Ταυτοποίηση υποδοχέων και μελέτη της σχέσης δομής δράσης στην κυτταρική μετανάστευση του αυξητικού παράγοντα πλειοτροπίνη

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ Ταυτοποίηση υποδοχέων και μελέτη της σχέσης δομής δράσης στην κυτταρική μετανάστευση του αυξητικού παράγοντα πλειοτροπίνη ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΜΑΡΙΟΣ Θ. ΜΙΚΕΛΗΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ, MSc ΠΑΤΡΑ 2009

2 ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΜΑΡΙΟΣ Θ. ΜΙΚΕΛΗΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ Ταυτοποίηση υποδοχέων και μελέτη της σχέσης δομής δράσης στην κυτταρική μετανάστευση του αυξητικού παράγοντα πλειοτροπίνη Ε. ΠΑΠΑΔΗΜΗΤΡΙΟΥ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΕΠΙΚΟΥΡΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ Π. ΚΟΡΔΟΠΑΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΜΕΛΟΣ ΤΡΙΜΕΛΟΥΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Α. ΠΑΠΑΠΕΤΡΟΠΟΥΛΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΜΕΛΟΣ ΤΡΙΜΕΛΟΥΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Σ. ΤΖΑΡΤΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΜΕΛΟΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Ν. ΚΑΡΑΜΑΝΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΜΕΛΟΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Π. ΚΑΤΣΩΡΗΣ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΜΕΛΟΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ Σ. ΤΟΠΟΥΖΗΣ ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΜΕΛΟΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ

3 Το έργο συγχρηματοδοτήθηκε κατά: 80% της Δημόσιας Δαπάνης από την Ευρωπαϊκή Ενωση Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο 20% της Δημόσιας Δαπάνης από το Ελληνικό Δημόσιο Υπουργείο Ανάπτυξης Γενική Γραμματεία Ερευνας και Τεχνολογίας και από τον Ιδιωτικό Τομέα στο πλαίσιο του Μέτρου 8.3 του Ε.Π. Ανταγωνιστικότητα Γ Κοινοτικό Πλαίσιο Στήριξης.

4 Πρόλογος Η παρούσα εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Μοριακής Φαρμακολογίας του Τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών, υπό την επίβλεψη της Επίκουρης Καθηγήτριας κ. Ευαγγελίας Παπαδημητρίου. Η περίοδος της εκπόνησης της διδακτορικής μου διατριβής, αλλά και της εργασίας μου στο Εργαστήριο Μοριακής Φαρμακολογίας γενικότερα, αποτέλεσαν για εμένα από τις πιο παραγωγικές και ευχάριστες περιόδους της ζωής μου. Θεωρώ τον εαυτό μου ιδιαίτερα ευτυχή γιατί είχα την ευκαιρία να συναναστραφώ με αξιόλογους ανθρώπους και να αποκομίσω χρήσιμες εμπειρίες για τη ζωή μου. Για την ευκαιρία αυτή θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαίτερα την κ. Παπαδημητρίου, καθώς και για την αμέριστη συμπαράστασή της, την εμπιστοσύνη που μου έδειξε όλα αυτά τα χρόνια, τις ερευνητικές αρχές που με δίδαξε και για τη βοήθεια και την καθοδήγησή της, τόσο ως επιστήμονας, όσο και ως άνθρωπος. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Καθηγητή του Τμήματος Φαρμακευτικής κ. Παύλο Κορδοπάτη για τη συμμετοχή του στην τριμελή συμβουλευτική επιτροπή, για την ευκαιρία που έδωσε να χρησιμοποιήσω εξοπλισμό του εργαστηρίου του, για τη συνολική βοήθειά του, και τις εύστοχες συμβουλές και παρατηρήσεις του. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Καθηγητή του Τμήματος Φαρμακευτικής κ. Ανδρέα Παπαπετρόπουλο για την καθοδήγησή του, τη βοήθειά του σε αντιδραστήρια (π.χ. πλασμίδια έκφρασης), τις εύστοχες συμβουλές και παρατηρήσεις του. Θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Καθηγητή του Τμήματος Φαρμακευτικής κ. Σωκράτη Τζάρτο για τη συμμετοχή του στην επταμελή εξεταστική επιτροπή, τις συμβουλές και τις παρατηρήσεις του και τις εποικοδομητικές συζητήσεις μας. Ευχαριστώ τον Καθηγητή του Τμήματος Χημείας κ. Νικόλαο Καραμάνο για τη συμμετοχή του στην επταμελή εξεταστική επιτροπή και τις εύστοχες συμβουλές και παρατηρήσεις του. Ευχαριστώ θερμά τον πρώτο μου δάσκαλο και Αναπληρωτή Καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας κ. Παναγιώτη Κατσώρη για τη συμμετοχή του στην επταμελή εξεταστική επιτροπή και τις συμβουλές του από την αρχή της ερευνητικής μου πορείας. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον Επίκουρο Καθηγητή του Τμήματος Φαρμακευτικής κ. Σταύρο Τοπούζη για τη σημαντική συνεισφορά του τόσο στα πλαίσια της εκπόνησης της διδακτορικής μου διατριβής, όσο και στην προσπάθειά μου για την αναζήτηση μεταδιδακτορικής

5 έρευνας. Οφείλω ένα μεγάλο ευχαριστώ στους φίλους μου Βασίλη Ρούκο και Στέργιο Δερμενούδη για τη βοήθειά τους με τα πειράματα ανοσοφθορισμού και τους καθηγητές τους κ. Ζωή Λυγερού και κ. Ιωάννη Μισιρλή αντίστοιχα, που μας έδωσαν τη δυνατότητα για τη χρήση των μικροσκοπίων και στο φίλο μου Χρήστο Πέτρου για τη βοήθειά του στην απομόνωση της πλειοτροπίνης με τη χρήση του HPLC. Ευχαριστώ επίσης τους φίλους μου Μαρία Παναγιώτου και Πέτρο Δέδε. Ένα πολύ μεγάλο ευχαριστώ οφείλω στους μεταπτυχιακούς φοιτητές με τους οποίους είχα τη χαρά να συνεργαστώ όλα τα χρόνια παραμονής μου στο Εργαστήριο Μοριακής Φαρμακολογίας. Τέλος, δεν ξεχνώ ότι αυτά που πέτυχα τα τελευταία χρόνια θα ήταν αδύνατα χωρίς την υλική και ηθική συμπαράσταση των γονέων μου και της αδερφής μου Αγγελικής και τους ευχαριστώ.

6 Περιεχόμενα ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1 1. Αγγειογένεση Γενικά Αγγειογενετική διαδικασία Μόρια που συμμετέχουν Μη αγγειογενετική ανάπτυξη αιμοφόρων αγγείων Μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων κατά την αγγειογένεση Χημειοτακτική μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων Απτοτακτική μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων Μηχανοτακτική μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων Ιντεγκρίνες Δομή ιντεγκρινών Εντοπισμός και λειτουργία Μεταβίβαση σήματος από το εσωτερικό του κυττάρου στον 24 εξωκυττάριο χώρο (inside-out signaling) Μεταβίβαση σήματος από τον εξωκυττάριο χώρο στο 25 εσωτερικό του κυττάρου (outside-in signaling) 2.3. Ο ρόλος των ιντεγκρινών στη μετανάστευση των ενδοθηλιακών 26 κυττάρων 2.4. Αλληλεπίδραση ανάμεσα σε ιντεγκρίνες και υποδοχείς αυξητικών 27 παραγόντων 2.5. Ιντεγκρίνες στην αγγειογένεση Έκφραση νέων ιντεγκρινών Διαφοροποίηση της έκφρασης προϋπαρχόντων ιντεγκρινών Μεταβολές στη λειτουργία των ιντεγκρινών του ενδοθηλίου 34 κατά την αγγειογένεση 2.6. Ιντεγκρίνη α ν β 3 και αγγειογένεση Πλειοτροπίνη Δομή γονιδίου της πλειοτροπίνης και γονιδιακή έκφραση Πρωτεϊνική δομή της πλειοτροπίνης Αλληλεπιδράσεις, υποδοχείς της πλειοτροπίνης και μεταβίβαση 43 σήματος Μόρια που αλληλεπιδρούν με την πλειοτροπίνη Ν-Συνδεκάνη Υποδοχέας με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ (RPTPβ/ζ) Κινάση αναπλαστικού λεμφώματος (ALK) Βιολογικά ενεργά τμήματα της πλειοτροπίνης Ο ρόλος της πλειοτροπίνης σε αγγειογένεση καρκίνο Midkine 60 ΣΚΟΠΟΣ 63

7 ΜΕΘΟΔΟΙ Παραγωγή και απομόνωση ανθρώπινης ανασυνδυασμένης πλειοτροπίνης Ανάπτυξη βακτηριακών κυττάρων σε στερεή καλλιέργεια Ανάπτυξη βακτηριακών κυττάρων σε υγρή καλλιέργεια Κατάψυξη βακτηριακών κυττάρων Εισαγωγή πλασμιδιακού DNA σε βακτήρια Παρασκευή επιδεκτικών κυττάρων για μετασχηματισμό (competent cells) Μετασχηματισμός δεκτικών βακτηριακών κυττάρων (transformation) Ανίχνευση βέλτιστων συνθηκών για έκφραση της υπό μελέτη πρωτεΐνης Μικρής κλίμακας ανάπτυξη βακτηριακών κυττάρων σε υγρή καλλιέργεια Μικρής κλίμακας απομόνωση ολικού πρωτεϊνικού εκχυλίσματος των βακτηριακών κυττάρων και διαχωρισμός κλασμάτων Παραγωγή ανθρώπινης ανασυνδυασμένης πλειοτροπίνης Απομόνωση ανθρώπινης ανασυνδυασμένης πλειοτροπίνης Απομόνωση πρωτεϊνών από τη χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη εμβρύου όρνιθας Προετοιμασία αυγών Ομογενοποίηση του ιστού της χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης Απομόνωση πρωτεϊνών από καλλιέργειες ευκαρυωτικών κυττάρων Προσδιορισμός της συγκέντρωσης ολικών πρωτεϊνών σε διάλυμα (Μέθοδος Bradford) Λύση κυττάρων μετά από ενεργοποίηση για πειράματα μελέτης φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών Ανοσοκατακρήμνιση Ανάλυση πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακριλαμιδίου με αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) Ανάλυση πρωτεϊνών κατά Western Χρώση πηκτώματος πολυακριλαμιδίου με Coomasie Διαδικασία αποδέσμευσης αντισώματος από PVDF μεμβράνη (stripping) Παρασκευή ECGS (Endothelial Cell Growth Supplement) από εγκέφαλο βοός Θρεπτικά μέσα των χρησιμοποιούμενων κυττάρων Απομόνωση ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC από φλέβα ομφάλιου λώρου ανθρώπου Μέτρηση κυττάρων σε αιμοκυτταρόμετρο Neubauer Ανακαλλιέργεια κυττάρων Κατάψυξη κυττάρων Απόψυξη κυττάρων Μέτρηση του χημειοτακτισμού των κυττάρων (Transfilter assay) Επώαση κυττάρων με παράγοντες για μελέτη φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών 121

8 20. Βιοτινυλίωση πρωτεϊνών κυτταρικής μεμβράνης ευκαρυωτικών 123 κυττάρων και ανάλυσή τους 21. Διαμόλυνση κυττάρων με παρεμβαλλόμενο RNA (sirna, RNAi) Μετασχηματισμός ευκαρυωτικών κυττάρων Ανοσοφθορισμός Ποσοτικοποίηση ανοσοαποτυπωμάτων με σύστημα ανάλυσης εικόνας Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων 133 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Αναστολή της λειτουργικότητας της ιντεγκρίνης α ν β 3 αναστέλλει την επαγόμενη από πλειοτροπίνη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC 2. Ο αυξητικός παράγοντας Midkine αναστέλλει τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC Η πλειοτροπίνη αλληλεπιδρά με την ιντεγκρίνη α ν β 3 (Ι) Η πλειοτροπίνη αλληλεπιδρά με την ιντεγκρίνη α ν β 3 (ΙΙ) Η πλειοτροπίνη εντοπίζεται στην κυτταρική μεμβράνη των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC Συνεντοπισμός της ιντεγκρίνης α ν β 3 και της πλειοτροπίνης στην κυτταρική μεμβράνη των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC Η midkine δεν αλληλεπιδρά με την ιντεγκρίνη α ν β Η πλειοτροπίνη και η midkine αλληλεπιδρούν με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ Η πλειοτροπίνη επάγει τη φωσφορυλίωση της τυροσίνης 773 στη β 3 υπομονάδα της ιντεγκρίνης Μελέτη της επαγόμενης από την πλειοτροπίνη φωσφορυλίωσης της ιντεγκρίνης β 3 σε συνάρτηση με το χρόνο Η midkine επάγει τη φωσφορυλίωση της τυροσίνης 773 στη β 3 υπομονάδα της ιντεγκρίνης Η επαγόμενη από την πλειοτροπίνη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC δεν εξαρτάται από την περιοχή αναγνώρισης της RGD αλληλουχίας της ιντεγκρίνης 13. Η επαγόμενη από την πλειοτροπίνη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC εξαρτάται από την περιοχή μεταξύ των αμινοξέων της β 3 υπομονάδας της ιντεγκρίνης 14. Η πλειοτροπίνη προσδένεται στην κυστεϊνική θηλιά του του εξωκυτταρικού τμήματος της β 3 υπομονάδας της ιντεγκρίνης α ν β Το πεπτίδιο Β3 και το λειτουργικό αντίσωμα έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3 δεν επηρεάζουν τη φωσφορυλίωση της Υ773 της β 3 υπομονάδας της ιντεγκρίνης 16. Η ιντεγκρίνη α ν β 3 αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ Οι υπομονάδες α ν και β 3 της ιντεγκρίνης αλληλεπιδρούν με διαφορετικές ισομορφές του RPTPβ/ζ Ταυτοποίηση της μικρής ισομορφής του RPTPβ/ζ που αλληλεπιδρά με την ιντεγκρίνη α ν β Η μικρή ισομορφή του RPTPβ/ζ που αλληλεπιδρά με την ιντεγκρίνη α ν β 3 είναι διαμεμβρανική Συνεντοπισμός της ιντεγκρίνης α ν β 3 και του RPTPβ/ζ στην κυτταρική μεμβράνη των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC

9 21. Η αλληλεπίδραση της ιντεγκρίνης α ν β 3 με την πλειοτροπίνη είναι ανεξάρτητη από τον RPTPβ/ζ Ο RPTPβ/ζ είναι απαραίτητος για την επαγόμενη από την πλειοτροπίνη φωσφορυλίωση της Υ773 της β 3 υπομονάδας της ιντεγκρίνης α ν β Η επαγωγή της φωσφορυλίωσης της Υ773 της β 3 υπομονάδας της ιντεγκρίνης α ν β 3 από τον RPTPβ/ζ πραγματοποιείται μέσω της κινάσης c- 162 Src 24. Η κινάση c-src αλληλεπιδρά και με την υπομονάδα β 3 της ιντεγκρίνης α ν β Η έκφραση της ιντεγκρίνης α ν β 3 είναι καθοριστική για τη βιολογική δράση της πλειοτροπίνης στη μετανάστευση διαφόρων ειδών κυττάρων Υπερέκφραση άγριου τύπου και μεταλλαγμένης υπομονάδας β 3 της ιντεγκρίνης στα ΜΟ59Κ επηρεάζει την επαγόμενη από την πλειοτροπίνη μετανάστευση 27. Διαφορική απόκριση στην επαγόμενη από πλειοτροπίνη μετανάστευση σε κλώνους CHO που υπερεκφράζουν άγριου τύπου και μεταλλαγμένη β 3 υπομονάδα 28. Το πεπτίδιο S1 δεν επηρεάζει τη δέσμευση της πλειοτροπίνης στον RPTPβ/ζ Το πεπτίδιο S1 αναστέλλει τη δέσμευση της πλειοτροπίνης στην ιντεγκρίνη α ν β ΣΥΖΗΤΗΣΗ 173 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 181 ΣYNΤΜΗΣΕΙΣ 207 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 211 SUMMARY 213 ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ

10 ΕΙΣΑΓΩΓΗ

11 Εισαγωγή 1. Αγγειογένεση 1.1. Γενικά Η συνεχής παροχή οξυγόνου είναι απαραίτητη για την επιβίωση όλων των μεταζώων. Στα θηλαστικά, η ανάγκη για ένα λειτουργικό κυκλοφορικό σύστημα εμφανίζεται νωρίς στην ανάπτυξη, όταν η διάχυση από τα αιμοφόρα αγγεία στους περιφερειακούς μητρικούς ιστούς είναι ανεπαρκής να εφοδιάσει με οξυγόνο όλα τα κύτταρα του αναπτυσσόμενου εμβρύου. Στον άνθρωπο, όλες σχεδόν οι βασικές αιτίες θανάτου περιλαμβάνουν μεταβολές στην αγγείωση των ιστών και την παροχή οξυγόνου. Επιπλέον, η ομοιόσταση του οξυγόνου αποτελεί βασική αρχή για την κατανόηση της παθοφυσιολογίας της εξέλιξης, ανάπτυξης και διαφόρων ασθενειών (Semenza, 2007). Η ανάπτυξη του αγγειακού συστήματος αποτελεί ένα τέλειο παράδειγμα συντονισμού κυτταρικών διαδικασιών, όπως του πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης, της μετανάστευσης, της προσκόλλησης σε υπόστρωμα και της διακυτταρικής μεταγωγής σήματος κατά τη μορφογένεση του ιστού (Adams and Alitalo, 2007). Πρωτεύοντα ρόλο στην ανάπτυξη του αγγειακού συστήματος παίζουν τα αρχέγονα αιματοποιητικά κύτταρα (hematopoietic stem cells, HSCs). Από τα κύτταρα αυτά, με τη διαδικασία της ασύμμετρης διχοτόμησης προκύπτουν τόσο άλλα αρχέγονα αιματοποιητικά κύτταρα, όσο και πολυδύναμα προγονικά κύτταρα (multipotent progenitor cells), που έχουν έντονη την ικανότητα πολλαπλασιασμού. Από τα πολυδύναμα προγονικά κύτταρα προκύπτουν προγονικά κύτταρα με διαφορετικούς φαινότυπους και περιορισμένη δυνατότητα διαφοροποίησης (oligopotent progenitor cells) και πολλαπλασιασμού (Bryder et al, 2006), από τα οποία θα προκύψουν τα τελικά διαφοροποιημένα κύτταρα που απαρτίζουν το αγγειακό σύστημα. Η διαδικασία δημιουργίας του αγγειακού συστήματος ξεκινάει με τη νεοαγγειογένεση (vasculogenesis), που πραγματοποιείται κατά την εμβρυϊκή ζωή, και περιλαμβάνει το σχηματισμό του πρωτογενούς αγγειακού πλέγματος από τα μεσοδερμικά προγεννητικά κύτταρα (Risau, 1997), και συνεχίζεται μετά την εμβρυική και κατά την ενήλικη ζωή με τη διαδικασία της αγγειογένεσης. Ο 1

12 Εισαγωγή κλασικός ορισμός της αγγειογένεσης είναι η δημιουργία νέων αγγείων από προϋπάρχοντα (Risau, 1997; Sato and Loughna, 2002). Ο ορισμός αυτός έχει διαφοροποιηθεί και ως εξής: «Αγγειογένεση ονομάζεται η εξάπλωση νέων τριχοειδών αγγείων. Αυτά τα τριχοειδή αποτελούνται μόνο από αυλούς που επενδύονται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα και στερούνται λείων μυϊκών κυττάρων ή επιπλέον δομών για την επένδυσή τους.» (Heil et al, 2006). Πρόσφατα αναφέρθηκε και ο όρος «τριχοειδογένεση» (capillogenesis), που αναφέρεται στη δημιουργία τριχοειδών αγγείων κατά την ανάπτυξη ή την ενήλικη ζωή, ανεξαρτήτως μηχανισμών, διαδικασιών ή κυττάρων που συμμετέχουν (Kovacic et al, 2008). Ανεξάρτητα όμως από τους ορισμούς, η αγγειογένεση αποτελεί μια θεμελιώδη για τη ζωή, πολυσταδιακή διαδικασία που περιλαμβάνει γεγονότα όπως ενεργοποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων, αποικοδόμηση της εξωκυττάριας ύλης, μετανάστευση και πολλαπλασιασμό ενδοθηλιακών κυττάρων, ωρίμανση και σταθεροποίηση του νέου αγγείου με επιστράτευση περικυττάρων και λείων μυϊκών κυττάρων (Tirziu and Simons, 2005). Η συνεισφορά της αγγειογένεσης στην ανάπτυξη διαφόρων οργάνων συνεχίζεται και μετά τη γέννηση και μέχρι την ενηλικίωση, μετά την οποία τα περισσότερα αγγεία δεν αναπτύσσονται περαιτέρω. Στον ενήλικα, η αγγειογένεση λαμβάνει χώρα στις ωοθήκες και στη μήτρα κατά τον εμμηνορροϊκό κύκλο, στον πλακούντα κατά την εγκυμοσύνη και κατά την επούλωση πληγών. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα διατηρούν την ικανότητά τους να πολλαπλασιάζονται άμεσα, ως ανταπόκριση σε φυσιολογικά ερεθίσματα (π.χ. υποξία). Σε αρκετές διαταραχές, τα ερεθίσματα αυτά είναι έντονα, με αποτέλεσμα να διαταράσσεται η ισορροπία ανάμεσα σε αγγειογενετικούς και αντιαγγειογενετικούς παράγοντες και να επάγεται η αγγειογένεση. Οι νόσοι που σχετίζονται με αυξημένη αγγειογένεση είναι αρκετές, όπως η φλεγμονή, διαταραχές όρασης, οστεοαρθρίτιδα, ρευματοειδής αρθρίτιδα, ψωρίαση, με πιο γνωστή τον καρκίνο (Carmeliet, 2005). 2

13 Εισαγωγή 1.2. Αγγειογενετική διαδικασία Μόρια που συμμετέχουν Ενεργοποίηση της αγγειογενετικής διαδικασίας Το πιο σημαντικό μόριο μέχρι στιγμής που φαίνεται να ρυθμίζει τη μορφογένεση των αιμοφόρων αγγείων είναι ο αυξητικός παράγοντας του αγγειακού ενδοθηλίου A (Vascular Endothelial Growth Factor A ή VEGF-A), ο οποίος αποτελεί μέλος μιας μεγάλης οικογένειας αυξητικών παραγόντων που περιλαμβάνει και άλλα σημαντικά μόρια, όπως τους VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D και PlGF. Ο VEGF-A έχει βρεθεί ότι απαιτείται για το χημειοτακτισμό και τη διαφοροποίηση των προγονικών ενδοθηλιακών κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων, την άμεση επιστράτευσή τους σε αγγειακές δομές (νεοαγγειογένεση) και την εκβλάστηση νέων αγγείων (Ferrara et al, 2003; Shibuya, 2006). Κάποιοι από αυτούς τους ρόλους είναι σημαντικοί, τόσο στην ανάπτυξη νέων αγγείων στην ενήλικη ζωή, όσο και στον καρκίνο (Adams and Alitalo, 2007). Οι κυτταρικές ανταποκρίσεις στον VEGF και στους άλλους αυξητικούς παράγοντες ρυθμίζονται από μηχανισμούς που περιλαμβάνουν την έκφραση νέων αυξητικών παραγόντων, ισομορφών τους, καθώς και αρκετών υποδοχέων. Είναι π.χ. γνωστό ότι εναλλακτικό μάτισμα του VEGF-A μπορεί να οδηγήσει στην έκφραση μιας σειράς ισομορφών που ονομάζονται b ισομορφές, διαφέρουν στα τελευταία έξι αμινοξέα και έχουν αντι-αγγειογενετικές ιδιότητες, ενώ αυτό που φαίνεται τελικά να καθορίζει τη δημιουργία αγγείων είναι η σχετική ισορροπία μεταξύ τους (Ladomery et al, 2006). Η δέσμευση του VEGF-A στον υποδοχέα του VEGFR2 επάγει τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση των ενδοθηλιακών κυττάρων και τη δημιουργία αυλών. Στα έμβρυα, αυτή η διαδικασία ρυθμίζεται ανασταλτικά και από έναν άλλο υποδοχέα, τον VEGFR1, ο οποίος αν και έχει μεγαλύτερη συγγένεια δέσμευσης με τον VEGF, παρουσιάζει μικρή δράση κινάσης τυροσίνης. Ο υποδοχέας αυτός εκφράζεται και ως μια εκκρινόμενη, καταλυτικά ανενεργή, και επομένως ανασταλτική ισομορφή (Ferrara et al, 2003; Shibuya, 2006). Πέρα από τους αυξητικούς, πολλοί άλλοι παράγοντες φαίνονται να επηρεάζουν τη διαδικασία της αγγειογένεσης. Η σύνθεση της εξωκυττάριας ύλης (Extracellular 3

14 Εισαγωγή Matrix, ECM) που περιβάλλει το αγγείο μπορεί να επηρεάσει την αγγειογένεση θετικά ή αρνητικά (Nyberg et al, 2005). Η πρωτεολυτική απελευθέρωση των ισομορφών του VEGF και η δέσμευσή τους από μόρια της εξωκυττάριας ύλης αποτελεί βασικό ρυθμιστή της βιοδιαθεσιμότητας του VEGF και του προσανατολισμού των νεοσχηματισθέντων αγγείων (Lee et al, 2005). Επιπλέον, η φυσική αλληλεπίδραση ανάμεσα στα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα περικύτταρα φαίνεται να δρα ανασταλτικά στην εκβλάστηση νέων αγγείων (Armulik et al, 2005). Επιλογή των ενδοθηλιακών κυττάρων που θα μεταναστεύσουν Κατά την αγγειογενετική διαδικασία, κάποια ενδοθηλιακά κύτταρα από το τοίχωμα του τριχοειδούς αγγείου επιλέγονται για μετανάστευση, οδηγώντας στη δημιουργία νέας εκβλάστησης. Αυτά τα κύτταρα ονομάζονται tip cells (ακραία κύτταρα) και καθοδηγούν την εκβλάστηση. Τα κύτταρα αυτά είναι συγκεκριμένα, διαφορετικά το αγγειακό δίκτυο δε θα ήταν λειτουργικό. Οι υποδοχείς Notch και ο προσδέτης τους DLL4 (Delta-like-4) διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο για την εκβλάστηση του νέου αγγείου. Μειωμένα επίπεδα του DLL4 ή αναστολή της μεταγωγής σήματος από τους Notch υποδοχείς επάγουν τη δημιουργία πολλών tip cells, οδηγώντας σε δραματική αύξηση της εκβλάστησης και αναστόμωσης των αγγείων (Ridgway et al, 2006; Noguera-Troise et al, 2006; Hellstrom et al, 2007). Αντίστοιχα, οι ενδοθηλιακές εκβλαστήσεις μειώνονται δραματικά όταν επάγεται η μεταγωγή σήματος DLL-Notch σε έμβρυα zebrafish (Leslie et al, 2007; Siekmann and Lawson, 2007). Η έκφραση του DLL4 επάγεται στο tip cell, ενώ στα γειτονικά ενδοθηλιακά κύτταρα επάγεται η μεταγωγή σήματος από τον υποδοχέα Notch για να κατασταλεί η εκβλάστηση στα κύτταρα αυτά (Hellstrom et al, 2007; Siekmann and Lawson, 2007). Ο ρόλος του Notch δεν περιορίζεται μόνο στη φυσιολογική αγγειογένεση. Αναστολή της αλληλεπίδρασης DLL4-Notch σε καρκινικά μοντέλα προκαλεί εκτεταμένες διακλαδώσεις και αναστομώσεις των καρκινικών αγγείων. Παρόλα αυτά, αυτά τα αγγεία δεν είναι λειτουργικά, με αποτέλεσμα να αυξάνεται η υποξία και η διάχυση του αίματος και να οδηγούν σε μείωση του όγκου. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι το μονοπάτι του Notch μπορεί να αποτελέσει 4

15 Εισαγωγή στόχο για αντι-αγγειογενετική θεραπεία στον καρκίνο (Noguera-Troise et al, 2006). Ο μηχανισμός με τον οποίο ο υποδοχέας Notch διαφοροποιεί τη συμπεριφορά ενδοθηλιακών κυττάρων τα οποία υπόκεινται στα ίδια αγγειογενετικά ερεθίσματα, φαίνεται να σχετίζεται άμεσα με το μονοπάτι σηματοδότησης του VEGF-A. Η έκφραση του DLL4 επάγεται από τον VEGF-A, ενώ η ενεργοποίηση του Notch από το DLL4 αναστέλλει την έκφραση του VEGFR2 (Noguera-Troise et al, 2006). Για το λόγο αυτό, η έκφραση του DLL4 μπορεί να αντιστοιχεί σε αυξημένη μεταγωγή σήματος από τον VEGF σε συγκεκριμένα ενδοθηλιακά κύτταρα, ενώ στα γειτονικά τους κύτταρα, η ενεργοποίηση του Notch υποδοχέα καταστέλλει κάθε προ-αγγειογενετική ανταπόκριση (Εικόνα 1). Αύξηση των νεοσχηματισθέντων εκβλαστήσεων και χημειοτακτισμός Πέρα από τα δεδομένα που υπάρχουν σχετικά με τους μηχανισμούς που οδηγούν συγκεκριμένα κύτταρα να εκβλαστάνουν, λίγα είναι γνωστά για τη διαδικασία δημιουργίας νέων αγγείων. Τα κύτταρα που μεταναστεύουν υφίστανται μεγάλες φαινοτυπικές αλλαγές, αποκτούν έντονη επιθετική και μεταναστευτική συμπεριφορά, ενεργοποιούν πρωτεϊνάσες που είτε εκκρίνονται, είτε εντοπίζονται στην κυτταρική μεμβράνη και σταδιακά αποικοδομούν τη βασική μεμβράνη. Οι αλληλεπιδράσεις με τα γειτονικά ενδοθηλιακά κύτταρα τροποποιούνται, χωρίς να καταστρέφονται οι δεσμοί μεταξύ των κυττάρων και η ακεραιότητα του αγγειακού τοιχώματος (Εικόνα 1). Η κορυφαία επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων «βλέπει» τον αυλό του αγγείου και για το λόγο αυτό, η πολικότητα της κορυφαίας με τη βασική επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων πρέπει να αναστραφεί όταν τα νέα αγγεία προέρχονται από την εξωτερική (βασική) πλευρά του ενδοθηλίου. Με αντίστοιχο τρόπο, η επιμήκυνση του νέου αγγείου πρέπει να έχει πολικότητα και συγκεκριμένο προσανατολισμό (Adams and Alitalo, 2007). Σε συνάρτηση με την έκφραση του VEGFR2 στις κορυφές των διακλαδώσεων, η κατεύθυνση των ενδοθηλιακών κυττάρων καθορίζεται από τον VEGF-A. Αύξηση της συγκέντρωσης προσκολλημένης ισομορφής του VEGF-A (VEGF164 στο ποντίκι, VEGF165 στον άνθρωπο), ο οποίος δεσμεύει τη θειική ηπαράνη, επάγει τη μετανάστευση και τον προσανατολισμό των φιλοποδίων του tip cell. Είναι 5

16 Εισαγωγή πολύ πιθανό και άλλοι αυξητικοί παράγοντες που δεσμεύονται σε πρωτεογλυκάνες να έχουν αντίστοιχες δράσεις. Μια μικρή ισομορφή του VEGF-A που στερείται της αλληλουχίας που δεσμεύει τη θειική ηπαράνη (VEGF120 στο ποντίκι, VEGF121 στον άνθρωπο), έχει την ιδιότητα να επάγει το πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων, αλλά όχι τη μετανάστευση του tip cell και κατ επέκταση τη σωστή διαμόρφωση των αγγείων (Ruhrberg et al, 2002; Gerhardt et al, 2003). Οι Neuropilins (1 και 2) (διαμεμβρανικοί υποδοχείς που δεσμεύουν σεμαφορίνες και τον VEGF) μπορεί να συμμετέχουν σε αυτή τη διαφορική ανταπόκριση, γιατί η Neuropilin 1 μπορεί να επάγει τη μεταγωγή σήματος από τον VEGF164 (ή VEGF165), αλλά όχι από τον VEGF120 (ή VEGF121) (Klagsbrun et al, 2002; Ferrara et al, 2003; Pan et al, 2007). Παρόλα αυτά, όταν δεν εκφράζεται η Neuropilin 1, οι αλλοιώσεις στο αγγειακό πλέγμα και στα φιλοπόδια είναι μικρές, που σημαίνει ότι και άλλοι VEGF παίζουν σημαντικό ρόλο στη μετανάστευση των tip cells (Ruhrberg et al, 2002; Gerhardt et al, 2004). Κατά την ανάπτυξη και την ωρίμανση του νέου αγγείου, ένας άλλος αυξητικός παράγοντας που διαδραματίζει σημαντικό ρόλο είναι ο PDGF-B (αυξητικός παράγοντας των αιμοπεταλίων Β, Platelet Derived Growth Factor B). Σε αρκετούς αναπτυσσόμενους ιστούς, υψηλά επίπεδα του PDGF-B στα tip cells επάγουν την επιστράτευση των περικυττάρων που εκφράζουν στην επιφάνειά τους τον υποδοχέα β του PDGF (PDGFRβ). Η διαδικασία αυτή εξασφαλίζει ότι το ενδοθήλιο των αναπτυσσόμενων αγγείων σταθεροποιείται επαρκώς από τα κύτταρα που το επενδύουν (Gerhardt et al, 2003). 6

17 Εισαγωγή Εικόνα 1: Διαδικασία δημιουργίας νέου αγγείου. (Α) Η δημιουργία της εκβλάστησης ελέγχεται από την ισορροπία προ-αγγειογενετικών και αντι-αγγειογενετικών παραγόντων (έντονη αλληλεπίδραση με περικύτταρα, αναστολείς μορίων εξωκυττάριας ύλης, αναστολείς αυξητικών παραγόντων). Σε περιπτώσεις που επάγεται η αγγειογένεση, ορισμένα ενδοθηλιακά κύτταρα μεταναστεύουν για εκβλάστηση, ενώ άλλα δεν ανταποκρίνονται. Για τη μετανάστευση απαιτείται η αλλαγή της πολικότητας, η δημιουργία μεταναστευτικού φαινοτύπου, η τροποποίηση των συνδέσεων μεταξύ των κυττάρων και η αποικοδόμηση της γειτονικής εξωκυττάριας ύλης. (Β) Ο προσανατολισμός της εκβλάστησης καθορίζεται από την αύξηση της συγκέντρωσης του VEGF και εξαρτάται από την εξωκυττάρια ύλη. Η απελευθέρωση του αυξητικού παράγοντα PDGFB από τα tip cells οδηγεί σε επιστράτευση των περικυττάρων και συμμετοχή τους στο νεοσχηματισμένο αγγείο. Οι συνδέσεις μεταξύ των ενδοθηλιακών κυττάρων πρέπει να διατηρούνται μετά το σχηματισμό του αυλού, για να αποτρέπουν εκτεταμένη διαρροή. (Γ) Όταν δυο tip cells «συναντηθούν», οι μεταξύ τους αλληλεπιδράσεις καθορίζουν το εάν θα συντηχθούν για να σχηματίσουν αυλό. Ο σχηματισμός του αυλού λαμβάνει χώρα στα υποκείμενα ενδοθηλιακά κύτταρα (stalk cells) και περιλαμβάνει τη σύντηξη κενοτοπίων (intracellular vacuolation) αλλά και άλλους μηχανισμούς. (Δ) Η σύντηξη στα σημεία της σύνδεσης μεταξύ των ενδοθηλιακών κυττάρων συμβάλλει στη δημιουργία ενός συνεχούς αυλού. Η ροή του αίματος βελτιώνει τη μεταφορά οξυγόνου και έτσι μειώνει τα προ-αγγειογενετικά σήματα που επάγονται από την υποξεία. Τυχόν διάχυση επάγει διαδικασίες ωρίμανσης του αγγείου, όπως η σταθεροποίηση των συνδέσεων μεταξύ των ενδοθηλιακών κυττάρων, η εναπόθεση εξωκυττάριας ύλης και η στενή σύνδεση των περικυττάρων. Η απουσία αυξητικών παραγόντων μπορεί να οδηγήσει σε συρρίκνωση του νέου αγγείου και απόπτωση των ενδοθηλιακών κυττάρων (Adams and Alitalo, 2007). 7

18 Εισαγωγή Μετατροπή των εκβλαστήσεων σε αγγεία Για τη μετατροπή των εκβλαστήσεων από ενδοθηλιακά κύτταρα σε λειτουργικά αγγεία με ροή αίματος απαιτούνται ακόμα αρκετά βήματα (Εικόνα 1). Μια σημαντική διαδικασία που λαμβάνει χώρα είναι η μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων στη βάση των εκβλαστήσεων (stalk cells) πίσω από το αρχικό (tip cell), η οποία έχει παρατηρηθεί στο σχηματισμό αγγείων στο θώρακα των εμβρύων zebrafish (Kamei et al, 2006; Siekmann and Lawson, 2007). Εναλλακτικά, ο τοπικός πολλαπλασιασμός των ενδοθηλιακών κυττάρων επίσης μπορεί να οδηγήσει σε προέκταση των εκβλαστήσεων, όπως συμβαίνει στον αναπτυσσόμενο αμφιβληστροειδή στο ποντίκι, όπου πολλαπλασιάζονται τα ενδοθηλιακά stalk cells και όχι το tip cell (Gerhardt et al, 2003). Αυτές οι διαφορές στο μιτωτικό χαρακτήρα των κυττάρων, καθώς και οι διαφορές στην έκφραση των DLL4, VEGFR2 και PDGFb υποδηλώνουν ότι πρόκειται για διαφορετικά κύτταρα. Παρόλα αυτά, σε ορισμένες περιπτώσεις κάποια από τα ενδοθηλιακά stalk cells μπορεί να δημιουργήσουν φιλοπόδια και να εκφράσουν τον DLL4 ή τον PDGF-Β. Γι αυτό και μέχρι σήμερα δεν έχει διευκρινισθεί εάν οι αλλαγές αυτές ανάμεσα στα ενδοθηλιακά κύτταρα υποδηλώνουν κάποιο σταθερό, γενετικά ελεγχόμενο προφίλ, ή παροδικές προσαρμογές που έχουν να κάνουν με τη θέση τους στο αναπτυσσόμενο αγγείο. Για να επιτευχθεί η σύνδεση μεταξύ δυο αγγείων πρέπει το ενδοθηλιακό tip cell της κάθε εκβλάστησης να εντοπίσει και να αναγνωρίσει κάποιο άλλο αγγείο. Η προσκόλληση του κυττάρου αυτού με το αντίστοιχο κορυφαίο ή άλλο κύτταρο της γειτονικής εκβλάστησης επιτυγχάνεται με τη δημιουργία συνδέσεων προσκόλλησης και διακυτταρικής επικοινωνίας μεταξύ τους. Η αποτυχία δημιουργίας αυτών των συνδέσεων, των οποίων οι μηχανισμοί δεν είναι απόλυτα διευκρινισμένοι, αποκλείει τη δημιουργία σύνδεσης ανάμεσα σε αυτά τα αγγεία. Με τον τρόπο αυτό, αποκλείεται η δημιουργία σύνδεσης ανάμεσα σε μη συμβατά αγγεία (Adams and Alitalo, 2007). Για την επίτευξη της ροής αίματος στο νέο αγγείο, είναι απαραίτητη η δημιουργία ενδοθηλιακού αυλού, ο οποίος μπορεί να δημιουργείται πριν ή και μετά τη συγχώνευση του νέου αγγείου. Μέχρι σήμερα έχουν επιβεβαιωθεί τρεις μηχανισμοί σχηματισμού αυλού στο ενδοθήλιο. Αυτοί είναι: α) Η ανάπτυξη του 8

19 Εισαγωγή νέου αυλού πάνω σε προϋπάρχοντα αυλό (budding). β) Η δημιουργία κοιλότητας (cord hollowing), κατά την οποία μια κυλινδρική διάταξη πακεταρισμένων ενδοθηλιακών κυττάρων δημιουργεί ένα κεντρικό κενό με αλλαγή του σχήματος των κυττάρων, όπως λέπτυνσή τους στην περιφέρεια του αυλού. γ) Η ίδια διαδικασία, όχι από ομάδα κυττάρων, αλλά από ένα κύτταρο αυτή τη φορά (cell hollowing) (Εικόνα 1). Κατά τη διαδικασία αυτή, ανεξάρτητα κύτταρα δημιουργούν ενδοκυτταρικές κοιλότητες (κενοτόπια), οι οποίες σταδιακά ενώνονται και σχηματίζουν δομή αυλού. Οι μοριακοί μηχανισμοί που επάγουν αυτές τις διαδικασίες, αν και δεν είναι μέχρι στιγμής πλήρως αποσαφηνισμένοι, συμπεριλαμβάνουν τη συνεργιστική δράση ιντεγκρινών, της Cdc42, της Rac και της MT1-MMP, ενώ η πολικότητα των ενδοθηλιακών κυττάρων ρυθμίζεται από το σύμπλοκο Par3/Par6/PKCζ. Σημαντική αναφορά τέλος έχει γίνει και για το ρόλο της πρωτεΐνης EGF-like domain-7 (EGFL7 ή αγγειακή ενδοθηλιακή στατίνη), μιας μικρής εκκρινόμενης πρωτεΐνης που παράγεται στα ενδοθηλιακά κύτταρα και δεσμεύεται σε μόρια της εξωκυττάριας ύλης. Αν και ο ρόλος της δεν είναι ακόμα πλήρως αποσαφηνισμένος, έχει βρεθεί ότι αναστέλλει την προσκόλληση των κυττάρων χωρίς να επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό τους (Parker et al, 2004). Οι τρεις αυτοί μηχανισμοί λαμβάνουν χώρα στα ενδοθηλιακά κύτταρα τόσο κατά την εμβρυική ζωή, όσο και σε αγγειογενετικές διαδικασίες κατά την ενήλικη ζωή (Iruela-Arispe and Davis, 2009). Η δημιουργία του αυλού και η ροή του αίματος βοηθούν στη σταθεροποίηση του νέου αγγείου. Όσο περισσότερο επιτυγχάνεται μεταφορά του οξυγόνου, τόσο μειώνεται και η έκφραση του VEGF-A. Η επιστράτευση των περικυττάρων, η προσκόλληση μορίων του εξωκυττάριου χώρου στη βασική μεμβράνη και η μείωση του πολλαπλασιασμού των ενδοθηλιακών κυττάρων, επίσης επάγουν την ωρίμανση του αγγείου. Και σε αυτό το στάδιο της αγγειογενετικής διαδικασίας, όπως και σε όλα τα προηγούμενα, η σχετική ισορροπία ανάμεσα στους αγγειογενετικούς παράγοντες παίζει σημαντικό ρόλο για τη διατήρησή του νέου αγγείου. Διατάραξη της ισορροπίας αυτής μπορεί να οδηγήσει στην εξάλειψή του, μέσω απόπτωσης των ενδοθηλιακών κυττάρων. Η αναστόμωση των αγγείων αναστέλλεται γύρω από πλούσιες σε οξυγόνο αρτηρίες, όπου και μειώνεται η έκφραση του VEGF-A από την υποξία. Θεραπεία όγκων με αναστολείς του VEGF-A έχει δείξει ότι η βασική μεμβράνη και τα περικύτταρα παραμένουν σε 9

20 Εισαγωγή ανώριμα αγγεία που αναστάλθηκε η λειτουργία τους. Επειδή αυτές οι δομές ευνοούν την επαναδημιουργία των αγγείων μετά τη θεραπεία, γι αυτό και μόρια του εξωκυττάριου χώρου θα ήταν ενδιαφέροντες στόχοι στη θεραπεία κατά του καρκίνου (Mancuso et al, 2006) Μη αγγειογενετική ανάπτυξη αιμοφόρων αγγείων Η αγγειογενετική διακλάδωση των ενδοθηλιακών κυττάρων από τα υπάρχοντα αιμοφόρα αγγεία δεν είναι ο μοναδικός μηχανισμός που οδηγεί στην ανάπτυξη των αγγείων. Για παράδειγμα, μεγάλα αγγεία, όπως η αορτή στο πρώιμο έμβρυο, δημιουργούνται με τη νεοαγγειογένεση, διαδικασία που περιλαμβάνει την επιστράτευση αγγειοβλαστών και ενδοθηλιακών κυττάρων (Cleaver and Melton, 2003). Με αντίστοιχο τρόπο, τα πρόδρομα ενδοθηλιακά κύτταρα που προέρχονται από το μυελό των οστών και εντοπίζονται στην κυκλοφορία, θεωρούνται ότι συμβάλλουν στη νεοαγγειογενετική ανάπλαση ή παθολογική ανάπτυξη των αγγείων στον ενήλικα (Rafii et al, 2002). Τέτοια επιστράτευση των πρόδρομων ενδοθηλιακών κυττάρων στη μονοστοιβάδα του ενδοθηλίου θα μπορούσε να οδηγήσει σε αντίστοιχη αύξηση των αγγείων. Εναλλακτικά, η επιστράτευση των πρόδρομων ενδοθηλιακών κυττάρων σε αναπτυσσόμενες διακλαδώσεις του ενδοθηλίου μπορεί να συνδυάσει νεοαγγειογενετικούς και αγγειογενετικούς μηχανισμούς. Όμως στις περισσότερες περιπτώσεις, η συμβολή αυτών των ενδοθηλιακών κυττάρων στην αγγειογένεση είναι μικρή. O VEGF και οι υποδοχείς του θεωρούνται ότι διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση των πρόδρομων ενδοθηλιακών κυττάρων από το μυελό των οστών και στην επιστράτευσή τους σε συγκεκριμένα σημεία του σώματος. Και στις δυο περιπτώσεις, η έκφραση και η σηματοδότηση του VEGFR1 στα κύτταρα που προέρχονται από το μυελό των οστών θεωρείται σημαντική, παρά τον ανασταλτικό χαρακτήρα του υποδοχέα αυτού κατά την εμβρυογένεση (Rafii et al, 2002; Ferrara et al, 2003). Η σηματοδότηση του συστήματος VEGF-VEGFR1 ρυθμίζει επίσης την επιστράτευση των μονοκυττάρων από το μυελό των οστών, από τα οποία δεν προκύπτουν ενδοθηλιακά κύτταρα και δε συμμετέχουν στο ενδοθήλιο. Τα κύτταρα αυτά είτε απλά παραμένουν στον περιαγγειακό χώρο, είτε συμμετέχουν στη δημιουργία νέου αγγείου άμεσα ή έμμεσα, επάγοντας τον 10

21 Εισαγωγή πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων και την ενεργοποίηση των περικυττάρων (Shibuya, 2006; Grunewald et al, 2006). Ένας άλλος τρόπος ανάπτυξης αιμοφόρων αγγείων πραγματοποιείται με διαχωρισμό των αγγείων με τη μεσολάβηση άλλου ιστού (intussusception). Είναι ένας διαφορετικός μηχανισμός που οδηγεί στην επέκταση κάποιου αγγείου. Αν και λίγα είναι γνωστά σχετικά με το θέμα αυτό, εντούτοις η διαδικασία φαίνεται να περιλαμβάνει πολλαπλασιασμό ενδοθηλιακών κυττάρων, κυτταρική κίνηση, αποικοδόμηση εξωκυττάριας ύλης και εναπόθεση νέων μορίων εξωκυττάριας ύλης (Djonov and Makanya, 2005) Μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων κατά την αγγειογένεση Η μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων αποτελεί βασικό βήμα στη διαδικασία της αγγειογένεσης. Η διαδικασία της μετανάστευσης κατευθύνεται από χημειοτακτικά και άλλα ερεθίσματα, συνήθως περιλαμβάνει και αποικοδόμηση της εξωκυττάριας ύλης, ενώ απαιτεί και την ενεργοποίηση διαφόρων μονοπατιών μεταγωγής σήματος που οδηγούν σε αναδιαμόρφωση του κυτταροσκελετού. Η διαρκής αναδιαμόρφωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης οδηγεί σε δομές που ονομάζονται φιλοπόδια (filopodia), λαμελλιπόδια (lamellipodia) και ινίδια στρες (stress fibers), και τα οποία είναι απαραίτητα για την κυτταρική μετανάστευση. Τα φιλοπόδια είναι μεμβρανικές προεξοχές που περιέχουν μακριά, παράλληλα ινίδια ακτίνης σε στενή σύνδεση. Είναι συγκεκριμένες δομές που δρουν ως αισθητήρες των κινούμενων ερεθισμάτων. Τα λαμελλιπόδια είναι κυτταροπλασματικές προεξοχές που σχηματίζονται στο κύτταρο που μεταναστεύει από το άκρο που προηγείται και προς την κατεύθυνση της μετανάστευσης. Οι διαστάσεις τους είναι περίπου 1-5 μm μήκος και 2 μm εύρος. Τα ινίδια στρες είναι ινίδια ακτίνης με ανεστραμμένη πολικότητα, που συνδέονται με μόρια α-ακτινίνης και μυοσίνης και κατανέμονται κατά μήκος των συσταλτικών ινιδίων. Και οι τρεις δομές είναι απαραίτητες για να πραγματοποιηθούν τα ακόλουθα στάδια της μετανάστευσης (Εικόνα 2): α) Ανίχνευση του μεταναστευτικού σήματος από τα φιλοπόδια, β) δημιουργία και προεξοχή των λαμελλιποδίων και αμοιβαδοειδή κίνηση προς τα εμπρός, γ) προσκόλληση σε 11

22 Εισαγωγή προεξοχές της εξωκυττάριας ύλης (ECM), δ) συστολή του σώματος του κυττάρου που ρυθμίζεται από τα ινίδια στρες για να διευκολυνθεί η κίνηση προς τα εμπρός, ε) απελευθέρωση του οπίσθιου τμήματος του κυττάρου και στ) ανακύκλωση των πρωτεϊνών που συμμετέχουν στην προσκόλληση και τη μεταγωγή σήματος του κυττάρου. Εικόνα 2: Βασικά βήματα στη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Η μετανάστευση μπορεί να χωρισθεί σε έξι διαδοχικά βήματα: α) ανίχνευση του σήματος από τα φιλοπόδια μέσω της Cdc42, β) προέκταση του κυττάρου με δημιουργία λαμελλιποδίων μέσω του Rac1, γ) προσκόλληση των προεξοχών στην εξωκυττάρια ύλη στις εστίες προσκόλλησης, δ) συστολή του σώματος του κυττάρου μέσω των ινών στρες, επιτρέποντας την κίνηση προς τα εμπρός, ε) απελευθέρωση των συνδέσεων στο οπίσθιο τμήμα του κυττάρου μέσω των ινών στρες, στ) ανακύκλωση των πρωτεϊνών που συμμετείχαν στην προσκόλληση και στη μεταγωγή σήματος (Lamalice et al., 2007). Η μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων περιλαμβάνει τρεις μηχανισμούς: το χημειοτακτισμό (chemotaxis), που είναι η κατευθυνόμενη μετανάστευση κατά μήκος διαβάθμισης της συγκέντρωσης διαλυτού παράγοντα που επάγει τη μετανάστευση (VEGF, FGF2, PTN), τον απτοτακτισμό (haptotaxis), που είναι η κατευθυνόμενη μετανάστευση κατά μήκος διαβάθμισης καθηλωμένου προσδέτη, και το μηχανοτακτισμό (mechanotaxis), που είναι η κατευθυνόμενη μετανάστευση που επάγεται από μηχανικά ερεθίσματα (Li et al, 2005). Η μετανάστευση των 12

23 Εισαγωγή ενδοθηλιακών κυττάρων κατά την αγγειογένεση αποτελεί την ολοκληρωμένη απόρροια και των τριών μηχανισμών. Τυπικά, ο χημειοτακτισμός των ενδοθηλιακών κυττάρων επάγεται από αυξητικούς παράγοντες, όπως ο VEGF και bfgf (basic fibroblast growth factor, βασικός αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών), ενώ ο απτοτακτισμός σχετίζεται με αυξημένη μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων και ενεργοποιείται ως ανταπόκριση στις ιντεγκρίνες που δεσμεύονται σε μόρια εξωκυττάριας ύλης (Klemke et al, 1997; Giroux et al, 1999). Λόγω της θέσης τους στην εσωτερική επιφάνεια των αγγείων, τα ενδοθηλιακά κύτταρα έρχονται συνέχεια σε επαφή με δυνάμεις συνάφειας, οι οποίες συμβάλλουν στο να ενεργοποιηθούν μονοπάτια σηματοδότησης. Πρόσφατα δεδομένα δείχνουν ότι αυτές οι δυνάμεις ενεργοποιούν το μηχανοτακτισμό και ρυθμίζουν διάφορα στάδια της μετανάστευσης, συμπεριλαμβανομένης της προέκτασης της προεξοχής του κυττάρου, της προσκόλλησης στην εξωκυττάρια ύλη και αποκόλλησης του οπίσθιου μέρους του κυττάρου (Li et al, 2005). Για το λόγο αυτό, η μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων αποτελεί μια μηχανικά ολοκληρωμένη μοριακή διαδικασία που περιλαμβάνει δυναμικές και συντονισμένες αλλαγές στην κυτταρική προσκόλληση, στη μεταγωγή σήματος και στη δυναμική και οργάνωση του κυτταροσκελετού (Lamalice et al, 2007) Χημειοτακτική μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων Στη ρύθμιση της χημειοτακτικής μετανάστευσης των ενδοθηλιακών κυττάρων κατά την αγγειογένεση, συμμετέχουν πολλοί διαφορετικοί αυξητικοί παράγοντες. Τα τρία σημαντικότερα μόρια που επάγουν αυτού του είδους τη μετανάστευση είναι ο VEGF, ο bfgf και οι αγγειοποιητίνες, ενώ σε μικρότερο βαθμό, έχουν αναφερθεί και αρκετοί άλλοι αυξητικοί παράγοντες, όπως ο FGF-2, ο αυξητικός παράγοντας των ηπατικών κυττάρων (hepatocyte growth factor), ο PDGF, o TGF-β (αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού-β), οι ιντερλευκίνες, ο TNF-α (νεκρωτικός παράγοντας των όγκων), οι ephrins, η πλειοτροπίνη (PTN), διάφορα μόρια προσκόλλησης, η ενδογλίνη και η αγγειογενίνη. Οι πιο εκτεταμένες μελέτες όμως έχουν γίνει για τον VEGF. Στην επαγόμενη από τον VEGF μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων έχει βρεθεί ότι συμμετέχουν οι μικρές GTPάσες της οικογένειας Rho. Συγκεκριμένα, η 13

24 Εισαγωγή Cdc42 έχει βρεθεί ότι συμμετέχει στη λειτουργία των φιλοποδίων, που όπως προαναφέρθηκε λειτουργούν ως ανιχνευτές για τη μετανάστευση που θα ακολουθήσει (Gerhardt et al, 2003). Στα εκβλαστήματα των ενδοθηλιακών κυττάρων εκτείνονται φιλοπόδια στις ακραίες αποφύσεις τους όταν μεταναστεύουν σε αυξανόμενη συγκέντρωση του VEGF, γεγονός που δείχνει τη συμμετοχή των δομών αυτών στη μετανάστευση των κυττάρων από τον VEGF (Gerhardt et al, 2003). Ενεργοποίηση του VEGFR2 οδηγεί στην ενεργοποίηση της Cdc42, που μέσω του μονοπατιού της p38 οδηγεί στο σχηματισμό ινιδίων στρες (Lamalice et al, 2004), ενώ επαγόμενη από τον VEGFR2 ενεργοποίηση των Rac και WAVE2 οδηγεί στο σχηματισμό των λαμελλιποδίων, εξασφαλίζοντας την αμοιβαδοειδή κίνηση των ενδοθηλιακών κυττάρων (Lamalice et al, 2004, Yamazaki et al, 2003). H Rho, επάγοντας τη φωσφορυλίωση του VEGFR2 και την ενεργοποίηση της PI3K (3-κινάσης φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης) είναι σημαντικός ρυθμιστής της μετανάστευσης των ενδοθηλιακών κυττάρων (Gingras et al, 2000; van Nieuw Amerongen et al, 2003), ενώ η μοριακή σύνδεση μεταξύ VEGFR2 και RhoA επιτυγχάνεται με τη ROCK (Rho-associated kinase, κινάση σχετιζόμενη με την Rho) και τη FAK (focal adhesion kinase, κινάση εστιακής προσκόλλησης) (Le Boeuf et al, 2004; 2006). To μονοξείδιο του αζώτου (NO) είναι ένα άλλο μόριο που διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην επαγωγή της μετανάστευσης και την αγγειογένεση. Η άμεση παραγωγή από την enos (ενδοθηλιακή συνθάση του ΝΟ, endothelial ΝΟ synthase) σε ενδοθηλιακά κύτταρα μετά από διέγερση με VEGF (Williams et al, 2000), η μειωμένη αγγειογένεση που παρουσιάζουν ποντίκια που δεν εκφράζουν την enos (Garcia-Gardena et al, 1998), καθώς και η αναστολή στον επαγόμενο από VEGF χημειοτακτισμό που προκαλεί η αναστολή της παραγωγής του NO (Morales-Ruiz et al, 2001), συνηγορούν στην άποψη αυτή. Επιπλέον, η αλληλεπίδραση της enos με τη καβεολίνη-1, ρυθμίζει τη δραστικότητά της (Maniatis et al, 2006). Δεδομένου ότι η καβεολίνη-1 αλληλεπιδρά με το VEGFR-2 και η αλληλεπίδραση αυτή αναστέλλεται από τον VEGF, είναι πολύ πιθανό ο VEGF να ενεργοποιεί την παραγωγή ΝΟ μέσω αποδέσμευσης της enos από την καβεολίνη (Labrecque et al, 2003). Επίσης, η enos δεν είναι λειτουργική σε ενδοθηλιακά κύτταρα τα οποία δεν έχουν καβέολα (caveolae), και τα οποία δεν μπορούν να μεταναστεύσουν (Sonveaux et al, 2004; Navarro et al, 2004). 14

25 Εισαγωγή Παρόμοια με το ΝΟ, υπάρχουν ενδείξεις ότι και οι δραστικές μορφές οξυγόνου (ROS) επηρεάζουν τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων (Ushio-Fukai, 2006; Polytarchou et al., 2007; Polytarchou et al., 2009). Η Nck, μια μικρή πρωτεΐνη που αποτελείται από τρεις δομές SH3 και μια δομή SH2 και αλληλεπιδρά με τον VEGFR-2, παίζει ρόλο στη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων (Li et al, 2001). Επιπλέον, η τυροσίνη 1214 του VEGFR- 2 μπορεί να φωσφορυλιωθεί σε όλα τα ενδοθηλιακά κύτταρα, ενώ η τυροσίνη 951 φωσφορυλιώνεται σε ενδοθηλιακά κύτταρα ανώριμων αγγείων, τα οποία δεν έχουν περικύτταρα (Matsumoto et al, 2005). Η πρωτεΐνη TSAd/VRAP αλληλεπιδρά με τον φωσφορυλιωμένο VEGFR-2 στην Υ951 και δημιουργώντας σύμπλεγμα με την Src ρυθμίζει το σχηματισμό ινιδίων στρες και τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων (Matsumoto et al, 2005). Φαίνεται λοιπόν ότι η ενεργοποίηση του υποδοχέα (VEGFR-2) ενός αυξητικού παράγοντα (VEGF) μπορεί μέσα από πολλά μονοπάτια σηματοδότησης να ενεργοποιήσει τη μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων. Επιπλέον, ο συμπληρωματικός ρόλος της σηματοδότησης μέσω της p38 (πολυμερισμός ακτίνης) και της FAK (ανασύσταση των σημείων προσκόλλησης) στη δημιουργία ινιδίων στρες είναι ενδεικτικός της συμμετοχής τους σε αυτή τη διαδικασία (Lamalice et al, 2007) Απτοτακτική μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων Διαβαθμίσεις συγκεντρώσεων καθηλωμένων συστατικών του εξωκυττάριου χώρου, όπως το κολλαγόνο, επάγουν τη μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων ανεξάρτητα από χημειοτακτικές κυτταροκίνες (Davis and Senger, 2005). Αυτός ο τύπος μετανάστευσης ονομάζεται απτοτακτισμός και μπορεί να ορισθεί ως κατευθυνόμενη έρπουσα μετακίνηση κυττάρων πάνω σε πρωτεΐνες του εξωκυττάριου χώρου (Lamalice et al, 2007). Αυτές οι αλληλεπιδράσεις προσκόλλησης που επάγουν τον απτοτακτισμό των ενδοθηλιακών κυττάρων καθορίζονται κυρίως από συστατικά του εξωκυττάριου χώρου και από ιντεγκρίνες. 15

26 Εισαγωγή Το αγγειακό ενδοθήλιο υποστηρίζεται από εξωκυττάρια ύλη, η οποία περιλαμβάνει ενδοθηλιακά κύτταρα, περικύτταρα και λεία μυϊκά κύτταρα και είναι σημαντική για τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Συγκεκριμένα, ανάλογα με τη φύση της και το κυτταρικό περιεχόμενο μπορεί να επάγει ή να αναστέλλει τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Απουσία αγγειογενετικών ερεθισμάτων, η εξωκυττάρια ύλη συμβάλλει στη διατήρηση της ομοιόστασης των ενδοθηλιακών κυττάρων. Στα αρχικά στάδια όμως της αγγειογένεσης, η εξωκυττάρια ύλη πέπτεται από μεταλλοπρωτεϊνάσες, γεγονός που οδηγεί στη δημιουργία ερεθισμάτων είτε από πρωτεολυτικά θραύσματα της εξωκυττάριας ύλης, είτε από την απελευθέρωση αγγειογενετικών ερεθισμάτων (VEGF, bfgf) (Wang et al, 2005). Τα ενδοθηλιακά κύτταρα πρέπει να είναι προσκολλημένα στην εξωκυττάρια ύλη προκειμένου να μεταναστεύσουν. Μερικά συστατικά της εξωκυττάριας ύλης, όπως το κολλαγόνο τύπου Ι είναι ικανά να υποστηρίξουν τη μετανάστευση που επάγεται από αυξητικούς παράγοντες (Dejana et al, 1985), ενώ μόρια, όπως η ινονεκτίνη μπορούν να καθοδηγήσουν τη μετανάστευση και να ρυθμίσουν την ταχύτητά της (Smith et al, 2004; 2006). Αν και η σημασία του απτοτακτισμού in vivo έχει αποδειχθεί για αρκετά είδη κυττάρων, όπως τα Τ κύτταρα, εντούτοις στα ενδοθηλιακά ο ρόλος της δεν ακόμα πλήρως διευκρινισθεί (Davis and Senger, 2005). Ο απτοτακτισμός φαίνεται να είναι ιδιαίτερα σημαντικός για την επαγωγή της μετανάστευσης των ενδοθηλιακών κυττάρων κατά την επούλωση μεγάλου αγγείου (Herbst et al, 1988). Η σημασία της καθεμίας από τις πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ύλης στην επαγωγή του χημειοτακτισμού και του απτοτακτισμού των ενδοθηλιακών κυττάρων δεν είναι ξεκαθαρισμένη λόγω της αλληλεξάρτησης λειτουργικότητας και μεταγωγής σήματος. Για παράδειγμα, επαγόμενη από αυξητικούς παράγοντες χημειοτακτική μετανάστευση μπορεί να υποστηριχθεί από δυο ανεξάρτητα μονοπάτια μεταγωγής σήματος που οφείλονται στην προσκόλληση δυο διαφορετικών μορίων εξωκυττάριας ύλης. Επιπλέον, η ίδια ιντεγκρίνη μπορεί να προσδένεται σε παρόμοιες περιοχές (π.χ. περιοχή RGD) δυο διαφορετικών μορίων εξωκυττάριας ύλης και να δώσει παρόμοιες ανταποκρίσεις. Δυο ομάδες τέτοιων μορίων μπορεί να επάγουν τη μετανάστευση, αλλά με διαφορετική δραστικότητα, ενώ έχει βρεθεί 16

27 Εισαγωγή ότι δυο μόρια εξωκυττάριας ύλης μπορούν να έχουν και συνεργιστική δράση (Perruzzi et al, 2003). Κάποια μόρια της εξωκυττάριας ύλης (π.χ. κολλαγόνο) έχει βρεθεί ότι μπορούν να δεσμεύουν αυξητικούς παράγοντες (VEGF, bfgf) και να τους απελευθερώνουν σταδιακά, επάγοντας τη μεταναστευτική ικανότητα (Kanematsu et al, 2004a; 2004b). Τα ενδοθηλιακά κύτταρα δεσμεύονται στην εξωκυττάρια ύλη στις εστίες προσκόλλησης (focal adhesions), μέσω των οποίων τελικά έρχονται σε επαφή η εξωκυττάρια ύλη, η κυτταρική μεμβράνη και ο κυτταροσκελετός. Σε αυτές εντοπίζονται πρωτεΐνες σηματοδότησης, όπως η FAK και η παξιλίνη, και πρωτεΐνες που εντοπίζονται στην κυτταρική μεμβράνη και δεσμεύουν ακτίνη, όπως ταλίνη, βινκουλίνη, τενσίνη και α-ακτινίνη. Μέσα από τις δομές αυτές, τα ινίδια στρες δεσμεύονται στην κυτταρική μεμβράνη και στις ιντεγκρίνες. Στα κύτταρα που μεταναστεύουν, οι εστίες προσκόλλησης και τα ινίδια στρες δημιουργούνται στη διεύθυνση της μετανάστευσης και εναλλάσσονται, ώστε αυτή να επιτευχθεί (Romer et al, 1994) Μηχανοτακτική μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων Όπως γνωρίζουμε, τα ενδοθηλιακά κύτταρα επενδύουν εσωτερικά τον αυλό των αγγείων, επομένως υπόκεινται σε διαρκή μηχανική πίεση από τη ροή του αίματος, που αποτελεί τμήμα της αιμοδυναμικής πίεσης (Li et al, 2005). Αυτή η πίεση ονομάζεται «shear stress» και οφείλεται στην τριβή που ασκείται στο ενδοθήλιο από τη ροή του αίματος. Εάν ασκηθεί ομοιόμορφα αυτή η πίεση σε όλη την επιφάνεια του ενδοθηλίου, είναι 1000 έως 5000 φορές μικρότερη από τις ελκτικές δυνάμεις που ασκούνται από τις εστίες προσκόλλησης (Katsumi et al, 2004). Παρόλα αυτά, η πίεση αυτή ρυθμίζει τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων καλύτερα από ότι ο χημειοτακτισμός. Στη μικροκυκλοφορία, η πίεση αυτή οδηγεί τα ενδοθηλιακά κύτταρα στα διάκενα κατά την επούλωση πληγών, και επάγει τη δημιουργία λαμελλιποδίων και τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων στην κατεύθυνση της ροής. Επηρεάζει σημαντικά τόσο το χημειοτακτισμό, όσο και τον απτοτακτισμό των κυττάρων, προκαλώντας διάλυση των διακυτταρικών συνδέσεων, ενεργοποίηση μονοπατιών σηματοδότησης και 17

28 Εισαγωγή αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης, έτσι ώστε να επάγεται η μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων με πολωμένο τρόπο (Li et al, 2005). Υπάρχουν ενδείξεις ότι η εξωκυτταρική μηχανική δύναμη γίνεται αντιληπτή από τις ιντεγκρίνες και από τον ίδιο τον κυτταροσκελετό. Οι ιντεγκρίνες όμως εντοπίζονται στη βασική επιφάνεια των κυττάρων, ενώ η δύναμη από τη ροή του αίματος ασκείται στην κορυφαία επιφάνεια. Γλυκοπρωτεΐνες, όπως η συνδεκάνη- 4 μεταφέρουν τις δυνάμεις αυτές στις ιντεγκρίνες και στα σημεία διακυτταρικής προσκόλλησης μέσω του κυτταροσκελετού (Katsumi et al, 2004). Η ενεργοποίηση των ιντεγκρινών οδηγεί σε ενεργοποίηση μονοπατιών μεταγωγής σήματος που επάγουν τη μετανάστευση και περιλαμβάνουν τις Rho GTPάσες. Οι δυνάμεις του μηχανοτακτισμού ρυθμίζουν τις Rho GTPάσες σε διαφορετικά σημεία στα ενδοθηλιακά κύτταρα, μέσω ρύθμισης των μικροσωληνίσκων. Συγκεκριμένα, οι δυνάμεις αυτές επάγουν την επιμήκυνση των μικροσωληνίσκων στη διεύθυνση της ροής, οπότε ενεργοποιείται η Rac και επάγεται ο πολυμερισμός της ακτίνης και η δημιουργία λαμελλιποδίων στη διεύθυνση της ροής (Li et al, 2005). Η Rac όμως επάγει και η ίδια την επιμήκυνση των μικροσωληνίσκων μέσω της PAK, ενώ αναστέλλει την ενεργοποίηση της RhoA στα λαμελλιπόδια, ώστε η δράση της να περιορισθεί στο οπίσθιο μέρος του κυττάρου, δημιουργώντας τη συστολή που απαιτείται για την αποκόλληση του οπισθίου τμήματος του κυττάρου και τη μετανάστευση (Sander et al, 1999). Επιπλέον, μηχανικά ερεθίσματα από την κυτταρική μεμβράνη, από σημεία προσκόλλησης κυττάρου με εξωκυττάρια ύλη και κυττάρων μεταξύ τους μπορούν να συμμετέχουν στην ενεργοποίηση αυτού του μηχανισμού και των Rho GTPασών. Πιο συγκεκριμένα, αύξηση της ροής (άρα και του «shear stress») ενεργοποιεί μονοπάτια σηματοδότησης από τα caveolae, που ρυθμίζουν την ενεργότητα συγκεκριμένων Rho GTPασών, κυρίως της RhoA και της enos (Li et al, 2005; Gingras et al, 2000; Gratton et al, 2004). Αυτή η αύξηση οδηγεί σε συστολή των ινιδίων στρες στο οπίσθιο τμήμα των ενδοθηλιακών κυττάρων. Επιπλέον, ρυθμίζοντας την ανταλλαγή ιόντων Ca +2 από τα καβέολα, οι δυνάμεις του μηχανοτακτισμού μπορούν μέσω της πρωτεΐνης ROCK να αυξήσουν τη συστολή των ινιδίων ακτίνης/μυοσίνης και την αποκόλληση του οπίσθιου 18

29 Εισαγωγή τμήματος των ενδοθηλιακών κυττάρων που μεταναστεύουν (Lamalice et al, 2007). Οι δυνάμεις του μηχανοτακτισμού αποτελούν ένα συνεχές ερέθισμα για τα ενδοθηλιακά κύτταρα και, ρυθμίζοντας την ανταπόκριση των ενδοθηλιακών κυττάρων στα απτοτακτικά και χημειοτακτικά ερεθίσματα, επάγουν τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων κατά την αγγειογένεση. 2. Ιντεγκρίνες 2.1. Δομή ιντεγκρινών Οι ιντεγκρίνες είναι ετεροδιμερείς διαμεμβρανικοί υποδοχείς, που αποτελούνται από μια α και μια β αλυσίδα. Ρυθμίζουν την πρόσδεση του κυττάρου σε μόρια της εξωκυττάριας ύλης, αλλά αλληλεπιδρούν και με διαλυτούς προσδέτες ή προσδέτες της κυτταρικής μεμβράνης. Τη δημιουργία των αλυσίδων α και β ακολουθεί η σύνδεσή τους στο ενδοπλασματικό δίκτυο σε λειτουργικό ετεροδιμερές, το οποίο στη συνέχεια μεταφέρεται στην κυτταρική μεμβράνη (Cheresh, 1992). Αν και υπάρχουν τουλάχιστον 18 διαφορετικές α και 8 β αλυσίδες, εντούτοις μόνο 24 διαφορετικοί α/β συνδυασμοί έχουν ανιχνευθεί. Κάθε ετεροδιμερές α/β έχει τους δικούς του προσδέτες και τη δική του εξειδίκευση (μερικές ιντεγκρίνες έχουν πολλούς διαφορετικούς προσδέτες, ενώ άλλες έχουν λίγους). Το σύνολο των ιντεγκρινών που εντοπίζονται σε ένα κύτταρο καθορίζει τη βιολογική ανταπόκριση του κυττάρου αυτού σε ερεθίσματα από την εξωκυττάρια ύλη και το μικροπεριβάλλον. Όλες οι ιντεγκρίνες, με εξαίρεση τη β 4, έχουν μικρές κυτταροπλασματικές περιοχές και μερικές παρουσιάζουν δράση κινάσης τυροσίνης. Οι ιντεγκρίνες αποτελούν σημαντικούς ρυθμιστές της σηματοδότησης στο κύτταρο, πέρα από την ιδιότητα που του προσδίδουν να προσκολλάται στην εξωκυττάρια ύλη (Giancotti and Ruoslahti, 1999). Το εξωκυτταρικό τμήμα των υπομονάδων α και β συνήθως αποτελείται από αμινοξέα. Οι αλυσίδες α περιέχουν τέσσερις ή πέντε εξωκυτταρικές δομές και μια μικρή κυτταροπλασματική δομή. Οι μισές από τις 18 διαφορετικές 19

30 Εισαγωγή υπομονάδες α (α D, α E, α L, α M, α X, α 1, α 2, α 10, α 11 ) περιέχουν μια δομή Ι (από το insertion ή interaction) (Takada, et al, 2007), που είναι γνωστή ως δομή του παράγοντα von Willebrand A ή απλά ως δομή Α. Όταν μια δομή Ι είναι σε υπομονάδα α, αυτή είναι σχεδόν πάντα κοντά στην περιοχή του προσδέτη. Όταν η δομή Ι είναι απούσα από την υπομονάδα α (όπως στην α 3, α 4, α 5, α 6, α 7, α 8, α 9, α ν και α ΙΙb ), τότε η δομή πρόσδεσης σχηματίζεται από την περιοχή β-δομής της υπομονάδας α και μια δομή Ι της υπομονάδας β. Οι υπομονάδες β (β 1 -β 8 ) περιέχουν 8 εξωκυτταρικές περιοχές, συμπεριλαμβανομένης και μιας δομής Ι και μια κυτταροπλασματική περιοχή ποικίλου μεγέθους. Η δομή Ι της υπομονάδας α περιέχει μια συντηρημένη περιοχή που δεσμεύει μέταλλο (metal-ion-dependent adhesion site, MIDAS) που δεσμεύει Mg +2 κάτω από φυσιολογικές συνθήκες, ενώ η δομή Ι της υπομονάδας β έχει παρόμοια δομή, αλλά με τρεις περιοχές που δεσμεύουν μέταλλο [MIDAS, Adjacent MIDAS (ADMIDAS) και ligand-induced metal-binding site (LIMBS)] (Luo et al, 2007). Στις ιντεγκρίνες που φέρουν τις δομές Ι, αυτές παίζουν σημαντικό ρόλο στη διακυτταρική επικοινωνία (Takada et al, 2007). Οι κυτταροπλασματικές περιοχές των υπομονάδων α και β αλληλεπιδρούν με μια ποικιλία ενδοκυτταρικών πρωτεϊνών, όπως κινάσες και κυτταροσκελετικές πρωτεΐνες που επάγουν τη σηματοδότηση. Η ικανότητα των ιντεγκρινών να συσσωματώνονται και να αλληλεπιδρούν με κινάσες, όπως η FAK (Hauck et al, 2002), η κινάση Src (Parsons and Parsons, 1997), η PI3K (Franke et al, 1997) και η p21-εξαρτώμενες κινάσες (PDKs) (Attwell et al, 2000), παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της μεταγωγής σήματος από τις ιντεγκρίνες. Οι κυτταροσκελετικές περιοχές των υπομονάδων α και β είναι όλες σχετικά μικρές (20-50 αμινοξέα), με εξαίρεση τη β 4, που έχει μεγάλη κυτταροπλασματική περιοχή περίπου 1000 αμινοξέων και περιέχει τέσσερις επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες τύπου ινονεκτίνης ΙΙΙ (Suzuki and Naitoh, 1990). Στα ενδοθηλιακά κύτταρα έχουν αναφερθεί να εκφράζονται 10 διαφορετικές ιντεγκρίνες, ανάλογα με τη θέση και την κατάσταση των ενδοθηλιακών κυττάρων (Εικόνα 3). Οι πιο σημαντικές ιντεγκρίνες στα μη αγγειογενετικά ενδοθηλιακά κύτταρα είναι οι α 1 β 1, α 2 β 1, α 3 β 1, α 5 β 1, α 6 β 4, α 6 β 1 και α ν β 5. Είναι πολύ πιθανό να εκφράζεται και η α ν β 1, εφόσον και οι δυο αλυσίδες α ν και β 1 εκφράζονται 20

31 Εισαγωγή επαρκώς. Οι ιντεγκρίνες αυτές αποτελούν υποδοχείς για βασικά συστατικά της εξωκυττάριας ύλης (όπως κολλαγόνο και λαμινίνη), με εξαίρεση τις ιντεγκρίνες α ν β 5 και α 5 β 1, οι οποίες δεσμεύουν πιο προσωρινά προσδέτες, όπως η βιτρονεκτίνη και η ινονεκτίνη. Κατά την αγγειογένεση, πραγματοποιείται αναδιάταξη της προσωρινής εξωκυττάριας ύλης με επιπλέον προσδέτες για τις ιντεγκρίνες α ν β 5 και α 5 β 1, όπως και νέες ιντεγκρίνες (α ν β 3 ), που εκφράζονται στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων (Stupack and Cheresh, 2004) Εντοπισμός και λειτουργία Οι ιντεγκρίνες λειτουργούν σαν υποδοχείς που μπορούν να δέχονται και να ανιχνεύουν μεταβολές στις μηχανικές δυνάμεις που ασκούνται στον εξωκυττάριο χώρο. Στα θηλαστικά, η έκφραση μερικών ιντεγκρινών περιορίζεται σε συγκεκριμένους κυτταρικούς τύπους ή ιστούς (η α IIb β 3 στα αιμοπετάλια, η α 6 β 4 στα κερατινοκύτταρα, η α Ε β 7 στα Τ κύτταρα και στα δενδριτικά κύτταρα, η α 4 β 1 στα λευκοκύτταρα, η α 4 β 7 σε υποκατηγορία των Τ κυττάρων μνήμης και οι ιντεγκρίνες β 2 στα λευκοκύτταρα). Άλλες ιντεγκρίνες παρουσιάζουν ευρεία κατανομή, όπως η α ν β 3, που εκφράζεται στο ενδοθήλιο. Η αλληλουχία RGD στην ινονεκτίνη ανιχνεύθηκε αρχικά ως αλληλουχία πρόσδεσης στην ιντεγκρίνη (Pierschbacher and Ruoslahti, 1984), και αυτή αλλά και άλλες παραπλήσιες αλληλουχίες σε μόρια εξωκυττάριου χώρου θεωρούνται αλληλουχίες πρόσδεσης σε ιντεγκρίνες in vivo. Παρόλα αυτά, οι ιντεγκρίνες αναγνωρίζουν και άλλες διαφορετικές αλληλουχίες σε προσδέτες τους, όπως είναι η LDV στη VCAM-1 (αγγειακό μόριο προσκόλλησης-1, vascular cell adhesion molecule-1), που εκφράζεται στο ενδοθήλιο σε φλεγμονή και δεσμεύεται στην α 4 β 1. Αυτός ο τρόπος αναγνώρισης και ενεργοποίησης των ιντεγκρινών φαίνεται να είναι ο πιο συντηρημένος στα περισσότερα είδη θηλαστικών (Takada et al, 2007). 21

32 Εισαγωγή Ιντεγκρίνες που δεσμεύουν κολλαγόνο α 1 β 1 α 2 β 1 α 10 β 1 α 11 β 1 Ιντεγκρίνες λευκοκυττάρων α L β 2 α M β 2 α X β 2 α D β 2 Ιντεγκρίνες που δεσμεύουν λαμινίνη α 3 β 1 α 6 β 1 α 6 β 4 α 7 β 1 Ιντεγκρίνες που δεσμεύουν VCAM α 4 β 1 α 4 β 7 α Ε β 7 α 9 β 1 Ιντεγκρίνες που δεσμεύουν την RGD αλληλουχία α 5 β 1 α 8 β 1 α ν β 1 α ν β 3 α ΙΙb β 3 α ν β 5 α ν β 6 α ν β 8 Εικόνα 3: Γνωστά ετεροδιμερή ιντεγκρινών. Τα 24 γνωστά ετεροδιμερή ιντεγκρινών φαίνονται ομαδοποιημένα σε γενικές κατηγορίες, οι οποίες βασίζονται στη δομή και στην κοινή λειτουργία τους. Έτσι, για παράδειγμα οι ιντεγκρίνες α 1 β 1 και α 2 β 1 που δεσμεύουν κολλαγόνο μπορούν, κάτω από συγκεκριμένες συνθήκες, να δεσμεύσουν λαμινίνη, και αντίστοιχα, η ιντεγκρίνη α 3 β 1, που δεσμεύει λαμινίνη, μπορεί να δεσμεύσει κολλαγόνο. Η οικογένεια των ιντεγκρινών που δεσμεύουν την RGD αλληλουχία μπορούν όλες να δεσμεύσουν μέσω RGD κάποιους από τους προσδέτες τους. Οι ιντεγκρίνες των λευκοκυττάρων, που ονομάζονται και β 2 ιντεγκρίνες, εκφράζονται κυρίως στα λευκοκύτταρα και στα λεμφοκύτταρα, ρυθμίζουν τις αλληλεπιδράσεις κυττάρου με κύτταρο και κυττάρου με εξωκυττάρια ύλη και συμμετέχουν στην ανοσολογική λειτουργία (έχουν περιγραφεί και σε μερικά άλλα είδη κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων καρκινικών και κερατινοκυττάρων). Αντίστοιχα, οι ιντεγκρίνες που δεσμεύουν τη VCAM ή οι α 4 ιντεγκρίνες αρχικά ανιχνεύθηκαν στα λεμφοκύτταρα, αλλά έχουν βρεθεί και σε άλλους κυτταρικούς τύπους, και η α 9 β 1 συγκεκριμένα δεν εκφράζεται σε αιμοποιητικά κύτταρα. Οι ιντεγκρίνες που εκφράζονται στα ενδοθηλιακά κύτταρα είναι σε γκρι πλαίσια, ενώ αυτές που υπερεκφράζονται κατά την αγγειογένεση είναι υπογραμμισμένες. Το διακεκομμένο περίγραμμα στην α ν β 1 δείχνει ότι αν και οι δυο υπομονάδες εκφράζονται, δεν είναι σίγουρο εάν σχηματίζουν αυτό το ετεροδιμερές (Stupack and Cheresh, 2004). Οι αλλαγές στη στερεοδιαμόρφωση των ιντεγκρινών μπορεί να οδηγήσουν σε μονοπάτια μεταγωγής σήματος που αυξάνουν τη συγγένεια με διάφορους προσδέτες και επάγουν αναδιαμόρφωση του κυτταροσκελετού. Είναι γνωστό ότι οι ιντεγκρίνες υφίστανται αλλαγές στη στερεοδιαμόρφωση προκειμένου να επιτευχθεί μεταγωγή σήματος από το εσωτερικό του κυττάρου προς τον εξωκυττάριο χώρο (inside-out signaling) ή και αντίστροφα (outside-in signaling). Αν και υπάρχουν αντιφατικά δεδομένα σχετικά με την αλλαγή στη στερεοδιαμόρφωση της ιντεγκρίνης που επιφέρει δέσμευση με προσδέτη, εντούτοις όλα τα μέχρι σήμερα δεδομένα συνηγορούν ότι υπάρχει κάποια αλλαγή 22

33 Εισαγωγή της στερεοδιαμόρφωσης, που επάγει και τη σηματοδότηση (Stewart and Nemerow, 2007). Με πρόσδεση λοιπόν ενός εξωκυτταρικού προσδέτη, η ιντεγκρίνη δημιουργεί ένα ενδοκυτταρικό σήμα (outside-in signaling) και αντίστροφα, η λειτουργικότητά τους ρυθμίζεται από σηματοδότηση από το εσωτερικό του κυττάρου (inside-out signaling) (Hynes, 2002). Με τον τρόπο αυτό λειτουργούν ως διαμεμβρανικές συνδέσεις ανάμεσα στους εξωκυτταρικούς προσδέτες (άλλα κύτταρα ή εξωκυττάρια ύλη) και στα ινίδια του κυτταροσκελετού της ακτίνης, του οποίου τη λειτουργία οι ιντεγκρίνες επίσης ρυθμίζουν και τροποποιούν. Εκτός από τις πρωτεΐνες σηματοδότησης που αναφέραμε παραπάνω, πολλές άλλες πρωτεΐνες δεσμεύονται στο κυτταρο-πλασματικό τμήμα των ιντεγκρινών, όπως η ταλίνη, η βινκουλίνη και οι ERMs (ezrin, radixin και moesin) (εζρίνη, ραντιξίνη και μοεσίνη), οι οποίες προσδένονται στην ακτίνη και ενώνουν τις ιντεγκρίνες με τον κυτταροσκελετό, δημιουργώντας μεγάλα πρωτεϊνικά συμπλέγματα (Hynes, 2002). Από τις δομές αυτές, και μέσω μονοπατιών σηματοδότησης, πρόσδεση των ιντεγκρινών με διάφορα μόρια καθορίζει κυτταρικές λειτουργίες, όπως προσκόλληση, πολλαπλασιασμός, επιβίωση ή απόπτωση, μετανάστευση, αλλαγή σχήματος, έκφραση γονιδίων και διαφοροποίηση, μέσω του κυτταροσκελετού. Αποσιώπηση γονιδίων ιντεγκρινών σε ποντίκια έχει δείξει ότι συγκεκριμένες ιντεγκρίνες παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη (ιντεγκρίνες β 1 ), νεοαγγειογένεση (ιντεγκρίνες α ν ), λυμφαγγειογένεση (ιντεγκρίνη α 9 β 1 ), δημιουργία θρόμβων (ιντεγκρίνη α IIb β 3 ), ακεραιότητα του δέρματος (α 6 β 4 ) και ανοσολογικές αντιδράσεις (ιντεγκρίνες β 2 ). Αναστολή της έκφρασης της ιντεγκρίνης β 3 οδήγησε σε αυξημένη καρκινογένεση και αγγειογένεση (Taverna et al, 2004; 2005), επούλωση πληγών (Reynolds et al, 2005) και αυξημένη φλεγμονή και αθηροσκλήρωση (Weng et al, 2003), που σημαίνει ότι η ιντεγκρίνη α ν β 3 φυσιολογικά καταστέλλει αυτές τις διαδικασίες. 23

34 Εισαγωγή Μεταγωγή σήματος από το εσωτερικό του κυττάρου στον εξωκυττάριο χώρο (inside-out signaling) Η ικανότητα πρόσδεσης συγκεκριμένων ιντεγκρινών με τους προσδέτες τους στα θηλαστικά ρυθμίζεται αυστηρά από τη δομή του ετεροδιμερούς και από την κυτταροπλασματική μεταγωγή σήματος στο ίδιο το κύτταρο (inside-out signaling). Οι ιντεγκρίνες μπορούν να ενεργοποιηθούν ενδοκυτταρικά με σηματοδότηση από υποδοχείς που οδηγεί σε φωσφορυλίωση στην κυτταροπλασματική περιοχή των β υπομονάδων. Η αλληλεπίδραση των κυτταροπλασματικών περιοχών ανάμεσα στην υπομονάδα α και β φαίνεται απαραίτητη προκειμένου να διατηρηθεί η ιντεγκρίνη σε ανενεργή κατάσταση. Η αλληλεπίδραση αυτή αναστέλλεται παρουσία αγωνιστών, όπως χημειοκίνες, οι οποίες είναι γνωστό ότι ενεργοποιούν τις ιντεγκρίνες μέσω σηματοδότησης από υποδοχείς που συνδέονται με G- πρωτεΐνες (Ginsberg et al, 2005). Η κυτταροσκελετική πρωτεΐνη ταλίνη έχει προταθεί ότι παίζει ρόλο στη ρύθμιση της συγγένειας πρόσδεσης των ιντεγκρινών. Δέσμευση της κεφαλής της ταλίνης στην κυτταροπλασματική περιοχή της υπομονάδας β οδηγεί σε αποδιάταξη της σύνδεσης των κυτταροπλασματικών περιοχών των υπομονάδων α και β της ιντεγκρίνης, με αποτέλεσμα διαμορφωτική αλλαγή στο εξωκυτταρικό τμήμα της ιντεγκρίνης που αυξάνει τη συγγένεια με τον προσδέτη (Ginsberg et al, 2005). Μέχρι σήμερα έχουν προταθεί δυο μοντέλα για την αλλαγή αυτής της συγγένειας. Και στα δυο, η ανενεργή ιντεγκρίνη κάμπτεται, με την κεφαλή προς τη μεμβράνη. Στο μοντέλο της ακαμψίας (deadbolt model), αυτή η κάμψη διατηρείται και στην ενεργοποιημένη ιντεγκρίνη, αλλά κινήσεις των διαμεμβρανικών περιοχών δημιουργούν ολίσθηση των εξωκυτταρικών τμημάτων των υπομονάδων α και β και χαλάρωση της αλληλεπίδρασή τους (Arnaout et al, 2005). Στο άλλο μοντέλο (switchblade model), η αποδιάταξη των κυτταροπλασματικών και διαμεμβρανικών περιοχών των υπομονάδων α και β οδηγεί σε αντίστοιχη μετακίνηση μιας δομής (EGF-like repeat, epidermal growth factor repeat) στην υπομονάδα β, η οποία επάγει την κάμψη της κεφαλής εξωτερικά (Luo et al, 2007). Και στα δυο μοντέλα, τα προτεινόμενα γεγονότα αλλάζουν μέσα σε δευτερόλεπτα μετά την ενεργοποίηση της ιντεγκρίνης, οδηγώντας σε 24

35 Εισαγωγή διαμορφωτικές αλλαγές στην κεφαλή της ιντεγκρίνης, που αυξάνουν τη συγγένεια με τον προσδέτη (Takada et al, 2007). Η συγγένεια δέσμευσης ρυθμίζει άμεσα τη φύση της δέσμευσης με τον προσδέτη και φαίνεται να επηρεάζει το βαθμό και την κινητική της κυτταρικής προσκόλλησης. Στα λευκοκύτταρα, για παράδειγμα, η ιντεγκρίνη α L β 2 σε μέσης συγγένειας κατάσταση θα αλληλεπιδράσει με τον προσδέτη της στο ενδοθήλιο για να επιβραδύνει τα λευκοκύτταρα, που κυλούν αργά κατά μήκος του αγγειακού τοιχώματος χωρίς να δεσμεύονται. Μετατροπή, όμως, της α L β 2 στην κατάσταση υψηλής συγγένειας μετά από ενδοκυτταρική σηματοδότηση από άλλους υποδοχείς, οδηγεί στην πλήρη δέσμευση του λευκοκυττάρου και σηματοδοτείται η πολικότητά του και η μεταφορά του στο σημείο της φλεγμονής (Green et al, 2006) Μεταγωγή σήματος από τον εξωκυττάριο χώρο στο εσωτερικό του κυττάρου (outside-in signaling) Έχει προταθεί ότι με τη δέσμευση εξωκυτταρικών προσδετών, οι ιντεγκρίνες συσσωματώνονται στην κυτταρική μεμβράνη και μετάγουν σηματοδότηση στο εσωτερικό του κυττάρου (outside-in signaling). Η πρόσδεση εξωκυτταρικών προσδετών επάγει διαμορφωτικές αλλαγές που οδηγούν σε αλληλεπίδραση της κυτταροπλασματικής περιοχής της ιντεγκρίνης με ενδοκυτταρικά μόρια μεταγωγής σήματος. Τέτοιες είναι ο διαχωρισμός των κυτταροπλασματικών τμημάτων των υπομονάδων α και β και ο διαχωρισμός των διαμεμβρανικών τμημάτων (Arnaout et al, 2005). Αυτά τα μόρια μπορεί να είναι ένζυμα ή πρωτεΐνες προσαρμογής που αλληλεπιδρούν με δομές δυναμικής προσκόλλησης, όπως οι εστίες προσκόλλησης και τα ποδοσώματα (μικρές προεκβολές της κυτταρικής μεμβράνης) (Ginsberg et al, 2005; Shattil 2005). Με αυτόν τον τρόπο, η συγγένεια μιας ιντεγκρίνης με τον προσδέτη της καθορίζει την έκταση της σηματοδότησης στις εστίες προσκόλλησης. Αυτές οι εστίες είναι ενεργά σημεία που μεταδίδουν πληροφορίες όπως η πυκνότητα του εξωκυττάριου προσδέτη, η ένταση και η κατεύθυνση των εξωκυτταρικών δυνάμεων πάνω στο κύτταρο. Ένας άλλος τρόπος με τον οποίο ενεργοποιούνται 25

36 Εισαγωγή οι ιντεγκρίνες είναι και με πρόσδεση δισθενών ιόντων στην ειδική περιοχή των δομών Ι των υπομονάδων α και β (Takada et al, 2007). Το σημείο πρόσδεσης της αλληλουχίας RGD έχει βρεθεί στα ετεροδιμερή των ιντεγκρινών α ν β 3 (Xiong et al, 2002) και α IIb β 3 (Xiao et al, 2004). Πιο συγκεκριμένα, το σημείο πρόσδεσης αποτελείται από τη β-έλικα της υπομονάδας α και τη δομή Ι της υπομονάδας β. Η κρυσταλλική δομή της ιντεγκρίνης α ν β 3 έδειξε ότι η κάμψη της κεφαλής συνδυάζεται με μικρή συγγένεια για τον προσδέτη (Xiong et al, 2002). Για το λόγο αυτό προτάθηκε ότι όταν η ιντεγκρίνη βρίσκεται σε αυτή τη διαμόρφωση, δεν μπορεί να δεσμευθεί με προσδέτη ή να πραγματοποιήσει μεταγωγή σήματος από το εξωτερικό προς το εσωτερικό του κυττάρου. Παρόλα αυτά, βρέθηκε ότι όταν η ιντεγκρίνη α ν β 3 είναι σε αυτή τη μορφή μπορεί να δεσμεύσει ινονεκτίνη (Adair et al, 2005). Έκτοτε, έχουν προταθεί αρκετές ενδιάμεσες διαμορφώσεις των ιντεγκρινών που επάγουν τη δέσμευση με προσδέτες και οδηγούν σε διαφορετικές ικανότητες προσκόλλησης ή διαφοροποίησης (Sarantos et al, 2005) Ο ρόλος των ιντεγκρινών στη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων Όπως προαναφέρθηκε, οι ιντεγκρίνες έχουν τη δυνατότητα να τροποποιούν τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων, ρυθμίζοντας την προσκόλλησή τους στην εξωκυττάρια ύλη. Η ενεργοποίησή τους επιτρέπει τη λειτουργική σύνδεση των εστιών προσκόλλησης με τον κυτταροσκελετό της ακτίνης (Giancotti, 2000), ενώ ο ρόλος τους είναι ιδιαίτερα σημαντικός για τον απτοτακτισμό των ενδοθηλιακών κυττάρων (Lamalice et al, 2007). Επιπλέον, η ενεργοποίηση των ιντεγκρινών είναι απαραίτητη για την έναρξη και ρύθμιση της σηματοδότησης κατά την αγγειογένεση (Guo and Giancotti, 2004). Η σηματοδότηση έχει ως αποτέλεσμα τον ολιγομερισμό των ιντεγκρινών και την αλληλεπίδραση με τους προσδέτες, που γίνεται στα σημεία εστιακής προσκόλλησης. Ενεργοποίηση των ιντεγκρινών στα σημεία αυτά μπορεί να ξεκινήσει από υψηλότερη συγκέντρωση εξωκυττάριας ύλης, η οποία οδηγεί τις Rac και Cdc42 να επάγουν την αναδιαμόρφωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης μέσω του συμπλόκου Arp2/3, 26

37 Εισαγωγή και την επαγωγή σχηματισμού των ινιδίων ακτίνης μέσω της WASP. Εναλλακτικά, οι Rho GTPάσες ενεργοποιούν την PAK, η οποία αυξάνει τα επίπεδα της πολυμερισμένης ακτίνης ενεργοποιώντας την κινάση LIM. Το ενδιαφέρον είναι ότι η Rac και η Cdc42, μέσω σηματοδότησης από το εσωτερικό στον εξωκυττάριο χώρο (inside-out signaling), μπορούν να επιστρατεύσουν περισσότερες ιντεγκρίνες στα σημεία προσκόλλησης (Hsu et al, 2005). Πιθανότατα, πρωτεΐνες που εντοπίζονται ανοδικά των GTPασών, ειδικά η Rac, ενεργοποιούν την Cas (Crk-associated substrate, υπόστρωμα που σχετίζεται με τη Crk), και αυτή με τη σειρά της να δεσμεύει και ενεργοποιεί τη Crk (CT10 regulator of kinase, ρυθμιστής της κινάσης CT10). Τελικό αποτέλεσμα είναι η ενεργοποίηση των πρωτεϊνών που ενεργοποιούν τις GTPάσες, DOCK180 και ELMO (Chodniewicz and Klemke, 2004). Το μονοπάτι αυτό είναι παρόν στα ενδοθηλιακά κύτταρα και η ενεργοποίησή του είναι απαραίτητη για την επαγόμενη από τις ιντεγκρίνες μετανάστευση (Chodniewicz and Klemke, 2004). Επιπλέον, η ενεργοποίηση της RhoA ρυθμίζει τη συναρμολόγηση και τη συστολή των ινιδίων ακτομυοσίνης, που συμβάλλει στο «τράβηγμα» του οπίσθιου άκρου προς την κατεύθυνση της μετανάστευσης. Το μονοπάτι καθοδικά του RhoA περιλαμβάνει μια συνεργατική αλληλεπίδραση ανάμεσα στις πρωτεΐνες mdia και ROCK (Rho-associated kinase), απαραίτητη για την ενεργοποίηση των ινιδίων ακτομυοσίνης. Η διαδικασία περιλαμβάνει αύξηση της φωσφορυλίωσης της ελαφριάς αλυσίδας της μυοσίνης (myosin light chain, MLC) (Guo and Giancotti, 2004), η οποία μπορεί να επιτευχθεί και μέσω ενεργοποίησης των ERK (Klemke et al, 1997) Αλληλεπίδραση ανάμεσα σε ιντεγκρίνες και υποδοχείς αυξητικών παραγόντων Υπάρχουν πολλά στοιχεία που υποστηρίζουν ότι οι ιντεγκρίνες αλληλεπιδρούν με μονοπάτια σηματοδότησης αυξητικών παραγόντων και συμπληρώνεται η σηματοδότηση που ξεκινάει και από τα δυο είδη υποδοχέων. Πιο συγκεκριμένα, ο VEGF και o bfgf επάγουν την έκφραση και ενεργοποίηση αρκετών ιντεγκρινών, όπως είναι η α ν β 3, η α ν β 5 και η α 5 β 1, που συμμετέχουν στην αγγειογένεση 27

38 Εισαγωγή (Byzova et al, 2000). Αντίθετα, αρκετοί ενδογενείς αναστολείς της αγγειογένεσης, όπως η ενδοστατίνη, ασκούν τη δράση τους μπλοκάροντας τις ιντεγκρίνες (Guo and Giancotti, 2004). Άλλοι μηχανισμοί περιλαμβάνουν αλληλεπίδραση στο επίπεδο των υποδοχέων. Για παράδειγμα, η ιντεγκρίνη α 5 β 1 ρυθμίζει τον επαγόμενο από ινονεκτίνη πολλαπλασιασμό επιθηλιακών κυττάρων μέσω ενεργοποίησης των υποδοχέων του EGF (Kuwada and Li, 2000). Αντίστοιχα, η ιντεγκρίνη α ν β 3 αλληλεπιδρά με τον PDGF-β και με τον VEGFR-2 και ρυθμίζει τη δραστικότητά τους (Soldi et al, 1999; Borges et al, 2000; Masson-Gadais et al, 2003). Παρόλα αυτά, λίγα είναι γνωστά για το πώς η σηματοδότηση που ξεκινάει από υποδοχείς αυξητικών παραγόντων ή από ιντεγκρίνες ολοκληρώνεται μέσα στο κύτταρο και ενεργοποιεί συγκεκριμένους στόχους. Η ILK (integrin-linked kinase, κινάση που έρχεται σε επαφή με τις ιντεγκρίνες) συμβάλλει στην επικοινωνία των μονοπατιών σηματοδότησης που επάγονται από την ινσουλίνη και την ινονεκτίνη και η FAK (focal adhesion kinase, κινάση εστιακής προσκόλλησης) ενώνει τη σηματοδότηση που προέρχεται από τις ιντεγκρίνες και τους υποδοχείς του EGF και του PDGF (Dedhar et al, 1999; Sieg et al, 2000). Η FAK αποτελεί σημείο σύγκλισης ανάμεσα στο VEGFR-2 και την ιντεγκρίνη α ν β 3 και ρυθμίζει τη συγκρότηση των εστιών προσκόλλησης που είναι απαραίτητες για τη ρύθμιση του πολυμερισμού της ακτίνης και τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Πρόσφατα βρέθηκε ότι η ενεργοπoίηση του VEGFR-2 επάγει τη φωσφορυλίωση της FAK στη Ser732, που οδηγεί σε αλλαγή της στερεοδιαμόρφωσης της FAK, κάνοντας προσβάσιμη την Tyr407 για φωσφορυλίωση από την Pyk2, που με τη σειρά της ενεργοποιείται από την ιντεγκρίνη β 3 (Le Boeuf et al, 2006). Η FAK διαδραματίζει επίσης βασικό ρόλο στη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων από το σύμπλοκο ιντεγκρίνης α ν β 5 /VEGFR-2 (Avraham et al, 2003; Eliceiri, 2003). Επιπλέον, φαίνεται ότι η Src μπορεί να ρυθμίζει μονοπάτια μεταγωγής σήματος αυξητικών παραγόντων και μορίων εξωκυττάριας ύλης επιστρατεύοντας την ιντεγκρίνη α 5 β 1 σε πρωτεϊνικά σύμπλοκα με τη FAK (Eliceiri et al, 2002). Είναι επίσης γνωστό ότι οι ιντεγκρίνες α ν β 3 και α ν β 5 επάγουν τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων σε ανταπόκριση στην ενεργοποίηση του VEGFR-2 από 28

39 Εισαγωγή τον VEGF. Λαμβάνοντας υπόψη ότι στη σηματοδότηση που επάγεται και από τις δυο ιντεγκρίνες συμμετέχουν τα ίδια μόρια, όπως η Src και FAK, φαίνεται ο διαφορετικός ρόλος που μπορεί αυτές να έχουν στην αγγειογένεση. Για παράδειγμα, μόνο η ιντεγκρίνη α ν β 5 φαίνεται ότι εξαρτάται από τη σηματοδότηση του αυξητικού παράγοντα της ινσουλίνης για να επάγει τη μετανάστευση in vitro και τη μετάσταση in vivo (Brooks et al, 1997). Είναι γνωστό ότι οι διακυτταρικές αλληλεπιδράσεις αναστέλλουν την κυτταρική μετανάστευση και ότι για την έναρξή της πρέπει αυτές να ανασταλλούν. Σε αυτή τη λογική, η VEGF είναι ικανός να διαλύει τις διακυτταρικές συνδέσεις, καταστρέφοντας το σύμπλοκο VE-καντχερίνης/β-κατενίνης (VE-cadherin/βcatenin complex) στα σημεία προσκόλλησης (Weis et al, 2004 a,b). Αντίθετα, πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η αγγειογενετική σηματοδότηση που επάγεται από τον VEGFR-2 ενισχύεται με την αλληλεπίδραση της VE-καντχερίνης. Εάν ληφθεί υπόψη ότι η κυτταρική προσκόλληση που επάγεται από αλληλεπίδραση της ιντεγκρίνης α 2 β 1 με το κολλαγόνο τύπου Ι μειώνει τον εντοπισμό της Ε- καντχερίνης και της β-κατενίνης στις διακυτταρικές συνδέσεις, φαίνεται ότι οι ιντεγκρίνες τροποποιούν τη σηματοδότηση του VEGF, ρυθμίζοντας την αλληλεπίδραση VE-καντχερίνης και VEGFR-2 (Wallez et al, 2006). Η σημασία αυτών των πρόσφατων δεδομένων είναι μεγάλη γιατί δείχνει ότι η σηματοδότηση από τον VEGF δεν απαιτεί τη συνεργιστική δράση μόνο των ιντεγκρινών, αλλά και των καντχερινών. Ένα άλλο παράδειγμα αλληλεπίδρασης ιντεγκρινών με αυξητικούς παράγοντες είναι και η αλληλεπίδραση των ιντεγκρινών α 4 β 1 και α 6 β 1 με τον άλλο αυξητικό παράγοντα της ίδιας οικογένειας με την πλειοτροπίνη, της Midkine, καθώς και με τον υποδοχέα του LPR (low density lipoprotein receptor-related protein, πρωτεΐνη που συνδέεται με τον υποδοχέα λιποπρωτεϊνών χαμηλής πυκνότητας) (Muramatsu et al, 2004). Γενικά, φαίνεται ότι η αλληλεπίδραση ανάμεσα σε ιντεγκρίνες και υποδοχείς αυξητικών παραγόντων αυξάνει τη δραστικότητα και των δυο στη σηματοδότηση για την κυτταρική μετανάστευση (Lamalice et al, 2007). Πάντως, μένουν να γίνουν πολλά για να εξιχνιασθούν οι μηχανισμοί που συμμετέχουν και να διευκρινισθεί 29

40 Εισαγωγή πώς η σηματοδότηση και από τους δυο μηχανισμούς συναρμονίζεται για να ρυθμίσει το χημειοτακτισμό και την κυτταρική μετανάστευση Ιντεγκρίνες στην αγγειογένεση Τα αγγειογενετικά ενδοθηλιακά κύτταρα διαφοροποιούνται ως προς την έκφραση των ιντεγκρινών στην κυτταρική τους μεμβράνη με δυο βασικούς μηχανισμούς. Ο πρώτος είναι η μεταγραφή συγκεκριμένων υπομονάδων ιντεγκρινών, που έχει ως αποτέλεσμα διαφορές στη σχετική έκφραση των ιντεγκρινών αυτών. Η έκφραση ιντεγκρινών που δεσμεύουν συστατικά της εξωκυττάριας ύλης, όπως κολλαγόνο και λαμινίνη, τείνει να μειώνεται, ενώ αντίθετα η έκφραση ιντεγκρινών που δεσμεύουν συστατικά όπως ινωδογόνο, ινονεκτίνη, οστεοποντίνη, βιτρονεκτίνη και πρωτεολυμένες μορφές κολλαγόνου τείνει να αυξάνεται. Παρόλα αυτά, παρατηρείται γενικά αύξηση της έκφρασης των ιντεγκρινών κατά την αγγειογένεση. Η δεύτερη τροποποίηση των ιντεγκρινών λαμβάνει χώρα στο επίπεδο της λειτουργίας. Όταν τα ενδοθηλιακά κύτταρα ενεργοποιούνται από αγγειογενετικούς αυξητικούς παράγοντες, μεταβάλλονται τα χαρακτηριστικά δέσμευσης διαφόρων προσδετών στις ιντεγκρίνες της κυτταρικής τους μεμβράνης, προκειμένου να ανταπεξέλθουν στους καινούργιους τους ρόλους (Stupack and Cheresh, 2004) Έκφραση νέων ιντεγκρινών Τα ενδοθηλιακά κύτταρα στην αγγειογένεση εκφράζουν ένα διαφοροποιημένο σύνολο ετεροδιμερών ιντεγκρινών, που περιλαμβάνει ετεροδιμερή που δεν εκφράζονταν πριν. Η πιο σημαντική μεταβολή εντοπίζεται στην de novo έκφραση της ιντεγκρίνης α ν β 3, μιας ιντεγκρίνης που δεσμεύει μεγάλο εύρος συστατικών του εξωκυττάριου χώρου, συμπεριλαμβανομένου του ινωδογόνου, της ινονεκτίνης (Charo et al, 1990), του παράγοντα von Willebrand (Cheresh, 1987), της βιτρονεκτίνης και της οστεοποντίνης (Ross et al, 1993), ενώ μπορεί να αλληλεπιδράσει με βασικά συστατικά της εξωκυττάριας ύλης, όπως η λαμινίνη (Clyman et al, 1992) και πρωτεολυμένα τμήματα του κολλαγόνου (Davis, 1992) (Εικόνα 4). Η ιντεγκρίνη α ν β 3 εκφράζεται σε διαφορετικά είδη κυττάρων κατά την 30

41 Εισαγωγή εμβρυογένεση, αλλά η έκφρασή της περιορίζεται σε αγγειογενετικά ενδοθηλιακά και λεία μυϊκά κύτταρα και μερικούς πληθυσμούς αιματοποιητικών κυττάρων στον ενήλικα. Η ιντεγκρίνη α ν β 3 φαίνεται να είναι σημαντικός ρυθμιστής της αγγειογένεσης, γιατί αναστολή της δράσης της με μικρά μόρια ή αντισώματα αναστέλλει τη νεοαγγειογένεση σε διάφορα ζωικά μοντέλα (Brooks et al, 1994; MacDonald et al, 2001; Nemeth et al, 2003). Εκτός από την α ν β 3, μια άλλη ιντεγκρίνη που έχει βρεθεί να εκφράζεται de novo σε αγγειογενετικά ενδοθηλιακά κύτταρα είναι η α 4 (Vanderslice et al, 1998). Η ιντεγκρίνη α 4 β 1 αποτελεί υποδοχέα για τη δομή CS1 της ινονεκτίνης, όπως και για τη VCAM-1, ένα μόριο κυτταρικής προσκόλλησης της υπεροικογένειας των ανοσοσφαιρινών που εκφράζεται στα ενδοθηλιακά και λεία μυϊκά κύτταρα κατά την αγγειογένεση και τη φλεγμονή. Η ιντεγκρίνη α 4 β 1 μπορεί επίσης να δεσμεύει τις θρομβοσπονδίνες (Calzada et al, 2004). Στον ενήλικο, η ιντεγκρίνη α 4 είναι γενικά παρούσα μόνο σε αιματοποιητικά κύτταρα ή όγκους, αλλά έχει περιγραφεί σε κυτταροτροφοβλάστες και σε πρόδρομα ενδοθηλιακά κύτταρα κατά την ανάπτυξη (Sheppard et al, 1994), καθώς και σε καλλιέργειες ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro (Vanderslice et al, 1998). Η υπομονάδα α 4 κάνει σύμπλοκο με τις υπομονάδες β 1 και β 7 (και οι δυο ιντεγκρίνες έχουν εντοπισθεί σε καλλιέργειες ενδοθηλιακών κυττάρων) (Brezinschek et al, 1996). Οι προσδέτες της α 4 β 1, VCAM και θρομβοσπονδίνη (σε χαμηλές συγκεντρώσεις), είναι και οι δυο προαγγειογενετικοί και η αγγειογένεση που επάγουν αναστέλλεται με τη χορήγηση αντισωμάτων έναντι της ιντεγκρίνης α 4 β 1 (Koch et al, 1995; Calzada et al, 2004). 31

42 Εισαγωγή Εικόνα 4: Προσδέτες της ιντεγκρίνης α ν β 3. Στην εικόνα παρατίθενται μερικοί μόνο από τους προσδέτες της ιντεγκρίνης α ν β 3. Η ιντεγκρίνη α ν β 3 προσδένει μια μεγάλη ποικιλία προσδετών, συμπεριλαμβανομένων βασικών και προσωρινών μορίων της εξωκυττάριας ύλης, υποδοχέων κυτταρικής προσκόλλησης (CAMs), διαλυτών τμημάτων όλων των προσδετών, καθώς και τμημάτων των ίδιων των πρωτεασών. Η δέσμευση αυτών των διαλυτών τμημάτων στις ιντεγκρίνες παρεμποδίζει τη δέσμευση σε σταθερούς προσδέτες της εξωκυττάριας ύλης και μπορεί να επάγει την απόπτωση. Η ιντεγκρίνη α ν β 3 μπορεί να αλληλεπιδρά και με κυτταροκίνες που δεσμεύονται στην εξωκυττάρια ύλη, όπως bfgf και CTGF, αν και ο σκοπός των αλληλεπιδράσεων αυτών δεν έχει ακόμα χαρακτηρισθεί. Σε αρκετές α ν ιντεγκρίνες, συμπεριλαμβανομένης της α ν β 3, δεσμεύονται τα LAPβ1 και LAPβ3 (latency-associated peptides), που διατηρούν τον TGF-β σε ανενεργή κατάσταση. Ένας μεγάλος αριθμός παθογόνων πρωτεϊνών δεσμεύεται στην α ν β 3, όπως δηλητήρια φιδιών, καθώς και πρωτεΐνες που ρυθμίζουν την ενδοκυττάρωση και μεταφορά του ιικού γενετικού υλικού μέσα στο κύτταρο. Οι τελευταίες πρωτεΐνες αποτελούν σοβαρή αιτία για την καθιέρωση της ιντεγκρίνης α ν β 3 ως θεραπευτικό στόχο για την αγγειογένεση (Stupack and Cheresh, 2004) Διαφοροποίηση της έκφρασης προϋπαρχόντων ιντεγκρινών Η σχετική έκφραση των ιντεγκρινών που ήδη εκφράζονται στα ενδοθηλιακά κύτταρα επίσης διαφοροποιείται κατά την αγγειογένεση. Η έκφραση ιντεγκρινών, όπως η α 1 β 1 και η α 6 β 4 αναστέλλεται κατά την αγγειογένεση. Αυτό συνήθως συμβαίνει σε μεταγραφικό επίπεδο, αλλά μπορεί επίσης να συμβαίνει με ενδοκυττάρωση μέσω αλληλεπίδρασης με την τετρασπαρίνη PETA-3 (Sincock et 32

43 Εισαγωγή al, 1999). Δεν είναι σαφές εάν η ενδοκυττάρωση ή η δέσμευση της α 6 β 4 είναι απαραίτητα για την επιβίωση του κυττάρου. Αν και τα μονοκλωνικά αντισώματα που στοχεύουν την α 6 β 4 αυξάνουν την επιβίωση των κυττάρων σε αποκρίσεις stress (Tang et al, 1999), η δέσμευση της ιντεγκρίνης με τη λαμινίνη 5 είναι επαρκής να επιτρέψει την επιβίωση των μετασχηματισμένων κυττάρων απουσία άλλων προσδετών (Zahir et al, 2003). Τα ενδοθηλιακά κύτταρα που οριοθετούν ισχαιμικές περιοχές αυξάνουν δραματικά τη μεταγραφή της ιντεγκρίνης β 1 (Tagaya et al, 2001). Τα αυξημένα επίπεδα της υπομονάδας β 1 σχετίζονται με τα αυξημένα επίπεδα των υπομονάδων α 6 και α 5, αλλά και με τις υπομονάδες α 2 και α 1. Αύξηση της ιντεγκρίνης α 2 διατηρείται σε αγγειογενετικά ενδοθηλιακά κύτταρα και παίζει σημαντικό ρόλο, μαζί με την α 1, στη διατήρηση ενός αριθμού ιντεγκρινών που μπορούν να αλληλεπιδράσουν τόσο με πρωτεολυμένες όσο και με ολόκληρες μορφές κολλαγόνου της εξωκυττάριας ύλης. Αναστολή της ικανότητας δέσμευσης του κολλαγόνου με αναστολείς έναντι αυτών των δυο ιντεγκρινών αναστέλλει την αγγειογένεση (Senger et al, 1997). Μια άλλη ιντεγκρίνη που υπερεκφράζεται σε αγγειογενετικά ενδοθηλιακά κύτταρα είναι η ιντεγκρίνη α 5 β 1 (Boundreau and Varner, 2004). Αυτή η ιντεγκρίνη αποτελεί κυρίως υποδοχέα ινονεκτίνης, αλλά ρυθμίζει και την κυτταρική προσκόλληση στην αγγειοποιητίνη-1 και στη φιβρίνη (fibrin). Ανταγωνισμός της ιντεγκρίνης α 5 β 1 επάγει την απόπτωση στα αγγειογενετικά ενδοθηλιακά κύτταρα in vitro και in vivo (Kim et al, 2000), υποδηλώνοντας έτσι ένα σημαντικό ρόλο αυτής της ιντεγκρίνης στη ρύθμιση της αγγειογένεσης. Πράγματι, τα ποντίκια που δεν εκφράζουν την α 5 β 1 φαίνονται να παρουσιάζουν κάποιες αγγειακές ανωμαλίες, αν και (όπως και τα ποντίκια που δεν εκφράζουν την ινονεκτίνη) πεθαίνουν νωρίς κατά την εμβρυογένεση, εξαιτίας σοβαρών αναπτυξιακών ανωμαλιών. Για το λόγο αυτό είναι δύσκολο να συμπεράνουμε εάν αυτές οι αγγειακές ανωμαλίες που παρατηρούνται οφείλονται στην απουσία της α 5 β 1 από το ενδοθήλιο ή είναι δευτερογενείς ανωμαλίες. Πάντως, αυτά τα αποτελέσματα, συγκεντρωτικά, δείχνουν μια αυξημένη ικανότητα των ενδοθηλιακών κυττάρων να αλληλεπιδρούν με προσωρινά συστατικά του εξωκυττάριου χώρου, ενώ δε χάνουν την ικανότητά τους να αλληλεπιδρούν με βασικά χαρακτηριστικά του εξωκυττάριου χώρου. 33

44 Εισαγωγή Μεταβολές στη λειτουργία των ιντεγκρινών του ενδοθηλίου κατά την αγγειογένεση Εκτός από τις μεταβολές στη μεταγραφή των ιντεγκρινών, που μόλις αναφέρθηκαν, παρατηρούνται λειτουργικές μεταβολές ανάμεσα στις προϋπάρχουσες ιντεγκρίνες στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων. Αυτές οι μεταβολές λαμβάνουν χώρα σε λεπτά ή δευτερόλεπτα και μεταβάλλουν το ρόλο των ιντεγκρινών από δομές προσκόλλησης σε υπόστρωμα, σε λειτουργικούς υποδοχείς με ικανότητα μεταγωγής σήματος. Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, αναστέλλεται η δέσμευση με άλλα κύτταρα ή την υποκείμενη εξωκυττάρια ύλη από τις ενδοθηλιακές ιντεγκρίνες (συμπεριλαμβανομένων των α 1 β 1, α 2 β 1, α 5 β 1 και α ν β 5 ) (Sincock et al, 1999; Naik et al, 2003), οι οποίες συσσωματώνονται σε σύμπλοκα με άλλα μόρια της επιφάνειας των ενδοθηλιακών κυττάρων (υποδοχείς αυξητικών παραγόντων και άλλες ιντεγκρίνες) (Eliceiri et al, 2002). Αυτές οι σύμπλοκες μοριακές δομές επιστρατεύουν κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες μεταγωγής σήματος (Src, FAK) και ακολουθούν οι μοριακές διαδικασίες που περιγράφηκαν αναλυτικότερα παραπάνω. Η πιο καλά χαρακτηρισμένη ιντεγκρίνη που ενεργοποιείται με αυτόν τον τρόπο είναι η ιντεγκρίνη α ν β 5. Αυτή εκφράζεται σε έναν αριθμό κυττάρων και ιστών και ρυθμίζει την έντονη προσκόλληση του κυττάρου στην υποκείμενη εξωκυττάρια ύλη, αλλά φυσιολογικά δε σχετίζεται με εστίες προσκόλλησης (Wayner et al, 1991). Ως ανταπόκριση στην ενεργοποίηση από τον VEGF, η α ν β 5 κινητοποιείται και ρυθμίζει τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων και την είσοδό τους μέσα σε ιστούς (Eliceiri et al, 2002). Αυτή η διαδικασία εξαρτάται από πρωτεϊνάσες, όπως οι MMPs και ο ενεργοποιητής πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης (urokinase plasminogen activator, upa) (Yebra et al, 1996), οι οποίες τροποποιούν την υποκείμενη εξωκυττάρια ύλη, και από την επιστράτευση της FAK στο κυτταροπλασματικό άκρο της ιντεγκρίνης β 5 (Brooks et al, 1997). Ο VEGF και η ιντεγκρίνη α ν β 5 πραγματοποιούν μια λειτουργική συνεργασία στα αγγειογενετικά ενδοθηλιακά κύτταρα in vivo. Ο VEGF, μέσω της πρόσδεσής τους στο VEGFR-2, φαίνεται να επάγει τη μεταγωγή σήματος μαζί με την ιντεγκρίνη α ν β 5. Ανταγωνιστές της ιντεγκρίνης α ν β 5 αναστέλλουν την αγγειογένεση που 34

45 Εισαγωγή επάγεται από τον VEGF (Friedlander et al, 1995). Με αντίστοιχο τρόπο, ανταγωνιστές της ιντεγκρίνης α ν β 3 επίσης αναστέλλουν τη σηματοδότηση του VEGFR-2 (Mahabeleshwar et al, 2006), που όμως θα αναλυθεί εκτενέστερα στη συνέχεια. Αντίθετα, η αγγειογένεση που επάγεται από τον bfgf δεν επηρεάζεται από αντισώματα έναντι της α ν β 5, αλλά από αντισώματα έναντι της α ν β 3 (Friedlander et al, 1995; Hood et al, 2003). Αυτές οι παρατηρήσεις οδήγησαν στην ανίχνευση δυο διακριτών μονοπατιών της αγγειογένεσης, που καθένα φαίνεται να εξαρτάται, τουλάχιστον τις περισσότερες φορές (Mahabeleshwar et al, 2006), από διαφορετικά μονοπάτια μεταγωγής σήματος (Eliceiri et al, 2002; Hood et al, 2003) Ιντεγκρίνη α ν β 3 και αγγειογένεση Μια από τις πιο μελετημένες ιντεγκρίνες που υπερεκφράζονται στην αγγειογένεση είναι η α ν β 3. Η αναστολή της έκφρασής της σε ζωικά μοντέλα, καθώς και της λειτουργικότητάς της με χρήση διαφόρων αναστολέων έχουν αποτελέσει αντικείμενο αρκετών αναφορών. Παρόλο που η ανάλυση τέτοιων δεδομένων παρουσίασε αντιφατικά συμπεράσματα σε ορισμένες περιπτώσεις, η εκτεταμένη μελέτη της ιντεγκρίνης α ν β 3 δίνει επιπλέον στοιχεία για την κατανόηση του ρόλου των ιντεγκρινών, τόσο φυσιολογικά, όσο και σε ασθένειες που σχετίζονται με την αγγειογένεση. Η αρχική εντύπωση σχετικά με την ιντεγκρίνη α ν β 3 ήταν ότι εμπλέκεται στην παθολογική αγγειογένεση, λόγω της επαγωγής της έκφρασής της σε αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα που πολλαπλασιάζονται (Brooks et al, 1994; Drake et al, 1995). Βάσει των αρχικών αυτών παρατηρήσεων αναπτύχθηκαν διάφοροι αναστολείς των ιντεγκρινών α ν β 3 και α ν β 5, οι οποίοι ήταν είτε αντισώματα έναντι των συγκεκριμένων ιντεγκρινών είτε μικρομοριακοί αναστολείς. Τα μόρια αυτά ανέστειλαν την προσκόλληση των ενδοθηλιακών κυττάρων στην ινονεκτίνη και τη νεοαγγειογένεση σε μια ποικιλία in vivo μοντέλων, συμπεριλαμβανομένης της αγγειογένεσης σε όγκους και της επαγόμενης από υποξία αγγειογένεσης του αμφιβληστροειδούς (Brooks et al, 1994; 1995; Drake et al, 1995; Eliceiri and Cheresh, 1998; Friedlander et al, 1995; 1996). Από τις πρώτες αυτές εργασίες δημιουργήθηκε η άποψη ότι οι ιντεγκρίνες α ν β 3 και α ν β 5 είναι απαραίτητες κατά 35

46 Εισαγωγή την παθολογική αγγειογένεση, οπότε ξεκίνησε η διαδικασία δημιουργίας αποτελεσματικών αναστολέων έναντι των δυο αυτών ιντεγκρινών. Πράγματι, ανταγωνιστές της β 3 υπομονάδας χρησιμοποιούνται σήμερα σε κλινικές δοκιμές (Gutheil et al, 2000; Nabors et al, 2007). Τα πρώτα προβλήματα εμφανίσθηκαν όταν αυτοί οι παράγοντες δε φάνηκαν αντάξιοι των προσδοκιών τους στην αναστολή της αγγειογένεσης στις κλινικές δοκιμές για τον καρκίνο (Stupp and Ruegg, 2007). Παρόλα αυτά, το Cilengitide φάνηκε να είναι αποτελεσματικότερο στην αντιμετώπιση του γλοιοβλαστώματος και έχει εισέλθει στη φάση ΙΙΙ κλινικών δοκιμών, σε συνδυασμό με την κλασική θεραπεία για τη νόσο (Friess et al, 2006; Hariharan et al, 2007). Το ενδιαφέρον είναι ότι, αν και δεν έχει διερευνηθεί η αντιαγγειογενετική δράση του Cilengitide στον άνθρωπο, επηρεάζει την επιβίωση των ίδιων των κυττάρων του γλοιώματος, ενώ αναστολή της έκφρασης της α ν υπομονάδας της ιντεγκρίνης δεν επηρεάζει την αγγειογένεση κατά την ανάπτυξη (Bader et al, 1998). Επίσης, πρόσφατα βρέθηκε ότι αναστολή της α ν υπομονάδας σε ενδοθηλιακά κύτταρα που εκφράζουν τον Tie-2 υποδοχέα πάλι δεν είναι επαρκής να αναστείλει την αγγειογένεση (Lacy-Hulbert et al, 2007). Επιπλέον, ποντίκια που δεν εκφράζουν την υπομονάδα β 3 ή τις β 3 και β 5 εμφανίζουν φυσιολογικό αγγειακό δίκτυο χωρίς μεγάλες επιπτώσεις στην αγγειογένεση κατά την ανάπτυξη (Hodivala-Dilke et al, 1999; Huang et al, 2000; Reynolds et al, 2002), ενώ επιπλέον εμφανίζουν αυξημένη ανάπτυξη όγκων και παθολογική αγγειογένεση (Reynolds et al, 2002; Taverna et al, 2005). Αν και τα παραπάνω δεδομένα δείχνουν ότι η ιντεγκρίνη α ν β 3 δεν απαιτείται για την παθολογική αγγειογένεση, δεδομένης της επαγωγής της παθολογικής αγγειογένεσης στα ποντίκια που δεν εκφράζουν τη β 3 υπομονάδα, φαίνεται ότι η συμμετοχή της β 3 στη ρύθμιση της αγγειογένεσης είναι αναγκαία. Μεγάλη σημασία για τη διερεύνηση του ρόλου της β 3 είχαν πειράματα σε ποντίκια με μεταλλαγμένη β 3, στην οποία οι τυροσίνες 747 και 759 (αντίστοιχες των 773 και 785 στον άνθρωπο) αντικαταστάθηκαν από φαινυλαλανίνες (Law et al, 1999; Mahabeleshwar et al, 2006). Αν και τα ποντίκια αυτά ήταν βιώσιμα και γόνιμα, εντούτοις παρουσίασαν μειωμένη ανάπτυξη όγκων και παθολογική αγγειογένεση, γεγονός που δείχνει ότι η φωσφορυλίωση στις τυροσίνες 747 και 759 στην 36

47 Εισαγωγή ιντεγκρίνη β 3 συμμετέχει στην επαγωγή της παθολογικής αγγειογένεσης (Mahabeleshwar et al, 2006). Συνολικά, φαίνεται ότι η ιντεγκρίνη α ν β 3 μπορεί να έχει θετικό αλλά και αρνητικό ρόλο κατά την αγγειογένεση. Αυτό ίσως μπορεί να εξηγηθεί από το γεγονός ότι η ιντεγκρίνη α ν β 3 μπορεί να έχει και αγγειογενετικές και αντιαγγειογενετικές λειτουργίες, ανάλογα με τους προσδέτες της (Hodivala-Dilke, 2008) και το μικροπεριβάλλον. Πράγματι, η ιντεγκρίνη α ν β 3 δεσμεύεται σε μια πληθώρα παραγόντων που θεωρούνται ότι επάγουν την αγγειογένεση, συμπεριλαμβανομένων των VEGFR-2, βιτρονεκτίνης, ινονεκτίνης, Del1, ANGPTL3, CYR61, σιαλοπρωτεΐνης οστών και θρομβίνης, ενώ δεσμεύει και αρκετούς παράγοντες με αντιαγγειογενετική δράση, όπως θρομβοσπονδίνη, αγγειοστατίνη και τουμστατίνη (Hodivala-Dilke et al, 2003). Μια άλλη εξήγηση μπορεί να δοθεί αν ληφθεί υπόψη ότι η έκφραση και η λειτουργικότητα μιας ιντεγκρίνης μπορεί να επηρεάσει την έκφραση και λειτουργικότητα και άλλων ιντεγκρινών, ρυθμίζοντας έτσι την κυτταρική συμπεριφορά (Diaz-Gonzalez et al, 1996; Hodivala-Dilke et al, 1998). Σε αυτή τη βάση (integrin crosstalk), έχει βρεθεί ότι ενεργοποίηση της υπομονάδας β 1 από τις ιντεγκρίνες α 3 β 1 και α 6 β 1 αναστέλλει τη λειτουργικότητα της ιντεγκρίνης α ν β 3 στην προσκόλληση των κυττάρων. Πρόσφατα εξιχνιάσθηκε και ο μηχανισμός του φαινομένου αυτού, ο οποίος περιλαμβάνει συμμετοχή της πρωτεϊνικής κινάσης Α (protein kinase A, PKA), του αναστολέα-1 (inhibitor-1) και της φωσφατάσης PP1 (Gonzalez et al, 2008). Είναι πολύ πιθανό, αναστολή της έκφρασης της α ν β 3 να επάγει την αγγειογενετική δράση άλλων ιντεγκρινών, όπως της α 5 β 1. Αντίθετα, η αντιαγγειογενετική δράση της α ν β 3 μπορεί να αποδοθεί στην ικανότητά της να δεσμεύει αντιαγγειογενετικούς παράγοντες. Παράδειγμα αποτελεί η αλληλεπίδρασή της με την τουμστατίνη, ενδογενές πρωτεολυτικό τμήμα του κολλαγόνου IV, που αλληλεπιδρά με την α ν β 3 και αναστέλλει την αγγειογένεση (Maeshima et al, 2000; 2002; Kalluri, 2002; Hamano et al, 2003). Μια ακόμα εξήγηση που μπορεί να δοθεί σχετικά με τις «αντιφατικές» δράσεις της ιντεγκρίνης α ν β 3 στα ζώα είναι ότι στην περίπτωση που αναστέλλεται η έκφραση της α ν β 3 μπορεί από το αποτέλεσμα να υποτιμηθεί ο ρόλος της, επειδή άλλες πρωτεΐνες δρουν, αναπληρώνοντας μερικά τη δράση της. Αν και σε ενδοθηλιακά 37

48 Εισαγωγή κύτταρα που είχε ανασταλλεί η β 3 δε φάνηκε άλλες ιντεγκρίνες να συνεισφέρουν σε προσκόλληση ή μετανάστευση αυτών των κυττάρων, εντούτοις η αυξημένη παθολογική αγγειογένεση σε ποντίκια που δεν εκφράζουν τη β 3 μπορεί να εξηγηθεί από την αύξηση της έκφρασης και της λειτουργίας του VEGFR-2 (Reynolds et al, 2002; 2004; Robinson et al, 2004; Weis et al, 2007). Σε αντίθεση με τα παραπάνω αποτελέσματα, άλλες μελέτες έχουν δείξει ότι οι ανταγωνιστές της α ν β 3 ή η μετάλλαξη των δυο τυροσινών σε φαινυλαλανίνες μειώνουν την αλληλεπίδραση της ιντεγκρίνης β 3 με τον VEGFR-2 και τη φωσφορυλίωση του VEGFR-2, χωρίς να επηρεάζουν τα επίπεδα έκφρασής του (Soldi et al, 1999; Mahabeleshwar et al, 2006). Αυτό που επίσης πρέπει να σημειωθεί σχετικά με την έκφραση της μεταλλαγμένης β 3 (με αντικατάσταση των τυροσινών με φαινυλαλανίνες), είναι ότι ενώ δεν πρέπει να υπάρχει καθόλου σηματοδότηση στα ενδοθηλιακά κύτταρα, εντούτοις φαίνεται ότι αυτή η μεταλλαγμένη μορφή πρέπει να έχει κάποια δράση. Για παράδειγμα, τα ποντίκια που δεν εκφράζουν τη β 3 παρουσιάζουν πολλές ανωμαλίες στα αιμοπετάλια και αρκετές αιμορραγίες, οδηγώντας σε μεγάλα ποσοστά εμβρυικής θνησιμότητας (Hodivala-Dilke et al, 1999). Αυτός ο φαινότυπος δεν παρατηρήθηκε στα ποντίκια με τη μετάλλαξη. Καθοριστική συμβολή πάνω στο θέμα αυτό ήταν η υπερέκφραση τόσο της φυσιολογικής, όσο και της μεταλλαγμένης β 3 σε CHO κύτταρα. Μελέτη της λειτουργικότητας της ιντεγκρίνης σε αυτά τα κύτταρα έδειξε ότι τόσο στην περίπτωση της τυροσίνης 747, όσο και της 759, είναι η στερεοχημική διαμόρφωση της ιντεγκρίνης που έχει σημασία για τη λειτουργικότητά της και για την επαγωγή της φωσφορυλίωσης και όχι μόνο η δυνατότητά της να φωσφορυλιώνεται. Αντικατάσταση της τυροσίνης με φαινυλαλανίνη, ενώ στερεί από την ιντεγκρίνη την ικανότητα φωσφορυλίωσης, δεν πρέπει να αλλοιώνει σημαντικά τη στερεοδιαμόρφωση, οπότε η λειτουργικότητα και η μεταγωγή σήματος αναστέλλεται μερικά. Αντίθετα αντικατάσταση της τυροσίνης με διαφορετικό αμινοξύ (π.χ. αλανίνη) τροποποιεί τη στερεοδιαμόρφωση και οδηγεί σε πλήρη αναστολή της λειτουργικότητας της ιντεγκρίνης (Schaffner-Reckinger et al, 1998). Έτσι είναι ενδιαφέρον να σκεφτούμε ότι η μεταλλαγμένη μορφή της β 3 έχει τουλάχιστον μερική δράση και σηματοδότηση στα ενδοθηλιακά κύτταρα (Hodivala-Dilke, 2008). Σε αυτό συνηγορούν και πειράματα όπου φάνηκε ότι αυτή η μετάλλαξη στα αιμοπετάλια 38

49 Εισαγωγή δεν ανέστειλε τη σηματοδότηση από το εσωτερικό του κυττάρου προς το περιβάλλον (inside-out signaling), αλλά ανέστειλε τη σηματοδότηση από το περιβάλλον στο εσωτερικό του κυττάρου (outside-in signaling) (Law et al, 1999). 3. Πλειοτροπίνη Η πλειοτροπίνη (PTN) είναι ένας αυξητικός παράγοντας μοριακού μεγέθους 18 kda, ο οποίος, μαζί με τη Midkine, έναν άλλον αυξητικό παράγοντα με υψηλή αμινοξική ομολογία και παρόμοιες ιδιότητες, αποτελούν μια ομάδα αυξητικών παραγόντων που έχουν την ιδιότητα να δεσμεύονται στην ηπαρίνη. Πρόσφατα, αυτή η οικογένεια εμπλουτίστηκε με ακόμα δυο μέλη που εντοπίσθηκαν στη Drosophila, τις Miple 1 και 2, και οι οποίες εκφράζονται κατά την εμβρυογένεση στο νευρικό σύστημα και ενδόδερμα αντίστοιχα (Englund et al, 2006). Λόγω της σχεδόν ταυτόχρονης απομόνωσής της από διαφορετικούς ιστούς σε διαφορετικά εργαστήρια, απαντάται στη βιβλιογραφία με αρκετά άλλα ονόματα, τα κυριότερα από τα οποία είναι HARP (heparin affin regulatory peptide, ρυθμιστικό πεπτίδιο με ικανότητα πρόσδεσης στην ηπαρίνη) και HB-GAM (heparin binding growth associated molecule, μόριο που σχετίζεται με την ανάπτυξη και έχει την ικανότητα πρόσδεσης στην ηπαρίνη) (Mikelis et al, 2007). Η πλειοτροπίνη, όπως αναφέρει και το όνομά της, είναι ένας αυξητικός παράγοντας με πολλές δράσεις. Έχει σημαντικό ρόλο στην αγγειογένεση, ρυθμίζεται από αγγειογενετικά ερεθίσματα και ασκεί δράση μέσω των υποδοχέων της στα ενδοθηλιακά κύτταρα (Mikelis and Papadimitriou, 2008). Εκφράζεται σε πολλές ανθρώπινες κυτταρικές σειρές και σε πολλά είδη καρκίνου, όπως γλοιώματα, μελανώματα, νευροβλαστώματα, λευχαιμίες και καρκίνους παγκρέατος, προστάτη, παχέως εντέρου, στήθους, ωοθηκών και πνευμόνων. Αναφορικά με τη βιολογική δράση της, ενώ αρχικά έγινε γνωστή ως παράγοντας που επάγει ογκογενετικό φαινότυπο, υπάρχουν και δεδομένα που της προσδίδουν και ανασταλτικό χαρακτήρα (Mikelis et al, 2007). 39

50 Εισαγωγή 3.1. Δομή γονιδίου της πλειοτροπίνης και γονιδιακή έκφραση Το cdna της πλειοτροπίνης είναι πολύ συντηρημένο ανάμεσα στον άνθρωπο, βου, ποντίκι και αρουραίο (Li et al, 1990), ενώ η ομοιότητα στην εναλλαγή ιντρονίων εξωνίων στο γονίδιο της πλειοτροπίνης στον άνθρωπο, στο zebrafish και της πλειοτροπίνης και της midkine στο ποντίκι οδηγεί στο συμπέρασμα ότι τα μόρια αυτά πρέπει να προέρχονται από κοινό πρόγονο (Chang et al, 2004). Το γονίδιο της πλειοτροπίνης στον άνθρωπο καταλαμβάνει περισσότερες από βάσεις, περιέχει τουλάχιστον επτά εξόνια και εντοπίζεται στη θέση q33, στο έβδομο χρωμόσωμα (Li et al, 1992). Οι αλληλουχίες που περιέχουν το mrna της πλειοτροπίνης εντοπίζονται σε πέντε εξόνια με μέγεθος 1650 νουκλεοτίδια περίπου. Η αλληλουχία του πεπτιδίου σινιάλου, καθώς και των πρώτων πέντε αμινοξέων εντοπίζονται στο εξώνιο 2, ενώ το μεγαλύτερο μέρος της κωδικής αλληλουχίας της πρωτεΐνης της πλειοτροπίνης εντοπίζεται στα εξώνια 3 και 4 (Kretchmer et al, 1993). Ο υποκινητής της πλειοτροπίνης δεν περιέχει την αλληλουχία ΤΑΤΑ, αλλά περιέχει μια αλληλουχία CAAT, τέσσερις περιοχές πρόσδεσης για MyoD, δυο για AP1 και μια για GT1 (Li et al, 1992). Οι αλληλουχίες ΤΑΑΤ, που εντοπίζονται περίπου 100 νουκλεοτίδια ανοδικά του υποκινητή της πλειοτροπίνης, είναι τα σημεία πρόσδεσης του HOXA5, ο οποίος και τον ενεργοποιεί (Chen et al, 2005). Η πλειοτροπίνη εκφράζεται σε αυστηρά καθορισμένο χωρο-χρονικό πρότυπο (Rauvala, 1989). Η έκφρασή της επάγεται σημαντικά αναπτυξιακά και κατά τη γέννηση (Rauvala, 1989; Vanderwinden et al, 1992; Yeh et al, 1998), ενώ κατά την ανάπτυξη περιορίζεται σε κάποιες φυσιολογικές λειτουργίες (Vanderwinden et al, 1992; Milhiet et al, 1998). Λόγω της ευρείας κατανομής του mrna της και των ποικίλλων δράσεών της πρωτεΐνης πήρε το όνομα πλειοτροπίνη (Li et al, 1990). Στο αναπτυσσόμενο νευρικό σύστημα, το mrna της πλειοτροπίνης εντοπίζεται στο νευροεξώδερμα και μεσόδερμα (Vanderwinden et al, 1992), στα νευρικά εμβρυικά κύτταρα (Furuta et al, 2004; Jung et al, 2004), στα μονοπάτια των αναπτυσσόμενων νευρώνων (Rauvala et al, 1994), στους πυραμιδικούς νευρώνες CA1 στον ιππόκαμπο και σε μη νευρωνικούς κυτταρικούς τύπους, όπως αστροκύτταρα και κύτταρα Schwann (Vanderwinden et al, 1992). Σε τραυματισμό της σπονδυλικής στήλης στον αρουραίο επάγεται η έκφραση του 40

51 Εισαγωγή mrna και της πρωτεΐνης της πλειοτροπίνης στο σημείο της βλάβης. Η έκφραση εντοπίζεται στα αστροκύτταρα, ολιγοδενδροκύτταρα και στους νευρώνες (Wang et al, 2004). Επαγωγή της έκφρασης της πλειοτροπίνης εντοπίζεται σε νευροεκφυλιστικές νόσους, όπως σύνδρομο Alzheimer και Down, όπου έχει προταθεί και ως δείκτης νευρωνικής βλάβης (Wisniewski et al, 1996). Επίσης υπερεκφράζεται και στη νόσο του Parkinson (Ferrario et al, 2004), ενώ χορήγηση μορφίνης, γιοχιμπίνης και συνδυασμών τους δεν επηρεάζει την έκφρασή της (Ezquerra et al, 2007). Το mrna της πλειοτροπίνης εκφράζεται σε πρόδρομα κύτταρα οστού και χόνδρου (Vanderwinden et al, 1992) και σε κυτταρικά υποστρώματα σχηματισμού οστού (Imai et al, 1998), ενώ η έκφρασή της επάγεται κατά την επούλωση οστών (Imai et al, 1998) και στα κατάγματα (Petersen et al, 2004). Η έκφραση της πλειοτροπίνης επάγεται σημαντικά και σε ασθένειες οστών που σχετίζονται με αυξημένη αγγειογένεση, όπως οστεοαρθρίτιδα (Sanchez et al, 2005; Pufe et al, 2007). H πλειοτροπίνη εκφράζεται στα λεία μυϊκά κύτταρα (Milhiet et al, 1998), και στο μυοκάρδιο (Chen et al, 2004), ενώ φαίνεται να διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη νευρομυϊκή σύναψη, όπου συμμετέχει στη συσσώρευση των υποδοχέων ακετυλοχολίνης (Peng et al, 1995). Επιπλέον, η πλειοτροπίνη φαίνεται να συμμετέχει σε αλληλεπιδράσεις επιθηλίουμεσεγχύματος (Vanderwinden et al, 1992). Η απομόνωσή της από μήτρα βοός (Milner et al, 1989; Li et al, 1990) και η ανίχνευση της έκφρασής της στο αναπαραγωγικό σύστημα υποδηλώνουν το βασικό ρόλο της πλειοτροπίνης στη ρύθμιση του αναπαραγωγικού κύκλου (Milhiet et al, 1998; Fan et al, 2000). H ανίχνευσή της στο μαστικό αδένα (Ledoux et al, 1997), η σημασία της στη μορφογένεσή του (Kouros-Mehr and Web, 2006), η ανίχνευσή της στα Leydig κύτταρα των όρχεων (Vanderwinden et al, 1992) και η στειρότητα και οι μορφολογικές ανωμαλίες στους όρχεις των ποντικιών που δεν εκφράζουν την πλειοτροπίνη (Zhang et al, 1999) ολοκληρώνουν τον πολύπλευρο ρόλο της στην αναπαραγωγική διαδικασία. Τέλος, η έκφραση της πλειοτροπίνης επάγεται στο in vivo σύστημα της χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης εμβρύου όρνιθας από την επίδραση ακτίνων X (Polytarchou et al, 2004). 41

52 Εισαγωγή 3.2. Πρωτεϊνική δομή της πλειοτροπίνης Η πρωτοταγής πρωτεϊνική δομή της πλειοτροπίνης αποτελείται από 168 αμινοξέα, τα πρώτα 32 από τα οποία αποτελούν το πεπτίδιο-σινιάλο, μετά από πέψη του οποίου προκύπτει η ώριμη πρωτεΐνη των 136 αμινοξέων. Η πέψη του πεπτιδίου-σινιάλου μπορεί να πραγματοποιηθεί στις θέσεις -1 και -3 της πρόδρομης πρωτεΐνης (Merenmies et al, 1990), γεγονός που καθορίζεται από τον τύπο του κυττάρου. Το αποτέλεσμα των διαφορικών πέψεων οδηγεί σε δυο ισομορφές της ώριμης πρωτεΐνης που η μια έχει 3 αμινοξέα παραπάνω (139) στο αμινοτελικό άκρο (Bernard-Pierrot et al, 2001). Η ώριμη πρωτεΐνη περιέχει μεγάλο ποσοστό (24%) κατιονικών αμινοξέων, που είναι κυρίως λυσίνες, εντοπισμένες στα άκρα (Merenmies et al, 1990). Περιέχει επίσης και 10 υψηλά συντηρημένες κυστεΐνες (Merenmies et al, 1990), οι οποίες δημιουργούν πέντε (Kuo et al, 1990) ή τρεις (Hampton et al, 1992) δισουλφιδικούς δεσμούς. Η απουσία κλασικών θέσεων Ν-γλυκοσιλίωσης (Hampton et al, 1992) οδηγεί στο συμπέρασμα ότι δεν υφίσταται μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις, κάτι που επιβεβαιώνεται και με φασματομετρικές μεθόδους (Kuo et al, 1990). Σχετικά με την τριτοταγή διάταξη της πρωτεΐνης της πλειοτροπίνης δεν υπάρχουν μέχρι σήμερα πολλά δεδομένα (Εικόνα 5). Υποστηρίζεται ότι αποτελείται από δυο β-δομές, καθεμιά από τις οποίες περιέχει τρεις αντιπαράλληλες β-πτυχές, ενώ περιέχει και TSR αλληλουχίες, μέσω των οποίων δεσμεύεται σε πρωτεΐνες εξωκυττάριου χώρου και κυτταρικής μεμβράνης. Τα αμινο- και καρβοξυτελικό άκρα δεν έχουν συγκεκριμένη δομή και φαίνονται να δημιουργούν α-έλικα. Κατά τη δέσμευση της πλειοτροπίνης στην ηπαρίνη, που γίνεται μέσω των β-δομών, πραγματοποιείται αλλαγή της στερεοδιαμόρφωσης, ενώ αναγωγή του δισουλφιδικών δεσμών αναστέλλει σημαντικά την ικανότητα δέσμευσης (Kilpelainen et al, 2000). Οι δυο β-δομές της πλειοτροπίνης παρουσιάζουν μικρή ομολογία με τις τυπικές TSP1 δομές και διαφορετική στερεοδιαμόρφωση (Roszmusz et al, 2002). 42

53 Εισαγωγή Εικόνα 5: Σχηματική αναπαράσταση της τριτοταγούς δομής της πλειοτροπίνης. Οι β- πτυχές αντιπροσωπεύονται από τα βέλη και οι α-έλικες στο αμινοτελικό και καρβοξυτελικό άκρο από τους κυλίνδρους. Διακρίνονται επίσης οι δισουλφιδικοί δεσμοί. Οι αριθμοί αντιστοιχούν στα αντίστοιχα αμινοξέα της πρωτεΐνης. (Papadimitriou et al., 2004) 3.3. Αλληλεπιδράσεις, υποδοχείς της πλειοτροπίνης και μεταγωγή σήματος Μόρια που αλληλεπιδρούν με την πλειοτροπίνη Από τις πρώτες προσπάθειες απομόνωσης της πλειοτροπίνης από εγκέφαλο αρουραίου (Rauvala, 1989) και βοός (Kuo et al, 1990) η δυνατότητά της να προσδένεται στην ηπαρίνη αποτέλεσε το βασικό χαρακτηριστικό του μορίου. Η αλληλεπίδραση της πλειοτροπίνης με την ηπαρίνη λαμβάνει χώρα σε διάλυμα (K D = 460 nm), έχει στοιχειομετρία 3:1 (Fath et al, 1999), πραγματοποιείται μέσω των β-δομών της πλειοτροπίνης και οδηγεί σε αλλαγή της στερεοδιαμόρφωσής της (Kilpelainen et al, 2000). Καθεμιά β-δομή μόνη της παρουσιάζει μικρή ικανότητα δέσμευσης στην ηπαρίνη, κάτι που αλλάζει με τη συνεργιστική δράση και των δυο β-δομών (Raulo et al, 2005). Σε λειτουργικό επίπεδο, προσθήκη ηπαρίνης αναστέλλει τον επαγόμενο από πλειοτροπίνη κυτταρικό 43

54 Εισαγωγή πολλαπλασιασμό (Vacherot et al, 1999). Η ικανότητα δέσμευσης της πλειοτροπίνης στην ηπαρίνη βρίσκει εφαρμογές, πέρα από τις εφαρμογές απομόνωσης, και σε βιοτεχνολογικό επίπεδο (Soulie et al, 2002). Η πλειοτροπίνη δεσμεύεται στη θειική ηπαράνη (Mitsiadis et al, 1995). Τα μόρια θειικής ηπαράνης στην Ν-συνδεκάνη είναι απαραίτητα για τη δέσμευση της πλειοτροπίνης σε αυτήν και την επαγωγή της προέκτασης των νευριτών (Martin et al, 2006). Επώαση μεσαγγειακών κυττάρων με ηπαρινάση απομακρύνει την πλειοτροπίνη από τα κύτταρα, αποκαλύπτοντας τη σημασία της αλληλεπίδρασης στη δράση της πλειοτροπίνης στα κύτταρα αυτά (Martin et al, 2006). Πέρα από τη θειική ηπαράνη, η πλειοτροπίνη μπορεί να δεσμευθεί στη θειική δερματάνη και στη θειική χονδροϊτίνη Α (Vacherot et al, 1999) και Ε (Deepa et al, 2002) και υπάρχουν ενδείξεις ότι πολλά από τα μόρια αυτά παίζουν ρόλο στη μιτογόνο δράση της (Vacherot et al, 1999). Στα αρχικά στάδια της εμβρυογένεσης στο ποντίκι έχει ανιχνευθεί αλληλεπίδραση της πλειοτροπίνης με την PG- M/βερσικάνη, μια πρωτεογλυκάνη θειικής χονδροϊτίνης (Zou et al, 2000). Το ιδουρονικό οξύ (IdoUA) θεωρείται βασική προϋπόθεση για τη δέσμευση της πλειοτροπίνης σε αλυσίδες θειικής δερματάνης/θειικής χονδροϊτίνης σε έμβρυα θηλαστικών και για τη δημιουργία των νευριτών στα αρχικά στάδια της ανάπτυξης του εγκεφάλου (Bao et al, 2004). Ανάλυση των ολιγοσακχαριτών αυτών αποκάλυψε ότι οι οκτασακχαρίτες είναι η μικρότερη δυνατή δομή για αλληλεπίδραση με την πλειοτροπίνη σε φυσιολογικές συνθήκες άλατος, καθώς και ότι η πλειοτροπίνη δεσμεύεται σε αυτούς σε διαφορετικές αλληλουχίες με διαφορετική ικανότητα δέσμευσης (Bao et al, 2005). Η πλειοτροπίνη θεωρείται βασικό μόριο, μέσω της αλληλεπίδρασής της με αλυσίδες θειικής χονδροϊτίνης πλούσιων σε D δομές, για την αλληλεπίδραση των κυττάρων Purkinje με τα γλοιωματικά Bergmann κύτταρα (Shimazaki et al, 2005). Η ηπαρίνη και άλλες θειωμένες γλυκοσαμινογλυκάνες, όπως η θειική δερματάνη και η θειική χονδροϊτίνη-c, επάγουν το διμερισμό της πλειοτροπίνης, βήμα απαραίτητο για τη βιολογική της δράση (Bernard-Pierrot et al, 1999), ενώ πάλι η ηπαρίνη, η θειική ηπαράνη και η θειική δερματάνη προστατεύουν μερικά την πλειοτροπίνη από την πρωτεολυτική δράση της πλασμίνης (Polykratis et al, 2004). Η πλειοτροπίνη αποτελεί και στόχο για βακτηριακή προσκόλληση, μέσω 44

55 Εισαγωγή της αλληλεπίδρασής της με το βακτήριο Haemophilus influenzae τύπου Β, παθογόνο της ρινοφαρυγγικής κοιλότητας (Virkola et al, 2000). Η πλειοτροπίνη αλληλεπιδρά, πέρα από τον εαυτό της (διμερισμός), και με άλλους αυξητικούς παράγοντες. Πιο συγκεκριμένα, αναστέλλει τη βιολογική δράση του VEGF 165 (Heroult et al, 2004; Parthymou et al, 2008), δεσμευόμενη άμεσα σε αυτόν (Κ D =1.38 nm). Για την αλληλεπίδραση αυτή σημαντικό ρόλο φαίνονται να παίζουν οι TSR δομές της πλειοτροπίνης (Heroult et al, 2004). Τέλος, η αλληλεπίδραση της πλειοτροπίνης με το Υ-Ρ30, ένα πολυπεπτίδιο που παράγεται από τα μονοπύρηνα κύτταρα του περιφερικού αίματος (PBMC, peripheral blood mononuclear cells) του ανοσοποιητικού συστήματος της μητέρας κατά την εγκυμοσύνη, αποτελεί ακόμα ένα μηχανισμό επικοινωνίας του νευρικού με το ανοσοποιητικό σύστημα. Η αλληλεπίδραση αυτή φαίνεται να είναι τελικά υπεύθυνη για την επαγωγή των νευριτών που αποδίδεται στο πεπτίδιο Υ-Ρ30 κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου (Landgraf et al, 2008) Ν-Συνδεκάνη Η Ν-συνδεκάνη ή συνδεκάνη-3 (μοριακού μεγέθους 200 kda περίπου) απομονώθηκε από καλλιέργειες νευρικών κυττάρων και από εγκέφαλο αρουραίου μέσω στήλης με καθηλωμένη ανασυνδυασμένη πλειοτροπίνη (Raulo et al, 1994). Η Ν-συνδεκάνη αποτελείται από έναν πρωτεϊνικό κορμό 120 kda και 442 αμινοξέων, στον οποίο προσδένονται αλυσίδες θειικής ηπαράνης (Raulo et al, 1994), και παρουσιάζει υψηλή ομολογία σε άνθρωπο, ποντίκι και αρουραίο (Bernt et al, 2001). H Ν-συνδεκάνη εκφράζεται σημαντικά στον εγκέφαλο του εμβρύου και νεογέννητου αρουραίου (Carey et al, 1992). Η έκφραση της πλειοτροπίνης και της Ν-συνδεκάνης συμπίπτει χρονικά κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου, ενώ επίσης συνεντοπίζονται σε συγκεκριμένα σημεία στον εγκέφαλο του αρουραίου (Nolo et al, 1995). Έκφραση και συνεντοπισμός της πλειοτροπίνης και της Ν-συνδεκάνης πραγματοποιείται και στη νευρόσφαιρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι η μεταγωγή σήματος από την πλειοτροπίνη πραγματοποιείται και στα εμβρυικά νευρικά κύτταρα και συμμετέχει στη ρύθμιση της διαφοροποίησής τους (Furuta et al, 45

56 Εισαγωγή 2004). Έχει προταθεί ότι οι συνδεκάνες εκφράζονται πρωταρχικά στα αστροκύτταρα και μπορούν να προσδώσουν ένα υποστηρικτικό περιβάλλον για την επαναδημιουργία νευραξόνων, σε συνδυασμό με την πλειοτροπίνη, σε τραύματα του εγκεφάλου (Iseki et al, 2002). Η πλειοτροπίνη, σε συνδυασμό με την Ν-συνδεκάνη και τον RPTPβ/ζ, φαίνονται να ρυθμίζουν τη νευροπροστατευτική δράση του κυκλικού AMP (c-amp) στους ντοπαμινεργικούς νευρώνες (Mourlevat et al, 2005). H συμμετοχή της Ν-συνδεκάνης στη ρύθμιση της μακροχρόνιας ενίσχυσης (LTP, long term potentiation) φαίνεται από το γεγονός ότι η πλειοτροπίνη δεν την επηρεάζει σε ποντίκια που δεν εκφράζουν την Ν-συνδεκάνη (Kaksonen et al, 2002). Αυτή η ρύθμιση της πλαστικότητας από την αλληλεπίδραση της πλειοτροπίνης με την Ν-συνδεκάνη φαίνεται να είναι σημαντική για τη μάθηση και τη μνήμη (Pavlov et al, 2002). Επιπλέον, η Ν- συνδεκάνη έχει βρεθεί ότι αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα του αυξητικού παράγοντα EGF (EGFR, endothelial growth factor receptor) και ρυθμίζει τη μετανάστευση των νευρικών κυττάρων (Hienola et al, 2006). H Ν-συνδεκάνη έχει ανιχνευθεί ως υποδοχέας της πλειοτροπίνης σε προγονικά οστεοκύτταρα και οστεοβλάστες (Imai et al, 1998), ενώ η σύνθεση της πλειοτροπίνης από τους οστεοβλάστες και ο συνεντοπισμός της με την Ν- συνδεκάνη έχουν επιβεβαιωθεί in vivo (Tare et al, 2002). Η Ν-συνδεκάνη που εκφράζεται στα χονδροκύτταρα που πολλαπλασιάζονται in vivo φαίνεται ότι είναι άμεσος και επιλεκτικός ρυθμιστής της μιτωτικής συμπεριφοράς τους και ο ρόλος της μπορεί να περιλαμβάνει τη δημιουργία διμερών ή ολιγομερών δομών στην κυτταρική επιφάνεια (Kirsch et al, 2002). Αυξημένη έκφραση της Ν-συνδεκάνης παρατηρείται σε διαφοροποιημένα μυϊκά κύτταρα και απαιτείται για την επιτυχημένη αναγέννηση των μυοβλαστών σε πειράματα μεταμόσχευσης (Casar et al, 2004). Επίσης η Ν-συνδεκάνη εκφράζεται στην κνήμη μετά από κατάγματα (Song et al, 2006) και πιθανότατα δρα ως υποδοχέας της πλειοτροπίνης στα ηπατικά κύτταρα (Asahina et al, 2002) Μελέτες σχέσης δομής-δράσης στην πλειοτροπίνη έχουν δείξει ότι και οι δυο TSR δομές της δεσμεύονται στην θειική ηπαράνη (Raulo et al, 2005) και ρυθμίζουν την πλαστικότητα των συνάψεων (Raulo et al, 2006). H αλληλεπίδραση της πλειοτροπίνης με την Ν-συνδεκάνη οδηγεί στην ενεργοποίηση της c-src και της 46

57 Εισαγωγή Fyn και την αλληλεπίδρασή τους με την κορτακτίνη και την τουμπουλίνη (Εικόνα 6). Τελικό επακόλουθο αυτών είναι η αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού με αποτέλεσμα την προέκταση των νευριτών (Imai et al, 1998) και τη μετανάστευση των οστεοβλαστών (Kinnunen et al, 1998). Η συνδεκάνη μοιάζει με τους άλλους διαμεμβρανικούς υποδοχείς στην ικανότητά τους να διμερίζονται και να ολιγομερίζονται στην κυτταρική μεμβράνη. Πιθανό ενδεχόμενο θα ήταν η πλειοτροπίνη που δεσμεύεται στην Ν-συνδεκάνη να επάγει το διμερισμό ή ολιγομερισμό της στους νευρώνες, που ρυθμίζει τη σηματοδότηση στον κυτταροσκελετό (Asundi et al, 1995). Εικόνα 6: Σχηματική αναπαράσταση των γνωστών σηματοδοτικών μονοπατιών της Ν- συνδεκάνης που επάγονται από την πλειοτροπίνη και οδηγούν στην αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού (Mikelis et al, 2007) Υποδοχέας με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ (RPTPβ/ζ) O RPTPβ/ζ είναι μια πρωτεΐνη με δράση φωσφατάσης τυροσίνης και αποτελεί σήμερα τον πιο καλά χαρακτηρισμένο υποδοχέα της πλειοτροπίνης. Αρχικά απομονώθηκε και αυτός από το νευρικό ιστό ως μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη με 47

58 Εισαγωγή δράση φωσφατάσης τυροσίνης. Αποτελείται από ένα πολύ μεγάλο εξωκυτταρικό τμήμα που περιέχει μια αμινοτελική αλληλουχία με δομή καρβονικής ανυδράσης, ένα διαμεμβρανικό τμήμα και ένα κυτταροπλασματικό τμήμα που περιέχει δυο επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες φωσφατάσης, από τις οποίες αυτή που είναι κοντά στη μεμβράνη είναι καταλυτικά ενεργή (Krueger and Saito, 1992). Πέρα από αυτή, που αποτελεί τη μεγάλη διαμεμβρανική ισομορφή του υποδοχέα, έχει χαρακτηρισθεί μια πιο κοντή διαμεμβρανική ισομορφή (Levy et al, 1993) και δυο εκκρινόμενες ισομορφές (Εικόνα 7). Αυτές αντιστοιχούν στο εξωκυτταρικό τμήμα και είναι η φωσφακάνη (phosphacan) (Maurel et al, 1994) και η κοντή ισομορφή της φωσφακάνης ή PSI (phosphacan short isoform) (Garwood et al, 2003). Η κοντή διαμεμβρανική ισομορφή υπολείπεται ενός τμήματος 859 αμινοξέων από το εξωκυτταρικό τμήμα (Levy et al, 1993). H φωσφακάνη αντιστοιχεί στο εξωκυτταρικό τμήμα της μεγάλης διαμεμβρανικής ισομορφής του RPTPβ/ζ, στο οποίο δεσμεύεται και η πλειοτροπίνη (Maeda et al, 1996), και θεωρείται ότι ρυθμίζει κυτταρικές αλληλεπιδράσεις και αναπτυξιακές διαδικασίες στο νευρικό σύστημα (Maurel et al, 1994). Μεταβολές στις αλυσίδες θειικής χονδροϊτίνης της φωσφακάνης καθορίζονται αναπτυξιακά και ρυθμίζουν την ικανότητα πρόσδεσης της πλειοτροπίνης (Maeda et al, 2003). Η κοντή ισομορφή της φωσφακάνης είναι μια γλυκοσιλιωμένη πρωτεΐνη 90 kda, αντιστοιχεί στην αμινοτελική περιοχή καρβονικής ανυδράσης και ινονεκτίνης τύπου ΙΙΙ και υπολείπεται του μεγαλύτερου τμήματος της άλλης περιοχής (spacer region) του εξωκυτταρικού τμήματος του RPTPβ/ζ. Συνοπτικά, αντιστοιχεί περισσότερο στο εξωκυτταρικό τμήμα της κοντής διαμεμβρανικής ισομορφής του υποδοχέα και, σε αντίθεση με τη φωσφακάνη, δεν είναι πρωτεογλυκάνη (Garwood et al, 2003). Εκτός από τις ισομορφές του RPTPβ/ζ, σε φυσιολογικές συνθήκες ο RPTPβ/ζ μπορεί να αποικοδομηθεί από την MMP-9, από το μετατρεπτικό ένζυμο του TNF (TACE, Tumor Necrosis Factor Converting Enzyme), από την πρεσενιλίνη/γσεκρετάση (Chow et al, 2008 a) και από την πλασμίνη (Chow et al, 2008 b). Τόσο η πλειοτροπίνη (Polykratis et al, 2004), όσο και ο υποδοχέας της, RPTPβ/ζ (Chow et al, 2008 b) είναι και οι δυο φυσιολογικοί στόχοι της πρωτεολυτικής αποικοδόμησης από το σύστημα tpa/πλασμίνη. Φαίνεται ότι η πρωτεολυτική 48

59 Εισαγωγή αποικοδόμηση του RPTPβ/ζ συμμετέχει σε λειτουργικές διαδικασίες των συνάψεων (Chow et al, 2008 b) και στην ανάπτυξη του εγκεφάλου. Εικόνα 7: Σχηματική αναπαράσταση των γνωστών ισομορφών του RPTPβ/ζ. Διακρίνονται οι δυο διαμεμβρανικές (RPTPβ/ζ μεγάλη και μικρή ισομορφή) και οι δυο εκκρινόμενες ισομορφές (φωσφακάνη, PSI) και αναφέρονται οι περιοχές της καθεμιάς (Garwood et al, 2003). Η αλληλεπίδραση του RPTPβ/ζ με άλλες πρωτεΐνες αποκαλύπτει τις διαφορικές δράσεις που συμμετέχει. Η δέσμευση της φωσφακάνης στην τενασκίνη, μια πρωτεΐνη του εξωκυττάριου χώρου, λαμβάνει χώρα στο νευρικό σύστημα in vivo και φαίνεται να παίζει ρόλο στην ιστογένεση του νευρικού ιστού και στην ανάπτυξή του (Grumet et al, 1994; Barnea et al, 1994). Η δέσμευση του RPTPβ/ζ στην αμφοτερίνη (Milev et al, 1998) και στην Ng-CAM και N-CAM in vitro και στα C6 κύτταρα γλοιώματος (Milev et al, 1994) ενισχύει την παραπάνω άποψη. Η περιοχή της καρβονικής ανυδράσης του RPTPβ/ζ δεσμεύεται ειδικά στην κοντακτίνη, μια πρωτεΐνη 140 kda που εντοπίζεται στην επιφάνεια των νευρικών κυττάρων, και δρα σα λειτουργικός υποδοχέας για τον RPTPβ/ζ (Peles et al, 49

60 Εισαγωγή 1995). Ο RPTPβ/ζ αλληλεπιδρά με τον DNER, μια σχετιζόμενη με το Notch διαμεμβρανική πρωτεΐνη που εκφράζεται έντονα στα κύτταρα Purkinje της παρεγκεφαλίδας, και ρυθμίζει τον υποκυτταρικό εντοπισμό του, ελέγχοντας έτσι τη δημιουργία νευριτών (Fukazawa et al, 2008). Πρόσδεση της πλειοτροπίνης στην RPTPβ/ζ οδηγεί σε ενεργοποίηση αρκετών μονοπατιών μεταγωγής σήματος (Εικόνα 8). Ο RPTPβ/ζ παίζει σημαντικό ρόλο στη δημιουργία μνήμης, τροποποιώντας τη δράση της Rho GTPάσης (Tamura et al, 2006). Το μονοπάτι της πλειοτροπίνης με τον RPTPβ/ζ επάγει τη φωσφορυλίωση τυροσίνης της β-κατενίνης, καταστρέφει την αλληλεπίδρασή της με την κυτταροπλασματική περιοχή των καντερινών, αποσταθεροποιεί τα σημεία προσκόλλησης (adherens junctions) και μειώνει τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των κυττάρων (Meng et al, 2000; Deuel et al, 2002). Η πρόσδεση της πλειοτροπίνης στον RPTPβ/ζ ενεργοποιεί την πρωτεϊνική κινάση C (PKC, protein kinase C), επάγει τη φωσφορυλίωση της β-αντουσίνης (β-adducin) από την PKC και τη μεταφορά της τελευταίας είτε στον πυρήνα είτε στη μεμβράνη που συμβάλλει στην αποικοδόμηση των συμπλόκων του κυτταροσκελετού (Pariser et al, 2005 a). Η πρωτεΐνη Fyn έχει βρεθεί ότι δεσμεύεται στο κυτταροπλασματικό τμήμα του RPTPβ/ζ και ρυθμίζει το φαινότυπο του κυτταροσκελετού (Pariser et al, 2005 b). Η κινάση c-src επίσης αλληλεπιδρά άμεσα με τον RPTPβ/ζ και μετά από ενεργοποίησή του από την πλειοτροπίνη ενεργοποιείται η κινάση εστιακής προσκόλλησης (FAK, focal adhesion kinase), η κινάση της 3- φωσφατιδιλοϊνοσιτόλης (PI3K, phosphatidylinositol 3-kinase) και οι ERK1,2 (extracellular signal regulated kinases, κινάσες που ρυθμίζονται από εξωκυτταρικά σήματα) (Polykratis et al, 2005). Έχει επίσης δειχθεί ότι πρόσδεση της πλειοτροπίνης στον RPTPβ/ζ επάγει τη φωσφορυλίωση τυροσίνης του υποδοχέα 1 που αλληλεπιδρά με κινάσες και είναι δεσμευμένος με G υποδοχέα (G protein coupled receptor kinase-interactor 1) (Fukada et al, 2005) και αυξάνει την αλληλεπίδραση με τις Magi1 (Fukada et al, 2005) και Magi3 (Adamsky et al, 2003). Οι τελευταίες μπορούν να χρησιμεύσουν σα σκαλωσιά για διάφορα υποστρώματα του RPTPβ/ζ στην κυτταρική μεμβράνη. 50

61 Εισαγωγή Εικόνα 8: Σχηματική αναπαράσταση των γνωστών σηματοδοτικών μονοπατιών που ενεργοποιούνται μετά τη δέσμευση της πλειοτροπίνης στον RPTPβ/ζ (Mikelis et al, 2007). Η αρχική απομόνωση των ισομορφών του RPTPβ/ζ στον εγκέφαλο (Krueger et al, 1992; Levy et al, 1993; Maurel et al, 1994; Garwood et al, 2003) και η αναπτυξιακή ρύθμιση της έκφρασής του στο νευρικό σύστημα (Nishiwaki et al, 1997) δείχνουν το σημαντικό ρόλο που έχει στο σύστημα αυτό. Ο RPTPβ/ζ έχει φανεί ότι συμμετέχει στην επαγόμενη από την πλειοτροπίνη μετανάστευση των νευρικών (Maeda et al, 1998) και ενδοθηλιακών (Polykratis et al, 2005) κυττάρων. Αναστολή της έκφρασής του υποδηλώνει το σημαντικό ρόλο του για τη μετανάστευση και των δυο ειδών κυττάρων (Muller et al, 2003; Polykratis et al, 2005). Επιπλέον, ο απτοτακτισμός των κυττάρων γλοιοβλαστώματος από τη πλειοτροπίνη αναστέλλεται με αναστολή του RPTPβ/ζ, που οδηγεί στο συμπέρασμα ότι αυξημένη έκφραση της πλειοτροπίνης και του RPTPβ/ζ στα ανθρώπινα καρκινικά αστροκύτταρα πιθανόν να δημιουργούν μια αυτοκρινή 51

62 Εισαγωγή δράση, που είναι σημαντική για τη μετανάστευση αυτών των κυττάρων (Ulbricht et al, 2003). Μονοκλωνικά αντισώματα έναντι του RPTPβ/ζ (Ulbricht et al, 2003), καθώς και αναστολή της έκφρασής του με sirna (Foehr et al, 2006) αναστέλλουν την αύξηση του γλοιώματος in vitro και in vivo. Επίσης αναστολή της έκφρασης του RPTPβ/ζ αλλοιώνει τη μορφολογία των κυττάρων Purkinje, δείχνοντας τη σημασία του υποδοχέα στη ρύθμιση της μορφογένεσης των δενδριτών τους (Tanaka et al, 2003). Διαφοροποιημένοι οστεοβλάστες, σε αντίθεση με τα νευρικά κύτταρα, εκφράζουν ειδικά την κοντή διαμεμβρανική ισομορφή του RPTPβ/ζ (Schinke et al, 2008). Τα ποντίκια που δεν εκφράζουν RPTPβ/ζ, αν και δεν παρουσιάζουν εμφανείς ανωμαλίες (Harroch et al, 2000), εντούτοις εμφανίζουν μικρότερο πυρήνα αναγέννησης οστού και μικρότερο ρυθμό σύνθεσης νέου οστού (Schinke et al, 2008). Οι οστεοβλάστες που δεν εκφράζουν τον RPTPβ/ζ παρουσιάζουν μικρότερη έκφραση δεικτών οστεοβλαστών και έχουν μειωμένη ικανότητα για κυτταρικές προεκβολές σε υπόστρωμα matrigel (Schinke et al, 2008). Τα παραπάνω αποτελούν τις πρώτες ενδείξεις για το φυσιολογικό ρόλο του RPTPβ/ζ στην αναγέννηση των οστών. Τέλος, εκτός από την πλειοτροπίνη, στον RPTPβ/ζ προσδένεται και η βακτηριακή κυτταροτοξίνη VacA. Πρόσδεση είτε της πλειοτροπίνης είτε της VacA και ενεργοποίηση της σηματοδότησης του RPTPβ/ζ είναι ικανή να επάγει γαστρικό έλκος (Fujikawa et al, 2003) Κινάση αναπλαστικού λεμφώματος (ALK) O υποδοχέας ALK είναι ένας διαμεμβρανικός υποδοχέας 220 kda με δράση κινάσης τυροσίνης. Μαζί με το συγγενικό του μόριο, την 110 kda κινάση τυροσίνης των λευκοκυττάρων (LTK, leukocyte tyrosine kinase), ανήκουν στην υπεροικογένεια των υποδοχέων ινσουλίνης, λόγω της αμινοξικής ομολογίας των ενδοκυτταρικών δομών κινάσης. Ο ALK αρχικά ανακαλύφθηκε ως τμήμα μιας ογκογενετικής χιμαιρικής κινάσης τυροσίνης, της νουκλεοφοσμίνης (nucleophosmin, NPM)-ALK που εκφράζεται στα αναπλαστικά μεγαλοκυτταρικά λεμφώματα (Morris et al, 1994). H χιμαιρική NPM-ALK πρωτεΐνη εντοπίζεται τόσο στο κυτταρόπλασμα, όσο και στο νουκλεόπλασμα των κυττάρων στα οποία εκφράζεται. Έχει υποστηριχθεί ότι το τμήμα της νουκλεοφοσμίνης είναι υπεύθυνο 52

63 Εισαγωγή για το διμερισμό της χιμαιρικής πρωτεΐνης, που οδηγεί στη συνεχή ενεργοποίηση της κινάσης και στη μετασχηματιστική της δράση (Bischof et al, 1997). Έχουν ανιχνευθεί δυο ισομορφές του ALK, 220 και 140 kda σε μετασχηματισμένα κύτταρα HEK (Moog-Lutz et al, 2005) και σε εκχυλίσματα εγκεφάλου (Iwahara et al, 1997; Morris et al, 1997). H μικρή ισομορφή (140 kda) προκύπτει από πρωτεόλυση της μεγάλης ισομορφής, που συμβαίνει φυσιολογικά (Moog-Lutz et al, 2005). Η μεγάλη ισομορφή του ALK είχε περιγραφεί αρχικά ως «ορφανός» υποδοχέας με δράση κινάσης τυροσίνης, που εμφανίζει περιορισμένη έκφραση και ρυθμίζεται κατά την ανάπτυξη των οργάνων. Η μεγάλη ισομορφή του ALK έχει την κλασική δομή ενός υποδοχέα με δράση κινάσης τυροσίνης, δηλαδή ένα μεγάλο εξωκυτταρικό τμήμα, ένα λιπόφιλο διαμεμβρανικό τμήμα και ένα κυτταροπλασματικό με δομή κινάσης τυροσίνης (Iwahara et al, 1997; Morris et al, 1997). Ο ALK εκφράζεται κυρίως στο νευρικό σύστημα (Pulford et al, 1997). H μεγαλύτερη έκφραση παρατηρείται στον εγκέφαλο των νεογέννητων θηλαστικών, υποδηλώνοντας πιθανή συμμετοχή του στην ανάπτυξη του νευρικού συστήματος. Επειδή όμως η έκφρασή του παραμένει σε υψηλά επίπεδα και μετά την ενηλικίωση, πιθανόν να παίζει ρόλο και στο σχηματισμό των συνάψεων και στη διατήρησή τους (Morris et al, 1997). Αρκετές μελέτες αναφέρουν έκφραση της μεγάλης ισομορφής του ALΚ σε ινοβλάστες, ενδοθηλιακά κύτταρα, καθώς και σε κυτταρικές σειρές που προέρχονται από καρκίνους παγκρέατος και στήθους (Stoica et al, 2001; 2002), μελανώματα (Dirks et al, 2002), νευροβλαστώματα (Lamant et al, 2000; Stoica et al, 2002), γλοιώματα (Powers et al, 2002) και λεμφώματα (Delsol et al, 1997). Μια ποικιλία μαλακών όγκων, σε αντίθεση με τους φλεγμονώδεις μυοϊνοβλαστικούς όγκους (IMT, inflammatory myofibroblastic tumors), εκφράζουν τον ALK (Li et al, 2004). Ο ALK εκφράζεται επίσης σε οστεοβλαστικά κύτταρα (Hausser et al, 2005) και σε χονδροκύτταρα, επαγόμενος από τον ίδιο του τον προσδέτη (Pufe et al, 2007). H πιστοποίηση του ALK ως υποδοχέα της πλειοτροπίνης έχει επιβεβαιωθεί με διάφορα συστήματα, παρουσία και απουσία κυττάρων. Η πλειοτροπίνη δεσμεύεται στην εξωκυτταρική (ECD, extracellular domain) του υποδοχέα (K D =30 pm). Αντισώματα έναντι του υποδοχέα ή της πλειοτροπίνης ανέστειλαν τη 53

64 Εισαγωγή δέσμευσή της, τη μεταγωγή σήματος και τη βιολογική δράση (Stoica et al, 2001; Bowden et al, 2002; Powers et al, 2002). Επιπλέον, η ισομορφή 15 kda της πλειοτροπίνης επάγει τη φωσφορυλίωση του ALK και τη μεταγωγή σήματος στα γλοιώματα (Lu et al, 2005). Στα κύτταρα γλοιώματος U87, αναστολή της έκφρασης του ALK από ριβοένζυμα ανέστειλε την ανάπτυξη των όγκων σε ποντίκια και παρέτεινε την επιβίωσή τους, λόγω αυξημένης απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων (Powers et al, 2002). Επίσης, αναστολή της έκφρασης του ALK ή της πλειοτροπίνης στα Hs578T κύτταρα καρκίνου του μαστού, τα οποία υπερεκφράζουν ALK, είχε σαν αποτέλεσμα τη μείωση του μεγέθους των όγκων στα ποντίκια (Wang et al, 1997). Σε αντίθεση με τα παραπάνω αποτελέσματα, αρκετές μελέτες ακόμα υποστηρίζουν την άποψη ότι ο ALK είναι «ορφανός» υποδοχέας, γιατί δεν ανιχνεύουν δέσμευση ούτε της 15 kda ισομορφής της πλειοτροπίνης στον ALK (Mathivet et al, 2007). Μια ριζοσπαστική άποψη όσον αφορά την ενεργοποίηση του ALK διατυπώθηκε πρόσφατα. Σύμφωνα με αυτή, η επαγόμενη από την πλειοτροπίνη φωσφορυλίωση του ALK πραγματοποιείται ανεξάρτητα από την πρόσδεση της πλειοτροπίνης σε αυτόν, αλλά εξαρτάται από την ενεργοποίηση του RPTPβ/ζ από την πλειοτροπίνη, με αποτέλεσμα η ενεργοποίηση του ALK πραγματοποιείται από το μονοπάτι του RPTPβ/ζ (Perez- Pinera et al, 2007). Παρά την ανίχνευση του ALK ως λειτουργικού υποδοχέα για την πλειοτροπίνη λίγα είναι γνωστά για τη μεταγωγή σήματος από αυτόν μετά από ενεργοποίησή του με την πλειοτροπίνη (Εικόνα 9). Αμινοξική ανάλυση του ενδοκυτταρικού τμήματος του ALK αποκάλυψε πιθανές περιοχές δέσμευσης για τις πρωτεΐνες Shc, PI3K, πρωτεΐνη ενεργοποίησης της Ras GTPάσης (rasgap, Ras GTPaseactivating protein), IRS1 (insulin receptor substrate 1, υπόστρωμα 1 υποδοχέα ινσουλίνης), Grb2 (growth factor receptor-bound substrate 2, υπόστρωμα 2 που δεσμεύεται σε υποδοχείς αυξητικών παραγόντων) και φωσφολιπάση γ (PLCγ, phospholipase γ) (Morris et al, 1997). Πειράματα ανοσοκατακρήμνισης με τη χιμαιρική NPM-ALK πρωτεΐνη έδειξαν φυσική αλληλεπίδραση με τις πρωτεΐνες IRS1, Grb2 και Shc (Fujimoto et al, 1996). Τη δέσμευση της πλειοτροπίνης στον υποδοχέα ακολουθεί αλληλεπίδραση και ενεργοποίηση των Shc και IRS1 (Stoica et al, 2001; Fujimoto et al, 1996; Bischof et al, 1997), ενώ η Grb2 δεσμεύεται έμμεσα στον υποδοχέα, μέσω των συμπλόκων, που μπορεί να περιλαμβάνουν 54

65 Εισαγωγή και άλλες πρωτεΐνες πέρα από την Shc (Piccinini et al, 2002). Η σημασία του μονοπατιού της PI3K για τη μιτογόνο δράση του ALK επιβεβαιώνεται από αναφορές που δείχνουν ότι η PI3K είναι απαραίτητη για τη δράση της χιμαιρικής πρωτεΐνης NPM-ALK (Bai et al, 1998; Slupianek et al, 2001) και βασική για τη μιτογόνο και αγγειογενετική δράση της πλειοτροπίνης (Souttou et al, 2001 a). Η διαφοροποίηση των νευριτών μετά από πρόσδεση της πλειοτροπίνης στον ALK μπορεί να επιτευχθεί και μέσω του μονοπατιού των MAPK (Souttou et al, 2001 b), οι οποίες είναι υπεύθυνες και για την αντιαποπτωτική σηματοδότηση της πλειοτροπίνης στους ινοβλάστες (Bowden et al, 2002). Εικόνα 9: Σχηματική αναπαράσταση των μορίων που αλληλεπιδρούν με τον ALK μετά τη δέσμευση της πλειοτροπίνης και των δράσεων που ενεργοποιούνται (Mikelis et al, 2007) Βιολογικά ενεργά τμήματα της πλειοτροπίνης Η πλειοτροπίνη που παράγεται σε διαφορετικά συστήματα μπορεί να παρουσιάσει διαφορές ως προς τις βιολογικές δράσεις της (Kuo et al, 1990; Bohlen et al, 1991). Τα τρία επιπλέον αμινοξέα του αμινοτελικού άκρου, που 55

66 Εισαγωγή προκύπτουν από εναλλακτική πέψη του πεπτιδίου σινιάλου θεωρούνται ότι αυξάνουν τη σταθερότητα της πλειοτροπίνης (Delbe et al, 1995), ενώ δεν επηρεάζουν τη μιτογόνο δράση της (Bernard-Pierrot et al, 2001). Έκφραση της κωδικής αλληλουχίας που αντιστοιχεί στα αμινοξέα -31 έως +40 της πλειοτροπίνης λειτουργεί ανασταλτικά στην ογκογενετική δράση της πλειοτροπίνης στους ινοβλάστες και αναστέλλει τον ογκογενετικό φαινότυπο σε καρκινικά κύτταρα μαστού που εκφράζουν υψηλές ποσότητες πλειοτροπίνης (Zhang et al, 1997). Επιπλέον, έκφραση των πρώτων 40 αμινοξέων της πλειοτροπίνης αναστέλλει τη μεταγωγή σήματος που προκαλεί η πλειοτροπίνη στα U87MG κύτταρα γλοιώματος και προκαλώντας τετραπλοϊδία και ανευπλοϊδία αναστέλλει τα κύτταρα στη G1 φάση του κυτταρικού κύκλου, οδηγώντας τα σε απόπτωση (Chang et al, 2006). Ένα συνθετικό πεπτίδιο που αντιστοιχεί στα 43 αμινοξέα του καρβοξυτελικού άκρου της πλειοτροπίνης προκαλεί επαγωγή της δραστικότητας του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου, και κατ επέκταση της αγγειογένεσης (Kojima et al, 1995). Το καρβοξυτελικό μισό της πλειοτροπίνης επάγει την προέκταση των νευριτών στα πρότυπα ολόκληρου του μορίου (Inui et al, 2000), ενώ το αμινοτελικό δε φαίνεται να έχει καμία δράση (Inui et al, 2000). Τα αμινοξέα του καρβοξυτελικού άκρου της πλειοτροπίνης θεωρούνται το ενεργό τμήμα της όσον αφορά τη μιτογόνο δράση στα CHO-K1 κύτταρα (Bernard-Pierrot et al, 2001) και ενεργοποιούν και το μονοπάτι των MAP κινασών στα κύτταρα BEL (Souttou et al, 1997), ενώ τα αμινοξέα συμμετέχουν στην ογκογενετική δράση της πλειοτροπίνης (Bernard-Pierrot et al, 2001). Παρόλα αυτά, η πλειοτροπίνη που στερείται των αμινοξέων είναι ικανή να επάξει την προέκταση των νευριτών (Bernard-Pierrot et al, 2001). Η πλειοτροπίνη που στερείται τα 26 τελευταία αμινοξέα του καρβοξυτελικού άκρου δρα ως ενδογενής αναστολέας της μιτογόνου, αγγειογενετικής και ογκογενετικής δράσης της πλειοτροπίνης στα MDA-MB231 κύτταρα, δημιουργώντας μη λειτουργικό ετεροδιμερές με την κανονική μορφή (Bernard-Pierrot et al, 2002). Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι υπερέκφραση της συγκεκριμένης ισομορφής μειώνει τον επαγόμενο από πλειοτροπίνη πολλαπλασιασμό καρκινικών και ενδοθηλιακών κυττάρων και τα επίπεδα έκφρασης των VEGF-A και του HIF-1α. Επιπλέον, 56

67 Εισαγωγή υπερέκφραση της συγκεκριμένης ισομορφής αναστέλλει την ανάπτυξη όγκων και τη νεοαγγειογένεση in vivo (Duces et al, 2008). Το συνθετικό πεπτίδιο που περιλαμβάνει τα 26 αυτά αμινοξέα αναστέλλει τις βιολογικές δράσεις της πλειοτροπίνης, μέσω αναστολής της δέσμευσής της στο εξωκυτταρικό τμήμα του υποδοχέα ALK της πλειοτροπίνης (Bernard-Pierrot et al, 2002). Η β-δομή που εντοπίζεται στο καρβοξυτελικό μισό της πλειοτροπίνης είναι υπεύθυνη για την ανασταλτική της δράση στη μόλυνση με τον ιό HIV, αν και όταν υπάρχουν και οι δυο β-δομές της πλειοτροπίνης η δράση είναι ακόμα μεγαλύτερη, πιθανότατα λόγω συνεργιστικής δράσης ή πιο αποτελεσματικής στερεοδιαμόρφωσης που ευνοεί την πρόσδεση με τη νουκλεολίνη (Said et al, 2005). Υπερέκφραση του καρβοξυτελικού άκρου της πλειοτροπίνης (αμινοξέα ) στα SW13 κύτταρα οδηγεί στην επαγωγή αγγειογένεσης in vivo σε ίδια ποσοστά με την πλειοτροπίνη, ενώ αντίθετα στην υπερέκφραση του αμινοτελικού άκρου αν και δημιουργούνται όγκοι, εντούτοις δεν πραγματοποιείται αγγειογένεση (Zhang et al, 2006). Καθήλωση των πεπτιδίων που αντιστοιχούν στα αμινοξέα 1-21 και επάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε διάφορα είδη ενδοθηλιακών κυττάρων (Papadimitriou et al, 2000) και τα πεπτίδια αυτά παρουσιάζουν επαγωγή της αγγειογένεσης in vivo, καθώς και της μετανάστευσης των ενδοθηλιακών κυττάρων και του σχηματισμού ψευδαγγείων σε υπόστρωμα matrigel (Papadimitriou et al, 2001). Διάφορα πεπτίδια που προκύπτουν από πρωτεόλυση της πλειοτροπίνης μπορεί να έχουν διαφοροποιημένη ή και αντίθετη βιολογική δράση. Πέψη της πλειοτροπίνης από την πλασμίνη οδηγεί στην παραγωγή πέντε πεπτιδίων που αντιστοιχούν σε διαφορετικές περιοχές του μορίου. Τα πεπτίδια που περιέχουν μια από τις β-δομές επάγουν την αγγειογένεση in vitro, κάτι που δε φαίνεται να συμβαίνει σε πεπτίδια που περιέχουν και τις δυο β-δομές (Polykratis et al, 2004). Και οι δυο β-δομές απαιτούνται για την αλληλεπίδραση της πλειοτροπίνης με το VEGF165 (Heroult et al, 2004), κάτι που δικαιολογεί την ανασταλτική δράση των πεπτιδίων μέσω αλληλεπίδρασης με το VEGF165 και αναστολής της δράσης του. Παρόλα αυτά, χορήγηση των πεπτιδίων αυτών in vivo προκαλεί επαγωγή της 57

68 Εισαγωγή αγγειογένεσης με μηχανισμούς που δεν είναι απόλυτα διευκρινισμένοι (Polykratis et al, 2004). Προσπάθεια απομόνωσης της πλειοτροπίνης από τα HEK 293T κύτταρα οδήγησε στην απομόνωση δυο ισομορφών της πλειοτροπίνης με μοριακή μάζα 18 και 15 kda αντίστοιχα. Η ισομορφή των 15 kd στερείται των τελευταίων 12 αμινοξέων του καρβοξυτελικού άκρου και επάγει τον πολλαπλασιασμό κυττάρων γλοιώματος μέσω του ALK υποδοχέα της πλειοτροπίνης, ενώ ολόκληρο το μόριο επάγει τη μετανάστευση των ίδιων κυττάρων μέσω του υποδοχέα RPTPβ/ζ (Lu et al, 2005) Ο ρόλος της πλειοτροπίνης σε αγγειογένεση καρκίνο Η ανοσοϊστοχημική ανίχνευση και απομόνωση της πλειοτροπίνης από υψηλά αγγειώδεις ιστούς, όπως μήτρα βοός (Milner et al 1989) και αρουραίου (Vanderwinden et al, 1992) αποκάλυψε έναν πιθανό φυσιολογικό ρόλο της πλειοτροπίνης στην αγγειογένεση. Μια πληθώρα αναφορών δείχνουν μια θετική συσχέτιση ανάμεσα στην πλειοτροπίνη και στην in vivo και in vitro αγγειογένεση (Mikelis et al, 2007; Mikelis and Papadimitriou, 2008). H πλειοτροπίνη επάγει τη μετανάστευση ενδοθηλιακών (Papadimitriou et al, 2001; Brockman et al, 2003; Polykratis et al, 2005), αλλά και προγονικών ενδοθηλιακών κυττάρων (Heiss et al, 2008), ενώ η έκφρασή της επάγεται σημαντικά στα μεσαγγειακά νεφρικά κύτταρα που επάγονται για μετανάστευση (Martin et al, 2006). Επιπλέον, φαίνεται να επάγει τη διαφοροποίηση των μονοκυττάρων σε λειτουργικά ενδοθηλιακά κύτταρα (Sharifi et al, 2006). Σε εμβρυικά σωμάτια (embryoid bodies) που υπολείπονται σε έκφραση του FGFR-1 αυξάνεται η αγγείωσή τους μέσω επαγωγής της έκφρασης της πλειοτροπίνης (Magnusson et al, 2007). Αναφορικά με τα in vivo συστήματα της αγγειογένεσης, η πλειοτροπίνη επάγει την αγγειογένεση στο in vivo μοντέλο της χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης του εμβρύου όρνιθας (CAM) (Papadimitriou et al, 2001) και σε ενθέσεις υποστρώματος matrigel στα ποντίκια (Bernard-Pierrot et al, 2002). Επιπλέον, η πλειοτροπίνη αποτελεί έναν από τους αυξητικούς παράγοντες των οποίων η έκφραση συσχετίζεται με αύξηση της αγγειογένεσης στο in vivo μοντέλο της CAM (Polytarchou et al, 2004). 58

69 Εισαγωγή Εκτός όμως από το ρόλο της πλειοτροπίνης στη φυσιολογική αγγειογένεση, που προαναφέραμε, η πλειοτροπίνη θεωρείται παράγοντας που επάγει την παθολογική αγγειογένεση και την ανάπτυξη των όγκων. Πιο συγκεκριμένα, υπερέκφραση της πλειοτροπίνης σε φυσιολογικά κύτταρα οδηγεί σε αύξηση του πολλαπλασιασμού τους, σε ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη και δημιουργία όγκων σε ποντίκια (Fang et al, 1992; Chauhan et al, 1993). Αύξηση της έκφρασης της πλειοτροπίνης επάγει την ανάπτυξη καρκίνου του μαστού στα ποντίκια, πιθανότατα μέσω ενεργοποίησης του μικροπεριβάλλοντος των κυττάρων του στρώματος (Chang et al, 2007). Στην ίδια λογική, αναστολή της έκφρασης της πλειοτροπίνης σε κύτταρα χοριοκαρκινώματος ανέστειλε την ανάπτυξη των όγκων και της μετάστασης σε αθυμικά ποντίκια (Schulte et al, 1996). Χρήση ριβοενζύμων σε ανθρώπινα κύτταρα μελανώματος ανέστειλε, πέρα από την έκφραση της πλειοτροπίνης, τη δημιουργία αποικιών, την ανάπτυξη του όγκου και την αγγειογένεση σε αθυμικά ποντίκια (Czubayko et al, 1994; 1996). Αναστολή της έκφρασης της πλειοτροπίνης σε κύτταρα μελανώματος συνάδει με την αναστολή της κυκλίνης Ε, ρυθμιστή του κυτταρικού κύκλου, και με την αύξηση της έκφρασης του αναστολέα του κυτταρικού κύκλου p21 WAF1/Cip1 (Satyamoorthy et al, 2000), και με την αναστολή της ανάπτυξης όγκων μελανώματος σε αθυμικά ποντίκια (Malerczyk et al, 2005). Η αναστολή της έκφρασης της πλειοτροπίνης με ριβοένζυμα αποκαλύπτει το ρυθμιστικό ρόλο της πλειοτροπίνης και στα γλοιοβλαστώματα (Grzelinski et al, 2005; 2006). Παρόλα αυτά, το γεγονός ότι η πλειοτροπίνη δεν επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των ίδιων των κυττάρων γλοιώματος αυτών καθαυτών, αλλά επάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων της μικρογλοίας οδηγεί στην υπόθεση ότι η πλειοτροπίνη μπορεί να δρα ως ένας παρακρινής αυξητικός/αγγειογενετικός παράγοντας, ο οποίος παράγεται από τα γλοιώματα και συμβάλλει στην κακοήθειά τους στοχεύοντας ενδοθηλιακά και μικρογλοιακά κύτταρα (Mikelis et al, 2007). Βέβαια, σήμερα έχει αποδειχθεί ότι η πλειοτροπίνη δρα και ως αυτοκρινής και ως παρακρινής αυξητικός παράγοντας. Αναστολή της έκφρασης της πλειοτροπίνης στα ανθρώπινα κύτταρα από καρκίνο προστάτη LNCaP μειώνει την ανάπτυξη και τη μετανάστευσή τους και τη δυνατότητα να επάγουν 59

70 Εισαγωγή αγγειογένεση in vitro και in vivo (Hatziapostolou et al, 2005). Επιπλέον, ενεργοποίηση, στα ίδια κύτταρα, του FGFR (fibroblast growth factor receptor, υποδοχέας του αυξητικού παράγοντα των ινοβλαστών) από τον FGF2 (fibroblast growth factor 2, αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών 2) επάγει την έκφραση και έκκριση της πλειοτροπίνης και τελικά τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευσή τους, φανερώνοντας επιπλέον τη συνεργατική δράση της πλειοτροπίνης και του FGF2 (Hatziapostolou et al, 2006). Πέρα από τη χαρακτηρισμένη επαγωγική δράση της πλειοτροπίνης, πρόσφατα δεδομένα της αποδίδουν ανασταλτικό ρόλο στην ανάπτυξη του όγκου και της αγγειογένεσης. Είναι γνωστό ότι η έκφρασή της αυξάνεται σε κυτταρικές καλλιέργειες όταν η κυτταρική ανάπτυξη φθάνει σε επίπεδα κορεσμού ή σε κύτταρα που δεν πολλαπλασιάζονται (Papadimitriou et al, 2004). Επίσης έχει χαρακτηρισθεί η δέσμευση της πλειοτροπίνης με το VEGF και η επακόλουθη αναστολή που αυτή προκαλεί στη βιολογική του δράση (Heroult et al, 2004). Η πλειοτροπίνη έχει χαρακτηρισθεί ως αγγειοστατικός παράγοντας σε ένα in vivo μοντέλο νευροβλαστώματος (Calvet et al, 2006). Αναστολή της έκφρασης της πλειοτροπίνης στα C6 κύτταρα γλοιώματος οδηγεί σε αύξηση του πολλαπλασιασμού, της μετανάστευσης και ανάπτυξης in vitro και επαγωγή της αγγειογένεσης in vivo και in vitro (Parthymou et al, 2008). Φαίνεται λοιπόν ότι η πλειοτροπίνη δεν παρουσιάζει μόνο ποικιλία στις βιολογικές δράσεις, αλλά και στις αποκρίσεις της πάνω σε συγκεκριμένες βιολογικές δράσεις. Απαιτούνται πειράματα προκειμένου να αποσαφηνισθεί ο ρόλος της, να εξηγηθεί ο μηχανισμός της και να χαρακτηρισθούν οι παράγοντες που ορίζουν αυτήν την ποικιλομορφία στη δράση της. Η παρούσα εργασία ίσως να αποτελεί ένα μικρό βήμα στην αποσαφήνιση αυτών των παραγόντων. 4. Midkine Η midkine αποτελεί, όπως προαναφέρθηκε, τον άλλο αυξητικό παράγοντα της οικογένειας των αυξητικών παραγόντων όπου ανήκει και η πλειοτροπίνη. Η midkine βρέθηκε να είναι το προϊόν ενός γονιδίου που επάγεται από το ρετινοϊκό οξύ κατά τη διαφοροποίηση εμβρυικών καρκινικών κυττάρων (Kadomatsu et al, 60

71 Εισαγωγή 1988). Η Midkine που εκφράζεται στα πτηνά ονομάζεται RIHB (Vigny et al, 1989). H midkine και η πλειοτροπίνη μοιράζονται πολλές βιολογικές δράσεις, αλλά έχει και η καθεμία τις δικές της. Και η midkine έχει 10 υψηλά συντηρημένες κυστεΐνες και πολλά βασικά αμινοξέα στο μόριό της. Η midkine παρουσιάζει 55% αμινοξική ομολογία με την πλειοτροπίνη, και οι δυο αποτελούνται από αντίστοιχες αμινο- και καρβοξυτελικές περιοχές, ενώ οι μέχρι στιγμής αναλύσεις έχουν δείξει ότι η τρισδιάστατη δομή τους είναι παρόμοια. Κάθε δομή αποτελείται από τρεις αντιπαράλληλες β-πτυχές, οι δυο δομές ενώνονται με έναν εύκαμπτο συνδέτη και τα αμινο και καρβοξυτελικό άκρα είναι ευλύγιστα (Iwasaki et al, 1997; Kilpelainen et al, 2000). Η midkine έχει ικανότητα πρόσδεσης στην Ν-συνδεκάνη, όπως και η πλειοτροπίνη (Nakanishi et al, 1997). Οι αλυσίδες θειικής χονδροϊτίνης του υποδοχέα RPTPβ/ζ αποτελούν σημείο πρόσδεσης, εκτός της πλειοτροπίνης και της midkine. Η midkine παρουσιάζει συγγένεια πρόσδεσης 0.56 nm στον RPTPβ/ζ, ενώ η ικανότητα δέσμευσής της σε αυτόν καθορίζει λειτουργίες, όπως η κυτταρική μετανάστευση (Maeda et al, 1999). Η midkine, μέσω του RPTPβ/ζ, ενεργοποιεί την PI3K και τις ERK για τη μετανάστευση των οστεοβλαστών και την επιβίωση των νευριτών (Qi et al, 2001; Sakaguchi et al, 2003). Ο ALK αποτελεί επίσης ένα κοινό υποδοχέα και για τους δυο αυξητικούς παράγοντες (Stoica et al, 2002). Ο τέταρτος υποδοχέας για τη midkine είναι ο LPR (LDL receptor-related protein, πρωτεΐνη που σχετίζεται με τον υποδοχέα της LDL). Ο LRP έχει ανιχνευθεί ως μια πρωτεΐνη της κυτταρικής μεμβράνης που αλληλεπιδρά με τη midkine και συμμετέχει στην αντιαποπτωτική δράση της (Muramatsu et al, 2000). Πρόσδεση της midkine στον LRP έχει ως αποτέλεσμα την ενδοκυττάρωσή της, διαδικασία που είναι απαραίτητη για την άσκηση της αντιαποπτωτικής δράσης της midkine (Shibata et al, 2002). Η μεταφορά της midkine στον πυρήνα επιτυγχάνεται μέσω της νουκλεολίνης (Shibata et al, 2002). Αλληλεπίδραση της midkine με τους τέσσερις υποδοχείς της (Ν-συνδεκάνη, RPTPβ/ζ, ALK και LRP) μπορεί να οδηγήσει σε ενεργοποίηση μονοπατιών μεταγωγής σήματος και συγκεκριμένη βιολογική δράση, αν και οι μηχανισμοί ακόμα δεν έχουν πλήρως διαλευκανθεί. 61

72 Εισαγωγή Μια βασική λειτουργία της midkine, όπως και της πλειοτροπίνης, είναι η επαγωγή της προέκτασης των νευριτών (Maeda et al, 1999). Η έντονη έκφρασή της στο νευρικό σύστημα λαμβάνει χώρα από τα πρώιμα στάδια ανάπτυξης, αν και δεν παρουσιάζει το ίδιο πρότυπο έκφρασης με την πλειοτροπίνη. Η έκφρασή της είναι σημαντική για την ανάπτυξη της νευρομυϊκής σύναψης (Zhou et al, 1997), παρουσιάζει νευροπροστατευτικό ρόλο (Owada et al, 1999) και συμμετέχει σε νευροεκφυλιστικές ασθένειες (Kadomatsu and Muramatsu, 2004). Συμμετέχει επίσης στην ανάπτυξη των πνευμόνων, νεφρών και οστών (Kadomatsu and Muramatsu, 2004). Το πρότυπο έκφρασης της midkine, όπως και της πλειοτροπίνης, αυξάνει την πιθανότητα η midkine να διαδραματίζει βασικό ρόλο στον καρκίνο. Η έκφραση της midkine είναι μεγάλη τόσο στον καρκίνο, όσο και στα αρχικά στάδια της καρκινογένεσης (Ye et al, 1999; Konishi et al, 1999). Ενώ έχει πολύ περιορισμένη έκφραση σε ιστούς στον ενήλικο οργανισμό, εντούτοις παρουσιάζει ένα πολύ ευρύ πρότυπο έκφρασης σε διάφορους καρκίνους, πιο ευρύ και από της πλειοτροπίνης. Σε καρκίνο του πνεύμονα παρουσιάζει έντονη έκφραση σε στάδια που η πλειοτροπίνη ανιχνεύεται αμυδρά έως καθόλου (Garver et al, 1993). Το χαρακτηριστικό της midkine να εκφράζεται πολύ συχνά και έντονα σε κακοήθεις όγκους, ανεξάρτητα από τον ιστό, την κάνει υποψήφιο μόριο για χρήση ως καρκινικός δείκτης (Kadomatsu and Muramatsu, 2004). Τέλος, μελέτες στην έκφραση της πλειοτροπίνης ή της midkine σε ποντίκια που δεν εκφράζουν midkine ή πλειοτροπίνη αντίστοιχα έδειξε ότι η midkine ρυθμίζει τη γονιδιακή έκφραση της πλειοτροπίνης με υψηλό βαθμό εξειδίκευσης για κάθε όργανο. Το γεγονός αυτό δείχνει ότι η έκφραση της πλειοτροπίνης ακολουθεί την έκφραση της midkine αναπτυξιακά και ότι η αύξηση στην έκφραση της πλειοτροπίνης στα ποντίκια που δεν εκφράζουν τη midkine αποτελεί αντισταθμιστικό μηχανισμό για τις λειτουργίες που ελέγχονται από αυτή (Herradon et al, 2005). 62

73 ΣΚΟΠΟΣ

74

75 Σκοπός Σκοπός της εργασίας Η κυτταρική μετανάστευση αποτελεί μια βασική κυτταρική λειτουργία που είναι συνιστώσα μιας πληθώρας βιολογικών λειτουργιών, ανάμεσα στις οποίες σημαντική θέση κατέχει η αγγειογένεση. Η κυτταρική μετανάστευση επάγεται από αυξητικούς παράγοντες και ρυθμίζεται από αλληλεπιδράσεις μορίων της κυτταρικής μεμβράνης. Η πλειοτροπίνη (PTN) είναι ένας αυξητικός παράγοντας, ο οποίος επάγει την κυτταρική μετανάστευση αρκετών ειδών κυττάρων, ανάμεσα στα οποία είναι και τα ενδοθηλιακά (Mikelis et al., 2007). Έχει μοριακή μάζα 18 kda, παρουσιάζει υψηλή συγγένεια με την ηπαρίνη, και διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του νευρικού συστήματος και στην ανάπτυξη των όγκων. Η μιτογόνος δράση της πλειοτροπίνης, η ανίχνευση του mrna και της πρωτεΐνης της σε καρκινικές κυτταρικές σειρές και όγκους και η δράση της σε καρκινικά κύτταρα υποδεικνύουν το σημαντικό ρόλο που αυτή διαδραματίζει στην ανάπτυξη του καρκίνου. Πέρα από την άμεση δράση της πλειοτροπίνης στα καρκινικά κύτταρα, μια πληθώρα αναφορών συσχετίζουν τη δράση της με την in vivo και in vitro αγγειογένεση (Mikelis et al, 2007, Mikelis and Papadimitriou, 2008). Παρόλα αυτά, οι υποδοχείς της πλειοτροπίνης που συμμετέχουν σε αυτές τις αγγειογενετικές διαδικασίες δεν έχουν αποσαφηνισθεί πλήρως. Σε προηγούμενη μελέτη της ερευνητικής μας ομάδας διαπιστώθηκε ότι η πλειοτροπίνη επάγει τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων μέσω του υποδοχέα της RPTPβ/ζ (Polykratis et al, 2005). O RPTPβ/ζ είναι μια πρωτεογλυκάνη θειικής χονδροϊτίνης, η οποία εκφράζεται σε τέσσερις ισομορφές, δυο διαμεμβρανικές και δυο εκκρινόμενες (Garwood et al, 2003). Αρκετοί προσδέτες δεσμεύονται στην εξωκυτταρική περιοχή του RPTPβ/ζ, ανάμεσά τους αυξητικοί παράγοντες, μόρια εξωκυττάριας ύλης και μόρια κυτταρικής προσκόλλησης (Garwood et al, 2003). Πρόσφατα ο RPTPβ/ζ βρέθηκε να συνεντοπίζεται με τις ιντεγκρίνες α 6 β 1 και α 4 β 1 και αυτό το πολυμοριακό σύμπλοκο φαίνεται να ρυθμίζει την επαγόμενη από τη midkine μετανάστευση των οστεοβλαστών (Muramatsu et al, 2004). Οι ιντεγκρίνες αποτελούν μια οικογένεια διαμεμβρανικών υποδοχέων που ρυθμίζουν διακυτταρικές αλληλεπιδράσεις και αλληλεπιδράσεις κυττάρων με 63

76 Σκοπός εξωκυττάρια ύλη. Κάθε ιντεγκρίνη συνιστά ένα ετεροδιμερές που αποτελείται από μια α και μια β αλυσίδα (Hynes, 2002). Οι αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στις ιντεγκρίνες και στους προσδέτες τους είναι σημαντικές για έναν αριθμό κυτταρικών διαδικασιών, όπως προσκόλληση, μετανάστευση, πολλαπλασιασμός, διαφοροποίηση και επιβίωση (Hodivala-Dilke, 2003). Μια από τις πιο σημαντικές ιντεγκρίνες, η α ν β 3, εκφράζεται σε ιστούς μεσεγχυματικής προέλευσης και παρουσιάζει την πιο σημαντική de novo έκφραση κατά την αγγειογένεση. Εκφράζεται στην επιφάνεια αγγειογενετικών ενδοθηλιακών κυττάρων και παρουσιάζει έντονο πρότυπο έκφρασης κατά την εμβρυογένεση, ενώ στον ενήλικα, η έκφραση περιορίζεται σε αγγειογενετικά ενδοθηλιακά και λεία μυϊκά κύτταρα και σε μερικούς πληθυσμούς αιμοποιητικών κυττάρων. Εκτός από τα μόρια της εξωκυττάριας ύλης, η ιντεγκρίνη α ν β 3, αποτελεί συνυποδοχέα για μια σειρά υποδοχέων (Stupack and Cheresh, 2004), όπως υποδοχείς με δράση κινάσης τυροσίνης (Borges et al, 2000), και του RPTPα, οδηγώντας σε ενεργοποίηση της c-src (von Wichert et al, 2003; Vulin et al, 2005). Επειδή το μονοπάτι σηματοδότησης που ρυθμίζει την επαγόμενη από πλειοτροπίνη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων περιλαμβάνει μόρια που εμπλέκονται στην κυτταρική μετανάστευση που ρυθμίζεται από τις ιντεγκρίνες, σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση του πιθανού ρόλου των ιντεγκρινών α ν β 3 και α 5 β 1 στην επαγόμενη από την πλειοτροπίνη κυτταρική μετανάστευση. Επιπλέον, στο πλαίσιο της μελέτης της σχέσης δομήςδράσης της πλειοτροπίνης, διερευνήθηκε το τμήμα του μορίου της πλειοτροπίνης που συμμετέχει στην αλληλεπίδρασή της με μόρια της κυτταρικής μεμβράνης που εμπλέκονται στην επαγόμενη από πλειοτροπίνη κυτταρική μετανάστευση. 64

77 ΜΕΘΟΔΟΙ

78

79 Μέθοδοι 1. Παραγωγή και απομόνωση ανθρώπινης ανασυνδυασμένης πλειοτροπίνης Η παραγωγή και η απομόνωση ανθρώπινης ανασυνδυασμένης πλειοτροπίνης πραγματοποιήθηκε σε βακτηριακά κύτταρα Escherichia coli κλώνου BL-21 και υποκλώνου DE3pLys(S). O κλώνος BL-21 έχει καλή απόδοση σε έκφραση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών και, ως κλώνος της ομάδας Β, στερείται των κύριων πρωτεϊνασών που κωδικοποιούνται από τα γονίδια Ion και ompt, και καταλύει την ενδοπρωτεολυτική αποικοδόμηση κατεστραμμένων και ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών του κυττάρου (GST Gene Fusion System Handbook, Amersham Biosciences). O υποκλώνος DE3 περιέχει και ένα χρωμοσωματικό αντίγραφο του γονιδίου της Τ7 RNA πολυμεράσης και είναι κατάλληλος για παραγωγή πρωτεϊνών με επαγωγή με IPTG, ενώ τα κύτταρα με plys(s) εκφράζουν επιπλέον τη λυσοζύμη Τ7, που μειώνει τη βασική έκφραση της Τ7 RNA πολυμεράσης πριν την επαγωγή, προσδίδοντας μεγαλύτερη ανθεκτικότητα σε έκφραση πρωτεϊνών που επηρεάζουν την ανάπτυξη και τη βιωσιμότητα των κυττάρων, ενώ παρουσιάζει αντίσταση στη χλωραμφενικόλη και κατά συνέπεια μεγαλύτερο έλεγχο της παραγόμενης πρωτεΐνης (Novagen, Cat No 69451; Stratagene, Cat No ). Τα βακτήρια μετασχηματίστηκαν με πλασμίδιο που φέρει την ανθρώπινη αλληλουχία της πλειοτροπίνης. Για βελτιστοποίηση της απομόνωσης της πλειοτροπίνης χρησιμοποιήθηκε η τεχνολογία της Amersham για την απομόνωση πρωτεϊνών μέσω σύζευξής τους με την πρωτεΐνη Τρανσφεράση της Γλουταθειόνης ή GST (Glutathione-S- Transferase). Η πρωτεΐνη GST έχει μοριακή μάζα 26 kda, προέρχεται από το Schistosoma japonicum και όταν εκφράζεται στην Escherichia coli παρουσιάζει πλήρη ενζυμική δραστικότητα. Οι πρωτεΐνες που παράγονται σε σύντηξη με την GST παρουσιάζουν το χαρακτηριστικό να δεσμεύονται ειδικά σε γλουταθειόνη, οπότε μπορεί να επιτευχθεί αποτελεσματική απομόνωσή τους με χρωματογραφία συγγένειας (Gearing et al., 1989). Πραγματοποιήθηκε υποκλωνοποίηση της ανθρώπινης αλληλουχίας της πλειοτροπίνης στo πλασμίδιο-φορέα pgex-6p-1 (Εικόνα Μ1). Έτσι, από το πλασμίδιο pgex-6p-1 εκφράζεται μια χιμαιρική πρωτεΐνη, που αποτελείται από 65

80 Μέθοδοι την πρωτεΐνη GST αμινοτελικά και από την πλειοτροπίνη καρβοξυτελικά. Ανάμεσα στις δυο πρωτεϊνικές αλληλουχίες υπάρχει μια περιοχή, η οποία πέπτεται ειδικά από μια πρωτεϊνάση (PreScission Protease) που επίσης έχει την ικανότητα δέσμευσης στη γλουταθειόνη, όπως η GST. Με τον τρόπο αυτό, ά επιτυγχάνεται πλήρης καθαρισμός της πλειοτροπίνης, αφού τόσο η πρωτεΐνη GST, όσο και η πρωτεϊνάση δεσμεύονται στη στήλη κατά την έκλουση. Εικόνα Μ1: Σχηματική απεικόνιση της γενικής δομής των πλασμιδίων pgex και συγκεκριμένα της περιοχής πολλαπλών κλωνοποιήσεων (Multiple Cloning Site, MCS) του πλασμιδίου pgex-6p-1, που χρησιμοποιήθηκε. Διακρίνονται τα πλαίσια ανάγνωσης και τα βασικά χαρακτηριστικά του πλασμιδίου (GST Fusion System Handbook, Amersham Biosciences). 66

81 Μέθοδοι 1.1. Ανάπτυξη βακτηριακών κυττάρων σε στερεή καλλιέργεια (Hanahan, 1985) Υλικά και διαλύματα Στερεό θρεπτικό μέσο για ανάπτυξη βακτηρίων LB-agar Άγαρ (bacto-agar) 1.5% κ.β. σε θρεπτικό μέσο LB Το διάλυμα αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο) και αποχύνεται στα τρυβλία ανάπτυξης των βακτηρίων. Το θρεπτικό μέσο στερεοποιείται όταν η θερμοκρασία του φθάσει στους 40 o C. Διάλυμα Αμπικιλλίνης 50 mg/ml (σε νερό) Το διάλυμα αποστειρώνεται με διοχέτευσή του μέσα από φίλτρο με πόρους διαμέτρου 0.2 μm. Διάλυμα Χλωραμφενικόλης 50 mg/ml (σε νερό) Το διάλυμα αποστειρώνεται με διοχέτευσή του μέσα από φίλτρο με πόρους διαμέτρου 0.2 μm Πειραματική πορεία Όταν το θρεπτικό μέσο βρίσκεται σε θερμοκρασία περίπου 60 ο C και πριν στερεοποιηθεί, προστίθενται αντιβιοτικά (αμπικιλλίνη ή/και χλωραμφενικόλη) σε τελική συγκέντρωση 0.1 mg/ml. Σε σωληνάριο με παγωμένα βακτηριακά κύτταρα εμβαπτίζεται αποστειρωμένος μικροβιολογικός κρίκος και επιστρώνονται τα βακτηριακά κύτταρα που μεταφέρει, με οφιοειδείς κινήσεις, σε τρυβλία με στερεοποιημένο θρεπτικό μέσο. Τα τρυβλία επωάζονται ανεστραμμένα για 16 ώρες στους 37 ο C (Hanahan, 1985). 67

82 Μέθοδοι 1.2. Ανάπτυξη βακτηριακών κυττάρων σε υγρή καλλιέργεια (Hanahan, 1985) Υλικά και διαλύματα Υγρό θρεπτικό μέσο για ανάπτυξη βακτηρίων LB (Luria-Bertani) medium Εκχύλισμα ζύμης 0.5% κ.β. Βακτο-τρυπτόνη 1% κ.β. NaCl 1% κ.β. Ανάδευση μέχρι να διαλυθούν. Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται με καυστικό νάτριο (NaOH) 1Μ στο 7.0 και το διάλυμα αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Διάλυμα Αμπικιλλίνης 50 mg/ml (σε νερό) Διάλυμα Χλωραμφενικόλης 50 mg/ml (σε νερό) Πειραματική πορεία Μονήρεις αποικίες βακτηρίων που αναπτύσσονται σε στερεή καλλιέργεια μεταφέρονται (με τη βοήθεια αποστειρωμένου ακρορρυγχίου) σε υγρό θρεπτικό μέσο ανάπτυξης βακτηριών (εμβολιασμός). Ο εμβολιασμός πραγματοποιείται σε αποστειρωμένα σωληνάρια των 50 ml με 10 ml υγρού θρεπτικού μέσου, παρουσία αμπικιλλίνης ή και χλωραμφενικόλης σε τελική συγκέντρωση 0.1 mg/ml (Hanahan, 1985). Οι υγρές καλλιέργειες επωάζονται για 16 ώρες στους 37 ο C ή 25 ο C αντίστοιχα υπό συνεχή ανακίνηση. 68

83 Μέθοδοι 1.3. Κατάψυξη βακτηριακών κυττάρων (Hanahan, 1985) Υλικά και διαλύματα Στερεό θρεπτικό μέσο για ανάπτυξη βακτηρίων LB-agar Άγαρ (bacto-agar) 1.5% κ.β. σε θρεπτικό μέσο LB Το διάλυμα αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο) και αποχύνεται στα τρυβλία ανάπτυξης των βακτηρίων. Το θρεπτικό μέσο στερεοποιείται όταν η θερμοκρασία του φθάσει στους 40 o C. Υγρό θρεπτικό μέσο LB (Luria-Bertani) για ανάπτυξη βακτηρίων Εκχύλισμα ζύμης 0.5% κ.β. Βακτο-τρυπτόνη 1% κ.β. NaCl 1% κ.β. Ανάδευση μέχρι να διαλυθούν. Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται με καυστικό νάτριο (NaOH) 1Μ στο 7.0 και το διάλυμα αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Διάλυμα αποστειρωμένης γλυκερόλης Διάλυμα γλυκερόλης αποστειρώνεται για 20 min σε 121 ο C (αυτόκαυστο) είτε με διέλευσή του από βακτηριοστατικό φίλτρο. Πειραματική πορεία 1. Επιστρώνεται τρυβλίο ανάπτυξης βακτηρίων με στερεό θρεπτικό μέσο (LB-άγαρ) και αφήνεται σε θερμοκρασία δωματίου να στερεοποιηθεί. 2. Πραγματοποιείται εμβολιασμός του με βακτηριακά κύτταρα και επώαση στους 37 ο C για 16 ώρες (παρουσία αντιβιοτικών, όπου χρειάζεται). 3. Πραγματοποιείται εμβολιασμός μονήρους αποικίας σε αποστειρωμένο σωληνάριο των 50 ml με 10 ml υγρού θρεπτικού μέσου και επώαση στους 37 ο C υπό ανάδευση για 16 ώρες (παρουσία αντιβιοτικών, όπου χρειάζεται). 4. Μεταφορά υπό άσηπτες συνθήκες 100 μl από την υγρή καλλιέργεια σε αποστειρωμένο σωληνάριο των 50 ml με 10 ml υγρού θρεπτικού μέσου και 69

84 Μέθοδοι επώαση στους 37 ο C υπό ανάδευση με παρακολούθηση της οπτικής απορρόφησης (παρουσία αντιβιοτικών, όπου χρειάζεται). 5. Όταν η οπτική απορρόφηση της καλλιέργειας (Α=600 nm) γίνει 0.4 πραγματοποιείται μεταφορά υπό άσηπτες συνθήκες 0.8 ml υγρής καλλιέργειας σε αποστειρωμένα σωληνάρια φυγοκέντρου. 6. Προσθήκη 0.2 ml διαλύματος αποστειρωμένης γλυκερόλης ανά σωληνάριο. 7. Σύντομη ανάδευση σε αναδευτήρα τύπου vortex. 8. Άμεση κατάψυξη (-80 ο C) Εισαγωγή του πλασμιδιακού DNA σε βακτήρια Παρασκευή επιδεκτικών κυττάρων για μετασχηματισμό (competent cells) (Inoue et al, 1990) Προκειμένου να επιτευχθεί η εισαγωγή του πλασμιδιακού DNA στα βακτήρια, πρέπει αυτά να υποστούν μια διαδικασία που θα διευκολύνει την είσοδο του πλασμιδίου. Υλικά και διαλύματα Βακτήρια Escherichia Coli BL-21 DE3pLys(S) Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Στερεό θρεπτικό μέσο για ανάπτυξη βακτηρίων LB-agar Άγαρ (bacto-agar) 1.5% κ.β. σε θρεπτικό μέσο LB Το διάλυμα αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο) και αποχύνεται στα τρυβλία ανάπτυξης των βακτηρίων. Το θρεπτικό μέσο στερεοποιείται όταν η θερμοκρασία του φθάσει στους 40 o C. 70

85 Μέθοδοι Υγρό θρεπτικό μέσο LB (Luria-Bertani) για ανάπτυξη βακτηρίων Εκχύλισμα ζύμης 0.5% κ.β. Βακτο-τρυπτόνη 1% κ.β. NaCl 1% κ.β. Ανάδευση μέχρι να διαλυθούν. Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται με καυστικό νάτριο (NaOH) 1Μ στο 7.0 και το διάλυμα αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Διάλυμα ΤΒ HEPES 10 mm ph 6.7 CaCl 2 15 mm MnCl 2 55 mm KCl 250 mm Τα υλικά πλην του MnCl 2 αναδεύονται και το ph ρυθμίζεται με καυστικό κάλιο (ΚΟΗ) στο 6.7. Ακολουθεί προσθήκη MnCl 2 και αποστείρωση με χρήση βακτηριοστατικού φίλτρου. Πειραματική πορεία 1. Επιστρώνεται τρυβλίο ανάπτυξης βακτηρίων με στερεό θρεπτικό μέσο LBάγαρ και αφήνεται σε θερμοκρασία δωματίου να στερεοποιηθεί. 2. Πραγματοποιείται εμβολιασμός του τρυβλίου με κύτταρα του βακτηρίου Escherichia coli του στελέχους BL-21 και επώαση στους 37 ο C για 16 ώρες. 3. Μια μονήρης αποικία από το τρυβλίο μεταφέρεται υπό άσηπτες συνθήκες σε αποστειρωμένο σωληνάριο με 5 ml υγρό θρεπτικό μέσο καλλιέργειας βακτηρίων και επωάζεται υπό ανάδευση στους 37 ο C για 16 ώρες. 4. Σε 200 ml υγρού θρεπτικού μέσου LB προστίθενται 2 ml αποστειρωμένο MgCl 2, πραγματοποιείται εμβολιασμός με 2 ml από την υγρή καλλιέργεια και ακολουθεί επώαση υπό ανάδευση στους 37 ο C μέχρι η οπτική απορρόφηση της καλλιέργειας να φθάσει στα 600 nm. 5. Η καλλιέργεια τοποθετείται στον πάγο για 10 λεπτά. 6. Ακολουθεί συλλογή των κυττάρων με φυγοκέντρηση της καλλιέργειας στα g για 10 λεπτά στους 4 ο C. 71

86 Μέθοδοι 7. Το ίζημα των βακτηριακών κυττάρων επαναιωρείται σε 30 ml παγωμένου διαλύματος ΤΒ και επωάζεται στον πάγο για 10 λεπτά. 8. Τα κύτταρα φυγοκεντρούνται πάλι στα g για 10 λεπτά στους 4 ο C. 9. Το ίζημα των κυττάρων επαναιωρείται σε 8 ml ΤΒ με DMSO 7% με ήπια ανάδευση και επωάζεται στον πάγο για 10 λεπτά. 10. Τα κύτταρα μοιράζονται σε κλάσματα των 200 μl σε παγωμένα σωληνάρια τύπου eppendorf και ακολουθεί αποθήκευσή τους στους -80 ο C Μετασχηματισμός δεκτικών βακτηριακών κυττάρων (transformation) (Hanahan, 1985) Μετασχηματισμός (transformation) ονομάζεται η εισαγωγή του υπό μελέτη πλασμιδίου στα δεκτικά βακτήρια. Υλικά και διαλύματα Υγρό θρεπτικό μέσο LB (Luria-Bertani) για ανάπτυξη βακτηρίων Εκχύλισμα ζύμης 0.5% κ.β. Βακτο-τρυπτόνη 1% κ.β. NaCl 1% κ.β. Ανάδευση μέχρι να διαλυθούν. Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται με καυστικό νάτριο (NaOH) 1Μ στο 7.0 και το διάλυμα αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Στερεό θρεπτικό μέσο για ανάπτυξη βακτηρίων LB-agar Άγαρ (bacto-agar) 1.5% κ.β. σε θρεπτικό μέσο LB Το διάλυμα αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο) και αποχύνεται στα τρυβλία ανάπτυξης των βακτηρίων. Το θρεπτικό μέσο στερεοποιείται όταν η θερμοκρασία του φθάσει στους 40 o C. 72

87 Μέθοδοι Υγρό θρεπτικό μέσο SOB για ανάπτυξη βακτηρίων Βακτο-τρυπτόνη 2% κ.β. Εκχύλισμα ζύμης 0.5% κ.β. NaCl 0.05% KCl 2.5 mm MgCl 2 10 mm Ανάδευση όλων πλην του MgCl 2 μέχρι να διαλυθούν. Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται με καυστικό νάτριο (NaOH) 1Μ στο 7.0 και το διάλυμα αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Το διάλυμα διατηρείται στους 4 ο C και λίγο πριν τη χρήση γίνεται προσθήκη αποστειρωμένου διαλύματος MgCl 2 μέχρι τελικής συγκέντρωσης 10 mm. Υγρό θρεπτικό μέσο SOC για ανάπτυξη βακτηρίων Γλυκόζη 1Μ Προσθήκη στο SOB 20 ml αποστειρωμένου διαλύματος γλυκόζης 1Μ ανά λίτρο καλλιέργειας. Το διάλυμα της γλυκόζης αποστειρώνεται με τη χρήση βακτηριοστατικού φίλτρου και το διάλυμα SOB πρέπει να βρίσκεται σε θερμοκρασία 60 ο C κατά την προσθήκη του διαλύματος γλυκόζης. Το διάλυμα διατηρείται στους 4 ο C. Διάλυμα αμπικιλλίνης 50 mg/ml (σε νερό) Το διάλυμα αποστειρώνεται με διοχέτευσή του μέσα από φίλτρο με πόρους διαμέτρου 0.2 μm. Διάλυμα χλωραμφενικόλης 50 mg/ml (σε νερό) Το διάλυμα αποστειρώνεται με διοχέτευσή του μέσα από φίλτρο με πόρους διαμέτρου 0.2 μm. Πειραματική πορεία 1. Σωληνάριο που περιέχει 200 μl δεκτικών βακτηρίων μεταφέρεται από τους -80 ο C σε πάγο. Είναι σημαντικό η θερμοκρασία των βακτηριακών κυττάρων να μην υπερβεί τους 0 ο C. 2. Μοιράζεται η ποσότητα των βακτηρίων σε δυο αποστειρωμένα σωληνάρια, εκ των οποίων το ένα θα χρησιμοποιηθεί και το άλλο θα επιστρέψει στους -80 ο C. 73

88 Μέθοδοι 3. Στο σωληνάριο που θα χρησιμοποιηθεί, και το οποίο παραμένει στον πάγο, μεταφέρεται 1 μl πλασμιδιακού DNA. 4. Πραγματοποιείται ήπια ανάδευση με το χέρι (flicking). 5. Το σωληνάριο επωάζεται στον πάγο για 30 λεπτά. 6. Στη συνέχεια μεταφέρεται σε υδατόλουτρο με θερμοκρασία 42 ο C. Επωάζεται εκεί για 90 δευτερόλεπτα. 7. Αμέσως μεταφέρεται στον πάγο, όπου επωάζεται για 2 λεπτά. 8. Σε αποστειρωμένο σωληνάριο των 15 ml που περιέχει 1 ml υγρού θρεπτικού μέσου SOC προστίθεται το εναιώρημα των κυττάρων. 9. Ακολουθεί επώαση στους 37 ο C για 1 ώρα υπό ανάδευση. 10. Παρασκευάζεται τρυβλίο με στερεό θρεπτικό μέσο για την ανάπτυξη των βακτηρίων. Στο θρεπτικό μέσο λίγο πριν (όταν η θερμοκρασία είναι ανεκτή από το χέρι) αλλά και μετά τον πολυμερισμό του προστίθεται αμπικιλλίνη, ώστε η τελική συγκέντρωσή της στο θρεπτικό μέσο να είναι ίση με 0.1 mg/ml. Στην περίπτωσή μας (λόγω του πλασμιδίου BL21DE3pLys(S)) εκτός από την αμπικιλλίνη προστέθηκε με τον ίδιο τρόπο και στην ίδια συγκέντρωση και χλωραμφενικόλη. 11. Πραγματοποιείται μεταφορά των βακτηρίων σε αποστειρωμένο σωληνάριο τύπου Eppendorf. 12. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα 7000 g για 6 λεπτά, απόρριψη του υπερκειμένου και επαναιώρηση των κυττάρων σε 40 μl υγρού θρεπτικού μέσου LB. 13. Επίστρωση του εναιωρήματος των βακτηρίων στο στερεό θρεπτικό μέσο και τοποθέτηση του τελευταίου ανεστραμμένο σε επωαστικό θάλαμο με θερμοκρασία 37 ο C για 16 ώρες. 14. Το τρυβλίο ελέγχεται μακροσκοπικά για την ανάπτυξη αποικιών βακτηρίων ανθεκτικών σε αμπικιλλίνη και χλωραμφενικόλη. 74

89 Μέθοδοι 1.5. Ανίχνευση βέλτιστων συνθηκών για έκφραση της υπό μελέτη πρωτεΐνης Η ποιότητα και η ποσότητα της παραγόμενης πρωτεΐνης εξαρτάται από μια σειρά παραγόντων, οι σημαντικότεροι των οποίων είναι η θερμοκρασία επώασης της υγρής καλλιέργειας, ο χρόνος επώασης και η συγκέντρωση του IPTG. Το IPTG ή ισοπρόπυλο β-d-1-θειογαλακτοπυρανοσίδιο (Isopropyl β-d-1- thiogalactopyranoside) είναι ένα αντιδραστήριο που χρησιμοποιείται ως μιμητής της αλλολακτόζης, ενός μεταβολίτη της λακτόζης, ο οποίος επάγει τη μεταγραφή του οπερονίου της λακτόζης. Σε πειράματα κλωνοποίησης το IPTG χρησιμοποιείται για την επαγωγή της έκφρασης του υπό μελέτη γονιδίου (GST Gene Fusion System Handbook, Amersham). Για τον προσδιορισμό των βέλτιστων συνθηκών για την παραγωγή της πλειοτροπίνης πραγματοποιήθηκαν πιλοτικά πειράματα με διαφορετικούς χρόνους επώασης και συγκεντρώσεις IPTG. Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε θερμοκρασία 37 ο C, που θεωρείται η βέλτιστη για την απόδοση, σύμφωνα με τον κατασκευαστή του πλασμιδίου-φορέα Μικρής κλίμακας ανάπτυξη βακτηριακών κυττάρων σε υγρή καλλιέργεια Υλικά και διαλύματα Υγρό θρεπτικό μέσο για ανάπτυξη βακτηρίων LB (Luria-Bertani) medium Εκχύλισμα ζύμης 0.5% κ.β. Βακτο-τρυπτόνη 1% κ.β. NaCl 1% κ.β. Ανάδευση μέχρι να διαλυθούν. Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται με καυστικό νάτριο (NaOH) 1Μ στο 7.0 και το διάλυμα αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Στερεό θρεπτικό μέσο για ανάπτυξη βακτηρίων LB-agar 1.5% κ.β. άγαρ (bacto-agar) σε LB medium Το διάλυμα αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο) και αποχύνεται στα τρυβλία ανάπτυξης των βακτηρίων. Το θρεπτικό μέσο στερεοποιείται όταν η θερμοκρασία του φθάσει στους 40 o C. 75

90 Μέθοδοι Διάλυμα Αμπικιλλίνης 50 mg/ml (σε νερό) Διάλυμα Χλωραμφενικόλης 50 mg/ml (σε νερό) IPTG - β-d-1-θειογαλακτοπυρανοσίδιο (Isopropyl β-d-1- thiogalactopyranoside) Διαλύεται σε dh 2 O μέχρι τελικής συγκέντρωσης 100 mm. Το διάλυμα αποστειρώνεται με διήθηση. Πειραματική πορεία 1. Πραγματοποιείται επίστρωση των βακτηριακών κυττάρων σε τρυβλίο με στερεό θρεπτικό μέσο ανάπτυξης των βακτηρίων, παρουσία αμπικιλλίνης και χλωραμφενικόλης, και τοποθέτηση του τελευταίου ανεστραμμένο σε επωαστικό θάλαμο θερμοκρασίας 37 ο C για 16 ώρες. 2. Μεταφορά (με την άκρη αποστειρωμένου ακρορρυγχίου) μιας μονήρους αποικίας σε υγρό θρεπτικό μέσο, παρουσία αμπικιλλίνης και χλωραμφενικόλης, και επώαση υπό ανάδευση στους 37 ο C για 16 ώρες. 3. Μεταφορά 1 ml από την καλλιέργεια σε νέες υγρές καλλιέργειες όγκου 10 ml, παρουσία των ανωτέρω αντιβιοτικών. Επώαση υπό ανάδευση στους 37 ο C και έλεγχος της οπτικής πυκνότητας (A=600 nm) μέχρι συγκέντρωσης Επαγωγή της έκφρασης της πρωτεΐνης με προσθήκη IPTG μέχρι τελικής συγκέντρωσης 1 ή 2 mm. 5. Επώαση στους 37 ο C υπό ανάδευση και λήψη δείγματος (1 ml καλλιέργειας) στις 2, 4 και 5 ώρες επώασης. 6. Κατά τη λήψη δείγματος πραγματοποιείται φυγοκέντρηση στις g για 1 λεπτό, μεταφορά του υπερκειμένου σε άλλο σωληνάριο τύπου eppendorf και αποθήκευση υπερκειμένου και ιζήματος στους -20 ο C. 76

91 Μέθοδοι Μικρής κλίμακας απομόνωση ολικού πρωτεϊνικού εκχυλίσματος των βακτηριακών κυττάρων και διαχωρισμός κλασμάτων Μετά την πιλοτική ανάπτυξη των βακτηριακών κυττάρων και τη λήψη των δειγμάτων γίνεται έλεγχος της έκφρασης της προς μελέτη πρωτεΐνης. Ο έλεγχος έγκειται τόσο στην απόδοση της παραγόμενης πρωτεΐνης, όσο και στο κυτταρικό κλάσμα στο οποίο εντοπίζεται (θρεπτικό μέσο, υπερκείμενο ή ίζημα του λύματος των βακτηριακών κυττάρων). Υλικά και διαλύματα Ρυθμιστικό διάλυμα δειγμάτων 2x για SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση Ουρία 4Μ SDS 0.03 Μ Tris 0.05 Μ Γλυκερόλη 10% κ.ο. Κυανούν της βρωμοφαινόλης 2% κ.β. β-μερκαπτοαιθανόλη 10% κ.ο. ή διθειοθρεϊτόλη (DTT) 0.1 Μ PBS (10x) Na 2 HPO M KH 2 PO M NaCl 0.2 M Αραιώνεται σε dh 2 O 10 φορές πριν τη χρήση (PBS 1x, ph 7.4). Υγρό άζωτο (Ν 2 ) Πειραματική πορεία 1. Κατά την προετοιμασία του δείγματος για SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση υπάρχει διαφοροποίηση ανάμεσα στο υπερκείμενο και στο ίζημα. Στο υπερκείμενο προστίθεται ίσος όγκος ρυθμιστικού διαλύματος δειγμάτων για 2x ηλεκτροφόρηση, ενώ στο ίζημα πραγματοποιείται επαναιώρηση του ιζήματος των βακτηρίων σε 100 μl διαλύματος PBS 1x και διαδοχική στερεοποίηση-τήξη του διαλύματος με υγρό άζωτο και θερμοκρασία 42 ο C αντίστοιχα. Ακολουθεί φυγοκέντρηση g για 10 λεπτά σε 77

92 Μέθοδοι θερμοκρασία 4 ο C, μεταφορά του υπερκειμένου σε σωληνάριο τύπου Eppendorf και προσθήκη ίσου όγκου ρυθμιστικού διαλύματος δειγμάτων για 2x ηλεκτροφόρηση. Αντίστοιχος όγκος ρυθμιστικού διαλύματος δειγμάτων για 2x ηλεκτροφόρηση προστίθεται και στο ίζημα (inclusion bodies). 2. Όλα τα δείγματα θερμαίνονται στους ο C για 5 λεπτά. 3. Ακολουθεί SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων και ανάλυση κατά Western ή βάψιμο με τη χρωστική Coomasie brilliant blue ή με νιτρικό άργυρο (Sigma, ProteoSilver TM Silverstain Kit). Η μέγιστη έκφραση της πρωτεΐνης μας αναμενόταν και επιβεβαιώθηκε στο υπερκείμενο μετά τη λύση των βακτηριακών κυττάρων. Στο θρεπτικό μέσο της καλλιέργειας τα επίπεδα της πρωτεΐνης ήταν πολύ μικρά, ενώ στο ίζημα (inclusion bodies) η πρωτεΐνη ήταν αποδιαταγμένη. Η συλλογή της πρωτεΐνης από το ίζημα αποφεύχθηκε, γιατί λόγω των πολλών κυστεϊνών στο μόριο της προς μελέτη πρωτεΐνης υπήρχε πιθανότητα δημιουργίας πιθανών εναλλακτικών διαμορφώσεων κατά τη διαλυτοποίησή της. Έτσι, η συλλογή της πρωτεΐνης περιορίστηκε στο υπερκείμενο του λύματος των κυττάρων. Στην Εικόνα Μ2 φαίνεται ότι ο βέλτιστος χρόνος επώασης με IPTG είναι οι 4 ώρες και η βέλτιστη συγκέντρωσή του είναι 1 mm. Οι ίδιες συνθήκες διατηρήθηκαν σε όλες τις προσπάθειες απομόνωσης της ανθρώπινης ανασυνδυασμένης πλειοτροπίνης μέσω της τεχνολογίας σύζευξής της με GST. Εικόνα Μ2: Χαρακτηριστική εικόνα ανάλυσης κατά Western σε δείγματα από υπερκείμενο των βακτηριακών κυττάρων στις 2, 4 και 5 ώρες επώασης με IPTG. 78

93 Μέθοδοι 1.6. Παραγωγή ανθρώπινης ανασυνδυασμένης πλειοτροπίνης Μετά την ανίχνευση των συνθηκών για τη μέγιστη απόδοση της παραγόμενης πλειοτροπίνης, ακολούθησαν προσπάθειες απομόνωσής της σε μεγάλη κλίμακα. Η επιθυμητή ποσότητα της παραγόμενης πλειοτροπίνης ήταν περίπου 5 mg και αυτή η ποσότητα έπρεπε να παραχθεί στο μικρότερο δυνατό όγκο θρεπτικού μέσου (ώστε να είναι εφικτή η σήμανση της πρωτεΐνης για πειράματα διαμόρφωσης με χρήση NMR). Για το λόγο αυτό, επιλέχθηκε η χρήση στηλών GSTrap FF μεγέθους 1 ml. Τα πλεονεκτήματα που παρουσιάζει είναι καλή απόδοση πρωτεΐνης (μέχρι 12 mg), σε μικρό όγκο και δυνατότητα χειροκίνητης λειτουργίας για καλύτερο έλεγχο. Για την απομόνωση της πλειοτροπίνης καλλιεργήθηκαν βακτήρια σε όγκο θρεπτικού μέσου 1 λίτρου. Υλικά και διαλύματα Υγρό θρεπτικό μέσο για ανάπτυξη βακτηρίων LB (Luria-Bertani) medium Εκχύλισμα ζύμης 0.5% κ.β. Βακτο-τρυπτόνη 1% κ.β. NaCl 1% κ.β. Ανάδευση μέχρι να διαλυθούν. Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται με καυστικό νάτριο (NaOH) 1Μ στο 7.0 και το διάλυμα αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Στερεό θρεπτικό μέσο για ανάπτυξη βακτηρίων LB-agar 1.5% κ.β. άγαρ (bacto-agar) σε LB medium Το διάλυμα αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο) και αποχύνεται στα τρυβλία ανάπτυξης των βακτηρίων. Το θρεπτικό μέσο στερεοποιείται όταν η θερμοκρασία του φθάσει στους 40 o C. IPTG - β-d-1-θειογαλακτοπυρανοσίδιο (Isopropyl β-d-1- thiogalactopyranoside) Διαλύεται σε dh 2 O μέχρι τελικής συγκέντρωσης 100 mm. Το διάλυμα αποστειρώνεται με διήθηση. 79

94 Μέθοδοι Πειραματική πορεία 1. Πραγματοποιείται επίστρωση των βακτηριακών κυττάρων σε τρυβλίο με στερεό θρεπτικό μέσο ανάπτυξης των βακτηρίων, παρουσία αμπικιλλίνης και χλωραμφενικόλης, και τοποθέτηση του τελευταίου ανεστραμμένο σε επωαστικό θάλαμο θερμοκρασίας 37 ο C για 16 ώρες. 2. Μεταφορά (με την άκρη αποστειρωμένου ακρορρυγχίου) μιας μονήρους αποικίας σε 15 ml υγρού θρεπτικού μέσου, παρουσία αμπικιλλίνης και χλωραμφενικόλης, και επώαση υπό ανάδευση στους 37 ο C για 16 ώρες. 3. Μεταφορά 3 ml από την καλλιέργεια σε καθεμιά από 3 νέες υγρές καλλιέργειες όγκου 330 ml, παρουσία των ανωτέρω αντιβιοτικών. Επώαση υπό ανάδευση στους 37 ο C και έλεγχος της οπτικής πυκνότητας (A=600 nm) μέχρι συγκέντρωσης Επαγωγή της έκφρασης της πρωτεΐνης με προσθήκη IPTG μέχρι τελικής συγκέντρωσης 1 mm. 5. Επώαση στους 37 ο C υπό ανάδευση για 4 ώρες. 6. Συλλογή των βακτηριακών κυττάρων με διαδοχικές φυγοκεντρήσεις των 8000 g για χρόνο 10 λεπτά στους 4 ο C. 7. Αποθήκευση του τελικού ιζήματος των βακτηριακών κυττάρων στους - 20 ο C Απομόνωση ανθρώπινης ανασυνδυασμένης πλειοτροπίνης Για να επιτευχθεί η απομόνωση καθαρής ανθρώπινης ανασυνδυασμένης πλειοτροπίνης απαιτείται πρώτα η απομόνωση της χιμαιρικής πρωτεΐνης (αποτελούμενη από την GST και την πλειοτροπίνη) και στη συνέχεια η πέψη και απομάκρυνση της GST από την πλειοτροπίνη, ώστε η τελευταία να ληφθεί ιδανικά καθαρή. Για την πέψη και απομάκρυνση της GST από την πλειοτροπίνη χρησιμοποιήθηκε η πρωτεϊνάση PreScission (GST Gene Fusion System Handbook, Amersham Biosciences). Η πρωτεϊνάση PreScission είναι μια 80

95 Μέθοδοι χιμαιρική πρωτεΐνη που αποτελείται από την πρωτεΐνη GST και την πρωτεϊνάση 3C από τον ανθρώπινο ρινοϊό 3Cpro (γένος: Picornaviridae) (Cordingley et al, 1990; Walker et al, 1994). Η πρωτεϊνάση 3C αναγνωρίζει την αμινοξική αλληλουχία Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro και κόβει μεταξύ των αμινοξέων Gln και Gly. Η δεσμευμένη πρωτεΐνη GST στην πρωτεάση 3C διευκολύνει τη δέσμευση της χιμαιρικής πρωτεΐνης στη γλουταθειόνη και την απομάκρυνσή της από την πλειοτροπίνη μετά την πέψη. Βασικό πλεονέκτημα αποτελεί το γεγονός ότι η πρωτεϊνάση αυτή είναι πλήρως ενεργή στους 4 ο C, θερμοκρασία που ευνοεί τη διατήρηση της πρωτεΐνης (Cordingley et al, 1990). Πλεονέκτημα αποτελεί και το ότι η πέψη της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης μπορεί να γίνει πάνω στη στήλη, με αποτέλεσμα η πέψη και η απομόνωσή της μπορούν να πραγματοποιηθούν σε ένα βήμα, μειώνοντας έτσι απώλειες και χρόνο απομόνωσης. Όπως προαναφέρθηκε, χρησιμοποιήθηκαν στήλες GSTrap FF της Amersham. Η σταθερή ροή της παροχής δείγματος ή PBS εξασφαλίσθηκε με τη χρήση περισταλτικής αντλίας, ενώ η παροχή της πρωτεϊνάσης πραγματοποιήθηκε χειροκίνητα. PBS (10x) Na 2 HPO M KH 2 PO M NaCl 0.2 M Υλικά και διαλύματα Αραιώνεται σε dh 2 O 10 φορές πριν τη χρήση (PBS 1x, ph 7.4). Απροτινίνη (Trasylol) 1mg/ml Πρωτεϊνάση PreScission (2 Units/μl) Διάλυμα της πρωτεϊνάσης PreScission (ph 7.0) Tris-HCl 50 mm NaCl 150 mm EDTA 1 mm Διθειοθρεϊτόλη (DTT) 1 mm Το ph του διαλύματος ρυθμίζεται σε 7.0, ακολουθεί η προσθήκη EDTA και DTT. 81

96 Μέθοδοι Διάλυμα γλουταθειόνης (Elution Buffer) (ph 8.0) Tris-HCl 50 mm Ανηγμένη γλουταθειόνη 10 mm Διάλυμα NaCl 3Μ Υδατικό διάλυμα αιθανόλης 20% Υγρό άζωτο (Ν 2 ) Στήλη GSTrap FF όγκου 1 ml Πειραματική πορεία 1. Πραγματοποιείται επαναδιάλυση των βακτηριακών κυττάρων σε 70 ml PBS (1x) με τη βοήθεια αυτόματης πιπέτας και επαναλαμβανόμενες αναδεύσεις. 2. Ακολουθεί σπάσιμο των βακτηριακών κυττάρων με διαδοχικό πάγωμαξεπάγωμα του κυτταρικού εναιωρήματος σε υγρό άζωτο και στους 42 ο C αντίστοιχα. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται 4 φορές συνολικά. 3. Φυγοκέντρηση 20000g για 60 λεπτά στους 4 ο C. 4. Μεταφορά του υπερκειμένου σε αποστειρωμένο ποτήρι ζέσεως και προσθήκη απροτινίνης σε τελική συγκέντρωση 1 μg/ml (αναστολέας πρωτεϊνασών σερίνης). 5. Ενυδάτωση της στήλης με PBS. Απαιτείται προσοχή για να αποφευχθεί η είσοδος φυσαλίδων στη στήλη. 6. Διέλευση PBS από τη στήλη όγκου ίσο με πέντε όγκους στήλης (5 ml). 7. Διέλευση του δείγματος σε χαμηλή ροή (περίπου 0.2 ml/λεπτό). 8. Διέλευση από τη στήλη δέκα όγκους (10 ml) PBS για τον καθαρισμό της και την απομάκρυνση των μη ειδικά δεσμευμένων πρωτεϊνών. 9. Διέλευση από τη στήλη δέκα όγκους (10 ml) διαλύματος της πρωτεϊνάσης PreScission. 82

97 Μέθοδοι 10. Παρασκευή του μίγματος της πρωτεϊνάσης PreScission με το διάλυμά της. Για την GSTrap FF του 1 ml που χρησιμοποιήθηκε παρασκευάστηκε ποσότητα 1 ml από το μίγμα (80 μl πρωτεάσης PreScission μl διαλύματος της πρωτεϊνάσης PreScission). 11. Χορήγηση του διαλύματος της πρωτεϊνάσης PreScission στη στήλη μέχρι να καλυφθεί όλος ο όγκος της (1 ml). 12. Αεροστεγές σφράγισμα των δυο οπών της στήλης με τα ειδικά πώματα. 13. Επώαση της στήλης στους 4 ο C για χρόνο 4 ώρες. 14. Απομάκρυνση των πωμάτων από τη στήλη και διέλευση από αυτή διαλύματος της πρωτεϊνάσης PreScission, όγκου ίσου με 10 όγκους στήλης. Στο στάδιο αυτό απομονώνεται σε κλάσματα του 0.5 ml η απομονωμένη πρωτεΐνη. Στα τρία πρώτα κλάσματα συγκεντρώνεται η μεγαλύτερη ποσότητα της πρωτεΐνης. 15. Εκτεταμένες πλύσεις της στήλης με τη διέλευση από αυτή διαλύματος PBS, όγκου ίσου με δέκα φορές τον όγκο της στήλης. 16. Διέλευση από τη στήλη διαλύματος γλουταθειόνης, όγκου ίσου με δέκα φορές τον όγκο της στήλης. 17. Διέλευση από τη στήλη διαλύματος NaCl 3M, όγκου ίσου με δέκα φορές τον όγκο της στήλης. 18. Διέλευση από τη στήλη διαλύματος PBS, όγκου ίσου με δέκα φορές τον όγκο της στήλης. 19. Διέλευση από τη στήλη διαλύματος 20% αιθανόλης, όγκου ίσου με δυο φορές τον όγκο της στήλης. 20. Κλείσιμο των οπών της στήλης και αποθήκευσή της με το διάλυμα της αιθανόλης στους 4 ο C. Τα βήματα της παραπάνω πορείας αποτελούν τη διαδικασία αναγέννησης της στήλης, ώστε αυτή να μπορεί να χρησιμοποιηθεί παραπάνω από μια φορές. Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης που παρήχθη με τη μέθοδο αυτή (1 mg ανά λίτρο καλλιέργειας) ήταν επαρκής για in vitro πειράματα, όμως όχι για πειράματα 83

98 Μέθοδοι μελέτης της στερεοδιαμόρφωσης (NMR). Η πλειοτροπίνη που παρήχθη με τη μέθοδο αυτή δεν παρουσίασε απόλυτη καθαρότητα (Εικόνα Μ3). Για το λόγο αυτό, η πλειοτροπίνη αυτή χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας σε αναλύσεις δειγμάτων με ανάλυση κατά Western, που πραγματοποιήθηκαν στην παρούσα διατριβή. Εικόνα Μ3: Χαρακτηριστική εικόνα των κλασμάτων κατά την απομόνωση της πλειοτροπίνης, μετά από SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση και εμφάνιση με νιτρικό άργυρο (Silverstain) (Sigma, ProteoSilver TM Silverstain Kit). Φαίνονται όλες οι πρωτεΐνες που απομονώνονται σε κάθε κλάσμα. Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης είναι η ακόλουθη: Κλάσμα 1: 727 ng/μl, Κλάσμα 2: 491 ng/μl, Κλάσμα 3: 257 ng/μl, Κλάσμα 4: 172 ng/μl, Κλάσμα 5: 157 ng/μl. Κάθε κλάσμα έχει όγκο 0.5 ml. 2. Απομόνωση πρωτεϊνών από τη χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη εμβρύου όρνιθας (CAM) 2.1. Προετοιμασία αυγών (Giannopoulou et al, 2001) Τα γονιμοποιημένα αυγά όρνιθας ποικιλίας Leghorn (από τον αγροτικό πτηνοτροφικό συνεταιρισμό Ιωαννίνων «Πίνδος») μετά την παραλαβή τους καθαρίζονται με νερό και τοποθετούνται σε οριζόντια θέση στην αυγοθήκη. Στη συνέχεια τοποθετούνται σε επωαστικό θάλαμο με θερμοκρασία 37 ο C και υγρασία περίπου 55%. Η χρονική αυτή στιγμή θεωρείται η ώρα 0 της ανάπτυξης του 84

99 Μέθοδοι εμβρύου. Την 9 η ημέρα της ανάπτυξης του εμβρύου απομονώνεται η χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη με την εξής διαδικασία: 1. Λαμβάνεται το αυγό από τον επωαστικό θάλαμο χωρίς να αλλάξει ο προσανατολισμός του. 2. Με το πίσω μέρος λαβίδας ανοίγεται οπή στο κέλυφος του αυγού στο μπροστινό μέρος της κάτω επιφάνειας. 3. Ανοίγεται προσεκτικά με τη βοήθεια λαβίδας το κέλυφος του αυγού πάνω από τρυβλίο Petri και αφήνεται το έμβρυο και η αλβουμίνη να πέσουν στο τρυβλίο. Η χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη θα πρέπει να παραμένει κολλημένη στην εσωτερική επιφάνεια του κελύφους του αυγού. 4. Απομακρύνεται η χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη, εισάγεται σε τρυβλίο Petri, το οποίο περιέχει με παγωμένο διάλυμα PBS, και το οποίο είναι βυθισμένο σε πάγο. 5. Η μεμβράνη εμβαπτίζεται στο τρυβλίο Petri και τεμαχίζεται με ψαλίδι σε μικρά τεμάχια. 6. Τα τεμάχια της μεμβράνης μεταφέρονται σε σωληνάρια φυγοκέντρου, τα οποία βρίσκονται επίσης στον πάγο. 7. Τα σωληνάρια μεταφέρονται στους -20 ο C Ομογενοποίηση του ιστού της χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης PBS (10x) Na 2 HPO M KH 2 PO M NaCl 0.2 M Υλικά και διαλύματα Αραιώνεται σε dh 2 O 10 φορές πριν τη χρήση (PBS 1x, ph 7.4). 85

100 Μέθοδοι Διάλυμα RIPA (RIPA buffer) (ph 7.4) PBS 1x SDS 0.1% Triton X-100 1% PMSF 1 mm EDTA 5 mm Απροτινίνη 1μg/ml Na 3 VO 4 20 nm Πειραματική πορεία 1. Ομογενοποίηση διαφορετικών τμημάτων ιστού (από διαφορετικά αυγά) σε 300 μl διαλύματος RIPA στους 4 ο C. Χρησιμοποιείται ομογενοποιητής Potter-Elvenjem. 2. Μεταφορά του ομογενοποιήματος σε σωληνάρια φυγοκέντρου. 3. Φυγοκέντρηση σε g για 30 λεπτά στους 4 ο C. 4. Μεταφορά του υπερκειμένου σε νέο σωληνάριο φυγοκέντρου. 5. Ακολουθεί προσδιορισμός ολικών πρωτεϊνών στο υπερκείμενο με τη μέθοδο Bradford (βλέπε παράγραφο 4 στις Μεθόδους). 3. Απομόνωση πρωτεϊνών από καλλιέργειες ευκαρυωτικών κυττάρων Η μέθοδος αυτή της απομόνωσης των πρωτεϊνών εφαρμόζεται για την απομόνωση πρωτεϊνών από κυτταροκαλλιέργειες, παγωμένες και μη, στις περιπτώσεις που θα ακολουθήσει ανοσοκατακρήμνιση. PBS (10x) Na 2 HPO M KH 2 PO M NaCl 0.2 M Υλικά και διαλύματα Αραιώνεται σε dh 2 O 10 φορές πριν τη χρήση (PBS 1x, ph 7.4). 86

101 Μέθοδοι Διάλυμα RIPA (RIPA buffer) (ph 7.4) PBS 1x SDS 0.1% Triton X-100 1% PMSF 1 mm EDTA 5 mm Απροτινίνη 1μg/ml Na 3 VO 4 20 nm Πειραματική πορεία 1. Απομάκρυνση υπό κενό του θρεπτικού μέσου της καλλιέργειας. 2. Έκπλυση των κυττάρων 3 φορές με PBS στους 4 ο C. 3. Προσθήκη 500 μl παγωμένου διαλύματος RIPA ανά τρυβλίο 100 mm στους 4 ο C. 4. Παραμονή των τρυβλίων στους 4 ο C σε οριζόντια θέση για χρόνο 10 λεπτά, ώστε να μεγιστοποιηθεί η ποσότητα των εκχυλιζόμενων πρωτεϊνών. Το διάλυμα RIPA πρέπει να καλύπτει ιδανικά το τρυβλίο. Εάν όχι, πρέπει να πραγματοποιούνται τακτικές αναδεύσεις των τρυβλίων. 5. Λύση των κυττάρων με μηχανικό τρόπο (cell scraper) σε πάγο. 6. Μεταφορά του ομογενοποιήματος σε σωληνάρια φυγοκέντρου. 7. Φυγοκέντρηση σε g για 30 λεπτά στους 4 ο C. 8. Μεταφορά του υπερκειμένου σε νέο σωληνάριο φυγοκέντρου. 9. Ακολουθεί προσδιορισμός ολικών πρωτεϊνών στο υπερκείμενο με τη μέθοδο Bradford (ακολουθεί). 4. Προσδιορισμός της συγκέντρωσης ολικών πρωτεϊνών σε διάλυμα (Μέθοδος Bradford) (Bradford, 1976) Η συγκέντρωση των πρωτεϊνών σε ένα διάλυμα προσδιορίζονται εύκολα με χρωματομετρικές μεθόδους ή με μέτρηση της οπτικής απορρόφησης των 87

102 Μέθοδοι δειγμάτων σε μήκος κύματος Α=280 nm. Από τις πιο σύντομες και αξιόπιστες μεθόδους για προσδιορισμό μικροποσοτήτων πρωτεϊνών είναι η μέθοδος Bradford. Βασίζεται στην ικανότητα δέσμευσης της χρωστικής Coomasie G-250 σε βασικά αμινοξέα των πρωτεϊνών, αλλάζοντας ταυτόχρονα το μήκος κύματος της μέγιστης απορρόφησής τους. Η δέσμευση, επομένως και η αλλαγή αυτή, είναι ανάλογη της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών στο διάλυμα. Για τον ακριβή υπολογισμό της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης με βάση την οπτική απορρόφηση κατασκευάζεται πρότυπη καμπύλη με γνωστές συγκεντρώσεις αλβουμίνης ορού βοός (BSA). Η αλβουμίνη πρέπει να είναι διαλυμένη στο ίδιο διάλυμα που είναι και οι πρωτεΐνες, των οποίων η συγκέντρωση υπολογίζεται. Διάλυμα Bradford (1x) Coomasie G mm 95% αιθανόλη 5% κ.ό. 85% H 3 PO 4 10% κ.ό. Υλικά και διαλύματα Διήθηση του διαλύματος 3 φορές με χρήση διηθητικού χαρτιού. Πειραματική πορεία 1. Προσθήκη 5 ή 2 μl διαλύματος (σε περίπτωση εκχυλίσματος κυτταροκαλλιέργειας ή ομογενοποιήματος χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης αντίστοιχα) σε 995 ή 998 μl διαλύματος Bradford αντίστοιχα. 2. Έντονη ανάδευση σε αναδευτήρα τύπου vortex. 3. Επώαση των δειγμάτων για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 4. Φωτομέτρηση των δειγμάτων στα 595 nm (σε φασματοφωτόμετρο Hitachi U-1100). 5. Υπολογισμός της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών στο δείγμα, μέσω της πρότυπης καμπύλης της αλβουμίνης (BSA). 88

103 Μέθοδοι 6. Μεταφορά ποσότητας πρωτεΐνης 2-3 mg σε σωληνάρια φυγοκέντρου για πειράματα ανοσοκατακρήμνισης με αντισώματα έναντι συγκεκριμένων πρωτεϊνών. 5. Λύση κυττάρων μετά από ενεργοποίηση για πειράματα μελέτης φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών (Polykratis et al, 2005) Η λύση των κυττάρων και η απομόνωση των πρωτεϊνών με τη μέθοδο αυτή διαφοροποιείται από τη μέθοδο της απομόνωσης των πρωτεϊνών που περιγράφηκε προηγουμένως (Παράγραφος 3: Απομόνωση πρωτεϊνών από καλλιέργειες ευκαρυωτικών κυττάρων). Χρησιμοποιείται σε περιπτώσεις που μελετάται η επίδραση ενός παράγοντα στην κατάσταση φωσφορυλίωσης κάποιας πρωτεΐνης. Στα πειράματα πραγματοποιείται επώαση των κυττάρων με τον παράγοντα για τον απαιτούμενο χρόνο και είναι απαραίτητη η άμεση λύση τους μετά την αλλαγή του θρεπτικού μέσου, ώστε να μην προλάβουν να επέλθουν σε κατάσταση «stress». PBS (10x) Na 2 HPO M KH 2 PO M NaCl 0.2 M Υλικά και διαλύματα Αραιώνεται σε dh 2 O 10 φορές πριν τη χρήση (PBS 1x, ph 7.4). Ρυθμιστικό διάλυμα δειγμάτων (2x) Tris-HCl ph M Δωδεκακυλοθειϊκό Νάτριο (SDS) 0.03 M Γλυκερόλη 10% κ.ό. Κυανούν της βρωμοφαινόλης 2% κ.ό. Διθειοθρεϊτόλη (DTT) 0.1 Μ 89

104 Μέθοδοι Πειραματική πορεία Έχει προηγηθεί επώαση των κυττάρων με τον υπό μελέτη παράγοντα για το χρονικό διάστημα που απαιτείται. Με την ολοκλήρωση της επώασης πραγματοποιείται η ακόλουθη διαδικασία: 1. Προσθήκη σε σωληνάριο φυγοκέντρου 500 μl ρυθμιστικού διαλύματος δειγμάτων. Παρασκευή ενός σωληναρίου ανά δείγμα. 2. Θέρμανση των σωληναρίων στους 100 ο C μέχρι τη μεταφορά τους στο θάλαμο νηματικής ροής. Η μεταφορά πραγματοποιείται αμέσως πριν εξέλθει το τρυβλίο από το θάλαμο νηματικής ροής (βήμα 3). 3. Μεταφορά του τρυβλίου της κυτταροκαλλιέργειας από τον επωαστικό θάλαμο στο θάλαμο νηματικής ροής. 4. Αναρρόφηση του θρεπτικού μέσου της κυτταροκαλλιέργειας με πιπέτα Pasteur υπό κενό. 5. Ακολουθούν δυο σύντομα και ήπια ξεπλύματα του τρυβλίου με PBS (2-3 ml). 6. Μεταφορά 200 μl θερμού ρυθμιστικού διαλύματος δειγμάτων σε όλη την επιφάνεια του τρυβλίου στάγδην. 7. Ανάδευση του ρυθμιστικού διαλύματος με το ακρορρύγχιο της πιπέτας σε όλη την επιφάνεια του τρυβλίου. Στο στάδιο αυτό το ρυθμιστικό διάλυμα έχει μεγάλο ιξώδεις λόγω του DNA των κυττάρων που λύονται. 8. Μεταφορά του μίγματος πλέον ρυθμιστικού διαλύματος-λύματος κυττάρων σε σωληνάριο φυγοκέντρου. 9. Θέρμανση των σωληναρίων για 5 λεπτά σε 100 ο C. 10. Φυγοκέντρηση στα g για 4 λεπτά. 11. Μεταφορά στους -20 ο C. Τα δείγματα είναι πλέον έτοιμα για ανάλυση με SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση. 90

105 Μέθοδοι 6. Ανοσοκατακρήμνιση (Polykratis et al, 2005) Η ανοσοκατακρήμνιση είναι μια μέθοδος που χρησιμοποιείται για την απομόνωση πρωτεϊνών που είναι σε χαμηλή συγκέντρωση σε κάποιο διάλυμα, εκμεταλλευόμενη τη συγγένεια δέσμευσης που παρουσιάζουν σε ένα ειδικό γι αυτές αντίσωμα. Συγκεκριμένα, η πρωτεΐνη που θέλουμε να απομονώσουμε σχηματίζει σύμπλοκο με αντίσωμα έναντι αυτής που προσθέτουμε στο διάλυμα. Το ενδιαφέρον της μεθόδου είναι ότι και πρωτεΐνες που φυσιολογικά αλληλεπιδρούν με την αρχική επίσης δεσμεύονται στο ίδιο σύμπλοκο. Το γεγονός αυτό καθιστά τη μέθοδο χρήσιμη για μελέτες αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών. Στη συνέχεια, στο διάλυμα προστίθενται σφαιρίδια αγαρόζης που φέρουν στην επιφάνειά τους ομοιοπολικά δεσμευμένη πρωτεΐνη Α ή πρωτεΐνη G. Οι πρωτεΐνες A και G είναι βακτηριακής προέλευσης και δεσμεύουν με μεγάλη συγγένεια την Fc περιοχή ορισμένων τύπων IgG ανοσοσφαιρινών. Με τη χρήση τους δημιουργείται ένα σύμπλοκο σφαιριδίων-πρωτεΐνης Α/G-αντισώματος, στο οποίο δεσμεύεται επιλεκτικά το αντιγόνο που θέλουμε να κατακρημνίσουμε. Το σύμπλοκο αυτό απομονώνεται με φυγοκέντρηση και οι πρωτεΐνες που υπάρχουν σε αυτό αποδεσμεύονται με τη χρήση αποδιατακτικών παραγόντων. PBS (10x) Na 2 HPO M KH 2 PO M NaCl 0.2 M Υλικά και διαλύματα Αραιώνεται σε dh 2 O 10 φορές πριν τη χρήση (PBS 1x, ph 7.4) Εναιώρημα σφαιριδίων αγαρόζης με πρωτεΐνη A (Calbiochem, Cat. No. IP02) Εναιώρημα σφαιριδίων αγαρόζης με πρωτεΐνη G (Calbiochem, Cat. No. IP04) 91

106 Μέθοδοι Ρυθμιστικό διάλυμα δειγμάτων (2x) Tris-HCl ph M Δωδεκακυλοθειϊκό Νάτριο (SDS) 0.03 M Γλυκερόλη 10% κ.ό. Κυανούν της βρωμοφαινόλης 2% κ.ό. β-μερκαπτοαιθανόλη 10% κ.ό. Αντισώματα Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν παρατίθενται στον ακόλουθο πίνακα: Πίνακας Μ1: Παράθεση των αντισωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοκατακρήμνιση στην παρούσα εργασία. Στις στήλες από αριστερά αναγράφεται η πρωτεΐνη έναντι της οποίας πραγματοποιήθηκε η ανοσοκατακρήμνιση, η εταιρία παραγωγής, ο κωδικός του προϊόντος και η ποσότητα του αντισώματος που χρησιμοποιήθηκε ανά mg πρωτεΐνης. Πρωτεΐνη Εταιρία Κωδικός Ποσότητα α ν β 3 Chemicon MAB1976Z 5 μg/3 mg πρωτεΐνης α 5 β 1 Chemicon MAB μg/3 mg πρωτεΐνης α ν Chemicon AB μg/3 mg πρωτεΐνης β 3 Chemicon CBL479 3 μg/3 mg πρωτεΐνης PTN Santa Cruz H-75 3 μg/3 mg πρωτεΐνης MK PeproTech 500-P171 5 μg/3 mg πρωτεΐνης RPTPβ/ζ Santa Cruz C-19 3 μg/3 mg πρωτεΐνης Src Upstate GD11 (05-184) 3 μg/3 mg πρωτεΐνης α ν β 3 Abcam Ab μg/3 mg πρωτεΐνης IgG Sigma I μg/3 mg πρωτεΐνης Πειραματική πορεία Έχει προηγηθεί ο υπολογισμός της συγκέντρωσης της ολικής πρωτεΐνης με τη μέθοδο Bradford (περιγράφηκε στην παράγραφο 4) και η μεταφορά της ποσότητας πρωτεΐνης που θα ανοσοκατακρημνισθεί σε νέα σωληνάρια φυγοκέντρου τύπου Eppendorf. Στη συνέχεια πραγματοποιείται η ακόλουθη πορεία: 92

107 Μέθοδοι 1. Προσθήκη σε κάθε σωληνάριο ψυχρού διαλύματος PBS μέχρι ο όγκος του μίγματος να είναι ο ίδιος σε όλα τα δείγματα. Αυτό πραγματοποιείται προκειμένου να επιτευχθεί η ίδια κινητική των πρωτεϊνών σε όλα τα σωληνάρια. 2. Προσθήκη του κατάλληλου αντισώματος (Πίνακας Μ1) σε ποσότητα ανάλογη με τη ποσότητα της πρωτεΐνης. 3. Ανάδευση για 16 ώρες στους 4 ο C. Στο στάδιο αυτό πραγματοποιείται η δέσμευση του αντισώματος με την αντίστοιχη πρωτεΐνη και τις πρωτεΐνες που αυτή δεσμεύει. 4. Προσθήκη στα σωληνάρια 15 μl (για 3 mg ολικής πρωτεΐνης) εναιωρήματος σφαιριδίων πρωτεΐνης Α και πρωτεΐνης G. 5. Ανάδευση για 2 ώρες στους 4 o C. Στο στάδιο αυτό πραγματοποιείται η δέσμευση του συμπλόκου πρωτεΐνης-αντισώματος με τα σφαιρίδια. 6. Φυγοκέντρηση στα g για 5 λεπτά στους 4 ο C. 7. Απόρριψη του υπερκειμένου. 8. Προσθήκη 1 ml ψυχρού PBS ανά σωληνάριο (επαναιώρηση των σφαιριδίων). 9. Η φυγοκέντρηση και η απόρριψη του υπερκειμένου επαναλαμβάνονται ακόμα 2 φορές. 10. Στο ίζημα των σφαιριδίων που έχει απομείνει προστίθενται 50 μl ρυθμιστικού διαλύματος δειγμάτων (2x). 11. Τα σωληνάρια θερμαίνονται στους 100 ο C για χρόνο 5 λεπτά. Στα στάδια λαμβάνει χώρα η αποδέσμευση των πρωτεϊνών από τα σφαιρίδια. 12. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στα g για χρόνο 4 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 13. Μεταφορά του υπερκειμένου σε νέα σωληνάρια φυγοκέντρου. Απόρριψη των σφαιριδίων. 14. Αποθήκευση των σωληναρίων στους -20 ο C μέχρι την ανάλυσή τους με SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση. 93

108 Μέθοδοι 7. Ανάλυση πρωτεϊνών με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακριλαμιδίου με αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) (Laemmli, 1970; Neville, 1971) Υλικά και διαλύματα Διάλυμα ακρυλαμιδίου 30% κ.β. (ακρυλαμίδιο/μεθυλεν-δις-ακρυλαμίδιο 30/1) Ακρυλαμίδιο 30 g Μεθυλεν-δις-ακρυλαμίδιο 1 g Απεσταγμένο νερό μέχρι τελικού όγκου 100 ml Tris-HCl 1.5M, ph 8.8 Tris-base g Απεσταγμένο νερό Αρχική προσθήκη 80 ml απεσταγμένου νερού, ρύθμιση του διαλύματος σε ph=8.8 και προσθήκη απεσταγμένου νερού μέχρι τελικού όγκου 100 ml. Tris-HCl 0.5M, ph 6.8 Tris-base g Απεσταγμένο νερό Αρχική προσθήκη 80 ml απεσταγμένου νερού, ρύθμιση του διαλύματος σε ph=6.8 και προσθήκη απεσταγμένου νερού μέχρι τελικού όγκου 100 ml. Διάλυμα δωδεκακυλοθειικού νατρίου (SDS) 10% κ.β. SDS 10 g Απεσταγμένο νερό Αρχική προσθήκη 90 ml απεσταγμένου νερού, θέρμανση στους 68 ο C, ρύθμιση του διαλύματος σε ph=7.9 και προσθήκη απεσταγμένου νερού μέχρι τελικού όγκου 100 ml. Διάλυμα υπερθειικού αμμωνίου (AMPS) 20% κ.β. Ν,Ν,Ν,Ν -Τετραμεθυλ-αιθυλεν-διαμίνη (TEMED) 94

109 Μέθοδοι Ρυθμιστικό διάλυμα δειγμάτων (2x) Tris-HCl ph M Δωδεκακυλοθειικό Νάτριο (SDS) 0.03 M Γλυκερόλη 10% κ.ό. Κυανούν της βρωμοφαινόλης 2% κ.ό. β-μερκαπτοαιθανόλη 10% κ.ό. Ρυθμιστικό διάλυμα ηλεκτροδίων (5x) (Running Buffer) Γλυκίνη 2Μ Tris-base 0.25M Δωδεκακυλοθειικό Νάτριο (SDS) 0.02M Αραίωση του διαλύματος με απεσταγμένο νερό 1:5 πριν τη χρήση του. Πειραματική πορεία Στην παρούσα εργασία η ανάλυση των πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου πραγματοποιήθηκε παρουσία αποδιατακτικών παραγόντων (SDS, DTT). Η πορεία που ακολουθείται έχει ως εξής: 1. Συναρμολόγηση της συσκευής του πηκτώματος. 2. Παρασκευή του πηκτώματος διαχωρισμού. Ανάλογα με το μοριακό βάρος της υπό εξέταση πρωτεΐνης παρασκευάζεται πήκτωμα διαχωρισμού με συγκεκριμένη συγκέντρωση ακρυλαμιδίου. Η συγκέντρωση ακρυλαμιδίου αυξάνει όσο μειώνεται το μοριακό βάρος της υπό μελέτη πρωτεΐνης. Τα πηκτώματα που χρησιμοποιούνται στην παρούσα εργασία παρατίθενται στον Πίνακα Μ2. 3. Την παρασκευή του πηκτώματος και την προσθήκη του στη συσκευή ακολουθεί η προσθήκη 1-2 ml απεσταγμένου νερού. Το υπερκείμενο νερό διευκολύνει τη συμπαγή δομή του πηκτώματος και σταθεροποιεί την επάνω επιφάνειά του. Απομακρύνεται μετά τον πολυμερισμό του πηκτώματος και πριν την παρασκευή του πηκτώματος συμπύκνωσης. 4. Προσθήκη εξαρτήματος (χτενάκι) που χρησιμεύει στη δημιουργία θέσεων προσθήκης του δείγματος στο πήκτωμα συμπύκνωσης. 95

110 Μέθοδοι Πίνακας Μ2: Σύσταση των πηκτωμάτων διαχωρισμού. Πυκνότητα πηκτώματος 17.5% 15% 7.5% 6.2% 5% Απεσταγμένο H 2 O ml 2.18 ml 4.68 ml ml 5.08 ml Ακρυλαμίδιο 30% ml 5.01 ml 2.51 ml 2.09 ml 1.67 ml Tris-HCl 1.5M ph ml 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml 2.5 ml 10% SDS 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 20% AMPS 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl 100 μl TEMED 10 μl 10 μl 10 μl 10 μl 10 μl 5. Παρασκευή του πηκτώματος συμπύκνωσης. Η συγκέντρωσή του εξαρτάται από τη συγκέντρωση του πηκτώματος διαχωρισμού. Η σύστασή του παρατίθεται στον Πίνακα Μ3. 6. Προσθήκη του πηκτώματος συμπύκνωσης στη συσκευή και αναμονή για τον πολυμερισμό του (20-30 λεπτά). 7. Σε αυτό το χρονικό διάστημα είναι εφικτή η προετοιμασία των δειγμάτων. Τα δείγματα συνήθως φυλάσσονται στους -20 o C. 8. Θέρμανση των δειγμάτων στους 100 ο C για χρόνο 5 λεπτά. 9. Φυγοκέντρηση στα 12000g για 4 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Πίνακας Μ3: Σύσταση πηκτωμάτων συμπύκνωσης. Πυκνότητα πηκτώματος 3.5% 5% Απεσταγμένο H 2 O 2.45 ml 2.25 ml Ακρυλαμίδιο 30% ml 0.67 ml Tris-HCl 0.5M ph ml 1.0 ml 10% SDS 40 μl 40 μl 20% AMPS 40 μl 40 μl TEMED 4 μl 4 μl 96

111 Μέθοδοι 10. Με την ολοκλήρωση του χρόνου πολυμερισμού του πηκτώματος συμπύκνωσης, απομακρύνεται το εξάρτημα (χτενάκι) και μεταφέρεται η συσκευή του πηκτώματος στη συσκευή ηλεκτροφόρησης. 11. Μεταφορά καθορισμένης ποσότητας ολικής πρωτεΐνης από κάθε δείγμα στις θέσεις-υποδοχές που έχουν σχηματισθεί στο πήκτωμα πακεταρίσματος. 12. Εφαρμογή σταθερής τάσης 100 Volt (120 Volt για δυο πηκτώματα), με αποτέλεσμα τη μετακίνηση των δειγμάτων από τον αρνητικό στο θετικό πόλο του συστήματος. Η απόσταση που διανύει η κάθε πρωτεΐνη στο πήκτωμα διαχωρισμού είναι αντιστρόφως ανάλογη της μοριακής μάζας της. 13. Με την ολοκλήρωση της ηλεκτροφόρησης, υπάρχει η δυνατότητα μεταφοράς των πρωτεϊνών από το πήκτωμα σε μεμβράνη PVDF (ανάλυση κατά Western) ή χρώσης του πηκτώματος με διάλυμα χρωστικής Coomasie brilliant blue ή νιτρικού αργύρου (Silverstain). 8. Ανάλυση πρωτεϊνών κατά Western (Towbin et al, 1979) Υλικά και διαλύματα Ρυθμιστικό διάλυμα για τη συσκευή μεταφοράς πρωτεϊνών Γλυκίνη 0.04 Μ Tris-base 0.05 M Δωδεκακυλοθειικό Νάτριο (SDS) 1 mm Μεθανόλη (απόλυτη) 20% κ.ό. Ρυθμιστικό διάλυμα TBS ph 7.6 (10x) Tris-base 0.2 M NaCl 1.36 M Απεσταγμένο νερό Ρύθμιση του διαλύματος σε ph=7.6 και αραίωση του διαλύματος με απεσταγμένο νερό 1:10 πριν τη χρήση του. 97

112 Μέθοδοι Ρυθμιστικό διάλυμα TBS-Tween 20, ph 7.6 (TBS-T) Ρυθμιστικό διάλυμα TBS (1x) Tween % κ.ό. Μεμβράνη PVDF (polyvinylidene fluoride) Millipore Immobilon-P Transfer Membrane Άπαχο γάλα σε σκόνη (Regilait) Αλβουμίνη ορού βοός (Bovine Serum Albumin, BSA) Σύστημα χημειοφωταύγειας Χρησιμοποιείται το ολοκληρωμένο σύστημα χημειοφωταύγειας από την Pierce (ECL detection kit) (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). Πρώτα αντισώματα Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε ανάλυση πρωτεϊνών κατά Western παρατίθενται στον Πίνακα Μ4, ενώ στον Πίνακα Μ5 παρατίθενται οι συνθήκες για κάθε αντίσωμα. Πίνακας Μ4: Παράθεση των αντισωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση κατά Western. Στις στήλες από αριστερά αναγράφονται οι πρωτεΐνες, οι εταιρίες παραγωγής και οι κωδικοί των αντισωμάτων. Πρωτεΐνη Εταιρία Κωδικός PTN Lab. CRRET, France _ PTN Abnova H M01 MK PeproTech 500-P171 RPTPβ/ζ BD R / α ν Chemicon AB1930 β 3 Chemicon CBL479 β 3 Υ773 Abcam ab38460 β 3 Υ785 Abcam ab

113 Μέθοδοι Δεύτερα αντισώματα Τα δεύτερα αντισώματα, των οποίων οι συνθήκες αναφέρονται στον Πίνακα Μ5, είναι τα ακόλουθα: Anti-mouse IgG (A3682, goat, Fab-specific) συνδεδεμένο με υπεροξειδάση (Sigma) Anti-rabbit IgG (A0545, goat, whole molecule) συνδεδεμένο με υπεροξειδάση (Sigma) Anti-goat IgG (B3148, mouse, clone GT-34) συνδεδεμένο με υπεροξειδάση (Sigma) Στρεπταβιδίνη (S2438) συνδεδεμένη με υπεροξειδάση (Streptavidin-peroxidase polymer) (Sigma) Πίνακας Μ5: Παράθεση των συνθηκών των αντισωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση κατά Western. Στις στήλες από αριστερά αναγράφονται οι πρωτεΐνες, οι συνθήκες παρεμπόδισης της μη ειδικής δέσμευσης και επώασης του 1 ου και του 2 ου αντισώματος. Πρωτεΐνη PTN (Lab Ab) PTN (Abnova Ab) Παρεμπόδιση μη ειδικής δέσμευσης 1 ο Αντίσωμα 2 ο Αντίσωμα 3% BSA σε TBS-T 1:5000 σε TBS-T a-goat 1:7500 σε TBS-T 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 1:1000 σε TBS-T a-mouse 1:5000 σε TBS-T MK 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 1:1000 σε TBS-T a-rabbit 1:12500 σε TBS-T RPTPβ/ζ 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 1:500 σε TBS-T a-mouse 1:5000 σε TBS-T α ν 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 1:5000 σε TBS-T a-rabbit 1:12500 σε TBS-T β 3 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 1:1000 σε TBS-T a-mouse 1:5000 σε TBS-T β 3 Υ773 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 1:1000 σε TBS-T a-rabbit 1:12500 σε TBS-T β 3 Υ785 5% άπαχο γάλα σε TBS-T 1:1000 σε TBS-T a-rabbit 1:12500 σε TBS-T βιοτινυλιωμένες πρωτεΐνες 3% BSA σε TBS-T _ Streptavidinperoxidase polymer 1:5000 σε TBS-T 99

114 Μέθοδοι Πειραματική πορεία 1. Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφορητικής ανάλυσης ακολουθεί τοποθέτηση του πηκτώματος διαχωρισμού σε κατάλληλη συσκευή, για τη μεταφορά των πρωτεϊνών από το πήκτωμα σε μεμβράνη PVDF. 2. Η μεταφορά πραγματοποιείται με εφαρμογή ομοιογενούς ηλεκτρικού πεδίου (ηλεκτρομεταφορά). Το πήκτωμα και η μεμβράνη εμβαπτίζονται σε ρυθμιστικό διάλυμα μεταφοράς και εφαρμόζεται σταθερή ένταση ρεύματος 400 ma για χρόνο 3-4 ώρες, με τέτοιο τρόπο, ώστε οι αρνητικά φορτισμένες πρωτεΐνες οι οποίες βρίσκονται στο πήκτωμα να μεταφερθούν στη μεμβράνη PVDF. Ο χρόνος της μεταφοράς είναι ανάλογος με το μοριακό μέγεθος των πρωτεϊνών που είναι να μεταφερθούν. 3. Μετά το τέλος της μεταφοράς ακολουθεί εμβάπτιση της μεμβράνης σε ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T. Πραγματοποιούνται δυο ξεπλύματα των 5 λεπτών το καθένα υπό ανακίνηση, σε θερμοκρασία δωματίου. 4. Ακολουθεί κορεσμός των μη ειδικών θέσεων πρόσδεσης των αντισωμάτων με επώαση της μεμβράνης σε ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T με 3% BSA ή 5% άπαχο γάλα, ανάλογα με το πρώτο αντίσωμα (Πίνακας Μ5). Η μεμβράνη και στις δυο περιπτώσεις επωάζεται υπό ανακίνηση για δυο ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Εξαίρεση παρουσιάζεται στην περίπτωση βιοτινυλιωμένων πρωτεϊνών, όπου η επώαση (με 3% BSA) διαρκεί 16 ώρες στους 4 ο C. 5. Ακολουθεί απόχυση του παραπάνω διαλύματος και η μεμβράνη υφίσταται 3 ξεπλύματα των 5 λεπτών με διάλυμα TBS-T σε θερμοκρασία δωματίου. 6. Επώαση πρώτου αντισώματος: Η μεμβράνη επωάζεται με ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T που περιέχει το πρώτο αντίσωμα σε κατάλληλη αραίωση (Πίνακας Μ5). Η επώαση πραγματοποιείται υπό ανακίνηση στους 4 ο C για 16 ώρες (overnight επώαση). 7. Απόχυση του διαλύματος του πρώτου αντισώματος (το διάλυμα φυλάσσεται στους -20 ο C και μπορεί να επαναχρησιμοποιηθεί). Η 100

115 Μέθοδοι μεμβράνη υφίσταται 3 ξεπλύματα των 5 λεπτών με διάλυμα TBS-T σε θερμοκρασία δωματίου. 8. Επώαση δευτέρου αντισώματος: Η μεμβράνη επωάζεται με ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T που περιέχει το δεύτερο αντίσωμα σε κατάλληλη αραίωση (πίνακας Μ5). Η επώαση πραγματοποιείται υπό ανακίνηση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. 9. Απόχυση του διαλύματος του δευτέρου αντισώματος. Η μεμβράνη υφίσταται 5 ξεπλύματα των 5 λεπτών με TBS-T και 2 ξεπλύματα με TBS (για να απομακρυνθεί το Tween). 10. Το ανοσοαποτύπωμα της πρωτεΐνης στη μεμβράνη εμφανίζεται στο φιλμ με τη χρήση του συστήματος χημειοφωταύγειας (ECL). 9. Χρώση πηκτώματος πολυακρυλαμιδίου με Coomasie Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται κατά την απομόνωση της πλειοτροπίνης και αποτελεί μια σύντομη μέθοδο ελέγχου καθαρότητας και απόδοσης της έκφρασής της. Στερείται όμως ευαισθησίας σε σχέση με τη μέθοδο ανάλυσης πρωτεϊνών κατά Western, καθώς και εξειδίκευσης, γιατί βάφονται όλες οι πρωτεΐνες που αναλύονται στο πήκτωμα. Διάλυμα Χρωστικής Coomasie Μεθανόλη (απόλυτη) 45% κ.ό. Οξικό οξύ 10% κ.ό. Απεσταγμένο νερό 45% κ.ό. Coomasie R % κ.β. Υλικά και διαλύματα Αποχρωστικό διάλυμα Μεθανόλη (απόλυτη) 45% κ.ό. Οξικό οξύ 10% κ.ό. Απεσταγμένο νερό 45% κ.ό. 101

116 Μέθοδοι Διάλυμα οξικού οξέος Οξικό οξύ 7% κ.ό. Απεσταγμένο νερό 93% κ.ό. Πειραματική πορεία 1. Μετά την ολοκλήρωση της ηλεκτροφορητικής ανάλυσης των δειγμάτων, το πήκτωμα εμβαπτίζεται σε διάλυμα χρωστικής Coomasie. Η επώαση με το διάλυμα της χρωστικής Coomasie πραγματοποιείται σε θερμοκρασία δωματίου υπό συνεχή ανακίνηση, μέχρι να πραγματοποιηθεί πλήρης χρώση του πηκτώματος (περίπου 30 λεπτά). 2. Ακολουθεί αποχρωματισμός του πηκτώματος με επώαση υπό ανακίνηση σε αποχρωστικό διάλυμα. Το αποχρωστικό διάλυμα ανανεώνεται κατά διαστήματα μέχρι να μην υπάρχει μη ειδική χρώση στο πήκτωμα. 3. Ακολουθεί επώαση στο διάλυμα του οξικού οξέος μέχρι να φωτογραφηθεί. 10. Διαδικασία αποδέσμευσης αντισώματος από PVDF μεμβράνη (stripping) (Kain et al, 1994) Η διαδικασία της ανάλυσης των πρωτεϊνών κατά Western παρέχει τη δυνατότητα επαναχρησιμοποίησης των μεμβρανών με επώαση με διαφορετικά αντισώματα. Με τη διαδικασία της αποδέσμευσης των αντισωμάτων (stripping) πραγματοποιείται αποκόλληση από τη μεμβράνη των συμπλόκων πρώτου και δεύτερου αντισώματος, ενώ παραμένουν προσκολλημένες στη μεμβράνη οι ισχυρά δεσμευμένες (με υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις) σε αυτήν πρωτεΐνες από την ηλεκτρομεταφορά. 102

117 Μέθοδοι Υλικά και διαλύματα Διάλυμα αποδέσμευσης των αντισωμάτων από τη μεμβράνη Tris-HCl 62.5 mm, ph 6,8 Δωδεκακυλοθειικό νάτριο (SDS) 2% κ.β. β-μερκαπτοαιθανόλη 100 mm Ρυθμιστικό διάλυμα TBS-Tween 20, ph 7.6 (TBS-T) Ρυθμιστικό διάλυμα TBS (1x) Tween % κ.ό. Πειραματική πορεία 1. Μετά την έκθεση της μεμβράνης στο φιλμ ακολουθούν 3 επωάσεις των 5 λεπτών στη μεμβράνη υπό ανακίνηση με ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T. 2. Επώαση της μεμβράνης στο διάλυμα αποδέσμευσης των αντισωμάτων για 30 λεπτά σε θερμοκρασία ο C υπό ανακίνηση. 3. Ακολουθούν 6 επωάσεις των 5 λεπτών στη μεμβράνη υπό ανακίνηση με ρυθμιστικό διάλυμα TBS-T. 4. Πραγματοποιείται επώαση για την κάλυψη των ελεύθερων θέσεων της μεμβράνης και επαναλαμβάνεται η διαδικασία ανάλυσης των πρωτεϊνών κατά Western. 11. Παρασκευή ECGS (Endothelial Cell Growth Supplement) από εγκέφαλο βοός (Maciag et al, 1979) Κάθε είδος κυττάρων καλλιεργείται σε συγκεκριμένο θρεπτικό μέσο, ώστε να εξασφαλίζεται η ομαλή ανάπτυξή του. Το θρεπτικό μέσο των κυττάρων παρέχει τα απαραίτητα συστατικά για την επιβίωση και ανάπτυξή τους εντός ενός ορίου οξύτητας (ph) και θερμοκρασίας. Τα θρεπτικά μέσα μπορούν να διαχωριστούν σε συνθετικά, όταν είναι πλήρως γνωστή η ταυτότητα και η αναλογία των 103

118 Μέθοδοι συστατικών τους, και σε εμπειρικά, που περιέχουν συστατικά των οποίων η σύσταση δεν είναι επακριβώς καθορισμένη. Εμπειρικό συστατικό μπορεί να θεωρηθεί το συμπλήρωμα της ανάπτυξης των ενδοθηλιακών κυττάρων (endothelial cell growth supplement), το οποίο παράγεται από εγκέφαλο βοός, και χρησιμοποιείται ευρύτατα ως συμπλήρωμα σε θρεπτικά μέσα ενδοθηλιακών κυττάρων. Εγκέφαλος βοός Υλικά και διαλύματα Ποσότητα περίπου 600 g, ο οποίος πρέπει να έχει ληφθεί σε όσο το δυνατόν πιο άσηπτες συνθήκες. PBS (10x) Na 2 HPO M KH 2 PO M NaCl 0.2 M Αραιώνεται σε dh 2 O 10 φορές πριν τη χρήση (PBS 1x, ph 7.4) και αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Διάλυμα NaCl 0.1 M (σε θερμοκρασία 4 ο C) Διάλυμα πενικιλίνης/στρεπτομυκίνης Μεμβράνη διαπίδυσης περιοριστικού μεγέθους 10 kda (Sigma D-9527) Ομογενοποιητής με μαχαιρίδια Πειραματική πορεία 1. Εφόσον ο εγκέφαλος διατηρείται στους -20 ο C πρέπει να παραμείνει για μερικές ώρες στους 4 ο C, μέχρι να επανέλθει στη μαλακή υφή του. 2. Απομακρύνονται περιοχές του εγκεφάλου που περιέχουν πολύ αίμα και μεγάλα αγγεία, ενώ ταυτόχρονα γίνονται πλύσεις με PBS στους 4 ο C. 3. Ο εγκέφαλος τέμνεται σε μικρά τμήματα (περίπου 2-3 cm 2 το καθένα). 104

119 Μέθοδοι 4. Τοποθέτηση των τμημάτων του ιστού σε διάλυμα 0.1 Μ NaCl (απαιτούνται περίπου 500 ml διαλύματος για 600 gr ιστού). Συνήθως η διαδικασία πραγματοποιείται σε 200 ml διαλύματος με αντίστοιχη ποσότητα ιστού. 5. Ομογενοποίηση των τμημάτων του ιστού για 3 λεπτά, χρησιμοποιώντας παγωμένο ομογενοποιητή με μαχαιρίδια. Κατά τη διάρκεια της ομογενοποίησης το ph του ομογενοποιήματος πρέπει να διατηρείται σταθερό και ίσο με Ήπια ανάδευση του ομογενοποιήματος (ph 7.0) για 2 ώρες στους 4 ο C. 7. Φυγοκέντρηση του ομογενοποιήματος στα g για 40 λεπτά στους 4 ο C. 8. Συλλογή του υπερκειμένου και προσθήκη πενικιλίνης/στρεπτομυκίνης σε τελική συγκέντρωση 0.5% κ.β. (εναλλακτικά προστίθενται 12 ml πενικιλίνης/στρεπτομυκίνης από διάλυμα συγκέντρωσης μg/ml σε 200 ml διαλύματος). 9. Επώαση σε ηρεμία στους 4 ο C για περίπου 12 ώρες, προκειμένου να απομακρυνθούν τα λιπίδια (με τη βοήθεια σπάτουλας, δεδομένου ότι είναι στην επιφάνεια). Εάν το ph του διαλύματος δεν έχει παραμείνει σταθερό ρυθμίζεται στην τιμή Φυγοκέντρηση του ομογενοποιήματος στα g για 40 λεπτά στους 4 ο C. 11. Προετοιμασία της μεμβράνης διαπίδυσης με βρασμό για 1.5 ώρα και στη συνέχεια ακολουθούν εκτεταμένες πλύσεις με απεσταγμένο νερό. 12. Διαπίδυση του υπερκειμένου έναντι διαλύματος 0.1M NaCl για 2 ημέρες στους 4 ο C, με συχνές αλλαγές του διαλύματος. 13. Φυγοκέντρηση του ομογενοποιήματος στα g για 40 λεπτά στους 4 ο C. 14. Το υπερκείμενο κατανέμεται ανά 20 ml σε σωληνάρια των 50 ml και διατηρείται στους -20 ο C, έως ότου λυοφιλοποιηθεί. 15. Διατήρηση του λυοφιλοποιημένου υλικού στους 4 ο C (είναι σταθερό για περισσότερο από 6 μήνες). 105

120 Μέθοδοι 12. Θρεπτικά μέσα των χρησιμοποιούμενων κυττάρων (Maciag et al, 1979; Schaffner-Reckinger et al, 1998; Parthymou et al, 2008) Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν κυτταρικές καλλιέργειες από κύτταρα HUVEC (human umbilical vein endothelial cells, ενδοθηλιακά κύτταρα από φλέβα ομφάλιου λώρου), C6 (κύτταρα γλοιώματος αρουραίου), ΜΟ59Κ (κύτταρα ανθρώπινου γλοιώματος), LN18 (κύτταρα ανθρώπινου γλοιώματος), U87MG (κύτταρα ανθρώπινου γλοιώματος) και CHO (chinese hamster ovary cells). Σε όλα τα θρεπτικά μέσα που χρησιμοποιήθηκαν προστέθηκαν τα ακόλουθα αντιβιοτικά: Πενικιλίνη/Στρεπτομυκίνη 100 U/ml, Γενταμυκίνη 50 μg/ml, Αμφοτερικίνη 2.5 μg/ml και L-Γλουταμίνη 2 mm όπου χρειάστηκε. Τα αντιβιοτικά Πενικιλίνη/Στρεπτομυκίνη και Γενταμυκίνη προστατεύουν από βακτήρια και η Αμφοτερικίνη από μύκητες. Στη συνέχεια του κειμένου όταν αναφέρονται θρεπτικά υλικά για κυτταροκαλλιέργειες θα θεωρούνται ότι περιέχουν τα παραπάνω αντιβιοτικά. Οποιαδήποτε τροποποίηση θα αναφέρεται. Το πλήρες θρεπτικό μέσο για κάθε σειρά έχει ως εξής: HUVEC Μ199 85% κ.ό. Ορός εμβρύου βοός (FBS, Fetal Bovine Serum) 15% κ.ό. ECGS (Endothelial Cell Growth Supplement) 150 μg/ml απομονωμένο ECGS Ηπαρίνη (Heparin) 5 U/ml Το εκχύλισμα ECGS είναι εμπλουτισμένο σε FGF και είναι απαραίτητο για την ικανοποιητική ανάπτυξη των HUVEC. Η ηπαρίνη χρησιμοποιείται για να ενεργοποιηθεί ο ECGS. Μετά την προσθήκη του ECGS, ακολουθεί επώαση στους 37 ο C μέχρι να διαλυθεί και στη συνέχεια το θρεπτικό μέσο αποστειρώνεται με διοχέτευσή από φίλτρο με πόρους διαμέτρου 0.2 μm. C6 Ham s F12 90% κ.ό. Ορός εμβρύου βοός (FBS, Fetal Bovine Serum) 10% κ.ό. MO59K, U87MG Dulbecco s modified Eagle medium (DMEM)/Ham s F12 90% κ.ό. 106

121 Μέθοδοι Ορός εμβρύου βοός (FBS, Fetal Bovine Serum) 10% κ.ό. LN18 Dulbecco s modified Eagle medium (DMEM) 95% κ.ό. Ορός εμβρύου βοός (FBS, Fetal Bovine Serum) 5% κ.ό. CHO Dulbecco s modified Eagle medium (DMEM) 90% κ.ό. Ορός εμβρύου βοός (FBS, Fetal Bovine Serum) 10% κ.ό. Όλες οι καλλιέργειες πραγματοποιήθηκαν σε 37 ο C, 5% CO 2 και 100% υγρασία. 13. Απομόνωση ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC από φλέβα ομφάλιου λώρου ανθρώπου (Pipili-Synetos et al, 1998; Papadimitriou et al, 2000) Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν ενδοθηλιακά κύτταρα που απομονώνονταν από φλέβα ομφάλιου λώρου ανθρώπου. Οι ομφάλιοι λώροι προέρχονταν από την ιδιωτική μαιευτική κλινική της Πάτρας και από το Ολύμπιο μαιευτήριο και προέρχονταν από επεμβάσεις καισαρικής τομής. Μετά το τέλος κάθε επέμβασης, ο ομφάλιος λώρος εμβαπτίζεται σε ισότονο ρυθμιστικό διάλυμα (PBS 1x) και μεταφέρεται στον εργαστηριακό χώρο για την περαιτέρω διαδικασία απομόνωσης των ενδοθηλιακών κυττάρων. PBS (10x) Na 2 HPO M KH 2 PO M NaCl 0.2 M Υλικά και διαλύματα Αραιώνεται σε dh 2 O 10 φορές πριν τη χρήση (PBS 1x, ph 7.4) και αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). 107

122 Μέθοδοι Διάλυμα κολλαγενάσης 1% κ.β. 100 mg κολλαγενάσης τύπου 1Α σε 10 ml θρεπτικού μέσου Μ199 Το διάλυμα μοιράζεται σε ποσότητες μικρότερου όγκου και φυλάσσεται στους - 20 ο C μέχρι να χρησιμοποιηθεί. Για την απομόνωση των κυττάρων η κολλαγενάση χρησιμοποιείται σε τελική συγκέντρωση 0.01%. Θρεπτικό μέσο M199 Αναφέρεται αναλυτικά (Παράγραφος 12: Θρεπτικά μέσα χρησιμοποιούμενων κυττάρων). Πλήρες θρεπτικό μέσο για HUVEC Αναφέρεται αναλυτικά (Παράγραφος 12: Θρεπτικά μέσα χρησιμοποιούμενων κυττάρων). Πειραματική πορεία 1. Η κολλαγενάση αραιώνεται με θρεπτικό μέσο μέχρι τελικής συγκέντρωσης 0.01%. Η αραίωση πραγματοποιείται πάντα σε θρεπτικό μέσο ή σε άλλο διάλυμα που περιέχει Ca +2, τα οποία είναι απαραίτητα για τη δράση του ενζύμου. Το θρεπτικό μέσο που χρησιμοποιείται δεν πρέπει να περιέχει ορό, ο οποίος περιέχει αναστολείς διαφόρων ενζύμων, μεταξύ των οποίων και της κολλαγενάσης. Από τη στιγμή της αραίωσής της, η κολλαγενάση δε διατηρείται για μεγάλο χρονικό διάστημα (λιγότερο από 1 εβδομάδα στους 4 ο C). Ιδανικά, πρέπει να αραιώνεται αμέσως πριν χρησιμοποιηθεί. Η τελική συγκέντρωση της κολλαγενάσης αποτελεί ένα από τα πιο κρίσιμα στάδια για την απομόνωση των κυττάρων. 2. Ο ομφάλιος λώρος έχει δυο αρτηρίες και μια φλέβα, η οποία είναι μεγαλύτερη, πιο εύκολα διακριτή και με μαλακότερα τοιχώματα. Ξεπλένεται η φλέβα με PBS (με σύριγγα των 20 ml), ώστε να απομακρυνθούν υπολείμματα αίματος και θρόμβοι. Ελέγχεται εάν η φλέβα του ομφάλιου λώρου είναι ακέραια. Πριν την προσθήκη της κολλαγενάσης πρέπει να διασφαλιστεί ότι το τμήμα του λώρου που χρησιμοποιείται είναι ακέραιο. Τυχόν αλλοιώσεις του τοιχώματος της φλέβας καθιστούν αδύνατη την απομόνωση των κυττάρων. 108

123 Μέθοδοι 3. Κλείσιμο με τη βοήθεια αιμοστάτη του ενός άκρου του ομφάλιου λώρου. 4. Από το άλλο άκρο του ομφάλιου λώρου διοχετεύεται μέσα στη φλέβα το θρεπτικό μέσο με την κολλαγενάση. Η φλέβα αρχίζει να διογκώνεται λόγω του εισερχόμενου διαλύματος. 5. Με αιμοστάτη φράσσεται και το άλλο άκρο του ομφάλιου λώρου. 6. Ο ομφάλιος λώρος τοποθετείται σε αποστειρωμένο δοχείο και επωάζεται στους 37 ο C για λεπτά. 7. Αφαιρείται ο ένας αιμοστάτης και το διάλυμα που περιέχεται στη φλέβα του ομφάλιου λώρου (θρεπτικό μέσο με κολλαγενάση και αποκολλημένα κύτταρα HUVEC) συλλέγεται σε αποστειρωμένο σωληνάριο των 50 ml. 8. Αφαιρείται ο αιμοστάτης και από το άλλο άκρο του ομφάλιου λώρου. 9. Διοχετεύεται PBS, ξεπλένοντας τη φλέβα του ομφάλιου λώρου και το έκλουμα συλλέγεται στο ίδιο αποστειρωμένο σωληνάριο. 10. Πραγματοποιείται φυγοκέντρηση των κυττάρων στα 500 g για 4 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Το υπερκείμενο απορρίπτεται και τα κύτταρα επαναιωρούνται σε 10 ml πλήρους θρεπτικού μέσου. 11. Το εναιώρημα των κυττάρων μεταφέρεται σε τρυβλίο κατάλληλο για την καλλιέργεια κυττάρων. 12. Επώαση των κυττάρων σε 37 ο C, 5% CO 2 και 100% υγρασία. 13. Μια ημέρα αργότερα ακολουθεί αφαίρεση του θρεπτικού μέσου από το τρυβλίο, δυο ήπιες πλύσεις με PBS και αντικατάσταση με 10 ml νέου πλήρους θρεπτικού μέσου. Η διαδικασία πραγματοποιείται για να απομακρυνθούν τα ερυθρά αιμοσφαίρια και άλλα κύτταρα που δεν έχουν προσκολληθεί στον πυθμένα του τρυβλίου, και τα οποία είναι τοξικά για τα ζωντανά κύτταρα. 14. Παρατήρηση της καλλιέργειας σε μικροσκόπιο. Εάν η απομόνωση είναι επιτυχής διακρίνονται συσσωματώματα κυττάρων τα οποία είναι προσκολλημένα στον πυθμένα του τρυβλίου. 109

124 Μέθοδοι 15. Η επώαση των κυττάρων γίνεται με ανανέωση του θρεπτικού μέσου των κυττάρων κάθε 3-4 ημέρες, έως ότου φθάσουν σε βαθμό κάλυψης 80-90% του πυθμένα του τρυβλίου (πλήρης κάλυψη). 14. Μέτρηση κυττάρων σε αιματοκυτταρόμετρο Neubauer Η μέτρηση κυττάρων σε αιματοκυτταρόμετρο (Eικόνα Μ4) είναι η πιο άμεση, απλή και αποδοτική μέθοδος μέτρησης κυττάρων που βρίσκονται σε εναιώρημα. Το αιματοκυτταρόμετρο είναι μια τροποποιημένη αντικειμενοφόρος πλάκα που έχει δυο κατάλληλα επεξεργασμένες λείες επιφάνειες. Σε κάθε μια από αυτές διακρίνεται μια διαγράμμιση σε μορφή τετραγωνισμένου πλέγματος, το οποίο αποτελείται από 9 κύρια τετράγωνα με μήκος πλευράς 1 mm (εμβαδόν τετραγώνου 1 mm 2 ). Το κάθε τετράγωνο ορίζεται από τρεις παράλληλες γραμμές που απέχουν μεταξύ τους 2.5 μm, και οι οποίες χρησιμεύουν για το καθορισμό της θέσης των κυττάρων εντός ή εκτός του πλέγματος. Σε κάθε ένα από τα αρχικά τετράγωνα περιέχονται επιπλέον διαβαθμίσεις για διευκόλυνση της μέτρησης των κυττάρων. Το αιματοκυτταρόμετρο εμφανίζει δυο ίσου μεγέθους, λείες, προεξέχουσες επιφάνειες, με επίπεδο παράλληλο με τις διαγραμμισμένες, που ονομάζονται «ράχες», και στις οποίες στηρίζεται η καλυπτρίδα. Οι διαγραμμισμένες επιφάνειες βρίσκονται 0.1 mm χαμηλότερα από τις «ράχες». Μεταξύ της εξωτερικής πλευράς κάθε τετραγωνισμένης επιφάνειας και των σημείων που στηρίζεται η καλυπτρίδα υπάρχει μια κοίλη επιφάνεια. Στην κοίλη αυτή επιφάνεια τοποθετείται το κυτταρικό εναιώρημα, το οποίο με τριχοειδικά φαινόμενα απλώνεται στην τετραγωνισμένη επιφάνεια. 110

125 Μέθοδοι 1.0 mm Πρώτο τετράγωνο περι οχή βάθος όγκος = μετρήσιμα = μη μετρήσιμα Εικόνα Μ4: Αιματοκυτταρόμετρο Neubauer. Παρουσιάζεται σχηματικά και ο τρόπος υπολογισμού των κυττάρων. Ο όγκος του κυτταρικού εναιωρήματος που θα καλύπτει ένα από τα εννέα τετράγωνα είναι 0.1 mm 3 (1 mm x 0.1 mm) ή 10-4 ml. Έτσι η συγκέντρωση των κυττάρων στο κυτταρικό εναιώρημα (κύτταρα/ml) είναι: Αριθμός κυττάρων στο ένα από τα κύρια τετράγωνα x Ανακαλλιέργεια κυττάρων (Schaffner-Reckinger et al, 1998; Papadimitriou et al, 2000 ; Parthymou et al, 2008) Εκτός από τα κύτταρα που αναφέρθηκαν παραπάνω, στην παρούσα διδακτορική διατριβή χρησιμοποιήθηκαν και κύτταρα CHO σταθερά μετασχηματισμένα με πλασμίδιο, στο οποίο έχει κλωνοποιηθεί η αλληλουχία για την έκφραση της υπομονάδας β 3 της ιντεγκρίνης α ν β 3., τόσο αγρίου τύπου (wild type) (β 3 wt), όσο και με αντικατάσταση των τυροσινών 773 και 785 από φαινυλαλανίνες (mutant) (β 3 mut). Το συγκεκριμένο πλασμίδιο φέρει επιπλέον γονίδιο για ανθεκτικότητα έναντι της νεομυκίνης. Ως μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα CHO σταθερά 111

126 Μέθοδοι μετασχηματισμένα μόνο με το πλασμίδιο φορέα (χωρίς την κωδικοποιούσα αλληλουχία για την έκφραση της ιντεγκρίνης β 3 ) (vector). Για όλα τα κύτταρα ισχύει η κάτωθι πειραματική πορεία ανακαλλιέργειας, με κάποιες τροποποιήσεις που θα αναφερθούν. PBS (10x) Na 2 HPO M KH 2 PO M NaCl 0.2 M Υλικά και διαλύματα Αραιώνεται σε dh 2 O 10 φορές πριν τη χρήση (PBS 1x, ph 7.4) και αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Θρεπτικό μέσο της κάθε κυτταρικής σειράς (Παράγραφος 12: Θρεπτικά μέσα των χρησιμοποιούμενων κυττάρων) Πλήρες θρεπτικό μέσο της κάθε κυτταρικής σειράς (Παράγραφος 12: Θρεπτικά μέσα των χρησιμοποιούμενων κυττάρων) Τρυψίνη EDTA ( % σε PBS χωρίς Ca +2 ) Αιματοκυτταρόμετρο Πιπέτες Pasteur (αποστειρωμένες) Αποστειρώνονται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Διάλυμα Νεομυκίνης G 418, 50 mg/ml (σε αποστειρωμένο νερό) (Sigma) Χρησιμοποιείται μόνο στην περίπτωση των σταθερά μετασχηματισμένων κυττάρων CHO. Διάλυμα ζελατίνης (G1393, Sigma) Διάλυμα ζελατίνης 2%, το οποίο αραιώνεται πριν από τη χρήση του σε τελική συγκέντρωση 1% με PBS 1x. Διατηρείται στους 4 ο C. Χρησιμοποιείται μόνο στην περίπτωση των HUVEC. 112

127 Μέθοδοι Πειραματική πορεία Σημείωση: Στην περίπτωση των κυττάρων HUVEC, πριν προηγηθεί η ανακαλλιέργεια πραγματοποιείται επίστρωση των τρυβλίων καλλιέργειας που θα χρησιμοποιηθούν με διάλυμα ζελατίνης. Μετά την επίστρωση του διαλύματος ζελατίνης τα τρυβλία μεταφέρονται στον επωαστικό θάλαμο, όπου επωάζονται για χρόνο τουλάχιστον 20 λεπτά, ώστε η ζελατίνη να δεσμευθεί στον πυθμένα των τρυβλίων. Η ζελατίνη βελτιώνει τη δέσμευση των HUVEC στο τρυβλίο και βελτιώνει την κατάστασή τους σε πειράματα που απαιτείται επώαση σε θρεπτικό μέσο μειωμένης περιεκτικότητας σε ορό. Την επώαση ακολουθεί μια πλύση με διάλυμα PBS για την απομάκρυνση της περίσσειας ζελατίνης και ξεκινάει η διαδικασία της ανακαλλιέργειας. 1. Παρατήρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο. Η μορφολογία των κυττάρων είναι ενδεικτική της κατάστασής τους. Η ανακαλλιέργεια πραγματοποιείται όταν τα κύτταρα έχουν καλύψει το 80-90% της επιφάνειας του τρυβλίου στο οποίο καλλιεργούνται. Ο προσδιορισμός του βαθμού κάλυψης γίνεται με παρατήρηση του τρυβλίου στο μικροσκόπιο. Κύτταρα υγιή θεωρούνται αυτά που είναι προσκολλημένα στον πυθμένα του τρυβλίου χωρίς να έχει αλλάξει η μορφολογία τους. 2. Μεταφορά του τρυβλίου σε θάλαμο νηματικής ροής, όπου είναι δυνατή η εργασία υπό στείρες συνθήκες. 3. Αναρρόφηση του θρεπτικού μέσου της καλλιέργειας με πιπέτα Pasteur υπό κενό. 4. Έκπλυση των κυττάρων δυο φορές με PBS. Με τη διαδικασία αυτή απομακρύνονται τυχόν εναπομείναντα ίχνη ορού, τα οποία περιέχουν αναστολείς τρυψίνης. 5. Προσθήκη 1 ml τρυψίνης ανά τρυβλίο διαμέτρου 100 mm. 6. Παρατήρηση της αποκόλλησης των κυττάρων στο μικροσκόπιο. Υπό την επίδραση της τρυψίνης, τα κύτταρα αποκτούν σφαιρική μορφή και αποκολλώνται από το υπόστρωμα. Η επιβίωση των κυττάρων κινδυνεύει σε περίπτωση παραμονής τους πλέον των 10 λεπτών στην τρυψίνη (ο χρόνος αυτός μειώνεται στα 5 λεπτά στην περίπτωση των HUVEC). 113

128 Μέθοδοι 7. Με την ολοκλήρωση της αποκόλλησης των κυττάρων η τρυψίνη αναστέλλεται με την προσθήκη 3 ml πλήρους θρεπτικού μέσου (στην περίπτωση των HUVEC η αναστολή της τρυψίνης μπορεί να πραγματοποιηθεί και με Μ199 με 10% ορό). 8. Μεταφορά του εναιωρήματος των κυττάρων σε αποστειρωμένο σωλήνα των 15 ml. Ακολουθεί ήπιο ξέπλυμα με διάλυμα PBS και μεταφορά των κυττάρων που έχουν απομείνει στο τρυβλίο. 9. Φυγοκέντρηση στα 500 g για 4 λεπτά σε θερμοκρασία 26 ο C (ή θερμοκρασία δωματίου). 10. Μετά την ολοκλήρωση της φυγοκέντρησης ακολουθεί μεταφορά του σωλήνα στο θάλαμο νηματικής ροής και αναρρόφηση του υπερκειμένου με πιπέτα Pasteur υπό κενό. 11. Επαναιώρηση των κυττάρων σε 3 ml πλήρους θρεπτικού μέσου (στην περίπτωση ανακαλλιέργειας) ή σε 3 ml αντίστοιχου θρεπτικού μέσου χωρίς ορό (στην περίπτωση πειράματος κυτταρικής μετανάστευσης). 12. Επαναιώρηση των κυττάρων με τη βοήθεια πιπέτας. 13. Προσθήκη 10 μl από το εναιώρημα των κυττάρων στην ειδική υποδοχή του αιματοκυτταρόμετρου και μέτρηση του αριθμού των κυττάρων. 14. Υπολογισμός του αριθμού των κυττάρων. 15. Για κάθε ανακαλλιέργεια χρησιμοποιούνται κύτταρα ανά ml πλήρους θρεπτικού μέσου, εκτός από τις περιπτώσεις που τα κύτταρα θα χρησιμοποιηθούν σε ειδικά πειράματα. Σημείωση: Στην περίπτωση των μετασχηματισμένων κυττάρων CHO στο θρεπτικό μέσο περιλαμβάνεται το αντιβιοτικό νεομυκίνη G418 σε τελική συγκέντρωση 600 μg/ml. 114

129 Μέθοδοι 16. Κατάψυξη κυττάρων Η διατήρηση των κυττάρων για μεγάλο διάστημα είναι δυνατή με την αποθήκευσή τους σε υγρό άζωτο σε θερμοκρασίες μεταξύ -195 ο C και -210 ο C. Για μικρότερο χρονικό διάστημα (λίγους μήνες) μπορεί να διατηρηθεί και σε θερμοκρασίες - 80 ο C. Για την επιτυχή διατήρησή τους είναι απαραίτητη η καλή μεταβολική τους κατάσταση πριν την ψύξη, για το λόγο αυτό και η διαδικασία κατάψυξης των κυττάρων πραγματοποιείται όταν αυτά έχουν καλύψει το 80-90% της επιφάνειας του τρυβλίου. Για την επιτυχή κατάψυξή τους είναι απαραίτητη και η βαθμιαία ψύξη τους (περίπου 1 ο C ανά ώρα), μέχρι ένα κρίσιμο σημείο θερμοκρασίας, - 20 ο C. Η βαθμιαία ψύχη επιτυγχάνεται με τη χρήση μιας συσκευής με υποδοχές η οποία περιέχει ισοπροπανόλη, λόγω της οποίας γίνεται και η σταδιακή ψύξη. Προκειμένου να αποφευχθεί ο σχηματισμός πάγου στο εσωτερικό τους και να ελαχιστοποιηθεί η απώλεια νερού χρησιμοποιείται διμεθυλο-σουλφοξείδιο DMSO ή γλυκερόλη. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή χρησιμοποιήθηκε μόνο DMSO για την ψύξη ευκαρυωτικών κυττάρων. Διμεθυλο-σουλφοξείδιο (DMSO) Υλικά και διαλύματα Πρέπει να είναι ειδικό για κυτταροκαλλιέργειες (cell culture grade). Πλήρες θρεπτικό μέσο (Παράγραφος 12: Θρεπτικά μέσα των χρησιμοποιούμενων κυττάρων) Ορός εμβρύου βοός (FBS) Ειδικά φιαλίδια για την ψύξη των κυττάρων (cryovials) Δοχείο ψύξης κυττάρων με ισοπροπανόλη Δοχείο Dewar με υγρό άζωτο και ειδικές υποδοχές για την αποθήκευση των φιαλιδίων με τα κύτταρα 115

130 Μέθοδοι Πειραματική πορεία 1. Αποκόλληση των κυττάρων με τρυψίνη (όπως αναφέρθηκε στη διαδικασία της ανακαλλιέργειας). Τα κύτταρα από 1 τρυβλίο 100 mm αποθηκεύονται σε ένα φιαλίδιο. 2. Φυγοκέντρηση στα 500 g για 4 λεπτά στους 26 ο C. 3. Σημειώνονται στο φιαλίδιο το όνομα της κυτταρικής σειράς, η ημερομηνία κατάψυξης και η γενιά των κυττάρων. 4. Αφαιρείται το υπερκείμενο θρεπτικό μέσο. 5. Το ίζημα των κυττάρων επαναιωρείται σε 900 μl ορού (στην περίπτωση των HUVEC). Εναλλακτικά μπορεί να επαναιωρείται σε 950 μl πλήρους θρεπτικού μέσου (στην περίπτωση των C6, MO59K, U87MG, CHO) ή να επαναιωρείται σε 900 μl πλήρους θρεπτικού μέσου με επιπλέον προσθήκη 50 μl ορού (στην περίπτωση των LN18). 6. Μεταφορά του εναιωρήματος των κυττάρων στο ειδικό φιαλίδιο για την ψύξη των κυττάρων. 7. Προσθήκη της ποσότητας DMSO που απαιτείται (100 μl στα HUVEC και 50 μl στα C6, MO59K, U87MG και LN18). Την προσθήκη του DMSO ακολουθεί γρήγορη ανάδευση με πιπέτα και άμεση μεταφορά στο δοχείο ψύξης των κυττάρων με ισοπροπανόλη. Οι κινήσεις πρέπει να είναι σύντομες γιατί το DMSO είναι τοξικό για τα κύτταρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η τελική συγκέντρωση του DMSO δεν πρέπει να υπερβαίνει το 20% στο τελικό διάλυμα για να αποφευχθούν προβλήματα τοξικότητας, ενώ η προσθήκη του μειώνει τη δημιουργία κρυστάλλων νερού στο εσωτερικό των κυττάρων. 8. Τοποθέτηση του δοχείου ψύξης των κυττάρων στους -80 ο C για 24 ώρες. Με τον τρόπο αυτό επιτυγχάνεται η σταδιακή μείωση της θερμοκρασίας (περίπου 1 ο C ανά ώρα). 9. Τοποθέτηση του φιαλιδίου για την ψύξη των κυττάρων σε ειδική υποδοχή βυθισμένη σε υγρό άζωτο στο δοχείο Dewar. 116

131 Μέθοδοι 10. Καταγραφή στο τετράδιο του δοχείου Dewar της θέσης που βρίσκεται το φιαλίδιο, του είδους των κυττάρων, της ημερομηνίας και της γενιάς που θα έχουν τα κύτταρα όταν ξεπαγώσουν. 17. Απόψυξη κυττάρων Με τη διαδικασία αυτή, κύτταρα που βρίσκονται παγωμένα ακόμα και για μεγάλο χρονικό διάστημα, είναι δυνατό να οδηγηθούν σε καλλιέργεια. Λόγω της τοξικότητας του DMSO οι κινήσεις στη διαδικασία αυτή, όπως και στην κατάψυξη, πρέπει να είναι γρήγορες. Υλικά και διαλύματα Θρεπτικό μέσο της κάθε κυτταρικής σειράς Πλήρες θρεπτικό μέσο της κάθε κυτταρικής σειράς Πιπέτες Pasteur (αποστειρωμένες) Αποστειρώνονται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Πειραματική πορεία 1. Σε δοκιμαστικό σωλήνα των 15 ml προστίθενται 9 ml απλού θρεπτικού μέσου των συγκεκριμένων κυττάρων. 2. Αφαίρεση των κυττάρων από το υγρό άζωτο. 3. Σύντομο ξεπάγωμα με ανακίνηση σε υδατόλουτρο στους 37 ο C. 4. Μεταφορά των κυττάρων στo σωλήνα με τα 9 ml και γρήγορη ανάδευση. Το στάδιο αυτό αποσκοπεί στην αραίωση του DMSO στο θρεπτικό μέσο που βρίσκονται τα κύτταρα. 5. Φυγοκέντρηση στα 500 g για 4 λεπτά στους 26 ο C. 6. Απόρριψη του υπερκειμένου με πιπέτα Pasteur υπό κενό. 7. Επαναιώρηση του ιζήματος των κυττάρων σε 3 ml θρεπτικού μέσου στο δοκιμαστικό σωλήνα. Προσθήκη θρεπτικού μέσου μέχρι όγκου 10 ml. 117

132 Μέθοδοι 8. Φυγοκέντρηση στα 500 g για 4 λεπτά στους 26 ο C. 9. Απόρριψη του υπερκειμένου με πιπέτα Pasteur υπό κενό. 10. Επαναιώρηση του ιζήματος των κυττάρων σε 3 ml πλήρους θρεπτικού μέσου στο δοκιμαστικό σωλήνα. Προσθήκη πλήρους θρεπτικού μέσου μέχρι όγκου 10 ml. 11. Μεταφορά των κυττάρων σε τρυβλίο καλλιέργειας. Στην περίπτωση των HUVEC το τρυβλίο πρέπει να έχει επωασθεί με ζελατίνη (Παράγραφος 15: Ανακαλλιέργεια κυττάρων). 12. Παρατήρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο. 13. Μεταφορά του τρυβλίου στον επωαστικό θάλαμο. 14. Αλλαγή πλήρους θρεπτικού μέσου κάθε 3-4 ημέρες μέχρι τα κύτταρα να φθάνουν σε βαθμό επικάλυψης του τρυβλίου 80-90%. 18. Μελέτη του χημειοτακτισμού των κυττάρων (Transfilter assay) (Polytarchou et al, 2005) Με το πείραμα αυτό μελετάται η επίδραση μιας ουσίας στο χημειοτακτισμό των κυττάρων. Η χρησιμοποιούμενη διάταξη αποτελείται από μικροπλακίδια (Transwell Costar) που έχουν την ακόλουθη διαμόρφωση (Εικόνα Μ5). Στην επάνω επιφάνεια κάθε μικροκυψελίδας στερεώνεται μια ένθεση που διαμερισματοποιεί το κελί σε δυο μέρη. Ο μερικός διαχωρισμός της εσωτερικής μικροκυψελίδας από την εξωτερική επιτυγχάνεται μέσω μιας πολυμερούς κινητής μεμβράνης ανθρακικών με μέγεθος πόρων 8 μm, που αποτελεί και τον πυθμένα της εσωτερικής μικροκυψελίδας. Υλικά και διαλύματα Θρεπτικά μέσα για μελέτες κυτταρικής μετανάστευσης HUVEC: Μ199 με 0.25% BSA. Μετά τη διάλυση του BSA στο θρεπτικό ακολουθεί διήθηση με βακτηριοστατικό φίλτρο. C6: Ham s F12 με 2% FBS. 118

133 Μέθοδοι ΜΟ59Κ, U87MG: DMEM/Ham s F12 LN18, CHO:DMEM Σύστημα μελέτης χημειοτακτισμού Transfilter assay Μικροπλακίδια Transwell με διάμετρο πόρων μεμβράνης 8 μm (Costar, Avon, France). Διάλυμα κυανούν της τολουϊδίνης 0.33% κ.β. κυανούν της τολουϊδίνης σε PBS 1x Μονιμοποιητικό διάλυμα Carson s Φορμαλδεΰδη 37% 10% κ.ό. NaH 2 PO 4.Η 2 Ο 0.1 Μ NaOH 0.1 Μ Απεσταγμένο νερό Εικόνα Μ5: Σχηματική απεικόνιση μικροκυψελίδας Transwell Costar. (α) Το εναιώρημα των κυττάρων τοποθετείται στην εσωτερική μικροκυψελίδα, πάνω στην πορώδη μεμβράνη, ενώ η υπό μελέτη ουσία στην εξωτερική μικροκυψελίδα. (β) Κατά την επώαση του μικροπλακιδίου στους 37 ο C ένα ποσοστό των κυττάρων μεταναστεύει στην κάτω επιφάνεια της πορώδους μεμβράνης. Οι πόροι της μεμβράνης (8 μm) είναι αρκετά μικροί ώστε να επιτρέπουν μόνο την ενεργή διέλευση των κυττάρων. (γ) Τα κύτταρα που δε μετανάστευσαν απομακρύνονται. (δ, ε) Ακολουθεί μονιμοποίηση και χρώση των κυττάρων. (δ) Αντιπροσωπευτική εικόνα πορώδους φίλτρου με κύτταρα που έχουν μεταναστεύσει. (ε) Μεγαλύτερη μεγέθυνση ίδιας εικόνας. Διακρίνονται οι πόροι της μεμβράνης (μικρά βέλη) και τα κύτταρα μετά από μονιμοποίηση και χρώση (μεγάλα βέλη). (Polytarchou et al., 2007) 119

134 Μέθοδοι Πειραματική πορεία Έχει προηγηθεί επώαση των κυττάρων στους 37 ο C για 16 ώρες σε θρεπτικά μέσα που είτε στερούνται ορού ή περιέχουν μειωμένες ποσότητες ορού (αναφέρονται στα υλικά και διαλύματα). 1. Πραγματοποιείται η διαδικασία της ανακαλλιέργειας, όπως αναφέρθηκε παραπάνω. 2. Σε κάθε εξωτερική μικροκυψελίδα (κάτω μέρος της μεμβράνης) προστίθενται 600 μl θρεπτικό μέσο των αντίστοιχων κυττάρων, αν πρόκειται για κελίο αναφοράς (μάρτυρας). Στην περίπτωση μελέτης της χημειοτακτικής δράσης μιας ουσίας, η ουσία προστίθεται στην εξωτερική μικροκυψελίδα και σε θρεπτικό μέσο ίδιο με αυτό του κελιού-μάρτυρα. 3. Στην εσωτερική μικροκυψελίδα (πάνω μέρος της μεμβράνης) προστίθεται 100 μl θρεπτικού μέσου με κύτταρα. 4. Επώαση του μικροπλακιδίου στον επωαστικό κλίβανο των κυττάρων για 4 ώρες. 5. Μονιμοποίηση των κυττάρων με εμβάπτιση των εσωτερικών μικροκυψελίδων σε μονιμοποιητικό διάλυμα Carson s για τουλάχιστον 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 6. Προσεκτική απομάκρυνση των κυττάρων που βρίσκονται στο επάνω μέρος της μεμβράνης με βαμβακοφόρο στυλεό και έλεγχος της μεμβράνης στο μικροσκόπιο. Αν η απομάκρυνση των κυττάρων δεν είναι ικανοποιητική επαναλαμβάνεται η διαδικασία. 7. Με ανάλογη προσοχή κόβεται η μεμβράνη με τη βοήθεια νυστεριού, ανακτώντας τη μεγαλύτερη δυνατή επιφάνεια. 8. Τοποθέτηση της μεμβράνης σε αντικειμενοφόρο πλάκα, ώστε τα κύτταρα που έχουν μεταναστεύσει να βρίσκονται στην επάνω επιφάνεια. 9. Χρώση των κυττάρων με εναπόθεση 2 σταγόνων διαλύματος της χρωστικής κυανούν της τολουϊδίνης στη μεμβράνη για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 10. Αποχρωματισμός της μεμβράνης με διαδοχικές εμβαπτίσεις σε νερό. 120

135 Μέθοδοι 11. Τοποθέτηση της μεμβράνης σε αντικειμενοφόρο πλάκα με τα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια. 12. Εναπόθεση 2 σταγόνων νερού πάνω στη μεμβράνη και έγκλεισή της με καλυπτρίδα. 13. Μέτρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο, σε όλη την επιφάνεια της μεμβράνης, με τη βοήθεια βαθμονομημένου πλέγματος. Σημείωση: Ο συγκεκριμένος προσανατολισμός της μεμβράνης κατά τη διάρκεια της χρώσης της και της μέτρησης των κυττάρων αποτελεί δικλείδα ασφαλείας στην περίπτωση που δεν έχουν απομακρυνθεί αποτελεσματικά όλα τα κύτταρα από την επάνω επιφάνεια. Γνωρίζοντας τη θέση των κυττάρων αυτών, δεν προσμετρώνται, και δεν οδηγούμαστε σε λανθασμένες μετρήσεις. 19. Επώαση κυττάρων με παράγοντες για μελέτη φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών (Polykratis et al, 2005) Η συγκεκριμένη πειραματική διαδικασία πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα HUVEC γενιάς P1-P4. PBS (10x) Na 2 HPO M KH 2 PO M NaCl 0.2 M Υλικά και διαλύματα Αραιώνεται σε dh 2 O 10 φορές πριν τη χρήση (PBS 1x, ph 7.4) και αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). 121

136 Μέθοδοι Θρεπτικό μέσο Μ199 με BSA Μ199 με 0.25% BSA. Μετά τη διάλυση του BSA στο θρεπτικό ακολουθεί διήθηση με βακτηριοστατικό φίλτρο. Πιπέτες Pasteur (αποστειρωμένες) Αποστειρώνονται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Πειραματική πορεία 1. Παρατήρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο. Η πειραματική πορεία πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα HUVEC γενιάς P1-P4, και όταν τα κύτταρα είχαν καλύψει το 80-90% της επιφάνειας του τρυβλίου. 2. Μεταφορά του τρυβλίου σε θάλαμο νηματικής ροής, όπου είναι δυνατή η εργασία υπό στείρες συνθήκες. 3. Αναρρόφηση του θρεπτικού μέσου της καλλιέργειας με πιπέτα Pasteur υπό κενό. 4. Έκπλυση των κυττάρων δυο φορές με PBS. 5. Προσθήκη θρεπτικού μέσου Μ199 με BSA. 6. Επώαση για 16 ώρες στον επωαστικό θάλαμο. 7. Ανανέωση του θρεπτικού μέσου με νέο, προθερμασμένο στους 37 ο C, 1 ml λιγότερο από το κανονικό. 8. Επώαση για 1 ώρα στον επωαστικό θάλαμο. 9. Προσθήκη της υπό μελέτη ουσίας αραιωμένης σε 1 ml του ίδιου θρεπτικού μέσου. 10. Επώαση στον επωαστικό θάλαμο για χρόνο όσο απαιτούν οι συνθήκες του πειράματος. Ακολουθεί λύση των κυττάρων σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφηκε στην Παράγραφο

137 Μέθοδοι 20. Βιοτινυλίωση πρωτεϊνών κυτταρικής μεμβράνης ευκαρυωτικών κυττάρων και ανάλυσή τους Η συγκεκριμένη πειραματική διαδικασία πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα HUVEC (γενιάς P1-P4) σε καλλιέργεια, όταν τα κύτταρα κάλυπταν το 80-90% της επιφάνειας του τρυβλίου. PBS (10x) Na 2 HPO M KH 2 PO M NaCl 0.2 M Υλικά και διαλύματα Αραιώνεται σε dh 2 O 10 φορές πριν τη χρήση (PBS 1x, ph 7.4) και αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Πριν το πείραμα το PBS πρέπει να διατηρείται σε θερμοκρασία 4 ο C. N-υδροξυσουξινιμιδοβιοτίνη/NHS-D-βιοτίνη NHS-D-biotin) (H1759, Sigma) (N-hydroxysuccinimidobiotin/ Διαλύεται σε DMSO μέχρι συγκέντρωσης 30 mg/ml. Στη συνέχεια αραιώνεται σε PBS 1x. Αλβουμίνη ορού βοός (Bovine Serum Albumin, BSA) Αντίσωμα στρεπταβιδίνης με υπεροξειδάση (Streptavidin-Peroxidase Polymer) (S2438, Sigma) Πειραματική πορεία 1. Μεταφορά του τρυβλίου από τον επωαστικό θάλαμο σε πάγο. 2. Αναρρόφηση του θρεπτικού μέσου της καλλιέργειας υπό κενό. 3. Έκπλυση των κυττάρων 2 φορές με PBS στους 4 ο C. 4. Επώαση των κυττάρων με PBS με 0.5 mg/ml NHS-D-βιοτίνη για λεπτά στους 4 ο C. 123

138 Μέθοδοι 5. Ακολούθησαν εκτεταμένες (8-10) πλύσεις με PBS στους 4 ο C, για να απομακρυνθεί η περίσσεια της NHS-D-βιοτίνης πριν τη λύση των κυττάρων. 6. Ακολουθείται το πρωτόκολλο της λύσης των κυττάρων όπως περιγράφεται στην Παράγραφο 3, της μέτρησης πρωτεϊνών με τη μέθοδο Bradford όπως περιγράφεται στην Παράγραφο 4 και της ανοσοκατακρήμνισης όπως περιγράφεται στην Παράγραφο 6. Στη συγκεκριμένη περίπτωση, η ανοσοκατακρήμνιση πραγματοποιήθηκε σε 1.5 mg πρωτεΐνης με το αντίσωμα έναντι της ιντεγκρίνης α ν β Πραγματοποιείται ανάλυση των πρωτεϊνών σε πήκτωμα πολυακριλαμιδίου με αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE) (Παράγραφος 7) και ανάλυσή τους κατά Western (Παράγραφος 8). 21. Διαμόλυνση κυττάρων με παρεμβαλλόμενο RNA (sirna, RNAi) Σε αυτήν την πειραματική διαδικασία πραγματοποιήθηκε παροδική διαμόλυνση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC με παρεμβαλλόμενο RNA που είχε στόχο το mrna του RPTPβ/ζ. Ως φορέας για τη μεταφορά του παρεμβαλλόμενου RNA στο εσωτερικό των κυττάρων χρησιμοποιήθηκε ανιονική αμίνη. Δεδομένου ότι η συγκέντρωση του παρεμβαλλόμενου RNA, καθώς και η πυκνότητα των κυττάρων που υφίστανται τη διαμόλυνση επηρεάζουν το ποσοστό μετασχηματισμού και την τοξικότητα, προηγήθηκαν πειράματα για να καθορισθούν οι συνθήκες για την αναστολή της έκφρασης των υπό μελέτη πρωτεϊνών (Polykratis et al, 2005). Θρεπτικό μέσο (χωρίς αντιβιοτικά) M199 Υλικά και διαλύματα Πλήρες θρεπτικό μέσο (χωρίς αντιβιοτικά) Μ199 με 15% ορό εμβρύου βοός (FBS, Fetal Bovine Serum) Jet SI TM -ENDO 124

139 Μέθοδοι (402-04, Polyplus Transfection, Illkirch, France) Αλληλουχίες sirna για τον RPTPβ/ζ (VBC-Biotech Services, Vienna, Austria) Νοηματική αλληλουχία Αντι-νοηματική αλληλουχία 5 -AAAUGCGAAUCCUAAAGCGUU-3 5 -AACGCUUUAGGAUUCGCAUUU-3 Silencer R Negative Control sirna (Ambion, #4635) Πειραματική πορεία 1. Πραγματοποιείται η διαδικασία της ανακαλλιέργειας, όπως περιγράφεται στην Παράγραφο 15. Χρησιμοποιούνται κύτταρα σε τρυβλία των 60 mm και κύτταρα σε τρυβλία των 100 mm. Στην περίπτωση των HUVEC, τα τρυβλία πρέπει να έχουν επωασθεί με διάλυμα ζελατίνης 1% σε PBS. 2. Επώαση των κυττάρων για 24 ώρες με πλήρες θρεπτικό μέσο χωρίς αντιβιοτικά. 3. Παρατήρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο. Τα κύτταρα θα πρέπει να έχουν καλύψει το 30-50% της επιφάνειας του τρυβλίου πριν τη διαμόλυνσή τους. Tα κύτταρα κάλυπταν περίπου το 40% της επιφάνειας του τρυβλίου. 4. Προσθήκη 150 μl ή 300 μl (για τρυβλία 60 mm και 100 mm αντίστοιχα) σκέτου θρεπτικού μέσου χωρίς αντιβιοτικά σε σωληνάρια φυγοκέντρου (2 σωληνάρια ανά τρυβλίο). 5. Προσθήκη 6.3 μl και 12.6 μl διαλύματος jetsi ΤΜ -ENDO για τρυβλία των 60 και 100 mm αντίστοιχα, σε ένα από τα δυο σωληνάρια φυγοκέντρου ανά τρυβλίο. 6. Άμεση και έντονη ανάδευση σε αναδευτήρα τύπου vortex. 7. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά. 8. Στο διάστημα της επώασης πραγματοποιείται προσθήκη της αναγκαίας ποσότητας του παρεμβαλλόμενου RNA στο άλλο σωληνάριο (για το κάθε 125

140 Μέθοδοι τρυβλίο). Η τελική συγκέντρωση του παρεμβαλλόμενου RNA είναι 50 nm για την περίπτωση του RPTPβ/ζ και 33 nm για την περίπτωση των α ν και β Ήπια ανάδευση του μίγματος RNA-θρεπτικού μέσου σε αναδευτήρα τύπου vortex. 10. Με την ολοκλήρωση της επώασης, ακολουθεί προσθήκη του μίγματος jetsi ΤΜ -ENDO-θρεπτικό μέσο στο μίγμα RNA-θρεπτικό μέσο (για κάθε τρυβλίο). Είναι απαραίτητη η ανάμιξη των συστατικών με αυτή τη φορά. 11. Άμεση ανάδευση του μίγματος σε αναδευτήρα τύπου vortex για 10 δευτερόλεπτα. 12. Επώαση σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. 13. Στη διάρκεια αυτής της επώασης αφαιρείται το θρεπτικό μέσο από τα τρυβλία και προστίθεται σε αυτά νέο πλήρες θρεπτικό μέσο χωρίς αντιβιοτικά, προθερμασμένο στους 37 ο C. Η ποσότητα του θρεπτικού μέσου που προστίθεται είναι 3 και 6 ml σε τρυβλία των 60 και 100 mm αντίστοιχα. 14. Με το πέρας της επώασης ακολουθεί προσθήκη του μίγματος στα τρυβλία και ήπια ανάδευση. 15. Πραγματοποιείται επώαση των κυττάρων για 4 ώρες στον επωαστικό θάλαμο. 16. Προσθήκη ίδιας ποσότητας (3 ή 6 ml) προθερμασμένου πλήρους θρεπτικού μέσου χωρίς αντιβιοτικά στο κάθε τρυβλίο. 17. Επώαση των κυττάρων στον επωαστικό θάλαμο για 24 ή 48 ώρες. 18. Ακολουθεί λύση των κυττάρων για απομόνωση πρωτεΐνης (Παράγραφος 3) ή για πειράματα μελέτης φωσφορυλίωσης, (Παράγραφος 5) ή αντικατάσταση θρεπτικού μέσου με νέο χωρίς ορό (Παράγραφος 18) για πειράματα μελέτης χημειοτακτισμού. 126

141 Μέθοδοι 22. Μετασχηματισμός ευκαρυωτικών κυττάρων Ο παροδικός μετασχηματισμός ευκαρυωτικών κυττάρων αφορά στην εισαγωγή ενός κυκλικού μορίου DNA (πλασμιδίου) στο κύτταρο και την έκφρασή του για μια ή λίγες γενιές. Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε παροδικός μετασχηματισμός καρκινικών κυττάρων ΜΟ59Κ με πλασμίδια που φέρουν τη γονιδιακή αλληλουχία της ιντεγκρίνης β 3 (wtβ 3 ), αλλά και μεταλλαγμένης β 3, με αντικατάσταση των τυροσινών 773 και 785 με φαινυλαλανίνες (mutβ 3 ), καθώς και σκέτο το πλασμίδιο-φορέας. Το πλασμίδιο-φορέας που χρησιμοποιήθηκε ήταν pcdna3.1. Θρεπτικό μέσο Υλικά και διαλύματα Dulbecco s modified Eagle medium (DMEM)/Ham s F12 Πλήρες θρεπτικό μέσο Dulbecco s modified Eagle medium (DMEM)/Ham s F12 με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) jetpei TM -HUVEC (Polyplus Transfection, #108-01N) NaCl 150 mm (αποστειρωμένο) Πειραματική πορεία Η διαδικασία πραγματοποιείται σε θάλαμο νηματικής ροής σε στείρες συνθήκες. Τα πειράματα παροδικού μετασχηματισμού των κυττάρων ΜΟ59Κ στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκαν σε τρυβλία των 60 mm. 1. Πραγματοποιείται η διαδικασία της ανακαλλιέργειας, όπως περιγράφεται στην Παράγραφο 15. Χρησιμοποιούνται κύτταρα ΜΟ59Κ ανά τρυβλίο, σε πλήρες θρεπτικό μέσο. 2. Επώαση των κυττάρων για 24 ώρες. 127

142 Μέθοδοι 3. Παρατήρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο. Τα κύτταρα θα πρέπει να έχουν καλύψει το 50-60% της επιφάνειας του τρυβλίου πριν τη διαμόλυνσή τους. 4. Αφαίρεση του θρεπτικού και προσθήκη 4 ml πλήρους θρεπτικού μέσου, προθερμασμένου στους 37 ο C. 5. Υπολογισμός συμπλόκων. Ο παροδικός μετασχηματισμός πραγματοποιήθηκε με αναλογία Ν/Ρ=5 (N/P ratio=5). Η αναλογία Ν/Ρ αντιστοιχεί σε αναλογία του αντιδραστηρίου jetpei ΤΜ -HUVEC προς το DNA, αναφορικά με μόρια αζώτου του αντιδραστηρίου προς μόρια φωσφόρου του DNA. Δεδομένου ότι το διάλυμα jetpei TM -HUVEC έχει συγκέντρωση 7.5 mm και 1 μg DNA περιέχει 3 nmoles φωσφορικά ανιόντα, η ποσότητα jetpei TM - HUVEC που χρησιμοποιείται υπολογίζεται από τον τύπο: μl από jetpei TM -HUVEC = [(μg DNA x 3) x N/P ratio] / 7.5 Στα πειράματα χρησιμοποιήθηκε ποσότητα 10 μg DNA ανά τρυβλίο 60 mm. 6. Προσθήκη αντιδραστηρίου jetpei TM -HUVEC και DNA σε σωληνάρια φυγοκέντρου, κάθε ένα από τα οποία περιέχει 300 μl NaCl 150 mm. 7. Ελαφρά ανάδευση με αναδευτήρα τύπου vortex. 8. Προσθήκη του περιεχομένου του σωληναρίου με το jetpei TM -HUVEC στο σωληνάριο με το DNA. Είναι απαραίτητη η ανάμιξη των συστατικών με αυτή τη φορά. 9. Άμεση ανάδευση σε αναδευτήρα τύπου vortex. 10. Επώαση του μίγματος για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 11. Προσθήκη 500 μl από το μίγμα ανά τρυβλίο και ακολουθεί ήπια ανάδευση. 12. Επώαση των κυττάρων στον επωαστικό θάλαμο για 4 ώρες. 13. Αντικατάσταση του θρεπτικού μέσου με 5 ml προθερμασμένου πλήρους θρεπτικού μέσου. 14. Επώαση των κυττάρων στον επωαστικό θάλαμο για 24 ώρες. 15. Ακολουθεί λύση των κυττάρων για απομόνωση πρωτεΐνης όπως περιγράφεται στην Παράγραφο 3, αντικατάσταση θρεπτικού μέσου με νέο 128

143 Μέθοδοι χωρίς ορό όπως περιγράφεται στην Παράγραφο 18, ή μονιμοποίηση των κυττάρων όπως περιγράφεται στην Παράγραφο 24, ανάλογα με το είδος του πειράματος που ακολουθεί. 23. Ανοσοφθορισμός (Huang et al, 2006) Υλικά και διαλύματα Καλυπτρίδες μικρές Αποστειρώνονται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Λαβίδα με λεπτά άκρα Αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο). Μονωτική ζελατίνη τύπου Parafilm PBS (10x) Na 2 HPO M KH 2 PO M NaCl 0.2 M Αραιώνεται σε dh 2 O 10 φορές πριν τη χρήση (PBS 1x, ph 7.4), αποστειρώνεται για 20 λεπτά σε 121 ο C (αυτόκαυστο) και διατηρείται στους 4 ο C. Ρυθμιστικό διάλυμα PBS-Tween 20 Ρυθμιστικό διάλυμα PBS (1x) Tween % κ.ό. Διάλυμα 4% PFA Φορμαλδεΰδη 37% 10% κ.ό. Απεσταγμένο νερό Αλβουμίνη ορού βοός (Bovine Serum Albumin, BSA) Ορός εμβρύου βοός (Fetal Bovine Serum, FBS) 129

144 Μέθοδοι Πρώτα αντισώματα Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται σε ανάλυση πρωτεϊνών κατά Western παρατίθενται στον Πίνακα Μ6. Δεύτερα αντισώματα Τα δεύτερα αντισώματα, των οποίων οι συνθήκες αναφέρονται στον Πίνακα Μ6, είναι τα ακόλουθα: Alexa Fluor 594 chicken anti-mouse IgG (H+L) (A-21201, Molecular Probes, Invitrogen) Alexa Fluor 488 chicken anti-goat IgG (H+L) (A-21467, Molecular Probes, Invitrogen) Πίνακας Μ6: Παράθεση των αντισωμάτων και των συνθηκών τους όπως χρησιμοποιήθηκαν στα πειράματα ανοσοφθορισμού. Στις στήλες από αριστερά αναγράφονται οι πρωτεΐνες, οι εταιρίες παραγωγής των αντισωμάτων, οι συνθήκες παρεμπόδισης της μη ειδικής δέσμευσης και οι συνθήκες επώασης του 1 ου και του 2 ου αντισώματος. Πρωτεΐνη Εταιρία Παρεμπόδιση μη ειδικής δέσμευσης 1 ο Αντίσωμα 2 ο Αντίσωμα PTN Lab. 3% BSA, 10% FBS 1:500 σε 3% a-goat 1:500 σε CRRET σε PBS BSA / PBS 3% BSA / PBS RPTPβ/ζ Santa Cruz 3% BSA, 10% FBS σε PBS α ν β 3 Chemicon 3% BSA, 10% FBS σε PBS 1:100 σε 3% BSA / PBS 1:500 σε 3% BSA / PBS a-goat 1:500 σε 3% BSA / PBS a-mouse 1:500 σε 3% BSA / PBS Χρωστική DAPI Χρησιμοποιείται σε τελική συγκέντρωση 6 μg/ml σε PBS. Mowiol 4-88 (Calbiochem, San Diego, CA, USA) 130

145 Μέθοδοι Πειραματική πορεία Στην περίπτωση των HUVEC, πριν την έναρξη της πειραματικής πορείας του ανοσοφθορισμού πραγματοποιείται η ακόλουθη πορεία: Εναπόθεση μιας αποστειρωμένης καλυπτρίδας σε κάθε μικροκυψελίδα από μικροπλακίδιο έξι κελίων (6-well plate). Επίστρωση των κελίων (με τις καλυπτρίδες) με διάλυμα ζελατίνης 1%, όπως περιγράφεται στην Παράγραφο 15. Χρειάζεται προσοχή ώστε να καλυφθεί με ζελατίνη το σύνολο της επιφάνειας της καλυπτρίδας. Επώαση για τουλάχιστον 20 λεπτά στον επωαστικό θάλαμο. Μια πλύση με διάλυμα PBS. Στα υπόλοιπα είδη κυττάρων πραγματοποιείται η εναπόθεση της καλυπτρίδας σε κάθε μικροκυψελίδα του μικροπλακιδίου και ακολουθούν τα εξής βήματα: 1. Πραγματοποιείται η διαδικασία της ανακαλλιέργειας και επίστρωση των κυττάρων στο μικροπλακίδιο. Ο αριθμός των κυττάρων διαφοροποιείται ανάλογα με την καλλιέργεια. 2. Παρατήρηση των κυττάρων στο μικροσκόπιο. Τα κύτταρα θα πρέπει να έχουν καλύψει επιφάνεια μικρότερη του 80% της επιφάνειας της μικροκυψελίδας πριν την πραγματοποίηση του πειράματος. 3. Απομάκρυνση του μικροπλακιδίου από τον επωαστικό θάλαμο και τοποθέτησή του σε πάγο. Η χαμηλή θερμοκρασία είναι απαραίτητη για να μειωθεί το ποσοστό αποκόλλησης των κυττάρων κατά τη διαδικασία. 4. Απορρίπτεται το θρεπτικό μέσο και ακολουθούν τρεις σύντομες πλύσεις με PBS σε θερμοκρασία 4 ο C. 5. Μονιμοποίηση των κυττάρων με διάλυμα 4% PFA για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 6. Ακολουθούν τρεις πλύσεις, των 5 λεπτών η καθεμιά, με διάλυμα PBS υπό ανάδευση. Συνήθως ακολουθεί επώαση των κυττάρων με διάλυμα Triton 0.3% για άνοιγμα πόρων στην κυτταρική μεμβράνη. Επειδή όμως στα συγκεκριμένα πειράματα ενδιέφερε η σήμανση των πρωτεϊνών αποκλειστικά 131

146 Μέθοδοι στην κυτταρική μεμβράνη δεν πραγματοποιήθηκε το στάδιο αυτό (Huang et al, 2006). 7. Ακολουθεί κορεσμός των μη ειδικών θέσεων πρόσδεσης των αντισωμάτων (blocking) με επώαση με διάλυμα 3% BSA / 10% FBS σε PBS για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου υπό ανάδευση. 8. Μεταφορά των καλυπτρίδων (που περιέχουν τα κύτταρα) σε τρυβλία 60 mm των οποίων ο πυθμένας είναι καλυμμένος με μονωτική ζελατίνη τύπου Parafilm. Αυτό εμποδίζει τη διάχυση των αντισωμάτων από την καλυπτρίδα. 9. Πραγματοποιείται επώαση του πρώτου ή πρώτων αντισωμάτων, στις συγκεντρώσεις και στο διάλυμα που αναφέρονται παραπάνω (Πίνακας Μ6), για 16 ώρες στους 4 ο C. 10. Ακολουθούν τρεις πλύσεις, των 5 λεπτών η καθεμιά, με ρυθμιστικό διάλυμα PBS-T υπό ανάδευση. 11. Πραγματοποιείται επώαση του δεύτερου αντισώματος, στη συγκέντρωση και στο διάλυμα που αναφέρονται παραπάνω (Πίνακας Μ6) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Από την προσθήκη του δεύτερου αντισώματος και μετά η διαδικασία πραγματοποιείται σε σκοτεινό περιβάλλον. 12. Ακολουθούν τρεις πλύσεις, των 5 λεπτών η καθεμιά, με ρυθμιστικό διάλυμα PBS-T υπό ανάδευση. Σε περίπτωση που απαιτείται επώαση και με άλλο δεύτερο αντίσωμα επαναλαμβάνονται τα βήματα 11 και 12 και με το δεύτερο αντίσωμα του άλλου αντισώματος. Στα πειράματα με χρώση των πυρήνων με τη χρωστική DAPI, αυτή πραγματοποιείται ανάμεσα στις δυο πρώτες πλύσεις με PBS-T για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. 13. Οι καλυπτρίδες υφίστανται μια ταχεία πλύση με αποστειρωμένο νερό. 14. Εναπόθεση μιας σταγόνας διαλύματος Mowiol πάνω σε αντικειμενοφόρο πλάκα. 15. Τοποθέτηση των καλυπτρίδων στην αντικειμενοφόρο πλάκα, με την επιφάνεια των κυττάρων προς τα κάτω, στο σημείο ακριβώς όπου έχει τοποθετηθεί η σταγόνα του διαλύματος Mowiol. 132

147 Μέθοδοι 16. Επώαση των αντικειμενοφόρων σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Το διάλυμα Mowiol στερεοποιείται και δεν απαιτείται προσθήκη βερνικιού στην περιφέρεια. 17. Τα δείγματα είναι έτοιμα για παρατήρηση σε μικροσκόπιο φθορισμού. 24. Ποσοτικοποίηση ανοσοαποτυπωμάτων με σύστημα ανάλυσης εικόνας Προκειμένου να εξαχθούν ποσοτικά συμπεράσματα από ανοσοαποτυπώματα γίνεται ποσοτικοποίηση των ζωνών με τη χρήση συστήματος ανάλυσης εικόνας. Τα ανοσοαποτυπώματα ψηφιοποιούνται με χρήση σαρωτή (HP Scanjet G3010) και οι ψηφιακές φωτογραφίες αναλύονται με το πρόγραμμα Scion Image (Scion Corporation). Το λογισμικό είναι ρυθμισμένο κατάλληλα, ώστε για κάθε ζώνη που περιγράφεται, να καταγράφεται αυτόματα σε ένα λογιστικό φύλλο η επιφάνεια της ζώνης και η μέση έντασή της. Το γινόμενο των δυο αυτών παραμέτρων είναι ανάλογο της ποσότητας της πρωτεΐνης που αντιστοιχεί σε κάθε ζώνη και χρησιμοποιείται περαιτέρω για ποσοτικές αναλύσεις. 25. Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με τη χρήση του unpaired t-test ή του test ANOVA. Οι συγκρίσεις (μέση τιμή ± τυπικό σφάλμα) έγιναν μεταξύ της κάθε πειραματικής ομάδας και του αντίστοιχου μάρτυρα. 133

148 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

149 Αποτελέσματα 1. Αναστολή της λειτουργικότητας της ιντεγκρίνης α ν β 3 αναστέλλει την επαγόμενη από πλειοτροπίνη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC Από προηγούμενη μελέτη του εργαστηρίου γνωρίζουμε ότι η πλειοτροπίνη επάγει τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων (Polykratis et al, 2005). Δεδομένου ότι οι ιντεγκρίνες α ν β 3 και α 5 β 1 θεωρούνται από τις πλέον σημαντικές ιντεγκρίνες στην αγγειογένεση (Stupack and Cheresh, 2004), μελετήθηκε ο τυχόν ρόλος που μπορεί να έχουν στην επαγόμενη από την πλειοτροπίνη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων από φλέβα ομφάλιου λώρου ανθρώπου (HUVEC). Για τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν λειτουργικά αντισώματα έναντι των ιντεγκρινών α ν β 3 (Brooks et al, 1994) και α 5 β 1 (Mould et al, 1998). Πραγματοποιήθηκε επώαση των κυττάρων HUVEC με τα παραπάνω αντισώματα και διέγερση με πλειοτροπίνη για μελέτη της μετανάστευσης, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α1, αναστολή της λειτουργικότητας της ιντεγκρίνης α ν β 3 ελάττωσε, πέρα από την ενδογενή μετανάστευση, το ποσοστό της επαγωγής που προκαλεί η πλειοτροπίνη στη μετανάστευση των HUVEC. Η αναστολή που προκαλείται στην επαγωγική δράση της πλειοτροπίνης είναι δοσοεξαρτώμενη και πλήρης στη συγκέντρωση των 10 ng/ml, χωρίς να είναι τοξική για τα κύτταρα. Αντίθετα, προσθήκη του αντισώματος έναντι της ιντεγκρίνης α 5 β 1 ανέστειλε μόνο τα ενδογενή επίπεδα μετανάστευσης, χωρίς να επηρεάσει την επαγωγική δράση της πλειοτροπίνης. Προσθήκη αντισώματος-μάρτυρα στην αντίστοιχη συγκέντρωση δεν επηρέασε τη μετανάστευση των HUVEC. 135

150 Αποτελέσματα % Μετανάστευση % *** +42% ** Μάρτυρας PTN (100 ng/ml) +20% * +56% ** +44.5% ** anti-α 5 β 1 IgG anti-α V β 3 (ng/ml) 10 ng/ml Εικόνα Α1: Επίδραση των αντισωμάτων έναντι των ιντεγκρινών α ν β 3 και α 5 β 1 στην επαγόμενη από την πλειοτροπίνη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC. Η μετανάστευση των κυττάρων εκτιμήθηκε με το σύστημα χημειοτακτισμού Transwell, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα του ποσοστού των κυττάρων που μετανάστευσαν, ως προς την ομάδα του μάρτυρα, που δεν έχει επωασθεί με αντίσωμα (που θεωρείται 100%). *Ρ< 0.05, **Ρ< 0.01, ***Ρ< Ο αυξητικός παράγοντας Midkine αναστέλλει τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC Στη συνέχεια, έγινε προσπάθεια να διερευνηθεί αν ο μηχανισμός με τον οποίο η ιντεγκρίνη α ν β 3 συμμετέχει στη βιολογική δράση της πλειοτροπίνης είναι κοινός και με το άλλο μέλος της ίδιας οικογένειας αυξητικών παραγόντων, τη midkine. Για το λόγο αυτό, ελέγχθηκε η επίδραση της midkine στη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC (Εικόνα Α2). Σε αντίθεση όμως με την πλειοτροπίνη, η midkine όχι μόνο δεν προκάλεσε επαγωγή, αλλά αντίθετα ανέστειλε με στατιστικά σημαντικό τρόπο τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC. 136

151 Αποτελέσματα % Μετανάστευση Μάρτυρας -18% * MK (100 ng/ml) Εικόνα Α2: Επίδραση του αυξητικού παράγοντα midkine στη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC. Η μετανάστευση των κυττάρων εκτιμήθηκε με το σύστημα χημειοτακτισμού Transwell, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα του ποσοστού των κυττάρων που μετανάστευσαν, ως προς την ομάδα του μάρτυρα (που θεωρείται 100%). *Ρ< Η πλειοτροπίνη αλληλεπιδρά με την ιντεγκρίνη α ν β 3 (Ι) Προκειμένου να διερευνηθεί ο μηχανισμός με τον οποίο η ιντεγκρίνη α ν β 3 συμμετέχει στην επαγόμενη από την πλειοτροπίνη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων, μελετήθηκε τυχόν αλληλεπίδραση της ιντεγκρίνης α ν β 3 με την πλειοτροπίνη. Για το λόγο αυτό, κύτταρα HUVEC λύθηκαν και στο πρωτεϊνικό εκχύλισμα πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση έναντι των ιντεγκρινών α ν β 3 και α 5 β 1. Ακολούθησε SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση και ανάλυση κατά Western, με αντίσωμα έναντι της πλειοτροπίνης. Η λύση των κυττάρων, μέτρηση της συγκέντρωσης της ολικής πρωτεΐνης με τη μέθοδο Bradford, SDS- PAGE ηλεκτροφόρηση και ανάλυση κατά Western περιγράφονται αναλυτικά στις μεθόδους. Στην Εικόνα Α3Α φαίνεται ότι η πλειοτροπίνη δεσμεύεται στην ιντεγκρίνη α ν β 3, αλλά όχι στην α 5 β 1. Εκτός όμως από τα ανθρώπινα ενδοθηλιακά 137

152 Αποτελέσματα κύτταρα, αυτή η αλληλεπίδραση ελέγχθηκε αν ισχύει και στο in vivo μοντέλο της χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης εμβρύου όρνιθας (CAM), όπου είναι γνωστό ότι η ιντεγκρίνη α ν β 3 εκφράζεται στα αγγειογενετικά αγγεία (Brooks et al, 1994). Συγκεκριμένα, σε ομογενοποίημα CAM ένατης ημέρας ανάπτυξης (όπου η αγγειογενετική διαδικασία είναι έντονη) πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3 και ανάλυση κατά Western έναντι της πλειοτροπίνης (Eικόνα Α3Β). Και σε αυτό το μοντέλο διαπιστώνεται η αλληλεπίδραση της ιντεγκρίνης α ν β 3 με την πλειοτροπίνη. A B Εικόνα Α3: Μελέτη της αλληλεπίδρασης ανάμεσα στις ιντεγκρίνες α ν β 3, α 5 β 1 και την πλειοτροπίνη στο πρωτεϊνικό εκχύλισμα των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC (Α) και στο ομογενοποίημα της χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης CAM (Β). Η αλληλεπίδραση μελετήθηκε με ανοσοκατακρήμνιση έναντι των ιντεγκρινών και τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν έναντι της πλειοτροπίνης, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Με τον ίδιο τρόπο, και για επιβεβαίωση της αλληλεπίδρασης, ελέγχθηκε η αλληλεπίδραση της πλειοτροπίνης με τις υπομονάδες α ν και β 3 της ιντεγκρίνης α ν β 3 χωριστά. Συγκεκριμένα, στο πρωτεϊνικό εκχύλισμα των ενδοθηλιακών κυττάρων πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3 και των υπομονάδων α ν και β 3 και ανάλυση κατά Western έναντι της πλειοτροπίνης. 138

153 Αποτελέσματα Επιβεβαιώνεται και εδώ η αλληλεπίδραση της ιντεγκρίνης με την πλειοτροπίνη (Eικόνα Α4). Εικόνα Α4: Αλληλεπίδραση ανάμεσα στην ιντεγκρίνη α ν β 3 και τις υπομονάδες της α ν και β 3, και την πλειοτροπίνη στο πρωτεϊνικό εκχύλισμα των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC. Η αλληλεπίδραση μελετήθηκε με ανοσοκατακρήμνιση έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3 και των υπομονάδων της και τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν έναντι της πλειοτροπίνης, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. 4. Η πλειοτροπίνη αλληλεπιδρά με την ιντεγκρίνη α ν β 3 (ΙΙ) Για επιβεβαίωση της αλληλεπίδρασης της πλειοτροπίνης με την ιντεγκρίνη α ν β 3 πραγματοποιήθηκε και η αντίστροφη διαδικασία: Στο εκχύλισμα των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση με αντίσωμα για την πλειοτροπίνη και ανάλυση κατά Western για τις υπομονάδες α ν και β 3. Επιπλέον, ελέγχθηκε και πιθανή αλληλεπίδραση της midkine με αυτές τις υπομονάδες. Όπως φαίνεται και στις εικόνες, η πλειοτροπίνη αλληλεπιδρά τόσο με την υπομονάδα α ν (Εικόνα Α5), όσο και με την υπομονάδα β 3 (Εικόνα Α6) της ιντεγκρίνης α ν β 3, ενώ η midkine δεν αλληλεπιδρά με καμία από τις δυο υπομονάδες. 139

154 Αποτελέσματα Εικόνα Α5: Μελέτη της αλληλεπίδρασης ανάμεσα στην πλειοτροπίνη, τη midkine και την υπομονάδα α ν της ιντεγκρίνης στο πρωτεϊνικό εκχύλισμα των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC. Η αλληλεπίδραση μελετήθηκε με ανοσοκατακρήμνιση έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3, της πλειοτροπίνης και της midkine και τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν έναντι της υπομονάδας α ν, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Εικόνα Α6: Μελέτη της αλληλεπίδρασης ανάμεσα στην πλειοτροπίνη, τη midkine και την υπομονάδα β 3 της ιντεγκρίνης στο πρωτεϊνικό εκχύλισμα των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC. Η αλληλεπίδραση μελετήθηκε με ανοσοκατακρήμνιση έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3, της πλειοτροπίνης και της midkine και τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν έναντι της υπομονάδας β 3, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. 140

155 Αποτελέσματα 5. Η πλειοτροπίνη εντοπίζεται στην κυτταρική μεμβράνη των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC Η ιντεγκρίνη, όπως και οι υπόλοιποι υποδοχείς της πλειοτροπίνης, εντοπίζονται στην κυτταρική μεμβράνη. Δεδομένου ότι δεν υπάρχουν μέχρι στιγμής στοιχεία για τον εντοπισμό της πλειοτροπίνης στην κυτταρική μεμβράνη με πειράματα ανοσοφθορισμού, πραγματοποιήθηκε ανοσοφθορισμός για την πλειοτροπίνη σε κύτταρα HUVEC. Πραγματοποιώντας την πειραματική πορεία που περιγράφηκε στις μεθόδους, ανιχνεύθηκε καθαρά η πλειοτροπίνη στην περιφέρεια των ενδοθηλιακών κυττάρων και επιβεβαιώθηκε η θέση της με αντίστοιχες εικόνες ανάστροφης φάσης (Εικόνα Α7). Η πειραματική αυτή διαδικασία χρησίμευσε ως μάρτυρας για το πείραμα διπλού ανοσοφθορισμού που ακολούθησε. Εικόνα Α7: Ανίχνευση της πλειοτροπίνης στην περιφέρεια των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC. Πραγματοποιήθηκε ανοσοφθορισμός με αντίσωμα έναντι της πλειοτροπίνης, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Αντιπροσωπευτική εικόνα από μικροσκόπιο φθορισμού (Α) και η αντίστοιχη εικόνα με μικροσκοπία ανάστροφης φάσης (Β). 6. Συνεντοπισμός της ιντεγκρίνης α ν β 3 και της πλειοτροπίνης στην κυτταρική μεμβράνη των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC Σε περιπτώσεις αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών, τα πειράματα διπλού ανοσοφθορισμού μπορούν να προσδώσουν πρόσθετες πληροφορίες για την περιοχή του κυττάρου που λαμβάνει χώρα η αλληλεπίδραση αυτή. Για το λόγο αυτό πραγματοποιήθηκε πείραμα διπλού ανοσοφθορισμού για την πλειοτροπίνη 141

156 Αποτελέσματα και την ιντεγκρίνη α ν β 3. Από το πείραμα προκύπτει ότι η ιντεγκρίνη α ν β 3 και η πλειοτροπίνη συνεντοπίζονται στην περιφέρεια του κυττάρου και σε σημεία σύνδεσης των ενδοθηλιακών κυττάρων μεταξύ τους (Εικόνα Α8). Εικόνα Α8: Συνεντοπισμός της πλειοτροπίνης και της ιντεγκρίνης α ν β 3 στα ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC. Πραγματοποιήθηκε διπλός ανοσοφθορισμός με αντισώματα έναντι της πλειοτροπίνης (πράσινο) και της ιντεγκρίνης α ν β 3 (κόκκινο), όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Στις περιοχές συνεντοπισμού παρατηρούνται σημεία κίτρινου χρώματος. 7. H midkine δεν αλληλεπιδρά με την ιντεγκρίνη α ν β 3 Η πλειοτροπίνη με τη midkine είναι γνωστό ότι μοιράζονται κοινούς υποδοχείς (Kadomatsu and Muramatsu, 2004). Για το λόγο αυτό, μελετήθηκε τυχόν αλληλεπίδραση της midkine με την α ν β 3, με αντίστοιχο τρόπο, όπως και για την πλειοτροπίνη. Συγκεκριμένα, στο πρωτεϊνικό εκχύλισμα των ενδοθηλιακών κυττάρων πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3 και των υπομονάδων α ν και β 3 και ανάλυση κατά Western έναντι της midkine, όπως περιγράφεται στις μεθόδους (Εικόνα Α9). Διαπιστώθηκε ότι η midkine δεν αλληλεπιδρά με καμία από τις υπομονάδες της ιντεγκρίνης α ν β

157 Αποτελέσματα Εικόνα Α9: Μελέτη της αλληλεπίδρασης ανάμεσα στην ιντεγκρίνη α ν β 3, τις υπομονάδες της, α ν και β 3 και τη midkine στο πρωτεϊνικό εκχύλισμα των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC. Η αλληλεπίδραση μελετήθηκε με ανοσοκατακρήμνιση έναντι της ιντεγκρίνης και των υπομονάδων της και τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν έναντι της midkine, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. 8. H πλειοτροπίνη και η midkine αλληλεπιδρούν με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ Είναι γνωστό ότι η φωσφατάση RPTPβ/ζ είναι υποδοχέας τόσο για την πλειοτροπίνη, όσο και για τη midkine. Για να επιβεβαιωθεί αυτή η αλληλεπίδραση στα ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC και να ανιχνευθεί με ποια ισομορφή του υποδοχέα αλληλεπιδρούν, πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση στο πρωτεϊνικό εκχύλισμα των ενδοθηλιακών κυττάρων με αντισώματα για την πλειοτροπίνη και τη midkine και ανάλυση κατά Western για τον υποδοχέα RPTPβ/ζ. Τόσο η πλειοτροπίνη, όσο και η midkine δεσμεύονται ισχυρά με τη μεγάλη διαμεμβρανική ισομορφή του υποδοχέα (Εικόνα Α10). 143

158 Αποτελέσματα Εικόνα Α10: Αλληλεπίδραση ανάμεσα στην πλειοτροπίνη, τη midkine και τον RPTPβ/ζ στο πρωτεϊνικό εκχύλισμα των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC. Η αλληλεπίδραση μελετήθηκε με ανοσοκατακρήμνιση για την πλειοτροπίνη και για τη midkine και τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν έναντι του RPTPβ/ζ, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. 9. H πλειοτροπίνη επάγει τη φωσφορυλίωση της τυροσίνης 773 στην υπομονάδα β 3 της ιντεγκρίνης Είναι γνωστό ότι η λειτουργικότητα της ιντεγκρίνης ρυθμίζεται από το κυτταροπλασματικό τμήμα της, καθώς και ότι το κυτταροπλασματικό τμήμα της υπομονάδας β 3 μπορεί να φωσφορυλιωθεί για να ρυθμίσει αλληλεπιδράσεις με πρωτεΐνες μεταγωγής σήματος (Mahabeleshwar et al, 2007). Για το λόγο αυτό, μελετήθηκε τυχόν επίδραση της πλειοτροπίνης στη φωσφορυλίωση της υπομονάδας β 3 της ιντεγκρίνης. Στην περίπτωση της μεταγωγής σήματος από το εξωτερικό περιβάλλον στο εσωτερικό του κυττάρου (outside-in signaling), η ιντεγκρίνη α ν β 3 είναι από τα πρώτα μόρια που ενεργοποιούνται. Για το λόγο αυτό, και λαμβάνοντας υπόψη το χρόνο ενεργοποίησης άλλων μορίων μεταγωγής σήματος από την πλειοτροπίνη (Meng et al, 2000; Polykratis et al, 2005) μελετήθηκε η επαγόμενη από την πλειοτροπίνη φωσφορυλίωση της υπομονάδας β 3 της ιντεγκρίνης. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α11, η πλειοτροπίνη επάγει σε μεγάλο βαθμό τη φωσφορυλίωση της τυροσίνης 773, ενώ δε φαίνεται να επηρεάζει τη φωσφορυλίωση της τυροσίνης

159 Αποτελέσματα Α Β % Φωσφορυλίωση της β 3 ιντεγκρίνης Φωσφο-Y773 Μάρτυρας PTN (100 ng/ml) Φωσφο-Y785 Εικόνα Α11: Επίδραση της πλειοτροπίνης στη φωσφορυλίωση των τυροσινών 773 και 785 της ιντεγκρίνης β 3 στα ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC. (Α) Πραγματοποιήθηκε επώαση των ενδοθηλιακών κυττάρων με την πλειοτροπίνη για 7 λεπτά, λύση τους, SDS- PAGE ηλεκτροφόρηση και ανάλυση κατά Western με αντισώματα έναντι των φωσφορυλιωμένων Υ773 και Υ785, καθώς και έναντι της ολικής β 3, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. (Β) Η ποσοτικοποίηση των ζωνών των ανοσοαποτυπωμάτων πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στις μεθόδους. 145

160 Αποτελέσματα 10. Μελέτη της επαγόμενης από την πλειοτροπίνη φωσφορυλίωσης της ιντεγκρίνης β 3 σε συνάρτηση με το χρόνο Επόμενο βήμα, μετά την ανίχνευση της επαγωγής της φωσφορυλίωσης της υπομονάδας β 3 της ιντεγκρίνης από την πλειοτροπίνη, ήταν η μελέτη της επαγωγής αυτής σε συνάρτηση με το χρόνο (time course). Πραγματοποιήθηκε επώαση των ενδοθηλιακών κυττάρων με την πλειοτροπίνη και τα κύτταρα λύθηκαν μετά από χρόνο επώασης 3, 7, 11, 15 και 30 λεπτών. Ακολούθησε SDS- PAGE ηλεκτροφόρηση και ανάλυση κατά Western με αντισώματα έναντι φωσφορυλιωμένης β 3 Υ773 και ολικής β 3 ιντεγκρίνης, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α12, η επαγωγή της φωσφορυλίωσης της ιντεγκρίνης β 3 ξεκινάει στα 3 λεπτά και διατηρείται και στη μισή ώρα. Α Β % φωσφορυλίωση Y773 της β *** 3 ** *** 7 11 Χρόνος (λεπτά) *** 15 *** 30 Εικόνα Α12: Επίδραση της πλειοτροπίνης στη φωσφορυλίωση της τυροσίνης 773 στην ιντεγκρίνη β 3 στα ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC. (Α) Πραγματοποιήθηκε επώαση των ενδοθηλιακών κυττάρων με την πλειοτροπίνη για χρόνο 3, 7, 11, 15, 30 λεπτά, λύση τους, SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση και ανάλυση κατά Western με αντισώματα έναντι της φωσφορυλιωμένης Υ773 και έναντι της ολικής β 3, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. (Β) Η ποσοτικοποίηση των ζωνών των ανοσοαποτυπωμάτων και η στατιστική επεξεργασία πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται στις μεθόδους. 146

161 Αποτελέσματα 11. H midkine επάγει τη φωσφορυλίωση της τυροσίνης 773 στη β 3 υπομονάδα της ιντεγκρίνης Σε αναλογία με την πλειοτροπίνη, εξετάσθηκε τυχόν επίδραση και της midkine στη φωσφορυλίωση της τυροσίνης 773 της υπομονάδας β 3 της ιντεγκρίνης. Πιο συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκε επώαση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC για χρόνο 7 λεπτά με τη midkine, λύση τους, SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση και ανάλυση κατά Western με αντίσωμα έναντι της φωσφορυλιωμένης στην Υ773 β 3 και της ολικής β 3. Αν και η midkine, όπως προαναφέρθηκε, δεν αλληλεπιδρά με την ιντεγκρίνη α ν β 3, εντούτοις επάγει τη φωσφορυλίωσή της στην τυροσίνη 773 (Εικόνα Α13). Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι η δέσμευση των πλειοτροπίνη και midkine στην ιντεγκρίνη α ν β 3, δεν είναι απαραίτητη για την επαγωγή της φωσφορυλίωσης στην τυροσίνη 773. Επομένως, η επαγωγή αυτή πιθανότατα θα γίνεται με κάποιον άλλο τρόπο. Α Β % φωσφορυλίωση Y773 της β Μάρτυρας ** MK (100 ng/ml) Εικόνα Α13: Επίδραση της midkine στη φωσφορυλίωση της τυροσίνης 773 της ιντεγκρίνης β 3 στα ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC. (Α) Πραγματοποιήθηκε επώαση των ενδοθηλιακών κυττάρων με midkine για 7 λεπτά, λύση τους, SDS-PAGE ηλεκτροφό-ρηση και ανάλυση κατά Western με αντισώματα έναντι της φωσφορυλιωμένης Υ773, καθώς και έναντι της ολικής β 3 ιντεγκρίνης, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. (Β) Η ποσοτικοποίηση των ζωνών των ανοσοαποτυπωμάτων και η στατιστική επεξεργασία πραγμα-τοποιήθηκαν όπως περιγράφε-ται στις μεθόδους. 147

162 Αποτελέσματα 12. H επαγόμενη από την πλειοτροπίνη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC δεν εξαρτάται από την περιοχή αναγνώρισης της αλληλουχίας RGD στην ιντεγκρίνη Επόμενο βήμα, μετά την ανίχνευση της αλληλεπίδρασης της ιντεγκρίνης α ν β 3 με την πλειοτροπίνη, ήταν ο εντοπισμός της περιοχής στο μόριο της ιντεγκρίνης, η οποία εμπλέκεται στην αλληλεπίδραση με την πλειοτροπίνη. Δεδομένου ότι η αλληλεπίδραση της ιντεγκρίνης με αρκετούς προσδέτες γίνεται μέσω της αλληλουχίας RGD, ελέγχθηκε η επίδραση πεπτιδίου RGD στην επαγόμενη από την πλειοτροπίνη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC. Όπως φαίνεται και στην Εικόνα Α14, προεπώαση των κυττάρων με το πεπτίδιο RGD, αν και μειώνει σημαντικά την ενδογενή μετανάστευση, εντούτοις δεν επηρεάζει το ποσοστό επαγωγής της πλειοτροπίνης στη μετανάστευση των HUVEC. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι το η πλειοτροπίνη δεν προσδένεται στην ιντεγκρίνη α ν β 3 μέσω της περιοχής πρόσδεσης της αλληλουχίας RGD στην ιντεγκρίνη % *** Μάρτυρας PTN (100 ng/ml) % Μετανάστευση % * 0 _ Πεπτίδιο RGD Εικόνα Α14: Επίδραση του πεπτιδίου RGD στην επαγόμενη από την πλειοτροπίνη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC. Η μετανάστευση των κυττάρων εκτιμήθηκε με το σύστημα χημειοτακτισμού Transwell, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα του ποσοστού των κυττάρων που μετανάστευσαν, ως προς την ομάδα του μάρτυρα, που δεν έχει επωασθεί με το πεπτίδιο (που θεωρείται 100%). *Ρ< 0.05, ***Ρ<

163 Αποτελέσματα 13. H επαγόμενη από την πλειοτροπίνη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC εξαρτάται από την περιοχή μεταξύ των αμινοξέων της υπομονάδας β 3 της ιντεγκρίνης Η δέσμευση μιας άλλης ομάδας προσδετών, όπως η βιτρονεκτίνη (Antoni et al, 2004), το ινωδογόνο και ο παράγοντας von Willebrandt (Takagi et al, 1997) στην ιντεγκρίνη α ν β 3, πραγματοποιείται μέσω της κυστεϊνικής θηλιάς μεταξύ των αμινοξέων , στο εξωκυτταρικό τμήμα της υπομονάδας β 3 (Maile et al, 2006). Για το λόγο αυτό, παρασκευάσθηκε ένα συνθετικό πεπτίδιο που αντιστοιχεί στα αμινοξέα της υπομονάδας β 3 της ιντεγκρίνης (πεπτίδιο Β3) και μελετήθηκε η επίδρασή του στην επαγόμενη από πλειοτροπίνη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α15, προεπώαση των HUVEC με το πεπτίδιο Β3 όχι μόνο ανέστειλε πλήρως την επαγόμενη από πλειοτροπίνη μετανάστευση των HUVEC, αλλά προκάλεσε και στατιστικά σημαντική αναστολή στη μετανάστευσή τους (που θα εξηγηθεί αργότερα). Αντίθετα, ένα συνθετικό πεπτίδιο με την ίδια αλληλουχία αμινοξέων σε διαφορετική σειρά (αναδιαταγμένο πεπτίδιο Β3) δεν προκάλεσε καμία μεταβολή στην επαγόμενη από πλειοτροπίνη μετανάστευση των HUVEC. Το γεγονός αυτό σημαίνει ότι η επαγόμενη από πλειοτροπίνη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC εξαρτάται από την κυστεϊνική θηλιά στην περιοχή της υπομονάδας β 3 της ιντεγκρίνης (Εικόνα Α15). 149

164 Αποτελέσματα 140 *** Μάρτυρας PTN (100 ng/ml) *** 120 * % Μετανάστευση _ Πεπτίδιο Β3 Αναδιαταγμένο πεπτίδιο Β3 Εικόνα Α15: Επίδραση των πεπτιδίων Β3 και αναδιαταγμένου Β3 στην επαγόμενη από την πλειοτροπίνη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC. Η μετανάστευση των κυττάρων εκτιμήθηκε με το σύστημα χημειοτακτισμού Transwell, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα του ποσοστού των κυττάρων που μετανάστευσαν, ως προς την ομάδα του μάρτυρα, που δεν έχει επωασθεί με το πεπτίδιο (που θεωρείται 100%). *Ρ< 0.05, ***Ρ< H πλειοτροπίνη προσδένεται στην κυστεϊνική θηλιά του εξωκυτταρικού τμήματος της β 3 υπομονάδας της ιντεγκρίνης α ν β 3 Στην προσπάθεια να ανιχνευθεί ο μηχανισμός με τον οποίο η περιοχή της β 3 υπομονάδας της ιντεγκρίνης επηρεάζει την επαγόμενη από πλειοτροπίνη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC, πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση σε πρωτεϊνικό εκχύλισμα κυττάρων HUVEC, τα οποία είχαν επωασθεί με το πεπτίδιο Β3 ή με το αναδιαταγμένο πεπτίδιο Β3 ή με κανένα (μάρτυρας). Σε ίση ποσότητα πρωτεΐνης από τα τρία εκχυλίσματα, πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση με αντίσωμα έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3 και ανάλυση κατά Western για την πλειοτροπίνη. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α16, η δέσμευση της πλειοτροπίνης στην ιντεγκρίνη α ν β 3 αναστάλθηκε σημαντικά 150

165 Αποτελέσματα παρουσία του πεπτιδίου Β3, ενώ το αναδιαταγμένο πεπτίδιο Β3 δεν επηρέασε την αλληλεπίδραση. Εικόνα Α16: Επίδραση του πεπτιδίου Β3 και του αναδιαταγμένου πεπτιδίου Β3 στη δέσμευση της πλειοτροπίνης στην ιντεγκρίνη α ν β 3. Η αλληλεπίδραση μελετήθηκε με ανοσοκατακρήμνιση έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3 και τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν έναντι της πλειοτροπίνης, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. 15. Το πεπτίδιο Β3 και το λειτουργικό αντίσωμα έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3 δεν επηρεάζουν τη φωσφορυλίωση της Υ773 της υπομονάδας β 3 της ιντεγκρίνης Προκειμένου να διαπιστωθεί εάν η επαγωγή της φωσφορυλίωσης της Υ773 της υπομονάδας β 3 της ιντεγκρίνης από την πλειοτροπίνη εξαρτάται από τη φυσική αλληλεπίδρασή τους, πραγματοποιήθηκε μελέτη της επαγωγής της φωσφορυλίωσης της Υ773 της υπομονάδας β 3 παρουσία του πεπτιδίου Β3 και του λειτουργικού αντισώματος έναντι της α ν β 3 στις δραστικές τους συγκεντρώσεις. Ούτε το λειτουργικό αντίσωμα, ούτε το πεπτίδιο Β3 ανέστειλαν την επαγόμενη από την πλειοτροπίνη φωσφορυλίωση της Υ773 της υπομονάδας β 3 της 151

166 Αποτελέσματα ιντεγκρίνης (Εικόνα Α17). Το αποτέλεσμα αυτό υποδηλώνει ότι η επαγόμενη από την πλειοτροπίνη φωσφορυλίωση της ιντεγκρίνης β 3 πραγματοποιείται ανεξάρτητα από τη δέσμευσή της στην ιντεγκρίνη. 16. Η ιντεγκρίνη α ν β 3 αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ Σε προηγούμενη μελέτη του εργαστηρίου, αναστολή της έκφρασης του υποδοχέα της πλειοτροπίνης RPTPβ/ζ οδήγησε σε αναστολή της επαγόμενης από την πλειοτροπίνη μετανάστευσης των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC (Polykratis et al, 2005). Από τη στιγμή που, όπως αναφέρθηκε προηγούμενα, αναστολή της λειτουργικότητας της ιντεγκρίνης α ν β 3 επίσης ανέστειλε την επαγόμενη από την πλειοτροπίνη μετανάστευση των ίδιων κυττάρων, διερευνήθηκε η πιθανή αλληλεπίδραση του υποδοχέα RPTPβ/ζ με την ιντεγκρίνη α ν β 3. Σε πρωτεϊνικό εκχύλισμα κυττάρων HUVEC πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση έναντι των ιντεγκρινών α ν β 3 και α 5 β 1. Ακολούθησε SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση και ανάλυση κατά Western, με αντίσωμα έναντι του υποδοχέα RPTPβ/ζ. Η λύση των κυττάρων, μέτρηση της συγκέντρωσης της ολικής πρωτεΐνης με τη μέθοδο Bradford, SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση και ανάλυση κατά Western περιγράφονται αναλυτικά στις μεθόδους. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α18 η μεγάλη, πλήρως γλυκοζυλιωμένη διαμεμβρανική ισομορφή του υποδοχέα RPTPβ/ζ (>380 kda) αλληλεπιδρά τόσο με την ιντεγκρίνη α ν β 3, όσο και με την α 5 β 1. Όμως μόνο με την ιντεγκρίνη α ν β 3 αλληλεπιδρά και μια μικρότερου μεγέθους (ισο)μορφή (80-90 kda). Σε αντιστοιχία με το πρωτεϊνικό εκχύλισμα των HUVEC, πραγματοποιήθηκε η ίδια διαδικασία και σε ομογενοποίημα χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης εμβρύου όρνιθας (CAM). Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α18Β, με την ιντεγκρίνη α ν β 3 αλληλεπιδρά τόσο η μεγάλη (>380 kda) όσο και η μικρή (220 kda) διαμεμβρανική ισομορφή του RPTPβ/ζ, αλλά και η μικρή ισομορφή (80-90 kda), που προαναφέρθηκε στα HUVEC. 152

167 Αποτελέσματα Α Β 250 ** % Φωσφορυλίωση Υ773 της β * 0 Μάρτυρας PTN PTN + Πεπτίδιο Β3 PTN + anti-α ν β 3 Εικόνα Α17: Επίδραση του πεπτιδίου Β3 και του λειτουργικού αντισώματος έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3 στην επαγόμενη από την πλειοτροπίνη φωσφορυλίωση της τυροσίνης 773 της ιντεγκρίνης β 3 στα ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC. (Α) Πραγματοποιήθηκε επώαση των ενδοθηλιακών κυττάρων με πλειοτροπίνη για 7 λεπτά παρουσία του πεπτιδίου Β3 ή του λειτουργικού αντισώματος, λύση τους, SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση και ανάλυση κατά Western με αντισώματα έναντι της φωσφορυλιωμένης στην Υ773, καθώς και έναντι της ολικής υπομονάδας β 3, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. (Β) Η ποσοτικοποίηση των ζωνών των ανοσοαποτυπωμάτων και η στατιστική επεξεργασία πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στις μεθόδους. 153

168 Αποτελέσματα Εικόνα Α18: Μελέτη της αλληλεπίδρασης ανάμεσα στις ιντεγκρίνες α ν β 3, α 5 β 1 και τον RPTPβ/ζ στο πρωτεϊνικό εκχύλισμα των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC και στο ομογενοποίημα της χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης CAM. Η αλληλεπίδραση μελετήθηκε με ανοσοκατακρήμνιση έναντι των ιντεγκρινών και τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν έναντι του RPTPβ/ζ, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Για να επιβεβαιωθεί η αλληλεπίδραση της ιντεγκρίνης α ν β 3 με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ πραγματοποιήθηκε η αντίστροφη διαδικασία: Στο εκχύλισμα των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση με αντίσωμα για τον RPTPβ/ζ και ανάλυση κατά Western για τις υπομονάδες της ιντεγκρίνης α ν και β 3. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α19, το αντίσωμα έναντι του RPTPβ/ζ δεσμεύει τόσο την α ν όσο και τη β 3 υπομονάδα της ιντεγκρίνης α ν β 3. Εικόνα Α19: Μελέτη της αλληλεπίδρασης ανάμεσα στον RPTPβ/ζ και τις υπομονάδες α ν και β 3 στο πρωτεϊνικό εκχύλισμα των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC. Η αλληλεπίδραση μελετήθηκε με ανοσοκατακρήμνιση έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3 και του RPTPβ/ζ και τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν έναντι των υπομονάδων α ν και β 3, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. 154

169 Αποτελέσματα 17. Οι υπομονάδες α ν και β 3 της ιντεγκρίνης αλληλεπιδρούν με διαφορετικές ισομορφές του RPTPβ/ζ Με τη διαδικασία της ανοσοκατακρήμνισης που προαναφέρθηκε, επιβεβαιώθηκε ότι τόσο η α ν, όσο και η β 3 υπομονάδες της ιντεγκρίνης αλληλεπιδρούν με ισομορφές του RPTPβ/ζ. Αυτό που δε διευκρινίσθηκε ήταν με ποια από τις ισομορφές του RPTPβ/ζ αλληλεπιδρά η κάθε υπομονάδα. Για το λόγο αυτό, πραγματοποιήθηκε σε πρωτεϊνικό εκχύλισμα κυττάρων HUVEC ανοσοκατακρήμνιση για την ιντεγκρίνη α ν β 3, αλλά και για καθεμιά από τις υπομονάδες χωριστά και ακολούθησε ανάλυση κατά Western με αντίσωμα έναντι του RPTPβ/ζ. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α20, η μεγάλη, πλήρως γλυκοζυλιωμένη ισομορφή (>380 kda) του υποδοχέα αλληλεπιδρά με την υπομονάδα α ν, ενώ η μικρού μοριακού μεγέθους ισομορφή αλληλεπιδρά με την ισομορφή β 3. Εικόνα Α20: Αλληλεπίδραση ανάμεσα στην ιντεγκρίνη α ν β 3, τις υπομονάδες της, α ν, β 3 και τον υποδοχέα RPTPβ/ζ της πλειοτροπίνης στο πρωτεϊνικό εκχύλισμα των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC. Η αλληλεπίδραση μελετήθηκε με ανοσοκατακρήμνιση έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3 και των υπομονάδων της και τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν έναντι του RPTPβ/ζ, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. 155

170 Αποτελέσματα 18. Χαρακτηρισμός της μικρής (ισο)μορφής του RPTPβ/ζ που αλληλεπιδρά με την ιντεγκρίνη α ν β 3 Η μικρού μοριακού μεγέθους (ισο)μορφή του RPTPβ/ζ που περιγράφηκε παραπάνω, βρέθηκε να αλληλεπιδρά με την υπομονάδα β 3 της ιντεγκρίνης (Εικόνα Α20), ενώ δε βρέθηκε να αλληλεπιδρά με τους κλασικούς προσδέτες του RPTPβ/ζ, όπως η πλειοτροπίνη και η midkine (Εικόνα Α10). Αν και το συγκεκριμένο μοριακό μέγεθος έχει αναφερθεί και στο παρελθόν για ισομορφή του RPTPβ/ζ (Lorente et al, 2005), εντούτοις κρίθηκε απαραίτητη η περαιτέρω διερεύνηση και χαρακτηρισμός της υπομονάδας αυτής. Γνωρίζουμε από προηγούμενες μελέτες του εργαστηρίου ότι διαμόλυνση των κυττάρων HUVEC με παρεμβαλλόμενο RNA (sirna) έναντι του RPTPβ/ζ οδηγεί σε αναστολή της πρωτεϊνικής έκφρασης της μεγάλης διαμεμβρανικής ισομορφής του (Polykratis et al, 2005). Θελήσαμε να διερευνήσουμε αν η ίδια διαμόλυνση οδηγήσει σε αντίστοιχη μείωση της ισομορφής που διερευνούμε. Σε καλλιέργεια ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC πραγματοποιήθηκε διαμόλυνση με παρεμβαλλόμενο sirna έναντι του RPTPβ/ζ και αλληλουχίας που δεν εκφράζεται (sirna Negative). Ακολούθησε ανοσοκατακρήμνιση σε ίδια ποσότητα πρωτεΐνης έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3 και ανάλυση πρωτεϊνών κατά Western με αντίσωμα έναντι του RPTPβ/ζ, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Όπως φαίνεται και στην Εικόνα Α21, η μείωση της έκφρασης της μικρής ισομορφής που μελετάμε ακολουθεί τη μείωση της έκφρασης της μεγάλης διαμεμβρανικής ισομορφής του RPTPβ/ζ. 156

171 Αποτελέσματα Εικόνα Α21: Η ισομορφή του υποδοχέα RPTPβ/ζ μοριακής μάζας ~80 kda μειώνεται μετά από παροδική διαμόλυνση των κυττάρων HUVEC με παρεμβαλλόμενο RNA έναντι του RPTPβ/ζ (sirptρβ/ζ). Τη διαμόλυνση των κυττάρων με sirptρβ/ζ και αλληλουχίας που δεν εκφράζεται (sineg), aκολούθησε λύση των κυττάρων, ανοσοκατακρήμνιση σε ίση ποσότητα πρωτεΐνης έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3 και τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν έναντι του RPTPβ/ζ. Οι πειραματικές διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφονται στις μεθόδους. 19. Η μικρή ισομορφή του RPTPβ/ζ που αλληλεπιδρά με την ιντεγκρίνη α ν β 3 είναι διαμεμβρανική Στη βιβλιογραφία έχουν περιγραφεί διαμεμβρανικές και εκκρινόμενες ισομορφές του RPTPβ/ζ (Mikelis et al, 2008). Για να διερευνηθεί εάν η συγκεκριμένη ισομορφή είναι διαμεμβρανική, πραγματοποιήθηκε επώαση των ενδοθηλιακών κυττάρων με NHS-βιοτίνη, που δεν έχει την ικανότητα να διαπερνά την κυτταρική μεμβράνη (Eickmann et al, 2005; Whitaker et al, 2007). Η βιοτίνη, ως αρνητικά φορτισμένο μόριο έχει τη δυνατότητα να δεσμεύεται σε θετικά φορτισμένα αμινοξέα πρωτεϊνών. Για το λόγο αυτό, η NHS-βιοτίνη χρησιμοποιείται για να σημανθούν οι πρωτεΐνες που εντοπίζονται στην κυτταρική μεμβράνη. Ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC σε καλλιέργεια επωάσθηκαν με NHS-βιοτίνη και σε εκχύλισμα κυτταρικών πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3 και ανάλυση κατά Western με αντίσωμα στρεπταβιδίνης με 157

172 Αποτελέσματα υπεροξειδάση. Η στρεπταβιδίνη είναι μόριο που εκλεκτικά δεσμεύεται στη βιοτίνη και η όλη διαδικασία αποβλέπει στο να εμφανισθούν όλες οι πρωτεΐνες, οι οποίες δεσμεύονται στην ιντεγκρίνη α ν β 3 και εντοπίζονται στην κυτταρική μεμβράνη. Σε πρωτεϊνικό εκχύλισμα αντίστοιχης καλλιέργειας ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC ίδιας γενιάς πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση, σε ίδια ποσότητα πρωτεΐνης και με τις ίδιες συνθήκες, έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3 και ακολούθησε ανάλυση κατά Western με αντίσωμα για τον RPTPβ/ζ. Η ηλεκτροφόρηση πραγματοποιήθηκε στο ίδιο πήκτωμα για να επιτευχθεί ακρίβεια στην αντιστοίχιση των ζωνών. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α22, η μικρού μοριακού μεγέθους (80-90 kda) ισομορφή του RPTPβ/ζ είναι διαμεμβρανική. Η μεγάλη, πλήρως γλυκοσυλιωμένη ισομορφή του RPTPβ/ζ δεν εντοπίζεται βιοτινυλιωμένη λόγω του αρνητικού φορτίου των γλυκοσαμινογλυκανικών αλυσίδων (Wu et al, 1999), που εμποδίζουν την πρόσδεση της βιοτίνης. Η ισχυρή δέσμευση της βιοτίνης στο μόριο της μικρής διαμεμβρανικής ισομορφής του RPTPβ/ζ υποδηλώνει την πιθανά μειωμένου βαθμού γλυκοζυλίωση της τελευταίας. Εικόνα Α22: Εντοπισμός της μικρής ισομορφής του RPTPβ/ζ στην κυτταρική μεμβράνη. Πραγματοποιήθηκε επώαση των κυττάρων με NHS-βιοτίνη (αριστερά), λύση των κυττάρων, ανοσοκατακρήμνιση έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3 και τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν έναντι της βιοτίνης (αριστερά) και του RPTPβ/ζ (δεξιά). Οι πειραματικές διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφονται στις μεθόδους. 158

173 Αποτελέσματα 20. Συνεντοπισμός της ιντεγκρίνης α ν β 3 και του RPTPβ/ζ στην κυτταρική μεμβράνη των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC Πραγματοποιήθηκε πείραμα διπλού ανοσοφθορισμού για τον RPTPβ/ζ και την ιντεγκρίνη α ν β 3. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α23, o RPTPβ/ζ και η ιντεγκρίνη α ν β 3 συνεντοπίζονται στην περιφέρεια των κυττάρων. Εικόνα Α23: Συνεντοπισμός του RPTPβ/ζ και της ιντεγκρίνης α ν β 3 στα ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC. Πραγματοποιήθηκε διπλός ανοσοφθορισμός με αντισώματα έναντι του RPTPβ/ζ (πράσινο) και της ιντεγκρίνης α ν β 3 (κόκκινο), όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Στις περιοχές συνεντοπισμού παρατηρούνται σημεία κίτρινου χρώματος. 21. Η αλληλεπίδραση της ιντεγκρίνης α ν β 3 με την πλειοτροπίνη είναι ανεξάρτητη από τον RPTPβ/ζ Είδαμε προηγουμένως ότι υπάρχει αλληλεπίδραση ανάμεσα στην ιντεγκρίνη α ν β 3 και στον RPTPβ/ζ, καθώς και ότι αναστολή της λειτουργικότητας της ιντεγκρίνης α ν β 3 ή της έκφρασης του RPTPβ/ζ μειώνει την επαγόμενη από πλειοτροπίνη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC. Στην προσπάθεια να εξιχνιασθεί ο μηχανισμός της επαγωγής της μετανάστευσης από την πλειοτροπίνη, καθώς και ο ρόλος του καθενός από τα μόρια αυτά, αρχικά διερευνήθηκε το εάν είναι απαραίτητη η παρουσία του RPTPβ/ζ για την αλληλεπίδραση της πλειοτροπίνης με την ιντεγκρίνη α ν β 3. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκε αναστολή της έκφρασης του RPTPβ/ζ και μελετήθηκε η 159

174 Αποτελέσματα αλληλεπίδραση της πλειοτροπίνης με την ιντεγκρίνη α ν β 3. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α24, αναστολή της έκφρασης του RPTPβ/ζ δεν επηρέασε την αλληλεπίδραση της πλειοτροπίνης με την ιντεγκρίνη. Εικόνα Α24: Μελέτη του ρόλου του RPTPβ/ζ στην αλληλεπίδραση ανάμεσα στην πλειοτροπίνη και την ιντεγκρίνη α ν β 3 στο πρωτεϊνικό εκχύλισμα των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC. Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με sirna για τον RPTPβ/ζ ή για αλληλουχία που δεν εκφράζεται (sineg). Η αλληλεπίδραση μελετήθηκε με ανοσοκατακρήμνιση έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3 και των υπομονάδων της και τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν έναντι της πλειοτροπίνης, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. 22. Ο RPTPβ/ζ είναι απαραίτητος για την επαγόμενη από την πλειοτροπίνη φωσφορυλίωση της Υ773 της υπομονάδας β 3 της ιντεγκρίνης α ν β 3 Επόμενο βήμα στη διερεύνηση του ρόλου του RPTP στην επαγόμενη από την πλειοτροπίνη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων, ήταν η διερεύνηση τυχόν συμμετοχής του στην επαγόμενη από την πλειοτροπίνη φωσφορυλίωση της τυροσίνης 773 της υπομονάδας β 3 της ιντεγκρίνης α ν β 3. Για το λόγο αυτό, πραγματοποιήθηκε αναστολή της έκφρασης του RPTPβ/ζ με τη χρήση παρεμβαλλόμενης αλληλουχίας (sirna) και μελετήθηκε η μεταβολή που προκαλεί η πλειοτροπίνη στη φωσφορυλίωση της β 3. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α25, αναστολή της έκφρασης του RPTPβ/ζ αναστέλλει την επαγόμενη από την πλειοτροπίνη φωσφορυλίωση Υ773 της β 3 υπομονάδας της ιντεγκρίνης. Επομένως ο ρόλος του RPTPβ/ζ στην περίπτωση αυτή έγκειται στο να συμμετέχει στην επαγωγή της φωσφορυλίωσης της Υ773 της υπομονάδας β 3 από την πλειοτροπίνη. 160

175 Αποτελέσματα Α Β % φωσφορυλίωση Υ773 της β *** Μάρτυρας PTN (100 ng/ml) ** 0 si RPTPβ/ζ si NEG Μη μετασχηματισμένα Εικόνα Α25: Επίδραση της αναστολής της έκφρασης του RPTPβ/ζ στην επαγόμενη από την πλειοτροπίνη φωσφορυλίωση της τυροσίνης 773 της ιντεγκρίνης β 3 στα ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC. (Α) Πραγματοποιήθηκε αναστολή ή μη της έκφρασης του RPTPβ/ζ, επώαση των ενδοθηλιακών κυττάρων με πλειοτροπίνη για 7 λεπτά, λύση τους, SDS- PAGE ηλεκτροφόρηση και ανάλυση κατά Western με αντισώματα έναντι της φωσφορυλιωμένης Υ773 και της ολικής β 3 ιντεγκρίνης, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. (Β) Η ποσοτικοποίηση των ζωνών των ανοσοαποτυπωμάτων και η στατιστική επεξεργασία πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται στις μεθόδους. 161

176 Αποτελέσματα 23. Η επαγωγή της φωσφορυλίωσης της Υ773 της υπομονάδας β 3 της ιντεγκρίνης α ν β 3 από τον RPTPβ/ζ πραγματοποιείται μέσω της κινάσης c-src Γνωρίζουμε ότι πρόσδεση της πλειοτροπίνης στον RPTPβ/ζ οδηγεί σε ενεργοποίηση της κινάσης c-src (Polykratis et al, 2005). Στην προσπάθεια να διερευνηθεί το μονοπάτι, μέσω του οποίου ο RPTPβ/ζ φωσφορυλιώνει την ιντεγκρίνη, μελετήθηκε ο ρόλος της κινάσης c-src. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α26, προσθήκη του αναστολέα PP1 (αναστολέας της c-src) ανέστειλε την επαγόμενη από την πλειοτροπίνη φωσφορυλίωση της Υ773 της υπομονάδας β 3 της ιντεγκρίνης. Το αποτέλεσμα αυτό δείχνει ότι η επαγόμενη από την πλειοτροπίνη φωσφορυλίωση της Υ773 της υπομονάδας β 3 επιτυγχάνεται μέσω του RPTPβ/ζ. Α Β % φωσφορυλίωση Υ773 της β *** _ Μάρτυρας PTN (100 ng/ml) PP1 (5 μμ) Εικόνα Α26: Επίδραση του αναστολέα PP1 (της κινάσης c- Src) στην επαγόμενη από την πλειοτροπίνη φωσφορυλίωση της τυροσίνης 773 της ιντεγκρίνης β 3 στα ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC. (Α) Πραγματοποιήθηκε επώαση των ενδοθηλιακών κυττάρων με πλειοτροπίνη για 7 λεπτά, παρου-σία ή απουσία του αναστολέα, και ακολούθησε λύση τους, SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση και ανάλυση κατά Western με αντισώματα έναντι της φωσφορυλιωμένης Υ773 και της ολικής β 3 ιντεγκρίνης, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. (Β) Η ποσοτικοποίηση των ζωνών των ανοσοαποτυπωμάτων και η στατιστική επεξεργασία πραγματο-ποιήθηκαν όπως περιγράφεται στις μεθόδους. 162

177 Αποτελέσματα 24. Η κινάση c-src αλληλεπιδρά με την υπομονάδα β 3 της ιντεγκρίνης α ν β 3 Αν και είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία ότι η κινάση c-src αλληλεπιδρά με την υπομονάδα β 3 της ιντεγκρίνης α ν β 3 (Mahabeleshwar et al, 2007; Zou et al, 2007), εντούτοις διερευνήθηκε αυτή η αλληλεπίδραση στα ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC. Για το λόγο αυτό πραγματοποιήθηκε ανοσοκατακρήμνιση έναντι της υπομονάδας β 3 και της c-src και ανάλυση κατά Western έναντι της υπομονάδας β 3. Όπως φαίνεται και στην Εικόνα Α27, η κινάση c-src αλληλεπιδρά με την υπομονάδα β 3 της ιντεγκρίνης. Εικόνα Α27: Αλληλεπίδραση ανάμεσα στην υπομονάδα β 3 της ιντεγκρίνης α ν β 3 και την κινάσης c-src στο πρωτεϊνικό εκχύλισμα των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC. Η αλληλεπίδραση μελετήθηκε με ανοσοκατακρήμνιση έναντι της β 3 και της c-src και τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν έναντι της β 3, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. 163

178 Αποτελέσματα 25. Η έκφραση της ιντεγκρίνης α ν β 3 είναι καθοριστική για τη βιολογική δράση της πλειοτροπίνης στη μετανάστευση διαφόρων ειδών κυττάρων Όπως προαναφέρθηκε, η αλληλεπίδραση ιντεγκρίνης α ν β 3 πλειοτροπίνης είναι καθοριστικής σημασίας για την επαγόμενη από την πλειοτροπίνη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC. Το επόμενο βήμα ήταν να διερευνηθεί εάν αυτή η αλληλεπίδραση ισχύει μόνο για τα HUVEC ή αποτελεί γενικό μηχανισμό για την επαγόμενη από πλειοτροπίνη μετανάστευση. Για το λόγο αυτό, χρησιμοποιήθηκαν διάφορες σειρές καρκινικών κυττάρων γλοιώματος. Από προηγούμενα αποτελέσματα του εργαστηρίου, έχει ανιχνευθεί η έκφραση του RPTPβ/ζ σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν. Επίσης, η πλειοτροπίνη, αντίθετα με τον επαγωγικό ρόλο στη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC, είχε προκαλέσει στατιστικά σημαντική αναστολή στη μετανάστευση καρκινικών κυττάρων γλοιώματος MO59K. Με βάση τα παραπάνω, και δεδομένης της κοινής έκφρασης του RPTPβ/ζ, πραγματοποιήθηκαν πειράματα ανίχνευσης της ιντεγκρίνης και στις τέσσερις σειρές γλοιώματος που χρησιμοποιήθηκαν (Εικόνα Α28Α). Επίσης, ανιχνεύθηκε η επίδραση της πλειοτροπίνης στη μετανάστευσή τους (Εικόνες Α28Β, Α28Γ, Α28Δ) και συγκρίθηκαν τα αποτελέσματα. Όπως φαίνεται και στην Εικόνα Α28Α, η έκφραση της ιντεγκρίνης α ν β 3 στη σειρά κυττάρων γλοιώματος U87MG είναι πολύ αυξημένη, ακόμη και σε μεγαλύτερα επίπεδα από αυτήν των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC. Αντίθετα, η έκφραση της ιντεγκρίνης α ν β 3 στις σειρές κυττάρων γλοιώματος C6, MO59K και LN18 είναι σε μη ανιχνεύσιμα επίπεδα. Επιπλέον, η πλειοτροπίνη προκάλεσε στατιστικά σημαντική επαγωγή στη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων γλοιώματος U87MG, ενώ προκάλεσε στατιστικά σημαντική αναστολή στη μετανάστευση των γλοιωματικών κυττάρων C6 και LN18. Η ανασταλτική δράση της πλειοτροπίνης στη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων C6 συνάδει με την αυξημένη μετανάστευση των ίδιων κυττάρων, στα οποία έχει ανασταλεί η έκφραση της πλειοτροπίνης (Parthymou et al, 2007). Εάν σε αυτά προστεθεί το προηγούμενο εύρημα του εργαστηρίου ότι η πλειοτροπίνη αναστέλλει στατιστικά σημαντικά τη μετανάστευση των κυττάρων 164

179 Αποτελέσματα MO59K, τότε μπορεί να διατυπωθεί η άποψη ότι η έκφραση της ιντεγκρίνης καθορίζει την επίδραση της πλειοτροπίνης στην κυτταρική μετανάστευση. 26. Υπερέκφραση άγριου τύπου και μεταλλαγμένης υπομονάδας β 3 της ιντεγκρίνης στα MO59K επηρεάζει την επαγόμενη από την πλειοτροπίνη μετανάστευση Στην προηγούμενη παράγραφο διατυπώθηκε η άποψη ότι η έκφραση της ιντεγκρίνης α ν β 3 οδηγεί σε επαγωγική δράση της πλειοτροπίνης σε μετανάστευση. Προκειμένου να επιβεβαιωθεί η άποψη αυτή υπερεκφράσθηκε η υπομονάδα β 3 της ιντεγκρίνης (wt β 3 ) στα κύτταρα MO59K, στα οποία η ιντεγκρίνη δεν εκφράζεται σε ανιχνεύσιμα επίπεδα, και μελετήθηκε η απόκριση στην επαγόμενη από την πλειοτροπίνη μετανάστευση. Επιπλέον, για να διαπιστωθεί εάν η φωσφορυλίωση της β 3 επηρεάζει την επαγόμενη από πλειοτροπίνη μετανάστευση, πραγματοποιήθηκε υπερέκφραση και μεταλλαγμένης β 3, με αλλαγμένες τις τυροσίνες 773 και 785 σε φαινυλαλανίνες (mut β 3 ), και μελετήθηκε η επαγόμενη από την πλειοτροπίνη μετανάστευση των κυττάρων. Στην εικόνα Α29Α παρατίθενται χαρακτηριστικές εικόνες από μετασχηματισμένα κύτταρα μόνο με το πλασμίδιο-φορέα (μάρτυρας), και με την άγριου τύπου (wt β 3 ) και τη μεταλλαγμένη (mut β 3 ) υπομονάδα β 3 της ιντεγκρίνης. Παρατηρούμε ότι τόσο η άγριου τύπου, όσο και η μεταλλαγμένη υπομονάδα β 3 εκφράζονται έντονα στα μετασχηματισμένα κύτταρα MO59K. Στην Εικόνα Α29Β φαίνεται η επίδραση της πλειοτροπίνης στη μετανάστευση των κυττάρων. Τόσο στα φυσιολογικά, όσο και στα μετασχηματισμένα με το πλασμίδιο-φορέα κύτταρα η πλειοτροπίνη προκαλεί στατιστικά σημαντική αναστολή στη μετανάστευση. Αντίθετα, σε κύτταρα με υπερέκφραση της άγριου τύπου υπομονάδας β 3 της ιντεγκρίνης η πλειοτροπίνη προκαλεί στατιστικά σημαντική επαγωγή στη μετανάστευση. Τέλος, στα κύτταρα με υπερέκφραση της μεταλλαγμένης β 3, η πλειοτροπίνη παρουσιάζει τάση να αναστείλει τη μετανάστευση. 165

180 Αποτελέσματα % Μετανάστευση Μάρτυρας -13% ** PTN % Μετανάστευση Μάρτυρας -22% * PTN Sfaelou et al % Μετανάστευση Μάρτυρας -44% * PTN % Μετανάστευση Μάρτυρας +67.5% ** PTN Εικόνα Α28: Διαφορική έκφραση της ιντεγκρίνης α ν β 3 και απόκριση στην επαγόμενη από πλειοτροπίνη μετανάστευση. (Α) Διαφορική έκφραση της ιντεγκρίνης α ν β 3 σε διάφορες σειρές γλοιώματος. Πραγματοποιήθηκε ανοσοφθορισμός με αντίσωμα έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. (Β, Γ, Δ) Επίδραση της πλειοτροπίνης στη μετανάστευση διαφόρων σειρών γλοιώματος. Η μετανάστευση των κυττάρων εκτιμήθηκε με το σύστημα χημειοτακτισμού Transwell, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα του ποσοστού των κυττάρων που μετανάστευσαν, ως προς την ομάδα του μάρτυρα (που θεωρείται 100%). *Ρ< 0.05, **Ρ<

181 Αποτελέσματα Α Β 140 ** Control PTN (100 ng/ml) % Μετανάστευση ** *** 20 0 Μάρτυρας Πλασμίδιο wt β 3 mut β 3 Εικόνα Α29: Η έκφραση της υπομονάδας β 3 της ιντεγκρίνης καθορίζει την επαγόμενη από πλειοτροπίνη μετανάστευση. (Α) Έκφραση της υπομονάδας β 3 σε κύτταρα MO59K μετά από μετασχηματισμό. Πραγματοποιήθηκε ανοσοφθορισμός με αντίσωμα έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. (Β, Γ, Δ) Επίδραση της πλειοτροπίνης στη μετανάστευση μετασχηματισμένων κυττάρων MO59K. Η μετανάστευση των κυττάρων εκτιμήθηκε με το σύστημα χημειοτακτισμού Transwell, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα του ποσοστού των κυττάρων που μετανάστευσαν, ως προς την ομάδα του μάρτυρα (που θεωρείται 100%). **Ρ< 0.01, ***Ρ<

182 Αποτελέσματα 27. Διαφορική απόκριση στην επαγόμενη από πλειοτροπίνη μετανάστευση, σε κλώνους CHO που υπερεκφράζουν άγριου τύπου και μεταλλαγμένη υπομονάδα β 3 Για επιβεβαίωση της σημασίας της ιντεγκρίνης α ν β 3 στην επαγόμενη από πλειοτροπίνη μετανάστευση, χρησιμοποιήθηκαν κλώνοι μετασχηματισμένων κυττάρων CHO που υπερεκφράζουν άγριου τύπου (wt β 3 ) και μεταλλαγμένη (με αντικατάσταση των τυροσινών 773 και 785 από φαινυλαλανίνες) (mut β 3 ) υπομονάδα β 3 της ιντεγκρίνης (Schaffner-Reckinger et al, 1998). Στην εικόνα Α30Α παρατίθενται χαρακτηριστικές φωτογραφίες κυττάρων CHO μετασχηματισμένων με το πλασμίδιο-φορέα, με το πλασμίδιο που φέρει την αλληλουχία της υπομονάδας β 3 και με το πλασμίδιο που φέρει την αλληλουχία της μεταλλαγμένης υπομονάδας β 3 της ιντεγκρίνης. Είναι ενδεικτική η μεταβολή του σχήματος των κυττάρων και η έντονη ανίχνευση της ιντεγκρίνης στην περιφέρεια των κυττάρων σε ομοιόμορφη κατανομή (wt β 3 ) και μη (mut β 3 ). Στην Εικόνα Α30Β φαίνεται η επίδραση της πλειοτροπίνης στη μετανάστευση των κυττάρων. Υπερέκφραση της άγριου τύπου υπομονάδας β 3 της ιντεγκρίνης (wt β 3 ) οδηγεί σε επαγωγή της μετανάστευσης από την πλειοτροπίνη, ενώ στα κύτταρα μάρτυρας και σε αυτά με υπερέκφραση μεταλλαγμένης β 3 υπομονάδας της ιντεγκρίνης (mut β 3 ) υπάρχει ανασταλτική τάση της πλειοτροπίνης στη μετανάστευση των κυττάρων. Τόσο από τα πειράματα αυτά, όσο και από τα πειράματα με τα μετασχηματισμένα κύτταρα MO59K εξάγεται το συμπέρασμα ότι η έκφραση της ιντεγκρίνης α ν β 3 αποτελεί απαραίτητη προϋπόθεση για την επαγωγική δράση της πλειοτροπίνης στη μετανάστευση διαφόρων ειδών κυττάρων, αλλά και ότι η φωσφορυλίωση της ιντεγκρίνης στην τυροσίνη 773 είναι εξίσου σημαντική για την επαγωγική αυτή δράση της πλειοτροπίνης. 168

183 Αποτελέσματα Α Β 140 *** Control PTN (100 ng/ml) 120 % Μετανάστευση Πλασμίδιο wt β 3 mut β 3 Εικόνα Α30: Η έκφραση της υπομονάδας β 3 της ιντεγκρίνης καθορίζει την επαγόμενη από πλειοτροπίνη μετανάστευση. (Α) Φωτογραφίες από κλώνους CHO κυττάρων μετασχηματισμένων με το πλασμίδιο-φορέα (Μάρτυρας), με την αγρίου τύπου και τη μεταλλαγμένη β 3 υπομονάδα. Πραγματοποιήθηκε ανοσοφθορισμός με αντίσωμα έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. (Β) Επίδραση της πλειοτροπίνης στη μετανάστευση των ίδιων κλώνων CHO κυττάρων. Η μετανάστευση των κυττάρων εκτιμήθηκε με το σύστημα χημειοτακτισμού Transwell, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέση τιμή ± σταθερό σφάλμα του ποσοστού των κυττάρων που μετανάστευσαν, ως προς την ομάδα του μάρτυρα (που θεωρείται 100%). ***Ρ<

184 Αποτελέσματα 28. Πεπτίδιο που αντιστοιχεί στο καρβοξυτελικό άκρο της πλειοτροπίνης (πεπτίδιο S1) και αναστέλλει την επαγόμενη από πλειοτροπίνη κυτταρική μετανάστευση, δεν επηρεάζει τη δέσμευση της πλειοτροπίνης στον RPTPβ/ζ Σε προηγούμενες μελέτες διαπιστώθηκε ότι ένα πεπτίδιο που αντιστοιχεί στα 26 τελευταία αμινοξέα του καρβοξυτελικού άκρου της πλειοτροπίνης προκαλεί στατιστικά σημαντική αναστολή της αγγειογένεσης στο in vivo μοντέλο της CAM εμβρύου όρνιθας. Επίσης βρέθηκε ότι αναστέλλει την επαγόμενη από πλειοτροπίνη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC, καθώς και τον επαγόμενο από την πλειοτροπίνη σχηματισμό αυλών σε υπόστρωμα matrigel (Mikelis et al, 2004). Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, και λόγω της ανίχνευσης του ρόλου της ιντεγκρίνης α ν β 3 ως υποδοχέα της πλειοτροπίνης, έγινε προσπάθεια να διερευνηθεί ο μηχανισμός της ανασταλτικής δράσης του πεπτιδίου S1. Αρχικά, διερευνήθηκε ο πιθανός ρόλος του πεπτιδίου S1 στην αλληλεπίδραση της πλειοτροπίνης με τον υποδοχέα της RPTPβ/ζ. Για το λόγο αυτό ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC καλλιεργήθηκαν παρουσία και απουσία του πεπτιδίου S1 και μετά τη λύση τους ακολούθησε ανοσοκατακρήμνιση έναντι του RPTPβ/ζ, σε ίση ποσότητα πρωτεΐνης, και ανάλυση κατά Western έναντι της πλειοτροπίνης. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α31, περίσσεια του πεπτιδίου δεν ανέστειλε τη δέσμευση της πλειοτροπίνης στον υποδοχέα RPTPβ/ζ, γεγονός που οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η ανασταλτική δράση του πεπτιδίου S1 δεν οφείλεται στην αναστολή της πρόσδεσης της πλειοτροπίνης στον RPTPβ/ζ. 170

185 Αποτελέσματα Εικόνα Α31: Μελέτη του ρόλου του πεπτιδίου S1 στην αλληλεπίδραση της πλειοτροπίνης με τον RPTPβ/ζ. Κύτταρα HUVEC καλλιεργήθηκαν παρουσία (δεξιά) και απουσία (αριστερά) του πεπτιδίου S1. Η αλληλεπίδραση μελετήθηκε με ανοσοκατακρήμνιση έναντι του υποδοχέα RPTPβ/ζ και τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν έναντι της πλειοτροπίνης, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. 29. Το πεπτίδιο S1 αναστέλλει τη δέσμευση της πλειοτροπίνης στην ιντεγκρίνη α ν β 3 Δεδομένου του σημαντικού ρόλου της ιντεγκρίνης α ν β 3 στην επαγόμενη από την πλειοτροπίνη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων HUVEC, ελέγχθηκε το ενδεχόμενο ο ανασταλτικός ρόλος του πεπτιδίου S1 να οφείλεται στην αναστολή της αλληλεπίδρασης της πλειοτροπίνης με την ιντεγκρίνη α ν β 3. Για το λόγο αυτό, ακολουθήθηκε η διαδικασία που πραγματοποιήθηκε και για την αντίστοιχη μελέτη με τον RPTPβ/ζ (προηγούμενη παράγραφος). Ενδοθηλιακά κύτταρα HUVEC καλλιεργήθηκαν παρουσία και απουσία του πεπτιδίου S1 και μετά τη λύση τους ακολούθησε ανοσοκατακρήμνιση έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3 σε ίση ποσότητα πρωτεΐνης και ανάλυση κατά Western έναντι της πλειοτροπίνης. Όπως φαίνεται στην Εικόνα Α32, περίσσεια του πεπτιδίου ανέστειλε τη δέσμευση της πλειοτροπίνης στην ιντεγκρίνη α ν β 3, γεγονός που οδηγεί στο συμπέρασμα ότι η ανασταλτικός ρόλος του πεπτιδίου S1 πιθανότατα εντοπίζεται στην αναστολή της πρόσδεσης της πλειοτροπίνης στην ιντεγκρίνη α ν β 3. Επιπλέον, προσδίδει την 171

186 Αποτελέσματα πληροφορία ότι η πλειοτροπίνη αλληλεπιδρά με την ιντεγκρίνη α ν β 3 μέσω του καρβοξυτελικού της άκρου. Εικόνα Α31: Μελέτη του ρόλου του πεπτιδίου S1 στην αλληλεπίδραση της πλειοτροπίνης με την ιντεγκρίνη α ν β 3. Κύτταρα HUVEC καλλιεργήθηκαν παρουσία (δεξιά) και απουσία (αριστερά) του πεπτιδίου S1. Η αλληλεπίδραση μελετήθηκε με ανοσοκατακρήμνιση έναντι της ιντεγκρίνης α ν β 3 και τα ανοσοϊζήματα ελέγχθηκαν έναντι της πλειοτροπίνης, όπως περιγράφεται στις μεθόδους. 172