Λογγοβίτη Ιωάννα Βιολόγος

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ Μεταπτυχιακό δίπλωμα ειδίκευσης Ο ρόλος της ιντεγκρίνης α ν β 3 στην ενεργοποίηση της CDK5 Λογγοβίτη Ιωάννα Βιολόγος Πάτρα, 2015

2 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: Ευαγγελία Παπαδημητρίου, Καθηγήτρια του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, επιβλέπουσα Σταύρος Τοπούζης, Αναπληρωτής Καθηγητήςτου Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών Βασιλική Κωστούρου, Ερευνήτρια Γ στο ΕΚΕΒΕ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ ΦΛΕΜΙΝΓΚ

3 Με πολλή αγάπη στην οικογένεια μου και στον Δημήτρη

4 Πρόλογος Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Μοριακής Φαρμακολογίας της Φαρμακευτικής Σχολής του Πανεπιστημίου Πατρών, υπό την επίβλεψη της Καθηγήτριας κ. Ευαγγελίας Παπαδημητρίου. Αρχικά θα ήθελα να ευχαριστήσω την επιβλέπουσα καθηγήτριά μου κ. Ευαγγελία Παπαδημητρίου, η οποία πριν από τρία χρόνια περίπου μου έδωσε την ευκαιρία να ενταχθώ στην ερευνητική της ομάδα και να αποκτήσω επιστημονική κατάρτιση σε πολλά ενδιαφέροντα θέματα. Η εμπιστοσύνη που μου έδειξε καθώς και το μόνιμο ενδιαφέρον της για την πρόοδο της παρούσας εργασίας αποτέλεσε για εμένα κινητήρια δύναμη για την ολοκλήρωσή της. Την ευχαριστώ επίσης, για όλα εκείνα τα σπουδαία εφόδια που πήρα δουλεύοντας τα τελευταία χρόνια στο εργαστήριο της καθώς και για την εμπειρία που απέκτησα ως ερευνήτρια. Θα ήθελα επίσης, να ευχαριστήσω τον Αναπληρωτή Καθηγητή του Τμήματος Φαρμακευτικής κ. Σταύρο Τοπούζη, για την τιμή που μου έκανε να αποτελέσει μέλος της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής μου καθώς και για την πολύτιμη βοήθεια του όταν τη χρειάστηκα αλλά και για την ωραία συνεργασία που είχαμε όλα αυτά τα χρόνια. Ακόμα, ευχαριστώ την ερευνήτρια Γ Βαθμίδας στο ΕΚΕΒΕ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ ΦΛΕΜΙΝΓΚ, κ. Βασιλική Κωστούρου που δέχτηκε να ενταχθεί στα μέλη της τριμελούς εξεταστικής επιτροπής της παρούσας εργασίας. Τέλος, θα ήθελα ιδιαίτερα να ευχαριστήσω τις κυρίες Κουτσιούμπα Μαρίνα, Λάμπρου Μαργαρίτα και Ποιμενίδη Εύη οι οποίες με την αμέριστη βοήθεια τους και με την ανεξάντλητη υπομονή τους, μου μετέδωσαν όλες εκείνες τις απαραίτητες γνώσεις που χρειάζεται ένας νέος ερευνητής και που αποτελούν εφόδια για τη μετέπειτα πορεία του, καθώς και για το υπέροχο φιλικό κλίμα συνεργασίας που είχαμε όλο αυτό το διάστημα. Θα ήταν παράλειψη μου επίσης, να μην ευχαριστήσω και τα υπόλοιπα μέλη του εργαστηρίου, με τους οποίους είχα τη χαρά να συνεργαστώ όλα αυτά τα χρόνια και των οποίων η συμπαράσταση ήταν καθοριστική όταν την είχα ανάγκη, ενώ οφείλω ένα μεγάλο ευχαριστώ ιδιαίτερα στον κ. Δημήτρη Τασσόπουλο που ήταν ουσιαστικά δίπλα μου καθ όλη τη διάρκεια εκπόνησης της παρούσας εργασίας. Τέλος, ευχαριστώ τους γονείς μου για την υλική και ηθική

5 συμπαράσταση που μου παρείχαν όλα αυτά τα χρόνια καθώς χωρίς την καταλυτική τους βοήθεια τίποτα από όλα αυτά δε θα είχε συμβεί.

6 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Εισαγωγή 1. Πλειοτροπίνη (PTN) Εισαγωγικά για τη δομή του γονιδίου της και την πρωτεϊνική της δομή Βιολογικές δράσεις της PTN Ενεργά τμήματα της PTN Ο ρόλος της PTN στην αγγειογένεση και στον καρκίνο Υποδοχείς της PTN Υποδοχέας με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ (RPTPβ/ζ) Ιντεγκρίνη α ν β Ν-Συνδεκάνη Κινάση αναπλαστικού λεμφώματος (ALK) Νουκλεολίνη Αγγειογένεση Γενική θεώρηση Παράγοντες που επηρεάζουν την αγγειογένεση Στάδια της αγγειονετικής διαδικασίας Καρκινική αγγειογένεση Κυκλινο-εξαρτώμενες κινάσες (Cyclin dependent kinases, CDKs) Γενική θεώρηση και αναστολείς των CDKs Κυκλινο-εξαρτώμενη κινάση 5 (Cyclin-dependent kinase 5, CDK5) Δομή της CDK Έκφραση και βιολογικές δράσεις της CDK Ενεργοποίηση και ρύθμιση της δράσης της CDK CDK5 και καρκίνος CDK5 και αγγειογένεση...59 Σκοπός...63 Υλικά και Μέθοδοι 1. Απομόνωση ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC από φλέβα ομφάλιου λώρου ανθρώπου Παρασκευή πλήρους θρεπτικού μέσου για HUVEC Θρεπτικά μέσα των χρησιμοποιούμενων κυττάρων Ανακαλλιέργεια κυττάρων Μέτρηση κυττάρων σε αιμοκυτταρόμετρο Neubauer Κατάψυξη κυττάρων Απόψυξη Κυττάρων...74

7 8. Απομόνωση πρωτεϊνών από καλλιέργειες ευκαρυωτικών κυττάρων Προσδιορισμός της συγκέντρωσης ολικών πρωτεϊνών σε διάλυμα (Μέθοδος Bradford) Ανοσοκατακρήμνιση Ανάλυση πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακριλαμιδίου με αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) Ανάλυση πρωτεϊνών κατά Western Διαδικασία αποδέσμευσης αντισώματος από PVDF μεμβράνη (stripping) Ποσοτικοποίηση ανοσοαποτυπωμάτων Μέθοδος μέτρησης της ενεργότητας της κινάσης CDK Κατασκευή πρότυπων καμπυλών ενεργότητας της CDK5 σε ανοσοκατακρημνίσματα ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC και κυττάρων γλοιοβλαστώματος C Διαμόλυνση κυττάρων με παρεμβαλλόμενο RNA (sirna, RNAi) Μελέτη της μετανάστευσης των κυττάρων (Transwell Migration Assay) Μελέτη της δραστικότητας της CDK5 στη χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη (CAM) του εμβρύου όρνιθας Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων Αποτελέσματα 1. Η επαγόμενη από την PTN αλληλεπίδραση της CDK5 με την p35 δεν επηρεάζεται από την ιντεγκρίνη α ν β Η PTN προκαλεί επαγωγή της ενεργότητας της κινάσης CDK5 σε κύτταρα C Η αναστολή της έκφρασης του RPTPβ/ζ μειώνει την επαγόμενη από PTN ενεργοποίηση της κινάσης CDK5 σε κύτταρα C Η CDK5 δεν εμπλεκεται στη μειωμένη από PTN μετανάστευση των κυττάρων C Μέτρηση της ενεργοποίησης από την ΡΤΝ της CDK5 σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC Αναστολή της PΙ3K αναστέλει την επαγόμενη από PTN ενεργοποίηση της CDK5 σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC Αναστολή των ERK1/2 δεν επηρεάζει την επαγόμενη από PTN ενεργοποίηση της CDK5 σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC Αναστολή της κινάσης c-src με τη χρήση του αναστολέα PP1 επάγει την ενεργοποίηση της CDK5 σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC Αναστολή της c-src με τη χρήση του αναστολέα SU6656 δεν επηρεάζει την επαγόμενη από PTN ενεργοποίηση της CDK5 σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC Η CDK5 και η p35 αλληλεπιδρούν με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ Έκφραση και ενεργότητα της CDK5 στην CAM εμβρύου όρνιθας Συζήτηση Βιβλιογραφία...125

8 Συντμήσεις Περιλήψεις...155

9 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

10 Εισαγωγή 1. Πλειοτροπίνη (pleiotrophin, PTN) 1.1. Εισαγωγικά για τη δομή του γονιδίου της και την πρωτεϊνική της δομή Η πλειοτροπίνη (PTN) είναι ένας εκκρινόμενος αυξητικός παράγοντας μοριακής μάζας 18 kda και συμμετέχει σε πολλές διαφορετικές διαδικασίες, όπως στην κυτταρική αύξηση και επιβίωση, στην κυτταρική μετανάστευση, στην αγγειογένεση και στην ανάπτυξη των νευριτών. Ανακαλύφθηκε σχεδόν ταυτόχρονα από διαφορετικά εργαστήρια, ενώ απομονώθηκε από διαφορετικούς ιστούς πριν από 25 χρόνια και για αυτόν τον λόγο, της έχουν αποδοθεί αρκετά ονόματα όπως: HBGF-8 (heparin-binding growth factor-8), HB-GAM (heparin-binding growth-associated molecule) (Hampton et al. 1992), HBNF (heparin-binding neurotrophic factor), OSF-1 (osteoblastspecific factor) (Papadimitriou et al. 2009) και HARP (heparin affin regulatory peptide) (Laaroubi et al. 1995). Η PTN παρουσιάζει ομολογία (>50%) με μία άλλη πρωτεΐνη τη Midkine (MK) και περιέχει 10 υψηλά συντηρημένες κυστεΐνες. Η PTN και η MK είναι υψηλά συντηρημένες πρωτεΐνες και απαντώνται σε είδη που ποικίλουν από τη Drosophila μέχρι και τον άνθρωπο, ενώ έχουν συγγένεια δέσμευσης με την ηπαρίνη. Χρησιμοποιούν μερικώς τους ίδιους υποδοχείς και έχουν κοινές βιολογικές δράσεις, οι πιο καλά χαρακτηρισμένες από τις οποίες είναι η επαγωγή των νευριτών και η ανάπτυξη των όγκων (Héroult et al. 2004). Μελέτες έχουν δείξει πως ποντίκια που τους λείπει ταυτόχρονα η PTN και η MK παρουσιάζουν μη φυσιολογικούς φαινότυπους. Όταν όμως γίνεται απαλοιφή μόνο της μιας από τις δύο πτωτεινες, τότε τα πειραματόζωα είναι φυσιολογικά και εμφανίζουν σε μικρότερο βαθμό διαφορετικές ανωμαλίες, το οποίο δείχνει ότι τα δύο πεπτίδια αν και έχουν και παρόμοιες λειτουργίες, έχουν και διαφορετικούς ρόλους (Muramatsu et al. 2006). Ακόμα, υπάρχουν δεδομένα που αποδεικνύουν πως η έλλειψη της MK και της PTN θεωρείται σημαντικός γενετικός παράγοντας που οδηγεί στην ανάπτυξη νευροεκφυλιστικών διαταραχών, καθώς οι δύο αυτοί αυξητικοί παράγοντες δρουν συνεργατικά ως προς τη νευροπροστασία που προσφέρουν στη νευροτοξική δράση 1

11 Εισαγωγή φαρμάκων (Herradõn & Pérez-García 2014). Η PTN εκφράζεται φυσιολογικά σε ποικίλους ιστούς κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης, συμπεριλαμβανομένου του κεντρικού και περιφερικού νευρικού συστήματος, σε όργανα όπως είναι οι σιελογόνοι αδένες, ο πνεύμονας και ο νεφρός, στο πεπτικό και σκελετικό σύστημα, στα αισθητήρια όργανα και στα άκρα (Mitsiadis et al. 2008). Τα επίπεδά της είναι αρκετά χαμηλά στους ενήλικους ιστούς, ενώ έχει βρεθεί ότι υπερκφράζεται κατά τη διάρκεια της νεοαγγειογένεσης σε καταστάσεις όπως είναι η επούλωση τραυμάτων, ο καρκίνος, η οστεοαρθρίτιδα, η ρευματοειδής αρθρίτιδα, διάφορες νευροεκφυλιστικές ασθένειες, η φλεγμονή και η ισχαιμία (Mikelis & Papadimitriou 2008). Δομή και έκφραση του γονιδίου της PTN Το γονίδιο της PTN στον άνθρωπο εντοπίζεται στο μεγάλο βραχίονα του 7 ου χρωμοσώματος στις περιοχές 33-34, περιέχει τουλάχιστον επτά εξώνια και το ελάχιστο μέγεθός του είναι 42 kb (Lai 1992) (Kretschmer 1993). Το ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης της PTN τοποθετείται στα 4 πρώτα εξώνια. Το mrna της κωδικοποείται από πέντε εξώνια και αποτελείται από 1650 νουκλεοτίδια. Το πεπτίδιο σινιάλο και τα πέντε πρώτα αμινοξέα της ώριμης πρωτεΐνης βρίσκονται στο εξώνιο 2, ενώ η κωδική περιοχή της πρωτεΐνης εντοπίζεται στα εξώνια 3 και 4. Το εξώνιο 4 περιλαμβάνει το C-τελικό άκρο της PTN, το οποίο υποδηλώνει μια υποθετική πυρηνική μετατόπιση βασισμένη στην ομολογία της με την ιστόνη H1 (Papadimitriou et al. 2009). Η 5 μη μεταφραζόμενη περιοχή είναι μοναδική για το ανθρώπινο γονίδιο της PTN συγκρινόμενο με άλλα είδη, ενώ υπάρχουν διάφορες 5 μη μεταφραζόμενες περιοχές που έχουν προκύψει από εναλλακτικό μάτισμα, το οποίο μπορεί να συντελεί στην κυτταροειδική ή ιστοειδική έκφραση της PTN (Papadimitriou et al. 2009). Ο υποκινητής του ανθρώπινου γονιδίου της PTN φέρει περιοχή CCAAT αντί του κλασικού κουτιού TATA, εντοπισμένη 91 νουκλεοτίδια πριν από τη θέση έναρξης της μεταγραφής. Τα μέχρι σήμερα δεδομένα έχουν δείξει οτι στην περιοχή του υποκινητή της PTN υπάρχουν περιοχές δέσμευσης μεταγραφικών παραγόντων, τέσσερις για τον MyoD (Li et al. 1992), μία για τον GT1 (Li et al. 1992), δύο για τον AP-1 (Li et al. 1992) 2

12 Εισαγωγή (Polytarchou et al. 2005), μία για τον ΗΟΧΑ5 (Chen et al. 2005) και μία για τον SRE (Lai 1992) (Poimenidi et al. 2009). Τέλος, δύναται να υπάρχουν και θέσεις πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων για τους NFkB, CBP, RARE/TRE/VDE, EGFR-1, SP-1 (Kretschmer 1993) (Liedert et al. 2009) και για τον SOX2 που φαίνεται να ενεργοποιεί την έκφραση της ΡΤΝ σε βλαστικά κύτταρα γλοιοβλαστώματος. Η PTN απομονώθηκε για πρώτη φορά το 1989 από δύο διαφορετικά εργαστήρια από εγκέφαλο νεογέννητου αρουραίου (Rauvala 1989) και από μήτρα βοός (Milner 1989). Η έκφραση της ρυθμίζεται αυστηρά από τον κυτταρικό τύπο και από τον χρόνο κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης, και αυξάνεται ραγδαία τη στιγμή της γέννησης μέχρι και την πρώιμη μετεμβρυϊκή περίοδο (Rauvala 1989). Το γεγονός ότι η PTN είναι παρούσα σε αρκετούς ενήλικους ιστούς προτείνει ότι η PTN συμμετέχει σε φυσιολογικές διεργασίες και κατά την ενήλικη ζωή (Vanderwinden et al. 1992). Το γονίδιο της PTN υπερεκφράζεται σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις, όπως στη ρευματοειδή αρθρίτιδα (Pufe et al. 2003), στην οστεοαρθρίτιδα (Pufe et al. 2007) (Kaspiris et al. 2013), μετά από έναν τραυματισμό (Ezquerra et al. 2008) και στον καρκίνο (Papadimitriou et al. 2009). Η έκφραση της αυξάνεται από παράγοντες όπως TNFα (tumor necrosis factor α), ο EGF (epidermal growth factor) (Thomas Pufe et al. 2003), ο CNTF (ciliary neurotrophic factor) (Roger et al. 2006), τα μέλη της οικογένειας των FGFs (fibroblast growth factors) (Hatziapostolou et al. 2006), ο PDGF (platelet-derived growth factor) (Li et al. 1992), το camp (Mourlevat et al. 2005), η υποξία (Antoine et al. 2005), ο ορός (Poimenidi et al. 2009), το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Polytarchou et al. 2005), η enos (endothelial nitric oxide synthase) (Polytarchou et al. 2009), τα ανδρογόνα (Orr et al. 2011), τα οιστρογόνα (Lee, Jeong, Lim, Kim, Fuller W. Bazer, et al. 2012) και την ιντερφερόνη-γ (Li et al. 2010). Οι μεταγραφικοί παράγοντες Sox10 (Lee et al. 2008), SOX2 (Koyama-Nasu et al. 2014), HOXA5 (Chen et al. 2005) και AP-1 (Polytarchou et al. 2005) επηρεάζουν άμεσα την έκφραση του γονιδίου της PTN ύστερα από τη δέσμευση τους στις αντίστοιχες θέσεις πρόσδεσης στον υποκινητή του γονιδίου της. Τέλος, η έλλειψη του ογκοκατασταλτικού γονιδίου PTEN 3

13 Εισαγωγή (Phosphatase and Tensin Homologue) προκαλεί αύξηση στην έκφραση της PTN, η οποία εξαρτάται από το μονοπάτι της PI3K (phosphatidylinositol 3- kinase) (Li et al. 2006). Πρωτεϊνική δομή της PTN Η PTN αποτελείται από 168 αμινοξέα, ενώ το ώριμο πεπτίδιο περιέχει 136 αμινοξέα ως αποτέλεσμα της αποκοπής ενός τμήματος 32 αμινοξέων, του πεπτιδίου σινιάλου. Υπάρχει ακόμα μία θεωρία πως το ώριμο πεπτίδιο αποτελείται από 139 αμινοξέα καθώς έχει βρεθεί και δεύτερη περιοχή από την οποία αποκόπτεται το πεπτίδιο. Το αποτέλεσμα αυτών των δύο διαφορετικών πέψεων οδηγεί σε δύο ισομορφές της ώριμης πρωτεΐνης με διαφορά τριών αμινοξέων στο αμινοτελικό άκρο (Bernard-Pierrot et al. 2001). Η μοριακή μάζα της PTN όπως έχει προκύψει από SDS-PAGE ανάλυση είναι 18 kda (Hampton et al. 1992) ενώ μετά από ανάλυση με φασματοσκοπία μάζας, η μοριακή της μάζα υπολογίζεται περίπου στα 15,3 kda εξαιτίας του γεγονότος ότι το μόριο είναι πλούσιο σε κατιονικά αμινοξέα (24%), κυρίως λυσίνες εντοπισμένες στα άκρα του μόριου (Kuo et al. 1990) (Merenmies 1990). Το πεπτίδιο περιλαμβάνει 10 υψηλά συντηρημένες κυστεΐνες (Merenmies and Rauvala 1990), οι οποίες συμμετέχουν στο σχηματισμό πέντε δισουλφιδικών δεσμών (Kuo et al. 1990) ή τριών δεσμών (Hampton et al. 1992). Η PTN δε φέρει θέσεις Ν-γλυκοζυλίωσης ή άλλων μετα-μεταφραστικών τροποποιήσεων (Hampton et al. 1992) (Kuo, et al., 1990). Η τριτοταγής δομή του μορίου δεν έχει μελετηθεί μέχρι σήμερα εκτενώς και για αυτόν τον λόγο δεν υπάρχουν πολλά δεδομένα για τη διάταξη της πρωτεΐνης στο χώρο. Θεωρείται ότι απαρτίζεται από δύο β-δομές που ενώνονται με έναν εύκαμπτο συνδέτη και κάθε μια περιλαμβάνει τρεις αντιπαράλληλες β-πτυχές. Τα Ν- και C- τελικά άκρα είναι ιδιαίτερα εύκαμπτα λόγω των πολλών λυσινών και παίρνουν τυχαίες διαμορφώσεις (Kilpeläinen et al. 2000). Μελέτες φασματοσκοπίας NMR έδειξαν ότι το καρβοξυ-τελικό άκρο της PTN που περιλαμβάνει τα αμινοξέα , είναι πολύ ευέλικτο σε θερμοκρασία δωματίου, ενώ το βιολογικώς δραστικό τμήμα με τα αμινοξέα φέρει καθορισμένη δομή σε χαμηλότερη θερμοκρασία (Mikelis et al. 2011). 4

14 Εισαγωγή Πιστεύεται πως η δέσμευση της PTN στην ηπαρίνη γίνεται μέσω των β-δομών κάτι που οδηγεί σε αλλαγή της στερεοδιαμόρφωσής της, ενώ η αναγωγή των δισουλφιδικών δεσμών αναστέλλει σημαντικά τη δέσμευση της PTN στην ηπαρίνη (Kilpeläinen et al. 2000). Πρόσφατα αναφέρθηκε πως πιο σημαντική για την πρόσδεση στην ηπαρίνη είναι η C-TSR περιοχή (Ori et al. 2009) Βιολογικές δράσεις Ενεργά τμήματα της PTN Το όνομα πλειοτροπίνη (PTN) προδίδει την ευρεία κατανομή της και τις ποικίλες δράσεις της (Li et al, 1990). Η αρχική αναφορά που ασχολείται με την PTN προτείνει πως παίζει σημαντικό ρόλο στην ωρίμανση και στην ανάπτυξη του εγκεφάλου (Rauvala 1989). Από τότε, όλες οι αναφορές συσχετίζουν την PTN με σημαντικές βιολογικές δράσεις στο αναπτυσσόμενο νευρικό σύστημα όπου το mrna της εντοπίζεται στο νευρεοεξώδερμα και στο μεσόδερμα (Vanderwinden et al. 1992), στα νευρικά εμβρυϊκά κύτταρα (Jung et al. 2004) (Furuta et al. 2004), στα μονοπάτια των αναπτυσσόμενων νευρώνων (Rauvala et al. 1994), στους πυραμιδικούς νευρώνες CA1 στον ιππόκαμπο (Gonzalez-Castillo et al. 2015), και σε μη νευρωνικούς κυτταρικούς τύπους, όπως αστροκύτταρα και κύτταρα Schwann (Vanderwinden et al. 1992). Επίσης, εκφράζεται φυσιολογικά στα επιθηλιακά κύτταρα του κοχλία υποδηλώνοντας ένα ρόλο στην ακουστική λειτουργία (Zou et al. 2006). Η έκφραση της PTN επάγεται σε περιοχές που βρίσκονται κοντά στο σημείο της βλάβης, ύστερα από τραυματισμό της σπονδυλικής στήλης σε μοντέλα αρουραίων και εντοπίζεται κυρίως σε αστροκύτταρα, ολιγοδενδροκύτταρα και σε νευρώνες (Wang et al. 2004). Η PTN μπορεί να τροποποιεί την πλαστικότητα των συνάψεων (Amet et al. 2001) και να συμμετέχει μέσω της δέσμευσής της στον υποδοχέα της RPTPβ/ζ, στη μορφογένεση των κυττάρων Purkinje (Tanaka et al. 2003). Επίσης, έχει βρεθεί ότι υπερεκφράζεται σε νευροεκφυλιστικές ασθένειες όπως η νόσος Alzheimer και το σύνδρομο Down και για αυτό το λόγο μπορεί να προταθεί ως δείκτης νευρωνικής βλάβης (Wisniewski et al. 1996). Υπερεκφράζεται ακόμα στη νόσο του Parkinson και παίζει σημαντικό ρόλο στην προστασία και την ανακατασκευή του μέλανος 5

15 Εισαγωγή ραβδωτού συστήματος με αποκατάσταση της ντοπαμινεργικής νεύρωσης (Taravini et al. 2011). Η PTN διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη της μνήμης και της μάθησης (del Olmo et al. 2009). Πρόσφατα δεδομένα της έχουν αποδώσει ένα νευροπροστατευτικό ρόλο στην προκαλούμενη από αμφεταμίνη και από κοκαΐνη νευροτοξικότητα στο ραβδωτό σώμα η οποία τελικά οδηγεί σε ποικίλες νευροεκφυλιστικές ανωμαλίες (Herradõn & Pérez- García 2014) (Vicente-Rodríguez et al. 2015). Άλλωστε ο προστατευτικός της ρόλος έναντι του εθισμού και των νευρικών αλλοιώσεων που προκαλούνται από τα φάρμακα είναι πλέον αποδεδειγμένος σε ανάλογα πειραματικά μοντέλα, ενώ προτείνεται η χρήση της PTN για τη θεραπεία και τη διάγνωση νευροψυχιατρικών διαταραχών, με έμφαση στη νευροτοξικότητα, στη νευροεκφύλιση και στα επακόλουθά τους (Alguacil & Herradón 2015). Ακόμα, σε knockout ποντίκια για την PTN έχει δειχθεί πως η επαγόμενη από αμφεταμίνη αλλαγή στο μεταβολισμό της γλυκόζης στο ραβδωτό σώμα οδηγεί σε νευροτοξικότητα κάτι που μπορεί να αντιστραφεί ύστερα από χορήγηση PTN (Soto-Montenegro et al. 2015). Ανάλογες πειραματικές μελέτες έδειξαν πως το νευροπεπτίδιο CART (Cocaine- and amphetamine- regulated transcript), το οποίο παίζει νευροπροστατευτικό ρόλο στην εγκεφαλική ισχαιμία και στην επαναιμάτωση ύστερα από βλάβη λόγω στέρησης οξυγόνου και γλυκόζης σε καλλιεργούμενους νευρώνες, διορθώνει τη νευρωνική βλάβη με το να διευκολύνει την ανάπτυξη των νευριτών μέσω ενός μονοπατιού που εξαρτάται από την PTN για αυτό το λόγο το πεπτίδιο αυτό μπορεί να θεωρηθεί ως ένας σημαντικός θεραπευτικός παράγοντας για τη θεραπεία των νευροεκφυλιστικών παθήσεων (Y. Wang et al. 2014). Πρόσφατα δεδομένα ακόμα προτείνουν πως η βαθύτερη μελέτη των knockout μοντέλων για την PTN μπορεί να δώσει απαντήσεις σε διάφορα γνωστικά και συναισθηματικά προβλήματα που αντιμετωπίζουν καθημερινά οι άνθρωποι, καθώς η απουσία της PTN in vivo σχετίζεται με τέτοιου τύπου συμπεριφορικές διαταρραχές (Krellman et al. 2014). Τέλος, έχει βρεθεί πως η PTN ανταγωνίζεται την πρωτεΐνη Brd2 (Bromodomain-containing protein 2), που ανήκει στην οικογένεια των BET προσαρμογέων χρωματίνης, και είναι υπεύθυνη για την έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου στη διαφοροποίηση των νευρώνων. Η αλληλεπίδραση PTN- Brd2 διαμορφώνει την ισορροπία μεταξύ πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης στο 6

16 Εισαγωγή αναπτυσσόμενο νευρικό σύστημα των σπονδυλωτών (Garcia-Gutierrez et al. 2014). Η PTN επάγει την προσκόλληση, τη μετανάστευση, την επέκταση και τη διαφοροποίηση των ανθρώπινων προγονικών κυττάρων των οστεοβλαστών (Yang et al. 2003), συμμετέχοντας πιθανά στο σχηματισμό των οστών. Μελέτες έχουν δείξει πως η έκφραση της επάγεται με μηχανική φόρτιση σε οστεοκύτταρα in vitro και πως αυτή η επαγωγή της έκφρασής της μπορεί να είναι σημαντική για το σχηματισμό των οστών in vivo (Imai et al. 2009). Υπερέκφραση της PTN σε διαγονιδιακούς μύες, οδηγεί στην αύξηση του πάχους των οστών (Imai et al. 1998). Υπάρχουν βέβαια και δεδομένα που δείχνουν πως η απουσία της PTN δεν επηρεάζει τον σχηματισμό των οστών σε in vivo μοντέλα επίμυων (Lehmann et al. 2004), αν και φαίνεται να οδηγεί σε οστεοπενία κατά την ενηλικίωσή τους (Imai et al. 2009). Ζωικά μοντέλα που παρουσιάζουν έλλειψη τόσο στην PTN όσο και στη ΜΚ έχουν μικρότερο σωματικό μέγεθος και βάρος (Muramatsu et al. 2006). Ο πολυμορφισμός C>T στον υποκινητή του γονιδίου της ΡΤΝ σχετίζεται με τη μείωση της οστικής πυκνότητας σε μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες (Mencej-Bedrač et al. 2011). Επίσης, φαίνεται να διαδραματίζει κάποιο ρόλο και στην αποκατάσταση των καταγμάτων στους ενήλικες (Weiss et al. 2009). Η PTN συμμετέχει ακόμα και στο σχηματισμό του χόνδρου, αφού η έκφρασή της είναι αυξημένη κατά τη χονδρογένεση in vivo (Dreyfus et al. 1998) (Neame et al. 1993). Σε ασθένειες όπως η οστεοαρθρίτιδα, έχει βρεθεί πως η PTN εκφράζεται στα αρχικά στάδια, ενώ η συγκέντρωσή της στο αρθρικό υγρό μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείκτης για την πορεία της νόσου (Thomas Pufe et al. 2003). Αυτό επιβεβαιώνεται και αργότερα με πειραματικά δεδομένα που αποδεικνύουν την αυξημένη έκφραση της PTN και του υποδοχέα της RPTPβ/ζ στον ορό και στα χονδροκύτταρα ασθενών με οστεοαρθρίτιδα (Kaspiris et al. 2013). Υπάρχουν ωστόσο μελέτες που δείχνουν πως η μείωση της έκφρασης της PTN, η οποία μπορεί να προκληθεί ύστερα από μια ανοσοκατασταλτική θεραπεία για το μυέλωμα, μπορεί να οδηγήσει σε μειωμένη δραστηριότητα των οστεοβλαστών και τελικά στη δημιουργία προβλημάτων στη διαμόρφωση του οστού (Bolomsky et al. 2014). Άλλωστε, από προηγούμενες μελέτες είναι γνωστό πως ο ρόλος της PTN τόσο στην 7

17 Εισαγωγή επαγωγή της διαφοροποίησης και του πολλαπλασιασμού των οστεοβλαστών MC3T3-E1 (Kang et al. 2014), όσο και στη ανακατασκευή του οστού γενικότερα (Lamprou et al. 2014), είναι σημαντικός και για αυτό το λόγο θεωρείται πιθανά ελπιδοφόρα η ανάπτυξη μιας θεραπείας για την οστεοπόρωση με τη χορήγηση της PTN. Πρωτεομική ανάλυση εμπλουτισμένου θρεπτικού μέσου από θραύσματα οστών χοίρου, έδειξε πως το θρεπτικό αυτό μέσο περιείχε τουλάχιστον 150 πρωτεΐνες είτε εκκρινόμενες είτε της εξωκυττάριας μήτρας, ενώ ανάμεσά τους ανιχνεύθηκαν αρκετοί αυξητικοί παράγοντες που επηρέαζαν διάφορες κυτταρικές διεργασίες που σχετίζονται με την αναδόμηση του οστού, με κυριάρχη την PTN (Caballé- Serrano et al. 2014). Η συμμετοχή της PTN στη διαδικασία της χονδρογένεσης σχετίζεται με το να επάγει τη διαφοροποίηση των μεσεγχυματικών στρωματικών κυττάρων του μυελού των οστών και να αυξάνει την έκφραση μαρτύρων των χονδροκυττάρων, μέσω της δέσμευσής της στους υποδοχείς της και της ενεργοποίησης του μονοπατιού της PI3K (Bouderlique et al. 2014). Ενώ, τέλος σε πρόσφατη εργασία έδειξαν ότι η ρύθμιση της δράσης της PTN στις λειτουργίες των οστεοβλαστών επιτυγχάνεται μέσω της απελευθέρωσης του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα EGF (epidermal growth factor) η οποία οδηγεί σε διαενεργοποίηση του υποδοχέα EGFR και στην ενεργοποίηση των Akt και Erk κινασών (Fan et al. 2014). Η PTN διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του αναπαραγωγικού κύκλου (Fan et al. 2000), γεγονός που θεωρείται αναμενόμενο δεδομένου ότι η πρωτεΐνη απομονώθηκε από μήτρα βοός (Milner 1989). Τα επίπεδα της PTN διαφέρουν ανάλογα με τη φάση του κύκλου και αυξάνονται με την επίδραση της προγεστερόνης, κάτι που δείχνει ότι η έκφραση της είναι ορμονοεξαρτώμενη. Μελέτες που σχετίζονται με την PTN της όρνιθας, η οποία θεωρείται ότι είναι περισσότερο από 90% ομόλογη με την ανθρώπινη PTN (Hampton et al. 1992) έχουν δείξει πως η έκφρασή της στα επιθηλιακά κύτταρα των σαλπίγγων είναι εξαρτώμενα από τα επίπεδα των οιστρογόνων και πως η PTN συμμετέχει στην ανάπτυξη των σαλπίγγων και στο σχηματισμό του αυγού, για αυτό πλέον προτείνεται ως βιομάρτυρας για το επιθηλιακό καρκίνωμα των ωοθηκών (Lee et al. 2012). Θηλυκοί επίμυες που 8

18 Εισαγωγή δεν παράγουν ούτε την PTN ούτε τη MK, παρουσιάζουν προβλήματα στον αναπαραγωγικό τους κύκλο και κολπικές ανωμαλίες που έχουν ως αποτέλεσμα την απώλεια της γονιμότητάς τους (Muramatsu et al. 2006). Το μοτίβο έκφρασης της PTN, καθώς και των υποδοχέων της, κατά την ανάπτυξη του πλακούντα, δείχνουν ότι είναι πολύ πιθανό η PTN να εμπλέκεται στη διαδικασία της ανάπτυξης, αλλά και σε παθολογικές καταστάσεις (Ball et al. 2009). Η PTN εκφράζεται ακόμα στο μαστικό αδένα στις μυοεπιθηλιακές κυψελίδες, στα επιθηλιακά, στα ενδοθηλιακά και στα αγγειακά λεία μυϊκά κύτταρα (Ledoux et al. 1997). Σχετικά με την έκφραση της PTN στο μαστικό αδένα και στα επιθηλιακά μαστικά κύτταρα αξίζει να αναφέρουμε ότι πρόσφατα πειραματικά δεδομένα δείχνουν ότι η PTN αναστέλλει τη διαφοροποίηση των μαστικών επιθηλιακών κυττάρων και τα διατηρεί σε ένα προγονικό φαινότυπο, το οποίο αποδεικνύεται κατά την ανάπτυξη του μαστικού αδένα καθώς και σε καλλιέργειες ανάλογων κυττάρων, γεγονός που της αποδίδει ένα προστατευτικό ρόλο έναντι στον καρκίνο του μαστού (Rosenfield et al. 2012). Όσον αφορά στους αρσενικούς ενήλικους επίμυες, παράγεται στα κύτταρα Leydig των όρχεων και απουσία αυτής παρατηρείται στειρότητα, με ατροφικούς όρχεις και αποπτωτικά σπερματοκύτταρα (Zhang et al. 1999), εμπλέκοντας την PTN στη σπερματογένεση. Η PTN εκφράζεται στο εμβρυϊκό ήπαρ με την έκφρασή της σταδιακά να μειώνεται, αν και φαίνεται να την εμπλέκουν στην αναγέννηση αυτού (Asahina et al. 2002) (Ochiai et al. 2004). Έχει βρεθεί πως η PTN ρυθμίζει τη χολλαγειακή αντίδραση η οποία παρατηρείται σε διάφορες περιπτώσεις ηπατικής βλάβης με το να ελέγχει τη μετανάστευση των κυττάρων στα προγονικά ηπατικά κύτταρα μέσω του υποδοχέα RPTPZ1 (Michelotti et al. 2015). Η PTN έχει εντοπιστεί και στο μεσέγχυμα των νεφρών κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης (Mitsiadis et al. 1995). Το mrna της ενιχνεύεται στον αναπτυσσόμενο πνεύμονα και σε εμβρυϊκά βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα και ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των επιθηλιακών κυττάρων του πνεύμονα κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης των πνευμόνων (Mitsiadis et al. 1995) (Weng et al. 2009). Η απουσία της PTN έχει βρεθεί ότι επηρεάζει τη μορφογένεση της διακλάδωσης του πνεύμονα (Weng et al. 2009). Η PTN αποτελεί εκκρινόμενο συστατικό του μυελού των 9

19 Εισαγωγή οστών, απαραίτητο για την ανανέωση και τη διατήρηση αιματοποιητικών κυττάρων (Himburg et al. 2012). Ανάλογα δεδομένα έχουν δείξει πως η συστηματική χορήγηση PTN, σε ποντίκια που δέχονται ακτινοβολία και υπόκεινται σε μυελοκαταστολή οδηγεί σε αύξηση της επιβίωσης τους, με το να ρυθμίζει την αναγέννηση των αιμοποιητικών κυττάρων μέσω της ενεργοποίησης του RAS σηματοδοτικού μονοπατιού (Himburg et al. 2014). Η PTN και η MK αναφέρεται πως έχουν αντιβακτηριδιακές δράσεις λόγω της διαφύλαξης της ακεραιότητας των βακτηριακών κυτταρικών μεμβρανών (Svensson et al. 2010). Επίσης, πρόσφατα βρέθηκε πως η PTN επάγει τον πολλαπλασιασμό του ανθρώπινου ιού ανοσοανεπάρκειας τύπου 1 (HIV-1) μέσω της έκφρασης κυτταροκινών από μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (M Bika et al. 2010) (Achour et al. 2008). Ακόμα, η PTN φαίνεται να ρυθμίζει αρνητικά τη λιπογένεση μέσω της GSK-3β κινάσης και της β- κατενίνης (Gu et al. 2007). Επίσης, έχει βρεθεί πως η PTN επάγει τη μετανάστευση των επιθηλιακών κυττάρων του εντέρου, ενώ στην ίδια εργασία παρατήρησαν πως αυτή η μεταναστευτική ικανότητα των επιθηλιακών εντερικών κυττάρων αναστέλλεται ύστερα από τη χρήγηση μη στεροειδών αντιφλεγμονωδών φαρμάκων, η οποία τελικά δεν επιτρέπει την αποκατάσταση των κυττάρων και της εντερικής βλάβης που προκαλείται λόγω μείωσης της έκφρασης της PTN (Silver et al. 2012). Η PTN ανιχνεύεται σε λεία μυϊκά κύτταρα (Milner 1989) και στα κύτταρα του μυοκαρδίου, ενώ φαίνεται να αυξάνεται η έκφρασή της στην καρδιακή ανεπάρκεια (Asakura & Kitakaze 2009). Ένας ακόμα ρόλος που της έχει αποδοθεί είναι αυτός του ρυθμιστή της μελανογένεσης του δέρματος, όπου από πειραματικά δεδομένα έχει δειχθεί πως η PTN αναστέλλει τη δημιουργία μελανίνης στα φυσιολογικά ανθρώπινα μελανοκύτταρα μέσω της ενεργοποίησης των ERK1/2 (Choi et al. 2015) Ενεργά τμήματα της PTN Μέχρι σήμερα δεν έχει ξεκαθαρισθεί πλήρως ποιο τμήμα της PTN είναι υπεύθυνο για κάθε βιολογική της δράση. Μελέτες που έχουν γίνει για τη σχέση δομής-δράσης έχουν δείξει πως το καρβοξυτελικό άκρο της PTN επάγει την προέκταση νευριτών ενώ το αμινοτελικό δε φαίνεται να έχει καμία δράση (Inui et al. 2000). Τα κατάλοιπα του καρβοξυτελικού άκρου 10

20 Εισαγωγή που είναι πλούσια σε λυσίνες εμπλέκονται στη μιτογόνο δράση της PTN σε CHO-K1 κύτταρα (Bernard-Pierrot et al. 2001) και στην ενεργοποίηση της MAPK και της PI3K σε BEL κύτταρα (Souttou et al. 1997). Η ογκογενετική δράση της PTN πιθανά να οφείλεται στα αμινοξέα Η υπερέκφραση του τμήματος (καρβοξυτελικό άκρο) οδηγεί σε αυξημένη καρκινική αγγειογένεση in vivo, ενώ υπερέκφραση του αμινοτελικού της άκρου οδηγεί σε ανάπτυξη όγκων, όχι όμως σε αυξημένη καρκινική αγγειογένεση (Zhang et al. 2006). Μελέτες έχουν δείξει πως όταν λείπουν από το μόριο της ΡΤΝ τα 26 τελευταία αμινοξέα του καρβοξυτελικού άκρου, αλλάζει το μοτίβο δράσης της και συμπεριφέρεται ως ένας ενδογενής αναστολέας της μιτογόνου, αγγειογενετικής και ογκογενετικής δράσης που έχει στα κύτταρα MDA-MB231, με το να δημιουργεί ένα μη λειτουργικό ετεροδιμερές με την ΡΤΝ (Bernard- Pierrot et al. 2002). Ακόμα έχουν δείξει πως με αυτή την απαλοιφή αναστέλλεται ο επαγόμενος από PTN πολλαπλασιασμός των καρκινικών και ενδοθηλιακών κυττάρων, μειώνεται η έκφραση του VEGF, ενώ αποτρέπεται η ανάπτυξη των όγκων και η αγγειογένεση in vivo (Ducès et al. 2008) (Dos Santos et al. 2010). Τέλος, η παρουσία ενός συνθετικού πεπτιδίου που αντιστοιχεί στα τελευταία 25 αμινοξέα του καρβοξυτελικού άκρου της PTN έχει δείξει πως αναστέλλει την επαγόμενη από PTN αγγειογένεση in vivo καθώς και την επαγόμενη από PTN μετανάστευση και τον σχηματισμό αυλών ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro, με το να εμποδίζει την αλληλεπίδραση ολόκληρου του μορίου με την ιντεγκρίνη α ν β 3 (Mikelis et al. 2011). Άλλα πειραματικά δεδομένα έχουν δείξει πως τα πεπτίδια 1-21 και όταν τοποθετηθούν στην επιφάνεια καλλιέργειας επάγουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε διάφορα είδη ενδοθηλιακών κυττάρων σε αντίθεση με τα διαλυτά πεπτίδια που δεν εμφανίζουν κάποια δράση (Papadimitriou et al. 2000). Σε συμφωνία με τα παραπάνω, χρησιμοποιώντας τα ίδια πεπτίδια παρατήρησαν ότι επάγεται η αγγειογένεση in vivo, καθώς και ο πολλαπλασιασμός των ενδοθηλιακών κυττάρων και η δημιουργία αυλών in vitro (Papadimitriou et al. 2001). Έχουν διευρευνηθεί ως προς τη δράση τους και άλλα συνθετικά πεπτίδια που αντιπροσωπεύουν διαφορετικές περιοχές της PTN κάθε φορά, και έχει δειχθεί πως είτε αναστέλλουν την αγγειογενετική και ογκογενετική δράση αυτής μέσω αλληλεπίδρασης με την ηπαρίνη 11

21 Εισαγωγή (Hamma-Kourbali et al. 2008), είτε μπλοκάρουν τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την προσκόλληση των κυττάρων μέσω αλληλεπίδρασης του υποδοχέα με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ (RPTPβ/ζ) ή/ και ανταγωνισμού με την Ν-συνδεκάνη (Diamantopoulou et al. 2010). Πέψη της PTN με πλασμίνη οδηγεί στην παραγωγή πέντε πεπτιδίων που αντιστοιχούν σε διαφορετικές περιοχές του μορίου και έχουν διαφορετική βιολογική δράση. Τα παραγόμενα πεπτίδια όταν περιέχουν μία από τις β-δομές φαίνεται ότι επάγουν την αγγειογένεση in vitro, ενώ κάτι τέτοιο δεν συμβαίνει σε πεπτίδια που περιέχουν και τις δύο β-δομές (Polykratis et al. 2004). Οι β-δομές απαιτούνται για την αλληλεπίδραση PTN-VEGF 165 (Héroult et al. 2004), και αυτό είναι κάτι που δικαιολογεί την ανασταλτική δράση των πεπτιδίων μέσω αλληλεπίδρασης με τον VEGF 165 και επαγόμενη αναστολή της δράσης του. Παρόλα αυτά, η χορήγηση αυτών των πεπτιδίων in vivo προκαλεί επαγωγή της αγγειογένεσης, με μηχανισμούς που δεν είναι απόλυτα διευκρινισμένοι (Polykratis et al. 2004) Ο ρόλος της PTN στην αγγειογένεση και στον καρκίνο Ο πιθανός ρόλος της PTN στη φυσιολογική αγγειογένεση προτάθηκε όταν ανιχνεύτηκε για πρώτη φορά το mrna και απομονώθηκε η πρωτεΐνη της από αγγειοβριθείς ιστούς, όπως είναι η μήτρα βοός και η μήτρα επίμυος (Milner 1989) (Vanderwinden et al. 1992). Η αγγειογενετική της δράση έκτοτε έχει διαπιστωθεί σε in vivo συστήματα μελέτης, όπως η χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη εμβρύου όρνιθας (CAM assay) αλλά και σε εμφυτεύματα matrigel σε μυς (Papadimitriou et al. 2000) (Bernard-Pierrot et al. 2002). Υπάρχουν πολλές αναφορές που την εμπλέκουν με τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση ενδοθηλιακών κυττάρων (Papadimitriou et al. 2000) και το σχηματισμό αυλών σε μια ποικιλία πηκτωμάτων, όπως κολλαγόνου, ινώδους και matrigel (Papadimitriou et al. 2001). Επιπλέον, σε ενήλικα άτομα η PTN εντοπίζεται κυρίως σε καταστάσεις φλεγμονής, όπως κατά τη ρευματοειδή αρθρίτιδα (Thomas Pufe et al. 2003), όπου μπορεί να δρα ως παρακρινής αγγειογενετικός παράγοντας. Έχει βρεθεί επίσης ότι η άσκηση μηχανικής 12

22 Εισαγωγή φόρτισης στον ανθρώπινο μεσοσπονδύλιο δίσκο οδηγεί σε αυξημένη έκφραση της PTN, γεγονός που σχετίζεται με την αγγείωσή του (Neidlinger- Wilke et al. 2009), ενώ έχει επιβεβαιωθεί η αυξημένη έκφραση της PTN και η επαγόμενη αγγειογένεση του ιστού με ανοσοϊστοχημικές μελέτες σε τομές μεσοσπονδύλιων δίσκων. Πρόσφατα δεδομένα προτείνουν την επαγόμενη από PTN μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων μέσω της παραγωγής ελεύθερων δραστικών ριζών οξυγόνου (ROS), καθώς βρέθηκε πως η εξωγενής χορήγηση PTN είχε ως αποτέλεσμα την αυξημένη παραγωγή ριζών, τόσο σε ενδοθηλιακά όσο και σε καρκινικά κύτταρα προστάτη (Tsirmoula et al. 2015). Σε μία άλλη μελέτη αναφέρουν την PTN ως έναν αγγειογενετικό οδηγό που προάγει τη δημιουργία ενός προ-αγγειογενετικού περιβάλλοντος, μιας μεταναστευτικής συμπεριφοράς των ενδοθηλιακών κυττάρων και ενός εναλλακτικού φαινότυπου στα μακροφάγα, λειτουργεί δηλαδή ως μία τεχνητή αγγειακή μηχανή που μπορεί να χρησιμοποιηθεί όταν είναι αναγκαία η δημιουργία ενδοθηλίου σε αγγειακά μοσχεύματα (Palmieri et al. 2015). Εκτός από το ρόλο της PTN στη φυσιολογική αγγειογένεση, συμμετέχει σημαντικά και στην επαγωγή της παθολογικής αγγειογένεσης και στην ανάπτυξη όγκων. Το γονίδιο της PTN είναι ένα πρωτο-ογκογονίδιο που εδράζεται στη θέση q33-34, στο 7ο χρωμόσωμα (Li et al. 1992). Η πιθανή συμμετοχή της PTN στον καρκίνο προτάθηκε για πρώτη φορά ύστερα από την απομόνωσή της από το θρεπτικό μέσο της κακοήθους καρκινικής σειράς μαστού, MDA-MB-231 (Lupu et al. 1992). Η PTN έχει βρεθεί ότι εκφράζεται σε αρκετούς πρωτοπαθείς όγκους και διαφορετικές κυτταρικές σειρές σε υψηλά ποσοστά και η υπερέκφρασή της επάγει την αύξηση του πολλαπλασιασμού των φυσιολογικών κυττάρων (Fang et al. 1992). Tα υψηλότερα επίπεδα PTN παρατηρούνται σε μηνιγγιώματα (Vanderwinden et al. 1992), νευροβλαστώματα, διάχυτα αστροκυτταρώματα και γλοιοβλαστώματα. Υψηλά επίπεδα ανιχνεύονται επίσης και σε ορό ασθενών με καρκίνο του μαστού, του κόλου, του παγκρέατος και του πνεύμονα, καθώς επίσης και σε πολλαπλό μυέλωμα (Soulié et al. 2002) (Souttou et al. 1997). Αύξηση της έκφρασης της PTN σε επίμυες επάγει την ανάπτυξη καρκίνου του μαστού μέσω ενεργοποίησης του μικροπεριβάλλοντος των κυττάρων του στρώματος 13

23 Εισαγωγή (Chang et al. 2007). Επίσης, μελέτες έχουν δείξει ότι η PTN εκφράζεται μη φυσιολογικά σε καρκίνο του πνεύμονα, ιδιαίτερα σε μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (Small Cell Lung Cancer, SCLC), και μπορεί να θεωρηθεί ως ένας καρκινικός μάρτυρας για τη διάγνωση και την πρόγνωση αυτού του τύπου καρκίνου, καθώς φαίνεται πως η έκφρασή της σχετίζεται με τον βαθμό διαφοροποίησης του όγκου (Wang & Wang 2015). Η PTN φαίνεται να υπερεκφράζεται σε κακοήθη καρκίνο των όρχεων (Aigner et al. 2003), του τραχήλου της μήτρας, καθώς επίσης και στο 78% δειγμάτων ασθενών με καρκίνο του παγκρέατος (Souttou et al. 1998). Στην ίδια περίπτωση καρκίνου, σε πιο πρόσφατη μελέτη, προσπάθησαν να αναστείλουν την έκφραση της PTN στα καρκινικά παγκρεατικά κύτταρα και παρατήρησαν ότι η μείωση της έκφρασής της οδήγησε σε μειωμένη περινευρική διείσδυση των καρκινικών κυττάρων, ένα βήμα πολύ καθοριστικό για την εξέλιξη της νόσου (Feng 2014). Η PTN εκφράζεται ακόμα σε υψηλά ποσοστά σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου, κάτι που υποδηλώνει ότι μπορεί να προταθεί ως ανεξάρτητος προγνωστικός μάρτυρας (H. Hu et al. 2014). Σε καρκίνο των ωοθηκών επίσης έχει βρεθεί να εκφράζεται η PTN και τα σηματοδοτικά της μόρια, με την εμφάνισή της και μόνο να προδιαθέτει στην ανάπτυξη αυτού του τύπου καρκίνου (Sethi et al. 2014). Ακόμα και για τον καρκίνο του προστάτη, η PTN μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως προγνωστικός δείκτης καθώς σε μια μεταανάλυση γονιδίων που σχετίζονται με τον καρκίνο του προστάτη βρέθηκε ότι η PTN είναι ανάμεσα στα κύρια οκτώ γονίδια που η έκφρασή τους σχετίζεται με την εξέλιξη της νόσου (Wang et al. 2013). Επιπρόσθετα, η PTN προάγει την έκφραση του VEGF και την αγγειογένεση ορθοκολικών όγκων (Kong et al. 2012), ενώ συμβάλλει στην ανάπτυξη όγκων σε επίμυες με αλλομοσχεύματα ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων προστάτη (Tsirmoula et al. 2012). Αναστολή της έκφρασής της ωστόσο σε καρκινικά κύτταρα προστάτη LNCaP, μειώνει την ανάπτυξη και τη μετανάστευσή τους, καθώς και την επαγωγή της αγγειογέννεσης in vivo και in vitro (Hatziapostolou et al. 2005) (Tsirmoula et al. 2012). Πρόσφατα δεδομένα θέλουν τη συνύπαρξη της PTN με τη MK σε ανθρώπινα γλοιώματα να αποτελούν δείκτες για κακή πρόγνωση για την επιβίωση των ασθενών, καθώς και οι δύο ομόλογοι αυξητικοί παράγοντες είναι πολύ αυξημένοι στους καρκινικούς ιστούς σε σχέση με τους φυσιολογικούς (Ma et al. 2014). Επίσης, η PTN που παράγεται από κύτταρα 14

24 Εισαγωγή γλοιώματος, δεν επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των ίδιων των κυττάρων, αλλά διεγείρει τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση κυττάρων μικρογλοίας, γεγονός που οδηγεί στην υπόθεση ότι η PTN μπορεί να δρα ως ένας παρακρινής αυξητικός/αγγειογενετικός παράγοντας, ο οποίος παράγεται από τα γλοιώματα και συμβάλλει στην κακοήθειά τους στοχεύοντας ενδοθηλιακά και μικρογλοιακά κύτταρα (Mikelis et al. 2007). Αυξημένα είναι τα επίπεδα της PTN και σε ασθενείς με διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια, ενώ φαίνεται πως η έκφρασής της συμμετέχει στην ανάπτυξη της νόσου αφού προάγει την αγγειογένεση και τον πολλαπλασιασμό, πιθανά μέσω της ενεργοποίησης των ERK1/2 και της ρύθμισης της έκκρισης του VEGF, για αυτό και θεωρείται πιθανός θεραπευτικός στόχος παρέμβασης στη διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια (Zhu et al. 2015). Τέλος, υπάρχουν και αναφορές ότι η PTN δρα αρνητικά επί της αγγειογένεσης και της ογκογένεσης. Αρχικά, έχει βρεθεί αυξημένη η έκφρασή της σε κυτταρικές καλλιέργειες όταν τα κύτταρα δεν πολλαπλασιάζονται. Ακόμα, η άμεση αλληλεπίδραση της PTN με τον VEGF 165 έχει ως αποτέλεσμα την αναστολή της βιολογικής δράσης του τελευταίου (Héroult et al. 2004). Υπάρχουν αναφορές που θέλουν την PTN να έχει αγγειοστατικό ρόλο σε in vivo μοντέλο νευροβλαστώματος είναι ανθεκτικό σε θεραπεία με ιρινοτεκάνη (Calvet et al. 2006), ενώ έχει αποδειχθεί πως η αναστολή της έκφρασής της στα κύτταρα γλοιώματος επίμυ C6 προκαλεί αύξηση της ανάπτυξης των κυττάρων αυτών in vitro, αλλά και της αγγειογένεσης in vivo και in vitro (Parthymou et al. 2008). Η εξωγενής χορήγηση PTN σε κύτταρα γλοιώματος M059K και C6 προκαλεί αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης (Mikelis et al. 2009). Τέλος, ακόμα ένα παράδειγμα της ανασταλτικής δράσης της PTN προκύπτει από μία μελέτη με 149 δείγματα καρκίνου του μαστού και 32 φυσιολογικά, που απέδειξε ότι τα επίπεδα της PTN είναι σημαντικά μειωμένα στην πρώτη περίπτωση, ενώ στο 60% των περιπτώσεων αυτών είχε ανασταλεί και η έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα HOXA5. Εφόσον η PTN αποτελεί άμεσο μεταγραφικό στόχο του HOXA5, φαίνεται ότι η καταστολή του στον συγκεκριμένο τύπο καρκίνου οδηγεί σε μείωση της έκφρασης της PTN (Chen et al. 2005). Αναστολή, επίσης, της PTN σε CD19+ κύτταρα (υποομάδα των Β κυττάρων) από περιφερικό αίμα ασθενών με 15

25 Εισαγωγή λεμφοκυτταρική λευχαιμία, οδήγησε σε απόπτωση αυτών των κυττάρων, γεγονός που υποδηλώνει τη σημασία της στόχευσης της PTN στη θεραπεία της λεμφοκυτταρικής λευχαιμίας (Du et al. 2014) Υποδοχείς της PTN Υποδοχέας με δράση φωσφατάση τυροσίνης β/ζ (RPTPβ/ζ) Ο RPTPβ/ζ, γνωστός και ως RPTPζ ή β, είναι μια πρωτεογλυκάνη θειικής χονδροϊτίνης με ενδογενή δράση φωσφατάσης τυροσίνης (PTPαση), ανήκει στην οικογένεια V των RPTPs και είναι ο πιο καλά χαρακτηρισμένος υποδοχέας της PTN. Αρχικά, απομονώθηκε από το νευρικό ιστό και αποτελείται από ένα μεγάλο εξωκυτταρικό τμήμα που περιέχει μια αμινοτελική αλληλουχία με δομή καρβονικής ανυδράσης, μια περιοχή ινονεκτίνης τύπου ΙΙΙ και μια περιοχή πλούσια σε σερίνη και γλυκίνη, ένα διαμεμβρανικό τμήμα και ένα κυτταροπλασματικό με δύο επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες φωσφατάσης, με αυτή που βρίσκεται πιο κοντά στην πλασματική μεμβράνη να είναι και η καταλυτικά ενεργή (Krueger & Saito 1992). O RPTPβ/ζ έχει τέσσερις διαφορετικές ισομορφές: δυο διαμεμβρανικές και δύο εκκρινόμενες από τις οποίες η μία είναι η φωσφακάνη (Maurel et al. 1994) και η άλλη η μικρή ισομορφή της φωσφακάνης γνωστή ως PSI (phosphacan short isoform) (Garwood et al. 2003) (Εικόνα Ε1), οι οποίες είναι αποτέλεσμα εναλλακτικής ωρίμανσης του μεταγράφου (Barnea et al. 1994). Η μικρή διαμεμβρανική ισομορφή περιέχει τις ίδιες ενδοκυτταρικές περιοχές φωσφατάσης όπως η μεγάλη ισομορφή, διαφέρει όμως από αυτή καθώς της λείπει μια ιδιαίτερα γλυκοζυλιωμένη ακολουθία 859 αμινοξέων, οι οποίες αποτελούν θέσεις σύνδεσεις γλυκοζαμινογλυκανών (GAG) (Levy et al. 1993). Οι διαμεμβρανικές μορφές του υποδοχέα εκφράζονται κυρίως στους νευρώνες του φλοιού (Canoll et al. 1996). Οι δύο άλλες ισομορφές είναι εκκρινόμενες. Η φωσφακάνη είναι πρωτεογλυκάνη και περιέχει το εξωκυττάριο τμήμα της μεγάλης διαμεμβρανικής ισομορφής του υποδοχέα, στο οποίο δεσμεύεται η 16

26 Εισαγωγή PTN (Maeda et al. 1996) και θεωρείται ότι ρυθμίζει κυτταρικές αλληλεπιδράσεις και αναπτυξιακές διαδικασίες στο νευρικό σύστημα (Maurel et al. 1994). Η ικανότητα πρόσδεσης της PTN στη φωσφακάνη ρυθμίζεται από τις μεταβολές στις αλυσίδες της θειϊκής χονδροϊτίνης, οι οποίες καθορίζονται αναπτυξιακά (Maeda et al. 2003). Από την άλλη μεριά, η μικρή ισομορφή της φωσφακάνης (phosphacan short isoform, PSI) που ανακαλύφθηκε αργότερα, δεν είναι πρωτεογλυκάνη και υφίσταται μικρού βαθμού γλυκοζυλίωση, ενώ δεν έχει βρεθεί να αλληλεπιδρά με την PTN (Garwood et al. 2003). Γενικά, η μεγάλη διαμεμβρανική ισομορφή του υποδοχέα και η φωσφακάνη απαντούν ως πρωτεογλυκάνες θειϊκής χονδροϊτίνης με έντονη γλυκοζυλίωση (Faissner et al. 2006). Σε ορισμένους ιστούς, η μεγάλη διαμεμβρανική ισομορφή έχει ανιχνευθεί και ως γλυκοπρωτεΐνη (Fujikawa et al. 2003). Ο RPTPβ/ζ φέρει δύο θέσεις δέσμευσης της PTN, μία χαμηλής συγγένειας θέση δέσμευσης και μία υψηλή συγγένειας θέση δέσμευσης, ενώ η πέψη με τη χονδροϊτινάση ABC μπορεί να μειώσει τη συγγένεια δέσμευσης χωρίς να αλλάξει τον αριθμό των θέσεων. Η δέσμευση της PTN στον RPTPβ/ζ μπορεί να ανασταλεί με τη διαλυτή PTN, με ειδικές γλυκοζαμινογλυκάνες και με πέψη με χονδροϊτινάση ABC κάτι που υποδεικνύει πως είναι απαραίτητη η θειϊκή χονδροϊτίνη για τη δέσμευση της PTN στον υποδοχέα της RPTPβ/ζ (Xu et al. 2014). Η φαινομενική μοριακή μάζα του RPTPβ/ζ είναι 250 kda, ενώ οι γλυκοζυλιωμένες του ισομορφές αναλύονται στα 300 kda. Ο RPTPβ/ζ είναι η κύρια πρωτεογλυκάνη θειικής ηπαράνης στο αναπτυσσόμενο νευρικό σύστημα (Canoll et al. 1993) (Krueger & Saito 1992) (Levy et al. 1993) και η εξαρτώμενη από το χώρο και τη χρονική στιγμή έκφρασή του υποδεικνύει τον πιθανό του ρόλο στη μορφογένεση και την πλαστικότητα του νευρικού συστήματος (Canoll et al. 1993). Υπάρχουν δεδομένα που αποδεικνύουν πως ο RPTPβ/ζ στον αναπτυσσόμενο φλοιό εμπλέκεται στη νευρωνική μετανάστευση που επάγεται από την PTN (Canoll et al. 1993) ενώ η σίγαση του γονιδίου του ανέστειλε τη μεταναστευτική τους ικανότητα (Müller et al. 2003). Ο υποδοχέας RPTPβ/ζ ρυθμίζει τη μορφογένεση των δενδριτικών κυττάρων Purkinje στην αναπτυσσόμενη παρεγκεφαλίδα (Tanaka et al. 2003), ενώ έχει βρεθεί ότι εκφράζεται επίσης σε ολιγοδενδροκύτταρα και παίζει 17

27 Εισαγωγή σημαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση τους (Lamprianou et al. 2011). Ενώ, σε αντιπαράλληλη τροχιά φαίνεται να υπάρχει αρνητική ρύθμιση του υποδοχέα στη διαφοροποίηση των ολιγοδενδροκυττάρων (Kuboyama et al. 2012). Υπάρχουν ωστόσο in vivo αποτελέσματα που αποδεικνύουν πως η απώλεια του υποδοχέα RPTPβ/ζ δε διαταράσσει τη φυσιολογική ανάπτυξη του νευρικού συστήματος (Harroch et al. 2000). Η φωσφακάνη έχει βρεθεί να αλληλεπιδρά με μόρια της κυτταρικής προσκόλλησης όπως η N-CAM, η Ng- CAM και η τενασκίνη που εμπλέκονται στην προσκόλληση των νευρικών κυττάρων και των κυττάρων της γλοίας, στην ανάπτυξη των νευριτών και στη μεταγωγή σήματος κατά τη διάρκεια ανάπτυξης του κεντρικού νευρικού ιστού (Barnea et al. 1994) (Milev et al. 1994). Από πρόσφατα δεδομένα φαίνεται η εμπλοκή του RPTPβ/ζ στην ανάπτυξη της νόσου του Parkinson, ενώ θεωρείται πλέον ως ένας αποτελεσματικός στόχος για τη θεραπευτική αντιμετώπιση της νόσου, με την ανάπτυξη των κατάλληλων ανταγωνιστών του υποδοχέα (Herradón & Ezquerra 2009). Στους οστεοβλάστες, σε αντίθεση με τα νευρικά κύτταρα, εκφράζεται κυρίως η μικρή διαμεμβρανική ισομορφή του RPTPβ/ζ και παίζει καθοριστικό ρόλο στη μορφογένεση των οστών σε ποντίκια (Schinke et al. 2008). Επιβεβαίωση αυτού αποτελεί το γεγονός πως επίμυες που δεν εκφράζουν τον RPTPβ/ζ εμφανίζουν μικρότερο πυρήνα αναγέννησης οστών και μικρότερο ρυθμό σύνθεσης νέων οστών (Harroch et al. 2000), ενώ άλλα πειραματικά δεδομένα έχουν δείξει πως οι οστεοβλάστες που δεν εκφράζουν τον υποδοχέα παρουσιάζουν μικρότερη έκφραση οστεοβλαστικών δεικτών (Schinke et al. 2008). Έχει βρεθεί ότι ο RPTPβ/ζ υπερεκφράζεται κατά το στάδιο της τελικής διαφοροποίησης των οστεοβλαστών (Schinke et al. 2008). Ο RPTPβ/ζ εμπλέκεται και με έμμεσο τρόπο στο σχηματισμό των οστών, αφού αποτελεί υποδοχέα της ΡΤΝ, ο ρόλος της οποίας είναι ήδη αποδεδειγμένος στο σχηματισμό των οστών (Lamprou et al. 2014). Πρόσφατες μελέτες, έχουν δείξει πως ο υποδοχέας εκφράζεται επίσης στα χονδροκύτταρα και σε οστεοκύτταρα του υποχόνδριoυ οστού ασθενών με οστεοαρθρίτιδα, γεγονός που αποδεικνύει την εμπλοκή του στην παθοφυσιολογία της νόσου (Kaspiris et al. 2013). 18

28 Εισαγωγή Έχουν βρεθεί και άλλες ισομορφές του RPTPβ/ζ εκτός από αυτές που εμφανίζονται φυσιολογικά, καθώς η αποικοδόμησή του από διάφορους παράγοντες όπως η MMP-9, το μετατρεπτικό ένζυμο του TNF (TACE, Tumor Necrosis Factor Converting Enzyme), πρεσενιλίνη/γ-σεκρετάση (Chow et al. 2008b) και η πλασμίνη (Chow et al. 2008a) οδηγεί στη δημιουργία εκκρινόμενων, διαμεμβρανικών, ή κυτταροπλασματικών ισομορφών, η βιολογική σημασία των οποίων δεν έχει πλήρως αποσαφηνιστεί (Chow et al. 2008). Ο RPTPβ/ζ φαίνεται να εκφράζεται και σε άλλους τύπους κυττάρων πέραν των νευρικών, όπως στα ενδοθηλιακά κύτταρα (Polytarchou et al. 2009) (Polykratis et al. 2005), καθώς και σε καρκινικά κύτταρα από διάφορους τύπους καρκίνου, όπου φαίνεται να διαμεσολαβεί τις δράσεις της PTN και ίσως να αποτελεί θεραπευτικό στόχο (Lorente et al. 2005) (Foehr et al. 2006). Εικόνα Ε1: Σχηματική απεικόνιση των ισομορφών του RPTPβ/ζ. Στην εικόνα φαίνονται οι δύο διαμεμβρανικές και οι δύο εκκρινόμενες ισομορφές (Garwood et al. 2003). 19

29 Εισαγωγή Έχει προταθεί ότι δέσμευση της ΡΤΝ στον RPTPβ/ζ επάγει το διμερισμό του υποδοχέα και την απενεργοποίηση της δράσης του ως φωσφατάση. Ενεργοποίηση του RPTPβ/ζ που σχετίζεται με τη διαδικασία της μνήμης, οδηγεί σε ρύθμιση της ενεργότητας της GTPασης Rho (Tamura et al. 2006). Πρόσδεση της PTN στον RPTΡβ/ζ οδηγεί σε αύξηση της φωσφορυλίωσης σε τυροσίνη της β-κατενίνης, με επακόλουθη μείωση της αλληλεπίδρασης με την Ε-καντχερίνη και αποσταθεροποίηση των συνδέσεων μεταξύ των κυττάρων (Meng et al. 2000) (Deuel et al. 2002). Μέσω του μονοπατιού RPTPβ/ζ/ΡΤΝ αυξάνεται η φωσφορυλίωση της β-αντουσίνης μέσω της ενεργοποίησης της PKC και η β-αντουσίνη οδηγείται στον πυρήνα (Pariser et al. 2005). Επιπλέον, επηρεάζονται και οι κυτταροσκελετικές πρωτεΐνες (Pariser et al. 2005). H Fyn φαίνεται να αλληλεπιδρά με τον RPTPβ/ζ και η φωσφορυλίωσή της αυξάνεται μετά από αλληλεπίδραση της PTN με τον RPTPβ/ζ (Pariser et al. 2005). Έτσι, αντιλαμβανόμαστε πως η αλληλεπίδραση του RPTPβ/ζ με αυτά τα μόρια είναι σημαντική γιατί ρυθμίζει την σταθερότητα του κυτταροσκελετού, την κυτταρική πλαστικότητα, και τους μηχανισμούς προσκόλλησης των κυττάρων (Papadimitriou et al. 2009). Η υπερέκφραση ωστόσο, του RPTPβ/ζ έχει ως αποτέλεσμα την αυξημένη έκφραση των διαφόρων ρυθμιστών του, υποδεικνύοντας τη σημαντικότητα της σηματοδότησης από τον RPTPβ/ζ, σε ενήλικα ανθρώπινα λευκά προγονικά κύτταρα (Sim et al. 2006). Έχει βρεθεί πως όταν δεσμεύεται η ΡΤΝ στον RPTPβ/ζ στα ενδοθηλιακά κύτταρα, έχει ως αποτέλεσμα να αυξάνεται η αποφωσφορυλίωση της τυροσίνης 527 της κινάσης c-src, να ενεργοποιείται η κινάση εστιακής προσκόλλησης (focal adhesion kinase, FAK), η PI3K και οι κινάσες που ρυθμίζονται από εξωκυτταρικά σήματα (extracellular signal regulated kinases, ERK), γεγονότα που οδηγούν τελικά τα ενδοθηλιακά κύτταρα σε μετανάστευση και στο σχηματισμό αυλών (Polykratis et al. 2005). Επίσης, περαιτέρω μελέτες της ερευνητικής μας ομάδας έδειξαν πως η παρουσία της ιντεγκρίνης α ν β 3, είναι απαραίτητη για τη διαμεσολαβούμενη από τον RPTPβ/ζ μετανάστευση ενδοθηλιακών και καρκινικών κυττάρων γλοιoβλαστώματος και πιο συγκεκριμένα, ότι ο RPTPβ/ζ σχηματίζει ένα λειτουργικό σύπλοκο με την α ν β 3 στην κυτταρική μεμβράνη και είναι υπεύθυνος για την φωσφορυλίωση 20

30 Εισαγωγή της υπομονάδας β 3 στην τυροσίνη 773, μέσω ενεργοποίησης της c-src (Mikelis et al. 2009). Στην ίδια μελέτη παρατηρήθηκε ότι η PTN αναστέλλει τη μετανάστευση σε κύτταρα που λείπει η α ν β 3 αν και εκφράζεται φυσιολογικά ο υποδοχέας RPTPβ/ζ (Mikelis et al. 2009). Παλαιότερα δεδομένα έχουν δείξει πως η εμπλοκή του RPTPβ/ζ στην κυτταρική μετανάστευση διεγείρεται εκτός από την PTN, και από το μονοξείδιο του αζώτου (Nitrc Oxide, NO) (Polytarchou et al. 2009) και από την απροτινίνη (αναστολέας παγκρεατικής τρυψίνης βοοειδών) (Koutsioumpa et al. 2009), υποδεικνύοντας έτσι τον καθοριστικό του ρόλο στην αγγειογένεση. Από την άλλη μεριά, η αναστολή της έκφρασής του οδηγεί σε μειωμένη μετανάστευση, προσκόλληση και σχηματισμό αποικιών σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη DU145 (Diamantopoulou et al. 2010). Ακόμα έχει βρεθεί πως η PTN και ο υποδοχέας της RPTPβ/ζ επάγουν τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων του πνέυμονα A549 μέσω της μενίνης (Feng et al. 2010). Έντονη και συνεχής φαίνεται να είναι η έκφραση και η δράση του υποδοχέα και της PTN και σε διάφορους υποτύπους ανθρώπινου καρκίνου του μαστού (Perez-Pinera et al. 2007). Τα αποτελέσματα που έχουμε ως προς την αποτελεσματική στόχευση του RPTPβ/ζ είναι αρκετά περιορισμένα, ωστόσο υπάρχουν κάποια μονοκλωνικά αντισώματα έναντι του RPTPβ/ζ που χρησιμοποιούνται (Ulbricht et al. 2006), καθώς και πειράματα αναστολής της έκφρασής του με sirna (Foehr et al. 2006), τα οποία έχουν δείξει πως αναστέλλουν την ανάπυξη γλοιωμάτων in vitro και in vivo. Πιο πρόσφατα αποτελέσματα της ερευνητικής μας ομάδας έχουν δείξει πως ο αγγειογενετικός αυξητικός παράγοντας VEGF 165 έχει ως πιθανό υποδοχέα τον RPTPβ/ζ, μέσω του οποίου ρυθμίζει αγγειογενετικές λειτουργίες στα ενδοθηλιακά κύτταρα, για αυτόν τον λόγο ο RPTPβ/ζ προτείνεται ως πιθανός στόχος για την ανάπτυξη πρόσθετων ή εναλλακτικών αντι-vegf θεραπειών (Koutsioumpa et al. 2015). Τέλος, ο υποδοχέας RPTPβ/ζ βρέθηκε να συνδέεται με την IL-34 (Nandi et al. 2013), η οποία προάγει τη βιωσιμότητα και τον πολλαπλασιασμό των μονοκυττάρων, καθώς και τη διαφοροποίηση των κυττάρων του μυελού των οστών σε προγονικά κύτταρα μακροφάγων, ενώ για πρώτη φορά σχετίζεται η δράση της με τον καρκίνο και συγκεκριμένα με τη λευχαιμία (Booker et al. 2015). 21

31 Εισαγωγή Ιντεγκρίνη α ν β 3 Οι ιντεγκρίνες αποτελούν μία μεγάλη οικογένεια ετεροδιμερών διαμεμβρανικών υποδοχέων που εντοπίζονται σε πολλά είδη ζώων από τα σφουγγάρια μέχρι και τα θηλαστικά. Συντίθενται από μία α και μία β υπομονάδα και σκοπός της λειτουργίας τους είναι να ρυθμίζουν την πρόσδεση του κυττάρου σε μόρια της εξωκυττάριας ύλης και παράλληλα να αλληλεπιδρούν με διαλυτούς προσδέτες ή προσδέτες της κυτταρικής μεμβράνης. Η σύνδεση των δύο αλυσίδων γίνεται στο ενδοπλασματικό δίκτυο όπου τελικά επιτυγχάνεται η δημιουργία ενός λειτουργικού ετεροδιμερούς, το οποίο στη συνέχεια μεταφέρεται στην κυτταρική μεμβράνη (Cheresh 1992). Υπάρχουν τουλάχιστον 18 διαφορετικές α και 8 β αλυσίδες, και από αυτές προκύπτουν 24 διαφορετικοί α/β συνδυασμοί, με το κάθε ετεροδιμερές α/β να έχει τους δικούς του προσδέτες και τη δική του εξειδίκευση. Οι περισσότερες ιντεγκρίνες αναγνωρίζουν διάφορες πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ύλης και αντιστρόφως, μεμονωμένες πρωτεΐνες της εξωκυττάριας μήτρας, όπως η ινονεκτίνη, η λαμινίνη και το κολλαγόνο, δεσμεύονται σε διάφορες ιντεγκρίνες. Οι ιντεγκρίνες παίζουν σημαντικό ρόλο στη σηματοδότηση, και ο συνολικός αριθμός ιντεγκρινών που εντοπίζονται σε ένα κύτταρο είναι αυτός που καθορίζει τη βιολογική απόκριση του κυττάρου σε ερεθίσματα από την εξωκυττάρια ύλη και το μικροπεριβάλλον (Giancotti & Ruoslahti 1999). Τα εξωκυτταρικά τμήματα των δύο υπομονάδων είναι σχετικά μεγάλα και αποτελούνται περίπου από αμινοξέα, σε σχέση με τις μικρές κυτταροπλασματικές περιοχές που αποτελούνται από αμινοξέα. Οι ιντεγκρίνες εξαιτίας του γεγονότος ότι δεν έχουν οι ίδιες δραστικότητα κινάσης συμβάλλουν στην κυτταρική σηματοδότηση μέσω της στρατολόγησης, με τις κυτταροπλασματικές τους περιοχές, σηματοδοτικών μορίων όπως η FAK (Hauck et al. 2002), η c-src (Parsons & Parsons 1997), η PI3K (Franke et al. 1997), καθώς και πλήθος πρωτεϊνών του κυτταροσκελετού. Στα ενδοθηλιακά κύτταρα έχουν βρεθεί ότι εκφράζονται 10 διαφορετικές ιντεγκρίνες από τις οποίες οι πιο σημαντικές στα μη αγγειογενετικά ενδοθηλιακά κύτταρα είναι οι α 1 β 1, α 2 β 1, α 3 β 1, α 5 β 1, α 6 β 4, α 6 β 1 και α ν β 5. Πολύ πιθανά να εκφράζεται και η α ν β 1, εφόσον και οι δυο αλυσίδες α ν και β 1 εκφράζονται επαρκώς. Οι ιντεγκρίνες αυτές αποτελούν υποδοχείς για βασικά 22

32 Εισαγωγή συστατικά της εξωκυττάριας ύλης όπως είναι το κολλαγόνο και η λαμινίνη, με εξαίρεση τις ιντεγκρίνες α ν β 5 και α 5 β 1, οι οποίες δεσμεύουν πιο προσωρινά προσδέτες, όπως η βιτρονεκτίνη και η ινονεκτίνη. Κατά την αγγειογένεση, πραγματοποιείται αναδιάταξη της προσωρινής εξωκυττάριας ύλης με επιπλέον προσδέτες για τις ιντεγκρίνες α ν β 5 και α 5 β 1, όπως και νέες ιντεγκρίνες (α ν β 3 ), που εκφράζονται στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων (Stupack & Cheresh 2004). Το μοτίβο δράσης των ιντεγκρινών ως προς τους προσδέτες τους ρυθμίζεται αυστηρά από τη δομή τους και από τη μεταγωγή σήματος κυτταροπλασματικά στο ίδιο το κύτταρο μια διαδικασία που χαρακτηρίζεται από μέσα προς τα έξω σηματοδότηση. Έχει βρεθεί πως κάποιοι υποδοχείς μπορούν και ενεργοποιούν τις ιντεγκρίνες ενδοκυτταρικά με το να φωσφορυλιώνουν την κυτταροπλασματική περιοχή των β υπομονάδων τους. Απαραίτητη είναι η αλληλεπίδραση των κυτταροπλασματικών περιοχών ανάμεσα στην υπομονάδα α και β προκειμένου η ιντεγκρίνη να βρίσκεται σε ανενεργή κατάσταση. Λαμβάνει χώρα βέβαια και η αντίθετη διαδικασία η οποία χαρακτηρίζεται ως από έξω προς τα μέσα σηματοδότηση, όπου οι ιντεγκρίνες με τη δέσμευση διαφόρων εξωκυτταρικών προσδετών συσσωματώνονται στην κυτταρική μεμβράνη και στέλνουν σήματα στο εσωτερικό του κυττάρου. Στο κυτταροπλασματικό τμήμα των ιντεγκρινών, προσδένονται και άλλες πρωτεΐνες, όπως η ταλίνη, η βινκουλίνη, η εζρίνη, η ραντιξίνη και η μοεζίνη, οι οποίες προσδένονται επίσης και στην ακτίνη και ενώνουν τις ιντεγκρίνες με τον κυτταροσκελετό, δημιουργώντας έτσι μεγάλα πρωτεϊνικά συμπλέγματα (Hynes 2002). Η μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων ελέγχεται και τροποποείται από τις ιντεγκρίνες ενώ ρυθμίζουν την προσκόλλησή τους στην εξωκυττάρια ύλη. Η ενεργοποίηση των ιντεγκρινών θεωρείται απαραίτητη για την έναρξη και τη ρύθμιση της σηματοδότησης κατά την αγγειογένεση (Guo & Giancotti 2004) ενώ, επιτρέπει τη λειτουργική σύνδεση των εστιών προσκόλλησης με τον κυτταροσκελετό της ακτίνης (Giancotti 2000), ένα βήμα αρκετά σημαντικό για τον απτοτακτισμό των ενδοθηλιακών κυττάρων (Lamalice et al. 2007). Η α ν β 3 είναι μία από τις πιο καλά μελετημένες ιντεγκρίνες που έχει βρεθεί να υπερεκφράζεται κατά την αγγειογένεση και να διαδραματίζει βασικό ρόλο στη 23

33 Εισαγωγή ρύθμισή της. Κατά την εμβρυογένεση εκφράζεται σε διαφορετικά είδη κυττάρων ωστόσο, η έκφρασή της περιορίζεται σε αγγειογενετικά ενδοθηλιακά, λεία μυϊκά και μερικούς πληθυσμούς αιματοποιητικών κυττάρων στον ενήλικα. Οι μεταγραφικοί παράγοντες που είναι υπεύθυνοι για τη ρύθμισή της είναι οι Hox D3 (Boudreau et al. 1997) και Snail (Haraguchi et al. 2008). Η δράση της α ν β 3 σε in vivo πειραματικά μοντέλα δίνει αντιφατικά αποτελέσματα. Αναστολή της δράσης της με μικρά μόρια ή αντισώματα οδήγησε σε αναστολή της νεοαγγειογένεσης (Nemeth et al. 2003), ενώ μόνο αποσιώπηση του γονιδίου της β 3 οδήγησε σε αυξημένη καρκινογένεση και αγγειογένεση (Taverna et al. 2004), αυξημένη επούλωση πληγών (Reynolds et al. 2005), και αυξημένη φλεγμονή και αθηροσκλήρωση (Weng et al. 2003), κάτι που σίγουρα υποδεικνύει τη σημασία της α ν β 3 στο μηχανισμό αυτών των διαδικασιών. Η αυξημένη έκφραση της α ν β 3 σε αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα που πολλαπλασιάζονται, οδήγησε αρχικά στην υπόθεση ότι εμπλέκεται στην παθολογική αγγειογένεση (Brooks et al. 1994) (Drake et al. 1995). Η αναστολή της έκφρασης της υπομονάδας α ν δεν φαίνεται να επηρεάζει την αγγειογένεση κατά την ανάπτυξη (Bader et al. 1998). Ενώ παρόμοιο μοτίβο παρατηρείται και σε επίμυες που δεν εκφράζουν την υπομονάδα β 3 οι οποίοι εμφανίζουν φυσιολογικό αγγειακό δίκτυο, χωρίς να επηρεάζεται η αγγειογένεση κατά την ανάπτυξη (Huang et al. 2000) (Reynolds et al. 2002). Υπάρχουν ωστόσο και δεδομένα που δείχνουν ότι επάγεται η παθολογική αγγειογένεση σε επίμυες που δεν εκφράζουν την υπομονάδα β 3 (Reynolds et al. 2002) (Taverna et al. 2005). Και τα δύο αυτά αντιφατικά αποτελέσματα καταδεικνύουν την αναγκαιότητα ρύθμισης της αγγειογένεσης από τη β 3 υπομονάδα. Για να διερευνηθεί σε μεγαλύτερη λεπτομέρεια η σημασία και ο ρόλος της υπομονάδας β 3 χρησιμοποιήθηκαν επίμυες οι οποίοι εξέφραζαν τη μεταλλαγμένη β 3, καθώς οι τυροσίνες στις θέσεις 747 και 759 (αντίστοιχες των 773 και 785 στον άνθρωπο) είχαν αντικατασταθεί από φαινυλαλανίνες και παρατήρησαν ότι αν και ήταν βιώσιμοι και γόνιμοι, παρουσίαζαν μειωμένη ανάπτυξη όγκων και παθολογική αγγειογένεση γεγονός που υποδηλώνει ότι οι τυροσίνες στις θέσεις 747 και 759 της ιντεγκρίνης β 3 είναι καθοριστικές για την επαγωγή της παθολογικής αγγειογένεσης μέσω της φωσφορυλίωσης τους (Mahabeleshwar et al. 2006). Η ιντεγκρίνη α ν β 3 μπορεί να έχει είτε θετικό είτε αρνητικό ρόλο κατά την αγγειογένεση με τη δράση της να καθορίζεται κάθε 24

34 Εισαγωγή φορά από τους προσδέτες της και το μικροπεριβάλλον (Hodivala-Dilke 2008). Ο σημαντικός ρόλος της ιντεγκρίνης α ν β 3 στην αγγειογένεση φαίνεται και από το γεγονός ότι δεσμεύεται σε αρκετούς αγγειογενετικούς παραγόντες, όπως στον VEGFR-2, στη βιτρονεκτίνη, στην ινονεκτίνη, στη θρομβίνη και στην PTN, καθώς και σε αρκετούς αντι-αγγειογενετικούς παράγοντες, όπως στη θρομβοσπονδίνη, στην αγγειοστατίνη και στην τουμστατίνη (Hodivala-Dilke et al. 2003) (Mikelis et al. 2009). Ο αντιφατικός ρόλος της α ν β 3 στην αγγειογένεση μπορεί να εξηγηθεί λαμβάνοντας υπόψιν ότι η έκφραση και η λειτουργικότητα μιας ιντεγκρίνης μπορεί να επηρεάσει άλλες ιντεγκρίνες (Díaz-González et al. 1996). Η ενεργοποίηση της υπομονάδας β 1 των ιντεγκρινών α 3 β 1 και α 6 β 1, αναστέλλει τη λειτουργικότητα της α ν β 3 στην προσκόλληση των κυττάρων (Gonzalez et al. 2008). Αν και αυτό δεν επιβεβαιώνεται στην περίπτωση ενδοθηλιακών κυττάρων όπου έχει ανασταλλεί η έκφραση της β 3. Ωστόσο, η αυξημένη παθολογική αγγειογένεση σε επίμυες που δεν εκφράζουν τη β 3 όπως ανέφερα προηγουμένως μπορεί να εξηγείται λόγω αυξημένης έκφρασης και λειτουργίας του VEGFR-2 (Robinson 2004) (Weis et al. 2007). Η αυξημένη έκφρασή των ιντεγκρινών συνδέεται συχνά με την ανάπτυξη όγκων και μεταστάσεων παρολ αυτά δε θεωρούνται ογκογόνα μόρια. Έχει βρεθεί πως η έκφραση της α ν β 3 συνδέεται με την ανάπτυξη του όγκου και τις μεταστάσεις, σε διάφορους τύπους καρκίνου όπως στα μελανώματα, στα γλοιοβλαστώματα, στον καρκίνο του προστάτη, του μαστού, του παγκρέατος, των ωοθηκών και του τραχήλου της μήτρας (Weis & Cheresh 2011). Επίσης η ιντεγκρίνη α ν β 3 φαίνεται να εμπλέκεται στη δημιουργία των υπερτροφικών ουλών, μια κατάσταση που σχετίζεται με την υπερβολική εναπόθεση κολλαγόνου, με το να επάγει την εκτεταμένη διαφοροποίηση των ινοβλαστών και τη σύνθεση του κολλαγόνου, καθώς έχει δειχθεί πως η έκφρασή της σε ιστούς από τέτοιου τύπου ουλές είναι αυξημένη σε σχέση με τους φυσιολογικούς, γεγονός που υποδηλώνει πως η στόχευσή της ίσως μπορέσει να αποτελέσει αποτελεσματική θεραπεία για την αντιμετώπιση αυτών των υπερτροφικών ουλών (X. Hu et al. 2014). Έχει βρεθεί ακόμα πως η α ν β 3 σχετίζεται με την αυξημένη παραγωγή Τ βοηθητικών κυττάρων και την επαγόμενη αύξηση των κυτοκινών IL2 και IL10 κατά τη διάρκεια της 25

35 Εισαγωγή εγκυμοσύνης σε ποντικούς, κάτι που αντιστρέφεται παρουσία ενός αναστολέα της (S. Wang et al. 2014). Δεδομένα που υπάρχουν δείχνουν την α ν β 3 να αλληλεπιδρά με τον PDGF και με τον VEGFR-2, ρυθμίζοντας τη δραστικότητά τους (Borges et al. 2000) (Somanath et al. 2009). Αν και η ενδοκυτταρική σηματοδότηση από τις ιντεγκρίνες είναι αρκετά περίπλοκη και δεν υπάρχουν πολλά δεδομένα που να την αποσαφηνίζουν, ένα μόριο που θεωρείται ότι παίζει σημαντικό ρόλο σε αυτή την επαγωγή σήματος είναι η FAK κινάση η οποία ενώνει όποιαδήποτε σηματοδότηση προέρχεται από τις ιντεγκρίνες, τους υποδοχείς του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (epidermal growth factor, EGF) και του PDGF (Sieg et al. 2000), ενώ η ίδια κινάση πιστεύεται πως χρησιμεύει ως σημείο σύγκλισης για τους VEGFR-2 και α ν β 3, ρυθμίζοντας φυσικά τη συγκρότηση των εστιών προσκόλλησης, απαραίτητο βήμα για τον πολυμερισμό της ακτίνης και τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Άλλωστε όπως αποδείχθηκε σε μελέτες, η ενεργοπoίηση του VEGFR-2 οδηγεί σε φωσφορυλίωση της FAK στη Ser732 και αλλαγή της στερεοδιαμόρφωσής της, καθιστώντας έτσι εύκολη τη φωσφορυλίωση της Tyr407 από την Pyk2, που με τη σειρά της αυτή ενεργοποιείται από τη β 3 υπομονάδα (Le Boeuf et al., 2006). Φαίνεται επίσης, ότι η c-src μπορεί να ρυθμίζει μονοπάτια μεταγωγής σήματος αυξητικών παραγόντων και μορίων εξωκυττάριας ύλης, επιστρατεύοντας την α 5 β 1 σε πρωτεϊνικά σύμπλοκα με τη FAK (Eliceiri et al, 2002). Πιο πρόσφατα αποτελέσματα του εργαστηρίου μας αποδεικνύουν ακόμα μία αλληλεπίδραση της α ν β 3 ιντεγκρίνης με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ όταν και οι δύο εκφράζονται στην κυτταρική μεμβράνη, η οποία βέβαια είναι απαραίτητη για την επαγόμενη από PTN μεταναστευτική ικανότητα ενδοθηλιακών και καρκινικών κυττάρων, καθώς όπως παρατήρησαν σε κύτταρα που έλειπε η α ν β 3 ιντεγκρίνη αναστελλόταν αυτή η επαγωγική δράση της PTN στη μετανάστευση σημαντικά, προτείνοντας τη δημιουργία ενός λειτουργικού συμπλόκου μεταξύ της ιντεγκρίνης α ν β 3 και του υποδοχέα RPTPβ/ζ στη μεμβράνη των κυττάρων (Mikelis et al. 2009). Ακόμα μια εργασία της ομάδας μας έδειξε την εμπλοκή της α ν β 3 στην επαγόμενη PTN παραγωγή ελευθέρων δραστικών ριζών οξυγόνου (ROS) και κατ επέκταση τη ρύθμιση της μετανάστευσης των ενδοθηλιακών κυττάρων, αφού όπως αποδείχθηκε όταν μπλοκαρίστηκε η αλληλεπίδραση της PTN με την α ν β 3 με τη βοήθεια ενός συνθετικού 26

36 Εισαγωγή πεπτιδίου, αναστάλθηκε η επαγόμενη από PTN παραγωγή ROS (Tsirmoula et al. 2015) Ν-Συνδεκάνη Η PTN έχει βρεθεί ότι προσδένεται στις συνδεκάνες 1 και 3 (Raulo et al. 1994). Η συνδεκάνη-3 ή Ν-συνδεκάνη, είναι μια πρωτεΐνη της κυτταρικής επιφάνειας μοριακής μάζας 200 kda και αποτελείται από έναν πρωτεϊνικό κορμό 442 αμινοξέων, στον οποίο προσδένονται αλυσίδες θειϊκής ηπαράνης (Raulo et al. 1994) ενώ παρουσιάζει υψηλή ομολογία σε άνθρωπο, επίμυ και αρουραίο (Berndt et al, 2001). Η έκφραση τόσο της ΡΤΝ όσο και της Ν- συνδεκάνης συμπίπτει χρονικά κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου, ενώ επίσης έχει βρεθεί ότι συνεντοπίζονται σε συγκεκριμένα σημεία στον εγκέφαλο του αρουραίου (Nolo et al. 1995). H PTN προσδένεται στη N-συνδεκάνη στους οστεοβλάστες και στα πρόδρομα οστικά κύτταρα (Imai et al. 1998) (Tare et al. 2002). Η ΡΤΝ, σε συνδυασμό με την Ν-συνδεκάνη και τον RPTPβ/ζ, φαίνεται να ρυθμίζει τη νευροπροστατευτική δράση του κυκλικού AMP (c-amp) στους ντοπαμινεργικούς νευρώνες (Mourlevat et al. 2005). Η Ν- συνδεκάνη έχει βρεθεί ότι αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα EGF (EGFR, endothelial growth factor receptor) και ρυθμίζει τη μετανάστευση των νευρικών κυττάρων (Hienola et al. 2006). Πρόσφατα δεδομένα αποδεικνύουν ότι η ΡΤΝ και η Ν-συνδεκάνη συνεκφράζονται σε κύτταρα καρκίνου του παγκρέατος (Yao et al. 2009). Ενώ αυτός ο συνεντοπισμός όπως φαίνεται από πρόσφατα δεδομένα σχετίζεται με την εξέλιξη της νόσου αλλά και με την περινευρική διείσδυση των καρκινικών παγκρεατικών κυττάρων ένα κρίσιμο βήμα για την υποτροπή της νόσου (Yao 2013). H αλληλεπίδραση της ΡΤΝ με την Ν-συνδεκάνη οδηγεί στην ενεργοποίηση της c-src και της Fyn και την επακόλουθη αλληλεπίδραση αυτών με την κορτακτίνη και την τουμπουλίνη η οποία τελικά οδηγεί στην αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, στην προέκταση των νευριτών (Imai et al. 1998) και στη μετανάστευση των οστεοβλαστών (Kinnunen et al. 1998). Τέλος, λοιπόν υπάρχουν μελέτες που αποδίδουν στη Ν-συνδεκάνη ένα πολύ σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της αγγειογένεσης με το να διαμορφώνει τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων και προτείνοντας την έτσι, ως ένα 27

37 Εισαγωγή κατάλληλο θεραπευτικό στόχο για αντι-αγγειογενετικές θεραπείες (De Rossi & Whiteford 2013) Κινάση αναπλαστικού λεμφώματος (ALK) Ένας άλλος χαρακτηρισμένος υποδοχέας της PTN με δράση κινάσης τυροσίνης είναι ο ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase, ALK). Πρόκειται για μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη με μοριακό βάρος 220 kda που ανήκει στην υπεροικογένεια των υποδοχέων ινσουλίνης. O ALK ανακαλύφθηκε αρχικά ως τμήμα μιας πρωτεΐνης σύντηξης με δράση κινάσης τυροσίνης, της νουκλεοφοσμίνης (nucleophosmin, NPM-ALK), η οποία σχετίζεται με το αναπλαστικό λέμφωμα των μεγακαρυοκυττάρων (Morris et al. 1994). Έχουν βρεθεί δύο ισομορφές του ALK, με μοριακές μάζες 220 και 140 kda (Moog- Lutz et al. 2005) (Iwahara et al. 1997) (Morris et al. 1997). Η 140 kda ισομορφή προέρχεται από αποκοπή της 220 kda ισομορφής η οποία φτάνει σε τέτοιο βάρος εξαιτίας Ν-γλυκοζυλίωσης (Moog-Lutz et al. 2005). Η τελευταία έχει την τυπική δομή υποδοχέα με δράση κινάσης τυροσίνης και αποτελείται από μια μεγάλη εξωκυττάρια περιοχή, μια λιπόφιλη διαμεμβρανική περιοχή και ένα κυτταροπλασματικό τμήμα με δράση κινάσης τυροσίνης (Iwahara et al. 1997) (Morris et al. 1997). Το γονίδιο για τον ALK εκφράζεται στο νευρικό σύστημα (Pulford et al. 1997) σε καλλιέργειες ινοβλαστών, ενδοθηλιακών κυττάρων, καθώς επίσης και σε καρκινικές κυτταρικές σειρές παγκρέατος και μαστού (Stoica et al. 2001) (Stoica et al. 2002) (Perez-Pinera, Zhang, et al. 2007), μελανώματος (Dirks et al. 2002), νευροβλαστώματος (Lamant et al. 2000), γλοιοβλαστώματος (Powers et al. 2002) και σε non-hodgkin λεμφώματα (Delsol et al. 1997). Η PTN έχει βρεθεί να προσδένεται στην εξωκυτταρική περιοχή του ALK σε διάφορους τύπους κυττάρων (Stoica et al. 2002) με μεγάλη συγγένεια, ενώ αντισώματα έναντι του συγκεκριμένου τμήματος του υποδοχέα ή για την PΤΝ παρεμποδίζουν την πρόσδεση και τη μεταγωγή σήματος (Stoica et al. 2001) (Powers et al. 2002). Μία πιθανή εκδοχή είναι η διαφορετική ενεργοποίηση του ALK από τις δύο φυσικές ισομορφές της PTN (Lu et al. 2005) ή η έμμεση ενεργοποίηση του ALK από τη PTN, μέσω της PTN-επαγόμενης απενεργοποίησης του 28

38 Εισαγωγή υποδοχέα της RPTPβ/ζ (Perez-Pinera et al. 2007). Υπάρχουν δεδομένα σύμφωνα με τα οποία μια κατάλληλη θεραπευτική προσέγγιση του γλοιοβλαστώματος είναι η διπλή στόχευση του συμπλόκου ALK/PTN για ενίσχυση της αντιαγγειογενετικής δράσης του σε σχέση με απλή knockdown προσέγγιση (Grzelinski et al. 2009). Πρόσφατα προτάθηκε επίσης ότι η έκφραση τόσο του ALK όσο και της PTN, είναι απαραίτητη για την αυτοανανέωση και την ογκογονικότητα βλαστικών κυττάρων γλοιοβλαστώματος (Koyama-Nasu et al. 2014). Οι ALK πρωτεΐνες σύντηξης φαίνεται να ενεργοποιούν πολλά και διαφορετικά μονοπάτια όπως: των Ras / Raf / MEK / ERK1/2, των JAK / STAT (κινάση Janus / μεταγωγέας σημάτων και ενεργοποιητής της μεταγραφής), της PI3K (φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης 3- κινάση) / Akt (ΡΚΒ) και της PLC (φωσφολιπάση C), μονοπάτια που σχετίζονται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την κυτταρική επιβίωση (Chiarle et al. 2008) Νουκλεολίνη Η νουκλεολίνη (NCL) ή αλλιώς πρωτεΐνη C23 (Orrick et al. 1973) είναι μια πυρηνική πρωτεΐνη που εκφράζεται σε εκθετικά αυξανόμενα κύτταρα και εντοπίζεται κυρίως στις ινώδεις και κοκκιώδεις περιοχές των πυρηνίσκων (Lischwe et al. 1981) (Bugler et al. 1982) (Biggiogera et al. 1990). Ρυθμίζει το μεταβολισμό του DNA και του RNA, τη δομή της χρωματίνης, τη μεταγραφή του rdna, την ωρίμανση του rrna, την κυτταροκίνηση, τον πολλαπλασιασμό και την ανάπτυξη κυττάρων, την απόπτωση, καθώς και τη συναρμολόγηση, αναδίπλωση και ωρίμανση των ριβοσωμάτων (Srivastava & Pollard 1999). Είναι μια πολυλειτουργική φωσφοπρωτεΐνη, υψηλά συντηρημένη κατά την εξέλιξη (Srivastava & Pollard 1999) και αντιπροσωπεύει περίπου το 5% του συνόλου των πρωτεϊνών του πυρηνίσκου (Lapeyre et al. 1987). θεωρείται μία πρωτεΐνη μεταφορέας άλλων πρωτεϊνών μεταξύ πυρήνα/κυτταροπλάσματος καθώς επίσης και προσδέτης διαφόρων παραγόντων στην κυτταρική μεμβράνη. Η NCL υπερεκφράζεται σε πολλούς τύπους καρκινικών κυττάρων, (Mi et al. 2003) (Tate et al. 2006) (Christian et al. 2003) (Galzio et al. 2012). 29

39 Εισαγωγή Έχει φαινόμενη μοριακή μάζα 105 kda σε ανάλυση SDS-PAGE, ενώ η πραγματική υπολογισμένη μάζα της είναι 77 kda (Lapeyre et al. 1987) (Srivastava et al. 1989). Βρέθηκε πρόσφατα πως η NCL υφίσταται Ν- και O- γλυκοζυλίωση (Carpentier et al. 2005). Μελέτες μείωσης της έκφρασης της in vivo, έδειξαν τη σημαντική συμβολή της στη λειτουργία της RNA πολυμεράσης ως προς τη μεταγραφή της πυρηνικής χρωματίνης (Rickards et al. 2007). Η NCL αλληλεπιδρα με το RNA και ενεργεί ως μια πρωτεΐνη τσαπερόνη που παρεμποδίζει την κακή αναδίπλωσή rrnas εν τη γενέσει (Allain et al. 2000). Είναι σταθερή σε ενεργά διαιρούμενα κύτταρα σε σχέση με κύτταρα σε ηρεμία. Ο Tawfic και οι συνεργάτες του (1994) παρατήρησαν πως η φωσφορυλίωση και η αποικοδόμηση της NCL συμβαδίζουν, γεγονός που υποδηλώνει ότι η σταθερότητά της εξαρτάται επίσης και από τα επίπεδα φωσφορυλίωσής της. Η NCL είναι εξαιρετικά φωσφορυλιωμένη και η φωσφορυλίωσή της ρυθμίζεται κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου (Schneider & Issinger 1988)(Peter et al. 1990). Ο κυτταροπλασματικός εντοπισμός της NCL συνάδει με τη φωσφορυλίωσή της ενώ η πυρηνική της μετατόπιση συνάδει με την αποφωσφορυλίωσή της. Πρόσφατα, της αποδόθηκε ο χαρακτηρισμός της γλυκοπρωτεΐνης και αφορά στη NCL που εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα και στην κυτταρική μεμβράνη. Η κύρια λειτουργία της NCL είναι η σύνθεση rrna και η βιογένεση ριβοσωμάτων, ωστόσο εμπλέκεται και σε άλλες βιολογικές διεργασίες, όπως στην απόπτωση, στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και της μεταγραφής, σε ιογενείς λοιμώξεις, σε αυτοάνοσα νοσήματα και στην παθολογία νευροεκφυλιστικών ασθενειών (Koutsioumpa & Papadimitriou 2014). Έχει βρεθεί πως η υπερέκφραση της NCL ανέστειλε την επαγόμενη από οξειδωτικό στρες απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων και οδήγησε σε μείωση της έκφρασης του αποπτωτικού γονιδίου Bax, γεγονός που την καθιστά σημαντικό αρνητικό ρυθμιστή της απόπτωσης (Zhang et al. 2010). Η έκφρασή της επάγεται στα μέσα και στα τέλη της φάσης G1, καταδεικνύοντας την αναγκαιότητα της NCL για την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Άλλες αναφορές συσχετίζουν τη NCL με τη ρύθμιση της μεταγραφής διαφόρων παραγόντων. 30

40 Εισαγωγή Η NCL υπερεκφράζεται επί της μεμβράνης καρκινικών, καθώς και ενεργοποιημένων ενδοθηλιακών κυττάρων (Koutsioumpa & Papadimitriou 2014) και δρα ως μια πρωτεΐνη-μεταφορέας μεταξύ κυτταροπλάσματος και πυρήνα (Borer et al. 1989). Έχει αποδειχθεί πως ο λειτουργικός αποκλεισμός ή η μείωση της έκφρασής της μεμβρανικής NCL, αναστέλλουν τη μετανάστευση, το σχηματισμό αυλών (Destouches et al. 2008) (Koutsioumpa et al. 2012) και προκαλούν απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων (Fogal et al. 2009), καταδεικνύοντας έτσι πως η στόχευσή της στη μεμβράνη των καρκινικών κυττάρων, φαντάζει ένας αποτελεσματικός τρόπος για να ανασταλεί η αγγειογένεση και η καρκινική ανάπτυξη (Destouches et al. 2008). Οι περισσότεροι προσδέτες της μεμβρανικής NCL παίζουν κρίσιμο ρόλο στην αγγειογένεση και στην ογκογένεση. Η NCL λειτουργεί ως υποδοχέα χαμηλής συγγένειας για την ΡΤΝ. H ΡΤΝ δεσμεύεται στη NCL απουσία ηπαρίνης και κατά παρόμοιο τρόπο με τη MK (Said et al. 2005). Η NCL εμπλέκεται στις βιολογικές δράσεις της PTN όπως προκύπτει από την αναστολή του επαγόμενου από PTN σχηματισμού διακλαδωμένων δομών σε υπόστρωμα κολλαγόνου, καθώς και η μειωμένη διείσδυση ενδοθηλιακών κυττάρων σε matrigel που περιείχε ΡΤΝ και είχε ενεθεί υποδόρια σε επίμυες, έπειτα από επίδραση αναστολέων της NCL (Destouches et al. 2008). Αναφορές δείχνουν πως η PTN που στερείται τα 26 τελευταία αμινοξέα του καρβοξυτελικού άκρου, αναστέλλει σημαντικά τη μιτογόνο δράση ολόκληρου του μορίου στην in vitro και in vivo ανάπτυξη κυττάρων καρκίνου του προστάτη, μέσω έμμεσης ή άμεσης πρόσδεσης και άρα ανταγωνισμού με τους υποδοχείς της PTN, μεταξύ των οποίων πιθανώς και η NCL (Hamma-Kourbali et al. 2011). Η αλληλεπίδρασή της με διάφορους προσδέτες στην κυτταρική επιφάνεια οδηγεί στην άμεση ή έμμεση συμμετοχή της στη μεταγωγή σημάτων. Πολλές μελέτες επισημαίνουν τον πιθανό ρόλο της NCL ως στόχο για τη θεραπεία του καρκίνου. Σε αυτή την κατεύθυνση έχει αναπτυχθεί το ψευδoπεπτίδιο HB-19 το οποίο αναστέλλει τη λειτουργία της NCL ως υποδοχέας χαμηλής συγγένειας διαφόρων προσδετών (Said et al. 2005), αφού οδηγεί τη μεμβρανική NCL προς αποικοδόμηση. Επίσης, το πλέον αποτελεσματικό ψευδοπεπτίδιο Nucant (N6L), ανέστειλε την in vitro προσκόλληση, τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων, χωρίς να επηρεάσει την απόπτωση τους, μέσω αδρανοποίησης των κινασών c-src, 31

41 Εισαγωγή ERK1/2, ΑΚΤ και FAK (Birmpas et al. 2012). Τα αποτελέσματα αυτά τονίζουν την ισχυρή αντιαγγειογενετική δράση των πεπτιδίων στόχευσης της μεμβρανικής NCL και επιβεβαιώνουν τη λειτουργία της τελευταίας στην ανάπτυξη των αγγείων (Fogal et al. 2009). Ενώ τέλος, από πρόσφατα δεδομένα της ερευνητικής μας ομάδας, φαίνεται πως η έκφραση της α ν β 3 στην κυτταρική επιφάνεια και η φωσφορυλίωση της στην τυροσίνη στη θέση 773 καθορίζει τον επαγόμενο από την PTN- ή τον VEGF165- εντοπισμό της NCL στην κυτταρική μεμβράνη μέσω του μονοπατιού RPTPβ/ζ / c-src / PI3K και το οποίο τελικά οδηγεί στην κυτταρική μετανάστευση (Koutsioumpa et al. 2013) (Koutsioumpa et al. 2015). 2. ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ 2.1. Γενική θεώρηση Ο ακριβής ορισμός της αγγειογένεσης είναι η δημιουργία αιμοφόρων αγγείων από ήδη υπάρχοντα (Folkman et al., 1990). Η αγγειογένεση είναι μια πολύ βασική διαδικασία τόσο για την ανάπτυξη, όσο και για τη σωστά δομημένη φυσιολογία του ενήλικου οργανισμού μέσω της δημιουργίας ενός κλειστού κυκλοφορικού συστήματος για την παροχή οξυγόνου και θρεπτικών συστατικών στους διαφόρους ιστούς (Cameliet, 2004). Το αγγειακό σύστημα αναπτύσσεται αμέσως μετά τη διαδικασία της γαστριδίωσης. Ο σχηματισμός του εμβρυϊκού αγγειακού συστήματος ξεκίνησε από προγονικά κύτταρα, τους αιμαγγειοβλάστες οι οποίοι διαφοροποιούνται είτε σε αιμοποιητικά είτε σε ενδοθηλιακά κύτταρα (M. Luisa Iruela-Arispe, 2005) και με αυτή τη διαφοροποίηση δημιουργούνται τα πρώτα αγγεία, μια διαδικασία που ονομάζεται νεοαγγειογένεση (Carmeliet, 2003) (Εικόνα Ε2). Στη συνέχεια παράγονται νέα αγγεία με εκβλάστηση ή μη από τα ήδη υπάρχοντα και ύστερα από κατάλληλες διαδικάσιες αναδιαμόρφωσης συνδέονται και τελικά δημιουργούν ένα λειτουργικό αγγειακό δικτύο στους ενήλικες (M. Luisa Iruela- Arispe, 2005) (Risau, 1997). 32

42 Εισαγωγή Τα αγγεία φαίνεται να διαδραματίζουν πολύ σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των οργάνων στο έμβρυο και στην επούλωση των τραυματισμένων ιστών στον ενήλικα (Carmeliet, 2005). Τα αιμοφόρα αγγεία μεταφέρουν οξυγόνο, θρεπτικά συστατικά και όλα εκείνα τα σήματα που είναι υπεύθυνα για την διατήρηση των φυσιολογικών λειτουργιών των ιστών αλλά και των οργάνων. Τα μεγάλα αγγεία εκτός των ενδοθηλιακών κυττάρων που φέρουν σταθεροποιούνται και πλαισιώνονται από περικύτταρα και λεία μυικά κύτταρα (υποστηρικτικά κύτταρα) ενώ τα μικρά αγγεία αποτελούνται μόνο από ενδοθηλιακά κύτταρα (Carmeliet, 2003). Οι τρεις παραπάνω τύποι κυττάρων εκφράζουν όλες τις απαραίτητες πρωτεΐνες και μόρια που στοχεύουν στην σωστή δημιουργία αυλών και διακλαδώσεων του αγγειακού δικτύου. Κατά τη διάρκεια της αγγειογένεσης απαιτείται συντονισμός στην αποικοδόμηση της εξωκυττάριας ύλης, στον πολλαπλασιασμό και στη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων, ουσιαστικά λαμβάνουν χώρα οι εξής διαδικασίες: η δημιουργία των αγγείων, η σταθεροποίησή τους, η επακόλουθη διακλάδωσή τους, η ανάπλαση αυτών, το κλάδεμα τους και η εξειδίκευση τους, διαδικασίες που επιτρέπουν τη δημιουργία των αγγείων να εξελίσσεται συγχρόνως με την ωρίμανση τους (Carmeliet 2005) Τα μόρια που εμπλέκονται στη διαδικασία της αγγειογένεσης και αφορούν στη δημιουργία και ωρίμανση των αγγείων τόσο κατά την εμβρυική ανάπτυξη, όσο και κατά την ενήλικη ζωή, έχουν καθοριστικό ρόλο στην επιβίωση των οργανισμών καθώς από πειράματα με knock out ποντίκια που έχουν γίνει για αυτά τα μόρια δε δίνουν βιώσιμους πληθυσμούς. Κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης η αγγειογένεση συμμετέχει στη διαφοροποίηση και στην ανάπτυξη νέων οργάνων αλλά και στην επούλωση πληγών και στην αναπαραγωγική διαδικασία κατά την ενήλικη ζωή (Folkman, 1990). Την ωρίμανση των αγγείων επηρεάζουν διάφορες αλλαγές στο μικρο-περιβάλλον τους όπως η παρουσία υποξίας, οι χαμηλές τιμές ph καθώς και το μηχανικό στρες, ερεθίσματα στα οποία ανταποκρίνονται τα ενδοθηλιακά κύτταρα με το να πολλαπλασιάζονται άμεσα. Στις καταστάσεις αυτές, όπου διαταράσσεται η φυσιολογική ισορροπία ανάμεσα στους παράγοντες που σχετίζονται με την επαγωγή (αγγειογενετικοί) ή μη (αντιαγγειογενετικοί) της αγγειογένεσης παρατηρείται είτε ανεπαρκής ανάπτυξη αγγείων είτε παθολογικά αυξημένη 33

43 Εισαγωγή αγγειογένεση που σχετίζονται με μία πληθώρα ασθενειών, όπως ο καρκίνος, η ψωρίαση, η αρθρίτιδα και η τύφλωση (Carmeliet, 2005). Η αγγειογένεση είναι καθοριστική για την ανάπτυξη των όγκων καθώς για να διατηρηθούν «ζωντανοί» χρειάζονται οξυγόνο και θρεπτικά συστατικά. Άλλωστε χωρίς αιματική παροχή οι διαστάσεις ενός όγκου δεν ξεπερνούν τα 2-3 mm 3 εξαιτίας της υποξίας που αναπτύσσεται και οδηγεί σε θάνατο τα καρκινικά κύτταρα (Folkman 1990). Στα καρκινικά κύτταρα επομένως, ενεργοποιούνται κάποιοι μηχανισμοί οι οποίοι με τη σειρά τους επάγουν την αγγειογένεση, υφίστανται δηλαδή μια μεταβολή που καλείται αγγειογενετική μετατροπή (angiogenic switch). Σε αυτή την κατάσταση τα κύτταρα χάνουν την ισορροπία τους και αρχίζουν να συνθέτουν μεγάλες ποσότητες αγγειογενετικών μορίων και μικρότερες αντιαγγειογενετικών με αποτέλεσμα τα αγγεία να χάνουν την οργάνωση τους και το φυσιολογικό αγγειακό τους δίκτυο. Η διάμετρος των αγγείων είναι ανομοιογενής, ενώ τα κύτταρα είτε τα ενδοθηλιακά είτε τα περικύτταρα δεν εκφράζουν όλους τους κοινούς δείκτες και δε δρουν φυσιολογικά (Morikawa et al. 2002) Παράγοντες που επηρεάζουν την αγγειογένεση Η νεοαγγειογένεση και η αγγειογένεση ρυθμίζονται από αυξητικούς παράγοντες οι οποίοι είτε επάγουν είτε αναστέλλουν την αγγειογένεση και βρίσκονται σε μια διαρκή ισορροπία. Οι αυξητικοί αυτοί παράγοντες αφού δεσμευθούν στους αντίστοιχους υποδοχείς τους ενεργοποιούν μια σειρά κυτταρικών διεργασιών με στόχο τον πολλαπλασιασμό, την κινητικότητα και τη διαφοροποίηση (Gerwins et al. 2000). Ένας μεγάλος αριθμός διαφορετικών υποδοχέων αυξητικών παραγόντων εκφράζονται στα ενδοθηλιακά κύτταρα (Beck & D Amore 1997) και πολλοί από τους προσδέτες τους επάγουν την αγγειογένεση in vivo. Σε ορισμένες περιπτώσεις, οι αυξητικοί παράγοντες μπορεί να επάγουν την αγγειογένεση έμμεσα καθώς ρυθμίζουν την έκφραση άλλων παραγόντων όπως ο FGF και ο VEGF οι οποίοι είτε δρούν ανεξάρτητα είτε συνεργιστικά στην επαγωγή της αγγειογένεσης. 34

44 Εισαγωγή Εικόνα Ε2: Σχηματική αναπαράσταση της νεοαγγειογένεσης, του πρώιμου αγγειακού δικτύου και της αγγειογένεσης, δηλαδή του σχηματισμού νέων αγγείων από προϋπάρχοντα. Στη νεοαγγειογένεση αρχέγονα αγγειοβλαστικά κύτταρα που βρίσκονται στα πρώιμα όργανα τα οποία χαρακτηρίζονται ως νησίδες αίματος, αναπτύσσονται σε αιμοποιητικά και ενδοθηλιακά κύτταρα. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα θα σχηματίσουν το πρώιμο αγγειακό πλέγμα, το οποίο αναπτύσσεται και διαφοροποιείται περαιτέρω προκειμένου να σχηματίσει το ώριμο αγγειακό σύστημα. Η αγγειογένεση μπορεί να διαιρεθεί σε μία σειρά από διακριτές διαδικασίες (πρωτεόλυση, μετανάστευση, πολλαπλασιασμός και διαφοροποίηση). (Gerwins et al. 2000) Η διαταραχή της ισορροπίας μεταξύ των επαγωγέων και των αναστολέων της αγγειογένεσης ορίζεται ως αγγειογενετικός διακόπτης και ενεργοποιείται από διάφορα σήματα και σε διάφορες καταστάσεις και είναι υπεύθυνος για την εμφάνιση κακοήθειας. Η επικράτηση των αναστολέων της αγγειογένεσης εμποδίζει την ανάπτυξη του όγκου, μια κατάσταση που έχει αναφερθεί ως λήθαργος του όγκου. Γέρνοντας τώρα τη ζυγαριά προς τους επαγωγείς της 35

45 Εισαγωγή αγγειογένεσης οδηγούμαστε σε αυξημένη αγγειογένεση και αύξηση του όγκου. Οι αγγειογενετικοί παράγοντες επάγουν άμεσα ή έμμεσα τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Ο κύριος ρυθμιστής της φυσιολογικής και της παθολογικής αγγειογένεσης είναι ο VEGF-A (Vascular Endothelial Factor-A). Ο VEGF-A είναι μέλος μιας οικογένειας γονιδίων που περιλαμβάνει τον PlGF (placental growth factor), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D και VEGF-E, και όλοι τους προσδένονται με διαφορετική ειδικότητα και συγγένεια στους υποδοχείς τυροσινικής κινάσης VEGFR-1,-2 και -3 (Ferrara et al. 2003). Ο VEGF-A προσδένεται στον VEGFR-2 στα ενδοθηλιακά κύτταρα των αιμοφόρων αγγείων και προάγει την αγγειογένεση, ενώ ο VEGF-C και D προσδένονται επιλεκτικά στο VEGFR-3 που εκφράζεται κυρίως στα ενδοθηλιακά κύτταρα των λεμφαγγείων και προάγουν την λεμφοαγγειογένεση (Maby-El Hajjami & Petrova 2008). Ύστερα από εναλλακτικό μάτισμα του mrna προκύπτουν πέντε κύριες ισομορφές του VEGF-A που δεσμεύονται με υψηλή συγγένεια στους υποδοχείς VEGFR-1 και -2, VEGF-A145, 165, 189 και 206 και έχουν υψηλή συγγένεια δέσμευσης με την ηπαρίνη και χρειάζονται ενζυματική απελευθέρωση από την κυτταρική επιφάνεια για να δράσουν ένω ο VEGF-A121 είναι ελεύθερα διάχυτος και δε χρειάζεται περαιτέρω ενεργοποίηση (Tischer et al. 1991). Ο FGF-1 και -2 (Fibroblast growth factor) και ο PDGF-B και C (Platelet derived growth factor) είναι επίσης σημαντικοί θετικοί ρυθμιστές της αγγειογένεσης επάγοντας τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων με την άμεση αλληλεπίδραση τους με τους υποδοχείς τους. Οι αγγειοποιητίνες επίσης συντελούν στην επαγωγή της αγγειογένεσης με το να συνεργάζονται με άλλους αγγειογενετικούς παράγοντες, ενεργοποιώντας έτσι τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Ένας ακόμα μεγάλος αριθμός πολυπεπτιδικών παραγόντων, ορμονών και μεταβολιτών ρυθμίζουν άμεσα ή εμμεσα την αγγειογένεση. Από την άλλη μεριά, ένα πλήθος ενδογενών αναστολέων της αγγειογένεσης έχει χαρακτηριστεί και μελετηθεί εκτενώς. Εδώ ανήκουν στοιχεία και πρωτεολυτικά θραύσματα της εξωκυττάριας μήτρας και της βασικής μεμβράνης, όπως η θρομβοσπονδίνη-1, μια μεγάλη γλυκοπρωτεΐνη της εξωκυττάριας μήτρας, η ενδοστατίνη, ένα πρωτεολυτικό παράγωγο του 36

46 Εισαγωγή κολλαγόνου XVIII, η ιντερφερόνη-α και β και η αγγειοστατίνη (Vanessa Baeriswyl 2008). Παρακάτω παρατίθενται πίνακες με τους ενδογενείς επαγωγείς και αναστολείς της αγγειογένεσης. Πίνακας Ε1: Ενδογενείς επαγωγείς της αγγειογένεσης (Liekens et al. 2001) Επαγωγέας Μηχανισμός δράσης σε ενδοθηλιακά κύτταρα Πολ/σμος Μετανάστευση Διαφοροποίηση Αυξητικοί παράγοντες με συγγένεια στην ηπαρίνη VEGF PIGF FGF-1, FGF PTN Ephrins HIV-tat PDGF HGF/SF Αυξητικοί παράγοντες χωρίς συγγένεια στην ηπαρίνη TGF-α TGF-β Inhibition - + EGF IGF-I Παράγοντες φλεγμονής TNF-α Inhibition - + IL-8 + +? IL Προσταγλαδίνη E 1, E Ένζυμα PD-ECGF/TP - +? COX Αγγειογενίνη Μεταλλοπρωτεϊνάσες (MMPs) Ορμόνες Οιστρογόνα Προλιφερίνη? +? 37

47 Εισαγωγή Ολιγοσακχαρίτες Τμήματα υαλουρονικού οξέος Παράγοντες αιμοποίησης Ερυθροποιητίνη + + G-CSF + +? GM-CSF + +? Μόρια κυτταρικής προσκόλλησης VCAM-1 - +? Ε-σελεκτίνη Ιντεγκρίνες VE-κατχερίνη - +? Άλλα μόρια NO Αγγειοποιητίνη Πίνακας Ε2: Ενδογενείς αναστολείς της αγγειογένεσης (Liekens et al. 2001) Αναστολέας Αγγειοστατίνη (πλασμινογόνου) Ενδοστατίνη (κολλαγόνο XVIII) aaat (αντιθρομβίνη III) Προλακτίνη (θραύσμα 16 kda) TSP-1 Τροπονίνη I IFN-α IFN-γ PEDF IP-10 Μηχανισμός δράσης σε ενδοθηλιακά κύτταρα Πρωτεϊνικά θραύσματα πολλαπλασιασμού και απόπτωσης EC πολλαπλασιασμού και απόπτωσης EC πολλαπλασιασμού και απόπτωσης EC Διαλυτοί ρυθμιστές πολλαπλασιασμού EC πολλαπλασιασμού και απόπτωσης EC πολλαπλασιασμού EC πολλαπλασιασμού και απόπτωσης EC, της επαγωγής της αγγειογένεσης από τον FGF-2 πολλαπλασιασμού EC και ΙΡ-10 μετανάστευσης EC και πολλαπλασιασμού που επάγεται από τον FGF-2 πολλαπλασιασμού EC, μετανάστευσης που επάγεται από τον FGF-2 και την IL-8 38

48 Εισαγωγή PF-4 IL-12 IL-4 VEGI TIMP-1, -2 PAI-1 Ρετινοϊκό οξύ Ang-2 2-μεθοξυοιστραδιόλη p53 VHL πολλαπλασιασμού EC, μετανάστευσης που επάγεται από τον FGF-2 και την IL-8 INF-γ και ΙΡ-10 μετανάστευσης EC πολλαπλασιασμού EC δραστικότητας των ΜΜΡs' δραστικότητας του upa μετανάστευσης EC, μεταγραφικός παράγοντας ωρίμανσης των αγγείων, ανταγωνιστής της Ang-1 πολλαπλασιασμού, μετανάστευσης και απόπτωσης EC Ογκοκατασταλτικά γονίδια σύνθεσης TSP-1, σύνθεσης VEGF σύνθεσης VEGF 2.3. Στάδια της αγγειογενετικής διαδικασίας Η αγγειογένεση μπορεί να προκύψει κυρίως μέσα από δύο διαδικασίες, της εκβλάστησης και του εγκολεασμού (διαχωρισμός των αγγείων και δημιουργία θυγατρικών) (Jain & Carmeliet 2012) (Εικόνα Ε3). Κατά τη διάρκεια της εκβλάστησης, τα ενδοθηλιακά κύτταρα ενός προϋπάρχοντος αγγείου ενεργοποιούνται από αγγειογενετικά ερεθίσματα, όπως ο αυξητικός παράγοντας των ενδοθηλιακών κυττάρων VEGF-Α που παρέχεται από γειτονικά κύτταρα και η έκφραση του επάγεται είτε εξαιτίας κάποιου τραυματισμού είτε λόγω ισχαιμίας (Senger & Davis 2011). Τα ενδοθηλιακά κύτταρα στη συνέχεια αρχίζουν να παράγουν πρωτεάσες που αποικοδομούν τη γύρω βασική μεμβράνη, επιτρέποντας τους έτσι να μεταναστεύσουν προς το σηματοδοτικό ερέθισμα. Στο στάδιο αυτό τα αγγεία γίνονται αδύναμα και διαπερατά από πρωτεΐνες του πλάσματος. Αυτή η αγγειακή υπερδιαπερατότητα προκαλεί διαρροή των πρωτεϊνών της εξωκυττάριας μήτρας από το αίμα (ινωδογόνο, ινονεκτίνη κ.ά.) (Senger & Davis 2011). Η εκβλάστηση αποτελείται από τα οδηγά ακραία ενδοθηλιακά 39

49 Εισαγωγή κύτταρα (tip cells) και τα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα υποβάθρου (stalk cells) (Gerhardt et al. 2003). Τα οδηγά κύτταρα έχουν πολλαπλασιαστικό φαινότυπο σχηματίζοντας μακριά φιλοπόδια τα οποία οδηγούν την εκβλάστηση προς το ερέθισμα ενώ τα κύτταρα υποβάθρου συνθέτουν τη βάση του ταχέως εκτεινόμενου τριχοειδούς. Αν και οι δύο τύποι κυττάρων αποκρίνονται στον VEGF, τα ακραία κύτταρα μεταναστεύουν και δεν πολλαπλασιάζονται, ενώ τα κύτταρα υποβάθρου κυρίως πολλαπλασιάζονται μετά την επίδραση του VEGF. Έπειτα το αγγειογενετικό εκβλάστημα αναστομώνεται με τα άλλα νεοσυντιθέμενα αγγεία και επιτρέπουν την κυκλοφορία. Καθώς προχωρά η αγγειακή μοφογένεση τα αγγεία σχηματίζουν ώριμους αυλούς. Η βασική μεμβράνη ανασυγκροτείται και τα περικύτταρα στρατολογούνται στα νέα αγγεία. Τα περικύτταρα κοντά στους νεοσχηματιζόμενους αγγειακούς αυλούς ελέγχουν άμεσα τη συναρμολόγηση της βασικής μεμβράνης in vitro και in vivo (Stratman et al. 2009). Έτσι, η αγγειογένεση στους ενήλικες, ύστερα από ένα αγγειογενετικό ερέθισμα, πιστεύεται πως εξελίσσεται μέσα από τέσσερα βασικά στάδια: 1) αποικοδόμηση της βασικής μεμβράνης και ενεργοποίηση των ήρεμων ενδοθηλιακών κυττάρων 2) εκβλάστηση και πολλαπλασιασμός των ενδοθηλιακών κυττάρων στην προσωρινή εξωκυττάρια μήτρα 3) δημιουργία αυλών εντός της αγγειακής εκβλάστησης με αποτέλεσμα τη δημιουργία αγγειακών σωλήνων και 4) κάλυψη των αγγειακών σωλήνων με ώριμη αγγειακή βασική μεμβράνη σε συνεργασία με τα υποστηρικτικά περικύτταρα (Senger & Davis 2011). Ο άλλος τύπος της αγγειογένεσης, ο εγκολεασμός, περιγράφει τη διαδικασία όπου ένα προυπάρχον αγγείο διαιρείται σε δύο νέα αγγεία από το σχηματισμό τριχοειδών αξόνων ή από μηνύματα της εξωκυττάριας μήτρας. Πολύ λίγα είναι γνωστά σχετικά με τους μηχανισμούς που ρυθμίζουν αυτό τον τύπο της αγγειογένεσης, αναφορές όμως δείχνουν την συμμετοχή ινοβλαστών και περικυττάρων στο σχηματισμό αυτών των αξόνων (Burri et al. 2004). Μια σημαντική διαφορά αυτών των δύο μηχανισμών είναι ότι η εκβλάστηση 40

50 Εισαγωγή επιτρέπει την αγγειογένεση σε μη αγγειωμένους ιστούς, ενώ ο εγκολεασμός τη δημιουργία νέων αγγείων χωρίς να διακόπτεται η αιματική ροή. Εικόνα Ε3: Σχηματική αναπαράσταση της αγγειογένεσης με δύο διαφορετικούς μηχανισμούς: της εκβλάστησης και του εγκολεασμού (Mellberg 2008). Η ενεργοποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων, όπως προαναφέρθηκε, σχετίζεται με γεγονότα μέσω των οποίων ένα πλήρως διαφοροποιημένο κύτταρο, το οποίο δεν κινείται και δεν πολλαπλασιάζεται, αποκτά αγγειογενετικό φαινότυπο, δηλαδή την ικανότητα μετανάστευσης, διείσδυσης και πολλαπλασιασμού. Ο σημαντικότερος ρυθμιστής της ενεργοποίησης των ενδοθηλιακών κυττάρων φαίνεται να είναι ο VEGF που δρα ως αγγειογενετικός παράγοντας (Ferrara et al. 2003). Την ενεργοποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων ακολουθεί η αποικοδόμηση της εξωκυττάριας ύλης την οποία αναλαμβάνουν ένζυμα όπως οι πρωτεϊνάσες σερίνης (ενεργοποιητές του πλασμινογόνου και πλασμίνη) και οι μεταλλοπρωτεϊνάσες του στρώματος (matrix metalloproteinases, MMPs). Τα δύο αυτά ενζυμικά συστήματα αποικοδομούν συστατικά της εξωκυττάριας ύλης και απελευθερώνουν αυξητικούς παράγοντες, ενεργοποιούν άλλα ένζυμα ή/ και αποικοδομούν αυξητικούς παράγοντες οδηγώντας στην παραγωγή πρωτεολυτικών τμημάτων με διαφορετικές βιολογικές δράσεις. Η 41

51 Εισαγωγή αποικοδόμηση και η αναδιαμόρφωση της εξωκυττάριας ύλης είναι σημαντικός ρυθμιστικός μηχανισμός κατά τη διάρκεια της καρκινικής αγγειογένεσης και επιτρέπει στα ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα να μεταναστεύσουν και στα καρκινικά κύτταρα να διεισδύουν στους γύρω ιστούς (Kessenbrock et al. 2010). Η εξωκυττάρια ύλη συντίθεται από βιοχημικά και δομικά διαφορετικά συστατικά όπως πρωτεΐνες, πρωτεογλυκάνες και γλυκοπρωτεΐνες. Υπάρχουν δύο κύριες οικογένειες μεταλλοπρωτεϊνασών, οι δεσμευμένες στη μεμβράνη (MT-MMPs) και οι διαλυτές καθώς και οι ομάδες πρωτεϊνών ADAM (a disintegrin and metalloproteinase) και ADAMTS που επηρεάζουν την αναδιαμόρφωση της εξωκυττάριας ύλης. Η ενεργότητα των ενζυμικών συστημάτων που συμμετέχουν στην αποικοδόμηση της εξωκυττάριας ύλης ελέγχεται σε διάφορα επίπεδα μεταγραφικής ή μετα-μεταφραστικής ρύθμισης (Lu et al. 2011) ενώ τα επίπεδα έκφρασής τους είναι πολύ χαμηλά σχεδόν μη ανιχνεύσιμα στο ήρεμο ενδοθήλιο (Pepper 2001). Τα ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά και καρκινικά κύτταρα εκκρίνουν ένα μεγάλο αριθμό αυξητικών παραγόντων οι οποίοι μπορούν να επάξουν την έκφραση τέτοιων ενζύμων (Zucker et al. 1998). Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες και η πλασμίνη υπάρχουν ως πρόδρομα μόρια τα οποία είναι ενζυματικά ανενεργά μέχρι να μετατραπούν σε ώριμες πρωτεϊνάσες. Οι ενεργές μεταλλοπρωτεϊνάσες μπορούν να εξουδετερωθούν γρήγορα από ενδογενείς αναστολείς τους (TIMPs). Οι μεταλλοπρωτεϊνάσες στοχεύουν σε μια μεγάλη ποικιλία μορίων της εξωκυττάριας ύλης και εξωκυτταρικών πρωτεϊνών. Για παράδειγμα οι MMP-3 και -7 στοχεύουν πρωτεογκλυκάνες, την ινονεκτίνη και τη λαμινίνη ενώ η MMP-1 προτιμά κυρίως το κολλαγόνο ΙΙΙ. Οι κύριες μεταλλοπρωτεϊνάσες που εμπλέκονται στην καρκινική αγγειογένεση είναι η MMP-2, -9 και -14 και λιγότερο η -1 και η -7 (Page-McCaw et al. 2007). Οι ADAMTS από την άλλη μεριά είναι κυρίως υπεύθυνες για την αποικοδόμηση των πρωτεογλυκανών. Η MT1-MMP είναι ένα μόριο κλειδί στην καρκινική αγγειογένεση και η έκφρασή του φαίνεται να υπερυθμίζεται στα ακραία ενδοθηλιακά κύτταρα (tip cells) σε αναλύσεις πρωτεομικής (Koziol et al. 2012). Οι ADAMS -1, -9 και -16 είναι υπερεκφρασμένες στα ενδοθηλιακά ακραία κύτταρα (tip cells) και έτσι μπορούν να συμμετάσχουν στην αποικοδόμηση της εξωκυττάριας ύλης και να διευκολύνουν την ανάπτυξη του αγγείου προς την σωστή κατεύθυνση (Toro et al. 2010). Τέλος στο σύστημα ενεργοποιητών πλασμινογόνου/ πλασμίνης 42

52 Εισαγωγή (PA) περιλαμβάνονται δύο τύποι ενεργοποιητών, ο τύπος της ουροκινάσης (upa) και ο ιστικός τύπος (tpa). Ο upa σχετίζεται κυρίως με τη βιολογία των όγκων, ενώ ο tpa με την παραγωγή πλασμίνης για τη λύση ινώδους στα αγγεία. Ο ρόλος τους είναι η αποικοδόμηση των υποδοχέων προσκόλλησης και των αντίστοιχων προσδεμάτων τους στην εξωκυττάρια ύλη, μέσω παραγωγής της πλασμίνης (Pepper 2001). Η μετατροπή στη συνέχεια των ενδοθηλιακών εκβλαστήσεων σε λειτουργικά ώριμα αγγεία απαιτεί αρκετά βήματα. Για παράδειγμα η προέκταση των εκβλαστήσεων μπορεί να περιλαμβάνει τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων πίσω από τα ακραία κύτταρα ή εναλλακτικά ο τοπικός πολλαπλασιασμός των ενδοθηλιακών κυττάρων μπορεί να προάγει την προέκταση των εκβλαστήσεων. Για να δημιουργηθούν τώρα νέες αγγειακές συνδέσεις, τα ακραία κύτταρα πρέπει να καταστείλουν την κινητική και διερευνητική συμπεριφορά τους μόλις εντοπίσουν τους στόχους τους, τα ακραία κύτταρα των άλλων εκβλαστήσεων ή των ήδη υπάρχοντων αγγείων και να αναπτύξουν ισχυρές αλληλεπιδράσεις προσκόλλησης και διακυτταρικής επικοινωνίας στο σημείο της σύνδεσης. Η δημιουργία αυλών και η ροή αίματος συμμετέχουν στην περαιτέρω σταθεροποίηση του νέου αγγείου. Η επιστράτευση των περικυττάρων, η προσκόλληση των μορίων της εξωκυττάριας ύλης στη βασική μεμβράνη και η μείωση του πολλαπλασιασμού των ενδοθηλιακών κυττάρων επάγουν επίσης την ωρίμανση του αγγείου. Ακόμα και σε αυτό το στάδιο της αγγειογενετικής διαδικασίας η ισορροπία ανάμεσα στους προ- και αντι-αγγειογενετικούς παράγοντες διαδραματίζει σημαντικό ρόλο για τη διατήρηση του νέου αγγείου (Adams & Alitalo 2007). Η μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων είναι μια διαδικασία αγγειογενετική που ελέγχεται από χημειοτακτικά και άλλα ερεθίσματα, ενώ περιλαμβάνει την αποικοδόμηση της εξωκυττάριας όπως περιγράφηκε νωρίτερα, και απαιτεί την ενεργοποίηση διαφόρων σηματοδοτικών μονοπατιών που οδηγούν στην αναδιαμόρφωση του κυτταροσκελετού. Η αναδιαμόρφωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης οδηγεί σε δομές που ονομάζονται φιλοπόδια, λαμελλιπόδια και ινίδια του στρες, τα οποία είναι απαραίτητα για την κυτταρική μετανάστευση. Η μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων περιλαμβάνει τρεις μηχανισμούς: α) το 43

53 Εισαγωγή χημειοτακτισμό, που ορίζεται ως η κατευθυνόμενη μετανάστευση κατά μήκος διαβάθμισης της συγκέντρωσης ενός διαλυτού παράγοντα, β) τον αποτακτισμό, που ορίζεται ως η κατευθυνόμενη μετανάστευση κατά μήκος διαβάθμισης καθηλωμένου προσδέτη και γ) το μηχανοτακτισμό, που ορίζεται ως η κατευθυνόμενη μετανάστευση που επάγεται από μηχανικά ερεθίσματα (Li et al. 2005) Καρκινική αγγειογένεση Η ανάπτυξη του όγκου και η ικανότητα μετάστασης εξαρτώνται από την αγγειογένεση και τη λεμφοαγγειογένεση που ενεργοποιούνται από χημικά ερεθίσματα από τα καρκινικά κύτταρα σε μια φάση ραγδαίας άυξησης (Folkman 1971). Τα καρκινικά κύτταρα χωρίς αιματική ροή μεγαλώνουν εώς 1-2 mm 3 σε διάμετρο και μετά σταματούν, ενώ μεγαλώνουν πάνω από 2 mm 3 όταν τοποθετούνται σε περιοχή πλούσια σε αγγειογένεση. Απουσία αγγειακής υποστήριξης, οι όγκοι μπορεί να γίνουν νεκρωτικοί ή αποπτωτικοί, για αυτό το λόγο η αγγειογένεση είναι ένας σημαντικός παράγοντας στην πρόοδο του καρκίνου (Holmgren et al. 1995). Η αγγειογένεση διεγείρεται όταν ο καρκινικός ιστός χρειάζεται θρεπτικές ουσίες και οξυγόνο για την επιβίωση του και την ανάπτυξη του αλλά και για να καταφέρει να σχηματίσει μια διαδρομή για την έξοδο καρκινικών κυττάρων από αυτόν (Nishida et al. 2006). Άρα, με την αναστολή της αγγειογεντικής διαδιακασίας αναστέλλεται η ανάπτυξη των όγκων και των μεταστάσεων. Η αγγειογένεση ρυθμίζεται τόσο από μόρια ενεργοποιητές, όσο και από μόρια αναστολείς. Η μεταβολή στον αγγειογενετικό φαινότυπο περιλαμβάνει μια αλλαγή στην τοπική ισορροπία μεταξύ θετικών και αρνητικών ρυθμιστών της αγγειογένεσης. Αυτή η σηματοδότηση ενεργοποιεί συγκεκριμένα γονίδια στον ιστό ξενιστή που παράγουν πρωτεΐνες οι οποίες βοηθούν στην ανάπτυξη των αιμοφόρων αγγείων (Semenza 2002). Τα καρκινικά κύτταρα χρειάζονται πρόσβαση στα αγγεία για αύξηση και μετάσταση άρα η ανακάλυψη αναστολέων της αγγειογένεσης παρέχει ελπίδα για μείωση της θνησιμότητας και νοσηρότητας από διάφορους κακοήθεις όγκους. Η αντιαγγειογενετική θεραπεία περιλαμβάνει φαρμακολογικούς αναστολείς που στοχεύουν απευθείας σε μόρια που εμπλέκονται με την αγγειογένεση και παράγοντες που μπορεί 44

54 Εισαγωγή έμμεσα να επηρεάζουν το αγγειακό δίκτυο του όγκου με το να ρυθμίζουν την παραγωγή προ-αγγειογενετικών παραγόντων από τα καρκινικά κύτταρα (Goel et al. 2012). Οι τρεις μηχανισμοί αναστολέων της καρκινικής αγγειογένεσης που έχουν εγκριθεί είναι : α) η αναστολή της παραγωγής αυξητικών παραγόντων, όπως του VEGF (γεφιτινίμπη), β) η δέσμευση σε αυξητικούς παράγοντες που οδηγεί σε παρεμπόδιση της αλληλεπίδρασής τους με τους ειδικούς κυτταρικούς υποδοχείς τους (μπεβασιζουμάβη) και γ) η αδρανοποίηση υποδοχέων αυξητικών παραγόντων (σουνιτινίμπη). 3. Κυκλινο-εξαρτώμενες κινάσες (Cyclin-dependent kinases, CDKs) 3.1. Γενική θεώρηση και αναστολείς των CDKs Για την ακριβή και επιτυχημένη περάτωση της κυτταρικής διαίρεσης και την σωστή διαδοχή των φάσεών της, φροντίζουν οι μηχανισμοί ελέγχου (κυκλίνες και τα σημεία ελέγχου), οι οποίοι είναι αυτοί που επιτρέπουν τη μετάβαση από τη μία φάση στην άλλη, υπό συγκεκριμένες προϋποθέσεις (Hartwell & Weinert 1989). Οι κυκλινο-εξαρτώμενες κινάσες είναι βασικοί ρυθμιστές της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου. Είναι κινάσες σερίνης-θρεονίνης και η ενεργότητά τους εξαρτάται από τη σύνδεσή τους με τις ρυθμιστικές υπομονάδες, τις κυκλίνες και συγκεκριμένους αναστολείς, την κατάσταση φωσφορυλίωσής τους, καθώς και τη διαμεσολαβούμενη από την ουμπικουϊτίνη αποσύνθεσή τους (Gu et al. 1992) (Sherr CJ. 1996) (Brandeis & Hunt 1996) (Harper & Adams 2001). Λόγω της αλληλουχίας που φέρουν στην περιοχή της κινάσης τους, οι CDKs ανήκουν στην οικογένεια των πρωτεϊνικών κινασών CMGC (τα αρχικά προέρχονται από τα μέλη της οικογένειας), μαζί με τις κινάσες που ενεργοποιούνται από μιτογόνα (Mitogen-Activated Protein Kinases, MAPKs), τις κινάσες συνθετάσης του γλυκογόνου -3β (Glycogen-Synthase Kinases, Gsk3β), τις διπλής ειδικότητας κινάσες σερίνης (dual-specificity tyrosineregulated kinases, DYRK) και τις κινάσες τύπου CDK (CDK-like kinases) (Manning et al. 2002). Τις CDKs τις ανακάλυψαν πρώτη φορά σε πρότυπους 45

55 Εισαγωγή οργανισμούς, όπως οι ζύμες και οι βάτραχοι, και παρατήρησαν ότι η ενεργοποίησή τους σχετίζεται με τις ρυθμιστικές υπομονάδες, τις κυκλίνες, με πρωτεΐνες δηλαδή των οποίων τα επίπεδα υπόκεινται σε ρύθμιση κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου. Οι πρωτεΐνες αυτές εμπλέκονται στην ολοκλήρωση εξωκυττάριων και ενδοκυττάριων σημάτων, στη μεταγραφή γονιδίων και φυσικά στην κυτταρική διαίρεση (Malumbres 2014). Οι CDKs παρουσιάζουν μεγάλη ποικιλομορφία και εξειδίκευση, ενώ χωρίζονται σε δύο κατηγορίες, σε αυτές που δεσμεύουν πολλές κυκλίνες και μπορούν να ρυθμίσουν τον κυτταρικό κύκλο και σε αυτές που ενεργοποιούνται από μία και μόνο κυκλίνη και εμπλέκονται στη ρύθμιση της μεταγραφής. Οι τελευταίες ενεργοποιούνται συνήθως ανεξάρτητα από τα στάδια του κυτταρικού κύκλου και σχετίζονται μόνο με τη ρύθμιση της μεταγραφής διαφόρων γονιδίων. Η οικογένεια των CDKs αριθμεί στον άνθρωπο μέχρι σήμερα είκοσι μέλη CDK1- CDK20 και 29 κυκλίνες (Cao et al. 2014). Εξελικτικές μελέτες χωρίζουν τις CDKs σε οκτώ υποοικογένειες: τις CDK1, CDK4 και CDK5 (από τον κυτταρικό κύκλο της ζύμης) και τις CDK7, CDK8, CDK9, CDK11 και CDK20 (μεταγραφικοί παράγοντες). Η CDK1 είναι η μόνη CDK που είναι υπεύθυνη για τον κυτταρικό κύκλο στα θηλαστικά (Santamaría et al. 2007) ενώ οι CDK2 και CDK3 είναι περιττές (Malumbres & Barbacid 2005). Η ομόλογη της κυκλινο-εξαρτώμενης κινάσης Pho85 (Huang et al. 2007) στα θηλαστικά είναι η υποοικογένεια της CDK5 από τη CDK14 έως και τη CDK18. Η CDK5 παραδόξως δεν ενεργοποιείται από κυκλίνες αλλά από τις πρωτεΐνες CDK5R1 (p35) και CDK5R2 (p39). Οι CDKs που σχετίζονται με τη μεταγραφή γονιδίων είναι πιο συντηρημένες τόσο στην αλληλουχία όσο και στη λειτουργία τους. Η CDK7 μπορεί να φωσφορυλιώνει και να ενεργοποιεί άλλες CDKs, λειτουργώντας ως κινάση ενεργοποίησης (CDK- activating kinase, CAK). Αξίζει να αναφερθεί βέβαια πως σε αντίθεση με τις κυκλίνες που σχετίζονται με κινάσες του κυτταρικού κύκλου, οι κυκλίνες των μεταγραφικών CDKs δεν παρουσιάζουν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα των πρωτεϊνών τους κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου και πως αυτές οι μεταγραφικές κινάσες ρυθμίζονται από αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών ή από άλλους άγνωστους μηχανισμούς. Όπως όλα τα μέλη της οικογένειας των CMGC κινασών είναι κινάσες σερίνης θρεονίνης κατευθυνόμενες από προλίνη. Οι CDKs κυμαίνονται σε μέγεθος από 250 αμινοξέα έως και 1500 αμινοξέα. 46

56 Εισαγωγή Όπως όλες οι κινάσες, έχουν μια δομή που αποτελείται από το αμινοτελικό άκρο με τα β-πτυχωτά φύλλα και το καρβοξυτελικό που είναι πλούσιο σε α- έλικες και ανάμεσά τους η ενεργή τους περιοχή (Malumbres 2014). Η ρύθμιση της δράσης τους, όπως αναφέρθηκε, γίνεται μέσω της σύνδεσής τους με τις κυκλίνες, της φωσφορυλίωσης από κινάσες που ενεργοποιούν τις CDKs (CDK-Activating Kinase, CAK), της αποφωσφορυλίωσης από φωσφατάσες, καθως και την αλληλεπίδραση με πρωτεΐνες αναστολείς τους (CDK Inhibitors, CKIs), οι οποίοι ανήκουν στις οικογένειες Cip/Kip (p21, p27 και p57) και INK4 (p16, p18 και p19) (Pavletich 1999). Η πλούσια σε γλυκίνη περιοχή (G-loop) που βρίσκεται στο αμινοτελικό άκρο είναι μία επιπρόσθετη ρυθμιστική περιοχή η οποία περιλαμβάνει τα κατάλοιπα των οποίων η φωσφορυλίωση αναστέλλει την ενεργότητα των κινασών. Μελέτες έχουν δείξει πως φωσφορυλίωση στις θέσεις Thr14 και Tyr15 από τις κινάσες Wee1 και Myt αναστέλλει τη δραστικότητα διαφόρων CDKs, προλαμβάνοντας την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου σε περίπτωσης βλάβης του DNA. Απαλοιφή αυτών των φωσφορικών ομάδων από τις φωσφατάσες της οικογένειας Cdc25 απαιτείται για την ενεργοποίηση των CDKs και την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου (Malumbres & Barbacid 2005) (Boutros et al. 2007). Ανασταλτική φωσφορυλίωση στη Thr14 και στη Tyr15 δεν οδηγεί σε σημαντικές αλλαγές στη δομή των CDK αλλά αναστέλλει την ενεργότητά τους μέσω μείωσης της συγγένειας των CDKs με τα υποστρώματά τους. Ωστόσο, η φωσφορυλίωση στη θέση Tyr15 φαίνεται να ενεργοποιεί στην περίπτωση της CDK5, με το να βελτιώνει την αναγνώριση του υποστρώματος (Echalier et al. 2010). Αυτά τα κατάλοιπα απουσιάζουν από την CDK7 εφόσον από όσα είναι μέχρι τώρα γνωστά, αυτή η κινάση είναι συνεχώς ενεργή και ρυθμίζεται σε διάφορα επίπεδα. Οι CDKs μπορούν επίσης να ρυθμίζονται αρνητικά με το να δεσμεύονται σε μικρές πρωτεΐνες που ανήκουν στην οικογένεια των αναστολέων INK4 και Cip/Kip (Pavletich 1999) (Jeffrey et al. 2000). Οι INK4 πρωτεΐνες (p16 INK4a, p15 INK4b, p18 INK4c και p19 INK4d ) είναι ειδικές για τη CDK4 υποοικογένεια και αλληλεπιδρούν με μονομερείς CDKs εμποδίζονατς τη δέσμευση της κυκλίνης με τη θέση του ATP και αναστέλλοντας έτσι την ενεργοποίηση των CDK4 και CDK6 από τις κυκλίνες τύπου D ή από τις CAK (Jeffrey et al. 2000). Μέλη της οικογένειας των αναστολέων Cip/Kip (p21 Cip1, 47

57 Εισαγωγή p27 Kip1 και p57 Kip2 ) αλληλεπιδρούν τόσο με τις CDKs όσο και με τις υπομονάδες τους, τις κυκλίνες και αναστέλλουν τον ετεροδιμερισμό αυτών, δίνοντας επιπρόσθετα επίπεδα ρύθμισης άπαξ και σχηματιστεί αυτό το σύμπλοκο (Pavletich 1999). Η απορρύθμιση διαφόρων στοιχείων του κυτταρικού κύκλου σε καρκινικά κύτταρα, μεταξύ των οποίων και οι CDKs, οδήγησε στην ανακάλυψη φυσικών αναστολέων αυτών των κινασών και στη δημιουργία συνθετικών αναλόγων αυτών. Έχουν αναπτυχθεί αρκετοί αναστολείς τα τελευταία χρόνια, με περίπου 24 να έχουν οδηγηθεί σε κλινικές μελέτες (Lapenna & Giordano 2009) (Dickson & Schwartz 2009), κανένας όμως από αυτούς δεν είναι εκλεκτικός για μία και μόνο CDK και αυτό ίσως οφείλεται στο ότι όλες οι κινάσες παρουσιάζουν ομολογία στη θέση δέσμευσης του ATP (Knockaert et al. 2002). Διακρίνονται διάφορες κατηγορίες αναστολέων του κυτταρικού κύκλου με βάση τη χημική τους δομή όπως: φλαβόνες, πουρίνες, πυριμιδίνες, παυλόνες κ.ά. Εξαιρείται η φλαβοπυριδόλη, η ροσκοβιτίνη και η ZK που είναι ανάλογα φυσικών συστατικών Κυκλινο-εξαρτώμενη κινάση 5 (Cyclin-dependent kinase 5, CDK5) Δομή της CDK5 Η κυκλινο-εξαρτώμενη κινάση 5 (CDK5), γνωστή και ως κινάση CDC2 (CDC2-like kinase, NCLK), ανακαλύφθηκε στις αρχές του 90. Ο Hellmich και οι συνεργάτες του απομόνωσαν και χαρακτήρισαν τη νευρωνική κινάση τύπου Cdc2 από εγκέφαλο αρουραίου, η οποία παρουσιάστηκε ως μια κυκλινοεξαρτώμενη κινάση που φωσφορυλιώνει νευροϊνίδια σε μοτίβο λυσίνηςσερίνης-προλίνης. Είχε 61% ομολογία με την CDC2 του ανθρώπου και 58% με την αντίστοιχη του ποντικού (Hellmich et al. 1992). Η ονομασία CDK5 καθιερώθηκε το 1993, όταν ο Kobayashi και οι συνεργάτες του ανάγνωρισαν την περίπου 30 kda υπομονάδα του ενεργού ενζύμου (Kobayashi et al. 1993). 48

58 Εισαγωγή Το γονίδιο της CDK5 εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 7 και αποτελεί ένα αρκετά συντηρημένο μόριο μεταξύ των διαφόρων ευκαρυωτικών ειδών, ενώ αντίστοιχα γονίδια έχουν βρεθεί ακόμα και σε σπονδυλωτά όπως: Drosophila melanogaster, Saccharomyces cerevisiae, Xenopus laevis (Gervasi & Szaro 1995) (Hellmich et al. 1994) (Huang et al. 1996). Η CDK5 έχει μια δομή παρόμοια όλων των κυκλινο-εξαρτώμενων κινασών με μικρές ωστόσο διαφοροποιήσεις (Tarricone et al. 2001). Οι μιτωτικές CDKs έχουν μια δίλοβη δομή, με ένα μικρό Ν-λοβό και ένα μεγαλύτερο C-λοβό (Jeffrey et al. 1995). Ο λοβός του αμινοτελικού άκρου αποτελείται κυρίως από β-πτυχές και ο καρβοξυτελικός λοβός αποτελείται κυρίως από α έλικες. Ανάμεσα στους δύο λοβούς εντοπίζονται τα σημεία πρόσδεσης του ATP και του υποστρώματος. Τα απαραίτητα για τη σύνδεση με το ATP κατάλοιπα εντοπίζονται στο καρβοξυτελικό και το αμινοτελικό τμήμα, ενώ τα κατάλοιπα που ενέχονται στη δέσμευση του υποστρώματος ανευρίσκονται σχεδόν αποκλειστικά στο καρβοξυτελικό άκρο (De Bondt et al. 1993) Έκφραση και βιολογικές δράσεις της CDK5 Η CDK5 αποτελεί ένα ασυνήθιστο μέλος της οικογένειας των κυκλινοεξαρτώμενων κινασών. Εκφράζεται σε όλους τους ιστούς, αν και η υψηλότερη έκφραση και σχετική δραστικότητα κινάσης ανιχνεύεται κυρίως στο νευρικό σύστημα (Hellmich et al. 1992). Στο νευρικό σύστημα η CDK5 ελέγχει τη μετανάστευση των νευρώνων, την επέκταση των νευριτών και το σχηματισμό των συνάψεων (Ohshima et al. 1996). Εντούτοις, στους ενήλικες φαίνεται να ρυθμίζει την επιβίωση των νευρώνων, την πλαστικότητα των συνάψεων, την ενδοκυττάρια μεταφορά διαμέσου της μεμβράνης, ενώ έντονη είναι η συμμετοχή της στην παθοφυσιολογία του εθισμού σε ουσίες, στην επαγόμενη από στρες εμπέδωση της μνήμης, στη διαδικασία συσχετιζόμενης μάθησης, καθώς επίσης και στις μακροπρόθεσμες αλλαγές συμπεριφοράς (Zheng et al. 2010) (Hisanaga & Endo 2010) (Bibb 2003). Πειραματικά δεδομένα έχουν δείξει πως ποντικοί στους οποίους δεν εκφράζεται η CDK5 πεθαίνουν ακριβώς πριν ή μετά από τη γέννηση, ενώ εμφανίζουν σημαντικές ανωμαλίες σε αρκετές 49

59 Εισαγωγή περιοχές του εγκεφάλου (Gilmore et al. 1998) (Ohshima et al. 1996). Παρόμοια είναι τα αποτελέσματα και σε ποντικούς που δεν εκφράζεται η p35, η ρυθμιστική της υπομονάδα, με τη μόνη διαφορά ότι τα ζώα σε αυτή την περίπτωση είναι βιώσιμα και γόνιμα, ίσως εξαιτίας της άλλης υπομονάδας της p39 (Chae et al. 1997) (Kwon & Tsai 1998) (Kwon et al. 1999). Η απουσία ωστόσο και των δύο παρουσιάζει τον ίδιο ακριβώς φαινότυπο με τα ποντίκια που έχουν έλλειψη της CDK5 (Ko et al. 2001). Έχει βρεθεί πως η απορρύθμιση της δράσης της σχετίζεται με διάφορες νευροεκφυλιστικές παθήσεις, όπως είναι: η νόσος του Alzheimer (AD), η νόσος του Parkinson (PD), η πλάγια αμυοτροφική σκλήρυνση (ALS), εγκεφαλοπάθειες που σχετίζονται με prion (Prion-Related Encephalopathies, PRE), ή η οξεία νευρική βλάβη μετά από ισχαιμία/ισχαιμικό εγκεφαλικό επεισόδιο (Alvira et al. 2008) (Lopes et al. 2007) (Lopes et al. 2010) (Slevin & Krupinski 2009) (Tsai et al. 2004). Βασικός μηχανισμός απορρύθμισης της δράσης της είναι η δημιουργία των τμημάτων p25 και p29 που προκύπτουν από την αποκοπή του αμινοτελικού άκρου των p35 και p39 αντίστοιχα, ενώ η πέψη αυτή πραγματοποείται από τις καλπαΐνες (Kusakawa et al. 2000) (Lee et al. 2000) (Patrick et al. 1999). Με αυτό τον τρόπο λοιπόν, αυξάνεται η δραστικότητα της CDK5, καθώς τα πρωτεολυτικά τμήματα που προκύπτουν δεσμεύονται πιο έντονα στην κινάση CDK,5 ενώ έχουν και μεγαλύτερο χρόνο ημιζωής από τις αρχικές μορφές (Patrick et al. 1998) (Amin et al. 2002). Ο συσχετισμός της κινάσης αυτής με τη νόσο Alzheimer μπορεί να εξηγηθεί λόγω της αυξημένης έκφρασης τόσο της CDK5 όσο και της p25, που παρατηρείται σε εγκεφάλους ανθρώπων με τη νόσο, καθώς και εξαιτίας των δράσεων της που μπορούν τελικά να οδηγήσουν στα χαρακτηριστικά της ασθένειας (Grynspan et al. 1997) (Tseng et al. 2002). Επίσης, είναι γνωστό πως η απορρύθμιση της δράσης της CDK5 προκαλεί φωσφορυλίωση της πρόδρομης πρωτεΐνης αμυλοειδούς (APP) στη Thr668, με αποτέλεσμα την αύξηση της παραγωγής αμυλοειδούς (Lau et al. 2002). Η απορρυθμισμένη CDK5 έχει βρεθεί ότι υπερφωσφορυλιώνει την πρωτεΐνη tau (Xiong et al. 1992) (Zhang et al. 1993), η οποία αποδεσμεύεται από τους μικροσωληνίσκους και αθροίζεται υπό μορφή κυτταροπλασματικών ινιδίων και πλακών (Alonso et al. 2001) (Grundke-Iqbal et al. 1986). Πειράματα που 50

60 Εισαγωγή έχουν γίνει σε αρουραίους έχουν δείξει πως η ενεργοποίηση του συμπλόκου CDK5/p25 έχει ως αποτέλεσμα την υπερφωσφορυλίωση της tau στη Ser262/Thr205, στη Thr231 και στη Ser422 και την επακόλουθη κακή αιμάτωση του εγκεφάλου, μια κατάσταση που χαρακτηρίζει τη νόσο Alzheimer μέσω της μείωσης του microrna-195 (Sun et al. 2015). Άλλωστε υπάρχουν πλέον μελέτες που χαρακτηρίζουν την CDK5 και την p25 ως τους νέους ικανούς ρυθμιστές να ελέγξουν την αρχή και την εξέλιξη της παθολογίας της νόσου Alzheimer (Sheng et al. 2015). Δεδομένα επίσης από εγκεφάλους ασθενών που πάσχουν από Parkinson, δείχνουν διαφορετικά επίπεδα έκφρασης και δραστικότητας της CDK5 σε σύγκριση με εγκεφάλους φυσιολογικών ατόμων (Alvira et al. 2008). Η CDK5 φωσφορυλιώνει δύο ακόμα πρωτεΐνες που παίζουν πολύ σημαντικό ρόλο στην παθογένεια της νόσου, την παρκινίνη και την α-συνουκλεΐνη (Avraham et al. 2007) (Muntané et al. 2008) (Rubio de la Torre et al. 2009) (Rubio de la Torre et al. 2009). Η συσχέτιση της CDK5 με την παθοφυσιολογία της ALS καθώς και με την απώλεια εγκεφαλικής λειτουργίας λόγω ισχαιμίας, προκύπτει από την υπερφωσφορυλίωση που προκαλεί η απορρυθμισμένη κινάση στη μεγάλη υπομονάδα των νευροινιδίων (Heavy subunit of Neurofilaments, NF-H), με αποτέλεσμα τη διάλυση του κυτταροσκελετού (Nguyen et al. 2001) και των υποδοχέων NMDA (N-methyl-D-aspartate receptor) με αποτέλεσμα την εισροή ιόντων ασβεστίου και την πρόκληση απώλειας νευρώνων (Wang et al. 2003), αντίστοιχα. Πρόσφατα βρέθηκε πως η φωσφορυλίωση των NMDA υποδοχέων στη Ser1284, αποτελεί μια νέα θέση φωσφορυλίωσης από την CDK5 που σχετίζεται με τη νευρωνική ισχαιμία, κατάσταση που παρατηρείται κατά κόρον σε πολλές νευρολογικές παθήσεις (Lu et al. 2015). Από την άλλη μεριά έχει δειχθεί πως η σίγαση της έκφρασης της CDK5 προλαμβάνει την εγκεφαλική ισχαιμία που επάγεται από την εκφύλιση των νευρώνων και την επερχόμενη γνωστική δυσλειτουργία (Gutiérrez-Vargas et al. 2015). Η CDK5 αποτελεί ακόμα αναπόσπαστο κομμάτι της σοβαρής κατάθλιψης και των διαταρραχών λόγω άγχους καθώς επηρεάζει τη φωσφορυλίωση των υποδοχέων των γλυκοκορτικοειδών, αφού έχει βρεθεί πως η αυξημένη έκφραση αυτών λόγω στρες εμπλέκεται στην εξέλιξη της κατάθλιψης (Papadopoulou et al. 2015). Σε συμφωνία με αυτό υπάρχουν, τέλος, δεδομένα που δείχνουν πως τα προβλήματα μάθησης και μνήμης που επάγονται από 51

61 Εισαγωγή έντονο στρες εξαρτώνται άμεσα από την αυξημένη παραγωγή της CDK5 και της p25, η οποία οδηγεί σε αυξημένη ρύθμιση και φωσφορυλίωση των υποδοχέων των γλυκοκορτικοειδών και σε μειωμένη έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με τη μνήμη (Rei et al. 2015). Πρόσφατες μελέτες έχουν δώσει στην CDK5 και μη νευρωνικούς ρόλους, όπως για παράδειγμα ο θετικός ρυθμιστικός ρόλος που διαδραματίζει στην ανάπτυξη και στη διαφοροποίηση του μυϊκού συστήματος. Έχει βρεθεί πως η έκφρασή της αυξάνεται κατά τα αρχικά στάδια της μυογένεσης, ενώ η δραστικότητά της φαίνεται να είναι απαραίτητη για την έκφραση μορίων ειδικών της διαφοροποίησης των μυών, όπως είναι η μυογενίνη και η τροπονίνη Τ (Lazaro et al. 1997), και ότι τα γονίδια της μυογένεσης MyoD και MRF4 αποτελούν στόχους της (Philpott et al. 1997). Πρόσφατες μελέτες άλλωστε δίνουν στη CDK5 ένα θετικό ρόλο στην επιβίωση των μυοβλαστών έναντι της υποξίας καθώς η φτωχή επιβίωση αυτών λόγω υποξικού στρες αποτελεί ένα βασικό πρόβλημα στην αντιμετώπιση διαφόρων σκελετικών παθήσεων (Kang et al. 2015). Επίσης, η CDK5 φαίνεται να εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα και στους όρχεις, τόσο στην περιγεννητική περίοδο όσο και στην ενήλικη ζωή (Musa et al. 1998). Άλλωστε η αναστολή της έκφρασής της από τη ροσκοβιτίνη έχει δείξει πως προκαλεί προβλήματα στην ικανότητα γονιμοποίησης σε αρσενικούς ποντικούς συγκριτικά με αυτούς που δε δέχτηκαν αγωγή με ροσκοβιτίνη (Yin et al. 2015). Θετικός είναι ο ρόλος που διαδραματίζει επίσης και στην έξοδο της ινσουλίνης από το κύτταρο καθώς αναστολή της δραστικότητάς της από τη ροσκοβιτίνη μειώνει την επαγόμενη από γλυκόζη έκκριση της ινσουλίνης και τη διαδικασία εξωκυττάρωσης (Lilja et al. 2001). Η φωσφορυλίωση του PPARγ από το σύμπλοκο CDK5/p25 έχει δειχθεί πρόσφατα πως προάγει την παχυσαρκία και την απώλεια ευαισθησίας στην ινσουλίνη και άρα η ανάπτυξη θεραπειών έναντι αυτής της φωσφορυλίωσης μπορεί να είναι σημαντική για την αντιμετώπιση διαφόρων μεταβολικών παθήσεων (Mottin et al. 2015). Μελέτες που έχουν γίνει σχετικά με το ρόλο της CDK5 και της p35 στον πυρήνα, έχουν δείξει πως αυτές οι δύο παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της μεταγραφής γονιδίων, όπως η neuregulin-1 (NRG), η p53 και η MEF2 (Myocyte Enhancing Factor 2) (Zhang et al. 2002) (Gong et al. 2003), και το STAT3 (Signal Transducer and 52

62 Εισαγωγή Activator of Transcription 3) in vivo (Fu et al. 2005). Το ενεργό σύμπλοκο CDK5/p35 θεωρείται απαραίτητο για τη φυσιολογική αλληλεπίδραση των νευρώνων με τα κύτταρα γλοίας (Gupta et al. 2003). Δεδομένα από συγκεκριμένο τύπο κερατινοκυττάρων έχουν δείξει πως η αναστολή της δράσης της CDK5 με ροσκοβιτίνη επάγει την εξαρτώμενη από καντχερίνη συσσώρευση των κυττάρων αυτών, ενώ αναστέλλει την προσκόλληση σε ινονεκτίνη, μέσω της μείωσης της δράσης της ιντεγκρίνης β 1 (Nakano et al. 2005). Η αναστολή της κινάσης επίσης προκαλεί καταστροφή των εστιών προσκόλλησης, τη δημιουργία λαμελλιποδίων και την ανακατασκευή του δικτύου ακτίνης, στοιχεία που είναι απαραίτητα για την επούλωση πληγών στον κερατοειδή (Gao et al. 2004). Εξίσου σημαντικές είναι οι δράσεις της και στη διαδικασία της γήρανσης, φωσφορυλιώνοντας μόρια που συμμετέχουν σε σηματοδοτικά μονοπάτια αυτής, όπως η εζρίνη (Yang & Hinds 2003) και στην απόπτωση, όπως υποδεικνύεται από πειράματα σε ωοκύτταρα ποντικών (Lee et al. 2003) (Zhang et al. 1997), καθώς και σε άκρα ποντικών σε εμβρυϊκά στάδια, όπου η αυξημένη δραστικότητα της κινάσης εμφανίζεται σε αποπτωτικά κύτταρα με κατακερματισμό του DNA (Zhang et al. 1997). Αυξημένη έχει βρεθεί η έκφραση της CDK5 σε κύτταρα Leydig TM3 που σχετίζονται με αυξημένη παραγωγή τεστοστερόνης (Musa et al. 2000), ενώ φαίνεται επίσης να παίζει κάποιο ρόλο στην αγγειογένεση και τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων (Liebl et al. 2010). Τέλος, ακόμα πιο πρόσφατα δεδομένα της αποδίδουν κα το ρόλο του κρίσιμου ρυθμιστή της ανάπτυξης και της λειτουργίας των αγγείων του λεμφικού συστήματος μέσω της φωσφορυλίωσης του μεταγραφικού παράγοντα Foxc-2, αφού η αναστολή της έκφρασής της προκαλεί λεμφική δυσλειτουργία (Liebl et al. 2015) Ενεργοποίηση και ρύθμιση της δράσης της CDK5 Η CDK5, όπως και όλες οι CDKs, χρειάζονται τη σύνδεση με ένα ρυθμιστικό παράγοντα για να ενεργοποιηθούν και να αποκτήσουν ενζυμική δραστηριότητα. Αν και έχει βρεθεί πως η CDK5 δεσμεύεται σε πολλές κυκλίνες εντούτοις δεν ενεργοποιείται από αυτές (Xiong et al. 1992). Δύο είναι οι γνωστοί ενεργοποιητές της CDK5, οι πρωτεΐνες p35 και p39, με την πρώτη 53

63 Εισαγωγή να είναι πιο αποτελεσματική και πιο καλά μελετημένη, τόσο in vivo όσο και in vitro. Η πρωτεΐνη p35 (NCK5a, Neuronal CDK5 activator) ανακαλύφθηκε λόγω της αλληλεπίδρασης της με την CDK5, η οποία οδηγεί τελικά στην ενεργοποίηση αυτής (Lew et al. 1994) (Uchida et al. 1994). Η CDK5 αποτελεί την καταλυτική υπομονάδα ενός δραστικού συμπλόκου, με την p35 να αποτελεί τη ρυθμιστική υπομονάδα. Αποτελείται από 307 αμινοξέα και περιλαμβάνει το αμινοτελικό άκρο, την περιοχή δέσμευσης στην CDK5 και το καρβοξυτελικό άκρο. Η καλπαΐνη διασπά το αμινοτελικό άκρο μεταξύ των αμινοξέων 98 και 99, με αποτέλεσμα τη δημιουργία της p25. Η p25 είναι μια πρωτεολυμένη μορφή της p35, η οποία μπορεί επίσης και ενεργοποιεί την CDK5, προκαλώντας όμως αλλαγές στον κυτταρικό εντοπισμό της και αλλάζοντας τη συγγένειά της για διάφορα υποστρώματα. Η p25 διατηρεί την CDK5 σε μια υπερενεργή κατάσταση, γεγονός που έχει συσχετιστεί κυρίως με καταστάσεις νευροτοξικότητας (Patrick et al. 1999) (Lee et al. 2000). Η p35 εντοπίζεται αρχικά στη μεμβράνη όπως και η CDK5, ωστόσο μελέτες έχουν δείξει πως η πρωτεΐνη μεταφέρεται και στον πυρήνα (Fu et al. 2006). Η p39 (NCK5ai, Neuronal CDK5 activator isoform), παρουσιάζει 57% ομολογία με την p35 (Tang et al. 1995) και αποτελείται από 369 αμινοξέα. Όπως η p35, έτσι και αυτή περιλαμβάνει το αμινοτελικό άκρο, την περιοχή δέσμευσης στην CDK5 και το καρβοξυτελικό άκρο. Η καλπαΐνη διασπά το αμινοτελικό άκρο μεταξύ των αμινοξέων 99 και 100, με αποτέλεσμα τη δημιουργία της p29, η οποία συμβάλλει επίσης στην απορρυθμισμένη κατάσταση της CDK5 (Patzke et al. 2003). Η CDK5 έχει βρεθεί ότι υφίσταται μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις ενώ η δράση της προϋποθέτει την ύπαρξη προλίνης ανοδικά των καταλοίπων σερίνης και θρεονίνης που φωσφορυλιώνει. Οι βασικοί μηχανισμοί ρύθμισης της δράσης της CDK5 είναι: αρχικά η έκφραση των ενεργοποιητών της και η αλληλεπίδραση με αυτούς, η διάσπασή τους στις υπομονάδες p25 και p29 και η φωσφορυλίωση είτε της CDK5 είτε της p35. Η δράση της κινάσης εντοπίζεται κυρίως στο νευρικό σύστημα λόγω των ενεργοποιητών της οι οποίοι εμφανίζουν μεγαλύτερη έκφραση σε μεταμιτωτικούς νευρώνες (Tsai et al. 1993) (Zheng et al. 1998). Η p35, αλλά και η πρωτεολυτική της μορφή η 54

64 Εισαγωγή p25, αποκτούν τεταρτοταγή δομή παρόμοια με αυτή των κυκλινών (Tarricone et al. 2001). Από πειράματα στα οποία είχε γίνει απομόνωση της CDK5 από E.coli παρατηρήθηκε πως αυτή γινόταν ενεργή μόνο μετά τη σύνδεσή της με την p35 in vitro (Qi Zhong et al. 1995) (Tang et al. 1997) (Amin et al. 2002). Η δράση της CDK5 στον εγκέφαλο αυξάνεται όταν αρχίζει και η σύνθεση της p35 (Tsai et al. 1993). Ο χρόνος ημιζωής της p35 είαι 20 με 30 λεπτά περίπου και έχει βρεθεί πως οδηγείται προς ουμπικουϊτινιλίωση και αποσύνθεση στο πρωτεάσωμα. Η σύνθεση της έχει βρεθεί πως εξαρτάται από διάφορους παράγοντες με κυριότερο το νευροτροφικό παράγοντα που προέρχεται από τον εγκέφαλο (Brain-Derived Neurotrophic Factor, BDNF) (Tokuoka et al. 2000) (Bogush et al. 2007) ενώ, παράγοντες που αναστέλλουν την PI3K (Phosphatidylinositol-3 kinase, PI3K) έχει βρεθεί πως αναστέλλουν και την έκφρασή της (Bogush et al. 2007). Η σταθερότητα της p35 και κατ επέκταση ο χρόνος ημιζωής της αυξάνονται κατά πολύ όταν αναστέλλεται η δράση της CDK5, εξαιτίας της μείωσης της φωσφορυλίωσής της από την κινάση (Patrick et al. 1998). Ένας άλλος μηχανισμός μέσω του οποίου ρυθμίζεται η δράση της κινάσης είναι η φωσφορυλίωσή της σε συντηρημένα κατάλοιπα. Όπως όλες οι CDKs, έτσι και η CDK5 έχει 3 συντηρημμένες θέσεις φωσφορυλίωσης, με τη διαφορά ότι στην περίπτωση της CDK5 η Thr161 μετατρέπεται σε Ser159. Τα δεδομένα που αφορούν στη σημασία της φωσφωρυλίωσης σε αυτή τη θέση είναι αντιφατικά, δείχνοντας είτε επαγωγική (Sharma et al. 1999) είτε ανασταλτική δράση (Tarricone et al. 2001) της φωσφορυλίωσης σε αυτό το κατάλοιπο. Έχει βρεθεί επίσης πως η δραστικότητα της CDK5 επάγεται ακόμα και από κινάσες που φωσφορυλιώνουν την Tyr15 (Zukerberg et al. 2000) (Morigaki et al. 2011). Αναφορές σχετικά με την εντόπιση της p35 και της CDK5 δείχνουν πως όταν τα δύο αυτά μόρια εκφράζονται μαζί εντοπίζονται κυρίως στην περιφέρεια, γεγονός που υποδηλώνει πως τα περισσότερα υποστρώματα της κινάσης θα πρέπει να είναι διαμεμβρανικά ή πρωτεΐνες που σχετίζονται με τις μεμβράνες (Patrick et al. 1999). Έχει αποδειχθεί επίσης πως η δραστικότητα της CDK5 δεν επηρεάζεται από τους ενδογενείς αναστολείς των CDKs (Harper et al. 1995) και πως υπάρχουν άλλα πρωτεϊνικά μόρια που μπορεί να την 55

65 Εισαγωγή επηρεάσουν μέσω της αλληλεπίδρασης είτε με την ίδια την κινάση είτε με τους ενεργοποιητές της. Για παράδειγμα, στο σχηματισμό του συμπλόκου CDK5- p35 έχει βρεθεί πως δρα ανασταλτικά η κινάση καζεΐνης 2 και 4 (Casein Kinase 2, CK2 και Casein Kinase 4, CK4 αντίστοιχα), μέσω ανεξάρτητης δέσμευσης και με τα δύο μόρια (Lim et al. 2004) (Ching et al. 2002) CDK5 και καρκίνος Η νευρωνική μετανάστευση κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του νευρικού συστήματος και η μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων κατά τη διάρκεια της μετάστασης διαμεσολαβούνται από παρόμοιους κυτταρικούς και μοριακούς μηχανισμους, για αυτό το λόγο δεν είναι καθόλου παράδοξο που η CDK5 παίζει σημαντικό ρόλο στη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων. Έχει βρεθεί πως το σύμπλοκο CDK5-p35 είναι ενεργό στα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα και πως η αναστολή της δράσης της CDK5, φαρμακολογικώς ή μη, οδηγεί σε μείωση της μετανάστευσης των κυττάρων αυτών (Feldmann et al. 2010), καθώς η απενεργοποίηση της CDK5 επάγει μορφολογικές αλλαγές σε αυτά τα κύτταρα τα οποία χάνουν την πολικότητά τους, ενώ επηρεάζει και τη διεισδυτική τους ικανότητα με το να ρυθμίζει τον σχηματισμό των έντονων προεκτάσεων της μεμβράνης (invadopodia) (Quintavalle et al. 2011). Όλα αυτά συντελούν τελικά στη μείωση του όγκου και στη μετάσταση των κυττάρων του (Feldmann et al. 2010), προτείνοντας την CDK5 ως ένα πιθανό στόχο για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος (Feldmann et al. 2010). Αυτό επιβεβαιώνεται και από πρόσφατες μελέτες που έχουν δείξει πως η αναστολή της έκφρασης της CDK5 σε συνδυασμό με την αναστολή της έκφρασης της Akt σταματά την ανάπτυξη και τη μετάσταση του παγκρεατικού όγκου (Hu et al. 2015). Επίσης, φαίνεται να σχετίζεται με την εμφάνιση καρκίνου και η παρατήρηση ότι η CDK5 μπορεί να φωσφορυλιώνει και να ρυθμίζει τη μεταγραφική ικανότητα του STAT3 (Fu et al. 2004). Έχει βρεθεί πως το STA3 φωσφορυλιώνεται στη Ser727 στα καρκινικά κύτταρα του θυρεοειδούς, οδηγώντας σε αυξημένο κυτταρικό πολλαπλασιασμό και προάγοντας τον 56

66 Εισαγωγή σχηματισμό όγκου. Επίσης τα συσσωματώματα καλσιτονίνης που προέρχονται από καρκίνωμα του θυρεοειδούς φαίνεται να επάγουν την ενεργότητα της κινάσης και να προάγουν περαιτέρω τον πολλαπλασιασμό. Αναστολή της CDK5 σε ανοσοποιημένα ποντίκια καθυστερεί την ανάπτυξη του όγκου που εξαρτάται από τη φωσφορυλίωση του STA3 (Lin et al. 2007). Το ρετινοϊκό οξύ μπορεί επίσης να τροποποιεί τη δράση της CDK5 στα ίδια καρκινικά κύτταρα μέσω ενός μηχανισμού που περιλαμβάνει το μεταφορέα νατρίου/ιωδίου, μια μεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη, η οποία ρυθμίζει την πρόσληψη του ιωδίου (Jeong et al. 2006). Το σύνολο αυτών των παρατηρήσεων δίνει την πιθανότητα η CDK5 να θεωρείται ένας μοριακός στόχος για τη διάγνωση και τη θεραπεία του καρκίνου του θυρεοειδούς. Σε μία άλλη αναφορά σχετικά με την εμπλοκή της CDK5 στην ανάπτυξη του μυελώδους καρκίνου του θυρεοειδούς, καθοριστική θεωρείται η υπερέκφραση της p25 στα κύτταρα του θυρεοειδούς, ενώ η αυξημένη ενεργότητα της κινάσης οδηγεί σε αυξημένη κινητικότητα και σε αυξημένο πολλαπλασιασμό αυτών των κυττάρων, γεγονός που δείχνει πως η CDK5 και οι ρυθμιστές της αποτελούν κατάλληλους θεραπευτικούς στόχους έναντι αυτής καρκινογένεσης (Pozo et al. 2015). Στον καρκίνο του μαστού επίσης διαδραματίζει πολύ σημαντικό ρόλο, καθώς έχει παρατηρηθεί πως τα καρκινικά κύτταρα MCF-7 και MDA-MB321 παρουσιάζουν μειωμένο πολλαπλασιασμό είτε παρουσία της ροσκοβιτίνης είτε ύστερα από σίγαση του γονιδίου της CDK5. Η χρήση καρβοπλατίνης, ενός γνωστού χημειοθεραπευτικού φαρμάκου στον καρκίνο του μαστού, επάγει την ενεργοποίηση της CDK5 με το να αυξάνει την ενεργότητα των ERK λόγω απόκρισης σε βλάβη του DNA (Upadhyay et al. 2008). Ακόμα η αυξημένη ενεργότητα της CDK5 καθορίζει την σταθερότητα της p53, η οποία θα οδηγήσει σε κυτταρικό θάνατο λόγω απόκρισης σε βλάβη του DNA που προκαλείται από την καρβοπλατίνη (Upadhyay et al. 2008). Φαίνεται, λοιπόν, ότι η αυστηρή ρύθμιση της ενεργότητας της CDK5 μπορεί να είναι καθοριστική για την κυτταρική φυσιολογία, καθώς τοπική αλλά και χρονική αύξηση ή απώλεια της δράσης της μπορεί να οδηγήσει σε μη φυσιολογικό κυτταρικό πολλαπλασιασμό. 57

67 Εισαγωγή Η CDK5 εμπλέκεται ακόμα και στον καρκίνο του τραχήλου, ο οποίος προκαλείται απο τον ιό των ανθρώπινων θηλωμάτων (hpv), αφού έχει αποδειχθεί πως φωσφορυλιώνει την p53 στις θέσεις Ser20 και Ser43 και αναστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Εντούτοις, ο hpv μπορεί να επάγει την αποικοδόμηση της p53, για αυτόν τον λόγο κύτταρα μολυσμένα με τον ιό δεν υφίστανται απόπτωση ή παύση του κυτταρικού κύκλου, ακόμα και αν η p53 είναι αυξημένη. Άρα, τροποποίηση της κατάστασςη φωσφορυλίωσης της p53, είτε προάγοντας την ενεργότητα κινασών ή αναστέλλοντας φωσφατάσες, μπορεί να οδηγήσει σε απόπτωση (Ajay et al. 2010). Επομένως η φωσφορυλίωση της p53 από την CDK5 μπορεί να είναι ένα βασικό βήμα που θα οδηγεί σε αυξημένη σταθερότητα και μεταγραφική ενεργοποίηση της p53 (Zhang et al. 2002). Πρόσφατα δεδομένα έχουν δείξει πως η αναστολή της CDK5 σε καρκίνο των ωοθηκών, με έναν κατάλληλο αναστολέα αυτής, οδηγεί σε παύση του κυτταρικού κύκλου και σε απόπτωση των κυττάρων, ενώ σταματάει και την ανάπτυξη του όγκου (Chen et al. 2015). Άλλες αναφορές, δείχνουν πως η CDK5 είναι απαραίτητη για την κινητικότητα αλλά και για τη μεταστατική δυναμική των καρκινικών κυττάρων του προστάτη (Strock et al. 2006). Το σύμπλοκο CDK5-p35 φωσφορυλιώνει τον υποδοχέα των ανδρογόνων στη Ser81 και έτσι ρυθμίζεται η σταθερότητα της πρωτεΐνης ενώ αυξάνεται η συσσώρευσή της στον πυρήνα όπου τελικά ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων (Hsu et al. 2011). Σε μια άλλη μελέτη είδαν ότι η CDK5 αυξάνει τόσο την έκφραση όσο και την έκκριση του PSA του ειδικού προστατικού αντιγόνου δηλαδή, πιθανά μέσω της εξωκυττάρωσης κάτι που αποδεικνύει και πάλι ότι η CDK5 μπορεί να κατέχει ένα σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη. Άλλωστε, είναι γνωστό πως η CDK5 επιτυγχάνει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών προστατικών κυττάρων μέσω της φωσφορυλίωσης του υποδοχέα των ανδρογόνων AR και της ενεργοποίησης του μονοπατιού της Akt (Lindqvist et al. 2015). Υπάρχουν ακόμα μελέτες που συσχετίζουν την έκφραση της CDK5 και με άλλους τύπους καρκίνου, όπως ο μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα, καθώς έχουν παρατηρήσει πως υπάρχει μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης του συμπλόκου CDK5-p35 και του βαθμού 58

68 Εισαγωγή διαφοροποίησης και μετάστασης στους λεμφαδένες (Liu et al. 2011). Πιο πρόσφατα αποτελέσματα έχουν δείξει πως η συσχέτιση αυτή της CDK5 με το μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, επιτυγχάνεται μέσω της ρύθμισης του πολλαπλασιασμού, της κινητικότητας και της διεισδυτικότητας των καρκινικών κυττάρων, μέσω της αναδιαμόρφωσης του κυτταροσκελετού (Liu et al. 2015). Σύμφωνα με τελευταία δεδομένα η CDK5 και ο ενεργοποιητής της η p35, φαίνονται να σχετίζονται ακόμα και με την ανάπτυξη αδενωμάτων της υπόφυσης μέσω της αυξημένης έκφρασης του VEGF, η οποία όμως μπορεί να ανατραπεί είτε με τη χορήγηση ροσκοβιτίνης είτε άλλων αναστολέων της CDK5 (Xie et al. 2014). Μειωμένη έχει βρεθεί η έκφραση της CDK5 στον καρκίνο του στομάχου, ενώ έχει παρατηρηθεί ότι αυτή η μέιωση συσχετίζεται με την σοβαρότητα και την εξέλιξη της νόσου καθώς προάγεται η μετάσταση στους λεμφαδένες και επίσης η πυρηνική συσσώρευσή της βρέθηκε να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και την καρκινογένεση των καρκινικών κυττάρων του στομάχου (Cao et al. 2015). Τέλος, σε μια συνδυαστική μελέτη που έγινε σε ασθενείς με σοβαρό καρκίνο του μαστού παρατήρηθηκε ότι αυτοί οι ασθενείς έχουν πολύ φτωχή πρόγνωση παρ όλη την προσπάθεια που γίνεται για την αντιμετώπισή της νόσου, λόγω της ανάπτυξης ανθεκτικών καρκινικών κυττάρων τα οποία φαίνεται να εκφράζουν κάποιες φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες μεταξύ των οποίων και η CDK5, που επάγουν μέσω της βιμεντίνης τη μετάβαση των επιθηλιακών κυττάρων προς μεσεγχυματικά στα ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα (Deng et al. 2014) CDK5 και αγγειογένεση Η αγγειογένεση παίζει σημαντικό ρόλο στην επούλωση τραυματισμένων ιστών αλλά και στη δημιουργία του πλακούντα, ενώ έχει συσχετιστεί και με άλλες παθολογικές καταστάσεις όπως η διαβητική αμφηβλιστροειδοπάθεια, η αρθρίτιδα και η ψωρίαση (Tonini et al. 2003). Η CDK5 έχει προταθεί ως ένας καινούριος στόχος για την αντι-αγγειογενετική θεραπεία, καθώς αναστολή ή σίγασή της προλαμβάνει την αγγειογένεση (Liebl et al. 2010). Φαρμακολογική αναστολή της CDK5 με τη ροσκοβιτίνη μειώνει in vitro τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων δοσοεξαρτώμενα. Επίσης η θεραπεία με ροσκοβιτίνη 59

69 Εισαγωγή έχει αντι-αγγειογενετικα αποτελέσματα in vivo, κάτι που επιβεβαιώνεται περαιτέρω και όταν γίνεται σίγαση της CDK5, δείχνοντας με αυτόν τον τρόπο πως το φαρμακολογικό αποτέλεσμα είναι λόγω αναστολής της CDK5 και όχι της CDK2. Φαίνεται επίσης, πως η ενεργότητα της κινάσης είναι απαραίτητη για τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων, αφού όταν υπερεκφράζεται μία μεταλλαγμένη μορφή της CDK5 η οποία είναι καταλυτικά ανενεργή, η μετανάστευση των κυττάρων μειώνεται. Αναστολή της έκφρασης της CDK5 οδηγεί επιπρόσθετα σε μείωση της φωσφορυλίωσης της FAK (Focal Adhesion Kinase) στη Ser732, χωρίς όμως να προκαλεί αλλαγές στις εστίες προσκόλλησης ή να αλλάζει τη δυναμική των μικροσωληνίσκων. Παρολ αυτά, ύστερα από αναστολή της CDK5 αλλάζει η συνολική δομή της ακτίνης του κυτταροσκελετού με επακόλουθη αύξηση της δράσης της RhoA GTPάσης και μείωση της δράσης της Rac1 GTPάσης, προτείνοντας έτσι ένα ρόλο στη CDK5 ελέγχου της ακτίνης του κυτταροσκελετού στα ενδοθηλιακά κύτταρα τα οποία υποστηρίζουν τη μετανάστευση και την αγγειογένεση (Liebl et al. 2010). Παρόμοια δεδομένα δείχνουν μια συσχέτιση της ενεργότητας της CDK5 και της λειτουργίας των μικρών GTPασών στα επιθηλιακά κύτταρα του φακού (Tripathi & Zelenka 2009) (Tripathi & Zelenka 2010). Η CDK5 μειώνει την ενεργότητα της Src κινάσης, κάτι που οδηγεί σε αυξημένη φωσφορυλίωση της p190rhogap και σε επακόλουθη ενεργότητα της RhoA. Η αναστρέψιμη αναστολή της CDK5 με ολομουκίνη, αναστολέα των CDKs, αυξάνει την ενεργότητα της Src και μειώνει το σηματοδοτικό μονοπάτι Rho-ROCK, το οποίο είναι υπεύθυνο για τη φωσφορυλίωση της μυοσίνης και τη διατήρηση των ινιδίων του στρες που είναι απαραίτητα για την κυτταρική προσκόλληση. Το γεγονός ότι η CDK5 συνεντοπίζεται με τα ινίδια ακτίνης συμφωνεί και με την τοπική ενεργοποίηση της Rho η οποία διαμεσολαβείται από την αναστολή της Src (Tripathi & Zelenka 2009). Σε συμφωνία λοιπόν με όλα τα παραπάνω, η ολομουκίνη αυξάνει την έκφραση της μεταλλοπρωτεϊνάσης-9, η οποία απαιτείται για τη μετανάστευση των επιθηλιακών κυττάρων του κερατοειδούς, μάλλον μέσω της ενεργοποίησης της Src, για να οδηγήσει σε αυξημένη μετανάστευση αυτών των κυττάρων (Tripathi & Zelenka 2010). Πρόσφατα δεδομένα δείχνουν επίσης ότι η στόχευση του συμπλόκου CDK5/p35 μέσω 60

70 Εισαγωγή των αναστολέων CIP διατηρεί και ενισχύει την αγγειογένεση in vitro σε σταθερές υποξικές συνθήκες (Bosutti et al. 2013). Ενώ αναστολή της έκφρασης της CDK5 με ειδικά μικρά μόρια αναστολής κινασών φαίνεται να αναστέλλει την αγγειογένεση in vivo και in vitro, καταδεικνύοντας αυτά τα μόρια ως ισχυρές αντι-αγγειογενετικές ενώσεις (Weitensteiner et al. 2013). 61

71 ΣΚΟΠΟΣ

72 Σκοπός Η αγγειογένεση παίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεια διαφόρων ασθενειών, μεταξύ των οποίων και ο καρκίνος. Ο πολλαπλασιασμός και η κυτταρική μετανάστευση αποτελούν σημαντικά βήματα της διαδικασίας της αγγειογένεσης. Οι κυκλινο-εξαρτώμενες κινάσες (Cyclin- Dependent Kinases, CDKs), είναι κινάσες σερίνης-θρεονίνης που ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο (Malumbres 2014) και η έκφρασή τους υπόκειται σε ιστοειδικό έλεγχο (Miller & Flaherty 2014). Η CDK5, αν και ανήκει σε αυτήν την οικογένεια, δε συσχετίζεται με τον κυτταρικό κύκλο και η ρύθμιση της δράσης της επιτυγχάνεται μέσω της δέσμευσής της με τις ρυθμιστικές υπομονάδες p35 και p39. Εκφράζεται κυρίως στα νευρικά κύτταρα, και ελέγχει τη μετανάστευση των νευρώνων και την επέκταση των νευριτών κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου. Επίσης, η CDK5 εκφράζεται και δραστηριοποιείται και σε άλλους ιστούς, όπου επηρεάζει διαδικασίες όπως η επιβίωση, η μετανάστευση και η διαφοροποίηση διαφόρων τύπων κυττάρων (Rosales & Lee 2006), μεταξύ αυτών και των ενδοθηλιακών κυττάρων, διαδραματίζοντας σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της αγγειογένεσης (Liebl et al. 2010) (Sharma et al. 2004). Η πλειοτροπίνη (Pleiotrophin, PTN) είναι ένας εκκρινόμενος αυξητικός παράγοντας μοριακής μάζας 18 kda, ο οποίος παρουσιάζει υψηλή συγγένεια με την ηπαρίνη, ενώ διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του νευρικού συστήματος. Η PTN συμμετέχει στην καρκινική αγγειογένεση in vivo και in vitro, ενώ οι δράσεις της διαμεσολαβούνται από διάφορους υποδοχείς, όπως οι συνδεκάνες, ο υποδοχέας με δράση κινάσης τυροσίνης ALK (anaplastic lymphoma kinase), ο υποδοχέας με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ (receptor protein tyrosine phosphatase beta/zeta, RPTPβ/ζ), η ιντεγκρίνη α ν β 3 και η νουκλεολίνη (Papadimitriou et al. 2009) (Koutsioumpa et al. 2012) (Pantazaka & Papadimitriou 2012). O υποδοχέας RPTPβ/ζ είναι μια πρωτεογλυκάνη θειϊκής χονδροϊτίνης και έχει τέσσερις ισομορφές, δύο διαμεμβρανικές και δύο εκκρινόμενες. Η PTN προσδένεται στον RPTPβ/ζ και αυτό έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση αρκετών μονοπατιών μεταγωγής σήματος που συμβάλλουν σε πληθώρα διαδικασιών, όπως η αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού και η μετανάστευση ενδοθηλιακών και καρκινικών κυττάρων (Koutsioumpa & Papadimitriou 2012) (Pantazaka & Papadimitriou 2014). 63

73 Σκοπός Οι ιντεγκρίνες αποτελούν ετεροδιμερείς υποδοχείς της κυτταρικής μεμβράνης, που ρυθμίζουν την πρόσδεση του κυττάρου σε μόρια της εξωκυττάριας ύλης, ενώ παράλληλα αλληλεπιδρούν με διαλυτούς προσδέτες ή υποδοχείς της κυτταρικής μεμβράνης μέσω των οποίων προάγονται σημαντικές διαδικασίες, όπως η προσκόλληση, η μετανάστευση, ο πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση και η επιβίωση (Bridgewater et al. 2012). Η α ν β 3 είναι η πιο καλά χαρακτηρισμένη ιντεγκρίνη που υπερεκφράζεται κατά την αγγειογένεση και διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμισή της. Εκφράζεται σε αγγειογενετικά ενδοθηλιακά, λεία μυϊκά και μερικούς πληθυσμούς αιματοποιητικών κυττάρων, ενώ πολλές είναι οι αναφορές που συσχετίζουν την αυξημένη έκφραση της α ν β 3 με την εξέλιξη του καρκίνου (Gutheil et al. 2000); (Taverna et al. 2004); (Reynolds et al. 2009). Προηγούμενα αποτελέσματα της ερευνητικής μας ομάδας έδειξαν ότι η ιντεγκρίνη α ν β 3 αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ, ο οποίος με την ενεργοποίηση της κινάσης c-src οδηγεί σε φωσφορυλιώση της τυροσίνης στη θέση 773 (Tyr773) της β 3 υπομονάδας της α ν β 3 και αυτό τελικά επάγει τη μετανάστευση των ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων και των κυττάρων γλοιοβλαστώματος από την ΡΤΝ (Mikelis et al. 2009). Προηγούμενα αποτελέσματα της ερευνητικής μας ομάδας έχουν δείξει ότι η CDK5 ενεργοποιείται από την ΡΤΝ σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα μέσω του υποδοχέα της RPTPβ/ζ και εμπλέκεται στην επαγόμενη από PTN μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων (Λαμπροπούλου Ε, 2011). Ο σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της επίδρασης της ιντεγκρίνης α ν β 3 στην επαγόμενη από PTN ενεργοποίηση της κινάσης CDK5, καθώς και η αλληλεπίδραση της CDK5 με άλλα μόρια που εμπλέκονται στο σηματοδοτικό μονοπάτι της PTN στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Μελετήθηκε, επίσης, ο ρόλος της CDK5 στην αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης που προκαλεί η ΡΤΝ σε κύτταρα που δεν εκφράζουν την ιντεγκρίνη α ν β 3. Τέλος, μελετήθηκε η ενεργότητά της CDK5 στη χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη (CAM) του εμβρύου της όρνιθας σε διάφορα αναπτυξιακά στάδια σε σύγκριση με την αγγειογενετική δραστηριότητα του ιστού. 64

74 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

75 Υλικά και Μέθοδοι 1. Απομόνωση ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC από φλέβα ομφάλιου λώρου ανθρώπου Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν ενδοθηλιακά κύτταρα που απομονώθηκαν από τη φλέβα ομφάλιου λώρου ανθρώπου (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC). Οι ομφάλιοι λώροι είχαν προέλθει από τη μαιευτική κλινική του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου του Ρίου, από επεμβάσεις καισαρικής τομής. Μετά το τέλος κάθε επέμβασης, ο ομφάλιος λώρος τοποθείται σε αποστειρωμένο, ισότονο ρυθμιστικό διάλυμα PBS 1x και μεταφέρεται στον εργαστηριακό χώρο για τη διαδικασία απομόνωσης των ενδοθηλιακών κυττάρων. Υλικά και διαλύματα PBS (1X) ph : Na 2 HPO 4 10 mm KH 2 PO 4 2 mm NaCl 137 mm ΚCl 2.7 mm Το διάλυμα αποστειρώνεται και φυλάσσεται σε θερμοκρασία δωματίου. Διάλυμα κολλαγενάσης 1% κ.β. 100 mg κολλαγενάσης τύπου 1Α σε 10 ml θρεπτικού μέσου Μ199 Το διάλυμα φυλάσσεται στους -20 ο C μέχρι να χρησιμοποιηθεί. Θρεπτικό μέσο Μ199 για τα Huvec (αναφέρεται αναλυτικά στην παράγραφο με όλα τα θρεπτικά μέσα) Πλήρες θρεπτικό μέσο Μ199 για τα Huvec (αναφέρεται αναλυτικά στην παράγραφο με όλα τα θρεπτικά μέσα) 65

76 Υλικά και Μέθοδοι ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ 1. Ο ομφάλιος λώρος ανθρώπου λαμβάνεται υπό ασηπτικές συνθήκες, από γέννες που γίνονται με καισαρική τομή. Η απομόνωση των ενδοθηλιακών κυττάρων λαμβάνει χώρα στο εργαστήριο αμέσως μετά την άφιξη του λώρου. 2. Πραγματοποιείται αραίωση της κολλαγενάσης έως 100 φορές. Συγκεκριμένα λαμβάνονται 0,5 ml αρχικού διαλύματος κολλαγενάσης (1%) και αραιώνονται σε 50 ml θρεπτικού μέσου που περιέχει ιόντα ασβεστίου (Ca 2+ ) τα οποία θεωρούνται απαραίτητα για τη δράση του ενζύμου. Το θρεπτικό μέσο δεν πρέπει να έχει ορό γιατί αυτός περιέχει αναστολείς διαφόρων ενζύμων, μεταξύ αυτών και της κολλαγενάσης. Από τη στιγμή της αραίωσης του ενζύμου, αυτό διατηρείται για μικρό χρονικό διάστημα (μέχρι μια εβδομάδα στους 4 0 C). Ιδανικά όμως, η αραίωση πρέπει να γίνεται αμέσως πριν τη χρήση του ενζύμου. Η τελική συγκέντρωση της κολλαγενάσης αποτελεί ένα από τα σημαντικότερα στάδια στην απομόνωση των ενδοθηλιακών κυττάρων. 3. Ο ομφάλιος λώρος έχει δυο αρτηρίες και μια φλέβα. Η φλέβα βρίσκεται ανάμεσα στις αρτηρίες, είναι μεγαλύτερη, ευκολότερα διακριτή και επενδύεται από μαλακότερα τοιχώματα. Στο στάδιο αυτό σταθεροποιούμε τον ομφάλιο λώρο με αιμοστάτες και πραγματοποιείται η ανίχνευση της φλέβας. 4. Ξεπλένεται η φλέβα με αποστειρωμένο διάλυμα PBS 1Χ με τη βοήθεια μιας σύριγγας των 20 ml ώστε να απομακρυνθούν υπολείμματα αίματος και θρόμβοι. Ελέγχεται αν η φλέβα του ομφάλιου λώρου είναι ακέραια εφόσον τυχόν αλλοιώσεις του τοιχώματος της φλέβας καθιστούν αδύνατη την απομόνωση των κυττάρων. Επομένως, πριν την προσθήκη της κολλαγενάσης πρέπει να διασφαλιστεί ότι το τμήμα του λώρου που χρησιμοποιείται είναι ακέραιο. 5. Στη συνέχεια φράσσεται με τη βοήθεια του αιμοστάτη το ένα άκρο του ομφάλιου λώρου. 6. Από το άλλο (ελεύθερο) άκρο του ομφάλιου λώρου διοχετεύεται, χρησιμοποιώντας την σύριγγα των 20 ml, στη φλέβα το αραιωμένο διάλυμα της κολλαγενάσης με το θρεπτικό μέσο. Η φλέβα αρχίζει να διογκώνεται. Όταν η διόγκωση φτάσει στο κάτω άκρο του λώρου η διοχέτευση σταματά. 66

77 Υλικά και Μέθοδοι 7. Φράσσεται με έναν άλλο αιμοστάτη το επάνω άκρο του ομφάλιου λώρου. Σε αυτό το στάδιο ο ομφάλιος λώρος είναι ερμητικά κλεισμένος και από τα δυο άκρα του και περιέχει το διάλυμα της κολλαγενάσης. 8. Έπειτα ο ομφάλιος λώρος τοποθετείται σε αποστειρωμένο δοχείο και επωάζεται σε υδατόλουτρο στους 37 0 C για 20 λεπτά. 9. Αφαιρείται ο αιμοστάτης από τη μια πλευρά του ομφάλιου λώρου και το διάλυμα που περιέχεται στη φλέβα του (θρεπτικό μέσο με κολλαγενάση και αποκολλημένα κύτταρα HUVEC) συλλέγεται σε αποστειρωμένο σωληνάριο των 50 ml. 10. Αφαιρείται και ο δεύτερος αιμοστάτης από την άλλη πλευρά του ομφάλιου λώρου. 11. Ύστερα διοχετεύεται αποστειρωμένο PBS 1Χ μέσα στον ομφάλιο λώρο ξεπλένοντάς τον και το έκλουσμα συλλέγεται στο ίδιο αποστειρωμένο σωληνάριο που βρίσκονται τα αποκολλημένα κύτταρα. 12. Πραγματοποιείται φυγοκέντρηση των κυττάρων στα 28 Hz για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το υπερκείμενο απορρίπτεται και τα κύτταρα επαναιωρούνται σε 1 ml πλήρους θρεπτικού μέσου Μ Το εναιώρημα των κυττάρων μεταφέρεται σε τρυβλίο κατάλληλο για την καλλιέργεια κυττάρων το οποίο περιέχει ήδη 4 ml πλήρες θρεπτικό μέσο Μ199 και είναι επιστρωμένο κατάλληλα με διάλυμα ζελατίνης 1%. 14. Ακολουθεί η επώαση των κυττάρων σε κατάλληλες συνθήκες θερμοκρασίας, ατμόσφαιρας και υγρασίας (37 ο C, 5% CO 2 και 100% υγρασία). 15. Μία ημέρα αργότερα αφαιρείται το θρεπτικό μέσο από το τρυβλίο,ακολουθούν δύο ήπιες πλύσεις με PBS 1X και αντικατάσταση με 5 ml νέου πλήρους θρεπτικού μέσου Μ199. Η διαδικασία πραγματοποιείται για να απομακρυνθούν τα ερυθρά αιμοσφαίρια και άλλα κύτταρα που δεν έχουν προσκολληθεί στον πυθμένα του τρυβλίου και τα οποία είναι τοξικά για τα ζωντανά κύτταρα. 16. Παρατηρείται η καλλιέργεια στο μικροσκόπιο και εάν η απομόνωση είναι επιτυχής, διακρίνονται συσσωματώματα κυττάρων τα οποία είναι προσκολλημένα στον πυθμένα του τρυβλίου. 67

78 Υλικά και Μέθοδοι 17. Η επώαση των κυττάρων γίνεται με ανανέωση του θρεπτικού μέσου τους κάθε 3 ημέρες, έως ότου επιτευχθεί 80-90% κάλυψη του πυθμένα του τρυβλίου (πλήρης κάλυψη). 2. Παρασκευή πλήρους θρεπτικού μέσου για HUVEC Υλικά και Διαλύματα Θρεπτικό μέσο Μ199: M199 (earl s) 500 ml Πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη 100 ΙU/ml Γενταμυκίνη 50 μg/ml Αμφοτερικίνη 2.5 μg/ml L-γλουταμίνη 2,5 mm Πλήρες θρεπτικό μέσο για HUVEC: M199* 85% κ.ό. Ορός εμβρύου βοός (FBS, Fetal Bovine Serum) 15% κ.ό. ECGS (Endothelial Cell Growth Supplement) 150 μg/ml Ηπαρίνη 5 U/ml Το εκχύλισμα ECGS είναι εμπλουτισμένο σε αυξητικό παράγοντα των ινοβλαστών (FGF) και είναι απαραίτητο για την ικανοποιητική ανάπτυξη των HUVEC. Η ηπαρίνη χρησιμοποιείται για να ενεργοποιηθεί ο ECGS. Το θρεπτικό μέσο αποστειρώνεται με διοχέτευσή του με σύριγγα των 20 ml μέσα από φίλτρο με πόρους που έχουν διάμετρο 0,2 μm και φυλάσσεται στους 4 ο C. 68

79 Υλικά και Μέθοδοι 3. Θρεπτικά μέσα των χρησιμοποιούμενων κυττάρων Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν καλλιέργειες κυττάρων HUVEC, κυττάρων C6 (γλοιώματος αρουραίου) και κυττάρων ωοθηκών Κινέζικων χάμστερ (Chinese hamster ovary, CHO) σταθερά μετασχηματισμένων με πλασμίδιο για την έκφραση της υπομονάδας β 3 της ιντεγκρίνης α ν β 3 τόσο αγρίου τύπου (wtβ 3 ) ή μετασχηματισμένων μόνο με το πλασμίδιο φορέα (vector). Σε όλα τα θρεπτικά μέσα που χρησιμοποιήθηκαν προστέθηκαν τα ακόλουθα αντιβιοτικά: Πενικιλίνη/Στρεπτομυκίνη 100 ΙU/ml, Γενταμυκίνη 50 μg/ml, Αμφοτερικίνη 2,5 μg/ml, καθώς και L-Γλουταμίνη 2,5 mm ως πηγή ενέργειας και αζώτου. Τα αντιβιοτικά πενικιλίνη/στρεπτομυκίνη και γενταμυκίνη προστατεύουν από βακτήρια και η αμφοτερικίνη από μύκητες. Όλες οι καλλιέργειες πραγματοποιήθηκαν σε 37 ο C, 5% CO 2 και 100% υγρασία. HUVEC M199 Earles FBS 15% κ.ό. ECGS 150 μg/ml και Ηπαρίνη 5 U/ml C6 Ham s F12 90% κ.ό. FBS 10% κ.ό. CHO Dulbecco s modified Eagle medium (DMEM) 90% κ.ό. FBS 10% κ.ό. 69

80 Υλικά και Μέθοδοι 4. Ανακαλλιέργεια κυττάρων Όσον αφορά στην ανακαλλιέργεια των κυττάρων HUVEC, πριν ξεκινήσει η διαδικασία πραγματοποιείται επίστρωση των τρυβλίων με διάλυμα ζελατίνης 1%. Ύστερα τα τρυβλία μεταφέρονται στον επωαστικό θάλαμο και επωάζονται για χρόνο τουλάχιστον 20 λεπτά, ώστε η ζελατίνη να δεσμευθεί στον πυθμένα τους. Με αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται η καλύτερη δέσμευση των HUVEC στο τρυβλίο. Την επώαση ακολουθεί μία πλύση με διάλυμα PBS 1Χ για την απομάκρυνση της περίσσειας ζελατίνης και ξεκινάει η διαδικασία της ανακαλλιέργειας η οποία έχει ως εξής: 1. Η ανακαλλιέργεια πραγματοποιείται όταν τα κύτταρα έχουν καλύψει το 80-90% της επιφάνειας του τρυβλίου. Αυτός ο προσδιορισμός γίνεται με παρατήρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο. Κύτταρα υγιή θεωρούνται αυτά που είναι προσκολλημένα στον πυθμένα του τρυβλίου χωρίς να έχει αλλάξει η μορφολογία τους. 2. Το τρυβλίο μεταφέρεται με τα κύτταρα σε θάλαμο νηματικής ροής, όπου είναι δυνατή η επεξεργασία τους σε στείρες συνθήκες. Αναρροφάται το θρεπτικό μέσο της καλλιέργειας με τη βοήθεια κενού και τα κύτταρα ξεπλένονται τρεις φορές με PBS 1X. Με την διαδικασία αυτή απομακρύνεται καλά το πλήρες θρεπτικό μέσο. 3. Στη συνέχεια προστίθεται 1 ml τρυψίνης ανά τρυβλίο διαμέτρου 100 mm ή 0,5 ml τρυψίνης ανά τρυβλίο διαμέτρου 60 mm. Η τρυψίνη είναι πρωτεολυτικό ένζυμο και διασπά διακυτταρικές ή κυττάρου-υποστρώματος συνδέσεις. Η πορεία αποκόλλησης των κυττάρων παρακολουθείται στο μικροσκόπιο όπου τα κύτταρα αποκτούν σφαιρική δομή και αποκολλώνται από το υπόστρωμα. Ωστόσο τα κύτταρα διατρέχουν μεγάλο κίνδυνο αν παραμείνουν περισσότερο από 10 λεπτά στην τρυψίνη. 4. Με την ολοκλήρωση της αποκόλλησης των κυττάρων από το τρυβλίο, αναστέλλεται η δράση της τρυψίνης με την προσθήκη 1ml πλήρους θρεπτικού μέσου της εκάστοτε κυτταρικής σειράς που περιέχει 10% ορό. Ο ορός είναι αυτός που περιέχει αναστολείς πρωτεασών και άρα σταματά τη δράση της τρυψίνης έτσι ώστε τα κύτταρα να διατηρηθούν ακέραια. 70

81 Υλικά και Μέθοδοι 5. Μεταφέρεται το εναιώρημα των κυττάρων σε αποστειρωμένο σωληνάριο των 15 ml και ακολουθεί φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στα 28 Hz σε θερμοκρασία δωματίου. 6. Ύστερα απομακρύνεται το υπερκείμενο θρεπτικό μέσο με τη βοήθεια κενού και προστίθεται πλήρες θρεπτικό μέσο μέχρι τελικό όγκο 3 ml. Η επαναιώρηση των κυττάρων γίνεται με την βοήθεια πιπέτας. 7. Με τη βοήθεια πιπέτας επίσης τοποθετούνται 10 μl από το εναιώρημα των κυττάρων στην ειδική θέση του αιματοκυτταρόμετρου και πραγματοποιείται μέτρηση του αριθμού των κυττάρων στο μικροσκόπιο. 8. Για κάθε ανακαλλιέργεια κυττάρων HUVEC/C6/CHO χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα/ml πλήρους θρεπτικού μέσου, εκτός από τις περιπτώσεις που τα κύτταρα θα χρησιμοποιηθούν σε ειδικά πειράματα. 5. Μέτρηση κυττάρων σε αιμοκυτταρόμετρο Neubauer Η μέτρηση κυττάρων σε αιματοκυτταρόμετρο (Eικόνα 1) είναι η πιο άμεση, απλή και αποδοτική μέθοδος μέτρησης κυττάρων που βρίσκονται σε εναιώρημα. Το αιματοκυτταρόμετρο είναι μια τροποποιημένη αντικειμενοφόρος πλάκα που έχει δύο κατάλληλα επεξεργασμένες λείες επιφάνειες. Σε κάθε μία από αυτές διακρίνεται ένα τετράγωνο πλέγμα το οποίο αποτελείται από 9 επιμέρους τετράγωνα με μήκος πλευράς 1 mm (εμβαδόν τετραγώνου 1 mm 2 ). Το κάθε ένα τετράγωνο ορίζεται από τρείς παράλληλες γραμμές που απέχουν μεταξύ τους 2,5 μm, και οι οποίες χρησιμεύουν για τον καθορισμό της θέσης των κυττάρων εντός ή εκτός του πλέγματος. Επίσης κάθε ένα από τα αρχικά τετράγωνα περιέχει επιπλέον διαβαθμίσεις για να διευκολύνεται έτσι η μέτρηση των κυττάρων. Το επίπεδο του πλέγματος βρίσκεται 0,1 mm χαμηλότερα από δύο «ράχες» στις οποίες στηρίζεται η καλυπτρίδα. Υπάρχει μια κοίλη επιφάνεια μεταξύ της εξωτερικής πλευράς κάθε τετραγωνισμένης λείας επιφάνειας και των σημείων που στηρίζεται η καλυπτρίδα. Στην κοίλη αυτή επιφάνεια μεταφέρεται το κυτταρικό εναιώρημα, το οποίο με τριχοειδικά φαινόμενα απλώνεται στην τετραγωνισμένη επιφάνεια. Ο όγκος του κυτταρικού εναιωρήματος που θα καλύπτει ένα από τα 71

82 Υλικά και Μέθοδοι εννέα τετράγωνα είναι 0,1 mm 3 (1 mm 2 x 0.1 mm) ή 1 x 10-4 ml. Έτσι η συγκέντρωση των κυττάρων στο κυτταρικό εναιώρημα (κύτταρα/ml) είναι: Ο μέσος όρος από τα 2 κεντρικά τετράγωνα Χ Εικόνα 1. Πλακίδιο Neubauer. Παρουσιάζεται σχηματικά ο τρόπος υπολογισμού των κυττάρων. 6. Κατάψυξη κυττάρων Η διατήρηση των ζωικών κυττάρων για μεγάλο χρονικό διάστημα είναι δυνατή με την αποθήκευσή τους σε υγρό άζωτο, σε θερμοκρασίες μεταξύ C και C. Για μικρότερο χρονικό διάστημα (λίγους μήνες), μπορούν να διατηρηθούν και σε θερμοκρασίες -80 ο C. Για να πραγματοποιηθεί με επιτυχία η διατήρησή τους τα κύτταρα θα πρέπει να βρίσκονται σε καλή μεταβολική κατάσταση πριν την ψύξη, για το λόγο αυτό και η διαδικασία κατάψυξης των κυττάρων πραγματοποιείται όταν αυτά έχουν καλύψει το 80-90% της επιφάνειας του τρυβλίου. Για την επιτυχή κατάψυξή των κυττάρων, απαραίτητη είναι η σταδιακή ψύξη τους (περίπου 1 ο C ανά ώρα), μέχρι ένα κρίσιμο σημείο θερμοκρασίας, -20 ο C κάτι που επιτυγχάνεται με τη χρήση μιας συσκευής με κατάλληλες υποδοχές, η οποία περιέχει ισοπροπανόλη. Για την αποφυγή δημιουργίας πάγου στο εσωτερικό των 72

83 Υλικά και Μέθοδοι κυττάρων χρησιμοποιείται διμεθυλο-σουλφοξείδιο (dimethyl-sulfoxide, DMSO) ή γλυκερόλη. Η διαδικασία της κατάψυξης έχει ως εξής: 1. Αποκόλληση των κυττάρων με τρυψίνη (όπως αναφέρθηκε στη διαδικασία της ανακαλλιέργειας). 2. Φυγοκέντρηση για 5 στα 28 Hz σε θερμοκρασία δωματίου. 3. Ενώ πραγματοποιείται η φυγοκέντρηση, προστίθενται σε ένα ειδικό φιαλίδιο 50 μl DMSO στο οποίο πάνω σημειώνεται ο κυτταρικός τύπος, η γενιά που θα είναι τα κύτταρα όταν ξεπαγώσουν και η ημερομηνία ψύξης τους. 4. Μετά την ολοκλήρωση της φυγοκέντρησης αφαιρούμε το υπερκείμενο θρεπτικό μέσο και προσθέτουμε 950 μl ορού για να επαναιωρήσουμε το ίζημα των κυττάρων. 5. Προσθήκη του εναιωρήματος των κυττάρων στο φιαλίδιο που περιέχει τα 50μl DMSO και στη συνέχεια ακολουθεί πολύ καλή ανάδευση για να γίνει ομοιογενές το διάλυμα. 6. Ακολουθεί άμεση μεταφορά του στο δοχείο ψύξης των κυττάρων με την ισοπροπανόλη. Οι κινήσεις πρέπει να είναι σύντομες, γιατί το DMSO είναι τοξικό για τα κύτταρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η τελική συγκέντρωση του DMSO δεν πρέπει να υπερβαίνει το 20% στο τελικό διάλυμα για να αποφευχθούν προβλήματα τοξικότητας. 7. Τοποθέτηση του δοχείου ψύξης των κυττάρων στους C για 24 ώρες. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται η σταδιακή μείωση της θερμοκρασίας (περίπου 1 0 C ανά ώρα). 8. Τέλος τοποθετούμε το ειδικό φιαλίδιο με τα κύτταρα σε ειδικές υποδοχές στο υγρό άζωτο, έως ότου απαιτηθεί η επαναχρησιμοποίησή τους. Υλικά και διαλύματα Τα υλικά που χρησιμοποιούνται στην ανωτέρω διαδικασία είναι τα εξής: DMSO (dimethylsulfoxide, διμέθυλο-σουλφοξύδιο). Πλήρες θρεπτικό μέσο για τα εκάστοτε κύτταρα. 73

84 Υλικά και Μέθοδοι Ορός εμβρύου βοός (fetal bovine serum, FBS). Ειδικά φιαλίδια για την ψύξη των κυττάρων (cryovials). Δοχείο ψύξης κυττάρων με ισοπροπανόλη. Δοχείο dewar με υγρό άζωτο και ειδικές υποδοχές για την αποθήκευση των φιαλιδίων με τα κύτταρα. 7. Απόψυξη Κυττάρων Τα κύτταρα που είναι αποθηκευμένα στο υγρό άζωτο είναι δυνατόν να επανακαλλιεργηθούν. Η διαδικασία της απόψυξης γίνεται υπό άσηπτες συνθήκες και όσο το δυνατόν ταχύτερα, προκειμένου να μειωθεί ο χρόνος έκθεσης των κυττάρων στο DMSO, το οποίο είναι τοξικό σε θερμοκρασία δωματίου. Η διαδικασία απόψυξης των κυττάρων έχει ως εξής: 1. Σε δοκιμαστικό σωλήνα των 15 ml προστίθενται 9 ml απλού θρεπτικού μέσου των εκάστοτε κυττάρων.. 2. Μεταφορά των κυττάρων στo σωλήνα με τα 9 ml και γρήγορη ανάδευση. Το στάδιο αυτό αποσκοπεί στην αραίωση του DMSO στο θρεπτικό μέσο όπου βρίσκονται τα κύτταρα. 3. Φυγοκέντρηση στα 28 Hz για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 4. Αναρρόφηση του υπερκειμένου και προσθήκη 1 ml πλήρους θρεπτικού μέσου για επαναιώρηση του ιζήματος. 5. Μεταφορά του εναιωρήματος σε τρυβλίο που περιέχει 10ml πλήρους θρεπτικού μέσου. 6. Παρατήρηση στο μικροσκόπιο και μεταφορά σε θάλαμο επώασης όπου αναπτύσσονται τα κύτταρα. 7. Αλλαγή πλήρους θρεπτικού μέσου κάθε 3 ημέρες μέχρι τα κύτταρα να φθάνουν σε βαθμό επικάλυψης του τρυβλίου 80-90%. 74

85 Υλικά και Μέθοδοι Υλικά και διαλύματα Τα υλικά που χρησιμοποιούνται στην ανωτέρω διαδικασία είναι τα εξής: Θρεπτικό μέσο της κάθε κυτταρικής σειράς (περιγράφηκε νωρίτερα). Πλήρες θρεπτικό μέσο της κάθε κυτταρικής σειράς (περιγράφηκε νωρίτερα). Γυάλινες αποστειρωμένες πιπέτες Pasteur για την αναρρόφηση του θρεπτικού. 8. Απομόνωση πρωτεϊνών από καλλιέργειες ευκαρυωτικών κυττάρων Η απομόνωση των πρωτεϊνών από παγωμένες και μη κυτταροκαλλιέργειες γίνεται σε περιπτώσεις όπου ακολουθεί ανοσοκατακρήμνιση. Η λύση των κυττάρων γίνεται με το κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα το οποίο περιέχει αναστολείς που αποτρέπουν την πρωτεόλυση, αποφωσφορυλίωση και μετουσίωση των δειγμάτων ενώ όλη η διαδικασία πραγματοποιείται στον πάγο για να αποφευχθεί η καταστροφή του πρωτεϊνικού εκχυλίσματος. Η διαδικασία της απομόνωσης έχει ως εξής: 1. Απομακρύνετα το θρεπτικό μέσο της καλλιέργειας με την βοήθεια γυάλινης πιπέτας Pasteur υπό κενό. 2. Γίνεται έκπλυση των κυττάρων 3 φορές με PBS 1Χ στους 4 0 C. 3. Προστίθενται 600 μl ψυχρού διαλύματος RIPA ανά τρυβλίο 100 mm ή 300 μl ψυχρού διαλύματος RIPA ανά τρυβλίο 60 mm, στους 4 0 C. 4. Στη συνέχεια τα τρυβλία παραμένουν στον πάγο σε οριζόντια θέση για 10 λεπτά, ώστε να μεγιστοποιηθεί η ποσότητα του πρωτεϊνικού εκχυλίσματος. Το διάλυμα RIPA πρέπει να καλύπτει ιδανικά το τρυβλίο αλλιώς πρέπει να πραγματοποιούνται τακτικές αναδεύσεις των τρυβλίων. 75

86 Υλικά και Μέθοδοι 5. Ύστερα πραγματοποιείται λύση των κυττάρων με μηχανικό τρόπο (cell scraper) σε πάγο. 6. Μεταφέρεται το ομογενοποιήμα σε σωληνάρια τύπου eppendorf και φυγοκεντρείται στα g για 30 λεπτά στους 4 0 C. 7. Μεταφέρεται το υπερκείμενο σε νέο σωληνάριο τύπου eppendorf και ακολουθεί προσδιορισμός των ολικών πρωτεϊνών στο δείγμα με τη μέθοδο Bradford η οποία θα αναλυθεί παρακάτω. Υλικά και διαλύματα Τα υλικά που χρησιμοποιούνται στην ανωτέρω διαδικασία είναι τα εξής: Αποστειρωμένο PBS (1X) ph : Na 2 HPO 4 10 mm KH 2 PO 4 2 mm NaCl 137 mm ΚCl 2.7 mm Διάλυμα RIPA (Radio Immunoprecipitation Assay buffer) NaCl 150 mm Triton X % sodium deoxycholate 0.5% SDS (sodium dodecyl sulphate) 0.1% 50 mm Tris ph 8.0 PMSF 1 mm (αναστολέας πρωτεασών σερίνης) EDTA 5 mm (αναστολέας μεταλλοπρωτεασών) Απροτινίνη 1μg/ml (αναστολέας πρωτεασών σερίνης) Na 3 VO 4 20 nm (αναστολέας τυροσινικής φωσφατάσης) Το διάλυμα RIPA διατηρείται για καιρό στους 4 0 C και κάθε φορά που πρόκειται να χρησιμοποιηθεί προστίθενται οι διάφοροι αναστολείς στις συγκεντρώσεις που αναφέρονται πιο πάνω. 76

87 Υλικά και Μέθοδοι 9. Προσδιορισμός της συγκέντρωσης ολικών πρωτεϊνών σε διάλυμα (Μέθοδος Bradford) Η μέθοδος Bradford είναι μία από τις πιο απλές μεθόδους που χρησιμοποιούνται συνήθως για τον προσδιορισμό των ολικών πρωτεϊνών ενός δείγματος. Η μέθοδος βασίζεται στην αναλογική σύνδεση της χρωστικής Coomassie G-250 στα βασικά αμινοξέα των πρωτεΐνων. Οπότε όσο περισσότερες πρωτεΐνες υπάρχουν στο διάλυμα τόσο μεγαλύτερο ποσοστό χρωστικής δεσμεύεται και καθώς η μέθοδος είναι χρωματομετρική όσο αυξάνει η συγκέντρωση της πρωτεΐνης, τόσο το χρώμα του δείγματος γίνεται πιο σκούρο. Η χρωστική Coomassie G-250 απορροφά στα 595 nm στο ορατό φως. Για τον ακριβή υπολογισμό της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης με βάση την οπτική απορρόφηση, κατασκευάζεται πρότυπη καμπύλη με γνωστές συγκεντρώσεις αλβουμίνης ορού βοός (bovine serum albumin BSA). Η αλβουμίνη πρέπει να είναι διαλυμένη στο ίδιο διάλυμα που είναι και οι πρωτεΐνες, των οποίων η συγκέντρωση υπολογίζεται. Η διαδικασία του προσδιορισμού των ολικών πρωτεϊνών έχει ως εξής: 1. Προστίθενται 2 μl εκχυλίσματος κυτταροκαλλιέργειας σε 998 μl διαλύματος Bradford αντίστοιχα. 2. Ακολουθεί ανάδευση του δείγματος σε αναδευτήρα τύπου vortex. 3. Τα δείγματα επωάζονται για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 4. Ακολουθεί φωτομέτρηση των δειγμάτων στα 595 nm σε φασματοφωτόμετρο απλής δέσμης. 5. Στη συνέχεια υπολογίζεται η συγκέντρωση των πρωτεϊνών στο δείγμα, μέσω της πρότυπης καμπύλης της αλβουμίνης (BSA). 6. Τέλος μεταφέρεται συγκεκριμένη ποσότητα πρωτεΐνης σε σωληνάρια τύπου eppendorf (όση απαιτείται κάθε φορά) για πειράματα ανοσοκατακρήμνισης με αντισώματα έναντι συγκεκριμένων πρωτεϊνών. 77

88 Υλικά και Μέθοδοι 10. Ανοσοκατακρήμνιση Η ανοσοκατακρήμνιση είναι μία μέθοδος που επιτρέπει τον καθαρισμό μιας πρωτεΐνης από ένα διάλυμα ολικών πρωτεϊνών, αυτό επιτυγχάνεται με ένα αντίσωμα ειδικό για την πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει το οποίο έχει την ικανότητα να συνδέεται με την υπό μελέτη πρωτεΐνη μέσα σε ένα διάλυμα εκχύλισης. Στη συνέχεια το σύμπλοκο αντισώματος / αντιγόνου μπορεί να απομονωθεί από το διάλυμα χρησιμοποιώντας σφαιρίδια αγαρόζης τα οποία είναι συζευγμένα με πρωτεΐνη Α ή G. Με τη χρήση τους δημιουργείται ένα σύμπλοκο σφαιριδίωνπρωτεΐνης Α/G-αντισώματος, στο οποίο δεσμεύεται επιλεκτικά το αντιγόνο που θέλουμε να κατακρημνίσουμε. Το σύμπλοκο αυτό απομονώνεται με φυγοκέντρηση και οι πρωτεΐνες που υπάρχουν σε αυτό αποδεσμεύονται με τη χρήση αποδιατακτικών παραγόντων. Το δείγμα μπορεί στη συνέχεια να διαχωριστεί με SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση για ανάλυση κατά Western. Το ενδιαφέρον της μεθόδου είναι ότι και πρωτεΐνες που φυσιολογικά αλληλεπιδρούν με την αρχική, επίσης δεσμεύονται στο ίδιο σύμπλοκο. Το γεγονός αυτό καθιστά τη μέθοδο χρήσιμη για μελέτες αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών. Η διαδικασία της ανοσοκατακρήμνισης έχει ως εξής: 1. Αρχικά μεταφέρεται η ποσότητα της πρωτεΐνης που πρόκειται να ανοσοκατακρημνισθεί σε σωληνάρια τύπου eppendorf των 1,5 ml αφού πρώτα γίνει προσδιορισμός της συγκέντρωσης των ολικών πρωτεϊνών του δείγματος με την μέθοδο της Bradford. 2. Στη συνέχεια προστίθεται το κατάλληλο αντισώμα σε ποσότητα ανάλογη με την ποσότητα της πρωτεΐνης, ενώ ψυχρό διάλυμα PBS 1Χ προστίθεται μέχρι ο όγκος του μίγματος να είναι ο ίδιος σε όλα τα δείγματα. Η διαδικασία αυτή γίνεται για να υπάρχει η ίδια κινητική δέσμευσης της πρωτεΐνης. 3. Το δείγμα αφήνεται υπό ανάδευση για 16 ώρες στους 4 0 C και στο στάδιο αυτό πραγματοποιείται η δέσμευση του αντισώματος στην αντίστοιχη πρωτεΐνη. 4. Έπειτα προστίθενται στα σωληνάρια 15 μl (ανά 1 μg αντισώματος) εναιωρήματος σφαιριδίων πρωτεΐνης Α και πρωτεΐνης G. 78

89 Υλικά και Μέθοδοι 5. Τα δείγματα επωάζονται για 2 ώρες στους 4 0 C υπό α νάδευση όπου πραγματοποιείται η δέσμευση του συμπλόκου πρωτεΐνης-αντισώματος με τα σφαιρίδια. 6. Μετά ακολουθεί φυγοκέντρηση του δείγματο ς στα g για 5 λεπτά στους 4 0 C. 7. Το υπερκείμενο απορρίπτεται. 8. Προστίθεται 1 m l ψυχρού PBS 1Χ ανά σωληνά ρ ιο (επαναιώρηση των σφαιριδίων). 9. Η φυγοκέντρηση και η απόρριψη του υπερκε ι μένου επαναλαμβάνονται ακόμα 2 φορές. 10. Στο ίζημα των σφαιριδίων που έχει απομείνει προστίθενται 50 μl διαλύματος λύσης (2x) με 10% DTT ή β-μερκαπτοαιθανόλη. 11. Τα σωληνάρια θερμαίνονται στους C για 5 λεπτά. Στα στάδια 11-12, λαμβάνει χώρα η αποδέσμευση των πρωτεϊνών από τα σφαιρίδια. 12. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα g για 1 λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου. 13. Το υπερκείμενο μεταφέρεται σε νέα σωληνάρια τύπου eppendorf και γίνεται απόρριψη των σφαιριδίων. 14. Τέλος τα δείγματα αναλύονται σε W estern blot. Υλικά και διαλύματα Τα υλικά που χρησιμοποιούνται στην ανωτέρω διαδικασία είναι τα εξής: Αποστειρωμένο PBS (1X) ph : Na 2 HPO 4 10 mm KH 2 PO 4 2 mm NaCl 137 mm ΚCl 2.7 mm 79

90 Υλικά και Μέθοδοι Εναιώρημα σφαιριδίων αγαρόζης με πρωτεΐνη A (Calbiochem, Cat. No. IP02) Εναιώρημα σφαιριδίων αγαρόζης με πρωτεΐνη G (Calbiochem, Cat. No. IP04) (2x) διάλυμα δειγμάτων (sample loading buffer) Tris-HCl ph M SDS 0.03 M Γλυκερόλη 10% κ.ό. Κυανούν της βρωμοφαινόλης 2% κ.ό. β-μερκαπτοαιθανόλη ή DTT 10% κ.ό. (προστίθεται λίγο πριν τη χρήση) Αντισώματα Πρωτεΐνη Εταιρία Κωδικός Ποσότητα CDK5 Santa Cruz C-8 1 μg/0,5 mg πρωτεΐνης p35 Santa Cruz A-18 1 μg/0,5 mg πρωτεΐνης RPTPβ/ζ Santa Cruz C-19 3 μg/3 mg πρωτεΐνης α ν β 3 Chemicon MAB1976Z 3 μg/3 mg πρωτεΐνης IgG Sigma I ,5μg/3 mg πρωτεΐνης Πίνακας 1. Παρατίθενται τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοκατακρήμνιση στην παρούσα εργασία. Στις στήλες από αριστερά προς τα δεξιά αναγράφεται η πρωτεΐνη έναντι της οποίας πραγματοποιήθηκε η ανοσοκατακρήμνιση, η εταιρία παραγωγής, ο κωδικός του προϊόντος και η ποσότητα του αντισώματος που χρησιμοποιήθηκε ανά mg πρωτεΐνης. 80

91 Υλικά και Μέθοδοι 11. Ανάλυση πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακριλαμιδίου με αποδιατακτικές συνθήκες (SDS- PAGE) Η ανάλυση των πρωτεϊνών με τη διαδικασία της ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου βασίζεται στη μετακίνηση φορτισμένων μορίων σε ηλεκτρικό πεδίο ώσπου τελικά επτιτυγχάνεται ο διαχωρισμός τους. Οι τρεις παράγοντες που επηρεάζουν τη μετακίνηση του μορίου στο πεδίο είναι η ένταση του ηλεκτρικού πεδίου (Ε), το καθαρό φορτίο της πρωτεΐνης (z) και ο συντελεστής τριβής (f). Ο ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός γίνεται σε πήκτωμα το οποίο λειτουργεί ως μοριακός ηθμός. Το πήκτωμα της πολυακρυλαμίδης είναι ένα τρισδιάστατο πλέγμα από μακριές αλειφατικές αλυσίδες πολυακρυλαμίδης Τα πηκτώματα πολυακρυλαμίδης είναι τα καταλληλότερα για ηλεκτροφόρηση γιατί αποτελούνται από χημικά ουδέτερες ενώσεις και σχηματίζονται εύκολα. Τα μικρότερα μόρια μετακινούνται πιο εύκολα διαμέσου των πόρων του πηκτώματος, ενώ τα μεγαλύτερα καθυστερούν. Μόρια ενδιαμέσου μεγέθους μετακινούνται με διαφορετικές ταχύτητες. Η πορεία που ακολουθείται έχει ως εξής: 1. Αρχικά συναρμολογείται η συσκευή του πηκτώματος. 2. Στη συνέχεια παρασκεύαζεται το πήκτωμα διαχωρισμού. Ανάλογα με το μοριακό βάρος της υπό εξέταση πρωτεΐνης, παρασκευάζεται πήκτωμα διαχωρισμού με συγκεκριμένη συγκέντρωση ακρυλαμιδίου. Η συγκέντρωση ακρυλαμιδίου αυξάνει όσο μειώνεται το μοριακό βάρος της υπό μελέτη πρωτεΐνης. Τα πηκτώματα που χρησιμοποιούνται στην παρούσα εργασία παρατίθενται παρακάτω στον πίνακα. 3. Αφού τοποθετηθεί το πήκτωμα στην συσκευή ακολουθεί η προσθήκη 1-2 ml απεσταγμένου νερού. Το υπερκείμενο νερό διευκολύνει τη συμπαγή δομή του πηκτώματος και σταθεροποιεί την επάνω επιφάνειά του. 4. Μετά το πήξιμο του πηκτώματος διαχωρισμού απομακρύνεται το νερό και ακολουθεί η παρασκευή του πηκτώματος πακεταρίσματος. 5. Προσθήκη ειδικού εξαρτήματος (χτενάκι) που χρησιμεύει στη δημιουργία θέσεων προσθήκης του δείγματος στο πήκτωμα πακεταρίσματος. 81

92 Υλικά και Μέθοδοι Πυκνότητα πηκτώματος Απεσταγμένο H2O Ακρυλαμίδιο 30% Tris-HCl 1.5M ph % ml ml 2.5 ml 10% SDS 100 μl 20% AMPS 100 μl TEMED 10 μl Πίνακας 2: Σύσταση των πηκτωμάτων διαχωρισμού. 6. Ύστερα παρασκευάζεται το πήκτωμα πακεταρίσματος. Η συγκέντρωσή του εξαρτάται από τη συγκέντρωση του πηκτώματος διαχωρισμού. Η σύστασή του παρατίθεται παρακάτω στον πίνακα. 7. Προστίθεται το πήκτωμα πακεταρίσματος στη συσκευή και αφήνεται να πολυμεριστεί για λεπτά. 8. Σε αυτό το χρονικό διάστημα είναι εφικτή η προετοιμασία των δειγμάτων τα οποία συνήθως φυλάσσονται στους C. 9. Θέρμανση των δειγμάτων στους C για χρόνο 5 λεπτά. 10. Φυγοκέντρηση στα g για 1 λ επτό σε θερμοκρασία δωματίου. Πυκνότητα πηκτώματος 3.5% 5% Απεσταγμένο H2O 2.45 ml 2.25 ml Ακρυλαμίδιο 30% ml 0.67 ml Tris-HCl 0.5M ph ml 1.0 ml 10% SDS 40 μl 40 μl 20% AMPS 40 μl 40 μl TEMED 4 μl 4 μl Πίνακας 3: Σύσταση πηκτωμάτων πακεταρίσματος. 82

93 Υλικά και Μέθοδοι 11. Μετά τον πολυμερισμό του πηκτώματος πακεταρίσματος, απομακρύνεται το ειδικό εξάρτημα (χτενάκι) και μεταφέρεται η συσκευή του πηκτώματος στη συσκευή ηλεκτροφόρησης. 12. Μεταφέρεται συγκεκριμένη ποσότητα ολικής πρωτεΐνης από κάθε δείγμα στις θέσεις-υποδοχές του ειδικού εξαρτήματος στο πήκτωμα πακεταρίσματος. 13. Εφαρμόζεται σταθερή τάση 100 Volt, με σκοπό τη μετακίνηση των δειγμάτων από τον αρνητικό προς στο θετικό πόλο του συστήματος. Η απόσταση που διανύει η κάθε πρωτεΐνη στο πήκτωμα διαχωρισμού είναι αντιστρόφως ανάλογη της μοριακής μάζας της. 14. Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφόρησης, ακολουθεί η ανάλυση κατά Western. Εικόνα 2: Σχηματική απεικόνιση διαδικασίας SDS-PAGE ηλεκτροφόρησης. Υλικά και διαλύματα Διάλυμα ακρυλαμιδίου 30% κ.β. Ακρυλαμίδιο Μεθυλενo-δις-ακρυλαμίδιο 30 g 1 g Προσθήκη απεσταγμένου νερού μέχρι ο τελικος όγκος να φτάσει στα 100 ml. Φιλτράρισμα του διαλύματος με την βοήθεια ειδικών φίλτρων. Tris-HCl 1.5M, ph 8.8 Tris-base g Απεσταγμένο νερό 83

94 Υλικά και Μέθοδοι Αρχική προσθήκη 80 ml απεσταγμένου νερού, ρύθμιση του διαλύματος σε ph=8.8 και προσθήκη απεσταγμένου νερού μέχρι ο τελικός όγκος να φτάσει 100 ml. Tris-HCl 0.5M, ph 6.8 Tris-base g Απεσταγμένο νερό Αρχική προσθήκη 80 ml απεσταγμένου νερού, ρύθμιση του διαλύματος σε ph=6.8 και προσθήκη απεσταγμένου νερού μέχρι ο τελικός όγκος να φτάσει 100 ml. SDS 10 g Διάλυμα δωδεκακυλοθειικού νατρίου (SDS) 10% κ.β. Απεσταγμένο νερό Αρχική προσθήκη 80 ml απεσταγμένου νερού, θέρμανση στους 68 0 C και προσθήκη απεσταγμένου νερού μέχρι ο τελικός όγκος να φτάσει τα 100 ml. Διάλυμα υπερθειϊκού αμμωνίου (AMPS) 20% κ.β. Υπερθειϊκό αμμώνιο 0,2g Απεσταγμένο νερό Προσθήκη 0,2 g υπερθειϊκού αμμωνίου σε σωληνάριο (eppendorf) και προσθήκη απεσταγμένου νερού μέχρι το 1 ml. Φύλαξη στους 4 0 C για διάστημα 1-2 εβδομάδων. Ν,Ν,Ν,Ν -Τετραμεθυλ-αιθυλεν-διαμίνη(N,N,N,N -Tetramethylenethylene-diamine, TEMED) Φύλαξη σε σκούρο μπουκάλι σε θερμοκρασία δωματίου. (2x) διάλυμα δειγμάτων (sample loading buffer) Tris-HCl ph M SDS 0.03 M Γλυκερόλη 10% κ.ό. Κυανούν της βρωμοφαινόλης 2% κ.ό. β-μερκαπτοαιθανόλη ή DTT 10% κ.ό. 84

95 Υλικά και Μέθοδοι Ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροδίων (5x) (Running Buffer) Γλυκίνη 2 Μ Tris-base 0.25 M SDS 0.02 M Αραίωση του διαλύματος με απεσταγμένο νερό 1:5 πριν τη χρήση του. 12. Ανάλυση πρωτεϊνών κατά Western Η ανάλυση κατά Western είναι μία τεχνική ανάλυσης που χρησιμοποιείται ευρέως για την ανίχνευση ειδικών πρωτεϊνών από ένα δεδομένο δείγμα. Η τεχνική αυτή βασίζεται στην ηλεκτροφόρηση πηκτωμάτων για τον διαχωρισμό των μετουσιωμένων πρωτεϊνών ενώ στην συνέχεια οι πρωτεΐνες αυτές μεταφέρονται σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης ή PVDF όπου και ανιχνεύονται χρησιμοποιώντας αντισώματα ειδικά για την υπό εξέταση πρωτεΐνη. Η διαδικασία έχει ως εξής: 1. Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφόρησης, η οποία περιγράφηκε νωρίτερα, ακολουθεί η τοποθέτηση του πηκτώματος διαχωρισμού σε κατάλληλη συσκευή (sandwich) για τη μεταφορά των πρωτεϊνών από το πήκτωμα σε μεμβράνη PVDF η οποία έχει προηγουμένως ενεργοποιηθεί με μεθανόλη. 2. Η μεταφορά πραγματοποιείται με εφαρμογή ομοιογενούς ηλεκτρικού πεδίου. Το πήκτωμα και η μεμβράνη εμβαπτίζονται σε ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς και εφαρμόζεται σταθερή ένταση ρεύματος 400 ma για χρόνο 3-4 ώρες, έτσι ώστε οι αρνητικά φορτισμένες πρωτεΐνες οι οποίες βρίσκονται στο πήκτωμα να μεταφερθούν στη μεμβράνη PVDF. Ο χρόνος της μεταφοράς είναι ανάλογος με το μοριακό μέγεθος των πρωτεϊνών που πρέπει να μεταφερθούν. 85

96 Υλικά και Μέθοδοι Εικόνα 3: Σχηματική απεικόνιση της διαδικασίας μεταφοράς πρωτεϊνών σε μεμβράνη PVDF (transfer). 3. Αφού ολοκληρωθεί η μεταφορά η μεμβράνη εμβαπτίζεται σε ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T και πραγματοποιούνται δύο ξεπλύματα των 5 λεπτών το καθένα υπό ανακίνηση, σε θερμοκρασία δωματίου. 4. Ακολουθεί κορεσμός των μη ειδικών θέσεων πρόσδεσης των αντισωμάτων (blocking) με επώαση της μεμβράνης σε ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T με 3% BSA ή 5% άπαχο γάλα, ανάλογα με το πρώτο αντίσωμα (Πίνακας 5). Η μεμβράνη και στις δύο περιπτώσεις επωάζεται υπό ανακίνηση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. 5. Απόχυση του παραπάνω διαλύματος και η μεμβράνη υφίσταται 3 ξεπλύματα των 5 λεπτών με διάλυμα TBS-T σε θερμοκρασία δωματίου. 6. Επώαση πρώτου αντισώματος: Η μεμβράνη επωάζεται με ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T που περιέχει το πρώτο αντίσωμα σε κατάλληλη αραίωση (Πίνακας 4). Η επώαση πραγματοποιείται υπό ανακίνηση στους 4 0 C για 16 ώρες. 7. Απόχυση του διαλύματος του πρώτου αντισώματος (το διάλυμα φυλάσσεται στους C και μπορεί να επαναχρησιμοποιηθεί). Η μεμβράνη υφίσταται 3 ξεπλύματα των 5 λεπτών με διάλυμα TBS-T σε θερμοκρασία δωματίου. 8. Επώαση δευτέρου αντισώματος: Η μεμβράνη επωάζεται με ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T που περιέχει το δεύτερο αντίσωμα σε κατάλληλη αραίωση (Πίνακας 5). Η επώαση πραγματοποιείται υπό ανακίνηση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. 86

97 Υλικά και Μέθοδοι 9. Απόχυση του διαλύματος του δευτέρου αντισώματος. Η μεμβράνη υφίσταται 5 ξεπλύματα των 5 λεπτών με TBS-T και 2 ξεπλύματα με TBS (για να απομακρυνθεί το Tween). 10. Το ανοσοαποτύπωμα της πρωτεΐνης στη μεμβράνη εμφανίζεται σε φιλμ με τη χρήση του συστήματος χημειοφωταύγειας (ECL) σε ειδικό σκοτεινό θάλαμο. Το ECL περιέχει το υπόστρωμα του ενζύμου horseradish peroxidase το οποίο είναι συζευγμένο με τα δεύτερα αντισώματα. Στην ενισχυμένη αντίδραση χημειοφωταύγειας η υπεροξειδάση καταλύει την οξείδωση της luminol σε ένα αντιδραστήριο το οποίο εκπέμπει φως όταν διασπάται παρουσία τροποποιημένων φαινολών. Υλικά και διαλύματα Ρυθμιστικό διάλυμα για τη συσκευή μεταφοράς πρωτεϊνών (Transfer Buffer) (10x) Γλυκίνη 0.04 Μ Tris-base 0.05 M SDS 1 mm Ρυθμιστικό διάλυμα για τη συσκευή μεταφοράς πρωτεϊνών (Transfer Buffer)(1x) Transfer Buffer 10x Μεθανόλη Απεσταγμένο H 2 O 100 ml 200 ml 800 ml Ρυθμιστικό διάλυμα TBS ph 7.6 (10x) Tris-base 0,2 M NaCl 1,36 M Απεσταγμένο νερό Ρύθμιση του διαλύματος σε ph=7.6 και αραίωση του διαλύματος με απεσταγμένο νερό 1:10 πριν τη χρήση του. 87

98 Υλικά και Μέθοδοι Ρυθμιστικό διάλυμα TBS-Tween 20, ph 7.6 (TBS-T) Ρυθμιστικό διάλυμα TBS (1x) Tween % κ.ό. Μεμβράνη PVDF (polyvinylidene fluoride) Millipore Immobilon-P Transfer Membrane Άπαχο γάλα σε σκόνη (Regilait) Αλβουμίνη ορού βοός (Bovine Serum Albumin, BSA) Σύστημα χημειοφωταύγειας Χρησιμοποιείται το ολοκληρωμένο σύστημα χημειοφωταύγειας από την Pierce (ECL detection kit) (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Πρώτα αντισώματα Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε ανάλυση πρωτεϊνών κατά Western παρατίθενται στον Πίνακα 4, ενώ στον Πίνακα 5 παρατίθενται οι συνθήκες για κάθε αντίσωμα. Αντίσωμα CDK5 C-8 Προέλευση Πολυκλωνικό αντίσωμα, Santa Cruz p35 A-18 Πολυκλωνικό αντίσωμα, Santa Cruz Πίνακας 4: Παράθεση των αντισωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση κατά Western. Στις στήλες από αριστερά αναγράφονται οι πρωτεΐνες, οι κωδικοί των αντισωμάτων και οι εταιρίες παραγωγής τους. Δεύτερα αντισώματα Τα δεύτερα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν είναι τα εξής: Anti-goat IgG (sc-2020, donkey) συνδεδεμένο με υπεροξειδάση (Santa Cruz) Anti-rabbit IgG (#7074, goat) συνδεδεμένο με υπεροξειδάση (Cell Signalling) 88

99 Υλικά και Μέθοδοι Πρωτεΐνη Παρεμπόδιση μη ειδικής δέσμευσης 1ο Αντίσωμα 2ο Αντίσωμα CDK5 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 1:1000 σε TBS-T a-rabbit 1:2000 σε TBS-T (Cell Signalling) p35 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 1:1000 σε TBS-T a-goat 1:5000 σε TBS-T (Cell Signalling) Πίνακας 5: Παράθεση των συνθηκών των αντισωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση κατά Western. Στις στήλες από αριστερά αναγράφονται οι πρωτεΐνες, οι συνθήκες παρεμπόδισης, της μη ειδικής δέσμευσης και επώασης του 1ου και του 2ου αντισώματος. 13. Διαδικασία αποδέσμευσης αντισώματος από PVDF μεμβράνη (stripping) Ως stripping ορίζεται η διαδικασία αποδέσμευσης του πρώτου και δεύτερου αντισώματος από μια Western blot μεμβράνη και με αυτό τον τρόπο καθίσταται δυνατή η επαναχρησιμοποιίηση της ώστε να εξεταστούν περισσότερες από μία πρωτεΐνες στην ίδια μεμβράνη. Η διαδικασία αποδέσμευσης δεν επηρεάζει τις πρωτεΐνες που βρίσκονται ήδη δεσμευμένες (με υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις) ισχυρά στην μεμβράνη και περιλαμβάνει τα εξής στάδια: 1. Μετά την έκθεση της μεμβράνης στο φιλμ ακολουθούν 3 επωάσεις των 5 λεπτών της μεμβράνης υπό ανακίνηση με ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T. 2. Στη συνέχεια ακολουθεί η επώαση της μεμβράνης στο διάλυμα αποδέσμευσης των αντισωμάτων για 30 λεπτά σε θερμοκρασία C υπό ανακίνηση. 3. Ύστερα ακολουθούν 6 επωάσεις των 5 λεπτών της μεμβράνης υπό ανακίνηση με ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T. 4. Τέλος πραγματοποιείται ξανά επώαση για την κάλυψη των ελεύθερων θέσεων της μεμβράνης (blocking) και επαναλαμβάνεται η διαδικασία ανάλυσης των πρωτεϊνών κατά Western. 89

100 Υλικά και Μέθοδοι Υλικά και διαλύματα Διάλυμα αποδέσμευσης των αντισωμάτων από τη μεμβράνη 20 ml SDS 10% 12,5 ml 0,5Μ Τris-HCΙ pη 6,8 67,5 ml εξαιρετικά καθαρό νερό Προσθέστε 0,8 ml β-μερκαπτοαιθανόλης στον απαγωγό. Ρυθμιστικό διάλυμα TBS-Tween 20, ph 7.6 (TBS-T) Ρυθμιστικό διάλυμα TBS (1x) Tween % κ.ό. 14. Ποσοτικοποίηση ανοσοαποτυπωμάτων Για τη σωστή διεξαγωγη των ποσοτικών συμπερασμάτων από τα ανοσοαποτυπώματα των πρωτεϊνών, γίνεται μια επεξεργασία των film σε ειδικό πρόγραμμα του υπολογιστή. Αρχικά τα ανοσοαποτυπώματα ψηφιοποιούνται με την χρήση μηχανήματος σάρωσης και εν συνεχεία οι εικόνες επεξεργάζονται με το πρόγραμμα Scion Image (Scion Corporation). Το συγκεκριμένο λογισμικό είναι κατάλληλα προγραμματισμένο έτσι ώστε για κάθε ζώνη που περιγράφεται, να γίνεται υπολογισμός και καταγραφή αυτόματα σε ένα λογιστικό φύλλο η επιφάνεια της ζώνης και η μέση έντασή της. Το γινόμενο των δύο αυτών παραμέτρων είναι ανάλογο της ποσότητας της πρωτεΐνης που αντιστοιχεί σε κάθε ζώνη και χρησιμοποιείται περαιτέρω για ποσοτικές αναλύσεις. 15. Μέθοδος μέτρησης της ενεργότητας της κινάσης CDK5 Στις προηγούμενες μελέτες της ερευνητικής μας ομάδας, η ενεργότητα της CDK5 μπορούσε να εκτιμηθεί μόνο με έμμεσο τρόπο, παρακολουθώντας την 90

101 Υλικά και Μέθοδοι αλληλεπίδραση της CDK5 με τη ρυθμιστική της υπομονάδα p35 σε εκχυλίσματα ολικών πρωτεϊνών των κυττάρων. Στην παρούσα εργασία αναπτύξαμε μια μέθοδο άμεσης μέτρησης της ενεργότητας της κινάσης με τη βοήθεια ένος μη ραδιενεργού ολοκληρωμένου συστήματος (kit). Το ADP-Glo Kinase Assay kit παρέχει τη δυνατότητα μέτρησης της ενεργότητας διαφόρων κινασών μέσω του ποσοστού του ATP που καταναλώνεται και του παραγόμενου ADP, με άμεσο τρόπο. Βασική προϋπόθεση ωστόσο σε αυτή την πειραματική μέθοδο είναι το να προσδιορίσουμε στο σύστημα ποια κινάση μας ενδιαφέρει για αυτό και καταφύγαμε στη μέθοδο της ανοσοκατακρήμνισης με σκοπό την απομόνωση της υπό μελέτη πρωτεΐνης (CDK5) και την περαιτέρω μελέτη της ενεργότητάς της. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιήθηκε με σκοπό να ανιχνευθεί η δραστικότητα της κινάσης CDK5 πριν και μετά την επίδραση της PTN και διαφόρων αναστολέων των c-src, PI3K και ERK1/2 σε κύτταρα HUVEC και C6. Η διαδικασία έχει ως εξής: 1. Αρχικά πραγματοποιείται επίδραση της PTN σε κύτταρα HUVEC και C6 για 10 λεπτά. 2. Ακολουθεί λύση των κυττάρων σε διάλυμα λύσης (RIPA buffer) (εκχύλιση πρωτεϊνών από καλλιέργεια κυττάρων). 3. Υπολογίζεται η ποσότητα της ολικής πρωτεΐνης με τη μέθοδο Bradford όπως περιγράφηκε προηγουμένως και μεταφέρεται η ποσότητα της πρωτεΐνης που πρόκειται να ανοσοκατακρημνισθεί σε νέα σωληνάρια τύπου eppendorf. 4. Ύστερα προστίθεται αντίσωμα έναντι της CDK5 (Santa Cruz) σε ποσότητα ανάλογη με την ποσότητα της πρωτεΐνης (βλέπε, ανοσοκατακρήμνιση) και τα δείγματα τοποθετούνται στους 4 ο C υπό ανακίνηση για 16 ώρες τουλάχιστον. 5. Την επόμενη ημέρα προστίθενται 10 μl εναιωρήματος σφαιριδίων πρωτεΐνης A και G στα σωληνάρια και τα δείγματα επωάζονται στους 4 ο C υπό ανακίνηση για 2 ώρες. Στο στάδιο αυτό πραγματοποιείται η δέσμευση του συμπλόκου πρωτεΐνης-αντισώματος με τα σφαιρίδια. 91

102 Υλικά και Μέθοδοι 6. Στη συνέχεια πραγματοποιείται φυγοκέντρηση στα g για 5 λεπτά στους 4 ο C, γίνεται απόρριψη του υπερκειμένου και προσθήκη 500 μl ψυχρού PBS 1Χ ανά σωληνάριο (επαναιώρηση των σωληναρίων). 7. Η φυγοκέντρηση και η απόρριψη του υπερκειμένου επαναλαμβάνονται ακόμα 2 φορές, μία με το ψυχρό διάλυμα PBS 1X και μία με το διάλυμα αντίδρασης κινάσης (kinase reaction buffer 1X). 8. Η ποσότητα της κινάσης που δεσμεύτηκε στα σφαιρίδια στη συνέχεια επωάζεται με 25 μl διαλύματος αντίδρασης κινάσης σε ειδικά λευκά πιάτα για 30 λεπτά υπό ήπια ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου. 9. Έπειτα προστίθενται σε κάθε δείγμα 25 μl ADP-Glo Reagent, ένα ειδικό αντιδραστήριο που σταματάει τη δράση της κινάσης με το να εξαλείφει το υπολειπόμενο ATP και να κρατάει το παραγόμενο ADP μόνο, και το πιάτο αφήνεται για επώαση άλλα 40 λεπτά υπό ήπια ανάδευση. 10. Τέλος, η αντίδραση τερματίζεται με την προσθήκη 50 μl από το Kinase Detection Reagent, ένα ειδικό αντιδραστήριο που μετατρέπει το ADP σε ATP και επιτρέπει στο νεοσυντιθέμενο ATP να μετρηθεί χρησιμοποιώντας μια αντίδραση λουσιφεράσης/ λουσιφερίνης. Το φως που παράγεται σχετίζεται με την ποσότητα του ADP που έχει παραχθεί από τη δραστικότητα της κινάσης και ανιχνεύεται σε ειδικό μηχάνημα μέτρησης χημειοφωταύγειας (luminometer). 11. Στα δείγματα μετά από όλη αυτή τη διαδικασία γίνεται, προσθήκη ρυθμιστικού διαλύματος δειγμάτων (2Χ), ακολουθεί η θέρμανσή τους στους 100 ο C για 5 λεπτά και τέλος η φυγοκέντρησή τους στα g για 4 λεπτά, ώστε τελικά να διατηρηθούν μόνο τα υπερκείμενα αυτών στους - 20 ο C για αρκετό χρονικό διάστημα και να αναλυθούν σε SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση όταν αυτό είναι απαραίτητο. Υλικά και διαλύματα Αποστειρωμένο PBS (1X) ph : Na 2 HPO 4 10 mm KH 2 PO 4 2 mm 92

103 Υλικά και Μέθοδοι NaCl ΚCl 137 mm 2.7 mm Διάλυμα RIPA (Radio Immunoprecipitation Assay buffer) NaCl 150 mm Triton X % sodium deoxycholate 0.5% SDS (sodium dodecyl sulphate) 0.1% 50 mm Tris ph 8.0 PMSF 1 mm (αναστολέας πρωτεασών σερίνης) EDTA 5 mm (αναστολέας μεταλλοπρωτεασών) Απροτινίνη 1μg/ml (αναστολέας πρωτεασών σερίνης) Na 3 VO 4 20 nm (αναστολέας τυροσινικής φωσφατάσης) Εναιώρημα σφαιριδίων αγαρόζης με πρωτεΐνη A (Calbiochem, Cat. No. IP02) Εναιώρημα σφαιριδίων αγαρόζης με πρωτεΐνη G (Calbiochem, Cat. No. IP04) (2x) διάλυμα δειγμάτων (sample loading buffer) Tris-HCl ph M SDS 0.03 M Γλυκερόλη 10% κ.ό. Κυανούν της βρωμοφαινόλης 2% κ.ό. β-μερκαπτοαιθανόλη ή DTT 10% κ.ό. (προστίθεται λίγο πριν τη χρήση) Διάλυμα αντίδρασης κινάσης (kinase reaction buffer 1X) 40 M Tris (ph 7.5) 20 M MgCl2 0,01 mg/ml BSA 93

104 Υλικά και Μέθοδοι ADP-Glo Reagent (ADP-Glo Kinase Assay, Promega) Kinase Detection Reagent (ADP-Glo Kinase Assay, Promega) 16. Κατασκευή πρότυπων καμπυλών ενεργότητας της CDK5 σε ανοσοκατακρημνίσματα ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC και κυττάρων γλοιοβλαστώματος C6 Ένα πολύ βασικό και απαραίτητο βήμα στη διαδικασία μέτρησης της ενεργότητας της CDK5 με τη χρήση του ADP-Glo Kinase Assay kit ήταν να ελέγξουμε την κατάλληλη ποσότητα της ολικής πρωτεΐνης των κυττάρων που πρέπει να χρησιμοποιηθεί προκειμένου να έχουμε αξιόπιστες μετρήσεις. Για τον σκοπό αυτό, μετρήθηκε η ενεργότητα της CDK5 σε διάφορες ποσότητες ολικής πρωτεΐνης (25, 50, 100, 20 και 400 μg) ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC και κυττάρων γλοιοβλαστώματος C6, όπως φαίνεται στην Εικόνα 4. Φαίνεται ότι η ενεργότητα της CDK5 αυξάνεται γραμμικά σε ποσότητες ολικής πρωτεΐνης πάνω από 100 μg και στους δύο τύπους κυττάρων, με τιμές που δεν αγγίζουν τα όρια ευαισθησίας του φωτομέτρου. Από τα αποτελέσματα αυτά αποφασίστηκε πως η ποσότητα ολικής πρωτεΐνης που θα χρησιμοποιηθεί για τη μέτρηση της ενεργότητας της CDK5 είναι 100 μg. 94

105 Χημειοφωταύγεια (arbitrary units) Χημειοφωταύγεια (arbitrary units) Υλικά και Μέθοδοι Α Ποσότητα πρωτεΐνης (μg) B Ποσότητα πρωτεΐνης (μg) Εικόνα 4: Καμπύλες ενεργότητας της CDK5 σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC (A) και κύτταρα γλοιοβλαστώματος C6 (Β). Οι κόκκινες γραμμές αντιστοιχούν στις προσαρμοσμένες καμπύλες, ενώ οι διακεκομμένες γραμμές περνούν από τα σημεία μέτρησης. 95

106 Υλικά και Μέθοδοι 17. Διαμόλυνση κυττάρων με παρεμβαλλόμενο RNA (sirna, RNAi) Η μέθοδος του παρεμβαλλόμενου RNA (RNAi) χρησιμοποιείται για την σίγαση της έκφρασης γονιδίων που ελέγχουν διάφορες διεργασίες στο κύτταρο. Στην παρούσα εργασία λοιπόν, πραγματοποιήθηκε παροδική διαμόλυνση των κυττάρων C6 με παρεμβαλλόμενο RNA που είχε ως στόχο το mrna του RPTPβ/ζ. Ως φορέας για τη μεταφορά του παρεμβαλλόμενου RNA στο εσωτερικό των κυττάρων χρησιμοποιήθηκε ανιονική αμίνη. Δεδομένου ότι η συγκέντρωση του παρεμβαλλόμενου RNA, καθώς και η πυκνότητα των κυττάρων που υφίστανται τη διαμόλυνση επηρεάζουν το ποσοστό μετασχηματισμού και την τοξικότητα, προηγήθηκαν πειράματα για να καθορισθούν οι συνθήκες για την αναστολή της έκφρασης του RPTPβ/ζ γονιδίου. Η διαδικασία που ακολουθείται είναι η εξής: 1. Αρχικά πραγματοποιείται η διαδικασία της ανακαλλιέργειας, όπως περιγράφεται παραπάνω. Χρησιμοποιούνται κύτταρα σε μικροπλακίδια 6 κελιών (six-well plate). 2. Ακολουθεί επώαση των κυττάρων για 24 ώρες με πλήρες θρεπτικό μέσο χωρίς αντιβιοτικά. Την επόμενη μέρα τα κύτταρα παρατηρούνται στο μικροσκόπιο, αν λοιπόν έχουν καλύψει το 60-80% της επιφάνειας του τρυβλίου και φαίνονται και υγιή, τότε μπορεί να ξεκινήσει η διαδικασία της διαμόλυνσης με την παρασκευή αρχικά των κατάλληλων διαλυμάτων. 3. Σε σωληνάριο τύπου eppendorf προστίθεται 1 μl παρεμβαλλόμενου RNA (RPTPβ/ζ) και 99 μl από ειδικό μέσο επιμόλυνσης (sirna Transfection Medium). Ακολουθεί πολύ καλή ανάδευση. Η τελική συγκέντρωση του παρεμβαλλόμενου RNA είναι 80 nm και αντιστοιχεί σε ένα μόνο κελί του six well plate. 4. Σε σωληνάριο τύπου eppendorf προστίθενται 1,6 μl Negative Control sirna και 98,4 μl από ειδικό μέσο επιμόλυνσης (sirna Transfection Medium). Ακολουθεί πολύ καλή ανάδευση. Τα αρνητικού ελέγχου sirnas σχεδιάζονται για να μην έχουν κανένα γνωστό στόχο στα κύτταρα όπου χρησιμοποιούνται και είναι σημαντικά ώστε να γίνεται η διάκριση αν η σίγαση οφείλεται στην 96

107 Υλικά και Μέθοδοι ειδική αλληλουχία και όχι σε μη ειδικές επιδράσεις κατά τη διάρκεια του πειράματος του παρεμβαλλόμενου RNA. 5. Σε σωληνάριο τύπου eppendorf προστίθενται 8 μl από το αντιδραστήριο επιμόλυνσης (sirna transfection reagent) και 92 μl από το ειδικό μέσο επιμόλυνσης (sirna transfection medium). Ακολουθεί πολύ καλή ανάδευση. Αυτό επαναλαμβάνεται δύο φορές. 6. Aφού ολοκληρωθεί η παρασκευή των διαλυμάτων ακολουθεί η μίξη τους, με την προσθήκη των διαλυμάτων με το sirna σε αυτά με το αντιδραστήριο και όχι ανάποδα. Ακολουθεί πολύ καλή ανάδευση και αφήνονται για επωάση σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. 7. Μετά από τα 30 λεπτά επώασης πραγματοποιείται μια πλύση των κυττάρων με 1 ml transfection medium. 8. Σε κάθε σωληνάριο που περιέχει το sirna και το αντιδραστήριο προστίθενται 800 μl από το transfection medium με πολύ καλή ανάδευση. 9. Τελικά τα διαλύματα προστίθενται στα κύτταρα και ακολουθεί επώαση για 6 ώρες στον επωαστή. Μετά τις 6 ώρες προστίθεται 1ml θρεπτικού μέσου με διπλάσιες ποσότητες ορού και αντιβιοτικών. Περαιτέρω επώαση των κυττάρων για ώρες. 10. Την επόμενη μέρα αφαιρείται το θρεπτικό μέσο και προστίθεται νέο πλήρες θρεπτικό μέσο για άλλες 24 ώρες. 11. Ακολουθεί λύση των κυττάρων για απομόνωση πρωτεΐνης ή αντικατάσταση θρεπτικού μέσου με νέο χωρίς ορό, για πειράματα μελέτης χημειοτακτισμού. Υλικά και διαλύματα Πλήρες θρεπτικό μέσο (χωρίς αντιβιοτικά) HAM s F12 90% Ορός βοός (fetal bovine serum) 10% Θρεπτικό μέσο επιμόλυνσης (Transfection medium sc Santa Cruz Biotechnology Inc). 97

108 Υλικά και Μέθοδοι Αντιδραστήριο επιμόλυνσης (Transfection reagent sc Santa Cruz Biotechnology Inc). Αλληλουχίες sirna για τον RPTPβ/ζ (VBC-Biotech Services, VieVienna, Austria) Νοηματική αλληλουχία Αντι-νοηματική αλληλουχία 5 -AAAUGCGAAUCCUAAAGCGUU-3 5 -AACGCUUUAGGAUUCGCAUUU-3 Silencer R Negative Control sirna (Ambion, #4635) 18. Μελέτη της μετανάστευσης των κυττάρων (Transwell Migration Assay ) Με το πείραμα αυτό μελετάται η επίδραση μιας ουσίας στο χημειοτακτισμό των κυττάρων. Η μετακίνηση των κυττάρων από τη μια περιοχή στην άλλη ως απόκριση σε ένα χημικό ερέθισμα, είναι σημαντική διαδικασία για την εμβρυϊκή ανάπτυξη και την επούλωση τραυμάτων, ενώ παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στον καρκίνο, στην αθηροσκλήρωση και στην αρθρίτιδα. Στο πείραμα αυτό χρησιμοποιούνται τρυβλία 24 κελιών (24-well plate) μέσα στα οποία τοποθετούνται ειδικά ενθέματα που φέρουν στον πυθμένα τους μια πολυανθρακική μεμβράνη με μέγεθος πόρων 8 μm η οποία τελικά χωρίζει το κελί σε δύο μέρη. Η μεμβράνη αυτή χρησιμεύει ως εμπόδιο για τη διάκριση των μεταναστευτικών κυττάρων από τα μη-μεταναστευτικά κύτταρα (εικόνα 4). Η διαδικασία που ακολουθείται έχει ως εξής: 98

109 Υλικά και Μέθοδοι Εικόνα 4: Σχηματική απεικόνιση της διαδικασίας χημειοτακτισμού. Το εναιώρημα των κυττάρων τοποθετείται στην εσωτερική μικροκυψελίδα, πάνω στην πορώδη μεμβράνη, ενώ η υπό μελέτη ουσία στην εξωτερική μικροκυψελίδα. Κατά την επώαση του τρυβλίου στους 37 0 C ένα ποσοστό των κυττάρων μεταναστεύει στην κάτω επιφάνεια της πορώδους μεμβράνης. Οι πόροι της μεμβράνης (8 μm) είναι αρκετά μικροί ώστε να επιτρέπουν μόνο την ενεργή διέλευση των κυττάρων. Τα κύτταρα που δε μετανάστευσαν απομακρύνονται ενώ τα κύτταρα που μετανάστευσαν βάφονται και μετριούνται. 1. Κατά τη μελέτη επίδρασης της PTN και της ροσκοβιτίνης (αναστολέας της CDK5) στο χημειοτακτισμό των κυττάρων C6, προηγείται επώαση των κυττάρων στους 37 0 C για 16 ώρες σε θρεπτικό μέσο με μειωμένη ποσότητα ορού. Αρχικά, πραγματοποιείται η διαδικασία της ανακαλλιέργειας, όπως αναφέρεται νωρίτερα. 2. Σε κάθε εξωτερικό κελί (κάτω μέρος της μεμβράνης) προστίθενται 600 μl θρεπτικό μέσο, αν πρόκειται για κελί αναφοράς (μάρτυρας). Στην περίπτωση μελέτης της χημειοτακτικής δράσης μιας ουσίας, η ουσία προστίθεται στο εξωτερικό κελί και σε θρεπτικό μέσο ίδιο με αυτό του κελιού-μάρτυρα. 3. Στην εσωτερική μικροκυψελίδα (πάνω μέρος της μεμβράνης) προστίθενται 100 μl θρεπτικού μέσου με κύτταρα. 4. Επώαση του τρυβλίου στον επωαστικό κλίβανο των κυττάρων για 4 ώρες. 99

110 Υλικά και Μέθοδοι 5. Μονιμοποίηση των κυττάρων με εμβάπτιση των εσωτερικών μικροκυψελίδων σε μονιμοποιητικό διάλυμα Carson s για τουλάχιστον 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 6. Προσεκτική απομάκρυνση των κυττάρων που βρίσκονται στο επάνω μέρος της μεμβράνης με βαμβακοφόρο στυλεό (μπατονέτα) και έλεγχος της μεμβράνης στο μικροσκόπιο. Αν η απομάκρυνση των κυττάρων δεν είναι ικανοποιητική επαναλαμβάνεται η διαδικασία. 7. Με ανάλογη προσοχή κόβεται η μεμβράνη με τη βοήθεια νυστεριού, ανακτώντας τη μεγαλύτερη δυνατή επιφάνεια. 8. Τοποθέτηση της μεμβράνης σε αντικειμενοφόρο πλάκα, ώστε τα κύτταρα που έχουν μεταναστεύσει να βρίσκονται στην επάνω επιφάνεια. 9. Χρώση των κυττάρων με εναπόθεση 2 σταγόνων διαλύματος της χρωστικής κυανούν της τολουϊδίνης στη μεμβράνη για 40 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 10. Αποχρωματισμός της μεμβράνης με διαδοχικές εμβαπτίσεις σε νερό. 11. Τοποθέτηση της μεμβράνης σε μικροπλακίδια 96 κελιών. Εκχύλιση του διαλύματος κυανούν της τολουϊδίνης με προσθήκη διαλύματος SDS 1% (100 μl ανά μεμβράνη). 12. Ανακίνηση για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 13. Ακολουθεί φωτομέτρηση σε μήκος κύματος 630 nm. Υλικά και διαλύματα Θρεπτικό μέσο για μελέτη κυτταρικής μετανάστευσης C6 Ham s F12 98% Ορός βοός (Fetal bovine serum) 2% Σύστημα μελέτης χημειοτακτισμού Transwell migration assay Μικροπλακίδια Transwell με διάμετρο πόρων μεμβράνης 8 μm (Costar, Avon, France). 100

111 Υλικά και Μέθοδοι Διάλυμα κυανούν της τολουϊδίνης 0.33% κ.β. κυανούν της τολουϊδίνης σε PBS 1Χ. Μονιμοποιητικό διάλυμα Carson s Φορμαλδεΰδη 37% 10% κ.ό. NaH2PO4.Η2Ο 0.1 Μ NaOH 0.1 Μ Απεσταγμένο νερό SDS 0.1% 19. Μελέτη της δραστικότητας της CDK5 στη χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη (CAM) του εμβρύου όρνιθας Η χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη (CAM) εμβρύου όρνιθας είναι μια εξωεμβρυϊκή μεμβράνη και προκύπτει από την σύντηξη του χορίου και της αλλαντοΐδας, η οποία διαθέτει αιμοφόρα αγγεία, την τέταρτη ημέρα ανάπτυξης του εμβρύου. Χρησιμοποιείται ως ένα καλό μοντέλο για την in vivo μελέτη της αγγειογένεσης και άλλων βιολογικών διεργασιών. Στην παρούσα εργασία το παραπάνω μοντέλο χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη της δραστικότητας της CDK5 στα διάφορα αναπτυξιακά στάδια της CAM. Η διαδικασία που ακολουθείται έχει ως εξής: 1. Τα γονιμοποιημένα αυγά όρνιθας (Leghom, από τον αγροτικό πτηνοτροφικό συνεταιρισμό «Πίνδος» Ιωάννινα) μετά την παραλαβή τους καθαρίζονται με νερό και τοποθετούνται σε οριζόντια θέση σε αυγοθήκη, σε επωαστικό θάλαμο με θερμοκρασία 37 ο C και σχετική υγρασία περίπου 55%. Η χρονική αυτή στιγμή θεωρείται ως 0 ημέρα ανάπτυξης του εμβρύου. 2. Στις αναπτυξιακές μέρες 6, 9, 12, 15, και 18 της CAM πραγματοποιείται εκτομή του ιστού στους 4 ο C. 3. Η CAM μεταφέρεται σε τρυβλίο, το οποίο περιέχει ψυχρό διάλυμα PBS 1X. 101

112 Υλικά και Μέθοδοι 4. Ο ιστός τεμαχίζεται με τη βοήθεια ψαλιδιού, τοποθετείται σε σωληνάριο τύπου eppendorf και φυγοκεντρείται στους 4 ο C για 20 λεπτά στα g. 5. Αφαιρείται το υπερκείμενο υγρό και ο ιστός σε αυτό το στάδιο μπορεί να φυλαχθεί στους -20 ο C μέχρι να χρησιμοποιηθεί. 6. Ο ιστός ομογενοποιείται σε 2 ml διάλυμα λύσης RIPA για να επιτευχθεί η εκχύλιση των πρωτεϊνών του ιστού. 7. Ακολουθεί φυγοκέντρηση του ομογενοποιήματος στους 4 ο C, για 20 λεπτά στα g. 8. Το υπερκείμενο της ομογενοποίησης μεταφέρεται σε νέο σωληνάριο τύπου eppendorf. 9. Προστίθεται 2 μl από το δείγμα σε 998 μl αντιδραστηρίου Bradford. 10. Στη συνέχεια γίνεται προσδιορισμός της συγκέντρωσης των ολικών πρωτεϊνών του δείγματος όπως περιγράφηκε παραπάνω. 11. Τέλος, ελέγχεται η δραστικότητα της CDK5 με τη χρήση μη ραδιενεργού kit (ADP-Glo Kinase Assay, Promega) όπως αναλύθηκε προηγουμένως. Υλικά και διαλύματα Αποστειρωμένο PBS (1X) ph : Na 2 HPO 4 10 mm KH 2 PO 4 2 mm NaCl 137 mm ΚCl 2.7 mm Διάλυμα RIPA (Radio Immunoprecipitation Assay buffer) NaCl 150 mm Triton X % sodium deoxycholate 0.5% SDS (sodium dodecyl sulphate) 0.1% 50 mm Tris ph 8.0 PMSF 1 mm (αναστολέας πρωτεασών σερίνης) 102

113 Υλικά και Μέθοδοι EDTA 5 mm (αναστολέας μεταλλοπρωτεασών) Απροτινίνη 1μg/ml (αναστολέας πρωτεασών σερίνης) Na 3 VO 4 20 nm (αναστολέας τυροσινικής φωσφατάσης) Εναιώρημα σφαιριδίων αγαρόζης με πρωτεΐνη A (Calbiochem, Cat. No. IP02) Εναιώρημα σφαιριδίων αγαρόζης με πρωτεΐνη G (Calbiochem, Cat. No. IP04) (2x) διάλυμα δειγμάτων (sample loading buffer) Tris-HCl ph M SDS 0.03 M Γλυκερόλη 10% κ.ό. Κυανούν της βρωμοφαινόλης 2% κ.ό. β-μερκαπτοαιθανόλη ή DTT 10% κ.ό. (προστίθεται λίγο πριν τη χρήση) Διάλυμα αντίδρασης κινάσης (kinase reaction buffer 1X) 40 mm Tris (ph 7.5) 20 M MgCl2 0,1 mg/ml BSA ADP-Glo Reagent (ADP-Glo Kinase Assay, Promega) Kinase Detection Reagent (ADP-Glo Kinase Assay, Promega) 103

114 Υλικά και Μέθοδοι 20. Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων, από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα σε κάθε περίπτωση, έγινε με τη χρήση του unpaired t-test ή του test ANOVA. Οι συγκρίσεις (μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα) έγιναν μεταξύ της κάθε πειραματικής ομάδας και του αντίστοιχου μάρτυρα. 104

115 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

116 Αποτελέσματα 1. Η επαγόμενη από την PTN αλληλεπίδραση της CDK5 με την p35 δεν επηρεάζεται από την ιντεγκρίνη α ν β 3 Σημαντικό μόριο στην επαγόμενη από PTN μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων αποτελεί η ιντεγκρίνη α ν β 3, η οποία αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα της PTN RPTPβ/ζ σχηματίζοντας ένα λειτουργικό σύμπλοκο στη μεμβράνη των ενδοθηλιακών κυττάρων που είναι απαραίτητο για την επαγωγή της κυτταρικής μετανάστευσης από την ΡΤΝ (Mikelis et al. 2009). Προηγούμενα αποτελέσματα της ερευνητικής μας ομάδας αναφέρουν ότι η επαγόμενη από PTN μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC εξαρτάται από την κυστεϊνική θηλιά στην περιοχή της υπομονάδας β 3 και εξωγενής προσθήκη ενός συνθετικού πεπτιδίου που αντιστοιχεί στην περιοχή αυτή (πεπτίδιο Β3) αναστέλλει την αλληλεπίδραση της PTN με την α ν β 3 και την επαγόμενη από την PTN κυτταρική μετανάστευση (Mikelis et al. 2009). Με βάση τα παραπάνω, το πεπτίδιο Β3 χρησιμοποιήθηκε σε παλαιότερη εργασία προκειμένου να διερευνηθεί ο ρόλος της α ν β 3 στην ενεργοποίηση της CDK5 από την PTN σε κύτταρα HUVEC και διαπιστώθηκε πως το πεπτίδιο Β3 δεν προκάλεσε κάποια μεταβολή στην επαγόμενη από PTN αλληλεπίδραση των μορίων CDK5 και p35, υποδεικνύοντας ότι η ιντεγκρίνη α ν β 3 δεν εμπλέκεται στην ενεργοποίηση της CDK5 στα HUVEC (Λαμπροπούλου Ε, 2011). Προκειμένου να επιβεβαιώσουμε αυτήν την παρατήρηση, στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα C6 τα οποία φυσιολογικά δεν εκφράζουν την ιντεγκρίνη α ν β 3 και σταθερά διαμολυσμένα κύτταρα CHO που δεν εκφράζουν την υπομονάδα β 3 (CHO) ή που εκφράζουν την αγρίου τύπου υπομονάδα β 3 (CHOwt). Σε ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα των κυττάρων πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση με αντίσωμα έναντι της CDK5. Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE και ανάλυση κατά Western με αντίσωμα έναντι της p35 ή της CDK5. Στην Εικόνα Α1, φαίνεται ότι η ΡΤΝ αυξάνει την αλληλεπίδραση των μορίων CDK5 και p35 σε όλους τους υπό μελέτη τύπους κυττάρων, ενισχύοντας την άποψη ότι η ιντεγκρίνη α ν β 3 δεν εμπλέκεται στην ενεργοποίηση της CDK5. 105

117 Αποτελέσματα Α Β Eικόνα Α1: Μελέτη της επίδρασης της α ν β 3 στην επαγόμενη από PTN αλληλεπίδραση της CDK5 με την p35 σε ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα κυττάρων CHO (Α) και C6 (Β) στα οποία είχε προηγουμένως πραγματοποιηθεί επώαση με PTN για 10 λεπτά. Η αλληλεπίδραση μελετήθηκε με ανοσοκατακρήμνιση έναντι της CDK5 και τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν με αντίσωμα έναντι της p35 και της CDK5, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Οι εικόνες είναι αντιπροσωπευτικές από 2 και 5 ανεξάρτητα μεταξύ τους πειράματα στην περίπτωση των κυττάρων CHO και C6 αντίστοιχα. CHO, σταθερά διαμολυσμένα κύτταρα CHO που δεν εκφράζουν την υπομονάδα β 3 ; CHOwt, σταθερά διαμολυσμένα κύτταρα CHO που εκφράζουν την αγρίου τύπου υπομονάδα β Η PTN προκαλεί επαγωγή της ενεργότητας της κινάσης CDK5 σε κύτταρα C6 H επίδραση της PTN στην ενεργότητα της CDK5 σε κύτταρα γλοιώματος C6, τα οποία δεν εκφράζουν φυσιολογικά την α ν β 3, μελετήθηκε μετά από ανοσοκατακρήμνιση ολικών πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων με αντίσωμα έναντι της CDK5 και χρήση μη ραδιενεργού kit μέτρησης ενεργότητας κινασών, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α2, η PTN επάγει την ενεργότητα της CDK5 ύστερα από διέγερση των κυττάρων με PTN για 10 λεπτά. Παρουσία του αναστολέα της CDK5 ροσκοβιτίνη, η ενεργότητα της CDK5 σε μη διεγερμένα κύτταρα μειώνεται σημαντικά, ενώ η επαγωγή της ενεργότητας της CDK5 από την ΡΤΝ αναστέλλεται πλήρως, επιβεβαιώνοντας την ειδικότητα της μέτρησης της ενεργότητας της CDK5. Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν περαιτέρω την άποψη ότι η CDK5 ενεργοποιείται από την ΡΤΝ ανεξάρτητα από την ιντεγκρίνη α ν β

118 % Ενεργότητα της CDK5 Αποτελέσματα 400 P< PTN +PTN (100ng/ml) * Ροσκοβιτίνη Εικόνα Α2: Μελέτη της επίδρασης της PTN στην ενεργότητα της CDK5 μέσω μέτρησης της ενεργότητας της κινάσης με χρήση μη ραδιενεργού kit, όπως περιγράφεται αναλυτικά στις Μεθόδους. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα (n=3) του ποσοστού της ενεργότητας της CDK5 σε σύγκριση με κύτταρα που δε διεγέρθηκαν με PTN και/ή τον αναστολέα της CDK5 ροσκοβιτίνη (η ενεργότητα της CDK5 στα μη διεγερμένα κύτταρα ορίζεται ως 100%). Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστικά σημαντική μεταβολή σε σχέση με τα μη διεγερμένα κύτταρα. *Ρ< Η αναστολή της έκφρασης του RPTPβ/ζ μειώνει την επαγόμενη από PTN ενεργοποίηση της κινάσης CDK5 σε κύτταρα C6 Από προηγούμενες μελέτες της ερευνητικής ομάδας, γνωρίζουμε ότι ο υποδοχέας της PTN με δράση φωσφατάσης τυροσίνης RPTPβ/ζ εμπλέκεται στην επαγόμενη από PTN ενεργοποίηση της CDK5 στα ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC (Λαμπροπούλου Ε, 2011). Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε εάν ο υποδοχέας RPTPβ/ζ εμπλέκεται στην επαγόμενη από PTN ενεργοποίηση της CDK5 στα κύτταρα C6. Για το σκοπό αυτό, η έκφραση του RPTPβ/ζ μειώθηκε με τη χρήση κατάλληλου sirna. Τη διαμόλυνση των κυττάρων C6 με sirptpβ/ζ ή με αλληλουχία που δεν εκφράζεται (sineg), ακολούθησε διέγερση με PTN για 10 λεπτά, λύση των κυττάρων, ανοσοκατακρήμνιση σε ίση ποσότητα ολικής πρωτεΐνης έναντι της CDK5 και μέτρηση της ενεργότητας της κινάσης CDK5 όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α3, μείωση της έκφρασης του RPTPβ/ζ οδήγησε σε αναστολή της επαγόμενης από PTN 107

119 % Ενεργότητα της CDK5 Αποτελέσματα ενεργοποίησης της CDK5 στα κύτταρα C6. Επιπλέον, παρατηρήθηκε μείωση της ενεργότητας της CDK5 και σε μη διεγερμένα με PTN κύτταρα C6, υποδηλώνοντας ότι ο υποδοχέας RPTPβ/ζ ίσως να παίζει ρόλο στη διατήρηση της ενεργότητας της CDK5 και ανεξάρτητα από τη διέγερση με ΡΤΝ PTN +PTN (100 ng/ml) sineg sirptpβ/ζ Εικόνα Α3: Μελέτη της επίδρασης της αναστολής της έκφρασης του υποδοχέα RPTPβ/ζ στην επαγόμενη από PTN ενεργοποίηση της CDK5 σε κύτταρα C6. Αρχικά πραγματοποιήθηκε επώαση των κυττάρων C6 με sirna έναντι του υποδοχέα RPTPβ/ζ (sirptpβ/ζ) για 48 ώρες πριν την προσθήκη της PTN για 10 λεπτά. Ακολούθησε ανοσοκατακρήμνιση ολικών πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων των κυττάρων C6 με αντίσωμα έναντι της CDK5 και μέτρηση της ενεργότητας της κινάσης με χρήση μη ραδιενεργού kit, όπως περιγράφεται αναλυτικά στις Μεθόδους. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα (n=2) του ποσοστού της ενεργότητας της CDK5 σε σύγκριση με κύτταρα που δε διεγέρθηκαν με PTN και διαμολύνθηκαν με αλληλουχία που δεν εκφράζεται (sineg). Η ενεργότητα της CDK5 στα μη διεγερμένα sineg κύτταρα ορίζεται ως 100%. 4. Η CDK5 δεν εμπλεκεται στη μειωμένη από PTN μετανάστευση των κυττάρων C6 Σε προηγούμενα αποτελέσματα της ερευνητικής μας ομάδας έχει αποδειχθεί πως ο αναστολέας της CDK5 ροσκοβιτίνη αναστέλλει την επαγόμενη από PTN μετανάστευση των ανθρώπινων ενδοθηλιακών και καρκινικών κυττάρων γλοιοβλαστώματος που εκφράζουν φυσιολογικά την ιντεγκρίνη α ν β 3 (Λαμπροπούλου Ε, 2011). Στα κύτταρα C6 που δεν εκφράζουν ιντεγκρίνη, η ΡΤΝ αναστέλλει την κυτταρική μετανάστευση (Mikelis et al., 2009). Έτσι, στην 108

120 % Kυτταρική μετανάστευση Αποτελέσματα παρούσα εργασία διερευνήθηκε ο ρόλος της CDK5 στη μετανάστευση των κυττάρων C6 υπό την επίδραση της PTN. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α4, αναστολή της CDK5 με ροσκοβιτίνη δεν επηρεάζει τη μείωση της μετανάστευσης που προκαλείται από την PTN στα κύτταρα C6, υποδηλώνοντας ότι η επαγωγή της CDK5 από την ΡΤΝ στα κύτταρα αυτά δε σχετίζεται με την κυτταρική μετανάστευση P< PTN + PTN (100ng/ml) P< Ροσκοβιτίνη Εικόνα Α4: Μελέτη της επίδρασης της ροσκοβιτίνης (τελική συγκέντρωση 10 μm) στη μετανάστευση των κυττάρων C6. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα (n=4) του αριθμού των κυττάρων που μετανάστευσαν ως προς τον αντίστοιχο αριθμό των κυττάρων που δεν έχουν επωασθεί ΡΤΝ (των οποίων η μετανάστευση θεωρείται 100%). 5. Μέτρηση της ενεργοποίησης από την ΡΤΝ της CDK5 σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC Προκειμένου να επιβεβαιώσουμε και με τη μέθοδο που αναπτύχθηκε στο πλαίσιο της παρούσας εργασίας την ενεργοποίηση της κινάσης CDK5 από την ΡTN στα ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC, τα κύτταρα επωάστηκαν με ΡΤΝ και μετρήθηκε η ενεργότητα της κινάσης CDK5 όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α5, και με τη συγκεκριμένη μέθοδο επιβεβαιώνεται η ενεργοποίηση της CDK5 από την ΡΤΝ στα ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC. 109

121 % Eνεργότητα της CDK5 Αποτελέσματα P< PTN +PTN (100ng/ml) Εικόνα Α5: Μελέτη της επαγόμενης από PTN ενεργοποίηση της CDK5 με χρήση μη ραδιενεργού kit, όπως περιγράφεται αναλυτικά στις Μεθόδους. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα (n=14) του ποσοστού της ενεργότητας της CDK5 σε σύγκριση με ταμη διεγερμένα κύτταρα (όπου η ενεργότητα θεωρείται ως 100%). 6. Αναστολή της PΙ3K αναστέλει την επαγόμενη από PTN ενεργοποίηση της CDK5 σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC Είναι γνωστό από προηγούμενες μελέτες της ερευνητικής μας ομάδας ότι η επαγόμενη από ΡΤΝ ενεργοποίηση της CDK5 εξαρτάται από τον υποδοχέα RPTPβ/ζ (Λαμπροπούλου Ε, 2011). Είναι, επίσης, γνωστό ότι η κινάση ΡΙ3Κ βρίσκεται καθοδικά του RPTPβ/ζ και εμπλέκεται στην επαγόμενη από ΡΤΝ κυτταρική μετανάστευση στα κύτταρα HUVEC (Polykratis et al. 2005). Στην συνέχεια διερευνήθηκε η πιθανή συμμετοχή της PI3K στην επαγόμενη από PTN ενεργοποίηση της CDK5, χρησιμοποιώντας τον αναστολέα της PI3K wortmannin, με τη βοήθεια του μη ραδιενεργού kit μέτρησης ενεργότητας κινασών. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α6, ο αναστολέας wortmannin ανέστειλε πλήρως την επαγόμενη από PTN ενεργοποίηση της κινάσης CDK5, υποδεικνύοντας ότι η τελευταία επιτυγχάνεται μέσω ενεργοποίησης της κινάσης PI3K. Παρατηρείται 110

122 % Eνεργότητα της CDK5 Αποτελέσματα επίσης στατιστικά σημαντική μείωση της ενεργότητας της CDK5 και σε μη διεγερμένα με ΡΤΝ ενδοθηλιακά κύτταρα P<0.01 P<0.001 wortmannin -PTN +PTN (100ng/ml) Εικόνα Α6: Μελέτη της επίδρασης του αναστολέα της κινάσης PI3K wortmannin (τελική συγκέντρωση 100 nm) στην επαγόμενη από PTN ενεργοποίηση της CDK5. Πραγματοποιήθηκε επώαση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC με τον αναστολέα wortmannin για 15 λεπτά πριν την προσθήκη PTN και επιπλέον επώαση με ΡΤΝ για 10 λεπτά. Ακολούθησε ανοσοκατακρήμνιση ολικών πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων των κυττάρων HUVEC με αντίσωμα έναντι της CDK5 και επώαση με τα αντιδραστήρια του ειδικού kit όπως περιγράφεται αναλυτικά στις Μεθόδους. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα (n=4) του ποσοστού της ενεργότητας της CDK5 σε σύγκριση με κύτταρα που δε διεγέρθηκαν με καμία ένωση (όπου η ενεργότητα θεωρείται ως 100%). 7. Αναστολή των ERK1/2 δεν επηρεάζει την επαγόμενη από PTN ενεργοποίηση της CDK5 σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC Από προηγούμενα αποτελέσματα της ερευνητικής μας ομάδας είναι γνωστό ότι η ενεργοποίηση των κινασών ERK1/2 μέσω του υποδοχέα RPTPβ/ζ χρειάζεται για την επαγόμενη από PTN μετανάστευση ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC (Polykratis et al. 2005). Στην παρούσα εργασία δειρευνήθηκε εάν η αναστολή της ενεργοποίησης των ERK1/2 με τον αναστολέα U0126, εμπλέκεται στην επαγόμενη από PTN ενεργοποίηση της κινάσης CDK5 στα ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α7, η αναστολή των κινασών 111

123 % Eνεργότητα της CDK5 Αποτελέσματα ERK1/2 με τον αναστολέα U0126 για 15 λεπτά πριν την επίδραση με PTN για 10 λεπτά, δεν επηρέασε την επαγόμενη από PTN ενεργοποίηση της κινάσης CDK5 (επαγωγή 280 ± 66%), υποδεικνύοντας ότι η επαγόμενη από PTN ενεργοποίηση της κινάσης CDK5 δεν επιτυγχάνεται μέσω ενεργοποίησης των κινασών ERK1/2. Παρόλα αυτά, παρατηρείται στατιστικά σημαντική μείωση της ενεργότητας της CDK5 σε μη διεγερμένα με ΡΤΝ ενδοθηλιακά κύτταρα παρουσία του αναστολέα U P<0.05 P<0.01 P=0.055 U0126 -PTN +PTN (100ng/ml) Εικόνα Α7: Μελέτη της επίδρασης του αναστολέα της ενεργοποίησης των κινασών ERK1/2 U0126 (τελική συγκέντρωση 20 nm) στην επαγόμενη από PTN ενεργοποίηση της CDK5. Πραγματοποιήθηκε επώαση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC με τον αναστολέα U0126 για 15 λεπτά πριν την προσθήκη PTN και επιπλέον επώαση με ΡΤΝ για 10 λεπτά. Ακολούθησε ανοσοκατακρήμνιση ολικών πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων των κυττάρων HUVEC με αντίσωμα έναντι της CDK5 και επώαση με τα αντιδραστήρια του ειδικού kit όπως περιγράφεται αναλυτικά στις Μεθόδους. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα (n=4) του ποσοστού της ενεργότητας της CDK5 σε σύγκριση με τα κύτταρα που δε διεγέρθηκαν με καμία ένωση (όπου η ενεργότητα θεωρείται ως 100%). 8. Αναστολή της κινάσης c-src με τη χρήση του αναστολέα PP1 επάγει την ενεργοποίηση της CDK5 σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC Η κινάση c-src αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ και ενεργοποιείται μετά από επίδραση της ΡΤΝ σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC (Polykratis et al. 2005). 112

124 % Eνεργότητα της CDK5 Αποτελέσματα Στην παρούσα εργασία διερευνήθηκε πιθανός ρόλος της κινάσης c-src στην επαγόμενη από PTN ενεργοποίηση της κινάσης CDK5, με τη χρήση του αναστολέα της c-src PP1 και τη βοήθεια του μη ραδιενεργού kit μέτρησης ενεργότητας κινασών. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α8, ο αναστολέας PP1 από μόνος του προκαλεί σημαντική ενεργοποίηση της κινάσης CDK5, σε επίπεδα παρόμοια με την επαγωγή που προκαλείται από την ΡΤΝ. Επίδραση της ΡΤΝ στα κύτταρα δεν προκαλεί περαιτέρω ενεργοποίηση της CDK P< PTN +PTN (100ng/ml) 300 P< PP1 Εικόνα Α8: Μελέτη της επίδρασης του αναστολέα της κινάσης c-src PP1 (τελική συγκέντρωση 10μM) στην επαγόμενη από PTN ενεργοποίηση της CDK5. Πραγματοποιήθηκε επώαση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC με τον αναστολέα PP1 για 15 λεπτά πριν την προσθήκη PTN και επιπλέον επώαση με ΡΤΝ για 10 λεπτά. Ακολούθησε ανοσοκατακρήμνιση ολικών πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων των κυττάρων HUVEC με αντίσωμα έναντι της CDK5 και επώαση με τα αντιδραστήρια του ειδικού kit, όπως περιγράφεται αναλυτικά στις Μεθόδους. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα (n=3) του ποσοστού της ενεργότητας της CDK5 σε σύγκριση με τα κύτταρα που δε διεγέρθηκαν με καμία ένωση (όπου η ενεργότητα θεωρείται ως 100%). 113

125 % Eνεργότητα της CDK5 Αποτελέσματα 9. Αναστολή της c-src με τη χρήση του αναστολέα SU6656 δεν επηρεάζει την επαγόμενη από PTN ενεργοποίηση της CDK5 σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC Επειδή ο αναστολέας της κινάσης c-src ΡΡ1 δεν είναι απολύτως εκλεκτικός για την κινάση αυτή, η πιθανή συμμετοχή της c-src στην επαγόμενη από PTN ενεργοποίηση της CDK5 ελέγχθηκε και με τη χρήση ενός ακόμα αναστολέα, του SU6656, μετρώντας την επίδρασή του στην επαγόμενη από PTN ενεργοποίηση της CDK5 με τη βοήθεια του μη ραδιενεργού kit μέτρησης ενεργότητας κινασών. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α9, η αναστολή της κινάσης c-src με τον αναστολέα SU6656 για 15 λεπτά πριν την επίδραση με PTN για 10 λεπτά, δεν επηρέασε την επαγόμενη από PTN ενεργοποίηση της κινάσης CDK5, υποδεικνύοντας ότι η επαγόμενη από PTN ενεργοποίηση της κινάσης CDK5 δεν επιτυγχάνεται μέσω ενεργοποίησης της κινάσης c-src. Ο αναστολέας SU6656 δεν είχε καμία επίδραση στη βασική ενεργότητα της CDK5 στα μη διεγερμένα με ΡΤΝ ενδοθηλιακά κύτταρα. 300 P< PTN + PTN 100ng/ml SU6656 Εικόνα Α9: Μελέτη της επίδρασης του αναστολέα της κινάσης c-src SU6656 (τελική συγκέντρωση 10 μm) στην επαγόμενη από PTN ενεργοποίηση της CDK5. Πραγματοποιήθηκε επώαση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC με τον αναστολέα SU6656 για 15 λεπτά πριν την προσθήκη PTN και επιπλέον επώαση με ΡΤΝ για 10 λεπτά. Ακολούθησε ανοσοκατακρήμνιση ολικών πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων των κυττάρων HUVEC με αντίσωμα έναντι της CDK5 και επώαση με τα αντιδραστήρια του ειδικού kit όπως περιγράφεται αναλυτικά στις Μεθόδους. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα (n=3) του ποσοστού της ενεργότητας της CDK5 σε σύγκριση με τα κύτταρα που δε διεγέρθηκαν με καμία ένωση (όπου η ενεργότητα θεωρείται ως 100%). 114

126 Αποτελέσματα 10. Η CDK5 και η p35 αλληλεπιδρούν με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ Προηγούμες μελέτες της ερευνητικής μας ομάδας έχουν δείξει ότι τόσο η CDK5 όσο και ο ενεργοποιητής της p35 αλληλεπιδρούν άμεσα με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ. Αυτό έχει δειχτεί με ανοσοκατακρήμνιση και ανάλυση κατά Western των υπό μελέτη μορίων σε κύτταρα C6 και με πειράματα ανοσοκατακρήμνισης/φασματοφωτομετρίας μάζας και ανάλυσης Proximity Ligation Assay σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC (αδημοσίευτες παρατηρήσεις). Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε εάν τόσο η κινάση CDK5 όσο και ο ενεργοποιητής της p35 συγκατακρημνίζονται σε εκχυλίσματα ολικών πρωτεϊνών από ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC. Σε ολικά πρωτεϊνικά εκχυλίσματα των κυττάρων πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση με αντίσωμα έναντι του RPTPβ/ζ. Ακολούθησε ηλεκτροφόρηση SDS-PAGE και ανάλυση κατά Western με αντίσωμα έναντι της p35 ή της CDK5. Στην Εικόνα Α10, φαίνεται ότι και η CDK5 και η p35 συγκατακρημνίζονται με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ σε ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC, επιβεβαιώνοντας περαιτέρω την άποψη ότι τα μόρια αυτά αλληλεπιδρούν. Α Β Eικόνα Α10: Η αλληλεπίδραση μελετήθηκε με ανοσοκατακρήμνιση ολικών πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων από ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC με αντίσωμα έναντι του RPTPβ/ζ και τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν με αντίσωμα έναντι της p35 (Α) και της CDK5 (Β). 115

127 Αποτελέσματα 11. Έκφραση και ενεργότητα της CDK5 στην CAM εμβρύου όρνιθας Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήσαμε την CAM εμβρύου όρνιθας, που είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο μοντέλο μελέτης της αγγειογένεσης in vivo, για να διερευνήσουμε εάν και πως τα επίπεδα της ενεργότητας της κινάσης CDK5 μεταβάλλονται σε σχέση με την αγγειογένεση του ιστού. Για τη μέτρηση της ενεργότητας της CDK5 πραγματοποιήθηκε εκτομή του ιστού τις ημέρες 6, 9, 12, 15 και 18 ανάπτυξης του εμβρύου, ομογενοποίηση, προσδιορισμός ολικών πρωτεϊνών, ανοσοκατακρήμνιση με αντίσωμα έναντι της CDK5, επώαση με τα αντιδραστήρια του μη ραδιενεργού kit και μέτρηση της ενεργότητας όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Όπως φαίνεται στην εικόνα Α11, η ενεργότητα της κινάσης CDK5 αυξάνεται σημαντικά μεταξύ των ημερών 6 και 9 ανάπτυξης του εμβρύου και παραμένει σταθερή μέχρι τη 15 η ημέρα ανάπτυξης. Η ενεργότητα της κινάσης CDK5 μειώνεται μεταξύ της 15 ης και 18 ης ημέρας ανάπτυξης του εμβρύου. 116

128 % Eνεργότητα της CDK5 % Έκφραση CDK5 Αποτελέσματα Α Ημέρες ανάπτυξης εμβρύου όρνιθας Β 400 * 300 *** Ημέρες ανάπτυξης εμβρύου όρνιθας Εικόνα Α11: Μελέτη της έκφρασης (Α) και της ενεργότητας (Β) της κινάσης CDK5 στην CAM εμβρύου όρνιθας σε διάφορα αναπτυξιακά στάδια. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα του ποσοστού της έκφρασης (n=2) ή της ενεργότητας (n=3) της CDK5 σε σύγκριση με τα αντίστοιχα επίπεδα την 6 η ημέρα ανάπτυξης του εμβρύου (όπου η έκφραση/ενεργότητα θεωρείται ως 100%). Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν στατιστικά σημαντική διαφορά σε σύγκριση με την ενεργότητα της CDK5 την 6 η ημέρα ανάπτυξης του εμβρύου. *Ρ<0.05, ***Ρ< Η εικόνα στο Α είναι αντιπροσωπευτική ανάλυση κατά Western της ποσότητας της CDK5 που ανοσοκατακρημνίστηκε από ίση ποσότητα ολικής πρωτεΐνης του ιστού στις διάφορες ημέρες ανάπτυξης που μελετήθηκαν. 117