Η ΘΡΟΜΒΟΦΙΛΙΑ ΩΣ ΑΙΤΙΟ ΚΑΘ ΕΞΙΝ ΑΠΟΒΟΛΩΝ

Transcript

1 ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Η ΘΡΟΜΒΟΦΙΛΙΑ ΩΣ ΑΙΤΙΟ ΚΑΘ ΕΞΙΝ ΑΠΟΒΟΛΩΝ ΝΑΤΑΣΑ ΣΟΥΡΕΤΗ ΑΘΗΝΑ 2012

2 «Ένα Παιδί Γεννιέται» (75, 97) 2 Σελίδα

3 Αφιερωµένη, στην οικογένειά µου που µε στήριξε... Ευχαριστώ τον Καθηγητή µου Νικόλαο ρακούλη και όλους τους δασκάλους µου και τους γιατρούς που µου έδωσαν την ευκαιρία να γευθώ το «µυστήριο» της Κλινικής Φαρµακολογίας... 3 Σελίδα

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα Α.ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ... 7 ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 8 Αιµόσταση... 8 Αγγειακό τοίχωµα... 9 Αιµοπετάλια Παράγοντες πήξης Σύστηµα επαφής Σχηµατισµός προθροµβινάσης Σχηµατισµός ινώδους Σταθεροποίηση ινώδους Ινωδόλυση Αιµόσταση και κύηση Παράγοντες πήξης και κύηση Σύστηµα Ινωδόλυσης και κύηση Αιµοπετάλια και κύηση Το σύνδροµο καθ έξιν αποβολών Η θροµβοφιλία Σχέση γονιδίων µε την ανάπτυξη θροµβοφιλίας ΓONIDIO ΤΗΣ ΜΕΘΥΛΕΝΟ-ΤΕΤΡΑΥ ΡΟΦΥΛΛΙΚΗΣ ΑΝΑΓΩΓΑΣΗΣ (MTHFR C677T/A1298C) ΓΟΝΙ ΙΟ ΤΟΥ ΑΝΑΣΤΟΛΕΑ ΤΟΥ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΤΗ ΤΟΥ ΠΛΑΣΜΙΝΟΓΟΝΟΥ (Plasminogen activator inhibitor 1) (PAI-1) 4G/5G ΓΟΝΙ ΙΟ ΤΟΥ ΜΕΤΑΤΡΕΠΤΙΚΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ ΤΗΣ ΑΓΓΕΙΟΤΕΣΙΝΗΣ ACE (ACE Met 235Thr) Μετατρεπτικό ένζυµο της αγγειοτενσίνης ΓΟΝΙ ΙΟ ΤΗΣ ΑΠΟΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΗΣ Ε APOE Apolipoprotein E3 (APOE4) Τ3937+C4075, Apolipoprotein E4 (APOE3) C3937+C ΓΟΝΙ ΙΟ ΤΗΣ ΕΝ ΟΘΗΛΙΑΚΗΣ ΣΥΝΘΕΤΑΣΗΣ του Μονοξειδίου του αζώτου (e-nos GENE) Α. Ο ρόλος της ενδοθηλιακής συνθάσης του Μονοξειδίου του Αζώτου.. 27 Β. ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ ΜΟΝΟΞΕΙ ΙΟΥ ΤΟΥ ΑΖΩΤΟΥ Γ. Ενδοθηλιακή συνθετάση του NO οµή της enos Ε. ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΜΟΝΟΞΕΙ ΙΟΥ ΤΟΥ ΑΖΩΤΟΥ Σελίδα

5 ΣΤ.. Ζ. Η. Θ. ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ ΤΟΥ ΕΝ ΟΘΗΛΙΟΥ... Ρύθµιση της ροής του αίµατος... Ο ρόλος του µονοξειδίου του αζώτου στη ρύθµιση της ροής του αίµατος... Ο ρόλος άλλων ουσιών που παράγονται από το ενδοθήλιο στη ρύθµιση της ροής του αίµατος... Ρύθµιση της διαδικασίας της πήξης και ινωδόλυσης... Αρχική αιµόσταση... Κυρίως πήξη... Ινωδόλυση... Ο ρόλος του µονοξειδίου του αζώτου στην πήξη... ΥΠΕΡΟΜΟΚΥΣΤΕΪΝΑΙΜΙΑ... Ο ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΣ enos 3 - Glu298Asp... Ο ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΣ enos 3 - T768C Β. ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ Ο ΠΛΗΘΥΣΜΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΚΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ ΣΤΗΝ ΑΝΑΛΥΣΗ ΓΟΝΟΤΥΠΩΝ ΑΛΥΣΙ ΩΤΗ ΑΝΤΙ ΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (PCR) Υλικά Αντιδραστήρια ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ Aναλυτικές µέθοδοι ειγµατολειψίες Αποµόνωση γενετικού υλικού (DNA) και ανίχνευση πολυµορφισµών µε το CVD StripAssay της εταιρίας ViennaLab Diagnostics GmbH (Austria) 61 Αποµόνωση γενετικού υλικού (DNA) ιαδικασία Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυµεράσης Υβριδισµός και αποκάλυψη των πολυµορφισµών της µελέτης Γ. ΑΝΑΛΥΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ισορροπία Hardy-Weinberg Συνοπτική περιγραφή του δείγµατος Χορηγούµενη θεραπεία και µεταλλάξεις γονιδίων Κατανοµή γονοτύπων και αλληλόµορφων Σελίδα

6 Απλή λογαριθµιστική παλινδρόµηση για τη σχέση καθ έξιν αποβολών και πολυµορφισµών... Αθροιστικός δείκτης συνολικού κινδύνου για εµφάνιση καθ έξιν αποβολών... Εναλλακτικός αθροιστικός δείκτης συνολικού κινδύνου για την εµφάνιση καθ έξιν αποβολών... ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι Σελίδα

7 A ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 7 Σελίδα

8 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Αν κάποιος αναλογισθεί τη σηµαντικότητας µιας επιτυχούς τελειόµηνης κύησης, τότε εύκολα γίνεται αντιληπτό πως το φαινόµενο των καθ έξιν αποβολών είναι ζήτηµα ιδιαίτεραα ευαίσθητο και κυρίως φλέγον για τα ζευγάρια που το αντιµετωπίζουν και χρήζουν θεραπείας. Η αλµατώδης ανάπτυξη της τεχνολογίας και της µοριακής βιολογίας, έδωσε τα κατάλληλα εφόδια, ώστε σήµ µερα να είµαστε σε θέση να έχουµε µια σχετικώς εµπεριστατωµένη άποψη γι αυτό το καίριο ζήτηµα και να µπορούµ µε να αντιµετωπίσουµε ένα ιδιαίτερα µεγάλο ποσοστό των ατόµων που παρουσιάζουν καθ έξιν αποβολές. 1.1 Αιµόσταση Η αιµόσταση είναι ένας φυσιολογικός µηχανισµός µέσω του οποίου επιτυγχάνεται η αναστολή της αιµοραγίας και η οµαλή κυκλοφορία του αίµατος µέσα στα αγγεία. Στην διαδικασία της αιµόστασης συµµετέχουν: το αγγειακό τοίχωµα, τα αιµοπετάλια, οι παράγοντες πήξης, οι αναστολείς των παραγόντων πήξης καθώς και οι αναστολείς της ινωδόλυσης. Η ενεργοποίηση της αιµόστασης αρχίζει από τη στιγµή της βλάβης του ενδοθηλίου ή του τραυµατισµού του αγγείου. (Σχήµα 1) Σχήµα 1: Μηχανισµός αιµόστασης (1) 8 Σελίδα

9 1.2 Αγγειακό τοίχωµα Το αγγείο συσπάται αµέσως µετά την τρώση του. Η σύσπαση του αγγειακού τοιχώµατος οφείλεται στην παρουσία αγγειοσυσπαστικών ουσιών (αδρεναλίνη, νοραδρεναλίνη, θροµβοξάνη-α2) που, είτε εκλύονται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα αιµοπετάλια, είτε προσφέρονται µε την κυκλοφορία (1). Ο ρόλος της σύσπασης του αγγειακού τοιχώµατος είναι προφανής. Αφενός µειώνεται η ροή του αίµατος µέσα στο αγγείο και αφετέρου προσεγγίζουν τα χείλη του αγγειακού τραύµατος και διευκολύνεται η επίσχεση της αιµορραγίας (1). Όµως και τα ενδοθηλιακά κύτταρα συµµετέχουν στο µηχανισµό της αιµόστασης, εκκρίνοντας παράγοντες που την ευνοούν ή την αναστέλλουν (προστακυκλίνη, ιστικός παράγοντας, αντιθροµβίνη ΙΙΙ, θροµβοµοντουλίνη, παράγοντας von Willebrand, φιµπρονεκτίνη, ενεργοποιητής ιστικού πλασµινογόνου) (2, 3, 4, 5). (Σχήµα 2) Σχήµα 2: Ενδοθήλιο και ενεργοποίηση µηχανισµού πήξης-ινωδόλυσης (1-5) 9 Σελίδα

10 1.3 Αιµοπετάλια Τα αιµοπετάλια προστρέχουν στο σηµείο της βλάβης πριν από άλλα κυτταρικά στοιχεία. Προσκολλώνται στα χείλη του αγγειακού τραύµατος και συµβάλλουν αποφασιστικά στην επίσχεση της αιµορραγίας (6,7). Η προσκόλληση τους γίνεται πάνω στο κολλαγόνο και στα υπενδοθηλιακά µικροϊνίδια που αποκαλύπτονται µε την καταστροφή του ενδοθηλίου (φάση προσκόλλησης) (6,7). Με την προσκόλληση τους τα αιµοπετάλια ενεργοποιούνται και χάνουν τη δισκοειδή όψη τους. Γίνονται σφαιρικά, αποκτούν ψευδοπόδια και απελευθερώνουν ADP (8,9). Η παρουσία του ADP προκαλεί συσσώρευση και άλλων αιµοπεταλίων πάνω στα ήδη προσκολληµένα αιµοπετάλια, καλύπτοντας έτσι το αγγειακό τραύµα σε όλη του την έκταση (φάση συσσώρευσης) (9,10). Με την συνεχή συσσώρευση αιµοπεταλίων από την κυκλοφορία δηµιουργείται τελικά ο αντιαιµοπεταλιακός θρόµβος (πρωτογενής αιµοστατικός θρόµβος), που επαρκεί για να επιφέρει προσωρινή επίσχεση της αιµορραγίας παρόλο που είναι ασταθής Η οριστική αιµόσταση βέβαια θα επιτευχθεί µε το σχηµατισµό της ινικής µετά από την ενεργοποίηση του µηχανισµού πήξης. (9,10,11,12). 1.4 Παράγοντες πήξης Πήξη του αίµατος, είναι το σύνολο της αλληλοδιάδοχης ενεργοποίησης των πρωτεϊνών του πλάσµατος (παραγόντων πήξης), που οδηγεί στην παραγωγή θροµβίνης και στο σχηµατισµό ινώδους (ερυθρού θρόµβου). Αυτό οδηγεί σε απόφραξη του αγγείου και τελικά σε µόνιµη επίσχεση της αιµορραγίας Σύστηµα επαφής Το σύστηµα επαφής είναι ένα σύνολο προενζύµων που ενεργοποιούνται και µετατρέπονται σε δραστικά ένζυµα, µε την επαφή τους σε αρνητικά φορτισµένες επιφάνειες. Περιλαµβάνει τον παράγοντα ΧΙ, τον παράγοντα ΧΙΙ, την προκαλλικρείνη και το υψηλού µοριακού βάρους κινινογόνο (13, 14, 15, 16, 17, 18). Το σύστηµα αυτό αποσκοπεί στην ενεργοποίηση του παράγοντα ΧΙ (14, 18). Ο ενεργοποιηµένος παράγοντας ΧΙ, ενεργοποιεί τον παράγοντα ΙΧ (13-18) Σχηµατισµός προθροµβινάσης Η µετατροπή της προθροµβίνης σε θροµβίνη γίνεται µε την παρέµβαση της προθροµβινάσης. Η προθροµβινάση είναι ένα σύµπλεγµα µορίων αποτελούµενο 10 Σελίδα

11 από τον παράγοντα V, τον παράγοντα Χ, το φωσφολιπίδιο και τα ιόντα ασβεστίου (19). Ο παράγοντας Χ ενεργοποιείται από τον ενεργοποιηµένο παράγοντα VII (εξωγενής οδός) και από τον ενεργοποιηµένο παράγοντα ΙΧ (ενδογενής οδός), (Σχήµα 3), (14-18, 20-24). Σχήµα 3: Εξωγενής και Ενδογενής οδός µηχανισµού πήξης (14-18,20-24) Ο ενεργοποιηµένος παράγοντας Χ, που θα δηµιουργηθεί µε την εξωγενή αλλά και την ενδογενή οδό, µετατρέπει την προθροµβίνη σε θροµβίνη (19,25) Σχηµατισµός ινώδους Ινωδογένεση είναι το σύνολο των διεργασιών που οδηγούν στην µετατροπή του ινωδογόνου σε ινώδες και το σχηµατισµό του πήγµατος (26,27). Στο σχηµατισµό της ινωδογένεσης υπεισέρχονται: το ινωδογόνο, η προθροµβίνη και ο παράγοντας ΧΙΙΙ (26,27,28). Η µετατροπή του ινωδογόνου σε ινώδες, επιτελείται 11 Σελίδα

12 µε τη δράση της θροµβίνης. Η µετατροπή της προθροµβίνης σε θροµβίνη γίνεται µε την παρέµβαση της προθροµβινάσης (19, 25) Σταθεροποίηση ινώδους Ο παράγοντας ΧΙΙΙ που βρίσκεται ανάµεσα στα πολυµερισµένα µόρια ινώδους, ενεργοποιείται µε την δράση της θροµβίνης (28). Η πήξη του αίµατος αυτοελέγχεται µε: την αποδόµηση των ενεργοποιηµένων παραγόντων πήξεως από το ήπαρ, τους φυσιολογικούς αναστολείς της πήξης και την τοπική ενεργοποίηση του ινωδολυτικού µηχανισµού. Φυσιολογικοί αναστολείς της πήξης είναι: οι αναστολείς των σερίνη-εστερασών (αντιθροµβίνη ΙΙΙ, συµπαράγοντας ΙΙ της ηπαρίνης, αναστολέας της C1-εστεράσης, α1-αντιθρυψίνη, α2-αντιπλασµίνη, α2- µακροσφαιρίνη) και οι αναστολείς των επιταχυντών της πήξης (πρωτεΐνη C,πρωτεΐνη S).(29,30). (Σχήµα 4) 1.5 Ινωδόλυση Ινωδόλυση είναι το σύνολο των φαινοµένων που αποσκοπούν στην αποδόµηση του ινώδους (31). Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες οδηγεί στη λύση του θρόµβου. Η ινωδόλυση επιτελείται µε την παρέµβαση της πλασµίνης (31). Η πλασµίνη βρίσκεται στο πλάσµα σε αδρανή µορφή (πλασµινογόνο). Η µετατροπή του πλασµινογόνου σε πλασµίνη γίνεται µε την δράση των ενεργοποιητών του πλασµινογόνου (ιστικός ενεργοποιητής του πλασµινογόνου, ουροκινάση, βακτηριακοί ενεργοποιητές, πλασµατικοί ενεργοποιητές) (32). Η ινωδόλυση είναι φαινόµενο ελεγχόµενο από την παρουσία: των αναστολέων της ενεργοποίησης του πλασµινογόνου (plasminogen activator inhibitor-1, plasminogen activator inhibitor-2) και των αναστολέων της πλασµίνης (α2-αντιπλασµίνη, α1- αντιθρυψίνη, α2-µακροσφαιρίνη) (32). 12 Σελίδα

13 Σχήµα 4: Φυσικοί ανασταλτές (29-30) 1.6 Αιµόσταση και κύηση Η αιµόσταση είναι µία δυναµική και ευαίσθητη ισορροπία µεταξύ των συστηµάτων πήξεως και ινωδόλυσης. Κατά τη διάρκεια της εγκυµ µοσύνης αυτή η ισορροπία µετατοπίζεται προς µία κατάσταση υπερπηκτικότητας. Είναι πιο εµφανής προς το τέλος της εγκυµοσύνης και στην λοχεία, ενώ επανέρχεται στην προ της εγκυµοσύνης κατάσταση περίπου 4 βδοµάδες µετά τον τοκετό (33). Οι φυσιολογικές µεταβολές στην αιµόσταση, που συµβαίνουν κατά τη διάρκεια της εγκυµοσύνης, είναι πιθανότατα ορµονολογικής αιτιολογίας (34) και έχουν σκοπό την προστασία της εγκύου από σοβαρή αιµορραγία κατά τη διάρκεια του τοκετού (33,35). Ταυτόχρονα όµ µως, προδιαθέτουν για θροµβοεµβολικές επιπλοκές κατά τη διάρκεια της εγκυµοσύνης και της λοχείας (35). 1.7 Παράγοντες πήξης και κύηση Σχετικά µε τις µεταβολές των επιπέδων των παραγόντων πήξεως κατά τη διάρκεια της εγκυµοσύνης έχουν πραγµατοποιηθεί διάφορες µελέτες. Τα επίπεδα της προθροµβίνης παρουσιάζουν είτε αύξηση στην αρχή της εγκυµοσύνης που ακολουθείται από µείωση και σταθεροποίηση (36). Τα επίπεδα του παράγοντα VII αυξάνουν βαθµιαία κατά τη διάρκεια της εγκυµοσύνης, έτσι ώστε στο τέλος της να 13 Σελίδα

14 είναι 10-πλάσια από τα προ-εγκυµοσύνης επίπεδα (38). Κατα τη διάρκεια της εγκυµοσύνης παρατηρούνται σηµαντικές αλλαγές στο σύµπλεγµα του παράγοντα VIII. Τα επίπεδα του παράγοντα VIII, του αντιγόνου του παράγοντα von Willebrand (VWF) και της ριστοκετίνης, αυξάνονται σηµαντικά (39). Η αύξηση των επιπέδων του παράγοντα VIII, και του παράγοντα του von Willebrand είναι παράλληλη κατά το πρώτο µισό της εγκυµοσύνης, ενώ στην συνέχεια αποκλίνει λόγω της µεγαλύτερης αύξησης του αντιγόνου του παράγοντα von Willebrand. Έτσι, ο λόγος αντιγόνο του παράγοντα von Willebrand / παράγοντας VIII αυξάνει από 1 σε 2 (40). Τα επίπεδα των παραγόντων IX, X και ΧΙΙ αυξάνονται βαθµιαία κατά τη διάρκεια της εγκυµοσύνης (41, 42). Ωστόσο, αρκετοί συγγραφείς αναφέρουν ότι κατά τη διάρκεια της εγκυµοσύνης, η αύξηση των επιπέδων του παράγοντα IX είναι µικρή (43). Οι απόψεις για τον παράγοντα ΧΙ είναι αντικρουόµενες. Ορισµένοι συγγραφείς αναφέρουν ότι κατά τη διάρκεια της εγκυµοσύνης τα επίπεδα του µειώνονται βαθµιαία φτάνοντας στο 3 ο τρίµηνο επίπεδα 60-70% (43,44). Άλλοι αναφέρουν ότι τα επίπεδά του παραµένουν σταθερά ή εµφανίζουν µια µικρή αύξηση. (45). Τα επίπεδα του παράγοντα ΧΙΙΙ αυξάνουν στην αρχή της εγκυµοσύνης και επιστρέφουν στα προ της εγκυµοσύνης επίπεδα κατά το 3 ο τρίµηνο (46). Τα επίπεδα του ινωδογόνου αυξάνονται σταθερά κατά τη διάρκεια της εγκυµοσύνης. Λαµβάνοντας υπόψη την αύξηση του όγκου του πλάσµατος, τα επίπεδα του κυκλοφορούντος ινωδογόνου είναι περίπου διπλάσια από τα προ της εγκυµοσύνης επίπεδα (47,48,49,50). Για τις µεταβολές των επιπέδων των ενδογενών αντιπηκτικών παραγόντων κατά την διάρκεια της εγκυµοσύνης έχουν πραγµατοποιηθεί διάφορες µελέτες. Τα επίπεδα της πρωτείνης C και της αντιθροµβίνης ΙΙΙ, δεν φαίνεται να επηρεάζονται από την εγκυµοσύνη (37,51,52). Οµως κατά την διάρκεια της εγκυµοσύνης υπάρχει προοδευτική µείωση των επιπέδων της ολικής και της ελεύθερης πρωτεΐνης S (53) και προοδευτική αύξηση της αντίστασης στην ενεργοποιηµένη πρωτεΐνη C (37, 54). 1.8 Σύστηµα Ινωδόλυσης και κύηση Κατά τη φυσιολογική εγκυµοσύνη παρατηρείται επίσης µια βαθµιαία µείωση της ινωδόλυσης (55, 56, 57). Χαρακτηρίζεται από µείωση της δραστικότητας του tissue plasminogen activator (t-pa) και από αύξηση των επιπέδων του ενδοθηλιακής προελεύσεως plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1), του 14 Σελίδα

15 πλακουντιακής προελεύσεως plasminogen activator inhibitor-2 (PAI-2) και του thrombin activable fibrinolysis inhibitor (TAFI) (58, 59, 60). Άλλοι δείκτες υπερπηκτικότητας κατά τη φυσιολογική εγκυµοσύνη είναι τα αυξηµένα επίπεδα του D-dimer, του συµπλέγµατος θροµβίνης/αντιθροµβίνης (ΤΑΤ), των κλασµάτων προθροµβίνης 1 και 2 (F1+ 2) και του fibrinopeptide A (FPA) (61,62). 1.9 Αιµοπετάλια και κύηση Σχετικά µε τις µεταβολές των αιµοπεταλίων κατά τη διάρκεια της εγκυµοσύνης, συχνά αναγνωρίζεται µία ήπια θροµβοκυτταροπενία (κατά µέσο όρο µείωση 10%). Ο αριθµός των αιµοπεταλίων την 24 η εβδοµάδα της εγκυµοσύνης, είναι σηµαντικά µικρότερος από την 12 η εβδοµάδα (63). Η αύξηση του µέσου όγκου των αιµοπεταλίων, δείχνει ότι κατά το 3 ο τρίµηνο εµφανίζεται µία αντισταθµιστική προοδευτική καταστροφή των αιµοπεταλίων (64,65). Η µικρού βαθµού χρόνια ενδαγγειακή πήξη µέσα στην µητροπλακουντιακή κυκλοφορία, είναι µέρος της φυσιολογικής απάντησης στην εγκυµοσύνη. Έτσι, η φυσιολογική εγκυµοσύνη σχετίζεται µε ενα βαθµό αυξηµένης καταστροφής των αιµοπεταλίων, που αντισταθµίζεται µε την αυξηµένη παραγωγή τους. Υπάρχουν στοιχεία για την in vivo ενεργοποίηση των αιµοπεταλίων στην προχωρηµένη εγκυµοσύνη. Αυτό επιβεβαιώνεται και από τις υψηλές συγκεντρώσεις της β-thromboglobulin στο 2 ο και 3 ο τρίµηνο της εγκυµοσύνης (66). Ένας άλλος αθροιστικός παράγοντας που έχει και αγγειοσυσπαστική δράση, η θροµβοξάνη-α2, αυξάνεται από την αρχή της εγκυµοσύνης και παραµένει αυξηµένη καθόλη τη διάρκεια της. Συµπερασµατικά η κατάσταση υπερπηκτικότητας που παρατηρείται κατά τη διάρκεια της εγκυµοσύνης, οφείλεται στην αύξηση των παραγόντων πήξεως και στην εξασθένιση του αντιπηκτικού και ινωδολυτικού συστήµατος. (67) Η αύξηση στην θροµβωτική δραστηριότητα γίνεται µέγιστη κατά τον τοκετό και σχετίζεται µε την έξοδο του πλακούντα και την απελευθέρωση τροφοβλαστικών ουσιών στη θέση αποκόλλησής του (68). Η αναγκαιότητα αυτού του φαινοµένου γίνεται εύκολα κατανοητή, αν αναλογιστούµε ότι η αποκόλληση του πλακούντα προκαλεί οξεία απώλεια αίµατος (700 ml/min) που πρέπει να σταµατήσει άµεσα. Περίπου 3-4 εβδοµάδες µετά τον τοκετό, η πηκτικότητα του αίµατος και η ινωδόλυση επανέρχονται σε φυσιολογικά επίπεδα (69). Λόγω της κατάστασης υπερπηκτικότητας που παρατηρείται κατά τη διάρκεια της 15 Σελίδα

16 εγκυµοσύνης, είναι εύλογη η αύξηση του κινδύνου για θρόµβωση. Έχει υπολογιστεί ότι κατά τη διάρκεια της εγκυµοσύνης ο κίνδυνος για θρόµβωση είναι 6 φορές µεγαλύτερος (70,71,72). Κατα τη διάρκεια της λοχείας ο κίνδυνος για θρόµβωση είναι ακόµα µεγαλύτερος, ειδικά εάν έχει πραγµατοποιηθεί καισαρική τοµή. Όταν συνυπάρχουν διάφορες παθολογικές καταστάσεις κατά τη διάρκεια της εγκυµοσύνης και της λοχείας, ο κίνδυνος για θρόµβωση αυξάνει ακόµα περισσότερο. (73,74,70) 1.10 Το σύνδροµο καθ έξιν αποβολών Με τον όρο «σύνδροµο καθ' έξιν αποβολών» περιγράφεται η κατάσταση κατά την οποία µια γυναίκα έχει επαναλαµβανόµενες συνεχείς αποβολές δύο ή περισσοτέρων κλινικά αναγνωρισµένων κυήσεων. Οι καθ' έξιν αποβολές παρουσιάζουν συχνότητα στο γενικό πληθυσµό 1:200. (75) Αυτό σηµαίνει ότι ένα στα διακόσια ζευγάρια που προσπαθούν να δηµιουργήσουν οικογένεια αντιµετωπίζουν αυτή την οδυνηρή εµπειρία. Η κλασική Μαιευτική και Γυναικολογία, διαγνωστικά, αναγνωρίζει ως αιτίες των καθ' έξιν αποβολών δύο µεγάλες κατηγορίες. (75) Στην 1η κατηγορία αιτιών περιλαµβάνονται : 1. Ανατοµικές ανωµαλίες της µήτρας 2. Χρωµατοσωµατικές διαταραχές του ζευγαριού ή του κυήµατος 3. Μικροβιακοί παράγοντες και λοιµώξεις 4. Ενδοκρινολογικά νοσήµατα και διαταραχές 5. Ανοσολογικές ανωµαλίες και αυτοάνοσα νοσήµατα 6. ιαταραχές της πηκτικότητας του αίµατος (Θροµβοφιλία) Έχει διαπιστωθεί ότι τα πιο πάνω κλασικά αίτια, όλα µαζί, καλύπτουν και αιτιολογούν το 60% των περιπτώσεων των καθ' έξιν αποβολών. Στην 2η κατηγορία αιτιών, περιλαµβάνονται: οι περιπτώσεις που χαρακτηρίζονται µε τον γενικό όρο ιδιοπαθείς καταστάσεις Αυτή η κατηγορία καλύπτει το υπόλοιπο 40% των αιτίων των καθ' έξιν αποβολών. Ως ιδιοπαθείς καταστάσεις χαρακτηρίζονται εκείνες οι περιπτώσεις αποβολών που κατά την διερεύνηση τους µε τα κλασικά εργαστηριακά µέσα δεν διαπιστώνεται καµία εµφανής αιτία που να τις προκάλεσε, δηλαδή «Αγνώστου 16 Σελίδα

17 Αιτιολογίας». Αυτές οι Ιδιοπαθείς Αποβολές ή αγνώστου αιτιολογίας µπορεί να οφείλονται σε «Ανοσολογικά Αίτια». (75) Επίσης έχουν διερευνηθεί και διάφοροι αλλοι παράγοντες ως αιτίες καθ έξιν αποβολών και για πολλούς από αυτούς υπαρχουν ενδείξεις για θετική συσχέτιση. Μερικοί από αυτούς είναι: (75) 1. Κατανάλωση καφέ (Parazzini et al 1998), 2. Κάπνισµα (Domineguez-Rojas et al 1994), 3. Κατανάλωση αλκοόλ (Florey et al 1992, Harlap & Shiono 1980), 4. Έκθεση σε πενταχλωροφαινόλη PCP (συντηριτικό ξυλείας) (De Maeyer et al 1995), 5. Έκθεση σε PCB (Leoni et al 1989), 6. Έλλειψη σεληνίου (Al-kunani et al 2001), 7. Ψυχολογικοί παράγοντες (Bergant et al 1997, Suguira-Ogasawara et al 2002). Οι καθ έξιν αποβολές επίσης ταξινοµούνται σε πρωτοπαθείς και δευτεροπαθείς: (75) Ο όρος πρωτοπαθείς αποβολές αναφέρεται σε γυναίκες που έχουν δύο ή περισσότερες συνεχόµενες αυτόµατες αποβολές, µε τον ίδιο σύντροφο και καµία κύηση µετά την 20ή εβδοµάδα. Η κατάσταση αυτή συναντάται σε µία από 144 κυήσεις και είναι υπεύθυνη για το 6% των εµβρυϊκών απωλειών. Ο όρος δευτεροπαθείς αποβολές αναφέρεται σε γυναίκες που είχαν δύο αυτόµατες αποβολές, µε τον ίδιο σύντροφο, µετά την γέννηση ενός παιδιού ή µετά από έναν ενδοµήτριο θάνατο. Η κατάσταση αυτή συναντάται σε µία στις 500 κυήσεις και είναι υπεύθυνη για το 1,5% των εµβρυϊκών απωλειών Η θροµβοφιλία Ο Virchow είχε τονίσει ήδη από το 1856 ότι οι παράγοντες που προδιαθέτουν στο σχηµατισµό θρόµβων είναι: (75) α) η επιβράδυνση της ροής του αίµατος, β) ο πιθανός τραυµατισµός ή φλεγµονή των αγγείων και γ) η υπερπηκτικότητα του αίµατος. Θροµβοφιλία ορίζεται η τάση προς ανάπτυξη θρόµβωσης, εξ αιτίας ανωµαλίας στο σύστηµα πήξης. Για την κατανόηση των διαταραχών αυτών πρέπει 17 Σελίδα

18 να τονιστεί ο ρόλος των πρωτεϊνών C, S και της αντιθροµβίνης ΙΙΙ στο µηχανισµό της πήξης. (75) Ο ρόλος των πρωτεϊνών C και S, καθώς και της αντιθροµβίνης ΙΙΙ στην πήξη φαίνεται στο παρακάτω σχήµα. (Σχήµα 5) Σχήµα 5: Μηχανισµός πήξης (75) Συνεπώς, ο σχηµ µατισµός θρόµβου είναι αποτέλεσµα πολλών παθολογικών καταστάσεων, κληρονοµικών ή επίκτητων. Οι κληρονοµικές (γενετικά προκαθορισµένες) θροµ µβοφιλίες, θα µπορούσαν να συνοψισθούν στον Πίνακα 1. (75) Πίνακας 1: Κληρονοµικές (γενετικά προκαθορισµένες) θροµβοφιλίες Κληρονοµικές (γενετικά προκαθορισµένες) θροµβοφιλίες Αντίσταση στην ενεργοποιηµένη πρωτεΐνη C Μετάλλαξη του παράγοντα ΙΙ (G20210A) Ανεπάρκεια πρωτεϊνών C ή/και S Μετάλλαξη του MTHFR Ανεπάρκεια του παράγοντα ΧΙΙΙ Ανεπάρκεια αντιθροµβίνης ΙΙΙ Ανεπάρκεια του παράγοντα VII Παράγοντας XII Μετάλλαξη του παράγοντα V(Leiden) Ανεπάρκεια πρωτεΐνης Z 18 Σελίδα

19 Τα επίκτητα αίτια αφορούν σε καταστάσεις έντονου stress όπως οι επεµβάσεις και τα τραύµατα. Σ αυτές τις περιπτώσεις παρατηρείται µεγάλη απελευθέρωση ιστικών παραγόντων, που κινητοποιούν το µηχανισµό της πήξης ή βλάβη του ενδοθηλίου των αγγείων και φλεβική στάση, που σύµφωνα µε τον Virchow προδιαθέτουν σε σχηµατισµό θρόµβων. Εκτός αυτού, ως επίκτητες θροµβοφιλίες αναφέρονται στον Πίνακα 2. (75) Πίνακας 2: Επίκτητες θροµβοφιλίες Επίκτητες θροµβοφιλίες Αντιφωσφολιπιδικό σύνδροµο Αντιπηκτικό του λύκου Κολλαγονώσεις ιάχυτη ενδαγγειακή πήξη Επίδραση φαρµάκων Οξεία λεµφογενής λευχαιµία Θροµβοκυτταρωση Καρδιολιπίνες 1.12 Σχέση γονιδίων µε την ανάπτυξη θροµβοφιλίας ΓO IDIO ΤΗΣ ΜΕΘΥΛΕΝΟ-ΤΕΤΡΑΥ ΡΟΦΥΛΛΙΚΗΣ ΑΝΑΓΩΓΑΣΗΣ (MTHFR C677T/A1298C) Η MTHFR (αναγωγάση του 5,10 µεθυλενο-τετραϋδροφυλλικού οξέος) είναι ένα FAD-εξαρτώµενο ένζυµο, (φλαβινο-αδενινο-δινουκλεοτίδιο-εξαρτώµενο ένζυµο), το οποίο καταλύει τη µη αντιστρεπτή µετατροπή του 5,10-µεθυλενοτετραϋδροφυλλικού προς 5-µεθυλοτετραϋδροφυλλικό οξύ. 19 Σελίδα

20 Το 5-µεθυλοτετραϋδροφυλλικό οξύ λειτουργεί ως δότης µεθυλικής οµάδας στη σύνθεση της µεθειονίνης από οµοκυστεΐνη, µε ταυτόχρονη απελευθέρωση τετραϋδροφυλλικού οξέος, το οποίο χρησιµεύει για την αναγέννηση του 5,10 µεθυλενο-τετραϋδροφυλλικού. Είναι ένα ένζυµο το οποίο βρίσκεται στο κυτταρόπλασµα των κυττάρων. Η παραπάνω διαδικασία, συνεπώς, κατανέµει τα κυτταρικά αποθέµατα των µεταβολιτών του φυλλικού οξέος ανάµεσα στη σύνθεση της µεθειονίνης που είναι απαραίτητη για τη βιοσύνθεση των πρωτεϊνών και τη µεθυλίωση του DNA (µέσω της S-αδενοσυλοµεθειονίνης) αφενός και τη σύνθεση δεοξυθυµιδυλικού (dtmp) και πουρινών για τη σύνθεση DNA και RNA αφετέρου.(76), (77) O πολυµορφισµός C677T (κυτοσίνη θυµίνη) στο εξώνιο 4 του γονιδίου MTHFR (SNP rs ), προκαλεί την αντικατάσταση µιας αλανίνης από µια βαλίνη στη θέση 222 της πρωτεΐνης του ενζύµου MTHFR, µε αποτέλεσµα το ένζυµο να υφίσταται µερική απώλεια της καταλυτικής του δραστικότητας. (Εικόνα 7) Εικόνα 7: Θέση του ενζύµου MTHFR στην οµοιοστασία του φυλλικού οξέως,η επίδραση του πολυµορφισµού MTHFR C677T στην καταλυτική δραστικότητα του MTHFR (+) και η κατανοµή του πολυµορφισµού στη λευκή φυλή (%).(76,77) Tο ένζυµο MTHFR περιορίζει τη συγκέντρωση της οµοκυστεΐνης στο αίµα, εµποδίζοντας την τοξική δράση της τελευταίας προς το ενδοθηλιακό τοίχωµα των αγγείων. Μία µεταλλαγµένη µορφή του ενζύµου, που προκύπτει από την αντικατάσταση της θυµίνης από κυτοσίνη στη θέση 677, προκαλεί αύξηση της συγκέντρωσης της οµοκυστεΐνης στο αίµα (οµοκυστεϊναιµία) και αποτελεί 20 Σελίδα

21 προδιαθεσικό παράγοντα θροµβοφιλίας. Aλλη µετάλλαξη του ενζύµου εντοπίζεται στη θέση 1298 (αντικατάσταση της κυτοσίνης από αλανίνη), η οποία δεν έχει συσχετιστεί µε υψηλή οµοκυστεϊνη στο αίµα αλλά η ταυτόχρονη συνύπαρξη σε ετερόζυγη κατάσταση των δύο µεταλλάξεων (θέσεις 677 και 1298), έχει τις ίδιες επιπτώσεις όπως η 677T σε οµοζυγωτία.(77,76) ΓΟΝΙ ΙΟ ΤΟΥ ΑΝΑΣΤΟΛΕΑ ΤΟΥ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΤΗ ΤΟΥ ΠΛΑΣΜΙΝΟΓΟΝΟΥ PAI (Plasminogen activator inhibitor) 1 (PAI-1) Το PAI-1 είναι ο κύριος αναστολέας του ενεργοποιητή του ιστικού πλασµινογόνου (tpa) και της ουροκινάσης (upa), των ενεργοποιητών του πλασµινογόνου και, εποµένως της ινωδόλυσης (της φυσιολογικής δηλαδή διάσπασης των πηγµάτων του αίµατος). Πρόκειται για µια πρωτεϊνη αναστολέα των πρωτεασών σερίνης (SERPINE1). Η άλλη µορφή του PAI, η PAI-2 εκκρίνεται µόνο από τον πλακούντα και υφίσταται σε σηµαντικές ποσότητες µόνο κατά τη διάρκεια της κύησης. Επιπλέον, η πρωτεάση νεξίνη δρα ως αναστολέας του tpa και της ουροκινάσης. Ο κύριος πάντως αναστολέας των ενεργοποιητών του πλασµινογόνου είναι ο PAI-1. Γενετικοί και περιβαλλοντικοί παράγοντες επηρεάζουν τη συγκέντρωση του PAI-1 στο πλάσµα. Ο πλέον συχνός γενετικός παράγοντας είναι ο πολυµορφισµός 4G/5G (insertion/deletion) στην περιοχή του ενεργοποιητή του γονιδίου του PAI-1. (78,79) Οµοζυγωτία για το γονότυπο 4G/4G (deletion) έχει συσχετιστεί µε αυξηµένη συγκέντρωση PAI-1 στο πλάσµα ενώ οµοζυγωτία για το γονότυπο 5G/5G (insertion) έχει συσχετιστεί µε χαµηλή συγκέντρωση. Ο ετερoζυγωτικός γονότυπος 4G/5G είναι ο πλέον συχνός σε άτοµα που έχουν φυσιολογική συγκέντρωση PAI- 1 στο πλάσµα.(80,82,98) 21 Σελίδα

22 ΓΟΝΙ ΙΟ ΤΟΥ ΜΕΤΑΤΡΕΠΤΙΚΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ ΤΗΣ ΑΓΓΕΙΟΤΕΣΙΝΗΣ ACE (ACE Met 235Thr) Οι αγγειοτενσίνες είναι πεπτίδια που λειτουργούν ως αγγειοσυσπαστικοί παράγοντες. Μετατρεπτικό ένζυµο της αγγειοτενσίνης Το µετατρεπτικό ένζυµο της αγγειοτενσίνης (angiotensin converting enzyme, ACE) είναι µια γλυκοπρωτεϊνη, που περιέχει στο καταλυτικό της κέντρο ιόν ψευδαργύρου, µε δραστικότητα διπεπτίδυλο-καρβόξυ-πεπτιδάσης. Το ACE δρα ως εξω-πεπτιδάση, αποκόπτει δυο αµινοξέα από το καρβόξυ-τελικό άκρο του δεκαπεπτιδίου Ang I και την µετατρέπει στο βιολογικά δραστικό οκταπεπτίδιο Ang II. Επιπρόσθετα, το ACE υδρολύει και αδρανοποιεί τα αγγειοδιασταλτικά πεπτίδια βραδυκινίνη και καλλιδίνη. (80-84, 94) Το ένζυµο ACE (µετατροπέας της αγγειοτενσίνης Ι) έχει δύο κύριες λειτουργίες: 1. Καταλύει τη µετατροπή τηε αγγειοτενσίνης Ι σε ΙΙ, έναν πιθανό αγγειοσυσπαστικό παράγοντα. 2. Συµµετέχει στην ανενεργοποίηση της βραδυκινίνης, ενός πιθανού αγγειοδιαστολέα. Αυτές οι δυο λειτουργίες καθιστούν το ΑCE τον ιδανικό στόχο στη θεραπεία καταστάσεων όπως η υψηλή αρτηριακή πίεση, η καρδιακή ανεπάρκεια, η διαβητική νεφροπάθεια και ο σαγχαρώδης διαβήτης τύπου ΙΙ. (80-84, 94) Στον άνθρωπο, το γονίδιο ace βρίσκεται στο µακρύ σκέλος του χρωµοσώµατος 17 (17q23), έχει µέγεθος 21 kb και περιλαµβάνει 26 εξόνια και 25 εσόνια. Το ace διαθέτει δυο υποκινητές, ο πρώτος εντοπίζεται στο 5'-άκρο πριν το εξόνιο-1 (αναφέρεται ως σωµατικός υποκινητής, somatic promoter-spro), ενώ ο δεύτερος σε ένα εσωτερικό τµήµα του εσονίου-12 (σπερµατικός υποκινητής, germinal promoter-gpro), µε αποτέλεσµα την κωδικοποίηση δυο ισοµορφών του ACE. Η υποκίνηση της µεταγραφής από τον Spro, οδηγεί σε µεταγραφή όλων των εξονίων, αποκοπή του εξονίου-13 κατά το µάτισµα του ώριµου mrna, και παραγωγή της σωµατικής ισοµορφής (somatic ACE, sace), η οποία αποτελείται από 1306 αµινοξέα µε µοριακή µάζα 170 kda και εκφράζεται σε σωµατικούς 22 Σελίδα

23 ιστούς. Η υποκίνηση της µεταγραφής από τον Gpro, οδηγεί σε µεταγραφή των εξονίων 13-26, και παραγωγή της σπερµατικής ισοµορφής (testis ACE, tace ή germinal ACE, gace), η οποία αποτελείται από 732 αµινοξέα µε µοριακή µάζα 100 kda και εκφράζεται στα σπερµατικά κύτταρα, στους όρχεις. (80-84, 94) Στον άνθρωπο, η συγκέντρωση αγγειοτενσίνης στο πλάσµα αντανακλά αποκλειστικά την ηπατική παραγωγή και έχει υπολογισθεί ότι είναι περίπου ίση µε το ήµισυ της µέγιστης δραστικότητας της (Km) της ρενίνης. Κατά συνέπεια, παρότι γενικά η δραστηριοποίηση του συστήµατος ρενίνης-αγγειοτενσίνης εξαρτάται από τα επίπεδα της ρενίνης, η κινητική της αντίδρασης διάσπασης του αγγειοτενσινογόνου και παραγωγής Ang I, για δεδοµένα επίπεδα ρενίνης, επηρεάζεται από τα επίπεδα του αγγειοτενσινογόνου. Η σηµασία αυτής της παρατήρησης αποτυπώνεται στην κλινική συσχέτιση της παρουσίας του Μ235Τ πολυµορφισµού στο γονίδιο του αγγειοτενσινογόνου (αντικατάσταση της µεθειονίνης στην θέση 235 από θρεονίνη) µε την εµφάνιση υπέρτασης στον άνθρωπο. Σε αυτή την περίπτωση η ήπια αύξηση των επιπέδων αγγειοτενσινογόνου στο πλάσµα και στους ιστούς λόγω της αυξηµένης µεταγραφής του γονιδίου του οδηγεί σε αυξηµένη δραστικότητα του συστήµατος ρενίνης-αγγειοτενσίνης και προδιαθέτει στην εµφάνιση υπέρτασης. Αυτή η γραµµή σκέψης ενισχύεται από το εύρηµα ότι σε πειραµατόζωα που µε γενετική τροποποίηση εκφράζουν από µηδέν έως τέσσερα αντίγραφα του γόνου του αγγειοτενσινογόνου, παρατηρήθηκε ισχυρή θετική συσχέτιση του αριθµού των αντιγράφων µε τη συγκέντρωση αγγειοτενσινογόνου πλάσµατος και τα επίπεδα της αρτηριακής πίεσης. (80-84, 94) Πέραν της οµοιοστατικής του λειτουργίας, υπάρχουν ισχυρές πειραµατικές και κλινικές ενδείξεις, τόσο για το κυκλοφορούν όσο και το ιστικό σύστηµα ρενίνης-αγγειοτενσίνης, ότι συµµετέχει επίσης στην παθογένεια της υπέρτασης και τη βλάβη των οργάνων-στόχων της υπέρτασης, στην καρδιακή ανεπάρκεια, και τέλος στους µηχανισµούς εξέλιξης της νεφρικής νόσου. Τα τελικά ορµονικά παράγωγα του συστήµατος, οι αγγειοτενσίνες, προκύπτουν µέσω µιας διαδικασίας διαδοχικών πρωτεολυτικών διασπάσεων του αγγειοτενσινογόνου, που αποτελεί το αρχικό υπόστρωµα του συστήµατος, µε την δράση δυο κρίσιµων ενζύµων, της ρενίνης και του µετατρεπτικού ενζύµου της αγγειοτενσίνης (angiotensin converting enzyme, ACE). Η ρενίνη, που εκκρίνεται από τα παρασπειραµατικά κύτταρα του νεφρού, διασπά το παραγόµενο από τα 23 Σελίδα

24 ηπατοκύτταρα δεκατετραπεπτίδιο αγγειοτενσινογόνο και παράγεται το δεκαπεπτίδιο αγγειοτενσίνη Ι, το οποίο είναι ανενεργές και υδρολύεται στο ενεργό οκταπεπτίδιο αγγειοτενσίνη ΙΙ από το µετατρεπτικό ένζυµο της αγγειοτενσίνης. Ο ρυθµός διάσπασης του αγγειοτενσινογόνου από την ρενίνη αποτελεί το κρίσιµο βήµα που καθορίζει το µέγεθος ενεργοποίησης του συστήµατος ρενίνηςαγγειοτενσίνης. εδοµένου ότι αφενός µεν η συγκέντρωση αγγειοτενσινογόνου στο πλάσµα διατηρείται σε σταθερά επίπεδα στην πλειονότητα των φυσιολογικών και παθοφυσιολογικών καταστάσεων, αφετέρου δε η παραγόµενη και κυκλοφορούσα ρενίνη αντανακλά τα φυσιολογικά ερεθίσµατα που τροποποιούν την δραστικότητα του συστήµατος ρενίνης-αγγειοτενσίνης, η ρύθµιση της ρενίνης είναι το κοµβικό γεγονός που καθορίζει την δραστικότητα του συστήµατος. Η αγγειοτενσίνη ΙΙ (Ang II, 1-8) είναι το κύριο µεταβολικό προϊόν του συστήµατος. Η δράση της σε κυτταρικό επίπεδο εξαρτάται από την σύνδεσή της µε ειδικούς υποδοχείς της πλασµατοκυτταρικής µεµβράνης, τους ΑΤ1 και ΑΤ2 υποδοχείς, και τα ενδοκυττάρια γεγονότα που αυτή προκαλεί. Οι ΑΤ υποδοχείς ανήκουν στην υπεροικογένεια των συνδεδεµένων µε G πρωτείνη υποδοχέων (G protein-coupled receptor, GPCR). Οι ΑΤ1 υποδοχείς είναι υπεύθυνοι για την πλειονότητα των φυσιολογικών δράσεων της Ang ΙΙ. Τουλάχιστον άλλα τρία αγγειοτενσινικά πεπτίδια που παράγονται ως µεταβολικά προϊόντα της Ang II έχουν παρόµοιες ή διαφορετικές φυσιολογικές λειτουργίες. Το επταπεπτίδιο Ang III (2-8) έχει φυσιολογικές και φαρµακολογικές επιδράσεις παρόµοιες της Ang II, µε την οποία µοιράζονται τους ίδιους υποδοχείς (ΑΤ1 και ΑΤ2 υποδοχείς). Το εξαπεπτίδιο Ang IV (3-8) και το επταπεπτίδιο Ang 1-7 παράγονται από ιστικές πρωτεάσες και έχουν ειδικούς υποδοχείς. (80-84, 94) Ο πολυµορφισµός Ι/D του γονιδίου ACE επηρεάζει άµεσα τη δραστηριότητα του ACE (µετατρεπτικού ενζύµου της αγγειοτενσίνης)στο πλάσµα. Ο γονότυπος D/D προκαλεί µεγαλύτερη αύξηση της δραστηριότητας του ACE σε σύγκριση µε τους γονότυπους Ι/Ι και I/D. Έχει παρατηρηθεί ότι το D αλληλόµορφο συσχετίζεται µε αρτηριοσκλήρυνση και υπέρταση, και ιδιαίτερα σε άτοµα µε σαγχαρώδη διαβήτη τύπου ΙΙ µπορεί να οδηγήσει σε διαβητική νεφροπάθεια.καθώς το σύστηµα ρενίνης-αγγειοτενσίνης ρυθµίζει τα επίπεδα του PAI-1 στο πλάσµα, το ACE D αλληλόµορφο προκαλεί αυξηµένη έκφραση του αναστολέα του ενεργοποιητή του πλασµινογόνου (PAI-1) και κατά συνέπεια µειωµένη ινοδώλυση. Τα υψηλά επίπεδα αγγειοτενσίνης στο αίµα µπορεί να 24 Σελίδα

25 προκαλέσουν υπέρταση, διαβητική νεφροπάθεια και θροµβοεµβολικά επεισόδια. (80-84, 94) Οι πολυµορφισµοί PAI-1 4G και ACE I/D έχουν συσχετισθεί µε έµφραγµα του µυοκαρδίου,σταφανιαία νόσο,θροµβώσεις, καθ εξιν αποβολές, προεκλαµψίες, υπερταση της κύησης, καθυστέρηση της ανάπτυξης του εµβρύου και ενδοµήτριο εµβρυικό θάνατο. (80-84, 94) Η µεταβολή στη δραστικότητας του ACE ενζύµου οφειµόµενη στον πολυµορφισµό του γονιδίου ACE µπορεί να επηρρεάσει την ανταπόκριση στη θεραπεία µε αναστολείς του µετατρεπτικού ενζύµου αγγειοτενσίνης. Ο προσδιορισµός του γονοτύπου ACE µπορεί να αποδειχθεί χρήσιµος στην εξατοµικευµένη θεραπεία των ασθενών µε αρτηριακή υπέρταση, διαβητική νεφροπάθεια ή στεφανιαία νόσο. (80-84, 94) Η διαγραφή στο ιντρόνιο 16 του γονιδίου του µετατρεπτικού γονιδίου της αγγειοτενσίνης, σχετίζεται µε υψηλά επίπεδα αγγειοτενσίνης στο αίµα, τα οποία µπορεί να προκαλέσουν υπέρταση, διαβητική νεφροπάθεια, καθώς και προσβολή από θροµβοεµβολικό επεισόδιο. (80-84, 94) Σχήµα 6: Μια σχηµατική απεικόνιση της βιοχηµικής αντίδρασης της αγγειοτενσίνης και της ινωδόλυσης πού δείχνει το ρόλο του Μετατρεπτικού Ενζύµου της Αγγειοτενσίνης-Ι του Αναστολέα Του Ενεργοποιητή του Πλασµινογόνου-1. Η έκφραση του PAI-1 αυξάνεται στα 4G αλληλόµορφα του γονιδίου PAI-1 και από το D-αλληλόµορφο του γονιδίου ACE µέσω της Αγγειοτενσίνης ΙΙ.(Polymorphisms in the ACE and PAI-1 genes are associated with recurrent spontaneous miscarriages, T.Buchholz, Human Reproduction Vol.18, No.11 pp , 2003(83). 25 Σελίδα

26 ΓΟΝΙ ΙΟ ΤΗΣ ΑΠΟΛΙΠΟΠΡΩΤΕΪΝΗΣ Ε APOE Apolipoprotein E3 (APOE4) Τ3937+C4075 Apolipoprotein E4 (APOE3) C3937+C4075 Η απολιποπρωτεΐνη Ε (ΑpoΕ) αποτελείται από 299 αµινοξέα, παράγεται στο ήπαρ και λειτουργεί κυρίως ως ρυθµιστής του µεταβολισµού της LDLχοληστερίνης ελέγχοντας την πρόσδεση των σωµατιδίων LDL και των υπολειµµάτων χυλοµικρών µε τους υποδοχείς τους. Έτσι, η ApoE διαδραµατίζει καθοριστικό ρόλο στο µεταβολισµό των λιποπρωτεϊνών και της χοληστερόλης. Οι βασικές ισοµορφές της πρωτεΐνης είναι τρεις (ΑpoE2, ΑpoE3 και ΑpoE4) και κωδικοποιούνται από τρία αλληλόµορφα (ε2, ε3 και ε4, αντίστοιχα) που προκύπτουν από τους πολυµορφισµούς του γονιδίου στα κωδικόνια 112 και 158. Το γονίδιο που κωδικοποιεί την πρωτείνη αυτή στο χρωµόσωµα 12 (12q) παρουσιάζει αλληλικό πολυµορφισµό µε την εξής συχνότητα στους Καυκάσιους: Αpo E2(8%), ApoE3(78%) και ApoE4(14%). Η ΑpoE4 συσχετίζεται µε αυξηµένα επίπεδα LDL ενώ η ApoE2 µε ελαττωµένα επίπεδα LDL και αυξηµένα επίπεδα τριγλυκεριδίων. Η ApoE2 δεν προστατεύει πάντα από στεφανιαία νόσο, η ApoE4 συσχετίζεται µε αυξηµένο κίνδυνο εµφάνισης καρδιαγγειακών νοσηµάτων και αγγειακών δυλειτουργιών στην νεο-αναπτυσσόµενη µητροπλακουντιακή κυκλοφορία οδηγώντας σε εξαιρετικά µειωµένη ικανότητα σύνδεσης µεταξύ λιποπρωτεϊνών και υποδοχέων, µε αποτέλεσµα να αποτελεί παράγοντα επικινδυνότητας για τη δηµιουργία αθηρωµατικής πλάκας. Παράλληλα, αυξηµένη συχνότητα του αλληλοµόρφου E2 έχει παρατηρηθεί σε οικογένειες µε ιστορικό πρώιµης εκδήλωσης της νόσου του Alzheimer. Με την Ε3/Ε3 ισοµορφή θεωρείται φυσιολογικός ο µεταβολισµός των λιποπρωτεϊνών. Από αυτούς τους πολυµορφισµούς συναντούνται ευρέως σε οµοζυγωτία το αλληλόµορφο Ε3 µε συχνότητα 88% και σε ετεροζυγωτία το αλληλόµορφο Ε3 και Ε4 αντίστοιχα µε συχνότητα 12%, χωρίς να διαφοροποιείται η εξάπλωση της ετεροζυγωτίας σηµαντικά στις γυναίκες µε ιστορικό καθ έξιν αποβολών σε σχέση µε το γενικό γυναικείο πληθυσµό της αντίστοιχης αναπαραγωγικής ηλικίας.(86,90) 26 Σελίδα

27 ΓΟΝΙ ΙΟ ΤΗΣ ΕΝ ΟΘΗΛΙΑΚΗΣ ΣΥΝΘΑΣΗΣ του Μονοξειδίου του αζώτου (e- OS GE E) Α. Ο ρόλος της ενδοθηλιακής συνθάσης του Μονοξειδίου του αζώτου Το ενδοθήλιο αποτελεί ένα δυναµικό και ετερογενές σύστηµα που εκτείνεται σε όλο το αγγειακό δίκτυο και διαδραµατίζει κυρίαρχο ρόλο στη διατήρηση της οµοιοστασίας του καρδιαγγειακού συστήµατος µέσω της ρύθµισης της ροής του αίµατος, των µηχανισµών φλεγµονής και πήξης, της οξειδοαναγωγικής ισορροπίας και της αγγειογένεσης, αποτρέποντας παράλληλα την εµφάνιση και εξέλιξη της αθηροσκλήρωσης. (87-89, 91) Το ενδοθήλιο είναι ουσιαστικά µια κυτταρική µονοστοιβάδα που περιλαµβάνει στον ενήλικα κύτταρα, ζυγίζει περίπου 1 kg, καλύπτει συνολική επιφάνεια 1-7 m2 και επιτελεί τις πολυσχιδείς λειτουργίες του αφενός µέσω υποδοχέων της επιφάνειάς του και αφετέρου µέσω έκκρισης ενός µεγάλου αριθµού δραστικών ουσιών µε πολύπλοκες αυτοκρινείς, παρακρινείς και ενδοκρινείς δράσεις. Ιστορικά, οι πρώτες µελέτες του καρδιαγγειακού συστήµατος πραγµατοποιήθηκαν από τον William Harvey ο οποίος το 1628 περιέγραψε την κυκλοφορία του αίµατος. (87-89, 91) Στην συνέχεια, ο Malphigi υποστήριξε ότι υπάρχει διαχωρισµός µεταξύ αίµατος και ιστών και τεκµηρίωσε την ύπαρξη συστήµατος αγγείων εντός του οποίου κυκλοφορεί το αίµα. Η πρώτη αναφορά στο ενδοθήλιο έγινε ουσιαστικά το 18ο αιώνα από τον von Reckingausen, ο οποίος διαπίστωσε ότι τα αγγεία δεν είναι απλώς αγωγοί που διασχίζουν τους ιστούς αλλά επικαλύπτονται από κύτταρα. Μόνο όµως πολύ αργότερα και πιο συγκεκριµένα το 1891, ο Heidenhahn υποστήριξε ότι το ενδοθήλιο αποτελεί ένα ενεργό κυτταρικό σύστηµα µε δυνατότητα έκκρισης ποικίλων ουσιών. Το 1896, η διατύπωση του νόµου της τριχοειδικής ανταλλαγής από τον Starling ενίσχυσε περαιτέρω την άποψη ότι το ενδοθήλιο αντιπροσωπεύει έναν εκλεκτικό φυσικό φραγµό. Τα ευρήµατα αυτά επιβεβαιώθηκαν από την µελέτη του αγγειακού τοιχώµατος µε ηλεκτρονικό µικροσκόπιο από τον Palade το 1953 και από τις λειτουργικές µελέτες του Gowan το 1959 που κατέδειξαν την ύπαρξη αλληλεπιδράσεων µεταξύ του ενδοθηλίου και των λεµφοκυττάρων στα µετατριχοειδικά φλεβίδια. Στην συνέχεια, η ανάπτυξη τεχνικών καλλιέργειας των ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro 27 Σελίδα

28 κατά τη δεκαετία του 1970 επέτρεψαν τη λεπτοµερέστερη µελέτη της ενδοθηλιακής λειτουργίας. Ωστόσο, ήταν η διαπίστωση από τους Furchgott και Zawadzki το 1980 (87-89, 91) ότι το ενδοθήλιο είναι απαραίτητο για την αγγειοδιασταλτική δράση της ακετυλοχολίνης και στην συνέχεια η ανακάλυψη της παραγωγής του µονοξειδίου του αζώτου (NO) από τα ενδοθηλιακά κύτταρα που αποτέλεσαν το έναυσµα για µεγάλο αριθµό πειραµατικών και κλινικών µελετών που οδήγησαν στη διαµόρφωση της τρέχουσας άποψης για το ενδοθήλιο ως κεντρικού ρυθµιστή της οµοιοστασίας του καρδιαγγειακού συστήµατος. (87-89, 91) Το ενδοθήλιο ασκεί τις πολύπλοκες δράσεις του κυρίως µέσω της σύνθεσης και απελευθέρωσης του NO. Σήµερα είναι γνωστό το NO αποτελεί έναν από τους βασικότερους ρυθµιστές της οµοιοστασίας του ανθρώπινου οργανισµού και καταλαµβάνει κυρίαρχη θέση στους µηχανισµούς άµυνας έναντι της αγγειακής βλάβης, φλεγµονής, θρόµβωσης και αθηροσκλήρωσης. Ωστόσο, ακόµη και µέχρι πριν λίγες δεκαετίες το NO θεωρούνταν ως ένας επιζήµιος ρυπαντής, παράγωγο της καύσης της βενζίνης και άλλων καυσίµων, υπεύθυνο για την όξινη βροχή και τη δηµιουργία της τρύπας του όζοντος. Η αντίληψη αυτή άλλαξε ριζικά το 1980 µετά τα κλασσικά πειράµατα των Furchgott και Zawadski, οι οποίοι διαπίστωσαν ότι το ενδοθήλιο υπό την επίδραση ακετυλοχολίνης, ισταµίνης, ή βραδυκινίνης απελευθερώνει µια ασταθή και ευµετάβλητη ουσία που προκαλεί αγγειοδιαστολή των λείων µυϊκών ινών του αγγειακού τοιχώµατος, και την οποία ονόµασαν µυοχαλαρωτικό παράγοντα προερχόµενο από το ενδοθήλιο (endothelial derived relaxant factor). Το 1987, ο Palmer και οι συνεργάτες του κατέδειξαν ότι ο ανωτέρω παράγοντας είναι το ΝΟ. Η µεγάλη σηµασία του NO φαίνεται και από την ανακήρυξή του σε µόριο της χρονιάς από το περιοδικό Science το 1992 και από την απονοµή του Nobel Φυσιολογίας ή Ιατρικής το 1998 στους Robert F. Furchgott, Louis J. Ignarro και Ferid Murad για τις ανακαλύψεις τους σχετικά µε «τις δράσεις του ΝΟ ως αγγελιοφόρου στο καρδιαγγειακό σύστηµα». (87-89, 91) Το NO είναι ένα µόριο µε µεγάλη ικανότητα διάχυσης αλλά βραχεία ηµιπερίοδο ζωής και η βιολογική δραστικότητά του καθορίζεται από την ισορροπία σύνθεσης, µεταφοράς, αποθήκευσης και αδρανοποίησής του. Η συγκέντρωση του NO στον αγγειακό αυλό υπολογίζεται µεταξύ 0,1 και 10 µmol/l και εντός του αγγειακού τοιχώµατος µεταξύ 0,2 και 0,5 µmol/l. 28 Σελίδα

29 Β. ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΟΥ ΜΟΝΟΞΕΙ ΙΟΥ ΤΟΥ ΑΖΩΤΟΥ Το NO συντίθεται από µια οικογένεια τριών ενζύµων, τις συνθάσες του NO (NO synthases, NOS), οι οποίες καταλύουν την οξείδωση της L-αργινίνης σε L- κιτρουλλίνη µε παράλληλη παραγωγή ισοµοριακής ποσότητας NO. (90,91,94) Η οικογένεια των NOS περιλαµβάνει την νευρωνική NOS (neuronal NOS, nnos ή NOS1, µια πρωτεΐνη µε µοριακό βάρος 150 kda), την επαγώγιµη NOS (inducible NOS, inos ή NOS2, µοριακού βάρους 130 kda), και την ενδοθηλιακή NOS (endothelial NOS, enos ή NOS3, µοριακού βάρους 133 kda). Τα τρία αυτά ισοένζυµα κωδικοποιούνται από διαφορετικά γονίδια που εντοπίζονται στα χρωµοσώµατα 12, 17 και 7 αντίστοιχα και τα οποία θεωρείται ότι προέρχονται από ένα αρχικό κοινό γονίδιο. (87-89, 91) Τα τρία ισοένζυµα της NOS έχουν 50-60% δοµική οµολογία µεταξύ τους και µε το κυτόχρωµα P-450 και περιέχουν αίµη. Για να συνθέσουν NO, όλα χρησιµοποιούν µια πολύπλοκη σειρά βοηθητικών συµπαραγόντων και πιο συγκεκριµένα την αναχθείσα µορφή του φωσφορικού νικοτινοαµιδοαδενινοδινουκλεοτιδίου (NADPH), φλαβινοµονονουκλεοτίδιο (FMN), φλαβινοαδενινοδινουκλεοτίδιο (FAD), καλµοδουλίνη και τετραϋδροβιοπτερίνη (BH4). Όλες οι NOS συντίθενται ως µονοµερείς µορφές, οι οποίες όµως στερούνται την ικανότητα δέσµευσης L-αργινίνης και BH4 και δεν µπορούν να συνθέσουν NΟ. Ο διµερισµός τους είναι απαραίτητος για την σύνθεση του NO, είναι µη αναστρέψιµος και εξασφαλίζεται από την παρουσία της αίµης, µε αποτέλεσµα η καρβοξυτελική περιοχή του ενός µονοµερούς να συνδέεται µε την αµινοτελική περιοχή του άλλου. Τέλος, η ρύθµιση των nnos και enos πραγµατοποιείται τόσο σε επίπεδο 16 µεταγραφής των γονιδίων τους (ρύθµιση της παραγόµενης ποσότητας του ενζύµου) όσο και µετά την µετάφραση του αγγελιοφόρου RNA, (ρύθµιση της δραστικότητας του ενζύµου), ενώ η ρύθµιση της inos πραγµατοποιείται σχεδόν αποκλειστικά σε επίπεδο µεταγραφής. Έτσι, η δράση των nnos και enos εξαρτάται από τις µεταβολές της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης ασβεστίου ενώ η δράση της inos δεν επηρεάζεται από τις µεταβολές αυτές. Τα τρία αυτά ισοένζυµα παρουσιάζουν διακριτή ιστική έκφραση αλλά όλα εκφράζονται στο καρδιαγγειακό σύστηµα. (87-89, 91) 29 Σελίδα

30 Γ. Ενδοθηλιακή συνθετάση του O Η σύνθεση της enos κωδικοποιείται από γονίδιο που εντοπίζεται στο χρωµόσωµα 7q35.36, έχει µέγεθος 21 χιλιάδες ζεύγη βάσεων (kb) και περιλαµβάνει 26 εξόνια. Η αλληλουχία του καθορίστηκε το (87-89, 91) Στα ενδοθηλιακά κύτταρα η enos είναι το κυρίαρχο ισοένζυµο και είναι υπεύθυνη για το µεγαλύτερο ποσοστό NO που παράγεται από το ενδοθήλιο και για την πλειονότητα του NO στην συστηµατική κυκλοφορία. Η εκλεκτικά αυξηµένη έκφραση της enos στα ενδοθηλιακά κύτταρα αποδίδεται στην εκλεκτικά αυξηµένη δραστικότητα του προαγωγέα του γονιδίου του enos στα κύτταρα αυτά. Έκφραση της enos παρατηρείται επίσης στα αιµοπετάλια, στα ερυθρά αιµοσφαίρια, καθώς και σε διάφορα άλλα είδη κυττάρων που παράγουν συνεχώς NO. Ωστόσο, η έκφραση της enos στα κύτταρα αυτά και συνεπώς και η παραγόµενη ποσότητα NO είναι πολύ µικρότερη σε σχέση µε τα ενδοθηλιακά κύτταρα. (87-89, 91). οµή της e OS Η enos έχει δύο διακριτές περιοχές, την καρβοξυτελική που έχει δράση αναγωγάσης και περιέχει τις δεσµευτικές θέσεις για τα NADPH, FAD, FMN και την καλµοδουλίνη και την αµινοτελική περιοχή µε δράση οξυγενάσης, η οποία περιέχει τις δεσµευτικές θέσεις για το οξυγόνο, την αίµη, την BH4 και την L- αργινίνη. Η αίµη συµβάλλει επίσης στη σύνδεση της L-αργινίνης και της BH4 µε την enos. Επίσης, η BH4 και η L-αργινίνη ενισχύουν αµοιβαία την σύνδεσή τους µε την enos. (87-89, 91) Η σύνθεση του NO από την enos πραγµατοποιείται µε διαδοχική µεταφορά ηλεκτρονίων, µε εναρκτήριο γεγονός την σύνδεση της NADPH στην enos. Στην συνέχεια, τα ηλεκτρόνια µεταφέρονται από το NADPH στο FAD, µετά στο FMN, και από εκεί στην αίµη µε αποτέλεσµα την µετατροπή του τρισθενούς σιδήρου της αίµης (Fe+3) σε δισθενή (Fe+2), ο οποίος συνδέει και ενεργοποιεί το οξυγόνο, το οποίο υδροξυλιώνει την L-αργινίνη σε ένα ενδιάµεσο παράγωγο που παραµένει συνδεδεµένο στην enos. Στην συνέχεια η ίδια διαδικασία επαναλαµβάνεται και η υδροξυλιωµένη L-αργινίνη οξειδώνεται σε L- κιτρουλλίνη µε παράλληλη παραγωγή NO. (87-89, 91) 30 Σελίδα

31 Ε. ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΜΟΝΟΞΕΙ ΙΟΥ ΤΟΥ ΑΖΩΤΟΥ Ο κύριος µηχανισµός δράσης του NO είναι η ενεργοποίηση της γουανυλοκυκλάσης µε αποτέλεσµα αύξηση της συγκέντρωσης του δεύτερου αγγελιοφόρου κυκλικού GMP στα κύτταρα-στόχους και τελικά ελάττωση της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης ασβεστίου. Τα τελευταία όµως χρόνια, έχει αναδειχτεί, ως εξίσου σηµαντικός µηχανισµός δράσης του NO η σύνδεσή του µε θειϊκές οµάδες της κυστεΐνης των πρωτεϊνών, διαδικασία που χαρακτηρίζεται ως Snitrosylation και είναι ανεξάρτητη της οδού της γουανυλοκυκλάσης. Μέσω της οδού αυτής, το NO αντιδρά µε µεγάλο αριθµό πρωτεϊνών µε ποικίλους ρόλους (µεµβρανικοί υποδοχείς, δίαυλοι ιόντων, πρωτεΐνες G, κυτταροπλασµατικά ένζυµα, µεταγραφικοί παράγοντες) και ρυθµίζει τη δράση τους. Στην S- nitrosylation συµµετέχουν εκτός από το ίδιο το NO και µεταβολίτες του, όπως το N2O3. Ο ρυθµός της S-nitrosylation καθορίζεται από την συγκέντρωση του NO και των πρωτεϊνών που συµµετέχουν στην αντίδραση αλλά και από την τοπογραφική τους σχέση εντός του κυττάρου, καθώς ορισµένες πρωτεΐνες-στόχοι εντοπίζονται πλησίον της enos. (87-89, 91) Αντίθετα, τόσο η S-nitrosylation όσο και η αποσύνδεση του NO από τις πρωτεΐνες-στόχους δεν απαιτεί την συµµετοχή ενζύµων. ΣΤ. ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΕΣ ΤΟΥ ΕΝ ΟΘΗΛΙΟΥ 1. Ρύθµιση της ροής του αίµατος Το ενδοθήλιο κατέχει κυρίαρχη θέση στη ρύθµιση της ροής του αίµατος. Λόγω της στρατηγικής θέσης του, έχει τη δυνατότητα άµεσης ανίχνευσης των αιµοδυναµικών και µηχανικών αλλαγών (όπως το shear stress) ενώ παράλληλα υφίσταται άµεσα την επίδραση δραστικών µορίων (όπως η ακετυλοχολίνη). Σε απάντηση, το ενδοθήλιο εκκρίνει ένα σύνολο δραστικών ουσιών που ρυθµίζουν τον αγγειακό τόνο και συνεπώς την ροή του αίµατος και την αρτηριακή πίεση. (87-89, 91) Μεταξύ αυτών περιλαµβάνονται αγγειοδιασταλτικές ουσίες όπως το NO, η προστακυκλίνη (PGI2) και ο υπερπολωτικός παράγοντας του ενδοθηλίου (endothelium-derived hyperpolarizing factor) και αγγειοσυσπαστικές ουσίες όπως 31 Σελίδα

32 η ενδοθηλίνη, η αγγειοτενσίνη ΙΙ, η θροµβοξάνη Α2, η προσταγλανδίνη H2 και ο παράγοντας ενεργοποίησης των αιµοπεταλίων (platelet activating factor, PAF). Η ισορροπία αγγειοσυπαστικών και αγγειοδιασταλτικών ουσιών είναι εκείνη που καθορίζει τον αγγειακό τόνο κι επιτρέπει τη διατήρηση της οµοιοστασίας στο αγγειακό δίκτυο. (87-89, 91) Οι ανωτέρω ουσίες δεν αποθηκεύονται εντός των κυττάρων αλλά η ρύθµιση της δράσης τους επιτυγχάνεται µέσω της ρύθµισης της µεταγραφής των γονιδίων που κωδικοποιούν την σύνθεσή τους, µέσω της εκλεκτικής εντόπισης των υποδοχέων τους σε συγκεκριµένα κύτταρα-στόχους και µέσω του ταχύτατου καταβολισµού τους. Όσον αφορά τη ρύθµιση του βασικού αγγειακού τόνου, αυτή επιτυγχάνεται τόσο στις αρτηρίες µε λειτουργία αεροθαλάµου όσο και στις αρτηρίες αντίστασης µέσω της έκκρισης του ΝΟ, όπως διαπιστώθηκε αρχικά σε πειράµατα σε ζώα και στην συνέχεια στα στεφανιαία αγγεία ανθρώπων. Στη ρύθµιση του βασικού αγγειακού τόνου συµµετέχουν επίσης η ενδοθηλίνη-1 και η αγγειοτενσίνη II. (87-89, 91) 2. Ο ρόλος του µονοξειδίου του αζώτου στη ρύθµιση της ροής του αίµατος Η ελαστικότητα των µεγάλων αρτηριών συµµετέχει ενεργά στο δυναµικό έλεγχο της καρδιακής λειτουργίας και καθορίζεται από τον τόνο των λείων µυϊκών ινών, τα δοµικά στοιχεία του αγγειακού τοιχώµατος (κυρίως ελαστίνη και κολλαγόνο) και την πίεση που ασκείται στο τοίχωµα από τη ροή του αίµατος. Το NO αυξάνει την ελαστικότητα και διατασιµότητα των µεγάλων αρτηριών τόσο άµεσα όσο και ελαττώνοντας τον τόνο των λείων µυϊκών ινών, ο οποίος ρυθµίζει εν µέρει και την ελαστικότητα των αρτηριών. (87-89, 91) Στα µυοκαρδιακά κύτταρα, το NO ρυθµίζει την κατανάλωση οξυγόνου, τη σύζευξη διέγερσης-συστολής και τον πολλαπλασιασµό τους. Το NO ελαττώνει τη θετική ινότροπη δράση των κατεχολαµινών. Επίσης, το NO ρυθµίζει έµµεσα την καρδιακή λειτουργία επηρεάζοντας τις περιφερικές αντιστάσεις και την αιµατική ροή στα στεφανιαία αγγεία. Τέλος, το NO προστατεύει την καρδιά από τη διαδικασία του remodeling που εµφανίζεται σε παθολογικές καταστάσεις. (87-89, 91) 32 Σελίδα

33 Στους νεφρούς, το NO προκαλεί διούρηση και νατριούρηση µέσω αγγειοδιαστολής, ενώ αναστέλλει και άµεσα την σωληναριακή επαναρρόφηση του νατρίου. Στους φλοιώδεις νεφρώνες ασκεί αγγειοδιασταλτική δράση κυρίως στο προσαγωγό αρτηρίδιο ενώ στους παραµυελικούς νεφρώνες δρα και στο προσαγωγό και στο απαγωγό αρτηρίδιο. Οι δράσεις αυτές είναι άµεσες, από το ενδονεφρικά παραγόµενο NO, αλλά και έµµεσες λόγω της ελάττωσης της αρτηριακής πίεσης που προκαλεί το NO που παράγεται στην συστηµατική κυκλοφορία. Όπως στην συστηµατική κυκλοφορία έτσι και στους νεφρούς το NO ανταγωνίζεται την αγγειοσυσπαστική δράση της αγγειοτενσίνης ΙΙ και ιδιαίτερα στους φλοιώδεις νεφρώνες. Επιπλέον, η σχετικά εκλεκτική δράση του NO στο προσαγωγό αρτηρίδιο ευθύνεται για την εντονότερη αγγειοσυσπαστική δράση της αγγειοτενσίνης II στο απαγωγό αρτηρίδιο. Τέλος, το NO ανταγωνίζεται την ινωτική δράση στο σπείραµα και το διαµεσοσωληναριακό ιστό της αγγειοτενσίνης II και του TGF-β (transforming growth factor). (87-89, 91) Σε µια άλλη προσέγγιση το NO λειτουργώντας ως νευροδιαβιβαστής τόσο στο κεντρικό νευρικό σύστηµα όσο και στα περιφερικά νεύρα συµµετέχει στη ρύθµιση της δραστηριότητας του αυτόνοµου νευρικού συστήµατος. Το NO ελαττώνει τη δραστηριότητα του συµπαθητικού νευρικού συστήµατος κι ενισχύει τη δράση του παρασυµπαθητικού νευρικού συστήµατος προκαλώντας και µε τον έµµεσο αυτό τρόπο αγγειοδιαστολή. (87-89, 91) 3. Ο ρόλος άλλων ουσιών που παράγονται από το ενδοθήλιο στη ρύθµιση της ροής του αίµατος Τα ενδοθηλιακά κύτταρα συνθέτουν και εκκρίνουν ενδοθηλίνη-1, µια από τις ισχυρότερες ενδογενείς αγγειοσυσπαστικές ουσίες, η οποία συµβάλλει στη ρύθµιση του βασικού αγγειακού τόνου και της αρτηριακής πίεσης. Επιπλέον, η σύνθεση της ενδοθηλίνης-1 αυξάνεται υπό την επίδραση του shear stress, υποξίας και ισχαιµίας. Η ενδοθηλίνη-1 είναι το κυριότερο µέλος της οικογένειας των ενδοθηλινών, η οποία περιλαµβάνει πεπτίδια µε 21 αµινοξέα που παράγονται από µια ποικιλία κυττάρων. Μετά την σύνθεσή της, η ενδοθηλίνη-1 δεν αποθηκεύεται στα ενδοθηλιακά κύτταρα αλλά εκκρίνεται από αυτά, συνδέεται στον υποδοχέα 33 Σελίδα

34 της που εµφανίζει έντονη έκφραση στις λείες µυϊκές ίνες του αγγειακού τοιχώµατος, µε αποτέλεσµα αύξηση της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης του ασβεστίου και τελικά αύξηση του τόνου των λείων µυϊκών ινών. Αξίζει να σηµειωθεί ότι η δράση της ενδοθηλίνης-1 διατηρείται και µετά την αποσύνδεσή της από τον υποδοχέα της, λόγω της διατήρησης της επίδρασής της στην ενδοκυττάρια συγκέντρωση του ασβεστίου. Η ενδοθηλίνη-1 ενισχύει τη δράση και άλλων αγγειοσυσπαστικών ουσιών, όπως της αγγειοτενσίνης ΙΙ και των κατεχολαµινών. Στους νεφρούς τέλος, πέραν της αγγειοσύσπασης των νεφρικών αγγείων, η ενδοθηλίνη-1 προκαλεί σύσπαση των µεσαγγειακών κυττάρων, υπερπλασία των κυττάρων του σπειράµατος και επάγει την εναπόθεση κολλαγόνου. (87-89, 91) Είναι γνωστό ότι το σύστηµα ρενίνης-αγγειοτενσίνης-αλδοστερόνης διαδραµατίζει κυρίαρχο ρόλο στη ρύθµιση της οµοιοστασίας ύδατος και ηλεκτρολυτών στον ανθρώπινο οργανισµό. Η πρώτη δραστική ουσία του συστήµατος αυτού, η ρενίνη, εκκρίνεται από την παρασπειραµατική συσκευή στους νεφρούς σε καταστάσεις υποογκαιµίας, ελαττωµένης ωσµωτικότητας και διέγερσης του συµπαθητικού νευρικού συστήµατος. Η ρενίνη διασπά το ανενεργό δεκαπεπτίδιο αγγειοτενσινογόνο, το οποίο συντίθεται στο ήπαρ, σε αγγειοτενσίνη Ι. Εκτός από το συστηµατικό ΣΡΑΑ, πλήρως λειτουργικά συστήµατα ρενίνηςαγγειοτενσίνης υπάρχουν και τοπικά στους ιστούς, τα οποία ασκούν αυτοκρινείς και παρακρινείς δράσεις. Στο ενδοθήλιο υπάρχει επίσης τοπικό σύστηµα ρενίνηςαγγειοτενσίνης το οποίο συµµετέχει ενεργά στη ρύθµιση της αρτηριακής πίεσης. Επιπλέον, στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων εντοπίζεται το ΜΕΑ, το οποίο διασπά την αγγειοτενσίνη Ι τόσο του συστηµατικού όσο και των τοπικών ΣΡΑΑ στο ενεργό οκταπεπτίδιο αγγειοτενσίνη ΙΙ, το τελικό δραστικό προϊόν του ΣΡΑΑ. Οι δράσεις της αγγειοτενσίνης ΙΙ ασκούνται µέσω των υποδοχέων της, AT1 και AT2. Οι AT1 υποδοχείς είναι οι κύριοι υποδοχείς της αγγειοτενσίνης ΙΙ, µέσω αυτών ασκείται το σύνολο των δράσεων της και εντοπίζονται στην καρδιά, την περιφερική κυκλοφορία, τους νεφρούς, τα επινεφρίδια και το κεντρικό νευρικό σύστηµα. Η σηµασία των AT2 υποδοχέων είναι λιγότερο γνωστή, ενέχονται όµως στην σύνθεση και έκκριση του NO και ορισµένων προσταγλανδινών. Η αγγειοτενσίνη ΙΙ είναι ισχυρή αγγειοσυσπαστική ουσία και αντιτίθεται στη δράση του NO συµβάλλοντας στη ρύθµιση του αγγειακού τόνου και της αρτηριακής πίεσης. Επιπλέον, η αγγειοτενσίνη συνιστά ισχυρό ερέθισµα για την παραγωγή 34 Σελίδα

35 ενδοθηλίνης, η οποία ευθύνεται εν µέρει για τις αγγειοσυσπαστικές δράσεις της αγγειοτενσίνης ΙΙ. Η ενδοθηλίνη µε την σειρά της διευκολύνει την µετατροπή της αγγειοτενσίνης Ι σε αγγειοτενσίνη ΙΙ, δηµιουργώντας έτσι ένα κύκλωµα θετικής ανατροφοδότησης που οδηγεί σε περαιτέρω αγγειοσύσπαση. Τέλος, η αγγειοτενσίνη ΙΙ ασκεί καθοριστικό ρόλο στη ρύθµιση της αρτηριακής πίεσης και µέσω των δράσεών της αφενός στη σπειροειδή ζώνη του φλοιού των επινεφριδίων όπου διεγείρει την σύνθεση αλδοστερόνης, η οποία προκαλεί κατακράτηση νατρίου και ύδατος και αφετέρου στον εγκέφαλο, όπου διεγείρει το κέντρο της δίψας και τα κέντρα του συµπαθητικού νευρικού συστήµατος. Σε αντίθεση µε την επίδρασή του στο NO, το shear stress καταστέλλει το ΣΡΑΑ µέσω της δράσης του τόσο στην σύνθεση όσο και στη δραστικότητα του ΜΕΑ. (87-89, 91) Το ενδοθήλιο ρυθµίζει τον αγγειακό τόνο και µέσω των επιδράσεών του στον µεταβολισµό της βραδυκινίνης. Το παραγόµενο από τα ενδοθηλιακά κύτταρα ΜΕΑ, εκτός από την µετατροπή της αγγειοτενσίνης Ι σε αγγειοτενσίνη ΙΙ, διασπά και αδρανοποιεί τη βραδυκινίνη. Επιπλέον, τα ενδοθηλιακά κύτταρα παράγουν µια πρωτεάση, την PRCP (prolylcarboxypeptidase), η οποία διασπά την αγγειοτενσίνη ΙΙ και µετατρέπει το κινινογόνο σε βραδυκινίνη. Η βραδυκινίνη ασκεί αγγειοδιασταλτική δράση αυξάνοντας την σύνθεση του NO και της προστακυκλίνης. Τέλος, η ρύθµιση του αγγειακού τόνου από το ενδοθήλιο επιτυγχάνεται και µέσω της έκκρισης της προστακυκλίνης και του PAF. Πρόκειται για ενδοκυττάριους αγγελιοφόρους που συντίθενται παράλληλα από τα ενδοθηλιακά κύτταρα από κοινές πρόδροµες ουσίες µετά την επίδραση ποικίλων µηχανικών ερεθισµάτων και δραστικών ουσιών. Αντίθετα, δεν παράγονται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα σε κατάσταση ηρεµίας κι εποµένως δε φαίνεται να συµβάλλουν στη ρύθµιση του βασικού αγγειακού τόνου. εν αποθηκεύονται εντός των ενδοθηλιακών κυττάρων και χαρακτηρίζονται από βραχεία ηµιπερίοδο ζωής, γεγονός που περιορίζει τις δράσεις τους σε τοπικό επίπεδο. Έτσι, ασκούν αυτοκρινείς δράσεις στα ενδοθηλιακά κύτταρα και κυρίως ρυθµίζουν την σύνθεση άλλων αγγειοδραστικών ουσιών από το ενδοθήλιο. Εκτός όµως από τις οµοιότητές τους, οι δύο αυτοί παράγοντες παρουσιάζουν και σαφείς διαφορές στη ρύθµιση της σύνθεσής τους, στις δράσεις τους και στον τρόπο µε τον οποίο τις ασκούν. Όπως και µε το NO, το shear stress αυξάνει την παραγωγή προστακυκλίνης και φαίνεται να αποτελεί τον κυριο φυσιολογικό ρυθµιστή της 35 Σελίδα

36 παραγωγής της. Επιπλέον, η προστακυκλίνη εκκρίνεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα µετά την σύνθεσή της και δρα στους υποδοχείς της στις λείες µυϊκές ίνες του αγγειακού τοιχώµατος προκαλώντας αγγειοδιαστολή. Αντίθετα, ο PAF εκφράζεται στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων αλλά δεν εκκρίνεται από αυτά. Σε πειραµατικές συνθήκες, η ενδαγγειακή έγχυση του PAF προκαλεί είτε αγγειοσύσπαση είτε αγγειοδιαστολή, αναλόγως της χορηγούµενης συγκέντρωσης και του µελετούµενου αγγειακού δικτύου. In vivo, οι αιµοδυναµικές επιδράσεις του PAF φαίνεται ότι είναι κυρίως έµµεσες µέσω διέγερσης της έκκρισης εικοσανοειδών, λευκοτριενίων ή άλλων µεσολαβητών από τα ενεργοποιηµένα λευκοκύτταρα και αιµοπετάλια. (87-89, 91) 4. Ρύθµιση της διαδικασίας της πήξης και ινωδόλυσης Η διαδικασία της πήξης διακρίνεται σχηµατικά στην αρχική αιµόσταση, η οποία περιλαµβάνει την προσκόλληση των αιµοπεταλίων στο αγγειακό τοίχωµα και την συσσώρευσή τους και οδηγεί στον σχηµατισµό του αιµοπεταλιακού θρόµβου, και στην κυρίως πήξη, κατά την οποία µέσω ενός καταρράκτη αντιδράσεων των παραγόντων της πήξης σχηµατίζεται θροµβίνη, η οποία µετατρέπει το ινωδογόνο σε αδιάλυτη ινική µε αποτέλεσµα τον σχηµατισµό του σταθερού θρόµβου. Το φυσιολογικό ενδοθήλιο αποτρέπει την ενεργοποίηση του πηκτικού µηχανισµού µέσω της αρνητικά φορτισµένης επιφάνειάς του και µέσω έκκρισης µορίων που αναστέλλουν την συσσώρευση των αιµοπεταλίων (NO και προστακυκλίνη), έχουν αντιπηκτική δράση (θροµβοµοντουλίνη (thrombomodulin, TM), αναστολέας της οδού του ιστικού παράγοντα (tissue factor pathway inhibitor, TFPI), πρωτεΐνες C και S), ή ενεργοποιούν την ινωδόλυση (ιστικός ενεργοποιητής του ινωδογόνου (tissue plasminogen activator, tpa)). Με τον τρόπο αυτό το ενδοθήλιο συµβάλλει στη διατήρηση της ροής του αίµατος και της ιστικής αιµάτωσης. Αντίθετα, σε περιπτώσεις αγγειακού τραύµατος, το ενδοθήλιο εξασφαλίζει την αιµόσταση και την αποκατάσταση της βλάβης µέσω της σύνθεσης πρωτεϊνών όπως ο παράγοντας von Willebrand (von Willebrand factor, vwf). (87-89, 91) 36 Σελίδα

37 5. Αρχική αιµόσταση Ο vwf είναι µια µεγάλου µοριακού βάρους γλυκοπρωτεΐνη που συντίθεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα µεγακαρυοκύτταρα και αποθηκεύεται σ αυτά µέσα στα σωµάτια Weibel-Palade και στα α-κοκκία αντίστοιχα. Το µεγαλύτερο ποσοστό του κυκλοφορούντος vwf προέρχεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Εκκρίνεται από το ενδοθήλιο τόσο υπό φυσιολογικές συνθήκες όσο και µετά από την επίδραση θροµβίνης, κυτταροκινών και shear stress. Ο vwf συµµετέχει στην αρχική αιµόσταση κυρίως διευκολύνοντας την προσκόλληση των αιµοπεταλίων στους υπενδοθηλιακούς ιστούς σε σηµεία βλάβης του αγγειακού τοιχώµατος δρώντας ως γέφυρα µεταξύ των υποδοχέων GP Ib/V/IX των αιµοπεταλίων και των υπενδοθηλιακών ιστών. Η δράση του είναι εντονότερη σε στενωµένες αρτηρίες όπου αναπτύσσεται αυξηµένο shear stress. Επιπλέον, ενεργοποιεί τα αιµοπετάλια και αυξάνει τη συσσώρευσή τους ενώ συµµετέχει και στην κυρίως πήξη σταθεροποιώντας τον παράγοντα VIII. Τα αιµοπετάλια έχουν κεντρικό ρόλο στη διαδικασία της αρχικής αιµόστασης. Τα αιµοπετάλια, λόγω του µεγέθους τους, κινούνται κοντά στο ενδοθήλιο και έχουν τη δυνατότητα να αλληλεπιδράσουν µ αυτό ακόµα και σε φυσιολογικές συνθήκες. Ωστόσο, τα ενδοθηλιακά κύτταρα διαθέτουν στην επιφάνειά του µια ADPάση (CD39), η οποία µετατρέπει το ADP σε ανενεργό AMP αποτρέποντας έτσι την συσσώρευση των αιµοπεταλίων. Αντίθετα, µετά τη βλάβη του ενδοθηλίου, τα ενεργοποιηµένα αιµοπετάλια προσκολλώνται ευχερώς στους υπενδοθηλιακούς ιστούς µε την µεσολάβηση µορίων προσκόλλησης που εκφράζονται στην επιφάνεια των αιµοπεταλίων (PECAM-1, P-σελεκτίνη, ιντεγκρίνη αiibβ3 (GP IIb- IIIa)). Αυτά τα µόρια προσκόλλησης αλληλεπιδρούν µε ειδικούς συνδέτες που υπάρχουν στην εξωκυττάρια θεµέλια ουσία, όπως το κολλαγόνο, η φιµπρονεκτίνη και ο vwf. Τα αιµοπετάλια µπορούν να προσκολληθούν στο αγγειακό τοίχωµα και εµµέσως, συνδεόµενα µε ουδετερόφιλα και µονοκύτταρα. Τα αιµοπετάλια υπό βασικές συνθήκες εκφράζουν το CD40, έναν µεµβρανικό υποδοχέα µε µοριακό βάρος 50 kd, και µετά την ενεργοποίησή τους εκφράζουν και τον συνδέτη του υποδοχέα αυτού, το CD40L (CD40 ligand, CD40L, CD154), µια διαµεµβρανική γλυκοπρωτεΐνη µε µοριακό βάρος 39 kd και µε δοµική οµολογία µε τον TNF-α. Τόσο ο CD40 όσο και ο CD40L είναι λειτουργικά µόρια. Εκτός από τα ενεργοποιηµένα αιµοπετάλια, την ταυτόχρονη 37 Σελίδα

38 αυτή έκφραση CD40 και CD40L εµφανίζουν και τα ενεργοποιηµένα T- λεµφοκύτταρα, τα µακροφάγα, τα ενδοθηλιακά κύτταρα και οι λείες µυϊκές ίνες. Ο CD40L των αιµοπεταλίων προάγει την συσσώρευσή τους αλληλεπιδρώντας µε την ιντεγκρίνη αiibβ3. Η τελευταία είναι η κύρια αιµοπεταλιακή ιντεγκρίνη, αποτελεί τον υποδοχέα του ινωδογόνου και συνδεόµενη µαζί του είναι η κύρια υπεύθυνη για τη συσσώρευση των αιµοπεταλίων. Επιπλέον, το σύστηµα CD40/CD40L αυξάνει την έκφραση του ιστικού παράγοντα στα ενδοθηλιακά κύτταρα και τις λείες µυϊκές ίνες. Ο CD40L µπορεί ταχέως να διασπαστεί σε διαλυτή µορφή (soluble CD40L, scd40l) η οποία είναι βιολογικά δραστική, συνδέεται µε την ιντεγκρίνη αiibβ3 και µε το CD40 και προκαλεί ενεργοποίηση και άλλων αιµοπεταλίων. Το µεγαλύτερο ποσοστό scd40l στο αίµα προέρχεται από τα ενεργοποιηµένα αιµοπετάλια. (87-89, 91) Τέλος, η P-σελεκτίνη διαδραµατίζει σηµαντικό ρόλο στην αλληλεπίδραση αιµοπεταλίων, λευκοκυττάρων και ενδοθηλιακών κυττάρων. Η P-σελεκτίνη των αιµοπεταλίων επάγει την συσσώρευσή τους. 6. Κυρίως πήξη Ο ιστικός παράγοντας είναι µια διαµεµβρανική πρωτεΐνη µε µοριακό βάρος 45 kda, εντοπίζεται σε µια µεγάλη ποικιλία κυττάρων και στην εξωκυττάρια θεµέλια ουσία του αγγειακού τοιχώµατος και έχει πρωταγωνιστικό ρόλο στη διαδικασία της κυρίως πήξης. Τα φυσιολογικά ενδοθηλιακά κύτταρα εκφράζουν µικρήποσότητα ή και καθόλου ιστικό παράγοντα.(90,91,94) Ωστόσο, µε τη βλάβη του ενδοθηλίου, ο ιστικός παράγοντας άλλων κυττάρων και της εξωκυττάριας θεµέλιας ουσίας του αγγειακού τοιχώµατος έρχεται σε επαφή µε τους παράγοντες πήξης στον αγγειακό αυλό και ενεργοποιείται η διαδικασία της πήξης. Πιο συγκεκριµένα, η διαδικασία της κυρίως πήξης αρχίζει µε την σύνδεση του ιστικού παράγοντα στον ενεργοποιηµένο FVII και στην συνέχεια το σύµπλεγµα ιστικού παράγοντα-fviia ενεργοποιεί τον FX. Ο FXa σχηµατίζει µαζί µε τον FVa και ασβέστιο το σύµπλεγµα της προθροµβινάσης, το οποίο µετατρέπει την προθροµβίνη σε θροµβίνη, η κύρια λειτουργία της οποίας είναι να µετατρέπει το ινωδογόνο σε ινική. Επιπλέον, το σύµπλεγµα ιστικού παράγοντα-fviia ενεργοποιεί και τον FIX, ο οποίος µαζί µε τον FVIIIa και ασβέστιο σχηµατίζουν το σύµπλεγµα της δεκάσης, το οποίο και πάλι ενεργοποιεί τον FX. Η παραγόµενη 38 Σελίδα

39 θροµβίνη ενεργοποιεί τους απαραίτητους συµπαράγοντες FV και FVIII, καθώς και τον FXI, ο οποίο ενεργοποιεί τον FIX. Τέλος, η θροµβίνη ενεργοποιεί και τα αιµοπετάλια αλλά και τον παράγοντα XIII, ο οποίος σταθεροποιεί τον σχηµατιζόµενο θρόµβο. Τα ενεργοποιηµένα αιµοπετάλια έχουν σηµαντική συµµετοχή στην κυρίως πήξη, καθώς τα φωσφολιπίδια της επιφάνειάς τους επιταχύνουν τον σχηµατισµό των συµπλεγµάτων της δεκάσης και προθροµβινάσης. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα εκφράζουν την TM, µια διαµεµβρανική πρωτεΐνη που καταστέλλει την κυρίως πήξη µέσω πολλαπλών οδών. Λειτουργεί ως υποδοχέας υψηλής συγγένειας για τη θροµβίνη, η οποία, µετά την σύνδεσή της µε την TM εισέρχεται στο ενδοθηλιακό κύτταρο, αποικοδοµείται και δεν µπορεί να ασκήσει τις δράσεις της. Επιπλέον, η TM συνδεόµενη µε τη θροµβίνη µπορεί και τροποποιεί τη διαµόρφωση της τελευταίας ώστε η θροµβίνη να ενεργοποιεί την πρωτεΐνη C, έναν σηµαντικό αναστολέα της πήξης. Τέλος, η TM δεσµεύει και αναστέλλει τη δράση του FXa. Η διαδικασία της πήξης ελέγχεται και περιορίζεται στην περιοχή της αγγειακής βλάβης από 3 κύριες ρυθµιστικές πρωτεΐνες, την αντιθροµβίνη ΙΙΙ, την πρωτεΐνη C και τον TFPI. Η αντιθροµβίνη ΙΙΙ δρα ως αναστολέας πρωτεασών σερίνης και είναι ο κύριος αναστολέας της θροµβίνης και του FXa. Η εξωκυττάρια θεµέλια ουσία που υπόκειται των ενδοθηλιακών κυττάρων περιέχει θειϊκή ηπαράνη και γλυκοζαµινογλυκάνες που αυξάνουν τη δραστικότητα της αντιθροµβίνης ΙΙΙ. Η ενεργοποιηµένη πρωτεΐνη C είναι εξαιρετικά ισχυρός αντιπηκτικός παράγοντας. Όπως αναφέρθηκε, η πρωτεΐνη C ενεργοποιείται από τη θροµβίνη όταν η τελευταία συνδεθεί µε την TM. Η σύνδεση της πρωτεΐνης C µε τον υποδοχέα της στα ενδοθηλιακά κύτταρα (endothelial protein C receptor, EPCR) αυξάνει κατά 5 φορές την ενεργοποίησή της από το σύµπλεγµα θροµβίνης-θροµβοµοντουλίνης. Επιπλέον, η δραστικότητα της ενεργοποιηµένης πρωτεΐνης C ενισχύεται από την πρωτεΐνη S, η οποία παράγεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα και από άλλα είδη κυττάρων. Η ενεργοποιηµένη πρωτεΐνη C απενεργοποιεί µέσω πρωτεόλυσης τους FVa και FVIIIa και δρώντας στον EPCR ελαττώνει την έκφραση του ιστικού παράγοντα. Τέλος, τα ενδοθηλιακά κύτταρα παράγουν τον TFPI, τον κύριο αναστολέα της ενεργοποίησης της πήξης από τον ιστικό παράγοντα. Η ισορροπία µεταξύ ιστικού παράγοντα και TFPI είναι καθοριστική για τον έλεγχο της κυρίως πήξης. Ο TFPI αναστέλλει το σύµπλεγµα TF-FVIIa σχηµατίζοντας µαζί µε τον Fxa ένα 39 Σελίδα

40 ανενεργό τετραµερές σύµπλεγµα (TF-FVIIa-FXa-TFPI). O TFPI κυκλοφορεί και στο αίµα σε ελεύθερη µορφή (free TFPI, f-tfpi), η οποία επίσης ασκεί ισχυρή αντιπηκτική δράση. (87-89, 91) 7. Ινωδόλυση Τα ενδοθηλιακά κύτταρα ελέγχουν αποτελεσµατικά τη διαδικασία της ινωδόλυσης. Η δράση τους αυτή διαφοροποιείται ανάλογα µε την λειτουργική τους κατάσταση (βασικές συνθήκες ή µετά από ενεργοποίηση) και την παρουσία µορίων στον αγγειακό αυλό που συµµετέχουν στη διαδικασία πήξης και ινωδόλυσης. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα συνθέτουν tpa, ο οποίος είναι ο πιο σηµαντικός ενεργοποιητής της ινωδόλυσης καθώς καταλύει την µετατροπή του προενζύµου πλασµινογόνου σε πλασµίνη, η οποία µε την σειρά της διασπά την ινική. Στην συνέχεια, τα προϊόντα της διάσπασης της ινικής (fibrin degradation products, FDP) αναστέλλουν τον σχηµατισµό νέας ινικής. Επιπλέον, η πλασµίνη ελλατώνει και τη δραστηριότητα των αιµοπεταλίων. Πρέπει να αναφερθεί ότι µόνο ένα ποσοστό των ενδοθηλιακών κυττάρων παράγουν tpa, αλλά τόσο το ποσοστό των κυττάρων που συνθέτουν tpa όπως η παραγωγή και έκκρισή του αυξάνονται σηµαντικά µε την επίδραση ειδικών ερεθισµάτων. Επίσης, τα ενδοθηλιακά κύτταρα εκφράζουν τον υποδοχέα του tpa στην επιφάνειά τους και η σύνδεση του t- PA µε τον τελευταίο ενισχύει την ινωδολυτική του δράση. Ακόµη, τα ενδοθηλιακά κύτταρα διαθέτουν και υποδοχείς πλασµινογόνου, φέρνοντας το έτσι σε επαφή µε τον tpa και αυξάνοντας περαιτέρω την παραγωγή πλασµίνης. Τέλος, τα ενδοθηλιακά κύτταρα εκφράζουν και υποδοχείς πλασµίνης, προστατεύοντάς την µε αυτό τον τρόπο από την αναστολή από την α2- αντιπλασµίνη, τον ισχυρότερο αναστολέα της. (87-89, 91) Τα ενδοθηλιακά κύτταρα επάγουν την ινωδόλυση και µέσω παραγωγής της PRCP, η η οποία µετατρέπει την προκαλλικρεΐνη σε καλλικρεΐνη. Η καλλικρεΐνη στην συνέχεια ενεργοποιεί τον FXII. Ωστόσο, αυτή η αντίδραση δεν θεωρείται σήµερα ότι ενεργοποιεί την πήξη, καθώς µόνο σε σηπτικές καταστάσεις ή κατά την επαφή του αίµατος µε ξένες επιφάνειες (όπως στο σύστηµα της εξωσωµατικής κυκλοφορίας) παρατηρείται ενεργοποίηση της κυρίως πήξης από τον FXIIa. Αντίθετα, φαίνεται ότι ο FXIIa ενεργοποιεί το πλασµινογόνο. Επιπλέον, για να ενεργοποιηθεί η προκαλλικρεΐνη πρέπει να συνδεθεί µε το κινινογόνο και η 40 Σελίδα

41 παραγωγή καλλικρεΐνης από την PRCP συνοδεύεται από µετατροπή του κινινογόνου σε βραδυκινίνη. Η βραδυκινίνη αυξάνει την έκκριση tpa από τα ενδοθηλιακά κύτταρα κι ενεργοποιεί έτσι περαιτέρω την ινωδόλυση. Αντίθετα µε τις ανωτέρω δράσεις τους, τα ενδοθηλιακά κύτταρα µπορούν και να καταστείλουν την ινωδόλυση µέσω της σύνθεσης του αναστολέα της ενεργοποίησης του πλασµινιγόνου (plasminogen activator inhibitor, PAI-1). Ο PAI-1 ενεργοποιείται από την θροµβίνη και είναι ο κύριος αναστολέας της ενεργοποίησης του πλασµινογόνου από τον tpa. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα σε φυσιολογικές συνθήκες δεν παράγουν σηµαντικές ποσότητες PAI-1 αλλά η παραγωγή του αυξάνεται σηµαντικά µετά την έκθεση τους σε ορισµένα ερεθίσµατα (θροµβίνη, κυτταροκίνες, οξειδωµένη LDL). Ο PAI-1 συντίθεται και από τα ηπατοκύτταρα, τα αιµοπετάλια, τις λείες µυϊκές ίνες και τα λιποκύτταρα. Η ισορροπία µεταξύ tpa και PAI-1 καθορίζει την πορεία της ινωδόλυσης. Υπό φυσιολογικές συνθήκες, ο PAI-1 βρίσκεται στην κυκλοφορία σε σηµαντική περίσσεια σε σχέση µε τον t-pa µε τον οποίο σχηµατίζει σύµπλοκο και τον απενεργοποιεί. Έτσι αποτρέπεται η εκσεσηµασµένη παραγωγή πλασµίνης που θα οδηγούσε σε συστηµατική αιµορραγία ενώ παράλληλα καθίσταται δυνατή και η τοπική λύση του θρόµβου αποτρέποντας τον ανεξέλεγκτη παραγωγή του που θα οδηγούσε σε απόφραξη του αγγειακού αυλού. (87-89, 91) Τέλος, τα ενδοθηλιακά κύτταρα µπορούν να καταστείλουν την ινωδόλυση και µέσω της TM, καθώς το σύµπλεγµα TM-θροµβίνης επιταχύνει την ενεργοποίηση του TAFI (thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor), ενός σηµαντικού αναστολέα της ινωδόλυσης. Ο TAFI είναι µια καρβοξυπεπτιδάση που αποσπά από την ινική τις θέσεις σύνδεσης του πλασµινογόνου, της πλασµίνης και του t-pa µε αποτέλεσµα αναστολή της ινωδόλυσης. 8. Ο ρόλος του µονοξειδίου του αζώτου στην πήξη Το NO αναστέλλει την ενεργοποίηση, προσκόλληση και συσσώρευση των αιµοπεταλίων και ελαττώνει την έκφραση της P-σελεκτίνης, της ιντεγκρίνης αiibβ3 και του CD40L στην επιφάνειά τους. Εκτός από τη κατασταλτική δράση του στην αρχική αιµόσταση, το NO δρα και στην κυρίως πήξη ελαττώνοντας την παραγωγή θροµβίνης και ιστικού παράγοντα, ενώ επιπλέον ενεργοποιεί και την ινωδόλυση. Τέλος, τόσο τα αιµοπετάλια όσο και οι παράγοντες της πήξης 41 Σελίδα

42 αυξάνουν την παραγωγή NO ασκώντας έτσι αρνητική παλίνδροµη ρύθµιση στη διαδικασία της πήξης. Η προστακυκλίνη δρώντας στους υποδοχείς της στα αιµοπετάλια προκαλεί αναστολή της ενεργοποίησης, προσκόλλησης και συγκόλλησης των αιµοπεταλίων. Επίσης, τα αιµοπετάλια παράγουν θροµβοξάνη Α2, η οποία µπορεί να µετατραπεί σε προστακυκλίνη εντός των ενδοθηλιακών κυττάρων. Αντίθετα, η ενδοθηλίνη-1 αυξάνει την ενεργοποίηση των αιµοπεταλίων και η αγγειοτενσίνη ΙΙ αυξάνει την έκφραση του ιστικού παράγοντα στα ενδοθηλιακά κύτταρα και την σύνθεση και απελευθέρωση του PAI-1 από τα ενδοθηλιακά κύτταρα, όπως και τη δραστικότητά του. Τέλος, ο PAF ενεργοποιεί τα αιµοπετάλια και διεγείρει την προσκόλληση και συγκόλλησή τους. Η σύνθεση του PAF επάγεται από τη θροµβίνη αλλά το NO αναστέλλει τη δράση αυτή της θροµβίνης. (87-89, 91) Ζ. ΥΠΕΡΟΜΟΚΥΣΤΕΪΝΑΙΜΙΑ Η οµοκυστεΐνη είναι ένα αµινοξύ που σχηµατίζεται σε ένα ενδιάµεσο στάδιο της διαδικασίας παραγωγής της µεθειονίνης. Η οµοκυστεΐνη µπορεί να υποστεί µεθυλίωση σε µεθειονίνη από την συνθετάση της µεθειονίνης, η δράση της οποίας εξαρτάται από την παρουσία φυλλικού και βιταµίνης B12. Επίσης, η οµοκυστεΐνη µπορεί να µετατραπεί σε κυσταθειονίνη από την συνθετάση της κυσταθειονίνης, ενώ στην συνέχεια η κυσταθειονίνη διασπάται σε κυστεΐνη από τη λυάση της κυσταθειονίνης. Και τα δύο ένζυµα αυτής της οδού χρησιµοποιούν ως συνένζυµο τη βιταµίνη Β6. Η συγκέντρωση οµοκυστεΐνης παρουσιάζει µεγάλο εύρος διακύµανσης στο γενικό πληθυσµό και σχετίζεται αρνητικά µε την πρόσληψη φυλλικού και B12 και θετικά µε το άρρεν φύλο, την ηλικία, την κρεατινίνη, την αρτηριακή πίεση, το κάπνισµα και την κατανάλωση καφεΐνης και οινοπνεύµατος. Πριν το 1998, το 30% των ατόµων άνω των 67 ετών στις ΗΠΑ είχαν υπεροµοκυστεϊναιµία (>14 µmol/l). Σήµερα, µετά την εφαρµογή του εµπλουτισµού των αλεύρων µε φυλικό, τα επίπεδα οµοκυστεΐνης στις ΗΠΑ έχουν ελαττωθεί σηµαντικά. (87-89, 91) Η υπεροµοκυστεϊναιµία θεωρείται σήµερα ανεξάρτητος παράγοντας κινδύνου για εµφάνιση καρδιαγγειακής νοσηρότητας και θνησιµότητας. Ωστόσο, οι µηχανισµοί πρόκλησης αθηροσκλήρυνσης από τα αυξηµενα επίπεδα οµοκυστεΐνης δεν είναι εντελώς αποσαφηνισµένοι, αλλά η δυσµενής της επίδραση 42 Σελίδα

43 στο ενδοθήλιο φαίνεται να αποτελεί κεντρικό µηχανισµό. Σε πολλές µελέτες έχει διαπιστωθεί ενδοθηλιακή δυσλειτουργία σε άτοµα µε υπεροµοκυστεϊναιµία ενώ η ελάττωση των επιπέδων της οµοκυστεΐνης µε χορήγηση φυλλικού οξέος βελτιώνει την αγγειοδιασταλτική ικανότητα του ενδοθηλίου. (87-89, 91) Το οξειδωτικό stress είναι και στην υπεροµοκυστεϊναιµία ο κύριος µηχανισµός πρόκλησης ενδοθηλιακής δυσλειτουργίας. In vitro, η έκθεση ενδοθηλιακών κυττάρων σε αυξηµένες συγκεντρώσεις οµοκυστεΐνης αυξάνει την παραγωγή Ο2. Επίσης, η οµοκυστεΐνη αυξάνει την οξείδωση της LDL και καταστέλλει την υπεροξειδάση της γλουταθειόνης. Τα επίπεδα οµοκυστεΐνης σχετίζονται θετικά µε βαρύτητα του οξειδωτικού stress. Τέλος, η πειραµατική πρόκληση υπεροµοκυστεϊναιµίας (30-35 µmol/l) µε χορήγηση µεθειονίνης προκαλεί οξέως ενδοθηλιακή δυσλειτουργία µέσω του οξειδωτικού stress. Η οξεία αυτή ενδοθηλιακή δυσλειτουργία αναστρέφεται µε την χορήγηση αντιοξειδωτικών. Επιπλέον, η οµοκυστεΐνη καταστέλλει άµεσα την παραγωγή NO, ενεργοποιεί τη φλεγµονώδη διαδιακασία αυξάνοντας την παραγωγή κυτταροκινών και χηµειοκινών και την προσκόλληση των λευκοκυττάρων στο ενδοθήλιο, και πυροδοτεί τον καταρράκτη της πήξης αυξάνοντας την ενεργοποίηση και την ικανότητα των αιµοπεταλίων να συσσωρεύονται, την παραγωγή θροµβοξάνης και ιστικού παράγοντα και ελαττώνοντας τη δράση της πρωτεΐνης C. Το γονίδιο που κωδικοποιεί την ενδοθηλιακή συνθάση (92) του µονοξειδίου του αζώτου (e-nos) κλωνοποιήθηκε για πρώτη φορά το 1992 από τον Janssens και τους συνεργάτες του και τον Marsden και τους συνεργάτες του. Εκτεινόµενο σε 21kb γενωµικού DNA, στο χρωµόσωµα 7q35-36, τo e-nos γονίδιο περιέχει 26 εξόνια που κωδικοποιούν µία πρωτεΐνη 135-kD αποτελούµενη από αµινοξέα. Μετά το χαρακτηρισµό του e-nos γονιδίου, παρατηρήθηκαν διάφορες παραλλαγές αλληλοµόρφων που σχετίσθηκαν µε καρδιαγγειακές διαταραχές και απεικονίζονται στο παρακάτω σχήµα (Εικόνα 9). Τρεις τύποι µεταλλάξεων έχουν, µέχρι σήµερα, αναγνωρισθεί: στην περιοχή των (92)ιντρονίων, των εξονίων και της ρυθµιστικής περιοχής. 43 Σελίδα

44 Εικόνα 9: Σχηµατική απεικόνιση του γονιδίου που κωδικοποιεί την ενδοθηλιακή συνθάση του ΝΟ (e-nos). AUG σηµατοδοτεί την έναρξη της µεταγραφής. Ειδικοί πολυµορφισµοί σηµειώνονται µε βέλη. Ο σηµειακός νουκλεοτιδικός πολυµορφισµός G894T στο εξόνιο 7 οδηγεί σε µία αλλαγή στην αλληλουχία της e-nos πρωτεΐνης (Glu298Asp)..(89) Μέχρι σήµερα περισσότερες από 40 δηµοσιεύσεις περιγράφουν τους πολυµορφισµούς του e-nos γονιδίου και τις πιθανές συσχετίσεις τους µε διάφορες ασθένειες. Σε αυτές τις αναφορές εξετάζεται η πιθανή συσχέτιση ενός πολυµορφισµού του «υποψηφίου γονιδίου» µε την πιθανότητα ανάπτυξης κάποιας νόσου και τα αποτελέσµατα επεξεργάζονται στατιστικά. Αυτοί οι πολυµορφισµοί του γονιδίου οδηγούν σε αλλαγές στα επίπεδα, τη δραστηριότητα ή τη θέση του e- NOS ενζύµου που πιθανώς σχετίζονται µε ευαισθησία ανάπτυξης καρδιαγγειακών διαταραχών. Οι µεταλλάξεις αλληλόµορφων του e-nos γονιδίου µπορούν είτε άµεσα να επηρεάζουν τις ιδιότητες του e-nos ενζύµου είτε έµµεσα να οδηγούν σε αλλαγές στη δοµή του γονιδίου, που µε τη σειρά τους θα δώσουν άµεσες επιδράσεις. Μέχρι σήµερα έχουν περιγραφεί διάφοροι γενετικοί πολυµορφισµοί του e- NOS γονιδίου και έχουν χαρακτηρισθεί ως «ύποπτοι» σε διάφορες καρδιαγγειακές και πνευµονικές νόσους. (89) Η. Ο ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΣ e OS 3 - Glu298Asp Ένας συχνός σηµειακός νουκλεοτιδικός πολυµορφισµός (Single Nucleotide Polymorphism) έχει παρατηρηθεί στο εξόνιο 7 και συνίσταται από αντικατάσταση γουανίνης G από θυµίνη Τ στη νουκλεοτιδική θέση 894 (894G>T), που οδηγεί σε νουκλεοτιδική αντικατάσταση γλουταµινικού οξέος από ασπαρτικό οξύ στη θέση 44 Σελίδα

45 298 (Glu298Asp) ή (E298D) όπου Ε το σύµβολο του γλουταµινικού οξέος και D του ασπαρτικού οξέος. Ο πολυµορφισµός Glu298Asp είναι ο µόνος που οδηγεί σε αντικατάσταση αµινοξέος στο µόριο της e-nos πρωτεΐνης (89),(Εικόνα 9). Eικόνα 9: Σχηµατική αναπαράσταση του πολυµορφισµού e-nos Glu298Asp.(92) Μία τρισδιάστατη απεικόνιση του διµερούς e-nos που παρουσιάζει την αλλαγή του αµινοξέος στη θέση 298 φαίνεται στο παρακάτω σχήµα (Εικόνα 10). Αυτή η θέση του αµινοξέος βρίσκεται στην εξωτερική επιφάνεια του διµερούς και όπως φαίνεται δεν βρίσκεται κοντά στο ενεργό κέντρο του ενζύµου ή σε κρίσιµη περιοχή σύνδεσης του συνενζύµου (που βρίσκεται στην αριστερή περιοχή). Αυτή η αντικατάσταση του αµινοξέος ίσως έχει σηµαντικές συνέπειες όσον (89) αναφορά τη σταθερότητα και δραστικότητα του ενζύµου.επίσης, καθιστά το ένζυµο ευαίσθητο σε ενδοκυττάρια πρωτεόλυση και µεταγενέστερη αδρανοποίηση. Παρόλο που οι ειδικές αλληλεπιδράσεις σύνδεσης του e-nos µε τις δοµές της ενδοθηλιακής µεµβράνης δεν έχουν καθορισθεί πλήρως, αυτή η σηµειακή µετάλλαξη θα µπορούσε πιθανώς να αλλάξει τις αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης βάσει της τοποθέτησής της στην εξωτερική επιφάνεια του διµερούς. 45 Σελίδα

46 Εικόνα 10: Τρισδιάστατη απεικόνιση του διµερούς e-nos.(89) Η διαταραχή στη δραστικότητα του e-nos, που προκαλείται από τους γενετικούς πολυµορφισµούς, οδηγεί σε αλλαγή στην παραγωγή του ΝΟ και ίσως να οδηγεί σε ενδοθηλιακή δυσλειτουργία και να συµβάλλει στην παθογένεια διάφορων καρδιαγγειακών διαταραχών. Ο πολυµορφισµός Glu298Asp που περιγράφηκε παραπάνω είναι ένας από του τρείς γνωστούς πολυµορφισµούς που ανακαλύφθηκαν έως σήµερα που προκαλεί αλλαγές στην αλληλουχία της e-nos πρωτεΐνης οδηγώντας στην υπόθεση ότι η µετάλλαξη σε αυτό το σηµείο ίσως αλλάζει τη δραστικότητα της e- NOS ή τη ρύθµιση αυτής. Το µεταλλαγµένο γονίδιο 298Asp έχει συσχετισθεί µε τον αριθµό των στεφανιαίων αγγείων που έχουν υποστεί στένωση, µε στεφανιαίο αγγειόσπασµο, µε τον κίνδυνο ανάπτυξης οξέος εµφράγµατος του µυοκαρδίου µε στεφανιαία νόσο και υπέρταση, παρόλο που αυτά τα αποτελέσµατα είναι αµφισβητήσιµα. (89) Θ. Ο ΠΟΛΥΜΟΡΦΙΣΜΟΣ e OS 3 - T768C Όπως ήδη αναφέρθηκε, στην περιοχή του προαγωγέα του γονιδίου της enos έχουν εντοπιστεί τρεις πολυµορφισµοί, οι T786C, A922G και T1468A. Ο πιο σηµαντικός από τους τρεις φαίνεται ότι είναι (87-89,91) ο T786C, καθώς η παρουσία του C αλληλίου ελαττώνει κατά 50% το ρυθµό µεταγραφής του γονιδίου της enos τόσο υπό φυσιολογικές συνθήκες όσο και µετά την επίδραση υποξίας ή shear stress, ενώ οι άλλοι δύο πολυµορφισµοί δεν έχουν καµία επίδραση. Όπως και µε τον προηγούµενο πολυµορφισµό, η συχνότητα του C αλληλίου στο γενικό 46 Σελίδα

47 πληθυσµό είναι πολύ µεγαλύτερη στη λευκή φυλή (περίπου 61%) σε σχέση µε την κίτρινη φυλή (21% ως 32%). Η παρουσία του C αλληλίου σχετίζεται µε ελαττωµένη συγκέντρωση NOx σε ορισµένες µελέτες, αλλά όχι σε όλες. Επίσης, η παρουσία του σχετίστηκε µε διαταραχή της αγγειοδιασταλτικής ικανότητας του ενδοθηλίου στο γενικό πληθυσµό και σε ασθενείς µε στεφανιαία νόσο, αν και άλλες µελέτες δεν επιβεβαίωσαν αυτά τα ευρήµατα.(90,91) Επίσης, δε διαπιστώθηκε σχέση του πολυµορφισµού T786C µε τη βαρύτητα της αθηροσκλήρωσης στις καρωτίδες. Σε ορισµένες µελέτες, η παρουσία του C αλληλίου σχετίστηκε µε την παρουσία στεφανιαίας νόσου αν και όχι σε άλλες. Πάντως, στην πολύ πρόσφατη µεταανάλυση που προαναφέρθηκε και η οποία συµπεριέλαβε 22 µελέτες που εξέτασαν τη σχέση του πολυµορφισµού T786C µε την παρουσία στεφανιαίας νόσου (συνολικά ασθενείς και µάρτυρες) διαπιστώθηκε ότι η παρουσία του C αλληλίου αυξάνει τον κίνδυνο εµφάνισης στεφανιαίας νόσου κατά 17% ανεξαρτήτως φυλής. Αντίθετα, τα υπάρχοντα δεδοµένα για τη σχέση του πολυµορφισµού T786C µε την εµφάνιση ΑΕΕ είναι περιορισµένα, µε θετικές αλλά και αρνητικές αναφορές. (87-89,91) Τέλος, στην πολύ πρόσφατη Ελληνική µετα-ανάλυση στην οποία συµπεριλήφθησαν 7 µελέτες που διερεύνησαν τη σχέση του πολυµορφισµού T786C µε την εµφάνιση αρτηριακής υπέρτασης (συνολικά 2491 ασθενείς µε αρτηριακή υπέρταση και 3913 µάρτυρες), δεν διαπιστώθηκε παρουσία συσχέτισης. 47 Σελίδα

48 Β ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 48 Σελίδα

49 1. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Ο σκοπός αυτής της έρευνας είναι: Η αποκάλυψη, η συχνότητα κατανοµής και ο συσχετισµός των σηµειακών νουκλεοτιδικών πολυµορφισµών, (SNPs, single nucleotide polymorphisms) (Πίνακες 8 15) σε δείγµα γυναικες µε ιστορικό καθ έξιν αποβολών οι οποίες λαµβάνουν προληπτική αντι-θροµβοφιλική θεραπεία µε σαλικιλικό οξύ, ηπαρίνη χαµηλόυ µοριακού βάρους και γ-σφαιρίνη τόσο σε µονοθεραπεία όσο και σε συνδυασµένη διπλού ή και τριπλού φαρµακευτικού σχήµατος ανάλογα µε την διασπορά των συνοδών επιβαρυντικών παραγόντων από το µαιευτικόγυναικολογικό, αιµατολογικό και οικογενές-κοινωνικό ιστορικό των ασθενών. Πίνακας 8. Οι πολυµορφισµοί στην παρούσα µελέτη Πολυµορφισµοί και έλεγχος Θροµβοφιλίας 1.Plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1) 4G/5G 2.Angiotensinogen ( AGT) Met 235Thr 3.Endothelial nitric oxide synthase (NOS 3) T768C 4.Endothelial nitric oxide synthase (NOS 3) Gly298Asp 5.Apolipoprotein E3 (APOE3) Τ3937+C Apolipoprotein E4 (APOE4) C3937+C Methylenetetrahydrofolatereductase (MTHFR C677T/A1298C) Πίνακας 9. SNPs που µεταβλήθηκαν στον πολυµορφισµό MTHFR C677T Γονιδιακή αλληλουχία του πολυµορφισµού C677T MTHFR (79) PCR primer forward primer 5 CCGAAGCAGGGAGCTTTG 3 reverse primer 5 CGGTGCATGCCTTCACAA 3 ) C-allele 5 VIC-AAATCGgCTCCCGCAG3 T-allele 5 FAM-TGAAATCGaCTCCCGCA3 49 Σελίδα

50 Πίνακας 10. SNPs που µεταβλήθηκαν στον πολυµορφισµό MTHFR A1298C Γονιδιακή αλληλουχία του πολυµορφισµού A1298C MTHFR (79) PCR primer forward primer 5 AGAGCAAGTCCCCCAAGGA 3 reverse primer 5 CTTTGTGACCATTCCGGTTTG3 ) A-allele 5 VIC-AGTGAAGaAAGTGTCTTT3 C-allele 5 6-FAM-AGTGAAGcAAGTGTCTT3 Πίνακας 11. SNPs που µεταβλήθηκαν στον πολυµορφισµό PAI-1 4G/5G Γονιδιακή αλληλουχία του πολυµορφισµού PAI-1 4G/5G (81) 5 -ACACGTGG( /G)GGAGTCAG-3 Πίνακας 12. SNPs που µεταβλήθηκαν στον πολυµορφισµό ACE Met235Thr Γονιδιακή αλληλουχία του πολυµορφισµού ACE Met235Thr(83) I/D-ACE Forward: 5 - CTGGAGACCACTCCC ATCCTTTCT- 3 Reverse: 5 - GATGTGGC CATCACATT CGTCAGA Σελίδα

51 Πίνακας 13. SNPs που µεταβλήθηκαν στον πολυµορφισµό APOE3/APOE4 Γονιδιακή αλληλουχία του πολυµορφισµού APOE3(89) APOE 3937 /E3 Το APOE e3 αλληλόµορφο ορίζεται µε αντικατάσταση Τ στη θέση 3937 και C στη θέση 4075 APOE 3937-C 59-(FAM)-AAAAAAAAAGCGCGGACATGGAGGACGTGC-39 APOE 3937-T 59-(HEX)-AAAAAAAAAGGCGCGGACATGGAGGACGTGT-39 APOE 3937-common 59-(P)-GCGGCCGCCTGGTGCAGTACCAAAAAA-39 APOE 4075-C 59-(FAM)-AAAAAAAAAAACGATGCCGATGACCTGCAGAAGC-39 APOE 4075-T 59-(HEX)-AAAAAAAAAAAGCGATGCCGATGACCTGCAGAAGT-39 APOE 4075-common 59-(P)-GCCTGGCAGTGTACCAGGCCGGAAAAAAAATAAA-39 Το APOE e4 αλληλόµορφο ορίζεται µε αντικατάσταση C στη θέση 3937 και C στη θέση 4075 Πίνακας 14. SNPs που µεταβλήθηκαν στον πολυµορφισµό enos G-298A Γονιδιακή αλληλουχία του πολυµορφισµού enos G298A 51 Σελίδα

52 Πίνακας 15. SNPs που µεταβλήθηκαν στον πολυµορφισµό enos T-786C Γονιδιακή αλληλουχία του πολυµορφισµού enos T786C I/D- enos T-786C (rs ) PCR primers 5'-TGG AGA GTG CTG GTG TAC CCC A-3' and 5'-GCC TCC ACC CCC ACC CTG TC-3' Επιπλέον σκοπός της παρούσας µελέτης είναι να διευκρινισθεί και να επικολληθεί στην συνεχιζόµενη έρευνα της παγκόσµιας βιοϊατρικής κοινότητας για να µελετηθεί τόσο η έκβαση των κυήσεων µε καθ έξιν αποβολές υπό την χρήση φαρµευτικής θεραπείας απαντώντας στο µέλλον, στο ερώτηµα της καθηµερινής µαιευτικής πρακτικής το οποίο επικεντρώνεται στο κατά πόσο είναι δόκιµο να τίθενται οι ασθενείς µε τους αντίστοιχους πολυµορφισµούς σε προληπτική αγωγή πριν απωλέσουν πολύτιµα χρόνια της αναπαραγωγικής τους ηλικίας διερευνόντας το ιστορικό τους για καθ εξιν αποβολές και τα πιθανά αίτια αυτών. ηλαδή, κατά πόσο οι προαναφερθέντες πολυµορφισµοί είναι αξιόπιστοι βιολογικοί δείκτες προδιάθεσης (bio-markers) εµφάνισης θροµβοφιλίας σε εγκύους του πρώτου τριµήνου ώστε να γίνει δυνατή η δηµιουργία ενός συστήµατος βαθµονόµησης επικινδυνότητας (risk factor scoring system) για κάθε πολυµορφισµό ξεχωριστά ή συνολικά για όλους τους παραπάνω βιολογικούς δείκτες. 52 Σελίδα

53 2. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 2.1 Ο ΠΛΗΘΥΣΜΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΑΣΘΕΝΕΙΣ Στη µελέτη έλαβαν µέρος 40 γυναίκες ελληνικής καταγωγής, καυκάσιοι, κάτοικοι των Αθηνών ή της ευρύτερης περιοχής (Πίνακας 2.1). µε ιστορικό δύο και περισσοτέρων αποβολών. Οι γυναίκες προσήλθαν στα εξωτερικά ιατρεία του Μαιευτικού και Γυναικολογικού Θεραπευτηρίου «ΜΗΤΕΡΑ» κατά το χρονικό διάστηµα Σεπτέµβριος 2010 Οκτώβριος Πίνακας 2.1 ηµογραφικά στοιχεία - κριτήρια εισαγωγής ατόµων που συµµετείχαν στη µελέτη ΗΜΟΓΡΑΦΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ ΑΣΘΕΝΕΙΣ Αριθµός 40 Ηλικία (Μέσος όρος, έτη) 30 Αριθµός αποβολών 1-4 Ασπιρίνη, Ενοξαπαρίνη Χρόνια Φαρµακευτική Αγωγή νατριούχος/τινζαπαρίνη νατριούχος, γ-σφαιρίνη Καπνιστές/Μη καπνιστές 25/15 Οικογενειακό ιστορικό καθέξιν αποβολών Όχι Πρόκειται για γυναίκες από 23 ετών έως 46 ετών µε µία έως τέσσερις συνεχόµενες αποβολές. Όλες οι ασθενείς έδωσαν εθελοντικά γραπτή συγκατάθεση για τη λήψη βιολογικού δείγµατος µετά από προφορική και γραπτή ενηµέρωση (Παράρτηµα 1). Παράλληλα µε τη γραπτή συγκατάθεση, συµπληρωνόταν και ένα ερωτηµατολόγιο µε δηµογραφικά και επιδηµιολογικά στοιχεία (Παράρτηµα 2). Στο κάθε ερωτηµατολόγιο που συµπληρωνόταν, δινόταν και ένας κωδικός αριθµός ο οποίος γραφόταν και στο φιαλίδιο µε το αντίστοιχο βιολογικό δείγµα προς ανάλυση και καµία δυνατότητα ταυτοποίησης δεν υπήρχε µεταξύ των ασθενών και των βιολογικών δειγµάτων ή των ερωτηµατολογίων. Η διαδικασία λήψης του 53 Σελίδα

54 δείγµατος (αίµα) αποτελούσε µέρος της κοινής κλινικής πρακτικής. Στα στοιχεία που καταγράφονταν για τον κάθε ασθενή συµπεριλαµβάνονταν εκτός από τα κοινά δηµογραφικά στοιχεία, εάν ήταν καπνιστές και πόσο κάπνιζαν ηµερησίως και για πόσα χρόνια, εάν έπασχαν από σακχαρώδη διαβήτη, πολυκυστικές ωοθήκες, θυροειδοπάθεια καθώς και εάν υπήρχε ιστορικό καθέξιν αποβολών στο οικογενειακό τους περιβάλλον. Επίσης, ελήφθησαν στοιχεία που αφορούν τη φαρµακοθεραπεία. Στην οµάδα των καπνιστών συµπεριελήφθησαν και όσοι δήλωσαν ότι έχουν διακόψει το κάπνισµα, αλλά κάπνιζαν σε παλαιότερη περίοδο της ζωής τους. Μη καπνιστές θεωρήθηκαν µόνο όσοι δεν είχαν καπνίσει ουδέποτε στο παρελθόν. Η πορεία και η έκβαση της εγκυµοσύνης όλων των γυναικών παρακολουθήθηκε και καταγράφηκε. Η µελέτη εγκρίθηκε από την Επιστηµινική Επιτροπή και την Επιτροπή Ιατρικής εοντολογίας του Νοσοκοµείου «ΜΗΤΕΡΑ», παρέχοντας και την έγγραφη συγκατάθεση των ασθενών (ΠΑΡΑΤΗΜΑ Ι). 2.2 ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΚΗ ΠΡΟΣΕΓΓΙΣΗ ΣΤΗΝ ΑΝΑΛΥΣΗ ΓΟΝΟΤΥΠΩΝ ΑΛΥΣΙ ΩΤΗ ΑΝΤΙ ΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ (PCR) Σήµερα, η πιο επικρατής µέθοδος για την ανίχνευση και ταυτοποίηση γονιδίων αποτελεί η τεχνική της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης (polymerase chain reaction, PCR). Με την τεχνική PCR, µια ορισµένη αλληλουχία νουκλεοτιδίων µπορεί να πολλαπλασιασθεί γρήγορα και εκλεκτικά από οποιοδήποτε δείγµα γενωµικού DNA. (92,95)Βασική αρχή της PCR αποτελεί η εκθετική αναπαραγωγή του τµήµατος εκείνου του DNA που περιέχει την αλληλουχία που µας ενδιαφέρει. Η PCR αποτελεί µία πολύ γρήγορη και οικονοµική τεχνική που χρησιµοποιείται για να πολλαπλασιάσει µε ακρίβεια µικρά τµήµατα του DNA. Χάρη στην εξαιρετική ταχύτητα, ευαισθησία και εντυπωσιακή της απλότητα, η αντίδραση PCR αποτελεί σήµερα το πλέον βασικό και ουσιαστικό εργαλείο για την βιοϊατρική έρευνα αλλά και τα εργαστήρια Μοριακής ιαγνωστικής. Η PCR ανακοινώθηκε στην επιστηµονική κοινότητα για πρώτη φορά το Σήµερα, αποτελεί µία από τις πιο σηµαντικές επιστηµονικές ανακαλύψεις 54 Σελίδα

55 της δεκαετίας και έχει αλλάξει, µε επαναστατικό τρόπο, τη µελέτη του DNA. Ο εφευρέτης της µεθόδου, Karry Mullis, τιµήθηκε µε το βραβείο Νόµπελ το 1993 (92). Το DNA που πολλαπλασιάζεται µε την PCR µπορεί να προέρχεται από οποιοδήποτε ιστό. Στη συγκεκριµένη µελέτη, το γενωµικό DNA που χρησιµοποιήθηκε, αποµονώθηκε από τα εµπύρηνα κύτταρα δείγµατος ολικού αίµατος (EDTA). Για τους µάρτυρες η εξαγωγή DNA έγινε από επιθηλιακά κύτταρα της στοµατικής κοιλότητας τα οποία ελήφθησαν αναίµακτα µε την χρήση βαµβακοφόρου στυλεού Η PCR απαιτεί ελάχιστη ποσότητα DNA και, θεωρητικά, αρκεί το DNA ενός και µόνο κυττάρου για να ενισχυθεί η προς µελέτη αλληλουχία. Η αλληλουχία DNA που συνορεύει εκατέρωθεν µε την προς ενίσχυση αλληλουχία πρέπει να είναι γνωστή εκ των προτέρων, ώστε να προετοιµαστεί ο συνδυασµός των κατάλληλων συµπληρωµατικών εκκινητών DNA. Οι εκκινητές (DNA primers) είναι βραχείες συνθετικές αλληλουχίες DNA, µήκους 20 περίπου βάσεων, τα λεγόµενα ολιγονουκλεοτίδια, εξειδικευµένοι για την υβριδοποίηση µίας µοναδικής συµπληρωµατικής αλληλουχίας DNA. Το γενωµικό DNA, οι εκκινητές, τα δεοξυνουκλεοτίδια και µία πολυµεράση DNA υψηλής εξειδίκευσης, που θα πρέπει να είναι θερµοσταθερή, αναµιγνύονται σε έναν δοκιµαστικό σωλήνα. Η αντίδραση πραγµατοποιείται σε µία ειδική συσκευή, που ονοµάζεται θερµικός κυκλοποιητής (PCR thermal cycler), η οποία επιτρέπει την ακριβή ρύθµιση και αυξοµείωση της θερµοκρασίας κάθε λίγα λεπτά ή δευτερόλεπτα καθ όλη τη διάρκεια της αντίδρασης. Το DNA θερµαίνεται αρχικά στους C, ώστε να διαχωρισθούν οι δύο αλυσίδες της διπλής έλικας, µία διαδικασία που ονοµάζεται αποδιάταξη µε θέρµανση. Στη συνέχεια το µείγµα ψύχεται, ώστε να συνδεθούν τα συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια στη συµπληρωµατική τους αλληλουχία στο γενωµικό DNA. Μετά τη σύνδεση των ολιγονουκλεοτιδίων-εκκινητών, η DNA πολυµεράση χρησιµοποιεί τα δεοξυνουκλεοτίδια datp, dctp, dgtp και dttp, τα οποία βρίσκονται σε περίσσεια στο διάλυµα της PCR και πολυµερίζει -ανασυστήνει- την αλυσίδα του DNA. Σηµεία εκκίνησης για την παραγωγή ενός αντιγράφου της κάθε αλυσίδας του τµήµατος του γονιδίου που µελετάµε, αποτελούν οι εκκινητές. Έτσι, από ένα µόριο δίκλωνου DNA δηµιουργούνται δύο νέα δίκλωνα µόρια DNA. Στη συνέχεια αυτά τα προϊόντα της πολυµεράσης αποδιατάσσονται και πάλι µε 55 Σελίδα

56 θέρµανση και οι διαχωρισµένες αλυσίδες ψύχονται επιτρέποντας έτσι εκ νέου την πρόσδεση των εκκινητών. Με τον τρόπο αυτό, η DNA πολυµεράση παράγει δύο νέα αντίγραφα της κάθε αλυσίδας. Μετά από n τέτοιους κύκλους αποδιάταξης και αντίδρασης πολυµεράσης παράγονται 2x10 n νέα αντίγραφα της συγκεκριµένης αλληλουχίας DNA, ποσότητα που επαρκεί για τη διεξαγωγή περαιτέρω αναλύσεων στο συγκεκριµένο γονιδιακό τόπο.(92), (Σχήµα 11) Σχήµα 11. Απεικόνιση των βηµάτων της µεθόδου PCR (92) 56 Σελίδα

57 Στη συγκεκριµένη έρευνα χρησιµοποιήθηκε θερµικός κυκλοποιητής της εταιρείας TAKARA ο Thermalcycler που αποτελεί έναν ταχύ θερµικό κυκλοποιητή µε ικανότητα παρακολούθησης της PCR σε πραγµατικό χρόνο (real ( time). ). Έτσι, επιτρέπει την ταυτόχρονη ενίσχυση και α ανίχνευση νίχνευση των νουκλεϊκών οξέων-στόχων. (92) Στη συγκεκριµένη µέθοδο από 200 µ µl αίµατος και από επιθηλιακά κύτταρα ενός βαµβακοφόρου στυλεού αποµονώθηκε DNA,, η ποιότητα και η ποσότητα του οποίου ελέγχθηκε φασµατοφωτοµετρικά. Στην κυρίως αντίδραση PCR, χρησιµοποιήθηκαν εκκινητές που πολλαπλασιάζουν επιλεκτικά τµήµατα των εξής µεταλλάξεων: Ινωδογόνο Ινωδογόνο-β ( 455 G>A), ), αναστολέας ενεργοποιητή πλασµινογόνου-11 (ΡΑΙ (ΡΑΙ-1), MTHFR (C677T), MTHFR (Α1298C), ), Μετατρεπτικό ένζυµο αγγειοτενσίνης ((ACE, I/D), Απολιποπρωτεϊνη Β (R3500Q), ( Απολιποπρωτεϊνη E ((E2/Ε3/Ε4: κωδικόνια 112/158), Endothelial nitric oxide synthase (NOS 3) T T768C και Endothelial nitric oxide synthase (NOS 3) Gly298Asp. (92) Το προϊόν της αντίδρασης υβριδοποιήθηκε µε ανιχνευτές για τις αντίστοιχες µεταλλάξεις, ακινητοποιηµένους σε µεµβράνες νιτροκυτταρίνης (StripAssay ( CE, IVD ). (Σχήµα 12). Σχήµα 12: Παράδειγµα α αποτελέσµατος για την ταυτόχρονη ανίχνευση 26 παραλλαγών σε 9 γονίδια ((StripAssay), (Vienna Labs) 57 Σελίδα

58 2.3 Υλικά Αντιδραστήρια Για την αποµόνωση του γενετικού υλικού (DNA) από δείγµα ολικού αίµατος µε αντιπηκτικό EDTA, χρησιµοποιήθηκε το CVD StripAssay TM εταιρείας ViennaLab (Austria). Στο συγκεκριµένο kit περιλαµβάνονται τα παρακάτω αντιδραστήρια: 1. Lysis Solution 50 ml 2. GENXTRACT Resin 5 ml (κάθε φορά που προσθέτω GenxTRACT Resin το ανακινώ ακριβώς στην προσθήκη) 3. Amplification Mix A (κίτρινο καπάκι) 500 ml 4. Amplification Mix B (πράσινο καπάκι) 500 ml. Περιέχει 0,05 % NaN3 5. Taq Dilution Buffer (διάφανο καπάκι) 500ml 6. Typing Trays ( 3 ) 7. DNAT (µπλέ καπάκι. Περιέχει 1,6 % ΝaOH ) 8. Taq Dilution Buffer ( διάφανο καπάκι ) 500ml 9. Teststrips ( 20 ) 10. Hybridization Buffer (άσπρο καπάκι) 25ml 11. Wash Solution A (άσπρο καπάκι ) 80 ml 12. Conjugate Solution 25 ml (περιέχει αλκαλική φωσφατάση µαζί µε στρεπταβιδίνη) 13. Wash Solution B 80 ml 14. Color developer 25 ml. Περιέχει BCIP (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate) και ΝΒΤ (nitro blue tetrazolium) ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΟΣ ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ Κατά τα διάφορα στάδια της αναλυτικής διαδικασίας χρησιµοποιήθηκε ο παρακάτω εργαστηριακός εξοπλισµός: Thermacycler της ΤAKARA (Σχήµα 13, 14) 58 Σελίδα

59 Σχήµα (13). Ο κύκλος της µεθόδου TAKARA Σχήµα (14). Οι συνθήκες των κύκλων PCR της µεθόδου TAKARA Μικροφυγόκεντρος: Spectrafuge 16M, Labnet Plate Spin, Plate Refrigerated Centrifuge για flashing στα 10sec, Kubota Corporation, Japan (0-25x100 rpm) Συσκευή αυτόµατου αναδευτήρα (Vortex): Vibrofix VF1 Electronic, Janke&Kunkel, Labortechnik, Germany Ρυθµιζόµενες ογκοµετρικές πιπέττες ακριβείας: Nichipet EX, Japan. Πλαστικές πιπέττες Pasteur 59 Σελίδα

60 Πλαστικά tips για τις πιπέττες κίτρινα και µπλε, αποστειρωµένα και ελεύθερα ιχνών νουκλεασών, µε φίλτρο για αποφυγή επιµόλυνσης, Saoustedt, Germany Πλαστικά φιαλίδια των 1ml (Eppendorf), G-Kisker Taq polymerase, Go-Taq,Promega Υδατόλουτρο Memment WNB Aναλυτικές µέθοδοι ειγµατολειψίες Κατά τη διάρκεια της προγραµµατισµένης επίσκεψης των ασθενών στα πλαίσια της κοινής κλινικής πρακτικής γινόταν λήψη δείγµατος ολικού αίµατος για αιµατολογικό έλεγχο. Από 200 µl αίµατος αποµονώθηκε ολικό DNA. Φυλάσσονταν σε ψυγείο θερµοκρασίας +2 0 C για τις ανάγκες της µελέτης. Εν συνεχεία, τρεις φορές την εβδοµάδα πραγµατοποιούταν επιλογή των ασθενών από τους ιατρικούς φακέλους των νοσηλευόµενων βάσει του ερευνητικού πρωτοκόλλου, επίσκεψη των ασθενών για λήψη γραπτής συγκατάθεσης, συµπλήρωση του ερωτηµατολογίου και συλλογή των δειγµάτων από το νοσοκοµείο και µεταφορά τους στο εργαστήριο όπου τοποθετούνταν προς φύλαξη σε καταψύκτη θερµοκρασίας C, µέχρι να πραγµατοποιηθεί περαιτέρω επεξεργασία, αποµόνωση δηλαδή γενετικού υλικού. 60 Σελίδα

61 2.4.2 Αποµόνωση γενετικού υλικού (D A) και ανίχνευση πολυµορφισµών µε το CVD StripAssay TM της εταιρίαςviennalab Diagnostics GmbH (Austria)(93) Αποµόνωση γενετικού υλικού D A Το πρώτο βήµα της µεθόδου για την αποµόνωση DNA επιτύγχανε την προετοιµασία των λευκοκυτταρικών πυρήνων. Σε φιαλίδιο τύπου «eppendorf» των 1,5ml που περιείχε 1ml Lysis Solution washing προσθέτονταν 100µl ολικού αίµατος µε EDTA που είχαµε πρώτα αποψύξει σε θερµοκρασία 2 0 C κατά τη διάρκεια της προηγούµενης νύχτας.(96) Το µείγµα επωαζόταν σε θερµοκρασία δωµατίου για 15 λεπτά ώστε να επιτευχθεί ολική λύση και αποµάκρυνση των ερυθροκυττάρων. Τα ερυθρά αιµοσφαίρια περιέχουν σίδηρο ο οποίος αναστέλλει την PCR και για αυτόν το λόγο επιδιώκεται η αποµάκρυνσή τους. Στη συνέχεια πραγµατοποιούταν φυγοκέντρηση του µείγµατος για 5 λεπτά στα rpm (1,000 x g), ώστε να επιτευχθεί συσσωµάτωση των λευκοκυτταρικών πυρήνων. (96)Μετά τη φυγοκέντρηση, το υπερκείµενο απορρίπτονταν µε τη βοήθεια µιας πιπέτας και ακολουθούσε προσθήκη 1ml Lysis Solution. Έπειτα, το eppendorf τοποθετούνταν σε αυτόµατο αναδευτήρα έως ότου το συσσωµάτωµα που αποτελείτο από λευκοκυτταρικούς πυρήνες και θραύσµατα κυττάρων να επαναιωρηθεί πλήρως. Στη συνέχεια πραγµατοποιούταν φυγοκέντρηση του µείγµατος για 5 λεπτά στις rpm( x g). Μετά τη φυγοκέντρηση, το υπερκείµενο απορρίπτεται µε τη βοήθεια µιας πιπέτας αφήνωντας 50µl ιζήµατος. Οµογενοποιήθηκε το GenxTRACT Resin ανακινώντας δυνατά και προστέθηκε 200 µl GenxTRACT Resin στο ίζηµα. Κλείστηκε το φιαλίδιο και το τοποθετούµε στο αυτόµατο αναδευτήρα για 10 λεπτά. Εν συνεχεία γίνεται επώαση για 20 λεπτά, σε θερµοκρασία 56 ο C και τοποθέτησή του και πάλι στον αυτόµατο αναδευτήρα για 10 λεπτά. Έγινε επάνάληψη της επώασης για 10 λεπτά στους 98 C και πάλι τοποθετείται στο αυτόµατο αναδευτήρα για 10 λεπτά.τέλος πραγµατοποιείται φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στους rpm και ψύχω στην παγοκύστη. (93) 61 Σελίδα

62 ιαδικασία Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυµεράσης Στο επόµενο βήµα θα ετοιµάσουµε ένα διάλυµα Taq DNA πολυµεράσης 0,2 U/µl στο Taq diluition buffer. Απαιτείται το µίγµα της PCR να φυλάσσεται στην παγοκύστη. Για κάθε δείγµα ετοιµάζονται 2 µείγµατα PCR (Α και Β) στον πάγο. Το µείγµα Α αποτελείται από: 15µl Amplification Mix A (κίτρινο καπάκι), 5µl Taq DNA polymerase diluita (1U) και 5µl DNA. Ενώ το µείγµα B αποτελείται από: 15µl amplification Mix B (πράσινο καπάκι), 5µl TaqDNA polymerase diluita (1U), 5µl DNA. Σε κάθε φιαλίδιο προσθέτω 20 µl µίγµατος PCR A ή Β+ 5µl DNA.Τοποθετώ τα φιαλίδια στο κυκλοποιητή και τρέχτηκε το αντίστοιχο πρόγραµµα. Όταν τελειώσει το πρόγραµµα το µηχάνηµα συντηρεί τα δείγµατα οπότε ο υβριδισµός µπορεί να γίνει την επόµενη µέρα. (Πίνακας 2.2) pre-pcr Κύκλοι Πίνακας 2.2: Πρόγραµµα εκτέλεσης κύκλων Πρόγραµµα PCR Device στους 94 C για 2 λεπτά στου ς 94 C για 15 λεπτά στους 58C για 30 λεπτά στους 72 C για 30 λεπτά (35 κύκλοι) Τελευταία παράταση Συντήρηση στους 72 C για 3 λεπτά στους +4 ο C Υβριδισµός και αποκάλυψη των πολυµορφισµών της µελέτης Έπειτα γίνεται ο Υβριδισµός.Προθερµαίνω (το υδατόλουτρο πρέπει να είναι στους 45 C) στο υδατόλουτρο τα Hybridization Buffer και Wash solution A. Τα αντιδραστήρια DNAT, Conjugate solution, wash solution B, Color developer καθώς και τα strips που θα χρησιµοποιηθούν πρέπει να έρθουν σε θερµοκρασία δωµατίου πριν την χρήση. Υπολογίστηκε ένα strip για δείγµα. Σε κάθε σκαφίδιο (tray) προστέθηκε 20µl DNAT, 10µl προΐόν PCR A, 10µl PCR B αφέθηκαν να 62 Σελίδα

63 επωαστούν για 5 λεπτά και έπειτα προστέθηκαν 1ml Hybridization Buffer αναδεύω ελαφρώς.(96) Εµβαπτίστηκαν τα strips µε τη σηµασµένη πλευρά προς τα πάνω (να φαίνονται οι πράσινες και οι κόκκινες µπάντες), στα αντίστοιχα πηγαδάκια. Ακολουθεί επώαση στο υδατόλουτρο για 30 λεπτά υπό ανακίνηση. Εκπλύθηκαν µε 1ml wash solution A και το αφήνω για 10 δευτερόλεπτα, έγινε επανάληψη της έκπλησης µε 1 ml wash solution A και επωάστηκαν στο υδατόλουτρο για 15 λεπτά στους 45C. Τέλος εκπλύθηκαν µε 1 ml wash solution A και επωάζω για 15 λεπτά στο υδατόλουτρο υπο ανακίνηση και απορρίπτω το υγρό.στο τέλος γίνεται η ανάπτυξη χρωµογόνου σε θερµοκρασία δωµατίου. Προστίθεται 1ml conjugate solution και επωάζεται στον αναδευτήρα για 15 λεπτά. Πραγµατοποιούνται δύο εκπλήσεις µε 1ml Wash solution B και επωάζουµε για 5 λεπτά στον αναδευτήρα. Έπειτα πραγµατοποιείται µία ακόµα έκπληση µε 1ml wash solution B και επωάζεται 5 λεπτά στον αναδευτήρα.τέλος προσθέτω 1ml διάλυµα εµφάνισης και επώαση για 15 λεπτά στο σκοτάδι.απορρίπτω το υγρό. Ξεπλένεται 3-4 φορές µε απεσταγµένο νερό και στεγνώνω τα strips µε διηθητικό χαρτί. (Σχήµα 15, 16, 17) 63 Σελίδα

64 64 Σελίδα Σχήµα 15. Γονίδια που διερευνόνυαι µε την τεχνική StripAssay

65 Σχήµα 16. Εργαστηριακή Πιστποίηση Ανίχνευσης Γονιδίων που διερευνόνται µε την τεχνική StripAssay 1.Πολυµορφισµός MTHFR 3.Πολυµορφισµός APO E2/E3/E4 4.Πολυµορφισµός ACE 2.Πολυµορφισµός PAI 1 5.Πολυµορφισµός enos;nos3 Σχήµα 17. Το στέλεχος απεικόνισης των µεταλλάξεων (Strip) 65 Σελίδα

66 Γ ΑΝΑΛΥΣΗ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 66 Σελίδα

67 3. ΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ ΜΕΘΟ ΟΛΟΓΙΑ Το κριτήριο χι-τετράγωνο χρησιµοποιήθηκε για τον υπολογισµό των αποκλίσεων από την ισορροπία Hardy-Weinberg για κάθε έναν από τους υπό διερεύνηση πολυµορφισµούς. Οι αποκλίσεις αυτές υπολογίστηκαν χωριστά στις οµάδες των ασθενών και των µαρτύρων. Αρχικά συγκρίθηκαν οι συχνότητες ανά γονότυπο και αλληλόµορφο µεταξύ ασθενών και µαρτύρων. Για τη σύγκριση αυτή καθώς και για τη συσχέτιση της χορηγούµενης θεραπείας µε τις µεταλλάξεις των γονιδίων στην οµάδα των 40 ασθενών έγινε χρήση των κριτηρίων χι-τετράγωνο και Fisher s Exact ανάλογα µε τη µορφή των κατηγορικών µεταβλητών και των συχνοτήτων τους. Στη συνέχεια, η σχέση γονοτύπων των πολυµορφισµών και κινδύνου εµφάνισης καθ έξιν αποβολών µελετήθηκε µε τη βοήθεια λογαριθµιστικής παλινδρόµησης, όπου χρησιµοποιήθηκαν ανεξάρτητα το επικρατές (dominant), το υπολειπόµενο (recessive) και το προσθετικό (additive) µοντέλο. Οι αντίστοιχες τιµές των p-values προέκυψαν από το Wald test για το επικρατές και το υπολειπόµενο µοντέλο και από το Armitage test for trend για το προσθετικό µοντέλο. Στη συνέχεια, πραγµατοποιήθηκαν περαιτέρω αναλύσεις ανά αλληλόµορφο, µε χρήση και πάλι λογαριθµιστικής παλινδρόµησης. Όλες οι τιµές p βασίστηκαν σε δίπλευρους ελέγχους και συγκρίθηκαν µε επίπεδο στατιστικής σηµαντικότητας ίσο µε το 5%. Για τη στατιστική επεξεργασία χρησιµοποιήθηκε το στατιστικό λογισµικό SAS (SAS Institute Inc, Cary, NC, version 9.1). Πέραν όµως της επίδρασης του κάθε πολυµορφισµού χωριστά στον κίνδυνο εµφάνισης καθ έξιν αποβολών, κρίθηκε αναγκαίο να εκτιµηθεί ο συνολικός κίνδυνος που απορρέει από το σύνολο των πολυµορφισµών της παρούσας µελέτης. Για το σκοπό αυτό δηµιουργήθηκε ένας αλγόριθµος (TGS: Total Genotype Score), 67 Σελίδα

68 ενδεικτικός του συνολικού κινδύνου από τους πολυµορφισµούς των γονιδίων του κάθε ατόµου, ο οποίος λαµβάνει τιµές που κυµαίνονται από 0 έως 100. Για τον υπολογισµό αυτό ήταν απαραίτητη η «βαθµολόγηση» κάθε γονοτύπου από 0 έως 2 (GS: Genotype Score), ανάλογα µε τον αριθµό των «επικίνδυνων» αλληλόµορφων γονιδίων. Έτσι, µε 2 βαθµολογήθηκαν γονότυποι µε δύο αλληλόµορφα που αυξάνουν τον κίνδυνο, µε 0 γονότυποι χωρίς τέτοια αλληλόµορφα και µε 1 τα ετερόζυγα άτοµα. (Πίνακας 3.1) Ο αλγόριθµος αυτός έχει την ακόλουθη µορφή: TGS= * (GS 1 + GS GS N ), όπου Ν: το σύνολο των πολυµορφισµών Πίνακας 3.1: Περιγραφή του τρόπου βαθµολόγησης του κάθε γονοτύπου Γονότυποι GS: Genotype Score rs / C677T MTHFR CC (wild type/wild type) 0 TC (wild type/mutant) 1 TT (mutant/mutant) 2 rs / A1298C MTHFR AA (wild type/wild type) 0 CA (wild type/mutant) 1 CC (mutant/mutant) 2 rs / PAI-1 4G/5G 5G5G (wild type/wild type) 0 4G5G (wild type/mutant) 1 4G4G (mutant/mutant) 2 ApoE Ε2Ε3 0 Ε3Ε3 1 Ε3Ε4 2 rs699 / ACE Met235Thr INS/INS (wild type/wild type) 0 INS/DE (wild type/mutant) 1 DE/DE (mutant/mutant) 2 rs / NOS3Gly298Asp G/G (wild type/wild type) 0 T/G (wild type/mutant) 1 T/T (mutant/mutant) 2 68 Σελίδα

69 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 4.1. Ισορροπία Hardy-Weinberg Σύµφωνα µε την ισορροπία των Hardy-Weinberg οι σχετικές συχνότητες των αλληλοµόρφων παραµένουν σταθερές από γενιά σε γενιά αν δεν διαταραχθεί κανένας από τους παράγοντες που µπορούν να επηρεάσουν την όλη διαδικασία. Η τιµή 3.84 του κριτηρίου χι-τετράγωνο αντιστοιχεί στο όριο της στατιστικής σηµαντικότητας (p=0.05). Αν η τιµή του χι-τετράγωνο είναι µεγαλύτερη από 3.84, τότε υπάρχουν ενδείξεις για απόκλιση από την ισορροπία Hardy-Weinberg, η οποία εκφράζεται µε τη σχέση p 2 +2pq+q 2 =1. Έστω Α το επικρατές αλληλόµορφο, α το υπολειπόµενο αλληλόµορφο και p και q αντίστοιχα οι συχνότητες τους [freq(a) = p; freq(a) = q; p + q = 1]. Στην περίπτωση που ο υπό διερεύνηση πληθυσµός είναι σε ισορροπία, τότε freq(aa) = p 2 για τους AA οµοζυγώτες του πληθυσµού, freq(aa) = q 2 για τους αα οµοζυγώτες και freq(aa) = 2pq για τους ετεροζυγώτες. Στους Πίνακες 1.1 και 1.2 παρουσιάζονται οι παρατηρούµενες και οι αναµενόµενες συχνότητες γονοτύπων καθώς και οι τιµές p, q και χι-τετράγωνο σε ασθενείς και µάρτυρες αντίστοιχα. Αναλυτικότερα, στην οµάδα των 40 ασθενών, από τους 8 υπό διερεύνηση πολυµορφισµούς, οι 7 και συγκεκριµένα οι: (1) RS /C677T MTHFR (Χ 2 =0.648), (2) RS /A1298C MTHFR (Χ 2 =0.026), (3) RS (Χ 2 =0.643), (4) RS7412 (Χ 2 <0.0001), (5) RS699/ACE Met235Thr (X 2 =2.049), (6) RS /NOS3 T768C (X 2 =0.277) και (7) RS /NOS3Gly298Asp (X 2 =2.130) δε φάνηκε να αποκλίνουν από την ισορροπία Hardy-Weinberg. Ωστόσο βρέθηκε ένδειξη για οριακή απόκλιση στην περίπτωση του RS /PAI-1 4G/5G (Χ 2 =4.889). Στην οµάδα των µαρτύρων, όλοι οι πολυµορφισµοί ήταν σε συµφωνία µε την εν λόγω ισορροπία. 69 Σελίδα

70 Πίνακας 1.1: Αποτελέσµατα ελέγχου της ισορροπίας Hardy-Weinberg στην οµάδα των 40 ασθενών: παρατηρούµενες και αναµενόµενες συχνότητες γονοτύπων, υπολογισµός των τιµών p, q και κριτηρίου χι-τετράγωνο. Γονότυποι Παρατηρούµενες συχνότητες (%) Αναµενόµενες συχνότητες Αποτελέσµατα Ασθενείς RS / C677T MTHFR C/C 20 (50.0) p 2 *N=18.91 p=0.69 T/C 15 (37.5) 2*p*q*N=17.19 q=0.31 Τ/Τα 5 (12.5) q 2 *n=3.91 X 2 =0.648 RS / A1298C MTHFR A/A 18 (45.0) p 2 *N=18.23 p=0.68 C/A 18 (45.0) 2*p*q*N=17.55 q=0.33 C/C 4 (10.0) q 2 *n=4.23 X 2 =0.026 RS / PAI-1 4G/5G 5G/5G 14 (35.0) p 2 *N=10.51 p=0.51 4G/5G 13 (32.5) 2*p*q*N=19.99 q=0.49 4G/4G 13 (32.5) q 2 *n=9.51 X 2 =4.889 RS T/T 31 (77.5) p 2 *N=31.51 p=0.89 C/T 9 (22.5) 2*p*q*N=7.99 q=0.11 C/C 0 (0.0) q 2 *n=0.51 X 2 =0.643 RS7412 C/C 40 (100.0) p 2 *N=40.00 p=1.00 C/T 0 (0.0) 2*p*q*N=0.00 q=0.00 T/T 0 (0.0) q 2 *n=0.00 X 2 < RS699 / ACE Met235Thr DE/DE 16 (40.0) p2*n=13.81 p=0.59 INS/DE 15 (37.5) 2*p*q*N=19.39 q=0.42 INS/INS 9 (22.5) q2*n=6.81 X 2 =2.049 RS / NOS3 T768C T/T 13 (32.5) p2*n=13.81 p=0.59 C/T 21 (52.5) 2*p*q*N=19.39 q=0.41 C/C 6 (15.0) q2*n=6.81 X 2 =0.277 RS / NOS3Gly298Asp G/G 19 (47.5) p2*n=16.90 p=0.65 T/G 14 (35.0) 2*p*q*N=18.20 q=0.35 T/T 7 (17.5) q2*n=4.90 X 2 = Σελίδα

71 Πίνακας 1.2: Αποτελέσµατα ελέγχου της ισορροπίας Hardy-Weinberg στην οµάδα των 80 µαρτύρων: παρατηρούµενες και αναµενόµενες συχνότητες γονοτύπων, υπολογισµός των τιµών p, q και κριτηρίου χι-τετράγωνο. Γονότυποι Παρατηρούµενες συχνότητες (%) Αναµενόµενες συχνότητες Αποτελέσµατα Μάρτυρες RS / C677T MTHFR C/C 31 (38.8) p 2 *N=30.63 p=0.62 T/C 37 (46.2) 2*p*q*N=37.74 q=0.38 Τ/Τα 12 (15.0) q 2 *n=11.63 X 2 =0.031 RS / A1298C MTHFR A/A 34 (42.5) p 2 *N=33.80 p=0.65 C/A 36 (45.0) 2*p*q*N=36.40 q=0.35 C/C 10 (12.5) q 2 *n=9.80 X 2 =0.010 RS / PAI-1 4G/5G 5G/5G 26 (32.5) p 2 *N=26.45 p=0.58 4G/5G 40 (50.0) 2*p*q*N=39.10 q=0.43 4G/4G 14 (17.5) q 2 *n=14.45 X 2 =0.042 RS T/T 68 (85.0) p 2 *N=68.45 p=0.93 C/T 12 (15.0) 2*p*q*N=11.10 q=0.08 C/C 0 (0.0) q 2 *n=0.45 X 2 =0.526 RS7412 C/C 74 (92.5) p 2 *N=74.11 p=0.96 C/T 6 (7.5) 2*p*q*N=5.78 q=0.04 T/T 0 (0.0) q 2 *n=0.11 X 2 =0.121 RS699 / ACE Met235Thr DE/DE 38 (47.5) p2*n=37.81 p=0.69 INS/DE 34 (42.5) 2*p*q*N=34.38 q=0.31 INS/INS 8 (10.0) q2*n=7.81 X 2 =0.010 RS / NOS3 T768C T/T Ν/Α Ν/Α Ν/Α C/T Ν/Α Ν/Α Ν/Α C/C Ν/Α Ν/Α Ν/Α RS / NOS3Gly298Asp G/G 35 (43.8) p2*n=37.81 p=0.69 T/G 40 (50.0) 2*p*q*N=34.38 q=0.31 T/T 5 (6.2) q2*n=7.81 X 2 = Σελίδα

72 4.2. Συνοπτική περιγραφή του δείγµατος Στη µελέτη συµµετείχαν 40 γυναίκες (ασθενείς), οι οποίες είχαν ιστορικό δύο ή περισσοτέρων καθ έξιν αποβολών και 80 γυναίκες (µάρτυρες) προερχόµενες από τον γενικό πληθυσµό, οι οποίες δεν είχαν υποστεί καθ έξιν αποβολές. Στον Πίνακα 2 περιγράφονται τα βασικά χαρακτηριστικά γνωρίσµατα της οµάδας των 40 ασθενών. Η ηλικία τόσο των ασθενών όσο και των µαρτύρων κυµαίνονταν από 25 έως 44 έτη. Από την οµάδα των ασθενών, 16 (40.0%) ήταν ηλικίας έως 33 ετών και 24 (60.0%) άνω των 33 ετών. Αντίστοιχα στην οµάδα των µαρτύρων, 23 (28.8%) άτοµα ήταν ηλικίας έως 33 ετών και 57 (71.2%) άνω των 33 ετών. Η κατανοµή της ηλικίας δε βρέθηκε να διαφέρει µεταξύ ασθενών και µαρτύρων (p=0.215). Το 92.5% των ασθενών είχε υποστεί 2 καθ έξιν αποβολές και µόλις 7.5% είχαν ιστορικό τριών καθ έξιν αποβολών. Από το σύνολο των 40 ασθενών, η συντριπτική πλειοψηφία (75.0%) είχε λάβει µέτριας δράσης θεραπεία, ενώ µόλις 5 (12.5%) γυναίκες είχαν υποβληθεί σε ελαφριάς δράσης θεραπεία και άλλες 5 (12.5%) σε ισχυρής δράσης θεραπεία. Εκ των 40 γυναικών µε ιστορικό καθ έξιν αποβολών, σχεδόν οι µισές κάπνιζαν, ενώ 57.5% δήλωσαν ότι κατανάλωναν αλκοόλ. 72 Σελίδα

73 Πίνακας 2: Κατανοµή των χαρακτηριστικών γνωρισµάτων των 40 ασθενών (δηµογραφικές παράµετροι, ιστορικό αποβολών και συνήθειες του τρόπου ζωής). Μεταβλητές Ηλικία, έτη Ασθενείς (ν=40) Ν (%) Μάρτυρες (ν=80) Ν (%) (40.0) 23 (28.8) (60.0) 57 (71.2) Αριθµός καθ έξιν αποβολών 2 37 (92.5) Ν/Α 3 3 (7.5) Ν/Α Χορήγηση θεραπείας Ελαφριάς δράσης 5 (12.5) Ν/Α Μέτριας δράσης 30 (75.0) Ν/Α Υψηλής δράσης 5 (12.5) Ν/Α Κάπνισµα Όχι 21 (52.5) Ν/Α Ναι 19 (47.5) Ν/Α Κατανάλωση αλκοόλ Όχι 17 (42.5) Ν/Α Ναι 23 (57.5) Ν/Α Ν/Α: εν είναι γνωστό 4.3. Χορηγούµενη θεραπεία και µεταλλάξεις γονιδίων Στη συνέχεια θελήσαµε να διερευνήσουµε το ενδεχόµενο πιθανής συσχέτισης µεταξύ της χορηγούµενης θεραπείας και των γονοτύπων των 8 υπό διερεύνηση πολυµορφισµών στην οµάδα των 40 ασθενών. Τα σχετικά αποτελέσµατα δίνονται στους Πίνακες χωριστά για τον κάθε πολυµορφισµό. Όπως παρατηρούµε, δεν βρέθηκε ένδειξη για πιθανή συσχέτιση µεταξύ θεραπείας και γονοτύπων σε κανέναν από τους υπό εξέταση πολυµορφισµούς. 73 Σελίδα

74 Η χορηγούµενη θεραπεία χωρίζεται σε Ελαφριάς ρασης (µόνο χορήγηση σαλικιλικού οξέος), σε Μέτριας ράσης (συνδυασµένη χορήγηση σαλικιλικού οξέος µε ηπαρίνη χαµηλού µοριακού βάρους) και σε Υψηλής ράσης (µονοθεραπεία ή συνδυασµένη θεραπεία µε τα παραπάνω σκευάσµατα µε γ-σφαιρίνη) Πίνακας 3.1: Συσχέτιση της χορηγούµενης θεραπείας µε τις µεταλλάξεις των γονιδίων στην οµάδα των 40 ασθενών στον πολυµορφισµό rs Γονότυποι Ελαφριάς δράσης N (%) Μέτριας δράσης N (%) Υψηλής δράσης N (%) P- value RS / C677T MTHFR C/C (αρχέγονος τύπος/φυσιολογικό) 3 (60.0) 15 (50.0) 2 (40.0) T/C (ετερόζυγος τύπος) 2 (40.0) 11 (36.7) 2 (40.0) T/T (οµόζυγα µεταλλαγµένος τύπος) 0 (0.0) 4 (13.3) 1 (20.0) Η τιµή του P-value προέκυψε από το κριτήριο Fisher s Exact Πίνακας 3.2: Συσχέτιση της χορηγούµενης θεραπείας µε τις µεταλλάξεις των γονιδίων στην οµάδα των 40 ασθενών στον πολυµορφισµό rs Γονότυποι Ελαφριάς δράσης N (%) Μέτριας δράσης N (%) Υψηλής δράσης N (%) P- value RS / A1298C MTHFR A/A (αρχέγονος τύπος/φυσιολογικό) 2 (40.0) 13 (43.3) 3 (60.0) C/A (ετερόζυγος τύπος) 3 (60.0) 14 (46.7) 1 (20.0) C/C (οµόζυγα µεταλλαγµένος τύπος) 0 (0.0) 3 (10.0) 1 (20.0) Η τιµή του P-value προέκυψε από το κριτήριο Fisher s Exact 74 Σελίδα

75 Πίνακας 3.3: Συσχέτιση της χορηγούµενης θεραπείας µε τις µεταλλάξεις των γονιδίων στην οµάδα των 40 ασθενών στον πολυµορφισµό rs Γονότυποι Ελαφριάς δράσης N (%) Μέτριας δράσης N (%) Υψηλής δράσης N (%) P- value RS / PAI-1 4G/5G G/5G (αρχέγονος τύπος/φυσιολογικό) 2 (40.0) 9 (30.0) 3 (60.0) 4G/5G (ετερόζυγος τύπος) 1 (20.0) 12 (40.0) 0 (0.0) 4G/4G (οµόζυγα µεταλλαγµένος τύπος) 2 (40.0) 9 (30.0) 2 (40.0) Η τιµή του P-value προέκυψε από το κριτήριο Fisher s Exact Πίνακας 3.4: Συσχέτιση της χορηγούµενης θεραπείας µε τις µεταλλάξεις των γονιδίων στην οµάδα των 40 ασθενών στον πολυµορφισµό rs Γονότυποι Ελαφριάς δράσης N (%) Μέτριας δράσης N (%) Υψηλής δράσης N (%) P-value RS T/T 3 (60.0) 23 (76.7) 5 (100.0) T/C 2 (40.0) 7 (23.3) 0 (0.0) C/C 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Η τιµή του P-value προέκυψε από το κριτήριο Fisher s Exact Πίνακας 3.5: Συσχέτιση της χορηγούµενης θεραπείας µε τις µεταλλάξεις των γονιδίων στην οµάδα των 40 ασθενών στον πολυµορφισµό rs7412. Γονότυποι Ελαφριάς δράσης N (%) Μέτριας δράσης N (%) Υψηλής δράσης N (%) P-value RS C/C 5 (100.0) 30 (100.0) 5 (100.0) T/C 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) T/T 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Η τιµή του P-value προέκυψε από το κριτήριο Fisher s Exact 75 Σελίδα

76 Πίνακας 3.6: Συσχέτιση της χορηγούµενης θεραπείας µε τις µεταλλάξεις των γονιδίων στην οµάδα των 40 ασθενών στον πολυµορφισµό rs699. Γονότυποι Ελαφριάς δράσης N (%) Μέτριας δράσης N (%) Υψηλής δράσης N (%) P-value RS699 / ACE Met235Thr INS/INS (φυσιολογικό) 1 (20.0) 6 (20.0) 2 (40.0) INS/DE (φυσιολογικό) 2 (40.0) 12 (40.0) 1 (20.0) DE/DE (παθολογικό) 2 (40.0) 12 (40.0) 2 (40.0) Η τιµή του P-value προέκυψε από το κριτήριο Fisher s Exact Πίνακας 3.7: Συσχέτιση της χορηγούµενης θεραπείας µε τις µεταλλάξεις των γονιδίων στην οµάδα των 40 ασθενών στον πολυµορφισµό rs Γονότυποι Ελαφριάς δράσης N (%) Μέτριας δράσης N (%) Υψηλής δράσης N (%) P- value RS / NOS3 T768C T/T (αρχέγονος τύπος/φυσιολογικό) 1 (20.0) 12 (40.0) 0 (0.0) C/T (ετερόζυγος τύπος) 4 (80.0) 12 (40.0) 5 (100.0) C/C (οµόζυγα µεταλλαγµένος τύπος) 0 (0.0) 6 (20.0) 0 (0.0) Η τιµή του P-value προέκυψε από το κριτήριο Fisher s Exact Πίνακας 3.8: Συσχέτιση της χορηγούµενης θεραπείας µε τις µεταλλάξεις των γονιδίων στην οµάδα των 40 ασθενών στον πολυµορφισµό rs Γονότυποι Ελαφριάς δράσης N (%) Μέτριας δράσης N (%) Υψηλής δράσης N (%) P- value RS / NOS3Gly298Asp G/G (αρχέγονος τύπος/φυσιολογικό) 2 (40.0) 15 (50.0) 2 (40.0) T/G (ετερόζυγη µετάλλαξη/φυσιολογικό) 3 (60.0) 10 (33.3) 1 (20.0) T/T (οµόζυγη µετάλλαξη/παθολογικό) 0 (0.0) 5 (16.7) 2 (40.0) Η τιµή του P-value προέκυψε από το κριτήριο Fisher s Exact 76 Σελίδα

77 4.4. Κατανοµή γονοτύπων και αλληλόµορφων Αρχικά, υπολογίστηκε ο αριθµός των ατόµων που διαθέτουν τρεις διαφορετικούς γονότυπους για κάθε γονίδιο, ώστε να βρεθεί η συχνότητα εµφάνισής τους, και στη συνέχεια υπολογίστηκαν οι σχετικές συχνότητες. Τα αποτελέσµατα παρουσιάζονται στους Πίνακες και επιπλέον αποδίδονται γραφικά στα Γραφήµατα χωριστά για τον κάθε πολυµορφισµό. Από τις 40 ασθενείς, των οποίων το γονιδίωµα ελέγχθηκε για το σηµειακό πολυµορφισµό rs (76,77), το 50% είχε δύο αλληλόµορφα µε το αρχέγονο γονότυπο, δηλαδή είχε γονότυπο C/C. Στην περίπτωση του πολυµορφισµού rs , 18 (45.0%) άτοµα ήταν ετερόζυγα (γονότυπος C/Α) και 18 (45.0%) εµφάνισαν τον γονότυπο A/A. Όσον αφορά στον rs (78), οι τρείς γονότυποι είχαν παρόµοια συχνότητα εµφάνισης. Η συντριπτική πλειοψηφία (89,90) του rs (77.5%) ήταν της µορφής T/T και το 100% του rs7412 ήταν της µορφής C/C. Στον rs699 (94), το 22.5% είχε δύο αλληλόµορφα µε το αρχέγονο γονίδιο, δηλαδή είχε γονότυπο INS/INS. Σχεδόν οι µισές γυναίκες εµφάνισαν τον γονότυπο C/T στον πολυµορφισµό rs και τον αρχέγονο τύπο G/G στον rs Συγκρίνοντας τις συχνότητες ασθενών και µαρτύρων, δε βρέθηκε ένδειξη για στατιστικά σηµαντική συσχέτιση των γονοτύπων µε τον κίνδυνο καθ έξιν αποβολών σε κανέναν από τους εξεταζόµενους πολυµορφισµούς. Ωστόσο αξίζει να επισηµανθεί ότι τα αποτελέσµατα της συσχέτισης ήταν λίγο πάνω από τα όρια στατιστικής σηµαντικότητας σε δύο πολυµορφισµούς (87-89,91), και συγκεκριµένα στον rs (p=0.102) και στον rs (p=0.091), µε τους ασθενείς και στις δύο περιπτώσεις να εµφανίζουν ελαφρώς υψηλότερα ποσοστά της οµόζυγης µετάλλαξης συγκριτικά µε τους µάρτυρες. Στην περίπτωση του rs δεν ήταν εφικτή η διεξαγωγή ελέγχου, δεδοµένου ότι δεν υπήρχαν διαθέσιµα στοιχεία για τη 77 Σελίδα

78 συχνότητα εµφάνισης γονοτύπων του εν λόγω πολυµορφισµού στην οµάδα των µαρτύρων. Πίνακας 4.1: Συχνότητες εµφάνισης γονοτύπων ανά ασθενείς και µάρτυρες στον πολυµορφισµό rs (76,77) Γονότυποι Ασθενείς Μάρτυρες Σύνολο P- N (%) N (%) N (%) value RS / C677T MTHFR C/C (αρχέγονος τύπος/φυσιολογικό) 20 (50.0) 31 (38.8) 51 (42.5) T/C (ετερόζυγος τύπος) 15 (37.5) 37 (46.2) 52 (43.3) T/T (οµόζυγα µεταλλαγµένος τύπος) 5 (12.5) 12 (15.0) 17 (14.2) Η τιµή του P-value προέκυψε από το κριτήριο χι-τετράγωνο Γράφηµα 4.1: Συχνότητες εµφάνισης γονοτύπων ανά ασθενείς και µάρτυρες στον πολυµορφισµό rs % Ασθενείς Μάρτυρες 40% 30% 20% 10% 0% CC CT rs TT 78 Σελίδα

79 Πίνακας 4.2: Συχνότητες εµφάνισης γονοτύπων ανά ασθενείς και µάρτυρες στον πολυµορφισµό rs (76,77) Γονότυποι Ασθενείς Μάρτυρες Σύνολο P- N (%) N (%) N (%) value RS / A1298C MTHFR A/A (αρχέγονος τύπος/φυσιολογικό) 18 (45.0) 34 (42.5) 52 (43.3) C/A (ετερόζυγη µετάλλαξη/φυσιολογικό) 18 (45.0) 36 (45.0) 54 (45.0) C/C (οµόζυγη µετάλλαξη/παθολογικό) 4 (10.0) 10 (12.5) 14 (11.7) Η τιµή του P-value προέκυψε από το κριτήριο Fisher s Exact Γράφηµα 4.2: Συχνότητες εµφάνισης γονοτύπων ανά ασθενείς και µάρτυρες στον πολυµορφισµό rs % Ασθενείς Μάρτυρες 40% 30% 20% 10% 0% ΑΑ CA rs CC 79 Σελίδα

80 Πίνακας 4.3: Συχνότητες εµφάνισης γονοτύπων ανά ασθενείς και µάρτυρες στον πολυµορφισµό rs (78) Γονότυποι Ασθενείς Μάρτυρες Σύνολο P- N (%) N (%) N (%) value RS / PAI-1 4G/5G G/5G (αρχέγονος τύπος/φυσιολογικό) 14 (35.0) 26 (32.5) 40 (33.3) 4G/5G (ετερόζυγη µετάλλαξη/φυσιολογικό) 13 (32.5) 40 (50.0) 53 (44.2) 4G/4G (οµόζυγη µετάλλαξη/παθολογικό) 13 (32.5) 14 (17.5) 27 (22.5) Η τιµή του P-value προέκυψε από το κριτήριο χι-τετράγωνο Γράφηµα 4.3: Συχνότητες εµφάνισης γονοτύπων ανά ασθενείς και µάρτυρες στον πολυµορφισµό rs % Ασθενείς Μάρτυρες 40% 30% 20% 10% 0% 5G5G 4G5G rs G4G 80 Σελίδα

81 Πίνακας 4.4: Συχνότητες εµφάνισης γονοτύπων ανά ασθενείς και µάρτυρες στον πολυµορφισµό rs (86,90) Γονότυποι Ασθενείς Μάρτυρες Σύνολο N (%) N (%) N (%) P-value RS T/T 31 (77.5) 68 (85.0) 99 (82.5) T/C 9 (22.5) 12 (15.0) 21 (17.5) C/C 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Η τιµή του P-value προέκυψε από το κριτήριο Fisher s Exact Γράφηµα 4.4: Συχνότητες εµφάνισης γονοτύπων ανά ασθενείς και µάρτυρες στον πολυµορφισµό rs % Ασθενείς Μάρτυρες 80% 60% 40% 20% 0% ΤΤ rs TC 81 Σελίδα

82 Πίνακας 4.5: Συχνότητες εµφάνισης γονοτύπων ανά ασθενείς και µάρτυρες στον πολυµορφισµό rs7412. (86,90) Γονότυποι Ασθενείς Μάρτυρες Σύνολο N (%) N (%) N (%) P-value RS C/C 40 (100.0) 74 (92.5) 114 (95.0) C/T 0 (0.0) 6 (7.5) 6 (5.0) T/T 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Η τιµή του P-value προέκυψε από το κριτήριο Fisher s Exact Γράφηµα 4.5: Συχνότητες εµφάνισης γονοτύπων ανά ασθενείς και µάρτυρες στον πολυµορφισµό rs % Ασθενείς Μάρτυρες 80% 60% 40% 20% 0% CC rs7412 CT 82 Σελίδα

83 Πίνακας 4.6: Συχνότητες εµφάνισης γονοτύπων ανά ασθενείς και µάρτυρες στον πολυµορφισµό rs699. (94) Γονότυποι Ασθενείς Μάρτυρες Σύνολο N (%) N (%) N (%) P-value RS699 / ACE Met235Thr INS/INS (φυσιολογικό) 9 (22.5) 8 (10.0) 17 (14.2) INS/DE (φυσιολογικό) 15 (37.5) 34 (42.5) 49 (40.8) DE/DE (παθολογικό) 16 (40.0) 38 (47.5) 54 (45.0) Η τιµή του P-value προέκυψε από το κριτήριο χι-τετράγωνο Γράφηµα 4.6: Συχνότητες εµφάνισης γονοτύπων ανά ασθενείς και µάρτυρες στον πολυµορφισµό rs % Ασθενείς Μάρτυρες 40% 30% 20% 10% 0% INS/INS rs699 INS/DE DE/DE 83 Σελίδα

84 Πίνακας 4.7: Συχνότητες εµφάνισης γονοτύπων ανά ασθενείς και µάρτυρες στον πολυµορφισµό rs (87,88,89,91) Γονότυποι RS / NOS3 T768C Ασθενείς N (%) Μάρτυρες N (%) Σύνολο N (%) T/T (αρχέγονος τύπος/φυσιολογικό) 13 (32.5) N/A N/A C/T (ετερόζυγη µετάλλαξη/φυσιολογικό) 21 (52.5) N/A N/A C/C (οµόζυγη µετάλλαξη/παθολογικό) 6 (15.0) N/A N/A P- value Ν/Α: εν υπήρχαν διαθέσιµα στοιχεία Γράφηµα 4.7: Συχνότητες εµφάνισης γονοτύπων ασθενών στον πολυµορφισµό rs % 50% 40% 30% 20% 10% 0% 1,00 2,00 rs ,00 84 Σελίδα

85 Πίνακας 4.8: Συχνότητες εµφάνισης γονοτύπων ανά ασθενείς και µάρτυρες στον πολυµορφισµό rs (87,88,89,91) Γονότυποι Ασθενείς Μάρτυρες Σύνολο P- N (%) N (%) N (%) value RS / NOS3Gly298Asp G/G (αρχέγονος τύπος/φυσιολογικό) 19 (47.5) 35 (43.8) 54 (45.0) T/G (ετερόζυγη µετάλλαξη/φυσιολογικό) 14 (35.0) 40 (50.0) 54 (45.0) T/T (οµόζυγη µετάλλαξη/παθολογικό) 7 (17.5) 5 (6.2) 12 (10.0) Η τιµή του P-value προέκυψε από το κριτήριο χι-τετράγωνο Γράφηµα 4.8: Συχνότητες εµφάνισης γονοτύπων ανά ασθενείς και µάρτυρες στον πολυµορφισµό rs % Ασθενείς Μάρτυρες 40% 30% 20% 10% 0% GG TG rs TT 85 Σελίδα

86 Περαιτέρω ανάλυση ανά αλληλόµορφο (Πίνακας 4.9) απεκάλυψε ότι η κατανοµή των αλληλίων δεν παρουσιάζει σηµαντικές διαφορές µεταξύ ασθενών και µαρτύρων σε κανέναν από τους εξεταζόµενους πολυµορφισµούς. Πίνακας 4.9: Συχνότητες αλληλόµορφων των 40 ασθενών και των 80 υγιών µαρτύρων. Αλληλόµορφα Ασθενείς Μάρτυρες Σύνολο N (%) N (%) N (%) P-value RS / C677T MTHFR T 25 (31.3) 61 (38.1) 86 (35.8) C 55 (68.7) 99 (61.9) 154 (64.2) RS / A1298C MTHFR C 26 (32.5) 56 (35.0) 82 (34.2) A 54 (67.5) 104 (65.0) 158 (65.8) RS / PAI-1 4G/5G G 39 (48.8) 68 (42.5) 107 (44.6) 5G 41 (51.2) 92 (57.5) 133 (55.4) RS T 71 (88.8) 148 (92.5) 219 (91.3) C 9 (11.2) 12 (7.5) 21 (8.7) RS T 0 (0.0) 6 (3.8) 6 (2.5) C 80 (100.0) 154 (96.2) 234 (97.5) RS699 / ACE Met235Thr INS 33 (41.3) 50 (31.3) 83 (34.6) DE 47 (58.7) 110 (68.7) 157 (65.4) RS / NOS3Gly298Asp T 28 (35.0) 50 (31.2) 78 (32.5) G 52 (65.0) 110 (68.7) 162 (67.5) Οι τιµές των P-values προέκυψαν από το κριτήριο χι-τετράγωνο Οι τιµές των P-values προέκυψαν από το κριτήριο Fisher s Exact 86 Σελίδα

87 4.5. Απλή λογαριθµιστική παλινδρόµηση για τη σχέση καθ έξιν αποβολών και πολυµορφισµών Η διερεύνηση της σχέσης µεταξύ καθ έξιν αποβολών και πολυµορφισµών της παρούσας µελέτης έγινε µε τέσσερα ανεξάρτητα είδη στατιστικών µοντέλων: (α) το υπολειπόµενο µοντέλο, (β) το επικρατές µοντέλο, (γ) το προσθετικό µοντέλο και (δ) την ανάλυση ανά αλληλόµορφο. Ωστόσο θα πρέπει να αναφερθεί ότι η εφαρµογή αυτών των µοντέλων δεν κατέστη δυνατή στην περίπτωση του rs λόγω µη διαθεσιµότητας δεδοµένων από την οµάδα των µαρτύρων, καθώς και στους πολυµορφισµούς rs και rs7412 επειδή η συχνότητα εµφάνισης ορισµένων γονοτύπων ήταν µηδενική. Η κατανοµή των γονοτύπων και τα αποτελέσµατα των µοντέλων λογαριθµιστικής παλινδρόµησης, χωριστά για κάθε προτεινόµενο µοντέλο, παρουσιάζονται στους Πίνακες για κάθε έναν πολυµορφισµό. Αναφορικά µε τον πολυµορφισµό rs (Πίνακας 5.1), οι σχετικοί λόγοι εκτιµήθηκαν ως εξής: (α) 0.81 (95% ΟΑ: , p=0.712) κατά τη σύγκριση των Τ/Τ οµοζυγωτών έναντι των C/C+T/C σύµφωνα µε το υπολειπόµενο µοντέλο, (β) 0.63 (95% ΟΑ: , p=0.241) για τους T/C+T/T έναντι των C/C οµοζυγωτών σύµφωνα µε το επικρατές µοντέλο, (γ) 0.75 (95% ΟΑ: , p=0.310) κατά την προσθήκη ενός Τ αλληλόµορφου σύµφωνα µε το προσθετικό µοντέλο και, (δ) 0.74 (95% ΟΑ: , p=0.296) συγκρίνοντας το T έναντι του C αλληλόµορφου. 87 Σελίδα

88 Πίνακας 5.1: Σχετικοί λόγοι (ΣΛ), 95% όρια αξιοπιστίας (95% ΟΑ) και P-values, όπως αυτά προέκυψαν από απλές λογαριθµιστικές παλινδροµήσεις για τον κίνδυνο καθ έξιν αποβολών στον πολυµορφισµό rs (76,77) RS / C677T MTHFR Υπολειπόµενο µοντέλο Μονοπαραγοντική ανάλυση ΣΛ 95% ΟΑ P-value T/T έναντι C/C+T/C Επικρατές µοντέλο T/C+T/T έναντι C/C Προσθετικό µοντέλο T αλληλόµορφο έναντι C/C Ανάλυση ανά αλληλόµορφο T αλληλόµορφο έναντι C αλληλόµορφο * Οι τιµές των P-values προέκυψαν από το Wald test ** Οι τιµές των P-values προέκυψαν από το Armitage test for trend Συνεχίζοντας µε τον πολυµορφισµό rs , οι σχετικοί λόγοι εκτιµήθηκαν ως εξής: (α) 0.78 (95% ΟΑ: , p=0.688) κατά τη σύγκριση των C/C οµοζυγωτών έναντι των A/A+C/A σύµφωνα µε το υπολειπόµενο µοντέλο, (β) 0.90 (95% ΟΑ: , p=0.795) για τους C/A+C/C έναντι των A/A οµοζυγωτών σύµφωνα µε το επικρατές µοντέλο, (γ) 0.89 (95% ΟΑ: , p=0.700) κατά την προσθήκη ενός C αλληλόµορφου σύµφωνα µε το προσθετικό µοντέλο και, (δ) 0.89 (95% ΟΑ: , p=0.700) συγκρίνοντας το C έναντι του Α αλληλόµορφου (Πίνακας 5.2). 88 Σελίδα

89 Πίνακας 5.2: Σχετικοί λόγοι (ΣΛ), 95% όρια αξιοπιστίας (95% ΟΑ) και P-values, όπως αυτά προέκυψαν από απλές λογαριθµιστικές παλινδροµήσεις για τον κίνδυνο καθ έξιν αποβολών στον πολυµορφισµό rs (76,77) RS / A1298C MTHFR Υπολειπόµενο µοντέλο Μονοπαραγοντική ανάλυση ΣΛ 95% ΟΑ P-value C/C έναντι A/A+C/A Επικρατές µοντέλο C/A+C/C έναντι A/A Προσθετικό µοντέλο C αλληλόµορφο έναντι A/A Ανάλυση ανά αλληλόµορφο C αλληλόµορφο έναντι A αλληλόµορφο * Οι τιµές των P-values προέκυψαν από το Wald test ** Οι τιµές των P-values προέκυψαν από το Armitage test for trend Στην περίπτωση του πολυµορφισµού rs , ήδη από τη σύγκριση της συχνότητας των γονοτύπων µεταξύ ασθενών και µαρτύρων (Πίνακας 4.1) είχε εκτιµηθεί ότι το p-value ήταν λίγο πάνω από τα όρια της στατιστικής σηµαντικότητας (p=0.102). Σύµφωνα πλέον µε την λογαριθµιστική παλινδρόµηση προκύπτει ότι το οριακό αυτό εύρηµα προέρχεται από το υπολειπόµενο µοντέλο και συγκεκριµένα φαίνεται ότι ο κίνδυνος εµφάνισης καθ έξιν αποβολών είναι σχεδόν διπλάσιος για τις γυναίκες µε γονότυπο 4G/4G συγκριτικά µε τις γυναίκες που έχουν γονότυπο 5G/5G+4G/5G (ΣΛ=2.27; 95% ΟΑ: , p=0.067). Το επικρατές µοντέλο (p=0.784), το προσθετικό µοντέλο (p=0.384) και η ανάλυση ανά αλληλόµορφο (p=0.359) δεν εντόπισαν κάποια ένδειξη για συσχέτιση του rs µε τις καθ έξιν αποβολές. 89 Σελίδα

90 Πίνακας 5.3: Σχετικοί λόγοι (ΣΛ), 95% όρια αξιοπιστίας (95% ΟΑ) και P-values, όπως αυτά προέκυψαν από απλές λογαριθµιστικές παλινδροµήσεις για τον κίνδυνο καθ έξιν αποβολών στον πολυµορφισµό rs (78) RS / PAI-1 4G/5G Υπολειπόµενο µοντέλο Μονοπαραγοντική ανάλυση ΣΛ 95% ΟΑ P-value 4G/4G έναντι 5G/5G+4G/5G Επικρατές µοντέλο 4G/5G+4G/4G έναντι 5G/5G Προσθετικό µοντέλο 4G αλληλόµορφο έναντι 5G/5G Ανάλυση ανά αλληλόµορφο 4G αλληλόµορφο έναντι 5G αλληλόµορφο * Οι τιµές των P-values προέκυψαν από το Wald test ** Οι τιµές των P-values προέκυψαν από το Armitage test for trend Όσον αφορά στον rs699 πολυµορφισµό (Πίνακας 5.4), σύµφωνα µε το υπολειπόµενο µοντέλο, το προσθετικό µοντέλο και την ανάλυση ανά αλληλόµορφο δεν βρέθηκε ένδειξη για συσχέτιση του πολυµορφισµού αυτού και του κινδύνου εµφάνισης καθ έξιν αποβολών. Ωστόσο, το επικρατές µοντέλο αποκάλυψε µια οριακή ένδειξη για πιθανή συσχέτιση των δύο µεταβλητών. Συγκεκριµένα, τα άτοµα µε γονότυπο INS/DE+DE/DE φάνηκε να έχουν 62% µικρότερο κίνδυνο καθ έξιν αποβολών συγκριτικά µε τα άτοµα µε γονότυπο INS/INS (ΣΛ: 0.38; 95% ΟΑ: ; p=0.071). 90 Σελίδα

91 Πίνακας 5.4: Σχετικοί λόγοι (ΣΛ), 95% όρια αξιοπιστίας (95% ΟΑ) και P-values, όπως αυτά προέκυψαν από απλές λογαριθµιστικές παλινδροµήσεις για τον κίνδυνο καθ έξιν αποβολών στον πολυµορφισµό rs699.(94) RS699 / ACE Met235Thr Μονοπαραγοντική ανάλυση ΣΛ 95% ΟΑ P-value Υπολειπόµενο µοντέλο DE/DE έναντι INS/DE+ INS/INS Επικρατές µοντέλο INS/DE+ DE/DE έναντι INS/INS Προσθετικό µοντέλο DE αλληλόµορφο έναντι INS/INS Ανάλυση ανά αλληλόµορφο DE αλληλόµορφο έναντι INS * Οι τιµές των P-values προέκυψαν από το Wald test ** Οι τιµές των P-values προέκυψαν από το Armitage test for trend Όσον αφορά στον πολυµορφισµό rs , όπως προκύπτει από τον Πίνακα 5.5, αξίζει να επισηµανθεί ότι, σύµφωνα µε το υπολειπόµενο µοντέλο, οι T/T έναντι των T/G+G/G διατρέχουν σχεδόν τριπλάσιο κίνδυνο (ΣΛ: 3.18, 95% ΟΑ: ) να υποστούν καθ έξιν αποβολές. Ωστόσο το εύρηµα αυτό ήταν λίγο πάνω από τα όρια της στατιστικής σηµαντικότητας (p=0.063). Τα υπόλοιπα τρία µοντέλα (επικρατές, προσθετικό, ανάλυση ανά αλληλόµορφο) δεν κάνουν λόγο για πιθανή συσχέτιση του rs µε τον κίνδυνο καθ έξιν αποβολών. Τέλος στην περίπτωση του rs429358, η µόνη δυνατή σύγκριση ήταν αυτή του γονοτύπου T/C έναντι του T/T (ΣΛ: 1.65; 95% ΟΑ: ; p=0.311), όπου δε βρέθηκε ένδειξη για κάποια συσχέτιση του πολυµορφισµού rs και των καθ έξιν αποβολών. Στην περίπτωση του πολυµορφισµού rs7412, οι εξαιρετικά χαµηλές συχνότητες της ετερόζυγης και της οµόζυγης µετάλλαξης δεν επέτρεψαν τη διενέργεια ελέγχου συσχετίσεων. 91 Σελίδα

92 Πίνακας 5.5: Σχετικοί λόγοι (ΣΛ), 95% όρια αξιοπιστίας (95% ΟΑ) και P-values, όπως αυτά προέκυψαν από απλές λογαριθµιστικές παλινδροµήσεις για τον κίνδυνο καθ έξιν αποβολών στον πολυµορφισµό rs (87-89,91) RS / NOS3Gly298Asp Υπολειπόµενο µοντέλο Μονοπαραγοντική ανάλυση ΣΛ 95% ΟΑ P-value T/T έναντι T/G+G/G Επικρατές µοντέλο T/G+T/T έναντι G/G Προσθετικό µοντέλο T αλληλόµορφο έναντι G/G Ανάλυση ανά αλληλόµορφο T αλληλόµορφο έναντι G αλληλόµορφο * Οι τιµές των P-values προέκυψαν από το Wald test ** Οι τιµές των P-values προέκυψαν από το Armitage test for trend Αθροιστικός δείκτης συνολικού κινδύνου για εµφάνιση καθ έξιν αποβολών Εκτός από την ανεξάρτητη επίδραση του κάθε πολυµορφισµού που µελετήθηκε στις παραπάνω ενότητες, θελήσαµε επιπλέον να διερευνήσουµε αν η συνολική αθροιστική επίδραση των πολυµορφισµών σχετίζεται µε τον κίνδυνο καθ έξιν αποβολών. Η συχνότητα κατανοµής του αθροιστικού δείκτη περιγράφεται στον Πίνακα 6.1. Παρατηρούµε ότι το 20.0% των ασθενών και το 22.5% των µαρτύρων διατρέχει συνολικό κίνδυνο εµφάνισης καθ έξιν αποβολών σε ποσοστό άνω του 50%. ε βρέθηκε ένδειξη για στατιστικά σηµαντική διαφορά της µέσης τιµής του αθροιστικού δείκτη γονοτύπων µεταξύ των δύο οµάδων, σύµφωνα µε το κριτήριο t- test (p=0.892). 92 Σελίδα

93 Πίνακας 6.1: Αθροιστικός δείκτης του συνολικού κινδύνου (τιµές από 0 έως 100) για εµφάνιση καθ έξιν αποβολών από τους πολυµορφισµούς των γονιδίων στην οµάδα των 40 ασθενών και των 80 µαρτύρων. Αθροιστικός είκτης Γονοτύπων Ασθενείς N (%) Μάρτυρες N (%) Σύνολο N (%) (2.5) 1 (1.3) 2 (1.7) (5.0) 6 (7.5) 8 (6.7) (20.0) 18 (22.5) 26 (21.7) (52.5) 37 (46.2) 58 (48.3) (12.5) 14 (17.5) 19 (15.8) (7.5) 4 (5.0) 7 (5.8) Ο παραπάνω αλγόριθµος βασίστηκε στην υπόθεση ότι όλοι οι συµπεριληφθέντες πολυµορφισµοί συµµετέχουν στον αθροιστικό δείκτη µε το ίδιο βάρος. Ωστόσο πρακτικά αυτό µπορεί να µην είναι απόλυτα σωστό, δεδοµένου ότι ορισµένοι πολυµορφισµοί ενδέχεται να δρουν περισσότερο επιβαρυντικά σε σχέση µε ορισµένους άλλους. Για τον σκοπό αυτό δηµιουργήσαµε και έναν δεύτερο, εναλλακτικό αθροιστικό δείκτη, ο οποίος προέκυψε δίνοντας διαφορετικά βάρη στο GS (Genotype Score) του κάθε πολυµορφισµού, σύµφωνα µε τις υπάρχουσες βιβλιογραφικές ενδείξεις (76-94) Εναλλακτικός αθροιστικός δείκτης συνολικού κινδύνου για την εµφάνιση καθ έξιν αποβολών Η κατανοµή του εναλλακτικού αθροιστικού δείκτη παρουσιάζεται στον Πίνακα 7.1. Τελικά ούτε σε αυτή την περίπτωση βρέθηκε ένδειξη για στατιστικά σηµαντική διαφορά της µέσης τιµής του αθροιστικού δείκτη γονοτύπων µεταξύ των δύο οµάδων (p=0.644). 93 Σελίδα

94 Πίνακας 7.1: Εναλλακτικός αθροιστικός δείκτης του συνολικού κινδύνου (τιµές από 0 έως 100), κατόπιν απόδοσης στατιστικών βαρών, για εµφάνιση καθ έξιν αποβολών από τους πολυµορφισµούς των γονιδίων στην οµάδα των 40 ασθενών και των 80 µαρτύρων. Αθροιστικός είκτης Γονοτύπων Ασθενείς N (%) Μάρτυρες N (%) Σύνολο N (%) (12.5) 14 (17.5) 19 (15.8) (12.5) 6 (7.5) 11 (9.2) (47.5) 31 (38.7) 50 (41.6) (15.0) 14 (17.5) 20 (16.7) (12.5) 15 (18.8) 20 (16.7) 94 Σελίδα

95 5. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Αυτή η έρευνα έγινε µε σκοπό να τεκµηριώσουµε την απάντηση στο ερώτηµα αν υπάρχει συσχέτιση µεταξύ σηµειακών νουκλεοτιδικών πολυµορφισµών και καθ έξιν αποβολών. Όπως ανέφερα παραπάνω µε τον όρο καθ έξιν αποβολές αναφερόµαστε σε εγκύους που είχαν στο ιστορικό τους 2 αποβολές και άνω. Παρακολουθήθηκαν 40 γυναίκες που ελάµβαναν φαρµακευτική αγωγή και είδαµε πως άλλες ήταν ετερόζυγες και άλλες οµόζυγες ως προς τις 7 υπο µελέτη σηµειακές µεταλλάξεις της εργασίας αυτής. Όµως καταλήξαµε και εµείς από την ανάλυση των αποτελεσµάτων στην ήδη τεκµηριωµένη επιστηµονική θέση, ότι υπάρχει κάποια συσχέτιση µεταξύ τόσο των γυναικών µε ιστοριό καθ έξιν αποβολών όσο και των γυναικών του γενικού πληθυσµού µε τα τέσσερα από τα επτά επίµαχα γονίδια που ενοχοποιούνται για την συνεπίδρασή τους στην εµφάνιση της θροµβοφιλίας η οποία θεωρελιται ως µια από τις πιο σηµαντικές και δυνειτικά αντιµετωπίσιµες αιτίες των καθ έξιν αποβολών, τα οποία είναι: 1) rs C677T MTHFR, 2) rs A1298C MTHFR, 3) rs APOE και 4) rs699 - ACE. Όσον αφορά τον πολυµορφισµό rs NOS3 T768C, στον οποίο η συγκεκριµένη σηµειακή µετάλλαξη βρέθηκε να υπάρχει σε ποσοστό 52,5% σε ετεροζυγωτικό τύπο και σε ποσοστό 15% σε οµόζυγα µεταλλαγµένο τύπο, δεν είµαστε σε θέση να τεκµηριώσουµε την θετική συσχέτιση αυτού του πολυµορφισµού µε την εµφάνιση θροµβοφιλίας σε εγκύους για τον λόγο ότι δεν υπάρχει αντίστοιχο δείγµα µαρτύρων µε φυσιλογικό φαινότυπο για να επιτευχθεί η σύγκριση. Το γεγονός του υψηλού ποσοστού εµφάνισης ετεροζυγωτικού τύπου και οµοζυγα µεταλλαγµένου τύπου αποτελεί κριτήριο για την παραπέρα διερεύνηση. Όσον αφορά τον πολυµορφισµούς rs PAI-1 και τον rs NOS3 Glu-298-Asp, στους οποίους οι συγκεκριµένες σηµειακές µεταλλάξεις βρέθηκαν να υπάρχουν σε ποσοστό 32,5% σε ετεροζυγωτικό τύπο και σε ποσοστό 32,5% σε οµόζυγα µεταλλαγµένο τύπο για τον πρώτο πολυµορφισµό και σε ποσοστό 35% σε ετεροζυγωτικό τύπο και σε ποσοστό 17,5% σε οµόζυγα µεταλλαγµένο τύπο για τον δεύτερο πολυµορφισµό, είµαστε σε θέση να τεκµηριώσουµε την θετική συσχέτιση αυτού του πολυµορφισµού µε την εµφάνιση θροµβοφιλίας σε εγκύους για τον λόγο ότι το ποσοστό στατιστικής σηµαντικότητας για τον πρώτο πολυµορφισµό είναι p=0,102 και για τον δεύτερο είναι p=0,091. Γνωρίζουµε ότι οποιοδήποτε 95 Σελίδα

96 γενικευµένο συµπέρασµα θα ήταν παρακινδυνευµένο λόγω του µικρού δείγµατος έτσι ώστε αυτοί οι δύο πολυµορφισµοί να αποτελέσουν βιολογικούς δείκτες προδιάθεσης της θροµβοφιλίας. Ακόµα δε, δεν παρατηρήθηκε καµία συσχέτιση µε την ηλικία των γυναικών που απέβαλλαν ή προσπάθησαν να τκνοποιήσουν και καµία διαφοροποίηση δεν διαφάνηκε µε τις γυναίκες του γενικού πληθυσµού. Η έρευνα αυτή έγινε διότι όποια συσχέτιση αποδειχθεί µεταξύ των γονιδίων αυτών και γυναικών µε καθ έξιν αποβολές θα ήταν πολύ χρήσιµη, µιας και η σηµερινή πρακτική στην Μαιευτική Γυανικολογία της τελευταίας εικοσαετίας είναι γυναίκες µε ετερόζυγο τύπο µετάλλαξης σε τουλάχιστον 3 από τα επίµαχα γονίδια και ιστορικό καθ έξιν αποβολών να τίθενται σε προληπτική φαµακευτική αντιθροµβοφιλική αγωγή προκειµένου να τεκνοποιήσουν. Έτσι φιλοδοξούσαµε να µπορούσαµε να χρησιµοποιήσουµε αυτά τα γονίδια σαν δείκτες θροµβοφιλίας και κύησης στην παραπάνω οµάδα γυναικών. Και, επίσης, προχωρώντας παραπέρα, θα µπορούσαµε να διαµορφώσουµε και την ανάλογη θεραπεία διότι τώρα όλες οι γυναίκες µε εµπειρικό και αυθαίρετο τρόπο παίρνουν την ίδια σχεδόν θεραπεία κατά το διάστηαµα της προσπάθειάς τους να αποκτήσουν παιδί. Παρόλα αυτά τελικώς η εργασία µου αυτή ίσως αποτελέσει εύνασµα για να διερευνηθεί σε βάθος αυτή η σχέση των σηµειακών αυτών µεταλλάξεων και γυναικών µε καθ έξιν αποβολές. Απώτερος σκοπός δε, της έρευνας αυτής είναι να µελετηθεί τόσο η έκβαση των κυήσεων µε καθ έξιν αποβολές υπό την χρήση φαρµάκευτικής θεραπείας ως προληπτική αγωγή πριν απωλέσουν πολύτιµα χρόνια της αναπαραγωγικής τους ηλικίας διερευνόντας το ιστορικό τους για καθ εξιν αποβολές και τα πιθανά αίτια αυτών. 96 Σελίδα

97 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 97 Σελίδα

98 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. Rosenberg RD, Aird WC. Vascular-bed--specific hemostasis and hypercoagulable states. N Engl J Med 1999;340(20): Moncada S, Vane JR. The role of prostacyclin in vascular tissue. Fed Proc 1979;38(1): Hatton MW, Berry LR, Regoeczi E. Inhibition of thrombin by antithrombin III in the presence of certain glycosaminoglycans found in the mammalian aorta. Thromb Res 1978;13(4): MacIntyre DE, Pearson JD, Gordon JL. Localisation and stimulation of prostacyclin production in vascular cells. Nature 1978;271(5645): Nesheim M, Wang W, Boffa M, Nagashima M, Morser J, Bajzar L. Thrombin, thrombomodulin and TAFI in the molecular link between coagulation and fibrinolysis. Thromb Haemost 1997;78(1): Ruggeri ZM, Dent JA, Saldivar E. Contribution of distinct adhesive interactions to platelet aggregation in flowing blood. Blood 1999;94(1): Pytela R, Pierschbacher MD, Ginsberg MH, Plow EF, Ruoslahti E. Platelet membrane glycoprotein IIb/IIIa: member of a family of Arg-Gly-Asp--specific adhesion receptors. Science 1986;231(4745): Shattil SJ, Hoxie JA, Cunningham M, Brass LF. Changes in the platelet membrane glycoprotein IIb.IIIa complex during platelet activation. J Biol Chem 1985;260(20): Bennett JS, Vilaire G. Exposure of platelet fibrinogen receptors by ADP and epinephrine. J Clin Invest 1979;64(5): Colman RW. Platelet receptors. Hematol Oncol Clin North Am 1990;4(1): Holmsen H. Platelet metabolism and activation. Semin Hematol 1985;22(3): Radomski MW, Palmer RM, Moncada S. An L-arginine/nitric oxide pathway present in human platelets regulates aggregation. Proc Natl Acad Sci U S A 1990;87(13): Σελίδα

99 13. Mandle RJ, Colman RW, Kaplan AP. Identification of prekallikrein and highmolecular-weight kininogen as a complex in human plasma. Proc Natl Acad Sci USA 1976;73(11): Bouma BN, Griffin JH. Human blood coagulation factor XI. Purification, properties, and mechanism of activation by activated factor XII. J Biol Chem 1977;252(18): Halbmayer WM, Mannhalter C, Feichtinger C, Rubi K, Fischer M. The prevalence of factor XII deficiency in 103 orally anticoagulated outpatients suffering from recurrent venous and/or arterial thromboembolism. Thromb Haemost 1992;68(3): Colman RW, Pixley RA, Najamunnisa S, Yan W, Wang J, Mazar A, McCrae KR. Binding of high molecular weight kininogen to human endothelial cells is mediated via a site within domains 2 and 3 of the urokinase receptor. J Clin Invest 1997;100(6): Lin Y, Harris RB, Yan W, McCrae KR, Zhang H, Colman RW. High molecular weight kininogen peptides inhibit the formation of kallikrein on endothelial cell surfaces and subsequent urokinase-dependent plasmin formation. Blood 1997;90(2): Scott CF, Silver LD, Purdon AD, Colman RW. Cleavage of human high molecular weight kininogen by factor XIa in vitro. Effect on structure and function. J Biol Chem 1985;260(19): Tracy PB, Eide LL, Mann KG. Human prothrombinase complex assembly and function on isolated peripheral blood cell populations. J Biol Chem 1985;260(4): Fleck RA, Rao LV, Rapaport SI, Varki N. Localization of human tissue factor antigen by immunostaining with monospecific, polyclonal anti-human tissue factor antibody. Thromb Res 1990;59(2): Komiyama Y, Pedersen AH, Kisiel W. Proteolytic activation of human factors IX and X by recombinant human factor VIIa: effects of calcium, phospholipids, and tissue factor. Biochemistry 1990;29(40): Osterud B, Rapaport SI. Activation of factor IX by the reaction product of tissue factor and factor VII: additional pathway for initiating blood coagulation. Proc Natl Acad Sci USA 1977;74(12): Σελίδα

100 23. Hoffman M, Monroe DM, Oliver JA, Roberts HR. Factors IXa and Xa play distinct roles in tissue factor-dependent initiation of coagulation. Blood 1995;86(5): Bom VJ, Bertina RM. The contributions of Ca2+, phospholipids and tissuefactor apoprotein to the activation of human blood-coagulation factor X by activated factor VII. Biochem J 1990;265(2): Poort SR, Rosendaal FR, Reitsma PH, Bertina RM. A common genetic variation in the 3 -untranslated region of the prothrombin gene is associated with elevated plasma prothrombin levels, and an increase in venous thrombosis. Blood 1996;88(10): Ferry JD. The Mechanism of Polymerization of Fibrinogen. Proc Natl Acad Sci U S A 1952;38(7): Hermans J, McDonagh J. Fibrin: structure and interactions. Semin Thromb Hemost 1982;8(1): Schwartz ML, Pizzo SV, Hill RL, McKee PA. Human Factor XIII from plasma and platelets. Molecular weights, subunit structures, proteolytic activation, and cross-linking of fibrinogen and fibrin. J Biol Chem 1973;248(4): Schapira M, Scott CF, Colman RW. Protection of human plasma kallikrein from inactivation by C1 inhibitor and other protease inhibitors. The role of high molecular weight kininogen. Biochemistry 1981;20(10): Weitz JI, Hudoba M, Massel D, Maraganore J, Hirsh J. Clot-bound thrombin is protected from inhibition by heparin-antithrombin III but is susceptible to inactivation by antithrombin III-independent inhibitors. J Clin Invest 1990;86(2): Alkjaersig N, Fletcher AP, Sherry S. The mechanism of clot dissolution by plasmin. J Clin Invest 1959;38(7): Lijnen HR, Collen D. Interaction of plasminogen activators and inhibitors with plasminogen and fibrin. Semin Thromb Hemost 1982;8(1): Bremme KA. Haemostatic changes in pregnancy. Best Pract Res Clin Haematol 2003;16: Sattar N, Greer IA, Rumley A, Stewart G, Shepherd J, Packard CJ, Lowe GD. A longitudinal study of the relationships between haemostatic, lipid, and 100 Σελίδα

101 oestradiol changes during normal human pregnancy. Thromb Haemost 1999;81(1): O'Riordan MN, Higgins JR. Haemostasis in normal and abnormal pregnancy. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 2003;17: Stirling Y, Woolf L, North WR, Seghatchian MJ, Meade TW. Haemostasis in normal pregnancy. Thromb Haemost 1984;52(2): Clark P, Brennand J, Conkie JA, McCall F, Greer IA, Walker ID. Activated protein C sensitivity, protein C, protein S and coagulation in normal pregnancy. Thromb Haemost 1998;79(6): Dalaker K, Prydz H. The coagulation factor VII in pregnancy. Br J Haematol 1984;56(2): Cadroy Y, Grandjean H, Pichon J, Desprats R, Berrebi A, Fournie A, Boneu B. Evaluation of six markers of haemostatic system in normal pregnancy and pregnancy complicated by hypertension or pre-eclampsia. Br J Obstet Gynaecol 1993;100(5): Thornton Ca, Bonnar J. Factor VIII-related antigen and factor VIII coagulant activity in normal and preeclamptic pregnancy. Br J Obstet Gynaecol 1977;84(12): Hellgren M, Blomback M. Studies on blood coagulation and fibrinolysis in pregnancy, during delivery and in the puerperium. I. Normal condition. Gynecol Obstet Invest 1981;12(3): Donohoe S, Quenby S, Mackie I, Panal G, Farquharson R, Malia R, Kingdom J, Machin S. Fluctuations in levels of antiphospholipid antibodies and increased coagulation activation markers in normal and heparin-treated antiphospholipid syndrome pregnancies. Lupus 2002;11(1): Beller FK, Ebert C. The coagulation and fibrinolytic enzyme system in pregnancy and in the puerperium. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 1982;13(3): Phillips LL, Rosano L, Skrodelis V. Changes in factor XI (plasma thromboplastin antecedent) levels during pregnancy. Am J Obstet Gynecol 1973;116(8): Condie RG. A serial study of coagulation factors XII, XI and X in plasma in normal pregnancy and in pregnancy complicated by pre-eclampsia. Br J Obstet Gynaecol 1976;83(8): Σελίδα

102 46. Persson BL, Stenberg P, Holmberg L, Astedt B. Transamidating enzymes in maternal plasma and placenta in human pregnancies complicated by intrauterine growth retardation. J Dev Physiol 1980;2(1-2): Bonnar J, McNicol GP, Douglas AS. Fibrinolytic enzyme system and pregnancy. Br Med J 1969;3(5667): Gatti L, Tenconi PM, Guarneri D, Bertulessi C, Ossola MW, Bosco P, Gianotti GA. Hemostatic parameters and platelet activation by flow-cytometry in normal pregnancy: a longitudinal study. Int J Clin Lab Res 1994;24(4): Kjellberg U, Andersson NE, Rosen S, Tengborn L, Hellgren M. APC resistance and other haemostatic variables during pregnancy and puerperium. Thromb Haemost 1999;81(4): Cerneca F, Ricci G, Simeone R, Malisano M, Alberico S, $Guaschino S. Coagulation and fibrinolysis changes in normal pregnancy. Increased levels of procoagulants and reduced levels of inhibitors during pregnancy induce a hypercoagulable state, combined with a reactive fibrinolysis. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 1997;73(1): Faught W, Garner P, Jones G, Ivey B. Changes in protein C and protein S levels in normal pregnancy. Am J Obstet Gynecol 1995;172: Fernandez JA, Estelles A, Gilabert J, Espana F, Aznar J. Functional and immunologic protein S in normal pregnant women and in full-term newborns. Thromb Haemost 1989;61((3): Weiner CP, Brandt J. Plasma antithrombin III activity in normal pregnancy. Obstet Gynecol 1980;56(5): Clark P, Walker I. The phenomenon known as acquired activated protein C resistance. Br J Haematol 2001;115(4): Biezenski JJ, Moore HC. Fibrinolysis in normal pregnancy. J Clin Pathol 1958;11(4): Shaper AG, Macintosh DM, Evans CM, Kyobe J. Fibrinolysis and plasminogen levels in pregnancy and the puerperium. Lancet 1965;2(7415): Menon IS, Peberdy M, Rannie GH, Weightman D, Dewar HA. A comparative study of blood fibrinolytic activity in normal women, pregnant women and 102 Σελίδα

103 women on oral contraceptives. J Obstet Gynaecol Br Commonw 1970;77(8): Ishii A, Yamada S, Yamada R, Hamada H. t-pa activity in peripheral blood obtained from pregnant women. J Perin Med 1994;22(2): Kruithof EK, Tran-Thang C, Gudinchet A, Hauert J, Nicoloso G, Genton C, Welti H, Bachmann F. Fibrinolysis in pregnancy: a study of plasminogen activator inhibitors. Blood 1987;69(2): Chabloz P, Reber G, Boehlen F, Hohlfeld P, de Moerloose P. TAFI antigen and D-dimer levels during normal pregnancy and at delivery. Br J Haematol 2001;115(1): Collen D, de Cock F, Verstraete M. Quantitation of thrombin-antithrombin III complexes in human blood. Eur J Clin Invest 1977;7(5): Bellart J, Gilabert R, Miralles RM, Monasterio J, Cabero L. Endothelial cell markers and fibrinopeptide A to D-dimer ratio as a measure of coagulation and fibrinolysis balance in normal pregnancy. Gynecol Obstet Invest 1998;46(1): Bremme K, Ostlund E, Almqvist I, Heinonen K, Blomback M. Enhanced thrombin generation and fibrinolytic activity in the normal pregnancy and the puerperium. Obstet Gynecol 1992;80(1): Wallenburg HC, van Kessel PH. Platelet lifespan in normal pregnancy as determined by a non-radioisotopic technique. Br J Obstet Gynaecol 1978;134(7): Fay RA, Hughes AO, Farron NT. Platelets in pregnancy: hyperdestruction in pregnancy. Obstet Gynecol 1983;61(2): Douglas JT, Shah M, Lowe GD, Belch JJ, Forbes CD, Prentice CR. Plasma fibrinopeptide A and β-thromboglobulin in pre-eclampsia and pregnancy hypertension. Thromb Haemost 1982;47(1): Fitzgerald DJ, Mayo G, Catella F, Entman SS, FitzGerald GA. Increased thromboxane biosynthesis in normal pregnancy is mainly derived from platelets. Am J Obstet Gynecol 1987;157(2): Lanir N, Aharon A, Brenner B. Haemostatic mechanisms in human placenta. Best Pract Res Clin Haematol 2003;16(2): Σελίδα

104 69. Dahlman T, Hellgren M, Blomback M. Changes in blood coagulation and fibrinolysis in the normal puerperium. Gynecol Obstet Invest 1985;20(1): Brenner Β. Clinical management of thrombophilia-related placental vascular complications. Blood 2004;103(11): Eldor A. Thrombophilia and its treatment in pregnancy. J Thromb Thrombolysis 2001;12: Kierkegaard A. Incidence and diagnosis of deep vein thrombosis associated with pregnancy. Acta Obstet Gynaecol Scand 1983;62: Ginsberg JS, Brill-Edwards P, Burrows RF, Bona R, Prandoni P, Buller HR, Lensing A. Venous thrombosis during pregnancy: leg and trimester of presentation. Thromb Haemost 1992;67(5): Gherman RB, Goodwin TM, Leung B, Byrne JD, Hethumumi R, Montoro M. Incidence, clinical characteristics, and timing of objectively diagnosed venous thromboembolism during pregnancy. Obstet Gynecol 1999;94(5 Pt 1): H Θροµβοφιλία ως αίτιο καθέξιν Αποβολών. Γεώργιος Κρεατσάς, Αθανάσιος Παππάς. Πύλη του Ασκληπειού, Homocysteine, MTHFR C677T gene polymorphism, folic acid and vitamin B 12 in patients with retinal vein occlusion. Paola Ferrazzi1, Pierpaolo Di Micco1 *, Ilaria Quaglia1, Lisa S Rossi1, Alessandro G Bellatorre1,Giorgio Gaspari2, Lidia L Rota1 and Corrado Lodigiani1 77. Sacace Biotechnologies Srl 44 Scalabrini, str, Como, Italy 78. MTHFR C677T and A1298C Polymorphisms. Diet, Estrogen, and Risk of Colon Cancer, 2011, Karen Curtin 1, Jeannette Bigler 2, Martha L. Slattery 1, Bette Caan 3, John D. Potter 2, and Cornelia M. Ulrich Increased PAI-1 plasma levels and risk of death from dengue: no association with the 4G/5G promoter polymorphism ATA Mairuhu1 *, TE Setiati2, P Koraka3, CE Hack4, 5, 6, A Leyte7, SMH Faradz8, H ten Cate9, 10,DPM Brandjes1, ADME Osterhaus3, PH Reitsma11 and ECM van Gorp1 104 Σελίδα

105 80. Plasminogen Activator Inhibitor 1 4G/5G Polymorphism and Coagulation Factor XIII Val34Leu Polymorphism: Impaired Fibrinolysis and Early Pregnancy Loss 81. Clinical Chemistry :Astrid Dossenbach-Glaninger1, Michael van Trotsenburg2, Martin Dossenbach3, Christian Oberkanins4, Anne Moritz4, Walter Krugluger1, Johannes Huber2 and Pierre Hopmeier1 82. Sacace Biotechnologies Srl44 Scalabrini, str, Como, Italy, PAI-1 SNP- Screen Real Time Amplification Kit 83. Maternal/newborn genotype contribution of the reninangiotensin system (Met235Thr, Thr174Met, I/D-ACE, A2350G-ACE, A1166C-AT2R1, C3123A- AT2R2, 83 A/G-REN) to the risk of pre-eclampsia: a Romanian study. Journal of the Renin-Angiotensin- Aldosterone System 84. Lucia Maria Procopciuc1, Gabriela Alvarez R, Reguero JR, Batalla A, Iglesias-Cubero G, Cortina A, Alvarez V, and Coto E. Angiotensin converting enzyme, and angiotensin I.I. receptor 1 polymorphisms: association with early coronary disease. Cardiovasc Res 40: , Cambien F, Poirier O, Lecerf L, Evans A, Cambou JP, Arveiler D, Luc G, Bard JM, Bara L, Ricard S, Tiret L, Amouyel P, Alhenc-Gelas F, and Soubrier F. Deletion polymorphism in the gene for angiotensin converting enzyme is a potent risk factor for myocardial infarction. Nature 359: , 1992 Caracostea2, Gabriela Zaharie2, Mariana Puscas2, Georgiana Iordache2, Monica Popa2, Doina Colcear3, Ileana Olteanu1 and Florin Stamatian2 86. Lindpaintner K, Pfeffer MA, Kreutz R, Stampfer MJ, Grodstein F, La Motte F, Buring J, and Hennekens CH., A prospective evaluation of an angiotensin converting enzyme gene polymorphism, and the risk of ischemic heart disease. N Engl J Med 332: , Purandare N, Oude Voshaar RC, Davidson Y, Gibbons L, Hardicre J, Byrne J, McCollum C, Jackson A, Burns A, Mann DM. Deletion/insertion polymorphism of the angiotensin-converting enzyme gene and white matter hyperintensities in dementia: A pilot study J. Am Geriatr Soc Sep; 54(9): Clemens B Tempfer, Eva-Katrin Riener, Lucas A Hefler, Christoph Keck. Genetic thrombopfilia has pleiotropic effects in pregnancy. 105 Σελίδα

106 89. Common apolipoprotein E polymorphisms and risk of clinical malaria in the Gambia C Aucan, A J Walley, A V S Hill J Med Genet 2004;41: Κωνσταντίνου Α. Τζιοµάλου Παθ. Αριστοτέλειο Πανεπιστήµιο Θεσσαλονίκης - Ιατρική Σχολή : Ενδοθηλιακή υσλειτουργία σε ασθενείς µε Καρδιαγγειακά Νοσήµατα. Ο ρόλος του µονοξειδίου του Αζώτου (αριθµός :2264) 91. Clemens Tempfer, Gertrud Unfried, Robert Zeillinger, Lucas Hefler, Fritz Nagele, Johannes C.Huber. Endothelial nitric oxide synthase gene polymorphism in women with idiopathic recurrent miscarriage. 92. Χαίδω αφνή Νικόλαος ρακούλης. Μεταπτυχιακή Εργασία : ENOS & Καρδιαγγειακά Νοσήµατα. Φαρµακευτική Σχολή Αθηνών The association of Apoprotein E polymorphisms with recurrent pregnancy loss. Goodman C, Goodman CS, Hur J, Jeyendran RS, Coulam C. Am J Reprod Immunol Jan;61(1): Published in final edited form as: J Vasc Res ; 46(5): doi: / Inhibition of Nitric Oxide Synthases Abrogates Pregnancy-Induced Uterine Vascular Expansive Remodeling. George Osola, Carolyn Barrona, Natalia Gokinaa, and Maurizio Mandalab. adepartment of Obstetrics and Gynecology, College of Medicine, University of Vermont, Burlington, Vt., USA, bdepartment of Cell Biology, University of Calabria, Cosenza, Italy 95. Real-Time PCR Vs. Traditional PCR 96. CVD StripAssay TM ViennaLab Diagnostics Gmbh 97. Internet, Google 98. Polymorphisms in the ACE and PAI-1 gene are associated with recurrent spontaneous miscarriages. T.Buchholz, P.Lohse, N.Rogenhofer, E.Kosian, R.Pihusch and C.J.Thaler.Human Reproduction vol 18.No.11 pp , Σελίδα

107 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Περίληψη Εισαγωγή: Εκτιµήσαµε τη συσχέτιση µεταξύ σηµειακών νουκλεοτιδικών πολυµορφισµών PAI 1 4G/5G, ACE - Met 235Thr, NOS 3 - T768C, NOS 3 - Gly298Asp, APOE E3/Ε4 Τ3937+C4075/C3937+C4075, MTHFR C677T, MTHFR A1298C και τη πιθανότητα για καθ έξιν αποβολές. Επίσης ερευνήθηκε αν τα µεταλλαγµένα γονίδια σχετίζονται µε την ηλικία της γυναίκας και τον τύπο θεραπείας της. Υλικά και Μέθοδος: 40 γυναίκες µε καθ έξιν αποβολές στο ιστορικό τους, µελετήθηκαν µαζί µε 80 γυναίκες για µάρτυρες και όλες άνηκαν στον Ελληνικό πληθυσµό, µε την µέθοδο της αλυσιδωτής πολυµεράσης. Αποτελέσµατα: Σε όλες τις γυναίκες µελετήθηκε ο γονότυπός τους ως προς τις ακόλουθες µεταλλάξεις, όπου συσχετίστηκαν µε θετικό ή αρνητικό ιστορικό καθ έξιν αποβολών και µε θροµβοφιλία: Αναστολέας του Ενεργοποιητή του Πλασµινογόνου (PAI-1) 4G/5G (p 0,494 / p 0,102), Μετατρεπτικό Ένζυµο της Αγγειοτενσίνης (ACE) Met 235Thr (p 0,930 / p 0,179), Ενδοθηλιακή Συνθάση Νιτρικού Οξέως (NOS 3) T768C (p 0,125), Ενδοθηλιακή Συνθάση Νιτρικού Οξέως (NOS 3) Gly298Asp (p 0,532 / p 0,91), Απολιποπρωτείνη E3/Ε4 (APOE3 / Ε4) Τ C4075 (p 0,383 / p 0,308) / C C4075 (p 0,999 / p 0,177), Μεθυλεντετραυδροφολική Αναγωγάση (MTHFR C677T) (p 0,470 / p 0,501 Μεθυλεντετραυδροφολική Αναγωγάση, (MTHFR A1298C) (p 0,750 / p 0,963). Παρατηρήσαµε την ήδη γνωστή συσχέτιση µεταξύ των πολυµορφισµών: rs C677T MTHFR, rs A1298C MTHFR, rs APOE και rs699 ACE και των πληθυσµών ενισχύσαµε την σηµαντική συσχέτιση του πολυµορφισµού rs PAI-1 και αποκαλύφθηκε σηµαντική επίσης συσχέτιση του πολυµορφισµού rs nos3 Glu-298-Asp µεταξύ των πλυθυσµών. Συµπεράσµατα: Τα αποτελέσµατά µας επιβεβαίωσαν το γεγονός ότι οι γενετικές µεταβολές που ενέχονται στην εµφάνιση της θροµβοφιλίας έχουν µεγάλη σηµασία για το αποτέλεσµα της εγκυµοσύνης σε γυανίκες µε καθ έξιν αποβολές και γενετικό υπόβαθρο θροµβοφιλίας. Λέξεις Κλειδιά: Θροµβοφιλία, πολυµορφισµοί, καθ έξιν αποβολές, αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης, Ελλάδα. 107 Σελίδα

108 ABSTRACT Abstract Introduction: We evaluated the association of the mutated genotypes PAI 1 4G/5G, ACE - Met 235Thr, NOS 3 - T768C, NOS 3 - Gly298Asp, APOE E3/Ε4 Τ3937+C4075/C3937+C4075, MTHFR C677T, MTHFR A1298C with the risk and outcome of recurrent miscarriages and spontaneous abortions; we also investigated whether the mutated genes in fertile aged women who have been undertaken antithrombophilic therapy are associated with the age of them and the type of therapy. Materials and methods: 40 women with recurrent miscarriages in their history were genotyped, along with 80 women of controls, both of them belonging in the Greek population, using PCR analysis. Results: All of the women were genotyped for the following mutations with their relative association with the positive and non-positive history for abortions correlated with thrombophilia: Plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1) 4G/5G (p 0,494 / p 0,102), Angiotensinogen Converting Enzyme(ACE) Met 235Thr (p 0,930 / p 0,179), Endothelial nitric oxide synthase (NOS 3) T768C (p 0,125), Endothelial nitric oxide synthase (NOS 3) Gly298Asp (p 0,532 / p 0,91), Apolipoprotein E3/Ε4 (APOE3 / Ε4) Τ C4075 (p 0,383 / p 0,308) / C C4075 (p 0,999 / p 0,177), Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR C677T) (p 0,470 / p 0,501), Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR A1298C) (p 0,750 / p 0,963). We observed the already known correlation between these two populations and the polymorphisms: rs C677T MTHFR, rs A1298C MTHFR, rs APOE και rs699 ACE and we also enhanced the significant correlation between the polymorfism rs PAI-1 and we revealed the strong correlation between the polymorphism rs nos3 Glu-298-Asp and our populations, as well. Conclusions: The results of our study confirmed that, in women with recurrent miscarriages, the genetic variations implicated in thrombophilia and pregnancy outcome are important. Keywords Thrombophilia, polymorphisms, recurrent miscarriages, PCR, Greece 108 Σελίδα

109 109 Σελίδα ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ι

110 110 Σελίδα

111 111 Σελίδα

112 112 Σελίδα