ΤΟ ΦΑΙΝΟΜΕΝΟ ΕΠΙΘΗΛΙΑΚΗΣ ΠΡΟΣ ΜΕΣΕΓΧΥΜΑΤΙΚΗ ΜΕΤΑΤΡΟΠΗ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΜΕΤΑΣΤΑΣΗ ΕΠΙΘΗΛΙΑΚΩΝ ΚΑΡΚΙΝΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ

Transcript

1

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ ΣΤΙΣ ΒΑΣΙΚΕΣ ΙΑΤΡΙΚΕΣ ΕΠΙΣΤΗΜΕΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ : ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Ι. ΒΑΡΑΚΗΣ ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ : Ι. ΒΑΡΑΚΗΣ, Μ. ΑΣΗΜΑΚΟΠΟΥΛΟΥ, Ε. ΠΑΠΑ ΑΚΗ. ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΤΟ ΦΑΙΝΟΜΕΝΟ ΕΠΙΘΗΛΙΑΚΗΣ ΠΡΟΣ ΜΕΣΕΓΧΥΜΑΤΙΚΗ ΜΕΤΑΤΡΟΠΗ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΜΕΤΑΣΤΑΣΗ ΕΠΙΘΗΛΙΑΚΩΝ ΚΑΡΚΙΝΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Του ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΥ Κ. ΓΟΥΛΙΟΥΜΗ (Α.Μ 465) Πτυχιούχου Ιατρικής σχολής Πανεπιστηµίου Πατρών. ΠΑΤΡΑ ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΣ 2005

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελ. - ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ - ΕΙΣΑΓΩΓΗ - ΕΠΙ ΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ - ΙΕΙΣ ΥΣΗ ΚΑΙ ΜΕΤΑΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΚΑΡΚΙΝΩΝ - ΙΑΚΡΙΣΗ ΝΕΟΠΛΑΣΙΩΝ - ΚΑΡΚΙΝΟΣ - ΕΠΙΘΗΛΙΑΚΟΣ ΙΣΤΟΣ Μορφή επιθηλιακού κυττάρου οµές συνοχής µεταξύ επιθηλιακών κυττάρων Μόρια συνοχής (adhesion molecules) Σύνδεση κυττάρου κυττάρου Σύνδεση κυττάρου θεµέλιας ουσίας Κυτταροσκελετός Μικροσωληνίσκοι Μικρονηµάτια Ενδιάµεσα νηµάτια - ΕΠΙΘΗΛΙΑΚΗ ΠΡΟΣ ΜΕΣΕΓΧΥΜΑΤΙΚΗ ΜΕΤΑΤΡΟΠΗ (ΕΜΤ) - ΣΗΜΑΤΑ ΠΟΥ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΟΥΝ ΤΟ ΦΑΙΝΟΜΕΝΟ ΕΜΤ Σηµατοδοτικό µονοπάτι του TGF-β υποδοχείς του TGF-β Smads : τα βασικά επιτελεστικά µόρια στο µονοπάτι του TGF-β Άλλες οδοί ενεργοποίησης των Smads Smads και µεταγραφή Άλλες οδοί που ενεργοποιεί η Smad σηµατοδότηση Σηµατοδοτικό µονοπάτι των growth factors µε υποδοχείς RTK RTKs Σηµατοδοτικά µονοπάτια HGF\SF (hepatocyte growth factor\scatter factor) Σηµατοδότηση µέσω ιντεγκρινών Ενεργοποίηση των FAK Ενεργοποίηση του µονοπατιού ΜΑΡΚ Σύνδεση ιντεγκρινών µε το δίκτυο ακτίνης Επίδραση ιντεγκρινών στην ρύθµιση των RhoGTP Συνεργασία σηµατοδοτικών µονοπατιών ιντεγκρινών και υποδοχέων αυξητικών παραγόντων ILK (integrin linked kinase) Σηµατοδοτικό µονοπάτι του Wnt - ΣΗΜΑΤΟ ΟΤΙΚΑ ΜΟΝΟΠΑΤΙΑ ΚΑΙ ΕΠΙΤΕΛΕΣΤΙΚΑ ΜΟΡΙΑ Ras Ενεργοποίηση της πρωτεϊνης Raf και της οδού ERK-MAPK µ Ενεργοποίηση της Akt και Rac από την PI3K RalGEF ενεργοποίηση των Ral small GTPases. Ενεργοποίηση Rac από Tiam1 Ras και RhoGTPases Src PI3K

4 Oικογένεια RhoGTPases RhoGTPases και καντχερίνες MAPK (mitogen activated protein kinases) MAPKκαι αποδόµηση της θεµέλιας ουσίας Συµβολή των ΜΑΡΚ στην κυτταρική κίνηση - ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΟΥ ΕΜΤ - ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΟ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ ΤΗΣ ΕΜΤ Απώλεια των δοµών συνοχής Αποκόλληση κυττάρου κυττάρου > β κατενίνη > ο ρόλος της p120 κατενίνης > Αποδόµηση δεσµοσωµάτων Αποκόλληση κυττάρου βασικού υµένα Ο ρόλος της Ν- καντχερίνης ιαµόρφωση του κυτταροσκελετού κυτταρική κίνηση Κυτταρική κίνηση Αποφυγή του προγραµµατισµένου κυτταρικού θανάτου σε καρκινικό κύτταρο που υφίσταται ΕΜΤ Έκφραση µεταλλοπρωτεινασών Ρύθµιση των ΜΜΡ Ρόλος των ΜΜΡ στο ΕΜΤ και στην µετανάστευση των κυττάρων Μοριακή σηµατοδότηση του ΕΜΤ και αγγειογένεση - ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΟ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ ΤΗΣ ΕΜΤ ΣΤΟ ΣΤΡΩΜΑ ΤΩΝ ΚΑΡΚΙΝΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Στρώµα Ο ρόλος του στρώµατος στην µετανάστευση των καρκίνων κυττάρων Χαρακτηριστικά µυοϊνοβλάστη Προέλευση µυοϊνοβλάστη Παράγοντες που συντελούν στην δηµιουργία τους Ρόλος των µυοϊνοβλαστών - ΕΠΙΛΟΓΟΣ - ABSTRACT - ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ - ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

5 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η επιθηλιακή προς µεσεγχυµατική µετατροπή (EMT epithelial to mesenchymal transition) είναι ένας τύπος επιθηλιακής πλαστικότητας που χαρακτηρίζεται από µακράς διάρκειας φαινοτυπικές και µοριακές αλλαγές στο επιθηλιακό κύτταρο ως αποτέλεσµα µιας διαδικασίας διαφοροποίησης προς κύτταρο µεσεγχυµατικού τύπου. Η µοριακή αυτή διεργασία φαίνεται πως είναι θεµελιώδης κατά την µετάσταση επιθηλιακών καρκίνων και αποσκοπεί στην απόκτηση από τα καρκινικά κύτταρα φαινοτυπικών χαρακτήρων που τους δίνουν την δυνατότητα διείσδυσης στους ιστούς. Το ΕΜΤ, εκτός από την µετάσταση, αποτελεί βασική διεργασία τόσο στην εµβρυική ανάπτυξη όσο και στις παθολογικές καταστάσεις της φλεγµονής και της επούλωσης. Στόχος της παρούσας εργασίας είναι µια πλοήγηση µέσα από την βιβλιογραφία που αφορά το φαινόµενο ΕΜΤ και τις επιµέρους διεργασίες που το πλαισιώνουν. Στην πρώτη ενότητα θα γίνει παρουσίαση των µορίων που αναλαµβάνουν τον ρόλο της σηµατοδότησης του φαινοµένου το οποίο στη συνέχεια εξελίσσεται µέσα από την ενεργοποίηση δεδαλώδων σηµατοδοτικών µονοπατιών. Θα παρακολουθήσουµε ακόµα την µετάδοση του σήµατος µέσω των κοµβικών µορίων αυτών των µονοπατιών ως τον πυρήνα όπου το σήµα απαρτιώνεται αλληλεπιδρώντας µε µεταγραφικούς παράγοντες που ρυθµίζουν την έκφραση πρωτεϊνών σχετιζόµενων µε την µετατροπή του επιθηλιακού κυττάρου. Στην δεύτερη ενότητα της εργασίας θα γίνει αναφορά στις δοµικές και λειτουργικές αλλάγές του επιθηλιακού κυττάρου που του εξασφαλίζουν την µεταναστευτική δυναµική. Πιο συγκεκριµένα θα παρακολουθήσουµε πως το επιθηλιακό κύτταρο χάνει τη συνοχή του µε το περιβάλλον του εκφεύγοντας ταυτόχρονα της απόπτωσης. Επιπλέον θα εξετάσουµε την αναδιαµόρφωση του κυτταροσκελετού και την έκφραση νέων πρωτεϊνών µε σπουδαία συµµετοχή στο φαινόµενο. Τέλος θα γίνει αναφορά στην φαινοτυπική µετατροπή που επιφέρει το φαινόµενο ΕΜΤ στο στρώµα που περιβάλλει τον καρκίνο και πως αυτή µε τη σειρά της συνεισφέρει στα δίαφορα µοριακά γεγονότα που συνιστούν το φαινόµενο. Η µετάσταση είναι µια ραγδαία εξέλιξη στην αδυσώπητη πορεία του καρκίνου. Η κατανόησή της λοιπόν σε µοριακό επίπεδο είναι ζήτηµα νευραλγικής σηµασίας που ξεφεύγει απο τα πλαίσια του απλού ακαδηµαϊκού ενδιαφέροντος. Ο χειρισµός των µοριακών µηχανισµών για τον έλεγχο της µετάστασης θα µπορεί να αποτελέσει το στοίχηµα για την µοριακή χειρουργική του µέλλοντος. 3

6 ΕΠΙ ΗΜΙΟΛΟΓΙΑ ΤΟΥ ΚΑΡΚΙΝΟΥ Με βάση στατιστικά δεδοµένα ο καρκίνος έχει έναν σταθερό ρυθµό αύξησης. Σε αυτό συντελεί στις µέρες µας η σταδιακή γήρανση του πληθυσµού. Φαίνεται πως σήµερα ένας στους τρείς θα πάθει καρκίνο και ένας στους πέντε θα πεθάνει απο αυτόν. Ο ανθρώπινος πόνος και η οικονοµική αιµορραγία απο τον καρκίνο δικαιολογούν µια µεγάλη προσπάθεια όχι µόνο για την αντιµετώπισή του, αλλά και για την πρόληψή του. Στον πίνακα 1 παρουσιάζονται δείκτες σχετικά µε την επίπτωση νέων περιπτώσεων καρκίνου και των θανάτων απο αυτούς κατά το έτος 2000 τόσο στους άνδρες όσο και στις γυναίκες στις ΗΠΑ. (1) Πινακας 1. άνδρες γυναίκες εντόπιση % περιπτώσεις εντόπιση % Περιπτώσεις Επίπτωση καρκίνου προστάτη µαστού πνεύµονα πνεύµονα Κόλου & Κόλου & ορθού ορθού Ουρ Ενδοµητρίο κύστης υ λέµφωµα ωοθηκών µελάνωµα λέµφωµα Στοµατικής µελάνωµα κοιλότητας νεφρών κύστης λευκαιµία πάγκρεας παγκρέατος θυροειδούς λοιπά Λοιπά Θάνατοι απο καρκίνο Πνεύµονος πνεύµονα προστάτη µαστού Κόλου & Κόλου & ορθού ορθού παγκρέατος παγκρέατος λέµφωµα ωοθηκών λευκαιµία λέµφωµα οισοφάγου λευκαιµία Ήπατος & Ενδοµητρίο χοληφόρων υ Ουρ εγκεφάλου κύστης στοµάχου στοµάχου λοιπά Λοιπα

7 Στον πίνακα 2 που ακολουθεί φαίνονται οι 5 πιο συχνές εντοπίσεις καρκίνου τόσο στους άνδρες όσο και στις γυναίκες ανάλογα µε την ηλικιακή οµάδα. (1) Πίνακας 2 σειρά Όλες οι ηλικίες 1 Α,Γ: πνεύµονα 2 Α:προστάτη Γ: µαστός 3 Α,Γ: κόλονορθό 4 Α,Γ: πάγκρεας 5 Α: λεµφώµατα Γ: ωοθήκες Κάτω απο >80 Α,Γ: λευκαιµία Α: λεµφώµατα Γ: µαστός Α,Γ: εγκεφάλου Α: λευχαιµία Γ: τράχηλος Α: ενδοκρινικοί Γ: σαρκώµατα µαλακ. Μορίων Α: οστεοσαρκώµατα Γ: ενδοκρινικοί Α: λεµφώµατα Γ: οστεοσαρκώµατα Α: εγκεφάλου Γ: πνευµονα Α: πνεύµονα Γ: λευχαιµία Α: κόλοορθό Γ: εγκεφάλου Α: πνεύµονα Γ:µαστός Α ορθόκόλον Γ: πνεύµονας Α: πάγκρεας Γ: ορθόκόλον Α: λέµφωµα Γ: ωοθήκες Α: οισοφάγος Γ: τράχηλος Α,Γ: πνεύµονας Α:προστά της Γ: µαστός Α,Γ: κόλονορθό Α,Γ: πάγκρεας Α: λέµφωµα Γ: ωοθήκες Α,Γ: πνεύµο νας Α: προστά της Γ: κόλονορθό Α: κόλονορθό Γ: µαστός Α: κύστη Γ: πάγκρε ας Α: πάγκρε ας Γ: λέµφω µα Από τα παραπάνω δεδοµένα προκύπτει οτι οι καρκίνοι µαστού, πνεύµονα, κόλου και ορθού είναι το 40% των περιπτώσεων καρκίνου ενώ υψηλή είναι και η συχνότητα καρκίνων όπως προστάτη, ενδοµητρίου, στοµατικής κοιλότητας, παγκρέατος. Φαίνεται πως ο καρκίνος του πνεύµονα είναι η πρώτη αιτία θανάτου απο καρκίνο τόσο στους άνδρες όσο και στις γυναίκες. Επιπλέον υπάρχουν στατιστικά δεδοµένα που υποστηρίζουν µια κατακόρυφη άνοδο, σε αντίθεση µε την πλειοψηφία των καρκίνων, της επίπτωσης του καρκίνου του πνεύµονα απο την δεκαετία του 40 εως το 90 για τους άνδρες και και απο την δεκαετία του 70 έως τις µέρες µας για τις γυναίκες που πιθανόν σχετίζεται µε την αυξανόµενη χρήση του καπνού (εικ. 1). (2) Η συχνότητα του καρκίνου φαίνεται πως αυξάνεται µε την ηλικία. Έτσι στην παιδική ηλικία συναντάµε το 1 % των περιπτώσεων καρκίνου από το οποίο το ένα τρίτο είναι λευχαιµίες. 5

8 Όσον αφορά την κατανοµή στο φύλο οι νεοπλασίες είναι πιο συχνές στους άνδρες τόσο στην παιδική ηλικία όσο και στην ενήλικο ζωή. Επιπλέον διαφοροποίηση στην επίπτωση των διαφόρων καρκίνων παρατηρείται και µεταξύ διαφορετικών εθνολογικών οµάδων. Εικόνα 1 : Ο ρυθµός αύξησης της επίπτωσης διαφόρων καρκίνων σε σχέση µε την πρόοδο του χρόνου απο το 1930 εως στις µέρες µας στον άντρα και στη γυναίκα. Ολοκληρώνοντας την παρουσίαση των επιδηµιολογικών δεδοµένων του καρκίνου θα παρατεθεί ένας συνοπτικός κατάλογος επιβεβαιωµένων περιβαλλοντικών καρκινογόνων. Έτσι λοιπόν έχει σαφώς συσχετιστεί µε τον καρκίνο η χρήση καπνού, το αλκοόλ, οι υπεριώδεις και άλλες ακτινοβολίες, ίνες αµιάντου, διατροφικοί παράγοντες, χηµικοί παράγοντες, φαρµακευτικές ουσίες. Φυσικά εκτός απο τους περιβαλλοντικούς παράγοντες βασικός είναι ο ρόλος της γενετικής προδιάθεσης του κάθε ανθρώπου που συνδράµει ή ανθίσταται στην επίδραση του περιβάλλοντος. (2) ΙΕΙΣ ΥΣΗ ΚΑΙ ΜΕΤΑΣΤΑΣΗ ΤΩΝ ΚΑΡΚΙΝΩΝ Η διείσδυση και η µετάσταση είναι οι πλέον απειλητικές καταστάσεις στην πορεία του καρκίνου και σηµατοδοτούν ένα στάδιο στην εξέλιξη 6

9 της νεοπλασίας όπου στην συντριπτική πλειοψηφία των περιπτώσεων κάθε παρέµβασή µας στερείται της δυνατότητας ίασης. Περί το 30% των καρκινοπαθών έχουν ήδη µεταστάσεις κατά την αρχική διάγνωση. Η µετάσταση που είναι η εµφάνιση δευτερογενών εµφυτευµάτων σε αποµακρυσµένους ιστούς σε σχέση µε τον πρωτοπαθή όγκο ακολουθεί τρείς οδούς : α) διασπορά κατά συνέχεια ιστών, β) λεµφογενή διασπορά µέσω του δικτύου λεµφαγγείων-λεµφαδένων και γ) αιµατογενή µέσω διείσδυσης, κυρίως στο φλεβικό σύστηµα, και διασποράς σε αποµακρυσµένους ιστούς. Όπως και να συµβεί µια µετάσταση, βασικό της χαρακτηριστικό είναι η απώλεια δοµικής και λειτουργικής συνοχής µέρους των κυττάρων του πρωτοπαθούς όγκου µε τα περιβάλλοντα κύτταρα και τις µοριακές δοµές που αποτελούν την γειτονιά του µέσα στην οποία αρµονικά υφίσταται και λειτουργεί. Η διαδικασία της µετάστασης είναι µια αλληλουχία από διαδοχικά βήµατα που περιλαµβάνουν πολλαπλές διαντιδράσεις όγκου περιβάλλοντος. Έτσι λοιπόν το µεταστατικό δυναµικό εξαρτάται, φυσικά, από τον όγκο αλλά και απο το περιβάλλον του. (3) Τα διαδοχικά βήµατα συνοπτικά (εικ. 2) είναι : I. Μετατροπή των καρκινικών κυττάρων σε κύτταρα µε δυνατότητα να διεισδύουν (transformation), II. Τοπική διείσδυση των καρκινικών κυττάρων στους περιβάλλοντες ιστούς (invasion), III. Ενδαγγείωσή τους (intravasation), IV. Μεταφoρά τους µέσω του κυκλοφορικού συστήµατος (dissemination), V. Eξαγγείωση τους από το αγγειακό δίκτυο αποµακρυσµένων ιστών (extravasation), VI. Eγκατάστασή τους σε αυτούς (homing) & VII. Aνάπτυξη της µετάστασης στο Εικόνα 2 : Τα στάδια της µετάστασης. περιβάλλον του νέου ιστού (proliferation). 7

10 Η διασπορά και η εγκατάσταση των καρκινικών κυττάρων σε συγκεκριµένους ιστούς εξαρτάται από δύο παράγοντες, καταρχήν από την ανατοµική εντόπιση του πρωτοπαθούς όγκου και επιπλέον από τον ιστολογικό τύπο του. Με βάση τα παραπάνω συνήθως οι αποµακρυσµένες µεταστάσεις εντοπίζονται σε όργανα που αποτελούν το πρώτο τριχοειδικό δίκτυο που συναντά ο καρκίνος κατά την διασπορά του όπως για παράδειγµα συµβαίνει µε τις µεταστάσεις νεοπλασιών του εντέρου στο ήπαρ. Σε αντιδαστολή µε την προηγούµενη περίπτωση φαίνεται πως για τις µεταστάσεις άλλων καρκίνων υπάρχει ένα φαινόµενο τροπισµού για συγκεκριµένα όργανα, όπως για παράδειγµα συµβαίνει σε νεοπλασία του νεφρού που µεθίσταται στο θυρεοειδή ή νεοπλασία του προστάτη που συχνά διασπείρεται στα οστά. Το φαινόµενο αυτό έχει αποδοθεί σε διάφορους παράγοντες και έχει δηµιουργήσει διαφορετικές θεωρίες γύρω από την ερµηνεία του. Έχει λοιπόν καταρχήν φανεί ότι τοπικοί αυξητικοί παράγοντες και ορµόνες ευοδώνουν την µετάσταση των καρκινικών κυττάρων σε συγκεκριµένα όργανα. Μια δεύτερη θεωρία στηρίζεται στην ανάπτυξη δεσµών συνοχής των καρκινικών κυττάρων ειδικά µε τον βασικό υµένα συγκεκριµένων οργάνων. Τέλος, µια τρίτη θεωρία υποστηρίζει την πιθανότητα τα καρκινικά κύτταρα να έλκονται από χηµειοτακτικούς παράγοντες που έχουν µια κλίση συγκέντρωσης προς συγκεκριµένα όργανα. Από τα παραπάνω φαίνεται καθαρά πως για να µετασταθεί ένας όγκος σε έναν αποµακρυσµένο ιστό δεν αρκεί µόνο ο όγκος να είναι υψηλού δείκτη κακοήθειας αλλά πρέπει και το µικροπεριβάλλον να υποστηρίζει την εµφύτευση και την ανάπτυξή του. Τα τελευταία αποτελούν την κεντρική ιδέα της θεωρίας seed and soil. (3) Η διαλεύκανση αυτών των θεωριών µπορεί να αποτελέσει εφαλτήριο στον αγώνα για την αντιµετώπιση του καρκίνου. Η ερευνητική προσέγγιση που αναδεικνύεται σε αυτή την εργασία στοχέυει στο πλέον κοµβικό σηµείο της πορείας της µετάστασης που είναι το αρχικό στάδιο της µετανάστευσης του καρκινικού κυττάρου αποτέλεσµα της απόκτησης διεισδυτικής ικανότητας στα πλαίσια της ΕΜΤ. ΙΑΚΡΙΣΗ ΝΕΟΠΛΑΣΙΩΝ ΚΑΡΚΙΝΟΣ Στα κεφάλαια που προηγήθηκαν η επιδηµιολογία κατέστησε σαφές το µέγεθος της απειλής της ανθρώπινης υγείας και ζωής από τον καρκίνο, ενώ η παρουσίαση του φαινοµένου της µετάστασης οριοθέτησε την πλέον δυσοίωνη εξέλιξη εναντίον της οποίας εξακολουθεί να υπολείπεται 8

11 η γνώση και η παρεµβατική µας δυνατότητα. Πρίν η εργασία επικεντρωθεί στο βασικό της θέµα, το ΕΜΤ, είναι απαραίτητο να διευκρινιστεί ότι αυτό είναι ένα φαινόµενο που αφορά την µετσάταση µιας µεγάλης αλλά συγκεκριµένης οµάδας νεοπλασιών, τους καρκίνους επιθηλιακής προέλευσης. Προκύπτει έτσι η ανάγκη, σε αυτό το εισαγωγικό κεφάλαιο, να παρατεθεί ένας συνοπτικός ορισµός και διάκριση των νεοπλασιών. Η νεοπλασία είναι µια νέα δηµιουργία. Καθώς έχει οριστεί από τον Willis η νεοπλασία είναι µια ανώµαλη µάζα ιστών που αναπτύσσεται υπερβολικά και αδυνατεί να συνεργαστεί µε τους φυσιολογικούς ιστούς. Τα νεοπλάσµατα µοιάζουν µε παράσιτα που ανταγωνίζονται τους φυσιολογικούς ιστούς στις µεταβολικές τους ανάγκες. Η αυτονοµία τους ωστόσο δεν είναι πλήρης εφόσον για την επιβίωσή τους έχουν ανάγκη την αιµατική ή την ενδοκρινική υποστήριξη του οργανισµού. (2) Ο όρος όγκος (tumor) είναι ένας επιπλέον χαρακτηρισµός που αποδίδεται στην νεοπλασία. Η διάκριση σε καλοήθη κακοήθη εξαρτάται από την δυναµική της κλινικής του συµπεριφοράς. Αυτό που χαρακτηρίζει τους κακοήθεις όγκους είναι βασικά η δυνατότητα να µεθίστανται διεισδύοντας στους ιστούς καταστρέφοντάς τους. Οι κακοήθεις όγκοι ονοµάζονται επίσης καρκίνοι (cancers). Οι καρκίνοι µπορεί να προέρχονται απο διάφορους ιστούς. Όσοι αναπτύσσονται απο το µεσεγχυµατικό ιστό ονοµάζονται σαρκώµατα. Καρκίνοι από κύτταρα Εικονα 3 : Ιστολογική εικόνα καρκινώµατος γυναικείου µαστου επιθηλιακής προέλευσης ονοµάζονται καρκινώµατα (εικ. 3). Εδώ πρέπει να διευκρινιστεί ότι τα επιθηλιακά κύτταρα προέρχονται και από τις τρείς βλαστικές στοιβάδες. Έτσι, καρκίνωµα είναι τόσο η κακοήθης νεοπλασία των νεφρικών σωληναρίων που δηµιουγείται από επιθηλιακά κύτταρα που προέρχονται από το µεσόδερµα, όσο και καρκινώµατα του δέρµατος που αντίστοιχα προκαλούνται από επιθηλιακά κύτταρα προερχόµενα από το εξώδερµα και τέλος καρκινώµατα του επιθηλίου του εντέρου απο κύτταρα ενδοδερµατικής προέλευσης. Η επικέντρωση στη µελέτη της µετάστασης καρκίνων επιθηλιακής προέλευσης καθιστά αναγκαία την παρουσίαση της δοµής και της οργάνωσης του φυσιολογικού επιθηλιακού ιστού. Εξάλλου η αποδόµηση και επανοργάνωση των φυσιολογικών δοµών του ιστού, όπως των µορίων συνοχής, και η τροποποιηµένη ρύθµιση των διαφόρων µοριακών 9

12 λειτουργιών του, όπως της αλληλεπίδρασή του µε το περιβάλλον του, είναι στην ουσία το φαινοτυπικό αποτέλεσµα του φαινοµένου ΕΜΤ. ΕΠΙΘΗΛΙΑΚΟΣ ΙΣΤΟΣ Οι επιθηλιακοί ιστοί αποτελούνται από στενά συναθροισµένα πολυεδρικά κύτταρα µε πολύ λίγη µεσοκυττάρια ουσία. Η πρόσφυση των κυττάρων είναι ισχυρή. Έτσι σχηµατίζεται ένα κυτταρικό περίβληµα που καλύπτει την επιφάνεια του σώµατος και επενδύει τις κοιλότητες του. Ο επιθηλιακός ιστός έχει τις ακόλουθες βασικές λειτουργίες : 1) κάλυψη και επένδυση επιφανειών (δέρµα), 2) απορρόφηση (έντερο), 3) έκκριση (κύτταρα αδένων), 4) αισθητικότητα (νευροεπιθήλιο), 5) συσταλτικότητα (πχ µυοεπιθηλιακά κύτταρα). Τα επιθήλια προέρχονται και από τα τρία εµβρυϊκά βλαστικά δέρµατα. Εξωδερµατικής προέλευσης είναι το µεγαλύτερο µέρος του επιθηλίου που καλύπτει το δέρµα, το στόµα και τη µύτη. Από το ενδόδερµα προέρχεται το επιθήλιο που επενδύει το αναπνευστικό σύστηµα, τον πεπτικό σωλήνα και αδένες όπως το πάγκρεας και το ήπαρ. Άλλα επιθήλια προέρχονται από το µεσόδερµα όπως το Εικ 4 : επιθηλιακό κύτταρο και βασικός υµένας ενδοθηλιακό επένδυµα των αιµοφόρων αγγείων. Μορφή επιθηλιακών κυττάρων Η µορφή και οι διαστάσεις του ποικίλουν απο ψηλά κυλινδρικά έως κυβοειδή και χαµηλά πλακώδη κύτταρα. Όλα τα επιθηλιακά κύτταρα έχουν στην βασική τους επιφάνεια µια ελυτροειδή εξωκυττάρια δοµή που ονοµάζεται βασικός υµένας (εικ.4). Η δοµή αυτή είναι ορατή µε το ηλεκτρονικό µικροσκόπιο σαν µια πυκνή στοιβάδα nm που αποτελείται από ένα δίκτυ λεπτών ινών. Ο βασικός υµένας αποτελείται 10

13 κυρίως από κολλαγόνο τύπου IV, µια γλυκοπρωτεϊνη την υµενίνη (laminin) και πρωτεογλυκάνες (θειϊκή ηπαράνη). Ο βασικός υµένας µε ινίδια αγκυροβολίας προσκολλάται στον υποκείµενο συνδετικό ιστό. Ο ρόλος του είναι να δηµιουργεί ένα εκλεκτικό φράγµα µεταξύ του συνδετικού ιστού και άλλων κυττάρων, ενώ περιέχει κατάλληλες πληροφορίες για ορισµένες αλληλεπιδράσεις µεταξύ των κυττάρων. (4) ΟΜΕΣ ΣΥΝΟΧΗΣ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΕΠΙΘΗΛΙΑΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Υπάρχει µια ποικιλία δοµών συνοχής (εικ.9) µε την βοήθεια των οποίων τα επιθηλιακά κύτταρα οργανώνονται σε ιστό. Η σταθερότητα αυτών των δοµών συντελεί στη διατήρηση της συνοχής των ιστών. Παράλληλα, η δυναµική τους για µετατροπή διαδραµατίζει σπουδαίο ρόλο κατά την µορφογένεση αναπτυσσόµενων ιστών αλλά και κατά την παθολογική κατάσταση της µετάστασης του καρκίνου. Η ρύθµιση των δοµών συνοχής, που εξαρτάται από την αλληλεπίδρασή τους µε τα σηµατοδοτικά µονοπάτια, µπορεί να γίνει σε διάφορα επίπεδα συµπεριλαµβανοµένης της ισχύος της σύνδεσης, της συγκέντρωσης των δοµών συνοχής και της αλληλεπίδρασης µε τις ίνες του κυτταροσκελετού. Από τις δοµές που υπάρχουν στις πλάγιες επιφάνειες των επιθηλιακών κυττάρων διακρίνονται καταρχήν η αποφρακτική ζώνη (zonula occludentes) (εικ.5) που βρίσκεται στο κορυφαίο τµήµα των συνάψεων και δηµιουργεί µια ταινία που περιβάλλει το κύτταρο και φράζει το µεσοκυττάριο διάστηµα. Επιπλέον σε πολλά επιθήλια δηµιουργείται ζώνη πρόσφυσης (zonula adherens) που περικυκλώνει το κύτταρο και συνεισφέρει στην πρόσδεσή του µε το γειτονικό του. Εικ.5 : Αποφρακτική ζώνη και ζώνη πρόσφυσης. 11

14 Οι χασµατικές σύναψεις (gap junctions) που είναι συνάψεις επικοινωνίας, κατανέµονται σε όλη την πλάγια επιφάνεια και δηµιουργούν µια δοµή, συνδετήρα αποτελούµενη απο πρωτεϊνες, που σχηµατίζουν έναν υδρόφιλο πόρο µε διάµετρο 1,5 nm (εικ.6) Εικ. 6:χασµατικές συνάψεις Υπάρχουν επίσης τα δεσµοσώµατα (desmosomes) (εικ. 8) που είναι δισκοειδείς δοµές στην πλάγια επιφάνεια των επιθηλιακών κυττάρων και εξυπηρετούν την στέρεη πρόσφυση. Τέλος στην ζώνη επαφής µεταξύ του επιθηλιακού κυττάρου και του βασικού υµένα παρατηρούνται τα ηµιδεσµοσώµατα(hemidesmosomes) και τοπικές συνδέσεις (focal adhesions) που και πάλι ο ρόλος τους είναι η πρόσφυση των κυττάρων (εικ. 7). Εικόνα 9:Ηµιδεσµοσώµατα και focal adhesions. Εικόνα 8: εσµοσώµατα 12

15 εικόνα 9 : Συνοπτικό γράφηµα των δοµών συνοχή του επιθηλιακού κυττάρου. ΜΟΡΙΑ ΣΥΝΟΧΗΣ (ADHESION MOLECULES) Οι προηγούµενες δοµές που αναφέρθηκαν έχουν ως βάση της κατασκευής τους έναν αριθµό πρωτεϊνών επιφανείας (CAMs) που διαµεσολαβούν οµοφιλικές και ετεροφιλικές ενώσεις ή και ενώσεις µε την µεσολάβηση ενός προσδέτη, µε τις αντίστοιχες πρωτεϊνες του γειτονικού κυττάρου ή του βασικού υµένα. (εικ.11) Εικ. 10:CAMs Ταυτόχρονα το ενδοκυττάριο κοµµάτι τους δηµιουργεί συνδέσµους µε στοιχεία του κυτταροσκελετού. Υπάρχουν πέντε οµάδες CAM : 13

16 - οι καντχερίνες, - η υπεροικογένεια των ανοσοσφαιρινών (ICAMs), - οι σελεκτίνες, - οι συνδεκάνες και - οι ιντεγκρίνες καθεµία από τις οποίες δηµιουργεί διαφορετική δοµή που εξυπηρετεί είτε την συνοχή κυττάρου-κυττάρου, είτε αυτή κυττάρου-βασικού υµένα. (5) Εικ. 11 : Οµοφιλική,ετεροφιλική και ένωση µε προσδέτη Σύνδεση κυττάρου-κυττάρου. Τα µόρια συνοχής που διαµεσολαβούν µια τέτοια σύνδεση διακρίνονται σε ασβεστιοεξαρτώµενα όπως οι καντχερίνες, οι σελεκτίνες και ειδικές ιντεγκρίνες και σε ασβεστιοανεξάρτητα όπως τα ICAMs. Ο ρόλος του ασβεστίου είναι να µπαίνει µεταξύ των δεσµών των εκατέρωθεν µορίων κλειδώνοντάς τους. Οι καντχερίνες (εικ.12) (6) είναι µια οικογένεια πρωτεϊνών που ξεπερνούν τους δώδεκα τύπους. Κάθε καντχερίνη είναι µια διαµεµβρανική γλυκοπρωτεϊνη αποτελούµενη από αµινοξέα. Η εξωκυττάρια δοµή έχει 100 αµινοξέα και περιλαµβάνει σηµεία σύνδεσης ασβεστίου. Ενώνεται µε οµοφιλικό τρόπο µε τις εκατέρωθεν καντχερίνες του γειτονικού κυττάρου, ενώ το ενδοκυττάριο τµήµα της καντχερίνης ενώνεται µε ειδικές Εικ. 12 : Καντχερίνες πρωτεϊνες του κυτταροσκελετού. Υπάρχουν τέσσερις καλά µελετηµένοι τύποι καντχερινών. Η Ε και η P βρίσκονται στους επιθηλιακούς ιστούς, δηµιουργούν τις ζώνες πρόσφυσης και ενδοκυτταρίως ενώνονται µε ινίδια ακτίνης µέσω πρωτεϊνών όπως α, β και p120 κατενίνη, καθώς και α ακτίνη. Η δεσµοσωµική καντχερίνη απαντάται στην επιδερµίδα και στον πλακούντα, δηµιουργεί τα δεσµοσώµατα και ενδοκυτταρίως ενώνεται µε το δίκτυο κερατίνης µέσω δεσµοπλακινών και πλακογλοβινών. Τέλος η Ν 14

17 καντχερίνη που απαντάται στο νευρικό και τον µυϊκό ιστό δηµιουργεί ζώνες πρόσφυσης, ενώ ενδοκυτταρίως ενώνεται µε ινίδια ακτίνης µέσω κατενινών, α ακτίνης και βινκουλίνης. Οι σελεκτίνες (εικ.13) (6) είναι διαµεµβρανικές πρωτεϊνες που δηµιουργούν ασβεστιοεξαρτώµενους δεσµούς µε διπλανό κύτταρο µε την Εικ.13 : Σελεκτίνες διαµεσολάβηση ενός ολιγοσακχαρίτη. Οι ετεροφιλικού τύπου ενώσεις που δηµιουργούν έχουν προσωρινό χαρακτήρα και απαντώνται σε διαδικασίες όπως η ένωση των λευκών αιµοσφαιρίων µε τα ενδοθηλιακά κύτταρα πριν την εξαγγείωσή τους στον χώρο µιας φλεγµονής. Οι δεσµοί µε σελεκτίνες έχουν µικρή ισχύ επιτρέποντας στο λευκοκύτταρο να κυλάει πάνω στο ενδοθήλιο των αγγείων µέχρι να προσκολληθεί στέρεα και να εξαγγειωθεί. Οι ιντεγκρίνες διαµεσολαβούν κυρίως ένωση κυττάρου-θεµέλιας ουσίας, ωστόσο υπάρχουν ειδικές ιντεγκρίνες που ενώνουν τα επιθηλιακά κύτταρα µε τα γειτονικά τους. Στην κατηγορία των ασβεστιοανεξάρτητων ενώσεων κυττάρουκυττάρου ανήκει η υπεροικογένεια των ανοσοσφαιρινών µε εκπροσώπους τα N-CAMs, I-CAMs και L1. (εικ.14) (6) Αυτά είναι µονές διαµεµβρανικές πρωτεϊνες που ενώνονται ενδοκυττάρια µε τον κυτταροσκελετό. Η ένωσή τους µε τα γειτονικά κύτταρα γίνεται µε οµοφιλικό ή ετεροφιλικό τρόπο και είναι µικρότερης ισχύος από οτι των καντχερινών. Εικ.14 : Μόρια πρόσδεσης υπεροικογένειας ICAMs ανοσοσφαιρινών. 15

18 Σύνδεση κυττάρου-θεµέλιας ουσίας (matrix) Η ένωση των κυττάρων µε την θεµέλια ουσία πέρα από το ότι οργανώνει τα κύτταρα σε ιστούς παίζει ρόλο σε πολλές κυτταρικές λειτουργίες όπως στη ρύθµιση σηµατοδοτικών οδών που σχετίζονται µε την κυτταρική ανάπτυξη, την απόπτωση, την έκφραση γονιδίων κα. Το βασικό µόριο συνοχής στην ένωση κυττάρου-θεµέλιας ουσίας είναι οι ιντεγκρίνες που δηµιουργούν τις δοµές που ονοµάζονται ηµιδεσµοσώµατα και focal adhesions. Επιπλέον και άλλα µόρια όπως οι σελεκτίνες ή οι syndecans µπορεί να έχουν κάποιο ρόλο. Οι ιντεγκρίνες (εικ.15) (6) ειναι εξωκυττάριοι υποδοχείς µε ειδικότητα για πρωτεϊνικά µόρια της θεµέλιας ουσίας όπως ινωδόνεκτίνη, λαµινίνη ή κολλαγόνο IV. Η σύνδεση είναι ασβεστιοεξαρτώµενη και σχετικά µικρής ισχύος. Λόγω του µεγάλου αριθµου τέτοιων συνδέσεων το κύτταρο παραµένει στέρεα προσκολληµένο στο βασικό υµένα, ενώ διατηρεί την δυναµική του να µπορεί να µεταναστεύει µέσω της θεµέλιας ουσίας, αποδοµώντας δεσµούς και δηµιουργώντας νέους. Ενδοκυτταρίως η ιντεγκρίνη ενώνεται µε ινίδια ακτίνης του κυτταροσκελετού µέσω πρωτεϊνών όπως η ταλίνη και η α ακτίνη. Μερικές ιντεγκρίνες µπορούν να ενώνονται και µε τα ενδιάµεσα ινίδια Εικ. 15 : Ιντεγκρίνες κερατίνης του κυτταροσκελετού. Οι ιντεγκρίνες είναι ετεροδιµερή µε α και β υποµονάδα. Οι υποµονάδες αυτές που προκύπτουν απο εναλλακτικό µάτισµα δηµιουργούν συνδυασµούς µε διαφορετική συµπεριφορά όσον αφορά τους προσδέτες τους και τα σηµατοδοτικά µονοπάτια που ενεργοποιούν. Κάθε κύτταρο φέρει πολλά είδη ιντεγκρινών. Τέλος, υπάρχει µια άλλη οµάδα µορίων, οι συνδεκάνες (syndecans), (εικ. 16) (7) που είναι τετραµελής οικογένεια διαµεµβρανικών πρωτεογλυκανών που εξωκυττάρια ενώνονται µε heparinbinding domains της θεµέλιας ουσίας που βρίσκονται στην φιµπρονεκτίνη, Εικ 16 : syndecans λαµινίνη, κολλαγόνο. Ενδοκυττάρια ενώνονται µε την ακτίνη του 16

19 κυτταροσκελετού. Οι συνδεκάνες επίσης διαπλέκονται σε µονοπάτια σηµατοδότησης όµως στην διαδικασία το πιθανότερο είναι ότι δρούν επικουρικά στις ιντεγκρίνες. Οι syndecans εκφράζονται σε όλων των ειδών τα κύτταρα και η έκφρασή τους αλλάζει κατά την διάρκεια συγκεκριµένων παθοφυσιολογικών διεργασιών όπως κατά την µετάσταση και την µορφογένεση. Η ρύθµισή τους εξαρτάται από µικρές GTPases όπως Rac, Pak, cdc42, οπώς θα δούµε στην ανάλυση των µοριακών διεργασιών κατα την µελέτη του φαινοµένου ΕΜΤ. ΚΥΤΤΑΡΟΣΚΕΛΕΤΟΣ Η κυτταροπλασµατική µητρική ουσία περιέχει ένα πολύπλοκο δίκτυ που αποτελείται από µικροσωληνίσκους, µικρονηµάτια και ενδιάµεσα νηµάτια. Αυτές οι δοµικές πρωτεϊνες όχι µόνο συµµετέχουν στη µορφολογία και στο σχήµα του κυττάρου, αλλά επίσης παίζουν σηµαντικό ρόλο στην κυτταρική κίνηση. Στο συνολό τους αναφέρονται και ως κυτταροσκελετός. (4) (εικ. 17) Εικ. 17:Κυτταροσκελετός Μικροσωληνίσκοι Μέσα στο κυτταρόπλασµα των ευκαρυωτικών κυττάρων υπάρχουν σωληνοειδή όργανα γνωστά σαν µικροσωληνίσκοι. Η υποµονάδα ενός µικροσωληνίσκου αποτελείται από ένα ετεροδιµερές που έχει ως βάση κατασκευής α και β µόρια τουµπουλίνης. Οι µικροσωληνίσκοι θεωρείται πως έχουν ένα σηµαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και διατήρηση του σχήµατος του κυττάρου. Μικρονηµάτια Στα επιθηλιακά κύτταρα η ακτίνη βρίσκεται µε τη µορφή δικτύου µικρονηµατίων κάτω από την κυτταρική µεµβράνη. Τα µικρονηµάτια ακτίνης αποτελούν δοµικό συστατικό των µετακινούµενων 17

20 προσεκβολών του κυττάρου όπως τα ψευδοπόδια και τα φιλοπόδια. Πιθανόν οι περισσότερες διεργασίες που συνδέονται µε τα µικρονηµάτια να εξαρτώνται από την ταυτόχρονη παρουσία µυοσίνης. Ενδιάµεσα νηµάτια Πρόκειται για ινίδια ενδιάµεσου πάχους (10-12nm) και διακρίνονται σε διάφορες κατήγορίες. Αυτές είναι οι κυττοκερατίνες, που βρίσκονται στα επιθηλιακά κύτταρα, η βιµεντίνη στα µεσεγχυµατικά κύτταρα, η δεσµίνη, τα νευρογλοιακά νηµάτια και τα νευρονηµάτια. ΕΠΙΘΗΛΙΑΚΗ ΠΡΟΣ ΜΕΣΕΓΧΥΜΑΤΙΚΗ ΜΕΤΑΤΡΟΠΗ EPITHELIAL TO MESENCHYMAL TRANSITION (EMT) Tο εισαγωγικό κοµµάτι της εργασίας, που προηγήθηκε, έθεσε τις βάσεις ώστε να µπορέσουµε στην συνέχεια να παρακολουθήσουµε τις µοριακές µετατροπές που συµβαίνουν στο καρκινικό επιθηλιακό κύτταρο, στα πλαίσια του φαινοµένου ΕΜΤ που το προικοδοτούν µε την δυναµική διείσδυσης και µετάστασης σε αποµακρυσµένους ιστούς. Το ΕΜΤ είναι µια µορφή κυτταρικής πλαστικότητας κατά την οποία το επιθηλιακό κύτταρο υφίσταται µοριακές και µορφολογικές αλλαγές που του προσδίδουν χαρακτήρες µεσεγχυµατικού κυττάρου. (εικ.18) Το φαινόµενο έχει έναν καλά διευκρινισµένο ρόλο στην εµβρυογένεση. Εκεί η ρύθµιση διακοπτών ακριβείας που ενεργοποιούν τα προγράµµατα διαφοροποίησης µεταξύ επιθηλιακού και µεσεγχυµατικού κυττάρου εξυπηρετεί την δηµιουργία µιας στοιβάδας ειδικών µεσεγχυµατικών κυττάρων µε µεταναστευτικό χαρακτήρα. Ο ρόλος αυτών στη συνέχεια είναι να διαφοροποιηθούν στα διάφορα όργανα. Στον ενήλικο άνθρωπο το φαινόµενο ΕΜΤ έχει φυσιολογικό ρόλο στην επούλωση πληγών, ταυτόχρονα όµως το συναντάµε σε παθολογικές καταστάσεις. Χρακτηριστικές τέτοιες περιπτώσεις είναι νόσοι όπου όργανα καταστρέφονται στα πλαίσια ινωτικής διεργασίας, όπως µπορεί να συµβεί στο νεφρό, στον πνεύµονα ή στο ήπαρ. Επίσης σε ΕΜΤ αποδίδεται η βασική επιπλοκή της µακροχρόνιας περιτοναϊκής διύλισης που σχετίζεται µε την δηµιουργία ενός µεσοθηλιακού στρώµατος που περιβάλλει το περιτόναιο και εµποδίζει την περαιτέρω αποτελεσµατική διύλιση. (8) 18

21 Παρόλο που το φαινόµενο είναι καλά διαπιστωµένο στην εµβρυογένεση, στον καρκίνο σπάνια παρατηρείται, πιθανότατα λόγω παροδικής του εµφάνισης. (9) Η περίπτωση καρκίνου που το φαινόµενο είναι καλύτερα µελετηµένο είναι το καρκινοσάρκωµα, στο οποίο το ΕΜΤ, όταν είχε πρωτοπαρατηρηθεί, είχε προσδοθεί από τους παθολογοανατόµους µε τον όρο σαρκωµατοειδής διαδιαφοροποίηση. (10) Εικ. 18:ΕΜΤ Στα πλαίσια του ΕΜΤ σήµατα όπως αυξητικοί παράγοντες, ορµόνες, κυτταροκίνες µέσα από αυτοκρινείς ή παρακρινείς αγκύλες ενεργοποιούν σηµατοδοτικά µονοπάτια που καταλήγουν µέσω µεταγραφικών παραγόντων στην ρύθµιση της έκφρασης πρωτεϊνών που επιφέρουν το φαινοτυπικό αποτέλεσµα της επιθηλιακής προς µεσεγχυµατική µετατροπή στο καρκινικό κύτταρο. ΣΗΜΑΤΑ ΠΟΥ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΟΥΝ ΤΟ ΦΑΙΝΟΜΕΝΟ ΕΜΤ Το σήµα που θέτει σε κίνηση όλο τον καταράκτη µοριακών γεγονότων που καταλήγει στην µεσεγχυµατική µετατροπή των επιθηλιακών καρκινικών κυττάρων είναι πολλαπλό. Τα σήµατα προέρχονται από το περιβάλλον του κυττάρου, δηλαδή από στοιχεία της θεµέλιας ουσίας και ενεργοποιηµένα κύτταρα του στρώµατος. Από την άλλη µεριά το ίδιο το κύτταρο που υφίσταται την µετατροπή είναι ικανό να τροποποιεί το περιβάλλον του, ενεργοποιώντας το. Η έναρξη και η ολοκλήρωση του ΕΜΤ προκύπτει λοιπόν στην ουσία από µια 19

22 αλληλεπίδραση του επιθηλιακού κυττάρου και του ενεργοποιηµένου στρώµατος χωρίς να έχει επικρατήσει µια ξεκάθαρη θεωρία στην βιβλιογραφία σχετικά µε το εναρκτήριο γεγονός. Αυτό πιθανότατα είναι διαφορετικό στις διάφορες περιπτώσεις, πάντα µε κατάληξη τον φαύλο κύκλο που δηµιουργεί χαρακτήρα διεισδυτικό στα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα. Τα πειραµατικά δεδοµένα σήµερα έχουν ήδη καλά τεκµηριώσει την ενοχοποίηση στην σηµατοδότηση του ΕΜΤ διαφόρων παραγόντων. Πολλοί αυξητικοί παράγοντες όπως : EGF (epithelial growth factor), FGF (fibroblast growth factor), και κυριώς HGF\SF (hepatocyte growth factor ή scatter factor) δρώντας µέσω υποδοχέων τυροσινικής κινάσης (RTKs) ξεκινούν την δαιδαλώδη µοριακή σηµατοδότηση του ΕΜΤ. Ο αυξητικός παράγοντας TGF-β (transforming growth factor) είναι ένα άλλο µόριο µε θεµελιώδη ρόλο στη σηµατόδτηση του ΕΜΤ, αλλά και µε ένα ξεχωριστό ενδιαφέρον λόγω της διττής του φύσης στην ευόδωση αλλά και αποτροπή του καρκίνου. Αποδεδειγµένη είναι και η οδός ενεργοποίησης του ΕΜΤ µέσω µιας οικογένειας πρωτεϊνών που ονοµάζονται Wnt. Τέλος ακόµα και µόρια που προέρχονται από την ίδια την αποδόµηση της θεµέλιας ουσίας έχει φανεί πως είναι ικανά να προκαλέσουν µεσεγχυµατική µετατροπή µέσω οδών που ξεκινούν από υποδοχείς επιφανείας όπως οι ιντεγκρίνες. ΣΗΜΑΤΟ ΟΤΙΚΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ ΤΟΥ TGF-β. Ο transforming growth factor β ανήκει σε µια οικογένεια αυξητικών παραγόντων που εκκρίνoνται από µια ποικιλία κυττάρων µεταξύ των οποίων είναι τα επιθηλιακά κύτταρα και τα ενεργοποιηµένα κύτταρα του στρώµατος. Το χαρακτηριστικό αυτού του παράγοντα είναι πως µπορεί Εικ. 19:Ογκοπροαγωγικές και ογκοκατασταλτικές δράσεις του TGF- β. 20

23 να παρουσιάσει, ανάλογα µε την περίπτωση, τόσο ευοδωτική όσο και ανασταλτική δράση σε σχέση µε τον καρκίνο. Έτσι ενώ στους φυσιολογικούς ιστούς η λειτουργία του εµποδίζει την ανάπτυξη, οδηγεί σε απόπτωση και συµβάλλει στην σταθερότητα των χρωµοσωµάτων, κατά την διάρκεια της ογκογένεσης, διαφορές στην έκφραση του TGF β ή στην ανταπόκριση του κυττάρου σε αυτόν κλίνουν την ισορροπία προς την ευοδωτική δράση σε σχέση µε τον καρκίνο. (13) (25) (εικ19) Υποδοχείς TFG β Το σύµπλεγµα των υποδοχέων της οικογένειας TGF β βρίσκεται στην επιφάνεια των κυττάρων και δηµιουργείται από δύο τύπους, I και II, διαµεµβρανικών υποµονάδων κινάσης µε λειτουργία σερίνηςθρεονίνης. Στα θηλαστικά έχουν βρεθεί πέντε τύπου II υποµονάδες και επτά τύπου I, ενώ οι προσδέτες είναι εικοσιεννέα. (11) (εικ.20) Εικ. 20:Υποµονάδες υποδοχέα TGF- β Smads: Τα βασικά επιτελεστικά µόρια στο µονοπάτι του TGF β. Τα µόρια που αναλαµβάνουν να µεταδόσουν στο βασικό σηµατοδοτικό µονοπάτι το σήµα που δηµιουργείται από την ενεργοποίηση του υποδοχέα του TGF β είναι τα Smad. Υπάρχουν οκτώ διαφορετικά Smads. Κατά την ενεργοποίηση του υποδοχέα ο προσδέτης ενώνεται µε την υποµονάδα TβR II, αυτή ενώνεται και φωσφορυλιώνει τις σερίνες στην υποµονάδα TβR I. Η τελευταία διαθέτει µια αγκύλη εννέα αµινοξέων που ενώνεται µε την αγκύλη L3 του MH2 τµήµατος των Smad 2 και 3 και τα ενεργοποιεί µε φωσφορυλίωσή τους στην SSXS διαµόρφωση του C άκρου τους. (12) Στην σταθεροποίηση των υποδοχέων και στην ένωση και ενεργοποίηση των RSmads (receptor activated Smads) συµµετέχουν διάφορες πρωτεϊνες όπως SARA, Hgs\Hrs, Dab-2, Doc-1, TRAP-1, Axin καθώς και οι Smad 6 και 7 µε τη σύµπραξη του παράγοντα STRAP. (13) Μετά την ενεργοποίηση, τα RSmads 21

24 αποδεσµεύονται από το σύµπλοκο, ενώνονται µε το Smad 4 και µεταφέρονται στον πυρήνα. Εκεί αλληλεπιδρούν µε διάφορους µεταγραφικούς παράγοντες για να επηρεάσουν την µεταγραφή γονιδίων. (εικ. 21) Απο τα οκτώ Smads, το 6 και το 7 είναι τα µόνα ανασταλτικά του µονοπατιού. Αυτό το πραγµατοποιούν συνδεόµενα στα τµήµατα της υποµονάδας I που κανονικά ενώνονται τα RSmads που έτσι τα παρεµποδίζουν. Ακόµα το Smad 6 παρεµποδίζει την ένωση των RSmads µε το Smad 4, ενώ ένας τρίτος µηχανισµός που αναστέλλει το µονοπάτι είναι ο συνδυασµός των Smad 7 µε παράγοντες όπως Smurf 1 και 2 που ενώνονται πάνω στην υποµονάδα I και την οδηγούν σε αποδόµηση µέσω ουβικουϊτίνωσης. (14) Εικ.21 : Ενεργοποίηση των Smads Τα Smad εκφράζονται µόνιµα σχεδόν σε όλους τους τύπους κυττάρων. Εξαίρεση αποτελούν τα ανασταλτικά Smad 6 και 7 που τα επίπεδά τους ρυθµίζονται από εξωτερικά σήµατα. Η ενεργοποίηση των RTKs, η σηµατοδότηση απο ιντερφερόνη γ µέσω STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription) και η ενεργοποίηση του NFkB απο τον TNF-α προκαλούν ενεργοποίηση της έκφρασης των Smad 7 οδηγώντας σε αναστολή το TGF-β σηµατοδοτικό µονοπάτι. Επιπλέον τα επίπεδα των Smads µπορούν να ρυθµιστούν µεταµεταγραφικά από το σύστηµα αποδόµησης που διαµεσολαβείται απο την ουβικουϊτίνηπρωτεάσωµα. 22

25 Άλλες οδοί ενεργοποίησης των Smads Εικ.22 : Άλλες οδοί ενεργοποίηση των Smad. Η φωσφορυλίωση από την υποµονάδα I του υποδοχέα του TGF β είναι ο βασικός τρόπος ενεργοποίησης των Smads. Ωστόσο έχει φανεί ότι και το µονοπάτι των MAPK που ενεργοποιείται απο τα RTKs ή\και το Ras, στοχεύει στα RSmads. Το ενεργοποιηµένο Ras µπορεί να παρεµποδίζει την µετανάστευση των RSmads στον πυρήνα πράγµα που ερµηνεύει την τροποποιηµένη απάντηση TGF β επίδρασης σε κύτταρα που έχουν υπερενεργοποιηµένο το Ras. (15) Ακόµα η φωσφορυλίωση των Smads µπορεί να είναι αποτέλεσµα ενεργοποίησης απο την MEKK1 ( MAPK\Erk kinase kinase 1) (16) ή και από την CamKII (Ca +2\calmodulin-dependet protein kinase II). (17) (εικ. 22) Smads και µεταγραφή Η επίδραση των Smads στην µεταγραφή είναι άµεση, διαντιδρώντας µε έναν µεγάλο αριθµό µεταγραφικών παραγόντων ειδικών για συγκεκριµένες αλληλουχίες του DNA. Παραδείγµατα τέτοιων µεταγραφικών παραγόντων είναι ο Sp1, ο bhlh, ο AML\Runx και ο AP-1\bZIP. Το σύµπλοκο µεταγραφικού παράγοντα και Smads λειτουργεί µε την σύµπραξη συνενεργοποιητών όπως το CBP και το p300 (18) και συναποσιωπητών όπως (εικ.23) Εικ.23 : Συνενεργοποιητές, συναποσιωπητές. το c-myc, ATF3, TGIF, SNIP1, SIP1. (13) Επιπλέον, υπάρχουν µόρια που παρεµποδίζουν την ένωση των Smads µε το DNA όπως η PKC (protein kinase c) µε σηµαντικό ρόλο στην τροποποίηση της αναπτυξιακής, αντιαποπτωτικής δράσης του TGF β στους ιστούς. (19) 23

26 Επίσης, και το P53, σηµαντικό αντιογκογονίδιο, σε πολλές περιπτώσεις έχει στόχο τα ίδια γονίδια µε αυτά που ρυθµίζονται από το TGF β µονοπάτι. Η διαπλοκή αυτών των δύο δικτύων έχει δείξει πως πιθανή απώλεια της P53 µπορεί να σχετίζεται µε αντιστροφή της ογκοκατασταλτικής δράσης του TGF β. (20) Υπάρχουν πολλά γονίδια που ενεργοποιούνται και άλλα που αναστέλονται από το σηµατοδοτικό µονοπάτι του TGF β. Από την µία µεριά λοιπόν, ο TGF β µειώνει την έκφραση ρυθµιστών του κυτταρικού κύκλου, όπως για παράδειγµα του c-myc. Από την άλλη µπορεί να ενισχύει την έκφραση παραγόντων όπως το SIP1 το οποίο καταστέλει τον υποκινητή του γονιδίου της Ε-καντχερίνης παρεµποδίζοντας την έκφρασή της. Το εάν τα Smads θα δράσουν ευοδώνοντας ή καταστέλοντας ένα γονίδιο εξαρτάται από τον υποκινητή του γονιδίου, τους µεταγραφικούς παράγοντες που συµµετέχουν και το πλαίσιο αλληλεπίδρασης παραγόντων και σηµατοδοτικών οδών στο συγκεκριµένο κύτταρο. (21) Άλλες οδοί που ενεργοποιεί η TGF β σηµατοδότηση Εκτός από την µεταγραφή που διαµεσολαβείται απο Smads το TGFβ µπορεί να ενεργοποιεί και άλλα σηµατοδοτικά µονοπάτια. Μονοπάτια όπως αυτό των MAPK εµπλέκονται µε πολύ καθορισµένο τρόπο στην επιθηλιακή προς µεσεγχυµατική διαφοροποίηση προσδίδοντας στο TGFβ ρόλο προαγωγού της καρκινογένεσης και της µετάστασης. Μια τέτοια περίπτωση είναι η ενεργοποίηση των Erk-MAPK, η ενεργοποίηση του PI3K (phosphatidylinisitol-3-kinase) κα. (22) (εικ.24) Εικ.24 : Άλλες οδοί που ενεργοποιεί το TGF- β. Μια επιπλέον οδός, άµεσα εµπλεκόµενη στο ΕΜΤ, που µπορεί να ενεργοποιηθεί απο το TGFβ είναι αυτή των Rho GTPασων ( RhoA, Rac, Cdc42). (12) Τα µόρια αυτά µπορούν να επηρεάζουν την οδό του JNK (23) και p38 MAPK, συµµετέχουν όµως επιπλέον στην οργάνωση του 24

27 κυτταροσκελετού και στη δηµιουργία των λαµελιποδίων καθώς και στην επιθηλιακή προς µεσεγχυµατική µετατροπή. Χαρακτηριστική επίσης είναι η ενεργοποίηση του JNK και της p38 MAPK στα οποία καταλήγει η σηµατοδότηση που ξεκινά απο TGFβ περνώντας από έναν καταράκτη κινασών µε εναρκτήρια την TAK1 (TGFβ activated kinase 1). Η συµµετοχή της TAK1 µπορεί να µπλέξει και άλλη οδό καθώς φωσφορυλιώνει και ενεργοποιεί τον IkB ενεργοποιώντας έτσι το σηµατοδοτικό µονοπάτι του NF-kB. Οι οδοί που µπορεί να ακολουθήσει η TGFβ σηµατοδότηση έχουν το χαρακτηριστικό ότι αλληλορυθµίζονται. Για παράδειγµα τα Smads µπορούν να µειώσουν την ενεργότητα του TAK1 (23) αλλά και το c-jun αντίστροφα µπορεί να αναστείλει την σηµατοδότηση του Smad2 (24). Ένα δεύτερο παράδειγµα είναι η συµβολή του ενεργοποιηµένου Ras στην αποδόµηση της Smad4, µείωση της οποίας ωστόσο οδηγεί σε υπερενεργοποίηση το Ras\Erk µονοπάτι. Με αυτό τον τρόπο η ισορροπία µεταξύ της ενεργοποίησης της µίας ή της άλλης οδού είναι αυτό που καθορίζει την κυτταρική απάντηση στο TGFβ. (εικ.25) Εικ. 25 : Ογκοκατασταλτικό ή ογκοπροαγωγικό αποτέλεσµα ανάλογα µε την ισορροπία των σηµατοδοτικών µονοπατίων που ελέγχονται απο τον TGF- β. ΣΗΜΑΤΟ ΟΤΙΚΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ ΤΩΝ GROWTH FACTORS ΜΕ ΥΠΟ ΟΧΕΙΣ RTKs Μία από τις σηµαντικότερες οµάδες µορίων που επηρεάζουν την ανάπτυξη των κυττάρων είναι οι πολυπεπτιδικοί αυξητικοί παράγοντες όπως ο FGF, ο HGF, ο EGF κα. Τέτοια µόρια κυκλοφορούν στον ορό ή παράγονται τοπικά από τα κύτταρα δρώντας είτε παρακρινικά, είτε µέσα από αυτοκρινείς αγκύλες. Συνήθως οι δράσεις τους είναι πλειόµορφες. Εκτός από την κυτταρική ανάπτυξη ρυθµίζουν και πλήθος άλλες 25

28 δραστηριότητες όπως την κυτταρική κίνηση, την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού, την διαφοροποίηση, την αγγειογένεση, τη σύνθεση των µορίων του στρώµατος κα. RTKs Η δράση τους ασκείται µέσω της ενεργοποίησης ενός µεµβρανικού υποδοχέα RTK (receptor tyrosin kinase) που συνήθως είναι µια µονοµερής πρωτεϊνη µε ιδιότητα τυροσινικής κινάσης στο κυτταροπλασµατικό της τµήµα. Η ένωση του αυξητικού παράγοντα µε τον υποδοχέα οδηγεί σε διµερισµό του τελευταίου και αυτοφωσφορυλίωσή του σε συγκεκριµένες τυροσίνες. Στη συνέχεια µπαίνει σε εφαρµογή ένας καταράκτης διαδοχικών ενεργοποιήσεων µέσω φωσφορυλίωσης µορίων που φέρουν πρωτεϊνικό τµήµα SH2. Σηµατοδοτικές οδοί Στα µόρια αυτού του καταρράκτη κοµβικό ρόλο έχουν οι πρωτεϊνες που συνδέουν GTP όπως οι G πρωτεϊνες και η οικογένεια Ras, Rho, Rac. (26) Επόµενο κοµβικό σηµείο στο µονοπάτι που ξεκινάει από αυτές είναι η ενεργοποίηση των MAPK (mitogen-activated protein kinases) και των PI3K (phosphatidylinositol-3- kinases). Αυτά τα µόρια µεταδίδουν σήµατα µέχρι τον πυρήνα που αλληλεπιδρούν µε αυξητικούς παράγοντες µε τελικό στόχο είτε την µεταγραφή γονιδίων όπως myc, jun, fos είτε την λειτουργία κυκλινοεξαρτώµενων κινασών ασκώντας ρυθµιστικό ρόλο στα γεγονότα του κυτταρικού κύκλου. (εικ. 26) Εικ. 26:Οδοί σηµατοδότησης απο RTKs Επιπλέον, τα RTKs µπορούν να οδηγήσουν στην ενεργοποίηση µιας άλλης οµάδας κινασών, των src (Fyn, Yes) που δρούν µέσω σηµατοδοτικής οδού διαφορετικής απο αυτή των MAPK (27) η οποία έχει φανεί πως είναι πολύ σηµαντική στην πορεία του ΕΜΤ καθώς σχετίζεται µε την αποδόµηση των δοµών συνοχής. (28). 26

29 HGF\SF (hepatocyte growth factor\scatter factor) O HGF ανήκει στην κατηγορία των αυξητικών παραγόντων που περιγράφηκε προηγούµενα. Θεωρείται πρότυπος παράγοντας που προωθεί το κύτταρο προς αναπτυξιακές δραστηριότητες και έχει πολύ σηµαντικό ρόλο στην ΕΜΤ. οµικά είναι µια ετεροδιµερής γλυκοπρωτεϊνη µε α και β αλυσίδα. Η σύνθεση και η έκκρισή της γίνεται απο µεσεγχυµατικά κύτταρα, ενώ ενεργοποιείται από ένζυµα έξω από τα κύτταρα. (30) (31) ρά µέσω ενός διαµεµβρανικού υποδοχέα που έχει την ιδιότητα τυροσινικής κινάσης και κωδικοποιείται από το γονίδιο c-met. Ο υποδοχέας µπορεί να αναστέλλεται µε φωσφορυλίωση από την PKC (protein kinase c). Όπως ισχύει και για τους υπόλοιπους αυξητικούς παράγοντες ο υποδοχέας εφόσον ενεργοποιηθεί έχει τη ιδιότητα να φωσφορυλιώνει µόρια µε τµήµα SH2. Τέτοια µόρια είναι τα : PI3K, STAT3, GRB2, SHC, GAB1, PLC-γ. Αυτά µε τη σειρά τους µπορούν να ενεργοποιήσουν µικρές GTP-binding πρωτεϊνες όπως τις Ras, Rho, Rac που οδηγούν στην ενεργοποίηση των MAP κινασών και των PI3 κινασών. Επιπλέον µπορεί να ενεργοποιηθεί µια άλλη οικογένεια τυροσινικών κινασών, οι Src, η δράση των οποίων σχετίζεται µε την αποδόµηση των µορίων συνοχής. Τα γονίδια των οποίων τελικά θα επηρεαστεί η µεταγραφή εκφράζουν πρωτεϊνες που σχετίζονται µε ένα φάσµα λειτουργιών όπως ανάπτυξη, κινητικότητα, διεισδυτικότητα, αποφυγή απόπτωσης κα. Το φαινοτυπικό αποτέλεσµα στο οποίο θα οδηγήσει τελικά η σηµατοδότηση είναι συνάρτηση της διάρκειάς της, του περιβάλλοντος στο οποίο συµβαίνει και της παράλληλης σηµατοδότησης από άλλες οδούς. Πολύ σηµαντικά δεδοµένα της έρευνας σχετικά µε τον c-myc είναι η συνεργασία του µε άλλα διαµεµβρανικά µόρια. Τέτοια είναι η ιντεγκρίνη α6β4, η plexin B1 και το CD44. (30) (32) (33) Επιπλέον έχει ανακαλυφθεί η συµµετοχή του στην προστασία του αποκολληµένου από το περιβάλλον του καρκινικού κυττάρου από την απόπτωση. Το τελευταίο έχει φανεί πως συµβαίνει ύστερα από σύνδεση του υποδοχέα c-met µε το Fas των ΝΚ κυττάρων ώστε αυτό να αποκρυφθεί από το Fas-L του καρκινικού κυττάρου το οποίο σε αντίθετη περίπτωση θα οδηγείτο σε απόπτωσης. (30) ΣΗΜΑΤΟ ΟΤΗΣΗ ΜΕΣΩ ΙΝΤΕΓΚΡΙΝΩΝ Σε όλη την διάρκεια της ζωής των κυττάρων η δυναµική ισορροπία του δίκτυου πρωτεϊνών της εξωκυττάριας θεµέλιας ουσίας ασκεί µια 27

30 σηµαντική επιρροή στην συµπεριφορά του κυττάρου. Η επικοινωνία του κυττάρου µε την θεµέλια ουσία γίνεται µέσω των ιντεγκρινών. Οι ιντεγκρίνες είναι ετεροδιµερή µόρια µε α και β υποµονάδα ο συνδυασµός των οποίων προσφέρει µια µεγάλη οµάδα προσδετών στο στρώµα, συµπεριλαµβανοµένης της ινωδόνεκτίνης, της λαµινίνης, της βιντρονεκτίνης και του κολλαγόνου. Η σύνδεση του στρώµατος µε τον κυτταρικό σκελετό και ενδοκυττάριες πρωτεϊνες µέσω ιντεγκρινών στις τοπικές συνδέσεις (focal adhesions) δηµιουργεί εκτός από µια δοµή συνοχής και µια µονάδα µετάδοσης σηµάτων. Οι ιντεγκρίνες µεταδίδουν σήµατα µόνες τους αλλά και σε συνεργασία µε άλλα µονοπάτια όπως αυτά που ξεκινούν απο τα RTKs και ο χαρακτήρας της µετάδοσης είναι αµφίδροµος, δηλαδή τόσο από το κύτταρο προς το στρώµα όσο και το αντίστροφο. Τα σήµατα αυτά σχετίζονται µε την επιτέλεση σηµαντικών κυτταρικών λειτουργιών µεταξύ των οποίων είναι η αναδιαµόρφωση του κυτταροσκελετού, η απώλεια των δοµών συνοχής, η κυτταρική µετανάστευση, η κυτταρική επιβίωση, η ανάπτυξη αλλά και το ΕΜΤ στην περίπτωση του καρκίνου. (51) Εικ. 27:Σηµατοδοτικά µονοπάτια ιντεγκρινών. 28

31 Οι ιντεγκρίνες αποτελούν την αφετηρία για πολύ σηµαντικά σηµατοδοτικά µονοπάτια. Καίρια είναι η επάνδρωση από την µία των SFKs (Src family kinases) και απο την άλλη της FAK (Focal Adhesion Kinase). To Src µπορεί µέσα απο διαδοχικά βήµατα να ενεργοποιήσει την οικογένεια των RhoGTPασών, το ΡΑΚ, JNK και τον NF-kB. Η FAK ενεργοποιεί το µονοπάτι του PI3K προς Akt\PKB και τις ERK\MAPK. (35) (εικ. 27) Ενεργοποίηση της FAK. H FAK είναι µια πρωτεϊνη που βρίσκεται στο σύµπλοκο µορίων που περιβάλλουν την δοµική σύνδεση των ιντεγκρινών µε τα ινίδια ακτίνης του κυτταροσκελετού. Το σηµατοδοτικό µονοπάτι των ιντεγκρινών οδηγεί στην φωσφορυλίωση της FAK, ενώ η αποκόλληση των κυττάρων από το στρώµα οδηγεί σε αποφωσφορυλίωσή του. Στο ίδιο σύµπλοκο υπάρχουν επίσης πρωτεϊνες µε δοµικό ρόλο (αακτίνη, φιλαµίνη, βινκουλίνη), πρωτεϊνες που ρυθµίζουν την δυναµική των ινιδίων ακτίνης, (gelosolin), κινάσες (c-src, PI3K, RhoGAP, ILK) και adaptor πρωτεϊνες (paxillin, tallin, P130CAS, και Caveolin 1) που έχουν ρόλο στην ενεργοποίηση της FAK. Οι λειτουργίες της FAK φαίνεται πως σχετίζονται µε την διείσδυση και την µετανάστευση καθώς και µε την κυτταρική επιβίωση. (36) (37) (38) (εικ.28) Εικ. 28:Μόρια στο σύµπλοκο των focal adhesions. 29

32 Ενεργοποίηση της οδού των MAPK Σε κύτταρα που βρίσκονται σε ένωση µε το στρώµα παράλληλα µε την FAK ενεργοποιούνται οι ΜΑPK όπως οι όπως οι Erk1\2, JNK, p38 που οδηγούν το µονοπάτι σε έκφραση γονιδίων που σχετίζονται µε την ανάπτυξη και την διαφοροποίηση των κυττάρων. (35) Σύνδεση των ιντεγκρινών µε το δίκτυο ακτίνης. Βασική λειτουργία των ιντεγκρινών είναι να ενώνουν τα µόρια της θεµέλιας ουσίας µε το δίκτυο ινιδίων ακτίνης ενδοκυτταρίως. Ρόλο σε αυτή την ένωση παίζουν οι πρωτεϊνες tallin, ILK, filamin, a-actinin. Η δέσµευση της ιντεγκρίνης µε τη θεµέλια ουσία οδηγεί σε µια αλλαγή στην ουρά της β1 υποµονάδας της που την καθιστά ικανή να ενώνεται µε την talin που αλληλεπιδρά και µε την FAK. Όλος αυτός ο µηχανισµός φαίνεται πως έχει πολύ ουσιαστική συµµετοχή κατά την κυτταρική µετανάστευση όπου η αναδιαµόρφωση των ινιδίων ακτίνης δηµιουργεί προσεκβολές στην κυτταρική µεµβράνη που προσφέρουν την δυνατότητα κίνησης. (εικ.29) α β ILK filamin talin a-actinin Actin filament FAK Vinculin Εικ.29 : ένωση ιντεγκρίνης µε τα ινίδια ακτίνης Όσον αφορά την άλλη σερίνη\θρεονίνη κινάση που ενώνεται στις β υποµονάδες, την ILK, φαίνεται πως στόχος της είναι το PKB\Akt που έχει σχετιστεί µε την ανάπτυξη και την επιβίωση του κυττάρου. Επίσης στόχο αποτελεί και το µόριο GSK-3β που η φωσφορυλίωσή του ευνοεί την µετανάστευση β κατενίνης στον πυρήνα και την έκφραση γονιδίων που αυτή διαµεσολαβεί. (35) Επίδραση ιντεγκρινών στην ρύθµιση των Rho GTPασων Κατά την δέσµευση της θεµέλιας ουσίας µε τις ιντεγκρίνες µεταδίδονται και σήµατα που ενεργοποιούν τις Rho GTPασες. Ο ρόλος αυτών είναι βασικός στην επαναδιαµόρφωση του κυτταροσκελετού µε τη δηµιουργία δοµών όπως φιλοπόδια που εκτείνονται στην θεµέλια ουσία. Οι ιντεγκρίνες ενώνονται µε ίνες του κυτταροσκελετού και βοηθούν στην κίνηση του κυττάρου. Παράλληλα όµως έχει δειχθεί οτι ασκούν µεταγραφική ρύθµιση στα επίπεδα της κυκλίνης D επιδρώντας έτσι στην ρύθµιση του κυτταρικού κύκλου. (35) (εικ.30). 30

33 Εικ. 30:Επίδραση ιντεγκρινών στις RhoGTPases. Συνεργασια σηµατοδοτικών µονοπατιών ιντεγκρινών και υποδοχέων αυξητικών παραγόντων Η ανάπτυξη των κυττάρων είναι σαφώς επιβεβαιωµένο ότι εκτός από την ύπαρξη αυξητικών παραγόντων απαιτεί την προσκόλληση στην θεµέλια ουσία. Η συνεργασία αυτή δεν εντοπίζεται µόνο στο επίπεδο του υποδοχέα αλλά και στην πορεία του καταρράκτη της σηµατοδότησης. Οι δύο διαφορετικές σηµατοδοτικές οδοί που εξυπηρετούν το ίδιο αποτέλεσµα φαίνεται πως στην πορεία τους συγκλίνουν σε κάποια µόρια κλειδιά όπως τα : SHC, Ras\Raf- 1\MEK\Erk1\2, PI3K, Rho GTPases, JNK, RSK, FAK, paxillin, p130cas. (εικ. 31) Εικ.31 : Συνεργασία ιντεγκρινών- RTKs. 31

34 ILK (Integrin Linked Kinase) Η ILK είναι µια σερίνη\θρεονίνη κινάση που σχετίζεται µε τις β1 και β3 υποµονάδες των ιντεγκρινών, αλλά ταυτόχρονα και µε την ακτίνη και µυοσίνη γεγονός που την καθιστά κοµβικό µόριο στην διαµόρφωση του κυτταροσκελετού που είναι καθοδηγούµενη απο σήµατα του περιβάλλοντος του κυττάρου. (42) Η ILK αλληλεπιδρά µε την πρωτεϊνη PINCH που την φέρνει σε επαφή µε τους INTEGRINS HIF-1a Εικ. 32:ILK PI3K ILK GROWTH FACTORS CH-ILKBP MLC CYTOSKELETON MYOCIN PKB\Akt GSK-3 SNAIL\ZEB-1 NF-Kb AP-1 TAU VEGF b-cat\tcf E-CADHERIN inos Cox-2 υποδοχείς αυξητικών παραγόντων. Υπάρχουν διάφορες πρωτεϊνες που µπορεί να συνδέονται µε την ILK ρυθµίζοντας την λειτουργία της όπως η PKB και η GSK-3. (39) (40) Μάλιστα µέσω αναστολής της GSK-3 συµµετέχει στην αποτροπή της απόπτωσης των αποκολληµένων από την θεµέλια ουσία κυττάρων όπως θα παρουσιαστεί σε επόµενο κεφάλαιο, αλλά και στην ρύθµιση παραγόντων όπως β- κατενίνη\tcf και AP-1. Επίσης, µέσω ενεργοποίησης του PKB\Akt συµµετέχει στην ρύθµιση του παράγοντα NF-kB και του VEGF που σχετίζεται µε την αγγειογένεση. Τέλος φαίνεται πως συµµετέχει και σε άλλες τρείς σηµαντικές για το ΕΜΤ λειτουργίες όπως στην µείωση της έκφρασης της Ε-καντχερίνης µέσω των µεταγραφικών παραγόντων Snail και ΖΕΒ-1, (41) στην αυξηση της έκφρασης της ΜΜΡ-9 και τέλος στην αναδιαµόρφωση του κυτταροσκελετού. (εικ. 32) ΣΗΜΑΤΟ ΟΤΙΚΟ ΜΟΝΟΠΑΤΙ ΤΟΥ WNT Τα Wnts είναι µια µεγάλη οικογένεια εκκρινόµενων γλυκοζυλιοµένων προσδετών που εκφράζεται σε µια ποικιλία ιστών. Ο ρόλος τους πρωτοταυτοποιήθηκε στις µοριακές διεργασίες της εµβρυογένεσης. Για να γίνει κατανοητός ο ρόλος του Wnt στην µοριακή σηµατοδότηση αλλά και στο ΕΜΤ είναι απαραίτητο να παρατεθούν ορισµένα εισαγωγικά στοιχεία σχετικά µε τη συµµετοχή του µορίου β 32

35 κατενίνη στην µεταγραφή γονιδίων. (43) Η β κατενίνη, όπως έχει δειχτεί σε προηγούµενο κεφάλαιο, είναι δοµικό µόριο των ζωνών πρόσφυσης και πιο συγκεκριµένα ενώνει την Ε- καντχερίνη µε τα ινίδια ακτίνης του κυτταροσκελετού. Η ύπαρξη ελεύθερου µορίου β κατενίνης στο κυτταρόπλασµα οδηγεί στην ένωσή του µε την οικογένεια των µεταγραφικών παραγόντων TCF, και στην συνέχεια στην ενεργοποίηση µεταγραφής γονιδίων που διαθέτουν TCF binding element, όπως Εικόνα 33 : Wnt sfrp Frizzled Receptors Cross-talk with signaling pathways Cross-talk with Dvl? Signaling pathways? APC β-catenin turnover complex PP2A Axin PP2A cytosole nucleus Gsk-3Β Β-catenin Η κατάληξη της ελεύθερης β κατενίνης παρουσία και απουσία wnt σηµατοδότησης. β-catenin TCF Β-catenin MMP7 CyclinD1 Transcription c-myc µεταλλοπρωτεϊνασών, κυκλίνης D1, COX-2 και c-myc που σχετίζονται µε την ΕΜΤ και την προαγωγή της διείσδυσης και της µετάστασης. Η οµοιοστασία του κυττάρου προβλέπει ένα µηχανισµό αποµάκρυνσης των ελευθέρων β κατενινών που στηρίζεται στην αποδόµησή τους από το σύστηµα ουβικουϊτίνης-πρωτεασώµατος. Για να συµβεί αυτό θα πρέπει η β κατενίνη να βρίσκεται ενωµένη σε ένα σύµπλοκο που αποτελείται από την axin, το APC (adenomatus polyposis coli protein), τα PP2A (protein phosphatase 2A catalytic & regulatory) και το GSK-3β (glycogen synthase kinase 3β) που φαίνεται να έχει κοµβικό ρόλο καθώς φωσφορυλιώνει την β κατενίνη σταθεροποιώντας 33

36 το σύµπλοκο. Η σταθερότητα αυτού του συµπλόκου εξαρτάται από την διαντίδραση µε διάφορα σηµατοδοτικά µονοπάτια µεταξύ των οποίων το µονοπάτι του Wnt. Το Wnt δρά ενωµένο µε τον διαµεµβρανικό υποδοχέα FRZ. Αυτός ασκεί την δράση του µέσω των Dvl πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν µε την axin η οποία χάνει την δοµική της συσχέτιση µε την GSK-3Β και η τελευταία µε τη σειρά της τη δυνατότητα να φωσφορυλιώνει την β κατενίνη κρατώντας την στο σύµπλοκο ώστε να οδηγηθεί προς αποδόµηση. Ετσι η β κατενίνη είναι ελεύθερη να συµµετέχει στην µεταγραφή των γονιδίων που θα προσδώσουν επιθετικούς χαρακτήρες στο κύτταρο. Μεταλλάξεις ή πειράµατα µε knockout ποντίκια για οποιοδήποτε απο τα γονίδια που κωδικοποιούν τα παραπάνω µορια έχει αποδειχτεί ότι έχουν αξιόλογη επίπτωση στην καρκινογένεση. Χαρακτηριστικό παράδειγµα είναι οι περιπτώσεις κληρονοµικού καρκίνου του κόλου όπου κατά 80% ανευρίσκονται µεταλλάξεις του APC. Το σηµατοδοτικό µονοπάτι του Wnt αλληλεπιδρά και διαπλέκεται και µε άλλες οδούς, βασικά σε τέσσερα επίπεδα. Καταρχήν µπορεί να υφίσταται διαντίδραση µορίων διαφόρων οδών πρίν το επίπεδο της µεταγραφής. Χαρακτηριστικό παράδειγµα αποτελεί µια σερίνη\θερονίνη κινάση, η ILK (integrin linked kinase) η οποία σχετίζεται µε τις υποµονάδες των ιντεγκρινών. Η ILK φαίνεται πως ευοδώνει την µεταγραφική ενεργοποίηση απο το β κατενίνη\lef-1 σύµπλοκο. Επίσης αυξάνει την έκφραση του µεταγραφικού παράγοντα LEF-1. (44) Άλλο παράδειγµα αποτελεί η µείωση της δραστικότητας του GSK-3β απο τον υποδοχέα c-met του HGF που οδηγεί σε αύξηση του επιπέδου της ελεύθερης β κατενίνης. (45) εύτερον, το γονίδιο στόχος της Wnt σηµατοδότησης µπορεί να έχει στον υποκινητή του περιοχές που να είναι στόχοι για τα επιτελεστικά µόρια και άλλων οδών. (46) Τρίτον, ένα σηµατοδοτικό µονοπάτι µπορεί να αλλάζει την αντίδραση του κυττάρου σε άλλο σήµα χωρίς τα δύο µονοπάτια να διαπλέκονται σε καµία φάση. (47) Τέλος, δυο σήµατα µπορεί να µην έχουν καµία αλληλεπίδραση αλλά να προκαλούν ένα αθροιστικό αποτέλεσµα στο κύτταρο, όπως για παράδειγµα µπορεί να συµβαίνει σε ένα κύτταρο που υφίσταται την επίδραση της οδού του Wnt και του P53, όπου η εξώθηση σε πολλαπλασιασµό ταυτόχρονα µε την αδυναµία διόρθωσης των βλαβών του DNA προσδίδουν επιθετικό χαρακτήρα στο κύτταρο. (48) 34

37 ΣΗΜΑΤΟ ΟΤΙΚΑ ΜΟΝΟΠΑΤΙΑ ΚΑΙ ΕΠΙΤΕΛΕΣΤΙΚΑ ΜΟΡΙΑ Στο κεφάλαιο που προηγήθηκε έγινε παρουσίαση των µοριακών σηµάτων που θέτουν σε κίνηση τους µοριακούς µηχανισµούς ώστε το επιθηλιακό καρκινικό κύτταρο να αποκτήσει εκείνους τους µεσεγχυµατικούς χαρακτήρες που θα του προσδώσουν µια δυναµική διείσδυσης και µετάστασης. Επιπλέον συνοπτικά παρατέθηκαν οι σηµατοδοτικές οδοί που ξεκινώντας από ενεργοποίηση συγκεκριµένων υποδοχέων εξελίσσονται µέσα από έναν καταρράκτη µορίων και καταλήγουν να ασκήσουν την ρυθµιστική τους δράση στο γονιδίωµα, στον κυτταροσκελετό και στις δοµές συνοχής του κυττάρου. Οι οδοί αυτές στην πραγµατικότητα είναι ένα δαιδαλώδες δίκτυο αποτελούµενο από ένα µεγάλο αριθµό παραγόντων που διαπλέκονται και αλληλεπιδρούν µεταξύ τους. Η επιστηµονική έρευνα µε την ανακάλυψη στοιχείων σχετικά µε την διασύνδεση των διαφόρων παραγόντων διαρκώς προσθέτει µικρά κοµµάτια στο πάζλ της µοριακής σηµατοδότησης. Από τα πρόσφατα δεδοµένα της βιβλιογαφίας σχετικά µε το ΕΜΤ φαίνεται πως µεταξύ των οδών υπάρχουν κάποιες που είναι οι πλέον βασικές και µόρια που είναι τα πλέον κοµβικά. Το πρώτο από αυτά, το Ras, προκύπτει από την ενεργοποίηση των RTKs και δεσπόζει στην κορυφή του καταρράκτη των MAPK, της PI3K και των RhoGTPασων. Η Src είναι το έτερο κοµβικό µόριο που προκύπτει από την ενεργοποίηση των RTKs και των ιντεγκρινών, ενώ τα Smad είναι βασικά µόρια στο πολύ σηµαντικό µονοπάτι που σηµατοδοτείται από τον TGF-β. Στο κεφάλαιο που ακολουθεί, µέσα από µια πιο εκτενή παρουσίαση των παραπάνω µορίων θα επιχειρηθεί να αναδειχθεί ο ρόλος τους στην ΕΜΤ. Ras Η Ras είναι οµάδα πρωτεϊνών που βρίσκονται σε συσχέτιση µε την εσωτερική επιφάνεια της κυτταρικής µεµβράνης. Η ενεργοποίηση υποδοχέων επιφανείας προάγει τη απελευθέρωση γουανιδίνης από παράγοντες (GEFs) και την δεσµευσή της από την Ras µε αποτέλεσµα ενεργοποίησή της. Στη συνέχεια η Ras ενεργοποιεί µια σειρά απο µόρια άλλα από τα οποία παρουσιάζουν θετική δράση κατά την ογκογένεση (Raf, PI3K, Tiam 1, RalGEF) και άλλα αρνητική (Nore 1, RASSF). 35

38 Τελικά η ενεργοποίηση της Ras φαινοτυπικά εµπλέκεται στην διαµόρφωση του κυτταροσκελετού ώστε να δηµιουργηθούν τα φιλοπόδια, στην ρύθµιση της έκφρασης των µεταλλοπρωτεϊνασών, στην απώλεια της συνεκτικότητας των κυττάρων και στην αγγειογένεση. (49) (50) Ενεργοποίηση της πρωτεϊνης Raf και της οδού ERK-MAPK Η ενεργοποιηµένη πρωτεϊνη Ras ενεργοποιεί την πρωτεϊνη Raf (c- Raf-1, A-Raf, B-Raf). Τα ενεργοποιηµένα Raf φωσφορυλιώνουν και PI3K Akt ενεργοποιούν µε την σειρά τους τις MEK1\2 που είναι κινάσες για τις ERK 1και 2 Ras Rac MAPK. Συµπληρωµατικά πρέπει να αναφερθεί πως υπάρχουν δύο ακόµα Raf PAK µονοπάτια MAPK, αυτό MEK1 του JNK\SAPK και του ERK MAPK p38, που ενεργοποιούνται απο το κυτταρικό στρές. Eικ. 34:ενεργοποίηση µονοπατιού MAPK. Οι MAP κινάσες µεταναστεύουν στον πυρήνα όπου επηρεάζουν την µεταγραφή γονιδίων της οικογένειας Ets. (εικ. 34) Ενεργοποίηση της πρωτεϊνης Akt και Rac από την PI3K. Πολύ σηµαντική οδός είναι αυτή που ξεκινά µε την ενεργοποίηση της PI3 κινάσης. Η κινάση φωσφορυλιώνει την διφωσφορική 4,5 φωσφατιδυλινοσιτόλη και δηµιουργεί έτσι το PIP3. H PIP3 me την σειρά της στη συνέχεια ενεργοποιεί την κινάση σερίνης\θρεονίνης Akt\PKB. Αυτή εµπλέκεται και στην αύξηση της έκφρασης του NF-kB. Επιπλέον, η PI3K µπορεί να ενεργοποιεί τα Rac GEFs που προκαλούν την ενεργοποίηση µικρών GTPασων της οικογένειας Rho. RalGEF ενεργοποίηση των Ral small GTPases Ένα ακόµα µόριο που ενεργοποιείται από την πρωτεϊνη Ras είναι η οικογένεια µικρών Ral GTPases. Τα µόρια αυτά έχει φανεί πως έχουν ιδιαίτερη σηµασία στην επιβίωση καρκινικών κυττάρων που έχουν χάσει τις επαφές τους µε τη θεµέλια ουσία. 36

39 Ενεργοποίηση του Rac από Tiam 1. Το Tiam 1 ( T lymphoma invasion and metastasis protein 1) βρέθηκε πως είναι GEF για το Rac και δρα συνεργικά µε την PI3K. (εικ. 35) GEFs Tiam-1 Sos RasGRF RacGDP RasGDP GAPs bcr p120 RasGAP RacGTP RasGTP PAK PI3K Εικ. 35:GEFs, GAPs & Tiam1. RalGSD PI3K Ras και RhoGTPασες Οι οδοί που συµµετέχει η ενεργοποιηµένη Ras και οι RhoGTPασες (Rho, Rac, Cdc42) πολλές φορές διαπλέκονται και αλληλεπιδρούν µεταξύ τους. Κεντρικό ρόλο σε αυτή τη σχέση παίζουν οι πρωτεϊνες που ενεργοποιούν και τις δύο αυτές οµάδες, τα GEFs. Πιθανόν ένα GEF να ενεργοποιεί και τα δύο ή η ενεργοποίηση του Ras να είναι προϋπόθεση για την ενεργοποίηση από το κοινό GEF, της Rho. Επίσης, δύο µονοπάτια στην πορεία τους πιθανόν να συγκλίνουν στα ίδια επιτελεστικά µόρια ή σε µόρια που αλληλεπιδρούν. Ένα τέτοιο µόριο σύγκλισης των δύο µονοπατιών φαίνεται πως είναι η κινάση PAK η οποία ενεργοποιείται απο τη Rac και το Akt. Και η ίδια όµως η κινάση PAK µε τη σειρά της ενεργοποιεί τη Raf ή το MEK1 στη σηµατοδοτική οδό της Ras. Src Η πρωτεϊνη Src είναι µια κινάση που εντοπίζεται στις τοπικές συνδέσεις. Φέρει τµήµα SH2 και ενεργοποιείται µε φωσφορυλίωση από τα RTKs. Πολλά µόρια που συµµετέχουν στο σύµπλοκο των focal adhesions (β1 ιντεγκρίνη, paxillin, tensin, p130cas, FAK) φωσφορυλιώνονται απο τον Src µε αποτέλεσµα την αποσταθεροποίηση του συµπλόκου. Από την Src επίσης µπορούν να φωσφορυλιωθούν οι κατενίνες α, β, p120 και έτσι να αποσταθεροποιηθούν από το σύµπλοκο 37

40 µε τις καντχερίνες. Η πρωτεϊνη Src ενεργοποιείται από µονοπάτι διαφορετικό από των MAPK και ο ρόλος του στο ΕΜΤ εκτός της αποδόµησης συνεκτικών µορίων, φαίνεται πως Εικ. 36 : Λειτουργίες στις οποίες εµπλέκεται το Src. είναι και η αναδιαµόρφωση του κυτταροσκελετού, η κυτταρική κίνηση και η εισαγωγή του κυττάρου στην φάση S µε το να αυξάνει την έκφραση του c-myc. (29) (εικ. 36) PI3K Οι φωσφατιδυλινοσιτολ-3-κινάσες (PI3K) είναι µια οικογένεια ενζύµων µε βασικό ρόλο στην κυτταρική σηµατοδότηση. Ενεργοποιούνται απο υποδοχείς G πρωτεϊνών ή από πρωτεϊνες µε ιδιότητα τυροσινικής κινάσης είτε ακόµα και από µικρές GTP Ras. Αφού ενεργοποιηθούν στοχεύουν στην κυτταρική µεµβράνη όπου προκαλεί την δηµιουργία των 3-phosphoinositides. Η δηµιουργία των τελευταίων µπορεί να ανασταλεί από την ογκοκατασταλτική πρωτεϊνη PTEN. (85) Αυτά τα προϊόντα των λιπιδίων ενώνονται στο σύµπλοκο Akt\PKB. Παράλληλο γεγονός είναι η προσέλκυση των µορίων PKD1 και PKD2. Τα τελευταία ενεργοποιούν το Akt\PKB και αυτό µε τη σειρά του 38

41 ενεργοποιεί µέσω φωσφορυλίωσης µόρια όπως το GSK3Β και µεταγραφικούς παράγοντες που είναι υπεύθυνοι για την µεταγραφή γονιδίων όπως της κυκλίνης D1 συµµετέχοντας έτσι στην ρύθµιση του κυτταρικού κύκλου. Η PI3K είναι κοµβικό µόριο και για άλλα γεγονότα σχετιζόµενα µε το ΕΜΤ. Φαίνεται λοιπόν πως συµµετέχει στην αναδιαµόρφωση του κυτταροσκελετού αλλά και στην δηµιουργία λαµελιποδίων ρυθµίζοντας τις µικρές G πρωτεϊνες Rho και Rac. Επιπλέον συµµετέχει πιθανότατα στην ρύθµιση της κυτταρικής συνοχής εφόσον η ενεργοποίησή της είναι απαραίτητη για την δράση ρυθµιστών των ιντεγκρινών όπως CD28, Εικ. 37:PI3K. CD27, CD19. Μια άλλη λειτουργία που συσχετίζεται και µε την ενεργοποίηση του PI3K είναι η αυξηση της έκφρασης υποδοχέων της PDGFβ που έχουν πολύ σηµαντικό ρόλο στην νεοαγγειογένεση. Τέλος αποδεδειγµένη είναι η συµµετοχή του µονοπατιού PI3K\Akt στην ρύθµιση της κυτταρικής επιβίωσης. (52) (εικ. 37) Οικογένεια RhoGTPασων Η εν λόγω οικογένεια περιλαµβάνει τέσσερις βασικές υποοικογένειες, τις Rho (Α,Β,C), Rac (1,2,3,1b), Cdc42 και αυτές που δεν διαθέτουν ενεργότητα GTPασης. Τα περισσότερα από αυτά τα µόρια είναι γνωστά για το ρυθµιστικό τους ρόλο στην ακτίνη του κυτταροσκελετού όπως για παράδειγµα το RhoA προκαλεί την δηµιουργία stress fibers, το Ra1 την δηµιουργία λαµελιποδίων και το Cdc42 φιλοποδίων. Ωστόσο σηµαντικός είναι ο ρόλος τους και στην κυτταρική ανάπτυξη, στην κυτταρική συνοχή και στην καρκινογένεση. Στους καρκίνους υπάρχουν τρείς τρόποι οι Rho να οδηγηθούν σε υπερλειτουργία : α) αύξηση της έκφρασής τους, β) µετάλλαξή τους γ) 39

42 υπέρµετρη ενεργοποίησή τους απο σηµατοδοτικά µονοπάτια ή απο διαταραχή της ισσοροπίας µεταξύ των GΕFs (Guanidin exchange factors) και των GAPS (GTPase activating proteins) που είναι ρυθµιστικά µόρια της ενεργοποίησης των GTPασών. (53) (εικ. 38) 1. homeostasis - Rho 2. hyperproliferation - Rho - Rac - Rac - Cdc42 - Cdc42 > endocytosis Rho, Rac, Rab. Disassembly cadherin contacts > cleavage extr. Cadherin - Rac > degradation cadherin - Rac > COX2 - Rho 2. de-differentiation > oxygen radicals - Rac Loss polarity 4. invasion Increased motility - Rho - Rac Cleavage Ecm proteins - Rac - Rho - cdc24 - Rac - Rho 5. metastasis - Rho Εικ. 38 : Ο ρόλος της οικογένειας RhoGTPases στο ΕΜΤ. RhoGTPάσες και καντχερίνες. Είναι αποδεδειγµένο ότι οι Rho και Rac1 είναι απαραίτητες για την διαµόρφωση και τη διατήρηση των δοµών συνοχής που στηρίζονται στις καντχερίνες. Πιθανότατα αυτό γίνεται µέσω συµβολής στην ένωση και σταθεροποίηση των ινιδίων ακτίνης πάνω σε αυτές τις δοµές. Από τα προηγούµενα λοιπόν συνεπάγεται ότι µη φυσιολογική ενεργοποίηση αυτών των GTPασών ή αναστολή της λειτουργίας τους θα συµβάλλει στην αποσταθεροποίηση των δοµών συνοχής. Όσον αφορά την RhoA φαίνεται πως στην περίπτωση του ΕΜΤ είναι κοµβικό µόριο στα µονοπάτια των HGF και TGFβ και συµβάλλει στην αποσταθεροποίηση των καντχερινών πιθανόν όχι άµεσα αλλά στα πλαίσια δηµιουργίας των stress fibers που θα µπορούσαν να ευνοήσουν την ενδοκύτωση και αποµάκρυνση των καντχερινών. Ένας δεύτερος µηχανισµός είναι µέσω ενεργοποίησης της έκφρασης της COX-2 από την RhoA. Το COX-2 είναι ένζυµο που καταλύει την παραγωγή προσταγλανδινών που έχουν ρόλο στην ενδοκύττωση των καντχερίνων. Το Rac1 είναι ένα ακόµα µόριο που συµβάλλει στην οργάνωση ή αποσταθεροποίηση των δοµών καντχερίνης ανάλογα µε την ποσοτητά 40

43 του αλλά και την συνεργασία του µε άλλα µόρια στα πλαίσια του σηµατοδοτικού υπόβαθρου του κυττάρου σε µια δεδοµένη στιγµή. Ένα τέτοιο ρόλο θα µπορούσε να εξυπηρετεί η ελεύθερη κατενίνη p120 (54) που ενωµένη µε το Rac1 αντιστρέφει τις δράσεις του σε σχέση µε τις δοµές συνοχής. Το Rac1 όπως και το RhoA φαίνεται πως ρυθµίζει την ενδοκύτωση και αποµάκρυνση των καντχερινών. Επιπλέον όµως αποδίδεται στο Rac1 και ένας διαφορετικός µηχανισµός προσβολής των καντχερινών που στηρίζεται στην αποδόµησή τους απο MMPs. Το Rac1 µπορεί να ευοδώσει την έκφραση του ΜΜΡ-9. Τέλος ένας ακόµα µηχανισµός που εµµέσως το Rac1 συµβάλλει στην αποσταθεροποίηση των δοµών συνοχής της καντχερίνης είναι η φωσφορυλίωσή της στις τυροσίνες µέσω του µορίου ROS. MAPK (mitogen activated protein kinases) Το µονοπάτι ενεργοποίησης των ΜΑΡΚ είναι θεµελιώδες για τις µοριακές διεργασίες που θα οδηγήσουν το επιθηλιακό καρκινικό κύτταρο στην απόκτηση µεσεγχυµατικού, διεισδυτικού χαρακτήρα. (εικ.39) Τρείς ξεχωριστές οδοί ΜΑΡΚ έχουν χαρακτηριστεί : α) ERK1\2 (extracellular signal-regulated kinase 1\2), β) JNK\SAPK (c-jun N- terminal kinase\ stress activated protein kinase) γ) p38. Το ERK1\2 ενεργοποιείται από αυξητικούς παράγοντες µέσα απο διαδοχικές φωσφορυλιώσεις των Ras, Raf, MEK. Οι κινάσες JNK\SAPK και p38 από την άλλη µεριά ενεργοποιούνται από το κυτταρικό στρές. Η ενεργοποίηση των MAPK οδηγεί στην µετανάστευσή τους στον πυρήνα όπου αλληλεπιδρούν µε αυξητικούς παράγοντες µέσω φωσφορυλίωσης. (55) Ras Rho mitochondria BLC2 Bad Raf RhoK cell migration Cyt. c Bcl bad P MEK MLC Apaf1 Caspase 9 MAPK MLCK Cell proliferation Caspase MMPs ECM 3, 7 AP-1 degadation apoptosis Εικ. 39:λειτουργίες που σχετίζονται µε τις ΜΑΡΚ. 41

44 ΜΑΡΚ και αποδόµηση της θεµέλιας ουσίας Η αποδόµηση της θεµέλιας ουσίας είναι βασική προϋπόθεση για την µετανάστευση του καρκίνου. Ρυθµιστές των ενζύµων που αναλαµβάνουν αυτό το ρόλο είναι οι ΜΑΡΚ. Αυτό γίνεται µέσω ενεργοποίησης του µεταγραφικού παράγοντα ΑΡ-1 που επικάθεται στους υποκινητές γονιδίων όπως ΜΜΡ-1,3,7,9,11,13,19 και upa. Ταυτόχρονα η ίδια η παρουσία MMPs στη θεµέλια ουσία µπορεί να επηρεάσει µέσα από υποδοχείς επιφανείας το µονοπάτι των ΜΑΡΚ. Συµβολή των ΜΑΡΚ στην κυτταρική κίνηση Το µονοπάτι των ΜΑΡΚ έχει επιτελεστικό ρόλο στην λειτουργία του µοριακού µηχανισµού που είναι απαραίτητος για την κυτταρική κίνηση. Το µονοπάτι των ERK κινασών φαίνεται να συµµετέχει στην λειτουργία της MLCK (myosin light-chain kinase) που φωσφορυλιώνει τις ελαφρές αλύσους της µυοσίνης ενέργεια απαραίτητη για την αλληλεπίδρασή τους µε τα ινίδια ακτίνης κατά την κυτταρική κίνηση. (56) Στην λειτουργία τους αυτή οι ΜΑΡΚ ρυθµίζουν τα πρώϊµα στάδια της κυτταρικής κίνησης και συνεργάζονται µε τις Rho kinases που αναλαµβάνουν να συντηρήσουν αυτή την διεργασία. Στο µονοπάτι των ΜΑΡΚ τέλος αποδίδεται και µια από τις οδούς που εξασφαλίζουν την επιβίωση του καρκινικού κυττάρου από την µοριακή διεργασία της απόπτωσης όπως θα παρουσιαστεί εκτενέστερα σε επόµενο κεφάλαιο. ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΕΜΤ Η συνήθης κατάληξη των περισσοτέρων σηµατοδοτικών µονοπατιών είναι στον πυρήνα. Εκεί αλληλεπιδρούν µε συγκεκριµένους µεταγραφικούς παράγοντες ρυθµίζοντας την µεταγραφή γονιδίων είτε µε θετικό είτε µε αρνητικό τρόπο µε κατάληξη τα φαινοτυπικά αποτελέσµατα που προσδιορίζουν την ΕΜΤ. Έως τώρα έχει αναγνωριστεί µια πλειάδα µεταγραφικών παραγόντων σχετιζόµενων µε το φαινόµενο ΕΜΤ µεταξύ των οποίων τα : Slug, Snail, Wt1, cfos-er, cjun-er, β κατενίνη\tcf, ZEB1, ZEB2 (Sip1), E12\E47, caiso και Twist. 42

45 Εικ. 40:Μονοπάτια που συµµετέχουν στην µεταγραφή µέσω snail και slug. Τα µόρια της οικογένειας Snail και Slug είναι επιβεβαιωµένο οτι έχουν ένα πολύ σηµαντικό ρόλο στην µεταγραφική ρύθµιση του EMT. (57) Αποτελούν ενεργοποιητές της µεταγραφής και αλληλεπιδρούν µε το DNA µε ένα µοτίβο γνωστό ως δάκτυλοι ψευδαργύρου. Φαίνεται πως η έκφρασή τους αυξάνεται σε πρόκληση ΕΜΤ µε αρχικό σήµα EGF ή FGF µέσα απο το µονοπάτι του Ras\MAPK. Η ενεργοποίηση του Snail και Slug µπορεί να προκύψει και από σηµατοδότηση µε TGF β ως αποτέλεσµα του σηµατοδοτικού µονοπατιού των Smads. Τα Smads επιπλέον σχετίζονται και µε τον παράγοντα Sip1. Μέσω Snail φαίνεται επίσης να δρά και ο παράγοντας ILK, ενώ στο Slug µπορεί να καταλήξει και το µονοπάτι της Wnt σηµατοδότησης. (εικ.40, 41) O παράγοντας Snail ασκεί µεταγραφικό έλεγχο σε πολλά γονίδια σε σχέση µε το ΕΜΤ. Αφενός υπάρχουν γονίδια των οποίων η µεταγραφή ευοδώνεται. Τέτοια είναι η βιµεντίνη, η Ν-καντχερίνη, η φιµπρονεκτίνη, τα ΜΜΡs, τα γονίδια των RhoGTPασων. Αφετέρου υπάρχουν άλλα γονίδια των οποίων η έκφραση αναστέλλεται. 43

46 Χαρακτηριστικά παραδείγµατα είναι το γονίδιο της κυττοκερατίνης 18 και γονίδια που κωδικοποιούν µόρια των δοµών συνοχής του επιθηλιακού κυττάρου όπως Claudin, occludin των αποφρακτικών ζωνών, desmoplakin των δεσµοσωµάτων και το χαρακτηριστικότερο από όλα Ε-καντχερίνες της ζώνης πρόσφυσης. (58) Εκτός από το Snail ιδιότητα να επικάθονται στα E-boxes του υποκινητή του γονιδίου της Ε καντχερίνης και να τον αποσιωπούν έχουν και οι µεταγραφικοί παράγοντες Slug, Sip1, Ε12\Ε47 καθώς και ο Εικ.41:κυτταρικοί χαρακτήρες που επηρεάζει το Snail twist. Μέσω του τελευταίου παράγοντα µπορεί και συµµετέχει και το NF-kB στην µοριακή ρύθµιση του ΕΜΤ. (59) (60) ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΟ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ ΤΗΣ ΕΜΤ Η περιήγηση µέσα απο πολύπλοκα σηµατοδοτικά µονοπάτια έθεσε το µοριακό υπόβαθρο του ΕΜΤ. Στο κεφάλαιο, της εργασίας, που ακολουθεί θα παρουσιαστεί το φαινοτυπικό αποτέλεσµα των παραπάνω διεργασιών που οδηγεί το επιθηλιακό κύτταρο να απωλέσει διάφορα στοιχεία που το προσδιορίζουν αποκτώντας ταυτόχρονα χαρακτήρες µεσεγχυµατικού κυττάρου. (εικ.42) Το πρώτο σηµαντικό γεγονός στο οποίο συνίσταται αυτή η τροποποίηση είναι η απώλεια της συνοχής του επιθηλιακού κυττάρου µε τα γειτονικά του. Το αποξενωµένο πλέον κύτταρο πρέπει να αποκτήσει µοριακούς µηχανισµούς αποφυγής του προγραµµατισµένου κυτταρικού θανάτου. Η τροποποίηση του κυτταροσκελετού µε απόκτηση δοµών που δίνουν στο κύτταρο την δυνατότητα κίνησης είναι το δεύτερο σηµαντικό 44

47 γέγονος. Ταυτόχρονα κάνουν την εµφάνισή τους νέες πρωτεϊνες µε δοµικό ρόλο όπως η βιµεντίνη και η Ν καντχερίνη. Πολύ βασικό ζήτηµα στα πλαίσια του ΕΜΤ είναι η έκφραση µεταλλοπρωτεϊνασών που βοήθουν στην αποδόµηση της θεµέλιας ουσίας ανοίγοντας δρόµους στην Εικ. 42 : Φαινοτυπικά αποτελέσµατα µεσεγχυµατικής µετατροπής. διείσδυση του κυττάρου. Επίσης χαρακτηριστική είναι η παραγωγή από το τροποποιηµένο κύτταρο αγγειογενετικών και λεµφαγγειογενετικών παραγόντων µε συµβολή στην νεοαγγειογένεση και νεολεµφαγγειογένεση αντίστοιχα, που εξασφαλίζει τόσο την επιβίωση του καρκίνου όσο και την µετάστασή του. Τέλος θα γίνει αναφορά στον τεράστιο ρόλο της αµφίδροµης αλληλεπίδρασης του τροποποιηµένου καρκινικού κυττάρου µε το ενεργοποιηµένο στρώµα στην διείσδυση του καρκίνου. (26) (61) (62) (63) ΑΠΩΛΕΙΑ ΤΩΝ ΟΜΩΝ ΣΥΝΟΧΗΣ Αποκόλληση κυττάρου-κυττάρου. Τα επιθηλιακά κύτταρα όπως έχει περιγραφεί σε προηγούµενο κεφάλαιο ενώνονται µε τα γειτονικά τους µε την ζώνη πρόσφυσης και τα δεσµοσώµατα. Στις δοµές αυτές τα βασικά µόρια συνοχής είναι οι Ε- καντχερίνες. Η απώλεια αυτών των µορίων θα γίνει µέσα από πέντε µηχανισµούς. Ο πρώτος µηχανισµός είναι η αρνητική ρύθµιση της µεταγραφής τους από µεταγραφικούς παράγοντες µε κύριο τον Snail που σε προηγούµε να κεφάλαια φάνηκε πως είναι ένα τελικό επιτελεστικό µόριο για πολλά από τα σηµατοδοτικά µονοπάτια της ΕΜΤ (εικ.43) 45

48 Εικ. 43 : Επίδραση µεταγραφικών παραγόντων στα E-boxes του γονιδίου της Ε- καντχερίνης Ο δεύτερος µηχανισµός σχετίζεται µε µεταµεταγραφική ρύθµιση των Ε- καντχερινών µε φωσφορυλίωση ή ουβικουϊτίνωση που θα τις οδηγήσει σε αποσταθεροποίηση ή αποδόµηση αντίστοιχα. Μία από αυτές τις περιπτώσεις που διαµεσολαβείται απο το µόριο Src παρουσιάζεται στην εικόνα 44. το Src φαίνεται λοιπόν πως έλεγχει την έκφραση των Ε-καντχερίνών στο κύτταρο µε δύο µηχανισµούς. Καταρχήν ενεργοποιεί το Snail που αναστέλλει την µεταγραφή των Ε- καντχερινών αλλά και τις φωσφορυλιώνει σε συγκεκριµένα αµινοξέα. Αποτέλεσµα αυτού είναι η επικάθηση πάνω στις Ε-καντχερίνες του παράγοντα Hakai ο οποίος βοηθάει στην ενδοκύτωση των καντχερινών ώστε στη συνέχεια να αποδοµηθούν. (29) (51) Εικ. 44 : Μεταµεταγραφική ρύθµιση της ποσότητας των Ε- καντχερινών µεσώ του 46

49 Ο τρίτος µηχανισµός απώλειας των Ε-καντχερινών είναι η ενεργός αποδόµηση τους από πρωτεολυτικά ένζυµα των οποίων η έκφραση πυροδοτείται κατά την ΕΜΤ. (εικ.45) Εικ. 45 : Αποδόµηση των Ε-καντχερινών από πρωτεολυτικά ένζυµα. Ο τέταρτος µηχανισµός σχετίζεται µε την αποσταθεροποίηση του συµπλόκου που δηµιουργούν οι Ε-καντχερίνες µε τις κατενίνες. Ρόλο σε αυτό το µηχανισµό έχει η πρωτεϊνη IQGAP που είναι ένα επιτελεστικό µόριο στο µονοπάτι των RhoGTPσων. (66) Το IQGAP έχει την ιδιότητα να επικάθεται µεταξύ καντχερίνης και κατενίνης και ετσι να αποσταθεροοιεί το σύµπλοκο. (65) (83) Για να συµβεί αυτό πρέπει οι πρωτεϊνες Rac1 και Cdc42 να βρίσκονται στην ανενεργό µορφή τους αδυνατώντας να κρατήσουν δεσµευµένο το IQGAP. Συµµετοχή στην ενεργοποίηση των δύο αυτών µελών των RhoGTPασών έχει ο παράγοντας Tiam-1. Το µονοπάτι του Ras µειώνει την έκφραση αυτού του µορίου ενέργεια λοιπόν που συνεπάγεται σύµφωνα µε τα προηγούµενα αποσταθεροποίηση του συµπλέγµατος καντχερίνηςκατενίνης. Εικ. 46 : IQGAP πώλεια των δοµών συνοχής (εικ.46). 47

50 Ο τέλευταίος µηχανισµός απώλειας των Ε-καντχερινών θα γίνει µέσω καταστολής ή τροποποιηµένης λειτουργίας σηµατοδοτικών οδών που συντελούν στην συντήρηση των δοµών συνοχής. Είναι αποδεδειγµένο πως τα RhoA και Rac1 είναι απαραίτητα για την διατήρηση και διαµόρφωση των δοµών συνοχής που στηρίζονται στις καντχερίνες. Τροποποίηση της δράσης αυτών των µορίων υπό την ύπαρξη, για παράδειγµα ελέυθερης p120 κατενίνης µπορεί να τα οδηγήσει σε δηµιουργία µηχανισµών που οδηγούν σε ενδοκύττωση τις Ε-καντχερίνες. Β κατενίνη Eλεύθερη β κατενίνη θα προκύψει είτε ως αποτέλεσµα απόσπασής της απο το σύµπλοκο µε τους µηχανισµούς που περιγράφηκαν παραπάνω, είτε από αδυναµία να σχηµατίσει σύµπλοκο µε την Ε- καντχερίνη λόγω αναστολής της έκφρασης της τελευταίας συνεπεία µεταγραφικής της ρύθµισης ή µετάλλαξής της συνηθέστερα σχετιζόµενης µε υπερµεθυλίωση του υποκινητή της. (85) Η ελεύθερη β κατενίνη όπως είχε περιγραφεί δηµιουργεί σύµπλοκο µε τις πρωτεϊνες APC, axin GSK και οδηγείται προς αποδόµηση απο το σύστηµα ουβικουϊτινηπρωτεάσωµα. Η σηµατοδότηση από τις Wnt πρωτεϊνες παρεµποδίζει αυτόν τον µηχανισµό αποµάκρυνσης της κατενίνης η οποία καταλήγει στον πυρήνα δεσµευµένη στην οικογένεια µεταγραφικών παραγόντων Tcf\LEF (T cell factor\lymphoid enhancer factor) όπου και επηρεάζει την µεταγραφή γονιδίων. (67) Γονίδια των οποίων η µεταγραφή ενεργοποιείται έχει βρεθεί πως είναι η D-κυκλίνη, ρυθµιστική πρωτεϊνη του κυτταρικού κύκλου, το C-myc, το Jun, η Ν-καντχερίνη και η µατριλυσίνη που ανήκει στις µεταλλοπρωτεϊνασες και έχει σπουδαίο ρόλο στην αποδόµηση του βασικού υµένα και µορίων της θεµέλιας ουσίας. Ο ρόλος της p120 κατενίνης Η p120 είναι µια ακόµα κατενίνη που βρίσκεται στο σύµπλοκο µε τις Ε-καντχερίνες. Αποδόµηση λοιπόν του συµλόκου οδηγεί και αυτή να απελευθερωθεί στο κυτταρόπλασµα. Υπάρχουν πειραµατικές ενδείξεις οτι η p120 µπορεί να δράσει µέσω διαφορετικών σηµατοδοτικών µηχανισµών τόσο πρός την ενίσχυση των δοµών συνοχής όσο και προς την αλλαγή του κυττάρου πρός µεσεγχυµατικό χαρακτήρα. Οι δράσεις αυτές είναι αποτέλεσµα της ισορροπίας µεταξύ της δεσµευµένης του σταθερής µορφής στο σύµπλοκο των καντχερινών και της ελεύθερης µορφής στο κυτταρόπλασµα. Στη σηµατοδότηση αυτή φαίνεται πως 48

51 Εικ 47 : συµµετοχή κατενίνης p120. εµπλέκονται πάλι οι RhoGTPασες. Ο τρόπος που λειτουργεί η p120 που δεν δεσµεύεται στο σύµπλοκο των καντχερινών, είναι η ενεργοποίηση των Rac1και Cdc42 και η παρεµπόδιση της λειτουργίας της RhoA.(68) (69) Με αυτό τον τρόπο αίρεται ο έλεγχος που ασκεί η RhoA στον κυτταροσκελετό µε αποτέλεσµα το κύτταρο να µπορεί να µπεί σε φάση δυναµικής αναδιαµόρφωσης του κυτταροσκελετού του υπο την επίδραση των Rac1 και Cdc42. Όσον αφορά το ρόλο της στην µεταγραφή γονιδίων εµέσως µπορεί να δράσει µέσω της ρύθµισης του µονοπατιού των MAPK από τις RhoGTPασες αλλά και άµεσα αφού έχει βρεθεί η συσχέτισή της µε το µεταγραφικό παράγοντα kaiso που συνεργάζεται µε τον προερχόµενο απο την οδό του Wnt, παράγοντα β κατενίνη\lef στην έκφραση γονιδίων όπως c-fos, cyclin D1, c-myc. (70) (εικ.47) Αποδόµηση των δεσµοσωµάτων Τα δεσµοσώµατα είναι ο πιο ισχυρός δεσµός συνοχής λόγω των µηχανικών ιδιοτήτων του δικτύου κυττοκερατινών. (71) Η αποδόµηση των δεσµοσωµάτων µπορεί να γίνει µέσα απο διεργασίες που περιλαµβάνουν γεγονότα φωσφορυλίωσης. Η φωσφορυλίωση της δοµικής πρωτεϊνης δεσµοπλακίνης, µπορεί να αποτελεί ένα τέτοιο στόχο. (72) Αποκόλληση κυττάρου-βασικού υµένα Στα πλαίσια της ΕΜΤ το επιθηλιακό κύτταρο αποκολλάται από τα γειτονικά του αλλά ταυτόχρονα και από τον βασικό υµένα που το κρατάει σε επαφή µε την εξωκυττάρια θεµέλια ουσία. Η ένωση του κυττάρου µε το βασικό υµένα γίνεται µέσω των focal adhesions και των ηµιδεσµοσωµάτων. Αυτές οι δοµές συνοχής κατασκευαστικά στηρίζονται στις ιντεγκρίνες. (38) Η αποδόµησή τους σχετίζεται άµεσα µε το Src που 49

52 είναι κινάση προερχόµενη απο το σηµατοδοτικό µονοπάτι που ξεκινάει απο τα RTKs. (73) Επιπλέον, ο κοµβικός ρόλος της RhoA στην διαµόρφωση των focal adhesions καθιστά σηµαντική ως προς την αποδόµηση τους την απενεργοποίηση του RhoA απο παράγοντες όπως η ΡΚΑ (protein kinase A). (85) Ο ρόλος της Ν- καντχερίνης Ένα χαρακτηριστικό της ΕΜΤ είναι η εµφάνιση της Ν- καντχερίνης παράλληλα µε την εξαφάνιση των Ε-καντχερινών, γεγονός που είναι πιθανό να συµβαίνει κάτω απο κοινό µεταγραφικό έλεγχο από το Snail. (74) Η Ν-καντχερίνη έχει και αυτή ρόλο στην αυξηµένη διεισδυτική δυναµική του κυττάρου. ύο µηχανισµοί µέσα από τους οποίους έχει φανεί οτι συµβαίνει αυτό είναι καταρχήν οτι η Ν-καντχερίνη ενεργοποιεί τον υποδοχέα FGF χωρίς την παρουσία του αυξητικού παράγοντα µε αποτέλεσµα να ευοδώνει την έκφραση της ΜΜΡ-9. (75) (76) Έπειτα έχει φανεί πως µπορεί να αλληλεπιδρά µε τους ινοβλάστες του στρώµατος συµβάλλοντας έτσι στην κινητικότητα του κυττάρου. Τέλος, η παρουσία Ν-καντχερίνης καθιστά πιο αποτελεσµατική την ενεργοποίηση της οικογένειας RhoGTPασών από την κατενίνη p120. Αυτό συµβαίνει και εξαιτίας του οτι η Ν-καντχερίνη συνδέει λιγότερο σταθερά από την Ε- καντχερίνη την εν λόγω κατενίνη αλλά και επειδή η αύξηση της έκφρασης της Ν-καντχερίνης γίνεται παράλληλα µε την αύξηση έκφρασης της φωσφατάσης RPTPµ που διατηρεί σε ενεργό κατάσταση την p120. (77) (85) (103) ΑΝΑ ΙΑΜΟΡΦΩΣΗ ΤΟΥ ΚΥΤΤΑΡΟΣΚΕΛΕΤΟΥ- ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΚΙΝΗΣΗ Στην πορεία του ΕΜΤ συµβαίνει µια δραµατική αναδιαµόρφωση του κυτταροσκελετού που οδηγεί σε απώλεια της πολικότητας του κυττάρου και σε απόκτηση δοµών (filopodia, lamellipodia) που θα του δώσουν την δυνατότητα της κίνησης. Στα πλαίσια του φαινοµένου αυτού το δίκτυο ινιδίων ακτίνης αποσυντίθεται και ταυτόχρονα άλλες κατασκευές, που στηρίζονται στην ακτίνη, δηµιουργούνται. 50

53 Εικ.48 : Συµµετοχή των RhoGTPases στην αναδιαµόρφωση του κυτταροσκελετού. Όπως έχει προαναφερθεί η όλη διεργασία έχει ένα µοριακό υπόβαθρο όπου δεσπόζει ο ρόλος των RhoGTPασών. Φαίνεται οτι η πρωτεϊνη rho οργανώνει τις stress fibers και τις focal adhesions. Η Cdc42 σχετίζεται µε την δηµιουργία φιλοποδίων και η rac µε την κινητικότητα. Η ενεργοποίηση του µονοπατιού των RhoGTPασών δεν φαίνεται να σχετίζεται µε την ενεργοποίηση της µεταγραφικής δραστηριότητας όπως συµβαίνει µέσω της οδού των MAPK, αλλά µε µόρια που αλληλεπιδρούν άµεσα µε τα ινίδια ακτίνης. (εικ.48) Τα επιτελεστικά µόρια πάνω στα οποία δρούν οι RhoGTPασες περιλαµβάνουν τα Rock, LIM-kinase, ERM (Ezerin-Radixin-Moesin family) καθώς και το Marlin\Schwannomin που φέρει τµήµα που µπορεί να αλληλεπιδρά µε µόρια του κυτταροσκελετού όπως η ακτίνη και από την άλλη µεριά µε διαµεµβρανικά µόρια µε ιδιαίτερο ρόλο στη νέα δυναµική διαµόρφωση του κυττάρου όπως τα CD44, CD43, ICAMs. (78) Το µόριο CD44 ενωµένο µε τον κυτταροσκελετό και υπό την επίδραση των RhoGTPασών διατηρεί έναν σπουδαίο ρόλο στην κυτταρική κίνηση. Ταυτόχρονα όµως το µόριο CD44 έχει µια σπουσαία συµµετοχή στο φαινόµενο ΕΜΤ σε πολλαπλά επίπεδα. Έχει αποκαλυφθεί πως ο υποδοχέας του HGF, c-myc, χρειάζεται την συµβολή του CD44 για να ενεργοποιήσει τις MAPK. Σηµειώνεται επίσης η συµβολή του CD44 στην ενεργοποίηση του υποδοχέα της FGF. Αυτό το πραγµατοποιεί δεσµεύοντας ΜΜΡ-7 εξωκυτταρίως και πρωτεολύοντας µε αυτό τον FGFR που έτσι ενεργοποιείται. (34) Τέλος η ένωσή του µε υαλουρονικό, ινωδόνεκτίνη και κολλαγόνο της θεµέλιας ουσίας καθώς και το γεγονός 51

54 ότι φέρει ΜΜΡ-9 ίσως είναι επικουρικοί παράγοντες της διείσδυσης του καρκινικού κυττάρου. Εκτός απο το δίκτυο ακτίνης ο κυτταροσκελετός απαρτίζεται και από άλλες δοµές. Όσον αφορά τους µικροσωληνίσκους η ρύθµισή τους είναι επιβεβληµένη κατά την ΕΜΤ καθώς η ύπαρξή τους είναι απαραίτητη για την διατήρηση των δοµών συνοχής παρόλο που δεν συµµετέχουν άµεσα στην κατασκευή τους. Τα ενδιάµεσα ινίδια, όπως κυττοκερατίνες, είναι µια άλλη κατηγορία δοµών του κυτταροσκελετού που απαντώνται κυρίως στην κατασκευή των δεσµοσωµάτων. Οι κυττοκερατίνες υφίστανται έντονη ρύθµιση κατά την ΕΜΤ αφού σταδιακά εξαφανίζονται και την θέση τους παίρνει η βιµεντίνη καθώς το κύτταρο αποκτά µεσεγχυµατικό χαρακτήρα. (79) Κυτταρική κίνηση Τα βασικά γεγονότα που συµβαίνουν κατά την µετανάστευση των κυττάρων στην θεµέλια ουσία εξελίσσονται σε διαδοχικά στάδια. Αρχικά η κατεύθυνση του κυττάρου καθοδηγείται απο τον τοπικό πολυµερισµό σε δίκτυο, ινών ακτίνης που ακολουθείται απο την δηµιουργία και έκταση ενός lamellipodium. (5) Εφόσον το προέχον λαµελιπόδι ακουµπίσει σε προσδέτες που βρίσκονται στη θεµέλια ουσία, υποδοχείς τύπου ιντεγκρίνης που συναθροίζονται ενώνονται µε µόρια της θεµέλιας Εικ. 49:Φιλοπόδια 52

55 ουσίας και ταυτόχρονα δεσµεύουν κυτταροπλασµατικές πρωτεϊνες που είναι είτε σηµατοδοτικά µόρια (RhoGTPασες) είτε δοµικα µόρια για την σύνδεση των ιντεγκρινών µε τον κυτταροσκελετό. Οι δοµές που δηµιουργούνται που πλέον ονοµάζονται focal adhesions επανδρώνουν πρωτεάσες επιφανείας όπως MT1-MMP και upa\upar που προκαλούν πρωτεόλυση σε γειτονικές δοµές της θεµέλιας ουσίας ανοίγοντας δρόµο για την κυτταρική µετανάστευση. (80) (81) Το επόµενο βήµα περιλαµβάνει την ένωση των ινιδίων ακτίνης των focal adhesion µε πρωτεϊνες Εικ 50 : lamellipodia- filopodia όπως η µυοσίνη II. Η έλξη των ινιδίων ακτίνης απο την µια πλευρά οδηγεί σε αργό κύλισµα του αντιδιαµετρικού τµήµατος της µεµβράνης προς την αντίθετη κατεύθυνση. (85) (εικ.49, 50). ΑΠΟΦΥΓΗ ΤΟΥ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΤΙΣΜΕΝΟΥ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΘΑΝΑΤΟΥ ΣΕ ΚΑΡΚΙΝΙΚΟ ΚΥΤΤΑΡΟ ΠΟΥ ΥΦΙΣΤΑΤΑΙ ΕΜΤ Το φυσιολογικό επιθηλιακό κύτταρο για να µπορεί να επιβιώνει και να αναπτύσσεται είναι απαραίτητο να βρίσκεται σε άρρηκτο δεσµό µε το περιβάλλον του. Από εκεί θα εξασφαλίζει τόσο την επίδραση των απαραίτητων αυξητικών παραγόντων όσο και την λειτουργία του σηµατοδοτικού µονοπατιού επιβίωσης που ξεκινά µε σήµατα προερχόµενα από την θεµέλια ουσία µέσω ιντεγκρινών. Το κύτταρο που χάνει τις επαφές του µε το περιβάλλον του µπαίνει σε µια διαδικασία προγραµµατισµένου κυτταρικού θανάτου που ονοµάζεται απόπτωση. (Εικ. 51) 53

56 Εικ. 51:Εικόνα κυττάρου κατά την απόπτωση. Η απόπτωση εισήχθει ως όρος απο τον Kerr το Είναι µια διεργασία πολύ βασική κατά την εµβρυογένεση αλλά και σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις. Μορφολογικά και βιοχηµικά είναι διαφορετική από τον κυτταρικό θάνατο. Το κύτταρο κατά κάποιο τρόπο αυτοκτονεί χωρίς να επηρεάσει τα γειτονικά κύτταρα ή να προκαλέσει φλεγµονώδη αντίδραση. Ιστολογικά στοιχεία κυτταρικού θανάτου µε απόπτωση είναι η αποδόµηση της µεµβράνης, η συµπύκνωση της χρωµατίνης, η απώλεια της συνοχής µε τα γειτονικά κύτταρα, η σφαιρική διαµόρφωση και η συρίκνωση. Το κύτταρο που έχει υποστεί απόπτωση αποµακρύνεται απο µακροφάγα. Η απόπτωση θεωρείται αποτέλεσµα της δράσης ενδονουκλεασών και πρωτεασών γνωστών ως κασπάσες. (εικ.52) Υπάρχουν τρείς µηχανισµοί που ενεργοποιούν την αποπτωτική µηχανή. Ο πρώτος χαρακτηρίζεται από την δέσµευση των υποδοχέων θάνατου Fas του κυττάρου οι οποίοι µε τη συµµετοχή της πρωτεϊνης FADD ενεργοποιούν την προκασπάση 8 και αυτή µε της σειρά της την κασπάση 3 που προωθεί την απόπτωση. (89) Επιπλέον η κασπάση 8 Εικ. 52:Κασπάσες. ενεργοποιεί την πρωτεϊνη Bid που συµµετέχει στην απελευθέρωση του κυττοχρώµατος c από το µιτοχόνδριο. Το κυττόχρωµα c οδηγεί σε ολιγοµερισµό την Apaf-1 η οποία ενεργοποιεί την βασική κασπάση της απόπτωσης, την 3. Ο δεύτερος µηχανισµός έχει ως αφετηρία το κυτταρικό στρές που µέσα απο σηµατοδοτικά µονοπάτια οδηγεί το 54

57 µιτοχόνδριο να απελευθερώσει κυττοχρώµα c. Ο τρίτος µηχανισµός έχει να κάνει µε την απώλεια της συνοχής του κυττάρου µε τα γειτονικά του και µε την θεµέλια ουσία. Το ενωµένο µε την θεµέλια ουσία κύτταρο στέλνει σήµατα επιβίωσης µέσω των ιντεγκρινών. (εικ 53) Ο µηχανισµός που ενεργοποιείται σε αυτές τις περιπτώσεις φαίνεται πως είναι η αναστοστολή της δράσης του p53 απο το FAK, η αναστολή του Bax, η ενεργοποίηση υποδοχέων αυξητικών παραγόντων και η ενεργοποίηση του NF-kB. ECM Integrins PI3k Shc Ras activation P53 of VEGF P21 ILK Ras NF-kB EGF Bcl2\Bax Akt\PBK MAPK\ERK1-2 INHIBITION OF APOPTOSIS Εικ. 53:Σηµατοδοτικά µονοπάτια επιβίωσης απο τις ιντεγκρίνες. Τα καρκινικά κύτταρα παρόλο που στα πλαίσια της ΕΜΤ αποκολλώνται από το περιβάλλον τους καταφέρνουν να επιβιώνουν. Αυτό συµβαίνει λόγω ενεργοποίησης σηµατοδοτικών µονοπατιών που εξακολουθούν να στέλνουν σήµατα επιβίωσης. Ένα τέτοιο µονοπάτι είναι το PI3K- ILK- Akt\PKB που ενεργοποιεί το αντιαποπτωτικό µόριο Bcl-2 το οποίο σταθεροποιεί την µεµβράνη των µιτοχονδρίων για να µην Εικ. 54:Μονοπάτια επιβίωσης - απόπτωσης 55

58 απελευθερωθεί κυττόχρωµα c. Επίσης το µονοπάτι απενεργοποιεί µε φωσφορυλίωση την κασπάση 9 και ακόµα απενεργοποιεί µεταγραφικούς παράγοντες που ρυθµίζουν την µεταγραφή πρωτεϊνών σχετιζοµένων µε την απόπτωση. (90) Τέλος, στην αποφυγή της απόπτωσης εµπλέκεται και η ενεργοποίηση του µονοπατιού των MAPKs και πιο συγκεκριµένα των ERKs. Ο µηχανισµός µέσω του οποίου δρά φαίνεται πως είναι η φωσφορυλίωση της πρωτεϊνης BAD η οποία µε αυτό τον τρόπο ενώνεται µε την πρωτεϊνη και αποµακρύνεται απο τα µιτοχόνδρια. Η δράση της πρωτεϊνης BAD είναι το µπλοκάρισµα της αντιαποπτωτικής δράσης του Bcl-2. (86) (87) (88) (εικ. 54) ΕΚΦΡΑΣΗ ΜΕΤΑΛΛΟΠΡΩΤΕЇΝΑΣΩΝ οι µεταλλοπρωτεϊνάσες είναι οικογένεια από τουλάχιστον 20 µέλη εξαιρετικά συντηρηµένων ενδοπεπτιδασών από τις οποίες άλλες παράγονται από τα καρκινικά επιθηλιακά κύτταρα (πχ ΜΜΡ-7) και άλλες από τους ενεργοποιηµένους ινοβλάστες του καρκινικού στρώµατος (πχ ΜΜΡ-11). (93) Είκ. 55:Κατηγορίες µεταλλοπρωτεϊνασών. 56

59 Οι µεταλλοπρωτεϊνασες µαζί µε άλλες πρωτεϊνάσες όπως ADAMs, upa, Heparinases είναι ικανές να αποδοµούν σχεδόν οποιοδήποτε στοιχείο του βασικού υµένα και της θεµέλιας ουσίας. Η ενέργειά τους αυτή σε συνδυασµό µε την συµβολή στην απώλεια των δοµών συνοχής του κυττάρου, στην κυτταρική κίνηση, στην αποφυγή της απόπτωσης, στην ενεργοποίηση αυξητικών παραγόντων και στην νεοαγγειογένεση τα καθιστούν βασικούς ρυθµιστές του ΕΜΤ και σηµαντικά επιτελεστικά µόρια στην διείσδυση και µετάσταση του καρκινικού κυττάρου. (94) (εικ.55) Ρυθµιση των ΜΜΡ Φυσιολογικά η έκφραση των ΜΜΡs είναι χαµηλή και πυροδοτείται στις περιπτώσεις που απαιτείται η παρουσία τους. Η ρυθµισή τους γίνεται σε επίπεδο µεταγραφής ή και µεταµεταγραφικά. (92) Όσον αφορά το επίπεδο της µεταγραφής έχουν βρεθεί δυο περιοχές του υποκινητή των γονιδίων των MMPs που αλληλεπιδρούν µε τους µεταγραφικούς παράγοντες AP-1 και µε το σύµπλοκο β κατενίνη\lef ευοδωτικά αλλά και µε το P53 ανασταλτικά. (91) Οπως έχει παρουσιαστεί σε προηγούµενο κεφάλαιο ο AP-1 είναι µεταγραφικός παράγοντας που ενεργοποιείται στην πορεία του σηµατοδοτικού µονοπατιού της TGFβ, ενώ ο βκατενίνη\lef προέρχεται από Wnt σηµατοδότηση. Η µεταµεταγραφική ρύθµιση των MMPs αποδίδεται κυρίως σε µια οικογένεια πρωτεϊνών, τις TIMPs. Οι TIMPs δεν δρούν απλά ως απενεργοποιητές των ΜΜΡs αλλά έχουν πιο σύνθετο ρόλο αφού πολλες φορές συµµετέχουν και στην ενεργοποίηση τους όπως συµβαίνει µε την ΜΜΡ-2. Η συνύπαρξη των TIMPs µε τα ΜΜΡs στην µεµβράνη των λαµελιποδίων ίσως είναι βασικό γεγονός όσον αφορά την αποδόµηση της θεµέλιας ουσίας. Ρόλος των MMPs στο ΕΜΤ και στην µετανάστευση των κυττάρων Η συµβολή των ΜΜΡs στους µοριακούς µηχανισµούς που ελέγχουν την επιθηλιακή προς µεσεγχυµατική µετατροπή του καρκινικού κυττάρου εντοπίζεται σε πολλαπλά επίπεδα. Όσον αφορά την κυτταρική συνοχή θεωρείται πως το θεµελιώδες φαινόµενο αποδόµησης των Ε-καντχεριών αποδίδεται εν µέρει και στην πρωτεολυτική δράση της ΜΜΡ-3, αλλά και η αποδόµηση του CD44 γίνεται απο την ΜΜΡ-14. Στοιχεία έχουν δείξει πως ακόµα και στην αναδιαµόρφωση του κυτταροσκελετού οι ΜΜΡ µπορεί να έχουν κάποιο ρόλο. Το φαινόµενο της µετανάστευσης του κυττάρου στην θεµέλια ουσία χαρακτηρίζεται απο την έντονη παρουσία των ΜΜΡs. Τα ένζυµα αυτά εντοπισµένα στα λαµελιπόδια όχι µόνο αποδοµούν στοιχεία της θεµέλιας 57

60 ουσίας όπως το κολλαγόνο, τη λαµινίνη-5, το υαλουρονικό ανοίγοντας δρόµο για το κύτταρο και δηµιουργώντας θέσεις πρόσδεσης των ιντεγκρινών αλλά ταυτόχρονα, τµήµατα των αποδοµηµένων µορίων µπορούν να αποτελέσουν χηµειοτακτικούς παράγοντες που έλκουν το κύτταρο. Εικ. 56:Συµµετοχή των ΜΜΡ στην ενεργοποίηση µορίων του στρώµατος κατά την ΕΜΤ Η ενζυµατική δράση των ΜΜΡs είναι επίσης χρήσιµη για την ενεργοποίηση αυξητικών παραγόντων και κυττοκινών όπως οι FGF, IGF, TGF-α που έχουν σηµαίνον ρόλο στην ΕΜΤ. Το άλλο βασικό φαινόµενο στην πορεία της µετάστασης, η νεοαγγειογένεση, είναι επίσης στενά συνυφασµένο µε την δράση των ΜΜΡs. Εκτός από την ίδια την αποδόµηση της θεµέλιας ουσίας που είναι πρωταρχικό ζήτηµα για την έναρξη της αγγειογένεσης, τα MMPs φαίνεται πως εξυπηρτούν και άλλους ρόλους πχ ενεργοποίηση µορίων όπως VEGF και TGF-β απο τη ΜΜΡ-9 µε τη συµβολή των TIMPs. Τέλος, σπουδαία είναι η συµµετοχή των ΜΜΡs και στην αποτροπή της απόπτωσης. (96) Καταρχήν τα ΜΜΡs εκτέµνουν τον υποδοχέα θανάτου FasL καθώς επίσης και το CD-95 εµποδίζοντας την αναγνώριση από τα ΝΚ κύτταρα. Επιπλέον µειώνουν την κυτταροτοξική τους ικανότητα αυτών των κυττάρων µέσω κυττοκινών που προέρχονται απο MMP επεξεργασία (a1 proteinase) ή MMP ενεργοποίηση (IL8). (95) 58

61 ΜΟΡΙΑΚΗ ΣΗΜΑΤΟ ΟΤΗΣΗ ΤΟΥ ΕΜΤ ΚΑΙ ΑΓΓΕΙΟΓΕΝΕΣΗ Ένα ακόµα κρίσιµο για την επιβίωση του καρκινικού κυττάρου φαινοτυπικό αποτέλεσµα του δαιδαλώδους σηµατοδοτικού δικτύου που µπαίνει σε εφαρµογή κατά την ΕΜΤ είναι η δηµιουργία των αγγείων. Η δηµιουργία νέων αγγείων είναι απαραίτητη για την κυτταρική επιβίωση καθώς µεταφέρουν οξυγόνο και θρεπτικά συστατικά στον αναπτυσσόµενο όγκο και ταυτόχρονα αποµακρύνουν τα τοξικά προϊόντα του µεταβολισµού των κυττάρων. Όµως η δηµιουργία των νέων αγγείων προσφέρει στα καρκινικά κύτταρα µια οδό εισόδου στην συστηµατική κυκλοφορία ώστε να µετασταθούν σε αποµακρυσµένους ιστούς. Οι βασικές κυττοκίνες που πυροδοτούν την δηµιουργία αγγείων είναι η οικογένεια VEGF (vascular endothelial growth factor). Μέλη της οικογένειας όπως οι VEGF-C και D σχετίζονται ακόµα και µε την δηµιουργία λεµφαγγείων που επίσης έχουν συµβολή στον επιθετικό, µεταστατικό χαρακτήρα των καρκινωµάτων. (97) (98) (99) (100) Σε πολύ επιθετικούς καρκίνους όπως τα µελανώµατα έχει βρεθεί πως αυτοί οι αυξητικοί παράγοντες µπορούν να συνδέσουν τον όγκο µε την κυκλοφορία χωρίς την παρεµβολή αγγείων αλλά µε ένα φαινόµενο κατασκευής καναλιών γνωστό ως αγγειογενετική µίµηση (vasculogenic mimicry). (είκ.57) Oncogenic receptor pathway (eg EGFR\erbB-2) Tumor cell angiogenic receptor eg. VEGFR-2 Hypoxia Matrix \stroma Endothelial cell. Host cell Production and release of angiogenic Factors and proteases... Proliferation, migration, proteolysis Matrix invasion, colonaisation. invasion \ angiogenesis Εικ. 57:Καρκίνος και νεοαγγειογένεση. Στους σηµατοδοτικούς µηχανισµούς εµφάνισης των νεων αγγείων κοµβικό ρόλο έχει η απώλεια κατασταλτικών µορίων των µονοπατιών που είχαν αναλυθεί σε προηγούµενα κεφάλαια. Τέτοια παραδείγµατα αποτελούν η απώλεια του APC που ελέγχει την επίδραση της β κατενίνης 59

62 στην µεταγραφική µηχανή, η απώλεια του p53 και του ρυθµιστικού µορίου της οδού των PI3K, του PTEN. Υπάρχει πολύ πλούσια βιβλιογραφία σχετικά µε τις κοινές σηµατοδοτικές οδούς ελέγχου του ΕΜΤ και της αγγειογένεσης. Χαρακτηριστικά παραδείγµατα αποτελούν οι σηµατοδτικές οδοί των υποδοχέων αυξητικών παραγόντων (IGF, EFG, PDGF, TGFβ) που µέσω του µονοπατιού Ras-MAPK, του Src και του PI3K-Akt µπορούν να ευοδώσουν την έκφραση αγγειογενετικών κυττοκινών. Επιπλέον ακόµα και η έκφραση ΜΜΡs στα πλαίσια του ΕΜΤ είναι πολύ σηµαντική για την δηµιουργία των νέων αγγείων καθώς µε την ενζυµική τους δραστηριότητα ενεργοποιούν τον VEGF. (101) (102) ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΟ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ ΤΗΣ ΕΜΤ ΣΤΟ ΣΤΡΩΜΑ ΤΩΝ ΚΑΡΚΙΝΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Η µοριακή µηχανή που θα καταλήξει να µετατρέψει το επιθηλιακό κύτταρο σε µεσεγχυµατικό εξυπηρετεί µια σκοπιµότητα, να του δώσει τα εφόδια για να µπορεί να µετακινείται διεισδύοντας στον περιβάλλοντα ιστό. Ο ιστός αυτός δεν είναι άλλος απο το λεγόµενο στρώµα του καρκίνου. Το κύτταρο µετακινούµενο αποδοµεί µε τις µεταλλοπρωτεϊνάσ ες το στρώµα αλλά ταυτόχρονα χρησιµοποιεί τις ίνες Εικ. 58 : Αλληλεπίδραση καρκινικού κυττάρουενεργοποίηµένου ινοβλάστη. του για την προώθηση του. Στην πραγµατικότητα όµως εχει αποκαλυφθεί πως η αλληλεπίδραση στρώµατος καρκίνου είναι κάτι πολύ πιο λειτουργικό. Ο καρκίνος ενεργοποιεί το στρώµα γύρω του και το 60

63 ενεργοποιηµένο στρώµα µε προέχον κύτταρο τον µυοινοβλάστη συµβάλλει στην µοριακή σηµατοδότηση του ΕΜΤ. Η περιήγηση σε αυτή την αµοιβαία αλληλεπίδραση θα ξεκινήσει µε µια εισαγωγική ιστολογική περιγραφή του στρώµατος. Στρώµα Το στρώµα ενός επιθηλιακού καρκίνου είναι ο συνδετικός ιστός που περιβάλλει τα καρκινικά κύτταρα. Μεταξύ του κυττάρου και του στρώµατος δηµιουργείται ο βασικός υµένας που αποτελείται από κολλαγόνο τύπου IV, λαµινίνη και πρωτεογλυκάνες. Ο βασικός υµένας βρίσκεται στενά προσκολληµένος στα υπερκείµενα επιθηλιακά κύτταρα αλλά µε ινίδια αγκυροβολίας ενώνεται και µε τις ίνες κολλαγόνου του υποκείµενου στρώµατος συνδετικού ιστού. Το στρώµα εκτός από την θεµέλια ουσία βρίθει από ίνες και κύτταρα. Η άµορφη µεσοκυττάρια θεµέλια ουσία είναι άχρωµη, διαφανής, οµοιογενής και ιξώδης. Έχει δύο κατηγορίες συστατικών γλυκοζαµινογλυκάνες και γλυκοπρωτεϊνες. Οι γλυκοζαµινογλυκάνες είναι γραµµικοί πολυσακχαρίτες που σχηµατίζονται από επαναλαµβανόµενες µονάδες δισακχαριτών. Αυτοί ενώνονται µε ένα πρωτεϊνικό πυρήνα δηµιουργώντας τις πρωτεογλυκάνες (θειική δερµατάνη, θειική χονδροϊτίνη, θειική κερατάνη και θειική ηπαράνη) που είναι µόρια έντονα υδρόφιλα και ικανά να ενώνονται στις κολλαγόνες ίνες. Οι γλυκοπρωτεϊνες από την άλλη, είναι πρωτεϊνικά µόρια που φέρουν υδατάνθρακες και διατηρούν ρόλο δοµικό. Τέτοια µόρια είναι η ινοσυνδετίνη, η λαµινίνη και η χονδροσυνδετίνη. Οι ίνες που υπάρχουν στο στρώµα είναι τριών ειδών : ίνες κολλαγόνου, δικτυωτές και ελαστικές. Το κολλαγόνο είναι βασική δοµική πρωτεϊνη που δηµιουργεί σταθερότητα στους ιστούς προσφέροντας δύναµη αλλά ταυτόχρονα και ευκαµψία. Υπάρχουν διάφοροι τύποι που έχουν διαφορετική κατανοµή στους ιστούς. Οι δικτυωτές ίνες που αποτελούνται από κολλαγόνο III και γλυκοπρωτεϊνες, δηµιουργούν ένα χαλαρό και εύκαµπτο δίκτυ. Ενώ τέλος οι ελαστικές ίνες αποτελούνται από ελαστίνη και δηµιουργούν ένα ανώµαλο δίκτυ που συνεισφέρει στην ελαστικότητα του στρώµατος. Το στρώµα επιπλέον βρίθει από διάφορα κύτταρα. Άλλα από αυτά παράγονται επιτόπου, όπως οι ινοβλάστες και τα λιπώδη κύτταρα ενώ άλλα µεταναστεύουν από άλλες περιοχές. Ο ινοβλάστης έχει δοµικό ρόλο εφόσον είναι το κύτταρο που συνθέτει τις ίνες και την θεµέλια ουσία. Το λιποκύτταρο είναι µια παρακαταθήκη ενέγειας ενώ τα υπόλοιπα κύτταρα εξυπηρετούν την άµυνα. Τέτοια είναι τα πλασµατοκύτταρα, τα λεµφοκύτταρα και τα ηωσινόφιλα. Τα µακροφάγα είναι άλλα πολύ 61

64 σπουδαία για την άµυνα κύτταρα, ενώ τα σιτευτικά και τα βασεόφιλα έχουν ρόλο στην έκλυση φαρµακολογικά δραστικών ουσίων όπως η ισταµίνη. (4) Ο ρόλος του στρώµατος στην µετανάστευση των καρκινικών κυττάρων. Όπως προαναφέρθηκε τα επιθηλιακά κύτταρα και Tissue integrity το στρώµα τους Normal precancer cancer Normal stroma Cancer stroma INVASION βρίσκονται σε µια λεπτή αλλά αρµονική ισσοροπία που ελέγχεται απο µια πλειάδα εκκρινόµενων αυξητικών παραγόντων, κυττοκινών, πρωτεϊνασών και αναστολέων τους καθώς και πρωτεϊνικών µορίων του στρώµατος. Τα καρκινικά κύτταρα Είκ. 59 : Αλληλεπίδραση στρώµατος-καρκίνου. αλλάζοντας το ρεπερτόριο των παραγόντων αυτών καταλύουν την αρµονική ισσοροπία δηµιουργώντας συνθήκες ενεργοποίησης του στρώµατος. Σε ένα τέτοιο στρώµα συµβαίνουν µια σειρά από σηµαντικά µοριακά γεγονότα. Καταρχήν κάνει την παρουσία του ένα νέο κύτταρο, ο µυοινοβλάστης µε τεράστια λειτουργική σηµασία, έπειτα στο στρώµα προσελκύονται κύτταρα της φλεγµονής που εκκρίνουν µια σειρά από παράγοντες και τέλος δίδεται το έναυσµα για την δοµική αναδιοργάνωση του στρώµατος και για την δηµιουργία νέων αγγείων και λεµφαγγείων. (110) (Εικ. 59) Χαρακτηριστικά µυοινοβλάστη Οι µυοινοβλάστες είναι µεσεγχυµατικά κύτταρα που µοιράζονται χαρακτηριστικά τόσο λείων µυϊκών κυττάρων όσο και ινοβλαστών. Μορφολογικά είναι µεγάλα κύτταρα σχήµατος βελόνας µε ανώµαλο πυρήνα που χαρακτηρίζονται από την ύπαρξη stress fibers. Ανοσοιστοχηµικά η διάκρισή τους στηρίζεται σε δείκτες όπως η α ακτίνη λείων µυικών κυττάρων (α-sma), η βιµεντίνη, η προπυλ 4-υδροξυλάση και στην απουσία κυττοκερατινών. (103) 62

65 Προέλευση µυοινοβλάστη Το ερώτηµα που εγείρεται είναι ποιά είναι η προέλευση αυτών των κυττάρων. Το ζήτηµα αυτό ακόµα και στην πλέον σύγχρονη βιβλιογραφία παραµένει ακόµα αµφισβητήσιµο. Ένα ενδεχόµενο είναι να προέρχονται από λεία µυϊκά κύτταρα ή περικύτταρα της βασικής µεµβράνης των αγγείων. Άλλοι ερευνητές βρήκαν πως στους µυοινοβλάστες εκφράζεται ο δείκτης CD34+ ο οποίος εκφράζεται σε αιµοποιητικά προγονικά κύτταρα. (104) Μια τρίτη περίπτωση είναι οι µυοινοβλάστες να προέρχονται από τα επιθηλιακά κύτταρα, ενώ τέλος η µάλλον επικρατέστερη θεωρία υποστηρίζει πως προγονικά τους κύτταρα είναι οι ινοβλάστες του στρώµατος. (103) Παράγοντες που συντελούν στην δηµιουργία τους Η µετατροπή των ινοβλαστών σε µυοινοβλάστες προκύπτει από την επίδραση κυρίως δύο παραγόντων, του TGF β και του PDGF (platelet derived growth factor). Ο TGF β παράγεται απο τα καρκινικά κύτταρα και τα κύτταρα της φλεγµονής και είναι χηµειοτακτικός παράγοντας για τους ινοβλάστες και βασικός συντελεστής της µεταµόρφωσής τους. Ο PDFG παρόλο που δεν µπορεί να δράσει άµεσα σε αυτή την µετατροπή, ωστόσο η διέγερση παραγωγής TGF β από τα µακροφάγα που προκαλεί και η αναπτυξιακή του δράση για τα µεσεγχυµατικά κύτταρα του προσδίδουν ένα πολύ σηµαντικό ρόλο. Ο TGF β θεωρείται ότι βρίσκεται στο στρώµα σε µια συγκεκαλυµένη ανενεργό µορφή εξαιτίας της ένωσής του µε το σύµπλοκο LTBP1-LAP. Η απελευθέρωση απο το σύµπλοκο µε ανάκτηση της ενεργού µορφής ρυθµίζεται απο τις ΜΜΡ 2 και 9 και απο την ιντεγκρίνη ανβ6. Ο TGF β σε ελεύθερη µορφή συµβάλλει µε πολλαπλούς τρόπους στην εξέλιξη του καρκίνου ενεργοποιώντας το στρώµα, συµβάλλοντας στην αγγειο-λεµφαγγειογένεση, δηµιουργώντας µηχανισµούς επιβίωσης των κυττάρων από την απόπτωση αλλά κυρίως αποτελώντας σε συνεργασία µε το µονοπάτι Ras θεµελιώδη σηµατοδοτικά γεγονότα του ΕΜΤ όπου η αρχική εξωγενής TGF β έκκριση συντηρείται στην πορεία µέσα από αυτοκρινείς αγκύλες. (103) Ρόλος των µυοινοβλαστών Οι µυοινοβλάστες είναι ένα εργοστάσιο παραγωγής µορίων µε πολύ κρίσιµο ρόλο στην προώθηση αλλά και στην πρόκληση του καρκίνου. Στον παρακάτω πίνακα παρουσιάζονται τέτοια µόρια. (106) 63

66 κυττοκίνες Αυξητικοί παράγοντες χυµοκίνες ιαµεσολαβητές φλεγµονής IL-1 TGF β IL-8 P-A2-AP IL-6 CSF-1 MCP-1 PGE2 TNFα GM-CSF GRO-1a Prostacyclin IL-10 PDGF-AA MIP-1a NO PDGF-BB MIP-2 CO bfgf RANTES H2O2 IGF-I ENA-78 IGF-IΙ NGF KGF HGF Wnt-1 Από τα µόρια που παρατίθενται στον πίνακα προκύπτει ο ρόλος του µυοινοβλάστη ως προαγωγού του καρκίνου. Πολλοί απο τους αυξητικούς παράγοντες που είχαν περιγραφεί στην σηµατοδότηση του ΕΜΤ (Wnt1, HGF, FGF) έχουν προέλευση από αυτό το κύτταρο. (107) Επιπλέον µπορεί να παράγει µόρια που έχουν ρόλο στην αγγειογένεση, στην προσέλκυση και ενεργοποίηση κυττάρων της φλεγµονής και στην αναδιαµόρφωση του στρώµατος (ΜΜΡs, u-pa). (105) Ο µυοινοβλάστης µπορεί να έχει ρόλο όχι µόνο προαγωγού του επιθηλιακού καρκίνου αλλά και εκλυτικού αιτίου καθώς καρκινογόνα Soluble factors Cells expressed Responding Possible role cells HGF fibroblasts epithelia + proliferation + transformation + morphogenic IGF fibroblasts Epithelia (breast) - apoptosis + proliferation EGF Epithelia and epithelia + proliferation fibroblasts + morphogenic TGF β Epithelia and Epithelia and - proliferation fibroblasts fibroblasts +\- apoptosis + morphogenic FGF7 fibroblasts epithelia + proliferation + morphogenic IL6 fibroblasts Epithelia (colonic) + proliferation + transformation FGF2 fibroblasts epithelia + proliferation 64

67 + transformation FGF10 fibroblasts epithelia + Proliferation NGF fibroblasts epithelia +Transformation CXCL12 fibroblasts Epithelia + proliferation (glioblastoma) +transformation Wnt1 fibroblasts epithelia + proliferation MMP7, MMP1 fibroblasts ECM and growth factor activation in the stroma and affect epithelia +transformation +\- Proliferation +\- Apoptosis + morphogenic Πίνακας 2 : Κύττάρα που παράγούν αυξήτικούς παράγοντες, κύτταρα που ανταποκρίνονται σε αυτούς και ο ρόλος τους. όπως ακτινοβολία ή ιοί µπορεί πρώτα να µεταλλάσουν τον µυοινοβλάστη και αυτός µε τη σειρά του το επιθηλιακό κύτταρο. Υπάρχουν περιπτώσεις που έχει φανεί πως µεταλλάξεις που αφορούν τους µυοινοβλάστες όπως µεταλλαγµένος υποδοχέας του TGF β ή µεταλλάξεις που οδηγούν σε υπέρµετρη παραγωγή αυξητικών παραγόντων µπορεί στην πραγµατικότητα να είναι το εναρκτήριο γεγονός της καρκινογένεσης. Ακόµα και η τροποποιηµένη παραγωγή µεταλλοπρωτεϊνασών και upa απο το µυοινοβλάστη µπορεί ενεργοποιώντας αυξητικούς παράγοντες ή παράγοντας ενεργοποιηµένα θραύσµατα πρωτεϊνών του στρώµατος (RGDs) να αποτελέσει εκλυτικό αίτιο του καρκίνου. (103) (108) (109) 65

68 ΕΠΙΛΟΓΟΣ Το κύτταρο είναι η πιο περίτεχνη µηχανή µε την έννοια της αρµονίας να διέπει και το τελευταίο µακροµόριο της υπόστασής του. Οι πολύπλοκες λειτουργίες του στηρίζονται σε ένα δαιδαλώδες µοριακό υπόβαθρο όπου πλήθος παραγόντων αλληλεπιδρούν και διαπλέκονται µεταξύ τους συντηρώντας λεπτές ισορροπίες. Μια ελάχιστη παρέκκλιση µπορεί να διαταράξει αυτές τις ισορροπίες µε απρόβλεπτες συνέπειες για το κύτταρο. Η πλέον αδυσώπητη τέτοια συνέπεια είναι η ανταρσία µερικών κυττάρων έναντι του οργανισµού, όπως γλαφυρά θα µπορούσε να περιγραφεί ο καρκίνος. Η επιστήµη βρίσκεται ακόµα µακρυά από το να κατανοήσει πλήρως τα µοριακά γεγονότα που συνθέτουν τον εκτροχιασµό του κυττάρου από τις φυσιολογικές ισορροπίες και φυσικά απο το να παρέµβει για να τις διορθώσει. Ωστόσο ύστερα από µια πορεία δεκαετιών στην έρευνα όπου η κατάκτηση της κατανόησης της δοµής και λειτουργίας των µακροµορίων γεννούσε πολλαπλάσια ερωτήµατα, µικρά λιθαράκια διαρκώς προσθέτονταν. Ο σύγχρονος ερευνητής που επιχειρεί να συµβάλλει σε αυτό τον αγώνα έχει την τύχη να βλέπει µια πιο ολοκληρωµένη εικόνα του πολύπλοκου ψηφιδωτού. Αρωγός στο έργο του είναι η σύγχρονη τεχνολογία και η εύκολη παρακολούθηση της καθηµέρα εξελισσόµενης βιβλιογραφίας ανά τον κόσµο. Η παρούσα εργασία αποτέλεσε µια συνοπτική παρουσίαση της σύγχρονης βιβλιογραφίας που αφορά το κρίσιµο φαινόµενο της µεταµόρφωσης του επιθηλιακού κυττάρου σε µεσεγχυµατικό κατά την πορεία της µετάστασης του καρκίνου. Σκοπός της εργασίας ήταν να θέσει τις βάσεις κατανόησης αυτού του φαινοµένου και παράλληλα να προκαλέσει ερωτήµατα που θα µπορούσαν να είναι αφετηρία µιας ερυνητικής προσπάθειας καθώς το εν λόγω φαινόµενο εξακολουθεί να είναι ελλειπώς τεκµηριωµένο και µε πλήθος ανεξιχνίαστα ζητήµατα. Είναι βέβαιο πάντως πως η κοµβική του θέση στην εξέλιξη της µετάστασης πέρα απο το επιστηµονικό ενδιαφέρον που εγείρει θα µπορούσε να αναδείξει πιθανούς στόχους µιας µελλοντικής µοριακής θεραπευτικής παρέµβασης. 66

69 ABSTRACT Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is a type of epithelial cell plasticity which is characterized by long lasting phenotypic and molecular modifications of the epithelial cell as a result of a transforming procedure leading to a cell of mesenchymal type. This molecular procedure seems to be pivotal for the metastasis of epithelial cancers and its attribution to the epithelial cells is the gain of phenotypic characters which enable them to invade the tissues. EMT apart from metastasis is also an important molecular phenomenon during embryogenesis and inflammation. The target of this project is a scan through the recent bibliography about EMT. Specifically the project s first part is going to present the molecules that induce the phenomenon followed by the activation of the complicated signaling pathways of the cell. These paths which are consisted of nodal molecules lead the sing towards the nucleus where it interacts with transcription factors. The conclusion is the regulation of the transcription of some important genes for the phenotypic alteration of the epithelial cell to a cell with mesenchymal characters. The next subject with which this project is going to deal is the thorough presentation of the alterations of the epithelial cell. These include basically the abolishment of the adherence junctions and the reconstruction of the cytoskeleton with the formation of new structures such as filopodia and lamellipodia which endows the cell with the potential of kinesis. Additionally the transformed cells produce new proteins like N-cadherin and vimentin. They also modify the production of a family of proteins with unique importance for the EMT, the so called metalloproteinases. Moreover the cell which has gone through the impact of EMT phenomenon has the ability to induce neovascular formation and at the same time acquires molecular mechanisms to avoid the programmed cell death, known as apoptosis. Finally the transformed epithelial cell implies a phenotypic modification even to the surrounding stroma of the cancer with which the epithelial cells constitute a functional harmonic unit. From one hand the modification of the stroma activates it and the activated stroma from the other hand implies an intense impact to the most molecular subjects that are related to EMT. Metastasis is a rapid development in the ominous course of cancer. The effort to deceive the molecular basis of this phenomenon is not a subject of simple academic interest since the exploit of the molecular mechanisms so as to gain the control of metastasis could be the bet for a futuristic molecular surgery. Medical faculty of the university of Patras Department of Anatomy A.K. Goulioumis M.D Patras - September

70 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ : - ADAMs : adamalysin related membrane protease - APC : adenomatus poliposi coli - A-SMA : a smooth muscule cell actine - CAMs : cell adhesion molecules - Dvl : disheveled proteins - EGF : epithelial growth factor - ΕΜΤ : epithelial to mesenchymal transition - ERM : ezerin-radixin-moesin family - Erk : extracellular response kinase - FADD : fas associated death domain - FAK : focal adhesion kinase - FRZ : frizzled receptor - FGF : fibroblast growth factor - GEF : guanidine exchange factor - GSK-3-B : glycogen synthase kinase 3β. - HGF\SF : hepatocyte growth factor\scatter factor - ILK : integrin linked kinase - JNK : c-jun kinase - MAPK : mitogen -activated protein kinase - MEKK : MAPK kinases - MLCK : myosin light chain kinase - MMPs : matrix metalloproteinases - MT-MMP : membrane type MMP - PBK : protein kinase B - PDGF : Platelet derived growth factor - PI3K : phosphatidylinositol-3-kinase - PTEN : phosphatase and tensin omologue - R Smads : receptor regulated smads - RTKs : receptors tyrosine kinase - SFKs : Src family kinases - SIP : smad interacting protein - STAT : signal transducer and activator of transcription - TβR : TGF-β receptor - TCF\LEF : T cell factor\ lymphoid enhancer factor - TGF- β : transforming frowth factor-β - Tiam : T lymphoma invasion and metasis protein - TIMPs : tissue inhibito metalloproteinase - TNF-a : tumor necrosis factor a - u\pa : urokinase type plasminogen activator - VEGF : vascular endothelial growth factor 68

71 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Harrison s internal medicine. 15 th edition. 2. Basic pathology. Kumar- Cotran- Robbins 6 th edition. 3. Mechanisms of metastasis. Tri H Nguyen Clinics in dermatology. 2004;22: Basic histology. Junqueira, carneiro, o Kelly. 6 th edition. 5. Molecular cell Biology. Darnel, Lodish, Baltimore. 2 nd edition. 6. The Cell. Alberts 4 th edition. 7. Syndecans in tumor cell adhesion and signaling. D. Beavvais, A. Ropraeger. Reproductive biology and endocrinology 2004;2:3. 8. Peritoneal dialysis and epithelial to mesenchymal transition of mesothelial cells. M. Mo, E. Pezzi, R. Selgas. N Engl J Med Jan 30;348(5): Environmental guidance of normal and tumor cell plasticity. Epithelial- mesenchymal transitions as paradigm. G Prindull, D. Zipori. Blood vol103,no.8,pp Epithelial- mesenchymal transitions in human cancer. V. Marck, M. Bracke Lands Bioscience. 11. Signaling of the transforming growth factor- β family members through Smad proteins. S. Itoh, F. Itoh, M.Goumans. Eur J Biochem Dec;267(24): Review. 12. The TGF-β receptor activation process : an inhibitor- to substate- binding switch. M. Huse. Mol Cell Sep;8(3): Smad- dependent and Smad- independent pathways in TGF-β family signaling. R. Derynch, Y. Zhang. Nature vol A new Smurf in the village. K. Arora, R. Warrior. Dev Cell Oct;1(4): A mechanism of repression of TGF-β\Smad signaling by oncogenic Ras. M. Kretzschmar, J Doody, I. Tinokhina. Genes Dev Apr 1;13(7): MEKK-1, a component of the stress pathway can selectively activate Smad2- mediated transcriptional activation in endothelial cells. J. Brown, M. Dichiara, K. Aderson. J Biol Chem Mar 26;274(13): Inactivation of Smad- transforming growth factor- β signaling by Ca+2- calmodulindependent protein kinase II. S. Wicks, S. Lui, N. Abdel-Wahab. Mol Cell Biol Nov;20(21): Smad regulation in TGF-β signal transduction. A. Moustakas, S. Souchelnytskyi, C. Heldin. J Cell Sci Dec;114(Pt 24): Review Regulation of Smad signaling by protein Kinase C. I. Yakynovych, P. Ten Dijke, C. Heldin. FASEB J Mar;15(3): Epub 2001 Jan Convergence of p53 and TGF-β signaling networks. S. Dupont, L. Zacchigna, M. Adorno. Cancer letters 213 pp TGF-β signaling : positive and negative effects on tumorgenesis. L. Wakefield, A. Roberts. Current opinion in genetics and development 12: TGF-β receptor- activated p38 MAPK mediates Smad- independent TGF-β responses. L. Yu, M. Hebert, Y. Zhang. EMBO J Jul 15;21(14): Evidence for a role of JNK cascade in Smad &- mediated apoptosis. A. Mazars. J Biol Chem Sep 28;276(39): Epub 2001 Jul C-Jun associates with the oncoprotein Ski ans suppresses Smad 2 transcriptional activity. 69

72 M. Pessah. J Biol Chem Jul 11;278(28): Epub 2003 May The transforming growth factor- β signaling pathway in tumorgenesis. R. Wieser. Current opinion in oncology 13: Leaving the neighborhood : molecular mechanisms involved during epithelialmesenchymal transitions. P. Savagner. Bioessays 23: Src and Ras are involved in separate pathways in epithelial cell scattering. B. Boyer, S. Roche, M. Denoyelle. EMBO J Oct 1;16(19): The catalytic activity of the Src family kinases is required to disrupt cadherin dependent cell- cell contacts. D. Owens, G Wyke, A paraskeva. Mol Biol Cell Jan;11(1): Newest findings on the oldest oncogen: how activated Src does it. M. Frame. J Cell Sci Mar 1;117(Pt 7): Review. 30. Invasive growth : a genetic programme. A. Gentile, P. Conoglio. Int.j.dev.biol.48: Hepatocyte growth factor\scatter factor- induced intracellular signaling. K. Stuart, S. Riordan, S. Lidder. J. exp. Path 81, CD44 cell adhesion molecules. S. Goodison, V. Urquidi, D. Tarin. J. clin. Pathol: mol. Pathol. 52:189: The hyaluronan receptor CD44. C. Isake, H. Yarwood. The international journal of biochemistry & cell biology. 34 pp The role of the CD44\ezerin complex in cancer metastasis. T. Martin, G. Harrison, R. Mansel. Critical reviews in oncology\hematology vol.46 iss.2 pp Mitogenic signal transduction by integrin and growth factor receptor- mediated pathways. J. Lee, R. Juliano. Mol.cells vol.17,no.2,pp Adhesion molecules in biology and oncology. Z. Lukas, K. Dvorac. Acta vet.brno 73: FAK regulates biological processes important for the pathogenesis of cancer. V Necko, M. Schaller, J. Dunty. Cancer and metastasis reviews 22: Focal adhesion : structure and dynamics. V. Petit, J. Thiery. Biology of the cell 92: Phosphoinositide-3-OH kinase- dependent regulation of glycogen synthase kinase 3 and protein kinase B\Akt by the ILK. M. Delcommenne, C. Tan, V. Gray. Proc Natl Acad Sci U S A Sep 15;95(19): Inhibition of ILK suppresses activation of protein kinase B\Akt and induces cell cycle arrest and apoptosis of PTEN- mutant prostate cancer cells. S. Persad, S. Attwell. Proc Natl Acad Sci U S A Mar 28;97(7): Snail induction of epithelial to mesenchymal transition in tumor cells is accompanied by MUCI repression and ZEB1 expression. S. Guaita, I. Puig, C. Franci. J Biol Chem Oct 18;277(42): Epub 2002 Aug The role of integrin- linked kinase (ILK) in cancer progression. S. Persad, S. Dedhor. Cancer and metastasis Reviws 22: Wnt signaling in mammalian development and cancer. M. Smalley, T. Dale. Cancer and metastasis reviews 18: Cell adhesion and the integrin- linked kinase regulate the LEF-1 and β catenin signaling pathways. A. Novak, S. Hsu, G. Radeva. Proc Natl Acad Sci U S A Apr 14;95(8): Wnt 1 and HGF regulate GSK3 β activity and β catenin signaling in mammary epithelial cell. J. Papkoff, M. Aikowa. Biochem Biophys Res Commun Jun 29;247(3): Transcriptional repression due to high levels of wingless signaling. X. Yu, J. Piese, S. Eresh. Genes Dev Jul 15;16(14):

73 47. The induction of ret by Wnt-1 in Pc12 cells is atypically dependent on continual wnt expression. S. Zhend, B. Ranachandran, J. Haigh. Oncogene Feb 1;12(3): Increased expression of fibroblasts growth factor 8 in human breast cancer. S. Marsh, G. Banusal, C. Zmmit. Oncogene Jan 28;18(4): Ras and RhoGTPases : A family reunion. A. Sagi, A. Hall. Cell, vol.103, Oncogenic Ras and its role in tumor cell invasion and metastasis. P. Campbell, C. Der. Seminars in cancer biology 14: Integrin signaling during tumor progression. W. Guo, F. Giancotti. Nature. Vol Phosphatidylinositol 3 kinases in tumor progression. D. Roymans, H. Slegers. Eur. J. biochem. 268, Tumor progression : small GTPases and loss of cell- cell adhesion. E. Lozano, M betson, V. Braga. Bioessays 25: Regulation of RhoGTPases by p120- catenin. P. Anastasiadis, A. Reynalds. Current opinion in cell biology 13: Role of MAP kinase in tumor progression and invasion. K. Reddy, S. Nobka, N. Atanaskova. Cancer and metastasis Reviews 22: Regulation of cell motility by mitogen- activated protein kinase. R. Klenke, S. Cai, A. Giannini Unraveling signaling cascades for the Snail family of transcription factors. B. De Craene, F. Van Roy, G. Brex. Cellular signaling 17: transcriptional regulation of cadherins during development and carcinogenesis. H. Peinado, F. Portillo, A. Cano. Int j. dev. Boil. 48: Epithelial- mesenchymal transitions : twist in development and metastasis. Y. Hang, J. Massague. Cell, vol.118, Tumor metastasis : a new twist on epithelial- mesenchymal transitions. A. Vernon, C. La Bonne. Current biology, vol.14: Molecular aspects of epithelial cell plasticity : implications for local tumor invasion and metastasis. J. Gotzmann, M. Mikula, A Eger. Mutation research 566, Epithelial- mesenchymal transitions in development and pathologies. J. Thiery. Current opinion in cell biology 15: Induction and regulation of epithelial- mesenchymal transitions. B. Boyer, A. Valles, N. Edne. Biochemical; pharmacology vol. 60 pp Regulation of cadherin adhesive activity. B. Gubiner. J Cell Biol Feb 7;148(3): Review. 65. Cadherin and catenin alterations in human cancer. K. Hajra, E. Fearon. Genes, chromosomes & cancer 34: Rho family GTPases in cadherin mediated cell- cell adhesion. M. Fukata, K. Kaibuchi. Nat Rev Mol Cell Biol Dec;2(12): Review. 67. Wnt signaling and cancer. Polakis. Genes Dev Aug 1;14(15): Review. 68. p120 catenin regulates the actin cytoskeleton via Rho family GTPases. N. Noren, B. Liu, K. Burridge. J Cell Biol Aug 7;150(3): Inhibition of RhoA by p120. P.Anastasiadis, S. Moon, M. Thoreson. Nat Cell Biol Sep;2(9): The catenin p120 interacts with kaiso a novel BTB\POZ domain zinc finger transcriptional factor. J. Daniel, A Reynolds. Nucleic Acids Res Jul 1;30(13): Desmosomes : intercellular adhesive Junctions specialized for attachment of intermediate filaments. A. Kowatczyk, E. Bornslaeger, S. Norvell. Int Rev Cytol. 1999;185: Review. 71

74 72. Phosphorylation of the desmoplakin COOH terminus negatively regulates its interaction with keratin intermediate networks. T Stappenbeck, J Lamb, C. Corcoran. J Biol Chem Nov 25;269(47): PTEN interactions with focal adhesion kinase and suppression of the extracellular matrixdependent phosphatidylinositol 3-kinase\Akt cell survival pathway. M. Tamura, J Gu, E. Danen. J Biol Chem Jul 16;274(29): N- cadherin promotes motility in human breast cancer cells regardless of their E- cadherin expression. J Cell Biol Nov 1;147(3): A signaling pathway leading to metastasis is controlled by N- cadherin and the FGF receptor. K. Suyama, I. Shapiro, M. Guttman. Cancer Cell Oct;2(4): Changing neighbours, changing behavior : cell adhesion molecule- mediates signaling during tumor progression. G. Christofori. EMBO journal vol.22 no 10 pp PTPnu regulates N- cadherin- development neurite growth. S. Burden, S. Brady ERM proteins in cell adhesion and membrane dynamics. P. Mangeat, C Roy, M. Martin. Trends Cell Biol May;9(5): Review. 79. Rearrangements of desmosomal and cytoskeletal proteins during the transition from epithelial to fibroblastoid organization in cultured rat bladder carcinoma cells. B. Boyer, G. Tucker, A. Valles. J Cell Biol Oct;109(4 Pt 1): Prespecification and plasticity: Shifting mechanisms of cell migration. P. friedl. Current opinion in cell biology 16: Compensation mechanisms in tumor cell migration : mesenchymal- amoebois transition after blocking of pericellular proteolysis. K. Wolf, I. Mazo, H. Leung Cadherin- mediated cellular signaling. M. Wheelock, K. Johnson. Current opinion in cell biology 15: The role of E- cadherin- catenin complex : more than an intercellular glue? K. Harington, K. Syrigos. Annals of surgical oncology 7(10): Cell adhesion in tumor invasion and metastasis : loss of the glue is not enough. U. Cavallaro, G. Christofori. Biochimica et biophysica acta 1552 (2001) Clinical, cellular and molecular aspects of cancer invasion. M. Mareel, A. Icroy. Physiol.rev 83: Apoptosis in tumorgenesis and cancer therapy. G. McGill, D. Fisher. Frontiers in bioscience 2,pp: Extracellular matrix proteins and receptors in apoptosis Bad a heterodimeric partner for Bcl-xc and Bcl-2 displaces Bax and promotes cell death. E. Yang, J. Zha, J. Jochel. Cell Jan 27;80(2): Cell Jan 27;80(2): FADD a novel death domain- containing protein interacts with the death domain fas and initiates apoptosis. A. Chinnaiyan, K. O Rourhe, M. Tewari. Cell May 19;81(4): The PI3K\Akt signaling pathway delivers an antiapoptotic signal. S. Kennedy, A. Wagner, S. Conzen. Genes Dev Mar 15;11(6): P53 down regulate human matrix metalloproteinase. Y. Sun, L. Wenger, J. Rutter Matrix metalloproteinases : molecular aspects of their roles in tumor invasion and metastasis. S. Curran, G. Murray. European journal of cancer 36: A novel metalloproteinase gene specifically expressed in stromal cells of breast carcinoma. P. Basset, J. Bellocq, C. Wolf Tumor invasion and matrix metalloproteinases. 72

75 M. Polette, B. Raby, C. Gilles. Critical reviews in oncology\hematology. Vol 49, issu. 3 pp Extracelluler matrix remodeling : the role of matrix metalloproteinases. I. Stamenkovic. J.of pathology 200: trends in molecular medicine vol. 9.no Multiple roles of matrix metalloproteinases during apoptosis. F. Mannello, F. Lucketti, E. Falcieri. Apoptosis 10: Lymphatic vasculature : development, molecular regulation and role in tumor metastasis and inflammation. P. Saharikon, J. Tammela, M. Karhhainen. Trends in immunology vol.25 no Lymphatic function, lymphangiogenesis and cancer metastasis. M. Swartz, M. Shobe. Microscopy research and technique 55: Development of the lymphatic vascular system : a mystery unravels. Y. Hong, J. Shin, M. Detnar. Developmental dynamics vol. 231, issu. 3 pp Lymphangiogenesis and its role in cancer. M. Al-Rawi, R. Mansel, N. Jiang. Novartis found symp. 256: Parallels in invasion and angiogenesis provide pivotal points for therapeutic intervention. S. Ecceles. Int j. dev. Boil. 48: The extracellular matrix : a new turn- of the screw for anti- angiogenic strategies. L. Sanz, L. Alvorez. Trends Mol Med Jun;9(6): Role of tissue stoma in cancer invasion. O. De Wever, M. Mareel. Journal of pathology. 200: CD34+ fibrocytes in neoplastic and inflammatory pancreatic lesions. P. Borth, S. Ebrahinsade, A. Hellinger. Virchows Arch Feb;440(2): Inflammation and cancer. L. Coussens, Z. Werb. Nature. Vol Myofibroblast. Paracrine cells important in health and disease. D. Powell, R. Mifflin, J. Valentick. Am. J. physiol.277: Know thy neighbor : stomal cells can contribute oncogenic signals. T. Tisty, P. Hein. Current opinion in genetics and development 11: Fried or Foes- Bipolar effects of the tumor stroma in cancer. M. Mueller, N. Fusening. Nature reviews cancer 4, Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. N. Bhownick, E. Neilson, H. Moses. Nature. Vol The microenvironment of the tumor- host interface. L. Liotta, E. Kohn. Nature. Vol

76 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ- ΠΑΤΡΑ ΣΕΠΤΕΜΒΡΗΣ 2005 ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΣ Κ. ΓΟΥΛΙΟΥΜΗΣ a_k_goulioumis@hotmail.com