αποτελεσμάτων και στατιστική επεξεργασία. Διαπιστώθηκε ότι καμία από τις ουσίες ενεργοποιητές του πρωτεασώματος δεν παρουσίαζε θετική επίδραση τόσο

Transcript

1 Περίληψη Το Δίπτερο έντομο DrosophiJci rnejcrnogcister Θεωρείται ως πρότυπος οργανισμός στη μελέτη Θεμελιωδών κυτταροβιολογικών μηχανισμών, στους οποίους συγκαταλέγονται η γήρανση (senescence) και ο προγραμματισμένος κυτταρικός Θάνατος (progi ammed cell death). Το εν λόγω έντομο χαρακτηρίζεται από σύντομο κύκλο ζωής και μικρό σε μέγεθος γονιδίωμα, ενώ παράλληλα διαθέτει σύνθετα συστήματα (οργανικά και ενδοκρινικό), γεγονός που επιτρέπει τη μελέτη ταυ ρόλου των συντηρημένων μονοπατιών μεταγωγής σήματος μέσω εξελιγμένων γενετικών τεχνικών. Ένα από τα πρότυπα συστήματα μελέτης κυτταροβιολογικών αναπτυξιακών μηχανισμών στη D. rnekrnogcrster είναι η ωογένεση. Στο Θηλυκό έντομο της D. rne(cmogaster εντοπίζονται δύο ωοθήκες, καθεμία από τις οποίες αποτελείται από σειρές ωοθηκαρίων, οι οποίες περιέχουν μεγάλο αριθμό ωοθυλακίων διαδοχικών αναπτυξιακών σταδίων. Κάθε ωοθυλάκιο αποτελείται από ένα ωοκύτταρο και δεκαπέντε τροφοκύτταρα, ενώ περιβάλλεται από μία σειρά επιθηλιακών κυττάρων, τα θυλακοκύτταρα. H γενετικά ελεγχόμενη ωρίμανση του ωοκυττάρου ολοκληρώνεται δια μέσου του στάδιο-ειδικού προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου, τόσα των τροφοκυττάρων. άσο και διακριτών υποπληθυσμών των επιθηλιακών Θυλακοκυττάρων. 0 προγραμματισμένος κυτταρικός Θάνατος των τροφοκυττάρων συνιστά ένα φυσιολογικό μηχανισμό ανάπτυξης και διακρίνεται σε δύο βασικούς τύπους: στον απο πτωτικό και στον αυτοφαγικό κυτταρικό θάνατο. Τα ως άνω στοιχεία καθιστούν την ωογένεση ιδεώδες σύστημα ανάλυσης της επίδρασης διαφόρων εξωγενών παραγόντων, οι οποίοι έχουν ήδη ερευνηθεί σε κυτταρικές σειρές θηλαστικών, εφόσον καθίσταται δυνατή η μελέτη τους και στο αμέσως επόμενο επίπεδο κυτταρικής οργάνωσης, δηλαδή στο επίπεδα του ιστού. αλλά και του οργανισμού γενικότερα. Επιπροσθέτως, έχει ήδη δειχθεί ότι τα ωοθυλάκια μπορούν να καλλιεργηθούν in νitra σε επιλεγμένα θρεπτικά υλικά, με αποτέλεσμα να καθίσταται δυνατή η μελέτη της επίδρασης διαφόρων εξωγενών ουσιών κατά τη διάρκεια της ανάπτυξής τους. Ένα ακόμη πρότυπο σύστημα μελέτης κυτταροβιολογικών αναπτυξιακών μηχανισμών αποτελεί η μορφογένεση του οφθαλμού στη D. rnelanagaster. Ο σύνθετος οφθαλμός είναι το κύριο αισθητήριο όργανο του εντόμου και αποτελείται από 800 περίπου ομματίδια, τα οποία είναι οργανωμένα σε μία ακριβή εξαγωνική διάταξη. H μοναδική αυτή οργάνωση του σύνθετου οφθαλμού επιτρέπει στον οργανισμό την ανίχνευση κίνησης. την αναγνώριση προτύπων και την έγχρωμη όραση. Παράλληλα. η δομή του σύνθετου οφθαλμού επιτρέπει την άμεση αναγνώριση φαινοτύπων που οφείλονται σε μεταλλάξεις γονιδίων τα οποία εμπλέκονται καθοριστικά στην ανάπτυξή του. καθιστώντας τον με αυτό τον τρόπο

2 ένα πολύ ισχυρό γενετικό σύστημα μελέτης μοριακών μηχανισμών κυτταρικής διαφοροποίησης και ανάπτυξης. H γήρανση αποτελεί μία φυσική βιολογική διαδικασία. η οποία αφορά στη βαθμίαία μείωση διαφόρων φυσιολογικών διεργασιών του οργανισμού και οδηγεί τελικά στην κατάρρευση της ομοιόστασης. Στη διαδικασία της γήρανσης θεωρείται ότι συμβάλλουν διάφοροι παράγοντες τόσο γενετικοί, άσο και περιβαλλοντικοί, μεταξύ των οποίων και το αξειδωτικό στρες. Μεταξύ των βιολογικών διαδικασιών που μεταβάλλονται κατά τη γήρανση συγκαταλέγεται και η λειτουργία του πρωτεασώματος. το οποίο αποτελεί τον κύριο κυτταρικό πρωτεολυτικό μηχανισμό αποικοδόμησης πρωτεϊνών που είτε έχουν ολοκληρώσει τη λειτουργία τους στο κύτταρο, είτε έχουν υποστεί βλάβη. Το 20S πρωτεάσωμα αντιπροσωπεύει ένα σιίμπλοκο με τη μορφή «βαρελιού». στο εσωτερικού ταυ οποίου πραγματοποιείται η πρωτεολυτική αποικοδόμηση των υποστρωμάτων του και αποτελείται από 7 διαφορετικές μεταξύ τους α-ρυθμιστικές και 7 διαφορετικές μεταξύ τους βκαταλυτικές υπομονάδες, σε διάταξη α7β7β7α7. Είναι γνωστά ότι ουσίες που εμποδίζουν τη λειτουργία του πρωτεασώματος οδηγούν τα κύτταρα σε γήρανση και τελικά στο θάνατο. Συνεπώς, το πρωτεάσωμα μπορεί να θεωρηθεί ως ένας προστατευτικός μηχανισμός του κυττάρου έναντι της γήρανσης. μέσω της αποδόμησης των κατεστραμμένων, εξαιτίας οξειδωτικών παραγόντων, πρωτε~νών. Επίσης, το μονοπάτι πρωτεασώματος/ουμπικουιτίνης συμμετέχει ενεργά στη ρύθμιση διαφόρων κρίσιμων κυτταρικών διεργασιών, όπως ο κυτταρικός κύκλος, ο προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος και η μεταγραφή. διαδραματίζοντας ιδιαίτερα σημαντικό ρόλο στην κυτταρική φυσιολογία. Στόχο της παρούσας διατριβής αποτέλεσε η μελέτη της επίδρασης εξωγενών ουσιών, οι οποίες σχετίζονται με την ενεργοποίηση ή την καταστολή της λειτουργίας του πρωτεασώματος στο Δίπτερο έντομο D. nmelanogaster. H προσέγγιση του συγκεκριμένου στόχου πραγματοποιήθηκε μέσω της in sivo μελέτης της επίδρασης τόσο ενεργοποιητών. όσο και αναστολέων του πρωτεασώματος στη βιωσιμότητα και την αναπαραγωγική ικανότητα (εκκολαψιμότητα) ενήλικων εντόμων. Επιπλέον, μελετήθηκε η in 'ivo και η in vitro επίδραση αναστολέων του πρωτεασώματος κατά την ωογένεση του εντόμου D. melanogaster. Τέλος, μέσω της δημιουργίας διαγονιδιακών εντόμων (βασισμένων στην τεχνολογία GAL4/UAS) έγινε προσπάθεια ταυτοποίησης του in ι ίιο ρόλου του πρωτεασώματος στα υπό μελέτη πρότυπα αναπτυξιακά συστήματα του εν λόγω εντόμου. Αρχικά, διερευνήθηκε η in ιτιο επίδραση φυσικών εξωγενών παραγόντων που θεωρούνται ενεργοποιητές ταυ πρωτεασώματος στη βιωσιμότητα και στην εκκολαψιμότητα των ενήλικων εντόμων D. fnelanogaster. Για το σκοπό αυτό, οι ουσίες 1εα-GΑ, Ursolk acid και Ο1eυτομeίιι προστέθηκαν στην τροφή των εντόμων σε κατάλληλες συγκεντρώσεις και πραγματοποιήθηκε ποσοτική μέτρηση της βιωσιμότητας και εκκολαψιμότητάς τους, με επακόλουθη καταγραφή των

3 αποτελεσμάτων και στατιστική επεξεργασία. Διαπιστώθηκε ότι καμία από τις ουσίες ενεργοποιητές του πρωτεασώματος δεν παρουσίαζε θετική επίδραση τόσο στη βιωσιμότητα, όσο και στην εκκολαψιμότητα των νυμφών σε τέλεια έντομα. Στη συνέχεια; μελετήθηκε η επίδραση ενός ειδικού και εκλεκτικού αναστολέα του πρωτεασώματος, της ουσίας Bortezomib (ΡS-341(Velcade) στη βιωσιμότητα. εκκολαψιμότητα και ωογένεση των φυσικού και Dηιρ53-ί- μεταλλαγμένου τύπου εντόμων D. inelanugaster. Διαπιστώθηκε ότι ο εν λόγω αναστολέας παρουσιάζει σημαντική αρνητική επίδραση στη βιωσιμότητα των ενηλίκων εντόμων, ενώ φαίνεται ότι σταματά την ανάπτυξη των προνυμφών, εμποδίζοντας επομένως τη δημιουργία τέλειων εντόμων. Επιπλέον, αυξάνει στατιστικά σημαντικά το ποσοστό των ανωμάλων ωοθυλακίων στην ωογένεση και επάγει χαρακτηριστικά προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου σε τροφοκύτταρα ωοθυλακίων διαφορετικών αναπτυξιακών σταδίων από αυτών που φυσιολογικά συναντώνται. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε βιοχημική μελέτη της in vim επίδρασης του αναστολέα πρωτεασώματος Bortezomib σε ενήλικα έντομα D. nrelanogaster. Διαπιστώθηκε ότι έντομα υπό την επίδραση του συγκεκριμένου πρωτεασωμικού αναστολέα παρουσιάζουν σημαντική αύξηση των επιπέδων των ουμπικουιτινιωμένων πρωτεϊνών, όπως επίσης και των επιπέδων της πρωτεασωμιιιής υπομονάδας ρ54ιrριιιο, η οποία είναι υπεύθυνη για την αναγνώριση και πρόσδεση των ουμπικουιτινιωμένων πρωτεϊνών στο πρωτεάσωμα. H παρατηρούμενη αύξηση των επιπέδων των ουμπικουιτινιωμένων πρωτεϊνών Θα μπορούσε να θεωρηθεί ως άμεση συνέπεια της αναστολής της δράσης του πρωτεασώματος και συνεπώς. της αδυναμίας αποικοδόμησης των σημασμένων με μόρια ουμmκουιτίνης πρωτεϊνών, ενώ η αύξηση της υπομονάδας ρ54/rριιίθ αντανακλά την προσπάθεια συγκρότησης νέων πρωτεασωμάτων, προκειμένου ο οργανισμός να επιβιώσει, ενεργοποιώντας ισχυρούς αντισταθμιστικούς μηχανισμούς. Τέλος, διαπιστώθηκε ότι ο αναστολέας BoiTezoniib επάγει την ενεργοποίηση της κασπάσης τελεστή Drice, η οποία είναι ομόλογη της κασπάσης 3 των Θηλαστικών. και επομένως συμβάλλει καθοριστικά στην έναρξη και εκτέλεση ενός ισχυρού προγράμματος απόπτωσης. Τα γεγονός αυτό υποδεικνύει ότι η αναστολή του πρωτεασώματος σε έντομα D. inelanagaster συνδέεται άμεσα με ταν προγραμματισμένο κυτταρικό Θάνατο, καθώς οι επιπτώσεις της συσσώρευσης των προς αποικοδόμηση πρωτεϊνών είναι ιδιαίτερα σημαντικές στη φυσιολογία του κυττάρου. επηρεάζοντας τη φυσιολογική λειτουργία του και καθιστώντας την επιβίωσή του αδύνατη. Επιπλέον, μέσω της επίδρασης του πρωτεασωμικού αναστολέα Boilezomib. διερευνήθηκε η συμμετοχή της πρωτεϊνώς Dττιρ53 στην αναστολή του μονοπατιού πρωτεασώματος!ουμπικουιτίυης, καθώς έχει δειχθεί ότι κάτω από συνθήκες έντονου στρες η εν λόγω πρωτέίνη επάγει τη γήρανση και τον κυτταρικό θάνατο. Παρατηρήθηκε ότι σε μεταλλαγμένα έντομα Dmp53-~-. στα οποία απουσιάζουν και τα δύο αλληλόμορφα του γονιδίου Dmρ53, ή δράση του αναστολέα Bortezomib κατά

4 την ωογένεση. καθώς και κατά την ανάπτυξη των πρανυμφών, εμφανίζεται όμοια με αυτή στα έντομα φυσικού τύπου. Αντίθετα, διαπιστώθηκε ότι ο εν λόγω αναστολέαr, παρουσιάζει καθυστερημένη επίδραση στη βιωσιμότητα των Οιυρ534μεταλλαγμένων εντόμων. Συμπερασματικά, η δράση του αναστολέα Sortezomib φαίνεται να επηρεάζεται από την πρωτεΐνη Dmρ53, η οποία ενδεχομένως ενεργοποιεί άμεσα τον κυτταρικό θάνατο, μετά την αναστολή του πρωτεασώματος και την επακόλουθη συσσώρευση των αυμmκουιτινιωμένων πρωτεϊνών, ενώ η έλλειψή της συνοδεύεται από καθυστερημένη έναρξη του θανάτου, ο οποίος πιθανόν να ενεργοποιείται μέσω ανεξάρτητων της Dmρ53 σηματαδοτικών μονοπατιών. Προκειμένου να ερευνηθεί η λειτουργική συμμετοχή ταυ πρωτεασώματος στην ωογένεση πραγματοποιήθηκε in «ib α ανάπτυξη ωοθυλακϊων παρουσία των αναστολέων του πρωτεασώματος Epoxomiciii και MG-132. H δράση του φυσικού πεπτιδίου Epoxomiciii, που απομονώνεται από τον ακτινομύκητα Q996-17, διαπιστώθηκε ότι αναστέλλει την ανάπτυξη των ωοθυλακίων κατά 43%, ενώ η δράση του αναστολέα MG132 διαπιστώθηκε ότι οδηγεί σε πλήρη αναστολή της ανάπτυξης των ωοθυλακίων. Ακολούθως, μελετήθηκε η οργάνωση και δομική ακεραιότητα των κυτταρικών διαμερισμάτων των προσβεβλημένων ωοθυλακίων, μέσω διαφόρων ιtυττaρoβιολογικων τεχνικών, οι οποίες αποκάλυψαν, κυρίως, ένα απορυθμισμένο πρότυπο οργάνωσης του κυτταρικού σκελετού των τροφοκυττάρων, τα οποίο ενδεχομένως συνδέεται με την αδυναμία αποικοδόμησης πρωτεϊνών που σχετίζονται με την οργάνωση του σκελετού της νηματιακής ακτίνης. Επιπλέον, τα τροφοκύτταρα των εν λόγω ωοθυλακίων εμφανίζουν χαρακτηριστικά προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου, όπως συμπύκνωση χρωματίνης, παρουσία αυτοφαγικών σωματίων στα κυτταρόπλασμά τους, καθώς και παρουσία ενεργοποιημένης κασπάσης Drice. Προκειμένου να επιβεβαιωθούν τα επιβλαβή αποτελέσματα της αναστολής του πρωτεασώματος σε επίπεδα οργανικών συστημάτων, δημιουργήθηκαν διαγονιδιακά στελέχη D. mekinogasfer. βασισμένα στην τεχνολογία GAL4IUΑS, η οποία επιτρέπει την ανίχνευση ταυ in ν11'd ρόλου του πρωτεασώματος, μέσω της δημιουργίας ιστοειδικά ανεπαρκών συμπλόκων. Σε διαγονιδιακά στελέχη που χαρακτηρίζονται από απενεργοποίηση είτε της πρωτεασωμικής υπομονάδας β2, είτε της β6 στα κύτταρα της γενετικής σειράς των ωοθυλακίων, παρατηρήθηκε σημαντική μείωση στην εκκολαψιμότητα των εντόμων. καθώς και αύξηση στο ποσοστό των ανωμάλων ωοθυλακίων κατά τα σημείο ελέγχου της μέσης ωογένεσης. Το γεγονός αυτό είναι απόλυτα σύμφωνο με τα αποτελέσματα που προκυπτουν από τη μελέτη απομονωμένων ωοθυλακίων εντόμων τα οποία αναπτύσσονταν σε τροφή που περιείχε τον αναστολέα πρωτεασώματος Βαrιe-Ζοι τώ. Για ταν ίδιο σκοπό δημιουργήθηκαν διπλά διαγονιδιακά στελέχη με ιστοειδική απουσία έκφρασης ή απενεργοποίησης, σε προνϋμφες 3ου προνυμφικαύ σταδίου. των καθοριστικής σημασίας πρωτεασωμικών υπομονάδων α, β2, β5, β6, RpIil και Rpn2, καθώς και

5 απενεργαποίησης των πρωτεϊνών UbcDl, UbcD4, UbcD6 και ουμπικαυιτίνης που σχετίζονται στενά με τα μονοπάτι πρωτεασώματας!ουμπικουιτίνης. Παρατηρήθηκε διακοπή της ανάπτυξης των προνυμφών και επακόλουθος Θάνατος στο συνολικό πληθυσμό των εντόμων. Ομοίως, δεν παρατηρήθηκε καμία ανάπτυξη προνυμφών μετά την in νίιο προσθήκη του ανασταλέα Bortezoniib στην τροφή των πειραματόζωων. Οι παραπάνω παρατηρήσεις αποδεικνύουν το θεμελιώδη ρόλο του πρωτεασώματος σε όλα τα αναπτυξιακά στάδια του εντόμου D. mehrnogaster, εφόσον η απενεργαποίησή του, με οποιοδήποτε τρόπο. αναστέλλει τη φυσιολογική ανάπτυξη των ωοθυλακίων αλλά και τη φυσιολογική διαβίωση των εντόμων. Με σκοπό τη μελέτη της δράσης του μονοπατιού πρωτεασώματος/ αυμπικουιτίνης στη μορφογένεση του οφθαλμού στη D. me/anogaster, δημιουργήθηκαν διαγονιδιακά στελέχη στα οποία πραγματοποιήθηκε καταστολή της έκφρασης των πρωτεασωμικών υπομονάδων α5. β2, β5. β6, Rpiil και Rριι2, καθώς και των κρίσιμων ρυθμιστικών πρωτεϊνών που σχετίζονται με τα εν λόγω μονοπάτι UbcDl. UbcD4. UbcD6 και αυμπικουιτίνης, στους οφθαλμικούς εμβρυϊκούς δίσκους των εντόμων. Διαπιστώθηκε ότι στα παραπάνω μεταλλαγμένα έντομα, α οφθαλμός χαρακτηρίζεται από έντονο ανώμαλο φαινότυπο, που χαρακτηρίζεται από μη κανονική διάταξη σμηριγγών και μερική ή πλήρη έλλειψη ομματιδίων. Εξαίρεση αποτελούν τα στελέχη που χαρακτηρίζονται από απουσία έκφρασης των UbcDl και UbcD4 πρωτεϊνών, στα οποία οι οφθαλμοί εμφανίζονται φυσιολογικής μορφολογίας. ενδεχομένως εξαιτίας της μη συμμετοχής των ενζύμων αυτών στη ρύθμιση μονοπατιών που εμπλέκονται στη μορφολογία των οφθαλμών. Οι ανωτέρω πειραματικές προσεγγίσεις συσχετίζουν αναμφίβολα τη λειτουργική συμμετοχή ταυ πρωτεασώματος στη φυσιολογική ανάπτυξη των ομματιδίων, και κατ' επέκταση ταυ σύνθετου οφθαλμού, στο Δίπτερα έντομα D. rnelanogaster. Συνοψίζοντας. η μελέτη της αναστολής της λειτουργίας του πρωτεασώματος τόσα κατά την ανάπτυξη των εντόμων. όσο και κατά την ωογένεση και μορφογένεση του οφθαλμού στα Δίπτερο έντομα D. me/irnogaster. αναμφίβολα υποδεικνύει ότι οποιαδήποτε παρέμβαση στη φυσιολογική λειτουργία του πρωτεασώματος επάγει την ενεργοποίηση μηχανισμών κυτταρικού θανάτου, πιστοποιώντας τη συμβολή του στην ομαλή κυτταρική λειτουργία στα εν λόγω πρότυπα αναπτυξιακά συστήματα.