ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΙΩΝ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ CLOSTEROVIRUS, FOVEAVIRUS ΚΑΙ VITIVIRUS ΣΕ ΦΥΤΙΚΟΥΣ ΙΣΤΟΥΣ ΑΜΠΕΛΟΥ ΧΡΥΣΟΣΤΟΜΟΣ Ι. ΔΟΒΑΣ Γεωπόνος Α.Π.Θ. Υπότροφος Ι.Κ.Υ. ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2002

2 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΤΕΧΝΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΙΩΝ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ CLOSTEROVIRUS, FOVEAVIRUS ΚΑΙ VITIVIRUS ΣΕ ΦΥΤΙΚΟΥΣ ΙΣΤΟΥΣ ΑΜΠΕΛΟΥ ΧΡΥΣΟΣΤΟΜΟΣ Ι. ΔΟΒΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2002

3 ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΙΩΝ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ CLOSTEROVIRUS, FOVEAVIRUS ΚΑΙ VITIVIRUS ΣΕ ΦΥΤΙΚΟΥΣ ΙΣΤΟΥΣ ΑΜΠΕΛΟΥ ΧΡΥΣΟΣΤΟΜΟΣ Ι. ΔΟΒΑΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Τριμελής Συμβουλευτική Επιτροπή Ν. Ι. Κατής Καθηγητής Εισηγητής Κ. Τζαβέλλα-Κλωνάρη Καθηγήτρια Μέλος Κ. Θανασουλόπουλος Καθηγητής Μέλος Επταμελής Εξεταστική Επιτροπή Ν. Ι. Κατής Καθηγητής Εισηγητής Κ. Τζαβέλλα-Κλωνάρη Καθηγήτρια Μέλος Π. Κυριακοπούλου Καθηγήτρια Μέλος Γ. Διαμαντίδης Καθηγητής Μέλος Ε. Χατζηλουκάς Αν. Καθηγητής Μέλος Ν. Νικολάου Αν. Καθηγητής Μέλος Ε. Τσαγρή Επικ. Καθηγήτρια Μέλος ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ, ΝΟΕΜΒΡΙΟΣ 2002

4 (Πλάτων, Μενέξενος 246 Ε) Εικόνες εξώφυλλων Εμπρός: Μικρογραφία χειρογράφου. Παρίσι, Εθνική Βιβλιοθήκη, κωδ. gr74, Τετραευάγγελο, 11 ος αιώνας, φ. 39β. Η παραβολή της αμπέλου (λεπτομέρεια) Πίσω: Ψηφιδωτό στη Βασιλική Δουμετίου, Νικόπολη

5 Πρόλογος Ευχαριστίες Η παρούσα μελέτη εκπονήθηκε κατά τα έτη στο Εργαστήριο Φυτοπαθολογίας του Τμήματος Γεωπονίας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης (Α.Π.Θ.). Μέρος των πειραμάτων πραγματοποιήθηκαν στο εργαστήριο ιολογικών ελέγχων της εταιρίας ΒΙΤΡΟ ΕΛΛΑΣ Α.Ε. Ολοκληρώνοντας την προσπάθεια αυτή θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά όλους όσους συνέβαλαν στην πραγματοποίησή της. Θερμές ευχαριστίες οφείλω στον επιβλέποντα καθηγητή κ. Νικόλαο Ι. Κατή για την αμέριστη συμπαράσταση, τις οδηγίες και συμβουλές, την αγαστή συνεργασία, την οικειότητα, τη διαρκή υπομονή και κατανόησή του όλα αυτά τα χρόνια της σπουδής μου, καθώς και για τη μύησή μου στην επιστήμη της ιολογίας. Επίσης, στην καθηγήτρια κα. Κατίνα Τζαβέλα-Κλωνάρη και τον ομότιμο καθηγητή κ. Κωνσταντίνο Θανασουλόπουλο μέλη της τριμελούς επιτροπής, για τη συνεχή υποστήριξη, τη βοήθεια και τη συμβολή τους στη μελέτη αυτή, αλλά και καθ' όλη τη διάρκεια των μεταπτυχιακών μου σπουδών. Θερμές ευχαριστίες οφείλω να εκφράσω επίσης και στον Αναπληρωτή καθηγητή του πανεπιστημίου Ιωαννίνων κ. Ευστάθιο Χατζηλουκά για την πολύτιμη συμπαράσταση και βοήθειά του, τη μύηση μου στην επιστήμη της μοριακής βιολογίας και στη συγγραφή των επιστημονικών άρθρων, καθώς και τη συμβολή του κατά τη συγγραφή της. Την καθηγήτρια του Γ.Π.Α. κ. Παναγιώτα Κυριακοπούλου για τις υποδείξεις και τη συνεχή συμπαράσταση της, καθώς και τα υπόλοιπα μέλη της εξεταστικής επιτροπής, τους καθηγητές κ. Γρηγόριο Διαμαντίδη, Νικόλαο Νικολάου και Ευθυμία Τσαγρή για την κριτική ανάγνωση της διατριβής και τις ουσιαστικές υποδείξεις τους. Τον καθηγητή Ιολογίας στο πανεπιστήμιο του Μπάρι της Ιταλίας κ. Χρυσόστομο Βόβλα για την πολύτιμη φιλοξενία και υποστήριξή του κατά τη διάρκεια της επίσκεψης μου στο ''Dipartimento di Protezione delle Piante, Universita degli Studi'', το ''Centro di Studio del CNR sui Virus e le Virosi de le Colture Mediterranee'' και το μεσογειακό αγρονομικό ινστιτούτο ''International Center for Advanced Mediterranean Agronomic Studies'' του Μπάρι. Τον Ερευνητή Δρ Απόστολο Αυγελή (Εργαστήριο Φυτικής Ιολογίας, Ινστιτούτο Προστασίας Φυτών Ηρακλείου) για την ευγενική προσφορά απομονώσεων του GLRaV- 7 από τη συλλογή του και τις πληροφορίες σχετικά με τη διάγνωση των ιών της αμπέλου. Τον κ. Αθανάσιο Ταμπαρόπουλο, Διευθύνοντα Σύμβουλο της εταιρίας ΒΙΤΡΟ ΕΛΛΑΣ Α.Ε. για την ουσιαστική συμβολή του, την εμπιστοσύνη, συνεργασία και οικονομική στήριξη καθ' όλη τη διάρκεια της εργασίας αυτής. Την υπεύθυνο του τμήματος αμπελουργίας της εταιρίας και υποψήφια διδάκτορα του Γ.Π.Α. Χαρούλα Σπινθηροπούλου για τη συνεχή βοήθεια, την άριστη συνεργασία και τις πολύτιμες υποδείξεις κατά τη συγγραφή. Η συμβολή της ήταν καθοριστική, καθώς στη μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκαν, βιότυποι της αμπέλου που συνέλεξε η ίδια. Τον γεωπόνο Νίκο Λεβεντάκη, υπεύθυνο Τμήματος Έρευνας και Ανάπτυξης της εταιρίας, για την πολύτιμη συνεργασία και βοήθειά του σε όλες τις οργανωτικές και ερευνητικές ευθύνες όλα αυτά τα χρόνια. Τη γεωπόνο και υποψήφια διδάκτορα Α.Π.Θ. Κατερίνα Γρηγοριάδου, προϊσταμένη της in vitro παραγωγής της εταιρίας, για την παραχώρηση των μικρόφυτων αμπέλου. Τον αγαπημένο φίλο και συνεργάτη από τα φοιτητικά μας χρόνια, τεχνικό του εργαστηρίου φυτοπαθολογίας του Α.Π.Θ. Κώστα Ευθυμίου, για τη συνεχή βοήθεια, ουσιαστική συμβολή και συμπαράσταση του σε όλες τις δύσκολες στιγμές. Τον υποψήφιο διδάκτορα Ηρακλή Μπουμπουράκα και την μεταπτυχιακή φοιτήτρια Βαρβάρα Μαλιόγκα για τη διαρκή συνεργασία, βοήθεια και συμμετοχή τους. 1

6 Στο δάσκαλο μου της βυζαντινής μουσικής, μουσικοδιδάσκαλο και πρωτοψάλτη του Ι.Ν. Παναγίας Δεξιάς Θεσσαλονίκης, Νέστορα Παπαλεξίου, οφείλω τη γνώση της σημασίας που έχουν ο σεβασμός, η επιμονή, η λεπτομέρεια, η προσοχή, η σταθερότητα, η κίνηση και το πάθος, σε κάθε σημαντική δημιουργία της ζωής μας. Τα λόγια δύσκολα μπορούν να εκφράσουν τη συμβολή των ανθρώπων που είναι κοντά μας διαρκώς με σώμα και ψυχή. Ως ελάχιστο δείγμα ευχαριστίας για τις θυσίες τους, το παρόν σύγγραμμα, αφιερώνεται στους γονείς μου Γιάννη και Παρασκευή, την αδελφή μου Μάγδα και τη σύντροφο μου Μαρία Πασχαλίδου. 2

7 Τμήμα της έρευνας αυτής χρηματοδοτήθηκε από το ερευνητικό πρόγραμμα με τίτλο: Δημιουργία βασικού υλικού των ποικιλιών αμπέλου (Vitis vinifera) που πιθανώς συμμετείχαν στην παραγωγή του οίνου Μαλβαζία (ΠΑΒΕ 1999 No. 434). Πηγή Χρηματοδότησης: Γ.Γ.Ε.Τ. Μέρος των εξόδων καλύφθηκε από υποτροφία του Ιδρύματος Κρατικών Υποτροφιών (ΙΚΥ) καθώς και από την εταιρία ΒΙΤΡΟ ΕΛΛΑΣ Α.Ε. Οι βιότυποι αμπέλου που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ευγενική προσφορά της εταιρίας και ήταν παραδοτέο ερευνητικού προγράμματος με τίτλο Καταγραφή, μελέτη και διάσωση αυτόχθονων ποικιλιών αμπέλου της Μακεδονίας, της Θράκης και της Ηπείρου (LEADER II) το οποίο έγινε σε συνεργασία με το εργαστήριο αμπελολογίας του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών. 3

8 Περιεχόμενα ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα Πρόλογος-Ευχαριστίες... Περιεχόμενα. Συντομογραφίες ιών... Περίληψη. Κατάλογος εικόνων και πινάκων.. ΚΕΦ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση.. 1. Ιολογικές ασθένειες της αμπέλου 1.1 Ιοί της οικογένειας Closteroviridae 1.2 Ασθένεια της συστροφής των φύλλων της αμπέλου και ιοί του γένους Closterovirus που σχετίζονται με αυτήν Συμπτώματα, οικονομική σημασία Αιτιολογία Μετάδοση Διάγνωση Αντιμετώπιση της ασθένειας 1.3 Ιοί του γένους Vitivirus 1.4 Ιοί του γένους Foveavirus 1.5 Ασθένεια της βοθρίωσης του ξύλου της Αμπέλου και ιοί των γενών Foveavirus και Vitivirus, που σχετίζονται με αυτή Συμπτώματα Αιτιολογία Μετάδοση Διάγνωση Αντιμετώπιση της ασθένειας 1.6 Παραγωγή πιστοποιημένου πολλαπλασιαστικού υλικού αμπέλου 1.7 Σκοπός της εργασίας ΚΕΦ. 2. Ιολογικός έλεγχος βιότυπων αμπέλου προερχόμενων από α) διαδικασία κλωνικής επιλογής και β) συλλογή αυτόχθονων ποικιλιών 2.1 Περίληψη 2.2 Εισαγωγή 2.3 Υλικά και μέθοδοι Aντιδραστήρια Φυτικό υλικό Δοκιμές ELISA Αντίστροφη μεταγραφή-αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης Μηχανικές μολύνσεις των GVA και GVB 2.4 Αποτελέσματα 2.5 Συζήτηση ΚΕΦ. 3 Ανάπτυξη εστιασμένης RT-PCR με εκφυλισμένους εκκινητές για την ταυτόχρονη ανίχνευση ιών που ανήκουν στα γένη Foveavirus και Vitivirus Περίληψη 3.2 Εισαγωγή

9 Περιεχόμενα Σελίδα 3.3 Υλικά και μέθοδοι Aντιδραστήρια Διαλύματα Φυτικό υλικό Προετοιμασία των δειγμάτων για τις δοκιμές RT-PCR Εξειδικευμένη ανίχνευση με RT-PCR, των GVA, GVB, και GVD Σχεδιασμός εκφυλισμένων εκκινητών για την ταυτόχρονη ανίχνευση ιών που ανήκουν στα γένη Closterovirus και Crinivirus Ανάπτυξη μεθόδου εστιασμένης RT-PCR Μοριακή κλωνοποίηση και προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας των προϊόντων της PCR 3.4 Αποτελέσματα 3.5 Συζήτηση ΚΕΦ. 4 Ανάπτυξη εστιασμένης RT-PCR για την ταυτόχρονη ανίχνευση ιών που ανήκουν στα γένη Closterovirus, Foveavirus και Vitivirus με τη χρησιμοποίηση εκκινητών με εκφυλισμό οι οποίοι περιέχουν di, μαζί με ομόλογους εκκινητές που περιέχουν dg στη θέση της di Περίληψη 4.2 Εισαγωγή 4.3 Υλικά και μέθοδοι Χημικά, αντιδραστήρια, ένζυμα Φυτικό υλικό Προετοιμασία των δειγμάτων για την RT-PCR Σχεδιασμός εκφυλισμένων εκκινητών Ανάπτυξη εστιασμένης RT-PCR Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας 4.4 Αποτελέσματα 4.5 Συζήτηση ΚΕΦ. 5 Μερικός χαρακτηρισμός ενός νέου ιού του γένους Closterovirus στο αμπέλι Περίληψη 5.2 Εισαγωγή 5.3 Υλικά και μέθοδοι Φυτικό υλικό Ιολογικός έλεγχος Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας ενός νέου clostero-ιού και φυλογενετική ανάλυση Εξειδικευμένη ανίχνευση του νέου clostero-ιού με εστιασμένη RT-PCR Μηχανικές μολύνσεις 5.4 Αποτελέσματα και συζήτηση ΚΕΦ. 6 Ανίχνευση ιών που σχετίζονται με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου και τη βοθρίωση του ξύλου της αμπέλου, σε πρέμνα κατά τη διάρκεια του έτους. 6.1 Περίληψη 6.2 Εισαγωγή

10 Περιεχόμενα Σελίδα 6.3 Υλικά και μέθοδοι Φυτικό υλικό Ιολογικοί έλεγχοι Προετοιμασία των δειγμάτων για την πολλαπλή εστιασμένη RT-PCR 6.4 Αποτελέσματα και συζήτηση ΚΕΦ. 7 Γενική συζήτηση και συμπεράσματα. Βιβλιογραφία Παράρτημα

11 Συντομογραφίες ιών ApLV λανθάνων ιός της βερικοκιάς (Apricot latent virus, Foveavirus) ASPV ιός της βοθρίωσης του κορμού της μηλιάς (Apple stem pitting virus, Foveavirus) BPYV ιός του ψευδοϊκτερου των τεύτλων (Beet pseudo-yellows virus, Crinivirus) BYSV ιός του κίτρινου νανισμού των τεύτλων (Beet yellow stunt virus, Closterovirus) BYV ιός του ίκτερου των τεύτλων (Beet yellows virus,closterovirus) CGRMV ιός της πράσινης δακτυλιοειδούς ποικιλόχρωσης της κερασιάς (Cherry green ring mottle virus, Foveavirus) CNRMV ιός της νεκρωτικής ποικιλόχρωσης της κερασιάς (Cherry necrotic rusty mottle virus, Foveavirus) CTV ιός της τριστέτσας των εσπεριδοειδών (Citrus tristeza virus, Closterovirus) CYSDV ιός του κίτρινου παραμορφωτικού νανισμού των κολοκυνθοειδών (Cucurbit yellow stunting disorder virus, Crinivirus) GLRaV-1 σχετιζόμενος με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου ιός-1 (Grapevine leafroll-associated virus-1,closterovirus) GLRaV-2 σχετιζόμενος με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου ιός-2 (Grapevine leafroll-associated virus-2,closterovirus) GLRaV-3 σχετιζόμενος με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου ιός-3 (Grapevine leafroll-associated virus-3,closterovirus) GLRaV-4 σχετιζόμενος με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου ιός-4 (Grapevine leafroll-associated virus-4,closterovirus) GLRaV-5 σχετιζόμενος με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου ιός-5 (Grapevine leafroll-associated virus-5,closterovirus) GLRaV-6 σχετιζόμενος με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου ιός-6 (Grapevine leafroll-associated virus-6,closterovirus) GLRaV-7 σχετιζόμενος με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου ιός-7 (Grapevine leafroll-associated virus-7,closterovirus) GLRaV-8 σχετιζόμενος με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου ιός-8 (Grapevine leafroll-associated virus-8,closterovirus) GVA ιός A της αμπέλου (Grapevine virus A, Vitivirus) GVB ιός Β της αμπέλου (Grapevine virus B, Vitivirus) GVC ιός C της αμπέλου (Grapevine virus C) "υποθετικό μέλος, Vitivirus " GVD ιός D της αμπέλου (Grapevine virus D,, Vitivirus) HLV λανθάνων ιός του Heracleum (Heracleum latent virus,trichovirus) LChV-1 ιός της κερασιάς-1 (Little cherry virus-1,closterovirus) LIYV ιός του μολυσματικού ίκτερου του μαρουλιού (Lettuce infectious yellows virus,closterovirus) OLYaV ιός σχετιζόμενος με τον ίκτερο των φύλλων της ελιάς (Οlive leaf yellowing associated virus, Closterovirus) PBNSPV ιός της βοθρίωσης με νέκρωση του κορμού της δαμασκηνιάς (Plum bark necrosis stem pitting virus, Closterovirus) 7

12 PVYV ιός του ίκτερου των νεύρων της αχλαδιάς (Pear vein yellows virus, Foveavirus) PYVV ιός του ίκτερου των νεύρων της πατάτας (Potato yellow vein virus, Closterovirus) RSPaV-1 σχετιζόμενος με τη βοθρίωση του κορμού του Rupestris ιός-1 (Rupestris stem pitting associated virus-1, Foveavirus) TICV ιός της μολυσματικής χλώρωσης της ντομάτας (Tomato infectious chlorosis virus, Crinivirus) ToCV ιός της χλώρωσης της ντομάτας (Tomato chlorosis virus, Crinivirus) GFLV ιός του ριπιδωτού φύλλου της αμπέλου (Grapevine fanleaf virus, Νepovirus) TBRV ιός των μαύρων δακτυλίων της τομάτας (Tomato black ring virus, Νepovirus) ArMV ιός του μωσαϊκού του Arabis (Arabis mosaic virus, Νepovirus) GFkV ιός της κηλίδωσης της αμπέλου (Grapevine fleck virus) 8

13 Περίληψη Η σπουδαιότητα της αμπελοκαλλιέργειας στην Ε.Ε. και την Ελλάδα ειδικότερα, σε συνδυασμό με τις επερχόμενες αλλαγές και αυξημένες απαιτήσεις στο χώρο της πιστοποίησης πολλαπλασιαστικού υλικού καθιστούν αναγκαία την ύπαρξη αξιόπιστων τεχνικών για την ανίχνευση αλλά και τον χαρακτηρισμό των ιών της αμπέλου. Παρά την εντυπωσιακή αύξηση των γνώσεων τα τελευταία χρόνια σε ότι αφορά την αιτιολογία της συστροφής των φύλλων και της βοθρίωσης του ξύλου της αμπέλου, ο μεγάλος αριθμός των ιών που σχετίζονται με τις ασθένειες αυτές και τα μειονεκτήματα των διάφορων δοκιμών ανίχνευσης/ταυτοποίησης, καθιστούν τον έλεγχο του πολλαπλασιαστικού υλικού μια διαδικασία σύνθετη, συχνά με μικρή αξιοπιστία, επίπονη, χρονοβόρα, και με υψηλό κόστος. Επίσης, η συνεχιζόμενη ανακάλυψη νέων clostero-και viti-ιών δείχνει ότι στην αιτιολογία των ασθενειών εμπλέκονται και άλλοι άγνωστοι ιοί που ανήκουν στα γένη αυτά και για τα οποία προς το παρόν δεν υπάρχει δυνατότητα ανίχνευσης. Αντικείμενο της διδακτορικής διατριβής ήταν η ανάπτυξη αξιόπιστων μεθόδων ανίχνευσης καθώς και ο χαρακτηρισμός νέων άγνωστων ιών που σχετίζονται με τη συστροφή των φύλλων και τη βοθρίωση του ξύλου της Αμπέλου. Αρχικά, έγινε έλεγχος πρέμνων αμπέλου προερχόμενων από κλωνική επιλογή για την παρουσία ιών που σχετίζονται με τις δύο αυτές ασθένειες, με τις διαθέσιμες ορολογικές και μοριακές και τεχνικές, με στόχο τη συλλογή απομονώσεων ιών των γενών Closterovirus, Foveavirus και Vitivirus. Στη συνέχεια, αναπτύχθηκε μια μέθοδος πολλαπλής εστιασμένης RT-PCR η οποία χρησιμοποιεί εκκινητές με εκφυλισμό, για την ταυτόχρονη ανίχνευση ιών που ανήκουν στα γένη Foveavirus και Vitivirus. Η μέθοδος αυτή συνδυάσθηκε με μια απλουστευμένη και αξιόπιστη μέθοδο επεξεργασίας των δειγμάτων (αποτύπωση εκχυλίσματος φυτικού χυμού σε νάιλον μεμβράνη) και με μια δοκιμή, ανιχνεύει ταυτόχρονα τους RSPaV-1, GVA, GVB, και GVD στο αμπέλι, ενώ θεωρητικά είναι δυνατή η ανίχνευση και άλλων μελών που ανήκουν στα γένη Foveavirus και Vitivirus και προσβάλλουν άλλους ξενιστές. Επίσης, αναπτύχθηκε μια ακόμη μέθοδος πολλαπλής εστιασμένης RT-PCR για την ταυτόχρονη ανίχνευση ιών που ανήκουν στα γένη Closterovirus, Foveavirus και Vitivirus όπου μαζί με τους εκφυλισμένους εκκινητές που περιέχουν δεοξυινοσίνη, χρησιμοποιούνται αντίστοιχοι ομόλογοι εκκινητές οι οποίοι στις ομόλογες περιοχές, περιέχουν δεοξυγουανοσίνη στη θέση της di. Οι μέθοδοι αυτοί αξιολογήθηκαν με τον έλεγχο, κατά τη διάρκεια του έτους, πρέμνων γνωστής ιολογικής κατάστασης. Τέλος, έγινε μερικός χαρακτηρισμός ενός νέου clostero-ιού που ανακαλύφθηκε κατά τη διάρκεια της παρούσας μελέτης και αναπτύχθηκε μια εστιασμένη RT-PCR μέθοδος για την εξειδικευμένη ανίχνευση του. 9

14 Εικόνες και Πίνακες ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΕΙΚΟΝΩΝ ΚΑΙ ΠΙΝΑΚΩΝ 10

15 Εικόνες και Πίνακες ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΕΙΚΟΝΩΝ ΚΑΙ ΠΙΝΑΚΩΝ Εικόνες Εικόνα 2.1 Στάδια DAS-ELISA: (Α) ειδικό ΙgG, (Β) αντιγόνο, (Γ) συζευγμένο ειδικό ΙgG και (Δ) υπόστρωμα. Εικόνα 2.2 Στάδια DAS-ELISA με πρωτεΐνη "Α": (Α) πρωτεΐνη "Α", (Β) ειδικό ΙgG, (Γ) αντιγόνο, (Δ) συζευγμένο ειδικό ΙgG και (Ε) υπόστρωμα. Εικόνα 2.3 Στάδια TAS-ELISA, (Α) ειδικό πολυκλωνικό αντίσωμα, (Β) αντιγόνο, (Γ) ειδικό μονοκλωνικό αντίσωμα, (Δ) συζευγμένο αντι-ποντίκιαντίσωμα και (Ε) υπόστρωμα. Εικόνα 2.4 Στάδια Βιοτίνης-στρεπταβιδίνης ELISA: (Α) ειδικό αντίσωμα, (Β) αντιγόνο, (Γ) ειδικό αντίσωμα συζευγμένο με βιοτίνη, (Δ) στρεπταβιδίνη συζευγμένη με αλκαλική φωσφατάση και (Ε) υπόστρωμα Εικόνα 2.5 Διαδικασία της αντίδρασης RT-PCR σε δύο μικροσωλήνες. Εικόνα 2.6 Ποσοστά (%) προσβολής ιών σε δείγματα αμπέλου προερχόμενα από α) διαδικασία κλωνικής επιλογής και β) συλλογή αυτόχθονων ποικιλιών. Εικόνα 2.7 Ανάλυση προϊόντων της RT-PCR σε πηκτή αγαρόζης. Διαδρομές 1-19: ανίχνευση του RSPaV-1 σε δείγματα αμπέλου, με την χρήση των εκκινητών 9 και 10 (πηκτή Α) και των εκκινητών 13 και 14 (πηκτή Β) (Nolasco et al. 2000). + ή δηλώνουν την παρουσία ή απουσία αντίστοιχα ενός ορατού προϊόντος ή όχι σε μια τουλάχιστον πηκτή. Εικόνα 3.1 Προετοιμασία του δείγματος για RT-PCR με αποτύπωση εκχυλίσματος φυτικού χυμού σε νάιλον μεμβράνη και θερμική επεξεργασία. Εικόνα 3.2 Ευθυγράμμιση αλληλουχιών αμινοξέων και συντηρημένες περιοχές τμήματος της RdRp των: Ιός της βοθρίωσης της μηλιάς (Apple stem pitting virus, ASPV Foveavirus,) (EMBL, αριθμοί καταχώρησης: Q64962 and Q9E948), RSPaV-1 (O91724 και O91901), Ιός της νεκρωτικής ποικιλόχρωσης της κερασιάς (Cherry necrotic rusty mottle virus, CNRMV, Foveavirus), (Q9IH80), Ιός της πράσινης δακτυλιοειδούς ποικιλόχρωσης ποικιλόχρωσης της κερασιάς (Cherry green ring mottle virus, CGRMV Foveavirus), (Q9DJV1 και O91632), GVA (Q67704), GVD (Q96806) και GVB (Q96806). Η ευθυγράμμιση έγινε με το πρόγραμμα CLUSTAL V. *(30aa= 30 αμινοξέα). Εικόνα 3.3 Ευθυγράμμιση αλληλουχιών νουκλεοτιδίων που εκφράζουν τμήμα της RdRp των RSPaV-1, ASPV CGRMV, CNRMV, GVB, GVD και GVA και επιλογή εκκινητών. Η ευθυγράμμιση έγινε με το πρόγραμμα CLUSTAL V. Εικόνα 3.4 Δεσμοί ινοσίνης με κυτοσίνη, αδενίνη ή ουρακίλη Εικόνα 3.5 Διαδικασία μεθόδου εστιασμένης RT-PCR Εικόνα 3.6 Ένθεση του προϊόντος PCR στον ενεργοποιημένο πλασμιδιακό φορέα pcr 2. 1 Εικόνα 3.7 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων RT-PCR σε πηκτή αγαρόζης. Διαδρομές 1-4: ανίχνευση του GVD, (5-8): ανίχνευση του GVΒ, (9-12): ανίχνευση του GVΑ. Διαδρομές 1,5,9: GVD σε N. occidentalis, (2,6,10): GVB σε N. occidentalis, (3,4,7,8,11,12): GVA σε N. benthamiana Εικόνα 3.8 Ηλεκτροφόρημα σε πηκτή αγαρόζης, προϊόντων RT-PCR και ακόλουθης εστιασμένης PCR, τα οποία παράχθηκαν με τη χρήση των ζευγών εκκινητών ( RW π1, RW κ1 ) και ( RW εστ π1, RW εστ κ1 ) αντίστοιχα. Το εκμαγείο ήταν εκχύλισμα ολικού RNA από μίσχους φύλλων αμπέλου προσβλημένης με RSPaV-1, N. benthamiana με GVA, N. occidentalis με GVB και N. occidentalis με GVD. (ΥΓ: υγιή δείγματα, ΥΓ1 και ΥΓ2: αμπέλι, ΥΓ3: N. benthamiana, ΥΓ4: N. occidentalis). Σελίδα

16 Εικόνες και Πίνακες Εικόνα 3.9 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR τα οποία παράχθηκαν από αποτύπωση φυτικού εκχυλίσματος έξι δειγμάτων προσβλημένων με RSPaV-1, με τη χρήση των ζευγών εκκινητών ( RW π1, RW κ1 ) και ( RW εστ π2, RW εστ κ4 ). Διαδρομές 1-6: αποτύπωση σύμφωνα με La Notte et al. (1997), διαδρομές 7-12: βελτιωμένη αποτύπωση. Εικόνα 3.10 Ηλεκτροφόρημα σε πηκτή αγαρόζης, προϊόντων RT-PCR από μίσχους φύλλων βιότυπων αμπέλου προσβλημένων με RSPaV-1 (διαδρομές 1-17). Πηκτές Ι και II: προϊόντα RT-PCR τα οποία παράχθηκαν με τη χρήσιμοποίηση των ζευγών εκκινητών [9, 10 (πηκτή Ι)] και [(13, 14) πηκτή ΙΙ], με εκμαγείο εκχύλισμα ολικού RNA (Nolasco et al., 2000). Το + δηλώνει την παρουσία ορατού προϊόντος σε τουλάχιστον μία από τις δύο πηκτές, ενώ το δηλώνει την απουσία ορατού προϊόντος και στις δύο πηκτές. Πηκτή ΙΙΙ: Προϊόντα εστιασμένης RT-PCR τα οποία παράχθηκαν από αποτύπωση εκχυλίσματος φυτικού χυμού με τη χρήσιμοποίηση των ζευγών εκκινητών ( RW π1, RW κ1 ) και ( RW εστ π2, RW εστ κ4 ). Διαδρομές 18 και 19: υγιή φυτά, M: Δείκτης Μοριακού Βαρους, ανά 100 ζβ. Εικόνα 3.11 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος δείγματος προσβλημένου με RSPaV-1 μετά από διαδοχικές αραιώσεις (10 φορές) σε εκχύλισμα χυμού υγιούς δείγματος και με τη χρήση των ζευγών εκκινητών ( RW π1, RW κ1 ) και ( RW εστ π2, RW εστ κ4 ). Οι αριθμοί δηλώνουν τις αραιώσεις. Εικόνα 3.12 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR τα οποία παράχθηκαν από αποτύπωση φυτικού εκχυλίσματος χυμού τεσσάρων δειγμάτων προσβλημένων με RSPaV-1, με τη χρήση των ζευγών εκκινητών ( RW π1, RW κ1 ) και ( RW εστ π2, RW εστ κ4 ) (διαδρομές 1-5) ή των ζευγών ( RW π 1N, RW κ 1N ) και ( RW εστ π1n, RW εστ κ1n ) (διαδρομές 6-10). Διαδρομές 4 και 9: υγιές δείγμα. Εικόνα 3.13 Προϊόντα εστιασμένης RT-PCR τα οποία παράχθηκαν από αποτύπωση φυτικού εκχυλίσματος οκτώ δειγμάτων προσβλημένων με RSPaV-1, με τη χρήση των εστιασμένων εκκινητών ( RW εστ π2, RW εστ κ3 ) (διαδρομές 1-9) ή των εστιασμένων εκκινητών ( RW εστ π2, RW εστ κ2 ) (διαδρομές 9-18). Διαδρομές 5 και 14: υγιές δείγμα. Εικόνα 3.14 Προϊόντα εστιασμένης RT-PCR τα οποία παράχθηκαν από αποτύπωση φυτικού εκχυλίσματος τεσσάρων δειγμάτων προσβλημένων με RSPaV-1, με τη χρήση του εστιασμένου εκκινητή RW εστ π2 διαδοχικά με τους εκκινητες: RW εστ κ5 (διαδρομές 1-5), RW εστ κ4 (διαδρομές 6-10), RW εστ κ2 μαζί με RW εστ κ2β (διαδρομές 11-15) RW εστ κ2 (διαδρομές 16-20). Διαδρομές 4, 9, 14 και 19: υγιές δείγμα. Εικόνα 3.15 Φυλογενετική ανάλυση των ιών που ανήκουν στην γενεαλογία των tymo-ιών βασισμένη στις αλληλουχίες που κωδικοποιούν την RdRp (Hataya et al. 2000). Εικόνα 3.16 Δέσμευση αντικωδικίου, ενός μεταφορικού RNA γλυκίνης, με τρία διαφορετικά κωδίκια (GGU, GGC και GGA) εξαιτίας του ζευγαρώματος της ινοσίνης με ουρακίλη, κυτοσίνη ή αδενίνη. Εικόνα 4.1 Ευθυγράμμιση αλληλουχιών αμινοξέων που εκφράζουν τμήμα της HSP70 των GLRaV-2, GLRaV-1, Beet yellows virus (BYV), Beet yellow stunt virus (BYSV), Citrus tristeza virus (CTV), GLRaV-3, Potato yellow vein virus (PYVV), Tomato infectious chlorosis virus (TICV), Little cherry virus-1 (LChV-1), GLRaV-4, Οlive leaf yellowing associated virus (OLYaV), Tomato chlorosis virus (ToCV), Beet pseudo-yellows virus (BPYV), Cucurbit yellow stunting disorder virus (CYSDV), Plum bark necrosis stem pitting virus

17 Εικόνες και Πίνακες (PBNSPV), GLRaV-5, Lettuce infectious yellows virus (LIYV), GLRaV-7, Spinacia oleracea (σπανάκι), Mus musculus (επίμυς), Zea mays (καλαμπόκι). Η ευθυγράμμιση έγινε με το πρόγραμμα CLUSTAL V. Αναγράφονται οι αλληλουχίες των αμινοξέων που επιλέχθηκαν για το σχεδιασμό των εκκινητών καθώς και οι αντιδράσεις PCR στις οποίες αυτοί χρησιμοποιήθηκαν. Με πλάγιους χαρακτήρες στην περιοχή "phosphate 1" φαίνονται τα αμινοξέα που είναι συντηρημένα μόνο στις ιικές αλληλουχίες. (αα σημαίνει αριθμός αμινοξέων). Εικόνα 4.2 Ευθυγράμμιση με το πρόγραμμα CLUSTAL V, αλληλουχιών νουκλεοτιδίων που εκφράζουν τμήμα της HSP70 των GLRaV-1, GLRaV-2, GLRaV-3, GLRaV-4, GLRaV-5, GLRaV-7, LChV-1, CTV, BPYV, CYSDV, TICV και ToCV. Αναγράφονται οι τελικοί εκκινητές που επιλέχθηκαν. Εικόνα 4.3 Τοποθέτηση dc απέναντι από την dι, κατά τη διάρκεια των κύκλων της PCR. Εικόνα 4.4 Ζευγάρωμα με Αδενίνη και Γουανίνη αντίστοιχα, του αναλόγου πυριμιδίνης P (6Η,8Η-3,4-dihydropyrimido[4,5-c][1,2]oxazin-7-one). Εικόνα 4.5 Διαδικασία μεθόδου εστιασμένης RT-PCR για την ταυτόχρονη ανίχνευση clostero-, viti- και fovea-ιών, σε ιστούς αμπέλου. Εικόνα 4.6 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος μίσχου φύλλου έξι διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με GLRaV-3, με τη χρησιμοποίηση των εκκινητών που αναφέρονται στον Πίνακα 4.1. Επίδραση της ποσότητας μπεταΐνης που προστίθεται σε 1 ml διαλύματος "αποδέσμευσης". Διαδρομές 1-6: 0,2g μπεταΐνη, 7-12: 0,5g μπεταΐνη, 13-18: χωρίς μπεταΐνη. Εικόνα 4.7 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος τριών διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με GLRaV-3. Επίδραση του DMSO κατά την επώαση στους 94 ο C 2μl του διαλύματος "αποδέσμευσης" που περιείχε το εκμαγείο, παρουσία των εκκινητών, πριν την εφαρμογή RT-PCR. Διαδρομές 1-3: χωρίς DMSO, 4-6: με 10% DMSO. Εικόνα 4.8 Επίδραση της συγκέντρωσης του DMSO στην RT-PCR. Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος τεσσάρων διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με GLRaV-3. Διαδρομές 1-4: 6% DMSO, 5-8: 5% DMSO, 9-12: 4% DMSO, 13-16: 3% DMSO, 17-20: 2% DMSO. Εικόνα 4.9 Επίδραση του DMSO και της μπεταΐνης στην RT-PCR. Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος οκτώ διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με GLRaV-3. Διαδρομές 1-8: 5% DMSO, 9-16: 0,6Μ μπεταΐνη, 17-24: χωρίς πρόσθετα. Εικόνα 4.10 Επίδραση των ενζύμων της RT. Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος έξι διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με GLRaV-3. Διαδρομές 1-6: 1,4 μονάδες Superscript TM II, 7-12: 0,7 μονάδες Superscript TM II μαζί με 0,7 μονάδες AMV, 13-18: 1,4 μονάδες AMV. Εικόνα 4.11 Επίδραση της θερμοκρασίας κατά την RT. Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος δύο διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με GLRaV-3. Διαδρομές 1,2,7,8: RT στους 42 ο C, 3,4,9,10: RT στους 40 ο C και 5,6,11,12: RT στους 38 ο C. Διαδρομές 1-6: παρουσία 5% DMSO κατά την RT-PCR και 7-12: παρουσία 1Μ μπεταΐνης κατά την RT-PCR. Εικόνα 4.12 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με GLRaV-5, -1, -3, -6,

18 Εικόνες και Πίνακες και ενός με GLRaV-2 και -7 ταυτόχρονα. Διαδρομές 1-5: RT-PCR με Τα στους 46 ο C για 30'', 6-10: RT-PCR με Τα στους 43 ο C για 10'' και ακολούθως 38 ο C για 5'', 11-15: RT-PCR με Τα στους 43 ο C για 30'', 16-20: RT-PCR με Τα στους 40 ο C για 30''. Εικόνα 4.13 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με GLRaV-5, -6, -2, -3, και -1. Διαδρομές 1-9: RT-PCR, παρουσία του εκκινητή HSP π8 μαζί με τον HSP k7. Διαδρομές 10-18: RT-PCR, παρουσία του εκκινητή HSP π13 μαζί με τον HSP k7. Εικόνα 4.14 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με GLRaV-5, -2, -6, -1, και -3. Διαδρομές 1-9: RT-PCR, παρουσία του εκκινητή HSP π7 μαζί με τον HSP k7. Διαδρομές 10-18: RT-PCR, παρουσία του εκκινητή HSP π13 μαζί με τον HSP k7. Εικόνα 4.15 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με GLRaV-5, -2, -6, -1, και -3. Διαδρομές 1-9: RT-PCR παρουσία του εκκινητή HSP k7 μαζί με τον HSP π13. Διαδρομές 10-18: RT-PCR παρουσία του HSP k8 μαζί με τον HSP π13. Εικόνα 4.16 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος τριών διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με απομονώσεις του RSPaV-1 μετά από διαδοχικές αραιώσεις (10 φορές) σε εκχύλισμα χυμού υγιούς δείγματος. Οι αριθμοί δηλώνουν τις αραιώσεις. Πηκτή (Α): RT- PCR χωρίς τον εκκινητή RW κ1g. Πηκτή (Β): RT-PCR, παρουσία του RW κ1g. Εικόνα 4.17 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος επτά διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με GLRaV-6, -5, -1 και -3. Διαδρομές 1-8: RT-PCR, παρουσία του εκκινητή HSP pg3. Διαδρομές 9-16: χωρίς τον HSP pg3. Διαδρομές 4 και 12: υγιής μάρτυρας. Εικόνα 4.18 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος τεσσάρων διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με GLRaV-3. Διαδρομές 1-4: RT-PCR, παρουσία του εκκινητή HSP κ10 μαζί με τον HSP π13. Διαδρομές 5-8: RT-PCR, παρουσία των εκκινητών HSP k8 και HSP k9 μαζί με τον HSP π13. Διαδρομές 9-12: RT-PCR, παρουσία του εκκινητή HSP κ8 μαζί με τον HSP π13. Εικόνα 4.19 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων της βελτιωμένης εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος δειγμάτων προσβλημένων με διαφορετικούς clostero-ιούς: τρία με GLRaV-7, τρία με GLRaV-6, τρία με GLRaV-5, ένα με GLRaV-2 και -1 ταυτόχρονα, ένα με GLRaV-2, ένα με GLRaV-2 και -7 ταυτόχρονα, τρία με GLRaV-3 και τρία με GLRaV-1. Διαδρομή 19: υγιής μάρτυρας. Εικόνα 4.20 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων της βελτιωμένης εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος διαφορετικών clostero- και crini-ιών: LChV-1 από κεράσι, CTV από πορτοκαλιά, BPYV και CYSDV από αγγουριά, ΤICV και ToCV από ντομάτα. Διαδρομές 7,8 και 9: υγιείς μάρτυρες από πορτοκαλιά, αγγουριά και ντομάτα αντίστοιχα. Εικόνα 4.21 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος βιότυπων αμπέλου προσβλημένων με RSPaV-1 με τη χρησιμοποίηση του πρωτοκόλλου που αναφέρεται στην παρ Διαδρομές 1, 3 και 13: εκχύλισμα υγιών πρέμνων. Εικόνα 4.22 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων της βελτιωμένης εστιασμένης RT-PCR

19 Εικόνες και Πίνακες από αποτύπωση εκχυλίσματος τριών διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με GLRaV-3, -5 και -2, μετά από διαδοχικές αραιώσεις (10 φορές) σε εκχύλισμα χυμού υγιούς δείγματος. Οι αριθμοί δηλώνουν τις αραιώσεις. Εικόνα 4.23 Υπολογισμός του προφίλ αποδιάταξης του προϊόντος RT-PCR από τον GLRaV-3 μεν τη χρήση του αλγόριθμου Poland (Steger 1994). Εικόνα 4.24 Υπολογισμός της δευτεροταγούς δομής τμήματος του RNA του GLRaV-3 στους 55 ο C (Matzura and Wennborg, 1996). Σε τετράγωνο περίγραμμα βρίσκονται οι βάσεις με τις οποίες υβριδοποιείται ο εκκινητής HSP κ8. Εικόνα 5.1 Ευθυγράμμιση με το πρόγραμμα CLUSTAL V, αλληλουχιών νουκλεοτιδίων που εκφράζουν τμήμα της HSP70 των GLRaV-1 (LR1), GLRaV- 2 (LR2), GLRaV-3 (LR3), GLRaV-4 (LR4), GLRaV-5 (LR5), GLRaV-6 (LR6), GLRaV-7 (LR7), LChV-1, CTV, BPYV, CYSDV, TICV και ToCV και του νέου clostero-ιού (LR9). Οι εκκινητές "LR9 εστ π1" και''lr9 εστ κ2" που επιλέχθηκαν για την ανίχνευση του νέου clostero-ιού, αναφέρονται κάτω από τις ευθυγραμμίσεις. Εικόνα 5.2 Εξειδικευμένη ανίχνευση του νέου clostero-ιού με εστιασμένη RT- PCR. Εικόνα 5.3 Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας τμήματος του γονιδίου της HSP 70 του άγνωστου clostero-ιού. Ανίχνευση μέσω φθορισμού των ολιγονουκλεοτιδίων που δημιουργούνται με τη μέθοδο των διδεοξυαναλόγων. Κάθε μια από τις τέσσερις αντιδράσεις τερματισμού περιέχει σημασμένο διδεοξυ-ανάλογο που φθορίζει σε διαφορετικό μήκος κύματος. Εικόνα 5.4 Φυλογενετικό δένδρο που προσδιορίστηκε με βάση νουκλεοτιδικές αλληλουχίες τμήματος του γονιδίου της HSP 70, διαφόρων ιών της οικογένειας Closterovoridae (GLRaV-3, GLRaV-1, GLRaV-4, GLRaV-5, CTV, GLRaV-2, TICV, ToCV, CYSDV, BPYV, LChV-1 και GLRaV-7) και των ελληνικών απομονώσεων, του GLRaV-6 και του νέου clostero-ιού (GLRaV-9GR). Ως εξωτερική ομάδα (outgroup) χρησιμοποιήθηκε ομόλογο γονιδιακό τμήμα από το σπανάκι. Οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες ευθυγραμμίστηκαν με το πρόγραμμα Clustal V και η φυλογενετική απεικόνιση έγινε με το πρόγραμμα Treeview. H κλίμακα αντιπροσωπεύει τον αριθμό υποκατάστασης των νουκλεοτιδίων ανά θέση. Το μήκος των βραχιόνων είναι ανάλογο με τις γενετικές αποστάσεις που υπολογίστηκαν. Ο κωδικός πρόσβασης της κάθε αλληλουχίας στη βάση δεδομένων (EMBL), αναγράφεται δίπλα από το όνομα του ιού, ενώ τα αρχικά MB, ΑP και WF σημαίνουν δυνητική μετάδοση με κοκοειδή, αφίδες, ή αλευρώδεις (ταξινόμηση ιών μελών της οικογένειας Closteroviridae σύμφωνα με Karasev, 2000). Εικόνα 5.5 Εξειδίκευση ανίχνευσης του νέου clostero-ιού με τη χρησιμοποίηση των εστιασμένων εκκινητών LR9 εστ π1 και LR9 εστ κ2. Ανάλυση προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος δειγμάτων προσβλημένων με διαφορετικούς clostero-ιούς: δύο με GLRaV-5, δύο με GLRaV-6, δύο με GLRaV-1, ένα με GLRaV-3, ένα με GLRaV-2, ένα με GLRaV--7 και τρία με τον νέο clostero-ιό. Διαδρομή 13: υγιής μάρτυρας. Εικόνα 5.6 Ανίχνευση του νέου clostero-ιού σε βιότυπους αμπέλου, με τη χρησιμοποίηση των εστιασμένων εκκινητών LR9 εστ π1 και LR9 εστ κ2 μετά από ανάλυση προϊόντων της εστιασμένης RT-PCR. Διαδρομή 1: Κολοκυθάς, 2: Πρεβεζάνικο, 3: Ρεψοντεμπίνα, 4,5: Βλάχικο 6: Κοντοκλάδι, 7,8: Ντεμπίνα. Εικόνα 6.1 Επίδραση του PVPP στο διάλυμα "αποδέσμευσης". Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος πέντε

20 Εικόνες και Πίνακες διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με διάφορους clostero-ιούς. Διαδρομές 1-6: Επεξεργασία της αποτύπωσης, παρουσία 50% (ο/ο) ενυδατωμένου PVPP στο διάλυμα "αποδέσμευσης". Διαδρομές 7-12: Χωρίς PVPP. Εικόνα 6.2 Επίδραση του PVPP και του PVP στο διάλυμα "αποδέσμευσης". Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος έξι διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με διάφορους clostero-ιούς. Διαδρομές 1-6: Επεξεργασία της αποτύπωσης, παρουσία 50% (ο/ο) ενυδατωμένου PVPP στο διάλυμα "αποδέσμευσης". Διαδρομές 7-12: παρουσία 10% (β/ο) PVP. Διαδρομές 13-18: Χωρίς PVP ή PVPP. Εικόνα 6.3 Επίδραση του τύπου της μεμβράνης κατά την αποτύπωση του εκχυλίσματος. Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος έξι διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με διάφορους clostero-ιούς. Διαδρομές 1-6: αποτύπωση σε νάιλον μεμβράνη Hybond N+. Διαδρομές 7-12: αποτύπωση σε "porablot PVDF". Πίνακες Πίνακας 1.1 Προτεινόμενη ταξινόμηση των clostero-ιών (Karasev 2000). Πίνακας 1.2 Xαρακτηριστικά ιών του γένους Closterovirus οι οποίοι σχετίζονται με την συστροφή των φύλλων της αμπέλου. Πίνακας 1.3 Πειραματική μετάδοση με έντομα φορείς, ιών που σχετίζονται με το καρούλιασμα της αμπέλου Πίνακας 1.4 Xαρακτηριστικά ιών του γένους Vitivirus Πίνακας 1.5 Συμπτώματα που προκαλούνται σε τρεις διαφορετικούς δείκτες από τα τέσσερα σύνδρομα της βοθρίωσης του ξύλου. Πίνακας 2.1 Τύπος ELISA που χρησιμοποιήθηκε και προέλευση διαγνωστικών σκευασμάτων ανίχνευσης των διάφορων ιών Πίνακας 2.2 Εκκινητές για την ανίχνευση του RSPaV-1 (Nolasco et al 2000) Πινακας 2.3 Αποτελέσματα ιολογικών ελέγχων 38 βιότυπων ποικιλιών οινοποιίας (Vitis vinifera L.) προερχόμενα από κλωνική επιλογή Πινακας 2.4 Αποτελέσματα ιολογικών ελέγχων 80 βιότυπων ποικιλιών οινοποιίας προερχόμενα από συλλογή αυτόχθονων ποικιλιών. Πίνακας 3.1 Εκκινητές, θερμοκρασία επανασύνδεσης (annealing temperature, Ta) και μήκος προϊόντος για την ανίχνευση με RT-PCR, των GVA (De Meyer et al, 1999), GVB (Minafra et al, 1994) και GVD (Abou-Ghanem et al, 1999) Πίνακας 3.2 Παράδειγμα σχεδιασμού ενός εκφυλισμένου εκκινητή με βάση την αλληλουχία έξι αμινοξέων. Πίνακας 3.3 Εκφυλισμένοι εκκινητές που επιλέχθηκαν για την ανίχνευση των viti- και fovea-ιών. Πίνακας 3.4 Ποσοστά ομολογίας των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών των 200 ζβ που προσδιορίστηκαν από κλωνοποιημένα και μη προϊόντα της εστιασμένης PCR και των αντίστοιχα μεταφρασμένων αλληλουχιών των αμινοξέων, με ομόλογες δημοσιευμένες αλληλουχίες RdRp. Πίνακας 4.1 Εκφυλισμένοι εκκινητές που επιλέχθηκαν για την ανίχνευση των viti- fovea- και closterο-ιών. Πίνακας 4.2 Ποσοστά ομολογίας των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών των 500 ζβ που προσδιορίστηκαν από κλωνοποιημένα και μη προϊόντα της εστιασμένης PCR και των αντίστοιχα μεταφρασμένων αλληλουχιών των αμινοξέων, με ομόλογες δημοσιευμένες αλληλουχίες HSP 70. Πίνακας 7.1 Προτάσεις για το σχεδιασμό εκφυλισμένων εκκινητών

21 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Βιβλιογραφική ανασκόπηση 17

22 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση 1. Ιολογικές ασθένειες της αμπέλου Οι ιολογικές ασθένειες αποτελούν σημαντικά φυτοπαθολογικά προβλήματα των αγενώς πολλαπλασιαζόμενων φυτών κυρίως εξαιτίας της προοδευτικής συσσώρευσης τους, με μετάδοση σε διαφορετικό τόπο και χρόνο με τον αγενή πολλαπλασιασμό. Μέχρι πρόσφατα έχουν αναφερθεί 47 ιοί, που ανήκουν σε 18 γένη που προσβάλλουν το αμπέλι (Martelli 2000). Τρεις είναι οι σημαντικότερες ασθένειες ιολογικής αιτιολογίας, ενώ μεγάλος αριθμός ιών σχετίζονται με αυτές: Εκφυλιστικές ασθένειες και παρακμή της αμπέλου οι οποίες οφείλονται σε ιούς του γένους Nepovirus. Συστροφή ή καρούλιασμα των φύλλων της αμπέλου με την οποία σχετίζονται ιοί του γένους Closterovirus. Βοθρίωση του ξύλου της αμπέλου με την οποία μέχρι στιγμής σχετίζονται ιοί των γενών Foveavirus και Vitivirus. Πολλοί είναι οι παράγοντες που συνέβαλαν στην αυξημένη παρουσία και διασπορά των ιών στο αμπέλι. Οι πιο σημαντικοί είναι ο αγενής πολλαπλασιασμός της αμπέλου, ο εμβολιασμός των ευρωπαϊκών ποικιλιών σε υποκείμενα αμερικάνικων ειδών της αμπέλου και των υβριδίων τους, η ανεξέλεγκτη διακίνηση πολλαπλασιαστικού υλικού και η έλλειψη επαρκών γνώσεων για πολλούς ιούς. Επιπλέον, υπάρχουν σημαντικές δυσκολίες στο χαρακτηρισμό ορισμένων ιών της αμπέλου όπως η αδυναμία μηχανικής μετάδοσης και καθαρισμού τους αλλά και προβλήματα διάγνωσης που αφορούν τις τεχνικές ανίχνευσης (μειωμένη ευαισθησία ανίχνευσης, έλλειψη εξειδικευμένων αντισωμάτων, χαμηλός τίτλος αντιγόνου στους φυτικούς ιστούς, κόστος και αδυναμία ανίχνευσης άγνωστων ιών). Οι επιπτώσεις των ιολογικών προσβολών στο αμπέλι δεν είναι εύκολο να προβλεφτούν και εξαρτώνται από την παθογόνο δύναμη του κάθε ιού ή της φυλής του, το γενότυπο του ξενιστή, τις συνθήκες του περιβάλλοντος αλλά και τη συνεργιστική δράση των ιών σε μικτές μολύνσεις οι οποίες είναι πολύ συχνές. Στη συνέχεια θα περιγραφεί η οικογένεια Closteroviridae, τα γένη Vitivirus και Foveavirus και ακολούθως αντίστοιχα, οι ασθένειες με τις οποίες σχετίζονται ορισμένα μέλη τους. 1.1 Ιοί της οικογένειας Closteroviridae Η οικογένεια Closteroviridae περιλαμβάνει μέχρι στιγμής περισσότερους από 27 ιούς με εύκαμπτα νηματοειδή ιοσωμάτια μήκους nm, που περιέχουν μονόκλωνο θετικής πολικότητας RNA και ημι-έμμονο τρόπο μετάδοσης με έντομα όπως αφίδες, κοκκοειδή (Planococcus και Pseudococcus) ή αλευρώδεις (Bemisia, Trialeurodes) (Bar-Joseph et al., 1979, Bar-Joseph and Murant 1982, Dolja et al., 1994, Lister and Bar-Joseph 1981). Τα τελευταία χρόνια, σε διάφορες καλλιέργειες, οι καλλιεργητικές πρακτικές και η εξάπλωση των εντόμων φορέων (π.χ. αλευρώδεις) έχουν οδηγήσει στην εξάπλωση και ταυτοποίηση νέων ιών αλλά και σε εξάρσεις παλαιών ασθενειών που οφείλονται σε γνωστούς clostero-ιούς (Rocha-Pena et al., 1995, Wisler et 18

23 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση al., 1998). Η εξέλιξη των μοριακών τεχνικών βοήθησε σημαντικά στην ανάλυση του γονιδιώματος και στο χαρακτηρισμό πολλών από τους ιούς αυτούς. Αρχικά δύο διαφορετικά συστήματα χρησιμοποιήθηκαν για τη διαίρεση των clostero-ιών, ένα που βασιζόταν στη μορφολογία των ιοσωματίων και ένα στην μετάδοση με τα έντομα φορείς. Σύμφωνα με το πρώτο οι clostero-ιοί χωρίζονταν σε μια υποομάδα με μεγάλο μήκος ιοσωματίων ( nm) και μια με μικρό μήκος ιοσωματίων ( nm) (Bar-Joseph and Murant 1982, Bar-Joseph et al., 1979). To δεύτερο σύστημα που βασιζόταν στη μετάδοση με τους φορείς χρησιμοποιήθηκε λιγότερο, εξαιτίας των ελλιπών γνώσεων για αρκετούς από τους ιούς. Με βάση νέα δεδομένα που αφορούν και τη γονιδιακή οργάνωση των ιών, δημιουργήθηκε ένα νέο σύστημα ταξινόμησης (Dolja et al., 1994) σύμφωνα με το οποίο η οικογένεια Closteroviridae αποτελείται από το γένος Crinivirus με τυπικό μέλος τον ιό του μολυσματικού ίκτερου του μαρουλιού (Lettuce infectious yellows virus, LIYV) και το γένος Closterovirus με τυπικό μέλος τον ιό του ίκτερου των τεύτλων (Beet yellows virus, BYV). Στο γένος Crinivirus ανήκουν οι ιοί με μικρό μήκος ιοσωματίων, διμερές γονιδίωμα και οι οποίοι μεταδίδονται με αλευρώδεις (Wisler et al., 1998), ενώ στο γένος Closterovirus ανήκουν αυτοί που έχουν μεγάλο μήκος ιοσωματίων, μονομερές γονιδίωμα και μεταδίδονται με κοκκοειδή, αφίδες και πιθανόν με αλευρώδεις. Εκτός από την μορφολογία των ιοσωματίων άλλα κριτήρια για την κατάταξη των ιών στην οικογένεια Closteroviridae είναι: Ο εντοπισμός τους στο φλοίωμα, ο σχηματισμός εγκλείστων στο κυτταρόπλασμα, ο χαρακτηριστικός τύπος οργάνωσης και έκφρασης του γονιδιώματος καθώς και ο ημι-έμμονος τρόπος μετάδοσης (Dolja et al., 1994). Οι clostero-ιοί εντοπίζονται κυρίως στο φλοίωμα των ασθενών φυτών, γεγονός που πιθανώς οφείλεται στην εξελικτική προσαρμογή των ιών με τους φορείς μετάδοσης, οι οποίοι τρέφονται στο φλοίωμα. Εξαιτίας του χαρακτηριστικού τους τροπισμού, οι clostero-ιοί επηρεάζουν κυρίως το φλοίωμα των μολυσμένων φυτών, με αποτέλεσμα να προκαλούν συμπτώματα παρόμοια με αυτά τροφοπενιών και πρόωρης γήρανσης όπως για παράδειγμα μεσονεύρια χλώρωση, ίκτερο, ανθοκυάνωση, λεύκανση ή διαφάνεια των νεύρων, νανισμό και μάρανση. Εξαιτίας της δυσκολίας αναγνώρισης της ιολογικής φύσης των ασθενειών που προκαλούνται από τους clostero-ιούς με βάση τα συμπτώματα, οι ασθένειες αυτές συχνά δεν αναγνωρίζονται ως ιολογικές ή αποδίδονται σε άλλα αίτια. Στα πολυετή ξυλώδη φυτά έχουν περιγραφεί δύο ακόμη σύνδρομα, όπως η επαγόμενη ασυμφωνία εμβολίου-υποκειμένου, και οι ποικίλες ανωμαλίες στην ανάπτυξη του φλοιώματος και του ξυλώματος που έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση συστροφής των φύλλων, βοθρίωση του ξύλου, νανισμό, μειωμένο σφρίγος και μειωμένη ποσότητα και ποιότητα των καρπών. Εξαιτίας του εντοπισμού τους στο φλοίωμα των ασθενών φυτών, οι clostero-ιοί έχουν χαμηλό τίτλο, ενώ ο καθαρισμός τους είναι δύσκολος και με μικρή απόδοση. Αυτά, σε συνδυασμό με το μεγάλο γονιδίωμα και την αδυναμία μηχανικής μετάδοσης των περισσότερων, δημιουργούν σοβαρά προβλήματα στη μελέτη και το χαρακτηρισμό τους. 19

24 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση Ιδιαίτερο χαρακτηριστικό γνώρισμα των clostero-ιών είναι η παρουσία ενός γονιδίου που κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη θερμικής καταπόνησης (heat shock protein, HSP), καθώς και ένα διπλότυπο (δεύτερο αντίγραφο) της καψιδιακής πρωτεΐνης (ΚΠ), το CPd. Σε κάθε clostero-ιό έχουν αναφερθεί δυο τύποι ΚΠ, ο κύριος (CP) και ένα διπλότυπο της καψιδιακής πρωτεΐνης (CPd) το οποίο προκύπτει από αναδιπλασιασμό του γονιδίου της CP με κάποια απόκλιση στην αλληλουχία (Boyko et al., 1992). Έκθεση των φυτών σε θερμοκρασίες υψηλότερες, κατά 10 ο C η και περισσότερο από την συνήθη θερμοκρασία περιβάλλοντος έχει αποδειχθεί ότι μεταβάλλει την γονιδιακή έκφραση και προάγει την ανοχή των φυτών σε υψηλές θερμοκρασίες. Αυτό το φαινόμενο φαίνεται να είναι καθολικό στην φύση και έχει παρατηρηθεί σε όλους τους οργανισμούς που έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα (Howarth et al 1993, Vierling 1991). Η θερμική καταπόνηση επάγει τη σύνθεση συγκεκριμένων πρωτεϊνών που ονομάζονται πρωτεΐνες θερμικής καταπόνησης (heat shock proteins, HSPs). Μία ομάδα τέτοιων πρωτεϊνών με μοριακό βάρος 70 kda (HSP70) βοηθούν στη σωστή αναδίπλωση των παραγόμενων πρωτεϊνών και στη μεταφορά πρωτεϊνών διαμέσου των κυτταρικών μεμβρανών (Pelham 1986). Οι HSP70 συνδέονται με εκτεθειμένες υδροφοβικές επιφάνειες των αποδιαταγμένων πρωτεϊνών, εμποδίζοντας την μη αναστρέψιμη κροκίδωση τους και προλαμβάνουν με τον τρόπο αυτό τον θερμικό θάνατο των κυττάρων με την αναστολή συσσώρευσης κροκιδωμένων πρωτεϊνών. Όταν η θερμοκρασία επανέλθει σε φυσιολογικά επίπεδα οι HSP70 βοηθούν επίσης την επαναδιάταξη των αποδιαταγμένων πρωτεϊνών στη φυσική τους διαμόρφωση (Pelham 1988). Τα μέλη της οικογένειας Closteroviridae είναι οι μόνοι ιοί που κωδικοποιούν ομόλογες HSP70 πρωτεΐνες (HSP70 homologs, HSP70h). Έχει αποδειχθεί ο ρόλος των HSP70h στη διακυτταρική μετακίνηση των ιών διαμέσου των πλασμοδεσμάτων καθώς και στη συναρμολόγηση της ουράς των clostero-ιών (αποτελούμενη από τo διπλότυπο της καψιδιακής πρωτεΐνης CPd) και σύνδεση της με το κυρίως σώμα του ιού (αποτελούμενο από την CP) (Dina et al, 2001). Φυλογενετική ανάλυση γονιδιακών τμημάτων που εκφράζουν την πολυμεράση (RdRp), την ελικάση (ΗΕL) και την HSP70 διάφορων clostero-ιών, έδειξε σε κάθε τύπο πρωτεΐνης τρεις ομάδες, κάθε μια από τις οποίες σχετίζονταν σημαντικά με τον τρόπο μετάδοσης των ιών (Karasev 2000). Κάθε ομάδα περιλαμβάνει ιούς που μεταδίδονται αποκλειστικά από μια ομάδα εντόμων-φορέων (αφίδες, αλευρώδεις ή κοκκοειδή). Ο Karasev (2000) πρότεινε ότι με βάση τη φυλογενετική σχέση των πρωτεϊνών αυτών είναι δυνατό να υποθέσουμε τον πιθανό τρόπο μετάδοσης ενός clostero-ιού για τον οποίο οι φορείς είναι άγνωστοι. Επίσης, πρότεινε την αλλαγή του συστήματος ταξινόμισης των clostero-ιών που ισχύει από το 1994 (Dolja et al., 1994) με ένα νέο, στο οποίο θα διακρίνονται σε τρία γένη ανάλογα με τον τρόπο μετάδοσης τους. Τα ήδη υπάρχοντα γένη Crinivirus και Closterovirus τα μέλη των οποίων μεταδίδονται με αλευρώδεις και αφίδες αντίστοιχα, και το προτεινόμενο γένος Vinivirus, με τυπικό μέλος τον GLRaV-3 όπου θα ανήκουν οι clostero-ιοί που μεταδίδονται με κοκκοειδή (Πίνακας 1.1). 20

25 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση Πίνακας 1.1: Προτεινόμενη ταξινόμηση των clostero-ιών (Karasev 2000) Οικογένεια Closteroviridae Γένος Closterovirus Vinivirus Crinivirus Τυπικό Είδος BYV GLRaV-3 LIYV 1.2 Ασθένεια της συστροφής των φύλλων της αμπέλου και ιοί του γένους Closterovirus που σχετίζονται με αυτήν Η συστροφή των φύλλων της αμπέλου (Grapevine leafroll), είναι ένα σύνδρομο σύνθετης αιτιολογίας όπου συμμετέχουν διάφοροι ιοί του γένους Closterovirus. Είναι από τις πιο σημαντικές ασθένειες της αμπέλου και ευθύνεται για το 62% των απωλειών της παραγωγής που οφείλονται σε ιούς (Walter & Martelli 1997) Συμπτώματα, οικονομική σημασία Τα χαρακτηριστικά συμπτώματα της ασθένειας είναι ο ερυθρός ή χλωρωτικός μεσονεύριος μεταχρωματισμός στις ερυθρές και λευκές ποικιλίες αντίστοιχα, και η συστροφή των φύλλων προς τα κάτω. Τα πρώτα συμπτώματα εμφανίζονται το καλοκαίρι στα φύλλα της βάσης αλλά προοδευτικά επεκτείνονται, μέχρι το τέλος του καλοκαιριού, σε όλο το φύλλωμα. Οι βότρυες συνήθως είναι μικρότεροι σε αριθμό και μέγεθος, με ανομοιόμορφη ωρίμανση στις ράγες και μικρή περιεκτικότητα σε σάκχαρα. Γενικώς στα πρέμνα παρατηρείται μείωση της ζωηρότητας και της παραγωγής. Η ένταση των συμπτωμάτων εξαρτάται από την παθογόνο δύναμη του είδους του ιού, της φυλής του ιού, την ποικιλία, τις συνθήκες του περιβάλλοντος αλλά και τη συνεργιστική δράση των ιών σε μικτές μολύνσεις. Η καταπόνηση των φυτών από έλλειψη νερού και θρεπτικών στοιχείων, αυξάνουν την ένταση των συμπτωμάτων. Συχνά, η μόλυνση είναι λανθάνουσα, όπως για παράδειγμα στα αμερικάνικα υποκείμενα με αποτέλεσμα να δημιουργούνται σοβαρά προβλήματα διάδοσης της ασθένειας από την χρήση προσβλημένου πολλαπλασιαστικού υλικού. Οι απώλειες της παραγωγής κυμαίνονται από 3% μέχρι 66% (Goheen 1988, Woodham et al., 1984, Weber et al., 1993, Walter & Martelli. 1997), ενώ μειώνεται επίσης η ικανότητα ριζοβολίας των μοσχευμάτων καθώς και η περιεκτικότητα των βοτρύων σε σάκχαρα (Walter & Martelli 1997, 1996) Αιτιολογία Μέχρι σήμερα έχουν αναφερθεί οκτώ ορολογικά διαφορετικοί ιοί του γένους Closterovirus να προσβάλλουν το αμπέλι (Πίνακας 1.2) και οι οποίοι σχετίζονται με την ασθένεια της συστροφής των φύλλων, (Grapevine leafroll-associated Closterovirus-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7 και -8, GLRaV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8). Πρόσφατα ένας νέος closteroιός με 74% ομολογία νουκλεοτιδίων και μικρή ορολογική σχέση με τον GLRaV-2 απομονώθηκε από πρέμνο της ποικιλίας Redglobe στην Καλιφόρνια (Rowhani et al., 2000). Ορολογική συγγένεια, με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων, έχει επίσης 21

26 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση βρεθεί μεταξύ των GLRaV-1 και -3 (Seddas et al., 2000) όπως και μεταξύ των GLRaV-4, -5, και -8 (Monis 2000). Μέχρι στιγμής μόνο οι GLRaV-1, -3 και -7 θεωρούνται αυθεντικά παθογόνα αίτια της ασθένειας αφού έχει αποδειχθεί ότι μπορούν να προκαλέσουν από μόνοι τους τα τυπικά συμπτώματα της ασθένειας (Belli et al., 1995, Choueiri et al., 1997). Επιπλέον ο GLRaV-2, έχει σχέση με την εκδήλωση ασυμφωνίας εμβολίου-υποκειμένου στο υποκείμενο Kober 5BB (Greif et al., 1995). Στη χώρα μας έχουν εντοπιστεί οι GLRaV-7 (Avgelis & Boscia 2001), και GLRaV-1 και -3 (Katis et al., 1990, Avgelis et al., 1997) όπου σε δείγματα με χαρακτηριστικά συμπτώματα της ασθένειας το 42,4% ήταν προσβεβλημένο από τον GLRaV-1 και το 47,8 από τον GLRaV-3 ενώ το 9,8% και από τους δύο. Πίνακας 1.2. Xαρακτηριστικά ιών του γένους Closterovirus οι οποίοι σχετίζονται με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου. Ιός Φορέας Μήκος ιοσωματίων (nm) ΜΒ* (kda) καψιδιακής πρωτεΐνης Μέγεθος γονιδιώματος (Κbp) GLRaV-1 1 κοκκοειδή ? GLRaV-2 2? GLRaV-3 3 κοκκοειδή GLRaV-4 4? ? GLRaV-5 5? ? GLRaV-6 6? ? GLRaV-7 7? GLRaV-8 8?? 37? 1 Gugerli et al., 1984, Hu et al., 1990, Habili et al., 1997, Fazeli and Rezaian 2000, Sefc et al., Gugerli et al., 1984, Hu et al., 1990, Namba et al., 1991, Abou-Ganem et al., 1998, Zhu et al., 1998, Abou Ghanem et al., Zee et al., 1987, Ling et al., Hu et al., 1990, Zimmermann et al., 1990, Routh et al., Zimmermann et al., Gugerli et al., Choueri et al., 1996, Saldarelli et al., Monis & Bestwick 1997, Monis 2000 *ΜΒ= Μοριακό Βάρος Μετάδοση Ο αγενής πολλαπλασιασμός και η ανεξέλεγκτη χρήση προσβλημένου πολλαπλασιαστικού υλικού κατά τον εμβολιασμό είναι οι κυριότερες αιτίες για την ευρεία εξάπλωση της ασθένειας. Η ασθένεια δε μεταδίδεται μηχανικά αλλά υπάρχουν αναφορές φυσικής εξάπλωσης της ασθένειας σε αμπελώνες στην πρώην Γιουγκοσλαβία (Dimitrijevic 1973), την Κύπρο (Ιωάννου 1993), την Ιταλία (Βelli et al., 1993), την Ισπανία (από 33% σε 83% σε διάστημα τεσσάρων χρόνων) (Cabaleiro & Segura 1997), την Αυστραλία (από 23% σε 52% σε διάστημα ένδεκα χρόνων) (Habili & Nutter 1997), τη Νέα Ζηλανδία (Jordan et al., 1993) κλπ. Έχει επίσης αναφερθεί πειραματική 22

27 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση μετάδοση των GLRaV-1, και -3 με είδη των οικογενειών Pseudococcidae και Coccidae (Πίνακας 1.3), ενώ δεν υπάρχουν δεδομένα για τους GLRaV-2, -4, -5, -6, -7, και -8. Σύμφωνα με τον Κarasev (2000) με βάση την φυλογενετική σχέση των πρωτεϊνών αυτών είναι δυνατό να προβλέψουμε τον πιθανό τρόπο μετάδοσης ενός clostero-ιού για τον οποίο οι φορείς είναι άγνωστοι. Με βάση την υπόθεση αυτή οι GLRaV-4, -5 οι οποίοι σχετίζονται φυλογενετικά με τους GLRaV-1 και -3 είναι πιθανό να μεταδίδονται επίσης με κοκκοειδή, ο GLRaV-2 φυλογενετικά συγγενής των ΒΥV και CTV είναι πιθανό να μεταδίδεται με αφίδες, ενώ ο GLRaV-7 φυλογενετικά συγγενής των TICV, ToCV, BPYV και CYSDV είναι πιθανό να μεταδίδεται με αλευρώδεις. Πίνακας 1.3. Πειραματική μετάδοση με έντομα φορείς, ιών που σχετίζονται με το καρούλιασμα της αμπέλου Ιός Φορέας Αναφορές GLRaV-1 Neopulvinaria innumerabilis Fortusini et al.,1997 Parthenolecanium corni Fortusini et al.,1997 Pseudococcus affinis Golino et al., 1995 Rosciglione & Gugerli 1989 Planococcus ficus Engelbrecht & Kasdorf 1990 GLRaV-3 Planococcus citri Ioannou et al., 1997 Pseudococcus longispinus Petersen & Charles 1997 Pseudococcus calceolariae Petersen & Charles 1997 Pulvinaria vitis Belli et al., 1994 Ο GLRaV-2 είναι ο μοναδικός μηχανικά μεταδιδόμενος clostero-ιός που προσβάλλει το αμπέλι, και μεταδόθηκε στο Nicotiana benthamiana (Goszczynski et al., 1996) Διάγνωση Παρόλο που το φθινόπωρο σε κάποιες ποικιλίες τα συμπτώματα της ασθένειας είναι εμφανή, είναι πολύ δύσκολη η διάγνωση με οπτικό έλεγχο καθώς αυτά δεν είναι παθογνωμονικά ενώ παρόμοια συμπτώματα προκαλούνται και από άλλες αιτίες όπως τροφοπενίες, φυτοτοξικότητες, εντομολογικές προσβολές, φυσιολογικές αιτίες κλπ. Αντίθετα σε ορισμένες περιπτώσεις, ανάλογα με την ποικιλία, τον ιό και το περιβάλλον, δεν εμφανίζονται συμπτώματα. Η αξιόπιστη διάγνωση της ασθένειας γίνεται με τρεις διαφορετικές μεθοδολογίες οι οποίες συμπληρώνουν η μια την άλλη ανάλογα με τις ανάγκες και τις δυνατότητες που υπάρχουν. Οι τεχνικές ανίχνευσης έχουν προβλήματα τα οποία οφείλονται, ανάλογα με την περίπτωση, στη μικρή συγκέντρωση των ιών στους ιστούς, στη μειωμένη ευαισθησία ανίχνευσης, στην εξειδίκευση των διαγνωστικών, στο αυξημένο κόστος, στη δυσκολία εφαρμογής, και στην αδυναμία ανίχνευσης άγνωστων ιών. 23

28 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση α) Βιολογικός έλεγχος Παρατήρηση τυπικών συμπτωμάτων της ασθένειας μετά τον εμβολιασμό φυτοδεικτών που είναι ερυθρές ποικιλίες V. vinifera (Cabernet franc, C. Sauvignon, Merlot, Pinot noir, LN33) (Garau et al., 1997) οδηγεί σε ταυτοποίηση της ασθένειας. Όμως η μέθοδος αυτή είναι χρονοβόρα (18 μήνες), δεν είναι εξειδικευμένη, είναι λιγότερο αξιόπιστη σε σύγκριση με τις ορολογικές (Monis et al., 1995) και απαιτεί θερμοκηπιακές εγκαταστάσεις. Παρόλα αυτά είναι απαραίτητη η εφαρμογή της σε προγράμματα κλωνικής επιλογής συμπληρωματικά με την μέθοδο ELISA, αφού δεν υπάρχουν διαθέσιμα αντισώματα για όλους τους clostero-ιούς της αμπέλου (Rowhani et al., 1997). β) Ορολογικός έλεγχος Η ορολογική ταυτοποίηση των ιών που σχετίζονται με το καρούλιασμα των φύλλων της αμπέλου είναι επισφαλής καθώς ο τίτλος των ιών στα πρέμνα είναι χαμηλός, εμφανίζει εποχιακή διακύμανση αλλά και διακύμανση στους ιστούς του ξενιστή (Monis & Bestwick 1996, 1997, Habili et al., 1997, Boscia et al., 1997, De Sousa 1997). Επίσης είναι δύσκολη η παραγωγή εξειδικευμένων αντισωμάτων εξαιτίας της αδυναμίας μηχανικής μετάδοσης (εκτός από τον GLRaV-2) και της δυσκολίας καθαρισμού των ιών. Παρόλα τα προβλήματα προς το παρόν ο χαρακτηρισμός και η διάγνωση των ιών που σχετίζονται με την ασθένεια γίνεται κυρίως με μονοκλωνικά και πολυκλωνικά αντισώματα. Τα μονοκλωνικά αντισώματα είναι πιο αξιόπιστα αντιδραστήρια για την ανίχνευση των clostero-ιών σε σύγκριση με τα αντίστοιχα πολυκλωνικά τα οποία εμφανίζουν μικρή εξειδίκευση. Μονοκλωνικά αντισώματα έχουν παρασκευαστεί με εξειδίκευση έναντι των ιών GLRaV-1 (Bioreba AG, Reinach, Switzerland), GLRaV-2 (Gugerli & Ramel 1993), GLRaV-3 (Hu et al., 1990, Zimmermann et al., 1990), GLRaV- 6 (Gugerli et al., 1997) και GLRaV-8 (Monis 2000). Πολυκλωνικά και μονοκλωνικά διαγνωστικά σκευάσματα έναντι των ιών GLRaV-1, -2, -3, -5, -6 και -7 είναι διαθέσιμα στο εμπόριο, ορισμένα όμως από αυτά παρουσιάζουν μικρή ευαισθησία και αξιοπιστία ανίχνευσης (Monis & Bestwick 1997, Αυγελής & Ρούμπος, 1996, Δόβας & Κατής, αδημοσίευτα δεδομένα). Αξιόπιστη είναι η ανίχνευση των GLRaV-1, -3 και -6 κυρίως εξαιτίας της διαθεσιμότητας ποιοτικών διαγνωστικών, ενώ δυνατή είναι η ανίχνευση του GLRaV-2, -5, και -7 αλλά η χαμηλή ποιότητα των διαγνωστικών και η μικρή συγκέντρωση των ιών στους ιστούς δυσχεραίνουν τη διάγνωση (Boscia et al., 1997). Έχουν αναπτυχθεί διάφοροι τύποι ELISA για την ανίχνευση των GLRaV όπως η διπλή άμεση παρεμβολή ELISA (Double Antibody Sandwich, DAS), η τριπλή έμμεση παρεμβολή ELISA (Triple Antibody Sandwich, TAS) και η Biotin-streptavidin ELISA (Boscia et al., 1997). Τα αποτελέσματα της ELISA εξαρτώνται σημαντικά από την ποιότητα των αντιδραστηρίων, την εποχή δειγματοληψίας, τον φυτικό ιστό (φλοιό ξύλου, έλασμα φύλλων, μίσχοι φύλλων) καθώς και τη θέση λήψης του δείγματος στο φυτό. Μίσχοι παλαιών φύλλων της βάσης του πρέμνου αργά το καλοκαίρι έως και το φθινόπωρο και φλοίωμα ξύλου το χειμώνα (ξύσματα καμβίου μετά την απομάκρυνση του φλοιού) αποτελούν τα καλύτερα δείγματα για αξιόπιστο ιολογικό έλεγχο των 24

29 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση ευρωπαϊκών ποικιλιών (Boscia et al., 1997, De Sousa 1997). Πρέπει να λαμβάνονται τρία η τέσσερα δείγματα από διαφορετικά σημεία της κόμης του πρέμνου, εξαιτίας της ανισοκατανομής των ιών στο φυτό. Για τον έλεγχο των αμερικάνικων υποκειμένων είναι υποχρεωτική η χρήση φλοίωματος ξύλου το χειμώνα εξαιτίας της χαμηλής συγκέντρωσης των ιών (κάτω από το όριο ανίχνευσης) στα φύλλα (Boscia et al., 1991, Credi & Santucci 1990). γ) Μοριακοί έλεγχοι Ανίχνευση και ηλεκροφόρηση σε πολυακρυλαμίδη, δίκλωνου RNA Στηρίζεται στην απομόνωση δίκλωνου RNA (double stranded, dsrna) από τα φυτά και ανάλυση του με ηλεκροφόρηση σε πολυακρυλαμίδη. Είναι μη εξειδικευμένη μέθοδος διάγνωσης ιολογικών προσβολών για τις οποίες δεν είναι διαθέσιμες άλλες πιο εύχρηστες μέθοδοι. Είναι χρονοβόρα διαδικασία και απαιτεί μεγάλη ποσότητα ιστού, μέχρι και 20 g φλοιώματος. Στο αμπέλι έχει χρησιμοποιηθεί ως διαγνωστική μέθοδος (Hu et al., 1991, Habili et al., 1992) αλλά και για το μοριακό χαρακτηρισμό των closteroιών (Habili & Rezaian 1995). Μοριακός υβριδισμός Έχει χρησιμοποιηθεί στο παρελθόν για την ανίχνευση του GLRaV-3 (Ling et al 1993, Saldarelli et al 1994, Habili et al., 1995), αλλά δεν ενδείκνυται για το μαζικό έλεγχο δειγμάτων αφού η μέθοδος ELISA είναι πιο εύχρηστη και έχει παρόμοια ευαισθησία. Αντίστροφη Μεταγραφή-Αλυσιδωτή Αντίδραση της Πολυμεράσης (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) H μεγάλη ευαισθησία της RT-PCR αποτελεί σημαντικό πλεονέκτημα της μεθόδου ειδικά για την ανίχνευση των clostero-ιών οι οποίοι βρίσκονται σε χαμηλή συγκέντρωση και έχουν ανομοιόμορφη κατανομή στα πρέμνα. Είναι επίσης χρήσιμη στις περιπτώσεις όπου δεν υπάρχουν διαθέσιμα ειδικά αντισώματα για την εφαρμογή της ELISA. Η εφαρμογή της RT-PCR καθυστέρησε κυρίως εξαιτίας της έλλειψης πληροφοριών για τις νουκλεοτιδικές αλληλουχίες των ιών αλλά και της παρουσίας αναστολέων των ενζύμων της αντίδρασης (φαινολικές ενώσεις και πολυσακχαρίτες) στους ιστούς της αμπέλου (Nassuth et al 2000). Έχει χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση των GLRaV-1 (Habili et al., 1997, Sefc et al., 2000) και GLRaV-3 (Ling 1993, Habili et al., 1995, Nolasco et al., 1997, MacKenzie et al., 1997). Πρόσφατα αναφέρθηκε η ανάπτυξη μιας δοκιμής RT-PCR για την ανίχνευση του GLaRV-7 με περιορισμένο όμως εύρος ανίχνευσης καθώς δεν ανιχνεύει όλες τις απομονώσεις του ιού (Turturo et al., 2000α). Ανάλογα προβλήματα ανίχνευσης έχουν αναφερθεί και για τον GLaRV-1 (Turturo et al., 2000β). Ταυτόχρονη ανίχνευση των GLRaV-4 και -5 με τη χρήση ενός ζεύγους εκφυλισμένων εκκινητών που στοχεύουν το γονίδιο της HSP70 έχει αναφερθεί από τους Routh et al., (1998). Η διαδικασία εκχύλισης ολικού RNA κατάλληλου για την RT-PCR είναι χρονοβόρα, έχει υψηλό κόστος και το πιο σημαντικό, δεν μπορεί να εφαρμοστεί σε 25

30 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση μεγάλο αριθμό δειγμάτων εξαιτίας του αυξημένου κινδύνου επιμολύνσεως των δειγμάτων με αποτέλεσμα λανθασμένα θετικά αποτελέσματα. Προσπάθειες για την απλοποίηση της διαδικασίας απομόνωσης του εκμαγείου και μείωσης της δράσης των αναστολέων της PCR, έγιναν με εφαρμογή της ανοσοδέσμευσης (Sefc et al., 2000) ή βράσιμο του δείγματος και μεγάλη αραίωση του εκχυλίσματος φυτικού ιστού (Habili et al., 1997). Πρόσφατα αναφέρθηκε ένα απλό πρωτόκολλο προετοιμασίας δειγμάτων της αμπέλου, όπου φυτικό εκχύλισμα αποτυπώνεται σε νάιλον μεμβράνη η οποία χρησιμοποιείται στην RT-PCR μετά από θερμική επεξεργασία (La Notte et al., 1997), ενώ αργότερα αναφέρθηκε μια παραλλαγή της μεθόδου με απευθείας θερμική επεξεργασία του φυτικού εκχυλίσματος (Rowhani et al., 2000). Όμως και οι δύο μέθοδοι περιλαμβάνουν μεγάλες αραιώσεις του εκχυλίσματος κατά συνέπεια και του εκμαγείου, με αποτέλεσμα τη μείωση της ευαισθησίας ανίχνευσης σε σχέση με πρωτοκόλλα που χρησιμοποιούν εκχύλισμα RNA. To υψηλό κόστος της RT-PCR και ο μεγάλος αριθμός των ιών που προσβάλλουν το αμπέλι και σχετίζονται με σοβαρές ασθένειες, καθιστούν το μαζικό ιολογικό έλεγχο δειγμάτων σχεδόν απαγορευτικό και περιορίζουν την εφαρμογή της σε προγράμματα κλωνικής επιλογής ή εξυγίανσης πολλαπλασιαστικού υλικού σε συνδυασμό με την ELISA. Προσπάθειες μείωσης του κόστους έχουν γίνει με την ανάπτυξη μεθόδων πολλαπλής PCR, κατά την οποία γίνεται ταυτόχρονη ενίσχυση πολλών στόχων στην ίδια αντίδραση PCR, ενώ τα προϊόντα ενίσχυσης έχουν διαφορετικό μήκος με αποτέλεσμα την ταυτόχρονη και εξειδικευμένη ανίχνευση πολλών ιών. Με αυτόν τον τρόπο ανιχνεύτηκαν ταυτόχρονα οι GLRaV-3 και GVB (Minafra & Hadidi. 1994) οι GLRaV-3 και GVA (La Notte et al., 1997) καθώς και οι GLRaV-3, GVB και GVA (Nassuth et al., 2000). Για την ανίχνευση με RT-PCR όσο το δυνατό μεγαλύτερου εύρους απομονώσεων και φυλών ενός ιού, είναι σημαντικό οι εκκινητές να επιλέγονται από συντηρημένες περιοχές του γονιδιώματος τους. Η δυνατότητα επιλογής εκκινητών με μεγάλο εύρος ανίχνευσης εξαρτάται από τη γενετική παραλλακτικότητα των πληθυσμών του ιού. Για τον επιτυχή σχεδιασμό εκκινητών σε είδη ιών με μεγάλη γενετική παραλλακτικότητα (διαφορές ομολογίας μεταξύ των αλληλουχιών των βάσεων του γονιδιώματος τους μέχρι και 20%) είναι απαραίτητη η γνώση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας πολλών διαφορετικών απομονώσεων του ίδιου ιού ώστε να είναι δυνατή η εύρεση συντηρημένων περιοχών του γονιδιώματος. Τυχαίες μεταλλάξεις εξαιτίας των λαθών της RNA εξαρτώμενης RNA πολυμεράσης (RNA-depended RΝΑ polymerase, RdRp) και ο ανασυνδυασμός του RNA κατά τη διάρκεια του πολλαπλασιασμού των clostero-ιών είναι οι πρωταρχικές αιτίες της γενετικής παραλλακτικότητας τους (Karasev 2000). Όμως στην συνέχεια, παράγοντες όπως η αλληλεπίδραση του ιού με τους ξενιστές και τους φορείς μπορεί να μειώσει σημαντικά τη γενετική παραλλακτικότητα των πληθυσμών του κάθε ιού (Garcia-Arenal et al., 2001). Ο Karasev (2000) πρότεινε δύο μοντέλα για την επιδημιολογία των clostero-ιών τα οποία επηρεάζουν με διαφορετικό τρόπο τη γενετική παραλλακτικότητα των πληθυσμών του κάθε ιού. Έτσι λοιπόν η εξάπλωση των clostero-ιών που προσβάλλουν μονοετή και διετή είδη, ξεκινά από λίγες 26

31 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση αρχικές εστίες μόλυνσης και συνδέεται άμεσα με την δραστηριότητα των εντόμων φορέων. Υπάρχει λοιπόν μια συνεχής επιλογή για τις παραλλαγές του ιού με την καλύτερη μεταδοτικότητα από τους φορείς η οποία μειώνει τη γενετική παραλλακτικότητα των πληθυσμών του ιού. Στα αγενώς πολλαπλασιαζόμενα πολυετή φυτά, η πίεση επιλογής εξαιτίας των φορέων είναι μικρότερη εξαιτίας της αποτελεσματικής μετάδοσης των ιών μέσω του αγενούς πολλαπλασιασμού, ή μπορεί να απουσιάζει τελείως σε περιοχές όπου δεν υπάρχει ο φορέας, με αποτέλεσμα την αύξηση της γενετικής παραλλακτικότητας του ιού στα φυτά με το πέρασμα των χρόνων. Αυτό είναι και το μοντέλο που ταιριάζει στην επιδημιολογία των clostero-ιών στο αμπέλι και το οποίο προβλέπει είδη ιών με μεγάλη γενετική παραλλακτικότητα η οποία όμως αποτελεί σημαντικό πρόβλημα στην επιλογή εκκινητών με μεγάλο εύρος ανίχνευσης. Μεγάλη γενετική παραλλακτικότητα έχει αποδειχτεί μέχρι στιγμής για τον GLRaV-1 (Little et al., 2001). Με τη χρήση εκκινητών με μεγάλο εκφυλισμό οι οποίοι στοχεύουν σε συντηρημένες περιοχές συγγενών ιών, είναι δυνατή η ταυτόχρονη ανίχνευσή τους (γενική PCR, generic PCR), χωρίς όμως τη δυνατότητα ταυτοποίησης του είδους με βάση το μήκος του προϊόντος ενίσχυσης (μη εξειδικευμένη ανίχνευση) όπως στην πολλαπλή PCR. Με την παραπάνω μέθοδο αντιμετωπίζονται τα προβλήματα του εύρους ανίχνευσης της PCR εξαιτίας της μεγάλης γενετικής παραλλακτικότητας των ιών και γίνεται δυνατή η ανίχνευση άγνωστων συγγενών ιών, με αύξηση της αποτελεσματικότητας της διάγνωσης, ενώ παράλληλα μειώνεται το κόστος της. Ενδιαφέρον έχει η αναφορά για την ταυτόχρονη ανίχνευση των GLRaV-1, -2, -4, -5, και -7 με την χρήση δύο υψηλά εκφυλισμένων εκκινητών που στοχεύουν στο γονίδιο που κωδικοποιεί την HSP70 και πολλαπλασιάζουν μια περιοχή περίπου 600 ζευγών βάσεων (ζβ) από όλους τους clostero-ιούς (Saldarelli et al., 1998). Οι συγκεκριμένοι εκκινητές σχεδιάστηκαν από υψηλά συντηρημένες περιοχές του γονιδίου που κωδικοποιεί την HSP70 πολλών clostero-ιών (Tian et al., 1996). Η ταυτόχρονη ανίχνευση πολλών clostero-ιών κάνει τη μέθοδο ελκυστική για μαζικούς ελέγχους, έχει όμως χαμηλή ευαισθησία και εξειδίκευση εξαιτίας της χρήσης εκκινητών με μεγάλο εκφυλισμό. Εξαιτίας της χαμηλής ευαισθησίας απαιτεί την εκχύλιση ολικού RNA (ή dsrna για μείωση των μη ειδικών αντιδράσεων) και την ανίχνευση των προϊόντων της PCR με ευαίσθητες αλλά δύσχρηστες τεχνικές όπως η ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμίδης και στη συνέχεια βαφή με άργυρο. Επίσης δεν έδωσε ικανοποιητικά αποτελέσματα ανίχνευσης για διάφορες απομονώσεις clostero-ιών της αμπέλου (Saldarelli, προσωπική επικοινωνία). Όλα αυτά καθιστούν τη μέθοδο δύσχρηστη και αναξιόπιστη ως διαγνωστική τεχνική, ενώ παρόλα αυτά παραμένει χρήσιμη για τη μοριακή μελέτη άγνωστων clostero-ιών Αντιμετώπιση της ασθένειας Η κλωνική επιλογή και η παραγωγή υγιούς πολλαπλασιαστικού υλικού, είναι η πιο αποτελεσματική μέθοδος αντιμετώπισης της ασθένειας. Η διαδικασία κλωνικής επιλογής σε συνδυασμό με αξιόπιστο ιολογικό έλεγχο και εξυγίανση του 27

32 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση πολλαπλασιαστικού υλικού με καλλιέργεια μεριστώματος όπου είναι απαραίτητο έχει εφαρμοστεί σε πολλές χώρες για τη βελτίωση της παραγωγής αμπελοϊνικών προϊόντων τους (Walter & Martelli 1997). Κατά την κλωνική επιλογή επισημαίνονται στον αμπελώνα, πρέμνα που δεν εμφανίζουν ιολογικά συμπτώματα και τα οποία διαθέτουν ενδιαφέροντα τεχνολογικά χαρακτηριστικά. Στη συνέχεια, τα πρέμνα αυτά ελέγχονται για την παρουσία ιολογικών προσβολών με ορολογικές, μοριακές και βιολογικές μεθόδους και όσα είναι προσβλημένα εξυγιαίνονται με in vitro καλλιέργεια ακραίου μεριστώματος. Τα έκφυτα που προκύπτουν ελέγχονται ξανά για την παρουσία ιολογικών προσβολών και στη συνέχεια τα υγιή φυτά μετά από διαδοχικούς πολλαπλασιασμούς και πειραματική αξιολόγηση των τεχνολογικών χαρακτηριστικών τους, χρησιμοποιούνται για τη δημιουργία μητρικών φυτειών βασικού και πιστοποιημένου πολλαπλασιαστικού υλικού. Ο έλεγχος των μητρικών φυτειών για την παρουσία ιολογικών προσβολών πρέπει να είναι συνεχής. 1.3 Ιοί του γένους Vitivirus Το γένος Vitivirus περιλαμβάνει μέχρι στιγμής πέντε ιούς με εύκαμπτα νηματοειδή ιοσωμάτια μήκους nm, με τυπικό μέλος τον ιό A της αμπέλου (Grapevine virus A, GVA). Έχουν μονόκλωνο πολυαδενυλιωμένο RNA μεγέθους 7,3-7,6 kb, παράγουν μία καψιδιακή πρωτεΐνη μεγέθους 20,5-25,7 kda και εντοπίζονται στο φλοίωμα (Πίνακας 1.4). Οι ιοί αυτοί παλαιότερα περιλαμβάνονταν στο γένος Trichovirus. Άλλα μέλη του γένους είναι ο ιός Β της αμπέλου (Grapevine virus B, GVB), ο ιός D της αμπέλου (grapevine virus D, GVD), ενώ υποθετικό μέλος είναι ο ιός C της αμπέλου (Grapevine virus C, GVC) (Martelli et al 1997). Οι GVA και GVB μεταδίδονται με ημιέμμονο τρόπο με κοκκοειδή (Planococcus και Pseudococcus). Πίνακας 1.4. Xαρακτηριστικά ιών του γένους Vitivirus Μήκος ΜΒ (Κda) Μέγεθος Ιός Φορέας ιοσωματίων (nm) καψιδιακής πρωτεΐνης γονιδιώματος (ζβ) GVA 1 κοκκοειδή , GVB 2 κοκκοειδή , GVC 3? ,7? GVD 4? , Conti et al Boscia et al Monette & James Abou-Ghanem et al

33 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση 1.4 Ιοί του γένους Foveavirus Το γένος Foveavirus είναι πρόσφατα αναγνωρισμένο (Martelli & Jelkmann 1998) και περιλαμβάνει ιούς με εύκαμπτα νηματοειδή ιοσωμάτια μήκους 800 nm, με τυπικό μέλος τον ιό της βοθρίωσης της μηλιάς (Apple stem pitting virus, ASPV). Παράγουν μία ΚΠ μεγέθους kda. Το γονιδίωμά τους είναι μονόκλωνο θετικής πολικότητας πολυαδενιλιωμένο RNA μεγέθους 8,4-9,3 kb και περιλαμβάνει πέντε ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης (Open Reading Frames, ORFs) τα οποία κωδικοποιούν αντίστοιχα, τις πρωτεΐνες που σχετίζονται με τον πολλαπλασιασμό (ORF 1), τις θεωρούμενες ως πρωτεΐνες διακυτταρικής μετακίνησης (ORF 2, 3 και 4) και την ΚΠ (ORF 5). Η γονιδιακή τους οργάνωση (αριθμός και αλληλουχία των γονιδίων) μοιάζει με αυτή των γενών Potexvirus, Carlavirus και Allexivirus. Οι ιοί που περιλαμβάνονται στο γένος Foveavirus είναι: ο ιός της πράσινης δακτυλίωσης με ποικιλόχρωση της κερασιάς (Cherry green ring mottle virus, CGRMV), ο ιός του ίκτερου των νεύρων της αχλαδιάς (Pear vein yellows virus, PVYV), ο λανθάνων ιός της βερικοκιάς (Apricot latent virus, ApLV), ο ιός της βοθρίωσης του κορμού της μηλιάς (Apple stem pitting virus, ASPV) και ο ιός της αμπέλου σχετιζόμενος με την βοθρίωση του κορμού του Rupestris (Grapevine rupestris stem pitting associated virus, GRSPaV). Το εύρος ξενιστών του κάθε ιού περιορίζεται σε έναν ή ελάχιστους ξενιστές οι οποίοι είναι δικοτυλήδονα ξυλώδη φυτά όπως μηλιά, αχλαδιά, κερασιά, ροδακινιά, βερικοκιά, και αμπέλι, ενώ η διάδοση τους φαίνεται να είναι παγκόσμια. Τα συμπτώματα που προκαλούν στους ξενιστές τους είναι κυρίως βοθρίωση του ξύλου και ήταν η αφορμή για την ονομασία του γένους η οποία προέρχεται από την λατινική λέξη fovea που σημαίνει λάκκος. Μέχρι στιγμής δεν υπάρχουν γνωστοί φορείς των fovea-ιών, ενώ η ευρεία εξάπλωσή τους οφείλεται στη μετάδοσή τους με τον εμβολιασμό και τον αγενή πολλαπλασιασμό. 1.5 Ασθένεια της βοθρίωσης του ξύλου της Αμπέλου και ιοί των γενών Foveavirus και Vitivirus, που σχετίζονται με αυτή Η βοθρίωση του ξύλου της αμπέλου (Grapevine Rugose Wood, RW), έχει παγκόσμια διάδοση με σημαντικές οικονομικές επιπτώσεις καθώς προκαλεί μείωση στην ανάπτυξη και απόδοση των φυτών (Garau et al., 1985, Savino et al., 1985, Goheen, 1988). Η ασθένεια είναι σύνθετης αιτιολογίας με ποικίλη συμπτωμάτολογία (ανάλογα με τον ή τους ιούς που εμπλέκονται) η οποία αφορά παραμορφώσεις του κορμού των πρέμνων. Η βοθρίωση του ξύλου της αμπέλου παρατηρήθηκε σε πολλές αμπελουργικές περιοχές της χώρας, κυρίως σε ποικιλίες εμβολιασμένες σε αμερικάνικα υποκείμενα (Rumbos & Avgelis 1985) Συμπτώματα Τα προσβεβλημένα φυτά είναι συνήθως λιγότερο ζωηρά και πιθανά να έχουν καθυστερημένη έκπτυξη των οφθαλμών την άνοιξη. Οι αυτόριζες ευρωπαϊκές ποικιλίες της αμπέλου συνήθως δεν παρουσιάζουν συμπτώματα τα οποία όμως εμφανίζονται μετά 29

34 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση από εμβολιασμό σε υποκείμενα αμερικάνικων ειδών Vitis και υβριδίων τους (Bovey & Martelli 1992). Τα κυρίαρχα συμπτώματα είναι βοθρίωση και αυλακώσεις στο ξύλο του υποκειμένου, του εμβολίου ή και των δύο, ενώ μπορεί να εμφανιστεί μια τοπική διόγκωση επάνω από το σημείο εμβολιασμού. Η βοθρίωση του ξύλου της αμπέλου αποτελείται από τέσσερα διαφορετικά σύνδρομα ή ασθένειες οι οποίες διακρίνονται από τα συμπτώματα που προκαλούνται σε τρεις διαφορετικούς δείκτες Vitis (LN33, V. rupestris και Kober 5BB) (Garau et al 1997) (Πίνακας 1.5). Τα σύνδρομα είναι: 1. Η βοθρίωση κορμού του Rupestris (Rupestris stem pitting, RSP) 2. Η αυλάκωση κορμού του Kober 5BB (Kober stem grooving, KSG) 3. Ο φελλώδης φλοιός (Corky bark, CB) 4. Η αυλάκωση κορμού του LN33 (LN33 stem grooving, LNSG) Πίνακας 1.5. Συμπτώματα που προκαλούνται σε τρεις διαφορετικούς δείκτες από τα τέσσερα σύνδρομα της βοθρίωσης του ξύλου. Σύνδρομο Φυτοδείκτης LN33 V. Rupestris cv. St. George CB RSP KSG LNSG Αυλάκωση και βοθρίωση κορμού, διόγκωση των μεσογονάτιων διαστημάτων Αυλάκωση και βοθρίωση κορμού - - Βοθρίωση κάτω από το σημείο εμβολιασμού Kober 5BB - - (-)= Χωρίς συμπτώματα αυλάκωση και βοθρίωση κορμού - - αυλάκωση κορμού Αιτιολογία Έχουν απομονωθεί πέντε ιοί από πρέμνα με συμπτώματα βοθρίωσης. Τέσσερις viti-ιοί (GVA, GVB, GVC και GVD) (Martelli et al., 1997) και ένας fovea-ιός, ο GRSPaV (Zhang et al., 1998) ή ο σχετιζόμενος με την βοθρίωση του κορμού του Rupestris ιός-1 (Rupestris stem pitting associated virus-1, RSPaV-1) (Meng et al., 1998). Από αυτούς ο GVA σχετίζεται με την αυλάκωση κορμού του Kober 5BB (KSG) (Digiaro et al., 1994, Garau et al., 1994), ο GVB με τον φελλώδη φλοιό (CB) (Bonavia et al., 1996) και ο RSPaV-1 με την βοθρίωση κορμού του Rupestris (RSP) (Meng et al 1999). O GVD δεν βρέθηκε να σχετίζεται με κάποιο από τα τέσσερα σύνδρομα της βοθρίωσης (Boscia et al., 2001). Η δυνατότητα μηχανικής μετάδοσης των viti-ιών σε Nicotiana spp. βοήθησε στην απομόνωση και το γρήγορο χαρακτηρισμό τους, ενώ ο χαρακτηρισμός του RSPaV- 1 καθυστέρησε εξαιτίας της αδυναμίας μηχανικής μετάδοσης του σε φυτοδείκτες. Ο - 30

35 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση χαρακτηρισμός του RSPaV-1 έγινε με απομόνωση dsrna από πρέμνα που εμφάνιζαν το σύνδρομο RSP και το σύνολο του γονιδιώματός του (8.726 νουκλεοτίδια) δημοσιεύτηκε το 1998 παράλληλα σε δύο διαφορετικές δημοσιεύσεις (Zhang et al., 1998, Meng et al., 1998). O ιός είναι νηματοειδής, μήκους 800 nm με ΚΠ 28 kda και ανήκει στο γένος Foveavirus. Ο προσδιορισμός της αλληλουχίας των βάσεων πολλών απομονώσεων του ιού έδειξε μεγάλη παραλλακτικότητα (75-93% ομολογία στην αλληλουχία των βάσεων του γονιδιώματος τους) υποδηλώνοντας την παρουσία πολλών παραλλαγών (variants) του ιού (Meng et al., 1999). Φαίνεται να είναι από τους πιο διαδομένους ιούς της αμπέλου (Meng et al., 1999). Στην Πορτογαλία βρέθηκε σε 246 από σύνολο 288 δειγμάτων (ποσοστό 85%) (Nolasco et al., 2000) Μετάδοση Η βοθρίωση του ξύλου της αμπέλου μεταδίδεται κυρίως με τον εμβολιασμό και τον αγενή πολλαπλασιασμό. Παρατηρήθηκε επίσης εξάπλωση της για πρώτη φορά σε αμπελώνες στο Μεξικό (Teliz et al., 1980). Σύντομα παρουσιάστηκαν πειραματικά δεδομένα για την μετάδοση των GVA και GVB με Pseudococcus spp. και Planococcus spp. Συγκεκριμένα ο GVA μεταδόθηκε με τα Planococcus citri και P. ficus (Rosciglione & Castellano 1985, Engelbrecht & Kasdorf 1990). Ο GVB μεταδόθηκε από Planococcus ficus (Boscia et al., 1993), ενώ το Pseudococcus affinis, μετέδωσε και τους δύο (GVA και GVB) (Garau et al., 1995). Η μετάδοση του GVA από το Pseudococcus longispinus αναφέρθηκε να γίνεται με ημι-έμμονο τρόπο (La Notte et al., 1997). Πρόσφατα αναφέρθηκε μετάδοση του GVA με το Neopulvinaria innumerabilis (Fortusini et al., 1997). Μέχρι στιγμής δεν έχει αναφερθεί φορέας του RSPaV-1 ενώ υπάρχουν ενδείξεις για πιθανή μετάδοσή του με τη γύρη καθώς ανιχνεύτηκε σε γυρεόκοκκους ακόμα και μετά από μεταχείρισή τους με 1% sodium dodecyl sulphate (SDS) (Rowani et al., 2000b) Διάγνωση α) Βιολογικός έλεγχος Η διάγνωση γίνεται με παρατήρηση τυπικών συμπτωμάτων της ασθένειας μετά τον εμβολιασμό των υπό έλεγχο δειγμάτων στους φυτοδείκτες LN33, V. Rupestris και Kober 5BB (Πίνακας 5). Ο βιολογικός έλεγχος εφαρμόζεται ευρέως παρόλο που είναι χρονοβόρα διαδικασία (έως τρία χρόνια), έχει αυξημένο κόστος και δεν είναι αξιόπιστος (Minafra 2000). Παρόλα αυτά είναι απαραίτητη, προς το παρόν, η εφαρμογή του σε προγράμματα κλωνικής επιλογής συμπληρωματικά με τις υπόλοιπες μεθόδους ανίχνευσης. Με την ανάπτυξη των μοριακών μεθόδων ανίχνευσης διαπιστώθηκε ευρεία διάδοση του RSPaV-1 στις συλλογές του V. rupestris, που χρησιμοποιούνται ως δείκτες για την ασθένεια (πιθανά από ήπιες φυλές του RSPaV-1), με αποτέλεσμα να είναι υπό αμφισβήτηση η αξιοπιστία προηγούμενων βιολογικών ελέγχων (Meng et al., 2000a, Minafra et al., 2001). 31

36 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση β) Ορολογικός έλεγχος Η δυνατότητα μηχανικής μετάδοσης των viti-ιών σε Nicotiana spp. βοήθησε στην απομόνωσή τους και την παραγωγή πολυκλωνικών αντισωμάτων γεγονός που επιτρέπει την εξειδικευμένη ανίχνευση τους με ορολογικές μεθόδους. Όμως, οι viti-ιοί προκαλούν μικρή ανοσοαπόκριση με αποτέλεσμα συχνά να παράγεται αντιορός με χαμηλό τίτλο ακατάλληλος για χρήση στην ELISA (Boscia et al., 1997). Η παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων οδήγησε στην εφαρμογή πιο αξιόπιστων δοκιμών ELISA και για τους δύο ιούς (Boscia et al., 1992, Boscia et al., 1994, Bonavia et al., 1996). Επίσης, οι viti-ιοί όπως και οι clostero-ιοί βρίσκονται σε χαμηλές συγκεντρώσεις στους ιστούς της αμπέλου και έχουν παρόμοια κατανομή, γι αυτό και για την αξιόπιστη ανίχνευση τους με ELISA συνιστάται η χρήση φλοιώματος ξύλου κατά τη διάρκεια του χειμώνα (λήψη ξυσμάτων του καμβίου μετά την απομάκρυνση του φλοιού). Αύξηση της ευαισθησίας ανίχνευσης του GVA είναι δυνατή με την εφαρμογή ενός πρωτοκόλλου DAS-ELISA σε πλάκες επιστρωμένες με πρωτεΐνη Α, και τη χρήση μονοκλωνικού συζευγμένου αντισώματος (Boscia et al., 1992) η οποία επιτρέπει την ανίχνευση το ιού σε μίσχους ώριμων φύλλων και φλοίωμα ώριμου ξύλου (Boscia et al 1997). Παρ όλες τις βελτιώσεις όμως εμφανίζονται προβλήματα στην βελτιστοποίηση της τεχνικής και καλή επαναληψιμότητα των δοκιμών δεν έχει επιτευχθεί (Boscia et al 1997). Η ανίχνευση του GVB είναι πιο αξιόπιστη και ευαίσθητη με τη χρησιμοποίηση μονοκλωνικών αντισωμάτων σε πρωτοκόλλα ΤAS-ELISA (Boscia et al., 1994), όμως δεν ανιχνεύτηκαν επιτυχώς με αυτά, όλες οι απομονώσεις του ιού (Boscia et al., 1997). Η ανίχνευση του ιού γίνεται πιο αξιόπιστη χρησιμοποιώντας φλοιώμα ώριμου ξύλου το φθινόπωρο, ενώ είναι δυνατή και σε μίσχους φύλλων το φθινόπωρο (Bonavia et al., 1996). Το ίδιο πρωτόκολλο ELISA χρησιμοποιήθηκε επίσης για την αξιόπιστη ανίχνευση του GVD με μονοκλωνικά αντισωμάτα (Boscia et al 2001). Προβλήματα υπάρχουν στην ορολογική ανίχνευση του RSPaV-1 καθώς δεν είναι μηχανικά μεταδιδόμενος, δεν έχει απομονωθεί, ενώ τα ιοσωμάτια του δεν έχουν παρατηρηθεί ποτέ. Παρ όλα αυτά έγιναν προσπάθειες για την παρασκευή πολυκλωνικών αντισωμάτων μετά από έκφραση της καψιδιακής πρωτεΐνης του ιού σε βακτήρια (Minafra et al., 2001, Meng et al 2000b) με βάση τη γνώση της αλληλουχίας της, αλλά τα αντισώματα είναι ακατάλληλα για χρήση στη δοκιμή ELISA, ενώ είναι κατάλληλα για αποτύπωση Western. Οι δοκιμές ανίχνευσης έδειξαν μεγαλύτερη συγκέντρωση του αντιγόνου σε εκχυλίσματα από φλοίωμα ξύλου παρά σε εκχυλίσματα μίσχων, ενώ δεν εμφάνιζε σημαντικές διακυμάνσεις από τον Ιούνιο μέχρι τον Οκτώβριο (Minafra et al., 2001). γ) Μοριακοί έλεγχοι Με την ανάπτυξη των μοριακών μεθόδων έγινε δυνατός ο χαρακτηρισμός και η ανίχνευση του RSPaV-1, ενώ εφαρμόστηκαν πιο αξιόπιστες και ευαίσθητες μέθοδοι ανίχνευσης των viti-ιών. 32

37 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση Ανάλυση δίκλωνου RNA Είναι μη εξειδικευμένη μέθοδος έλεγχου και χρησιμοποιήθηκε για το μοριακό χαρακτηρισμό του RSPaV-1 από πρέμνα με συμπτώματα του συνδρόμου RSP (Zhang et al., 1998, Meng et al., 1998). Μοριακός υβριδισμός Έχει χρησιμοποιηθεί στο παρελθόν κυρίως για την ανίχνευση των GVA (Galiteli et al., 1985, Minafra et al., 1992, Saldarelli et al., 1994) και GVB (Saldarelli et al., 1993, Saldarelli et al., 1994) εξαιτίας των προβλημάτων ευαισθησίας και αξιοπιστίας των ορολογικών μεθόδων. Με την παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων η μέθοδος ELISA αντικατέστησε πλήρως την υβριδοποίηση καθώς η πρώτη έχει παρόμοια ευαισθησία, χαμηλότερο κόστος και είναι πιο πρακτική για μαζικούς ελέγχους. Αντίστροφη Μεταγραφή-Αλυσιδωτή Αντίδραση της Πολυμεράσης H υψηλή ευαισθησία της RT-PCR έδωσε τη δυνατότητα για αξιόπιστη ανίχνευση των GVA και GVB σε φύλλα αμπέλου αλλά και έντομα φορείς (κοκκοειδή) (Minafra et al., 1992, Minafra & Hadidi 1994, Chevalier et al., 1995, Rowhani et al., 1997). Αναφορά υπάρχει επίσης και για την ανίχνευση του GVD με PCR (Abou-Ghanem et al., 1997). Η μεγαλύτερη ευαισθησία και αξιοπιστία της PCR σε σχέση με την ELISA, καθιστούν την μέθοδο ελκυστική για την ανίχνευση των GVA και GVB (Gugerli 2000). Το πρόβλημα των αναστολέων της PCR που υπάρχουν στους ιστούς της αμπέλου απαιτεί χρονοβόρες διαδικασίες προετοιμασίας των δειγμάτων και αποτελεί ανασταλτικό παράγοντα για το μαζικό έλεγχο δειγμάτων. Ένα απλό πρωτόκολλο αποτύπωσης φυτικού εκχυλίσματος σε νάιλον μεμβράνη η οποία χρησιμοποιείται μετά από θερμική επεξεργασία στην RT-PCR, εφαρμόστηκε επιτυχώς για τους GVA και GVB (La Notte et al., 1997). Έχουν αναπτυχθεί επίσης πιο σύνθετες τεχνικές PCR για την ανίχνευση των viti-ιών με στόχο τη μείωση του κόστους των ελέγχων, όπως η πολλαπλή PCR για την ταυτόχρονη ανίχνευση των GVB και GLRaV-3 (Minafra & Hadidi. 1994) των GVA και GLRaV-3 (La Notte et al., 1997) των GVB, GVA και GLRaV-3, (Nassuth et al 2000). To μεγαλύτερο όμως πρόβλήμα των προαναφερθέντων τεχνικών PCR είναι η μεγάλη γενετική παραλλακτικότητα των πληθυσμών των ιών που εμπλέκονται στη βοθρίωση της αμπέλου, με αποτέλεσμα η επιλογή εκκινητών με μεγάλο εύρος ανίχνευσης, με βάση τις υπάρχουσες πληροφορίες για τις αλληλουχίες των ιών, να είναι δύσκολή έως αδύνατη. Μεγάλη γενετική παραλλακτικότητα έχει αναφερθεί για τον GVB με διαφορές ομολογίας των αλληλουχιών των βάσεων του γονιδιώματος μεταξύ των απομονώσεων να ανέρχονται έως 20% (Shi et al., 2000). Νέοι εκκινητές με μεγαλύτερο εύρος ανίχνευσης προτάθηκαν πρόσφατα για την ανίχνευση του GVA (De Meyer 2000). Έχουν γίνει επίσης προσπάθειες αξιολόγησης τουλάχιστον πέντε ζευγών εκκινητών για τη δυνατότητα ανίχνευσης πολλών παραλλαγών του RSPaV-1 (Zhang et al., 1998, Meng et al., 1999, Nolasko et al., 2000). Στο σύνολο όμως των δοκιμών, το εύρος ανίχνευσης ήταν περιορισμένο με το καλύτερο ζεύγος εκκινητών να επιτρέπει την ανίχνευση του 84% των απομονώσεων του RSPaV-1 (Meng et al., 1999, Nolasco et al., 2000). Για το λόγο αυτό προτάθηκε η χρήση δύο διαφορετικών ζευγών εκκινητών σε δύο διαφορετικές 33

38 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση δοκιμές και η ένωση των αποτελεσμάτων, με αποτέλεσμα να ανιχνεύεται το 96% των απομονώσεων (Nolasco et al., 2000). Τα προβλήματα διάγνωσης οφείλονται στη μεγάλη γενετική παραλλακτικότητα των πληθυσμών του RSPaV-1, βάση της οποίας προτάθηκε ότι ο ιός έχει πολλές παραλλαγές οι οποίες μπορεί να έχουν μεταξύ τους έως και 25% διαφορές στην ομολογία των αλληλουχιών των βάσεων του γονιδιώματός τους (Rowhani et al., 2000b, Soares et al., 2000, Meng et al., 1999). Μεγάλη γενετική παραλλακτικότητα έχει αναφερθεί επίσης και για άλλους δύο fovea-ιούς, τους ASPV (Rott & Jelkmann 2001) και ApLV (Gentit et al., 2001), οι οποίοι δεν προσβάλλουν το αμπέλι, υποδηλώνοντας ότι οι ιοί του γένους αυτού αποτελούν ο κάθε ένας, πληθυσμούς με στενά συγγενικές παραλλαγές. Αυτό πιθανώς οφείλεται στο γεγονός ότι οι ξενιστές τους είναι πολυετή φυτά, καθώς και στην απουσία φορέα, με αποτέλεσμα την αύξηση της γενετικής παραλλακτικότητας των πληθυσμών του ιού στα φυτά με το πέρασμα των χρόνων. Όμως αυτή η γενετική παραλλακτικότητα δημιουργεί σοβαρά προβλήματα στην επιλογή εκκινητών μεγάλου εύρους ανίχνευσης για την PCR. Ενδιαφέρον έχει η αναφορά για την ταυτόχρονη μη εξειδικευμένη ανίχνευση ιών των γενών Vitivirus και Trichovirus με τη χρήση δύο εκκινητών με μεγάλο εκφυλισμό, οι οποίοι στοχεύουν στο γονίδιο που κωδικοποιεί την πολυμεράση (RdRp) των ιών και πολλαπλασιάζουν μια περιοχή περίπου 360 ζβ όλων των viti- και μερικών tricho-ιών (Saldarelli et al., 1998). Όμως η μέθοδος αυτή έχει χαμηλή ευαισθησία και εξειδίκευση εξαιτίας της χρήσης εκκινητών με μεγάλο εκφυλισμό, απαιτεί την εκχύλιση ολικού RNA ή dsrna και στη συνέχεια, ανίχνευση των προϊόντων της PCR με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμίδης και βαφή αργύρου. Όλα αυτά καθιστούν τη μέθοδο δύσχρηστη και αναξιόπιστη ως διαγνωστική τεχνική, ενώ παραμένει χρήσιμη για την μοριακή μελέτη άγνωστων viti-ιών Αντιμετώπιση της ασθένειας Η κλωνική επιλογή και η παραγωγή υγιούς πολλαπλασιαστικού υλικού, είναι προς το παρόν, η πιο αποτελεσματική μέθοδος αντιμετώπισης της ασθένειας. Δυστυχώς κατά την κλωνική επιλογή είναι δύσκολη η επισήμανση πρέμνων που είναι απαλλαγμένα από τη βοθρίωση, καθώς σε αρκετές περιπτώσεις είναι λανθάνουσα αλλά και εξαιτίας της ευρύτατης διάδοσης της ασθένειας. Συνεπώς απαραίτητος είναι ο ιολογικός έλεγχος των επιλεγμένων πρέμνων με ορολογικές, μοριακές και βιολογικές μεθόδους (εμβολιασμός στους φυτοδείκτες LN33, V. Rupestris και Kober 5BB). Στη συνέχεια τα προσβλημένα πρέμνα εξυγιαίνονται με in vitro καλλιέργεια ακραίου μεριστώματος ή και σε συνδυασμό με θερμοθεραπεία (Gribaudo et al., 1997) και τα έκφυτα επανελέγχονται για την παρουσία ιών. Δυστυχώς οι δυσκολίες του μακροχρόνιου βιολογικού ελέγχου και η έλλειψη ειδικών αντισωμάτων για το σύνολο των ιών που σχετίζονται με την ασθένεια, δυσκολεύουν τον ιολογικό έλεγχο των μητρικών φυτειών για την παρουσία της ασθένειας. 34

39 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση 1.6 Παραγωγή πιστοποιημένου πολλαπλασιαστικού υλικού αμπέλου Διεθνώς, τα τελευταία χρόνια, υπήρξε μια σταδιακή υποβάθμιση της φυτοϋγιεινής κατάστασης των δενδρωδών καλλιεργειών (γιγαρτόκαρπα, πυρηνόκαρπα, εσπεριδοειδή και αμπέλι). Οι κύριες αιτίες ήταν: α) αύξηση της ζήτησης και εμπορίας πολλαπλασιαστικού υλικού σε εθνικό και διεθνές επίπεδο, β) ανεπαρκής γνώση των φυτοϋγειονομικών προβλημάτων πολλών καλλιεργειών, γ) ύπαρξη ξενιστών με λανθάνουσες μολύνσεις, δ) έλλειψη κατάλληλου φυτοϋγειονομικού ελέγχου του πολλαπλασιαστικού υλικού που διακινούνταν και αναποτελεσματικότητα των συστημάτων καραντίνας στις διάφορες χώρες (Martelli & Walter 1998). Οι αναφορές της επιστημονικής κοινότητας, η κατανόηση των σοβαρών προβλημάτων παραγωγής που εκπορεύονται από την υποβάθμιση αυτή καθώς και η αυξανόμενη ζήτηση από τους παραγωγούς για πολλαπλασιαστικό υλικό καλύτερης ποιότητας, οδήγησαν πολλές χώρες στη δημιουργία ή στον επανασχεδιασμό προγραμμάτων πιστοποίησης πολλαπλασιαστικού υλικού. Η πιστοποίηση είναι διαδικασία η οποία καθορίζεται από επίσημους κανονισμούς ή αρμόδιες κρατικές υπηρεσίες, όπου οι υποψήφιες μητρικές φυτείες δέχονται τακτικούς ελέγχους και επεμβάσεις που εγγυώνται την ταυτότητα του πολλαπλασιαστικού υλικού και την απουσία παθογόνων. Η πιστοποίηση της αμπέλου: Η υποβάθμιση της φυτοϋγείας των καλλιεργειών της αμπέλου σε όλα τα αμπελουργικά κράτη της Ευρωπαϊκής Ένωσης κυρίως εξαιτίας των ιώσεων, οδήγησε στην έκδοση της οδηγίας 68/93 Marketing of vegetatively propagated material of grapevines η οποία ταξινομεί το πολλαπλασιαστικό υλικό στις κατηγορίες "βασικό", "πιστοποιημένο" και "κοινό" και έδινε στοιχεία για τα φυτοϋγειονομικά χαρακτηριστικά των μητρικών φυτειών που παράγουν την κάθε κατηγορία. Στη συνέχεια, η οδηγία 71/40 προσδιόριζε τις απαιτήσεις φυτοϋγείας στους αμπελώνες παραγωγής βασικού υλικού, όπου επιβλαβείς ιώσεις, όπως ο μολυσματικός εκφυλισμός και η συστροφή (καρούλιασμα) των φύλλων, πρέπει να εκριζωθούν ενώ στις φυτείες παραγωγής υλικού των άλλων κατηγοριών πρέπει να απουσιάζουν φυτά με συμπτώματα ιολογικών ασθενειών. Μετά από τις δύο οδηγίες, εθνικά προγράμματα πιστοποίησης πραγματοποιούνται σε πολλές χώρες μέλη της Ε.Ε., με πολύ ικανοποιητικά αποτελέσματα στη Γαλλία, Γερμανία και Ιταλία, χώρες με μεγάλη παράδοση στην πιστοποίηση πολλαπλασιαστικού υλικού. Πρόσφατα μία ομάδα επιστημόνων μέλη του Διεθνούς συμβουλίου για τη μελέτη των ιολογικών ασθενειών της αμπέλου (International Council for the study of Virus and virus-like diseases of the Grapevine, ICVG), εξέτασε την παρούσα κατάσταση της πιστοποίησης στις χώρες της Ε.Ε. και πρότεινε ένα σχήμα παραγωγής Π.Υ. αμπέλου που να ενοποιεί τις διαδικασίες που εφαρμόζονται στα κράτη μέλη της Ε.Ε. Tο πρωτόκολλο ταξινομεί το πολλαπλασιαστικό υλικό σε τέσσερις κατηγορίες με συγκεκριμένα χαρακτηριστικά: "προβασικό", "βασικό", "πιστοποιημένο" και "κοινό" (Martelli & Walter 1998). Για να εγγραφεί και να πιστοποιηθεί ένας κλώνος πρέπει να είναι αποτέλεσμα κλωνικής επιλογής και να είναι απαλλαγμένος από τις παρακάτω ασθένειες. 35

40 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση Μολυσματικό εκφυλισμό (Grapevine fanleaf virus) και άλλων ευρωπαϊκών ιών Nepovirus. Καρούλιασμα των φύλλων. Βοθρίωση του ξύλου (Rugose wood complex) Ιό της κηλίδωσης του φύλλου της αμπέλου (Grapevine fleck virus). Ίκτεροι της αμπέλου (Yellows diseases). 1.7 Σκοπός της εργασίας Η σπουδαιότητα της αμπελοκαλλιέργειας στην Ε.Ε. και την Ελλάδα ειδικότερα, σε συνδυασμό με τις επερχόμενες αλλαγές και αυξημένες απαιτήσεις στο χώρο της πιστοποίησης πολλαπλασιαστικού υλικού καθιστούν αναγκαία την ύπαρξη τεχνικών για την ανίχνευση και χαρακτηρισμό των ιών της αμπέλου. Η αξιοπιστία και ευαισθησία της ανίχνευσης, το μικρό κόστος και η δυνατότητα εφαρμογής μαζικών ιολογικών ελέγχων είναι μεταξύ άλλων από τους βασικούς παράγοντες για την υλοποίηση και επιτυχία ενός προγράμματος πιστοποίησης πολλαπλασιαστικού υλικού. Με βάση τη διεθνή βιβλιογραφία, παρά την εντυπωσιακή αύξηση των γνώσεων σε ότι αφορά την αιτιολογία του καρούλιασματος των φύλλων και της βοθρίωσης του ξύλου της αμπέλου καθώς και τον χαρακτηρισμό πολλών ιών που σχετίζονται με τις ασθένειες αυτές, ο έλεγχος του πολλαπλασιαστικού υλικού παραμένει μια διαδικασία σύνθετη και συχνά με μικρή αξιοπιστία. Ο μεγάλος αριθμός των ιών που σχετίζονται με τις δύο ασθένειες και τα μειονεκτήματα των διάφορων δοκιμών ανίχνευσης, καθιστούν τον έλεγχο επίπονο, χρονοβόρο, και με υψηλό κόστος. Επίσης, η συνεχιζόμενη ανακάλυψη νέων clostero-και viti-ιών συνηγορεί στη μεγάλη πιθανότητα παρουσίας και άλλων άγνωστων ιών που ανήκουν στα γένη αυτά και για τα οποία προς το παρόν δεν υπάρχει δυνατότητα ανίχνευσης. Ανάλογα προβλήματα διάγνωσης δεν παρουσιάζονται για τους ιούς που εμπλέκονται στις εκφυλιστικές ασθένειες της αμπέλου καθώς και για τον ιό της κηλίδωσης του φύλλου της αμπέλου, αφού η ανίχνευση τους είναι αξιόπιστη και γίνεται εύκολα με την μέθοδο ELISA. Με βάση τα παραπάνω η παρούσα διατριβή κύριο στόχο είχε την ανάπτυξη αξιόπιστων μεθόδων ανίχνευσης και το χαρακτηρισμό ιών που σχετίζονται με τη συστροφή των φύλλων και την βοθρίωση του ξύλου της αμπέλου. Στην αρχή, έγινε προσπάθεια να ελεγχθούν φυτά αμπέλου προερχόμενα από κλωνική επιλογή, για την παρουσία ιών, με εφαρμογή των διαθέσιμων μοριακών και ορολογικών τεχνικών, με στόχο τη συλλογή απομονώσεων ιών των γενών Closterovirus, Foveavirus και Vitivirus. Στη συνέχεια, αναπτύχθηκε μια μέθοδος εστιασμένης RT-PCR με εκφυλισμένους εκκινητές για την ταυτόχρονη ανίχνευση ιών που ανήκουν στα γένη Foveavirus και Vitivirus. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιεί μια απλουστευμένη και αξιόπιστη μέθοδο επεξεργασίας των δειγμάτων και με μια δοκιμή ανιχνεύει ταυτόχρονα τους RSPaV-1, GVA, GVB, και GVD στο αμπέλι, ενώ θεωρητικά είναι δυνατή η ανίχνευση και άλλων μελών που ανήκουν στα γένη Foveavirus και Vitivirus. Επίσης αναπτύχθηκε επιτυχώς 36

41 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση μια ακόμη μέθοδος εστιασμένης RT-PCR για την πολλαπλή ανίχνευση ιών που ανήκουν στα γένη Closterovirus, Foveavirus και Vitivirus με μια καινοτομία που αφορά τη χρήση εκφυλισμένων εκκινητών οι οποίοι περιέχουν δεοξυινοσίνη μαζί με ομόλογους εκκινητές που περιέχουν δεοξυγουανοσίνη. Οι δύο μέθοδοι αξιολογήθηκαν ελέγχοντας κατά τη διάρκεια του έτους, φυτά αγρού γνωστής ιολογικής κατάστασης. Τέλος, έγινε προσπάθεια μερικού χαρακτηρισμού και εξειδικευμένης ανίχνευσης ενός νέου closteroιού που ανακαλύφθηκε κατά τη διάρκεια ανάπτυξης των παραπάνω μεθόδων ανίχνευσης. 37

42 Κεφ. 2. Ιολογικός έλεγχος βιότυπων αμπέλου ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Ιολογικός έλεγχος βιότυπων αμπέλου προερχόμενων από α) διαδικασία κλωνικής επιλογής και β) συλλογή αυτόχθονων ποικιλιών 38

43 Κεφ. 2. Ιολογικός έλεγχος βιότυπων αμπέλου Κεφάλαιο 2. Ιολογικός έλεγχος βιότυπων αμπέλου προερχόμενων από α) διαδικασία κλωνικής επιλογής και β) συλλογή αυτόχθονων ποικιλιών 2.1 Περίληψη Βιότυποι οινοποιήσιμων ποικιλιών αμπέλου (Vitis vinifera L.) προερχόμενοι α) από διαδικασία κλωνικής επιλογής ορισμένων σημαντικών ποικιλιών του Ελληνικού αμπελώνα και β) από συλλογή αυτόχθονων ποικιλιών, κυρίως από τη Μακεδονία, τη Θράκη και την Ήπειρο, ελέγχθηκαν για την παρουσία ιών. Ο ιολογικός έλεγχος έγινε σε κληματίδες που συλλέχθηκαν κατά το χειμερινό κλάδεμα καρποφορίας. Ελέγχθηκαν δείγματα ξύλου (φλοίωμα), ορολογικώς με την μέθοδο ELISA για την παρουσία του ιού του ριπιδωτού φύλλου της αμπέλου (Grapevine fanleaf virus, GFLV), του ιού των μαύρων δακτυλίων της τομάτας (Tomato black ring virus, TBRV), του ιού του μωσαϊκού του Arabis (Arabis mosaic virus, ArMV), των ιών-1,-2,-3,-5,-6 και -7 που σχετίζονται με την ασθένεια της συστροφής των φύλλων της αμπέλου (Grapevine leafroll-associated virus -1,-2,-3,-5,-6,-7, GLRaV -1,- 2,-3,-5,-6,-7), του ιού της κηλίδωσης της αμπέλου (Grapevine fleck virus, GFkV) και των ιών Α και Β της αμπέλου (Grapevine A, B, GVA, GVB). Τέλος, 37 πρέμνα ελέγχθηκαν με RT-PCR χρησιμοποιώντας δύο ζεύγη εκκινητών για την παρουσία στελεχών του RSPaV-1. Τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική παρουσία των GFkV (43%), GLRaV-2 (23%), GLRaV-3 (23,7%), GLRaV-1 (15%), GVA (23%) και GFLV (9,3%). Μικρή ήταν η συχνότητα παρουσίας των: GLRaV-7 (6%), GVB (1,7%), GLRaV-5 (3,4%), και GLRaV-6 (3,4%), ενώ δεν ανιχνεύτηκε ο ArMV. Τέλος παρατηρήθηκε υψηλή συχνότητα παρουσίας στελεχών του RSPaV-1 σε ποσοστό (78%). Τα αυστηρότερα κριτήρια της κλωνικής επιλογής είχαν ως αποτέλεσμα την επιλογή υλικού με μικρότερο ποσοστό προσβολής των GLRaV-1, -2, -3, -7 και GVA σε σχέση με το υλικό της συλλογής αυτόχθονων ποικιλιών. Τα δεδομένα αυτά επιβεβαιώνουν τα σημαντικά ιολογικά προβλήματα που παρουσιάζονται όταν η επιλογή του πολλαπλασιαστικού υλικού αμπέλου γίνεται με βάση μόνο την απουσία συμπτωμάτων. 2.2 Εισαγωγή H παραγωγή πιστοποιημένου πολλαπλασιαστικού υλικού μετά από κλωνική επιλογή είναι προς το παρόν η πιο αποτελεσματική μέθοδος αντιμετώπισης των ιολογικών ασθενειών της αμπέλου. Σημαντικό τμήμα της διαδικασίας κλωνικής επιλογής είναι οι ιολογικοί έλεγχοι οι οποίοι στην περίπτωση της αμπέλου είναι επίπονοι και με αυξημένο κόστος. Στη συγκεκριμένη εργασία, βιότυποι οινοποιήσιμων ποικιλιών (Vitis vinifera L.) προερχόμενοι α) από διαδικασία κλωνικής επιλογής ορισμένων από τις πιο σημαντικές οινοποιήσιμες ποικιλίες των Ελληνικών αμπελώνων και β) από τη συλλογή αυτόχθονων ποικιλιών, κυρίως από τη Μακεδονία, τη Θράκη και την Ήπειρο, ελέγχθηκαν για την παρουσία ιών, με την εφαρμογή μοριακών και ορολογικών τεχνικών. 39

44 Κεφ. 2. Ιολογικός έλεγχος βιότυπων αμπέλου Σκοπός της εργασίας ήταν η διερεύνηση της παρουσίας των ιών σε πρέμνα μετά την κλωνική επιλογή ή τη διαδικασία συλλογής αυτόχθονων ποικιλιών, η επιλογή πρέμνων με προσβολή από παραλλαγές του RSPaV-1, πρέμνων με μονές προσβολές από clostero-ιούς, η συλλογή απομονώσεων των GVA και GVB και η επισήμανση των προβλημάτων διάγνωσης. 2.3 Υλικά και μέθοδοι Aντιδραστήρια Tα χημικά που χρησιμοποιήθηκαν προέρχονταν από τις παρακάτω εταιρείες: Διάφορα χημικά: Sigma Ένζυμα, αντιδραστήρια μοριακής βιολογίας (εκκινητές, dntps κλπ): Life Technologies TM MD HΠΑ, New England Biolabs Inc. ΗΠΑ, Finnzymes Φιλανδία. Αντισώματα: Agritest Ιταλία, Sanofi Γαλλία, Bioreba ΑG Eλβετία Φυτικό υλικό Τα δείγματα ήταν ευγενική χορηγία της εταιρίας ΒΙΤΡΟ ΕΛΛΑΣ Α.Ε., και η συλλογή τους έγινε από την Χ. Σπινθηροπούλου. Α) Κλωνική επιλογή: Για τη συγκεκριμένη διαδικασία κλωνικής επιλογής χρησιμοποιήθηκε πρωτόκολλο (Πρωτόκολλο ΒΙΤΡΟ) που βασίστηκε στο γαλλικό (Chambres d Agriculture, 1981) και ιταλικό πρότυπο (Fregoni, 1998) καθώς και σε αυτό του Εργαστηρίου Αμπελολογίας του Γ.Π.Α. Η κλωνική επιλογή πριν από τον ιολογικό έλεγχο περιλαμβάνει την επισήμανση των βιότυπων η οποία βασίστηκε κυρίως στα χαρακτηριστικά των βοτρύων και έλαβε υπόψη της τα επιθυμητά χαρακτηριστικά της ποικιλίας και την απουσία εμφανών ιολογικών συμπτωμάτων. Τα αμπελογραφικά και αγρονομικά χαρακτηριστικά των επισημασμένων πρέμνων καταγράφηκαν για μία τριετία, ενώ ταυτόχρονα πραγματοποιήθηκαν αμπελομετρικές μετρήσεις στα πλήρως ανεπτυγμένα φύλλα. Οι βιότυποι διατηρήθηκαν στον αγρό. Έγινε ιολογικός έλεγχος 38 βιότυπων από 14 ποικιλίες. Β) Συλλογή αυτόχθονων ποικιλιών: Ως κριτήριο επιλογής αντιπροσωπευτικών πρέμνων για την συλλογή αυτόχθονων ποικιλιών και κλώνων ήταν τα αμπελογραφικά και αγρονομικά χαρακτηριστικά. Έγινε παράλληλη προσπάθεια επιλογής με κριτήριο την απουσία ιολογικών συμπτωμάτων ενώ σε ελάχιστες περιπτώσεις λήφθηκαν και φυτά με ήπια συμπτώματα πιθανών ιολογικών προσβολών. Η επισήμανση των πρέμνων έγινε κατά την πλήρη (βιομηχανική) ωρίμανση των βοτρύων και σε αντίθεση με την κλωνική επιλογή η παρατήρηση αφορούσε ένα έτος. Έγινε ιολογικός έλεγχος 80 βιότυπων από 50 ποικιλίες. Χρησιμοποιήθηκε φλοίωμα από κληματίδες που συλλέχθηκαν κατά το χειμερινό κλάδεμα καρποφορίας. Κάθε δείγμα αποτελούνταν από τρεις κληματίδες από διάφορα 40

45 Κεφ. 2. Ιολογικός έλεγχος βιότυπων αμπέλου σημεία της κόμης του πρέμνου οι οποίες διατηρήθηκαν για μερικές εβδομάδες στους 0-4 o C μέχρι να ελεγχθούν Δοκιμές ELISA Χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος ELISA με εμπορικά διαγνωστικά σκευάσματα (Πίνακας 2.1) έναντι των ιών: Ριπιδωτό φύλλο της αμπέλου (Grapevine fanleaf virus, GFLV) Ιός του μωσαϊκού του Arabis (Arabis mosaic virus, ArMV) Ιοί -1,-2,-3,-5,-6 και -7 που σχετίζονται με την ασθένεια της συστρφής των φύλλων της αμπέλου (Grapevine leafroll-associated virus -1,-2,-3,-5,-6,-7, GLRaV-1,-2,-3,- 5,-6,-7) Ιός της κηλίδωσης της αμπέλου (Grapevine fleck virus, GFkV) Ιοί Α και Β της αμπέλου (Grapevine A, B, GVA, GVB) Πίνακας 2.1 Τύπος ELISA που χρησιμοποιήθηκε και προέλευση διαγνωστικών σκευασμάτων ανίχνευσης των διάφορων ιών Ιός Τύπος ELISA Προέλευση αντισωμάτων GVA DAS* Agritest, Ιταλία GVB TAS Agritest, Ιταλία GLRaV-1 DAS Agritest, Ιταλία GLRaV-2 DAS Agritest, Ιταλία GLRaV-2 Biotin-streptavidin Sanofi, Γαλλία GLRaV-3 DAS Agritest, Ιταλία GLRaV-5 Biotin-streptavidin Sanofi, Γαλλία GLRaV-6 DAS Bioreba ΑG, Eλβετία GLRaV-7 DAS Agritest, Ιταλία GLRaV-7 Biotin-streptavidin Sanofi, Γαλλία GFkV ΤAS Agritest, Ιταλία GFLV DAS Agritest, Ιταλία ArMV DAS Agritest, Ιταλία * Χρησιμοποίηση πλάκας ELΙSA επιστρωμένης με πρωτεΐνη Α Aνοσοενζυμική δοκιμή ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay): Εφαρμόστηκαν τρεις τύποι ELISA, η διπλή άμεση παρεμβολή ELISA (Double Antibody Sandwich, DAS), η τριπλή έμμεση παρεμβολή ELISA (Triple Antibody Sandwich, TAS) και η Βιοτίνη-στρεπταβιδίνη ELISA (Biotin-streptavidin ELISA). Οι μικροπλάκες 41

46 Κεφ. 2. Ιολογικός έλεγχος βιότυπων αμπέλου πολυστυρενίου ήταν της Costar (9018 high binding) και χρησιμοποιήθηκαν 100 μl αντιδραστηρίων ανά βοθρίο. Κατά την επεξεργασία των δειγμάτων, ξύσματα καμβίου (0,4g περίπου) παρελήφθησαν από τις κληματίδες με λεπίδα, μετά την απομάκρυνση του φλοιού. Στη συνέχεια, τοποθετήθηκαν σε δοκιμαστικούς σωλήνες και ομογενοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα (Tris-HCl 0,5M ph 8,2, NaCl 0,15M, 0,1% Tween 20, 2% PVP) σε αναλογία 1/10 (β/ο) με τη χρήση μηχανικού ομογενοποιητή. Το υλικό φυγοκεντρήθηκε για δύο λεπτά στις στροφές/λεπτό (σ/λ) και το υπερκείμενο τοποθετήθηκε στη μικροπλάκα σε δύο επαναλήψεις (100μl/βοθρίο). Επίσης χρησιμοποιήθηκαν ένα θετικό και δύο υγιή δείγματα ως μάρτυρες. Όλα τα συζευγμένα με αλκαλική φωσφατάση αντισώματα ανοσοσφαιρίνης (IgG), αραιώνονταν σε διάλυμα του συζευγμένου αντισώματος (conjugate buffer: PBS-T, 2% PVP και 0,2% αλβουμίνη αβγού). Οι μετρήσεις της οπτικής πυκνότητας (ΟΠ) των βοθρίων έγιναν στα 405 nm με το φωτόμετρο Stat Fax 2100 (Awareness Technology INC). Αξιολόγηση των αποτελεσμάτων: Οι τιμές ΟΠ των δοκιμών ELISA υπολογίστηκαν με αφαίρεση από το σύνολο των τιμών ΟΠ των βοθρίων, της ΟΠ που οφείλεται στο υλικό της μικρομικροπλάκας και στο υπόστρωμα. Αυτό έγινε με τοποθέτηση σε ένα περιφερειακό βοθρίο της μικροπλάκας στο οποίο δεν είχαν τοποθετηθεί IgG και δείγμα, 100μl διαλύματος υποστρώματος και στη συνέχεια η τιμή της ΟΠ του βοθρίου μετρήθηκε και αφαιρέθηκε αυτόματα από τις τιμές ΟΠ του συνόλου των βοθρίων. Ως θετικά θεωρήθηκαν τα δείγματα με ΟΠ τουλάχιστον διπλάσια από αυτή του υγιούς μάρτυρα. Διαλύματα 1. PBS (ph=7,4) 8,0g NaCl, 0,2g KH 2 PO 4, 2,9g Na HPO.12H 2 4 2O, 0,2g KCl, απεσταγμένο νερό μέχρι 1lt 2. PBS-Τween PBS, 0,05% v/v Tween (Sigma) 3. Διάλυμα επίστρωσης της μικροπλάκας (ph: 9,6): 0,014M Na 2 CO 3, 0,035MNaHCO 3 4. Διάλυμα ομογενοποίησης: Tris-HCl 0,5M ph 8,2, NaCl 0,15M, 0,1% Tween 20, 2% PVP 5. Διάλυμα του συζευγμένου αντισώματος PBS-Tween, Αλβουμίνη αβγού 0,2% (Sigma) Πολυβινιλικό πυρολιδόνιο 2%, Polyvinyl pyrrolidone (PVP, MB=44000) 6. Διάλυμα υποστρώματος (Substrate buffer ph:9,8): 97ml διαιθανολαμίνη (Sigma) απεσταγμένο νερό μέχρι 1lt 7. Υπόστρωμα Φωσφορική παρανιτροφαινόλη (PNPP) (Sigma) 42

47 Κεφ. 2. Ιολογικός έλεγχος βιότυπων αμπέλου Διπλή άμεση παρεμβολή ELISA, DAS-ELISA: Η DAS-ELISA χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των ιών GVA, GLRaV-1, -2, -3, -6, -7, GFLV και ArMV με πολυκλωνικά και μονοκλωνικά αντισώματα (Πίνακας 2.1, Εικόνα 2.1). Τα στάδια της μεθόδου είναι: 1ο στάδιο: Προσρόφηση του ειδικού IgG στη μικροπλάκα. Τοποθετήθηκαν 100μl/βοθρίο πολυκλωνικών IgG σε διάλυμα επιστρώσεως της μικροπλάκας (coating buffer, ph 9,6) σε συγκέντρωση 1μg/ml. Η μικροπλάκα επωάστηκε για 3 ώρες στους 37 ο C και στη συνέχεια, πλύθηκε 3 φορές ανά 3 λεπτά με PBS-Tween. 2ο στάδιο: Προσθήκη των δειγμάτων. Τοποθετήθηκαν 100μl/βοθρίο εκχύλισμα φυτικού ιστού, ακολούθησε επώαση στους 4 ο C για ώρες και πλύσιμο 3 φόρες ανά 3 λεπτά με PBS-Tween. 3o στάδιο: Προσθήκη IgG συζευγμένων με ειδικό ένζυμο Τοποθετήθηκαν 100μl/βοθρίο ΙgG συζευγμένων με αλκαλική φωσφατάση, αραιωμένο σε διάλυμα του συζευγμένου αντισώματος, σε αραίωση 1/1000 και η μικροπλάκα επωάστηκε για 3 ώρες στους 37 ο C. Μετά την επώαση η μικροπλάκα πλύθηκε 3 φόρες ανά 3 λεπτά με PBS-Tween. 4o στάδιο: Προσθήκη υποστρώματος. Τοποθετήθηκαν 100μl/ βοθρίο, του υποστρώματος φωσφορική παρανιτροφαινόλη (pparanitrophenyl phosphate, PNPP) αραιωμένο σε διάλυμα υποστρώματος (substrate buffer, ph 9.8) σε συγκέντρωση 1 mg/ml. Μετά από επώαση μίας έως 2 ωρών (ανάλογα με τα αντισώματα) σε θερμοκρασία δωματίου, μετρήθηκε η οπτική πυκνότητα στα 405 nm. Εικόνα 2.1 Στάδια DAS-ELISA: (Α) ειδικό ΙgG, (Β) αντιγόνο, (Γ) συζευγμένο ειδικό ΙgG και (Δ) υπόστρωμα. Για την ανίχνευση του GVA οι μικροπλάκες επιστρώθηκαν με πρωτεΐνη Α 100μl/βοθρίο σε διάλυμα επιστρώσεως της μικροπλάκας (coating buffer, ph 9.6) σε συγκέντρωση 1μg/ml. (Εικόνα 2.2). Η μικροπλάκα επωάστηκε για 2 ώρες στους 37 ο C και στη συνέχεια πλύθηκε 3 φορές ανά 3 λεπτά με PBS-Tween. Τα άλλα στάδια είναι όμοια με αυτά της DAS-ELISA. 43

48 Κεφ. 2. Ιολογικός έλεγχος βιότυπων αμπέλου Ε Δ Γ A B A A A A A Εικόνα 2.2 Στάδια DAS-ELISA με επίστρωση πρωτεΐνης "Α": (Α) πρωτεΐνη "Α", (Β) ειδικό ΙgG, (Γ) αντιγόνο, (Δ) συζευγμένο ειδικό ΙgG και (Ε) υπόστρωμα. Τριπλή έμμεση παρεμβολή ELISA, ΤAS-ELISA: Χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των ιών GVΒ, GFΚV και ArMV με πολυκλωνικά και μονοκλωνικά αντισώματα (Πίνακας 2.1, Εικόνα 2.3). 1ο στάδιο: Προσρόφηση των ειδικών πολυκλωνικών ΙgG στη μικροπλάκα. 2ο στάδιο: Προσθήκη των δειγμάτων. 3o στάδιο: Προσθήκη μονοκλωνικού αντισώματος. Τοποθετήθηκαν 100μl/βοθρίο μονοκλωνικού αντισώματος διαλυμένου σε διάλυμα του συζευγμένου αντισώματος σε αραίωση 1/1000. Στη συνέχεια, η μικροπλάκα επωάστηκε για 2 1/2 ώρες στους 37 ο C, και αμέσως μετά πλύθηκε 3 φόρες ανά 3 λεπτά με PBS-Tween. 4ο στάδιο: Προσθήκη αντί-ποντίκι-αντισώματος Τοποθετήθηκαν 100μl/βοθρίο μονοκλωνικό αντί-ποντίκι-αντίσωμα συζευγμένο με αλκαλική φωσφατάση, διαλυμένο σε διάλυμα συζευγμένου αντισώματος σε αραίωση 1/1000 και η μικροπλάκα επωάστηκε για 2,5 ώρες στους 37 ο C. Αμέσως μετά πλύθηκε 3 φόρες ανά 3 λεπτά με PBS-Tween. 5ο στάδιο: Προσθήκη υποστρώματος PNPP αραιωμένο σε διάλυμα υποστρώματος. Δ Γ Ε Β Α Εικόνα 2.3 Στάδια TAS-ELISA, (Α) ειδικό πολυκλωνικό αντίσωμα, (Β) αντιγόνο, (Γ) ειδικό μονοκλωνικό αντίσωμα, (Δ) συζευγμένο αντι-ποντίκι-αντίσωμα και (Ε) υπόστρωμα. 44

49 Κεφ. 2. Ιολογικός έλεγχος βιότυπων αμπέλου Βιοτίνη-στρεπταβιδίνη ELISA: Χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση των ιών GLRaV-2, - 5 και -7, με πολυκλωνικά και μονοκλωνικά αντισώματα (Πίνακας 2.1, Εικόνα 2.4). 1ο στάδιο: Προσρόφηση ειδικών πολυκλωνικών IgG στη μικροπλάκα. 2ο στάδιο: Προσρόφηση δειγμάτων. 3o στάδιο: Προσθήκη αντισώματος συζευγμένου με βιοτίνη. Τοποθετήθηκαν 100μl/βοθρίο αντισώματος συζευγμένου με βιοτίνη σε διάλυμα PBS-Tween + 0,1% BSA, σε αραίωση 1/100. Στη συνέχεια, η μικροπλάκα επωάστηκε για 2 1/2 ώρες στους 37 ο C και μετά πλύθηκε 3 φόρες ανά 3 λεπτά με PBS-Tween. 4ο στάδιο: Προσθήκη στρεπταβιδίνης συζευγμένης με αλκαλική φωσφατάση. Τοποθετήθηκαν 100μl/βοθρίο στρεπταβιδίνης συζευγμένης με αλκαλική φωσφατάση, σε διάλυμα PBS-Tween + 0,1% BSA, σε αραίωση 1/100 και η μικροπλάκα επωάστηκε για 60 λεπτά στους 37 ο C. Μετά την επώαση η μικροπλάκα πλύθηκε 3 φoρές ανά 3 λεπτά με PBS- Tween. 5ο στάδιο: Προσθήκη υποστρώματος PNPP αραιωμένο σε διάλυμα υποστρώματος. Ε Δ Δ Εικόνα 2.4 Στάδια Βιοτίνης-στρεπταβιδίνης ELISA: (Α) ειδικό αντίσωμα, (Β) αντιγόνο, (Γ) ειδικό αντίσωμα συζευγμένο με βιοτίνη, (Δ) στρεπταβιδίνη συζευγμένη με αλκαλική φωσφατάση και (Ε) υπόστρωμα 45

50 Κεφ. 2. Ιολογικός έλεγχος βιότυπων αμπέλου Αντίστροφη μεταγραφή-αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) Για την ανίχνευση στελεχών του ιού-1, που σχετίζεται με τη βοθρίωση του κορμού του Rupestris (Grapevine rupestris stem pitting associated virus-1, RSPaV-1), ελέγχθηκαν 37 πρέμνα με τη χρήση δύο ζευγών εκκινητών σε δύο διαφορετικές δοκιμές PCR (Meng et al 1999, Nolasco et al 2000, Πίνακας 2.2). Χρησιμοποιήθηκε εκχύλισμα ολικού RNA από μίσχους φύλλων και ως θετικά χαρακτηρίσθηκαν τα δείγματα που έδωσαν προϊόν σε τουλάχιστον μία από τις δύο δοκιμές. Πίνακας 2.2 Εκκινητές για την ανίχνευση του RSPaV-1 (Nolasco et al 2000) Εκκινητής Αλληλουχία Προϊόν RSPaV 9 5 -GGCCAAGGTTCAGTTTG-3 RSPaV ACACCTGCTGTGAAAGC ζβ RSPaV GATGAGGTYCAGTTGTTTCC-3 RSPaV ATCCAARGGRCCTTTTGACC ζβ Μεταχειρίσεις για την αδρανοποίηση των RNAασών: Όλα τα υαλικά σκεύη αποστειρώθηκαν για 8 ώρες στους 180 C, ενώ τα επαναχρησιμοποιούμενα πλαστικά επωάσθηκαν, για 12 ώρες στους 37 C, σε διάλυμα 0,1% DEPC και ακολούθησε αποστείρωση σε αυτόκαυστο. Τα διαλύματα που χρησιμοποιήθηκαν παρασκευάσθηκαν με τη χρήση απεσταγμένου νερού, στο οποίο προστέθηκε 0,1% διαίθυλοπυρανθρακικό, (diethylpyrocarbonate, DEPC) και επωάσθηκαν για τουλάχιστον 8 ώρες στους 37 ο C και έπειτα για 15 στους 100 ο C. Τα χημικά που χρησιμοποιήθηκαν προορίζονται και χρησιμοποιούνται αποκλειστικά για μεταχείριση RNA. Διαδικασία εκχύλισης ολικού RNA: Η εκχύλιση του RNA έγινε με μια μέθοδο που χρησιμοποιεί διοξείδιο του πυριτίου (SiO 2 ) για την δέσμευση των μορίων RNA αποφεύγοντας τη χρήση φαινόλης και έχει χρησιμοποιηθεί επιτυχώς για την απομόνωση RNA από ξυλώδεις ιστούς με υψηλή συγκέντρωση φαινολικών ουσιών (Rott & Jelkmann 2001). Σε πλαστική σακούλα, 300 mg φυτικού ιστού (ξύσματα καμβίου) ομογενοποιήθηκαν σε 3 ml διαλύματος ομογενοποίησης (0,4 M Θειοκυανιούχος γουανιδίνη, 0,2 Μ ΝαOAc ph 5,2, 25mM EDTA, 1,0 M KOAc και 2,5% PVP-40). Πεντακόσια (500) μl του ομογενοποιήματος μεταφέρθηκαν σε μικροσωλήνα των 1,5 ml στον οποίο είχαν προστεθεί 100 μl 10% N-lauryl sarkosyl και 5 μl 2-μερκαπτοαιθανόλη. To διάλυμα επωάστηκε στους 70 ο C για 10 min με δύο ενδιάμεσες αναδεύσεις, τοποθετήθηκε στον πάγο για 5 λεπτά και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στις rpm για 10 λεπτά. Τριακόσια (300) μl του υπερκείμενου διαλύματος τοποθετήθηκαν σε ένα νέο μικροσωλήνα στον οποίο είχαν προστεθεί 150 μl αιθανόλης, 300 μl διαλύματος ΝaI 6Μ και 25 μl υδατικού αιωρήματος 46

51 Κεφ. 2. Ιολογικός έλεγχος βιότυπων αμπέλου SiO 2 (Sigma S-5631). Το διάλυμα επωάσθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 10 λεπτά με περιοδική ανάδευση και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στις rpm για 1 λεπτό. Το ίζημα του SiO 2 επαναδιαλύθηκε σε 500 μl διαλύματος έκπλυσης (10,0 mμ Tris-HCl, ph 7,5, 0,5 mm EDTA, 50,0 mm NaCl, 50% αιθανόλη) και φυγοκεντρήθηκε στις rpm για 1 λεπτό. Το στάδιο της έκπλυσης του ιζήματος επαναλήφθηκε δύο φορές, και οι μικροσωλήνες τοποθετήθηκαν σε θάλαμο νηματικής ροής να στεγνώσουν για λίγα λεπτά. Η παραλαβή του RNA έγινε μετά από την επαναδιάλυση του ιζήματος του SiO 2 σε 150 μl απεσταγμένου νερού (που υπέστη μεταχείριση με DEPC) και επώαση στους 70 ο C για 4 λεπτά. Το διάλυμα φυγοκεντρήθηκε στις rpm για 3 λεπτά και το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε νέο μικροσωλήνα και αποθηκεύτηκε στους -80 ο C. Ένα μl υπερκείμενου (εκχύλισμα ολικού RNA) χρησιμοποιήθηκε στην RT-PCR. Το διάλυμα 6Μ ΝaI παρασκευάστηκε με διάλυση 0,75 g Na 2 SO 3 σε 40 ml νερό και προσθήκη 36 g ΝaI και στη συνέχεια αποθηκεύτηκε σε σκοτεινό δοχείο στους 4 ο C. Η προετοιμασία του αιωρήματος SiO 2 έγινε με την προσθήκη 60 g SiO 2 σε 500 ml απεσταγμένο νερό. Το SiO 2 αναδεύτηκε καλά και αφέθηκε να καθιζάνει για 24 ώρες. Τo υπερκείμενo απορρίφθηκε (470 ml περίπου) και προστέθηκαν εκ νέου 500 ml απεσταγμένου νερού. Το αιώρημα αναδεύτηκε καλά και αφέθηκε να καθιζάνει για 5 ώρες. Τo υπερκείμενo απορρίφθηκε (440 ml περίπου) και τα εναπομείναντα 60 ml αιωρήματος ρυθμίστηκαν σε ph 2,0 με HCl και αποθηκεύτηκαν στους 4 ο C. RT-PCR σε δύο μικροσωλήνες: Για τον πολλαπλασιασμό μητρών RNA πρέπει πρώτα να γίνει σύνθεση μονόκλωνου, συμπληρωματικού DNA (cdna) παρουσία του ενζύμου αντίστροφη μεταγραφάση (reverse transcriptase). Το RNA-cDNA υβρίδιο χρησιμοποιείται περαιτέρω με κατάλληλους εκκινητές σε αναλογία 1/10 με το μείγμα αντίδρασης της PCR (Εικόνα 2.5). Η σύνθεση του πρώτου, συμπληρωματικού κλώνου DNA (cdna), που είναι απαραίτητος στην αντίδραση της PCR, έγινε σε μικροσωλήνες των 0,2 ml, σε συνολικό όγκο αντίδρασης των 15 µl για κάθε δείγμα. Κάθε μικροσωλήνας περιείχε: 50 mm Tris-HCl (ph: 8,3), 75 mm KCl, 10 mm DTT, 3 mμ MgCl 2, 0,5 mm κάθε dntp, 10 μμ τυχαία εξαμερή, 15 μονάδες αναστολέα RN-ασών (RNaseout, Life Technologies TM ), 75 μονάδες αντίστροφη μεταγραφάση, (Maloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase [M-MLV RT, Life Technologies TM, MD, USA]) και συμπληρώθηκε με απεσταγμένο νερό που υπέστη μεταχείριση με DEPC μέχρι τελικού όγκου 14 μl και στη συνέχεια προστέθηκε 1 μl εκχύλισματος ολικού RNA. Τα σωληνάρια τοποθετήθηκαν σε θερμοκυκλοποιητή (Gene Amp 2400, Perkin Elmer), όπου επωάστηκαν για 10 λεπτά στους 20 C, στην συνέχεια για 50 λεπτά στους 37 C και τέλος, για 4 λεπτά στους 94 C. Στη συνέχεια ένα μl του προϊόντος της αντίστροφης μεταγραφής προστέθηκαν σε διάλυμα αντίδρασης της PCR σε μικροσωλήνες των 0,2 ml, με τελικό όγκο αντίδρασης των 20 µl για κάθε δείγμα. Κάθε μικροσωλήνας περιείχε: 20 mm Tris-HCl (ph: 8,4), 50 mm KCl, 1,5 mm MgCl 2, 0,2 mm κάθε dntp, 0,2 μm κάθε εκκινητή, 0,5 μονάδες Taq πολυμεράση (Taq 47

52 Κεφ. 2. Ιολογικός έλεγχος βιότυπων αμπέλου DNA Polymerase [Life Technologies TM ]) και συμπληρώθηκε με νερό που υπέστη μεταχείριση με DEPC μέχρι τελικού όγκου των 19 μl.. 1. RT Επώαση 10 λεπτά 20 o C 50 λεπτά 37 o C 4 λεπτά 94 o C Α) RT Όγκος αντίδρασης 15 μl 50 mm Tris-HCl (ph: 8,3) 75 mm KCl 10 mm DTT 3 mm MgCl mm κάθε dntp 10 μμ τυχαία εξαμερή 15 μονάδες RNASEOUT 75 μονάδες M-MLV (Αντίστροφη μεταγραφάση ) 1 μl δείγμα RT-PCR σε δύο μικροσωλήνες 1μl χυμό 1. RT 2μl c-dna 2. PCR Επώαση 3 λεπτά 94 o C 40 κύκλοι 30 δευτερόλεπτα 94 o C 30 δευτερόλεπτα 52 o C 30 δευτερόλεπτα 72 o C 2 λεπτά 72 o C Β) PCR Όγκος αντίδρασης 20μl 20 mm Tris-HCl (ph: 8,4) 50 mm KCl 1,5 mm MgCl 2 0,2 mm κάθε dntp 0,2 μm κάθε εκκινητής 2 μl προϊόν RT (cdna) 0,5 μονάδες Taq πολυμεράση Τα σωληνάρια τοποθετήθηκαν σε θερμοκυκλοποιητή (Gene Amp 2400, Perkin Elmer), όπου επωάστηκαν σύμφωνα με τα παρακάτω στάδια αντίδρασης: 2. PCR Εικόνα 2.5 Διαδικασία της αντίδρασης RT-PCR σε δύο μικροσωλήνες. 1. Αρχική αποδιάταξη του εκμαγείου DNA: επώαση του μίγματος της αντίδρασης στους 94 ο C, για 3 λεπτά. 2. Αποδιάταξη του εκμαγείου DNA: επώαση του μίγματος της αντίδρασης στους 94 ο C, για 30 δευτερόλεπτα. 3. Επανασύνδεση του εκμαγείου με τους εκκινητές: υβριδοποίηση των εκκινητών με το εκμαγείο με επώαση για 30 δευτερόλεπτα σε θερμοκρασία 52 ο C. 4. Επιμήκυνση των δεσμευμένων εκκινητών: μέσω επώασης για 30 δευτερόλεπτα στους 72 ο C. Τα στάδια 2, 3 και 4 επαναλαμβάνονται 39 φορές. Η αντίδραση ολοκληρώθηκε με μία τελευταία επώαση επί 2 λεπτά στους 72 ο C για να συμπληρωθούν όλες οι τυχόν ημιτελείς αλυσίδες. Ανίχνευση των προϊόντων της PCR: Για την ανάλυση των προϊόντων της PCR (DNA) χρησιμοποιήθηκε η ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης. Η παρασκευή της πηκτής έγινε με τη χρήση υψηλής καθαρότητας αγαρόζης (Life Technologies TM ) σε τελική συγκέντρωση 1,5% σε 1xTΑE ρυθμιστικό διάλυμα. Το διάλυμα θερμάνθηκε μέχρι βρασμού, 48

53 Κεφ. 2. Ιολογικός έλεγχος βιότυπων αμπέλου τοποθετήθηκε σε συσκευή οριζόντιας ηλεκτροφόρησης και η συσκευή πληρώθηκε με 1xTΑE ρυθμιστικό διάλυμα. Στη συνέχεια, 12 μl του προϊόντος αντίδρασης της PCR αναμείχθηκαν με 1,3μl διαλύματος που περιείχε 0,25% κυανούν της βρωμοφαινόλης και 40% σακχαρόζη και τοποθετήθηκαν στα βοθρία της πηκτής. Σε κάθε πηκτή τοποθετήθηκαν υγιής μάρτυρας και ένας δείκτης μοριακού βάρους που περιείχε τμήματα DNA γνωστού μοριακού βάρους (Life Technologies TM ). Η ηλεκτροφόρηση έγινε σε τάση 110 volt για περίπου 90 λεπτά. Το πήγμα εμβαπτίστηκε στη συνέχεια σε υδατικό διάλυμα βρωμιούχου αιθίδιου (0,5 mg/ml) και επωάστηκε επί 30 σε θερμοκρασία δωματίου. Κατά την διάρκεια της επώασης, το βρωμιούχο αιθίδιο εισχωρεί στο πήγμα, δεσμεύεται εκλεκτικά μεταξύ επαλλήλων βάσεων του DNA. Η θέση του DNA έγινε ορατή με απευθείας τοποθέτηση της πηκτής κάτω από υπεριώδη ακτινοβολία σε τράπεζα φθορισμού (UV transilluminator). Το μέγεθος των τμημάτων του DNA καθορίσθηκε με βάση τον δείκτη μοριακού βάρους Μηχανικές μολύνσεις για την απομόνωση των GVA και GVB Εκχύλισμα από ξύσματα καμβίου πρέμνων προσβλημένων με GVA και GVB, σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα 0,01M που περιείχε 2,5% νικοτίνη, τελικό ph 9,5 (αραίωση 1:10), χρησιμοποιήθηκε για τη μηχανική μόλυνση των φυτοδεικτών Nicotiana benthamiana και N. occidentalis. Ένα μήνα μετά τη μόλυνση έγινε ιολογικός έλεγχος των φυτοδεικτών με ELISA, για την παρουσία των GVA και GVB. 49

54 Κεφ. 2. Ιολογικός έλεγχος βιότυπων αμπέλου 2.4 Αποτελέσματα Δοκιμές ELISA: Τα συνολικά αποτελέσματα ιολογικών ελέγχων 38 βιότυπων οινοποιήσιμων ποικιλιών (Vitis vinifera L.) από διαδικασία κλωνικής επιλογής και 80 βιότυπων από τη συλλογή των αυτόχθονων ποικιλιών έδειξαν την παρουσία των ιών GFkV (52.2%), GLRaV-1 (13,3%), GLRaV-2 (25,5%), GLRaV-3 (22,2%), GLRaV-5 (1,1%), GLRaV-6 (1,1%), GLRaV-7 (6,6%), GVA (23,3%), GVB (2,2%), και GFLV (11,1%) ενώ δεν ανιχνεύτηκε ο ArMV (Πινακες 2.3 και 2.4). Τα αυστηρότερα κριτήρια της κλωνικής επιλογής είχαν ως αποτέλεσμα την επιλογή υλικού με μικρότερο ποσοστό προσβολής των GLRaV-1, -2, -3, -7 και GVA σε σχέση με το υλικό που συλλέχθηκε με τη διάσωση (Εικόνα Διάσωση Κλωνική επιλογή GFLV GLRaV-1 GLRaV-2 GLRaV-3 GLRaV-7 GLRaV-5 GLRaV-6 GFKV GVA GVB RSPaV-1 Εικόνα 2.6 Ποσοστά (%) προσβολής ιών σε δείγματα αμπέλου προερχόμενα από α) διαδικασία κλωνικής επιλογής και β) συλλογή αυτόχθονων ποικιλιών. Η διάγνωση του GLRaV-7 δεν ήταν αξιόπιστη με τη μέθοδο DAS ELISA παρουσιάζοντας χαμηλή ευαισθησία ανίχνευσης, ενώ η βιοτίνη-στρεπταβιδίνη ELISA παρουσίασε μεγαλύτερη ευαισθησία. Στην περίπτωση του GLRaV-2 η DAS ELISA ενώ παρουσίασε ικανοποιητική ευαισθησία ανίχνευσης, είχε μικρότερο εύρος ανίχνευσης των απομονώσεων του ιού σε σχέση με την βιοτίνη-στρεπταβιδίνη ELISA (σε τέσσερα δείγματα από τα 27 προσβλημένα με GLRaV-2 ο ιός ανιχνεύθηκε μόνο με την βιοτίνη-στρεπταβιδίνη ELISA). Παρά την ευαισθησία της η βιοτίνη-στρεπταβιδίνη ELISA είχε προβλήματα επαναληψιμότητας. Τέλος, επιλέχθηκαν 28 φυτά (δείγματα 1,5,6,7,9,11,12,13,14, Πίνακας 2.3 και δείγματα 1-19, Πίνακας 2.4) για την περαιτέρω ανάπτυξη και αξιολόγηση των μοριακών τεχνικών ανίχνευσης των ιών του γένους Closterovirus. 50

55 Κεφ. 2. Ιολογικός έλεγχος βιότυπων αμπέλου Πινακας 2.3 Αποτελέσματα ιολογικών ελέγχων 38 βιότυπων ποικιλιών οινοποιίας (Vitis vinifera L.) προερχόμενα από κλωνική επιλογή Σύνολο προσβολών /18 Ποσοστό % ΔΕΙΓΜΑ ΒΙΟΤΥΠΟΣ ΠΕΡΙΟΧΗ GVA GVB GLRaV-1 GLRaV-2 GLRaV-3 GLRaV-5 GLRaV-6 GLRaV-7GFKV GFLV ArMV RSPaV-1 1 Mοσχομαύρο 3 Κοζάνη / Βελβενδός Μοσχόμαυρο Κοζάνη / Βελβεντός 3 Μοσχομαύρο (1) Κοζάνη / Εράτυρα Μοσχόμαυρο Κοζάνη / Σιάτιστα Ρομπόλα 1 Κεφαλονιά / Μαυράτα Αγιοργίτικο 2 Νεμέα / Κούτσι + 7 Ασύρτικο 1 Σαντορίνη / Μεγαλοχώρι + 8 Ασύρτικο Θεσ/νίκη / Μεγαλοχώρι Μαλαγουζιά 2 Αττική/Παλήνη Μαλαγουζιά Θεσ/νίκη / Επανωμή Μαυροδαφνη 4 Πάτρα / Πουσικά + 12 Ντεμπίνα 1 Ιωάννινα / Ζίτσα 13 Ντεμπίνα 2 Ιωάννινα / Ζίτσα + 14 Ντεμπίνα 4 Ιωάννινα / Ζίτσα Ξινόμαυρο (1) Ημαθία / Νάουσα + 16 Ξινόμαυρο (2) Ημαθία / Νάουσα + 17 Ξινόμαυρο (3) Λάρισσα / Ραψάνη + 18 Ξινόμαυρο (4) Κοζάνη / Βελβενδός + 19 Ξινόμαυρο (5) Κοζάνη / Σιάτιστα Ξινόμαυρο (6) Κοζάνη / Πελεκάνος Ξινόμαυρο (7) Κιλκίς / Γουμένισσα Ξινόμαυρο (8) Θεσ/νίκη / Όσσα Ξινόμαυρο (9) Θεσ/νίκη / Όσσα + 24 Ροδίτης (1) Χαλκιδική / Αγ. Παύλος Ροδίτης (2) Χαλκιδική / Αγ. Παύλος 26 Ροδίτης (3) Θεσ/νίκη / Αγχίαλος Ροδίτης (4) Θεσ/νίκη / Αγχίαλος + 28 Ροδίτης (5) Ορεστιάδα / Πεντάλοφος Λημνιό (1) Χαλκιδική / Αγ. Παύλος 30 Λημνιό (2) Χαλκιδική / Αγ. Παύλος 31 Αθήρι Χαλικδική / Άγιο Όρος Μοσχόγκαλτσο Γρεβενά / Τρίκωμο + 33 Ιταλικό Λάρισσα / Ραψάνη + 34 Νεγκόσκα (1) Κιλκίς / Γουμένισσα + 35 Νεγκόσκα (2) Κιλκίς / Γουμένισσα Νεγκόσκα (3) Κιλκίς / Γουμένισσα + 37 Νεγκόσκα (4) Κιλκίς / Γουμένισσα Νεγκόσκα (5) Κιλκίς / Γουμένισσα +

56 Κεφ. 2. Ιολογικός έλεγχος βιότυπων αμπέλου Πινακας 2.4 Αποτελέσματα ιολογικών ελέγχων 80 βιότυπων ποικιλιών οινοποιίας προερχόμενα από συλλογή αυτόχθονων ποικιλιών. Σύνολο προσβολών /19 Ποσοστό % ΔΕΙΓΜΑ ΒΙΟΤΥΠΟΣ ΠΕΡΙΟΧΗ GVA GVB GLRaV-1 GLRaV-2GLRaV-3GLRaV-5 GLRaV-6 GLRaV-7 GFKV GFLV ArMV RSPaV-1 1 Βάψα Νάουσα Ασπρούδι (27) Σέρρες Βάψα 1 Κοζάνη / Βελβενδός Βάψα 5 Κοζάνη / Βελβενδός Ροδίτης 3 Αγχίαλος Μαυροδάφνη 2 Πάτρα / Πουσικά + 7 Πρεκνιάρικο 2 Ημαθία / Νάουσα Ρομπόλα 2 Κεφαλονιά / Μαυράτα Σιδερίτης 4 Πάτρα / ορεινή Αχαϊα Σιδερίτης 3 Πάτρα / ορεινή Αχαϊα καλονή 2* Λέσβος Μπογιαμάς Εβρος / Σουφλί Δαμιάτης Σέρρες Σέφκα Σουφλίου Εβρος / Σουφλί Σαββατιανό 3 Θήβα / Ερυθραί Ποταμίσι Σαντορίνη / Μεγαλοχώρι + 17 Αγριογλυκάδι Σαντορίνη / Μεγαλοχώρι Γαιδουριά Σαντορίνη / Μεγαλοχώρι + 19 Κρητικό Σαντορίνη / Μεγαλοχώρι 20 Ζουμιάτικο Σέρρες / Αμπελοί Τρίνκα Σέρρες / Αμπελοί Κόινιαρο (1) Σέρρες / Τριανταφυλλιά + 23 Κόινιαρο (2) Σέρρες / Τριανταφυλλιά Κόινιαρο (3) Σέρρες / Τριανταφυλλιά 25 Κόινιαρο (4) Σέρρες / Τριανταφυλλιά + 26 Καράπαπας Ορεστιάδα / Πεντάλοφος 27 Σέφκα (1) Ορεστιάδα / Πεντάλοφος λευκό ψιλόραγο* Ορεστιάδα / Πεντάλοφος 29 μαύρο ψιλόραγο* Ορεστιάδα / Πεντάλοφος + 30 Φαρτσάλο (3) Κιλκίς / Γουμένισσα 31 πρεκνάδι ροζέ* Ορεστιάδα / Πεντάλοφος 32 λευκό* Ορεστιάδα / Πεντάλοφος + 33 Φαρτσάλο (2) Κιλκίς / Γουμένισσα 34 Παμίδι ροζέ Ορεστιάδα / Πεντάλοφος Ροδίτης Ορεστιάδα / Πεντάλοφος μελανοιώδες* Ορεστιάδα / Πεντάλοφος μαύρο χονδρόραγο* Ορεστιάδα / Πεντάλοφος + 38 Φαρτσάλο (1) Κιλκίς / Γουμένισσα 39 Καρναχαλάς Εβρος / Σουφλί Τσουγιάννηδες Εβρος / Σουφλί + +

57 Κεφ. 2. Ιολογικός έλεγχος βιότυπων αμπέλου ΔΕΙΓΜΑΒΙΟΤΥΠΟΣ ΠΕΡΙΟΧΗ GVA GVB GLRaV-1 GLRaV-2GLRaV-3GLRaV-5 GLRaV-6 GLRaV-7 GFKV GFLV ArMV RSPaV-1 41 Παμίδι κόκκινο Εβρος / Σουφλί Παμίδι Εβρος / Σουφλί Βουλγαρούδια (1) Εβρος / Σουφλί Μοσχάτο Σουφλίου Εβρος / Σουφλί + 45 Ασπρούδι Σέρρες + 46 Μπογιαμάς Εβρος / Σουφλί Κερατσούδα Εβρος / Σουφλί Ξινοστάφυλο Κοζάνη / Εράτυρα Αλεποουρά Κοζάνη / Πελεκάνος Χονδρόμαυρο Κοζάνη / Σιάτιστα Κόκκινο Κοζάνη / Εράτυρα Βεργιώτικο (1) Κοζάνη / Βελβενδός + 53 Βεργιώτικο (2) Κοζάνη / Βελβενδός + 54 Σκλείθρο (1) Κοζάνη / Σιάτιστα Νεύρο (1) Κοζάνη / Πελεκάνος 56 Κορίθι μαύρο Κοζάνη / Σιάτιστα Νιγρικιώτικο (1) Κοζάνη / Σιάτιστα Νιγρικιώτικο (2) Κοζάνη / Σιάτιστα + 59 Κορίθι λευκό Κοζάνη / Σιάτιστα Νεροντέμπινα Κοζάνη / Σιάτιστα + 61 Μοσχάτο μαύρο Κοζάνη / Σιάτιστα Νιγρικιώτικο (3) Κοζάνη / Σιάτιστα μαύρο ψιλόραγο (1)* Κοζάνη / Πελεκάνος Σκλείθρο (2) Κοζάνη / Εράτυρα Σέφκα (2) Κοζάνη / Εράτυρα Μαύρο μοσχάτο (2) Κοζάνη / Εράτυρα Βουλγάρικο Κοζάνη / Εράτυρα Σέφκα (3) Κοζάνη / Εράτυρα Κοκκινούσκα (1) Κοζάνη / Εράτυρα Νεύρο (2) Κοζάνη / Εράτυρα + 71 Κοκκινούσκα (2) Κοζάνη / Εράτυρα Cinsaut Σέρρες μαύρο ψιλόραγο (2)* Κοζάνη / Πελεκάνος Σταυρωτό Λάρισσα / Ραψάνη + 75 του γιατρού* Ημαθία / Νάουσα Κουκούλι Ημαθία / Νάουσα Πρεκνιάρικο Ημαθία / Νάουσα + 78 Μπατίκι Κοζάνη / Βελβενδός 79 Φωκιανό Χαλκιδική / Αγ. Παύλος + 80 Τσαπουρνάκος Κοζάνη / Βελβενδός 53 +

58 Κεφ. 2. Ιολογικός έλεγχος βιότυπων αμπέλου Δοκιμές RT-PCR: Παρατηρήθηκε υψηλή συχνότητα παρουσίας στελεχών του RSPaV-1 (78%) χωρίς να παρουσιάζεται σαφής διαφοροποίηση μεταξύ των δύο τρόπων επιλογής (κλωνική επιλογή, διάσωση) (Εικόνες 2.6 και 2.7, Πίνακες 2.3 και 2.4). M Α) εκκινητές 9 και 10 Δείκτης ΜΒ 100 bp 498 ζβ Δείκτης ΜΒ 100 bp Β) εκκινητές 13 και ζβ Εικόνα 2.7 Ανάλυση προϊόντων της RT-PCR σε πηκτή αγαρόζης. Διαδρομές 1-19: ανίχνευση του RSPaV-1 σε δείγματα αμπέλου, με την χρήση των εκκινητών 9 και 10 (πηκτή Α) και των εκκινητών 13 και 14 (πηκτή Β) (Nolasco et al. 2000). + δηλώνει την την παρουσία ενός ορατού προϊόντος σε μια τουλάχιστον πηκτή (θετικό δείγμα). δηλώνει την απουσία ορατού προϊόντος και στις δύο πηκτές (αρνητικό δείγμα). Μηχανικές μολύνσεις για την απομόνωση των GVA και GVB: Δύο απομονώσεις του GVA διατηρήθηκαν σε Nicotiana benthamiana και μια του GVB σε N. occidentalis. 54

59 Κεφ. 2. Ιολογικός έλεγχος βιότυπων αμπέλου 2.5 Συζήτηση H παραγωγή πιστοποιημένου πολλαπλασιαστικού υλικού με τη διαδικασία της κλωνικής επιλογής είναι προς το παρόν η πιο αποτελεσματική μέθοδος αντιμετώπισης των ιολογικών ασθενειών της αμπέλου (Walter & Martelli 1997). Δυστυχώς κατά την επισήμανση των πρέμνων (πρώτο στάδιο της κλωνικής επιλογής), είναι δύσκολη η επιλογή φυτών που είναι απαλλαγμένα από ιούς καθώς σε αρκετές περιπτώσεις, όπως στην περίπτωση των RSPaV-1 και GFKV (Walter & Martelli 1997), η προσβολή είναι λανθάνουσα. Επίσης, η ένταση των συμπτωμάτων που προκαλούνται από ιούς που σχετίζονται με την ασθένεια της συστροφής των φύλλων της αμπέλου εξαρτάται σημαντικά από τον συνδυασμό, ποικιλία ξενιστή - ιός ή φυλή του ιού - συνθήκες περιβάλλοντος, με αποτέλεσμα σε πολλές περιπτώσεις τα συμπτώματα της ασθένειας να μην είναι εμφανή. Όλα αυτά έχουν ως συνέπεια η επιλογή πολλαπλασιαστικού υλικού αμπέλου που γίνεται με βάση μόνο την απουσία συμπτωμάτων, όπως συνηθίζεται κατά την μαζική επιλογή για την παραγωγή του υλικού της κατηγορίας standard, να μην εξασφαλίζει υλικό απαλλαγμένο από ιούς. Τα αποτελέσματα του ιολογικού ελέγχου που αφορούν τη συλλογή των αυτόχθονων ποικιλιών, συμφωνούν με το παραπάνω συμπέρασμα. Σημαντική ήταν η παρουσία των ιών GFLV, GLRaV-1,-2,-3,-7 και GVA, ενώ ιδιαίτερα υψηλή η παρουσία δύο λανθανόντων ιών του GFKV (43%) και του RSPaV-1 (78%), του οποίου η παρουσία αναφέρεται για πρώτη στην Ελλάδα. Η εφαρμογή των αυστηρότερων κριτηρίων της κλωνικής επιλογής (παρακολούθηση των χαρακτηριστικών των επισημανθέντων πρέμνων για μία τριετία) είχε ως αποτέλεσμα την επιλογή υλικού με μικρότερο ποσοστό παρουσίας των GLRaV-1, -2, -3, -7 (ιοί που θεωρούνται αυθεντικά αίτια της ασθένειας της συστροφής των φύλλων της αμπέλου, Belli et al. 1995, Choueiri et al. 1997) και του GVA, σε σχέση με το υλικό της συλλογής των αυτόχθονων ποικιλιών. Δεν συνέβη όμως το ίδιο και για τους δύο λανθάνοντες ιούς GFKV και RSPaV-1, των οποίων τα ποσοστά προσβολής ήταν παρόμοια με αυτά της συλλογής των αυτόχθονων ποικιλιών (Εικόνα 2.6). Παραμένει σημαντική όμως η παρουσία των GLRaV-3 (18%), GLRaV-2 (8%) και GVA (18%). Σε ότι αφορά τους GLRaV-2 και -3, είναι πιθανό κάποιες από τις προσβολές να είναι λανθάνουσες ή τα συμπτώματα της ασθένειας της συστροφής των φύλλων να εμφανίζονται μετά από την πλήρη ωρίμανση των σταφυλιών, περίοδο κατά την οποία γίνεται η μελέτη και καταγραφή των αμπελογραφικών και αγρονομικών χαρακτηριστικών των επισημασμένων πρέμνων στην κλωνική επιλογή. Συμπερασματικά, κατά την κλωνική επιλογή φαίνεται ότι έχουμε μια μείωση της παρουσίας ιολογικών ασθενειών όπως οι εκφυλιστικές ασθένειες και η ασθένεια της συστροφής των φύλλων της αμπέλου, ενώ ελάχιστη μεταβολή της παρουσίας των RSPaV-1 και GFKV. Σε ότι αφορά τον ιολογικό έλεγχο, η βιοτίνη-στρεπταβιδίνη ELISA παρ όλη την ευαισθησία της είχε προβλήματα επαναληψιμότητας που πιθανά οφείλονταν στην έλλειψη σταθερότητας των αντιδραστηρίων (βιοτινυλιωμένα αντισώματα και σύζευγμα στρεπταβιδίνης-αλκαλικής φωσφατάσης). Η διάγνωση του GLRaV-7 με τη μέθοδο ELISA δεν ήταν αξιόπιστη εξαιτίας της χαμηλής ευαισθησίας (DAS-ELISA) και προβλημάτων επαναληψιμότητας (βιοτίνη-στρεπταβιδίνη ELISA). Επίσης ορισμένες 55

60 Κεφ. 2. Ιολογικός έλεγχος βιότυπων αμπέλου απομονώσεις του GLRaV-2 δεν ανιχνεύονται με τη DAS-ELISA ενώ ανιχνεύονται με τη βιοτίνη-στρεπταβιδίνη ELISA πιθανώς εξαιτίας διαφορετικής εξειδίκευσης των αντισωμάτων. Εξαιτίας των προβλημάτων επαναληψιμότητας της Βιοτίνη-στρεπταβιδίνη ELISA η ανίχνευση του GLRaV-2 παραμένει επισφαλής. Το μοναδικό υλικό ελληνικών ποικιλιών που διακινείται σήμερα στη χώρα μας είναι της κατηγορίας standard. Η καθολική προσβολή σημαντικών ελληνικών ποικιλιών όπως για παράδειγμα το Αγιωργίτικο, του οποίου το σύνολο των βιότυπων που ελέγχθηκαν ήταν προσβεβλημένοι τουλάχιστον με τον GLRaV-1 (δεδομένα δεν αναφέρονται), καθιστά απαραίτητη την απαλλαγή των ποικιλιών αυτών από τους ιούς, με in vitro καλλιέργεια ακραίου μεριστώματος και/ή θερμοθεραπείας, με στόχο την παραγωγή πιστοποιημένου πολλαπλασιαστικού υλικού. Η συμβολή των διαγνωστικών ιολογικών τεχνικών είναι πολύ σημαντική για την επιτυχία των στόχων αυτών. Με δεδομένα τα προβλήματα διάγνωσης, που διαπιστώθηκαν και στην παρούσα εργασία, προς το παρόν είναι απαραίτητος ο συνδυασμός ορολογικών (ELISA), μοριακών (RT- PCR) αλλά και βιολογικών τεχνικών (εμβολιασμός σε φυτοδείκτες) για τον αξιόπιστο ιολογικό έλεγχο πολλαπλασιαστικού υλικού αμπέλου. 56

61 Κεφ. 3. Tαυτόχρονη ανίχνευση Fovea- και Viti-ιών ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 Ανάπτυξη εστιασμένης RT-PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές με εκφυλισμό για την ταυτόχρονη ανίχνευση ιών που ανήκουν στα γένη Foveavirus και Vitivirus 57

62 Κεφ. 3. Tαυτόχρονη ανίχνευση Fovea- και Viti-ιών Κεφάλαιο 3 Ανάπτυξη εστιασμένης RT-PCR με εκκινητές με εκφυλισμό για την ταυτόχρονη ανίχνευση ιών που ανήκουν στα γένη Foveavirus και Vitivirus 3.1 Περίληψη Τα υψηλά ποσοστά προσβολής της αμπέλου από ιούς των γενών Vitivirus (GVA, GVB) και Foveavirus (διάφορες παραλλαγές του RSPaV-1) στις μεσογειακές χώρες, καθιστούν απαραίτητη την παραγωγή υγιούς πολλαπλασιαστικού υλικού γεγονός που προϋποθέτει τον ιολογικό έλεγχο με μεθόδους ταχείας διάγνωσης, υψηλής ευαισθησίας και αξιοπιστίας. Για την αντιμετώπιση του ανωτέρω προβλήματος αναπτύχθηκε μία δοκιμή εστιασμένης Aντίστροφης Mεταγραφής-Αλυσιδωτής Αντίδρασης της Πολυμεράσης (Νested Reverse Transcription-Polymerase Chain Reactiοn, Nested RT- PCR) για την ταυτόχρονη ταχεία και μειωμένου κόστους ανίχνευση των ιών που ανήκουν στα γένη Vitivirus (GVA, GVB, GVD) και Foveavirus (RSPaV-1). Αυτό επιτεύχθηκε με την χρησιμοποίηση εκκινητών με εκφυλισμό, που δεσμεύονται σε συντηρημένες αλληλουχίες του ιικού γονιδίου της RNA εξαρτώμενης RNA πολυμεράσης (RNA depended RNA polymerase, RdRp). Η μειωμένη εξειδίκευση και ευαισθησία της RT-PCR, που οφείλεται στη χρησιμοποίηση των εκκινητών με εκφυλισμό, βελτιώθηκε με την εφαρμογή εστιασμένης-pcr. Η αυξημένη ευαισθησία της εστιασμένης PCR επιτρέπει την περαιτέρω επιτάχυνση της διαδικασίας, με την εφαρμογή ενός πρωτοκόλλου προετοιμασίας των δειγμάτων, όπου εκχύλισμα φυτικού χυμού, αποτυπώνεται σε νάιλον μεμβράνη, η οποία χρησιμοποιείται μετά από θερμική επεξεργασία στην RT-PCR χωρίς να είναι απαραίτητη η απομόνωση RΝΑ. Η μέθοδος αυτή, εστιασμένη RT-PCR με δέσμευση αποτυπώματος, εφαρμόστηκε επιτυχώς για την ανίχνευση των GVA, GVB, και GVD (σύνολο 4 απομονώσεις) και του RSPaV-1 σε 30 πρέμνα. 3.2 Εισαγωγή Από τα αποτελέσματα του Κεφαλαίου 2 είναι φανερή η σημαντική παρουσία στην Ελλάδα τουλάχιστον δύο ιών (GVA και RSPaV-1) οι οποίοι σχετίζονται με τη βοθρίωση της αμπέλου. Προς το παρόν για τον αξιόπιστο ιολογικό έλεγχο του πολλαπλασιαστικού υλικού της αμπέλου για την παρουσία ιών οι οποίοι σχετίζονται με την ασθένεια της βοθρίωσης, είναι απαραίτητος ο συνδυασμός βιολογικών, ορολογικών (ELISA) και μοριακών (RT-PCR) τεχνικών (Boscia et al., 1997). Όμως προβλήματα αξιοπιστίας της διάγνωσης παρουσιάζονται και στις τρεις ομάδες τεχνικών ανίχνευσης. Οι viti-ιοί προκαλούν μικρή ανοσοαπόκριση με αποτέλεσμα συχνά να παράγεται χαμηλού τίτλου αντιορός ακατάλληλος για χρήση στην ELISA (Boscia et al., 1997). Επίσης, βρίσκονται σε χαμηλές συγκεντρώσεις στους ιστούς της αμπέλου, για την ανίχνευση τους με ELISA συνιστάται η χρησιμοποίηση φλοιώματος ξύλου κατά τη διάρκεια του χειμώνα, ενώ εμφανίζονται προβλήματα επαναληψιμότητας αλλά και μειωμένου εύρους ανίχνευσης (Boscia et al 1997). Προβλήματα υπάρχουν και στην ορολογική ανίχνευση του RSPaV-1 καθώς τα διαθέσιμα πολυκλωνικά αντισώματα είναι 58

63 Κεφ. 3. Tαυτόχρονη ανίχνευση Fovea- και Viti-ιών ακατάλληλα για χρήση στη δοκιμή ELISA (Minafra et al., 2001, Meng et al 2000b). Προς το παρόν ο RSPaV-1 ανιχνεύεται με παράλληλη χρησιμοποίηση δύο διαφορετικών δοκιμών PCR όμως η μέθοδος δεν καταφέρνει να ανιχνεύσει περίπου το 4% των απομονώσεων του ιού (Nolasco et al., 2000). Η μεγαλύτερη ευαισθησία και αξιοπιστία της PCR, σε σχέση με την ELISA, την καθιστούν ελκυστική και για την ανίχνευση των GVA και GVB. Όμως οι αναστολείς της PCR που υπάρχουν στους ιστούς της αμπέλου απαιτούν χρονοβόρες διαδικασίες προετοιμασίας των δειγμάτων γεγονός που αποτελεί ανασταλτικό παράγοντα για εφαρμογές ρουτίνας κατά το μαζικό έλεγχο δειγμάτων. To μεγαλύτερο όμως πρόβλημα είναι η μεγάλη γενετική ποικιλομορφία των πληθυσμών των ιών που εμπλέκονται στη βοθρίωση, με αποτέλεσμα η επιλογή εκκινητών με μεγάλο εύρος ανίχνευσης, με βάση τις υπάρχουσες πληροφορίες για τις αλληλουχίες των γονιδιωμάτων, να είναι δύσκολη έως αδύνατη (Meng et al., 1999, Shi et al., 2000, De Meyer 2000, Rowhani et al., 2000b, Soares et al., 2000). Η χρησιμοποίηση εκκινητών με εκφυλισμό που στοχεύουν συντηρημένες περιοχές του ιδίου γένους, συνδυάζει με επιτυχία μεγάλο εύρος ανίχνευσης (σύνολο των απομονώσεων ενός ιού) και μειωμένο κόστος (ταυτόχρονη ανίχνευση πολλών ιών). Ταυτόχρονη ανίχνευση ιών του γένους Vitivirus έχει αναφερθεί με τη χρησιμοποίηση δύο εκκινητών με μεγάλο εκφυλισμό που στοχεύουν στο γονίδιο που κωδικοποιεί την RdRp των ιών (Saldarelli et al., 1998). Όμως, η μέθοδος αυτή έχει σημαντικά μειωμένη ευαισθησία και εξειδίκευση πιθανώς εξαιτίας της χρησιμοποίησης εκκινητών με μεγάλο εκφυλισμό. Επίσης, εξαιτίας της μειωμένης ευαισθησίας απαιτεί ως εκμαγείο την εκχύλιση ολικού RNA ή και dsrna (εξαιτίας της μειωμένης εξειδίκευσης) και στη συνέχεια, ανίχνευση των προϊόντων της PCR με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμίδης και χρώση αργύρου με αποτέλεσμα η μέθοδος να είναι δύσχρηστη και αναξιόπιστη ως διαγνωστική τεχνική. Σκοπός της εργασίας ήταν η διερεύνηση της δυνατότητας ταυτόχρονης ανίχνευσης των ιών που ανήκουν στα γένη Vitivirus (GVA, GVB, GVD) και Foveavirus (RSPaV-1) με τη χρησιμοποίηση εκκινητών με εκφυλισμό, που δεσμεύονται σε εξελικτικά συντηρημένες αλληλουχίες των ιικών γονιδίων της RdRp πολυμεράσης. Παράλληλα έγινε προσπάθεια βελτίωσης της εξειδίκευσης και της ευαισθησίας της RT- PCR, με τη χρησιμοποίηση εκκινητών οι οποίοι περιέχουν δεοξυινοσίνη (deoxyinosine, di) και την εφαρμογή εστιασμένης-pcr με στόχο τη βελτίωση της αξιοπιστίας της διάγνωσης. Στη συνέχεια διερευνήθηκε η δυνατότητα επεξεργασίας των δειγμάτων με την αποτύπωση σε νάιλον μεμβράνη, εκχυλίσματος φυτικού ιστού, χωρίς να είναι απαραίτητη η απομόνωση RΝΑ. Η μέθοδος αυτή, εστιασμένη RT-PCR με δέσμευση αποτυπώματος, αξιολογήθηκε για την ανίχνευση των GVA, GVB, και GVD (συνολικά 4 απομονώσεις σε Nicotiana sp) και του RSPaV-1 σε 30 πρέμνα. 3.3 Υλικά και μέθοδοι Αντιδραστήρια Tα χημικά που χρησιμοποιήθηκαν προέρχονταν από τις παρακάτω εταιρίες: Διάφορα χημικά: Backer, Fluka, Sigma 59

64 Κεφ. 3. Tαυτόχρονη ανίχνευση Fovea- και Viti-ιών Βιοχημικά αντιδραστήρια: Duchefa, Fluka Αντιδραστήρια μοριακής βιολογίας: BioLabs NEW ENGLAND Inc. ; MWG AG BIOTECH; Life Technologies TM, MD, ΗΠΑ Ένζυμα, Aντιδραστήρια μοριακής βιολογίας (εκκινητές, dntps κλπ): Life Technologies TM MD HΠΑ, New England Biolabs Inc. ΗΠΑ, Finnzymes Φιλανδία. Σκευάσματα (Kits): Invitrogen, BV, Cronigen The Netherlands; Life Technologies TM, MD, ΗΠΑ Διαλύματα Υγρό θρεπτικό μέσο ανάπτυξης βακτηρίων (LB medium, ph: 7): 5 g/l τρυπτόνη (Tryptone) (Flucka), 10 g/l εκχύλισμα ζύμης (Yeast extract) (Flucka), 5 g/l NaCl Στερεό υπόστρωμα ανάπτυξης βακτηρίων (LB agar): LB medium, 15 g/l άγαρ (agar) (Flucka) X-Gal (40 mg/ml): 400 mg X-Gal σε 10ml διμεθυλοφορμαμίδιο (dimethyleformamide) Θρεπτικό υπόστρωμα ανάπτυξης SOC: 2% τρυπτόνη, 0,5% εκχύλισμα ζύμης (Yeast extract), 10mM NaCl, 2,5mM KCl, 10mM MgSO 4, 10mM MgCl 2, 20mM γλυκόζη TE, ph 8: 10mM Tris HCl, 1mM αίθυλενο-διάμινο-τετραοξικό-οξύ (EDTA) Διάλυμα ομογενοποίησης δειγμάτων: 0.5 M Tris, (ph 8,2), 0,14 M NaCl, 10% PVP- 40, 1% BSA, 0,05% Tween 20 και 0,7% Na 2 SO 3 Διάλυμα "αποδέσμευσης" εκμαγείου: (0,1 M γλυκίνη-naoh, ph 9,0, 50 mm NaCl, 1 mm EDTA, 0.5% Triton X-100, 1% β-μερκαπτοεθανόλη) Φυτικό υλικό Οι viti-ιοί που χρησιμοποιήθηκαν ήταν δύο ελληνικές απομονώσεις του GVA σε Nicotiana benthamiana, μια του GVB σε N. occidentalis και μια ιταλική απομόνωση του GVD σε N. occidentalis ευγενική χορηγία του Dr Pasquale Saldarelli (Centro di Studio del CNR sui Virus e le Virosi delle Colture Mediterranee, Bari, Italy). Επίσης χρησιμοποιήθηκαν 37 βιότυποι ποικιλιών (Vitis vinifera L.), από τους οποίους οι 29 ήταν προσβεβλημένοι από τον RSPaV-1 (Κεφ. ΙΙ, Πίνακες 2.3 και 2.4) Προετοιμασία των δειγμάτων για τις δοκιμές RT-PCR Χρησιμοποιήθηκαν δύο μέθοδοι προετοιμασίας των δειγμάτων, η εκχύλιση ολικού RNA και η αποτύπωση εκχυλίσματος φυτικού χυμού σε νάιλον μεμβράνη. Η εκχύλιση ολικού RNA έγινε με μέθοδο που χρησιμοποιεί διοξείδιο του πυριτίου (SiO 2 ) (Rott & Jelkmann 2001) (βλέπε Κεφ. 2). Η αποτύπωση εκχυλίσματος φυτικού χυμού σε νάιλον μεμβράνη έγινε σύμφωνα με μια διαδικασία που αναφέρθηκε προηγουμένως (La Notte et al.,, 1997) η οποία βελτιώθηκε σημαντικά στη συνέχεια, ώστε να έχει πιο αξιόπιστα αποτελέσματα με την RT-PCR. Η βελτιωμένη διαδικασία περιλάμβανε τα εξής στάδια (Εικόνα 3.1): Μεμβράνες Hybond N + (Roche Diagnostics GmbH, Germany) τοποθετήθηκαν σε διάλυμα 50 mm NaOH, 2.5 mm EDTA, και στη συνέχεια αφέθηκαν να στεγνώσουν 60

65 Κεφ. 3. Tαυτόχρονη ανίχνευση Fovea- και Viti-ιών στον αέρα. Οι μεμβράνες κόπηκαν σε μικρά τμήματα (5 x 5 mm) και κάθε τμήμα τοποθετήθηκε στον πυθμένα ενός μικροσωλήνα (1,5 ml) με τη χρήση αποστειρωμένης λαβίδας. Σε πλαστική σακούλα, ομογενοποιήθηκαν περίπου 100 mg φυτικού ιστού (ξύσματα καμβίου ή μίσχοι ώριμων φύλλων που λήφθηκαν με αποστειρωμένη λεπίδα) σε 2 ml διαλύματος ομογενοποίησης [0.5 M Tris, (ph 8,2), 0,14 M NaCl, 10% PVP-40, 1% BSA, 0,05% Tween 20 και 0,7% Na 2 SO 3 ]. Μια μικρή ποσότητα μεταφέρθηκε σε μικροσωλήνα των 1,5 ml, φυγοκεντρήθηκε στις rpm για 2 λεπτά, και 1,5 μl τοποθετήθηκε με προσοχή στη μεμβράνη μέσα στο μικροσωλήνα. Οι αποτυπωμένες μεμβράνες αφέθηκαν να στεγνώσουν μέσα σε θάλαμο οριζόντιας νηματικής ροής σε θερμοκρασία δωματίου, πριν από τη χρησιμοποίηση τους ή την αποθήκευσή τους στους 20 o C. Η απελευθέρωση του RNA εκμαγείου από την μεμβράνη έγινε με την προσθήκη στους μικροσωλήνες 200 µl ενός διαλύματος "αποδέσμευσης" (0,1 M γλυκίνη-naoh, ph 9,0, 50 mm NaCl, 1 mm EDTA, 0.5% Triton X-100, 1% 2-μερκαπτοαιθανόλη) το οποίο περιείχε 0,5μΜ του εκκινητή RW κ1 (Παρ , Πιν. 3.3). Οι μικροσωλήνες επωάστηκαν για 4 λεπτά στους 94 C, αναδεύτηκαν για 2 δευτερόλεπτα και 1 μl χρησιμοποιήθηκε στην RT-PCR, ενώ οι μικροσωλήνες αποθηκεύτηκαν στους -25 ο C για μελλοντική χρήση. Αποτύπωση σε νάιλον μεμβράνη 1. Oμογενοποίηση ιστού 1/20 σε [0.5 M Tris, (ph 8,2), 0,14 M NaCl, 10% PVP-40, 1% bovine serum albumin (BSA), 0.05% Tween 20 και 0.7% Na 2 SO 3 ]. 2. Φυγοκέντρηση 5000rpm 3. Αποτύπωση 1,5 μl σε νάιλον μεμβράνη μl GES GES 0.1 M glycine-naoh, ph 9,0 50 mm NaCl 1mM EDTA 0,5% Triton X-100 1% β-mercaptoethanol o C 4 λεπτά 1μl 5. RT-PCR Εικόνα 3.1 Προετοιμασία του δείγματος για RT-PCR με αποτύπωση εκχυλίσματος φυτικού χυμού σε νάιλον μεμβράνη και θερμική επεξεργασία. Για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας ανίχνευσης της εστιασμένης RT-PCR με δέσμευση αποτυπώματος, μίσχοι φύλλων από τρία διαφορετικά πρέμνα προσβλημένα με τον RSPaV-1 και από ένα υγιές, ομογενοποιήθηκαν σε διάλυμα ομογενοποίησης όπως περιγράφηκε παραπάνω. Στη συνέχεια, έγιναν διαδοχικές αραιώσεις (10 φορές) των εκχυλισμάτων των θετικών δειγμάτων με τη χρησιμοποίηση εκχυλίσματος από τα υγιή δείγματα, και ακολούθησε η αποτύπωσή τους στη μεμβράνη. 61

66 Κεφ. 3. Tαυτόχρονη ανίχνευση Fovea- και Viti-ιών Εξειδικευμένη ανίχνευση των GVA, GVB, και GVD με RT-PCR Οι απομονώσεις των GVA, GVB, και GVD, ελέγχθηκαν με RT-PCR σε δύο μικροσωλήνες (βλέπε Κεφ. ΙΙ) με ειδικούς εκκινητές (De Meyer et al, 1999, Abou- Ghanem et al, 1999, Minafra et al, 1994) (Πίνακας 3.1), με τη χρησιμοποίηση εκχυλίσματος ολικού RNA από μίσχους φύλλων (Rott & Jelkmann 2001). Πίνακας 3.1 Εκκινητές, θερμοκρασία επανασύνδεσης (annealing temperature, Ta) και μήκος προϊόντος για την ανίχνευση με RT-PCR, των GVA (De Meyer et al, 1999), GVB (Minafra et al, 1994) και GVD (Abou-Ghanem et al, 1999). Ιός Εκκινητής Αλληλουχία Τa Προϊόν GVA GVD GVB G5 G6 GD1 GD2 C410 H28 5 -CCAGAGGWGTTTGAGACAATA-3 5 -GTCCCGACCAAGGCGATGTACCC-3 5 -GTACCTTAGGACGCTCTTCGGG-3 5 -CGTACTCACACTCGACCCAACG-3 5 -ATCAGCAAACACGCTTGAACCG-3 5 -GTGCTAAGAACGTCTTCACAGC-3 52 o C 195 ζβ 60 o C 700 ζβ 59 o C 450 ζβ Σχεδιασμός εκκινητών με εκφυλισμό για την ταυτόχρονη ανίχνευση ιών που ανήκουν στα γένη Foveavirus και Vitivirus Οι εκκινητές είναι ο κύριος παράγοντας που καθορίζει την εξειδίκευση του προϊόντος της PCR. Η παρουσία συντηρημένων περιοχών στην αλληλουχία των αμινοξέων σε μια ομάδα πρωτεϊνών όπως για παράδειγμα η RdRp επιτρέπει το σχεδιασμό εκκινητών για την ανίχνευση των γονιδίων που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες αυτές. Η ομοιότητα όμως που παρατηρείται στις συντηρημένες περιοχές των αμινοξέων, σπανίως διατηρείται όταν εξεταστούν οι αλληλουχίες των νουκλεοτιδίων που κωδικοποιούν τις αντίστοιχες περιοχές των αμινοξέων στα διάφορα γονίδια και αυτό οφείλεται στον εκφυλισμό του γενετικού κώδικα (πολλά αμινοξέα κωδικοποιούνται με περισσότερες από μια τριπλέτες νουκλεοτιδίων). Οι αντίστοιχοι εκκινητές που σχεδιάζονται με βάση τις περιοχές αυτές λέγονται εκκινητές με εκφυλισμό (degenerate primers) και αποτελούνται από μείγμα εκκινητών έτσι ώστε να καλύπτονται όλοι οι δυνατοί συνδυασμοί νουκλεοτιδίων. O εκφυλισμός ενός εκκινητή εκφράζει το άθροισμα του συνόλου των εκκινητών από τους οποίους αποτελείται (Πίνακας 3.2). Πίνακας 3.2 Παράδειγμα σχεδιασμού ενός εκκινητή με εκφυλισμό με βάση την αλληλουχία έξι αμινοξέων. Αμινοξέα A K A G Q T Κωδικοποίηση GCΝ AAR GCΝ GGΝ CAR ACΝ * Εκκινητής 5 -GCΝAARGCΝGGΝCARAC-3 Εκφυλισμός 4x 2x 4x 4x 2=256 * Ν=Α ή Τ ή C ή G, R= Α ή G 62

67 Κεφ. 3. Tαυτόχρονη ανίχνευση Fovea- και Viti-ιών Με τη χρησιμοποίηση εκκινητών με εκφυλισμό, είναι δυνατή η ταυτόχρονη ανίχνευση συγγενών ιών. Η RdRp των RNA ιών έχει συντηρημένες περιοχές (motifs I- VIII) (Koonin, 1991). Δύο εκκινητές με μεγάλο εκφυλισμό που στοχεύουν στο γονίδιο που κωδικοποιεί την RdRp (motifs II και V, Koonin 1991) ιών των γενών Vitivirus και Trichovirus έχουν ήδη σχεδιαστεί (Saldarelli et al.,, 1998). Ομοίως στην παρούσα εργασία σχεδιάστηκαν εκφυλισμένοι εκκινητές από τις αντίστοιχες γονιδιακές περιοχές των viti- και fovea-ιών. Για την επιλογή συντηρημένων περιοχών του γονιδιώματος για τον σχεδιασμό των εκκινητών, έγινε ευθυγράμμιση των αλληλουχιών αμινοξέων τμήματος της RdRp επτά απομονώσεων fovea-ιών και τριών viti-ιών που έχουν δημοσιευτεί στην βάση δεδομένων του European Molecular Biology Laboratory- European Bioinformatics Institute, (EMBL-EBI). Η ευθυγράμμιση των αλληλουχιών έγινε με το πρόγραμμα CLUSTAL V (Thompson et al., 1994) (Εικόνα 3.2). ASPV AKAGQTLACFQHSVLCRFAPYMRYIESN 30aa GVCTESDYEAFDASQDHFILAF 30aa SFAIMRFTGEA ASPV AKAGQTLACFQHAVLCRFAPYMRYIEAK 30aa GVCTESDYEAFDASQDHFILAF 30aa NFAIMRFTGEA GRSPaV AKAGQTLACFQHAVLVRFAPYMRYIEKK 30aa GICTESDYEAFDASQDHFILAF 30aa SFSIMRFTGEA RSPaV-1 AKAGQTLACFQHAVLVRFAPYMRYIEKK 30aa GICTESDYEAFDASQDHFILAF 30aa SFSIMRFTGEA CNRMV AKAGQTLACFHHNVLCRLAPYVRYIEKK 30aa GTCTESDYEAFDSSQDANILAF 30aa RFAVMRFTGEA CGRMV AKAGQTLACFHHNVLCRLAPYIRYIEKK 30aa GMCTESDYEAFDSSQDANILAF 30aa QFAVMRFTGEA CGRMV AKAGQTLACFHHNVLCRLAPYIRYIEKK 30aa GMCTESDYEAFDSSQDANILAF 30aa QFAVMRFTGEA GVA AKAGQTIACFAHSVLCRFGPILRQTEKA 30aa MMGTDSDYEAFDRSQDEKVLDL 30aa DLAVMRFSGEF GVD AKAGQTIACFCHSVLCRFGPKLRQTEKA 30aa FRGTDSDYEAFDRSQDEKILRL 30aa NLAIMRFSGEF GVB AKAGQTIACFCHAVLCRFGPLLRQTEKA 30aa LDGTDSDYEAFDRSQDEKVLDF 30aa SLAVMRFSGEF ******.*** *.*...* *..*.*.******* *** *...***.**. Περιοχές για τον σχεδιασμό των εκκινητών: AKAGQT(I/L)ACF T(E/D)SDYEAF MRF(S/T)GE(A/F) Εικόνα 3.2 Ευθυγράμμιση αλληλουχιών αμινοξέων και συντηρημένες περιοχές τμήματος της RdRp των: Ιός της βοθρίωσης της μηλιάς (Apple stem pitting virus, ASPV Foveavirus,) (EMBL, αριθμοί καταχώρησης: Q64962 and Q9E948), RSPaV- 1 (O91724 και O91901), Ιός της νεκρωτικής ποικιλόχρωσης της κερασιάς (Cherry necrotic rusty mottle virus, CNRMV, Foveavirus), (Q9IH80), Ιός της πράσινης δακτυλιοειδούς ποικιλόχρωσης ποικιλόχρωσης της κερασιάς (Cherry green ring mottle virus, CGRMV Foveavirus), (Q9DJV1 και O91632), GVA (Q67704), GVD (Q96806) και GVB (Q96806). Η ευθυγράμμιση έγινε με το πρόγραμμα CLUSTAL V. *(30aa= 30 αμινοξέα). Στη συνέχεια, για την τελική επιλογή των εκκινητών έγινε ευθυγράμμιση αλληλουχιών των νουκλεοτιδίων που εκφράζουν τις συντηρημένες περιοχές, της πολυπεπτιδικής αλυσίδας της RdRp (Εικόνα 3.3). Η επιλογή των εκκινητών έγινε με κύριο κριτήριο το μικρότερο δυνατό εκφυλισμό. Ο σχεδιασμός ενός εκκινητή που να περιλαμβάνει το σύνολο των πιθανοτήτων κωδικοποίησης της σερίνης, αυξάνει σημαντικά τον εκφυλισμό του καθώς η σερίνη κωδικοποιείται από έξι διαφορετικές τριπλέτες νουκλεοτιδίων [TC(A/G/C/T) και AG(T/C)]. Για τη μείωση του εκφυλισμού του εκκινητή RW εστ κ4 λήφθηκαν υπ όψη μόνο τα κωδίκια TC(A/G/C/T) επειδή και τα δύο γένη ιών έχουν προτίμηση σε αυτά για την κωδικοποίηση της σερίνης στο συγκεκριμένο σημείο του γονιδιώματος (Εικόνα 3.3). 63

68 Κεφ. 3. Tαυτόχρονη ανίχνευση Fovea- και Viti-ιών GRSPaV RSPaV-1 ASPV ASPV CGRMV CGRMV CNRMV GVB GVD GVA (RW εστ π1) 5 -GGGGCARACIHTIGCITGYTT-3 Nested (RW π 1) 5 -WGCIAARGCIGGICARAC-3 RT-PCR GRSPaV RSPaV-1 ASPV ASPV CGRMV CGRMV CNRMV GVB GVD GVA (RW εστ κ4) 3 -TGNCTIAGICTRATRCTYCGIAA-5 Nested GRSPaV RSPaV-1 ASPV ASPV CGRMV CGRMV CNRMV GVB GVD GVA (RW κ 1) 3 -TACKCIAARWSICCICTYMR-5 RT-PCR Εικόνα 3.3 Ευθυγράμμιση αλληλουχιών νουκλεοτιδίων που εκφράζουν τμήμα της RdRp των RSPaV-1, ASPV CGRMV, CNRMV, GVB, GVD και GVA και επιλογή εκκινητών. Η ευθυγράμμιση έγινε με το πρόγραμμα CLUSTAL V. Για την περαιτέρω μείωση του εκφυλισμού των εκκινητών τοποθετήθηκε δεοξυινοσίνη στα σημεία που ο εκφυλισμός των εκκινητών είχε την τιμή 4 (αντί για A/G/C/T). Για παράδειγμα ο εκκινητής 5 -GCΝAARGCΝGGΝCARAC-3 με εκφυλισμό 256 (Πίνακας 3.2), μετά από την προσθήκη ινοσίνης (di) γίνεται 5 - GCΙAARGCΙGGΙCARAC-3 με αντίστοιχο εκφυλισμό 4. Η ινοσίνη μπορεί να ζευγαρώνει με κυτοσίνη, αδενίνη ή ουρακίλη σύμφωνα με το φαινόμενο αστάθειας 'wobble' (Εικόνα 3.4) και έχει χρησιμοποιηθεί για τη μείωση του εκφυλισμού των εκκινητών (Rossolini et al., 1994). 64

69 Κεφ. 3. Tαυτόχρονη ανίχνευση Fovea- και Viti-ιών Σχεδιάστηκαν διαφορετικά ζεύγη εκκινητών για την εφαρμογή τους σε RT-PCR και εστιασμένη PCR, αντίστοιχα. Για την RT-PCR σχεδιάστηκε ένα ζεύγος εκκινητών το οποίο θεωρητικά πολλαπλασιάζει μια περιοχή 363 ζβ των viti- και fovea-ιών (Πίνακας 3.3): RW π1 :5 -WGCIAARGCIGGICARAC-3 RW κ1 :5 -RMYTCICCISWRAAICKCAT-3 Κριτήρια κατά το σχεδιασμό των εκκινητών ήταν η παρόμοια κινητική δέσμευσης τους και η ελάχιστη θερμοκρασία τήξης τους (min Tm) να είναι περίπου 46 o C. Η min Tm των εκκινητών που περιέχουν di υπολογίστηκε προσθέτοντας 2ºC για κάθε μια από τις βάσεις Α ή Τ και τις εκφυλισμένες περιοχές εκτός από τον εκφυλισμό S (G ή C), 4ºC για κάθε μια από τις βάσεις G ή C και τον εκφυλισμό S και 0ºC για την di (Barti, 1997). Εικόνα 3.4 Δεσμοί Για την εστιασμένη PCR αρχικά σχεδιάστηκαν ινοσίνης με κυτοσίνη, διάφορα ζεύγη εκκινητών τα οποία θεωρητικά αδενίνη ή ουρακίλη πολλαπλασιάζουν μια περιοχή 198 ζβ από το προϊόν της RT- PCR: RW εστ π RW εστ π1 :5 -GCIGGICARACIHTIGCITGYTT-3 RW εστ π2 : 5 -GGGGCARACIHTIGCITGYTT-3 RW εστ κ RW εστ κ1 :5 -RTCRAAIGCYTCRTARTCIGAITCIGT-3 RW εστ κ2 : 5 -TCRAAIGCYTCRTARTCIGAITCIGT-3 RW εστ κ2β : 5 -CRAAIGCYTCRTARTCIGAITCMGT-3 RW εστ κ3 : 5 -TCRAAIGCYTCRTARTCIGAITC-3 RW εστ κ4 : 5 -AAIGCYTCRTARTCIGAITCNGT-3 RW εστ κ5 : 5 -TCRAAIGCYTCRTARTCIGANTC-3 Κριτήρια για το σχεδιασμό των εκκινητών ήταν η παρόμοια κινητική δέσμευση τους ενώ η ελάχιστη θερμοκρασία τήξης τους (min Tm) να είναι μεγαλύτερη κατά 10ºC περίπου από αυτή των εκκινητών που χρησιμοποιούνται στην RT-PCR. Οι εκκινητές αξιολογήθηκαν για τη δυνατότητα ευαίσθητης ανίχνευσης με τη χρησιμοποίηση προϊόντων από δοκιμές RT-PCR μετά από αποτύπωση φυτικού εκχυλίσματος σε νάιλον μεμβράνη, δειγμάτων που αναφέρονται στην παράγραφο Κάθε εκκινητής δοκιμάστηκε σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες επανασύνδεσης (50ºC, 54ºC και 58ºC). Τελικά επιλέχθηκαν οι RW εστ π1 και RW εστ κ4 (Πίνακας 3.3) 65

70 Κεφ. 3. Tαυτόχρονη ανίχνευση Fovea- και Viti-ιών Πίνακας 3.3 Εκκινητές με εκφυλισμό που επιλέχθηκαν για την ανίχνευση των viti- και fovea-ιών. Εκκινητές Αλληλουχία Αντιστοιχία σε αμινοξέα δοκιμή/ μηκος προϊόντος Εκφυλισμός RW π 1 5 -WGCIAARGCIGGICARAC-3 AKAGQT RT-PCR/ 8 RW κ 1 5 -RMYTCICCISWRAAICKCAT-3 MRF(S/T)GE(A/F) 363 ζβ 128 RW εστ π2 5 -GGGGCARACIHTIGCITGYTT-3 GQT (I/L)ACF Εστιασμένη PCR/ 12 RW εστ κ4 5 -AAIGCYTCRTARTCIGAITCNGT-3 T(E/D)SDYEAF 198 ζβ 32 (W=A+T; R=A+G; M=A+C; Y=C+T; S=G+C; K=G+T; H=A+T+C; N=A+T+C+G; I=Iνοσίνη) Τέλος, διερευνήθηκε η δυνατότητα ανίχνευσης των ιών μετά από αποτύπωση φυτικού εκχυλίσματος σε νάιλον μεμβράνη, δειγμάτων που αναφέρονται στην παράγραφο χρησιμοποιώντας τους παρακάτω εκκινητές με πλήρη εκφυλισμό (χωρίς di): RW π 1N : 5 -GCNAARGCNGGNCARAC-3 RW κ 1N : 5 -RMYTCNCCNSWRAANCKCAT-3 RW εστ π1n :5 -GGNCARACNHTNGCNTGYTT-3 RW εστ κ1n :5 -AANGCYTCRTARTCNGANTCNGT Ανάπτυξη μεθόδου εστιασμένης RT-PCR Οι αντιδράσεις βελτιστοποιήθηκαν ως προς τη συγκέντρωση του MgCl 2 (1,5 mm / 2,0 mm / 2,5 mm) και των εκκινητών (0,2 / 0,5 / 1,0µM), ενώ η βέλτιστη Τα βρέθηκε πειραματικά. Τελικά επιλέχθηκαν οι παρακάτω συνθήκες αντιδράσεων. RT-PCR στον ίδιο μικροσωλήνα: Στη μέθοδο αυτή η σύνθεση του συμπληρωματικού DNA και ακολούθως η αντίδραση της PCR γίνονται στον ίδιο μικροσωλήνα των 0,2 ml και στο ίδιο διάλυμα αντίδρασης (Εικόνα 3.5). Η αντίδραση έγινε σε συνολικό όγκο 25 µl για κάθε δείγμα. Κάθε μικροσωλήνας περιείχε: 10 mm Tris-HCl (ph: 8,8), 50 mm KCl, 1,5 mm MgCl 2, 0,1 % Τriton Χ-100, 0,25 mm κάθε dntp, 5,0 mm DTT, 12 μονάδες RNASEOUT αναστολέα ριβονουκλεασών (Life Technologies TM MD, USA), 0,6 μονάδες Dynazyme TM II DNA πολυμεράση (Finnzymes, Finland), 1 μονάδα AMV αντίστροφη μεταγραφάση (Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase, Finnzymes, Finland), 1 µm από κάθε εκκινητή (RW π1 και RW κ1) και συμπληρώθηκε με απεσταγμένο νερό (που υπέστη μεταχείριση με DEPC) μέχρι τελικού όγκου των 24 μl. Στη συνέχεια προστέθηκε 1,0 μl εκχυλίσματος ολικού RNA ή διαλύματος "αποδέσμευσης" από επεξεργασία αποτυπωμένης μεμβράνης και οι μικροσωλήνες τοποθετήθηκαν σε θερμοκυκλοποιητή 66

71 Κεφ. 3. Tαυτόχρονη ανίχνευση Fovea- και Viti-ιών (Gene Amp 2400, Perkin Elmer), όπου επωάστηκαν σύμφωνα με τα παρακάτω στάδια για την αντίδραση της αντίστροφης μεταγραφής: για 60 λεπτά στους 42 o C, 2 λεπτά στους 50 o C και στη συνέχεια, για 4 λεπτά στους 94 o C. Ακολούθησαν για την αντίδραση της PCR, 40 κύκλοι των 30 δευτερόλεπτων στους 95 o C, 30 δευτερόλεπτων στους 42 o C και 15 δευτερόλεπτων στους 72 o C και η αντίδραση ολοκληρώθηκε με μία τελευταία επώαση επί 2 λεπτά στους 72 ο C. Εστιασμένη PCR: Η αντίδραση έγινε σε συνολικό όγκο 21 µl για κάθε δείγμα με τη χρησιμοποίηση 1 μl από το προϊόν της RT-PCR (Εικόνα 3.5). Κάθε μικροσωλήνας περιείχε: 10 mm Tris-HCl (ph: 8,8), 50 mm KCl, 1,5 mm MgCl 2, 0,1 % Τriton Χ-100, 0.2 mm κάθε dntp, 0,5 μονάδες Dynazyme TM II DNA πολυμεράση (Finnzymes, Finland), 1 µm από κάθε εκκινητή (RW εστ π2 και RW εστ κ4) και συμπληρώθηκε με απεσταγμένο νερό (που υπέστη μεταχείριση με DEPC) μέχρι τελικού όγκου των 20 μl. Οι μικροσωλήνες τοποθετήθηκαν σε θερμοκυκλοποιητή (Gene Amp 2400, Perkin Elmer), όπου επωάστηκαν για 3 λεπτά στους 95 o C, 10 δευτερόλεπτα στους 49 o C και στη συνέχεια για 10 δευτερόλεπτα στους 72 o C. Ακολούθησαν για την αντίδραση της PCR, 39 κύκλοι των 20 δευτερόλεπτων στους 95 o C, 20 δευτερόλεπτων στους 54 o C και 10 δευτερόλεπτων στους 72 o C και η αντίδραση ολοκληρώθηκε με μία τελευταία επώαση επί 2 λεπτά στους 72 ο C. Για την ανάλυση των προϊόντων της PCR χρησιμοποιήθηκε η ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης σε τελική συγκέντρωση 1,8% σε 1xTΑE ρυθμιστικό διάλυμα (βλέπε κεφ 2). RT-PCR στον ίδιο μικροσωλήνα ΕΣΤΙΑΣΜΕΝΗ-PCR 1μl GES 1. RT-PCR 1μl προϊόν RT-PCR 2. nested PCR 1. RT-PCR 60 min 42 o C 2 min 50 o C 4 min 94 o C 40 κύκλοι 30 sec 95 o C 30 sec 42 o C 15 sec 72 o C 2 min 72 o C 2. ΕΣΤΙΑΣΜΕΝΗ-PCR 3 min 94 o C 40 κύκλοι 20 sec 95 o C 20 sec 54 o C 10 sec 72 o C 2 min 72 o C Εικόνα 3.5: Διαδικασία μεθόδου εστιασμένης RT-PCR 67

72 Κεφ. 3. Tαυτόχρονη ανίχνευση Fovea- και Viti-ιών Μοριακή κλωνοποίηση και προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας των προϊόντων της PCR Θρεπτικό διάλυμα ανάπτυξης βακτηρίων και αντιβιοτικά: Οι βακτηριακές καλλιέργειες αναπτύχθηκαν σε υγρό θρεπτικό διάλυμα LB [5g/l τρυπτόνη (Tryptone) (Flucka), 10g/l εκχύλισμα ζύμης (Yeast extract) (Flucka), 5g/l NaCl, αμπικιλίνη 100μg/ml ph: 7], στους 37 C, σε γυάλινους αποστειρωμένους σωλήνες υπό συνεχή ανάδευση (225 rpm) ή σε τρυβλία Petri που περιείχαν στερεό θρεπτικό διάλυμα LB (15g agar /l LB). Εξαγωγή του DNA προϊόντος της PCR, από πήγμα αγαρόζης: Για την εξαγωγή του DNA από το πήγμα αγαρόζης χρησιμοποιήθηκε το σκεύασμα "Concert TM matrix gel extraction system" (Life Technologies TM MD, USA). Το προϊόν της PCR (80μl), αναλύθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης και η επιθυμητή DNA ζώνη απομακρύνθηκε με αποστειρωμένη λεπίδα, τοποθετήθηκε σε μικροσωλήνα (1,5 ml) και προστέθηκαν τρεις όγκοι ρυθμιστικού διαλύματος διαλυτοποίησης (gel sοlubilisation buffer, L1) και 1/10 όγκοι διοξειδίου του πυριτίου (silica resin) για την δέσμευση του DNA. Οι μικροσωλήνες αναδεύτηκαν και τοποθετήθηκαν στους 50 C για 15 λεπτά, για να διαλυθεί η αγαρόζη και να δεσμευθεί το DNA στη στερεή φάση του SiO 2. Κατόπιν το μίγμα φυγοκεντρήθηκε για 30 δευτερόλεπτα στις 5.000rpm και το υπερκείμενο απομακρύνθηκε. Ακολούθησε ένα ακόμη πλύσιμο με το διάλυμα L1 και άλλα δυο με το διάλυμα L2 το οποίο περιέχει αιθανόλη. Το ίζημα SiO 2 αφέθηκε να στεγνώσει και επαναιωρήθηκε σε 20μl διαλύματος ΤΕ, για να ακολουθήσει επώασή του για 5 λεπτά στους 50 C για να απελευθερωθεί το DNA στο υδατικό διάλυμα. Μετά από φυγοκέντρηση του διαλύματος για 30 δευτερόλεπτα στις rpm, το υπερκείμενο συλλέχθηκε σε αποστειρωμένο μικροσωλήνα (1,5 ml). Το καθαρισμένο προϊόν της PCR χρησιμοποιήθηκε είτε για κλωνοποίηση, είτε απευθείας για προσδιορισμό της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας. Στελέχη βακτηριακών κυττάρων φορείς κλωνοποίησης: Στη διαδικασία του μετασχηματισμού (transformation) χρησιμοποιήθηκε το βακτήριο Esherichia coli (Invitrogen BV, Cronigen, The Netherlands): F - mcra Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 reca1 deor arad139 Δ(ara-leu)7697 galu galk rpsl (Str R ) endal nupg. Τα προϊόντα της PCR κλωνοποιήθηκαν με τη βοήθεια του πλασμιδιακού φορέα pcr 2.1-TOPO (Invitrogen, The Netherlands) Κλωνοποίηση των προϊόντων της PCR: Για την κλωνοποίηση των προϊόντων της PCR χρησιμοποιήθηκε το σύστημα κλωνοποίησης TOPO TA Cloning version H (Invitrogen, The Netherlands). Η επιτυχής ένθεση του προϊόντος της PCR στον πλασμιδιακό φορέα βασίζεται στη μη εξαρτώμενη από το εκμαγείο, ικανότητα της Taq πολυμεράσης να τοποθετεί ένα μόριο αδενίνης (Α) σε κάθε ένα από τα δύο 3 άκρα του προϊόντος της PCR που συνθέτει (Mead et al.,, 1991). Με σκοπό την αξιοποίηση αυτής της ικανότητας της Taq πολυμεράσης, το μόριο του γραμμικού πλασμιδιακού φορέα φέρει προεξέχοντα μόρια θυμίνης (Τ) σε κάθε ένα από τα δύο 3 άκρα του ώστε να συνδέονται με τα συμπληρωματικά μόρια αδενίνης που προεξέχουν στα 3 άκρα του 68

73 Κεφ. 3. Tαυτόχρονη ανίχνευση Fovea- και Viti-ιών προϊόντος της PCR. Με αυτόν τον τρόπο επιτυγχάνεται η ένθεση του προϊόντος PCR στο φορέα (Εικόνα 3.6). Ιδιαίτερο χαρακτηριστικό του συγκεκριμένου συστήματος είναι η χρησιμοποίηση του ενζύμου της τοποϊσομεράσης Ι (topoisimerase I) το οποίο καταλύει τη σύνδεση του προϊόντος PCR στο φορέα. Εικόνα 3.6 Ένθεση του προϊόντος PCR στον ενεργοποιημένο πλασμιδιακό φορέα pcr 2. 1 Η διαδικασία της κλωνοποίησης περιλαμβάνει: 1) την ένθεση του προϊόντος της PCR στο πλασμιδιακό φορέα και την επώαση του μίγματος σε θερμοκρασία δωματίου για 5. 2) τον μετασχηματισμό των επιδεκτικών κυττάρων (competent cells) με την είσοδο σε αυτά του πλασμιδίου. 3) επιλογή και ανάλυση δέκα λευκών αποικιών για την ανίχνευση της ένθεσης (προϊόν PCR). Για την παρασκευή του μίγματος κλωνοποίησης, προστέθηκαν σε αποστειρωμένο μικροσωλήνα, 2μl προϊόντος PCR, 1μl διάλυμα με τον πλασμιδιακό φορέα και 2μl νερό. Η αντίδραση διακόπτεται με την προσθήκη ενός μl διαλύματος αναστολής της κλωνοποίησης (6x TOPO Cloning Stop Solution) και ο μικροσωλήνας μεταφέρεται στον πάγο. Αμέσως μετά ακολουθεί η διαδικασία του μετασχηματισμού των επιδεκτικών κυττάρων. Ένας μικροσωλήνας με επιδεκτικά κύτταρα μεταφέρεται από τους 80 C σε πάγο. Ακολουθεί προσθήκη 2 μl του μίγματος με τον πλασμιδιακό φορέα, ελαφρά ανάδευση και ο μικροσωλήνας τοποθετείται στο πάγο για 30 λεπτά. Ακολουθεί μεταφορά του μικροσωλήνα σε θερμόλουτρο σε θερμοκρασία 42 C για 30 δευτερόλεπτα, στη συνέχεια τοποθετείται πάλι στον πάγο και προστίθενται 250μl θρεπτικού μέσου SOC που βρίσκεται σε θερμοκρασία δωματίου. Το φιαλίδιο στη συνέχεια τοποθετείται σε ανακινούμενο θάλαμο επώασης στους 37ºC για 60 λεπτά. Στο χρονικό αυτό διάστημα, προετοιμάζονται κατάλληλα, τρυβλία Petri με LB άγαρ που περιέχει αμπικιλίνη σε συγκέντρωση 50 μg/ml. Ποσότητα 40μl X-Gal συγκέντρωσης 40mg/ml προστίθεται σε κάθε τρυβλίο και ακολούθως, μεταφέρονται στους 37 C για μισή ώρα. Στη συνέχεια, σε κάθε τρυβλίο προσθέτονται 100μl διαλύματος των μετασχηματισμένων βακτηρίων, απλώνονται με τη βοήθεια γυάλινης ράβδου και τοποθετούνται στους 37 C για ώρες. Επιλέγονται δέκα λευκές αποικίες οι οποίες μεταφέρονται σε αποστειρωμένους γυάλινους δοκιμαστικούς σωλήνες 69

74 Κεφ. 3. Tαυτόχρονη ανίχνευση Fovea- και Viti-ιών που περιέχουν 3ml υγρό LB θρεπτικό μέσο και αμπικιλίνη σε συγκέντρωση 100μg/ml και τοποθετούνται σε ανακινούμενο θάλαμο επώασης (225 rpm) στους 37ºC για ώρες. Ανάλυση θετικών κλώνων: Για τον έλεγχο της επιτυχούς ένθεσης του προϊόντος PCR στον πλασμιδιακό φορέα, 1μl από κάθε υγρή καλλιέργεια χρησιμοποιήθηκε απευθείας σε PCR με τους εκκινητές 'RW εστ π1' και 'RW εστ κ4' όπως περιγράφηκε στην παράγραφο Συντήρηση των κλώνων: Οι επιθυμητοί κλώνοι αποθηκεύτηκαν σε υγρή αποικία παρουσία 15% αποστειρωμένης γλυκερόλης, στους -80ºC. Εξαγωγή του πλασμιδιακού DNA: Για την εξαγωγή του πλασμιδιακού DNA, χρησιμοποιήθηκε το σύστημα, High Purity Plasmid Midiprep System (Life Technologies TM, MD, USA). Καλλιέργεια κυττάρων (40 ml) φυγοκεντρήθηκε στις 5000 σ/λ για 10 λεπτά. Το κυτταρικό ίζημα κρατήθηκε, διαλύθηκε με τη βοήθεια ενός διαλύματος (200 mm NaOH, 1% sodium dodecyl sulphate β/o) για 5 λεπτά και στη συνέχεια φυγοκεντρήθηκε στα g για 10 λεπτά. Το υπερκείμενο διάλυμα τοποθετήθηκε σε στήλη που περιέχει στρώμα ρητίνης με ικανότητα ανταλλαγής ανιόντων (τα αρνητικά φορτισμένα ιόντα φωσφόρου του DNA, αλληλεπιδρούν με τα θετικά φορτισμένα φορτία της ρητίνης και δεσμεύονται στην επιφάνειά της). Η στήλη ξεπλύθηκε δύο φορές με 10 ml διαλύματος μειωμένης αλατότητας που επιτρέπει την παραμονή του πλασμιδιακού DNA στη ρητίνη. Στη συνέχεια, το πλασμιδιακό DNA εκλούστηκε με τη βοήθεια διαλύματος υψηλής αλατότητας και συλλέχθηκε σε αποστειρωμένο μικροσωλήνα στον οποίο προστέθηκε ισοπροπανόλη σε αναλογία 7/10. Το μίγμα αναδεύτηκε και φυγοκεντρήθηκε στις σ/λ για 30 λεπτά. Μετά την απομάκρυνση του υπερκείμενου, το ίζημα του πλασμιδιακού DNA ξεπλύθηκε με διάλυμα 70% αλκοόλης και ακολούθησε φυγοκέντρηση στις σ/λ για 5 λεπτά. Η αλκοόλη απομακρύθηκε και το ίζημα αφέθηκε να στεγνώσει. Τελικά το DNA αναδιαλύθηκε σε 200μl διαλύματος TE. Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας: Ο προσδιορισμός της νουκλεοτιδιακής αλληλουχίας πραγματοποιήθηκε την μέθοδο διδεοξυ-αναλόγων του Sanger (ρυθμιζόμενη διακοπή της αντιγραφής του DNA). Και οι δύο νουκλεοτιδικές αλυσίδες του προϊόντος της PCR στον πλασμιδιακό φορέα προσδιορίστηκαν διαδοχικά σε αναλυτή ABI Prism 3700 DNA, με τη χρήση του πακέτου "ABI PRISM BigDye Terminators v3.0" (Applied biosystems, Foster City, CA). Η αλληλουχία τεσσάρων προϊόντων εστιασμένης PCR από αντίστοιχα δείγματα (ένα με GVA και τρία με RSPaV-1), προσδιορίστηκε μετά από καθαρισμό, με τη χρησιμοποίηση των εκκινητών: Rw seq up : 5 -CARACGHTGGCGTGYTT-3 ή/και Rw seq down :5 -AAGGCYTCRTARTCGGAGTC-3 Οι αλληλουχίες εξετάστηκαν για ομοιότητες με τις καταχωρημένες αλληλουχίες στη βάση δεδομένων του NCBI (National Centre for Biotechnology Information, Bethesda, USA) με εφαρμογή του αλγόριθμου BLAST. 70

75 Κεφ. 3. Tαυτόχρονη ανίχνευση Fovea- και Viti-ιών 3.4 Αποτελέσματα Τα αποτελέσματα ελέγχου των απομονώσεων GVA, GVB, και GVD με τα διαθέσιμα πρωτόκολλα RT-PCR έδωσαν τα αναμενόμενα προϊόντα των 200, 450 και 700 ζβ αντίστοιχα (Εικόνα 3.7) GVD GVB GVA 700 ζβ 450 ζβ 200 ζβ Δείκτης ΜΒ 100 ζβ Εικόνα 3.7 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων RT-PCR σε πηκτή αγαρόζης. Διαδρομές 1-4: ανίχνευση του GVD, (5-8): ανίχνευση του GVΒ, (9-12): ανίχνευση του GVΑ. Διαδρομές 1,5,9: GVD σε N. occidentalis, (2,6,10): GVB σε N. occidentalis, (3,4,7,8,11,12): GVA σε N. benthamiana. Η βελτιστοποιημένη εστιασμένη RT-PCR με τη χρήση ολικού RNA ή αποτυπώματος μεμβράνης έδωσε τα αναμενόμενα προϊόντα για το σύνολο των απομονώσεων των GVA, GVB, GVD και RSPaV-1 (Εικόνες 3.8 και 3.10). Ανάλυση σε πηκτή αγαρόζης, προϊόντων RT-PCR και ακόλουθης εστιασμένης PCR, τα οποία παράχθηκαν με τη χρησιμοποίηση των ζευγών εκκινητών (RW π1, RW κ1) και (RW εστ π1, RW εστ κ1) αντίστοιχα φαίνονται στην Εικόνα 3.8. H ανάλυση των προϊόντων της RT φανέρωσε ένα μη ειδικό προϊόν στην περίπτωση ενός υγιούς δείγματος, ενώ δεν έδειξε προϊόντα, ή ήταν αδύναμης έντασης, στην περίπτωση των θετικών δειγμάτων (Εικόνα 3.8). Η ακόλουθη εστιασμένη PCR έδειξε μεγάλη ευαισθησία και εξειδίκευση δίνοντας προϊόντα μεγάλης έντασης και μόνο στην περίπτωση των θετικών δειγμάτων (Εικόνα 3.8). Όταν χρησιμοποιήθηκε αποτύπωμα μεμβράνης η ένταση των προϊόντων της RT-PCR μειώθηκε δραματικά όμως η εστιασμένη PCR που ακολούθησε ανίχνευσε με επιτυχία το σύνολο των απομονώσεων (δεδομένα δεν αναφέρονται). Σύγκριση των αλληλουχιών που προσδιορίστηκαν από κλωνοποιημένα και μη προϊόντα της εστιασμένης PCR με δημοσιευμένες αλληλουχίες RdRp, επιβεβαίωσαν την αντίστοιχη προέλευσή τους από ιό (Πίνακας 3.4). 71

76 Κεφ. 3. Tαυτόχρονη ανίχνευση Fovea- και Viti-ιών GVB RSPaV-1 GVB RSPaV-1 ΥΓ1 ΥΓ2 GVA GVD ΥΓ4 ΥΓ3 ΥΓ1 ΥΓ2 GVA GVD ΥΓ4 ΥΓ3 363 ζβ 201 ζβ Δείκτης ΜΒ RT-PCR 100 ζβ εστιασμένη PCR Εικόνα 3.8 Ηλεκτροφόρημα σε πηκτή αγαρόζης, προϊόντων RT-PCR και ακόλουθης εστιασμένης PCR, τα οποία παράχθηκαν με τη χρησιμοποίηση των ζευγών εκκινητών ( RW π1, RW κ1 ) και ( RW εστ π1, RW εστ κ1 ) αντίστοιχα. Το εκμαγείο ήταν εκχύλισμα ολικού RNA από μίσχους φύλλων αμπέλου προσβλημένης με RSPaV-1, N. benthamiana με GVA, N. occidentalis με GVB και N. occidentalis με GVD. (ΥΓ: υγιή δείγματα, ΥΓ1 και ΥΓ2: αμπέλι, ΥΓ3: N. benthamiana, ΥΓ4: N. occidentalis). Πίνακας 3.4 Ποσοστά ομολογίας των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών των 200 ζβ που προσδιορίστηκαν από κλωνοποιημένα και μη προϊόντα της εστιασμένης PCR και των αντίστοιχα μεταφρασμένων αλληλουχιών των αμινοξέων, με ομόλογες δημοσιευμένες αλληλουχίες RdRp. Αλληλουχίες Ομολογία νουκλεοτιδίων Ομολογία Δημοσιευμένες αλληλουχίες αμινοξέων Ιός Κωδικός πρόσβασης Κλώνος α 82% 90% RSPaV-1 AF Κλώνος β 99% 100% GVD Y15892 Προϊόν PCR α 83% 96% GVA X75433 Κλώνος γ 79% 96% GVB X75448 Παρακάτω αναφέρονται οι αλληλουχίες που προσδιορίστηκαν: Κλώνος α (RSPaV-1) GCnGGnCAGACnCTnGCnTGCTTTCAACATGCAGTTTTGGTTCGTTTTGCTCCTTATAT GAGGTACATTGAAAAGAAGCTCATGCAAGCTTTAAAACCGAATTTTTACATTCACTCTG GTAAAGGTCTTGATGAACTTAATGAATGGGTTAAAGCGCGAAACTTTACAGGCATTTGC ACnGAnTCnGATTACGAAGCnTTCGA 72

77 Κεφ. 3. Tαυτόχρονη ανίχνευση Fovea- και Viti-ιών Κλώνος β (GVD) GCnGGnCAGACnCTnGCnTGTTTTTGTCATTCTGTGTTGTGCAGATTCGGACCCAAATT GAGGCAGACTGAGAAGGCGCTGAAGATGATGCTGCCAGCCAATGTCATGATATACAGCC AGAAGAATTACTCTGATTTGGATAAGTGGTGCAAGAACTTTGTGACTGATTTCAGAGGC ACNGAnTCnGACTATGAAGCnTTTGA Προϊόν PCR α (GVA) GCnGGnCAGACnCTnGCnTGCTTTGCACATTCAGTGCTCTGTAGATTCGGACCAATACT GAGACAGACTGAGAAAGCGCTGAGGGAGCTTATGCCG Κλώνος γ (GVB) GCnGGnCAGACnCTnGCnTGCTTCTGCCATGCTGTCCTATGTCGGTTCGGACCACTGCT CCGCCAAACTGAGAAGGCGTTGAGGGATCAACTAGGGCCCAATGTGATGATTTACTCTC AGAAGAACTACACCGATTTGGATAAATGGTGCAAGAACTTCGTGCGAACCTTGGATGGA ACCGACTCnGACTATGAAGCnTTCGA Σε μερικά από τα δείγματα παρατηρήθηκε αναστολή της RT-PCR όταν έγινε απευθείας αποτύπωση του φυτικού χυμού σε νάιλον μεμβράνη σύμφωνα με τους La Notte, et al.,, (1997). Η διαδικασία βελτιώθηκε σημαντικά όταν πριν από την αποτύπωση, τα δείγματα ομογενοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα (0,5 M Tris, ph 8,2, 0,14 M NaCl, 0,05% Tween 20) με αραίωση 1/20, ενώ επιπλέον προσθήκη PVP-40 (10%), BSA (1%) και Na 2 SO 3 (0,7%) στο ρυθμιστικό διάλυμα, μείωσε σημαντικά την δραστηριότητα των αναστολέων της PCR (Εικ. 3.9). Μετά από τις βελτιώσεις αυτές, το σύνολο των αποτυπώσεων έδωσε εκμαγεία κατάλληλα για PCR Δείκτης ΜΒ 100 ζβ Εικόνα 3.9 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR τα οποία παράχθηκαν από αποτύπωση φυτικού εκχυλίσματος έξι δειγμάτων προσβλημένων με RSPaV-1, με τη χρησιμοποίηση των ζευγών εκκινητών ( RW π1, RW κ1 ) και ( RW εστ π2, RW εστ κ4 ). Διαδρομές 1-6: αποτύπωση σύμφωνα με La Notte et al. (1997), διαδρομές 7-12: βελτιωμένη αποτύπωση. 73

78 Κεφ. 3. Tαυτόχρονη ανίχνευση Fovea- και Viti-ιών Ο RSPaV-1 ανιχνεύτηκε στα 32 από τα 37 δείγματα υπαίθρια καλλιεργούμενων βιότυπων V. vinifera μετά από αποτύπωση εκχυλίσματος μίσχων φύλλων. Μόνο τα 29 από τα 32 δείγματα είχαν προηγουμένως αναγνωριστεί ως θετικά χρησιμοποιώντας τα ζεύγη των εκκινητών (9,10) και (13,14) (κεφ. 2) και ως εκμαγείο ολικό RNA, ενώ τα άλλα τρία δείγματα βρέθηκαν θετικά μόνο από την εστιασμένη RT-PCR. Μέρος των αποτελεσμάτων παρουσιάζεται στην Εικόνα Στα τρία αυτά δείγματα η παρουσία του RSPaV-1 επιβεβαιώθηκε μετά από απευθείας προσδιορισμό της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας των αντίστοιχων προϊόντων εστιασμένης PCR. ζβ ζβ ζβ Εικόνα 3.10 Ηλεκτροφόρημα σε πηκτή αγαρόζης, προϊόντων RT-PCR από μίσχους φύλλων βιότυπων αμπέλου προσβλημένων με RSPaV-1 (διαδρομές 1-17). Πηκτές Ι και II: προϊόντα RT-PCR τα οποία παράχθηκαν με τη χρήσιμοποίηση των ζευγών εκκινητών [9, 10 (πηκτή Ι)] και [(13, 14) πηκτή ΙΙ], με εκμαγείο εκχύλισμα ολικού RNA (Nolasco et al., 2000). Το + δηλώνει την παρουσία ορατού προϊόντος σε τουλάχιστον μία από τις δύο πηκτές, ενώ το δηλώνει την απουσία ορατού προϊόντος και στις δύο πηκτές. Πηκτή ΙΙΙ: Προϊόντα εστιασμένης RT-PCR τα οποία παράχθηκαν από αποτύπωση εκχυλίσματος φυτικού χυμού με τη χρήσιμοποίηση των ζευγών εκκινητών ( RW π1, RW κ1 ) και ( RW εστ π2, RW εστ κ4 ). Διαδρομές 18 και 19: υγιή φυτά, M: Δείκτης Μοριακού Βαρους, ανά 100 ζβ. Παρακάτω αναφέρεται η αλληλουχία ενός από τα προϊόντα του οποίου προσδιορίστηκαν και οι δυο νουκλεοτιδικές αλυσίδες: 74

79 Κεφ. 3. Tαυτόχρονη ανίχνευση Fovea- και Viti-ιών Προϊόν PCR β [παρουσίασε 81% ομολογία νουκλεοτιδίων και 94% ομολογία αμινοξέων με τον RSPaV-1 (EMBL, κωδικός πρόσβασης AF057136)]: GCnGGnCAGACnCTnGCnTGCTTCCAACACGCTATTTTGGTCCGCTTTGCTCCTTAC ATGAGATACATTGAAAAGAAGCTTATGCAAGCATTGAAACCCTACTTCTACATTCACTC AGGCAAAGGCCTTGATGAGCTAAATGAATGGGTTAGGGCCAGAGATTTCACAGGTGTGT GCACnGAnTCnGATTACGAAGCnTT Η εστιασμένη RT-PCR με αποτύπωση εκχυλίσματος μίσχων φύλλου, έδωσε θετικά αποτελέσματα σε αραιώσεις (10-2 έως 10-3 φορές), εκχυλισμάτων των θετικών δειγμάτων (Εικόνα 3.11) παρουσιάζοντας μεγάλη ευαισθησία ανίχνευσης. 201ζβ Δείκτης ΜΒ 100 ζβ Εικόνα 3.11 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος δείγματος προσβλημένου με RSPaV-1 μετά από διαδοχικές αραιώσεις (10 φορές) σε εκχύλισμα χυμού υγιούς δείγματος και με τη χρησιμοποίηση των ζευγών εκκινητών ( RW π1, RW κ1 ) και ( RW εστ π2, RW εστ κ4 ). Οι αριθμοί δηλώνουν τις αραιώσεις. Δεν ήταν δυνατή η ανίχνευση των ιών σε δείγματα αμπέλου προσβλημένων με RSPaV-1, μετά από αποτύπωση εκχυλίσματος φυτικού χυμού σε νάιλον μεμβράνη και με τη χρησιμοποίηση εκκινητών με πλήρη εκφυλισμό (χωρίς di) (Εικόνα 3.12): RW π 1N : 5 -GCNAARGCNGGNCARAC-3 RW κ 1N : 5 -RMYTCNCCNSWRAANCKCAT-3 RW εστ π1n :5 -GGNCARACNHTNGCNTGYTT-3 RW εστ κ1n :5 -AANGCYTCRTARTCNGANTCNGT-3 Οι εστιασμένοι εκκινητές που σχεδιάστηκαν εμφάνισαν διαφορετική ευαισθησία και εύρος ανίχνευσης των διάφορων απομονώσεων (Εικόνες 3.13 και 3.14), ενώ καλύτεροι ήταν οι RW εστ π1 και RW εστ κ4. 75

80 Κεφ. 3. Tαυτόχρονη ανίχνευση Fovea- και Viti-ιών Δείκτης ΜΒ 1 00 ζβ Εικόνα 3.12 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR που παράχθηκαν από αποτύπωση φυτικού εκχυλίσματος χυμού τεσσάρων δειγμάτων προσβλημένων με RSPaV-1, με τη χρήση των ζευγών εκκινητών ( RW π1, RW κ1 ) και ( RW εστ π2, RW εστ κ4 ) (διαδρομές 1-5) ή των ζευγών ( RW π 1N, RW κ 1N ) και ( RW εστ π1n, RW εστ κ1n ) (διαδρομές 6-10). Διαδρομές 4 και 9: υγιές δείγμα RW εστ κ3 Δείκτης ΜΒ 100 ζβ RW εστ κ2 RW εστ κ3 :5 -TCRAAIGCYTCRTARTCIGAITC-3 RW εστ κ2 :5 -TCRAAIGCYTCRTARTCIGAITCIGT-3 Εικόνα 3.13 Προϊόντα εστιασμένης RT-PCR τα οποία παράχθηκαν από αποτύπωση φυτικού εκχυλίσματος οκτώ δειγμάτων προσβλημένων με RSPaV-1, με τη χρησιμοποίηση των εστιασμένων εκκινητών ( RW εστ π2, RW εστ κ3 ) (διαδρομές 1-9) ή των εστιασμένων εκκινητών ( RW εστ π2, RW εστ κ2 ) (διαδρομές 9-18). Διαδρομές 5 και 14: υγιές δείγμα. 76

81 Κεφ. 3. Tαυτόχρονη ανίχνευση Fovea- και Viti-ιών ζβ RW εστ κ5 RW εστ κ4 RW εστ κ2β RW εστ κ2 + RW εστ κ2 Δείκτης ΜΒ 100 ζβ RW εστ κ2 :5 -TCRAAIGCYTCRTARTCIGAITCIGT-3 RW εστ κ2β : 5 -CRAAIGCYTCRTARTCIGAITCMGT-3 RW εστ κ4 : 5 -AAIGCYTCRTARTCIGAITCNGT-3 RW εστ κ5 :5 -TCRAAIGCYTCRTARTCIGANTC-3 Εικόνα 3.14 Προϊόντα εστιασμένης RT-PCR τα οποία παράχθηκαν από αποτύπωση φυτικού εκχυλίσματος τεσσάρων δειγμάτων προσβλημένων με RSPaV-1, με τη χρησιμοποίηση του εστιασμένου εκκινητή RW εστ π2 διαδοχικά με τους εκκινητες: RW εστ κ5 (διαδρομές 1-5), RW εστ κ4 (διαδρομές 6-10), RW εστ κ2 μαζί με RW εστ κ2β (διαδρομές 11-15) RW εστ κ2 (διαδρομές 16-20). Διαδρομές 4, 9, 14 και 19: υγιές δείγμα. 77

82 Κεφ. 3. Tαυτόχρονη ανίχνευση Fovea- και Viti-ιών 3.5 Συζήτηση Στη μελέτη αυτή με τη χρήση εστιασμένης RT-PCR με εκκινητές με εκφυλισμό που περιείχαν δεοξυινοσίνη (di) πολλαπλασιάστηκε επιτυχώς τμήμα του γονιδιώματος τριών viti-ιών (GVA, GVB και GVD) και 29 απομονώσεων του fovea-ιού RSPaV-1. Προηγουμένως για την ανίχνευση των 29 αυτών απομονώσεων απαιτούνταν η χρησιμοποίηση δύο διαφορετικών ζευγών εκκινητών σε δύο διαφορετικές δοκιμές (Nolasco et al.,, 2000). Η νέα μέθοδος ανιχνεύει τρεις επιπλέον απομονώσεις του RSPaV-1, των οποίων η ανίχνευση με τη χρησιμοποίηση των εκκινητών που σχεδιάστηκαν από τους Nolasco et al., (2000), δεν ήταν δυνατή. Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας των προϊόντων της εστιασμένης PCR επιβεβαίωσε την προέλευση τους από παραλλαγές του RSPaV-1. Τα αποτελέσματα αυτά αποτελούν σημαντικές ενδείξεις ότι η εστιασμένη RT-PCR που περιγράφηκε είναι αποτελεσματική για την ανίχνευση όλων των χαρακτηρισμένων viti- και fovea-ιών αλλά πιθανώς και άλλων άγνωστων ιών που ανήκουν στα γένη αυτά. Η μέθοδος αυτή είναι χρήσιμη για το μαζικό έλεγχο δειγμάτων γιατί μειώνει σημαντικά το χρόνο και το κόστος διάγνωσης (ταυτόχρονη ανίχνευση πολλών ιών), ενώ παράλληλα έχει ικανοποιητική ευαισθησία και εξειδίκευση με την εφαρμογή εστιασμένης PCR. Η ευαισθησία της, επιτρέπει την εφαρμογή ενός απλού πρωτοκόλλου επεξεργασίας των δειγμάτων που περιλαμβάνει την αποτύπωση εκχυλίσματος φυτικού χυμού σε νάιλον μεμβράνη και θερμική επεξεργασία πριν την RT-PCR. Η μέθοδος αυτή έδωσε αξιόπιστα αποτελέσματα ανίχνευσης των ιών σε μίσχους φύλλων και φλοίωμα ξύλου. Αρχικά διερευνήθηκε η δυνατότητα βελτίωσης της ευαισθησίας και εξειδίκευσης της RT-PCR για την ανίχνευση των viti-ιών η οποία αναπτύχθηκε από τους Saldarelli et al., (1998), αλλά και αύξησης του εύρους ανίχνευσης της ώστε να περιλαμβάνει και τους fovea-ιούς. Οι Hataya et al., (2000) υποστήριξαν με δεδομένα φυλογενετικής ανάλυσης ότι τα πρόσφατα γένη Vitivirus και Foveavirus μαζί με τα γένη Trichovirus, Capillovirus και Carlavirus σχετίζονται γενετικά και πρότειναν τη δημιουργία μιας νέας οικογένειας με το όνομα Carlaviridae η οποία θα περιλαμβάνει τα προαναφερθέντα γένη (Εικόνα 3.15). Η γενετική αυτή συγγένεια, επέτρεψε την εύρεση συντηρημένων περιοχών σε ομόλογες αλληλουχίες αμινοξέων οι οποίες κωδικοποιούνται από το γονίδιο της RdRp και το σχεδιασμό εκκινητών με εκφυλισμό οι οποίοι στοχεύουν αλληλουχίες των viti-ιών και fovea-ιών. Η επιλογή των εκκινητών έγινε από περιοχές υψηλά συντηρημένες και με το μικρότερο δυνατό εκφυλισμό. Η χρησιμοποίηση εκκινητών με μεγάλο εκφυλισμό, μειώνει σημαντικά την ευαισθησία της PCR γιατί μόνο ένα μικρό κλάσμα των ολιγονουκλεοτιδίων υβριδοποιείται επιτυχώς με το εκμαγείο με αποτέλεσμα η συγκέντρωση τους να είναι περιοριστική για την PCR. Για το λόγο αυτό, οι εκκινητές τροποποιήθηκαν με την εισαγωγή μορίων di σε θέσεις εκφυλισμού, μειώνοντας έτσι τον εκφυλισμό τους χωρίς να μειώνεται ο αριθμός των πιθανών αλληλουχιών στόχων. Παράλληλα η συγκέντρωση του κάθε εκκινητή στην PCR αυξήθηκε από 0,2 σε 1 μμ. Οι εκκινητές που περιέχουν di, σε σχέση με αντίστοιχους εκκινητές με εκφυλισμό οι οποίοι δεν περιέχουν di, αυξάνουν την εξειδίκευση και ευαισθησία της PCR (Rossolini et al., 1994, Ehlers et al., 78

83 Κεφ. 3. Tαυτόχρονη ανίχνευση Fovea- και Viti-ιών 1999). Σε συμφωνία με τις μελέτες αυτές, τα αποτελέσματα της εργασίας αυτής έδειξαν ότι η απόδοση των εκκινητών με πλήρη εκφυλισμό (χωρίς di) δεν ήταν ικανοποιητική (Εικόνα 3.12). Εικόνα 3.15 Φυλογενετική ανάλυση των ιών που ανήκουν στην γενεαλογία των tymo-ιών βασισμένη στις αλληλουχίες που κωδικοποιούν την RdRp (Hataya et al. 2000). 79

84 Κεφ. 3. Tαυτόχρονη ανίχνευση Fovea- και Viti-ιών Η ινοσίνη (Ι) απαντάται στην τρίτη θέση (5 άκρο) του αντικωδικίου μερικών μεταφορικών RNA (trna) μορίων και ζευγαρώνει με ουρακίλη, κυτιδίνη ή αδενοσίνη κατά την αναγνώριση του κωδικίου (Εικόνα 3.16). Η di δε συμπεριφέρεται ουδέτερα όταν βρίσκεται σε έναν εκκινητή παρόλο που είναι λιγότερο επιλεκτική από τις υπόλοιπες τέσσερις βάσεις. Η σταθερότητα του ζευγαρώματος της dι με τις τέσσερις βάσεις του DNA είναι μικρότερη από αυτή του ζευγαρώματος Α:Τ και εξαρτάται σημαντικά από την αλληλουχία του εκκινητή (Martin & Castro 1985). Ανεξάρτητα από την αλληλουχία του εκκινητή, η σειρά σταθερότητας του ζευγαρώματος είναι Ι:C > I:A > I:T I:G (Martin & Castro 1985, Bergstrom et al., 1997). Για τους λόγους αυτούς οι εκκινητές ανάλογα με την αλληλουχία τους και με ποια από τις τέσσερις βάσεις του DNA ζευγαρώνουν οι dis που περιέχουν, εμφανίζουν σημαντικές διαφορές της Τm. Είναι πιθανό επίσης να υπάρξει σημαντική αστάθεια κατά τον υβριδισμό εκκινητών οι οποίοι περιέχουν αρκετές dis. Για το λόγο αυτό, di υποκαταστάσεις έγιναν μόνο σε θέσεις με εκφυλισμό τέσσερα. Επίσης εξαιτίας της αδυναμίας ακριβούς υπολογισμού της Τm και εκτίμησης της απόδοσης ενός εκκινητή που περιέχει dis, αξιολογήθηκαν διάφοροι εκκινητές για την αποτελεσματικότητα πολλαπλασιασμού του εκμαγείου (Εικ και 3.14). Όταν σε έναν εκκινητή υπάρχει dι πολύ κοντά στο 3 άκρο του, είναι πιθανό να προκαλεί σημαντική αστάθεια κατά τον υβριδισμό του, ειδικά όταν η αντίστοιχη βάση του εκμαγείου απέναντι από την di, είναι dt ή dg. Στην περίπτωση αυτή είναι προτιμότερο να υπάρχει πλήρης εκφυλισμός του εκκινητή στην περιοχή αυτή ώστε να υπάρχει δυνατότητα σταθερής σύνδεσης των πέντε νουκλεοτιδίων που βρίσκονται στο 3 άκρο του εκκινητή, με το εκμαγείο. Αυτό έγινε φανερό από την καλύτερη απόδοση του εκκινητή RW εστ κ4 σε σχέση με τον εκκινητή RW εστ κ2 και τη βελτίωση των αποτελεσμάτων όταν ο RW εστ κ2 χρησιμοποιήθηκε μαζί με τον RW εστ κ2β (Εικ και 3.14). Η χρησιμοποίηση εκκινητών με εκφυλισμό με μεγάλο αριθμό πιθανών αλληλουχιών στόχων, μπορεί να μειώσει την εξειδίκευση της PCR εξαιτίας της αυξημένης πιθανότητας κάποιων ολιγονουκλεοτιδίων να υβριδοποιηθούν με αλληλουχίες μηστόχους. Η εστιασμένη PCR έχει αυξημένη εξειδίκευση και ευαισθησία σε σύγκριση με την απλή PCR, καθώς χρησιμοποιεί εστιασμένους εκκινητές οι οποίοι πολλαπλασιάζουν Εικόνα 3.16 Δέσμευση αντικωδικίου, ενός μεταφορικού RNA γλυκίνης, με τρία διαφορετικά κωδίκια (GGU, GGC και GGA) εξαιτίας του ζευγαρώματος της ινοσίνης με ουρακίλη, κυτοσίνη ή αδενίνη. 80

85 Κεφ. 3. Tαυτόχρονη ανίχνευση Fovea- και Viti-ιών εξειδικευμένα το ειδικό προϊόν της πρώτης PCR επιβεβαιώνοντας και ενισχύοντας τα αποτελέσματα της. Στην παρούσα μελέτη, η εφαρμογή εστιασμένης PCR με τη χρησιμοποίηση εκκινητών με εκφυλισμό βελτίωσε σημαντικά την ευαισθησία και εξειδίκευση της ανίχνευσης των viti-ιών και του RSPaV-1 σε σχέση με την απλή RT- PCR, επιλύοντας προβλήματα παραγωγής μη ειδικών προϊόντων και μικρής απόδοσης της αντίδρασης (Εικόνα 3.8). Για να μειωθεί η πιθανότητα επιμόλυνσης των δειγμάτων κατά την επεξεργασία τους, είναι σημαντικό να ελαχιστοποιούνται τα στάδια μεταφοράς των διαλυμάτων των εκμαγείων. Στα περισσότερα πρωτόκολλα εστιασμένων PCR τα προϊόντα της πρώτης PCR αραιώνονται έως 1000 φορές, ώστε να αποφευχθεί η δραστηριότητα των εκκινητών της πρώτης PCR κατά τη διάρκεια της εστιασμένης PCR. Για να αποφευχθεί το στάδιο αυτό, σχεδιάστηκαν εσωτερικοί εκκινητές με Tm υψηλότερο από αυτό των εξωτερικών εκκινητών, ώστε να αποφευχθεί οποιαδήποτε υβριδοποίηση των εξωτερικών εκκινητών κατά την εστιασμένη PCR εξαιτίας της εφαρμογής υψηλής Τα. Επίσης χρησιμοποιήθηκε μόνο το 5% των προιόντων της RT-PCR, ελαχιστοποιώντας την ποσότητα των εξωτερικών εκκινητών στην εστιασμένη PCR. Η προετοιμασία των δειγμάτων αμπέλου για την RT-PCR απαιτεί την εκχύλιση ολικού RNA εξαιτίας της παρουσίας στους ιστούς της αμπέλου, υψηλών συγκεντρώσεων αναστολέων της PCR όπως είναι οι φαινολικές ενώσεις και οι πολυσακχαρίτες (Rezaian et al., 1992, Rowhani et al., 1993, Levy et al., 1994, Minafra & Hadidi 1994, Staub et al., 1995). Η εκχύλιση ολικού RNA είναι διαδικασία επίπονη η οποία δεν επιτρέπει την επεξεργασία μεγάλου αριθμού δειγμάτων, ενώ παράλληλα αυξάνει σημαντικά την πιθανότητα επιμόλυνσης των δειγμάτων εξαιτίας των πολλών μεταχειρίσεων και γι αυτό δεν είναι πρακτική για αναλύσεις ρουτίνας. Η απευθείας αποτύπωση φυτικού χυμού σε νάιλον μεμβράνη (La Notte, et al., 1997) δεν έδωσε αξιόπιστα αποτελέσματα ανίχνευσης πιθανόν εξαιτίας της μεγαλύτερης ευαισθησίας σε αναστολείς, της RT-PCR σε ένα μικροσωλήνα σε σχέση με την RT-PCR σε δύο μικροσωλήνες (Dovas et al., 2001). Οι πολυσακχαρίτες αναστέλλουν τη δράση των πολυμερασών (Furukawa & Bahavanandan, 1983, Fang et al., 1992). Επίσης, οι φαινολικές ενώσεις σχηματίζουν μη αναστρέψιμους ομοιοπολικούς δεσμούς με πρωτεΐνες μετά από οξείδωση των γειτονικών διύδροξυ ομάδων τους και τη μετατροπή τους σε κινόνες. Αυτές οι αντιδράσεις καταλύονται από πολυφαινολοξειδάσες και μονοφαινολοξειδάσες. Οι κινόνες είναι εξαιρετικά δραστικές ουσίες οι οποίες πολυμερίζονται μεταξύ τους, οξειδώνουν άλλες φαινολικές ενώσεις και συνδέονται με δραστικές ομάδες των πρωτεϊνών προκαλώντας συσσωμάτωση και καθίζηση τους (Pierpoint, 1996). Με παρόμοιο τρόπο οι κινόνες αναστέλλουν και τη δράση των ενζύμων της RT-PCR. Στη μελέτη αυτή, η αξιοπιστία και η επαναληψιμότητα της RT-PCR βελτιώθηκε σημαντικά όταν τα δείγματα, πριν από την αποτύπωση, ομογενοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε Na 2 SO 3, PVP, και BSA. Το Na 2 SO 3 είναι αντιοξειδωτική ουσία η οποία παρεμποδίζει την ενζυμική οξείδωση των φαινολικών υποστρωμάτων, τo PVP είναι ένα υδατοδιαλυτό πολυμερές το οποίο προσροφά φαινολικές ενώσεις (Pierpoint, 1996) και οι πρωτεΐνες του BSA αντιδρούν με τις τανίνες και τις κινόνες (Pierpoint, 1969). Οι πολυσακχαρίτες αντιδρούν με αμινοξέα 81

86 Κεφ. 3. Tαυτόχρονη ανίχνευση Fovea- και Viti-ιών (ελεύθερα ή δεσμευμένα) με αντιδράσεις Maillard. Η ταχύτητα των αντιδράσεων αυτών αυξάνει με την αύξηση του ph και της θερμοκρασίας. Κατά την απελευθέρωση του RNA εκμαγείου από την μεμβράνη μετά την προσθήκη του διαλύματος "αποδέσμευσης", η παρουσία υψηλής συγκέντρωσης γλυκίνης (0,1 M) σε αλκαλικό ph (9,0) και η επώαση σε υψηλή θερμοκρασία (4 λεπτά στους 94 C) πιθανώς επιταχύνει τις αντιδράσεις Maillard των πολυσακχαριτών με τη γλυκίνη με αποτέλεσμα να μην είναι διαθέσιμοι ώστε να προκαλέσουν αναστολή της RT-PCR. Η απλή επεξεργασία των δειγμάτων με αποτύπωση, συνδυασμένη με RT-PCR σε ένα μικροσωλήνα, επιτρέπει τον ταχύ και χαμηλού κόστους έλεγχο μεγάλου αριθμού δειγμάτων. Η εστιασμένη PCR που ακολουθεί αντισταθμίζει την πιθανή μείωση της ευαισθησίας εξαιτίας των αραιώσεων του εκμαγείου κατά την προετοιμασία του δείγματος. Επίσης η δυνατότητα της μεθόδου αυτής να δίνει εκμαγεία κατάλληλα για RT-PCR από εκχυλίσματα ιστών αμπέλου με υψηλή συγκέντρωση φαινολικών ενώσεων, καθιστά πιθανή την εφαρμογή της και για το μαζικό ιολογικό έλεγχο άλλων ξυλωδών φυτών όπως τα οπωροφόρα δένδρα, τα οποία επίσης περιέχουν υψηλές συγκεντρώσεις φαινολικών ενώσεων. Η ELISA αποτελεί ένα γρήγορο και εύχρηστο διαγνωστικό εργαλείο. Όμως η μικρή της ευαισθησία την καθιστά αναξιόπιστη για την ανίχνευση των ιών της αμπέλου εξαιτίας της ανομοιόμορφης κατανομής τους αλλά και της μικρής συγκέντρωσης τους στους φυτικούς ιστούς. Η έλλειψη εξειδικευμένων αντισωμάτων εναντίον τoυ RSPaV-1 και η πιθανή ύπαρξη άγνωστων viti- και fovea-ιών, καθιστούν επίσης τη διάγνωση ανεπαρκή. Η ανίχνευση των παραλλαγών του RSPaV-1 (Nolasko et al.,, 2000) ή των viti-ιών (Saldarelli et al.,, 1998), βασίζονταν σε υψηλού κόστους και χρονοβόρα πρωτοκόλλα RT-PCR με προβλήματα σε ότι αφορά το εύρος ανίχνευσης, την ευαισθησία και την εξειδίκευση. Η μεγάλη ευαισθησία της εστιασμένης RT-PCR που περιγράφηκε στην παρούσα εργασία και η χρησιμοποίηση εκκινητών με εκφυλισμό ικανών να υβριδοποιούνται σε συντηρημένες γονιδιακές περιοχές των viti- και fovea-ιών ξεπερνούν τα προαναφερθέντα προβλήματα. Τα αποτελέσματα των δοκιμών είναι διαθέσιμα σε λίγες ώρες και το κόστος των ελέγχων μειώνεται σημαντικά με την ταυτόχρονη ανίχνευση ιών και των δύο γενών. Σημαντικό επίσης πλεονέκτημα της μεθόδου είναι ότι τα αποτυπωμένα δείγματα μπορούν να συντηρηθούν για μεγάλο χρονικό διάστημα (προκαταρτικά αποτελέσματα δείχνουν ότι η ανίχνευση είναι αξιόπιστη μετά από τουλάχιστον δύο μηνών αποθήκευση στους 20 o C), ενώ εύκολη και χωρίς προβλήματα είναι και η μεταφορά τους σε μεγάλες αποστάσεις. 82

87 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Ανάπτυξη εστιασμένης RT-PCR για την ταυτόχρονη ανίχνευση ιών που ανήκουν στα γένη Closterovirus, Foveavirus και Vitivirus με τη χρησιμοποίηση εκκινητών με εκφυλισμό οι οποίοι περιέχουν di, μαζί με ομόλογους εκκινητές που περιέχουν dg στη θέση της di 83

88 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών Κεφάλαιο 4 Ανάπτυξη εστιασμένης RT-PCR για την ταυτόχρονη ανίχνευση ιών που ανήκουν στα γένη Closterovirus, Foveavirus και Vitivirus με τη χρησιμοποίηση εκκινητών με εκφυλισμό οι οποίοι περιέχουν di, μαζί με ομόλογους εκκινητές που περιέχουν dg στη θέση της di 4.1 Περίληψη Αναπτύχθηκε μία δοκιμή εστιασμένης RT-PCR με αποτύπωση μεμβράνης, με εκκινητές με εκφυλισμό που περιέχουν δεοξυινοσίνη (dι), για την ταυτόχρονη ανίχνευση ιών που ανήκουν στα γένη Closterovirus και Crinivirus. Οι εκκινητές, δεσμεύονται σε εξελικτικά συντηρημένες αλληλουχίες του γονιδίου της πρωτεΐνης HSP70. Η εφαρμογή εστιασμένης PCR αύξησε την εξειδίκευση και ευαισθησία της ανίχνευσης. Η ευαισθησία αυξήθηκε ακόμη περισσότερο (δέκα φορές) όταν μαζί με τους εκκινητές με εκφυλισμό που περιέχουν di, χρησιμοποιήθηκαν αντίστοιχοι ομόλογοι εκκινητές στους οποίους, στις ομόλογες περιοχές, η di έχει αντικατασταθεί με dg. Οι εκκινητές αυτοί είναι μικρότεροι, έχουν μικρότερο εκφυλισμό και μεγαλύτερη αποδοτικότητα ενίσχυσης από τους αντίστοιχους εκκινητές που περιέχουν di. Η μέθοδος αυτή συνδυάσθηκε με αντίστοιχη μέθοδο για την ανίχνευση ιών των γενών Vitivirus και Foveavirus, επιτρέποντας την πολλαπλή RT-PCR ενίσχυση στον ίδιο μικροσωλήνα, γονιδιακών περιοχών ιών που ανήκουν στα τρία γένη και τις δύο ακόλουθες εστιασμένες PCR (μία για την ανίχνευση των viti-ιών και μια για την ανίχνευση των fovea-ιών) να γίνουν παράλληλα. Αξιολογήθηκαν διάφοροι εκκινητές, και βελτιστοποιήθηκαν οι συνθήκες αντίδρασης (βελτιωτικές ενώσεις της PCR, θερμοκυκλοποίηση) για την αποδοτική ενίσχυση όλων των διαθέσιμων εκμαγείων. Αυτές οι βελτιώσεις επέτρεψαν την ταυτόχρονη ανίχνευση σε μίσχους φύλλων αμπέλου, παραλλαγών του RSPaV-1 και απομονώσεων των GLRaV-1, -2, -3, -5, -6, και -7. Επίσης ανιχνεύθηκαν επιτυχώς απομονώσεις και άλλων clostero- και crini-ιών όπως, ο ιός της κερασιάς-1 (Little cherry virus-1, LChV-1), ο ιός της τριστέτσας των εσπεριδοειδών (Citrus tristeza virus, CTV), ο ιός ψευδοϊκτερου των τεύτλων (Beet pseudo-yellows virus, BPYV), ο ιός του κίτρινου παραμορφωτικού νανισμού των κολοκυνθοειδών (Cucurbit yellow stunting disorder virus, CYSDV), ο ιός της μολυσματικής χλώρωσης της ντομάτας (Tomato infectious chlorosis virus, TICV) και ο ιός της χλώρωσης της ντομάτας (Tomato chlorosis virus, ToCV). Τα προκαταρτικά αποτελέσματα δείχνουν ότι η μέθοδος αυτή μπορεί να ανιχνεύσει αξιόπιστα, ιούς που ανήκουν και στα τρία γένη, επιτρέποντας την απλή, γρήγορη και με μικρότερο κόστος ανάλυση μεγάλου αριθμού δειγμάτων σε σχήματα παραγωγής και πιστοποίησης πολλαπλασιαστικού υλικού. 4.2 Εισαγωγή Από τα αποτελέσματα του κεφαλαίου 2 είναι φανερή η σημαντική παρουσία στην Ελλάδα clostero-ιών οι οποίοι σχετίζονται με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου. Προς το παρόν για τον ιολογικό έλεγχο πολλαπλασιαστικού υλικού 84

89 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών αμπέλου για την παρουσία ιών οι οποίοι σχετίζονται με την ασθένεια, εφαρμόζονται βιολογικές (εμβολιασμός σε φυτοδείκτες), ορολογικές (ELISA) και μοριακές (RT- PCR) τεχνικές (Boscia et al., 1997). Όμως οι μέθοδοι αυτοί παρουσιάζουν προβλήματα αξιοπιστίας της διάγνωσης. Η ορολογική ταυτοποίηση των ιών που σχετίζονται με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου είναι επισφαλής καθώς, παρουσιάζουν χαμηλό τίτλο στους φυτικούς ιστούς, εμφανίζουν εποχιακή διακύμανση αλλά και ανισοκατανομή στους βραχίονες των πρέμνων (Monis & Bestwick 1996, 1997, Habili et al., 1997, Boscia et al., 1997, De Sousa 1997), ενώ παρουσιάζονται προβλήματα επαναληψιμότητας, μειωμένου εύρους ανίχνευσης και χαμηλής ποιότητας των διαγνωστικών (Boscia et al., 1997). Παρόμοια προβλήματα διαπιστώθηκαν και στην παρούσα εργασία (Κεφ.2) σε ότι αφορά την ανίχνευση των GLRaV-2, -5, και -7. Προβλήματα περιορισμένου εύρους ανίχνευσης απομονώσεων των GLaRV-1 και -7, έχουν αναφερθεί και για την RT-PCR (Turturo et al., 2000α & 2000β), εξαιτίας της μεγάλης γενετικής παραλλακτικότητας των πληθυσμών των clostero-ιών της αμπέλου (Little et al., 2001) η οποία δυσχεραίνει την επιλογή εκκινητών με μεγάλο εύρος ανίχνευσης. Για την επίλυση του προβλήματος είναι απαραίτητη η γνώση της αλληλουχίας του γονιδιώματος πολλών απομονώσεων του κάθε ιού από διάφορες γεωγραφικές περιοχές το οποίο προς το παρόν δεν είναι εύκολο. Η χρησιμοποίηση εκφυλισμένων εκκινητών που στοχεύουν συντηρημένες περιοχές ενός γένους, μπορεί να χρησιμοποιηθεί με επιτυχία σε ανάλογες περιπτώσεις βλέπε κεφ. 3. Ταυτόχρονη ανίχνευση των GLRaV-1, -2, -4, -5, και -7 έχει αναφερθεί με τη χρησιμοποίηση δύο υψηλά εκφυλισμένων εκκινητών που στοχεύουν στο γονίδιο που κωδικοποιεί την HSP70 (Saldarelli et al., 1998). Οι συγκεκριμένοι εκκινητές σχεδιάστηκαν από υψηλά συντηρημένες περιοχές του γονιδίου που κωδικοποιεί την HSP70 πολλών clostero-ιών (Tian et al., 1996). Όμως, η μέθοδος αυτή έχει σημαντικά μειωμένη ευαισθησία και εξειδίκευση εξαιτίας της χρησιμοποίησης υψηλά εκφυλισμένων εκκινητών. Επίσης, εξαιτίας της μειωμένης ευαισθησίας απαιτεί ως εκμαγείο την εκχύλιση ολικού RNA ή και dsrna (εξαιτίας της μειωμένης εξειδίκευσης) και στη συνέχεια, ανίχνευση των προϊόντων της PCR με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμίδης και χρώση αργύρου με αποτέλεσμα η μέθοδος να είναι δύσχρηστη και αναξιόπιστη. Τέλος η μέθοδος αυτή δεν έδωσε ικανοποιητικά αποτελέσματα για την ανίχνευση διάφορων απομονώσεων clostero-ιών της αμπέλου (Saldarelli, προσωπική επικοινωνία). Με δεδομένα τα προβλήματα διάγνωσης, προς το παρόν για τον αξιόπιστο ιολογικό έλεγχο πολλαπλασιαστικού υλικού αμπέλου, είναι απαραίτητος ο συνδυασμός ορολογικών, μοριακών, αλλά και βιολογικών τεχνικών. Σκοπός της εργασίας ήταν η διερεύνηση της δυνατότητας ταυτόχρονης ανίχνευσης ιών που ανήκουν στα γένη Closterovirus και Crinivirus με τη χρησιμοποίηση εκφυλισμένων εκκινητών που περιέχουν di και δεσμεύονται σε συντηρημένες αλληλουχίες των γονιδίων της HSP70 ιϊκής προέλευσης. Με στόχο τη βελτίωση της αξιοπιστίας της διάγνωσης αναπτύχθηκε επιτυχώς μια μέθοδος 85

90 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών εστιασμένης RT-PCR με δέσμευση αποτυπώματος, και αξιολογήθηκαν διάφοροι εκκινητές για την αποτελεσματικότητα τους. Η μέθοδος αυτή, αξιολογήθηκε για την ανίχνευση ιών που ανήκουν στα γένη Closterovirus και Crinivirus, σε βιότυπους αμπέλου καθώς και σε άλλα φυτά. Παράλληλα, συνδυάστηκε με επιτυχία με τη μέθοδο που αναπτύχθηκε στο κεφ. 3 επιτρέποντας έτσι την ταυτόχρονη ανίχνευση clostero-, viti- και fovea-ιών, σε ιστούς αμπέλου. 86

91 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών 4.3 Υλικά και μέθοδοι Χημικά, αντιδραστήρια, ένζυμα Tα χημικά που χρησιμοποιήθηκαν προέρχονταν από τις παρακάτω εταιρίες. Χημικά: Backer, Fluka, Sigma. Αντιδραστήρια μοριακής βιολογίας: NEW ENGLAND BioLabs Inc., Life Technologies TM, ΗΠΑ. Ένζυμα, Aντιδραστήρια μοριακής βιολογίας (εκκινητές, dntps κλπ): Life Technologies TM MD HΠΑ, New England Biolabs Inc. ΗΠΑ, Finnzymes Φιλανδία. Σκευάσματα (Kits): Invitrogen, BV, Cronigen The Netherlands; Life Technologies TM, MD, ΗΠΑ. Εκκινητές: MWG Biotech, Γερμανία Φυτικό υλικό Χρησιμοποιήθηκαν τρία πρέμνα προσβλημένα με τον GLRaV-7, ευγενική προσφορά του Δρ. Α. Αυγελή (ΕΘΙΑΓΕ, Ινστιτούτο προστασίας φυτών, Ηράκλειο Κρήτης), ενώ επιλέχθηκαν 23 διαφορετικοί βιότυποι αμπέλου, προσβλημένοι με διάφορους clostero-ιούς (Κεφ. 2). Η ταυτοποίηση των ιών έγινε ορολογικά με ELISA και χρησιμοποιήθηκαν φυτά με μονές προσβολές clostero-ιών: πέντε με GLRaV-1, τρία με GLRaV-2, οκτώ με GLRaV-3, τρία με GLRaV-5, τρία με GLRaV-6, ένα με διπλή προσβολή (GLRaV-2 και GLRaV-7), ενώ 19 από αυτά ήταν προσβλημένα και με τον RSPaV-1 (Κεφ. 2, Πίνακες 2.3 και 2.4). Επίσης χρησιμοποιήθηκαν απομονώσεις και άλλων clostero- και crini-ιών όπως, ο ιός της κερασιάς-1 (Little cherry virus-1, LChV-1) από κερασιά, ο ιός της τριστέτσας των εσπεριδοειδών (Citrus tristeza virus, CTV) από πορτοκαλιά, ο ιός ψευδοϊκτερου των τεύτλων (Beet pseudo-yellows virus, BPYV) από αγγουριά, ο ιός του κίτρινου παραμορφωτικού νανισμού των κολοκυνθοειδών (Cucurbit yellow stunting disorder virus, CYSDV) από αγγουριά, ο ιός της μολυσματικής χλώρωσης της ντομάτας (Tomato infectious chlorosis virus, TICV) από ντομάτα και ο ιός της χλώρωσης της ντομάτας (Tomato chlorosis virus, ToCV) από ντομάτα Προετοιμασία των δειγμάτων για την RT-PCR Η αποτύπωση εκχυλίσματος φυτικού χυμού σε νάιλον μεμβράνη έγινε σύμφωνα με τη διαδικασία που αναπτύχθηκε στο κεφ. 3 η οποία βελτιώθηκε με τη χρήσιμοποίηση μπεταΐνης, ώστε να έχει μεγαλύτερη αξιοπιστία ανίχνευσης του GLRaV-3. Η βελτιωμένη διαδικασία περιλάμβανε τα ίδια στάδια που αναφέρθηκαν (Παρ , Εικόνα 3.1) με τη διαφορά ότι το διάλυμα "αποδέσμευσης" (0,1 M γλυκίνη-naoh, ph 9,0, 50 mm NaCl, 1 mm EDTA, 0.5% Triton X-100, 1% β-μερκαπτοαιθανόλη) περιείχε 1 μμ του κάθε εκκινητή 'HSP κ8' και 'HSP κ9' για την ανίχνευση των clostero-ιών και του RW κ1 για την ανίχνευση των viti- και fovea-ιών (Παρ ). Τέλος, προστέθηκε 0,5 g μπεταΐνη (Sigma B-2754) για κάθε ml διαλύματος, ακολούθησε ανάδευση και αποθήκευση στους -20 ο C μέχρι τη χρησιμοποίηση του. 87

92 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών Για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας ανίχνευσης της εστιασμένης RT-PCR με δέσμευση αποτυπώματος, μίσχοι φύλλων από τρία διαφορετικά πρέμνα (προσβλημένα με GLRaV-1 ή GLRaV-3 ή GLRaV-5 και ταυτόχρονα με RSPaV-1) και από ένα υγιές, ομογενοποιήθηκαν σε διάλυμα ομογενοποίησης (Παρ ). Στη συνέχεια, έγιναν διαδοχικές αραιώσεις (10 φορές) των εκχυλισμάτων των θετικών δειγμάτων με τη χρησιμοποίηση εκχυλίσματος από τα υγιή δείγματα, και ακολούθησε η αποτύπωσή τους σε νάιλον μεμβράνη Σχεδιασμός εκφυλισμένων εκκινητών για την ταυτόχρονη ανίχνευση ιών που ανήκουν στα γένη Closterovirus και Crinivirus Δύο εκκινητές με υψηλό εκφυλισμό έχουν σχεδιαστεί από συντηρημένες περιοχές (phosphate 1 και 2), του γονιδίου που κωδικοποιεί την HSP70 πολλών clostero-ιών (Tian et al., 1996). Ομοίως στην παρούσα εργασία σχεδιάστηκαν εκκινητές με εκφυλισμό από τις αντίστοιχες γονιδιακές περιοχές και ακόμη μία, την ''connect 1'' (Tian et al., 1996). Αρχικά έγινε επιλογή συντηρημένων περιοχών του γονιδιώματος με ευθυγράμμιση των αλληλουχιών αμινοξέων τμήματος της HSP70 εικοσιένα απομονώσεων clostero- και crini-ιών, που έχουν δημοσιευτεί στην βάση δεδομένων του EMBL-EBI. Επειδή ομόλογα γονίδια HSP70 υπάρχουν σε όλους τους οργανισμούς, ευθυγραμμίστηκαν παράλληλα και έξι μη ιικές αλληλουχίες ώστε να εντοπιστούν περιοχές οι οποίες να επιτρέπουν το σχεδιασμό εξειδικευμένων εκκινητών για την ανίχνευση των clostero- και crini-ιών. Η ευθυγράμμιση των αλληλουχιών έγινε με το πρόγραμμα CLUSTAL V (Thompson et al., 1994) (Εικόνα 4.1). Στη συνέχεια, για την τελική επιλογή των εκκινητών έγινε ευθυγράμμιση των ιικών νουκλεοτιδικών αλληλουχιών που εκφράζουν τις συντηρημένες περιοχές, της πολυπεπτιδικής αλυσίδας της HSP70 (Εικόνα 4.2). Η επιλογή των εκκινητών έγινε με κύριο κριτήριο το μικρότερο δυνατό εκφυλισμό. Ο σχεδιασμός ενός εκκινητή που να περιλαμβάνει το σύνολο των πιθανοτήτων κωδικοποίησης της σερίνης αυξάνει σημαντικά τον εκφυλισμό του καθώς η σερίνη κωδικοποιείται από έξι διαφορετικές τριπλέτες νουκλεοτιδίων [TC(A/G/C/T) και AG(T/C)]. Για τη μείωση του εκφυλισμού χρησιμοποιήθηκε ο συνδυασμός δύο εκκινητών (HSP εστ π10 και HSP εστ π11), ενώ για το σχεδιασμό του εκκινητή HSP εστ κ1 λήφθηκαν υπ όψη μόνο τα κωδίκια TC(A/G/C/T) επειδή και τα δύο γένη ιών έχουν προτίμηση σε αυτά για την κωδικοποίηση της σερίνης στο συγκεκριμένο σημείο του γονιδιώματος (Εικόνα 4.2). Για την περαιτέρω μείωση του εκφυλισμού των εκκινητών τοποθετήθηκε δεοξυινοσίνη στα σημεία που ο εκφυλισμός των εκκινητών είχε την τιμή 4. Σχεδιάστηκαν διαφορετικοί εκκινητές για την εφαρμογή τους σε RT-PCR και εστιασμένη PCR αντίστοιχα και έγινε προσπάθεια ώστε να μπορούν θεωρητικά, να πολλαπλασιάζουν το εκμαγείο στόχο κάτω από τις ίδιες συνθήκες PCR με τους αντίστοιχους εκκινητές που επιλέχθηκαν για την ανίχνευση των viti- και fovea-ιών (Παρ ). 88

93 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών GLRaV-2 GLRaV-1 BYV BYSV CTV GLRaV-1 GLRaV-3 PYVV TICV LChV-1 GLRaV-4 OLYaV ToCV BPYV CYSDV PBNSPV GLRaV-5 LIYV GLRaV-7 GLRaV-3 GLRaV-1 Sp. oleracea Sp. oleracea Mus musculus Mus musculus Mus musculus Zea mays Κωδικός EMBL Εικόνα 4.1 Περιοχή "phosphate 1" Περιοχή "connect 1" Περιοχή "phosphate 2" I FE GLDFGTTF RT-PCR TS G NEPSAAA RT-PCR L DFGGGT FGTTFST εστιασμένη-pcr O39854 GLDFGTTFSTVCVYKD--GRVFSFKQNN 130aa QCVYMI NEPSAAAL SA-CNSIGKKS--ANLAV YDFGGGT 209 O56881 GFDFGTTFSTVCVYKD--GRVFSFKQNN 130aa QCVYMV NEPSAAAL ST-CNAINKKS--ANLAV YDFGGGT 209 Q65894 GLDFGTTFSSVCAYVG--EELYLFKQRD 130aa PCVYMV NEPSAAAL SA-CSRIKGAT--SPVLV YDFGGGT 209 Q65855 GVDFGTTFSSVCVFNS--GRLHVFKQQN 130aa TCVHMM NEPSAAAL ST-CGRTDMSA--RNLLV YDFGGGT 209 BAB18526 GLDFGTTFSTVAMATS--SELVILKQSN 130aa TCVYII NEPSAAAY ST-LPKLSSAD--KYLAV YDFGGGT 208 Q9Q6Q1 GLDFGTTFSTSCFSIPTQDDSGCVSLVN 131aa PLRALI NEPTSAAL YG-AVKG-GSLR-ETYAV FDFGGGT 202 O71192 GIDFGTTFSTICFSP--SGVSGCTPVAG 129aa PVRGVV NEPTAAAL YS-LAKS-RVED-LLLAV FDFGGGT 202 Q9QJK4 GLDFGTTFSTISSYSD--GVMKVLKLNN 131aa SLRRII NEPSAAAI YN-VSKYPNYKY---FIM YDFGGGT 201 P89214 GLEFGTTFSTISAYVN--GKMFELPLNN 126aa PCRRII NEPSAAAV YC-VSRYPEYDY---FLV YDFGGGT 196 Q98159 GIDFGTTFSTISGFVN--GSFVSLLVDK 131aa PVRRII NEPSAAAM HQ-LFINPKENN---FVV FDFGGGT 200 O56372 GLEFGTTFSTLCFSAG-RGVDGCVPESD 127aa QVQAVV NEPTAAGL SA-FVAVDKESI-EYMVV YDLGGGT 195 Q9Q1X6 GFHFGTTFSTVCIASS--NEILMLNNDD 126aa PVFHIM NEPSAALF AS-MLDMKKTSDWDSYVV YDFGGGT 202 Q9YYN4 GLDFGTTFSTISCFYN--NKLFSLKLNG 131aa NLRRIV NEPSAAAI YC-VSKYPQYAY---FYI YDFGGGT 201 P87542 GLEFGTTFSTISSFTN--GEMKTLYVNN 126aa SLRRII NEPSAAAI YS-VSKYPQHNY---FIM YDFGGGT 196 P87635 GLEFGTTFSTISSYVN--GVMKVLKLNE 126aa SLRRII NEPSAAAI YF-VSKYPQYNN---FLM YDFGGGT 196 Q9QCV8 -LDFGTTFSSVCFSPA-NKSNGCTEESD 126aa GVRAVI NEPTAAGF CS-LLEKTGGAT-SYTLV YDFGGGT 194 O LEFGTTFSTLCFSAG-RGVDGCVPESD 126aa QVQAVV NEPTAAGL SA-FVTVDKNSI-EYMVV YDLGGGT 194 Q83047 GLDFGTTFSTVSTLVN--NSMYVLRLGD 132aa PCRRII NEPSAAAV YC-VSRYPNYNY---FLV YDFGGGT 202 O57013 GFDFGTTFSTVSALIN--DKFVELNMNG 126aa SVNQIV NEPSAAAI YS-FFTNPDKED---ILM YDFGGGT 195 O TFSTACFSVPSQDDSGCVSLVN 122aa PLRALI NEPTSAAL YG-AVRG-GALK-ETYAV FDFGGGT 193 Q9IEN4 --DFGTTFSTACFSVPSQDESGCVSLVN 126aa PLRALI NEP Q41374 GIDLGTTYSCVGVWQH--DRVEIIANDQ 136aa NVMRII NEPTAAAI AYGLDKKATSVGEKNVLI FDLGGGT 210 HS7E_SPIO GIDLGTTYSRVGVWQH--DRVEIIANDQ 135aa NVMRII NEPTAAAI AYGLDKKATSVGEKNVLI FDLGGGT 209 HS71_MOUSEGIDLGTTYSCVGVFQH--GKVEIIANDQ 133aa NVLRII NEPTAAAI AYGLDR--TGKGERNVLI FDLGGGT 204 Q9QWJ5 GIDLGTTYSCVGVFQH--GKVEIIANDQ 133aa NVLRII NEPTAAAI AYGLDR--TGKGERNVLI FDLGGGT 204 BAB23387 GIDLGTTYSCVGVFKN--GRVEIIANDQ 158aa NVMRII NEPTAAAI AYGLDK---REGEKNILV FDLGGGT 230 BIP3MAIZE GIDLGTTYSCVGVYKN--GHVEIIANDQ 129aa NVARII NEPTAAAI AYGLDK---KGGEkiLV- FDLGGGT 89

94 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών Εικόνα 4.1 Ευθυγράμμιση αλληλουχιών αμινοξέων που εκφράζουν τμήμα της HSP70 των GLRaV-2, GLRaV-1, Beet yellows virus (BYV), Beet yellow stunt virus (BYSV), Citrus tristeza virus (CTV), GLRaV-3, Potato yellow vein virus (PYVV), Tomato infectious chlorosis virus (TICV), Little cherry virus-1 (LChV-1), GLRaV-4, Οlive leaf yellowing associated virus (OLYaV), Tomato chlorosis virus (ToCV), Beet pseudoyellows virus (BPYV), Cucurbit yellow stunting disorder virus (CYSDV), Plum bark necrosis stem pitting virus (PBNSPV), GLRaV-5, Lettuce infectious yellows virus (LIYV), GLRaV-7, Spinacia oleracea (σπανάκι), Mus musculus (επίμυς), Zea mays (καλαμπόκι). Η ευθυγράμμιση έγινε με το πρόγραμμα CLUSTAL V. Αναγράφονται οι αλληλουχίες των αμινοξέων που επιλέχθηκαν για το σχεδιασμό των εκκινητών καθώς και οι αντιδράσεις PCR στις οποίες αυτοί χρησιμοποιήθηκαν. Με πλάγιους χαρακτήρες στην περιοχή "phosphate 1" φαίνονται τα αμινοξέα που είναι συντηρημένα μόνο στις ιικές αλληλουχίες. (αα σημαίνει αριθμός αμινοξέων). 90

95 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών GLRaV-1: AF : GLRaV-1: GLAY15891 : GLRaV-3: AF : GLRaV-2: GLAV4131 : GLRaV-2: AF : GLRaV-2: GLA15890 : CTV: CYSDV: BPYV: Y18420 U67448 U67447 : : : ToCV: AF : TICV: LChV-1: U67449 X93351 : : GLRaV-7: Y15987 : GLRaV-5: AF : GLRaV-4: AF : HSP εστ π11 5 -TYGGGACGACGTTYTCNAC-3 Nested HSP εστ π12 5 -TTYGGGACGACGTTYAGYAC-3 Nested HSP π 1G 5 -AGTTYGGGACGACGTT-3 RT-PCR HSP π 1 5 -GGIHTIGAITTYGGIACIACITT-3 RT-PCR HSP εστ κ 13G 3 -TTRCTPGGGWSGMGGCG-5 Nested HSP εστ κ TTRCTYGGIWSIMGICGICS-5 Nested GLRaV-1: AF : GLRaV-1: GLAY15891 : GLRaV-3: AF : GLRaV-2: GLAV4131 : GLRaV-2: AF : GLRaV-2: GLA15890 : CTV: CYSDV: BPYV: Y18420 U67448 U67447 : : : ToCV: AF : TICV: LChV-1: U67449 X93351 : : GLRaV-7: Y15987 : GLRaV-5: AF : GLRaV-4: AF : gg tt GA TT GG AC AC TTc AC t g T c g g GGACTTGATTTTGGGACTACTTTCAGCACGTCCTGTTTTTCGATCCCCACGCAAGACGA ACTTTCAGTACGGCTTGTTTTTCAGTTCCATCGCAAGATGA GGTATAGATTTTGGAACCACTTTCAGCACAATCTGCTTTTC---CCCATCT---GGGGT GGTTTGGACTTTGGCACCACATTCTCTACGGTGTGTGTGTA-----CAAGGATGGACGA GGTTTGGACTTTGGCACCACATTCTCTACGGTGTGTGTGTA-----CAAGGATGGACGA GGTTTTGATTTTGGTACCACATTCTCTACGGTGTGCGTGTA-----CAAAGATGGACGA GGTTTAGACTTTGGTACCACGTTTTCGACGGTGGCTATGG------CTACATCCTCTGA GGATTAGAGTTCGGTACGACTTTCTCTACTATCAGCAGTTA-----TGTTAATGGT-GT GGGTTAGAGTTCGGTACAACTTTCAGTACCATTAGTTCTTT-----CACCAATGGA-GA GGTTTGGATTTTGGTACTACATTCAGTACTATTAGTTGTTT-----CTATAATAAC-AA GGGTTAGAGTTCGGTACTACTTTCAGTACTATCAGTGCGTA-----CGTTAATGGG-AA GGTATCGATTTTGGAACTACGTTCTCGACGATCTCTGGTTT-----TGTAAATGGA-TC GGGTTTGATTTTGGTACTACTTTTAGTACCGTATCAGCTTT-----AATCAATGAC-AA -GGTTAGAATTCGGAACCACATTCTCAACACTCTGCTTTTCTG---CTGGCAGAGGCGT GGATTAGAATTCGGCACTACATTCTCCACCTTGTGCTTTTCGG---CGGGTCGGGGAGT T T AA GAaCC C gc GC Gc T t t g ag -CTCATAAACGAACCAACGTCGGCAGCTTTATACGGGGCTGTTAAGG-GAGGTTCGTTG -CTTATAAACGAGCCAACGTCAGCAGCTTTGTACGGAGCTGTTAGGG-GAGGTGCGCTG -GTTGTTAACGAACCGACGGCCGCAGCCCTCTATTCCTTAGCTAAGTCGCGAGTAGAAG TATGATCAATGAACCTTCAGCGGCTGCGCTATCTGCGTGTAATTCGG-TTGGAAAGAAG TATGATCAATGAACCTTCAGCGGCTGCGCTATCTGCGTGTAATTCGA-TTGGAAAGAAG TATGGTCAACGAACCTTCAGCCGCCGCACTATCTACGTGCAACGCGA-TTAATAAGAAG CATTATTAACGAACCTTCAGCAGCCGCGTACTCCACTTTACCTAAGT-TGAGTTCGGCA -ATTATAAACGAACCATCTGCAGCAGCTATATAC---TTTGTTTCAA-AGTATCCGCAG -ATAATCAATGAACCGTCTGCAGCAGCGATTTAT---TCCGTCTCAA-AGTACCCGCAG -ATAGTCAATGAACCGTCGGCTGCCGCTATTTAC---TGCGTTTCTA-AATATCCGCAG -ATAATAAACGAACCATCTGCCGCTGCTGTATAC---TGTGTCAGTC-GTTATCCAGAA -ATTATAAATGAACCCTCTGCTGCTGCTATGCAT---CAATTGTTTA-TTAATCCTAAG -ATTGTGAATGAACCTAGTGCCGCCGCAATATAC---TCATTCTTTA-CGAATCCAGAT -GTGGTGAACGAGCCGACCGCGGCGGGTTTAAGTGCGTTTGTCACCG-TGGACAAGAAT -GTCGTGAATGAACCAACAGCCGCTGGTTTGAGCGCCTTTGTCGCTG-TTGACAAAGAG : 59 : 41 : 53 : 54 : 54 : 54 : 53 : 53 : 53 : 53 : 53 : 53 : 53 : 55 : 56 : 558 : 540 : 559 : 576 : 576 : 576 : 573 : 549 : 549 : 549 : 549 : 546 : 546 : 542 : 543 GLRaV-1: AF : GLRaV-1: GLAY15891 : GLRaV-3: AF : GLRaV-2: GLAV4131 : GLRaV-2: AF : GLRaV-2: GLA15890 : CTV: CYSDV: BPYV: Y18420 U67448 U67447 : : : ToCV: AF : TICV: LChV-1: U67449 X93351 : : GLRaV-7: Y15987 : GLRaV-5: AF : GLRaV-4: AF : HSP κ 2C 3 -CTRAANCCCCCICCITG-5 RT-PCR HSP κ 2 3 -CTRAANCCICCICCITG-5 RT-PCR a attt gt TacGA TT GG GG GG AC TT GA CGT---GAGACTTACGCCGTCTTCGATTTCGGAGGAGGGACATTGGACA : 604 AAA---GAGACGTACGCCGTCTTCGACTTCGGAGGAGGAACAT : 580 ACC---TATTATTA-GCGGTTTTTGATTTTGGGGGAGGGACTTTCGACG : 604 TCC---GCAAATTTGGCTGTTTACGATTTCGGTGGTGGGACCTTCGACG : 622 TCC---GCAAATTTGGCTGTTTACGATTTCGGTGGTGGGACCTTCGACG : 622 TCT---GCGAATTTAGCTGTATACGACTTCGGCGGAGGAACATTCGA-- : 620 GAT---AAATATTTAGCCGTTTACGACTTCGGCGGTGGGACTTTCGACG : 619 TAT---AACAACTTCCTGATGTATGACTTCGGAGGAGGAACTTTTGATT : 595 CAC---AATTATTTCATAATGTATGACTTTGGTGGCGGTACTTTCGAC- : 594 TAT---GCTTATTTCTATATTTACGATTTTGGTGGCGGTACTTTCGACA : 595 TAC---GATTATTTCCTTGTATACGACTTTGGTGGAGGTACATTTGA-- : 593 GAA---AATAATTTTGTGGTTTTCGATTTTGGTGGAGGCACTTTTGATG : 592 AAG---GAAGATATTTTGATGTACGATTTTGGTGGAGGAACATTCGA-- : 590 TCCATAGAGTACATGGTTGTCTACGACTTGGGAGGCGGGACGTTTGAAA : 591 TCCATAGAATACATGGTTGTCTATGACTTAGGAGGCGGCACATTTGAA- : 591 Εικόνα 4.2 Ευθυγράμμιση με το πρόγραμμα CLUSTAL V, αλληλουχιών νουκλεοτιδίων που εκφράζουν τμήμα της HSP70 των GLRaV-1, GLRaV-2, GLRaV-3, GLRaV-4, GLRaV-5, GLRaV-7, LChV-1, CTV, BPYV, CYSDV, TICV και ToCV. Αναγράφονται οι τελικοί εκκινητές που επιλέχθηκαν. 91

96 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών Για την RT-PCR σχεδιάστηκαν ζεύγη εκκινητών από τις περιοχές (phosphate 1 και phosphate 2) (Tian et al., 1996), τα οποία θεωρητικά πολλαπλασιάζουν μια περιοχή περίπου ζβ των clostero- και crini-ιών: Περιοχή "phosphate 1" Όνομα εκκινητή 5 -GIHTIGAITTYGGIACIACITTYWSIAC-3 'HSP π1' 5 -GGIYTIGAITTIGGIACIAC-3 'HSP π2' 5 -GGIHTIGAITTYGGIACNAC-3 'HSP π3' 5 -GGIHTIGAITTIGGIACIAC-3 'HSP π4' 5 -GGIHTIGAITTYGGIACIACNTT-3 'HSP π5' 5 -GGIHTIGAITTYGGIACIACITTY-3 'HSP π6' 5 -TNGAITTYGGIACIACITTY-3 'HSP π7' 5 -TNGAITTYGGIACIACITT-3 'HSP π8' 5 -TIGAITTYGGIACIACITTYAG-3 'HSP π9' 5 -TIGAITTYGGIACIACITTYTC-3 'HSP π10' 5 -HTIGAITTYGGIACYACITT-3 'HSP π11' 5 -GGIHTIGAITTYGGIACYACITT-3 'HSP π12' 5 -GGIHTIGAITTYGGIACIACITT-3 'HSP π13' 5 -TTYGGGACGACGTT-3 'HSP πg1' 5 -GTTYGGGACGACGTT-3 'HSP πg2' 5 -AGTTYGGGACGACGTT-3 'HSP πg3' Περιοχή "phosphate 2" Όνομα εκκινητή 5 -TCIAAIGTICCICCICCIAARTCRWA-3 'HSP κ1' 5 -TCIAAIGTICCICCICCIAA-3 'HSP κ2' 5 -TCIAAIGTICCICCICCNAA-3 'HSP κ3' 5 -AAIGTICCICCICCIAARTC-3 'HSP κ4' 5 -CCICCICCIAARTCRWA-3 'HSP κ5' 5 -GTICCICCICCIAARTC-3 'HSP κ6' 5 -GTICCICCICCIAARTCRWA-3 'HSP κ7' 5 -GTICCICCICCNAARTC-3 5 -GTICCICCCCCNAARTC-3 5 -GTICCICCBCCBAARTC-3 'HSP κ8' 'HSP κ9' 'HSP κ10' (W=A+T, R=A+G, M=A+C, Y=C+T, S=G+C, K=G+T, H=A+T+C, N=A+T+C+G, I=Ινοσίνη) 92

97 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών Τα κριτήρια για το σχεδιασμό των εκκινητών ήταν η παρόμοια με αυτά που αναφέρονται στην Παρ Για την εστιασμένη PCR σχεδιάστηκαν ζεύγη εκκινητών από τις περιοχές ''phosphate 1'' και ''connect 1'' (Tian et al., 1996), τα οποία θεωρητικά πολλαπλασιάζουν μια περιοχή περίπου ζβ από το προϊόν της RT-PCR: Περιοχή "phosphate 1" Όνομα εκκινητή 5 -GGAGTTYGGGACGACITT-3 'HSP εστ π1' 5 -GGGHTGGAGTTYGGGACGACNTT-3 'HSP εστ π2' 5 -TGGAGTTYGGGACGACNTT-3 'HSP εστ π3' 5 -TGGAGTTYGGGACGACITT-3 'HSP εστ π4' 5 -GGAGTTYGGGACGACNTT-3 'HSP εστ π5' 5 -GAGTTYGGGACGACNTT-3 'HSP εστ π6' 5 -TTYGGGACGACITTYWSIAC-3 'HSP εστ π7' 5 -AGTTYGGGACGACITTYWSIAC-3 'HSP εστ π8' 5 -TTYGGGACGACNTTYWSNAC-3 'HSP εστ π9' 5 -TTYGGGACGACGTTYAGYAC-3 'HSP εστ π10' 5 -TYGGGACGACGTTYTCNAC-3 'HSP εστ π11' 5 -TYGGGACGACGTTYAGYAC-3 'HSP εστ π12' 5 -TTYGGGACYACGTTYAGYAC-3 'HSP εστ π13' 5 -TYGGGACGACGTTYTCIAC-3 'HSP εστ π14' 5 -TTYGGGACYACGTTYTCIAC-3 'HSP εστ π15' Περιοχή "connect 1" Όνομα εκκινητή 5 -SCIGCIGMISWIGGYTCRTT-3 'HSP εστ κ1' *5 -GCGGMGSWGGGPTCRTT-3 'HSP εστ κg1' 5 -GCGGMGSWGGGYTCRTT-3 'HSP εστ κg2' 5 -GGCGGMGSWGGGYTC-3 'HSP εστ κg3' (W=A+T, R=A+G, M=A+C, Y=C+T, S=G+C, K=G+T, H=A+T+C, N=A+T+C+G, I=Ινοσίνη, *P=6Η,8Η-3,4-dihydropyrimido[4,5-c][1,2]oxazin-7-one) Κριτήρια για το σχεδιασμό των εκκινητών ήταν η παρόμοια κινητική τους δράση, ενώ η ελάχιστη θερμοκρασία τήξης τους (min Tm) να είναι μεγαλύτερη κατά 10ºC περίπου από αυτή των εκκινητών που χρησιμοποιούνται στην RT-PCR. Οι εκκινητές αξιολογήθηκαν για τη δυνατότητα ευαίσθητης ανίχνευσης με τη χρησιμοποίηση προϊόντων από δοκιμές RT-PCR μετά από αποτύπωση φυτικού εκχυλίσματος σε νάιλον μεμβράνη, των απομονώσεων που αναφέρονται στην 93

98 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών παράγραφο Οι εξωτερικοί εκκινητές δοκιμάστηκαν αρχικά σε θερμοκρασία επανασύνδεσης 43ºC, ενώ όσοι είχαν μεγάλο εύρος ανίχνευσης και ευαισθησία, δοκιμάστηκαν σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες επανασύνδεσης (38ºC, 43ºC και 48ºC), ομοίως και οι πιο αξιόλογοι εστιασμένοι εκκινητές, σε θερμοκρασίες επανασύνδεσης 50ºC, 54ºC και 58ºC. Οι εκκινητές που τελικά επιλέχθηκαν αναφέρονται στον Πίνακα 4.1. Πίνακας 4.1. Εκκινητές με εκφυλισμό που επιλέχθηκαν για την ανίχνευση των vitifovea- και closterο-ιών. Εκκινητής Αλληλουχία Αντίστοιχη αλληλουχία αμινοξέων Εκφυλισμός RW π1 * 5 -WGCIAARGCIGGICARAC-3 AKAGQT 8 RW κ1 * 5 -RMYTCICCISWRAAICKCAT-3 MRF(S/T)GE(A/F) 128 RW κ1g 5 -GCCGSWRAAGCKCAT-3-16 RW εστ π2 * 5 -GGGGCARACIHTIGCITGYTT-3 GQT (I/L)ACF 12 RW εστ κ4 * 5 -AAIGCYTCRTARTCIGAITCNGT-3 T(E/D)SDYEAF 32 HSP π13 5 -GGIHTIGAITTYGGIACIACITT -3 G(I/L/F)(D/E)FGTTF 6 HSP πg3 5 -AGTTYGGGACGACGTT-3-2 HSP κ8 5 -GTICCICCICCNAARTC-3 D(F/L)GGGT 8 HSP κ9 5 -GTICCICCCCCNAARTC-3-8 HSP εστ π10 5 -TTYGGGACGACGTTYAGYAC-3 8 FGTTFST HSP εστ π11 5 -TYGGGACGACGTTYTCNAC-3 16 HSP εστ κ1 5 -SCIGCIGMISWIGGYTCRTT-3 NEP(T/S)(S/A)A(A/G) 64 HSP εστ κg1 5 -GCGGMGSWGGGPTCRTT-3-16 Δοκιμή / Μήκος προϊόντος RT-PCR/ 363 ζβ Εστιασμένη PCR/ 198 ζβ One step RT-PCR/ ζβ Εστιασμένη PCR/ ζβ (W=A+T, R=A+G, M=A+C, Y=C+T, S=G+C, K=G+T, H=A+T+C, N=A+T+C+G, I=Ινοσίνη, P=(6Η,8Η-3,4-dihydropyrimido[4,5-c][1,2]oxazin-7-one) * Εκκινητές που αναφέρθηκαν στο Κεφ. 3. Στην παρούσα εργασία εκτός από τους εκκινητές με εκφυλισμό οι οποίοι περιέχουν di, σχεδιάστηκαν και ομόλογοι εκκινητές στους οποίους η di αντικαταστάθηκε με dg στις ομόλογες περιοχές (Εικ 4.2). Κατά την PCR (στο στάδιο της επέκτασης των εκκινητών), η πολυμεράση τοποθετεί dc απέναντι από την dι, εξαιτίας της μεγαλύτερης σταθερότητας του ζευγαρώματος της dι με την dc (Εικ 4.3) (Martin & Castro 1985, Rossolini et al., 1994). Επομένως μετά τον δεύτερο κύκλο της PCR υπάρχει δυνατότητα επιτυχούς υβριδισμού των ομόλογων εκκινητών που περιέχουν dg αντί της di (Εικόνα 4.3) 94

99 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών Πρώτος κύκλος PCR Υβριδοποίηση και επέκταση του ανοδικού εκκινητή HSPπ 1 5 GGIATIGAITTAGGIACIACITT-3 3 CCTTAGCTCAATCCATGGTGCAAacacatcacta...5 Δεύτερος κύκλος PCR, επέκταση του καθοδικού εκκινητή 5 GGIAT IGAITTAGGIACIACITTtgtgtagtgat...3 CTCAATCCCTGCTGCAAacacatcacta...5 C Τρίτος κύκλος PCR Υβριδοποίηση και επέκταση του πάνω εκκινητή HSP π1g 5 - GTTYGGGACGACGTT-3 3 CCCTACCT CAATCCCTGCTGCAAacacatcacta...5 Εικόνα 4.3 Τοποθέτηση dc απέναντι από την dι, κατά τη διάρκεια της PCR. Η σταθερότητα του ζεύγους βάσεων Ι:C είναι μικρότερη από αυτή του ζεύγους Α:Τ (Martin & Castro 1985) και κατά συνέπεια είναι ακόμη μικρότερη από αυτή του ζευγαρώματος G:C, με αποτέλεσμα οι ομόλογοι αυτοί εκκινητές, κατά την PCR, να υβριδοποιούνται με μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα στην αντίστοιχη περιοχή των μονόκλωνων αλυσίδων του DNA. Το μήκος των εκκινητών μειώθηκε ώστε να έχουν το επιθυμητό Tm με αποτέλεσμα να μπορεί να μειωθεί και ο εκφυλισμός τους. Ως αποτέλεσμα, ο εκκινητής RW κ1 ο οποίος περιέχει τρεις di και έχει εκφυλισμό 128, χρησιμοποιήθηκε μαζί με τον RW κ1g, ο οποίος έχει παρόμοιο Τm και εκφυλισμό 16 (Πίνακας 4.1). Κατά αντιστοιχία, οι εκκινητές HSP π13 και HSP εστ κ1, χρησιμοποιήθηκαν μαζί με τους εκκινητές HSP πg3 και HSP εστ κg1 αντίστοιχα (Πίνακας 4.1), ενώ οι εστιασμένοι εκκινητές HSP εστ π10 και HSP εστ π11 οι οποίοι P : Αδενίνη P : Γουανίνη Εικόνα 4.4 Ζευγάρωμα με Αδενίνη και Γουανίνη αντίστοιχα, του αναλόγου πυριμιδίνης P (6Η,8Η-3,4-dihydropyrimido[4,5-c][1,2]oxazin-7-one). 95

100 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών έχουν μερική ομολογία νουκλεοτιδίων με τον εξωτερικό εκκινητή HSP π13 (Εικόνα 4.2), σχεδιάστηκαν να περιέχουν dg αντί της di στις ομόλογες περιοχές. Ο εκφυλισμός του εκκινητή HSP εστ κg1 μειώθηκε ακόμη περισσότερο με την εισαγωγή στο σημείο εκφυλισμού Υ, ενός αναλόγου πυριμιδίνης P (6Η,8Η-3,4-dihydropyrimido[4,5- c][1,2]oxazin-7-one) το οποίο όταν εισάγεται στα ολιγονουκλεοτίδια ζευγαρώνει είτε με Α είτε με G (Εικ 4.4), ενώ η σταθερότητα του ζεύγους βάσεων P:A και P:G είναι ισοδύναμη με αυτή των ζευγών T:A και T:G αντίστοιχα (Lin & Brown 1989, Lin & Brown 1992) Ανάπτυξη εστιασμένης RT-PCR Οι αντιδράσεις βελτιστοποιήθηκαν ως προς τη συγκέντρωση του MgCl 2, των εκκινητών, των ενζύμων της αντίστροφης μεταγραφής, των προσθετικών της PCR (μπεταϊνη, DMSO, BSA), ενώ η βέλτιστη Τα προσδιορίστηκε πειραματικά. Τελικά επιλέχθηκαν οι παρακάτω συνθήκες αντιδράσεων. RT-PCR στον ίδιο μικροσωλήνα: Η αντίδραση έγινε σε συνολικό όγκο 25 µl για κάθε δείγμα. Κάθε μικροσωλήνας περιείχε: 10 mm Tris-HCl (ph: 8,8), 50 mm KCl, 1,5 mm MgCl 2, 0,1 % Τriton Χ-100, 0,25 mm κάθε dntp, 5,0 mm DTT, 5% DMSO, 12 μονάδες RNASEOUT αναστολέα ριβονουκλεασών (Life Technologies TM, USA), 0,8 μονάδες Dynazyme TM II DNA πολυμεράση (Finnzymes, Finland), 0,7 μονάδες AMV αντίστροφη μεταγραφάση (Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase, Finnzymes, Finland), 0.7 μονάδες Superscript TM II Rnase H αντίστροφη μεταγραφάση (Life Technologies TM, USA), 1 µm από κάθε εκκινητή RW π1, RW κ1 και RW κ1g για την ανίχνευση των fovea- και viti-ιών, 1 µm από τον HSP π13, 0,5 μμ από τους HSP κ8, HSP κ9 και 0,4μΜ από τον HSP πg3 για την ανίχνευση των clostero-ιών και συμπληρώθηκε με απεσταγμένο νερό (που υπέστη μεταχείριση με DEPC) μέχρι τελικού όγκου 24 μl. Στη συνέχεια προστέθηκε 1,0 μl διαλύματος "αποδέσμευσης" (παρ ) από επεξεργασία αποτυπωμένης μεμβράνης και οι μικροσωλήνες τοποθετήθηκαν σε θερμοκυκλοποιητή (PTC-200 peltier thermal Cycler, MJ Research), όπου επωάστηκαν σύμφωνα με τα παρακάτω στάδια για την αντίδραση της αντίστροφης μεταγραφής: για 60 λεπτά στους 42 o C, 2 λεπτά στους 50 o C και στη συνέχεια, για 4 λεπτά στους 94 o C. Ακολούθησαν για την αντίδραση της PCR, πέντε κύκλοι που περιλάμβαναν τα στάδια: (α) 30 δευτερόλεπτα στους 95 o C, (β) 10 δευτερόλεπτα στους 43 o C, (γ) 5 δευτερόλεπτα στους 38 o C και (δ) 15 δευτερόλεπτα στους 72 o C, τριανταπέντε κύκλοι που περιλάμβαναν τα στάδια: (α) 30 δευτερόλεπτα στους 95 o C, (β) 30 δευτερόλεπτα στους 43 o C και (γ) 15 δευτερόλεπτα στους 72 o C και η αντίδραση ολοκληρώθηκε με μία τελευταία επώαση επί 2 λεπτά στους 72 ο C (Εικόνα 4.5). Εστιασμένη PCR: Έγιναν δύο διαφορετικές αντιδράσεις εστιασμένης PCR. Για την ανίχνευση των viti- και fovea-ιών, η αντίδραση έγινε σε συνολικό όγκο 20µl με τη χρησιμοποίηση 1 μl από το προϊόν της RT-PCR (Εικόνα 3.5). Κάθε μικροσωλήνας περιείχε: 10 mm Tris-HCl (ph: 8,8), 50 mm KCl, 1,5 mm MgCl 2, 0,1 % Τriton Χ-100, 0.2 mm κάθε dntp, 0,5 μονάδες Dynazyme TM II DNA πολυμεράση (Finnzymes, Finland), 1 µm από τον εκκινητή RW εστ π2, 1,5 μμ από τον RW εστ κ4 και 96

101 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών συμπληρώθηκε με απεσταγμένο νερό (που υπέστη μεταχείριση με DEPC) μέχρι τελικού όγκου των 19μl. Οι μικροσωλήνες τοποθετήθηκαν σε θερμοκυκλοποιητή (Gene Amp 2400, Perkin Elmer), όπου επωάστηκαν για 3 λεπτά στους 95 o C, 10 δευτερόλεπτα στους 48 o C και στη συνέχεια, για 10 δευτερόλεπτα στους 72 o C. Ακολούθησαν 39 κύκλοι που περιλάμβαναν τα στάδια: (α) 30 δευτερόλεπτα στους 95 o C, (β) 30 δευτερόλεπτα στους 54 o C, (γ) 10 δευτερόλεπτα (με επέκταση του χρόνου κατά 1 δευτερόλεπτο μετά από κάθε κύκλο) στους 72 o C και η αντίδραση ολοκληρώθηκε με μία τελευταία επώαση επί 2 λεπτά στους 72 ο C (Εικόνα 4.5). Για την ανίχνευση των clostero-ιών εφαρμόστηκε το ίδιο προφίλ θερμοκυκλοποίησης, ενώ η αντίδραση περιείχε επίσης 3% DMSO και 1μΜ από τους εστιασμένους εκκινητές HSP εστ π10, HSP εστ π11, HSP εστ κ1 και HSP εστ κg1. RT-PCR στον ίδιο μικροσωλήνα ΕΣΤΙΑΣΜΕΝΗ-PCR 1μl GES 1. RT-PCR 1. RT-PCR 60 min 42 o C 2 min 50 o C 4 min 94 o C 30 sec 95 o C 10 sec 43 o C 5 κύκλοι 5 sec 38 o C 15 sec 72 o C 30 sec 95 o C 35 κύκλοι 30 sec 43 o C 20 sec 72 o C 2 min 72 o C 1μl προϊόν RT-PCR 2. εστιασμένη PCR Clostero-ιοί 2. εστιασμένη PCR Fovea-ιοί Viti-ιοί 2. ΕΣΤΙΑΣΜΕΝΗ-PCR 3 min 95 o C 15 sec 48 o C 15 sec 72 o C 30 sec 95 o C 39 κύκλοι 30 sec 54 o C 10 sec 72 o C +1sec/κύκλο 2 min 72 o C Εικόνα 4.5 Διαδικασία μεθόδου εστιασμένης RT-PCR για την ταυτόχρονη ανίχνευση clostero-, viti- και fovea-ιών, σε ιστούς αμπέλου. Για την ανάλυση των προϊόντων της PCR χρησιμοποιήθηκε η ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης σε τελική συγκέντρωση 1,8% σε 1xTΑE ρυθμιστικό διάλυμα (βλέπε Κεφ. 2) Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας Ο προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο διδεοξυ-αναλόγων του Sanger (Παρ ). Ένα προϊόν εστιασμένης PCR, από απομόνωση του GLRaV-6, κλωνοποιήθηκε και αλληλουχήθηκε. Έξι προϊόντα εστιασμένης PCR (από απομονώσεις των GLRaV-1, -2, -3, -5) αλληλουχήθηκαν μετά από καθαρισμό, με τη χρησιμοποίηση του εκκινητή HSP εστ π10 ή του HSP εστ π11. 97

102 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών Οι αλληλουχίες των απομονώσεων της μελέτης αυτής συγκρίθηκαν για ομοιότητες με τις καταχωρημένες αλληλουχίες στη βάση δεδομένων του NCBI με εφαρμογή του αλγόριθμου BLAST (διεύθυνση διαδικτύου: 98

103 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών 4.4 Αποτελέσματα Με τη χρησιμοποίηση της πολλαπλής εστιασμένης RT-PCR με αποτύπωμα μεμβράνης ανιχνεύτηκε η παρουσία των απομονώσεων clostero- και crini-ιών σε αμπέλι, κερασιά, πορτοκαλιά, αγγουριά και ντομάτα. Για την ανίχνευση απομονώσεων του GLRaV-3, ήταν επιπλέον απαραίτητη η προσθήκη μπεταΐνης στο διάλυμα "αποδέσμευσης" του εκμαγείου (Εικόνα 4.6) ζβ ΔείκτηςΜΒ ανά 100 ζβ 0,2 g μπεταΐνη 0,5 g μπεταΐνη 0 g μπεταΐνη Εικόνα 4.6 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος μίσχου φύλλου έξι διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με GLRaV-3, με τη χρησιμοποίηση των εκκινητών που αναφέρονται στον Πίνακα 4.1. Επίδραση της ποσότητας μπεταΐνης που προστίθεται σε 1 ml διαλύματος "αποδέσμευσης". Διαδρομές 1-6: 0,2g μπεταΐνη, 7-12: 0,5g μπεταΐνη, 13-18: χωρίς μπεταΐνη. Ανάλογα αποτελέσματα υπήρξαν όταν δύο μl του διαλύματος "αποδέσμευσης" που περιείχε το εκμαγείο, επωάστηκαν στους 94 ο C για 3 λεπτά παρουσία των εκκινητών και 10% DMSO, πριν την εφαρμογή RT-PCR (Εικόνα 4.7) ζβ DMSO 0% DMSO 1 0% ΔείκτηςΜΒ ανά 1 00 ζβ Εικόνα 4.7 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος τριών διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με GLRaV-3. Επίδραση του DMSO κατά την επώαση στους 94 ο C 2μl του διαλύματος "αποδέσμευσης" που περιείχε το εκμαγείο, παρουσία των εκκινητών, πριν την εφαρμογή RT-PCR. Διαδρομές 1-3: χωρίς DMSO, 4-6: με 10% DMSO. 99

104 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών Για την αποτελεσματική ανίχνευση απομονώσεων του GLRaV-3 ήταν απαραίτητη η προσθήκη 5% DMSO στην RT-PCR (Εικόνα 4.8), ενώ λιγότερο αποτελεσματική ήταν η προσθήκη μπεταΐνης (Εικόνα 4.9) ζβ DMSO 6% ΔείκτηςΜΒ DMSO 5% DMSO 4% DMSO 3% DMSO 2% ανά 100 ζβ Εικόνα 4.8 Επίδραση της συγκέντρωσης του DMSO στην RT-PCR. Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος τεσσάρων διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με GLRaV-3. Διαδρομές 1-4: 6% DMSO, 5-8: 5% DMSO, 9-12: 4% DMSO, 13-16: 3% DMSO, 17-20: 2% DMSO ζβ DMSO 5% ΔείκτηςΜΒ ΔείκτηςΜΒ ανά 100 ζβ Mπεταΐνη 0,6Μ ανά 100 ζβ Μάρτυρας (χωρίς πρόσθετα) Εικόνα 4.9 Επίδραση του DMSO και της μπεταΐνης στην RT-PCR. Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος οκτώ διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με GLRaV-3. Διαδρομές 1-8: 5% DMSO, 9-16: 0,6Μ μπεταΐνη, 17-24: χωρίς πρόσθετα. 100

105 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών Επίσης η ταυτόχρονη χρησιμοποίηση δύο διαφορετικών ενζύμων αντίστροφης μεταγραφής (AMV και Superscript TM II) αύξησε το εύρος και την επαναληψιμότητα ανίχνευσης (Εικόνα 4.10) ζβ Superscript II 1,4 u AMV 0,7 u + Superscript II 0,7u AMV 1,4 u ΔείκτηςΜΒ ανά 100 ζβ Εικόνα 4.10 Επίδραση των ενζύμων της RT. Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος έξι διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με GLRaV-3. Διαδρομές 1-6: 1,4 μονάδες Superscript TM II, 7-12: 0,7 μονάδες Superscript TM II μαζί με 0,7 μονάδες AMV, 13-18: 1,4 μονάδες AMV. Για τους εκκινητές που επιλέχθηκαν η βέλτιστη θερμοκρασία αντίστροφης μεταγραφής ήταν 42 ο C (Εικόνα 4.11), ενώ η βέλτιστη θερμοκρασία υβριδισμού (Ta) για την RT-PCR και την εστιασμένη PCR ήταν αντίστοιχα, 43 o C και 54 o C ζβ ΔείκτηςΜΒ ανά 100 ζβ RT 42 o C RT 40 o C RT 38 o C RT 42 o C RT 40 o C DMSO 5% Mπεταΐνη 1Μ RT 38 o C Εικόνα 4.11 Επίδραση της θερμοκρασίας κατά την RT. Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος δύο διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με GLRaV-3. Διαδρομές 1,2,7,8: RT στους 42 ο C, 3,4,9,10: RT στους 40 ο C και 5,6,11,12: RT στους 38 ο C. Διαδρομές 1-6: παρουσία 5% DMSO κατά την RT-PCR και 7-12: παρουσία 1Μ μπεταΐνης κατά την RT-PCR. 101

106 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών Κατά την RT-PCR, θερμοκρασίες Ta υψηλότερες από 45 o C καθώς και μικρότερες από 43 o C δεν έδωσαν επαναλήψιμα αποτελέσματα για μερικές απομονώσεις των GLRaV-6 και GLRaV-5, καθώς και του GLRaV-3 αντίστοιχα (Εικόνα 4.12). Επίσης όταν η Ta ήταν 43 o C δεν ήταν επαναλήψιμη η ανίχνευση μιας απομόνωσης του GLRaV- 5. Το σύνολο των απομονώσεων ανιχνεύτηκε επιτυχώς όταν τροποποιήθηκε τo στάδιο του υβριδοποίησης των εκκινητών, κατά τη διάρκεια των πέντε πρώτων κύκλων της PCR, με την προσθήκη μετά από το πρώτο στάδιο (10 δευτερόλεπτα στους 43 o C), ενός επιπλέον σταδίου (5 δευτερόλεπτα στους 38 o C) (Εικόνα 4.12). GLRaV -1 GLRaV -3 GLRaV GLRaV -6 GLRaV -5 GLRaV -1 GLRaV -3 GLRaV GLRaV -6 GLRaV -5 GLRaV -1 GLRaV -3 GLRaV GLRaV -6 GLRaV -5 GLRaV -1 GLRaV -3 GLRaV GLRaV -6 GLRaV ζβ ΔείκτηςΜΒ ανά 100 ζβta 46 o C, 30 Ta 43 o C, o C, 5 Ta 43 o C, 30 Ta 40 o C, 30 Εικόνα 4.12 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με GLRaV-5, -1, -3, -6, και ενός με GLRaV-2 και -7 ταυτόχρονα. Διαδρομές 1-5: RT-PCR με Τα στους 46 ο C για 30'', 6-10: RT-PCR με Τα στους 43 ο C για 10'' και ακολούθως 38 ο C για 5'' στους πέντε πρώτους κύκλους και Τα 43 ο C στους υπόλοιπους, 11-15: RT-PCR με Τα στους 43 ο C για 30'', 16-20: RT-PCR με Τα στους 40 ο C για 30''. Οι εκκινητές που σχεδιάστηκαν παρουσίασαν διαφορετική απόδοση ως προς τη δυνατότητα τους να πολλαπλασιάζουν συγκεκριμένα εκμαγεία αλλά και την ευαισθησία ανίχνευσης. Μερικά συγκριτικά αποτελέσματα της απόδοσης των εκκινητών παρουσιάζονται στις εικόνες 4.13, 4.14 και Οι εκκινητές που παρουσίασαν το μεγαλύτερο εύρος ανίχνευσης και τη μεγαλύτερη ευαισθησία αναφέρθηκαν στον πίνακα

107 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών GLRaV -6 GLRaV -2 GLRaV -3 GLRaV -5 GLRaV -1 GLRaV -1 GLRaV -3 GLRaV -6 GLRaV -2 GLRaV -3 GLRaV -5 GLRaV -1 GLRaV -1 GLRaV GLRaV -1 GLRaV -3 GLRaV -1 GLRaV -3 A 500 ζβ HSP π8 ΔείκτηςΜΒ ανά 100 ζβ HSP π13 Εικόνα 4.13 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με GLRaV-5, -6, -2, -3, και - 1. Διαδρομές 1-9: RT-PCR, παρουσία του εκκινητή HSP π8 μαζί με τον HSP k7. Διαδρομές 10-18: RT-PCR, παρουσία του εκκινητή HSP π13 μαζί με τον HSP k7. GLRaV -2 GLRaV -6 GLRaV -1 GLRaV -5 GLRaV -1 GLRaV -3 GLRaV -3 GLRaV -2 GLRaV -3 GLRaV -2 GLRaV -6 GLRaV -1 GLRaV -5 GLRaV -1 GLRaV -3 GLRaV GLRaV -2 GLRaV -3 B 500 ζβ HSP π7 ΔείκτηςΜΒ ανά 100 ζβ HSP π13 Εικόνα 4.14 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με GLRaV-5, -2, -6, -1, και - 3. Διαδρομές 1-9: RT-PCR, παρουσία του εκκινητή HSP π7 μαζί με τον HSP k7. Διαδρομές 10-18: RT-PCR, παρουσία του εκκινητή HSP π13 μαζί με τον HSP k7. 103

108 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών GLRaV -6 GLRaV -6 GLRaV -7 GLRaV -5 GLRaV -5 GLRaV -2 GLRaV -1 GLRaV -3 GLRaV -5 GLRaV -6 GLRaV -6 GLRaV -7 GLRaV -1 GLRaV -5 GLRaV -2 GLRaV -1 GLRaV GLRaV -3 B 500 ζβ ΔείκτηςΜΒ ανά 100 ζβ HSP κ7 HSP κ8 Εικόνα 4.15 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με GLRaV-5, -2, -6, -1, και -3. Διαδρομές 1-9: RT-PCR παρουσία του εκκινητή HSP k7 μαζί με τον HSP π13. Διαδρομές 10-18: RT-PCR παρουσία του HSP k8 μαζί με τον HSP π13. Η προσθήκη των εκκινητών RW κ1g και HSP πg3 στην αντίδραση RT-PCR, αύξησε την ευαισθησία της ανίχνευσης των fovea- και clostero- ιών αντίστοιχα, κατά δέκα περίπου φορές (Εικόνες 4.16 και 4.17) A 200 ζβ B 200 ζβ ΔείκτηςΜΒ ανά 100 ζβ ζβ RSPaV-1 RSPaV-1 RSPaV-1 Εικόνα 4.16 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος τριών διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με απομονώσεις του RSPaV-1 μετά από διαδοχικές αραιώσεις (10 φορές) σε εκχύλισμα χυμού υγιούς δείγματος. Οι αριθμοί δηλώνουν τις αραιώσεις. Πηκτή (Α): RT-PCR χωρίς τον εκκινητή RW κ1g. Πηκτή (Β): RT-PCR, παρουσία του RW κ1g. 104

109 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών GLRaV-6 GLRaV-5 GLRaV-1 YΓ GLRaV-3 GLRaV-3 GLRaV-3 GLRaV-6 GLRaV-5 GLRaV-1 YΓ GLRaV-3 GLRaV-3 GLRaV GLRaV-3 GLRaV ζβ HSP π13 + HSP πg3 ΔείκτηςΜΒ ανά 100 ζβ HSP π13 Εικόνα 4.17 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος επτά διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με GLRaV-6, -5, -1 και -3. Διαδρομές 1-8: RT-PCR, παρουσία του εκκινητή HSP πg3. Διαδρομές 9-16: χωρίς τον HSP πg3. Διαδρομές 4 και 12: υγιής μάρτυρας. Παρόμοια αποτελέσματα έδωσε και η προσθήκη του εκκινητή HSP εστ κg1 στην εστιασμένη PCR για την ανίχνευση των clostero-ιών (δεδομένα δεν αναφέρονται). Για την αξιόπιστη ανίχνευση ορισμένων απομονώσεων του GLRaV-3 ήταν απαραίτητη στην RT-PCR, η χρησιμοποίηση και του εκκινητή HSP κ9 (Εικόνα 4.18) ζβ HSP κ10 HSP κ8 + HSP κ9 HSP κ8 ΔείκτηςΜΒ ανά 100 ζβ Εικόνα 4.18 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος τεσσάρων διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με GLRaV-3. Διαδρομές 1-4: RT-PCR, παρουσία του εκκινητή HSP κ10 μαζί με τον HSP π13. Διαδρομές 5-8: RT-PCR, παρουσία των εκκινητών HSP k8 και HSP k9 μαζί με τον HSP π13. Διαδρομές 9-12: RT-PCR, παρουσία του εκκινητή HSP κ8 μαζί με τον HSP π

110 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών Με τη βελτίωση των συνθηκών οι δοκιμές εστιασμένης RT-PCR, έδωσαν επαναλήψιμα αποτελέσματα, με αναμενόμενα προϊόντα ζβ για το σύνολο των απομονώσεων των Clostero- και Crini-ιών καθώς και 200 ζβ για το σύνολο των παραλλαγών του RSPaV-1. Η ταυτόχρονη παρουσία RSPaV-1 και clostero-ιών στα δείγματα δεν επηρέασε το αποτέλεσμα των ελέγχων. Επιλεγμένα αποτελέσματα παρουσιάζονται στις εικόνες 4.19, 4.20 και GLRaV-7 GLRaV-7 GLRaV-6 GLRaV-7 GLRaV-6 GLRaV-5 GLRaV-5 GLRaV-5 GLRaV-6 GLRaV-2 GLRaV-2+7 GLRaV-3 GLRaV-3 GLRaV-2+-1 GLRaV-3 GLRaV-1 GLRaV ΥΓ GLRaV ζβ ΔείκτηςΜΒ ανά 100 ζβ Εικόνα 4.19 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων της βελτιωμένης εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος δειγμάτων προσβλημένων με διαφορετικούς clostero-ιούς: τρία με GLRaV-7, τρία με GLRaV-6, τρία με GLRaV-5, ένα με GLRaV-2 και -1 ταυτόχρονα, ένα με GLRaV-2, ένα με GLRaV-2 και -7 ταυτόχρονα, τρία με GLRaV- 3 και τρία με GLRaV-1. Διαδρομή 19: υγιής μάρτυρας. LChV -1 CTV BPYV CYSDV TICV ToCV YΓ YΓ YΓ ζβ ΔείκτηςΜΒ ανά 1 00 ζβ Εικόνα 4.20 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων της βελτιωμένης εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος διαφορετικών clostero- και crini-ιών: LChV-1 από κεράσι, CTV από πορτοκαλιά, BPYV και CYSDV από αγγουριά, ΤICV και ToCV από ντομάτα. Διαδρομές 7,8 και 9: υγιείς μάρτυρες από πορτοκαλιά, αγγουριά και ντομάτα αντίστοιχα. 106

111 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών ζβ ΔείκτηςΜΒ ανά 100 ζβ Εικόνα 4.21 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος βιότυπων αμπέλου προσβλημένων με RSPaV-1 με τη χρησιμοποίηση του πρωτοκόλλου που αναφέρεται στην παρ Διαδρομές 1, 3 και 13: εκχύλισμα υγιών πρέμνων. Σύγκριση των αλληλουχιών των 500 ζβ που προσδιορίστηκαν από κλωνοποιημένα και μη προϊόντα της εστιασμένης PCR με ομόλογες δημοσιευμένες αλληλουχίες HSP 70, επιβεβαίωσαν την προέλευσή τους από ιούς (Πίνακας 4.2). Πίνακας 4.2 Ποσοστά ομολογίας των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών των 500 ζβ που προσδιορίστηκαν από κλωνοποιημένα και μη προϊόντα της εστιασμένης PCR και των αντίστοιχα μεταφρασμένων αλληλουχιών των αμινοξέων, με ομόλογες δημοσιευμένες αλληλουχίες HSP 70. Δημοσιευμένες αλληλουχίες Αλληλουχίες Ομολογία Κωδικός Ιός νουκλεοτιδίων πρόσβασης GLRaV-4 AF % 85% Ομολογία αμινοξέων Κλώνος α (GLRaV-6 GR) GLRaV-5 AF % 90% Προϊόν PCR α GLRaV-1 AF % 93% Προϊόν PCR β GLRaV-2 GLAV % 93% Προϊόν PCR γ GLRaV-2 GLAV % 96% Προϊόν PCR δ GLRaV-2 GLAV % 96% Προϊόν PCR ε GLRaV-3 AF % 95% Προϊόν PCR στ GLRaV-5 AF % 97% Παρακάτω αναφέρονται οι αλληλουχίες που προσδιορίστηκαν: Κλώνος α (GLRaV-6 GR): TTTGGnACnACGTTCTCCACGTTGTGCTTCTCCGCCGGACGAGGCGTGAATGGTTGTG TTCCAGAGAGCGACACCATCTACATACCGACGGTTGTTGGTATCAGGAAGGACGGG ACCTATGCGATAGGTTTGGGGGCACTGTTAGAACCGGATCTGTTAGTCTATAGAGAC ATTAAAAGATATTTTGGTATGAACAAGTTCAACGCTGAAGGTTACAGAAAGAAACTG AAGCCGAAATTTGAGGTGGTAGTTAAAAATTGGTCTGCTTGTATTGGTCCATCCTCTG GTGAAAAGGGAAAAACCAGGAGCGTTCTGGCTCTGGCGTGCATGTTCGTGTCAGCTT 107

112 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών TAGCGAAGATGGCTGTTAAGATGACCGGTAGTGCTGTGGTTTTGTCGGTGTGTTCTGT GCCCGCGGAATATAGTTCATATATGCGAAATTTTATATTCCAAAGCTGTTCACTGGC AAAAATTATGGTTCAAGCAGTGGTGAATGAACCnTCnGC Μετάφραση: TFSTLCFSAGRGVNGCVPESDTIYIPTVVGIRKDGTYAIGLGALLEPDLLVYRDIKRYFGM NKFNAEGYRKKLKPKFEVVVKNWSACIGPSSGEKGKTRSVLALACMFVSALAKMAVK MTGSAVVLSVCSVPAEYSSYMRNFIFQSCSLAKIMVQAVVNEP Προϊόν PCR α (GLRaV-1GR): GTGTGTCATTGGTgAATTCTCTGTTCGTCCCAACGCAGATTTTTATAGGAAGTGACAT GACATACAGCATTGGACACAGAGCTTACTCCGATTT Προϊόν PCR β (GLRaV-2 GR): GTGTATAAGGATGGACGGGTTTTTTCATTCAAGCAGAATAATTCGGCGTACATCCCA ACTTACCTCTATCTCTTTTCCGATTCTAACCACATGACGTTTGGTTACGAGGCTGAAT CGTTGATGAGTAACTTGAAAGTTAGGGGCTCGTTTTATAGAGATTTGAAACGTTGGG TGGGTTGCGATTCGAGTAACCTCGACGAATACCTCGATCGTTTAAAACCTCACTACT CGGTACGCTTGATTAAGATTGGTTCTGGTTTGAACGAAACCGTTTCTATTGGAAGCTT CGGGGGCACTGTCAGATCTGAGGCTCATCTACCGGGGTTGATAGCCCTTTTTATCAA GGCTATCGTTGGCTGTGCTGAGAACGCGTTTGCGTGTACTTGCACTGGGATTATCTGT TCGGTACCCGCCAATTACGATAGTGTCCAAAGGAATTTTACTGATCAGTGCGTTTCA C Προϊόν PCR γ (GLRaV-2 GR): GTTTTTTCATTCAAGCAGAATAATTCGGCGTACATCCCAACTTACCTCTATCTCTTTTC CGATTCTAACCACATGACGTTTGGTTACGAGGCTGAATCGTTGATGAGTAACTCGAA AGTTAGGGGCTCGTTTTATAGAGATTTGAAACGTTGGGTGGGTTGCGATTCGAGTAA CTCGACG Προϊόν PCR δ (GLRaV-2 GR): TCTCTTCTCCGATTCTAACCACATGACTTTTGGTTACGAGGCCGAATCACTGATGAGT AATCTGAAAGTTAAAGGTTCGTTTTATAGAGATTTAAAACGTTGGGTGGGTTGCGAT TCGAGTAACCTCGACGCGTACCTTGACCGTTTAAAACCTCATTACTCGGACCGCTTG GTTAAGATTGGCTCTGGCTTGAACCACACTGTTTCAATTGGAAA Προϊόν PCR ε (GLRaV-3 GR): GGTTGTACTCCTGTAGCTGGTAGTGTTTATGTTGAAACCCAAATTTTTATACCTGTAG GTAACTCTACTTATTTAATTGGTAAAGCAGCGGGGAAAGCTTATCGCGACGGTGTAG AGGGGAGGTTGTACGTTAACCCGAAAAGG Προϊόν PCR στ (GLRaV-5 GR): TGCTGGCAGAGGTGTGGACGGTTGTGTTCCTGAGAGTGACACCGTGTATATACCAAC GGTAGTTGGTATACGAAAAGACGGAACATACACAATAGGTTTGGGGGCTTTGCTAG AAAAGGATGTACTCGTTTATCGGGACATAAAAAGATATTTTGGTATGAACAAATTCA 108

113 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών ATGCCGAAGTGTACAAGAAAAAGCTAAAACCTAAATTTGAGGTCATAGTGAAAAAC TGGTCAGCTTACATTGGTCCGTCTTCTGGAGAGAAAGGGAAAACCAGGAGCGTTATC GCTTTGGCGTGTATGTTTGTATCCGCTTTGGCGAAGATGGCCGTGTCAATTACTGGTA GTGCTGTGAAATTGTCTGTGTGTTCTGTGCCTGCT Η βελτιωμένη εστιασμένη RT-PCR με αποτύπωση εκχυλίσματος μίσχων φύλλου, έδωσε θετικά αποτελέσματα σε αραιώσεις (10-1 έως 10-2 ), εκχυλισμάτων των προσβλημένων με GLRaV-2, -3 και -5 δειγμάτων, παρουσιάζοντας ικανοποιητική ευαισθησία ανίχνευσης (Εικόνα 4.22) ζβ ΔείκτηςΜΒ ανά 100 ζβ GLRaV-3 GLRaV-5 GLRaV-2 Εικόνα 4.22 Ηλεκτροφόρημα προϊόντων της βελτιωμένης εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος τριών διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με GLRaV- 3, -5 και -2, μετά από διαδοχικές αραιώσεις (10 φορές) σε εκχύλισμα χυμού υγιούς δείγματος. Οι αριθμοί δηλώνουν τις αραιώσεις. 109

114 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών 4.5 Συζήτηση Στην παρούσα εργασία, με τη χρήση εστιασμένης RT-PCR και εκκινητές με εκφυλισμό οι οποίοι περιείχαν δεοξυινοσίνη (di), πολλαπλασιάστηκε επιτυχώς τμήμα του γονιδιώματος 26 απομονώσεων διάφορων clostero-ιών που προσβάλλουν το αμπέλι (GLRaV-1, GLRaV-2, GLRaV-3, GLRaV-5, GLRaV-6 και GLRaV-7) καθώς και άλλων clostero- και crini-ιών (CTV, LChV-1, BPYV, CYSDV, TICV και ToCV), από διάφορους ξυλώδεις ή ποώδεις ξενιστές όπως κερασιά, πορτοκαλιά, αγγούρι και ντομάτα (Εικόνες 4.19 και 4.20). Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας των προϊόντων της εστιασμένης PCR επιβεβαίωσε την προέλευση τους από τους ιούς αυτούς. Τα αποτελέσματα αυτά αποτελούν σημαντικές ενδείξεις ότι η εστιασμένη RT-PCR που περιγράφηκε είναι αποτελεσματική για την ανίχνευση όλων των γνωστών ιών που σχετίζονται με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου, αλλά πιθανά και άλλων άγνωστων ιών που ανήκουν στα γένη Closterovirus, το οποίο αποτελεί πλεονέκτημα για τον αποτελεσματικό ιολογικό έλεγχο σε σχήματα παραγωγής πιστοποιημένου πολλαπλασιαστικού υλικού. Η μέθοδος αυτή συνδυάσθηκε με αντίστοιχη μέθοδο για την ανίχνευση ιών των γενών Vitivirus και Foveavirus, με στόχο την πολλαπλή RT-PCR ενίσχυση στον ίδιο μικροσωλήνα, γονιδιακών περιοχών ιών που ανήκουν στα τρία γένη. Στη συνέχεια ακολουθούσαν δύο διαφορετικές εστιασμένες PCR, μία για την ανίχνευση των viti-ιών και fovea-ιών και μια για την ανίχνευση των clostero-ιών, εφαρμόζοντας και για τις δύο, όμοιες συνθήκες θερμοκυκλοποίησης. Η μέθοδος αυτή είναι χρήσιμη για το μαζικό έλεγχο δειγμάτων γιατί: α) έχει μεγάλο εύρος ανίχνευσης απομονώσεων κάθε ιού αλλά και ιών διαφορετικών γενών, εξαιτίας της χρησιμοποίησης εκφυλισμένων εκκινητών, και β) έχει αυξημένη εξειδίκευση και ευαισθησία σε σύγκριση με άλλες μεθόδους PCR για την ανίχνευση ιών της αμπέλου (Saldarelli et al 1998), εξαιτίας της εφαρμογής εστιασμένης PCR και χρησιμοποίησης μαζί με τους εκκινητές με εκφυλισμό που περιέχουν di, αντίστοιχων ομόλογων εκκινητών, στις ομόλογες περιοχές των οποίων, η di έχει αντικατασταθεί με dg. Η αυξημένη ευαισθησία επέτρεψε την εφαρμογή ενός απλού πρωτοκόλλου επεξεργασίας των δειγμάτων με αποτύπωση του φυτικού εκχυλίσματος σε νάιλον μεμβράνη. Όλα τα παραπάνω συμβάλλουν στη σημαντική μείωση του χρόνου και του κόστους της διάγνωσης, ενώ παράλληλα αυξάνουν την αξιοπιστία της. Αρκετά προβλήματα παρουσιάστηκαν κατά τη βελτιστοποίηση της μεθόδου εξαιτίας του εκφυλισμού των εκκινητών, καθώς και του μεγάλου αριθμού των διαφορετικών εκμαγείων που πρέπει να πολλαπλασιαστούν κάτω από τις ίδιες συνθήκες PCR. Τα περισσότερα προβλήματα αφορούσαν την εύρεση του βέλτιστου προφίλ θερμοκυκλοποίησης, τη μειωμένη ευαισθησία ανίχνευσης αρκετών εκκινητών, καθώς και την αξιόπιστη ανίχνευση απομονώσεων του GLRaV-3. Το σύνολο των εκκινητών που σχεδιάστηκαν, θα μπορούσε θεωρητικά να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση του συνόλου των ιών που χρησιμοποιήθηκαν στην εργασία αυτή, όμως ελάχιστοι από αυτούς αποδείχθηκαν ικανοποιητικοί. Δύο φαίνεται να είναι οι κυριότερες αιτίες: α) ο πιθανός σχηματισμός διμερών μεταξύ των πολλών διαφορετικών ολιγονουκλεοτιδίων που υπάρχουν στις δοκιμές PCR, εξαιτίας των 110

115 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών πολλών εκκινητών και του εκφυλισμού τους και β) οι εκκινητές ανάλογα με την αλληλουχία τους και με ποια από τις τέσσερις βάσεις του DNA ζευγαρώνουν οι di που περιέχουν, εμφανίζουν σημαντικές διαφορές της Τm, επειδή η di δεν συμπεριφέρεται ουδέτερα όταν βρίσκεται σε έναν εκκινητή παρόλο που είναι λιγότερο επιλεκτική από τις υπόλοιπες τέσσερις βάσεις (Martin & Castro 1985, Bergstrom et al., 1997). Τα αποτελέσματα της εργασίας αυτής, έδειξαν ότι η απόδοση των δοκιμών PCR στις οποίες χρησιμοποιούνται εκκινητές με εκφυλισμό οι οποίοι περιέχουν di, μπορεί να αυξηθεί σημαντικά με την παράλληλη χρησιμοποίηση αντίστοιχων ομόλογων εκκινητών στις ομόλογες περιοχές των οποίων η di έχει αντικατασταθεί με dg (Εικόνες 4.16 και 4.17). Οι εκκινητές αυτοί έχουν μικρότερο μήκος και εκφυλισμό και υβριδοποιούνται πιο αποτελεσματικά από τους αντίστοιχους εκκινητές που περιέχουν di, με αποτέλεσμα την υψηλότερη αποτελεσματικότητα πολλαπλασιασμού του εκμαγείου κατά την PCR. Με την προσέγγιση αυτή, εκκινητές που περιέχουν di και έχουν υψηλό εκφυλισμό, μπορούν να χρησιμοποιηθούν αποτελεσματικά όταν απαιτείται μεγάλη ευαισθησία ανίχνευσης. Η βέλτιστη Τα στην RT-PCR βρέθηκε να είναι οι 43 ο C. Σε χαμηλότερες θερμοκρασίες υπήρχαν προβλήματα ανίχνευσης απομονώσεων του GLRaV-3, πιθανώς εξαιτίας της αρνητικής επίδρασης της δευτεροταγούς δομής του μονόκλωνου DNA (η οποία σχηματίζεται σε χαμηλές θερμοκρασίες), στον επιτυχή υβριδισμό των εκκινητών στο στόχο τους. Μειωμένη όμως παρέμενε η αποτελεσματικότητα ανίχνευσης μιας απομόνωσης του GLRaV-5 στους 43 ο C. Προσδιορισμός της αλληλουχίας του προϊόντος της εστιασμένης RT-PCR, της απομόνωσης του GLRaV-5 με τους εκκινητές HSP π4 και HSP εστ π2 σε Τα 38 ο C, έδειξε ότι κατά τον υβριδισμό του εξωτερικού εκκινητή HSP π13 (5 -GGIHTIGAITTYGGIACIACITT-3 ) στο συγκεκριμένο εκμαγείο, απέναντι από την di, που βρίσκεται στην τρίτη θέση από το 3 άκρο του εκκινητή, υπήρχε dg (δεδομένα δεν αναφέρονται). Είναι πιθανό η παρουσία di κοντά στο 3 άκρο του εκκινητή να προκαλεί αστάθεια στον υβριδισμό του, εξαιτίας της αστάθειας του ζευγαρώματος της di με την dg (Martin & Castro 1985, Bergstrom et al., 1997). Με δεδομένο ότι οι εκκκινητές χρειάζονται τουλάχιστον τρία συνεχή ζευγαρώματα νουκλεοτιδίων στο 3 άκρο για επιτυχή PCR (Sommer & Tautz, 1989), είναι πιθανό η παραπάνω περίπτωση να επηρεάζει αρνητικά την αποτελεσματικότητα της PCR. Στην περίπτωση αυτή είναι προτιμότερο να υπάρχει πλήρης εκφυλισμός κοντά στο 3 άκρο του εκκινητή και τέτοιοι εκκινητές απέδωσαν καλύτερα στην παρούσα εργασία [ο HSP κ8 αντί του HSP κ6, ο HSP εστ π3 αντί του HSP εστ π4, ο HSP εστ π11 αντί του HSP εστ π14 και ο HSP εστ π14 αντί του HSP εστ π11 (δεδομένα δεν αναφέρονται)]. Στην περίπτωση όμως του HSP π13, η RT-PCR με τους εκκινητές HSP π5, με πλήρη εκφυλισμό στο 3 άκρο και ακολούθως η εστιασμένη PCR με τον HSP εστ π9, δεν ήταν αποτελεσματικές για την ανίχνευση του συνόλου των απομονώσεων clostero-ιών, πιθανά εξαιτίας του υψηλού βαθμού εκφυλισμού των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν. Τροποποίηση του σταδίου υβριδισμού του εκκινητή HSP π13 των πρώτων πέντε κύκλων της RT-PCR με εφαρμογή δύο σταδίων επώασης, ένα στους 43 ο C για 10 (για την επιτυχή υβριδοποίηση του HSP π13 σε αλληλουχίες του GLRaV-3) και στη συνέχεια ένα 111

116 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών στους 38 ο C για 5 για την αποτελεσματική υβριδοποίηση του 3 άκρου του εκκινητή στην περίπτωση του GLRaV-5, οδήγησε στην επίλυση του προβλήματος. Η εφαρμογή των χαλαρών αυτών συνθηκών υβριδοποίησης επέτρεψε την επιτυχή και επαναλήψιμη ανίχνευση του συνόλου των απομονώσεων των clostero- και crini-ιών που ελέγχθηκαν (Εικόνες 4.12, 4.19 και 4.20). Η παρουσία 5% DMSO στην RT-PCR αποδείχθηκε απαραίτητη για την ανίχνευση απομονώσεων του GLRaV-3. Ορισμένες περιοχές του δίκλωνου τμήματος DNA που έχουν υψηλή θερμοκρασία τήξης (Τm) είναι πιθανό να εμποδίζουν τον πολλαπλασιασμό του DNA κατά την PCR (McDowell et al., 1998). Όταν το προφίλ αποδιάταξης (denaturation profile) του προϊόντος RT-PCR από τον GLRaV-3 υπολογίστηκε με τη χρήση του αλγόριθμου Poland (Steger 1994), (διεύθυνση διαδικτύου: εντοπίστηκε μια περιοχή με τοπικά υψηλό Τm (Εικόνα 4.23). Είναι πιθανό η περιοχή αυτή να μην αποδιατάσεται πλήρως κατά την RT-PCR με αποτέλεσμα να μειώνεται η απόδοση της PCR. Εικόνα 4.23 Υπολογισμός του προφίλ αποδιάταξης του προϊόντος RT-PCR από τον GLRaV-3 με τη χρήση του αλγόριθμου Poland (Steger 1994). Το DMSO αποσταθεροποιεί τη δευτεροταγή δομή του μονόκλωνου DNA καθώς και το δίκλωνο DNA, αποσταθεροποιώντας το ζευγάρωμα των βάσεων. Στην περίπτωση του GLRaV-3, το DMSO πιθανώς διευκολύνει την πλήρη αποδιάταξη του εκμαγείου στους 94 ο C αλλά και τον υβριδισμό των εκκινητών με το στόχο τους, μειώνοντας τη δευτεροταγή δομή του μονόκλωνου DNA στη χαμηλή θερμοκρασία υβριδισμού (43-38 o C). Παρόμοια αποτελέσματα είχε και η προσθήκη μπεταΐνης στην RT-PCR (Εικόνα 4.9), ενός άλλου πρόσθετου της PCR με παρόμοια δράση (Rees et al., 1993), η οποία 112

117 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών όμως στη συγκέντρωση που ήταν αποτελεσματική (1Μ), μείωνε σημαντικά την ευαισθησία της ανίχνευσης (δεδομένα δεν αναφέρονται). Επιπλέον προβλήματα αποτελεσματικότητας ανίχνευσης του GLRaV-3 παρουσιάστηκαν πιθανώς εξαιτίας της δευτεροταγούς δομής του μονόκλωνου RNA στόχου στη χαμηλή θερμοκρασία (42 ο C) κατά το στάδιο της RT, η οποία μπορεί να εμποδίζει την πρόσβαση και τον επιτυχή υβριδισμό του καθοδικού εκκινητή HSP κ8 μειώνοντας την αποτελεσματικότητα της. Το προφίλ της δευτεροταγούς δομής του RNA μπορεί να υπολογιστεί θεωρητικά με τη χρήση ενός αλγόριθμου γνωστού ως Vienna RNA package (Hofacker et al., 1994) (διεύθυνση διαδικτύου: Ο αλγόριθμος αυτός χρησιμοποιήθηκε μέσω του προγράμματος RNAdraw (Matzura and Wennborg, 1996) και υπολογίστηκε το προφίλ της δευτεροταγούς δομής του RNA του GLRaV-3 με αποτέλεσμα να βρεθεί μια σταθερή δομή έλικα με μεγάλο ποσοστό G και C η οποία θα μπορούσε να εμποδίσει την πρόσβαση του HSP κ8 (Εικόνα 4.24). U U U A A U A G C A U U A A A G U G G G U C C C U C U G U C G U A C U A U G A U G C A G G G U A G G U A U G U C C U A U G A U C G A A G G U C C A G A U G C G G C U C C A A G A U U A G G C A G C C C U C U A U U C C G A C U U U C G G A G G G G G U U U U U U A A G G C U U U A A G U C G C U U U G G C G A G A G U A G G Εικόνα 4.24 Υπολογισμός της δευτεροταγούς δομής τμήματος του RNA του GLRaV-3 στους 55 ο C (Matzura and Wennborg, 1996). Σε τετράγωνο περίγραμμα βρίσκονται οι βάσεις με τις οποίες υβριδοποιείται ο εκκινητής HSP κ8. U U A U U A A U A C G A C Η μπεταΐνη αποσταθεροποιεί το ζευγάρωμα των βάσεων G:C (Rees et al., 1993) και δυσχεραίνει το σχηματισμό της δευτεροταγούς δομής που προκαλείται από περιοχές με μεγάλο ποσοστό G και C (Henke et al., 1997). Η παρουσία μπεταΐνης στο διάλυμα αποδέσμευσης του εκμαγείου μαζί με τον εκκινητή HSP κ8 βελτίωσε σημαντικά την απόδοση της RT-PCR για την ανίχνευση απομονώσεων του GLRaV-3, πιθανώς παρεμποδίζοντας το σχηματισμό της συγκεκριμένης δομής έλικα με μεγάλο ποσοστό G 113

118 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών και C και επιτρέποντας έτσι τον υβριδισμό του εκκινητή HSP κ8. Παρόμοια αποτελέσματα είχε και η εφαρμογή ενός ακόμη τρόπου διευκόλυνσης υβριδισμού HSP κ8, με επώαση στους 94 ο C για 2 λεπτά, 2μl του διαλύματος "αποδέσμευσης" που περιείχε το εκμαγείο, παρουσία του εκκινητή και 10% DMSO (ανάλογη δράση με τη μπεταΐνη), πριν από την εφαρμογή RT-PCR (Εικ 4.7). Είναι πιθανό επίσης να υπάρξει αστάθεια κατά τον υβριδισμό εκκινητών σε περιπτώσεις παρουσίας αρκετών ζευγών I:G ή I:T τα οποία συμβάλλουν σημαντικά στην αποσταθεροποίηση. Στην περίπτωση ανίχνευσης ορισμένων απομονώσεων του GLRaV- 3 η παρουσία του HSP k2c ήταν απαραίτητη πιθανότατα εξαιτίας της αποσταθεροποίησης υβριδισμού του HSP k2 με το γονιδίωμα του GLRaV-3 εξαιτίας της παρουσίας των ζευγών I : G (Εικ. 4.2). H αντίστροφη μεταγραφάση (Reverse transcriptase, RT) είναι μια RNA εξαρτώμενη DNA πολυμεράση η οποία χρησιμοποιείται στις μοριακές τεχνικές για τη σύνθεση συμπληρωματικού DNA (complementary DNA, cdna) από αγγελιοφόρο RNA (messenger RNA, mrna). Στην πράξη χρησιμοποιούνται ευρέως οι γενετικά ανασυνδυασμένες RT δύο ρετροϊών, του Avian myeloblastosis virus (AMV), και του Moloney murine leukemia virus (M-MLV). Εκτός από τη δραστηριότητα πολυμεράσης, τα ένζυμα αυτά έχουν και ακόμη μια ανεξάρτητη δραστηριότητα RN-άσης 'Η', η οποία εξειδικευμένα, αποικοδομεί το RNA σε ένα υβρίδιο RNA/DNA (DeStefano et al., 1991, Wisniewski et al., 2000). Η δραστηριότητα RN-άσης 'Η' ανταγωνίζεται αυτή της πολυμεράσης με αποτέλεσμα να μειώνεται το μήκος και η ποσότητα του παραγόμενου cdna (Berger et al., 1983). Μεταλλαγή στην περιοχή του ενζύμου που είναι υπεύθυνη για τη δραστηριότητα RN-άσης 'Η' μπορεί να προκαλέσει μείωση της δραστηριότητας αυτής, με επακόλουθο τη σημαντική αύξηση του μήκους και της ποσότητας του παραγόμενου cdna (Kotewicz et al., 1988). Ένα ακόμη πρόβλημα κατά την αντίστροφη μεταγραφή, με τη χρησιμοποίηση RT ρετροϊών είναι οι παύσεις της μεταγραφής που κάνουν σε περιοχές δευτεροταγούς δομής του RNA, με επακόλουθο την αποδέσμευση τους από το εκμαγείο με παράλληλη δράση RN-άσης 'Η' (Harrison et al., 1998). Ορισμένες από τις παύσεις αυτές, είναι μοναδικές για κάθε RT (DeStefano et al., 1991). Στην παρούσα εργασία ήταν απαραίτητη η ταυτόχρονη χρησιμοποίηση δύο διαφορετικών ενζύμων RT (AMV και Superscript TM II) κατά την αντίστροφη μεταγραφή (Εικόνα 4.10). Η AMV παρουσιάζει σημαντική δραστηριότητα RN-άσης 'Η', ενώ η Superscript TM II είναι μια M-MLV RT, χωρίς αυτή τη δραστηριότητα. Η παρουσία μόνο της Superscript TM II κατά την αντίστροφη μεταγραφή δεν έδωσε ικανοποιητικά αποτελέσματα ανίχνευσης απομονώσεων του GLRaV-3 πιθανώς εξαιτίας της αδυναμίας αποδιάταξης του υβριδίου RNA/DNA (εξαιτίας της περιοχής που αναφέρθηκε με το τοπικά υψηλό Τm και του υψηλότερου Τm που παρουσιάζουν τα υβρίδια RNA/DNA σε σχέση με τα αντίστοιχα υβρίδια DNA/DNA). Η ταυτόχρονη παρουσία της AMV RT δίνει τη δυνατότητα αποικοδόμησης του RNA στο παραγόμενο υβρίδιο RNA/DNA με αποτέλεσμα τη σημαντική βελτίωση της απόδοσης της RT-PCR κατά την ανίχνευση απομονώσεων του GLRaV-3. Αντιστρόφως, η παρουσία μόνο της AMV RT, πάλι δεν έδωσε ικανοποιητικά αποτελέσματα (Εικόνα 4.10). Η ταυτόχρονη παρουσία της 114

119 Κεφ. 4. Tαυτόχρονη ανίχνευση Clostero-, Fovea- και Viti-ιών Superscript TM II RT πιθανώς να βοηθάει με την αύξηση του μήκους και της ποσότητας του παραγόμενου cdna, αλλά και να συνεχίζει τη μεταγραφή σε περιοχές δευτεροταγούς δομής του RNA, όπου η AMV RΤ κάνει παύσεις. Η μέθοδος που περιγράφηκε παραπάνω είναι η πρώτη αναφορά μιας πολλαπλής εστιασμένης RT-PCR η οποία επιτρέπει την ταχεία, αξιόπιστη και χαμηλού κόστους ανίχνευση ιών που σχετίζονται με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου. Επίσης, είναι συμβατή με την ταυτόχρονη ανίχνευση Fovea- και viti-ιών (ιοί που σχετίζονται με τη βοθρίωση του ξύλου της αμπέλου). Επιπλέον, προκαταρτικά αποτελέσματα δείχνουν ότι η αποτύπωση των δειγμάτων σε νάιλον μεμβράνη δίνει εκμαγεία κατάλληλα για RT- PCR στην περίπτωση και άλλων φυτικών ειδών με σημαντική παρουσία φαινολικών ενώσεων στους ιστούς τους, όπως η κερασιά και η πορτοκαλιά. 115

120 ΚΕΦ. 5 Xαρακτηρισμός ενός νέου Clostero-ιού ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Μερικός χαρακτηρισμός ενός νέου ιού του γένους Closterovirus στο αμπέλι

121 ΚΕΦ. 5 Xαρακτηρισμός ενός νέου Clostero-ιού Κεφάλαιο Περίληψη Έντεκα βιότυποι αμπέλου από την περιοχή Ζίτσα των Ιωαννίνων, προερχόμενοι από κλωνική επιλογή, οι οποίοι μετά από ορολογικό έλεγχο βρέθηκαν ελεύθεροι από τους GLRaV -1,-2,-3,-5,-6 και 7, ελέγχθηκαν με εστιασμένη RT-PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές με εκφυλισμό για την ταυτόχρονη ανίχνευση viti- fovea- και clostero-ιών (Kεφ. 4). Τα αποτελέσματα έδειξαν οκτώ από τους βιότυπους (ποικιλίες Ντεμπίνα, Ρεψοντεμπίνα, Κολοκυθάς και Κοντοκλάδι), να είναι προσβλημένοι από ιούς του γένους Closterovirus. Ένα από τα προϊόντα 500 ζευγών βάσεων κλωνοποιήθηκε και προσδιορίστηκε η αλληλουχία του, η οποία εμφάνισε μεγαλύτερη συγγένεια με τους GLRaV-5 και GLRaV-4 με ομολογία νουκλεοτιδίων 80 και 74%, αντίστοιχα. Με βάση την αλληλουχία αυτή, σχεδιάστηκαν δύο εκκινητές οι οποίοι χρησιμοποιήθηκαν με επιτυχία για την εξειδικευμένη ανίχνευση με PCR του νέου ιού ο οποίος εντοπίστηκε και στους οκτώ βιότυπους. 5.2 Εισαγωγή Ο αγενής πολλαπλασιασμός και η χρήση πολλαπλασιαστικού υλικού άγνωστης φυτουγείας κατά τον εμβολιασμό, είναι οι κυριότερες αιτίες για την παρουσία και ευρεία εξάπλωση μεγάλου αριθμού clostero-ιών (GLRaV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8) που σχετίζονται με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου. Ο χαρακτηρισμός πέντε νέων clostero-ιών την περασμένη δεκαετία, υποδηλώνει τη μεγάλη πιθανότητα παρουσίας και άλλων άγνωστων clostero-ιών της αμπέλου, των οποίων η ανίχνευση δεν ήταν δυνατή με τις διαθέσιμες μεθόδους. Για το λόγο αυτό, έγινε προσπάθεια αξιολόγησης της δυνατότητας ελέγχου δειγμάτων αμπέλου για την παρουσία άγνωστων ιών οι οποίοι δεν έχουν ακόμη χαρακτηριστεί, με τη χρησιμοποιώντας εστιασμένη RT-PCR για την ταυτόχρονη ανίχνευση viti-, fovea- και clostero-ιών (Κεφ. 4). Συγκεκριμένα, βιότυποι αμπέλου οι οποίοι μετά από ορολογικό έλεγχο βρέθηκαν ελεύθεροι από την παρουσία γνωστών clostero-ιών, ελέγχθηκαν με εστιασμένη RT-PCR και τα προϊόντα χρησιμοποιήθηκαν για το μερικό χαρακτηρισμό ενός νέου clostero-ιού. 116

122 ΚΕΦ. 5 Xαρακτηρισμός ενός νέου Clostero-ιού 5.3 Υλικά και μέθοδοι Φυτικό υλικό Χρησιμοποιήθηκαν 11 βιότυποι αμπέλου των ποικιλιών Ντεμπίνα (πέντε βιότυποι), Ρεψοντεμπίνα (ένας βιότυπος), Κοντοκλάδι (ένας βιότυπος), Κολοκυθάς (ένας βιότυπος), Βλάχικο (δύο βιότυποι) και Πρεβεζάνικο (ένας βιότυπος), από την περιοχή Ζίτσα, προερχόμενοι από κλωνική επιλογή Ιολογικός έλεγχος Οι βιότυποι ελέγχθηκαν με τη μέθοδο ELISA για την παρουσία των GLRaV -1,- 2,-3,-5,-6 και -7 (Παρ ) και με εστιασμένη RT-PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές με εκφυλισμό για την παρουσία clostero-ιών (Παρ ) Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας ενός νέου clostero-ιού και φυλογενετική ανάλυση Ένα προϊόν εστιασμένης PCR μήκους 500 ζβ, από δείγμα βιότυπου ποικιλίας Ντεμπίνα, κλωνοποιήθηκε και αλληλουχήθηκε. Ο προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας έγινε με τη μέθοδο διδεοξυ-αναλόγων του Sanger (Παρ ). Η αλληλουχία συγκρίθηκε με τις καταχωρημένες αλληλουχίες στη βάση δεδομένων του NCBI με εφαρμογή του αλγόριθμου BLAST (διεύθυνση διαδικτύου: Η νουκλεοτιδική αλληλουχία του νέου ιού που προσδιορίστηκε, ευθυγραμμίστηκε με δημοσιευμένες ομόλογες αλληλουχίες διαφόρων ιών της οικογένειας Closteroviridae, καθώς και το σπανάκι, που χρησιμοποιήθηκε ως εξωτερική ομάδα (outgroup), με το πρόγραμμα Clustal V (Thompson et al., 1994) και στη συνέχεια δημιουργήθηκε φυλογενετικό δέντρο με τη χρησιμοποίηση του προγράμματος Treeview (Page, 1996) Εξειδικευμένη ανίχνευση του νέου clostero-ιού με εστιασμένη RT-PCR Για την εξειδικευμένη ανίχνευση του νέου clostero-ιού με PCR, είναι απαραίτητο οι εκκινητές που σχεδιάζονται, να υβριδοποιούνται σε περιοχές στόχους οι οποίες είναι μοναδικές για τον ιό. Γι αυτό, κατά την επιλογή των εκκινητών, χρησιμοποιήθηκε η ευθυγράμμιση της αλληλουχίας του νέου ιού, με άλλες ομόλογες ιικές περιοχές (Παρ ), με στόχο την εξεύρεση περιοχών του γονιδίωματος του ιού οι οποίες δεν παρουσιάζουν ομοιότητα με αντίστοιχες περιοχές άλλων clostero-ιών (Εικόνα 5.1). Οι εστιασμένοι εκκινητές που επιλέχθηκαν είναι οι παρακάτω: LR9 εστ π1 : 5 - GGGAGCGTTGTTGGAACCA-3 και LR9 εστ κ2 : 5 - CGGCACAGAACAAACAGACAGA-3 117

123 ΚΕΦ. 5 Xαρακτηρισμός ενός νέου Clostero-ιού LR9 εστ π1: 5 - GGGAGCGTTGTTGGAACCA-3 LR9 εστ κ2: 3 -AGACAGACAAACAAGACACGGC-5 Εικόνα 5.1 Ευθυγράμμιση με το πρόγραμμα CLUSTAL V, αλληλουχιών νουκλεοτιδίων που εκφράζουν τμήμα της HSP70 των GLRaV-1 (LR1), GLRaV-2 (LR2), GLRaV-3 (LR3), GLRaV-4 (LR4), GLRaV-5 (LR5), GLRaV-6 (LR6), GLRaV-7 (LR7), LChV-1, CTV, BPYV, CYSDV, TICV και ToCV και του νέου clostero-ιού (LR9). Οι εκκινητές "LR9 εστ π1" και''lr9 εστ κ2" που επιλέχθηκαν για την ανίχνευση του νέου closteroιού, αναφέρονται κάτω από τις ευθυγραμμίσεις. 118

124 ΚΕΦ. 5 Xαρακτηρισμός ενός νέου Clostero-ιού Για την ανίχνευση του νέου clostero-ιού, εφαρμόστηκε ένα πρωτόκολλο εστιασμένης RT-PCR, παρόμοιο με αυτό που αναφέρεται στην Παρ , με τη διαφορά ότι στην εστιασμένη PCR χρησιμοποιούνται οι εξειδικευμένοι εκκινητές LR9 εστ π1 και LR9 εστ κ2 (Εικόνα 5.2). Κατά την εστιασμένη PCR η συγκέντρωση του κάθε εκκινητή ήταν 0,2 μm, ενώ ο συνθήκες θερμοκυκλοποίησης ήταν: 3 λεπτά στους 94 o C, 39 κύκλοι που περιλάμβαναν τα στάδια, (α) 30 δευτερόλεπτα στους 95 o C, (β) 20 δευτερόλεπτα στους 60 o C, (γ) 10 δευτερόλεπτα στους 72 o C και η αντίδραση ολοκληρώθηκε με μία τελευταία επώαση 2 λεπτών στους 72 ο C. Το αναμενόμενο προϊόν της εστιασμένης PCR ήταν 274 ζβ. Με τη μέθοδο αυτή ελέγχθηκε το σύνολο των βιότυπων αμπέλου από την περιοχή Ζίτσα που ήταν διαθέσιμοι, καθώς και 26 διαφορετικοί βιότυποι αμπέλου προσβλημένοι με διάφορους clostero-ιούς (Παρ ). RT-PCR στον ίδιο μικροσωλήνα ΕΣΤΙΑΣΜΕΝΗ-PCR 1μl GES 1. RT-PCR 1μl προϊόν RT-PCR 2. εστιασμένη PCR 1. RT-PCR 60 min 42 o C 2min50 o C 4 min 94 o C 30 sec 95 o C 10 sec 43 o 3 min 94 C o C 5 κύκλοι 5 sec 38 o C 30 sec 95 o C 15 sec 72 o 40 κύκλοι C 20 sec 60 o C 30 sec 95 o C 10 sec 72 o C 30 sec 43 o C 2min κύκλοι o C 20 sec 72 o C 2min72 o C Εικόνα 5.2 Εξειδικευμένη ανίχνευση του νέου clostero-ιού με εστιασμένη RT-PCR. 2. ΕΣΤΙΑΣΜΕΝΗ-PCR Μηχανικές μολύνσεις Εκχύλισμα από ξύσματα καμβίου του βιοτύπου ποικιλίας Ντεμπίνα ο οποίος ήταν προσβλημένος με τον νέο clostero-ιό, σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα 0,01M που περιείχε 2,5% νικοτίνη, ph 9,5 (αραίωση 1:10), χρησιμοποιήθηκε για τη μηχανική μόλυνση των φυτοδεικτών Chenopodium quinoa, Nicotiana benthamiana, N. clevelandii, N. glutinosa, N. rustica, N. sylvestris, N. tabacum L., N. occidentalis Samsum και Physalis floridana. 119

125 ΚΕΦ. 5 Xαρακτηρισμός ενός νέου Clostero-ιού 5.4 Αποτελέσματα και συζήτηση Το σύνολο των βιότυπων αμπέλου από την περιοχή Ζίτσα, βρέθηκαν ελεύθεροι από τους GLRaV -1,-2,-3,-5,-6 και -7 με τη μέθοδο ELISA. Τα αποτελέσματα της εστιασμένης RT-PCR έδειξαν οκτώ από τους βιότυπους των ποικιλιών Ντεμπίνα, Ρεψοντεμπίνα, Κολοκυθάς και Κοντοκλάδι από την περιοχή της Ζίτσας, να είναι προσβλημένοι από clostero-ιούς. Η αλληλουχία ενός προϊόντος PCR από την ποικιλία Ντεμπίνα, κλωνοποιήθηκε, προσδιορίστηκε και αναφέρεται παρακάτω (Εικ. 5.3): GLRaV-9GR: ACCTTTTCAACACTATGCTTTTCTGCTGGGAGAGGCGTTGAAGGTTGTGTCCC TGAGAGTGACACAATTTACATACCAACCGTGGTCGGTATCAGAAAAGATGGA ACGTACACGATAGGTCTGGGAGCGTTGTTGGAACCAGACGTGATGGTGTAC CGAGACATCAAGAGGTATTTTGGTATGAACAAATTCAATGCTGAGACTTACA GGAACAAGCTGAAACCTAAGTTCGAAGTGATAGTGAAAGATTGGTCAGCTTA CATTGGACCAACTTCTGGAGAGAAAGGGAAGGCTAGAAGTGTCATAGCTTTG GCCTGTATGTTCGTATCGGCTTTGGCAAAAATGGCAGTTTCTATGACTGGGAA TGCCGTCACTCTGTCTGTTTGTTCTGTGCCGGCTGAATACAGCTCTTATATG AGAAATTTCATCTTCCAAGGCTGTACTCTGGCAAAGATTATGGTTCAGGCTGT TGTGAACGAACC Μετάφραση: TFSTLCFSAGRGVEGCVPESDTIYIPTVVGIRKDGTYTIGLGALLEPDVMVYRDIK RYFGMNKFNAETYRNKLKPKFEVIVKDWSAYIGPTSGEKGKARSVIALACMFVS ALAKMAVSMTGNAVTLSVCSVPAEYSSYMRNFIFQGCTLAKIMVQAVVNEP Εικόνα 5.3 Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας τμήματος του γονιδίου της HSP 70 του άγνωστου clostero-ιού. Ανίχνευση μέσω φθορισμού των ολιγονουκλεοτιδίων που δημιουργούνται με τη μέθοδο των διδεοξυ-αναλόγων. Κάθε μια από τις τέσσερις αντιδράσεις τερματισμού περιέχει σημασμένο διδεοξυ-ανάλογο που φθορίζει σε διαφορετικό μήκος κύματος. 120

126 ΚΕΦ. 5 Xαρακτηρισμός ενός νέου Clostero-ιού Σύγκριση της αλληλουχίας αυτής με τις δημοσιευμένες αλληλουχίες έδειξε ότι αποτελεί τμήμα γονιδίου το οποίο κωδικοποιεί πρωτεΐνη ομόλογη με μέλη των πρωτεϊνών της οικογένειας HSP 70 και έχει μεγάλη συγγένεια με τις HSP 70 που απαντώνται στους ιούς μέλη του γένους Closterovirus. Η μεγαλύτερη ομολογία νουκλεοτιδίων παρουσιάστηκε με τους GLRaV-5 (80%) GLRaV-4 (74%) και GLRaV-6 (74%) ενώ η ομολογία των αμινοξέων με τους ίδιους ιούς ήταν 90, 88 και 90%, αντίστοιχα. Η φυλογενετική ανάλυση ομόλογων αλληλουχιών ιών της οικογένειας Closteroviridae, έδειξε ότι ο νέος clostero-ιός ανήκει στο γένος Closterovirus και πιο συγκεκριμένα σε υποομάδα ιών που πιθανώς μεταδίδονται με κοκκοειδή (Karasev, 2000) (Εικόνα 5.4) Εικόνα Σπανάκι L26243 (outgroup) GLRaV-3 AF GLRaV-1 GLAY15891 GLRaV-1 AF GLRaV-1 AF GLRaV-4 AF GLRaV-6 LR6 GR GLRaV-9GR LR9 GLRaV-5 AF CTV Y18420 GLRaV-2 GLA15890 GLRaV-2 GLAV GLRaV-2 AF TICV U67449 ToCV AF CYSDV U67448 BPYV U67447 LChV-1 X93351 GLRaV-7 Y15987 MB AP WF Γένος Closterovirus Γένος Crinivirus Εικόνα 5.4 Φυλογενετικό δένδρο που προσδιορίστηκε με βάση νουκλεοτιδικές αλληλουχίες τμήματος του γονιδίου της HSP 70, διαφόρων ιών της οικογένειας Closteroviridae (GLRaV-3, GLRaV-1, GLRaV-4, GLRaV-5, CTV, GLRaV-2, TICV, ToCV, CYSDV, BPYV, LChV-1 και GLRaV-7) και των ελληνικών απομονώσεων, του GLRaV-6 και του νέου clostero-ιού (GLRaV-9GR). Ως εξωτερική ομάδα (outgroup) χρησιμοποιήθηκε ομόλογο γονιδιακό τμήμα από το σπανάκι. Οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες ευθυγραμμίστηκαν με το πρόγραμμα Clustal V και η φυλογενετική απεικόνιση έγινε με το πρόγραμμα Treeview. H κλίμακα αντιπροσωπεύει τον αριθμό υποκατάστασης των νουκλεοτιδίων ανά θέση. Το μήκος των βραχιόνων είναι ανάλογο με τις γενετικές αποστάσεις που υπολογίστηκαν. Ο κωδικός πρόσβασης της κάθε αλληλουχίας στη βάση δεδομένων (EMBL), αναγράφεται δίπλα από το όνομα του ιού, ενώ τα αρχικά MB, ΑP και WF σημαίνουν δυνητική μετάδοση με κοκοειδή, αφίδες, ή αλευρώδεις αντίστοιχα (ταξινόμηση ιών μελών της οικογένειας Closteroviridae σύμφωνα με Karasev, 2000). 121

127 ΚΕΦ. 5 Xαρακτηρισμός ενός νέου Clostero-ιού Οι εκκινητές LR9 εστ π1 και LR9 εστ κ2 που σχεδιάστηκαν, ανιχνεύουν εξειδικευμένα τον νέο clostero-ιό, αφού οι δοκιμές PCR δεν έδωσαν προϊόντα με απομονώσεις άλλων closero-ιών της αμπέλου (Εικ. 5.5) ζβ Δείκτης ΜΒ 100 ζβ GLRaV-? GR GLRaV-7 GLRaV-2 GLRaV-3 GLRaV-1 GLRaV-6 GLRaV-5 ΥΓ Εικόνα 5.5 Εξειδίκευση ανίχνευσης του νέου clostero-ιού με τη χρησιμοποίηση των εστιασμένων εκκινητών LR9 εστ π1 και LR9 εστ κ2. Ανάλυση προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος δειγμάτων προσβλημένων με διαφορετικούς clostero-ιούς: δύο με GLRaV-5, δύο με GLRaV-6, δύο με GLRaV-1, ένα με GLRaV-3, ένα με GLRaV-2, ένα με GLRaV-7 και τρία με το νέο clostero-ιό. Διαδρομή 13: υγιής μάρτυρας. Ο ιολογικός έλεγχος των 11 βιοτύπων από την περιοχή της Ζίτσας έδειξε την παρουσία του νέου clostero-ιού στις ποικιλίες Ντεμπίνα (πέντε βιότυποι), Ρεψοντεμπίνα (ένας βιότυπος), Κοντοκλάδι (ένας βιότυπος) και Κολοκυθάς (ένας βιότυπος) (Εικ. 5.6), ενώ ο ιός δε βρέθηκε στις ποικιλίες Βλάχικο (δύο βιότυποι) και Πρεβεζάνικο (ένας βιότυπος). Δείκτης ΜΒ 100 ζβ ζβ ζβ Εικόνα 5.6 Ανίχνευση του νέου clostero-ιού σε βιότυπους αμπέλου, με τη χρησιμοποίηση των εστιασμένων εκκινητών LR9 εστ π1 και LR9 εστ κ2 μετά από ανάλυση προϊόντων της εστιασμένης RT-PCR. Διαδρομή 1: Κολοκυθάς, 2: Πρεβεζάνικο, 3: Ρεψοντεμπίνα, 4,5: Βλάχικο 6: Κοντοκλάδι, 7,8: Ντεμπίνα. 122

128 ΚΕΦ. 5 Xαρακτηρισμός ενός νέου Clostero-ιού Σε κανέναν από τους φυτοδείκτες που χρησιμοποιήθηκαν δεν αναπτύχθηκαν συμπτώματα μετά από μηχανική μόλυνση χρησιμοποιώντας εκχύλισμα από πρέμνα προσβλημένα με το νέο clostero-ιό, ούτε βρέθηκε η παρουσία του ιού μετά από έλεγχο τους με PCR. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι με τη μέθοδο που αναπτύχθηκε στο κεφάλαιο 4, είναι δυνατός ο έλεγχος δειγμάτων αμπέλου για την παρουσία ιών οι οποίοι δεν έχουν ακόμη χαρακτηριστεί, ενώ είναι χρήσιμη και για το μερικό χαρακτηρισμό τους, όπως φάνηκε και στην περίπτωση του νέου clostero-ιού. Πιθανώς, η συχνότητα εμφάνισης του ιού αυτού να είναι υψηλή στην περιοχή της Ζίτσας αφού βρέθηκε σε 8 από τα 11 δείγματα που ελέγχθηκαν. Παρόλα αυτά απαραίτητη είναι στο μέλλον η διερεύνηση της σχέσης του με την ασθένεια της συστροφής των φύλλων, και οι επιπτώσεις του στην παραγωγή. Η εξειδικευμένη εστιασμένη RT-PCR που αναπτύχθηκε, χρησιμοποιεί κατά την RT-PCR γενικούς εκκινητές για την ανίχνευση των clostero-ιών και στη συνέχεια, κατά την εστιασμένη PCR εξειδικευμένους εκκινητές για την ανίχνευση του νέου clostero-ιού. Η εξειδίκευση της ανίχνευσης με το σύστημα αυτό, φάνηκε ότι δεν επηρεάζεται από την ύπαρξη των γενικών εκκινητών που χρησιμοποιούνται κατά την RT-PCR. Με βάση τα αποτελέσματα αυτά, ενδιαφέρον θα είχε στο μέλλον η διερεύνηση της δυνατότητας πολλαπλής εξειδικευμένης ανίχνευσης των clostero-ιών της αμπέλου με την ταυτόχρονη παρουσία κατά την εστιασμένη PCR, πολλών ζευγών εκκινητών, εξειδικευμένων για κάθε ιό. Η παραγωγή διαφορετικού μήκους προϊόντων από κάθε ζεύγος, θα έδινε τη δυνατότητα ταυτοποίησης των ιών μετά από ανάλυση των προϊόντων σε πηκτή αγαρόζης. 123

129 Κεφ.6 Ανίχνευση ιών σε πρέμνα κατά τη διάρκεια του έτους ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6 Ανίχνευση ιών που σχετίζονται με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου και τη βοθρίωση του ξύλου της αμπέλου, σε πρέμνα κατά τη διάρκεια του έτους 124

130 Κεφ.6 Ανίχνευση ιών σε πρέμνα κατά τη διάρκεια του έτους Κεφάλαιο 6 Ανίχνευση ιών που σχετίζονται με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου και τη βοθρίωση του ξύλου της αμπέλου, σε πρέμνα κατά τη διάρκεια του έτους 6.1 Περίληψη Με στόχο το μαζικό έλεγχο δειγμάτων αμπέλου κατά τη διάρκεια του έτους βελτιώθηκε η διαδικασία προετοιμασίας του δείγματος με την προσθήκη ενυδατωμένου πολυβινιλοπολυπυρολιδόνιου (PVPP) στο διάλυμα "αποδέσμευσης", για τη δέσμευση των φαινολικών ενώσεων που απαντώνται σε φυτικούς ιστούς αμπέλου. Στη συνέχεια, αξιολογήθηκε η ευαισθησία ανίχνευσης, κατά τη διάρκεια του έτους, διαφόρων closteroιών και παραλλαγών του RSPaV-1, της μεθόδου ELISA καθώς και της πολλαπλής εστιασμένης RT-PCR, χρησιμοποιώντας δείγματα από 28 διαφορετικούς βιότυπους αμπέλου, προσβλημένους με διάφορους clostero-ιούς και παραλλαγές του RSPaV-1. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το σύνολο των απομονώσεων ανιχνεύτηκε και με τις δύο μεθόδους, ELISA (GLRaV-1,-2,-3,-5 και -6) και πολλαπλή εστιασμένη RT-PCR (GLRaV-1,-2,-3,-5,-6, -9GR και RSPaV-1), σε δείγματα ξύλου που λήφθηκαν τον Ιανουάριο. Σε δείγματα μίσχων φύλλου που λήφθηκαν κατά τη διάρκεια της βλαστικής περιόδου η ανίχνευση τους ήταν αξιόπιστη μετά τις 15 Ιουνίου, με πολλαπλή εστιασμένη RT-PCR για το σύνολο των ιών και των απομονώσεων, ενώ με τη μέθοδο ELISA μόνο για τις απομονώσεις του GLRaV Εισαγωγή Η ορολογική ανίχνευση των clostero-ιών που σχετίζονται με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου είναι επισφαλής, καθώς παρουσιάζουν χαμηλό τίτλο στους φυτικούς ιστούς, εμφανίζουν εποχιακή διακύμανση αλλά και άνιση κατανομή στους βραχίονες των πρέμνων (Monis & Bestwick 1996, 1997, Habili et al., 1997, Boscia et al., 1997, De Sousa 1997). Τα αποτελέσματα της ELISA εξαρτώνται σημαντικά από την ποιότητα των αντιδραστηρίων, την εποχή δειγματοληψίας, το φυτικό ιστό (φλοίωμα ξύλου, έλασμα φύλλων, μίσχοι φύλλων) καθώς και τη θέση λήψης των δείγματων από το φυτό. Μίσχοι παλαιών φύλλων της βάσης του πρέμνου αργά το καλοκαίρι έως και το φθινόπωρο και φλοίωμα ξύλου το χειμώνα (ξύσματα καμβίου μετά την απομάκρυνση του φλοιού) αποτελούν τα καλύτερα δείγματα για αξιόπιστο ιολογικό έλεγχο των ευρωπαϊκών ποικιλιών (Boscia et al., 1997, De Sousa 1997). Για τους λόγους αυτούς οι ιολογικοί έλεγχοι γίνονται το χειμώνα με τη χρησιμοποίηση φλοιώματος, μια διαδικασία χρονοβόρα που περιορίζεται σε μικρό χρονικό διάστημα. Προβλήματα υπάρχουν και στην ορολογική ανίχνευση του RSPaV-1 καθώς τα αντισώματα που έχουν παραχθεί προς το παρόν είναι ακατάλληλα για χρήση στη δοκιμή ELISA (Minafra et al., 2001, Meng et al., 2000b), ενώ ήταν κατάλληλα για αποτύπωση Western. Οι δοκιμές ανίχνευσης έδειξαν μεγαλύτερη συγκέντρωση του αντιγόνου σε εκχυλίσματα φλοιώματος ξύλου παρά σε εκχυλίσματα μίσχων, ενώ δεν εμφάνιζε σημαντικές διακυμάνσεις από τον Ιούνιο μέχρι τον Οκτώβριο (Minafra et al., 2001). 125

131 Κεφ.6 Ανίχνευση ιών σε πρέμνα κατά τη διάρκεια του έτους Για τη διερεύνηση της δυνατότητας πραγματοποίησης ιολογικών ελέγχων και κατά τη διάρκεια της βλαστικής περιόδου, αξιολογήθηκε η αποτελεσματικότητα ανίχνευσης clostero-ιών και παραλλαγών του RSPaV-1, ορολογικώς με ELISA (GLRaV- 1,-2,-3,-5 και -6) και πολλαπλή εστιασμένη RT-PCR (clostero-ιοί και fovea-ιοί), σε δείγματα διαφόρων βιοτύπων αμπέλου, που συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια του έτους. 6.3 Υλικά και μέθοδοι Φυτικό υλικό Για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας ανίχνευσης, κατά τη διάρκεια του έτους, διαφόρων clostero-ιών και παραλλαγών του RSPaV-1, με ELISA και πολλαπλή εστιασμένη RT-PCR, χρησιμοποιήθηκαν δείγματα από 28 διαφορετικούς βιότυπους αμπέλου, προσβλημένων με διάφορους clostero-ιούς και παραλλαγές του RSPaV-1 και από έναν υγιή βιότυπο (Κεφ. 4, Κεφ. 2, Πίνακες 2.3 και 2.4). Οι βιότυποι προέρχονταν από την συλλογή της BΙΤΡΟ ΕΛΛΑΣ Α.Ε., καλλιεργούνταν στο Νισέλι Ημαθείας και αναφέρονται παρακάτω: α/α Βιότυπος ποικιλίας Ιοί. 1. Mοσχομαύρο 3 GLRaV-3 + RSPaV-1 2. Βάψα GLRaV-3 + RSPaV-1 3. Ασπρούδι GLRaV-3 + RSPaV-1 4. Βάψα 1 GLRaV-3 + RSPaV-1 5. Βάψα 5 GLRaV-3 + RSPaV-1 6. Ροδίτης 3 GLRaV-3 + RSPaV-1 7. Μαυροδάφνη 2 GLRaV-3 8. Πρεκνιάρικο 2 GLRaV-3 + RSPaV-1 9. Ρομπόλα 2 GLRaV-1 + RSPaV Μαλαγουζιά 2 GLRaV-1 + RSPaV Σιδερίτης 4 GLRaV-1 + RSPaV Σιδερίτης 3 GLRaV-1 + RSPaV Ρομπόλα 1 GLRaV-1 + RSPaV καλονή 2 GLRaV-1 + RSPaV Αγιοργίτικο 2 GLRaV-1 + RSPaV Μπογιαμάς GLRaV-2 + RSPaV Δαμιάτης GLRaV-2 + RSPaV Σέφκα Σουφλίου GLRaV-2 + RSPaV Σαββατιανό 3 GLRaV-2 + GLRaV-7 + RSPaV Ασύρτικο 1 GLRaV Ποταμίσι GLRaV Αγριογλυκάδι GLRaV-5 + RSPaV Μαλαγουζιά 2 GLRaV-6 + RSPaV Μαυροδαφνη 4 GLRaV-6 + RSPaV Γαιδουριά GLRaV Ντεμπίνα 1 GLRaV-9GR 27. Ντεμπίνα 2 GLRaV-9GR + RSPaV Ντεμπίνα 4 GLRaV-9GR + RSPaV Κρητικό Απαλλαγμένο από clostero-ιούς και RSPaV-1 126

132 Κεφ.6 Ανίχνευση ιών σε πρέμνα κατά τη διάρκεια του έτους Σε επτά δειγματοληψίες που έγιναν από τον Ιανουάριο μέχρι τον Οκτώβριο του 2002 (15/1, 15/5, 15/6, 15/7, 15/8, 15/9 και 15/10), λήφθηκαν δείγματα από κάθε πρέμνο, που αποτελούνταν από τρία τμήματα ώριμου ξύλου τον Ιανουάριο ή μίσχοι από τρία παλαιά φύλλα από τη βάση των βλαστών στις υπόλοιπες δειγματοληψίες. Επίσης, ελέγχθηκαν με πολλαπλή εστιασμένη RT-PCR, τμήματα βλαστών βάρους 0,1g από δύο μικρόφυτα ηλικίας δύο μηνών, που αναπτύχθηκαν in vitro σε υπόστρωμα MS (Murashige and Skoog, 1962), με προσθήκη ρυθμιστών αύξησης. Τα μικρόφυτα προήλθαν από βιότυπους των ποικιλιών Αγιοργίτικο και Ξινόμαυρο προσβλημένους με GLRaV-1 και RSPaV-1 και με τον RSPaV-1, αντίστοιχα Ιολογικοί έλεγχοι Το σύνολο των δειγμάτων ελέγχθηκαν με ELISA (Παρ ) για την παρουσία των GLRaV-1,-2,-3,-5 και -6 και με πολλαπλή εστιασμένη RT-PCR (Παρ ) για την παρουσία clostero-, fovea- και viti-ιών Προετοιμασία των δειγμάτων για την πολλαπλή εστιασμένη RT-PCR Η αποτύπωση εκχυλίσματος φυτικού χυμού σε νάιλον μεμβράνη έγινε, με μικρές αλλαγές, σύμφωνα με τη διαδικασία που αναπτύχθηκε προηγουμένως (Παρ ). Σε προκαταρτικές δοκιμές εξετάστηκε η δυνατότητα χρησιμοποίησης για την αποτύπωση του εκχυλίσματος, εκτός από την νάιλον μεμβράνη "Hybond N+" και ενός άλλου τύπου μεμβράνης, της "porablot PVDF". Επίσης δοκιμάστηκε η επίδραση της προσθήκης 10% PVP (β/ο) ή 50% (ο/ο) ενυδατωμένου αδιάλυτου πολυβινιλοπολυπυρολιδόνιου (polyvinylpolypyrrolidone, PVPP, Sigma P-6755) στο διάλυμα "αποδέσμευσης", με στόχο τη βελτίωση της επαναληψιμότητας ανίχνευσης των ιών σε ιστούς αμπέλου με υψηλές συγκεντρώσεις φαινολικών ενώσεων. Η ενυδάτωση του PVPP έγινε με ανάδευση 8g PVPP σε 250 ml διαλύματος GES (0.1 M γλυκίνη-naoh, ph 9.0, 50 mm NaCl, 1 mm EDTA) για τουλάχιστον 2 ώρες και στη συνέχεια, το υπερκείμενο απορρίφθηκε. Στη βελτιωμένη διαδικασία επεξεργασίας των δειγμάτων χρησιμοποιήθηκε κατά την αποτύπωση, νάιλον μεμβράνη Hybond N+, και ένα βελτιωμένο διάλυμα "αποδέσμευσης" που παρασκευάστηκε με προσθήκη στο ενυδατωμένο PVPP, ίσου όγκου διαλύματος (0,1 M γλυκίνη-naoh, ph 9,0, 50 mm NaCl, 1 mm EDTA, 0.5% Triton X-100, 1% β-μερκαπτοαιθανόλη) που περιείχε 1 μμ του κάθε εκκινητή 'HSP κ8', 'HSP κ9' και RW κ1 (Παρ ). Τέλος, προστέθηκε 0,5 gr μπεταΐνη για κάθε ml τελικού διαλύματος, ακολούθησε ανάδευση και αποθήκευση στους -20 ο C μέχρι τη χρήση του. Η διαδικασία απελευθέρωσης του εκμαγείου από τη μεμβράνη, ήταν όμοια με αυτή που περιγράφηκε στην Παρ με τη διαφορά ότι μετά από το στάδιο επώασης των μικροσωλήνων στους 94 ο για 4 λεπτά, ακολούθησε έντονη ανάδευση τους για 2 δευτερόλεπτα και στη συνέχεια, φυγοκέντρηση στις σ/λ για ένα λεπτό. 127

133 Κεφ.6 Ανίχνευση ιών σε πρέμνα κατά τη διάρκεια του έτους 6.4 Αποτελέσματα και συζήτηση Σε προκαταρτικές δοκιμές ελέγχου μεγάλου αριθμού δειγμάτων από αποτύπωση εκχυλίσματος μίσχου φύλλων, παρατηρήθηκε σε μερικές από αυτές αναστολή της RT- PCR. Οι αποτυπώσεις αυτές έδωσαν εκμαγεία κατάλληλα για PCR όταν, για τη δέσμευση των φαινολικών ενώσεων, προστέθηκε ενυδατωμένο PVPP στο διάλυμα "αποδέσμευσης" (Εικ. 6.1). Αντίστοιχη προσθήκη PVP δεν έδωσε θετικά αποτελέσματα (Εικ. 6.2). ΥΓ GLRaV-6 GLRaV-3 GLRaV-3 ΥΓ GLRaV-6 GLRaV-3 GLRaV-3 GLRaV-1 GLRaV GLRaV-1 GLRaV ζβ ΔείκτηςΜΒ ανά 100 ζβ GES + PVPP GES Εικόνα 6.1 Επίδραση του PVPP στο διάλυμα "αποδέσμευσης". Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος πέντε διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με διάφορους clostero-ιούς. Διαδρομές 1-6: Επεξεργασία της αποτύπωσης, παρουσία 50% (ο/ο) ενυδατωμένου PVPP στο διάλυμα "αποδέσμευσης". Διαδρομές 7-12: Χωρίς PVPP. Κατά την αποτύπωση του εκχυλίσματος, η μεμβράνη Hybond N+ έδωσε καλύτερα αποτελέσματα από την porablot PVDF (Εικ. 6.3). Το σύνολο των απομονώσεων ανιχνεύτηκε και με τις δύο μεθόδους, ELISA για τους (GLRaV-1,-2,-3,-5 και -6) και πολλαπλή εστιασμένη RT-PCR για τους (GLRaV-1,-2,- 3,-5,-6, -9GR και RSPaV-1), σε δείγματα ξύλου στις 15 Ιανουαρίου. Σε δείγματα μίσχων φύλλου, με τη μέθοδο ELISA ανιχνεύτηκαν αξιόπιστα μετά τις 15 Ιουνίου, μόνο οι απομονώσεις του GLRaV-3. Αντίστοιχα, με την πολλαπλή εστιασμένη RT-PCR το σύνολο των απομονώσεων των GLRaV-1, GLRaV-2, GLRaV-3, GLRaV-5, GLRaV-6, GLRaV-9GR και RSPaV-1 ανιχνεύτηκε επιτυχώς μετά τις 15 Ιουνίου, ενώ στις 15 Μαΐου δεν ανιχνεύτηκε το σύνολο των απομονώσεων του GLRaV-1, δύο απομονώσεις του GLRaV-2 και μια του GLRaV-5. Οι RSPaV-1 και GLRaV-1 ανιχνεύτηκαν σε μικρόφυτα ποικιλιών Ξινόμαυρο και Αγιοργίτικο, με πολλαπλή εστιασμένη RT-PCR, ενώ δεν ανιχνεύτηκε με τη μέθοδο ELISA, ο GLRaV

134 Κεφ.6 Ανίχνευση ιών σε πρέμνα κατά τη διάρκεια του έτους GLRaV-3 GLRaV-2+-7 GLRaV-1 GLRaV-6 GLRaV GLRaV-5 GLRaV-2+-7 GLRaV-1 GLRaV-6 GLRaV-5 GLRaV-3 GLRaV-3 GLRaV-3 GLRaV-3 GLRaV-2+-7 GLRaV-1 GLRaV-6 GLRaV ζβ GES + PVPP ΔείκτηςΜΒ ανά 100 ζβ GES + PVP GES Εικόνα 6.2 Επίδραση του PVPP και του PVP στο διάλυμα "αποδέσμευσης". Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος έξι διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με διάφορους clostero-ιούς. Διαδρομές 1-6: Επεξεργασία της αποτύπωσης, παρουσία 50% (ο/ο) ενυδατωμένου PVPP στο διάλυμα "αποδέσμευσης". Διαδρομές 7-12: παρουσία 10% (β/ο) PVP. Διαδρομές 13-18: Χωρίς PVP ή PVPP. GLRaV-3 GLRaV-6 GLRaV-5 GLRaV-2+-7 GLRaV-3 GLRaV-6 GLRaV-5 GLRaV-2+-7 GLRaV-2 GLRaV GLRaV-2 GLRaV ζβ ΔείκτηςΜΒ ανά 100 ζβ Nylon PVDF Εικόνα 6.3 Επίδραση του τύπου της μεμβράνης κατά την αποτύπωση του εκχυλίσματος. Ηλεκτροφόρημα προϊόντων εστιασμένης RT-PCR από αποτύπωση εκχυλίσματος έξι διαφορετικών δειγμάτων προσβλημένων με διάφορους closteroιούς. Διαδρομές 1-6: αποτύπωση σε μεμβράνη νάιλον Hybond N+. Διαδρομές 7-12: αποτύπωση σε "porablot PVDF". 129

135 Κεφ.6 Ανίχνευση ιών σε πρέμνα κατά τη διάρκεια του έτους Από τα παραπάνω αποτελέσματα φαίνεται πως η μέθοδος ELISA, με εξαίρεση του GLRaV-3, δεν είναι αξιόπιστη για την ανίχνευση clostero-ιών, κατά τη διάρκεια της βλαστικής περιόδου, σε πρέμνα που αναπτύσσονται στη Βόρειο Ελλάδα. Αντίθετα, η αυξημένη ευαισθησία της πολλαπλής εστιασμένης RT-PCR επιτρέπει την αξιόπιστη ανίχνευση του RSPaV-1 από την αρχή της βλαστικής περιόδου και μετά τα μέσα Ιουνίου, για τους ιούς του γένους Closterovirus. Επίσης, η μέθοδος ανιχνεύει ιούς (RSPaV-1 και GLRaV-1) σε μικρόφυτα που αναπτύσσονται in vitro γεγονός που δίνει τη δυνατότητα ελέγχου έκφυτων τα οποία παράγονται από διαδικασίες εξυγίανσης βιοτύπων αμπέλου με in vitro καλλιέργεια ακραίου μεριστώματος στα πρώτα στάδια ανάπτυξής τους. Αυτό δεν μπορεί να γίνει αξιόπιστα με τη μέθοδο ELISA εξαιτίας της χαμηλής συγκέντρωσης του τίτλου των ιών στους ιστούς των μικρόφυτων στα πρώτα στάδια ανάπτυξης, αλλά και της μεγάλης ποσότητας ιστού που απαιτείται για τον ιολογικό έλεγχο του συνόλου των ιών. 130

136 Κεφ. 7 Γενική συζήτηση και συμπεράσματα ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7 Γενική συζήτηση και συμπεράσματα 131

137 Κεφ. 7 Γενική συζήτηση και συμπεράσματα Κεφάλαιο 7 Γενική συζήτηση και συμπεράσματα Το πολλαπλασιαστικό υλικό των ελληνικών ποικιλιών αμπέλου που διακινείται σήμερα στη χώρα μας είναι της κατηγορίας standard. H παραγωγή πιστοποιημένου πολλαπλασιαστικού υλικού μετά από κλωνική επιλογή είναι προς το παρόν η πιο αποτελεσματική μέθοδος αντιμετώπισης των ιολογικών ασθενειών της αμπέλου και βελτίωσης των αμπελοοϊνικών προϊόντων, ενώ τη βάση για την επιτυχία ενός τέτοιου προγράμματος αποτελεί ο αξιόπιστος ιολογικός έλεγχος. Η μέθοδος ELISA δίνει ικανοποιητικά αποτελέσματα για την ανίχνευση των εκφυλιστικών ασθενειών της αμπέλου οι οποίες οφείλονται σε ιούς του γένους Nepovirus (Boscia et al., 1997), όμως σημαντικά προβλήματα διάγνωσης παρουσιάζονται στη περίπτωση των ασθενειών συστροφή των φύλλων της αμπέλου και βοθρίωση του ξύλου της αμπέλου. Ο μεγάλος αριθμός των ιών που σχετίζονται με τις δύο ασθένειες και ο απαραίτητος συνδυασμός ορολογικών (ELISA), μοριακών (RT-PCR) αλλά και βιολογικών τεχνικών (εμβολιασμός σε φυτοδείκτες), καθιστούν τον ιολογικό έλεγχο επίπονο, χρονοβόρο, και με υψηλό κόστος. Στη μελέτη αυτή, αναπτύχθηκε μια εστιασμένη RT-PCR με εκκινητές με εκφυλισμό που περιείχαν di και χρησιμοποιώντας αποτύπωση εκχυλίσματος φυτικού ιστού πολλαπλασιάστηκε επιτυχώς, τμήμα του γονιδιώματος τριών viti-ιών (GVA, GVB και GVD), παραλλαγών ενός fovea-ιού (29 απομονώσεις του RSPaV-1) και έξι closteroιών (26 απομονώσεις των GLRaV-1, -2, -3, -5, -6 και -7) που προσβάλλουν το αμπέλι. Επίσης τρεις απομονώσεις του RSPaV-1 καθώς και ένας άγνωστος clostero-ιός από αμπέλι, ανιχνεύτηκαν μόνο με τη μέθοδο αυτή. Τέλος, ανιχνεύτηκαν επιτυχώς έξι ακόμη ιοί της οικογένειας Closteroviridae (LChV-1, CTV, BPYV, CYSDV, ΤICV και ToCV) από διάφορους ξυλώδεις ή ποώδεις ξενιστές όπως κερασιά, πορτοκαλιά, αγγουριά και ντομάτα. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η μέθοδος αυτή, είναι ιδιαίτερα αξιόπιστη για την ανίχνευση των ήδη χαρακτηρισθέντων viti- fovea- και clostero-ιών, αλλά και άγνωστων ιών που ανήκουν στα γένη αυτά και προσβάλλουν το αμπέλι, χωρίς να είναι απαραίτητη η εφαρμογή ορολογικών και βιολογικών δοκιμών. Η μέθοδος αυτή είναι χρήσιμη για το μαζικό έλεγχο δειγμάτων γιατί μειώνει σημαντικά το χρόνο και το κόστος διάγνωσης (ταυτόχρονη ανίχνευση πολλών ιών και απλό πρωτόκολλο επεξεργασίας των δειγμάτων), ενώ παράλληλα έχει ικανοποιητική ευαισθησία που επιτρέπει την εφαρμογή της κατά τη διάρκεια του καλοκαιριού, κάτι που δεν είναι δυνατόν να γίνει ορολογικώς για το σύνολο των ιών (Κεφ 5). Σημαντικό επίσης πλεονέκτημα της μεθόδου είναι ότι μετά την αποτύπωση τα δείγματα μπορούν να αποθηκευτούν για μεγάλο χρονικό διάστημα. Επιπλέον, προκαταρτικά αποτελέσματα δείχνουν ότι μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση ιών των γενών αυτών που προσβάλλουν και άλλα φυτά ξενιστές, όπως για παράδειγμα η κερασιά (Rott & Jelkmann, 2001, Kirby et al., 2001, Jelkmann et al., 1997, Theilmann et al., 2002, Rott & Jelkmann, 2001) καθώς και για την "ανακάλυψη" και μερικό χαρακτηρισμό νέων ιών. Τέλος η προσέγγιση αυτή, μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την πολλαπλή ανίχνευση ιών που ανήκουν σε άλλα γένη 132

138 Κεφ. 7 Γενική συζήτηση και συμπεράσματα όπου υπάρχουν περιοχές του γονιδιώματος οι οποίες είναι συντηρημένες μεταξύ των μελών τους, όπως τα Tobamovirus, Potyvirus και Cucumovirus (Letschert et al., 2002, Chen et al., 2001, Gibbs & Mackenzie 1997, Pappu et al., 1993, Choi et al., 1999). Τα προβλήματα που παρουσιάζονται κατά τη βελτιστοποίηση των μεθόδων PCR που χρησιμοποιούν εκκινητές με εκφυλισμό, οφείλονται κυρίως στα πολλά και διαφορετικά εκμαγεία που πρέπει να πολλαπλασιαστούν κάτω από τις ίδιες συνθήκες. Ένας σημαντικά μεγάλος αριθμός παραγόντων μπορούν να μεταβληθούν γεγονός που καθιστά τη βελτιστοποίηση χρονοβόρα και επίπονη. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής, που περιλάμβανε δύο διαφορετικές ομάδες στόχων (Viti-, Fovea-ιοί και Closteroιοί) έδειξαν ότι πρέπει να δοκιμάζονται πολλοί διαφορετικοί εκκινητές με εκφυλισμό για την αποτελεσματικότητά τους. Οι βέλτιστες αρχικές συνθήκες δοκιμών περιλαμβάνουν τη χρησιμοποίηση 1.5 mm MgCl 2 και την εφαρμογή μέγιστου αριθμού κύκλων (40), ενώ ο πιο σημαντικός παράγοντας είναι η θερμοκρασία υβριδοποίησης των εκκινητών. Γενικώς προτείνεται η προσθήκη 5% DMSO στην RT-PCR, για την περίπτωση εκμαγείων που περιέχουν περιοχές δίκλωνου DNA με υψηλό Τm ή αυξημένη δευτεροταγή δομή του μονόκλωνου DNA στόχου στις χαμηλές θερμοκρασίες υβριδοποίησης (43 o C) των εκκινητών κατά την RT-PCR. Επίσης, προτείνεται η προσθήκη μπεταΐνης και των καθοδικών εκκινητών στο διάλυμα απελευθέρωσης του εκμαγείου, για τη μείωση της ανάπτυξης δευτεροταγούς δομής του RΝΑ στις χαμηλές θερμοκρασίες και την επιτυχή υβριδοποίηση εκκινητών - στόχου. Μια βάση είναι γενική (universal), όταν υβριδοποιείται με κάθε μια από τις τέσσερις φυσικές βάσεις χωρίς διάκριση και χωρίς να αποσταθεροποιεί τη διπλή έλικα του DNA. Ο βάσεις αυτές είναι χρήσιμες σε εφαρμογές σχεδιασμού εκκινητών και μοριακών δεικτών. Η ευρέως χρησιμοποιούμενη γενική βάση είναι η υποξανθίνη (hypoxanthine), της οποίας νουκλεοζίτης είναι η 2 -δεοξυινοσίνη (di) η οποία όμως δε συνδέεται με όμοιες αλληλεπιδράσεις με τους τέσσερις φυσικούς νουκλεοζίτες αλλά παρόλα αυτά είναι λιγότερο επιλεκτική από τις υπόλοιπες τέσσερις βάσεις. Η διπλή έλικα του DNA είναι αποτέλεσμα συνέργιας πολλών δεσμών που την ενισχύουν και σταθεροποιείται από τους δεσμούς υδρογόνου των ζευγών βάσεων αλλά και από τις αλληλεπιδράσεις των γειτονικών βάσεων εξαιτίας του στοιβάγματος τους (αλληλεπιδράσεις επιστοίβασης, stacking interactions). Ως αποτέλεσμα των αλληλεπιδράσεων αυτών η συμβολή της di στη σταθερότητα υβριδοποίησης του εκκινητή με το στόχο, εξαρτάται σημαντικά από το νουκλεοζίτη με τον οποίο συνδέεται αλλά και την αλληλουχία του εκκινητή. Η σταθερότητα του ζευγών της Ι με τις τέσσερις βάσεις του DNA είναι μικρότερη από αυτή των ζευγών Α:Τ και ανεξάρτητα από την επίδραση της αλληλουχίας η σειρά σταθερότητας των ζευγών είναι Ι:C > I:A > I:T I:G (Martin & Castro 1985, Bergstrom et al., 1997). Το ζεύγος Ι:C συμβάλλει στη σταθερότητα υβριδοποίησης του εκκινητή (σε μικρότερο όμως βαθμό από το ζεύγος Α:T), το ζεύγος Ι:Α προκαλεί μικρή αποσταθεροποίηση, ενώ μεγαλύτερη προκαλούν τα ζεύγη I:T και I:G, η οποία όμως παραμένει μικρότερη από αυτή που προκαλείται από μη συμβατά ζεύγη π.χ. C:C ή A:C (Martin & Castro 1985). Για τους λόγους αυτούς οι εκκινητές ανάλογα με την αλληλουχία τους και με ποια από τις τέσσερις βάσεις του DNA ζευγαρώνουν οι di που 133

139 Κεφ. 7 Γενική συζήτηση και συμπεράσματα περιέχουν, εμφανίζουν σημαντικές διαφορές της Τm. Δεν είναι λοιπόν δυνατό να υπολογιστεί η ακριβής θερμοκρασία υβριδοποίησης των εκκινητών (Τa) κατά την PCR. Στην παρούσα μελέτη, τα δεδομένα έδειξαν ότι ο κανόνας που υπολογίζει την Τm των εκκινητών προσθέτοντας 2ºC για κάθε μια από τις βάσεις Α ή Τ και τις εκφυλισμένες περιοχές, 4ºC για κάθε μια από τις βάσεις G ή C και 0ºC για κάθε di, προσεγγίζει αρκετά καλά τη βέλτιστη Ta, μετά τους πρώτους κύκλους της PCR (εξαιτίας της τοποθέτησης dc απέναντι από την dι, κατά τη διάρκεια των πρώτων κύκλων). Η θερμοκρασία όμως αυτή δεν είναι ικανοποιητική στους πρώτους κύκλους της PCR, για ορισμένα εκμαγεία, εξαιτίας της πιθανής παρουσίας κατά την υβριδοποίηση πολλών ζευγών I:T ή/και I:G τα οποία προκαλούν αποσταθεροποίηση. Είναι προτιμότερο λοιπόν στους πρώτους 1-5 κύκλους της PCR να εφαρμόζεται Ta μικρότερη κατά 6-10 o C από την υπολογισμένη Τm, ανάλογα με τον αριθμό των di που περιέχουν οι εκκινητές. Ενδιαφέρον παρουσιάζουν και άλλες ενώσεις οι οποίες συμπεριφέρονται ως γενικές βάσεις και χωρίζονται σε δύο ομάδες: Στην πρώτη ομάδα περιλαμβάνονται ετεροκυκλικές βάσεις, όπως η 5-νιτροϊνδόλη "5-nitroindole" και η 3-νιτροπυρρόλη "3-nitropyrrole" (Loakes 2001), οι οποίες όταν αντικαθιστούν τις φυσικές βάσεις, δεν μπορούν να σχηματίσουν δεσμούς υδρογόνου αλλά δημιουργούν ισχυρές αλληλεπιδράσεις επιστοίβασης με τις γειτονικές βάσεις. Καθώς δεν σχηματίσουν δεσμούς υδρογόνου, υβριδοποιούνται με κάθε μια από τις τέσσερις φυσικές βάσεις χωρίς διάκριση και έχουν το πλεονέκτημα οι εκκινητές να μην εμφανίζουν σημαντικές διαφορές της Τm ανάλογα με το στόχο όπως στη περίπτωση της di. Όμως, στην έλλειψη δεσμών υδρογόνου οφείλεται και η αποσταθεροποίηση της διπλής έλικας του DNA που προκαλείται από την παρουσία βάσεων 5-νιτροϊνδόλης ή 3- νιτροπυρρόλης η οποία είναι παρόμοια ή σημαντικά μεγαλύτερη αντίστοιχα, από αυτή που προκαλούν τα ζεύγη I:T και I:G. Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με το ιδιαίτερα αυξημένο κόστος τους, κάνουν απαγορευτική τη χρησιμοποίησή τους για την ανίχνευση ιών. Στη δεύτερη ομάδα περιλαμβάνονται βάσεις οι οποίες έχουν τη δυνατότητα σχηματισμού δεσμών υδρογόνου με τις φυσικές βάσεις, όπως οι ενώσεις "P" και "Κ" οι οποίες συμπεριφέρονται ως ανάλογα πυριμιδίνης και πουρίνης, αντίστοιχα (Lin & Brown 1989, Lin & Brown 1992). Έτσι το ανάλογο P ζευγαρώνει με da και dg και το ανάλογο Κ ζευγαρώνει με dc και dt. Το πλεονέκτημα των βάσεων P και Κ είναι ότι συμβάλλουν σημαντικά στην σταθεροποίηση της διπλής έλικας του DNA με αποτέλεσμα να μπορούν να χρησιμοποιηθούν χωρίς προβλήματα σε εκκινητές, αντικαθιστώντας τις θέσεις εκφυλισμού Υ και R, αντίστοιχα. Ενδιαφέρον έχει η πρόσφατη αναφορά ενός νέου νουκλεοζίτη ο οποίος προέρχεται από τη βάση 8-αζα-7-δεαζααδενίνη ("8-aza-7- deazaadenine" ή "pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4-amine") και συνδέεται με όμοιες αλληλεπιδράσεις με τους τέσσερις φυσικούς νουκλεοζίτες συμβάλλοντας σημαντικά στη σταθεροποίηση της διπλής έλικας του DNA (Seela & Debelak 2000). Όμως δεν υπάρχουν στοιχεία για τη δυνατότητα επέκτασης, από τις πολυμεράσες που χρησιμοποιούνται κατά την PCR, των εκκινητών που περιέχουν το νουκλεοζίτη αυτό. 134

140 Κεφ. 7 Γενική συζήτηση και συμπεράσματα Προς το παρόν, η di παραμένει ο πιο σημαντικός και χαμηλού κόστους νουκλεοζίτης ο οποίος μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε περιοχές εκφυλισμού των εκκινητών, χρειάζεται όμως να λαμβάνεται υπόψη η πιθανή αποσταθεροποίηση της διπλής έλικας του DNA που μπορεί να προκληθεί από την παρουσία της. Συνοψίζοντας συμπεράσματα από τη μελέτη αυτή, προτάσεις για το σχεδιασμό και τη χρησιμοποίηση εκφυλισμένων εκκινητών που περιέχουν di αναφέρονται στον Πίνακα 7.1. Πίνακας 7.1 Προτάσεις για το σχεδιασμό και τη χρησιμοποίηση εκφυλισμένων εκκινητών 1. Να τοποθετείται di 1 μόνο σε θέσεις που έχουν εκφυλισμό Να αποφεύγεται η τοποθέτηση di σε περιοχές του εκκινητή (ανάμεσα σε ακολουθίες A και Τ), οι οποίες δε συνδέονται ισχυρά με το εκμαγείο. Να λαμβάνεται υπόψη η πιθανότητα σημαντικής αποσταθεροποίησης υβριδισμού του εκκινητή με ορισμένους στόχους, εξαιτίας των πολλών ζευγών I:G και Ι:T (στις περιπτώσεις αυτές είναι προτιμότερο να χρησιμοποιείται πλήρης εκφυλισμός σε κάποια θέση Ι ή να χρησιμοποιείται ένας ακόμη εκκινητής που σε κάποια θέση αντί για Ι να έχει C ή Α ανάλογα με το συγκεκριμένο στόχο. 3. Είναι προτιμότερο να υπάρχει πλήρης εκφυλισμός (χωρίς di) στις πρώτες πέντε θέσεις νουκλεοτιδίων από το 3 άκρο του εκκινητή για αποτελεσματικό υβριδισμό στο σημείο αυτό του εκκινητή. 4. Ο εκφυλισμός των εκκινητών πρέπει να είναι ο μικρότερος δυνατός (να γίνεται προσπάθεια ώστε να είναι κάτω από 32). 5. Όταν ο εκφυλισμός του εκκινητή είναι υψηλός, α) να χρησιμοποιείται dp* στη θέση εκφυλισμού Y, β) να λαμβάνονται υπόψη μόνο τα κωδίκια στα οποία έχουν προτίμηση οι οργανισμοί για την κωδικοποίηση των αμινοξέων στο συγκεκριμένο σημείο του γονιδιώματος γ) να χρησιμοποιούνται δύο διαφορετικοί εκκινητές με εκφυλισμό με μικρό συνολικό άθροισμα εκφυλισμού (περίπτωση κωδικοποίησης της σερίνης). 6. Να χρησιμοποιούνται μαζί με τους εκκινητές που περιέχουν di, αντίστοιχοι ομόλογοι εκκινητές οι οποίοι στις ομόλογες περιοχές, περιέχουν dg στη θέση της di. 7. Η Tm των εκκινητών που περιέχουν di να υπολογίζεται προσθέτοντας 2ºC για κάθε μια από τις βάσεις Α ή Τ και τις εκφυλισμένες περιοχές εκτός από τον εκφυλισμό S (G ή C), 4ºC για κάθε μια από τις βάσεις G ή C και τον εκφυλισμό S και 0ºC για κάθε di. 8. Στους πρώτους 1-5 κύκλους της PCR να εφαρμόζεται Ta μικρότερη από την Τm (6-10 o C, ανάλογα με τον αριθμό των di που περιέχουν οι εκκινητές. Η συγκέντρωση του κάθε εκφυλισμένου εκκινητή στην PCR να είναι 0,2μΜ επί τον αριθμό του εκφυλισμού του (για εκφυλισμό μέχρι 4) και 1μΜ για εκφυλισμό μεγαλύτερο από 4. 1 di=2'-δεοξυινοσίνη, 2 P=6Η,8Η-3,4-dihydropyrimido[4,5-c][1,2]oxazin-7-one) 135

141 Κεφ. 7 Γενική συζήτηση και συμπεράσματα Ο νέος clostero-ιός που ανιχνεύτηκε στο αμπέλι καθώς και ο GLRaV-6 (του οποίου τμήμα της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας τμήματος της HSP 70 προσδιορίστηκε για πρώτη φορά στη μελέτη αυτή), σχετίζονται γενετικά με τους GLRaV-4 και GLRaV-5 και φαίνεται να δημιουργούν μια ξεχωριστή υποομάδα μέσα στην ομάδα που περιλαμβάνει ιούς που δυνητικά μεταδίδονται με κοκκοειδή (Εικόνα 6.4). Η παρουσία του νέου clostero-ιού φαίνεται να είναι σημαντική στην περιοχή της Ζίτσας, ενώ ενδιαφέρον θα είχε στο μέλλον, μια εκτεταμένη μελέτη για την παρουσία του ιού σε βιότυπους αμπέλου που καλλιεργούνται στις υπόλοιπες περιοχές της χώρας μας αλλά και της Ευρωπαϊκής Ένωσης, με τη χρησιμοποίηση των εκκινητών που σχεδιάστηκαν στη μελέτη αυτή. 136

142 Βιβλιογραφία Βιβλιογραφία Abou Ghanem N.A., Sabanadzovic S., Castellano M.A., Boscia D., Martelli G.P Properties of a new isolate of grapevine leafroll-associated virus 2. Vitis 39: Abou-Ganem N., Sabanadzovic S., Minafra A., Saldarelli P., Martelli G.P Some molecular properties of grapevine leafroll-associated virus 2 and molecular organization of the 3 region of the viral genome. J. Plant Pathol. 80: Abou-Ghanem N., Saldarelli P., Minafra A., Buzkan N., Castellano M.A., Martelli G.P Properties of grapevine virus D, a novel putative trichovirus. J. Plant Pathol. 79: Avgelis A., Boscia D Grapevine leafroll-associated closterovirus 7 in Greece. Phytopath. Mediterranea 40: Avgelis A., Rumbos I., Katis N., Rumbou A., Nikolaou N., Dimou D Association of closteroviruses GLRaV 1 and GLRaV 3 with leafroll symptoms in Greek vineyards, p In O. A. Sequeira,de, J. C. Sequeira, and M. T. Santos (ed.), Extended abstracts 12th Meeting ICVG, Lisbon, Portugal, 29 September-2 October Dept. Plant Pathology, Estação Agronomica Nacional, Oeiras, Portugal. Bar-Joseph M., Garnsey S.M., Gonsalves D The closteroviruses: a distinct group of elongated plant viruses. Adv. Virus Res. 25: Bar-Joseph M., Murant A.F Closterovirus group. CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses. No. 260 Belli G., Fortusini A., Casati P., Belli L., Bianco P.A., Prati S Transmission of a grapevine leafroll associated closterovirus by the scale insect Pulvinaria vitis L. Riv. Pat. Veg., S.V, 4: Belli G., Fortusini A., Casati P., Cinquanta S., Bianco P.A., Scattini G Evidence that the closteroviruses GLRV-1 and GLRV-3 are causal agents of grapevine leafroll disease. Riv. Pat. Veg., S.V. 5: Belli G., Fortusini A., Prati S Natural spread of grapevine leafroll disease in a vineyard of northern Italy, p In P. Gugerli (ed.), Extended abstracts 11th Meeting ICVG, Montreux, Switzerland, 6-9 September Federal Agricultural Research Station of Changins, CH-1260 Nyon, Switzerland. Berger S.L., Wallace D.M., Puskas R.S., Eschenfeldt W.H Reverse transcriptase and its associated ribonuclease H: interplay of two enzyme activities controls the yield of single-stranded complementary deoxyribonucleic acid. Biochemistry, 22: Bergstrom D.E., Zhang P., Johnson W.T Comparison of the base pairing properties of a series of nitroazole nucleobase analogs in the oligodeoxyribonucleotide sequence 54-d(CGCXAATTYGCG)-34. Nucleic Acids Res. 25:

143 Βιβλιογραφία Bonavia M., Digiaro M., Boscia D., Boari A., Bottalico G., Savino V., Martelli G.P Studies on "corky rugose wood" of grapevine and on the diagnosis of grapevine virus B. Vitis 35: Boscia D., Aslouj E., Elicio V., Savino V., Castellano M.A., Martelli G.P Production, characterization and use of monoclonal antibodies to grapevine virus A. Arch. Virol. 127: Boscia D., Boari A., Castellano M.A., Savino V., Martelli G.P Production of monoclonal antibodies to grapevine trichovirus B, p In Proceedings 9th Congress of the Mediterranean Phytopathological Union, September 1994, Kusadasi-Aydin, Turkey. Boscia D., Digiaro M., Fresno J., Greif C., Grenan S., Kassemeyer H.H., Prota V.A., Sequeira de O.A ELISA for the detection and identification of grapevine viruses, p In B. Walter (ed.), Sanitary selection of the grapevine. Protocols for detection of viruses and virus-like diseases. (Les Colloques no 86). INRA Editions, Paris, France. Boscia D., Digiaro M., Safi M., Garau R., Zhou Z., Minafra A., Abou Ghanem- Sabanadzovic N., Bottalico G., Potere O., Production of monoclonal antibodies to Grapevine virus D and contribution to the study of its aetiological role in grapevine diseases. Vitis 40: Boscia D., Savino V., Minafra A., Namba S., Elicio V., Castellano M.A., Gonsalves D., Martelli G.P Properties of a filamentous virus isolated from grapevines affected by corky bark. Arch. Virol. 130: Boscia, D., Savino V., Elicio V., Jebahi S.D., Martelli G.P Detection of closteroviruses in grapevine tissues, p In I. C. Rumbos, R. Bovey, D. Gonsalves, W. B. Hewitt, and G. P. Martelli (ed.), Proceedings of the 10th Meeting of the International Council for the Study of Viruses and Virus Diseases of the Grapevine (ICVG), Volos, Greece. Boscia, D., V. Savino, A. Minafra, S. Namba, V. Elicio, M.A. Castellano, D. Gonsalves, and G.P. Martelli Properties of a filamentous virus isolated from grapevines affected by corky bark. Arch. Virol. 130: Bovey R., Martelli G.P Directory of Major Virus and Virus-like Diseases of Grapevines. Mediterranean Fruit Crop Improvement Council, Tunis (Tunisia). 111 p. Boyko V.P., Karasev A.V., Agranovsky A.A., Koonin E.V., Dolja V.V Capsid protein gene duplication in a filamentous virus of plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: Cabaleiro C., Segura S Field transmission of grapevine leafroll associated virus 3 (GLRaV-3) by the mealybug Planococcus citri. Plant Disease 81: Chambres d Agriculture, 672, Juin Organisation generale de la selection clonale en France. 138

144 Βιβλιογραφία Chen J., Chen J., Adams M.J A universal PCR primer to detect members of the Potyviridae and its use to examine the taxonomic status of several members of the family. Arch. Virol. 146: Chevalier S., Greif C., Clauzel J.M., Walter B., Fritsch C Use of an immunocapture-polymerase chain reaction procedure for the detection of grapevine virus A in Kober stem grooving-infected grapevines. J. Phytopathol. 143: Choi S.K., Choi J.K., Park W.M., Ryu K.H RT-PCR detection and identification of three species of cucumoviruses with a genus-specific single pair of primers J. Virol. Methods 83 (1-2): Choueiri E., Castellano M. A., Digiaro M., Bottalico G., Martelli G.P New data on grapevine leafroll-associated virus 7, p In O. A. Sequeira, de, J. C. Sequeira, and M. T. Santos (ed.), Extended abstracts 12th Meeting ICVG, 29 September-2 October 1997, Lisbon, Portugal. Choueri E., Boscia D., Digiaro M., Castellano M.A., Martelli G.P Some properties of a hitherto undescribed filamentous virus of the grapevine. Vitis 35: Conti M., Milne R.G., Luisoni E., Boccardo G A closterovirus from a stempitting-diseased grapevine. Phytopathology 70: Credi R., Santucci A Serological detection of grapevine leafroll-associated closterovirus-like particles: Apparent absence of viral antigens in leaves of graftinoculated American rootstocks, p In I. C. Rumbos, R. Bovey, D. Gonsalves, W. B. Hewitt, and G. P. Martelli (ed.), Proceedings of the10th Meeting of the International Council for the Study of Viruses and Virus Diseases of the Grapevine (ICVG). Volos, Greece. De Meyer J., Gaudin M., Bourquin L., Jacab G., Malnoe P., Gugerli P New primers for the molecular identification and detection of Grapevine virus A (GVA) In: Extended abstracts 13th Meeting ICVG, Adelaide, Australia, March, pp De Sousa E Efficiency of diagnosis of grapevine leafroll virus (GLRaV3), p In O. A. Sequeira,de, J. C. Sequeira, and M. T. Santos (ed.), Extended abstracts 12th Meeting ICVG, Lisbon, Portugal, 29 September-2 October Dept.Plant Pathology, Estação Agronomica Nacional, Oeiras, Portugal. DeStefano J.J., Buiser R.G., Mallaber L.M., Myers T.W., Bambara R.A., Fay P.J Polymerization and RNase-H activities of the reverse transcriptases from Avianmyeloblastosis, Human immunodeficiency, and Moloney murine leukemia viruses are functionally uncoupled. J. Biol. Chem. 266: Digiaro M., Popovic Bedzrob M., D' Onghia A.M., Boscia D., Savino V On the correlation between grapevine virus A and rugose wood. Phytopath. medit. 33:

145 Βιβλιογραφία Dimitrejevic B Some observations on natural spread of grapevine leafroll disease in Yugoslavia. 5 th Meet. ICVG, Salice Terme, Riv. Patol. Vegetale (S IV) 9: Dina V.A., Napuli A.J., Creamer R., Dolja V Cell-to-cell movement and assembly of a plant Closterovirus: roles for the capsid proteins and HSP 70 homolog. The EMBO Journal 20: Dolja V.V., Karasev A.V., Koonin E.V Molecular biology and evolution of closteroviruses: sophisticated build-up of large RNA genomes. Annu. Rev. Phytopathol. 32: Dovas C.I., Hatziloukas E., Salomon R., Barg E., Shiboleth Y., Katis N.I Evaluation of methods for Allium spp. virus detection. J. Phytopathology. 149: Ehlers B., Borchers K., Grund C., Frolich K., Ludwig H., Buhk H.J Detection of new DNA polymerase genes of known and potentially novel herpesviruses by PCR with degenerate and deoxyinosine-substituted primers. Virus Genes 18: Engelbrecht D.J., Kasdorf G.G.F Transmission of grapevine leafroll disease and associated closteroviruses by the vine mealybug, Planococcus ficus. Phytophylactica 22: Fang G., Hammar S., Grumet R A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA. Biofeedback 13: Fazeli C.F., Rezaian M.A Nucleotide sequence and organization of ten open reading frames of the grapevine leafroll-associated virus 1 genome and identification of three subgenomic RNAs. J. Gen. Virol. 81: Fortusini A., Scattini G., Prati S., Cinquanta S., Belli G Transmission of grapevine leafroll virus 1 (GLaRV-1) and grapevine virus A (GVA) by scale insects, p In O. A. Sequeira,de, J. C. Sequeira, and M. T. Santos (ed.), Extended abstracts 12th Meeting ICVG, Lisbon, Portugal, 29 September-2 October 1997, Portugal. Fregoni, Μ., Protocollo internationale di selezione clonale della vite, Viticoltura di qualita. p Furukawa K., Bahavanandan V.P Influences of anionic polysaccharides on DNA synthesis in isolated nuclei and by DNA polymerase a: correlation of observed effects with properties of the polysaccharides. Biochim. Biophys. Acta 740: Gallitelli D., Savino V., Martelli G.P The use of a spot hybridization method for the detection of Grapevine virus A in the sap of Grapevine. Phytopath. Mediterranea 24: Garau R., Cugusi M., Dore M., Prota U Investigations on the yield of Monica and Italia vines affected by legno riccio (stem pitting). Phytopath. Mediterranea 24:

146 Βιβλιογραφία Garau R., Padilla V., Rumbos I., Walter B., Savino V Indexing for the identification of virus and virus-like diseases of the grapevine, p In B. Walter (ed.), Sanitary selection of the grapevine. Protocols for detection of viruses and virus-like diseases (Les Colloques no 86). INRA Editions, Paris, France. Garau R., Prota V.A., Boscia D., Fiori M., Prota U Pseudococcus affinis Mask., new vector of grapevine trichoviruses A and B. Vitis 34: Garau R., Prota V.A., Piredda R., Boscia D., Prota U On the possible relationship between Kober stem grooving and grapevine virus A. Vitis 33: Garcia-Arenal F., Fraile A., Malpica J.M Variability and genetic structure of plant virus populations. Annu. Rev. Phytopathol. 39: Gibbs A., Mackenzie A A primer pair for amplifying part of the genome of all potyvirids by RT-PCR. J. Virol. Methods 63: 9 16 Goheen A.C., Rupestris stem pitting. In: R. C. Pearson and A. C. Goheen (eds.), Compendium of Grape Diseases. American Phytopathological Society Press, St. Paul, Minnesota, USA, 53. Goheen A.C., Hopkins D.L Pierce s disease. IN: Compendium of Grape Disease (Pearson R.C. & A.C. Goheen, Eds), APS, St Paul, USA, pp Golino D.A., Sim S.T., Rowhani A Transmission studies of grapevine leafroll associated virus and grapevine corky bark associated virus by the obscure mealybug. Amer. J. Enol. Vitic. 46: 408. Goszczynski D.E., Kasdorf G.G.F., Pietersen G., Van Tonder H Detection of two strains of grapevine leafroll-associated virus 2. Vitis 35: Greif C., Garau R., Boscia D., Prota V.A., Fiori M., Bass P., Walter B., Prota U The relationship of grapevine leafroll-associated closterovirus 2 with a graft incompatibility condition of grapevines. Phytopath. medit. 34: Gribaudo I., Mannini F., Lenzi R Virus elimination in grapevine cultivars of northwestern Italy through meristem culture and in vitro thermotherapy, p In O. A. Sequeira,de, J. C. Sequeira, and M. T. Santos (ed.), Extended abstracts 12th Meeting ICVG, Lisbon, Portugal, 29 September-2 October Dept.Plant Pathology, Estação Agronomica Nacional, Oeiras, Portugal. Gugerli P., Brugger J., Bovey R L enroulement de la vigne: mise en evidence de particules et developpment d une methode immmuno-enzymatique pour la diagnostic rapide. Rev. Suisse Vitic. Arboric. Hortic. 16: Gugerli P., Brugger J.J., Ramel M.E Identification immuno-chimique du 6e virus associé à la maladie de l'enroulement de la vigne et amélioration des techniques de diagnostic pour la sélection sanitaire en viticulture (Immunochemical identification of the sixth virus associated with grapevine leafroll disease and improvement of the diagnostic techniques for the sanitary selection in viticulture). Rev. suisse vitic. arboric. hortic. 29: Gugerli P., Brugger J.J., Ramel M.E Immuno-chemical and biological distinction of grapevine leafroll associated viruses 2 and 6 in complex infections with other 141

147 Βιβλιογραφία known and unidentified viruses, p In O. A. Sequeira,de, J. C. Sequeira, and M. T. Santos (ed.), Extended abstracts 12 th Meeting ICVG, Lisbon, Portugal, 29 September-2 October Dept.Plant Pathology, Estação Agronomica Nacional, Oeiras, Portugal. Gugerli P., Ramel M.E Grapevine leafroll associated virus II analyzed by monoclonal antibodies, p In P. Gugerli (ed.), Extended abstracts 11th Meeting ICVG, Montreux, Switzerland, 6-9 September Federal Agricultural Research Station of Changins, CH-1260 Nyon, Switzerland. Habili N., Fazeli C.F., Ewart A., Hamilton R., Cirami R., Saldarelli P., Minafra A., Rezaian M.A Natural spread and molecular analysis of grapevine leafrollassociated virus 3 in Australia. Phytopathology 85: Habili N., Fazeli C.F., Rezaian M.A Identification of a cdna clone specific to grapevineleafroll-associated virus 1, and occurrence of the virus in Australia. Plant Pathol. 46: Habili N., Krake L.R., Barlass M., Rezaian M.A Evaluation of biological indexing and dsrna analysis in grapevine virus elimination. Ann. Appl. Biol. 121: Habili N., Nutter F.W Temporal and spatial analysis of grapevine leafrollassociated virus 3 in Pinot Noir grapevines in Australia. Plant Disease 81: Habili, N. and M.A. Rezaian Cloning and molecular analysis of double-stranded RNA associated with grapevine leafroll disease. Ann. Appl. Biol. 127: Harrison G.P., Mayo M.S., Hunter E. Lever A.M.L Pausing of reverse transcriptase on retroviral RNA templates is influenced by secondary structures both 5' and 3' of the catalytic site. Nucleic Acids Res., 26: Hataya T., Uchino K., Arimoto R., Sudam N., Sano T., Shikata E., Uyeda I., Molecular characterization of Hop latent virus and phylogenetic relationships among viruses closely related to carlaviruses. Arch. Virol. 145: Henke, W., Herdel, K., Jung, K., Schnorr, D., Loening, S.A., Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences. Nucleic Acids Res. 25, Hofacker,I.L., Fontana,W., Stadler,P.F., Bonhöffer,S., Tacker,M. and Schuster,P. (1994) Fast folding and comparison of RNA secondary structures. Monatshefte f. Chemie, 125: Howarth C.J., Ougham H.J Gene expression under temperature stress. New Phytol. 125: Hu J.S., Gonsalves D., Boscia D., Maixner M., Golino D Comparison of rapid detection assays for grapevine leafroll disease associated closteroviruses. Vitis 30: Hu J.S., Gonsalves D., Boscia D., Namba S Use of monoclonal antibodies to characterize grapevine leafroll associated closteroviruses. Phytopathology 80:

148 Βιβλιογραφία Hu J.S., Gonsalves D., Telitz D Characterization of closterovirus-like particles associated with grapevine leafroll disease. J. Phytopathol. 128: Ioannou N Occurrence and natural spread of grapevine leafroll-associated closteroviruses in Cyprus, p In P. Gugerli (ed.), Extended abstracts 11th Meeting ICVG, Montreux, Switzerland, 6-9 September Federal Agricultural Research Station of Changins, CH-1260 Nyon, Switzerland. Ioannou N., Hadjinicolis A., Hadjinicoli A Epidemiology of the grapevine leafrollmealybug complex in Cyprus, p In O. A. Sequeira,de, J. C. Sequeira, and M. T. Santos (ed.), Extended abstracts 12th Meeting ICVG, October 1997, Lisbon, Portugal. Jelkmann W., Fechtner B., Agranovsky A.A Complete genome structure and phylogenetic analysis of little cherry virus, a mealybug-transmissible closterovirus. Journal of general virology, 78: Jordan D., Petersen C., Morgan L., Segaran A Spread of grapevine leafroll and its associated virus in New Zealand vineyards, p In P. Gugerli (ed.), Extended abstracts 11th Meeting ICVG, 6-9 September 1993 Montreux, Switzerland. Karasev A.V Genetic diversity and evolution of closteroviruses. Annu. Rev. Phytopathol. 38: Karasev A.V., Nikolaeva O.V., Koonin E.V., Gumpf D.J., Garnsey S.M., Screening of the closterovirus genome by degenerate primer-mediated polymerase chain reaction. J. Gen. Virol. 75: Katis N., Hatziloukas S., Tsagris M., Rumbos I.C., Roubelakis-Angelakis K.A Presence of closteroviruses and viroids in grapevine varieties with symptoms of leaf roll and stem pitting diseases, p In I. C. Rumbos, R. Bovey, D. Gonsalves, W. B. Hewitt, and G. P. Martelli (ed.), Proceedings of the 10th Meeting of the International Council for the Study of Viruses and Virus Diseases of the Grapevine (ICVG), Volos, Greece. Kirby M.J., Kirby M.J., Adams A.D Occurrence of Cherry virus A in the UK. Plant Pathol., 50: 801. Kotewicz M.L., Sampson C.M., D'Alessio J.M., Gerard G.F.. Isolation of cloned Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase lacking ribonuclease H activity. Nucleic Acids Res. 16: La Notte P., Buzkan N., Choueiri E., Minafra A., Martelli G.P Acquisition and transmission of grapevine virus A by the mealybug Pseudococcus longispinus. J. Plant Pathol. 79: La Notte P., Minafra A., Saldarelli P A spot PCR technique for the detection of phloem-limited grapevine viruses. J. Virol. Meth. 66: Langeveldt S.A., Dore J.M., Memelink J., Derks A.F.L.M., van der Vlugt C.I.M., Asjes C.J., Bol J.F Identification of potyviruses using the polymerase chain reaction with degenerate primers. J. Gen. Virol. 72:

149 Βιβλιογραφία Letschert B., Adam G., Lesemann D.E., Willingmann P., Heinze C Detection and differentiation of serologically cross-reacting tobamoviruses of economical importance by RT-PCR and RT-PCR-RFLP. J. Virol. Methods 106: Levy L., Lee I.M., Hadidi. A Simple and rapid preparation of infected plant tissue extracts for PCR amplification of virus, viroid, and ML0 nucleic acids. J. Virol. Methods 49: Lin, P.K.T., Brown, D.M., Synthesis and duplex stability of oligonucleotides containing cytocine-thymine analogs. Nucleic Acids Res. 17: Lin, P.K.T., Brown, D.M., Synthesis of oligodeoxyribonucleotides containing degenerate bases and their use as primers in the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res. 20: Ling K., Alvizo-Villasana H.F., Hu J., Gonsalves D Molecular cloning of dsrna isolated from tissue infected with grapevine leafroll virus type III, p In P. Gugerli (ed.), Extended abstracts 11th Meeting ICVG, 6-9 September 1993, Montreux, Switzerland. Ling K., Hu J., Gonsalves D Molecular cloning and detection of grapevine leafroll virus by nucleic acid hybridization and polymerase chain reaction. Phytopathology 83: 245. Ling K.S., Zhu H.Y., Alvizo H., Hu J.S., Drong R.F The coat protein gene of grapevine leafroll associated closterovirus-3: cloning, nucleotide sequencing and expression in transgenic plants. Arch. Virol. 142: Lister R.M., Bar-Joseph M Closteroviruses. In: Handbook of Plant Virus Infections: Comparative Diagnosis, ed. E Kurstak, pp Amsterdam: Elsevier/North Holland Little A., Fazeli C.F., Rezaian M.A Hypervariable genes in Grapevine leafroll associated virus 1. Virus Research 80: Loakes D., The applications of universal DNA base analogues. Nucleic Acids Res. 29: Page, R. D. M TREEVIEW: An application to display phylogenetic trees on personal computers. Computer Applications in the Biosciences 12: MacKenzie D.J, McLean M.A., Mukerji S., Green M Improved RNA extraction from woody plants for the detection of viral pathogens by reverse transcriptionpolymerase chain reaction. Plant Disease 81: Martelli G.P Grapevine virology highlights In: Extended abstracts 13th Meeting ICVG, Adelaide, Australia, March, pp Martelli G.P., Jelkmann W Foveavirus, a new plant virus genus. Arch. Virol. 143: Martelli G.P., Minafra A., Saldarelli P Vitivirus, a new genus of plant viruses. Arch. Virol. 142: Martelli G.P., Walter B Virus Certification of Grapevines, p In Hadidi, A., R. K. Khetarpal, H. Koganezawa (eds.), Plant Virus Disease Control. APS Press, St. Paul, MN, USA. 144

150 Βιβλιογραφία Martin, F.H., Castro, M.M., Base pairing involving deoxyinosine: implications for probe design. Nucleic Acids Res. 13: Matzura, O., Wennborg, A., RNAdraw: an integrated program for RNA secondary structure calculation and analysis under 32-bit Microsoft Windows". Computer Applications in the Biosciences (CABIOS) 12: McDowell, D.G., Burns, N.A., Parkes, H.C., Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR. Nucleic Acids Res. 26: Meng B., Credi R., Petrovic N., Gonsalves D. 2000b. Serological detection of RSPaV in grapes as compared to RT-PCR and indicator indexing. In: Extended abstracts 13th Meeting ICVG, Adelaide, Australia, March, pp Meng B., Goszczynski D.E., Gonsalves D. 2000a. Detection of Rupestris stem associated virus -1 in the indicator Vitis rupestris St George and sequence analysis. In: Extended abstracts 13th Meeting ICVG, Adelaide, Australia, March, pp Meng B., Johnson R., Peressini S., Forsline P.L., Gonsalves D Rupestris stem pitting associated virus-1 is consistently detected in grapevines that are infected with rupestris stem pitting. Eur. J. Plant Pathology 105: Meng B., Pang S.Z., Forsline P., McFerson J.R., Gonsalves D Nucleotide sequence and genome structure of grapevine rupestris stem pitting associated virus-1 reveal similarities to apple stem pitting virus. J. Gen. Virol. 79: Meng B., Zhu H., Gonsalves D Rupestris stem pitting associated virus-1 consists of a family of sequence variants. Arch. Virol. 144: Minafra A Rugose wood of grapevines. In: Extended abstracts 13th Meeting ICVG, Adelaide, Australia, March, pp Minafra A. Hadidi A Sensitive detection of grapevine virus A, B, or leafrollassociated III from viruliferous mealybugs and infected tissue by cdna amplification. J. Virol. Methods 47: Minafra A., Casati P., Elicio V., Rowhani A., Saldarelli P., Savino V., Martelli G.P Serological detection of Grapevine rupestris stem pitting- associated virus (GRSPaV) by a polyclonal antiserum to recombinant virus coat protein. Vitis 39: Minafra A., Hadidi A Sensitive detection of grapevine virus A, B, or leafrollassociated III from viruliferous mealybugs and infected tissue by cdna amplification. J. Virol. Methods 47: Minafra A., Hadidi A. Martelli G.P Detection of grapevine closterovirus A by polymerase chain reaction amplification. Phytopathology 82: Minafra A., Russo M., Martelli G.P Further studies on the use of molecular probes to grapevine closterovirus A. Vitis 31: Monette P.L., James D Detection of a closteroviruslike particle from a corky barkaffected grapevine cultivar. Vitis 30:

151 Βιβλιογραφία Monis J Development of monoclonal antibodies reactive to a new grapevine leafroll-associated closterovirus. Plant Dis. 84: Monis J., Bestwick R.K Detection and localization of grapevine leafroll associated closteroviruses in greenhouse and tissue culture grown plants. Amer. J. Enol. Vitic. 47: Monis J., Bestwick R.K Serological detection of grapevine associated closteroviruses in infected grapevine cultivars. Plant Dis. 81: Monis J., Bestwick R.K., Stamp J.A Seasonal detection of grapevine leafroll associated viruses in greenhouse and tissue culture grown grapevines. Phytopathology 84: Monis J., Bestwick R.K., Stamp J.A Detection of grapevine associated closteroviruses by a sensitive Western blot immunoassay. Amer. J. Enol. Vitic. 46: 404. Murashige, T and F. Skoog A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: Namba S., Boscia D., Azzam O., Maixner M., Hu J.S., Purification and properties of closteroviruslike particles associated with grapevine corky bark disease. Phytopathology 81: Nassuth A., Pollari E., Helmeczy K., Stewart S., Kofalvi S.A Improved RNA extraction and one-tube RT-PCR assay for simultaneous detection of control plant RNA plus several viruses in plant extracts. J. Virol. Methods 90: Nolasco G., Mansinho A., Santos M.T., Soares C., Sequeira Z., Sequeira C., Correia P.K., Sequeira O.A Large scale evaluation of primers for diagnosis of rupestris stem pitting associated virus-1. Eur. J. Plant Pathology 106: Nolasco G., Sequeira Z., Santos M.T., Sequeira J.C., Sequeira O.A IC/RT-PCR coupled to exonuclease fluorescent assay. Early-spring detection of GLRaV-3 in leaf petioles, p In O. A. Sequeira,de, J. C. Sequeira, and M. T. Santos (ed.), Extended abstracts 12th Meeting ICVG, 29 September-2 October 1997, Lisbon, Portugal. Pappu S.S., Brand R., Pappu H.R., Rybicki E.P., Gough K.H., Frenkel M.J., Niblett C.L A polymerase chain reaction method adapted for selective amplification and cloning of 30 sequences of potyviral genomes: application to dasheen mosaic virus. J. Virol. Methods. 41: Pelham H.R.B Speculations on the function of the major heat shock and glucose regulated proteins. Cell 46: Pelham H.R.B Heat shock proteins: coming in from the cold. Nature 332: Petersen C.L., Charles J.G Transmission of grapevine leafroll-associated closteroviruses by Pseudococcus longispinus and P. calceolariae. Plant Pathology 46: Pierpoint W.S o-quinones formed in plant extracts: their reaction with BSA. Biochem. J. 112:

152 Βιβλιογραφία Pierpoint W.S The extraction of enzymes from plant tissues rich in phenolic compounds In: Methods in Molecular Biology, Vol. 59: Protein purification protocols. Ed. S. Doonan. Humana Press Inc. Totowa, NJ. pp Rees, W.A., Yager, T.D., Korte, J., von Hippel, P.H., Betaine can eliminate the base pair composition dependence of DNA melting. Biochemistry 32: Rezaian M.A., Krake L.R., Golino D.A Common identity of grapevine viroids from USA and Australia revealed by PCR analysis. Intervirology 34: Rocha-Pena M.A., Lee R.F., Lastra R., Niblett C.L., Ochoa-Corona F.M Citrus tristeza virus and its aphid vector Toxoptera citricida: threats to citrus production in the Caribbean and Central and North America. Plant Dis.79: Rosciglione B., Castellano M.A Further evidence that mealybugs can transmit grapevine virus A (GVA) to herbaceous hosts. Phytopath, Mediterranea, 24: Rosciglione B., Gugerli P Transmission of grapevine leafroll disease and an associated closterovirus to healthy grapevine by the mealybug Planococcus ficus Signoret, p In E. Tanne (ed.), Proceedings of the 9th Meeting of the International Council for the Study of Viruses and Virus Diseases of the Grapevine (ICVG), September 1987, Kiryat Anavim, Israel. Rossolini G.M., Cresti S., Ingianni A., Cattani P., Riccio M.L., Satta S Use of deoxyinosine-containing primers vs degenerate primers for polymerase chain reaction based on ambiguous sequence information. Mol. Cell. Probes 8: Rott M.E. & Jelkmann W Characterization and detection of several filamentous viruses of cherry: Adaption of an alternative cloning method (DOP-PCR) and modification of an RNA extraction protocol. Eur. J. Plant Pathol. 107: Rott M.E. & Jelkmann W Identification of a Second Closterovirus Associated with Little Cherry Disease, Little cherry virus-2. Acta Horticulturae, 550: Rott M.E., Jelkmann W Characterization and detection of several filamentous viruses of cherry: Adaptation of an alternative cloning method (DOP-PCR), and modification of an RNA extraction protocol. Eur. J. Plant Pathol. 107: Routh G., Zhang Y.P., Saldarelli P., Rowhani A Use of degenerate primers for partial sequencing and RT-PCR-based assays of grapevine leafroll-associated viruses 4 and 5. Phytopathology 88: Rowhani A., Biardi L., Johnson R., Saldarelli P., Zhang Y.P., Chin J., Green M. 2000b. Simplified sample preparation method and one-tube RT-PCR for grapevine viruses. In: Extended abstracts 13th Meeting ICVG, March, Adelaide, Australia, 148. Rowhani A., Chay. C., Golino D.A., Falk B.W Development of a polymerase chain reaction technique for the detection of grapevine fanleaf virus in grapevine tissue. Phytopathology 83: Rowhani A., Jia L., Golino D.A Detection of grapevine viruses using colorimetric PCR, p. 98. In O. A. Sequeira,de, J. C. Sequeira, and M. T. Santos (ed.), 147

153 Βιβλιογραφία Extended abstracts 12th Meeting ICVG, 29 September-2 October 1997, Lisbon, Portugal. Rowhani A., Uyemoto J.K., Golino D.A A comparison between serological and biological assays in detecting grapevine leafroll associated viruses. Plant Disease 81: Rowhani A., Zhang Y.P., Chin J., Minafra A., Golino D.A., Uyemoto J.K. 2000b. Grapevine rupestris stem pitting associated virus: population diversity, titer in the host and possible transmission vector. In: Extended abstracts 13th Meeting ICVG, Adelaide, Australia, March, pp. 37 Rowhani A., Zhang Y.P., Golino D.A. Uyemoto J.K., Isolation and partial characterization of two new viruses from grapevine. In: Extended abstracts 13th Meeting ICVG, March, Adelaide, Australia, 82. Rumbos I., Avgelis A Natural spread, importance and distribution of yellows, stem pitting and enation disease of grapevine in some viticultural areas of Greece. Proc.8th Meeting ICVG,Bari.Phytopathol.Mediter. 24: Saldarelli P., Guglielmi Montano H., Martelli G.P Non-radioactive molecular probes for the detection of three filamentous viruses of the grapevine. Vitis 33: Saldarelli P., Minafra A., Garau R., Martelli G.P A cloned probe to grapevine virus B. Riv. Pat. Veg., S.V. 3: Saldarelli P., Minafra A., Martelli G.P., Walter B Detection of grapevine leafrollassociated closterovirus III by molecular hybridization. Plant Pathology 43: Saldarelli P., Rowhani A., Routh G., Minafra A. Digiaro M Use of degenerate primers in a RT-PCR assay for the identification and analysis of some filamentous viruses, with special reference to clostero- and vitiviruses of the grapevine. Eur. J. Plant Pathol. 104: Savino V., Boscia D., Musci D., Martelli G.P Effect of legno riccio (stem pitting) on Italia vines grafted onto rootstocks of different origin. Phytopathologia Mediterranea 24: Seddas A., Haidar M.M., Greif C., Jacquet C., Cloquemin G. Walter B Establishment of a relationship between grapevine leafroll closteroviruses 1 and 3 by use of monoclonal antibodies. Plant Pathol 49: Seela F., Debelak H The N 8 -(2'-deoxyribofuranoside) of 8-aza-7-deazaadenine: a universal nucleoside forming specific hydrogen bonds with the four canonical constituents. Nucleic Acids Res. 28: Sefc K.M., Leonhardt W., Steinkellner H Partial sequence identification of grapevine-leafroll- associated virus-1 and development of a highly sensitive IC- RT- PCR detection method. J. Virol. Methods 86: Shi B.J., Habili N., Webb D., Symons R.H Extensive variation of sequence within Grapevine virus B isolates. In: Extended abstracts 13th Meeting ICVG, Adelaide, Australia, March, pp

154 Βιβλιογραφία Soares C., Mansinho A., Teixeira Santos M., Sequeira O.A., Nolasco G Studying the genomic variability of Rupestris stem pitting associated virus-1. In: Extended abstracts 13th Meeting ICVG, Adelaide, Australia, March, pp Sommer, R., Tautz, D., Minimal homology requirements for PCR primers. Nucleic Acids Res. 17: Staub U., Polivka H., Gross H.J Two rapid microscale procedures for isolation of total RNA from leaves rich in polyphenols and polysaccharides: application for sensitive detection of grapevine viroids. J. Virol. Methods 52: Steger, G., Thermal denaturation of double-stranded nucleic acids: prediction of temperatures critical for gradient gel electrophoresis and polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res. 22: Teliz D., Valle P., Goheen A.C., Luevano S Grape corky bark and stem pitting in Mexico. I. Occurrence, natural spread, natural spread, distribution, effect on yield and evaluation of symptoms in 128 grape cultivars. Proc.7th Meeting ICVG, Niagara Falls (Canada Agriculture, Research Branch) Theilmann J., Mozafari J., Reade R., Wu Z., Xie W., Jesperson G., Bernardy M., Eastwell K.C., Rochon D Partial Nucleotide Sequence and Genome Organization of a Canadian Isolate of Little cherry virus and Development of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay-Based Diagnostic Test. Phytopathology, vol. 92, no. 1, pp Thompson, J.D., Higgins, D.G., Gibson, T.J., CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22: Tian T., Klaassen V.A., Soong G.W., Wisler J., Duffus J.E., Falk B.W Generation of cdnas specific to lettuce infectious yellows closterovirus and other whiteflytransmitted viruses by RT-PCR and degenerate oligonucleotide primers corresponding to the closterovirus gene encoding the heat shock protein 70 homolog. Phytopathol. 86: Turturo C., Rott M.E., Minafra A., Saldarelli P., Jelkmann W., Martelli G.P., 2000α. Partial molecular characterization and RT-PCR detection of grapevine leafroll associated virus 7. Ext. Astr. 13 th Meet ICVG, Adelaide, Turturo C., Rott M.E., Minafra A., Saldarelli P., Jelkmann W., Martelli G.P., 2000β. Grapevine leafroll associated virus 1: Partial cloning and RT-PCR detection. In: Extended abstracts 13th Meeting ICVG, Adelaide, Australia, March, pp Vierling E The roles of heat shock proteins in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: Walter B., Martelli G. P Clonal selection of the vine: sanitary and pomological selection. Influence of viroses and quality. Part one: Effects of viroses on the culture of the vine and its products. Bull. OIV 69:

155 Βιβλιογραφία Walter B., Martelli G.P Clonal and sanitary selection of the grapevine, p In B. Walter (ed.), Sanitary selection of the grapevine. Protocols for detection of viruses and virus-like diseases (Les Colloques no 86). INRA Editions, Paris, France. Weber A., Maixner M., Reinert W Monitoring of field populations of the vector Hyalesthes obsoletus fot infestation with Vergilbungskrankeit. Ext. Abstr. 12 th Meet. ICVG, Lisbon, Wisler G.C., Duffus J.E., Liu H.Y., Li R.H Ecology and epidemiology of whiteflytransmitted closteroviruses. Plant Dis. 82: Wisniewski M., Balakrishnan M., Palaniappan C., Fay P.J., Bambara R.A The Sequential Mechanism of HIV Reverse Transcriptase RNase H. J. Biol. Chem. 275: Woodham R.C., Antcliff A.J., Krake L.R., Teliz R.H Yield differences between sultana clones related to virus status and genetic factors. Vitis 23: Zee F., Gonsalves D., Goheen A., Kim K.S., Pool R., Lee R.F Cytopathology of leafroll-diseased grapevines and the purification and serology of associated closteroviruslike particles. Phytopathology 77: Zhang Y.P., Uyemoto Golino D., Rowhani A Nucleotide sequence and RT-PCR detection of a virus associated with grapevine rupestris stem pitting disease. Phytophathology 88: Zhu H.Y., Ling K.S., Goszczynski D.E., McFerson J.R., Gonsalves D Nucleotide sequence and genome organization of grapevine leafroll-associated virus-2 are similar to beet yellows virus, the closterovirus type member. J. Gen. Virol. 79: Zimmermann D., Bass P., Legin R., Walter B Characterization and serological detection of four closterovirus-like particles associated with leafroll disease on grapevine. J. Phytopathol. 130: Zimmermann D., Sommermeyer G., Walter B., Van Regenmortel M.H.V Production and characterization of monoclonal antibodies specific to closterovirus-like particles associated with grapevine leafroll disease. J. Phytopathol. 130: Αυγελής Α Ιώσεις της αμπέλου. Γεωργία-Κτηνοτροφία, 10: Αυγελής Α., Ρούμπος Ι Αξιολόγηση των ανοσοενζυμικών δοκιμών DAS-ELISA και Biotin-streptavidin ELISA στην ανίχνευση τεσσάρων ιών της αμπέλου. Γεωτεχνικά Επιστ. Θέματα, 7:

156 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 151

157 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Σύμβολα για Αμινοξέα Ala Arg Asn Asp Cys Cln Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val Αλανίνη Αργινίνη Ασπαραγίνη Ασπαρτικό οξύ Κυστεϊνη Γλουταμίνη Γλουταμικό οξύ Γλυκίνη Υστιδίνη Ισολευκίνη Λευκίνη Λυσίνη Μεθιονίνη Φαινυλαλανίνη Προλίνη Σερίνη Θρεονίνη Τρυπτοφάνη Τυροσίνη Βαλίνη (A) (R) (N) (D) (C) (Q) (E) (G) (H) (I) (L) (Lys) (M) (F) (Pro) (S) (T) (W) (Y) (V) Ο Γενετικός κώδικας Πρώτη θέση Δεύτερη θέση 5 - άκρο U C A G Phe (F) Ser (S) Tyr (Y) Cys (C) U Phe (F) Ser (S) Tyr (Y) Cys (C) Leu (L) Ser (S) Stop Stop Leu (L) Ser (S) Stop Trp (W) C A G Leu (L) Leu (L) Leu (L) Leu (L) Ile (I) Ile (I) Ile (I) Met (M) Val (V) Val (V) Val (V) Val (V) Pro (P) Pro (P) Pro (P) Pro (P) Thr (T) Thr (T) Thr (T) Thr (T) Ala (A) Ala (A) Ala (A) Ala (A) His (H) His (H) Gln (Q) Gln (Q) Asn (N) Ans (N) Lys (K) Lys (K) Asp (D) Asp (D) Glu (E) Glu (E) Arg (R) Arg (R) Arg (R) Arg (R) Ser (S) Ser (S) Arg (R) Arg (R) Gly (G) Gly (G) Gly (G) Gly (G) Τρίτη θέση 3 άκρο U C A G U C A G U C A G U C A G 152

158 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Ο Γενετικός κώδικας A C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Y Ala GC U/A/C/G Cys UG U/C Asp GA T/C Glu GA A/G Phe UU U/C Gly GG U/A/C/G His CA U/C Ile AU U/C/A Lys AA A/G Leu UU A/G ή CU U/A/C/G Met AUG Asn AA U/C Pro CC U/A/C/G Gln CA A/G Arg CG U/A/C/G ή AG A/G Ser UC U/A/C/G ή AG U/C Thr AC U/A/C/G Val GU U/A/C/G Trp UGG Tyr UA U/C Σύμβολα θέσεων εκφυλισμού των εκκινητών N=G/A/T/C V=G/A/C B=G/T/C H=A/T/C D=G/A/T K=G/T S=G/C W=A/T M=A/C Y=C/T R=A/G I=G/T 153

159