ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ «Ιατρική Ερευνητική Μεθοδολογία»

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ «Ιατρική Ερευνητική Μεθοδολογία» «Μελέτη των αλληλεπιδράσεων των ενδοθηλιακών κυττάρων ανθρώπου με την λαμινίνη σε διεργασίες προσκόλλησης» ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΑ Λ. ΤΟΠΟΥΡΙΔΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2008

2 ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ: Επιβλέπων: ΚΟΛΙΑΚΟΣ Γ. Αναπληρωτής καθηγητής, εργαστήριο Βιολογικής Χημείας, Ιατρική σχολή, Α.Π.Θ. ΚΑΛΟΓΙΑΝΝΗ Μ. Καθηγήτρια τμήματος Βιολογίας, εργαστήριο Φυσιολογίας Ζώων, Τομέας ζωολογίας, Α.Π.Θ. ΠΑΛΕΤΑΣ Κ. Αναπληρωτής καθηγητής, εργαστήριο μεταβολικών νοσημάτων, Α Παθολογική κλινική, Ιπποκράτειο Νοσοκομείο Θεσσαλονίκης Η παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο Βιολογικής Χημείας της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης 2

3 Για την επίτευξή της βοήθησαν τα μέλη της τριμελούς επιτροπής και κυρίως ο κ. Κολιάκος, τα μέλη του εργαστηρίου Βιολογικής Χημείας και κυρίως η Βιοχημικός και υποψήφια διδάκτωρ Κωστίδου Έλενα καθώς και ο ιατρός και επιστημονικός συνεργάτης Δανιηλίδης Άγγελος από τη Γ Γυναικολογική-Μαιευτική Κλινική του Ιπποκρατείου Νοσοκομειου Θεσσαλονίκης. Τους ευχαριστώ όλους θερμά για την πολύτιμη προσφορά τους. ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ σελ.6 ΕΙΣΑΓΩΓΗ σελ.7 1. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα σελ.7 2. Τα μονοκύτταρα του αίματος σελ.8 3. Η εξωκυττάρια ουσία, η βασική μεμβράνη και οι λαμινίνες _σελ.8 Η εξωκυττάρια ουσία σελ.8 Η βασική μεμβράνη σελ.9 Οι λαμινίνες σελ.9 4. Η αθηρομάτωση σελ.10 Εισαγωγικά σελ.10 Διαφοροποίηση μονοκυττάρων στον υπενδοθηλιακό χώρο - σελ.11 Στρατολόγηση μονοκυττάρων και δενδριτικών κυττάρων σε προχωρημένα στάδια αθηροσκλήρωσης σελ.12 Μηχανισμοί σχηματισμού αφρωδών κυττάρων σελ.13 Αφρώδη κύτταρα και σχηματισμός νεκρωτικών πυρήνων _σελ.15 3

4 5. Η αλληλεπίδραση των ενδοθηλιακών κυττάρων με τα μονοκύτταρα του αίματος σελ Τα μόρια προσκόλλησης που μεσολαβούν στην αλληλεπίδραση των ενδοθηλιακών κυττάρων με τα μονοκύτταρα του αίματοςσελ.17 Σελεκτίνες σελ.18 Ιντεγκρίνες σελ.19 Υπεροικογένεια ανοσοσφαιρινών σελ Το μόριο προσκόλλησης ICAM-1 σελ.22 Δομή σελ.22 Ρύθμιση σελ.23 Λειτουργία σελ.25 Παθολογία και Θεραπεία σελ Η οξείδωση στην αθηρωμάτωση σελ Τα ενδοθηλιακά κύτταρα και το οξειδωτικό στρες στην αθηρωμάτωση σελ.27 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ σελ.29 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ σελ Απομόνωση και καλλιέργεια ενδοθηλιακών κυττάρων σελ Απομόνωση μονοκυττάρων σελ Οξείδωση της λαμινίνης σελ Προσκόλληση ενδοθηλιακών κυττάρων σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης σελ Έκφραση του μορίου προσκόλλησης ICAM-1 από ενδοθηλιακά κύτταρα προσκολλημένα σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης σελ Προσκόλληση μονοκυττάρων σε υπόστρωμα προσκολλημένων σε οξειδωμένη ή μη οξειδωμένη λαμινίνη ενδοθηλιακών κυττάρων σελ.32 4

5 7. Στατιστική ανάλυση σελ.33 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ σελ Προσκόλληση ενδοθηλιακών κυττάρων σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης σελ Έκφραση του μορίου προσκόλλησης ICAM-1 από ενδοθηλιακά κύτταρα προσκολλημένα σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης σελ Προσκόλληση μονοκυττάρων σε υπόστρωμα προσκολλημένων σε οξειδωμένη ή μη οξειδωμένη λαμινίνη ενδοθηλιακών κυττάρων σελ. 35 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ σελ.36 ΣΥΖΗΤΗΣΗ σελ.37 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ σελ.41 5

6 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η προσκόλληση των μονοκυττάρων και των ενδοθηλιακών κυττάρων στην εξωκυττάρια ουσία έχει συνδεθεί με την αθηροσκλήρωση. Επίσης, η οξείδωση των πρωτεϊνών της εξωκυττάριας ουσίας, ως αποτέλεσμα της δράσης των ελευθέρων ριζών, επιδρά στις αλληλεπιδράσεις τους με τα κύτταρα. Με δεδομένο ότι η λαμινίνη αποτελεί βασικό συστατικό της βασικής μεμβράνης, μελετήθηκε η επίδραση της οξείδωσής της στην προσκόλληση ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων πάνω σε αυτή. Επιπρόσθετα, έχοντας υπ όψη ότι τα ενδοθηλιακά κύτταρα εκφράζουν το μόριο προσκόλλησης ICAM-1 στην κυτταρική τους επιφάνεια, διερευνήθηκε η έκφραση του ICAM-1 από ενδοθηλιακά κύτταρα που προσκολλώνται σε οξειδωμένη λαμινίνη ή στη μη οξειδωμένη της μορφή. Τέλος, μιας και το μόριο προσκόλλησης ICAM-1 συμβάλλει στην προσκόλληση των μονοκυττάρων στο ενδοθήλιο, εξετάστηκε εάν η οξείδωση της λαμινίνης επιδρά στην προσκόλληση των μονοκυττάρων στα ενδοθηλιακά κύτταρα, τα οποία είναι ήδη προσκολλημένα πάνω σε αυτή. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα απομονώθηκαν από ομφάλιους λώρους, ενώ τα μονοκύτταρα από δείγματα αίματος. Η διερεύνηση της προσκόλλησης των ενδοθηλιακών κυττάρων στην οξειδωμένη ή μη οξειδωμένη λαμινίνη πραγματοποιήθηκε σε πλάκα τύπου ELISA με τη βοήθεια του Hemacolor staining kit, το οποίο βάφει το DNA των κυττάρων. Επίσης, η έκφραση του μορίου προσκόλλησης ICAM-1 από ενδοθηλιακά κύτταρα, τα οποία ήταν προσκολλημένα σε οξειδωμένη ή μη οξειδωμένη λαμινίνη, μελετήθηκε με τη μέθοδο ανοσοενζυμομέτρησης ELISA, χρησιμοποιώντας αντίσωμα που αναγνωρίζει το ICAM-1. Τέλος, η προσκόλληση των μονοκυττάρων στα ενδοθηλιακά κύτταρα, τα οποία ήταν προσκολλημένα σε οξειδωμένη ή μη οξειδωμένη λαμινίνη, εξετάστηκε σε πλάκα τύπου ELISA με τη μέθοδο της μυελοϋπεροξειδάσης. Τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας έδειξαν ότι τα ενδοθηλιακά κύτταρα προσκολλώνται περισσότερο στην οξειδωμένη μορφή της λαμινίνης και ότι τα ενδοθηλιακά κύτταρα που προσκολλώνται στην οξειδωμένη λαμινίνη εκφράζουν το μόριο προσκόλλησης ICAM-1 σε μεγαλύτερο ποσοστό, συγκριτικά με τα ενδοθηλιακά κύτταρα που προσκολλώνται στη μη οξειδωμένη της μορφή. Τέλος, τα μονοκύτταρα του αίματος προσκολλώνται περισσότερο σε ενδοθηλιακά κύτταρα, τα οποία έχουν προσκολληθεί σε υπόστρωμα οξειδωμένης λαμινίνης. Συμπεραίνουμε λοιπόν ότι η οξείδωση των πρωτεινών της εξωκυττάριας ουσίας, στην περίπτωσή μας της λαμινίνης, επηρεάζει την αλληλεπίδρασή τους με τα ενδοθηλιακά κύτταρα και συμβάλλει στην αυξημένη προσκόλληση των μονοκυττάρων του αίματος σε αυτά. Δηλαδή, η οξείδωση της λαμινίνης του υπενδοθηλιακού χώρου συμβάλλει στην ενισχυση των πρώτων σταδίων της αθηροσκλήρωσης. Με δεδομένη την εμπλοκή του παράγοντα NFkB στους μηχανισμούς ρύθμισης έκφρασης του μορίου προσκόλλησης ICAM-1, η παρούσα πειραματική εργασία θα μπορούσε να ολοκληρωθεί στο μέλλον με τη μελέτη της έκφρασης του παράγοντα NFkB και του μορίου προσκόλλησης ICAM-1 σε επίπεδο mrna. Τέλος, για μια πιο ολοκληρωμένη εικόνα της συμβολής τροποποιήσεων της εξωκυττάριας ουσίας στην αλληλεπίδρασή της με τα ενδοθηλιακά κύτταρα, θα βοηθούσε η επανάληψη των πειραμάτων σε υπόστρωμα οξειδωμένου και μη οξειδωμένου κολλαγόνου IV, το οποίο αποτελεί ακόμα μια άφθονη πρωτεΐνη της εξωκυττάριας ουσίας. 6

7 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα ενδοθηλιακά κύτταρα Τα ενδοθηλιακά κύτταρα (Εικόνα 1) προέρχονται από τα πρόδρομα ενδοθηλιακά κύτταρα, τα οποία παράγονται στο μυελό των οστών και βρίσκονται στην κυκλοφορία του αίματος μέχρι να διαφοροποιηθούν και να σχηματίσουν το ενδοθήλιο. Το ενδοθήλιο είναι μια συνεχής στιβάδα κυττάρων, η οποία χωρίζει την κυκλοφορία του αίματος από το τοίχωμα των αγγείων. Είναι ένας δυναμικός ιστός και ελέγχει σημαντικές λειτουργίες, όπως η διατήρηση της κυκλοφορίας και ρευστότητας του αίματος καθώς και η ρύθμιση της πήξης του αίματος και φλεγμονωδών αποκρίσεων (Gonzalez and Selwyn, 2003). Εικόνα 1. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα. (Αριστερά: αναπαράσταση in vivo, Δεξιά: καλλιέργεια ενδοθηλιακών κυττάρων από αρτηρία ανθρώπου). Το ενδοθήλιο αντιδρά σε αλλαγές της ροής του αίματος και των δυνάμεων διατμητικής τάσης, φωσφορυλιώνοντας τη συνθάση του μονοξειδίου του αζώτου (eνοs). Μετά την ενεργοποίηση της eνοs, παράγεται μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ. ) και τελικά επέρχεται αγγειοδιαστολή. Με τον τρόπο αυτό, το ενδοθήλιο ανταποκρίνεται και προσαρμόζεται σε αλλαγές της κυκλοφορίας και ρευστότητας του αίματος. Επιπρόσθετα, το ενδοθήλιο περιορίζει τη θρόμβωση τοπικά, παράγοντας ενεργοποιητές του πλασμινογόνου, διατηρώντας μια αρνητικά φορτισμένη επιφάνεια και εκκρίνοντας ηπαράνες και θρομβοδουλίνες (Behrendt and Ganz, 2002). Τέλος, το ενδοθήλιο διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην πρόκληση της αθηροσκλήρωσης, ιδιότητα που αποτελεί αντικείμενο μελέτης της παρούσας εργασίας. 7

8 Τα μονοκύτταρα του αίματος Ένα άλλο είδος κυττάρων που συμμετέχει στην πρόκληση της αθηροσκλήρωσης είναι τα μονοκύτταρα (Εικόνα 2). Πρόκειται για λευκά κύτταρα του αίματος (αντιπροσωπεύουν το 3 με 8% των λευκοκυττάρων) που αποτελούν κύριο συστατικό του ανοσοποιητικού συστήματος του ανθρώπου. Προστατεύουν τον οργανισμό μας από παθογόνα, που μεταφέρονται με την κυκλοφορία του αίματος, και κινούνται γρήγορα (σε διάστημα περίπου οκτώ με δέκα ωρών) προς σημεία μόλυνσης των ιστών. Διακρίνονται εύκολα στο μικροσκόπιο, εξαιτίας του μεγάλου πυρήνα τους. Παράγονται στο μυελό των οστών από πρόδρομα αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα, που ονομάζονται μονοβλάστες. Τα μονοκύτταρα παραμένουν στην κυκλοφορία για μία με τρεις ημέρες και στη συνέχεια μεταφέρονται σε άλλους ιστούς. Εκεί, ωριμάζουν και μετατρέπονται σε διάφορους τύπους μακροφάγων. Εικόνα 2. Η δομή ενός μονοκυττάρου. Τα μονοκύτταρα είναι υπεύθυνα για τη φαγοκύττωση ξένων ουσιών που εισέρχονται στο σώμα μας. Αυτό το επιτυγχάνουν είτε έμμεσα, καλύπτοντας το παθογόνο με ενδιάμεσες πρωτεΐνες (αντισώματα ή πρωτεΐνες συμπληρώματος), είτε άμεσα, με απευθείας σύνδεσή τους στο παθογόνο μέσω υποδοχέων. Τα μονοκύτταρα μπορούν επίσης να καταστρέφουν μολυσμένα κύτταρα, μέσω αντισωμάτων, ιδιότητα γνωστή ως κυτταροτοξικότητα. Τέλος, τα μονοκύτταρα, όπως είδαμε, είναι υπεύθυνα για την προστασία των ιστών από ξένες ουσίες. Ταυτόχρονα, όμως, εμπλέκονται και στα πρώτα στάδια της αθηροσκλήρωσης (Bobryshev, 2006), ιδιότητα προς την οποία στρέφεται το ενδιαφέρον της παρούσας εργασία. Είναι γνωστό ότι τα μονοκύτταρα αλληλεπιδρούν με το ενδοθήλιο των αγγείων για να περάσουν στον υπενδοθηλιακό χώρο. Στην ενίσχυση της αλληλεπίδρασης αυτής είναι πιθανό να συμβάλλουν τροποποιήσεις κάποιων συστατικών της εξωκυττάριας ουσίας, όπως της λαμινίνης. Η εξωκυττάρια ουσία, η βασική μεμβράνη και οι λαμινίνες Η εξωκυττάρια ουσία Η εξωκυττάρια ουσία είναι μια τρισδιάστατη κατασκευή, η οποία περιβάλλει και διαχωρίζει τα συστατικά των περισσότερων ιστών, καθορίζει τη δομή τους και αλληλεπιδρά με τα περισσότερα κύτταρα (Engel, 1992). 8

9 Η βασική μεμβράνη Η βασική μεμβράνη αποτελεί έναν ειδικό σχηματισμό της εξωκυττάριας ουσίας που αποτελείται από ένα λεπτό στρώμα πρωτεϊνών και πρωτεογλυκανών στο οποίο επικάθεται το βασικό τμήμα των επιθηλιακών και ενδοθηλιακών κυττάρων. Οι βασικές μεμβράνες όχι μόνο προσφέρουν μηχανική υποστήριξη, αλλά επηρεάζουν επίσης και τη συμπεριφορά του κυττάρου. Τα κύρια μοριακά συστατικά των βασικών μεμβρανών είναι το κολλαγόνο τύπου IV, οι πρωτεογλυκάνες και οι γλυκοπρωτεΐνες. Μεταξύ των γλυκοπρωτεϊνών πιο κοινές είναι οι λαμινίνες (Engel, 1992). Οι λαμινίνες Οι λαμινίνες είναι μια οικογένεια που αποτελείται από τουλάχιστον έντεκα μεγάλες (μοριακού βάρους Daltons) ετεροτριμερείς γλυκοπρωτεΐνες της βασικής μεμβράνης. Αλληλεπιδρούν κυρίως με ιντεγκρίνες (διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που εκφράζονται από τα κύτταρα ως αβ ετεροδιμερή και περιέχουν θέσεις σύνδεσης για την αλληλουχία RGD της λαμινίνης, Decker, 2000), αλλά έχει ανακαλυφθεί ότι υποδοχείς τους αποτελούν και οι δυστρογλυκάνες σε μυϊκά και επιθηλιακά κύτταρα καθώς επίσης και οι μη ιντεγκρινικοί υποδοχείς που αναγνωρίζουν το πεπτίδιο YIGSR (Engel, 1992). Η λαμινίνη-ι απομονώθηκε από τον όγκο Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) και είναι η καλύτερα χαρακτηρισμένη λαμινίνη. Υπάρχει ως δομή με σχήμα ασύμμετρου σταυρού που αποτελείται από τις αλυσίδες α1, β1 και γ1 (Εικόνα 3). Μέχρι σήμερα έχουν αναγνωρισθεί πέντε α, τρεις β και τρεις γ αλυσίδες. Εικόνα 3. Το μόριο της λαμινίνης-ι αποτελείται από τις αλυσίδες α1, β1 και γ1 και έχει τη μορφή ασύμμετρου σταυρού. Πέρα από το δομικό ρόλο της λαμινίνης-ι, έχουν αναφερθεί πολλές βιολογικές δραστηριότητές της. Η λαμινίνη-ι συμμετέχει στην ανάπτυξη των νευριτών, στη συσσωμάτωση των αιμοπεταλίων, στη θρομβογένεση (Hill-Bator A. and Opolski A., 2002), στην εμβρυική ανάπτυξη (Miner J.H. et al, 1997), στην αγγειογένεση, στην προσκόλληση φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων καθώς και στη μετάσταση καρκινικών κυττάρων (Kleinman H.K. et al, 1993 και Timpl R. and Brown J.C., 1994). 9

10 Στο εργαστήριο Βιολογικής Χημείας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης έχει ήδη μελετηθεί η συμβολή τροποποιήσεων της λαμινίνης (καρβονυλίωση) στην αλληλεπίδρασή της με τα μονοκύτταρα του αίματος στο διαβήτη (Kostidou et al, 2007). Είναι πιθανό λοιπόν, με παρόμοιο τρόπο, τροποποιήσεις της λαμινίνης (οξείδωση) να επηρεάζουν την αλληλεπίδρασή της με τα ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων και να συμβάλουν στην πρόκληση της αθηρομάτωσης. Η αθηρομάτωση Εισαγωγικά Η αθηροσκλήρωση είναι υπεύθυνη για τους μισούς θανάτους στο δυτικό κόσμο και γι αυτό αποτελεί μια από τις κυριότερες προκλήσεις που αντιμετωπίζει η ιατρική στις μέρες μας (Poston and Johnson-Tidey, 1996). Πρόκειται για μια χρόνια ανοσο-φλεγμονώδη ασθένεια, στην οποία πραγματοποιείται αλληλεπίδραση μεταξύ των μονοκυττάρων του αίματος και του ενεργοποιημένου ενδοθηλίου των αγγείων. Η αλληλεπίδραση αυτή είναι καίριας σημασίας και οδηγεί σε περαιτέρω αλλαγές στον έσω χιτώνα του αγγείου (Bobryshev, 2006). Σε γενικές γραμμές κατά την εξέλιξη της νόσου, τα μονοκύτταρα μεταναστεύουν προς τον υπενδοθηλιακό χώρο, όπου διαφοροποιούνται σε μακροφάγα και δενδριτικά κύτταρα (Εικόνα 4) (Bobryshev, 2005). Εικόνα 4. Στην αθηροσκλήρωση τα μονοκύτταρα του αίματος ρολάρουν επάνω στο ενδοθήλιο του αγγειακού τοιχώματος, αλληλεπιδρούν με τα ενδοθηλιακά κύτταρα και προσκολλώνται πάνω σε αυτά. Στη συνέχεια, μεταναστεύουν προς τον υπενδοθηλιακό χώρο, όπου διαφοροποιούνται σε μακροφάγα και δενδριτικά κύτταρα. Στον υπενδοθηλιακό χώρο, όπου υπάρχουν αθηρογενετικές λιποπρωτεΐνες (Williams and Tabas, 2005), η πλειοψηφία των μακροφάγων μετατρέπεται σε αφρώδη κύτταρα (Ross, 1993). Τα αφρώδη κύτταρα συναθροίζονται σχηματίζοντας τον αθηρωματικό πυρήνα και καθώς εξελίσσεται η διεργασία αυτή, τα αθηρωματικά κέντρα των πλακών γίνονται νεκρωτικά, αποτελούμενα από λιπίδια, κρυστάλλους χοληστερόλης και κυτταρικά υπολλείματα (Takahashi et al, 2002). 10

11 Από τις προαναφερθείσες διεργασίες, στην παρούσα εργασία εστιάσαμε το ενδιαφέρον μας στην προσκόλληση των μονοκυττάρων του αίματος επάνω στα ενδοθηλιακά κύτταρα, βήμα σημαντικό για τον σχηματισμό της αθηρωματικής πλάκας. Έτσι το πρώτο στάδιο της αθηρομάτωσης περιγράφεται αναλυτικά σε επόμενη ενότητα παρακάτω («Η αλληλεπίδραση των ενδοθηλιακών κυττάρων με τα μονοκύτταρα του αίματος στην αθηρομάτωση»). Ακολουθεί η περιγραφή των διεργασιών μετά την είσοδο των μονοκυττάρων στον υπενδοθηλιακό χώρο. Διαφοροποίηση των μονοκυττάρων στον υπενδοθηλιακό χώρο Από τη στιγμή που τα μονοκύτταρα βρεθούν στον υπενδοθηλιακό χώρο, διαφοροποιούνται σε μακροφάγα, τα οποία χαρακτηρίζονται από συνεχώς αυξανόμενο αριθμό κυστιδίων, πρωτογενών και δευτερογενών λυσοσωμάτων. Η διαφοροποίηση συνοδεύεται από μια συνεχώς αυξανόμενη έκφραση του αντιγόνου CD68, το οποίο εντοπίζεται στα λυσοσώματα. Ο κύριος ρυθμιστής της διαφοροποίησης in vitro φαίνεται να είναι ο αποικιοδιεγερτικός παράγοντας των μακροφάγων (M-CSF, Macrophage Colony-Stimulating Factor). Ο πληθυσμός των μακροφάγων στις πρώιμες αθηροσκληρωτικές βλάβες είναι ετερογενής. Η πλειοψηφία των μακροφάγων συσσωρεύουν λιπίδια στο κυτταρόπλασμά τους και μετατρέπονται σε αφρώδη κύτταρα. Υπάρχουν και μακροφάγα, τα οποία δε μετατρέπονται σε αφρώδη κύτταρα, εξαιτίας πιθανών προστατευτικών μηχανισμών ενάντια στη συσσώρευση λιπιδίων στο κυτταρόπλασμά τους. Η συνεισφορά αυτών των μακροφάγων στην πορεία της αθηροσκλήρωσης δεν είναι πλήρως κατανοητή. Τα μονοκύτταρα που διεισδύουν στον υπενδοθηλιακό χώρο μπορούν να διαφοροποιηθούν και σε δενδριτικά κύτταρα, τα οποία είναι τα κατεξοχήν αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα. Τα κύτταρα αυτά εμπλέκονται σε ασυνήθιστα μεγάλης διάρκειας κυτταρικές διεργασίες, οι οποίες βοηθούν στο σχηματισμό συνεχών κυτταρικών δικτύων (Millonig et al, 2001). Η διαφοροποίηση των μονοκυττάρων σε μακροφάγα ή σε δενδριτικά κύτταρα εξαρτάται από τις συνθήκες στο μικροπεριβάλλον τους. Πιο συγκεκριμένα, από το περιεχόμενό του σε κυτοκίνες και την ισορροπία μεταξύ του αποικιοδιεγερτικού παράγοντα των μακροφάγων (M-CSF, Macrophage Colony-Stimulating Factor) και του αποικιοδιεγερτικού παράγοντα των πολυμορφοπύρηνων/μακροφάγων (GM-CSF, Granulocyte/Macrophage Colony-Stimulating Factor) (Lotze and Thomson, 2001). Τα μακροφάγα και τα δενδριτικά κύτταρα, μαζί με τα Τ λεμφοκύτταρα, τα οποία μεταναστεύουν από την κυκλοφορία στον υπενδοθηλιακό χώρο, αποτελούν τον λεγόμενο λεμφοειδή ιστό, ο οποίος συνδέεται με τον αγγειακό (VALT, Vascular- Associated Lymphoid Tissue). Ο ιστός αυτός παρέχει ανοσολογική επιτήρηση του αρτηριακού τοιχώματος (Wick et al, 2004). Στις περιοχές με προδιάθεση για αθηροσκλήρωση, πέρα από το λεμφοειδή ιστό που συνδέεται με τον αγγειακό (VALT), συσσωρεύονται και άλλα κύτταρα, τα οποία φαίνεται να προέρχονται από κύτταρα του αίματος, αλλά έχουν πολύ διαφορετική μορφή από τα ήδη γνωστά κύτταρα που εναποτίθενται στα τοιχώματα των αγγείων (Εικόνα 5). Για παράδειγμα, σε αντίθεση με τα μακροφάγα, στο κυτταρόπλασμα αυτών των κυττάρων το δίκτυο των λυσοσωμικών κυστιδίων δεν είναι αναπτυγμένο. Επίσης, τα συσσωματώματα αυτά εξαφανίζονται καθώς η πρώιμη αθηροσκληρωτική βλάβη εξελίσσεται σε αθηρωματική πλάκα. 11

12 Εικόνα 5. Συσσωματώματα αγνώστων κυττάρων (συμβολίζονται με?) σε περιοχές ανθρώπινων αρτηριών με προδιάθεση για αθηρομάτωση. Απεικονίζεται η πιθανή προέλευση των κυττάρων αυτών καθώς και η σύνδεση των συσσωματωμάτων με τα δενδριτικά κύτταρα (συμβολίζονται με αστεράκι). LDC=Low Differentiated Cell, E=Ενδοθηλιακό κύτταρο. Στρατολόγηση μονοκυττάρων και δενδριτικών κυττάρων σε προχωρημένα στάδια αθηροσκλήρωσης Σε ανεπτυγμένες αθηροματικές πλάκες σχηματίζονται ινώδη καλύμματα, ώστε να διαχωρισθούν οι νεκρωτικοί πυρήνες. Στα καλύμματα αυτά εντοπίζονται λίγα μόνο μακροφάγα, δενδριτικά κύτταρα και Τ λεμφοκύτταρα. Τα δενδριτικά κύτταρα και τα Τ λεμφοκύτταρα βρίσκονται στις περιοχές νεοαγγειοποίησης (neovascularisation) των ανεπτυγμένων πλακών, οι οποίες αντιπροσωπεύουν την έλευση του vasa vasorum στην πλάκα (Εικόνα 6). Τα μονοκύτταρα εισέρχονται στην πλάκα μέσω της νεοαγγειοποίησης (Bobryshev and Lord, 1998). 12

13 Εικόνα 6. Σχηματική αναπαράσταση της κατανομής των δενδριτικών κυττάρων (DC, μαύρα αστεράκια) και των Τ-λεμφοκυττάρων (πράσινοι κύκλοι) σε ανεπτυγμένες αθηροματικές πλάκες. Και τα δύο είδη κυττάρων εντοπίζονται στις περιοχές νεοαγγειοποίησης. Η περιοχή γύρω από τα νέα αγγεία συχνά περιέχει δενδριτικά κύτταρα, τα οποία έρχονται σε επαφή με Τ λεμφοκύτταρα και μακροφάγα (Εικόνα 7), σηματοδοτώντας πιθανώς την έναρξη ανοσολογικής απόκρισης στην περιοχή αυτή (Bobryshev and Lord, 1998). Τα μακροφάγα που περιβάλλουν τα νέα αγγεία εκφράζουν τον όξινο αυξητικό παράγοντα των ινοβλαστών (afgf-1, acidic Fibroblast Growth Factor). Ο βαθμός συσσώρευσης των κυττάρων φλεγμονής στις ανεπτυγμένες πλάκες σχετίζεται με την έκφραση της καδερίνης VE (VE-cadherin) στα νέα αγγεία. Παρεμπόδιση της έκφρασης της καδερίνης VE σχετίζεται με την εξάντληση της ακεραιότητας των ενδοθηλιακών κυττάρων των νέων αγγείων. Η παρεμπόδιση της έλευσης του vasa vasorum στην πλάκα αποτελεί θεραπευτική προσέγγιση, με στόχο την παρεμπόδιση της εισόδου προαφρωδών κυττάρων και τη μετέπειτα πορεία της αθηρωματικής πλάκας. Εικόνα 7. Στις περιοχές νεοαγγειοποίησης τα δενδριτικά κύτταρα (μάυρο) αλληλεπιδρούν με Τ-λεμφοκύτταρα (ρόζ) και με μακροφάγα (κίτρινο). Μηχανισμοί σχηματισμού αφρωδών κυττάρων Τα μακροφάγα, ως απάντηση στο μικροπεριβάλλον της πλάκας, εσωτερικεύουν και μεταβολίζουν πολλά υπενδοθηλιακά συστατικά. Μελέτες in vitro έδειξαν ότι τροποποιημένες λιποπρωτεΐνες, όπως οι οξειδωμένες LDL και οι β-vldl, επάγουν τα μακροφάγα να εισάγουν λιπίδια (Williams and Tabas, 2005). Οι τροποποιημένες λιποπρωτεΐνες συλλαμβάνονται από τα μακροφάγα μέσω πολλών και διαφορετικών υποδοχέων-περισυλλεκτών (scavenger receptor). Οι υποδοχείς αυτοί χαχρακτηρίζονται από πολλές διακριτές δομές και αναγνωρίζουν μια ποικιλία πολυανιονικών προσδεμάτων, συμπεριλαμβανομένων των οξειδωμένων LDL. Μελέτες in vitro και in vivo έδειξαν ότι δύο τέτοιοι υποδοχείς, ο SR-A και ο CD36, προσλαμβάνουν την οξειδωμένη LDL και έτσι αποτελούν τον κύριο μηχανισμό σχηματισμού αφρωδών κυττάρων (Εικόνα 8) (Febbraio et al, 2000). Άλλες 13

14 πρόσφατες μελέτες αναφέρουν ότι διαφορετικοί μηχανισμοί συμβάλλουν στη συσσώρευση εστέρων χοληστερόλης από τα μακροφάγα in vivo (Moore et al, 2005). Εικόνα 8. Τα μακροφάγα στο περιβάλλον της αθηροματικής πλάκας προσλαμβάνουν οξειδωμένες LDL, εστέρες χοληστερόλης και άλλα λιπίδια και μετατρέπονται σε αφρώδη κύτταρα. Μετά την πρόσληψή τους από τα μακροφάγα, οι οξειδωμένες LDL και οι β- VLDL, μεταφέρονται με κυστίδια στα λυσοσώματα. Αρχικά, η αποθηκευμένη στα μακροφάγα χοληστερόλη είναι σε μορφή εστέρων σε κυτταροπλασματικά σταγονίδια λίπους, τα οποία συνδέονται στην κυτταρική μεμβράνη. Τα αφρώδη κύτταρα σε ανθρώπινες αρτηρίες εμφανίζουν ετερογένεια, με μερικά να περιέχουν κυτταροπλασματικά σταγονίδια λίπους, τα οποία συνδέονται στην κυτταρική μεμβράνη, ενώ κάποια άλλα να χαρακτηρίζονται από κυτταροπλασματικά σταγονίδια λίπους, τα οποία δε συνδέονται στην κυτταρική μεμβράνη. Στα κύτταρα αυτά δεν αποδομείται όλη η ποσότητα της οξειδωμένης LDL στα λυσοσώματα (Bobryshev, 2005). Στα αρχικά στάδια της αθηροσκλήρωσης, είναι πιθανή η έξοδος μερικών αρφωδών κυττάρων από την πλάκα προς την κυκλοφορία του αίματος, ενώ σε προχωρημένα στάδια, όταν σχηματίζεται το ινώδες κάλυμμα, η έξοδος μπορεί να συμβεί συμπτωματικά. Επίσης, έχει αναφερθεί και η έξοδος των δενδριτικών κυττάρων προς την κυκλοφορία του αίματος. Σε αντίθεση με τα μακροφάγα, τα δενδριτικά κύτταρα σπάνια συσσωρεύουν λιπίδια στο κυτταρόπλασμά τους και η μεταναστευτική τους ικανότητα είναι αξιοσημείωτη (Lotze and Thomson, 2001). Η μαζική απελευθέρωση αφρωδών κυττάρων, σταγονιδίων λίπους, κρυστάλλων χοληστερόλης και κυτταρικών υπολειμμάτων στην κυκλοφορία του αίματος συμβαίνει κατά τη ρήξη της πλάκας. Η παθοφυσιολογική σημασία αυτού του γεγονότος δεν έχει όμως ακόμη διευκρινισθεί. Ο μετασχηματισμός των μακροφάγων σε αφρώδη κύτταρα επηρεάζεται από πολλούς παράγοντες, μεταξύ των οποίων και ο ρόλος της Chlamydia pneumoniae (Byrne and Klayoglu, 1999). Πράγματι, το κυτταρόπλασμα αφρωδών κυττάρων σε ανθρώπινες αθηρωματικές πλάκες, πέρα από σταγονίδια λίπους, περιέχει και δομές που προσομοιάζουν με διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια της Chlamydia pneumoniae. 14

15 Στην επιτάχυνση του μετασχηματισμού των μακροφάγων σε αφρώδη κύτταρα εμπλέκονται επίσης και αυτοάνοσα σύμπλοκα. Πολλές πρόσφατες μελέτες υπογραμμίζουν το ρόλο πολλών κυτοκινών, των υποδοχέων PPAR (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor) και διαφόρων γονιδίων, που κωδικοποιούν για υποδοχείς λιποξυγενασών και λευκοτριενίων, στο σχηματισμό τους (Rader and apaure, 2005 και Shashkin et al, 2005). Έχει βρεθεί ότι η πρόσληψη οξειδωμένης χοληστερόλης από τα μακροφάγα επάγει την έκφραση των υποδοχέων PPAR-γ στα κύτταρα αυτά (Babaev et al, 2005) και ότι η ενεργοποίηση των υποδοχέων αυτών καταστέλλει την ωρίμανση των δενδριτικών κυττάρων, παρεμποδίζοντας έτσι ανοσολογικές αποκρίσεις (Luo et al, 2004). Αφρώδη κύτταρα και σχηματισμός νεκρωτικών πυρήνων Από τα πρώτα στάδια της αθηροσκλήρωσης τα αφρώδη κύτταρα σχηματίζουν συσσωματώματα, με κάποιο μηχανισμό, ο οπίος δεν είναι πλήρως κατανοητός (Εικόνα 9). Τα αφρώδη κύτταρα εκφράζουν έντονα την Ε-καδερίνη πριν τη συσσωμάτωση, ικανότητα την οποία χάνουν όταν συσσωματώνονται (Bobryshev et al, 1998). Οι αλλαγές στην έκφραση της καδερίνης ελέγχουν τις μορφολογικές αλλαγές των συσσωματωμάτων, το πότε δηλαδή θα σχηματιστούν ή θα αποδομηθούν. Εικόνα 9. Κατά την εξέλιξη της αθηροσκλήρωσης τα αφρώδη κύτταρα σχηματίζουν συσσωματώματα, τα οποία αποτελούν τη βάση του αθηροματικού πυρήνα. Η έντονη συσσωμάτωση των αφρωδών κυττάρων οδηγεί στο σχηματισμό του αθηροματικού πυρήνα. Στο κεντρικό τμήμα του πυρήνα, τα κύτταρα αυτά οδηγούνται σε απόπτωση και παρατηρείται συγκέντρωση εξωκυτταρικών λιπιδίων καθώς και κυτταρικών υπολειμμάτων. Η απόπτωση των αφρωδών κυττάρων επάγεται από πολλά μονοπάτια μεταγωγής σημάτων, στα οποία εμπλέκονται το μονοξείδιο του αζώτου, η p53, το σύστημα Fas/Fas ligand και οι οξυστερόλες που παράγονται από την οξείδωση (Natarajan and Cai, 2005). Ο θάνατος των αφρωδών κυττάρων, βάσει μιας διαφορετικής θεωρίας, μπορεί να οφείλεται στη νέκρωση και όχι στην απόπτωση (Bobryshev et al, 2001). 15

16 Καθώς μεγαλώνει η πλάκα, γύρω από το νεκρωτικό πυρήνα συσσωρεύονται ολοένα και περισσότερα αφρώδη κύτταρα, αλλά και μακροφάγα. Και τα δύο είδη κυττάρων παράγουν και απελευθερώνουν μεταλλοπρωτεϊνάσες, οι οποίες συμβάλλουν στην καταστροφή της πλάκας. Μάλιστα, η παρουσία των μακροφάγων στην περιοχή αυτή αποτελεί δέικτη αστάθειας των αθηροματικών πλακών (Moreno et al, 1994). Ο ρόλος των μακροφάγων και των αφρωδών κυττάρων στην αποσταθεροποίηση και ρήξη της πλάκας έχει αποτελέσει αντικείμενο μελέτης πολλών ερευνητών (Boyle 2005, Li and Glass, 2002). Η αλληλεπίδραση των ενδοθηλιακών κυττάρων με τα μονοκύτταρα του αίματος στην αθηρομάτωση Στο προ-αθηροσκληρωτικό στάδιο πολλά κύτταρα του αίματος, κυρίως μονοκύτταρα και Τ λεμφοκύτταρα, προσκολλώνται στο ενδοθήλιο των αγγείων με προδιάθεση. Η συνεχώς αυξανόμενη προσκόλληση των κυττάρων αυτών στο ενδοθήλιο αποτελεί γνώρισμα των πρώιμων σταδίων της αθηροσκλήρωσης (Wick et al, 2004). Σύμφωνα με την τροποποιημένη υπόθεση της «απάντησης στη βλάβη», που συμβαίνει στην αθηροσκλήρωση (Ross, 1993), κάποιες βλάβες στο ενδοθήλιο ή το ενδοθηλιακό στρες οδηγούν στην προσκόλληση των μονοκυττάρων σε αυτό και τη μετέπειτα μετανάστευσή τους στον έσω χιτώνα των αγγείων (Εικόνα 10). Εικόνες ηλεκτρονικού μικροσκόπιου έδειξαν ότι τα ενδοθηλιακά κύτταρα σε τέτοιες περιοχές εμφανίζουν μεγάλο αριθμό μικροκυστιδίων στο κυτταρόπλασμά τους. Χαρακτηρίζονται δηλαδή από αυξημένη μεταφορά ουσιών μεταξύ τους και επομένως ενεργοποιούνται. Η αυξημένη διαπερατότητα του ενδοθηλίου στο στάδιο αυτό οδηγεί στη συσσώρευση λιποπρωτεϊνών, κυρίως των LDL, στον έσω χιτώνα των αγγείων. Στο σημείο αυτό και σύμφωνα με μελέτες σε ανθρώπους και σε πειραματόζωα, οι λιποπρωτεΐνες υφίστανται τροποποίηση (Williams and Tabas, 2005). Εικόνα 10. Στα πρώιμα στάδια της αθηροσκλήρωσης, βλάβες στο ενδοθήλιο των αγγείων προσελκύουν μονοκύτταρα από την κυκλοφορία του αίματος, ώστε να προσκολληθούν στις θέσεις αυτές. 16

17 Η προσκόλληση των μονοκυττάρων στα ενδοθηλιακά κύτταρα και η μετέπειτα μετανάστευσή τους υποβοηθείται από μόρια προσκόλλησης που βρίσκονται στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων (Quehenberger, 2005). Η προσάραξη και το ρολάρισμα των μονοκυττάρων στην ενδοθηλιακή στιβάδα μεσολαβείται από σελεκτίνες. Η δυνατή προσκόλλησή τους όμως πραγματοποιείται με την αλληλεπίδραση ιντεγκρινών με τα προσδέματά τους, τα μόρια προσκόλλησης ICAM-1 και VCAM-1. Περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τα μόρια προσκόλλησης αναφέρονται στην επόμενη ενότητα. Στην κυκλοφορία του αίματος οι ιντεγκρίνες που εκφράζονται από τα μονοκύτταρα χαρακτηρίζονται από χαμηλή συγγένεια προς τα προσδέματά τους. Υπό την επίδραση όμως χυμοκινών, η κατάσταση αντιστρέφεται. Παρομοίως, στα ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα εκφράζονται συνεχώς σελεκτίνες και ιντεγκρίνες, σε αντίθεση με τα ενδοθηλιακά κύτταρα σε περιοχές χωρίς αθηροσκληρωτικές βλάβες. Πολλοί χημειοεκλυτικοί παράγοντες και κυτοκίνες ρυθμίζουν την προσκόλληση των μονοκυττάρων στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Μερικοί από αυτούς είναι οι εξής: η χημειοεκλυτική πρωτεΐνη των μονοκυττάρων-1 (MCP-1, Monocyte Chemoattractant Protein-1), ο αποικιοδιεγερτικός παράγοντας των μακροφάγων (M- CSF, Macrophage Colony-Stimulating Factor), αποικιοδιεγερτικός παράγοντας των πολυμορφοπύρηνων/μακροφάγων (GM-CSF, Granulocyte/Macrophage Colony- Stimulating Factor), η μεταναστευτική πρωτεΐνη φλεγμονής-1 (MIP-1, Migratory Inflammatory Protein-1), ο παράγοντας TNF-α (Tumor Necrosis Factor-α), ο μετασχηματίζων μεταγραφικός παράγοντας (TGF-β, Transforming Growth Factor-β) και η ενδοθηλίνη-1 (ET-1, Endothelin-1) (Daugherty et al, 2005). Τα μονοκύτταρα στην κυκλοφορία ενεργοποιούνται από πολλές προ-φλεγμονώδεις κυτοκίνες, όπως οι ιντερλευκίνες IL-1, -6, -8, -10 και -12 και ο παράγοντας TNF-α, που παράγονται απο τα κύτταρα του έσω χιτώνα των αγγείων ως απάντηση στη διέλευση των λιποπρωτεϊνών. Η οξειδωμένη LDL ενεργοποιεί άμεσα τα μονοκύτταρα και επάγει τη μετανάστευσή τους προς το τοίχωμα των αγγείων. Τα ενεργοποιημένα μονοκύτταρα «ρολάρουν» επάνω στα ενδοθηλιακά κύτταρα και προσκολλώνται σε αυτά που ενεγοποιήθηκαν από σήματα προερχόμενα από τον έσω χιτώνα των αγγείων. Στις περιοχές όπου υπάρχει επαφή μεταξύ μονοκυττάρων και ενδοθηλιακών κυττάρων, τα ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα εκφράζουν πολλούς αυξητικούς παράγοντες και αγγειοδραστικές ουσίες, όπως το μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ), η ενδοθηλίνη-1 και οι αγγειοτασίνες Ι και ΙΙ. Οι ουσίες αυτές ρυθμίζουν τις προσκολλητικές ιδιότητες του ενδοθηλίου (Daugherty et al, 2005). Μετά την προσκόλληση, τα μονοκύτταρα μεταναστεύουν προς τον υπενδοθηλιακό χώρο. Τα μόρια προσκόλλησης PECAM-1 (Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1) και JAM-A (Junctional Adhesion Molecule-A) συγκεντρώνονται στους συνδέσμους μεταξύ των ενδοθηλιακών κυττάρων και παρουσιάζονται στα μονοκύτταρα (Ostermann et al, 2005). Τα μόρια αυτά συνδέονται με τα μονοκύτταρα που μεταναστεύουν και τα βοηθούν να διασχίσουν το ενδοθήλιο, διεργασία που ονομάζεται διαπίδυση. Τα μόρια προσκόλλησης που μεσολαβούν στην αλληλεπίδραση των ενδοθηλιακών κυττάρων με τα μονοκύτταρα του αίματος Σε καταστάσεις φλεγμονής, όπως αυτή της αθηρωμάτωσης, παρατηρούνται πολλές διακυτταρικές αλληλεπιδράσεις. Τα λευκοκύτταρα αλληλεπιδρούν με άλλα λευκοκύτταρα, με ενδοθηλιακά κύτταρα, με λεία μυικά κύτταρα, με την εξωκυττάρια 17

18 ουσία και με διάμεσα κύτταρα. Οι πρωτεΐνες οι οποίες συμμετέχουν στις αλληλεπιδράσεις ονομάζονται μόρια προσκόλλησης και ανήκουν σε τέσσερις οικογένειες: των σελεκτινών, των προσδεμάτων των σελεκτινών, των ιντεγκρινών και των ανοσοσφαιρινών (Harlan and Liu, 1992 και Springer, 1994). Ο κύριος ρόλος των μορίων προσκόλλησης είναι να προωθούν τη στρατολόγηση των λευκοκυττάρων από την κυκλοφορία του αίματος προς τον υπενδοθηλιακό χώρο. Η διαδικασία αυτή περιλαμβάνει τα εξής στάδια: το «ρολάρισμα» των λευκοκυττάρων επάνω στην ενδοθηλιακή στιβάδα, τη σταθερή προσκόλληση και ενεργοποίησή τους και τη διαπίδυσή τους στον υπενδοθηλιακό χώρο (Εικόνα 11). Εικόνα 11. Κατά την είσοδο των μονοκυττάρων του αίματος στον υπενδοθηλιακό χώρο αλληλεπιδρούν με τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η αλληλεπίδραση γίνεται σε τέσσερα στάδια, καθένα από τα οποία μεσολαβείται από διαφορετικά μόρια προσκόλλησης. Σελεκτίνες Το «ρολάρισμα» των λευκοκυττάρων μεσολαβείται κυρίως από σελεκτίνες και προσδέματα σελεκτινών (Kansas, 1996). Η σελεκτίνη Ρ εκφράζεται από ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα και αιμοπετάλια, η σελεκτίνη Ε από ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα και η σελεκτίνη L εκφράζεται συνεχώς από την πλειοψηφία των λευκοκυττάρων. Τα μόρια αυτά χαρακτηρίζονται από μια εξαρτώμενη από το ασβέστιο αμινοτελική δομή λεκτίνης, από μια δομή παρόμοια με αυτή του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα, από συνεχείς επαναλήψεις όμοιες με αυτές των πρωτεϊνών του συμπληρώματος, από μια διαμεμβρανική δομή και από μια κυτταροπλασματική ουρά. Η γλυκοπρωτεΐνη-1 της σελεκτίνης-ρ (PSGL-1, P-Selectin Glycoprotein-1) αποτελεί ένα από τα κυριότερα προσδέματα των σελεκτινών. Έχουν βρεθεί πολλά υποψήφια προσδέματα σελεκτινών, τα οποία είναι κυρίως υδρογονάνθρακες με ομάδες φουκόζης και σιαλικού οξέος, χωρίς όμως να είναι γνωστός ο παθοφυσιολογικός τους ρόλος (Quehenberger, 2005). Η παρεμπόδιση μιας ή περισσότερων σελεκτινών ή της PSGL-1 επιδρά σημαντικά στο «ρολάρισμα» των λευκοκυττάρων, μειώνοντας τελικά την περαιτέρω προσκόλληση και μετανάστευσή τους (Kansas, 1996). Στον Πίνακα 1 αναφέρονται στοιχεία για την εναλλακτική ονομασία, την εντόπιση, τα προσδέματα των σελεκτινών και τη λειτουργία των λευκοκυττάρων στην οποία εμπλέκονται (Krieglstein and Granger, 2001). 18

19 Μόριο προσκόλλησης Σελεκτίνη L Σελεκτίνη Ρ Σελεκτίνη Ε Εναλλακτική ονομασία CD62L, LAM-1, LECAM-1 CD62P, PADGEM, GMP-140 CD62E, ELAM-1 Εντόπιση Λευκοκύτταρα (Όλα) Ενδοθηλιακά κύτταρα, αιμοπετάλια Ενδοθηλιακά κύτταρα Πρόσδεμα Σελεκτίνες Ρ και Ε GlyCAM, CD14 MAdCAM- 1 (Mucosal Addressin Cell Adhesion Molecule-1) Σελεκτίνη L PSGL-1, 120kD PSL Σελεκτίνη L CLA, SSEA-1 250kD ESL Λειτουργία λευκοκυττάρων «Ρολάρισμα» «Ρολάρισμα» «Ρολάρισμα» Πίνακας 1. Τα χαρακτηριστικά των σελεκτινών και ο ρόλος τους στην αλληλεπίδραση μεταξύ ενδοθηλιακών κυττάρων και λευκοκυττάρων. Ιντεγκρίνες Η προσκόλληση των λευκοκυττάρων στα ενδοθηλιακά κύτταρα και η μετανάστευσή τους στον υπενδοθηλιακό χώρο μεσολαβείται από ιντεγκρίνες και μέλη της οικογένειας των ανοσοσφαιρινών (Harlan and Liu, 1992 και Springer, 1994). Οι ιντεγκρίνες είναι ετεροδιμερή μόρια και χαρακτηρίζονται από μια κοινή β υπομονάδα, η οποία συνδέεται μη ομοιοπολικά με μια ποικιλία α υπομονάδων. Μέχρι σήμερα είναι γνωστές 15 α και 8 β υπομονάδες. Οι ιντεγκρίνες β 1 (CD29) καλούνται πολύ όψιμα αντιγόνα (Very Late Antigens, VLA), επειδή εκφράζονται από τα λεμφοκύτταρα πολύ μετά την ενεργοποίησή τους. Οι ιντεγκρίνες των λευκοκυττάρων χαρακτηρίζονται από τη β 2 (CD18) υπομονάδα. Η LFA-1 (γνωστή και ως α L β 2 ή ως CD11a/CD18) και η Mac-1 (γνωστή και ως α M β 2 ή ως CD11b/CD18) είναι οι ιντεγκρίνες που εμπλέκονται στη στρατολόγηση των μονοκυττάρων του αίματος στο ενδοθήλιο των αγγείων. Η β 3 υποοικογένεια περιλαμβάνει τις κυτο-προσκολλητίνες α IIb β 3 (GPIIb/IIIa) και α V β 3 (υποδοχέας βιτρονεκτίνης). Πολλές ιντεγκρίνες περιέχουν μια θέση σύνδεσης με το τριπεπτίδιο RGD (Αργινίνη-Γλυκίνη-Ασπαραγινικό οξύ), το οποίο υπάρχει σε πολλές πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας (Springer, 1990). Μια από τις ιντεγκρίνες, η α 4 β 1 (VLA-4), αναγνωρίζει το μοτίβο EILDVPST (Γλουταμινικό οξύ-ισολευκίνη-λευκίνη-ασπαραγινικό οξύ-βαλίνη-προλίνη-σερίνη- Θρεονίνη) μέσα στην περιοχή CS-1 (Connecting Segment) της φιμπρονεκτίνης, η οποία είναι προϊόν εναλλακτικού ματίσματος (Komoriya et al, 1991). Οι ιντεγκρίνες εκφράζονται συνεχώς από λευκοκύτταρα, ενδοθηλιακά και άλλα κύτταρα και μεσολαβούν στις διακυτταρικές αλληλεπιδράσεις και στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ κυττάρων και εξωκυττάριας ουσίας. Στον Πίνακα 2 αναφέρονται στοιχεία για την εναλλακτική ονομασία, την εντόπιση, τα προσδέματα των ιντεγκρινών και τη λειτουργία των λευκοκυττάρων στην οποία εμπλέκονται (Krieglstein and Granger, 2001). 19

20 Μόριο προσκόλλησης CD11a/CD18 CD11b/CD18 CD11c/CD18 Εναλλακτική ονομασία LFA-1 α L β 2 Mac-1 α Μ β 2 p150,95 α x β 2 CD11d/CD18 α d β 2 CD49d/CD29 VLA-4 α 4 β 1 Εντόπιση Λευκοκύτταρα (Όλα) Πολυμορφοπύρηνα, μονοκύτταρα Πολυμορφοπύρηνα, μονοκύτταρα Μυελομονοκυτταρι κές σειρές, μακροφάγα Λεμφοκύτταρα, μονοκύτταρα, ηωσινόφιλα, βασεόφιλα CD49d/β 7 α 4 β 7 Λεμφοκύτταρα Πρόσδεμα ICAM-1 ICAM-2 ICAM-1 ic3b; Fb ic3b; Fb? ICAM-1 ICAM-3 VCAM-1 Μόρια εξωκυττάριας ουσίας VCAM-1 MAdCAM-1 Λειτουργία λευκοκυττάρων Προσκόλληση/ Μετανάστευση Προσκόλληση/ Μετανάστευση Προσκόλληση/ Μετανάστευση? Προσκόλληση/ Μετανάστευση? Προσκόλληση Προσκόλληση φιμπρονεκτίνη Πίνακας 2. Τα χαρακτηριστικά των ιντεγκρινών και ο ρόλος τους στην αλληλεπίδραση μεταξύ ενδοθηλιακών κυττάρων και λευκοκυττάρων. Υπεροικογένεια ανοσοσφαιρινών Στην υπεροικογένεια των ανοσοσφαιρινών ανήκουν τύπου Ι διαμεμβρανικές πρωτεΐνες, οι οποίες χαρακτηρίζονται από εξωκυτταρικές δομές με δομή ανοσοσφαιρίνης, μία διαμεμβρανική περιοχή και μία μικρή κυτταροπλασματική ουρά. Στην κατηγορία αυτή ανήκουν τα εξής μόρια προσκόλλησης: τα διακυτταρικά μόρια προσκόλλησης-1, 2 και 3 (Intercellular Adhesion Molecules, ICAM-1, 2 και 3), το μόριο προσκόλλησης αιμοπεταλίων και ενδοθηλιακών κυττάρων-1 (Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1, PECAM-1) και το αγγειακό μόριο προσκόλλησης-1 (Vascular Cell Adhesion Molecule-1, VCAM-1). Η έκφραση των ICAM-1 και VCAM-1 αυξάνεται μετά την ενεργοποίηση του ενδοθηλίου από κυτοκίνες φλεγμονής, ενώ το PECAM-1 εκφράζεται συνεχώς από τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Μάλιστα, η έκφραση των ICAM έπειτα από επίδραση κυτοκινών δεν αυξάνεται σημαντικά σε όργανα, όπως ο πνεύμονας, τα οποία χαρακτηρίζονται από σταθερή έκφρασή των ICAM. Αντίθετα, σε όργανα, όπως η καρδιά, όπου δεν παρατηρείται συνεχής έκφραση των ICAM, η επίδραση των κυτοκινών αυξάνει κατά πολύ την έκφραση αυτών των μορίων προσκόλλησης (Panes et al, 1995 και Henninger et al, 1997). Το ICAM-2 αποτελεί μια περικομμένη μορφή του ICAM-1 και εκφράζεται στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Σε αντίθεση με το ICAM-1 όμως, η έκφρασή του δεν αυξάνεται στα ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα (Nortamo et al, 1991). Το VCAM-1 εκφράζεται σε αμελητέα ποσότητα στα μη ενεργοποιημένα ενδοθηλιακά κύτταρα, ενώ υπό την επίδραση κυτοκινών η έκφρασή του αυξάνεται. Τέλος, το PΕCAM εκφράζεται συνεχώς στο ενδοθήλιο, τα λευκοκύτταρα και τα αιμοπετάλια. Το VCAM-1 αποτελεί το ενδοθηλιακό πρόσδεμα για την ιντεγκρίνη VLA-4, τα ICAM-1, 2 και 3 συνδέονται στις ιντεγκρίνες LFA-1, ενώ τα ICAM-1 και 2 συνδέονται επίσης στις ιντεγκρίνες Mac-1. Το PECAM-1 συνδέεται με μόρια PECAM-1 άλλων κυττάρων, αλλά επίσης και στις ιντεγκρίνες α V β 3. Η παρεμπόδιση ενός ή περισσότερων εκπροσώπων αυτής της κατηγορίας μειώνει την προσκόλληση 20

21 και διαπίδυση των λευκοκυττάρων στο ενδοθήλιο, ενώ σε μερικές περιπτώσεις επιδρά και στο «ρολάρισμα» τους πάνω σε αυτό (Huo and Ley, 2001). Στον Πίνακα 3 αναφέρονται στοιχεία για την εναλλακτική ονομασία, την εντόπιση, τα προσδέματα τους και τη λειτουργία των λευκοκυττάρων στην οποία εμπλέκονται (Krieglstein and Granger, 2001). Μόριο Εναλλακτική Λειτουργία Εντόπιση Πρόσδεμα προσκόλλησης ονομασία λευκοκυττάρων ICAM-1 CD54a Ενδοθήλιο, CD11a/CD18 Προσκόλληση/ μονοκύτταρα CD11b/CD18 Μετανάστευση ICAM-2 CD102 Ενδοθήλιο CD11a/CD18 Προσκόλληση/ Μετανάστευση VCAM-1 CD106 Ενδοθήλιο CD49d/CD29 Προσκόλληση PECAM-1 CD31 PECAM-1 Ενδοθήλιο, άλλων Προσκόλληση/ λευκοκύτταρα, κυττάρων, Μετανάστευση αιμοπετάλια α ν β 3 MAdCAM-1 Ενδοθήλιο Σελεκτίνη L Προσκόλληση/ (εντέρου) CD49d/β 7 Μετανάστευση Πίνακας 3. Τα χαρακτηριστικά των εκπροσώπων της υπεροικογένειας των ανοσοσφαιρινών και ο ρόλος τους στην αλληλεπίδραση μεταξύ ενδοθηλιακών κυττάρων και λευκοκυττάρων. Είναι εμφανής ο ρόλος των προαναθερθέντων μορίων προσκόλλησης στις πολύπλοκες κυτταρικές αλληλεπιδράσεις, οι οποίες συμβάλουν στη δημιουργία αθηροσκλήρωσης. Για το λόγο αυτό έχουν αναπτυχθεί πολλές θεραπευτικές στρατηγικές, οι οποίες εστιάζουν στην παρεμπόδιση της λειτουργίας των μορίων προσκόλλησης και της επακόλουθης ανάπτυξης αθηροματικών βλαβών (Krieglstein and Granger, 2001). Πράγματι, ποντίκια με απώλεια γονιδίων που κωδικοποιούν για μόρια προσκόλλησης καθυστερούν να αναπτύξουν αθηρωσκλήρωση (Quehenberger, 2005). Επίσης, έχει βρεθεί ότι πλήθος βακτηριακών τοξινών, κυτοκινών και οξειδωτικών παραγόντων επάγουν την de novo σύνθεση των εξής μορίων προσκόλλησης στα ενδοθηλιακά κύτταρα: του ICAM-1, του VCAM-1, του MAdCAM-1 και των σελεκτινών E και P. Η μέγιστη έκφραση των μορίων αυτών παρατηρείται τρεις με έξι ώρες μετά την έκθεση στο αρχικό ερέθισμα. Στη διαδικασία εμπλέκονται οι μεταγραφικοί παράγοντες NFkB και AP-1. Έχουν αναγνωρισθεί θέσεις σύνδεσης του παράγοντα NFkB στους προαγωγείς των γονιδίων που κωδικοποιούν για το ICAM-1, το VCAM-1 και τη σελεκτίνη E, ενώ θέσεις σύνδεσης του παράγοντα AP-1 υπάρχουν στους προαγωγείς των γονιδίων που κωδικοποιούν για το ICAM-1 και τη σελεκτίνη E. Παρεμποδιστές των μεταγραφικών παραγόντων ή πυρηνική μετατόπισή τους έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση της έκφρασης των μορίων προσκόλλησης in vitro και in vivo, η οποία επάγεται από κυτοκίνες ή οξειδωτικούς παράγοντες, και της επακόλουθης στρατολόγησης των μονοκυττάρων του αίματος στην ενδοθηλιακή στιβάδα (Collins et al, 1995). Στην παρούσα εργασία το ενδιαφέρον εστιάστηκε στο μόριο προσκόλλησης ICAM-1, διότι εμπλέκεται κατά κύριο ρόλο στη διαδικασία της προσκόλλησης των μονοκυττάρων του αίματος στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Στην προσκόλληση μεσολαβεί και το PECAM, αλλά η έκφραση του μορίου αυτού είναι σταθερή στα ενδοθηλιακά κύτταρα και δεν επάγεται από την ενεργοποίησή τους. Αντίθετα, η έκφραση των 21

22 μορίων ICAM και VCAM-1 επάγεται μετά από την ενεργοποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων, γεγονός που παρουσιάζει ενδιαφέρον. Συγκριτικά με το VCAM-1, το ICAM-1, όπως προαναφέρθηκε, πέρα από την προσκόλληση εμπλέκεται και στο στάδιο της μετανάστευσης των μονοκυττάρων. Επίσης, ο προαγωγέας του γονιδίου που κωδικοποιεί για το ICAM-1 πέρα από τον παράγοντα NFkB, ο οποίος ρυθμίζει και τον προαγωγέα του γονιδίου που κωδικοποιεί για το VCAM-1, ρυθμίζεται επιπρόσθετα και από τον παράγοντα AP-1. Τέλος, η έκφραση του VCAM-1 είναι επαγώμενη μόνο σε ορισμένα όργανα, όπως η καρδιά, ενώ σε άλλα, όπως ο πνεύμονας, είναι σταθερή. Επομένως μελετώντας την έκφρασή του εξασφαλίζεται μια πιο ολοκληρωμένη εικόνα των διεργασιών που πραγματοποιούνται στην αθηρωμάτωση. Τέλος, σε αντίθεση με τα υπόλοιπα μέλη της υποοικογένειας ICAM (-2 και - 3), το ICAM-1 συνδέεται με δύο ιντεγκρίνες των μονοκυττάρων (και όχι με μία) και είναι ο μόνος εκπρόσωπος της υποοικογένειας, του οποίου η έκφραση αυξάνεται υπό την επίδραση κυτοκινών. Το γεγονός αυτό είναι ενδιαφέρον, δεδομένης της, εξαιτίας του οξειδωτικού στρες, έκκρισης κυτοκινών που παρατηρείται στην αθηροσκλήρωση. Στην Εικόνα 12 που ακολουθεί φαίνονται τα μόρια προσκόλλησης VLA, LFA-1, Mac-1, ICAM-1 και VCAM-1 και η εμπλοκή τους στην είσοδο των μονοκυττάρων στον υπενδοθηλιακό χώρο (Weber and Springer, 1998). Εικόνα 12. Προσκόλληση ενός μονοκυττάρου στο ενδοθήλιο και διαπίδυσή του στον υπενδοθηλιακό χώρο. Το VCAM-1 συμβάλει στην προσκόλληση, ενώ το ICAM-1 και στις δύο διεργασίες, συνδεόμενο εξειδικευμένα με τις ιντεγκρίνες LFA-1 και Mac-1. Το μόριο προσκόλλησης ICAM-1 Δομή Το διακυτταρικό μόριο προσκόλλησης-1 (ICAM-1, CD54) είναι μια διαμεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη, η οποία ανήκει στην υπεροικογένεια των ανοσοσφαιρινών. Κάθε μόριο αποτελείται από πέντε εξωκυτταρικές διακριτές δομές με δομή ανοσοσφαιρίνης, μία διαμεμβρανική δομή και μία κυτταροπλασματική ουρά (Stolpe and Saag, 1996). Ολόκληρη η πρωτεΐνη κωδικοποιείται από επτά εξόνια και 22

23 έξι ιντρόνια που βρίσκονται στο χρωμόσωμα 19. Κάθε μία από τις πέντε διακριτές δομές με δομή ανοσοσφαιρίνης κωδικοποιείται από ένα διαφορετικό εξόνιο. Η τελική πρωτεΐνη αποτελείται από 505 αμινοξέα και το μοριακό της βάρος κυμαίνεται από 80 εως 114 kda, ανάλογα με το επίπεδο της γλυκοσυλίωσής της, το οποίο ποικίλει ανάλογα τον κυτταρικό τύπο και το εξωκυτταρικό περιβάλλον (Newman et al, 1990). Το ICAM-1 συμμετέχει σε πολλές διεργασίες. Συνδέεται με υποδοχείς της οικογένειας των ιντεγκρινών, μεσολαβώντας με αυτόν τον τρόπο στις αλληλεπιδράσεις μεταξύ κυττάρων και επιτρέποντας τη μεταγωγή σημάτων. Το ICAM-1 αλληλεπιδρά εξειδικευμένα με τους υποδοχείς του και προάγει αναστρέψιμες αλληλεπιδράσεις προσκόλλησης. Επιπρόσθετα, εμπλέκεται στην ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων και στη στρατολόγηση των λευκοκυττάρων του αίματος και έτσι αλλαγές στη δομή ή την έκφρασή του σχετίζονται με ανοσολογικά σύνδρομα (Sligh et al, 1993). Είναι λοιπόν εμφανής η ανάγκη κατανόησης των μηχανισμών που ελέγχουν την έκφρασή του. Ρύθμιση Το ICAM-1 ρυθμίζεται σε μεταγραφικό επίπεδο με τέσσερις πιθανούς ρυθμιστικούς μηχανισμούς, στους οποίους συμμετέχουν: ο μεταγραφικός παράγοντας NFkB, η ιντερφερόνη IFN-γ και οι πρωτεϊνικές κινάσες JAK/STAT (Janus kinase/signal transducers and activators of transcription), ο μεταγραφικός παράγοντας AP-1 και οι MAP κινάσες (Mitogen-Activated Protein kinases) και τέλος η πρωτεϊνική κινάση C (PKC) (Roebuck and Finnegan, 1999). Το μονοπάτι του παράγοντα NFkB παρακινείται από κυτοκίνες, όπως ο TNF-α και η ιντερλευκίνη IL-1β. Όπως φαίνεται στην Εκόνα 13, οι κυτοκίνες αυτές ενεργοποιούν τον παράγοντα NIK μέσω διαφορετικών υποδοχέων. Στη συνέχεια, ο NIK αποδομεί τον παράγοντα IkB και έτσι απελευθερώνεται ο NFkB. Ο ελεύθερος πλέον NFkB διμερίζεται, μετατοπίζεται στον πυρήνα (κυρίως ως p50/p65) και προάγει τη μεταγραφή του ICAM-1. Το μονοπάτι αυτό αποτελεί τον πιο συχνό μηχανισμό ρύθμισης του ICAM-1 (Shrikant et al, 1994). Εικόνα 13. Μεταγραφική ρύθμιση του ICAM-1 μεσω του NFkB ή του AP-1 και των MAP κινασών (Niessen et al, 2002). 23

24 Η ιντερφερόνη γάμμα επιδρά επίσης στη μεταγραφική ρύθμιση του ICAM-1. Στο μονοπάτι αυτό οι πρωτεΐνες JAK συνδέονται στις κυτταροπλασματικές ουρές των υποδοχέων των κυτοκινών, φωσφορυλιώνουν η μία την άλλη και ενεργοποιούν τις πρωτεΐνες STAT. Όπως φαίνεται στην Εικόνα 14, οι ενεργοποιημένες STAT σχηματίζουν ομοδιμερή και συνδέονται στα στοιχεία IRE (Interferon-γ Response Element), προάγοντας έτσι τη μεταγραφή του ICAM-1 (Janeway et al, 2001). Εικόνα 14. Μεταγραφική ρύθμιση του ICAM-1 μέσω των κινασών JAK/STAT και της ιντερφερόνης IFN-γ (Roebuck and Finnegan, 1999). Στη δεξιά πλευρά της Εικόνας 13 εμφανίζονται δύο μονοπάτια μεταγωγής σήματος, τα οποία ενεργοποιούν τον προαγωγέα του ICAM-1 στις θέσεις AP-1 όταν δρουν ταυτόχρονα. Αυξητικοί παράγοντες και κυτοκίνες ενεργοποιούν τις κινάσες ERK1 και ERK2 και αυτές με τη σειρά τους τους παράγοντες SRF και Elk-1. Οι τελεύταιοι παράγοντες προάγουν τη μεταγραφή του μεταγραφικού παράγοντα Fos και ο Fos προάγει τη μεταγραφή του ICAM-1 (Karin, 1996). Παράλληλα, άλλα λιγότερο ρυθμιζόμενα σήματα (Roebuck and Finnegan, 1999), όπως άλλες κυτοκίνες και το οξειδωτικό στρες, ενεργοποιούν είτε το μονοπάτι JNK, είτε το μονοπάτι p38. Τα μονοπάτια αυτά ενεργοποιούν τους παράγοντες ATF-2 και c-jun και προάγουν τη μεταγραφή του μεταγραφικού παράγοντα Jun. Στη συνέχεια, οι παράγοντες Fos και Jun διμερίζονται, συνδέονται στις θέσεις AP-1 του προαγωγέα του ICAM-1 και προάγουν τη μεταγραφή του ICAM-1 (Karin et al, 1997). Τέλος, το ICAM-1 ρυθμίζεται έμμεσα από την PKC. Ενεργοποιητές της PKC, όπως οι φορβολεστέρες (Εικόνα 13), αυξάνουν την έκφραση του ICAM-1. Υπάρχει επίσης η υπόθεση ότι η δραστικότητα της PKC είναι απαραίτητη για την γενική έκφραση του ICAM-1, μεσολαβώντας σε όλους τους προαναφερθείς μηχανισμούς. Ο 24

25 ακριβής μηχανισμός ρύθμισης της PKC δεν είναι πλήρως κατανοητός, αλλά έχει αποδειχθεί ότι φάρμακα που αναστέλλουν τη δράση της παρεμποδίζουν την έκφραση του ICAM-1 (Rahman et al, 1999). Λειτουργία Οι ιντεγκρίνες, οι οποίες μεσολαβούν στις διακυτταρικές αλληλεπιδράσεις και επιτρέπουν τη μεταγωγή σημάτων, αποτελούν τους υποδοχείς του ICAM-1. Χαρακτηρίζονται από δύο υπομονάδες, τις α και τις β. Υπάρχουν πολλές οικογένειες α και β υπομονάδων, οι οποίες συνδυάζονται με διαφορετικούς τρόπους, δημιουργώντας μια ποικιλία ιντεγκρινών, κάθε μια από τις οποίες έχει διακριτό ρόλο. Το ICAM-1 συνδέεται εξειδικευμένα με δύο ιντεγκρίνες, την LFA-1 (γνωστή και ως α L β 2 ή ως CD11a/CD18) και την Mac-1 (γνωστή και ως α M β 2 ή ως CD11b/CD18) (Janeway et al, 2001). Η αλληλεπίδραση μεταξύ αυτών των δύο μορίων επιτρέπει στο ICAM-1 να επιδράσει στη λειτουργία και ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων και στην αλληλεπίδραση των ενδοθηλιακών κυττάρων με τα μονοκύτταρα του αίματος. Στα CD8 T λεμφοκύτταρα η μη εξειδικευμένη αλληλεπίδραση μεταξύ του ICAM-1 και της ιντερλευκίνης LFA-1 αποτελεί το πρώτο βήμα στην αναγνώριση του στόχου. Η στιγμιαία αυτή αλληλεπίδραση δίνει το χρόνο στο Τ λεμφοκύτταρο να παρατάξει τον υποδοχέα του με το σύμπλοκο πεπτιδίου:mhc τύπου I. Η επιτυχής αλληλεπίδραση του υποδοχέα του Τ λεμφοκυττάρου με το προβληματικό κύτταρο δίνει το έναυσμα για να ξεκινήσει η κυτταροτοξική δράση (Goldstein et al, 2000). Το ICAM-1 εκφράζεται και από αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (APC, Antigen Presenting Cells) παραπλέυρως του συμπλόκου ιστοσυμβατότητας MHC τύπου II. Με μηχανισμό παρόμοιο με αυτόν στα Τ λεμφοκύτταρα, το ICAM-1 παρέχει τον απαραίτητο χρόνο για την ενεργοποίηση του CD4 T λεμφοκυττάρου (Stolpe and Saag, 1996). Όσον αφορά την αλληλεπίδραση των ενδοθηλιακών κυττάρων με τα μονοκύτταρα του αίματος, αυτή μεσολαβείται ασθενώς και όχι εξειδικευμένα από τις σελεκτίνες P, E και L. Η προσκόλληση των δύο τύπων κυττάρων ενισχύεται σημαντικά με την ενεργοποίηση του ICAM-1. Ενώ οι σελεκτίνες υποκινούν το «ρολάρισμα» των λευκοκυττάρων πάνω στο ενδοθήλιο, η αλληλεπίδραση του ICAM- 1 των ενδοθηλιακών κυττάρων με τις ιντεγκρίνες LFA-1 και Mac-1 των μονοκυττάρων του αίματος σταθεροποιεί το μονοκύτταρο, ώστε να κινηθεί προς τον υπενδοθηλιακό χώρο. Στο σημείο αυτό ξεκινά η διαπίδυση, η διάσχιση δηλαδή της ενδοθηλιακής στιβάδας από τα λευκοκύτταρα. Η διαπίδυση μεσολαβείται από την πρωτεΐνη PECAM (CD31), η οποία εκφράζεται από τα μονοκύτταρα και από τους διακυτταρικούς συνδέσμους των ενδοθηλιακών κυττάρων (Schleimer and Bochner, 1998). Παθολογία και Θεραπεία Ανωμαλίες στην έκφραση του ICAM-1 έχουν παρατηρηθεί σε διαφόρου τύπου κακοήθειες, στο αλλεργικό άσθμα, στην αθηρωμάτωση, στην ισχαιμία, σε νευρολογικά σύνδρομα και στην απόρριψη μοσχευμάτων (Stolpe and Saag, 1996). Ανάλογα με τον τύπο της ασθένειας, χρησιμοποιούνται δύο διαφορετικά είδη θεραπευτικής προσέγγισης: η μέσω αντισωμάτων εξουδετέρωση του ICAM-1 ή της ιντεγκρίνης LFA-1 και η φαρμακολογική επαγωγή του ICAM-1. Σε περιπτώσεις όπου η υπερέκφραση του ICAM-1 επιδρά αρνητικά στους ασθενείς, όπως συμβαίνει στην αθηρωμάτωση, το άσθμα και την απόρριψη μοσχευμάτων, χρησιμοποιούνται παρεμποδιστές της προσκόλλησης των μονοκυττάρων στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Ενέσιμο διαλυτό ICAM-1 συνδέεται με 25

26 ιντεγκρίνες και το διμερές μόριο που σχηματίζεται παρεμποδίζει τη φυσιολογική αλληλεπίδραση μεταξύ ICAM-1 και ιντεγκρίνης LFA-1. Πέρα από την παρεμπόδιση ιντεγκρινών, χρησιμοποιούνται επίσης μονοκλωνικά αντισώματα ενάντια στο ICAM- 1, μειώνοντας έτσι τις αρνητικές του επιδράσεις (Stolpe and Saag, 1996). Έχει αποδειχθεί ότι και άλλα φάρμακα, όπως το Zofenopril, παρεμποδίζουν την έκφραση του ICAM-1 (Cominacini et al, 2002). Τέλος, σε περιπτώσεις όπου η στρατολόγηση κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων είναι απαραίτητη, επάγεται φαρμακευτικά η έκφραση του ICAM-1. Όγκοι σε διάφορους ιστούς, στους οποίους υπερεκφράστηκε το ICAM-1, αναπτύχθηκαν πιο αργά συγκριτικά με όγκους που εκφράζουν φυσιολογικά επίπεδά του (Boyer et al, 1995 kai Okegawa et al, 2002). Όπως προαναφέρθηκε, η έκφραση του ICAM-1 επάγεται υπό την επίδραση οξειδωτικού στρες. Με δεδομένο ότι τέτοιες καταστάσεις οξείδωσης παρατηρούνται στην αθηροσκλήρωση, είναι λογικό να μελετάται η αλλαγή έκφρασης του μορίου αυτού κατά την εξέλιξη της νόσου και επομένως και της οξείδωσης. Η οξείδωση στην αθηρομάτωση Μια από τις πιθανές υποθέσεις για την πρόκληση της αθηροσκλήρωσης, δεδομένης της φλεγμονώδους φύσης της ασθένειας, είναι αυτή των οξειδωτικών τροποποιήσεων (Singh and Jialal, 2006). Στοιχεία που προκύπτουν από μελέτες αποκαλύπτουν ότι οι παράγοντες κινδύνου για την ανάπτυξή της (η υπερλιπιδαιμία, η υπέρταση, το κάπνισμα και ο διαβήτης) προκαλούν μέσω ενός κοινού μηχανισμού την παραγωγή ελευθέρων ριζών (ROS, Reactive Oxygen Species). Οι ROS με τη σειρά τους οξειδώνουν βιομόρια, όπως οι LDL, και στη συνέχεια αυξάνουν την έκφραση προϊόντων διαφόρων γονιδίων στα κύτταρα του αγγειακού τοιχώματος (Kunsch and Medford, 1999). Τα προϊόντα αυτά, είτε είναι μόρια προσκόλλησης είτε μόρια που σχετίζονται με τη φλεγμονή, προάγουν την είσοδο των μονοκυττάρων του αίματος στον υπενδοθηλιακό χώρο και την περαιτέρω απελευθέρωση φλεγμονοδών σημάτων. Τα σήματα αυτά ενισχύουν την ήδη υπάρχουσα τοπική φλεγμονώδη απάντηση καθώς και τη δυσλειτουργία των ενδοθηλιακών κυττάρων (Η δυσλειτουργία του ενδοθηλίου περιγράφεται στην επόμενη ενότητα). Βέβαια, τα κύτταρα των θηλαστικών προστατεύονται από τις ROS με μηχανισμούς αντιοξειδωτικής άμυνας. Παραδείγματα τέτοιων μηχανισμών αποτελούν τα ένζυμα καταλάση, σουπεροξειδική δισμουτάση (SOD, SuperOxide Didmoutase) και περοξειδάση της γλουταθειόνης (GPx, Glutathione Peroxidase). Όταν διαταράσσεται η οξειδοαναγωγική ομοιόσταση του κυττάρου και ο ρυθμός σχηματισμού των ROS υπερέχει της αντιοξειδωτικής άμυνας, δημιουργείται η κατάσταση που είναι γνωστή ως οξειδωτικό στρές. Παρ όλο που, σύμφωνα με πειραματικά δεδομένα, υποδεικνύεται η εμπλοκή του οξειδωτικού στρές στην παθογένεση της αθηροσκλήρωσης, δεν είναι ακόμη γνωστός ο ρόλος κάθε πιθανής πηγής παραγωγής των ROS στην εξέλιξη της ασθένειας. Σε πρόσφατες μελέτες το ενδιαφέρον στρέφεται στις ενζυμικές πηγές των ROS. Αυτές περιλαμβάνουν την οξειδάση της ξανθίνης, την οξειδάση των φωσφορυλιωμένων νικοτιναμιδο αδενινο νουκλεοτιδίων NADPH (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate), μιτοχονδριακές πηγές και τη συνθάση του μονοξειδίου του αζώτου NOS (Nitric Oxide Synthase). Εν συντομία, τα προαναφερθέντα ένζυμα χρησιμοποιούν ως πηγές ηλεκτρονίων ποικίλα υποστρώματα, τα οποία ανάγουν το μοριακό οξυγόνο και το μετατρέπουν σε διαφόρων μορφών ROS. Η αφαίρεση ενός ηλεκτρονίου από το οξυγόνο οδηγεί στο σχηματισμό 26

27 σουπεροξειδίου, ενώ αν αφαιρεθούν δύο ηλεκτρόνια σχηματίζεται υπεροξείδιο του υδρογόνου. Η αυτοξειδοαναγωγή του σουπεροξειδίου, από την SOD, οδηγεί επίσης στο σχηματισμό υπεροξείδιου του υδρογόνου. Τελικά, από το σουπεροξείδιο και το υπεροξείδιο του υδρογόνου προκύπτουν πολλά ακόμη είδη ROS, όπως λιπιδικές (LO. και LOO. ), ανθρακοκεντρικές, θειικές και υδροξυλικές ρίζες καθώς και υποχλωριώδες οξύ (Cipollone et al, 2007). Είναι πλέον γνωστό ότι το οξειδωτικό στρές διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη δυσλειτουργία των ενδοθηλιακών κυττάρων κατά την αθηροσκλήρωση. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα και το οξειδωτικό στρες στην αθηρωμάτωση Δυσλειτουργία του ενδοθηλίου παρατηρείται σε πολλές καρδιαγγειακές ασθένειες, συμπεριλαμβανομένης και της αθηροσκλήρωσης (Endemann and Schiffrin, 2004). Πράγματι, η ενδοθηλιακή δυσλειτουργία συνδέεται με την εξασθένηση της εξαρτώμενης από το ενδοθήλιο αγγειοδιαστολής, η οποία προκαλείται από την απώλεια βιοδραστικότητας του ΝΟ στο τοίχωμα του αγγείου. Η ελάττωση της βιοδιαθεσιμότητας του ΝΟ είναι αποτέλεσμα μειωμένης έκφρασης της συνθάσης του στα ενδοθηλιακά κύτταρα (enos, endothelial cell NOS), έλλειψης υποστρώματος (Lαργινίνη) ή συμπαραγόντων του ενζύμου (τετραϋδροβιοπτερίνη ΒΗ 4 ), αλλαγών της μεταγωγής σήματος που σχετίζονται με μη ικανοποιητική ενεργοποίηση του ενζύμου, και αυξημένης αποδόμησης του ΝΟ από τις ROS. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, οι μηχανισμοί αντιοξειδωτικής άμυνας των ενδοθηλιακών κυττάρων ελαχιστοποιούν τις προαναθερθείσες διεργασίες και έτσι διατηρούν μια λεπτή ισορροπία μεταξύ ΝΟ. και Ο _. 2. Διαταραχή της λεπτής αυτής ισορροπίας παρατηρείται σε πολλές ασθένειες. Σε κουνέλια με υπερχοληστερολαιμία και εξασθένηση της εξαρτώμενης από το ενδοθήλιο αγγειοδιαστολής, για παράδειγμα, η παραγωγή του ΝΟ. και των οξειδωτικών προϊόντων του είναι, παραδόξως, αυξημένη. Και η μεταγωγή σήματος που οδηγεί στην ενεργοποίηση της συνθάσης enos βρέθηκε φυσιολογική στα πειραματόζωα αυτά (Minor et al, 1990). Έτσι γεννήθηκε η ιδέα της υπόθεσης ότι στην υπερχοληστερολαιμία το ΝΟ. οξειδώνεται προς οξείδια του αζώτου, όπως το νιτρώδες κα το νιτρικό, τα οποία δεν έχουν αγγειοδραστικές ιδιότητες. Στη συνέχεια, αποδείχηκε ότι η θεραπεία των κουνελιών αυτών με SOD ενίσχυσε την εξαρτώμενη από το ενδοθήλιο αγγειοδιαστολή (Mugge et al, 1991). Η παρατήρηση αυτή επιβεβαίωσε την υπόθεση ότι στην υπερχοληστερολαιμία, η βιοδιαθεσιμότητα του ΝΟ. μειώνεται από το Ο _. 2. Επιπρόσθετα, η εξασθένηση της εξαρτώμενης από το ενδοθήλιο αγγειοδιαστολής έχει συσχετισθεί με αυξημένη αποδόμηση του ΝΟ. από τις ROS σε πειραματόζωα, αλλά και σε ανθρώπους, με διάφορες ασθένειες (υπέρταση, διαβήτης, καρδιακή ανεπάρκεια). Στους ασθενείς αυτούς, η χορήγηση αντιοξειδωτικών βιταμινών φαίνεται να αυξάνει την εξαρτώμενη από το ενδοθήλιο αγγειοδιαστολή (Solzbach et al, 1997). Μεταξύ των ROS που αντιδρούν με το ΝΟ., το σουπεροξείδιο είναι ο κυριότερος εκπρόσωπος. Βέβαια, και οι λιπιδικές ρίζες LO. και LOO. αντιδρούν με το ΝΟ. σχηματίζοντας τις ενώσεις LONO και LOONO αντίστοιχα. Επίσης τα προϊόντα που προκύπτουν από την οξείδωση της LDL, υδροϋπεροξειδικές και αλκοξυλικές λινελαϊκές ρίζες, συμμετέχουν σε αντιδράσεις με το ΝΟ.. Για το λόγο αυτό, μόνο η οξειδωμένη LDL, και όχι η LDL στη φυσιολογική της μορφή, παρεμποδίζει την εξαρτώμενη από το ενδοθήλιο αγγειοδιαστολή. 27

28 Οι ROS αυξάνουν και την προσκόλληση των μονοκυττάρων του αίματος στο ενδοθήλιο, προκαλούν απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων και συμμετέχουν στην αγγειογένεση. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, το ενδοθήλιο παρουσιάζει μια αδρανή φλεγμονώδη κατάσταση. Όπως προαναφέρθηκε, όμως, διάφορα προφλεγμονώδη ερεθίσματα επάγουν την έκφραση μορίων προσκόλλησης στα κύτταρα αυτά, με αποτέλεσμα την αυξημένη προσκόλληση μονοκυττάρων στην επιφάνειά τους και τον τελικό σχηματισμό αθηροματικής πλάκας. Η έκφραση πολλών μορίων προσκόλλησης από τα ενδοθηλιακά κύτταρα, όπως τα VCAM-1 και ICAM-1, εξαρτάται από τις ROS. Πράγματι, η έκφραση του VCAM-1 και του ICAM-1 καταστέλλεται υπό την επίδραση των αντιοξειδωτικών μορίων PDTC (Pyrrolidine DiThioCarbamate) και NAC. Επίσης, δεδομένης της ιδιότητάς του να περισυλλέγει ρίζες, το ΝΟ. μπορεί να δράσει ως αντιοξειδωτικό και μειώνει την έκφραση του VCAM-1, πιθανώς παρεμποδίζοντας το σχηματισμό περοξυ-λιπαρών οξέων. Σχετικά με την απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων, φαίνεται να προκαλείται από βλάβη στα κύτταρα αυτά ή έκθεσή τους σε Ο _. 2, Η 2 Ο 2, οξειδωμένη LDL, αγγειοτενσίνη ΙΙ, γλυκόζη και TNF-α. Η απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων οδηγεί σε απώλειά τους και έχει ως αποτέλεσμα την έναρξη της αγγειογένεσης για το σχηματισμό της αθηροματικής πλάκας. Υπό την επίδραση αντιοξειδωτικών βιταμινών, NAC, SOD και καταλάσης η απόπτωση παρεμποδίζεται. Συμπεραίνουμε λοιπόν ότι οι ROS ρυθμίζουν και τους αποπτωτικούς μηχανισμούς των ενδοθηλιακών κυττάρων. Μια άλλη μορφή προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου, η anoikis, προκαλείται από την αποκόλληση των ενδοθηλιακών κυττάρων από την εξωκυττάρια ουσία. Η διαδικασία αυτή συνδέεται με αυξημένες ενδοκυτταρικές ROS, που ενδεχομένως παράγονται από τα μιτοχόνδρια, και παρεμποδίζεται από τις ουσίες NAC και DPI [DiPhenylene Iodonium, παρεμποδιστής ενζύμων που περιέχουν φλαβίνη, όπως οι NAD(P)H οξειδάσες] (Cipollone et al, 2007). Τέλος, οι ROS εμπλέκονται και στην αγγειογένεση, μια σημαντική διαικασία όχι μόνο για φυσιολογικές διεργασίες, όπως η εμβρυική ανάπτυξη και η επούλωση των τραυμάτων, αλλά και για παθολογικές καταστάσεις, όπως ο καρκίνος, η διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια και η αθηροσκλήρωση. Η μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων, ο πολλαπλασιασμός τους και ο σχηματισμός του σωλήνα αποτελούν σημαντικά γεγονότα για την πορεία της αγγειογένεσης. Οι ROS εμπλέκονται άμεσα με όλους αυτούς τους μηχανισμούς. Πράγματι, το Η 2 Ο 2 προάγει τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων και μεσολαβεί στη γένεση του σωλήνα, η οποία ενεργοποιείται από τα λεμφοκύτταρα (Maulik and Das, 2002). Επίσης, οι ROS δρουν και ως μεσολαβητές αγγειογενετικών αυξητικών παραγόντων, όπως του ενδοθηλιακού VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor). Έχει αναφερθεί ότι οι NAD(P)H οξειδάσες ρυθμίζουν όχι μόνο την επαγωγή της έκφρασης του VEGF, αλλά και την επαγώμενη από τον VEGF αγγειογένεση (Ushio-Fukai et al, 2002). 28

29 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Η προσκόλληση των μονοκυττάρων και των ενδοθηλιακών κυττάρων στην εξωκυττάρια ουσία έχει συνδεθεί με την αθηροσκλήρωση. Επίσης, η οξείδωση των πρωτεϊνών της εξωκυττάριας ουσίας, ως αποτέλεσμα της δράσης των ελευθέρων ριζών, επιδρά στις αλληλεπιδράσεις τους με τα κύτταρα. Με δεδομένο ότι η λαμινίνη αποτελεί βασικό συστατικό της βασικής μεμβράνης, μελετήσαμε την επίδραση της οξείδωσής της στην προσκόλληση ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων πάνω σε αυτή. Επιπρόσθετα, έχοντας υπ όψη ότι τα ενδοθηλιακά κύτταρα εκφράζουν το μόριο προσκόλλησης ICAM-1 στην κυτταρική τους επιφάνεια, διερευνήσαμε την έκφραση του ICAM-1 από ενδοθηλιακά κύτταρα που προσκολλώνται σε οξειδωμένη λαμινίνη ή στη μη οξειδωμένη της μορφή. Τέλος, μιας και το μόριο προσκόλλησης ICAM-1 συμβάλλει στην προσκόλληση των μονοκυττάρων στο ενδοθήλιο, εξετάσαμε εάν η οξείδωση της λαμινίνης επιδρά στην προσκόλληση των μονοκυττάρων στα ενδοθηλιακά κύτταρα, τα οποία είναι ήδη προσκολλημένα πάνω σε αυτή. 29

30 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Απομόνωση και καλλιέργεια ενδοθηλιακών κυττάρων Τα ενδοθηλιακά κύτταρα απομονώνονταν από ομφάλιους λώρους, οι οποίοι προέρχονταν από τη Γ Γυναικολογική-Μαιευτική Κλινική του Ιπποκρατείου Νοσοκομείου Θεσσαλονίκης. Αρχικά, οι λώροι ξεπλένονταν εξωτερικά με φυσιολογικό ορό και εσωτερικά με στείρο διάλυμα PBS (Phosphate Buffered Saline, ph 7.4: 80mM Na 2 HPO 4, 20mM NaHPO 4 100mM NaCl) με τη βοήθεια σύρριγγας. Στη συνέχεια, γεμίζονταν με διάλυμα κολλαγενάσης 0.5μg/ml και επωάζονταν σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. Έπειτα, συλλέγονταν το περιεχόμενό τους και οι λώροι ξεπλένονταν με θρεπτικό υλικό 199 Earle (Biochrom AG). Το θρεπτικό υλικό συλλέγονταν μαζί με το προηγούμενο έκπλυμα του διαλύματος κολλαγενάσης και φυγοκεντρούνταν για 10 λεπτά στις στροφές. Το ίζημα που προέκυπτε από τη φυγοκέντρηση και περιείχε τα ενδοθηλιακά κύτταρα αναδιαλύονταν σε 5ml πλήρους θρεπτικού υλικού 199 Earle (20% ορού FCS, 25Mm HEPES, 50μl Πενικιλίνης/Στρεπτομυκίνης, 0.25μg/ml φουγκιζόνης, 50μg/ml γενταμυκίνης, 90μg/ml ηπαρίνης), τοποθετούνταν σε φλάσκα 25cm 2 (Corning), η οποία είχε ήδη καλυφθεί με ζελατίνη (0.2% σε διάλυμα PBS, Sigma) και καλλιεργούνταν σε κλίβανο επώασης με παροχή διοξειδίου του άνθρακα CO 2 (Automatic CO 2 Incubator, Forma Scientific). Την επόμενη μέρα, το θρεπτικό υλικό απομακρύνονταν από τη φλάσκα και τα κύτταρα αποκολλώνταν με διάλυμα 0.05% τρυψίνης και 0.02% EDTA. Στη συνέχεια, το διάλυμα συλλέγονταν και φυγοκεντρούνταν για 10 λεπτά στις στροφές. Τέλος, το ίζημα που προέκυπτε από τη φυγοκέντρηση αναδιαλύονταν σε πλήρες θρεπτικό υλικό 199 Earle και τα ενδοθηλιακά κύτταρα ήταν έτοιμα για χρήση. Απομόνωση μονοκυττάρων Τα μονοκύτταρα απομονώνονταν από το αίμα υγιών δοτών. Το αίμα συλλέγονταν το πρωί, προ φαγητού, σε ειδικό δοχείο με διάλυμα PBS, που περιείχε 1mM EDTA ph 7.2, ώστε να αποφευχθεί η πήξη του. Στη συνέχεια, προσθέτονταν προσεκτικά 10ml διαλύματος φικόλης συγκέντρωσης 1.077g/ml (Ficoll-Paque Plus, Healthcare Biosciences AB), προκειμένου να διαχωρισθούν τα λευκοκύτταρα από τα υπόλοιπα κύτταρα του αίματος. Ακολουθούσε φυγοκέντρηση για 20 λεπτά στα 400g και απομόνωση της στιβάδας των λευκοκυττάρων. Μετά από τρεις πλύσεις με διάλυμα PBS, που περιείχε 1mM EDTA ph 7.2, τα λευκοκύτταρα διαλύονταν σε πλήρες θρεπτικό υλικό IMDM (Iscove-Medium, Biochrom) και ακολουθούσε προσθήκη διαλύματος περκόλης 46% (Percoll, Biochrom AG), προκειμένου να διαχωρισθούν τα μονοκύτταρα από τα υπόλοιπα λευκοκύτταρα. Έπειτα, πραγματοποιούνταν φυγοκέντρηση για 30 λεπτά στα 550g και το ίζημα με τα μονοκύτταρα αναδιαλύονταν με διάλυμα PBS, που περιείχε 1mM EDTA ph 7.2. Τέλος, ακολουθούσε άλλη μία φυγοκέντρηση και το ίζημα με τα μονοκύτταρα αναδιαλύονταν σε πλήρες θρεπτικό υλικό IMDM, οπότε ήταν έτοιμα για χρήση. Ο αριθμός των μονοκυττάρων μετρούνταν σε πλάκα Newbauer, μετά από 1:1 αραίωση με διάλυμα 0.4% trypan blue. Συνήθως συλλέγονταν μονοκύτταρα/ml με 98% βιωσιμότητα. 30

31 Οξείδωση της λαμινίνης Η λαμινίνη (Invitrogen) διαλύονταν σε διάλυμα PBS και επωάζονταν με 100mM EDTA, 833mM ασκορβικού οξέος (Merk) και 100mM ένωσης θειικού αμμωνίου με δισθενή σίδηρο (Fluka) σε θερμοκρασία 37 o C για 1 ώρα. Ακολουθούσε ολονύκτια διαπίδυση της οξειδωμένης λαμινίνης έναντι διαλύματος PBS σε θερμοκρασία 4 o C, κατά τη διάρκεια της οποίας πραγματοποιούνταν δύο αλλαγές του διαλύματος. Την επόμενη μέρα η οξειδωμένη λαμινίνη συλλέγονταν και αποθηκεύονταν στους -80 o C. Προσκόλληση ενδοθηλιακών κυττάρων σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης Οι μετρήσεις έγιναν σε πλαστικές πλακέτες τύπου ELISA των ενεννηνταέξι θέσεων (Greiner Βio-one). Κάθε θέση καλύπτονταν με 50μl διαλύματος οξειδωμένης ή μη οξειδωμένης λαμινίνης συγκέντρωσης 37.5μg/ml, διαλυμένης σε PBS και επωάζονταν ολονύκτια σε θερμοκρασία δωματίου. Την επόμενη μέρα προσθέτονταν 100μl εναιωρήματος ενδοθηλιακών κυττάρων σε πλήρες θρεπτικό υλικό 199 Earle ( κύτταρα σε κάθε θέση) σε όλες τις θέσεις και ακολουθούσε επώαση για 30 λεπτά σε θερμοκρασία 37 o C (Automatic CO 2 Incubator). Το εναιώρημα των μη προσκολλημένων ενδοθηλιακών κυττάρων απομακρύνονταν στη συνέχεια με απότομη εκτίναξη της πλακέτας ELISA και ακολουθούσε πλύση όλων των θέσεών της με 100μl στείρου διαλύματος PBS ph 6. Κατόπιν, προσθέτονταν διαδοχικά σε κάθε θέση από 80μl άχρωμου διαλύματος μονιμοποίησης (Fixing solution, Microscopy Hemacolor Kit, Merck), διαλύματος κόκκινου χρώματος (Colour reagent red, Microscopy Hemacolor Kit, Merck) και διαλύματος μπλε χρώματος (Colour reagent blue, Microscopy Hemacolor Kit, Merck), τα οποία απομακρύνονταν αμέσως μετά την προσθήκη τους, με απότομη εκτίναξη της πλακέτας ELISA. Μετά την απομάκρυνση του τρίτου διαλύματος μπλε χρώματος, η πλακέτα εκτινάσσονταν ήπια επάνω σε διηθητικό χαρτί και ακολουθούσαν δύο πλύσεις όλων των θέσεών της με 200μl διαλύματος πλύσης (Wash buffer ph 7.2, Microscopy Hemacolor Kit, Merck). Έπειτα, η πλακέτα αφήνονταν να στεγνώσει για λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, προσθέτονταν 200μl διαλύματος 10% οξικού οξέος σε νερό (Applichem), ακολουθούσε αναδιάλυση του περιεχομένου και επώαση για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου υπό ήπια ανάδευση. Τέλος, μετρούνταν η απορρόφηση σε μήκος κύματος 570nm με φωτόμετρο μέτρησης ELISA Stat-Fax 2100 (Awareness Technology). Έκφραση του μορίου προσκόλλησης ICAM-1 από ενδοθηλιακά κύτταρα προσκολλημένα σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης Οι μετρήσεις έγιναν σε πλαστικές πλακέτες τύπου ELISA των ενεννηνταέξι θέσεων. Κάθε θέση καλύπτονταν με 50μl διαλύματος οξειδωμένης ή μη οξειδωμένης λαμινίνης συγκέντρωσης 37.5μg/ml, διαλυμένης σε PBS (Phosphate Buffered Saline, ph 7.4: 80mM Na 2 HPO 4, 20mM NaHPO 4 100mM NaCl) και επωάζονταν ολονύκτια σε θερμοκρασία δωματίου. Την επόμενη μέρα προσθέτονταν 100μl εναιωρήματος ενδοθηλιακών κυττάρων σε πλήρες θρεπτικό υλικό 199 Earle σε όλες τις θέσεις και 31

32 ακολουθούσε ολονύκτια επώαση σε θερμοκρασία 37 o C (Automatic CO 2 Incubator). Την τρίτη μέρα του πειράματος και αφού απομακρύνονταν το εναιώρημα των μη προσκολλημένων ενδοθηλιακών κυττάρων με απότομη εκτίναξη της πλακέτας, πραγματοποιούνταν πλύση όλων των θέσεων της πλακέτας με 200μl στείρου διαλύματος PBS ph 6. Στη συνέχεια σε κάθε θέση προσθέτονταν 50μl διαλύματος που περιείχε το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-icam-1 (ICAM-1 SC mouse monoclonal IgG1, Santa Cruz Biotechnology) συγκέντρωσης 0.2μg/θέση ή 4 μg/ml σε θρεπτικό υλικό 199 Earle και ακολουθούσε επώαση σε θερμοκρασία 37 o C για 1 ώρα υπό ήπια ανάδευση (Metal Block Heater, Bioline Scientific). Έπειτα και αφού απομακρύνονταν το διάλυμα που περιείχε το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-icam-1 με απότομη εκτίναξη της πλακέτας, πραγματοποιούνταν τρείς διαδοχικές πλύσεις όλων των θέσεών της με 200μl στείρου διαλύματος PBS ph 6. Κατόπιν, σε κάθε θέση προσθέτονταν 100μl διαλύματος που περιείχε το αντίσωμα anti-mouse IgG συνδεδεμένο με υπεροξειδάση (horseradish peroxidase) αραιωμένο 1/ σε θρεπτικό υλικό 199 Earle και ακολουθούσε επώαση σε θερμοκρασία 37 o C για 1 ώρα υπό ήπια ανάδευση (Metal Block Heater). Έπειτα και αφού απομακρύνονταν το διάλυμα που περιείχε το αντίσωμα anti-mouse IgG με απότομη εκτίναξη της πλακέτας, πραγματοποιούνταν τέσσερις διαδοχικές πλύσεις όλων των θέσεών της με 200μl στείρου διαλύματος PBS ph 6. Σε κάθε θέση της πλακέτας προσθέτονταν 100μl διαλύματος ph 5, που περιείχε μια ταμπλέτα 3,3,5,5 -διυδροχλωρικής τετραμεθυλβενζιδίνης (3,3,5,5 -TetraMethylBenzidine dihydrochloride, TMB, Sigma) και 1.455g Na 2 HPO 4, 1.91g κιτρικού οξέος και 40μl 30% H 2 O 2 (Merk) σε τελικό όγκο 200ml, και μετρούνταν η απορρόφηση σε μήκος κύματος 450nm με φωτόμετρο μέτρησης ELISA Stat-Fax Μετά το τέλος της πρώτης μέτρησης ακολουθούσε επώαση της πλακέτας σε θερμοκρασία 37 o C για 50 λεπτά υπό ήπια ανάδευση και μια δεύτερη μέτρηση της απορρόφησης σε μήκος κύματος 450nm. Στο πείραμα αυτό μετρήθηκε η απορρόφηση και σε θέσεις ελέγχου (control), οι οποίες δεν ήταν καλυμμένες με οξειδωμένη ή μη οξειδωμένη λαμινίνη. Στις θέσεις αυτές πραγματοποιούνταν η πειραματική διαδικασία από το δεύτερο στάδιό της (προσθήκη εναιωρήματος ενδοθηλιακών κυττάρων) και έπειτα. Προσκόλληση μονοκυττάρων σε υπόστρωμα προσκολλημένων σε οξειδωμένη ή μη οξειδωμένη λαμινίνη ενδοθηλιακών κυττάρων Οι μετρήσεις έγιναν σε πλαστικές πλακέτες τύπου ELISA των ενεννηνταέξι θέσεων. Κάθε θέση καλύπτονταν με 50μl διαλύματος οξειδωμένης ή μη οξειδωμένης λαμινίνης συγκέντρωσης 37.5μg/ml, διαλυμένης σε PBS (Phosphate Buffered Saline, ph 7.4: 80mM Na 2 HPO 4, 20mM NaHPO 4 100mM NaCl) και επωάζονταν ολονύκτια σε θερμοκρασία δωματίου. Την επόμενη μέρα προσθέτονταν 100μl εναιωρήματος ενδοθηλιακών κυττάρων σε πλήρες θρεπτικό υλικό 199 Earle σε όλες τις θέσεις και ακολουθούσε ολονύκτια επώαση σε θερμοκρασία 37 o C (Automatic CO 2 Incubator). Την τρίτη μέρα του πειράματος και αφού απομακρύνονταν το εναιώρημα των μη προσκολλημένων ενδοθηλιακών κυττάρων με απότομη εκτίναξη της πλακέτας, προσθέτονταν σε κάθε θέση της 100μl εναιωρήματος μονοκυττάρων σε πλήρες θρεπτικό υλικό IMDM. Ακολουθούσε επώαση της πλακέτας σε θερμοκρασία 37 o C (Automatic CO 2 Incubator) για 30 λεπτά και απομέκρυνση των μη προσκολλημένων μονοκυττάρων με αναρρόφηση. Κατόπιν, πραγματοποιούνταν πλύση όλων των θέσεων της πλακέτας με 100μl στείρου διαλύματος PBS ph 6. Στη συνέχεια, σε όλες τις θέσεις και πολύ γρήγορα και προσεκτικά, προσθέτονταν 50μl διαλύματος λύσης που περιείχε 0.5% hexadecyltrimethylammonium bromide (Fluka) σε PBS ph 6 και 32

33 ακολουθούσε επώαση σε θερμοκρασία 37 o C (Automatic CO 2 Incubator) για 30 λεπτά. Μετά την επώαση, σε κάθε θέση προσθέτονταν 50μl διαλύματος που περιείχε 0.2mg/ml O-dianisidinedihydrochloride (Sigma) και 4mM H 2 O 2 σε PBS ph 6. Ακολουθούσε επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά υπό ήπια ανάδευση. Τέλος, μετρούνταν η δραστικότητα της μυελοϋπεροξειδάσης (ΜΡΟ) του κυτταρολύματος σε μηκος κύματος 405nm με φωτόμετρο μέτρησης ELISA Stat-Fax Στο πείραμα αυτό μετρήθηκε και η δραστικότητα της μυελοϋπεροξειδάσης και σε δείγματα μονοκυττάρων, στα οποία η δραστικότητα αναμένονταν να είναι 100%. Τα δείγματα αυτά προετοιμάζονταν ως εξής: Την Τρίτη μέρα του πειράματος και λίγο πριν τη λήξη της επώασης των μονοκυττάρων σε θερμοκρασία 37 o C (Automatic CO 2 Incubator) για 30 λεπτά, στις θέσεις της πλακέτας προσθέτονταν 100μl εναιωρήματος μονοκυττάρων σε αποστειρωμένο eppendorf. Ακολουθούσε φυγοκέντρηση για 1 λεπτό, απομάκρυνση του υπερκειμένου και προσθήκη 100μl διαλύματος PBS ph 6. Κατόπιν, πραγματοποιούνταν αναδιάλυση, φυγοκέντρηση για 1 λεπτό, απομάκρυνση του υπερκειμένου και προσθήκη 50μl διαλύματος λύσης. Η λύση των μονοκυττάρων στα eppendorf πραγματοποιούνταν ταυτόχρονα με τη λύση των μονοκυττάρων στις θέσεις της πλακέτας και η ακόλουθη επώαση σε θερμοκρασία 37 o C (Automatic CO 2 Incubator) για 30 λεπτά ήταν κοινή. Μετά τη λήξη της επώασης ακολουθούσε αναδιάλυση του περιεχομένου των eppendorf και προσθήκη του σε κενές θέσεις της πλακέτας ELISA. Τέλος, η προσθήκη του διαλύματος που περιείχε 0.2mg/ml O-dianisidinedihydrochloride (Sigma) και 4mM H 2 O 2 σε PBS ph 6 και η φωτομέτρηση σε μηκος κύματος 405nm πραγματοποιούνταν παράλληλα με τα υπόλοιπα δέιγματα στις θέσεις της πλακέτας ELISA. Στατιστική ανάλυση Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε με την τρίτη έκδοση του στατιστικού προγράμματος GraphPad Instat (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Οι τιμές εκφράζονται ως μέσοι όροι ± διακυμάνσεις (SDs). Τέλος, η στατιστική σημαντικότητα των διαφορών μεταξύ των ομάδων δεδομένων μας εκτιμήθηκε με το Student t-test (paired ή unpaired). 33

34 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Προσκόλληση ενδοθηλιακών κυττάρων σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης Στην προσπάθειά μας να ερευνήσουμε εάν η οξείδωση της λαμινίνης θα μπορούσε να επιδράσει στις αλληλεπιδράσεις της με τα ενδοθηλιακά κύτταρα, μελετήθηκε η προσκόλληση ενδοθηλιακών κυττάρων σε υπόστρωμα οξειδωμένης ή μη οξειδωμένης λαμινίνης. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων υποδεικνύουν ότι τα ενδοθηλιακά κύτταρα προσκολλώνται στην οξειδωμένη λαμινίνη σε μεγαλύτερο βαθμό συγκριτικά με το μη οξειδωμένο μόριο (p=0.011) (Γράφημα 1). Προσκόλληση ενδοθηλιακών κυττάρων σε οξειδωμένη ή μη οξειδωμένη λαμινίνη 0,4 Απορρόφηση (590nm) 0,36 0,32 0,28 0,24 0,2 Λαμινίνη Οξ. Λαμινίνη Γράφημα 1. Προσκόλληση ενδοθηλιακών κυττάρων σε οξειδωμένη ή μη οξειδωμένη λαμινίνη. Έκφραση του μορίου προσκόλλησης ICAM-1 από ενδοθηλιακά κύτταρα προσκολλημένα σε υπόστρωμα οξειδωμένης και μη οξειδωμένης λαμινίνης Προκειμένου να ποσοτικοποιήσουμε τυχόν διαφορές στην έκφραση του μορίου προσκόλλησης ICAM-1 μεταξύ ενδοθηλιακών κυττάρων προσκολλημένων σε οξειδωμένη και μη οξειδωμένη λαμινίνη, χρησιμοποιήθηκε μια ευαίσθητη μέθοδος ανοσοενζυμομέτρησης (ELISA), όπως αναφέρεται στην ενότητα «Υλικά και Μέθοδοι». Τα αποτελέσματα των πειραμάτων υποδεικνύουν ότι τα ενδοθηλιακά κύτταρα που έχουν προσκολληθεί στην οξειδωμένη λαμινίνη εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα του ICAM-1 συγκριτικά με τα ενδοθηλιακά κύτταρα που έχουν προσκολληθεί στο μη οξειδωμένο μόριο (p<0.0001) (Γράφημα 2). 34

35 Έκφραση του ICAM-1 σε ενδοθηλιακά κύτταρα προσκολλημένα σε οξειδωμένη ή μη οξειδωμένη λαμινίνη 0,52 Απορρόφηση (450nm) 0,47 0,42 0,37 0,32 0,27 Λαμινίνη Οξ. Λαμινίνη Μόνο κύτταρα Γράφημα 2. Έκφραση του μορίου προσκόλλησης ICAM-1 σε ενδοθηλιακά κύτταρα, τα οποία έχουν προσκολληθεί σε οξειδωμένη ή μη οξειδωμένη λαμινίνη. Προσκόλληση μονοκυττάρων σε υπόστρωμα προσκολλημένων σε οξειδωμένη ή μη οξειδωμένη λαμινίνη ενδοθηλιακών κυττάρων Αφού διαπιστώθηκε ότι τα ενδοθηλιακά κύτταρα προσκολλώνται στην οξειδωμένη λαμινίνη σε μεγαλύτερο βαθμό συγκριτικά με το μη οξειδωμένο μόριο,θελήσαμε να ερευνήσουμε εαν το προαναφερθέν γεγονός μπορεί να επηρεάσει την προσκόλληση των μονοκυττάρων στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Για το λόγο αυτό, μελετήσαμε την προσκόλληση μονοκυττάρων σε ενδοθηλιακά κύτταρα, τα οποία είχαν προηγουμένως προσκολληθεί σε οξειδωμένη ή μη οξειδωμένη λαμινίνη. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων υποδεικνύουν ότι τα μονοκύτταρα προσκολλώνται περισσότερο σε ενδοθηλιακά κύτταρα, τα οποία έχουν ήδη προσκολληθεί σε οξειδωμένη λαμινίνη (p=0.005) (Γράφημα 3). Προσκόλληση μονοκυττάρων σε ενδοθηλιακά κύτταρα προσκολλημένα σε οξειδωμένη ή μη οξειδωμένη λαμινίνη 0,48 Απορρόφηση (405nm) 0,465 0,45 0,435 0,42 0,405 Ενδοθηλιακά κύτταρα + Λαμινίνη Ενδοθηλιακά κύτταρα + Οξ. Λαμινίνη Γράφημα 3. Προσκόλληση μονοκυττάρων του αίματος σε ενδοθηλιακά κύτταρα, τα οποία έχουν ήδη προσκολληθεί σε οξειδωμένη ή μη οξειδωμένη λαμινίνη. 35