Ανάπτυξη επισωματικού φορέα για τη γονιδιακή μεταφορά του τεχνητού μεταγραφικού παράγοντα ενεργοποίησης της γ-σφαιρίνης

Transcript

1 Ανάπτυξη επισωματικού φορέα για τη γονιδιακή μεταφορά του τεχνητού μεταγραφικού παράγοντα ενεργοποίησης της γ-σφαιρίνης Γεώργιος Δρύλλης Μεταπτυχιακό Πρόγραμμα Βασικών Ιατρικών Επιστημών Ιατρική Πατρών Εργαστήριο Γενικής Βιολογίας Επιβλέπουσα Καθηγήτρια: Αγλαία Αθανασιάδου

2 Γονιδιακή Θεραπεία: αντιμετώπιση μιας ανθρώπινης ασθένειας με τη μεταφορά του θεραπευτικού γονιδίου ή θεραπευτικής κασέττας σε κύτταρα πάσχοντος. Σωματική γονιδιακή θεραπεία Στρατηγικές γονιδιακής μεταφοράς στον οργανισμό Εξωσωματική (ex vivo) γονιδιακή θεραπεία Ενδοσωματική (in vivo) γονιδιακή θεραπεία

3 Προβλήματα συστημάτων γονιδιακής θεραπείας Η συχνά βραχύβια φύση της γονιδιακής θεραπείας Δεν αντιμετωπίζονται πολυπαραγοντικές ασθένειες Προβλήματα με τα ιικά οχήματα Ανοσο-απάντηση (immune response) Μεταλλαξιγένεση λόγω ενσωμάτωσης

4 Στρατηγικές μεταφοράς γονιδίου Προσθήκη ( gene addition, gene augmentation ) Αναστολή έκφρασης σε περιπτωση υπερέκφρασης γονιδίου ή αλλαγής της πρωτείνης: 1) με χρήση ριβοενζύμων 2) sirnas (small interfering RNAs) 3) Antisence DNA (ολιγονουκλεοτίδια συμπληρωματικού νοήματος) 4) morpholinos Μεταφορά γονιδίων αυτοκτονίας- τοξικών γονιδίων (π.χ μεταφορά θυμιδιλικής κινάσης σε καρκινικά κύτταρα)

5 Διόρθωση µεταλλάξεων in-situ (genome editing) Η στρατηγική αυτή αφορά στη διόρθωση µεταλλάξεων µέσω τροποποίησης του γονοτύπου. Πρόκειται για νεότερη προσέγγιση νουκλεασών µε δοµή δακτύλων ψευδαργύρου (ZFNs) στοχευµένηθραύσητης αλυσίδας του DNA στη θέση της µετάλλαξης. Μηχανισµοί του κυττάρου επιδιορθώνουν τη θραύση µέσω οµόλογου ανασυνδυασµού µήτρα το φυσιολογικό αλληλόµορφο, το οποίο οµοίως παρέχεται εξωγενώς. Προκαλείται οµόλογος ανασυνδυασµός σε συχνότητα ικανή για να έχει θεραπευτική αξία.

6 Κατηγορίες οχημάτων 1) Ιϊκοί φορείς: α) ρετρο-ιοί β) αδενο-ιοί γ) Lenti-ιοί δ) αδενοσυνδεόμενοι ιοί ε) ιοί του απλού έρπητα (ΗSV) 2) Μη ιϊκοί φορείς: Μεταφέρονται στα κύτταρα: Α) Φυσικές μέθοδοι: i)ηλεκτροδιάτρηση (electroporation) ii)χρήση στερεών σωματιδίων (biolistics) με ένεση Β) Χημικές μέθοδοι: i) calcium phosphate transfection ii)deae-dextran transfection (κατιονικό πολυμερές) iii) λιποσώματα 3) Αυτοαναπαραγόμενοι επισωματικοί φορείς μεταφοράς με φυσικές και χημικές μεθόδους

7 Aυτο-αναπαραγώμενοι επισωματικοί φορείς (Replicating Episomal Vectors, REV) Mη ιϊκοί φορείς που χρησιμοποιούν ορισμένα μόνο τμήματα του ιϊκού γενετικού υλικού (ori). Μπορούν να μεταφέρουν μεγάλα τμήματα DNA. Έχουν την ιδιότητα να παραμένουν επί μακρόν στα κύτταρα χωρίς να ενσωματώνονται στο γονιδιωματικό DNA, δεν προκαλούν μεταλλαξιγένεση και παραμένουν ως επίσωμα. Δεν εμφανίζουν δυνατότητα κυτταρικής στόχευσης και παρουσιάζουν χαμηλότερη απόδοση της διαδικασίας διαμόλυνσης των κυττάρων- στόχων (transfection efficiency). Οι νεότερης γενιάς REV δεν κωδικοποιούν καμία ιϊκή πρωτείνη Δείχνουν κατάλληλοι μη ιϊκοί φορείς για γονιδιακή θεραπεία.

8 Οι αυτο-αναπαραγόμενοι επισωματικοί φορείς που θα χρησιμοποιηθούν στην παρούσα εργασία, βασίζονται στη χρήση χρωμοσωμικών στοιχείων S/MAR.

9 S/MARs (scaffold/matrix attachment regions) DNA περιοχές, μεγέθους από 300 εώς μερικές χιλιάδες βάσεις, που εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση των χρωμοσωμάτων με την πυρηνική θεμέλια ουσία Αλληλουχίες πλούσιες κατά 70% σε αδενίνη και θυμίνη Φαίνεται ότι παίζουν ρόλο στη µεταγραφική ενίσχυση, ενώ διαθέτουν μονωτική δραστηριότητα (insulators) καθορίζοντας τα όρια μεταξύ αυτόνομων χρωματινικών περιοχών. Γενικότερα, οι S/MAR περιοχές παίζουν έναν πολύ σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της δομής και της λειτουργίας των χρωμοσωμάτων στα ευκαρυωτικά κύτταρα.

10 Στόχοτηςσυγκεκριμένηςεργασίαςαποτελείη ανάπτυξη αυτο-αναπαραγόμενου επισωματικού φορέα για τη γονιδιακή μεταφορά του τεχνητού μεταγραφικού παράγοντα ενεργοποίησης της γ- σφαιρίνης.

11 Αιμοσφαιρινοπάθειες Οι αιμοσφαιρινοπάθειες είναι κληρονομούμενες διαταραχές 1. Ανισορροπία στον λόγο των α προς β αλυσίδων της αιμοσφαιρίνης (θαλασσαιμία) 2. Διαταραχές στην λειτουργία των β-αλυσίδων (δρεπανοκυτταρική αναιμία). Ηβ-θαλασσαιμία: απουσία ήμείωσητωνβ-αλυσίδων καθίζηση των α-αλυσίδων και καταστροφή των ερυθρών αιμοσφαιρίων. Οι αιμοσφαιρινοπάθειες : εξαιρετικά μοντέλα ασθενειών για την γονιδιακή θεραπεία.

12

13 Ενεργοποίηση της γ-σφαιρίνης παρατηρείται κυρίως σε ενήλικες με σύνδρομο HPFH

14 Κληρονομική Παραμονή της Εμβρυικής Αιμοσφαιρίνης (HPFH) Η κληρονομική παραμονή της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης μπορεί να οφείλεται είτε α) σε ελλείψεις του DNA, είτε β) σε σημειακές μεταλλάξεις Αυξημένη HbF στην ενήλικο ζωή Ελλείψεις Μη ελλειμματική HPFH

15 Αιμοσφαιρινοπάθειες- Γονιδιακή Θεραπεία Δύο στρατηγικές για τη γονιδιακή θεραπεία στις αιμοσφαιρινοπάθειες: 1) Μεταφορά του φυσιολογικού β- γονιδίου στα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα. 2) Ενεργοποίηση του γ- γονιδίου στα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα βάση της γνώσης ότι ενήλικες (και ασθενείς) που παρουσιάζουν HPFH (κληρονομική παραμονή της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης) έχουν καλή κλινική εικόνα.

16 Η εργασία αυτή εντάσσεται στη δεύτερη στρατηγική. Αφορά μια γενικότερη στρατηγική µεταφοράς γονιδίου που εμπλέκει μεταφορά τεχνητών µεταγραφικών παραγόντων. Ανάπτυξη τεχνητών µεταγραφικών παραγόντων, στοχευµένων προς συγκεκριµένες περιοχές του DNA (υποκινητή γονιδίου) που με µεταφορά στα κατάλληλα κύτταρα οδηγεί σε ενεργοποίηση του εν λόγω γονιδίου. π.χ ανάπτυξη τεχνητού µεταγραφικού παράγοντα για την ενεργοποίηση του γονιδίου της γ σφαιρίνης µε σκοπό τη θεραπεία της β θαλασσαιµίας και της δρεπανοκυτταρικής αναιµίας (Tobjorn Graslund, 2004).

17

18

19 pcdna3-zif-vp64

20 ΣΚΟΠΟΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ 1) Η παραγωγή του επισωματικού φορέα Zif-VP64-EP2 με τη κασέτα pcmv-egfp- S-MAR. 2) Με υποκινητή για το γονίδιο του Zif-VP64 τον psffv υποκινητή. Παράλληλα θα κατασκευαστεί και ένας επισωματικός φορέας με υποκινητή για το γονίδιο του Zif-VP64 τον pef1/htlv. 3) Πιστοποίηση της λειτουργικότητας του νέου πλασμιδίου Zif- VP64- EP2 με μεταφορά του στην ευκαρυωτική κυτταρική σειρά Κ562.

21 Για αυτό το σκοπό: 1) Αρχικά, αντικαθίσταται ο υποκινητής pcmv από τον υποκινητή psffv για το σχηματισμό του επισωματικού φορέα pcdna3-psffv. Παράλληλα, αντικαθίσταται ο υποκινητής pcmv από τον υποκινητή pef1/htlv για το σχηματισμό του επισωματικού φορέα pcdna3- pef1/htlv. 2) Στη συνέχεια, μεταφέρεται η κασέττα pcmv-egfp- S-MAR στον επισωματικό φορέα pcdna3-psffv.

22 Βήμα 1 : Κατασκευή του επισωματικού φορέα pcdna3- psffv και παράλληλα του επισωματικού φορέα pcdna3- pef1/htlv.

23 pcdna3-zif-vp64 MluI XhoI

24 pcdna3-psffv MluI XhoI psffv Zif VP64 pcdna3-sffv 5927 bp

25 pcdna3-pef1-htlv MluI XhoI pef1/htlv Zif pcdna3-ef1/ HTLV 6207 bp VP64

26 1) Παραγωγή του πλασμιδιακού τμήματος* pc3 DNA *XhoI*MluI pepi-sffv *XhoI*MluI pepi- EF1/HTLV *XhoI*MluI λhindiii * EcoRI * 5497bp 5148bp 688bp 564bp

27 pef1/htlv 1 psffv egfp egfp pepi-sffv 6568 bp pepi-ef1/htlv 6854 bp S/MAR S/M AR (MluI) 1) SFFV-F: CACCAACGCGTATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGG (XhoI) 2) SFFV-R: CACACCTCGAGCGGGTACCCGGGCGACTC (MluI) 3) EF1-F: AGGCCACGCGTGAAGGTTAGTAGTCGACGTGTCC (XhoI) 4) EF1-R: CGGCCCTCGAGCATCAAAACAAAACGAAACAAAAC

28 2) Παραγωγή ένθετων DNA: psffv και pef1-htlv SFFV SFFV SFFV SFFV EF1 EF1 EF1 EF1 λhind III 730bp 457bp 564bp 3) Αντίδραση λιγάσης με το πλασμίδιακό τμήμα και το καθένα από τα δύο ένθετα DNA και 4) Μετασχηματισμός επιδεκτικών βακτηριακών κυττάρων με τα δύο νέα constructs

29 I) Κατασκευή του pcdna3-psffv 4947bp λ*hindiii bp 564bp 457bp 564bp Υποβάλαμε σε κατάτμηση με NheI για πιστοποίηση των αποικιών.

30 pcdna3-psffv psffv Zif VP64 pcdna3-sffv 5927 bp

31 IΙ) Κατασκευή του pcdna3- pef1/htlv λ*hindiii λ*hindiii *EcoRI 5kb 1kb 564 bp Kατάτμηση με NheI και ΗindIII για πιστοποίηση των αποικιών. 730bp

32 pcdna3-pef1-htlv pef1/htlv Zif pcdna3-ef1/ HTLV 6207 bp VP64

33 Βήμα 2 : Ηεισαγωγήτης κασέτας pcmv-egfp- S- MAR: 4kb στο pcdna3-psffv.

34 Αντίδραση λιγάσης με τυφλά άκρα τόσο στο ένθετο DNA όσο και στο πλασμιδιακό τμήμα. NsiI NsiI pcmv pepi-egfp 6767 bp egfp S/M AR DraIII

35 Zif-VP64-EP2 psffv pcdna3-psffv 5927bp NsiI DraIII

36 1. Παραγωγή του πλασμιδιακού τμήματος * και του ένθετου DNA ** pcdna 3- SFFVxNsiI xdraiii pepiegfpxnsii xdraiii λ*hindiii 5600bp* 4000bp** 300bp 2700bp 2. Αντίδραση λιγάσης με το πλασμίδιακό τμήμα και το ένθετo DNA και 3. Μετασχηματισμός επιδεκτικών βακτηριακών κυττάρων με τo νέο construct

37 Vector pc3*xhoi: 1 ζώνη 5923bp Vector pc3*mlui: 1 ζώνη 5923bp αποικία*mlui *XhoI: 3 ζώνες Αποικία*XhoI: 1 ζώνη 9486 bp Αποικία*MluI: 2 ζώνες 5.5 kb, 4 kb 5kb, 4 kb, 457bp λ*hindiii *EcoRI λ*hind III Άκοπος vector: pc3-sf Άκοπη αποικία vector *XhoI αποικία *XhoI vector* MluI αποικία* MluI αποικία* ΧhoI-MluI 9 λ*hindiii *EcoRI 10 λ*hindiii bp 9486 bp 5923 bp 5500 bp 5000bp 4000 bp 4000bp 564bp 457bp

38 Zif-VP64-EP2 Zif Zif psffv VP64 VP64 pcmv Zif-VP64-EP bp egfp S-MAR

39 Βήμα 3 : Πιστοποίηση της λειτουργικότητας του νέου επισωματικού φορέα Zif- VP64-EP2 με μεταφορά του στην ευκαρυωτική κυτταρική σειρά Κ562.

40 Διαμόλυνση Κ562 κυττάρων με το Zif-VP64-EP2 Εικόνα φωτονικού μικροσκοπίου: Κ562 + Zif-VP64-EP2 Εικόνα φωτονικού μικροσκοπίου: untransfected Κ562 κύτταρα

41 Εικόνα μικροσκοπίου φθορισμού: Κ562 + Zif-VP64-EP2 Εικόνα φωτονικού μικροσκοπίου: untransfected Κ562 κύτταρα

42 Συζήτηση- Συμπεράσματα Τα Κ562 κύτταρα διαμολυσμένα με το όχημα Zif-VP64- ΕΡ2 εμφανίζουν εξαιρετικά έντονο φθορισμό. Το S/MAR είναι σε θέση να διαμεσολαβήσει την εγκατάσταση του επισώματος στον πυρήνα του ξενιστικού κυττάρου. Η μακράς διάρκειας διαμολυσμένη καλλιέργεια (3 μήνες) καταδεικνύει ότι το όχημα είναι λειτουργικό και διατηρείται ως επισωματικό σε Κ562 κύτταρα διαμολυσμένα κύτταρα με το Zif-VP64- ΕΡ2.

43