

151 Αποτελέσματα Σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης (%) ,01 0, [Κυκλοεξιμίδιο] (μμ) Σχήμα 16. Αναστολή της πρωτεϊνοσυνθετικής ενεργότητας των ριβοσωμάτων του στελέχους αγρίου τύπου και των μεταλλαγμένων στελεχών παρουσία κυκλοεξιμιδίου. Ως 100% ορίζεται η ποσότητα της πολυφαινυλαλανίνης που σχηματίζεται όταν τα ριβοσώματα επωάζονται απουσία κυκλοεξιμιδίου. Καμπύλες: ( ) rdnwt, ( ) rdn1a, ( ) rdn1t, ( ) rdn Επίδραση των μεταλλάξεων rdn1a, rdn1t και rdn2 στο στάδιο της μετατόπισης Στην παρούσα ενότητα μελετήθηκε η επίδρασή των μεταλλάξεων rdn1a, rdn1t και rdn2 στην μετατόπιση του πεπτιδύλο-trna από την Α στην P ριβοσωματική περιοχή. Είναι γνωστό ότι όταν η P περιοχή είναι κατειλημμένη με αποακυλιωμένο trna, τότε το Ac-[ 3 H]Phe-tRNA προσδένεται αποκλειστικά στην Α περιοχή. Ακολούθως, μπορεί να πάρει μέρος σε μία αντίδραση μετατόπισης παρουσία παραγόντων επιμήκυνσης και 11 mm Mg 2+. Η μετατόπιση του Ac-Phe-tRNA από την Α στην P περιοχή ελέγχθηκε με τη βοήθεια της αντίδρασης πουρομυκίνης (1 mm πουρομυκίνης για 10 min στους 30 ο C) Εξάρτηση της αντίδρασης μετατόπισης των ριβοσωμάτων των μεταλλαγμένων στελεχών από τη συγκέντρωση του κλάσματος των διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων Αρχικά, εξετάσθηκε η ικανότητα των ριβοσωμάτων του κάθε στελέχους για μετατόπιση παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων του κλάσματος των διαλυτών 141

152 Αποτελέσματα πρωτεϊνικών παραγόντων (SPF). Σε μία σταθερή ποσότητα του συμπλόκου προμετατόπισης, προστέθηκαν αυξανόμενες συγκεντρώσεις SPF και η μετατόπιση πραγματοποιήθηκε για 1 min στους 30 ο C. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 17 η έκταση της αντίδρασης μετατόπισης αυξήθηκε γραμμικά, ανάλογα με την χρησιμοποιούμενη συγκέντρωση SPF και έφτασε σε πλατώ όταν όλο το πεπτιδύλο-trna μετατοπίζεται από την Α στην P περιοχή σε όλα τα ενεργά ριβοσώματα στο μίγμα αντίδρασης. Επίσης, όπως φαίνεται στο ίδιο Σχήμα, η συγκέντρωση των SPF που απαιτείται για να επιτευχθεί το 50% της μέγιστης ικανότητας μετατόπισης κυμαίνεται στα ίδια επίπεδα για τα ριβοσώματα όλων των υπό μελέτη στελεχών και υπολογίζεται στα 0,15 mg/ml SPF. Η αυθόρμητη μετατόπιση, δηλαδή η μετατόπιση απουσία ευκαρυωτικών παραγόντων επιμήκυνσης κυμάνθηκε στο 25-30% για όλα τα στελέχη. Επομένως, το πραγματικό ποσοστό μετατόπισης παρουσία SPF αντικατοπτρίζει το 70-75% της αντίδρασης μετατόπισης. Στο Σχήμα 17, το 100% συμβολίζει την έκταση της αντίδρασης παρουσία παραγόντων επιμήκυνσης, έχει δηλαδή αφαιρεθεί το ποσοστό που αντιστοιχεί στην αυθόρμητη αντίδραση μετατόπισης. 100 Ενζυμική μετατόπιση (%) ,5 1 1,5 2 [SPF] (mg/ml) Σχήμα 17. Εξάρτηση του σταδίου της μετατόπισης του πεπτιδυλο-trna από την συγκέντρωση των ευκαρυωτικών παραγόντων επιμήκυνσης που περιέχονται στο κλάσμα των διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων (SPF). Οι συγκεντρώσεις του SPF στις οποίες επιτεύχθηκε 50% μετατόπιση ήταν περίπου 0,15 mg/ml για όλα τα υπό μελέτη στελέχη. Καμπύλες: ( ) rdnwt, ( ) rdn1a, ( ) rdn1t, ( ) rdn2. 142

153 Αποτελέσματα Επίδραση του κυκλοεξιμιδίου στο στάδιο της μετατόπισης της μετάφρασης Η μελέτη της επίδρασης των σημειακών μεταλλάξεων rdn1a, rdn1t και rdn2 ολοκληρώθηκε με την μελέτη της αναστολής της ενζυμικής μετατόπισης από το κυκλοεξιμίδιο. Η τελική συγκέντρωση των διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων που προστέθηκαν στο σύμπλοκο προμετατόπισης ήταν τουλάχιστον ίση προς 0,15 mg/ml SPF όση δηλαδή αναφέρθηκε προηγουμένως ότι επάγει το 50% της μέγιστης ικανότητας για μετατόπιση. Στο Σχήμα 18 φαίνεται ότι τα ριβοσώματα του στελέχους rdn1t έχουν μεγαλύτερη ικανότητα για μετατόπιση καθώς το 50% αναστολής της μετατόπισης προκλήθηκε από 200 μμ κυκλοεξιμιδίου έναντι 120 μμ του αντιβιοτικού που επέφεραν το ίδιο ποσοστό αναστολής στα ριβοσώματα του στελέχους αγρίου τύπου. Τα αποτελέσματα αυτά έρχονται σε συμφωνία με αυτά που αναφέρθηκαν έως τώρα σχετικά με την μεγαλύτερη ανθεκτικότητα του στελέχους rdn1t στο κυκλοεξιμίδιο in vivo αλλά και με την αναστολή της σύνθεσης πολυφαινυλαλανίνης από το κυκλοεξιμίδιο in vitro. Τα άλλα δυο μεταλλαγμένα στελέχη, τα rdn1α και rdn2, εμφάνισαν ελαφρώς μικρότερη ικανότητα μετατόπισης σε σχέση με το στέλεχος του αγρίου τύπου. Πράγματι, η αναστολή της ενζυμικής μετατόπισης κατά 50% παρατηρήθηκε στα 100 μμ κυκλοεξιμιδίου, δηλαδή στο ήμισυ της συγκέντρωσης του αντιβιοτικού που προκαλεί το ίδιο ποσοστό αναστολής στα ριβοσώματα του στελέχους rdn1t. Τα παραπάνω αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν, πραγματοποιώντας τα πειράματα της αναστολής της ενζυμικής μετατόπισης παρουσία διαφόρων συγκεντρώσεων κυκλοεξιμιδίου, χρησιμοποιώντας την ελάχιστη συγκέντρωση των διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων κατά την οποία η αντίδραση μετατόπισης παρουσία SPF φθάνει σε πλατώ. Από το Σχήμα 17, προκύπτει ότι η ελάχιστη συγκέντρωση SPF για να επιτευχθεί η μετατόπιση όλου του πεπτιδύλο-trna από την Α στην P περιοχή σε όλα τα ενεργά ριβοσώματα στο μίγμα αντίδρασης είναι ίση προς 1 mg/ml. 143

154 Αποτελέσματα 100 Ενζυμική μετατόπιση (%) [Κυκλοεξιμίδιο] (μμ) Σχήμα 18. Αναστολή της ενζυμικής μετατόπισης παρουσία κυκλοεξιμιδίου. Το ποσοστό του Ac-Phe-tRNA που μετατοπίστηκε από την Α στην P ριβοσωματική περιοχή προσδιορίσθηκε με 1 mm πουρομυκίνης για 10 min στους 30 ο C. 100 % ήταν η έκταση της μετατόπισης απουσία του αντιβιοτικού. Καμπύλες: ( ) rdnwt, ( ) rdn1a, ( ) rdn1t, ( ) rdn2. 144

155 Αποτελέσματα 3. ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ΣΤΙΣ ΕΛΙΚΕΣ 12, 18 ΚΑΙ 34 ΤΟΥ 18S rrna ΤΗΣ ΖΥΜΗΣ ΕΠΙ ΤΗΣ ΚΑΤΑΛΥΤΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΡΙΒΟΣΩΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΕΠΙ ΤΟΥ ΣΤΑΔΙΟΥ ΤΗΣ ΜΕΤΑΤΟΠΙΣΗΣ Σε αυτή την ενότητα της διατριβής εξετάστηκε η επίδραση και άλλων σημειακών μεταλλάξεων του ριβοσωματικού RNA επί χαρακτηριστικών παραμέτρων της πρωτεϊνοσύνθεσης. Η διαφοροποίηση από την προηγούμενη πειραματική ενότητα εστιάζεται στο γεγονός ότι δεν υπάρχει πληροφόρηση από μελέτες σε προκαρυωτικά κύτταρα για τις συγκεκριμένες μεταλλάξεις. Επιπλέον, επιχειρήθηκε, για πρώτη φορά η διαλεύκανση της επίδρασης του συνδυασμού δυο μεταλλάξεων ταυτόχρονα. Στόχος της μελέτης αυτής είναι να εξακριβωθεί εάν υπάρχουν και άλλες έλικες, πέραν των ήδη γνωστών, που εμπλέκονται στη ρύθμιση της ριβοσωματικής λειτουργίας Χρησιμοποιηθέντα στελέχη Στην παρούσα φάση, μελετήθηκε ο ρόλος του καταλοίπου C310 της έλικας 12 και του καταλοίπου G1206 της έλικας 34 του 18S rrna επί χαρακτηριστικών παραμέτρων της λειτουργίας του ριβοσώματος της ζύμης. Για το λόγο αυτό κατασκευάστηκαν στελέχη ζύμης που φέρουν συγκεκριμένες υποκαταστάσεις αυτών των καταλοίπων. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, η χρησιμοποιούμενη αρίθμηση των ριβονουκλεοτιδικών καταλοίπων στη ζύμη υπακούει σε εκείνη που έχει προκύψει από την ανάλυση της δευτεροταγούς δομής του 16S rrna σε κύτταρα E. coli, για λόγους άμεσης σύγκρισης. Εκτός από την επίδραση των μεμονωμένων υποκαταστάσεων επί της ριβοσωματικής λειτουργίας εξετάστηκε η επίδραση αυτών σε συνδυασμό με την μετάλλαξη rdn2 της έλικας 18 του 18S rrna. Τα στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα φάση για την εύρεση του ρόλου των ελίκων 12, 18 και 34 του 18S rrna είναι τα εξής: Το στέλεχος L1494 το οποίο φέρει απάλειψη του μεγαλύτερου μέρους των χρωμοσωματικών RDN αλληλουχιών και στο οποίο όλα τα μόρια του rrna κωδικοποιούνται από ένα υψηλού αριθμού αντιτύπων πλασμίδιο prdn-wt (βλέπε Κεφάλαιο Υλικά & Μέθοδοι). Χρησιμοποιήθηκε ως το αγρίου τύπου στέλεχος και θα αναφέρεται ως rdnwt. 145

156 Αποτελέσματα Το μεταλλαγμένο στέλεχος L1887 το οποίο αντί του πλασμιδίου prdn-wt φέρει το πλασμίδιο prdn-com1 στο οποίο έχει εισαχθεί η υποκατάσταση C310G. Πρόκειται για μια σημειακή μετάλλαξη στην έλικα 12 και το στέλεχος που τη φέρει θα αναφέρεται ως com1. Ας σημειωθεί ότι σε κύτταρα E. coli στη θέση 310 του 16S rrna υπάρχει γουανίνη (G), ενώ σε κύτταρα ζύμης στην αντίστοιχη θέση υπάρχει κυτοσίνη (C). Με άλλα λόγια, η συγκεκριμένη μετάλλαξη επαναφέρει, τρόπον τινά, την έλικα 12 της ζύμης στην προκαρυωτική κατάσταση. Το μεταλλαγμένο στέλεχος L1888 το οποίο φέρει το πλασμίδιο prdnrdn2com1 αντί του πλασμιδίου prdn-wt. Στο πλασμίδιο prdn-rdn2com1 έχουν εισαχθεί οι υποκαταστάσεις C310G στην έλικα 12 και G517A στην έλικα 18 του 18S rrna. Το στέλεχος που φέρει το πλασμίδιο αυτό θα αναφέρεται ως rdn2com1. Το μεταλλαγμένο στέλεχος L1893 το οποίο φέρει το πλασμίδιο prdnrdn2com6 αντί του prdn-wt. Το στέλεχος που φέρει αυτό το πλασμίδιο περιέχει τις σημειακές μεταλλάξεις G517A στη θηλειά 530 της έλικας 18 και G1206C στην έλικα 34 του 18S rrna. Στην παρούσα μελέτη θα αναφέρεται ως rdn2com6. Τέλος, για λόγους άμεσης σύγκρισης ξαναχρησιμοποιήθηκε το στέλεχος L1522 το οποίο φέρει το πλασμίδιο prdn-rdn2 αντί του prdn-wt. Το στέλεχος αυτό, όπως έχει ήδη αναφερθεί, φέρει τη σημειακή μετάλλαξη G517A στη θηλειά 530 της έλικας 18 και στην παρούσα μελέτη θα αναφέρεται ως rdn Τα προηγηθέντα πειράματα και αποτελέσματα Τα αποτελέσματα που αναφέρονται στην παρούσα ενότητα (3.2) περιλαμβάνονται στη διατριβή για την απόκτηση Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης του υποψήφιου διδάκτορα Μάριου Ζουριδάκη (Μ. Ζουριδάκης, 2003). Επί πλέον, τα αποτελέσματα αυτά έχουν συμπεριληφθεί στην ανακοίνωση 2 (βλέπε Παράρτημα ΙΙ). Τα ριβοσώματα του com1 μεταλλαγμένου στελέχους επιτελούν τη μετάφραση με ελαττωμένη πιστότητα καθώς η συχνότητα λάθους αυξήθηκε σε σχέση με την αντίστοιχη του στελέχους rdnwt. Η απώλεια της μεταφραστικής πιστότητας συνοδεύτηκε από μια εντυπωσιακά αυξημένη ευαισθησία των com1 κυττάρων στην παρομομυκίνη σε σύγκριση με τα κύτταρα του στελέχους rdnwt (Πίνακας 10). Σε συμφωνία με τον επιρρεπή σε μεταφραστικά λάθη χαρακτήρα της μετάλλαξης com1 146

157 Αποτελέσματα ήταν και η αύξηση της ικανότητας πρόσδεσης του Phe-tRNA στην ριβοσωματική Α περιοχή. Πίνακας 10. Χαρακτηριστικές ιδιότητες των μεταλλάξεων com1, rdn2, rdn2com1 και rdn2com6 επί της ανάπτυξης των κυττάρων και επί της λειτουργίας των εξ αυτών ριβοσωμάτων. Παρουσιάζονται α) οι μεταφραστικές συχνότητες λάθους των ριβοσωμάτων του αγρίου τύπου και των μεταλλαγμένων στελεχών, απουσία και παρουσία 50 μμ παρομομυκίνης (ΠΜ) β) οι συγκεντρώσεις της παρομομυκίνης οι οποίες προκαλούν αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων κατά 50% σε σχέση με τα κύτταρα αγρίου τύπου και γ) η ικανότητα δέσμευσης του [ 3 H]-Phe-tRNA στην Α περιοχή των ριβοσωμάτων του αγρίου τύπου και των μεταλλαγμένων στελεχών. Οι τιμές που παρουσιάζονται αφορούν την Μέση Τιμή ± Τυπικό Σφάλμα. Στέλεχος Συχνότητα λάθους απουσία ΠΜ Συχνότητα λάθους + 50 μμ ΠΜ rdnwt 0,0036 ± 0,0004 0,0140 rdn2 ~0 * 0,0067 com1 0,0051 ± 0,0002 * 0,0444 rdn2com1 0,0037 ± 0,0003 0,0346 rdn2com6 0,0035 ± 0,0002 0,0243 [ΠΜ] για 50% αναστολή ανάπτυξης (μμ) Ικανότητα δέσμευσης στην Α περιοχή (% του rdnwt) rdnwt 75 ± rdn2 508 ± 94 * 93 ± 5 com1 5 ± 2 * 137 ± 4 * rdn2com1 85 ± ± 14 rdn2com6 125 ± 11 * 123 ± 10 * * Στατιστικώς σημαντική διαφορά (one-way analysis of variance, F-Scheffè test, p < 0.05) σε σύγκριση με τα ριβοσώματα του στελέχους αγρίου τύπου rdnwt. Έχοντας υπ όψιν ότι η μετάλλαξη com1 προκαλεί ελάττωση της μεταφραστικής πιστότητας ενώ η μετάλλαξη rdn2 στη θηλειά 530 της έλικας 18 του 18S rrna προκαλεί υπερακρίβεια κατά τη μετάφραση (Πίνακας 10), εξετάστηκε η επίδραση του συνδυασμού των δυο μεταλλάξεων. Έτσι, το στέλεχος που φέρει τη διπλή μετάλλαξη rdn2com1 παρουσίασε ίδια επίπεδα συχνότητας λάθους με το στέλεχος αγρίου τύπου. Αυτό πρακτικά σημαίνει ότι η προς αντίθετη κατεύθυνση επίδραση των μεμονωμένων μεταλλάξεων παραμένει τέτοια και στο διπλά 147

158 Αποτελέσματα μεταλλαγμένο στέλεχος, γι αυτό και η συχνότητα λάθους του διπλά μεταλλαγμένου στελέχους ουσιαστικά προκύπτει από τον μέσο όρο των επιμέρους συχνοτήτων λάθους. Το στέλεχος rdn2com1 παρουσιάζει επίσης παρόμοια προς το στέλεχος αγρίου τύπου επίπεδα αντίστασης στην παρομομυκίνη in vivo καθώς επίσης παρόμοια ικανότητα πρόσδεσης του υποστρώματος στην Α περιοχή του ριβοσώματος (Πίνακας 10). Τα αποτελέσματα αυτά ωθούν στο συμπέρασμα ότι η συνύπαρξη των μεταλλάξεων rdn2 και com1 δεν είναι συνεργατική για το ριβόσωμα αλλά απλώς αθροιστική (αλγεβρικά). Τέλος, παρόμοιο φαινότυπο με το στέλεχος rdn2com1, όσον αφορά την επίδραση επί της μεταφραστικής πιστότητας παρουσίασε και το έτερο υπό μελέτη διπλά μεταλλαγμένο στέλεχος rdn2com6. Ωστόσο, το στέλεχος rdn2com6 παρουσίασε αυξημένη ανθεκτικότητα έναντι παρομομυκίνης όπως επίσης ελαφρώς αυξημένη ικανότητα πρόσδεσης του Phe-tRNA στην Α ριβοσωματική περιοχή, σε σύγκριση με το στέλεχος rdnwt (Πίνακας 10). 3.3 Επίδραση των ελίκων 12, 18 και 34 του 18S rrna στην καταλυτική ενεργότητα του ριβοσώματος Εκτός από την επίδραση των συγκεκριμένων νουκλεοτιδικών καταλοίπων των ελίκων 12, 18 και 34 του rrna της μικρής ριβοσωματικής υπομονάδας επί της διαδικασίας της αποκωδικοποίησης της γενετικής πληροφορίας, διερευνήθηκε η πιθανότητα επίδρασης τους επί της ταχύτητας του σχηματισμού των πεπτιδικών δεσμών. Όπως έχει ήδη αναφερθεί η τελευταία λειτουργία αποτελεί κύρια ενεργότητα της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας. Η καταλυτική ενεργότητα πεπτιδυλοτρανσφεράσης των ριβοσωμάτων του αγρίου τύπου και των μεταλλαγμένων στελεχών προσδιορίστηκε με την αντίδραση πουρομυκίνης η οποία έλαβε χώρα στους 30 ºC παρουσία 9 mm Mg 2+. Κάτω από αυτές τις συνθήκες η αντίδραση μεταξύ του τριμερούς συμπλόκου C, δηλαδή του [Ac-Phe-tRNA 80S ριβόσωμα poly(u)], με περίσσεια πουρομυκίνης ακολουθεί κινητική ψευδοπρώτης τάξεως καταλήγοντας στο σχηματισμό Ac-Phe-πουρομυκίνης. Στο Σχήμα 19, παρουσιάζονται τα διαγράμματα διπλού αντιστρόφου για όλα τα μεταλλαγμένα στελέχη. Είναι πολύ ενδιαφέρον ότι η μετάλλαξη com1 αυξάνει την καταλυτική κινητική σταθερά πρώτης τάξεως k 3 στο διπλάσιο, δηλαδή στα 2,83 min -1 από 1,46 min -1 στο στέλεχος rdnwt (Πίνακας 11). Ο λόγος είναι μια σταθερά 148

159 Αποτελέσματα δευτέρας τάξης και αποτελεί τον ακριβέστερο δείκτη της καταλυτικής ενεργότητας του ριβοσώματος ως ριβοενζύμου. Ο λόγος k 3 /K s είναι αυξημένος από το 1,72 στο rdnwt στο 4,03 στο com1 στέλεχος. Παράλληλα με την υψηλή ενεργότητα πεπτιδυλοτρανσφεράσης που επιδεικνύουν τα com1 ριβοσώματα παρατηρήθηκε και εξαιρετικά αυξημένη ικανότητα πρόσδεσης του Ac-Phe-tRNA στην P ριβοσωματική περιοχή του στελέχους com1 (Πίνακας 11). Η υψηλή καταλυτική ενεργότητα των com1 ριβοσωμάτων εξασθενεί όταν η μετάλλαξη com1 συνεκφράζεται με τη μετάλλαξη rdn2. Πράγματι, η καταλυτική κινητική σταθερά k 3 του διπλά μεταλλαγμένου στελέχους rdn2com1 ελαττώθηκε στο 1,92 min -1 αλλά παρέμεινε σε υψηλότερα επίπεδα από εκείνα του στελέχους αγρίου τύπου και του στελέχους rdn2. Μπορεί επίσης να ειπωθεί ότι η φυσιολογική καταλυτική ενεργότητα των rdn2 ριβοσωμάτων βελτιώνεται αισθητά παρουσία της μετάλλαξης com1. Τέλος, η παρουσία της μετάλλαξης com6 επιφέρει αύξηση της καταλυτικής ενεργότητας των rdn2 ριβοσωμάτων, όπως φαίνεται από την αύξηση κατά 70% της κινητικής σταθεράς k 3 του διπλά μεταλλαγμένου στελέχους rdn2com6 στο 2,22 min -1 από 1,25 min -1 στο rdn2 στέλεχος /kobs (min) (1/[πουρομυκίνη]) x 10 3 M -1 Σχήμα 19. Διαγράμματα διπλού αντιστρόφου (1/k obs έναντι 1/[πουρομυκίνη]) για την αντίδραση πουρομυκίνης του συμπλόκου C από ριβοσώματα του στελέχους αγρίου τύπου και των μεταλλαγμένων στελεχών: Ευθείες: ( ) rdnwt, ( ) rdn2, ( ) com1, ( ) rdn2com1, ( ) rdn2com6. Από τα παραπάνω διαγράμματα μπορούν να υπολογιστούν οι τιμές των K s και k 3 των στελεχών. 149

160 Αποτελέσματα Επίσης, από τα δεδομένα του Πίνακα 11 προκύπτει ότι η ικανότητα πρόσδεσης του Ac-[ 3 H]Phe-tRNA στην P περιοχή των ριβοσωμάτων των στελεχών rdn2, rdn2com1 και rdn2com6 δεν παρουσιάζει στατιστικώς σημαντική διαφοροποίηση συγκριτικά προς το στέλεχος αγρίου τύπου. Πίνακας 11. Κινητικές παράμετροι ριβοσωμάτων του στελέχους αγρίου τύπου και των μεταλλαγμένων στελεχών. Στέλεχος Πρόσδεση στην Ρ περιοχή k 3 K s k 3 /K s (% του rdnwt) (min -1 ) (mm) (min -1. mm -1 ) rdnwt 100 1,46 ± 0,04 0,85 1,72 rdn2 99 ± 7 1,25 ± 0,06 * 0,75 1,67 com1 160 ± 16 * 2,83 ± 0,10 * 0,70 4,04 rdn2com1 87 ± 10 1,92 ± 0,15 * 0,65 2,95 rdn2com6 93 ± 10 2,22 ± 0,29 * 0,67 3,31 * Στατιστικώς σημαντική διαφορά (one-way analysis of variance, F-Scheffè test, p < 0.05) σε σύγκριση με τα ριβοσώματα του στελέχους αγρίου τύπου rdnwt. 3.4 Ανθεκτικότητα των κυττάρων έναντι του κυκλοεξιμιδίου in vivo Πειράματα σε υγρές καλλιέργειες Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την επίδραση του αντιβιοτικού σε υγρές καλλιέργειες in vivo, επιβεβαιώνουν προηγούμενα ευρήματα τα οποία υποδηλώνουν την μεγάλη ευαισθησία που προκαλεί η μετάλλαξη rdn2 έναντι του κυκλοεξιμιδίου, με το 50% της αναστολής της κυτταρικής ανάπτυξης να εκδηλώνεται στα 20 μg/l κυκλοεξιμιδίου έναντι 40 μg/l κυκλοεξιμιδίου για το στέλεχος rdnwt (Σχήμα 20). Η μετάλλαξη com1 παρουσίασε ελαφρώς υψηλότερα επίπεδα ανθεκτικότητας στο κυκλοεξιμίδιο σε σχέση με το στέλεχος rdn2, αλλά παρέμεινε σαφώς πιο ευαίσθητη σε σύγκριση με το στέλεχος αγρίου τύπου. Το 50% της αναστολής της ανάπτυξης των κυττάρων com1 προκλήθηκε από 25 μg/l κυκλοεξιμιδίου. Τέλος, η παρουσία της μετάλλαξης rdn2 στα στελέχη με υπόστρωμα τις μεταλλάξεις com1 και com6, περιόρισε εν μέρει την ευαισθησία των rdn2 κυττάρων έναντι του κυκλοεξιμιδίου. 150

161 Αποτελέσματα Πράγματι, η αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης κατά 50% επήλθε στα 30 μg/l κυκλοεξιμιδίου για τα διπλά μεταλλαγμένα rdn2com1 και rdn2com Πυκνότητα κυττάρων Α660 (%) [Κυκλοεξιμίδιο] (μg/l) Σχήμα 20. Αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων του στελέχους αγρίου τύπου και μεταλλαγμένων στελεχών παρουσία κυκλοεξιμιδίου. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε YPD καλλιέργειες στους 30 ο C. Η ανάπτυξη των καλλιεργειών διεκόπη, όταν η Α 660 για την καλλιέργεια μάρτυρα (ανάπτυξη απουσία αντιβιοτικού) έφθασε την τιμή 0,9 η οποία ελήφθη ως 100%. Καμπύλες: ( ) rdnwt, ( ) rdn2, ( ) com1, ( ) rdn2com1, ( ) rdn2com Δοκιμασία ανθεκτικότητας έναντι κυκλοεξιμιδίου επί φίλτρου Η επαλήθευση των προαναφερθέντων αποτελεσμάτων εξακριβώθηκε έπειτα από ανάπτυξη των κυττάρων αγρίου τύπου και των μεταλλαγμένων στελεχών σε στερεές YPAD καλλιέργειες στις οποίες είχαν προστεθεί φίλτρα που είχαν εμποτισθεί με διαφορετικούς όγκους (2 και 5 μl) διαλύματος κυκλοεξιμιδίου αρχικής συγκέντρωσης 1 mg/ml. Στην Εικόνα 24, παρατηρείται ότι τα στελέχη rdn2com1 και rdn2com6 παρουσιάζουν ενδιάμεσο προφίλ ανθεκτικότητας στο κυκλοεξιμίδιο σε σχέση με την μεγαλύτερη ευαισθησία των στελεχών rdn2 και com1 και την μεγαλύτερη ανθεκτικότητα του στελέχους αγρίου τύπου. Πράγματι, οι περιοχές ελεύθερες κυττάρων γύρω από το με κυκλοεξιμίδιο εμποτισμένο φίλτρο είναι μικρότερες από τις αντίστοιχες των στελεχών rdn2 και com1, αλλά μεγαλύτερες από την περιοχή 151

162 Αποτελέσματα ελεύθερη κυττάρων του στελέχους αγρίου τύπου. Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με εκείνα που πραγματοποιήθηκαν σε υγρές καλλιέργειες. 2 μg 0 5 μg Εικόνα 24. Αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης του στελέχους-μάρτυρα και των μεταλλαγμένων στελεχών ζύμης. Τα κύτταρα απλώθηκαν σε στερεές YPΑD καλλιέργειες στις οποίες είχαν προστεθεί φίλτρα που είχαν εμποτιστεί με συγκεκριμένες ποσότητες διαλύματος κυκλοεξιμιδίου 1 mg/ml. H επώαση των κυττάρων έγινε στους 30 ºC για χρονικό διάστημα 3-4 ημερών. Η ανθεκτικότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε από την περιοχή ελεύθερη κυττάρων γύρω από το εμποτισμένο με κυκλοεξιμίδιο φίλτρο. Εμφάνιση στελεχών από αριστερά προς δεξιά : rdnwt, rdn2, com1, rdn2com1, rdn2com6. Στην ίδια εικόνα, εκτός από την ανθεκτικότητα προς το κυκλοεξιμίδιο, έχουμε και διάγνωση, με την βοήθεια της έντασης του χρώματος των αποικιών, σχετικά με το κατά πόσο οι μεταλλάξεις που μελετάμε παρουσιάζουν κατασταλτική ή αντικατασταλτική δράση (βλέπε Κεφάλαιο Υλικά & Μέθοδοι). Όπως φαίνεται στην Εικόνα 24, οι αποικίες του com1 στελέχους είναι άχρωμες. Αυτό σημαίνει ότι η μετάλλαξη com1 δρα ως καταστολέας των κωδικίων λήξης. Αντίθετα, οι αποικίες των στελεχών που φέρουν τις μεταλλάξεις rdn2, rdn2com1 και rdn2com6 εμφανίζονται έγχρωμες υποδηλώνοντας ότι προκαλούν αντικαταστολή. Μάλιστα η διαβάθμιση του κόκκινου χρώματος σχετίζεται με το διαφορετικό βαθμό αντικαταστολής που προκαλεί η επίδραση κάθε μετάλλαξης, όπως αναφέρθηκε σε προηγούμενη παράγραφο (βλέπε παράγραφο 2.4.2). 3.5 Επίδραση των μεταλλάξεων com1, rdn2 και com6 επί του σταδίου της μετατόπισης Είναι γνωστό ότι όταν η P ριβοσωματική περιοχή είναι κατειλημμένη με αποακυλιωμένο trna, τότε το Ac-[ 3 H]Phe-tRNA προσδένεται αποκλειστικά στην Α περιοχή του ριβοσώματος. Ακολούθως, μπορεί να πάρει μέρος σε μία αντίδραση μετατόπισης παρουσία παραγόντων επιμήκυνσης. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η παρουσία του αποακυλιωμένου trna στην Ρ περιοχή διευκολύνει την 152

163 Αποτελέσματα πρόσδεση του παράγοντα επιμήκυνσης EF-G στο ριβόσωμα (Wilson & Nierhaus 2005). Η μετατόπιση του Ac-Phe-tRNA από την Α στην P περιοχή ελέγχθηκε με τη βοήθεια της αντίδρασης πουρομυκίνης (1 mm πουρομυκίνης για 10 min στους 30 ο C) η οποία χρησιμοποιείται ως αντίδραση παρακολούθησης Εξάρτηση της αντίδρασης μετατόπισης των ριβοσωμάτων των μεταλλαγμένων στελεχών από τη συγκέντρωση του κλάσματος των διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων H ικανότητα για μετατόπιση εξακριβώθηκε επωάζοντας τα ριβοσώματα κάθε στελέχους με διαφορετικές συγκεντρώσεις του κλάσματος των διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων (SPF). Σε μία σταθερή ποσότητα του συμπλόκου προμετατόπισης, προστέθηκαν αυξανόμενες συγκεντρώσεις SPF και η μετατόπιση πραγματοποιήθηκε για 1 min στους 30 ο C. Στη συνέχεια προστέθηκε πουρομυκίνη σε τελική συγκέντρωση 1 mm καθώς επίσης κυκλοεξιμίδιο σε τελική συγκέντρωση 100 μμ προκειμένου να αποκλειστεί η πιθανότητα μετατόπισης κατά τη διάρκεια της επώασης με πουρομυκίνη. Η επώαση με πουρομυκίνη έλαβε χώρα για 10 min μετά το τέλος των οποίων η αντίδραση τερματίστηκε με προσθήκη ισοδύναμου όγκου προς το μίγμα της αντίδρασης- διαλύματος NaOH. Το προϊόν που σχηματίστηκε, δηλαδή η Ac-Phe-πουρομυκίνη, προσδιορίστηκε σε μετρητή υγρού σπινθηρισμού. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 21 η έκταση της αντίδρασης μετατόπισης αυξήθηκε αναλογικά με την χρησιμοποιούμενη συγκέντρωση SPF, φτάνοντας σε πλατώ όταν όλο το πεπτιδύλο-trna υπό μορφή Ac-Phe-tRNA μετατοπίζεται από την Α στην P περιοχή σε όλα τα ενεργά ριβοσώματα στο μίγμα αντίδρασης. Πράγματι, το πλατώ της αντίδρασης μετατόπισης επήλθε μόλις στα 0,2 mg/ml SPF. Ως μέτρο σύγκρισης της ικανότητας μετατόπισης προσδιορίζεται η συγκέντρωση των πρωτεϊνικών παραγόντων (SPF) που προκαλούν διέγερση της αντίδρασης μετατόπισης κατά 50%. Η συγκέντρωση των SPF που απαιτείται για να επιτευχθεί αυτό το ποσοστό μετατόπισης κυμαίνεται στα ίδια επίπεδα για τα ριβοσώματα όλων των υπό μελέτη στελεχών και υπολογίζεται στα 0,15 mg/ml SPF. Το 100%, στο Σχήμα 21, δηλώνει την έκταση της αντίδρασης παρουσία παραγόντων επιμήκυνσης, έχοντας αφαιρέσει το ποσοστό που αντιστοιχεί στην αυθόρμητη αντίδραση μετατόπισης. 153

164 Αποτελέσματα 100 Ενζυμική μετατόπιση (%) ,5 1 1,5 2 [SPF] (mg/ml) Σχήμα 21. Εξάρτηση του σταδίου της μετατόπισης του πεπτιδυλο-trna, υπό τη μορφή του Ac-Phe-tRNA, από την συγκέντρωση των ευκαρυωτικών παραγόντων επιμήκυνσης που περιέχονται στο κλάσμα των διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων (SPF). Οι συγκεντρώσεις του SPF στις οποίες επιτεύχθηκε 50% μετατόπιση ήταν περίπου 0,15 mg/ml για όλα τα υπό μελέτη στελέχη. Καμπύλες: ( ) rdnwt, ( ) rdn2, ( ) com1, ( ) rdn2com1, ( ) rdn2com Επίδραση του κυκλοεξιμιδίου στο στάδιο της μετατόπισης της μετάφρασης Η μελέτη της επίδρασης των παραπάνω μεταλλάξεων ολοκληρώθηκε με την μελέτη της αναστολής της ενζυμικής μετατόπισης από το κυκλοεξιμίδιο. Η τελική συγκέντρωση των διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων που προστέθηκε στο σύμπλοκο προμετατόπισης ήταν τουλάχιστον ίση προς 0,15 mg/ml SPF όση δηλαδή αναφέρθηκε προηγουμένως ότι επάγει το 50% της μέγιστης ικανότητας για μετατόπιση. Ως μέτρο σύγκρισης της ανασταλτικής δράσης του κυκλοεξιμιδίου, υπολογίστηκε η συγκέντρωση του αντιβιοτικού που επιφέρει μείωση της ικανότητας μετατόπισης στο 50% της μέγιστης τιμής. Στο Σχήμα 22 φαίνεται ότι τα ριβοσώματα των στελεχών rdn2 και com1 έχουν μειωμένη ικανότητα για μετατόπιση καθώς το 50% αναστολής της μετατόπισης προκλήθηκε από 80 και 100 μμ κυκλοεξιμιδίου, αντίστοιχα, έναντι 200 μμ αντιβιοτικού στα ριβοσώματα του στελέχους αγρίου τύπου. Τα αποτελέσματα αυτά έρχονται σε συμφωνία με αυτά που αναφέρθηκαν έως τώρα σχετικά με την μεγαλύτερη ευαισθησία των στελεχών rdn2 και com1 στο κυκλοεξιμίδιο in vivo. Ο συνδυασμός των μεταλλάξεων rdn2 και com1 προκάλεσε αύξηση της ανθεκτικότητας 154

165 Αποτελέσματα στην ανασταλτική δράση του κυκλοεξιμιδίου καθώς το 50% της ενζυμικής μετατόπισης παρατηρήθηκε στα 140 μμ κυκλοεξιμιδίου. Το αποτέλεσμα της ταυτόχρονης παρουσίας των μεταλλάξεων rdn2 και com1 φαίνεται να είναι συνεργατικό κι όχι αθροιστικό. Το έτερα διπλά μεταλλαγμένο στέλεχος rdn2com6 παρουσίασε ακόμη υψηλότερα επίπεδα ανθεκτικότητας στο κυκλοεξιμίδιο αφού η αναστολή της ενζυμικής μετατόπισης κατά 50% παρατηρήθηκε στα 160 μμ κυκλοεξιμιδίου. Και αυτά τα αποτελέσματα έρχονται σε συμφωνία με αυτά που προαναφέρθηκαν σχετικά με την μεγαλύτερη ανθεκτικότητα των στελεχών rdn2com1 και rdn2com6 στο κυκλοεξιμίδιο in vivo, σε σχέση με τα αντίστοιχα στελέχη που φέρουν κάθε μετάλλαξη μεμονωμένα. 100 Ενζυμική μετατόπιση (%) [Κυκλοεξιμίδιο] (μμ) Σχήμα 22. Αναστολή της ενζυμικής μετατόπισης παρουσία κυκλοεξιμιδίου. Το ποσοστό του Ac-Phe-tRNA που μετατοπίστηκε από την Α στην P ριβοσωματική περιοχή προσδιορίσθηκε με 1 mm πουρομυκίνης για 10 min στους 30 ο C. 100 % ήταν η έκταση της μετατόπισης απουσία του αντιβιοτικού. Καμπύλες: ( ) rdnwt, ( ) rdn2, ( ) com1, ( ) rdn2com1, ( ) rdn2com6. 155

166 Αποτελέσματα 4. ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΣΗΜΕΙΑΚΗΣ ΜΕΤΑΛΛΑΞΗΣ rdn12a ΣΤΗ ΘΗΛΙΑ 530 ΤΗΣ ΕΛΙΚΑΣ 18 ΤΟΥ 18S rrna ΤΗΣ ΖΥΜΗΣ ΕΠΙ ΤΗΣ ΚΑΤΑΛΥΤΙΚΗΣ ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑΣ ΤΟΥ ΡΙΒΟΣΩΜΑΤΟΣ ΚΑΙ ΕΠΙ ΤΟΥ ΣΤΑΔΙΟΥ ΤΗΣ ΜΕΤΑΤΟΠΙΣΗΣ Η θηλιά 530 αποτελεί μια από τις πιο συντηρημένες περιοχές του 16S rrna τόσο στην αλληλουχία της όσο και στη δευτεροταγή της δομή (Woese et al., 1975, Gutell et al., 1985), γεγονός που αντανακλά τη σημασία που έχει στη λειτουργία του ριβοσώματος. Έχει πάρει την ονομασία της από την ομώνυμη βάση G530 η οποία διαδραματίζει σημαντικό ρόλο κατά τη διαδικασία αποκωδικοποίησης του mrna, όπως αναφέρθηκε ήδη στην Εισαγωγή. Η αλληλουχία της θηλιάς 530 έχει συντηρηθεί σε μεγάλο βαθμό και στον σακχαρομύκητα Saccharomyces cerevisiae, παρά τα δυο δισεκατομμύρια χρόνια που τον χωρίζουν από το E. coli. Η σημασία της θηλιάς 530, και κατά επέκταση της έλικας 18 του 18S rrna, στη ριβοσωματική λειτουργία καταφάνηκε προηγουμένως από τη διερεύνηση της επίδρασης της υποκατάστασης G517A (μετάλλαξη rdn2). Στην παρούσα πειραματική ενότητα περιγράφεται η επίδραση μιας άλλης σημειακής μετάλλαξης στη θηλιά 530 επί χαρακτηριστικών παραμέτρων της ριβοσωματικής λειτουργίας Χρησιμοποιηθέντα στελέχη Τα στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα φάση για τη διερεύνηση της επίδρασης της έλικας 18 του 18S rrna επί της πρωτεϊνοσύνθεσης είναι τα ακόλουθα: Το στέλεχος L1912 το οποίο φέρει απάλειψη του μεγαλύτερου μέρους των χρωμοσωματικών RDN αλληλουχιών και στο οποίο όλα τα μόρια του rrna κωδικοποιούνται από ένα υψηλού αριθμού αντιτύπων πλασμίδιο prdn-wt (βλέπε Κεφάλαιο Υλικά & Μέθοδοι). Χρησιμοποιήθηκε ως το αγρίου τύπου στέλεχος και θα αναφέρεται ως rdnwt. Το μεταλλαγμένο στέλεχος L1922 το οποίο φέρει, αντί του πλασμιδίου prdnwt, το πλασμίδιο prdn-rdn12a στο οποίο έχει εισαχθεί η υποκατάσταση C526A. Πρόκειται για μια σημειακή μετάλλαξη στην θηλιά 530 της έλικας 18 και το στέλεχος που τη φέρει θα αναφέρεται ως rdn12a. 156

167 Αποτελέσματα 4.2. Τα προηγηθέντα πειράματα και αποτελέσματα Τα ριβοσώματα του rdn12a μεταλλαγμένου στελέχους παρουσίασαν σημαντική απώλεια της μεταφραστικής πιστότητας των νοηματικών κωδικίων, καθώς η συχνότητα λάθους τριπλασιάστηκε σε σχέση με την αντίστοιχη των ριβοσωμάτων του στελέχους rdnwt. Η απώλεια της μεταφραστικής πιστότητας συνοδεύτηκε από αύξηση της ευαισθησίας των rdn12a κυττάρων στην παρομομυκίνη σε σύγκριση με τα κύτταρα του στελέχους αγρίου τύπου (Πίνακας 12). Σε συμφωνία με τον επιρρεπήσε μεταφραστικά λάθη- χαρακτήρα της μετάλλαξης rdn12a ήταν και η καταστολή των μη νοηματικών κωδικίων όπως αυτό διαπιστώθηκε από την απώλεια του κόκκινου χρώματος των κυτταρικών αποικιών κατά την ανάπτυξη των κυττάρων σε στερεές καλλιέργειες. Επί πλέον, παρατηρήθηκε αύξηση της ικανότητας πρόσδεσης του Phe-tRNA στην ριβοσωματική Α περιοχή κατά 18% σε σχέση με τα ριβοσώματα του στελέχους αγρίου τύπου. Αυτή η αύξηση είναι συμβατή με τον κατασταλτικό φαινότυπο της μετάλλαξης rdn12a. Πίνακας 12. Χαρακτηριστικές ιδιότητες της μετάλλαξης rdn12a επί της ανάπτυξης των κυττάρων και επί της λειτουργίας των εξ αυτών ριβοσωμάτων. Παρουσιάζονται α) οι μεταφραστικές συχνότητες λάθους των ριβοσωμάτων του αγρίου τύπου και του μεταλλαγμένου στελέχους, απουσία και παρουσία 20 μμ παρομομυκίνης (ΠΜ), β) οι συγκεντρώσεις της παρομομυκίνης οι οποίες προκαλούν αναστολή της ανάπτυξης των rdn12a κυττάρων κατά 50% σε σχέση με τα κύτταρα αγρίου τύπου και γ) η ικανότητα δέσμευσης του [ 3 H]-Phe-tRNA στην Α περιοχή των ριβοσωμάτων του αγρίου τύπου και του μεταλλαγμένου στελέχους. Οι τιμές που δίνονται αφορούν την Μέση Τιμή ± Τυπικό Σφάλμα. Στέλεχος Συχνότητα λάθους απουσία ΠΜ Συχνότητα λάθους + 20 μμ ΠΜ rdnwt ± ± rdn12a ± * ± * [ΠΜ] για 50% αναστολή ανάπτυξης (μμ) Ικανότητα δέσμευσης στην Α περιοχή (% του rdnwt) rdnwt 208 ± rdn12a 150 ± 6 * 118 ± 3 * * Στατιστικώς σημαντική διαφορά (one-way analysis of variance, F-Scheffè test, p < 0.05) σε σύγκριση με τα ριβοσώματα του στελέχους αγρίου τύπου rdnwt. 157

168 Αποτελέσματα Τα αποτελέσματα αυτά προέρχονται από την εκπόνηση της διπλωματικής εργασίας της βιολόγου Αικατερίνης Γουδέβενου και έχουν ανακοινωθεί σε εθνικό συνέδριο (βλέπε ανακοίνωση 6 στο Παράρτημα ΙΙ). 4.3 Επίδραση της μετάλλαξης rdn12α της έλικας 18 του 18S rrna επί της ικανότητας πρόσδεσης στην Ρ ριβοσωματική περιοχή και επί της καταλυτικής ενεργότητας του ριβοσώματος της ζύμης Αρχικά, πραγματοποιήθηκε ο σχηματισμός του τριμερούς συμπλόκου C, δηλαδή του Ac-[ 3 H]Phe-tRNA 80S ριβόσωμα poly(u). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 13, τα ριβοσώματα του στελέχους rdn12α παρουσιάζουν αύξηση της ικανότητας πρόσδεσης του Ac-[ 3 H]Phe-tRNA στην Ρ ριβοσωματική περιοχή κατά 44% σε σύγκριση με την αντίστοιχη ικανότητα των ριβοσωμάτων του στελέχους rdnwt. Το προσροφημένο σε μεμβράνες νιτρικής κυτταρίνης- τριμερές σύμπλοκο C αποπροσροφήθηκε με τη χρήση του απορρυπαντικού Zwittergent. Εν συνεχεία, τo αποπροσροφημένο σύμπλοκο C αντέδρασε με πουρομυκίνη, όπως έχει ήδη περιγραφεί. Οι τιμές των φαινομενικών σταθερών k obs για τις χρησιμοποιούμενες συγκεντρώσεις και για όλα τα υπό μελέτη στελέχη συνοψίζονται στον Πίνακα 14. Από τα δεδομένα αυτά φαίνεται ότι δεν παρατηρούνται σημαντικές διαφορές μεταξύ των στελεχών. Στο Σχήμα 23, παρουσιάζονται τα διαγράμματα διπλού αντιστρόφου για όλα τα μεταλλαγμένα στελέχη. Παρατηρούμε ότι η μετάλλαξη rdn12α δεν επηρεάζει την καταλυτική ενεργότητα των ριβοσωμάτων. Η κινητική σταθερά πρώτης τάξεως k 3 προσδιορίστηκε σε 1,77 min -1 για το εν λόγω στέλεχος και σε 1,64 min -1 για το στέλεχος rdnwt (Πίνακας 14). Ο λόγος k 3 /K s είναι και αυτός παρόμοιος μεταξύ των στελεχών. Τέλος, τόσο από το Σχήμα 23 όσο και από τον Πίνακα 14 είναι φανερό ότι η K s είναι περίπου ίδια για όλα τα στελέχη, γεγονός που σημαίνει ότι δεν αλλάζει η συγγένεια της πουρομυκίνης προς το ριβόσωμα. 158

169 Αποτελέσματα Πίνακας 13. Κινητικές παράμετροι ριβοσωμάτων του στελέχους αγρίου τύπου και του μεταλλαγμένου στελέχους rdn12a. Στέλεχος Πρόσδεση στην Ρ περιοχή k 3 K s k 3 /K s (% του rdnwt) (min -1 ) (mm) (min -1. mm -1 ) rdnwt 100 1,64 ± 0,16 0,75 2,19 rdn12a 144 ± 5 * 1,77 ± 0,15 0,83 2,13 * Στατιστικώς σημαντική διαφορά (one-way analysis of variance, F-Scheffè test, p < 0.05) σε σύγκριση με τα ριβοσώματα του στελέχους αγρίου τύπου rdnwt. Πίνακας 14. Τιμές k obs των ριβοσωμάτων των στελεχών για όλες τις συγκεντρώσεις πουρομυκίνης. [πουρομυκίνη] (mm) k obs (min -1 ) rdnwt rdn12a 2 1,19 1,25 1 0,94 0,97 0,4 0,57 0,58 0,1 0,19 0,19 0,0625 0,13 0, /kobs (min) (1/[πουρομυκίνη]) x 10 3 M -1 Σχήμα 23. Διαγράμματα διπλού αντιστρόφου για την αντίδραση πουρομυκίνης του τριμερούς συμπλόκου C με ριβοσώματα του στελέχους αγρίου τύπου και του μεταλλαγμένου στελέχους. Ευθείες: ( ) rdnwt, ( ) rdn12α. 159

170 Αποτελέσματα 4.4 Ανθεκτικότητα των κυττάρων έναντι του κυκλοεξιμιδίου in vivo Πειράματα σε υγρές καλλιέργειες Καλλιέργειες των κυττάρων των μεταλλαγμένων στελεχών αναπτύχθηκαν στους 30 ºC παρουσία μιας ευρείας κλίμακας συγκεντρώσεων του κυκλοεξιμιδίου. Όταν η κυτταρική καλλιέργεια που επωάστηκε απουσία αντιβιοτικού προσέγγισε τιμή οπτικής απορρόφησης Α 660 ίσης προς 0,9 τότε σταμάτησε η επώαση και των υπολοίπων κυτταρικών καλλιεργειών. Ως μέτρο σύγκρισης της επίδρασης του κυκλοεξιμιδίου επί της κυτταρικής ανάπτυξης, προσδιορίσθηκε η συγκέντρωση του αντιβιοτικού που αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων κατά 50%. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την επίδραση του αντιβιοτικού σε υγρές καλλιέργειες in vivo, δείχνουν (Σχήμα 24) πως η μετάλλαξη rdn12α παρουσιάζει μικρότερη ανθεκτικότητα στο κυκλοεξιμίδιο. Συγκεκριμένα, το 50% της αναστολής της κυτταρικής ανάπτυξης εκδηλώνεται στα 14 μg/l κυκλοεξιμιδίου έναντι 18 μg/l κυκλοεξιμιδίου για το στέλεχος rdnwt. 100 Πυκνότητα κυττάρων Α660 (%) [Κυκλοεξιμίδιο] (μg/l) Σχήμα 24. Αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων των μεταλλαγμένων στελεχών παρουσία κυκλοεξιμιδίου. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε YPD στους 30 ο C. Η ανάπτυξη των καλλιεργειών διεκόπη όταν η Α 660 για την καλλιέργεια μάρτυρα (στέλεχος που αναπτύσσεται απουσία αντιβιοτικού) έφθασε την τιμή 0,9 η οποία ελήφθη ως 100%. Καμπύλες: ( ) rdnwt, ( ) rdn12α. 160

171 Αποτελέσματα Δοκιμασία ανθεκτικότητας έναντι κυκλοεξιμιδίου επί φίλτρου Μια επιπλέον δοκιμασία με την οποία επιβεβαιώθηκε το πρότυπο της ανθεκτικότητας των υπό μελέτη στελεχών έναντι του κυκλοεξιμιδίου, προήλθε από την ανάπτυξη των κυττάρων των δυο στελεχών σε στερεές YPAD καλλιέργειες στις οποίες είχαν προστεθεί φίλτρα που είχαν εμποτισθεί με διαφορετικούς όγκους (2 και 5 μl) διαλύματος κυκλοεξιμιδίου. Στην Εικόνα 25 βλέπουμε ότι το rdn12a στέλεχος παρουσιάζει την μεγαλύτερη ευαισθησία στο αντιβιοτικό, καθώς εμφανίζεται σημαντική αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων του. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι στα 2 μg και 5 μg του κυκλοεξιμιδίου, η κυκλική ζώνη του μεταλλαγμένου στελέχους rdn12a είναι μεγαλύτερη κατά 3 και 2 mm, αντίστοιχα, σε σχέση με τις αντίστοιχες ζώνες του αγρίου τύπου στελέχους rdnwt. 2 μg H 2 O 5 μg rdnwt rdn12α Εικόνα 25. Αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης του στελέχους αγρίου τύπου και των μεταλλαγμένων στελεχών ζύμης. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε στερεές YPΑD καλλιέργειες στις οποίες είχαν προστεθεί φίλτρα που είχαν εμποτιστεί με διαφορετικούς όγκους διαλύματος κυκλοεξιμιδίου συγκέντρωσης 1 mg/ml. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 30 ºC για χρονικό διάστημα 3-4 ημερών. Η ανθεκτικότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε από την περιοχή ελεύθερη κυττάρων γύρω από το εμποτισμένο με κυκλοεξιμίδιο φίλτρο. Στην ίδια Εικόνα, εκτός από την ανθεκτικότητα προς το κυκλοεξιμίδιο, έχουμε και διάγνωση, με την βοήθεια της έντασης του χρώματος των αποικιών, του φαινοτύπου καταστολής που προκαλεί η μετάλλαξη rdn12a. Η κατασταλτική δράση υποδηλώνεται από το λευκό χρώμα που παρουσιάζουν οι κυτταρικές αποικίες του στελέχους rdn12a. Η παρουσία του λευκού χρώματος υποδηλώνει τη βιοσύνθεση αδενίνης, όπως έχει ήδη αναφερθεί. 161

172 Αποτελέσματα 4.5 Πρωτεϊνοσυνθετική ενεργότητα των ριβοσωμάτων παρουσία κυκλοεξιμιδίου Η ευαισθησία του στελέχους rdn12a έναντι του κυκλοεξιμιδίου, κατέστησε αναγκαία τη διερεύνηση της επίδρασης του αντιβιοτικού επί της πρωτεϊνοσυνθετικής ενεργότητας των ριβοσωμάτων. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε η in vitro poly(u) δοκιμασία μετάφρασης και μια ευρεία κλίμακα συγκεντρώσεων κυκλοεξιμιδίου προκειμένου να προσδιοριστεί η συγκέντρωση εκείνη που προκαλεί αναστολή της πρωτεϊνοσυνθετικής ενεργότητας των ριβοσωμάτων στο ήμισυ της μέγιστης (50%) που παρατηρείται απουσία του αντιβιοτικού. Όπως παρατηρείται στο Σχήμα 25, τα ριβοσώματα του στελέχους που φέρει τη μετάλλαξη rdn12a παρουσίασαν ελάττωση της πρωτεϊνοσυνθετικής τους ενεργότητας σε σχέση με τα ριβοσώματα του στελέχους rdnwt. Πράγματι, η συγκέντρωση του κυκλοεξιμιδίου που απαιτήθηκε για την αναστολή της σύνθεσης πολυφαινυλαλανίνης κατά 50% υπολογίστηκε στα 0,35 μμ για τα ριβοσώματα του στελέχους rdn12a έναντι 0,75 μμ για τα ριβοσώματα του στελέχους rdnwt. Σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης (%) ,01 0, [Κυκλοεξιμίδιο] (μμ) Σχήμα 25. Αναστολή της πρωτεϊνοσυνθετικής ενεργότητας των ριβοσωμάτων του στελέχους αγρίου τύπου και του στελέχους rdn12a, παρουσία κυκλοεξιμιδίου. Ως 100% ορίζεται η ποσότητα της πολυφαινυλαλανίνης που σχηματίζεται όταν τα ριβοσώματα επωάζονται απουσία κυκλοεξιμιδίου. Καμπύλες: ( ) rdnwt, ( ) rdn12α. 162

173 Αποτελέσματα 4.6 Επίδραση της μετάλλαξης rdn12α της έλικας 18 του 18S rrna επί του σταδίου της μετατόπισης της πρωτεϊνοσύνθεσης Το γεγονός ότι τα κύτταρα του στελέχους rdn12α παρουσιάζουν μεγαλύτερη ευαισθησία στο κυκλοεξιμίδιο, υποδεικνύει ότι η συγκεκριμένη μετάλλαξη επηρεάζει το στάδιο της μετατόπισης. Η υπόθεση αυτή εξετάσθηκε με την αντίδραση μετατόπισης, η οποία ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας την αντίδραση πουρομυκίνης ως αντίδραση παρακολούθησης, δηλαδή χρησιμοποιώντας 1 mm πουρομυκίνης για 10 min στους 30 ο C. Το κυκλοεξιμίδιο χρησιμοποιήθηκε στην αντίδραση μετατόπισης για δύο λόγους: Πρώτον, κατά την διάρκεια της μετατόπισης και πριν την αντίδραση πουρομυκίνης σε διαφορετικές συγκεντρώσεις με σκοπό την εύρεση της συγκέντρωσης που προκαλεί αναστολή της μετατόπισης στο αγρίου τύπου στέλεχος και στο rdn12α μεταλλαγμένο στέλεχος και δεύτερον κατά την διάρκεια της αντίδρασης πουρομυκίνης σε υψηλές συγκεντρώσεις για να αποκλειστεί η πιθανότητα μετατόπισης κατά την αντίδραση πουρομυκίνης. Είναι γνωστό ότι όταν η P περιοχή είναι κατειλημμένη με αποακυλιωμένο trna, τότε το Ac-[ 3 H]Phe-tRNA προσδένεται αποκλειστικά στην Α περιοχή. Ακολούθως, μπορεί να πάρει μέρος σε μία αντίδραση μετατόπισης παρουσία παραγόντων επιμήκυνσης και 11 mm Mg Εξάρτηση της αντίδρασης μετατόπισης των ριβοσωμάτων των μεταλλαγμένων στελεχών από τη συγκέντρωση του κλάσματος των διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων Αρχικά εξετάσθηκε η ικανότητα των ριβοσωμάτων του κάθε στελέχους για μετατόπιση παρουσία διαφορετικών συγκεντρώσεων του κλάσματος των διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων (SPF). Σε μία σταθερή ποσότητα του συμπλόκου προμετατόπισης, προστέθηκαν αυξανόμενες συγκεντρώσεις SPF και η μετατόπιση πραγματοποιήθηκε για 1 min στους 30 ο C. Στη συνέχεια προστέθηκε πουρομυκίνη σε τελική συγκέντρωση 1 mm καθώς επίσης κυκλοεξιμίδιο σε τελική συγκέντρωση 100 μμ και η αντίδραση τερματίστηκε μετά από 10 min με προσθήκη διαλύματος NaOH. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 26, η έκταση της αντίδρασης μετατόπισης αυξήθηκε αναλογικά με την χρησιμοποιούμενη συγκέντρωση SPF, φτάνοντας σε πλατώ όταν 163

174 Αποτελέσματα όλο το πεπτιδύλο-trna, υπό μορφή Ac-[ 3 H]Phe-tRNA, μετατοπίζεται από την Α στην P περιοχή σε όλα τα ενεργά ριβοσώματα στο μίγμα αντίδρασης. Επίσης όπως φαίνεται στο ίδιο Σχήμα, για το 50% της μετατόπισης χρειάζεται μικρότερη συγκέντρωση SPF για το στέλεχος rdn12α σε σύγκριση με το στέλεχος αγρίου τύπου (0,2 mg/ml έναντι 0,3 mg/ml). Το γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι το στέλεχος rdn12α παρουσιάζει μεγαλύτερη ικανότητα μετατόπισης του πεπτιδύλο-trna από την A στην P περιοχή παρουσία παραγόντων επιμήκυνσης έναντι του στελέχους αγρίου τύπου. Το 100% στο Σχήμα 26, δηλώνει την έκταση της αντίδρασης παρουσία παραγόντων επιμήκυνσης, έχοντας αφαιρέσει το ποσοστό που αντιστοιχεί στην αυθόρμητη αντίδραση μετατόπισης, δηλαδή στην μετατόπιση που πραγματοποιείται απουσία παραγόντων επιμήκυνσης. 100 Ενζυμική μετατόπιση (%) ,5 1 1,5 2 [SPF] (mg/ml) Σχήμα 26. Εξάρτηση του σταδίου της μετατόπισης του πεπτιδυλο-trna από την συγκέντρωση των ευκαρυωτικών παραγόντων επιμήκυνσης που περιέχονται στο κλάσμα των διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων (SPF). Οι συγκεντρώσεις του SPF στις οποίες επιτεύχθηκε 50% μετατόπιση ήταν περίπου 0,15 mg/ml για όλα τα υπό μελέτη στελέχη. Καμπύλες: ( ) rdnwt, ( ) rdn12α Επίδραση του κυκλοεξιμιδίου επί του σταδίου της μετατόπισης της μετάφρασης Η μελέτη της επίδρασης της σημειακής μετάλλαξης rdn12a ολοκληρώθηκε με την μελέτη της αναστολής της ενζυμικής μετατόπισης από το κυκλοεξιμίδιο. Η τελική συγκέντρωση των διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων που προστέθηκε στο σύμπλοκο 164

175 Αποτελέσματα προμετατόπισης ήταν τουλάχιστον ίση προς εκείνη που προκαλεί το 50% της μέγιστης ικανότητας για μετατόπιση, δηλαδή 0,2 mg/ml για το στέλεχος rdn12a και 0,3 mg/ml για το στέλεχος αγρίου τύπου. Στο Σχήμα 27 φαίνεται ότι το 50% αναστολής της μετατόπισης επιτυγχάνεται στα 200 μμ κυκλοεξιμιδίου για το αγρίου τύπου στέλεχος, ενώ για το rdn12a μεταλλαγμένο στέλεχος το ίδιο ποσοστό αναστολής της μετατόπισης επιτυγχάνεται στα 100 μμ κυκλοεξιμιδίου, δηλώνοντας έτσι μεγαλύτερη ευαισθησία του στελέχους αυτού στο αντιβιοτικό. Τα αποτελέσματα αυτά είναι σε συμφωνία με αυτά που αναφέρθηκαν έως τώρα σχετικά με την ανθεκτικότητα των στελεχών στο κυκλοεξιμίδιο. 100 Ενζυμική μετατόπιση (%) [Κυκλοεξιμίδιο] (μμ) Σχήμα 27. Αναστολή της ενζυμικής μετατόπισης παρουσία κυκλοεξιμιδίου. Το ποσοστό του Ac-Phe-tRNA που μετατοπίστηκε από την Α στην P ριβοσωματική περιοχή προσδιορίσθηκε με 1 mm πουρομυκίνης για 10 min στους 30 ο C. 100% ήταν η έκταση της μετατόπισης απουσία του αντιβιοτικού. Καμπύλες: ( ) rdnwt, ( ) rdn12α. Τα παραπάνω αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν, πραγματοποιώντας τα πειράματα της αναστολής της ενζυμικής μετατόπισης, χρησιμοποιώντας την ελάχιστη συγκέντρωση των διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων κατά την οποία η αντίδραση μετατόπισης παρουσία SPF φθάνει σε πλατώ. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 26, αυτή η συγκέντρωση SPF είναι ίση προς 1 mg/ml. Χρησιμοποιώντας αυτή τη συγκέντρωση SPF το πρότυπο της αναστολής της ενζυμικής μετατόπισης ήταν ίδιο με αυτό που παρουσιάζεται στο Σχήμα

176 Αποτελέσματα 5. ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΕΠΙΔΡΑΣΗΣ ΤΗΣ ΣΗΜΕΙΑΚΗΣ ΜΕΤΑΛΛΑΞΗΣ com3 ΤΟΥ 25S rrna ΤΗΣ ΜΕΓΑΛΗΣ ΡΙΒΟΣΩΜΑΤΙΚΗΣ ΥΠΟΜΟΝΑΔΑΣ ΤΗΣ ΖΥΜΗΣ ΕΠΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΩΝ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΩΝ ΤΟΥ ΡΙΒΟΣΩΜΑΤΟΣ Όπως έχει, ήδη, αναφερθεί η μικρή ριβοσωματική υπομονάδα είναι κατεξοχήν υπεύθυνη για τη σωστή αποκωδικοποίηση της γενετικής πληροφορίας ενώ η ριβοσωματική καταλυτική ενεργότητα αποτελεί κύρια λειτουργία της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας. Στις ενότητες που προηγήθηκαν, παρουσιάστηκε η επίδραση μιας σειράς μεταλλάξεων της μικρής υπομονάδας επί της λειτουργίας της πρωτεϊνοσύνθεσης. Στις παραγράφους που ακολουθούν, παρουσιάζεται η επίδραση επί της ριβοσωματικής λειτουργίας μιας σημειακής μετάλλαξης στο 25S rrna, δηλαδή στη μεγάλη υπομονάδα του ριβοσώματος. Αξίζει να αναφερθεί πως η περιοχή την οποία μελετάμε βρίσκεται αρκετά μακριά, τουλάχιστον σε ότι αφορά την δευτεροταγή της δομή, από το λεγόμενο κέντρο της ριβοσωματικής πεπτιδυλοτρανσφεράσης Χρησιμοποιηθέντα στελέχη Τα στελέχη που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα φάση για τη διερεύνηση της επίδρασης του 25S rrna επί της πρωτεϊνοσύνθεσης είναι τα ακόλουθα: Το στέλεχος L1494 το οποίο φέρει απάλειψη του μεγαλύτερου μέρους των χρωμοσωματικών RDN αλληλουχιών και στο οποίο όλα τα μόρια του rrna κωδικοποιούνται από ένα υψηλού αριθμού αντιτύπων πλασμίδιο prdn-wt (βλέπε Κεφάλαιο Υλικά & Μέθοδοι). Χρησιμοποιήθηκε ως το αγρίου τύπου στέλεχος και θα αναφέρεται ως rdnwt. Το μεταλλαγμένο στέλεχος L1895 το οποίο φέρει, αντί του πλασμιδίου prdnwt, το πλασμίδιο prdn-rdncom3 στο οποίο έχει εισαχθεί η υποκατάσταση C1057G. Πρόκειται για μια σημειακή μετάλλαξη στην έλικα 42 και το στέλεχος που τη φέρει θα αναφέρεται ως com3. Ας σημειωθεί, τέλος, ότι στο 23S rrna του προκαρυωτικού ριβοσώματος υπάρχει φυσιολογικά το κατάλοιπο της γουανίνης (G) στη θέση 1057, ενώ στην αντίστοιχη περιοχή του 25S rrna του ευκαρυωτικού ριβοσώματος υπάρχει φυσιολογικά το κατάλοιπο της κυτοσίνης (C) (Πίνακας 2). Επομένως, η συγκεκριμένη υποκατάσταση προκαλεί την επιστροφή, τρόπον τινά, της μεγάλης υπομονάδας του ευκαρυωτικού ριβοσώματος στην προκαρυωτική κατάσταση. 166

177 Αποτελέσματα 5.2. Τα προηγηθέντα πειράματα και αποτελέσματα Τα ριβοσώματα του com3 στελέχους παρουσίασαν σημαντική βελτίωση της μεταφραστικής πιστότητας, καθώς η συχνότητα λάθους ελαττώθηκε σχεδόν κατά 2 φορές σε σχέση με την αντίστοιχη των ριβοσωμάτων του στελέχους rdnwt. Ωστόσο, η αύξηση της μεταφραστικής πιστότητας δεν συνοδεύτηκε από ανάλογη αύξηση της ανθεκτικότητας των com3 κυττάρων στην παρομομυκίνη σε σύγκριση με τα κύτταρα του στελέχους αγρίου τύπου. (Πίνακας 15). Σε συμφωνία με τον υπερακριβή χαρακτήρα της μετάλλαξης com3 ήταν και η αναγνώριση των μη νοηματικών κωδικίων, δηλαδή ο φαινότυπος αντικαταστολής, όπως αυτός διαπιστώθηκε από την εμφάνιση κόκκινου χρώματος στις κυτταρικές αποικίες κατά την ανάπτυξη του com3 στελέχους σε στερεές καλλιέργειες. Επί πλέον, παρατηρήθηκε μια μικρή αύξηση, στατιστικώς μη σημαντική, της ικανότητας πρόσδεσης του Phe-tRNA στην ριβοσωματική Α περιοχή κατά 8% σε σχέση με τα ριβοσώματα του στελέχους αγρίου τύπου. Πίνακας 15. Χαρακτηριστικές ιδιότητες της μετάλλαξης com3 επί της ανάπτυξης των κυττάρων και επί της λειτουργίας των εξ αυτών ριβοσωμάτων. Παρουσιάζονται α) οι μεταφραστικές συχνότητες λάθους των ριβοσωμάτων του αγρίου τύπου και του com3 στελέχους, απουσία και παρουσία 50 μμ παρομομυκίνης (ΠΜ), β) οι συγκεντρώσεις της παρομομυκίνης οι οποίες προκαλούν αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης κατά 50% και γ) η ικανότητα δέσμευσης του [ 3 H]-Phe-tRNA στην Α περιοχή των ριβοσωμάτων του αγρίου τύπου και του com3 στελέχους. Οι τιμές που παρουσιάζονται αφορούν την Μέση Τιμή ± Τυπικό Σφάλμα. Στέλεχος Συχνότητα λάθους απουσία ΠΜ Συχνότητα λάθους + 50 μμ ΠΜ rdnwt ± ± com ± * ± * [ΠΜ] για 50% αναστολή ανάπτυξης (μμ) Ικανότητα δέσμευσης στην Α περιοχή (% του rdnwt) rdnwt 70 ± com3 73 ± ± 3 * Στατιστικώς σημαντική διαφορά (one-way analysis of variance, F-Scheffè test, p < 0.05) σε σύγκριση με τα ριβοσώματα του στελέχους αγρίου τύπου rdnwt. 167

178 Αποτελέσματα Τα αποτελέσματα αυτά προέρχονται από την εκπόνηση της διπλωματικής εργασίας του βιολόγου Γεώργιου Μπελιμπασάκη και έχουν ανακοινωθεί σε εθνικό συνέδριο (βλέπε ανακοίνωση 5 Παραρτήματος ΙΙ). 5.3 Πρωτεϊνοσυνθετική ενεργότητα των μεταλλαγμένων ριβοσωμάτων Σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης των αγρίου τύπου και μεταλλαγμένων ριβοσωμάτων Η πρωτεϊνοσυνθετική ενεργότητα των ριβοσωμάτων, δηλαδή η ικανότητα τους για μετάφραση μηνύματος, προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την in vitro poly(u) δοκιμασία για τη σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης. Η αντίδραση σύνθεσης πολυφαινυλαλανίνης απαιτεί την παρουσία διαλυτών πρωτεϊνικών παραγόντων της μετάφρασης οι οποίοι περιέχονται στο ακάθαρτο εκχύλισμα S30 που προκύπτει κατά την παρασκευή του συστήματος ελεύθερο κυττάρων. Στο Σχήμα 28 φαίνεται ότι η ενεργότητα των com3 ριβοσωμάτων ελαττώθηκε σε σχέση με την αντίστοιχη των ριβοσωμάτων αγρίου τύπου, σε 41 pmol φαινυλαλανίνης για κάθε pmol ριβοσώματος από 59 pmol φαινυλαλανίνης / pmol ριβοσώματος, αντίστοιχα. Όταν στο in vitro poly(u) σύστημα για τη σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης προστέθηκε το αμινογλυκοζiτικό αντιβιοτικό παρομομυκίνη σε τελική συγκέντρωση 50 μμ, τότε παρατηρήθηκε μία αύξηση στην ικανότητα σύνθεσης πολυφαινυλαλανίνης για όλα τα στελέχη (Σχήμα 28), προσδίδοντας στο αντιβιοτικό το χαρακτηρισμό ως διεγέρτη της πρωτεϊνοσυνθετικής ενεργότητας. Ωστόσο, τα ριβοσώματα του στελέχους com3 παρουσίασαν την ίδια ανεπάρκεια στην πρωτεϊνοσυνθετική τους ενεργότητα σε σχέση με τα ριβοσώματα του στελέχους rdnwt, με τις τιμές ενσωμάτωσης φαινυλαλανίνης να προσδιορίζονται στα 188 και 353 pmol φαινυλαλανίνης για κάθε pmol ριβοσώματος, αντίστοιχα Κινητική ενσωμάτωσης φαινυλαλανίνης Ένα, επί πλέον, κριτήριο της πρωτεϊνοσυνθετικής ενεργότητας των ριβοσωμάτων των στελεχών προέρχεται από τις in vitro δοκιμασίες της κινητικής της αντίδρασης σχηματισμού πολυφαινυλαλανίνης, με τις οποίες προσδιορίζεται η σχηματιζόμενη, σε κάθε χρονική στιγμή, πολυφαινυλαλανίνη. Από το σχηματισμό των καμπύλων που έδωσε η κινητική ανάλυση (Σχήμα 29), παρατηρήθηκε ότι τα ριβοσώματα του στελέχους com3 παρουσιάζουν ελάττωση του 168

179 Αποτελέσματα αρχικού ρυθμού σύνθεσης πολυφαινυλαλανίνης όπως υποδηλώνει η μικρότερη κλίση της καμπύλης. Επί πλέον, η έκταση της σύνθεσης πολυφαινυλαλανίνης των ριβοσωμάτων του στελέχους com3 είναι κατά 3 φορές μικρότερη σε σχέση με την αντίστοιχη των ριβοσωμάτων αγρίου τύπου. Τα αποτελέσματα αυτά είναι σε συμφωνία με τα αντίστοιχα της ικανότητας σχηματισμού πολυφαινυλαλανίνης. 400 Πολυφαινυλαλανίνη (cpm x 10 4 /A260 ribs) Σύνθεση πολυφαινυλαλανίνης (pmol Phe/pmol ribs) Σχήμα 28. Ικανότητα σύνθεσης πολυφαινυλαλανίνης στους 30 ºC για τα ριβοσώματα του στελέχους αγρίου τύπου και του μεταλλαγμένου στελέχους, απουσία (λευκές στήλες) και παρουσία 50 μμ παρομομυκίνης (μαύρες στήλες). Με αστερίσκο υποδηλώνεται η στατιστικώς σημαντική διαφορά σε σύγκριση με τα ριβοσώματα του στελέχους αγρίου τύπου, απουσία και παρουσία παρομομυκίνης, αντίστοιχα rdnwt com3 * * Χρόνος (min) Σχήμα 29. Κινητική του σχηματισμού της πολυφαινυλαλανίνης στους 30 ºC για τα ριβοσώματα του στελέχους-μάρτυρα και των μεταλλαγμένων στελεχών. Καμπύλες: ( ) rdnwt, ( ) com3. 169

180 Αποτελέσματα 5.4 Επίδραση της μετάλλαξης com3 του 25S rrna επί της ικανότητας πρόσδεσης στην Ρ ριβοσωματική περιοχή και επί της καταλυτικής ενεργότητας του ριβοσώματος της ζύμης Η πρόσδεση του πεπτιδύλο-trna, υπό την μορφή του Ac-[ 3 H]Phe-tRNA, στην P περιοχή του ριβοσώματος επιτεύχθηκε κατόπιν αντίδρασης παρασκευής του τριμερούς συμπλόκου C, δηλαδή του Ac-[ 3 H]Phe-tRNA poly(u) 80S ριβοσώματος. Στην παρούσα μελέτη, παρατηρήθηκε αύξηση στην πρόσδεση του Ac-[ 3 H]-PhetRNA στη P περιοχή του ριβοσώματος από 100% στο στέλεχος rdnwt σε 116% στο com3 στέλεχος (Πίνακας 16). H επίδραση της μετάλλαξης com3 στις καταλυτικές ιδιότητες του ριβοσώματος μελετήθηκε με τη βοήθεια της αντίδρασης πουρομυκίνης. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η αντίδραση μεταξύ του ενεργού τριμερούς συμπλόκου C με περίσσεια πουρομυκίνης ακολουθεί κινητική ψευδοπρώτης τάξεως καταλήγοντας στο σχηματισμό Ac-Pheπουρομυκίνης. Οι τιμές των φαινομενικών σταθερών k obs για τις χρησιμοποιούμενες συγκεντρώσεις και για όλα τα υπό μελέτη στελέχη συνοψίζονται στον Πίνακα 17. Επίσης, όπως φαίνεται στον Πίνακα 16, η μετάλλαξη com3 μειώνει την καταλυτική σταθερά k 3 από 1,46 min -1 στο rdnwt σε 0,95 min -1 στο com3 στέλεχος, χωρίς να επηρεάζει σημαντικά την σταθερά Κ s. Ο λόγος k 3 /K s, που είναι ο ακριβέστερος δείκτης της ενεργότητας ενός ενζύμου, είναι μειωμένος από το 1,72 στο rdnwt στο 1,25 στο com3 στέλεχος. Πίνακας 16. Κινητικές παράμετροι ριβοσωμάτων του στελέχους αγρίου τύπου και του μεταλλαγμένου στελέχους. Στέλεχος Πρόσδεση στην Ρ περιοχή k 3 K s k 3 /K s (% του rdnwt) (min -1 ) (mm) (min -1. mm -1 ) rdnwt 100 1,46 ± 0,04 0,85 1,72 com3 116 ± 5 * 0,95 ± 0,06 * 0,76 1,25 * Στατιστικώς σημαντική διαφορά (one-way analysis of variance, F-Scheffè test, p < 0.05) σε σύγκριση με τα ριβοσώματα του στελέχους αγρίου τύπου rdnwt 170

181 Αποτελέσματα Πίνακας 17. Τιμές k obs των ριβοσωμάτων των στελεχών για όλες τις συγκεντρώσεις πουρομυκίνης. [πουρομυκίνη] (mm) k obs (min -1 ) rdnwt com3 2 0,98 1,06 1 0,85 0,71 0,4 0,47 0,27 0,1 0,14 0,11 0,0625 0,10 0,07 Τα παραπάνω αποτελέσματα εκφράστηκαν γραφικά με το διάγραμμα του διπλού αντιστρόφου (Σχήμα 30). Οι ευθείες τέμνουν τον άξονα των Y σε σημείο από το οποίο υπολογίζεται η k 3 και τον άξονα των Χ σε σημείο από το οποίο υπολογίζεται η Κ s για το κάθε στέλεχος. Η μεγαλύτερη κλίση της ευθείας υποδηλώνει μεγάλη τιμή του λόγου 1/k 3 άρα, με αντιστροφή, μικρή τιμή της κινητικής σταθεράς k 3 και συνεπώς χαμηλή ταχύτητα σχηματισμού πεπτιδικών δεσμών. Πράγματι, όπως φαίνεται στο Σχήμα 30, η κλίσης της ευθείας για το com3 στέλεχος είναι μεγαλύτερη, δηλαδή η ευθεία τέμνει τον άξονα των Y σε υψηλότερο σημείο σε σχέση με την ευθεία που αντιστοιχεί στο rdnwt στέλεχος. Η ευθεία για το στέλεχος com3 τέμνει τον άξονα των Y στο 1,05 οπότε με αντιστροφή λαμβάνεται η τιμή της k 3 η οποία όπως προαναφέρθηκε είναι 0,95 min -1, ενώ η ευθεία για το rdnwt στέλεχος τέμνει τον άξονα των Y στο 0,68 οπότε με αντιστροφή λαμβάνεται η τιμή της k 3 η οποία όπως προαναφέρθηκε είναι 1,46 min -1. Τέλος, στο Σχήμα 30 φαίνεται ότι η τομή των ευθειών με τον άξονα των x είναι περίπου στο ίδιο σημείο οπότε με αντιστροφή λαμβάνουμε την ίδια περίπου τιμή για την K s. 171

182 Αποτελέσματα /kobs (min) (1/[πουρομυκίνη]) x 10 3 M -1 Σχήμα 30. Διαγράμματα διπλού αντιστρόφου (1/k obs έναντι 1/[πουρομυκίνη]) για την αντίδραση πουρομυκίνης του συμπλόκου C από ριβοσώματα του στελέχους αγρίου τύπου και του μεταλλαγμένου στελέχους. Ευθείες: ( ) rdnwt, ( ) com3. Από τα παραπάνω διαγράμματα μπορούν να υπολογιστούν οι τιμές των K s και k 3 των στελεχών. 5.5 Ανθεκτικότητα των κυττάρων έναντι του κυκλοεξιμιδίου in vivo Πειράματα σε υγρές καλλιέργειες Καλλιέργειες των κυττάρων των μεταλλαγμένων στελεχών αναπτύχθηκαν στους 30 ºC παρουσία αυξανομένων συγκεντρώσεων του κυκλοεξιμιδίου. Ως μέτρο σύγκρισης της επίδρασης του κυκλοεξιμιδίου επί της κυτταρικής ανάπτυξης, προσδιορίσθηκε η συγκέντρωση του αντιβιοτικού που αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων κατά 50%. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν από την επίδραση του αντιβιοτικού σε υγρές καλλιέργειες in vivo, δείχνουν (Σχήμα 31) πως η μετάλλαξη com3 παρουσιάζει παρόμοια επίπεδα ανθεκτικότητας στο κυκλοεξιμίδιο με το στέλεχος rdnwt. Συγκεκριμένα, το 50% της αναστολής της κυτταρικής ανάπτυξης εκδηλώνεται περίπου στα 30 μg/l κυκλοεξιμιδίου και για τα δύο στελέχη Δοκιμασία ανθεκτικότητας έναντι κυκλοεξιμιδίου επί φίλτρου Η ανθεκτικότητα των υπό μελέτη στελεχών έναντι του κυκλοεξιμιδίου επιβεβαιώθηκε και με πειράματα ανάπτυξης των κυττάρων των δυο στελεχών σε 172

183 Αποτελέσματα στερεές YPAD καλλιέργειες στις οποίες είχαν προστεθεί φίλτρα που είχαν εμποτισθεί με διαφορετικούς όγκους (2 και 5 μl) 1 mg/ml διαλύματος κυκλοεξιμιδίου. Στην Εικόνα 26 βλέπουμε ότι το com3 στέλεχος παρουσιάζει ίδια επίπεδα ανθεκτικότητας στο κυκλοεξιμίδιο με το στέλεχος αγρίου τύπου καθώς τόσο στα 2 μg όσο και στα 5 μg του κυκλοεξιμιδίου, οι κυκλικές ζώνες ελεύθερες κυττάρων και των δυο στελεχών καταλαμβάνουν παρόμοιες εκτάσεις από τα εμποτισμένα με αντιβιοτικό φίλτρα. Εκτός από την ανθεκτικότητα προς το κυκλοεξιμίδιο, το σύστημα αυτό προσδίδει και διάγνωση, με την βοήθεια της έντασης του χρώματος των αποικιών, σχετικά με το κατά πόσο οι μεταλλάξεις που μελετήσαμε παρουσιάζουν κατασταλτική ή αντικατασταλτική δράση. Στην Εικόνα 26 φαίνεται ότι το com3 στέλεχος είναι περισσότερο ερυθρό από το αγρίου τύπου στέλεχος γεγονός που οφείλεται στην αντικατασταλτική δράση της μετάλλαξης C1057G. 100 Πυκνότητα κυττάρων Α660 (%) [Κυκλοεξιμίδιο] (μg/l) Σχήμα 31. Αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης των στελεχών παρουσία κυκλοεξιμιδίου. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε YPD στους 30 ο C. Η ανάπτυξη των καλλιεργειών διεκόπη όταν η Α 660 για την καλλιέργεια μάρτυρα (στέλεχος που αναπτύσσεται απουσία αντιβιοτικού) έφθασε την τιμή 0,9 η οποία ελήφθη ως 100%. Καμπύλες: ( ) rdnwt, ( ) com3. 173

184 Αποτελέσματα 2 μg H 2 O 5 μg rdnwt com3 Εικόνα 26. Αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης του στελέχους αγρίου τύπου και του στελέχους com3. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε στερεές YPΑD καλλιέργειες στις οποίες είχαν προστεθεί φίλτρα που είχαν εμποτιστεί με διαφορετικούς όγκους διαλύματος κυκλοεξιμιδίου συγκέντρωσης 1 mg/ml. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 30 ºC για χρονικό διάστημα 3-4 ημερών. Η ανθεκτικότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε από την περιοχή ελεύθερη κυττάρων γύρω από το εμποτισμένο με κυκλοεξιμίδιο φίλτρο. 174