ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΟ ΕΤΟΣ Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΛΙΠΙΔΙΩΝ ΣΤΗ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ HDL ΠΑΧΥΣΑΡΚΩΝ ΓΥΝΑΙΚΩΝ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΑΠΩΛΕΙΑ ΒΑΡΟΥΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΙΑΤΡΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ Διευθύντρια: Καθηγήτρια Ν. ΒΑΒΑΤΣΗ-ΧΡΙΣΤΑΚΗ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΟ ΕΤΟΣ Aριθμ.2118 Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΛΙΠΙΔΙΩΝ ΣΤΗ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ HDL ΠΑΧΥΣΑΡΚΩΝ ΓΥΝΑΙΚΩΝ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΑΠΩΛΕΙΑ ΒΑΡΟΥΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ του ΘΕΜΙΣΤΟΚΛΗ Α. ΤΖΩΤΖΑ ΙΑΤΡΟΥ ΕΝΔΟΚΡΙΝΟΛΟΓΟΥ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΟ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2007

2 2

3 3 Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Α. ΤΡΙΑΝΤΟΣ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ - ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ Μ. ΚΑΡΑΜΟΥΖΗΣ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Ι. ΠΗΔΩΝΙΑ-ΜΑΝΙΚΑ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Α. ΤΡΙΑΝΤΟΣ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ - ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ Μ. ΚΑΡΑΜΟΥΖΗΣ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Ι. ΠΗΔΩΝΙΑ-ΜΑΝΙΚΑ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Ν. ΒΑΒΑΤΣΗ ΧΡΙΣΤΑΚΗ, ΤΑΚΤΙΚΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Α. ΚΩΤΣΗΣ, ΤΑΚΤΙΚΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Ι. ΠΑΠΑΔΗΜΑΣ, ΤΑΚΤΙΚΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Ι. ΓΙΩΒΟΣ, ΑΝΑΠΛ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Η έγκριση της Διδακτορικής Διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδηλοί αποδοχήν των γνωμών του συγγραφέως (Νόμος 5343/32, άρθρο και ν.1268/82 άρθρο 50 8)

4 4

5 5 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΜΠΟΝΤΗΣ

6 6

7 7 Στους γονείς μου, Αναστάσιο και Αιμιλία Στη γυναίκα μου Γιώτα Στις κόρες μου Αιμιλία και Σοφία

8 8

9 9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα ΠΡΟΛΟΓΟΣ 15 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΟΙ ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΟΙ ΚΥΡΙΕΣ ΚΑΤΗΓΟΡΙΕΣ ΤΩΝ ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Λιποπρωτεΐνες που μεταφέρουν κυρίως τριγλυκερίδια Λιποπρωτεΐνες που μεταφέρουν κυρίως χοληστερόλη Λιποπρωτεΐνη(α) ΟΙ ΑΠΟΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΕΣ Απολιποπρωτεΐνη Β Απολιποπρωτεΐνη Α Απολιποπρωτεΐνη Α Απολιποπρωτεΐνη CII Απολιποπρωτεΐνη Ε ΤΑ ΕΝΖΥΜΑ ΤΟΥ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΥ ΤΩΝ ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Η λιποπρωτεϊνική λιπάση (LPL) Η ηπατική λιπάση (HL) Η ενδοθηλιακή λιπάση (ΕL) H λεκιθίνη-χοληστερολο-ακυλο-τρανσφεράση (LCAT) ΟΙ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΤΩΝ ΛΙΠΙΔΙΩΝ Η πρωτεΐνη μεταφοράς εστέρων χοληστερόλης Η πρωτεΐνη μεταφοράς φωσφολιπιδίων 44

10 ΟΙ ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ Οι LDL υποδοχείς Η σχετική με LDL υποδοχείς πρωτεΐνη (LRP) Οι περισυλλέκτες υποδοχείς (scavenger υποδοχείς, SR) Ο περισυλλέκτης υποδοχέας (SR-B1) των HDL ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΩΝ O μεταβολισμός των χυλομικρών Ο μεταβολισμός των VLDL O μεταβολισμός των LDL Oι HDL και η ανάστροφη μεταφορά χοληστερόλης ΠΑΧΥΣΑΡΚΙΑ ΚΑΙ ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΕΣ Παχυσαρκία: Ορισμοί Επιδημιολογικά δεδομένα Η παχυσαρκία ως νόσος Το μεταβολικό σύνδρομο Η δυσλιπιδαιμία της παχυσαρκίας Παθοφυσιολογία του μεταβολισμού των λιποπρωτεϊνών Η επίδραση των στεροειδικών ορμονών Δίαιτα,απώλεια βάρους και μεταβολές των λιποπρωτεϊνών Μεταβολές λιποπρωτεϊνών Παθοφυσιολογία των λιποπρωτεϊνικών μεταβολών ΠΑΧΥΣΑΡΚΙΑ ΚΑΙ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΛΙΠΙΔΙΩΝ Τα επίπεδα των πρωτεϊνών μεταφοράς λιπιδίων πλάσματος στην παχυσαρκία Η επίδραση των πρωτεϊνών μεταφοράς λιπιδίων πλάσματος στη διαφοροποίηση των HDL κατά την απώλεια βάρους 88

11 11 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 1. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΥΛΙΚΟ ΜΕΘΟΔΟΙ ΜΕΛΕΤΗΘΕΝΤΑ ΑΤΟΜΑ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ Ανθρωπομετρία Εργαστηριακές μετρήσεις Λιπίδια και απολιποπρωτεΐνες ορού Παράμετροι ινσουλινοαντίστασης Μετρήσεις ορμονών Μετρήσεις της μάζας των CETP και PLTP πλάσματος Ηλεκτροφόρηση των υποκλασμάτων των HDL Βιοστατιστική ανάλυση ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 117 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ. Σχήματα σημαντικών συσχετίσεων ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ SUMMARY ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 189

12 12

13 13 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΧΟΛ=Ολική χοληστερόλη ΤΓΛ=Τριγλυκερίδια HDL=Υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες ΙDL=Ενδιάμεσης πυκνότητας λιποπρωτεΐνες LDL=Χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες VLDL=Πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες ΑποB=Απολιποπρωτεΐνη Β ΑποA=Απολιποπρωτεΐνη Α LP(α)=Λιποπρωτεΐνη (α) EX = Eστεροποιημένη Χοληστερόλη ΜΕΧ =Μη εστεροποιημένη (ελεύθερη) Χοληστερόλη LPL=Λιποπρωτεϊνική λιπάση HL=Ηπατική λιπάση EL=Ενδοθηλιακή λιπάση LCAT=Λεκιθίνη-χοληστερολο-ακυλο-τρανσφεράση CETP=Πρωτεΐνη μεταφοράς εστέρων χοληστερόλης PLTP=Πρωτεΐνη μεταφοράς φωσφολιπιδίων RCT=Ανάστροφη μεταφορά χοληστερόλης ACAT=Ακυλο-CoA-χοληστερόλη ακυλοτρανσφεράση LRP=Πρωτεΐνη σχετική με τους LDL υποδοχείς MTP=Μικροσωμιακή πρωτεΐνη μεταφοράς τριγλυκεριδίων ΒΣ=Σωματικό βάρος BMI=Δείκτης μάζας σώματος WC=Περίμετρος μέσης WHR=Αναλογία περιμέτρων μέσης προς ισχία ΣΛ%= Επι τοις εκατό ποσοστό σωματικού λίπους

14 14

15 15 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παχυσαρκία αποτελεί μία νόσο της εποχής, η οποία λαμβάνει επιδημικές διαστάσεις όχι μόνο στις αναπτυγμένες χώρες του δυτικού κόσμου, αλλά και στις αναπτυσσόμενες. Στη χώρα μας, η επίπτωση της παχυσαρκίας είναι από τις υψηλότερες στην Ευρώπη, με ποσοστά της τάξης του 23%, υψηλότερα στους άνδρες (26%) σε σχέση με τις γυναίκες (18%). Η αλλαγή του τρόπου ζωής, με κυρίαρχο στοιχείο την υπερβολική και ακατάστατη λήψη τροφής και τη μείωση της σωματικής δραστηριότητας, είναι τα κύρια αίτια της επιδημικής διάστασης της παχυσαρκίας. Η παχυσαρκία προκαλεί σημαντικές σωματικές, ψυχοκοινωνικές και οικονομικές επιπτώσεις. Στον τομέα της σωματικής υγείας, η αυξημένη επίπτωση του σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2, του μεταβολικού συνδρόμου και των καρδιαγγειακών συμβαμάτων ευθύνονται για την αυξημένη θνησιμότητα των παχυσάρκων ατόμων. Η διαταραχή των λιπιδίων του αίματος αποτελεί πιθανότατα τον κύριο προδιαθεσικό παράγοντα για αθηρωμάτωση στα παχύσαρκα άτομα. Οι διαταραχές λιπιδίων που συχνότερα παρατηρούνται είναι τα αυξημένα τριγλυκερίδια και η ελαττωμένη HDL, και οφείλονται κατά κύριο λόγο στην ινσουλινοαντίσταση της παχυσαρκίας, ιδίως αυτής του σπλαχνικού τύπου. Την τελευταία δεκαετία έχει διαπιστωθεί ότι, εκτός της κλασικής δυσλιπιδαιμίας, και άλλοι παράγοντες επιβαρύνουν την αθηρωμάτωση της παχυσαρκίας. Οι παράγοντες αυτοί εκκρίνονται και από το λιπώδη ιστό, ο οποίος θεωρείται πλέον ενεργός ενδοκρινής αδένας, και είναι μεταξύ άλλων ο ογκονεκρωτικός παράγων α, η ιντερλευκίνη 6, η ρεζιστίνη, το αγγειοτενσινογόνο και η C-αντιδρώσα πρωτεΐνη. Πρόσφατα έχει διαπιστωθεί ότι, στην ομάδα αυτών των πρωτεϊνικών ουσιών ανήκουν και οι δύο πρωτεΐνες μεταφοράς λιπιδίων, δηλαδή η πρωτεΐνη μεταφοράς εστέρων χοληστερόλης (CETP) και η πρωτεΐνη μεταφοράς φωσφολιπιδίων

16 16 (PLTP). Οι πρωτεΐνες αυτές επιδρούν σημαντικά στο μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών και ιδίως της καρδιοπροστατευτικής HDL χοληστερόλης. Η μεν CETP ελαττώνει τα επίπεδα της HDL χοληστερόλης, μεταφέροντας εστέρες χοληστερόλης από τις HDL προς τις VLDL και LDL, η δε PLTP συμμετέχει στην ανακατανομή των HDL, προκαλώντας το σχηματισμό μεγάλων και μικρών HDL. Παράλληλα, η PLTP αυξάνει την παραγωγή αθηρογόνων λιποπρωτεϊνών, πλούσιων σε απολιποπρωτεΐνη Β, από το ήπαρ και ελαττώνει τις αντιοξειδωτικές τους ιδιότητες. Λόγω του μηχανισμού δράσης τους, οι CETP και PLTP έχουν προαθηρογόνες ιδιότητες και θεωρούνται αναδυόμενοι παράγοντες κινδύνου για καρδιαγγειακά νοσήματα. Φάρμακα που αναστέλλουν τη δραστικότητα της CETP και μπορεί να αυξήσουν σημαντικά τα επίπεδα της ολικής HDL, βρίσκονται ήδη σε τελική φάση κλινικών μελετών. Στην παχυσαρκία, οι πρωτεΐνες αυτές έχουν βρεθεί αυξημένες λόγω του υπερτροφικού λιπώδους ιστού. Μερικές δε μελέτες έδειξαν την ελάττωση των επιπέδων τους μετά από απώλεια σωματικού βάρους σε παχύσαρκα άτομα. Μέχρι σήμερα, απ όσο μπορούμε να γνωρίζουμε, απουσιάζουν δεδομένα που να έχουν εκτιμήσει την ταυτόχρονη μεταβολή τους σε διαφορετικά χρονικά στιγμιότυπα της απώλειας βάρους και, παράλληλα, την επίδρασή τους στη διαφοροποίηση των υποκλασμάτων των HDL. Σκοπός της μελέτης μας ήταν να διερευνήσουμε τη συμπεριφορά των CETP και PLTP πλάσματος σε παχύσαρκες γυναίκες κατά τη βραχεία, αλλά και την τετράμηνη απώλεια βάρους, ύστερα από ολιγοθερμιδική δίαιτα, καθώς και την συνδυασμένη επίδραση των μεταβολών των πρωτεϊνών αυτών στις μεταβολές των υποκλασμάτων των HDL. Οι απαντήσεις στα παραπάνω ερωτήματα δίδουν χρήσιμες πληροφορίες, τόσο για την κατανόηση της παθοφυσιολογίας των HDL κατά την απώλεια βάρους, όσο και σε πιο πρακτικό επίπεδο, για τη δυνατότητα ταυτόχρονης

17 17 επίδρασης σε δύο νέους παράγοντες κινδύνου μέσω της δίαιτας και της απώλειας βάρους. Η όλη εργασία χωρίζεται σε δύο μέρη, το γενικό και το ειδικό. Στο γενικό μέρος αναλύονται αρχικά οι επιμέρους συνιστώσες του μεταβολισμού των λιποπρωτεϊνών και, συγκεκριμένα, οι κύριες κατηγορίες των λιποπρωτεϊνών, οι απολιποπρωτεΐνες, τα ένζυμα που συμμετέχουν, οι πρωτεΐνες μεταφοράς λιπιδίων και οι διάφοροι υποδοχείς. Στο δεύτερο κεφάλαιο περιγράφεται συνολικά ο μεταβολισμός της κάθε λιποπρωτεΐνης χωριστά, δηλαδή των χυλομικρών, των VLDL, των LDL και των HDL. Στο τρίτο κεφάλαιο δίδονται γενικά στοιχεία για την παχυσαρκία, σχετικά με την επίπτωσή της και τις συνοδές επιπλοκές. Γίνεται αναφορά στο μεταβολικό σύνδρομο, το οποίο συνδέεται άμεσα με την παχυσαρκία και αποτελεί μία αμφιλεγόμενη νοσολογική οντότητα. Στο ίδιο κεφάλαιο περιγράφονται αναλυτικά οι διαταραχές των λιποπρωτεϊνών στην παχυσαρκία και, τέλος, η επίδραση της διαιτητικής θεραπείας και της απώλειας βάρους στις μεταβολές των λιποπρωτεϊνών. Στο τέταρτο κεφάλαιο παρατίθεται η μέχρι σήμερα υπάρχουσα γνώση για την επίδραση της παχυσαρκίας και της απώλειας βάρους στα επίπεδα των πρωτεϊνών μεταφοράς λιπιδίων πλάσματος, καθώς και η συμμετοχή τους στη διαφοροποίηση των HDL. Στο ειδικό μέρος παρουσιάζεται αρχικά, με συνοπτικό τρόπο, ο σκοπός της μελέτης. Στο 2 ο κεφάλαιο περιγράφεται ο τρόπος επιλογής του πληθυσμού της μελέτης. Στη συνέχεια, αναλύεται η μεθοδολογία που ακολουθήθηκε και περιγράφονται οι 3 φάσεις του πρωτοκόλλου, δηλαδή ο χρόνος 0 πριν την παρέμβαση, ο χρόνος 4 εβδομάδες και ο χρόνος 16 εβδομάδες μετά την παρέμβαση. Αναλύονται λεπτομερώς η ποσότητα και ποιότητα της χορηγηθείσας δίαιτας και οι μετρήσεις που έγιναν σε κάθε στιγμιότυπο. Στο ίδιο κεφάλαιο περιγράφονται οι τεχνικές ανθρωπομετρίας και γίνεται αναφορά στην εργαστηριακή μέθοδο των μετρήσεων των λιπιδίων, των παραμέτρων ινσουλινοαντίστασης και των συναφών

18 18 ορμονών. Ιδιαίτερη έμφαση δίδεται στην περιγραφή της μέτρησης των επιπέδων CETP και PLTP πλάσματος, καθώς και στην ηλεκτροφόρηση των υποκλασμάτων των HDL, που έγιναν στο Εργαστήριο Βιοχημείας Λιποπρωτεϊνών της Ιατρικής Σχολής Βουργουνδίας στη Dijon της Γαλλίας, υπό την επίβλεψη του διευθυντή Dr Lagrost. Αξίζει να αναφερθεί ότι, η συγκεκριμένη επιστημονική ομάδα είναι η πρώτη παγκοσμίως, η οποία περιέγραψε τη συγκεκριμένη μέθοδο μέτρησης των δύο πρωτεϊνών. Στο 3 ο κεφάλαιο παρουσιάζονται λεπτομερώς τα αποτελέσματα για όλα τα στιγμιότυπα της μελέτης, ενώ στο ειδικό παράρτημα απεικονίζονται γραφήματα των σημαντικών συσχετίσεων μεταξύ των διαφόρων παραμέτρων. Στο 4 ο κεφάλαιο γίνεται συζήτηση και σύγκριση των ευρημάτων με τα ήδη υπάρχοντα βιβλιογραφικά δεδομένα και στο 5 ο κεφάλαιο παρατίθενται τα συμπεράσματα της μελέτης. Στο 6 ο και 7 ο κεφάλαιο γίνεται μία σύντομη περίληψη στα Ελληνικά και τα Αγγλικά, αντίστοιχα, όλης της μελέτης και η εργασία κλείνει με το 8 ο κεφάλαιο, όπου παρατίθεται η σχετική βιβλιογραφία, με έμφαση σε πρόσφατες αναφορές. Η έναρξη, η εκτέλεση και η ολοκλήρωση της εργασίας αυτής θα ήταν ιδιαίτερα δύσκολη, χωρίς την ουσιαστική συμβολή διακεκριμένων επιστημόνων, τους οποίους θεωρώ χρέος μου να ευχαριστήσω. Ιδιαίτερα θερμές ευχαριστίες και ευγνωμοσύνη εκφράζω στον επιβλέποντα της διατριβής μου Αναπλ. Καθηγητή κ. Αθ. Τριάντο, για την ανάθεση του θέματος, το σχεδιασμό, την εκτέλεση και διόρθωση της παρούσας μελέτης, καθώς και για τη γενικότερη υπομονή του στην παρακολούθηση όλων των σταδίων της διατριβής. Ευχαριστώ θερμά τον Αναπλ. Καθηγητή κ. Μιχάλη Καραμούζη και την Αναπλ. Καθηγήτρια κ. Ιφιγένεια Πηδώνια-Μανίκα για την ουσιαστική συμβολή τους σε όλα τα στάδια της μελέτης.

19 19 Ευχαριστώ θερμά τις Καθηγήτριες κ. Α. Δημητριάδου και Ν. Βαβάτση- Χριστάκη, που μου έδωσαν τη δυνατότητα να εκπονήσω τη διατριβή στο εργαστήριο Βιολογικής Χημείας του ΑΠΘ. Ιδιαίτερες ευχαριστίες οφείλω στο διευθυντή της Ενδοκρινολογικής Κλινικής του Νοσοκομείου Παναγία, όπου και εργάζομαι, τον ενδοκρινολόγο κ. Γ. Κρασσά, για την υποστήριξη και κατανόηση που έδειξε σε όλη τη διάρκεια της μελέτης. Ευχαριστώ θερμά την πρώην προϊσταμένη της Ενδοκρινολογικής Κλινικής του Νοσοκομείου Παναγία, κ. Α. Τιγγίρη και τη συνάδελφο, ιατρό κ. Μ. Κακλαμάνου για τη συμβολή τους στο δύσκολο έργο της συλλογής υλικού. Επίσης, το συνάδελφο, ιατρό κ. Χ. Ζάρρα για τη βοήθειά του. Η εργασία αυτή δεν θα ήταν δυνατό να ολοκληρωθεί, εάν δεν γινόταν η λεπτομερής και σχολαστική στατιστική επεξεργασία από τον Θ. Κωνσταντινίδη, Αναπλ. Καθηγητή του Πανεπιστημίου Θράκης και τον κ. Κ. Τζιόμαλο, Ιατρό Παθολόγο, τους οποίους και ευχαριστώ θερμά. Οφείλω ένα μεγάλο ευχαριστώ στη γυναίκα μου Γιώτα και στην κ. Άννυ Γεροδήμου για τη φιλολογική επιμέλεια και διόρθωση του κειμένου. Επίσης, στη Χρ. Τραγούδα για την εξαιρετική γραμματειακή υποστήριξη. Τέλος, αλλά όχι τελευταίο, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά το βιοχημικό κ. L.Lagrost, διευθυντή του Τμήματος Βιοχημείας του Πανεπιστημίου Βουργουνδίας της Dijon της Γαλλίας, διότι επέβλεψε αυτοπροσώπως τη μέτρηση των εξειδικευμένων λιπιδαιμικών παραμέτρων. Ένα τελευταίο ευχαριστώ στην οικογένειά μου, για την κατανόηση που έδειξε κατά τη διάρκεια της εκπόνησής της. Θεμιστοκλής Α. Τζώτζας

20 20 «Το καινούργιο δημιουργείται από πρωτότυπη τακτοποίηση παλαιών πραγμάτων» Ζακ Μονό «Ο Έρωτας, η Εργασία και η Γνώση είναι αστείρευτες πηγές της ζωής, αυτές που πρέπει να την κυβερνούν» Βίλχελμ Ράϊχ

21 21 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

22 22

23 23 1. ΟΙ ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΕΣ 1.1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Τα λιπίδια του οργανισμού αποτελούν σημαντικές ενώσεις υψηλής ενέργειας για τον οργανισμό και συμμετέχουν στο σχηματισμό και τη διαμόρφωση των κυτταρικών μεμβρανών. Στα κύρια λιπίδια που διακινούνται στο αίμα περιλαμβάνονται η χοληστερόλη, τα λιπαρά οξέα συνδεδεμένα με αλβουμίνη, και τα φωσφολιπίδια. Τα λιπαρά οξέα αποτελούν τα κυριότερα καύσιμα-μόρια στα κύτταρα. Εναποθηκεύονται συνήθως στο λιπώδη ιστό, ως τριακυλογλυκερόλες ή τριγλυκερίδια, όπου και παραμένουν όταν τα ενεργειακά επίπεδα είναι εξασφαλισμένα (1). Η χοληστερόλη συμμετέχει στο σχηματισμό των κυτταρικών μεμβρανών, αλλά και στη βιοσύνθεση χολικών οξέων, βιταμίνης D και στεροειδικών ορμονών ως πρόδρομη ουσία. Η χοληστερόλη δεν είναι δυνατόν να οξειδωθεί σε CO2 και Η2Ο και επομένως να χρησιμοποιηθεί ως μόριοκαύσιμο, διότι οι ιστοί των θηλαστικών δεν διαθέτουν κατάλληλα ένζυμα για να διασπάσουν και να οξειδώσουν στεροειδείς πυρήνες (2). Τα λιπίδια είναι υδρόφοβα μόρια, αδιάλυτα στο νερό, και για να κυκλοφορήσουν στο αίμα συνδέονται με ένα πρωτεϊνικό μόριο, το οποίο ονομάζεται απολιποπρωτεΐνη ή αποπρωτεΐνη (απo). H ένωση του λιπιδικού με το πρωτεΐνικό τμήμα αποτελεί συνολικά τη λιποπρωτεΐνη (1). Xαρακτηριστικά, οι λιποπρωτεΐνες αποτελούνται από έναν κεντρικό πυρήνα, που περιέχει την εστεροποιημένη χοληστερόλη και τα τριγλυκερίδια και από ένα περιφερικό χιτώνιο, αποτελούμενο από συνάθροιση ειδικών απολιποπρωτεϊνών, φωσφολιπιδίων και ελεύθερης χοληστερόλης. Oι λιποπρωτεΐνες διακρίνονται ανάλογα με την πυκνότητα ή

24 24 την ηλεκτροφορητική τους κινητικότητα σε 4 μεγάλες κατηγορίες: Tα χυλομικρά, τις VLDL (πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες ή προ β λιποπρωτεΐνες), τις LDL (χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες ή β λιποπρωτεΐνες) και τις HDL (υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες ή α λιποπρωτεΐνες) (Πίνακας 1) (1). Οι κύριες πηγές παραγωγής λιποπρωτεϊνών είναι το ήπαρ και το έντερο. Πίνακας 1. Ταξινόμηση λιποπρωτεϊνών πλάσματος [Προσαρμογή από Τρακατέλλης (1)] Ταξινόμηση με υπερφυγοκέντρηση Ταξινόμηση με ηλεκτροφόρηση Κύρια λιπίδια που Κύριες αποπρωτεΐνες μεταφέρουν Χυλομικρά Χυλομικρά Τριγλυκερίδια Α,Β,C Λιποπρωτεΐνες πολύ προ-β Τριγλυκερίδια B,C,E χαμηλής πυκνότητας (VLDL) λιποπρωτεΐνες Λιποπρωτεΐνες β-λιποπρωτεΐνες Εστέρες B χαμηλής πυκνότητας (LDL) χοληστερόλης Λιποπρωτεΐνες υψηλής πυκνότητας (HDL) α-λιποπρωτεΐνες Φωσφολιπίδια, εστέρες χοληστερόλης A

25 OI KYPIEΣ KATHΓOPIEΣ TΩN ΛIΠOΠPΩTEΪNΩN Λιποπρωτεΐνες που μεταφέρουν κυρίως τριγλυκερίδια Xυλομικρά Eίναι ευμεγέθη μόρια πολύ χαμηλής πυκνότητας, αποτελούμενα κατά 85 95% από αμιγή τριγλυκερίδια, που προέρχονται από τις τροφές. Συντίθενται στο έντερο μέσω της απολιποπρωτεΐνης Β 48 (αποb 48 ), η οποία παράγεται τοπικά (1). Η αποβ 48 αποτελεί μία από τις 2 μορφές της απολιποπρωτεΐνης Β και έχει μοριακό βάρος (ΜΒ) 246 ΚDa. Η άλλη μορφή είναι η αποb 100, με MB 549 ΚDa. Στην κυκλοφορία, τα πλούσια σε τριγλυκερίδια χυλομικρά εμπλουτίζονται ταχέως και με άλλες απολιποπρωτεΐνες, όπως αποe (ΜΒ 39 ΚDa) και αποc (CI, CII, CIII, μοριακού βάρους 6,5, 8,5 και 8,75 ΚDa, αντίστοιχα). O ρόλος των χυλομικρών είναι να μεταφέρουν τα τριγλυκερίδια (ενέργεια) της τροφής κατά τη μεταγευματική περίοδο, από το έντερο προς τους περιφερικούς ιστούς (σκελετικούς μυς, λιπώδη ιστό, κλπ.) και το ήπαρ (3). Tα χυλομικρά μεταβολίζονται σε 2 στάδια: α) Με την υδρόλυση των τριγλυκεριδίων κατά την κυκλοφορία και μεταφορά μέσω του ειδικού ενζύμου λιποπρωτεϊνική λιπάση (LPL). Tο ένζυμο αυτό επιτρέπει την αποθήκευση των λιπαρών οξέων στο λιπώδη ιστό με τη μορφή των τριγλυκεριδίων β) Με την πρόσληψη των υπολοίπων προϊόντων διάσπασης των χυλομικρών, των υπολειπομένων σωματιδίων ( remnants ), από το ήπαρ, μέσω ενός ειδικού υποδοχέα LDL, της πρωτεΐνης σχετικής με τους LDL υποδοχείς( LRP) (4). Η αποτελεσματική σύνδεση των υπολειπομένων σωματιδίων ή καταλοίπων με τους υποδοχείς στο ήπαρ επηρεάζεται άμεσα από τα επίπεδα και τον πολυμορφισμό της απολιποπρωτεΐνης Ε (4).

26 Πολύ χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (VLDL) Eίναι μόρια μεγάλου μοριακού βάρους, που αποτελούνται κατά 80 90% από λιπίδια (4/5 από τριγλυκερίδια και 1/5 από χοληστερόλη). Παράγονται από το ήπαρ και είναι υπεύθυνα για τη μεταφορά κυρίως των ενδογενών (ηπατικών) τριγλυκεριδίων (1). H παραγωγή τους διεγείρεται από την αυξημένη προσφορά ελεύθερων λιπαρών οξέων (ΕΛΟ) στα ηπατοκύτταρα. Περιέχουν αποb100, αποe και αποc. Kαταβολίζονται όπως τα χυλομικρά, σε ενδιάμεσης πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (IDL), μέσω του ενζύμου LΡL και στη συνέχεια σε LDL. Oι IDL καταβολίζονται γρήγορα και, σε φυσιολογικές συνθήκες, απουσιάζουν από την ηλεκτροφόρηση των λιποπρωτεϊνών (4) Λιποπρωτεΐνες που μεταφέρουν κυρίως χοληστερόλη Xαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (LDL) Aποτελούν σημαντική πηγή χοληστερόλης, για τις ανάγκες της στεροειδογένεσης και δημιουργίας μεμβρανών των ιστών. Eίναι μόρια μέσου μεγέθους, πλούσια σε χοληστερόλη (50%) και πρωτεΐνη (25%), κυρίως αποπρωτεΐνη B (1). Oι LDL αποτελούν κατά το μεγαλύτερο ποσοστό τους προϊόντα καταβολισμού των VLDL. Tο 75% του καταβολισμού των LDL γίνεται μέσω των ειδικών LDL υποδοχέων, τους οποίους διαθέτουν όλοι οι ιστοί, ενώ άλλοι μηχανισμοί περιλαμβάνουν ακόμη καταβολισμό από μη ειδικούς κυτταρικούς υποδοχείς (περισυλλέκτες υποδοχείς ή scavenger receptors). Περιγράφησαν για πρώτη φορά στα μακροφάγα κύτταρα και, η πρόσληψη αυξημένης ποσότητας χοληστερόλης μέσω αυτών, αποδείχθηκε ότι οδηγεί στο σχηματισμό των αφρωδών κυττάρων, δίδοντας κατ αυτόν τον τρόπο μία εξήγηση για την πρόκληση αθηροσκλήρωσης. Από τότε, έχουν περιγραφεί πολλά νέα μέλη της οικογένειας των υποδοχέων τύπου scavenger,

27 27 ανάλογα με την ικανότητά τους να αναγνωρίζουν τροποποιημένες λιποπρωτεΐνες, αλλά και προϊόντα απόπτωσης (5). Μία υποκατηγορία των LDL, oι μικρές-πυκνές LDL, είναι πιο επιρρεπείς από τις φυσιολογικού μεγέθους LDL σε τροποποίηση και σε πρόσληψη από τα μακροφάγα κύτταρα, με αποτέλεσμα να θεωρούνται ιδιαίτερα αθηρογόνες (6) Υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνες (HDL) Είναι μόρια μικρού μοριακού βάρους, πλούσια σε αποπρωτεΐνες (κυρίως A1 και A2), φωσφολιπίδια και χοληστερόλη, και θεωρούνται υπεύθυνα κυρίως για την απομάκρυνση της χοληστερόλης από τους ιστούς προς το ήπαρ (1). Οι αποα αποτελούν πρωτεΐνες που συμμετέχουν όχι μόνο δομικά, αλλά και λειτουργικά στο μεταβολισμό των HDL. Oι HDL παράγονται είτε απευθείας από το ήπαρ και το έντερο ή έμμεσα, κατόπιν μεταφοράς λιπιδίων και αποπρωτεϊνών κατά τη διάρκεια της λιπόλυσης των χυλομικρών και των VLDL (3). Οι HDL παρουσιάζουν μεγάλη ετερογένεια και κυκλοφορούν στο πλάσμα είτε ως δισκοειδή μόρια (πρωτογενείς HDL) είτε ως σφαιρικά (ώριμες HDL). Ανάλογα με τη μέθοδο διαχωρισμού τους, διακρίνονται στα εξής κύρια υποκλάσματα: σε HDL2b, HDL2a (μεγάλα μόρια), και σε HDL3a, HDL3b, HDL3c (μικρά μόρια), σύμφωνα με την ηλεκτροφόρηση βαθμίδωσης σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου, και σε α-, προ-α, προ-β-hdl και γ-hdl, με βάση την ηλεκτροφόρηση σε αγαρόζη (7). Οι α-hdl αντιστοιχούν στις HDL2 και HDL3 και αποτελούν την πλειοψηφία των HDL σε σφαιρική μορφή, ενώ οι προ-β (pre-β-hdl) είναι τα πρωτογενή κλάσματα και έχουν κυρίως δισκοειδή μορφή. Οι γ-hdl είναι δισκοειδή μόρια μικρής συγκέντρωσης στο αίμα. Επίσης, ανάλογα με την περιεκτικότητα των HDL σε αποα, διακρίνουμε τις πλούσιες σε αποα1 (Α-I HDL), τις πλούσιες σε αποa2 (A-II HDL) και τις περιέχουσες ταυτόχρονα αποα1 και αποα2 (ΑΙ/ΑΙΙ HDL) (7). Oι HDL2, πλούσιες σε αποa1, είναι αυτές που μεταφέρουν όλο και

28 28 μεγαλύτερες ποσότητες εστεροποιημένης χοληστερόλης προς το ήπαρ και είναι πιθανόν ότι είναι οι κατ εξοχήν αντιαθηρογόνες λιποπρωτεΐνες. O καταβολισμός των HDL δεν είναι απόλυτα ξεκάθαρος. Το 1996 απομονώθηκε ένας ειδικός περισυλλέκτης υποδοχέας, ο SRΒ1, ο οποίος φαίνεται ότι συμμετέχει ενεργά στη διαδικασία καταβολισμού των HDL (8). Στην παρακάτω εικόνα απεικονίζονται τα διάφορα υποκλάσματα των HDL, ανάλογα με το μέγεθος και τη σύσταση σε αποπρωτεΐνες. Εικόνα 1. Τα υποκλάσματα των HDL [προσαρμογή από Barter και συν(7)] Λιποπρωτεΐνη (α) [LP(α)] Η λιποπρωτεΐνη(α) παρουσιάζει φυσικοχημικές ιδιότητες παρόμοιες με την LDL, αλλά περιέχει επιπλέον μία ειδική γλυκοπρωτεΐνη, την απολιποπρωτεΐνη (α) [απο(α)]. Η απολιποπρωτεΐνη (α) αποτελείται από έξι ισομορφές, οι οποίες καθορίζονται γενετικά. Η δομή της εμφανίζει ισχυρή

29 29 ομολογία με το μόριο του πλασμινογόνου. O φυσιολογικός ρόλος της λιποπρωτεΐνης (α) δεν έχει διευκρινισθεί, όμως φαίνεται να συμμετέχει ενεργά στην επούλωση των τραυμάτων, μεταφέροντας τοπικά χοληστερόλη, ενώ προάγει παράλληλα και την αγγειογένεση (9). Eίναι πιθανό ότι, οι αυξημένες συγκεντρώσεις LP(α) αποτελούν παράγοντα αγγειακού κινδύνου, διότι η LP(α) κατά το 1/3 καταβολίζεται από τους περισυλλέκτες υποδοχείς ( scavenger receptors ) και στη συνέχεια οξειδώνεται. Τα επίπεδα της LP(α) υπόκεινται σε αυστηρό γενετικό έλεγχο και, αξίζει να τονισθεί ότι, δεν μειώνονται από τη διαιτητική και φαρμακευτική υπολιπιδαιμική θεραπεία. Πρόσφατα, καθορίσθηκαν κατευθυντήριες οδηγίες από το Αμερικανικό Ινστιτούτο Υγείας για την αξιολόγηση των μετρήσεων των επιπέδων της LP(α) στην κλινική πράξη (10). Επίσης, το 2005 εκδόθηκαν ευρωπαϊκές οδηγίες για την Πρόληψη της Καρδιαγγειακής Νόσου (ΚΑΝ), σύμφωνα με τις οποίες η LP(α) θεωρείται πλέον ως σημαντικός αναδυόμενος παράγοντας κινδύνου, ιδίως όταν η συγκέντρωσή της ξεπερνά τα 30mg/dl στο πλάσμα (11). Οι φυσικοχημικές ιδιότητες των κύριων λιποπρωτεϊνών φαίνονται στον πίνακα 2.

30 30 Πίνακας 2. Χαρακτηριστικά των κύριων λιποπρωτεϊνών [Προσαρμογή από Pownall,Gotto(12)] ΧΥΛΟΜΙΚΡΑ VLDL LDL HDL LP(α) Πυκνότητα (g/ml) 0,93 0,95-1,006 1,019-1,063 1,063-1,21 1,055-1,085 Ηλεκτροφορητική κινητικότητα Ακίνητα Προ-βήτα Βήτα Άλφα Βραδεία προ-βήτα Μέγεθος (Ǻ) Σύσταση % πρωτεΐνη τριγλυκερίδια χοληστερόλη φωσφολιπίδια κύριες αποπρωτεΐνες Β48 C I, C II, C III A I, A IV, E Β100 C I,C II,C III E Β100 Α Ι, Α ΙΙ C I, C II,C III E Β100, (α) 1.3 OΙ ΑΠΟΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΕΣ Aποτελούν το πρωτεϊνικό τμήμα της λιποπρωτεΐνης και συντίθενται στο ήπαρ και στο έντερο. Όλες οι απολιποπρωτεΐνες χαρακτηρίζονται από την παρουσία επαναλαμβανόμενων ελίκων, οι οποίες εμφανίζουν μία υδρόφιλη και μία υδρόφοβη επιφάνεια. Eκτός του δομικού ρόλου τους, χρησιμεύουν στην αναγνώριση των λιποπρωτεϊνών από τους εκάστοτε ειδικούς υποδοχείς και ως ενεργοποιητές ή αναστολείς ενζύμων. Oι κύριες αποπρωτεΐνες είναι η αποb, η αποa1, η αποa2, η αποcii και η αποe (13).

31 Aπολιποπρωτεΐνη B Aποτελείται από την αποb 48, η οποία συμβάλλει στην παραγωγή των χυλομικρών και την αποb 100, που συμμετέχει στην έκκριση των VLDL. Η αποb 48 συντίθεται στο έντερο, ενώ η αποb 100 στο ήπαρ, σε πολύ μεγαλύτερες ποσότητες από την αποb 48. Η αποb 100 είναι απαραίτητη για την ηπατική σύνθεση των VLDL, ενώ στη συνέχεια μεταφέρεται αναλλοίωτη στις VLDL, IDL και LDL (13). Η παραγωγή των VLDL από το ήπαρ γίνεται στο ενδoπλασματικό δίκτυο, μέσω συνένωσης ενός μη-λιπιδιωμένου μορίου αποb 100 και ενός λιπιδικού σταγονιδίου. Για την παραγωγή του λιπιδικού μέρους, αλλά και τη συνένωση αυτού με την αποb, έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι είναι απαραίτητη η παρουσία μιας πρωτεΐνης, η οποία ονομάζεται μικροσωμιακή πρωτεΐνη μεταφοράς τριγλυκεριδίων (microsomal triglyceride transfer protein, MTP) (14). Η έλλειψη της MTP προκαλεί τη νόσο α-βήτα λιποπρωτεϊναιμία, η οποία χαρακτηρίζεται από αδυναμία του ήπατος να παράγει λιποπρωτεΐνες περιέχουσες την αποb (χυλομικρά, VLDL και LDL). H ηπατική σύνθεση και έκκριση της αποb 100 ρυθμίζεται από τα ηπατικά επίπεδα της χοληστερόλης, των τριγλυκεριδίων και των λιπαρών οξέων. Η αποb 100 αποτελεί το 90% των αποπρωτεϊνών των LDL και γι αυτό υπάρχει απόλυτη συσχέτιση μεταξύ LDL και αποb. Aναγνωρίζεται από τον ειδικό υποδοχέα B E, ο οποίος βρίσκεται στην κυτταρική μεμβράνη των ιστών, και είναι υπεύθυνη για τον καταβολισμό των LDL. Οι δύο μορφές της αποb κωδικοποιούνται από το ίδιο γονίδιο, το οποίο εδράζεται στο χρωμόσωμα 2 (13) Aπoλιποπρωτεΐνη A1 Συντίθεται στο ήπαρ και το έντερο και η παραγωγή της διεγείρεται από τα οιστρογόνα. H αποa1 ενεργοποιεί το ένζυμο λεκιθίνη-χοληστερολοακυλο-τρανσφεράση (LCAT), το οποίο επιτρέπει την εστεροποίηση της χοληστερόλης εντός των HDL (13). H αποα1 απαντάται κυρίως στις πρωτογενείς HDL και στις HDL2 και παίζει ουσιώδη ρόλο στην ανάστροφη

32 32 μεταφορά χοληστερόλης (15). Eίναι η κατ εξοχήν αντιαθηρογόνος απολιποπρωτεΐνη. Tο υπεύθυνο γονίδιο για τη σύνθεσή της βρίσκεται στο χρωμόσωμα 11. Σημειακή μετάλλαξη ή πλήρης εξάλειψη του ενεργού γονιδίου της αποa 1 έχουν σαν αποτέλεσμα την παραγωγή πολύ χαμηλής ποσότητας HDL, με συνέπεια την πρώιμη ανάπτυξη ΚΑΝ στις προσβεβλημένες οικογένειες (16) Απολιποπρωτεΐνη A2 Αποτελεί τη δεύτερη σε ποσότητα αποπρωτεΐνη των HDL και συντίθεται στο ήπαρ. Ο ακριβής λειτουργικός ρόλος της αποa2 παραμένει άγνωστος. Πρόσφατες μελέτες, όμως, σε ποντίκια αλλά και στον άνθρωπο έδειξαν ότι, τα αυξημένα επίπεδα της αποa2 μπορεί να σχετίζονται με την εκδήλωση της οικογενούς συνδυασμένης υπερλιπιδαιμίας και ενδεχομένως με το σύνδρομο ινσουλινοαντίστασης (17). Μέχρι σήμερα θεωρείτο ως μία αποπρωτεΐνη μάλλον ήσσονος σημασίας, καθόσον κατά την απουσία της δεν εμφανίζονταν παθολογικές λιποπρωτεΐνες (13). Η αποa2 συμβάλλει, σε μικρότερο όμως βαθμό σε σύγκριση με την αποa 1, στη διαδικασία της ανάστροφης μεταφοράς της χοληστερόλης Απολιποπρωτεΐνη CII Συντίθεται στο ήπαρ και ανήκει στην κατηγορία των αποc, η οποία περιλαμβάνει τρεις ισοπρωτεΐνες (C I, C II, C III ). Kύρια δράση της αποc II είναι η διέγερση της λιποπρωτεϊνικής λιπάσης και έτσι, κατά την απουσία της, εμφανίζεται το σύνδρομο της υπερχυλομικροναιμίας (13). Tο υπεύθυνο γονίδιο της αποcii βρίσκεται στο χρωμόσωμα 19.

33 Απολιποπρωτεΐνη E Παράγεται σε διάφορους ιστούς, αλλά κύρια πηγή της είναι το ήπαρ. Kυκλοφορεί σε τρεις ισομορφές (E2, E3, E4), που διαφέρουν ανάλογα με την παρουσία κυστεΐνης ή αργινίνης στις θέσεις 112 και 152. Tα ισόμορφα αυτά καθορίζονται γενετικά από ένα σύστημα 3 αλληλίων, που βρίσκονται στο ίδιο επιτόπιο. Kατ αυτόν τον τρόπο προκύπτουν 6 διαφορετικοί φαινότυποι, 3 ομοζυγώτες (E2 E2, E3 E3, E4 E4) και 3 ετεροζυγώτες (E3 E2, E4 E3, E4 E2) (3). Στο γενικό πληθυσμό, η συχνότητα του Ε2 αλληλίου κυμαίνεται γύρω στο 7%, του Ε3 στο 78% και του Ε4 στο 15%. Συχνότερα συναντάται η ομοζυγωτική κατάσταση για το αλλήλιο Ε3. H σύνδεση των ισόμορφων με τον υποδοχέα B E ποικίλλει. Tα ισόμορφα E3 συνδέονται φυσιολογικά, τα Ε4 λιγότερο καλά, ενώ η σύνδεση του E2 μειονεκτεί ιδιαίτερα. H διαταραγμένη σύνδεση του Ε4 προκαλεί τη διαταραχή του καταβολισμού κυρίως των LDL και, κατά συνέπεια, υπερχοληστερολαιμία. Γενικά, ο πολυμορφισμός της αποπρωτεΐνης Ε επηρεάζει κατά 10-15% τα επίπεδα της χοληστερόλης πλάσματος, αλλά και επιδρά στην αποτελεσματικότητα της θεραπευτικής παρέμβασης. Οι φέροντες το αλλήλιο αποe4 είναι πιθανό ότι παρουσιάζουν καλύτερη απάντηση στη διαιτητική θεραπεία και οι φορείς του αποe2 αλληλίου απαντούν καλύτερα στη θεραπεία με στατίνες (18). Επίσης, τα άτομα με φαινότυπο E2/E2 έχουν προδιάθεση για εμφάνιση δυσλιπιδαιμίας με αύξηση IDL (δυσ βήτα λιποπρωτεϊναιμία ή τύπος IIΙ κατά Fredrikson) (13). Στον πίνακα 3 φαίνονται οι κύριες απολιποπρωτεΐνες.

34 34 Πίνακας 3. Oι απολιποπρωτεΐνες και οι κύριες λειτουργίες τους [Προσαρμογή από Perret και συν (13)] Aπολιποπρωτεΐνη Λιποπρωτεΐνη που περιέχεται Kύρια λειτουργία AπoB48 Xυλομικρά, remnants Δομική πρωτεΐνη χυλομικρών AπoB100 VLDL, IDL, LDL Δομική πρωτεΐνη των VLDL, LDL Σύνδεση με LDL υποδοχείς AπoA I HDL Δομική πρωτεΐνη των HDL Ενεργοποίηση της LCAT Διεγείρει την πρόσληψη χοληστερόλης από τα κύτταρα AπoA II HDL Δομική πρωτεΐνη των HDL Ενεργοποίηση ηπατικής λιπάσης AπoAIV HDL, χυλομικρά Eνεργοποίηση LPL και LCAT AπoCII Xυλομικρά, VLDL Kύριο συνένζυμο για LPL AπoCIII AπoE Xυλομικρά, VLDL, HDL Remnants, VLDL, LDL, HDL Αναστολέας LPL Διεγέρτης ηπατικής παραγωγής VLDL Σύνδεση με LDL υποδοχέα, σύνδεση με υποδοχέα LRP Aπo(α) LP(α) Δομική πρωτεΐνη για LP(α) Aναστολέας της ενεργοποίησης του πλασμινογόνου

35 TA ENZYMA ΤΟΥ ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΥ ΤΩΝ ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΙΝΩΝ H λιποπρωτεϊνική λιπάση (LPL) Είναι μία γλυκοπρωτεΐνη με 448 αμινοξέα και αποτελεί το ένζυμο-κλειδί της κατανομής τριγλυκεριδίων ( ενέργειας ) στους ιστούς. Συντίθεται στα παρεγχυματικά κύτταρα και στη συνέχεια μεταφέρεται στα ενδοθηλιακά κύτταρα των τριχοειδών. Η LPL απελευθερώνεται στο πλάσμα των τριχοειδών των αγγείων και δρα στα διερχόμενα λιποπρωτεϊνικά σωματίδια (εικόνα 2). Η απελευθέρωσή της γίνεται με την επίδραση της ηπαρίνης και, γι αυτό, η μέτρησή της στον ορό προϋποθέτει τη χορήγηση ηπαρίνης (3). Yδρολύει τα τριγλυκερίδια των χυλομικρών και των VLDL, τα οποία μετατρέπει σε υπολειπόμενα σωματίδια, απελευθερώνοντας μονογλυκερίδια και ελεύθερα λιπαρά οξέα. Επικουρικά, η LPL δρα επαγωγικά στην πρόσληψη των λιποπρωτεϊνών, μέσω των ειδικών υποδοχέων τους, και επίσης μεσολαβεί στην εκλεκτική πρόσληψη ορισμένων εστέρων χοληστερόλης, αλλά και λιπόφιλων βιταμινών από τους ιστούς (19). Η πλήρης έλλειψη του ενζύμου δημιουργεί υπερχυλομικροναιμία, ενώ η μερική έλλειψη προκαλεί μικτή υπερλιπιδαιμία ή υπερτριγλυκεριδαιμία. Παρουσιάζει μεγάλη δομική ομολογία με την ηπατική και παγκρεατική λιπάση, όχι όμως και με την ορμονοευαίσθητη λιπάση (HSL) του λιπώδους ιστού, της οποίας ο κύριος ρόλος είναι η απελευθέρωση των λιπαρών οξέων από τα λιποκύτταρα, κατόπιν ορμονικού ερεθίσματος. H LPL βρίσκεται κυρίως στο λιπώδη ιστό, στον καρδιακό ιστό και στους σκελετικούς μύες. Ανιχνεύσιμα επίπεδά της διαπιστώνονται επίσης στα μακροφάγα κύτταρα, στον εγκέφαλο, στον πλακούντα, στους πνεύμονες, στο σπλήνα, στα β-κύτταρα του παγκρέατος και στους στεροειδοπαραγωγούς ιστούς. H LΡL έχει βραχεία ημιπερίοδο ζωής και χρησιμοποιεί ως συνένζυμο την αποcii. Το γονίδιο που την κωδικοποιεί βρίσκεται στο χρωμόσωμα 8 (20).

36 36 H ρύθμιση της LΡL ποικίλλει, ανάλογα με τη συγκεκριμένη ενεργειακή κατάσταση. Kατά τη διάρκεια νηστείας, παρατηρείται αυξημένη δραστηριότητα της LΡL των μυών και χαμηλή του λιπώδους ιστού, έτσι ώστε τα τριγλυκερίδια να κατευθύνονται προς τους μύες, οι οποίοι τα χρησιμοποιούν ως καύσιμο. Kατά τη μεταγευματική περίοδο, όπου δεν υπάρχει άμεση ενεργειακή ανάγκη, η LΡL του λιπώδους ιστού αυξάνει, με σκοπό την αποθήκευση των τριγλυκεριδίων στο λιπώδη ιστό. Συγκεκριμένα, η LPL υδρολύει τα τριγλυκερίδια των χυλομικρών σε ΕΛΟ, τα οποία εισέρχονται στα λιποκύτταρα, όπου επανεστεροποιούνται σε τριγλυκερίδια, για να σχηματίσουν τις λιπαποθήκες (20). Η ενεργότητα της LPL διαφέρει σημαντικά, ανάλογα με τον ιστό που τη χρησιμοποιεί. Διαταραχές στην έκφραση του ενζύμου στους περιφερικούς ιστούς προκαλούν διαταραχές στην κατανομή των λιπαρών οξέων, με αποτέλεσμα την εμφάνιση σημαντικών μεταβολικών συνεπειών. Για παράδειγμα, μετρίως χαμηλά επίπεδα LPL, όπως αυτά που παρατηρούνται σε άτομα με ετερόζυγο βλάβη του γονιδίου της, παρουσιάζουν υψηλά επίπεδα ΕΛΟ, με αποτέλεσμα υπερτριγλυκεριδαιμία ή συνδυασμένη υπερλιπιδαιμία (21). Αντίθετα, η χρόνια αύξηση της LPL του λιπώδους ιστού, σε σχέση με αυτή του μυϊκού, δρώντας ευοδωτικά στην αποθήκευση των τριγλυκεριδίων στο λιπώδη ιστό, συμμετέχει στην εκδήλωση παχυσαρκίας, εφ όσον συνυπάρχουν γενετική προδιάθεση και διατροφικές διαταραχές. Με ανάλογο τρόπο, αυξημένη συγκέντρωση LPL στα μακροφάγα των αγγείων ευνοεί την εναπόθεση λίπους στα αγγεία και την προδιάθεση για αθηρωμάτωση (22). Ο πιθανός μηχανισμός δράσης στην περίπτωση αυτή φαίνεται να είναι το γεγονός ότι, η LPL των μακροφάγων των αγγείων υδρολύει τις πλούσιες σε τριγλυκερίδια λιποπρωτεΐνες του πλάσματος, προκαλώντας το σχηματισμό υπολειπομένων σωματιδίων, τα οποία δρουν βλαπτικά στο αγγειακό ενδοθήλιο, ενώ, παράλληλα, τα απελευθερούμενα τοπικά ΕΛΟ αυξάνουν τη διαπερατότητα του ενδοθηλίου

37 37 στις LDL (23). Επίσης, η υπερέκφραση της LPL στα β-κύτταρα του παγκρέατος, αλλά και στο μυϊκό ιστό, είναι δυνατόν να παίζει ρόλο στην πρόκληση ινσουλινοαντίστασης, απελευθερώνοντας μεγάλη ποσότητα ΕΛΟ (24). Άρα, η ειδική δράση ανά ιστό της LPL παίζει κυρίαρχο ρόλο στο μεταβολισμό του λίπους, των λιποπρωτεϊνών και των υδατανθράκων. H ινσουλίνη είναι η ορμόνη που κυρίως επάγει τη δράση της LΡL στο λιπώδη ιστό και η διέγερση αυτή συντελείται 3-4 ώρες μετά τη λήψη ενός μικτού γεύματος. Παράγοντες που αναστέλλουν τη δράση της in vitro είναι ο ογκωτικός νεκρωτικός παράγων α (TNFα) και η ιντερλευκίνη 1 (IL1) (3). Στην εικόνα 2 απεικονίζεται η δράση της λιποπρωτεϊνικής λιπάσης στα χυλομικρά και στις VLDL στο λιπώδη ιστό. Εικόνα 2. Η δράση της λιποπρωτεϊνικής λιπάσης στο λιπώδη ιστό [Προσαρμογή από Frayn(3)] H ηπατική λιπάση (HL) Η HL είναι ένα λιπολυτικό ένζυμο, που συντίθεται στα ηπατοκύτταρα και εκκρίνεται στην επιφάνεια των ηπατοκυττάρων και των ηπατικών

38 38 ενδοθηλιακών κυττάρων. Η HL διαφέρει από την LPL, διότι δεν χρησιμοποιεί συνένζυμο για τη δράση της, δρά μόνο σε επίπεδο ηπατοκυττάρου και η επίδρασή της ασκείται στα μικρού μεγέθους σωματίδια. Η επίδραση της HL ασκείται κυρίως στο μεταβολισμό των υπολειπομένων σωματιδίων (ΙDL), των LDL και των HDL, όπου υδρολύει τα μονογλυκερίδια, τα διγλυκερίδια, τα τριγλυκερίδια, αλλά και τα φωσφολιπίδια και τους εστέρες χοληστερόλης (25). Η HL είναι κυρίως υπεύθυνη για τη μετατροπή των IDL σε LDL και των HDL2 σε HDL3 (26). Αυτή η τελευταία μετατροπή, δηλαδή των μεγάλων, σφαιρικών σωματιδίων HDL σε μικρά, δισκοειδή μέσω υδρόλυσης τριγλυκεριδίων και φωσφολιπιδίων, γίνεται σε συνδυασμό με τη δράση της πρωτεΐνης μεταφοράς εστέρων χοληστερόλης CETP (27). Επίσης, η HL παίζει σημαντικό ρόλο στον καταβολισμό των υπολειπομένων σωματιδίων (remnants) κατά τη μεταγευματική περίοδο. Μαζί με τις πρωτεΐνες μεταφοράς λιπιδίων, η HL καθορίζει τα επίπεδα των HDL ιδίως των HDL2 στο πλάσμα και έχει βρεθεί ισχυρή αντίστροφη σχέση μεταξύ δραστηριότητας HL και HDL2 (28). Επίσης, η HL πιθανώς επάγει τον καταβολισμό των HDL μέσω των ηπατικών υποδοχέων SR-BI. Αυτή η τελευταία δράση έχει αποδειχθεί στα ποντίκια, αλλά όχι ακόμη στον άνθρωπο (26). Η δραστηριότητα της ηπατικής λιπάσης βρίσκεται υπό ισχυρή ορμονική επίδραση. Τα οιστρογόνα ελαττώνουν τα επίπεδά της, ενώ τα ανδρογόνα και τα αναβολικά στεροειδή τα αυξάνουν, με αποτέλεσμα οι άνδρες να έχουν χαμηλότερα επίπεδα HDL από τις γυναίκες (29). Αυξημένη HL έχει βρεθεί στην παχυσαρκία, ιδίως ανδρικού τύπου, και σε καταστάσεις ινσουλινοαντίστασης (30) και εξηγεί εν μέρει τις χαμηλές HDL στις καταστάσεις αυτές. Μέχρι σήμερα παραμένει αδιευκρίνιστο κατά πόσο η HL έχει προ- ή αντιαθηρογόνες ιδιότητες (31).

39 H Ενδοθηλιακή λιπάση (ΕL) Ανακαλύφθηκε το 1999 και έχει χαρακτήρα φωσφολιπάσης, σε αντίθεση με τις LPL και HL, οι οποίες είναι κυρίως τριγλυκεριδικές λιπάσες (32). Παράγεται από το ενδοθήλιο των ιστών και υδρολύει τα φωσφολιπίδια της HDL, μειώνοντας τα επίπεδά της και απελευθερώνοντας τοπικά ελεύθερα λιπαρά οξέα, τα οποία χρησιμοποιούνται ως πηγή ενέργειας. Έχει βρεθεί ότι, η έκφραση της EL στους ιστούς επάγεται από τις φλεγμονώδεις κυτοκίνες TNFα και IL1β, και ίσως αυτή να είναι η αιτία των χαμηλών επιπέδων HDL, που παρατηρούνται σε φλεγμονώδεις καταστάσεις. Γενικότερα, πιθανολογείται ότι οι αλλαγές στις HDL, που προκαλούνται από την αύξηση της EL, είναι προαθηρογόνες (33) H λεκιθίνη χοληστερολο ακυλο τρανσφεράση (LCAT) Eίναι μία γλυκοπρωτεΐνη πλάσματος, που παράγεται στο ήπαρ και ενσωματώνεται στην επιφάνεια των HDL. Καταλύει τη μεταφορά μίας ακυλο-ομάδας από τη φωσφατιδυλοχολίνη προς τη χοληστερόλη, ώστε να σχηματισθούν εστέρες χοληστερόλης. Η LCAT εστεροποιεί την ελεύθερη χοληστερόλη, που βρίσκεται στην επιφάνεια των HDL και, σταδιακά, η εστεροποιημένη αυτή χοληστερόλη διεισδύει στον πυρήνα της λιποπρωτεΐνης αυτής. Kατ αυτόν τον τρόπο, το ένζυμο βοηθάει στη σταδιακή μεταφορά από τους περιφερικούς ιστούς προς το ήπαρ προοδευτικά μεγαλύτερης ποσότητας χοληστερόλης. Κατά τη μεταφορά αυτή προάγεται ο σχηματισμός όλο και μεγαλύτερων σωματιδίων HDL, που εμπλουτίζονται σταδιακά σε αποπρωτεΐνη Α1. H αποa1 διεγείρει τη δράση της LCAT (34).

40 ΟΙ ΠΡΩΤΕΪΝΕΣ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΛΙΠΙΔΙΩΝ Η μεταφορά των εστέρων χοληστερόλης μεταξύ των διαφόρων λιποπρωτεϊνών συνιστά ένα κομβικό σημείο της ομοιοστασίας της χοληστερόλης και ειδικότερα σε ό,τι αφορά στη διακίνησή της από τους περιφερικούς ιστούς προς το ήπαρ (2). Οι εξωηπατικοί ιστοί δεν διαθέτουν ένζυμα που να μεταβολίζουν τη χοληστερόλη και, κατά συνέπεια, η περίσσειά της είναι αναγκαίο να διοχετεύεται μέσω κάποιου κεντρικού μηχανισμού προς το ήπαρ, για να εκκριθεί τελικά μέρος της υπό τη μορφή των χολικών οξέων. Η διαδικασία αυτή, που ονομάζεται ανάστροφη μεταφορά της χοληστερόλης (ΑΜΧ - reverse cholesterol transport), ολοκληρώνεται μέσα στην πλασματική κυκλοφορία και είναι ουσιώδης, όχι μόνο για τη σωστή κυτταρική λειτουργία, αλλά και για την προστασία των αγγείων από την αθηρωμάτωση (35). Πρωταγωνιστές της διαδικασίας της ΑΜΧ είναι οι HDL, οι οποίες είναι οι θεωρούμενες κατ εξοχήν καρδιοπροστατευτικές λιποπρωτεΐνες, ενώ ορισμένοι πλασματικοί παράγοντες παίζουν και αυτοί σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο, όπως π.χ. οι πρωτεΐνες μεταφοράς λιπιδίων, δηλαδή η πρωτεΐνη μεταφοράς εστέρων χοληστερόλης (cholesterol ester transfer protein, CETP) και η πρωτεΐνη μεταφοράς φωσφολιπιδίων (phospholipid transfer protein, PLTP). Οι CETP και PLTP ανήκουν στην ίδια οικογένεια γλυκοπρωτεϊνών και η μεν CETP μεταφέρει κυρίως εστέρες χοληστερόλης μεταξύ των λιποπρωτεϊνών, ενώ η PLTP φωσφολιπίδια (35).

41 41 Στην παρακάτω εικόνα 3, αναπαρίσταται η τρισδιάστατη δομή της PLTP, παρόμοια της οποίας είναι και η CETP. Εικόνα 3. Τρισδιάστατη δομή της PLTP, δίκην κοίλου «μπούμερανγκ», του οποίου τα δύο άκρα σχηματίζουν σήραγγες (tunnels), που ευνοούν τη μεταφορά των λιπιδίων [Προσαρμογή από Huuskonen και συν(36)] H πρωτεΐνη μεταφοράς εστέρων χοληστερόλης (CETP) Η CETP είναι μία υδρόφοβη γλυκοπρωτεΐνη, μοριακού βάρους 74 KDa, γενετικά καθοριζόμενη, η οποία παράγεται κυρίως στο ήπαρ, αλλά και στο λιπώδη ιστό και κυκλοφορεί στο πλάσμα, συνδεδεμένη κυρίως με τις HDL (37). Το γονίδιό της στον άνθρωπο βρίσκεται στο χρωμόσωμα 16, κοντά στο γονίδιο της LCAT. Τα περισσότερα είδη ζώων έχουν CETP και ορισμένα μάλιστα μεγάλης δραστικότητας (κουνέλι, πέστροφα), ενώ ο άνθρωπος, όπως και ο χοίρος, η κότα, η σαύρα, κ.ά, εμφανίζουν δραστικότητα ενδιάμεσου βαθμού. Στον άνθρωπο απομονώθηκε το 1982 από τους Morton και Zilversmit (38). Η CETP προάγει την ανακατανομή εστέρων χοληστερόλης, τριγλυκεριδίων και, σε μικρότερο βαθμό, φωσφολιπιδίων μεταξύ των λιποπρωτεϊνών του πλάσματος. Πιο συγκεκριμένα, η CETP μεταφέρει εστέρες χοληστερόλης από τις HDL προς τις VLDL και LDL και

42 42 ταυτόχρονα ανταλλάσσονται τριγλυκερίδια από τις VLDL και τις LDL προς τις HDL (39). Η διαδικασία αυτή προωθεί κατά κύριο λόγο την ΑΜΧ, δηλαδή τη μεταφορά της χοληστερόλης μέσω των HDL από τους περιφερικούς ιστούς προς το ήπαρ. Στην εικόνα 4 απεικονίζεται συνοπτικά η δράση της CΕTP. Εικόνα 4. Η CETP προκαλεί ανταλλαγές εστέρων χοληστερόλης και τριγλυκεριδίων μεταξύ των διαφόρων λιποπρωτεϊνών (ΕΧ=Εστεροποιημένη χοληστερόλη, ΤΓΛ=Τριγλυκερίδια) [Προσαρμογή από Lagrost (39)] Η ανταλλαγή λιπιδίων μέσω της CETP έχει ως αποτέλεσμα σημαντικές μεταβολές στα σωματίδια των HDL, με κύριο στοιχείο την ελάττωση της ποσότητας χοληστερόλης εντός αυτών, με συνέπεια να ευνοείται ο σχηματισμός κλασμάτων μικρού μεγέθους του τύπου HDL 3b και HDL 3c. Άρα, τελικά, η αυξημένη συγκέντρωση της CETP προκαλεί την ελάττωση των επιπέδων της HDL (40). Η CETP, λόγω της εμφανούς επίδρασής της στις HDL, φαίνεται να παίζει σημαντικό ρόλο στη διαδικασία της αθηρωμάτωσης. Μελέτες στον

43 43 άνθρωπο και σε κουνέλια έχουν δείξει ότι, η ελάττωση της CETP, εφόσον συνοδεύεται με αύξηση της HDL, ασκεί αθηροπροστατευτική δράση (41). Μελέτες σε Ιάπωνες, οι οποίοι παρουσιάζουν σε μεγάλο βαθμό έλλειψη της CETP, έχουν δείξει χαμηλά ποσοστά καρδιαγγειακής νόσου, ενώ το ίδιο ισχύει και για ορισμένους πολυμορφισμούς του γονότυπου της CETP (42). Ειδικοί αναστολείς της CETP αποτελούν τελευταία αντικείμενο επισπευσμένης φαρμακολογικής έρευνας στον άνθρωπο. Ένας τέτοιος, η Torcetrapid, είναι δυνατόν να αυξάνει κατά δοσοεξαρτώμενο τρόπο τα επίπεδα της ΗDL, από 46% έως 106% (43). Πρόσφατα, απομονώθηκε μία πρωτεΐνη, η οποία αναστέλλει τη δράση της CETP και χαρακτηρίσθηκε ως πρωτεΐνη αναστέλλουσα τη μεταφορά λιπιδίων (lipid transfer inhibitor protein, LTIP) (44). Η πρωτεΐνη αυτή είναι συνδεδεμένη με τις HDL και τα φυσικοχημικά της χαρακτηριστικά ταιριάζουν με αυτά της απολιποπρωτεΐνης CΙ (45). Η CETP φαίνεται επίσης να συμμετέχει στη διαδικασία απομάκρυνσης της χοληστερόλης από μερικά ειδικά κύτταρα όπως μακροφάγα, λεία μυϊκά κύτταρα και ινοβλάστες (46). Επίσης, λόγω της ύπαρξης υψηλών ποσοτήτων CETPmRNA στο λιπώδη ιστό, ενδέχεται η CETP να συμμετέχει στη διευκόλυνση του μεταβολισμού και στην εν γένει φυσιολογική ομοιόσταση της χοληστερόλης εντός του λιπώδους αυτού ιστού (47). Διάφοροι περιβαλλοντικοί, διατροφικοί και ορμονικοί παράγοντες επηρεάζουν τα επίπεδα της CETP, αλλά το σημαντικότερο ρόλο παίζουν οι γενετικές μεταλλάξεις και οι πολυμορφισμοί του γονιδίου της, τα οποία προκαλούν μείωση των επιπέδων της (39)(44). Οι γυναίκες γενικά έχουν υψηλότερα επίπεδα CETP από τους άνδρες. Στον πίνακα 4 που ακολουθεί παρουσιάζονται οι παράγοντες που επηρεάζουν τα επίπεδα της CETP.

44 44 Πίνακας 4. Παράγοντες που επηρεάζουν τα επίπεδα της CETP [ Προσαρμογή από Lagrost (39) και Yamashita, Matsuzava (46)] Αύξηση CETP Βρεφική ηλικία Χοληστερόλη τροφής Οξεία χορήγηση λίπους Δυσλιπιδαιμία (ιδίως ΤΓΛ) Υπερκατανάλωση καφέ Κάπνισμα Αγγειακά νοσήματα Υπερθυρεοειδισμός Σακχαρώδης διαβήτης Παχυσαρκία Νεφρωσικό σύνδρομο Μείωση CETP Τρίτη Ηλικία Μετάλλαξη γονιδίων Αύξηση σωματικής δραστηριότητας Ω3 λιπαρά οξέα Υποϋποφυσισμός Οινόπνευμα Στατίνες Υποθυρεοειδισμός Ινσουλινοευαισθησία Κορτικοειδή Μεγαλακρία Στις περιπτώσεις που υπάρχει αύξηση της CETP συνήθως μειώνονται και τα επίπεδα της HDL, ενώ το αντίθετο συμβαίνει σε καταστάσεις που μειώνουν τη CETP (40) Η πρωτεΐνη μεταφοράς φωσφολιπιδίων (PLTP) Η ταυτοποίηση της πρωτεΐνης μεταφοράς φωσφολιπιδίων έγινε για πρώτη φορά από τον Wirtz και Zilversmit το 1970 (48), αλλά η ονομασία PLTP δόθηκε 10 χρόνια αργότερα. Η PLTP είναι μία γλυκοπρωτεΐνη με ΜΒ 80 KDa, η οποία παρουσιάζει ομολογία με 3 άλλες πρωτεΐνες, την CETP, την πρωτεΐνη που συνδέει λιποπολυσακχαρίδες (lipopolysaccharide binding protein, LBP) και την πρωτεΐνη που αυξάνει τη βακτηριδιακή διαπερατότητα (bactericidal permeability increasing protein, BPI) (36).

45 45 H κλωνοποίηση του cdna της PLTP έγινε το 1994 (49), ενώ η έρευνα γύρω από την κατανόηση του ρόλου της πρωτεΐνης αυτής σημείωσε μεγάλη πρόοδο την τελευταία πενταετία. Το γονίδιο της PLTP εδράζεται στο χρωμόσωμα 20 και περιέχει 13,3 κιλοβάσεις. Το ήπαρ και ο λιπώδης ιστός είναι οι κύριοι ιστοί που εκφράζουν το mrna της PLTP, αλλά υψηλά επίπεδα της πρωτεΐνης συναντώνται επίσης στις ωοθήκες, το θύμο αδένα και τον πλακούντα (50). Οι κύριες δράσεις της PLTP στο μεταβολισμό των λιποπρωτεϊνών είναι οι εξής δύο: Η πρώτη αφορά στη μεταφορά φωσφολιπιδίων μεταξύ των διαφόρων λιποπρωτεϊνών, ενώ η δεύτερη στην ανακατανομή των σωματιδίων HDL σε μεγαλύτερα και μικρότερα σωματίδια (51). Άλλες δευτερεύουσες δράσεις σχετίζονται με τη διευκόλυνση της μεταφοράς αποκομιδής χοληστερόλης από τα περιφερικά κύτταρα μέσω των HDL, με τη βελτίωση των αντιφλεγμονωδών ιδιοτήτων των HDL και την επαγωγή της ηπατικής έκκρισης των λιποπρωτεϊνών που περιέχουν αποb (52). Κατά συνέπεια, η συμμετοχή της πρωτεΐνης σε όλα τα στάδια μεταβολισμού των HDL είναι ιδιαίτερα σημαντική. Η PLTP, ως κατεξοχήν πρωτεΐνη μεταφοράς φωσφολιπιδίων, παραλαμβάνει τα φωσφολιπίδια των πλούσιων σε τριγλυκερίδια (ΤΓΛ) λιποπρωτεϊνών (χυλομικρά, VLDL) κατά τη διάρκεια της λιπόλυσης μέσω LPL, και τα μεταφέρει στις πρωτογενείς (nascent), πολύ μικρές HDL, προάγοντας την αύξηση σε μέγεθος και αριθμό αυτών των τελευταίων (53). Η δεύτερη κύρια δράση της PLTP γίνεται άμεσα στα HDL σωματίδια. Πιο συγκεκριμένα, η PLTP προκαλεί σύντηξη (fusion) δύο μέσου μεγέθους σωματιδίων HDL των HDL3 και ανακατανομή των φωσφολιπιδίων τους, εκτοπίζοντας την απολιποπρωτεΐνη Α1, με αποτέλεσμα το σχηματισμό ενός ενδιάμεσου, ασταθούς σωματιδίου, το οποίο στη συνέχεια διαιρείται σε 2 μόρια, ένα μεγάλου μεγέθους (HDL2) και ένα μικρού μεγέθους (προ-β- HDL) (54,55). Κατ αυτόν τον τρόπο ευνοείται ο σχηματισμός, αφ ενός μεν

46 46 των προ-β-hdl, δηλαδή των κλασμάτων που θεωρούνται ως οι αρχικοί παραλήπτες της χοληστερόλης από τους ιστούς κατά την ΑΜΧ, αφ ετέρου δε των μεγάλων σωματιδίων HDL 2a και HDL 2b. Ο ρόλος της PLTP στο μεταβολισμό της HDL φαίνεται στην εικόνα 5 Εικόνα 5. Η επίδραση της PLTP στο μεταβολισμό των HDL [Προσαρμογή από Huuskonen,Ehnohlm(56)] Η συγκριτική μελέτη των PLTP και CETP στα υποκλάσματα των HDL παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον. Πειράματα σε ανθρώπινο πλάσμα έδειξαν ότι, η επώαση μεμονωμένων λιποπρωτεϊνών με καθαρή PLTP ή CETP, προάγει το σχηματισμό διαφορετικών τύπων HDL υποκλασμάτων. Η PLTP προκαλεί κυρίως το σχηματισμό μεγάλων μορίων HDL (HDL2a, HDL2b), ενώ η CETP το σχηματισμό μικρών μορίων HDL (HDL3a, HDL3b) (40,55).

47 47 Στην παρακάτω εικόνα 6 απεικονίζεται επιγραμματικά ο μηχανισμός επίδρασης των πρωτεϊνών μεταφοράς λιπιδίων στις HDL Eικόνα 6. Μηχανισμός επίδρασης των CETP(A) και PLTP(B) στις HDL (EX=Εστεροποιημένη χοληστερόλη, ΕΛΟ=Ελεύθερα λιπαρά οξέα, ΦΛ=Φωσφολιπίδια, ΤΓΛ=Τριγλυκερίδια) [Προσαρμογή από Lagrost(40)]

48 48 Η συμμετοχή της PLTP στην αθηρωματική διαδικασία δεν έχει απολύτως διευκρινισθεί. Μελέτες σε διαγονιδιακά ποντίκια, τα οποία υπερεκφράζουν την PLTP, δείχνουν ότι η υπερδιπλάσια (x φορές) έκφραση της PLTP συνοδεύεται με μείωση των HDL κατά 30-40% οπότε, κατά συνέπεια, και με αύξηση της συχνότητας των αθηρωματικών βλαβών. Αντίθετα, ήπια αύξηση (x 1.3 φορές) της δραστικότητας της PLTP ή μία ελαφρά μείωσή της δεν επηρεάζει σημαντικά τα επίπεδα της HDL και φυσικά την αθηρογένεση (52). Οι μελέτες στον άνθρωπο είναι πολύ περιορισμένες, όμως τα αποτελέσματα οδηγούν στο συμπέρασμα ότι, η πρωτεΐνη αυτή έχει πιθανόν προαθηρογόνες ιδιότητες (52). Μελέτη σε 1102 ασθενείς έδειξε ότι, η δραστικότητα της PLTP αποτελεί παράγοντα κινδύνου για καρδιαγγειακή νόσο (57). Πολύ πρόσφατα, σε 82 ασθενείς με Σ.διαβήτη τύπου 2 βρέθηκε ότι, η αυξημένη δραστικότητα της PLTP είναι επιβαρυντικός παράγοντας για την εξέλιξη της αθηρωμάτωσης, όπως αυτή εκτιμήθηκε από το πάχος του εσω-μέσου χιτώνα των καρωτίδων αρτηριών (58). Προς υποστήριξη αυτών των συμπερασμάτων, διάφορες παθολογοανατομικές μελέτες απέδειξαν την παρουσία ανοσοαντιδρώσας PLTP σε αθηρωματικές πλάκες στεφανιαίων αρτηριών και επίσης την έκφραση της πρωτεΐνης αυτής σε μακροφάγα και αφρώδη κύτταρα (59,60). Σε αντίθεση με όλα τα προηγούμενα, σε πρόσφατη μελέτη διαπιστώθηκε ότι, η PLTP είναι δυνατό να αποτελεί προστατευτικό παράγοντα για ΚΑΝ (61). Για τη μέτρηση της μάζας της PLTP, αλλά και της CETP, εφαρμόζεται η ενζυματική μέθοδος με πολυκλωνικά αντισώματα (ELISA) (62,63). Στον πίνακα 5 παρουσιάζονται ορισμένες συγκεκριμένες καταστάσεις που επηρεάζουν τα επίπεδα της PLTP.

49 49 Πίνακας 5. Παράγοντες που επηρεάζουν τα επίπεδα της PLTP [Προσαρμογή από Albers,Cheung (52) και Huuskonen και συν (53)] Αύξηση PLTP Ηλικία Παχυσαρκία Υπερτριγλυκεριδαιμία Στεφανιαία νόσος Φλεγμονώδεις καταστάσεις Κατάχρηση οινοπνεύματος Μείωση PLTP Στεαρικό οξύ Απώλεια βάρους Ινσουλινοθεραπεία Acipimox Υπεργλυκαιμικό clamp Διακοπή λήψης οινοπνεύματος Κάπνισμα Νόσος Alzheimer Στατίνες 1.6 OI YΠOΔOXEIΣ TΩN ΛIΠOΠΡΩTEΪNΩN Oι LDL υποδοχείς H ανακάλυψή τους έγινε το 1974 από τους Brown και Goldstein, οι οποίοι βραβεύθηκαν και με το βραβείο Nόμπελ Iατρικής. Ο υποδοχέας LDL βρίσκεται σε όλα τα κύτταρα και επιτρέπει τη μεταφορά της χοληστερόλης στον ενδοκυττάριο χώρο των ιστών, μέσω ενός ευαίσθητου και ρυθμιζόμενου μηχανισμού, ο οποίος επηρεάζει όλη την ομοιοστασία της χοληστερόλης (2). O υποδοχέας, εκτός των LDL, αναγνωρίζει και άλλες λιποπρωτεΐνες που περιέχουν τις αποb και αποe, όπως χυλομικρά, υπολειπόμενα σωματίδια, VDL και IDL. Για το λόγο αυτό ονομάζεται και υποδοχέας B E.

50 50 Ο υποδοχέας Β-Ε ανευρίσκεται σε όλους τους ιστούς, και κυρίως σε ιστούς με ιδιαίτερα αυξημένες ανάγκες σε χοληστερόλη, όπως π.χ. οι στεροειδοπαραγωγοί ενδοκρινείς αδένες, η λευκή ουσία του ΚΝΣ, ιστοί με έντονη αναγεννητικότητα και, κυρίως, το ήπαρ. Οι LDL υποδοχείς είναι συγκεντρωμένοι στην επιφάνεια του κυττάρου κατά ειδικές ζώνες. Η σύνδεση ενός μορίου αποb 100 ή αποe με τον υποδοχέα προκαλεί, μέσω ενδοκύττωσης, την ενδοκυττάρια είσοδο του συμπλέγματος λιποπρωτεΐνηυποδοχέας και την αποθήκευσή του με τη μορφή ενδοκυτταρικού κυστιδίου. Εικόνα 6. Η σύνδεση των LDL στον ειδικό υποδοχέα και ο ενδοκυττάριος μεταβολισμός χοληστερόλης [ Προσαρμογή από Τρακατέλλης (2)] Το σύμπλεγμα των ενδοκυττάριων λιποπρωτεϊνών διασπάται και τα διάφορα συστατικά τους ανακυκλώνονται. Η αυξημένη απελευθέρωση χοληστερόλης στο κύτταρο προκαλεί μια σειρά ρυθμίσεων, που σκοπό έχουν τη διατήρηση της ενδοκυττάριας ομοιοστασίας της χοληστερόλης. Συγκεκριμένα, αναστέλλεται η έκφραση του ενζύμου-κλειδί της βιοσύνθεσης της χοληστερόλης της HMG-COA αναγωγάσης, διεγείρεται

51 51 η δραστηριότητα του ενζύμου ακυλο-coa-χοληστερόλη ακυλοτρανσφεράση (ACAT), το οποίο προκαλεί τον ενδοκυττάριο σχηματισμό εστέρων χοληστερόλης, και καταστέλλεται η έκφραση του υπεύθυνου για το σχηματισμό LDL-υποδοχέων γονιδίου (26). Σύμφωνα με τα παραπάνω, είναι βέβαιο ότι ο υποδοχέας LDL αποτελεί την κύρια οδό μεταβολισμού της χοληστερόλης στον οργανισμό και καθημερινά αποκαθαίρονται μέσω αυτής περί τα ¾ της κυκλοφορούσας χοληστερόλης. Οι μεταλλάξεις του γονιδίου του υποδοχέα-ldl προκαλούν μείωση του αριθμού των υποδοχέων από 50% (ετερόζυγος κατάσταση) έως 90% (ομόζυγος κατάσταση) και είναι υπεύθυνες για την οικογενή υπερχοληστερολαιμία, η οποία κληρονομείται κατά τον αυτοσωματικό επικρατούντα χαρακτήρα (64) Η σχετική με LDL υποδοχείς πρωτεΐνη (LRP) Aποτελεί ένα ξεχωριστό υποδοχέα της κυτταρικής μεμβράνης, ο οποίος εκφράζεται κυρίως στο ηπατοκύτταρο. Aναγνωρίζει και συνδέει τις λιποπρωτεΐνες που είναι πλούσιες σε αποe, δηλαδή τα υπολειπόμενα σωματίδια των χυλομικρών και των VLDL, όχι όμως και τις πλούσιες σε αποb-λιποπρωτεΐνες, δηλαδή τις LDL(4) Οι περισυλλέκτες υποδοχείς (Scavenger receptors, SR) Οι υποδοχείς αυτοί παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον, διότι σχετίζονται με το παθοφυσιολογικό υπόστρωμα της αθηρωμάτωσης. Περιγράφηκαν αρχικά στα μακροφάγα κύτταρα ως εναλλακτικοί υποδοχείς της LDL, οι οποίοι συνεισφέρουν στην κάθαρση της περίσσειας χοληστερόλης και λιπιδίων. Κατ αυτόν τον τρόπο τα μακροφάγα συσσωρεύουν εστέρες χοληστερόλης στο κυτταρόπλασμά τους, με μη ρυθμιζόμενο τρόπο, και

52 52 μετατρέπονται σταδιακά σε αφρώδη κύτταρα, τα οποία αποτελούν πια τις πρωτογενείς αιτίες βλάβης στην αθηρωμάτωση. Σύμφωνα με νεότερα δεδομένα, περισυλλέκτης υποδοχέας θεωρείται κάθε επιφανειακός υποδοχέας, ο οποίος αναγνωρίζει όλες τις τροποποιημένες, λόγω οξείδωσης, γλυκοζυλίωσης ή ακετυλίωσης, λιποπρωτεΐνες, αλλά και τα αποπτωτικά κύτταρα και διάφορα άλλα παθογόνα στοιχεία του οργανισμού, π.χ. τα βακτήρια (26). Υπάρχει κάποια διχογνωμία σχετικά με τον προστατευτικό ή επιβαρυντικό ρόλο των περισυλλεκτών υποδοχέων στην αθηρωμάτωση. Η παρουσία τους στα μακροφάγα κύτταρα, αντίθετα με τις παλαιότερες απόψεις, μπορεί να είναι ωφέλιμη, διότι συμβάλλει στην απομάκρυνση διαφόρων επιβαρυντικών ουσιών γιά το αγγειακό τοίχωμα (5). Οι προστατευτικές τους ιδιότητες προϋποθέτουν, βέβαια, την έκφραση σε ικανοποιητικό βαθμό πρωτεϊνών μεταφοράς και ενός μηχανισμού αποδόμησης εντός του μακροφάγου, ώστε να απομακρυνθούν επαρκώς τα προαθηρογόνα στοιχεία. Τέτοιοι περισυλλέκτες υποδοχείς έχουν ταυτοποιηθεί και στο ήπαρ, όπου τελικά ασκούν σημαντική αντιαθηρωματική δράση, αποδομώντας τις τροποποιημένες λιποπρωτεΐνες, οι οποίες όπως αναφέραμε είναι ιδιαίτερα αθηρογόνες. Γενικότερα φαίνεται ότι, οι υποδοχείς αυτοί παίζουν ρόλο στο μηχανισμό «κάθαρσης» του οργανισμού, με σκοπό την αποπομπή ξένων σωμάτων, παθογόνων οργανισμών, γηρασμένων κυττάρων ή κυττάρων σε απόπτωση (5). Οι SR διαιρούνται σε 2 κύριες κατηγορίες: SR τύπου Α, οι οποίοι εκφράζονται στα μακροφάγα των ιστών, στα ενδοθηλιακά κύτταρα της αορτής και στα ενδοθηλιακά κύτταρα του Kupffer και SR τύπου Β, oι οποίοι συνδέουν την τροποποιημένη LDL. Μία ομάδα της δεύτερης κατηγορίας, ο SR-B1, έχει αποδειχθεί ότι λειτουργεί ως υποδοχέας για την HDL και είναι

53 53 ικανός να μεσολαβεί στην εκλεκτική πρόσληψη εστέρων χοληστερόλης από τις HDL (8) Ο περισυλλέκτης υποδοχέας (SR-B1) των HDL Αρχικά ταυτοποιήθηκε ως υποδοχέας τροποποιημένων LDL λόγω ακετυλίωσης, αλλά στη συνέχεια αποδείχθηκε ότι συνδέει και μεταβολίζει και τις HDL. Εκφράζεται κατά κύριο λόγο στο ήπαρ, αλλά και σε στεροειδοπαραγωγούς ιστούς, όπως ωοθήκες, όρχεις και επινεφρίδια (5). Η σύνδεση των HDL στον SR-B1 επιτρέπει την πρόσληψη της χοληστερόλης των HDL στα προαναφερθέντα κύτταρα-στόχους. Κατά τη σύνδεση των HDL με τον υποδοχέα, παρατηρείται μία εκλεκτική είσοδος των λιπιδίων εντός του κυττάρου, χωρίς όμως να μεταβολίζεται το λιποπρωτεϊνικό μόριο. Ο υποδοχέας SR-B1 φαίνεται ότι μεσολαβεί για ένα σημαντικό αριθμό αντιαθηρογόνων δράσεων των HDL. Συγκεκριμένα, δίδει τη δυνατότητα παροχής, μέσω των HDL, αντιοξειδωτικών ουσιών όπως βιταμίνης Ε εντός των κυττάρων, προάγει τη διεγερτική δράση της HDL στην παραγωγή νιτρικού οξειδίου στα ενδοθηλιακά κύτταρα και συμβάλλει στην αποδόμηση των οξειδωμένων λιπιδίων (65). Τέλος, οι SR-B1 παίζουν καθοριστικό ρόλο στην ομαλή ολοκλήρωση της ανάστροφης μεταφοράς χοληστερόλης, δεδομένου ότι συμβάλλουν στον ηπατικό καταβολισμό των ώριμων μορφών HDL (4). 2. METABOΛIΣMOΣ TΩN ΛIΠOΠPΩTEΪNΩΝ Οι λιποπρωτεΐνες που κυκλοφορούν στο πλάσμα συγκροτούν μεγάλου Μ.Β. ευμετάβλητα μόρια, μη σταθερής πυκνότητας, αφ ενός μεν λόγω των ασθενών μοριακών δυνάμεων που τις συγκρατούν, αφ ετέρου δε λόγω της συνεχούς ανακατανομής τους από τα λιπολυτικά ένζυμα και τις πρωτεΐνες

54 54 μεταφοράς. Κατ αυτόν τον τρόπο, κυκλοφορεί στο πλάσμα μία σταθερά ακολουθία («continuum») λιποπρωτεϊνών, διαφορετικών πυκνοτήτων και σύστασης, οι οποίες αρχίζουν να εμφανίζονται από πρωτογενώς παραγόμενα σωματίδια, όπως π.χ. οι VLDL, και καταλήγουν τελικά σε ώριμα σωματίδια, όπως π.χ. οι LDL. Tα ένζυμα αυτά και οι πρωτεΐνες, παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανακατανομή των λιποπρωτεϊνών και στον εν δυνάμει προσδιορισμό και καθορισμό τους ως αθηρογόνων ή αντιαθηρογόνων. 2.1 O ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΧΥΛΟΜΙΚΡΩΝ Tα χυλομικρά συντίθενται στα επιθηλιακά κύτταρα του εντέρου και αποτελούνται κατά κύριο λόγο (95%) από τα τριγλυκερίδια της τροφής και στη συνέχεια (2%) από τη χοληστερόλη και τα φωσφολιπίδια. Tο πρωτεϊνικό τμήμα των χυλομικρών, αποτελούμενο κυρίως από αποb48, σχηματίζεται στα εντερικά κύτταρα. Tα σχηματισμένα χυλομικρά διηθούν τη βασική μεμβράνη, εισέρχονται στα λεμφικά αγγεία (θωρακικός πόρος) και στη συνέχεια κυκλοφορούν στο αίμα, όπου εμπλουτίζονται από πρωτεΐνες, οι οποίες προέρχονται από μεταφορά από τις HDL (αποc και αποe) (2). H παραμονή τους στην κυκλοφορία διαρκεί μόλις λίγα λεπτά και η ημιπερίοδος ζωής τους υπολογίζεται σε πέντε λεπτά. O καταβολισμός των χυλομικρών έχει σκοπό την ταχεία παροχή τριγλυκεριδίων, δηλαδή ενέργειας, στους ιστούς. Η λιποπρωτεϊνική λιπάση, ένζυμο του ενδοθηλίου των αγγείων, είναι το υπεύθυνο ένζυμο, το οποίο υδρολύει τα τριγλυκερίδια των χυλομικρών, απελευθερώνοντας ελεύθερα λιπαρά οξέα (ΕΛΟ). Όλοι οι ιστοί πλην του εγκεφάλου διαθέτουν λιποπρωτεϊνική λιπάση και, κατά συνέπεια, μπορούν να προσλαμβάνουν τα ΕΛΟ των χυλομικρών. Περίπου 80% των εξωγενών τριγλυκεριδίων προσλαμβάνονται από το λιπώδη και το μυϊκό ιστό και 20% από άλλους ιστούς (4). H εξελισσόμενη λιπόλυση

55 55 των χυλομικρών οδηγεί στο σχηματισμό των υπολειπομένων σωματιδίων των χυλομικρών (chylomicron remnants), τα οποία είναι σωματίδια σχετικά εμπλουτισμένα σε εστεροποιημένη χοληστερόλη και αποb, μικρότερου μεγέθους από τα χυλομικρά (66). Κατά τη διαδικασία της λιπόλυσης των χυλομικρών αποδεσμεύονται φωσφολιπίδια από την επιφάνειά τους, ένα μέρος των οποίων συνδέεται με την αποa1 για να σχηματίσει τις πρωτογενείς («nascent») HDL (4) Tα «υπολειπόμενα χυλομικρά», λόγω της σύστασής τους, καταβολίζονται γρήγορα μέσω του υποδοχέα που ονομάζεται πρωτεΐνη σχετιζόμενη με τις LDL (LRP), κυρίως από το ήπαρ (70%) και δευτερευόντως από το μυϊκό ιστό και το μυελό των οστών (3,66). Η μεταγευματική χυλομικροναιμία διαρκεί φυσιολογικά από 2 έως 4 ώρες και εξαρτάται από την ισορροπία μεταξύ εντερικής παραγωγής και ηπατικής και εξωηπατικής κάθαρσης. Στις συνήθεις συνθήκες προσδιορισμού των λιποπρωτεϊνών δηλαδή μετά 12ωρη νηστεία τα χυλομικρά συνήθως απουσιάζουν από το πλάσμα. Εξαίρεση παρατηρείται σε ορισμένες παθολογικές καταστάσεις, λόγω ενζυματικών διαταραχών, όπως π.χ. η έλλειψη της LPL ή της αποcii. H υπερχυλομικροναιμία προκαλεί κυρίως παγκρεατίτιδα, ενώ η συσσώρευση «υπολειπομένων χυλομικρών» αυξάνει τον κίνδυνο αθηρωμάτωσης (26). Στην εικόνα 7 απεικονίζεται ο μεταβολισμός των χυλομικρών.

56 56 Εικόνα 7. Ο μεταβολισμός των χυλομικρών συνοπτικά [Προσαρμογή από Le,Brown (67)] 2.2 O ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΤΩΝ VLDL Η σύνθεση των VLDL γίνεται στο ηπατοκύτταρο, με δομικό πρωτεϊνικό υπόστρωμα την αποπρωτεΐνη B100 και τις πρωτεΐνες αποc και αποe που ανταλάσσονται και με λιπιδικό υπόστρωμα τα τριγλυκερίδια και τους εστέρες χοληστερόλης, σε αναλογία 4-5 προς 1 (67). H συνάθροιση των επιμέρους στοιχείων και η φυσιολογική έκκριση της VLDL στο ηπατοκύτταρο, προϋποθέτει την ύπαρξη μίας πρωτεΐνης μεταφοράς, της μικροσωμιακής πρωτεΐνης μεταφοράς τριγλυκεριδίων (microsomal triglyceride transfer protein, (MTP) (14,68). Η MTP συμβάλλει στην έκκριση και την ισορροπία μεταξύ των διαφόρων δομών εντός των πλουσίων σε

57 57 αποπρωτεΐνη-β λιποπρωτεϊνών, κυρίως στις VLDL (68). Στην α-βλιποπρωτεϊναιμία, η μετάλλαξη του γονιδίου της MTP εμποδίζει την ηπατική έκκριση λιποπρωτεϊνών πλούσιων σε αποβ, με κλινικό αποτέλεσμα την ηπατική στεάτωση και τις διαταραχές στη λευκή ουσία του ΚΝΣ (26). Oι VLDL μεταφέρουν τα ενδογενή τριγλυκερίδια προς τους ιστούς, αλλά σε αντίθεση με τα χυλομικρά, που καταβολίζονται άμεσα αυτές μετατρέπονται κυρίως σε LDL (2). Aρχικά, οι VLDL υδρολύονται από την LPL, μέσω ενεργοποίησής της από το συνένζυμο αποcιι, απελευθερώνοντας τριγλυκερίδια και ελεύθερα λιπαρά οξέα και τα απελευθερούμενα μικρότερα μόρια αποτελούν τα υπολειπόμενα σωματίδια των VLDL (IDL). Kατά τη μετατροπή αυτή, συμβαίνουν έντονες ανακατανομές λιπιδίων, οι οποίες επηρεάζουν γενικά όλες τις λιποπρωτεΐνες. Tα μόρια VLDL, χάνοντας μέρος των τριγλυκεριδίων μέσω της LPL, ελαττώνονται σε μέγεθος και, σταδιακά, τα λιπίδια της επιφάνειάς τους κυρίως φωσφολιπίδια αλλά και αποπρωτεΐνες μεταφέρονται και χρησιμεύουν στο σχηματισμό των πρωτογενών ( nascent ) HDL. Tαυτόχρονα, στον πυρήνα παρατηρείται μεταφορά τριγλυκεριδίων από τις VLDL προς τις HDL, ενώ ταυτόχρονα μεταφέρεται χοληστερόλη από τις HDL προς τις VLDL. Oι ανταλλαγές αυτές γίνονται μέσω της πρωτεΐνης CETP (4). Aποτέλεσμα των ανταλλαγών αυτών είναι ο σχηματισμός των IDL, οι οποίες είναι πλούσιες σε χοληστερόλη, αποb και αποe. Mέρος των ΙDL καθαίρεται μέσω των υποδοχέων LRP, ενώ το υπόλοιπο μετατρέπεται σε LDL μέσω της ηπατικής λιπάσης. Συνολικά, το 50% περίπου των VLDL μετατρέπεται τελικά σε LDL (4,66). Στην εικόνα 8 απεικονίζεται συνοπτικά ο μεταβολισμός των VLDL.

58 58 Εικόνα 8. Ο μεταβολισμός των VLDL (CE=Εστεροποιημένη χοληστερόλη) [ Προσαρμογή από Le,Brown (67)] 2.3 O ΜΕΤΑΒΟΛΙΣΜΟΣ ΤΩΝ LDL H παραγωγή των LDL γίνεται είτε απευθείας στο ήπαρ, είτε μέσω καταβολισμού από τις VLDL, όπως προαναφέρθηκε. Μετά τη λιπόλυση των VLDL, μέσω της δράσης της LPL και στη συνέχεια της HL, σχηματίζονται οι LDL (69).To μόριο της LDL αποτελείται κυρίως από αποb 100 και εστέρες χοληστερόλης. Υπάρχουν διαφορετικά υποκλάσματα LDL στο πλάσμα, που χαρακτηρίζονται ανάλογα με την πυκνότητα και το μέγεθός τους. Η

59 59 διαφοροποίησή τους προκύπτει από τις διαφορές στα λιπίδια της επιφάνειας του μορίου τους και τη δομική θέση της αποb (69). Tο μέγεθος και η πυκνότητα των VLDL προσδιορίζει σε μεγάλο βαθμό την ποιότητα των LDL. Για παράδειγμα, οι μεγάλες VLDL απολιπιδιώνονται γρήγορα και σε μεγάλο βαθμό μέσω του ενζύμου HL και οι σχηματιζόμενες LDL είναι μικρές σε μέγεθος και πυκνές (70). Ανεξάρτητα από το μέγεθος, η ποσότητα της αποb ανά μόριο LDL είναι σταθερή και ίδια με αυτή των VLDL. Αυτό δηλώνει ότι, κάθε μόριο LDL προέρχεται από τον καταβολισμό ενός μορίου VLDL (4). Τα LDL σωματίδια καταβολίζονται μέσω των ειδικών υποδοχέων Β-Ε. H χοληστερόλη, που απελευθερώνεται μέσα στο κύτταρο μετά τη σύνδεση των LDL με τον υποδοχέα, ασκεί αρνητική ρυθμιστική δράση, που έχει ως αποτέλεσμα την αποφυγή συσσώρευσης χοληστερόλης. H δράση αυτή ασκείται στο ένζυμο υδροξυ μεθυλ συνένζυμο A (HMG CoA) αναγωγάση, το οποίο είναι το ένζυμο κλειδί της ενδοκυττάριας σύνθεσης χοληστερόλης (2). Eπίσης, η ενδοκυττάρια χοληστερόλη αναστέλλει τη σύνθεση των υποδοχέων LDL, οπότε ελαττώνεται η είσοδος της χοληστερόλης. Tο σύστημα αυτό συντονίζει τη σχέση ενδογενούς εξωγενούς χοληστερόλης, ώστε να υπάρχει σταθερή διαθεσιμότητα χοληστερόλης στο κύτταρο. Για παράδειγμα, η μεγάλη πρόσληψη χοληστερόλης από τις τροφές άνω των 500mg ημερησίως καταστέλλει την ηπατική σύνθεση χοληστερόλης και τη δραστηριότητα των LDL υποδοχέων (64). Σε ορισμένους ιστούς, όπου η ανάγκη για χοληστερόλη είναι ιδιαίτερα σημαντική, όπως στις γονάδες και τα επινεφρίδια, ο αριθμός των LDL υποδοχέων είναι μεγάλος. Η μερική ή πλήρης έλλειψη των υποδοχέων LDL είναι υπεύθυνη για την οικογενή υπερχοληστερολαιμία. To μόριο της LDL είναι δυνατό να υποστεί διάφορες μετατροπές, όπως γλυκοζυλίωση αλλά και οξείδωση, οι οποίες φυσικά διαταράσσουν το μεταβολισμό της. Στη γλυκοζυλίωση παρατηρείται αλλοίωση των

60 60 διαθεσίμων υπολειμμάτων λυσίνης της αποb, λόγω υπεργλυκαιμικού περιβάλλοντος (Σ.Διαβήτης). Η οξειδωμένη τάξη των LDL (ox LDL) χαρακτηρίζεται από την παρουσία ενεργών αλδεϋδών και την αυξημένη παρουσία οξυστερολών, αλλά και από ελαττωμένη χοληστερόλη και κατάτμηση της αποb (4). Οι οξειδωμένες LDL προσλαμβάνονται ταχέως από τους περισυλλέκτες υποδοχείς των μακροφάγων και μπορεί να προκαλέσουν κυτταροτοξική αντίδραση και το σχηματισμό φυσικά των αφρωδών κυττάρων (70). Επίσης, λόγω του μικρού τους μεγέθους, διεισδύουν ευκολότερα στο αρτηριακό ενδοθήλιο, ενώ αναγνωρίζονται σε μικρότερο βαθμό από τους LDL υποδοχείς. Oξειδωμένες LDL έχουν βρεθεί στην αθηρωματική πλάκα σε πειραματόζωα, αλλά και στον άνθρωπο. Για τους παραπάνω λόγους, θεωρείται σήμερα πιθανό ότι, τα υψηλά επίπεδα μικρών-πυκνών LDL στο πλάσμα, τέτοια όπως παρατηρούνται σε καταστάσεις ινσουλινοαντίστασης, αποτελούν σημαντικό παράγοντα κινδύνου για πρώιμη αθηρωμάτωση (71). Η παραγωγή και ο μεταβολισμός των LDL απεικονίζονται στην εικόνα 9. Εικόνα 9. Παραγωγή και μεταβολισμός των LDL [Προσαρμογή από Parthasarathy (69)]

61 OΙ HDL ΚΑΙ ΤΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΤΗΣ ΑΝΑΣΤΡΟΦΗΣ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΧΟΛΗΣΤΕΡΟΛΗΣ (ΑΜΧ) Όλα τα κύτταρα του οργανισμού έχουν την ικανότητα αφ ενός να βιοσυνθέτουν μόνα τους χοληστερόλη, αφ ετέρου να την προσλαμβάνουν μέσω των λιποπρωτεϊνών LDL από τον εξωκυττάριο χώρο. Η είσοδος της χοληστερόλης στα κύτταρα εξισορροπείται από μία ανάστροφη ροή, η οποία επιτρέπει στα κύτταρα να απαλλάσσονται από την περίσσεια χοληστερόλης. Προς την κατεύθυνση αυτή, σημαντικό ρόλο παίζει το ήπαρ, το οποίο είναι το μοναδικό όργανο που είναι ικανό να απεκκρίνει σημαντικές ποσότητες χοληστερόλης (2). Συνεπώς, υπάρχει ένας συνεχής κύκλος μεταφοράς της χοληστερόλης από τα περιφερικά κύτταρα προς το ήπαρ, από όπου η χοληστερόλη θα απεκκριθεί στη χολή, είτε απ ευθείας ή μέσω σχηματισμού των χολικών οξέων. Αυτός ο μεταβολικός δρόμος ονομάζεται ανάστροφη μεταφορά της χοληστερόλης (AMX) και οι HDL αποτελούν το κύριο όχημα για τη μεταφορά αυτή (35). H ΑΜΧ αποτελεί τη μόνη δυνατότητα του οργανισμού να ελαττώνει την περίσσεια χοληστερόλης από τα κύτταρα του αγγειακού τοιχώματος και, κατά συνέπεια, να περιορίζει το σχηματισμό αφρωδών κυττάρων και την πρόκληση αθηροσκλήρωσης, καθόσον η χοληστερόλη δεν καταβολίζεται (72). Η ΑΜΧ περιλαμβάνει 4 διαδοχικές μεταβολικές οδούς: 1) Το σχηματισμό των πρωτογενών HDL και την παραλαβή της ελεύθερης χοληστερόλης από τα περιφερικά κύτταρα, 2) Τη σταδιακή ωρίμανση των πρωτογενών HDL μέσω του ενζύμου LCAT, 3) Τη διαφοροποίηση και ανακατασκευή (remodeling) των ώριμων HDL μέσω των πρωτεϊνών μεταφοράς CETP, PLTP και της ηπατικής λιπάσης. 4) Την είσοδο της χοληστερόλης της HDL στο ηπατοκύτταρο (73). Την τελευταία πενταετία σημειώθηκαν σημαντικές πρόοδοι στην κατανόηση του πολύπλοκου κύκλου της ΑΜΧ, ιδίως σε ό,τι

62 62 αφορά στο σχηματισμό των πρωτογενών σωματιδίων και τον καταβολισμό των ωρίμων HDL στο ηπατοκύτταρο.(35). Αναλυτικότερα, οι 4 μεταβολικές οδοί της ΑΜΧ έχουν ως εξής: 1η οδός: Σχηματισμός πρωτογενών HDL Oι πρωτογενείς HDL ονομάζονται προ-β-hdl (pre-β-hdl), έχουν δισκοειδή μορφή και αποτελούνται από αποα1, φωσφολιπίδια και μικρή ποσότητα χοληστερόλης. O σχηματισμός τους προέρχεται από 3 πηγές: α) απ ευθείας από το ήπαρ ή το έντερο, β) από τη διάσπαση των χυλομικρών ή των VLDL κατά την υδρόλυση των τριγλυκεριδίων μέσω LPL και γ) κατά τις μετατροπές των ωρίμων HDL από τις πρωτεΐνες μεταφοράς, την HL, την EL και τον υποδοχέα SR-B1 (74). Οι πρωτογενείς HDL αποτελούν τους κατ εξοχήν αποδέκτες της ελεύθερης χοληστερόλης από τα κύτταρα. Η εξωκυττάρια συναρμολόγηση της πρωτογενούς HDL ξεκινάει από μία διαμεμβρανική πρωτεΐνη, που ονομάζεται μεταφορέας ABCA1 (75). H πρωτεΐνη αυτή αντλεί με ενεργητικό τρόπο μέσω ATP χοληστερόλη και φωσφολιπίδια από ενδοκυττάριες μεμβράνες, τα μεταφέρει στην κυταρική μεμβράνη, όπου αναγνωρίζονται και παραλαμβάνονται από την αποa1 των HDL. Κατ αυτόν τον τρόπο, το αρχικό σύμπλεγμα που αποτελείτο από την αποa1 και λίγα λιπίδια, παραλαμβάνοντας χοληστερόλη και φωσφολιπίδια από τις κυτταρικές μεμβράνες, μετατρέπεται σε δισκοειδές σωματίδιο, τύπου προ-β-hdl (75). Η σημασία της πρωτεΐνης ABCA1 στην ομοιόσταση της HDL καταδείχθηκε πρόσφατα στους ασθενείς με νόσο Tangier, οι οποίοι αν και έχουν φυσιολογικά επίπεδα αποa1, παρουσιάζουν πολύ χαμηλά επίπεδα HDL και συχνά πρώιμη αθηρωμάτωση. Στη νόσο Tangier διαπιστώθηκαν μία ή περισσότερες μεταλλάξεις του γονιδίου της ABCA1, με αποτέλεσμα να καθίσταται αδύνατη η μεταφορά χοληστερόλης προς τις πρωτογενείς HDL (74). Αξίζει να σημειωθεί ότι, ένα ποσοστό της ενδοκυττάριας χοληστερόλης

63 63 μεταφέρεται στον εξωκυττάριο χώρο, μέσω παθητικής διήθησης, αλλά και μέσω του ηπατικού υποδοχέα SR-B1. 2η οδός: H εστεροποίηση της χοληστερόλης από την LCAT H LCAT παίζει ουσιώδη ρόλο στην ωρίμανση των πρωτογενών HDL σε μεγάλα σωματίδια. Το ένζυμο προκαλεί εστεροποίηση της ελεύθερης χοληστερόλης, η οποία υπάρχει αρχικά στην επιφάνεια της προ-β-hdl. Η εστεροποιημένη χοληστερόλη, ως υδρόφοβη, εισέρχεται στον πυρήνα του πρωτογενούς, δισκοειδούς σωματιδίου, το οποίο εμπλουτιζόμενο με φωσφολιπίδια, αυξάνει σταδιακά σε μέγεθος και μετατρέπεται σε σφαιρικό σωματίδιο τύπου HDL3 (76). Η συνεχιζόμενη αύξηση του σωματιδίου, μέσω επιπλέον παραλαβής φωσφολιπιδίων και μη εστεροποιημένης χοληστερόλης από τα κύτταρα, οδηγεί στο σχηματισμό μεγαλύτερων σφαιρικών σωματιδίων, των HDL2 (εικόνα 10). Οι HDL2 θεωρούνται ως κατ εξοχήν αντιαθηρογόνες, διότι αποδομούν μεγάλη ποσότητα χοληστερόλης προς το ήπαρ. Οι 2 πρώτες μεταβολικές οδοί συνοψίζονται στην παρακάτω εικόνα 10.

64 64 Εικόνα 10. Εστεροποίηση κυτταρικής χοληστερόλης και σχηματισμός σωματιδίων HDL (ΜΕΧ=Μη Εστεροποιημένη Χοληστερόλη) [Προσαρμογή από Barter (35)] 3 η οδός: Ανακατανομή των ωρίμων HDL Οι πρωτεΐνες μεταφοράς CETP και PLTP λειτουργούν ως «κανάλι» μεταξύ των λιποπρωτεϊνών, συνεισφέροντας στην ανταλλαγή λιπιδίων μεταξύ αυτών (73). Η CETP ειδικότερα, προκαλεί μεταφορά εστέρων χοληστερόλης από τις HDL2 προς τις πλούσιες σε αποβ λιποπρωτεΐνες (VLDL, IDL,LDL), ενώ αντίστροφα, ιδιαίτερα από τις VLDL, μεταφέρονται τριγλυκερίδια. Κατ αυτόν τον τρόπο, ένα μεγάλο μέρος των εστέρων χοληστερόλης, εισερχόμενο στο μεταβολικό μονοπάτι VLDL IDL LDL, καταβολίζεται από τους ειδικούς υποδοχείς LDL στο ήπαρ. Οι νεοσχηματιζόμενες HDL (HDL3) είναι πτωχές σε χοληστερόλη, πλουσιότερες σε τριγλυκερίδια και αποτελούν κατάλληλο υπόστρωμα για υδρόλυση από την ηπατική λιπάση, με τελικό αποτέλεσμα την περαιτέρω ελάττωση σε μέγεθος του σωματιδίου HDL και την απελευθέρωση προ-β

65 65 μη λιπιδιωμένης αποa1. H συνδυασμένη δράση CETP και HL προκαλεί το σχηματισμό των HDL3, οι οποίες μεταβολίζονται μέσω των ηπατικών υποδοχέων SR-B1 (77). Η PLTP μεταφέρει φωσφολιπίδια από τις VLDL προς τις HDL κατά τη διάρκεια της λιπόλυσης, με αποτέλεσμα την αύξηση του μεγέθους της HDL. Επίσης, η PLTP δρα απ ευθείας στις HDL και προκαλεί σχηματισμό μεγάλου μεγέθους HDL, με ταυτόχρονη απελευθέρωση μικρού μεγέθους HDL τύπου προ-β και μη λιπιδιωμένης αποa1 (77). Από τις παραπάνω αντιδράσεις, οι οποίες καταλύονται από τις CETP, PLTP και HL, απελευθερώνονται συνεχώς πρωτογενείς HDL και αποa1. Κατά συνέπεια, η ΑΜΧ μπορεί να θεωρηθεί ως ένας κύκλος, στον οποίο οι παραλήπτες της ενδοκυττάριας χοληστερόλης (προ-β-hdl, αποa1), ανανεώνονται διαρκώς, με σκοπό τη δέσμευση και διοχέτευση της χοληστερόλης προς το ήπαρ (78). Στην εικόνα 11 απεικονίζεται η δράση των λιπασών και των CETP, PLTP στα κλάσματα των HDL (79). Εικόνα 11. Η επίδραση των λιπασών και των CETP, PLTP στις HDL (EX=Εστεροποιημένη Χοληστερόλη, ΕΛ.Χ=Ελεύθερη Χοληστερόλη) [Προσαρμογή από Rader (79)]

66 66 4 η οδός: Είσοδος της χοληστερόλης HDL στο ηπατοκύτταρο και σε άλλους ιστούς Το ήπαρ, οι νεφροί και οι στεροειδοπαραγωγοί ιστοί αποτελούν τα κατ εξοχήν όργανα καταβολισμού των HDL. Η μη εστεροποιημένη χοληστερόλη των HDL καταβολίζεται κυρίως από τους ειδικούς υποδοχείς SR-B1, οι οποίοι παίζουν κυρίαρχο ρόλο στην αποδομή των HDL από το ήπαρ, αλλά και στην παροχή εστέρων χοληστερόλης για στερoειδογένεση σε άλλους ιστούς, όπως τα επινεφρίδια και οι ωοθήκες. Οι ίδιοι υποδοχείς καταβολίζουν τα τριγλυκερίδια και τα φωσφολιπίδια των HDL. Τα μεγάλα, σφαιρικά σωματίδια τύπου HDL2 αποτελούν τα εκλεκτά υποκλάσματα για καταβολισμό από τους SR-B1 υποδοχείς (35). Η εκλεκτική σύνδεση των HDL2 με τον υποδοχέα SR-B1 προκαλεί ενδοκύττωση και απολιπιδίωση του πυρήνα του σωματιδίου, με αποτέλεσμα την απελευθέρωση μικρών, δισκοειδών σωματιδίων HDL, τα οποία γίνονται διαθέσιμα ως περιφερικοί αποδέκτες επιπλέον κυτταρικής χοληστερόλης. Η χοληστερόλη της HDL είναι δυνατόν να καταβολισθεί στους ίδιους υποδοχείς και ως εστεροποιημένη, αφού υποστεί τη δράση της LCAT. Επίσης, η εστεροποιημένη χοληστερόλη μπορεί να καταβολισθεί έμμεσα, αφού ενσωματωθεί στις VLDL μέσω CETP, ακολουθώντας τον καταβολικό δρόμο της LDL (79). Στην εικόνα 12 απεικονίζονται οι οδοί καταβολισμού των HDL στο ήπαρ (35).

67 67 Εικόνα 12. Ηπατικός καταβολισμός των HDL [Προσαρμογή από Barter(35)] Ο μεταβολισμός της HDL και η ανάστροφη μεταφορά χοληστερόλης στο σύνολό της απεικονίζονται στην επόμενη εικόνα Εικόνα 13. Η ΑΜΧ επιγραμματικά [Προσαρμογή από Calabresi (80)]

68 68 Παραμένει, εν πολλοίς και παρά την εντατική έρευνα, αδιευκρίνιστος ο βαθμός της συμμετοχής των επιμέρους παραμέτρων στον κύκλο της AMX. Η ταυτοποίηση των κυρίαρχων μεταβολικών οδών στην ΑΜΧ είναι εξαιρετικής σπουδαιότητας, διότι κατ αυτόν τον τρόπο θα δοθούν προτεραιότητες κατ επιλογήν στη θεραπευτική παρέμβαση. Η δομική όμως ετερογένεια και η ετερόκλητη λειτουργικότητα των υποκλασμάτων HDL, τις καθιστούν δύσκολο και ασαφή θεραπευτικό στόχο. Η στιγμιαία π.χ. μέτρηση της HDL στο πλάσμα δεν αντανακλά απαραίτητα και τη συνολική δράση της, όπως συμβαίνει με την LDL, με αποτέλεσμα να αποτελεί έναν μη ειδικό, αλλά και έναν μη ευαίσθητο, κατά συνέπεια, δείκτη της εκτίμησης αθηρογενετικότητας (81). Στην επόμενη εικόνα 14, παρουσιάζεται επιγραμματικά ο μεταβολισμός των λιποπρωτεϊνών στο σύνολό του. Εικόνα 14. O μεταβολισμός όλων των λιποπρωτεϊνών σε σύντομη απεικόνιση [Προσαρμογή από Parthasarathy (82)]

69 69 3. ΠΑΧΥΣΑΡΚΙΑ ΚΑΙ ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΕΣ 3.1 ΠΑΧΥΣΑΡΚΙΑ : ΟΡΙΣΜΟΙ ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ Ως παχυσαρκία ορίζεται η συνολική αύξηση του λίπους του σώματος πάνω από τα φυσιολογικά λεγόμενα όρια. Για την εκτίμηση της παχυσαρκίας στην καθημερινή πράξη χρησιμοποιείται ο δείκτης μάζας σώματος (ΔΜΣ) (Body Mass Index, BMI), ο οποίος ορίζεται ως το πηλίκο του βάρους (σε κιλά) διά το τετράγωνο του ύψους (σε μέτρα) (BMI=Β/Υ 2 ). Σύμφωνα με το ΔΜΣ, το σωματικό βάρος των ατόμων κατηγοριοποιείται ως εξής): Πίνακας 6. Όρια δείκτη μάζας σώματος [Προσαρμογή από WHO (83)] Ελλιποβαρής κάτω από 18,5 kg/m 2 Φυσιολογικό σωματικό βάρος 18,5 kg/m 2 έως 24,9 kg/m 2 Σωματικό υπέρβαρο 25 έως 29,9 kg/m 2 Παχυσαρκία 1 ου βαθμού 30 έως 34,9 kg/m 2 Παχυσαρκία 2 ου βαθμού 35 έως39,9 kg/m 2 Παχυσαρκία 3 ου βαθμού Ή Νοσογόνος Παχυσαρκία άνω των 40 kg/m 2 Τα τελευταία χρόνια έχει αποδειχθεί ότι, η συσσώρευση λίπους στην κοιλιά αποτελεί σημαντικότερο επιβαρυντικό παράγοντα για μεταβολικές

70 70 επιπλοκές της παχυσαρκίας, σε σχέση με το ολοσωματικό λίπος. Η κατανομή του σωματικού λίπους μπορεί να εκτιμηθεί από την αναλογία περιμέτρου μέσης προς περίμετρο ισχίων (ΠΜΙ) (Waist-to-Hip Ratio, WHR), η οποία θεωρείται αυξημένη όταν είναι άνω των 0,85 στις γυναίκες και άνω του 1,00 στους άνδρες (83). Τελευταία χρησιμοποιείται περισσότερο η απλή μέτρηση της περιμέτρου μέσης (ΠΜ) (Waist circumference, WC) ως κατ εξοχήν δείκτης της κεντρικής ή ανδρικού τύπου παχυσαρκίας. Το 1998 το Αμερικανικό Ινστιτούτο Υγείας υιοθέτησε το συνδυασμό αυξημένου ΔΜΣ (άνω του 25) με την αυξημένη ΠΜ ( 102 cm σε άνδρες και 88cm σε γυναίκες) ως ένδειξη σπλαχνικής παχυσαρκίας (84). Η ΠΜ χρησιμοποιείται όλο και περισσότερο διεθνώς ως δείκτης παχυσαρκίας. Είναι πλέον ευρέως αποδεκτό ότι, η παχυσαρκία αποκτά επιδημικές διαστάσεις, όχι μόνο στις αναπτυγμένες, αλλά και στις αναπτυσσόμενες χώρες. Υπολογίζεται ότι, πλέον του 50% των Ευρωπαίων ενηλίκων ηλικίας ετών είναι είτε υπέρβαροι ή παχύσαρκοι. Το υπερβάλλον βάρος είναι συχνότερο στις γυναίκες, ενώ η παχυσαρκία στους άνδρες. Τα επίπεδα της παχυσαρκίας στην Ευρώπη είναι της τάξης του 10-20% στους άνδρες και 15-25% στις γυναίκες, ενώ οι τάσεις είναι συνεχώς αυξητικές (85). Τα παρατηρούμενα ποσοστά στην Ελλάδα είναι από τα πλέον υψηλά στην Ευρώπη, σύμφωνα και με την πρόσφατη πανελλήνια επιδημιολογική μελέτη της Ελληνικής Ιατρικής Εταιρείας Παχυσαρκίας. Τα ποσοστά παχυσαρκίας, λοιπόν, στους ενήλικες είναι 26% στους άνδρες και 18% στις γυναίκες, ενώ αυτά του σωματικού υπέρβαρου 41% στους άνδρες και 30% στις γυναίκες (86). Σημαντικοί προδιαθεσικοί παράγοντες για την επιδημική διάσταση της παχυσαρκίας στη χώρα μας είναι, κατ αρχήν, η υιοθέτηση του δυτικού διατροφικού μοντέλου εις βάρος της παραδοσιακής μεσογειακής διατροφής, ακόμη η μείωση της σωματικής δραστηριότητας

71 71 και η καθιστική ζωή, διάφοροι κοινωνικοί και οικονομικοί παράγοντες, κ.ά. (85) 3.2 Η ΠΑΧΥΣΑΡΚΙΑ ΩΣ ΝΟΣΟΣ Η συμμετοχή της παχυσαρκίας στην εκδήλωση ορισμένων παθήσεων είναι αποδεδειγμένη και η ίδια η παχυσαρκία θεωρείται πλέον νόσος. Αναφορικά με τη θνησιμότητα, υπάρχει μία σημαντική θετική συσχέτιση μεταξύ σωματικού βάρους και θνησιμότητας, όταν ειδικά ο δείκτης μάζας σώματος ξεπερνάει το 30. Η αυξημένη θνησιμότητα οφείλεται κυρίως στο σακχαρώδη διαβήτη τύπου 2, στα καρδιαγγειακά επεισόδια και σε ορισμένους καρκίνους (87). Οι επιπλοκές της παχυσαρκίας διακρίνονται σε: α) Μεταβολικές, όπου κύριο ρόλο παίζει η συσσώρευση ενδοκοιλιακού λίπους. Οι κυριότερες απ αυτές είναι ο σακχαρώδης διαβήτης τύπου 2, το μεταβολικό σύνδρομο, τα καρδιαγγειακά νοσήματα, η χολολιθίαση, κ.ά. β) Μηχανικές, όπου κυρίαρχο ρόλο παίζει ο βαθμός της παχυσαρκίας. Οι κυριότερες είναι η οστεοαρθρίτιδα γονάτου, οι κιρσοί κάτω άκρων, το λεμφοίδημα κ.ά. γ) Μικτές, όπου συνυπάρχουν μεταβολικοί και μηχανικοί παράγοντες, π.χ. σύνδρομο απνοιών κατά τον ύπνο, αρτηριακή υπέρταση, κλπ. Στον πίνακα 7 καταγράφονται οι κυριότερες επιπτώσεις της παχυσαρκίας στα διάφορα συστήματα.

72 72 Πίνακας 7. Συμπτώματα και επιπλοκές της παχυσαρκίας [Προσαρμογή από Basdevant(87)] ΜΕΤΑΒΟΛΙΚΟ ΣΥΝΔΡΟΜΟ (Σπλαχνική παχυσαρκία) Σ. διαβήτης 2 Δυσλιπιδαιμία Αρτηριακή υπέρταση Διαταραχές πήξης Μικρολευκωματινουρία Υπερουριχαιμία ΕΝΔΟΚΡΙΝΕΙΣ Αραιομηνόρροια Υπογονιμότητα Πολυκυστικές ωοθήκες Υπογοναδισμός ΚΑΡΔΙΑΓΓΕΙΑΚΟ Αρτ. Υπέρταση Στεφ. Νόσος Καρδ. Ανεπάρκεια Κιρσοί άκρων ΑΝΑΠΝΕΥΣΤΙΚΟ Δύσπνοια Σύνδρομο υπνικής άπνοιας Πνευμονική εμβολή ΠΕΠΤΙΚΟ Χολολιθίαση Γαστροοισοφαγική παλινδρόμηση Λιπώδες ήπαρ Κήλες ΜΥΟΣΚΕΛΕΤΙΚΟ Ραχιαλγίες Οστεοαρθρίτιδα Oυρική αρθρίτιδα ΝΕΟΠΛΑΣΜΑΤΑ Μαστού Ενδομητρίου Παχέος εντέρου Προστάτη Χοληδόχου κύστης ΔΕΡΜΑ Μυκητιάσεις Κυτταρίτιδα Λεμφοίδημα ΨΥΧΟ-ΚΟΙΝΩΝΙΚΕΣ Χαμηλή αυτοεκτίμηση Κατάθλιψη Κοινωνικός ρατσισμός Δυσχέρεια ανεύρεσης εργασίας

73 ΤΟ ΜΕΤΑΒΟΛΙΚΟ ΣΥΝΔΡΟΜΟ Το μεταβολικό σύνδρομο (Μετ.Συν) αποτελεί μία συστάδα συναφών μεταβολικών διαταραχών, που αυξάνει τον κίνδυνο για εκδήλωση καρδιαγγειακής νόσου. Παρουσιάζει αυξημένη συχνότητα στις δυτικές κοινωνίες και η εμφάνισή του αυξάνει παράλληλα με την επιδημία της παχυσαρκίας. Υπολογίζεται ότι το 1/3 των υπέρβαρων ή και παχύσαρκων ατόμων πάσχει από μεταβολικό σύνδρομο, ενώ έχει καταγραφεί ότι οι άνδρες προσβάλλονται συχνότερα από τις γυναίκες (88). Το Μετ.Συν έχει περιγραφεί για πρώτη φορά επισήμως το 1998 από τον Reaven ως σύνδρομο Χ (89). Τα κυριότερα συστατικά του είναι η αντίσταση στη δράση της ινσουλίνης, η κεντρικού τύπου παχυσαρκία, η διαταραχή της ομοιόστασης της γλυκόζης, η δυσλιπιδαιμία και η αρτηριακή υπέρταση, όλοι τεκμηριωμένοι παράγοντες κινδύνου για εμφάνιση καρδιαγγειακής νόσου (89). Συχνά συνυπάρχουν και άλλες κλινικές ή βιοχημικές διαταραχές, όπως το σύνδρομο των πολυκυστικών ωοθηκών, η μη-αλκοολική λιπώδης διήθηση του ήπατος, η χολολιθίαση, το σύνδρομο απνοιών κατά τον ύπνο, η μικρολευκωματινουρία, η υπερουριχαιμία, διαταραχές πήξης και ινωδόλυσης και η αύξηση των φλεγμονωδών κυτταροκινών. Λόγω της άγνωστης ακόμη ειδικής αιτιολογίας και χαρακτηρισμού αλλά και της πολυμορφίας του Μετ.Συν, δεν υπάρχει μέχρι σήμερα ομόφωνη γνώμη ως προς τα διαγνωστικά, κατ αρχήν, κριτήριά του. Ο πρώτος γενικός ορισμός δόθηκε το 1998 από τον WHO και είχε ως κυρίαρχη παράμετρο την εκτίμηση της ινσουλινοαντίστασης ή της διαταραχής ανοχής της γλυκόζης (90). Το 2001 προτάθηκαν από αμερικανούς επιστήμονες (NCEP-ATPIII) νέα διαγνωστικά κριτήρια για τον ορισμό του Μετ.Συν, τα οποία αποδείχθηκαν μάλλον πιο εύχρηστα στην κλινική πράξη.

74 74 Πίνακας 8. Ορισμός μεταβολικού συνδρόμου κατά NCEP-ATPIII (91) Παράγων κινδύνου - Κεντρική παχυσαρκία (περίμετρος μέσης) Άνδρες Γυναίκες Φυσιολογικά όρια >102 cm > 88 cm - Τριγλυκερίδια 150mg /dl - HDL Άνδρες Γυναίκες < 40mg/dl < 50mg/dl - Αρτηριακή πίεση 130/ 85mgHg - Γλυκόζη νηστείας 110mg/dl Διάγνωση Μετ.Συν όταν συνυπάρχουν 3 ή περισσότεροι παράγοντες κινδύνου Το 2005 η Διεθνής Ομοσπονδία Διαβήτη (IDF) πρότεινε νέα διαγνωστικά κριτήρια για εφαρμογή στην κλινική πράξη και στις επιδημιολογικές μελέτες. Στο νέο ορισμό του Μετ.Συν (πίνακας 9), απαραίτητο συστατικό για τη διάγνωση θεωρείται πλέον η κεντρικού τύπου παχυσαρκία, όπως αυτή καθορίζεται από τη μέτρηση της περιμέτρου μέσης (92).

75 75 Πίνακας 9. Ορισμός μεταβολικού συνδρόμου κατά IDF(92) - Κεντρικού τύπου παχυσαρκία: Περίμετρος μέσης > 80cm(Γ), > 94cm (A): Ευρώπη > 88cm (Γ), > 100cm (A): ΗΠΑ και 2 από τους παρακάτω παράγοντες κινδύνου - ΑΠ 130/85mgHg - Γλυκόζη νηστείας 100mg/dl - Τριγλυκερίδια 150mg/dl - HDLχοληστερόλη < 50mg/dl (Γ), < 40mg/dl (A) Εάν υιοθετηθεί τελικά ο τελευταίος ορισμός, αναμένεται να αυξηθεί ιδιαίτερα η επίπτωση ποσοστών του Μετ.Συν. Το κυριότερο, πάντως, παθοφυσιολογικό υπόστρωμα του Μετ.Συν είναι η αντίσταση στην ινσουλίνη. Σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη ινσουλινοαντίστασης παίζουν τα ελεύθερα λιπαρά οξέα (ΕΛΟ), τα οποία είναι ιδιαίτερα αυξημένα επί παχυσαρκίας, ιδίως κεντρικού τύπου (89). Τα ΕΛΟ απελευθερώνονται είτε από τα τριγλυκερίδια (ΤΓΛ) του υπερτροφικού λιπώδους ιστού μέσω της ορμονοευαίσθητης λιπάσης (HSL), ή από τη λιπόλυση των πλουσίων σε ΤΓΛ λιποπρωτεϊνών μέσω της λιποπρωτεϊνικής λιπάσης (LPL). Η ινσουλίνη είναι μία ορμόνη με ιδιαίτερα σημαντική αντιλιπολυτική δράση. Κατά συνέπεια, όσο σοβαρότερη είναι η ινσουλινοαντίσταση, τόσο μεγαλύτερες ποσότητες ΕΛΟ παράγονται από τα λιποκύτταρα, τα οποία με τη σειρά τους επιδεινώνουν το πρόβλημα, συμβάλλοντας στην ανάπτυξη της ινσουλινοαντίστασης (93). Τα τελευταία χρόνια ταυτοποιήθηκαν πολλοί ορμονικοί παράγοντες εκκρινόμενοι από το λιπώδη ιστό, οι οποίοι φαίνεται ότι συμμετέχουν ενεργά στη διαμόρφωση καταστάσεων ινσουλινοευαισθησίας. Κύριοι

76 76 τέτοιοι παράγοντες είναι οι λεγόμενες λιποκυττοκίνες, που είναι πιθανό να συμβάλλουν σε καθοριστικό βαθμό στην παθοφυσιολογία του μεταβολικού συνδρόμου. Έχει βρεθεί ότι, η παχυσαρκία του ΜετΣυν χαρακτηρίζεται ως μία κατάσταση χρόνιας, υποκλινικής φλεγμονής, κατά την οποία παρατηρείται αύξηση της συγκέντρωσης ηπατικών δεικτών φλεγμονής (π.χ. C-αντιδρώσα πρωτεΐνη, ινωδογόνο, κλπ.) και προφλεγμονωδών κυτταροκινών (TNFa, IL 6, λεπτίνη, κλπ.) (94). Οι περισσότερες πληθυσμιακές μελέτες έχουν δείξει ισχυρές συσχετίσεις μεταξύ του ΒΜΙ και ορισμένων κυτταροκινών, όπως του ογκονεκρωτικού παράγοντα α (TNFa )και της ιντερλευκίνης 6 (IL 6 ). Συνεπώς, μπορούμε να υποθέσουμε ότι, η αύξηση της συγκέντρωσης των κυτταροκινών είναι το αποτέλεσμα υπερπαραγωγής τους από τον υπερτραφέντα λιπώδη ιστό. Το τελικό συμπέρασμα είναι ότι, ο λιπώδης ιστός, μέσω των κυτταροκινών, είναι άμεσα υπεύθυνος για τη χρόνια υποκλινική φλεγμονή, η οποία με τη σειρά της ευθύνεται για την ανάπτυξη της ινσουλινοαντίστασης, των συστατικών του Μετ.Συν, τη δυσλειτουργία του ενδοθηλίου και τελικά του υψηλού καρδιαγγειακού κινδύνου (95). Από τις λιποκυτταροκίνες του λιπώδες ιστού, αυτές που άμεσα συμμετέχουν στην ανάπτυξη ευαισθησίας των ιστών στην ινσουλίνη είναι ο TNFa, η IL 6, η λεπτίνη, η ρεζιστίνη και η λιπονεκτίνη (95). Ο TNFa και η IL 6 είναι προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες, οι οποίες μέσω αυτοκρινικής και παρακρινικής οδού αναστέλλουν τη δράση της ινσουλίνης στους υποδοχείς, προκαλώντας άμεσα ινσουλινοαντίσταση στο ήπαρ και τους σκελετικούς μύες (94). Η λεπτίνη, η οποία σχεδόν αποκλειστικά παράγεται από το λιπώδη ιστό, δρα κυρίως στον υποθάλαμο, προκαλώντας ελάττωση της πρόσληψης τροφής. Σε περιπτώσεις λεπτινοαντίστασης, όπως αυτές που παρατηρούνται επί παχυσαρκίας, διαταράσσεται ο μεταβολισμός των ΕΛΟ, με αποτέλεσμα συσσώρευση ενδιαμέσων λιπιδίων και πρόκληση ινσουλινοαντίστασης (96). Επίσης, η

77 77 λεπτίνη θεωρείται και κυτταροκίνη με προφλεγμονώδεις ιδιότητες. Η ρεζιστίνη, επιδεινώνει την ινσουλινοαντίσταση, η επίδρασή της όμως είναι μάλλον ήπια στον άνθρωπο, σε σχέση με τα ποντίκια (94). Η λιπονεκτίνη εκφράζεται αποκλειστικά στο λιπώδη ιστό και κυκλοφορεί στο αίμα σε πολύ υψηλές συγκεντρώσεις, έως και 1000 φορές υψηλότερες από ό,τι η λεπτίνη. Τα παχύσαρκα άτομα, όμως, έχουν χαμηλότερα επίπεδα λιπονεκτίνης από τα άτομα φυσιολογικού βάρους και τα επίπεδά τους είναι επίσης ελαττωμένα σε σχέση με αυτά ατόμων με μεταβολικό σύνδρομο και σ.διαβήτη τύπου 2 (97). Η λιπονεκτίνη προκαλεί ευαισθητοποίηση των ιστών στη δράση της ινσουλίνης, μέσω αύξησης της οξείδωσης των ΕΛΟ και αναστολής της ηπατικής παραγωγής της γλυκόζης. Τα επίπεδα της λιπονεκτίνης αυξάνονται από τα αντιδιαβητικά φάρμακα θειαζολεδινεδιόνες και το αποτέλεσμα αυτό είναι πιθανό ότι συμβάλλει ουσιαστικά στην επαγωγή της ινσουλινοευαισθησίας που αυτά προκαλούν (98). Η λιπονεκτίνη, εκτός των άλλων, ασκεί προστατευτική δράση στο ενδοθήλιο, παρεμποδίζοντας τη διαδικασία σχηματισμού της αθηρωματικής πλάκας. Οι λιποκυτταροκίνες του λιπώδους ιστού, λόγω της συμμετοχής τους στην ινσουλινοαντίσταση και την αθηρωμάτωση, αποτελούν ένα σημαντικά ενδιαφέροντα θεραπευτικό στόχο και, ως εκ τούτου, δοκιμάζονται συνεχώς νέα φάρμακα με άκρως εξειδικευμένη δράση (98).

78 Η ΔΥΣΛΙΠΙΔΑΙΜΙΑ ΤΗΣ ΠΑΧΥΣΑΡΚΙΑΣ Παθοφυσιολογία του μεταβολισμού των λιποπρωτεϊνών Η παθοφυσιολογία των λιποπρωτεΐνικών διαταραχών επί παχυσαρκίας έχει ιδιαίτερα μελετηθεί τα τελευταία χρόνια και φαίνεται ότι, οι διαταραχές αυτές οφείλονται στο συνδυασμό σπλαχνικής κατανομής του λίπους και ινσουλινοαντίστασης. Κομβικό σημείο των διαταραχών είναι η ηπατική υπερπαραγωγή των VLDL (99). Η υπάρχουσα ινσουλινοαντίσταση προκαλεί μείωση της αντιλιπολυτικής διαδικασίας στο λιποκύτταρο, ιδίως στο σπλαχνικού τύπου, με αποτέλεσμα αυξημένη προσαγωγή ελεύθερων λιπαρών οξέων (ΕΛΟ) προς το ήπαρ μέσω της πυλαίας, που έχει ως αποτέλεσμα την αυξημένη σύνθεση τριγλυκεριδίων και ηπατικών VLDL (100). Η ίδια η ινσουλινοαντίσταση προκαλεί επίσης μείωση της ενεργότητας της LPL των ιστών, με αποτέλεσμα το μειωμένο καταβολισμό των VLDL και επίταση της υπερτριγλυκεριδαιμίας. Λόγω της υπερτριγλυκεριδαιμίας αυτής ευνοείται η μεταφορά ΤΓΛ από τις VLDL προς τις HDL και LDL μέσω της CETP, ενώ αντίστροφα μεταφέρονται εστέρες χοληστερόλης. Ως αποτέλεσμα των ανταλλαγών αυτών σχηματίζονται LDL και HDL σωματίδια, τα οποία είναι πλούσια σε ΤΓΛ και πτωχά σε εστέρες χοληστερόλης και αποτελούν ένα καλό ενζυμικό υπόστρωμα για την ηπατική λιπάση (HL). Η HL, η οποία ως γνωστόν, είναι αυξημένη στην παχυσαρκία, υδρολύει τα ΤΓΛ των LDL και HDL σωματιδίων, μετατρέποντας τις μεγάλες αραιές LDL σε μικρές και πυκνές και τις μεγάλες HDL2 σε μικρές και πυκνές τύπου HDL3, με τελικό αποτέλεσμα τη συνολική μείωση της συγκέντρωσης των ευεργετικών HDL (100,101). Στην παραπάνω διαδικασία σχηματισμού μικρών-πυκνών LDL και HDL, η HL και η CETP δρουν με απόλυτη συνέργεια.

79 79 Επιμέρους λεπτομερείς μελέτες της επίδρασης της παχυσαρκίας στα υποκλάσματα των HDL όχι μόνο επιβεβαίωσαν τη μείωση των HDL2, αλλά κατέδειξαν επιπλέον αύξηση των πρωτογενών υποκλασμάτων τύπου προβ1-hdl, αύξηση της παραγωγής αλλά και του καταβολισμού της αποa1 και τελικά μειωμένη συνολική ικανότητα των HDL στην αποκομιδή της χοληστερόλης από τα κύτταρα ( ). Ορισμένες φορές παρατηρείται και αύξηση της LDL. Έχει βρεθεί ότι τα παχύσαρκα άτομα παρουσιάζουν αυξημένη δραστηριότητα του ενζύμου σύνθεσης της χοληστερόλης HMG-CoA αναγωγάσης (105) και έχει υπολογισθεί ότι, για κάθε κιλό αύξησης του βάρους αυξάνει το ποσοστό βιοσύνθεσης της χοληστερόλης κατά 20 mg ημερησίως. Η αύξηση της χοληστερόλης προέρχεται κατά ένα ποσοστό και από την αυξημένη παραγωγή των VLDL, οι οποίες εν μέρει μετατρέπονται σε LDL. Στην παρακάτω εικόνα απεικονίζονται οι κύριες διαταραχές των λιποπρωτεϊνών επι παχυσαρκίας. Εικόνα 15. Συνοπτική απεικόνιση κύριων λιποπρωτεΐνικών διαταραχών επί παχυσαρκίας [Προσαρμογή από Betteridge(106)]

80 80 Πιο πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι, η ινσουλινοαντίσταση που προάγει τη δυσλιπιδαιμία αφορά όχι μόνο στο ήπαρ και το σπλαχνικό λίπος, αλλά και στο λίπος πέριξ των σκελετικών μυών. Σε αρκετές εργασίες έχει καταγραφεί η συσχέτιση μεταξύ συσσώρευσης ΕΛΟ στους μύες και της αντίστασης στην ινσουλίνη (107) Η επίδραση των στεροειδικών ορμονών Οι μεταβολές των στεροειδικών ορμονών (κορτικοειδή, DHEA, DHEA-S, ορμόνες του φύλου) που παρατηρούνται στην κεντρικού τύπου παχυσαρκία, έχουν άμεση σχέση με τη δυσλιπιδαιμία της ινσουλινοαντίστασης. Αναφορικά με τα γλυκοκορτικοειδή πιθανολογείται ότι, η κεντρικού τύπου παχυσαρκία είναι μία κατάσταση υπερδιέγερσης του υποθαλαμουποφυσιακού-επινεφριδιακού άξονα ως αποτέλεσμα άγχους ή άλλων εξωτερικών παραγόντων που επιδρούν στο φλοιό του εγκεφάλου (108). Έχει διαπιστωθεί επίσης αυξημένος αριθμός υποδοχέων γλυκοκορτικοειδών στο σπλαχνικό λίπος σε σχέση με το υποδόριο. Είναι γνωστό ότι τα παχύσαρκα άτομα παρουσιάζουν αυξημένη έκκριση της κορτιζόλης. Συνεπώς, θεωρείται πιθανό ότι, η κεντρικού τύπου παχυσαρκία μπορεί εν μέρει να οφείλεται σε κάποιου βαθμού λειτουργική υπερκορτιζολαιμία, η οποία μπορεί να προκαλεί ινσουλινοαντίσταση, αυξημένες VLDL και ελάττωση LDL υποδοχέων. Σήμερα, η κεντρικού τύπου παχυσαρκία θεωρείται από μερικούς κατάσταση τοπικής μορφής συνδρόμου Cushing (109). Σχετικά με τις ορμόνες του φύλου έχει διαπιστωθεί ότι, γυναίκες με κεντρικού τύπου παχυσαρκία και ινσουλινοαντίσταση παρουσιάζουν αυξημένα επίπεδα ελεύθερης τεστοστερόνης και χαμηλά SHBG (Sex Hormone Binding Globulin). Οι ορμονικές αυτές μεταβολές συσχετίζονται

81 81 άμεσα με τα στοιχεία της δυσλιπιδαιμίας της παχυσαρκίας και, συγκεκριμένα, με τη χαμηλή HDL και τα υψηλά τριγλυκερίδια. Ιδιαίτερα η χαμηλή συγκέντρωση SHBG φαίνεται ότι αποτελεί ένα αυτόνομο στοιχείο του συνδρόμου ινσουλινοαντίστασης (110). Η SHBG είναι η πρωτεΐνη που συνδέει την τεστοστερόνη και την οιστραδιόλη και η σύνθεσή της ελαττώνεται από την υπερινσουλιναιμία. Οι ορμόνες του φύλου, οιστραδιόλη και τεστοστερόνη, ασκούν σημαντικές μεταβολικές επιδράσεις σε γυναίκες και άνδρες, μέσω άμεσης ή έμμεσης ρύθμισης της ιστικής λιποπρωτεϊνικής λιπάσης (LPL). Σε γενικές γραμμές, τα οιστρογόνα μειώνουν την παραγωγή της LPL του λιπώδους ιστού και η δράση αυτή εκδηλώνεται εντονότερα στο υποδόριο λίπος των γλουτών και των μηρών, όπου παρατηρείται αυξημένη συγκέντρωση οιστρογονικών υποδοχέων (111). Η μειωμένη δραστικότητα της LPL οδηγεί σε τοπική συσσώρευση λίπους. Τα ανδρογόνα ασκούν διεγερτική επίδραση στην LPL του υποδόριου λιπώδους ιστού, αλλά αρνητική σε αυτήν του σπλαχνικού. Συμπερασματικά, η αναλογία μεταξύ ανδρογόνων-οιστρογόνων φαίνεται ότι είναι αυτή που καθορίζει τη διαφορετική κατανομή του λίπους, που παρατηρείται στα δύο φύλα (111). Η τεστοστερόνη προκαλεί επίσης σημαντική αύξηση της ηπατικής λιπάσης και η αύξηση αυτή εξηγεί τη χαμηλότερη HDL, που παρατηρείται στους άνδρες σε σχέση με τις γυναίκες. Υψηλή ηπατική λιπάση έχουν, όπως προαναφέρθηκε, και τα περισσότερα παχύσαρκα άτομα (25). Ενδιαφέρον παρουσιάζει η σχέση μεταξύ παχυσαρκίας, επινεφριδιακών ανδρογόνων[δεϋδροεπιανδροστερόνης(dhea)-θειικής δεϋδροεπιανδροστερόνης (DHEA-S)] και λιποπρωτεϊνών. Τα επίπεδα της DHEA στις περισσότερες μελέτες είναι χαμηλά σε παχύσαρκα άτομα, ενώ η σχέση μεταξύ παχυσαρκίας και DHEA-S ποικίλλει, συνήθως διαφοροποιούμενη ανάλογα με την ηλικία, η οποία μειώνει τα επίπεδα των DHEA-S. H ελάττωση της DHEA-S με την πάροδο της ηλικίας είναι πιθανό

82 82 ότι σχετίζεται με την ανάπτυξη σπλαχνικής παχυσαρκίας και ινσουλινοαντίστασης (112). Τα αυξημένα επίπεδα DHEA και DHEA-S σχετίζονται με ευνοϊκή λιπιδαιμική εικόνα, συχνότερα με μειωμένα τριγλυκερίδια, αλλά και σε μερικές μελέτες με υψηλά επίπεδα HDL (113). Άλλοι ερευνητές δεν παρατήρησαν συσχετίσεις μεταξύ των επινεφριδιακών αυτών ανδρογόνων και των λιποπρωτεϊνών και πιθανολογείται ότι, η σχέση αυτή μπορεί να εξηγηθεί από τις μεταβολές του βάρους και της κατανομής του λίπους. Επίσης, τουλάχιστον στους άνδρες, η επίδραση της DHEA στις λιποπρωτεΐνες προσομοιάζει με αυτή της τεστοστερόνης και είναι πιθανό ότι, η ευνοϊκή επίδραση της DHEA στα λιπίδια ασκείται μέσω της μετατροπής της τελικά σε τεστοστερόνη (112). 3.5 ΔΙΑΙΤΑ, ΑΠΩΛΕΙΑ ΒΑΡΟΥΣ ΚΑΙ ΜΕΤΑΒΟΛΕΣ ΤΩΝ ΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Μεταβολές λιποπρωτεϊνών Κατά την απώλεια βάρους τα λιπίδια του ορού των παχύσαρκων μειώνονται, με αποτέλεσμα να παρατηρείται και ελάττωση του καρδιαγγειακού κινδύνου (114). Σε μια μεγάλη μετα-αναλυτική επεξεργασία 70 μελετών (115) βρέθηκε ότι, η ελάττωση του βάρους συνοδεύεται κατά μέσο όρο με μείωση της ολικής χοληστερόλης κατά 13%, των LDL κατά 11% και των τριγλυκεριδίων κατά 32%. Οι ΗDL ελαττώνονται αρχικά κατά την ενεργητική φάση της απώλειας κατά 8%, αλλά στη φάση της διατήρησης αυξάνονται κατά 12% σε σχέση με την αρχική τους τιμή. Όσο υψηλότερα είναι τα αρχικά επίπεδα των λιπιδίων, τόσο μεγαλύτερη είναι η πιθανή ελάττωσή τους. Ειδικότερα, οι άνδρες κατά την απώλεια βάρους παρουσιάζουν μεγαλύτερη βελτίωση των λιπιδίων απ ό,τι οι γυναίκες (116). Η κατανομή του σωματικού λίπους παίζει και αυτή σημαντικό ρόλο. Παχύσαρκες γυναίκες με ανδρικού τύπου

83 83 παχυσαρκία αυξάνουν σημαντικά τις HDL, ανεξάρτητα από το συνολικό ΒΜΙ, κατά την απώλεια βάρους. Η βελτίωση αυτή σχετίζεται άμεσα με την ποσότητα του σπλαχνικού λίπους (117). Η αντανάκλαση της απώλειας βάρους στα λιπίδια εμφανίζει 2 φάσεις: Η πρώτη φάση είναι αυτή της οξείας ελάττωσης θερμίδων και της ενεργητικής απώλειας βάρους και η 2 η φάση αυτή της σταθεροποίησης και διατήρησης του βάρους σε νέα, χαμηλότερα επίπεδα. Κατά την 1 η φάση παρατηρείται ελάττωση όλων των λιποπρωτεϊνικών κλασμάτων, συμπεριλαμβανομένων και των HDL. Κατά τη 2 η φάση της σταθεροποίησης ή της ήπιας απώλειας βάρους, που συνήθως συμβαίνει μετά τον 3 ο μήνα, παρατηρούνται μικρότερες μειώσεις των LDL και των τριγλυκεριδίων, αλλά και αύξηση της HDL πάνω από τα αρχικά επίπεδα (115). Οι διαφορές αυτές των μεταβολών στις 2 φάσεις οφείλονται στη διαφορετική επίδραση, που ασκεί η μείωση των θερμίδων (ιδίως η μείωση λιπαρών) σε σύγκριση με την ελάττωση του βάρους per se (118). Οι Leenen και συνεργάτες (119) έδειξαν ότι, η ελάττωση του βάρους κατά 13 kg, ελάττωσε per se την ολική χοληστερόλη κατά 50%, την LDL κατά 60% και τα τριγλυκερίδια κατά 70%, ενώ αύξησε την HDL κατά 12.5%. Αντίθετα, η ελάττωση του διατροφικού λίπους και των θερμίδων χωρίς ελάττωση του βάρους ελάττωσε την ολική χοληστερόλη κατά 7.2%, την LDL κατά 5.2% και τα τριγλυκερίδια κατά 12.9% και μείωσε την HDL κατά 11.1%. Φαίνεται ότι, η επίδραση της ελάττωσης του βάρους per se είναι ευνοϊκότερη στη βελτίωση των λιπιδίων απ ό,τι η επίδραση της ελάττωσης του διατροφικού λίπους και των θερμίδων (120). Σε συμφωνία με τα παραπάνω, οι Lichenstein και συν. (121) βρήκαν ότι σε υπερχοληστερολαιμικούς ασθενείς η υπολιπιδαιμική δίαιτα βελτιώνει βραχυπρόθεσμα τα λιπίδια, εφ όσον όμως συνοδεύεται από σημαντική απώλεια βάρους. Αντίθετα, σε μικρότερες απώλειες κιλών, η επίδραση της αλλαγής του διατροφικού λίπους ίσως παίζει σπουδαιότερο

84 84 ρόλο απ ό,τι η απώλεια βάρους per se, όπως προκύπτει από μία μεταανάλυση 27 μελετών (122). Η διαφορετική αναλογία λίπους-υδατανθράκων στις δίαιτες χαμηλών θερμίδων παίζει επίσης σημαντικό ρόλο στην επίδραση των λιπιδίων του αίματος (115). Σχετικά αυξημένο ποσοστό υδατανθράκων στη δίαιτα είναι δυνατόν να μειώνει τα επίπεδα HDL και να αυξάνει τα τριγλυκερίδια, λόγω επιδείνωσης της ινσουλινοαντίστασης. Η ευνοϊκή επίδραση στα λιπίδια κατά την απώλεια βάρους είναι πιο εμφανής όταν η ολιγοθερμιδική δίαιτα είναι σχετικά εμπλουτισμένη σε μονοακόρεστα λιπαρά (123). Τελευταία, διαπιστώνεται η βελτίωση των λιποπρωτεϊνών ακόμη και σε μετρίου βαθμού απώλειες βάρους, της τάξης του 5-10% (124). Σε γενικές γραμμές, απώλεια βάρους 5-10% προκαλεί μείωση της LDL κατά 15% και των τριγλυκεριδίων κατά 20-30% και αύξηση της HDL κατά 8-10% (125). Σε πρόσφατη μετα-ανάλυση διαπιστώθηκε επίσης ότι, για 10kg απώλειας βάρους σε μακροχρόνια βάση, η ελάττωση της ολικής χοληστερόλης είναι της τάξης των 0,23mmol/L (8,6mg%) (126). Αντίθετα, οι Wadden και συν. βρήκαν ότι, η σημαντική βελτίωση στα λιπίδια διατηρείται μακροπρόθεσμα (δηλαδή μετά 1-2 χρόνια) μόνο εάν η απώλεια βάρους είναι σημαντικού βαθμού, δηλαδή άνω του 10% (127) Παθοφυσιολογία των λιποπρωτεϊνικών μεταβολών Οι παθοφυσιολογικοί μηχανισμοί των μεταβολών των λιποπρωτεϊνών κατά την απώλεια βάρους δεν είναι επαρκώς διευκρινισμένοι. Αναφορικά με τη χοληστερόλη φαίνεται ότι κατά την απώλεια βάρους α) ελαττώνεται η δραστηριότητα του ενζύμου σύνθεσης της ενδοκυττάριας χοληστερόλης, δηλαδή η HMGCoA αναγωγάση, β) κινητοποιείται εναποθηκευμένη ποσότητα χοληστερόλης από το λιπώδη ιστό, η οποία επίσης δρα

85 85 ανασταλτικά στην ηπατική σύνθεση χοληστερόλης και γ) αυξάνει η απέκκριση χοληστερόλης από τη χολή (116,128). Τα επίπεδα των τριγλυκεριδίων βελτιώνονται σημαντικά και άμεσα με την απώλεια βάρους. Η βελτίωση αυτή οφείλεται στην απώλεια λίπους per se, αλλά και στην αύξηση της ινσουλινοευαισθησίας (129,130). Παρατηρείται ελάττωση παραγωγής VLDL ή αύξηση του καταβολισμού τους. Έχει βρεθεί ότι, η LPL του λιπώδους ιστού κατά την ελάττωση και σταθεροποίηση του βάρους αυξάνει (131), με αποτέλεσμα τον καλύτερο καταβολισμό των ΤΓΛ. Η αύξηση αυτή, βέβαια, επάγει την εναπόθεση των τριγλυκεριδίων στο λιπώδη ιστό, με αποτέλεσμα να δυσχεραίνει την περαιτέρω απώλεια βάρους (132). Η δραστηριότητα της LPL επηρεάζει και τις μεταβολές των HDL κατά την απώλεια βάρους. Κατά την εφαρμογή της ολιγοθερμιδικής δίαιτας επιβραδύνεται η σύνθεση χυλομικρών και VLDL, με αποτέλεσμα να μειώνεται για προσαρμοστικούς λόγους και η LPL των ιστών κατά 50-80%. Μείωση της τελευταίας έχει ως αποτέλεσμα ελαττωμένη μεταφορά λιπιδίων από τις VLDL και τα χυλομικρά προς τις HDL (133). Όταν το βάρος σταθεροποιηθεί σε χαμηλότερα επίπεδα, η δραστικότητα της LPL σταδιακά αποκαθίσταται και συχνά ξεπερνάει τα αρχικά της επίπεδα, με αποτέλεσμα να αυξάνονται σημαντικά και οι HDL. Σημαντικός παράγοντας που προκαλεί μείωση των HDL κατά την ελάττωση του βάρους είναι η μικρότερη παραγωγή της αποa1, η οποία οφείλεται κυρίως στην οξεία μείωση του λίπους και της χοληστερόλης των τροφών (134). Η πτώση αυτή της αποa1 έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση όλων των υποκλασμάτων της HDL (προ-β, HDL3, HDL2), αφορά όμως περισσότερο την HDL2, δηλαδή τα σωματίδια που είναι πιο πλούσια σε αποa1 (135,136). Μετά τη σταθεροποίηση του βάρους, συνήθως μετά 3-6 μήνες, τα κλάσματα των HDL αυξάνουν σε επίπεδα υψηλότερα από τα αρχικά και η αύξηση αυτή αφορά κυρίως στα υποκλάσματα HDL2 (135).

86 86 Τέλος, η μείωση της ηπατικής λιπάσης που παρατηρείται κατά την απώλεια βάρους ενδέχεται να παίζει κάποιο ρόλο στην αύξηση της HDL (137).

87 87 4. ΠΑΧΥΣΑΡΚΙΑ ΚΑΙ ΠΡΩΤΕΙΝΕΣ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΛΙΠΙΔΙΩΝ 4.1 ΤΑ ΕΠΙΠΕΔΑ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΛΙΠΙΔΙΩΝ ΠΛΑΣΜΑΤΟΣ ΣΤΗΝ ΠΑΧΥΣΑΡΚΙΑ Η παχυσαρκία, ιδίως η σπλαχνικού τύπου, αποτελεί προαθηρογόνο κατάσταση, κυρίως λόγω της συνοδού δυσλιπιδαιμίας και, συγκεκριμένα, της υπερτριγλυκεριδαιμίας και των χαμηλών επιπέδων HDL. H τάση για αθηρωμάτωση, που παρουσιάζουν τα παχύσαρκα άτομα, οφείλεται και σε άλλους παράγοντες, δηλαδή σε ουσίες που υπερεκκρίνονται, είτε λόγω της συνοδού ινσουλινοαντίστασης ή λόγω του υπερτροφικού λιπώδους ιστού (99). Προαθηρογόνοι παράγοντες που εκκρίνονται από το λιπώδη ιστό είναι ο TNFa, η IL6, o PAI1, το αγγειοτενσινογόνο και, πιθανώς, η λεπτίνη (138). Οι πρωτεΐνες μεταφοράς λιπιδίων, CETP και PLTP, εκκρίνονται κατά ένα ποσοστό από το λιπώδη ιστό (139). Πρόσφατες in vivo και in vitro μελέτες δείχνουν ότι έχουν προαθηρογόνες ιδιότητες (42). Παρά το γεγονός ότι, τα επίπεδα του πλάσματος των πρωτεϊνών αυτών έχουν βρεθεί αυξημένα στην παχυσαρκία ( ) και στο μεταβολικό σύνδρομο (144), ελάχιστες είναι οι μελέτες που επιχείρησαν να εξετάσουν τις μεταβολές τους μετά από ολιγοθερμιδική δίαιτα και σχετική απώλεια σωματικού βάρους (137,145). Εξ όσων είμαστε σε θέση να γνωρίζουμε, δεν υπάρχουν βιβλιογραφικά δεδομένα που να διερευνούν την ταυτόχρονη μεταβολή της CETP και PLTP σε διάφορες φάσεις της απώλειας βάρους και, συγκεκριμένα, άμεσα μετά από οξεία εφαρμογή ολιγοθερμιδικής δίαιτας, αλλά και ύστερα από σταθερή απώλεια βάρους για μερικούς μήνες.

88 Η ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΜΕΤΑΦΟΡΑΣ ΛΙΠΙΔΙΩΝ ΠΛΑΣΜΑΤΟΣ ΣΤΗ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ HDL ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΑΠΩΛΕΙΑ ΒΑΡΟΥΣ ΟΙ HDL αποτελούν προστατευτικό παράγοντα από την αθηρωμάτωση και τα επίπεδά τους είναι συνήθως χαμηλά στην παχυσαρκία(107). Μετά από μακρόχρονη και σταθεροποιημένη απώλεια βάρους, τα επίπεδα της HDL ιδίως των κατ εξοχήν καρδιοπροστατευτικών HDL2 αυξάνουν. Κατά τη βραχυπρόθεσμη, όμως, ή και μεσοπρόθεσμη απώλεια βάρους συχνά παρατηρείται ελάττωση (114). Οι μηχανισμοί των μεταβολών αυτών δεν είναι απόλυτα διευκρινισμένοι, ενώ υπάρχει η υποψία ότι, οι μεταβολές των πρωτεϊνών μεταφοράς λιπιδίων στο πλάσμα ενδέχεται να παίζουν κάποιο σημαντικό ρόλο (136,137). Λόγω του μηχανισμού δράσης τους, η μεν CETP μειώνει συνολικά τα επίπεδα των HDL, μετατρέποντας τις μεγάλες HDL2 σε μικρές HDL3, ενώ η PLTP ευνοεί το σχηματισμό των μεγάλων HDL2 σωματιδίων, αλλά και των πολύ μικρών των πρωτογενών τύπου προ-β-hdl (40). Εξ όσων γνωρίζουμε, η συνδυασμένη επίδραση της CETP και PLTP στη διαφοροποίηση των υποκλασμάτων HDL παχυσάρκων κατά την απώλεια βάρους δεν έχει εξετασθεί μέχρι στιγμής. Η διερεύνηση της συμπεριφοράς των CETP και PLTP σε παχύσαρκες γυναίκες κατά τη μηνιαία, αλλά και την τετράμηνη απώλεια βάρους, ύστερα από δίαιτα, καθώς και η ενορχηστρωμένη επίδραση των μεταβολών των πρωτεϊνών αυτών στις μεταβολές των υποκλασμάτων των HDL, αποτέλεσε το σκοπό για τον οποίο πραγματοποιήθηκε η εργασία αυτή.

89 89 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

90 90

91 91 1.ΣΚΟΠΟΣ Σκοπός της παρεμβατικής, προοπτικής αυτής μελέτης ήταν: 1. Nα μελετηθεί, σε παχύσαρκες γυναίκες, η μεταβολή των πρωτεϊνών μεταφοράς λιπιδίων πλάσματος CETP και PLTP κατά την απώλεια βάρους ύστερα από εφαρμογή δίαιτας χαμηλών θερμίδων, σε δύο χρονικά στιγμιότυπα, 4 και 16 εβδομάδων. 2. Να εκτιμηθεί η σχέση των μεταβολών αυτών των πρωτεϊνών πλάσματος με τις τυχόν μεταβολές των επιμέρους υποκλασμάτων των HDL κατά την απώλεια βάρους. 3. Να μελετηθούν οι μεταβολές άλλων παραμέτρων, όπως ανθρωπομετρικών, παραμέτρων ινσουλινοαντίστασης, βασικών λιπιδίων, απολιποπρωτεϊνών και ορμονών κατά την απώλεια βάρους και η τυχόν συσχέτισή τους με τις μεταβολές των πρωτεϊνών μεταφοράς λιπιδίων.

92 92 2.ΥΛΙΚΟ-ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 ΜΕΛΕΤΗΘΕΝΤΑ ΑΤΟΜΑ Από 78 παχύσαρκες γυναίκες, οι οποίες επιλέχθηκαν αρχικά για να ενταχθούν στη μελέτη, οι 44 πληρούσαν τα κριτήρια εισόδου και εντάχθηκαν τελικά στο πρωτόκολλο. Τα κριτήρια εισόδου περιελάμβαναν γυναίκες αναπαραγωγικής ηλικίας ή μετεμμηνοπαυσιακές, με δείκτη μάζας σώματος (ΔΜΣ) πάνω από 30kg/m 2, χωρίς όμως αυτός να υπερβαίνει το 50, ηλικίας μεταξύ 18 και 65 ετών. Οι παχύσαρκες γυναίκες συγκρίθηκαν στο χρόνο 0 με 25 φυσιολογικού βάρους γυναίκες, παρόμοιας ηλικίας. Κριτήρια αποκλεισμού για όλο τον πληθυσμό ήταν ο εγκατεστημένος σακχαρώδης διαβήτης, οριζόμενος ως γλυκόζη νηστείας>126mg/dl, η σοβαρού βαθμού οικογενής ή δευτερογενής δυσλιπιδαιμία (οριζόμενη ως ολική χοληστερόλη και/ή τριγλυκερίδια πλάσματος>400mg/dl), η λήψη υπολιπιδαιμικών, ορμονικών ή άλλων φαρμάκων, ικανών να επηρεάσουν τα λιπίδια και/ή το σωματικό βάρος, κατάχρηση οινοπνεύματος (λήψη άνω των 50γρ/ημέρα καθαρής αιθυλικής αλκοόλης), κάπνισμα άνω των πέντε σιγαρέτων ημερησίως και η παρουσία συστηματικού νοσήματος ή νεοπλασίας. Επίσης, κανένα από τα συμμετέχοντα άτομα δεν έπρεπε να έχει εφαρμόσει δίαιτα απώλειας βάρους για τουλάχιστον 4 μήνες πριν την έναρξη της μελέτης και να έχει αυξομειώσει το βάρος του για πάνω από 4 κιλά στο διάστημα αυτό.

93 ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Οι 44 επιλεγείσες παχύσαρκες γυναίκες εντάχθηκαν σε διατροφικό πρόγραμμα απώλειας βάρους μέσης διάρκειας 4 μηνών, το οποίο περιελάμβανε 3 φάσεις, που περιγράφονται στη συνέχεια. 1η φάση (χρόνος 15 μέρες έως χρόνος 0 ): Ηταν η περίοδος της αρχικής ένταξης στη μελέτη (run-in period). Στη φάση αυτή έγινε η επιλογή για την ένταξη στη μελέτη σύμφωνα με τα κριτήρια εισόδου και αποκλεισμού και η καταγραφή των διαιτητικών συνηθειών των παχυσάρκων γυναικών. Επίσης, στο διάστημα αυτό έγινε σύσταση στις παχύσαρκες γυναίκες να μη μεταβάλουν τις διατροφικές τους συνήθειες και να διατηρήσουν το σύνηθες επίπεδο σωματικής δραστηριότητας. Στο χρόνο 0 εκτιμήθηκε η ημερήσια πρόσληψη θερμίδων κάθε ατόμου μέσω του βασικού μεταβολισμού ηρεμίας (ΒΜΗ), δηλαδή της ενέργειας που καταναλώνει ένα άτομο όταν είναι κατακεκλιμένο, ξύπνιο και χωρίς να εκτελεί καμία δραστηριότητα. Για τον υπολογισμό του ΒΜΗ χρησιμοποιούνται κάποιες εξισώσεις, οι οποίες λαμβάνουν υπ όψιν το σωματικό βάρος, το ύψος και την ηλικία. Εμείς χρησιμοποιήσαμε την, τεκμηριωμένη βιβλιογραφικά, εξίσωση Harris-Benedict, η οποία για τις γυναίκες έχει ως εξής: ΒΜΗ=[ ,6x(Σ.Βάρος σε kgs)+1,8x(υψος σε cm)-4,7x(ηλικία σε χρ.)] (146). 2η φάση (χρόνος 0 έως 4 βδομάδες): Αποτέλεσε την αρχική φάση της παρέμβασης. Στο χρόνο 0 έγιναν ανθρωπομετρικές μετρήσεις και εργαστηριακές εξετάσεις σε όλες τις παχύσαρκες γυναίκες και τους μάρτυρες. Συγκεκριμένα, μετρήθηκε το βάρος σώματος (σε κιλά), το ύψος (σε m), η περίμετρος μέσης (σε cm) και η περίμετρος ισχίων (σε cm) και υπολογίσθηκαν ο δείκτης μάζας σώματος (ΔΜΣ) ως ΣΒ/Υ 2 και ο λόγος περιμέτρων μέσης/ισχίων (ΠΜΙ). Επίσης,

94 94 υπολογίσθηκε το επί τοις εκατό ποσοστό του σωματικού λίπους (ΣΛ%), με την τεχνική της βιοηλεκτρικής αντίστασης των ιστών (ΒΙΑ). Ο εργαστηριακός έλεγχος περιελάμβανε: Mετρήσεις των βασικών λιπιδίων πλάσματος (ολική χοληστερόλη, τριγλυκερίδια, HDL), υπολογισμό της LDL χοληστερόλης, μετρήσεις απολιποπρωτεϊνών (αποα1, αποβ) και λιποπρωτεΐνης (α)[lp(a)], μετρήσεις παραμέτρων μεταβολισμού υδατανθράκων (γλυκόζη πλάσματος, ινσουλίνη ορού νηστείας και υπολογισμός του δείκτη ινσουλινοαντίστασης ΗΟΜΑ) και ορμονικών παραμέτρων σχετιζόμενων με την παχυσαρκία, όπως Τριιωδοθυρονίνης (Τ3), Κορτιζόλης, Θειικής δεϋδροεπιανδροστερόνης (DHEA-S), Ολικής Τεστοστερόνης, 17β- Οιστραδιόλης και της Σφαιρίνης που συνδέει τις φυλετικές ορμόνες (SHBG). Οι ορμονικοί προσδιορισμοί έγιναν στο εργαστήριο Βιολογικής Χημείας του ΑΠΘ υπό την επίβλεψη του Αν. Καθηγητή κ. Μ. Καραμούζη. Οι εξειδικευμένες αναλύσεις του μεταβολισμού των λιποπρωτεϊνών, δηλαδή η ηλεκτροφόρηση σε γέλη πολυακρυλαμιδίου για το διαχωρισμό των υποκλασμάτων των HDL και οι γραφικές αποδόσεις, οι μετρήσεις της μάζας της πρωτεΐνης μεταφοράς εστέρων χοληστερόλης (CETP) και της μάζας της πρωτεΐνης μεταφοράς φωσφολιπιδίων (PLTP) στο πλάσμα με ενζυμομετρική μέθοδο (ELISA), πραγματοποιήθηκαν στο εξειδικευμένο Βιοχημικό εργαστήριο μεταβολισμού λιποπρωτεϊνών και αθηροσκλήρωσης του Πανεπιστημίου της Βουργουνδίας, στην πόλη Dijon της Γαλλίας (Διευθυντής κ. L. Lagrost), όπου διέθεταν και τα ειδικά αντισώματα. Μετά τη διενέργεια του αρχικού ελέγχου στο χρόνο 0, σε όλες τις παχύσαρκες γυναίκες χορηγήθηκε δίαιτα χαμηλών θερμίδων, η οποία είχε θερμιδικό έλλειμμα της τάξης των 1000kcal ημερησίως, σε σχέση με την αρχικά υπολογισμένη ημερήσια πρόσληψη θερμίδων. Η ολιγοθερμιδική αυτή δίαιτα περιελάμβανε κατά μέσο όρο 1251±210kcal ημερησίως, με εύρος 905 έως 1840 kcal ημερησίως, ανάλογα με το εκάστοτε αρχικό

95 95 σωματικό βάρος της κάθε γυναίκας. Η σύσταση του διατροφικού πακέτου στα επιμέρους θρεπτικά συστατικά είχε ως εξής: Ολικά Λιπαρά Οξέα 28,6±3,2% ή 39,1±11,0γρ (μονοακόρεστα 13,4±1,7%, πολυακόρεστα 9,0±1,4% και κεκορεσμένα 6,0±1,1%), Υδατάνθρακες: 48,3±4,1% (146,2±19,7 γρ), Πρωτεΐνες 23,2±1,4% (70,5±13,8γρ.) και Χοληστερόλη 159,5±37,4 mgr. Είναι πρόδηλο ότι επρόκειτο για μια ισορροπημένη ολιγοθερμιδική διατροφή, πτωχή σε ολικά λιπαρά οξέα, αλλά σχετικά εμπλουτισμένη σε μονοακόρεστα, περιέχουσα ικανοποιητική ποσότητα υδατανθράκων και πρωτεϊνών. Η χορήγηση της δίαιτας έγινε από το λογισμικό πακέτο χορήγησης διαιτολογίων Science Fit 200A (Science Technologies, Athens, Greece). Κλινική παρακολούθηση και καταγραφή των μεταβολών του σωματικού βάρους πραγματοποιούνταν κάθε 1 εβδομάδα. Στο τέλος της 4 ης εβδομάδας έγινε δεύτερος πλήρης εργαστηριακός έλεγχος. Σκοπός των μετρήσεων στο χρονικό αυτό στιγμιότυπο ήταν να εκτιμηθούν οι μεταβολές των λιπιδίων και των πρωτεϊνών πλάσματος, υπό συνθήκες οξείας ελάττωσης θερμίδων (κυρίως διατροφικού λίπους) και πριν την αξιοσημείωτη απώλεια βάρους. Είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία ότι, οι διάφορες λιποπρωτεΐνες και ιδίως οι HDL μεταβάλλονται διαφορετικά όταν ελαττώνονται οι προσλαμβανόμενες θερμίδες και διαφορετικά όταν χάνεται σωματικό βαρος. Οι περισσότερες μελέτες δείχνουν ότι, οι HDL ελαττώνονται μεν συνολικά, αλλά μεταβάλλεται και η αναλογία των υποκλασμάτων τους κατά την αρχική φάση της δίαιτας. Η ενδεχόμενη μεταβολή των πρωτεϊνών μεταφοράς είναι πιθανό ότι παίζει κάποιο ρόλο στις μεταβολες αυτές, αλλά αυτό μέχρι σήμερα δεν έχει απολύτως διαλευκανθεί.

96 96 3η φάση (Χρόνος 4 έως 16 εβδομάδες) Ηταν η φάση της κατ εξοχήν απώλειας σωματικού βάρους και των επακόλουθων λιπιδικών μεταβολών. Στο διάστημα αυτό συνεχίσθηκε η εβδομαδιαία κλινική παρακολούθηση των γυναικών. Περί την 6η με 8η εβδομάδα της μελέτης έγινε αναπροσαρμογή του ολιγοθερμιδικού διαιτολογίου και χορηγήθηκε ημερήσιο διαιτολόγιο με επιπλέον θερμιδικό έλλειμμα της τάξης του 20% των αρχικών θερμίδων, χωρίς αλλαγή στην αναλογία των θρεπτικών συστατικών, με σκοπό να υπερκερασθεί η πτώση του βασικού μεταβολισμού και να συνεχισθεί η απώλεια βάρους. Προς το τέλος της μελέτης και περί τη 14η-15η εβδομάδα έγινε σύσταση στις γυναίκες να σταθεροποιήσουν το βάρους τους, έτσι ώστε ο τελευταίος έλεγχος να πραγματοποιηθεί υπό συνθήκες σταθερής, πλέον, μεταβολικής κατάστασης. Περί τη 16η-17η εβδομάδα έγινε ο τελευταίος πλήρης, ανθρωπομετρικός και εργαστηριακός έλεγχος. Από τα δεδομένα της βιβλιογραφίας εκτιμάται ότι, στο σημείο αυτό επέρχεται σε κάποιο βαθμό επανάκαμψη των αρχικών επιπέδων των HDL, και μάλιστα σε επίπεδα επιπλέον των αρχικών, αφού προηγήθηκε αρχικά η ελάττωσή τους. Μεγάλο ενδιαφέρον παρουσιάζει η διερεύνηση της επίδρασης των μεταβολών των CETP και PLTP στις αλλαγές αυτές των HDL, όπως και των υποκλασμάτων τους. Επιπλέον, παράλληλα με όλες αυτές τις μεταβολές, διερευνήθηκε και η επίδραση παραμέτρων, όπως της ινσουλινοαντίστασης, των δεικτών σωματικού λίπους και των διαφόρων ορμονών. Στον παρακάτω πίνακα καταγράφονται τα χαρακτηριστικά των παχυσάρκων γυναικών πριν την έναρξη της μελέτης (χρόνος 0 ) και των φυσιολογικών μαρτύρων.

97 97 Πίνακας 1. Χαρακτηριστικά παχυσάρκων και φυσιολογικού βάρους γυναικών (μάρτυρες) Παράμετρος Παχύσαρκες (n=44) Νορμοβαρείς (n=25) P Ηλικία (χρ.) 41,0±11,7 41,3±13,3 NS ΒΣ (kg) 96,7±15,0 61,4±4,5 0,000 ΔΜΣ (kg/m 2 ) 36,8±5,4 23,0±1,5 0,000 ΣΛ (%) 45,7±5,2 30,1±4,0 0,000 ΠΜ (cm) 100,0±10,0 77,4±7,9 0,000 ΠΜΙ 0,82±0,07 0,79±0,07 NS 2.3 ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ Ανθρωπομετρία Το σωματικό βάρος των ασθενών μετρήθηκε σε ηλεκτρονική ζυγαριά τύπου Seca με απόκλιση 0,1kg και το ύψος με ελαστική μεζούρα με απόκλιση 1cm. Ο δείκτης μάζας σώματος υπολογίσθηκε ως το πηλίκο του βάρους (σε κιλά) διά του ύψους στο τετράγωνο (σε μέτρα). Εξ ορισμού, όλες οι παχύσαρκες γυναίκες της μελέτης είχαν ΔΜΣ πάνω από 30 και οι φυσιολογικού βάρους κάτω από 25. Η περίμετρος μέσης (ΠΜ σε cm) μετρήθηκε στο μεσοδιάστημα μεταξύ της τελευταίας πλευράς και της άνω λαγόνιας ακρολοφίας ενώ η περίμετρος ισχίων (ΠΙ σε cm) στο πιο προέχον σημείο των γλουτών. Επίσης, υπολογίσθηκε ο λόγος περιμέτρων μέσης/ισχίων (ΠΜΙ). Για την εκτίμηση του ποσοστού του σωματικού λίπους των παχυσάρκων γυναικών χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της βιοηλεκτρικής αντίστασης των ιστών (Bioelectrical impedance analysis, BIA) (147). Η αρχή της μεθόδου

98 98 στηρίζεται στο γεγονός ότι, το σωματικό λίπος αποτελεί κακό αγωγό σε εφαρμοζόμενο ηλεκτρικό ρεύμα, ενώ η άλιπη μάζα μαζί με το ύδωρ και τους ηλεκτρολύτες αποτελούν καλό αγωγό. Στην πράξη, διοχετεύεται ένα χαμηλής ενέργειας ηλεκτρικό ρεύμα, συνήθως<5khz, μέσω καλωδίων που τοποθετούνται στα άνω και κάτω άκρα, οπότε ανάλογα με την ευχέρεια διέλευσής του από το ολοσωματικό ύδωρ, εκτιμάται η συνολική αντίσταση των ιστών. Με δεδομένο ότι η ποσότητα ύδατος αποτελεί το 73% της άλιπης μάζας, υπολογίζεται η λιπώδης μάζα ως η διαφορά της άλιπης μάζας από το σωματικό βάρος (148). Η μέθοδος ΒΙΑ είναι ταχείας εφαρμογής (διάρκεια 2 ), φθηνή, το άτομο δεν ακτινοβολείται, έχει ικανοποιητική επαναληψιμότητα (3-4%) όπως και ακρίβεια. Για τη μελέτη του συγκεκριμένου πληθυσμού χρησιμοποιήθηκε μηχάνημα τύπου Akern, το οποίο εξέπεμπε συχνότητα ρεύματος 50Khz και 800μΑ (μοντέλο ΒΙΑ101Α, Akern STA, Φλωρεντία, Ιταλία). Το % ποσοστό σωματικού λίπους (ΣΛ%) υπολογίσθηκε από το λογισμικό Bodygram (version 1,21, Akern Srl Bioresearch, Φλωρεντία, Ιταλία) (149). Το μηχάνημα αυτό αποτελεί εξελιγμένη μορφή της μεθόδου ΒΙΑ, διότι παρέχει τη δυνατότητα λεπτομερούς διαχωρισμού της λιπώδους μάζας από το ολοσωματικό ύδωρ και γι αυτό μπορεί να διακρίνει αλλαγές σωματικού λίπους, ακόμα και σε περιπτώσεις μικρού βαθμού απώλειας βάρους (150).

99 Εργαστηριακές μετρήσεις Όλες οι αιμοληψίες έγιναν στα παχύσαρκα και νορμοβαρή άτομα σε ύπτια θέση, μετά από 12ωρη νηστεία, το πρωί, μεταξύ 8.00 και Τα δείγματα ορού και πλάσματος λαμβάνονταν μετά από φυγοκέντρηση στους 4ºC και διατηρούνταν όλα σε βαθειά κατάψυξη (-70ºC) έως τη στιγμή της μέτρησής τους. Για τις εξειδικευμένες μετρήσεις που έγιναν στο Εργαστήριο Βιοχημείας του Πανεπιστημίου της Βουργουνδίας στη Γαλλία, μεταφέρθηκαν δείγματα ορού και πλάσματος σε ξηρό πάγο με ευθύνη του ιδίου του υποψηφίου. Συνολικά, ο εργαστηριακός έλεγχος περιελάμβανε τα παρακάτω: Μετρήσεις λιπιδίων ορού και απολιποπρωτεϊνών, εκτίμηση παραμέτρων ινσουλινοαντίστασης, διενέργεια ορμονολογικών εξετάσεων, ανάλυση υποκλασμάτων HDL και μέτρηση πρωτεϊνών μεταφοράς λιπιδίων πλάσματος Λιπίδια και απολιποπρωτεΐνες ορού Η μέτρηση της ολικής χοληστερόλης στον ορό έγινε με φασματοφωτομετρική μέθοδο, με το kit Chol-HL της εταιρείας Biosis (Βιοτεχνολογικές εφαρμογές ΕΠΕ, Αθήνα). Η συγκέντρωση των τριγλυκεριδίων στον ορό υπολογίσθηκε επίσης φασματοφωτομετρικά, από την ποσότητα της ελεύθερης γλυκερόλης που ελευθερώνεται από τη διάσπαση των ΤΓΛ σε ΕΛΟ και γλυκερόλη (kit Τριγλυκερίδια GPO/PAP, εταιρεία Biosis). Η ολική HDL χοληστερόλη μετρήθηκε ποσοτικά στον ορό με μέθοδο ανοσοαναστολής (kit HDL C L-type, εταιρεία Βiochem Diagnostics, Π.Φάληρο). Όλες οι παραπάνω μετρήσεις έγιναν στον αυτόματο αναλυτή Wako Chemicals GmBH, Combe, Japan. Η LDL χοληστερόλη υπολογίσθηκε από τον τύπο του Friedewald: LDL=Ολική Χοληστερόλη-(ΤΓΛ/5+ HDL) (151).

100 100 Οι αποα1 και αποβ μετρήθηκαν στον ορό με ανοσολογική μέθοδο, με τα kits Human Apolipoprotein A1 και Human Apoliporotein B αντίστοιχα (Dade Behring Marburg GmbH,Germany). Η μέθοδος χρησιμοποιεί ειδικό αντίσωμα έναντι μίας ή περισσότερων αντιγονικών θέσεων στο μόριο της απολιποπρωτεΐνης. Ο Ν αντιορός στην ανθρώπινη αποα1 παράγεται από ανοσοποίηση κουνελιών με υψηλής καθαρότητας ανθρώπινη αποα1. Ο Ν αντιορός στην ανθρώπινη αποβ παράγεται από ανοσοποίηση κουνελιών με LDL (κλάσμα πυκνότητας 1,025-1,05 g/ml), το οποίο λαμβάνεται από ανθρώπινους ορούς. Το φυσιολογικό διάστημα αναφοράς στις γυναίκες για την αποa1 είναι 1,25-2,15g/lt, η διαναλυτική διακύμανση 1,15% και η ενδοαναλυτική 5,7%. Για την αποb, το διάστημα αναφοράς είναι 0,55-1,25g/lt, η διαναλυτική διακύμανση 1,9% και η ενδοαναλυτική 2,4%. Η LP(a) μετρήθηκε στον ορό με ανοσολογική μέθοδο, με το kit N-Latex LP(a)reagent (Dade Behring Marburg GmbH,Germany). Ο Ν αντιορός στην ανθρώπινη LP(a) παράγεται από ανοσοποίηση κουνελιών με υψηλής καθαρότητας ανθρώπινη LP(a). Η διαναλυτική διακύμανση της μεθόδου είναι 1,5%, ενώ η ενδοαναλυτική 1,7%. Οι μετρήσεις των αποb, αποa1 και LP(a) έγιναν στο νεφελόμετρο τύπου Behring Diagnostics GmBH (Marburg, Germany) Παράμετροι ινσουλινοαντίστασης Η γλυκόζη μετρήθηκε στον ορό ενζυματικά με την αντίδραση της οξειδάσης της γλυκόζης (kit Σάκχαρο-GOD/PAP, εταιρεία Biosis). Η συγκέντρωση της ινσουλίνης μετρήθηκε στα δείγματα των ορών ανοσοραδιομετρικά (IRMA), με το kit INS-IRMA Biosource Europe SA (Nivelles, Belgium). Η εξέταση αυτή της Biosource βασίζεται στο διαχωρισμό επιστρωμένων σωληναρίων. Τα Mabs1, τα αντισώματα σύλληψης, προσκολλώνται στην κάτω και εσωτερική επιφάνεια του πλαστικού σωληναρίου. Οι βαθμονομητές ή τα δείγματα που προστίθενται

101 101 στα σωληνάρια εμφανίζουν κατ αρχήν χαμηλή συγγένεια προς τα Μabs1. Προσθήκη Μab2, του αντισώματος σηματοδότησης που είναι σεσημασμένο με Ι 125, θα ολοκληρώσει το σύστημα έναρξης της ανοσολογικής αντίδρασης. Μετά την πλύση και απομόνωση περίσσειας Ι 125, η υπολειπόμενη ραδιενέργεια που είναι δεσμευμένη στο σωληνάριο, αντιστοιχεί στη συγκέντρωση του αντιγόνου. Η χρήση αρκετών διακριτών Mabs αποφεύγει την υπερειδικότητα, που είναι συνήθης σε IRMA 2 σημείων, καθώς και την ανάγκη συσκευής ανάδευσης ή επώασης στους 37 0 C. Το όριο ανίχνευσης, το οποίο ορίσθηκε ως η φαινομενική συγκέντρωση δύο τυπικών αποκλίσεων πάνω από τις μέσες μετρήσεις σε μηδενική δέσμευση, ήταν 1 μιu/ml. Για την εκτίμηση της ειδικότητας της μεθόδου, ορμόνες διασταυρούμενης αντίδρασης προστέθηκαν σε ένα βαθμονομητή υψηλής τιμής (100μΙU/ml ή 4ng/ml) και μετρήθηκε η φαινομενική απόκριση της ινσουλίνης. Διαπιστώθηκε ότι, ινσουλίνες ζώων εμφανίζουν διασταυρούμενη αντιδραστικότητα, ενώ ανθρώπινες, χοίρειες και βόειες προϊνσουλίνες δεν παρουσιάζουν διασταυρούμενη αντιδραστικότητα (152). Η ενδοαναλυτική διακύμανση του δείγματος, η οποία υπολογίσθηκε από τη μέτρηση 2 δειγμάτων αναφοράς γνωστής συγκέντρωσης αναλυτή επί 10 φορές στο ίδιο πακέτο αντιδραστηρίων, βρέθηκε ότι ήταν της τάξης του 2,2% και 1,6% στα 2 δείγματα αντιστοίχως, ενώ η διαναλυτική διακύμανση, η οποία μετρήθηκε σε 2 δείγματα γνωστής συγκέντρωσης σε 20 διαφορετικά πακέτα, ήταν 6,5% και 6,1%, αντίστοιχα. Το φυσιολογικό διάστημα αναφοράς για το εργαστήριό μας ήταν 2-25 μιu/ml. Στην εργασία μας για την εκτίμηση της ινσουλινοαντίστασης χρησιμοποιήθηκε ο δείκτης ΗΟΜΑ (Homeostasis Modes Assessment). Ο δείκτης αυτός χρησιμοποιεί βασικές μετρήσεις γλυκόζης και ινσουλίνης νηστείας και, μέσω μαθηματικού μοντέλου, δίνει πληροφορίες για την ομοιοστατική απάντηση της γλυκόζης για διαφορετικά επίπεδα είτε

102 102 ανεπάρκειας των β-κυττάρων ή αντίστασης των ιστών στη δράση της ινσουλίνης (153). Κατ αυτόν τον τρόπο, η μέθοδος ΗΟΜΑ προσδίδει μία ποσοτική εκτίμηση της συμβολής της ινσουλινοέκκρισης και της ινσουλινοαντίστασης στα επίπεδα γλυκόζης του αίματος κατά τη νηστεία. Ο υπολογισμός της στην πράξη γίνεται από το πηλίκο Γλυκόζη νηστείας (mmol/lt) x Ινσουλίνη νηστείας (μιu/ml) / 22,5 (153). H μέθοδος έχει εφαρμογή όχι μόνο σε παχύσαρκα άτομα, αλλά και σε άτομα με δυσανοχή στη γλυκόζη ή με Σ.Διαβήτη τύπου 2, όπου δίνει πληροφορίες σχετικά με την επιμέρους συμβολή της μειωμένης ινσουλινοέκκρισης ή της ινσουλινοαντίστασης στην υπεργλυκαιμία. Μειονέκτημα της μεθόδου αποτελεί η μεγάλη διακύμανση του υπολογισμού ινσουλινοαντίστασης κατά τη μέτρηση στο ίδιο άτομο, που μπορεί να φτάσει έως και στο 30% (154). Η μέθοδος ΗΟΜΑ έχει τεκμηριωθεί ως αξιόπιστος δείκτης για την εκτίμηση της ινσουλινοαντίστασης σε μεγάλες επιδημιολογικές μελέτες παχυσάρκων και φυσιολογικού βάρους ατόμων, που παρουσιάζουν διαφορετικά επίπεδα δυσανεξίας στη γλυκόζη (155) Μετρήσεις ορμονών Τεστοστερόνη: Η συγκέντρωση της τεστοστερόνης μετρήθηκε στα δείγματα ορού με την αρχή της ραδιοανοσομέτρησης (RIA), με το kit Testo- RIA-CT, Biosource Europe SA (Nivelles, Belgium). Η βασική αρχή της μεθόδου στηρίζεται στο ότι, μία σταθερή ποσότητα στεροειδούς σημασμένου με Ι 125 ανταγωνίζεται το προς μέτρηση στεροειδές, το οποίο υπάρχει στο δείγμα ή στο βαθμονομητή, για σταθερή ποσότητα θέσεων αντισωμάτων, που είναι ακινητοποιημένα στο τοίχωμα ενός σωληναρίου πολυστυρενίου. Δεν απαιτείται εκχύλιση ή χρωματογραφία, λόγω της υψηλής ειδικότητας των επιστρωμένων αντισωμάτων. Μετά από επώαση διάρκειας 3 ωρών στους 37ºC, η αντίδραση ανταγωνισμού τερματίζεται με

103 103 ένα βήμα αναρρόφησης. Τα σωληνάρια κατόπιν πλένονται με 3ml διαλύματος πλύσης και στη συνέχεια αναρροφούνται. Χρησιμοποιείται μία καμπύλη βαθμονόμησης και προσδιορίζονται οι συγκεντρώσεις τεστοστερόνης των δειγμάτων με αναγωγή των συγκεντρώσεων στην καμπύλη βαθμονόμησης. Το όριο ανίχνευσης είναι 0,05ng/ml. Το ποσοστό διασταυρούμενης αντίδρασης, υπολογιζόμενο σε σύγκριση της συγκέντρωσης που αποδίδει αναστολή 50%, ήταν: με την διυδροτεστοστερόνη 0,31, με την ανδροστενεδιόνη 0,28, με την 17-βοιστραδιόλη 0,004, με την προγεστερόνη 0,01 και με την κορτιζόλη <0,0001. Η ενδοαναλυτική διακύμανση του δείγματος καθορίσθηκε χρησιμοποιώντας μέτρηση 3 δειγμάτων αναφοράς γνωστής συγκέντρωσης αναλυτή επί 10φορές στο ίδιο πακέτο αντιδραστηρίων και βρέθηκε ότι είναι της τάξης 4,6%, 3,3% και 4,4% αντίστοιχα για τα 3 δείγματα, ενώ η διαναλυτική διακύμανση, η οποία μετρήθηκε σε 2 δείγματα γνωστής συγκέντρωσης σε 20 διαφορετικά πακέτα, ήταν 6,2% και 4,8%. Το φυσιολογικό διάστημα αναφοράς ήταν 0,11-0,79ng/ml για τις προεμμηνοπαυσιακές γυναίκες και <0,06-0,50 ng/ml για τις μετεμμηνοπαυσιακές (156). 17-β-οιστραδιόλη (17-β-Ε2): Η συγκέντρωση της 17-β-Ε2 μετρήθηκε στα δείγματα ορού με την αρχή της ραδιοανοσομέτρησης (RIA) με το kit Ε 2 - RIA-CT Biosource Europe S.A (Nivelles, Belgium). Μία σταθερή ποσότητα στεροειδούς σημασμένου με Ι 125 ανταγωνίζεται με το στεροειδές που θα μετρηθεί, το οποίο υπάρχει στο δείγμα ή στο βαθμονομητή, για σταθερή ποσότητα θέσεων αντισωμάτων που είναι σταθεροποιημένα στο τοίχωμα ενός ειδικού σωληναρίου πολυστυρενίου. Δεν απαιτείται εκχύλιση ή χρωματογραφία, λόγω της υψηλής ειδικότητας των επιστρωμένων αντισωμάτων. Μετά από επώαση διάρκειας 3 ωρών στους 37ºC, η αντίδραση ανταγωνισμού τερματίζεται με ένα βήμα αναρρόφησης. Τα

104 104 σωληνάρια κατόπιν πλένονται με 3 ml διαλύματος πλύσης και στη συνέχεια αναρροφούνται. Χρησιμοποιείται μία γραφική καμπύλη βαθμονόμησης αναφοράς και προσδιορίζονται οι συγκεντρώσεις της Ε2 των δειγμάτων με αναγωγή συγκεντρώσεων από την καμπύλη βαθμονόμησης. Τα όρια ανίχνευσης της μεθόδου είναι 10pg/ml. Η ενδοαναλυτική διακύμανση του δείγματος καθορίσθηκε μέσω μέτρησης 2 δειγμάτων αναφοράς γνωστής συγκέντρωσης αναλυτή επί 10 φορές στο ίδιο πακέτο αντιδραστηρίων και ήταν της τάξης του 5,9% και 4,9%, ενώ η διαναλυτική διακύμανση, η οποία υπολογίσθηκε σε 2 δείγματα γνωστής συγκέντρωσης σε 20 διαφορετικά πακέτα, ήταν 10,1% και 6,2%. Το kit παρουσιάζει διασταυρούμενη αντίδραση με την οιστρόνη 1,8, την οιστριόλη 1,2, την αιθυνυλοιστραδιόλη 0,8 και την 17-βαλεριανική οιστραδιόλη 0,3. Το φυσιολογικό διάστημα αναφοράς για την ωοθυλακική φάση του κύκλου οπότε και έγιναν οι μετρήσεις μας ήταν pg/ml, ενώ στις μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες ήταν 3-30pg/ml (157). Σφαιρίνη δεσμεύουσα τις φυλετικές ορμόνες(shbg): Η συγκέντρωση της SHBG μετρήθηκε στον ορό με ανοσοραδιομετρική εξέταση (IRMA) με το kit Active SHBG DSL-7400 (Oxon, United Kingdom). Η μέτρηση της SHBG γίνεται με τη μέθοδο τύπου «σάντουιτς». Στο kit χρησιμοποιούνται μονοκλωνικά αντισώματα ποντικιού, που κατευθύνονται κατά δύο διαφορετικών επιτοπίων της SHBG και επομένως δεν είναι ανταγωνιστικά. Τα δείγματα ορού, τα δείγματα ελέγχου και οι βαθμονομητές ελέγχου επωάζονται σε ειδικά σωληνάρια, επιστρωμένα με το πρώτο μονοκλωνικό αντίσωμα. Μετά την επώαση, αποχύνεται το περιεχόμενο και τα σωληνάρια ξεπλένονται. Στη συνέχεια προστίθεται το δεύτερο μονοκλωνικό αντίσωμα, το οποίο είναι επισημασμένο με Ι 125. Μετά τη δεύτερη επώαση, τα περιεχόμενα των σωληναρίων ξεπλένονται, έτσι ώστε να απομακρυνθεί το μη δεσμευμένο επισημασμένο με Ι 125 αντίσωμα.η δεσμευμένη ραδιενέργεια προσδιορίζεται σε gamma counter.

105 105 Oι συγκεντρώσεις SHBG των δειγμάτων προσδιορίζονται με συγκρίσεις στην πρότυπη καμπύλη. Η συγκέντρωση της SHBG των δειγμάτων είναι ευθέως ανάλογη της ραδιενέργειας. Η ενδοαναλυτική διακύμανση του δείγματος καθορίσθηκε χρησιμοποιώντας μέτρηση 3 δειγμάτων αναφοράς γνωστής συγκέντρωσης αναλυτή επί 10 φορές στο ίδιο πακέτο αντιδραστηρίων και ήταν της τάξης του 11,5%, 10,3%, και 8,7%, ενώ η διαναλυτική διακύμανση η οποία μετρήθηκε σε 3 δείγματα γνωστής συγκέντρωσης, σε 10 διαφορετικά πακέτα, ήταν 3,7%, 1,1% και 3,4%. Το όριο ευαισθησίας της εξέτασης είναι 3nmol/L. Το φυσιολογικό διάστημα αναφοράς για την ωοθυλακική φάση του κύκλου είναι nmol/L, ενώ στις μετεμμηνοπαυσιακές γυναίκες nmol/L(158). Κορτιζόλη: H συγκέντρωση της κορτιζόλης μετρήθηκε στον ορό με ανοσοραδιομετρική μέθοδο (RIA) με το kit Cortisol RIA Immunotech (Prague, Czech Republic). Tα δείγματα ορού που εξετάζονται, επωάζονται σε σωληνάρια επιστρωμένα με μονοκλωνικό αντίσωμα, μαζί με ιχνηθέτη κορτιζόλη, επισημασμένη με Ι 125. Μετά την επώαση, αποχύνονται τα υγρά περιεχόμενα των σωληναρίων με απορρόφηση και μετράται η δεσμευμένη ραδιενέργεια. Κατασκευάζεται πρότυπη καμπύλη και οι άγνωστες τιμές προσδιορίζονται με παρεμβολή στην καμπύλη αυτή. Η ενδοαναλυτική διακύμανση του δείγματος υπολογίσθηκε αφού διάφορα δείγματα εξετάσθηκαν δύο φορές το καθένα σε 17 σειρές και ήταν της τάξης του 9,2%, ενώ η διαναλυτική διακύμανση, που προέκυψε από την εξέταση διαφόρων δειγμάτων 10 φορές στη σειρά, ήταν 5,8%. Το όριο ευαισθησίας της εξέτασης είναι 0,36μg/dl. Το χρησιμοποιούμενο αντίσωμα είναι πολύ εξειδικευμένο για την κορτιζόλη και οι διασταυρούμενες αντιδράσεις με άλλα φυσικά στεροειδή ή φάρμακα, είναι πολύ χαμηλές. Τα φυσιολογικά όρια αναφοράς για τις πρωινές ώρες(8:00-9:00) είναι nΜ ή 9,0-26,0μg/dl (159).

106 106 Θειική Δεϋδροεπιανδροστερόνη (DHEA-S): Η συγκέντρωση της DHEA-S μετρήθηκε στον ορό με ραδιοανοσομετρική μέθοδο (RIA) με το kit DHEA-S-RIA-CT Biosource Europe S.A (Nivelles, Belgium). Για τη μέτρησή της τα δείγματα και τα πρότυπα επωάζονται μαζί με θειική DHEA επισημασμένη με Ι 125, ως ιχνηθέτη, σε σωληνάρια επιστρωμένα με μονοκλωνικό αντίσωμα. Μετά την επώαση, αποχύνονται τα υγρά περιεχόμενα των σωληναρίων και μετράται η δεσμευμένη ραδιενέργεια. Κατασκευάζεται πρότυπη καμπύλη και οι άγνωστες τιμές προσδιορίζονται με παρεμβολή στην καμπύλη αυτή. Η ενδοαναλυτική διακύμανση του δείγματος καθορίσθηκε με βάση τη μέτρηση 2 δειγμάτων αναφοράς γνωστής συγκέντρωσης αναλυτή επί 9 φορές στο ίδιο πακέτο αντιδραστηρίων και ήταν μικρότεροι ή ίσοι με 10,6%, ενώ η διαναλυτική διακύμανση, η οποία μετρήθηκε σε 3 δείγματα γνωστής συγκέντρωσης σε 9 διαφορετικά πακέτα, ήταν μικρότερη ή ίση με 7,4%. Η ευαισθησία της μεθόδου ήταν της τάξης του 0,06μg/ml. Τα φυσιολογικά όρια για τις προεμμηνοπαυσιακές γυναίκες ήταν 0,3-3,3μg/ml, ενώ για τις μετεμμηνοπαυσιακές 0,3-2,0μg/ml (160). Ολική Τριιωδοθυρονίνη (Τ3): Η συγκέντρωση της ολικής Τ3 μετρήθηκε στον ορό με ραδιοανοσομετρική μέθοδο (RIA) με το kit RIA-mat T3 Byk- Sangtec Diagnostica GmbH (Dietzenbach, Germany). Η αρχή της μεθόδου είναι ανάλογη με τις προαναφερθείσες RIA τεχνικές. Η ενδοαναλυτική διακύμανση του δείγματος καθορίσθηκε με βάση τη μέτρηση 3 δειγμάτων αναφοράς και ήταν της τάξης των 8,0%, 5,0% και 6,0%, ενώ η διαναλυτική διακύμανση, η οποία μετρήθηκε σε 3 δείγματα γνωστής συγκέντρωσης σε 11 διαφορετικά kits, ήταν της τάξης του 4,5%, 3,0% και 3,0%. Το όριο ευαισθησίας της μεθόδου είναι <0,1ng/ml. Τα φυσιολογικά όρια της Τ3 είναι 0,7-2,0ng/ml (161).

107 Μέτρηση της μάζας των CETP και PLTP στο πλάσμα Μέτρηση CETP πλάσματος Η μάζα της CETP στο πλάσμα μετρήθηκε με ανοσοενζυμική μέθοδο (ELISA) στο Εργαστήριο Βιοχημείας Λιποπρωτεϊνών της Ιατρικής Σχολής Βουργουνδίας στη Dijon της Γαλλίας. Η επιστημονική ομάδα που επόπτευε και διεξήγαγε τις μετρήσεις, υπό το διευθυντή Dr Lagrost,έχει μεγάλη εμπειρία και είναι η πρώτη η οποία περιέγραψε τη συγκεκριμένη μέθοδο (63). Η μέθοδος χρησιμοποιεί ένα μονοκλωνικό αντίσωμα TP1 (162), παρόμοιο με τα μονοκλωνικά αντισώματα TP2 που ήδη έχουν χρησιμοποιηθεί για τον ραδιοανοσομετρικό προσδιορισμό της CETP (163), το οποίο εξουδετερώνει ειδικά την ικανότητα της CETP στο να καταλύει ταυτόχρονα την ανταλλαγή εστέρων χοληστερόλης με τριγλυκερίδια και την ανακατανομή των σωματιδίων HDL μεταξύ τους. Το ειδικό αυτό αντίσωμα αναγνωρίζει ένα παρόμοιο επιτόπιο, το οποίο βρίσκεται στο καρβοξυτελικό τμήμα του μορίου της CETP. Τα ειδικά αντι-cetp μονοκλωνικά αντισώματα TP1 και TP2 παρασκευάσθηκαν στο κλινικό ερευνητικό Ινστιτούτο στο Mόντρεαλ, μετά από ανοσοποίηση ποντικιών με κεκαθαρμένη ανθρώπεια CETP, και προσφέρθηκαν ευγενικά για την πραγματοποίηση της μελέτης(162). Για τη μέτρηση της μάζας της CETP χρησιμοποιήθηκε συγκριτική ενζυμική ανοσοχημική μέθοδος, σύμφωνα με τη γενική μεθοδολογία που χρησιμοποιήθηκε στο εργαστήριο βιοχημείας λιποπρωτεϊνών στη Dijon της Γαλλίας για τον προσδιορισμό της ανθρώπινης αποα-ιv (164) και αποβ (165). Όλα τα βήματα της δοσολογίας των ανοσοχημικών μεθόδων (αραιώσεις, αποχύσεις, πλυσίματα και φωτομετρία) εκτελέσθηκαν με το Biomek 1000 BioRobotics System (Beckman Instruments, Palo Alto, USA),

108 108 σε συνδυασμό με τον αυτόματο βραχίονα Zymark στο προαναφερθέν βιοχημικό εργαστήριο στη Dijon. Επίστρωση πλακών: Όγκος 100 μl από το κλάσμα CETP-MonoQ (8μg/ml) σε ρυθμιστικό διάλυμα αποτελούμενο από 15mol/l Na 2 CO 3, 35mmol/l NaHCO 3, 35mmol/l NaHCO 3, 3 mmol/l NaN 3 (ph 9,6), τοποθετήθηκε σε κάθε πηγάδι μίας πλάκας 96 θέσεων από πολυστυρένιο l (Immuno 96F type I από Nync, Kamstup, Denmark). Μετά από ολονύκτια επώαση στους 4ºC, οι πλάκες εκπλύθησαν 4 φορές με 150mmol/l NaCl, 0,025%(ν/ν) Tween 20 washing solution. Για να αποτραπεί η μη ειδική απορόφηση, κάθε πηγαδάκι επωάσθηκε στη συνέχεια για 30 σε θερμοκρασία δωματίου με 200ml από ένα διάλυμα βοείου λευκωματίνης, συγκέντρωσης 1%(w/ν), το οποίο περιείχε 10mmol/l Na 2 HPO 4, 5mol/l NaH 2 PO 4 και 150 mmol/l NaCl που ρυθμίστηκε σε PH 7,2 με NaOH (ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορούχου λευκωματίνης). Επεξεργασία δειγμάτων: Τα δείγματα του πλάσματος που περιείχαν CETP προς μέτρηση διαλύθηκαν στο ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορούχου λευκωματίνης. Τα αντι-cetp μονοκλωνικά αντισώματα (ΤΡ1) διαλύθηκαν στο ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορούχου λευκωματίνης, το οποίο περιείχε 1% Triton Χ-100 (Pierce Chemical Cο, Rockford, IL). Ίσα μέρη των διαλυμένων δειγμάτων και των διαλυμάτων με αραιωμένο μονοκλωνικό αντίσωμα αναμείχθηκαν σε 96 βαθειά πηγάδια της πλάκας τιτλοποίησης (Beckman) όλη τη νύκτα στους 4ºC. Ποσότητες 100 μl των μειγμάτων τοποθετήθηκαν στα μικροπηγάδια της ανοσολογικής πλάκας και επωάσθηκαν για 3 ώρες στους 37ºC. Στη συνέχεια, οι πλάκες εκπλύθησαν 4 φορές με διάλυμα Tween 20. Ανίχνευση των συνδεδεμένων αντισωμάτων αντι-cetp: Μία ποσότητα 100 μl από αντισώματα έναντι μυός συνδεδεμένα με υπεροξειδάση (BioRad, Richmond, CA), διαλυμένα σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορούχου λευκωματίνης, τοποθετήθηκαν σε κάθε πηγάδι και επωάσθηκαν για 1 ώρα

109 109 στους 37ºC. Στο τέλος της επώασης, οι πλάκες εκπλύθησαν εκ νέου 4 φορές με το διάλυμα Tween 20. Μία ποσότητα 100 μl από πρόσφατα ετοιμασμένο διάλυμα, αποτελούμενο από 0,4g/l ο-φαινυλενεδιαμίνη, 0,68g/l διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου διαλυμένο σε 6,6mmol/l φωσφορικού νατρίου και 3,4mmol/l ρυθμιστικού διαλύματος κιτρικού (pη 5,2), τοποθετήθηκαν σε κάθε πηγάδι. Μετά από 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και σε σκοτάδι, η αντίδραση διεκόπη εντελώς με την προσθήκη 50 μl από 2,5mmol/l H 2 SO 4. Οι απορροφήσεις μετρήθηκαν στα 490nm φωτομετρικά στο σύστημα Biomek 1000Robotics και τα δεδομένα αποθηκεύθηκαν στο δίσκο του υπολογιστή για περαιτέρω επεξεργασία (63). Ρύθμιση: Παγωμένο πλάσμα που είχε χρησιμοποιηθεί για τη ρύθμιση του ραδιοανοσομετρικού προσδιορισμού της CETP, όπως περιγράφηκε από τους Marcel και συν. (163) και παραχωρήθηκε ευγενικά από το καρδιολογικό ινστιτούτο του Πανεπιστημίου της Ottawa του Καναδά, χρησιμοποιήθηκε ως αρχικό πρότυπο. Mία πρότυπη καμπύλη που κατασκευάστηκε από ένα σύνολο από 8 αραιώσεις του αρχικού προτύπου, χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η συγκέντρωση της CETP σε μία ποσότητα νορμολιπιδαιμικών πλασμάτων, τα οποία αποτέλεσαν έτσι τη δευτερεύουσα πρότυπη καμπύλη (συγκέντρωση της CETP, 1,99±0,16mg/l). Αυτή η ποσότητα, διαχωριζόμενη σε ποσότητες των 100 μl και κατεψυγμένη σε υγρό άζωτο, χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης της CETP σε διάφορα βιολογικά δείγματα. Μία καμπύλη βαθμονόμησης για κάθε πλάκα του ανοσοπροσδιορισμού της CETP κατασκευάσθηκε στη συνέχεια με 8 διπλές διαλύσεις του δευτερεύοντος προτύπου πλάσματος (συγκεντρώσεις CETP από περίπου 0,004mg/l σε 0,5mg/l). Οι πρότυπες καμπύλες συγκρίθηκαν με τις τιμές των δεδομένων και ο υπολογισμός των συγκεντρώσεων της CETP πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ενός λογισμικού ανάλυσης

110 110 δεδομένων (Immunofit EIA/RIA Data Analysis Software, Beckman). Αναλύθηκαν 4 συγκεντρώσεις από κάθε δείγμα και η τελική συγκέντρωση της CETP προσδιορίσθηκε από το μέσο όρο των 4 αποτελεσμάτων. Ειδικότητα του προσδιορισμού της CETP: Η ελάχιστα ανιχνεύσιμη ποσότητα ήταν 1 mg από CETP ανά πηγάδι με εύρος κυμαινόμενο από 1-10 mg/πηγάδι. Αυτά τα όρια ανίχνευσης έχουν παρόμοιο εύρος με εκείνα της ραδιοανοσολογικής μεθόδου (163). Επίσης, οι καμπύλες αναφοράς που κατασκευάσθηκαν για τα νορμολιπιδαιμικά και για τα υπερλιπιδαιμικά πλάσματα ήταν παράλληλες και κατά συνέπεια η ανοσοαντίδραση της CETP διαπιστώθηκε ότι είναι ανεξάρτητη από τα επίπεδα των λιπιδίων (63). Ακρίβεια: Η ακρίβεια του προσδιορισμού εκτιμήθηκε μετά από ανάλυση του πλάσματος 9 φορές στο ίδιο πηγαδάκι της πλάκας και μετά από 9 προσδιορισμούς του ίδιου πλάσματος σε διάστημα 10 ημερών. Η διαναλυτική και ενδοαναλυτική διακύμανση ήταν 4% και 6% αντίστοιχα (63). Φυσιολογικές τιμές: Ο μέσος όρος της συγκέντρωσης της CETP ήταν 2,77±0,59 μg/ml (εύρος διακύμανσης 1,87-4,23μg/ml) και ήταν παρόμοια με τον ραδιοανοσολογικό προσδιορισμό της σε νορμολιπιδαιμικό πληθυσμό (163,166). Συσχέτιση μεταξύ μάζας CETP και δραστικότητας: Στην παρούσα μελέτη δεν έγινε μέτρηση της δραστικότητας της CETP, η οποία μετράται ως η μεταφορά ραδιοσεσημασμένων εστέρων χοληστερόλης από τις HDL3 προς τα σωματίδια VLDL+LDL (163). Αξίζει να τονισθεί ότι, αν και ο προσδιορισμός της ενεργότητας μεταφοράς λιπιδίων στο πλάσμα έχει αποδειχθεί χρήσιμος στην κλινική πράξη, στην ουσία δεν προσφέρει αξιόπιστη και ειδική εκτίμηση της CETP per se, λόγω της παρουσίας τροποποιητικών παραγόντων στο πλάσμα (62). Για το λόγο αυτό, η προαναφερθείσα ενζυμομετρική μέθοδος είναι η πλέον κατάλληλη για τον

111 111 ακριβή προσδιορισμό της CETP. Σε κάθε περίπτωση, έχει ήδη περιγραφεί σημαντική θετική συσχέτιση μεταξύ μάζας και δραστικότητας της CETP (63), γεγονός που μας επέτρεψε να συμπεράνουμε ότι, η CETP δεν παρουσίασε αλλοιώσεις ενεργότητας για οποιονδήποτε λόγο. Μέτρηση PLTP πλάσματος H μάζα της PLTP στο πλάσμα μετρήθηκε με ανοσοενζυμική μέθοδο (ELISA) στο Εργαστήριο Βιοχημείας Λιποπρωτεϊνών της Ιατρικής Σχολής Βουργουνδίας στη Dijon της Γαλλίας (62). Χρησιμοποιήθηκε συγκριτική ELISA της PLTP, σύμφωνα με τεχνική παρόμοια με αυτή που εφαρμόσθηκε για τη μέτρηση της CETP (63). H μέθοδος χρησιμοποιεί αντι-pltp πολυκλωνικά αντισώματα. Ο αντιορός έναντι κεκαθαρμένης ανθρώπειας PLTP παρασκευάσθηκε μετά από ανοσοποίηση ενός λευκού κουνελιού της Νέας Ζηλανδίας, βάρους 3 κιλών, με 4 ενέσεις 250μg PLTP σε διάστημα 2 εβδομάδων. Η αφαίμαξη έγινε 8 ημέρες μετά την τελευταία ένεση, ο ορός παρελήφθη μέσω υπερφυγοκέντρησης σε χαμηλή ταχύτητα. Το κλάσμα IgG του ορού απομονώθηκε με τη χρήση μιας πρωτεΐνης Α column (protein A-Sepharose 4 Fast Flow, Pharmacia), σύμφωνα με τη διαδικασία που περιγράφηκε από τον παρασκευαστή. Αυτό το πείραμα έγινε σύμφωνα με το πλαίσιο του προγράμματος «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals», που δημοσιεύθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας των Ηνωμένων Πολιτειών (NIH publication No.81-23, revised 1985). Για τη μέτρηση της μάζας της PLTP χρησιμοποιήθηκε συγκριτική ενζυμική ανοσοχημική μέθοδος σύμφωνα με τη γενική μεθοδολογία πού χρησιμοποιήθηκε στο εργαστήριο βιοχημείας λιποπρωτεϊνών στη Dijon της Γαλλίας γιά τον προσδιορισμό της ανθρώπινης αποα-ιv (164), της αποβ (165) και της CETP (63). Όλα τα βήματα της δοσολογίας των ανοσοχημικών μεθόδων (αραιώσεις, αποχύσεις, πλυσίματα και

112 112 φωτομετρία) εκτελέσθηκαν με το Biomek 1000 BioRobotics System (Beckman Instruments, PaloAlto, USA), σε συνδυασμό με τον αυτόματο βραχίονα Zymark στο προαναφερθέν βιοχημικό εργαστήριο στη Dijon από το ειδικευμένο προσωπικό. Επίστρωση πλακών: Όγκος 100 μl από μερικώς κεκαθαρμένο κλάσμα PLTP (συγκέντρωση πρωτεΐνης 15 mg/l) σε ρυθμιστικό διάλυμα, αποτελούμενο από 15mol/l Na 2 CO 3, 35mmol/l NaHCO 3, 35mmol/l NaHCO 3, 3 mmol/l NaN 3 (ph 9,6), τοποθετήθηκε σε κάθε πηγάδι μίας πλάκας 96 θέσεων από πολυστυρένιο l (Immuno 96F type I από Nync, Kamstup, Denmark). Μετά από ολονύκτια επώαση στους 4ºC, οι πλάκες εκπλύθησαν 4 φορές με 150mmol/l NaCl-0,025% Tween-20 διάλυμα έκπλυσης. Κάθε πηγαδάκι επωάσθηκε στη συνέχεια για 30 σε θερμοκρασία δωματίου με 200μl από ένα διάλυμα βοείου λευκωματίνης, συγκέντρωσης 1%(w/ν), το οποίο περιείχε 10mmol/l Na 2 HPO 4, 5mol/l NaH 2 PO 4 και 150 mmol/l NaCl που ρυθμίστηκε σε PH 7,2 με NaOH (ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορούχου λευκωματίνης). Επεξεργασία δειγμάτων: Τα δείγματα του πλάσματος που περιείχαν PLTP, για να μετρηθούν, διαλύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορούχου λευκωματίνης και αναμείχθηκαν με ίσο όγκο πολυκλωνικών αντι-cetp αντισωμάτων διαλυμένων σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορούχου λευκωματίνης το οποίο περιείχε 1% Triton Χ-100 (Pierce Chemical Cο, Rockford, IL). Τα δείγματα του ολικού πλάσματος διαλύθηκαν σε συγκεντρώσεις 1:2 έως 1:16 στο ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορούχου λευκωματίνης. Στη συνέχεια, τα μείγματα αναμείχθησαν στα 96 βαθειά πηγάδια της πλάκας τιτλοποίησης (Beckman) όλη τη νύκτα στους 4 ο C. Ποσότητες 100 μl των μειγμάτων τοποθετήθηκαν στα μικροπηγάδια της ανοσολογικής πλάκας και επωάσθηκαν για 3 ώρες στους 37ºC. Στο τέλος της επώασης οι πλάκες εκπλύθησαν 4 φορές με το διάλυμα εκπλύσεως Tween 20.

113 113 Ανίχνευση των συνδεδεμένων αντισωμάτων αντι-pltp: Μία ποσότητα 100 μl από αντισώματα έναντι μυός συνδεδεμένα με υπεροξειδάση (BioRad, Richmond, CA), διαλυμένα σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορούχου λευκωματίνης, τοποθετήθηκαν σε κάθε πηγάδι και επωάσθηκαν για 1 ώρα στους 37ºC. Στο τέλος της επώασης, οι πλάκες εκπλύθησαν εκ νέου 4 φορές με το διάλυμα επλύσεως Tween 20. Μία ποσότητα 100 μl από πρόσφατα ετοιμασμένο διάλυμα, αποτελούμενο από 0,4g/l ο- φαινυλενεδιαμίνη, 0,68g/l διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου διαλυμένο σε 6,6mmol/l φωσφορικού νατρίου και 3,4mmol/l ρυθμιστικού διαλύματος κιτρικού (pη 5,2), τοποθετήθηκε σε κάθε πηγάδι. Μετά από 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και σε σκοτάδι, η αντίδραση διεκόπη εντελώς με την προσθήκη 50 μl από 2,5mmol/l H 2 SO 4. Οι απορροφήσεις μετρήθηκαν στα 490nm φωτομετρικά στο σύστημα Biomek 2000 Robotics και τα δεδομένα αποθηκεύθηκαν στο δίσκο του υπολογιστή για περαιτέρω επεξεργασία (62). Ρύθμιση μεθόδου: Kαθαρή PLTP (ειδική ενεργότης ~10μmol/mg/h) χρησιμοποιήθηκε ως αρχικό πρότυπο για τη ρύθμιση της μεθόδου. Η ποσότητα της PLTP στα απομονωμένα κλάσματα προσδιορίσθηκε με SDS τριχοειδή ηλεκτροφόρηση πηκτής, με καρβονική ανυδράση ως εσωτερικό πρότυπο. H συγκέντρωση της μάζας της PLTP προσδιορίσθηκε συγκρίνοντας την κορυφή της περιοχής της PLTP με την κορυφή της περιοχής που ελήφθη με μία γνωστή ποσότητα καρβονικής ανυδράσης. Τελικά, μία πρότυπη καμπύλη βαθμονόμησης τύπου ELISA -η οποία κατασκευάσθηκε με βάση καθωρισμένα διαλύματα καθαρής PLTP-, χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των επιπέδων της PLTP σε κατεψυγμένα, νορμολιπιδαιμικά ανθρώπεια πλάσματα, τα οποία αποτέλεσαν το δευτερεύον πρότυπο. Με λίγα λόγια, 8 διαλύσεις (συγκεντρώσεις PLTP από 0,0275 έως 3,52mg/l) χρησιμοποιήθηκαν για να κατασκευασθεί η δευτερεύουσα καμπύλη

114 114 βαθμονόμησης για κάθε πλάκα ανοσοτιτλοποίησης. Οι πρότυπες καμπύλες συγκρίθηκαν με τα δεδομένα, χρησιμοποιώντας λογισμικό ανάλυσης δεδομένων (Λογισμικό ανάλυσης δεδομένων Immnofit EIA/RIA, Beckman). Αναλύθηκαν 4 συγκεντρώσεις από κάθε δείγμα και η συγκέντρωση της PLTP προσδιορίσθηκε από το μέσο όρο των 4 αποτελεσμάτων. Ακρίβεια: Οι ενδοαναλυτικοί και οι διαναλυτικοί συντελεστές διακύμανσης εκτιμήθηκαν μετά από ανάλυση του ίδιου δείγματος πλάσματος 5 φορές στο ίδιο πηγαδάκι της πλάκας, την ίδια ημέρα και για 5 συνεχόμενες ημέρες, αντίστοιχα. Η διαναλυτική και ενδοαναλυτική διακύμανση ήταν 5,7% και 7,8% αντίστοιχα. Φυσιολογικές τιμές: Η μέση συγκέντρωση πλάσματος της PLTP ήταν 3,95±1,04 mg/l (εύρος διακύμανσης 1,98-5,71), με παρόμοια επίπεδα σε άνδρες και γυναίκες. Συσχέτιση μεταξύ μάζας PLTP και δραστικότητας: Tα επίπεδα της μάζας της PLTP συσχετίσθηκαν θετικά και σημαντικά με τη δραστικότητα μεταφοράς φωσφολιπιδίων, η οποία μετρήθηκε ως το ποσοστό μεταφοράς ραδιοσεσημασμένης φωσφατιδυλχολίνης από δότες [ 14 C]DPPC-liposome σε δέκτες απομονωμένης HDL (62). Αξίζει να τονισθεί ότι, αν και ο προσδιορισμός της ενεργότητας μεταφοράς λιπιδίων στο πλάσμα έχει αποδειχθεί χρήσιμος στην κλινική πράξη, στην ουσία δεν προσφέρει αξιόπιστη και ειδική εκτίμηση της PLTP per se, λόγω της παρουσίας τροποποιητικών παραγόντων στο πλάσμα (62). Για το λόγο αυτό, η προαναφερθείσα ενζυμομετρική μέθοδος φαίνεται να είναι η πλέον κατάλληλη για τον ακριβή προσδιορισμό της PLTP (167,168).

115 Υπολογισμός των υποκλασμάτων των HDL με ηλεκτροφόρηση σε βαθμιδωμένη πηκτή πολυακρυλαμιδίου H ποσοστιαία κατανομή των υποκλασμάτων των HDL υπολογίσθηκε με ηλεκτροφόρηση, ύστερα από την απομόνωση με υπερφυγοκέντρηση του κλάσματος ορού πυκνότητας d<1,21g/ml σε υλικό Spiragel 1,5% έως 25% (Spiral, Couternon, France), σύμφωνα με την τεχνική που περιγράφεται από τους Lagrost και συν. (55) και αντιστοιχεί στα υπόκλάσματα των HDL. Σε συντομία, το κλάσμα ορού που αντιστοιχεί σε πυκνότητα <1,21 g/ml ηλεκτροφορήθηκε σε g/l βαθμίδωσης πηκτής πολυακρυλαμιδίου (55). Η ηλεκτροφορητική κινητικότητα ρυθμίστηκε στα 70 V για την πρώτη ώρα και στη συνέχεια στα 150V για 20 ώρες σε ρυθμιστικό διάλυμα 90mmol/l Tris, 80mmol/lt βορικού οξέως, ph 8,3 που περιείχε 3mmol/l EDTA και 3mmol/l NaN 3. Στο τέλος της ηλεκτροφόρησης οι πηκτές βάφηκαν με Commassie Brilliant Blue (169) (εικόνα 1, σελ.133). H εικόνα των ποσοστών της κατανομής των υποκλασμάτων HDL ελήφθη μετά από ανάλυση της βαθμίδωσης σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου, με πυκνομέτρο Βio-Rad GS-670 (Bio-Rad, Hercules, CA). H σχετική αναλογία των υποκλασμάτων των HDL στον ορό ελήφθη μετά από υπολογισμό της σχετικής επιφάνειας κάτω από την καμπύλη και μετά από συσχέτισή τους με την ολική επιφάνεια, η οποία αποτελεί το ολικό κλάσμα της HDL στον ορό. Τα απομονωμένα κλάσματα είχαν ως εξής: HDL2b=9,71-12,9nm, HDL2a=8,77-9,71nm, HDL3a=8,17-8,77nm, HDL3b=7,76-8,17nm, HDL3c=7,21-7,76nm, (170,171,172) (εικόνα 1) Βιοστατιστική ανάλυση Αρχικά έγινε ηλεκτρονική καταγραφή των δεδομένων με τη χρήση ενός πακέτου εργασίας (spreadsheet), και στη συνέχεια τα δεδομένα

116 116 μεταφέρθηκαν σε ένα στατιστικό πακέτο (statistical package) για τη βιοστατιστική ανάλυσή τους. Διαμορφώθηκε μία σχεσιακή βάση δεδομένων (sequential data base), ώστε να είναι ευχερής η ανάκληση των τιμών για έλεγχο της εγκυρότητας των ηλεκτρονικών καταγραφών. Η εισαγωγή των τιμών στη βάση των δεδομένων έγινε με τη χρήση του πακέτου EXCEL version 2000 for Windows 2000 ( 2000, Microsoft Corp), ενώ για τη βιοστατιστική ανάλυση εφαρμόσθηκαν οι κατάλληλες δοκιμασίες με τη χρήση του στατιστικού πακέτου SPSS version 12 for Windows 2000 (2000, SPSS Inc). Για την παραγωγή των γραφικών παραστάσεων έγινε χρήση των παραπάνω πακέτων. Ακολούθως έγινε έλεγχος της κανονικότητας των κατανομών (normal distribution goodness of fit) όλων των ποσοτικών μεταβλητών (quantitative variables) με τη χρήση της μη παραμετρικής δοκιμασίας Kolmogorov- Smirnov. Διαπιστώθηκε ότι, όλες οι μεταβλητές της μελέτης ακολουθούσαν κανονική κατανομή στην πρωτογενή τους μορφή, επομένως ήταν εφαρμόσιμες οι παραμετρικές δοκιμασίες. Για την περιγραφή του υλικού χρησιμοποιήθηκε ο μέσος όρος (mean) και η τυπική απόκλιση (standard deviation). Οι ανεξάρτητες μεταβλητές συγκρίθηκαν μεταξύ τους με τη δοκιμασία Student s t-test. Για τον υπολογισμό των συντελεστών συσχέτισης (correlation coefficients) μεταξύ των μεταβλητών χρησιμοποιήθηκαν οι δοκιμασίες Pearson s correlation analysis και Spearman s Rank order correlation analysis. Το επίπεδο σημαντικότητας που ορίσθηκε ήταν το 5% (p<0,05).

117 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Παρουσιάζονται αρχικά τα αποτελέσματα και οι συσχετίσεις των παραμέτρων στις παχύσαρκες γυναίκες (χρόνος 0 ) καθώς και στην ομάδα των φυσιολογικού βάρους γυναικών (μάρτυρες) πριν από την παρέμβαση, στη συνέχεια τα αποτελέσματα των μεταβολών τους σε απόλυτη τιμή (Δ) και οι συσχετίσεις πριν και μετά από 4 εβδομάδες δίαιτας και αρχική απώλεια βάρους στις παχύσαρκες, και τέλος οι μεταβολές (Δ) των παραμέτρων και οι συσχετίσεις τους μετά από 16 εβδομάδες απώλειας βάρους. 3.1 Ολες οι παράμετροι στις παχύσαρκες γυναίκες και στους μάρτυρες σε χρόνο 0 Στους πίνακες 2 και 3 φαίνονται οι ανθρωπομετρικές, μεταβολικές και ορμονικές παράμετροι στις μάρτυρες και στις παχύσαρκές γυναίκες στο χρόνο 0.

118 118 Πίνακας 2. Ανθρωπομετρία και μεταβολικές παράμετροι σε παχύσαρκες και φυσιολογικού βάρους γυναίκες (μάρτυρες) σε χρόνο 0 Παράμετρος Παχύσαρκες Μάρτυρες P (N=44) (N=25) BΣ (kg) 96,7±15,0 61,4±4,5 0,000 ΔΜΣ (kg/m 2 ) 36,8±5,4 23,0±1,5 0,000 ΣΛ (%) 45,7±5,2 30,1±4,0 0,000 ΠΜ (cm) 100,0±10,0 77,4±7,9 0,000 ΠΜΙ 0,82±0,07 0,79±0,07 NS Γλυκόζη (mg/dl) 96,2±12,5 91,2±11,5 NS Ινσουλίνη (μiu/ml) 17,7±11,9 8,0±2,9 0,000 HOMA 4,34±3,59 1,79±0,65 0,001 ΧΟΛ (mg/dl) 232,0±50,2 194,9±28,75 0,001 ΤΓΛ (mg/dl) 146,3±73,3 87,3±49,6 0,001 LDL C (mg/d) 147,4±42,1 116,5±24,9 0,001 HDL C (mg/dl) 55,3±11,2 60,5±10,6 NS AποA 1 (g/l) 1,49±0,26 1,54±0,25 NS AποB (g/l) 1,10±0,27 0,91±0,24 0,005 LP(a) (mg/dl) 19,6±13,4 19,6±14,3 NS

119 119 Πίνακας 3. Οι ορμονικές παράμετροι σε παχύσαρκες και μάρτυρες σε χρόνο 0 Παράμετρος Παχύσαρκες Μάρτυρες P (N=44) (N=25) Τεστοστερόνη (ng/ml) 0,46±0,23 0,38±0,18 NS Oιστραδιόλη (pg/ml) 92,4±45,8 130,4±52,6 0,04 SHBG (mmol/l) 83,4±64,3 118,7±54,0 0,02 Koρτιζόλη (μg/dl) 19,3±5,8 17,5±5,6 NS DHEAS (ng/ml) 1,53±0,83 1,51±0,72 NS Τ3 (ng/ml) 1,35±0,25 1,29±0,23 NS Όπως φαίνεται στούς πίνακες 2 και 3, οι παχύσαρκες γυναίκες σε σχέση με τις μάρτυρες είχαν εξ ορισμού αυξημένους τους δείκτες παχυσαρκίας, υψηλότερα επίπεδα ινσουλίνης ορού, δείκτη ΗΟΜΑ και βασικών λιπιδίων (ολική χοληστερόλη, τριγλυκερίδια, LDL, αποβ), αλλά και χαμηλότερα επίπεδα 17-β-οιστραδιόλης και SHBG. Η HDL χοληστερόλη ήταν χαμηλότερη στις παχύσαρκες γυναίκες σε σχέση με τις μάρτυρες (55,3±11,2 έναντι 60,5±10,6mg/dl), αλλά η διαφορά δεν ξεπέρασε τη στατιστική σημαντικότητα (p=0,06). Στον πίνακα 4, φαίνονται τα αποτελέσματα των ειδικών παραμέτρων του μεταβολισμού των λιποπρωτεϊνών στις παχύσαρκες και στις μάρτυρες.

120 120 Πίνακας 4. Οι πρωτεΐνες μεταφοράς λιπιδίων πλάσματος και τα υποκλάσματα των HDL σε παχύσαρκες και μάρτυρες Παράμετρος Παχύσαρκες Μάρτυρες Ρ (N=44) (N=25) HDL C (mg/dl) 55,3±11,2 60,5±10,6 NS HDL 2b (%) 27,83±5,10 27,56±2,91 NS HDL 2a (%) 24,59±2,10 24,59±2,77 NS HDL 3a (%) 20,74±2,31 19,89±3,57 NS HDL 3b (%) 13,66±2,44 14,22±2,69 NS HDL 3C (%) 13,18±3,30 13,72±4,32 NS Λόγος HDL 2/3 1,133±0,288 1,108±0,176 NS CETP (mg/l) 2,75± 0,75 2,71±1,04 NS PLTP (mg/l) 9,04±2,32 7,03±2,66 0,002 Όπως φαίνεται στον πίνακα 4, τα επίπεδα της CETP στο πλάσμα δεν διέφεραν μεταξύ παχυσάρκων και μαρτύρων (Π:2,75±0,75 έναντι Μ:2,71±1,04 mg/l), ενώ τα επίπεδα PLTP πλάσματος ήταν σημαντικά υψηλότερα στις παχύσαρκες σε σχέση με τις μάρτυρες (Π:9,04±2,32 έναντι Μ:7,03±2,66mg/l, p=0,002). Επίσης, τα υποκλάσματα των HDL και η αναλογία HDL 2 /HDL 3 δε διέφεραν σημαντικά μεταξύ των 2 ομάδων. Συσχετίσεις στις παχύσαρκες και τις μάρτυρες Σε ό,τι αφορά στις συσχετίσεις των διαφόρων παραμέτρων με τις πρωτεΐνες μεταφοράς λιπιδίων πλάσματος και με τα υποκλάσματα των HDL, διαπιστώθηκαν τα εξής:

121 121 Στις μάρτυρες τα επίπεδα της PLTP συσχετίσθηκαν θετικά με την ολική χοληστερόλη (r=0,65, p=0,001), την LDL (r=0,60, p=0,004) και τη γλυκόζη νηστείας (r=0,51,p=0,009), ενώ τα επίπεδα της CETP δε συσχετίσθηκαν σημαντικά με κάποια παράμετρο. Το πηλίκο HDL2/HDL3 παρουσίασε αρνητική συσχέτιση με την ηλικία (r=-0,56, p=0,004), το ΒΣ (r=-0,64, p=0,001), το ΔΜΣ (r=-0,67, p=0,000), την ΠΜ (r=-0,72, p=0,000), την ΠΜΙ (r=-0,59, p=0,002), τα επίπεδα ολικής χοληστερόλης (r=-0,43, p=0,033), αποβ (r=-0,52,p=0,007) και τριγλυκεριδίων(r=-0,54, p=0,005). Στα σχήματα 1,2,3,4,5,6 (Σελ ) απεικονίζονται γραφικά οι προαναφερθείσες σημαντικές συσχετίσεις των CETP, PLTP και του λόγου HDL2/3 με τις άλλες παραμέτρους στις μάρτυρες. Στις παχύσαρκες γυναίκες η CETP πλάσματος συσχετίσθηκε θετικά με την ολική χοληστερόλη (r=0,35, p=0,03) και την LDL χοληστερόλη (r=0,39, p=0,01), ενώ η PLTP θετικά με την ΠΜ% (r=0,31, p=0,05), το ΣΛ% (r=0,33, p=0,04) και αρνητικά με τα επίπεδα της οιστραδιόλης (r=-0,63, p=0,015). Είναι ενδιαφέρον ότι, στις παχύσαρκες τα επίπεδα των CETP και PLTP παρουσίασαν ισχυρή θετική συσχέτιση μεταξύ τους (r=0,43, p=0,004). Τα επίπεδα της ολικής HDL συσχετίσθηκαν αρνητικά με το ΒΣ (r=-0,50, p=0,013), την ΠΜ (r=-0,66, p=0,000), την ΠΜΙ (r=-0,41, p=0,047), τα επίπεδα ινσουλίνης (r=-0,62, p=0,001), το δείκτη HOMA (r=-0,59, p=0,003) και θετικά με τα επίπεδα της αποα1 (r=0,50, p=0,013). Στα σχήματα 7,8,9,10,11,12 (Σελ ) απεικονίζονται οι παραπάνω σημαντικές συσχετίσεις των CETP, PLTP και της ολικής HDL με τις άλλες παραμέτρους στις παχύσαρκες στο χρόνο 0.

122 Mεταβολές παραμέτρων πριν και μετά από 4 εβδομάδες ολιγοθερμιδικής δίαιτας Στους πίνακες 5 και 6 φαίνονται οι μεταβολές των παραμέτρων της μελέτης μετά από την εφαρμογή δίαιτας 4 εβδομάδων. Πίνακας 5. Μεταβολές ανθρωπομετρίας, βασικών λιπιδίων και παραμέτρων μεταβολισμού της γλυκόζης μετά από δίαιτα 4 εβδομάδων Παχύσαρκες Παχύσαρκες % Παράμετρος Χρόνος 0 Χρόνος 4ε P μεταβολή (N=38) (N=38) BΣ (kg) 96,6±15,2 92,5±14,4 0,000-4,2 ΔΜΣ (kg/m 2 ) 36,7±5,0 35,2±4,7 0,000-4,1 ΣΛ (%) 45,4±5,0 44,0±5,2 0,000-3,1 ΠΜ (cm) 99,9±10,3 99,4±10,9 0,000-0,5 ΠΜΙ 0,82±0,07 0,81±0,08 0,004-1,2 Γλυκόζη (mg/dl) 96,3±12,3 94,2±12,7 NS -2,2 Ινσουλίνη (μiu/ml) 18,6±12,4 14,9±10,3 0,002-19,9 HOMA 4,59±3,75 3,63±3,44 0,01-20,9 ΧΟΛ (mg/dl) 236,2±50,7 207,6±44,3 0,000-12,1 ΤΓΛ (mg/dl) 147,9±69,8 128,0±46,4 0,047-13,4 LDL C (mg/dl) 150,0±41,4 131,3±38,3 0,000-12,5 HDL C (mg/dl) 56,1±11,7 50,1±9,2 0,000-11,1 AπoA 1 (g/l) 1,49±0,27 1,37±0,24 0,019-8,1 AπoB (g/l) 1,10±0,28 1,00±0,27 0,010-9,1 LP(a) (mg/dl) 20,9±13,8 19,6±12,9 NS -6,2

123 123 Πίνακας 6. Μεταβολές ορμονικών παραμέτρων μετά από δίαιτα 4 εβδομάδων Παχύσαρκες Παχύσαρκες % Παράμετρος Χρόνος 0 Χρόνος 4ε P μεταβολή (N=38) (N=38) Τεστοστερόνη (ng/ml) 0,47±0,24 0,45±0,27 NS -4,2% Oιστραδιόλη (pg/ml) 89,9±45,6 90,8±41,6 NS +1,0% SHBG (mmol/l) 82,5±60,7 107,5±74,4 0, ,3% Koρτιζόλη (μg/dl) 19,2±5,8 18,3±5,7 NS -4,7% DHEAS (ng/ml) 1,49±0,82 1,50±0,87 NS +0,7% ΟλικήΤ3 (ng/ml) 1,37±0,25 1,25±0,26 0,001-8,8% Από τα αποτελέσματα διαπιστώνεται ότι, η εφαρμογή ολιγοθερμιδικής δίαιτας για διάστημα 1 μηνός προκάλεσε ήπια, αλλά στατιστικά σημαντική, μείωση του βάρους και του ΔΜΣ, της τάξης του 4% σε σχέση με τα αρχικά τους επίπεδα. Παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές μεταβολές στις περισσότερες μεταβολικές παραμέτρους. Η ολική χοληστερόλη και η LDL μειώθηκαν κατά περίπου 12%, τα τριγλυκερίδια κατά 13%, η αποb κατά 9%, ενώ παράλληλα μειώθηκαν σημαντικά τα επίπεδα της ολικής HDL κατά 11% και της AπoA1 κατά 8%. Αντίθετα, τα επίπεδα της LP(α) δεν παρουσίασαν στατιστικά σημαντική μεταβολή. Σημαντική μείωση διαπιστώθηκε στα επίπεδα ινσουλίνης και στο δείκτη ινσουλινοαντίστασης ΗΟΜΑ, κατά 20% και 21% αντίστοιχα, ενώ τα επίπεδα γλυκόζης νηστείας δεν μεταβλήθηκαν σημαντικά. Σε επίπεδο ορμονών, οι φυλετικές και επινεφριδιακές ορμόνες

124 124 δεν μεταβλήθηκαν σημαντικά, αντίθετα η SHBG αυξήθηκε σημαντικά κατά 30% και η ολική Τ3 ελαττώθηκε σημαντικά κατά περίπου 9%. Στον επόμενο πίνακα 7, καταγράφονται οι μεταβολές των υποκλασμάτων HDL καθώς και των CETP και PLTP. Πίνακας 7. Μεταβολές των πρωτεϊνών μεταφοράς λιπιδίων και των υποκλασμάτων των HDL μετά από 4 εβδομάδες ολιγοθερμιδικής Παχύσαρκες Παχύσαρκες % Παράμετρος Χρόνος 0 Χρ. 4 εβδ. Ρ μεταβολή (N=38) (N=38) CETP (mg/l) 2,76±0,79 2,31±0,69 0,000-16,3 PLTP (mg/l) 9,01±2,44 8,35±2,57 0,043-7,4 HDL (mg/dl) 56,10±11,67 50,10±9,21 0,000-11,1 HDL2b (%) 27,07±4,65 26,14±5,21 0,013-3,4 HDL2a (%) 24,57±2,01 24,25±2,04 0,038-1,3 HDL3a (%) 20,95±2,36 21,37±2,86 NS +3,4 HDL3b (%) 13,99±2,20 14,58±2,33 0,004 +4,2 HDL3c (%) 13,41±3,09 13,63±3,03 NS +1,6 Λόγος HDL2/3 1,09±0,23 1,04±0,24 0,003-4,5 Όπως φαίνεται στον πίνακα 7, η μείωση της ολικής HDL κατά την οξεία ελάττωση των θερμίδων και την αρχική απώλεια βάρους, συνοδεύθηκε και με αλλαγές στη δομή των επιμέρους υποκλασμάτων, και συγκεκριμένα με μία στροφή προς τα μικρού μεγέθους υποκλάσματα. Η εκατοστιαία ποσότητα των HDL 2b και HDL 2a μειώθηκε σημαντικά, κατά 3,4% και 1,3% αντίστοιχα, ενώ αντίθετα η εκατοστιαία ποσότητα των HDL 3b αυξήθηκε

125 125 σημαντικά κατά 4,2%. Ως αποτέλεσμα των αλλαγών αυτών, ο λόγος HDL 2 προς HDL 3 κατά το διάστημα αυτό μειώθηκε σημαντικά κατά 4,5%. Η συγκέντρωση της CETP στο πλάσμα μειώθηκε σημαντικά κατά 16,3% (από 2,76±0,79 σε 2,31±0,69mg/l, p=0,000) και το ίδιο παρατηρήθηκε και με τη συγκέντρωση της PLTP (μείωση κατά 7,4% από 9,01±2,44 σε 8,35±2,57mg/l, p=0,043). Συσχετίσεις των μεταβολών μεταξύ των διαφόρων παραμέτρων στις 4 εβδομάδες της διαιτητικής παρέμβασης Οι μεταβολές σε απόλυτη τιμή (Δ) των επιπέδων της CETP στις 4 εβδομάδες συσχετίσθηκαν θετικά με τις μεταβολές του σωματικού βάρους (r=0,35, p=0,031), του ΔΜΣ (r=0,32, p=0,05), της ολικής χοληστερόλης (r=0,34, p=0,038,) και της LDL (r=0,34, p=0,035,). Δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση μεταξύ των μεταβολών των επιπέδων της CETP και των μεταβολών παραμέτρων ινσουλινοαντίστασης, επιπέδων HDL και υποκλασμάτων της. Οι μεταβολές (Δ) των επιπέδων της PLTP συσχετίσθηκαν θετικά με τις μεταβολές του % σωματικού λίπους (r=0,42, p=0,009), της ΠΜ (r=0,38, p=0,02) και της ΠΜΙ (r=0,40, p=0,014). Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές συσχετίσεις των μεταβολών των επιπέδων της PLTP με τις παραμέτρους ινσουλινοαντίστασης, των επιπέδων HDL και των υποκλασμάτων των HDL. Οι μεταβολές αμφοτέρων των CETP και PLTP δεν συσχετίσθηκαν με την ολική πρόσληψη θερμίδων της δίαιτας (r=0,18, p=0,28, και r=0,01, p=0,96, αντιστοίχως). Επίσης, δεν παρατηρήθηκε καμία συσχέτιση των μεταβολών τους με τα επιμέρους λιπαρά οξέα της δίαιτας: με τα κεκορεσμένα λιπαρά (r=0,29, p=0,07 για την CETP και r=0,19, p=0,25 για την PLTP), με τα μονοακόρεστα (r=-0,13, p=0,41 για την CETP και r=-0,09, p=0,57 για την PLTP), αλλά ούτε και με τα πολυακόρεστα (r=0,23, p=0,18 για την CETP και r=0,15, p=0,37 για την PLTP).

126 126 Είναι ενδιαφέρον ότι, οι μεταβολές των επιπέδων CETP και PLTP συσχετίσθηκαν θετικά μεταξύ τους κατά τη διάρκεια της μηνιαίας απώλειας βάρους (r=0,47, p=0,003), όχι όμως και στο τέλος του μήνα (r=0,27, p=0,11). Στα σχήματα 13,14,15,16 (Σελ ) απεικονίζονται σχηματικά οι διαπιστωθείσες σημαντικές συσχετίσεις των μεταβολών (Δ) των CETP και PLTP μεταξύ τους και με άλλες παραμέτρους στις 4 εβδομάδες της παρέμβασης.

127 Μεταβολές παραμέτρων πριν και 4 μήνες μετά την απώλεια βάρους Οι μεταβολές των διαφόρων βασικών παραμέτρων φαίνονται στους πίνακες 8 και 9. Πίνακας 8. Μεταβολές ανθρωπομετρίας, βασικών λιπιδίων και παραμέτρων μεταβολισμού γλυκόζης μετά από 4μηνη απώλεια βάρους Παχύσαρκες Παχύσαρκες % Παράμετρος Χρόνος 0 Χρόνος 16ε P μεταβολή (Ν=24) (Ν=24) ΒΣ (kg) 100,7± 15,4 89,9 ±13,0 0,000-10,7 ΔΜΣ (kg/m 2 ) 38,2± 5,0 34,1± 4,4 0,000-10,7 ΣΛ (%) 47,1± 5,3 42,1 ±4,9 0,000-10,6 ΠΜ (cm) 102,7 ±10,2 93,3± 9,9 0,000-9,1 ΠΜΙ 0,82± 0,09 0,81 ±0,08 NS -1,2 Γλυκόζη (mg/dl) 96,7± 11,0 92,2± 12,6 NS -4,6 Iνσουλίνη (μιu/ml) 19,2 ±12,9 13,0 ±7,1 0,005-32,3 HOMA 4,69± 3,75 2,99± 1,75 0,006-36,2 ΧΟΛ (mg/dl) 236,7±53,0 197,1 ±55,4 0,000-16,6 ΤΓΛ (mg/dl) 138,3± 60,9 116,9± 43,6 NS -15,4 LDL (mg/dl) 152,9 ±44,1 126,7± 33,4 0,000-17,1 HDL (mg/dl) 56,1± 11,3 53,5 ±10,0 NS -4,6 AποΑ 1 (g/l) 1,49± 0,30 1,47± 0,31 NS -1,4 ΑποΒ (g/l) 1,12± 0,28 0,96 ±0,21 0,001 14,2 LP(a) (mg/dl) 16,6± 9,9 14,2 ±8,7 NS -14,4

128 128 Πίνακας 9. Μεταβολές ορμονικών παραμέτρων μετά από 4μηνη απώλεια βάρους Παχύσαρκες Παχύσαρκες % Παράμετρος Χρόνος 0 Χρόνος 16ε P μεταβολή (Ν=24) (Ν=24) Τεστοστερόνη (ng/ml) 0,44 ±0,20 0,39 ±0,22 NS -11,3 Oιστραδιόλη (pg/ml) 100,1 ±48,0 108,2 ±55,4 NS +7,5 SHBG (mmol/l) 91,7 ±70,6 112,7 ±69,2 0, ,6 Κορτιζόλη (μg/dl) 18,7± 5,8 17,2± 5,6 NS -8,0 DHEAS (ng/ml) 1,42± 0,73 1,33± 0,65 NS -6,3 Ολική Τ3 (ng/ml) 1,37± 0,27 1,17± 0,22 0,000-14,6 Από τα αποτέλεσματα που καταγράφηκαν στους προηγούμενους πίνακες διαπιστώνεται ότι, η εφαρμογή της ολιγοθερμιδικής δίαιτας για 4 μήνες προκάλεσε σημαντική μείωση των ανθρωπομετρικών δεικτών (του σ. βάρους, του ΔΜΣ και του ΣΛ % κατά περίπου 10,5%, της ΠΜ κατά 9%), των βασικών λιπιδίων (της ολικής και της LDL χοληστερόλης κατά περίπου 17% και της αποb κατά 14%), των παραμέτρων μεταβολισμού υδατανθράκων (της ινσουλίνης κατά 32% και του δείκτη ΗΟΜΑ κατά 36%) και της ολικής Τ3 κατά 15%. Η SHBG αυξήθηκε σημαντικά κατά περίπου 19%. Αντίθετα, δεν μεταβλήθηκαν σημαντικά ο δείκτης ΠΜΙ, τα επίπεδα των τριγλυκεριδίων, της ολικής HDL, της αποα1, της LP(α), της γλυκόζης, της τεστοστερόνης, της οιστραδιόλης, της κορτιζόλης και της DHEAS.

129 129 Στον επόμενο πίνακα 10 φαίνονται οι επιμέρους μεταβολές των υποκλασμάτων των HDL και των CETP και PLTP μετά από τετράμηνη δίαιτα. Πίνακας 10. Μεταβολές των υποκλασμάτων των HDL και των CETP και PLTP μετά από 4μηνη απώλεια βάρους Παχύσαρκες Παχύσαρκες % Παράμετρος Χρόνος 0 Χρόνος 16ε p μεταβολή (Ν=24) (Ν=24) HDL 2b (%) 27,60±4,76 26,99±4,43 NS -2,2% HDL 2a (%) 24,90±2,21 24,27±1,85 0,032-2,5% HDL 3a (%) 20,89±2,23 20,67±2,39 ΝS -1,0% HDL 3b (%) 13,82±2,28 14,49±2,11 0,046 +4,6% HDL 3c (%) 12,77±2,97 13,58±3,06 0,052 +6,0% Λόγος HDL2/3 1,13±0,27 1,07±0,20 NS -5,3% CETP (mg/l) 2,95±0,81 2,52±0,67 0,002-14,6% PLTP (mg/l) 9,75±2,44 8,19±2,25 0,000-16,0% Από τα παραπάνω αποτελέσματα φαίνεται ότι, τα επίπεδα της ολικής HDL αρχίζουν να ανακάμπτουν σε σχέση με την πτώση τους μετά την 4 η εβδομάδα της δίαιτας και δεν διαφέρουν πλέον σημαντικά σε σχέση με τα αρχικά επίπεδα. Συνεχίζεται, όμως, η παρατηρούμενη στροφή προς τα μικρότερα σωματίδια HDL και, συγκεκριμένα, παρατηρείται σημαντική αύξηση των HDL 3b και των HDL 3c και σημαντική μείωση των HDL 2a, όμως ο

130 130 λόγος HDL2/HDL3 δεν διαφέρει πλέον σημαντικά σε σχέση με τα αρχικά επίπεδα. Τα επίπεδα των CETP και PLTP παρουσιάζουν σημαντική μείωση σε σχέση με τα αρχικά επίπεδα, της τάξης του 14,5% και 16%, αντίστοιχα. Συσχετίσεις των μεταβολών μεταξύ των διαφόρων παραμέτρων στους 4 μήνες της διαιτητικής παρέμβασης Οι μεταβολές (Δ) των επιπέδων της CETP σχετίσθηκαν σημαντικά και θετικά με τις μεταβολές (Δ) του ΒΣ (r=0,57, p=0,003), του ΔΜΣ (r=0,54, p=0,007), της ΠΜ (r=0,40, p=0,049), της Ολ.Χολ (r=0,77, p=0,000), της LDL (r=0,44, p=0,31) και της ΑπoB (r=0,43, p=0,035). Oι μεταβολές των επιπέδων της PLTP σχετίσθηκαν θετικά με την ΠΜΙ (r=0,52, p=0,01) και αρνητικά με την SHBG (r=-0,48, p=0,02). Στα σχήματα 17,18,19,20 (Σελ ) απεικονίζονται σχηματικά οι διαπιστωθείσες σημαντικές συσχετίσεις των μεταβολών (Δ) κατά τους 4 μήνες τις παρέμβασης. Συσχετίσεις παραμέτρων στο τέλος του 4 ου μήνα (κατά την ολοκλήρωση της μελέτης) Tα επίπεδα της CETP συσχετίσθηκαν σημαντικά και θετικά με τα επίπεδα της PLTP (r=0,44, p=0,036), ενώ τα επίπεδα της PLTP σημαντικά και αρνητικά με τα επίπεδα της 17-β-οιστραδιόλης (r= -0,64, p=0,015). Τα ολικά επίπεδα της HDL είχαν αρνητική, ισχυρή συσχέτιση με τις ανθρωπομετρικές παραμέτρους ΒΣ (r=-0,58, p=0,03), ΠΜ (r=-0,68, p=0,000) και ΣΛ% (r=-0,56, p=0,005) και με τα επίπεδα ινσουλίνης ορού (r=-0,49, p=0,014) και ΗΟΜΑ (r=-0,46, p=0,024). Θετική συσχέτιση είχαν τα ολικά επίπεδα της HDL με τα επίπεδα της αποα1 (r=0,55, p=0,000). Ο λόγος HDL 2/3 είχε αρνητική συσχέτιση με το ΒΣ (r=-0,45, p=0,027) και την

131 131 ΠΜ (r=-0,52, p=0,009,) ενώ θετική συσχέτιση με τα επίπεδα της κορτιζόλης (r=0,44, p=0,036). Στα σχήματα 21,22,23,24,25,26 (Σελ ) απεικονίζονται σχηματικά οι σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ των διαφόρων παραμέτρων κατά την ολοκλήρωση της μελέτης. Στην εικόνα 1 απεικονίζονται τα κλάσματα των HDL σε ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου ενδεικτικά σε μία παχύσαρκη γυναίκα και οι μεταβολές τους κατά την απώλεια βάρους. Στις εικόνες 2α και 2β απεικονίζονται συνολικά οι μεταβολές των CETP και PLTP πλάσματος, καθώς και του λόγου HDL2/HDL3, στα 2 χρονικά στιγμιότυπα της μελέτης.

132 132 Εικόνα 1. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου. Απεικονίζονται τα υποκλάσματα των HDL σε παχύσαρκη γυναίκα και οι μεταβολές τους μετά από 4 και 16 εβδομάδες απώλειας βάρους. Διακρίνεται η μείωση των HDL-2 και η ήπια αύξηση των HDL-3