Διονυσία Λυμπεράτου Χημικός

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΔΜΠΣ «ΙΑΤΡΙΚΗ ΧΗΜΕΙΑ: ΣΧΕΔΙΑΣΜΟΣ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ» Ο Ρόλος της Αντι-Οιστρογονικής Θεραπείας στο Μεταστατικό Δυναμικό των Καρκινικών Κυττάρων Μαστού Διονυσία Λυμπεράτου Χημικός Επιβλέπων: Άγγελος Κούτρας Πάτρα 2012

2 2

3 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Άγγελος Κ. Κούτρας (Επιβλέπων) Χαράλαμπος Π. Καλόφωνος Θωμάς Μακατσώρης Λέκτορας Παθολογίας-Ογκολογίας Καθηγητής Παθολογίας-Ογκολογίας Λέκτορας Παθολογίας-Ογκολογίας 3

4 4

5 Ευχαριστίες Θα ήθελα να εκφράσω τις θερμότατες ευχαριστίες μου στον επιβλέποντα της παρούσας εργασίας, κ. Άγγελο Κούτρα, Λέκτορα Ογολογίας-Παθολογίας τμήματος Ιατρικής, Πανεπιστημίου Πατρών, για την αμέριστη βοήθειά του σε επιστημονικά ζητήματα, την συνεχή ηθική υποστήριξή του και την εμπιστοσύνη του. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στον κ. Χαράλαμπο Καλόφωνο, Καθηγητή Ογκολογίας-Παθολογίας, τμήματος Ιατρικής, Πανεπιστημίου Πατρών και Διευθυντή της Ογκολογικής Κλινικής, για τη γενναιόδωρη φιλοξενία στο εργαστήριο Κλινικής Ογκολογίας και που χωρίς την ουσιαστική του συνδρομή η εργασία αυτή θα παρέμενε μια ιδέα. Ακόμη, ένα μεγάλο ευχαριστώ στον κ. Θωμά Μακατσώρη, Λέκτορα Ογκολογίας-Παθολογίας, τμήματος Ιατρικής, Πανεπιστημίου Πατρών, για την ευγενική του συμμετοχή στην τριμελή εξεταστική επιτροπή μου. Θα ήθελα επίσης να εκφράσω τις εγκάρδιες ευχαριστίες μου την κ. Ευσταθία Γιαννοπούλου, PhD για την πολυτιμότατη βοήθειά της σε πρακτικά και θεωρητικά ζητήματα, την υπομονή της, καθώς και για την καίρια συμβολή της στην πραγματοποίηση και ολοκλήρωση της εργασίας. Επίσης, θα ήθελα να εκφράσω τις ευχαριστίες μου σε όλα τα μέλη του εργαστηρίου για την πρακτική και ηθική βοήθεια που μου προσέφεραν, καθώς και για τις εποικοδομητικές συζητήσεις μας, οι οποίες αποτέλεσαν για μένα πηγή έμπνευσης. Ένα πολύ μεγάλο ευχαριστώ ανήκει στους οικείους μου, οι οποίοι μοιράστηκαν τις χαρές, τον ενθουσιασμό, αλλά και τις λύπες και απογοητεύσεις που μου επιφύλασσε η διαδικασία εκπόνησης και συγγραφής της παρούσας εργασίας. Ευχαριστώ πρώτα απ όλα τους γονείς μου, οι οποίοι με στήριξαν με όλη τους την αγάπη και την καλή τους θέληση. Τον αδελφό μου Παναγιώτη, για την αγάπη του, την συνεχή του συμπαράσταση και ψυχολογική υποστήριξη. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω την αγαπημένη μου φίλη Σταυρούλα Μανωλάκου, για το έμπρακτο ενδιαφέρον που έδειξε σε ότι αφορά το ζήτημα των μεταπτυχιακών μου σπουδών και την άμεση ηθική και πρακτική συμμετοχή της. 5

6 6

7 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 9 Οιστρογόνα Οιστρογονικοί Υποδοχείς σελ Ορμονοανθεκτικός Καρκίνος Μαστού.14 HER2 + καρκίνος μαστού Τριπλά αρνητικός καρκίνος μαστού (Triple Negative Breast Cancer, TNBC) Ορμονοευαίσθητος Καρκίνος Μαστού Ορμονοθεραπευτικές Προσεγγίσεις Διήθηση-Μετάσταση Κυτταρική Μετανάστευση Εξωκυττάριο Υλικό (Extracellular matrix - ECM) και Μεταλλοπρωτεϊνάσες (Matrix Metalloproteinases - MMPs) Μετάπτωση Επιθηλιακών Κυττάρων σε Κύτταρα με Μεσεγχυματικό Φαινότυπο (Epithelial Mesenhymal Transition, EMT) Κινάση εστιακής προσκόλλησης (Focal Adhesion Kinase-FAK) ΣΚΟΠΟΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT.97 7

8 8

9 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ο καρκίνος του μαστού αποτελεί την πιο συχνή μορφή κακοήθειας στις γυναίκες του δυτικού κόσμου, ενώ συνιστά την δεύτερη αιτία θανάτου από καρκίνο. Εκτιμάται ότι περίπου μία στις οκτώ γυναίκες θα εμφανίσει καρκίνο του μαστού σε κάποια χρονική στιγμή της ζωής της 1. Ο κίνδυνος ανάπτυξης καρκίνου του μαστού σχετίζεται μεταξύ άλλων με: την πρόωρη εμμηναρχή την καθυστερημένη εμμηνόπαυση την χορήγηση υψηλών δόσεων οιστρογόνων για μεγάλο χρονικό διάστημα μετά την εμμηνόπαυση 2-4. Οι παραπάνω παράγοντες αυξάνουν την διάρκεια έκθεσης του επιθηλίου του μαζικού αδένα στα οιστρογόνα και/ή την προγεστερόνη. Συνεπώς, πολλοί τύποι καρκίνου μαστού εξαρτώνται από αυτές τις ορμόνες όχι μόνο σε ό,τι αφορά στην ανάπτυξη του όγκου, αλλά και αργότερα στην πρόοδο της νόσου και στο μεταστατικό της δυναμικό. Ο καρκίνος του μαστού χωρίζεται σε υποκατηγορίες ανάλογα με το μοριακό προφίλ της νόσου. Η έκφραση οιστρογονικών (Estrogen Receptors, ERs) και/ή προγεστερονικών υποδοχέων (Progesteron Receptors, PRs) παρατηρείται στο μεγαλύτερο ποσοστό ασθενών με καρκίνο μαστού. Ακολουθεί ο τριπλά αρνητικός και πιο σπάνιος είναι ο HER2 + (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2- HER) ο οποίος παρουσιάζει μόνο υπερέκφραση του αντίστοιχου ογκογονιδίου (Πίνακας 1). Επίσης, σημαντικό ρόλο στην κατηγοριοποίηση του καρκίνου του μαστού διαδραματίζει το καρκινικό αντιγόνο Ki67. Το Ki67 είναι μια πρωτεϊνη που εδράζεται στον πυρήνα και στον ανθρώπινο οργανισμό κωδικοποιείται από το γονίδιο MKi67. Αποτελεί προγνωστικό δείκτη του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και επιπλέον συνδέεται άρρηκτα με τη μεταγραφή του ριβοσωμικού RNA. Η πρωτεϊνη Ki67 είναι παρούσα σε όλες τις φάσεις ανάπτυξης και διαίρεσης του κυτταρικού κύκλου (G 1, S, G 2 και μίτωση), αλλά είναι απούσα κατά τη φάση G

10 Πίνακας 1: Οι βασικοί μοριακοί υπότυποι καρκίνου του μαστού Υπότυποι Τείνουν να είναι ER-, PR-, HER2+ Ki67ER-, PR-, Τριπλά HER2, αρνητικός κυτοκερατίνη 5/6+ και/ή EGFR Αυλικού τύπου ER+ και/ή PR+, Α (Luminal A) HER2-χαμηλό ER+ και/ή PR+, Αυλικού τύπου HER2+ (HER2- με Β (Luminal B) υψηλό Ki67) HER2 Συχνότητα εμφάνισης 7-12% 14-20% Ορμονοάντοχοι όγκοι 42-59% 6-19% Ορμονοευαίσθητοι όγκοι ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΑ Τα οιστρογόνα είναι στεροειδή μόρια που προέρχονται από συγκεκριμένο μοριακό σκελετό, ο οποίος αποτελείται από τέσσερις δακτυλίους ατόμων άνθρακα. Ο πρώτος εκ των τεσσάρων δακτυλίων, εμφανίζει αρωματικότητα καθώς και σταθερή υποκατάσταση με υδροξυλομάδα ( ΟΗ) στον C3. Εικόνα 1: Μοριακή δομή στεροειδών 10

11 Τα πιο γνωστά είναι η οιστραδιόλη και η οιστρόνη τα οποία εκκρίνονται από τις ωοθήκες, αν και η οιστρόνη παράγεται και από άλλα όργανα όπως τα επινεφρίδια. A Εικόνα 2: Η Μοριακή δομή της Α) Οιστρόνης και της Β) 17β-Οιστραδιόλης (Ε 2 ). B Τα οιστρογόνα είναι ορμόνες και δρουν ως σηματοδοτικά μόρια στον οργανισμό. Ένα σηματοδοτικό μόριο ασκεί την δράση του ταξιδεύοντας μέσω της συστηματικής κυκλοφορίας και αλληλεπιδρώντας με κύτταρα σε διάφορους ιστούς-στόχους. Ο μαστός και η μήτρα, που παίζουν σημαντικό ρόλο στην αναπαραγωγή, είναι δύο από τους κύριους στόχους των οιστρογόνων. Επιπλέον, τα οιστρογονικά μόρια δρουν στα οστά, την καρδιά, το ήπαρ και τον εγκέφαλο 6. Εικόνα 3: Ιστοί-στόχοι των οιστρογόνων 7 11

12 ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΙΚΟΙ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ (Estrogen Receptors - ERs) Για να μεταδοθεί το ενδοκυττάριο σήμα από τα οιστρογόνα, απαιτείται η δέσμευσή τους στους ERs που εδράζονται στον πυρήνα του κυττάρου. Οι ERs απαρτίζονται από δύο υποκατηγορίες, τους ERα και τους ERβ που ανακαλύφθηκαν σχετικά πρόσφατα 8, 9. Αυτοί οι υποδοχείς ανήκουν στην υπεροικογένεια των πυρηνικών ορμονικών υποδοχέων που λειτουργούν ως μεταγραφικοί παράγοντες όταν δεσμεύονται με οιστρογόνα. Έπειτα από τη σύνδεσή τους με τις ορμόνες, οι ERs μεταφέρονται στον πυρήνα και δεσμεύονται στο DNA με μεγάλη συγγένεια σε συγκεκριμένες περιοχές που ονομάζονται περιοχές ανταπόκρισης σε οιστρογόνα (Estrogen Response Elements - EREs). Έχει παρατηρηθεί ότι ο ERβ είναι λιγότερο ισχυρός μεταγραφικός παράγοντας σε σύγκριση με τον ERα, σε μια πληθώρα εκκινητών των EREs 10. Επίσης έχει αποδειχθεί ότι οι δύο ERs μπορούν να σχηματίσουν λειτουργικά ετεροδιμερή, τα οποία υπερισχύουν έναντι των ομοδιμερών και ότι τα ERα:ERβ ετεροδιμερή, πιθανώς εμφανίζουν μεγαλύτερου βαθμού συγγένεια με τα EREs. Στους περισσότερους ορμονοευαίσθητους καρκίνους του μαστού έχει βρεθεί συνέκφραση του ERα και του ERβ και άρα είναι πιθανό ότι συμβαίνει ετεροδιμερισμός. Επίσης, πιθανολογείται ότι η έκφραση του ERβ ενδεχομένως διαδραματίζει έναν προστατευτικό ρόλο ενάντια στον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό και στην καρκινογένεση σε ορισμένους ιστούς, ενδεχομένως δρώντας ανασταλτικά στις μιτογόνες ικανότητες του ERα. Πρόσφατα δεδομένα από την πρωτεϊνική ανάλυση του ERβ υποδεικνύουν ότι η έκφρασή του αποτελεί ευνοϊκό προγνωστικό δείκτη στον καρκίνο του μαστού. Αν και η ακριβής συμμετοχή του στην εξέλιξη της νόσου παραμένει ακόμα άγνωστη, η πρόσφατη υπόθεση εισηγείται ότι τα αυξημένα επίπεδα έκφρασης του ERβ σχετίζονται με αυξημένη πιθανότητα καλής ανταπόκρισης των ασθενών στην ορμονοθεραπεία. Ο κλασικός μηχανισμός δράσης του ER περιλαμβάνει τη δέσμευση των οιστρογόνων με τον υποδοχέα στον πυρήνα και στη συνέχεια οι υποδοχείς διμερίζονται και δεσμεύονται στα EREs που εδράζονται στους εκκινητές των γονιδίων στόχων 11. Επίσης, η δέσμευση των ορμονών, επάγει δομική αλλαγή στη θέση δέσμευσης του προσδέτη πάνω στον υποδοχέα. Αυτή η δομική αλλαγή επιτρέπει την επιστράτευση πρωτεϊνών που έχουν συνεργιστική δράση 12. Ωστόσο, νεότερα δεδομένα έχουν αναδείξει σηματοδοτικά μονοπάτια που 12

13 παρεκκλίνουν από τον κλασικό μηχανισμό δράσης του ER και είναι πλέον αποδεκτό ότι οι ERs δύνανται να ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση με μια πληθώρα διακριτών μηχανισμών. Περίπου το ένα τρίτο των γονιδίων που ρυθμίζονται από τους ERs δεν περιέχουν ERE αλληλουχίες 13. Σε αυτή την περίπτωση η γονιδιακή ρύθμιση πραγματοποιείται χωρίς άμεση δέσμευση των ERs στο DNA, ρυθμίζοντας τη λειτουργία άλλων μεταγραφικών παραγόντων μέσω αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών στον πυρήνα 14. Τυπικό παράδειγμα αποτελεί η πρωτεΐνη AP-1 (activator protein 1) που δεν διαθέτει ERE περιοχή. Τα οιστρογόνα ασκούν τη επίδρασή τους μέσω της επιρροής του ER στη γονιδιακή ρύθμιση, αλλά μια πληθώρα άλλων επιδράσεων των οιστρογόνων είναι τόσο ταχεία όπου δεν μπορεί να εξαρτάται από την ενεργοποίηση του RNA και της σύνθεσης πρωτεϊνών. Αυτές οι δράσεις είναι γνωστές ως μη-γενομικές και πιστεύεται ότι πραγματοποιούνται μέσω μεμβρανικά-σχετιζόμενων ERs. Τέτοιες δράσεις συχνά συσχετίζονται με ενεργοποίηση καταρρακτών σηματοδότησης από πρωτεϊνικές κινάσες 15. Ωστόσο, μη γενομικές δράσεις των οιστρογόνων ενδεχομένως επηρεάζουν έμμεσα την γονιδιακή ρύθμιση μέσω ενεργοποίηση σηματοδοτικών μονοπατιών όπου περιστασιακά δρουν σε στόχους μεταγραφικών παραγόντων. Οι λειτουργίες πολλών μεταγραφικών παραγόντων, συμπεριλαμβανομένου του AP-1, ρυθμίζονται μέσω φωσφορυλίωσης της πρωτεϊνικής κινάσης και αυτοί οι μεταγραφικοί παράγοντες μπορούν έτσι να αποτελούν στόχους της μη-γενομικής δράσης των οιστρογόνων. 13

14 Εικόνα 4: Γενομική και μη-γενομική δράση των οιστρογόνων 16 ΟΡΜΟΝΟΑΝΘΕΚΤΙΚΟΣ ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΜΑΣΤΟΥ HER2 + καρκίνος μαστού Ο HER2 είναι μέλος της οικογένειας των επιδερμικών αυξητικών παραγόντων τυροσινικής κινάσης, που περιλαμβάνει τον EGFR/HER1, HER2, HER3 και HER4. Ομοδιμερισμός ή ετεροδιμερισμός αυτών των παραγόντων καταλήγει στην φωσφορυλίωση των καταλοίπων της ενδοκυττάριας περιοχής και την έναρξη του καταρράκτη σηματοδότησης. Ακολουθεί στρατολόγηση μορίων που είναι υπεύθυνα για την έναρξη πολλών σηματοδοτικών μονοπατιών που εμπλέκονται στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση 17,

15 Εικόνα 5: Ομο/Ετερο-διμερισμός και σηματοδότηση των υποδοχέων της οικογένειας HER 19. Εκτιμάται ότι περίπου το 20% των καρκίνων μαστού εμφανίζουν υπερ-έκφραση του HER2, που συνεπάγεται την εμφάνιση επιθετικού φαινοτύπου και μειωμένης επιβίωσης. Η στοχευμένη θεραπεία των HER2 + καρκίνων μαστού με παράγοντες που στοχεύουν το HER2 όπως μονοκλωνικά αντισώματα και αναστολείς τυροσινικής κινάσης, έχει βελτιώσει σημαντικά την εξέλιξη της εν λόγω νόσου 20. Τριπλά αρνητικός καρκίνος μαστού (Triple Negative Breast Cancer - TNBC) Ο τριπλά αρνητικός καρκίνος μαστού αποτελεί μια υπο-ομάδα των καρκίνων μαστού που δεν εκφράζουν τους οιστρογονικούς υποδοχείς, τους προγεστερονικούς υποδοχείς και τους HER2. Αυτή η ετερογενής ομάδα όγκων έχει σημαντική επικάλυψη με βασικούς τύπους (basal-like) όγκους, καθώς και με όγκους που σχετίζονται με μεταλλάξεις στο BRCA1 γονίδιο. Η χημειοθεραπεία αποτελεί την τυπική θεραπευτική προσέγγιση σε αυτόν τον 15

16 ιδιαίτερα επιθετικό τύπο καρκίνου και συγκριτικά με άλλους υπότυπους, οι TNBC παρουσιάζουν τουλάχιστον ανάλογη ευαισθησία στην χημειοθεραπεία. Ωστόσο, παρά την αυξημένη χημειοευαισθησία, οι TNBC συνοδεύονται από δυσμενέστερη πρόγνωση συγκριτικά με τους υπόλοιπους υπότυπους καρκίνου μαστού 21. OΡΜΟΝΟΕΥΑΙΣΘΗΤΟΣ ΚΑΡΚΙΝΟΣ ΜΑΣΤΟΥ (ER + ) Σημαντικό ποσοστό των καρκίνων μαστού (περίπου 75%) έχουν θετικούς οιστρογονικούς και/ή προγεστερονικούς υποδοχείς. Ο ορμονοευαίσθητος καρκίνος του μαστού δεν παρουσιάζει επιθετικό φαινότυπο, αφού έχει αναφερθεί ότι το σύμπλοκο E 2 -ER διαδραματίζει προστατευτικό ρόλο ως προς την διηθητική και μεταναστευτική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων 9. Επίσης, ο ER + καρκίνος μαστού σχετίζεται με υψηλή διαφοροποίηση και συνήθως συνοδεύεται από καλή πρόγνωση, ωστόσο ο ακριβής μηχανισμός σύμφωνα με τον οποίο η Ε 2 καταστέλλει την διήθηση παραμένει μέχρι και σήμερα άγνωστος. Ο ER + καρκίνος μαστού κατηγοριοποιείται σε δύο μεγάλες ομάδες, την Αυλικού τύπου Α (Luminal A) και την Αυλικού τύπου Β (Luminal B) (βλ. πίνακα 1). Στην πρώτη ομάδα κατατάσσονται όγκοι που εκφράζουν οιστρογονικούς και/ή προγεστερονικούς υποδοχείς με χαμηλό παράγοντα πολλαπλασιασμού (Κi67) και θεωρείται ως η λιγότερο επιθετική μορφή ER + καρκίνου του μαστού 9. Στην κατηγορία Luminal B περιλαμβάνονται οι όγκοι που εκφράζουν οιστρογονικούς και/ή προγεστερονικούς υποδοχείς με ταυτόχρονη υπερ-έκφραση του ογκογονιδίου HER2. Λόγω της παρουσίας του HER2, η ομάδα αυτή παρουσιάζει πιο επιθετικό φαινότυπο 22. Οι στοχευμένες θεραπείες είναι εφικτές τόσο στην Luminal A όσο και στην Luminal B υποκατηγορία του ER + καρκίνου μαστού. Ανάλογα με την κατάσταση του έμμηνου κύκλου χορηγείται κατάλληλος θεραπευτικός παράγοντας που είτε μειώνει τα επίπεδα των στεροειδών ορμονών, είτε παρεμποδίζει τη συμπλοκοποίηση του υποδοχέα με τον προσδέτη του. Το τελευταίο συνεπάγεται απενεργοποίηση και καταστολή του σήματος. Επιπλέον, στην Luminal Β ομάδα έχουν ρόλο και οι παράγοντες που στοχεύουν το HER

17 ΟΡΜΟΝΟΘΕΡΑΠΕΥΤΙΚΕΣ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΕΙΣ Εκλεκτικοί Τροποποιητές των Υποδοχέων των Οιστρογόνων (Selective Estrogen Receptor Modulators, SERMs) Οι SERMs είναι μια κατηγορία ενώσεων που δρουν στον οιστρογονικό υποδοχέα. Ο μηχανισμός δράσης τους είναι συνδυαστικός και μπορούν να ασκούν αγωνιστική ή ανταγωνιστική δράση, ανάλογα με τον ιστό στόχο. Συνεπώς, έχουν τη δυνατότητα να παρεμποδίζουν αλλά και να επάγουν την δράση των οιστρογόνων σε διάφορους ιστούς 23. Κύριος εκπρόσωπος αυτής της κατηγορίας φαρμάκων είναι η ταμοξιφαίνη, ενώ υπάρχουν και άλλοι εμπορικά διαθέσιμοι SERMs όπως η ραλοξιφαίνη, η τορεμιφαίνη και άλλοι. Ταμοξιφαίνη Η ταμοξιφαίνη είναι ένας μη στεροειδικός παράγοντας με δυνητικά αντιοιστρογονικές ιδιότητες που ανταγωνίζεται τα οιστρογόνα στις θέσεις δέσμευσης στο μαστό και σε άλλους ιστούς. Συντέθηκε για πρώτη φορά το 1966, ενώ κλινικές μελέτες τεκμηρίωσαν το σημαντικό όφελος σε ασθενείς με πρώιμο ή προχωρημένο καρκίνο μαστού. Εγκρίθηκε από τον FDA πριν το 1984 και έως σήμερα αποτελεί την συχνότερη επιλογή ορμονοθεραπείας τόσο σε γυναίκες, όσο και σε άντρες με ορμονοευαίσθητο καρκίνο του μαστού 24. Εικόνα 6: Μοριακή δομή ταμοξιφαίνης 24 Η ταμοξιφαίνη προσδένεται ανταγωνιστικά στον οιστρογονικό υποδοχέα δημιουργώντας ένα πυρηνικό σύμπλοκο που μειώνει την σύνθεση DNA και παρεμποδίζει την δράση των οιστρογόνων. Επιπλέον, επηρεάζει τον κυτταρικό κύκλο σταματώντας τα κύτταρα στην φάση G 0 /G 1, εμποδίζοντας την δέσμευση της οιστραδιόλης στους αντίστοιχους υποδοχείς. Η ταμοξιφαίνη είναι προ-φάρμακο με 17

18 χαμηλή συγγένεια για τον οιστρογονικό υποδοχέα. Μεταβολίζεται στο ήπαρ από το κυτόχρωμα P450 στους δύο φαρμακολογικά ενεργούς μεταβολίτες της, την ενδοξιφαίνη και την 4-υδρoξυ-ταμοξιφαίνη, οι οποίοι παρουσιάζουν 30 έως 100 φορές μεγαλύτερη συγγένεια με τον υποδοχέα σε σύγκριση με το προφάρμακο 24. Ο μηχανισμός δράσης της ταμοξιφαίνης περιλαμβάνει αρχικά την δέσμευσή της στον οιστρογονικό υποδοχέα και στη συνέχεια αλληλεπίδραση με το DNA. Το σύμπλοκο υποδοχέα-ταμοξιφαίνης προκαλεί την έκκριση πρωτεϊνών καταστολέων που σταματούν την ενεργοποίηση των γονιδίων που επάγονται από τα οιστρογόνα. Η δράση της ρυθμίζεται από διάφορες μεταβλητές, συμπεριλαμβανομένων των αυξητικών παραγόντων. Σύμφωνα με πρόσφατες μελέτες, η ανάπτυξη αντίστασης στην ταμοξιφαίνη οφείλεται σε σημαντικό βαθμό στα υψηλά επίπεδα έκφρασης του υποδοχέα HER2. Επίσης, σημαντικό ρόλο στην αντίσταση στην ταμοξιφαίνη φαίνεται να παίζει και η διασταυρούμενη επικοινωνία μεταξύ του ER και άλλων σηματοδοτικών μονοπατιών, όπως η οδός PI3K/Akt/mTOR 22, 25. Γενικά η ταμοξιφαίνη θεωρείται φάρμακο με ευνοϊκό προφίλ ασφάλειας και σημαντικό όφελος για τους ασθενείς. Ωστόσο, μια δυνητικά επικίνδυνη αλλά σχετικά ασυνήθη ανεπιθύμητη ενέργεια αποτελούν τα θρομβο-εμβολικά επεισόδια. Επιπλέον, αν και δρα ανταγωνιστικά στο μαστό, ασκεί αγωνιστική δράση στα οστά και τη μήτρα (estrogen-like action). Η ιδιότητα της ταμοξιφαίνης να δρα αγωνιστικά στο ενδομήτριο την ενοχοποιεί για την αυξημένη πιθανότητα ανάπτυξης καρκίνου του ενδομητρίου σε γυναίκες που έχουν υποβληθεί σε θεραπεία για μεγάλο χρονικό διάστημα. Επιπλέον, η αγωνιστική δράση της στα οστά σχετίζεται με εμφάνιση οστεοπόρωσης σε προ-εμμηνοπαυσιακές γυναίκες. Αναστολείς αρωματάσης (AIs) Οι αναστολείς αρωματάσης χορηγούνται ως ορμονοθεραπεία σε μεταεμμηνοπαυσιακές γυναίκες με καρκίνο του μαστού. Η αρωματάση είναι το ένζυμο που καταλύει την μετατροπή των ανδρογόνων σε οιστρογόνα, μια διαδικασία γνωστή και ως αρωματοποίηση. Στις προ-εμμηνοπαυσιακές γυναίκες, κύρια πηγή οιστρογόνων αποτελούν οι ωοθήκες, ενώ στις μεταεμμηνοπαυσιακές απαιτείται η μετατροπή των ανδρογόνων σε οιστρογόνα 18

19 μέσω της αρωματάσης. Οι αναστολείς αρωματάσης αναστέλλουν την δράση του ενζύμου και συνεπώς παρεμποδίζουν την παραγωγή οιστρογόνων στους περιφερικούς ιστούς. Υπάρχουν αρκετά εμπορικά διαθέσιμα σκευάσματα αναστολέων αρωματάσης, όπως letrozole, exemestane, anastrozole και άλλα. Εκλεκτικοί Τροποποιητές των Υποδοχέων των Οιστρογόνων με αμιγή ανταγωνιστική δράση (Selective Estrogen Receptor Downregulators, SERDs) Στην κατηγορία αυτή ανήκουν οι ενώσεις με αμιγή αντι-οιστρογονική δράση, που δρουν ανταγωνιστικά έναντι των οιστρογόνων σε όλους τους ιστούς. Τα κύρια χαρακτηριστικά των SERDs είναι η αντιμιτογόνος δράση, η επαγωγή της απόπτωσης, η ικανότητα μείωσης των επιπέδων έκφρασης του ER, η έλλειψη διασταυρούμενης αντίστασης με την ταμοξιφαίνη, καθώς και η έλλειψη αγωνιστικών ιδιοτήτων στους ERs 26. Fulvestrant Το fulvestrant ανήκει στους SERDs και αντιπροσωπεύει μια νέα κατηγορία ορμονοθεραπείας για την αντιμετώπιση ασθενών με ορμονοευαίσθητο καρκίνο του μαστού 27, 28. Αποτελεί ανταγωνιστή του οιστρογονικού υποδοχέα και παρουσιάζει 100 φορές μεγαλύτερη συγγένεια με αυτόν σε σύγκριση με την ταμοξιφαίνη 29. Εικόνα 7: Μοριακή δομή fulvestrant 30 19

20 Το fulvestrant θεωρείται αμιγές αντιοιστρογόνο, αφού δεν εμφανίζει αγωνιστικές ιδιότητες και ως εκ τούτου στερείται των ανεπιθύμητων ενεργειών των SERMs. Χορηγείται ενδομυϊκά μία φορά το μήνα, σε αντίθεση με τους SERMs που χορηγούνται καθημερινά per os. Ο μηχανισμός δράσης του περιλαμβάνει την δέσμευση, την αναστολή και στη συνέχεια την αποικοδόμηση του ER και του PR, καταλήγοντας στην παρεμπόδιση μετάδοσης του οιστρογονικού σήματος. Κλινικά δεδομένα με την χρήση του fulvestrant υπάρχουν σε μετα-εμμηνοπαυσιακές γυναίκες όπου έχει αποδειχθεί εξίσου αποτελεσματική θεραπεία με τον αναστολέα αρωματάσης αναστροζόλη, σε προθεραπευμένες με ταμοξιφαίνη ασθενείς. Επιπλέον, πρόσφατη τυχαιοποιημένη μελέτη εισηγείται ότι το fulvestrant ενδεχομένως να πλεονεκτεί έναντι της αναστροζόλης ως θεραπεία πρώτης γραμμής 26, LHRH αγωνιστές Οι LHRH αγωνιστές είναι συνθετικά πεπτίδια, σχεδιασμένα με βάση την φυσική υποθαλαμική ορμόνη LHRH. Χρησιμοποιούνται ευρύτατα σε ορμονοεξαρτώμενους καρκίνους, όπως του προστάτη και του μαστού. Σε προ-εμμηνοπαυσιακές γυναίκες με καρκίνο μαστού, οι LHRH αγωνιστές επάγουν φαρμακευτική ωοθηκεκτομή, καταστέλλοντας την παραγωγή οιστρογόνων από τις ωοθήκες. 20

21 ΔΙΗΘΗΣΗ-ΜΕΤΑΣΤΑΣΗ Στα φυσιολογικά κύτταρα η σηματοδότηση για κυτταρική διαίρεση διενεργείται μέσω των αυξητικών παραγόντων. Αντίθετα, τα καρκινικά κύτταρα διαιρούνται ανεξάρτητα από την ύπαρξη εξωγενών αυξητικών παραγόντων, χρησιμοποιώντας αυτοκρινή σηματοδότηση με μιτογόνους παράγοντες που εκκρίνονται στο εξωκυττάριο υλικό και διεγείρουν τον πολλαπλασιασμό. Μια ακόμη σημαντική ικανότητα που διαθέτουν τα κακοήθη κύτταρα και που δεν την εμφανίζουν τα καλοήθη, είναι η διήθηση. Με τον όρο διήθηση περιγράφεται η ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να διαπερνούν τους φυσικούς φραγμούς των ιστών, όπως τη βασική μεμβράνη και το στρώμα, προσβάλλοντας έτσι τους παρακείμενους ιστούς. Επιπλέον, στην διήθηση περιλαμβάνεται και η καταστροφή των ιστών από όπου προέρχονται τα καρκινικά κύτταρα 34. Η μετάσταση ορίζεται ως η απόδραση κάποιων καρκινικών κυττάρων από τον αρχικό όγκο, τα οποία ταξιδεύοντας μέσω της κυκλοφορίας τελικά δημιουργούν νέα εστία όγκου σε μια απομακρυσμένη περιοχή. Στην διαδικασία της μετάστασης, η διήθηση αποτελεί το πρώτο στάδιο του μεταστατικού κύκλου Τόσο στην διήθηση όσο και τη μετάσταση, η κυτταρική κίνηση είναι απαραίτητη και αποτελεί τον ακρογωνιαίο λίθο και των δύο φαινομένων. Εικόνα 8: Διήθηση καρκινικών κυττάρων στα αιμοφόρα αγγεία 38 21

22 ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΜΕΤΑΝΑΣΤΕΥΣΗ Η κυτταρική κίνηση είναι μια πολύπλοκη φυσιολογική διαδικασία που είναι απαραίτητη για την εμβρυϊκή ανάπτυξη και ομοιόσταση. Κατά τη γαστριδίωση, τη διαδικασία σχηματισμού του εμβρύου, η μετανάστευση είναι κατ εξοχήν ανεπτυγμένη, όπου τα κύτταρα μεταναστεύουν μαζικά ώστε να δημιουργηθούν οι τρεις βλαστικές στιβάδες (ενδόδερμα, εξώδερμα και μεσόδερμα) που συνιστούν έμβρυο τριών εβδομάδων. Τα κύτταρα μετακινούνται σε συγκεκριμένες περιοχές εντός αυτών των στιβάδων και διαφοροποιούνται για να δημιουργήσουν πληθώρα ιστών και οργάνων. Η κυτταρική μετανάστευση δεν περιορίζεται μόνο στην εμβρυική εξέλιξη, αλλά λαμβάνει χώρα και στους ενήλικες όπου έχει κεντρικό ρόλο σε φυσιολογικές, αλλά και παθολογικές καταστάσεις. Χαρακτηριστικό παράδειγμα φυσιολογικής διαδικασίας αποτελεί η συνεχής ανανέωση του δέρματος μέσω της μετανάστευσης των πρόδρομων κυττάρων από την βασική στιβάδα στα ανώτερα στρώματα της επιδερμίδας. Άλλες ομοιοστατικές λειτουργίες κατά τις οποίες λαμβάνει χώρα η κυτταρική κίνηση αποτελεί η άμεση και αποτελεσματική απόκριση του ανοσοποιητικού συστήματος για την επούλωση τραυμάτων. Εκτός από τις φυσιολογικές λειτουργίες, η κυτταρική μετανάστευση πραγματοποιείται και κατά την διάρκεια παθολογικών καταστάσεων όπως οι αγγειακές παθήσεις, οι χρόνιες φλεγμονώδεις νόσοι καθώς και η ανάπτυξη όγκου και η μετάσταση. Ο σχηματισμός όγκου συνοδεύεται από την δημιουργία αγγειακού δικτύου, η οποία περιλαμβάνει την μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων από προϋπάρχοντα αιμοφόρα αγγεία, τα οποία πολλαπλασιαζόμενα δημιουργούν νέα τριχοειδή αγγεία (αγγειογένεση). Μετακίνηση επίσης μπορεί να συμβεί κατά την διάρκεια της μετάστασης, όταν μερικά από τα κύτταρα του πρωτοπαθούς όγκου ταξιδεύουν μέσω της κυκλοφορίας σε άλλες περιοχές όπου και αναπτύσσουν δευτεροπαθείς νεοπλασματικές εστίες Η κυτταρική κίνηση κατηγοριοποιείται σε δύο μεγάλες ομάδες και περιλαμβάνει την κίνηση μονήρων κυττάρων και την κίνηση όπου η μετανάστευση γίνεται υπό τη μορφή στιβάδων κυττάρων 42,

23 1) Μετανάστευση μονήρων κυττάρων (single cell movement) Η μετανάστευση μονήρων κυττάρων απαρτίζεται από δύο υποκατηγορίες: Μεσεγχυματική κίνηση Η μεσεγχυματική κίνηση των κυττάρων αποτελείται από πέντε στάδια. Αρχικά το κύτταρο πολώνεται και δημιουργείται μια πρόσθια προσεκβολή. Αυτό είναι αποτέλεσμα συσσώρευσης ινιδίων ακτίνης τα οποία σπρώχνουν τη μεμβράνη προς τα έξω. Για την σταθεροποίηση αυτής της προσεκβολής δημιουργούνται σύμπλοκα πρόσφυσης. Ακολουθεί αποικοδόμηση του εξωκυττάριου χώρου από πρωτεάσες όπως οι μεταλλοπρωτεϊνασες (Matrix Metalloproteinases, MMPs) και συστολή του κυττάρου. Λόγω αυτής της συστολής το σώμα του κυττάρου μετακινείται προς τα εμπρός 44. Αμοιβοειδής κίνηση Πολλά κύτταρα δεν ακολουθούν τα μεσεγχυματικά χαρακτηριστικά, αλλά χρησιμοποιούν ένα λιγότερο προσκολλητικό τύπο κίνησης, την αμοιβοειδή. Κατά την αμοιβοειδή κίνηση τα κύτταρα δημιουργούν προσεκβολές γνωστές ως φιλοπόδια ή λαμελιπόδια τα οποία βοηθούν το κυτταρικό σώμα να μετακινηθεί. Τα αμοιβοειδή καρκινικά κύτταρα διαθέτουν χαμηλό βαθμό προσκόλλησης με το κολλαγόνο εξαιτίας των χαμηλών επιπέδων έκφρασης των ιντεγκρινών β 1 και β Η αμοιβοειδής κίνηση επιτρέπει να κύτταρα να αποκολλώνται πρόωρα και να διασκορπίζονται σε μεταστατικές εστίες από ένα μικρό πρωτοπαθή όγκο και είναι η πιο συχνή μορφή κίνησης που παρατηρείται στα σαρκώματα και μικροκυτταρικά καρκινώματα του πνεύμονα 44. 2) Συλλογική μετανάστευση κυττάρων (collective cell migration) Τρεις βασικές αρχές διέπουν τη συλλογικά κυτταρική μετανάστευση. Αρχικά, τα κύτταρα παραμένουν φυσικά και λειτουργικά συνδεδεμένα μεταξύ τους, έτσι ώστε να διατηρηθεί η ακεραιότητα των διακυτταρικών συζεύξεων καθ όλη τη διάρκεια της κίνησης. Δεύτερον, πολυκυτταρική πόλωση καθώς και αναδιοργάνωση της ακτίνης του κυτταροσκελετού 23

24 δημιουργούν προσεκβολές που προωθούν την κυτταρική κίνηση και διατηρούν τις διακυτταρικές συζεύξεις. Τρίτον, σε πολλές περιπτώσεις οι υπο μετακίνηση κυτταρικές ομάδες τροποποιούν δομικά τον ιστό γύρω από το μονοπάτι μετανάστευσης αποδομώντας τη βασική μεμβράνη και τα συστατικά της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας 46. Τα κύτταρα που μετακινούνται συλλογικά δημιουργούν επίσης προσεκβολές, τα ψευδοπόδια. Επιπλέον, χρησιμοποιούν τις β 1 και β 3 ιντεγκρίνες για να σταθεροποιήσουν προσφύσεις που είναι ενωμένες με τον κυτταροσκελετό. Επίσης προκαλούν άμεση διάρρηξη του εξωκυττάριου χώρου με πρωτεόλυση, έτσι ώστε να μπορούν να μεταναστεύσουν. Σε αυτό τον τύπο κυτταρικής μετακίνησης παρατηρείται συστολή της ακτινομυοσίνης και έτσι καθίστανται τα κύτταρα ικανά προς μετανάστευση 45. Η κυτταρική κίνηση κατέχει κεντρικό ρόλο τόσο κατά την εμβρυογένεση και την φυσιολογική λειτουργία του κυττάρου, όσο και κατά την διήθηση και τη μετάσταση των όγκων. Η μετάσταση αποτελείται από τέσσερα στάδια τα οποία συνολικά απαρτίζουν τον καταρράκτη της μετάστασης 44 (Εικόνα 8). 1) Διήθηση και μετακίνηση: Μεμονωμένα κύτταρα αποκόπτονται από τον αρχικό όγκο και εισβάλλουν στους παρακείμενους υγιείς ιστούς. Κατά την διάρκεια αυτής της διαδικασίας, λυτικά ένζυμα αποικοδομούν το εξωκυττάριο υλικό και έτσι διευκολύνουν τη μετανάστευση. 2) Ενδοαγγείωση: Η έκκριση πρωτεολυτικών ενζύμων διευκολύνει τα καρκινικά κύτταρα να διαπεράσουν τα αιμοφόρα αγγεία και να εισέλθουν στην κυκλοφορία του αίματος. 3) Κυκλοφορία: Τα καρκινικά κύτταρα ταξιδεύουν μέσω της ροής του αίματος όπου οι συνθήκες είναι ιδιαιτέρως τοξικές λόγω της αυξημένης συγκέντρωσης οξυγόνου και της παρουσίας κυτταροτοξικών λευκοκυττάρων. Τα πιο επιθετικά και ανθεκτικά καρκινικά κύτταρα που καταφέρνουν να επιζήσουν, εγκαταλείπουν την κυκλοφορία του αίματος. Στην συνέχεια εισβάλουν στο επιθήλιο, είτε μέσω πολλαπλασιασμού είτε με την βοήθεια πρωτεολυτικών ενζύμων (εξαγγείωση). 24

25 4) Δημιουργία νέων αποικιών, πολλαπλασιασμός και αγγειογένεση: Τα καρκινικά κύτταρα εγκαθίστανται σε μια απομακρυσμένη περιοχή του ιστού και δημιουργούν μια δεύτερη εστία όγκου. Ακολουθεί ο πολλαπλασιασμός τους και νεο-αγγειογένεση έτσι ώστε να εξασφαλιστεί επαρκές αγγειακό δίκτυο για την συντήρηση του νέου όγκου. Εικόνα 9: Τα τέσσερα βήματα για την δημιουργία μετάστασης 47 25

26 ΕΞΩΚΥΤΤΑΡΙΟ ΥΛΙΚΟ (EXTRACELLULAR MATRIX - ECM) ΚΑΙ ΜΕΤΑΛΛΟΠΡΩΤΕΪΝΑΣΕΣ (MATRIX METALLOPROTEINASES - MMPs) Το εξωκυττάριο υλικό είναι μια δυναμική δομή που συντονίζει την συμπεριφορά των κυττάρων μέσω της αλληλεπίδρασής του με αυτά. Αποτελείται από πρωτεογλυκάνες, θειϊκή ηπαρίνη και χονδροϊτίνη, υαλουρονικό οξύ, κολλαγόνο, ελαστίνη κ.α. Τα συστατικά του ECM, οι MMPs, οι υποδοχείς του ECM καθώς και οι ιντεγκρίνες, εμπλέκονται στην ρύθμιση κυτταρικών διαδικασιών όπως ο πολλαπλασιασμός, η επιβίωση, η μετανάστευση, η διαφοροποίηση και η διήθηση. Το ECM έχει διττή φύση και είτε αποτελεί έναν φραγμό, είτε ένα υπόστρωμα για διήθηση. Κατά την διαδικασία της διήθησης, τα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα διαρρηγνύουν την κυτταρική μεμβράνη, εδραιώνουν επαφές με το υποκείμενο ενδιάμεσο υλικό προεκβάλλοντας ψευδοπόδια μέσα σε αυτό και εναλλάσσοντας την θέση πρόσφυσης σε συνδυασμό με την κυτταρική συστολή, τελικά μεταναστεύουν. Σε αυτή την διαδικασία παίζουν σημαντικό ρόλο οι MMPs 48. Οι MMPs αποτελούν μια οικογένεια πρωτεασών ικανή να αποδομεί τα συστατικά της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας. Απαρτίζονται από τουλάχιστον 28 μέλη διαμεμβρανικών ενζύμων και περίπου 22 είδη έχουν ανιχνευτεί να εκφράζονται σε ανθρώπινους ιστούς 49. Τα ένζυμα αυτά εκκρίνονται και δεσμεύονται στη μεμβράνη ως αδρανή ένζυμα που απαιτούν πρωτεολυτική επεξεργασία για να απελευθερώσουν το καταλυτικά ενεργό ένζυμο. Έπειτα από ενεργοποίηση, μπορούν να αποικοδομήσουν με πρωτεόλυση, σχεδόν όλα τα συστατικά του ECM, όπως υποδοχείς της επιφάνειας ή λειτουργικές πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην συνοχή μεταξύ των κυττάρων τους ή με το εξωκυττάριο υλικό. Η αλληλεπίδραση αυτή σε ένα δεύτερο στάδιο διεγείρει την ενεργοποίηση των αυξητικών παραγόντων και των υποδοχέων τους 50. Οι MMPs εμπλέκονται σε πολλές φυσιολογικές διαδικασίες όπως η ανάπλαση ιστών και η νεο-αγγειογένεση. Επιπλέον, οι MMPs διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο και σε παθολογικές καταστάσεις, όπως τα αυτοάνοσα νοσήματα, οι φλεγμονώδεις και αγγειακές παθήσεις καθώς και η καρκινογένεση Εκτενείς μελέτες που έχουν διεξαχθεί για περισσότερα από 40 χρόνια έχουν αποκαλύψει ότι οι MMPs είναι οι κύριοι μεσολαβητές των αλλαγών που παρατηρούνται στο μικροπεριβάλλον των κυττάρων κατά την εξέλιξη του όγκου 51, 55. Η αποικοδόμηση του ECM διευκολύνει την αγγειογένεση, την διήθηση και μετάσταση του όγκου, καθώς και απελευθερώνει μόρια που έχουν προ-ογκογενετικές ιδιότητες 26

27 56. Πιο συγκεκριμένα, καθ όλη την διάρκεια της διήθησης των καρκινικών κυττάρων οι MMPs συμμετέχουν καθοριστικά με δύο πιθανούς τρόπους. Ο πρώτος είναι ότι αποικοδομούν την βασική μεμβράνη και το ενδιάμεσο υλικό, έτσι ώστε να δημιουργηθούν μονοπάτια μέσα από τα οποία θα μπορούν να διέλθουν τα υπό μετακίνηση καρκινικά κύτταρα. Ένας εναλλακτικός τρόπος συμμετοχής τους σε αυτή την διαδικασία είναι η τροποποίηση του εξωκυττάριου μικροπεριβάλλοντος το οποίο με τη σειρά του επηρεάζει την συμπεριφορά των κυττάρων. Η απελευθέρωση και η ενεργοποίηση παραγόντων επιβίωσης και κίνησης από το ECM, η πρωτεολυτική αποικοδόμηση της Ε-καντχερίνης η οποία διατηρεί τις κυτταρικές επαφές, η απελευθέρωση και μετακίνηση στο κυτταρόπλασμα της β-κατενίνης και της Ν- καντχερίνης οδηγούν σε ενεργοποίηση του μηχανισμού μετάπτωσης των επιθηλιακών κυττάρων σε κύτταρα με μεσεγχυματικό φαινότυπο (Epithelial Mesenchymal Transition, ΕΜΤ). Εικόνα 10: Η αλληλεπίδραση των MMPs με τα συστατικά του ECM και η συμμετοχή τους στην διαδικασία της μετάστασης

28 Μία από τις πιο καλά μελετημένες ομάδες των MMPs είναι οι ζελατινάσες ή τύπου IV κολλαγενάσες, εξ αιτίας της ικανότητάς τους να διασπούν το κολλαγόνο τύπου IV. Σε αυτές ανήκουν οι MMP-2 και MMP-9 που σύμφωνα με εκτενείς μελέτες έχει φανεί ότι εμπλέκονται στη μεταστατική διαδικασία διαφόρων τύπων καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου και του καρκίνου του μαστού Πιο συγκεκριμένα, στον ER + καρκίνο του μαστού υπάρχουν δεδομένα που συνηγορούν ότι η έκφραση των MMP-2 και MMP-9 ρυθμίζεται τόσο από τα οιστρογόνα, όσο και από τις αντιοιστρογονικές θεραπείες. Σύμφωνα με τον Nillson et al., τα οιστρογόνα μειώνουν τα επίπεδα έκφρασης των MMPs, ένα φαινόμενο το οποίο αντιστρέφεται με την χορήγηση αντι-οιστρογόνων, προτείνοντας ότι η αναστολή του ER ακολουθείται από αύξηση των επιπέδων έκφρασης των MMPs και συνεπώς πιο ενισχυμένο μεταστατικό δυναμικό. Οι MMPs έχουν θεωρηθεί ως πιθανοί διαγνωστικοί και προγνωστικοί βιοδείκτες σε διάφορους τύπους και στάδια όγκων 62. Η υπόθεση ότι οι MMPs μπορούν να αποτελέσουν θεραπευτικούς στόχους ενάντια στον καρκίνο αναπτύχθηκε πριν 27 χρόνια λόγω του ότι το μεταστατικό δυναμικό σε διάφορους καρκίνους σχετιζόταν με την ικανότητα των κυττάρων να αποικοδομούν τη βασική μεμβράνη 63. Ως εκ τούτου, μια πληθώρα αναστολέων των MMPs έχει σχεδιαστεί και δοκιμαστεί σε κλινικές μελέτες και έως σήμερα βρίσκονται σε πειραματικό στάδιο 48. ΜΕΤΑΠΤΩΣΗ ΕΠΙΘΗΛΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΑ ΜΕ ΜΕΣΕΓΧΥΜΑΤΙΚΟ ΦΑΙΝΟΤΥΠΟ (EPITHELIAL - MESENCHYMAL TRANSITION, EMT) Το ΕΜΤ αρχικά ορίστηκε ως μια κεντρική διαδικασία διαφοροποίησης που συμβαίνει στα αρχικά στάδια της εμβρυογένεσης. Χαρακτηρίζεται από κυτταρική και μοριακή μετατροπή κατά την οποία τα κύτταρα χάνουν την συνοχή μεταξύ τους, πολώνονται και αναδιοργανώνουν τον κυτταροσκελετό τους. Το αποτέλεσμα αυτών των αλλαγών είναι η απομόνωση των κυττάρων, η απόκτηση ικανότητας κίνησης και η ανθεκτικότητα στην απόπτωση 64. Τα τελευταία 20 χρόνια, λεπτομερείς in vitro μελέτες έχουν αποκαλύψει τον συσχετισμό του ΕΜΤ και με άλλες φυσιολογικές διαδικασίες, όπως η ανάπλαση ιστών. Επιπλέον, το ΕΜΤ έχει ενοχοποιηθεί και για παθολογικές διαδικασίες όπως η εξέλιξη και μετάσταση όγκων, ωστόσο η έλλειψη 28

29 κλινικών δεδομένων δεν έχει εδραιώσει αυτή την υπόθεση και την καθιστά έως και σήμερα αμφιλεγόμενη. Υπάρχει αυξημένη αποδοχή ότι η αποκόλληση καρκινικών κυττάρων και η μεταφορά τους στο στρώμα απαρτίζει εξελικτικό ρόλο στην διαδικασία του ΕΜΤ, επιτρέποντας στα στατικά κύτταρα να αποκτήσουν δυναμική κίνησης. Τα επιθηλιακά κύτταρα είναι πολωμένα και άρρηκτα συνδεδεμένα με διακυτταρικές συζεύξεις, οι οποίες αποτρέπουν την κινητικότητά τους. Αντιθέτως, τα μεσεγχυματικά κύτταρα χαρακτηρίζονται από απουσία σταθερών διακυτταρικών συνδέσεων και διαθέτουν κινητήριες ιδιότητες. Κατά την διάρκεια του ΕΜΤ, τα επιθηλιακά κύτταρα χάνουν τις διακυτταρικές συζεύξεις τους, επάγοντας τον διαχωρισμό τους από τα περιβάλλοντα κύτταρα. Το αποτέλεσμα είναι η απόκτηση μεσεγχυματικών χαρακτηριστικών και συνεπώς καθίστανται ικανά να μεταναστεύσουν από τον μητρικό ιστό. Κεντρικό ρόλο στη μετάβαση από επιθηλιακό σε μεσεγχυματικό φαινότυπο διαδραματίζει η απώλεια έκφρασης της Ε-καντχερίνης. Η Ε-καντχερίνη ανήκει στην οικογένεια των καντχερινών, των οποίων το εξωκυττάριο τμήμα συμμετέχει στις διακυτταρικές συζεύξεις, ενώ η κυτταροπλασματική «ουρά» συγκεντρώνει κατενίνες και άλλα σηματοδοτικά και στηρικτικά μόρια της μεμβράνης που συνδέονται με την ακτίνη του κυτταροσκελετού 65, 66. Εικόνα 11: Ο ρόλος της Ε-καντχερίνης μεταξύ κυττάρων 19 29

30 Η παρουσία της Ε-καντχερίνης σε αυτές τις συζεύξεις περιορίζει την κυτταρική κίνηση και καθιερώνει την δομή της κορυφαίας-βασικοπλάγιας πολωσιμότητας. Αντίθετα, η απουσία έκφρασής της καθώς και η έλλειψη συνοχής της στην κυτταρική επιφάνεια, επιτρέπουν στα καρκινικά κύτταρα να απαγκιστρωθούν από την πρωτογενή εστία του όγκου και να διασπαρούν 67, 68. Η απώλεια έκφρασης της Ε-καντχερίνης αποτελεί ορόσημο στην διαδικασία του ΕΜΤ, καταλήγοντας στην αποσταθεροποίηση των συνδέσεων μεταξύ των κυττάρων και στην αποκόλληση αυτών από τα γειτονικά τους. Αυτό το σημαντικό γεγονός είναι το αποτέλεσμα καταστολής της Ε-καντχερίνης μέσω υπερέκφρασης πολλών διαφορετικών καταστολέων της που επάγουν ΕΜΤ. Οι πιο σημαντικοί αναστολείς είναι οι Snail 1 (Snail) και Snail 2 γνωστό και ως Slug, που ως μεταγραφικοί παράγοντες απαιτείται η είσοδος τους στον πυρήνα ώστε να ασκήσουν τη δράση τους. Επίσης, σημαντικοί καταστολείς της E-καντχερίνης θεωρούνται το Twist 1 και 2, το ΖΕΒ 1 και 2, το Ε12/47 και άλλα. Όλοι οι παραπάνω μεταγραφικοί παράγοντες προσδένονται στις περιοχές «E-boxes» του υποκινητή της Ε-καντχερίνης και καταστέλλουν την έκφρασή της 69. Η έκφραση του Snail υπόκειται σε αρνητική ρύθμιση από την συνθάση του γλυκογόνου GSK-3β, η οποία διατηρείται σε ενεργή κατάσταση στα επιθηλιακά κύτταρα προωθώντας την έξοδο του Snail από τον πυρήνα και την κυτταροπλασματική του αποικοδόμηση 70. Σηματοδοτικά μονοπάτια και ΕΜΤ Έπειτα από δέσμευση με τον αντίστοιχο προσδέτη, οι υποδοχείς τυροσινικής κινάσης δημιουργούν διμερή και αυτοφωσφορυλιώνονται στα κατάλοιπα τυροσίνης, τα οποία με την σειρά τους δρουν ως θέσεις δέσμευσης πρωτεϊνών που διαθέτουν SH2 περιοχές όπως η Grb2, η PI3K και η Src που διεγείρουν σημαντικά μονοπάτια μεταγωγής σήματος. Το Grb2 ενεργοποιεί τον παράγοντα ανταλλαγής της γουανίνης Sos ο οποίος με τη σειρά του επιτρέπει την ενεργοποίηση του καταρράκτη σηματοδότησης Ras-Raf-MEK-MAPK που τελικά επιδρά στην έκφραση γονιδίων. Επιπλέον της ενεργοποίησης του μονοπατιού MAPK, το Ras μπορεί επίσης να σηματοδοτήσει μέσω PI3K την Rac, μια Rho GTPase και μπορεί να συνεργαστεί με τον αυξητικό παράγοντα μετατροπής β (Transforming Growth Factor β,tgfβ) προκαλώντας ΕΜΤ 40. Αφού ενεργοποιηθεί το PI3K, δημιουργεί το δεύτερο σηματοδοτικό μόριο PIP3 το οποίο οδηγεί στην ενεργοποίηση της κινάσης σερίνης/θρεονίνης Akt, που 30

31 εμπλέκεται στον κυτταρικό κύκλο, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη διαδικασία της απόπτωσης, ενώ επίσης παίζει σημαντικό ρόλο επάγοντας ΕΜΤ. Πράγματι, η Akt φωσφορυλιώνει και συνεπώς αναστέλλει την δράση της GSK-3β, διεγείροντας έτσι την αυξημένη έκφραση του Snail και της β-κατενίνης, οι οποίες υπό άλλες συνθήκες θα προορίζονταν για πρωτεολυτική αποικοδόμηση από την ενεργή GSK- 3β. Επιπλέον, το μονοπάτι PI3K/Akt οδηγεί και σε ενεργοποίηση των Rho GTPases και συνεργάζεται με την σηματοδότηση του TGFβ για να προκαλέσουν ΕΜΤ 71. Η Src είναι μια κυτταροπλασματική κινάση τυροσίνης που ακολουθεί την σηματοδότηση των ιντεγκρινών και των αυξητικών παραγόντων. Η ενεργοποιημένη Src μπορεί να φωσφορυλιώσει την κινάση εστιακής προσκόλλησης (Focal Adhesion Kinase, FAK), οδηγώντας σε ενεργοποίηση της ΜΑΡΚ η οποία τελικά φωσφορυλιώνει την κινάση ελαφριάς αλυσίδας της μυοσίνης (MLC). H τελευταία δημιουργεί την φωσφο-μυοσίνη που ενισχύει την κυτταρική συστολή και ως εκ τούτου προωθεί το ΕΜΤ 72. O TGFβ είναι ένας από τους πιο ισχυρούς και καλά μελετημένους επαγωγείς του ΕΜΤ. Δρα μέσω των υποδοχέων κινασών σερίνης/θρεονίνης για να φωσφορυλιωθούν οι κυτταροπλασματικές Smads, οι οποίες έπειτα από μετακίνηση στον πυρήνα ενεργοποιούν τους καταστολείς της Ε-καντχερίνης που ανήκουν στην οικογένεια Snail. Επίσης, ο ενεργοποιημένος υποδοχέας του TGFβ φωσφορυλιώνει την πρωτεΐνη Par6 η οποία δεσμεύεται στη Smurf1, όπου με την σειρά της οδηγεί σε αποικοδόμηση της Rho μέσω ουβικιτίνωσης 73. Επιπλέον, ο TGFβ μπορεί να σηματοδοτήσει μέσω των μονοπατιών κινάσης σύνδεσης των ιντεγκρινών (integrinlinked kinase), ΜΑΡΚ και PI3K. Η κινάση σερίνης/θρεονίνης ILK είναι ένα σηματοδοτικό πρωτεϊνικό μόριο που διεγείρεται από τις ιντεγκρίνες και τους αυξητικούς παράγοντες. Η ενεργοποιημένη ILK μπορεί να φωσφορυλιώσει άμεσα μόρια στόχους όπως η Akt και η GSK-3β, καταλήγοντας στην απενεργοποίηση της τελευταίας. Το αποτέλεσμα είναι η διέγερση του μονοπατιού της Wnt-β-κατενίνης και η υπερέκφραση του Snail που υπό άλλες συνθήκες θα καταστελλόταν από τη GSK-3β 70. Ο ρόλος του Notch φαίνεται επίσης να είναι σημαντικός τόσο στις εξελικτικές, όσο και τις νεοπλασματικές ιδιότητες του ΕΜΤ. Η ενεργοποίηση του διαμεμβρανικού υποδοχέα Notch έπειτα από δέσμευση με τον προσδέτη του Jagged, οδηγεί στη μετατόπιση του Notch στον πυρήνα και ενεργοποίηση στοχευμένων γονιδίων όπως το Hey1 που επάγει τη μείωση έκφρασης της Ε-καντχερίνης και συνεπώς ΕΜΤ

32 Ο πυρηνικός μεταγραφικός παράγοντας NF-κB σε φυσιολογικές καταστάσεις εδράζεται στο κυτταρόπλασμα σε ανενεργή μορφή σχετιζόμενος με τις πρωτεΐνες IκB. Το μονοπάτι ενεργοποιείται όταν μέσω απόκρισης των κυτταροκινών και αυξητικών παραγόντων, οι IκB απομακρύνονται επιτρέποντας την πυρηνική μετατόπιση του NF-κB, όπου στην συνέχεια ενεργοποιεί γονίδια στόχους συμπεριλαμβανομένου του Snail και του Bcl-2. Δεδομένων των γνωστών αντιαποπτωτικών του ιδιοτήτων, το Bcl-2 μπορεί επίσης να συναινέσει στην επαγωγή ΕΜΤ 75. Σύμφωνα με την κατασταλτική δράση στο Snail, η ενεργοποιημένη GSK-3β αναστέλλει την σηματοδότηση του NF-κB και ως εκ τούτου συμβάλει στην διατήρηση του Snail σε χαμηλά επίπεδα στα φυσιολογικά ενδοθηλιακά κύτταρα 70. Η διέγερση του ECM από τις ιντεγκρίνες καταλήγει στην ομαδοποίηση αυτών στις θέσεις πρόσφυσης και στην ενεργοποίηση μιας πληθώρας σηματοδοτικών μορίων όπως FAK, Src, Ras, PI3K, Rho GTPases και ILK. Όταν η FAK αυτοφωσφορυλιωθεί δεσμεύεται στην Src και την ενεργοποιεί. Η Src με την σειρά της φωσφορυλιώνει τη FAK στα κατάλοιπα τυροσίνης και δημιουργεί SH2 (Src Homology 2-SH2) θέσεις δέσμευσης για τη Grb2-Sos που τελικά καταλήγει στην ενεργοποίηση του Ras-MAPK. Οι θέσεις φωσφορυλίωσης τυροσίνης στη FAK δεσμεύονται επίσης και ενεργοποιούν το PI3K, οδηγώντας έτσι σε ενεργοποίηση του μονοπατιού των PI3K-PIP3-Akt. Επιπλέον, σύμφωνα με πρόσφατες μελέτες έχει βρεθεί ότι η ιντεγκρίνη β 3 αποτελεί σημαντικό μόριο του, επαγόμενου από τον TGFβ, ΕΜΤ μέσω φυσικής αλληλεπίδρασης της ιντεγκρίνης με τον υποδοχέα του TGFβ. Η αλληλεπίδραση αυτή οδηγεί σε φωσφορυλίωση της τυροσίνης του υποδοχέα του TGFβ από τη Src, όπου επιτρέπει την ενεργοποίηση της MAPK και συνεπώς την επαγωγή ΕΜΤ 76. Κινάση εστιακής προσκόλλησης (Focal Adhesion Kinase-FAK) H FAK είναι μια τυροσινική κινάση των 125-kDa που δεν διαθέτει υποδοχέα. Αυτό που κάνει τη FAK να ξεχωρίζει από τις υπόλοιπες τυροσινικές κινάσες χωρίς υποδοχέα, είναι η έλλειψη SH2 και SH3 περιοχών. Ελέγχει μια πληθώρα κυτταρικών σηματοδοτικών μονοπατιών μεταξύ των οποίων είναι η κινητικότητα και επιβίωση των κυττάρων 77. Η FAK εμπλέκεται ιδιαιτέρως στον σχηματισμό καθώς και στην αλλαγή των θέσεων προσκόλλησης 78. Είναι ένα εξαιρετικά σημαντικό μόριο για την εξέλιξη και πρόοδο του καρκίνου εφόσον είναι γνωστό ότι υπερεκφράζεται σε διάφορους τύπους κακοήθειας, κυρίως στα αρχικά στάδια της ογκογένεσης

33 Μελέτες έχουν αποδείξει ότι η ενεργοποιημένη FAK εμφανίζεται σε υψηλότερα επίπεδα στα μετακινούμενα καρκινικά κύτταρα μαστού, σε επιθετικούς τύπους καρκίνου, καθώς και στις μεταστατικές εστίες συγκριτικά με τον πρωτοπαθή όγκο 80, 81. Εικόνα 12: Η αλληλεπίδραση της FAK με αυξητικούς παράγοντες, ιντεγκρίνες και την Src καταλήγει σε κυτταρική επιβίωση και μετανάστευση 82. FAΚ - κυτταρική επιβίωση Ο συσχετισμός της FAK με την κυτταρική επιβίωση αποκαλύφθηκε πρώτη φορά από τους Frisch et al 83, οι οποίοι απέδειξαν ότι το ενεργοποιημένο μεμβρανικό σύμπλοκο της FAK, γνωστό ως CD2FAK, προλαμβάνει μια μορφή απόπτωσης που επάγεται από την αποκόλληση των κυττάρων από το ECM, γνωστή ως anoikis. Αυξημένα επίπεδα έκφρασης της FAK φαίνεται ότι καταστέλλουν την απόπτωση, κάτι το οποίο ενδεχομένως σχετίζεται με την φωσφορυλίωση της στις θέσεις Y 397 και Y 925, καθώς και τη δράση της ως κινάση. Αντίθετα, η αναστολή έκφρασης της FAK οδηγεί σε επαγωγή της απόπτωσης σε διάφορες κυτταρικές σειρές. Πολλές μελέτες έχουν 33

34 δείξει ότι τόσο η καταλυτική δράση όσο και η αυτοφωσφορυλίωση Y 397 της FAK απαιτούνται για την προστασία των κυττάρων από απόπτωση Η αυτοφωσφορυλίωση Y 397 της FAK και συνεπώς η ενεργοποίησή της, δημιουργούν θέσεις δέσμευσης για πρωτεΐνες με SH2 περιοχές, όπως η Src και το PI3K. Το σύμπλοκο FAK-Src μεταβιβάζει σήματα επιβίωσης στα καρκινικά κύτταρα μαστού. Επιπλέον, η FAK μπορεί να δεσμευτεί στην p85 υπομονάδα του PI3K και να θέσει σε λειτουργία το μονοπάτι επιβίωσης του PI3K. Σύμφωνα με πρόσφατα δεδομένα η FAK μπορεί ακόμη να ενισχύσει την κυτταρική επιβίωση, μέσω της αλληλεπίδρασής της και τελικά αναστολή της λειτουργίας του p53 87, 88. FAK- κυτταρικός πολλαπλασιασμός και ανάπτυξη του όγκου Εκτός από τον θετικό ρόλο σχετικά με την επιβίωση, τα σηματοδοτικά μονοπάτια της FAK μπορούν να ενισχύσουν την εξέλιξη του όγκου διεγείροντας την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Ο σχηματισμός του συμπλόκου FAK-Src στις εστίες προσκόλλησης προκαλεί την ενεργοποίηση της ERK, την υπερέκφραση της κυκλίνης D1 καθώς και την ελαττωμένη έκφραση της p21. Η σηματοδότηση μέσω της FAK οδηγεί στην μεταγραφική ενεργοποίηση του εκκινητή της κυκλίνης D1 και άλλων μεταγραφικών παραγόντων που συντηρούν την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου 89, 90. FAK- κυτταρική μετανάστευση Η κυτταρική μετανάστευση απαιτεί συνδυασμένη και δυναμική ρύθμιση των εστιών προσκόλλησης που εγκαθιδρύονται από ιντεγκρίνες καθώς και τα δίκτυα του κυτταροσκελετού που ενώνονται με αυτές. Η FAK λειτουργεί σαν πρωτεΐνη κλειδί στην ρύθμιση των δυναμικών των εστιών προσκόλλησης με δεδομένο ότι τα κύτταρα χωρίς FAK εμφανίζουν ελαττωματική μεταναστευτικότητα και διαθέτουν τεράστιες περιφερειακές δομές εστιών προσκόλλησης. Περεταίρω μελέτες που παρακολουθούν την δυναμική των εστιών προσκόλλησης σε κύτταρα που στερούνται έκφρασης της FAK και Src καθιστούν και τα δύο αυτά μόρια κριτικής σημασίας στην αλλαγή προσφύσεων των ιντεγκρινών που οδηγεί στην κυτταρική κίνηση 91. Η έκφραση της FAK αλλά όχι η δραστικότητά της ως κινάση, απαιτείται για κυτταρική μετανάστευση διεγειρόμενη από τον EGF και τον PDGF, προτείνοντας έναν σημαντικό ρόλο στην λειτουργία της FAK ως συνδέτη πρωτεϊνών για τη μεσολάβηση και ρύθμιση της κυτταρικής μετανάστευσης. Γενικά ο ρόλος της FAK στην προώθηση της κυτταρικής κίνησης είναι άμεσα συσχετισμένος με τα δύο κύρια μόρια Src και PI3K. Έτσι, η FAK έχει δειχθεί ότι αντιδρά άμεσα και φωσφορυλιώνει 34

35 μια προσαρμοστική πρωτεΐνη, τη Grb7, για να ενισχύσει την κινητικότητα των κυττάρων Η FAK έχει επίσης αποδειχθεί ότι μπορεί να επάγει την κυτταρική μετανάστευση μέσω άμεσης ρύθμισης πρωτεϊνών-κλειδιών που εμπλέκονται στην αναδιοργάνωση της ακτίνης του κυτταροσκελετού, συμπεριλαμβανομένης της υποοικογένειας Rho GTPases, της N-WASP και του σύμπλοκου Arp2/3 82, FAK - διήθηση Η ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να εισβάλουν στους γειτονικούς ιστούς απαιτεί την δυνατότητα αποικοδόμησης του εξωκυττάριου υλικού. Έχει αναφερθεί ότι η FAΚ διευκολύνει την διηθητική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων μέσω ρύθμισης των MMPs. Πιο συγκεκριμένα, έχει βρεθεί ότι η FAK διεγείρει των σχηματισμό συμπλόκων, στα οποία συμμετέχει και η Src, που τελικά οδηγούν σε αυξημένα επίπεδα έκφρασης των MMP-2 και MMP Τα ευρήματα αυτά επιβεβαιώθηκαν όταν έπειτα από αναστολή της FAK σε καρκινικά κύτταρα, η έκκριση της MMP-9 μειώθηκε 101. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι η FAK είναι πιθανό να μεσολαβεί σε αυξημένη διηθητικότητα λόγω της ιδιότητάς της να επάγει ΕΜΤ. Η συνεργασία της FAK με την Src διαταράσσει τις συνδέσεις της Ε-καντχερίνης, ενισχύοντας έτσι την κυτταρική κινητικότητα και διηθητικότητα 102, 103. FAK - αγγειογένεση H ικανότητα της FAK να προωθεί την κυτταρική κίνηση, πολλαπλασιασμό και διήθηση εισάγει ένα δυνητικό ρόλο της FAK στην αγγειογένεση που απαρτίζει αρχικό στάδιο στην εξέλιξη και μετάσταση του όγκου. Σε κακοήθεις όγκους η FAK βρέθηκε να εκφράζεται στα αιμοφόρα αγγεία και να προωθεί το σχηματισμό τριχοειδών αγγείων σε εγκεφαλικά ενδοθηλιακά κύτταρα 104. Επιπλέον δεδομένα για το ρόλο της FAK στην αγγειογένεση προέρχονται από μελέτες με ιντεγκρίνες, τα πρόδρομα μόρια στη σηματοδοτική διαδικασία της FAK. Πιο συγκεκριμένα, βρέθηκε ότι η παρεμπόδιση των ιντεγκρινών α ν β 3 με μονοκλωνικά αντισώματα ή με μικρούς μοριακούς αναστολείς, ανέστειλε το αγγειογενετικό δυναμικό του όγκου σε μια πληθώρα in vivo μοντέλων 91, 105, 106. Ακόμη, μια πρόσφατη μελέτη απέδειξε ότι ο σχηματισμός ενός σηματοδοτικού συμπλόκου που εξαρτάται από τη Src και περιέχει FAK και α ν β 5 ιντεγκρίνες, είναι απαραίτητο για τη διέγερση της αγγειογένεσης μέσω VEGF σε μοντέλα ποντικιών

36 36

37 ΣΚΟΠΟΣ Ο καρκίνος του μαστού αποτελεί την πιο συχνή μορφή κακοήθειας σε γυναίκες. Εκτιμάται ότι οιστρογονικοί υποδοχείς (Estrogen Receptors - ERs) εκφράζονται περίπου στο 70% των περιπτώσεων. Σε αυτή την κατηγορία καρκίνων του μαστού η ορμονοθεραπεία αποτελεί βασική θεραπευτική προσέγγιση, καθώς συνοδεύεται από σημαντικά κλινικά οφέλη για τις ασθενείς. Ωστόσο, παρά την δραστικότητα της ορμονοθεραπείας, η νόσος συχνά υποτροπιάζει και συνοδεύεται από απομακρυσμένες εστίες λόγω του μεταστατικού της δυναμικού. Πολλές μελέτες έχουν αξιολογήσει τα αντι-οιστρογόνα ως προς τη διήθηση καθώς και τα επίπεδα έκφρασης των MMPs, ωστόσο τα μονοπάτια μετάστασης καθώς και ο αντίκτυπος της αντι-οιστρογονικής θεραπείας σε αυτούς τους μηχανισμούς παραμένει έως και σήμερα αμφιλεγόμενος. Σκοπός εκπόνησης της παρούσης διπλωματικής εργασίας ήταν η σύγκριση δύο εκλεκτικών ανταγωνιστών του οιστρογονικού υποδοχέα (ER), του Fulvestrant και της Tamoxifen από μια διαφορετική οπτική γωνία, αυτή της κυτταρικής μετανάστευσης. Πιο συγκεκριμένα μελετήσαμε την επίδρασή των φαρμάκων στο μεταστατικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων μαστού, χρησιμοποιώντας τις καρκινικές σειρές μαστού MCF-7 και T47D, που εκφράζουν τον ER. Πραγματοποιήθηκε μελέτη της κυτταρικής μετανάστευσης και πως επιδρούν οι προαναφερθείσες ουσίες στα μονοπάτια αυτά. Επιπλέον, αξιολογήθηκαν τα επίπεδα των πρωτεολυτικών ενζύμων, των MMPs, που αποικοδομούν τα συστατικά της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας, διευκολύνοντας έτσι τη διήθηση σε παρακείμενους ιστούς. Εν συνεχεία, μελετήθηκε το φαινόμενο μετάπτωσης επιθηλιακών κυττάρων σε μεσεγχυματικά (ΕΜΤ), διερευνώντας την έκφραση των πρωτεϊνικών μορίων Snail και Ε-καντχερίνη, που σχετίζονται άμεσα με αυτό. Επίσης έγινε ποιοτική αξιολόγηση του κυτταρικού τόπου στον οποίο εδράζονται τα εν λόγω μόρια. Τέλος, διερευνήθηκε η επίδραση των οιστρογόνων στη φωσφορυλίωση του καταλοίπου Υ της κινάσης εστιακής προσκόλλησης, FAK, καθώς και πως επηρεάζουν τα υπό εξέταση φάρμακα την οργάνωση των ινιδίων ακτίνης του κυτταροσκλετού. 37

38 38

39 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Καλλιέργεια ανθρώπινων καρκινικών επιθηλιακών κυττάρων Για την παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν τα ανθρώπινα καρκινικά επιθηλιακά κύτταρα μαστού MCF-7 και T47D (American Type Culture Collection, ATCC, USA). Η διαδικασία ανακαλλιέργειας των καρκινικών κυττάρων είναι η ακόλουθη: Διαδικασία ανακαλλιέργειας κυττάρων Παρατήρηση των κυττάρων στο πλαστικό μέσο στο οποίο βρίσκονται προσκολλημένα (τρυβλίο Petri) στο μικροσκόπιο. Η εικόνα των κυττάρων είναι ενδεικτική της κατάστασης στην οποία βρίσκονται. Κύτταρα τα οποία είναι προσκολλημένα στον πυθμένα του τρυβλίου θεωρούνται υγιή ενώ επιπλέοντα κύτταρα στο θρεπτικό μέσo είναι κατά πάσα πιθανότητα νεκρά. Η ανακαλλιέργεια γίνεται όταν τα κύτταρα έχουν καλύψει κατά 80-90% την επιφάνεια του τρυβλίου στο οποίο καλλιεργούνται. Μεταφορά του τρυβλίου με τα κύτταρα σε θάλαμο νηματικής ροής, όπου είναι δυνατή η εργασία υπό στείρες συνθήκες. Αναρρόφηση του θρεπτικού μέσου της καλλιέργειας με πιπέτα Pasteur υπό κενό. Πλύσιμο των κυττάρων δύο φορές με PBS. Με τη διαδικασία αυτή απομακρύνονται τυχόν εναπομείναντα ίχνη ορού, τα οποία περιέχουν αναστολείς της τρυψίνης. Τα κύτταρα δεν πρέπει να μένουν για μεγάλο χρονικό διάστημα χωρίς θρεπτικό μέσο ή PBS, αφού είναι ιδιαίτερα ευπαθή κατά την επαφή τους με τον αέρα. Επιπλέον, και ο χρόνος παραμονής των κυττάρων στο PBS (το οποίο δεν περιέχει ιόντα Ca 2+ ) δεν πρέπει να είναι μεγάλος, γιατί παρατηρείται απώλεια της επαφής τους με το υπόστρωμα. Προσθήκη κατάλληλης ποσότητας τρυψίνης. Παρατήρηση της αποκόλλησης των κυττάρων στο μικροσκόπιο. Τα κύτταρα δεν πρέπει να μένουν για πολύ ώρα στην τρυψίνη, ο συνιστώμενος χρόνος κατά μέσο όρο είναι τα 7 λεπτά και μπορεί να παραταθεί έως και τα 15 λεπτά. Αμέσως μόλις παρατηρηθεί η αποκόλληση των κυττάρων, αναστέλλεται η τρυψίνη με την προσθήκη διπλάσιας ποσότητας πλήρους θρεπτικού μέσου 39