ΔΙΑΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΗ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΘΝΙΚΟ ΜΕΤΣΟΒΙΟ ΠΟΛΥΤΕΧΝΕΙΟ ΣΧΟΛΗ ΗΛΕΚΤΡΟΛΟΓΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ & ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΥΠΟΛΟΓΙΣΤΩΝ ΣΧΟΛΗ ΜΗΧΑΝΟΛΟΓΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΔΙΑΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΗ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ «ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΔΙΑΦΟΡΙΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΒΛΑΣΤΙΚΩΝ/ΠΡΟΓΟΝΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΤΟΥ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΣΕ ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΟΥΣ ΜΥΕΣ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΟΙΧΙΩΝ DNA» ΠΑΠΑΔΗΜΗΤΡΙΟΥ ΧΡΗΣΤΟΣ ΠΑΤΡΑ, ΟΚΤΩΒΡΙΟΣ 2013

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΘΝΙΚΟ ΜΕΤΣΟΒΙΟ ΠΟΛΥΤΕΧΝΕΙΟ ΣΧΟΛΗ ΗΛΕΚΤΡΟΛΟΓΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ & ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΥΠΟΛΟΓΙΣΤΩΝ ΣΧΟΛΗ ΜΗΧΑΝΟΛΟΓΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΔΙΑΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ ΣΤΗ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ «ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΔΙΑΦΟΡΙΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΒΛΑΣΤΙΚΩΝ/ΠΡΟΓΟΝΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΤΟΥ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΣΕ ΓΕΝΕΤΙΚΑ ΤΡΟΠΟΠΟΙΗΜΕΝΟΥΣ ΜΥΕΣ ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΟΙΧΙΩΝ DNA» ΠΑΠΑΔΗΜΗΤΡΙΟΥ ΧΡΗΣΤΟΣ ΠΑΤΡΑ 2013 Επιβλέπων Καθηγητής: Ταραβήρας Σταύρος, Αναπληρωτής Καθηγητής, Εργαστήριο Φυσιολογίας, Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Τριμελής εξεταστική επιτροπή: Λυγερού Ζωή Αναπληρωτής Καθηγήτρια Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Ταραβήρας Σταύρος, Αναπληρωτής Καθηγητής, Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Κωστόπουλος Γεώργιος, Καθηγητής, Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών 2

3 ΠΕΡΙΛΗΨΗ:... 6 ABSTRACT: ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΟΙΧΙΕΣ Μικροσυστοιχίες DNA Μικροσυστοιχίες cdna ΠΛΑΤΦΟΡΜΕΣ ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΟΙΧΙΩΝ CDNA DNA μικροσυστοιχίες τυπωμένες σε γυάλινα πλακίδια Μικροσυστοιχίες DNA in situ σύνθεσης ολιγονουκλεοτιδίων Τα Chip υβριδισμού GeneChip της Affymetrix Περισσότερες εμπορικά διαθέσιμες τεχνολογίες Μικροσυστοιχιών ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Συλλογή δεδομένων Διόρθωση θορύβου υποβάθρου Κανονικοποίηση Η διαδικασία της συνόψισης (Summarization) Ο αλγόριθμος RMA Έλεγχος ποιότητας υβριδοποίησης Προσδιορισμός της στατιστικώς σημαντικής διαφορικής έκφρασης Η τιμή Fold Change Η τιμή p-value Μετα-ανάλυση δεδομένων Η ΠΡΩΤΕΙΝΗ GEMININ ΕΜΠΛΕΚΕΤΑΙ ΣΤΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΟΥ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΜΟΥ ΚΑΙ ΤΗΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗΣ H πρωτεϊνική δομή της Geminin Η Geminin ρυθμίζει τον κυτταρικό κύκλο μέσω της αλληλεπίδρασης της με το Cdt Ο ρόλος της Geminin στις αποφάσεις κυτταρικής διαφοροποίησης Η Geminin επηρεάζει κυτταρικές αποφάσεις µέσω αλληλεπίδρασης µε μεταγραφικούς παράγοντες Η Geminin αλληλεπιδρά µε πρωτεΐνες του βασικού µηχανισµού µεταγραφής Η Geminin επηρεάζει κυτταρικές αποφάσεις µέσω της αλληλεπίδρασης της µε παράγοντες που ρυθµίζουν την δομή της χρωµατίνης ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΙΑΦΟΡΟΠΟΪΗΣΗ ΤΟΥ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ Η ανάπτυξη του αιμοποιητικού συστήματος κατά την εμβρυο-γένεση του µυός Τα κύρια µοντέλα διαφοροποίησης των εµβρυικών και ενηλίκων βλαστικών κυττάρων του αιµοποιητικού συστήµατος Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ GEMININ ΣΤΗΝ ΑΥΤΟ-ΑΝΑΝΕΩΣΗ ΚΑΙ ΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΒΛΑΣΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΠΡΟΓΟΝΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΤΟΥ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ Αδρανοποίηση του γονιδίου της Geminin στα βλαστικά κύτταρα του αιμοποιητικού

4 1.6.2 Η αδρανοποίηση της Geminin στα βλαστικά κύτταρα του αιµοποιητικού επιφέρει πρόωρο εµβρυικό θάνατο ΣΚΟΠΟΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗΣ ΔΙΑΤΡΙΒΗΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΓΕΝΩΜΙΚΟΥ DNA ΜΕ ΔΙΑΛΥΜΑ ΦΑΙΝΟΛΗΣ ΧΛΩΡΟΦΟΡΜΙΟΥ-ΙΣΟΑΜΥΛΙΚΗΣ ΑΛΚΟΟΛΗΣ (PCI) ΓΟΝΟΤΥΠΗΣΗ ΤΩΝ ΜΥΩΝ ΜΕ ΤΗΝ ΜΕΘΟΔΟ ΤΗΣ PCR Στρατηγική γονοτύπησης των γενετικά τροποποιημένων μυών στους οποίους επιτελείται ιστοειδική αδρανοποίηση του γονιδίου της Geminin Αντίδραση PCR µε τη χρήση των εκκινητών zo Αντίδραση PCR µε τη χρήση των εκκινητών Αντίδραση PCR για την ανίχνευση των διαγονιδίων VavCre ΗΛΕΚΤΡΟΦΌΡΗΣΗ ΣΕ ΠΉΚΤΩΜΑ ΑΓΑΡΌΖΗΣ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΕΜΒΡΥΙΚΟΥ ΥΠΑΤΟΣ ΑΠΟ ΤΟΥΣ ΜΥΕΣ Καταμέτρηση των κυττάρων με αιμοκυτταρόμετρο Neubauer και μικροσκόπιο ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΟΛΙΚΟΥ RNA ΣΥΝΘΕΣΗ CDNA ΑΠΟ ΟΛΙΚΟ MRNA ΔΙΑΛΥΜΑΤΑ ΥΒΡΙΔΙΣΜΟΣ ΜΙΚΡΟΣΥΣΤΟΙΧΙΩΝ CDNA AFFYMETRIX GENECHIP Σύνθεση πρώτου κλώνου cdna Σύνθεση 2 ου κλώνου cdna Σύνθεση crna με χρήση μεταγραφής in vitro Καθαρισμός του παραγόμενου crna Δεύτερος κύκλος, Σύνθεση πρώτου κλώνου cdna από crna Υδρόλυση crna με RNase H για την παραγωγή μονόκλωνου cdna Καθαρισμός του παραγόμενου cdna (ssdna, single strand DNA) Θρυμματισμός ssdna Σήμανση θρυμματισμένου DNA Διαδικασία υβριδισμού ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΠΡΟΦΙΛ ΔΙΑΦΟΡΙΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΠΟ GENE ONTOLOGY ANALYSIS ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΤΟΥ METACORE ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΑΠΟ ΤΗΝ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΗΣ ΛΙΣΤΑΣ ΤΩΝ ΣΗΜΑΝΤΙΚΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΤΟΥ ΛΟΓΙΣΜΙΚΟΥ GSEA ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Η ΑΠΟΥΣΙΑ ΤΗΣ GEMININ ΠΡΟΑΓΕΙ ΤΗΝ ΥΠΕΡ-ΕΚΦΡΑΣΗ ΣΥΓΚΕΚΡΙΜΕΝΩΝ ΗΟΧ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ Η ΑΠΟΥΣΙΑ ΤΗΣ GEMININ ΔΕΝ ΕΠΗΡΕΑΖΕΙ ΤΗΝ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΠΟΥ ΑΠΟΤΕΛΟΥΝ ΜΕΛΗ ΤΩΝ ΠΟΛΥ- ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ POLYCOMB ΚΑΙ TRITHORAX

5 4.7 Η ΑΠΟΣΙΩΠΗΣΗ ΤΗΣ GEMININ ΕΠΗΡΕΑΖΕΙ ΕΠΙΛΕΚΤΙΚΑ ΣΤΟΧΟΥΣ ΤΟΥ ΣΥΜΠΛΟΚΟΥ POLYCOMB ΠΟΥ ΣΧΕΤΙΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΤΗ ΑΥΤΟ ΑΝΑΝΕΩΣΗ ΚΑΙ ΔΙΑΤΗΡΗΣΗ ΤΩΝ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΩΝ ΒΛΑΣΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Η ΑΠΟΣΙΩΠΗΣΗ ΤΗΣ GEMININ ΠΡΟΚΑΛΕΙ ΤΗΝ ΥΠΕΡ-ΕΚΦΡΑΣΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ ΠΟΥ ΣΧΕΤΙΖΟΝΤΑΙ ΜΕ ΠΕΡΙΠΤΩΣΕΙΣ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑΣ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Η ΠΡΩΤΕΪΝΗ GEMININ ΣΥΜΜΕΤΕΧΕΙ ΣΤΗ ΡΥΘµΙΣΗ ΤΗΣ ΑΥΤΟ-ΑΝΑΝΕΩΣΗΣ ΤΩΝ ΒΛΑΣΤΙΚΩΝ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Ο ΡΟΛΟΣ ΤΩΝ ΣΥΜΠΛΟΚΩΝ POLYCOMB ΚΑΙ TRITHORAX ΣΤΗΝ ΑΥΤΟ-ΑΝΑΝΕΩΣΗ ΚΑΙ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΒΛΑΣΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΤΟΥ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΚΑΙ Η ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΤΟΥ ΜΕ ΤΗΝ GEMININ ΤΟ ΠΡΟΦΙΛ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΣΥΓΚΕΚΡΙΜΕΝΩΝ ΓΟΝΙΔΙΩΝ ΣΤΟΥΣ FL/KO VAV CRE ΜΥΕΣ ΜΟΙΑΖΕΙ ΜΕ ΕΚΕΙΝΟ ΠΟΥ ΠΑΡΑΤΗΡΕΙΤΑΙ ΣΤΙΣ ΠΕΡΙΠΤΩΣΕΙΣ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑΣ Η ΑΠΟΥΣΙΑ ΤΗΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ GEMININ ΠΡΟΚΑΛΕΙ ΤΗΝ ΥΠΕΡ- ΕΚΦΡΑΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΠΟΥ ΔΙΑΘΕΤΟΥΝ ΤΗ HOMEODΟMAIN ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗ ΠΕΡΙΟΧΗ ΕΠΙΛΟΓΟΣ ΠΑΡΑΠΟΜΠΕΣ

6 Περίληψη: Κατά την ανάπτυξη του οργανισμού, η απόκτηση εξειδικευμένων κυτταρικών λειτουργιών βασίζεται στην ασύμμετρη διαίρεση βλαστικών κυττάρων, την παραγωγή προγονικών κυττάρων και τη σταδιακή διαφοροποίησή τους. Η διαδικασία αυτή απαιτεί τον συντονισμό των μηχανισμών ελέγχου των κυτταρικών διαιρέσεων με επι-γενετικούς και μεταγραφικούς ρυθμιστικούς μηχανισμούς. Προκειμένου να κατανοήσουμε την ρύθμιση των μηχανισμών αυτών στα βλαστικά και πρόδρομα κύτταρα του αιμοποιητικού συστήματος, μελετήσαμε την πρωτεΐνη Geminin, η οποία έχει δειχθεί να συμμετέχει τόσο στην ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, όσο και στον έλεγχο των αποφάσεων για διαφοροποίηση. Σε προηγούμενα πειράματα που πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριό μας απομονώθηκαν βλαστικά και προγονικά κύτταρα του αιμοποιητικού συστήματος από το εμβρυικό ήπαρ διαγονιδιακών μυών 15.5 ημερών που φέρουν ιστοειδική απαλοιφή της Geminin με την χρήση του Cre-LoxP συστήματος υπό τον έλεγχο των ρυθμιστικών στοιχείων του γονιδίου vav. Η αδρανοποίηση της Geminin στα βλαστικά και πρόδρομα κύτταρα του εμβρυικού ήπατος οδηγεί σε πρόωρο θάνατο και ανώμαλη ανάπτυξη του αιμοποιητικού συστήματος. Αποτελέσματα του εργαστηρίου μας προτείνουν πως η Geminin διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στις διαδικασίες της αυτό-ανανέωση και διαφοροποίηση των βλαστικών και προγονικών κυττάρων του αιμοποιητικού συστήματος. Για να διαλευκάνουμε τα μοριακά μονοπάτια στα οποία συμμετέχει η Geminin και για τον εντοπισμό του γονιδιακού δικτύου μέσω του οποίου η Geminin ελέγχει τις διαδικασίες αυτό-ανανέωσης και διαφοροποίησης του αιμοποιητικού συστήματος, πραγματοποιήσαμε πειράματα μικροσυστοιχιών DNA. Η παρούσα πτυχιακή εργασία εστιάστηκε στην ανάλυση της συγκριτική μελέτης του γονιδιώματος από τον κυτταρικό πληθυσμό βλαστικών και προγονικών κυττάρων του αιμοποιητικού συστήματος που πραγματοποιήθηκε μεταξύ γονιδιακά τροποποιημένων μυών και μυών μαρτύρων αγρίου τύπου. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης προτείνουν πως η έλλειψη της Geminin απορρυθμίζει την έκφραση σημαντικών αναπτυξιακών γονιδίων, όπως μεταγραφικών παραγόντων και ρυθμιστών αναδιάταξης της χρωματίνης που εμπλέκονται στην εμβρυική αιμοποίηση. Οι διαταραχές αυτές μπορούν να αιτιολογήσουν το φαινότυπο που παρουσιάζουν οι μύες στους οποίους έχουμε αδρανοποιήσει το γονίδιο της Geminin. Στο φαινότυπο αυτό παρατηρείται η συσσώρευση των βλαστικών κυττάρων και η ταυτόχρονη μείωση του πληθυσμού και της ικανότητας διαφοροποίησης των προγονικών κυττάρων του αιμοποιητικού συστήματος. 6

7 Abstract: During the development of the organism, the acquisition of specialized cellular functions is based on the asymmetric division of stem cells, the production of progenitor cells and their gradual differentiation. This process requires the coordination of the cell proliferation control mechanisms by epigenetic and transcriptional regulatory mechanisms. In order to understand the regulation of these mechanisms in stem and progenitor cells of the hematopoietic system, we studied the protein Geminin, which has been shown to be involved in both cell cycle regulation and in differentiation decision control. In previous experiments conducted in our laboratory we isolated hematopoietic stem and progenitor cells from the fetal liver of transgenic mice at embryonic day The transgenic mice bear tissue specific deletion of Geminin using the Cre-LoxP system under the control of regulatory elements of the vav gene. Inactivation of Geminin in stem and progenitor cells of the fetal liver leads to early death and abnormal development of the hematopoietic system. Previous results from our laboratory suggest that Geminin plays an important role in the selfrenewal and differentiation processes of hematopoietic stem and progenitor cells. We performed cdna microarray experiments to elucidate the molecular pathways and to identify the gene networks through which Geminin controls the self-renewal and differentiation processes in the hematopoietic system. The present study is focused on the whole genome comparison from the hematopoietic stem and progenitor cell population between transgenic mice and wild type mice, used as control samples. The results indicate the deregulation in the expression of important developmental genes like, transcription factors and chromatin rearrangement regulators involved in embryonic hematopoiesis. The abnormalities in gene expression caused by the absence of Geminin in the hematopoietic system of the embryos explain the presented phenotype which is characterized by the accumulation of stem cells and the simultaneous reduction of the progenitor cell population and their ability to differentiate. 7

8 1 Εισαγωγή 1.1 Μικροσυστοιχίες Οι μικροσυστοιχίες χρησιμοποιώντας υψηλής απόδοσης μεθόδους ανάλυσης (high-throughput) αποτελούν μια τεχνολογία πειραματικής διαδικασίας σχεδιασμένη με σκοπό να εκτελεί ταυτόχρονα πολλαπλά πειράματα βιολογικού ενδιαφέροντος σε ένα μόνο κύκλο εκτέλεσης της διαδικασίας. Η τεχνολογία αυτή εμπίπτει στην κατηγορία των «Lab-On a- Chip» συσκευών, δηλαδή συσκευές που ενσωματώνουν μία ή περισσότερες εργαστηριακές λειτουργίες σε ένα μόνο τσιπ/πλακίδιο μεγέθους μερικών τετραγωνικών χιλιοστών ή εκατοστών, Εικόνα 1.1. Η τεχνολογία των μικροσυστοιχιών περιλαμβάνει τις εξής κατηγορίες: Μικροσυστοιχίες DNA: σε αυτή την κατηγορία εμπίπτουν οι μικροσυστοιχίες cdna, μικροσυστοιχίες ολιγονουκλεοτιδίων και μικροσυστοιχίες απλών πολυμορφισμών νουκλεοτιδίων (SNPs). MMChips: για την παρακολούθηση των πληθυσμών microrna Μικροσυστοιχίες πρωτεϊνών Μικροσυστοιχίες πεπτιδίων: για την πραγματοποίηση λεπτομερών αναλύσεων σχετικά με τα σημεία αλληλεπιδράσεων των πρωτεϊνών μεταξύ τους Μικροσυστοιχίες ιστών Κυτταρικές μικροσυστοιχίες: συχνά ονομάζεται και μικροσυστοιχίες επιμόλυνσης (transfection microarrays) Μικροσυστοιχίες χημικών ενώσεων Μικροσυστοιχίες αντισωμάτων Συστοιχίες υδατανθράκων (glycoarrays) Μικροσυστοιχίες φαινοτύπων Εικόνα 1.1: Παράδειγμα μικροσυστοιχίας. οι μικροσυστοιχίες είναι 2-διάστατες συστοιχίες βιολογικού υλικού επάνω σε ένα στερεό υπόστρωμα που υπόκεινται σε μελέτη με χρήση μεθόδων υψηλής απόδοσης και ανάλυσης (high-throughput screening). Το υπόστρωμα συνήθως είναι ένα υάλινο πλακίδιο ή ένα λεπτό πλακίδιο πυριτίου 8

9 1.1.1 Μικροσυστοιχίες DNA Στην συγκεκριμένη έρευνα χρησιμοποιήθηκε η τεχνολογία των DNA μικροσυστοιχιών. Η τεχνολογία αυτή διαθέτει και υπο-κατηγορίες που αναφέρονται στον πίνακα που ακολουθεί, Πίνακας 1.1. Πίνακας 1.1: Κατηγορίες/Εφαρμογές μικροσυστοιχιών DNA Εφαρμογή/Τεχνολογία Μελέτη έκφρασης γονιδίων, μικροσυστοιχίες cdna Συγκριτική υβριδοποίηση γονιδιώματος (Comparative genomic hybridization) Aνοσοκατακρήμνιση Χρωματίνης σε Chip (Chromatin immunoprecipitation on Chip) DamID (DNA adenine methyltransferase identification) Μικροσυστοιχίες SNP Μικροσυστοιχίες εξωνίων Μικροσυστοιχίες γονιδίων Περιγραφή Σε ένα πείραμα για τη μελέτη της έκφρασης γονιδίων σε έναν οργανισμό πραγματοποιείται η ταυτόχρονη παρακολούθηση χιλιάδων γονιδίων για τη μελέτη μιας συγκεκριμένη ασθένειας είτε τη μελέτη της διαδικασίας ή/και του εξελικτικού σταδίου στην έκφραση των γονιδίων του προς μελέτη οργανισμού [1]. Συγκριτική υβριδοποίηση γονιδιώματος (CGH) ή Χρωμοσωμική Ανάλυση Μικροσυστοιχιών (CMA) είναι μια μοριακοκυτταρογενετική μέθοδος για την ανάλυση των μεταβολών του αριθμού των DNA αντιγράφων στο σύνολο του DNA ενός συγκεκριμένου ατόμου και πιο συχνά σε καρκινικά κύτταρα [2, 3]. Αλληλουχίες DNA που συνδέονται με μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη μπορούν να απομονωθούν πραγματοποιώντας ανοσοκατακρήμνιση σε αυτή την πρωτεΐνη (ChIP). Αυτά τα θραύσματα μπορεί στη συνέχεια να υβριδοποιηθούν σε μικροσυστοιχίες επιτρέποντας τον προσδιορισμό της θέσης στην οποία η πρωτεΐνη αυτή δεσμεύεται, σε όλο το γονιδίωμα [4]. Χαρακτηριστικό παράδειγμα ανοσοκατακρήμνισης πρωτεϊνών αποτελούν οι τροποποιήσεις των ιστονών (H3K27me3, H3K4me2, H3K9me3, κλπ.) από την Polycomb ομάδα πρωτεϊνών (PRC2: Suz12, PRC1: YY1) και από την ομάδα πρωτεϊνών trithorax (Ash1) για τη μελέτη των επιγενετικών προφίλ. Όπως συμβαίνει και στην τεχνολογία ChIP, πρωτεΐνες που δεσμεύονται σε συγκεκριμένες περιοχές ενδιαφέροντος στο γονιδίωμα ενός οργανισμού μπορούν να απομονωθούν και να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση του προσδιορισμού της θέσης τους. Σε αντίθεση με την τεχνολογία ChIP, στην τεχνολογία μικροσυστοιχιών DamID δεν απαιτείται η χρήση αντισωμάτων, αλλά κάνει χρήση της μεθυλίωσης της αδενίνης κοντά στις θέσεις πρόσδεσης της πρωτεΐνης ώστε επιλεκτικά να ενισχύσει των πολλαπλασιασμό εκείνων των περιοχών[5]. Για τον προσδιορισμό πολυμορφισμών μεταξύ των αλληλομόρφων εντός ή μεταξύ πληθυσμών [6]. Στις μικροσυστοιχίες εξωνίων χρησιμοποιούνται ειδικοί ανιχνευτές (probes) σχεδιασμένοι για τις αναμενόμενες ή πιθανές θέσεις ματίσματος των εξωνίων ενός γονιδίου. Μια μικροσυστοιχία γονιδίων σύντηξης μπορεί να ανιχνεύσει 9

10 σύντηξης (Fusion gene arrays) συγχωνεύσεις γονιδιακών μεταγράφων, π.χ. από δείγματα καρκίνου. Ο σχεδιασμός των ανιχνευτών (probes) επιτρέπει τις συνδυαστικές μετρήσεις των χιμαιρικών μεταγράφων. Μικροσυστοιχίες πλήρους κάλυψης (Tiling array) Αποτελούνται από επικαλυπτόμενες συστοιχίες με σκοπό την ανίχνευση της έκφρασης νέων μεταγράφων ή εναλλακτικών ματισμάτων που ήταν άγνωστα μέχρι στιγμής [7] Μικροσυστοιχίες cdna Μία μικροσυστοιχία DNA είναι μια συλλογή από μικροσκοπικές κηλίδες DNA που συνδέονται σε μια στερεή επιφάνεια. Οι μικροσυστοιχίες DNA χρησιμοποιούνται για τη μέτρηση των επιπέδων έκφρασης μεγάλων αριθμών γονιδίων ταυτόχρονα ή για τη γονοτύπηση πολλαπλών περιοχών του γονιδιώματος. Κάθε κηλίδα DNA περιέχει πικομοριόγραμμα (picomoles) μιας ειδικής αλληλουχίας DNA, γνωστή ως ανιχνευτές (probes, reporters ή oligos). Οι μικροσυστοιχίες DNA μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση μορίων DNA ή την ανίχνευση μορίων RNA που μπορεί να έχουν μεταφραστεί σε πρωτεΐνες. Στην περίπτωση της ανίχνευσης μορίων RNA οι μικροσυστοιχίες εξακολουθούν να αποκαλούνται μικροσυστοιχίες DNA αφού αντί για τη χρήση του RNA μορίου χρησιμοποιείται το μόριο του cdna έχοντας προηγηθεί η διαδικασία της αντίστροφης μεταγραφής. Η διαδικασία της μέτρησης της γονιδιακής έκφρασης μέσω του cdna ονομάζεται «μελέτη έκφρασης γονιδίων, (gene expression analysis)» ή «προφίλ έκφρασης γονιδίων, (gene expression profiling)» [8]. Η τεχνολογία των μικροσυστοιχιών cdna χρησιμοποιήθηκε και στην παρούσα μελέτη για την δημιουργία του μεταγραφικού προφίλ των βλαστικών & προγονικών βλαστικών κυττάρων του αιμοποιητικού συστήματος έπειτα από την επιλεκτική αδρανοποίηση της πρωτεΐνης Geminin από το αιμοποιητικό σύστημα γενετικά τροποποιημένων μυών. Για την ευκολότερη κατανόηση του τρόπου λειτουργίας των μικροσυστοιχιών παρατίθενται στη συνέχεια οι ορισμοί των 2 βασικότερων τεχνικών όρων που θα συναντούμε συχνά στην παρούσα διπλωματική εργασία. Στόχος ή γονίδιο στόχος: Κατακερματισμένη και βιοτινυλιωμένη ακολουθία cdna που προπαρασκευάζεται από το mrna των βιολογικών δειγμάτων προς μελέτη. Οι ακολουθίες στόχος υβριδοποιούνται με τις ακολουθίες του γονιδίου ανιχνευτή που βρίσκεται επάνω στο Chip υβριδισμού. Η ένταση υβριδοποίησης μεταξύ στόχου και ανιχνευτή καταμετράται από έναν σαρωτή lazer αφού έχει προηγηθεί η σήμανσή τους με βιοτίνη-στρεπταβιδίνη-φυκοερυθρίνη (SAPE). Στη επόμενες παραγράφους περιγράφεται αναλυτικά η διαδικασία και ο τρόπος υβριδοποίησης μεταξύ των αλληλουχιών. 10

11 Ανιχνευτής: Μονόκλωνο ολιγονουκλεοτίδιο DNA που συντίθεται απευθείας στην επιφάνεια της συστοιχίας χρησιμοποιώντας φωτολιθογραφία και συνδυαστική χημεία. Το 25 βάσεων ολιγονουκλεοτίδιο σχεδιάζεται να είναι συμπληρωματικό προς ένα συγκεκριμένο μετάγραφο γονιδίου. Η τεχνολογία των μικροσυστοιχιών DNA εκμεταλλεύεται την αρχή της συμπληρωματικότητας των βάσεων και επαφίεται στο κεντρικό δόγμα της μοριακής βιολογίας. Δηλαδή, ένα γονίδιο εκφράζεται με τη μεταγραφή των εξωνίων του DNA σε μονόκλωνο mrna το οποίο αυτό αργότερα μεταφράζεται σε πρωτεΐνη από τα ριβοσωμάτια. Με τις cdna μικροσυστοιχίες είναι δυνατό να ποσοτικοποιούμε τα επίπεδα της έκφρασης των mrna μορίων σύμφωνα με τη δέσμευση/υβριδοποίηση των cdna μορίων του πειραματικού δείγματος στους ήδη γνωστούς ανιχνευτές που βρίσκονται στο πλακίδιο (chip). Με τον τρόπο αυτό, οι μικροσυστοιχίες cdna μας παρέχουν ένα στιγμιότυπο του συνόλου της μεταγραφικής δραστικότητας σε ένα βιολογικό δείγμα. Η μέτρηση των επιπέδων mrna έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα πολύτιμο εργαλείο για την μοριακή ανίχνευση της έκφρασης του γονιδίου [9]. 1.2 Πλατφόρμες μικροσυστοιχιών cdna Υπάρχουν δύο πλατφόρμες / τύποι μικροσυστοιχιών cdna. 1. Glass (Γυάλινες) DNA μικροσυστοιχίες στις οποίες προκατασκευασμένα θραύσματα cdna «τυπώνονται» σε ένα γυάλινο πλακίδιο. 2. Υψηλής πυκνότητας μικροσυστοιχίες ολιγονουκλεοτιδίων που αποκαλούνται και ως «τσιπ» (chip) στις οποίες πραγματοποιείται in situ σύνθεση των ολιγονουκλεοτιδίων DNA μικροσυστοιχίες τυπωμένες σε γυάλινα πλακίδια Οι μικροσυστοιχίες DNA που τυπώνονται σε γυάλινα πλακίδια ήταν το πρώτο είδος DNA μικροσυστοιχιών που αναπτύχθηκε. Οι συγκεκριμένες μικροσυστοιχίες παράγονται με τη χρήση μιας ρομποτικής συσκευής, η οποία εναποθέτει/τυπώνει DNA κηλίδες (spots) ενός nanoliter του ( μm σε διάμετρο) πάνω σε μια γυάλινη επιφάνεια ή πλάκα μικροσκοπίου. Κάθε κηλίδα απέχει από την άλλη απόσταση περίπου μm και κάθε κηλίδα αντιστοιχεί ένα γονίδιο. Έτσι, σε μια επιφάνεια 3,6 τετραγωνικών εκατοστών τυπώνονται περίπου διαφορετικά γονίδια. Οι γυάλινες διαφάνειες που χρησιμοποιούνται στις συγκεκριμένες cdna μικροσυστοιχίες είναι ειδικά κατασκευασμένες ικανοποιώντας φυσικο-χημικά χαρακτηριστικά όπως: η εξαιρετική χημική αντοχή έναντι διαλυτών, καλή μηχανική σταθερότητα και χαμηλά επίπεδα εγγενή φθορισμού [10]. 11

12 Ωστόσο, αποτελεί πρόκληση η πραγματοποίηση μελέτης διαφορικής έκφρασης για όλο το γονιδίωμα ενός οργανισμού με τη χρήση μικροσυστοιχιών τυπωμένων σε γυάλινο υπόστρωμα. Χρειάζεται η εκτέλεση μιας σειράς διαδοχικών βημάτων που απαιτούν ιδιαίτερη προσέγγιση. Αυτά είναι: Επιλογή των γονιδίων που θα συμμετέχουν στη μελέτη Προετοιμασία των ολιγονουκλεοτιδίων DNA από τα γονίδια που έχουν επιλεγεί Ενίσχυση των θραυσμάτων DNA με PCR Τύπωση των κηλίδων DNA στις γυάλινες επιφάνειες που συνήθως είναι επικαλυπτόμενες με poly (L-lysine). Η τύπωση πραγματοποιείται από ρομποτικές συσκευές. Οι μικροσυστοιχίες στεγνώνουν για μια μέρα σε θερμοκρασία δωματίου και εκτίθενται σε υπερ-ιώδη ακτινοβολία για την ισχυρή δέσμευση των ολιγονουκλεοτιδίων επάνω στη γυάλινη επιφάνεια Μικροσυστοιχίες DNA in situ σύνθεσης ολιγονουκλεοτιδίων Η πλατφόρμα των in situ σύνθεσης ολιγονουκλεοτιδίων αποτελεί μια πολύ καλά μελετημένη τεχνολογία που χρησιμοποιεί την in situ χημική σύνθεση η οποία αναπτύχθηκε από τους Stephen Fodor et al., Η τεχνολογία των in situ μικροσυστοιχιών εξελίχτηκε περαιτέρω από την κυρίαρχη εταιρία του χώρου, την Affymetrix. Τα GeneChips της Affymetrix είναι πλατφόρμες βασισμένες στην υψηλής πυκνότητας συστοιχιών από DNA ολιγονουκλεοτίδια. Τα GeneChips της Affymetrix μπορούν να συμπεριλάβουν μέχρι και γονίδια ανιχνευτές σε ένα τετράγωνο chip μεγέθους 1.28 τετραγωνικών εκατοστών, Εικόνα 1.2. Σήμερα, ανάλογα με το είδος και την τεχνολογία της μελέτης που πραγματοποιείται κατασκευάζονται και chip με μέγεθος 0.6 τετραγωνικών εκατοστών. Τα GeneChips χρησιμοποιούνται συνήθως σε μελέτες ανίχνευσης μεταλλάξεων και πολυμορφισμών όπως επίσης και σε μελέτες διαφορικής έκφρασης γονιδίων Τα Chip υβριδισμού GeneChip της Affymetrix Τα chip υβριδισμού GeneChip της Affymetrix κατασκευάζονται με την εναπόθεση αλληλουχιών βάσεων (Α,Τ,C,G), που αποκαλούμε ολιγονουκλεοτίδια, επάνω σε ένα λεπτό φύλλο πυριτίου. Τα ολιγονουκλεοτίδια που βρίσκονται στα chip της Affymetrix αποτελούνται από 25 βάσεις σε σειρά. Κάθε ολιγονουκλεοτίδιο είναι τοποθετημένο σε μια γνωστή θέση της συστοιχίας γνωρίζοντας έτσι την ταυτότητα κάθε γονιδίου με σκοπό την ερμηνεία των μοτίβων και της έντασης υβριδισμού για την εξαγωγή αποτελεσμάτων σχετικά με τη σχετική έκφραση κάθε γονιδίου. 12

13 Α cm Μέγεθος πίνακα συστοιχιών GeneChips 1.28 cm Δ. Β θέσεις ολιγονουκλεοτιδίων/ανιχνευτών GeneChips Γ. Εκατομμύρια στήλες ολιγονουκλεοτιδίων DNA σε κάθε θέση Κάθε ολιγονουκλεοτίδιο DNA έχει μέγεθος 25 βάσεις Εικόνα 1.2: Α.: Μέγεθος ενός Affymetrix GeneChip, Β.: Τυπωμένες θέσεις σε ένα λεπτό φύλλο πυριτίου, Γ.: Εκατομμύρια αλληλουχίες βάσεων τοποθετούνται σε κάθε θέση που αντιστοιχεί σε γνωστό γονίδιο ανιχνευτή, Δ. Κάθε αλληλουχία αποτελείται από 25 βάσεις (A,C,T,G) Κάθε γονίδιο αντιπροσωπεύεται στη συστοιχία από μια σειρά διαφορετικών ολιγονουκλεοτιδικών ανιχνευτών. Κάθε ανιχνευτής αποτελείται από ένα ζεύγος ολιγονουκλεοτιδίων στο οποίο η μια αλληλουχία υβριδοποιείται επακριβώς με το γονίδιο στόχο (Perfect-Match, PM) ενώ η άλλη αλληλουχία του ζεύγους, Mis-Match (MM), διαφέρει από την PM αλληλουχία κατά μία βάση στο κέντρο του 25μερούς. Η PM αλληλουχία έχει στόχο τη μέτρηση της γονιδιακής έκφρασης ενώ η MM ακολουθία χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό της έντασης του θορύβου υποβάθρου και της μη επιθυμητής υβριδοποίησης. Tα σήματα των δυο αυτών εντάσεων μπλέκονται μεταξύ τους. Με τη χρήση του αλγορίθμου MAS (ή MAS5) αφαιρείτε η ένταση του mis-match ανιχνευτή από την ένταση του perfect match ανιχνευτή έτσι ώστε να έχουμε το αποτέλεσμα της έκφρασης του γονιδίου που αντιστοιχεί στο συγκεκριμένο ζεύγος ανιχνευτών. Οι ανιχνευτές επιλέγονται βάση σύγχρονων και ανανεωμένων βάσεων δεδομένων όπως αυτή της Genebank. Οι αλληλουχίες των ανιχνευτών πιστεύεται ότι αναγνωρίζουν και υβριδοποιούνται σε μοναδικές περιοχές στο 3 άκρο του εκάστοτε γονιδίου. Η παρακάτω εικόνα αποτελεί σχηματική αναπαράσταση ενός ζεύγους ανιχνευτή. 13

14 Εικόνα 1.3: Σχηματική αναπαράσταση ενός ζεύγους ανιχνευτή Για το πείραμα των μικροσυστοιχιών της παρούσας πτυχιακής χρησιμοποιήθηκαν τα chips της Affymetrix GeneChip Gene1.0 ST για ποντικό. Τα συγκεκριμένα chips είναι νέας γενιάς και χρησιμοποιούν μόνο Perfect-Match τεχνολογία με κάθε ανιχνευτή να είναι ένα ολιγονουκλεοτίδιο 25 βάσεων. Αντίθετα, τα προηγούμενης τεχνολογίας chips της Affymetrix χρησιμοποιούσαν Perfect- Match και Mis-Match ανιχνευτές προκειμένου να επιτύχουν την επιθυμητή ανάλυση μεταξύ θεμιτού και ανεπιθύμητου σήματος. Σε αυτό το σημείο ορίζουμε ως ανάλυση την δυνατότητα διαχωρισμού σωστών έναντι τυχαίων υβριδοποιήσεων (π.χ. θόρυβος) μεταξύ ανιχνευτών και στόχων. Έτσι, αντί να χρησιμοποιούνται ΜΜ ανιχνευτές για τον υπολογισμού του θορύβου υποβάθρου, στη νέα γενιά μικροσυστοιχιών ο υπολογισμό του θορύβου υποβάθρου πραγματοποιείται με τη χρήση 17,000 ανιχνευτών ελέγχου. Το chip μεταξύ των άλλων εμπεριέχει και poly-α controls όπως επίσης και controls υβριδισμού για τον έλεγχο της ποιότητας και του πειράματος σε όλα τα στάδια της εκτέλεσής του. Το GeneChip Mouse Gene 1.0 ST παρέχει πληροφορία για 28,853 γονίδια διαθέτοντας 770,317 ξεχωριστούς ανιχνευτές, δηλαδή περίπου 27 ανιχνευτές για κάθε γονίδιο παρέχοντας υψηλού επιπέδου ανάλυση και εξασφαλίζοντας την ορθότητα των αποτελεσμάτων [11]. 14

15 1.2.4 Περισσότερες εμπορικά διαθέσιμες τεχνολογίες Μικροσυστοιχιών Illumina BeadChip Arrays Τα Illumina BeadChips είναι συστοιχίες διατεταγμένες σε σειρά, οι διαθέσιμοι τύποι αποτελούνται από έξι, οκτώ ή 12 επιμέρους συστοιχίες ενσωματωμένες σε κάθε BeadChip. Οι συστοιχίες του chip διαχωρίζονται η μια από την άλλη έτσι ώστε κάθε συστοιχία να μπορεί να υβριδοποιείται με ένα διαφορετικό δείγμα και πολλαπλά δείγματα να μπορούν να αναλύονται και να επεξεργάζονται ταυτόχρονα. Η αρχή λειτουργίας των μικροσυστοιχιών BeadChip της Illumina βασίζεται σε ανιχνευτές (probes) που δεσμεύονται σε μαγνητικά σφαιρίδια τα οποία είναι τυχαία κατανεμημένα στις συστοιχίες. Οι συστοιχίες στη συνέχεια σαρώνονται για την ανίχνευση της θέσης του κάθε σφαιριδίου, κάθε σφαιρίδιο φέρει μια μοναδική αλληλουχία ολιγονουκλεοτιδίων. Κατά τη σάρωση των μικροσυστοιχιών εκτός από την πληροφορία της θέσης κάθε σφαιριδίου λαμβάνουμε και την πληροφορία έκφρασης των αντίστοιχων ολιγονουκλεοτιδίων που υπάρχουν στα σφαιρίδια [12, 13]. Οι μικροσυστοιχίες της Illumina είναι διαθέσιμες για το γονιδίωμα του μυ και του ανθρώπου. Για τον μυ, στα chip των 6 θέσεων εξετάζονται ανιχνευτές (συνολικά) και στα chip των 8 θέσεων εξετάζονται ανιχνευτές. Για μελέτες στο ανθρώπινο γονιδίωμα διατίθενται τα chip των 12 θέσεων που διαθέτουν ανιχνευτές. Κάθε ανιχνευτής είναι ένα ολιγονουκλεοτίδιο 50 βάσεων. Για κάθε ανιχνευτή υπάρχουν 30 αντίγραφα στις συστοιχίες των 6 και 8 θέσεων και 15 αντίγραφα στις συστοιχίες των 12 θέσεων. Η μέτρηση της έντασης υβριδισμού για κάθε ανιχνευτή προκύπτει ως ο σταθμισμένος μέσος όρος των τιμών έντασης κάθε αντιγράφου για τον συγκεκριμένο ανιχνευτή. Τα περισσότερα γονίδια αντιπροσωπεύονται από έναν τύπο ανιχνευτή (ίδια αλληλουχία) ενώ κάποια άλλα από 2 ανιχνευτές. Ο αριθμός των διαφορετικών ανιχνευτών εξαρτάται από τα υπάρχοντα ισόμορφα του κάθε γονιδίου [13]. Εικόνα 1.4: Illumina BeadChip 12 θέσεων 15

16 Agilent Οι μικροσυστοιχίες τις Agilent χρησιμοποιούν την τεχνολογία της τύπωσης των ανιχνευτώνολιγονουκλεοτιδίων σε ειδικές γυάλινες καλυπτρίδες. Κάθε ανιχνευτής είναι ένα ολιγονουκλεοτίδιο 60 βάσεων. Οι μικροσυστοιχίες της Agilent είναι διαθέσιμες για αρκετούς οργανισμούς αλλά και για την κατασκευή μικροσυστοιχιών προσαρμοσμένες στις ανάγκες της κάθε έρευνας [14]. Τα περισσότερα γονίδια αντιπροσωπεύονται από έναν ανιχνευτή ενώ η μειοψηφία από δύο. Ο αριθμός των ανιχνευτών για κάθε γονίδιο εξαρτάται από διαφορετικά μετάγραφα του κάθε γονιδίου που υπάρχουν. Ο αριθμός των ανιχνευτών για κάθε συστοιχία ποικίλει αλλά είναι της τάξης των δεκάδων χιλιάδων όπως συμβαίνει και με τις υπόλοιπες τεχνολογίες μικροσυστοιχιών. Η πιο διαδεδομένη έκδοση είναι αυτή των 4X44Κ, δηλαδή κάθε chip φέρει 4 διαφορετικές ενσωματωμένες συστοιχίες όπου κάθε μία έχει ανιχνευτές. Οι συστοιχίες του chip διαχωρίζονται η μια από την άλλη έτσι ώστε κάθε συστοιχία να μπορεί να υβριδοποιείται με ένα διαφορετικό δείγμα και πολλαπλά δείγματα να μπορούν να αναλύονται και να επεξεργάζονται ταυτόχρονα [13]. Εικόνα 1.5: Agilent Chip 4X44K 16

17 1.3 Πειραματική διαδικασία Δημιουργία βιολογικού ερωτήματος Μελέτη για τις στατιστικές απαιτήσεις του πειράματος Επιλογή της τεχνολογίας μικροσυστοιχιών Για παράδειγμα: μονοχρωματική ή δυχρωματική υβριδοποίηση cdna, πλατφόρμα νέας ή προηγούμενης γενιάς. Υπολογισμός κόστους, επαναληψιμότητας, διαθεσιμότητας και συγκρισιμότητας. Υπολογισμός βιολογικών αντιγράφων Εύρεση πιθανών πηγών τεχνικών και βιολογικών σφαλμάτων για την απόκτηση των αντιγράφων. Υπολογισμός του απαραίτητου αριθμού βιολογικών αντιγράφων. Πειραματικός σχεδιασμός Προσδιορισμός των δειγμάτων που θα συγκριθούν. Τεχνικές για τη λήψη των τιμών γονιδιακής έκφρασης Προσδιορισμός αλγορίθμων και εργαλείων βιοπληροφορικής για: α) την κανονικοποίηση και λήψη των τιμών γονιδιακής έκφρασης από τις εικόνες έντασης υβριδισμού β) ελέγχου της συνολικής ποιότητας των αποτελεσμάτων του πειράματος. Δημιουργία λίστας στατιστικώς σημαντικών γονιδίων Προσδιορισμός στατιστικών μοντέλων σύμφωνα με τον πειραματικό σχεδιασμό. Προσδιορισμός στατιστικών μεγεθών για τον υπολογισμό της διαφορικής έκφρασης. Εύρεση βιολογικών αποτελεσμάτων Προσδιορισμός μοριακών μονοπατιών και γονιδιακών αλληλεπιδράσεων. Δημιουργία υποθέσεων βάση των ευρημάτων για τον σχεδιασμό νέων πειραμάτων με στόχο τη μελέτη των υποθέσεων αυτών. Εικόνα 1.6: Περίληψη πειραματικής διαδικασίας μικροσυστοιχιών DNA Η πειραματική διαδικασία σε ένα πείραμα με τη χρήση μικροσυστοιχιών αρχίζει με τον ορισμό ενός ή περισσότερων βιολογικών ερωτημάτων. Στα πειράματα μοριακής βιολογίας ο επιστήμονας έχει ήδη μια ιδέα ή μια υπόθεση την οποία προσπαθεί να επιβεβαιώσει. Στην περίπτωση όμως των πειραμάτων που περιλαμβάνουν μικροσυστοιχίες cdna με σκοπό την μελέτη του γενετικού προφίλ ενός οργανισμού, το πείραμα προηγείται της υποθέσεως. Ωστόσο, ένας επιστήμονας συνήθως έχει ήδη μια ιδέα για το τι συμβαίνει στον προς μελέτη οργανισμό, δηλαδή μια υπόθεση. Σε αυτή την περίπτωση το πείραμα της μελέτης της γονιδιακής έκφρασης εκτελείται με σκοπό να αποδειχθεί ή να απορριφτεί δυνητικά η συγκεκριμένη υπόθεση. Με άλλα λόγια, ο επιστήμονας κάνει μια ειδική πρόβλεψη για τα επίπεδα της έκφρασης των γονιδίων προς μελέτη, όπου μετά το πείραμα αυτή η υπόθεση μπορεί να αποδειχθεί ψευδής ή αληθής. Τις περισσότερες όμως φορές, ένα πείραμα για τη μελέτη της γονιδιακής έκφρασης λαμβάνει χώρα πριν να υπάρχει αρκετή γνώση για το πώς τα γονίδια που μας αφορούν αλληλεπιδρούν προκειμένου να επιτευχθεί έλεγχος μιας προηγούμενης πειραματικής διαδικασίας. Έτσι λοιπόν χωρίς την ύπαρξη της πειραματικής υπόθεσης, τα αποτελέσματα ενός πειράματος για τη μελέτη της γονιδιακής έκφρασης έχουν σκοπό να οδηγήσουν τον επιστήμονα στον προσδιορισμό μιας υπόθεσης η οποία να μπορεί να ελεγχθεί από περεταίρω πειραματικές διαδικασίες [15]. Εφόσον ο επιστήμονας έχει προσδιορίσει τη βιολογική ερώτηση ή υπόθεση που τον οδήγησε στην απόφαση για την πραγματοποίηση του πειράματος μικροσυστοιχιών, σειρά έχει ο προσδιορισμός της κατάλληλης πλατφόρμας και τεχνολογίας μικροσυστοιχιών που θα χρησιμοποιήσει. Στο σημείο αυτό, ο επιστήμονας θα πρέπει να επιλέξει από τις διαθέσιμες τεχνολογίες DNA μικροσυστοιχιών εκείνη η οποία θα αποφέρει τα πιο συμβατά και κατάλληλα αποτελέσματα σύμφωνα με το βιολογικό ερώτημα ή υπόθεση. Καθοριστικός παράγοντας αποτελεί το κόστος της εκάστοτε 17

18 τεχνολογίας και των πειραματικών διαδικασιών που ακολουθούν για τη διαθεσιμότητα των δειγμάτων και του υλικοτεχνικού εξοπλισμού. Η τεχνολογία που θα χρησιμοποιηθεί για την εκτέλεση του πειράματος είναι ο παράγοντας που καθορίζει τον αριθμό των βιολογικών δειγμάτων που θα μελετηθούν καθώς και την ποιότητα τους. Σε μια συγκριτική μελέτη όπως αυτή των μικροσυστοιχιών DNA, όσο μεγαλύτερος είναι ο αριθμός των βιολογικών δειγμάτων που θα συμμετέχει στο πείραμα τόσο πιο έγκυρα και κοντά στην πραγματικότητα θα είναι τα αποτελέσματα του πειράματος. Ο ελάχιστος αριθμός βιολογικών αντιγράφων για ένα πείραμα μονοχρωματικής σήμανσης είναι τρία πειραματικά δείγματα και τρία δείγματα ελέγχου. Ο προτεινόμενος αριθμός βιολογικών αντιγράφων είναι πέντε τόσο για τα πειραματικά δείγματα και τα δείγματα ελέγχου (μάρτυρες). Στο σημείο αυτό ο επιστήμονας θα πρέπει να έχει τη λύση για τα προβλήματα πρόσβασης και διαθεσιμότητας του προς μελέτη βιολογικού υλικού, π.χ. τον τρόπο απομόνωσης RNA από συγκεκριμένους ιστούς ή/και πληθυσμούς κυττάρων. Τα επόμενα βήματα έχουν σχέση με την πραγματοποίηση του πειράματος και την εξαγωγή αποτελεσμάτων. Η πραγματοποίηση του πειράματος της υβριδοποίησης των chip το οποίο θα περιγράψουμε στην ενότητα «υλικά και μέθοδοι» διαρκεί πολύ λίγο σε σχέση με τον σχεδιασμό του πειράματος πριν το πείραμα υβριδοποίησης και την ερμηνεία των αποτελεσμάτων που ακολουθεί μετά την ολοκλήρωση του πειράματος υβριδοποίησης των μικροσυστοιχιών. Το πείραμα της υβριδοποίησης ακολουθεί κατά κύριο λόγο τις οδηγίες του κατασκευαστή και απαιτεί 3 με 5 ημέρες για την ολοκλήρωσή του. Για την εξαγωγή αποτελεσμάτων από τα δεδομένα του πειράματος των μικροσυστοιχιών DNA χρησιμοποιούνται τεχνικές ανάλυσης και αλγόριθμοι που μας επιτρέπουν να κάνουμε συγκρίσιμα τα chip υβριδισμού μεταξύ τους και να απομακρύνουμε κάθε περιττή πληροφορία που πιθανά να διαστρεβλώσει τα αποτελέσματά μας και να μας οδηγήσει σε λανθασμένα συμπεράσματα. Αυτοί οι αλγόριθμοι στη συνέχεια ποσοτικοποιούν τη φθορίζουσα ακτινοβολία από τον υβριδισμό των ολιγονουκλεοτιδίων παρέχοντάς μας συγκριτικά μέτρα έτσι ώστε να διερευνήσουμε την έκφραση των γονιδίων σε ολόκληρο το γονιδίωμα ενός οργανισμού. Τα πειράματα μικροσυστοιχιών DNA δημιουργούν πολύ μεγάλο όγκο δεδομένων παρέχοντας τη δυνατότητα εκτίμησης της συνολικής κατάστασης ενός οργανισμού ή πληθυσμού κυττάρων. Η ανάλυση αυτής της μεγάλης ποσότητας δεδομένων αποτελεί τη μεγαλύτερη πρόκληση σε ένα πείραμα μικροσυστοιχιών DNA και καταλαμβάνει το μεγαλύτερο χρονικό διάστημα του πειράματος. Κατά τη διάρκεια αυτή πραγματοποιούνται οι αναλύσεις για τις τιμές έκφρασης των γονιδίων κάθε ομάδας δειγμάτων και τη σύγκριση της διαφορικής έκφρασης μεταξύ των ομάδων. 18

19 Έχοντας αυτά τα δεδομένα οδηγούμαστε στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων κάνοντας χρήση ειδικευμένων λογισμικών που αναγνωρίζουν χαρακτηριστικά, πρότυπα και συμπεριφορές των γονιδίων που παρουσιάζουν διαφορική έκφραση μεταξύ των πειραματικών και των δειγμάτων ελέγχου. Τα λογισμικά αυτά μας βοηθούν να κατηγοριοποιήσουμε τα υποψήφια προς μελέτη δείγματα και να εντοπίσουμε τον τρόπο με τον οποίον συνδέονται μεταξύ του οδηγώντας μας στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων που προϋπήρχαν του πειράματος Συλλογή δεδομένων Μετά τη σάρωση των μικροσυστοιχιών τα δεδομένα συλλέγονται για περαιτέρω ανάλυση και ερμηνεία. Οι περισσότεροι κατασκευαστές μικροσυστοιχιών, παρέχουν ειδικό εμπορικό λογισμικό ανάλυσης δεδομένων μικροσυστοιχιών μαζί με τον εξοπλισμό σάρωσης των chip. Στην περίπτωσή μας, η συλλογή και πρωταρχική επεξεργασία των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με το λογισμικό της Affymetrix, Affymetrix GeneChip Operating Software (GCOS). Το συγκεκριμένο λογισμικό λαμβάνει και αναλύει τις εικόνες των μικροσυστοιχιών, παρέχει παρακολούθηση ροής των δεδομένων, διαχειρίζεται τα δεδομένα πειράματος, και διεξάγει τη βασική ανάλυση της έκφρασης των γονιδίων. A B.. Εικόνα 1.7: A: Σαρωτής μικροσυστοιχιών Β. Εικόνα που λαμβάνουμε μετα τη σάρωση των μικροσυστοιχιών. Το συγκεκριμένο αρχείο φέρει την πληροφορία των εντάσεων φθορισμού των υβριδοποιημένων μεταγράφων Διόρθωση θορύβου υποβάθρου Σε ένα chip μικροσυστοιχίας, η ένταση φθορισμού κάθε κηλίδας είναι ένας συνδυασμός της έντασης φθορισμού υποβάθρου κοντά στην κηλίδα και της έντασης της ίδιας της κηλίδας υβριδισμού. Το στάδιο διόρθωση υποβάθρου στοχεύει στην απομάκρυνση της έντασης των μηβιολογικών σημάτων φθορισμού (θόρυβος). Τυπικά παραδείγματα μη-βιολογικών σημάτων υποβάθρου αποτελούν: η μη ειδική δέσμευση των μεταγράφων, ατελές πλύσιμο των 19

20 μικροσυστοιχιών μετά τη διαδικασία της υβριδοποίησης, μοτίβα υποβάθρου που επαναλαμβάνονται στις εικόνες που συλλέχτηκαν από τον σαρωτή. Ο θόρυβος υποβάθρου έχει μεγάλο αντίκτυπο κυρίως στα μετάγραφα (transcripts) γονιδίων των οποίων ο αριθμός είναι περιορισμένος. Σε αυτά τα γονίδια η ένταση φθορισμού από το παραγόμενο σήμα υβριδοποίησης είναι χαμηλή. Ομοίως, ο θόρυβος υποβάθρου ανιχνεύεται στις χαμηλές εντάσεις φθορισμού με αποτέλεσμα το σήμα υβριδοποίησης να μπερδεύεται με το σήμα θορύβου. Επομένως, μικρές αλλαγές στο μετρούμενο σήμα έχουν μεγάλο αντίκτυπο στον υπολογισμό της γονιδιακής έκφρασης αυτών των γονιδίων. Ο κλασσικός τρόπος για την απομάκρυνση του θορύβου είναι ο προσδιορισμός κατώτατης και ανώτατης τιμής έντασης κατωφλίου. Με αυτόν τον τρόπο απορρίπτονται οι τιμές έντασης του σήματος που είναι εκτός των επιθυμητών ορίων. Στην πλατφόρμα που χρησιμοποιήθηκε για το συγκεκριμένο πείραμα, τα όρια του θορύβου εκτιμούνται χρησιμοποιώντας ως αναφορά ένα σύνολο από περίπου γονίδια-ανιχνευτές υποβάθρου [12] Κανονικοποίηση Όπως αναφέραμε και στην εισαγωγή, το πείραμα για τη μελέτη της διαφορικής έκφρασης γονιδίων μεταξύ των γονιδιακώς τροποποιημένων και των φυσιολογικών δειγμάτων περιλαμβάνει τη σύγκριση της έκφρασης των γονιδίων μεταξύ αυτών των δύο περιπτώσεων. Προκειμένου να υπάρχει τόσο στατιστική όσο και βιολογική σημαντικότητα κάθε περίπτωση/γκρουπ βιολογικών αντιγράφων περιλαμβάνει πέντε ξεχωριστά δείγματα (chip) του ίδιο γονοτύπου. Σε κάθε όμως chip υβριδισμού, ανεξαρτήτως γκρουπ ή γονοτύπου λόγο της τυχαίας κατανομής του θορύβου προκύπτουν διαφορετικές τιμές κατανομής των εντάσεων, Εικόνα 1.8, Α1&Α2. Έτσι λοιπόν η ομαδοποίηση δύο ή περισσοτέρων chip υβριδισμού στο ίδιο βιολογικό γκρουπ προϋποθέτει την πραγματοποίηση προσαρμογών στην κατανομή των εντάσεων. Το αποτέλεσμα αυτής της επεξεργασίας των τιμών εντάσεων σε κάθε βιολογικό γκρουπ ονομάζεται κανονικοποίηση. Η κανονικοποίηση είναι η μέθοδος που στοχεύει στο να φέρει τις διαφορετικές κατανομές των τιμών εντάσεων μεταξύ των μικροσυστοιχιών στο ίδιο επίπεδο έτσι ώστε οι τιμές που λαμβάνουμε από κάθε γονίδιο μεταξύ των chip που ανήκουν στο ίδιο βιολογικό γκρουπ να είναι συγκρίσιμες. Η διαδικασία αυτή πραγματοποιείται από ειδικούς αλγορίθμους στη φάση της επεξεργασίας των τιμών έντασης φθορισμού που λαμβάνουμε από τη σχετική εικόνα μετά τη σάρωση των chip. 20

21 Log 2 expr, iintensity Density Log 2 expr, iintensity Density Α1 Α2 Sample entities Β1 Log 2 expr Β2 Sample entities Log 2 expr Εικόνα 1.8: Σύγκριση κατανομής τιμών εντάσεων μεταξύ κανονικοποιημένων και μη κανονικοποιημένων δειγμάτων. Κάθε χρωματιστό κουτί και καμπύλη αντιστοιχεί σε διαφορετικό chip υβριδισμού. Εικόνες Α1,Α2: κατανομή εντάσεων μεταξύ των chip που υβριδισμού του ίδιου βιολογικού γκρουπ πριν την εφαρμογή της κανονικοποίησης. Τόσο στο box plot, Α1 όσο και στο διάγραμμα εντάσεων υπάρχει εμφανής απόκλιση μεταξύ των κατανομών με αποτέλεσμα να μην είναι δυνατή η συσχέτιση των chip που ανήκουν στο ίδιο γκρουπ, π.χ. γκρουπ με τα δείγματα ελέγχου. Εικόνες Β1,Β2: Οι κατανομές εντάσεων μεταξύ των chip μετά την εφαρμογή της κανονικοποίησης είναι ταυτόσημες, γεγονός που κάνει εφικτή την ομαδοποίηση και συνόψιση των βιολογικών αντιγράφων που ανήκουν στον ίδιο γκρουπ/γονότυπο Η διαδικασία της συνόψισης (Summarization) Το σήμα από την ένταση φθορισμού που προκύπτει με την υβριδοποίηση των ολιγονουκλεοτιδίων των δειγμάτων με τα ολιγονουκλεοτίδια στόχους που βρίσκονται στο chip υβριδοποίησης καταγράφεται από τον laser σαρωτή και παράγει μια εικόνα. Στη συνέχεια η εικόνα με την πληροφορία των εντάσεων φθορισμού για κάθε γονίδιο στο chip υβριδοποίησης υπόκειται σε επεξεργασία για τη διόρθωση του θορύβου υποβάθρου και την κανονικοποίηση των κατανομών της έντασης μεταξύ των chip του ίδιου γκρουπ. Σειρά έχει η διαδικασία της συνόψισης, κατά την οποία πραγματοποιείται η ταύτιση των «φωτεινών κηλίδων/υβριδοποιημένων γονιδίων που βρίσκονται σε προκαθορισμένες θέσεις στο chip υβριδοποίησης με τα ονόματά τους. Δηλαδή πια 21

22 τιμή έντασης αντιστοιχεί σε κάθε γονίδιο στο chip. Η διαδικασία αυτή βασίζεται στα ειδικά αρχεία σήμανσης (annotation files) στα οποία καταγράφονται οι θέσεις όλων των γονιδίων που υπάρχουν πάνω στο chip. Τα αρχεία αυτά είναι μοναδικά για κάθε τύπο chip και διατίθενται από την εταιρία παραγωγής των μικροσυστοιχιών που χρησιμοποιήθηκαν για το πείραμα. Υλοποιώντας το παραπάνω βήμα λαμβάνουμε την τιμή έκφρασης για κάθε γονίδιο που έχει υβριδοποιηθεί επιτυχώς στο chip. Τέλος, «συνοψίζεται» η τιμή έκφρασης για κάθε γονίδιο των chip που ανήκουν στο ίδιο βιολογικό γκρουπ προκειμένου να υπολογιστεί μια τιμή (και όχι πέντε) για κάθε γονίδιο του ίδιου βιολογικού γκρουπ. Η διαδικασία αυτή εκτελείται αυτόματα μια φορά για τα chip που ανήκουν στην ομάδα των πειραματικών δειγμάτων και μια για αυτά που ανήκουν στην ομάδα των δειγμάτων ελέγχου. Τέλος, λαμβάνουμε μια τιμή έκφρασης π.χ. για το γονίδιο Meis1 από το δείγμα ελέγχου και μια από το πειραματικό δείγμα. Γνωρίζοντας τις τιμές έκφρασης σε κάθε μια από τις δύο περιπτώσεις υπολογίζεται στη συνέχεια η διαφορική έκφραση του γονιδίου Meis1. Δηλαδή κατά πόσο έχει μεταβληθεί η παραγωγή του mrna του Meis1 γονιδίου στο πειραματικό δείγμα σε σχέση με το δείγμα ελέγχου Ο αλγόριθμος RMA Στην παρούσα μελέτη οι διαδικασίες της διόρθωσης θορύβου υποβάθρου, κανονικοποίησης και συνόψισης εκτελούνται από τον αλγόριθμο RMA. Ο αλγόριθμος RMA της Affymetrix Gene Chips πραγματοποιεί διαδοχικά τις παραπάνω διαδικασίες. Η διαφορά του συγκεκριμένου αλγορίθμου από όλους τους υπολοίπους έγκειται στο γεγονός ότι είναι σχεδιασμένος για να χρησιμοποιείται με τη νέα τεχνολογία των chip όπου πραγματοποιείται μόνο Perfect Match υβριδισμός μεταξύ ολιγονουκλεοτιδίων στόχων και ανιχνευτών. Δηλαδή, ο αλγόριθμος RMA υπολογίζει τις τιμές έντασης φθορισμού από την υβριδοποίηση των ολιγονουκλεοτιδίων στόχων με τα ολιγονουκλεοτίδια ανιχνευτές που υπάρχουν στο chip. Τα ολιγονουκλεοτίδια ανιχνευτές (probes) είναι συμπληρωματικά των ολιγονουκλεοτίδια στόχων που προέρχονται από τα προς μελέτη δείγματα. Η διόρθωση υποβάθρου που χρησιμοποιείται στον RMA είναι μια μη γραμμική διόρθωση, η οποία πραγματοποιείται σε κάθε chip ξεχωριστά και βασίζεται στην κατανομή των τιμών των PM ανιχνευτών που βρίσκονται στο chip της Affymetrix. Ο θόρυβος υπολογίζεται βάση των τιμών φθορισμού περίπου ανιχνευτών που χρησιμοποιούνται ως αναφορά. Οι τιμές έντασης φθορισμού των PM ανιχνευτών αποτελούν μίξη του θορύβου υποβάθρου του οποίου το σήμα (Ν) έχει κανονική κατανομή και του σήματος που προσπαθούμε να απομονώσουμε αφαιρώντας των θόρυβο. Ο θόρυβος υποβάθρου (Ε) στον αλγόριθμο RMA υπολογίζεται ως ο μέσος όρος του 22

23 επιθυμητού σήματος (S) υπό τη συνθήκη των παρατηρούμενων τιμών των PM ανιχνευτών (Ο) χρησιμοποιώντας μια μέθοδο εκτίμησης πιθανότητα πυρήνα [Εικόνα 1.9]. Εικόνα 1.9: Η αναμενόμενη τιμή (Ε) μιας τυχαίας μεταβλητής είναι ο σταθμισμένος μέσος όρος όλων των πιθανών τιμών που αυτή η τυχαία μεταβλητή μπορεί να πάρει. Θόρυβος υποβάθρου (Ε), ένταση σήματος υβριδισμού (S), ένταση σήματος υβριδισμού των ανιχνευτών αναφοράς (Ο). Για την πραγματοποίηση της διαδικασίας της κανονικοποίησης ο RMA αλγόριθμος χρησιμοποιεί τη μέθοδο της ποσοστημόριας κανονικοποίησης (quantile normalization). Στην ποσοστημόρια κανονικοποίηση σε δυο ή περισσότερες κατανομές πού δεν έχουν κατανομή αναφοράς εξάγεται ο μέσος όρος. Έτσι, η υψηλότερη τιμή σε όλες τις περιπτώσεις των κατανομών γίνεται ο μέσος όρος των υψηλότερων τιμών, η δεύτερη υψηλότερη τιμή καθίσταται ο μέσος όρος των αμέσως χαμηλότερων τιμών και ούτω καθεξής. Η συγκεκριμένη τεχνική θεωρείται πολύ αποτελεσματική κάνοντας τις κατανομές πανομοιότυπες μεταξύ τους. Η διαδικασία της συνόψισης βασίζεται στην υπόθεση ότι ο λογάριθμος των παρατηρούμενων τιμών εντάσεων των PM ανιχνευτών ακολουθούν ένα γραμμικό προσθετικό μοντέλο. Η παραγόμενη αριθμητική ακολουθία περιλαμβάνει 3 σήματα: τον όρο ομοιότητας της έντασης μεταξύ των ανιχνευτών, έναν όρο εξαρτώμενο από το γονίδιο (η τιμή έκφρασης) και έναν όρο σφάλματος. Ο όρος της συγγένειας/ομοιότητας μεταξύ των ανιχνευτών αθροίζει στο 0, ενώ οι τιμές εξαρτώμενες από το γονίδιο υπολογίζονται με τη χρήση του αλγορίθμου median polish. Με αυτό τον τρόπο ο RMA προβλέπει και προστατεύει από την πρόσμιξη ακραίων τιμών (outliers) με αυτές του μέσου όρου. Yij=Log2 N(B(PMij)) Εικόνα 1.10: Ο μαθηματικός τύπος συνόψισης έχει αποτέλεσμα το μέτρο της γονιδιακής έκφρασης για κάθε ανιχνευτή σε κάθε chip. PMij: τιμή έντασης υβριδισμού ανιχνευτή/στόχου, Β: «συμπεριφορά» ανιχνευτή, π.χ. μέτρο διαφοροποίησης της τιμής log(pm) μετά τη διόρθωση υποβάθρου, Ν: όρος σφάλματος Έλεγχος ποιότητας υβριδοποίησης Μετά την ολοκλήρωση της υβριδοποίησης και της απόκτησης των τιμών έντασης πρέπει να πραγματοποιείται ο έλεγχος της ποιότητας υβριδοποίησης για την ανίχνευση ατελειών που δεν είναι οπτικά εμφανείς. Παράδειγμα αντίστοιχων ατελειών είναι η ύπαρξη pattern στην εικόνα εντάσεων φθορισμού που προέρχεται από το chip. Αφαιρώντας δείγματα τα οποία έχουν υποστεί 23

24 αποδόμηση του RNA (RNA degradation) ή δείγματα στα οποία η υβριδοποίηση των ολιγονουκλεοτιδίων στόχων με τα νουκλεοτίδια των ανιχνευτών ήταν ανεπιτυχείς λαμβάνουμε μια πιο σωστή εκτίμηση των αποτελεσμάτων [16]. Οι μικροσυστοιχίες ολιγονουκλεοτιδίων χρησιμοποιούν ανιχνευτές (probes) ελέγχου που υβριδοποιούνται με RNA spikes-ins ή αλλιώς Poly-A Control. Κάθε GeneChip περιέχει αρκετά σύνολα ανιχνευτών γονιδίων από το βακτήριο Β. subtilis τα οποία είναι απών στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς. Αυτά τα Poly-A RNA δείγματα ελέγχου (Lys, Phe, Thr, και dap) των βακτηριακών γονιδίων συντίθενται in vitro. Πολυαδενυλιωμένα μετάγραφα των γονιδίων αυτών είναι αναμιγμένα σε κλιμακωτές συγκεντρώσεις στο κοκτέιλ υβριδισμού με το RNA των προς μελέτη δειγμάτων. Αυτοί οι ανιχνευτές ελέγχου σχεδιάστηκαν ειδικά για να διατελέσουν ρόλο αμερόληπτου μάρτυρα με σκοπό την επίβλεψη όλης της διαδικασίας σήμανσης και υβριδισμού των γονιδίων ανιχνευτών με τα προς μελέτη γονίδια στόχους. Αυτό το κοκτέιλ ελέγχου εισέρχεται στην αρχή της πειραματικής διαδικασίας κατά τη δημιουργία του πρώτου κλώνου cdna από το ολικό RNA των προς μελέτη δειγμάτων. Στη συνέχεια τα Poly-A controls ενισχύονται και σημαίνονται μαζί με τα δείγματα προς μελέτη. Εξετάζοντας την ένταση υβριδισμού των Poly-A controls μπορούμε να έχουμε γνώμη για την επιτυχία και την ποιότητα της σήμανσης ανεξάρτητα από την ποιότητα των προς μελέτη δειγμάτων. Μετά την ολοκλήρωση του πειράματος, υπολογίζεται ο βαθμός υβριδισμού μεταξύ των spike-ins μεταγράφων και των ανιχνευτών ελέγχου για την κανονικοποίηση των μετρήσεων υβριδισμού των πειραματικών δειγμάτων στο chip [17-20]. Τα RNA spike-ins είναι ένα μείγμα από crna μεταγράφων σημασμένων με βιοτίνη. Το μείγμα αποτελείται από μετάγραφα biob, bioc, biod και cre σε κλιμακωτές συγκεντρώσεις των 1.5, 5, 25, και 100 pm αντίστοιχα. Σύμφωνα με το πρωτόκολλο υβριδισμού της Affymetrix, tο biob θα πρέπει να είναι παρόν τουλάχιστον στο 50% του συνόλου των chip που χρησιμοποιήθηκαν για το πείραμα ενώ τα μετάγραφα bioc, biod και cre θα πρέπει όχι μόνο να είναι παρόν σε κάθε chip που έχει υβριδοποιηθεί αλλά και να παρουσιάζουν κατά αντιστοιχία αυξανόμενες συγκεντρώσεις. Το λογισμικό GeneSpring υπολογίζει αυτόματα τις συγκεντρώσεις των υβριδοποιημένων ολιγονουκλεοτιδίων και παράγει το αντίστοιχο διάγραμμα. Το διάγραμμα αυτό χρησιμοποιείται για την ερμηνεία του ελέγχου υβριδοποίησης παρουσιάζοντας τις τιμές εντάσεως φθορισμού των συγκεκριμένων ανιχνευτών οπού στον άξονα X αναγράφεται το χαρακτηριστικό μετάγραφο και στον άξονα Υ ο λογάριθμος της κανονικοποιημένης τιμής του σήματος [Εικόνα 1.11]. 24

25 Εικόνα 1.11: Το διάγραμμα ελέγχου ποιότητας υβριδοποίησης. Το διάγραμμα παράχθηκε με τη βοήθεια του GeneSpring και προέρχεται από το πείραμα που πραγματοποιήθηκε για την παρούσα μελέτη. Η διάγραμμα αποτελεί χαρακτηριστικό παράδειγμα επιτυχούς υβριδοποίησης αφού τηρούνται όλες οι προϋποθέσεις που αναφέρει το πρωτόκολλο υβριδοποίησης της Affymetrix. Προκειμένου να μετρήσουμε και να ποσοτικοποιήσουμε τη δέσμευση των μορίων cdna στους ειδικούς ανιχνευτές, σημαίνουμε με βιοτίνη και έπειτα ξεπλένουμε το chip ώστε να παραμείνουν μόνο τα σημασμένα μόρια στο τα οποία έχουν υβριδοποιηθεί με τους ανιχνευτές της μικροσυστοιχίας. Στη συνέχεια χορηγούμε στο chip ένα διάλυμα που περιέχει ένα φθορίζον μόριο και το οποίο δεσμεύεται από τη βιοτίνη που υπάρχει στα εναπομείναντα cdna μόρια του chip. H υβριδοποίηση των cdna μορίων με τους συμπληρωματικούς ανιχνευτές μετριέται από λέιζερ το οποίο προκαλεί τον φθορισμό των υβριδοποιημένων γονιδίων. Η μέτριση της έντασης φθορισμού πραγματοποιείται από ειδικούς ανιχνευτές φωτός όμοιους με αυτούς που βρίσκονται στις ψηφιακές φωτογραφικές μηχανές. Όσο πιο έντονο είναι το σήμα που εκπέμπεται από τα φθορίζοντα μόρια, τόσο υψηλότερο είναι το επίπεδο υβριδοποίησης των cdna μορίων με τους ανιχνευτές και κατ επέκταση η έκφραση του mrna. Τα επίπεδα έντασης φθορισμού συσχετίζονται θετικά με τα επίπεδα έκφρασης ενός δεδομένου mrna μορίου. Δηλαδή, όσο υψηλότερα τα επίπεδα ανίχνευσης ενός mrna μορίου, τόσο υψηλότερα είναι και τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης που κωδικοποιείται στον προς μελέτη οργανισμό. Εικόνα 1.12: Παράδειγμα αρχείου εικόνας που προκύπτει από τη σάρωση με λέιζερ μιας μικροσυστοιχίας cdna 25

26 1.3.7 Προσδιορισμός της στατιστικώς σημαντικής διαφορικής έκφρασης Η πιο διαδεδομένη και επιστημονικά αναγνωσμένη τεχνική για τον εντοπισμό των ανιχνευτών που παρουσιάζουν ασυνήθιστα επίπεδα έκφρασης στο chip υβριδισμού του πειραματικού δείγματος σε σχέση με το δείγμα ελέγχου είναι η χρήση της λεγόμενης «σημαντικής διαφορικής έκφρασης». Αποκαλούμε σημαντική την διαφορική έκφραση ενός μεταγράφου όταν ή έκφραση αυτού διαφέρει κατά μέσο όρο τουλάχιστον το διπλάσιο από το δείγμα ελέγχου. Εκτενέστερη αναφορά γίνεται στις παραγράφους που ακολουθούν. Πιο εξελιγμένες προσεγγίσεις λαμβάνουν υπ όψη το μέγεθος του δείγματος (replicates/team) και την ισχύ της μεταβλητότητας των τιμών υβριδισμού/έκφρασης των ανιχνευτών. Στην περίπτωση αυτή αναφερόμαστε στη στατιστική σημαντικότητα που παρουσιάζει κάθε ανιχνευτής μεταξύ των δειγμάτων που συγκρίνονται. Η στατιστική σημαντικότητα υπολογίζεται με τη χρήση στατιστικών τεστ όπως το t-test και το ANOVA. Η επιλογή του test που θα κρίνει την στατιστική σημαντικότητα εξαρτάται από το σχεδιασμό του πειράματος. Όταν η σύγκριση των τιμών διαφορικής έκφρασης γονιδίων πραγματοποιείται μεταξύ δύο ομάδων, π.χ. ομάδα που περιλαμβάνει τα πειραματικά δείγματα και ομάδα που περιλαμβάνει τα δείγματα ελέγχου/αναφοράς, τότε το στατιστικό τεστ που χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό της στατιστικής σημαντικότητας είναι το t-test. Διαφορετικά, όταν έχουμε περισσότερες των δύο ομάδων σύγκρισης και πολλά replicates ανά ομάδα εκτελείται το στατιστικό τεστ ANOVA[21, 22] Η τιμή Fold Change Η τιμή Fold Change χρησιμοποιείται για την ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης σε πειράματα όπως οι μικροσυστοιχίες, qpcr, RNA-seq και άλλα. Η τιμή Fold Change είναι ένας αριθμός που περιγράφει το μέτρο της διαφοράς αλλαγής από μια αρχική σε μια τελική τιμή. Για παράδειγμα, εάν έχουμε μια αρχική τιμή 30 και μία τελική τιμή 60, η τελική τιμή αντιστοιχεί στον διπλασιασμό της αρχικής τιμής, δηλαδή σε μια αύξηση της τάξης του 2x, ή τιμή Fold Change ίση με 2. Στα πειράματα όπου πραγματοποιείται η μελέτη της γονιδιακής έκφρασης, αρχική είναι η τιμή της έκφρασης ενός γονιδίου όπως αυτή υπολογίζεται στο βιολογικό δείγμα ελέγχου, ενώ τελική είναι η τιμή που λαμβάνουμε στο πειραματικό δείγμα. Η τιμή fold change είναι ξεχωριστή για κάθε γονίδιο και εκφράζει το κατά πόσες φορές η έκφραση του γονιδίου αυτού στο πειραματικό δείγμα έχει μεταβληθεί σε σύγκριση με την τιμή της έκφρασης του ίδιου γονιδίου όπως αυτή εμφανίζεται στο βιολογικό δείγμα ελέγχου. Δηλαδή, το fold change είναι ο πολλαπλασιαστής με τον οποίο όταν θα πολλαπλασιάσουμε την τιμή της έκφρασης ενός γονιδίου στο δείγμα ελέγχου, θα έχουμε ως αποτέλεσμα την τιμή της γονιδιακής έκφρασης του ίδιου γονιδίου στο πειραματικό δείγμα. 26

27 H τιμή Fold Change υπολογίζεται ως ο λόγος της τελικής τιμής προς την αρχική τιμή, δηλαδή εάν η αρχική τιμή είναι Α και η τελική τιμή είναι Β, η τιμή Fold Change είναι Β / Α. Μια μεταβολή από 20 σε 80 θα έχει τιμή Fold Change ίση με 4, αφού 20 X 4 = 80. Σε ένα άλλο παράδειγμα, μια μεταβολή τιμής από 80 σε 20 θα έχει τιμή Fold Change ίση με 0.25, ή -4 = 1/4 αφού το 20 είναι το ¼ του 80. Προκειμένου να υπάρχει ρεαλιστική αντιπροσώπευση του επιπέδου αλλαγής σε όλο το φάσμα των θετικών αριθμών, όταν ο λόγος τελικής προς αρχικής τιμής είναι μικρότερες του 1 αντικαθιστούμε τον δεκαδικό αριθμό με την αρνητική τιμή του αντίστροφου του, π.χ. μια αλλαγή 80 έως 20 αντιστοιχεί σε τιμή Fold Change ίση με -4, δηλαδή σε μια τετραπλάσια μείωση [23] Η τιμή p-value Η στατιστική σημαντικότητα ενός αποτελέσματος είναι η πιθανότητα ότι η παρατηρηθείσα σχέση ή τιμή σε ένα δείγμα εμφανίστηκε από καθαρή τύχη και ότι στον πληθυσμό από τον οποίο το δείγμα προήλθε, καμία τέτοια σχέση ή τιμή δεν υπάρχει. Κάποιος θα μπορούσε να πει ότι η στατιστική σημασία ενός αποτελέσματος μας λέει κάτι για το βαθμό στον οποίο το αποτέλεσμα είναι "αληθινό" (από την άποψη της ύπαρξης "αντιπροσώπευσης του πληθυσμού"). Δηλαδή, η τιμή p- value αντιπροσωπεύει έναν δείκτη της αξιοπιστίας ενός αποτελέσματος. Όσο υψηλότερη η p-value, λιγότερο μπορούμε να εμπιστευτούμε την παρατηρηθείσα σχέση μεταξύ των μεταβλητών στο δείγμα. Συγκεκριμένα, η p-value αντιπροσωπεύει την πιθανότητα του λάθους που περιλαμβάνεται στην αποδοχή του παρατηρηθέντος αποτελέσματός ως έγκυρο. Παραδείγματος χάριν, μια τιμή p-value ίση με 0.05 (δηλ., 1/20) δείχνει ότι υπάρχει μια πιθανότητα 5% η σχέση μεταξύ των μεταβλητών που βρίσκονται στο δείγμα μας να είναι "ψευδής". Με άλλα λόγια, υποθέτοντας ότι στον πληθυσμό δεν υπάρχει καμία εξάρτηση μεταξύ των μεταβλητών, και επαναλαμβάνοντας τα πειράματα μας, θα μπορούσαμε να αναμείνουμε ότι περίπου σε κάθε 20 επαναλήψεις του πειράματος θα υπήρχε ένα στο οποίο η σχέση μεταξύ των εν λόγω μεταβλητών θα ήταν ίση ή ισχυρότερη απ' ότι στους δικούς μας υπολογισμούς. Σε πολλούς τομείς της έρευνας, η p-value του 0.05 αποτελεί τιμή κατωφλίου και χαρακτηρίζεται ως η διαχωριστική γραμμή που οριοθετεί το αποδεκτό "ποσοστό λάθους", p-value Κάθε τιμή με p-value > 0.05 δεν θεωρείται στατιστικά αποδεκτή. Η ανάλυση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών αποτελεί αντικείμενο έντονης έρευνας. Προκειμένου η διαφορική έκφραση ενός ή περισσοτέρων γονίδιων να αποτελέσει αντικείμενο επιστημονικής μελέτης θα πρέπει εκτός από βιολογική να παρουσιάζει και στατιστική σημαντικότητα. Βιολογική σημαντικότητα παρουσιάζει ένα γονίδιο όταν η τιμή της διαφορικής έκφρασης στο πειραματικό δείγμα είναι ίση ή μεγαλύτερη του δύο. Όταν δηλαδή το mrna ενός γονιδίου στο πειραματικό δείγμα εκφράζεται δυο φορές περισσότερο ή 2 φορές λιγότερο σε σχέση 27

28 με το δείγμα ελέγχου. Όταν η τιμή Fold Change ενός γονιδίου στο πειραματικό δείγμα είναι θετική σε σύγκριση με το δείγμα ελέγχου, τότε μιλάμε για υπερ-έκφραση του γονιδίου στο πειραματικό δείγμα. Διαφορετικά, όταν η τιμή αυτή είναι αρνητική εννοούμε ότι το γονίδιο υπο- εκφράζεται, δηλαδή η έκφραση του γονιδίου στο πειραματικό δείγμα είναι χαμηλότερη σε σύγκριση με το δείγμα ελέγχου. Ένα γονίδιο χαρακτηρίζεται ως στατιστικώς σημαντικό όταν η τιμή p-value που προκύπτει από το στατιστικό τεστ είναι ίση ή μικρότερη του 0.05, p-value Αυτό σημαίνει οτι η πιθανότητα η τιμή Fold Change ενός γονιδίου να είναι ψευδής είναι ίση ή μικρότερη από 5%. Ο λόγος ύπαρξης των στατιστικών τεστ είναι για να προσδιορίσουμε με εγκυρότητα το μέτρο της διαφορικής έκφρασης μεταξύ των δειγμάτων που συγκρίνουμε [24, 25] Μετα-ανάλυση δεδομένων Ανάλυση οντολογίας γονιδίων (Gene ontology analysis) Έχοντας εντοπίσει τα γονίδια με τη σημαντικότερη διαφορική έκφραση και στατιστική σημαντικότητα, επόμενο βήμα στη διαδικασία ανάλυσης των δεδομένων, είναι η «μετα-ανάλυση» των δεδομένων. Η μετα-ανάλυση των δεδομένων σκοπό έχει τον εντοπισμό κοινών προτύπων και συμπεριφορών μεταξύ των γονιδίων με σημαντική διαφορική έκφραση όπως επίσης και την ομαδοποίηση αυτών των γονιδίων σύμφωνα με τις λειτουργίες επιτελούν στον οργανισμό. Η ομαδοποίηση των γονιδίων βάση των λειτουργιών και των χαρακτηριστικών τους πραγματοποιείται με χρήση της «οντολογικής ανάλυσης γονιδίων», (Gene Ontology Analysis, GO). Η ανάλυση αυτή κατατάσσει ιεραρχικά τα γονίδια σε λίστες αρχίζοντας από πολύ γενικά γνωρίσματα ή λειτουργίες όπως για παράδειγμα «κοινά γνωρίσματα μεταβολικών διαδικασιών». Οι γενικές λίστες/ομαδοποιήσεις διαιρούνται περαιτέρω σε λίστες που αντιστοιχούν σε συγκεκριμένες διαδικασίες, όπως την κατηγορία «ινοσιτόλη και παραγωγική φωσφορυλίωση» [26]. Στη συγκεκριμένη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν τα λογισμικά MetaCore, IPA και GeneSpring για την πραγματοποίηση της GO Analysis. Ο τρόπος λειτουργίας των λογισμικών αυτών είναι πανομοιότυπος και ακολουθείται η κατηγοριοποίηση του GO project για κάθε γονίδιο [26]. Η διαφορά μεταξύ τους έγκειται στο γεγονός ότι κατατάσσουν και ομαδοποιούν τα γονίδια με διαφορετικό τρόπο. Για παράδειγμα: το γονίδιο Meis1 εντάσσεται από το GO project στην κατηγορία των μεταγραφικών παραγόντων. Το λογισμικό IPA εντάσσει το Meis1 σε μια ειδική κατηγορία/ομάδα μεταγραφικών παραγόντων που σχετίζονται με την αιμοποίηση, ενώ το GeneSpring δεν διαθέτει ξεχωριστή κατηγορία για μεταγραφικούς παράγοντες που σχετίζονται με την αιμοποίηση αλλά εντάσσει το Meis1 στην ίδια ομάδα μαζί με τους υπόλοιπους μεταγραφικούς παράγοντες. 28

29 Τα αποτελέσματα που προκύπτουν από μια τέτοιου είδους ανάλυση μας δίνουν κυρίως πληροφορίες για κυτταρικές και μοριακές διαδικασίες που διαταράσσονται στα πειραματικά δείγματα. Ο υπολογισμός της μεταβολής δραστικότητας των διαδικασιών αυτών βασίζεται στα γονίδια που σχετίζονται με αυτές και παρουσιάζουν σημαντική διαφορική έκφραση. Αντίθετα με την διαφορική έκφραση γονιδίων στην οποία χρησιμοποιείται η τιμή του Fold Change, στην ανάλυση οντολογιών δεν έχουμε μετρήσιμη πληροφορία για το κατά πόσο μια κατηγορία γονιδίων διαφέρει μεταξύ των δειγμάτων προς σύγκριση. Στην ανάλυση των οντολογιών κάθε κατηγορία συνοδεύεται από μια τιμή p-value και βάση αυτή αξιολογείται η σημαντικότητα της μεταβολής της και ταυτόχρονα υποδεικνύεται κατά πόσο είναι αληθές το αποτέλεσμα της ανάλυσης. Όσο μικρότερη είναι η τιμή p-value τόσο πιο σίγουροι είμαστε ότι η συγκεκριμένη κατηγορία ή ομάδα παρουσιάζει διαφορά μεταξύ των πειραματικών δειγμάτων και των δειγμάτων που χρησιμοποιούνται ως αναφορά. Υπολογισμός στατιστικής σημαντικότητας στη μελέτη ανάλυσης Οντολογιών Η στατιστική σημαντικότητα αξιολογείται βάση του μεγέθους της τομής μεταξύ του συνόλου των δεδομένων του χρήστη (λίστα διαφορικής έκφρασης γονιδίων) και του συνόλου των γονιδίων που αντιστοιχούν σε μια υπάρχουσα κατηγορία, π.χ. κατηγορία «blood coagulation» στο MetaCore. Οι κατηγορίες/ομαδοποιήσεις των γονιδίων βασίζονται στην υπάρχουσα βιβλιογραφία και σε δημοσιευμένες έρευνες που αποδεικνύουν τη συσχέτιση ενός γονιδίου με συγκεκριμένες ασθένειες, κυτταρικές λειτουργίες και μοριακές αλληλεπιδράσεις. Ας υποθέσουμε ένα σύνολο με όλα τα γονίδια στη βάση δεδομένων της MetaCore μεγέθους N. Αντίστοιχα το σύνολο των δεδομένων εισαγωγής του χρήστη ως R. Με n συμβολίζουμε το υποσύνολο των δεδομένων του συνόλου Ν που έρχονται σε κοινή ομολογία με το υποσύνολο r των δεδομένων εισαγωγής του χρήστη, r=n. Για τον υπολογισμό της στατιστικής σημαντικότητας ορίζουμε ως την μηδενική υπόθεση (null hypothesis, Ηο) το γεγονός ότι τα σύνολα R και n είναι ανεξάρτητα μεταξύ τους έτσι ώστε το μέγεθος της τομής τους να ακολουθεί υπερ-γεωμετρική κατανομή. Η εναλλακτική υπόθεση υποστηρίζει ότι υπάρχει θετική συσχέτιση μεταξύ των συνόλων R και n. Βασισμένη σε αυτή την υπόθεση υπολογίζεται η στατιστική σημαντικότητα (p-value) ως η πιθανότητα η τομή 2 τυχαίων υποσυνόλων του N να έχουν μέγεθος ίσο ή μεγαλύτερο του n [27]. Εικόνα 1.13: Μαθηματικός τύπος υπολογισμού στατιστικής σημαντικότητας/p-value στο λογισμικό MetaCore 29

30 Εύρεση προτύπων διαφοροποίησης Εκτός από την σύγκριση της στατιστικής σημαντικότητας και των τιμών διαφορικής έκφρασης κάθε γονιδίου ξεχωριστά υπάρχει και ένας επιπλέον τρόπος της μετα-ανάλυσης των δεδομένων. Αυτή η μέθοδος ονομάζεται Gene Set Analysis και εστιάζεται στη διαφορική έκφραση ενός συνόλου γονιδίων που ανήκουν σε ένα προκαθορισμένο γκρουπ [28, 29]. Τα Gene sets είναι γκρουπ γονιδίων που σχετίζονται λειτουργικά σύμφωνα με την ισχύουσα γνώση και βιβλιογραφία. Τα γκρουπ των γονιδίων συνήθως προέρχονται από την KEGG [30], εγκυκλοπαίδεια του Κιότο για τα γονίδια και το γονιδίωμα, όρους της Οντολογίας γονιδίων (Gene Ontology) [26], γονίδια που έχουν κοινά λειτουργικά χαρακτηριστικά. Εκπρόσωπος αυτής της μεθόδου ανάλυσης αποτελεί ο αλγόριθμος GSEA (Gene Set Enrichment Analysis) ο οποίος υπολογίζει τη σημαντικότητα των γονιδιακών γκρουπ βάση της συσχέτισης των επιπέδων έκφρασης τους μεταξύ των 2 φαινοτύπων. Το αποτέλεσμα μιας ανάλυσης GSEA είναι το enrichment score (ES), το οποίο εκφράζει τον βαθμό στον οποίο ένα γκρουπ γονιδίων υπερ-εκπροσωπείται στη κορυφή ή στη βάση ενός προκαθορισμένου και βαθμονομημένου πίνακα γονιδίων. Η κορυφή της λίστας εκπροσωπεί τον πειραματικό φαινότυπο ενώ η βάση το δείγμα ελέγχου. Το GSEA υπολογίζει το ES καθώς πραγματοποιεί την προσπέλαση του βαθμονομημένου πίνακα από την κορυφή προς την βάση. Κάθε φορά που ο αλγόριθμος εντοπίζει ένα γονίδιο από τη λίστα του χρήστη στην προκαθορισμένη λίστα του αλγορίθμου τότε αυξάνετε ένα στατιστικό άθροισμα, όταν το γονίδιο δεν συμπεριλαμβάνεται στη λίστα τότε μειώνεται το στατιστικό άθροισμα. Το μέτρο της αύξησης εξαρτάται από τη συσχέτιση του πειραματικού δείγματος και του δείγματος ελέγχου. Το ES αντιπροσωπεύει την μέγιστη απόκλιση από το 0 που έχει υπολογιστεί κατά την προσπέλαση του βαθμονομημένου πίνακα. Οι πίνακες αυτοί έχουν δημιουργηθεί από το Broad Institute και συντελούν την βάση δεδομένων MSigDB[28]. Θετικός αριθμός του ES σημαίνει ότι υπάρχει υπερ έκφραση μιας συγκεκριμένης ομάδας γονιδίων στο πειραματικό δείγμα. Αρνητικός αριθμός του ES σημαίνει ότι υπάρχει υπο- έκφραση μιας συγκεκριμένης ομάδας γονιδίων στο πειραματικό σε σχέση με το δείγμα ελέγχου. Το μέτρο για τον καθορισμό των αποτελεσμάτων της ανάλυσης GSEA είναι η κανονικοποιημένη τιμή του ES, το normalized enrichment score (NES). Πραγματοποιώντας την κανονικοποίηση του ES επιτυγχάνεται ο συσχετισμός μεταξύ του ES και του μεγέθους κάθε πίνακα. Έτσι το NES χρησιμοποιείται για την ποσοτικοποίηση του ES σε σχέση με όλο το γονιδίωμα του οργανισμού προς μελέτη και των εκάστοτε κατηγοριών μεταξύ τους. Το NES για κάθε κατηγορία υπολογίζεται ως ο λόγος του ES κάθε πίνακα προς το μέσο όρο των ES scores από το σύνολο των κατηγοριών/πινάκων [31]. 30

31 1.4 Η ΠΡΩΤΕΙΝΗ GEMININ ΕΜΠΛΕΚΕΤΑΙ ΣΤΗ ΡΥΘΜΙΣΗ ΤΟΥ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΜΟΥ ΚΑΙ ΤΗΣ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗΣ H πρωτεϊνική δομή της Geminin Η Geminin χαρακτηρίστηκε αρχικά σε 2 ανεξάρτητες μελέτες σαν ένας αναστολέας της αντιγραφής του DNA και σαν ρυθμιστής της νευρωνικής διαφοροποίησης. Σε αυτές τις μελέτες οι MgGarry και Kirschner έδειξαν ότι η Geminin πρωτεολύεται ειδικά κατά τη μίτωση και αναστέλλει την έναρξη της αντιγραφής του DNA αλλά όχι την επιμύκηνση. Επίσης, έδειξαν ότι η υπερέκφραση της Geminin ανέστειλε το «φόρτωμα» του MCM πρωτεϊνικού συμπλόκου, ενός συμπλόκου απαραίτητου για την αδειοδότηση του DNA για έναν νέο κύκλο αντιγραφής, στην χρωματίνη [32-34]. Η Geminin είναι µια πυρηνική πρωτεΐνη, ομόλογα της οποίας έχουν βρεθεί στα είδη Xenopus laevis, Homo sapiens, Mus musculus, Drosophila melanogaster, Gallus gallus, Caenorhabditis elegans, Rattus norvegicus, Bos taurus. Φαίνεται ότι η Geminin απαντάται στα μετάζωα και αποτελεί έναν εξελικτικά νέο ρυθμιστικό μηχανισµό της αντιγραφής του DNA. Μια μελέτη στο Αrabidopsis thaliana έδειξε ότι µία ανάλογη της Geminin πρωτεΐνη η GEM προσδένει το Cdt1 και εμπλέκεται σε αποφάσεις κυτταρικής διαφοροποίησης στα φυτά [35]. H Geminin έχει δειχθεί ότι φέρει διαφορετικά δομικά μοτίβα που καθορίζουν την αλληλεπίδραση της µε άλλες πρωτεΐνες, ρυθμίζουν το προφίλ έκφρασής της κατά τον κυτταρικό κύκλο και τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό της πρωτεΐνης. Στο αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης υπάρχει µια σύντομη αλληλουχία, η RRTLKVIQP, η οποία αποτελεί το μοτίβο αποικοδόμησης (destruction box) της πρωτεΐνης [36]. Η συγκεκριμένη αλληλουχία γίνεται στόχος ουβικουιτινιλίωσης από το APC κατά την διάρκεια της μίτωσης και οδηγεί στην αποικοδόµηση της πρωτεΐνης. Επίσης στο αμινοτελικό άκρο του µορίου όπως δείχθηκε από πειράματα στον Xenopus υπάρχει ένα μοτίβο πυρηνικού εντοπισμού NLS (Νuclear Localising Signal). Επίσης η ίδια έρευνα πρότεινε ότι τα αμινοξέα της XGeminin είναι απαραίτητα για την αλληλεπίδραση της µε την Crm πρωτεΐνη και τον Crmεξαρτώμενο πυρηνικό αποκλεισμό της Geminin, µια διαδικασία που μπορεί να συνδέεται µε την απενεργοποίηση της Geminin [37]. 31

32 Εικόνα 1.14: Τριτοταγής δομή της Geminin. Η τριτοταγής μορφή της Geminin αποτελείται από το κεφάλι (head) μεταξύ των αμινοξέων 1-80, το λαιμό (neck) μεταξύ των αμινοξέων , το κεντρικό τμήμα (body) μεταξύ των αμινοξέων και την ουρά (tail), [34]. Επίσης το αμινοτελικό μέρος της πρωτεΐνης και συγκεκριμένα τα αμινοξέα της Geminin επαρκούν για να επάγουν νευρογένεση σε έμβρυα του Xenopus laevis [33]. Η κεντρική περιοχή της Geminin συγκροτείται από ένα μοτίβο σπειροειδούς σπειράματος (coiled coil) το οποίο αποτελείται από πέντε επαναλήψεις των επτά αμινοξέων. Η κύρια περιοχή αλληλεπίδρασης µε το Cdt1 εντοπίζεται στο αμινοτελικό άκρο του μοτίβου ελικοειδούς έλικας της πρωτεΐνης και ιδιαίτερα σημαντικά για αυτή την αλληλεπίδραση είναι τα αμινοξέα της Geminin του ποντικού. Τα αμινοξέα αυτά είναι υψηλά συντηρημένα ανάμεσα στα ορθόλογα της geminin. Το αμινοτελικό άκρο του διμερούς των σπειροειδών σπειραμάτων της Geminin αλληλεπιδρά τόσο µε το αμινοτελικό όσο και µε το καρβόξυ-τελικό άκρο του Cdt1. Σε αντίθεση η καρβοξυτελική περιοχή της Geminin δεν φαίνεται να επηρεάζει την πρόσδεση του Cdt1 [38]. Ωστόσο µια άλλη μελέτη πρότεινε ότι η καρβοξυτελική περιοχή της mgeminin και συγκεκριμένα τα αμινοξέα αλληλεπιδρούν µε αμινοξέα του Cdt1 και είναι υπεύθυνα για την δημιουργία ενός ετεροεξαµερούς Geminin-Cdt1 [ 2x(2xGeminin-1xCdt1] [39] [Εικόνα 1.15]. Επίσης έχει δειχθεί ότι η Geminin αλληλεπιδρά µε την καταλυτική υπομονάδα Brg1 του SWI/SNF συμπλόκου και ότι η αλληλεπίδραση αυτή συμβαίνει µέσω της αµινοτελικής περιοχής του Brg1 και των αµινοξέων της Geminin [40]. 32

33 Εικόνα 1.15: Δομή του συμπλόκου Cdt1/Geminin στον άνθρωπο. Το (2x[Cdt1:2xGeminin]) ετεροεξαμερές παρουσιάζεται ως 3D σκίτσο στο οποίο το μόριο της Cdt1 είναι πορτοκαλί και το μόριο της Geminin πράσινο και μπλε. Στα χρωματιστά κουτιά με χρώμα μοβ, ροζ και μπλε παρουσιάζονται αντίστοιχα οι 3 επιφάνειες διεπαφής μεταξύ των πρωτεϊνών κατ αντιστοιχία με τις λειτουργικές περιοχές στις σηματοδοτημένες μπάρες των αμινοξέων, De Marco et al., Η Geminin ρυθμίζει τον κυτταρικό κύκλο μέσω της αλληλεπίδρασης της με το Cdt1. Στα τελικά στάδια της μίτωσης και τα αρχικά της G1 φάσης του κυτταρικού κύκλου γίνονται διεργασίες απαραίτητες για να πυροδοτηθεί ένας καινούργιος κύκλος αντιγραφής του DNA. Αυτή η διαδικασία απαιτεί αρκετούς εναρκτήριους παράγοντες όπως είναι το σύμπλεγμα αναγνώρισης των αφετηριών (origin recognition complex-(orc) το Cdc6 και το Cdt1 που στρατολογούνται στα σημεία έναρξης της αντιγραφής (origin of replication, Ori), πριν από την φόρτωση των ελικασών minichromosome maintenance complex (MCM) επάνω στη χρωματίνη, με αποτέλεσμα το DNA να αδειοδοτείται για αντιγραφή [41-43]. Είναι πολύ σημαντικό το DNA να αντιγράφεται μόνο μια φορά σε κάθε κυτταρικό κύκλο έτσι ώστε τα θυγατρικά κύτταρα να φέρουν, μετά την διαίρεση, την σωστή ποσότητα του DNA. Για αυτό το λόγο το κύτταρο έχει αναπτύξει μηχανισμούς για να αποκλείσει την επαν-αντιγραφή (rereplication) ελέγχοντας την δράση των μορίων του προαντιγραφικού συμπλόκου. Η Geminin είναι υπεύθυνη για την καταστολή της υπερ-αντιγραφής μέσω της αλληλεπίδρασης της με τον παράγοντα αδειοδότησης της αντιγραφής Cdt1. Η Geminin αρχίζει να εκφράζεται κατά την διάρκεια της S φάσης του κυτταρικού κύκλου μετά την έναρξη της αντιγραφής και τα επίπεδα της διατηρούνται υψηλά μέχρι το τέλος της M φάσης. Δεσμεύεται ισχυρά στο Cdt1 και καταστέλλει την πρόσδεση του στα σημεία έναρξης της αντιγραφής με αποτέλεσμα να 33

34 αποτρέπεται το φόρτωμα των MCMs στα σημεία έναρξης της αντιγραφής για δεύτερη φορά μέσα στον ίδιο κυτταρικό κύκλο και άρα την υπερ-αντιγραφή [44, 45]. Η Geminin αποικοδομείται από το APC σύμπλοκο στο τέλος της μίτωσης κατά την μετάβαση από την ανάφαση στην μετάφαση [32]. Αυτή η καταστολή της έκφρασης της Geminin είναι πολύ σημαντική διότι έτσι το Cdt1, που αρχίζει να εκφράζεται στην G1 φάση του κυτταρικού κύκλου, είναι ικανό να δεσμευτεί στα Ori με αποτέλεσμα την συγκρότηση του προαντιγραφικού συμπλόκου και την αδειοδότηση της αντιγραφής του DNA στον καινούργιο κυτταρικό κύκλο, Εικόνα Εικόνα 1.16: Αδειοδότηση και έναρξη της αντιγραφής στα μετάζωα. Η Geminin εκφράζεται στις φάσεις S,G2 και Μ του κυτταρικού κύκλου. Ρόλος της είναι η δέσμευση του Cdt1 με σκοπό την παρεμπόδιση της πρόσδεσης του στα σημεία έναρξης της αντιγραφής (Ori). Κατά την G1 φάση, όπου η Geminin πρωτεολύεται, το προαντιγραφικό σύμπλοκο, που αποτελείται από τις πρωτεΐνες ORC, Cdc6,Cdt1, προσδένεται στα Ori με αποτέλεσμα να αδειοδοτείται το κύτταρο για αντιγραφή και να φορτώνονται οι ελικάσες MCMs, Luo et al., Ο ρόλος της Geminin στις αποφάσεις κυτταρικής διαφοροποίησης Η ισορροπημένη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού και της διαφοροποίησης είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη και ομοιόσταση του οργανισμού. Επιπρόσθετα του ρόλου της στην ρύθμιση του πολλαπλασιασμού, η Geminin αναγνωρίστηκε σαν µια πρωτεΐνη η οποία επάγει την διαφοροποίηση προς νευρική κυτταρική μοίρα. Η ένεση του mrna της Geminin σε έμβρυα Xenopus επάγει την επέκταση της νευρικής πλάκας και την έκτοπη νευρογένεση εις βάρος της επιδερμίδας, µε µια διαδικασία η οποία καταστέλλει την σηματοδότηση µέσω BMP4 και επάγει συγκεκριμένα προ-νευρικά γονίδια [33]. Παρόμοια αποτελέσματα αποκτήθηκαν από πειράματα στην Drosophila, όπου ή έκτοπη υπερέκφραση της του οµολόγου της Geminin της Drosophila, είχε ως αποτέλεσμα τον σχηματισμό νευρικών κυττάρων έξω από τα φυσιολογικά χωρικά περιθώρια [46]. Αν και αυτές οι αρχικές έρευνες πρότειναν ότι η Geminin έχει κάποιο ρόλο στην διαδικασία της νευρογένεσης, 34

35 δεν ήταν εύκολα αντιληπτό πως ένας αναστολέας της αντιγραφής του DNA μπορεί να επηρεάσει την δέσμευση και διαφοροποίηση των νευρικών προγονικών κυττάρων Η Geminin επηρεάζει κυτταρικές αποφάσεις µέσω αλληλεπίδρασης µε μεταγραφικούς παράγοντες Έρευνες από τους Del Bene et al and Luo et al. 2004, πρότειναν ότι η Geminin μπορεί να κατευθύνει την απόφαση των προγονικών κυττάρων για πολλαπλασιασμό ή διαφοροποίηση. Πιο συγκεκριµένα πρότειναν ανταγωνιστικές αλληλεπιδράσεις µεταξύ της Geminin, του Cdt1 και των µεταγραφικών παραγόντων Hox και Six3 [47]. H δέσμευση της Geminin στον six3 δεν εμποδίζει την ικανότητα δέσμευσης του six3 στο DNA αλλά εμποδίζει την ικανότητα του να ενεργοποιήσει την µεταγραφή, ενώ ο six3 εµποδίζει την αλληλεπίδραση Geminin-Cdt1 [Εικόνα 1.17]. H υπερέκφραση της Geminin στον ιχθύ Medaka επάγει συγκεκριµένες ανωµαλίες στον σχηµατισµό του οφθαλµού και του πρόσθιου εγκεφάλου λόγω µειωµένου κυτταρικού πολλαπλασιασµού, πρόωρης διαφοροποίησης και αυξηµένης απόπτωσης. Αντίθετα η απενεργοποίηση της Geminin οδηγεί σε σχηµατισµό µεγενθυµένου οφθαλµού λόγω του αυξηµένου κυτταρικού πολλαπλασιασµού [47, 48]. Αυτά τα πειραµατικά αποτελέσµατα προτείνουν την άµεση, ανταγωνιστική αλληλεπίδραση µεταξύ της Geminin και του six3 για τον έλεγχο του κυτταρικού πολλαπλασιασµού και διαφοροποίησης [Εικόνα 1.17]. Επιπλέον, η Geminin του µυός έχει δειχτεί ότι αλληλεπιδρά µε τα HoxD10 και HoxA11, ενώ πειράµατα κατακρήµνισης, έδειξαν την αλληλεπίδραση της ανασυνδυασµένης Geminin µε άλλες Hox πρωτεΐνες όπως οι HoxA7, B7, C8, C9, και A10 [48]. Η αλληλεπίδραση αυτή εµποδίζει τους Hox µεταγραφικούς παράγοντες να προσδεθούν στο DNA και αναστέλλει την ικανότητα τους να ενεργοποιήσουν την µεταγραφή. 35

36 Εικόνα 1.17: Η Geminin ρυθµίζει τον κυτταρικό πολλαπλασιασµό, την δέσµευση και διαφοροποίηση των προγονικών κυττάρων µέσω αλληλεπιδράσεων µε µεταγραφικούς παράγοντες και σύµπλοκα αναδιάταξης της χρωµατίνης. (Α) Οι ανταγωνιστικές αλληλεπιδράσεις µεταξύ της Geminin και του µεταγραφικού παράγοντα six3 καθορίζουν την απόφαση των προγονικών κυττάρων του οφθαλµού για πολλαπλασιασµό ή διαφοροποίηση [47]. Β) Οι αλληλεπιδράσεις της Geminin µε τον µεταγραφικό παράγοντα AP4 έχουν προταθεί ότι περιορίζουν την έκφραση των νευρικών γονιδίων στα µη νευρικά κύτταρα. Η Geminin και ο AP4 συγκροτούν ένα λειτουργικό σύµπλοκο το οποίο προσελκύει τις SMRT και HDAC3 καταστέλλοντας τα γονίδια PAHX-AP1 και DYRK1A [49]. Γ) Η Geminin ρυθµίζει την έκφραση των Hox γονιδίων µέσω αλληλεπιδράσεων µε το σύµπλοκο Polycomb και απευθείας δέσµευση των Hox πρωτεϊνών. Αυτές οι αλληλεπιδράσεις συντελούν στην αναστολή της µεταγραφής των γονιδιακών στόχων των Hox πρωτεϊνών επηρεάζοντας τις κυτταρικές αποφάσεις νωρίς κατά την ανάπτυξη [48] ) Η Geminin δεσµεύεται απευθείας στην Brg1 πρωτεΐνη του SWI/SNF συµπλόκου αναδιάταξης της χρωµατίνης και αναστέλλει την αλληλεπίδρασή του µε bhlh µεταγραφικούς παράγοντες οι οποίοι ρυθµίζουν την διαδικασία της νευρογένεσης [40] Ε) Η χρονική ρύθµιση της έκφρασης του sox2 κατά την εγκαθίδρυση της νευρικής πλάκας εξαρτάται από αλληλεπιδράσεις µεταξύ των Geminin, ERNI και BERT, των καταστολέων HP1a και HP1γ και της καταλυτικής υποµονάδας του SWI/SNF συµπλόκου, Brahma (Brm). Η Geminin και ο Brm συνδέονται στον Ν2 υποκινητή του Sox2 γονιδίου, προσελκύοντας τον ERNI. O παράγοντας ERNI αλληλεπιδρά µε την Geminin και στρατολογεί την HP1γ η οποία καταστέλλει την έκφραση του sox2. O παράγοντας BERT καταστέλλει την αλληλεπίδραση της Geminin µε τον ERNI, εκτοπίζοντας την HP1γ από το σύµπλοκο και επιτρέποντας στην Geminin και τον Brm να επάγουν την έκφραση του Sox2 [50]. ΣΤ) Η ενεργοποίηση της µεταγραφής σε συγκεκριµένους υποκινητές ρυθµίζεται από την συνεργατική δράση της Geminin και του παράγοντα TIPT2 [51]. Έχει προταθεί ότι η Geminin και ο TIPT2 δρουν σαν μεταγραφικοί ενεργοποιητές των NF1 και TATA-box υποκινητών σε αλληλεπίδραση µε την βασική µεταγραφική µηχανή (BTM). Δ.Δ, Δ. Καραμήτρος

37 1.4.5 Η Geminin αλληλεπιδρά µε πρωτεΐνες του βασικού µηχανισµού µεταγραφής Η Geminin µπορεί να επηρεάσει την µεταγραφή µέσω της αλληλεπίδρασης της µε το βασικό µηχανισµό µεταγραφής. Ο παράγοντας TIPT2 (TATA-binding protein-like factor-interacting protein isoform 2), ο οποίος παρουσιάζει εκτεταμένο προφίλ έκφρασης σε ιστούς του εμβρύου και του ενηλίκου µυός, δείχθηκε ότι αποτελεί έναν καινούριο παράγοντα αλληλεπίδρασης της Geminin [Εικόνα 1.17]. O TIPT2 αλληλεπιδρά µε µέλη του Polycomb όπως τους Scmh1, Mph2, Ring1B, τον γενικό µεταγραφικό παράγοντα TBP (TATA box binding protein) και την σχετική πρωτεΐνη TBPL1. Ο TIPT2 δρα συνεργατικά µε την Geminin και τον TBP για την ενεργοποίηση υποκινητών οι οποίοι περιέχουν ΤΑΤΑ-box και µε τον TBPL1 για την ενεργοποίηση του NF1 υποκινητή. Επιπλέον η Geminin και ο TIPT2 ανιχνεύθηκαν προσδεμένοι στην χρωματίνη κοντά σε θέσεις πρόσδεσης των TBP/TBPL1. Αυτά τα δεδομένα προτείνουν ότι τόσο η Geminin όσο και ο TIPT2 προσδένονται στην βασική µεταγραφική µηχανή (basic transcriptional machinery) για την από κοινού ενεργοποίηση της µεταγραφής [51] Η Geminin επηρεάζει κυτταρικές αποφάσεις µέσω της αλληλεπίδρασης της µε παράγοντες που ρυθµίζουν την δομή της χρωµατίνης Επιπρόσθετα του ρόλου της Geminin στην ρύθµιση της µεταγραφής µέσω της απευθείας αλληλεπίδρασής της µε µεταγραφικούς παράγοντες, η Geminin είναι ικανή να επηρεάζει επιγενετικούς δείκτες και την οργάνωση της χρωµατίνης. Η Geminin προωθεί τη διφορική (bivalent) κατάσταση της χρωματίνης, που χαρακτηρίζεται από την παρουσία ενεργοποιητικών και κατασταλτικών τροποποιήσεων των ιστονών, στα γονίδια που κωδικοποιούν μεταγραφικούς παράγοντες και προωθούν την νευρογένεση [52]. Αυτός ο συνδυασμός ενεργοποίησης και καταστολής της τροποποίησης των ιστονών διατηρεί τα αναπτυξιακά γονίδια σε μια κατάσταση ετοιμότητας τα οποία όμως στην ουσία είναι κατασταλμένα [53, 54]. Αυτή η επιγενετική κατάσταση περιορίζει την έκφραση των γονιδίων που ρυθμίζουν τη δέσμευση των αδιαφοροποίητων βλαστικών και των πρόδρομων νευρικών κυττάρων σε νευρωνικές κυτταρικές γραμμές, καθώς η Geminin αλληλεπιδρά µε τον παράγοντα Scmh1 του συµπλόκου Polycomb [48]. Πειράµατα µε τη χρήση της τεχνικής ChIP (Chromatin Immunoprecipitation) πρότειναν ότι η Geminin εμπλέκεται στη ρύθµιση του κυτταρικού πολλαπλασιασµού και της κυτταρικής διαφοροποίησης. Η Geminin προσδένεται σε Plzf ρυθμιστικά στοιχεία του HoxD11 γονιδίου συμμετέχοντας στην καταστολή Hox γονιδίων [48]. 37

38 Αυτά τα πειράµατα υποστηρίχθηκαν περεταίρω από την έκτοπη έκφραση της Geminin στο νευρικό σωλήνα όρνιθος το οποίο είχε ως αποτέλεσμα σε μετακίνηση του οπίσθιου ορίου µεταγραφής του HoxB9 γονιδίου, γεγονός το οποίο υποδεικνύει ότι η Geminin εμπλέκεται στην καταστολή της έκφρασης των Hox γονιδίων. Επίσης η Geminin βρέθηκε να αλληλεπιδρά µε το SWI/SNF, ένα ATPεξαρτώμενο σύµπλοκο αναδιάταξης της χρωµατίνης [Εικόνα 1.17]. Έχει προταθεί ότι η Geminin αλληλεπιδρά µε τον Brg1, την καταλυτική υπο-μονάδα του SWI/SNF συµπλόκου, ρυθμίζοντας την νευρογένεση [40]. Η έκφραση της Geminin δείχθηκε να εµποδίζει τις αλληλεπιδράσεις του SWI/SNF µε bhlh µεταγραφικούς παράγοντες, µε αποτέλεσμα την καταστολή της γονιδιακής έκφρασης νευρικών γονιδίων και την διατήρηση των νευρικών προγονικών κυττάρων σε µια αδιαφοροποίητη κατάσταση. Ένα παράδειγμα του τρόπου με τον οποίον οι αλληλεπιδράσεις της Geminin μπορούν να ρυθμίσουν τη δομή της χρωµατίνης και να οδηγήσουν σε µεταγραφική ενεργοποίηση γονιδίων προήλθε από µελέτες της µεταγραφικής ενεργοποίησης του sox2 γονιδίου. Ο sox2 είναι ένας µεταγραφικός παράγοντας ο οποίος σχετίζεται µε την αναπτυξιακή πλαστικότητα των προγονικών κυττάρων, εµπλέκεται στον καθορισµό της κυτταρικής µοίρας και στην ρύθµιση της αρχιτεκτονικής της χρωµατίνης. Οι Papanayotou et al αναγνώρισαν δύο νέες πρωτεΐνες οι οποίες φέρουν µοτίβο σπειροειδούς σπειράµατος, τις ERNI και BERT, σαν µοριακούς παρτενέρ της Geminin. Έδειξαν ότι οι ανταγωνιστικές αλληλεπιδράσεις µεταξύ Geminin, ERNI και BERT καθορίζουν την προσέλκυση των ετεροχρωµατινικών πρωτεϊνών HP1α και HP1γ και ρυθµίζουν την ικανότητα του SWI/SNF συµπλόκου να ενεργοποιήσει την µεταγραφή του sox2 γονιδίου µέσω του N2 ενισχυτή του [Εικόνα 1.17]. Τα αποτελέσµατα προτείνουν ότι αυτές οι αλληλεπιδράσεις ελέγχουν την χρονική έκφραση του sox2 γονιδίου, βοηθώντας τον καθορισµό της νευρικής πλάκας στα έµβρυα των πτηνών [50]. Αυτά τα δεδοµένα δείχνουν ότι η Geminin αλληλεπιδρά µε έναν αριθµό µεταγραφικών παραγόντων και παραγόντων αναδιάταξης της χρωµατίνης ελέγχοντας µεταγραφικά προγράµµατα και επιγενετικές τροποποιήσεις και επηρεάζοντας την αυτό-ανανέωση και διαφοροποίηση των προγονικών νευρικών κυττάρων. Αυτός ο ρόλος υποστηρίζεται επίσης από πειράµατα γενετικής απαλοιφής του γονιδίου στον µυ, τα οποία καταδεικνύουν τον κεντρικό ρόλο της Geminin στην ρύθµιση της αυτό-ανανέωσης και διαφοροποίησης των εµβρυικών βλαστικών κυττάρων. Τα έµβρυα µυός από τα οποία απουσιάζει η Geminin σταµατούν την ανάπτυξη τους στο στάδιο των 8 κυττάρων και αποτυγχάνουν να δηµιουργήσουν την ενδοκυττάρια µάζα (ICM inner cell mass). Αυτά τα δεδοµένα καθώς και νεότερες µελέτες στο αιµοποιητικό σύστηµα υποστηρίζουν την ιδέα ότι η Geminin µπορεί να έχει ένα γενικό ρόλο στην ρύθµιση της κυτταρικής διαφοροποίησης και δέσμευσης των προγονικών κυττάρων [55, 56]. 38

39 1.5 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΚΑΙ ΙΑΦΟΡΟΠΟΪΗΣΗ ΤΟΥ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ Η ανάπτυξη του αιμοποιητικού συστήματος κατά την εμβρυογένεση του µυός Χρησιμοποιώντας τον µυ σα ζωικό μοντέλο για τη μελέτη της ανάπτυξης του αιμοποιητικού συστήματος των θηλαστικών, δείχθηκε ότι όλα τα διαφοροποιημένα κύτταρα που το αποτελούν προέρχονται από πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα. Κατά την ανάπτυξη του εμβρύου τα ανώριμα προγονικά κύτταρα του αιµοποιητικού βρίσκονται στην ανατοµική περιοχή µε µεσοδερµική προέλευση µέσα στο έµβρυο του µυ, την AGM (Αorta Gonad Mesonefros) περιοχή [57, 58]. Σε αυτή την περιοχή παρουσιάζονται κατά την 8-10η ηµέρα της εµβρυικής ανάπτυξης τα πρώτα βλαστικά κύτταρα του αιμοποιητικού συστήματος (Hematopoietic Stem Cells, HSCs) τα οποία θα παράγουν τα κύτταρα του µόνιµου αιµοποιητικού συστήµατος [59]. Μετά την 10η ηµέρα τα HSCs από την AGM περιοχή, διαµέσου της κυκλοφορίας, µεταναστεύουν στο ενδοθήλιο του εµβρυικού ήπατος, Εικόνα Από την 11η εµβρυική ηµέρα τα HSCs πολλαπλασιάζονται µε συνέπεια να αυξάνονται σε αριθµό µε εκθετικό ρυθµό, ευνοούµενα από το υποστηρικτικό µικροπεριβάλλον που δηµιουργούν τα ηπατικά κύτταρα [60]. Από τα μέσα της εµβρυικής ανάπτυξης µέχρι λίγο πριν τη γέννηση το εµβρυικό ήπαρ παραµένει το κυρίως αιµοποιητικό όργανο ενώ από την 16η εµβρυική ηµέρα τα βλαστικά και προγονικά αιµοποιητικά κύτταρα αποικίζουν τον µυελό των οστών και τον σπλήνα. Είναι γενικά αποδεκτό ότι ο αριθµός των HSCs του εµβρυικού ήπατος αυξάνεται όχι µόνο λόγω της µετανάστευσης τους από άλλους ιστούς αλλά και λόγω του in situ πολλαπλασιασµού τους [61, 62]. Η πρώτη φάση µετανάστευσης αιµοποιητικών κυττάρων προς το εµβρυικό ήπαρ διαρκεί από την 9 η έως την 10η εµβρυική ηµέρα, όταν το ενδοθήλιο του ήπατος αποικίζεται από µυελοερυθροειδείς προγόνους οι οποίοι παράγουν ώριµα ερυθροκύτταρα [63]. Το πρώτο κύµα κυτταρικής µετανάστευσης προς το ήπαρ είναι πιο πιθανό ότι ξεκινά από τον αµνιακό σάκο, ο οποίος έχει ήδη παράξει µεγάλο αριθµό προγονικών κυττάρων του αιµοποιητικού και έχει εγκαθιδρύσει τις πρώτες συνδέσεις µε το εµβρυικό ήπαρ µέσω αγγείων. Τα πρώτα HSCs κύτταρα παρουσιάζονται στο εµβρυικό ήπαρ την 11η εµβρυική ηµέρα προέρχονται από την AGM περιοχή και τον πλακούντα και διέρχονται µέσω των αγγείων [59]. Μετά την 12η εµβρυική ηµέρα το ήπαρ γίνεται ο κεντρικός εµβρυικός ιστός στον οποίο παρατηρείται αυτό-ανανέωση και διαφοροποίηση των HSCs. O αριθµός των HSCs φθάνει το µέγιστο των περίπου 1000 κυττάρων κατά την 15η µε 16η εµβρυική ηµέρα, ύστερα από την οποία φθάνει σε ένα πλατώ και αρχίζει να ελαττώνεται [60, 63]. Σε όλη αυτή τη χρονική περίοδο το εµβρυικό ήπαρ έχει µεγάλη περιεκτικότητα σε προγονικά κύτταρα του αιµοποιητικού όλων των κυτταρικών σειρών (ερυθροειδή, µυελοειδή, λεµφοειδή) γεγονός που επιβεβαιώνει τον σηµαντικό του ρόλο ως όργανο παραγωγής διαφοροποιηµένων 39

40 αιµοποιητικών κυττάρων. Με την πρόοδο της κύησης η διαδικασία της διαφοροποίησης αλλάζει κατεύθυνση προς διαφορετικές κυτταρικές σειρές. Αρχικά το πρώιµο εµβρυικό ήπαρ είναι εµπλουτισµένο σε CFU-E (colony formation unit erythroid κύτταρα και προερυθροβλάστες, υποδεικνύοντας ενεργή ερυθροποίηση, ενώ τα µυελοειδή και λεµφοειδή κύτταρα παράγονται σε µετέπειτα αναπτυξιακά στάδια. Υπάρχει περιορισµένη γνώση για το µικροπεριβάλλον του εµβρυικού ήπατος το οποίο υποστηρίζει τον πολλαπλασιασµό και διαφοροποίηση των HSCs. Είναι ενδιαφέρον το γεγονός ότι στο εµβρυικό ήπαρ τα HSCs βρίσκονται εντός του κυτταρικού κύκλου, ενώ αντίθετα στο µυελό των οστών τα HSCs είναι ηρεµούντα (quiescent). Εικόνα 1.18: Η χρονική σειρά των κύριων γεγονότων κατά την αιµοποίηση στο έµβρυο του µυός. Τα πάνω βέλη απεικονίζουν την ημέρα κατά την οποία παράγονται αιµοποιητικά κύτταρα από τους συγκεκριµένους ιστούς. Τα κάτω βέλη απεικονίζουν την εκκίνηση της µετανάστευσης των αιµοποιητικών κυττάρων προς τους δευτερεύοντες αιµοποιητικούς ιστούς [59]. 40

41 1.5.2 Τα κύρια µοντέλα διαφοροποίησης των εµβρυικών και ενηλίκων βλαστικών κυττάρων του αιµοποιητικού συστήµατος Το επικρατές µοντέλο για τη διαφοροποίηση των βλαστικών κυττάρων του αιµοποιητικού στον ενήλικο µυ προβλέπει ότι το πρώτο βήµα δέσµευσης προς διαφοροποίηση των βλαστικών κυττάρων του αιµοποιητικού ή των πολυδύναµων προγονικών κυττάρων του αιµοποιητικού (MPP, multipotent progenitors) περιλαµβάνει τον αυστηρό διαχωρισµό µεταξύ µυελοποίησης και λεµφοποίησης [64]. Αυτό το µοντέλο υποστηρίζεται από τα πειράµατα που οδήγησαν στην απομόνωση του κοινού προγόνου της µυελοειδούς σειράς (CMP, common myeloid progenitor) και του κοινού προγόνου της λεµφοειδούς σειράς (CLP, common lymphoid progenitor) αντίστοιχα, όπως και των παραγώγων του CMP, των κοινών προγόνων των µεγακαρυοκυττάρων /ερυθροκυττάρων (MEP, Megakaryocyte/Erythroid progenitor) και κοκκιοκυττάρων/µονοκυττάρων (GMP, granulocyte/monocyte progenitor)[65-67]. Σύµφωνα µε το προηγούµενο µοντέλο ο CMP και οι άµεσοι απόγονοι του οι GMP και MEP, θα παράγουν τελικώς διαφοροποιηµένα, µεγακαρυοκύτταρα, µονοκύτταρα, κοκκιοκύτταρα και ερυθροκύτταρα ενώ από τον CLP θα παραχθούν τα ώριµα B και Τ κύτταρα. Ορισμένα δεδομένα προτείνουν µια εναλλακτική πορεία κατά την διαφοροποίηση του ενήλικου αιµοποιητικού συστήματος αφού βρέθηκε ότι τα ενήλικα πολυδύναµα προγονικά κύτταρα του αιµοποιητικού µπορούν να παράγουν διαφοροποιηµένους απογόνους οι οποίοι παρουσιάζουν ταυτόχρονα δυναµικό διαφοροποίησης προς B και T κύτταρα αλλά και προς µονοκύτταρα και κοκκιοκύτταρα, χωρίς να µπορούν να παράγουν µεγακαρυοκύτταρα [68, 69]. 41

42 Εικόνα 1.19: Το µοντέλο του διαχωρισµού µεταξύ µυελοειδούς και λεµφοειδούς κυτταρικής µοίρας. Σύµφωνα µε το µοντέλο αυτό το πρώτο βήµα περιλαµβάνει το διαχωρισµό µεταξύ της µυελοειδούς και λεµφοειδούς κυτταρικής σειράς όπως υποστηρίχθηκε από την αποµόνωση του κοινού προγόνου της λεµφοειδούς σειράς (CLP) και του κοινού προγόνου της µυελοειδούς σειράς (CMP). Τα LT-HSCs (long term-haemopoietic stem cells) είναι αιµοποιητικά βλαστικά κύτταρα τα οποία µπορούν να δώσουν µακράς διάρκειας ανασύσταση του αιµοποιητικού συστήµατος ενώ αντίθετα τα ST-HSCs (short-term haemopoietic stem cells) είναι βλαστικά κύτταρα του αιµοποιητικού µε πιο περιορισµένο δυναµικό αυτό-ανανέωσης. Η διαφοροποίηση του κοινού προγόνου της λεµφοειδούς σειράς µπορεί σύµφωνα µε το παρόν µοντέλο να δώσει προ-β, προ-τ και προ-νκ κυτταρικούς προγόνους, ενώ ο κοινός πρόγονος της µυελοειδούς σειράς διαφοροποιείται στους κοινό πρόγονο των κοκκιοκυττάρων, µονοκυττάρων (GMP) και κοινό πρόγονο των µεγακαρυοκυττάρων, ερυθροκυττάρων (MEP) [70]. 42

43 1.6 Ο ΡΟΛΟΣ ΤΗΣ GEMININ ΣΤΗΝ ΑΥΤΟ-ΑΝΑΝΕΩΣΗ ΚΑΙ ΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΒΛΑΣΤΙΚΩΝ ΚΑΙ ΠΡΟΓΟΝΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΤΟΥ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ Αδρανοποίηση του γονιδίου της Geminin στα βλαστικά κύτταρα του αιμοποιητικού Στο εργαστήριό μας αναπτύχθηκε τεχνική που χρησιμοποιεί το Cre/LoxP σύστηµα για την δηµιουργία µυών του γονοτύπου Geminin flox/flox στους οποίους τα εξώνια 3&4 στον γονιδιακό τόπο της Geminin περιβάλλονται από 2 loxp θέσεις και µυών Geminin+/- οι οποίοι φέρουν ένα WT και ένα ΚΟ αλληλόµορφο ( ιδακτορική διατριβή Πανωραίας Κοταντάκη). Για να επεκτείνουμε την ανάλυση µας σχετικά µε τον in vivo ρόλο της Geminin στην ανάπτυξη και διαφοροποίηση του αιµοποιητικού συστήµατος, χρησιµοποιήσαµε ένα σχήµα διασταυρώσεων το οποίο επιτρέπει την απενεργοποίηση του γονιδίου της Geminin στα βλαστικά κύτταρα του αιµοποιητικού. Πιο συγκεκριµένα µύες Geminin flox/flox, διασταυρώθηκαν µε µύες Geminin+/- οι οποίοι έφεραν ταυτόχρονα και το διαγονίδιο VavCre (Εικόνα 1.20). Έχει δειχθεί ότι η Cre υπό τον έλεγχο των ρυθµιστικών στοιχείων του Vav γονιδίου εκφράζεται από την 12η εµβρυική ηµέρα στα βλαστικά κύτταρα του αιµοποιητικού (HSCs haemopoietic stem cells). Στα αποτελέσµατα που παρουσιάζονται ακολούθως οι Fl/koVavCre µύες χρησιµοποιήθηκαν για την µελέτη της ανάπτυξης του αιµοποιητικού συστήµατος απουσία της Geminin, ενώ οι Fl/wt, Fl/wtVavCre και Fl/ko µύες από την ίδια γέννα χρησιµοποιήθηκαν ως ζώα µάρτυρες (Διδακτορική διατριβή, Δ. Καραμήτρου). Δείγμα ελέγχου Δείγμα ελέγχου Πειραματικό δείγμα Δείγμα ελέγχου Εικόνα 1.20: Σχήµα διασταυρώσεων για τη δημιουργία µυών στους οποίους αδρανοποιείται το γονίδιο της Geminin στα βλαστικά κύτταρα του αιμοποιητικού Οι µύες του γονοτύπου GemininWT/KO διασταυρώθηκαν µε διαγονιδιακούς µύες στους οποίους η έκφραση του γονιδίου της Cre ελέγχεται από τα ρυθµιστικά στοιχεία του γονιδίου Vav. Τα ζώα απόγονοι του γονοτύπου GemininWT/KOVavCre από την προηγούµενη διασταύρωση επιλέχθηκαν και διασταυρώθηκαν εκ νέου µε µύες του γονοτύπου GemininFl/Fl. Η τελευταία διασταύρωση οδήγησε στην γέννηση µυών των γονοτύπων GemininFl/WT, GemininFL/KO, GemininFL/WTVavCre τα οποία χρησιμοποιούνται ως ζώα µάρτυρες και GemininFL/KOVavCre οι οποίοι είναι µύες στους οποίους απενεργοποιείται το γονίδιο της Geminin στα βλαστικά κύτταρα του αιµοποιητικού (Διδακτορική διατριβή Δ. Καραμήτρος). 43

44 1.6.2 Η αδρανοποίηση της Geminin στα βλαστικά κύτταρα του αιµοποιητικού επιφέρει πρόωρο εµβρυικό θάνατο Σε προηγούμενη μελέτη του εργαστηρίου μας δείχθηκε πως η απενεργοποίηση της Geminin στα βλαστικά κύτταρα του αιµοποιητικού µπορεί να προκαλεί πρόωρο εµβρυικό θάνατο. Κατά την 15η εµβρυική ηµέρα το εµβρυικό ήπαρ, το οποίο είναι το κύριο αιµοποιητικό όργανο σε αυτό το στάδιο, ήταν σηµαντικά µικρότερο στα Fl/koVavCre έµβρυα σε σχέση µε τα έµβρυα µάρτυρες (Εικόνα 1.21Γ). Επιπλέον το ήπαρ των Fl/koVavCre µυών παρουσίασε ανωµαλίες στον σχηµατισµό ερυθροκυττάρων. Η γενική µορφολογική εξέταση των εµβρύων Fl/koVavCre δεν αποκάλυψε άλλες σοβαρές ανωµαλίες (Εικόνα 1.21A). Τέλος κατά την 17η εµβρυική ηµέρα τα έµβρυα στα οποία είχε απενεργοποιηθεί το γονίδιο της Geminin στα βλαστικά κύτταρα του αιµοποιητικού έφεραν νεκρωτικό ιστό σε µεγάλη έκταση, γεγονός το οποίο υποδεικνύει τον θάνατό τους γύρω από αυτό το στάδιο. Τα ευρήµατα αυτά προτείνουν ότι ο πρόωρος εµβρυικός θάνατος των Fl/koVavCre εµβρύων µπορεί να προέρχεται από την µειωµένη παρουσία ερυθροκυττάρων και την ελλιπή οξυγόνωση των ιστών του εµβρύου (Διδακτορική διατριβή, Δ. Καραμήτρος). Ως συνέχεια της παραπάνω μελέτης πραγματοποιήθηκε η ανάλυση της αποτελεσµατικής απαλοιφής των εξωνίων 3&4 του floxed αλληλοµόρφου παρουσία της VavCre, ποσοτικοποιήθηκε το mrna της Geminin στα βλαστικά και προγονικά αιµοποιητικά κύτταρα εµβρυικού ήπατος από Fl/koVavCre και έµβρυα µάρτυρες µε τη χρήση PCR πραγµατικού χρόνου. Για το σκοπό αυτό, αποµονώθηκε ολικό mrna από Lin-ckithighsca1+ και Lin- ckithighsca1- κυτταρικούς πληθυσµούς που είχαν αποµονωθεί µε τη χρήση FACS από ηπατικά κύτταρα Fl/koVavCre και εµβρύων µαρτύρων 15ης εµβρυικής ηµέρας. Τα αποτελέσµατα από την ανάλυση µε PCR πραγµατικού χρόνου έδειξαν µείωση περίπου 90% της ποσότητας του mrna της Geminin τόσο στα Lin-ckithighsca1+ όσο και στα Lin-ckithighsca1- κύτταρα από τα Fl/koVavCre έµβρυα 15ης ηµέρας σε σχέση µε τους αντίστοιχους κυτταρικούς πληθυσµούς από τα έµβρυα µάρτυρες. Αυτά τα αποτελέσµατα προτείνουν ότι η έκφραση της Cre υπό τον έλεγχο των ρυθµιστικών στοιχείων του γονιδίου Vav, απενεργοποιεί την Geminin στα βλαστικά και προγονικά κύτταρα του αιµοποιητικού. Επιπλέον συµπεραίνουµε ότι η απενεργοποίηση της Geminin στα βλαστικά κύτταρα του αιµοποιητικού οδηγεί σε σοβαρές ανωµαλίες στη διαδικασία της αιµοποίησης στο εµβρυικό ήπαρ των µυών και τελικά στον πρόωρο εµβρυικό θάνατο (Διδακτορική διατριβή, Δ. Καραμήτρος, 2012). 44

45 Εικόνα 1.21: Η αδρανοποίηση του γονιδίου της Geminin στα βλαστικά κύτταρα του αιµοποιητικού οδηγεί σε πρόωρο εµβρυικό θάνατο. Α) Fl/koVavCre και µάρτυρες έµβρυα 15ης ηµέρας. Τα Fl/koVavCre έµβρυα είναι αναιµικά µε εµφανώς µειωµένο µέγεθος ήπατος. Β) Ανάλυση µε PCR πραγµατικού χρόνου (RT-PCR) της παρουσίας του µηνύµατος της Geminin σε δείγµατα cdna από διαχωρισµένα µε κυτταροµετρία ροής βλαστικά (Lin - c-kit high Sca-1 + ) και προγονικά (Lin - c-kit high Sca-1 - ) κύτταρα του αιµοποιητικού από Fl/koVavCre και ζώα µάρτυρες. Το ραβδόγραµµα αναπαριστά την έκφραση της Geminin σε σχέση µε την έκφραση του ενδογενούς µάρτυρα HPRT. Γ) Εµβρυικό ήπαρ από Fl/koVavCre και µάρτυρες έµβρυα 15ης ηµέρας. Το εµβρυικό ήπαρ από τα Fl/koVavCre έµβρυα παρουσιάζει δραµατική µείωση σε µέγεθος και στον συνολικό αριθµό αιµοποιητικών κυττάρων. ) Η γονοτύπηση 29 νεογέννητων από διαφορετικές γέννες υποδεικνύει ότι µύες του γονοτύπου Fl/koVavCre δεν επιβιώνουν έως την γέννηση, (Διδακτορική διατριβή, Δ. Καραμήτρος, 2012). Έχει αποδειχθεί πως η απουσία της Geminin οδηγεί σε ανώμαλη ανάπτυξη του αιµοποιητικού συστήματος του εμβρυικού ήπατος (Διδακτορική διατριβή, Δ. Καραμήτρος, 2012), αφού σε πειράματα τα οποία πραγµατοποιήθηκαν σε έµβρυα 15ης ηµέρας ο συνολικός αριθµός κυττάρων των Fl/koVavCre εµβρύων, βρέθηκε να είναι µειωµένος κατά 6 φορές σε σχέση µε τα έµβρυα µάρτυρες των οποίων ο αντίστοιχος αριθμός εκτιμάτε σε 6-7x10 7. Πιο συγκεκριμένα παρατηρήθηκε µια σηµαντική µείωση στα ερυθροκύτταρα, µε τα Ter119+ να µειώνονται κατά 90% στα Fl/koVavCre έµβρυα. Σηµαντικές µειώσεις παρατηρήθηκαν επίσης στα µυελοκύτταρα και λεµφοκύτταρα του ήπατος. Τα µυελοειδή GR1+ και Mac-1+ εµβρυικά ηπατικά κύτταρα µειώθηκαν κατά 85% και 89% αντίστοιχα στα Fl/koVavCre έµβρυα σε σχέση µε τους µάρτυρες. Επίσης τα Β220+ λεµφοκύτταρα παρουσίασαν µια σηµαντική µείωση της ταξης του 70%. Τέλος µια µη στατιστικά σηµαντική µείωση παρατηρήθηκε και στα Cd11c+ κύτταρα στα έµβρυα από τα οποία απενεργοποιείται η Geminin σε σχέση µε τα έµβρυα µάρτυρες (Διδακτορκή διατριβή, Δ. Καραμήτρος, 2012). Οι ανωμαλίες στα κύτταρα της ερυθροειδούς, µυελοειδούς και λεµφοειδούς σειράς του εµβρυικού ήπατος καθώς επίσης και οι µειώσεις στον αριθµό των ώριμων κυττάρων του αιµοποιητικού προτείνουν ότι η Geminin µπορεί να παίζει ρυθµιστικό ρόλο στην ανάπτυξη και διαφοροποίηση των βλαστικών και προγονικών κυττάρων του αιµοποιητικού. Αναλύσεις που πραγματοποιήθηκαν με κυτταρομετρία ροής για να διερευνηθεί εάν η απενεργοποίηση της Geminin επηρεάζει την αυτό-ανανέωση των βλαστικών κυττάρων του αιµοποιητικού έδειξαν µια αύξηση του LSK (Lin - c-kit high Sca-1 + ) κυτταρικού πληθυσµού κατά 13 φορές σε σχέση µε τα έµβρυα µάρτυρες, συνοδευόµενη από µια σηµαντική 45

46 µείωση των LK (Lin - c-kit high Sca-1 - ) κυττάρων που αποτελούνται από κυτταρικούς πληθυσµούς ερυθροειδών και µυελοειδών προγονικών κυττάρων. Ένθεση με BrdU σε Fl/koVavCre και έµβρυα µάρτυρες µετρήθηκε in vivo. Τα αποτελέσματα της οποίας υποδεικνύουν ότι οι αυξηµένοι αριθµοί των LSK κυττάρων δεν οφείλονται στον αυξηµένο κυτταρικό πολλαπλασιασµό αφού δεν ανιχνεύθηκε στατιστικώς σηµαντική διαφορά στην ένθεση BrdU µεταξύ των LSK κυττάρων από Fl/koVavCre και έµβρυα µάρτυρες. Σε αντίθεση τα LK κύτταρα από τα οποία απουσιάζει η Geminin παρουσίασαν µείωση στην ενσωµάτωση BrdU κατά 80% σε σχέση µε τα κύτταρα µάρτυρες, γεγονός το οποίο προτείνει µια ανωµαλία στον πολλαπλασιασµό των προγονικών κυττάρων in vivo. Στο σύνολο τους αυτά τα αποτελέσµατα επιβεβαιώνουν τις παρατηρούµενες ανωµαλίες στην οµοιόσταση των HSCs των Fl/koVavCre εµβρύων. Οι παρατηρούµενες µεγάλες µειώσεις στον αριθµό των προγονικών κυττάρων του αιµοποιητικού είναι πιθανόν να προέρχονται λόγω ανωµαλιών στην διαφοροποίηση των LSK HSCs από τα οποία απουσιάζει η Geminin και είναι σύµφωνες µε την µειωµένη ικανότητα κυτταρικού πολλαπλασιασµού των HPCs από τα Fl/koVavCre έµβρυα. 46

47 2 Σκοπός μεταπτυχιακής διατριβής Η παραγωγή των πλήρως διαφοροποιημένων κυττάρων του αίματος κατά την διάρκεια της ζωής ενός οργανισμού στηρίζεται στην ικανότητα των βλαστικών κυττάρων του αιμοποιητικού για αυτόανανέωση και διαφοροποίηση. Για την ομαλή ολοκλήρωση αυτής της διαδικασίας απαιτείται ο αυστηρός έλεγχος της αυτό-ανανέωσης και της διαφοροποίησης των βλαστικών κυττάρων του αιμοποιητικού, ο οποίος επιτυγχάνεται µέσω του συντονισμού της αντιγραφής του DNA, της µεταγραφής συγκεκριμένων γονιδίων και της ρύθμισης της δομής της χρωµατίνης. Αποτελέσµατα από πρόσφατη μελέτη του εργαστηρίου μας (Διδακτορική διατριβή, Δ. Καραμήτρος, 2012) πρότειναν ότι ο καίριος ρόλος της Geminin κατά την εμβρυική αιμοποίηση έγκειται στην ρύθµιση της διαφοροποίησης κατά την μετάβαση από τα βλαστικά κύτταρα του αιμοποιητικού προς τα προγονικά κύτταρα του αιμοποιητικού. Σκοπός αυτής της μεταπτυχιακής διατριβής είναι η ταυτοποίηση του δικτύου γονιδίων μέσω του οποίου η Geminin ρυθμίζει τη μετάβαση από τα βλαστικά προς τα προγονικά κύτταρα του αιμοποιητικού. Για το λόγο αυτό απομονώθηκαν βλαστικά και προγονικά κύτταρα του αιμοποιητικού συστήματος από το εμβρυικό ήπαρ με χρήση κυτταρομετρητή ροής. Στη συνέχεια, απομονώθηκε RNA από τους παραπάνω κυτταρικούς πληθυσμούς και πραγματοποιήθηκε συγκριτική μελέτη του γονιδιακού προφίλ έκφρασης μεταξύ γονιδιακά τροποποιημένων και φυσιολογικών μυών με τη χρήση της τεχνολογίας των μικροσυστοιχιών cdna. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν επεξεργάστηκαν και ερμηνεύτηκαν με εργαλεία βιο-πληροφορικής για την εύρεση των πιθανών μηχανισμών μέσω των οποίων η Geminin εμπλέκεται στην ρύθμιση της αυτόανανέωσης και εγκαθίδρυσης μεταγραφικών προγραμμάτων που έχουν ως αποτέλεσμα της διαφοροποίηση των βλαστικών και προγονικών κυττάρων του αιμοποιητικού συστήματος. 47

48 3 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 3.1 Απομόνωση και καθαρισμός γενωμικού DNA με διάλυμα φαινόλης χλωροφορμίου-ισοαμυλικής αλκοόλης (PCI) Για την εύρεση του γονοτύπου των προς μελέτη μυών εφαρμόζεται η μέθοδος της PCR χρησιμοποιώντας ως μήτρα γενομικό DNA. Το γενομικό DNA μπορεί να απομονωθεί από οποιονδήποτε ιστό του ζώου. Στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκε ως πηγή ιστού ένα κομμάτι μεγέθους 1cm περίπου από την ουρά ή το πόδι των μυών. Πειραματική διαδικασία: 1. Ο ιστός ή τα κύτταρα από τα οποία απομονώνεται γενωμικό DNA επωάζονται για 18h σε διάλυμα λύσης (500µl) µε την παρουσία πρωτεινάσης K (100ng/ml). 2. Προσθήκη ίσου όγκου διαλύματος PCI και ισχυρή ανάδευση. 3. Φυγοκέντρηση στις rpm για 15min, σε θερμοκρασία δωματίου. 4. Αφαίρεση της υπερκείμενης φάσης και μεταφορά της σε καινούριο eppendorf. 5. Προσθήκη ίσου όγκου χλωροφορμίου και ισχυρή ανακίνηση του μείγματος. 6. Φυγοκέντρηση στις rpm για 5min στους 25 o C. 7. Μεταφορά του υπερκείμενου σε καινούριο eppendorf, προσθήκη ίσου όγκου ισοπροπανόλης ακολουθούμενη από ισχυρή ανάμειξη του διαλύματος. 8. Κατακρήμνιση του DNA στους -20o C για 16 h. 9. Φυγοκέντρηση στις rpm για 30min σε θερμοκρασία 4o C. 10. Αφαίρεση του υπερκείμενου και ξέπλυμα του ιζήματος µε 300µl 70% αιθανόλης (EtOH). 11. Ανάδευση µε ήπιο vortex. 12. Φυγοκέντρηση στις rpm για 10min σε θερμοκρασία δωματίου. 13. Αφαίρεση του υπερκειμένου και επαναδιάλυση του ιζήματος σε 50µl διπλά αποσταγμένου νερού (ddη2ο). 14. Επώαση του επαναδιαλυμένου DNA σε θερμοκρασία δωματίου για αναδίπλωση της τριτοταγής του δομής. 15. Φωτομέτρηση του DNA για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης του. Υλικά: Διάλυμα λύσης (100mM Tris HCl ph 8.5, 5mM EDTA, 0,2% SDS) Πρωτεϊνάση Κ (10mg/ml) Διάλυμα Φαινόλης-Χλωροφορμίου-Ισοαμυλικής Αλκοόλης (25:24:1 Phenol, Chloroform, Isoamyl alcohol, PCI) Χλωροφόρμιο Ισοπροπανόλη Διάλυμα ΕtOH 70% Αποστειρωμένο ddh2o 48

49 3.2 Γονοτύπηση των μυών με την μέθοδο της PCR Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR, polymerase chain reaction) είναι μία μέθοδος βιοχημείας και μοριακής βιολογίας για την απομόνωση και τον πολλαπλασιασμό μίας αλληλουχίας DNA, μέσω της ενζυμικής αναπαραγωγής του DNA χωρίς τη χρήση ζωντανών μικροοργανισμών. Με την PCR μια συγκεκριμένη περιοχή του γονιδιώματος μπορεί να πολλαπλασιαστεί μέχρι και δισεκατομμύρια φορές, δεδομένου ότι είναι γνωστή η νουκλεοτιδική του αλληλουχία. Η αλληλουχία του γονιδίου είναι απαραίτητη για τον σχεδιασμό των συνθετικών DNA ολιγονουκλεοτιδίων (εκκινητές primer), όπου το καθένα είναι συμπληρωματικό με μία από τις αλυσίδες του δίκλωνου DNA. Τα ολιγονουκλεοτίδια που θα χρησιμοποιηθούν ως εκκινητήρες πρέπει να δεσμεύονται σε θέσεις αντίθετες από την αλληλουχία που πρόκειται να ενισχυθεί, με άλλα λόγια καθορίζουν τα άκρα του θραύσματος DNA που πρόκειται να ενισχυθεί. Στην παρούσα εργασία απαραίτητος είναι ο διαχωρισμός των τριών διαφορετικών αλληλομόρφων της Geminin που φέρουν οι μύες που χρησιμοποιήθηκαν. Τα αλληλόμορφα αυτά είναι το αγρίου τύπου (WT) αλληλόμορφο, το Floxed αλληλόμορφο που περιέχει τις LoxP θέσεις και το ΚΟ αλληλόμορφο που δεν περιέχει τα εξώνια 3 και 4 του γονιδίου της Geminin, Εικόνα 3.1. Επίσης μέσω της PCR πιστοποιείται η ύπαρξη ή όχι του γονιδίου της Cre ρεκομπινάσης Στρατηγική γονοτύπησης των γενετικά τροποποιημένων μυών στους οποίους επιτελείται ιστοειδική αδρανοποίηση του γονιδίου της Geminin Δυο σετ εκκινητών χρησιμοποιήθηκαν για τον διαχωρισμό των τριών αλληλομόρφων της Geminin με βάση το διαφορετικό μέγεθος των κομματιών DNA που ενισχύθηκαν. Το πρώτο σετ των εκκινητών ενισχύει ένα τμήμα DNA που στην περίπτωση του WT αλληλόμοφου έχει μέγεθος 549 βάσεων ενώ στην περίπτωση του Floxed αλληλόμοφου έχει μέγεθος 597 βάσεων. Το δεύτερο σετ εκκινητών ενισχύει ένα τμήμα DNA που έχει μέγεθος 249 βάσεων στο ΚΟ αλληλόμορφο. Ενισχύει επίσης ένα τμήμα DNA που έχει μέγεθος 1900 βάσεις στο WT αλληλόμορφο και 1948 βάσεις στο Floxed αλληλόμορφο τα οποία όμως δεν τα παίρνουμε ως προϊόντα της PCR λόγω του μεγέθους τους. Για την γονοτύπηση των μυών στους οποίους πραγματοποιείται ιστοειδική απενεργοποίηση του γονιδίου της Geminin, χρησιμοποιήθηκε µια στρατηγική PCR κατά την οποία 2 ζεύγη εκκινητών µε 2 ξεχωριστές αντιδράσεις PCR ανιχνεύουν όλα τα πιθανά αλληλόμορφα του γονιδιακού τόπου της Geminin (Karamitros et al., 2010a). 49

50 Εικόνα 3.1: γονιδιακός τόπος της Geminin (αλληλόμορφο αγρίου τύπου), το αλληλόµορφο το οποίο έχει προέλθει ύστερα από γονιδιακή στόχευση (αλληλόµορφο floxed) και το αλληλόµορφο από το οποίο απουσιάζουν τα εξώνια 3&4 (αλληλόµορφο ΚΟ). Οι θέσεις πρόσδεσης των εκκινητών της στρατηγικής PCR που ακολουθήθηκε για την γονοτύπηση των ποντικών παριστάνονται µε βέλη (Διδακτορική διατριβή, Δημήτρης Καραμήτρος, 2012) Αντίδραση PCR µε τη χρήση των εκκινητών zo H πρώτη αντίδραση PCR µε τη χρήση του ζεύγους εκκινητών zo250-zo251, ενισχύει µια περιοχή 280bp του KO αλληλοµόρφου του γενετικού τόπου της Geminin. Οι ίδιοι εκκινητές ενισχύουν µια περιοχή περίπου 1900bp του αγρίου τύπου αλληλοµόρφου, ωστόσο συνήθως το προϊόν δεν ανιχνεύεται λόγω του µεγάλου µεγέθους του. Στην Εικόνα 3.1 δίνονται οι θέσεις πρόσδεσης των εκκινητών και τα μεγέθη των προϊόντων της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης στα αλληλόµορφα αγρίου τύπου, floxed και KO. Πίνακας 3.1: Αντίδραση PCR για την ανίχνευση του ΚΟ αλληλόµορφου του γονιδιακού τόπου της Geminin Αντιδραστήριο Αρχική συγκέντρωση διαλυμάτων Όγκος ανα 50 μl αντίδρασης Τελική συγκέντρωση διαλυμάτων Δείγμα DNA 100 ng/μl 3 μl 6ng/μl 10Χ ρυθμιστικό διάλυμα 10x 5 μl 1x Διάλυμα MgCl2 25 mm 3 μl 1,5 mm Δεοξυριβονουκλεοτίδια (dntps) 10 mm 1 μl 200 μl zo250 εκκινητής 100 pmoles/ul 0.5 μl 1 pmol/μl zo251 εκκινητής 100 pmoles/ul 0.5 μl 1 pmol/μl Taq πολυμεράση 5 U/μl 1 μl 0,1 Units/μl Αποστειρωμένο H2O - Έως τα 50 μl - Πρόγραµµα της αντίδρασης PCR µε τη χρήση των εκκινητών zo250-zo251: C για 5min. x C για 45sec C για 45sec C για 1min. 5. Επανάληψη των βηµάτων 2,3,4 για 34 κύκλους C για 10min. 50

51 3.2.3 Αντίδραση PCR µε τη χρήση των εκκινητών Η δεύτερη αντίδραση PCR (Πίνακας 3.2) µε τη χρήση του ζεύγους εκκινητών ενισχύει µια περιοχή DNA 549bp στο αλληλόμορφο αγρίου τύπου και µια περιοχή 583bp στο αλληλόμορφο floxed, Εικόνα 3.1. Τα προϊόντα αυτά µπορούν να διαχωριστούν σε πήκτωμα αγαρόζης περιεκτικότητας 2%. Στον παρακάτω πίνακα φαίνονται τα αντιδραστήρια και οι τελικές συγκεντρώσεις τους όπως χρησιμοποιήθηκαν στην συγκεκριμένη αντίδραση. Πίνακας 3.2: Αντίδραση PCR για την ανίχνευση των Fl και WT αλληλοµόρφων του γονιδιακού τόπου της Geminin Αντιδραστήριο Αρχική συγκέντρωση διαλυμάτων Όγκος ανα 50 μl αντίδρασης Τελική συγκέντρωση διαλυμάτων Δείγμα DNA 100 ng/μl 3 μl 6ng/μl 10Χ ρυθμιστικό διάλυμα 10x 5 μl 1x Διάλυμα MgCl2 25 mm 3 μl 1,5 mm Δεοξυριβονουκλεοτίδια (dntps) 10 mm 1 μl 200 μl 2003 εκκινητής 100 pmoles/ul 0.5 μl 1 pmol/μl 2004 εκκινητής 100 pmoles/ul 0.5 μl 1 pmol/μl Taq πολυμεράση 5 U/μl 1 μl 0,1 Units/μl Αποστειρωμένο H2O - Έως τα 50 μl - Πρόγραμμα της αντίδρασης PCR µε τη χρήση των εκκινητών : C για 5min. x C για 45sec C για 45sec C για 1min. 5. Επανάληψη των βημάτων 2,3,4 για 34 κύκλους C για 10min Αντίδραση PCR για την ανίχνευση των διαγονιδίων VavCre Η παρακάτω αντίδραση PCR χρησιμοποιήθηκε για την γονοτύπηση των ζώων που ήταν διαγονιδιακά για την έκφραση της VavCre και ενισχύει µια περιοχή περίπου 200kb, Πίνακας 3.3: Αντίδραση PCR για την ανίχνευση των VavCre διαγονιδίων. 51

52 Πίνακας 3.3: Αντίδραση PCR για την ανίχνευση των VavCre διαγονιδίων Αντιδραστήριο Αρχική συγκέντρωση διαλυμάτων Όγκος ανα 50 μl αντίδρασης Τελική συγκέντρωση διαλυμάτων Δείγμα DNA 100 ng/μl 1 μl 5ng/μl 10Χ ρυθμιστικό διάλυμα 10x 2 μl 1x Διάλυμα MgCl2 25 mm 1,6 μl 1,5 mm Δεοξυριβονουκλεοτίδια (dntps) 10 mm 0,4 μl 200 mm each VaVCre Forward εκκινητής 50 pmoles/ul 0,1 μl 0.25 pmol/μl VaVCre Reverse εκκινητής 50 pmoles/ul 0,1 μl 0.25 pmol/μl Taq πολυμεράση 5 U/μl 0,3 μl 0,1 Units/μl Αποστειρωμένο H2O - Έως τα 20 μl - Πρόγραμμα της αντίδρασης PCR µε τη χρήση των εκκινητών CD2/VavCre forward και reverse: C για 3min.x C για 40sec C για 40sec C για 30sec. 5. Επανάληψη των βημάτων 2,3,4 για 30 κύκλους C για 5min. Πειραματική διαδικασία: 1. Προετοιμασία του master mix το οποίο περιέχει όλα τα συστατικά της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (εκτός του DNA) υπολογισμένο για τον αριθμό των δειγμάτων DNA προς γονοτύπηση. 2. Αραίωση των δειγμάτων DNA προς γονοτύπηση σε τελική συγκέντρωση 100ng/µl 3. Προσθήκη του κατάλληλου όγκου αντιδραστηρίων από το master mix στα ειδικά σωληνάρια της PCR και τελικά προσθήκη 3µl του DNA. Για τον αρνητικό μάρτυρα χρησιμοποιούνται όλα τα συστατικά της αντίδρασης εκτός από τo DNA. 4. Τοποθέτηση των σωληναρίων PCR στον θερµοκυκλοποιητή και χρήση του αντίστοιχου προγράμματος. 5. Ανάλυση των προϊόντων της αντίδρασης PCR µέσω ηλεκτροφόρησης σε πήκτωμα αγαρόζης. Υλικά: DNA μήτρα Εκκινητές (MWG/Eurofins) Taq πολυμεράση (Invitrogen) datp, dttp, dgtp, dctp Διάλυμα MgCl2 (Invitrogen) Ρυθμιστικό διάλυμα πολυμεράσης (Invitrogen) 52

53 Όνομα εκκινητή Αλληλουχία zo250 5-GGAATATTTAGAGTTCTGAAATGAGATG-3 zo251 5-CCAACTCAGTCACTGTCCTGTT TTTGGACGCATGGGACAGACC GTCCAGGCTGCAGTGTCTCAC-3 CreForward: 5' 5-AGATGCCAGGACATCAGGAACCTG-3 CreReverse: 5' 5-ATCAGCCACACCAGACACAGAGATC-3 Πίνακας 3.4: Αλληλουχίες εκκινητών που χρησιµοποιήθηκαν στις αντιδράσεις PCR για την γονοτύπηση των µυών στους οποίους είχε απενεργοποιηθεί η Geminin 3.3 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Πειραματική διαδικασία: 1. Επιλογή και συναρμολόγηση κατάλληλου καλουπιού αγαρόζης και ηλεκτροφορητικής συσκευής. 2. Παρασκευή του ηλεκτροφορητικού διαλύματος. Ως ηλεκτροφορητικά διαλύματα χρησιμοποιούνται συνήθως το Tris-Acetate EDTA (TAE) και το Tris-Borate EDTA (TBE). Στην συγκεκριμένη πειραματική εργασία χρησιμοποιήθηκε το 0.5X TΒE. 3. Ανάλογα µε το μέγεθος του DNA που πρέπει να διαχωριστεί παρασκευάζεται αγαρόζη κατάλληλης συγκέντρωσης σε διάλυμα 0.5X TΒE. 4. H αγαρόζη τήκεται σε φούρνο μικροκυμάτων. 5. Αφήνουμε την αγαρόζη να κρυώσει και προσθέτουμε βρωμιούχο αιθίδιο σε συγκέντρωση 0,5µg/ml. 6. Ρίχνουμε την αγαρόζη στην ηλεκτροφορητική συσκευή και αφού πολυμεριστεί προσθέτουμε ΤΒΕ 7. Φορτώνουμε στις ειδικές θέσεις (πηγάδια) τα δείγματα του DNA, τα οποία έχουν αναμιχθεί µε διάλυμα χρωστικών (6x DNA loading dye) στην κατάλληλη αναλογία. 8. Εφαρμογή κατάλληλης τάσης για όση ώρα απαιτείται. 9. Παρατήρηση των ζωνών του DNA µε έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία. Υλικά: ΤΒΕ (Τris-borate/EDTA 10X): Για 1lt.: 108gr. Tris base 55gr. Boric acid 40ml 0,5M EDTA ph: 8.0 Απεσταγµένο H2O TAE (Tris-acetate/EDTA 50X) : Για 1lt: 121gr Tris base 28,55ml glacial acetic acid 53

54 50ml 0,5M EDTA ph:8.0 Διάλυμα χρωστικών(6x): 0.25% orange G χρωστική 20% ficoll 110mM Tris-HCl, ph 7,5 Αγαρόζη (Invitrogen) EtBr 10mg/ml Μάρτυρας DNA 1kb (Invitrogen, N3232) 3.4 Απομόνωση εμβρυικού ύπατος από τους μύες 1. Τα ζώα τα οποία θέλουμε να μελετήσουμε θανατώνονται µε χρήση διοξειδίου του άνθρακα (CO2). 2. Γίνεται τομή κατά μήκος της κοιλιακής χώρας. 3. Αφαιρείται, η μήτρα του ποντικού που περιέχει τα έμβρυα προς μελέτη και τοποθετούνται σε 50ml Falcons τα οποία περιέχουν PBS 1x. Σημείωση: Καθ όλη την διάρκεια του πειράματος όλα τα διαλύματα, οι ιστοί και τα κύτταρα κρατούνται σε πάγο. 4. Τοποθετούμε τη μήτρα που περιέχει τα έμβρυα σε πιάτα με διάμετρο 10 cm στα οποία έχουμε προσθέσει κρύο PBS 1x. 5. Με τη χρήση στερεοσκοπίου και χειρουργικών εργαλείων διαχωρίζουμε το έμβρυο από τον εμβρυικό σάκο, τον πλακούντα και τον υπόλοιπο συνδετικό ιστό. Όταν ολοκληρωθεί η διαδικασία για κάθε έμβρυο μεταφέρουμε μόνο τα έμβρυα σε καινούργιο πιάτο 10 cm στο οποίο έχουμε προσθέσει PBS 1x. 6. Με τη βοήθεια του στερεοσκοπίου και των χειρουργικών εργαλείων απομονώνουμε το εμβρυικό ήπαρ από κάθε έμβρυο προσπαθώντας να διατηρήσουμε την ακεραιότητα του ήπατος ενώ ταυτόχρονα να αποφύγουμε τη συλλογή συνδετικού ιστού ή άλλων ιστών πέραν αυτού του ήπατος. 7. Κάθε εμβρυικό ήπαρ το τοποθετούμε σε ξεχωριστό αριθμημένο πηγάδι πιάτου που περιέχει 24 πηγάδια αφού προηγουμένως έχουμε προσθέσει κρύο PBS 1x σε καθένα από αυτά με τη χρήση πιπέτας Pasteur. 8. Στο ίδιο πηγάδι με το ήπαρ τοποθετούμαι και κάποιο μέλος του εμβρύου (ουρά ή πόδι) το οποίο συλλέξαμε από το συγκεκριμένο έμβρυο και θα χρησιμοποιηθεί για απομόνωση DNA και τη γονοτύπηση του εμβρύου. 9. Γίνεται καταγραφή των ιστών που προέρχονται από έμβρυα αγρίου τύπου και των ιστών που προέρχονται από τα γεν. τροποποιημένα έμβρυα. 54

55 Σημείωση: Ο διαχωρισμός γίνεται βάση φαινοτυπικών χαρακτηριστικών. Το ήπαρ που προέρχεται από μεταλλαγμένα έμβρυα είναι ανεμικό, παρουσιάζει ανομοιομορφία ιστού και έχει σημαντικά μικρότερο μέγεθος. Σημείωση: Προκειμένου να συλλέξουμε ικανοποιητικό αριθμό κυττάρων ορίζουμε ως κατώτατο όριο για την συνέχιση του πειράματος, τη συλλογή 3 διαφορετικών ηπατικών ιστών από γεν. τροποποιημένους μύες. Ο αριθμός των ιστών ήπατος αγρίου τύπου να ισούται με τον αριθμό των ιστών ήπατος από γεν. τροποποιημένους. 10. Διαχωρίζουμε τους ιστούς σε 2 πιάτα των 6cm τα οποία περιέχουν 5ml από το κρύο διάλυμα 2% FBS (2% FBS + PBS 1x) το οποίο έχουμε ετοιμάσει πριν την εκκίνηση της πειραματικής διαδικασίας. Στο ένα πιάτο των 6cm τοποθετούμαι τους ιστούς που προέρχονται από έμβρυα αγρίου τύπου ενώ στο άλλο τους ιστούς που προέρχονται από τους γεν. τροποποιημένους μύες. 11. Ασκείται μηχανική πίεση στους ιστούς με έμβολο σύριγγας και με τη χρήση φίλτρων με πόρους διαμέτρου 70μm, δημιουργείται εναιώρημα κυττάρων. Σημείωση: φιλτράρουμε το εναιώρημα 3 με 4 φορές με τη χρήση ηλεκτρονικής πιπέτας (pipette boy) προκειμένου να διαλυθούν τα συσσωματώματα κυττάρων. 12. Συλλέγουμε ξεχωριστά το εναιώρημα των διαφορετικών κυτταρικών τύπων σε σωληνάρια falcon 5ml. 13. Φυγοκέντρηση στις 1200rpm για 5 Min στους 4 0 C. 14. Κρατάμε προσεκτικά το ίζημα των κυττάρων απομακρύνοντας το υπερκείμενο υγρό. 15. Επαν-αραιώνουμε το ίζημα των κυττάρων σε τόσα ml θρεπτικού διαλύματος 2% FBS + PBS 1x όσα και ο αριθμός των εμβρυικών ιστών που περιέχει. Σημείωση: Αν για παράδειγμα το κυτταρικό διάλυμα των γεν. τροποποιημένους μυών προέρχεται από τη συλλογή 3 εμβρυικών ιστών ήπατος προσθέτουμε σε κάθε σωληνίσκο 3ml θρεπτικού διαλύματος Καταμέτρηση των κυττάρων με αιμοκυτταρόμετρο Neubauer και μικροσκόπιο Σημείωση: Τα παρακάτω βήματα εκτελούνται εξίσου και στα δυο δείγματα των κυτταρικών τύπων που έχουμε. 1. Δημιουργία 1 ου διαλύματος: Σε νέο eppendorf κάνουμε αραίωση 1:5 με 5μl εναιώρημα κυττάρων και 20μl διαλύματος 2% FBS. 2. Δημιουργία 2 ου διαλύματος: Σε νέο eppendorf κάνουμε νέο διάλυμα 1:1 χρησιμοποιώντας 12μl του 1 ου διαλύματος και 12μl triban blue για τη χρώση των νεκρών κυττάρων. 3. Εγχέουμε 10 μl από το 2 ο διάλυμα (1:1) σε κάθε ένα από τα δύο ειδικούς θαλάμους που διαθέτει η καλυπτρίδα. 55

56 4. Με τη χρήση μικροσκοπίου καταμετρούμε τα κύτταρα που βρίσκονται στο κεντρικό τετράγωνο (που πλαισιώνεται από 3 παράλληλες γραμμές, το κεντρικό τετράγωνο είναι 5x5, περιέχει 25 μικρότερα τετράγωνα (4x4) τα οποία με τη σειρά τους περιέχουν 16 τετράγωνα), διαδοχικά, πρώτα στο ένα ειδικό πηγάδι και μετά στο δεύτερο [Εικόνα 3.2: Πλέγμα καταμέτρησης αιμοκυτταρόμετρου Neubauer]. Εικόνα 3.2: Πλέγμα καταμέτρησης αιμοκυτταρόμετρου Neubauer 5. Στη συνέχεια υπολογίζουμε το μέσο όρο των δύο αριθμών που προέκυψαν από τη μέτρηση των κυττάρων στους δύο θαλάμους. 6. Για να υπολογίσουμε τον αριθμό των κυττάρων πολλαπλασιάζουμε τον αριθμό που προέκυψε από τον υπολογισμό του μέσου όρου *10,000 * τον όγκο του διαλύματος (ml) * 2 (1:1 dilution) * 5 (1:5 dilution), Πίνακας 3.5. Σημείωση: Αν ο αριθμός των κυττάρων που προκύπτει είναι πολύ μεγάλος, μας δύνεται η δυνατότητα να μετρήσουμε τον αριθμό των κυττάρων που βρίσκονται μόνο στην πρώτη γραμμή του κεντρικού τετραγώνου και να τον πολλαπλασιάσουμε με το 5 (όσες και οι γραμμές του τετραγώνου) και να συνεχίσουμε τους πολλαπλασιασμούς που προκύπτουν για τον υπολογισμού του συνολικού αριθμού των κυττάρων. 56

57 Παράδειγμα καταμέτρησης Θάλαμος Α Θάλαμος Β Ζωντανά κύτταρα Πεθαμένα κύτταρα (μπλε) 2 1 Σύνολο κυττάρων ανά γραμμή Μέσος όρος (Α+Β)= Συνολικός αριθμός κυττάρων του δείγματος = (κυτ.)*5 (γραμ.)*5 (αραίωση) *2 (ΤΒ) *10,000 *3 (ml 3,75*107, (37,5 εκ.) κύτταρα Πίνακας 3.5: Παράδειγμα καταμέτρησης κυττάρων με χρήση αιματοκκυταρόμετρου Neubauer 3.5 Απομόνωση ολικού RNA Για όλα τα πειράματα απαιτείται υψηλής ποιότητας RNA από μικρό αριθμό κυττάρων (<10 5 ) και για το λόγο αυτό προτιμήθηκε το RNeasy micro Kit της Qiagen για την απομόνωση του RNA σύμφωνα µε τις οδηγίες του κατασκευαστή. 3.6 Σύνθεση cdna από ολικό mrna Για την ποσοτικοποίηση του mrna συγκεκριμένων γονιδίων χρησιμοποιήθηκε ένα πρωτόκολλο cdna σύνθεσης 2 βημάτων µε την χρήση εκκινητών oligo-dt ή τυχαίων εξαμερών. Στο πρώτο βήμα (αντίστροφη μεταγραφή) γίνεται η σύνθεση του 1ου κλώνου συμπληρωματικού cdna µε τη χρήση της Murine Moloney Leukemia Virus (MMLV) αντίστροφης μεταγραφάσης και στην δεύτερη αντίδραση PCR χρησιμοποιείται το προϊόν της 1ής αντίδρασης και το ένζυμο πολυμεράση 1 σε συνδυασμό µε ειδικούς εκκινητές έναντι του γονιδίου, το mrna του οποίου θέλουμε να ποσοτικοποιήσουμε. Πειραματική διαδικασία: Προσδιορίζεται η αρχική συγκέντρωση του RNA και ανάλογα µε την εφαρμογή η αντίδραση σύνθεσης cdna αρχίζει µε την χρήση ng RNA. 1. Προετοιμάζεται το master mix [ Πίνακας 3.6] και ως αρνητικός μάρτυρας χρησιμοποιείται master mix το οποίο περιέχει όλα τα υπόλοιπα αντιδραστήρια εκτός της αντίστροφης μεταγραφάσης. Το master mix κατανέμεται στα σωληνάρια της PCR και τελικά προστίθεται το RNA από τα δείγµατα προς εξέταση. Εφαρμόζεται το ακόλουθο πρόγραμμα στον θερμοκυκλοποιητή: 37 C για 60 min. 95 C για 3 min. 10 C έως την αφαίρεση των δειγμάτων 57

58 2. Το προϊόν cdna-rna της προηγούμενης αντίδρασης αντίστροφης μεταγραφής χρησιμοποιείται ως μήτρα για την 2η αντίδραση PCR στην οποία χρησιμοποιούνται εκκινητές ειδικοί για τα προς εξέταση γονίδια. Το master mix για την 2η αντίδραση PCR φαίνεται στον παρακάτω πίνακα, Πίνακας 3.6. Για την 2η αντίδραση PCR εφαρμόζεται το ακόλουθο πρόγραμμα: C για 10min. x C για 45sec C για 1min C για 1min 30sec. 7. Επανάληψη των βηµάτων 2,3,4 για 40 κύκλους C για 10min. Πίνακας 3.6: Αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής RNA σε cdna Αρχική Όγκος ανα Τελική συγκέντρωση Αντιδραστήριο συγκέντρωση 15 μl διαλυμάτων διαλυμάτων αντίδρασης Δείγμα RNA 100 ng/μl 5 μl 5ng/μl 10Χ ρυθμιστικό διάλυμα PCR 10x 1.5 μl 1x Διάλυμα MgCl2 25 mm 2 μl 1,5 mm Δεοξυριβονουκλεοτίδια (dntps) 10 mm 1,5 μl 10 mm Oligo-dT 12.5 μμ 0,16 μl 12.5 μμ RNAasin 40 U/μl 1,0 μl 40 U/μl Murine moloney leukemia virus (MMLV) αντίστροφη µεταγραφάση 500 U/μl 0,7 μl 350 U/μl Αποστειρωμένο H2O - Έως τα 15 μl - Πίνακας 3.7: 2η Αντίδραση PCR για την ανίχνευση της έκφρασης γονιδίων προς μελέτη Αντιδραστήριο Δείγμα cdna 10Χ ρυθμιστικό διάλυμα PCR II Αρχική συγκέντρωση διαλυμάτων ΝΑ Όγκος ανα 20 μl αντίδρασης 1 μl από την αντίδραση της αντίστροφης μεταγραφής Τελική συγκέντρωση διαλυμάτων 5ng/μl 10x 2,0 μl 1x Διάλυμα MgCl2 25 mm 1,6 μl 1,5 mm Δεοξυριβονουκλε οτίδια (dntps) 10 mm 2 μl 200 mm each Εκκινητής forward 25 μμ 0,2 μl 25 μμ Εκκινητής reverse 25 μμ 0,2 μl 25 μμ Taq Gold πολυμεράση 50 U/μl 0,1 μl 5 U Αποστειρωμένο H2O - Έως τα 20 μl - 58

59 Υλικά: Σωληνάρια PCR (nuclease free) MMLV αντίστροφη μεταγραφάση (+PCR buffer, +MgCl2, Applied Biosystems N ) Gene Amp dntps (Applied Biosystems, N ) AmpliTaq Gold πολυμεράση (+PCR buffer ΙΙ, +MgCl2, Applied Biosystems N ) Η2Ο (nuclease-free) Ειδικοί εκκινητές για τα προς εξέταση γονίδια 3.7 Διαλύματα PBS 10x Τελικός όγκος 500ml 40gr NaCl 1gr KCl 7,2gr Na 2 HPO 4 1gr KH PO 2 4 Δεν χρειάζεται ρύθμιση του ph PBS 1x Τελικός όγκος 100ml 90ml νερό 10ml PBS 10x Ρύθμιση του ph σε 7,2-7,4 με HCl Tail buffer: 100mM Tris HCl ph8.5 5mM EDTA 0,2% SDS 200mM NaCl EtOH 70% 70ml EtOH 100% 30ml dd H 2 O 59

60 3.8 Υβριδισμός μικροσυστοιχιών cdna Affymetrix GeneChip Εικόνα 3.3: Τα βήματα της πειραματικής διαδικασίας και τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν στο πείραμα μικροσυστοιχιών. 60

61 Για το πείραμα χρησιμοποιήθηκε το Ambion WT Expression Kit που περιέχει όλα τα απαραίτητα διαλύματα για τη δημιουργία cdna από δείγματα ολικού RNA. Το παραγόμενο cdna υπόκειται σε θρυμματισμό και σήμανση με τη χρήση των αντιδραστηρίων του GeneChip WT Terminal Labeling Kit. Αντιδραστήρια Σύνθεση πρώτου κλώνου cdna Αρχίζουμε το πείραμα με 100ng (συνιστώμενη ποσότητα RNA από την Affymetrix) ολικού RNA για καθένα από τα 10 προς μελέτη δείγματα. Τα 5 από δείγματα αποτελούν τα δείγματα ελέγχου/μάρτυρες και είναι αυτά με τα οποία θα συγκριθούν τα πειραματικά δείγματα για την αποσαφήνιση του γονιδιακού προφίλ μεταξύ μεταλλαγμένων και αγρίου τύπου μυών. Σε αυτό το σημείο θα πρέπει να επισημάνουμε πως οι υπολογισμοί των όγκων των αντιδραστηρίων έγιναν για 11 δείγματα. Προσθέσαμε δηλαδή στους υπολογισμούς μας το 10% του αριθμού των προς μελέτη δειγμάτων με σκοπό την αποφυγή λαθών κατά τη διάρκεια του pipeting. Αναλώσιμα Εικόνα 3.4: Αντιδραστήρια που περιέχονται στο Ambion WT Expression Kit για την παραγωγή cdna από ολικό RNA Φέρνουμε το Poly-A control κοκτέιλ στη σωστή συγκέντρωση σύμφωνα με την αρχική ποσότητα ολικού RNA όπως φαίνεται στον παρακάτω πίνακα. Ποσότητα Πρώτο Δεύτερο Τρίτο Τέταρτο Όγκος 4 ου διαλύματος που θα ολικού RNA διάλυμα διάλυμα διάλυμα διάλυμα προστεθεί στο ολικό RNA 100 ng 1:20 1:50 1:50 1:5 1 µl Μεταφέρουμε τα δείγματα ολικού RNA σε 8 tube strip των 200ml και προσθέτουμε 1ul από το Poly- A control mix σε κάθε δείγμα. Δημιουργία Master Mix για τον πρώτο κύκλο σύνθεσης 1 ου κλώνου cdna σύμφωνα με τους όγκους και τα αντιδραστήρια που ακολουθούν στον παρακάτω πίνακα. 61

62 Αντιδραστήρια Όγκος/αντίδραση Όγκος για 11 αντιδράσεις First Strand Buffer Mix 4 µl 44 µl First-Strand Enzyme mix 1 µl 11 µl Τελικός όγκος 5 µl 55 µl Προσθέτουμε 5ul από το παραπάνω Master Mix σε κάθε δείγμα Τοποθετούμε τα δείγματα στους: o o o 25 o C για 60 λεπτά 42 o C για 60 λεπτά 4 o C για 2 λεπτά Σύνθεση 2 ου κλώνου cdna Δημιουργία Masterix Mix 2 ου κλώνου όπως φαίνεται στον παρακάτω πίνακα. Αντιδραστήρια Όγκος/αντίδραση Όγκος για 11 αντιδράσεις Nuclease free water 32.5 µl 357,5 µl Second Strand Buffer Mix 12.5 µl 137,5 µl Second Strand Enzyme Mix 5 µl 55 µl Τελικός όγκος 50 µl 550 µl Προσθέτουμε 50µl από το Master Mix 2 ου κλώνου σε κάθε δείγμα Τοποθετούμε τα δείγματα στους: o 16 O C για 60 min o 65 O C για 10 min o 4 o C για 2 min Σύνθεση crna με χρήση μεταγραφής in vitro Προετοιμασία Master Mix in vitro μεταγραφής (IVT) σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα Αντιδραστήρια Όγκος/αντίδραση Όγκος για 11 αντιδράσεις IVT Buffer Mix 24 µl 264 µl IVT Enzyme Mix 6 µl 66 µl Total Volume 30 µl 330 µl Προσθέτουμε 30ul από το IVT Master Mix σε κάθε δείγμα που πλέον περιέχει δίκλωνο cdna. Τοποθετούμε τα δείγματα στου 40 O C για 16 ώρες. Στο σημείο αυτό μπορούμε να σταματήσουμε την πειραματική διαδικασία και να τοποθετήσουμε τα δείγματα στους -20 O C. 62

63 3.8.4 Καθαρισμός του παραγόμενου crna Προθερμαίνουμε το αrna Elution Solution στους O C Προετοιμάζουμε το crna Binding Mix σύμφωνα με τον πίνακα που ακολουθεί Αντιδραστήρια Όγκος/αντίδραση Όγκος για 11 αντιδράσεις Nucleic Acid Binding Beads* 10 µl 110 µl Nucleic Acid Binding Buffer Concentrate 50 µl 550 µl Τελικός όγκος 60 µl 660 µl Προσθέτουμε 60ul από το crna Binding Mix στα πηγάδια από το πιάτο U Bottom για κάθε δείγμα προς μελέτη που έχουμε. Τοποθετούμε στα πηγάδια με το crna Binding Mix όλη την ποσότητα crna που υπάρχει και αναμιγνύουμε καλά με τη χρήση πιππέτας. Προσθέτουμε σε κάθε δείγμα 60ul ισο-προπανόλη Καλύπτουμε το πιάτο με προστατευτικό αυτοκόλλητο και τοποθετούμε το τοποθετούμε στο shaker για 2 λεπτά στις 500rpm Τοποθετούμε το πιάτο στην ιδική μαγνητική βάση για 5 λεπτά και απομακρύνουμε το υπερκείμενο υγρό από κάθε δείγμα. X 3 Προσθέτουμε σε κάθε δείγμα 100ul Nucleic Acid wash solution. Τοποθετούμε το πιάτο στην ιδική μαγνητική βάση για 5 λεπτά και απομακρύνουμε το υπερκείμενο υγρό από κάθε δείγμα και το αφήνουμε να στεγνώσει για 3 περίπου λεπτά. Προσθέτουμε το 40ul σε κάθε δείγμα από το προθερμασμένο crna elution solution Καλύπτουμε το πιάτο με προστατευτικό αυτοκόλλητο και τοποθετούμε το τοποθετούμε στο shaker για 3 λεπτά στην μέγιστη ταχύτητα Τοποθετούμε το πιάτο στην ιδική μαγνητική βάση για 5 λεπτά Μεταφέρουμε το υπερκείμενο διάλυμα σε ένα Nuclease-free eppendorf tube (1.5 ml) 63

64 Ελέγχουμε με τη χρήση nanodrop τη συγκέντρωση του crna. Σύμφωνα με τις οδηγίες της Affymetrix η ποσότητα crna που χρειαζόμαστε για το επόμενο βήμα της διαδικασίας ανέρχεται στα 10 ug ενώ ο όγκος του crna διαλειμματος να είναι μέχρι 18ul Δεύτερος κύκλος, Σύνθεση πρώτου κλώνου cdna από crna Προετοιμασία Master Mix με τους random primers του 2 ου κύκλου σύνθεσης cdna σύμφωνα με τον πίνακα που ακολουθεί: Αντιδραστήρια Συγκέντρωση αντιδραστηρίου Όγκος/αντίδραση Όγκος για 11 αντιδράσεις crna 10μg 18 µl Random primers 3μg/μl 2 µl 22 µl Μέχρι να συμπληρωθεί ο RNase-free water όγκος των 22 μl/αντίδραση Τελικός όγκος 22 µl Πιπετάρουμε 4ul από το Master Mix σε τόσα PCR tubes όσα και τα δείγματα που συμμετέχουν στο πείραμα. Προσθέτουμε σε κάθε έναν από τους PCR tubes 18ul crna από κάθε δείγμα αντίστοιχα Τοποθετούμε τα δείγματα σε έναν PCR cycler με το εξής πρόγραμμα: o 70 o C για 5 λεπτά o 25 o C για 5 λεπτά o 4 o C για 2 λεπτά Προετοιμασία του Master Mix 2 ου κύκλου σύνθεσης cdna Αντιδραστήρια Όγκος/αντίδραση Όγκος για 11 αντιδράσεις 2nd-Cycle buffer mix 8 µl 88 µl 2nd-Cycle enzyme mix 8 µl 88 µl Τελικός όγκος 16µL 176 µl Προσθέτουμε 16 ul από το παραπάνω Master Mix σε κάθε αντίδραση φτάνοντας τα 38ul σε κάθε PCR tube. 22 ul από το προηγούμενο βήμα και 16 από την τρέχουσα διαδικασία Τοποθετούμε τα δείγματα σε έναν PCR cycler με το εξής πρόγραμμα: o 25 o C για 10 λεπτά o 42 o C για 90 λεπτά o 70 o C για 10 λεπτά o 4 o C για 2 λεπτά 64

65 3.8.6 Υδρόλυση crna με RNase H για την παραγωγή μονόκλωνου cdna Προσθέτουμε 2ul RNase H σε κάθε δείγμα, στον ίδιο PCR tube φθάνοντας τον τελικό όγκο των 40ul διαλύματος σε κάθε PCR tube. Τοποθετούμε τα δείγματα σε έναν PCR cycler με το εξής πρόγραμμα: o 37 o C για 45 λεπτά o 95 o C για 5 λεπτά o 4 o C για 2 λεπτά Καθαρισμός του παραγόμενου cdna (ssdna, single strand DNA) Προθερμαίνουμε το Elution Solution στους O C Προετοιμάζουμε το ssdna Binding Mix σύμφωνα με τον πίνακα που ακολουθεί Αντιδραστήρια Nucleic Acid Binding Beads* Όγκος/αντίδραση Όγκος για 11 αντιδράσεις 10 µl 110 µl Nucleic Acid Binding Buffer 50 µl 550 µl Concentrate Τελικός όγκος 60 µl 660 µl Προσθέτουμε 18ul Nuclease-free νερό στα πηγάδια από το πιάτο U Bottom για κάθε δείγμα προς μελέτη που έχουμε Προσθέτουμε 60ul από το ssdna Binding Mix στα πηγάδια από το πιάτο U Bottom για κάθε δείγμα προς μελέτη που έχουμε. Μεταφέρουμε από τα PCR tubes στα πηγάδια του U Bottom plate με το ssdna Binding Mix όλη την ποσότητα cdna που υπάρχει (40ul) και αναμιγνύουμε καλά με τη χρήση πιππέτας. Προσθέτουμε σε κάθε δείγμα 120ul % αιθανόλη και αναμιγνύουμε καλά με τη χρήση πιππέτας. Καλύπτουμε το πιάτο με προστατευτικό αυτοκόλλητο και τοποθετούμε το τοποθετούμε στο shaker για 2 λεπτά στις 500rpm Τοποθετούμε το πιάτο στην ιδική μαγνητική βάση για 5 λεπτά και απομακρύνουμε το υπερκείμενο υγρό από κάθε δείγμα. Προσθέτουμε σε κάθε δείγμα 100ul Nucleic Acid wash solution. 65 X 3

66 Τοποθετούμε το πιάτο στην ιδική μαγνητική βάση για 5 λεπτά και απομακρύνουμε το υπερκείμενο υγρό από κάθε δείγμα και το αφήνουμε να στεγνώσει για 3 περίπου λεπτά. Προσθέτουμε το 40ul σε κάθε δείγμα από το προθερμασμένο elution solution Καλύπτουμε το πιάτο με προστατευτικό αυτοκόλλητο και τοποθετούμε το τοποθετούμε στο shaker για 3 λεπτά στην μέγιστη ταχύτητα Τοποθετούμε το πιάτο στην ιδική μαγνητική βάση για 5 λεπτά Μεταφέρουμε το υπερκείμενο διάλυμα σε ένα Nuclease-free eppendorf tube (1.5 ml) Ελέγχουμε με τη χρήση nanodrop τη συγκέντρωση του ssdna. Σύμφωνα με τις οδηγίες της Affymetrix η ποσότητα ssdna που χρειαζόμαστε για το επόμενο βήμα της διαδικασίας ανέρχεται στα 5.5 ug ενώ ο όγκος του ssdna διαλειμματος να είναι μέχρι 40ul Θρυμματισμός ssdna Στη συνέχεια της πειραματικής διαδικασίας χρησιμοποιούμε τα αντιδραστήρια του Ambion WT Expression Kit. Εικόνα 3.5: Περιεχόμενα του Ambion WT Expression Kit. Το συγκεκριμένο Kit περιέχει τα απαραίτητα αντιδραστήρια από τον θρυμματισμό μέχρι και την ολοκλήρωση του πειράματος υβριδισμού των μικροσυστοιχιών Προετοιμασία του Master Mix θρυμματισμού σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα. Αντιδραστήρια Συγκέντρωση αντιδραστηρίου Όγκος/αντίδραση Όγκος για 11 αντιδράσεις cdna Fragmentation Buffer 10Χ 4,8 µl 52,8 µl UDG 10U/µL 1 µl 11 µl APE U/µL 1 µl 11 µl Total Volume 6.8 µl 74,8 µl 66

67 Σε κάθε δείγμα ssdna που βρίσκεται στα PCR tubes προσθέτουμε 6.8 μl από το παραπάνω Master Mix και RNase-free νερό μέχρι ο τελικός όγκος κάθε δείγματος να είναι 48μl. Τοποθετούμε τα δείγματα σε έναν PCR cycler με το εξής πρόγραμμα: o 37 o C για 60 λεπτά o 93 o C για 2 λεπτά o 4 o C για 2 λεπτά Μεταφέρουμε τα δείγματα σε νέα PCR strip tubes. Ελέγχουμε με τη χρήση του Bioanalyzer το μέγεθος των θραυσμάτων το οποίο θα πρέπει να κυμαίνετε μεταξύ 40 και 70 nt, χαρακτηριστικό παράδειγμα αποτελέσματος ελέγχου με το Bioanalyzer παρατίθεται στην Εικόνα 3.6. Στην περίπτωση που δε θα μεταβούμε στο επόμενο βήμα της πειραματικής διαδικασίας που είναι η σήμανση του θρυμματισμένου ssdna, Εικόνα 3.6: Παράδειγμα αποτελέσματος ελέγχου του θρυμματισμένου DNA με χρήση Bioanalyzer μπορούμε να αποθηκεύσουμε τα δείγματα στους - 20 Celsius Σήμανση θρυμματισμένου DNA Προετοιμάζουμε το Master Mix σήμανσης σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα Αντιδραστήρια Συγκέντρωση αντιδραστηρίου Όγκος/αντίδραση Όγκος για 11 αντιδράσεις TdT Buffer 5Χ 12 µl 132 µl TdT 30U/μL 2 µl 22 µl DNA Labeling Reagent 5mM 1 µl 11 µl Total Volume 15 µl 165 µl Σε νέα PCR strip tubes προσθέτουμε 15μl από το παραπάνω Master Mix σε τόσες θέσεις όσα και τα δείγματα που συμμετέχουν στο πείραμα Προσθέτουμε 45μl από τα δείγματα του θρυμματισμένου DNA. Ο τελικός όγκος κάθε αντίδρασης είναι 60 μl. Τοποθετούμε τα δείγματα σε έναν PCR cycler με το εξής πρόγραμμα: o 37 o C για 60 λεπτά o 70 o C για 2 λεπτά o 4 o C για 2 λεπτά Σε αυτό το σημείο μπορούμε να αποθηκεύσουμε τα δείγματα στου -20 o C 67

68 3.8.10Διαδικασία υβριδισμού Προετοιμάζουμε το Master Mix υβριδισμού σύμφωνα με τον παρακάτω πίνακα Αντιδραστήρια Συγκέντρωση αντιδραστηρίου Όγκος/αντίδραση Όγκος για 11 αντιδράσεις Δείγμα σημασμένου και θρυμματισμένου ssdna 2.5 μg/ml 27 µl Control Oligonucleotide B2 3nM 1,7 µl 18,7 µl Eukaryotic Hybridization Controls 20Χ 5 µl 55 µl Hybridization Mix 2Χ 50 µl 550 µl H 2 O 9.3 µl 102,3 µl DMSO 7 µl 77 µl Final Volume 100 µl Τοποθετούμε τα δείγματα σε έναν PCR cycler με το εξής πρόγραμμα: o 99 o C για 5 λεπτά o 45 o C για 5 λεπτά Κάνουμε spin τα δείγματα στη μέγιστη ταχύτητα για 1 λεπτό Αδειάζομε το υγρό που περιέχουν τα chip υβριδοποίησης και τα γεμίζουμε τόσα chip όσα και τα δείγματα που συμμετέχουν στο πείραμα με 80 μl από το Master Mix υβριδοποίησης. Τοποθετούμε τα Chip σε ειδικό περιστρεφόμενο φούρνο και τα αφήνουμε για 16 ώρες στους 45 o C προκειμένου να πραγματοποιηθεί η υβριδοποίηση Ακολουθεί η διαδικασία χρώσης και πλυσίματος των μικροσυστοιχιών στα ειδικά μηχανήματα σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι μικροσυστοιχίες τοποθετούνται στον ειδικό Lazer σαρωτή για την απόκτηση της εικόνας των εντάσεων του υβριδισμού μεταξύ στόχων και ανιχνευτών. Διαδικασία επεξεργασίας και ανάλυσης των εικόνων όπως περιγράφεται στην εισαγωγή 68

69 4 Αποτελέσματα Για τη μελέτη της διαφορικής έκφρασης γονιδίων πραγματοποιήθηκε η σύγκριση του γονιδιώματος μεταξύ των μυών αγρίου τύπου και των γενετικά τροποποιημένων μυών από τους οποίους απουσίαζε το γονίδιο Geminin. Για το λόγο αυτό δημιουργήθηκαν 2 ομάδες δειγμάτων σύμφωνα με τον γονότυπό τους. Απομονώθηκε RNA από Lin - ckit high sca1 + και Lin - c-kit high sca1 - κυτταρικούς πληθυσμούς που είχαν απομονωθεί µε τη χρήση FACS από ηπατικά κύτταρα FL/KO VavCre και εμβρύων μαρτύρων 15.5ης εμβρυικής ημέρας. Η πρώτη ομάδα δειγμάτων αποτελείται από δείγματα μυών με γονότυπο FL/KO VavCre ενώ η δεύτερη ομάδα απαρτίζεται επίσης από τους κυτταρικούς πληθυσμούς Lin - ckit high sca1 + και Lin - c-kit high sca1 - των εμβρύων μαρτύρων και αποτελούν τα δείγματα αναφοράς βάση των οποίων θα συγκριθούν τα πειραματικά δείγματα των κυτταρικών πληθυσμού του FL/KO VavCre γονοτύπου. Συλλέχθηκε υλικό 5 γεννήσεων από κάθε ομάδα γονοτύπων (FL/KO VavCre & WT) με σκοπό να απομονωθεί RNA ώστε να προκύψουν 5 ανεξάρτητα πειράματα/chip υβριδισμού από κάθε γονότυπο. Σε κάθε μια από τις γεννήσεις συλλέχτηκε το εμβρυικό ήπαρ από όλα τα FL/KO vav cre (μεταλλαγμένα) έμβρυα και τα αντίστοιχα έμβρυα που δεν παρουσιάζουν τον φαινότυπο των μεταλλαγμένων εμβρύων για να χρησιμοποιηθούν ως δείγματα ελέγχου (γονότυποι: FL/WT, FL/KO, FL/WT Vav Cre). Χρησιμοποιήθηκε το unpaired t-test για τον προσδιορισμό της στατιστικής σημαντικότητας του γονιδιακού προφίλ έκφρασης, όπως υποδεικνύει το MAQC Project [71]. Το unpaired t-test είναι κάθε στατιστικό τεστ που εξετάζει μια υπόθεση η οποία ακολουθεί την t κατανομή εάν υποστηρίζεται η μηδενική υπόθεση «Ηo» και χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό του κατά πόσο διαφέρουν μεταξύ τους 2 διαφορετικά/ανεξάρτητα σετ δεδομένων που ακολουθούν την κανονική κατανομή. T-test: Z =. Τo MicroArray Quality Control (MAQC) Project ιδρύθηκε από την Υπηρεσία Τροφίμων και Φαρμάκων των Η.Π.Α (US FDA) για την ανάπτυξη προτύπων και μετρήσεων ελέγχου ποιότητας των δεδομένων και των αναλύσεων που προκύπτουν από πειράματα μικροσυστοιχιών DNA με σκοπό να διασφαλιστεί η επαναληψιμότητα των πειραμάτων μικροσυστοιχιών. 69

70 Πείραμα Κανονικοποίηση εξάλειψη θορύβου 2 Αριθμός συγκρίσεων / καταστάσεων Πάνω από 2 Αριθμός βιολογικών αντιγράφων 1 Αριθμός βιολογικών αντιγράφων Πάνω από 1 T-test PCA Clustering ANOVA Λίστα των στατιστικώς σημαντικών γονιδίων Μετα ανάλυση δεδομένων: GO Analysis GSEA Article searches Pathway Analysis Εξαγωγή / Ερμηνεία Αποτελεσμάτων Εικόνα 4.1: Διάγραμμα διαδικασιών και εργαλείων που χρησιμοποιήθηκαν για την εξαγωγή και ερμηνεία των αποτελεσμάτων διαφορικής έκφρασης από τις μικροσυστοιχίες cdna. 4.1 Προφίλ διαφορικής έκφρασης γονιδίων Η κύρια λίστα της διαφορικής έκφρασης γονιδίων αποτελείται από γονίδια των οποίων η έκφραση στο πειραματικό δείγμα έχει μεταβληθεί σημαντικά σε σύγκριση με αυτά στο δείγμα ελέγχου. Η λίστα της διαφορικής έκφρασης γονιδίων συμπεριλαμβάνει τα γονίδια των οποίων η αλλαγή της έκφραση σε σύγκριση με το δείγμα ελέγχου παρουσιάζει επιστημονικό ενδιαφέρον και θα πρέπει να μελετηθούν περαιτέρω. Τη συγκεκριμένη λίστα γονιδίων θα αποκαλούμε «Κύρια Λίστα (ΚΛ)» και είναι αυτή που χρησιμοποιήθηκε σε όλες τις αναλύσεις και μελέτες για την ερμηνεία του γενετικού προφίλ των γενετικά τροποποιημένων μυών στους οποίους έχει αποσιωπηθεί η πρωτεΐνη Geminin από το αιμοποιητικό τους σύστημα. Όπως αναφέρεται και στην προηγούμενη παράγραφο, για τη δημιουργία της συγκεκριμένης λίστας έγινε η χρήση του στατιστικού τεστ «T test unpaired» προκειμένου να διαπιστωθεί η στατιστική σημαντικότητα των γονιδίων βάση των τιμών έντασης φθορισμού που παρουσιάζει κάθε γονίδιο σε ένα γκρουπ δειγμάτων. Tα γκρουπ που εξετάζουμε 70

71 είναι δύο, το γκρουπ που περιλαμβάνει τα 5 chips που υβριδοποιήθηκαν με cdna που προέρχεται από τους FL/KO VavCre μύες και το γκρουπ με 5 chips που υβριδοποιήθηκαν με cdna από μύες αγρίου τύπου. Η μέτρηση της έκφρασης των γονιδίων πραγματοποιήθηκε μεταξύ αυτών των δυο γκρουπ και η τιμή της διαφοράς της έκφρασης που προκύπτει από τη μεταξύ τους σύγκριση ονομάζεται τιμή της διαφορικής έκφρασης. Υπάρχει μέτρο στην τιμή της διαφορικής έκφρασης. Το μέτρο για τον χαρακτηρισμό της διαφορικής έκφρασης ονομάζεται Fold Change (Παράγραφος 1.3.8). Η αρχική λίστα που προκύπτει από t-test αποτελείται από συνολικά 702 γονίδια. Στη λίστα αυτή συμπεριλαμβάνονται 97 θεωρητικά ή υποτιθέμενα γονίδια/κομμάτια DNA το οποία στη συνέχεια απομακρύνουμε με αποτέλεσμα να προκύπτει η «Κύρια Λίστα» διαφορικής έκφρασης που συμπεριλαμβάνει 605 γονίδια. Όσα γονίδια έχουν τιμή Fold Change μεγαλύτερη ή μικρότερη του 1.5, δηλαδή εντός του διαστήματος FC = (-, -1.5] + [1.5,+ ) και τιμή p-value 0.05, καλύπτουν τα κριτήρια στατιστικής και επιστημονικής σημαντικότητας και είναι αυτά που περιλαμβάνονται στην Λίστα με τα σημαντικά γονίδια. Στην Εικόνα 4.2Α παρουσιάζεται το volcano plot το οποίο αποτελεί γραφική απεικόνιση των γονιδίων που αποτελούν την κύρια λίστα γονιδίων. To volcano plot μας επιτρέπει να έχουμε μια γρήγορη απεικόνιση του συνόλου των γονιδίων που καλύπτουν τα κριτήρια της κύριας λίστας σημαντικότητας σε σχέση με το σύνολο των γονιδίων που έχουν υβριδοποιηθεί στα chip. Στον άξονα των «X» παρατίθενται οι τιμές της διαφορικής έκφρασης ως λογάριθμος με βάση το 2. Στον άξονα των «Υ» παρατίθενται οι τιμές της στατιστικής σημαντικότητας ως λογάριθμος με βάση το 10. Ο λόγος για τη χρήση της λογαριθμικής κλίμακας είναι για την καλύτερη αναπαράσταση των δεδομένων σε μικρότερο χώρο αφού με τη χρήση της λογαριθμικής κλίμακας το εύρος τιμών μειώνεται σημαντικά χωρίς όμως να χάνεται η απαραίτητη πληροφορία. Τα όρια FC = (-, -1.5] + [1.5,+ ) και η τιμή p-value 0.05 σημειώνονται με πράσινες διαχωριστικές γραμμές. Τα κόκκινα σημεία αντιπροσωπεύουν τα γονίδια που τηρούν τα κριτήρια ένταξης στη λίστα σημαντικότητας. Τα κόκκινα σημεία που βρίσκονται δεξιά του σημείου (0,0) του καρτεσιανού επιπέδου αντιπροσωπεύουν τα γονίδια με θετική διαφορική έκφραση ενώ όσα κόκκινα σημεία βρίσκονται αριστερά του σημείου (0,0) αντιπροσωπεύουν τα γονίδια με αρνητική διαφορική έκφραση. Στην Εικόνα 4.2Β παρουσιάζονται τα αποτελέσματα του στατιστικού τεστ στο οποίο καταγράφεται ο συσχετισμός στατιστικής και επιστημονικής σημαντικότητας p-value/ Fold Change. Πιο συγκεκριμένα, υπάρχει καταγραφή του αριθμού των γονιδίων ανάλογα με κάθε συνδυασμό p-value/ Fold Change. Στο κόκκινο τετράγωνο επισημαίνεται ο αριθμός των γονιδίων με διαφορική έκφραση που τηρεί τα κριτήρια που θέσαμε, FC = (-, -1.5] + [1.5,+ ) και τιμή p- value

72 Α. Β. Log 2 (Fold Change) Εικόνα 4.2: Α. Volcano Plot Β. Αποτελέσματα στατιστικού τεστ Τ-test unpaired Στην Εικόνα 4.3 παρουσιάζεται το «xρωμοδιάγραμμα» ή αλλιώς «Heat Map» της Κύριας Λίστας από την οποία έχουν αφαιρεθεί 97 γονίδια που αποτελούσαν υποθετικά γονίδια. Στο χρωμοδιάγραμμα (Heat Map, HM) η διακύμανση της διαφορικής έκφρασης των γονιδίων που αναπαριστάται είναι παράλληλη με τη διακύμανση των χρωματικών αλλαγών από το κόκκινο προς το πράσινο. Η μέγιστη τιμή διαφορικής έκφρασης αντιστοιχεί στο κόκκινο χρώμα και η τιμή αυτή ελαττώνεται καθώς οι κόκκινες αποχρώσεις σκουραίνουν μέχρι να γίνουν μαύρο. Το χρώμα μαύρο αντιστοιχεί σε μηδενική διαφορική έκφραση. Οι αρνητικές τιμές διαφορικής έκφρασης παρατηρούνται από τις σκούρες πράσινες αποχρώσεις μέχρι την έντονη πράσινη που αντιστοιχεί στη μέγιστη τιμή υποέκφρασης η αλλιώς στην χαμηλότερη τιμή διαφορικής έκφρασης. Από τα 605 γονίδια της νέας λίστας τα 202 έχουν τιμή Fold Change 2.0 και παρουσιάζουν υψηλότερο επιστημονικό ενδιαφέρον σε σχέση με τα υπόλοιπο εξαιτίας της υψηλότερης τιμής διαφορικής έκφρασης. Από την Λίστα τα 451 (9.4%) γονίδια παρουσιάζουν υψηλότερη τιμή έκφρασης στο πειραματικό δείγμα σε σύγκριση με το δείγμα ελέγχου ενώ 154 (3.2%) γονίδια παρουσιάζουν χαμηλότερη τιμή έκφρασης στο πειραματικό δείγμα. Τα δεδομένα αυτά υπαγορεύουν ότι η Geminin συμμετέχει σε πολυάριθμες διαδικασίες στα βλαστικά και προγονικά κύτταρα του αιμοποιητικού συστήματος αφού η 72

73 αδρανοποίηση της επιφέρει αλλαγές στην έκφραση του γονιδιώματος στο συγκεκριμένο εξελικτικό στάδιο των κύτταρο σε ποσοστό 12.6%. A. B. Γ. Χαρακτηριστικά στοιχεία "Κύριας Λίστας" Τιμή Fold Change value: ± 1.5 p-value: 0.05 Συνολικός αριθμός γονιδίων: 605 Αριθμός γονιδίων με Fold Change value > +1.5: 451 Αριθμός γονιδίων με Fold Change value < - 1.5: 154 Maximum Fold Change value: Minimum Fold Change value: Αριθμός γονιδίων με Fold Change ± 2.0: 202 Αριθμός γονιδίων με Fold Change value > +2.0: 153 Αριθμός γονιδίων με Fold Change value < - 2.0: 49 Εικόνα 4.3: Α. Χρωμοδιάγραμμα (Heat Map) Κύριας Λίστας γονιδίων με διαφορική έκφραση. Κάθε γραμμή του χρωμοδιαγράμματος αντιστοιχεί σε ένα γονίδιο. Τα μαύρα στοιχεία χαρακτηρίζουν τα γονίδια με τη μικρότερη τιμή διαφορικής έκφρασης. Τα κοκκινα στοιχεία τα γονίδια με θετικό πρόσημο διαφορικής έκφρασης και τα πράσινα, τα γονίδια με αρνητικό πρόσημο διαφορικής έκφρασης. Β. Διάγραμμα Venn που παρουσιάζει την ποσοστιαία επικάληψη των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων του πειραματικού σε σύγκριση με το δείγμα ελέγχου. Γ. Πίνακας με τα χαρακτηριστικά στοιχεία των γονιδίων της Κύριας Λίστας. 73

74 4.2 Αποτελέσματα από Gene Ontology Analysis με χρήση του MetaCore Χρησιμοποιώντας τα γονίδια της Κύριας Λίστας ως δεδομένα εισόδου για την πραγματοποίηση της μελέτης «Gene Ontology Analysis», με το λογισμικό MetaCore, λαμβάνουμε αποτελέσματα που επιβεβαιώνουν τη αναγκαιότητα για την περαιτέρω κατανόηση των λειτουργιών της πρωτεΐνης Geminin. Ο τρόπος λειτουργίας και η μέθοδος για την εξαγωγή αποτελεσμάτων από το συγκεκριμένο λογισμικό αναφέρεται στην εισαγωγή της παρούσας πτυχιακής εργασίας, βλ. παράγραφο «μετα-ανάλυση δεδομένων». Η υψηλή στατιστική σημαντικότητα των δεδομένων από τη μελέτη Gene Ontology Analysis δηλώνουν πως η Geminin αποτελεί κυρίαρχο παράγοντα ομοιόστασης στα θηλαστικά εφόσον αποδεδειγμένα η έλλειψή της προκαλεί μεταβολές σε σημαντικές οργανικές διαδικασίες. Στην Εικόνα 4.5 παρουσιάζονται οι 10 διεργασίες με το υψηλότερο p-value από κάθε κατηγοριοποίηση γονιδιακών υποσυνόλων που προσφέρει το λογισμικό MetaCore όπως αυτές έχουν προκύψει μετά την αποσιώπηση της πρωτεΐνης Geminin στο αιμοποιητικό σύστημα των μυών. Στην Εικόνα 4.5Α παρουσιάζονται οι δέκα κυτταρικές διαδικασίες που σύμφωνα με την GO ανάλυση έχουν επηρεαστεί περισσότερο στους FL/KO vav cre μύες. Οι διαδικασίες αυτές σχετίζονται με το αιμοποιητικό και το ανοσοποιητικό σύστημα τονίζοντας έτσι τη σημασία της Geminin στο εξελικτικό στάδιο της εμβρυικής αιμοποίησης στην οποία έλαβε χώρα η αποσιώπηση της πρωτεΐνης. Η υψηλή στατιστική σημαντικότητα που χαρακτηρίζει τις διαδικασίες αυτές αποτελεί ένδειξη ότι η απορύθμιση τους συνέβαλε στον εμβρυικό θάνατο των FL/KO vav cre μυών στην 15.5η εμβρυική ημέρα. Στην Εικόνα 4.5Β παρουσιάζονται τα αποτελέσματα του Gene Ontology Analysis για τις μοριακές λειτουργίες που επηρεάζονται στα κύτταρα του αιμοποιητικού από την αποσιώπηση της Geminin. Και οι 10 λειτουργίες που παρουσιάζουν τα υψηλοτέρα επίπεδα στατιστικής σημαντικότητας αλλά και 25 από τις 50 συνολικά μοριακές διαδικασίες σχετίζονται με τη δέσμευση των πρωτεϊνών στο DNA. Τα αποτελέσματα αυτά προτείνουν ότι ο ρόλος της Geminin στην εμβρυική αιμοποίηση και συγκεκριμένα στο εξελικτικό στάδιο της διαφοροποίησης των βλαστικών κυττάρων σχετίζεται κυρίως με δεσμευτικές πρωτεΐνες του DNA και όχι με τον κυτταρικό κύκλο. Το γεγονός αυτό έρχεται να οριοθετήσει την υπόθεσή μας για τον ρόλο της Geminin στην αυτό-ανανέωση και διαφοροποίηση των βλαστικών και προγονικών κυττάρων του αιμοποιητικού. Με τον όρο της οριοθέτησης εννοούμε την άμεση ή/και έμμεση συσχέτιση της Geminin με μεταγραφικούς παράγοντες και πρωτεΐνες που ενδεχομένως να εμπλέκονται στη μεταγραφή γονιδίων ή/και επιγενετική τροποποίηση του DNA. 74

75 Στην Εικόνα 4.5Γ παρουσιάζονται οι ασθένειες που μπορεί να προκληθούν σε έναν οργανισμό ως αποτέλεσμα της απουσίας της Geminin από το αιμοποιητικό σύστημα. Τα δεδομένα αυτά προτείνουν τη συσχέτιση της Geminin με πρωτεΐνες και μεταβολικά μονοπάτια που σχετίζονται με τη ανάπτυξη ασθενειών και τον καρκίνο. Στην Εικόνα 4.5Δ αναφέρονται τα δίκτυα των διαδικασιών που επηρεάζονται από την αποσιώπηση της Geminin. Κοινό χαρακτηριστικό αποτελεί το γεγονός της διατάραξης μοριακών δικτύων που σχετίζονται με την κυτταρική προσκόλληση και την κυτταρική συσσώρευση. Κυτταρικές Διαδικασίες A. B. Μοριακές Λειτουργίες Ασθένειες Γ. Δ. Δίκτυα Διαδικασιών Εικόνα 4.5: Οι δέκα υψηλότερες τιμές στατιστικές σημαντικότητας από την ανάλυση οντολογιών γονιδίων (Gene Ontology Analysis) με τη χρήση του λογισμικού MetaCore. Κατηγορίες Gene Ontology Α. Κυτταρικές Διαδικασίες, B. Μοριακές Λειτουργίες, Γ. Ασθένειες, Δ. Δίκτυα Διαδικασιών. 75

76 # Πίνακας 4.1. Ενδεικτικός πίνακας με τους αριθμούς των γονιδίων που χρησιμοποιήθηκαν από το λογισμικό MetaCore για τον υπολογισμό των αποτελεσμάτων στατιστικής σημαντικότητας. Στην αριστερή στήλη παρουσιάζονται τα δεδομένα για την κατηγορία των «Κυτταρικών Διαδικασιών» και στη δεξιά τα δεδομένα για την κατηγορία των «Μοριακών Λειτουργιών». Για τον μαθηματικό τύπο υπολογισμού του p-value βλ. Εισαγωγή, Μετα-ανάλυση δεδομένων Κυτταρικές Διαδικασίες Μοριακές Λειτουργίες A.A Ονόματα διαδικασιών pvalue Γονίδια της ΚΛ που Γονίδια Ονομάτα pvalue Γονίδια της ΚΛ Γονίδια συμπίπτουν με τη της λειτουργειών που συμπίπτουν της 1 hemostasis 5.8E-32 Metacore 87 MetaCore 652 protein binding 6.86E-15 με τη Metacore 307 MetaCor e regulation of body fluid 6.8E binding 5.22E levels 3 wound healing 4.2E purine ribonucleotide 6.7E binding 4 blood coagulation 4.8E ribonucleotide 6.88E binding 5 coagulation 4.8E purine nucleotide 1.02E binding 6 cell activation 3.4E purine 1.18E platelet activation 1.2E ribonucleoside triphosphate guanyl nucleotide binding binding 2.55E response to wounding 1.6E guanyl 2.55E ribonucleotide 9 immune system process 2.2E binding GTP binding 1.22E response to stress 7.9E nucleotide binding 3.3E Αποτελέσματα από την ανάλυση της λίστας των σημαντικών γονιδίων με χρήση του λογισμικού GSEA Όμοια με τη Gene Ontology Analysis, το GSEA μας υποδεικνύει τις λειτουργίες εκείνες που έχουν επηρεαστεί περισσότερο στους μεταλλαγμένους μύες. Για τον τρόπο λειτουργίας της ανάλυσης GSEA βλ. Εισαγωγή, παράγραφο Τα αποτελέσματα από το GSEA συμπίπτουν επί το πλείστον με την Gene Ontology Analysis υποδεικνύοντας κυτταρικές λειτουργίες που σχετίζονται με τη δέσμευση πρωτεϊνών στο DNA είτε αυτό πρόκειται για πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη μεταγραφή του DNA είτε στη μεθυλίωση του. Τα αποτελέσματα του GSEA παρουσιάζονται στην εικόνα 4.6 με τη μορφή διαγράμματος στο οποίο παρατίθεται το Normalized Enrichment Score (βλ. εισαγωγή, μετα-ανάλυση δεδομένων) κάθε λειτουργίας υποδεικνύοντας το βαθμό που έχει επηρεαστεί η κάθε λειτουργία στους FL/KO Vav Cre μύες σε σύγκριση με τους μύες αγρίου τύπου μετά την αποσιώπηση της πρωτεΐνης Geminin. Στο διάγραμμα παρουσιάζονται οι 20 λειτουργίες που αναδείχθηκαν από το λογισμικό του GSEA και παρουσιάζουν αξιοσημείωτες μεταβολές στου FL/KO Vav Cre μύες. Η μεταβολή των διαδικασιών αυτών θεωρείτε αξιοσημείωτη βάση της τιμής διαφορικής έκφρασης των γονιδίων που παρουσιάζουν οι FL/KO Vav Cre μύες και που συγκαταλέγονται στις λίστες του GSEA. Πραγματοποιήθηκε μελέτη στα 443 γονίδια που το GSEA χρησιμοποίησε προκειμένου να υπολογίσει ποιες κυτταρικές λειτουργίες έχουν επηρεαστεί από την αποσιώπηση της Geminin, Πίνακας 4.1. Από τα 443 γονίδια προσμετρήθηκαν 156 διαφορετικά γονίδια για τον υπολογισμό 20 76

77 κυτταρικών λειτουργιών. Πολλά από τα γονίδια που χρησιμοποιήθηκαν από το GSEA για την ανάλυση εμφανίζονται σε πάνω από 1 κατηγορίες. Η συχνότητα εμφάνισης κάθε γονιδίου σε σύνολο 20 λειτουργιών καταγράφεται στο διάγραμμα της Εικόνα 4.7. Υποθέτουμε πως όσο πιο συχνά ένα γονίδιο συμμετέχει στις λειτουργίες που επηρεάζονται τόσο πιο πολύ θα ευθύνεται για την ανισορροπία της ομοιόστασης του οργανισμού. Η πλειοψηφία των γονιδίων αυτών έχουν εντοπιστεί και ως οι μεταγραφικοί παράγοντες με τη σημαντικότερη επιστημονική και στατιστική σημαντικότητα από το GeneSpring λογισμικό (Εικόνα 4.8),επαληθεύοντας με αυτό τον τρόπο την εγκυρότητα των αποτελεσμάτων. Ως αποτέλεσμα αυτής της ανάλυσης έχουμε τα γονίδια που χαρακτηρίζουν τον τρόπο με τον οποίο δρα η Geminin και προκαλεί τη συσσώρευση των αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων ταυτόχρονα με τη μείωση των προγονικών και τελικός διαφοροποιημένων κυττάρων του αιμοποιητικού. Εικόνα 4.6: Διάγραμμα από την ανάλυση GSEA. Το διάγραμμα παρουσιάζει τις κυτταρικές λειτουργίες που επηρεάστηκαν από την αποσιώπηση της GEMININ. Η διαδικασία που επηρεάστηκε περισσότερα εμφανίζεται τέρμα αριστερά και είναι αυτή με το υψηλότερο Normalized Enrichment Score. 77

78 Πίνακας 4.2: Αναλυτικά τα στοιχεία και ο αριθμός των γονιδίων που συμμετείχαν στην ανάλυση GSEA που απεικονίζεται στο διάγραμμα της εικόνας 4.6 Εικόνα 4.7: Συχνότητα εμφάνισης γονιδίων στις 20 κυτταρικές λειτουργίες που ανέδειξε το GSEA ως εκείνες που επηρεάζονται περισσότερο απο την αποσιώπηση της Geminin Α.Α Όνομα λίστας Αρ. γονιδίων NES 1 RESPONSE_TO_STRESS CELL_SURFACE_RECEPTOR_LINKED_SI GNAL_TRANSDUCTION_GO_ TRANSCRIPTION REGULATION_OF_CELLULAR_METABOLI C_PROCESS 5 REGULATION_OF_METABOLIC_PROCES S 6 TRANSCRIPTION_DNA_DEPENDENT RNA_BIOSYNTHETIC_PROCESS REGULATION_OF_NUCLEOBASENUCLEO SIDENUCLEOTIDE_AND_NUCLEIC_ACID_ METABOLIC_PROCESS 9 ANATOMICAL_STRUCTURE_MORPHOGE NESIS 10 RNA_METABOLIC_PROCESS NUCLEOBASENUCLEOSIDENUCLEOTIDE _AND_NUCLEIC_ACID_METABOLIC_PRO CESS 12 RESPONSE_TO_EXTERNAL_STIMULUS DNA_BINDING REGULATION_OF_GENE_EXPRESSION ANATOMICAL_STRUCTURE_DEVELOPME NT 16 BIOPOLYMER_METABOLIC_PROCESS ORGAN_DEVELOPMENT POSITIVE_REGULATION_OF_CELLULAR_ PROCESS 19 NON_MEMBRANE_BOUND_ORGANELLE INTRACELLULAR_NON_MEMBRANE_BOU ND_ORGANELLE Σύνολο γονιδίων που συμμετείχαν στην ανάλυση

79 4.4 Μεταγραφικοί παράγοντες FL/KO WT Εικόνα 4.8: Heat Map των σημαντικότερων μεταγραφικών παραγόντων αναδείχτηκαν από το λογισμικό GeneSpring Από το σύνολό των μεταγραφικών παραγόντων (ΜΠ) που υπάρχουν στο γονιδίωμα, 27 είναι οι μεταγραφικοί παράγοντες που αναδείχθηκαν από το λογισμικό GeneSpring ως εκείνοι με σημαντική διαφορική έκφραση στους FL/KO Vav Cre μύες σε σχέση με τους μύες αγρίου τύπου. Και οι 27 παρουσιάζουν στατιστική σημαντικότητα p<0.05 και διαφορική έκφραση > ± 1.5 σε σχέση με τους μύες αγρίου τύπου. Στην Εικόνα 4.8 καταγράφονται τα ονόματα των μεταγραφικών παραγόντων, το χρωμοδιάγραμμα (Heat Map) και η τιμή της διαφορικής έκφρασης που παρουσιάζουν σε σχέση με του μύες αγρίου τύπου. Οι 23 από τους 27 μεταγραφικούς παράγοντες στους FL/KO Vav Cre ποντικούς παρουσιάζουν σημαντική αύξηση της έκφρασης τους ενώ 4 από τους 27 παρουσιάζουν σημαντικά μειωμένη έκφραση σε σχέση με τους μύες αγρίου τύπου. Οι 19 από τους 27 ΜΠ [Εικόνα 4.8] χαρακτηρίζονται και ως σημαντικά γονίδια πού επηρεάζονται από την αποσιώπηση της Geminin στους FL/KO Vav Cre μύες και όπως αυτά προέκυψαν από την μετα-ανάλυση των αποτελεσμάτων από το λογισμικό GSEA, Εικόνα

80 4.5 Η απουσία της Geminin προάγει την υπερ-έκφραση συγκεκριμένων ΗΟΧ μεταγραφικών παραγόντων Από τη συγκριτική μελέτη διαφορικής έκφρασης γονιδίων μεταξύ των πειραματικών δειγμάτων και των δειγμάτων ελέγχου, προκύπτει ότι η απουσία της πρωτεΐνης Geminin προκαλεί την υπερ έκφραση γονιδίων της HoxΑ οικογένειας. Συγκεκριμένα, τα γονίδια Hoxa10, Hoxa3, Hoxa7, Hoxa5, Hoxa6 και Hoxa9 εκφράζονται από 1.3 έως 2.8 φορές περισσότερο στα πειραματικά δείγματα σε σύγκριση με τα δείγματα ελέγχου. Αναλυτικά αναφέρονται οι τιμές έκφρασης και στατιστικής σημαντικότητας των παραπάνω γονιδίων στον πίνακα Α της Εικόνα 4.9. Α. Γονίδιο p-value Fold Change Hoxa Β. Μετ/νο Δείγμα Φυσ/κο Δείγμα Hoxa Hoxa Hoxa Hoxa Hoxa Εικόνα 4.9: Α. Πίνακας με τις τιμές της διαφορικής έκφρασης γονιδίων (Fold Change) της HoxA στα μεταλλαγμένα δείγματα σε σύγκριση με τα φυσιολογικά. Στη στήλη p-value επισημαίνεται η στατική σημαντικότητα των τιμών διαφορικής έκφρασης. Β. Σύγκριση του μεγέθους διαφορικής έκφρασης των γονιδίων της HoxA οικογένειας στο μεταλλαγμένο και φυσιολογικό δείγμα με χρήση Heat Map. 4.6 Η απουσία της Geminin δεν επηρεάζει την έκφραση των πρωτεϊνών που αποτελούν μέλη των πολύ-πρωτεϊνικών συμπλόκων Polycomb και Trithorax Tα πολύ πρωτεϊνικά σύμπλοκα Polycomb (PcG) και Trithorax (TrX) ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων Hox και εμπλέκονται στις διαδικασίες της ανάπτυξης του οργανισμού. Πιο συγκεκριμένα, το PcG αποτελείται από δύο επιμέρους σύμπλοκα, το PRC1 και το PRC2. Στον Πίνακας 4.3 καταγράφονται οι τιμές της διαφορικής έκφρασης γονιδίων που αντιστοιχούν στις πρωτεΐνες που αποτελούν τα σύμπλοκα PCG και Trx, όπως αυτά προέκυψαν από την συγκριτική μελέτη μεταξύ των μεταλλαγμένων μυών και των μυών αγρίου τύπου. Τα δεδομένα από την έκφραση των γονιδίων των FL/KO Vav Cre μυών υποδεικνύουν πως η έκφραση των γονιδίων που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες και απαρτίζουν τα σύμπλοκα trithorax, PRC1 και PRC2 στους FL/KO Vav Cre μύες δεν μεταβάλλονται από την αποσιώπηση της πρωτεΐνης Geminin. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα αυτό 80