Η επίδραση της µετάγγισης του αίµατος στην ανοσοαπόκριση των ασθενών µε έµφαση στους αριθµούς και λειτουργίες των Τregs.

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥ ΩΝ ΚΑΤΕΥΘΥΝΣΗ: ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ Η επίδραση της µετάγγισης του αίµατος στην ανοσοαπόκριση των ασθενών µε έµφαση στους αριθµούς και λειτουργίες των Τregs. Τσιτσογιάννη Ευγενία ΑΜ: 415 Επιβλέπουσα καθηγήτρια: Μουζάκη Αθανασία, Καθηγήτρια Ιατρικής Σχολής Πανεπιστηµίου Πατρών. Πάτρα, 2010

2 Μέλη Τριµελούς Εξεταστικής - Συµβουλευτικής Επιτροπής: Μουζάκη Αθανασία Καθηγήτρια Τµήµατος Ιατρικής, Σχολής Επιστηµών Υγείας, Πανεπιστηµίου Πατρών. Φουρτούνας Κωνσταντίνος Αναπληρωτής Καθηγητής Τµήµατος Ιατρικής, Σχολής Επιστηµών Υγείας, Πανεπιστηµίου Πατρών Κεφαλιακού Μαρίνα Λέκτορας Τοµέα Γενετικής, Βιολογίας Κυττάρου και ανάπτυξης, Τµήµατος Βιολογίας, Πανεπιστηµίου Πατρών. 2

3 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Ευχαριστίες 4 Περίληψη... 5 Abstract.. 5 Εισαγωγή Tregs Είδη Tregs ηµιουργία Tregs Φαινότυπος Tregs CD TNF/TNFR CD28/B CD Υποδοχείς γ c κυτταροκινών Neuropilin Γαλεκτίνη Υποδοχείς χυµοκινών Ιντεγκρίνες Μηχανισµοί καταστολής ιάχυση διαλυτών παραγόντων Κύτταρο µε κύτταρο επαφή TLRs FoxP Ανακάλυψη Το γονίδιο FoxP ράση FoxP Κλινικές προοπτικές.. 46 Αντικείµενο-Σκοπός.. 48 Πειραµατικό µέρος Ασθενείς και αντιδραστήρια Ασθενείς Αντιδραστήρια Φαινοτύπιση Αποµόνωση PBMC µε φυκόλη Επιφανειακή χρώση Ενδοκυττάρια χρώση Κυτταροµετρία ροής.. 51 Αποτελέσµατα Ανάλυση των CD4 + CD25 + FoxP3 + % των λεµφοκυττάρων Ανάλυση των CD4 + CD25 high CD127 low % των λεµφοκυττάρων Ανάλυση των CD4 + CD25 + FoxP3 + % των CD Ανάλυση των CD4 + CD25 high CD127 low % των CD Ανάλυση των Tregs % των λεµφοκυττάρων Ανάλυση των Tregs % των CD Συζήτηση 79 Βιβλιογραφία. 82 3

4 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η εργασία αυτή εκπονήθηκε στα πλαίσια του µεταπτυχιακού προγράµµατος σπουδών του Βιολογικού τµήµατος Θετικών σπουδών του Πανεπιστηµίου Πατρών. Στο σηµείο αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω θερµά την κα. Αθανασία Μουζάκη, επιβλέπουσα καθηγήτρια, για την εµπιστοσύνη που µου έδειξε κατά την ανάθεση αυτής της εργασίας, για τις ώρες που µου αφιέρωσε για την επίλυση των όποιων προβληµάτων και προβληµατισµών προέκυπταν κατά την εκπόνηση της αλλά κυρίως για τις πάντα ιδιαίτερες συζητήσεις που µου πρόσφερε δηµιουργώντας ένα ωραίο κλίµα επικοινωνίας. Τον κ. Κωνσταντίνο Φουρτούνα και την κα. Κεφαλιακού Μαρίνα, που δέχθηκαν µε µεγάλη προθυµία να είναι µέλη της τριµελούς επιτροπής. Τον κ. Αλέξη Χατζηαντωνίου και τον κ. Άλκη Καλυβωκά, ειδικευόµενους γιατρούς της Ορθοπαιδικής κλινικής του Γενικού Πανεπιστηµιακού Νοσοκοµείου Πατρών για την παραχώρηση των δειγµάτων για την έρευνα και για το ευχάριστο κλίµα συνεργασίας. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερµά όλα τα µέλη του εργαστηρίου κυτταροµετρίας ροής, τόσο για την καθοδήγηση και τις συµβουλές τους κατά τα πρώτα βήµατα, όσο κυρίως για το όλο κλίµα που δηµιουργούσαν κάνοντας τις πολλές ώρες παραµονής στο εργαστήριο ιδιαίτερα ευχάριστες και διασκεδαστικές. 4

5 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Το ανοσιακό σύστηµα καταφέρνει να προστατεύει τον οργανισµό από πολλούς µολυσµατικούς παράγοντες και παράλληλα εξασφαλίζει ανοσολογική ανοχή µε το να ελέγχει την πρόοδο των ανοσολογικών αποκρίσεων τόσο έναντι των αυτόλογων συστατικών όσο και των µολυσµατικών παραγόντων αφού παρέλθει ο κίνδυνος. Αυτό επιτυγχάνεται µέσω µιας ιδιαίτερης οµάδας κυττάρων, τα Tregs. Τα Tregs είναι ένας υποπληθυσµός των Τ κυττάρων που αποτελεί έναν µικρό αριθµό (5-10%) του συνολικού πληθυσµού CD4 + T λεµφοκυττάρων στα υγιή άτοµα. Τα κύτταρα αυτά καταστέλλουν ενεργά παθολογικές και φυσιολογικές ανοσιακές αποκρίσεις, συµβάλλοντας έτσι στη διατήρηση της ανοσολογικής αυτοανοχής και οµοιόστασης. Υπάρχουν δύο πληθυσµοί, τα φυσικής προέλευσης και τα προσαρµοσµένα Tregs κύτταρα τα οποία διαφέρουν βάσει του προφίλ παραγωγής κυτταροκινών και των ικανοτήτων τους να καταστέλλουν τις ανοσιακές αποκρίσεις. Και οι δύο πληθυσµοί δηµιουργούνται στο θύµο, τα µεν φυσικά Tregs εξέρχονται ως λειτουργικά ώριµος πληθυσµός, τα δε προσαρµοσµένα Tregs διαφοροποιούνται κι άλλο και αποκτούν τις κατασταλτικές τους ιδιότητες στην περιφέρεια ως συνέπεια ενεργοποίησης των ώριµων Τ κυττάρων κάτω από συγκεκριµένες συνθήκες (παρουσία ανοσοτροποποιητικών κυτταροκινών ή επαναλαµβανόµενων ερεθισµάτων µε µη επαγγελµατικά ΑΠΚ). Τα Tregs χαρακτηρίζονται από την ιδιαίτερη έκφραση κάποιων µορίων στην επιφάνεια τους όπως είναι το CD25, το GITR, το CTLA-4, το CD127 και άλλων µέσω των οποίων επιφέρουν και την κατασταλτική δράση τους. Το πιο σηµαντικό όµως µόριο που εκφράζεται από τα Tregs και συγκεκριµένα τα φυσικής προέλευσης Tregs είναι το FoxP3. Πρόκειται για έναν µεταγραφικό καταστολέα της οικογένειας FKH που παίζει σηµαντικό ρόλο στην ανάπτυξη, λειτουργία και διατήρηση των κυττάρων αυτών. εν είναι τυχαίο ότι ο παράγοντας αυτός ευθύνεται και για τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά των Tregs καθώς φάνηκε να καταστέλλει την παραγωγή της IL-2, της IL-4, της IFN-γ και άλλων κυτταροκινών ενώ ρυθµίζει θετικά τα γονίδια IL-2Ra (CD25), Ctla4 (CTLA-4) και Tnfrsf18 (GITR). Τα Tregs καταστέλλουν την ενεργοποίηση και/ή την επέκταση πολλών τύπων κυττάρων, όπως είναι τα αθώα Τ κύτταρα, τα Β, τα NKT και τα δενδριτικά. Ο ακριβής τρόπος δράσης τους δεν είναι σαφής αλλά φαίνεται να δρουν είτε µέσω έκκρισης ανοσοκατασταλτικών κυτταροκινών (IL-10 και/ή TGF-β), είτε µέσω άµεσων κύτταρου µε κύτταρο επαφών. Χάρη στα ειδικά µόρια που παράγουν στερούν την πολύτιµη IL-2 από τα υπόλοιπα κύτταρα εµποδίζοντας τον πολλαπλασιασµό τους, τροποποιούν τις αντιγονοπαρουσιαστικές ικανότητες των ΑΠΚ και καταστέλλουν τα Teff και ενδεχοµένως τα σκοτώνουν-. Στην παρούσα εργασία, έγινε προσπάθεια να δειχθεί η σχέση µεταξύ των φυσικών και των προσαρµοσµένων Tregs σε άτοµα που υποβλήθηκαν σε εγχειρήσεις και να δειχθεί κατά πόσο επηρεαζόταν σε αριθµούς οι πληθυσµοί των κυττάρων αυτών. ABSTRACT The immune system has the ability to protect the organism from a variety of infectious factors and it ensures immune tolerance as well, since it controls the progress of the immunological responses against both self antigens and infectious 5

6 factors after the risk expires. This is accomplished through a special cell population, Tregs. Tregs are a subpopulation of T cells which constitutes a small portion (5-10 %) of the total CD4 + T lymphocytes in healthy people. These cells suppress pathological and physiological immune responses, contributing in the preservation of immunotolerance and homeostasis. There are two populations, natural and adaptive Tregs which differ for the production of cytokines and their ability to suppress immunological responses. Both populations are generated in thymous; natural Tregs leave thymous as a functionally mature population, while adaptive Tregs differentiate more and acquire their suppression ability in the periphery as a consequence of activation of the mature T cells under certain circumstances (in presence of immunomodulator cytokines or after repeated stimulations with non professional APCs). Tregs are characterized for the particular way they express in their surface some molecules as CD25, GITR, CTLA-4, CD127 and others through which they induce their suppressive action. However, the most important molecule that is expressed in Tregs, in natural Tregs specifically, is FoxP3. FoxP3 is a transcription suppressor of FKH family and is crucial for the development, function and preservation of these cells. It should be mentioned that this factor is responsible for the specific characteristics of Tregs since it is suppresses the production of IL-2, IL-4, IFN-γ and other cytokines while it induces the expression of IL-2Ra (CD25), Ctla4 (CTLA-4) και Tnfrsf18 (GITR) genes. Tregs suppress the activation and/or expansion of many cell types, such as naïve T cells, B cells, NKT and dendritic cells. The accurate way they act is not clearly but it seems that they either express immunosuppressive cytokines (IL-10 and/or TGF-β), or through cell to cell contacts. Thanks to the molecules they express, they have the ability to deprive the valuable IL-2 from the rest cells preventing their proliferation, to modify the antigen-representing ability of APCs and to suppress Teff cells and possibly kill them-. In the present study, it has been made an effort to show the relationship between natural and adaptive Tregs in subjects that have been operated and to show in which way the numbers of these populations where affected. 6

7 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το ανοσιακό σύστηµα προστατεύει από χιλιάδες παθογενή µικρόβια ενώ ελέγχει παρεκκλίνουσες ή υπερβολικές ανοσιακές αποκρίσεις που είναι επικίνδυνες για το άτοµο. Το πώς αυτό εξασφαλίζεται, είναι το ερώτηµα κλειδί για την ανοσολογία. [1] Η άποψη που επικρατεί είναι πως η ανοσολογική ανοχή επιτυγχάνεται µε δύο κυρίως µηχανισµούς, τον εσωτερικό του κυττάρου ή υποχωρητικό και τον εξωτερικό του κυττάρου ή επικρατή µηχανισµό. [2-4] Το υποχωρητικό µοντέλο υποστηρίζει ότι η ανοχή εξασφαλίζεται µε το να αγνοούνται τα ιδία είτε µέσω φυσικής διαγραφής τους στο θύµο είτε µέσω ανεργίας, δηλ. αποσιώπησης των αυτοδραστικών λεµφοκυττάρων είτε αποµόνωσης του αντιγόνου και για καιρό θεωρούταν ο κύριος µηχανισµός της αυτοανοχής. [1,2,4,5] Η ανεργία µπορεί σε γενικές γραµµές να χαρακτηριστεί ως ειδική περίπτωση αρνητικής ρύθµισης µε εσωτερικούς του κυττάρου τρόπους. Η επαγωγή της ανεργίας είναι µια ενεργή διαδικασία και τουλάχιστον στα ώριµα περιφερικά Τ κύτταρα µπορεί να εξαχθεί µε παράταση σηµατοδότησης του Ca +2 που προέρχεται από την TCR σηµατοδότηση. Η σηµατοδότηση από Ca +2 οδηγεί σε ενεργοποίηση των µελών της NFAT οικογένειας µεταγραφικών παραγόντων. Στα περιφερικά Τ κύτταρα από την CD28 σηµατοδότηση επάγεται ο AP-1 (το Fos-Jun ετεροδιµερές) και η συνεργαστική πρόσδεση του συµπλέγµατος NFAT/AP-1 στους υποκινητές συγκεκριµένων γονιδίων, όπως είναι της IL-2 και του CD25, προκαλούν ανοσιακές αποκρίσεις. Αντίθετα, ένα διαφορετικό πρόγραµµα εκτελείται από τους NFAT χωρίς την παρουσία του AP-1 σε περιπτώσεις ανεργίας. Η ενεργοποίηση των NFAT απουσία του ΑΡ-1 οδηγεί σε ανικανότητα των Τ κυττάρων να καταφέρουν να αποκριθούν σε TCR (λόγω της απότοµης αύξησης του ορίου διέγερσης), να παράγουν IL-2 αλλά και να διαφοροποιηθούν σε αποτελεσµατικά κύτταρα που παράγουν κυτταροκίνες όπως IFN-γ ή TNF-α. Αντ αυτού, τα ανεργικά κύτταρα εκφράζουν αυξηµένα επίπεδα IL- 10. Η ανεργία µπορεί να παρακαµφθεί µε παροχή εξωγενούς IL-2 και ισχυρής TCR/CD28 διέγερσης και τα µέχρι πρότινος ανεργικά κύτταρα να ενεργοποιηθούν. [3] Το επικρατές µοντέλο από την άλλη, δεν απαιτεί πλήρη αποµάκρυνση της αυτοδραστικότητας αλλά βασίζεται σε επικρατείς προστατευτικούς µηχανισµούς που ελέγχουν και αναστέλλουν τα αυτοδραστικά λεµφοκύτταρα. [2] Αυτό επιτυγχάνεται µέσω ενός υποπληθυσµού των Τ κυττάρων, αποκαλούµενα Tregs, που καταστέλλουν ενεργά παθολογικές και φυσιολογικές ανοσιακές αποκρίσεις, συµβάλλοντας έτσι στη διατήρηση της ανοσολογικής αυτοανοχής και οµοιόστασης. [1,5] Αυτά τα κύτταρα Τ (Τregs), τα περισσότερα των οποίων εκφράζουν τον CD25 δείκτη ενεργοποίησης, αποτελούν έναν µικρό αριθµό (5-10%) του συνολικού πληθυσµού CD4 + T λεµφοκυττάρων στα υγιή άτοµα, παίζουν ενεργό ρόλο στην εγκαθίδρυση και διατήρηση της ανοσολογικής αδράνειας σε αυτόλογα συστατικά (ανοσολογική αυτοανοχή) και αρνητικό έλεγχο σε ποικίλες άνοσες αποκρίσεις σε µη αυτόλογα αντιγόνα. [6,7] Επίσης, τα Tregs έχουν κάποια χαρακτηριστικά της ανεργίας καθώς δεν αποτυγχάνουν να ρυθµίζουν το Ca +2, πολλαπλασιάζονται από µόνα τους, ή παράγουν IL-2 όπως και άλλες προφλεγµονώδεις κυτταροκίνες σε απόκριση σε TCR διέγερση. [3] Η ύπαρξη των Tregs σαν συγκεκριµένη κυτταρική οντότητα υπήρξε θέµα έντονης αµφισβήτησης µέχρι πρόσφατα εξαιτίας της έλλειψης αξιόπιστων δεικτών για το καθορισµό τους, την αµφιβολία για τη µοριακή βάση του κατασταλτικού φαινοµένου, την απουσία απτών δεδοµένων για το ρόλο τους σε ανοσολογικές ασθένειες και ακόµη για την απατηλή φύση κάποιων κατασταλτικών φαινοµένων αυτών καθ 7

8 αυτών. [6,8] Τα πρόσφατα χρόνια παρόλα αυτά χαρακτηρίζονται από αυξανόµενο ενδιαφέρον για τα Tregs σε πολλά πεδία της βασικής και κλινικής ανοσολογίας και για το λόγο αυτό, πολυάριθµες µελέτες ξεκίνησαν µε στόχο τη κυτταρική βιολογία των Tregs για περισσότερες λεπτοµέρειες, και πιο ειδικά πτυχές της διαφοροποίησης και των λειτουργικών δυνατοτήτων τους. [7,8] Αυτές οι µελέτες τονίζουν πως τα Tregs δε δρουν σε αποµόνωση αλλά επηρεάζονται τα ίδια από άλλα κύτταρα του ανοσιακού συστήµατος. Εγκαθιδρύεται εποµένως µια ισορροπία που επιτρέπει τις αποκρίσεις έναντι επικίνδυνων µικροβίων ελαχιστοποιώντας τις ανοσολογικές παθολογίες. [7] 1. Τregs 1.1. Είδη Τregs ύο κύριοι πληθυσµοί Tregs περιγράφηκαν βάσει της ειδικότητας και των µηχανισµών δράσης τους: τα φυσικής προέλευσης και τα προσαρµοσµένα Tregs κύτταρα. [1,5] Αυτοί οι κυτταρικοί τύποι φαίνεται να διαφέρουν βάσει του προφίλ παραγωγής κυτταροκινών και των ικανοτήτων τους να καταστέλλουν τις ανοσιακές αποκρίσεις µέσω άµεσων κύτταρου µε κύτταρο επαφών ή έκκριση ανοσοκατασταλτικών κυτταροκινών (IL-10 και/ή TGF-β). Παρόλα αυτά, η σχέση µεταξύ αυτών δεν έχει ξεκαθαριστεί. [8,9] Πίνακας 1: Υποπληθυσµοί των φυσικών και των επαγώµενων Tregs κυττάρων. [18] Τα φυσικά Tregs κύτταρα που αποκαλούνται και επαγγελµατικά Tregs, αναπτύσσονται στο θύµο και καταλήγουν σε έναν ενδογενή µακράς διαρκείας πληθυσµό αυτοαντιγονοειδικών Τ κυττάρων στην περιφέρεια προορισµένου να εµποδίζει πιθανές αυτοάνοσες αντιδράσεις in vitro και in vivo, η ανάπτυξη και λειτουργία των οποίων εξαρτάται από την έκφραση του µεταγραφικού παράγοντα FoxP3. [1,5,9] Αντιπροσωπεύουν το 5-10% των περιφερικών CD4 + Τ κυττάρων σε ποντίκια και ανθρώπους και είναι ο πιο καλά µελετηµένος πληθυσµός Τregs κυττάρων. [4,10] Περιγράφονται ως CD25 + CD4 + Tregs επειδή χαρακτηρίζονται από την ιδιοσυστατική υψηλή έκφραση της α αλυσίδας του υποδοχέα της IL-2, IL-2Rα (CD25), ιδιαίτερα ο µικρός υποπληθυσµός των κυττάρων που έχουν τον CD25 high φαινότυπο. [1,5,8,9] Επίσης, εκφράζουν επαγόµενα από γλυκοκορτικοειδή γονίδια TNF-υποδοχέων, δεν παράγουν κυτταροκίνες και δρουν µέσω ενός εξαρτώµενου από την επαφή µηχανισµού, ο οποίος κατά πάσα πιθανότητα περιλαµβάνει και τα δύο µεµβρανικά CTLA-4 και TGF-β. [1,11] Για τον τελευταίο, εκτός του ότι επιταχύνει τον θάνατο των Th1 και Th2 κυττάρων, υπάρχουν ενδείξεις πως προστατεύει τα 8

9 Tregs από απόπτωση λόγω της θετικής ρύθµισης του Bcl-XL αναστέλλοντας την έκφραση του Fas συνδέτη ή µέσω της ενεργοποίησης της α 5 β 1 ιντεγκρίνης και/ή του προσδέτη της. [12] Τα προσαρµοσµένα Tregs προέρχονται επίσης από το θύµο αλλά διαφοροποιούνται κι άλλο και αποκτούν τις κατασταλτικές τους ιδιότητες στην περιφέρεια ως συνέπεια ενεργοποίησης των ώριµων Τ κυττάρων κάτω από συγκεκριµένες συνθήκες έκθεσης σε αντιγόνο και/ή συνδιέγερσης. [1,5,11] Σε αυτά περιλαµβάνονται τα από διασταύρωση ρυθµιστικά Th1 και Th2 κύτταρα, τα CD4 + που παράγουν IL-10 (Tr1), τα Th3 που παράγουν διαλυτό TGF-β, τα CD4 + CD45RB low, τα CD4 + CD62L high, τα CD8 + CD25 +, τα CD8 + CD28, τα διπλά θετικά Tregs (DN) Tregs κύτταρα, τα CD4 CD8 T κύτταρα που εκκρίνουν συγκεκριµένο γ/δ TCR και τα φυσικά φονικά Τ κύτταρα (NKT) όπως χαρακτηρίστηκαν σε πολλά συστήµατα. [5,10,11,13] Εικόνα 1: Εξωθυµική επαγωγή και λειτουργία των επαγώµενων Tregs. [28] Τα Tr1 κύτταρα εντοπίζονται ιδιαίτερα εντός του εντερικού βλεννογόνου και µπορούν να επαχθούν in vitro από διαφοροποίηση των ηρεµούντων ή αθώων CD4 + T κυττάρων παρουσία IL-10 (συνεργαστικά µε IFN-α), βιταµίνης D 3 και dexamethasone, επαναλαµβανόµενου ερεθισµού µε ανώριµα δενδριτικά κύτταρα, ενεργοποίηση από αντι-cd3 και αντι CD46 mabs και όπως δείχθηκε πιο πρόσφατα, από φυσικά κύτταρα που παρουσιάζουν α 4 β 7 ιντεγκρίνη. [13-15] Πιο πρόσφατα, η IL- 27 που παράγεται από δενδριτικά κατόπιν αλληλεπίδρασης µε τα Tregs που εκφράζουν FoxP3, έδειξε να είναι και αυτή παράγοντας κλειδί στη δηµιουργία των Tr1 που µπορούσαν να επαχθούν περαιτέρω από τον TGF-β. [16] Παράλληλα, η IL- 15 φαίνεται να είναι σηµαντική για τη διέγερση του πολλαπλασιασµού των Tr1. [17] Τα Tr1 κύτταρα καθορίστηκαν αρχικά σε µελέτες ως CD4 + T κύτταρα που ενεργοποιήθηκαν παρουσία IL-10 και έγιναν ανεργικά. [8,9] Ανάλυση αυτών των ανεργικών Τ κυτταρικών πληθυσµών σε κλωνικό επίπεδο έδειξε πως περιείχαν έναν υποπληθυσµό κλώνων Τ κυττάρων (Tr1 κύτταρα) που είχαν ένα µοναδικό πρότυπο παραγωγής κυτταροκινών. Τα Tr1 κύτταρα παράγουν υψηλά επίπεδα IL-10 µε ή χωρίς TGF-β, µέτρια ποσά IFN-γ και IL-5 και λίγο ή και καθόλου IL-2 ή IL-4. [9,11] Αυτά τα δεδοµένα υποδεικνύουν ότι τα ανεργικά λόγω IL-10 CD4 + T κύτταρα περιέχουν πρόδροµους των Tr1 κυττάρων και πως η IL-10 είναι ένας παράγοντας κλειδί για τη διαφοροποίηση τους. [9] Πιο σηµαντικά, τα Tr1 κύτταρα φάνηκε να 9

10 µπορούν να ρυθµίσουν την ενεργοποίηση και των αθώων και των µνηµονικών T κυττάρων και να εµπλέκονται σε αρνητική ρύθµιση των ανοσιακών αποκρίσεων in vitro και in vivo, µέσω της παραγωγής των ανοσοκατασταλτικών κυτταροκινών IL-10 και TGF-β. [9,18] Τα Th3 κύτταρα (που χαρακτηρίζονται από την παραγωγή TGF-β), ένας άλλος υποπληθυσµός των CD4 + Tregs κυττάρων µε µη αντιγονοειδικές κατασταλτικές επιδράσεις, αναγνωρίστηκαν σε µελέτες ανοχής από το στόµα καθώς δηµιουργούνται αρχικά κατόπιν εισόδου ξένου αντιγόνου µέσω κατάποσης. [8,9,13,14,18] Η παρουσία δενδριτικών κυττάρων σε µια κατάσταση ενεργοποίησης διαφορετική από αυτήν που προωθεί τη δηµιουργία των Th1 και Th2 εµπλέκεται στη δηµιουργία και των Th3 κυττάρων. Πρόσφατη έρευνα έδειξε επαγωγή κυττάρων σαν τα Th3 από αθώα Τ κύτταρα από φυσικά Tregs που εκφράζουν α 4 β 1 ιντεγκρίνη. [13] Τα Th3 εκτός της παραγωγής του TGF-β, ο οποίος καταστέλλει των πολλαπλασιασµό των Th1 και Th2 κυττάρων, παράγουν και ποικίλες ποσότητες IL-10 και IL-4 και η τελευταία φάνηκε να είναι παράγοντας κλειδί στη διαφοροποίηση και αύξηση των Th3 σε αντίθεση µε τα Tr1. [9,15,17,18] Τα Th3 κύτταρα διεγείρουν επίσης τα πλασµατοκύτταρα να εκκρίνουν IgA. [13,19] Εικόνα 2: Προέλευση και κατασταλτική δράση των διάφορων υποπληθυσµών των Tregs. [13] 10

11 1.2. ηµιουργία Tregs Η πρώιµη ανάπτυξη και διαφοροποίηση των Τ κυττάρων στο εσωτερικό του θύµου είναι ένας περίπλοκος και αξιοθαύµαστος µηχανισµός. Περίπου 1010 ποικιλίες TCR δηµιουργούνται στους αναπτυσσόµενους λεµφοκυτταρικούς κλώνους µέσω µια τυχαίας διαδικασίας αναδιάταξης των γονιδίων των σωµατικών κυττάρων. Κατά τη διεργασία αυτή, συχνά δηµιουργούνται Τ κύτταρα που αναγνωρίζουν αυτοαντιγόνα. Λόγω της ικανότητας αυτών των αυτοδραστικών Τ κυττάρων να προκαλούν αυτοάνοσες επιθέσεις, αποµακρύνονται µόνιµα από το θύµο µέσω κλωνικής εξάλειψης, διαδικασία γνωστή ως αρνητική επιλογή. Κάποια εξ αυτών καταφέρνουν όµως να ξεφύγουν των θυµικών αµυνών και να καταφύγουν σε περιφερικά λεµφικά όργανα. [5,20] Εικόνα 3: Ανάπτυξη και διαφοροποίηση Τ κυττάρων στο εσωτερικό του θύµου (journals.cambridge.org/fulltext_content/erm/e...) Τα αυτοαντιδρώντα αυτά Τ κύτταρα που ξεφεύγουν της αρνητικής επιλογής, µπορεί έπειτα να ενεργοποιηθούν από περιφερικούς ιστούς -ή µιµούµενα των αυτοαντιγόνων εξωγενή αντιγόνα- οδηγώντας σε επακόλουθη επίθεση έναντι του ιδίου. Για το λόγο αυτό, απαιτούν µια διαφορετική στρατηγική για να εξουδετερωθεί η ενδεχόµενη αυτοανοσία που προκαλούν. [5,20] Αν και τα κυκλοφορούντα αυτοδραστικά Τ κύτταρα είναι παρόντα σε όλα τα άτοµα, η διάδοση των αυτοάνοσων ασθενειών επηρεάζει µόνο µια µικρή µερίδα ανθρώπων, δείχνοντας πως οι µηχανισµοί περιφερικής ανοχής χειρίζονται τα σιωπηλά και εν δυνάµει παθογενή Τ κύτταρα. [5] Αυτό επιτυγχάνεται από το θύµο που ναι µεν παράγει συνεχώς παθογενή αυτοαντιδρώντα CD4 + T κύτταρα, παράγει όµως και λειτουργικά ώριµα CD25 + CD4 + Tregs ικανά να τα ελέγξουν. Αυτή η συγκεντρωτική παραγωγή των Tregs αναφέρεται ως τρίτη λειτουργία του θύµου, λειτουργία σηµαντική όπως φάνηκε από τη στιγµή που προσαρµοσµένη µεταφορά των ώριµων θυµοκυττάρων, από όπου έχουν 11

12 εξαλειφθεί τα CD25 + Τ κύτταρα, επάγει πολλές αυτοάνοσες ασθένειες σε συγγενικά ποντίκια µε ανεπάρκεια Τ κυττάρων. [5,6] Ο θύµος φυσιολογικά παράγει την πλειοψηφία των CD25 + CD4 + Tregs, αν όχι όλα, σαν ένα λειτουργικά ώριµο Τ κυτταρικό υποπληθυσµό, ο οποίος φαίνεται να αποτελεί µια ξεχωριστή κυτταρική σειρά και να είναι συναφής µε αυτόν που βρίσκεται στην περιφέρεια. [5,6]. Η ενδοθυµική δηµιουργία µπορεί να διεκπεραιωθεί απουσία του TGF-β (transforming growth factor-b) και παρουσία ενός κυρίαρχου αρνητικού TGFβ υποδοχέα, αυτό µέσω TGF-β ανεξάρτητων µηχανισµών. Αντίθετα, η σηµατοδότηση από τον TGF-β είναι απαραίτητη για τη διατήρηση των φυσιολογικών αριθµών των Tregs στους περιφερικούς λεµφικούς ιστούς. Η µετατροπή των αθώων Τ κυττάρων σε Tregs στους περιφερικούς λεµφικούς ιστούς ενισχύεται από TGF-β σηµατοδότηση στα κύτταρα που µετατρέπονται. [21] Τα φυσικά Tregs αναπτύσσονται στο θύµο κατά τη διάρκεια των πρώιµων εµβρυικών και νεογέννητων σταδίων ανάπτυξης των Τ κυττάρων. Στα ποντίκια είναι πολυκλωνικά και µελλοντικά ικανά να αναγνωρίζουν ποικίλα αυτοαντιγόνα. [5] Πολλά αποτελέσµατα δείχνουν τον µυελό του θύµου ως το σηµείο της θετικής επιλογής των CD25 + CD4 + Tregs κυττάρων, παρόλο που ο ρυθµιστικός φαινότυπος εµφανιζόταν µόνο όταν τα κύτταρα έφταναν στο στάδιο της µονής θετικής κατάστασης, η οποία είναι αργά στη διαδικασία επιλογής. [5,22] Άλλες µελέτες έδειξαν το φλοιό του θύµου ως το σηµείο της θετικής επιλογής των CD25 + CD4 + Tregs κυττάρων, κυρίως λόγω της έκφρασης των MHC II µορίων από τα φλοιικά επιθηλιακά κύτταρα του θύµου. Βοηθητικά µόρια, όπως CD28, B7 και CD40, εκφράζονται στα αναπτυσσόµενα θυµοκύτταρα και θυµικά στρωµατικά κύτταρα και συντελούν στη θυµική δηµιουργία των CD25 + CD4 + Tregs. [5,23] Από εκεί και έπειτα, κάποια δεδοµένα υποδεικνύουν πως αυτά τα κύτταρα επιλέγονται αρνητικά στον µυελό και εξαλείφονται, αν και είναι λιγότερο ευαίσθητα από τα CD25 ανάλογα τους στην αγωνιστικά επαγόµενη κλωνική έκλειψη. Για το λόγο αυτό, η επιλογή των Tregs µοιάζει µε τη διαδικασία επιλογής των άλλων θυµοκυττάρων, µε µόνη διαφορά τη συγγένεια των αλληλεπιδράσεων. [5,9] εν είναι γνωστό γιατί κάποια θυµοκύτταρα διαφεύγουν της αρνητικής επιλογής και διαφοροποιούνται σε Τregs. Προτάθηκε πως ειδικού εύρους αποτελέσµατα συγγένειας και στην επιλογή των Tregs και στην παράδοση κάποιων σηµάτων οδηγούν τα κύτταρα αυτά στην ανεργία και την ικανότητα παραγωγής αντιαποπτωτικών µορίων που τα προστατεύουν από αρνητική επιλογή. [5] Η παρουσία στον ανθρώπινο εµβρυικό και νεογέννητο θύµο υποπληθυσµών ώριµων CD4 + ή CD8 + θυµοκυττάρων που εκφράζουν υψηλά επίπεδα CD25 και έχουν τα ίδια χαρακτηριστικά µε τα κυκλοφορούντα CD4 + CD25 high ρυθµιστικά κύτταρα δείχθηκε πρόσφατα. Κανένα καταληκτικό δεδοµένο όµως δεν υπήρξε για το αν τα Tregs ακολουθούν ένα αναπτυξιακό µονοπάτι ως ξεχωριστή γενιά ή αν δηµιουργούνται µε διαφορές στη σηµατοδότηση κατά την επιλογή TCR. είχθηκε πως στους ανθρώπους στον εµβρυικό θύµο απαιτείται το µόριο CD25 κατά τη εβδοµάδα της κύησης, στο CD1a + στάδιο κατά την απόκτηση της έκφρασης του CD27 από τα CD4 + CD8 + διπλά θετικά θυµοκύτταρα. Επιπλέον, τα πρώτα CD8 + CD25 + κύτταρα εντοπίζονται στο έµβρυο στο επακόλουθο CD1a + CD27 + στάδιο. Τελικά, στο πιο ώριµο CD1a - CD27 + στάδιο µόνο τα CD4 + CD8 + διπλά θετικά και τα CD4 + µονά θετικά θυµοκύτταρα εκφράζουν υψηλά επίπεδα CD25, ενώ ένα µικρό ποσοστό των CD8 + µονά θετικών κυττάρων δείχνουν χαµηλότερη έκφραση επιπέδων CD25. [5] Κατόπιν της εξόδου από το θύµο, σύµφωνα µε κάποιους ερευνητές, τα Tregs φαίνεται να εισέρχονται στην κυκλοφορία ως αθώα CD45RA + GITR - T κύτταρα, 12

13 πραγµατικά ικανά να καταστείλουν πολλαπλασιασµό ή πολυκλωνική ενεργοποίηση αποτελεσµατικών κυττάρων αλλά ακόµη χωρίς τη δυνατότητα να αντιδρούν, ή να καταστέλλουν αποκρίσεις σε αυτοαντιγόνα. Αυτό συµβαίνει µετά τη µετατόπιση εντός των δευτερογενών λεµφικών οργάνων, όπου αποκτούν ένα φαινότυπο πιο µνηµονικού τύπου. Παρόλα αυτά, δε µπορεί να εξαιρεθεί ότι κάποια συµβατικά CD4 + CD25 - Tregs κύτταρα µετατρέπονται σε CD4 + CD25 + Tregs στην περιφέρεια. Ως αποτέλεσµα, τα ενεργοποιηµένα Tregs κύτταρα εκφράζουν CD69, GITR και CD45RO και είναι ικανά να καταστείλουν µιας ευρείας κλίµακας αποκρίσεων, κυρίως λόγω των αυτοδραστικών Τ αποτελεσµατικών κυττάρων που διαφεύγουν από τις επιλογές στο θύµο. [5] Η σηµασία του θύµου στην παραγωγή των Tregs φαίνεται από αποτελέσµατα θυµεκτοµής. Θυµεκτοµή σε νεογέννητα ποντίκια για παράδειγµα, οδηγεί σε αυτόµατη ανάπτυξη πολυοργανικών αυτοάνοσων ασθενειών συµπεριλαµβανοµένων της γαστρίτιδας, του θυροειδούς και της ωοθηκίτιδας σε επιλεγµένα µυικά στελέχη που µπορούν να ξεπεραστούν µε την προσαρµοσµένη µεταφορά CD4 + CD25 + κυττάρων από φυσιολογικά ποντίκια. Επιπλέον, θυµεκτοµή σε ενήλικες και επακόλουθη ακτινοβόληση προκαλεί τύπου 1 διαβήτη και θυρεοειδίτιδα σε κάποια στελέχη αρουραίων, ενώ εµβολιασµός µε CD4 + Τ κύτταρα από ιστοσυµβατά φυσιολογικά ζώα αποτρέπει αποτελεσµατικά τον τύπου 1 διαβήτη. [6] Είναι σαφές ότι τα θυµικά Tregs εµπλέκονται στους ενεργούς µηχανισµούς της περιφερικής ανοχής των αυτοδραστικών Τ κυττάρων που διέφυγαν της αρνητικής επιλογής στο θύµο. [5,6] Τέλος, όπως προαναφέρθηκε, τα προσαρµοσµένα Tregs δηµιουργούνται µεν στο θύµο αλλά διαφοροποιούνται και αποκτούν τις κατασταλτικές δράσεις τους στην περιφέρεια κάτω από συγκεκριµένες συνθήκες που τυπικά περιλαµβάνουν Τ κυτταρική ενεργοποίηση παρουσία ανοσοτροποποιητικών κυτταροκινών ή επαναλαµβανόµενων ερεθισµάτων µε µη επαγγελµατικά ΑΠΚ. Αυτός είναι και ο λόγος που πολλές φορές αναφέρονται ως εξωθυµικά δηµιουργηµένα Tregs. Εικόνα 4: Έλεγχος των ανοσιακών αποκρίσεων από φυσικής προέλευσης και επαγώµενα Tregs. [14] 13

14 Πράγµατι, µεγάλη είναι η επιρροή των δενδριτικών κυττάρων στην εξωθυµική ανάπτυξη των ρυθµιστικών κυττάρων. Τα µέχρι τώρα µοντέλα της βασισµένης στα δενδριτικά ανοχής δηλώνουν ότι η αναγνώριση του αντιγόνου από τα Τ κύτταρα σε ανώριµα δενδριτικά οδηγεί σε ανεκτικότητα ενώ µε ώριµα δενδροκύτταρα προκαλούν αποτελεσµατικές αποκρίσεις. Ένα σύστηµα φτιαγµένο µε αυτόν τον τρόπο θα ήταν αποτελεσµατικό στη διατήρηση της αυτοανοχής στη φυσιολογική δυναµική ισορροπία, απουσία δηλαδή φλεγµονωδών σηµάτων κινδύνου, ενώ θα στήριζε παραγωγικές άνοσες αποκρίσεις ακολουθούµενες από ωρίµανση των δενδριτικών πυροδοτηµένη από την παρουσία µικροβίων. Παρόλα αυτά, θα υπήρχε πάντα ο πιθανός κίνδυνος τα δενδριτικά κύτταρα να ωρίµαζαν κατά τη διάρκεια άσηπτης φλεγµονής, όπως κατόπιν µηχανικής βλάβης, που θα µπορούσαν να εξάγουν ανοσία σε αυτοαντιγόνα. Παροµοίως, η αυτοανοχή θα µπορούσε θεωρητικά να διαταραχθεί από αυτοαντιγόνα που παρουσιάζονται σε δενδριτικά κύτταρα που ωρίµασαν λόγω σύγχρονης µικροβιακής µόλυνσης. [6] Φαίνεται όµως πως το ανοσιακό σύστηµα µπορεί να έχει ένα ακόµη επίπεδο ελέγχου για την προστασία έναντι διαφόρων ειδών σεναρίων. Σε στήριξη αυτού, αναφέρθηκε πρόσφατα ότι η απόκριση των συµβατικών CD4 + Τ κυττάρων σε αυτόλογα πεπτίδια παρουσιασµένα από ώριµα, αλλά όχι από ανώριµα δενδριτικά οδηγεί σε δηµιουργία κυττάρων που µοιάζουν µε τα Tregs. Αν επιβεβαιωθεί, αυτή η ικανότητα του ανοσιακού συστήµατος να αλλάζει τόσο δραµατικά την απόκριση του ανάλογα µε το είδος του αντιγόνου που αναγνωρίζεται είναι ιδιαίτερα αξιοθαύµαστη, ειδικά δεδοµένου του φαινότυπου των σχετικά ώριµων δενδριτικών κυττάρων. Πιθανότατα οι ακολουθούµενες αποκρίσεις σχετίζονται µε τη φύση της πηγής των βοηθητικών σηµάτων όπως ποιος TLR έχει δεσµευτεί, µόνος ή σε συνδυασµό. [6] Στους ανθρώπους πολλές είναι οι κλινικές παρατηρήσεις που υποστηρίζουν τη σύνδεση µεταξύ µειωµένης θυµικής λειτουργίας και κατεστραµµένης δηµιουργίας Tregs και επαγωγή αυτοάνοσων ασθενειών: [23] Παιδιά µε θυµική υποπλασία λόγω διαγραφής του 22q.2 εµφανίζουν κατεστραµµένη δηµιουργία Tregs και διατρέχουν υψηλό κίνδυνο εµφάνισης αυτοάνοσων ασθενειών. [23] Ένας µεταγραφικός παράγοντας, ο AIRE, βρέθηκε πρόσφατα στον ανθρώπινο θύµο. Η κύρια λειτουργία του είναι να προωθεί την εκτοπική έκφραση ιστοειδικών αυτοαντιγόνων (ινσουλίνη, θυρογλουβίνη, myelin basic protein, retinal antigen κ.α.) στα επιθηλιακά κύτταρα του µυελού του θύµου. Αυτό οδηγεί στη ρύθµιση της ανοχής σε πολλά όργανα όπως το πάγκρεας και το θυρεοειδή αδένα. Ένας ρόλος κλειδί για το AIRE στην αυτοανοσία πιστοποιήθηκε από την ανακάλυψη ότι ποντίκια µε ανεπάρκεια AIRE εµφανίζουν µια ποικιλία αυτοάνοσων διαταραχών. Στους ανθρώπους, µεταλλάξεις του AIRE οδηγούν σε APECED (autoimmune polyendocrinopathy candidiasis ectodermal dystrophy). [23-25] Μείωση της θυµικής λειτουργίας έχει αναφερθεί σε ασθενείς µε πολλαπλή σκλήρυνση και ρευµατοειδή αρθρίτιδα, που εµφανίζουν µειωµένους αριθµούς Trecs υποδεικνύοντας µειωµένη θυµική απόδοση. Ο αριθµός των Trecs µειώνεται επίσης εκθετικά µε την πάροδο των χρόνων και µείωση των Trecs (T-cell receptor excision cycles) σε νεαρούς ασθενείς µε αυτοάνοσες ασθένειες υποδεικνύει πρόωρη γήρανση του θύµου. Καθώς η λειτουργία των Tregs µειώνεται µε τη θυµική γήρανση, είναι λογικό η επαγωγή των Tregs στους πρόωρα γηρασµένους θύµους ασθενών µε αυτοάνοσες ασθένειες να είναι λιγότερο αποτελεσµατική, και τα µη 14

15 ρυθµιστικά Τ κύτταρα που φέρουν έναν αυτοδραστικό TCR µπορεί να διαφύγουν της θυµικής επιλογής µε µεγαλύτερη συχνότητα. [23] 1.3. Φαινότυπος Τregs Τα φυσικά CD4 + Tregs εκφράζουν ιδιοσυστατικά µια ποικιλία µορίων κυτταρικής επιφάνειας όπως είναι τα CD25, CD122, CD132, CD71, CD95, HLA-DR, CD62L, CD45RB low /CD45RO, CD45RC low, CD38, CD127 low, µέλη των TNFR (GITR, TNFR2, OX40, 4-1BB), CTLA-4 και ICOS, DX5, Ly6, galectin-1, PD-L1, TGF-βR1, neuropilin-1, LAG-3, ιντεγκρίνες και υποδοχείς χυµοκινών. [2,5,6,14,23,26-29] Εκφράζουν επίσης υψηλά επίπεδα άλλων βοηθητικών µορίων όπως τα CD5, CD44, LFA-1 και ICAM-1. [14,28] Τα κυριότερα µόρια βάσει των οποίων αναγνωρίζονται και περιγράφονται είναι τα CD25 (CD25 high ), CD127 (CD127 low ), GITR και CTLA-4. Εικόνα 5: Φαινότυπος Tregs ( Αν και οι περισσότεροι από τους παραπάνω δείκτες ρυθµίζονται θετικά µετά την ενεργοποίηση των Τ κυττάρων και κανένας από αυτούς, ανεξάρτητα από τις ρυθµιστικές δυνατότητες τους, δεν εκφράζεται µοναδικά στα φυσικά CD4 + Τ κύτταρα, τα επίπεδα έκφρασης τους και η ιδιοσυστατική φύση τους στα Τregs τα έκαναν χρήσιµα ως περιγραφικούς παράγοντες επιτρέποντας την αποµόνωση και διερεύνηση των ρυθµιστικών ιδιοτήτων τους. [6,23] Η ανακάλυψη ενός αδιαµφισβήτητου δείκτη επιφάνειας στα φυσικά CD4 + Tregs παραµένει το ιερό δισκοπότηρο, ειδικά όπου επιδιώκεται η αποµόνωση ανθρώπινων Tregs για κλινικούς σκοπούς. [6] Ο φαινότυπος της επιφάνειας των φυσικών Tregs υποδεικνύει ότι είναι σε µια κατάσταση αρχικής επαφής µε το αντιγόνο και τουλάχιστον επιφανειακά, µοιάζουν µε τα µνηµονικά/ενεργοποιηµένα Τ κύτταρα. [5,6] Ο φαινότυπος και η λειτουργία των Tregs κυττάρων διατηρείται σταθερός µετά τη διέγερση µε αντιγόνο και τη κυτταρική διαίρεση in vitro και in vivo. Γι αυτό, αν και µεγαλώνουν in vitro παρουσία εξωγενούς IL-2, αυτά τα επεκταµένα κύτταρα ξαναγίνονται ανεργικά και µε κατασταλτικές ιδιότητες όταν αποµακρυνθεί η IL-2. [2] 15

16 Στο θύµο του εµβρύου τα CD4 + CD25 + Τ κύτταρα έχουν επιφανειακά χαρακτηριστικά παρόµοια µε αυτά που αναφέρθηκαν για τα µετεµβρυικά θυµοκύτταρα: έκφραση GITR, CD122 και ενδοκυτταρικού CTLA-4. Επίσης τα CD8 + CD25 + θυµοκύτταρα που αναπτύσσονται στο θύµο του εµβρύου έχουν πολλά κοινά χαρακτηριστικά µε τα CD4 + CD25 + ανάλογα τους, καθώς και µε τα CD8 + CD25 + Tregs που εντοπίζονται στον µετεµβρυικό θύµο. Να σηµειωθεί πως τα CD25 + εµβρυικά θυµοκύτταρα έχουν την προοπτική να καταστείλουν την πολλαπλασιαστική απόκριση των αυτόλογων CD25 - Τ κυττάρων σαν ώριµα φυσικά Tregs κύτταρα. [5] Επίσης, τα φυσικά Tregs έχουν µικρά τελοµερή υποδεικνύοντας πως αυτά τα κύτταρα έχουν υποστεί επαναλαµβανόµενα επεισόδια διέγερσης από αντιγόνα in vivo. Επιπλέον στοιχεία για in vivo ενεργοποιήσεις προέρχονται από τα Trecs (T-cell receptor excision circles), ένα µέτρο της περιφερικής επέκτασης τους που ακολουθεί της εξόδου από το θύµο, το οποίο δείχνει επίσης ότι τα φυσικά Tregs υφίστανται υψηλά επίπεδα περιφερικής επέκτασης. [14,23] CD25 Το CD25 ήταν ο πρώτος και ο καλύτερος δείκτης επιφάνειας για παραγόµενα στο θύµο CD4 + Tregs. [6,30] Πολλές πρόσφατες µελέτες έδειξαν καθαρά ότι είναι δείκτης της χρονικά ενεργής κατάστασης τους που όµως µπορεί να εκφραστεί σε κάθε ενεργοποιηµένο Τ κύτταρο δηµιουργώντας προβλήµατα αναγνώρισης τους στο ανθρώπινο σύστηµα, όπου υπάρχουν σχετικά µεγάλοι αριθµοί ενεργοποιηµένων Τ κυττάρων. [6,30] Για το λόγο αυτό, ο καλύτερος τρόπος να επιλεγούν φυσικά ανθρώπινα CD4 + Tregs είναι να επιλεγεί ο πληθυσµός που εκφράζει πολύ υψηλά επίπεδα CD25. [6] Η υψηλή ιδιοσυστατική έκφραση του CD25 από τα Tregs γεννά το ερώτηµα αν είναι απλά ένας καλός δείκτης ή ένα µόριο σηµαντικό για τη λειτουργία τους. Πολλές σειρές δεδοµένων υποδεικνύουν πως το CD25 είναι απαραίτητο για τη διατήρηση των φυσικών CD25 + CD4 + Tregs στο ανοσιακό σύστηµα. Έχει δειχθεί για παράδειγµα ότι ποντίκια µε έλλειψη IL-2, IL-2Rα (CD25) ή IL-2Rβ (CD122) αναπτύσσουν θανατηφόρες φλεγµονώδεις ασθένειες, το επονοµαζόµενο σύνδροµο ανεπάρκειας IL- 2, το οποίο µπορεί να αποτραπεί µε εµβολιασµό µε φυσικά CD25 + CD4 + T κύτταρα όσο παρέχεται πηγή IL-2 πειραµατικά. [6,30] Πειράµατα δείχνουν πως εξουδετέρωση της κυκλοφορούσας IL-2 µειώνει επιλεκτικά τον αριθµό των CD25 + CD4 + T κυττάρων σε φυσιολογικά ποντίκια και συνεπώς προκαλεί οργανοειδικές αυτοάνοσες ασθένειες παρόµοιες µε εκείνες που παράγονται µε την εξάλειψη των φυσικών Tregs, δείχνοντας πως η IL-2 είναι σηµαντική για την ανάπτυξη, διατήρηση και λειτουργία των CD25 + CD4 + Tregs στην περιφέρεια. [6,30] TNF/TNFR Η σηµατοδότηση TNF/TNFR είναι µεγάλης σηµασίας για τη δράση των Tregs. Στην υπεροικογένεια των TNFR περιλαµβάνονται µόρια όπως τα GITR, CD40, TNFR2, OX40 και 4-1ΒΒ. 16

17 Εικόνα 6: Σηµατοδότηση TNF-TNFR ( Το GITR (TNFRSF18) εκφράζεται στα Tregs σε µεγαλύτερα επίπεδα σε σχέση µε άλλα Τ κύτταρα αλλά όπως τα πιο πολλά υποψήφια µόρια για την αναγνώριση των Tregs, η έκφραση του ρυθµίζεται θετικά σε συµβατικά ενεργοποιηµένα CD4 + T κύτταρα. [1,4-6,15,27] Πρόκειται για ένα κυτταροπλασµατικό µόριο 70 kd που εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα στην επιφάνεια των ηρεµούντων φυσικών Tregs στην περιφέρεια και στο θύµο. Στερείται της ενδοκυτταρικής δοµής θανάτου, η οποία απαιτείται για την επαγωγή της απόπτωσης και για το λόγο αυτό, η πρόσδεση του GITR προκαλεί ενίσχυση της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου. [1,5,6,27,31] Πιστεύεται µάλιστα πως το µόριο αυτό καθιστά τα CD4 + CD25 + θυµοκύτταρα ανθεκτικά στην αρνητική επιλογή στο θύµο καθώς µπορεί να µετατρέψει Τ κύτταρα και θύµου και περιφέρειας σε ανθεκτικά σε επαγόµενη από TCR απόπτωση προωθώντας την ανάπτυξη των φυσικών Tregs κυττάρων. [27] Επίσης, το GITR µεσολαβεί σε ενδοκυττάρια σηµατοδότηση µε την επιστράτευση των TRAF (TNF receptor associated factor) πρωτεϊνών στα κυτταροπλασµατικά τους άκρα οδηγώντας σε θετική ρύθµιση του CD69 και του CD25, και ενίσχυση της παραγωγής των κυτταροκινών IL-2, IFN-γ, IL-4 και ιδιαίτερα της IL-10. [27,31] Επιπλέον, η σύνδεση του GITR µπορεί να πυροδοτήσει την επαναπροσανατολιζόµενη κυτταροτοξικότητα από αντι-cd3, ERK φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση του NFkB. [31] Το GITR όταν αλληλεπιδρά µε το συνδέτη του ή αγωνιστικά αντισώµατα καταργεί την κατασταλτική δράση των φυσικών Tregs. [27] Αντι-GITR mab (DTA-1) είναι σε θέση να ενισχύει τις άνοσες αποκρίσεις in vitro και in vivo µπλοκάροντας τη καταστολή των CD25 + CD4 + Tregs in vitro, καθιστώντας τα Τeff κύτταρα ανθεκτικά στις κατασταλτικές δράσεις των Tregs, ή και τα δύο. [1,5,6] Επιπλέον, η έγχυση του προκαλεί την επαγωγή αυτοανοσίας in vivo καθώς αυξάνει τον πολλαπλασιασµό των CD25 - CD4 + κυττάρων µέσω µεταγωγής συνδιεγερτικού σήµατος [5,6] 17

18 Πιο συγκεκριµένα, αρχικά είχε υποτεθεί πως το DTA-1, από τη στιγµή που είναι µη εξαλειπτικό, µετέφερε ένα σήµα µπλοκαρίσµατος της καταστολής στα CD25 + CD4 + Tregs. Παρόλα αυτά, κάποια πολύ πρόσφατα δεδοµένα προτείνουν αντ αυτού ότι η σύνδεση του GITR σε ενεργοποιηµένα Τ κύτταρα, µη Tregs, τα καθιστά ανθεκτικά σε καταστολή. [6] Άλλα στοιχεία που συνηγορούν στο ότι η διέγερση µέσω GITR µπορεί να κάνει τα αποτελεσµατικά Τ κύτταρα ανθεκτικά στην Tregs καταστολή είναι ότι ο πολλαπλασιασµός των GITR-ανεπαρκή CD25 - T κυττάρων µπορεί να ανασταλεί µε αγρίου τύπου Tregs ακόµα και παρουσία αγωνιστικών αντι- GITR αντισωµάτων και ότι η ένεση αγωνιστικών αντι-gitr αντισωµάτων σε ποντίκια µε όγκους οδηγεί σε εκρίζωση του όγκου. [1] Επίσης δείχθηκε πως, ενώ παρουσία Tregs τα CD8 + T κύτταρα αποτυγχάνουν να παράγουν IFN-γ και δε µειώνουν το ιικό φορτίο, η καταστολή καταργείται µε χρήση αντι-gitr αντισωµάτων, οδηγώντας σε επανάκτηση της ικανότητας παραγωγής IFN-γ και σηµαντική µείωση του ιικού φορτίου. [31] Ο φυσικός συνδέτης του GITR (GITRL) έχει πλέον κλωνοποιηθεί και η κατανοµή του έχει διαλευκανθεί. [6] Εκφράζεται στα ΑΠΚ (δενδριτικά, µακροφάγα και Β κύτταρα) και η έκφραση του, η οποία ρυθµίζεται αρνητικά µετά την ωρίµανση, µπορεί να ρυθµιστεί από τον µεταγραφικό παράγοντα NF-1 και µε εναλλακτικό µάτισµα. [1,6,27,31] Ο GITRL παρέχει ένα σηµαντικό σήµα στα CD25 - T κύτταρα, καθιστώντας τα ανθεκτικά στη ρύθµιση από φυσικά Tregs κατά την έναρξη των ανοσιακών αποκρίσεων, κάτι που αποδεικνύεται και από το γεγονός ότι οι GITRLs ρυθµίζονται αρνητικά από φλεγµονώδες ερέθισµα ενισχύοντας την επιδεκτικότητα των Teff στην καταστολή. [23,27] Τα σχετικά µοτίβα κατανοµής του GITR σε ενεργοποιηµένα Τ κύτταρα και Tregs και του GITRL στα ΑΠΚ προτείνουν µια πολύπλοκη δυναµική αλληλεπίδραση η οποία τώρα ερευνάται. [6] Εικόνα 7: Καταστολή µέσω GITR. [46] 18

19 Ένα άλλο µέλος της οικογένειας των TNFR είναι το CD40. Το CD40 είχε µελετηθεί αρχικά γιατί είναι επαγωγέας σήµατος για τη λειτουργία των Β κυττάρων και την ενεργοποίηση των µονοκυττάρων και δενδριτικών. Επίσης, παίζει ρόλο και µάλιστα σηµαντικό κατά τη διάρκεια φλεγµονής και εκφράζεται και από µη αιµοποιητικά κύτταρα όπως τα επιθηλιακά και ενδοθηλιακά του θύµου. Κατόπιν ενεργοποίησης ρυθµίζεται θετικά σε δενδριτικά και µονοκύτταρα και τα CD154 + (CD40L) Τ κύτταρα µπορούν να επάγουν τη διαφοροποίηση και ενεργοποίηση, καθώς και την αυξηµένη έκφραση των MHC, συνδιεγερτικών και προσκόλλησης µορίων και παραγωγή κυτταροκινών. Πρόσφατες µελέτες επικεντρώθηκαν στον πιθανό ρόλο του CD40 στην επαγωγή ανοχής έναντι µοσχεύµατος και δηµιουργία Tregs. [31] Καθώς η σύνδεση του CD40 στα Β κύτταρα και στα ΑΠΚ οδηγεί σε ενεργοποίηση και ωρίµανση τους, ανεπάρκεια CD40L σε NOD ποντίκια έδειξε να αναστέλλει την ενεργοποίηση των CD8 + T κυττάρων. Η καταστολή της ασθένειας συνδέθηκε µε την αναστολή της ωρίµανσης των δενδριτικών ενώ τα CD40L + Th κύτταρα κατάργησαν την προστασία όπως τα ενεργοποιηµένα δενδριτικά, το CpG DNA, ή το αντι- CD40mAb. Αυτές οι παρατηρήσεις προτείνουν πως η CD40 σηµατοδότηση απελευθερώνει τα ανώριµα δενδριτικά από την καταστολή των CD4 + CD25 + T κυττάρων, οδηγώντας σε εξέλιξη της ασθένειας. [31] Εναλλακτικά, µελέτες έδειξαν πως NOD ποντίκια µε ανεπάρκεια CD40 είχαν µειωµένους αριθµούς Tregs, τα οποία δεν ήταν λειτουργικά όταν ελέγχονταν in vitro και προσθήκη CD40-αγωνιστικού αντισώµατος απουσία CD40L προκαλούσε µια συστηµατική και ιστοειδική αύξηση των Tregs. Η παρουσία CD40 ή διεγερµένων µε TNF-α ΑΠΚ δεν επηρέαζε την ικανότητα των Tregs να καταστέλλουν ειδικά τα CD8 + T κύτταρα σε περιβάλλον µε επάρκεια CD40L. Από όλα αυτά µαζί, φαίνεται ανάγκη για αλληλεπίδραση CD40-CD40L στην καταστολή της αποτελεσµατικής φάσης των ανοσιακών αποκρίσεων. Έκφραση και της TNF-α και συνδιεγερτικών µορίων Β7.1 στα πανγκρεατικά νησίδια µπορούν να ξεπεράσουν την απαίτηση για CD40 CD40L συνδιέγερση των παθογονικών CD8 + T κυττάρων. Ποντίκια µε ανεπάρκεια TNF/B7-1/CD40L αναπτύσσουν ραγδαία διαβήτη, ενώ ποντίκια µε επάρκεια CD40L όχι. [31] Η εξέλιξη της ασθένειας συµπίπτει µε µειωµένους αριθµούς των Tregs στα νησίδια και στους παγκρεατικούς λεµφαδένες σε CD40L ανεπαρκή αλλά όχι σε CD40L επαρκή ποντίκια. [18,31] Ενδιαφέρων είναι το γεγονός ότι TNF/B7-1 CD40L ανεπαρκή CD8 κύτταρα είναι ανθεκτικά σε ρύθµιση από τα Tregs in vivo, ενώ προσθήκη αγωνιστικού αντι-cd40l επάγει µια συστηµατική και ιστοειδική αύξηση του αριθµού των Tregs, που αποτυγχάνουν να καθυστερήσουν την ανάπτυξη του διαβήτη απουσία CD40L. Αυτές οι παρατηρήσεις εντείνουν τη πιθανότητα ότι το CD40 δεν εµπλέκεται άµεσα στην µέσω Tregs καταστολή αλλά αντ αυτού, µπορεί να κάνει τα Τ κύτταρα στόχους να επιδέχονται σήµατα καταστολής από τα Tregs. [31] Το πιο κοντινό οµόλογο των CD40 CD40L εντός της οικογένειας TNF είναι το µονοπάτι RANK RANKL. Πράγµατι, σε διαγονιδιακά µοντέλα, µπλοκάρισµα του µονοπατιού µε διαλυτό RANK-Fc µείωσε τους αριθµούς των CD4 + CD25 + T κυττάρων σε λεµφαδένες κοντά στο πάγκρεας οδηγώντας σε διαβήτη. [18] Το 4-1ΒΒ (CD137) -µέλος της οικογένειας TNFR (TNFRSF9)- έχει συνδιεγερτικό ρόλο στην ενεργοποίηση και διατήρηση της επιβίωσης των CD4, CD8 και ΝΚ κυττάρων. [15,27] Το 4-1ΒΒ εκφράζεται και στα φυσικά Tregs. Μπορεί να επάγει τον πολλαπλασιασµό των Tregs τόσο in vitro όσο και in vivo. Τα επεκταµένα 4-1ΒΒ Tregs είναι λειτουργικά, καθώς παραµένουν κατασταλτικά για άλλους Τ πληθυσµούς 19

20 σε συγκαλλιεργούµενα συστήµατα. Συνολικά, το 4-1ΒΒ µπορεί να συνδέεται µε την επέκταση των φυσικών Tregs. [27] Το ΟΧ40 (CD134) -µέλος της οικογένειας TNFR (TNFRSF4)- εκφράζεται παροδικά στα αποτελεσµατικά Τ κύτταρα κατόπιν TCR πυροδότησης και εκφράζεται τόσο από αθώα όσο και από ενεργοποιηµένα φυσικά Tregs. [15,27,32] Το ΟΧ40 δείχθηκε να συνδιεγείρει τις CD4 + T κυτταρικές αποκρίσεις και συνδέεται µε αυξηµένη Τ κυτταρική επέκταση και αποτελεσµατική λειτουργία, αυξηµένη επιβίωση των Τ κυττάρων και ενίσχυση της ανάπτυξης των µνηµονικών κυττάρων. [32] Το ΟΧ40 συµµετέχει στην ανάπτυξη και οµοιόσταση των φυσικών Tregs καθώς βρέθηκε πως ο αριθµός των φυσικών Tregs µειώνεται στον σπλήνα ποντικιών µε ΟΧ40 ανεπάρκεια, ενώ αυξάνεται σε σπλήνες ποντικιών που υπερεκφράζουν τον συνδέτη τους, OX40L. Πέραν της οµοιοστατικής λειτουργίας του όµως, το ΟΧ40 συµβάλει και στις αποτελεσµατικές καταστολές µέσω Tregs. Αναφορές έδειξαν πως σηµατοδότηση από ΟΧ40 στα Tregs µπορεί να ελέγξει την µέσω Tregs καταστολή του πολλαπλασιασµού των CD4 + T κυττάρων, τη µεταγραφή του γονιδίου της IL-2 και την παραγωγή κυτταροκίνης και απουσία του η καταστολή των Τ κυτταρικών αποκρίσεων από τα φυσικά Tregs καταστρέφεται σε µεγάλο βαθµό. [27] Ο ρόλος όµως της ΟΧ40 συνδιέγερσης στην µέσω Tregs καταστολή πρέπει να µελετηθεί περαιτέρω. [32] CD28/B7 Η σηµατοδότηση Β7/CD28 είναι επίσης µεγάλης σηµασίας για τη δράση των Tregs και για τη διατήρηση της οµοιόστασης τους. [18,32] Η Β7 οικογένεια αποτελείται από τύπου Ι διαµεµβρανικές πρωτεΐνες που µπορούν να µεσολαβήσουν στην συνδιεγερτική ή κατασταλτική δράση. Τέτοια είναι τα Β7.1 (CD80), B7.2 (CD86) και Β7RP1. Η CD28 οικογένεια, η οποία ανήκει στην TNF υπεροικογένεια, αποτελείται από τα µόρια ICOS, CTLA-4 και φυσικά CD28. [31] Πέραν της σηµατοδότησης από τον TCR χρειάζεται ένα ακόµα σήµα προκειµένου να επέλθει αποτελεσµατική ανοσιακή απόκριση. Το σήµα αυτό προέρχεται από ένα συνδιεγερτικό υποδοχέα CD28 [3] Η CD28 συνδιέγερση εµπλέκεται σε µεγάλου φάσµατος Τ κυτταρικές αποκρίσεις, συµπεριλαµβανοµένου του πολλαπλασιασµού των Τ κυττάρων, της παρεµπόδισης της ανεργίας, της επαγωγής αντιαποπτωτικών παραγόντων όπως ο Bcl-xL και της ρύθµισης της Th1/Th2 ισορροπίας. Πιο συγκεκριµένα, δείχθηκε πως η πρόσδεση του CD28 ενισχύει την παραγωγή IL-2 αλλά διεγείρει και την παραγωγή Th2 κυτταροκινών όπως είναι IL-4 και η IL-5. Από τη άλλη, διαταραχή του µονοπατιού CD28/B7 µε χρήση αντισωµάτων που το µπλοκάρουν, ή σε ποντίκια µε ανεπάρκεια CD28 ή σε ποντίκια µε ΑΠΚ µε ανεπάρκεια Β7, εµποδίζει την παραγωγή IL-4 και IL-5 ενώ έχει µικρή επίδραση στην INF-γ. Επιπλέον, το CD28 παίζει σηµαντικό ρόλο στη διαφοροποίηση των Β κυττάρων και της παραγωγής αντισωµάτων µέσω ελέγχου από τα Τ κύτταρα. Τέλος, το CD28 κατευθύνει και τη µετανάστευση των Τ κυττάρων σε περιοχές φλεγµονής µέσω της επαγωγής της παραγωγής ειδικών χυµοκινών και ρύθµισης υποδοχέων χυµοκινών. [33] 20

21 Εικόνα 8: Σχηµατική αναπαράσταση των αντίθετων επιδράσεων του CD28 στις ανοσιακές αποκρίσεις. [33] Τα συνδιεγερτικά µόρια Β7.1 (CD80) και Β7.2 (CD86) είναι οι συνδέτες του CD28 και ρυθµίζονται θετικά στα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα µετά την έκθεση σε µικροβιακά προϊόντα που αναγνωρίζονται από υποδοχείς εξελικτικά διατηρηµένους. [3] Συγκεκριµένα, ο Β7.2 είναι ο επικρατής προσδέτης του CD28 στην έναρξη της ανοσιακής απόκρισης. [33] Το CTLA-4 έχει 30% οµολογία µε το CD28 και προσδένει τους ίδιους συνδέτες, Β7.1 και Β7.2, στα ΑΠΚ. Το CTLA-4 εκφράζεται µόνο στα Tregs και η θετική του ρύθµιση εξαρτάται από CD28 συνδιέγερση. [1,33] Τα ICOS είναι ένα πρόσφατο µόριο της CD28 οικογένειας που έχει 20% οµολογία µε το CD28 και προσδένεται στο B7RP-1 στα ΑΠΚ. Παροµοίως µε το CTLA-4, το ICOS δεν εκφράζεται από τα αθώα Τ κύτταρα αλλά ρυθµίζεται θετικά κατόπιν της TCR ενεργοποίησης. [33] CD127 Σε µια προσπάθεια να βρεθούν νέοι δείκτες για τα ανθρώπινα Tregs παρατηρήθηκε ότι το CD127 -δηλ η α αλυσίδα του υποδοχέα της IL-7 (IL-7Ra)- ρυθµίζεται αρνητικά σε όλα τα ανθρώπινα Τ κύτταρα µετά την ενεργοποίηση και σε αντίθεση µε την αναφερόµενη επανέκφραση του στην πλειοψηφία των αποτελεσµατικών και µνηµονικών Τ κυττάρων, τα FoxP3 + Τ κύτταρα παρέµεναν CD127 low/-. [26,34,35] Το παραπάνω χαρακτηριστικό προφίλ έκφρασης σύµφωνα µε τον Seddiki και τους συνεργάτες του παρατηρείται επειδή τα Tregs κύτταρα, που απαιτούν IL-2 για να επιβιώσουν, µπορεί να µη χρειάζονται την IL-7 ή τον υποδοχέα της CD127 σε σχέση µε τα µη ρυθµιστικά που είναι µεν ανεξάρτητα της IL-2 αλλά απαιτούν IL-7. [26,35] Παράλληλα, ο Liu και οι συνεργάτες του µε µελέτες ανάλυσης του προφίλ έκφρασης 21

22 γονιδίων των CD4 + CD25 high και CD4 + CD25 - T κυττάρων έδειξαν αρνητική ρύθµιση του CD127 στα Tregs, και η µείωση αυτή του CD127 mrna επιβεβαιώθηκε και µε χρήση ποσοτικής PCR. [26] Και οι δύο παραπάνω οµάδες έδειξαν πως υπήρχε σηµαντική σύνδεση µεταξύ του FoxP3 και του CD127 low φαινοτύπου εντός του CD4 + CD25 + πληθυσµού. In vivo, τα ποικίλα επίπεδα της έκφρασης του ανθρώπινου FoxP3 δείχνουν µια αντίστροφη σχέση µε τα επίπεδα του CD127, µε τα κύτταρα που εκφράζουν τα υψηλότερα επίπεδα CD127 να έχουν και τα χαµηλότερα επίπεδα FoxP3. Αυτό µπορεί να είναι το άµεσο αποτέλεσµα της καταστολής του CD127 από το FoxP3 και/ή την συνεχή έκθεση σε αντιγόνο και τη σηµατοδότηση από το CD28 in vivo που οδηγεί σε αρνητική ρύθµιση του CD127. Πράγµατι, ο Liu και οι συνεργάτες του έδειξαν ότι ο FoxP3 προσδένεται στην περιοχή του υποκινητή του CD127 καταστέλλοντας το. [26] Σε έρευνα του Seddiki και των συνεργατών του σε ανθρώπινους ιστούς δείχθηκε ότι τα FoxP3 + κύτταρα στους λεµφαδένες ήταν CD127 low και πως αυτός ο πληθυσµός ήταν παρόµοιου µεγέθους µε τον CD25 + CD127 low πληθυσµό. Στο θύµο από την άλλη οι σχέσεις µεταξύ των δεικτών ήταν διαφορετικές όλα τα pre-t και τα ανώριµα Τ κύτταρα είναι CD25 + CD127 + και ο FoxP3 + CD127 low πληθυσµός είναι σηµαντικά µεγαλύτερος από τον CD25 + CD127 low πληθυσµό και αυτό γιατί αν και όλα τα CD4 + CD8 FoxP3 + θυµοκύτταρα ήταν CD127 low, σχεδόν τα µισά από τα θυµικά FoxP3 + στερούνταν έκφραση CD25. [26] Για τους παραπάνω λόγους, η έκφραση του CD127 στην επιφάνεια των κυττάρων είναι ένας πολύ καλός δείκτης που σε συνδυασµό µε το CD25 αλλά και άλλους επιφανειακούς δείκτες επιτρέπει την αναγνώριση και αποµόνωση των ρυθµιστικών κυττάρων Υποδοχείς γ c κυτταροκινών Κάποιες κυτταροκίνες, όπως είναι οι IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 και IL-21, είναι µέλη της οικογένειας των γ c κυτταροκινών πράγµα που σηµαίνει πως µοιράζονται την γ c αλυσίδα του υποδοχέα τους και είναι ικανές να σηµατοδοτούν µέσω αυτής. [36] Οι κυτταροκίνες αυτές φαίνονται να είναι σηµαντικές για την επιβίωση και λειτουργία των φυσικών Tregs και οι υποδοχείς τους εκφράζονται στην επιφάνεια των φυσικών Tregs. [14,36] Η έναρξη σηµατοδότησης από γ c κυτταροκίνες ενεργοποιεί το STAT5, το οποίο φαίνεται να είναι σηµαντικό για την ανάπτυξη των φυσικών Tregs και/ή την επιβίωση τους ενώ πρόσφατα δεδοµένα δείχνουν πως οι IL- 2, IL-7 και IL-15 έχουν µια µοναδική ικανότητα να επάγουν την έκφραση του FoxP3 και να διατηρούν τα ανθρώπινα φυσικά Tregs in vitro. [14] Από τις παραπάνω γ c κυτταροκίνες, η IL-7 είναι µια σηµαντική κυτταροκίνη που ο ρόλος της στην στήριξη της οµοιόστασης των αθώων Τ κυττάρων δεν είχε συνειδητοποιηθεί αρχικά λόγω του σηµαντικού ρόλου της στην πρώιµη ανάπτυξη των Tregs. Η IL-7 προσδένεται στην γ c και τη µοναδική της α αλυσίδα IL-7Ra (CD127) ενεργοποιώντας πολλά µονοπάτια µεταγωγής σήµατος όπως και των JAK1 και JAK3 (Janus kinase), MAPK, src κινασών, PI(3)-K και PKB (ή Akt) πρωτεϊνικών κινασών. [36] Η αντιαποπτωτική πρωτεΐνη Bcl-2 είναι ο πιο γνωστός καθοδικός στόχος της σηµατοδότησης από την γ c της IL-7 και θετική ρύθµιση αυτής της πρωτεΐνης από την IL-7 είναι µία από τις σηµαντικότερες επιδράσεις στην ανάπτυξη των θυµοκυττάρων. Στην πραγµατικότητα, υπερέκφραση της Bcl-2 µόνο αποκαθιστά σε µεγάλο βαθµό τον αριθµό των αθώων Τ κυττάρων σε ποντίκια µε ανεπάρκεια IL-7. [36] 22

23 Τα σήµατα της IL-7 στα Τ κύτταρα διατηρούν επίσης το µέγεθος τους και προωθούν το µεταβολισµό της γλυκόζης και των πρωτεϊνών. Αυτό είναι σηµαντικό γιατί µείωση στο µέγεθος, αυξηµένη πρωτεϊνική αποικοδόµηση µαζί µε µειωµένη σύνθεση πρωτεϊνών και µειωµένος µεταβολισµός της γλυκόζης µπορούν όλα να οδηγήσουν σε θάνατο από αµέλεια. Πιο συγκεκριµένα, µειωµένος µεταβολισµός της γλυκόζης οδηγεί σε απώλεια συστατικών που χρειάζονται τα µιτοχόνδρια για να διατηρήσουν το ηλεκτροχηµικό δυναµικό της εσωτερικής τους µεµβράνης, ζωτικής σηµασίας µηχανισµού για την βιωσιµότητα του κυττάρου. Η ΡΚΒ οικογένεια κινασών φαίνεται να είναι ο καταλληλότερος µεσολαβητής αυτών των τροφικών επιδράσεων της IL-7 καθώς πολλοί πιστοποίησαν την ικανότητα της σηµατοδότησης από την ΡΚΒ να προωθεί και τον µεταβολισµό της γλυκόζης και την πρωτεϊνική σύνθεση. Αν και αναστολείς της ΡΚΒ µπορούν να µειώσουν το µέγεθος των αθώων CD4 + T κυττάρων in vitro, φαίνεται πως ένας συνδυασµός µονοπατιών σηµατοδότησης είναι υπεύθυνος για τον έλεγχο του κυτταρικού µεταβολισµού in vivo. [36] Εικόνα 9: Πολλαπλά ενδοκυτταρικά σήµατα προερχόµενα από την IL-7 οδηγούν στη διατήρηση, τον µεταβολισµό και στο µέγεθος των CD4 + T κυττάρων. [36] Neuropilin-1 Η Nrp-1 (Neuropilin-1) είναι συνυποδοχέας ενός υποδοχέα της κινάσης της τυροσίνης και για τα µέλη της οικογένειας των VEGF (vascular endothelial growth factor) και για τα µέλη της οικογένειας των Sema (semaphoring). [27] Αρχικά περιγράφηκε ως βασικό συστατικό των ανοσολογικών συνάψεων (αξονική καθοδήγηση), αλλά παίζει σηµαντικό ρόλο και στην ενεργοποίηση, στην καρδιαγγειακή ανάπτυξη, στην αγγειογένεση και στην εξέλιξη των όγκων. [5,6,13,27] Η Nrp-1 υπερεκφράζεται ιδιοσυστατικά από τα Tregs, ανεξάρτητα της κατάστασης ενεργοποίησης τους, ενώ η έκφραση της στα Teff, είναι που είναι ήδη χαµηλή, ρυθµίζεται ιδιαίτερα αρνητικά κατόπιν της Τ κυτταρικής ενεργοποίησης. [5,6,25,27] Η NRp-1 µπορεί γι αυτό να επιτρέψει το διαχωρισµό των Teff από τα Tregs πριν και µετά την ενεργοποίηση. [19,27] Η έκφραση της Nrp1 συρρυθµίζεται µε την έκφραση του FoxP3. [25,27] Εκτοπική έκφραση του FoxP3 επάγει την έκφραση της, προτείνοντας πως η έκφραση της 23

24 συνδέεται µε τα γενετικά συµβάντα που σχετίζονται µε το FoxP3 στα Tregs. [25] Για το λόγο αυτό, τα CD4 + Nrp high κύτταρα εµφανίζουν υψηλά επίπεδα έκφρασης FoxP3 mrna και µόνο τα CD4 + Nrp1 high T κύτταρα καταστέλλουν τον πολλαπλασιασµό των αθώων CD4 + CD25 - T κυττάρων. [27] Έτσι, η Nrp1 λόγω της έκφρασης της στην επιφάνεια των Tregs, είναι εξαιρετικός δείκτης, πρέπει όµως να σηµειωθεί πως τα ανθρώπινα CD4 + CD25 high Tregs δεν εκφράζουν Nrp1. [25,27] Γαλεκτίνη-10 Πρωτεοµική ανάλυση των ανθρώπινων CD4 + CD25 + Tregs έδειξε τη γαλεκτίνη-10 να είναι ένας ειδικός ενδοκυτταρικός δείκτης των CD4 + CD25 + Tregs. Επιπρόσθετη ανάλυση έδειξε ότι sirna µείωση της έκφρασης της γαλεκτίνης-10 καταργούσε την κατασταλτική δράση των Tregs αλλά χρειάζεται περεταίρω διερεύνηση. [16] Υποδοχείς χυµοκινών Η έκφραση υποδοχέων χυµοκινών ελέγχει τον εντοπισµό των λεµφοκυττάρων και την κίνηση τους προς προσβεβληµένους λεµφικούς και µη ιστούς. Τα φυσικά Tregs εκφράζουν ξεχωριστούς υποκινητές χυµοκινών που παρέχουν κατευθυντικές εντολές κατά τη µετανάστευση και επιστράτευση των Τ κυττάρων σε περιοχές φλεγµονής επιτρέποντας τα να αποικίζουν σε δευτερογενείς λεµφικούς ιστούς και περιοχές φλεγµονής. Οι χυµοκίνες που εµπλέκονται στην καθοδήγηση των φυσικών Tregs σε περιοχές φλεγµονής δεν είναι πλήρως γνωστές. In vitro µελέτες έχουν δείξει ότι µεγάλο µέρος των φυσικών Tregs του περιφερικού αίµατος των ανθρώπων εκφράζουν επιλεκτικά CCR4 και CCR8 και παρουσιάζουν χηµειοτακτική απόκριση σε συνδέτες του CCR4. Μια άλλη µελέτη έδειξε πως τα φυσικά Tregs σε προδιαβητικά NOD ποντίκια µπορεί να εκφράζουν υψηλά επίπεδα CCR7, παρέχοντας τους την ικανότητα να µεταναστεύουν προς τις λεµφικής προέλευσης CCL19 και CCL21 χυµοκίνες. Ο D'Ambrosio και οι συνεργάτες του βρήκαν ότι το CCR6 εκφράζεται σε διαφορετικούς υποπληθυσµούς σε ανθρώπους και ποντίκια και πως αυτά τα CCR6 + φυσικά Tregs κύτταρα εµπλουτίζονται στο περιφερικό αίµα, έχουν υψηλότερους ρυθµούς αλλαγών, παράγουν γρήγορα IL-10 κατόπιν αντιγονικής διέγερσης και συγκεντρώνονται στο ΚΝΣ µετά από επαγωγή ΕΑΕ. Ο Bystry και οι συνεργάτες του έδειξαν ότι τα µυικά φυσικά Tregs εκφράζουν CCR5 και αποκρίνονται in vitro σε χυµοκίνες που ενεργοποιούν το CCR5, συµπεριλαµβανοµένων των MIP-1α, MIP-1β, ή RANTES. Επιπλέον, άλλες µελέτες έδειξαν πως το CCR5 µπορεί να τροποποιεί τη δράση των φυσικών Tregs σε GvHD και σε περιπτώσεις όγκων σε ανθρώπους. Πιο πρόσφατα, δείχθηκε στο µοντέλο Leishmania major σε ποντίκι ότι το CCR5 κατευθύνει τον εντοπισµό των Tregs που παράγουν IL-10 σε περιοχές µόλυνσης όπου καταστέλλουν την επέκταση των Τeff και την παραγωγή IFN-γ, προωθώντας έτσι την εγκαθίδρυση της µόλυνσης και εξασφαλίζοντας µακράς διάρκειας παραµονή του παρασίτου στον ξενιστή. Τέλος, υπάρχουν στοιχεία που υποδεικνύουν πως η έκφραση µιας ποικιλίας υποδοχέων χυµοκινών στα φυσικά Tregs µπορεί να τα ενισχύει µε ένα πλεονέκτηµα έναντι των αποτελεσµατικών Τ κυττάρων και να τους επιτρέπει να αποκρίνονται σε φλεγµονώδη σήµατα, να µεταναστεύουν πιο αποτελεσµατικά σε περιοχές φλεγµονής και να παρεµποδίζουν ανοσιακές αποκρίσεις. [14] 24

25 Ιντεγκρίνες Η ιντεγκρίνη α E β 7 (CD103) πρόσφατα δείχθηκε σαν µάρτυρας των ανθρώπινων Tregs κυττάρων. Αρχικά, περιγράφηκε ως υποδοχέας εντοπισµού των ενδοεπιθηλιακών λεµφοκυττάρων του εντέρου που διευκόλυνε την προσκόλληση των Τ κυττάρων στα επιθηλιακά κύτταρα. Πιο πρόσφατα, σε µυικά µοντέλα, βρέθηκε ένας ρόλος για την ανοσορύθµιση του δέρµατος και της αρθρίτιδας. Έγινε έπειτα η υπόθεση πως αυτή η ιντεγκρίνη µάλλον εξυπηρετεί των διαχωρισµό για πολλούς διαφορετικούς Τ κυτταρικούς υποπληθυσµούς: CD103 + CD25 + T κύτταρα εκφράζουν υψηλά επίπεδα επιπλέον προσκολλητικών µορίων και φλεγµονώδεις χυµοκίνες επιτρέποντας την µετανάστευση τους σε προσβεβληµένους ιστούς. Στο ανθρώπινο σύστηµα, αναφέρθηκε επιπροσθέτως πως τα Tregs που εκφράζουν α E β 7 ιντεγκρίνη µπορούν να µετατρέψουν άλλα CD4 + T κύτταρα σε σαν Tr1 κύτταρα που παράγουν IL-10. [25] Επίσης, ο Stassen και οι συνεργάτες του πρότειναν πως τα CD25 + κύτταρα εκφράζουν είτε α 4 β + 7 είτε α 4 β + 1 κατηγοριοποιώντας τα σε δύο κατηγορίες όσων αφορά στην έκφραση ιντεγκρινών: τα α 4 β + 7 Tregs, που µπορούν να καταστείλουν παρακείµενα κύτταρα in vitro και να επάγουν τη δηµιουργία Tr1 κυττάρων και τα α 4 β + 1 κύτταρα, που επάγουν τα Th3 κύτταρα. Εξήχθη εποµένως το συµπέρασµα πως οι µεταναστευτικές και κατασταλτικές ιδιότητες των Τregs υποπληθυσµών καθορίζονται και από τις ανατοµικές περιοχές που βρίσκονται. [19] Εικόνα 10: Οικογένεια ιντεγκρινών ( 25

26 1.4. ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΚΑΤΑΣΤΟΛΗΣ Χωρίς αµφισβήτηση, το πιο αξιόλογο χαρακτηριστικό των CD25 + CD4 + Tregs είναι η ικανότητα τους να µετριάζουν τις ανοσιακές αποκρίσεις. [5,6,21] Η επαγωγή της κατασταλτικής δράσης των φυσικών Tregs απαιτεί αντιγονική διέγερση (δηλ, σήµα ενεργοποίησης των TCRs) και προφανώς IL-2, ενώ η καταστολή που προέρχεται από τα ενεργοποιηµένα Tregs είναι µη αντιγονο-ειδική έναντι των παρευρισκόµενων κυττάρων. [1,5] Τα φυσικά FOXP3 + CD25 + CD4 + Tregs φαίνεται να είναι ικανά να αναστείλουν πολλά κύτταρα που εµπλέκονται τόσο στους έµφυτους όσο και στους επίκτητους µηχανισµούς ανοσίας. [1,5,6] Πιο συγκεκριµένα, τα φυσικά Tregs καταστέλλουν την ενεργοποίηση και/ή την επέκταση πολλών τύπων ανοσιακών κυττάρων, όπως των CD4 + και CD8 + T κυττάρων (in vitro ακόµα και απουσία ΑΠΚ) αλλά και τον σχηµατισµό κυτταροκινών από αυτά. Καταστέλλουν επίσης τον πολλαπλασιασµό των Β κυττάρων, την παραγωγή ανοσοσφαιρινών και την αλλαγή ισοτύπου. Στόχους καταστολής αποτελούν και οι κυτταροτοξικές λειτουργίες των ΝΚ και των ΝΚΤ καθώς και η λειτουργία και ωρίµανση των δενδριτικών κυττάρων. Επιπλέον, τα φυσικά Tregs αναστέλλουν όχι µόνο την ενεργοποίηση και/ή επέκταση των αθώων Τ κυττάρων, αλλά και τη λειτουργία των αποτελεσµατικών Τ κυττάρων. [1] Τέλος, µπορούν να καταστείλουν και τα µνηµονικά Τ κύτταρα αν και ελέγχουν πιο αποτελεσµατικά την ενεργοποίηση και/ή επέκταση των αθώων Τ κυττάρων. [1,9] Ουσιαστικά, η καταστολή των Tregs µπορεί να χωριστεί στους µηχανισµούς εκείνους που επιτυγχάνονται µέσω σχετικά µεγάλης διάχυσης διαλυτών παραγόντων και σε εκείνους που απαιτούν στενή κυτταρική επαφή. [6] Εικόνα 11: Πιθανοί µηχανισµοί καταστολής των CD4 + CD25 + Tregs in vivo. [6] 26

27 ιάχυση διαλυτών παραγόντων Αν και η αρχή του ανοσοκατασταλτικού µηχανισµού των Tregs παραµένει άγνωστη, πολλά in vivo πειραµατικά µοντέλα δείχνουν ότι τα Tregs εκκρίνουν µεγάλες ποσότητες ανοκατασταλτικών κυτταροκινών συµπεριλαµβανοµένων των IL- 9, IL-10 και TGF-β από τη στιγµή που ενεργοποιούνται. Αυτές οι κυτταροκίνες είναι ικανές να αναστείλουν την ενεργοποίηση των Th1, Th2 κυττάρων και CTLs που απαιτούνται για την κυτταρική ανοσία, φλεγµονή και παραγωγή αντισωµάτων. [20] Μελέτες in vivo βασισµένες κυρίως στο IBD µοντέλο έδειξαν την σηµαντικότητα των ανοσοτροποποιητικών κυτταροκινών IL-10 και TGF-β. Με το µπλοκάρισµα της σηµατοδότησης της IL-10 in vivo µε ένα αντι-il-10r mab, ήταν πιθανό να καταργηθεί η φυσική δράση παρεµπόδισης της κολίτιδας από τα CD45RB low κύτταρα. Παροµοίως, CD45RB low κύτταρα από IL-10 / ποντίκια στερούνταν την κατά τ άλλα ενδογενή τους ικανότητα να προστατεύουν από κολίτιδα και επιπλέον ήταν κολιτιδογενή τα ίδια όταν µεταφέρονταν µόνα τους. Η σηµαντικότητα της IL-10 δείχνεται περισσότερο από την παρατήρηση πως στελέχη IL-10 / εµφανίζουν αυτόµατα κολίτιδες. [1,6] Παροµοίως, επίκτητη µεταφορά CD4 + CD25 + T κυττάρων σε ποντίκια µε αλλογενετικά µοσχεύµατα δέρµατος επάγει ανοχή του µοσχεύµατος, αλλά ένεση αντι-il-10r επιταχύνει αξιοσηµείωτα την απόρριψη του. In vitro πειράµατα έδειξαν επίσης πως τα Tregs µπορούν να επάγουν την έκφραση του ανοσοκατασταλτικού συνδιεγερτικού µορίου Β7-Η4 στα δενδριτικά κύτταρα µέσω της δράσης της IL-10. [1] Εξέταση του in vivo ρόλου του TGF-β έδειξε µια εικόνα παρόµοια µε αυτή της IL- 10, µε τη λειτουργία των Tregs να µπλοκάρεται παρουσία εξουδετεροποιητικών αντι- TGF-β mabs. Μερικά δεδοµένα προτείνουν επίσης πως ο TGF-β µπορεί να µη δρα απαραίτητα ως διαλυτός παράγοντας αλλά µπορεί και να βρίσκεται στην επιφάνεια των ενεργοποιηµένων CD25 + CD4 + Tregs. [6] Τα φυσικά Tregs εκφράζουν υψηλά ποσά µεµβρανοδεσµευµένου TGF-β και επίσης συνεκφράζουν thrombospondin, έναν παράγοντα ικανό να µεταµορφώσει αδρανή TGF-β στην ενεργή του µορφή. [6,28] Τα T κύτταρα είναι ο βασικός στόχος του TGF-β, καθώς τα CD4 + ή τα CD8 + T κύτταρα εκφράζουν έναν αρνητικά επικρατή υποδοχέα τύπου ΙΙ του TGF-β και δεν αποκρίνονται σ αυτόν ξεφεύγοντας από την καταστολή των CD4 + CD25 + T κυττάρων in vivo. [37] Παρόλα αυτά δείχθηκε χωρίς καµία αµφιβολία µε χρήση Τ κυττάρων από διαγονιδιακά ποντίκια µε ανεπάρκεια Smad3 και αρνητικά επικρατή TGF-β RII, ο οποίος προφανώς δε µπορεί να αντιδράσει µε TGF-β να είναι ακόµα επιδεκτικά σε καταστολή µέσω φυσικών Tregs. Επιπλέον, φυσικά Tregs µε ανεπάρκεια TGF-β είναι τόσο κατασταλτικά όσο και τα αγρίου τύπου. [28] 27

28 Εικόνα 12: Απελευθέρωση διαλυτών παραγόντων και κααστολή των Teff ( Ένα σηµατοδοτικό µόριο που µπορεί να είναι σχετικό µε την ευαισθησία στις εξαρτώµενες από TGF-β επιδράσεις των Tregs είναι η Cbl-b (ubiquitin ligase), η οποία ρυθµίζει αρνητικά τη δράση των PI3K (phosphatidylinositide 3-kinase), p85 και Vav1. Απουσία CD28 διέγερσης, η σηµατοδότηση από TCR αναστέλλεται από το Cbl-b: τα CD28 σήµατα µπορούν να ξεπεράσουν αυτή την καταστολή, εν µέρει µέσω της ίδιας της Cbl-b. [31] Παρόλα αυτά, µε βάση τα in vitro δεδοµένα, τόσο το αντι-il-10 όσο και το αντι- TGF-β, µε εξαίρεση του προσδεδεµένου στην µεµβράνη TGF-β, απέτυχαν να διαταράξουν την CD25 + CD4 + Tregs καταστολή. [6] Επιπλέον, µελέτες που συγκρίνουν λειτουργικά τα CD4 + CD25 + FoxP3 + Tregs µε τα CD4 + CD25 Teff οδήγησαν στην ανακάλυψη της κυτταροκίνης IL-35, ενός καινούριου µέλους της οικογένειας της IL-12 ετεροδιµερικής κυτταροκίνης. Το γονίδιο Ebi3 (Epstein Barr-virus-induced gene 3) δείχθηκε να εκφράζεται κατά προτίµηση στα Tregs µαζί µε την IL-12a αλυσίδα (ή p35) για το σχηµατισµό του ετεροδιµερούς IL-35. Πειράµατα in vitro που ακολούθησαν έδειξαν πως Ebi1 knockout ή IL-12a knockout ποντίκια είχαν σηµαντικά µειωµένες κατασταλτικές ικανότητες. Επιπροσθέτως, Teff τα οποία είχαν επιµολυνθεί µέσω ρετροϊού µε IL-35 αποκτούσαν κατασταλτική ενεργότητα και ανασυνδυασµένη IL-35 ανάστελνε τον πολλαπλασιασµό των Teff. Υποπληθυσµοί CD4 + και CD8 + T κυττάρων µπορεί επίσης να εκφράζουν µικρά ποσά IL-35, προτείνοντας πως µπορεί να εµπλέκεται στην ρυθµιστική τους λειτουργία. Το αν µπορεί η IL-35 να επαχθεί ή όχι σε FoxP3 + Th3 κύτταρα δεν είναι γνωστό. [16] Να σηµειωθεί τέλος πως υπερκείµενα από κατασταλµένες καλλιέργειες ή ενεργοποιηµένα CD25 + CD4 + Tregs δεν έδειξαν έµφυτη κατασταλτική ενεργότητα και 28

29 καταστολή δεν παρατηρήθηκε ούτε κατά µήκος ηµιδιαπερατής µεµβράνης. Αυτές οι in vitro παρατηρήσεις φαίνεται να απορρίπτουν το ρόλο των διαλυτών παραγόντων γενικότερα. οδηγώντας στο συµπέρασµα ότι η καταστολή των Tregs επέρχεται µε έναν µηχανισµό άµεσης κυττάρου µε κύτταρο επαφής και όχι µέσω κυτταροκινών. [6] Κύτταρο µε κύτταρο επαφή Πρόσφατα πειραµατικά δεδοµένα δείχνουν πως η σηµατοδότηση από την IL-2 είναι καίριας σηµασίας για την ανάπτυξη, διατήρηση και επιβίωση των Tregs, η κατασταλτική δράση των οποίων σχετίζεται µε την ικανότητα τους να αναστέλλουν την παραγωγή της IL-2. [9,20] Πρόσφατα δείχθηκε πως η ιδιοσυστατική έκφραση υποδοχέων υψηλής συγγένειας για την IL-2 µπορεί να µετατρέψει τα φυσικά Tregs σε µια συνεχώς τροφοδοτούµενη πηγή από IL-2, στερώντας τα αυτοδραστικά Τ κύτταρα από αυτόν τον σηµαντικό αυξητικό παράγοντα. [5,6] Με τον τρόπο αυτό, τα CD4 + CD25 κύτταρα παρουσία CD25 + ρυθµιστικών θυµοκυττάρων είναι ανίκανα να παράγουν την α αλυσίδα του υποδοχέα της IL-2 και γι αυτό δεν αποκρίνονται στην IL-2. Επιπλέον, η ανικανότητα των αποτελεσµατικών Τ κυττάρων να πολλαπλασιαστούν δεν επηρεαζόταν από την προσθήκη εξωγενούς IL-2, αλλά ξεπερνιόταν µε την προσθήκη IL-15, µια κυτταροκίνης που διεγείρει τα Τ κύτταρα και δεν µοιράζεται την α αλυσίδα του υψηλής συγγένειας υποδοχέα της IL-2. Αυτά τα ευρήµατα είναι συνεπή µε µια µελέτη που δείχνει πως καταστολή του πολλαπλασιασµού επαγόµενου από IL-2 ανθρώπινων Τ κυττάρων και φωσφορυλίωση των STAT3 και STAT5 από τον TGF-β1 µπορεί να ξεπερνιέται πλήρως µε τη θεραπεία των Τ κυττάρων µε IL-15. [5] Τα CD25 + CD4 + Tregs είναι ανεργικά in vitro δηλαδή δεν πολλαπλασιάζονται ή παράγουν IL-2 σε απάντηση σε ερεθίσµατα συµβατικών Τ κυττάρων [π.χ., συνδεδεµένο σε µικροσφαιρίδια αντι-cd3, ConA (concanavlin Α) ή σπληνικά ΑΠΚ]. Αυτή η ανεργία µπορεί όµως να παρακαµφθεί από ένα πιθανό ερέθισµα όπως η προσθήκη υψηλής δόσης εξωγενούς IL-2 ή αντι-cd28 ή χρήση ώριµων δενδριτικών κυττάρων ως ΑΠΚ. [6] Παρόλα αυτά, δεδοµένης της σχετικά φυσιολογικής σπανιότητας των φυσικών Tregs, είναι µάλλον απίθανο ότι ένα απλό µοντέλο ανταγωνισµού-κατάργησης µόνο θα µπορούσε να ευθύνεται για τις κατασταλτικές τους ιδιότητες in vivo. [6] Άλλα µοντέλα για την καταστολή των CD25 + CD4 + Tregs προτείνουν µια πιο ενεργή και ανταγωνιστική µορφή καταστολής που βασίζεται στην έκφραση ειδικών ανασταλτικών µορίων. Η ταυτότητα και ακόµα και η ίδια η ύπαρξη τέτοιων ανασταλτικών µορίων είναι ανεπιβεβαίωτη, αλλά ένα πιθανό µόριο θα µπορούσε να είναι το εκφραζόµενο από τα Tregs CTLA-4 (CD152). [6,20] Όπως προαναφέρθηκε, το CTLA-4, εκφράζεται ιδιοσυστατικά από τα φυσικά Tregs και η έκφραση του αυξάνεται από τη διέγερση των Tregs, ενώ τα αθώα Τ κύτταρα εκφράζουν αυτό το µόριο µόνο κατόπιν ενεργοποίησης. Αποδείξεις πως το CTLA-4 έχει βασικό ρόλο στην καταστολή µέσω Tregs in vivo και in vitro προέρχονται από το γεγονός ότι, µπλοκάρισµα του CTLA-4 σε φυσιολογικά ποντίκια οδηγεί σε ανάπτυξη οργανοειδικών αυτοάνοσων ασθενειών παρόµοιων µε αυτές που επάγονται από την εξάλειψη των Tregs. Επίσης, µπλοκάρισµα του CTLA-4 µε Fab αντι-ctla-4 mab, καταργεί την καταστολή µέσω CD25 + CD4 + Tregs κυττάρων in vitro όταν CD25 + CD4 + Τ κύτταρα προέρχονται από φυσιολογικά ποντίκια (γι αυτό και ιδιοσυστατικά εκφραζόµενου CTLA-4), και αποκρινόµενα Τ κύτταρα 29

30 αποµονώνονται από CTLA-4 ανεπαρκή ποντίκια. Επιπλέον, εκτοπική εξαναγκαστική έκφραση του FoxP3 σε αθώα Τ κύτταρα ρυθµίζει θετικά την έκφραση του CTLA-4 µε FoxP3-εξαρτώµενο τρόπο. [1] Αυτά τα αποτελέσµατα συντελούν σε πολλούς πιθανούς ρόλους του CTLA-4 στην καταστολή µέσω Tregs. Ένας είναι πως, το CTLA-4 στα Tregs αλληλεπιδρά µε τα µόρια CD80 και CD86 στα ΑΠΚ και µεταδίδει ένα συνδιεγερτικό σήµα στα Tregs (που µπορεί να ενεργοποιούν µαζί µε σήµατα για τους TCRs τα Tregs να επιφέρουν καταστολή). [1,6] Μπλοκάρισµα του CTLA-4 εµποδίζει έτσι την ενεργοποίηση των Tregs και γι αυτό, µειώνει την καταστολή προκαλώντας αυτοάνοσες ασθένειες. Αυτό το µπλοκάρισµα µπορεί και να δυναµώνει την αλληλεπίδραση του CD28 που εκφράζεται από τα Tregs µε τα CD80 και CD86 λιγότερο ανταγωνιστικά και γι αυτό να µετάγεται στα Tregs ένα σήµα µείωσης της καταστολής, επειδή η ισχυρή σύνδεση των παραπάνω µαζί µε διέγερση του TCR µπορεί να καταργήσει την καταστολή µέσω Tregs. [1] Ένας ακόµα πιθανός ρόλος για το CTLA-4 στη λειτουργία των Tregs είναι ότι µπορεί να µεσολαβεί στην καταστολή άµεσα πυροδοτώντας την παραγωγή του ενζύµου IDO (indoleamine 2,3-dioxygenase) στα δενδριτικά κύτταρα όταν αλληλεπιδρά µε τους συνδέτες του CD80 και CD86 παρουσία IFN-γ και µετάγει σήµα ενεργοποίησης του STAT-1. [1,6,31] Το IDO καταλύει την µετατροπή της τρυπτοφάνης σε κυνουρενίνη και άλλους µεταβολίτες, που έχουν πιθανά ανοσοκατασταλτικά αποτελέσµατα στο τοπικό περιβάλλον των δενδριτικών κυττάρων µέσω κυτταροτοξικότητας ή πιθανή επαγωγή de novo δηµιουργίας Tregs από αθώα CD25 - CD4 + T κύτταρα. [1,6] Επίσης, µείωση των ποσοτήτων της προσβάσιµης ελεύθερης τρυπτοφάνης που φαίνεται να είναι σηµαντική για την ενεργοποίηση και τη διέγερση του πολλαπλασιασµού των αποτελεσµατικών κυττάρων, οδηγεί αυτά τα κύτταρα σε απόπτωση σε ένα περιβάλλον όπου δεν υπάρχει τρυπτοφάνη [18,28] Με αυτόν τον τρόπο, τα CD25 + CD4 + Tregs µπορεί να επιφέρουν τη καταστολή κατά προσέγγιση µέσω της δράσης τους στα ΑΠΚ. [1,6] Εικόνα 13: Τα Tregs κύτταρα αναστέλλουν τα Τ κύτταρα µέσω επαγωγής 2,3-IDO στα δενδριτικά κύτταρα. [18] Εναλλακτικά, το CTLA-4 στα Tregs µπορεί να συνδέεται µε το CD80, και σε µικρότερο βαθµό µε το CD86, που εκφράζονται από τα ενεργοποιηµένα 30

31 αποκρινόµενα Τ κύτταρα και vα µεταδίδουν άµεσα ένα σήµα αρνητικό στα αποκρινόµενα αυτά Τ κύτταρα. [1,5,6] Σε στήριξη αυτού, κάποιοι ερευνητές έδειξαν ότι B7 / ανταποκρινόµενα κύτταρα ήταν ανθεκτικά σε καταστολή in vitro και επήγαν αδράνεια σε συµµεταφερόµενα CD25 + CD4 + Tregs. [6] Άλλος τρόπος µε τον οποίο το CTLA-4 συµβάλει στην µέσω Tregs καταστολή είναι ότι µπορεί να αυξάνει τη φυσική αλληλεπίδραση µεταξύ Tregs και ΑΠΚ, ενισχύοντας έτσι την ενεργοποίηση των Tregs ή την κατασταλτική αλληλεπίδραση µε άλλους τύπους Τ κυττάρων ή ΑΠΚ, µε το να ρυθµίζει θετικά την έκφραση του LFA-1 (lymphocyte function-associated antigen-1). [1] Ένα άλλο µόριο που φαίνεται να συµµετέχει στην καταστολή µέσω Tregs είναι το LAG3 (lymphocyte activation gene 3, ή CD223). Το LAG3 είναι ένα CD4- σχετιζόµενο µόριο προσκόλλησης που προσδένεται στα µόρια MHC II (major histocompatibility complex τύπου II). [1,18] Το LAG3 εκφράζεται στην επιφάνεια των Tregs µετά την ενεργοποίηση τους. Αντι-LAG3 αντισώµατα καταργούν την καταστολή των Tregs in vivo, και η κατασταλτική ενεργότητα Tregs αποµονωµένων από LAG3 knockout ποντίκια είναι κατεστραµµένη in vitro. Επιπλέον, εκτοπική έκφραση του LAG3 σε αθώα CD4 + T κύτταρα τους προσδίδει µια κατασταλτική λειτουργία. Τα MHC II µόρια εκφράζονται στα ΑΠΚ (δενδριτικά κύτταρα, Β κύτταρα, µονοκύτταρα και µακροφάγα) και σε ενεργοποιηµένα Τ κύτταρα. Για το λόγο αυτό, το LAG3 µπορεί να εξηγεί πως µπορούν τα Tregs να καταστείλουν διαφορετικούς πληθυσµούς λεµφοκυττάρων. Παρόλα αυτά, ο ακριβής ρόλος του LAG3 στην καταστολή των Tregs in vivo παραµένει άγνωστος, επειδή τα ποντίκια µε ανεπάρκεια LAG3 δε παρουσιάζουν αυτοάνοσες καταστάσεις, αντίθετα µε ποντίκια µε ανεπάρκεια CTLA-4 που αναπτύσσουν µη αυτόνοµες (ελεγχόµενες από τα Tregs) πολλαπλές αυτοανοσίες ή φλεγµονές. [1] Ένας άλλος µηχανισµός καταστολής των Tregs είναι η τροποποίηση των αντιγονοπαρουσιαστικών ικανοτήτων των ΑΠΚ. Επειδή τα ΑΠΚ γίνονται ανοσογενετικά παρουσία κυτταροκινών όπως είναι οι IL-4, IL-10, IL-13 και TGF-β, τα προσαρµοσµένα Tregs µπορούν να ρυθµίσουν αρνητικά την αντιγονοπαρουσιαστική ικανότητα τους µέσω IL-10 και TGF-β. Συγκεκριµένα, η IL- 10 τροποποιεί την έκφραση των συνδιεγερτικών µορίων CD80 και CD86 και τα MHC II και έτσι επηρεάζει τις αντιγονοπαρουσιαστικές τους ιδιότητες παρακωλύοντας κατά συνέπεια την ενεργοποίηση άλλων τύπων Τ κυττάρων. [1,5,6,28] Μελέτη των CD8 + CD28 - Tregs από αλλοειδικές και ξενοειδικές Τ κυτταρικές σειρές, έδειξε πως τα κύτταρα αυτά αναστέλλουν τον πολλαπλασιασµό των Th µε έναν µηχανισµό που περιλαµβάνει αλληλεπιδράσεις µε ΑΠΚ. Τα CD8 + CD28 - Tregs µπορούν να µπλοκάρουν συνδιεγερτικά µόρια των ΑΠΚ όπως τα CD80, CD86, CD54 και CD58. Η κατασταλτική δράση δε µπορεί να καταργηθεί µε χρήση εξουδετεροποιητικών αντισωµάτων για τα IL-4, IL-10, TGF-β, και CTLA-4. Αντίθετα µε την καταστολή των συνδιεγερτικών µορίων, τα CD8 + CD28 + Tregs έχουν δειχθεί πως ρυθµίζουν θετικά τους ανασταλτικούς υποδοχείς του ILT3 και του ILT4 (inhibitory immunoglobulin-like transcript) στα δενδριτικά. [18,38] Τα δενδριτικά κύτταρα και τα επιθηλιακά που αλληλεπιδρούν µε αλλοειδικά Τ κύτταρα, γίνονται ανεκτικά σε Τh που αναγνωρίζουν συµπλέγµατα αντιγόνου/mhc στην επιφάνεια τους. Επιπλέον, ILT3 high ILT4 high δενδριτικά και επιθηλιακά φάνηκε να προωθούν τη διαφοροποίηση των CD8 + T και CD4 + Tregs. [38] Όλα µαζί, αυτά τα δεδοµένα δείχνουν πως τα CD8 + CD28 - Tregs καταστέλλουν τις ανοσιακές αποκρίσεις µε άµεσες αλληλεπιδράσεις µε τα δενδριτικά και τροποποιώντας τις ιδιότητες τους καθιστώντας τα ανεκτικά. [18] 31

32 Ένας άλλος µηχανισµός καταστολής εµπλέκει το µεµβρανικό TGF-β και το NOTCH1, ένα διαµεµβρανικό µόριο η έκφραση του οποίου απαιτείται για τη δέσµευση των Τ κυττάρων από τους λεµφικούς προγόνους. Η ενδοκυτταρική δοµή του NOTCH1, η οποία διαχωρίζεται µετά την πρόσδεση των συνδετών του jagged 1 και jagged 2, δρα ως µεταγραφικός παράγοντας που επάγει την έκφραση του HES1 (hairy and enhancer of split 1), ενός ανασταλτικού µεταγραφικού παράγοντα. Έχει δειχθεί ότι η µεµβρανική έκφραση του TGF-β απαιτείται για την έκφραση των συνδετών του NOTCH στα Tregs. Τα Tregs που εκφράζουν τον µεµβρανοδεσµευµένο TGF-β µπορούν να ενεργοποιήσουν το NOTCH1 HES1 άξονα στα ενεργοποιηµένα Τ κύτταρα και η αναστολή του NOTCH1 µονοπατιού καταργεί την µέσω Tregs καταστολή των αλλεργικών φλεγµονών των αεραγωγών. Παρόλα αυτά, σε αντίθεση µε αυτά τα ευρήµατα που υποστηρίζουν µια σηµαντική συµβολή του TGF-β στην καταστολή των Tregs, άλλοι ανέφεραν πως τα φυσικά Tregs που αποµονώθηκαν από νεογέννητα TGF-β knockout ποντίκια έχουν φυσική κατασταλτική ενεργότητα in vitro και µπορούν να εµποδίσουν ασθένειες φλεγµονών του εντέρου in vivo. [1] Επίσης, τα CD8 + Τ κύτταρα µπορεί να ρυθµίζουν τις Τ κυτταρικές αποκρίσεις µέσω των CD94-NKG2 υποδοχέων τους. Το Qa-1, MHC τύπου Ib, έχει την προοπτική να παρουσιάζει ξένα αλλά και αυτόλογα πεπτίδια στα CD8 + T κύτταρα, πράγµα που σηµαίνει ότι το µόριο αυτό µπορεί να δρα ως αντιγονικός στόχος των CD8 + T κυττάρων. Τα συµπλέγµατα Qa-1/αυτόλογο πεπτίδιο µπορούν να προσδεθούν στους CD94-NKG2 υποδοχείς των CD8 + T κυττάρων και καθώς η κατασταλτική δράση των CD8 + T κυττάρων µπορεί να µπλοκαριστεί µε αντισώµατα έναντι του Qa-1, προτάθηκε πως ενδεχοµένως ένα µη κλασσικό µονοπάτι ΜΗC τύπου Ib παίζει ρόλο στον περιορισµό της καταστολής από CD8 + T κύτταρα. Πράγµατι, Qa-1 -/- ποντίκια παρουσιάζουν πολλαπλή EAE, η οποία συνδέεται µε τη διαφυγή των Qa-1 -/- CD4 + T κυττάρων από την καταστολή από CD8 + T κύτταρα. Το Qa-1 έχει περιορισµένους πολυµορφισµούς και εκφράζεται σε ενεργοποιηµένα αλλά όχι ηρεµούντα Τ κύτταρα. [18] Η παρατήρηση ότι ασθενείς µε µεταλλάξεις στο γονίδιο της περφορίνης πάσχουν από HLH (hemophagocytic lymphohistiocytosis) υποδεικνύει σηµαντική εµπλοκή της περφορίνης στη ρύθµιση των ανοσιακών αποκρίσεων. Αυτοί οι ασθενείς έχουν ένα υπερενεργό ανοσιακό σύστηµα, και οι ανοσιακές αποκρίσεις σε µολύνσεις δε ρυθµίζονται αρνητικά µετά την κατάπαυση της µόλυνσης. Μη θεραπευµένοι HLH ασθενείς αναπτύσσουν τότε καταστροφές οργάνων τελευταίου σταδίου εξαιτίας εισχώρησης λεµφοκυττάρων και ενεργοποίησης µακροφάγων. Ποντίκια µε ανεπάρκεια περφορίνης αναπτύσσουν µια ασθένεια παρόµοια µε την HLH κατόπιν έκθεσης σε ιούς. Πολυµορφισµοί στο γονίδιο της περφορίνης µπορεί να προδιαθέτουν σε µια παρατεταµένη ενεργοποίηση του ανοσιακού συστήµατος κατά τη διάρκεια µολύνσεων, η οποία θα µπορούσε να επιφέρει κατάρρευση της ανοσοανοχής. [23] Για τους παραπάνω λόγους έγινε η διαπίστωση πως τα Tregs µπορούν σαν έναν άλλο µηχανισµό της καταστολής τους να σκοτώσουν αποτελεσµατικά κύτταρα. [1] Το µονοπάτι Perforin/granzyme (granule exocytosis) είναι ο βασικός µηχανισµός δράσης των κυτταροτοξικών λεµφοκυττάρων (NK και κυτταροτοξικών T λεµφοκυττάρων) µε τον οποίο σκοτώνουν ενδοκυτταρικά παθογόνα και καρκινικά κύτταρα. [1,13,27,28] Τα ενεργοποιηµένα φυσικά Tregs εκφράζουν GZ-A και πολύ µικρές ποσότητες GZ-B, ενώ τα προσαρµοσµένα Tregs κύτταρα εκφράζουν πιο πολύ GZ-B. Αυτό το µονοπάτι µπορεί να εξηγήσει εν µέρει την εξαρτώµενη από επαφή καταστολή των φυσικών Tregs. [27] 32

33 Εικόνα 14: Μονοπάτι περφορίνης-gz ( Τόσο τα φυσικά όσο και τα προσαρµοσµένα Tregs παρουσιάζουν κυτταροτοξικότητα εξαρτηµένη της περφορίνης ενάντια των αυτόλογων κυττάρων στόχων, συµπεριλαµβανοµένων των ενεργοποιηµένων CD4 + και CD8 + T κυττάρων, των CD14 + µονοκυττάρων και των ώριµων και ανώριµων δενδροκυττάρων. Αυτή η κυτταροτοξικότητα δεν διενεργείται µέσω αλληλεπιδράσεων Fas/FasL αλλά εξαρτάται από CD18 προσκολλητικές αλληλεπιδράσεις καθώς αντισώµατα έναντι αυτού παρενέβησαν στη θανάτωση. [1,13,27,28] Η απελευθέρωση του γκρανζύµου Β µπορεί να σκοτώσει Τ και Β κύτταρα σε έναν ανεξάρτητο της περφορίνης και έναν εξαρτώµενο της περφορίνης τρόπο αντίστοιχα. [1,28] Πρόσφατη έρευνα σε ποντίκια δείχνει πως το GZ-B είναι ένα βασικό συστατικό της καταστολής µέσω Tregs και η επαγωγή της ρυθµιστικής δράσης τους συνδέεται µε θετική ρύθµιση της έκφρασης του GZ-B κατόπιν ενεργοποίησης τους µε αντι-cd3 και αντι-cd46, αποδεικνύοντας ότι το GZ-B εµπλέκεται στην µέσω επαφής καταστολή από τα Tregs σε ποντίκια. [27,28] Επίσης, τα Tregs µπορούν να προωθήσουν τον κυτταρικό κύκλο σε αδρανείς φάσεις (φάση G1-S) τόσο στα CD4 + όσο και στα CD8 + T κύτταρα µέσω ενός µηχανισµού που παραµένει άγνωστος, αλλά απαιτεί άµεση κυττάρου µε κύτταρο επαφή και µπορεί να εµπλέκει σήµατα µέσω των CTLA-4 και/ή GITR. [9,17,39] Αυτή η παύση συχνά οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο. [39] Παράλληλα, ενδέχεται να επάγουν απόπτωση στα αποκρινόµενα κύτταρα. Η in vitro και in vivo ενεργοποίηση του TRAIL/DR5 (TNF-related apoptosis-inducing ligand /death receptor 5) µονοπατιού είναι ένας γνωστός µηχανισµός για την επαγωγή απόπτωσης και πρόσφατα βρέθηκε πως το TRAIL ρυθµίζεται θετικά µετά την ενεργοποίηση των Tregs, ενώ τα ενεργοποιηµένα Teff βρέθηκαν να εκφράζουν αυξηµένα επίπεδα DR5. Επιπλέον, µπλοκάρισµα του DR5 µε αντισώµατα µείωσε σηµαντικά την κατασταλτική δράση των Tregs in vitro και in vivo. [16] 33

34 Εικόνα 15: Σηµατοδότηση TRAIL-DR4/5 ( Σε ποντίκια, τα CD4 + CD25 + FoxP3 + Tregs εκφράζουν κατά προτίµηση εξωνουκλεοτιδάσες CD39 και CD73 στην κυτταρική επιφάνεια τους και η έκφραση τους ενισχύεται και σταθεροποιείται από το FoxP3. Tο CD39 αποικοδοµεί νουκλεοσίδια τρι- και διφωσφορικά όπως το ATP σε AMPs και το CD73 καταβολίζει την µετατροπή του AMP σε αδενοσίνη. Η παρουσία εξωκυτταρικού ΑΤΡ θεωρείται ως ένδειξη της καταστροφής των ιστών και µπορεί να λειτουργήσει σαν ένα φυσικό ανοσολογικό βοηθητικό και προειδοποιητικό σήµα µε την πρόσδεση του σε πουρινεργικούς υποδοχείς. Αντίθετα, η αδενοσίνη είναι γνωστή πως επιφέρει ανοσοκατασταλτική επίδραση στα κύτταρα του ανοσολογικού, για παράδειγµα αναστέλλει των πολλαπλασιασµό των Th1 κυττάρων και τη σύνθεση του TNF ή IFNγ µετά τη δέσµευση σε υποδοχείς αδενοσίνης. Γι αυτό, η αποµάκρυνση του προφλεγµονώδους ATP µέσω του CD39 και η µετατροπή του σε ανοσοκατασταλτικό AMP από το CD73 αντιπροσωπεύει έναν άλλο µηχανισµό µε τον οποίο τα CD4 + CD25 + FoxP3 + CD39 + CD73 + Tregs µπορούν να καταστείλουν τις ανοσιακές αποκρίσεις. [16] Η ύπαρξη ενός ακόµη µηχανισµού φάνηκε όταν ανακαλύφθηκε ότι το PDE3B (camp-cleaving enzyme phosphodiesterase 3B) µειώνεται κατά πολύ στα Tregs σε σύγκριση µε τα συµβατικά CD4 + T κύτταρα. Ως συνέπεια, τα Tregs έχουν υψηλά επίπεδα camp, ενός δεύτερου αγγελιοφόρου γνωστού για τη ρύθµιση µιας ποικιλίας κυτταρικών λειτουργιών σε πολλών ειδών κύτταρα. Στα Τ λεµφοκύτταρα, αυξηµένα 34

35 επίπεδα του ενδογενούς camp αναστέλλει την κυτταρική ενεργοποίηση, την παραγωγή κυτταροκινών και τον πολλαπλασιασµό των κυττάρων µέσω παρεµπόδισης της ενεργοποίησης των Ras και Rap1 (και τα δύο µικρές GTPάσες). Ο Bopp έδειξε τότε πως η εξαρτώµενη από την επαφή καταστολή των φυσικών Tregs κυττάρων µπορεί να συµβεί µε έναν πολύ γνωστό µηχανισµό, την ενδοκυττάρια µεταφορά του camp µε χασµοσυνδέσµους. Μετά την αλληλεπίδραση των Tregs µε τα κύτταρα στόχους, τα επίπεδα του camp εντός των τελευταίων αυξάνονται, οδηγώντας σε ανοσοκαταστολή η οποία µπορεί να µπλοκαριστεί µε την προσθήκη αναστολέων των χασµοσυνδέσµων. Αυτά τα δύο παραδείγµατα συνδέουν τον προαναφερόµενο ρόλο των µεταβολιτών των νουκλεοτιδίων στην ανοσορύθµιση της από τα Tregs µε εξαρτώµενο της επαφής µηχανισµό. [16] Εικόνα 16: Σχηµατική αναπαράσταση των διαφορετικών κατασταλτικών µηχανισµών των ntregs. [16] Πιο πρόσφατα, τέθηκε το ερώτηµα αν τα ανθρώπινα Tregs εµφανίζουν διαφορετικές κατασταλτικές δράσεις στα Th1 ή Th2 πολωµένα αποτελεσµατικά κύτταρα. Κλώνοι Τ κυττάρων δηµιουργήθηκαν από CD25 + θυµοκύτταρα (και CD4 + και CD8 + ) και η κατασταλτική τους δράση εκτιµήθηκε στους Th1 ή Th2 κυτταρικούς κλώνους που προέρχονταν από CD4 + CD25 - θυµοκύτταρα. Τα αποτελέσµατα υπέδειξαν ότι ο πολλαπλασιασµός των Th1 κλώνων καταστελλόταν εντελώς και από τα CD4 + και από τα CD8 + αυτόλογα Tregs κύτταρα, ενώ τα ίδια Tregs επέφεραν πολύ µικρότερη καταστολή στους Th2 κλώνους. [5] Αυτή η διαφορά οφειλόταν στην ικανότητα των Th2 κυττάρων να παράγουν κυτταροκίνες που τους επιτρέπουν να πολλαπλασιάζονται ακόµα και απουσία ανταπόκρισης σε IL-2. Πράγµατι, η κατασταλτική δράση των CD25 + θυµοκυττάρων στους Th2 κλώνους ενισχυόταν από εξουδετέρωση της IL-4 σε καλλιέργεια, ενώ µπλοκαριζόταν τελείως από την προσθήκη ανασυνδυασµένων IL-4, IL-7, IL-9, και IL-15. Αντίθετα, ο πολλαπλασιασµός των Th1 κυττάρων επανακτώνταν µόνο µε τοποθέτηση σε καλλιέργεια µε IL-15. Ανάλογα, οι Th2 κλώνοι εξέφραζαν σηµαντικά υψηλότερα επίπεδα IL-4R και IL-9R mrna σε σχέση µε τους Th1 κλώνους, ενώ η 35

36 έκφραση των Th1 και Th2 κυττάρων σε IL-2R, IL-7R και IL-15R ήταν συγκρίσιµη. [5] Αυτά τα δεδοµένα προτείνουν ότι, αν και τα Tregs ρυθµίζουν τις αποκρίσεις και των Th1 και των Th2 ρυθµίζοντας αρνητικά την έκφραση του IL-2R στα αποτελεσµατικά Τ κύτταρα, τα Th2 κύτταρα µπορεί να ξεφεύγουν µερικώς αυτής της κατασταλτικής δράσης µέσω της ικανότητας τους να ανταποκρίνονται σε αυξητικούς παράγοντες διαφορετικούς της IL-2 όπως είναι οι IL-4, IL-7 και IL-9. Συγκεκριµένα η IL-4, που παράγεται από τα Th2 και δρα µε αυτοκρινή τρόπο, µπορεί, εν µέρει τουλάχιστον, να υπερκεράσει τη ρυθµιστική δράση των CD4 + CD25 + Tregs. Τελικά, αυτά τα δεδοµένα είναι συνεπή µε την παρατήρηση ότι εξάλειψη σε ποντίκια των CD4 + CD25 + T κυττάρων εµποδίζει την επαγόµενη από αντιγόνο διαφοροποίηση των Th2 µέσω αύξησης τη διαφοροποίησης των Th1 κυττάρων. [5] Η απόδειξη ότι και τα CD4 + CD25 + και τα CD8 + CD25 + Tregs θυµοκύτταρα µπορούν να επιφέρουν ισχυρή κατασταλτική δράση στα Th1, αλλά πολύ χαµηλότερη στα Th2, είναι µεγάλου µελλοντικού ενδιαφέροντος. Στην πραγµατικότητα, ενώ οι αυτοάνοσες ασθένειες σχετίζονται κυρίως µε ανοσιακές αποκρίσεις µέσω Th1, τα Th2 κύτταρα εντοπίζονται πιο σπάνια σε ιστούς που προσβάλλονται από αυτοάνοσες διαταραχές και οι κυτταροκίνες τους µπορεί να παίζουν και έναν προστατευτικό ρόλο είτε διευκολύνοντας την ανάπτυξη και λειτουργία των Th1 κυττάρων είτε αποσβήνοντας τη δράση των ενεργοποιηµένων από τα Th1 µακροφάγων. Για το λόγο αυτό, είναι λογικό που τα Th2 κύτταρα είναι λιγότερο επιδεκτικά σε σχέση µε τα Th1 στην κατασταλτική δράση των φυσικών Tregs. Επιπλέον, η παρατήρηση ότι τα Th2 κύτταρα είναι ελάχιστα επιδεκτικά στη, και µπορούν εύκολα να διαφύγουν από τη, δράση των CD25 + Tregs που θα µπορούσε να συνεισφέρει στην εξήγηση χρονικοποιήσεων των φλεγµονών που παρατηρούνται σε αλλεργικές διαταραχές µέσω των Th2. [5] Όποιος και αν είναι ο µηχανισµός της καταστολής, είναι απαραίτητο να ελεγχθεί η έκταση της καταστολής µέσω Tregs προς όφελος του ατόµου επειδή η υπερβολική καταστολή µπορεί να οδηγήσει σε ανοσοκαταστολή και να καταστήσει το άτοµο ευπαθές σε µολύνσεις και καρκίνους ενώ πολύ χαµηλή ανοσοκαταστολή µπορεί να προκαλέσει αυτοάνοσες καταστάσεις και αλλεργίες. Ιδιαίτερα κατά τη διάρκεια µικροβιακών µολύνσεων, η καταστολή των Tregs πρέπει να εξασθενήσει για να επιτραπεί η αποτελεσµατική µικροβιο-ειδική καταστολή ενώ πολύ δυνατή αντιµικροβιακή άνοση απόκριση θα έπρεπε να ρυθµιστεί αρνητικά για να αποφευχθούν ανοσολογοπαθολογικές καταστροφές ιστών. Υπάρχουν πλέον απτά δεδοµένα πως η επέκταση και η ενεργοποίηση των φυσικών Tregs υπόκεινται σε ποικίλους τρόπους ελέγχου. Όπως αναφέρεται παραπάνω, οι κυτταροκίνες και τα συνδιεγερτικά µόρια παίζουν βασικό ρόλο στον έλεγχο αυτό. [1] 1.5. TLRs Το πώς ακριβώς ρυθµίζεται η δραστηριότητα των Tregs ώστε να επιτραπεί η αποτελεσµατική ανοσολογική απόκριση έναντι των παθογόνων χωρίς παθολογικές επανενεργοποιήσεις προβληµάτισε πολλούς ανοσολόγους. Μικροβιακές µολύνσεις ανιχνεύονται αρχικά από κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήµατος που χρησιµοποιούν µια ποικιλία τύπων υποδοχέων αναγνώρισης για την ανίχνευση χαρακτηριστικών στοιχείων που εκφράζονται από τα παθογόνα. Μία από τις πιο σηµαντικές οικογένειες των υποδοχέων αυτών είναι οι TLR υποδοχείς (Toll-like receptors) που αναγνωρίζουν PAMPs (pathogen-associated molecular patterns), 36

37 δηλαδή µια ποικιλία µικροβιακών προϊόντων, όπως συστατικά του κυτταρικού τοιχώµατος και µοτίβα προκαρυωτικού DNA και εκφράζονται από πολλούς πληθυσµούς κυττάρων όπως και των µακροφάγων, δενδριτικών, και επιλεκτικά κάποιων Β και Τ υποπληθυσµών. [7,40] Εικόνα 17: Είδη TLRs και αλληλεπίδραση µε τους συνδέτες τους ( Έχει γίνει η υπόθεση πως στα πλαίσια µιας πρώιµης φλεγµονώδους απόκρισης σε παρεισφρύσαντες µικροοργανισµούς, η µέσω TLR ενεργοποίηση των ΑΠΚ οδηγεί σε απελευθέρωση κυτταροκινών και CD4 + T κυτταρικών αποκρίσεων που είναι ανθεκτικά σε καταστολή. Παράλληλα, οι ίδιοι συνδέτες των TLRs δρουν απευθείας στα φυσικά Tregs µέσω του TLR2 για να διατηρήσουν την έκφραση του FoxP3 και επάγουν τον πολλαπλασιασµό των Tregs µε πρόσκαιρα ελαττωµένη καταστολή. Με τον καιρό, παρουσία µη επιθετικών συµβιωτικών βακτηρίων, το περιβάλλον των κυτταροκινών αλλάζει και γίνεται ανεκτικό, όπου τα φυσικά Tregs καταστέλλουν τα αποτελεσµατικά CD4 + T πιο αποτελεσµατικά. Το αν και άλλα ενδογενή µόρια, όπως HSP (heat shock proteins) έχουν επίσης τροποποιητικό ρόλο, πρέπει να διαλευκανθεί. [14] Για την ακρίβεια, η αναγνώριση µικροβιακών συστατικών από TLRs που εκφράζονται στην επιφάνεια των δενδριτικών κυττάρων πυροδοτεί την ενεργοποίηση των τελευταίων οδηγώντας την έναρξη της κυτταρικής ενεργοποίησης των κατάλληλων Teff. Η επαγόµενη από τους TLRs ενεργοποίηση των δενδριτικών κυττάρων αυξάνει την συνδιέγερση των δενδριτικών η οποία ενισχύει άµεσα την ενεργοποίηση των Teff. [7] Οι Pasare και Medzhitov έδειξαν πως η ενεργοποίηση της σηµατοδότησης από TLR στα δενδριτικά κύτταρα παίζει επίσης ρόλο µε έναν εξωγενώς του κυττάρου τρόπου ενισχύοντας τις αποκρίσεις των Teff υπερπηδώντας τη καταστολή των CD4 + CD25 + Tregs πιθανότατα από ενίσχυση σηµατοδότησης, ιδιαίτερα µέσω CD28, όπως µπορεί να προκύψει από την απόκριση των δενδριτικών σε µολύνσεις. [7,19] 37

38 Πιο συγκεκριµένα, δενδριτικά κύτταρα καλλιεργηµένα µε το LPS (lipopolysaccharide) συνδέτη του TLR4 ή τον συνδέτη CpG dinucleotide του TLR9, καταργούν in vitro την καταστολή που επιφέρεται µέσω φυσικών Tregs. Αυτό το µπλοκάρισµα της ενεργότητας των Tregs απαιτεί έκκριση IL-1β και IL-6 από τα δενδριτικά κύτταρα, για το λόγο αυτό, υπερκείµενα τέτοιων TLR-διεγερµένων δενδριτικών κυττάρων µπορούν επίσης να καταργήσουν την καταστολή. [7,14,19,40] Η IL-6 που παράγεται από τα διεγερµένα δενδριτικά κύτταρα µπορεί να είναι ένας διαλυτός µεσολαβητής που αναστέλλει τη λειτουργία των Tregs υπό τέτοιες συνθήκες. Επιπλέον, το µπλοκάρισµα του υποδοχέα της IL-6 επεκτείνει τα Tregs και ενισχύει την κατασταλτική τους δράση. [1,7] Ωστόσο η παραγωγή IL-6 από µόνη της δεν είναι αρκετή καθώς ένας ακόµη µηχανισµός επαγόµενος από τον TLR απαιτείται. Η ερώτηση κλειδί είναι ποιοι άλλοι παράγοντες δρουν µαζί µε την IL-6 και µε ποιο τρόπο παρακάµπτουν τη δράση των Tregs. [7] Εικόνα 18: Επιδράσεις των TLR συνδετών τροποποιούν απευθείας τη λειτουργία των φυσικών Tregs κατόπιν άµεσης αλληλεπίδρασης των TLRL µε τα Tregs. [16] Ως προς το τελευταίο, οι παράγοντες που εκκρίνονται από τα ενεργοποιηµένα δενδριτικά κύτταρα φαίνεται να δρουν στα αποκρινόµενα Τ κύτταρα, κάνοντας τα ανθεκτικά στις ανασταλτικές επιδράσεις των Tregs. Η σηµαντική συµβολή της IL-6 στο να υπερνικηθεί η δράση των Tregs in vivo επιβεβαιώθηκε από την ανακάλυψη ότι αποτελεσµατικό έναυσµα των Teff θα µπορούσε να αποκατασταθεί σε ποντίκια µε ανεπάρκεια IL-6 µε τη µείωση των CD4 + CD25 + Tregs κυττάρων. Αυτά τα αποτελέσµατα ενισχύουν το ρόλο των έµφυτων κυττάρων του ανοσοποιητικού (δενδριτικά κύτταρα) στις προσαρµοσµένες ανοσοποιητικές αποκρίσεις και αποδεικνύουν πως για αποτελεσµατική ενεργοποίηση των Teff είναι απαραίτητο να υπερκεραστεί η επικρατής αρνητική ρύθµιση από τα Tregs. [7] Να σηµειωθεί όµως πως, πρόσφατες µελέτες προτείνουν πως η αναγνώριση των παθογόνων από ενδογενείς ανοσολογικούς υποδοχείς δεν είναι πάντα διεγερτικοί συστατικά προερχόµενα από κάποια βακτηριακά παθογόνα µπορούν να αναστείλουν την ενεργοποίηση των ΑΠΚ έχοντας σαν αποτέλεσµα τη καταστολή του ανοσιακού συστήµατος και µια απόκριση όπου επικρατεί η IL-10. Τόσο η IL-10 όσο και τα µη ενεργοποιηµένα ΑΠΚ µπορούν να ενισχύσουν την ανάπτυξη εξειδικευµένων για το παθογόνο Tregs κυττάρων, το οποίο προκύπτει σε έναν αριθµό διαφορετικών ειδών µόλυνσης. [7] Αυτό συµβαίνει γιατί κάποια µέλη των TLRs, εκφράζονται σε Tregs και συµµετέχουν στην ενεργοποίηση και επέκταση τους. Τα CD4 + CD25 + Tregs εκφράζουν επιλεκτικά TLR2, TLR4, TLR5, TLR7 και TLR8 σε υψηλότερα επίπεδα από τα CD4 + Teff και συνδέτες τους, όπως οι πολυσακχαρίτες, είναι ικανοί να ξεπεράσουν την ανικανότητα τους να παράγουν IL-2 και την συνδεδεµένη ανεργία επάγοντας τον πολλαπλασιασµό και την κατασταλτική δράση τους. [16,19,40] Να 38

39 σηµειωθεί παρόλα αυτά πως, οι κατασταλτικές ιδιότητες των Tregs ενισχυόταν µετά την αποµάκρυνση του προσδέτη του TLR. [19] Όλα µαζί, αυτά τα στοιχεία δείχνουν πως ο αριθµός των αντιγονο-δραστικών Tregs και η κατασταλτική τους δράση µπορεί να προσαρµοστούν να ελέγχουν τη ρύθµιση είτε θετικά είτε αρνητικά των φυσιολογικών ή παθολογικών ανοσιακών αποκρίσεων. [1] 2. FOXP3 Μια βαθύτερη κατανόηση των αναπτυξιακών διεργασιών των φυσικών Tregs επιτεύχθηκε µέσω του γονιδίου FoxP3 (factor forkhead box protein 3). [5] Το γονίδιο FoxP3 (για τους ανθρώπους) κωδικοποιεί έναν µεταγραφικό καταστολέα της οικογένειας FKH (forkhead/winged-helix) που ονοµάζεται Scurfin. [5,6] Aν και υπάρχουν και µεταγραφικοί ενεργοποιητές και καταστολείς στην οικογένεια αυτή, οι πρωτεΐνες που περιέχουν την FKH δοµή συνήθως συµµετέχουν στη ρύθµιση της δέσµευσης της κυτταρικής σειράς και της αναπτυξιακής διαφοροποίησης. [41] Μεταλλάξεις του στον άνθρωπο οδηγούν σε IPEX (immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome), ένα Χ-συνδεδεµένο σύνδροµο ανοσοανεπάρκειας που συνδέεται µε αυτοάνοσες ασθένειες σε πολλά ενδοκρινικά όργανα (όπως τύπου 1 διαβήτης και θυρεοειδής), ατοπικές δερµατίτιδες και θανάσιµες µολύνσεις. Παροµοίως, µεταλλάξεις του στο ποντίκι που χαρακτηρίζουν το στέλεχος Scurfy επιφέρουν ένα θανατηφόρο Χ-συνδεδεµένο πολλαπλασιασµό της λέµφου που χαρακτηρίζεται από πολυοργανική ανοσοπαθολογία παρόµοια µε την ανθρώπινη ασθένεια IPEX. [6,20,42] Ποντίκια µε ανεπάρκεια FoxP3 παρουσιάζουν επίσης αλλεργική απορύθµιση µε έντονη παρουσία IgE επιπέδων και εωσινοφιλία σε απουσία Th2. Η παρουσία υψηλών επιπέδων IgE είναι ιδιαίτερο χαρακτηριστικό της ανεπάρκειας CD4 + CD25 + Treg και είναι κοινό και σε άλλα ποντίκια που στερούνται CD4 + CD25 + Treg. [40] 2.1. Ανακάλυψη Η παρατήρηση ότι σε ανθρώπους και ποντίκια µε µεταλλάξεις στο γονίδιο FoxP3 αναπτυσσόταν ένα φάσµα αυτοάνοσων και φλεγµονωδών ασθενειών που έµοιαζαν έντονα µε τις καταστάσεις που προκαλούνταν από την εξάλειψη των CD25 + CD4 + Tregs, οδήγησαν πολλές οµάδες να ερευνήσουν τη σχέση του γονιδίου αυτού µε την ανάπτυξη και λειτουργία των Tregs. [1,5-7,30] Η άµεση απόδειξη της σύνδεσης της λειτουργίας της έκφρασης του FoxP3 µε τα φυσικής προέλευσης CD4 + Tregs δόθηκε αρχικά από µελέτες απώλειας λειτουργίας. [2]. Πράγµατι, πειράµατα έκφρασης του FoxP3 mrna σε φυσιολογικά ποντίκια έδειξαν ότι το FoxP3 mrna και η πρωτεΐνη Scurfin εκφράζονται ειδικά στα CD25 + CD4 + Tregs [6] Από την άλλη, µεταλλαγµένα Scurfy ποντίκια ή µε στοχευµένη απαλοιφή του FoxP3 ήταν ανίκανα να αναπτύξουν φυσικά CD25 + CD4 + Tregs, αν και περιείχαν µεγάλους αριθµούς χρονικά ενεργοποιηµένων CD25 + µη ρυθµιστικών Τ κυττάρων, ενώ αντίθετα ο αριθµός των CD25 + CD4 + Tregs αυξανόταν σηµαντικά σε διαγονιδιακά ποντίκια που υπερέκφραζαν το FoxP3. [2,6,43] Παράλληλα, εκτοπική έκφραση του FoxP3 µε χρήση ρετροϊού για επιµόλυνση, µετέτρεπε τα αθώα CD4 + CD25 - T και CD8 + CD25 - T κύτταρα σε κύτταρα µε το 39

40 φαινότυπο και τα λειτουργικά χαρακτηριστικά των Tregs, τουλάχιστον σε ποντίκια, [1,2,5-7,30] Έτσι, αυτά τα κύτταρα που εξέφραζαν FoxP3 αποτύγχαναν να πολλαπλασιαστούν και εξέκριναν ελάχιστα IL-2, IFN-γ και IL-4 ως απόκριση σε TCR διέγερση in vitro. [2] Από την άλλη, η έκφραση του FoxP3 οδήγησε σε θετική ρύθµιση σχετιζόµενων µε τα Tregs επιφανειακών µορίων, συµπεριλαµβανοµένων των CD25, CTLA-4, GITR και CD103. Επιπλέον, τα διαγονιδιακά µε FoxP3 Τ κύτταρα ανέστειλαν τον πολλαπλασιασµό και την παραγωγή IL-2 από τα αθώα CD25 CD4 + T κύτταρα in vitro. Ο τρόπος αυτής της in vitro καταστολής φάνηκε να είναι παρόµοιος µε αυτή των CD25 + CD4 + Treg κυττάρων, επειδή αυτά τα κύτταρα απαιτούσαν TCR διέγερση και κυτταρική επαφή µε το αποκρινόµενο κύτταρο-στόχο για να επιφέρουν καταστολή. [2,3,5-7] Πιο σηµαντικά, συµµεταφορά Foxp3 τροποποιηµένων Τ κυττάρων µε CD25 CD4 + T κύτταρα εµπόδισε αυτοάνοσες ασθένειες σε SCID ποντίκια. in vitro αλλά και αυτοάνοσες γαστρίτιδες και ασθένειες φλεγµονής του εντέρου σε µυικά µοντέλα in vivo. [2,3,5-7] Παράλληλα, µε τέτοιες µελέτες απώλειας λειτουργίας δείχθηκε απευθείας και ο αναντικατάστατος ρόλος του FoxP3 στην ανάπτυξη των Tregs. Ο FoxP3 είναι απαραίτητος για τη δηµιουργία των CD25 + CD4 + T κυττάρων και οι θανατηφόρες λεµφοπολλαπλασιαστικές ασθένειες σε scurfy ή FoxP3 ανεπαρκή ποντίκια οφείλονται αρχικά, αν όχι εξ ολοκλήρου, στην ελαττωµατική γένεση αυτών των ρυθµιστικών πληθυσµών. Αυτό αποδεικνύεται από το γεγονός ότι αν και CD25 + CD4 + T κύτταρα είναι παρόντα στην περιφέρεια scurfy ή µε ανεπάρκεια FoxP3 ποντικιών, δεν είναι ούτε ανεργικά ούτε κατασταλτικά in vitro. [2] Επιπλέον, από πειράµατα χιµαιρικών µυελών των οστών, όπου σε ακτινοβοληµένα ποντίκια επανεγκαθίδρυαν ένα µίγµα αλλογενικών σηµασµένων FoxP3 - και FoxP3 + κυττάρων µυελού των οστών, δείχθηκε πως αυτές οι χίµαιρες, που ήταν µωσαϊκά CD4 + T κυττάρων που είτε εξέφραζαν FoxP3 είτε όχι, παρέµεναν υγιείς όπως και τα θηλυκά άτοµα που φέρουν µεταλλάξεις του FoxP3. Αξίζει να σηµειωθεί πως τα CD25 + CD4 + CD8 T κύτταρα που δηµιουργούνταν στο θύµο και την περιφέρεια ήταν ολοκληρωτικά FoxP3 + προέλευσης, υποδεικνύοντας πως ο FoxP3 απαιτούνταν για τη δηµιουργία των CD25 + CD4 + T κυττάρων. [2] Σηµαντικό ήταν επίσης να δειχθεί πως η έκφραση του FoxP3 δεν είναι µια άµεση συνέπεια της ενεργοποίησης των Τ κυττάρων. Αυτό επιτεύχθηκε επειδή in vitro διέγερση των CD25 - CD4 + κυττάρων επί τρεις µέρες µε αντι-cd3 mabs παρουσία of IL-2 ή CD28 mab απέτυχε να επιφέρει έκφραση του FoxP3. Επίσης, ούτε τα αποτελεσµατικά Th1 ούτε τα αποτελεσµατικά Th2 κύτταρα από αθώα Τ κύτταρα εξέφρασαν FoxP3. Επιπλέον, διέγερση των CD25 + CD4 + κυττάρων µε αντι-cd3 mab και IL-2 δεν άλλαξε τα επίπεδα έκφρασης του FoxP3. Για το λόγο αυτό, η έκφραση του FoxP3 είναι σταθερή στα CD25 + CD4 + Tregs κύτταρα ανεξάρτητα από τον τρόπο ή την φάση ενεργοποίησης. [42] Για όλους τους παραπάνω λόγους φαίνεται πως το FoxP3 είναι ο παράγοντας κλειδί για την ανάπτυξη και λειτουργία των φυσικών CD25 + CD4 + Tregs, τα οποία, σύµφωνα µε τον Sakaguchi και τους συνεργάτες του, είναι εν δυνάµει καταστολείς της αυτοανοσίας ακριβώς λόγω της έκφρασης του FoxP3. [6,44] Το σηµαντικό είναι πως, σε αντίθεση µε τους δείκτες επιφάνειας που χρησιµοποιούνταν µέχρι τότε, δε βρέθηκε ποτέ σε µη Tregs που ακολουθούσαν συµβατική ενεργοποίηση ή διαφοροποίηση Th1 και Th2, ούτε σε ΝΚ Τ κύτταρα. [6,7,30] εδοµένου ότι οι άνθρωποι φέρουν φυσικά CD25 + CD4 + Tregs µε φαινότυπο και λειτουργία συγκρίσιµη µε αυτή των αρουραίων, είναι πιο πιθανό ότι στο IPEX, καταστροφή του FoxP3 γονιδίου καταστρέφει την ανάπτυξη των θυµικών Tregs 40

41 προκαλώντας υπερενεργοποίηση των αυτοδραστικών Τ κυττάρων από αυτοαντιγόνα, συµβιωτικά βακτήρια ή αβλαβή συστατικά του φυσικού περιβάλλοντος. Αυτό έχει πολλές επιπτώσεις στην αυτοανοχή και στις αυτάνοσες/φλεγµονώδεις ασθένειες των ανθρώπων. [6,20] Αυτή η σύνδεση του IPEX µε τη διαταραγµένη λειτουργία των Tregs είναι το πιο σαφές παράδειγµα ότι µια ανωµαλία στα φυσικά Tregs είναι η πρωταρχική αιτία αυτοάνοσων ασθενειών και αλλεργιών. είχνει επίσης ότι η ανάπτυξη των φυσικών Tregs είναι, εν µέρει τουλάχιστον, γενετικά και αναπτυξιακά καθορισµένη. Τέλος καθιστά σαφές πως ετεροζυγίες για το FoxP3 σε θηλυκά (εξαιτίας τυχαίας απενεργοποίησης του Χ χρωµοσώµατος κατά τη διάρκεια ειδικής επεξεργασίας µεµονωµένων Tregs, ετερόζυγα θηλυκά έχουν FoxP3-ελλατωµατικά Tregs και FoxP3-κανονικά σα γενετικά µωσαϊκά) απεικονίζουν ότι ο µηχανισµός της επικρατούς αυτοανοχής λειτουργεί φυσιολογικά στους ανθρώπους, Αυτή η παρατήρηση αποδεικνύει πως ακόµα και µειωµένοι αριθµοί FoxP3 + Tregs είναι ικανοί να ελέγξουν δυναµικά παθογενή Τ κύτταρα και επιπλέον ακόµα και µερική αποκατάσταση των Tregs µπορεί να είναι αρκετή να θεραπεύσει το IPEX ή άλλες αυτοάνοσες παθολογίες. [6] Παρόµοιο πρότυπο έκφρασης FoxP3 καταγράφηκε επίσης σε ανθρώπινα κύτταρα, µε κάποιες όµως διαφορές. Για παράδειγµα, υπάρχει τουλάχιστον µια περίπτωση του FoxP3 να επάγεται φανερά κατόπιν συγκεκριµένης ενεργοποίησης των ανθρώπινων φυσικών CD25 - T κυττάρων µέσω αντισώµατος, κάτι που δεν έχει παρατηρηθεί µέχρι τώρα σε µυικό µοντέλο. [1,6] Επίσης, κάποια βήµατα της ενεργοποίησης των ανθρώπινων φυσικών CD25 - Τ κυττάρων από δενδριτικά κύτταρα οδήγησαν και αυτά σε θετική ρύθµιση του FoxP3. [6] 2.2. Το γονίδιο FoxP3 Το αγρίου τύπου FoxP3 γονίδιο κωδικοποιεί για µια πρωτεΐνη 48-kDa, που προσδένεται στο DNA και καταστέλλει τη µεταγραφή. Η πρωτεΐνη αυτή εκφράζεται σε χαµηλά επίπεδα πρωταρχικά στα CD4 T κύτταρα, ενώ τα επίπεδα έκφρασης της δε φαίνεται να µεταβάλλονται µετά την ενεργοποίηση. [41] Ο παράγοντας FoxP3 έχει µια πλούσια σε προλίνες Ν-τελική περιοχή, που διευκολύνει τη µεταγραφική καταστολή, έναν C 2 H 2 δακτύλιο ψευδαργύρου και ένα φερµουάρ λευκίνης. [2,40] Η δοµή φερµουάρ λευκίνης δείχθηκε σε µελέτες άλλων παραγόντων της οικογένειας πως συµµετέχει στον σχηµατισµό οµοδιµερών και ετεροδιµερών. [14,40] είχθηκε επίσης ότι χρειάζεται διµερισµός και συµµετοχή και άλλων παραγόντων της οικογένειας για τη λειτουργία του. [3] Εικόνα 19: Το γονίδιο FoxP3 [40] 41

42 Το πιο σηµαντικό και ξεχωριστό όµως χαρακτηριστικό του FoxP3 είναι ο εντοπισµός µιας δοµής FKH (forkhead/winged helix) στο C-τελικό άκρο της πρωτεΐνης χάρη στην οποία έχει την ικανότητα να προσδένεται στο DNA και να δρα ως µεταγραφικός παράγοντας. Η FKH δοµή, µόλις 84 αµινοξέων, απαιτείται για τη ρύθµιση της λειτουργίας των Τ κυττάρων. Γενικά, η δοµή αυτή εντοπίζεται κοντά στο Ν-τελικό άκρο, όµως αυτό το ιδιαίτερο χαρακτηριστικό µπορεί να είναι σηµαντικό για τη λειτουργία της και να συµβάλει στο διαχωρισµό της από τις άλλες ενεργές πρωτεΐνες της FKH οικογένειας στα CD4 T κύτταρα. [41] Απλές αµινοξικές διαγραφές στην περιοχή του φερµουάρ και µεταλλάξεις και διαγραφές στην FKH δοµή συνδέονται µε την ανάπτυξη του IPEX αλλά και του XLAAD (X-linked autoimmunity-allergic dysregulation syndrome). Καθώς η πλειοψηφία των µεταλλάξεων στον άνθρωπο εντοπίζονται εντός της FKH δοµής, υποδεικνύεται έτσι ο ρόλος της στη λειτουργία του FoxP3. [2,42] Mια εισαγωγή 2 bp στο εξώνιο 8 προκαλεί αλλαγή στο πλαίσιο ανάγνωσης και πρώιµο κωδικόνιο λήξης που οδηγεί σε παραγωγή προϊόντος χωρίς την FKH δοµή και το σήµα πυρηνικού εντοπισµού στο C- τελικό καθιστώντας τον µη λειτουργικό µεταγραφικό ρυθµιστή. [2,40,41,45] Επιπλέον, ένας ειδικός πολυµορφισµός στην περιοχή του υποκινητή του FoxP3 συνδέεται µε τον αυτοάνοσο διαβήτη. [23] Λίγα όµως είναι γνωστά και σχετικά µε τους παράγοντες που εµπλέκονται στην έκφραση του FoxP3. Πρόσφατα, µια µελέτη έδειξε ότι η πλησιέστερη στο γονίδιο του FoxP3 περιοχή υποκινητή περιέχει θέσεις πρόσδεσης των µεταγραφικών παραγόντων Sp1, AP1 και STAT5, καθώς και έξι περιοχές σύνδεσης NF-AT (nuclear factor of activated T cells). [1,21] Τα µονοπάτια των NF-AT και AP-1 εµπλέκονται στη µεταγωγή των TCR και συνδιεγερτικών σηµάτων, και η έκφραση του γονιδίου του FoxP3 παρατηρήθηκε σε αθώα Τ κύτταρα κατόπιν ενεργοποίησης των TCR σε ανθρώπους αλλά όχι σε ποντίκια, όπως προαναφέρθηκε. Η επαγωγή της έκφρασης του FoxP3 αναστέλλεται από την κυκλοσπορίνη Α, υποδεικνύοντας πως αυτό το φάρµακο µπορεί να εξασθενεί την αυτοανοχή σε συγκεκριµένες καταστάσεις επηρεάζοντας τα φυσικά Tregs. [1,41] Εικόνα 20: Τα µεταγραφικά σύµπλοκα του NFAT και η ενεργοποίηση των Τ κυττάρων. [3] Από την παρατήρηση ότι ο υποκινητής δεσµεύει Sp1 και NFAT µόνο αδύναµα σε σχέση µε τη δέσµευση τους σε υποκινητές γονιδίων όπως αυτών που κωδικοποιούν την IL-2 και IL-10, πυροδοτήθηκε η έρευνα για FoxP3 ενισχυτές λόγω του ότι η ενεργότητα του υποκινητή του FoxP3 ήταν µεγαλύτερη παρουσία του SV40 ενισχυτή. Η έρευνα οδήγησε στον προσδιορισµό µιας εξελικτικά διατηρηµένης περιοχής ενισχυτή (θέσεις µε +2738) µε NFAT και Smad θέσεις πρόσδεσης. [21] Μέχρι πρότινος, δεν υπήρχε κανένα στοιχείο για το πώς η σηµατοδότηση από τον TGF-β µπορεί να συµβάλει στην έκφραση του FoxP3, καθώς πρόσδεση Smad πρωτεϊνών στον υποκινητή του FoxP3 δεν είχε αναφερθεί. Πράγµατι, ο Tone και οι 42

43 συνεργάτες του έδειξαν ότι ο υποκινητής δεν περιέχει αλληλουχίες πρόσδεσης για Smad πρωτεΐνες, ανακαλύφθηκε όµως ότι η πρόσδεση των NFAT και Smad3 στον ενισχυτή προκαλεί µια σηµαντική ενίσχυση της ενεργότητας του υποκινητή του FoxP3 και κατάληξαν ότι η συνεργιστική δράση των NFAT και Smad3 είναι επιβεβληµένη για την έκφραση του FoxP3. [21] Ενδιαφέρον είναι το γεγονός ότι η πρόσδεση της Smad3 στον ενισχυτή συνέβαινε µόνο κατά τα πρώιµα στάδια τη εξαρτώµενης από TGF-β επαγωγής και φαινόταν να είναι διαθέσιµη στα µετέπειτα στάδια ενώ η πρόσδεση του NFAT απαιτούνταν καθ όλη την 24ωρη περίοδο παρακολούθησης. [21] Με µια πρώτη µατιά, αυτά τα αποτελέσµατα φαίνονται να είναι κατά κάποιο τρόπο σε διαφωνία µε την ιδέα ότι η έλλειψη σε σηµατοδότηση από τον TGF-β δεν έχει καµία επίδραση στην ενδοθυµική δηµιουργία των Tregs. Θα µπορούσε να συµφωνηθεί παρόλα αυτά πως οι ακτιβίνες ή οι µορφογεννητικοί παράγοντες των οστών της οικογένειας των TGF-β µπορούν να λειτουργούν ενδοθυµικά ακόµα και παρουσία ενός επικρατούς αρνητικού TGF-β υποδοχέα II για να φωσφορυλιώσουν Smad πρωτεΐνες. [21] Επιπλέον, η προφανής απαίτηση TGF-β σηµατοδότησης για τη διατήρηση των περιφερικών Tregs δε φαίνεται να είναι ιδιαίτερα συµβατή µε την ιδέα ότι η Smad3 είναι απαραίτητα µόνο κατά τα πρώιµα στάδια της θετικής ρύθµισης του FoxP3. Εδώ θα µπορούσε να συµφωνηθεί ότι η διατήρηση των Tregs απαιτεί TGF-β για λόγους διαφορετικούς της θετικής ρύθµισης του FoxP3. [2,21] Επίσης, η συνεχής απαίτηση για πρόσδεση του NFAT στον ενισχυτή του FoxP3 µπορεί να είναι σε σύγκρουση µε την ιδέα ότι ο NFAT προσδένεται στο FoxP3, το οποίο θεωρητικά θα µπορούσε να παρεµβάλλει στη θέση πρόσδεσης στον ενισχυτή του FoxP3. [21] Παρ όλες τις παραπάνω επιφυλάξεις, πιστεύεται ότι η πρόσδεση των NFAT και Smad3 στον ενισχυτή του FoxP3 είναι επιβεβληµένη για την έκφραση του FoxP3. Το γεγονός ότι αυτή η πρόσδεση προκαλεί ακετυλίωση της Η4 και ότι αυτή η ακετυλίωση συµβαίνει µόνο στα FoxP3 + κύτταρα αποτελεί µια καλή επιβεβαίωση για αυτόν τον ισχυρισµό. [21] Αν και αυτά τα αποτελέσµατα δεν µπορούν να δηµιουργήσουν κανόνα ότι υπάρχει ένα Smad3-ανεξάρτητο και εποµένως TGF-β-ανεξάρτητο µονοπάτι στην επαγωγή του FoxP3, φαίνεται να έχει ανακαλυφθεί ένα TGF-β-εξαρτώµενο µονοπάτι επαγωγής της έκφρασης του FoxP3. Είναι γνωστό εδώ και κάποιο διάστηµα ότι in vitro TGF-β-εξαρτώµενη επαγωγή δεν οδηγεί σε πολύ σταθερό φαινότυπο Foxp3 + Tregs και γι αυτό µάλλον και άλλοι παράγοντες συµβάλλουν in vivo. Από τα αποτελέσµατα των Tone και συνεργατών προκύπτει το ερώτηµα αν υπάρχουν Smad3- ανεξάρτητα µονοπάτια στην επαγωγή του FoxP3, το οποίο πιθανώς θα µπορούσε να ελεγχθεί κάνοντας knock-in ένα FoxP3 αλληλόµορφο µε µεταλλαγµένη θέση πρόσδεσης της Smad3. [21] Η µετα-µεταφραστική τροποποίηση είναι ένας µηχανισµός που µπορεί να αλλάξει τον εντοπισµό και τη λειτουργία των πρωτεϊνών. Ο ανθρώπινος FoxP3 παράγοντας φωσφορυλιώνεται από µια αδιευκρίνιστη κινάση ή και κινάσες και επίσης ακετυλιώνεται από ακετυλοτρανσφεράσες όπως είναι η ΤΙΡ60. Η ΤΙΡ60 βρέθηκε να σχετίζεται µε τις HDAC1 (class l histone deacetylases) και µε τις τύπου ΙΙ όπως είναι η HDAC7. Οι ΗΑΤ και HDAC πρωτεϊνικές οικογένειες, αρχικά θεωρούταν πως ρύθµιζαν µόνο τη δοµή της χρωµατίνης και τη λειτουργία της και ότι τροποποιούσαν ιστόνες αλλά και µη ιστονικές πρωτεΐνες. Η ακετυλίωση των ιστονών, η οποία συµβαίνει στα Ν-τελικά άκρα των ιστονών Η3 και Η4, πιστεύεται γενικά πως αυξάνει την προσβασιµότητα στη µεταγραφική µηχανή που προωθεί την µεταγραφή του γονιδίου. Πρόσφατες µελέτες έδειξαν πως οι ΗΑΤs τροποποιούν µια ποικιλία µη 43

44 ιστονικών πρωτεϊνών. Οι περισσότερες από αυτές τις ακετυλιωµένες µη ιστονικές πρωτεΐνες περιλαµβάνουν περισσότερους από 30 µεταγραφικούς παράγοντες που πρσδένονται στο DNA, όπως οι p53, BCL6, STAT3, FOXO4, η υποµονάδα RelA του NFkB. [46] 2.3. ράση του παράγοντα FoxP3 Ο FoxP3, που εκφράζεται ειδικά στα φυσικά CD25 + CD4 + Tregs (ενώ λίγα µετάγραφα, αν όχι καθόλου, εντοπίζονται σε άλλους λεµφοκυτταρικούς πληθυσµούς και ιστούς, όπως τα Β κύτταρα, τα CD8 + T κύτταρα, στον εγκέφαλο, την καρδιά, τα νεφρά και το λάρυγγα), παίζει σηµαντικό ρόλο στην ανάπτυξη, λειτουργία και διατήρηση των κυττάρων αυτών. [1,2,30,42] Σε αντίθεση µε τα συµβατικά CD4 + Τ λεµφοκύτταρα, τα CD4 + CD25 + Tregs µπορούν να διαφοροποιηθούν πλήρως στον θύµο. [7] Στο θύµο, η έκφραση του FoxP3 αρχίζει στο όψιµο διπλά θετικό στάδιο, και τα FoxP3 + CD4 + Tregs µπορούν να εντοπιστούν σε ποντίκια από την τρίτη µέρα της γέννησης τους, δείχνοντας µια καλή σύνδεση µε το εύρηµα πως θυµεκτοµή τη τρίτη µέρα της γέννησης προκαλεί οργανοειδικές αυτοάνοσες ασθένειες οι οποίες µπορούν να αποφευχθούν µε εµβολιασµό µε φυσικά CD25 + CD4 + Tregs. [1,3] Αλλά ποια γεγονότα υπαγορεύουν τη δέσµευση της κυτταρικής σειράς των Tregs in vivo; Τα ανοδικά σήµατα που ενεργοποιούν τη µεταγραφή του FoxP3 παραµένουν άγνωστα. Παρόλα αυτά, δεδοµένου πως οι αλληλεπιδράσεις υψηλής συγγένειας των TCR προωθούν τη δηµιουργία των Tregs στο θύµο, ένα τέτοιο µονοπάτι θα ήταν το ίδιο µε τα επαγόµενα από τους TCRs σήµατα. Αυτά τα αποτελέσµατα προτείνουν πως η υψηλή συγγένεια αλληλεπίδρασης των TCRs µπορεί να είναι υπεύθυνη για την επαγωγή της έκφρασης του FoxP3. [2] Μια άλλη ελκυστική πιθανότητα είναι ότι η έκφραση του FoxP3 επάγεται από εξειδικευµένους πληθυσµούς αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων (ΑΠΚ). Στο θύµο, η ανάπτυξη των Tregs απαιτεί παρουσίαση από τα επιθηλιακά κύτταρα του θύµου ενώ στην περιφέρεια παρόµοια σήµατα µπορεί να παρέχονται από εναποµείναντες πληθυσµούς δενδριτικών κυττάρων. [7] 44

45 Εικόνα 21: Έλεγχος της ανάπτυξης των Tregs από το FoxP3. Στον θύµο, ένα ανώριµο θυµοκύτταρο που εκφράζει υψηλής συγγένειας TCR για τα αυτοαντιγόνα-mhc II που παρουσιάζονται από το επιθήλιο του θύµου ρυθµίζει θετικά την έκφραση του FoxP3 και διαφοροποιείται σε Treg. Τα κύτταρα που εκφράζουν χαµηλής συγγένειας TCRs επιλέγονται θετικά ως συµβατικά βοηθητικά (Th) ή τοξικά (Tc) Τ κύτταρα. Στην περιφέρεια, τα θυµικής προέλευσης Tregs καταστέλλουν τα αποκρινόµενα Th ή Tc κύτταρα όταν ενεργοποιούνται από τα ΑΠΚ. Μπορεί επίσης να καταστείλουν τη λειτουργία των ΑΠΚ και τέτοια απενεργοποιηµένα ΑΠΚ µπορεί να αποτύχουν να ενεργοποιήσουν τα αποκρινόµενα κύτταρα. Υπό συνθήκες ανοχής ή αντιφλεγµονώδεις, τα Th ή Tc κύτταρα µπορεί να αποκτήσουν έκφραση του FoxP3 και να διαφοροποιηθούν σε Tregs στην περιφέρεια. Ο TGF-b µπορεί να προωθεί αυτή τη δηµιουργία Tregs στην περιφέρεια. [2] Η παραγωγή της IL-2 στα Τ κύτταρα ελέγχεται κυρίως σε µεταγραφικό επίπεδο από έναν καλά χαρακτηρισµένο υποκινητή 300 bp, ο οποίος ελέγχεται από τη συναρµολόγηση πολλών µεταγραφικών παραγόντων που εξαρτώνται από τη διέγερση σε ένα σύµπλεγµα, αλλά και τη τοπική δοµή της χρωµατίνης, ακετυλοτρανσφεράσες ιστονών και αποακετυλάσες ιστονών και την µεθυλίωση του νησιδίου CpG από την IL-2 περιοχή υποκινητή. Ο FoxP3 φάνηκε να καταστέλλει την παραγωγή IL-2 µέσω άµεσης αλληλεπίδρασης µε τις διατηρηµένες FKH περιοχές πρόσδεσης κοντά στην περιοχή πρόσδεσης του ΝFAT στον υποκινητή της IL-2 παρεµποδίζοντας της πρόσδεσης του τελευταίου στον υποκινητή. Αυτή η αναστολή µπορεί να ευθύνεται και για την ανεργία των CD25 + CD4 + T κυττάρων, την ανικανότητα τους να παράγουν IL-2. [2,3,46] Εικόνα 22: Μοντέλα πρόσδεσης του FoxP3 στη ρυθµιστική αλληλουχία του γονιδίου της IL-2. [ Ο FoxP3 εκτός της IL-2 είναι αναστολέας και της IL-4, της IFN-γ και άλλων ρυθµιζόµενων από το NFAT κυτταροκινών µέσω άµεσων φυσικών αλληλεπιδράσεων 45

46 µε τους NF-κB (nuclear factor-κb) και NFAT, για την ακρίβεια µέσω αναστολής των αποτελεσµάτων των δύο αυτών µεταγραφικών παραγόντων-κλειδί. [1,14,23,30] Προσδένεται επίσης στην περιοχή του υποκινητή και στον ενισχυτή του granulocyte macrophage colony-stimulating factor κοντά στις περιοχές πρόσδεσης του NFAT. [23] Ο FoxP3 µπορεί επίσης να αναστείλει το CREB (camp response elementbinding) µονοπάτι µέσω αλληλεπίδρασης µε την συνενεργοποιητική του CREB p300 πρωτεΐνη. [1,3] Μια πρόσφατη µελέτη έδειξε πως το σύµπλεγµα NFAT FOXP3 απαιτείται για την κατασταλτική δράση των Tregs. Τέτοιο σύµπλοκο ρυθµίζει θετικά και την έκφραση του CD25 και CTLA-4. [1,3,30] Επειδή το FoxP3 είναι βασικό γονίδιο ελέγχου για την ανάπτυξη και λειτουργία των Tregs, DNA microarray ανάλυση σε µυικά CD25 + CD4 + T κύτταρα σε σύγκριση µε CD25 CD4 + T κύτταρα πριν ή κατόπιν ενεργοποίησης, και µε FoxP3-επαγόµενα και µε FoxP3-µη επαγόµενα CD4 + T κύτταρα αποκάλυψε πως σχετικά λίγα γονίδια ρυθµίζονται αρνητικά ενώ των περισσοτέρων η έκφραση αυξάνεται. Θετικά ρυθµίζονται τα IL-2Ra (CD25), Ctla4 (CTLA-4) και Tnfrsf18 (GITR) ενώ η IL-2 καταστέλλεται στα Tregs σε σύγκριση µε τα ενεργοποιηµένα. [3] Επίσης, αποκαλύφθηκαν πολλά γονίδια που ρυθµίζονται θετικά σε FoxP3- εξαρτώµενο και FoxP3-ανεξάρτητο τρόπο. Για παράδειγµα, γονίδια που κωδικοποιούν για GPR83 (G protein-coupled receptor 83), ECM1 (extracellular matrix protein 1), CMTM7 (CKLF-like MARVEL transmembrane domain containing 7), NKG7 (natural killer cell group 7 sequence), SOCS2 (suppressor of cytokine signaling 2) και γλουταρεδοξίνη ρυθµίζονται θετικά από την έκφραση του FoxP3 σε αθώα CD4 + Τ κύτταρα, ενώ η θετική ρύθµιση των insulin-like 7, galectin-1, granzyme B και των γονιδίων helios στα φυσικά Tregs είναι FoxP3-ανεξάρτητη. Μελέτες σε ανθρώπους έδειξαν ότι η έκφραση των γονιδίων των LGALS3 (lectin, galactoside-binding, soluble 3) και UBD (ubiquitin D) εξαρτάται από την έκφραση του FoxP3. Η λειτουργική σηµασία της θετικής ρύθµισης των παραπάνω γονιδίων για την καταστολή παραµένει άγνωστη. Μια τέτοια προσέγγιση όµως θα παρείχε νέα δεδοµένα για την κατανόηση των µηχανισµών καταστολής µέσω των Tregs και καινούριους ειδικούς µεµβρανικούς δείκτες για τα Tregs. [1,30] 3. ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΠΡΟΟΠΤΙΚΕΣ Από την στιγµή που αναγνωρίστηκε ο πληθυσµός των Tregs και η συµµετοχή του στις ανοσιακές αποκρίσεις, µεγάλη προσπάθεια καταβλήθηκε για την επίλυση όλων των µυστηρίων που αφορούν στο φαινότυπο, στη δηµιουργία και στη λειτουργία τους, τονίζοντας ακριβώς την σηµασία του πληθυσµού αυτού στην εξασφάλιση της φυσιολογικής λειτουργίας του ανοσολογικού συστήµατος και καθιστώντας τον πιθανό θεραπευτικό εργαλείο. Πιο συγκεκριµένα, παρατηρήθηκε στα λεµφοκύτταρα του περιφερικού αίµατος σε ασθενείς µε γαστρεντερικές κακοήθειες, αδενοκαρκινώµατα του στήθους, καρκίνους του λάρυγγα, καρκίνους του εγκεφάλου ή µελανώµατα ένα αυξανόµενο ποσοστό των CD4 + CD25 + T κυττάρων, ενώ άλλοι πρότειναν την παρουσία αυτών των κυττάρων µεταξύ των TILs (tumor-infiltrating T lymphocytes) ή σε αποστραγγιστικούς λεµφαδένες όγκων από διαφόρων ειδών καρκίνους [1,8,47] Αυτές οι κλινικές παρατηρήσεις και παρόµοια ευρήµατα από µυικούς όγκους προτείνουν πως η µείωση του αριθµού των Tregs ή η εξασθένηση της λειτουργίας τους µπορεί να αυξήσει την αποτελεσµατικότητα των ανοσοθεραπειών για τον καρκίνο, γιατί αυτά µπορεί να 46

47 παρεµποδίζουν την αποτελεσµατική ανοσοεπίβλεψη ενάντια καρκινικών κυττάρων που προκύπτουν και εµποδίζουν τις αποτελεσµατικές ανοσιακές αποκρίσεις συµβάλλοντας έτσι στην εγκαθίδρυση των όγκων. [1] Πράγµατι, η αποµάκρυνση των Tregs κυττάρων ή το µπλοκάρισµα των ανοσορυθµιστικών µονοπατιών που επάγονται από τα κύτταρα αυτά οδηγεί στη επανάκτηση της φυσικής επίβλεψης σε ανοσίες όγκων και/ή βελτίωση στις αποκρίσεις σε εµβόλια για τον καρκίνο. [7,8] Παροµοίως µε την ογκολογική ανοσία, µείωση του αριθµού των Tregs, εξασθένηση της λειτουργίας τους και µεσολάβηση στην παρουσία τους µπορεί να ενισχύσει και τις αντιµικροβιακές άνοσες αποκρίσεις και µπορεί να βοηθήσει στη θεραπεία χρόνιων µολύνσεων, όπως µολύνσεις από HIV (human immunodeficiency virus) ή HCV (hepatitis C virus). [1] Από την άλλη, προτείνεται αύξηση του αριθµού των Tregs ή της δράσης τους για τη θεραπεία αλλεργιών και αυτοάνοσων και/ή φλεγµονωδών ασθενειών, ή για την επαγωγή ανοχής µοσχευµάτων. [1] Μείωση του αριθµού ή καταστροφή της λειτουργίας των Tregs έχουν αναφερθεί σε πολυάριθµες ανθρώπινες αλλεργικές, φλεγµονώδεις ή αυτοάνοσες ασθένειες, εποµένως in vivo ή ex vivo επέκταση των Tregs, ειδικά των αντιγονο-ειδικών, µπορεί να είναι ένας αποτελεσµατικός τρόπος για τη θεραπεία των ασθενειών αυτών. [1] Παροµοίως, η επέκταση των αντιγονο-ειδικών Tregs µπορεί να χρησιµοποιηθεί για την επαγωγή ανοχής σε αλλογενικά όργανα, να καταστείλει την απόρριψη µοσχευµάτων και τη θεραπεία της ασθένειας µοσχεύµατος εναντίον ξενιστή. [1,10] Η ανοχή µοσχεύµατος µπορεί να εγκαθιδρυθεί ή η αυτοανοχή να επανεγκαθιδρυθεί αν τα αποτελεσµατικά Τ κύτταρα µπορούν να καταστραφούν επιλεκτικά ή να κατασταλούν ενώ τα Tregs παραµείνουν ανέπαφα ή, πιο γενικά, αν είναι πιο ανθεκτικά από τα αποτελεσµατικά Τ κύτταρα σε συγκεκριµένη αγωγή της καταστροφής ή καταστολής των Tregs. [1,44] Εικόνα 23: Ο επιλεκτικός χειρισµός της λειτουργίας των Tregs είναι το ζητούµενο της ανοσολογίας. [28] 47

48 ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΟ-ΣΚΟΠΟΣ Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η µελέτη του πληθυσµού των Τregs µετά από εγχείρηση και µετάγγιση αίµατος. Για τον σκοπό αυτό παρακολουθήθηκαν ασθενείς της ορθοπεδικής κλινικής του Γενικού Πανεπιστηµιακού Νοσοκοµείου Πατρών οι οποίοι εισήχθησαν λόγω πολλαπλών τραυµάτων και χωρίστηκαν σε δύο οµάδες: σε αυτούς που χρειάστηκαν µετάγγιση αίµατος και σ αυτούς που δε χρειάστηκαν. 48

49 ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΙ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΑ 1.1 Ασθενείς Συνολικά, µελετήθηκαν 31 δότες, κυµαινόµενης ηλικίας 28 µε 87 χρόνων, µέσης ηλικίας 69 ετών εκ των οποίων 25 γυναίκες και 6 άνδρες οι οποίοι χωρίστηκαν σε επιµέρους κατηγορίες µε βάση τη γενική τους κατάσταση, την ανάγκη µετάγγισης, την εµφάνιση περιεγχειρητικών προβληµάτων και του είδους του αίµατος που έλαβαν. ότης Φύλο Ηλικία Κατάσταση Επέµβαση Μονάδες µετάγγισης Επιπλοκές 1 Γυναίκα 75 Υγιής Ολική αρθ/ική γόνατος 2 Ναι 2 Γυναίκα 60 Υγιής Ολική αρθ/ική ισχίου 0 Όχι 3 Γυναίκα 79 Υγιής Ανάστροφη ήλωση µηρια 0 Όχι 4 Γυναίκα 60 Υγιής Ολική αρθ/ική γόνατος 0 Ναι 5 Γυναίκα 64 Υγιής Ολική αρθ/ική γόνατος 0 Όχι 6 Άνδρας 60 Υγιής Ηµιολική αρθ/ική ώµου 0 Όχι 7 Γυναίκα 70 Υγιής Ηµιολική αρθ/ική ώµου 1 Ναι 8 Άνδρας 36 Υγιής Ολική αρθ/ική ισχίου 0 Όχι 9 Γυναίκα 56 Ασθενής Οπίσθια σπονδυλοδεσία 4 Όχι 10 Γυναίκα 56 Υγιής Ολική αρθ/ική γόνατος 0 Όχι 11 Γυναίκα 73 Υγιής Ολική αρθ/ική ισχίου 0 Όχι 12 Άνδρας 66 Υγιής Ολική αρθ/ική ισχίου 2 Ναι 13 Γυναίκα 74 Υγιής Ολική αρθ/ική ισχίου 1 Όχι 14 Γυναίκα 55 Υγιής Ολική αρθ/ική ισχίου 0 Όχι 15 Γυναίκα 70 Υγιής Ολική αρθ/ική γόνατος 1 Όχι 16 Άνδρας 70 Υγιής Ολική αρθ/ική ισχίου 1 Όχι 17 Γυναίκα 50 Υγιής Οπίσθια σπονδυλοδεσία 0 Όχι 18 Άνδρας 58 Υγιής Εσωτερική οστεοσύνθεση 2 Όχι 19 Γυναίκα 74 Υγιής Ολική αρθ/ική γόνατος 1 Όχι 20 Γυναίκα 28 Ασθενής Αφαίρεση έκτοπης οστεοποίησης 2 Ναι 21 Γυναίκα 65 Ασθενής Ολική αρθ/ική ισχύου 3 Όχι 22 Γυναίκα 87 Υγιής Κυφοπλαστική 0 Όχι 23 Γυναίκα 76 Υγιής Ολική αρθ/ική γόνατος 0 Όχι 24 Γυναίκα 76 Υγιής Ολική αρθ/ική γόνατος 1 Όχι 25 Γυναίκα 74 Υγιής Ολική αρθ/ική ισχίου 0 Όχι 26 Γυναίκα 79 Υγιής Επέκταση σπονδυλοδεσί 1 Όχι 27 Γυναίκα 41 Υγιής Ολική αρθ/ική ισχίου 1 Ναι 28 Γυναίκα 74 Υγιής Εκφυλιστική σχολίωση- 1 Όχι 29 Γυναίκα 72 Υγιής Αναθεώρηση ολικού ισχ 1 Ναι 30 Άνδρας 69 Υγιής Ολική αρθ/ική ισχίου 2 Ναι 31 Γυναίκα 56 Ασθενής Ολική αρθ/ική γόνατος 1 Όχι Πίνακας 2: Στοιχεία ασθενών. 49

50 1.2 Αντιδραστήρια 3-color flow cytometer (Beckman Coulter) fluorescein isothiocyanate (FITC)-CD4 (Beckman Coulter) phycoerythrin (PE)-indodicarbocyanine (Cy5)-CD25 (Beckman Coulter) phycoerythrin (PE)-CD25 (Becton Dickinson) phycoerythrin (PE)-CD127 (Beckman Coulter) phycoerythrin (PE)-indodicarbocyanine (Cy5)-FoxP3 (e-bioscience) 2. ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΣΗ Τα δείγµατα των αιµάτων ελήφθησαν σε Vacutainer µε EDTA την ηµέρα που εισήχθησαν οι ασθενείς, µία µέρα µετά την εγχείρηση και 7 µέρες µετά την εγχείρηση. Από κάθε δείγµα αποµονώθηκαν τα περιφερικά µονοκύτταρα του αίµατος τα οποία αναλύθηκαν φαινοτυπικά µέσα σε σύντοµο χρονικό διάστηµα. Πιο λεπτοµερώς: 2.1. Αποµόνωση PBMC µε φυκόλη. Αφαίρεση ορού από το δείγµα του αίµατος και προσθήκη της ίδιας ποσότητας RPMI ή PBS. Τοποθέτηση φυκόλης ποσότητας της µισής αυτής της ποσότητας του αίµατος σε φάλκον των 15 ml και επιστοίβαξη του αίµατος προσεκτικά ώστε να µην ανακατευτούν οι δύο φάσεις. Φυγοκέντρηση στις 2500 rpm για 35 min στους 24 ο C. Παρατήρηση του διαχωρισµού των κυττάρων σε ζώνες. Αφαίρεση του επάνω στρώµατος (πλάσµα και αιµοπετάλια) µε πιπέττα Pasteur. Μεταφορά του στρώµατος των λεµφοκυττάρων σε φάλκον των 15 ml που περιέχει PBS µέχρι τελικού όγκου 15 ml. Φυγοκέντρηση στις 1800 rpm για 10 min στους 24 ο C. Απόρριψη υπερκείµενου και επαναδιάλυση του ιζήµατος σε PBS µέχρι τελικού όγκου 15 ml. Φυγοκέντρηση στις 1800 rpm για 10 min στους 4 ο C. Απόρριψη υπερκείµενου και επαναδιάλυση του ιζήµατος σε PBS µέχρι τελικού όγκου 4 ml. Μέτρηση κυττάρων στο µικροσκόπιο Επιφανειακή χρώση Τοποθέτηση 10 6 κυττάρων σε RIA και προσθήκη PBS µέχρι το µέσο του. Φυγοκέντρηση στις 2500 rpm για 7 min στους 24 ο C. Απόρριψη υπερκείµενου και προσθήκη 3 λ CD4-FITC και 6λ CD25-PE Επώαση 20 min στο σκοτάδι Προσθήκη 1 ml PBS Φυγοκέντρηση στις 2500 rpm για 7 min στους 24 ο C. Απόρριψη υπερκείµενου Προσθήκη 500 λ Fix/Perm και απαλό vortex Επώαση 30 min στους 4 ο C Προσθήκη 1 ml perm wash και απαλό vortex Φυγοκέντρηση 2500 rpm 10 min 50

51 Απόρριψη υπερκείµενου Προσθήκη 1 ml perm wash (αναδιάλυση και µεταφορά σε eppendorf) Φυγοκέντρηση στις 2500 rpm για 10 min στους 25 o C. Αφαίρεση υπερκείµενου µε πιπέττα Προσθήκη 50 λ perm wash (αναδιάλυση) Προσθήκη 20 λ FoxP3-Pc5 (αναδιάλυση) Επώαση 30 min στους 4 ο C Προσθήκη 1 ml perm wash (αναδιάλυση και µεταφορά σε RIA) Φυγοκέντρηση 2500 rpm 10 min Απόρριψη υπερκείµενου Προσθήκη 1 ml perm wash (αναδιάλυση) Φυγοκέντρηση 2500 rpm 10 min (επανάληψη αυτού του βήµατος) Απόρριψη υπερκείµενου Προσθήκη 500 λ PBS Ανάλυση δείγµατος σε κυτταροµετρητή ροής 2.3. Ενδοκυττάρια χρώση Τοποθέτηση 10 6 κυττάρων σε RIA και προσθήκη PBS µέχρι το µέσο του. Φυγοκέντρηση στις 2500 rpm για 7 min στους 24 ο C. Απόρριψη υπερκείµενου και προσθήκη 3 λ CD4-FITC,6λ CD25-Pc5 και 5 λ CD127- PE Επώαση 20 min στο σκοτάδι. Προσθήκη 500 λ PBS Ανάλυση δείγµατος σε κυτταροµετρητή ροής 2.4. Κυτταροµετρία ροής Κατά την ανάλυση των δειγµάτων για τον προσδιορισµό του µεταγραφικού παράγοντα FoxP3 διέρχονται τουλάχιστον κύτταρα. Αρχικά, γίνεται διαχωρισµός του πληθυσµού των λεµφοκυττάρων από τους πληθυσµούς των µονοπύρηνων και πολυµορφοπύρηνων κυττάρων µε βάση τον πρόσθιο και πλάγιο σκεδασµό, αλλά και της µεθόδου επεξεργασίας που ενδεχοµένως να εµποδίζει τον εντοπισµό των µονοπύρηνων κυττάρων. Εικόνα 24: Στικτόγραµµα κατανοµής πληθυσµών µε βάση τον πρόσθιο και πλάγιο σκεδασµό. 51

52 Κατόπιν ο πληθυσµός των λεµφοκυττάρων ελέγχεται για την έκφραση του επιφανειακού δείκτη CD4 και γίνεται επιλογή του πληθυσµού εκείνου που τον εκφράζει (CD4 + Τ κύτταρα). Εικόνα 25: Στικτόγραµµα και ιστόγραµµα CD4 + T κυττάρων. Έπειτα, ο πληθυσµός CD4 + T κυττάρων ελέγχεται για την έκφραση του επιφανειακού µορίου CD25 και γίνεται επιλογή του πληθυσµού εκείνου που τον εκφράζει (CD4 + CD25 + T κύτταρα). Εικόνα 26: Στικτόγραµµα και ιστόγραµµα CD25 + κυττάρων στον πληθυσµό των CD4 + Τ κυττάρων. Ακολούθως, ο πληθυσµός των CD4 + CD25 + T κυττάρων ελέγχεται για την έκφραση του ενδοκυτταρικού παράγοντα FoxP3 και επιλέγεται ο πληθυσµός εκείνος που τον εκφράζει (ntregs). 52

53 Εικόνα 27: Στικτόγραµµα και ιστόγραµµα FoxP3 + κυττάρων στον πληθυσµό των CD4 + CD25 + Τ κυττάρων. Παρόµοια είναι και η ανάλυση των δειγµάτων για τον προσδιορισµό του πληθυσµού των CD4 + CD25 high CD127 low κυττάρων. Κατά την ανάλυση διέρχονται τουλάχιστον κύτταρα. Αρχικά, γίνεται διαχωρισµός του πληθυσµού των λεµφοκυττάρων από τους πληθυσµούς των µονοπύρηνων και πολυµορφοπύρηνων κυττάρων µε βάση τον πρόσθιο και πλάγιο σκεδασµό. Εικόνα 28: Στικτόγραµµα κατανοµής πληθυσµών µε βάση τον πρόσθιο και πλάγιο σκεδασµό. Κατόπιν ο πληθυσµός των λεµφοκυττάρων ελέγχεται για την έκφραση του επιφανειακού δείκτη CD4 και γίνεται επιλογή του πληθυσµού εκείνου που τον εκφράζει (CD4 + Τ κύτταρα). 53

54 Εικόνα 29: Στικτόγραµµα και ιστόγραµµα CD4 + T κυττάρων. Έπειτα, ο πληθυσµός CD4 + T κυττάρων ελέγχεται για την έκφραση του επιφανειακού µορίου CD25 και γίνεται επιλογή του πληθυσµού εκείνου που τον εκφράζει σε υψηλά επίπεδα (CD4 + CD25 high T κύτταρα). Εικόνα 30: Στικτόγραµµα και ιστόγραµµα CD25 high κυττάρων στον πληθυσµό των CD4 + Τ κυττάρων. Ακολούθως, ο πληθυσµός των CD4 + CD25 high T κυττάρων ελέγχεται για την έκφραση του επιφανειακού παράγοντα CD127 και επιλέγεται ο πληθυσµός εκείνος που τον εκφράζει σε χαµηλά επίπεδα (CD4 + CD25 high CD127 low ). 54

55 Εικόνα 31: Στικτόγραµµα και ιστόγραµµα CD127 low κυττάρων στον πληθυσµό των CD4 + CD25 high Τ κυττάρων. Σε κάθε περίπτωση, οι ορισµοί των ορίων κάθε περιοχής γίνεται µε χρήση ισοτυπικού µάρτυρα που παρέχει τις απαραίτητες πληροφορίες για τις περιοχές αρνητικού φθορισµού του κάθε αντισώµατος. 55

56 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων έγινε µε το στατιστικό τεστ ANOVA και τη µέθοδο Wilcoxon. 1. ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ CD4 + CD25 + FOXP3 + % ΤΩΝ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ. Το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των λεµφοκυττάρων στους υγιείς δότες εµφανίζει µια κάποια µεταβολή κατά τη δειγµατοληψία πριν (1,67 ±3,28), µετά (1,64 ±3,41) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (1,26 ±0,1) που όµως δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,987). ιαφορετική όµως είναι η εικόνα που προκύπτει από την απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των λεµφοκυττάρων στους υγιείς δότες κατά τη δειγµατοληψία πριν (153,42 ±276,88), µετά (250,08 ±461,54) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (450,5 ±120,92) αλλά όχι και στατιστικά σηµαντική (p=0,591). Από την άλλη, το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των λεµφοκυττάρων στους ασθενείς δότες εµφανίζει µια κάποια µεταβολή κατά τη δειγµατοληψία πριν (0,44 ±0,49), µετά (0,9 ±0,66) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (0,59) διαφορετική από αυτή των υγιών δοτών αλλά όχι και στατιστικά σηµαντική (p=0,569). Παρόµοια όµως είναι και η εικόνα που προκύπτει από την απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των λεµφοκυττάρων στους ασθενείς δότες κατά τη δειγµατοληψία πριν (139,75 ±210,49), µετά (156,25 ±159,98) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (151) αλλά όχι και στατιστικά σηµαντική (p=0,992). Εικόνα 32: Ανάλυση του ποσοστού και της απόλυτης τιµής των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των λεµφοκυττάρων σε υγιείς και άρρωστους δότες. Το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των λεµφοκυττάρων στους µεταγγισµένους δότες εµφανίζει µια κάποια µεταβολή κατά τη δειγµατοληψία πριν (1,55 ±3,32), µετά (1,07 ±1,88) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (1,04 ±0,39) που όµως δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,868). ιαφορετική όµως είναι η εικόνα που προκύπτει από την απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των λεµφοκυττάρων στους µεταγγισµένους δότες κατά τη δειγµατοληψία πριν (188 ±287), µετά (227,88 ±462,78) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (350,67 ±192,9) αλλά όχι και στατιστικά σηµαντική (p=0,812). 56

57 Από την άλλη, το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των λεµφοκυττάρων στους µη µεταγγισµένους δότες εµφανίζει µια κάποια µεταβολή κατά τη δειγµατοληψία πριν (0,78 ±0,45) και µετά την εγχείρηση (2,16 ±4,37) διαφορετική από αυτή των µεταγγισµένων δοτών αλλά όχι και στατιστικά σηµαντική (p=0,547). Παρόµοια είναι και η εικόνα που προκύπτει από την απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των λεµφοκυττάρων στους µη µεταγγισµένους δότες κατά τη δειγµατοληψία πριν (36 ±21,23) και µετά την εγχείρηση (250,23 ±408,48) αλλά όχι και στατιστικά σηµαντική (p=0,322). Εικόνα 33: Ανάλυση του ποσοστού και της απόλυτης τιµής των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των λεµφοκυττάρων σε µεταγγισµένους και µη µεταγγισµένους δότες. Πιο λεπτοµερώς, το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των λεµφοκυττάρων στους δότες που µεταγγίστηκαν διαφοροποιείται ανάµεσα σε αυτούς που µεταγγίστηκαν µε ολικό αίµα και σε αυτούς που έλαβαν συµπυκνωµένα ερυθρά αιµοσφαίρια. Το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των λεµφοκυττάρων στους δότες που µεταγγίστηκαν µε ολικό αίµα εµφανίζει µια κάποια µεταβολή κατά τη δειγµατοληψία πριν (0,66 ±0,51), µετά (1,04 ±2) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (0,89 ±0,42) που όµως δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,866) ενώ το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των λεµφοκυττάρων στους δότες που µεταγγίστηκαν µε συµπυκνωµένα ερυθρά εµφανίζει ακριβώς αντίστροφη µεταβολή κατά τη δειγµατοληψία πριν (3,34 ±5,77), µετά (1,19 ±1,68) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (1,33) που όµως δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,767). Παράλληλα, παρόµοια είναι η εικόνα που προκύπτει από την απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των λεµφοκυττάρων στους µεταγγισµένους µε ολικό αίµα κατά τη δειγµατοληψία πριν (130,5 ±163,3), µετά (221,62 ±500,15) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (258 ±151,32) που όµως δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,856). ιαφορετική όµως είναι η εικόνα που προκύπτει από την απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των λεµφοκυττάρων στους µεταγγισµένους µε συµπυκνωµένα ερυθρά δότες κατά τη δειγµατοληψία πριν (303 ±461,91), µετά (248,25 ±375,36) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (536) που όµως δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,834). 57

58 Εικόνα 34: Ανάλυση του ποσοστού και της απόλυτης τιµής των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των λεµφοκυττάρων σε µεταγγισµένους ανάλογα µε το είδος του αίµατος που τους δόθηκε και µη µεταγγισµένους δότες. Το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των λεµφοκυττάρων στους δότες που δεν παρουσίασαν περιεγχειρητικά προβλήµατα εµφανίζει µια κάποια µεταβολή κατά τη δειγµατοληψία πριν (1,8 ±3,6), µετά (1,88 ±3,58) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (1,33) που όµως δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,988). ιαφορετική όµως είναι η εικόνα που προκύπτει από την απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των λεµφοκυττάρων στους δότες που δεν παρουσίασαν περιεγχειρητικά προβλήµατα κατά τη δειγµατοληψία πριν (183 ±313,67), µετά (282,48 ±484,92) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (536) αλλά όχι στατιστικά σηµαντική (p=0,69). Από την άλλη, η εικόνα που προκύπτει για το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των λεµφοκυττάρων στους δότες που παρουσίασαν περιεγχειρητικά προβλήµατα εµφανίζει µια κάποια µεταβολή κατά τη δειγµατοληψία πριν (0,62 ±0,55), µετά (0,45 ±0,51) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (0,89 ±0,42) αλλά όχι στατιστικά σηµαντική (p=0,574). Παρόµοια είναι και η εικόνα που προκύπτει από την απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των λεµφοκυττάρων στους δότες που παρουσίασαν περιεγχειρητικά προβλήµατα κατά τη δειγµατοληψία πριν (95 ±111,57), µετά (90 ±100,58) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (258 ±151,32) αλλά όχι και στατιστικά σηµαντική (p=0,183). Εικόνα 35: Ανάλυση του ποσοστού και της απόλυτης τιµής των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των λεµφοκυττάρων σε δότες µε και χωρίς περιεγχειρητικά προβλήµατα. 58

59 2. ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ CD4 + CD25 high CD127 low % ΤΩΝ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ. Το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low % των λεµφοκυττάρων στους υγιείς δότες εµφανίζει µια κάποια µεταβολή κατά τη δειγµατοληψία πριν (3,56 ±1,7), µετά (3,31 ±2,05) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (4,79 ±0,81) που όµως δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,574). Παρόµοια είναι και η εικόνα που προκύπτει από την απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 high CD127 low % των λεµφοκυττάρων στους υγιείς δότες κατά τη δειγµατοληψία πριν (143 ±151,81), µετά (223,33 ±218,93) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (664,5 ±311,83) και µάλιστα στατιστικά σηµαντική (p=0,008). Από την άλλη, το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low % των λεµφοκυττάρων στους ασθενείς δότες εµφανίζει µια κάποια µεταβολή κατά τη δειγµατοληψία πριν (1,52 ±0,92), µετά (2,66 ±2,32) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (1,35) αλλά όχι και στατιστικά σηµαντική (p=0,641). Όσων αφορά στην εικόνα που προκύπτει από την απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 high CD127 low % των λεµφοκυττάρων στους ασθενείς δότες κατά τη δειγµατοληψία πριν (122,25 ±193,11), µετά (365 ±376,83) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (175), είναι διαφορετική αλλά όχι και στατιστικά σηµαντική (p=0,56). Εικόνα 36: Ανάλυση του ποσοστού και της απόλυτης τιµής των CD4 + CD25 high CD127 low % των λεµφοκυττάρων σε υγιείς και άρρωστους δότες. Το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low % των λεµφοκυττάρων στους µεταγγισµένους δότες εµφανίζει µια κάποια µεταβολή κατά τη δειγµατοληψία πριν (2,96 ±1,79), µετά (3,05 ±1,86) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (3,64 ±2,07) που όµως δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,848). Από την άλλη,, η εικόνα που προκύπτει από την απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 high CD127 low % των λεµφοκυττάρων στους µεταγγισµένους δότες κατά τη δειγµατοληψία πριν (169,58 ±169), µετά (247,07 ±235,66) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (501,33 ±358,46) είναι διαφορετική αλλά όχι και στατιστικά σηµαντική (p=0,089). Το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low % των λεµφοκυττάρων στους µη µεταγγισµένους δότες εµφανίζει µια κάποια µεταβολή κατά τη δειγµατοληψία πριν (3,31 ±1,94) και µετά την εγχείρηση (3,45 ±2,27) αλλά όχι και στατιστικά σηµαντική (p=0,918). Παρόµοια είναι και η εικόνα που προκύπτει από την απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 high CD127 low % των λεµφοκυττάρων στους µη µεταγγισµένους δότες κατά τη δειγµατοληψία πριν (42,5 ±36,76) και µετά την εγχείρηση (230,46 ±244,28) αλλά όχι και στατιστικά σηµαντική (p=0,154). 59

60 Εικόνα 37: Ανάλυση του ποσοστού και της απόλυτης τιµής των CD4 + CD25 high CD127 low % των λεµφοκυττάρων σε µεταγγισµένους και µη µεταγγισµένους δότες. Πιο λεπτοµερώς, το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low % των λεµφοκυττάρων στους δότες που µεταγγίστηκαν διαφοροποιείται ανάµεσα σε αυτούς που µεταγγίστηκαν µε ολικό αίµα και σε αυτούς που έλαβαν συµπυκνωµένα ερυθρά αιµοσφαίρια. Το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low % των λεµφοκυττάρων στους δότες που µεταγγίστηκαν µε ολικό αίµα εµφανίζει µια κάποια µεταβολή κατά τη δειγµατοληψία πριν (2,91 ±1,28), µετά (3,69 ±1,77) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (3,36 ±2,84) που όµως δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,63) ενώ το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low % των λεµφοκυττάρων στους δότες που µεταγγίστηκαν µε συµπυκνωµένα ερυθρά εµφανίζει ακριβώς αντίστροφη µεταβολή κατά τη δειγµατοληψία πριν (3,06 ±2,81), µετά (1,47 ±0,96) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (4,22) που όµως δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,434). Παράλληλα, παρόµοια είναι η εικόνα που προκύπτει από την απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 high CD127 low % των λεµφοκυττάρων στους µεταγγισµένους µε ολικό αίµα κατά τη δειγµατοληψία πριν (155,12 ±170,73), µετά (281,7 ±272,16) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (309,5 ±190,21) που όµως δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,471). ιαφορετική όµως είναι η εικόνα που προκύπτει από την απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 high CD127 low % των λεµφοκυττάρων στους µεταγγισµένους µε συµπυκνωµένα ερυθρά δότες κατά τη δειγµατοληψία πριν (198,5 ±187,2), µετά (160,5 ±66,73) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (885) που είναι µάλιστα στατιστικά σηµαντική (p=0,009). 60

61 Εικόνα 38: Ανάλυση του ποσοστού και της απόλυτης τιµής των CD4 + CD25 high CD127 low % των λεµφοκυττάρων σε µεταγγισµένους ανάλογα µε το είδος του αίµατος που τους δόθηκε και µη µεταγγισµένους δότες. Το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low % των λεµφοκυττάρων στους δότες που δεν παρουσίασαν περιεγχειρητικά προβλήµατα εµφανίζει µια κάποια µεταβολή κατά τη δειγµατοληψία πριν (3,24 ±2), µετά (3,09 ±2,18) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (4,22) που όµως δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,87). Παρόµοια είναι και η εικόνα που προκύπτει από την απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 high CD127 low % των λεµφοκυττάρων στους δότες που δεν παρουσίασαν περιεγχειρητικά προβλήµατα κατά τη δειγµατοληψία πριν (139,7 ±166,09), µετά (242,09 ±238,69) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (885) και στατιστικά σηµαντική (p=0,01). Το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low % των λεµφοκυττάρων στους δότες που παρουσίασαν περιεγχειρητικά προβλήµατα εµφανίζει µια κάποια µεταβολή κατά τη δειγµατοληψία πριν (2,74 ±1,4), µετά (3,89 ±1,22) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (3,36 ±2,84) αλλά όχι στατιστικά σηµαντική (p=0,492). Από την άλλη, η εικόνα που προκύπτει από την απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 high CD127 low % των λεµφοκυττάρων στους δότες που παρουσίασαν περιεγχειρητικά προβλήµατα κατά τη δειγµατοληψία πριν (134,67 ±153,84), µετά (225,8 ±246,18) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (309,5 ±190,21) είναι διαφορετική αλλά όχι και στατιστικά σηµαντική (p=0,536). Εικόνα 39: Ανάλυση του ποσοστού και της απόλυτης τιµής των CD4 + CD25 high CD127 low % των λεµφοκυττάρων σε δότες µε και χωρίς περιεγχειρητικά προβλήµατα. 61

62 3. ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ CD4 + CD25 + FOXP3 + % ΤΩΝ CD4 +. Το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των CD4 + στους υγιείς δότες εµφανίζει µια κάποια µεταβολή κατά τη δειγµατοληψία πριν (6,99 ±7,3), µετά (6,03 ±8,18) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (3,13 ±0,18) που όµως δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,801). Η εικόνα που προκύπτει από την απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των CD4 + στους υγιείς δότες εµφανίζει µια κάποια µεταβολή τελείως διαφορετική κατά τη δειγµατοληψία πριν (153,42 ±276,88), µετά (250,08 ±461,54) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (450,5 ±120,92) αλλά όχι και στατιστικά σηµαντική (p=0,591). Το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των CD4 + στους ασθενείς δότες εµφανίζει µια κάποια µεταβολή κατά τη δειγµατοληψία πριν (3,5 ±1,53), µετά (4,99 ±2,79) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (4,6) που δεν είναι όµως στατιστικά σηµαντική (p=0,66). Παρόµοια είναι και η εικόνα που προκύπτει από την απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των CD4 + στους ασθενείς δότες κατά τη δειγµατοληψία πριν (139,75 ±210,49), µετά (156,25 ±159,98) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (151) αλλά και αυτή όχι στατιστικά σηµαντική (p=0,992). Εικόνα 40: Ανάλυση του ποσοστού και της απόλυτης τιµής των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των CD4 + σε υγιείς και άρρωστους δότες. Το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των CD4 + στους µεταγγισµένους δότες εµφανίζει µια κάποια µεταβολή κατά τη δειγµατοληψία πριν (6,38 ±7,39), µετά (5,17 ±5,72) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (3,62 ±0,86) που όµως δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,757). Από την άλλη, η εικόνα που προκύπτει για το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των CD4 + στους µη µεταγγισµένους δότες κατά τη δειγµατοληψία πριν (5,33 ±2,95) και µετά την εγχείρηση (6,83 ±9,81) είναι διαφορετική σε σχέση µε αυτή των µεταγγισµένων δοτών αλλά όχι στατιστικά σηµαντική (p=0,772). 62

63 Εικόνα 41: Ανάλυση του ποσοστού και της απόλυτης τιµής των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των CD4 + σε µεταγγισµένους και µη µεταγγισµένους δότες. Πιο λεπτοµερώς, το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των CD4 + στους δότες που µεταγγίστηκαν διαφοροποιείται ανάµεσα σε αυτούς που µεταγγίστηκαν µε ολικό αίµα και σε αυτούς που έλαβαν συµπυκνωµένα ερυθρά αιµοσφαίρια. Το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των CD4 + στους δότες που µεταγγίστηκαν µε ολικό αίµα εµφανίζει µια κάποια µεταβολή κατά τη δειγµατοληψία πριν (4,35 ±2,97), µετά (4,81 ±6,16) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (3,93 ±0,95) που όµως δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,962) ενώ το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των CD4 + στους δότες που µεταγγίστηκαν µε συµπυκνωµένα ερυθρά εµφανίζει διαφορετική µεταβολή κατά τη δειγµατοληψία πριν (10,45 ±12,10), µετά (6,32 ±4,5) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (3) που όµως δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,712). Από την άλλη, η εικόνα που προκύπτει από την απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των CD4 + στους µεταγγισµένους µε ολικό αίµα εµφανίζει µια µεταβολή κατά τη δειγµατοληψία πριν (130,5 ±163,3), µετά (221,62 ±500,15) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (258 ±151,32) που όµως δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,856). ιαφορετική όµως είναι η εικόνα που προκύπτει από την απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των CD4 + στους µεταγγισµένους µε συµπυκνωµένα ερυθρά δότες κατά τη δειγµατοληψία πριν (303 ±461,91), µετά (248,25 ±375,36) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (536) που είναι µάλιστα στατιστικά σηµαντική (p=0,834). Εικόνα 42: Ανάλυση του ποσοστού και της απόλυτης τιµής των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των CD4 + σε µεταγγισµένους ανάλογα µε το είδος του αίµατος που τους δόθηκε και µη µεταγγισµένους δότες. 63

64 Το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των CD4 + στους δότες που δεν παρουσίασαν περιεγχειρητικά προβλήµατα εµφανίζει µια κάποια µεταβολή κατά τη δειγµατοληψία πριν (7,24 ±7,74), µετά (6,8 ±8,48) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (3) που όµως δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,888). Από την άλλη, η εικόνα που προκύπτει για το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των CD4 + στους δότες που παρουσίασαν περιεγχειρητικά προβλήµατα κατά τη δειγµατοληψία πριν (4,26 ±3,41), µετά (2,88 ±2,42) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (3,93 ±0,95) είναι διαφορετική αλλά όχι και στατιστικά σηµαντική (p=0,674). Εικόνα 43: Ανάλυση του ποσοστού και της απόλυτης τιµής των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των CD4 + σε δότες µε και χωρίς περιεγχειρητικά προβλήµατα. 4. ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ CD4 + CD25 high CD127 low % ΤΩΝ CD4 +. Το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low % των CD4 + στους υγιείς δότες εµφανίζει µια κάποια µεταβολή κατά τη δειγµατοληψία πριν (10,66 ±6,13), µετά (8,83 ±4,6) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (15,81 ±6,87) που όµως δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,162). Παρόµοια η εικόνα που προκύπτει για το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low % των CD4 + στους ασθενείς δότες κατά τη δειγµατοληψία πριν (4,49 ±3,77), µετά (10,54 ±8,7) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (13,91) αλλά όχι στατιστικά σηµαντική (p=0,343). 64

65 Εικόνα 44: Ανάλυση του ποσοστού και της απόλυτης τιµής των CD4 + CD25 high CD127 low % των CD4 + σε υγιείς και άρρωστους δότες. Το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low % των CD4 + στους µεταγγισµένους δότες εµφανίζει µια κάποια µεταβολή κατά τη δειγµατοληψία πριν (9,63 ±6,71), µετά (10,27 ±5,14) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (15,18 ±4,98) που όµως δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,347). Παρόµοια είναι η εικόνα που προκύπτει για το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low % των CD4 + στους µη µεταγγισµένους δότες κατά τη δειγµατοληψία πριν (7,56 ±4,57) και µετά την εγχείρηση (7,67 ±4,62) αλλά όχι και στατιστικά σηµαντική (p=0,969). Εικόνα 45: Ανάλυση του ποσοστού και της απόλυτης τιµής των CD4 + CD25 high CD127 low % των CD4 + σε µεταγγισµένους και µη µεταγγισµένους δότες. Πιο λεπτοµερώς, το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low % των CD4 + στους δότες που µεταγγίστηκαν διαφοροποιείται ανάµεσα σε αυτούς που µεταγγίστηκαν µε ολικό αίµα και σε αυτούς που έλαβαν συµπυκνωµένα ερυθρά αιµοσφαίρια. Το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low % των CD4 + στους δότες που µεταγγίστηκαν µε ολικό αίµα εµφανίζει µια κάποια µεταβολή κατά τη δειγµατοληψία πριν (9,86 ±6,3), µετά (9,94 ±4,77) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (12,43 ±2,09) που όµως δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,82) ενώ και το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low % των CD4 + στους δότες που µεταγγίστηκαν µε συµπυκνωµένα ερυθρά εµφανίζει παρόµοια µεταβολή κατά τη δειγµατοληψία πριν 65

66 (9,17 ±8,5), µετά (11,1 ±6,72) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (20,67) που όµως δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,453). Παράλληλα, παρόµοια είναι η εικόνα που προκύπτει από την απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 high CD127 low % των CD4 + στους µεταγγισµένους µε ολικό αίµα κατά τη δειγµατοληψία πριν (155,12 ±170,73), µετά (281,7 ±272,16) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (309,5 ±190,21) που όµως δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,471). ιαφορετική όµως είναι η εικόνα που προκύπτει από την απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 high CD127 low % των CD4 + στους µεταγγισµένους µε συµπυκνωµένα ερυθρά δότες κατά τη δειγµατοληψία πριν (198,5 ±187,2), µετά (160,5 ±66,73) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (885) που είναι µάλιστα στατιστικά σηµαντική (p=0,009). Εικόνα 46: Ανάλυση του ποσοστού και της απόλυτης τιµής των CD4 + CD25 high CD127 low % των CD4 + σε µεταγγισµένους ανάλογα µε το είδος του αίµατος που τους δόθηκε και µη µεταγγισµένους δότες. Το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low % των CD4 + στους δότες που δεν παρουσίασαν περιεγχειρητικά προβλήµατα εµφανίζει µια κάποια µεταβολή κατά τη δειγµατοληψία πριν (8,55 ±5,64), µετά (9,39 ±5,38) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (20,67) που όµως δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,123). Από την άλλη, η εικόνα που προκύπτει για το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low % των CD4 + στους δότες που παρουσίασαν περιεγχειρητικά προβλήµατα κατά τη δειγµατοληψία πριν (10,05 ±7,43), µετά (7,4 ±2,34) και 7 µέρες µετά την εγχείρηση (12,43 ±2,09) είναι διαφορετική αλλά όχι και στατιστικά σηµαντική (p=0,53). Εικόνα 47: Ανάλυση του ποσοστού και της απόλυτης τιµής των CD4 + CD25 high CD127 low % των CD4 + σε δότες µε και χωρίς περιεγχειρητικά προβλήµατα. 66

67 5. ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ Tregs % ΤΩΝ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ. Καθώς ήταν αναµενόµενο, κατά την στατιστική ανάλυση βρέθηκε ότι οι τιµές των δύο διαφορετικής προέλευσης Tregs είναι συνδεδεµένες για το λόγο αυτό επιχειρήθηκε να αναλυθεί η διαφορά στις τιµές τους µε τη µέθοδο Wilcoxon. Πιο συγκεκριµένα, κατά τη δειγµατοληψία πριν την εγχείρηση το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + (1,36 ±2,87) είναι µικρότερο από αυτό των CD4 + CD25 high CD127 low (3,07 ±1,61), µια διαφορά που είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,007). Μετά την εγχείρηση, η διαφορά παραµένει καθώς τα ποσοστά των CD4 + CD25 + FOXP3 + (1,54 ±3,18) και των CD4 + CD25 high CD127 low (3,4 ±2,57) µεγαλώνουν, αλλά δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,701). Εφτά µέρες µετά την εγχείρηση, το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + (1,04 ±0,39) µικραίνει και το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low (3,64 ±2,07) µεγαλώνει αυξάνοντας τη µεταξύ τους διαφορά που όµως αλλά δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,109). Η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + (150 ±255,18) κυµαίνεται σε ελαφρώς µικρότερα επίπεδα από αυτό των CD4 + CD25 high CD127 low (153,2 ±151,18), µια µικρή διαφορά που δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,897). Μετά την εγχείρηση, οι τιµές αµφότερων µεγαλώνουν και η διαφορά των CD4 + CD25 + FOXP3 + (237,57 ±432,82) και των CD4 + CD25 high CD127 low (312,62 ±291,02) µεγαλώνει αλλά δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,972). Εφτά µέρες µετά την εγχείρηση, τόσο η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + (350,67 ±192,9) όσο και η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 high CD127 low (501,33 ±358,46) µεγαλώνουν αλλά η µεταξύ τους διαφορά δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,109). Εικόνα 48: Ανάλυση του ποσοστού και της απόλυτης τιµής των CD4 + CD25 + FOXP3 + και CD4 + CD25 high CD127 low % των λεµφοκυττάρων. Με * σηµαίνεται η στατιστικά σηµαντική διαφορά. Κατά τη δειγµατοληψία πριν την εγχείρηση στους υγιείς δότες το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + (1,67 ±3,28) είναι µικρότερο από αυτό των CD4 + CD25 high CD127 low (3,31 ±1,57), µια διαφορά που είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,034). Μετά την εγχείρηση, το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + (1,64 ±3,41) µικραίνει και το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low (3,62 ±2,72) µεγαλώνει αυξάνοντας την µεταξύ τους διαφορά που δεν είναι όµως στατιστικά σηµαντική (p=0,878). Εφτά µέρες µετά την εγχείρηση, το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + (1,26 ±0,1) µικραίνει και το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low (4,79 ±0,81) µεγαλώνει αυξάνοντας τη µεταξύ τους διαφορά που όµως αλλά δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,18). 67

68 Η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + (153,42 ±276,88) κυµαίνεται σε ελαφρώς µικρότερα επίπεδα µε αυτό των CD4 + CD25 high CD127 low (157,96 ±147,85), µια µικρή διαφορά που δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,48). Μετά την εγχείρηση, οι τιµές αµφότερων µεγαλώνουν και η διαφορά των CD4 + CD25 + FOXP3 + (250,08 ±461,54) και των CD4 + CD25 high CD127 low (296,9 ±283,16) µεγαλώνει αλλά δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,508). Εφτά µέρες µετά την εγχείρηση, τόσο η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + (450,5 ±120,92) όσο και η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 high CD127 low (664,5 ±311,83) µεγαλώνουν αλλά η µεταξύ τους διαφορά δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,18). Εικόνα 49: Ανάλυση του ποσοστού και της απόλυτης τιµής των CD4 + CD25 + FOXP3 + και CD4 + CD25 high CD127 low % των λεµφοκυττάρων στους υγιείς δότες. Με * σηµαίνεται η στατιστικά σηµαντική διαφορά. Κατά τη δειγµατοληψία πριν την εγχείρηση στους ασθενείς δότες το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + (0,44 ±0,49) είναι µικρότερο από αυτό των CD4 + CD25 high CD127 low (1,52 ±0,92), µια διαφορά που δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,068). Μετά την εγχείρηση, καθώς τα ποσοστά των CD4 + CD25 + FOXP3 + (0,9 ±0,66) και των CD4 + CD25 high CD127 low (2,66 ±2,32) µεγαλώνουν αµφότερα, η διαφορά παραµένει αλλά δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,285). Εφτά µέρες µετά την εγχείρηση, τα ποσοστά των CD4 + CD25 + FOXP3 + (0,59) και των CD4 + CD25 high CD127 low (1,35) µεγαλώνουν διατηρώντας τη µεταξύ τους διαφορά. Η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + (139,75 ±210,49) κυµαίνεται σε ελαφρώς µεγαλύτερα επίπεδα από αυτό των CD4 + CD25 high CD127 low (122,25 ±193,11), µια µικρή διαφορά που δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,066). Μετά την εγχείρηση, οι τιµές αµφότερων µεγαλώνουν αλλά πλέον η διαφορά των CD4 + CD25 + FOXP3 + (156,25 ±159,98) και των CD4 + CD25 high CD127 low (365 ±376,83) είναι προς όφελος των τελευταίων αλλά δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,109). Εφτά µέρες µετά την εγχείρηση, τόσο η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + (151) όσο και η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 high CD127 low (175) εµφανίζουν µια πτώση επιστρέφοντας σε επίπεδα λίγο µεγαλύτερα από τις τιµές που παρατηρήθηκαν πριν την εγχείρηση. 68

69 Εικόνα 50: Ανάλυση του ποσοστού και της απόλυτης τιµής των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των λεµφοκυττάρων στους άρρωστους δότες. και CD4 + CD25 high CD127 low Κατά τη δειγµατοληψία πριν την εγχείρηση στους µεταγγισµένους δότες το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + (1,55 ±3,32) είναι µικρότερο από αυτό των CD4 + CD25 high CD127 low (3,19 ±1,75), µια διαφορά που είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,034). Μετά την εγχείρηση, το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + (1,07 ±1,88) µικραίνει και το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low (2,68 ±1,93) µεγαλώνει αυξάνοντας την µεταξύ τους διαφορά που δεν είναι όµως στατιστικά σηµαντική (p=0,26). Εφτά µέρες µετά την εγχείρηση, το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + (1,04 ±0,39) µικραίνει και το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low (3,64 ±2,07) µεγαλώνει αυξάνοντας τη µεταξύ τους διαφορά που όµως δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,109). Η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + (188 ±287) κυµαίνεται σε ελαφρώς µεγαλύτερα επίπεδα από αυτό των CD4 + CD25 high CD127 low (186,71 ±164,81), µια µικρή διαφορά που δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,906). Μετά την εγχείρηση, οι τιµές αµφότερων µεγαλώνουν και η διαφορά των CD4 + CD25 + FOXP3 + (227,88 ±462,78) και των CD4 + CD25 high CD127 low (257,78 ±276,27) µεγαλώνει υπέρ των τελευταίων αλλά δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,515). Εφτά µέρες µετά την εγχείρηση, τόσο η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + (350,67 ±192,9) όσο και η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 high CD127 low (501,33 ±358,46) µεγαλώνουν αλλά η µεταξύ τους διαφορά δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,109). 69

70 Εικόνα 51: Ανάλυση του ποσοστού και της απόλυτης τιµής των CD4 + CD25 + FOXP3 + και CD4 + CD25 high CD127 low % των λεµφοκυττάρων στους µεταγγισµένους δότες. Με * σηµαίνεται η στατιστικά σηµαντική διαφορά. Κατά τη δειγµατοληψία πριν την εγχείρηση στους µη µεταγγισµένους δότες το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + (0,78 ±0,45) είναι µικρότερο από αυτό των CD4 + CD25 high CD127 low (2,92 ±1,46), µια διαφορά που δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,068). Μετά την εγχείρηση, τα ποσοστά των CD4 + CD25 + FOXP3 + (2,16 ±4,37) και των CD4 + CD25 high CD127 low (5 ±3,4) µεγαλώνουν, το ίδιο και η µεταξύ τους διαφορά που δεν είναι όµως στατιστικά σηµαντική (p=0,465). Η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + (36 ±21,23) είναι µικρότερη από αυτή των CD4 + CD25 high CD127 low (109,38 ±123,87), µια διαφορά που δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,465). Μετά την εγχείρηση, οι τιµές αµφότερων µεγαλώνουν και η διαφορά των CD4 + CD25 + FOXP3 + (250,23 ±408,48) και των CD4 + CD25 high CD127 low (436 ±325,46) µεγαλώνει αλλά δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,465). Εικόνα 52: Ανάλυση του ποσοστού και της απόλυτης τιµής των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των λεµφοκυττάρων στους µη µεταγγισµένους δότες. και CD4 + CD25 high CD127 low Κατά τη δειγµατοληψία πριν την εγχείρηση στους δότες που παρουσίασαν περιεγχειρητικά προβλήµατα το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + (0,62 ±0,55) είναι µικρότερο από αυτό των CD4 + CD25 high CD127 low (2,91 ±1,24), µια διαφορά που είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,028). Μετά την εγχείρηση, το ποσοστό των 70

71 CD4 + CD25 + FOXP3 + (0,45 ±0,51) µικραίνει και το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low (4,21 ±1,55) µεγαλώνει αυξάνοντας τη διαφορά τους που δεν είναι όµως στατιστικά σηµαντική (p=0,109). Εφτά µέρες µετά την εγχείρηση, το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + (0,89 ±0,42) επανέρχεται και ξεπερνάει τα επίπεδα προ εγχείρησης και το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low (3,36 ±2,84) µεγαλώνει επίσης, µε µια διαφορά µεταξύ τους που όµως δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,18). Η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + (95 ±111,57) κυµαίνεται σε ελαφρώς µικρότερα επίπεδα από αυτή των CD4 + CD25 high CD127 low (132,12 ±130,87), µια µικρή διαφορά που δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,6). Μετά την εγχείρηση, η µεν απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + (90 ±100,58) µικραίνει, η δε τιµή των CD4 + CD25 high CD127 low (293,33 ±321,57) µεγαλώνει αυξάνοντας τη µεταξύ τους διαφορά που όµως δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,109). Εφτά µέρες µετά την εγχείρηση, τόσο η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + (258 ±151,321) όσο και η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 high CD127 low (309,5 ±190,21) µεγαλώνουν αλλά η µεταξύ τους διαφορά δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,18). Εικόνα 53: Ανάλυση του ποσοστού και της απόλυτης τιµής των CD4 + CD25 + FOXP3 + και CD4 + CD25 high CD127 low % των λεµφοκυττάρων στους δότες που εµφάνισαν περιεγχειρητικά προβλήµατα. Με * σηµαίνεται η στατιστικά σηµαντική διαφορά. Κατά τη δειγµατοληψία πριν την εγχείρηση στους δότες που δεν παρουσίασαν περιεγχειρητικά προβλήµατα το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + (1,8 ±3,6) είναι µικρότερο από αυτό των CD4 + CD25 high CD127 low (3,13 ±1,75), µια διαφορά που δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,074). Μετά την εγχείρηση, τόσο το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + (1,88 ±3,58) όσο και των CD4 + CD25 high CD127 low (3,15 ±2,83) µεγαλώνει, εποµένως η διαφορά παραµένει αν και δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,721). Εφτά µέρες µετά την εγχείρηση, το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + (1,33) µικραίνει και το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low (4,22) µεγαλώνει αυξάνοντας την µεταξύ τους διαφορά. Η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + (183 ±313,67) κυµαίνεται σε ελαφρώς µεγαλύτερα επίπεδα από αυτό των CD4 + CD25 high CD127 low (160,86 ±160,07), µια µικρή διαφορά που δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,721). Μετά την εγχείρηση, οι τιµές αµφότερων µεγαλώνουν και η διαφορά των CD4 + CD25 + FOXP3 + (282,48 ±484,92) και των CD4 + CD25 high CD127 low (318,4 ±299,64) µεγαλώνει υπέρ των τελευταίων αλλά δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,508). Εφτά µέρες µετά την 71

72 εγχείρηση, τόσο η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + (536) όσο και η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 high CD127 low (885) µεγαλώνουν. Εικόνα 54: Ανάλυση του ποσοστού και της απόλυτης τιµής των CD4 + CD25 + FOXP3 + και CD4 + CD25 high CD127 low % των λεµφοκυττάρων στους δότες που δεν εµφάνισαν περιεγχειρητικά προβλήµατα. 6. ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΩΝ Tregs % ΤΩΝ CD4 +. Αντιστοίχως, η εικόνα που προέκυψε από την ανάλυση των διαφορετικής προέλευσης Tregs % των CD4 + είναι η εξής: Κατά τη δειγµατοληψία πριν την εγχείρηση στους δότες το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + (6,12 ±6,48) είναι µικρότερο από αυτό των CD4 + CD25 high CD127 low (8,1 ±5,04), µια διαφορά που δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,056). Μετά την εγχείρηση, το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + (5,89 ±7,65) µικραίνει και το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low (11,27 ±5,69)µεγαλώνει αυξάνοντας τη µεταξύ τους διαφορά που δεν είναι όµως στατιστικά σηµαντική (p=0,463). Εφτά µέρες µετά την εγχείρηση, το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + (3,62 ±0,86) µικραίνει και το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low (15,18 ±4,98) µεγαλώνει αυξάνοντας ακόµα περισσότερο τη µεταξύ τους διαφορά που όµως δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,109). Η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + (150 ±255,18) κυµαίνεται σε ελαφρώς µικρότερα επίπεδα από αυτό των CD4 + CD25 high CD127 low (153,2 ±151,18), µια µικρή διαφορά που δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,897). Μετά την εγχείρηση, οι τιµές αµφότερων µεγαλώνουν και η διαφορά των CD4 + CD25 + FOXP3 + (237,57 ±432,82) και των CD4 + CD25 high CD127 low (312,62 ±291,02) µεγαλώνει αλλά δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,972). Εφτά µέρες µετά την εγχείρηση, τόσο η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + (350,67 ±192,9) όσο και η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 high CD127 low (501,33 ±358,46) µεγαλώνουν αλλά η µεταξύ τους διαφορά δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,109). 72

73 Εικόνα 55: Ανάλυση του ποσοστού και της απόλυτης τιµής των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των CD4 + στους δότες. και CD4 + CD25 high CD127 low Κατά τη δειγµατοληψία πριν την εγχείρηση στους υγιείς δότες το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + (6,99 ±7,3) είναι µικρότερο από αυτό των CD4 + CD25 high CD127 low (8,65 ±5,04), µια διαφορά που δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,05). Μετά την εγχείρηση, το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + (6,03 ±8,18) µικραίνει και το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low (11,48 ±5,11)µεγαλώνει αυξάνοντας την µεταξύ τους διαφορά που δεν είναι όµως στατιστικά σηµαντική (p=0,878). Εφτά µέρες µετά την εγχείρηση, το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + (3,13 ±0,18) µικραίνει και το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low (15,81 ±6,87) µεγαλώνει αυξάνοντας τη µεταξύ τους διαφορά που όµως δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,18). Η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + (153,42 ±276,88) κυµαίνεται σε ελαφρώς µικρότερα επίπεδα από αυτό των CD4 + CD25 high CD127 low (157,96 ±147,85), µια µικρή διαφορά που δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,48). Μετά την εγχείρηση, οι τιµές αµφότερων µεγαλώνουν και η διαφορά των CD4 + CD25 + FOXP3 + (250,08 ±461,54) και των CD4 + CD25 high CD127 low (296,9 ±283,16) µεγαλώνει αλλά δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,508). Εφτά µέρες µετά την εγχείρηση, τόσο η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + (450,5 ±120,92) όσο και η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 high CD127 low (664,5 ±311,83) µεγαλώνουν αλλά η µεταξύ τους διαφορά δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,18). 73

74 Εικόνα 56: Ανάλυση του ποσοστού και της απόλυτης τιµής των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των CD4 + στους υγιείς δότες. και CD4 + CD25 high CD127 low Κατά τη δειγµατοληψία πριν την εγχείρηση στους ασθενείς δότες το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + (3,5 ±1,53) είναι µικρότερο από αυτό των CD4 + CD25 high CD127 low (4,49 ±3,77), µια διαφορά που δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,715). Μετά την εγχείρηση, καθώς τα ποσοστά των CD4 + CD25 + FOXP3 + (4,99 ±2,79) και των CD4 + CD25 high CD127 low (10,54 ±8,7) µεγαλώνουν αµφότερα, η διαφορά παραµένει αλλά δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,285). Εφτά µέρες µετά την εγχείρηση, τα ποσοστά των CD4 + CD25 + FOXP3 + (4,6) και των CD4 + CD25 high CD127 low (13,91) µεγαλώνουν διατηρώντας τη µεταξύ τους διαφορά. Η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + (139,75 ±210,49) κυµαίνεται σε ελαφρώς µεγαλύτερα επίπεδα από αυτό των CD4 + CD25 high CD127 low (122,25 ±193,11), µια µικρή διαφορά που δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,066). Μετά την εγχείρηση, οι τιµές αµφότερων µεγαλώνουν αλλά πλέον η διαφορά των CD4 + CD25 + FOXP3 + (156,25 ±159,98) και των CD4 + CD25 high CD127 low (365 ±376,83) είναι προς όφελος των τελευταίων αλλά δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,109). Εφτά µέρες µετά την εγχείρηση, τόσο η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + (151) όσο και η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 high CD127 low (175) εµφανίζουν µια πτώση επιστρέφοντας σε επίπεδα λίγο µεγαλύτερα από τις τιµές που παρατηρήθηκαν πριν την εγχείρηση. 74

75 Εικόνα 57: Ανάλυση του ποσοστού και της απόλυτης τιµής των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των CD4 + στους άρρωστους δότες. και CD4 + CD25 high CD127 low Κατά τη δειγµατοληψία πριν την εγχείρηση στους µεταγγισµένους δότες το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + (6,38 ±7,39) είναι µικρότερο από αυτό των CD4 + CD25 high CD127 low (9,61 ±5,86), µια διαφορά που δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,136). Μετά την εγχείρηση, το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + (5,17 ±5,72) µικραίνει και το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low (10,67 ±5,98) µεγαλώνει αυξάνοντας τη µεταξύ τους διαφορά που δεν είναι όµως στατιστικά σηµαντική (p=0,139). Εφτά µέρες µετά την εγχείρηση, το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + (3,62 ±0,86) µικραίνει και το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low (15,18 ±4,98) µεγαλώνει αυξάνοντας τη µεταξύ τους διαφορά που όµως αλλά δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,109). Η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + (188 ±287) κυµαίνεται σε ελαφρώς µεγαλύτερα επίπεδα από αυτό των CD4 + CD25 high CD127 low (186,71 ±164,81), µια µικρή διαφορά που δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,906). Μετά την εγχείρηση, οι τιµές αµφότερων µεγαλώνουν και η διαφορά των CD4 + CD25 + FOXP3 + (227,88 ±462,78) και των CD4 + CD25 high CD127 low (257,78 ±276,27) µεγαλώνει υπέρ των τελευταίων αλλά δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,515). Εφτά µέρες µετά την εγχείρηση, τόσο η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + (350,67 ±192,9) όσο και η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 high CD127 low (501,33 ±358,46) µεγαλώνουν αλλά η µεταξύ τους διαφορά δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,109). 75

76 Εικόνα 58: Ανάλυση του ποσοστού και της απόλυτης τιµής των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των CD4 + στους µεταγγισµένους δότες. και CD4 + CD25 high CD127 low Κατά τη δειγµατοληψία πριν την εγχείρηση στους µη µεταγγισµένους δότες το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + (5,33 ±2,95) είναι µικρότερο από αυτό των CD4 + CD25 high CD127 low (6,12 ±2,87), µια διαφορά που δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,144). Μετά την εγχείρηση, τα ποσοστά των CD4 + CD25 + FOXP3 + (6,83 ±9,81) και των CD4 + CD25 high CD127 low (12,6 ±5,52) µεγαλώνουν, το ίδιο και η µεταξύ τους διαφορά που δεν είναι όµως στατιστικά σηµαντική (p=0,465). Η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + (36 ±21,23) είναι µικρότερη από αυτή των CD4 + CD25 high CD127 low (109,38 ±123,87), µια διαφορά που δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,465). Μετά την εγχείρηση, οι τιµές αµφότερων µεγαλώνουν και η διαφορά των CD4 + CD25 + FOXP3 + (250,23 ±408,48) και των CD4 + CD25 high CD127 low (436 ±325,46) µεγαλώνει αλλά δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,465). Εικόνα 59: Ανάλυση του ποσοστού και της απόλυτης τιµής των CD4 + CD25 + FOXP3 + % των CD4 + στους µη µεταγγισµένους δότες. και CD4 + CD25 high CD127 low Κατά τη δειγµατοληψία πριν την εγχείρηση στους δότες που παρουσίασαν περιεγχειρητικά προβλήµατα το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + (4,26 ±3,41) είναι µικρότερο από αυτό των CD4 + CD25 high CD127 low (9,12 ±6,52), µια διαφορά που δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,075). Μετά την εγχείρηση, τα ποσοστά τόσο των 76

77 CD4 + CD25 + FOXP3 + (2,88 ±2,42) όσο και των CD4 + CD25 high CD127 low (8,12 ±2,96) µικραίνουν αλλά η µεταξύ τους διαφορά παραµένει αν και δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,109). Εφτά µέρες µετά την εγχείρηση, το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + (3,93 ±0,96) προσεγγίζει τα επίπεδα προ εγχείρησης και το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low (12,43 ±2,09) µεγαλώνει επίσης, θεµελιώνοντας µια διαφορά µεταξύ τους που δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,18). Η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + (95 ±111,57) κυµαίνεται σε ελαφρώς µικρότερα επίπεδα από αυτή των CD4 + CD25 high CD127 low (132,12 ±130,87), µια µικρή διαφορά που δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,6). Μετά την εγχείρηση, η µεν απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + (90 ±100,58) µικραίνει, η δε τιµή των CD4 + CD25 high CD127 low (293,33 ±321,57) µεγαλώνει αυξάνοντας τη µεταξύ τους διαφορά που όµως δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,109). Εφτά µέρες µετά την εγχείρηση, τόσο η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + (258 ±151,321) όσο και η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 high CD127 low (309,5 ±190,21) µεγαλώνουν αλλά η µεταξύ τους διαφορά δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,18). Εικόνα 60: Ανάλυση του ποσοστού και της απόλυτης τιµής των CD4 + CD25 + FOXP3 + και CD4 + CD25 high CD127 low % των CD4 + στους δότες που εµφάνισαν περιεγχειρητικά προβλήµατα. Κατά τη δειγµατοληψία πριν την εγχείρηση στους δότες που δεν παρουσίασαν περιεγχειρητικά προβλήµατα το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + (7,24 ±7,74) κυµαίνεται σε ελαφρώς µικρότερα επίπεδα από αυτό των CD4 + CD25 high CD127 low (7,72 ±4,52), µια διαφορά που δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,386). Μετά την εγχείρηση, το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + (6,8 ±8,48) µικραίνει ενώ αυτό των CD4 + CD25 high CD127 low (12,21 ±6,07) µεγαλώνει αυξάνοντας τη µεταξύ τους διαφορά αν και δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,878). Εφτά µέρες µετά την εγχείρηση, το ποσοστό των CD4 + CD25 + FOXP3 + (3) µικραίνει ακόµα περισσότερο και από την άλλη το ποσοστό των CD4 + CD25 high CD127 low (20,67) µεγαλώνει αυξάνοντας τη µεταξύ τους διαφορά. Η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + (183 ±313,67) κυµαίνεται σε ελαφρώς µεγαλύτερα επίπεδα από αυτό των CD4 + CD25 high CD127 low (160,86 ±160,07), µια µικρή διαφορά που δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,721). Μετά την εγχείρηση, οι τιµές αµφότερων µεγαλώνουν και η διαφορά των CD4 + CD25 + FOXP3 + (282,48 ±484,92) και των CD4 + CD25 high CD127 low (318,4 ±299,64) µεγαλώνει υπέρ των τελευταίων αλλά δεν είναι στατιστικά σηµαντική (p=0,508). Εφτά µέρες µετά την εγχείρηση, τόσο η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 + FOXP3 + (536) όσο και η απόλυτη τιµή των CD4 + CD25 high CD127 low (885) µεγαλώνουν. 77

78 Εικόνα 61: Ανάλυση του ποσοστού και της απόλυτης τιµής των CD4 + CD25 + FOXP3 + και CD4 + CD25 high CD127 low % των CD4 + στους δότες που δεν εµφάνισαν περιεγχειρητικά προβλήµατα. 78