ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ Αριθμ. 2904

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΜΕΑΣ ΜΟΡΦΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗΣ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ Α.Π.Θ ΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΑΡΚΑΒΕΛΑΣ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ Αριθμ ΜΕΛΕΤΗ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΣΕ ΟΓΚΟΥΣ ΕΓΚΕΦΑΛΟΥ ΜΕ ΣΤΟΧΟ ΤΗΝ ΑΝΑΓΝΩΡΙΣΗ ΕΙΚΤΩΝ ΠΡΟΒΛΕΨΗΣ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ ΣΕ ΣΤΟΧΕΥΜΕΝΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΕΣΠΟΙΝΑΣ ΤΕΛΕΒΑΝΤΟΥ ΙΑΤΡΟΥ - ΠΑΘΟΛΟΓΟΑΝΑΤΟΜΟΥ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ιδακτορική διατριβή στα πλαίσια του Ερευνητικού Προγράμματος ΠΕΝΕ, Α.Π. 583/03 ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2010

2 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΚΑΡΚΑΒΕΛΑΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΧΥΤΙΡΟΓΛΟΥ ΠΡΟ ΡΟΜΟΣ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΩΤΟΥΛΑ ΒΑΣΙΛΙΚΗ, ΕΠΙΚ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΚΑΡΚΑΒΕΛΑΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΧΥΤΙΡΟΓΛΟΥ ΠΡΟ ΡΟΜΟΣ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΩΤΟΥΛΑ ΒΑΣΙΛΙΚΗ, ΕΠΙΚ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΦΟΥΝΤΖΗΛΑΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΤΑΣΚΟΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΠΟΛΥΖΩΙ ΗΣ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΝ ΡΙΟΠΟΥΛΟΥ ΟΙΚΟΝΟΜΟΥ ΛΟΥΙΖΑ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ «Ἡ ἒγκρισις τῆς ιδακτορικῆς ιατριβῆς ὑπό τῆς Ἰατρικῆς Σχολῆς τοῦ Ἀριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, δέν ὑποδηλοῖ ἀποδοχήν τῶν γνωμῶν τοῦ συγγραφέως». (Νόμος 5343/32, ἂρθρ καί ν. 1268/82, ἂρθρ. 50 8) 2

3 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΠΡΟΕ ΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ Β. ΝΤΟΜΠΡΟΣ 3

4 4

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 9 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Επιδημιολογία.. 13 Ιστολογική κατάταξη των όγκων γλοίας Γενετικές και επιγενετικές μεταβολές των όγκων γλοίας σε σχέση με τα ιστολογικά τους χαρακτηριστικά.. 15 Αστροκυτταρικοί όγκοι με διάχυτη ανάπτυξη Περίγραπτοι αστροκυτταρικοί όγκοι Όγκοι με επενδυματική διαφοροποίηση.. 20 Ολιγοδενδρογλοιακοί και μικτοί όγκοι.. 21 Μοριακή ταξινόμηση των όγκων γλοίας Πρόβλεψη απάντησης σε θεραπευτικά μέσα ρόλος στοχευμένης θεραπείας Ρόλος του υποδοχέα EGFR και της μεταλλαγμένης του μορφής EGFRvIII στη θεραπεία των γλοιωμάτων Ρόλος του υποδοχέα ΜΕΤ στους αστροκυτταρικούς όγκους Ρόλος υποδοχέα HER2 στα γλοιώματα Ρόλος της ενδοκυττάριας οδού ενεργοποίησης της PI3K κινάσης Ρύθμιση της οδού PI3K Φωσφατάσες PHLPP1 και PHLPP Ρόλος της πρωτεΐνης Darpp32 στην ογκογένεση Στόχευση ενδοκυττάριων μορίων της οδού PI3K Οδός ενεργοποίησης της Src κινάσης, πρωτεΐνες Stat και στοχευμένη θεραπεία. 32 Αγγειογένεση στα γλοιώματα Παράγοντας VEGF Θεραπεία με αντι-αγγειογενετικούς παράγοντες Ρόλος μηχανισμών επιδιόρθωσης στα γλοιώματα ανθεκτικότητα σε θεραπεία με αλκυλιωτικούς παράγοντες Γονίδια MGMT και TP Γονίδια επιδιόρθωσης MMR. 37 Χρωμοσωμική απώλεια 1p/19q στους όγκους γλοίας

6 ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΣΥΛΛΟΓΗ ΥΛΙΚΟΥ ΣΤΑ ΙΑ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑΣ ΤΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΤΩΝ ΚΥΒΩΝ ΠΑΡΑΦΙΝΗΣ ΚΑΤΑΣΚΕΥΗ ΙΣΤΙΚΩΝ ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΟΙΧΙΩΝ (TMA).. 48 ΕΚΧΥΛΙΣΗ DNA ΕΚΧΥΛΙΣΗ RNA ΑΝΟΣΟΪΣΤΟΧΗΜΕΙΑ ΠΟΣΟΤΙΚΗ PCR ΠΡΑΓΜΑΤΙΚΟΥ ΧΡΟΝΟΥ (RTQ PCR) MULTIPLEX LIGATION-DEPENDENT PROBE AMPLIFICATION (MLPA) ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΑΝΟΣΟΪΣΤΟΧΗΜΙΚΗ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΧΝΟΤΗΤΑ ΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΕΠΙΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΜΕΤΑΒΟΛΩΝ Συχνότητα μεταβολών των υποδοχέων EGFR, MET και HER2, καθώς και στοιχείων της ενδοκυττάριας οδού ενεργοποίησης PI3K.. 61 Συχνότητα μεταβολών της ενδοκυττάριας οδού ενεργοποίησης Src-STAT Συχνότητα μεταβολών ρυθμιστών κυτταρικού κύκλου και γονιδίων επιδιόρθωσης Συχνότητα έκφρασης του VEGF Συχνότητα χρωμοσωμικών απωλειών στα 1p και 19q ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΜΕ ΤΑ ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΩΝ ΟΓΚΩΝ ιαφορές ανάμεσα σε πρωτοπαθή-δευτεροπαθή γλοιοβλαστώματα Όγκοι με ολιγοδενδρογλοιακό στοιχείο Ιστολογική διαβάθμιση των όγκων και συσχέτιση με μοριακά προφίλ ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΩΝ ΤΩΝ ΟΓΚΩΝ ΜΕ ΤΗΝ ΗΛΙΚΙΑ ΤΩΝ ΑΣΘΕΝΩΝ ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΜΕ ΤΑ ΚΛΙΝΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΩΝ ΑΣΘΕΝΩΝ Ηλικία ασθενών Επιβίωση ιάστημα ελεύθερο επιδείνωσης της νόσου ΣΥΣΧΕΤΙΣΕΙΣ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΠΟΥ ΕΞΕΤΑΣΤΗΚΑΝ Παράμετροι που σχετίζονται με τους υποδοχείς EGFR, MET και HER2. 80 Παράμετροι που σχετίζονται με την αγγειογένεση Παράμετροι που σχετίζονται με τα γονίδια επιδιόρθωσης MGMT και MSH

7 Παράμετροι που σχετίζονται με απώλειες στις χρωμοσωμικές θέσεις 1p ή/και 19q.. 86 Παράμετροι που σχετίζονται με την ενδοκυττάρια αυξητική οδό PI3K Παράμετροι που σχετίζονται με την οδό ενεργοποίησης Src-STAT ΕΙ ΙΚΑ ΜΟΡΙΑΚΑ ΠΡΟΦΙΛ ΑΝΑΓΝΩΡΙΣΗ ΠΡΟΦΙΛ ΓΟΝΙ ΙΑΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΓΙΑ ΤΑ ΓΛΟΙΟΒΛΑΣΤΩΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Μεταβολές του υποδοχέα EGFR Έκφραση και ενεργοποίηση του υποδοχέα ΜΕΤ Έκφραση του υποδοχέα HER Παράμετροι της ενδοκυττάριας οδού PI3K Παράμετροι της ενδοκυττάριας οδού Src-STAT Απώλειες στις χρωμοσωμικές περιοχές 1p και 19q Μεταβολές των γονιδίων επιδιόρθωσης MGMT και MSH Έκφραση του γονιδίου MDM Έκφραση του γονιδίου p16 INK4A Αγγειογενετικός παράγοντας VEGF Αναγνώριση προφίλ γονιδιακής έκφρασης για τα γλοιοβλαστώματα. 137 ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

8 8

9 ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η ιστολογική διαβάθμιση των όγκων γλοίας, σύμφωνα με την κατάταξη της Παγκόσμιας Οργάνωσης Υγείας για τους όγκους του KNΣ [1], αποτελεί τον κυριότερο παράγοντα καθορισμού της βιολογικής τους συμπεριφοράς. Οι όγκοι ιστολογικού βαθμού κακοήθειας ΙΙ, θεωρούνται χαμηλού βαθμού κακοήθειας, παρουσιάζουν ωστόσο πιθανότητα εξέλιξης σε υψηλού βαθμού κακοήθειας νεοπλάσματα. Οι όγκοι ιστολογικού βαθμού κακοήθειας ΙΙΙ, με σημαντικότερο εκπρόσωπο το αναπλαστικό αστροκύτωμα, παρουσιάζουν σημαντική ετερογένεια ως προς τη βιολογική τους συμπεριφορά [2]. Το γλοιοβλάστωμα θεωρείται ιστολογικού βαθμού κακοήθειας ΙV και μπορεί να αναπτυχθεί de-novo, ή σπανιότερα μετά από εξέλιξη από χαμηλότερου βαθμού κακοήθειας νεόπλασμα. Παρά τις επιθετικές θεραπευτικές προσεγγίσεις, η πρόγνωση του γλοιοβλαστώματος παραμένει κακή. Παρόλα αυτά, μικρό ποσοστό των ασθενών με γλοιοβλάστωμα, παρουσιάζει επιβίωση που ξεπερνά τους 36 μήνες [3, 4], γεγονός που αντανακλά την ετερογένεια που παρατηρείται και μεταξύ αυτών των πολύ επιθετικών όγκων. Μελέτες των τελευταίων 20 χρόνων έχουν αποκαλύψει πληθώρα γενετικών και επιγενετικών μεταβολών που χαρακτηρίζουν τους όγκους γλοίας. Επίσης, η ταυτόχρονη αξιολόγηση πολλαπλών γενωμικών μεταβολών ή/και μεταβολών γονιδιακής έκφρασης, οδήγησε στην προσπάθεια μοριακής ταξινόμησης των όγκων γλοίας, με την αναγνώριση ειδικών μοριακών προφίλ που σχετίζονται με ιστολογικές αλλά και κλινικές παραμέτρους. Η κατανόηση των πολύπλοκων μηχανισμών που οδηγούν στην εξέλιξη των όγκων γλοίας, μπορεί να βοηθήσει στον καθορισμό της βιολογικής τους συμπεριφοράς και στη συσχέτιση με τα ιστολογικά ευρήματα, αλλά και να συμβάλει σε έναν πιο ορθολογικό τρόπο αντιμετώπισης, κυρίως μέσω της αναγνώρισης δεικτών που μπορούν να προβλέψουν την πιθανότητα απάντησης σε θεραπευτικά μέσα, στα πλαίσια της εξατομικευμένης θεραπείας. Επίσης, με δεδομένη την επιτυχία της στοχευμένης θεραπείας σε άλλα νεοπλάσματα, γίνονται προσπάθειες αναγνώρισης ογκογονιδίων, καθοριστικών για την εξέλιξη των όγκων γλοίας, τα οποία μπορεί να χρησιμεύσουν ως θεραπευτικοί στόχοι, μέσω του εκλεκτικού τους αποκλεισμού. Ο EGFR ήταν ο πρώτος διαμεμβρανικός υποδοχέας που χρησιμοποιήθηκε ως θεραπευτικός στόχος σε πολλούς συμπαγείς όγκους. Ο EGFR υπερεκφράζεται στο 40% περίπου των γλοιοβλαστωμάτων και στο 10% των αναπλαστικών αστροκυτωμάτων, ενώ η μεταλλαγμένη του μορφή, ο ΕGFRvIII παρατηρείται πολύ συχνά στους υψηλού βαθμού κακοήθειας όγκους γλοίας [4]. Παρά τις συνεχιζόμενες προσπάθειες θεραπευτικού αποκλεισμού τόσο του EGFR όσο και της μεταλλαγμένης του μορφής στους όγκους γλοίας, αυτές δεν έχουν αποφέρει τα αναμενόμενα αποτελέσματα, λόγω της γρήγορης ανάπτυξης ανθεκτικότητας στη θεραπεία. Μια από τις προσπάθειες να ξεπεραστεί το πρόβλημα της ανάπτυξης ανθεκτικότητας, είναι ο συνδυασμένος αποκλεισμός του EGFR με άλλους διαμεμβρανικούς υποδοχείς που συμμετέχουν στην παθογένεια των όγκων γλοίας, καθώς και με μόρια ενδοκυττάριων οδών μεταγωγής σήματος. Στην κατεύθυνση αυτή αναμένεται να συμβάλει η αποκάλυψη των πολύπλοκων μηχανισμών ενδοκυττάριας μεταγωγής μηνυμάτων αύξησης και κυρίως η αναγνώριση ενδογενών ανασταλτικών μορίων, αφού αυτά θεωρείται ότι μπορεί να λειτουργήσουν ως δείκτες πρόβλεψης της απάντησης στη στοχευμένη θεραπεία. Αναστολείς της ενδοκυττάριας οδού PI3K, της κύριας οδού που ενεργοποιείται από τον EGFR, είναι κυρίως οι φωσφατάσες. H φωσφατάση PTEN απουσιάζει συχνά από τα γλοιοβλαστώματα, ενώ οι φωσφατάσες PHLPP1 και 2, αποδείχθηκε πρόσφατα ότι συμμετέχουν στην βιολογία των όγκων γλοίας. Οι δράσεις της πρωτεΐνης Darpp32 που αποτελεί κύριο ρυθμιστή της οδού ΡΙ3Κ στα νεοπλάσματα είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστες, ενώ ο ρόλος της στην εξέλιξη των όγκων γλοίας δεν έχει, από όσο γνωρίζουμε, μελετηθεί. 9

10 Ένας άλλος τρόπος αντιμετώπισης της ανάπτυξης ανθεκτικότητας στη στοχευμένη θεραπεία είναι η αναστολή της αγγειογένεσης, μια που το αγγειακό στοιχείο χαρακτηρίζει τα υψηλού βαθμού κακοήθειας γλοιώματα, και ειδικά το γλοιοβλάστωμα. Παρόλα αυτά η αντι-αγγειογενετική θεραπεία στους όγκους γλοίας παρουσιάζει σημαντικά προβλήματα που οφείλονται εν μέρει στην απουσία, προς το παρόν, προβλεπτικών δεικτών. Η πρόσφατη αναγνώριση διαφορετικών ισομορφών τόσο των αγγειογενετικών παραγόντων όσο και των υποδοχέων τους, που προκύπτουν από εναλλακτικό μάτισμα, οδήγησε στην ξεχωριστή τους αξιολόγηση σε διάφορους τύπους νεοπλασμάτων με στόχο την κατανόηση των πολύπλοκων μηχανισμών της αγγειογένεσης, αλλά και την αναγνώριση δεικτών πρόβλεψης απάντησης στην αντιαγγειογενετική θεραπεία. Στην παρούσα μελέτη αξιολογήθηκαν οι μεταβολές του EGFR και άλλων διαμεμβρανικών υποδοχέων σε σχέση με ενδοκυττάριους μηχανισμούς που σχετίζονται με την ενεργοποίησή τους, αλλά και γενωμικές μεταβολές που συχνά παρατηρούνται στους όγκους γλοίας. Μελετήθηκαν επίσης οι μεταβολές στην έκφραση τόσο του γονιδίου DARPP32 όσο και διαφορετικών ισομορφών του αγγειογενετικού παράγοντα VEGF, σε σχέση με το μοριακό μικροπεριβάλλον που τις συνοδεύει. Τέλος, οι επιγενετικές και γενετικές μεταβολές των όγκων, αξιολογήθηκαν κυρίως σε σχέση με τα ιστολογικά τους χαρακτηριστικά, σε μια προσπάθεια περαιτέρω κατανόησης της βιολογικής συμπεριφοράς των όγκων γλοίας, οι οποίοι παρουσιάζουν τόσο σημαντική ετερογένεια. Στο σημείο αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον επιβλέποντα της διατριβής Καθηγητή κ. Γεώργιο Καρκαβέλα, ιευθυντή του Εργαστηρίου Γενικής Παθολογίας και Παθολογικής Ανατομικής, για την εμπιστοσύνη που μου επέδειξε στην ανάθεση του θέματος, το συνεχές ενδιαφέρον, τις πολύτιμες συμβουλές και την ουσιαστική βοήθεια, τόσο για την ολοκλήρωση της διατριβής, όσο και για την γενικότερή μου εκπαίδευση στην Παθολογική Ανατομική και ειδικά τη Νευροπαθολογία. Στην Επίκουρη Καθηγήτρια κ. Βασιλική Κωτούλα επιθυμώ να εκφράσω τις ειλικρινείς μου ευχαριστίες, μια που αποτέλεσε την ψυχή και το μυαλό της μελέτης αυτής. Η επιστημονική της κατάρτιση, όσον αφορά τους μηχανισμούς μοριακής παθολογίας, το σχεδιασμό της μελέτης, τη σωστή διεξαγωγή του πειραματικού μέρους, την ανάλυση των αποτελεσμάτων, αλλά και για όλα τα στάδια της διατριβής ήταν παραπάνω από καθοριστική. Στον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Πρόδρομο Χυτίρογλου θα ήθελα να εκφράσω τις θερμές μου ευχαριστίες για την πολύτιμη συμπαράσταση, ουσιαστική βοήθεια και καθοδήγηση, αλλά και τη γενικότερη στήριξη σε όλα τα στάδια διεξαγωγής της διατριβής. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τον Καθηγητή κ. Γεώργιο Φούντζηλα, για τη βοήθεια, τις εύστοχες παρατηρήσεις και κυρίως για την παραχώρηση υλικού από την Ελληνική Συνεργαζόμενη Ογκολογική ομάδα, καθώς και για τη συμβολή του στη συλλογή κλινικών πληροφοριών από τους ασθενείς. Τον κ. Αθανάσιο Φάσσα ευχαριστώ για τη συνεργασία και την παραχώρηση κλινικών πληροφοριών από τους ασθενείς. Ευχαριστώ ιδιαίτερα την τεχνολόγο κ. Αιμιλία ασκαλάκη, για την πολύτιμή της συμβολή στη διεξαγωγή του πειραματικού μέρους, την υπομονή και αφοσίωση που επέδειξε, καθώς και τις βιολόγους κ. Ελπίδα Χαραλάμπους και κ. Σοφία Χρυσάφη, για τη βοήθειά τους στη διεξαγωγή των πειραμάτων. Την κ. Αντιγόνη Μαλούση και την κ. Αναστασία Ελευθεράκη ευχαριστώ για τη συμβολή τους στη στατιστική ανάλυση, ειδικά για την αναγνώριση των μοριακών προφίλ και τις συσχετίσεις με τις κλινικές παραμέτρους. 10

11 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 11

12 12

13 Επιδημιολογία Οι πρωτοπαθείς όγκοι του ΚΝΣ αποτελούν περίπου το 2-3% όλων των νεοπλασμάτων. Στις δυτικές χώρες, η ετήσια επίπτωσή τους είναι περίπου 15/100,000 πληθυσμό και ο επιπολασμός τους έχει υπολογισθεί σε περίπου 69/100,000 πληθυσμό. Ανάμεσα σε αυτούς συχνότεροι είναι οι όγκοι γλοίας, οι οποίοι αποτελούν το 70% όλων των πρωτοπαθών όγκων του ΚΝΣ [5]. Ο συχνότερος όγκος γλοίας είναι τo γλοιοβλάστωμα, ένα πολύ επιθετικό νεόπλασμα, με μέσο χρόνο επιβίωσης μήνες. Το γλοιοβλάστωμα αποτελεί το 50-60% των πρωτοπαθών όγκων του ΚΝΣ και η ετήσιά του επίπτωση υπολογίζεται σε 5-8/100,000 πληθυσμό [4]. Ιστολογική κατάταξη όγκων γλοίας Οι όγκοι γλοίας κατατάσσονται σύμφωνα με την ιστολογική κατάταξη της Παγκόσμιας Οργάνωσης Υγείας [1] και μπορεί να είναι περίγραπτοι ή να αναπτύσσονται διάχυτα. Η ιστολογική διαβάθμιση, σύμφωνα με την οποία οι όγκοι γλοίας ταξινομούνται σε 4 βαθμούς κακοήθειας, είναι ο κυριότερος παράγοντας πρόγνωσης της βιολογικής συμπεριφοράς των όγκων. Οι όγκοι γλοίας ιστολογικού βαθμού Ι έχουν συνήθως τη δυνατότητα πλήρους υποστροφής μετά τη χειρουργική εξαίρεση, οι όγκοι ιστολογικού βαθμού ΙΙ, παρά τη γενικά αργή τους ανάπτυξη συχνά υποτροπιάζουν, ενώ μερικοί από αυτούς έχουν την τάση να μεταπίπτουν σε όγκους υψηλότερου βαθμού κακοήθειας. Έτσι, η μέση επιβίωση για αυτούς είναι 5-8 χρόνια μετά τη διάγνωση. Οι όγκοι γλοίας ιστολογικού βαθμού ΙΙΙ και ΙV είναι γενικά επιθετικοί με πολύ κακή πρόγνωση, γι αυτό θεωρούνται υψηλού βαθμού κακοήθειας. Παρακάτω περιγράφονται σχηματικά οι κυριότεροι όγκοι γλοίας, σε σχέση με την ιστολογική τους διαβάθμιση και ανάλογα με τρόπο που αναπτύσσονται, όπως προτείνεται από τους Riemenschneider και Reifenberger [5]. To γλοιοβλάστωμα με ολιγοδενδρογλοιακό στοιχείο, αν και θεωρείται παραλλαγή του κλασικού γλοιοβλαστώματος, περιγράφεται μαζί με τους μικτούς όγκους, λόγω της στενής ιστολογικής του συνάφειας με το αναπλαστικό ολιγοαστροκύτωμα. 13

14 14

15 Γενετικές και επιγενετικές μεταβολές των όγκων γλοίας σε σχέση με τα ιστολογικά τους χαρακτηριστικά Αστροκυτταρικοί όγκοι με διάχυτη ανάπτυξη ιάχυτο αστροκύτωμα Το διάχυτο αστροκύτωμα χαρακτηρίζεται από καλά διαφοροποιημένα ινιδώδη ή γεμιστοκυτταρικά νεοπλασματικά αστροκύτταρα σε χαλαρό, συχνά μικροκυστικό υπόστρωμα, ενώ χαρακτηριστικά οι μιτώσεις απουσιάζουν. Η πιο γνωστή γενετική μεταβολή στα διάχυτα αστροκυτώματα που παρατηρείται στο 50% περίπου των όγκων, είναι οι μεταλλάξεις του γονιδίου TP53 [6]. Σε πρόσφατες μελέτες έχουν αναφερθεί και μεταλλάξεις του γονιδίου IDH1, το οποίο κωδικοποιεί μια δεϋδρογενάση που συμμετέχει στο μεταβολικό κύκλο του κιτρικού οξέος. Οι μεταλλάξεις αυτές παρατηρήθηκαν έως και στο 77% των διάχυτων αστροκυτωμάτων και θεωρήθηκαν ως καλός προγνωστικός δείκτης για την εξέλιξη της νόσου [7]. Kυτταρογενετικές μεταβολές που παρατηρούνται σε αυτόν τον ιστολογικό τύπο είναι οι χρωμοσωμικές απώλειες στα 22q, 13, 10q και 17p, καθώς και η τρισωμία ή γονιδιακή ενίσχυση που αφορά στο χρωμόσωμα 7 [8, 9]. Συχνές είναι επίσης και οι επιγενετικές μεταβολές, όπως η μεθυλίωση του επαγωγέα των γονιδίων MGMT και p14 ARF [10]. Άλλα γονίδια που βρέθηκε να απενεργοποιούνται με αυτόν τον μηχανισμό είναι τα PCDH και EMP3 [11, 12]. Το ινιδώδες αστροκύτωμα αποτελείται κυρίως από ινιδώδη νεοπλασματικά αστροκύτταρα και από ποικίλους αριθμούς γεμιστοκυττάρων, τα οποία δεν ξεπερνούν το 20% του νεοπλασματικού πληθυσμού. To γεμιστοκυτταρικό αστροκύτωμα χαρακτηρίζεται από την παρουσία σημαντικού αριθμού γεμιστοκυτταρικών νεοπλασματικών αστροκυττάρων, το ποσοστό των οποίων, σύμφωνα με την WHO, πρέπει να ξεπερνά το 20% των νεοπλασματικών κυττάρων. Ενώ θεωρείται πιο επιθετικό από το διάχυτο ινιδώδες αστροκύτωμα, κατατάσσεται και αυτό στους όγκους ιστολογικού βαθμού κακοήθειας ΙΙ [1]. Τα γεμιστοκύτταρα δεν έχουν μιτωτική δραστηριότητα και θεωρούνται διαφοροποιημένα κύτταρα με απορρύθμιση των αποπτωτικών μηχανισμών, όπως φαίνεται από τη συχνή ανοσοϊστοχημική τους θετικότητα για τον αντι-αποπτωτικό δείκτη Bcl-2 [13]. Η επιθετική συμπεριφορά όμως των όγκων αυτών αποδίδεται στην ταυτόχρονη παρουσία μικρού μεγέθους νεοπλασματικών κυττάρων, με υψηλό μιτωτικό δείκτη, το ποσοστό των οποίων έχει προγνωστική αξία [14]. Παρά τον υψηλότερο μιτωτικό δείκτη που παρουσιάζουν οι όγκοι αυτοί, οι μιτώσεις εξακολουθούν να απουσιάζουν. Σε περίπτωση παρουσίας μιτώσεων, οι όγκοι με υψηλό ποσοστό γεμιστοκυτττάρων κατατάσσονται στα αναπλαστικά αστροκυτώματα [14]. Το γεμιστοκυτταρικό αστροκύτωμα χαρακτηρίζεται από την συχνότερη παρουσία μεταλλάξεων στο TP53, σε σχέση με το διάχυτο ινιδώδες. Μεταλλάξεις του TP53 παρατηρούνται σε ποσοστό έως και 75% των όγκων αυτών [14]. Το πρωτοπλασματικό αστροκύτωμα, από την άλλη, παρουσιάζει σπανιότερα μεταλλάξεις του γονιδίου TP53, αφού ανοσοϊστοχημική θετικότητα για την πρωτεΐνη παρατηρείται στο 25% περίπου των όγκων [15]. Το πρωτοπλασματικό αστροκύτωμα αποτελείται από μικρού μεγέθους νεοπλασματικά κύτταρα με κυτταροπλασματικές προσεκβολές, η μορφολογία των οποίων καθιστά τη διαφορική διάγνωση από το ολιγοδενδρογλοίωμα δύσκολη. Η απουσία όμως της απώλειας στη χρωμοσωμική περιοχή 1p, χαρακτηριστικής γενωμικής μεταβολής των ολιγοδενδρογλοιωμάτων, επιβεβαιώνει την αστροκυτταρική προέλευση του νεοπλάσματος [16]. 15

16 Αναπλαστικό αστροκύτωμα Το αναπλαστικό αστροκύτωμα χαρακτηρίζεται από διάχυτη ανάπτυξη νεοπλασματικών αστροκυττάρων, με παρουσία σημαντικής πυρηνικής ατυπίας, κυτταροβρίθειας και κυρίως μιτώσεων, οι οποίες και το διαχωρίζουν ιστολογικά από το διάχυτο αστροκύτωμα. Οι γενετικές μεταβολές που παρατηρούνται στο διάχυτο αστροκύτωμα, όπως οι μεταλλάξεις των γονιδίων TP53 και IDH1, καθώς και γενωμικές μεταβολές που αφορούν στο χρωμόσωμα 7, παρατηρούνται συχνά και εδώ [5]. Γενικά θεωρείται ότι η μετάπτωση του διάχυτου αστροκυτώματος σε αναπλαστικό συνοδεύεται από την απόκτηση επιπλέον γενετικών μεταβολών, όπως είναι η απώλεια του 19q και οι μεταλλάξεις του ογκοκατασταλτικού γονιδίου RB1 [5]. Άλλες γενωμικές μεταβολές που παρατηρούνται στο αναπλαστικό αστροκύτωμα, είναι οι χρωμοσωμικές απώλειες στα 6, 9p, 11p και 22q [9]. Ενίσχυση του γονιδίου CDK4 στο 12q έχει παρατηρηθεί σε όγκους που δεν παρουσιάζουν απώλεια του γονιδίου p16 INK4Α, που βρίσκεται στη χρωμοσωμική περιοχή 9p [17]. Η απώλεια στο 10q, που συνοδεύεται από απώλεια του PTEN, καθώς και οι μεταλλάξεις του γονιδίου, θεωρούνται σπάνιες μεταβολές στα αναπλαστικά αστροκυτώματα και έχουν συνδεθεί με επιθετικότερη συμπεριφορά των όγκων [18]. To ίδιο ισχύει και για τη γονιδιακή ενίσχυση του EGFR, η οποία παρατηρείται μόλις στο 10% των όγκων [19]. Τέλος, ενώ η υπερέκφραση του υποδοχέα PDGFRA είναι συχνή στα αναπλαστικά αστροκυτώματα και συνδέεται και αυτή με την ιστολογική μετάπτωση από το διάχυτο αστροκύτωμα (Reimenschneider 2009), η ενίσχυση του γονιδίου είναι σπάνια [18]. Ο γλοιονευρωνικός όγκος με εστίες νευροπιλήματος είναι σπάνιος όγκος γλοίας ιστολογικού βαθμού κακοήθειας II ή ΙΙΙ, που χαρακτηρίζεται από νησίδες νευροπιλήματος με νευρωνική διαφοροποίηση και ανοσοϊστοχημική θετικότητα στη συναπτοφυσίνη και σε άλλους δείκτες νευρωνικής διαφοροποίησης (WHO 2007). Το νεοπλασματικό στοιχείο της γλοίας έχει ιστολογικά χαρακτηριστικά διάχυτου ή αναπλαστικού αστροκυτώματος. Η συχνή παρουσία μεταλλάξεων στο γονίδιο TP53 [20], καθώς και η απουσία της χαρακτηριστικής χρωμοσωμικής απώλειας 1p/19q [21], τον διαχωρίζουν από το πρόσφατα περιγραφόμενο ολιγοδενδρογλοίωμα με νευροκυτταρική διαφοροποίηση, με το οποίο η διαφορική διάγνωση σε ιστολογικό επίπεδο είναι δύσκολη [20]. Η εγκεφαλική γλοιωμάτωση είναι σπάνιος όγκος γλοίας που χαρακτηρίζεται από εκτεταμένη διάχυτη διήθηση του εγκεφαλικού παρεγχύματος και καταλαμβάνει τουλάχιστον 3 λοβούς του εγκεφάλου. Τα ιστολογικά του χαρακτηριστικά είναι συνήθως αυτά του διάχυτου ή αναπλαστικού αστροκυτώματος, αλλά λόγω της κακής του βιολογικής συμπεριφοράς θεωρείται ιστολογικού βαθμού κακοήθειας ΙΙΙ κατά τη WHO. Μελέτες των γενετικών μεταβολών των όγκων αυτών απέδειξαν τη μονοκλωνική προέλευση του νεοπλάσματος και ότι δεν αποτελεί αποτέλεσμα επεκτατικής ανάπτυξης διάχυτου ή αναπλαστικού αστροκυτώματος [22, 23]. Συχνές και σε αυτούς τους όγκους είναι οι μεταλλάξεις του γονιδίου TP53, οι οποίες θεωρούνται αρχικές μεταβολές, ενώ επιπλέον κυτταρογενετικές μεταβολές, όπως οι απώλειες στα 2q και 19q, θεωρούνται ότι συμβάλλουν στην εξέλιξη της νόσου [22, 23]. 16

17 Γλοιοβλάστωμα Το γλοιοβλάστωμα είναι ένα κυτταροβριθές νεόπλασμα με έντονη συνήθως πυρηνική ατυπία. Χαρακτηρίζεται από την παρουσία μικροαγγειακής υπερπλασίας και νέκρωσης, στοιχεία που το διακρίνουν από το αναπλαστικό αστροκύτωμα. Εμφανίζει μεγάλο αριθμό γενετικών και επιγενετικών μεταβολών, ενώ εκτός από τις μεταβολές που αναφέρθηκαν στο διάχυτο και αναπλαστικό αστροκύτωμα, παρατηρείται επιπλέον τυπικά απώλεια του χρωμοσώματος 10 [24]. Τα γλοιοβλαστώματα στο 90% των περιπτώσεων αναπτύσσονται de novo, χωρίς προηγούμενη ένδειξη παρουσίας γλοιώματος χαμηλότερου βαθμού κακοήθειας και σε αυτή την περίπτωση λέγονται πρωτοπαθή. Τα δευτεροπαθή γλοιοβλαστώματα εμφανίζονται συνήθως σε μικρότερης ηλικίας ασθενείς, σε έδαφος όγκου ιστολογικού βαθμού κακοήθειας ΙΙ ή ΙΙΙ. Ένα γλοιοβλάστωμα χαρακτηρίζεται ως δευτεροπαθές όταν υπάρχει γνωστό ιστορικό χαμηλότερου βαθμού κακοήθειας γλοιώματος ή όταν αναγνωριστούν ιστολογικά αντίστοιχες περιοχές. Μελέτες των τελευταίων χρόνων κατέδειξαν διαφορετικά μοριακά προφίλ για τις δύο αυτές ομάδες των γλοιοβλαστωμάτων [24]. Τα πρωτοπαθή γλοιοβλαστώματα χαρακτηρίζονται από συχνή γονιδιακή ενίσχυση του EGFR, από απώλεια του γονιδίου p16 INK4Α, καθώς και από ενίσχυση των γονιδίων MDM2 και CDK4 [24]. Συχνή είναι επίσης και η απενεργοποίηση του γονιδίου NDRG2 μέσω μεθυλίωσης του επαγωγέα του [25]. Τα δευτεροπαθή γλοιοβλαστώματα, από την άλλη, παρουσιάζουν συχνότερα μεταλλάξεις των γονιδιων TP53 και IDH1 [26], απώλεια του γονιδίου p14 ARF, καθώς και χρωμοσωμική απώλεια των 19q και 13q [27]. Συχνή σε αυτούς τους όγκους είναι επίσης και η μεθυλίωση του επαγωγέα του γονιδίου MGMT, όπως επίσης και η μεθυλίωση του επαγωγέα των γονιδίων RB1, p14 ARF, p16 INK4Α,RUNX3 και ΤES [24, 28]. Και οι δύο οντότητες εμφανίζουν πολλαπλές γενετικές και επιγενετικές μεταβολές που τελικά επηρεάζουν τη ρύθμιση κυρίως των ενδοκυττάριων οδών PI3K/Akt και MAPK, αλλά και τον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου μέσω της οδού CDK/Rb [9, 29]. Ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα αποτελέσματα πρόσφατης μελέτης, όπου το 85% των εξεταζόμενων γλοιοβλαστωμάτων εμφάνισε μεταβολές που επηρέαζαν την οδό ενεργοποίησης PI3Κ. Στην ίδια μελέτη, αναφέρθηκαν και νέες, έως τότε, μεταβολές στα γλοιοβλαστώματα, όπως μεταλλάξεις των γονιδίων ERBB2 (HER2), NF1 και PIK3R1 [30]. Η μικροαγγειακή υπερπλασία είναι ένα χαρακτηριστικό στοιχείο του γλοιοβλαστώματος και χαρακτηρίζεται από πολλές στιβάδες μιτωτικά ενεργών ενδοθηλιακών κυττάρων, που πολλές φορές οδηγούν σε σπειραματοειδείς σχηματισμούς ή προβάλλουν στον αγγειακό αυλό. Για το σχηματισμό νέων τριχοειδών απαραίτητη προϋπόθεση είναι ο πολλαπλασιασμός και η μετανάστευση των ενδοθηλιακώv κυττάρων, διαδικασίες που προκαλούνται από τους αγγειογενετικούς παράγοντες. Οι παράγοντες VEGF και FGF εκφράζονται από τα νεοπλασματικά και λιγότερο από τα ενδοθηλιακά κύτταρα του γλοιοβλαστώματος, ενώ αντίθετα τα τελευταία εκφράζουν σε μεγαλύτερο βαθμό τους υποδοχείς VEGFR1 και 2 [31]. H υπερέκφραση των αγγειογενετικών παραγόντων VEGF και PDGF είναι συχνή στα γλοιοβλαστώματα και έχει συνδεθεί με την ιστολογική μετάπτωση από το αναπλαστικό αστροκύτωμα [32, 33]. Ειδικά η ανοσοϊστοχημική έκφραση του VEGF σε αναπλαστικά αστροκυτώματα χωρίς μικροαγγειακή υπερπλασία έχει συνδεθεί με την επιθετική συμπεριφορά των όγκων [33]. Η πηκτική νέκρωση με περιφερική ψευδοπασσαλιδωτή διάταξη των νεοπλασματικών κυττάρων αποτελεί το δεύτερο χαρακτηριστικό γνώρισμα του γλοιοβλαστώματος και θεωρείται δυσμενής προγνωστικός δείκτης. Αν και η παθογένειά της δεν έχει ξεκαθαριστεί πλήρως, θεωρείται κυρίως αποτέλεσμα αγγειοαποφρακτικών και θρομβωτικών μηχανισμών και συμβαίνει παράλληλα με την μικροαγγειακή υπερπλασία [34]. Η θρόμβωση συμβαίνει κυρίως ως απάντηση στην υποξία, από τον παράγοντα TF, ενώ η ενδοθηλιακή απόπτωση, η οποία αποτελεί την αρχή της νέκρωσης, ενεργοποιείται κυρίως από την αγγειοποιητίνη 2 [34]. Τα κύτταρα στην περιφέρεια των 17

18 νεκρώσεων εκφράζουν τον παράγοντα HIF και τους αγγειογενετικούς παράγοντες VEGF και IL8, αλλά παρουσιάζουν επίσης και αυξημένη δραστηριότητα του λυτικού ενζύμου ζελατινάση. Έτσι θεωρείται ότι στην πραγματικότητα τα κύτταρα αυτά μεταναστεύουν μακριά από ένα υποξικό κέντρο [35]. Στο σχηματισμό της νέκρωσης θεωρείται ότι συμβάλλει και η ενδοκυττάρια οδός της Akt κινάσης, η μη-ρυθμισμένη ενεργοποίηση της οποίας είναι συχνή στα γλοιοβλαστώματα και οδηγεί σε υπερκατανάλωση θρεπτικών ουσιών από τα νεοπλασματικά κύτταρα [36]. Τα γλοιοβλαστώματα με μικροκυτταρική μορφολογία αναπτύσσονται συνήθως denovo, εμφανίζουν όμως πολύ συχνότερα ενίσχυση του γονιδίου EGFR σε σχέση με τα υπόλοιπα πρωτοπαθή γλοιοβλαστώματα. H μεταβολή αυτή παρατηρείται σε ποσοστό έως και 90% των όγκων, στους οποίους η μορφολογία αυτή κυριαρχεί [37]. Μεγάλα κοκκιώδη κύτταρα αστροκυτταρικής προέλευσης, που χαρακτηρίζονται από άφθoνο PAS θετικό κυτταρόπλασμα λόγω λυσοσωματιακής άθροισης, μπορεί να ανευρεθούν στο γλοιοβλάστωμα και μερικές φορές σε μεγάλους αριθμούς. Οι όγκοι αυτοί χαρακτηρίζονται από κοινό μοριακό προφίλ, με απουσία ενίσχυσης του γονιδίου EGFR και συχνή απώλεια των χρωμοσωμικών περιοχών 1p, 9p, 10q, 17p και 19q [38, 39]. Ειδικά η συχνή απώλεια στα 9p και 19q έχει συνδεθεί με την επιθετική βιολογική συμπεριφορά των όγκων με μεγάλους αριθμούς κοκκιωδών κυττάρων [39]. Τα γλοιοβλαστώματα με επιθηλιακή διαφοροποίηση εμφανίζουν συχνά απώλειες στα χρωμοσώματα 9p και 10. Οι όγκοι με επιθηλιακά κύτταρα παρουσιάζουν επίσης απώλεια έκφρασης της πρωτεΐνης p21 και μεταλλάξεις του TP53, ενώ από την άλλη οι όγκοι με επιθηλιοειδή κύτταρα εμφανίζουν συχνά ενίσχυση των γονιδίων EGFR και PDGFRA, με αναφερόμενες συχνότητες 65% και 25% αντίστοιχα [40]. Σε σπάνιες περιπτώσεις ειδικά σε νέους ασθενείς, τα γλοιοβλαστώματα χαρακτηρίζονται από έντονη παρουσία διαυγών, «αφρωδών» νεοπλασματικών κυττάρων, τα οποία καθιστούν πολλές φορές τη διαφορική διάγνωση από το πλειόμορφο ξανθοαστροκύτωμα δύσκολη. Σε πρόσφατη μελέτη που περιλάμβανε μικρό αριθμό τέτοιων όγκων, παρατηρήθηκαν απώλειες στις χρωμοσωμικές περιοχές 9p και 10q, ενώ χαρακτηριστικά απουσίαζε η γονιδιακή ενίσχυση των EGFR, CDK4 και MDM2 [41]. Το γλοιοσάρκωμα χαρακτηρίζεται από διφασική εμφάνιση και απαραίτητη προϋπόθεση για τη διάγνωσή του είναι η αναγνώριση νεοπλασματικού ατρακτοκυτταρικού στοιχείου, αρνητικού στην ανοσοϊστοχημική χρώση για GFAP (WHO 2007). Το σαρκωματόμορφο αυτό στοιχείο μπορεί να εμφανίσει ετερόλογη διαφοροποίηση προς νεοπλασματικό οστό ή χόνδρο [42]. Γενωμικές μελέτες απέδειξαν την μονοκλωνική προέλευση των δύο στοιχείων του νεοπλάσματος [43, 44]. Το γλοιοσάρκωμα εμφανίζει παρόμοιες γενετικές μεταβολές με το πρωτοπαθές γλοιοβλάστωμα, αλλά χαρακτηρίζεται από μικρότερου βαθμού γενωμική αστάθεια. Χαρακτηριστικά συνήθως απουσιάζουν τόσο η γονιδιακή ενίσχυση του EGFR όσο και η απώλεια του γονιδίου p16 INK4Α, ενώ οι μεταλλάξεις του γονιδίου TP53 παρατηρούνται στο 25% περίπου των όγκων. Αντίθετα, παρουσιάζει συχνά γονιδιακή ενίσχυση των CDK4 και MDM2, μεταβολές που έχουν συνδυαστεί με την ανάπτυξη του σαρκωματώδους στοιχείου [45]. Το γιγαντοκυτταρικό γλοιοβλάστωμα εμφανίζει μεγάλο αριθμό πολυπύρηνων νεοπλασματικών κυττάρων και σε ποικίλο βαθμό δίκτυο δικτυωτών ινών. Παρουσιάζει πολύ συχνά μεταλλάξεις του γονιδίου TP53, που παρατηρούνται στο 90% των όγκων, ενώ συχνές είναι και οι μεταλλάξεις του γονιδίου PTEN. Η γονιδιακή ενίσχυση του EGFR και η απώλειες στο χρωμόσωμα 9 τυπικά απουσιάζουν [5]. 18

19 Περίγραπτοι αστροκυτταρικοί όγκοι Πιλοκυτταρικό αστροκύτωμα Τα πιλοκυτταρικά αστροκυτώματα παρατηρούνται κυρίως σε παιδιά και νέους ενήλικες και χαρακτηρίζονται από διφασική ιστολογική εικόνα με ποικίλο αριθμό δίπολων κυττάρων σε συνάφεια με ίνες Rosenthal και πολυγωνικών κυττάρων σε χαλαρό υπόστρωμα με μικροκύστεις και ηωσινόφιλα κοκκώδη σωμάτια. Γενικά το πιλοκυτταρικό αστροκύτωμα εμφανίζει πολύ λιγότερες γενετικές μεταβολές σε σχέση με το διάχυτο αστροκύττωμα. Σε ασθενείς με νευροϊνωμάτωση, τα πιλοκυτταρικά αστροκυτώματα που αναπτύσσονται εμφανίζουν απώλεια του ογκοκατασταλτικού γονιδίου NF1 [5], μεταβολή που δεν παρατηρείται στα αντίστοιχα σποραδικά. Τα σποραδικά πιλοκυτταρικά αστροκυτώματα εμφανίζουν πολύ συχνά, σε ποσοστό που κυμαίνεται από 60-80% μεταβολές του γονιδίου BRAF, που συνίστανται κυρίως σε ανασυνδυασμό και πιο σπάνια σε σημειακές μεταλλάξεις. Μικρό ποσοστό των πιλοκυτταρικών αστροκυτωμάτων παρουσιάζει επίσης ενίσχυση του γονιδίου HIPK2 [46, 47]. Σε αντίθεση με τα διάχυτα αστροκυτώματα, τα πιλοκυτταρικά δεν εμφανίζουν μεταλλάξεις του γονιδίου IDH1. Ο ταυτόχρονος έλεγχος για μεταλλάξεις στα γονίδια BRAF και IDH1 έχει προταθεί για τη διάκριση των δύο τύπων αστροκυτωμάτων [5]. Σε μελέτη πολυγονιδιακής έκφρασης σε διάχυτα αστροκυτώματα και πιλοκυτταρικά, παρατηρήθηκε ειδικό προφίλ έκφρασης στα πιλοκυτταρικά αστροκυττώματα, που αφορούσε σε γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που σχετίζονται με τη συνοχή και τη διηθητική ικανότητα των κυττάρων [48]. Το πιλοκυτταρικό αστροκύτωμα χαρακτηρίζεται επίσης από υπερέκφραση γονιδίων που σχετίζονται με το ανοσοποιητικό σύστημα, όπως τα HLADRa, IgG3 και IgGK. Η ανοσοϊστοχημική θετικότητα για την πρωτεΐνη HLADRa, έχει προταθεί για τη διάκριση από το ολιγοδενδρογλοίωμα [49]. Το πιλοκυτταρικό αστροκύτωμα τυπικά δεν εμφανίζει ιστολογικά στοιχεία κακοήθειας, όπως αναπλασία, νέκρωση και μικροαγγειακή υπερπλασία. Στις περιπτώσεις όμως που αυτά τα στοιχεία αναγνωρίζονται, τότε ο αντίστοιχος όγκος πρέπει να χαρακτηρίζεται ως αναπλαστικό πιλοκυτταρικό αστροκύτωμα, μια που εμφανίζει πιο επιθετική βιολογική συμπεριφορά [50]. Το πιλομυξοειδές αστροκύτωμα αποτελεί ειδικό ιστολογικό υπότυπο του πιλοκυταρικού και επίσης εμφανίζει πιο επιθετική βιολογική συμπεριφορά, γι αυτό θεωρείται ιστολογικού βαθμού κακοήθειας ΙΙ (WHO 2007). Σε μελέτες πολυγονιδιακής έκφρασης παρατηρήθηκε ότι τόσο τα πιλομυξοειδή όσο και τα αναπλαστικά πιλοκυτταρικά αστροκυτώματα παρουσίασαν ελαττωμένη έκφραση του γονιδίου ALDHIL1, που κωδικοποιεί μια δεϋδρογενάση [51]. Πλειόμορφο ξανθοαστροκύτωμα Το πλειόμορφο ξανθοαστροκύτωμα (ΠΞΑ) εμφανίζεται τυπικά σε επιφανεική θέση στα εγκεφαλικά ημισφαίρια, σε παιδιά ή νεαρούς ενήλικες. Χαρακτηρίζεται από πλειόμορφα και κενοτοπιώδη νεοπλασματικά κύτταρα αστροκυτταρικής προέλευσης, τα οποία συχνά περιβάλλονται από δικτυωτές ίνες και ηωσινόφιλα κοκκώδη σωμάτια. Γενετικές μεταβολές που χαρακτηρίζουν τους διάχυτα αναπτυσσόμενους αστροκυτταρικούς όγκους, όπως οι μεταλλάξεις του γονιδίου TP53, καθώς και η γονιδιακή ενίσχυση των EGFR, CDK4 και MDM2, είναι εξαιρετικά σπάνιες στο ΠΞΑ [52, 53]. Στο φαινόμενο αυτό αποδόθηκε η σχετικά καλή βιολογική συμπεριφορά του νεοπλάσματος. Παρατηρούνται όμως συχνά απώλειες στο χρωμόσωμα 9, οι οποίες οδηγούν σε ομόζυγη απώλεια των ογκοκατασταλτικών γονιδίων CDKN2A και TSC1 [54]. 19

20 Υποεπενδυματικό γιγαντοκυτταρικό αστροκύτωμα Το υποεπενδυματικό γιγαντοκυτταρικό αστροκύττωμα (ΥΓΑ) είναι καλοήθης όγκος με αργή ανάπτυξη, που εμφανίζεται στο τοίχωμα των πλάγιων κοιλιών, κυρίως σε ασθενείς με οζώδη σκλήρυνση. Αποτελείται από μεγάλα γαγγλιοειδή κύτταρα αστροκυτταρικής όμως διαφοροποίησης. Μετά από γενωμικές μελέτες αποδείχθηκε ότι οι χρωμοσωμικές μεταβολές είναι εξαιρετικά σπάνιες στο ΥΓΑ [55]. Αντίθετα, οι όγκοι αυτοί χαρακτηρίζονται από απενεργοποίηση λόγω μεταλλάξεων και των δύο αλληλίων των ογκοκατασταλτικών γονιδίων TSC1 ή TSC2. Οι πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από τα γονίδια αυτά συμμετέχουν στη ρύθμιση της αυξητικής οδού της mtor κινάσης [56]. Όγκοι με επενδυματική διαφοροποίηση Επενδύμωμα Το επενδύμωμα αναπτύσσεται κυρίως σε παιδιά και νεαρούς ενήλικες, στα τοιχώματα των κοιλιών ή του μυελικού σωλήνα και συνήθως εμφανίζει αργή ανάπτυξη. Ιστολογικά χαρακτηρίζεται από την παρουσία νεοπλασματικών επενδυματικών κυττάρων, τα οποία εμφανίζουν ανοσοϊστοχημική θετικότητα για τις πρωτεΐνες S100 και βιμεντίνη και συχνά για το επιθηλιακό μεμβρανικό αντιγόνο. Παρουσιάζει πολλές ιστολογικές παραλλαγές, με παρουσία αντίστοιχων ιστολογικών υποτύπων, οι κυριότεροι από τους οποίους είναι το κυτταροβριθές, το θηλώδες, το διαυγοκυτταρικό και το τανυκυτταρικό επενδύμωμα (WHO 2007). Οι πιο συχνές γενετικές μεταβολές του επενδυμώματος είναι οι απώλειες στα χρωμοσώματα 6q, 10, 13, 14 και 22, καθώς και η ενίσχυση γονιδίων που βρίσκονται στα χρωμοσώματα 1q, 7, 9, 12q, 15q και 18 [57]. Γενωμικές μελέτες κατέληξαν σε διαφορετικούς συνδυασμούς γενωμικών μεταβολών ανάλογα με την ηλικία των ασθενών, την εντόπιση και το ιστολογικό τύπο των όγκων. Σύμφωνα τις μελέτες αυτές η γονιδιακή ενίσχυση που αφορά στη χρωμοσωμική περιοχή 1q συνδέθηκε με χειρότερη πρόγνωση [57]. Επίσης, μελέτες πολυγονιδιακής έκφρασης κατέδειξαν διαφορετικά μοριακά προφίλ για τους όγκους με υπερσκηνιδιακή ή νωτιαία εντόπιση. Τα υπερσκηνιδιακά επενδυμώματα εμφάνισαν συχνότερα αυξημένα επίπεδα mrna έκφρασης για γονίδια των οικογενειών των γονιδίων EPHB-EPHPIN και NOTCH, ενώ τα επενδυμώματα του νωτιαίου μυελού παρουσίασαν συχνά υπερέκφραση mrna για γονίδια της οικογένειας HOX [58, 59]. Το επενδύμωμα παρουσιάζει επίσης απενεργοποίηση πολλών γονιδίων με επιγενετικούς μηχανισμούς. Μικρός αριθμός των όγκων παρουσιάζει μεθυλίωση του επαγωγέα των γονιδίων CASP1, MGMT, TIMP3 και THBS1, ενώ η μεθυλίωση του γονιδίου RASSF1A συναντάται συχνότερα, με άγνωστη ωστόσο επίπτωση [60]. Αναπλαστικό επενδύμωμα Το αναπλαστικό επενδύμωμα αντιστοιχεί σε κακόηθες γλοίωμα με γρήγορη ανάπτυξη και κακή πρόγνωση. Ιστολογικά χαρακτηρίζεται από υψηλή μιτωτική δραστηριότητα, η οποία συχνά συνοδεύεται από μικροαγγειακή υπερπλασία και εστίες νέκρωσης. Εμφανίζει παρόμοιες γενετικές και επιγενετικές μεταβολές με το επενδύμωμα χαμηλού βαθμού κακοήθειας, ενώ πολύ λίγες από αυτές έχουν συνδεθεί με τα χαρακτηριστικά κακοήθειας. Κάποιες από αυτές, οι οποίες παρατηρούνται συχνότερα στο αναπλαστικό επενδύμωμα, είναι οι χρωμοσωμικές απώλειες στα 10q, 9 και 13, καθώς και η γονιδιακή ενίσχυση που αφορά στη χρωμοσωμική περιοχή 1q. Η επιθετική βιολογική συμπεριφορά των όγκων έχει συνδεθεί επίσης με την παρουσία γονιδιακής ενίσχυσης του EGFR [57]. 20

21 Μυξοθηλώδες επενδύμωμα Το μυξοθηλώδες επενδύμωμα εμφανίζεται συχνότερα σε νεαρούς ενήλικες, εντοπίζεται σχεδόν αποκλειστικά στο νωτιαίο μυελό και αναπτύσσεται αργά. Αποτελείται από κυβοειδή ή επιμήκη κύτταρα σε θηλώδη διάταξη γύρω από ιναγγειακούς άξονες με μυξοειδές υπόστρωμα. Παρά την αργή του ανάπτυξη, αποτελείται από ανευπλοειδικά ή τετραπλοειδικά κύτταρα και εμφανίζει ποικίλες γενωμικές μεταβολές, οι συχνότερες από τις οποίες είναι η γονιδιακή ενίσχυση που αφορά στα χρωμοσώματα 9 και 18 [5]. Επίσης, μελέτες πολυγονιδιακής mrna έκφρασης έδειξαν συχνά αυξημένα επίπεδα έκφρασης για τα γονίδια HOXB5, PLA2G5 και ITH2 [58]. Υποεπενδύμωμα Το υποεπενδύμωμα εμφανίζει αργή ανάπτυξη, είναι τυπικά συνδεδεμένο με το τοίχωμα των κοιλιών και αποτελείται από ομάδες νεοπλασματικών κυττάρων γλοίας που περιβάλλονται από άφθονο ινιδώδες υπόστρωμα με συχνή μικροκυστική εκφύλιση. Τα δεδομένα όσον αφορά τις γενετικές και επιγενετικές μεταβολές του υποεπενδυμώματος είναι ελάχιστα. Σε κυτταρογενετική μελέτη που περιλάμβανε μικρό αριθμό όγκων, δεν παρατηρήθηκαν δομικές χρωμοσωμικές μεταβολές [61]. Ολιγοδενδρογλοιακοί και μικτοί όγκοι Ολιγοδενδρογλοίωμα Το ολιγοδενδρογλοίωμα είναι ένα καλής διαφοροποίησης νεόπλασμα των ενηλίκων με ολιγοδενδρογλοιακή διαφοροποίηση και συχνότερη εντόπιση στα εγκεφαλικά ημισφαίρια. Ιστολογικά εμφανίζει μέτρια κυτταροβρίθεια και αποτελείται από ομοιόμορφα κύτταρα με χαρακτηριστική διαυγή άλω στις τομές παραφίνης. Άλλα χαρακτηριστικά του είναι οι μικροεπασβεστώσεις, η μικροκυστική ή βλεννώδης εκφύλιση του υποστρώματος, η παρουσία μικρογεμιστοκυττάρων, καθώς και ένα δίκτυο από διακλαδιζόμενα λεπτοτοιχωματικά αγγεία. Κυτταρική ατυπία μπορεί να υπάρχει, απουσιάζει όμως η σημαντική μιτωτική δραστηριότητα. Χαρακτηριστική γενετική μεταβολή του ολιγοδενδρογλοιώματος είναι η συνδυασμένη απώλεια των χρωμοσωμικών περιοχών 1p και 19q, που προκύπτει από μια ασταθή μετάθεση [62]. Η μεταβολή αυτή παρατηρείται στο 65% περίπου των όγκων και είναι σημαντικό να αναγνωριστεί, μια και αποτελεί τόσο θετικό προγνωστικό δείκτη, όσο και προβλεπτικό δείκτη απάντησης στην ακτινοθεραπεία και τη χημειοθεραπεία [5]. Παρά τη συχνή παρουσία της απώλειας 1p19q στα ολιγοδενδρογλοιώματα, μελέτες έδειξαν ότι η ιστολογική εξέταση από μόνη της, ακόμα και με την εφαρμογή αυστηρών διαγνωστικών κριτηρίων, όπως πχ. την πλήρη απουσία γεμιστοκυττάρων, δεν μπορεί να προβλέψει την παρουσία της [63]. Παρόλα αυτά, έχει αποδειχθεί ότι η μεταβολή αυτή συνοδεύεται από κυτταρικό φαινότυπο νευρωνικού τύπου, όπως φάνηκε από την ανοσοϊστοχημική θετικότητα των όγκων σε νευρωνικούς δείκτες, όπως η alphainternexin. Η εφαρμογή της ανοσοϊστοχημικής χρώσης, έχει προταθεί ότι μπορεί να διακρίνει τα ολιγοδενδρογλοιώματα αλλά και τα αστροκυτώματα με απώλεια στα 1p και 19q [64]. Λιγότερο συχνές γενετικές μεταβολές του ολιγοδενδρογλοιώματος είναι η γονιδιακή ενίσχυση που αφορά στα χρωμοσώματα 7 και 19q, καθώς και οι απώλειες στα χρωμοσώματα 4, 6, 9p και 10q [65-67]. Όπως και το διάχυτο αστροκύτωμα, εμφανίζει συχνά μεταλλάξεις του γονιδίου IDH1 [68], ενώ οι μεταλλάξεις του γονιδίου TP53 είναι σπάνιες [69]. Απενεργοποίηση γονιδίων μέσω μεθυλίωσης του επαγωγέα τους, έχει παρατηρηθεί μεταξύ άλλων για τα 21

22 p16 INK4Α, p14 ARF, RB1, DAPK, ESR1, THBS και TIMP3 [70]. Συχνή είναι επίσης και η μεθυλίωση του επαγωγέα του γονιδίου MGMT [71]. Αναπλαστικό ολιγοδενδρογλοίωμα Το αναπλαστικό ολιγοδενδρογλοίωμα εμφανίζει εστιακά ή διάχυτα ιστολογικά στοιχεία κακοήθειας. Η ολιγοδενδρογλοιακή μορφολογία συνήθως εν μέρει διατηρείται, αλλά παρατηρείται επιπλέον έντονη πυρηνική ατυπία και μιτώσεις. Τα χαρακτηριστικά λεπτοτοιχωματικά αγγεία συχνά επίσης παρατηρούνται τουλάχιστον εστιακά, αλλά ταυτόχρονα υπάρχει σε ποικίλο βαθμό μικροαγγειακή υπερπλασία. Η νέκρωση, ακόμα και η τυπική νέκρωση του γλοιοβλαστώματος δεν αποκλείει τη διάγνωση του αναπλαστικού ολιγοδενδρογλοιώματος, εφόσον όμως αποκλειστεί η παρουσία σημαντικού αστροκυτταρικού στοιχείου. Το αναπλαστικό αστροκύτωμα παρουσιάζει παρόμοιο μοριακό προφίλ με το ολιγοδενδρογλοίωμα, με την παρουσία όμως επιπρόσθετων γενετικών μεταβολών. Η ταυτόχρονη απώλεια στα 1p και 19q είναι εξίσου συχνή, με σημαντικό προγνωστικό και προβλεπτικό ρόλο. Συχνές όμως είναι και οι απώλειες στα χρωμοσώματα 9p και 10 [72], ενώ γενωμικές μελέτες κατέδειξαν σημαντική γενωμική αστάθεια στους όγκους αυτούς. Παρατηρήθηκαν μεταξύ άλλων απώλειες στα χρωμοσώματα 4, 6, 11, 13, 18 και 22q, καθώς και γονιδιακή ενίσχυση που αφορά στα χρωμοσώματα 15 και 20 [65, 67]. Οι μεταλλάξεις του γονιδίου PTEN παρατηρούνται συνήθως σε όγκους χωρίς απώλεια στα 1p και 19q [73], ενώ σπάνια μπορεί να παρατηρηθούν μεταλλάξεις του γονιδίου PIK3CA [73]. H γονιδιακή ενίσχυση των EGFR και PDGFRA είναι επίσης σπάνια [65, 67]. Ολιγοαστροκύτωμα και αναπλαστικό ολιγοαστροκύτωμα Το ολιγοαστροκύτωμα (ΟΑ) είναι ένα διάχυτης ανάπτυξης γλοίωμα, με παρουσία διακριτών στοιχείων ολιγοδενδρογλοιώματος και διάχυτου αστροκυτώματος. Οι μιτώσεις είναι λίγες ή απουσιάζουν ενώ χαρακτηριστικά δεν παρατηρείται νέκρωση ή μικροαγγειακή υπερπλασία. Το αναπλαστικό ολιγοαστροκύτωμα (ΑΟΑ) εμφανίζει τα ιστολογικά χαρακτηριστικά του ολιγοαστροκυτώματος, με επιπλέον ιστολογικά χαρακτηριστικά κακοήθειας, όπως μιτώσεις, πυρηνική ατυπία ή μικροαγγειακή υπερπλασία, ενώ η παρουσία νέκρωσης δεν είναι συμβατή με τη διάγνωση αυτή. Τόσο το ΑΟ όσο και το ΑΟΑ παρουσιάζουν παρόμοιες γενετικές μεταβολές με τους αντίστοιχους αμιγώς ολιγοδενδρογλοιακούς όγκους, σε σημαντικά όμως μικρότερη συχνότητα. H χαρακτηριστική απώλεια στα 1p και 19q παρατηρείται μόλις στο 25-30% των όγκων [74]. Συχνά όμως παρουσιάζουν και μεταβολές που παρατηρούνται στο διάχυτο και το αναπλαστικό αστροκύτωμα, όπως μεταλλάξεις του γονιδίου TP53 και απώλεια του χρωμοσώματος 17 [65]. Σε μελέτες που περιλάμβαναν αποκλειστικά ολιγοαστροκυτώματα, υποστηρίχθηκε η γενετική ετερογένεια των όγκων, με μοριακά προφίλ που πιθανόν να αντιστοιχούν στα 2 ξεχωριστά ιστολογικά τους στοιχεία [75]. Γλοιοβλάστωμα με ολιγοδενδρογλοιακό στοιχείο Το νεόπλασμα αυτό εμφανίζει ανάλογα ιστολογικά χαρακτηριστικά με το ΑΟΑ, με μιτώσεις, κυτταρική ατυπία και έντονη μικροαγγειακή υπερπλασία, αλλά με την επιπλέον παρουσία νέκρωσης. Η τελευταία είναι το μόνο ιστολογικό στοιχείο που διαχωρίζει το νεόπλασμα αυτό από το αναπλαστικό ολιγοαστροκύτωμα. Το γλοιοβλάστωμα με ολιγοδενδρογλοιακό στοιχείο εμφανίζει τις τυπικές γενετικές μεταβολές του κλασικού γλοιοβλαστώματος, όπως ενίσχυση του γονιδίου EGFR, απώλεια του γονιδίου p16 INK4Α, μεταλλάξεις του γονιδίου TP53, καθώς και απώλεια του χρωμοσώματος 10q και μεταλλάξεις του γονιδίου PTEN. Αυτές όμως οι μεταβολές παρατηρούνται σε μικρότερο βαθμό. Επιπλέον, ένα μικρό ποσοστό αυτών των όγκων 22

23 εμφανίζει την τυπική ταυτόχρονη απώλεια των 1p και 19q και στο γεγονός αυτό αποδόθηκε η σχετικά καλύτερη πρόγνωση του γλοιοβλαστώματος με ολιγοδενδρογλοιακό στοιχείο σε σχέση με το τυπικό γλοιοβλάστωμα [76, 77]. Μοριακή ταξινόμηση των όγκων γλοίας Παρά τη μεγάλη πρόοδο των τελευταίων χρόνων όσον αφορά τον καθορισμό των γενετικών και επιγενετικών μεταβολών των όγκων γλοίας σε σχέση με την ιστολογία, επί του παρόντος κυριότεροι προγνωστικοί παράγοντες σε ιστολογικό επίπεδο και επίπεδο γενετικών μεταβολών παραμένουν η ιστολογική διαβάθμιση και η ταυτόχρονη απώλεια στα 1p και 19q, αντίστοιχα [78]. Τυπικά τα ολιγοδενδρογλοιώματα έχουν καλύτερη πρόγνωση σε σχέση με τους αστροκυτταρικούς όγκους και μεταξύ των υψηλού βαθμού κακοήθειας όγκων με διάχυτη ανάπτυξη, την καλύτερη πρόγνωση κατέχει το αναπλαστικό ολιγοδενδρογλοίωμα [79]. Αλλά δυστυχώς, τα ιστολογικά χαρακτηριστικά του ολιγοδενδρογλοιώματος δεν μπορούν από μόνα τους να προβλέψουν την παρουσία της τυπικής απώλειας στα 1p και 19q [63]. Επίσης, μεταξύ των γλοιωμάτων περιλαμβάνονται όγκοι με μη-τυπική μορφολογία, οι οποίοι είναι δύσκολο να ταξινομηθούν σε έναν ιστολογικό τύπο [80]. Το κυριότερο ίσως πρόβλημα που παρουσιάζει η εφαρμοζόμενη ιστολογική κατάταξη είναι η σημαντική ετερογένεια που παρουσιάζουν τα γλοιώματα ενός ιστολογικού τύπου, ως προς τη βιολογική τους συμπεριφορά [81]. Μεταξύ των χαμηλού βαθμού κακοήθειας όγκων, μερικοί εμφανίζουν τάση υποτροπής, ενώ άλλοι παραμένουν αμετάβλητοι για χρόνια [78]. Παρόμοια ετερογένεια παρουσιάζουν και τα αναπλαστικά αστροκυτώματα, ενώ τα γλοιοβλαστώματα, παρά τη γενικά πολύ κακή τους πρόγνωση, εμφανίζουν μεγάλη ποικιλία γενετικών και επιγενετικών μεταβολών, που στις περισσότερες περιπτώσεις δεν αντιστοιχούν στα ιστολογικά ευρήματα. Επίσης, ενώ έχουν αναγνωριστεί διαφορετικές μοριακές οδοί που εμπλέκονται στη δημιουργία και εξέλιξη των πρωτοπαθών και δευτεροπαθών γλοιοβλαστωμάτων, αυτά δεν είναι πάντα εύκολο να διαχωριστούν, τόσο σε κλινικό όσο και σε ιστολογικό επίπεδο [24]. Από την άλλη, μεταξύ των διαφορετικών ιστολογικών τύπων των γλοιωμάτων παρατηρούνται πολλές φορές κοινές γενετικές και επιγενετικές μεταβολές, όπως επίσης μερικές φορές ιστολογικά ετερογενείς όγκοι αντιστοιχούν σε ένα πιο ομοιογενή γονότυπο. Τα φαινόμενα αυτά της αλληλοεπικάλυψης εξηγούνται από τη μονοκλωνική προέλευση των νεοπλασμάτων [82]. Στην προσπάθεια να ξεπεραστούν οι περιορισμοί της ιστολογικής ταξινόμησης των όγκων γλοίας ως προς την πρόγνωση, όλο και περισσότερες μελέτες πραγματοποιούνται, κατά τις οποίες αξιολογούνται πολλαπλές γενετικές και επιγενετικές μεταβολές. Όσον αφορά τους όγκους χαμηλού βαθμού κακοήθειας, μελέτη πολυγονιδιακής έκφρασης που περιλάμβανε αποκλειστικά όγκους ιστολογικού βαθμού κακοήθειας Ι και II, κατέληξε σε 2 διαφορετικά μοριακά προφίλ που σχετίζονταν με καλή πρόγνωση. Το πρώτο προφίλ ταυτιζόταν με το πιλοκυτταρικό αστροκύτωμα, ενώ η δεύτερη ομάδα περιλάμβανε όλους τους όγκους ανεξαρτήτως ιστολογίας, οι οποίοι παρουσίαζαν ταυτόχρονη απώλεια στα 1p και 19q. Σε αυτή την ομάδα περιλαμβάνονταν ολιγοδενδρογλοιώματα, ολιγοαστροκυτώματα, καθώς και διάχυτα αστροκυτώματα [83]. Σε δεύτερη αντίστοιχη μελέτη, προτάθηκαν για τους όγκους ιστολογικού βαθμού κακοήθειας ΙΙ πιθανά γονίδια που σχετίζονται με την μετάπτωση σε υψηλού βαθμού κακοήθειας γλοιώματα [84]. Γενωμική μελέτη που περιλάμβανε όγκους ιστολογικού βαθμού κακοήθειας ΙΙΙ όλων των ιστολογικών τύπων, κατέληξε σε 3 γενωμικά προφίλ με διαφορά στην πρόγνωση, ανάλογα με την παρουσία ή όχι της χαρακτηριστικής απώλειας 1p/19q από τη μία και ενίσχυσης του γονιδίου EGFR από την άλλη, δύο μεταβολές που θεωρήθηκαν αλληλοαναιρούμενες. Μεταξύ των όγκων που δεν εμφάνιζαν καμία από τις δύο αυτές μεταβολές, η παρουσία ολιγοδενδρογλοιακού στοιχείου αποδείχθηκε ως ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης [85]. 23

24 Σε μελέτες που περιλάμβαναν αποκλειστικά γλοιοβλαστώματα, κατά τις οποίες εξετάστηκε ταυτόχρονα μεγάλος αριθμός γενετικών μεταβολών, αναγνωρίστηκαν ομάδες όγκων με μοριακά προφίλ που σχετίζονταν με την πρόγνωση [81, 86, 87]. Κατά τις μελέτες αυτές προτάθηκαν και νέες μοριακές παράμετροι που σχετίζονταν με τη βιολογική συμπεριφορά των πολύ επιθετικών αυτών όγκων [88]. Γενετική ετερογένεια παρατηρείται και μεταξύ των γλοιοβλαστωμάτων που χαρακτηρίζονται ως πρωτοπαθή. Και σε αυτή την ομάδα έχουν αναγνωριστεί ταυτόχρονες ή αλληλοαναιρούμενες μεταβολές που σχετίζονται με την πρόγνωση [89]. Τέλος, τόσο γενωμικές όσο και μελέτες πολυγονιδιακής έκφρασης που περιλάμβαναν γλοιώματα όλων των βαθμών κακοήθειας, κατέληξαν σε αλγόριθμους γενετικών και επιγενετικών μεταβολών που διαμόρφωναν προγνωστικές ομάδες όγκων, ανεξάρτητα από τον ιστολογικό βαθμό κακοήθειας [80, 81, 90]. Υποστηρίχθηκε μάλιστα ειδικά για τα προφίλ γονιδιακής mrna έκφρασης, ότι σχετίζονταν σε μεγαλύτερο βαθμό με την επιβίωση, σε σχέση με την ιστολογική κατάταξη, ακόμα και με την ιστολογική διαβάθμιση [80]. Τέτοιες εξετάσεις τόσο μεγάλου αριθμού γενετικών και επιγενετικών μεταβολών με εξειδικευμένες μεθόδους ανίχνευσης, είναι φανερό ότι δεν μπορούν να εφαρμόζονται στην κλινική πράξη για την προγνωστική κατηγοριοποίηση των ασθενών με όγκους γλοίας. Οι μελέτες όμως αυτές μπορούν να αναδείξουν τις κυριότερες μοριακές παραμέτρους που σχετίζονται με την πρόγνωση, καθώς και τη συσχέτισή τους με την ιστολογική κατάταξη, έτσι ώστε να ξεπεραστούν τα προβλήματα που παρουσιάζει η ιστολογική εξέταση στους όγκους γλοίας. Με αυτόν τον τρόπο μπορεί η ιστολογική εξέταση σε συνδυασμό με την ανίχνευση διαφορετικών για κάθε τύπο όγκου γενετικών ή επιγενετικών μεταβολών με μοριακές μεθόδους, να βοηθήσει ουσιαστικά τόσο ως προς τον καθορισμό της πρόγνωσης όσο και ως προς το θεραπευτικό σχεδιασμό των νεοπλασμάτων αυτών. Πρόβλεψη απάντησης σε θεραπευτικά μέσα ρόλος στοχευμένης θεραπείας στους όγκους γλοίας Με τις εφαρμοζόμενες θεραπευτικές προσεγγίσεις, που βασίζονται κυρίως στον ιστολογικό βαθμό κακοήθειας και την ιστολογική κατάταξη των όγκων, η υποτροπή για τα γλοιώματα υψηλού βαθμού κακοήθειας είναι αναπόφευκτη, ενώ οι θεραπευτικές επιλογές για τους όγκους μετά από υποτροπή δεν έχουν αποφέρει ουσιαστικά αποτελέσματα. Έτσι, ο μέσος χρόνος επιβίωσης για τα αναπλαστικά γλοιώματα με διάχυτη ανάπτυξη είναι 2-5 έτη, ενώ για τα γλοιοβλαστώματα μόνο μήνες [91, 92]. Με βάση την πληθώρα των ερευνητικών δεδομένων που αφορούν στις γενετικές και επιγενετικές μεταβολές που χαρακτηρίζουν τους όγκους γλοίας, έγιναν προσπάθειες αναγνώρισης μοριακών παραμέτρων που θα μπορούσαν να προβλέψουν την απάντηση σε θεραπευτικά μέσα, με στόχο την προσαρμογή της θεραπείας ανάλογα με το μοριακό προφίλ των όγκων (εξατομικευμένη θεραπεία). Ενώ πολλές από τις γενετικές και επιγενετικές μεταβολές που αναφέρθηκαν στους όγκους γλοίας αξιολογήθηκαν όσον αφορά το ρόλο τους στην πρόβλεψη ευαισθησίας ή ανθεκτικότητας σε συγκεκριμένους θεραπευτικούς παράγοντες, μόνο για λίγες από αυτές ο προβλεπτικός τους ρόλος επιβεβαιώθηκε σε κλινικό επίπεδο. Επί του παρόντος, η καθιερωμένη θεραπεία για τα υψηλής κακοήθειας γλοιώματα είναι ακτινοθεραπεία με ταυτόχρονη ή/και συνεχιζόμενη χορήγηση τεμοζολομίδης [Stupp & Hegi 2009, ESMO guidelines]. Η πρώτη μοριακή παράμετρος που αναγνωρίστηκε για τη θεραπεία των όγκων γλοίας είναι η μεθυλίωση του επαγωγέα του γονιδίου MGMT. Αν και η μεταβολή αυτή θεωρήθηκε από τις περισσότερες μελέτες ως προβλεπτικός δείκτης ευαισθησίας στη θεραπεία, ο έλεγχός της στην κλινική πράξη παρουσιάζει δυσκολίες [93]. Από την άλλη, ο έλεγχος της συνδυασμένης απώλειας στα χρωμοσώματα 1p και 19q εφαρμόζεται σήμερα ευρέως στους όγκους γλοίας για την πρόβλεψη απάντησης στην εφαρμοζόμενη θεραπεία. Παρόλα αυτά, οι μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στη 24

25 συσχέτιση της παραμέτρου αυτής με την ανταπόκριση στη θεραπεία δεν έχουν διαλευκανθεί [5]. Με δεδομένη την επιτυχία της στοχευμένης θεραπείας σε άλλα νεοπλάσματα που στηρίζεται στον εκλεκτικό αποκλεισμό ενεργοποιημένων ογκογονιδίων, ακολούθησε πλήθος ερευνών, κατά τις οποίες αξιολογήθηκε η πιθανότητα αποκλεισμού παθολογικά ενεργοποιημένων γονιδίων στην περίπτωση των όγκων γλοίας, με την ανάπτυξη εκλεκτικών αναστολέων που θα μπορούσαν να διαπεράσουν τον ούτως ή άλλως διαταραγμένο αιματο-εγκεφαλικό φραγμό. Κύριους θεραπευτικούς στόχους που αξιολογούνται σε πειραματικό ή/και κλινικό επίπεδο, αποτελούν ο EGFR και άλλοι υποδοχείς αυξητικών παραγόντων, μόρια που συμμετέχουν σε ενδοκυττάριες οδούς ενεργοποίησης, καθώς και παράγοντες που συμμετέχουν στην αγγειογένεση. Με την κατανόηση των πολύπλοκων μοριακών οδών που εμπλέκονται στο σχηματισμό και την εξέλιξη των όγκων γλοίας, καθώς και των μηχανισμών ανάπτυξης ανθεκτικότητας στη θεραπεία, είναι δυνατή η αναγνώριση νέων θεραπευτικών στόχων, αλλά και μοριακών παραμέτρων με προβλεπτικό ρόλο. Ρόλος του υποδοχέα EGFR και της μεταλλαγμένης του μορφής EGFRvIII στη θεραπεία των γλοιωμάτων Το γονίδιο EGFR βρίσκεται στη χρωμοσωμική περιοχή 7p12 και κωδικοποιεί την έκφραση ενός διαμεμβρανικού υποδοχέα με δραστηριότητα τυροσινικής κινάσης, ο οποίος, όπως όλοι οι υποδοχείς της ίδιας οικογένειας, αποτελείται από 3 τμήματα, ένα εξωμεμβρανικό, ένα διαμεμβρανικό και ένα ενδοκυττάριο, με δραστηριότητα τυροσινικής κινάσης [94]. Οι κύριες ενδοκυττάριες οδοί ενεργοποίησης του υποδοχέα ΕGFR είναι οι οδοί των PI3K και MAPK κινασών, η οδός της φωσφολιπάσης C, καθώς και η οδός της Src κινάσης [95]. Υπερέκφραση ή ενεργοποίηση του EGFR έχει παρατηρηθεί, εδώ και πολλά χρόνια, σε πάνω από 50% των επιθηλιακών νεοπλασμάτων [96]. Όσον αφορά τους όγκους γλοίας, ενίσχυση του γονιδίου παρατηρείται στο 40% περίπου των γλοιοβλαστωμάτων, κυρίως των πρωτοπαθών και μόνο στο 10-17% των αναπλαστικών αστροκυτωμάτων [24, 85, 97]. Αντίστοιχα, υπερερέκφραση του γονιδίου σε επίπεδο mrna και πρωτεΐνης, έχει παρατηρηθεί περίπου στο 60% των πρωτοπαθών και στο 10% των δευτεροπαθών γλοιοβλαστωμάτων [24]. Σε in vitro μελέτες σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος, αποδείχθηκε ότι ο EGFR ενεργοποιεί τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη διηθητική ικανότητα των νεοπλασματικών κυττάρων [98], ενώ υποστηρίχθηκε ότι προσδίδει ανθεκτικότητα στην ακτινοθεραπεία και τη χημειοθεραπεία [99]. Σε κλινικό επίπεδο όμως, η προγνωστική σημασία της γονιδιακής ενίσχυσης και της υπερέκφρασης του EGFR στους όγκους γλοίας δεν είναι ξεκάθαρη [97, 100, 101]. Ενίσχυση του γονιδίου παρατηρείται συχνότερα σε όγκους με χρωμοσωμική απώλεια του 10q, μεταβολή που συναντάται συχνά στα πρωτοπαθή γλοιοβλαστώματα [85, 102]. Άλλες γενετικές μεταβολές που φάνηκε ότι συνυπάρχουν με την ενίσχυση του EGFR, είναι η απώλεια του 9p, καθώς και η απενεργοποίηση του p16 INK4Α [85]. Η πιο συχνή μεταλλαγμένη μορφή του EGFR είναι ο EGFRvIII, ο οποίος παρατηρείται στο 20-30% των γλοιοβλαστωμάτων γενικά και στο 50-60% των γλοιοβλαστωμάτων με γονιδιακή ενίσχυση του EGFR [103]. Προκύπτει από παθολογικό εσωτερικό ανασυνδυασμό στο γονίδιο του EGFR, κατά τον οποίο ο καινούργιος υποδοχέας που προκύπτει δεν περιλαμβάνει τα εξόνια 2-8 που αντιστοιχούν στο μεγαλύτερο τμήμα της εξωμεμβρανικής περιοχής του υποδοχέα [104, 105]. Το αποτέλεσμα είναι το «κολόβωμα» του EGFR που παράγεται μ αυτόν τον τρόπο, ο EGFRvIII, να έχει παθολογική διαμόρφωση στο χώρο και να βρίσκεται διαρκώς σε ενεργοποιημένη (φωσφορυλιωμένη) κατάσταση [106], η οποία επάγει την ενεργοποίηση ενδοκυττάριων οδών μεταφοράς αυξητικών μηνυμάτων, κυρίως της PI3K κινάσης [107], ενώ οι ακριβείς μηχανισμοί λειτουργίας του δεν έχουν ξεκαθαριστεί. Μετά από in vitro μελέτες θεωρήθηκε ότι επάγει τη διηθητική ικανότητα των νεοπλασματικών κυττάρων και την 25

26 αγγειογένεση [108], ενώ του αποδόθηκαν αντιαποπτωτικές λειτουργίες [109], καθώς και επίδραση στα αρχέγονα κύτταρα του όγκου [103]. Θεωρήθηκε επίσης ότι συμμετέχει στην ανθεκτικότητα στην ακτινοθεραπεία [110, 111], ενώ ο προγνωστικός του ρόλος δεν έχει ξεκαθαριστεί [112, 113]. Άλλες μεταλλαγμένες μορφές του EGFR που αφορούν στο εξωκυττάριό του τμήμα, θεωρούνται σπάνιες, ενώ η κλινική τους σημασία δεν είναι γνωστή [105, 114]. Επίσης, μεταλλάξεις που οδηγούν σε μεταβολή του ενδοκυττάριου τμήματος του υποδοχέα δεν έχουν παρατηρηθεί στα γλοιοβλαστώματα [115, 116]. Η εφαρμογή αναστολέων του EGFR για τη θεραπεία των υψηλού βαθμού κακοήθειας γλοιωμάτων, αλλά και άλλων νεοπλασμάτων με ενεργοποίηση του υποδοχέα στηρίχθηκε στη θεωρία της «εξάρτησης από ογκογονίδιο» (oncogene addiction), με βάση την οποία μετά την απορρύθμιση των βασικών κυτταρικών λειτουργιών, η επιβίωση των νεοπλασματικών κυττάρων μπορεί να εξαρτάται από ένα ογκογονίδιο. Αναστολή του ογκογονιδίου αυτού θα μπορούσε να οδηγήσει στον κυτταρικό θάνατο τα νεοπλασματικά κύτταρα με επιλεκτικό τρόπο [19]. Ένας τρόπος αποκλεισμού του υποδοχέα είναι τα μονοκλωνικά αντισώματα, τα οποία χρησιμοποιούνται ευρέως για την αντιμετώπιση άλλων νεοπλασμάτων, όπως τα καρκινώματα του παχέος εντέρου και του μαστού [117]. Αντισώματα εναντίον του EGFR, όπως το cetuximab (Erbitux) και το nimotuzumab (Theraloc) έχουν χρησιμοποιηθεί στα γλοιοβλαστώματα και δοκιμάζονται σε κλινικές μελέτες σε συνδυασμό με ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία [118, 119]. Βασικά προβλήματα των μεγαλομοριακών αυτών ενώσεων που συνδέονται με το εξωκυττάριο τμήμα του EGFR είναι από τη μια η δυσκολία στο να διαπεράσουν τον αιματο-εγκεφαλικό φραγμό και από την άλλη το γεγονός ότι δεν αναστέλλουν τη δράση του EGFRvIII. Η εφαρμογή ειδικών αντισωμάτων εναντίον της μεταλλαγμένης αυτής μορφής, αποτελεί εναλλακτικό τρόπο προσέγγισης με ελπιδοφόρα αποτελέσματα μετά από προκλινικές μελέτες [120]. H επιλεκτική στόχευση του EGFRvIII αποτελεί ενδιαφέρουσα προοπτική, λόγω της συχνής του έκφρασης στα γλοιοβλαστώματα, αλλά και της απουσίας του στους φυσιολογικούς ιστούς [103]. Η δεύτερη κύρια κατηγορία αναστολέων του EGFR, που έχουν χρησιμοποιηθεί σε γλοιοβλαστώματα, είναι οι μικρομοριακοί αναστολείς, οι οποίοι συνδέονται με το ενδοκυττάριο τμήμα του υποδοχέα αναστέλλοντας τη δράση της τυροσινικής κινάσης [117]. Στην κατηγορία αυτή ανήκει το gefitinib (Iressa), το οποίο όμως δεν αποδείχτηκε αποτελεσματικό για τα γλοιοβλαστώματα, γεγονός που αποδόθηκε κυρίως στην απουσία μεταλλάξεων του ενδοκυττάριου τμήματος του υποδοχέα [116]. Σε πειραματικά μοντέλα δείχθηκε ευαισθησία στη θεραπεία με Iressa για τους όγκους που εκφράζουν τη φυσιολογική μορφή, όχι όμως και γι αυτούς που εκφράζουν τον EGFRvIII [121]. In vitro μελέτες σε κυτταρικές σειρές [122] επιβεβαίωσαν την μειωμένη αποτελεσματικότητα του gefitinib στην αναστολή των νεοπλασματικών κυττάρων με έκφραση του EGFRvIII. Αντίθετα, αντίστοιχες μελέτες με έναν άλλο μικρομοριακό αναστολέα, το erlotinib (Tarceva) έδειξαν ελάττωση της έκφρασης της μεταλλαγμένης μορφής [123]. Παρόλα αυτά, κλινικές μελέτες που ακολούθησαν απέτυχαν στο να καταδείξουν την αποτελεσματικότητα του erlotinib στα γλοιοβλαστώματα [124], έτσι το ενδιαφέρον στράφηκε προς την αποκάλυψη άλλων, εκτός του EGFRvIII, προβλεπτικών δεικτών ευαισθησίας. Πράγματι, σε κλινική μελέτη [125] παρατηρήθηκε ότι όγκοι με ταυτόχρονη έκφραση του EGFRvIII και διατήρηση της φωσφατάσης PTEN, η οποία αποτελεί κύριο ρυθμιστή της οδού της PI3K κινάσης, ανταποκρίνονταν καλύτερα στη θεραπεία με erlotinib, γεγονός που επιβεβαιώθηκε από μελέτες σε πειραματικά μοντέλα [126]. Επίσης η απάντηση στο erlotinib συνδέθηκε με χαμηλά επίπεδα ενεργοποιημένης Akt [127]. Παρόλα αυτά, μεγάλη κλινική μελέτη που ολοκληρώθηκε πρόσφατα δεν έδειξε ανταπόκριση των γλοιοβλαστωμάτων στο erlotinib, ενώ δεν επιβεβαίωσε τον προβλεπτικό ρόλο της φωσφατάσης PTEN, αλλά ούτε και της γονιδιακής ένισχυσης του EGFR ή της έκφρασης του EGFRvIII [128]. Τέλος, μικρομοριακοί αναστολείς, οι οποίοι αναστέλλουν ειδικά τη λειτουργία του EGFRvIII, έχουν αναπτυχθεί και εφαρμόζονται σε πειραματικό στάδιο [103]. 26

27 Μετά την αποτυχία των μικρομοριακών αναστολέων του EGFR, ως μονοθεραπεία, για την αντιμετώπιση των υψηλού βαθμού κακοήθειας γλοιωμάτων και την αδυναμία αναγνώρισης προβλεπτικών δεικτών, καταβάλλονται προσπάθειες για τη διερεύνηση των μηχανισμών ανθεκτικότητας των γλοιοβλαστωμάτων στους μικρομοριακούς αναστολείς του EGFR. Ένας από αυτούς θεωρείται ότι είναι η γενωμική αστάθεια, η οποία χαρακτηρίζει όγκους με έκφραση του EGFRvIII και απώλεια της δράσης της φωσφατάσης PTEN, όπως φάνηκε από μελέτες σε κυτταρικές σειρές [129]. Σε πρόσφατη προκλινική μελέτη με εφαρμογή erlotinib, έχουν αποκαλυφθεί 2 γονίδια που σχετίζονται με ευαισθησία, καθώς και 10 γονίδια που πιθανώς να σχετίζονται με ανθεκτικότητα στο φάρμακο, ευρήματα που μένει να επιβεβαιωθούν από επόμενες κλινικές εφαρμογές [130].Επίσης, η σχετικά συχνή απενεργοποίηση του γονιδίου ANXA1 στο χρωμόσωμα 10 που παρατηρήθηκε πρόσφατα σε γλοιοβλαστώματα [30], θεωρήθηκε ότι παίζει ρόλο στην μη ελεγχόμενη ενεργοποίηση του EGFR, ακόμα και σε απουσία ενίσχυσης του γονιδίου [131]. Για την ανθεκτικότητα στους μικρομοριακούς αναστολείς, αλλά και ως δείκτες χειρότερης πρόγνωσης ανάμεσα στους όγκους με ενεργοποίηση του EGFR, έχουν ενοχοποιηθεί επίσης γονίδια που συμμετέχουν στην αγγειογένεση [132, 133]. Aπό την άλλη, με δεδομένη την αλληλεπίδραση μεταξύ των διάφορων διαμεμβρανικών υποδοχέων, το ενδιαφέρον στράφηκε προς τη συνδυασμένη στόχευση του EGFR με άλλους υποδοχείς με δραστηριότητα κινάσης. Επίσης, η ταυτόχρονη στόχευση ενδοκυττάριων μορίων μεταγωγής σήματος, κυρίως της οδού PI3K/Αkt, θεωρείται σήμερα ένας τρόπος αντιμετώπισης της ανθεκτικότητας στην θεραπεία με αναστολείς του EGFR. Για το σκοπό αυτό αναμένεται να βοηθήσει και η αναγνώριση άλλων ενδοκυττάριων οδών που ελέγχουν βασικές κυτταρικές λειτουργίες και που ρυθμίζονται από τον EGFR [19]. Η ανθεκτικότητα στους αναστολείς του EGFR θεωρήθηκε επίσης ότι μπορεί να ξεπεραστεί με την ταυτόχρονη εφαρμογή αντι-αγγειογενετικής θεραπείας, και τον περιορισμό, με αυτό τον τρόπο, τόσο του διηθητικού όσο και του αγγειακού στοιχείου των όγκων γλοίας. Παραδείγματα τέτοιου είδους συνδυασμένης στόχευσης είναι η εφαρμογή erlotinib με τον αναστολέα του αγγειογενετικού παράγοντα VEGF bevacizumab, καθώς και παραγόντων με την ικανότητα να αποκλείουν ταυτόχρονα τόσο την δράση του EGFR όσο και του υποδοχέα αγγειογένεσης VEGFR2 [4]. Ρόλος του υποδοχέα ΜΕΤ στους αστροκυτταρικούς όγκους Ο MET είναι, όπως και ο EGFR, ένας διαμεμβρανικός υποδοχέας με δραστηριότητα τυροσινικής κινάσης, για τον οποίο ο κύριος διεγερτικός αυξητικός παράγοντας (ligand) είναι ο HGF (hepatocyte growth factor). Η ενεργοποίηση του υποδοχέα MET κατέχει σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση και έχει ενοχοποιηθεί για την ανάπτυξη πoλλών τύπων νεοπλασμάτων, όπως του ηπατοκυτταρικού καρκινώματος, του αδενοκαρκινώματος του παχέος εντέρου και του γλοιοβλαστώματος [134], κυρίως μέσω υπερέκφρασης και γονιδιακής ενίσχυσης [135, 136], αλλά και μέσω ενεργοποιητικών, γεννητικών ή σωματικών, σημειακών μεταλλάξεων [137]. Έχουν παρατηρηθεί πάνω από 20 διαφορετικές σωματικές ή γεννητικές σημειακές μεταλλάξεις που αφορούν στο γονίδιο ΜΕΤ [138]. Υπερέκφραση του MET έχει παρατηρηθεί σε ποσοστό 33.9% των γλοιοβλαστωμάτων και έχει συνδεθεί με μικρότερο χρόνο επιβίωσης και ανθεκτικότητα στην ακτινοθεραπεία και την κλασική χημειοθεραπεία [134]. Τα τελευταία χρόνια έχουν αναπτυχθεί και χρησιμοποιηθεί σε in-vitro και in-vivo μελέτες, φαρμακευτικοί παράγοντες που εκλεκτικά στοχεύουν την οδό ενεργοποίησης HGF/c-MET. Οι κυριότεροι από αυτούς είναι ανταγωνιστές του HGF, όπως ο NK4 [139], ένα ειδικό αντίσωμα εναντίον του c-met (L2G7), το οποίο σε μελέτη σε πειραματόζωα φάνηκε να εμποδίζει την ανάπτυξη γλοιοβλαστώματος [140] και μικρομοριακοί αναστολείς της περιοχής του MET με δραστηριότητα τυροσινικής κινάσης. Κύριοι εκπρόσωποι των τελευταίων είναι οι παράγοντες SU11274, PHA και SGX523, οι οποίοι, αν και βρίσκονται σε αρχικό πειραματικό στάδιο, έχουν δώσει ελπιδοφόρα αποτελέσματα [137, 141, 142]. 27

28 Με δεδομένο τον προσανατολισμό των πρόσφατων ερευνών στην συνδυασμένη στοχευμένη θεραπεία, λόγω της αλληλοεπικαλυπτόμενης δράσης των διάφορων υποδοχέων αλλά και των ενεργοποιητικών τους οδών, έχει προταθεί ότι η μειωμένη ανταπόκριση στους παράγοντες εναντίον του EGFR, οφείλεται εν μέρει στην αλληλεπίδρασή του με τον MET [143]. Πράγματι, στο πλαίσιο αυτό, σε μελέτη σε πειραματόζωα, έχει καταδειχθεί η συνεργική δράση των μικρομοριακών αναστολέων του EGFR (erlotinib) και του αντι-hgf αντισώματος L2G7, σε γλοιοβλαστώματα που εκφράζουν EGFRvIII, σε απουσία της φωσφατάσης PTEN [136]. Εδώ αξίζει να σημειωθεί ότι η απουσία της φωσφατάσης PTEN, όπως και για τον EGFR, προσδίδει ανθεκτικότητα στους αναστολείς του ΜΕΤ, όταν αυτοί χρησιμοποιηθούν ως μονοθεραπεία [144]. Ρόλος υποδοχέα HER2 στα γλοιώματα Ο υποδοχέας HER2/neu, διαμεμβρανικός υποδοχέας που ανήκει στην οικογένεια των υποδοχέων με δραστηριότητα τυροσινικής κινάσης, θεωρείται σημαντικός για τον έλεγχο της ανάπτυξης του καρκίνου. Η έκφρασή του θεωρείται από παλιά δυσμενής προγνωστικός δείκτης για πολλούς όγκους, όπως το καρκίνωμα του μαστού και του πνεύμονα [145, 146]. Στον εγκέφαλο, παίζει ρόλο στον έλεγχο της κυτταρικής ανάπτυξης και διαφοροποίησης κατά την εμβρυογένεση [147], ενώ θεωρείται, μετά τον EGFR, ο συχνότερα εκφραζόμενος υποδοχέας στους όγκους γλοίας, αν και υψηλά επίπεδα έκφρασης παρατηρούνται σπάνια. Η υπερέκφραση του υποδοχέα στα γλοιοβλαστώματα θεωρήθηκε δυσμενής προγνωστικός δείκτης [148]. Όσον αφορά τη στόχευση του HER2 στον καρκίνο, είναι γνωστή η εφαρμογή του μονοκλωνικού αντισώματος trastuzumab στο μαστό, σε όγκους που εκφράζουν τον υποδοχέα. Η υπερέκφραση του υποδοχέα HER2 λόγω γονιδιακής ενίσχυσης έχει θεωρηθεί επίσης, μετά από πολλές μελέτες σε διάφορους τύπους νεοπλασμάτων προβλεπτικός δείκτης ευαισθησίας σε θεραπεία με αναστολείς του EGFR [149, 150]. Μια από τις διαφορές μεταξύ των γλοιωμάτων και των άλλων όγκων, είναι η απουσία του HER2 στα φυσιολογικά κύτταρα γλοίας των ενηλίκων [147], γεγονός που διευκολύνει την επιλεκτική στόχευση των νεοπλασματικών κυττάρων. Πράγματι, σε εφαρμογή του trastuzumab σε κυτταρικές σειρές γλοιοβλαστωμάτων, αυτό φάνηκε να επιτείνει την απόπτωση και την κυτταροτοξικότητα ADCC, ακόμα και σε κύτταρα με χαμηλά επίπεδα έκφρασης του υποδοχέα [151]. Για την εφαρμογή όμως στοχευμένης θεραπείας εναντίον του HER2 σε κλινικές μελέτες, πρέπει να ξεπεραστεί το εμπόδιο του αιματο-εγκεφαλικού φραγμού. Για το σκοπό αυτό, έχει εφαρμοσθεί σε μελέτη σε πειραματόζωα ένας μικρομοριακός αναστολέας της οικογένειας των υποδοχέων με δραστηριότητα κινάσης, συμπεριλαμβανομένου και του HER2 (JNJ ), ο οποίος διαπερνά τόσο το μικροπεριβάλλον μεταστατικών όγκων εγκεφάλου όσο και τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό [152]. Η συνδυασμένη στόχευση υποδοχέων με δραστηριότητα κινάσης έχει αποδόσει ενθαρρυντικά αποτελέσματα τόσο σε προκλινικές όσο και σε κλινικές μελέτες. Ο πρώτος παράγοντας με συνδυασμένη δράση που αναπτύχθηκε, είναι το lapatinib, το οποίο αποκλείει τη δραστηριότητα του EGFR και του HER2, αφού συνδεθεί με το ενδοκυττάριό τους τμήμα. Το lapatinib έχει εγκριθεί το 2007 από την U.S FDA για τον καρκίνο του μαστού και εφαρμόζεται σε συνδυασμό με capecitebine για τη θεραπεία των μεταστατικών HER2 θετικών καρκινωμάτων [153, 154]. Σε προκλινικό στάδιο και σε στάδιο κλινικών δοκιμών σε διάφορους τύπους καρκίνων βρίσκονται και άλλοι παράγοντες με συνδυασμένη στόχευση υποδοχέων της οικογένειας του HER2 [152, 155]. Τέλος, με δεδομένο το γεγονός ότι κύτταρα με υπερέκφραση HER2 παράγουν τον αγγειογενετικό παράγοντα VEGF σε υψηλά επίπεδα [156], έχει εφαρμοστεί σε in-vitro μελέτες συνδυασμός αντι-αγγειογενετικής θεραπείας (VEGF-trap) με trastuzumab σε καρκινώματα μαστού με υπερέκφραση HER2 [157]. 28

29 Ρόλος της ενδοκυττάριας οδού ενεργοποίησης της PI3K κινάσης Η κύρια οδός ενεργοποίησης των υποδοχέων με δραστηριότητα κινάσης, όπως είναι οι υποδοχείς EGFR, ΜΕΤ και HER2 είναι η οδός της PI3K κινάσης, η οποία κατέχει κεντρική θέση στην καρκινογένεση. Η ενεργοποίησή της στα νεοπλάσματα, πέρα από τη μη-ρυθμισμένη ενεργοποίηση των υποδοχέων, προκύπτει από γενετικές και επιγενετικές μεταβολές ενδοκυττάριων συστημάτων μορίων. Οι κυριότερες από αυτές και περισσότερο μελετημένες είναι η απουσία της φωσφατάσης PTEN λόγω μεταλλάξεων, γονιδιακής απώλειας ή επιγενετικών αλλαγών, η ενίσχυση και οι μεταλλάξεις του γονιδίου PIK3CA, καθώς και η ενίσχυση και οι μεταλλάξεις των γονιδίων AKT, που κωδικοποιούν τους τρεις τύπους της Akt κινάσης [158]. Μεταλλάξεις ή ενίσχυση των γονιδίων ΑΚΤ έχουν περιγραφεί σε πολλούς τύπους νεοπλασμάτων [159, 160], ενώ για τα γλοιοβλαστώματα, έχουν αναφερθεί ενίσχυση και υπερέκφραση mrna του γονιδίου ΑΚΤ1 [161], καθώς και ενίσχυση του γονιδίου AKT3 [162]. Το γονίδιο PIK3CA κωδικοποιεί την έκφραση της καταλυτικής υποομάδας p110alpha της PIK3Ka, που ανήκει στην τάξη 1Α των PI3K κινασών. Ενεργοποίηση του γονιδίου αυτού μέσω μεταλλάξεων έχει περιγραφεί σε μικρό αριθμό γλοιοβλαστωμάτων, σε ποσοστό που ποικίλει ανάλογα με τη μελέτη, αλλά κυμαίνεται κυρίως από 0-7% [161, 163, 164]. Οι μεταλλάξεις αυτές φάνηκε να είναι εξίσου σπάνιες, τόσο στα πρωτοπαθή όσο και στα δευτεροπαθή γλοιοβλαστώματα, ενώ παρατηρήθηκαν αποκλειστικά σε υψηλού βαθμού κακοήθειας γλοιώματα, κυρίως γλοιοβλαστώματα, αλλά και σε αναπλαστικά αστροκυτώματα και ολιγοδενδρογλοιώματα [73, 165]. Η ενίσχυση του γονιδίου PIK3CA θεωρείται τα τελευταία χρόνια συχνή γενετική μεταβολή για πολλούς τύπους νεοπλασμάτων, ενώ στα γλοιοβλαστώματα έχει παρατηρηθεί σε ποσοστό που ποικίλει από 0 έως και 64% [161, 164, 166, 167]. Επιπλέον, η γονιδιακή ενίσχυση του PIK3CA και οι μεταβολές του γονιδίου PTEN θεωρούνται ως αλληλοαναιρούμενες μεταβολές στα γλοιοβλαστώματα [165]. Ρύθμιση της οδού PI3K - Φωσφατάσες PHLPP1 και PHLPP2 Ο έλεγχος της ενεργοποίησης της oδού της PI3K κινάσης επιτυγχάνεται φυσιολογικά κυρίως από τις φωσφατάσες, οι πιο γνωστές από τις οποίες, εκτός από τη φωσφατάση PTEN, είναι οι φωσφατάσες PP1 και PP2A, καθώς και οι φωσφατάσες PHLPP [168]. Οι τελευταίες, ανήκουν στην οικογένεια των φωσφατασών PPM και προκαλούν αποφωσφορυλίωση της Akt κινάσης. Αποτελούνται από 3 μέλη, τις PHLPP1α και PHLPP1β, οι οποίες αποτελούν ισομορφές του ίδιου γονιδίου που βρίσκεται στο 18q21.3, καθώς και την PHLPP2, η οποία κωδικοποιείται από γονίδιο που βρίσκεται στο 16q22.3. Οι φωσφατάσες PHLPP εκτός από την αναστολή της οδού της ΡI3K κινάσης, συμμετέχουν στη ρύθμιση και άλλων οδών ενεργοποίησης, όπως την οδό Ras-Raf-MEK και την οδό της πρωτεϊνικής κινάσης C [169]. Όσον αφορά τη συμμετοχή τους στη ρύθμιση της οδού της ΡΙ3Κ κινάσης, είναι γνωστή η εκλεκτική απενεργοποίηση των τριών τύπων της Αkt κινάσης. Συγκεκριμένα, η φωσφατάση PHLPP1 προκαλεί απενεργοποίηση των κινασών Akt1 και Akt2, ενώ η PHLPP2 προκαλεί αποφωσφορυλίωση της Akt 3 [169]. Επομένως, οι φωσφατάσες PHLPP θεωρούνται ογκοκατασταλτικά γονίδια, αν και έχει αναφερθεί και ο πιθανός ογκογενετικός ρόλος της PHLPP1, μια που οι δύο τύποι της Akt κινάσης, Αkt 1 και 2, οι οποίες απενεργοποιούνται από την PHLPP1, έχουν επιπλέον ογκοκατασταλτική δράση μέσω ανιόντων ρυθμιστικών μηχανισμών, ανασταλτικών της αύξησης [169]. Ελάττωση της έκφρασης mrna των γονιδίων PHLPP1 και 2 έχει παρατηρηθεί σε κυτταρικές σειρές χρόνιας μυελογενούς λευχαιμίας, όπου αποδόθηκε σε καταστολή από το ογκογονίδιο BCR-ABL, αφού μετά από εφαρμογή αναστολέων του ογκογονιδίου, σημειώθηκε αύξηση της έκφρασης του mrna των φωσφατασών σε φυσιολογικά επίπεδα [170]. 29

30 Επιπλέον, τα γονίδια που κωδικοποιούν τις PHLPP, βρίσκονται σε χρωμοσωμικές περιοχές με συχνές απώλειες σε πολλούς τύπους νεοπλασμάτων. Τα σποραδικά καρκινώματα παχέος εντέρου παρουσιάζουν συχνή απώλεια του 18q, όπου βρίσκεται το γονίδιο PHLPP1 [171]. Πράγματι, σε ανοσοϊστοχημική μελέτη παρατηρήθηκε απώλεια έκφρασης της PHLPP1, αλλά και της PHLPP2 σε καρκινώματα παχέος εντέρου [172]. Απώλειες στο 16q, όπου βρίσκεται το γονίδιο PHLPP2 έχουν αναφερθεί σε καρκινώματα μαστού, προστάτη αδένα και ωοθηκών, καθώς και σε όγκους του Wilms και σε ηπατοκυτταρικά καρκινώματα [ ]. Ρόλος της πρωτεΐνης Darpp32 στην ογκογένεση Η πρωτεΐνη Darpp32 κωδικοποιείται από το γονίδιο PPP1R1B, το οποίο βρίσκεται στην χρωμοσωμική περιοχή 17q12 και είναι γνωστή για το νευροδιαβιβαστικό της ρόλο στην ντοπαμινεργική οδό, μεταβάλλοντας το βαθμό φωσφορυλίωσης πολλαπλών ενδοκυττάριων μοριακών στόχων, τόσο στην κυτταρική μεμβράνη όσο και στο κυτταρόπλασμα [178]. Θεωρείται μόριο με διπλό ρόλο, αφού αποκτά ιδιότητες αναστολής φωσφατάσης ή κινασών, ανάλογα με τη θέση φωσφορυλίωσής της [178]. Φωσφορυλίωση στη θέση Thr34 από την πρωτεϊνική κινάση Α (PKA), προκαλεί αναστολή της φωσφατάσης PP1, ενώ με φωσφορυλίωση στη Thr75 από την κινάση CDK5, αποκτά ανασταλτικές ιδιότητες έναντι της κινάσης PKA. Η φωσφατάση PP1 και η κινάση PKA συμμετέχουν στην ενδοκυττάρια οδό ενεργοποίησης PI3K, με ανασταλτικό και ενεργοποιητικό ρόλο, αντίστοιχα. H φωσφατάση PP1 αναστέλλει την ενεργοποίηση της κινάσης Akt, ενώ η κινάση PKΑ, φαίνεται να κατέχει κεντρική θέση στη ρύθμιση της οδού, δρώντας ευοδωτικά στην ενεργοποίηση της κινάσης PI3K, με άγνωστους ωστόσο μηχανισμούς [179]. Η πρωτεΐνη Darpp32 βρέθηκε να εκφράζεται και σε άλλους ιστούς εκτός από τον εγκέφαλο, όπως σε φυσιολογικά επιθήλια μαστού, προστάτη αδένα, παχέος εντέρου και στομάχου [178], ενώ ο ρόλος της στην καρκινογένεση δεν είναι ακόμα γνωστός [180]. Μελέτες υποστηρίζουν ογκογενετική δράση για την πρωτεΐνη Darpp32, αφού βρέθηκε να υπερεκφράζεται, μαζί με την ισομορφή της, t-darpp, σε αδενoκαρκινώματα μαστού, προστάτη αδένα, παχέος εντέρου και στομάχου [178, 181], ενώ σε μελέτη σε καρκινώματα ανώτερου γαστρεντερικού σε επίπεδο DNA, mrna και πρωτείνης, η υπερέκφραση που παρατηρήθηκε αποδόθηκε κυρίως σε μεταγραφικούς και μεταμεταγραφικούς μηχανισμούς, αφού μόνο μικρός αριθμός όγκων παρουσίασε ενίσχυση του γονιδίου [181]. Η δεύτερη ισομορφή t-darrp, από την οποία λείπει η θέση φωσφορυλίωσης της Thr34, αναγνωρίστηκε πρώτη φορά σε μελέτη καρκινωμάτων στομάχου, όπου διαπιστώθηκε η υπερέκφρασή της σε επίπεδο mrna και πρωτεΐνης [182]. Στη συνέχεια, in-vitro μελέτες κατέδειξαν ότι η έκφραση της ισομορφής αυτής έπαιζε ρόλο στην ανθεκτικότητα κυττάρων καρκινωμάτων μαστού στο trastuzumab [183]. H t-darpp φάνηκε να έχει αντιαποπτωτικές ιδιότητες, αλλά και ικανότητα ενεργοποίησης της Akt με φωσφορυλίωση στη θέση Ser473 [183]. Υπάρχουν επίσης δεδομένα που υποστηρίζουν πιθανή ογκοκατασταλτική δράση της Darpp32 σε ορισμένους τύπους νεοπλασμάτων. Σε ανοσοϊστοχημική μελέτη σε προκαρκινικές βλάβες και καρκινώματα πλακώδους επιθηλίου, αναφέρεται χαμηλότερη έκφραση σε σχέση με το φυσιολογικό επιθήλιο [184]. Επίσης, σε in-vitro μελέτες σε κυτταρικές σειρές, αναφέρεται ο ρόλος της Darpp32 στη διατήρηση της διαφοροποίησης των θυρεοειδικών κυττάρων [185], ενώ σε πρόσφατη μελέτη σε κυτταρικές σειρές καρκινωμάτων μαστού, αναφέρεται ανταγωνιστική δράση μεταξύ των δύο ισομορφών στην κυτταρική επιβίωση, ενώ υπερέκφραση μόνο της ισομορφής Darpp32 οδηγούσε σε κυτταρικό θάνατο [179]. Tέλος, καρκινώματα από πλακώδες επιθήλιο του οισοφάγου με έκφραση της Darpp32 θεωρήθηκαν λιγότερο επιθετικά [186]. 30

31 Στόχευση ενδοκυττάριων μορίων της οδού PI3K Με δεδομένο το γεγονός ότι η εφαρμογή των αναστολέων των υποδοχέων EGFR και του MET ως μονοθεραπεία δεν έχει αποφέρει τα αναμενόμενα αποτελέσματα, ειδικά στα γλοιώματα μετά από υποτροπή, το ενδιαφέρον στρέφεται προς την στόχευση άλλων μορίων της οδού ενεργοποίησης της Αkt/PKB, και ειδικά στην mtor κινάση, αλλά και το γονίδιο PKI3CA. Η mtor κινάση ενεργοποιείται από την Akt/PKB που με τη σειρά της ελέγχει την πρωτεϊνική σύνθεση, την αγγειογένεση και την είσοδο στον κυτταρικό κύκλο. Αναστολείς της mtor εφαρμόζονται σε κλινικές δοκιμές και είναι η ραπαμυκίνη (sirolimus) και τα ανάλογά της (temsirolimus, everolimus). Οι παράγοντες αυτοί έχουν εφαρμοσθεί δοκιμαστικά σε ασθενείς με μη-μικροκυτταρικά καρκινώματα πνεύμονα, καρκινώματα μαστού, τραχήλου, μήτρας, όπως επίσης και σε ασθενείς με σαρκώματα, μεσοθηλίωμα, λέμφωμα από κύτταρα του μανδύα και γλοιοβλάστωμα [158]. Άλλοι θεραπευτικοί στόχοι της οδού είναι η PI3K και η Αkt κινάσες. Μικρομοριακοί αναστολείς της PI3K, που στρέφονται εναντίον κυρίως της υποομόδας p110alpha που κωδικοποιείται από το γονίδιο PKI3CA έχουν εφαρμοστεί σε γλοιοβλαστώματα, με ενθαρρυντικά αποτελέσματα [187]. Γενικά η εφαρμογή των αναστολέων της mtor ως μονοθεραπεία απέδωσε φτωχά αποτελέσματα στις περισσότερες περιπτώσεις. Επίσης, ο συνδυασμένος αποκλεισμός ενδοκυττάριων μορίων της οδού της PI3K, με ταυτόχρονη στόχευση της PI3K και της mtor, ενώ βρίσκεται σε φάση I/II κλινικών δοκιμών, φαίνεται να έχει περισσότερο κυτταροστατική παρά κυτταροτοξική δράση [188, 189]. Τα δεδομένα αυτά αφήνουν ανοικτό πεδίο έρευνας από τη μια για την αναγνώριση δεικτών προβλεπτικών ευαισθησίας ή αντοχής στην θεραπεία και από την άλλη για τη συνδυασμένη θεραπεία με άλλους παράγοντες. Οι έρευνες προσανατολίζονται στο συνδυασμό αποκλεισμού υποδοχέων και μορίων που συμμετέχουν στις ενδοκυττάριες οδούς ενεργοποίησής τους. Σε μελέτη με πειραματόζωα, έχει καταδειχθεί συνεργική δράση του αναστολέα της mtor everolimus με τον αναστολέα του EGFR gefitinib στο γλοιοβλάστωμα [190], ενώ σε μελέτη σε κυτταρικές σειρές μη-μικροκυτταρικού καρκινώματος πνεύμονα με έκφραση ΜΕΤ, αναφέρεται συνέργεια του αναστολέα του MET PHA με την ραπαμυκίνη [191]. Σε πρόσφατη μελέτη σε κυτταρικές σειρές γλοιοβλαστωμάτων εφαρμόστηκε το αντίσωμα L2G7 εναντίον του παράγοντα HGF σε συνδυασμό με ραπαμυκίνη [144]. Επίσης, σε αντίστοιχες μελέτες, έχει αναφερθεί συνεργική δράση ενός αναστολέα της PI3K και της mtor με erlotinib σε κύτταρα με μεταλλάξεις στο γονίδιο PTEN [192]. Σε in vitro μελέτες σε κυτταρικές σειρές καρκινωμάτων μαστού έχει εφαρμοσθεί συνδυασμός trastuzumab και ραπαμυκίκης [193], ενώ σε in vitro και in vivo μελέτες έχει αποδώσει ενθαρρυντικά αποτελέσματα η εφαρμογή ενός αναστολέα της Akt κινάσης (AKTi-1/2 naphthytidone) σε καρκινώματα μαστού με γονιδιακή ενίσχυση HER2 και/ή ενεργοποίηση του γονιδίου PIK3CA μέσω μεταλλάξεων [194]. Μια άλλη κατεύθυνση, είναι η συνδυασμένη εφαρμογή αναστολέων της οδού με αντιαγγειογενετικούς παράγοντες. Στα γλοιοβλαστώματα, σε στάδιο κλινικών δοκιμών βρίσκεται η εφαρμογή του αναστολέα της mtor RAD001, σε συνδυασμό με τον παράγοντα AEE788, αποκλειστή, τόσο του EGFR όσο και του υποδοχέα VEGFR2, ο οποίος συμμετέχει στην αγγειογένεση, διαδικασία πολύ σημαντική για την εξέλιξη των όγκων γλοίας [4]. εν έχουν καθοριστεί μέχρι στιγμής μοριακοί δείκτες προβλεπτικοί απάντησης στη θεραπεία με αναστολείς της οδού της PI3K, αν και έχουν προταθεί, μετά από μελέτες σε κυτταρικές σειρές, η απώλεια έκφρασης της ΡΤΕΝ και η ενεργοποίηση της Αkt. Στην ίδια μελέτη προτείνεται η αυξημένη έκφραση του γονιδίου CMYC ως δείκτης αντοχής στη ραπαμυκίνη [195]. Παρόλα αυτά, σε πρόσφατη μελέτη σε πειραματικά μοντέλα γλοιοβλαστωμάτων, αμφισβητείται ο προβλεπτικός ρόλος της απουσίας της φωσφατάσης PTEN ως προς την ανταπόκριση στο everolimus [196]. Τέλος, η παρουσία μεταλλάξεων του γονιδίου PIK3CA έχει συνδεθεί με αυξημένη ανταπόκριση σε θεραπεία με αναστολείς της PI3K κινάσης [187, 197]. 31

32 Οδός ενεργοποίησης της Src κινάσης, πρωτεΐνες Stat και στοχευμένη θεραπεία Σε πρόσφατες έρευνες το ενδιαφέρον έχει στραφεί σε μια εναλλακτική οδό ενεργοποίησης του EGFR και των άλλων υποδοχέων αυξητικών παραγόντων, μέσω της ενεργοποίησης της Src-κινάσης, η οποία με τη σειρά της ενεργοποιεί τις πρωτεϊνες Stat. Οι τελευταίες, μετά την ενεργοποίησή τους εισέρχονται στον πυρήνα, όπου λειτουργούν ως μεταγραφικοί παράγοντες, ελέγχοντας σημαντικές κυτταρικές λειτουργίες. Η παθολογική (αυξημένη ή μη ελεγχόμενη) ενεργοποίηση των πρωτεϊνών Stat και ειδικά των Stat3 και 5b, διαπιστώθηκε ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση, οδηγώντας στην μεταγραφή γονιδίων που επάγουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση [198, 199]. Η πρωτεΐνη Stat1 θεωρείται ότι έχει ογκοκατασταλτική δράση [200], ενώ έρευνες που αφορούσαν στο γονίδιο STAT5Α σε διάφορους τύπους νεοπλασμάτων κατέληξαν σε αντικρουόμενα συμπεράσματα [199, 201, 202]. H Src κινάση είναι μια κυτταροπλασματική πρωτεΐνη με δραστηριότητα κινάσης, η οποία υπερεκφράζεται σε αρκετά νεοπλάσματα, όπως στα καρκινώματα εντέρου, μαστού, παγκρέατος και πνεύμονα [203]. Η έκφραση και ενεργοποίηση της Src έχει βρεθεί να αυξάνει με την εξέλιξη της νόσου και θεωρείται δυσμενής προγνωστικός δείκτης [204]. Στα γλοιοβλαστώματα, μετά από μελέτες σε πειραματικά μοντέλα, η Src φάνηκε να αυξάνει τη διηθητική ικανότητα των όγκων [205]. Μικρομοριακοί αναστολείς της Src (dasatinib, AZD-0530, SKI-606), εφαρμόζονται σε πειραματικό στάδιο, αλλά και σε κλινικές μελέτες για ορισμένους τύπους νεοπλασμάτων [204]. Το dasatinib έχει δοκιμασθεί σε καρκινώματα από πλακώδες επιθήλιο κεφαλής/τραχήλου, καθώς και σε καρκινώματα προστάτη και παγκρέατος, ενώ οι παράγοντες AZD-0530 και SKI-606 έχουν δοκιμασθεί σε καρκινώματα μαστού και παχέος εντέρου αντίστοιχα [204]. Η εφαρμογή dasatinib στα γλοιώματα, βρίσκεται σε φάση κλινικών δοκιμών [206], ενώ σε πειραματικό στάδιο εφαρμόζεται με ποικίλους συνδυασμούς με άλλους παράγοντες, όπως τεμοζολομίδη και αντισώματα εναντίον του EGFR [206, 207]. Η ογκογόνος δραστηριότητα των STAT3 και STAT5B έχει διαπιστωθεί σε μεγάλο αριθμό όγκων (καρκινώματα μαστού, πνεύμονα, κεφαλής-τραχήλου), ενώ ο ρόλος του STAT5A φαίνεται να είναι πιο σύνθετος [199, 201, 202]. Γενικά θεωρείται ότι η δράση των πρωτεΐνών Stat διαφέρει στους διάφορους ιστούς και πολλοί από τους μηχανισμούς ενεργοποίησης αλλά και ελέγχου τους δεν είναι γνωστοί [208]. Όσον αφορά τα γλοιοβλαστώματα, αυτά φαίνεται να παρουσιάζουν συχνά ενεργοποίηση της Stat1 [209]. Σε πρόσφατη in vitro μελέτη αναφέρεται ενεργοποίηση της Stat3 σε ποσοστό 60% των υψηλού βαθμού κακοήθειας αστροκυτταρικών όγκων και η ενεργοποίηση αυτή σχετιζόταν με το βαθμό κακοήθειας. Στην ίδια μελέτη αναφέρεται ταυτόχρονη έκφραση του EGFR και της Stat3 σε ποσοστό 27.2% των υψηλόβαθμων αστροκυτταρικών όγκων. Στις περιπτώσεις αυτές προτείνεται η συνδυασμένη εφαρμογή gefitinib και ενός νέου αναστολέα της Stat3 (JSI-124). Ο αναστολέας αυτός, σε εφαρμογή σε κυτταρικές σειρές, φάνηκε να αυξάνει την ευαισθησία των νεοπλασματικών κυττάρων της γλοίας στην τεμοζολομίδη, τη νιτροζουρία και τη σισπλατίνη [210]. Γενικά η Stat3 αναμένεται να παίξει σημαντικό ρόλο στην στοχευμένη θεραπεία των γλοιοβλαστωμάτων, μια που η ανώμαλή της ενεργοποίηση θεωρείται αποτέλεσμα αυξημένων διεγερτικών μηνυμάτων και όχι σημειακών μεταλλάξεων. Για την κατεύθυνση αυτή, έχουν αναπτυχθεί φαρμακευτικοί αναστολείς της Stat3 (AG490, WP1066, cucurbitacin I) με ενθαρρυντικά αποτελέσματα σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος in vitro, βρίσκονται όμως ακόμα σε αρχικά στάδια εφαρμογής σε κλινικές μελέτες [211]. Όσον αφορά το ογκοκατασταλτικό γονίδιο STAT1, αυτό αναγνωρίστηκε πρόσφατα ως πιθανός δείκτης ευαισθησίας στη θεραπεία με erlotinib [130], ενώ αντίθετα η ενεργοποίηση της Stat5 έχει συνδεθεί με την ανθεκτικότητα στη χημειοθεραπεία με camptothecin [212]. 32

33 Αγγειογένεση στα γλοιώματα Παράγοντας VEGF Είναι σήμερα γνωστό ότι η αγγειογένεση είναι απαραίτητη προϋπόθεση για την ανάπτυξη και εξέλιξη των όγκων, καθώς και για τη μεταστατική τους δραστηριότητα. Μελέτες σε πειραματόζωα έχουν αποδείξει ότι η ανάπτυξη και επιβίωση των κυττάρων των κακοήθων γλοιωμάτων εξαρτώνται άμεσα από την αγγειογένεση [213]. Σε ιστολογικό επίπεδο, το αγγειακό δίκτυο στο γλοιοβλάστωμα είναι μορφολογικά και λειτουργικά μη-φυσιολογικό, οδηγώντας σε αγγειογενές οίδημα, αύξηση της υδροστατικής πίεσης στο διάμεσο χώρο και δυσκολία στην πρόσβαση οξυγόνου και φαρμάκων [214]. Η αγγειογένεση είναι μια πολύπλοκη διαδικασία, η οποία στους φυσιολογικούς ιστούς είναι το αποτέλεσμα συντονισμένης δράσης ενδογενών παραγόντων που προάγουν και αναστέλλουν την αγγειογένεση. Στον καρκίνο και ειδικά κατά την εξέλιξη των νεοπλασμάτων, υπάρχει απορρύθμιση της διαδικασίας με επικράτηση των αγγειογενετικών έναντι των ανασταλτικών παραγόντων [31]. Έχουν αναγνωριστεί πάνω από 30 ενδογενείς αγγειογενετικοί παράγοντες, μεταξύ των οποίων ο κυριότερος και περισσότερο μελετημένος είναι ο παράγοντας VEGF,ο οποίος κατέχει κεντρικό ρόλο στην ογκογένεση. O VEGF (ή VEGF-A), αποτελεί μέλος μιας ευρύτερης ομάδας παραγόντων (VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, PIGF) και συνδέεται με τους διαμεμβρανικούς υποδοχείς VEGFR1 & 2 με δραστηριότητα κινάσης. Είναι σήμερα αποδεκτό ότι κύριο ρόλο στην αγγειογενετική δράση του VEGF στους όγκους παίζει η ενεργοποίηση του υποδοχέα VEGFR2, ο οποίος εκφράζεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα και ενεργοποιεί με τη σειρά του διάφορες οδούς ενεργοποίησης, όπως την οδό της φωσφολιπάσης C, καθώς και τις οδούς των Src και PI3K κινασών [31, 215, 216]. O VEGF έχει βρεθεί να εκφράζεται στο 30-60% των περισσότερων συμπαγών όγκων και έως το 100% των νεφροκυτταρικών καρκινωμάτων, και έχει συνδεθεί αρνητικά με την πρόγνωση, με διαφορετικά αποτελέσματα ανάλογα με τη μελέτη [216]. Ενεργοποίηση της έκφρασης του VEGF από τα νεοπλασματικά κύτταρα σε μεταμεταγραφικό επίπεδο μπορεί να προκληθεί από ενεργοποίηση ογκογονιδίων, όπως τα Κ-RAS και EGFR, αλλά και από απώλεια δράσης ογκοκατασταλτικών γονιδίων, όπως τα TP53 και CDKN2A [217, 218]. Σε ανοσοϊστοχημικές μελέτες σε αστροκυτταρικούς και ολιγοδενδρογλοιακούς όγκους, η έκφραση του VEGF από τα νεοπλασματικά κύτταρα έχει συσχετιστεί με τον ιστολογικό βαθμό κακοήθειας, το βαθμό της αγγειοβρίθειας και την πρόγνωση [32, 219]. 33

34 Θεραπεία με αντι-αγγειογενετικούς παράγοντες Η θεραπεία με αντι-αγγειογενετικούς παράγοντες γνωρίζει τα τελευταία χρόνια μεγάλο ενδιαφέρον, με κυριότερο εκπρόσωπο το bevacizumab (Avastin), ένα μονοκλωνικό αντίσωμα που στρέφεται εναντίον του VEGF. Το bevacizumab εφαρμόζεται ως μονοθεραπεία σε μεταστατικά καρκινώματα του παχέος εντέρου, μη μικροκυτταρικά καρκινώματα πνεύμονα και μεταστατικά καρκινώματα μαστού, ενώ πρόσφατα έχει εγκριθεί η χρήση του στα γλοιοβλαστώματα, μετά από υποτροπή [220]. Εχει εφαρμοστεί επίσης σε κλινικές δοκιμές σε συνδυασμό με irinotecan, έναν αποκλειστή της TOPO-I, σε αναπλαστικά αστροκυτώματα μετά από υποτροπή [221]. Άλλοι αντι-αγγειογενετικοί παράγοντες που εφαρμόζονται σε πειραματικό και κλινικό επίπεδο για τη θεραπεία των όγκων γλοίας είναι μικρομοριακοί αναστολείς των υποδοχέων της οικογένειας VEFGR [222] αλλά και των υποδοχέων PDGFR [223, 224], μια που ενίσχυση του γονιδίου PDFGRA έχει παρατηρηθεί στο 13% των γλοιοβλαστωμάτων [30], ενώ σε μελέτη που περιλάμβανε όγκους γλοίας όλων των βαθμών κακοήθειας, πρωτεϊνική έκφραση του παράγοντα PDGF παρατηρήθηκε στο 81,2% των όγκων, ο βαθμός της οποίας σχετιζόταν με το βαθμό κακοήθειας [225]. Αν και τα αποτελέσματα από τη χρήση του bevacizumab είναι ενθαρρυντικά, οι επιπτώσεις όσον αφορά την γενική επιβίωση και την περαιτέρω υποτροπή των όγκων είναι απογοητευτικές. Αυτό έχει αποδοθεί στην ανάπτυξη ανθεκτικότητας στη θεραπεία, στην αύξηση της διηθητικής ικανότητας των όγκων, στην τοξικότητα του φαρμάκου σε μεγάλες δόσεις και στην απουσία προς το παρόν προβλεπτικών δεικτών απάντησης στη θεραπεία. Για τους λόγους αυτούς, η ανάγκη για προσεκτική επιλογή των ασθενών που θα απαντήσουν στη θεραπεία με Avastin με τη λιγότερη δυνατή δοσολογία είναι επιτακτική. Προτεινόμενοι προβλεπτικοί δείκτες είναι τα επίπεδα του VEGF στο περιφερικό αίμα και στους όγκους, καθώς και ο VEGFR1 [216]. Παρόμοια προβλήματα εμφανίζει και η εφαρμογή άλλων αντι-αγγειογενετικών παραγόντων, λόγω της απουσίας προς το παρόν προβλεπτικών δεικτών, αλλά και της αδυναμίας των κλασικών απεικονιστικών μεθόδων να καταδείξουν με ασφάλεια τις μεταβολές του διηθητικού στοιχείου των όγκων [226]. Θεωρείται επίσης ότι η αναστολή της αγγειογένεσης μπορεί να συμβάλει στην ελάττωση της αποτελεσματικότητας άλλων φαρμάκων, επιδρώντας στον αιματο-εγκεφαλικό φραγμό, γεγονός που θα πρέπει να ληφθεί υπόψη κατά τη συνδυασμένη θεραπεία με άλλους παράγοντες [227]. 34

35 Ρόλος μηχανισμών επιδιόρθωσης στα γλοιώματα - Ανθεκτικότητα σε θεραπεία με αλκυλιωτικούς παράγοντες Γονίδια MGMT και ΤP53 Το γονίδιο MGMT (O 6 -methylguanine DNA methyltransferase),το οποίο βρίσκεται στην περιοχή 10q26, κωδικοποιεί ένα βασικό ένζυμο επιδιόρθωσης του DNA, το οποίο απομακρύνει αλκυλομάδες από την θέση Ο 6 της γουανίνης και μ αυτό τον τρόπο προφυλάσσει το DNA από αλκυλιωτικές βλάβες. Σε απώλεια λειτουργίας του ενζύμου, οι αλκυλιωμένες θέσεις στο DNA, και ιδίως η Ο 6 -μεθυλογουανίνη, δεν επιδιορθώνονται και η παρουσία τους ενεργοποιεί την απόπτωση, με τελικό αποτέλεσμα την κυτταροτοξικότητα [228]. Η αλκυλίωση του DNA και ιδίως η δημιουργία πολλαπλών θέσεων Ο 6 -μεθυλογουανίνης αποτελούν έναν από τους κύριους μηχανισμούς κυτταροτοξικότητας των αλκυλιωτικών χημειοθεραπευτικών φαρμάκων [229, 230], όπου ο βαθμός και η διάρκεια της φαρμακευτικής επίδρασης εξαρτώνται μεταξύ άλλων και από την ακεραιότητα της p53 [ ], καθώς και από τη δυνατότητα αναστολής του κυτταρικού κύκλου μέσω p21 CIP1/WAF1 [234]. Με βάση όλα τα παραπάνω, θεωρήθηκε αναμενόμενο και έχει αποδειχθεί πολλαπλές φορές σε πειραματικό επίπεδο σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος [229, 230, 235], καθώς επίσης μελανώματος [236] και παγκρέατος [237], ότι η έκφραση και λειτουργικότητα της πρωτεΐνης MGMT στην πραγματικότητα εμποδίζουν, ενώ η απουσία έκφρασης διευκολύνει την κυτταροτοξική δράση αλκυλιωτικών φαρμάκων. Με βάση τα πιο πάνω ευρήματα, ακολούθησε πλήθος κλινικών μελετών σε όγκους γλοίας, όπου αξιολογήθηκαν με διάφορες μεθόδους, τόσο η απενεργοποίηση του γονιδίου με μεθυλίωση του επαγωγέα του, όσο και η γονιδιακή έκφραση. Παρά τη δυσαρμονία μεταξύ των αποτελεσμάτων και παρά τη δημοσίευση περιορισμένου αριθμού εργασιών όπου υποστηρίζεται το αντίθετο [238], οι περισσότερες μελέτες κατέληξαν ότι τόσο η μεθυλίωση του επαγωγέα του γονιδίου MGMT όσο και η ελαττωμένη έκφραση σε επίπεδο mrna και πρωτεΐνης, αποτελούν θετικό προβλεπτικό δείκτη απάντησης στην ακτινοθεραπεία και τη χημειοθεραπεία με αλκυλιωτικά φάρμακα, κυρίως τεμοζολομίδη [93, 235, ]. Η τεμοζολομίδη ως χημική ουσία ανήκει στις ιμιδαζοτετραζίνες [242, 243] και χρησιμοποιείται σήμερα ευρέως σε συνδυασμό με ακτινοθεραπεία [241, 244, 245] ή ως μονοθεραπεία για την αντιμετώπιση των γλοιωμάτων υψηλού βαθμού κακοήθειας μετά τη χειρουργική εκτομή [246]. Ο προβλεπτικός ρόλος της μεθυλίωσης του γονιδίου, όσον αφορά την ανταπόκριση στη θεραπεία με τεμοζολομίδη, δε φάνηκε να έχει την ίδια αξία για τα γλοιοβλαστώματα μετά από υποτροπή, ενώ το αντίθετο υποστηρίχθηκε για τους αντίστοιχους αστροκυτταρικούς και ολιγοδενδρογλοιακούς όγκους ιστολογικού βαθμού κακοήθειας ΙΙΙ [247]. Οι αναφερόμενες συχνότητες παρουσίας της μεθυλίωσης του επαγωγέα του γονιδίου για τα γλοιοβλαστώματα, τα αναπλαστικά αστροκυτώματα και τα αναπλαστικά ολιγοδεδρογλοιώματα είναι 75%, 12-39% και έως 88%, αντίστοιχα [71, 235, 248]. Ο προγνωστικός ρόλος της μεθυλίωσης του επαγωγέα και της ελαττωμένης έκφρασης του γονιδίου MGMT ανεξάρτητα από τη λήψη ακτινοθεραπείας και χημειοθεραπείας, δεν έχει ακόμα ξεκαθαριστεί. Μελέτες σε γλοιοβλαστώματα με εφαρμογή μόνο χειρουργικής εκτομής, η μεθυλίωση του επαγωγέα θεωρήθηκε ως ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης για μεγαλύτερη επιβίωση [235]. Σε άλλες μελέτες δεν αναφέρεται συσχέτιση [238], ενώ έχει υποστηριχθεί και η πιθανότητα η γενετική αυτή μεταβολή να χαρακτηρίζει όγκους με πιο επιθετική συμπεριφορά [249]. Όσον αφορά τα χαμηλού βαθμού κακοήθειας γλοιώματα, η μεθυλίωση του επαγωγέα του MGMT φαίνεται να είναι συχνότερη, αφού έχει παρατηρηθεί σε ποσοστά που κυμαίνονται από 60 έως και 90% [71, 250], ενώ θεωρήθηκε ως ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης επιθετικότερης συμπεριφοράς για τους όγκους αυτούς [251]. Αντίθετα, σε εφαρμογή θεραπείας με τεμοζολομίδη σε χαμηλού βαθμού κακοήθειας γλοιώματα, μεγαλύτερο διάστημα ελεύθερο νόσου σημειώθηκε στις περιπτώσεις με μεθυλίωση του επαγωγέα του γονιδίου [250]. 35

36 Παρά το γεγονός ότι η μεθυλίωση του επαγωγέα του γονιδίου MGMT ήταν ο πρώτος και περισσότερο μελετημένος προβλεπτικός δείκτης απάντησης στη θεραπεία και παρά τη γενική ομοφωνία των ερευνητών ως προς τον προβλεπτικό του ρόλο σε σχέση με την ανταπόκριση στη θεραπεία με τεμοζολομίδη, η εξέταση της μεθυλίωσης του επαγωγέα του MGMT δεν έτυχε ευρείας εφαρμογής στην κλινική πράξη, κυρίως λόγω αδυναμίας καθορισμού της καταλληλότερης μεθόδου ανίχνευσης της απενεργοποίησης του γονιδίου [93]. Επίσης, ενώ η επιβίωση φαίνεται να είναι μεγαλύτερη για τους όγκους με μεθυλίωση του επαγωγέα του γονιδίου, η υποτροπή είναι αναπόφευκτη, με τελική ανάπτυξη ανθεκτικότητας, οι ακριβείς μηχανισμοί της οποίας δεν είναι γνωστοί [252]. Μια από τις προσπάθειες αντιμετώπισης της ανθεκτικότητας στην τεμοζολομίδη είναι η εφαρμογή αναστολέων του MGMT, ο έλεγχος των οποίων σε συνδυασμό με άλλα χημειοθεραπευτικά φάρμακα βρίσκεται σε στάδιο κλινικών δοκιμών [ ]. Από την άλλη, η χρησιμοποίηση ενός μόνο προβλεπτικού δείκτη θα ήταν υπεραπλουστευτική προσέγγιση. Αντίθετα, η μεθυλίωση του επαγωγέα του γονιδίου MGMT θεωρήθηκε μέρος ενός σύνθετου μοριακού προφίλ που χαρακτηρίζει όγκους με λιγότερο επιθετική συμπεριφορά [256]. Η συχνότερη μεθυλίωση του επαγωγέα του γονιδίου σε ολιγοδενδρογλοιώματα με ταυτόχρονη απώλεια των 1p και 19q έχει επιβεβαιωθεί από σειρά μελετών [71]. Από την άλλη, σε μελέτη σε 46 ολιγοδενδρογλοιώματα ιστολογικού βαθμού κακοήθειας ΙΙ και ΙΙΙ, συχνότερη μεθυλίωση παρατηρήθηκε στους όγκους με διατήρηση του 1p [257]. Η απώλεια του 1p σε συνδυασμό με την απενεργοποίηση του MGMT στα υψηλού βαθμού κακοήθειας γλοιώματα θεωρήθηκαν συνεργικοί προβλεπτικοί δείκτες για καλύτερη ανταπόκριση στην τεμοζολομίδη [258]. Επίσης, η μεθυλίωση του γονιδίου MGMT βρέθηκε να είναι συχνότερη στα δευτεροπαθή γλοιοβλαστώματα με μεταλλάξεις του γονιδίου TP53, καθώς και με απώλειες στα 10p και 19q [256]. Η συνύπαρξη των μεταβολών των γονιδίων TP53 και MGMT έχει επιβεβαιωθεί και από άλλες μελέτες [248, 259], ενώ τελευταία αμφισβητήθηκε, αφού μεθυλίωση του επαγωγέα του MGMT παρατηρήθηκε σε μεγάλο αριθμό, τόσο πρωτοπαθών γλοιοβλαστωμάτων, όσο και όγκων χωρίς μεταλλάξεις του TP53 [249]. Ο προγνωστικός ρόλος των μεταλλάξεων στο ογκοκατασταλτικό γονίδιο TP53 στους όγκους γλοίας δεν έχει καθοριστεί με σαφήνεια. Στα γλοιοβλαστώματα, η παρουσία μεταλλάξεων στο TP53 έχει θεωρηθεί δείκτης καλύτερης πρόγνωσης [260]. Από την άλλη, τόσο οι μεταλλάξεις του γονιδίου όσο και η ανοσοϊστοχημική θετικότητα για την πρωτεΐνη p53, θεωρήθηκαν ως δείκτες επιθετικότερης συμπεριφοράς για τα χαμηλού βαθμού κακοήθειας γλοιώματα [261]. Επίσης, η παρουσία μεταλλάξεων του γονιδίου TP53 σε όγκους με μεθυλίωση του MGMT θεωρήθηκε ως ένας από τους μηχανισμούς ανάπτυξης ανθεκτικότητας στην τεμοζολομίδη [262]. Αντίθετα, οι όγκοι με μεταλλάξεις του TP53 φάνηκε να ανταποκρίνονται καλύτερα σε εναλλακτικές χημειοθεραπευτικές προσεγγίσεις [χλωροαιθυλιωτικοί παράγοντες] [263]. 36

37 Γονίδια επιδιόρθωσης MMR Τα γονίδια MMR συμμετέχουν στην επιδιόρθωση σημειακών μεταβολών της αλληλουχίας ζευγών βάσεων που προκύπτουν κατά την αντιγραφή του DNA [255]. Η απενεργοποίηση των γονιδίων αυτών οδηγεί στη συσσώρευση μεταλλάξεων κυρίως σε επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες (μικροδορυφόροι), οδηγώντας σε μικροδορυφορική αστάθεια (Μ Α). Η Μ Α που προκύπτει από απενεργοποίηση των γονιδίων επιδιόρθωσης παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη των νεοπλασμάτων. Περιγράφηκε αρχικά σε καρκινώματα παχέος εντέρου (σύνδρομο Lynch, κληρονομικός καρκίνος παχέος εντέρου μη-σχετιζόμενος με πολυποδίαση) και στη συνέχεια παρατηρήθηκε σε ποικίλο βαθμό και σε άλλα νεοπλάσματα, όπως καρκινώματα στομάχου ή ωοθηκών, ενώ θεωρήθηκε δείκτης καλύτερης πρόγνωσης [264]. Στους όγκους εγκεφάλου, ο βαθμός συμμετοχής και ο ρόλος της Μ Α δεν έχει ξεκαθαριστεί. Ενώ σε μελέτες σε μυελοβλαστώματα, παρατηρήθηκε μεθυλίωση του γονιδίου MSH6 σε ποσοστό 75% [265], ανοσοϊστοχημικές μελέτες σε γλοιοβλαστώματα έδειξαν απουσία έκφρασης των γονιδίων MSH2 και MSH6 σε πολύ περιοριμένο αριθμό γλοιοβλαστωμάτων [266, 267]. Παρόλα αυτά, μεθυλίωση του γονιδίου MLH1 παρατηρήθηκε σε χαμηλού βαθμού κακοήθειας γλοιώματα μετά από υποτροπή και προτάθηκε ως δείκτης επιθετικής συμπεριφοράς [268]. Εκτός από τη λειτουργία τους στην επιδιόρθωση λαθών κατά την αντιγραφή, τα γονίδια MMR κατά την επίδραση χημειοθεραπευτικών φαρμάκων ενεργοποιούν μεταξύ άλλων τους αποπτωτικούς μηχανισμούς αυξάνοντας την κυτταροτοξικότητα. Στα γλοιοβλαστώματα, σε in-vivo μελέτες, καθώς και σε κλινικές μελέτες που ακολούθησαν, οι μεταλλάξεις του γονιδίου MSH6 ενοχοποιήθηκαν για την ανάπτυξη ανθεκτικότητας στη θεραπεία με τεμοζολομίδη [30, 269, 270], ενώ από άλλους, ο ρόλος της ανεπάρκειας των γονιδίων MMR στην ανθεκτικότητα των υψηλού βαθμού κακοήθειας γλοιωμάτων στη θεραπεία αμφισβητήθηκε [271]. 37

38 Χρωμοσωμική απώλεια 1p/19q στους όγκους γλοίας Η συνδυασμένη απώλεια των χρωμοσωμικών περιοχών 1p και 19q παρατηρήθηκε αρχικά σε ολιγοδενδρογλοιώματα [272], ενώ στη συνέχεια θεωρήθηκε προβλεπτικός δείκτης ανταπόκρισης στη χημειοθεραπεία, για τα αναπλαστικά ολιγοδενδρογλοιώματα [273]. Σε μελέτες που ακολούθησαν, η μεταβολή αυτή παρατηρήθηκε στην πλειοψηφία των ολιγοδενδρογλοιακών όγκων (50-80%), θεωρήθηκε ως ανεξάρτητος θετικός προγνωστικός δείκτης, ενώ επιβεβαιώθηκε η καλύτερη ανταπόκριση των ασθενών αυτών στην ακτινοθεραπεία και τη χημειοθεραπεία [257, 274]. Η συνδυασμένη απώλεια 1p/19q προκύπτει από μια ασταθή μετάθεση t(1;19)(q10;p10) που έχει ως αποτέλεσμα την απώλεια ολόκληρου του βραχέος σκέλους του χρωμοσώματος 1 [62]. Σε μελέτες σε αστροκυτταρικούς και μικτούς ολιγοδενδρογλοιακούς όγκους ιστολογικού βαθμού κακοήθειας ΙΙ και ΙΙΙ, η μεταβολή αυτή παρατηρήθηκε σε ποσοστά 20-50% [85, 162, 275] και συσχετίστηκε με καλύτερη πρόγνωση [85], καθώς και με καλύτερη ανταπόκριση στη θεραπεία με τεμοζολομίδη, ειδικά όταν συνδυάζεται με μεθυλίωση του γονιδίου MGMT [258]. Συχνότερη μεθυλίωση του γονιδίου MGMT παρατηρήθηκε και σε ολιγοδενδρογλοιακούς όγκους με απώλεια 1p/19q [71]. Στα γλοιοβλαστώματα η ταυτόχρονη απώλεια των 1p και 19q είναι πολύ σπάνια [276], ενώ συχνότερη είναι η μεμονωμένη απώλεια του 19q [256] και του τελομερικού άκρου του 1p [162]. Παρά το γεγονός ότι ο έλεγχος της συνδυασμένης απώλειας 1p/19q εφαρμόζεται ευρέως στους όγκους γλοίας ως προβλεπτικός δείκτης, οι μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στη συσχέτιση της απώλειας 1p/19q με την καλύτερη κλινική πορεία των ασθενών και την καλύτερη ανταπόκριση στη θεραπεία δεν έχουν διαλευκανθεί. Η ανταπόκριση στη χημειοθεραπεία μπορεί εν μέρει να εξηγηθεί από τη συχνότερη μεθυλίωση και ελαττωμένη mrna έκφραση του γονιδίου MGMT [71, 258, 275], ενώ μελέτες πολυγονιδιακής έκφρασης έδειξαν ότι τα γλοιώματα με απώλεια 1p/19q χαρακτηρίζονται από μοριακό προφίλ εν μέρει νευρωνικού τύπου, το οποίο σχετίζεται με καλύτερη πρόγνωση [64]. Παρόλα αυτά, δεν έχουν καθοριστεί συγκεκριμένα γονίδια που συμμετέχουν στη χαρακτηριστική μετάθεση, αν και έχουν προταθεί αρκετά [ ]. Το γονίδιο NOTCH2, που βρίσκεται κεντρομερικά στο 1p, αν και προτάθηκε αρχικά ως πιθανό ογκοκατασταλτικό γονίδιο [282], στη συνέχεια αναιρέθηκε τόσο ως προς τον ογκοκατασταλτικό του ρόλο όσο και ως προς τη συμμετοχή του στη μετάθεση [283]. 38

39 ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 39

40 40

41 ΣΥΛΛΟΓΗ ΥΛΙΚΟΥ Στη μελέτη περιλαμβάνονται 191 προηγουμένως διαγνωσμένοι πρωτοπαθείς όγκοι γλοίας (189 υλικά εκτομής και 2 υλικά στερεοτακτικής βιοψίας) από 187 ενήλικες ασθενείς, 99 άνδρες και 88 γυναίκες, ηλικίας από 19 έως 78 ετών (μέση ηλικία 54,13 ετών). Σε όλους τους ασθενείς υπήρχε υλικό που εξαιρέθηκε κατά την πρώτη διάγνωση, ενώ σε 4 ασθενείς εξετάστηκαν 2 όγκοι από εκτομή σε δύο διαφορετικούς χρόνους, μετά από υποτροπή. Οι ιστοί που εξετάστηκαν ήταν μονιμοποιημένoι σε φορμόλη και εγκλεισμένοι σε κύβους παραφίνης. Η συλλογή του υλικού έγινε κυρίως από το αρχείο του εργαστηρίου Γενικής Παθολογίας και Παθολογικής Ανατομικής του ΑΠΘ (ΕΓΠΠΑ, περίοδος ) και από την Ελληνική Συνεργαζόμενη Ογκολογική Ομάδα (HeCOG), ενώ πραγματοποιήθηκε επιπλέον προοπτική συλλογή υλικών του εργαστηρίου Γενικής Παθολογίας και Παθολογικής Ανατομικής του ΑΠΘ, που αποστάληκαν κατά την περίοδο , για σκοπούς μοριακής διαγνωστικής. Σε όλα τα περιστατικά, καταγράφηκαν οι κλινικοπαθολογοανατομικές πληροφορίες των ιστολογικών εκθέσεων και εκτιμήθηκαν οι υπάρχουσες ανοσοϊστοχημικές χρώσεις (Κi- 67, GFAP). Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε εκτίμηση των τομών αιματοξυλίνηςηωσίνης, αξιολόγηση του ιστολογικού βαθμού κακοήθειας (ΙΒΚ) και του τύπου του νεοπλάσματος στο διαθέσιμο υλικό [ΕΙΚΟΝΕΣ 1,2], ενώ αξιολογήθηκαν τα επιμέρους ιστολογικά χαρακτηριστικά των όγκων (νεκρώσεις, αιμορραγία, μικροαγγειακή υπερπλασία). Τα γενικά κλινικά και ιστολογικά χαρακτηριστικά των όγκων περιγράφονται στον ΠΙΝΑΚΑ 1. Ως δευτεροπαθή θεωρήθηκαν τα γλοιοβλαστώματα (ΙΒΚ IV) για τα οποία υπήρχε πληροφορία από το ιστορικό ότι προήλθαν από εξέλιξη χαμηλότερου βαθμού κακοήθειας όγκο γλοίας, καθώς και αυτά στα οποία υπήρχαν, σε ιστολογικό επίπεδο, περιοχές σαφώς χαμηλότερου βαθμού κακοήθειας όγκου. Κλινικές πληροφορίες σχετικά με την μετέπειτα πορεία των ασθενών (follow up) συγκεντρώθηκαν από 67/187 ασθενείς, 59 από το υλικό που χορηγήθηκε από την HeCOG και 8 από το προοπτικό υλικό του ΕΓΠΠΑ. Πληροφορίες υπήρχαν για την επιβίωση των ασθενών (χρόνος επιβίωσης) και για το διάστημα ελεύθερο επιδείνωσης της νόσου (ΠΙΝΑΚΑΣ 2). 41

42 42

43 43

44 A B IBKII IBKII Γ IBKIIΙ IBKIV ΕΙΚΟΝΑ 1: Α: ιάχυτο ινιδώδες αστροκύτωμα, Β: Γεμιστοκυτταρικό αστροκύτωμα, Γ: Αναπλαστικό ολιγοδενδρογλοίωμα, : Γλοιοβλάστωμα με γιγαντοκυτταρικούς χαρακτήρες IBK: Ιστολογικός βαθμός κακοήθειας IBKII IBKIII Μ : 2% Μ : 15-20% IBKIV IBKIV Μ : 10% Μ : 70% EIKONA 2: Ανοσοϊστοχημική χρώση για Ki67. Οι υψηλού βαθμού κακοήθειας όγκοι εμφάνισαν μεγάλη διακύμανση στον μιτωτικό δείκτη. ΙΒΚ: Ιστολογικός βαθμός κακοήθειας, Μ : Μιτωτικός δείκτης 44

45 ΣΤΑ ΙΑ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑΣ ΤΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΤΩΝ ΚΥΒΩΝ ΠΑΡΑΦΙΝΗΣ Η σειρά επεξεργασίας του υλικού των κύβων παραφίνης σε σχέση με την πηγή προέλευσης του υλικού, τον αριθμό των όγκων και την αποτελεσματικότητα των εφαρμοζόμενων μεθόδων, περιγράφεται σχηματικά στις ΕΙΚΟΝΕΣ 3, 4 και 5. Γενικά, τόσο για την κατασκευή των μικροσυστοιχιών, όσο και για την εκχύλιση των δειγμάτων DNA και RNA, χρησιμοποιήθηκαν οι περιοχές του διαθέσιμου υλικού των όγκων με τον υψηλότερο ιστολογικό βαθμό κακοήθειας. Στην ΕΙΚΟΝΑ 6 αναφέρονται σχηματικά τα δείγματα μη-νεοπλασματικής εγκεφαλικής ουσίας ( ΜΝΕ) που χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες στις μεθόδους και στην ΕΙΚΟΝΑ 7 αναφέρονται οι επιπλέον περιοχές χαμηλότερου ιστολογικού βαθμού κακοήθειας που εξετάστηκαν, στις περιπτώσεις των δευτεροπαθών γλοιοβλαστωμάτων. Ανάμεσα στο υλικό που παραλήφθηκε από την HeCOG (EIKONA 4), περιλαμβάνονταν 5 κοινές περιπτώσεις με το υλικό του ΕΓΠΠΑ. Το υλικό των περιπτώσεων αυτών, αφορούσε υλικό της ίδιας εκτομής, αλλά από διαφορετική περιοχή του όγκου, έτσι επαναλήφθηκε η διαδικασία επεξεργασίας, για αξιολόγηση της ετερογένειας των όγκων. ΕΙΚΟΝEΣ 3, 4, 5: Στάδια επεξεργασίας του υλικού ανάλογα με την προέλευσή του ΕΙΚΟΝΑ 3 AΡΧΕΙΑΚΟ ΥΛΙΚΟ ΕΓΠΠΑ 98 όγκοι κατασκευή 8 TMA (60 IBK ΙV, 18 IBK ΙΙΙ, 20 IBK ΙΙ) Εφαρμογή ΑΙΧ (ΤΜΑ) 97 όγκοι (59 IBK ΙV, 18 IBK ΙΙΙ, 20 IBK ΙΙ) (100%) Εκχύλιση DNA (ΤΜΑ) 81/97 όγκοι (48 IBK ΙV+14 IBK III+19 IBK II) (83.5%) Εκχύλιση RNA (ΤΜΑ) 75/97 όγκοι (49 IBK ΙV+13 IBK III+13 IBK II) (77.3%) Αποτελέσματα ΑΙΧ 97/97 όγκοι (100%) Απώλεια: 0% 1,2,3: ιαδοχικά στάδια επεξεργασίας του υλικού ΕΓΠΠΑ: Εργαστήριο Γενικής Παθολογίας/Παθολογικής Ανατομικής ΤΜΑ: Ιστικές μικροσυστοιχίες IBK: Ιστολογικός βαθμός κακοήθειας ΑΙΧ: Ανοσοϊστοχημεία Aποτελέσματα από εφαρμογές σε DNA (MLPA, RTQ-PCR) 64/97 όγκοι (35 IBK ΙV+14 IBK III+15 IBK II) (66%) Απώλεια: 34% Aποτελέσματα από εφαρμογές σε RNA (RTQ-PCR) 73/97 όγκοι (49 IBK ΙV+12 IBK III+12 IBK II) (75.3%) Απώλεια: 24.7% 45

46 ΕΙΚΟΝΑ 4 ΥΛΙΚΟ HeCOG 70 όγκοι (67 ΙΒΚ ΙV, 2 ΙΒΚ ΙΙΙ, 1 ΙΒΚ ΙΙ) Εκχύλιση DNA (WS) 63 όγκοι (60 ΙΒΚ ΙV+2 ΙΒΚ III+1 ΙΒΚ II) (100%) Εκχύλιση RNA (WS) 63 όγκοι (60 ΙΒΚ ΙV+2 ΙΒΚ III+1 ΙΒΚ II) (100%) Κατασκευή ΤΜΑ 49/63 όγκοι (3 TMA) (46 ΙΒΚ ΙV+2 ΙΒΚ III+1 ΙΒΚ II) (77.8%) Aποτελέσματα από εφαρμογές σε DNA (MLPA, RTQ-PCR) 47/63 όγκοι (46 ΙΒΚ ΙV+1ΙΒΚ III) (74.6%) Απώλεια: 25.4% Aποτελέσματα από εφαρμογές σε RNA (RTQ-PCR) 57/63 όγκοι (55 ΙΒΚ ΙV+1ΙΒΚ III+1ΙΒΚ II) (90.5%) Απώλεια: 9.5% Αποτελέσματα ΑΙΧ 48/63 όγκοι (46 ΙΒΚ ΙV+1 ΙΒΚ III+1 ΙΒΚ II) (76.2%) Απώλεια: 23.8% 1,2,3: ιαδοχικά στάδια επεξεργασίας του υλικού HeCOG: Ελληνική Συνεργαζόμενη Ογκολογική Ομάδα WS: Ολόκληρες τομές ΤΜΑ: Ιστικές μικροσυστοιχίες ΑΙΧ: Ανοσοϊστοχημεία ΙΒΚ: Ιστολογικός βαθμός κακοήθειας ΕΙΚΟΝΑ 5 ΠΡΟΟΠΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΕΓΠΠΑ 36 όγκοι Εφαρμογή ΑΙΧ (WS) MGMT& PTEN Εκχύλιση DNA (WS) ΕφαρμογήRTQ-PCR για ενίσχυση γονιδίου EGFR Εκχύλιση RNA (WS) RTQ-PCR για γονιδιακή έκφραση EGFR/ EGFRvIII 9 όγκοι επιστροφή ΚΠ Εφαρμογή ΑΙΧ (TMA & WS) 25/27 όγκοι (18 ΙΒΚ ΙV+6 ΙΒΚ III+1 ΙΒΚ II) (92.6%) 27 όγκοι 9 όγκοι κατασκευή 1 ΤΜΑ 18 όγκοι (WS) Εκχύλιση DNA (ΤΜΑ & WS) 26/27 όγκοι (19 ΙΒΚ ΙV+6 ΙΒΚ III+1ΙΒΚ II) (96.3%) ΕΓΠΠΑ: Εργαστήριο Γενικής Παθολογίας/Παθολογικής Ανατομικής WS: Ολόκληρες τομές ΤΜΑ: Ιστικές μικροσυστοιχίες ΑΙΧ: Ανοσοϊστοχημεία ΙΒΚ: Ιστολογικός βαθμός κακοήθειας Εκχύλιση RNA (ΤΜΑ & WS) 26/27 όγκοι (19 ΙΒΚ ΙV+6 ΙΒΚ III+1ΙΒΚ II) (96.3%) Αποτελέσματα ΑΙΧ 25/27 όγκοι (18 ΙΒΚ ΙV+6 ΙΒΚ III+1ΙΒΚ II) (92.6%) Απώλεια: 7.4% Aποτελέσματα από εφαρμογές σε DNA (MLPA, RTQ-PCR) 21/27 όγκοι (14 ΙΒΚ ΙV+6 ΙΒΚ III+1ΙΒΚ II) (77.8%) Απώλεια: 22.2% Aποτελέσματα από εφαρμογές σε RNA (RTQ-PCR) 24/27 όγκοι (17 ΙΒΚ ΙV+6 ΙΒΚ III+1ΙΒΚ II) (88.9%) Απώλεια: 11.1% 46

47 ΕΙΚΟΝΑ 6: Μη νεοπλασματικά δείγματα εγκεφάλου ( ΜΝΕ-μάρτυρες) Μάρτυρες ΑΙΧ 26 δείγματα Μάρτυρες DNA 8 δείγματα Μάρτυρες RNA 9 δείγματα 17 περιπτώσεις από περιοχές παρακείμενες των όγκων (ΤΜΑ, από 1-2 cores*) + 6 περιπτώσεις από περιοχές παρακείμενες των όγκων (WS) + 3 περιπτώσεις, από περιστατικά μη νεοπλασματικών παθήσεων 1 (ΤΜΑ, από 2 cores*) 2 περιπτώσεις 3 περιπτώσεις από περιοχές παρακείμενες από περιοχές παρακείμενες των όγκων των όγκων (εκχύλιση από ΤΜΑ) (εκχύλιση από ΤΜΑ) περιπτώσεις 5 περιπτώσεις από περιοχές παρακείμενες από περιοχές παρακείμενες των όγκων των όγκων (εκχύλιση από WS) (εκχύλιση από WS) περιπτώσεις 3 περιπτώσεις από περιστατικά μη από περιστατικά μη νεοπλασματικών παθήσεων 1 νεοπλασματικών παθήσεων 1 (εκχύλιση από ΤΜΑ, (εκχύλιση από ΤΜΑ, συγχώνευση σε 1 δείγμα) συγχώνευση σε 1 δείγμα) *: Τα cores των φυσιολογικών δειγμάτων στα TMA των όγκων, για καλύτερη αξιολόγηση των αποτελεσμάτων της ΑΙΧ 1: 2 περιπτώσεις εκτομής κροταφικού λοβού, 1 περίπτωση αγγειοδυσπλασίας, WS: Ολόκληρες τομές, ΤΜΑ: Ιστικές μικροσυστοιχίες, cores: Μικροϊστοτεμάχια, ΑΙΧ: Ανοσοϊστοχημεία ΕΙΚΟΝΑ 7: Πρόσθετη εξέταση χαμηλότερου βαθμού κακοηθείας περιοχών σε δευτεροπαθή γλοιοβλαστώματα Εφαρμογή ΑΙΧ Εφαρμογή μεθόδων σε DNA και RNA 2 όγκοι με αποτελέσματα ΑΙΧ για δύο περιοχές 5 όγκοι από 2 δείγματα DNA/RNA* 1 σε ΤΜΑ (1 core ΙΒΚ ΙΙ, 2 cores ΙΒΚ ΙV) εκτός ΤΜΑ, όπου εφαρμόστηκε ΑΙΧ σε ολόκληρη τομή. Αποτελέσματα για δύο περιοχές, ΙΒΚ ΙΙΙ & ΙV αντίστοιχα Σε έναν όγκο εκχύλιση DNA/RNA από ΤΜΑ, 2 δειγμάτων ΙΒΚ ΙΙ & IV αντίστοιχα Σε 4 όγκους εκχύλιση DNA/RNA από WS, 2 δειγμάτων για κάθε έναν, (σε 2 όγκους δείγματα ΙΒΚ ΙΙ & ΙV και στους υπόλοιπους δείγματα ΙΒΚ II & III, III & IV αντίστοιχα *: Αποτελέσματα από DNA για 3 όγκους, αποτελέσματα από RNA για 5 όγκους ΑΙΧ: ανοσοϊστοχημεία, ΤΜΑ: ιστικές μικροσυστοιχίες, core: μικροϊστοτεμάχιο, ΙΒΚ: Ιστολογικός βαθμός κακοήθειας 47

48 ΚΑΤΑΣΚΕΥΗ ΙΣΤΙΚΩΝ ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΟΙΧΙΩΝ (TISSUE MICROARRAYS, TMA) Μετά από εκτίμηση των τομών αιματοξυλίνης-ηωσίνης, επιλέχθηκαν οι κύβοι παραφίνης με υλικό κατάλληλο για την κατασκευή μικροσυστοιχιών (επάρκεια καλής ποιότητας υλικού χωρίς νέκρωση, καλή μορφολογία κυττάρων) και σημειώθηκαν οι εστίες που χρησιμοποιήθηκαν στις ιστικές μικροσυστοιχίες. Με τη μέθοδο των μικροσυστοιχιών (διάμετρος μικροϊστοτεμαχίων: 1,5χιλ, Beecher Instruments, Sun Prairie, WI) κατασκευάστηκαν συνολικά 11 κύβοι παραφίνης από 180 όγκους προερχόμενους από 176 ασθενείς. Από κάθε περίπτωση χρησιμοποιήθηκαν 2-3 μικροϊστοτεμάχια από τον όγκο, ενώ για τις 5 κοινές περιπτώσεις που αναφέρονται παραπάνω, όπως και για ένα αναπλαστικό αστροκύτωμα, χρησιμοποιήθηκαν τελικά 4-6 μικροϊστοτεμάχια από διαφορετικές περιοχές κάθε όγκου. Σε 17 περιπτώσεις χρησιμοποιήθηκαν επιπλέον 1-2 μικροϊστοτεμάχια από περιοχές παρακείμενες του όγκου, με φυσιολογική μορφολογία, ή με αλλοιώσεις αντιδραστικής γλοίωσης. Προστέθηκαν επίσης 6 μικροϊστοτεμάχια από 3 περιπτώσεις μη νεοπλασματικών εγκεφαλικών παθήσεων, από το αρχείο του ΕΓΠΠΑ (ΕΙΚΟΝΑ 6). Από τους κύβους παραφίνης των περιπτώσεων αυτών, επιλέχθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν περιοχές ιστολογικά φυσιολογικής εγκεφαλικής ουσίας. Όσον αφορά τα δευτεροπαθή γλοιοβλαστώματα, χρησιμοποιήθηκαν 2-3 μικροϊστοτεμάχια από τις περιοχές του διαθέσιμου υλικού με το μεγαλύτερο ιστολογικό βαθμό κακοηθείας, ενώ σε μία περίπτωση προστέθηκε επιπλέον 1 μικροϊστοτεμάχιο από περιοχή ιστολογικού βαθμού κακοήθειας ΙΙ (ΕΙΚΟΝΑ 7). Στην κατασκευή των μικροσυστοιχιών, χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες για τη μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας αλλά και για τον προσανατολισμό των κύβων παραφίνης, διάφοροι ιστοί, προερχόμενοι από το ΕΓΠΠΑ και από την HeCOG. Χρησιμοποιήθηκαν ιστικά τεμαχίδια από καρκίνωμα παχέος εντέρου, φυσιολογικό δέρμα, πλακούντα, φυσιολογικό μαστό, μελάνωμα, νεφρό, θυρεοειδή και σεμίνωμα όρχεως. Από τους 11 κύβους παραφίνης που παρασκευάσθηκαν, πάρθηκαν αρχικά αχρωμάτιστες τομές πάχους 2μm, για εφαρμογή της μεθόδου της ανοσοϊστοχημείας. Οι δύο τομές (πρώτη και τελευταία) χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη-ηωσίνη, για αξιολόγηση του υλικού των μικροσυστοιχιών. 48

49 ΕΚΧΥΛΙΣΗ DNA Η εκχύλιση DNA έγινε εν μέρει από 10 τομές πάχους 10μm που πάρθηκαν από τις μικροσυστοιχίες μετά την λήψη των αχρωμάτιστων τομών για ανοσοϊστοχημεία και εν μέρει από ολόκληρες τομές πάχους 10μm, μετά από μακροεκτομή. Η διαδικασία απομόνωσης πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας πακέτο αντιδραστηρίων του εμπορίου (QIAamp mini, QIAGEN). Μετά την αποπαραφίνωση των τομών (κλιβανισμός στους 58 C για 2-3 ώρες, εμβάπτιση σε ξυλόλη και σε οινόπνευμα 100 ) και την τοποθέτηση των ιστικών τεμαχίων σε μικρά φυαλίδια, προστέθηκε ρυθμιστικό διάλυμα (ATL, QIAamp mini, QIAGEN) και 15-20μl πρωτεϊνάσης Κ. Μετά από επώαση σε υδατόλουτρο στους 56 C για ώρες, συνεχίστηκε η διαδικασία σύμφωνα με τις οδηγίες του παρασκευαστή, με διαδοχικές φυγοκεντρήσεις σε ψυκτική φυγόκεντρο. Μετά από φωτομέτρηση των δειγμάτων ακολούθησε έλεγχος ποιότητας του υλικού με τη μέθοδο της πολλαπλής PCR (multiplex control PCR [BIOMED2]). Ικανής ποσότητας και ποιότητας DNA (μέγεθος προϊόντων ζεύγη βάσεων) απομονώθηκε για 174 δείγματα από 166 όγκους (163 ασθενείς). Σε 8 όγκους (7 ΙΒΚ IV και έναν ΙΒΚ ΙΙΙ), όπου υπήρχε αρκετό υλικό πάρθηκαν από 2 δείγματα (μελέτη ετερογένειας όγκων). Απομονώθηκαν επίσης 8 δείγματα μη νεοπλασματικής εγκεφαλικής ουσίας (περιγράφονται στη συνέχεια), καθώς επίσης και 5 δείγματα από περιοχές χαμηλότερου βαθμού κακοηθείας, στην περίπτωση των δευτεροπαθών γλοιοβλαστωμάτων (ΕΙΚΟΝΕΣ 6 & 7). Ετσι συνολικά, τα δείγματα DNA ήταν 187. Εκχύλιση DNA από τομές ιστικών μικροσυστοιχιών: Εκχύλιση DNA από τομές μικροσυστοιχιών έγινε για 89 όγκους από το ΕΓΠΠΑ (ΕΙΚΟΝΕΣ 3 & 4). Μετά την αποπαραφίνωση των τομών και τον προσανατολισμό τους με τη βοήθεια των αντίστοιχων τομών αιματοξυλίνης-ηωσίνης, απομονώθηκαν τα μικροϊστοτεμάχια που αντιστοιχούσαν στις περιοχές των όγκων. Σε 2 περιπτώσεις απομονώθηκαν ξεχωριστά τα μικροϊστοτεμάχια από τις μη-νεοπλασματικές περιοχές, ενώ απομονώθηκαν και συγχωνεύτηκαν σε ένα δείγμα τα μικροϊστοτεμάχια από τις περιπτώσεις μηνεοπλασματικών παθήσεων (ΕΙΚΟΝΑ 6). Σε μία περίπτωση δευτεροπαθούς γλοιοβλαστώματος, απομονώθηκε σε ξεχωριστό δείγμα περιοχή χαμηλότερου βαθμού κακοήθειας (ΕΙΚΟΝΑ 7). ύο ξεχωριστά δείγματα πάρθηκαν επίσης για ένα αναπλαστικό αστροκύτωμα. Εκχύλιση DNA από ολόκληρες τομές: Εκχύλιση DNA από ολόκληρες τομές έγινε για 81 όγκους από την HeCOG και το ΕΓΠΠΑ (ΕΙΚΟΝΕΣ 4 & 5). Κατά την εκτίμηση των τομών αιματοξυλίνης-ηωσίνης των ΚΠ που προορίζονταν για εκχύλιση DNA/RNA, σημειώθηκε η περιοχή του όγκου, κατάλληλη για μακροεκτομή (καλά διατηρημένος ιστός, αποφυγή νεκρώσεων/αιμορραγίας) και υπολογίστηκε ο αριθμός των απαιτούμενων τομών για απομόνωση DNA, λαμβάνοντας υπόψη το μέγεθος της περιοχής του όγκου και το ποσοστό των νεοπλασματικών κυττάρων. Στις τομές, σημειώθηκαν ξεχωριστά οι περιοχές μη νεοπλασματικής εγκεφαλικής ουσίας παρακείμενες των όγκων, καθώς και περιοχές χαμηλότερου βαθμού κακοηθείας (δευτεροπαθή γλοιοβλαστώματα), όπου αυτό ήταν δυνατό. Ο αριθμός των τομών κυμάνθηκε μεταξύ 3 και 14, πάχους 10μm. Μετά την αποπαραφίνωση των τομών και τον προσανατολισμό τους απομονώθηκαν οι σημειωμένες περιοχές με τη μέθοδο της μακροεκτομής. Σε 5 περιπτώσεις απομονώθηκε ξεχωριστά υλικό από μη νεοπλασματικές περιοχές (ΕΙΚΟΝΑ 6) και σε 4 περιπτώσεις δευτεροπαθών γλοιοβλαστωμάτων απομονώθηκε ξεχωριστά υλικό από περιοχές χαμηλότερου ΙΒΚ (ΕΙΚΟΝΑ 7). Οι περιπτώσεις από την HeCOG που αφορούσαν σε κοινούς όγκους με το ΕΓΠΠΑ απομονώθηκαν σε ξεχωριστά δείγματα, 49

50 όπως επίσης και 2 επιπλέον όγκοι, όπου απομονώθηκε DNA από 2 κύβους παραφίνης (7 όγκοι από 2 δείγματα DNA, για την αξιολόγηση της ετερογένειας των όγκων). ΕΚΧΥΛΙΣΗ RNA Η εκχύλιση RNA έγινε εν μέρει από 8-10 τομές πάχους 10μm που πάρθηκαν από τις μικροσυστοιχίες μετά τη λήψη των αχρωμάτιστων τομών για εκχύλιση DNA και εν μέρει από ολόκληρες τομές πάχους 10μm, μετά από μακροεκτομή. Μετά την αποπαραφίνωση των τομών και την απομόνωση των ιστοτεμαχιδίων, τα δείγματα επωάστηκαν στους 56 C με πρωτεϊνάση Κ. Την επομένη, απομονώθηκε RNA με τη βοήθεια διαλύματος TRIZOL-LS. Περίπου 2μgr από το RNA αυτό χρησιμοποιήθηκαν για τη σύνθεση cdna με τυχαία εξαμερή ως εκκινητές, την ανάστροφη τρανσκριπτάση Superscript II και την προσθήκη RNase H στα τελικά στάδια (όλα τα αντιδραστήρια από την εταιρεία Invitrogen). Στη συνέχεια δημιουργήσαμε διάλυμα 1:20 cdna με συγκέντρωση ng/μl, από το οποίο χρησιμοποιήθηκε μέρος για έλεγχο παρουσίας μεταγράφων β-ακτίνης, με τη μέθοδο της απλής ανάστροφης PCR. Ικανής ποσότητας και ποιότητας cdna (θετικότητα στη β-ακτίνη) παράχθηκε για 169 δείγματα από 159 όγκους (156 ασθενείς). Σε 10 όγκους απομονώθηκαν από 2 δείγματα. Με τη μέθοδο αυτή παράχθηκε κατάλληλο cdna για επιπλέον 14 δείγματα, 9 από μη νεοπλασματικές περιοχές (ΕΙΚΟΝΑ 6) και 5 από περιοχές χαμηλότερου ιστολογικού βαθμού κακοήθειας (δευτεροπαθή γλοιοβλαστώματα, ΕΙΚΟΝΑ 7). Ετσι, συνολικά τα δείγματα cdna ήταν 183. Εκχύλιση RNA από τομές ιστικών μικροσυστοιχιών: Εκχύλιση RNA από τομές μικροσυστοιχιών έγινε για 83 όγκους από το ΕΓΠΠΑ. Απομόνωση RNA από φυσιολογικές περιοχές ήταν δυνατή για 3 περιπτώσεις όγκων και για τις περιπτώσεις μη-νεοπλασματικών παθήσεων (4 δείγματα, ΕΙΚΟΝΑ 6). Απομονώθηκε επίσης RNA από χαμηλότερου βαθμού κακοήθειας περιοχή, σε μία περίπτωση δευτεροπαθούς γλοιοβλαστώματος (ΕΙΚΟΝΑ 7). ύο δείγματα πάρθηκαν επίσης από μία περίπτωση αναπλαστικού αστροκυτώματος. Εκχύλιση RNA από ολόκληρες τομές: Εκχύλιση RNA από ολόκληρες τομές μετά από μακροεκτομή πραγματοποιήθηκε για 81 όγκους από τη HeCOG και από το προοπτικό υλικό του EΓΠΠΑ. Χρειάστηκαν από 4-10 τομές για κάθε όγκο. RNA από φυσιολογικές περιοχές απομονώθηκε από 5 περιπτώσεις, ενώ από 4 περιπτώσεις απομονώθηκε ξεχωριστά υλικό από χαμηλότερου βαθμού κακοήθειας περιοχή (ΕΙΚΟΝΕΣ 6 & 7). Όπως και στην εκχύλιση DNA, για 8 γλοιοβλαστώματα όπου υπήρχε αρκετό υλικό σε 2 κύβους παραφίνης, πάρθηκαν 2 ξεχωριστά δείγματα. Επίσης σε ένα αναπλαστικό ολιγοαστροκύτωμα, πάρθηκαν 2 ξεχωριστά δείγματα από τις αστροκυτταρικές και ολιγοδενδρογλοιακές περιοχές, αντίστοιχα (2 δείγματα cdna). 50

51 ΑΝΟΣΟΪΣΤΟΧΗΜΕΙΑ Εφαρμόστηκε ανοσοϊστοχημεία σε τομές πάχους 2μm από τις μικροσυστοιχίες (153 όγκοι) και σε τομές πάχους 2μm από ολόκληρες τομές (27 όγκοι, ένας από τους οποίους υπήρχε και στις μικροσυστοιχίες). Η αποκάλυψη του αντιγόνου έγινε με διάλυμα κιτρικού οξέος (ph ) ή EDTA (ph ) και η εμφάνιση του συμπλόκου αντιγόνου-αντισώματος με το σύστημα Envision (DAKO, Glostrup, DK). Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν, οι εφαρμοζόμενες αραιώσεις και η επεξεργασία αποκάλυψης του αντιγόνου σε κάθε περίπτωση περιγράφονται στον ΠΙΝΑΚΑ 3. H εφαρμογή ανοσοϊστοχημείας έδωσε αποτελέσματα για 179 όγκους από 175 ασθενείς, 22 ιστολογικού βαθμού κακοηθείας (ΙΒΚ) ΙΙ, 27 ΙΒΚ ΙΙΙ και 130 ΙΒΚ ΙV). 51

52 52

53 ΠΟΣΟΤΙΚΗ PCR ΠΡΑΓΜΑΤΙΚΟΥ ΧΡΟΝΟΥ (Real Τime Quantitative[RTQ] PCR) Για την αξιολόγηση της σχετικής mrna έκφρασης για 19 στόχους χρησιμοποιήθηκαν δοκιμασίες έτοιμες (Applied Biosystems, Biosolutions, Athens, GR) ή σχεδιαζόμενες για τους σκοπούς της παρούσας μελέτης, οι οποίες περιλάμβαναν ανιχνευτές Taqman- MGB (ΠΙΝΑΚΕΣ 4 & 5). Ως γονίδιο μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε η β-γλυκορουνιδάση (GUSB). Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, που περιλάμβανε 40 κύκλους, πραγματοποιήθηκε στο μηχάνημα ABI7500 και για την ανάλυση των αποτελεσμάτων χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό πρόγραμμα SDS v1.4. Κατάλληλα δείγματα για ανάλυση θεωρήθηκαν αυτά που εμφάνισαν τιμές Ct (Cycle Threshold) κάτω από 36. Η τιμή της σχετικής mrna έκφρασης υπολογίσθηκε με τη μέθοδο 2^-dCt, η οποία προτείνεται για εκκινητές μικρού αριθμού ζευγών βάσεων [284]. Σχεδιάστηκαν επίσης μικρού μήκους εκκινητές DNA για την ανίχνευση των γονιδιακών αντιγράφων του EGFR, σεσημασμένοι με ανιχνευτή FAM/MGB, ενώ ως γονίδιο μάρτυρας για την περίπτωση αυτή χρησιμοποιήθηκε το γονίδιο SELE (120 ζεύγη βάσεων). Με τη μέθοδο της RTQ-PCR αξιολογήθηκε η παρουσία ενίσχυσης του γονιδίου EGFR για 79 όγκους (12 ΙΒΚ ΙΙ, 17 ΙΒΚ ΙΙΙ και 50 ΙΒΚ ΙV), ενώ ως μάρτυρες για τη συγκεκριμένη αντίδραση χρησιμοποιήθηκαν 5 ΜΝΕ (ΕΙΚΟΝΑ 6). Για τον υπολογισμό του σχετικού αριθμού γονιδιακών αντιγράφων, ακολουθήθηκε και εδώ η προτεινόμενη μέθοδος 2^-dCT. Τα όρια ποιοτικού διαχωρισμού των αποτελεσμάτων της RTQ-PCR καθορίστηκαν σε 5 ΜΝΕ, ως οι ποσοτικές τιμές των στόχων σε σχέση με τα γονίδια-μάρτυρες, συν τρείς φορές την τυπική απόκλιση. 53

54 54

55 MULTIPLEX LIGATION-DEPENDENT PROBE AMPLIFICATION (MLPA) Μέθοδος MLPA για την ανίχνευση χρωμοσωμικής απώλειας και γονιδιακής ενίσχυσης Για την ανίχνευση χρωμοσωμικών απωλειών στα 1p και 19q χρησιμοποιήθηκε το πρωτόκολλο SALSA MLPA KIT P088-B1 Oligodendroglioma 1p-19q (MRC-Holland), με το οποίο αξιολογήσιμα αποτελέσματα προέκυψαν για 71 όγκους (10 ΙΒΚ ΙΙ, 15 ΙΒΚ ΙΙΙ, 46 ΙΒΚ IV) και 2 ΜΝΕ, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Με τη μέθοδο MLPA διερευνήθηκε επίσης η παρουσία ενίσχυσης του γονιδίου EGFR, με το πρωτόκολλο SALSA MLPA KIT P105-C1 Oligodendroglioma-2 (MRC-Holland). Αξιολογήσιμα αποτελέσματα με τη μέθοδο αυτή πάρθηκαν για 47 όγκους, 2 ΙΒΚ ΙΙ, 1 ΙΒΚ ΙΙΙ και 44 ΙΒΚ IV, καθώς και για ένα ΜΝΕ, το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας. Σε κάθε αντίδραση χρησιμοποιήθηκε επιπλέον ως μάρτυρας, δείγμα από περιφερικό αίμα υγιούς ατόμου, όπως προτείνεται από την εταιρεία παραγωγής των συγκεκριμένων πρωτοκόλλων (MRC-Holland). Για την εφαρμογή των πρωτοκόλλων ακολουθήθηκαν οι οδηγίες του παρασκευαστή (MRC-Holland). Το πρώτο στάδιο περιλαμβάνει τη διάσπαση της διπλής έλικας του DNA και τον υβριδισμό με 2 εκκινητές για κάθε αλληλουχία-στόχο. Μετά την αραίωση των δειγμάτων (50-200ng/5ul) και την επώασή τους στους 98 ºC για 5 και στους 25 ºC για 10, ακολούθησε επώαση στους 95 ºC για 1 και στους 60 ºC για ώρες, μετά την προσθήκη 1.5μl από το αντιδραστήριο SALSA Probe-mix και 1.5μl ρυθμιστικού διαλύματος (MLPA-buffer). Την επόμενη μέρα ακολούθησε το δεύτερο στάδιο, που έχει ως στόχο την σύνδεση των 2 εκκινητών μεταξύ τους και την ταυτόχρονη αποσύνδεσή τους από την αλληλουχία στόχο. Για το σκοπό αυτό, μετά από επώαση των δειγμάτων στους 54 ºC για 1, ακολούθησε προσθήκη 32μl από μείγμα που περιείχε ένζυμο σύνδεσης (λιγκάση) και 2 ρυθμιστικά διαλύματα, σε ποσότητες που προτείνονται από τον παρασκευαστή. Το τρίτο στάδιο περιλάμβανε την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCReppendorf), κατά την οποία μόνο οι παραγόμενοι εκκινητές για κάθε στόχο, όπως προκύπτουν μετά από τη μεταξύ τους σύνδεση παράγουν προϊόντα προς ανίχνευση. Τα προϊόντα που παράγονται με αυτό τον τρόπο έχουν διαφορετικό μήκος ( nt) για κάθε ανιχνευόμενο στόχο. Το μείγμα της αντίδρασης περιλάμβανε ρυθμιστικό διάλυμα, 2 ένζυμα και τους εκκινητές, σε ποσότητες που προτείνονται από τον παρασκευαστή. Ο διαχωρισμός των προϊόντων της PCR αντίδρασης (50λ για κάθε δείγμα) πραγματοποιήθηκε με τριχοειδική ηλεκτροφόρηση σε ακρυλαμίδιο (ABI 1730, Applied Biosystems) και η ποσοτικοποίησή τους (λήψη καμπύλης γονιδιακών αντιγράφων),με το αντίστοιχο λογισμικό (Genemapper software, Applied Biosystems). Η ανάλυση των αποτελεσμάτων πραγματοποιήθηκε στο πρόγραμμα Excel, όπως περιγράφεται από τον παρασκευαστή. Αρχικά, για την αξιολόγηση της καταλληλότητας των δειγμάτων για εκτίμηση, υπολογίσθηκε η αναλογία του προϊόντος για κάθε στόχο και της αντίστοιχης συνδυασμένης τιμής για τα γονίδια-μάρτυρες, που περιλαμβάνονται στο κάθε πρωτόκολλο. Στη συνέχεια, ο λόγος αυτός διαιρέθηκε με την αντίστοιχη αναλογία για τα δείγματα μάρτυρες της κάθε αντίδρασης. Με βάση προηγούμενες αναφορές, η γονιδιακή ενίσχυση εκτιμήθηκε για τα δείγματα με τιμές >1.2, ενώ η χρωμοσωμική απώλεια για τα δείγματα με τιμές <0.8 [285]. 55

56 Μέθοδος MS-MLPA (Methylation-Specific MLPA) για τον έλεγχο μεθυλίωσης επαγωγέα γονιδίων Για την ανίχνευση της μεθυλίωσης του επαγωγέα των γονιδίων επιδιόρθωσης MGMT και MSH6, εφαρμόστηκαν 2 πρωτόκολλα, από την εταιρεία MRC-Holland. Σε δείγματα DNA από 25 όγκους (2 ΙΒΚ ΙΙ, 10 ΙΒΚ ΙΙΙ, 13 ΙΒΚ IV) και σε 2 ΜΝΕ εφαρμόστηκε το πρωτόκολλο SALSA MS-MLPA KIT ME011 Mismatch Repair genes ([MMR], MRC-Holland), με το οποίο ανιχνεύονται 3 θέσεις μεθυλίωσης για τα γονίδια MGMT και MSH6. Σε δείγματα DNA από 33 όγκους (1 ΙΒΚ ΙΙ, 1 ΙΒΚ ΙΙΙ, 31 ΙΒΚ IV) και σε 1 ΜΝΕ εφαρμόστηκε το πρωτόκολλο SALSA MS-MLPA KIT ME002-A1 Tumor suppressor-2 (MRC-Holland), με το οποίο ανιχνεύονται 2 θέσεις μεθυλίωσης για το γονίδιο MGMT και 1 θέση για το γονίδιο MSH6. Σε κάθε αντίδραση, όπως και για τις μεθόδους ανίχνευσης γονιδιακών αντιγράφων, χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας δείγμα DNA από περιφερικό αίμα υγιούς ατόμου. Το πρώτο στάδιο της μεθόδου (διάσπαση της διπλής έλικας του DNA υβριδισμός) πραγματοποιήθηκε όπως αναφέρεται παραπάνω. Κατά το δεύτερο στάδιο (σύνδεση των εκκινητών μεταξύ τους - αποσύνδεση από τον στόχο), μετά την προσθήκη 13μl από μείγμα ρυθμιστικού διαλύματος (Ligase-buffer A), τα δείγματα διαχωρίστηκαν σε δύο μέρη από 10μl. Στο πρώτο μέρος προστέθηκε μείγμα ενζύμου (λιγκάση) και ρυθμιστικού διαλύματος, ενώ στο δεύτερο προστέθηκαν επιπλέον 0.5μl από μια ενδονουκλεάση (Hhal enzyme), η οποία διασπά τους στόχους χωρίς παρουσία μεθυλίωσης. Μετά από επώαση των δειγμάτων στους 49 ºC για 30 και στους 98 ºC για 5, το τρίτο στάδιο περιλαμβάνει την αντίδραση PCR, όπου για τα δείγματα με την προσθήκη ενδονουκλεάσης, παράγονται προϊόντα μόνο σε παρουσία μεθυλίωσης. Για την τριχοειδική ηλεκτροφόρηση (ABI 1730, Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκαν 25μl προϊόντος για κάθε δείγμα, ενώ η ποσοτικοποίηση πραγματοποιήθηκε και εδώ με το ανάλογο λογισμικό (Genemapper software, Applied Biosystems). Κατά την ανάλυση των αποτελεσμάτων, μετά τον υπολογισμό της σχετικής τιμής γονιδιακών αντιγράφων για κάθε στόχο σε σχέση με τα γονίδια μάρτυρες, η εκτίμηση της παρουσίας μεθυλίωσης έγινε με βάση το λόγο της σχετικής αυτής τιμής για κάθε στόχο, σε κάθε δείγμα με και χωρίς την επίδραση ενζύμου. Η τιμή που προκύπτει με αυτόν τον τρόπο, λέγεται αναλογία μεθυλίωσης και αντιστοιχεί στο ποσοστό των μεθυλιωμένων αλληλουχιών [286]. 56

57 ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με το πρόγραμμα SPSS, v12. Για τις συσχετίσεις μεταξύ ποιοτικών παραμέτρων χρησιμοποιήθηκαν τα Pearson s chi square και Fisher s exact tests. Για τις συσχετίσεις των ποσοτικών τιμών σχετικής έκφρασης χρησιμοποιήθηκε το Spearman s Rho test, ενώ οι γραμμικές τους συσχετίσεις υπολογίσθηκαν με τη μέθοδο r 2. Για τον υπολογισμό των συσχετίσεων μεταξύ ποσοτικών και ποιοτικών παραμέτρων χρησιμοποιήθηκε το Mann-Whitney test. Η επιβίωση υπολογίσθηκε ως ο χρόνος από την ημερομηνία της χειρουργικής εκτομής έως την κατάληξη ή την τελευταία εξέταση του ασθενούς. Το διάστημα ελεύθερο επιδείνωσης της νόσου (PFS) ορίστηκε ως το χρονικό διάστημα έως την παρουσία επιδείνωσης της νόσου, με ακτινολογικά (MRI) και κλινικά κριτήρια. Για τον υπολογισμό του αντίκτυπου των εξεταζόμενων μεταβολών στις κλινικές παραμέτρους χρησιμοποιήθηκε η ανάλυση Cox (Cox proportional hazards regression models). H ανάλυση ROC (Reciever Operating characteristic curve) εφαρμόσθηκε για την εκτίμηση των συσχετίσεων με το 6μηνο διάστημα ελεύθερο επιδείνωσης της νόσου (6-month PFS), το οποίο χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση της ανταπόκρισης στη θεραπεία [287]. Με το πρόγραμμα JMP 8.0 έγινε προσπάθεια αναγνώρισης προφίλ γονιδιακής έκφρασης, με την εφαρμογή 2 μεθόδων (K-means και hierarchical clustering). Κατά τη μέθοδο hierarchical clustering ακολουθήθηκε η διαδικασία Ward clustering. Ως όριο στατιστικής σημαντικότητας θεωρήθηκε το a=5%. 57

58 ΑΝΟΣΟΪΣΤΟΧΗΜΙΚΗ ΕΚΤΙΜΗΣΗ Ki-67 Ο μιτωτικός δείκτης υπολογίστηκε με βάση το ποσοστό των κυττάρων του όγκου που εμφάνιζαν πυρηνική θετικότητα (ΕΙΚΟΝΑ 2). Για τη στατιστική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε το όριο του 5%, το οποίο αναφέρεται γενικά ως αδρό όριο διαχωρισμού των χαμηλού και υψηλού βαθμού κακοήθειας γλοιωμάτων (WHO 2007), με τον εξής αλγόριθμο: Μ..< ή = 5%=1, >5%=2. GFAP Αξιολογήθηκε η κυτταροπλασματική θετικότητα των νεοπλασματικών κυττάρων, ενώ μελετήθηκαν καλύτερα τα κυτταροπλασματικά μορφολογικά χαρακτηριστικά των νεοπλασματικών κυττάρων (μορφολογία προσεκβολών), καθώς και οι περιοχές αντιδραστικής γλοίωσης. MGMT Αξιολογήθηκε το ποσοστό της πυρηνικής θετικότητας ανάμεσα στα νεοπλασματικά κύτταρα και η ένταση της χρωστικής αντίδρασης (ήπια, έντονη), σε σχέση με τα θετικά ενδοθηλιακά κύτταρα (εσωτερικός μάρτυρας). Θετικοί θεωρήθηκαν οι όγκοι με τουλάχιστον ήπιας έντασης πυρηνική θετικότητα σε ποσοστό 5% των νεοπλασματικών κυττάρων (Cairncross 2007, Esteller 2000). Λαμβάνοντας υπόψη ότι τα προτεινόμενα όρια θετικότητας στη βιβλιογραφία ποικίλουν μεταξύ των ερευνητών [235, 288] και το γεγονός ότι στη μελέτη συμπεριλήφθηκαν όγκοι ιστολογικού βαθμού κακοήθειας ΙΙ και ΙΙΙ, για την στατιστική ανάλυση θέσαμε ως δεύτερο όριο έντονης θετικότητας το ποσοστό του 20%. PTEN Θετικοί στη χρώση για την φωσφατάση PTEN θεωρήθηκαν οι όγκοι με έντονη θετικότητα σε ποσοστό τουλάχιστον 75% των νεοπλασματικών κυττάρων [125]. Η ένταση της χρώσης αξιολογήθηκε με βάση τη θετικότητα των ενδοθηλιακών κυττάρων (εσωτερικός μάρτυρας). EGFR Αξιολογήθηκε η κυτταροπλασματική ή η μεμβρανική θετικότητα. Για την αξιολόγηση ήπιας και έντονης θετικότητας για τον EGFR, χρησιμοποιήθηκε ο εξής αλγόριθμος: Ποσοστό θετικότητας νεοπλασματικών κυττάρων: <5%=1, >5% και <50%=2, > ή = 50%=3 [101]. EGFRvIII Θετικοί θεωρήθηκαν οι όγκοι με κυτταροπλασματική θετικότητα στα νεοπλασματικά κύτταρα, τουλάχιστον εστιακά [125]. Θετικός εσωτερικός μάρτυρας για τον EGFRvIII δεν αναφέρεται στη βιβλιογραφία. Ως αρνητικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκαν οι περιοχές μη νεοπλασματικής εγκεφαλικής ουσίας ( ΜΝΕ), καθώς και οι μάρτυρες από άλλους ιστούς που υπήρχαν στις μικροσυστοιχίες (αποκλεισμός μη ειδικής χρώσης, επιμόλυνσης πρωτογενούς αντισώματος). 58

59 p53 Αξιολογήθηκε το ποσοστό των νεοπλασματικών κυττάρων με πυρηνική θετικότητα. Θετικοί θεωρήθηκαν οι όγκοι με τουλάχιστον 5% θετικά νεοπλασματικά κύτταρα, ενώ τέθηκε δεύτερο όριο έντονης πρωτεϊνικής έκφρασης [θετικότητα σε ποσοστό > ή = 60% των νεοπλασματικών κυττάρων] [289]. p16 ΙΝΚ4Α, p21 Waf1/Cip1, p27 kip1 Αξιολογήθηκε η πυρηνική και η κυτταροπλασματική θετικότητα ξεχωριστά. Θετικοί θεωρήθηκαν οι όγκοι με θετικότητα σε ποσοστό τουλάχιστον 5% των νεοπλασματικών κυττάρων [289]. Phospho-Stat1 (Tyr701), phospho-stat3 (Tyr705), phospho-stat5 (Tyr694) Αξιολογήθηκε η πυρηνική θετικότητα στα νεοπλασματικά κύτταρα. Θετικοί θεωρήθηκαν οι όγκοι με ποσοστό θετικών κυττάρων πάνω από 10%, όριο που προέκυψε από προσαρμογή των αναφερόμενων ορίων θετικότητας στη βιβλιογραφία [101]. Phospho-Akt (Thr308), Phospho-Akt (Ser473) Στην περίπτωση του αντισώματος phospho-akt (Ser473) αξιολογήθηκαν ξεχωριστά η πυρηνική και η κυτταροπλασματική θετικότητα. Θετικοί θεωρήθηκαν οι όγκοι με τουλάχιστον 5% θετικά νεοπλασματικά κύτταρα, ενώ η ενεργοποίηση της Akt αξιολογήθηκε με βάση την κυτταροπλασματική θετικότητα. Στην περίπτωση της phospho-akt (Thr308), προσμετρήθηκε μόνο η κυτταροπλασματική θετικότητα, μια και η πυρηνική ήταν δύσκολο να αξιολογηθεί αξιόπιστα στους όγκους υψηλού βαθμού κακοήθειας, λόγω του συχνά μεγάλου ποσοστού έντονης κυτταροπλασματικής θετικότητας [101]. Phospho-mTOR (Ser2448), Phospho-Met (Tyr1234/1235), Phospho-Src (Tyr527) Για τα υπόλοιπα αντισώματα που ανιχνεύουν θέσεις φωσφορυλίωσης, αξιολογήθηκε η κυτταροπλασματική θετικότητα των νεοπλασματικών κυττάρων (ποσοστό > ή = 5%) [101, 290]. Πυρηνική θετικότητα δεν παρατηρήθηκε στις χρώσεις για τα τρία αυτά αντισώματα, ούτε στους όγκους αλλά ούτε και στο μη-νεοπλασματικό εγκέφαλo. 59

60 60

61 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΧΝΟΤΗΤΑ ΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΕΠΙΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΜΕΤΑΒΟΛΩΝ Η συχνότητα των γενωμικών μεταβολών και της σχετικής mrna έκφρασης (αυξημένηελαττωμένη), καθώς και η συχνότητα πρωτεϊνικής έκφρασης και ενεργοποίησης για τους μοριακούς στόχους που διερευνήθηκαν, απεικονίζονται στον ΠΙΝΑΚA 6. Συχνότητα μεταβολών των υποδοχέων EGFR, ΜΕΤ και HER2, καθώς και στοιχείων της ενδοκυττάριας οδού ενεργοποίησης PI3K EGFR και EGFRvIII Ενίσχυση του γονιδίου EGFR παρατηρήθηκε σε 40 υψηλού βαθμού κακοήθειας γλοιώματα (34,2%), 35 ιστολογικού βαθμού κακοήθειας (ΙΒΚ) IV και 5 ΙΒΚ ΙΙΙ. Yπερέκφραση του mrna παρατηρήθηκε σε 49 υψηλού βαθμού κακοηθείας γλοιώματα (30,8%), 43 ΙΒΚ ΙV και 6 ΙΒΚ ΙΙΙ, ενώ πρωτεϊνική υπερέκφραση (κυτταροπλασματική ή μεμβρανική θετικότητα σε ποσοστό > 50% των νεοπλασματικών κυττάρων) παρατηρήθηκε σε 54 όγκους (36,5%), 47 ΙΒΚ IV, 6 ΙΒΚ ΙΙΙ και σε έναν χαμηλού βαθμού κακοήθειας όγκο (διάχυτο αστροκύτωμα). Η ανασυνδυασμένη μορφή του EGFR, EGFRvIII παρουσίασε αυξημένη έκφραση του mrna σε 13 όγκους (8,2%), 8 ΙΒΚ ΙV, 3 ΙΒΚ ΙΙΙ και 2 ΙΒΚ ΙΙ. Σχετική υπερέκφραση του mrna παρατηρήθηκε σε 35 όγκους (22%), 25 ΙΒΚ ΙV, 4 ΙΒΚ ΙΙΙ και 6 ΙΒΚ ΙΙ. Κυτταροπλασματική θετικότητα για την πρωτεΐνη παρατηρήθηκε σε 51 όγκους (34,9%), 40 ΙΒΚ IV, 5 ΙΒΚ ΙΙΙ και 6 ΙΒΚ ΙΙ. Ταυτόχρονη υπερέκφραση του mrna για τα γονίδια EGFR και EGFRvIII παρατηρήθηκε σε 15 γλοιοβλαστώματα (8,8%). Ταυτόχρονη πρωτεϊνική υπερέκφραση του EGFR (κυτταροπλασματική ή μεμβρανική θετικότητα σε ποσοστό > 50% των νεοπλασματικών κυττάρων) και πρωτεϊνική έκφραση του EGFRvIII σημειώθηκε σε 24 γλοιοβλαστώματα (18%). MET και HER2 Ο υποδοχέας ΜΕΤ παρουσίασε σχετικά αυξημένη έκφραση του mrna σε 7 γλοιοβλαστώματα, ενώ υψηλά επίπεδα έκφρασης, ενδεικτικά ενίσχυσης του γονιδίου, σημειώθηκαν σε μόνο 4 υψηλού βαθμού κακοήθειας γλοιώματα, 3 ΙΒΚ IV και 1 ΙΒΚ III. Ένας όγκος από αυτούς, ΙΒΚ IV, παρουσίασε και ενίσχυση του γονιδίου EGFR ενώ ένα δεύτερο γλοιοβλάστωμα εμφάνισε υπερέκφραση του mrna για το γονίδιο EGFRvIII, χωρίς παρουσία γονιδιακής ενίσχυσης του EGFR. Ενεργοποίηση της πρωτεΐνης MET παρατηρήθηκε σε 4 μόνο γλοιοβλαστώματα, 3 από τα οποία εμφάνισαν αυξημένη mrna έκφραση του γονιδίου (2 υψηλή). Σχετικά αυξημένα επίπεδα έκφρασης mrna για το γονίδιο HER2, σε σχέση με τα ΜΝΕ σημειώθηκαν σε 18 όγκους (12,8%), 12 ΙΒΚ IV, 3 ΙΒΚ ΙΙΙ και 3 ΙΒΚ ΙΙ. Σε κανέναν όγκο δεν παρατηρήθηκαν πολύ υψηλά επίπεδα έκφρασης HER2, ενδεικτικά γονιδιακής ενίσχυσης. 61

62 62

63 Ενεργοποίηση της Αkt και της mtor Φωσφορυλίωση της Αkt στη θέση Ser473 (κυτταροπλασματική θετικότητα), παρατηρήθηκε σε 62 όγκους (38,3%) (56 ΙΒΚ IV, 5 IBK ΙΙΙ και 1 IBK II). Πυρηνική θετικότητα για την ίδια θέση φωσφορυλίωσης παρατηρήθηκε σε 28 όγκους, 19 ΙΒΚ ΙV, 6 ΙΒΚ ΙΙΙ και 3 ΙΒΚ ΙΙ. Φωσφορυλίωση της Akt στη θέση Thr308 παρουσίασαν 114 όγκοι (80,3%) 91 ΙΒΚ IV, 12 ΙΒΚ ΙΙΙ και 11 ΙΒΚ ΙΙ. Ενεργοποίηση της πρωτεΐνης mtor παρουσίασαν 67 όγκοι (59,8%), 41 ΙΒΚ IV, 14 ΙΒΚ ΙΙΙ και 12 ΙΒΚ ΙΙ. PIK3CΑ & PTEN ιατήρηση της έκφρασης της φωσφατάσης PTEN (θετικότητα >75%) παρουσίασαν μόνο 43 όγκοι (25,7%). Αντίθετα, απώλεια έκφρασης PTEN παρουσίασαν 124 όγκοι (74,3%), 91 ΙΒΚ ΙV, 17 ΙΒΚ ΙΙΙ και 16 ΙΒΚ ΙΙ. Σχετικά αυξημένη έκφραση του mrna για το γονίδιο PIK3CA, σε σχέση με τα ΜΝΕ παρατηρήθηκε μόνο σε 4 όγκους (2,8%), 3 ΙΒΚ ΙΙ και έναν ΙΒΚ ΙV, ενώ κανένας δεν εμφάνισε πολύ υψηλά επίπεδα έκφρασης. Οι μέσες τιμές σχετικής έκφρασης του mrna για το PIK3CA στους όγκους ΙΒΚ ΙΙ, ΙΙΙ και ΙV ήταν 0,04, 0,03 και 0,01, αντίστοιχα. Φωσφατάσες PHLPP1, PHLPP2 και γονίδιο DARPP32 Για τα τρία αυτά γονίδια, παρατηρήθηκε γενικά σχετική ελάττωση της έκφρασης του mrna σε σχέση με τα ΜΝΕ. Σχετική ελάττωση έκφρασης του mrna για την φωσφατάση PHLPP1 σημειώθηκε σε 23 όγκους (16,8%, 19 ΙΒΚ IV, 3 ΙΒΚ ΙΙΙ, 1 ΙΒΚ ΙΙ), ενώ μεγάλη ελάττωση της έκφρασης σε σχέση με τα φυσιολογικά δείγματα παρατηρήθηκε σε 32 όγκους (23,4%, 29 ΙΒΚ IV, 2 ΙΒΚ ΙΙΙ, 1 ΙΒΚ ΙΙ). Αντίστοιχα, σχετική ελάττωση έκφρασης του mrna για τη φωσφατάση PHLPP2 σημειώθηκε σε 40 όγκους (27,6%, 30 ΙΒΚ IV, 6 ΙΒΚ ΙΙΙ, 4 ΙΒΚ ΙΙ), ενώ μεγάλη ελάττωση της έκφρασης του γονιδίου σε σχέση με τα ΜΝΕ παρατηρήθηκε σε 81 όγκους (55,9%, 69 ΙΒΚ IV, 8 ΙΒΚ ΙΙΙ, 4 ΙΒΚ ΙΙ). Ταυτόχρονη μεγάλη ελάττωση της σχετικής έκφρασης mrna των γονιδίων PHLPP1 και PHLPP2 σημείωσαν 29 όγκοι (21%), 26 ΙΒΚ IV, 2 ΙΒΚ ΙΙΙ και 1 ΙΒΚ ΙΙ. Το γονίδιο DARPP32 παρουσίασε χαμηλή έκφραση mrna σε 29 όγκους (20%, 19 ΙΒΚ IV, 5 ΙΒΚ ΙΙΙ, 5 ΙΒΚ ΙΙ), ενώ σε 91 όγκους (62,8%) κυρίως ΙΒΚ ΙV (79), η έκφρασή του ήταν σε ιδιαίτερα χαμηλά επίπεδα. Σχετική αύξηση της έκφρασης ή υπερέκφραση του mrna δεν παρατηρήθηκε σε κανένα όγκο. Οι υπόλοιποι όγκοι εμφάνισαν έκφραση σε επίπεδα ανάλογα με τα ΜΝΕ. Πολύ χαμηλή έκφραση mrna για τα γονίδια PHLPP1, PHLPP2 και DARPP32 παρατηρήθηκε σε 21 όγκους (15,3%), 18 ΙΒΚ IV, 2 ΙΒΚ ΙΙΙ και 1 ΙΒΚ ΙΙ. Φυσιολογικά επίπεδα έκφρασης και για τα τρία γονίδια, σε σχέση με τα ΜΝΕ παρατηρήθηκαν σε 9 όγκους (6,6%), 4 ΙΒΚ ΙΙ, 2 ΙΒΚ ΙΙΙ και 3 γλοιοβλαστώματα. 63

64 Συχνότητα μεταβολών της ενδοκυττάριας οδού ενεργοποίησης Src-STAT Σχετικά υψηλά επίπεδα έκφρασης του mrna για το γονίδιο Src σημειώθηκαν σε 5 όγκους (93,5%), ενώ μόνο ένα γλοιοβλάστωμα παρουσίασε πιο υψηλά επίπεδα γονιδιακής έκφρασης (0,7%). Από την άλλη, ενεργοποίηση της πρωτεΐνης Src παρατηρήθηκε σε 47 όγκους (32,2%). Το γονίδιο STAT1 εμφάνισε υψηλά ή πολύ υψηλά επίπεδα έκφρασης mrna σε 49 όγκους συνολικά (34,5%, 35 ΙΒΚ IV, 9 ΙΒΚ ΙΙΙ, 5 ΙΒΚ ΙΙ) ενώ πρωτεϊνική ενεργοποίηση σημειώθηκε σε 46 όγκους (31,3%, 34 ΙΒΚ IV, 5 ΙΒΚ ΙΙΙ, 7 ΙΒΚ ΙΙ). Υψηλή ή πολύ υψηλή mrna έκφραση για το γονίδιο STAT3 παρουσίασαν συνολικά 45 όγκοι (35,3%), 29 ΙΒΚ IV, 9 ΙΒΚ ΙΙΙ και 7 ΙΒΚ ΙΙ, ενώ κανένα χαμηλού βαθμού κακοήθειας γλοίωμα δεν εμφάνισε πολύ υψηλή σχετική έκφραση του γονιδίου. Ενεργοποίηση της πρωτεΐνης Stat3 εμφάνισαν πολύ περισσότεροι όγκοι [100 (70,9%), από τους οποίους 81 ΙΒΚ IV, 7 ΙΒΚ ΙΙΙ και 12 ΙΒΚ ΙΙ]. Αύξηση σχετικής γονιδιακής έκφρασης (mrna) για το γονίδιο STAT5A σημειώθηκε σε 27 όγκους (18,6%), 16 ΙΒΚ ΙV, 5 ΙΒΚ ΙΙΙ και 6 ΙΒΚ ΙΙ, ενώ σε κανέναν από αυτούς δεν παρατηρήθηκαν ιδιαίτερα υψηλά επίπεδα σχετικής έκφρασης. Το γονίδιο STAT5B, από την άλλη, παρουσίασε σχετική αύξηση έκφρασης mrna σε 15 όγκους (10,4%), 7 ΙΒΚ IV, 5 ΙΒΚ ΙΙΙ και 3 ΙΒΚ ΙΙ. Ένας από αυτούς (αναπλαστικό αστροκύτωμα) είχε πολύ υψηλά επίπεδα έκφρασης, σε σχέση με τα φυσιολογικά δείγματα. Ενεργοποίηση της πρωτεΐνης Stat5 (θετικότητα για τη θέση φωσφορυλίωσης σε ποσοστό >10%) παρατηρήθηκε σε 15 όγκους (10,1%), 10 ΙΒΚ IV, 1 ΙΒΚ ΙΙΙ και 4 ΙΒΚ ΙΙ. Συχνότητα μεταβολών ρυθμιστών κυτταρικού κύκλου και γονιδίων επιδιόρθωσης p16 INK4A, p21 Waf1/Cip1, p27 KIP1, p53 και MDM2 Αυξημένη σχετική έκφραση mrna για το γονίδιο p16 INK4A παρατηρήθηκε σε 17 όγκους (11,3%), ενώ πολύ υψηλά επίπεδα έκφρασης (σχετική έκφραση >10) σημειώθηκαν σε 4 μόνο γλοιοβλαστώματα, 3 δευτεροπαθή και 1 πρωτοπαθές. Πυρηνική πρωτεϊνική έκφραση για τα p16 INK4A, p21 Waf1/Cip1 και p27 KIP1 παρατηρήθηκε σε ποσοστά 9,4, 73,8 και 88,4% αντίστοιχα, ενώ τα αντίστοιχα ποσοστά κυτταροπλασματικής θετικότητας για τις ίδιες πρωτεΐνες ήταν 18,5, 31,7 και 49% αντίστοιχα (ΠΙΝΑΚΑΣ 6 ) Η πρωτεΐνη p53 παρουσίασε έκφραση (5-60% των νεοπλασματικών κυττάρων) σε 68 όγκους (45,9%) (46 ΙΒΚ IV, 8 ΙΒΚ ΙΙΙ, 14 ΙΒΚ ΙΙ), ενώ έντονη θετικότητα σε ποσοστό >60% των νεοπλασματικών κυττάρων σημειώθηκε μόνο σε 8 γλοιοβλαστώματα. Σχετικά αυξημένα επίπεδα έκφρασης mrna για το γονίδιο MDM2 παρατηρήθηκαν σε 16 όγκους (10,7%, 14 ΙΒΚ IV, 1 ΙΒΚ ΙΙΙ, 1 ΙΒΚ ΙΙ), ενώ πολύ υψηλή έκφραση ενδεικτική γονιδιακής ενίσχυσης παρατηρήθηκε σε 13 όγκους (8,7%, 10 ΙΒΚ IV, 2 ΙΒΚ ΙΙΙ, 1 ΙΒΚ ΙΙ) MGMT και MSH6 Μεθυλίωση του γονιδίου MGMT παρατηρήθηκε σε 21 όγκους (37,5%, 17 ΙΒΚ IV, 3 ΙΒΚ ΙΙΙ, 1 ΙΒΚ ΙΙ), ενώ πολύ χαμηλή mrna έκφραση του γονιδίου σημειώθηκε σε 48 όγκους (32%, 40 ΙΒΚ IV, 1 ΙΒΚ ΙΙΙ, 7 ΙΒΚ ΙΙ). Αρνητική ανοσοϊστοχημική χρώση για την πρωτεΐνη (πυρηνική θετικότητα <5% των νεοπλασματικών κυττάρων) παρατηρήθηκε σε 61 όγκους (36,3%, 52 ΙΒΚ IV, 6 ΙΒΚ ΙΙΙ, 3 ΙΒΚ ΙΙ), ενώ χαμηλή έκφραση (θετικότητα σε ποσοστό 5-20%) παρατηρήθηκε σε 59 όγκους (35,1%, 43 ΙΒΚ IV, 9 ΙΒΚ ΙΙΙ, 7 ΙΒΚ ΙΙ). Έντονη θετικότητα για την πρωτεΐνη (>20%) σημειώθηκε για 48 όγκους (28,6%, 29 ΙΒΚ IV, 11 ΙΒΚ ΙΙΙ, 8 ΙΒΚ ΙΙ). 64

65 Μεθυλίωση του γονιδίου MSH6 παρατηρήθηκε σε 22 όγκους (40%, 16 ΙΒΚ IV, 6 ΙΒΚ ΙΙΙ). Συχνότητα έκφρασης του VEGF Οι ισομορφές του γονιδίου VEGF, VEGFxxxa, εμφάνισαν αυξημένη σχετική έκφραση mrna σε 35 όγκους (23,3%, 31 ΙΒΚ IV, 3 ΙΒΚ ΙΙΙ,1 ΙΒΚ ΙΙ) ενώ πολύ υψηλά επίπεδα παρατηρήθηκαν σε 36 όγκους (24%, 35 ΙΒΚ IV, 1 ΙΒΚ ΙΙΙ). Οι αντίστοιχες συχνότητες της έκφρασης mrna για τις ισομορφές VEGFxxxb ήταν 26 (17,3%, 24 ΙΒΚ IV, 2 ΙΒΚ ΙΙΙ) και 21 (14%, 20 ΙΒΚ IV, 1 ΙΒΚ ΙΙΙ). Χαμηλή αναλογία έκφρασης των 2 ομάδων ισομορφών VEGFxxxb/xxxa παρατηρήθηκε σε 13 όγκους (8,7%, 12 ΙΒΚ IV, 1 ΙΒΚ ΙΙΙ), ενώ ιδιαίτερα χαμηλή αναλογία σημειώθηκε για 68 όγκους (45,3%, 52 ΙΒΚ IV, 5 ΙΒΚ ΙΙΙ, 11 ΙΒΚ ΙΙ). Συχνότητα χρωμοσωμικών απωλειών στα 1p και 19q Αξιολογήσιμα αποτελέσματα για τον έλεγχο απώλειας του 19q είχαμε για 60 όγκους, από τους οποίους οι 21 (35%, 9 ΙΒΚ IV, 8 ΙΒΚ ΙΙΙ, 4 ΙΒΚ ΙΙ) παρουσίασαν απώλεια της χρωμοσωμικής περιοχής και για τα δύο αλληλόμορφα. Απώλεια της περιοχής 1p13 (γονίδιο NRAS) παρατηρήθηκε σε 27 από τους 62 όγκους που εκτιμήθηκαν (43,5%, 16 ΙΒΚ IV, 8 ΙΒΚ ΙΙΙ, 3 ΙΒΚ ΙΙ). H συχνότητα απώλειας για τα 1p36 (τελομερικό άκρο) και 1p22 (γονίδιο BCAR3) ήταν 25 (45,5%, 12 ΙΒΚ IV, 9 ΙΒΚ ΙΙΙ, 4 ΙΒΚ ΙΙ) και 26 (46,4%, 15 ΙΒΚ IV, 8 ΙΒΚ ΙΙΙ, 3 ΙΒΚ ΙΙ) όγκοι, αντίστοιχα. Ταυτόχρονη απώλεια για τις χρωμοσωμικές περιοχές 1p και 19q παρατηρήθηκε σε 20 από τους 59 όγκους που εξετάστηκαν (33,9%, 9 ΙΒΚ IV, 8 ΙΒΚ ΙΙΙ, 3 ΙΒΚ ΙΙ). 65

66 ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΜΕ ΤΑ ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΩΝ ΟΓΚΩΝ ιαφορές ανάμεσα σε πρωτοπαθή δευτεροπαθή γλοιοβλαστώματα Η μόνη στατιστικά σημαντική συσχέτιση των πρωτοπαθών σε σχέση με τα δευτεροπαθή γλοιοβλαστώματα που βρέθηκε, ήταν η πυρηνική ανοσοϊστοχημική θετικότητα για τη θέση φωσφορυλίωσης Ser473 της Akt, η οποία παρατηρήθηκε κυρίως στα δευτεροπαθή γλοιοβλαστώματα (p=0,019 ChiSq). Όλοι οι όγκοι με απώλεια της χρωμοσωμικής περιοχής 1p22 αφορούσαν σε δευτεροπαθή γλοιοβλαστώματα, αλλά δεν προέκυψε στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα λόγω του μικρού αριθμού των όγκων με απώλεια (μόνο 5). Υπερέκφραση του mrna του γονιδίου EGFR παρατηρήθηκε στο 38,8% των δευτεροπαθών γλοιοβλαστωμάτων (7/18) και στο 34% των πρωτοπαθών (36/106, p=0,872 ChiSq). Υπερέκφραση της μεταλλαγμένης μορφής του γονιδίου EGFRvIII παρατηρήθηκε επίσης τόσο στα πρωτοπαθή (19/106) όσο και στα δευτεροπαθή γλοιοβλαστώματα (6/18, p=0,180 ChiSq). Μεταξύ των δευτεροπαθών γλοιoβλαστωμάτων με υπερέκφραση EGFR (mrna), 2 ανήκαν σε ασθενείς με γνωστό ιστορικό χαμηλού βαθμού κακοήθειας αστροκυτώματος και 5 περιλάμβαναν περιοχές ιστολογικά χαμηλότερου βαθμού κακοήθειας γλοιώματος (ιστολογικός χαρακτηρισμός). Αντίστοιχα, μεταξύ των δευτεροπαθών γλοιοβλαστωμάτων με υπερέκφραση EGFRvIII (mrna) 2 ανήκαν σε ασθενείς με γνωστό ιστορικό (υποτροπή). Ένας από αυτούς τους 2 όγκους εμφάνισε ταυτόχρονη υπερέκφραση των EGFR και EGFRvIII (mrna), ενώ ο δεύτερος παρουσίασε φυσιολογικά επίπεδα έκφρασης mrna EGFR. Αυξημένη σχετική έκφραση του mrna για το γονίδιο p16 INK4Α παρατηρήθηκε σε μεγαλύτερο ποσοστό δευτεροπαθών γλοιοβλαστωμάτων (5/17, 29,4% ) σε σχέση με τα πρωτοπαθή (11/100, 11%). Παρολ αυτά δε σημειώθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά ανάμεσα στις δύο ομάδες όγκων (p=0,068 ChiSq). Όγκοι με ολιγοδενδρογλοιακό στοιχείο Έκφραση ή υπερέκφραση του mrna για το p16 INK4Α παρατηρήθηκε συχνότερα στους όγκους με ολιγοδενδρογλοιακό στοιχείο (5/9, 55,6%) σε σχέση με τους αμιγώς αστροκυτταρικούς όγκους (26/141, 18,5%), με στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα (p<0,0001, ChiSq). Πολύ χαμηλή αναλογία έκφρασης του mrna των ισομορφών του VEGF, VEGFxxxb/xxxa παρατηρήθηκε αποκλειστικά στους αμιγώς αστροκυτταρικούς όγκους (p=0,016 ChiSq), ενώ κανένας από τους 9 όγκους με ολιγοδενδρογλοιακό στοιχείο που εξετάστηκαν δεν παρουσίασε πολύ χαμηλές τιμές. Υπερέκφραση του mrna για το γονίδιο EGFR παρατηρήθηκε τόσο στους αστροκυτταρικούς όγκους όσο και στους όγκους με παρουσία ολιγοδενδρογλοιακού στοιχείου (p=0,087, ChiSq). Όσο για την έκφραση του mrna για το γονίδιο EGFRvIII, αν και γονιδιακή υπερέκφραση σημειώθηκε μόνο σε έναν από τους 10 όγκους με ολιγοδενδρογλοιακό στοιχείο που εξετάστηκαν, δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική συσχέτιση (p=0,283, ChiSq). Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι από τους 9 όγκους με ολιγοδενδρογλοιακό στοιχείο που εξετάστηκαν για έκφραση του mrna για το γονίδιο MGMT, κανένας δεν εμφάνισε πολύ χαμηλή σχετική έκφραση. Παρ όλα αυτά, δεν σημειώθηκε στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα (p=0,067, ChiSq). Συσχέτιση της ιστολογικής παρουσίας ολιγοδενδρογλοιακού στοιχείου δε σημειώθηκε ούτε για τις χρωμοσωμικές απώλειες στα 1p και 19q, οι αριθμοί όμως των όγκων αυτών με αξιολογήσιμο αποτέλεσμα και με απώλεια ήταν πολύ μικροί σε σχέση με το σύνολο των όγκων. Παρόλα αυτά, τα δύο αναπλαστικά ολιγοδενδρογλοιώματα που εξετάστηκαν, παρουσίασαν απώλεια για όλες τις θέσεις που εξετάστηκαν, με 66

67 ταυτόχρονη μεθυλίωση του γονιδίου MGMT, ενώ ένα είχε μεθυλίωση του γονιδίου MSH6. Ιστολογική διαβάθμιση των όγκων και συσχέτιση με μοριακά προφίλ Γενωμικές αλλαγές που σχετίζονται με την ιστολογική διαβάθμιση Στον ΠΙΝΑΚΑ 7 αναφέρονται οι γενωμικές μεταβολές που παρουσίασαν συσχέτιση με την ιστολογική διαβάθμιση και η στατιστική σημαντικότητα (p). Στον ΠΙΝΑΚΑ 8 αναφέρεται η συχνότητα των γενωμικών μεταβολών σε σχέση με τον ΙΒΚ. Χρωμοσωμικές απώλειες στα 1p22 και 1p36, καθώς και ταυτόχρονη χρωμοσωμική απώλεια στα 1p και 19q παρατηρήθηκαν πιο συχνά στα γλοιώματα ΙΒΚ II και ΙΙΙ, σε σχέση με τα γλοιοβλαστώματα (p=0,015, 0,013 και 0,007 αντίστοιχα, ChiSq). Ενίσχυση του γονιδίου EGFR, από την άλλη, παρατηρήθηκε κυρίως στα γλοιοβλαστώματα, σε σχέση με τα γλοιώματα ΙΒΚ ΙΙ και ΙΙΙ (p=0,011, ChiSq) ιαφορές στη γονιδιακή έκφραση που σχετίζονται με την ιστολογική διαβάθμιση Οι διαφορές στη γονιδιακή έκφραση (mrna) που παρουσίασαν συσχέτιση με τον ιστολογικό βαθμό κακοήθειας των όγκων, η στατιστική σημαντικότητα (p), καθώς και η μέθοδος στατιστικής ανάλυσης για τον κάθε μοριακό στόχο περιγράφονται στον ΠΙΝΑΚΑ 7, ενώ στον ΠΙΝΑΚΑ 9 αναγράφονται οι μέσες τιμές σχετικής mrna έκφρασης για κάθε στόχο, σε κάθε ΙΒΚ, καθώς και στα ΜΝΕ. Υπερέκφραση του mrna για το γονίδιο EGFR παρατηρήθηκε σχεδόν αποκλειστικά σε όγκους ΙΒΚ IV (p=0,011), ενώ η έκφραση του μεταλλαγμένου γονιδίου EGFRvIII ήταν μεγαλύτερη στα χαμηλού ΙΒΚ γλοιώματα (p=0,019, ΜW). Από την άλλη, ταυτόχρονη γονιδιακή υπερέκφραση για τα δύο γονίδια παρατηρήθηκε αποκλειστικά σε γλοιοβλαστώματα (p=0,019, ChiSq). Τα γονίδια MDM2 και MET παρουσίασαν υψηλότερες τιμές σχετικής έκφρασης του mrna στα γλοιώματα υψηλού βαθμού κακοήθειας (p=0,001 και για τα δύο, MW). Οι μέσες τιμές σχετικής έκφρασης mrna για το γονίδιο PIK3CA ήταν χαμηλότερες στα γλοιοβλαστώματα σε σχέση με τους όγκους ΙΒΚ ΙΙ και ΙΙΙ (p<0,000, MW). To γονίδιο SRC παρουσίασε υψηλότερες μέσες τιμές mrna έκφρασης στα γλοιοβλαστώματα, σε σχέση με τους όγκους ΙΒΚ ΙΙ και ΙΙΙ (p=0,001 MW). Το γονίδιο STAT3 παρουσίασε συχνότερα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης στους όγκους ΙΒΚ ΙΙΙ σε σχέση με τους χαμηλού ΙΒΚ όγκους (p=0,010 ChiSq). Αντίθετα, τα γονίδια STAT5A και STAT5B παρουσίασαν συχνότερα υψηλές τιμές σχετικής mrna έκφρασης στους χαμηλού ΙΒΚ όγκους (p=0,018, p=0,003, αντίστοιχα, ChiSq). Το γονίδιο MGMT εμφάνισε σημαντικά χαμηλότερες τιμές σχετικής έκφρασης του mrna στα γλοιοβλαστώματα, σε σχέση με τους όγκους ΙΒΚ ΙΙΙ (p<0.0001, ΜW), ενώ η συχνότητα χαμηλής έκφρασης του mrna για τα γονίδια PHLPP1, PHLPP2 και DARPP32 βρέθηκε να αυξάνει ανάλογα με το βαθμό κακοήθειας (p<0,0001 και για τα 3, MW). Επίσης, πολύ χαμηλή αναλογία έκφρασης των ισομορφών του VEGF, VEGFxxxb/xxxa, παρατηρήθηκε συχνότερα στα γλοιοβλαστώματα (p=0,004, MW). 67

68 ιαφορές στην πρωτεϊνική έκφραση και ενεργοποίηση που σχετίζονται με την ιστολογική διαβάθμιση Οι διαφορές στην έκφραση και ενεργοποίηση πρωτεϊνών που παρουσίασαν συσχέτιση με τον ΙΒΚ, καθώς και οι αντίστοιχες τιμές στατιστικής σημαντικότητας (p) περιγράφονται στον ΠΙΝΑΚΑ 7. Στον ΠΙΝΑΚΑ 10 αναγράφονται τα αποτελέσματα της ανοσοϊστοχημείας σε σχέση με τον ΙΒΚ των όγκων. Έντονη πρωτεϊνική έκφραση του EGFR (κυτταροπλασματική ή μεμβρανική θετικότητα σε ποσοστό >50% των νεοπλασματικών κυττάρων), παρατηρήθηκε, όπως και για τη γονιδιακή υπερέκφραση, σχεδόν αποκλειστικά σε γλοιοβλαστώματα (p<0,0001, ChiSq), ενώ το ίδιο φάνηκε να ισχύει και για την πρωτεϊνική έκφραση του EGFRvIII με ταυτόχρονη έντονη θετικότητα για τον EGFR (p<0,0001, ChiSq) (ΕΙΚΟΝΕΣ 9 και 10). Φωσφορυλίωση της Αkt και για τις δύο θέσεις φωσφορυλίωσης (Ser473 και Thr308) παρατηρήθηκε σχεδόν αποκλειστικά σε όγκους IBK ΙV (p<0,0001, ChiSq, και για τις δύο θέσεις φωσφορυλίωσης). Επίσης, η πρωτεΐνη Stat3 παρουσίασε ενεργοποίηση συχνότερα στα γλοιοβλαστώματα, σε σχέση με τους όγκους IBK II και ΙΙΙ (p=0,016, ChiSq). Θετικότητα για την πρωτεΐνη MGMT (>5% πυρηνική θετικότητα) παρατηρήθηκε συχνότερα στα γλοιώματα IBK ΙΙ και ΙΙΙ σε σχέση με τα γλοιοβλαστώματα, με ήπια θετική συσχέτιση (p=0,024 ChiSq), ενώ έντονη θετικότητα για την ίδια πρωτεΐνη (πυρηνική θετικότητα σε ποσοστό >20% των vεοπλασματικών κυττάρων) παρατηρήθηκε κυρίως σε γλοιώματα IBK ΙΙ και ΙΙΙ (p<0,0001, ChiSq) [EIKONΑ 8]. 68

69 69

70 70

71 71

72 72

73 Α Β Γ Ε Ζ ΕΙΚΟΝΑ 8: Παραδείγματα ανοσοϊστοχημικής έκφρασης για την MGMT σε ΜΝΕ (Α), και σε όγκους της γλοίας (Β-Ζ). Β-Γ: Σε όγκους ΙΒΚΙΙ ήταν συχνή η έντονη έκφραση της πρωτεΐνης (>20% έντονη χρώση).,ε : Αναπλαστικό αστροκύτωμα ( ) και γλοιοβλάστωμα (Ε) με θετικότητα σε ~15% των κυττάρων. Ζ: Η απώλεια έκφρασης της πρωτεΐνης ήταν συχνότερη στα γλοιοβλαστώματα. ΜΝΕ: είγματα μη-νεοπλασματικού εγκεφάλου, ΙΒΚ: Ιστολογικός βαθμός κακοήθειας 1A 1B 2A EGFR 2B EGFRvIII ΕΙΚΟΝΑ 9: ύο περιπτώσεις γλοιοβλαστωμάτων (1, 2) με πρωτεϊνική υπερέκφραση για τον EGFR και έκφραση για τον EGFRvIII. IBKII IBKIII ΕΙΚΟΝΑ 10: ύο περιπτώσεις όγκων ΙΒΚ ΙΙ και ΙΙΙ με ανοσοϊστοχημική θετικότητα για τον EGFRvIII. Η χρώση για τον EGFR στους όγκους αυτούς ήταν αρνητική. ΙΒΚ: Ιστολογικός βαθμός κακοήθειας 73

74 ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΙΣΤΟΛΟΓΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΩΝ ΤΩΝ ΟΓΚΩΝ ΜΕ ΤΗΝ ΗΛΙΚΙΑ ΤΩΝ ΑΣΘΕΝΩΝ Η ηλικία των ασθενών παρουσίασε θετική συσχέτιση με την ιστολογική διαβάθμιση των όγκων (p<0,0001, MW). Τα γλοιοβλαστώματα παρατηρήθηκαν σε μεγαλύτερης ηλικίας ασθενείς (μέση ηλικία 56,6) σε σχέση με τα γλοιώματα IBK ΙΙ και ΙΙΙ (μέσες ηλικίες ασθενών 40,8 και 46,7 αντίστοιχα). Επίσης τα δευτεροπαθή γλοιοβλαστώματα παρατηρήθηκαν σε νεότερους ασθενείς (μέση ηλικία 48,5) σε σχέση με τα πρωτοπαθή (μέση ηλικία 57,9), με στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα (p=0,013, MW). ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΜΕ ΤΑ ΚΛΙΝΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΤΩΝ ΑΣΘΕΝΩΝ Ηλικία ασθενών Οι απώλειες στις χρωμοσωμικές θέσεις 1p13 και 1p36, καθώς και η ταυτόχρονη χρωμοσωμική απώλεια στα 1p και 19q παρατηρήθηκαν σε νεότερους ασθενείς [μέση ηλικία σε απώλεια 46,0, 47,7, 46,4 και στατιστική σημαντικότητα (p, ChiSq) 0,002, 0,040, 0,028 αντίστοιχα]. Απώλεια στο 1p22 παρατηρήθηκε επίσης σε νεότερους ασθενείς (μέση ηλικία 53,4) σε σχέση με τους όγκους χωρίς απώλεια (μέση ηλικία ασθενών 56,7), με μικρότερη όμως διαφορά, η οποία δεν έδωσε στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα. (p=0,423, ChiSq). Σε νεότερους ασθενείς παρατηρήθηκε επίσης και η έκφραση των πρωτεϊνών p53 (θετικότητα >5%), p21 Waf1/Cip1 (πυρηνική θετικότητα) και p27 KIP1 (κυτταροπλασματική θετικότητα), με τιμές στατιστικής σημαντικότητας (p) 0,006, 0,002, 0,005 αντίστοιχα (MW). Αντίθετα, τόσο η ενεργοποίηση της πρωτεϊνης Stat3 όσο και η έντονη πρωτεϊνική έκφραση του EGFR παρατηρήθηκαν σε μεγαλύτερες ηλικίες ασθενών (p=0,007 και 0,029, MW). Tέλος, αντίστροφη συσχέτιση με την ηλικία των ασθενών εμφάνισε και η mrna έκφραση για το γονίδιο DARPP32 (p=0.0034, Spearman s rho). Eπιβίωση - ιάστημα ελεύθερο επιδείνωσης της νόσου Απώλεια στο 1p36 Η απώλεια στο τελομερικό άκρο του 1p εμφάνισε στατιστικά σημαντική συσχέτιση τόσο με την επιβίωση των ασθενών όσο και με το διάστημα ελεύθερο επιδείνωσης της νόσου (p=0,029 και 0,044, Caplan Meier). Ο χρόνος επιβίωσης ήταν μεγαλύτερος για τους ασθενείς με απώλεια στο 1p36 (μέσος χρόνος επιβίωσης 34,0 μήνες) σε σχέση με τους ασθενείς για τους οποίους δεν παρατηρήθηκε απώλεια (μέσος χρόνος επιβίωσης 14,7 μήνες) [EIKONΑ 11]. Η μέση τιμή του διαστήματος ελεύθερου επιδείνωσης για τους όγκους με απώλεια στο 1p36 ήταν 20,9 μήνες, ενώ για τους όγκους χωρίς απώλεια ήταν 10,4 μήνες. 74

75 Απώλεια στο 1p22 (γονίδιο BCAR3) Το διάστημα ελεύθερο επιδείνωσης ήταν μεγαλύτερο στους όγκους με διατήρηση της χρωμοσωμικής περιοχής 1p22 (μέση τιμή 12,9 μήνες), σε σχέση με τους όγκους με απώλεια (μέση τιμή 6,4 μήνες). Παρόλα αυτά δε βρέθηκε στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα. Γονίδιο MGMT H μεθυλίωση του γονιδίου MGMT και η απουσία έκφρασης της πρωτεΐνης εμφάνισαν τάση συσχέτισης με μεγαλύτερη επιβίωση (ΕΙΚΟΝΑ 12), χωρίς όμως στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα (p=0,085, Caplan Meier). Από την άλλη, δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση με το διάστημα ελεύθερο επιδείνωσης για καμία από τις εξεταζόμενες παραμέτρους. P=0,029 P=0,044 Απώλεια 1p36 Απώλεια 1p36 Επιβίωση (μήνες) ιάστημα ελεύθερο επιδείνωσης (μήνες) EIKONA 11: Σχέση της απώλειας του 1p36 με την επιβίωση και το διάστημα ελεύθερο επιδείνωσης της νόσου, για τους ασθενείς με γλοιοβλάστωμα. P=0,137 Μεθυλίωση γονιδίου MGMT P=0,085 Απουσία πρωτεΐνης MGMT Eπιβίωση (μήνες) Eπιβίωση (μήνες) EIKONA 12: Η μεθυλίωση του επαγωγέα του γονιδίου MGMT, καθώς και η απουσία έκφρασης της πρωτεΐνης στα γλοιοβλαστώματα, παρουσίασαν τάση συσχέτισης με μεγαλύτερη επιβίωση των ασθενών, χωρίς όμως στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα. 75

76 Έκφραση αγγειογενετικών και αντι-αγγειογενετικών ισομορφών του VEGF Οι όγκοι με υψηλή έκφραση των αγγειογενετικών ισομορφών του VEGF εμφάνισαν συντομότερα επιδείνωση μετά τη λήψη ακτινοθεραπείας/τεμοζολομίδης σε σχέση με τους όγκους με χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης, χωρίς όμως στατιστικά σημαντική συσχέτιση (p=0,062, Caplan-Meier, ΕΙΚΟΝΑ 13). Η υψηλή έκφραση των αντι-αγγειογενετικών ισομορφών του VEGF (άνω τριτημόριο τιμών σχετικής έκφρασης) εμφάνισε συσχέτιση με συντομότερο διάστημα ελεύθερο επιδείνωσης (p=0,027). Η συσχέτιση με την κλινική αυτή παράμετρο ανευρέθηκε πολύ ισχυρότερη, μετά από διαχωρισμό των τιμών σε τεταρτημόρια, για τους όγκους με πολύ υψηλές τιμές σχετικής mrna έκφρασης των αντι-αγγειογενετικών ισομορφών του VEGF (p=0,004, Caplan-Meier, EIKONA 13). P=0,062 P=0,004 Υψηλή έκφραση VEGFxxxa Υψηλή έκφραση VEGFxxxb ιάστημα ελεύθερο επιδείνωσης (μήνες) ιάστημα ελεύθερο επιδείνωσης (μήνες) ΕΙΚΟΝΑ 13: Οι ισομορφές VEGFxxxb στα γλοιοβλαστώματα παρουσίασαν ισχυρή συσχέτιση με το διάστημα ελεύθερο επιδείνωσης της νόσου. H υψηλή έκφραση των ισομορφών VEGFxxxa παρουσίασε επίσης τάση συσχέτισης με την κλινική αυτή παράμετρο, χωρίς όμως στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα. 76

77 Έκφραση mrna για το γονίδιο DARPP32 Κατά τη στατιστική ανάλυση με τη μέθοδο Cox regression διαπιστώθηκε ότι η υψηλή mrna έκφραση για το γονίδιο DARPP32, ενώ δεν παρουσίασε συσχέτιση με μεγαλύτερη επιβίωση, εμφάνισε τάση συσχέτισης με μεγαλύτερο διάστημα ελεύθερο επιδείνωσης (HR=0.179, 95% CI= , p=0.076). Περαιτέρω διερεύνηση με τη μέθοδο ROC αποκάλυψε την τιμή σχετικής έκφρασης ως όριο διαχωρισμού των δειγμάτων, με στατιστικά σημαντική συσχέτιση με την ανταπόκριση των ασθενών στη θεραπεία, όπως ορίστηκε με βάση το 6μηνο διάστημα ελεύθερο επιδείνωσης. εκατρείς από 27 (48.1%) ασθενείς με όγκους με τιμές σχετικής έκφρασης < παρουσίασαν επιδείνωση στο πρώτο 6μηνο της θεραπείας από την άλλη, μόνο 3 από 39 (7.7%) ασθενείς με όγκους με τιμές σχετικής έκφρασης εμφάνισαν επιδείνωση στο ίδιο χρονικό διάστημα. Επίσης, οι ασθενείς που αντιστοιχούσαν σε υψηλότερα από την προτεινόμενη τιμή επίπεδα έκφρασης mrna για την Darpp32, παρουσίασαν γενικά μεγαλύτερο διάστημα ελεύθερο επιδείνωσης (12.6 μήνες) σε σχέση με τους ασθενείς που αντιστοιχούσαν σε χαμηλές τιμές σχετικής έκφρασης (6.1 μήνες, p<0,001, Caplan-Meier). Μεταξύ των ασθενών με υψηλά επίπεδα έκφρασης mrna για το γονίδιο DARPP32 παρατηρήθηκε επίσης μεγαλύτερη επιβίωση μετά από την αρχική εκτομή (19.9 μήνες για τιμές σε σχέση με 14.8 μήνες για τιμές <0.0291, p=0.032, Caplan-Meier) [ΕΙΚΟΝΑ 14]. Έκφραση mrna για το γονίδιο STAT5B Η ανάλυση ROC όσον αφορά την έκφραση mrna για το γονίδιο STAT5B αποκάλυψε την τιμή σχετικής έκφρασης , ως όριο διαχωρισμού των όγκων, με στατιστικά σημαντική συσχέτιση με την ανταπόκριση στη θεραπεία. Συγκεκριμένα, μόνο το 10% (4/40) των ασθενών με όγκους με υψηλή έκφραση του γονιδίου ( ) εμφάνισαν επιδείνωση σε χρονικό διάστημα 6 μηνών από την αρχική διάγνωση. Αντίθετα, επιδείνωση στο ίδιο χρονικό διάστημα εμφάνισε το 45.8% (11/24) των ασθενών με χαμηλή (<0.2305) σχετική έκφραση για το STAT5B. Επιπλέον, οι ασθενείς με όγκους με υψηλά επίπεδα έκφρασης mrna για το γονίδιο STAT5B παρουσίασαν μεγαλύτερο διάστημα ελεύθερο επιδείνωσης σε σχέση με τους ασθενείς στους οποίους αντιστοιχούσαν χαμηλές τιμές (μέση τιμή 12.8 μήνες για τιμές σχετικής έκφρασης του STAT5B , σε σχέση με 6.5 μήνες για τιμές <0.2305, p=0.0045, Caplan-Meier). Οι υψηλές τιμές σχετικής έκφρασης για το γονίδιο STAT5B παρουσίασαν επίσης τάση συσχέτισης με μεγαλύτερη επιβίωση μετά την αρχική εκτομή, χωρίς όμως στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα [ΕΙΚΟΝΑ 15]. Ταυτόχρονη υψηλή έκφραση DARPP32 και STAT5B Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι οι ασθενείς με ταυτόχρονη υψηλή mrna έκφραση για τα γονίδια DARPP32 και STAT5B (n=30) παρουσίασαν σημαντικά μεγαλύτερο διάστημα ελεύθερο επιδείνωσης (18 μήνες), σε σχέση με τους ασθενείς με όγκους με χαμηλή έκφραση σε ένα ή και στα δύο γονίδια (n=36, 8.8 μήνες, p= ). Συγκεκριμένα, το διάστημα ελεύθερο επιδείνωσης για τους όγκους με υψηλή έκφραση ήταν σημαντικά μεγαλύτερο από τους όγκους με χαμηλή mrna έκφραση και για τα δύο γονίδια (n=15, 7.6 μήνες, p=0.0004) ή από αυτούς με χαμηλή έκφραση μόνο για το γονίδιο DARPP32 (n=12, 8.2 μήνες, p= ) [EIKONA 16]. 77

78 A B Ανταπόκριση στη θεραπεία ανάλογα με την έκφραση του DARPP32 σε ασθενείς με γλοιοβλάστωμα Χωρίς επιδείνωση Με επιδείνωση Ευαισθησία Αριθμός ασθενών Ειδικότητα p= Γ ιάστημα ελεύθερο επιδείνωσης (μήνες) DARPP DARPP32 < Επιβίωση (μήνες) ΕΙΚΟΝΑ 14: Σχέση της έκφρασης mrna για το γονίδιο DARPP32 με την κλινική πορεία των ασθενών με γλοιοβλάστωμα. 78

79 A B Ανταπόκριση στη θεραπεία ανάλογα με την έκφραση του STAT5B σε ασθενείς με γλοιοβλάστωμα Χωρίς επιδείνωση Με επιδείνωση Ευαισθησία Αριθμός ασθενών Ειδικότητα p= Γ ιάστημα ελεύθερο επιδείνωσης (μήνες) STAT5B STAT5B < Επιβίωση (μήνες) ΕΙΚΟΝΑ 15: Σχέση της έκφρασης mrna για το γονίδιο STAT5B με την κλινική πορεία των ασθενών με γλοιοβλάστωμα. ΕΙΚΟΝΑ 16: Η ταυτόχρονη υψηλή mrna έκφραση για τα γονίδια DARPP32 και STAT5B παρουσίασε ισχυρή συσχέτιση με μεγαλύτερο διάστημα ελεύθερο επιδείνωσης της νόσου (μήνες), στους ασθενείς με γλοιοβλάστωμα. ιάστημα ελεύθερο επιδείνωσης (μήνες) Υψηλή έκφραση DARPP32 & STAT5B Χαμηλή έκφραση DARPP32 ή/και STAT5B 79

80 ΣΥΣΧΕΤΙΣΕΙΣ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΠΑΡΑΜΕΤΡΩΝ ΠΟΥ ΕΞΕΤΑΣΤΗΚΑΝ Παράμετροι που σχετίζονται με τους υποδοχείς EGFR, MET και HER2 Παράμετροι που σχετίζονται με τον EGFR και το μεταλλαγμένο προϊόν του γονιδίου, τον EGFRvIII Οι παράμετροι που σχετίζονται με τoν EGFR και τον EGFRvIII, καθώς και η στατιιστική σημαντικότητα (p), περιγράφονται στον ΠΙΝΑΚΑ 11. Η γονιδιακή ενίσχυση του EGFR εμφάνισε ισχυρή συσχέτιση τόσο με την έκφραση του mrna (p<0,000 MW) όσο και με την έντονη θετικότητα στην πρωτεΐνη (θετικότητα >50%, p<0,0001 Chi Sq). Οι περισσότεροι όγκοι με ενίσχυση γονιδίου (24/30 όγκοι) είχαν έντονη έκφραση πρωτεΐνης, ενώ μόνο ένας ήταν αρνητικός. Από την άλλη, 11 από τους 65 όγκους με έντονη πρωτεϊνική έκφραση του EGFR δεν παρουσίασαν γονιδιακή ενίσχυση. Η έκφραση του mrna για το γονίδιο EGFR εμφάνισε αρνητική συσχέτιση με τις χρωμοσωμικές απώλειες στα 1p22, 1p36 και 1p/19q (p=0,040, 0,002 και 0,025 αντίστοιχα, MW). Οι όγκοι με απώλειες στις συγκεκριμένες θέσεις, παρουσίασαν χαμηλότερη σχετική έκφραση του EGFR. Αρνητική συσχέτιση με την έκφραση του mrna για τον EGFR σημειώθηκε επίσης και για την πρωτεϊνική έκφραση του p53 (θετικότητα >5%, p=0,016 MW). Θετική συσχέτιση της έκφρασης του EGFR σημειώθηκε για την έκφραση του mrna για το γονίδιο MDM2 (p=0,010, Spearman;s Rho). Η έκφραση του mrna για το γονίδιο EGFRvIII εμφάνισε θετική συσχέτιση τόσο με τη γονιδιακή ενίσχυση (p=0,001, MW) όσο και με την έντονη πρωτεϊνική έκφραση του EGFR (p=0,025, MW). H έντονη πρωτεϊνική έκφραση του EGFR εκτός από τη γονιδιακή ενίσχυση, παρουσίασε θετική συσχέτιση και με τη σχετική έκφραση του mrna του γονιδίου (p<0,0001, ΜW). Από την άλλη, η θετικότητα της πρωτεΐνης σε ποσοστό 5-50% των νεοπλασματικών κυττάρων δεν εμφάνισε συσχέτιση με την έκφραση του mrna (p=0,759, MW). Αρνητική συσχέτιση σημειώθηκε επίσης με την έντονη θετικότητα στην πρωτεΐνη MGMT (>20%, p=0,014, ChiSq), καθώς και με τη θετικότητα στην πρωτεΐνη p53 (p=0,014, ChiSq). Η πρωτεϊνική έκφραση του EGFRvIII εμφάνισε θετική συσχέτιση με την έντονη πρωτεϊνική έκφραση του EGFR (p=0,029 ChiSq) και με την φωσφορυλίωση της Akt στη Thr308 (p=0,012 ChiSq), ενώ δεν παρουσίασε συσχέτιση με την mrna έκφραση του EGFRvIII. Η ταυτόχρονη πρωτεϊνική έκφραση του EGFRvIII και η έντονη θετικότητα για την πρωτεΐνη του EGFR εμφάνισε θετική συσχέτιση με την ενίσχυση του γονιδίου (p=0,002 ChiSq) και με την έκφραση του mrna για τον EGFR (p<0,0001, ChiSq), καθώς και με την έκφραση mrna για τον EGFRvIII (p=0,001 MW). (ΠΙΝΑΚΑΣ 11). 80

81 81

82 Παράμετροι που σχετίζονται με την έκφραση του υποδοχέα ΜΕΤ Aρνητική συσχέτιση της έκφρασης του mrna για το γονίδιο ΜΕΤ παρατηρήθηκε τόσο με την ενίσχυση του γονιδίου του EGFR (p=0,019, MW), όσο και την έντονη πρωτεΐνική έκφραση του EGFR (p=0,023, MW), παρά το μικρό αριθμό τον όγκων με αυξημένη σχετική mrna έκφραση για τον υποδοχέα MET (βλέπε συχνότητες έκφρασης). Μεταξύ των όγκων με υπερέκφραση του mrna του γονιδίου (4 υψηλού ΙΒΚ γλοιώματα) μόνο ένας, ΙΒΚ IV, παρουσίασε και ενίσχυση του γονιδίου EGFR ενώ ένα δεύτερο γλοιοβλάστωμα εμφάνισε υπερέκφραση του mrna για το γονίδιο EGFRvIII, χωρίς παρουσία γονιδιακής ενίσχυσης ή υπερέκφρασης mrna για τον EGFR. Η έκφραση mrna για το γονίδιο ΜΕΤ εμφάνισε θετική συσχέτιση με την έκφραση mrna των γονιδίων p16 INK4A, MDM2, SRC, STAT3, HER2 και PIK3CA (mrna, ΠΙΝΑΚΑΣ 12). Η έκφραση του ΜΕΤ εμφάνισε επίσης θετική συσχέτιση και με την ενεργοποίηση της Akt στη Thr308 (p=0,004, MW). Οι περισσότεροι όγκοι με αυξημένη έκφραση του mrna για το γονίδιο MET (9 από 11) ήταν θετικοί για φωσφορυλίωση της Αkt στη Τhr308, ενώ για τους υπόλοιπους 2 δεν υπήρξαν αξιολογήσιμα αποτελέσματα για την ανοσοϊστοχημική χρώση. Ενεργοποίηση της πρωτεΐνης mtor παρουσίασαν 3 από τους 7 όγκους με αξιολογήσιμα αποτελέσματα, ενώ 2 όγκοι εμφάνισαν mrna έκφραση για το γονίδιο MGMT (ΠΙΝΑΚΑΣ 12). Οι συσχετίσεις της ενεργοποίησης του υποδοχέα ΜΕΤ δεν αξιολογήθηκαν λόγω του μικρού αριθμού των θετικών όγκων (μόνο 4 όγκοι). ύο από αυτούς εμφάνισαν υπερέκφραση mrna και οι υπόλοιποι δύο παρουσίασαν αυξημένη σχετική έκφραση mrna για το γονίδιο ΜΕΤ. Μεταξύ των 4 αυτών όγκων, σε κανέναν δεν παρατηρήθηκε γονιδιακή ενίσχυση ή υπερέκφραση mrna για τον ΕGFR, ενώ ένας από αυτούς παρουσίασε υπερέκφραση του mrna για τον EGFRvIII με φυσιολογικά επίπεδα έκφρασης mrna για τον EGFR. Παράμετροι που σχετίζονται με την έκφραση του υποδοχέα HER2 Η έκφραση του mrna για το γονίδιο HER2 ήταν παράλληλη με την αντίστοιχη έκφραση για τα γονίδια MDM2 (p<0,0001, Spearman s Rho), p16 INK4Α (p<0,0001, Spearman s Rho), PIK3CA (p<0,0001, Spearman s Rho) και MGMT (p<0,0001, Spearman s Rho). Παράλληλη ήταν και η mrna έκφραση του γονιδίου HER2 με τα γονίδια SRC (p<0,0001, Spearman s Rho), STAT3 (p=0,009, Spearman s Rho), STAT5A (p=0,012, Spearman s Rho) και STAT5B (p=0,008, Spearman s Rho). Οι όγκοι με έκφραση mrna για το γονίδιο HER2 είχαν γενικά υψηλά επίπεδα αντίστοιχης έκφρασης για τις αντι-αγγειογενετικές ισομορφές του VEGF, xxxb (p=0,008, Spearman s Rho) [ΠΙΝΑΚΑΣ 12]. 82

83 Παράμετροι που σχετίζονται με την αγγειογένεση H έκφραση του mrna για τις ισομορφές του VEGF (VEGFxxxa, VEGFxxxb) παρουσίασε στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις με πολλές παραμέτρους, που περιγράφονται στον ΠΙΝΑΚΑ 12. Παράμετροι που σχετίζονται με την έκφραση των ισομορφών VEGFxxxa Η mrna έκφραση των ισομορφών VEGFxxxa εμφάνισε θετική συσχέτιση με τη γονιδιακή ενίσχυση (p=0,015, MW) και mrna έκφραση (p<0,000, Spearman s Rho) του EGFR, καθώς και με τη φωσφορυλίωση της Akt στη Thr308 (p=0,035, MW). Η έκφραση των δύο ομάδων ισομορφών του VEGF ήταν παράλληλη (p<0,0001, Spearman s Rho) με ισχυρή γραμμική συσχέτιση (r 2 =0,778, ΕΙΚΟΝA 20). Η έκφραση mrna για τις ισομορφές VEGFxxxa, εμφάνισε αρνητική συσχέτιση με τις χρωμοσωμικές απώλειες στα 1p36 και 1p/19q (p=0,014 και 0,004, αντίστοιχα, ΜW), καθώς και με την mrna έκφραση του MGMT (p=0,005, Spearman s Rho). Αρνητική συσχέτιση εμφάνισε επίσης με την έκφραση των γονιδίων PHLPP1 (p=0,005, Spearman s Rho), STAT1 (p=0,019, Spearman s Rho), STAT5A (p=0,002, Spearman s Rho) και SRC (p<0,000, Spearman s Rho). Παράμετροι που σχετίζονται με την έκφραση των ισομορφών VEGFxxxb Η έκφραση των ισομορφών VEGFxxxb εμφάνισε θετική συσχέτιση με την mrna έκφραση του EGFR (p<0,0001, Spearman s Rho), την ταυτόχρονη πρωτεϊνική έκφραση EGFR/EGFRvIII (p=0,002, MW) και την mrna έκφραση του HER2 (p=0,008, Spearman s Rho). Αρνητική συσχέτιση παρατηρήθηκε με την mrna έκφραση των γονιδίων STAT1 (p=0,023, Spearman s Rho) και STAT5A (p=0,023, Spearman s Rho). Παράμετροι που σχετίζονται με την αναλογία έκφρασης VEGFxxxb/xxxa H αναλογία έκφρασης των ισομορφών του VEGF, VEGFxxxb/xxxa, παρουσίασε θετική συσχέτιση με γενωμικές μεταβολές, καθώς και με μεταβολές γονιδιακής και πρωτεϊνικής έκφρασης (ΠΙΝΑΚΑΣ 12). Γενωμικές μεταβολές που συσχετίστηκαν με υψηλή αναλογία έκφρασης VEGFxxxb/xxxa ήταν η ενίσχυση του EGFR (p=0,016, MW), καθώς και οι χρωμοσωμικές απώλειες στα 1p22 (p=0,008, MW), 1p36 (p=0,014, MW) και 1p/19q (0,003, MW). Υψηλά επίπεδα αναλογίας έκφρασης παρατηρήθηκαν σε όγκους με αυξημένη σχετική mrna έκφραση των γονιδίων EGFR (p=0,040, Spearman s Rho), MGMT (p=0,019, Spearman s Rho), HER2 (p<0,0001, Spearman s Rho), PHLPP1 (p=0,005, Spearman s Rho) και PIK3CA (p=0,004, Spearman s Rho). Επίσης υψηλή αναλογία έκφρασης VEGFxxxb/xxxa παρατηρήθηκε σε όγκους με ταυτόχρονη έντονη πρωτεϊνική έκφραση του EGFR και πρωτεϊνική έκφραση του ΕGFRvIII (p<0,0001, MW). 83

84 84

85 Παράμετροι που σχετίζονται με τα γονίδια επιδιόρθωσης MGMT και MSH6 Οι μοριακές παράμετροι που εμφάνισαν συσχέτιση με τις εξεταζόμενες μεταβολές των γονιδίων MGMT και MSH6 παρουσιάζονται στον ΠΙΝΑΚΑ 13. Παράμετροι που σχετίζονται με την MGMT Η μεθυλίωση του γονιδίου MGMT παρουσίασε ήπια θετική συσχέτιση μόνο με την πρωτεϊνική έκφραση του EGFRvIII (p=0,043, ChiSq), ενώ δεν παρουσίασε συσχέτιση ούτε με την mrna έκφραση του MGMT (p=0,957, MW) αλλά ούτε και με την ήπια (θετικότητα σε ποσοστό 5-20%, p=0,331, ChiSq) ή έντονη (θετικότητα σε ποσοστό >20%, p=0,522, ChiSq) έκφραση της πρωτεΐνης. H έκφραση mrna του MGMT παρουσίασε αρνητική συσχέτιση με την έκφραση της πρωτεΐνης p53 σε ποσοστό >5% των νεοπλασματικών κυττάρων (p=0,028, MW), ενώ θετική συσχέτιση υπήρξε με την mrna έκφραση πολλών γονιδίων (ΠΙΝΑΚΑΣ 13). εν υπήρξε στατιστικά σημαντική συσχέτιση με την έντονη (>20%) έκφραση της πρωτεΐνης MGMT (p=0,07, MW), παρόλο που οι όγκοι με έντονη θετικότητα στην πρωτεΐνη είχαν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου. H έντονη πρωτεϊνική έκφραση της MGMT (ποσοστό θετικότητας >20%) συσχετίστηκε αντίστροφα με τον υψηλό μιτωτικό δείκτη (p=0,006, ChiSq) και τη γονιδιακή έκφραση του VEGFxxxa (p=0,005, MW). Η πρωτεϊνική έκφραση σε ποσοστό >5% παρουσίασε θετική συσχέτιση με την απώλεια στη χρωμοσωμική θέση 19q (p=0,008, ChiSq) Παράμετροι που σχετίζονται με τη μεθυλίωση του γονιδίου MSH6 Η μεθυλίωση του γονιδίου MSH6 εμφάνισε θετική συσχέτιση με την χρωμοσωμική απώλεια στο 1p36 (p=0,027, ChiSq), αφού οι περισσότεροι όγκοι με μεθυλίωση (5 από 8) εμφάνισαν ταυτόχρονη απώλεια στο 1p36. Η μεθυλίωση του MSH6 δεν παρουσίασε συσχέτιση με το γονίδιο MGMT [μεθυλίωση, (p=0,256, ChiSq), mrna έκφραση (p=0,330, MW) ή ανοσοϊστοχημική θετικότητα, ήπια (p=0,539, ChiSq) ή έντονη (p=0,532, ChiSq)]. Μεταξύ των όγκων με μεθυλίωση του MSH6, 11 (3 IBK ΙΙΙ και 8 γλοιοβλαστώματα) παρουσίασαν ταυτόχρονη μεθυλίωση του γονιδίου MGMT, ενώ 7 (4 IBK ΙΙΙ και 3 γλοιοβλαστώματα) παρουσίασαν ταυτόχρονα απώλεια των χρωμοσωμικών περιοχών 1p και 19q. 85

86 Παράμετροι που σχετίζονται με απώλειες στις χρωμοσωμικές θέσεις 1p και 19q Οι μοριακές παράμετροι που εμφάνισαν συσχέτιση με τις χρωμοσωμικές απώλειες στα 1p και 19q παρουσιάζονται στον ΠΙΝΑΚΑ 14. Παράμετροι που σχετίζονται με την απώλεια στο 19q (γονίδιο CCNE1) Η απώλεια στη χρωμοσωμική περιοχή 19q εμφάνισε αρνητική συσχέτιση μόνο με την πρωτεϊνική έκφραση της MGMT (θετικότητα >5%, p=0,008, ChiSq). Μεμονωμένη απώλεια 19q χωρίς ταυτόχρονη απώλεια 1p/19q παρατηρήθηκε μόνο σε ένα διάχυτο αστροκύτωμα, το οποίο παρουσίασε επιπλέον απώλεια του 1p36. Παράμετροι που σχετίζονται με την απώλεια στο 1p13 (γονίδιο NRAS) Μεμονωμένη απώλεια στο 1p13 χωρίς συνδυασμένη απώλεια 1p/19q σημειώθηκε σε 5 γλοιοβλαστώματα, ένα από τα οποία παρουσίασε επιπλέον απώλεια του 1p36. Παράμετροι που σχετίζονται με την απώλεια στο 1p22 (γονίδιο BCAR3) Εκτός από τη χαμηλή mrna έκφραση του EGFR και τη σχέση με τον VEGF που αναφέρονται παραπάνω, οι όγκοι με απώλεια στο 1p22 εμφάνισαν συχνότερα ενεργοποίηση της πρωτεϊνης Src (p=0,034, ChiSq), η οποία παρατηρήθηκε σε 7/15 όγκους με απώλεια και σε 4/27 όγκους χωρίς απώλεια της συγκεκριμένης χρωμοσωμικής περιοχής. Mεμονωμένη απώλεια στο 1p13 χωρίς απώλεια 1p/19q παρατηρήθηκε σε 5 γλοιοβλαστώματα, χωρίς άλλη απώλεια στις περιοχές του 1p και 19q που εξετάστηκαν. Παράμετροι που σχετίζονται με την απώλεια στο 1p36 (τελομερικό 1p) Εκτός από τη σχέση της απώλειας του τελομερικού άκρου του 1p με τον EGFR και τον VEGF, οι όγκοι με απώλεια στη συγκεκριμένη χρωμοσωμική θέση εμφάνισαν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης mrna για το STAT5A (p=0,009, MW). Η απώλεια στο 1p36 εμφάνισε αρνητική συσχέτιση με τη φωσφορυλίωση της Αkt στη Thr308 (p=0,023 ChiSq). Οι περισσότεροι όγκοι με φωσφορυλίωση της Akt στη Thr308 (21 από 23) δεν παρουσίασαν απώλεια στο 1p36. Απώλεια στο 1p36 χωρίς συνδυασμένη απώλεια 1p/19q παρουσίασαν 6 όγκοι (1 ΙΒΚ ΙΙ, 1 ΙΒΚ ΙΙΙ και 4 ΙΒΚ IV). Παράμετροι που σχετίζονται με τη συνδυασμένη απώλεια 1p/19q Όλοι οι όγκοι με ταυτόχρονη απώλεια στα 1p και 19q (19/19) παρουσίασαν απώλειες και στα 19q, 1p13, 1p22 και 1p36 (p<0,0001, ChiSq και για τις 3 θέσεις), γεγονός που επιβεβαιώνει την ορθότητα διεξαγωγής των μεθόδων. Μεμονωμένες απώλειες στις περιοχές 1p13, 1p22, 1p36 και 19q παρατηρήθηκαν σε επιπλέον 15/59 όγκους (25,4%), 1 ΙΒΚ ΙΙ, 1 ΙΒΚ ΙΙΙ και 13 ΙΒΚ IV. Τονίζεται και εδώ η αρνητική συσχέτιση της συνδυασμένης απώλειας 1p/19q με την έκφραση mrna του EGFR (p=0,025, MW), καθώς και η υψηλή αναλογία έκφρασης των ισομορφών του VEGF (VEGFxxxb/xxxa) που εμφάνισαν αυτοί οι όγκοι (p=0,003, ChiSq). 86

87 87

88 Παράμετροι που σχετίζονται με την ενδοκυττάρια αυξητική οδό PI3K Οι συσχετίσεις των εξεταζόμενων παραμέτρων που σχετίζονται με την ενδοκυττάρια οδό PI3K αναφέρονται στον ΠΙΝΑΚΑ 15. Παράμετροι που σχετίζονται με την ενεργοποίηση της πρωτεΐνης Αkt Ενεργοποίηση της Akt με φωσφορυλίωση στη Ser473 εμφάνισαν οι όγκοι με ενεργοποίηση των πρωτεϊνών Src (p=0,027 ChiSq) και Stat3 (p=0,003, ChiSq) (EIKONΑ 17Α). Η φωσφορυλίωση της Akt στη Ser473 εμφάνισε επίσης θετική συσχέτιση με την έκφραση της πρωτεΐνης p53 (>5%, p=0,021, ChiSq ) και την κυτταροπλασματική εντόπιση του p16 INK4A (p=0,014, ChiSq) (EIKONA 17Β). Οι όγκοι με έκφραση mrna για το γονίδιο DARPP32, στην πλειοψηφία τους δεν παρουσίασαν φωσφορυλίωση της Akt στη θέση αυτή (p=0,004, MW). Φωσφορυλίωση της Akt στη Thr308 παρουσίασαν κυρίως οι όγκοι με πρωτεϊνική έκφραση του EGFRvIII (p=0,012, ChiSq), καθώς και οι όγκοι με υπερέκφραση mrna για το γονίδιο ΜΕΤ (p=0,004, MW). Οι περισσότεροι όγκοι με ταυτόχρονη έντονη (>50%) πρωτεϊνική έκφραση για τον EGFR και πρωτεϊνική έκφραση για τον EGFRvIII (22 από 24) ήταν θετικοί για τη φωσφορυλίωση της Akt στη Thr308 (p=0,035, ChiSq). Θετική συσχέτιση σημειώθηκε επίσης με τα αυξημένα επίπεδα mrna έκφρασης για τις ισομορφές VEGFxxxa (p=0,035, MW). Αρνητική συσχέτιση παρουσίασε η φωσφορυλίωση της Akt στη Thr308 με την απώλεια του 1p36 (p=0,023, MW), αφού 21 από τους 23 όγκους με φωσφορυλίωση της Akt στη Thr308 δεν είχαν απώλεια της συγκεκριμένης χρωμοσωμικής θέσης. Τέλος, οι περισσότεροι όγκοι εμφάνισαν ταυτόχρονη φωσφορυλίωση της Akt στις δύο θέσεις φωσφορυλίωσης, Ser473 και Thr308 (p=0,004, ChiSq) [ΠΙΝΑΚΑΣ 15]. Παράμετροι που σχετίζονται με την ενεργοποίηση της πρωτεΐνης mtor Η ενεργοποίηση της πρωτεΐνης mtor ήταν παράλληλη με τη φωσφορυλίωση της Akt, τόσο στη Ser473 (p=0,047, ChiSq) όσο και στη Thr308 (p=0,021, ChiSq) (EIKONA 17Γ). Οι περισσότεροι όγκοι με φωσφορυλίωση της Akt στη Ser473 (31 από 43) παρουσίασαν ενεργοποίηση της mtor. Από την άλλη, 47 από τους 56 όγκους με φωσφορυλίωση της mtor εμφάνισαν ενεργοποίηση της Akt με φωσφορυλίωση στη Thr308. Ταυτόχρονη ενεργοποίηση της mtor σημειώθηκε επίσης με την ενεργοποίηση της πρωτεΐνης Stat3 (p=0,006, ChiSq) [ΕΙΚΟΝΑ 17Α], ενώ αρνητική συσχέτιση παρουσιάστηκε με την mrna έκφραση του γονιδίου STAT5A (p=0,029, MW). 88

89 Α Phospho-Stat3 Phospho-Akt(Ser473) phospho-mtor Β Phospho-Akt(Ser473) p16 INK4A p53 Γ Phospho-Akt(Thr308) Phospho-Akt(Ser473) Phospho-mTOR ΕΙΚΟΝΑ 17: Ανοσοϊστοχημικά προφίλ 3 γλοιοβλαστωμάτων με ενεργοποίηση της οδού Akt/mTOR: Η φωσφορυλίωση της Akt στη Ser473 και της mtor ήταν συχνά ταυτόχρονη με την ενεργοποίηση της πρωτεΐνης Stat3 (A),ενώ συνδυαζόταν με κυτταροπλασματική εντόπιση του p16 INK4A και έντονη έκφραση του p53 (B). Η περίπτωση Γ αντιστοιχεί σε γλοιοβλάστωμα με γιγαντοκυτταρικούς χαρακτήρες, όπου παρατηρείται ταυτόχρονη φωσφορυλίωση της Akt στις 2 θέσεις με επιπλέον ενεργοποίηση της πρωτεΐνης mtor. 89

90 Παράμετροι που σχετίζονται με την έκφραση του PIK3CA Η mrna έκφραση του PIK3CA εμφάνισε θετική συσχέτιση με την έκφραση του mrna πολλών γονιδίων. Οι όγκοι με αυξημένη mrna έκφραση για το PIK3CA παρουσίασαν αυξημένα επίπεδα mrna έκφρασης για τα γονίδια ΜΕΤ (p=0,027, Spearman s Rho), HER2 (p<0,0001, Spearman s Rho) και MDM2 (p<0,0001, Spearman s Rho), καθώς και υψηλή αναλογία έκφρασης VEGFxxxb/xxxa (p=0,004, Spearman s Rho). Η έκφραση mrna για το γονίδιο PIK3CA ήταν επίσης παράλληλη με την αντίστοιχη έκφραση των γονιδίων MGMT (p<0,0001, Spearman s Rho), SRC (p<0,0001, Spearman s Rho), STAT1 (p=0,027, Spearman s Rho), STAT3 (p=0,001, Spearman s Rho), STAT5A (p=0,006, Spearman s Rho) και STAT5B (p=0,002, Spearman s Rho). Παράμετροι που σχετίζονται με την έκφραση του γονιδίου DARPP32 Η έκφραση mrna για το γονίδιο DARPP32 εμφάνισε ισχυρή συσχέτιση με την αντίστοιχη έκφραση για τα γονίδια PHLPP1, PHLPP2, SRC, STAT1, STAT3, STAT5A και STAT5B (p<0,0001 για όλες τις παραμέτρους, Spearman s Rho [ΠΙΝΑΚΑΣ 15]). Οι τιμές των γραμμικών συσχετίσεων της έκφρασης mrna του γονιδίου DARPP32 με την αντίστοιχη έκφραση των γονιδίων SRC, STAT και PHLPP αναγράφονται στην ΕΙΚΟΝΑ 20. Θετική συσχέτιση παρατηρήθηκε επίσης και με την έκφραση mrna για τα γονίδια MGMT, PIK3CA και HER2 (στατιστική σημαντικότητα, ΠΙΝΑΚΑΣ 15). Οι όγκοι γλοίας με χαμηλή mrna έκφραση του DARPP32 παρουσίασαν συχνότερα ενεργοποίηση των πρωτεϊνών Stat3 (p=0,009, MW), Src (p=0,026, MW) και Αkt, με φωσφορυλίωση στη Ser473 (p=0,004, MW). Κατά την ξεχωριστή ανάλυση των γλοιοβλαστωμάτων, η πιο πάνω θετική συσχέτιση διατηρήθηκε μόνο για την ενεργοποίηση της Αkt (p=0,018, MW), ενώ δεν παρατηρήθηκε για τις πρωτεΐνες Src και Stat3. Τα γλοιοβλαστώματα με χαμηλή έκφραση DARPP32 παρουσίασαν επιπλέον συχνότερη κυτταροπλασματική έκφραση της πρωτεΐνης p16 INK4A (p=0,039, MW) [ΕΙΚΟΝΑ 18]. Η έκφραση του DARPP32 δεν παρουσίασε συσχέτιση με τη μεθυλίωση του MGMT, την γονιδιακή ενίσχυση του EGFR, την έκφραση των EGFRvIII και MGMT, των πρωτεϊνών p53, p21 CIP1/WAF1, p27 KIP1, καθώς και την ενεργοποίηση των Stat1, Stat5 και mtor. Παράμετροι που σχετίζονται με την έκφραση των γονιδίων PHLPP1 και PHLPP2 Η έκφραση mrna για τα γονίδια PHLPP1 και PHLPP2, εκτός από την ισχυρή συσχέτιση με την αντίστοιχη έκφραση για το γονίδιο DARPP32, εξίσου ισχυρή συσχέτιση παρατηρήθηκε με την έκφραση mrna των γονιδίων SRC, STAT1, STAT3, STAT5A και STAT5B (p<0,0001 για όλες τις παραμέτρους, Spearman s Rho [ΠΙΝΑΚΑΣ 15]). Οι τιμές των γραμμικών συσχετίσεων (r 2 ) αναγράφονται στην ΕΙΚΟΝΑ 20. Θετικές συσχετίσεις παρατηρήθηκαν επίσης και για τα γονίδια MGMT, PIK3CA και MDM2 (στατιστική σημαντικότητα, ΠΙΝΑΚΑΣ 15), ενώ το γονίδιο PHLPP1 παρουσίασε επιπλέον παράλληλη αύξηση γονιδιακών αντιγράφων με το HER2 (p=0,006, Spearman;s rho). Οι όγκοι με αυξημένη σχετική έκφραση του γονιδίου PHLPP1 παρουσίασαν επίσης υψηλή αναλογία VEGFxxxb/xxxa (p=0,005, Spearman s Rho), καθώς και συχνότερη έκφραση των πρωτεϊνών p53 (>5%, p=0,003, MW) και p27 (πυρηνική θετικότητα, p=0,009, MW). Με ξεχωριστή εξέταση των γλοιοβλαστωμάτων, η υψηλή έκφραση των PHLPP1 και PHLPP2 συσχετίστηκε με την πυρηνική θετικότητα για την p27 KIP1, ενώ η έκφραση του PHLPP1 με την κυτταροπλασματική εντόπιση του p16 INK4A (EIKONA 19). 90

91 A B DARPP32 σε σχέση με τον ΙΒΚ DARPP32 και ΑΙΧ στα γλοιώματα p<0.001 p=0.026 p=0.009 p=0.004 p<0.001 p=0.02 Γ ΜΝΕ ΙΒΚ ΙΙ p<0.001 ΙΒΚ ΙΙΙ ΙΒΚ ΙV DARPP32 και ΑΙΧ στα γλοιοβλαστώματα p=0.039 p=0.018 Phospho-Src - Phospho-Src + phospho-src Phospho-Stat3 - Phospho-Stat3 + Phospho-Akt-S473 - Phospho-Akt-S473 + phospho-stat3 p16 (κυτ/μα) - p16 (κυτ/μα) + pakt S473 - pakt S473 + phospho-akts473 p16 INK4A ΕΙΚΟΝΑ 18: Έκφραση DARPP32 στους όγκους γλοίας: Α: Σχέση με ΙΒΚ και έκφραση στα ΜΝΕ, Β και Γ: Συσχετίσεις με ανοσοϊστοχημικά ευρήματα, στο σύνολο των όγκων (Β) και στα γλοιοβλαστώματα (Γ). : Ανοσοϊστοχημικό προφίλ γλοιοβλαστώματος με χαμηλή έκφραση mrna για το γονίδιο DARPP32. ΜΝΕ: είγματα μη-νεοπλασματικού εγκεφάλου, ΙΒΚ: Ιστολογικός βαθμός κακοήθειας, ΑΙΧ: ανοσοϊστοχημεία 91

92 A B PHLPP1 PHLPP2 STAT5A p16 (κυτ/μα) - p16 (κυτ/μα) + p27 (πυρήνας) - p27 (πυρήνας) + p27 (πυρήνας) - p27 (πυρήνας) + pakt S473 - pakt S473 + pmtor - pmtor + Γ p= p= p= p= p= ΓΒ, p16 INK4A ΓΒ, p27 KIP1 phospho-akt-s473 ΓΒ, p27 KIP1 ΜΝΕ, p27 KIP1 phospho-mtor ΕΙΚΟΝΑ 19: Σχέση έκφρασης mrna για τα γονίδια PHLPP1, PHLPP2 και STAT5A με τα ανοσοϊστοχημικά ευρήματα. Η διατήρηση της έκφρασης των PHLPP1 και 2 σχετίζεται με την πυρηνική έκφραση της p27 KIP1 στα γλοιοβλαστώματα (Α), όπως είναι και η αναμενόμενη έκφραση στο φυσιολογικό εγκέφαλο (Γ). Η χαμηλή έκφραση του PHLPP1 συνοδεύεται συχνά από κυτταροπλασματική εντόπιση του p16 INK4A (A, Γ), ενώ τα αντίστοιχα γλοιοβλαστώματα εμφάνιζαν συχνά, αν και χωρίς στατιστικά σημαντικό αποτέλεσμα, επιπλέον κυτταροπλασματική έκφραση του p27 KIP1 (Γ). Β, : Η χαμηλή έκφραση του γονιδίου STAT5A συνοδευόταν από ενεργοποίηση της οδού Akt/mTOR στα γλοιοβλαστώματα. ΓΒ: γλοιοβλάστωμα, ΜΝΕ: είγματα μη-νεοπλασματικού εγκεφάλου 92