ΔΙΕΡΕΤΝΗΗ ΣΩΝ ΒΙΟΔΡΑΣΙΚΩΝ ΕΝΩΕΩΝ ΣΗ ΜΑΤΡΗ ΣΑΥΙΔΑ ΜΕΗΝΙΑ ύγκριςη με τη ουλτανίνα Κρήτησ και τη ςταφίδα Καλιφόρνιασ

Transcript

1 ΔΙΕΡΕΤΝΗΗ ΣΩΝ ΒΙΟΔΡΑΣΙΚΩΝ ΕΝΩΕΩΝ ΣΗ ΜΑΤΡΗ ΣΑΥΙΔΑ ΜΕΗΝΙΑ ύγκριςη με τη ουλτανίνα Κρήτησ και τη ςταφίδα Καλιφόρνιασ Απρίλιοσ 215

2 Προγραμματιςμένεσ δράςεισ Βιβλιογραφική αναςκόπηςη του θέματοσ Εκχύλιςη, ανάλυςη και χαρακτηριςμόσ των λιπόφιλων και πτητικών ςυςτατικών Εκχύλιςη, ανάλυςη και χαρακτηριςμόσ των πιο πολικών δευτερογενών μεταβολιτών Απομόνωςη και διευκρίνιςη τησ δομήσ κύριων ςυςτατικών Καταμέτρηςη ςυνολικού φορτίου πολυφαινολών και αντιοξειδωτικήσ δράςησ Ανάλυςη δευτερογενών μεταβολιτών δύο ανταγωνιςτικών ειδών Αξιολόγηςη των αποτελεςμάτων

3 Βιβλιογραφική αναςκόπηςη για τισ ςταφίδεσ, τη ςύςταςή τουσ και τουσ τρόπουσ εκχύλιςησ και ανάλυςησ των ςυςτατικών τους Andrew P. Breksa III, Gary R. Takeoka, Marlene B. Hidalgo, Ana Vilches, Justine Vasse, David W. Ramming. Antioxidant activity and phenolic content of 16 raisin grape (Vitis vinifera L.) cultivars and selections. Food Chemistry 121 (21) Bin Zhao, Clifford A. Hall III. Composition and antioxidant activity of raisin extracts obtained from various solvents. Food Chemistry 18 (28) Antonia Chiou, Vaios T. Karathanos, Anastasia Mylona, Fotini N. Salta, Fani Preventi, Nikolaos K. Andrikopoulos. Currants (Vitis vinifera L.) content of simple phenolics and antioxidant activity. Food Chemistry 12 (27) Jiangfei Meng, Yulin Fang, Ang Zhang, Shuxia Chen, Tengfei Xu, Zhangcheng Ren, Guomin Han, Jinchuan Liu, Hua Li, Zhenwen Zhang, Hua Wang. Phenolic content and antioxidant capacity of Chinese raisins produced in Xinjiang Province. Food Research International 44 (211) Ana Marquez, Montserrat Dueñas, María P. Serratosa, and Julieta Merida. Identification by HPLC-MS of Anthocyanin Derivatives in Raisins. Journal of Chemistry Volume 213, Article ID , 7 pages Antonia Chiou, Eirini A. Panagopoulou, Fotini Gatzali, Stephania De Marchi, Vaios T. Karathanos. Anthocyanins content and antioxidant capacity of Corinthian currants (Vitis vinifera L., var. Apyrena). Food Chemistry 146 (214)

4 Βιβλιογραφική αναςκόπηςη για τισ ςταφίδεσ, τη ςύςταςή τουσ και τουσ τρόπουσ εκχύλιςησ και ανάλυςησ των ςυςτατικών τους F.B. El-kassas, A.M. Ali, S.E. Mostafa. Phenolic compounds as antioxidants of some products manufactured from two cultivated Egyptian varieties of seedless grapes. Annals of Agricultural Science (214) 59(2), Phenolic profile of Sercial and Tinta Negra Vitis vinifera L. grape skins by HPLC DAD ESI-MSn. Novel phenolic compounds in Vitis vinifera L. grape. Food Chemistry 135 (212) Gary Williamson, Arianna Carughib. Polyphenol content and health benefits of raisins. Nutrition Research 3 (21) Dong Wang, Jian Cai, Bao-Qing Zhu, Guang-Feng Wu, Chang-Qing Duan, Guang Chen, Ying Shi. Study of free and glycosidically bound volatile compounds in air-dried raisins from three seedless grape varieties using HS-SPME with GC-MS. Food Chemistry 177 (215) Hasim Kelebek, Michael Jourdes, Serkan Selli and Pierre-Louis Teissedre. Comparative evaluation of the phenolic content and antioxidant capacity of sun-dried raisins. J Sci Food Agric 213; 93: Feng Zhang, Eisuke Daimaru, Masao hnishi, Mikio Kinoshita and Yoshihiko Tokuji. leanolic Acid and Ursolic Acid in Commercial Dried Fruits. Food Sci. Technol. Res., 19 (1), , 213

5 Βιβλιογραφική αναςκόπηςη για τισ ςταφίδεσ, τη ςύςταςή τουσ και τουσ τρόπουσ εκχύλιςησ και ανάλυςησ των ςυςτατικών τους Κατηγορίεσ δευτερογενών μεταβολιτών Φλαβονοειδό (φλαβονόλεσ, φλαβανόλεσ, φλαβανόνεσ) Ανθοκυανύνεσ Στιλβϋνια Υδροξυκιναμμωμικϊ οξϋα Υδροξυβενζοώκϊ οξϋα Τριτερπενικϊ οξϋα

6 Βιβλιογραφική αναςκόπηςη για τισ ςταφίδεσ, τη ςύςταςή τουσ και τουσ τρόπουσ εκχύλιςησ και ανάλυςησ των ςυςτατικών τους Βιολογικέσ δράςεισ Ιςχυρό αντιοξειδωτικό δρϊςη Καρδιοπροςτατευτικό Αντικαρκινικό Αντιφλεγμονώδησ Αντιμικροβιακό Αντιιικό Αντιαλλεργικό

7 Ανάπτυξη πρωτόκολλων εκχύλιςησ για την παραλαβή των πτητικών & μη πτητικών ςυςτατικών Α. Πτητικά ςυςτατικά Υδραπόςταξη ςε μικροκφματα δείγματοσ τησ κορινθιακήσ ςταφίδασ Μεςςηνίασ (τελικό προϊόν) και ςυλλογή του αρωματικοφ φδατοσ (Hydrosol). Εκχφλιςη του αρωματικοφ φδατοσ με CH 2 Cl 2 GC-MS Eκχφλιςη δείγματοσ τησ ςταφίδασ με n-pentane GC-MS λιπαρά οξζα. Β. Λιπόφιλα ςυςτατικά Εκχφλιςη (x2) με διχλωρομεθάνιο Γ. Υαινολικά ςυςτατικά και ςάκχαρα Διαδοχικό εκχύλιςη (x2) με διχλωρομεθϊνιο (CH 2 Cl 2 ) & αιθανόλη (Et) Καθαριςμόσ ςε ςφςτημα SPE C-18 για απομάκρυνςη των ςακχάρων και παραλαβή των φαινολών Πραγματοποιήθηκαν εκχυλίςεισ ςε κομμζνεσ και άκοπεσ ςταφίδεσ, οι οποίεσ δεν ζδειξαν ιδιαίτερη διαφορά ςτην ποςότητα του εκχυλίςματοσ. Όλεσ οι εκχυλίςεισ (με CH 2 Cl 2 και Et) πραγματοποιήθηκαν 3 φορζσ για το κάθε δείγμα ςταφίδασ (αξιολόγηςη τησ ακρίβειασ των αποτελεςμάτων).

8 Ανάλυςη των πτητικών ςυςτατικών GC-MS Αρωματικό φδωρ (Hydrosol): Furfural (3,67min), 2E-Heptanal (6,34min), Hexanoic acid (6.9min), Benzene acetaldehyde (9.24), ctanoid acid (14.66min), Nonanoic acid (19.2min), γ-nonalactone (22.78min) Πτητικό κλάςμα (Volatile fraction): Ethyl hexadecanoate, 8-ctadecenoic acid, Methyl linoleate, 9-ctadecenoic acid (Z)-ethyl ester, Ethyl octadecanoate, Dotriacontane, Pentacosane, Eicosane, 1-Eicosanol, Hexadecanal, 1-Hexacosanal A b u n d a n c e 2 2 T I C : T S 3. D T im e - - >

9 Εκχυλίςεισ δειγμάτων * με CH 2 Cl 2 Ποςότητα (mg) Κορινθιακή ουλτανίνα Καλιφόρνια εκχυλίςματοσ 19 /22 /2 23 /22 /24 - Α Τλη /5 /48 36 /37 /38 53 /54/ 55 Σελικό * Για όλεσ τισ εκχυλύςεισ χρηςιμοποιόθηκαν 1g δεύγματοσ. Καλό επαναληψιμότητα τησ εκχυλιςτικόσ διαδικαςύασ Η απόδοςη του ϊπολου κλϊςματοσ εύναι μεγαλύτερη ςτο τελικό προώόν ςε ςύγκριςη με την πρώτη ύλη Μεγαλύτερη απόδοςη ςτο δεύγμα του τελικού Καλιφόρνιασ (.54 %) και μικρότερη ςε αυτό τησ α -ύλησ Σουλτανύνασ (.2 %)

10 Ποιοτικόσ έλεγχοσ (TLC) Α Β Φρωματογραφήματα λεπτήσ ςτιβάδασ: (Α) εμφϊνιςη με αντιδραςτόριο θειώκόσ βαννιλύνησ και παρατόρηςη ςτο ορατό (Β) παρατόρηςη ςτα 254 nm Παρουςύα τερπενοειδών Παρόμοια ποιοτικό ςύςταςη Μικρότερη περιεκτικότητα μη πτητικών ςυςτατικών ςτο δεύγμα Καλιφόρνιασ

11 Απομόνωςη και ταυτοποίηςη τερπενοειδών Τγρή χρωματογραφία ςτήλησ (Στατική φάση: Γϋλη πυριτύου κανονικόσ φϊςεωσ, Κινητή φάση: Μύγμα διαλυτών CH 2 Cl 2 :Me αυξανόμενησ πολικότητασ) Φρωματογραφήματα λεπτήσ ςτιβάδασ: (Α) εμφϊνιςη με αντιδραςτόριο θειώκόσ βαννιλύνησ και παρατόρηςη ςτο ορατό (Β) παρατόρηςη ςτα 254 nm

12 Ι. Κλάςμα 92-95: Σριτερπενικόσ εςτέρασ

13 ΙΙ. Κλάςμα 1-15: Ολεανολικό οξύ (~ 2% του ϊπολου κλϊςματοσ) H H H H

14 Εκχυλίςεισ δειγμάτων * με Et Ποςότητα (g) εκχυλίςματοσ Κορινθιακή ουλτανίνα Καλιφόρνια Α Τλη 15.5 /15 / /6 / Σελικό 2 /2.5 / /6.4 / /12/ * Για όλεσ τισ εκχυλύςεισ χρηςιμοποιόθηκαν 1g δεύγματοσ. Η απόδοςη ςτα δεύγματα τησ Κορινθιακής όταν μεγαλύτερη από την απόδοςη ςτα δεύγματα τησ Καλιφόρνιας και τησ Σουλτανίνας Στην Κορινθιακό η απόδοςη όταν ςχεδόν ύδια ςτο δεύγμα τησ πρώτησ ύλησ και το δεύγμα του τελικού προώόντοσ Μεγϊλη περιεκτικότητα ςε ςϊκχαρα

15 Ανάκτηςη φαινολών από το Et εκχύλιςμα με SPE Ποςότητα (mg) Α Τλη Σελικό Κορινθιακή ουλτανίνα Καλιφόρνια * Για όλεσ τισ ανακτόςεισ χρηςιμοποιόθηκαν 5 mg αρχικό εκχύλιςμα Η Κορινθιακή δίνει το μεγαλύτερο ποςοςτό (2.4 %) φαινολικού κλάςματοσ ςε ςύγκριςη με τη ουλτανίνα (.4-.8 %) και τη Καλιφόρνια (.6 %) Σο φαινολικό φορτίο (Μέθοδοσ Folin ciocalteau) ήταν παρόμοιο ( % mg GAE/g εκχυλίςματοσ)

16 Comparative chromatograms for the three species RT: 1,27-21, SM: 7B 14, 8,99 11,99 8,68 6,19 1,94 1,52 2,71 5,69 6,61 15,54 16,24 18,42 12,5 19, Time (min) 2,92 13,44 2,92 14,1 3,85 7,52 11,68 19,62 1,48 4,12 6,2 16,3 17,17 19,21 14, 12,1 2,94 8,68 9,82 3,87 7,5 1,37 5,49 16,29 16,54 19,17 19,63 NL: 1,21E6 Base Peak F: FTMS - c ESI Full ms [1,-1,] MS Callifornia_open NL: 1,65E6 Base Peak F: FTMS - c ESI Full ms [1,-1,] MS stafida_meoh_c18_ open NL: 2,34E6 Base Peak F: FTMS - c ESI Full ms [1,-1,] MS sultanina_teliko_ope n California Corinthian Sultanina

17 Intensity RT: 1,27-21, SM: 7B 14, 8,99 11,99 8,68 6,19 1,94 1,52 2,71 5,69 6,61 15,54 16,24 18,42 12,5 19, Time (min) 2,92 13,44 2,92 14,1 3,85 7,52 11,68 19,62 1,48 4,12 6,2 16,3 17,17 19,21 14, 12,1 2,94 8,68 9,82 3,87 7,5 1,37 5,49 16,29 * 16,54 Flavonols region 19,17 19,63 NL: 1,21E6 Base Peak F: FTMS - c ESI Full ms [1,-1,] MS Callifornia_open NL: 1,65E6 Base Peak F: FTMS - c ESI Full ms [1,-1,] MS stafida_meoh_c18_ open NL: 2,34E6 Base Peak F: FTMS - c ESI Full ms [1,-1,] MS sultanina_teliko_ope n California Corinthian Sultanina * Rt 14.min: azelaic acid Sultanina has intense flavonol peaks Corinthian has the most intense flavonol peaks: bigger range of flavonol structures and higher relative quantity (in comparison to the other groups) California contains the least flavonol structures.

18 Intensity RT: 7,74-17,49 SM: 7B ,68 8,99 11,99 13,1 14, 14, Time (min) 16,24 12,5 13,44 8,7 14,1 9,8 11,68 17,17 8,68 9,82 11,64 8,55 9,52 8,9 11,36 12,1 11,62 11,84 12,99 14, 14,4 16,29 16,15 16,54 16,99 9,42 1,28 12,3 13,31 16,18 17,9 7,99 8,72 1,43 11,71 13,43 15,41 16,97 California Corinthian Sultanina H Quercetin rutinoside (Rutin) Quercetin glucoside H Kaempferol glucoside Comparison with authentic standards from our Chemical library H Rutinose Glucose Glucose

19 Relative Abundance Intensity Insight in the Flavonols region RT:9,94-17,85 SM: 7B ,5 13,44 14,1 12,74 1,89 11,68 15,18 15,95 16,3 17,17 11,64 1,98 12,1 12,71 14, 15,33 16,29 16, Time (min) Corinthian Sultanina 17,81 Rt 12.5min Isorhamnetin hexoside Rt 12.5min Quercetin H H CH 3 Hexose Rt 12.5min H Glucose Quercetin 3--glucoside Rt 13.11min H Glucose Kaempferol 3--glucoside Rt 14. min H Azelaic acid Compound produced during stress -Antimicrobial - Anti-inflamatory - Tyrosinase inhibitor

20 Relative Abundance Intensity Insight in the Flavonols region RT:9,94-17,85 SM: 7B ,5 13,44 14,1 12,74 1,89 11,68 15,18 15,95 16,3 17,17 12,1 14, Corinthian Sultanina Rt 12.88min Dimmer of Vanillic acid H CH , ,64 1,98 12,71 15,33 16, Time (min) 17,81 Rt 11.68min Rt 12.71min Rt min H H H Rutinose Quercetin 3--rutinoside Rutinose Kaempferol -rutinoside Hexose Kaempferol hexoside

21 Fatty acids region RT: 1,27-21, SM: 7B 14, 8,99 11,99 8,68 6,19 1,94 1,52 2,71 5,69 6,61 15,54 16,24 18,42 12,5 19, Time (min) 2,92 13,44 2,92 14,1 3,85 7,52 11,68 19,62 1,48 4,12 6,2 16,3 17,17 19,21 14, 12,1 2,94 8,68 9,82 3,87 7,5 1,37 5,49 16,29 16,54 19,17 19,63 NL: 1,21E6 Base Peak F: FTMS - c ESI Full ms [1,-1,] MS Callifornia_open NL: 1,65E6 Base Peak F: FTMS - c ESI Full ms [1,-1,] MS stafida_meoh_c18_ open NL: 2,34E6 Base Peak F: FTMS - c ESI Full ms [1,-1,] MS sultanina_teliko_ope n California Corinthian Sultanina C-18 unsaturated fatty acids

22 Intensity Benzoic acids region RT: 1,1-11,63 SM: 7B 8,99 4 8,68 8,51 9,84 1,94 6,19 2 1,52 2,2 3,8 5,36 5,69 6,61 8,1 9,97 NL: 5,87E5 Base Peak F: FTMS - c ESI Full ms [1,-1,] MS callifornia_open California ,27 7,52 3,85 8,7 1,48 8,1 9,8 3,61 4,12 1,89 6,2 6,59 NL: 9,34E5 Base Peak F: FTMS - c ESI Full ms [1,-1,] MS stafida_meoh_c18_o pen Corinthian ,87 1,37 2,5 3,28 4,86 5,49 6,38 8,68 7,5 8,1 9,82 11,33 NL: 8,49E5 Base Peak F: FTMS - c ESI Full ms [1,-1,] MS Sultanina_Teliko_ope n Sultanina Small bicarboxylic acids Time (min) Small phenolic acids are absent from California raisin/ only p-hydroxybenzoic acid present. Also they are absent from the initial material of Soultanina currents. It can be found in initial material of Korinthiaki in small amounts. They are major constituents of Korinthiaki final product and

23 Relative Abundance Relative Abundance Relative Abundance The Benzoic acids region / small bicarboxylic acids RT:1,17-6,77SM:7B 6, ,52 2,22,36 3,83,16 3,52 4,894,965,485,69 6, ,27 1 1, ,85 1,48 3,61 4,12 1,89 2,62,85 5,45,24 5,976,26,59 3,87 5,49 1,371,8 2,52,783,1 4,644,86 5,72 6, Time (min) California Corinthian Sultanina Rt 1.27 & 1.48 min Succinic acid, Malic acid H H nly present in Corinthian Rt 3.61min Rt 3.85min Rt 4.12 min CH 3 Rt 6.19min H Protocatechuic acid H Hexose Protocatechuic acid hexoside H Hexose H p-hydroxybenzoic Vanillic acid hexosideacid

24 Hydroxycinnamic acids/ Catechins/???Unidetified category RT: 1,27-21, SM: 7B 14, 8,99 11,99 8,68 6,19 1,94 1,52 2,71 5,69 6,61 15,54 16,24 18,42 12,5 19, Time (min) 2,92 13,44 2,92 14,1 3,85 7,52 11,68 19,62 1,48 4,12 6,2 16,3 17,17 19,21 14, 12,1 2,94 8,68 9,82 3,87 7,5 1,37 5,49 16,29 16,54 19,17 19,63 NL: 1,21E6 Base Peak F: FTMS - c ESI Full ms [1,-1,] MS Callifornia_open NL: 1,65E6 Base Peak F: FTMS - c ESI Full ms [1,-1,] MS stafida_meoh_c18_ open NL: 2,34E6 Base Peak F: FTMS - c ESI Full ms [1,-1,] MS sultanina_teliko_ope n California Corinthian Sultanina

25 Relative Abundance Relative Abundance Relative Abundance Hydroxycinnamic acids/ Catechins RT:6,54-11,72SM:7B ,99 8,68 8,51 9,84 1,94 6,61 7,7 7,8 8,1 9,97 1,6 11,71 7,52 8,7 8,1 9,8 1,89 11,68 6,59 7,18 1, 11,4 6,74 6,98 7,5 9,82 8,68 11,64 11,33 8,1 8,43 1,441, Time (min) California Corinthian Sultanina Some peaks of this region remain unidentified (Rts 8.7, 8.99 & 9.26 min) Rt 7.52min H Rt 8.1min Rt 9.3 min CH 3 Rt 1.94min Hexose Catechin H p-coumaric acid hexoside H Ferulic acid H p-coumaric acid

26 Intensity Ειδικέσ εκχυλίςεισ για ανάκτηςη χρωςτικών (ανθοκυανίνεσ) ύγκριςη με πρότυπεσ ουςίεσ in process. Eκχύλιςη με όξινη Me (HCl.1% v/v) Καθαριςμόσ ςε SPE DSC-18 με χρόςη H 2 και Μe (HCl,3% v/v). Απόδοςη.56% (2.8mg κλϊςματοσ χρωςτικών από 5mg ποςότητασ εκχυλύςματοσ) HPLC-HRMS/MS, positive mode- Comparison with standard compounds RT: 8,64-16,98 SM: 7B ,11 1,51 11,5 13,15 11,72 12,61 12,55 13,23 13,36 15,72 16,29 14,94 9,84 11,24 11,4 13,28 13,5 15,29 16,47 13,2 H H glucose Delphinidin 3--glucoside ,15 9,9 1,94 11,96 12,66 13,74 15,27 13,31 15,91 16,47 glucose Cyanidin 3--glucoside H CH 3 1,46 11,59 12,47 13,74 14,59 15,48 16, Time (min) glucose Petulidin 3--glucoside

27 υμπεράςματα Σο φυτοχημικό προφίλ τησ μαύρησ ςταφίδασ Μεςςηνίασ είναι πλουςιότερο ςε ςύγκριςη με τα ανταγωνιςτικά προΰόντα Σα κύρια ςυαςτατικά του άπολου κλάςματοσ των μεταβολιτών είναι τριτερπενικά παράγωγα Σο φαινολικό φορτίο τησ μαύρησ ςταφίδασ Μεςςηνίασ είναι 3-4 φορέσ μεγαλύτερο ςε ςύγκριςη με τα ανταγωνιςτικά προΰόντα Σα κύρια ςυςτατικά του φαινολικού κλάςματοσ είναι φλαβονοειδικοί γλυκοςίδεσ καιμπφερόλησ & κερκετίνησ, φαινολικά οξέα και γλυκοςίδεσ τουσ & ανθοκυανίνεσ Προοπτικέσ Βελτιςτοποίηςη πρωτόκολλου παραλαβήσ ανθοκυανινών υγκριτική μελέτη των δειγμάτων ωσ προσ τισ περιεχόμενεσ χρωςτικέσ Ποςοτικοποίηςη των κύριων τερπενοειδών ςτα δείγματα? Απομόνωςη και ταυτοποίηςη άλλων δευτερογενών μεταβολιτών από το άπολο (διχλωρομεθανικό ) κλάςμα?