ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΓΕΩΠΟΝΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΦΥΤΟΠΡΟΣΤΑΣΙΑΣ ΒΑΡΒΑΡΑΣ Ι. ΜΑΛΙΟΓΚΑ Πτυχιούχου Γεωπόνου Α.Π.Θ. ΜΟΡΙΑΚΟΣ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ, ΕΞΕΛΙΚΤΙΚΕΣ ΣΧΕΣΕΙΣ ΚΑΙ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΙΩΝ ΤΗΣ ΑΜΠΕΛΟΥ ΕΝΟΣ ΔΙΑΚΡΙΤΟΥ ΦΥΛΟΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΚΛΑΔΟΥ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ AMPELOVIRUS ΚΑΙ ΕΞΥΓΙΑΝΣΗ ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2008

2 ΒΑΡΒΑΡΑΣ Ι. ΜΑΛΙΟΓΚΑ ΜΟΡΙΑΚΟΣ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ, ΕΞΕΛΙΚΤΙΚΕΣ ΣΧΕΣΕΙΣ ΚΑΙ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΙΩΝ ΤΗΣ ΑΜΠΕΛΟΥ ΕΝΟΣ ΔΙΑΚΡΙΤΟΥ ΦΥΛΟΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΚΛΑΔΟΥ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ AMPELOVIRUS ΚΑΙ ΕΞΥΓΙΑΝΣΗ ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ Υποβλήθηκε στη Σχολή Γεωπονίας Τομέας Φυτοπροστασίας Ημερομηνία Προφορικής Εξέτασης: 15 Σεπτεμβρίου, 2008 Εξεταστική Επιτροπή Καθηγητής Ν. Ι. Κατής, Επιβλέπων Καθηγήτρια Κ. Τζαβέλα-Κλωνάρη, Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Καθηγήτρια Π. Η. Κυριακοπούλου, Μέλος Τριμελούς Συμβουλευτικής Επιτροπής Καθηγητής Μ. Αρσενάκης, Εξεταστής Αν. Καθ. Π. Μαρκουλάτος, Εξεταστής Αν. Καθ. Ε. Χατζηλουκάς, Εξεταστής Λέκτορας Ε. Χατζηβασιλείου, Εξεταστής

3

4 Βαρβάρα Ι. Μαλιόγκα Α.Π.Θ. ΜΟΡΙΑΚΟΣ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ, ΕΞΕΛΙΚΤΙΚΕΣ ΣΧΕΣΕΙΣ ΚΑΙ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΙΩΝ ΤΗΣ ΑΜΠΕΛΟΥ ΕΝΟΣ ΔΙΑΚΡΙΤΟΥ ΦΥΛΟΓΕΝΕΤΙΚΟΥ ΚΛΑΔΟΥ ΤΟΥ ΓΕΝΟΥΣ AMPELOVIRUS ΚΑΙ ΕΞΥΓΙΑΝΣΗ ΠΟΛΛΑΠΛΑΣΙΑΣΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ «Η έγκριση της παρούσης Διδακτορικής Διατριβής από τη Σχολή Γεωπονίας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης δεν υποδηλώνει αποδοχή των γνωμών του συγγραφέως» (Ν. 5343/1932, άρθρο 202, παρ. 2)

5 Όπου το τηλεσκόπιο σταματάει να μας βοηθάει εκεί αρχίζει το μικροσκόπιο. Ποιο απ τα δύο έχει μεγαλύτερη θέα; (Β. ΟΥΓΚΩ) στους γονείς μου, Γιάννη και Στέλλα στ αδέλφια μου, Γιώργο και Αλέκα στον Παύλο

6 ΠΡΟΛΟΓΟΣ-ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η παρούσα διατριβή εκπονήθηκε κατά τα έτη στο Εργαστήριο Φυτοπαθολογίας της Σχολής Γεωπονίας του Αριστοτελείου Πανεπιστημίου Θεσσαλονίκης (Α.Π.Θ.). Μέρος των πειραμάτων έλαβαν χώρα στο εργαστήριο in vitro παραγωγής της εταιρίας ΒΙΤΡΟ ΕΛΛΑΣ Α.Ε. (Νησέλι, Ημαθία). Ολοκληρώνοντας την προσπάθεια αυτή και πριν προβώ στην ανάπτυξη της διδακτορικής μου διατριβής αισθάνομαι την ανάγκη να ευχαριστήσω όλους όσους συνέβαλαν στην περάτωσή της. Ευχαριστώ ιδιαίτερα τον επιβλέποντα καθηγητή κ. Νικόλαο Κατή για τη συνεχή καθοδήγηση, το ειλικρινές ενδιαφέρον, την άριστη συνεργασία και την αμέριστη υποστήριξη και κατανόηση καθ όλη τη διάρκεια των μεταπτυχιακών μου σπουδών. Επίσης, την καθηγήτρια κ. Κ. Τζαβέλλα-Κλωνάρη και την ομότιμη καθηγήτρια κ. Π. Η. Κυριακοπούλου για τη συμμετοχή τους στην τριμελή συμβουλευτική επιτροπή αυτής της διατριβής καθώς και για την πολύ καλή συνεργασία και τη συνεχή υποστήριξη που μου προσέφεραν. Θερμές ευχαριστίες θα ήθελα να εκφράσω και στα υπόλοιπα μέλη της επταμελούς εξεταστικής επιτροπής, τον καθηγητή κ. Μ. Αρσενάκη, τους αναπληρωτές καθηγητές κ. Π. Μαρκουλάτο και Ε. Χατζηλουκά και την λέκτορα κ. Ε. Χατζηβασιλείου για την κριτική ανάγνωση της παρούσας διατριβής και τις χρήσιμες υποδείξεις τους. Ιδιαίτερες ευχαριστίες αρμόζουν στον λέκτορα της Κτηνιατρικής Σχολής του Α.Π.Θ. κ. Χρυσόστομο Δόβα για τη μύησή μου στις μεθόδους φυλογενετικών αναλύσεων καθώς και για τη βοήθειά του στην ανάπτυξη μοριακών τεχνικών. Τον ευχαριστώ για τις πολλές ώρες συζητήσεων που αφορούσαν στην αξιολόγηση των αποτελεσμάτων της παρούσας διατριβής, για την πολύτιμη καθοδήγηση αλλά και για τη διαρκή υποστήριξη, εμψύχωση και συνεργασία. Ευχαριστίες επίσης εκφράζονται στους: Δρ. P. Gugerli (Agroscope Changins-Wadenswil Research Station ACW, Switzerland) για την παροχή απομονώσεων ιών και αντιορών. Δ. Δήμου (Διεύθυνση Αγροτικής Ανάπτυξης, Τμήμα Φυτοπροστασίας, Ναύπλιο) για την προμήθεια δειγμάτων αμπέλου από την περιοχή της Νεμέας. Την εταιρεία ΒΙΤΡΟ ΕΛΛΑΣ Α.Ε. για την παροχή βιοτύπων αμπέλου και για τη βοήθεια στο κομμάτι του μικροπολλαπλασιασμού. Ευχαριστώ επίσης την υποψήφια διδάκτορα του Βιολογικού Τμήματος Φωτεινή Σκιαδά για την άριστη συνεργασία και τη σημαντική βοήθεια στις τεχνικές της ιστοκαλλιέργειας, την υποψήφια διδάκτορα της Γεωπονικής Σχολής Ιουλία Λαγούρου για τη μύησή μου στις τεχνικές ηλεκτροφόρησης πρωτεϊνών καθώς και τους υποψήφιους διδάκτορες της Κτηνιατρικής Σχολής Ηλία Μπουζαλά και Ευαγγελία Χατζηνάσιου για τη βοήθειά τους στη διαδικασία παραγωγής αντισωμάτων. 1

7 Ένα θερμό ευχαριστώ στους συναδέλφους του Εργαστηρίου Φυτοπαθολογίας Κώστα Ευθυμίου, Λεωνίδα Λώτο, Ασημίνα Κατσιάνη, Χριστίνα Καλογήρου, Ματθαίο Μαθιουδάκη, Παύλο Σαΐνη και Αναστασία Χαρού για τη διαρκή βοήθεια και υποστήριξη αλλά και για το ιδιαίτερα φιλικό κλίμα στο χώρο του εργαστηρίου όπου μοιραστήκαμε ευχάριστες αλλά και δύσκολες στιγμές. Ένα μεγάλο ευχαριστώ αρμόζει στον Παύλο Παυλίδη για την συνεχή εμψύχωση, την αμέριστη συμπαράσταση και την προτροπή να γίνομαι συνεχώς καλύτερη. Κυρίως όμως θα ήθελα να ευχαριστήσω τους γονείς μου και τ' αδέλφια μου γιατί ήταν πάντα δίπλα μου και με ενθάρρυναν σε κάθε σημαντική στιγμή. 2

8 Η παρούσα διατριβή χρηματοδοτήθηκε από το ερευνητικό πρόγραμμα ΠΕΝΕΔ 2003 με τίτλο: Χαρακτηρισμός ιών της αμπέλου που σχετίζονται με την ασθένεια της συστροφής των φύλλων, κυτταρολογική μελέτη και εξυγίανση πολλαπλασιαστικού υλικού με βιοτεχνολογικές μεθόδους. Το έργο συγχρηματοδοτήθηκε κατά: 75% της Δημόσιας Δαπάνης από την Ευρωπαϊκή Ενωση Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο 25% της Δημόσιας Δαπάνης από το Ελληνικό Δημόσιο Υπουργείο Ανάπτυξης Γενική Γραμματεία Ερευνας και Τεχνολογίας και από τον Ιδιωτικό Τομέα στο πλαίσιο του Μέτρου 8.3 του Ε.Π. Ανταγωνιστικότητα Γ Κοινοτικό Πλαίσιο Στήριξης. Μέρος των εξόδων καλύφθηκε από υποτροφία του Ιδρύματος Κρατικών Υποτροφιών (Ι.Κ.Υ.). 3

9 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Σελίδα Πρόλογος-Ευχαριστίες 1 Περιεχόμενα 4 Συντομογραφίες 7 Περίληψη 10 Abstract 12 Ευρετήριο εικόνων και πινάκων 14 Κεφάλαιο 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση Η οικογένεια Closteroviridae Ταξινόμηση Γονιδιακή οργάνωση, μηχανισμοί έκφρασης και λειτουργίες πρωτεϊνών Αναπαραγωγή Καψιδίωση και μετακίνηση Καταστολείς του κυτταρικού μηχανισμού σίγησης RNA Άλλα μεταβλητά γονίδια Γενετική παραλλακτικότητα των clostero-ιών Φυλογενετικές σχέσεις των clostero-ιών Πιθανό εξελικτικό σενάριο της οικογένειας Closteroviridae Η ασθένεια συστροφής των φύλλων της αμπέλου και ιοί της οικογένειας Closteroviridae που σχετίζονται με αυτήν Συμπτωματολογία και επιπτώσεις στην παραγωγή Αιτιολογία Επιδημιολογία Διάγνωση Αντιμετώπιση της ασθένειας Σκοπός της εργασίας 41 Κεφάλαιο 2. Εξελικτικές σχέσεις ιών της αμπέλου που ανήκουν σε ένα διακριτό φυλογενετικό κλάδο του γένους Ampelovirus Περίληψη Εισαγωγή Υλικά και Μέθοδοι Απομονώσεις ιών Ιολογικός έλεγχος Επεξεργασία των δειγμάτων για τις ορολογικές δοκιμές και εκχύλιση νουκλεϊκών οξέων Προσδιορισμός νουκλεοτιδικών αλληλουχιών Ανάλυση αλληλουχιών και κατασκευή φυλογενετικών δέντρων Ανάλυση θετικής επιλογής (Positive selection analysis) Αποτελέσματα Συγκρίσεις αλληλουχιών Φυλογενετική ανάλυση Μοριακή παραλλακτικότητα και γενετικές αποστάσεις μεταξύ απομονώσεων των GLRaV-4, -5, -6, -9, - Pr και De Θετική επιλογή (Positive selection) Συζήτηση 63 Κεφάλαιο 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των δυο νέων ιών (GLRaV-Pr, GLRaV-De) της υποομάδας Ι του γένους Ampelovirus και ορολογική ανίχνευση της καψιδιακής πρωτεΐνης του GLRaV-Pr 70 4

10 3.1. Περίληψη Εισαγωγή Υλικά και Μέθοδοι Απομονώσεις ιών και εκχύλιση dsrna Κλωνοποίηση και προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του GLRaV-Pr Κλωνοποίηση και προσδιορισμός τμήματος της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του GLRaV-De Ανάλυση νουκλεοτιδικών αλληλουχιών και κατασκευή φυλογενετικών δέντρων Παραγωγή ειδικών για τον GLRaV-Pr πολυκλωνικών αντισωμάτων Ορολογικές δοκιμές Αποτελέσματα Προφίλ dsrna Ανάλυση νουκλεοτιδικής αλληλουχίας και γονιδιακή οργάνωση του GLRaV-Pr Ανάλυση τμήματος της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας και γονιδιακή οργάνωση του GLRaV-De Φυλογενετική ανάλυση Παραγωγή ειδικών για τον GLRaV-Pr πολυκλωνικών αντισωμάτων Ορολογικές δοκιμές Συζήτηση 102 Κεφάλαιο 4. Γενική και ειδική ανίχνευση ιών-μελών της υποομάδας Ι του γένους Ampelovirus Περίληψη Εισαγωγή Υλικά και Μέθοδοι Φυτικό υλικό και απομονώσεις clostero-ιών Προετοιμασία φυτικού υλικού Δημιουργία ομάδας αλληλουχιών, πολλαπλή στοίχιση και σχεδιασμός εκκινητών Αντίστροφη μεταγραφή-αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR) Δοκιμές ένθετης PCR Γενική ανίχνευση των ampelo-ιών της υποομάδας Ι Ειδική ανίχνευση των ampelo-ιών της υποομάδας Ι Δοκιμές πολλαπλής PCR Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας Αποτελέσματα Γενική ανίχνευση των ampelo-ιών της υποομάδας Ι Ειδική ανίχνευση των ampelo-ιών της υποομάδας Ι Δοκιμές πολλαπλής PCR Συζήτηση 125 Κεφάλαιο 5. Εξυγίανση δυο ποικιλιών της αμπέλου από τον GLRaV-Pr και τον σχετιζόμενο ιό με τη βοθρίωση του κορμού του Rupestris (GRSPaV) Περίληψη Εισαγωγή Υλικά και Μέθοδοι Εγκατάσταση φυτικού υλικού in vivo και in vitro Εύρεση του καταλληλότερου υποστρώματος πολλαπλασιασμού Ιn vitro θερμοθεραπεία και καλλιέργεια μεριστωμάτων και βλαστικών κορυφών Ανίχνευση των GLRaV-Pr και GRSPaV με δοκιμές ένθετης RT-PCR Σκληραγώγηση έρριζων φυταρίων και εγκλιματισμός σε εδαφικές συνθήκες Αποτελέσματα Εγκατάσταση φυτικού υλικού in vivo και in vitro 138 5

11 Εύρεση του καταλληλότερου υποστρώματος πολλαπλασιασμού Επιβίωση των εκφύτων και εξυγίανση μετά τη θερμοθεραπεία Σκληραγώγηση έρριζων φυταρίων Συζήτηση 143 Κεφάλαιο 6. Γενική Συζήτηση 146 Βιβλιογραφία 152 6

12 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ΙΩΝ BPYV Ιός του ψευδο-ίκτερου των τεύτλων (Beet pseudo-yellows virus, Crinivirus) BYSV Ιός του κίτρινου νανισμού των τεύτλων (Beet yellow stunt virus, Closterovirus) BYV Ιός του ίκτερου των τεύτλων (Beet yellows virus, Closterovirus) BYVV Σχετιζόμενος ιός με την ασθένεια κίτρινων νεύρων του βατόμουρου (Blackberry yellow vein associated virus, Crinivirus) CTV Ιός της τριστέτσας των εσπεριδοειδών (Citrus tristeza virus, Closterovirus) CYSDV Ιός του ίκτερου με νανισμό των κολοκυνθοειδών (Cucurbit yellow stunting disorder virus, Crinivirus) CYV Ιός του ίκτερου της αγγουριάς (Cucumber yellows virus, Crinivirus) FLMaV-1 Σχετιζόμενος με την ποικιλόχρωση των φύλλων της συκιάς ιός 1 (Fig leaf mottle associated virus-1, Closterovirus) FLMaV-2 Σχετιζόμενος με την ποικιλόχρωση των φύλλων της συκιάς ιός 2 (Fig leaf mottle associated virus-2, Ampelovirus) GFKV Ιός της κηλίδωσης της αμπέλου (Grapevine fleck virus, Maculavirus) GFLV Ιός του ριπιδωτού φύλλου της αμπέλου (Grapevine fanleaf virus, Nepovirus) GLRaV-1 Σχετιζόμενος με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου ιός-1 (Grapevine leafroll-associated virus-1, Ampelovirus) GLRaV-2 Σχετιζόμενος με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου ιός-2 (Grapevine leafroll-associated virus-2, Closterovirus) GLRaV-3 Σχετιζόμενος με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου ιός-3 (Grapevine leafroll-associated virus-3, Ampelovirus) GLRaV-4 Σχετιζόμενος με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου ιός-4 (Grapevine leafroll-associated virus-4, Ampelovirus) GLRaV-5 Σχετιζόμενος με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου ιός-5 (Grapevine leafroll-associated virus-5, Ampelovirus) GLRaV-6 Σχετιζόμενος με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου ιός-6 (Grapevine leafroll-associated virus-6, Ampelovirus) GLRaV-7 Σχετιζόμενος με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου ιός-7 (Grapevine leafroll-associated virus-7, Closteroviridae) GLRaV-8 Σχετιζόμενος με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου ιός-8 (Grapevine leafroll-associated virus-8, Ampelovirus) GLRaV-9 Σχετιζόμενος με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου ιός-9 (Grapevine leafroll-associated virus-9, Ampelovirus) GRSPaV Σχετιζόμενος ιός με τη βοθρίωση του κορμού του Rupestris (Grapevine Rupestris stem pitting associated virus, Foveavirus) GVA Ιός A της αμπέλου (Grapevine virus A, Vitivirus) GVB Ιός Β της αμπέλου (Grapevine virus B, Vitivirus) 7

13 LChV-1 LChV-2 LIYV LSV MiV-1 OLYaV PapMV PBNSPaV PMWaV-1 PMWaV-2 PMWaV-3 PYVV RBDV RMoV SBLV SCFaV ShVX SPaV SPCSV SPSVV TICV ToCV ToMV TRV TSMV Ιός 1 της μικροκαρπίας της κερασιάς (Little cherry virus-1, Closteroviridae) Ιός 2 της μικροκαρπίας της κερασιάς (Little cherry virus-2, Ampelovirus) Ιός του μολυσματικού ίκτερου του μαρουλιού (Lettuce infectious yellows virus, Closterovirus) Λανθάνων ιός του κρίνου (Lily symptomless virus, Carlavirus) Ιός 1 της μέντας (Mint virus-1, Closterovirus) Σχετιζόμενος ιός με το κιτρίνισμα των φύλλων της ελιάς (Olive leaf yellowing-associated virus, Closteroviridae) Ιός του μωσαϊκού της Carica papaya (Papaya mosaic virus, Potexvirus) Ιός της βοθρίωσης με νέκρωση του κορμού της δαμασκηνιάς (Plum bark necrosis stem pitting virus, Ampelovirus) Σχετιζόμενος με την ασθένεια μαρασμού από κοκκοειδή του ανανά ιός-1 (Pineapple mealybug wilt associated virus 1, Ampelovirus) Σχετιζόμενος με την ασθένεια μαρασμού από κοκκοειδή του ανανά ιός-2 (Pineapple mealybug wilt associated virus 2, Ampelovirus) Σχετιζόμενος με την ασθένεια μαρασμού από κοκκοειδή του ανανά ιός-3 (Pineapple mealybug wilt associated virus 3, Ampelovirus) Ιός των κίτρινων νεύρων της πατάτας (Potato yellow vein virus, Crinivirus) Ιός του θαμνώδους νανισμού του σμέουρου (Raspberry bushy dwarf virus, Nepovirus) Ιός της ποικιλόχρωσης του σμέουρου (Raspberry mottle virus, Closterovirus) Λανθάνων ιός του είδους Claytonia sp. (Spring beauty latent virus, Tobamovirus) Σχετιζόμενος ιός με τη χλωρωτική κηλίδωση της φράουλας (Strawberry chlorotic fleck associated virus, Closterovirus) Ιός Χ του ασκαλλωνίου (Shallot virus X, Allexivirus) Σχετιζόμενος ιός με την ωχρότητα της φράουλας (Strawberry pallidosis associated virus, Crinivirus) Ιός του χλωρωτικού νανισμού της γλυκοπατάτας (Sweetpotato chlorotic stunt virus, Crinivirus) Ιός των βυθισμένων νεύρων της γλυκοπατάτας (Sweetpotato sunken vein virus, Crinivirus) Ιός της μολυσματικής χλώρωσης της ντομάτας (Tomato infectious chlorosis virus, Crinivirus) Ιός της χλώρωσης της ντομάτας (Tomato chlorosis virus, Crinivirus) Ιός του μωσαϊκού της ντομάτας (Tomato mosaic virus, Tobamovirus) Ιός του κροταλισμού του καπνού (Tobacco rattle virus, Tobravirus) Ιός του έντονου μωσαϊκού της τουλίπας (Tulip severe mosaic virus, Ampelovirus) 8

14 ΆΛΛΕΣ ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ΑΠΑ Ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης AlkB πρωτεΐνες της υπεροικογένειας των 2-oxoglutarate και Fe(II)- εξαρτώμενων οξυγενασών ΒΑP Βενζυλαμινοπουρίνη BIC Bayesian Information Criterion bp Ζεύγη βάσεων (ζβ) BPP Bayesian posterior probability BSA Ορός αλβουμίνης μόσχου CP Καψιδιακή πρωτεΐνη CPm Διπλότυπο της καψιδιακής πρωτεΐνης DAS-ELISA Διπλή άμεση παρεμβολή ELISA DEPC Διαίθυλοπυροανθρακικό οξύ DMSO Διμέθυλοσουλφοξείδιο DNTPs 3 τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια dsrna δίκλωνο RNA DTT Διθειοθρεϊτόλη EDTA Αιθύλενοδιάμινοτετραοξικό οξύ ELISA Ανοσοενζυμική δοκιμή (Enzyme-linked immunosorbent assay) FEL Fixed-effects likelihood method GLRD Ασθένεια συστροφής των φύλλων της αμπέλου HEL Ελικάση HSP70h Ομόλογο της πρωτεΐνης θερμικής καταπόνησης 70 IgG γ-σφαιρίνη IPTG Ισοπροπυλο-θειο-γαλακτοζίδιο Kb Χιλιάδες βάσεων Kda Χιλιάδες Dalton LB Θρεπτικό διάλυμα Luria Bertani L-Pro Οδηγός πρωτεϊνάση ML Μέγιστη Πιθανοφάνεια μl Μικρόλιτρα ΜΒ Μοριακό βάρος ΜΕΤ Μεθυλοτρανσφεράση ΝΑΑ Ναφθαλινοξικό οξύ Ni-NTA Νικέλιο-Νιτριλοτριοξικό οξύ NJ Ένωση Γειτόνων nm Νανόμετρα NPB Μη παραμετρική ανάλυση bootstrap PAGE Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμίδης POL Πολυμεράση PTA-ELISA Plate trapped antigen-elisa PVP Πολυβινυλικό πυρρολιδόνιο 5 -RACE Ταχεία ενίσχυση του 5 άκρου του c-dna RT-PCR Αντίστροφη μεταγραφή-αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης SDS Δωδέκυλοθειϊκό νάτριο sgrna Υπογoνιδιωματικό RNA TAS-ELISA Τριπλή έμμεση παρεμβολή ELISA TRIS 2-άμινο-2-υδροξυμέθυλο-1,3-προπανοδιόλη ΤΕ Tris-HCl EDTA 9

15 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Τα τελευταία χρόνια πολλοί νέοι ιοί σχετιζόμενοι με την ασθένεια συστροφής των φύλλων της αμπέλου (Grapevine leafroll associated viruses, GLRaVs) απομονώθηκαν παγκοσμίως από διάφορες ποικιλίες. Μέχρι πρόσφατα αυτοί οι ιοί ανέρχονταν στους 9, ενώ άλλες δύο απομονώσεις (προσωρινές ονομασίες GLRaV-Pr και GLRaV-De) προσδιορίστηκαν επίσης από Ελληνικές ποικιλίες αμπέλου. Οι περισσότεροι από αυτούς τους ιούς κατατάσσονται στο νέο-ιδρυθέν γένος Ampelovirus της οικογένειας Closteroviridae. Mε βάση φυλογενετικές αναλύσεις αλληλουχιών τμήματος της ομόλογης HSP70 πρωτεΐνης (HSP70h) oι GLRaV-4, -5, - 6, -9, -Pr και -De σχετίζονται περισσότερο μεταξύ τους σε σχέση με τους άλλους GLRaVs. Αυτή η ομάδα ιών, που περιλαμβάνει τους περισσότερους GLRaVs, είναι ελάχιστα μελετημένη, με προβλήματα στον χαρακτηρισμό, την ταξινόμηση και την ανίχνευσή τους. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν οι εξελικτικές σχέσεις αυτών των ιών με τη βοήθεια αναλύσεων γενετικής παραλλακτικότητας, θετικής επιλογής και φυλογενειών μέγιστης πιθανοφάνειας (Maximum Likelihood, ML). Προσδιορίστηκαν νέες γενετικές πληροφορίες και αναλύθηκαν ομάδες αλληλουχιών από την HSP70h (Ντελικό τμήμα) και την CP για διάφορα μέλη της ομάδας. Οι ML τοπολογίες επιβεβαίωσαν τις στενές φυλογενετικές σχέσεις των GLRaV-4, -5, -6, -9, -Pr και GLRaV-De (Υποομάδα Ι) σε σχέση με τους άλλους ampelo-ιούς και αποκάλυψαν την παρουσία πολύ μικρών δια-ειδικών εξελικτικών αποστάσεων. Η φυλογένεια τμήματος της HSP70h, συνοδευόμενη από ανάλυση bootstrap, διευκόλυνε την αναγνώριση ειδών μέσα στην ομάδα, ενώ ταυτόχρονα παρέχει ένα χρήσιμο εργαλείο για τη ταχεία ταξινόμηση των παραπάνω ιών. Οι υπολογισμοί των d N /d S έδειξαν ότι, μέσα στην Closteroviridae, οι ιοί αυτοί υπόκεινται στους πιο ισχυρούς περιορισμούς αντικατάστασης αμινοξέων. Τα αποτελέσματα των παραπάνω υπολογισμών δείχνουν μια ανεξάρτητη εξελικτική πορεία για τους ιούς-μέλη της ομάδας, που πιθανώς σχετίζεται με την ξεχωριστή της οικοθέση, η οποία αφορά επιτυχή προσαρμογή στον ξενιστή, μετάδοση με αγενή πολλαπλασιασμό και απουσία φορέων με μεγάλη αποτελεσματικότητα μετάδοσης. Η ομάδα αλληλουχιών της HSP70h χρησιμοποιήθηκε για το σχεδιασμό νέων εκκινητών, οι οποίοι εφαρμόστηκαν σε δοκιμές ένθετης PCR, για τη γενική ανίχνευση ιών-μελών αυτής της γενεαλογίας και την ειδική διάγνωση κάθε είδους. Το διαγνωστικό σχήμα που αναπτύχθηκε εδώ προτείνεται ως ένα εργαλείο που μπορεί να εφαρμοστεί σε ελέγχους ρουτίνας, συστήματα πιστοποίησης αλλά και για τον εμπλουτισμό των γενετικών πληροφοριών ήδη γνωστών ή και νέων ampelo-ιών, που κατατάσσονται σ αυτή τη γενεαλογία, μέσω της επιλεκτικής ενίσχυσής τους σε μικτές μολύνσεις με άλλους ιούς της οικογένειας Closteroviridae. Τα γονιδιώματα των GLRaV-Pr και GLRaV-De προσδιορίστηκαν περαιτέρω χρησιμοποιώντας ιικό dsrna. Ο GLRaV-Pr είναι ο πρώτος πλήρως χαρακτηρισμένος ιός της αμπέλου της υποομάδας Ι του γένους Ampelovirus, με μήκος γονιδιώματος νουκλεοτίδια, ένα από τα μικρότερα 10

16 στην οικογένεια Closteroviridae. Περιλαμβάνει 7 ΑΠΑ που δυνητικά κωδικοποιούν μια πολυπρωτεΐνη (253 kda), μια RdRp (58,2 kda), μια υδρόφοβη πρωτεΐνη (5,2 kda), μία HSP70h (58,5 kda), μια πρωτεΐνη 60 kda (p60), μια CP (30 kda) και μια πρωτεΐνη μεγέθους 23 kda (p23). Στα πλαίσια χαρακτηρισμού του GLRaV-Pr παράχθηκε ειδικό αντίσωμα εναντίον της ανασυνδυασμένης CP του ιού και αξιολογήθηκε σε διάφορες ορολογικές δοκιμές. Επίσης, προσδιορίστηκε ένα τμήμα μήκους νουκλεοτιδίων της γονιδιωματικής ακολουθίας του GLRaV-De που αντιστοιχεί στις περιοχές που κωδικοποιούν την HSP70h, την p60, την CP και τμήμα της p23. Οι GLRaV-Pr και -De διαφέρουν πάνω από 10% σε επίπεδο αμινοξέων από τους γνωστούς συγγενικούς ιούς. Το συμπέρασμα αυτό, σε συνδυασμό με την ορολογική τους διαφοροποίηση, τη γονιδιακή οργάνωση και τα αποτελέσματα των φυλογενετικών αναλύσεων στηρίζουν το μελλοντικό τους προσδιορισμό ως νέα είδη. Συγκρίσεις του GLRaV-Pr με τις διαθέσιμες πλήρεις αλληλουχίες των γενετικώς συγγενών PMWaV-1, PBNSPaV και τον μερικώς χαρακτηρισμένο GLRaV-9 έδειξαν ότι, μέσα στο γονιδιακά μεταβλητό γένος των ampelo-ιών, η συγκεκριμένη γενεαλογία εμφανίζει μεγάλη ομοιομορφία στη γονιδιακή οργάνωση και περιλαμβάνει τους μικρότερους και απλούστερους ιούς της οικογένειας Closteroviridae. Αυτή η παρατήρηση, σε συνδυασμό με τις τοπολογίες που υπολογίστηκαν στην παρούσα μελέτη με τις μεθόδους Μέγιστης Πιθανοφάνειας (ML) και ανάλυσης κατά Bayes των πιο συντηρημένων εξελικτικά πρωτεϊνών HEL, RdRp και HSP70h, επιβεβαιώνουν ότι τα είδη αυτά ακολουθούν μια ξεχωριστή εξελικτική πορεία και διαφοροποιούνται σημαντικά από άλλους ιούς που εντάσσονται στο γένος Ampelovirus. Η γενεαλογία αυτή θα μπορούσε στο μέλλον να αποτελέσει ένα ξεχωριστό γένος. Τέλος, έγινε προσπάθεια εξυγίανσης δύο οινοποιήσιμων ποικιλιών, της Μαντηλαριάς και του Πρεβεζάνικου, από τους GLRaV-Pr και GRSPaV (οικ. Flexiviridae). Η εξυγίανση έγινε με συνδυασμένη εφαρμογή in vitro θερμοθεραπείας και καλλιέργειας βλαστικών κορυφών. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν την ευκολότερη εξυγίανση των φυτών της αμπέλου από ιούς της οικογένειας Closteroviridae, σε σχέση με εκείνη του GRSPaV. 11

17 ABSTRACT During the last decades new leafroll associated viruses (GLRaVs) have been isolated from grapevine. As a result GLRaVs were raised to 9 while two new isolates (temporary designations GLRaV-Pr and GLRaV-De) were recently determined from Greek grapevine varieties. The majority of these viruses are classified within the recently established genus Ampelovirus of the family Closteroviridae. Based on phylogenies of partial HSP70h sequences, GLRaV-4, -5, -6, -9, -Pr and -De were found to be more closely related to each other compared to the other GLRaVs. This virus group that includes most of the GLRaVs is barely studied, with problems on their characterization, taxonomy and detection. In this study the evolutionary relationships of this virus group were studied based on molecular variability, positive selection analysis and maximum likelihood (ML) phylogenies. Additional sequences from different isolates were determined and datasets corresponding to the N terminal HSP70h and full CP genes were analysed. ML topologies established the closer phylogenetic relationships of GLRaV-4, -5, -6, - 9, -Pr and GLRaV-De in regard to the other ampeloviruses, revealing very low interspecies evolutionary distances. The HSP70h phylogeny and bootstrap analysis enabled the identification of species providing a useful taxonomic tool for their rapid demarcation. d N /d S estimations showed that, within the Closteroviridae, these viruses are subjected to the strongest constraints against amino acid substitutions demonstrating a distinct evolutionary trait for this lineage probably related to its particular niche that involves successful adaptation to the host, transmission through vegetative propagation and lack of highly efficient vectors. The HSP70h data set obtained in this study was used for designing new primers, which were applied in nested PCR assays, for the generic detection of members of this lineage and the specific diagnosis of each virus-species. The developed detection scheme is proposed as a tool that can be used in routine screening and certification schemes and could be useful for the enrichment of sequence information of known and novel ampeloviruses, classified within this lineage, enabling their selective amplification in mixed Closteroviridae virus infections. The genomes of GLRaV-Pr and GLRaV-De were further determined using isolated viral dsrna. GLRaV-Pr is the first fully sequenced grapevine virus of subgroup I ampeloviruses. Its nucleotide sequence is 13,696 nucleotides long, one of the smallest in the Closteroviridae, and contains 7 ORFs which potentially encode a 253 kda polyprotein, a 58,2 kda RdRp, a 5,2 kda protein (p5), a 58,5 kda HSP70h, a 60 kda protein (p60), a 30 kda CP and a protein of 23 kda (p23). A specific polyclonal antibody was raised against the recombinant GLRaV-Pr CP and was evaluated in different serological assays. A 4,319 nucleotides region corresponding to the HSP70h, p60, CP and p23 (partial) genes was also determined for GLRaV-De. GLRaV-Pr and -De differ by more than 10% in amino acids from the known closely related species. This along with their serological differentiation, genome organization and phylogenetic analysis support their future 12

18 assignment as tentative species. Comparisons of GLRaV-Pr with the only available genetically related fully sequenced PMWaV-1, PBNSPaV and the partially sequenced GLRaV-9 revealed that, within the genetically diverse genus of ampeloviruses, this lineage of closely related species exhibits high uniformity on genome organization including the smallest and simplest viruses within the Closteroviridae. This observation coupled by Maximum likelihood and Bayesian analysis topologies of the most evolutionary conserved HEL, RdRp and HSP70h proteins obtained herein, confirm that these species follow a distinct evolutionary course and are substantially differentiated from the other virus species classified within the genus Ampelovirus. Consequently, this lineage could in the future constitute a new separate genus. Finally, studies were carried out to eliminate GLRaV-Pr and GRSPaV (Flexiviridae) in two wine cultivars, Mantilaria and Prevezaniko. Virus elimination was achieved by combining in vitro thermotherapy and shoot tip culture. The results confirmed that virus elimination in grapevine is easier to occur on species of the Closteroviridae family than on GRSPaV. 13

19 ΕΥΡΕΤΗΡΙΟ ΕΙΚΟΝΩΝ ΚΑΙ ΠΙΝΑΚΩΝ ΕΙΚΟΝΕΣ Σελίδα Εικόνα 1.1. Ηλεκτρονιομικρογραφίες ιικών σωματιδίων ιών της οικογένειας 17 Closteroviridae Εικόνα 1.2. Χάρτες γονιδιακής οργάνωσης επιλεγμένων αντιπροσώπων των τριών γενών της οικογένειας Closteroviridae 21 Εικόνα 1.3. Χάρτης γονιδιακής οργάνωσης και λειτουργιών των πρωτεϊνών ενός πρότυπου clostero-ιού, του ιού του ικτέρου των τεύτλων (Beet yellows virus, BYV) 22 Εικόνα 1.4. Ηλεκτρονιομικρογραφία του ιικού σωματιδίου του BYV 23 Εικόνα 1.5. Φυλογενετικές σχέσεις ιών της οικογένειας Closteroviridae με βάση την αλληλουχία του ομολόγου της HSP70 29 Εικόνα 1.6. Υποθετικό εξελικτικό σενάριο της οικογένειας Closteroviridae 30 Εικόνα 1.7. Συμπτώματα της ασθένειας συστροφής των φύλλων της αμπέλου σε 32 ερυθρή ποικιλία Εικόνα 2.1 Φυλογενετικά δέντρα που κατασκευάστηκαν με ανάλυση μέγιστης πιθανοφάνειας χρησιμοποιώντας την ομάδα ομόλογων αλληλουχιών που αντιστοιχούν στο τμήμα της HSP70h 54 Εικόνα 2.2 Φυλογενετικά δέντρα που κατασκευάστηκαν με ανάλυση μέγιστης πιθανοφάνειας χρησιμοποιώντας την ομάδα ομόλογων αλληλουχιών που αντιστοιχούν στην CP 55 Εικόνα 2.3 Πολλαπλή στοίχιση αμινοξέων A) τμήματος της HSP70h και B) αλληλουχιών της CP των συγγενών με τον GLRaV-5 ampelo-ιών 57 Εικόνα 2.4 Προφίλ υδροφιλικότητας της CP ampelo-ιών της υποομάδας Ι (GLRaV-4, -5, -9, -Pr, -De) 61 Εικόνα 3.1. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης (1,3%) εκχυλίσματος dsrna από τον GLRaV-Pr 82 Εικόνα 3.2. Πλήρης γονιδιακή οργάνωση του GLRaV-Pr και η στρατηγική προσδιορισμού της αλληλουχίας του 83 Εικόνα 3.3. Αναγνώριση και σύγκριση των papain-like πρωτεασών μεταξύ των ampelo- (GLRaV-Pr, GLRaV-9, PMWaV-1, PBNSPaV, GLRaV-3, GLRaV-1, PMWaV-2), 84 clostero- (GLRaV-2) και crini-ιών (LIYV) Εικόνα 3.4. Πολλαπλή στοίχιση αμινοξέων των πρωτεϊνών που αντιστοιχούν στο ORF 1α/1β του GLRaV-Pr και επιλεγμένων ampelo- (GLRaV-9, GLRaV-3, GLRaV-1, PMWaV-1, PBNSPaV, PMWaV-2, LChV-2), clostero- (GLRaV-2) και crini-ιών (LIYV) 88 Εικόνα 3.5. Τμήμα της γονιδιακής οργάνωσης του GLRaV-De και η στρατηγική προσδιορισμού της αλληλουχίας αυτής της περιοχής 91 Εικόνα 3.6. Πολλαπλή στοίχιση αμινοξέων της HSP70h των GLRaV-Pr, GLRaV-De και επιλεγμένων ampelo- (GLRaV-9, GLRaV-5, PMWaV-1, PBNSPaV, GLRaV-3, GLRaV-1, PMWaV-2, LChV-2), clostero- (GLRaV-2) και crini-ιών (LIYV) 93 Εικόνα 3.7. Φυλογενετικά δέντρα που υπολογίστηκαν με τις μεθόδους Μέγιστης Πιθανοφάνειας και κατά Bayes ανάλυσης χρησιμοποιώντας ομόλογες αλληλουχίες από τις περιοχές της HEL, RdRp και της HSP70h 96 14

20 Εικόνα 3.8. SDS-πηκτή πολυακρυλαμίδης για την αξιολόγηση της επαγωγής έκφρασης της ανασυνδυασμένης CP 97 Εικόνα 3.9. Καθαρισμός υπό συνθήκες αποδιάταξης της ανασυνδιασμένης CP που παράχθηκε από βακτήρια μετασχηματισμένα με το pqe31 μετά από επαγωγή με IPTG 98 Εικόνα Σύγκριση της έντασης των πρωτεϊνικών ζωνών των τεσσάρων κλασμάτων της καθαρής ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης με εκείνες δεδομένης ποσότητας BSA 99 Εικόνα Ανοσοανίχνευση μέσω στυπώματος Western διαφόρων ποσοτήτων της καθαρής κλωνοποιημένης CP 100 Εικόνα Ανοσοανίχνευση του GLRaV-Pr μέσω στυπώματος Western 101 Εικόνα Γενετικοί χάρτες επιλεγμένων αντιπροσώπων των δυο υποομάδων του γένους Ampelovirus που έχουν πλήρως αλληλουχηθεί 102 Εικόνα Πολλαπλή στοίχιση των AlkB περιοχών διαφόρων ampelo-(glrav-pr, GLRaV-9, GLRaV-3, PBNSPaV, LChV-2) και flexi-ιών [Shallot virus X (ShVX), Papaya mosaic virus (PapMV), Lily symptomless virus (LSV), Grapevine virus A (GVA), Rupestris stem pitting associated virus (RSPaV)] 105 Εικόνα Σύγκριση του γονιδιώματος του GLRaV-Pr με εκείνο του κοινού προγόνου της οικογένειας Closteroviridae όπως προτείνεται από το υποθετικό εξελικτικό σενάριο των Dolja και συν., (2006) 107 Εικόνα 4.1 Πολλαπλή στοίχιση τμήματος του γονιδίου που κωδικοποιεί το ομόλογο της HSP Εικόνα 4.2 Σχηματική απεικόνιση των αναμενόμενων προϊόντων και των αντίστοιχων περιοχών υβριδοποίησης των εκκινητών που σχεδιάστηκαν για τη γενική και ειδική ανίχνευση των ampelo-ιών της υποομάδας Ι στο γονίδιο που κωδικοποιεί την HSP70h 116 Εικόνα 4.3. Σχηματική απεικόνιση της διαγνωστικής μεθόδου 117 Εικόνα 4.4. Γενική ανίχνευση των ampelo-ιών της υποομάδας Ι 121 Εικόνα 4.5. Πολλαπλή ανίχνευση των GLRaV-Pr, -De, -5 και GLRaV-4, -6, αντίστοιχα 124 Εικόνα 5.1. Διαδικασία λήψης επάκριου μεριστώματος 135 Εικόνα 5.2. Ιn vitro διατήρηση του φυτικού υλικού 138 Εικόνα 5.3. Ανάπτυξη φυταρίων των ποικιλιών Μαντηλαριά (Α) και Πρεβεζάνικο 139 (Β) σε διάφορα θρεπτικά υποστρώματα Εικόνα 5.4. Ανάλυση σε πηκτή αγαρόζης των προϊόντων των δοκιμών ένθετης RT-PCR, που προήλθαν από έλεγχο μολυσμένου και εξυγιασμένου φυτικού υλικού των ποικιλιών Μαντηλαριά και Πρεβεζάνικο 141 Εικόνα 5.5. Φυτά των ποικιλιών Μαντηλαριά και Πρεβεζάνικο κατά τη 142 διαδικασία της σκληραγώγησης ΠΙΝΑΚΕΣ Πίνακας 1.1. Χαρακτηριστικά ιών των τριών γενών της οικογένειας Closteroviridae 19 Πίνακας 1.2. Κατάταξη και ιδιότητες των clostero-ιών της αμπέλου (GLRaVs) 33 Πίνακας 1.3 Έντομα-φορείς ορισμένων από τους ιούς που σχετίζονται με την ασθένεια GLRD 35 Πίνακας 2.1 Απομονώσεις ιών της οικογένειας Closteroviridae που αναλύθηκαν στην παρούσα μελέτη 49 15

21 Πίνακας 2.2 Μέσος όρος δια-ειδικών γενετικών αποστάσεων, όπως υπολογίστηκαν με το μοντέλο Tamura-Nei (MEGA3.1 software) για την ομάδα αλληλουχιών της HSP70h, όλων των ιών της αμπέλου της υποομάδας Ι καθώς και απομονώσεων των GLRaV-1 και GLRaV-3 59 Πίνακας 2.3 Μέσος όρος δια-ειδικών γενετικών αποστάσεων όπως υπολογίστηκαν με το μοντέλο Tamura-Nei (MEGA3.1 software) για την ομάδα νουκλεοτιδικών αλληλουχιών της CP των ιών της αμπέλου της υποομάδας Ι καθώς και απομονώσεων των GLRaV-1 και GLRaV-3 60 Πίνακας 2.4 Αναλογίες d N /d S και αριθμοί θέσεων που υπόκεινται σε θετική και αρνητική επιλογή σε διάφορες ομάδες αλληλουχιών, όπως υπολογίστηκαν από το μοντέλο αντικατάστασης FEL 62 Πίνακας 3.1. Εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του γονιδιώματος των GLRaV-Pr και GLRaV-De 75 Πίνακας 3.2. Ποσοστό ομοιότητας σε επίπεδο αμινοξέων διαφόρων πρωτεϊνών που κωδικοποιούνται από τον GLRaV-Pr και επιλεγμένων μελών της Closteroviridae 86 Πίνακας 3.3 Ποσοστό ομοιότητας σε επίπεδο αμινοξέων των πρωτεϊνών HSP70h, p61, και CP του GLRaV-De και επιλεγμένων μελών της Closteroviridae 92 Πίνακας 3.4. Αποτελέσματα TAS- και DAS-ELISA (τιμές οπτικής πυκνότητας στα 405nm) από δείγματα αμπέλου χρησιμοποιώντας τον αντιορό που αναπτύχθηκε εναντίον της ανασυνδυασμένης CP του GLRaV-Pr 101 Πίνακας 4.1. Απομονώσεις των σχετιζόμενων με την ασθένεια GLRD ιών 1, -2, -3, -4, -5, -6, -9, -De και -Pr (GLRaV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -9, -De, -Pr) που χρησιμοποιήθηκαν για τη βελτιστοποίηση των δοκιμών PCR 112 Πίνακας 4.2. Εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση ampelo-ιών της υποομάδας Ι 115 Πίνακας 4.3. Ανίχνευση ampelo-ιών της υποομάδας Ι σε δείγματα αμπέλου που συλλέχθηκαν από την περιοχή της Νεμέας με τη χρησιμοποίηση του προτεινόμενου διαγνωστικού σχήματος 123 Πίνακας 5.1. Σύσταση θρεπτικών υποστρωμάτων εγκατάστασης και πολλαπλασιασμού των ποικιλιών Μαντηλαριά και Πρεβεζάνικο 133 Πίνακας 5.2. Ανάπτυξη φυταρίων των ποικιλιών Μαντηλαριά (Α) και Πρεβεζάνικο (Β) σε διάφορα θρεπτικά υποστρώματα 140 Πίνακας 5.3. Ποσοστά επιβίωσης και εξυγίανσης φυταρίων μετά τη θερμοθεραπεία και την καλλιέργεια μεριστωμάτων και βλαστικών κορυφών

22 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Βιβλιογραφική ανασκόπηση 1.1. Η οικογένεια Closteroviridae Η οικογένεια Closteroviridae περιλαμβάνει είδη φυτικών ιών με το μεγαλύτερο θετικής πολικότητας μονόκλωνο RNA γονιδίωμα που ανέρχεται σε 20 kb (Karasev, 2000). Μεγαλύτερο RNA γονιδίωμα έχει βρεθεί μόνο στην οικογένεια Coronaviridae (30 kb) που περιλαμβάνει ζωικούς ιούς (Dolja και συν., 2006). Οι clostero-ιοί έχουν εύκαμπτα, νηματοειδή ιικά σωματίδια (Εικ. 1.1), τα οποία σύμφωνα με μελέτες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας δεν είναι ομοιόμορφα αλλά εμφανίζουν μια «ουρά», που τους δίνει τη μορφή «κροταλία» (rattlesnake) (Εικ. 1.1.Γ) (Agranovsky και συν., 1995; Febres και συν., 1996; Tian και συν., 1999). Μεταδίδονται με ημι-έμμονο τρόπο με έντομα της τάξης των Ομοπτέρων (αφίδες, αλευρώδεις, κοκκοειδήψευδόκοκκοι) και προκαλούν σοβαρές ασθένειες σε ένα μεγάλο αριθμό οικονομικώς σημαντικών καλλιεργειών παγκοσμίως (τεύτλα, εσπεριδοειδή, ντομάτα, πατάτα, γλυκοπατάτα, μαρούλι, αμπέλι, ανανάς, κερασιά και διάφορα καλλωπιστικά) (Karasev, 2000). Η οικογένεια περιλαμβάνει περισσότερους από 40 ιούς ως οριστικά ή προσωρινά μέλη (Fauquet και συν., 2005). A) B) Γ) Εικόνα 1.1. Ηλεκτρονιομικρογραφίες ιικών σωματιδίων ιών της οικογένειας Closteroviridae. A) Ιικό σωματίδιο του ιού της τριστέτσας των εσπεριδοειδών (CTV). B) Ιικό σωματίδιο του ιού του ικτέρου των τεύτλων (BYV) (από Γ) Σήμανση με κολλοειδή χρυσού ιικού σωματιδίου του BYV, το βέλος επιδεικνύει την ουρά (ράβδος= 300nm) (από Agranovsky και συν., 1995) 17

23 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση Η μόλυνση των φυτών από τους clostero-ιούς προκαλεί την δημιουργία μεμβρανωδών εγκλείστων στο κυτταρόπλασμα, το οποίο αποτελεί παθογνωμονικό χαρακτηριστικό της μόλυνσης από τους συγκεκριμένους ιούς (Lesemann, 1988). Τα ιικά σωματίδια εντοπίζονται συνήθως σε ιστούς τους φλοιώματος, παρεγχυματικά κύτταρα και σπανιότερα, σε ορισμένους συνδυασμούς ιού/ξενιστή, σε κύτταρα του μεσόφυλλου αργά κατά τη διαδικασία της μόλυνσης. Εξαιτίας αυτού του τροπισμού οι clostero-ιοί χαρακτηρίζονται ως σχετιζόμενοι με το φλοίωμα (phloem-associated) και φαίνεται πως έχουν προσαρμοστεί εξελικτικά σε έντομα-φορείς με παρόμοιες τροφικές προτιμήσεις (Ομόπτερα). Επιπλέον, καθώς επηρεάζουν κυρίως το φλοίωμα των ασθενών φυτών προκαλούν συμπτώματα που μοιάζουν με τροφοπενίες και πρόωρη γήρανση όπως για παράδειγμα μεσονεύρια χλώρωση, ίκτερο, ανθοκυάνωση, λεύκανση ή διαφάνεια των νεύρων, νανισμό και μάρανση. Στα πολυετή ξυλώδη φυτά έχουν περιγραφεί δύο ακόμη σύνδρομα, όπως η επαγόμενη ασυμφωνία εμβολίουυποκειμένου και οι ποικίλες ανωμαλίες στην ανάπτυξη του φλοιώματος και του ξυλώματος που έχουν ως αποτέλεσμα την εμφάνιση συστροφής των φύλλων, βοθρίωση του ξύλου, νανισμό, μειωμένο σφρίγος, μειωμένη ποσότητα και υποβαθμισμένη ποιότητα των καρπών (Karasev, 2000). Λόγω της δυσκολίας αναγνώρισης της ιολογικής φύσης των ασθενειών που προκαλούνται από τους clostero-ιούς με βάση τα συμπτώματα, οι ασθένειες αυτές συχνά δεν αναγνωρίζονται ως ιολογικές ή αποδίδονται σε άλλα αίτια. Εξαιτίας του εντοπισμού τους στο φλοίωμα των ασθενών φυτών, οι clostero-ιοί έχουν χαμηλό τίτλο, ενώ ο καθαρισμός τους είναι δύσκολος και με μικρή απόδοση. Αυτά, σε συνδυασμό με το μεγάλο γονιδίωμα και την αδυναμία μηχανικής μετάδοσης των περισσοτέρων, καθιστούν αρκετά επίπονη τη μελέτη και το χαρακτηρισμό τους Ταξινόμηση Κατά την ίδρυσή της το 1998 η οικογένεια Closteroviridae περιλάμβανε δύο γένη ιών τα Closterovirus και Crinivirus, των οποίων η κύρια διαφορά ήταν το μονομερές και διμερές γονιδίωμα, αντίστοιχα (Martelli και συν., 2000). Ωστόσο η πρόσφατη απόκτηση νέων μοριακών και βιολογικών δεδομένων οδήγησε σε ανακατάταξη της ταξινομικής δομής της οικογένειας και τη σύσταση ενός νέου γένους, του Ampelovirus (από την Ελληνική λέξη άμπελος), το οποίο επίσης περιλαμβάνει ιούς με μονομερές γονιδίωμα (Martelli και συν., 2002). 18

24 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση Η κυριότερη διαφορά μεταξύ των τριών γενών αφορά στον τύπο του εντόμου φορέα με τον οποίο μεταδίδονται. Συγκεκριμένα, αν και υπάρχουν πολλά είδη ιών των οποίων οι φορείς δεν είναι γνωστοί, οι ιοί του γένους Closterovirus μεταδίδονται δυνητικά με αφίδες, οι ampelo-ιοί με κοκκοειδή ή ψευδοκόκκους και οι ιοί του γένους Crinivirus με αλευρώδεις (Πίνακας 1.1) (Karasev, 2000; Martelli και συν., 2000). Ωστόσο, διαφορές εντοπίζονται και στην γονιδιακή οργάνωση των ιών-μελών των τριών γενών (Εικ. 1.2) με πιο σημαντική την αντιστροφή της θέσης γονιδίων που κωδικοποιούν δομικές πρωτεΐνες των ιών. Πίνακας 1.1. Χαρακτηριστικά ιών των τριών γενών της οικογένειας Closteroviridae Γένος Τυπικό μέλος Τύπος γονιδιώματος Μήκος ιϊκού Μέγεθος RNA γονιδιώματος Μέγεθος CP Μέγεθος CPm Έντομαφορείς σωματιδίου (nm) (kb) (kda) (kda) Closterovirus BYV Μονομερές ,5 19, Αφίδες Ampelovirus GLRaV-3 Μονομερές ,9 19, Κοκκοειδή- Ψευδόκοκκοι Crinivirus LIYV Διμερές και ,3 19, ~80 Αλευρώδεις (Από Martelli και συν., 2002) Γονιδιακή οργάνωση, μηχανισμοί έκφρασης και λειτουργίες πρωτεϊνών Συγκριτική ανάλυση του γονιδιώματος των πλήρως χαρακτηρισμένων ιών των τριών γενών της οικογένειας Closteroviridae αποκάλυψε την παρουσία δύο επιπέδων γονιδιωματικής συντήρησης. Το πρώτο αφορά μια ομάδα γονιδίων που σχετίζονται με την αναπαραγωγή, η οποία αποτελεί κοινό χαρακτηριστικό και άλλων ζωικών και φυτικών θετικής πολικότητας RNA ιών της alphavirus-like υπεροικογένειας. Το δεύτερο επίπεδο αφορά μια αλληλουχία πέντε γονιδίων, η οποία χαρακτηρίζει την οικογένεια Closteroviridae και σχετίζεται με την καψιδίωση του ιικού σωματιδίου και τη διακυτταρική μετακίνηση του ιού (Εικ. 1.2, 1.3) (Karasev, 2000; Dolja και συν., 2006). Οι RNA ιοί χρησιμοποιούν διάφορες στρατηγικές έκφρασης του γονιδιώματός τους. Οι clostero-ιοί, από εκτεταμένες μελέτες που έγιναν κυρίως με τον ιό της 19

25 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση τριστέτσας των εσπεριδοειδών (Citrus tristeza virus, CTV), τον ιό του ικτέρου των τεύτλων (Beet yellows virus, BYV) και τον ιό του μολυσματικού ικτέρου του μαρουλιού (Lettuce infectious yellows virus, LIYV), εμφανίζουν το πιο πολύπλοκο σύστημα έκφρασης μέσα στην υπερ-οικογένεια των alpha-like ιών με τη χρησιμοποίηση τριών διαφορετικών μηχανισμών. Οι μηχανισμοί αυτοί είναι η πρωτεόλυση, η (+1) μετακίνηση του μεταφραστικού πλαισίου και ο σχηματισμός ενός μεγάλου αριθμού υπογονιδιωματικών RNAs (subgenomic RNAs, sgrnas) (Dolja και συν., 1994; Agranovsky, 1996; Karasev, 2000). Οι δύο πρώτοι χρησιμοποιούνται για την έκφραση πρωτεϊνικών προϊόντων που κωδικοποιούνται από τα δύο πρώτα ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης (ΑΠΑ), ενώ ο τελευταίος αφορά στην έκφραση των υπόλοιπων ΑΠΑ που βρίσκονται στο 3 άκρο του γονιδιώματος Αναπαραγωγή Όπως συμβαίνει σε όλους τους θετικής πολικότητας RNA ιούς τα τμήματα της ρεπλικάσης των clostero-ιών εκφράζονται απευθείας από το ιικό RNA (Karasev και συν., 1989). Το προϊόν του ΑΠΑ που εδράζεται στο 5 άκρο του γονιδιώματος περιλαμβάνει δομές RNA μεθυλοτρανσφεράσης (ΜΕΤ) και ελικάσης (HEL) (Εικ. 1.2). Ο ρόλος αυτών των πρωτεϊνών έχει διερευνηθεί σε άλλους ιούς και φαίνεται πως σχετίζονται με την τοποθέτηση καλύπτρας στο RNA, τη σύνθεση θετικής και αρνητικής πολικότητας RNA και τον διαχωρισμό δίκλωνων μορίων (Strauss & Strauss, 1994; Buck, 1996; Ahola και συν., 1999). Η RNA-εξαρτώμενη RNA πολυμεράση (POL) κωδικοποιείται από ένα καθοδικό ΑΠΑ (Εικ. 1.2) που εκφράζεται μέσω ενός μηχανισμού +1 μετακίνησης του μεταφραστικού πλαισίου (Agranovsky και συν., 1994; Karasev και συν., 1995). Επομένως, η μετάφραση του γονιδιωματικού RNA οδηγεί στην παραγωγή δύο μεγάλων πολυπρωτεϊνών. Η μία περιλαμβάνει τις δομές ΜΕΤ και HEL και η άλλη κωδικοποιεί την τριπλέτα ΜΕΤ-HEL-POL, η οποία παράγεται σε πολύ μικρότερες ποσότητες λόγω της μικρής συχνότητας μετακίνησης του μεταφραστικού πλαισίου. Η γονιδιακή τριπλέτα ΜΕΤ-HEL-POL των clostero-ιών είναι συντηρημένη σε ολόκληρη την υπεροικογένεια των alpha-like ιών (Koonin & Dolja, 1993). Ένα χαρακτηριστικό των ρεπλικασών των clostero-ιών είναι η παρουσία μιας μεγάλης μεταβλητής περιοχής μεταξύ των δομών ΜΕΤ και HEL. Αυτή η περιοχή υφίσταται περαιτέρω πρωτεόλυση, πιθανώς με κάποια άγνωστη πρωτεολυτική δραστηριότητα μέσα στην ίδια ΜΕΤ-HEL πολυπρωτεΐνη ή με τη στρατολόγηση κάποιας κυτταρικής 20

26 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση πρωτεάσης, για την παραγωγή δύο προϊόντων με δομές ΜΕΤ και HEL, αντίστοιχα (Erokhina και συν., 2000; Dolja και συν., 2006). Εικόνα 1.2. Χάρτες γονιδιακής οργάνωσης επιλεγμένων αντιπροσώπων των τριών γενών της οικογένειας Closteroviridae. Τα ονόματα των γενών παρουσιάζονται δεξιά. BYV (Beet yellows virus), ιός του ικτέρου των τεύτλων (Agranovsky και συν., 1994); LIYV (Lettuce infectious yellows virus), ιός του μολυσματικού ικτέρου του μαρουλιού (Klaassen και συν., 1995); GLRaV-3 (Grapevine leafrollassociated virus-3), ο σχετιζόμενος με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου ιός 3 (Ling και συν., 2004). Τα ΑΠΑ φαίνονται ως κύλινδροι με τις αντίστοιχες ονομασίες των πρωτεϊνών που κωδικοποιούν. L-Pro: papain-like πρωτεάση, MET: μεθυλοτρανσφεράση, HEL: ελικάση, POL: πολυμεράση, p6: 6 kda πρωτεΐνη, HSP70h: Ομόλογο της πρωτεΐνης θερμικής καταπόνησης 70, p60: 60 kda πρωτεΐνη, CPm: διπλότυπο της ΚΠ, CP: καψιδιακή πρωτεΐνη. Οι ειδικές ανά γονιδίωμα ιού πρωτεΐνες παρουσιάζονται με το γράμμα p συνοδεύομενο από το μοριακό βάρος της πρωτεΐνης εκτός από την περιοχή AlkB. Η 5 -τελική περιοχή του RNA των clostero-ιών κωδικοποιεί μια οδηγό papainlike πρωτεΐνάση (L-Pro) (Εικ. 1.2) η οποία απελευθερώνεται από την πολυπρωτεΐνη μέσω αυτοπρωτεόλυσης (Agranovsky και συν., 1994). Εκτός από τη λειτουργία αυτή η L-Pro παίζει κυρίαρχο ρόλο στον πολλαπλασιασμό του ιικού γονιδιώματος, καθώς στην περίπτωση του BYV η απομάκρυνσή της μειώνει την ποσότητα του παραγόμενου ιικού RNA (Peng & Dolja, 2000). Επειδή η L-Pro εντοπίζεται στα έγκλειστα σωμάτια αναπαραγωγής του ιού (Zinovkin και συν., 2003), η λειτουργία της στον πολλαπλασιασμό του RNA μπορεί να σχετίζεται με ενεργοποίηση της ιικής 21

27 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση ρεπλικάσης ή την προστασία του RNA από αποδόμηση από το αμυντικό σύστημα του ξενιστή. Επιπλέον, έχει αποδειχθεί ότι η L-Pro του BYV παίζει ρόλο στη διασυστηματική μετακίνηση του ιού (Peng και συν., 2003). Ορισμένοι clostero-ιοί (CTV, GLRaV-2) κωδικοποιούν δύο πρωτεάσες που πιθανώς εξελίχτηκαν μέσω διπλασιασμού του γονιδίου. Εικόνα 1.3. Χάρτης γονιδιακής οργάνωσης και λειτουργιών των πρωτεϊνών ενός πρότυπου closteroιού, του ιού του ικτέρου των τεύτλων (Beet yellows virus, BYV). Οι ονομασίες και τα χρώματα των πρωτεϊνών είναι τα ίδια όπως στην εικόνα 1.2. Οι λειτουργίες των πρωτεϊνών παρουσιάζονται πάνω και κάτω από το διάγραμμα (τροποποιημένο από Dolja και συν., 2006) Καψιδίωση και μετακίνηση Σε αντίθεση με το γονιδιακό μπλοκ αναπαραγωγής των clostero-ιών, τα επόμενα πέντε γονίδια συνιστούν έναν μοναδικό γενετικό πυρήνα που δεν απαντάται εκτός της οικογένειας Closteroviridae (Dolja και συν., 1994). Αυτό το πενταπλό γονιδιακό μπλοκ κωδικοποιεί μια υδρόφοβη πρωτεΐνη ~6 kda (p6), ένα ομόλογο των πρωτεϊνών θερμικής καταπόνησης 70 (HSP70 homolog, HSP70h), μια πρωτεΐνη ~60 kda (p60), την καψιδιακή πρωτεΐνη (CP) και ένα διπλότυπο της καψιδιακής πρωτεΐνης (CPm) (Εικ. 1.2, 1.3). Η p6 είναι μια διαμεμβρανική πρωτεΐνη που εδράζεται στο ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) και συμβάλλει στη διακυτταρική μετακίνηση του ιού (Alzhanova και συν., 2000; Peremyslov και συν., 2004β). Επειδή αυτή η πρωτεΐνη δεν απαιτείται για την αναπαραγωγή και την καψιδίωση του ιού (Peremyslov και συν., 1998; Alzhanova 22

28 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση και συν., 2001), θεωρείται μια συμβατική πρωτεΐνη μετακίνησης (MP). Η CP σχηματίζει το μακρύ ελικοειδές σώμα των εύκαμπτων νηματοειδών ιικών σωματιδίων και καψιδιώνει περίπου 95% του ιικού RNA (Εικ. 1.4). Το γονίδιο που κωδικοποιεί την CPm είναι παράλογο (paralog) της CP και προέρχεται από αναδιπλασιασμό του γονιδίου της CP με κάποια απόκλιση στην αλληλουχία (Boyko και συν., 1992). Η CPm αποτελεί βασικό συστατικό της ουράς του ιικού σωματιδίου (Εικ. 1.4) (Agranovsky και συν., 1995; Tian και συν., 1999). Για τη συναρμολόγηση της ουράς εκτός από την CPm, όπως έδειξαν μελέτες με τον BYV, απαιτούνται επίσης οι πρωτεΐνες HSP70h και p60, οι οποίες είναι δευτερεύοντα αλλά αναπόσπαστα συστατικά (Alzhanova και συν., 2001; Napuli και συν., 2000, 2003; Peremyslov και συν., 2004α; Satyanarayana και συν., 2000, 2004). Θα πρέπει να σημειωθεί πως τα μέλη της οικογένειας Closteroviridae και οι ιοί του γένους Mimivirus, που προσβάλλουν τα πρωτόζωα Acanthamoeba (Raoult και συν., 2004), είναι οι μοναδικοί ιοί που κωδικοποιούν ομόλογα της οικογένειας των πρωτεϊνών θερμικής καταπόνησης HSP70. Οι μοριακοί συνοδοί της οικογένειας των HSP70s απαντώνται σε όλους τους τύπους κυτταρικών οργανισμών και συμβάλλουν στην επιβίωση του κυττάρου σε συνθήκες θερμικής καταπόνησης (Lewis & Pelham, 1985), ενώ έχουν και πολλούς άλλους ρόλους όπως η ορθή αναδίπλωση των πρωτεϊνών, η μεταφορά τους μέσα στο κύτταρο κ.τ.λ. (Bukau & Horwich, 1998; Ellis & Hartl, 1999). Σε αντιστοιχία με αυτούς τους κυτταρικούς μοριακούς συνοδούς, οι ομόλογες πρωτεΐνες των clostero-ιών έχουν πολύ συντηρημένα το άμινο (Ν)-τελικό άκρο, τη δομή ATPάσης και λιγότερο το καρβόξυ (C)-τελικό άκρο τους (Agranovsky και συν., 1991; Bork και συν., 1992). Εικόνα 1.4. Ηλεκτρονιομικρογραφία του ιικού σωματιδίου του BYV. Παρουσιάζονται η πρωτεϊνική σύνθεση και το μήκος του καψιδιωμένου ιικού RNA (τροποποιημένο από Alzhanova και συν., 2001). 23

29 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση Εκτεταμένες μελέτες με μεταλλαγές αμινοξέων έδειξαν πως αυτές οι δομές εμπλέκονται στη συναρμολόγηση του ιικού σωματιδίου (Alzhanova και συν., 2001). Επίσης βρέθηκε πως το C-τελικό άκρο της p60, εντοπίζεται στο εσωτερικό του ιικού σωματιδίου και έχει δομή καψιδιακής πρωτεΐνης, ενώ η N-τελική περιοχή είναι εκτεθειμένη στην επιφάνεια (Napuli και συν., 2003). Οι πρωτεΐνες HSP70h και p60 δρουν συνεργιστικά για τη διευκόλυνση ενσωμάτωσης της CPm και τον προσδιορισμό του κατάλληλου μήκους της ουράς (Satyanarayana και συν., 2004), η οποία καψιδιώνει το 5 άκρο (~700 νουκλεοτίδια) του RNA (Εικ. 1.4). Το σώμα του ιού και η ουρά μπορούν να συναρμολογηθούν ανεξάρτητα το ένα από το άλλο. Μελέτες που έγιναν στο ιικό σωματίδιο του BYV έδειξαν πως η ουρά είναι στενότερη από το σώμα και περιλαμβάνει τρία τμήματα (Peremyslov και συν., 2004α). Το κορυφαίο τμήμα της αποτελείται από την πρωτεΐνη p20 (20 kda) (Εικ. 1.3), η οποία διευκολύνει την ενσωμάτωση των άλλων δομικών στοιχείων. Απενεργοποίηση αυτής της πρωτεΐνης οδηγεί σε κοντύτερη ουρά, αλλά φυσιολογικό σώμα. Ωστόσο, καθώς τα ορθόλογα (ortholog) της p20 δεν έχουν βρεθεί σε άλλους clostero-ιούς, δεν είναι σαφές κατά πόσον το πρότυπο της τμηματοποιημένης ουράς είναι κοινό χαρακτηριστικό της οικογένειας. Μια αξιοσημείωτη διαπίστωση που επίσης προέκυψε από μελέτη του ιικού σωματιδίου του BYV είναι ότι οι πέντε δομικές πρωτεΐνες απαιτούνται και για την διακυτταρική μετακίνηση του ιού (Dolja, 2003). Στην περίπτωση της CP αυτή η απαίτηση θα μπορούσε να προκύψει απλά από την ανάγκη για προστασία κατά τη μετακίνησή του μεγάλου σε μέγεθος και άρα ευπαθούς στην αποδόμηση ιικού RNA. Ωστόσο, φαίνεται απίθανο ότι ο ρόλος της ουράς είναι μόνο προστατευτικός. Αυτό ενισχύεται και από μια σειρά πειραμάτων που έδειξαν ότι, πρώτον η CP μπορεί να καψιδιώσει ολόκληρο το γονιδίωμα σε περίπτωση παρεμπόδισης σχηματισμού της ουράς με μεταλλαγές (Alzhanova και συν., 2001). Δεύτερον, η ουρά περιλαμβάνει την HSP70h, τη μόνη ιική πρωτεΐνη που βρέθηκε σε πλασμοδέσματα (PD), τα διακυτταρικά κανάλια μεταφοράς των ιών (Medina και συν., 1999). Τρίτον, η p20 είναι διαθέσιμη για τη συναρμολόγηση του ιικού σωματιδίου και τη διακυτταρική μετακίνηση, αλλά απαιτείται κυρίως για τη διασυστηματική μετακίνηση του BYV μέσω των ηθμαγγειωδών δεσμίδων (Prokhnevsky και συν., 2002). Όλα αυτά οδηγούν στο συμπέρασμα ότι η ουρά δημιουργήθηκε εξελικτικά για τη διευκόλυνση της διακυτταρικής και διασυστηματικής μετακίνησης των μεγάλων γονιδιωμάτων των clostero-ιών (Dolja, 2003). 24

30 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση Αν και το πενταπλό γονιδιακό μπλοκ είναι συντηρημένο στα μέλη της οικογένειας αυτό δεν ισχύει και για τη διαδοχή των γονιδίων. Στα γένη Ampelovirus και Crinivirus η θέση των γονιδίων που κωδικοποιούν τις CPm και CP είναι ανεστραμμένη και το γονίδιο της CPm είναι κατά πολύ μεγαλύτερο από εκείνο του γένους Closterovirus (Εικ. 1.2) (Klaassen και συν., 1995; Melzer και συν., 2001; Kreuze και συν., 2002; Ling και συν., 2004) Καταστολείς του κυτταρικού μηχανισμού σίγησης RNA Είναι κοινώς αποδεκτό ότι όλοι οι φυτικοί ιοί κωδικοποιούν πρωτεΐνες που σχετίζονται με τρεις τουλάχιστον λειτουργίες: την αναπαραγωγή, την καψιδίωση και την μετακίνηση στα μολυσμένα φυτά. Ωστόσο αναμφισβήτητα η καταστολή σίγησης του RNA, του κυτταρικού δηλαδή αμυντικού μηχανισμού αποδόμησης του ιικού RNA στα φυτά, έχει αναδειχτεί πρόσφατα ως η τέταρτη καθολική λειτουργία των φυτικών ιών (Baulcombe, 2004). Ορισμένοι απ αυτούς διαθέτουν εξειδικευμένους καταστολείς που επιτελούν αποκλειστικά αυτή τη λειτουργία, ενώ άλλοι χρησιμοποιούν ως καταστολείς πρωτεΐνες που σχετίζονται με την αναπαραγωγή, καψιδίωση ή τη μετακίνηση του ιού (Silhavy & Burgyan, 2004; Voinett, 2005). Οι περισσότεροι από τους εξειδικευμένους καταστολείς είναι πρωτεΐνες μικρού μοριακού βάρους που δεν εμφανίζουν ομολογία με άλλες πρωτεΐνες του ιού ή του ξενιστή. Αυτό δείχνει ότι η προέλευση των καταστολέων είναι πρόσφατη και πιθανώς εξελίχτηκαν ώστε να αντιμετωπίσουν ένα πολύ ισχυρό αμυντικό σύστημα των φυτών εναντίον των παρασιτικών RNAs. Η έρευνα για την παρουσία καταστολέων της σίγησης RNA στους clostero-ιούς έδωσε αρκετά ενδιαφέροντα αποτελέσματα. Μελέτη του γονιδιώματος του BYV έδειξε ότι η p21 (Εικ. 1.3), καθώς και ορθόλογες πρωτεΐνες άλλων ιών του γένους Closterovirus, όπως ο σχετιζόμενος με το καρούλιασμα των φύλλων της αμπέλου ιός 2 (Grapevine leafroll associated virus 2, GLRaV-2) και ο ιός του κίτρινου νανισμού των τεύτλων (Beet yellow stunt virus, BYSV), είναι καταστολείς της σίγησης RNA (Reed και συν., 2003; Chiba και συν., 2006). Επιπλέον, ο CTV εμφανίζει ένα πιο πολύπλοκο σύστημα καταστολής, που στοχεύει σε διαφορετικές φάσεις της σίγησης RNA με τη στρατολόγηση τριών στοιχείων του γονιδιώματός του. Συγκεκριμένα, οι πρωτεΐνες p20 και CP αλληλεπιδρούν με τη διασυστηματική μετακίνηση του σήματος σίγησης, ενώ η p23 μπορεί μόνο να αναστείλει την σίγηση τοπικά (Lu και συν., 2004). Στον ιό του χλωρωτικού νανισμού της γλυκοπατάτας (Sweet potato chlorotic 25

31 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση stunt virus, SPCSV) δύο πρωτεΐνες, η p22 και ένα ομόλογο της RNάσης ΙΙΙ, δρουν συνεργιστικά και προκαλούν δραματική μείωση της σίγησης του RNA (Kreuze και συν., 2005). Τέλος, ο ιός της χλώρωσης της ντομάτας (Tomato chlorosis virus, ToCV) κωδικοποιεί τρεις καταστολείς της γονιδιακής σίγησης που εντοπίζονται στα δύο μόρια RNA του γονιδιώματος. Το RNA1 κωδικοποιεί την p22 που λειτουργεί ως εξειδικευμένος καταστολέας, ενώ το RNA2 μεταβίβασε αυτή τη λειτουργία στις δομικές πρωτεΐνες CP και CPm (Canizares και συν., 2008). Ειδικά η CPm αναφέρεται ως καταστολέας της σίγησης RNA για πρώτη φορά γεγονός το οποίο αυξάνει το εύρος λειτουργιών αυτού του τύπου της πρωτεΐνης. Ο λόγος για τον οποίο οι clostero-ιοί ανέπτυξαν περισσότερους καταστολείς σε σχέση με έναν μόνο των μικρότερων ιών είναι αδιευκρίνιστος. Ένα πιθανό σενάριο είναι ότι η αργή αναπαραγωγή των μεγάλων RNA γονιδιωμάτων τους τα καθιστά πιο επιρρεπή στην αποδόμηση από τον κυτταρικό μηχανισμό σίγησης σε σχέση με τους μικρότερους ιούς (Dolja και συν., 2006) Άλλα μεταβλητά γονίδια Το γονιδίωμα των ιών της οικογένειας Closteroviridae είναι διανθισμένο με εξειδικευμένα κατά είδος γονίδια των οποίων τα προϊόντα δεν έχουν ορθόλογα σε άλλους ιούς (Εικ. 1.2). Στις περισσότερες περιπτώσεις τέτοια γονίδια αναγνωρίστηκαν κοντά στη μη-κωδική περιοχή του 3 άκρου (Untranslated region, UTR). Με εξαίρεση την p20 του BYV οι λειτουργίες των πρωτεϊνών αυτών δεν έχουν ακόμη διαλευκανθεί. Ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα τέτοιων γονιδίων είναι η περιοχή AlkB η οποία βρέθηκε πρόσφατα στις πολυπρωτεΐνες δυο ampelo-ιών, του σχετιζόμενου με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου ιού 3 (Grapevine leafroll associated virus-3, GLRaV-3) και του ιού 2 της μικροκαρπίας της κερασιάς (Little cherry virus-2, LChV-2). Οι AlkB-like πρωτεΐνες είναι μέλη της υπεροικογένειας των 2-oxoglutarate και Fe(II)-εξαρτώμενων οξυγενασών, η οποία είναι ευρέως διαδεδομένη σε ευκαρυωτικούς και προκαρυωτικούς οργανισμούς (Aravind & Koonin, 2001). Ομόλογες πρωτεΐνες έχουν βρεθεί στις ρεπλικάσες τουλάχιστον άλλων 22 φυτικών ιών με μονόκλωνο θετικής πολικότητας RNA γονιδίωμα, αλλά εντοπίζονται κυρίως σε μια υποομάδα της οικογένειας Flexiviridae (Bratlie & Drablos, 2005; Martelli και συν., 2007). Σε αντιστοιχία με τις κυτταρικές AlkB δομές η παρουσία τους στο γονιδίωμα των ιών είναι πιθανό να σχετίζεται με την επιδιόρθωση του ιικού RNA από τη μεθυλίωση που προκαλούν διάφοροι 26

32 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση περιβαλλοντικοί παράγοντες (Aas και συν., 2003), διευκολύνοντας έτσι την μακροχρόνια παραμονή τους σε πολυετείς φυτικούς ξενιστές Γενετική παραλλακτικότητα των clostero-ιών Οι clostero-ιοί εμφανίζουν πολύ μεγάλη γενετική παραλλακτικότητα η οποία είναι ενδεικτική μιας συνεχούς εξέλιξης (Karasev, 2000). Ένας από τους κυριότερους παράγοντες που οδηγεί, σε αντιστοιχία με άλλους θετικής πολικότητας (+) RNA ιούς, σ αυτή την παραλλακτικότητα είναι ο ανασυνδυασμός (recombination). Η πιο άμεση απόδειξη λειτουργίας αυτού του μηχανισμού στους clostero-ιούς είναι η παρουσία ελαττωματικών RNAs (defective RNAs) και η ανίχνευση ανασυνδυασμένων γονιδιωμάτων (χίμαιρες) (CTV, LChV-2) (Mawassi και συν., 1996; Che και συν., 2003; Rott & Jelkmann, 2005). Mε βάση φυλογενετικές αναλύσεις και στοιχεία επιδημιολογίας (τρόπος μετάδοσης), o Karasev (2000) πρότεινε δυο μοντέλα τα οποία επηρεάζουν με διαφορετικό τρόπο τη γενετική παραλλακτικότητα και την εξέλιξη των clostero-ιών. Η επιβίωση και εξάπλωση των clostero-ιών που προσβάλλουν ετήσια και διετή είδη φυτών συνδέεται άμεσα με την δραστηριότητα των εντόμων-φορέων. Υπάρχει μια συνεχής, δυνατή πίεση επιλογής για τις παραλλαγές των ιών που εμφανίζουν πιο μεγάλη μεταδοτικότητα από τους φορείς και η οποία κατ επέκταση μειώνει τη γενετική παραλλακτικότητα των πληθυσμών των ιών αυτών. Αντίθετα, στους ιούς που προσβάλλουν αγενώς πολλαπλασιαζόμενα πολυετή φυτά, η πίεση επιλογής από τους φορείς είναι μικρότερη ή απουσιάζει τελείως σε περιοχές όπου δεν ενδημεί ο φορέας. Αυτό οφείλεται στην αποτελεσματική μετάδοση των ιών μέσω του αγενούς πολλαπλασιασμού, με αποτέλεσμα με το πέρασμα των χρόνων να αυξάνεται η γενετική παραλλακτικότητα. Επομένως, τα έντομα-φορείς φαίνεται ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη των clostero-ιών λειτουργώντας όχι μόνο ως φορείς μετάδοσης και διασποράς τους, άλλα και ως παράγων εξελικτικής επιλογής (evolutionary bottlenecks). 27

33 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση Φυλογενετικές σχέσεις των clostero-ιών Οι μελέτες για την διερεύνηση των εξελικτικών σχέσεων των clostero-ιών, στηρίχτηκαν σε φυλογενετικές αναλύσεις εξελικτικά συντηρημένων πρωτεϊνών (Karasev, 2000; Dolja και συν., 2006). Για τον υπολογισμό φυλογενετικών δέντρων χρησιμοποιήθηκε κυρίως το γονίδιο της HSP70h, το οποίο εντοπίζεται μόνο στην Closteroviridae και είναι πολύ συντηρημένο μεταξύ όλων των μελών της οικογένειας. Εξαιτίας του υψηλού βαθμού συντήρησης, ιδιαίτερα του 5 άκρου του γονιδίου, οι περισσότερες διαθέσιμες αλληλουχίες clostero-ιών προέρχονται από την περιοχή αυτή. Η HSP70h χρησιμοποιήθηκε επίσης από τους Martelli και συν. (2002) για το διαχωρισμό των clostero-ιών σε τρία γένη (Εικ. 1.5). Οι τοπολογίες των δέντρων, αν και στηρίζουν τη μονοφυλετική προέλευση των τριών γενών, δεν δείχνουν στενότερες γενετικές σχέσεις μεταξύ τους Πιθανό εξελικτικό σενάριο της οικογένειας Closteroviridae Πρόσφατα προτάθηκε ένα σενάριο για την εξέλιξη των τριών γενών της οικογένειας με βάση τα αποτελέσματα φυλογενετικών αναλύσεων (RdRp, L-Pro, HSP70h, p60, CP, CPm), τη γονιδιακή οργάνωση, καθώς και στοιχεία βιολογίας των ιών, όπως ο τρόπος μετάδοσής τους (Dolja και συν., 2006). Σύμφωνα μ αυτό, η μονοφυλετική γενεαλογία των clostero-ιών προήλθε από έναν φυτικό ιό της υπεροικογένειας των alpha-like ιών, ο οποίος περιελάμβανε την τυπική MET-HEL- POL ρεπλικάση, μια πρωτεΐνη μετακίνησης όμοια με την p6 των clostero-ιών και μια CP η οποία σχημάτιζε το νηματοειδές καψίδιο (Εικ. 1.6). Αυτός ο αρχέγονος ιός εξελίχτηκε στον τελευταίο κοινό πρόγονο των closteroιών με την πρόσληψη αρκετών νέων γονιδίων. Μεταξύ αυτών ήταν το γονίδιο L-Pro και μια κεντρική περιοχή στη ρεπλικάση, η οποία διευκόλυνε την αναπαραγωγή του RNA και δημιούργησε τις συνθήκες για διεύρυνση του γονιδιώματος του προγόνου. Ταυτόχρονα, το γονίδιο HSP70 ενσωματώθηκε μέσω ανασυνδιασμού με κάποιο κυτταρικό mrna, ενώ το γονίδιο p60 προήλθε από διπλασιασμό και εξελικτική απόκλιση από τη CP. Η συνεξέλιξη των HSP70h και p60 οδήγησε στην εμφάνιση μιας πρωτότυπης ουράς στο ιικό σωματίδιο, η οποία ώθησε την διακυτταρική μετακίνηση του διευρυμένου γονιδιώματος του αρχέγονου clostero-ιού. 28

34 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση Εικόνα 1.5. Φυλογενετικές σχέσεις ιών της οικογένειας Closteroviridae με βάση την αλληλουχία του ομολόγου της HSP70 (Martelli και συν., 2002). Οι τιμές σε κάθε κλάδο αντιπροσωπεύουν τον αριθμό επαναλήψεων της ανάλυσης bootstrap στον οποίο ανακτήθηκε ο συγκεκριμένος κλάδος. Επειδή οι περισσότεροι clostero-ιοί μεταδίδονται με έντομα θεωρήθηκε πως και ο πρόγονος της οικογένειας μεταδίδονταν με τον ίδιο τρόπο. Σύμφωνα με τον Karasev (2000) τα τρία σύγχρονα γένη της Closteroviridae προσαρμόστηκαν εξελικτικά στους διαφορετικούς τύπους των εντόμων-φορέων τους. Εικάζεται, πως την ίδια περίοδο εμφανίστηκαν οι CPms με αναδιπλασιασμό και απόκλιση από το γονίδιο της CP. Αυτό το σενάριο στηρίχτηκε σε φυλογενετικές αναλύσεις της CPm καθώς και στην αντίστροφη θέση των γονιδίων των CP και CPm στο γένος Closterovirus σε σχέση με εκείνη στα γένη Crinivirus και Ampelovirus (Dolja και συν., 2006). Τα γένη Crini- και Ampelovirus μπορεί να εμφανίστηκαν ανεξάρτητα από τον κοινό πρόγονο της οικογένειας (Εικ. 1.6). Εναλλακτικά, πιθανώς οι crini-ιοί να εξελίχτηκαν από τη διάσπαση του γονιδιώματος ενός ampelo-ιού σε δύο τμήματα (Εικ. 1.6). Η ίδια θέση των γονιδίων που κωδικοποιούν τις CP και CPm, καθώς και το 29

35 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση μεγαλύτερο μέγεθος των CPm στους crini- και ampelo-ιούς, σε σχέση με εκείνους του γένους Closterovirus, συμβαδίζουν με το τελευταίο σενάριο. Εικόνα 1.6. Υποθετικό εξελικτικό σενάριο της οικογένειας Closteroviridae. Τα συμπαγή βέλη δείχνουν άμεση κατακόρυφη προέλευση. Μια εναλλακτική προέλευση των crini-ιών από τη διάσπαση του γονιδιώματος ενός αρχέγονου ampelo-ιού παρουσιάζεται με το διακεκομμένο βέλος (τροποποιημένο από Dolja και συν., 2006).. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι μετά την εμφάνιση των CPms ελάχιστα επιπρόσθετα γονίδια συντηρημένα μέσα σε κάθε γένος εμφανίστηκαν. Τα περισσότερα νέα γονίδια ήταν ειδικά για κάθε ιό. Το γένος Ampelovirus εμφανίζει τη μεγαλύτερη παραλλακτικότητα στην οικογένεια. Αν και οι βασικές γονιδιακές ομάδες αναπαραγωγής, καψιδίωσης και διακυτταρικής μετακίνησης υπάρχουν σε όλα τα γνωστά μέλη του γένους συχνά διαταράσσονται από την ενσωμάτωση επιπρόσθετων γονιδίων και αλλαγές στη γονιδιακή διάταξη (Fazeli & Rezaian, 2000; Theilmann και 30

36 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση συν., 2002; Rott & Jelkmann, 2005). Παρόμοια τάση για αύξηση του αριθμού των νέων ειδικών, κατά ιό, γονιδίων παρατηρείται και στους ζωικούς corona-ιούς (Gorbalenya και συν., 2006). Φαίνεται πως αυτή η τακτική παρέχει στους ιούς με μεγάλα RNA γονιδιώματα την ικανότητα να προσαρμόζονται γρήγορα σε νέους ξενιστές, φορείς ή εναλλασσόμενες περιβαλλοντικές συνθήκες Η ασθένεια συστροφής των φύλλων της αμπέλου και ιοί της οικογένειας Closteroviridae που σχετίζονται με αυτήν Το αμπέλι, όπως και τα περισσότερα πολυετή, αγενώς αναπαραγόμενα είδη, έχει συσσωρευμένα φυτοπαθολογικά προβλήματα, κυρίως ιολογικά. Η συστροφή των φύλλων της αμπέλου (Grapevine leafroll disease, GLRD) αναγνωρίστηκε ως ασθένεια ιολογικής αιτιολογίας πριν από περίπου 70 χρόνια (Scheu, 1935). Τα συμπτώματα υπήρχαν βέβαια στην Ευρώπη για περισσότερα από 100 χρόνια, αλλά αποδίδονταν σε διαταραχές της φυσιολογίας των πρέμνων. Πρόκειται για ένα σύνδρομο σύνθετης αιτιολογίας στο οποίο εμπλέκονται διάφοροι ιοί της οικογένειας Closteroviridae. Είναι από τις πιο σημαντικές και ευρέως διαδεδομένες ασθένειες της αμπέλου και ευθύνεται για απώλειες της παραγωγής που κυμαίνονται από 3% έως 66% (Woodham και συν., 1984; Goheen, 1988; Weber και συν., 1993; Walter & Martelli, 1997) Συμπτωματολογία και επιπτώσεις στην παραγωγή Τα χαρακτηριστικά συμπτώματα της ασθένειας είναι ο ερυθρός ή χλωρωτικός μεσονεύριος μεταχρωματισμός στις ερυθρές και λευκές ποικιλίες, αντίστοιχα (Εικ. 1.7). Το έλασμα των φύλλων συστρέφεται προς τα κάτω, ενώ ταυτόχρονα γίνεται τραχύ και εύθραυστο εξαιτίας της συσσώρευσης υδατανθράκων. Τα πρώτα συμπτώματα εμφανίζονται αργά το καλοκαίρι στα φύλλα της βάσης αλλά προοδευτικά επεκτείνονται, μέχρι τις αρχές φθινοπώρου, σε όλη την κόμη. Οι βότρεις συνήθως είναι μικρότεροι σε αριθμό και μέγεθος, με ανομοιόμορφη ωρίμανση στις ράγες και χαμηλή περιεκτικότητα σε σάκχαρα. Γενικώς στα πρέμνα παρατηρείται μείωση της ζωηρότητας και της παραγωγής. Τα προσβεβλημένα πρέμνα τείνουν να διατηρούν τα φύλλα τους περισσότερο σε σχέση με τα υγιή. Η ένταση των συμπτωμάτων εξαρτάται από την παθογόνο δύναμη του είδους του ιού, του στελέχους του ιού, την ποικιλία, τις συνθήκες του περιβάλλοντος αλλά και τη 31

37 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση συνεργιστική δράση των ιών σε μικτές μολύνσεις. Η καταπόνηση των φυτών από έλλειψη νερού και θρεπτικών στοιχείων, αυξάνουν την ένταση των συμπτωμάτων. Σε ορισμένες περιπτώσεις, όπως για παράδειγμα στα αμερικάνικα υποκείμενα, η μόλυνση είναι λανθάνουσα, με αποτέλεσμα να δημιουργούνται σοβαρά προβλήματα διάδοσης της ασθένειας από την χρήση προσβεβλημένου πολλαπλασιαστικού υλικού. Τέλος, αξιοσημείωτη είναι η μείωση της ικανότητας ριζοβολίας των μοσχευμάτων (Walter & Martelli 1996, 1997; Krake και συν., 1999). Εικόνα 1.7. Συμπτώματα της ασθένειας συστροφής των φύλλων της αμπέλου σε ερυθρή ποικιλία Αιτιολογία Έως σήμερα έχουν αναφερθεί εννέα ορολογικώς διακριτοί ιοί της οικογένειας Closteroviridae που σχετίζονται με την ασθένεια GLRD (Grapevine leafrollassociated virus-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8 και -9) (Πίνακας 1.2). Από αυτούς σύμφωνα με την πιο πρόσφατη ταξινόμηση (Martelli και συν., 2002, Gugerli, 2003) οι GLRaV-1, -3, -4, -5, -6, -8 και -9 είναι οριστικά ή προσωρινά μέλη του γένους Ampelovirus, ο GLRaV-2 είναι clostero-ιός και ο GLRaV-7 είναι μη-ταξινομημένο μέλος της οικογένειας Closteroviridae. Μέχρι στιγμής μόνο οι GLRaV-1, -3 και -7 θεωρούνται αυθεντικά παθογόνα αίτια της ασθένειας, καθώς έχει αποδειχθεί ότι μπορούν να προκαλέσουν από μόνοι τους τα τυπικά συμπτώματα της ασθένειας (Belli και συν., 1995, Choueiri και συν., 1997). Επιπλέον ο GLRaV-2, έχει σχέση με την εκδήλωση ασυμφωνίας εμβολίου-υποκειμένου, ενώ πρόσφατα ένα απομακρυσμένο στέλεχος του ιού βρέθηκε να συνδέεται με την παρακμή νεαρών αμπελώνων (Greif και συν., 1995; Rowhani και συν., 2002). Εξαιτίας του χαμηλού τίτλου, της ανισοκατανομής, της παρουσίας των ιών αυτών σε μικτές μολύνσεις στα προσβεβλημένα πρέμνα και της αδυναμίας μηχανικής τους μετάδοσης σε ποώδεις ξενιστές, με εξαίρεση τον GLRaV-2 που μεταδίδεται στο Nicotiana benthamiana (Goszczynski και συν., 1996), ο χαρακτηρισμός των ιών αυτών είναι πολύ δύσκολος. Μόνο οι GLRaV-2 (Zhu και συν., 1998) και -3 (Ling και 32

38 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση συν., 2004) έχουν χαρακτηριστεί πλήρως έως σήμερα, ενώ έχει προσδιοριστεί ένα μεγάλο τμήμα του γονιδιώματος του GLRaV-1 (Fazeli & Rezaian, 2000). Φυλογενετικές αναλύσεις τμήματος της HSP70h με τη μέθοδο ένωσης γειτόνων (Neighbour Joining, NJ) (Dovas & Katis, 2003β; Saldarelli και συν., 2006; Prosser και συν., 2007) έδειξαν ότι οι GLRaV-4, -5, -6 και -9 σχετίζονται περισσότερο γενετικά μεταξύ τους, σε σχέση με τους υπόλοιπους ιούς. Ωστόσο, υπάρχουν προβλήματα στο χαρακτηρισμό αυτής της ομάδας. Οι περισσότερες διαθέσιμες αλληλουχίες προέρχονται από το 5 άκρο της HSP70h, ενώ δεν είναι γνωστή η πλήρης αλληλουχία του γονιδιώματος κανενός από αυτούς τους ιούς. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων ετών, νέα είδη ή απομακρυσμένα στελέχη ήδη γνωστών ειδών ampelo-ιών, έχουν απομονωθεί από διάφορες ποικιλίες αμπέλου και κατατάχθηκαν στην παραπάνω φυλογενετική ομάδα, γεγονός που δείχνει ότι η αιτιολογία του συνδρόμου GLRD δεν έχει πλήρως διαλευκανθεί. Πίνακας 1.2. Κατάταξη και ιδιότητες των clostero-ιών της αμπέλου (GLRaVs) Ιός Γένος Διάταξη της CPm Έντομοφορέας Μηχανική Θεωρητικό ΜΒ CP σε σχέση με τη CP μετάδοση ΜΒ* CP (kda) σε (kda) SDS-PAGE ανάλυση GLRaV-2 Closterovirus Ανοδικά - Ναι 21, GLRaV-1 Ampelovirus Καθοδικά Κοκκοειδή, Όχι 35, GLRaV-3 Ψευδόκοκκοι 34, GLRaV , GLRaV-5 Καθοδικά Κοκκοειδή, 29, Ψευδόκοκκοι GLRaV GLRaV GLRaV-9 Καθοδικά Κοκκοειδή, - 29,467 - Ψευδόκοκκοι GLRaV-7 Μηταξινομημένο - - Όχι (Τροποποιημένο από Gugerli, 2003) *ΜΒ: Μοριακό βάρος, -: δεν είναι γνωστό Ο GLRaV-9 είναι μεταξύ των πιο πρόσφατα αναγνωρισμένων ειδών (Alkowni και συν., 2004). Ομοίως, ένα απομακρυσμένο στέλεχος του GLRaV-4 έχει 33

39 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση χαρακτηριστεί (Cornuet και συν., 2003; Saldarelli και συν., 2006), ενώ ένας ampeloιός (WC HSP-16) συγγενικός του GLRaV-5 απομονώθηκε πρόσφατα σε αμπελώνες στη Νότια Αφρική (Prosser και συν., 2007). Τέλος, αλληλουχίες του ομολόγου της HSP70 δύο νέων πιθανώς ampelo-ιών, ορολογικώς διαφορετικών από όλους τους ήδη γνωστούς ιούς που εμπλέκονται στην αιτιολογία της GLRD προσδιορίστηκαν από δύο ελληνικές ποικιλίες αμπέλου, το Πρεβεζάνικο (απομόνωση με την προσωρινή ονομασία GLRaV-Pr) και την Ντεμπίνα (απομόνωση με την προσωρινή ονομασία GLRaV-De) (Δόβας, 2002; Dovas & Katis, 2003β). Φυλογενετικές αναλύσεις που στηρίχτηκαν σ αυτή τη γενετική περιοχή κατέταξαν τους GLRaV-Pr και De στην ίδια ομάδα με τους GLRaV-4, -5, -6 και Επιδημιολογία Τα επιδημιολογικά δεδομένα για την ασθένεια είναι περιορισμένα. Γενικώς ο GLRaV-3 είναι ο πιο συχνά απαντώμενος από τους ιούς που σχετίζονται με την ασθένεια GLRD, ενώ ακολουθούν οι GLRaV-1 και GLRaV-2 (Gugerli, 2003). Οι πιο κοινοί τρόποι εξάπλωσης (διασποράς) των GLRaVs είναι ο αγενής πολλαπλασιασμός και ο εμβολιασμός μολυσμένου πολλαπλασιαστικού υλικού και κυρίως των Αμερικανικών υποκειμένων αμπέλου που δεν εμφανίζουν συμπτώματα της ασθένειας (λανθάνουσα μόλυνση). Η διασπορά της GLRD στον αγρό σε σχέση με την παρουσία συγκεκριμένων έντομων-φορέων έχει αναφερθεί σε διάφορες χώρες (Ν. Αφρική, Ν. Ζηλανδία, Ισπανία, Μεξικό, Ιταλία, Κύπρος, Γαλλία, Ισραήλ, Η.Π.Α., Αυστραλία) αλλά αφορά τον GLRaV-3 (Engelbrecht & Kasdorf, 1985, 1990; Tanne και συν., 1989; Belli και συν., 1993; Ioannou, 1993; Golino και συν., 1995; Habili & Nutter, 1997; Teliz και συν., 1989; Bonfiglioli και συν., 2002; Sforza και συν., 2003; Cabaleiro & Segura, 1997α, 2006;). Σε μια πρόσφατη μελέτη παρακολούθησης της διασποράς του GLRaV-3 σε πειραματικά τεμάχια, όπου εντοπίστηκε το Planococcus citri βρέθηκε πως μέσα σε 8-9 έτη το 80% των πρέμνων ήταν μολυσμένα (ρυθμός μόλυνσης % ανά έτος) (Cabaleiro & Segura, 2006). Κατά τη διάρκεια των τελευταίων 20 ετών διάφορα είδη εντόμων που ανήκουν σε δύο οικογένειες ημιπτέρων, τους ψευδοκόκκους (Pseudococcidae) και τα κοκκοειδή (Coccidae), έχουν αναφερθεί ότι μπορούν να μεταδώσουν ορισμένους clostero-ιούς που εμπλέκονται στην GLRD σε εργαστηριακές συνθήκες (GLRaV-1,- 34

40 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση 3,-5,-9) (Πίνακας 1.3) (Sforza και συν., 2003; Gugerli, 2003; Sim και συν., 2003; Zorloni και συν., 2006). Οι μηχανισμοί μετάδοσης των clostero-ιών με αυτά τα είδη εντόμων δεν είναι ακόμη γνωστοί. Πίνακας 1.3 Έντομα-φορείς ορισμένων από τους ιούς που σχετίζονται με την ασθένεια GLRD Ιός Φορέας Βιβλιογραφική αναφορά Coccidae Pseudococcidae GLRaV-1 Neopulvinaria innumerabilis Fortusini και συν., 1997 Parthenolecanium corni Fortusini και συν., 1997; Sforza και συν., 2000 Heliococcus bohemicus Sforza και συν., 2000 Phenococcus aceris Sforza και συν., 2000 GLRaV-3 Pulvinaria vitis Belli και συν., 1994; Fortusini και συν., 1997 Heliococcus bohemicus Sforza και συν., 2000; Zorloni και συν., 2006 Phenococcus aceris Sforza και συν., 2000 Pseudococcus longispinus Tanne και συν., 1989; Petersen & Charles, 1997; Sforza και συν., 2000 Pseudococcus affinis Golino και συν., 1995 Pseudococcus viburni Golino και συν., 1998α Pseudococcus maritimus Golino και συν., 1998α Pseudococcus calcerolariae Petersen & Charles, 1997; Sforza και συν., 2000 Planococcus ficus Rosciglione & Gugerli, 1989 Pseudococcus citri Sforza και συν., 2000; Naima και συν., 2002 GLRaV-5 Pseudococcus longispinus Golino και συν., 2002; Sim και συν., 2003 GLRaV-9 Pseudococcus longispinus Sim και συν., 2003 Υποτίθεται ότι, σε αντιστοιχία με τους άλλους ιούς της οικογένειας Closteroviridae, η μετάδοση και αυτών των ιών γίνεται με ημι-έμμονο τρόπο (Cabaleiro & Segura, 1997β). Πάντως δεν φαίνεται να υπάρχει εξειδίκευση ως προς 35

41 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση τη μετάδοση ενός είδος ιού από ένα είδος εντόμου (Sforza και συν., 2003; Gugerli, 2003). Επιπλέον, δεν έχει αναφερθεί μετάδοση των GLRaV-4, -6, -7 και -8 με έντομα (Gugerli, 2003). Για τον GLRaV-2 έγιναν προσπάθειες μετάδοσης με είδη του γένους Pseudococcus (Golino και συν., 1998α), οι οποίες όμως δεν επιβεβαιώθηκαν σε πρόσφατη μελέτη (Golino και συν., 2002) Διάγνωση Στις περισσότερες ποικιλίες αμπέλου παρατηρούνται τυπικά συμπτώματα της ασθένειας GLRD προς τα τέλη καλοκαιριού με αρχές φθινοπώρου. Ωστόσο η διάγνωση της ασθένειας με βάση τη συμπτωματολογική εικόνα δεν είναι αξιόπιστη καθώς παρόμοια συμπτώματα προκαλούνται και από άλλα αίτια όπως τροφοπενίες, φυτοτοξικότητες, εντομολογικές προσβολές κλπ. Επιπλέον, σε ορισμένα υβρίδια ή αμερικανικά υποκείμενα δεν εκδηλώνονται συμπτώματα της ασθένειας (Krake και συν., 1999). Η αξιόπιστη διάγνωση της GLRD γίνεται με βιολογικές, ορολογικές και μοριακές δοκιμές, τρεις διαφορετικές μεθοδολογίες οι οποίες συμπληρώνουν η μια την άλλη ανάλογα με τις ανάγκες και τις δυνατότητες των εργαστηριακών υποδομών που υπάρχουν. Βιολογική δοκιμή Η βιολογική δοκιμή αφορά στην πραγματοποίηση εμβολιασμών σε φυτοδείκτες ερυθρών ποικιλιών του γένους Vitis (Cabernet franc, C. Sauvignon, Merlot, Pinot noir). Οι δείκτες μετά από ένα αρκετά μεγάλο χρονικό διάστημα (τουλάχιστον 18 μήνες) ελέγχονται για την εκδήλωση τυπικών συμπτωμάτων της ασθένειας GLRD (Garau και συν., 1997). Τα μειονεκτήματα της μεθόδου, εκτός από το γεγονός ότι είναι χρονοβόρα, είναι η έλλειψη εξειδίκευσης ως προς τον εμπλεκόμενο ιό-αίτιο και η ανάγκη ύπαρξης θερμοκηπιακών εγκαταστάσεων. Για τη μείωση του χρονικού διαστήματος που απαιτείται για την εκδήλωση των συμπτωμάτων αναπτύχθηκαν επίσης τεχνικές εμβολιασμού in vitro (Tanne και συν., 1996). Ορολογική ανίχνευση Οι ορολογικές δοκιμές χρησιμοποιούνται ευρέως για την ανίχνευση ορισμένων ιών που σχετίζονται με την ασθένεια. Ωστόσο, η παραγωγή υψηλού τίτλου αντιορού για τους ιούς αυτούς δεν είναι εύκολη, κυρίως εξαιτίας της δυσκολίας καθαρισμού τους, που συνδέεται με την παρουσία μικτών μολύνσεων και το χαμηλό τίτλο των ιών 36

42 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση στα πρέμνα (Hu και συν., 1990; Choueiri και συν., 1996). Επιπλέον, η ορολογική ανίχνευση είναι επισφαλής εξαιτίας της εποχιακής διακύμανσης του τίτλου των ιών, αλλά και της ανισοκατανομής στους ιστούς του ξενιστή (Monis & Bestwick 1996, 1997, Habili και συν., 1997, Boscia και συν., 1997, De Sousa, 1997). Έχουν αναπτυχθεί διάφοροι τύποι ELISA για την ανίχνευση των GLRaVs όπως η διπλή άμεση παρεμβολή ELISA (Double Antibody Sandwich, DAS), η τριπλή έμμεση παρεμβολή ELISA (Triple Antibody Sandwich, TAS) και η Biotin-streptavidin ELISA (Boscia και συν., 1997). Τα αποτελέσματα της ELISA εξαρτώνται σε σημαντικό βαθμό από την ποιότητα των αντιδραστηρίων, την εποχή δειγματοληψίας των ιστών, το είδος του φυτικού ιστού (φλοιό ξύλου, έλασμα φύλλων, μίσχοι φύλλων) καθώς και τη θέση λήψης του στο φυτό. Μίσχοι παλαιών φύλλων της βάσης του πρέμνου αργά το καλοκαίρι έως και το φθινόπωρο και φλοίωμα ξύλου το χειμώνα (ξύσματα καμβίου μετά την απομάκρυνση του φλοιού) αποτελούν τον πλέον κατάλληλο ιστό για αξιόπιστο ιολογικό έλεγχο των ευρωπαϊκών ποικιλιών (Boscia και συν., 1997, De Sousa, 1997). Επίσης, θα πρέπει να λαμβάνονται τρία ή τέσσερα δείγματα από διαφορετικά σημεία της κόμης του πρέμνου, εξαιτίας της ανισοκατανομής των ιών στο φυτό. Για τον έλεγχο των αμερικάνικων υποκειμένων είναι υποχρεωτική, για την αξιόπιστη ανίχνευσή τους, η χρήση φλοίωματος ξύλου το χειμώνα εξαιτίας της χαμηλής συγκέντρωσης των ιών (κάτω από το όριο ανίχνευσης) στα φύλλα (Credi & Santucci, 1991; Boscia και συν., 1991). Μέχρι σήμερα αξιόπιστη θεωρείται μόνο η ορολογική ανίχνευση των GLRaV-1, -3, -6 και -7 κυρίως εξαιτίας της διαθεσιμότητας ποιοτικών διαγνωστικών. Έχουν αναπτυχθεί αντισώματα και για τους GLRaV-2, -4 και -5 αλλά η χαμηλή ειδικότητά τους δεν επιτρέπει την χρησιμοποίησή τους για αξιόπιστη ορολογική ανίχνευση (Boscia και συν., 1997). Τα τελευταία χρόνια για την αντιμετώπιση των προβλημάτων καθαρισμού των GLRaVs και παραγωγής ειδικών αντισωμάτων χρησιμοποιείται ευρέως η τεχνολογία των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών (κυρίως καψιδιακή πρωτεΐνη) από κλωνοποιημένα ιικά γονίδια που εκφράζονται σε Escherichia coli. Με τη μέθοδο αυτή έχουν παραχθεί αντισώματα έναντι των GLRaV-2, -3 και -5 (Good & Monis, 2001; Xu και συν., 2006; Ling και συν., 2000, 2007), τα οποία χρησιμοποιούνται επιτυχώς σε δοκιμές ανοσοανίχνευσης με στύπωμα Western, ανοσοπροσροφητική ηλεκτρονική μικροσκοπία (ISEM) και έμμεση ELISA (Ling και συν., 2007), ενώ σε ελάχιστες 37

43 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση μόνον περιπτώσεις μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε δοκιμές DAS-ELISA (Ling και συν., 2000). Μοριακή ανίχνευση Μεταξύ των ευρέως χρησιμοποιούμενων μοριακών μεθόδων διάγνωσης είναι η απομόνωση δίκλωνου RNA (double stranded, dsrna) από τα φυτά και η ανάλυση του με ηλεκροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμίδης ή αγαρόζης. Το dsrna αποτελεί ενδιάμεση αναπαραγωγική μορφή των ιών με μονόκλωνο RNA γονιδίωμα και είναι ιδιαίτερα ανθεκτικό στην ενζυμική αποδόμηση (Dodds και συν., 1984). Ιδιαίτερα οι ιοί της οικογένειας Closteroviridae έχουν ένα πολύ χαρακτηριστικό προφίλ dsrna το οποίο περιλαμβάνει μια ζώνη μεγάλου μοριακού βάρους (15-20 kb), ενώ σε αρκετές περιπτώσεις ανιχνεύονται και μικρότερες που αντιστοιχούν σε υπογονιδιωματικά RNA. Στο αμπέλι η απομόνωση dsrna χρησιμοποιείται κυρίως για το μοριακό χαρακτηρισμό των clostero-ιών (Zhu και συν., 1998; Ling και συν., 1998; Fazeli & Rezaian, 2000) και πιο σπάνια ως διαγνωστική μέθοδος (Hu και συν., 1991; Habili και συν., 1992). Άλλωστε είναι χρονοβόρα διαδικασία και απαιτεί μεγάλη ποσότητα φυτικού ιστού. Η πιο γνωστή μοριακή μέθοδος ανίχνευσης παθογόνων με RNA γονιδίωμα, όπως είναι οι ιοί της αμπέλου, είναι η αντίστροφη μεταγραφή-αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR). Η μέθοδος είναι γρήγορη και με υψηλή ευαισθησία, σημαντικά πλεονεκτήματα ειδικά για την ανίχνευση των clostero-ιών οι οποίοι βρίσκονται σε χαμηλή συγκέντρωση και έχουν ανομοιόμορφη κατανομή στα πρέμνα, ενώ με προσεκτική επιλογή κατάλληλων εκκινητών μπορεί να μεταβληθεί η ειδικότητά της. Είναι επίσης χρήσιμη στις περιπτώσεις των ιών για τους οποίους δεν υπάρχουν διαθέσιμα ειδικά αντισώματα για την ορολογική ανίχνευση. Τέλος, το πιο σημαντικό πλεονέκτημα της μεθόδου είναι η εφαρμογή της στον χαρακτηρισμό ιών, μετά από προσδιορισμό της αλληλουχίας του παραγόμενου προϊόντος (Sequencing). Η προετοιμασία του φυτικού εκχυλίσματος αποτελεί ένα κρίσιμο βήμα στη διαδικασία της RT-PCR. Το αμπέλι, όπως και τα περισσότερα ξυλώδη είδη, περιέχει υψηλές ποσότητες πολυσακχαριτών και φαινολικών ουσιών που εμποδίζουν τη δράση των ενζύμων της αντίδρασης (Nassuth και συν., 2000). Για την αποφυγή αυτών των ουσιών έχουν προταθεί διάφορες προσεγγίσεις όπως η εκχύλιση ολικού RNA, η εφαρμογή ανοσοδέσμευσης (Sefc και συν., 2000), μεγάλη αραίωση του φυτικού εκχυλίσματος (Habili και συν., 1997) και αποτύπωση του φυτικού 38

44 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση εκχυλίσματος σε νάιλον μεμβράνη, η οποία χρησιμοποιείται μετά από θερμική επεξεργασία (La Notte και συν., 1997; Dovas & Katis, 2003γ). Για τη διάγνωση των ιών της αμπέλου έχουν αναπτυχθεί αρκετές παραλλαγές της μεθόδου όπως ένθετη (nested-) RT-PCR (Dovas & Katis, 2003γ, Dovas και συν., 2006), πολλαπλή (multiplex-) (Gambino & Gribaudo, 2006) και RT-PCR πραγματικού χρόνου (Real-time-RT-PCR) (Beuve και συν., 2007; Osman και συν., 2007). Πρόσφατα η ανάπτυξη μιας γενικής ένθετης RT-PCR (Dovas & Katis, 2003γ) με εκφυλισμένους εκκινητές που στοχεύουν στο συντηρημένο 5 -άκρο του γονιδίου της HSP70h επέτρεψε την ταυτόχρονη ανίχνευση του συνόλου των ιών που σχετίζονται με την GLRD. Με την εφαρμογή μεθόδων γενικής PCR μπορεί να αποφευχθεί η ειδική ανίχνευση κάθε συγγενικού ιού μειώνοντας έτσι τον απαιτούμενο χρόνο και το κόστος ενώ είναι δυνατή η διάγνωση και λήψη αρχικών γενετικών πληροφοριών ιών που δεν έχουν καταγραφεί. Όσον αφορά την ειδική ανίχνευση των clostero-ιών της αμπέλου υπάρχουν προβλήματα τα οποία σχετίζονται με την υψηλή ενδο-ειδική τους παραλλακτικότητα (Karasev, 2000), που δυσχεραίνει την επιλογή συντηρημένων περιοχών για το σχεδιασμό των εκκινητών. Επιπλέον, ο περιορισμένος αριθμός των διαθέσιμων δημοσιευμένων αλληλουχιών απομονώσεων για αρκετούς απ αυτούς (GLRaV-4, -5, -6, -9) καθιστά αδύνατη την εκτίμηση της γενετικής τους παραλλακτικότητας και άρα την ανάπτυξη αξιόπιστων και εξειδικευμένων μοριακών μεθόδων ανίχνευσής τους. Συγκεκριμένα, έχουν αναπτυχθεί αρκετές δοκιμές RT-PCR (Sefc και συν., 2000; Ling και συν., 2001; Bertazzon & Angelini, 2004; Little & Rezaian, 2006) για την αξιόπιστη ανίχνευση των GLRaV-1, -2 και -3. Πρόσφατα, αναπτύχθηκε μια δοκιμή ένθετης RT-PCR με σταδιακή πτώση της θερμοκρασίας υβριδοποίησης των εκκινητών (Dovas και συν., 2006) καθώς και δοκιμές RT-PCR πραγματικού χρόνου (real time) για την ειδική ανίχνευση αυτών των ιών (Beuve και συν., 2007; Osman και συν., 2007). Από την άλλη πλευρά η μοριακή διάγνωση των GLRaV-4, -5, -6 και -9 είναι επισφαλής. Αν και έχουν αναπτυχθεί δοκιμές συμβατικής και πραγματικού χρόνου RT-PCR (Osman και συν., 2007) για τη διάγνωση των GLRaV-4 (Routh και συν., 1998), GLRaV-5 (Routh και συν., 1998; Good & Monis, 2001) και GLRaV-9 (Alkowni και συν., 2004), ο αριθμός των διαθέσιμων δημοσιευμένων αλληλουχιών απομονώσεων, που χρησιμοποιήθηκε για το σχεδιασμό των εκκινητών ήταν περιορισμένος. Τέλος, αναφέρθηκε η ανάπτυξη μιας δοκιμής RT-PCR για την 39

45 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση ανίχνευση του GLaRV-7 με περιορισμένο όμως εύρος ανίχνευσης των απομονώσεων του ιού (Turturo και συν., 2000) Αντιμετώπιση της ασθένειας Η εγκατάσταση αμπελώνων με ποικιλίες πιστοποιημένες και απαλλαγμένες από ιούς, σύμφωνα με τις οδηγίες της Ε.Ε. για το αμπέλι, είναι το πιο βασικό μέτρο αντιμετώπισης της ασθένειας. Για την παραγωγή πιστοποιημένου πολλαπλασιαστικού υλικού εφαρμόζεται η διαδικασία κλωνικής επιλογής σε συνδυασμό με αξιόπιστο ιολογικό έλεγχο και εξυγίανση, όπου είναι απαραίτητη (Walter & Martelli, 1997). Κατά την κλωνική επιλογή επισημαίνονται στον αμπελώνα, πρέμνα που δεν εμφανίζουν ιολογικά συμπτώματα και τα οποία διαθέτουν ενδιαφέροντα τεχνολογικά χαρακτηριστικά. Στη συνέχεια, τα πρέμνα αυτά ελέγχονται για την παρουσία ιολογικών προσβολών με ορολογικές, μοριακές και βιολογικές μεθόδους και όσα είναι προσβλημένα εξυγιαίνονται. Για την εξυγίανση μολυσμένων κλώνων αμπέλου έχουν εφαρμοστεί διάφορες μέθοδοι. Αυτές στηρίζονται κυρίως στην τεχνολογία του μικροπολλαπλασιασμού (micropropagation) ή ιστοκαλλιέργειας (tissue culture) με την οποία παράγεται πολλαπλασιαστικό υλικό από πολύ μικρά φυτικά τμήματα, που αποχωρίζονται από το γονικό φυτό και αναπτύσσονται in vitro κάτω από ασηπτικές συνθήκες (Ελευθερίου, 1994). Μεταξύ των ευρύτερα διαδεδομένων συστημάτων μικροπολλαπλασιασμού που εφαρμόζονται για την εξυγίανση της αμπέλου είναι η καλλιέργεια μεριστωμάτων (Golino και συν., 1998) και βλαστικών κορυφών (Credi & Badini, 1997). Οι μέθοδοι αυτές συχνά συνδυάζονται με τη διαδικασία της θερμοθεραπείας (Leonhardt και συν., 1998), την υποβολή δηλαδή των φυτών σε υψηλές θερμοκρασίες (32-40 o C), για την αποτελεσματική εξάλειψη των ιών (George, 1993). Έχουν χρησιμοποιηθεί επίσης και άλλες τεχνικές εξυγίανσης, όπως η σωματική εμβρυογένεση, η κρυοδιατήρηση και η χημειοθεραπεία (Wang και συν., 2003; Popescu και συν., 2003; Gambino και συν., 2006; Panattoni και συν., 2007α,β). Η πλειονότητα των μελετών εξυγίανσης ποικιλιών αμπέλου από τους ιούς που συνδέονται με την GLRD αφορούν τους GLRaV-1 και -3 (Goussard και συν., 1991; Gribaudo και συν., 1997; Gambino και συν., 2006; Panattoni και συν., 2007α). Τα έκφυτα που προκύπτουν από τη φάση της εξυγίανσης επανελέγχονται για την παρουσία ιολογικών προσβολών και στη συνέχεια τα υγιή φυτά μετά από διαδοχικούς 40

46 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση πολλαπλασιασμούς και αξιολόγηση των τεχνολογικών χαρακτηριστικών τους, χρησιμοποιούνται για τη δημιουργία μητρικών φυτειών βασικού και πιστοποιημένου πολλαπλασιαστικού υλικού. Οι μητρικές φυτείες θα πρέπει να ελέγχονται περιοδικά για την παρουσία ιολογικών προσβολών Σκοπός της εργασίας Η απομόνωση νέων clostero- ιών ανά τον κόσμο από την άμπελο τις τελευταίες δεκαετίες εγείρει πολλά ερωτηματικά τόσο για την ίδια την ασθένεια GLRD, όσο και για τους λόγους για τους οποίους συνυπάρχουν τόσοι πολλοί διαφορετικοί ιοί της οικογένειας Closteroviridae στο είδος Vitis vinifera, καθώς και για τις γενετικές σχέσεις των ιών αυτών. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι οι περισσότεροι νέοι ιοί ή απομακρυσμένα στελέχη ήδη γνωστών ιών (GLRaV-9, WC HSP-16, GLRaV-Pr, GLRaV-De) κατατάσσονται φυλογενετικά (αναλύσεις τμήματος του ομολόγου της HSP70) μαζί με τους ampelo-ιούς GLRaV-4, -5 και -6. Συνιστούν έτσι την πολυπληθέστερη ομάδα ιών που σχετίζεται με την GLRD, η οποία ωστόσο είναι και η λιγότερο μελετημένη. Υπάρχουν σημαντικά προβλήματα που αφορούν στον χαρακτηρισμό και την κατάταξή τους. Επιπλέον, εξαιτίας του μικρού αριθμού των διαθέσιμων γενετικών πληροφοριών δεν ήταν μέχρι πρόσφατα δυνατή η σε βάθος μελέτη των γενετικών τους σχέσεων, όπως και η κατάταξη νέων απομονώσεων σε είδη χρησιμοποιώντας μόνο ένα τμήμα της γενετικής τους αλληλουχίας. Τέλος, υπάρχουν σημαντικά προβλήματα και στην ανίχνευση των ιών αυτών. Με βάση τα παραπάνω ο στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η απόκτηση μιας βαθύτερης γνώσης της εξελικτικής ιστορίας αυτής της γενεαλογίας που περιλαμβάνει την πλειονότητα των ιών που σχετίζονται με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου. Η μελέτη αυτή στηρίχτηκε σε αναλύσεις γενετικής παραλλακτικότητας, θετικής επιλογής και σε φυλογένειες μέγιστης πιθανοφάνειας (Maximum Likelihood, ML). Για την πραγματοποίηση των αναλύσεων προσδιορίστηκαν νέες αλληλουχίες από το Ν-τελικό άκρο της HSP70h και την CP για διάφορα μέλη αυτής της ομάδας των γενετικά συγγενικών ampelo-ιών. Επιπλέον, αξιολογήθηκε η πιθανότητα χρησιμοποίησης της ML φυλογένειας της HSP70h ως εργαλείο ταξινόμησης των ιών αυτών. Η ομάδα αλληλουχιών της HSP70h χρησιμοποιήθηκε για το σχεδιασμό νέων εκκινητών για τη γενική και ειδική ανίχνευση ιών αυτής της ομάδας. Οι δοκιμές 41

47 Κεφ. 1. Βιβλιογραφική ανασκόπηση ένθετης RT-PCR που αναπτύχθηκαν αξιολογήθηκαν και σε δείγματα αγρού. Προκειμένου να διερευνηθεί η γονιδιακή οργάνωση των υπό μελέτη ιών, προσδιορίστηκε η πλήρης νουκλεοτιδική αλληλουχία του GLRaV-Pr και τμήμα της αλληλουχίας του GLRaV-De με τη χρησιμοποίηση ιικού dsrna. Τα αποτελέσματα συγκρίσεων της γονιδιακής οργάνωσης και φυλογενετικών αναλύσεων χρησιμοποιήθηκαν για την εξαγωγή αξιόλογων συμπερασμάτων για την εξέλιξη αυτών των ιών. Τέλος, έγιναν προσπάθειες εξυγίανσης δύο ποικιλιών αμπέλου, της Μαντηλαριάς και του Πρεβεζάνικου από τον νέο ampelo-ιό GLRaV-Pr και τον σχετιζόμενο ιό με τη βοθρίωση του κορμού του Rupestris (GRSPaV) εφαρμόζοντας in vitro θερμοθεραπεία και καλλιέργεια μεριστωμάτων και βλαστικών κορυφών. 42

48 Κεφ. 2. Εξελικτικές σχέσεις ampelo-ιών που ανήκουν σε μια διακριτή υποομάδα ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 Εξελικτικές σχέσεις ιών της αμπέλου που ανήκουν σε ένα διακριτό φυλογενετικό κλάδο του γένους Ampelovirus 2.1. Περίληψη Μελετήθηκαν οι εξελικτικές σχέσεις των σχετιζόμενων με την ασθένεια της συστροφής των φύλλων της αμπέλου ιών -4, -5, -6, -9 και δύο νέων απομονώσεων ampelo-ιών (GLRaV-Pr και GLRaV-De). Η μελέτη αφορούσε αναλύσεις γενετικής παραλλακτικότητας, θετικής επιλογής και φυλογενετική ανάλυση (κατασκευή φυλογενετικών δέντρων) με τη μέθοδο μέγιστης πιθανοφάνειας. Προσδιορίστηκαν νέες νουκλεοτιδικές αλληλουχίες των ιών από τις γενετικές περιοχές που κωδικοποιούν τμήμα του ομολόγου της πρωτεΐνης θερμικής καταπόνησης 70 (HSP70h, Ν-τελικό άκρο) και ολόκληρη την καψιδιακή πρωτεΐνη (CP), οι οποίες στοιχίστηκαν με ομόλογες αλληλουχίες μελών της οικογένειας Closteroviridae. Οι τοπολογίες που προέκυψαν από τη φυλογενετική ανάλυση των δύο γενετικών περιοχών επαλήθευσαν τις πολύ στενές φυλογενετικές σχέσεις των GLRaV-4, -5, -6, - 9, -Pr και GLRaV-De σε σχέση με τους άλλους ampelo-ιούς και αποκάλυψαν την παρουσία πολύ μικρών δια-ειδικών εξελικτικών αποστάσεων για αυτή την πολυπληθή γενεαλογία. Η φυλογένεια τμήματος της HSP70h συνοδεύομενη από ανάλυση bootstrap διευκόλυνε την αναγνώριση ειδών μέσα σ αυτή την ομάδα, ενώ ταυτόχρονα παρέχει ένα χρήσιμο εργαλείο για τη ταχεία ταξινόμηση των παραπάνω ιών. Οι υπολογισμοί των d N /d S με τη χρήση των ομάδων αλληλουχιών της CP και της HSP70h έδειξαν ότι, μέσα στην Closteroviridae, οι ιοί αυτοί υπόκεινται στους πιο ισχυρούς περιορισμούς αντικαταστάσεων αμινοξέων. Τα αποτελέσματα των παραπάνω υπολογισμών δηλώνουν μια ανεξάρτητη εξελικτική πορεία γι αυτή τη ομάδα των ιών, που πιθανώς σχετίζεται με την ξεχωριστή της οικοθέση η οποία αφορά επιτυχή προσαρμογή στον ξενιστή, μετάδοση με αγενή πολλαπλασιασμό και απουσία φορέων με μεγάλη αποτελεσματικότητα μετάδοσης. 43

49 Κεφ. 2. Εξελικτικές σχέσεις ampelo-ιών που ανήκουν σε μια διακριτή υποομάδα 2.2. Εισαγωγή Η Closteroviridae είναι η μοναδική οικογένεια φυτικών ιών που κωδικοποιεί ένα ομόλογο της 70-kDa πρωτεΐνης θερμικής καταπόνησης (HSP70h), μια πρωτεΐνη που εμφανίζει ομοιότητες με τους κυτταρικούς συνοδούς (cellular chaperones) και παρουσιάζει πολύ συντηρημένα τμήματα στο N-τελικό άκρο και την περιοχή ATPase, μεταξύ όλων των μελών της οικογένειας (Agranovski και συν., 1991; Dolja και συν., 1994). Αρκετές πρόσφατες μελέτες περιλαμβάνουν φυλογενετικές αναλύσεις αυτής της περιοχής για τον προσδιορισμό των εξελικτικών σχέσεων μεταξύ μελών της Closteroviridae και ακόμη πιο συγκεκριμένα μεταξύ ιών του γένους Ampelovirus που προσβάλλουν την άμπελο (Karasev, 2000; Martelli και συν., 2002; Dolja και συν., 2006; Saldarelli και συν., 2006). Ομοίως η CP, αν και είναι λιγότερο συντηρημένη σε σύγκριση με την HSP70h, έχει επίσης χρησιμοποιηθεί σε φυλογενετικές αναλύσεις της οικογένειας Closteroviridae (Dolja και συν., 2006). Η HSP70h και η CP ανήκουν στην ομάδα γονιδίων που σχετίζονται με την καψιδίωση και μετακίνηση του ιού στο φυτό-ξενιστή, ένα πενταπλό γονιδιακό μπλοκ, το οποίο υπάρχει μόνο στην οικογένεια Closteroviridae (Dolja και συν., 2006). Μέσα στο γένος Ampelovirus οι GLRaV-4, -5, -6 και -9 σχετίζονται φυλογενετικά σύμφωνα με αναλύσεις τμήματος της HSP70h με τη μέθοδο ένωσης γειτόνων (Neighbour Joining, NJ) (Dovas & Katis, 2003β; Saldarelli και συν., 2006; Prosser και συν., 2007). Σ αυτή την ομάδα εντάσσονται όλοι οι πρόσφατα ανακαλυφθέντες ιοί της αμπέλου του γένους Ampelovirus, περιλαμβανομένων των GLRaV-Pr και De που απομονώθηκαν από Ελληνικές ποικιλίες (βλέπε κεφ. 1) (Dovas & Katis, 2003β). Ωστόσο, οι διαθέσιμες αλληλουχίες των παραπάνω ιών ήταν περιορισμένες την περίοδο των αναλύσεων που περιέχουν οι περισσότερες εργασίες. Επιπλέον, τα φυλογενετικά δέντρα υπολογίστηκαν με NJ αναλύσεις χωρίς κατάλληλες στοιχίσεις αλληλουχιών και μοντέλα αντικατάστασης αμινοξέων ή νουκλεοτιδίων, ενώ σε κάποιες περιπτώσεις δεν πραγματοποιήθηκε ανάλυση bootstrap. Ως αποτέλεσμα προέκυψαν περιορισμένα συμπεράσματα για τις γενετικές σχέσεις των ιών αυτών, ενώ δεν ήταν δυνατή και η κατάταξη νέων απομονώσεων σε είδη, χρησιμοποιώντας τμήμα της γενετικής αλληλουχίας, όπως στην περίπτωση της πρόσφατα αναγνωρισμένης απομόνωσης WC HSP-16 (Prosser και συν., 2007). Στην παρούσα μελέτη αποκτήθηκαν νέες γενετικές πληροφορίες από την HSP70h (τμήμα) και την CP για διάφορα μέλη αυτής της ομάδας των γενετικά συγγενικών ampelo-ιών. Οι γενετικές σχέσεις των ιών αυτής της ομάδας προσδιορίστηκαν, μέσα 44

50 Κεφ. 2. Εξελικτικές σχέσεις ampelo-ιών που ανήκουν σε μια διακριτή υποομάδα στην οικογένεια Closteroviridae, με τη χρησιμοποίηση φυλογενετικών αναλύσεων των παραπάνω περιοχών με τη μέθοδο της μέγιστης πιθανοφάνειας και κατάλληλα μοντέλα αντικατάστασης. Επιπλέον, αξιολογήθηκε η πιθανότητα χρησιμοποίησης της ML φυλογένειας της HSP70h ως ένα εργαλείο ταξινόμησης για το διαχωρισμό των ιών αυτών και την κατάταξη απομονώσεων σε είδη. Τέλος, διερευνήθηκαν οι γενετικές αποστάσεις και το επίπεδο συντηρημένων αλληλουχιών μεταξύ των ιών αυτών, ενώ υπολογίστηκαν οι αναλογίες των μη-συνώνυμων / συνώνυμων αντικαταστάσεων (d N /d S ) και ο αριθμός των θέσεων που υπόκεινται σε αρνητική επιλογή, ώστε να εκτιμηθούν οι εξελικτικές πιέσεις που ασκούνται στα γονίδια της HSP70h και της CP. Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η απόκτηση βαθύτερης γνώσης της εξελικτικής ιστορίας της γενεαλογίας αυτής, που περιλαμβάνει την πλειονότητα των ιών που σχετίζονται με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου. 45

51 Κεφ. 2. Εξελικτικές σχέσεις ampelo-ιών που ανήκουν σε μια διακριτή υποομάδα 2.3. Υλικά και Μέθοδοι Απομονώσεις ιών Χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 12 απομονώσεις των GLRaV-4, -5, -6, GLRaV-Pr και GLRaV-De (Dovas & Katis, 2003β; Dovas και συν., 2006) για την απόκτηση νουκλεοτιδικών αλληλουχιών (Πίνακας 2.1). Αυτές προήλθαν από βιοτύπους αμπέλου που ήταν προϊόντα κλωνικής επιλογής της εταιρείας Βίτρο Ελλάς Α.Ε και έφεραν μονές μολύνσεις με ampelo-ιούς. Όσον αφορά τις απομονώσεις των πιθανώς νέων ampelo-ιών (GLRaV-Pr, -De), ο GLRaV-De ανιχνεύτηκε σε διάφορους βιοτύπους της εταιρείας (Ντεμπίνα 1, Ντεμπίνα 2) (Δόβας, 2002), ενώ αργότερα απομονώθηκε και ο GLRaV-Pr από την ποικιλία Πρεβεζάνικο (Dovas & Katis, 2003β). Στην παρούσα μελέτη ελέγχθηκαν και άλλες ποικιλίες για την παρουσία του GLRaV-Pr χρησιμοποιώντας μια ένθετη RT-PCR για τη γενική ανίχνευση closteroιών (παρ ) (Dovas & Katis, 2003γ; Dovas και συν., 2006) Ιολογικός έλεγχος Για την επιβεβαίωση των μονών μολύνσεων τα πρέμνα που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη ελέγχθηκαν μοριακά με δοκιμές ειδικής RT-PCR για την παρουσία των GLRaV-1, -2, -3, -4, -5 και -9 (Routh και συν., 1998; Alkowni και συν., 2004; Dovas και συν., 2006). Επιπλέον εφαρμόστηκε η ορολογική δοκιμή DAS-ELISA για την ανίχνευση των GLRaV-1, -2, -3, -6 και -7. Οι βιότυποι που χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση των GLRaV-Pr και De ελέγχθηκαν επίσης με την DAS-ELISA για την παρουσία των GFLV και GVA και με την ΤAS-ELISA για τους GFKV και GVB. Τέλος, εφαρμόστηκε η ένθετη γενική RT-PCR για την ανίχνευση ιών των γενών Foveavirus και Vitivirus (παρ ) (Dovas & Katis, 2003α). Οι ορολογικές σχέσεις μεταξύ των απομονώσεων αξιολογήθηκαν περαιτέρω με τη δοκιμή TAS-ELISA με συνδυασμό πολυκλωνικών (RAC-Nyon GLRaV-9 1st / ) και μονοκλωνικών αντισωμάτων (RAC-Nyon Mab GLRaV- 9:27-1 lot M146-06) που εμφανίζουν μεγάλο εύρος ανίχνευσης των GLRaV-4, -5, -6 και -9. Τα αντισώματα έναντι των ιών αυτών ήταν μια ευγενική χορηγία του Dr P. Gugerli (Agroscope Changins-Wadenswil Research Station ACW, Switzerland). Οι δοκιμές DAS- και TAS-ELISA πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφονται στο παράρτημα Ι (παρ. 3). 46

52 Κεφ. 2. Εξελικτικές σχέσεις ampelo-ιών που ανήκουν σε μια διακριτή υποομάδα Επεξεργασία των δειγμάτων για τις ορολογικές δοκιμές και εκχύλιση νουκλεϊκών οξέων Χρησιμοποιήθηκε φλοίωμα από κληματίδες που συλλέχθηκαν κατά το χειμερινό κλάδεμα καρποφορίας. Κάθε δείγμα αποτελούνταν από τρεις κληματίδες από διάφορα σημεία της κόμης του πρέμνου. Για τις δοκιμές ELISA, ξύσματα καμβίου (0,4 g περίπου) παρελήφθησαν από τις κληματίδες με λεπίδα, μετά την απομάκρυνση του φλοιού. Στη συνέχεια, τοποθετήθηκαν σε δοκιμαστικούς σωλήνες και ομογενοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα (Tris-HCl 0,5 M ph 8,2, NaCl 0,15 M, 0,1% Tween 20, 2% PVP) σε αναλογία 1/10 (β/ο). Το υλικό φυγοκεντρήθηκε για δύο λεπτά στις g (centrifuge 5417, eppendorf) και το υπερκείμενο τοποθετήθηκε στη μικροπλάκα σε δύο επαναλήψεις (100μl/βοθρίο). Για τις μοριακές δοκιμές, πραγματοποιήθηκε εκχύλιση ολικού RNA από 0,4 gr ξύσματος καμβίου σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφηκε από τους Rott και Jelkmann (2001), η οποία τροποποιήθηκε με την προσθήκη 6% PVP και 0,2 M β- μερκαπτοαιθανόλης στο διάλυμα εκχύλισης (βλέπε παράρτημα Ι, παρ. 4). Η μέθοδος στηρίζεται στη δέσμευση των μορίων του RNA από το διοξείδιο του πυριτίου (SiO 2 ). Για τους GLRaV-Pr και GLRaV-De απομονώθηκε επίσης δίκλωνο RNA (dsrna) από ξύσματα φλοιού χειμερινού ξύλου των ποικιλιών Μαντηλαριά (βιότυπος 3) και Ντεμπίνα (βιότυπος 1), αντίστοιχα σύμφωνα με τη διαδικασία που περιγράφεται στην παρ Προσδιορισμός νουκλεοτιδικών αλληλουχιών Αναλύθηκαν δύο διαφορετικές γενετικές περιοχές που κωδικοποιούν τμήμα της HSP70h και ολόκληρη την CP, αντίστοιχα. Για την απόκτηση γενετικών πληροφοριών από το συντηρημένο Ν-τελικό άκρο της HSP70h εφαρμόστηκε μια ένθετη RT-PCR για τη γενική ανίχνευση clostero-ιών (Dovas και συν., 2006). Η πρώτη RT-PCR πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στην παράγραφο Στην ένθετη PCR tο μίγμα της αντίδρασης (20μl) περιλάμβανε, 1 μl από την πρώτη RT- PCR, 10 mm Tris-HCl (ph 8.8), 50 mm KCl, 1,5 mm MgCl 2, 0,1 % Triton X-100, 3% DMSO, 0,2 mm από κάθε dntp, 1 μονάδα Platinum Taq DNA πολυμεράση (Invitrogen, The Netherlands), 1 μm από κάθε εκκινητή dhspnest1, dhspnest2 και 2 μm από τους dhspnest3, dhspnest3g (Dovas & Katis, 2003γ). Το προφίλ 47

53 Κεφ. 2. Εξελικτικές σχέσεις ampelo-ιών που ανήκουν σε μια διακριτή υποομάδα θερμοκυκλοποίησης στην ένθετη PCR περιλάμβανε τα εξής στάδια 3 λεπτά στους 94 ºC, 5 κύκλους των 30 δευτερολέπτων στους 95 ºC, 30 δευτερολέπτων στους 48 ºC και 20 δευτερολέπτων στους 72 o C και 35 κύκλους των 30 δευτερολέπτων στους 95 ºC, 10 δευτερολέπτων στους 58 ºC, 10 δευτερολέπτων στους 53 ºC, 10 δευτερολέπτων στους 48 ºC και 20 δευτερολέπτων στους 72 ºC. Η αντίδραση ολοκληρώθηκε με μια τελευταία επώαση για 2 λεπτά στους 72 ºC. Επιπλέον, οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες του γονιδίου της CP των GLRaV-De και GLRaV-Pr, προέκυψαν μετά από ενίσχυση μιας γονιδιωματικής περιοχής μήκους ζβ η οποία εκτείνεται μεταξύ του 3 άκρου της p60 των ampelo-ιών και του 5 άκρου της CPm. Για το σκοπό αυτό σχεδιάστηκαν εκφυλισμένοι εκκινητές (CPup:5 -AAAGAYACCCCSGTTAGGGGWTTTC-3, CPdo:5 -CCRTTATTWGT AGCTACWACATTRCCYA-3 ), από συντηρημένες γενετικά περιοχές δημοσιευμένων αλληλουχιών των GLRaV-4, GLRaV-5 και GLRaV-9 και χρησιμοποιήθηκαν σε μια δοκιμή RT-PCR σε ένα μικροσωλήνα. Το μείγμα της αντίδρασης (25 µl) περιείχε: 2 µl ολικού RNA, 10 mm Tris-HCl (ph: 8,8), 50 mm KCl, 1,5 mm MgCl 2, 0,1 % Τriton Χ-100, 0,25 mm κάθε dntp, 5,0 mm DTT, 5% DMSO, 12 μονάδες RNASEOUT αναστολέα ριβονουκλεασών (Life Technologies TM, USA), 0,8 μονάδες Dynazyme TM II DNA πολυμεράση (Finnzymes, Finland), 0,7 μονάδες AMV αντίστροφη μεταγραφάση (Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase, Finnzymes, Finland), 0,7 μονάδες Superscript TM II Rnase H αντίστροφη μεταγραφάση (Life Technologies TM, USA), 1 µm από κάθε εκκινητή και συμπληρώθηκε με απεσταγμένο νερό (που υπέστη μεταχείριση με DEPC) μέχρι τελικού όγκου 25 μl. Oι μικροσωλήνες τοποθετήθηκαν σε θερμοκυκλοποιητή (Mastercycler gradient, Eppendorf), όπου επωάστηκαν σύμφωνα με τα παρακάτω στάδια για την αντίδραση της αντίστροφης μεταγραφής: για 50 λεπτά στους 47 o C, 10 λεπτά στους 50 o C και στη συνέχεια, για 4 λεπτά στους 94 o C. Ακολούθησαν για την αντίδραση της PCR, πέντε κύκλοι που περιλάμβαναν τα στάδια: 30 δευτερόλεπτα στους 95 o C, 30 δευτερόλεπτα στους 54 o C, 80 δευτερόλεπτα στους 72 o C, τριανταπέντε κύκλοι που περιλάμβαναν τα στάδια: 30 δευτερόλεπτα στους 95 o C, 15 δευτερόλεπτα στους 58 o C, 15 δευτερόλεπτα στους 54 o C και 80 δευτερόλεπτα στους 72 o C και η αντίδραση ολοκληρώθηκε με μία τελευταία επώαση για 2 λεπτά στους 72 ο C. 48

54 Κεφ. 2. Εξελικτικές σχέσεις ampelo-ιών που ανήκουν σε μια διακριτή υποομάδα Πίνακας 2.1 Απομονώσεις ιών της οικογένειας Closteroviridae που αναλύθηκαν στην παρούσα μελέτη Γένος και Όνομα ιού Συντομογραφία/ απομόνωση Κωδικοί πρόσβασης στην EMBL-EBI HSP70h Ampelovirus Little cherry virus 2 LChV-2 AF AF GLRaV-1 AF AF GLRaV-1 AF Grapevine leafroll associated virus - 1 GLRaV-1 Y GLRaV-1 AJ GLRaV-1 AY GLRaV-1 EF GLRaV-3 AF AF Grapevine leafroll associated virus - 3 GLRaV-3 AY GLRaV-3 EF WC HSP-10 EF GLRaV-4 - AM GLRaV-4 AF Grapevine leafroll associated virus - 4 GLRaV-4 DQ AM GLRaV-4 LR-Rod AM GLRaV-4 LR-Sav AM GLRaV-4 LR-Rom AM GLRaV-5 AF AF Grapevine leafroll associated virus - 5 GLRaV-5 LR-Pot AM GLRaV-5 LR-K5 AM GLRaV-6 AJ Grapevine leafroll associated virus - 6 GLRaV-6 LR-Mal AM GLRaV-6 LR-Sk AM Grapevine leafroll associated virus - 9 GLRaV-9 AY AY Grapevine leafroll associated virus - Pr (πιθανό είδος) Grapevine leafroll associated virus - De CP GLRaV-Pr1 AM GLRaV-Pr2 AM GLRaV-Pr3 AM AM WC HSP-16 EF GLRaV-De1 AM AM (πιθανό είδος) GLRaV-De2 AM Pineapple mealybug wilt associated virus-1 PMWaV-1 AF AF Pineapple mealybug wilt associated virus-2 PMWaV-2 AF AF Plum bark necrosis stem pitting associated virus PBNSPaV AF Tulip severe mosaic virus TSMV ABM Fig leaf mottle associated virus-2 FLMaV-2 AM Closterovirus Grapevine leafroll associated virus - 2 GLRaV-2 AF AF Beet yellows virus BYV AAF14302 M59452 Beet yellow stunt virus BYSV U51931 U51931 Mint virus-1 MiV1 AAW32895 AAV58835 Fig leaf mottle associated virus-1 FLMaV-1 AM Raspberry mottle virus RMoV DQ DQ Strawberry chlorotic fleck associated virus SCFaV DQ DQ Citrus tristeza virus CTV U16304 U16304 Crinivirus Tomato infectious chlorosis virus TICV U Tomato chlorosis virus ToCV DQ AY Cucurbit yellow stunting disorder virus CYSDV AJ Sweetpotato chlorotic stunt virus SPCSV AJ AJ Potato yellow vein virus PYVV AJ AJ Strawberry pallidosis associated virus SPaV AY AY Cucumber yellows virus CYV AB AB Beet pseudo-yellows virus BPYV AY AY Blackberry yellow vein associated virus BYVV - AY Sweetpotato sunken vein virus SPSVV - CAA56919 Lettuce infectious yellows virus LIYV U15441 U15441 Μη-ταξινομημένα μέλη Grapevine leafroll associated virus - 7 GLRaV-7 Y Little cherry virus 1 LChV-1 Y10237 Y10237 Olive leaf yellowing-associated virus OLYaV AJ Οι κωδικοί πρόσβασης των ακολουθιών που προσδιορίστηκαν στην παρούσα μελέτη σημειώνονται με έντονη γραφή. 49

55 Κεφ. 2. Εξελικτικές σχέσεις ampelo-ιών που ανήκουν σε μια διακριτή υποομάδα Η ανάλυση των προϊόντων της PCR έγινε σε πηκτή αγαρόζης 1,5% (Life Technologies TM ) και στη συνέχεια ακολούθησε χρώση με βρωμιούχο αιθίδιο σύμφωνα με τη διαδικασία που περιγράφεται στο παράρτημα Ι (παρ. 5). Τα επιθυμητά τμήματα DNA αποκόπηκαν από την πηκτή, καθαρίστηκαν με το σύστημα matrix gel extraction system (Marligen Bioscience, USA) και κλωνοποιήθηκαν στον πλασμιδιακό φορέα pcr2.1 χρησιμοποιώντας το Topo TA cloning kit (Invitrogen, The Netherlands) (βλέπε παράρτημα Ι, παρ. 7). Το πλασμιδιακό DNA απομονώθηκε από βακτηριακά κύτταρα με τη χρησιμοποίηση του προϊόντος Nucleobond (Macherey-Nagel, Germany) (βλέπε παράρτημα Ι, παρ. 7), ενώ προσδιορίστηκε η νουκλεοτιδική αλληλουχία των δύο αλυσίδων DNA με τη μέθοδο τερματισμού των διδεόξυ-αναλόγων του Sanger (Sanger και συν., 1977) Ανάλυση αλληλουχιών και κατασκευή φυλογενετικών δέντρων Αλληλουχίες ampelo-ιών και άλλων μελών της Closteroviridae, ήδη δημοσιευμένων ή/και προσδιορισμένων στην παρούσα μελέτη (Πίνακας 2.1), χρησιμοποιήθηκαν για την εξαγωγή φυλογενειών. Δημιουργήθηκαν δύο ομάδες αλληλουχιών (datasets) αμινοξέων από είδη της Closteroviridae, που αντιστοιχούν στο Ν-τελικό άκρο της HSP70h ( αμινοξέα, ανάλογα με το είδος) και σε ολόκληρη την CP ( αμινοξέα), αντίστοιχα. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκαν δύο ομάδες αλληλουχιών νουκλεοτιδίων που περιλάμβαναν 18 ακολουθίες τμήματος της HSP70h (448 νουκλεοτίδια) και 6 της CP ( νουκλεοτίδια), αντίστοιχα από διάφορες απομονώσεις των GLRaV-4, -5, -6, -9, -Pr και -De (Πίνακας 2.1). Ο GLRaV-6 δεν συμπεριλήφθηκε σε καμία από τις ομάδες ακολουθιών της CP λόγω της απουσίας ομόλογων αλληλουχιών. Η στοίχιση των αλληλουχιών αμινοξέων έγινε με τον ProbCons (Do και συν., 2005), έναν αλγόριθμο που χρησιμοποιεί συνδυασμό πιθανολογικών μοντέλων και τεχνικές πολλαπλής στοίχισης που στηρίζονται στην εξαγωγή σταθερών αποτελεσμάτων. Η στοίχιση των νουκλεοτιδικών αλληλουχιών πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με εκείνη των αντίστοιχων μεταφρασμένων αλληλουχιών σε αμινοξέα χρησιμοποιώντας την εντολή Alignment Explorer του προγράμματος MEGA έκδοση 3.1 (Kumar και συν., 2004). Η πιθανότητα παρουσίας ανασυνδυασμών στις δύο ομάδες αλληλουχιών νουκλεοτιδίων αξιολογήθηκε με τον αλγόριθμο GARD, ο οποίος είναι διαθέσιμος 50

56 Κεφ. 2. Εξελικτικές σχέσεις ampelo-ιών που ανήκουν σε μια διακριτή υποομάδα στην ιστοσελίδα (Kosakovsky-Pond και συν., 2006), καθώς και τον SimPlot (Lole και συν., 1999). Τα κατάλληλα μοντέλα αντικατάστασης αμινοξέων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το PROTTEST έκδοση 1.3 με το Bayesian information criterion (BIC) (Abascal και συν., 2004), ενώ τα αντίστοιχα μοντέλα αντικατάστασης νουκλεοτιδίων βρέθηκαν με το FINDMODEL ( /findmodel/findmodel.html). Μετά την επιλογή του βέλτιστου μοντέλου σε κάθε περίπτωση, εφαρμόστηκε το πρόγραμμα PhyML, το οποίο χρησιμοποιεί έναν κλιμακωτό αλγόριθμο που προσαρμόζει την τοπολογία του δέντρου και το μήκος των κλάδων ταυτόχρονα (Guindon & Gascuel, 2003) για την πραγματοποίηση φυλογενετικών αναλύσεων μέγιστης πιθανοφάνειας (ML). Η αξιοπιστία της φυλογενετικής υπόθεσης αξιολογήθηκε με τη χρησιμοποίηση της μη παραμετρικής ανάλυσης bootstrap (NPB). Οι μέσες δια-ειδικές και ενδο-ειδικές γενετικές αποστάσεις των ιών του γένους Ampelovirus που σχετίζονται με την ασθένεια GLRD υπολογίστηκαν με εφαρμογή του μοντέλου Tamura-Nei, το οποίο είναι διαθέσιμο στο MEGA 3.1 (Kumar και συν., 2004), χρησιμοποιώντας τις ομάδες νουκλεοτιδικών αλληλουχιών της HSP70h και της CP και συμπεριλαμβάνοντας ομόλογες γονιδιωματικές αλληλουχίες των GLRaV- 1 και GLRaV-3 (Πίνακας 2.1). Τα ποσοστά ομολογίας των αλληλουχιών σε επίπεδο νουκλεοτιδίων και αμινοξέων προσδιορίστηκαν με το GeneDoc ( /biomed/genedoc). Επιπλέον, στην ομάδα νουκλεοτιδικών αλληλουχιών της CP έγιναν δυο επιπλέον υπολογισμοί γενετικών αποστάσεων χρησιμοποιώντας: α) τα πρώτα 120 νουκλεοτίδια του 5 άκρου και β) τα υπόλοιπα νουκλεοτιδικά κατάλοιπα του 3 άκρου. H πρόβλεψη αντιγονικού περιεχομένου της CP έγινε σύμφωνα με τους Hopp & Woods (1981) με τη χρησιμοποίηση του λογισμικού BioEdit (Hall, 1999) Ανάλυση θετικής Επιλογής (Positive selection analysis) Πραγματοποιήθηκε ανάλυση θετικής επιλογής για τα δύο γονίδια (HSP70h, CP) και των τριών γενών της οικογένειας Closteroviridae. Πιο συγκεκριμένα, επιλέχθηκαν 178 κωδικόνια της CP (που καλύπτουν το C-τελικό άκρο) και χρησιμοποιήθηκαν σε δύο ομάδες αλληλουχιών που αντιστοιχούν στις υποομάδες Ι και ΙΙ των ampelo-ιών (Εικ. 2.1A, 2.2A), έτσι ώστε να δημιουργηθούν στοιχίσεις 51

57 Κεφ. 2. Εξελικτικές σχέσεις ampelo-ιών που ανήκουν σε μια διακριτή υποομάδα χωρίς κενά. Ομοίως, έγινε στοίχιση 141 κωδικονίων από το N-τελικό άκρο της HSP70h και χρησιμοποιήθηκαν τέσσερις ομάδες αλληλουχιών που αντιστοιχούν στους clostero-ιούς, crini-ιούς και τις υποομάδες Ι και ΙΙ των ampelo-ιών, αντίστοιχα. Δεν πραγματοποιήθηκε ανάλυση θετικής επιλογής για την ομάδα αλληλουχιών της CP των clostero- και crini-ιών εξαιτίας των μεγάλων γενετικών αποστάσεων που υπάρχουν μεταξύ διαφορετικών ειδών στα γένη αυτά. Για κάθε ομάδα αλληλουχιών υπολογίστηκαν οι αναλογίες μη-συνώνυμων και συνώνυμων αλλαγών σε κάθε θέση αμινοξέων με τη μέθοδο FEL (Fixed-effects likelihood method, FEL), η οποία είναι πλέον κατάλληλη για ένα μεσαίο αριθμό ακολουθιών (Kosakovsky-Pond και συν., 2005α; Kosakovsky-Pond & Frost, 2005β), στο διαθέσιμο στο διαδίκτυο Datamonkey server ( Ένα βέλτιστο μοντέλο αντικατάστασης νουκλεοτιδίων επιλέχθηκε με τη μέθοδο FEL και στη συνέχεια κατασκευάστηκαν φυλογενετικά δέντρα με τη μέθοδο ένωσης γειτόνων. Η μέθοδος χρησιμοποιήθηκε επίσης για τον υπολογισμό της αναλογίας μη-συνώνυμων αντικαταστάσεων ανά μησυνώνυμη θέση (d N ) προς συνώνυμες αντικαταστάσεις ανά συνώνυμη θέση (d S ), η οποία παρέχει μια ένδειξη των πιέσεων επιλογής που δρουν σε ένα γονίδιο, καθώς και για τον υπολογισμό του 95% διαστήματος εμπιστοσύνης για κάθε ομάδα δεδομένων. Οι τιμές της αναλογίας d N / d S 1 επιδεικνύουν αρνητική επιλογή. 52

58 Κεφ. 2. Εξελικτικές σχέσεις ampelo-ιών που ανήκουν σε μια διακριτή υποομάδα 2.4. Αποτελέσματα Συγκρίσεις αλληλουχιών Όλες οι αλληλουχίες που αποκτήθηκαν στην παρούσα μελέτη συγκρίθηκαν, μετά την απομάκρυνση των περιοχών πρόσδεσης των εκκινητών, με ομόλογες γενετικές περιοχές άλλων ampelo-ιών που είναι ήδη καταχωρημένες στη βάση δεδομένων του NCBI με εφαρμογή του αλγόριθμου BLAST ( Έτσι επιβεβαιώθηκε η ιική τους προέλευση και οι αλληλουχίες κατατέθηκαν στην EMBL-EBI με τους κωδικούς πρόσβασης που παρουσιάζονται στον Πίνακα 2.1 (Παράρτημα ΙΙ). Οι αλληλουχίες που προσδιορίστηκαν περιλάμβαναν τμήματα της HSP70h (448 ζβ) από τον GLRaV-4 (τρεις απομονώσεις), GLRaV-5 (δύο απομονώσεις) και GLRaV-6 (δύο απομονώσεις). Επιπλέον ομόλογες αλληλουχίες της HSP70h από δυο απομονώσεις του GLRaV- De και τρεις του GLRaV-Pr αποκτήθηκαν από εκχυλίσματα ολικού RNA ή αποδιαταγμένου δίκλωνου RNA βιοτύπων Ντεμπίνας, Πρεβεζάνικου και Μαντηλαριάς, αντίστοιχα. Θα πρέπει να επισημανθεί ότι στους βιοτύπους αμπέλου που βρέθηκαν μολυσμένοι με τους GLRaV-Pr ή De δεν ανιχνεύτηκε κανένας από τους γνωστούς ιούς που σχετίζονται με την GLRD όπως προέκυψε από τους ορολογικούς ή μοριακούς (RT-PCR) ελέγχους. Οι ποικιλίες Πρεβεζάνικο και Μαντηλαριά (βιότυποι 1, 3) βρέθηκαν μολυσμένες με τον fovea-ιό GRSPaV. Το τμήμα της αλληλουχίας της HSP70h απομονώσεων του GLRaV-Pr έδειξε μεγαλύτερη ομοιότητα σε αμινοξέα (93-94%) με την ομόλογη γονιδιακή περιοχή μιας πρόσφατα αναγνωρισμένης απομόνωσης ampelo-ιού από τη Νότια Αφρική ( WC HSP-16, αcc. no: EF103905). Ομοίως, οι αντίστοιχες ακολουθίες τμήματος της HSP70h απομονώσεων του GLRaV-De ήταν πιο κοντά γενετικά με τον GLRaV-5 (ομοιότητα αμινοξέων 86-89%) και τον GLRaV-9 (ομοιότητα αμινοξέων 87-89% ). Οι εκφυλισμένοι εκκινητές που σχεδιάστηκαν στη μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκαν επιτυχώς για την ενίσχυση του γονιδίου της CP απομονώσεων των GLRaV-De και GLRaV-Pr, με εκχυλίσματα dsrna από βιοτύπους Ντεμπίνας και Μαντηλαριάς, αντίστοιχα. Η CP του GLRaV-Pr είναι ελαφρώς μεγαλύτερη (273 αμινοξέα), με ένα προβλεπόμενο μοριακό βάρος (M.B.) ~30kDa, παρόμοιο σε μέγεθος με αυτό της ομόλογης γενετικής περιοχής του GLRaV-4 (272 αμινοξέα). 53

59 Κεφ. 2. Εξελικτικές σχέσεις ampelo-ιών που ανήκουν σε μια διακριτή υποομάδα Α) LR -SK 96 LR -Mal 62 AJ GLRaV-De GLRaV-De2 AY AF LR -K5 100 LR -Pot DQ AF LR -Rom 91 LR -Rod LR -Sav 100 EF GLRaV-Pr1 61 GLRaV-Pr3 GLRaV-Pr2 PBNSPaV PMWaV-1 TSMV LChV-2 FLMaV-2 97 AF AY EF GLRaV-3 EF PMWaV-2 AJ Y AF GLRaV-1 AF EF AY SCFaV CTV MiV-1 RMoV FLMaV-1 GLRaV-2 BYSV 82 BYV OLYaV 79 GLRaV-7 LChV-1 99 LIYV TICV ToCV 98 CYSDV 83 SPCSV 67 PYVV SPaV BPYV CYV Υποομάδα ΙΙ GLRaV-6 GLRaV-De GLRaV-9 GLRaV-5 GLRaV-4 GLRaV-Pr Υποομάδα Ι Ampelovirus Closterovirus Crinivirus Β) AJ96796 LR-SK LR-Mal GLRaV-6 96 GLRaV-De1 GLRaV-De2 GLRaV- - De 86 AF LR-K5 GLRaV-5 99 LR-Pot AY GLRaV-9 94 DQ AF LR-Rom LR-Sav LR-Rod GLRaV-4 63 EF GLRaV-Pr1 100 GLRaV-Pr2 GLRaV- - Pr 77 GLRaV-Pr3 PMWaV-1 Εικόνα 2.1 Φυλογενετικά δέντρα που κατασκευάστηκαν με ανάλυση μέγιστης πιθανοφάνειας χρησιμοποιώντας την ομάδα ομόλογων αλληλουχιών που αντιστοιχούν στο τμήμα της HSP70h. A) Δέντρο που κατασκευάστηκε με αλληλουχίες αμινοξέων της οικογένειας Closteroviridae. Η ρίζα του δέντρου τοποθετήθηκε στο ενδιάμεσο σημείο του μακρύτερου κλάδου (midpoint rooted) B) Δέντρο που κατασκευάστηκε με νουκλεοτιδικές αλληλουχίες των συγγενών με τον GLRaV-5 ampelo-ιών χρησιμοποιώντας τον PMWaV-1 ως taxon αναφοράς (out-group). Οι αριθμοί πάνω από κάθε κλάδο είναι οι τιμές της μη-παραμετρικής ανάλυσης bootstrap (NPB) που δίνονται ως ποσοστά 1000 επαναλήψεων. Παρουσιάζονται μόνο τιμές με P > 0.6. Οι ιοί που περιλαμβάνονται υποδεικνύονται στον Πίνακα 2.1. Οι GLRaVs αναφέρονται με τους κωδικούς πρόσβασης τους στη βάση δεδομένων εκτός από τις αλληλουχίες που προσδιορίστηκαν στην παρούσα μελέτη που παρουσιάζονται με έντονη γραφή και το όνομα της απομόνωσής τους. 54

60 Κεφ. 2. Εξελικτικές σχέσεις ampelo-ιών που ανήκουν σε μια διακριτή υποομάδα GLRaV-De1 95 AY AF AM AM GLRaV-Pr3 64 PMWaV GLRaV-De GLRaV-9 GLRaV-5 GLRaV-4 Α) Β) GLRaV-Pr LChV-2 AF GLRaV-1 PMWaV-2 AF GLRaV-3 78 SCFaV 97 CTV RMoV 99 MiV-1 66 BYSV BYV 68 GLRaV SPSVV SPCSV ToCV LIYV 99 LChV-1 PYVV BYVV 96 SPaV BPYV CYV Υποομάδα Ι Υποομάδα ΙΙ Ampelovirus Closterovirus Crinivirus AY AF GLRaV-De1 AM AM GLRaV-Pr3 PMWaV-1 GLRaV-9 GLRaV-5 GLRaV -De GLRaV-4 GLRaV -Pr Εικόνα 2.2 Φυλογενετικά δέντρα που κατασκευάστηκαν με ανάλυση μέγιστης πιθανοφάνειας χρησιμοποιώντας την ομάδα ομόλογων αλληλουχιών που αντιστοιχούν στην CP. A) Δέντρο που κατασκευάστηκε με αλληλουχίες αμινοξέων της οικογένειας Closteroviridae. Η ρίζα του δέντρου τοποθετήθηκε στο ενδιάμεσο σημείο του μακρύτερου κλάδου (midpoint rooted) B) Δέντρο που κατασκευάστηκε με νουκλεοτιδικές αλληλουχίες ampelo-ιών συγγενικών του GLRaV-5 χρησιμοποιώντας τον PMWaV-1 ως taxon αναφοράς (out-group). Οι αριθμοί πάνω από κάθε κλάδο είναι οι τιμές μη-παραμετρικής ανάλυσης bootstrap (NPB) που δίνονται ως ποσοστά 1000 επαναλήψεων. Παρουσιάζονται μόνο τιμές με P > 0.6. Οι ιοί που περιλαμβάνονται υποδεικνύονται στον Πίνακα 2.1. Οι GLRaVs αναφέρονται με τους κωδικούς πρόσβασης τους στη βάση δεδομένων εκτός από τις αλληλουχίες που προσδιορίστηκαν στην παρούσα μελέτη που παρουσιάζονται με το όνομα της απομόνωσής τους σε έντονη γραφή. 55

61 Κεφ. 2. Εξελικτικές σχέσεις ampelo-ιών που ανήκουν σε μια διακριτή υποομάδα Αντιθέτως, η CP του GLRaV-De έχει μικρότερο μέγεθος (269 αμινοξέα) και ένα θεωρητικό M.B. ~29kDa και είναι πιο κοντά στους GLRaV-5 (269 αμινοξέα) και GLRaV-9 (268 αμινοξέα). Δυστυχώς, παρά τις αλλεπάλληλες προσπάθειες χρησιμοποιώντας τους εκφυλισμένους εκκινητές που αναφέρονται στα υλικά και μέθοδοι (παρ ), δεν ήταν δυνατό να πολλαπλασιαστεί η CP του GLRaV-6, η οποία ακόμη παραμένει άγνωστη. Τέλος, με τη χρησιμοποίηση μονοκλωνικών αντισωμάτων (ευγενική χορηγία Dr P. Gugerli), ανιχνεύθηκαν εκτός από τον GLRaV- Pr και όλες οι απομονώσεις των GLRaV-4, -5, -6 και GLRaV-De Φυλογενετική ανάλυση Για τις φυλογενετικές αναλύσεις επιλέχθηκε ένα μοντέλο αντικατάστασης αμινοξέων, που παρήγαγε τις χαμηλότερες τιμές BIC για κάθε ομάδα ακολουθιών. Συγκεκριμένα, το μοντέλο WAG + di + dγ επιλέχτηκε για τις δύο ομάδες ακολουθιών αμινοξέων της οικογένειας Closteroviridae. Για τις ομάδες νουκλεοτιδικών αλληλουχιών, επιλέχτηκαν τα GTR + dγ και Tamura-Nei + dγ για την ανάλυση της HSP70h και της CP, αντίστοιχα. Τα δύο φυλογενετικά δέντρα που προέκυψαν από την ML ανάλυση των ομάδων αλληλουχιών αμινοξέων της HSP70h και της CP, έδωσαν όμοιες τοπολογίες και διαχώρισαν τα γένη Ampelovirus, Closterovirus και Crinivirus ως ξεχωριστές μονοφυλετικές ομάδες (Εικ. 2.1A, 2.2A). Επιπλέον, οι ampelo-ιοί διαχωρίστηκαν περαιτέρω σε δύο διαφορετικές υποομάδες (I και II) και στα δύο δέντρα. Οι απομονώσεις των υπό μελέτη ampelo-ιών, δηλαδή των GLRaV-4, -5, -6, -9, -Pr και - De, εντάχθηκαν στην ίδια ομάδα που ήταν πιο κοντινή γενετικά με τον PMWaV-1. Δυστυχώς, με τη χρησιμοποίηση αλληλουχιών αμινοξέων, οι φυλογενετικές σχέσεις που προέκυψαν μεταξύ μελών αυτής της υποομάδας δεν υποστηρίζονταν από υψηλές τιμές bootstrap ώστε να διαχωρίσουν όλα τα είδη ως διακριτές γενεαλογίες. Επίσης, οι GLRaV-1 και GLRaV-3, οι δύο άλλοι ιοί του γένους Ampelovirus της αμπέλου, ομαδοποιήθηκαν στην άλλη υποομάδα (II) του γένους και συνεπώς ήταν απομακρυσμένοι γενετικά από τους GLRaV-4, -5, -6, -9, -Pr και -De. Στα φυλογενετικά δέντρα που κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας τις ομάδες νουκλεοτιδικών αλληλουχιών (Εικ. 2.1B, 2.2B), η τοπολογία της CP έδειξε μια στενότερη σχέση μεταξύ των GLRaV-9 και -5. Οι δύο απομονώσεις των GLRaV-De 56

62 Κεφ. 2. Εξελικτικές σχέσεις ampelo-ιών που ανήκουν σε μια διακριτή υποομάδα και GLRaV-Pr ήταν εμφανώς διακριτές από τα άλλα είδη με τον GLRAV-Pr να είναι ο πιο απομακρυσμένος γενετικά (Εικ. 2.2B). Επιπλέον, η τοπολογία της HSP70h GLRaV-5 GLRaV-5 LR-Pot GLRaV-5 LR-K5 GLRaV-4 GLRaV-4 GLRaV-4 LR-Rod GLRaV-4 LR-Sav GLRaV-4 LR-Rom GLRaV-6 GLRaV-6 LR-Mal GLRaV-6 LR-Sk GLRaV-9 WC HSP-16 GLRaV-Pr1 GLRaV-Pr2 GLRaV-Pr3 GLRaV-De1 GLRaV-De LCFSAGRGVDGCVPESDTVYIPTVVGIRKDGTYTIGLGALLEKDVLVYRDIKRYFGMNKFNAEVYKKKLKPKFEVIVKNWSAYIGPSSGEKGKTRSVIAL...R...AT.Y...V......R...AT.Y...V......I...N...NT.MM..R...L..D..VS...V......I...N...V...DT.MR..R...V..E.AVS...V......E...I...N...I...DQ.RM..R...Q..D..VS...V......E...I...N...ENI.I...DK.MM...Q..D..VS...V......E...I...N...I...DQ.MM...L..D..VS...V......N...I...A...P.L...G.R...V...C...L.....I...PNL...S.R...V..S...C...L.....I...PNL...G.R...V...C...L.....E...S...L...V...T..Q......I...V.R...I...DS.ME...N...T..T...V...T....I...V.R...R.I...DS.L...N...T...V...R......I...V.R...R...DS.M...N...V...R......V.R...R...DS.M...N...V...R......E...I...P..M...T.RN...D...T...A......E...I...S..M...S.RS...D...T...A... GLRaV-5 GLRaV-5 LR-Pot GLRaV-5 LR-K5 GLRaV-4 GLRaV-4 GLRaV-4 LR-Rod GLRaV-4 LR-Sav GLRaV-4 LR-Rom GLRaV-6 GLRaV-6 LR-Mal GLRaV-6 LR-Sk GLRaV-9 WC HSP-16 GLRaV-Pr1 GLRaV-Pr2 GLRaV-Pr3 GLRaV-De1 GLRaV-De ACMFVSALAKMAVSITGSAVKLSVCSVPAEYSSYMRNFIFQGCNLAKIQ...T...S......T...S......L...E..T......E..T...A......E..T...D.H...E..T...N.H...V..T...N.H...KM...V...S.S...M...KM...V...S.S...M...KM...V...S.S...M...T...S.S......VR...Q...TQ.S...S.K...H...R...Q...TQ.S...K...H...VR...Q...TQ.S...K...H...VR...Q...TQ.S...K...H...M..N..T...T...M...V...M...S.T.T...T...VM A) GLRaV-De1 GLRaV-9 GLRaV-5 GLRaV-Pr3 GLRaV-4 GLRaV-4 GLRaV-De1 GLRaV-9 GLRaV-5 GLRaV-Pr3 GLRaV-4 GLRaV MSGTVDPA-VP-SV--PTSSPLPESEADKRAREEKEKRELEEIESLPVVQGRTTVGTFEALISSTNGVLDISKVEIPRLFNVTIPGVVSGKHKVLGAKAI.AQVPT-T-A.-A.--S.PPLT..T.EERKR...R..K...P.KN..D...N...A.LQ...R.....ASQNV-A.-AL--..T..TH.T..ERK...D...AD...Q...I...D...N.S...L.RL.L...I..R.L.TER.TASNP.TG.AQ..VPERG.TPEQ.K...DR..A.ID..N...A...V..E...S..NGN.T..NLTTLN...A...A...I...L.ASVGNN.Q..-G.SP.IVP.RT.T.ELR...Q.RKD...NA...AT.KV..D..D...N.A...LT.L...A...I...T..R.L.ASVGNN.QT.-G.SP.IVP.RT.T.EQR...Q..KD...NA...AT.KV..D..D...N.A...LT.L...A...I...T..R.L WNLGKAKGISESDKHQIQFLMQAFQDFITHSTSPKVSSASNRTITGKYDGKEVTVAHDEIKTALDNSIGSFGYENTPRQFGRAFTAAIVQGISSGKLEVN...S...R..V...T...S......S...V...S...S....E...R..V...V...GS...S...R...D.V...T...AA...L....A...V..M..V...T...L....A...V..M..V...T...L... GLRaV-De1 GLRaV-9 GLRaV-5 GLRaV-Pr3 GLRaV-4 GLRaV TKICASHGVPPNYYPYSPDCLHVDARLFGYDASLAAELGKMVAINKPSNGSRVTHNLYEDTKVAPDIFLGNRR...SN...R......SN.A...R......A...KA...R...K...I...KA...R......I...T...KA...R... B) Εικόνα 2.3 Πολλαπλή στοίχιση αμινοξέων A) τμήματος της HSP70h και B) αλληλουχιών της CP των συγγενών με τον GLRaV-5 ampelo-ιών. 57

63 Κεφ. 2. Εξελικτικές σχέσεις ampelo-ιών που ανήκουν σε μια διακριτή υποομάδα ομαδοποίησε κάθε ομάδα απομονώσεων που αντιπροσώπευαν ένα είδος ως μια ανεξάρτητη εξελικτικά γενεαλογία, που υποστηριζόταν από υψηλές τιμές bootstrap. Μέσα σε κάθε ομάδα, οι απομονώσεις έδειξαν πολύ μικρές γενετικές αποστάσεις (Εικ. 2.1B). Τέλος, η πρόσφατα αναγνωρισμένη απομόνωση WC HSP-16 (Prosser και συν., 2007), που είχε προηγουμένως καταταχθεί ως πιθανή απομόνωση του GLRaV-5 για την οποία μόνο ένα τμήμα της HSP70h είναι γνωστό (Acc. no. EF103905), ομαδοποιήθηκε με απομονώσεις του GLRaV-Pr Μοριακή παραλλακτικότητα και γενετικές αποστάσεις μεταξύ απομονώσεων των GLRaV-4, -5, -6, -9, - Pr και -De Δεν εντοπίστηκε κανένας ανασυνδυασμός στις ομάδες ακολουθιών νουκλεοτιδίων που μελετήθηκαν χρησιμοποιώντας τους αλγόριθμους GARD και SimPlot. Μέσα στην ομάδα ακολουθιών της HSP70h της υποομάδας Ι των ampelo-ιών, όλες οι αλληλουχίες ήταν πλήρως στοιχισμένες χωρίς καθόλου κενά. Υψηλός βαθμός συντήρησης των αλληλουχιών παρατηρήθηκε σε όλο το μήκος της πολλαπλής στοίχισης, ο οποίος ήταν ακόμη μεγαλύτερος όταν χρησιμοποιήθηκαν οι αντίστοιχες αλληλουχίες σε αμινοξέα (Εικ. 2.3A). Πιο συγκεκριμένα, οι ομοιότητες σε νουκλεοτίδια και αμινοξέα μεταξύ διαφορετικών ειδών της ομάδας κυμαίνονταν μεταξύ 69-79% και 83-93% αντίστοιχα, ενώ οι αντίστοιχες ενδο-ειδικές ομοιότητες ήταν 82-98% και %. Η υψηλότερη ενδο-ειδική παραλλακτικότητα παρατηρήθηκε στον GLRaV-4 (μέχρι 18% σε νουκλεοτίδια και 11% σε αμινοξέα), ενώ ο GLRaV-6 είναι ο πιο συντηρημένος (3-5% σε νουκλεοτίδια και 3-4% σε αμινοξέα). Οι αλληλουχίες της υποομάδας Ι συγκρίθηκαν με τις ομόλογες των πιο απομακρυσμένων GLRaV-1 και GLRaV-3 και έδειξαν πολύ χαμηλότερες ομοιότητες που κυμαίνονταν μεταξύ 39-49% σε νουκλεοτίδια και 27-31% σε αμινοξέα. Οι μέσες ενδο-ειδικές γενετικές αποστάσεις κυμαίνονταν από 0,036 ± 0,007 μέχρι 0,155 ± 0,016 για την υποομάδα Ι ενώ οι αντίστοιχες τιμές για τους GLRaV-1 και GLRaV-3 ήταν 0,145 ± 0,015 και 0,042 ± 0,008. Περιορισμένη παραλλακτικότητα διαπιστώθηκε μεταξύ ειδών της υποομάδας Ι με τη μικρότερη απόσταση να παρατηρείται μεταξύ των GLRaV-5 και GLRaV-De και τη μεγαλύτερη μεταξύ των GLRaV-6 και GLRaV-Pr. Οι γενετικές αποστάσεις μεταξύ των ειδών ήταν πολύ 58

64 Κεφ. 2. Εξελικτικές σχέσεις ampelo-ιών που ανήκουν σε μια διακριτή υποομάδα μικρότερες στην υποομάδα Ι σε σχέση με εκείνες που προέκυψαν από αντίστοιχες συγκρίσεις με τους GLRaV-1 και GLRaV-3 (Πίνακας 2.2). Η στοίχιση της ομάδας αλληλουχιών της CP από ιούς της υποομάδας Ι έδειξε παρόμοιο βαθμό συντήρησης, ο οποίος ήταν μεγαλύτερος σε επίπεδο αμινοξέων (Εικ. 2.3B). Ένα μεγάλο τμήμα της CP που καλύπτει το 3 ήμισυ του γονιδίου ήταν αξιοσημείωτα συντηρημένο μεταξύ όλων των συμπεριλαμβανομένων ιών. Πίνακας 2.2 Μέσος όρος δια-ειδικών γενετικών αποστάσεων, όπως υπολογίστηκαν με το μοντέλο Tamura-Nei (MEGA3.1 software) για την ομάδα αλληλουχιών της HSP70h, όλων των ιών της αμπέλου της υποομάδας Ι καθώς και απομονώσεων των GLRaV-1 και GLRaV-3 GLRaV-3 GLRaV-3 GLRaV-Pr GLRaV-4 GLRaV-5 GLRaV-6 GLRaV-9 GLRaV-De GLRaV-1 GLRaV-Pr ± GLRaV ± GLRaV ± GLRaV ± GLRaV ± GLRaV-De ± GLRaV ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± *συμπεριλαμβάνεται το τυπικό σφάλμα. Οι δια-ειδικές ομοιότητες σε νουκλεοτίδια και αμινοξέα κυμαίνονταν μεταξύ 67-80% και 75-86% αντίστοιχα, ενώ οι αντίστοιχες ομοιότητες με τους GLRaV-1 και GLRaV-3 ήταν πολύ μικρότερες (32-37% σε νουκλεοτίδια και 16-22% σε αμινοξέα). Οι Tamura-Nei γενετικές αποστάσεις μεταξύ ειδών της υποομάδας Ι κυμαίνονταν μεταξύ 0,226 και 0,405, ενώ οι αντίστοιχες αποστάσεις από τους GLRaV-1 και GLRaV-3 ήταν σημαντικά μεγαλύτερες (Πίνακας 2.3). Το διάγραμμα ομοιότητας (similarity plot) των αλληλουχιών που περιλαμβάνονται στις αλληλουχίες της CP της υποομάδας Ι έδειξαν μια αύξηση στο ποσοστό ομοιότητας (>50%) μετά τα πρώτα 120 νουκλεοτίδια (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ομοίως μια διαφορετική συμπεριφορά υδροφιλικότητας παρατηρήθηκε μεταξύ των πρώτων 40 αμινοξέων του N-τελικού άκρου και του υπόλοιπου γονιδίου. Αυτή η περιοχή εμφάνισε μεγαλύτερη υδροφιλικότητα και αντιγονικό περιεχόμενο (Εικ. 2.4). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι 59

65 Κεφ. 2. Εξελικτικές σχέσεις ampelo-ιών που ανήκουν σε μια διακριτή υποομάδα δεν παρατηρήθηκε αντίστοιχη υδροφιλικότητα στο N-τελικό άκρο της CP των GLRaV-1 και GLRaV-3 (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Περαιτέρω υπολογισμός της μοριακής παραλλακτικότητας και των γενετικών αποστάσεων που πραγματοποιήθηκε ξεχωριστά στα πρώτα 120 νουκλεοτίδια και την υπόλοιπη περιοχή έδειξε υψηλή δια-ειδική παραλλακτικότητα (34-62% σε νουκλεοτίδια, 29-52% σε αμινοξέα) όπως και ετερογένεια των Tamura-Nei γενετικών αποστάσεων (d: 0,505-1,139) στο 5 άκρο της CP ιών της υποομάδας Ι. Ένα μεγαλύτερο επίπεδο συντήρησης σε νουκλεοτίδια (69-83%) και αμινοξέα (81-93%) παρατηρήθηκε στην υπόλοιπη περιοχή (d: 0,184-0,375). Πίνακας 2.3 Μέσος όρος δια-ειδικών γενετικών αποστάσεων, όπως υπολογίστηκαν με το μοντέλο Tamura-Nei (MEGA3.1 software) για την ομάδα νουκλεοτιδικών αλληλουχιών της CP, των ιών της αμπέλου της υποομάδας Ι καθώς και απομονώσεων των GLRaV-1 και GLRaV-3 GLRaV-3 GLRaV GLRaV-3 GLRaV-1 GLRaV-De GLRaV-9 GLRaV-5 GLRaV-Pr GLRaV-4 GLRaV-De GLRaV GLRaV GLRaV-Pr GLRaV Θετική επιλογή (Positive selection) Οι υπολογισμοί των d N / d S για τις ομάδες ακολουθιών της CP και της HSP70h έδειξαν διαφορετικά μοτίβα εξέλιξης για τα τρία γένη της οικογένειας Closteroviridae (Πίνακας 2.4). Διαπιστώθηκαν σημαντικές διαφορές ακόμη και μέσα στις δυο υποομάδες των ampelo-ιών που αναλύθηκαν. Η τιμή της αναλογίας d N /d S για την υποομάδα I, ήταν 0,085 και 0,091 για την CP και την HSP70h αντίστοιχα, υποδεικνύοντας ισχυρή πίεση αρνητικής επιλογής. Οι τιμές αυτές ήταν σημαντικά μικρότερες από εκείνες της υποομάδας II. Ένας μεγάλος αριθμός αρνητικά επιλεγμένων κωδικονίων αναγνωρίστηκε και στις δύο ομάδες αλληλουχιών της υποομάδας I. Η μέθοδος FEL ανέδειξε 129 και 115 αρνητικά επιλεγμένες θέσεις στην CP και την HSP70h, αντίστοιχα (σημαντικές σε επίπεδο p < 0.1). Αυτοί οι αριθμοί ήταν υψηλότεροι από εκείνους που υπολογίστηκαν για την υποομάδα II των ampelo-, crini- και clostero-ιών (Πίνακας 2.4). Τέλος, εκτός από μία θετικώς επιλεγμένη θέση 60

66 Κεφ. 2. Εξελικτικές σχέσεις ampelo-ιών που ανήκουν σε μια διακριτή υποομάδα Εικόνα 2.4 Προφίλ υδροφιλικότητας της CP ampelo-ιών της υποομάδας Ι (GLRaV-4, -5, -9, -Pr, -De). Οι μέσες τιμές αντιγονικότητας απεικονίζονται ανά θέση κατά μήκος της αλληλουχίας αμινοξέων. Ο άξονας x περιλαμβάνει 273 κατάλοιπα, καθένα από τα οποία αντιπροσωπεύει ένα αμινοξύ της CP. Ο αξόνας y αντιπροσωπεύει το εύρος των τιμών υδροφιλικότητας (από 3 εώς -3,4) (Hope & Woods, 1981). 61

67 Κεφ. 2. Εξελικτικές σχέσεις ampelo-ιών που ανήκουν σε μια διακριτή υποομάδα στην HSP70h των crini-ιών, η μέθοδος FEL δεν αναγνώρισε καμιά άλλη θέση με ένδειξη θετικής επιλογής (σημαντική στο επίπεδο p < 0.1). Πίνακας 2.4 Αναλογίες d N /d S και αριθμοί θέσεων που υπόκεινται σε θετική και αρνητική επιλογή σε διάφορες ομάδες αλληλουχιών, όπως υπολογίστηκαν από το μοντέλο αντικατάστασης FEL Ομάδα αλληλουχιών CP Μέσος όρος Αναλογία d N /d S Ελάχιστη και μέγιστη τιμή Αριθμός θέσεων που υπόκεινται σε θετική επιλογή Αριθμός θέσεων που υπόκεινται σε αρνητική επιλογή Αριθμός % Αριθμός % Ampelovirus 0,085 0,079-0, ,5 υποομάδα I Ampelovirus 0,325 0,311-0, ,8 υποομάδα II Closterovirus NA α NA NA NA NA NA Crinivirus NA NA NA NA NA NA HSP70h Ampelovirus 0,091 0,086-0, ,5 υποομάδα I Ampelovirus 0,201 0,195-0, ,7 υποομάδα II Closterovirus 0,257 0,250-0, ,2 Crinivirus 0,178 0,173-0, ,1 Οι ομάδες αλληλουχιών αντιπροσωπεύονται από τα γονίδια των HSP70h (141 κωδικόνια) και CP (178 κωδικόνια) και περιλάμβαναν τους ακόλουθους ιούς. CP: Ampelovirus υποομάδα I (GLRaV-4,-5,-9,- De,-Pr και PMWaV-1), Ampelovirus υποομάδα II (GLRaV-1,-3, PMWaV-2 και LChV-2), Closterovirus (BYSV, BYV, GLRaV-2, MiV1, RMoV, SCFaV και CTV), Crinivirus (SPSVV, SPCSV, ToCV, LIYV, SPaV, BPYV, CYV, BYVV και PYVV). HSP70h: Ampelovirus υποομάδα I (GLRaV-4,-5,-6,-9,-De,-Pr και PMWaV-1), Ampelovirus υποομάδα II (GLRaV-1,-3, PMWaV-2, FLMaV-2 και LChV-2), Closterovirus (BYSV, BYV, GLRaV-2, MiV1, RMoV, SCFaV, FLMaV-1 και CTV), Crinivirus (SPCSV, ToCV, LIYV, TICV, CYSDV, SPaV, BPYV, CYV και PYVV) α NA, μη εφαρμόσιμο 62

68 Κεφ. 2. Εξελικτικές σχέσεις ampelo-ιών που ανήκουν σε μια διακριτή υποομάδα 2.5. Συζήτηση Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκαν οι εξελικτικές σχέσεις των GLRaV-4, -5, - 6, -9 και των πρόσφατα απομονωμένων GLRaV-De και GLRaV-Pr, με βάση τις γονιδιακές περιοχές που κωδικοποιούν την HSP70h και την CP. Συνολικά, παρατηρήθηκε υψηλό επίπεδο συντηρημένων ακολουθιών μεταξύ των διαφορετικών ειδών που μελετήθηκαν και για τις δύο γενετικές περιοχές. Η μικρότερη δια-ειδική παραλλακτικότητα ήταν 7 % και 14% σε αμινοξέα για την HSP70h και τη CP, αντίστοιχα. Αυτές οι τιμές είναι οριακές για διαχωρισμό των ειδών και θα μπορούσαν να συγκριθούν με αντίστοιχες τιμές ενδο-ειδικής παραλλακτικότητας clostero-ιών (LChV-2, CTV, GLRaV-2 και GLRaV-4) που εμφανίζουν μεγάλη γενετική ποικιλομορφία (Mawassi και συν., 1996; Angelini και συν., 2004; Rott & Jelkmann, 2004; Meng και συν., 2005; Παρούσα μελέτη). Ενδιαφέρον παρουσιάζει επίσης το γεγονός ότι παρατηρήθηκε μια αλληλοεπικάλυψη μεταξύ της υψηλότερης (93%) διαειδικής (GLRaV-5 GLRaV-9) και της χαμηλότερης (89%) ενδο-ειδικής (GLRaV-4) ομοιότητας σε αμινοξέα στο γονίδιο της HSP70h. Επιπλέον, οι γενετικές αποστάσεις Tamura-Nei μεταξύ των συγγενικών με τον GLRaV-5 ampelo-ιών ήταν σημαντικά μικρότερες και για τα δύο γονίδια από τις αντίστοιχες τιμές που αφορούσαν συγκρίσεις με τους GLRaV-1 ή GLRaV-3, αντίστοιχα (Πίνακες 2.2 και 2.3). Όσον αφορά την CP, η ανάλυση του προφίλ υδροφιλικότητας της πρωτεΐνης έδειξε ένα ισχυρό αντιγονικό περιεχόμενο στο N-τελικό άκρο (πρώτα 40 αμινοξέα) για όλους τους συγγενικούς με τον GLRaV-5 ampelo-ιούς, υποδεικνύοντας ότι αυτή η περιοχή είναι εκτεθειμένη στην επιφάνεια του ιικού σωματιδίου όπως αποδείχτηκε στο παρελθόν για ιούς των γενών Potyvirus και Potexvirus (Shukla και συν., 1988; Sober και συν., 1988) (Εικ. 2.4). Επιπλέον, σε αντίθεση με το πολύ συντηρημένο C ήμισυ της πρωτεΐνης, υψηλή παραλλακτικότητα παρατηρήθηκε στο Ν-τελικό άκρο, μεταξύ των αλληλουχιών διαφορετικών μελών της ομάδας. Κατά συνέπεια, οι διαφορές αυτές στις αλληλουχίες μπορεί να αντικατοπτρίζουν αντίστοιχες διαφορές στις αντιγονικές περιοχές των πολυπεπτιδίων γεγονός το οποίο, παρά τη συγγένειά τους, θα μπορούσε να ερμηνεύσει την ορολογική παραλλακτικότητα που παρατηρείται μεταξύ των συγγενικών με τον GLRaV-5 ampelo-ιών. Η παραλλακτικότητα αυτή μπορεί να φτάσει ακόμη και στο επίπεδο του στελέχους (ενός ιού), όπως ήταν η περίπτωση δυο διαφορετικών παραλλαγών (variants) του GLRaV-4 που δεν ανιχνεύονταν αξιόπιστα με ειδικό αντιορό (Saldarelli και συν., 2006). Ωστόσο, παρά τη δια-ειδική γενετική παραλλακτικότητα στο N-τελικό άκρο 63

69 Κεφ. 2. Εξελικτικές σχέσεις ampelo-ιών που ανήκουν σε μια διακριτή υποομάδα της πρωτεΐνης, η σημαντική διατήρηση της αλληλουχίας στην υπόλοιπη CP δείχνει ότι αυτή η γενετική περιοχή υπόκειται σε ισχυρή πίεση αρνητικής επιλογής. Ενδιαφέρον παρουσιάζει ακόμη η παρατήρηση ότι το μέγεθος της CP μεταξύ των συγγενών με τον GLRaV-5 ampelo-ιών ( αμινοξέα) είναι σημαντικά μικρότερο από εκείνο των περισσότερο απομακρυσμένων γενετικά ampelo-ιών GLRaV-1 και -3 ( αμινοξέα) με αυτές τις διαφορές να εντοπίζονται κυρίως στο ιδιαίτερα μεταβλητό N-τελικό άκρο (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Οι γενετικές σχέσεις μεταξύ των ιών του γένους Ampelovirus της αμπέλου διερευνήθηκαν περαιτέρω με ML φυλογενετικές αναλύσεις, χρησιμοποιώντας αρκετά μεγάλες ομάδες ακολουθιών που αντιστοιχούν σε τμήμα του γονιδίου που κωδικοποιεί την HSP70h και σε ολόκληρο το γονίδιο της CP, ακριβείς στοιχίσεις των ακολουθιών και κατάλληλα μοντέλα αντικατάστασης νουκλεοτιδίων ή αμινοξέων. Οι τοπολογίες που προέκυψαν και για τις δυο ομάδες αλληλουχιών αμινοξέων, της HSP70h και CP αντίστοιχα, επιβεβαίωσαν τις στενές φυλογενετικές σχέσεις των GLRaV-4, -5, -6, -9, -Pr και GLRaV-De ομαδοποιώντας όλα τα είδη σε μια διακριτή μονοφυλετική γενεαλογία (Εικ. 2.1A, 2.2A). Αυτή η ομάδα ιών διαφοροποιείται εμφανώς από τους GLRaV-1 και GLRaV-3, που εμπλέκονται επίσης στην αιτιολογία της GLRD. Η φυλογένεια που προέκυψε χρησιμοποιώντας την ομάδα νουκλεοτιδικών αλληλουχιών της HSP70h ομαδοποίησε το σύνολο των απομονώσεων ενός είδους ιού ως μια ανεξάρτητη εξελικτικά γενεαλογία (Εικ 2.1B). Στο φυλογενετικό δέντρο που προέκυψε από την CP, παρατηρήθηκε μεγαλύτερη συσχέτιση μεταξύ των GLRaV-4, 5, -9 και -De (Εικ. 2.2A, B), ενώ η απομόνωση του GLRaV-Pr ήταν πιο απομακρυσμένη. Αυτή η ομαδοποίηση αντικατοπτρίζει επίσης τις ορολογικές σχέσεις των παραπάνω ιών, καθώς ο GLRaV-Pr ήταν η μόνη απομόνωση ιού αυτής της γενεαλογίας, που δεν ανιχνεύθηκε ορολογικά με το ευρέως φάσματος μονοκλωνικό αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη (wide-spectrum Mab, Dr. P. Gugerli). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι κατασκευάστηκαν επίσης φυλογενετικά δέντρα με τη μέθοδο ένωσης γειτόνων (NJ trees) χρησιμοποιώντας τις ομάδες νουκλεοτιδικών αλληλουχιών της HSP70h και της CP ωστόσο οι τιμές bootstrap που προέκυψαν ήταν οριακές, ενώ η ομαδοποίηση των GLRaV-4, -5, -9 και -De δεν υποστηριζόταν (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επίσης, η απομόνωση WC HSP-16 (Prosser και συν., 2007), η οποία είχε προηγουμένως ενταχθεί ως πιθανή απομόνωση του GLRaV-5 μετά από φυλογενετική ανάλυση ένωσης γειτόνων (NJ phylogeny), 64

70 Κεφ. 2. Εξελικτικές σχέσεις ampelo-ιών που ανήκουν σε μια διακριτή υποομάδα στη μελέτη αυτή ομαδοποιήθηκε με απομονώσεις του GLRaV-Pr και αυτό υποστηρίχτηκε από υψηλές τιμές bootstrap. Τέλος, με βάση τις ML φυλογενετικές αναλύσεις με ανάλυση bootstrap της HSP70h και της CP οι απομονώσεις των GLRaV-Pr και GLRaV-De διαφοροποιούνται εμφανώς από τα άλλα συγγενή είδη, ενώ θα πρέπει να σημειωθεί πως δεν προέκυψε ορολογική αντίδραση των ιών αυτών με ειδικά αντισώματα εναντίον όλων των ήδη γνωστών ιών που σχετίζονται με την ασθένεια GLRD. Οι ιοί της αμπέλου που κατατάσσονται στην υποομάδα Ι του γένους Ampelovirus, σε σχέση με άλλους φυλογενετικούς κλάδους της οικογένειας Closteroviridae, εμφανίζουν ασυνήθιστα εξελικτικά γνωρίσματα που χαρακτηρίζονται από ένα μεγάλο αριθμό ειδών με μικρές γενετικές αποστάσεις ανάμεσά τους. Αξιοσημείωτο είναι το γεγονός ότι στους ιούς αυτούς συμπεριλαμβάνονται όλα τα νέα είδη ιών της Closteroviridae που απομονώθηκαν τα τελευταία χρόνια από το αμπέλι. Η μονοφυλετική προέλευση και οι στενές φυλογενετικές σχέσεις που παρατηρήθηκαν μεταξύ μελών της υποομάδας υποδεικνύουν την παρουσία ενός προγόνου, διαφορετικού από εκείνο των GLRaV-1 και -3. Στο συμπέρασμα αυτό οδηγεί επίσης το σημαντικά μικρότερο μέγεθος της CP τους σε σχέση με την CP των GLRaV-1 και -3. Οι μικρές δια-ειδικές γενετικές αποστάσεις των συγγενικών ιών του GLRaV-5 θα μπορούσαν να ερμηνευτούν ως απόρροια μιας νεότερης εξελικτικά ηλικίας αν και φαίνεται πως οι ισχυρές πιέσεις αρνητικής επιλογής που δρουν εναντίον των γενετικών αλλαγών ενδέχεται επίσης να είναι υπεύθυνες για χαμηλούς ρυθμούς εξέλιξης. Οι υπολογισμοί της παρούσας μελέτης, που στηρίζονται σε αναλύσεις θετικής επιλογής της HSP70h και της CP, δείχνουν ότι οι ampelo-ιοί της υποομάδας Ι, συμπεριλαμβανομένου και του PMWaV-1, υπόκεινται σε ισχυρές πιέσεις επιλογής εναντίον της αντικατάστασης αμινοξέων, οι οποίες φαίνεται ότι είναι πολύ μεγαλύτερες από τις αντίστοιχες στην υποομάδα ΙΙ των ampelo-ιών (Πίνακας 2.4), στους clostero- και crini-ιούς, άρα επιδεικνύουν ένα διαφορετικό τρόπο εξέλιξης. Οι φυτικοί RNA ιοί, ιδιαιτέρως εκείνοι που προσβάλλουν πολυετείς ξενιστές όπως οι GLRaVs, εμφανίζουν μεγάλο βαθμό γενετικής παραλλακτικότητας. Πρόσφατα, αναγνωρίστηκαν δυο γενετικώς απομακρυσμένες ομάδες απομονώσεων του GLRaV-1 οι οποίες διαφοροποιούνται στην HSP70h κατά 13,9% σε επίπεδο νουκλεοτιδίων (Kominek και συν., 2005), ενώ διαπιστώθηκε υψηλή παραλλακτικότητα και εντός απομονώσεων του είδους (Little και συν., 2001). Επίσης, μελέτες της δομής πληθυσμών του GLRaV-3 έδειξαν την παρουσία μικτών 65

71 Κεφ. 2. Εξελικτικές σχέσεις ampelo-ιών που ανήκουν σε μια διακριτή υποομάδα μολύνσεων από διάφορες παραλλαγές του ιού και υψηλές τιμές παραλλακτικότητας εντός απομονώσεων του είδους ιδιαίτερα στο γονίδιο της CP (Turturo και συν., 2005). Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώθηκε υψηλή ενδο-ειδική ετερογένεια, έως και 18% (σε νουκλεοτίδια), στην HSP70h του GLRaV-4 επιβεβαιώνοντας προηγούμενες μελέτες (Saldarelli και συν., 2006). Η γενετική δομή των πληθυσμών των ιών αυτών, που προκαλούν μολύνσεις σε πολυετή φυτά, επηρεάζεται από το μοντέλο quasispecies. Ο όρος viral quasispecies έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως στην Ιολογία, για να περιγράψει έναν πληθυσμό παραλλαγών που έχουν κοινή προέλευση αλλά διαφορετικές γενετικές αλληλουχίες, ως αποτέλεσμα μιας επιρρεπούς σε λάθη αναπαραγωγής με υψηλούς ρυθμούς μεταλλαγών, γενετικών αλλαγών (drift) και πίεσης επιλογής (Smith και συν., 1997). Αυτός ο τρόπος οργάνωσης είναι ένα κοινό γνώρισμα των RNA ιών και σε ορισμένες περιπτώσεις είναι η κύρια κατευθυντήρια δύναμη για μακροχρόνια επιβίωση των ιών στη φύση (Domingo και συν., 1998). Τα πληθυσμιακά φαινόμενα της στενωπού (bottlenecks) οδηγούν σε τυχαίες μεταβολές στη γενετική σύνθεση των πληθυσμών ιών μειώνοντας την ενδοπληθυσμιακή παραλλακτικότητα και αυξάνοντας την δια-πληθυσμιακή. Η ειδογένεση (speciation) στη γενεαλογία των συγγενικών του GLRaV-5 ampelo-ιών είναι πιθανώς αποτέλεσμα μιας τυχαίας γενετικής παρέκκλισης (genetic drift) που επέδρασε καθοριστικά και η οποία μπορεί να προκλήθηκε από περιστασιακά πληθυσμιακά φαινόμενα του στενωπού (bottlenecks) σε ιικά quasispecies. Ως αίτιες θα μπορούσαν να είναι η εκλεκτική μετάδοση από κάποιο έντομο-φορέα, περιβαλλοντικοί παράγοντες ή ακόμα και γενετικός ανασυνδυασμός. Για τις δύο γονιδιωματικές περιοχές που μελετήθηκαν, της HSP70h και της CP, οι αναλογίες d N /d S και ο αριθμός των θέσεων που υπόκεινται σε αρνητική επιλογή στηρίζουν την άποψη ότι η αρνητική επιλογή ήταν η κύρια εξελικτική δύναμη κατά τη διαφοροποίηση των συγγενικών ampelo-ιών του GLRaV-5. Η ισχυρή πίεση αρνητικής επιλογής και η μικρή δια-ειδική παραλλακτικότητα αποτελούν ένδειξη ότι αυτή η γενεαλογία των ιών έφτασε σε ένα μέγιστο προσαρμογής (adaptive peak), έτσι ώστε οι περισσότερες αλλαγές αμινοξέων μειώνουν την προσαρμοστικότητα και απομακρύνονται με αρνητική επιλογή. Αυτό πιθανώς συνδέεται με μια συγκεκριμένη οικοθέση που κατέχει αυτή η γενεαλογία ιών, η οποία μεταξύ άλλων περιλαμβάνει μακροχρόνια συνύπαρξη με έναν ξενιστή (αμπέλι) και επιτυχή εξάπλωση (διασπορά) μέσω του εμβολιασμού και του αγενούς πολλαπλασιασμού. Ένα επακόλουθο αυτής της επιτυχούς προσαρμογής θα μπορούσε να είναι η χαμηλότερη παθογένεια σε σχέση με 66

72 Κεφ. 2. Εξελικτικές σχέσεις ampelo-ιών που ανήκουν σε μια διακριτή υποομάδα τους πιο απομακρυσμένους γενετικά GLRaV-1 και -3 ampelo-ιούς, αλλά αυτό θα πρέπει να μελετηθεί διεξοδικά. Παρόλα ταύτα, σύμφωνα με τις παρατηρήσεις μας οι διαφορετικοί βιότυποι αμπέλου που φέρουν μονές μολύνσεις με απομονώσεις των GLRaV-5, -6, -Pr και -De δεν συνδέονται σταθερά με τα τυπικά συμπτώματα της ασθένειας συστροφής των φύλλων σε αντίθεση με τους GLRaV-1 και -3. Μέσα στην υποομάδα Ι των ampelo-ιών υπάρχει ένας μεγάλος αριθμός αυτών των στενά συγγενικών ειδών σε αντίθεση με τις υπόλοιπες γενεαλογίες της οικογένειας Closteroviridae. Αυτό θα μπορούσε να αποδοθεί σε ένα συνδυασμό των παρακάτω παραγόντων: α) την αποτελεσματική εξάπλωση (διασπορά) των quasispecies μέσω του εμβολιασμού και του αγενούς πολλαπλασιασμού και β) την απουσία ενός εντόμου-φορέα που θα αποτελούσε ένα ισχυρό παρεμβατικό φαινόμενο της στενωπού στην εξελικτική πορεία των ιών αυτών ευνοώντας την επιβίωση και διασπορά ενός ή περιορισμένου αριθμού παραλλαγών του ιού που είναι καλύτερα προσαρμοσμένα στον ξενιστή (Pirone & Blanc, 1996; Ali και συν., 2006). Προς το παρόν δεν υπάρχουν διαθέσιμες πληροφορίες για τις γενετικές περιοχές που καθορίζουν τη μετάδοσης των ιών αυτών με κοκκοειδή ή/και την εξειδίκευση της μετάδοσης (Andret-Link & Fuchs, 2005). Ως γνωστόν η CP επηρεάζει σε σημαντικό βαθμό τη μετάδοση των φυτικών ιών και διαθέτει συντηρημένα μοτίβα (motifs) αμινοξέων στο N-τελικό άκρο της πρωτεΐνης, που βρίσκονται εκτεθειμένα στην επιφάνεια του ιικού σωματιδίου, όπως στην περίπτωση των poty-ιών που μεταδίδονται με αφίδες (Arteya και συν., 1991). Στην παρούσα μελέτη δεν παρατηρήθηκε καμία ιδιαίτερα συντηρημένη ακολουθία αμινοξέων στο υδροφιλικό Ν-τελικό άκρο της CP, που θα μπορούσε να συνδέεται με τη μετάδοση με φορείς των συγγενικών του GLRaV-5 ampelo-ιών. Ωστόσο, η CPm θα μπορούσε να αποτελεί μια εναλλακτική πρωτεΐνη που σχετίζεται με την μετάδοση, όπως βρέθηκε στον αλευρωδομεταδιδόμενο LIYV (Tian και συν., 1999). Διαφορετικά είδη εντόμων που ανήκουν σε δύο οικογένειες ημιπτέρων, οι ψευδόκοκκοι (Pseudococcidae) και τα κοκκοειδή (Coccidae), έχουν αναφερθεί ως φορείς ορισμένων clostero-ιών που εμπλέκονται στη GLRD σε εργαστηριακές συνθήκες (GLRaV-1,-3,-5,-9) (Sforza και συν., 2003; Gugerli, 2003; Sim και συν., 2003; Zorloni και συν., 2006). Ωστόσο δεν υπάρχει εξειδίκευση ως προς τη μετάδοση ενός είδος ιού από ένα είδος εντόμου και επιπλέον αυτός ο τρόπος μετάδοσης δεν φαίνεται να παίζει κυρίαρχο ρόλο στην διασπορά της ασθένειας σε συνθήκες αγρού (Sforza και συν., 2003; Gugerli, 2003). Αντιθέτως, με εξαίρεση τους GLRaV-1 και -3, ο αγενής πολλαπλασιασμός και ο 67

73 Κεφ. 2. Εξελικτικές σχέσεις ampelo-ιών που ανήκουν σε μια διακριτή υποομάδα εμβολιασμός είναι οι πιο κοινοί τρόποι εξάπλωσης (διασποράς) των GLRaVs. Δεν έχει αναφερθεί μετάδοση με έντομα των GLRaV-4, -6, -7 και -8, (Gugerli, 2003) και γενικώς η διασπορά στον αγρό της GLRD από έντομα-φορείς έχει μελετηθεί ελάχιστα και αφορά κυρίως τον GLRaV-3 (Cabaleiro & Segura, 1997, 2006; Habili & Nutter, 1997). Μια σημαντική παρατήρηση που προέκυψε από τις φυλογενετικές τοπολογίες (Εικ. 2.1A, 2.2A) είναι η ομαδοποίηση των συγγενών με τον GLRaV-5 ampelo-ιών με τον PMWaV-1 και των GLRaV-1 και GLRaV-3 με τον PMWaV-2. Πρόσφατα, αναγνωρίστηκε άλλος ένας πιθανώς νέος PMWaV-3, ο οποίος είναι πιο κοντά γενετικά στον PMWaV-1 και τους συγγενείς με τον GLRaV-5 ampelo-ιούς (Sether και συν., 2005). Η παρουσία του PMWaV-2 μαζί με την έκθεση σε κοκκοειδή ευθύνονται για την ασθένεια του μαρασμού από κοκκοειδή του ανανά (Pineapple mealybug wilt disease) ωστόσο, οι PMWaV-1 και PMWaV-3 δεν συνδέονται σταθερά με την ασθένεια (Sether & Hu, 2002; Sether και συν., 2005). Προφανώς, η κατάσταση στον ανανά, ένα πολυετές αγενώς αναπαραγόμενο φυτικό είδος, είναι παρόμοια με το σύμπλοκο GLRD. Ο PMWaV-2, ο οποίος προκαλεί τυπικά συμπτώματα της ασθένειας στον ανανά, όπως και οι GLRaV-1 και GLRaV-3 στο αμπέλι (GLRD), μεταδίδεται με κοκκοειδή στον αγρό. Από την άλλη πλευρά, δεν υπάρχουν δεδομένα για τους PMWaV-1 και PMWaV-3, όπως και για τους συγγενείς του GLRaV-5 ampelo-ιούς, που να υποστηρίζουν τη σημαντική διασπορά τους με φορείς σε συνθήκες αγρού και επιπλέον δεν σχετίζονται σταθερά με την εκδήλωση συμπτωμάτων της ασθένειας με την οποία συνδέονται. Συνολικά, οι συγγενικοί ampelo-ιοί του GLRaV-5 διαφοροποιούνται σημαντικά από τα άλλα μέλη του γένους, ακολουθώντας μια διαφορετική εξελικτική πορεία και θα μπορούσαν να αποτελέσουν μια ξεχωριστή ταξινομική ομάδα. Συνεπώς, ένας πιθανός διαχωρισμός των ampelo-ιών σε δυο διαφορετικά γένη θα πρέπει να ληφθεί υπόψιν σε μια μελλοντική επανεξέταση της ταξινομικής κατάστασης του γένους. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής δείχνουν ότι οι συγκρίσεις ομοιότητας σε επίπεδο νουκλεοτιδίων και αμινοξέων μεταξύ διαφορετικών απομονώσεων των συγγενών με τον GLRaV-5 ampelo-ιών μπορεί να είναι λιγότερο αποφασιστικές για την οριοθέτηση των ειδών αυτών. Για το λόγο αυτό προτείνεται ως πιο κατάλληλο κριτήριο για τη γρήγορη κατάταξή τους ο διαχωρισμό τους σε γενεαλογίες ειδών που εξάγονται με φυλογενετική ανάλυση μέγιστης πιθανοφάνειας της HSP70h χρησιμοποιώντας κατάλληλα μοντέλα αντικατάστασης και υποστηρίζονται από 68

74 Κεφ. 2. Εξελικτικές σχέσεις ampelo-ιών που ανήκουν σε μια διακριτή υποομάδα υψηλές τιμές bootstrap. Οι αναλύσεις της μελέτης έδειξαν την ύπαρξη έξι γενεαλογιών κάθε μία από τις οποίες αντιστοιχεί σε ένα ξεχωριστό είδος ampelo-ιού δηλαδή τους GLRaV-4, -5, -6, -9 και τους δύο νέους που αντιπροσωπεύονται από απομονώσεις των GLRaV-Pr και -De. Ωστόσο θα πρέπει να σημειωθεί ότι μελλοντικά, κάθε γενεαλογία ειδών θα πρέπει να χαρακτηριστεί από στελέχη αναφοράς τα οποία θα επιλεγούν μετά από συγκριτική φυλογενετική ανάλυση περισσότερων γενετικών περιοχών. 69

75 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 Μοριακός χαρακτηρισμός των δυο νέων ιών (GLRaV-Pr, GLRaV-De) της υποομάδας Ι του γένους Ampelovirus και ορολογική ανίχνευση της καψιδιακής πρωτεΐνης του GLRaV-Pr 3.1. Περίληψη Προσδιορίστηκε η πλήρης αλληλουχία νουκλεοτιδίων του GLRaV-Pr, καθώς και ένα μεγάλο τμήμα του γονιδιώματος του GLRaV-De με τη χρησιμοποίηση εκχυλίσματος ιικού dsrna. Ο GLRaV-Pr είναι ο πρώτος πλήρως χαρακτηρισμένος ιός της αμπέλου της υποομάδας Ι του γένους Ampelovirus, με μήκος γονιδιώματος νουκλεοτίδια ένα από τα μικρότερα στην οικογένεια Closteroviridae. Περιλαμβάνει 7 ΑΠΑ που δυνητικά κωδικοποιούν μια πολυπρωτεΐνη (253 kda), μια RdRp (58,2 kda), μια υδρόφοβη πρωτεΐνη (5,2 kda), μια HSP70h (58,5 kda), μια πρωτεΐνη 60 kda (p60), μια CP (30 kda) και μια πρωτεΐνη 23 kda (p23). Επίσης, προσδιορίστηκε ένα τμήμα μήκους νουκλεοτιδίων της γονιδιωματικής αλληλουχίας του GLRaV-De το οποίο αντιστοιχεί στις περιοχές που κωδικοποιούν την HSP70h, την p60, την CP και τμήμα της p23. Οι GLRaV-Pr και -De διαφέρουν πάνω από 10% σε επίπεδο αμινοξέων από τους γνωστούς συγγενικούς ιούς, γεγονός το οποίο στηρίζει την μελλοντική τους αποδοχή ως διαφορετικά είδη. Ακόμη, παράχθηκε ειδικό αντίσωμα εναντίον της ανασυνδυασμένης CP του GLRaV-Pr και αξιολογήθηκε σε διάφορες ορολογικές δοκιμές. Συγκρίσεις του GLRaV-Pr με τις μόνες διαθέσιμες πλήρεις αλληλουχίες των γενετικώς συγγενών PMWaV-1, PBNSPaV και τον μερικώς χαρακτηρισμένο GLRaV-9 έδειξαν ότι η συγκεκριμένη γενεαλογία, που περιλαμβάνει τους GLRaV-4, -5, -6, -9 και -De, εμφανίζει μεγάλη ομοιομορφία στη γονιδιακή οργάνωση και περιλαμβάνει τους μικρότερους και απλούστερους ιούς της οικογένειας Closteroviridae. Αυτό σε συνδυασμό με τις τοπολογίες που υπολογίστηκαν στην παρούσα μελέτη με τις μεθόδους Μέγιστης Πιθανοφάνειας (ML) και ανάλυσης κατά Bayes δείχνουν ότι τα είδη αυτά ακολουθούν μια ξεχωριστή εξελικτική πορεία και διαφοροποιούνται σημαντικά από άλλους ιούς που εντάσσονται στο γένος Ampelovirus. Η γενεαλογία αυτή θα μπορούσε στο μέλλον να αποτελέσει ένα ξεχωριστό γένος. 70

76 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών 3.2. Εισαγωγή Οι ιοί του γένους Ampelovirus είναι από τους λιγότερο μελετημένους μέσα στην οικογένεια Closteroviridae κυρίως διότι προσβάλλουν ξυλώδεις ξενιστές (αμπέλι, ανανάς, κερασιά, δαμασκηνιά) γεγονός το οποίο δημιουργεί σημαντικές δυσκολίες στο χαρακτηρισμό τους. Τα τελευταία χρόνια, από τα μέλη του γένους έχει προσδιοριστεί η πλήρης νουκλεοτιδική αλληλουχία των GLRaV-3, LChV-2, PMWaV-1 και του προσωρινού είδους PBNSPaV (Ling και συν., 2004; Rott & Jelkmann, 2004; Al Rwahnih και συν., 2007; Melzer και συν., 2008), ενώ οι διαθέσιμες αλληλουχίες των PMWaV-2 και GLRaV-1 δεν περιλαμβάνουν το 5 άκρο τους (Fazeli & Rezaian, 2000; Melzer και συν., 2001). Από τους ιούς της αμπέλου που κατατάσσονται στην υποομάδα Ι του γένους Ampelovirus (GLRaV-4, -5, -6, -9, - Pr, -De) (κεφ. 2), δεν έχει προσδιοριστεί καμία πλήρης αλληλουχία έως σήμερα. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν ο περαιτέρω χαρακτηρισμός των GLRaV- Pr και GLRaV-De, ώστε να εμβαθύνουμε στη γονιδιακή οργάνωση αυτής της γενεαλογίας και να εμπλουτίσουμε τη βασική μας γνώση για τους clostero-ιούς. Με βάση την πλήρη και τμηματική νουκλεοτιδική αλληλουχία των GLRaV-Pr και GLRaV-De αντίστοιχα που προσδιορίστηκαν εδώ και την γονιδιακή τους οργάνωση, οι ιοί αυτοί θεωρούνται νέα διακριτά είδη του γένους Ampelovirus για τα οποία προτείνονται οι ονομασίες GLRaV-10 και -11, αντίστοιχα. Συγκριτική ανάλυση της γονιδιακής οργάνωσης του GLRaV-Pr με εκείνη άλλων ampelo-ιών σε συνδυασμό με ML και κατά Bayes φυλογενετική ανάλυση επιβεβαίωσε την ανεξάρτητη εξελικτική πορεία της γενεαλογίας των GLRaV-4, -5, -6, -9, -Pr και -De συμπεριλαμβάνοντας επίσης τους PMWaV-1 και PBNSPaV και ανέδειξε περαιτέρω την ανάγκη για αναθεώρηση της τρέχουσας ταξινόμησης του γένους. 71

77 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών 3.3. Υλικά και Μέθοδοι Απομονώσεις ιών και εκχύλιση dsrna Χρησιμοποιήθηκε ιστός από φυτά αμπέλου ποικιλίας Μαντηλαριά (βιότυπος 3) και Ντεμπίνα (βιότυπος 1), που έφεραν μονές μολύνσεις με τους clostero-ιούς GLRaV-Pr και GLRaV-De, αντίστοιχα όπως επιβεβαιώθηκε με ορολογικές και μοριακές δοκιμές (βλέπε κεφ. 2). Η Mαντηλαριά βρέθηκε επίσης μολυσμένη με τον GRSPaV. Η εκχύλιση dsrna στηρίχτηκε σε μια τροποποίηση της διαδικασίας που περιγράφηκε από τον Valverde και συν. (1990). Συγκεκριμένα, 80 γρ ξύσματος φλοιού χειμερινού ξύλου ομογενοποιήθηκαν με υγρό άζωτο και μεταφέρθηκαν σε μια φιάλη με 2 όγκους 2X STE (0,1 M NaCl, 0,05 M Tris-base, 0,001 M EDTA) που περιείχε επίσης 2% β-μερκαπτοαιθανόλη, 1% SDS και 0,7% Na 2 SO 3. Σ αυτό προστέθηκαν 3 όγκοι μείγματος φαινόλης-χλωροφορμίου 1:1 και μετά από ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά, μεταφέρθηκε σε δοχεία GSA και φυγοκεντρήθηκε (Sorvall, Dupond, U.S.A.) για 20 λεπτά στις g σε θερμοκρασία 25 o C. Στη συνέχεια, απομακρύνθηκε το υπερκείμενο και στο ίζημα προστέθηκαν 100 ml STE 2X με 0,7% Na 2 SO 3 και επαναλήφθηκε η φυγοκέντρηση. Το υπερκείμενο ενώθηκε με εκείνο της προηγούμενης φάσης και προστέθηκε αιθανόλη έτσι ώστε η τελική συγκέντρωση της επί του τελικού όγκου να είναι 16%. Ακολούθησε διόγκωση της κυτταρίνης (CF-11, Sigma-Aldrich) με STE 16 ( STE 10X + 16% αιθανόλη), απόχυση του υπερκειμένου, προσθήκη του διαλύματος του προηγούμενου σταδίου και ανάδευση για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Αυτό φυγοκεντρήθηκε στις g για 5 λεπτά, και μετά από απομάκρυνση της υπερκείμενης φάσης το ίζημα διαλυτοποιήθηκε σε 200 ml STE 16. Η φυγοκέντρηση επαναλήφθηκε τρεις φορές και η τελευταία πραγματοποιήθηκε στις g για 7 λεπτά. Το ίζημα επαναδιαλυτοποιήθηκε σε STE 16 και μεταφέρθηκε σε στήλη. Η κυτταρίνη αφέθηκε στη στήλη, ώστε να εξατμιστεί εντελώς η αιθανόλη και στη συνέχεια ξεπλύθηκε με 4 ml STE 1X. Η έκλουση του dsrna έγινε με προσθήκη 10 ml STE επί 4 φορές. Στο διάλυμα προστέθηκε αιθανόλη, έτσι ώστε η τελική της συγκέντρωση να είναι 16% επί του τελικού όγκου. Ακολούθησε ένας δεύτερος κύκλος χρωματογραφίας. Αυτή τη φορά χρησιμοποιήθηκαν 2 γρ. κυτταρίνης, έγινε ανάδευση για 20 λεπτά, μεταφορά σε στήλη και ξέπλυμα με 50 ml STE 16. Μετά από εξάτμιση της αιθανόλης ακολούθησε άλλο ένα ξέπλυμα με 2 ml STE, ενώ η έκλουση έγινε με 12 ml STE (4 ml χ 3 φορές). 72

78 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών Στο διάλυμα προστέθηκαν 0,1 όγκος NaOAc 3 Μ, ph 5,5 και 2,5 όγκοι αιθανόλης και τοποθετήθηκε στους -80 o C για όλο το βράδυ ώστε να κατακρημνιστεί το dsrna. Την επόμενη μέρα έγινε φυγοκέντρηση για 30 λεπτά σε g στους 4 o C. Το ίζημα αφέθηκε να στεγνώσει και διαλυτοποιήθηκε σε 285 μl ΤΕ, ph 7,4. Ακολούθησε πέψη με τα ένζυμα RΝase A, DNase I και proteinase K. Συγκεκριμένα στον παραπάνω όγκο ΤΕ προστέθηκαν 0,3 Μ NaCl, 2,4 μl RNase Α (5 μονάδες) και ακολούθησε επώαση στους 25 o C για 30 λεπτά. Προστέθηκαν ακόμη 4 μl NaCl 3 M, 5 μονάδες DNase I και 1Χ διαλύματος του ενζύμου και ακολούθησε επώαση στους 25 o C για 30 λεπτά. Τέλος, προστέθηκαν 20 μl 10% SDS, 1 μl proteinase K και ακολούθησε επώαση για 20 λεπτά στους 37 o C. Στο τελικό διάλυμα προστέθηκαν 600 μl 1:1 φαινόλη/χλωροφόρμιο και φυγοκεντρήθηκε (Eppendorf Centrifuge 5417C) στις g για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο κατακρημνίστηκε στους -80 o C, όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Ακολούθησε φυγοκέντρηση για 20 λεπτά στις g, ξήρανση του ιζήματος και διαλυτοποίηση σε 20 μl ΤΕ, ph 7,4. Μετά από άλλη μια φυγοκέντρηση στις g για 3 λεπτά το υπερκείμενο (dsrna) αναλύθηκε σε πηκτή αγαρόζης χαμηλού σημείου τήξης 1,3% (AppliChem, Germany) για 3,5 ώρες στα 100 volt και παρατηρήθηκε πάνω από τράπεζα υπεριώδους ακτινοβολίας μετά από χρώση για μισή ώρα με SYBR gold (Molecular probes, Eugene, Oregon, USA) Κλωνοποίηση και προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του GLRaV-Pr Προκειμένου το dsrna να χρησιμοποιηθεί ως εκμαγείο για την ταυτοποίηση της αλληλουχίας του γονιδιώματος του GLRaV-Pr, πριν από την ανάλυσή του στην πηκτή αγαρόζης, ένα τροποποιημένο ολιγονουκλεοτίδιο dsblocked49 (Πίνακας 3.1) συνδέθηκε στο 3 άκρο του μορίου με τη βοήθεια του ενζύμου T4 RNA λιγάση (New England Biolabs, United Kingdom) σύμφωνα με τις οδηγίες της εταιρείας. Μια αμινομάδα ( NH2) τοποθετήθηκε στο υδροξυλικό άκρο του ολιγονουκλεοτιδίου για να παρεμποδίσει τη σύνδεση περισσοτέρων του ενός μορίων. Για τη σύνδεση χρησιμοποιήθηκαν 50 μονάδες του ενζύμου T4 RNA λιγάση, 10 μl dsrna, 5 μl του διαλύματος του ενζύμου (10Χ), 1μΜ του ολιγονουκλεοτιδίου dsblocked49 και η αντίδραση συμπληρώθηκε στα 50 μl με νερό που είχε υποστεί κατεργασία με DEPC. Ακολούθησε επώαση στους 17 C για 15 ώρες και ανάλυση σε πηκτή χαμηλού σημείου τήξεως αγαρόζης (1,3%). 73

79 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών Η μεγαλύτερου ΜΒ ζώνη dsrna αποκόπηκε από την πηκτή και μετά από δύο ξεπλύματα των 10 λεπτών σε 1 όγκο διαλύματος αντίστροφης μεταγραφής (RT) (Invitrogen, The Netherlands) διαλυτοποιήθηκε σε 1 όγκο του ίδιου διαλύματος. Το dsrna επωάστηκε στους 70 C για 5 λεπτά. Στη συνέχεια, 7,5 μl dsrna αναμείχθηκαν με 1 μl oligo-dt 18, 1 μl DMSO, 10 μονάδες αναστολέα ριβονουκλεασών RNASEOUT (Invitrogen, The Netherlands) και μετά από θερμική αποδιάταξη στους 99 C για 1 λεπτό, το διάλυμα μεταφέρθηκε σε πάγο. Τρία μl από το αποδιαταγμένο dsrna προστέθηκαν σε τελικό όγκο μείγματος αντίστροφης μεταγραφής 20 μl που περιείχε 50 mm Tris-HCl (ph 8.3), 75 mm KCl, 3 mm MgCl 2, 0,5 mm από κάθε dntp, 10 mm DTT, 12 μονάδες RNASEOUT αναστολέα ριβονουκλεασών (Invitrogen, The Netherlands) και 100 μονάδες αντίστροφη μεταγραφάση Superscript II RNAse H - (Invitrogen, The Netherlands). Η αντίδραση έλαβε χώρα στους 42 C για 1,5 ώρα. Ακολούθησε πέψη του RNA με την προσθήκη 4 μονάδων του ενζύμου Rnase H (Takara, Japan) και επώαση στους 37 C για 20 λεπτά και στους 80 C για 15 (απενεργοποίηση ενζύμου). Δύο μl cdna χρησιμοποιήθηκαν σε διάφορες δοκιμές PCR με τους εκκινητές που αναφέρονται στον Πίνακα 3.1. Μια γονιδιωματική περιοχή 490 ζβ από την HSP70h του GLRaV-Pr είχε προηγουμένως προσδιοριστεί με τη χρησιμοποίηση εκφυλισμένων εκκινητών (κεφ. 2). Με βάση την αλληλουχία αυτή σχεδιάστηκαν δυο ανοδικοί εκκινητές (HSPup3 και HSPnestup1) και χρησιμοποιήθηκαν σε μια ένθετη PCR μαζί με τους καθοδικούς (dspcr49, dsnest49) συμπληρωματικούς ως προς το συνδεδεμένο στο 3 -άκρο ολιγονουκλεοτίδιο, ενισχύοντας ένα προϊόν μήκους ζβ. Το προϊόν αυτό περιλάμβανε το σύνολο της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του ιού από την HSP70h έως το 3 άκρο. Άλλα τμήματα του γονιδιώματος ανοδικά του γονιδίου της HSP70h ενισχύθηκαν με PCR με τη χρησιμοποίηση των ακόλουθων ζευγών εκφυλισμένων ή ειδικών εκκινητών: Polup3-HSPdo1 / Polup3-HSPnestdo2, Helup2 / Poldo1, Helup3- Heldo1 / Helup3-Helnestdo2 (Πίνακας 3.1, Εικ. 3.2). Η ακολουθία του 5 άκρου προσδιορίστηκε με μια ένθετη PCR στην οποία οι συμπληρωματικοί, ως προς το συνδεδεμένο στο 3 -άκρο ολιγονουκλεοτίδιο, εκκινητές dspcr49 και dsnest49 χρησιμοποιήθηκαν ως ανοδικοί μαζί με τους καθοδικούς Hel do4 και Helnestdo4, αντίστοιχα (Εικ. 3.2). Επιπλέον, εφαρμόστηκαν δοκιμές 5 -RACE (Rapid Amplification of 5 c-dna End) χρησιμοποιώντας ως εκμαγείο dsrna και ολικό RNA. 74

80 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών Πίνακας 3.1. Εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του γονιδιώματος των GLRaV-Pr και GLRaV-De Εκκινητής Νουκλεοτιδική αλληλουχία (5-3 ) Συγκέντρωση στην αντίδραση (μμ) Dsblocked49 PO 4 -GTGCTGCAGCTCTACGACGACCTCC(A) 17 -NH 2 DsPCR49 CGAGGTCGTCGTCCAGCTGTGTCAG 0,2 66 Dsnest49 CGTCGTCCAGCTGTGTCAGCACTGTC 0,2 66 HSPup3 α TGGGCGCTCTATTGGAGAGGGATGTTC 0,2 65 HSPnestup1 α CCGCGTTGGTTCGGATGGCTGTG 0,2 64 HSPdo1 b ACAGCCATCCGAACCAACGCGGATAC 0,2 64 HSPnestdo2 β ACGCCTCACACCGACCACCGTC 0,2 62 Polup3 α GARCTGGATATYTCIAAGTAYGAYAARTCTCA Helup2 α AATGCTGTTCCTGGKGCWGGIAARAC 0, Poldo1 β CCTGTTGCTCTACCATAGAATTCAGAAG 0,2 61 Helup3 α CTGAAAGGAGGAGGTGGGAATTGGTAYG 0,4 63 Heldo1 β TGCATTTCGACTCGCCGTCAACACC 0,2 64 Helnestdo2 β TCTCGAACGTCTTCCCTGCCCCAGGAAC 0,2 66 Heldo4 β AGGGGACGGCAGTCAAAAGTGGTAAG 0,2 62 Helnestdo4 β AGCAACACTTCTAAGAGCCAAAACACCG 0, RCabridged α TAGACTGCAACTATGCTAGGGIIGGGIIGGGIIG 0, RCnest α ACTGACTGTAGACTGCAACTATGCTAGG 0,5 64 Heldo11 β CAAGGCCTTCTTACCTGACTTGTTCAAG 0,2 62 Heldo12 β ATGCGCCCGGAGAAGAGCTTACC 0,2 64 M 3 cpf α AATAGCATGCAATGACGGAGCGAGTGAC 0,2 65 M 3 cpr β AATTCTGCAGCTTACGGTTGCCCAAAAAG 0,2 64 HSPDeup1 α CCGGCTGAATACAGCTCTTATATGAG 0,2 61 CPDedo1 β CAGTTCGACCCACCAATCGTTTTACCATAC 0,2 62 HSPDenestup1 α TGTACTCTGGCAAAGATTATGGTTCAGGCTG 0,2 64 CPDenestdo1 β CAATAGGATTCCCTTTCCTCGCGCCCAATAG 0,2 66 α ανοδικός, β καθοδικός, R: A/G, Y: C/T, W: A/T, K: G/T, I: Ινοσίνη Θερμοκρασία υβριδοποίησης (Tm σε o C) 75

81 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών Εν συντομία, έγινε σύνδεση του 3 άκρου του cdna με μια ακολουθία dctp με την χρησιμοποίηση του ενζύμου τελική δεοξυνουκλεοτιδιλική τρανφεράση (New England Biolabs, United Kingdom). Για τη σύνδεση χρησιμοποιήθηκαν 10 μονάδες του ενζύμου, 1 mm dctp, 0,25 mm CoCl 2, 3 μl του διαλύματος NEB4 (10X) και η αντίδραση συμπληρώθηκε στα 30 μl με νερό που είχε υποστεί κατεργασία με DEPC. Αυτό το cdna αποτέλεσε εκμαγείο σε μια δοκιμή PCR όπου ο εκκινητής 5 RCabridged συνδυάστηκε με τον ειδικό για τον ιό Hel do11 ενώ ακολούθησε και μια ένθετη PCR στην οποία χρησιμοποιήθηκαν οι 5 RCnest και Hel do12 (Πίνακας 3.1). Το μίγμα όλων των αντιδράσεων PCR ήταν όπως περιγράφεται στην παρ με την προσθήκη των κατάλληλων εκκινητών στις συγκεντρώσεις που αναφέρονται στον Πίνακα 3.1, ενώ οι συνθήκες θερμοκυκλοποίησης που εφαρμόστηκαν αναφέρονται αναλυτικά στο παράρτημα Ι (Πίνακας 2). Τα επιθυμητά προϊόντα της PCR αποκόπηκαν από την πηκτή. Για την εξαγωγή του DNA χρησιμοποιήθηκε το σύστημα matrix gel extraction system (Marligen Bioscience, USA) και ακολούθησε κλωνοποίηση στον πλασμιδιακό φορέα pcr2.1 με το Topo TA cloning kit (Invitrogen, The Netherlands) (βλέπε παράρτημα, παρ. 7). Το πλασμιδιακό DNA απομονώθηκε από βακτηριακά κύτταρα με τη βοήθεια του προϊόντος "Nucleobond" (Macherey-Nagel, Germany) (βλέπε παράρτημα, παρ. 7), ενώ η νουκλεοτιδική αλληλουχία των δύο αλυσίδων DNA προσδιορίστηκε με τη μέθοδο τερματισμού των διδεόξυ-αναλόγων του Sanger (Sanger και συν., 1977). Σε όλες τις περιπτώσεις αλληλουχήθηκαν δύο διαφορετικοί κλώνοι από το ίδιο προϊόν της PCR ώστε να αξιολογηθεί η συνέπεια των δεδομένων αλληλούχησης Κλωνοποίηση και προσδιορισμός τμήματος της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του GLRaV-De Για τον προσδιορισμό τμήματος της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του GLRaV-De χρησιμοποιήθηκε εκχύλισμα αποδιαταγμένου dsrna σύμφωνα με τη διαδικασία που περιγράφεται για τον GLRaV-Pr (παρ ) με τη διαφορά ότι αντί για τον εκκινητή oligo-dt 18 προστέθηκε 1 μl του CPDedo1 (Πίνακας 3.1). Τρεις γενωμικές περιοχές του GLRaV-De, από την HSP70h, την CP και p23 αντίστοιχα, είχαν προηγουμένως προσδιοριστεί με τη χρησιμοποίηση εκφυλισμένων εκκινητών (κεφ. 2). Για τον προσδιορισμό της περιοχής που μεσολαβεί μεταξύ του 5 76

82 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών άκρου της HSP70h και τμήματος της CP σχεδιάστηκαν, με βάση τις ήδη γνωστές ακολουθίες, δυο ζεύγη εκκινητών (HSPDeup1 - CPDedo1, HSPDenestup1 - CPDenestdo1, Πίνακας 3.1, Εικ. 3.4) που χρησιμοποιήθηκαν σε μια RT-PCR σ ένα μικροσωλήνα και σε μια ένθετη PCR, αντίστοιχα, ενισχύοντας ένα προϊόν μήκους ζβ. Το μείγμα όλων των αντιδράσεων ήταν όπως περιγράφεται στην παρ με την προσθήκη των κατάλληλων εκκινητών στις συγκεντρώσεις του Πίνακα 3.1 και οι συνθήκες θερμοκυκλοποίησης που εφαρμόστηκαν αναφέρονται αναλυτικά στο παράρτημα Ι (Πίνακας 2). Ο καθαρισμός του επιθυμητού προϊόντος PCR, η κλωνοποίηση και η αλληλούχηση έγιναν όπως περιγράφονται στην παρ Ανάλυση νουκλεοτιδικών αλληλουχιών και κατασκευή φυλογενετικών δέντρων Για την ανάλυση των αλληλουχιών χρησιμοποιήθηκαν οι βάσεις δεδομένων της EMBL-EBI. Τα ΑΠΑ ταυτοποιήθηκαν με τα λογισμικά ORF finder και FGENESV0, αντίστοιχα και τα θεωρητικά ΜΒ των κωδικοποιούμενων πρωτεϊνών υπολογίστηκαν με το ExPASy ( Επιπλέον, για τον εντοπισμό συντηρημένων ακολουθιών πρωτεϊνών χρησιμοποιήθηκε το CDD (conserved domain database) (Marchler-Bauer και συν., 2003), ενώ οι ομοιότητες αμινοξέων και τα μοτίβα διαμεμβρανικής δομής προσδιορίστηκαν με τα GeneDoc ( και TMHMM (Krogh και συν., 2001), αντίστοιχα. Για την κατασκευή των φυλογενετικών δέντρων, χρησιμοποιήθηκαν τρεις ομάδες ομόλογων αλληλουχιών αμινοξέων ειδών της οικογένειας Closteroviridae, κάθε μια από τις οποίες αντιστοιχούσε στην ελικάση (HEL, μοτίβα I-VI, Εικ. 3.4Β), την περιοχή RdRp_2 της πολυμεράσης όπως αυτή ορίζεται στην ηλεκτρονική βιβλιοθήκη Pfam HMM ( και την HSP70h (μοτίβα A-H, Εικ. 3.5). Οι αλληλουχίες στοιχίστηκαν με το ProbCons (Do και συν., 2005), ενώ τα κατάλληλα μοντέλα αντικατάστασης αμινοξέων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το PROTTEST έκδοση 1.3 με το Bayesian information criterion (BIC) (Abascal και συν., 2004). Μετά την επιλογή του βέλτιστου σε κάθε περίπτωση μοντέλου, εφαρμόστηκαν δύο διαφορετικοί αλγόριθμοι για τις φυλογενετικές αναλύσεις. Τα δέντρα μέγιστης πιθανοφάνειας υπολογίστηκαν με το PhyML (Guindon & Gascuel, 77

83 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών 2003) και η ανάλυση κατά Bayes πραγματοποιήθηκε με τον αλγόριθμό MrBayes έκδοση 3.1 (Huelsenbeck and Ronquist, 2001). Ανάλογα με τη μέθοδο που εφαρμόστηκε, η αξιοπιστία της φυλογενετικής υπόθεσης αξιολογήθηκε με τη χρησιμοποίηση της μη-παραμετρικής ανάλυσης bootstrap (NPB) για το PhyML, και της Bayesian posterior probability (BPP) για το MrBayes Παραγωγή ειδικών για τον GLRaV-Pr πολυκλωνικών αντισωμάτων α) Πολλαπλασιασμός του γονιδίου της CP και σύνδεση με πλασμιδιακό φορέα έκφρασης πρωτεϊνών Για την παραγωγή των ειδικών αντισωμάτων, ενισχύθηκε αρχικά ολόκληρο το γονίδιο της CP με το ζεύγος εκκινητών M 3 cpf και M 3 cpr (Πίνακας 3.1), που εδράζουν στα άκρα του γονιδίου και οι οποίοι περιλάμβαναν τις αλληλουχίες στόχους των περιοριστικών ενδονουκλεασών Sph1 και Pst1 αντίστοιχα στο 5 άκρο τους. Οι συνθήκες θερμοκυκλοποίησης που εφαρμόστηκαν περιελάμβαναν επώαση για 4 λεπτά στους 94 ºC, 5 κύκλους των 30 δευτερολέπτων στους 95 ºC, 30 δευτερολέπτων στους 52 ºC και 30 δευτερολέπτων στους 72 o C και 35 κύκλους των 30 δευτερολέπτων στους 95 ºC, 30 δευτερολέπτων στους 62 ºC και 30 δευτερολέπτων στους 72 ºC. Η αντίδραση ολοκληρώθηκε με μια τελευταία επώαση για 2 λεπτά στους 72 ºC. Η ζώνη DNA μεγέθους 876 ζβ αποκόπηκε από την πηκτή αγαρόζης και καθαρίστηκε με το matrix gel extraction system (Marligen Bioscience, USA). Ακολούθησε κλωνοποίηση στον πλασμιδιακό φορέα pcr2.1 με το TA cloning kit (Invitrogen, The Netherlands). Το πλασμιδιακό DNA απομονώθηκε από τα βακτηριακά κύτταρα με τη χρησιμοποίηση του προϊόντος "Nucleobond" (Macherey- Nagel, Germany) και ακολούθησε πέψη με τις περιοριστικές ενδονουκλεάσες Sph1 και Pst1 (New England Biolabs, UK). Χρησιμοποιήθηκαν 10 μονάδες του ενζύμου Sph1, 1 μg πλασμιδιακού DNA, 1 μl του διαλύματος των ενζύμων (NEB2), 20 μονάδες του ενζύμου Pst1, 0,1 μl BSA και η αντίδραση συμπληρώθηκε στα 10 μl με νερό που είχε υποστεί κατεργασία με DEPC. Η πέψη έλαβε χώρα για 6 ώρες στους 37 ο C και ακολούθησε απενεργοποίηση των ενδονουκλεασών με επώαση στους 80 ο C για 30 λεπτά. Ακολούθησε κατευθυνόμενη σύνδεση (ligation) του τμήματος DNA του γονιδίου της CP στον πλασμιδιακό φορέα έκφρασης πρωτεϊνών pqe 31 (Qiagen, Germany) 78

84 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών (βλέπε παράρτημα Ι, Εικ. 1), ο οποίος περιελάμβανε μια ακολουθία 6χHis στο Ν- τελικό άκρο. Για τη σύνδεση χρησιμοποιήθηκαν 100 ng του τμήματος DNA του γονιδίου της CP, 80 ng του πλασμιδιακού φορέα, ο οποίος είχε προηγουμένως κοπεί με τις ενδονουκλεάσες Sph1 και Pst1, 200 μονάδες του ενζύμου Τ4 DNA λιγάση (New England Biolabs, UK), 1 μl του διαλύματος του ενζύμου (10Χ) και η αντίδραση συμπληρώθηκε στα 10 μl με νερό που είχε υποστεί κατεργασία με DEPC. Ακολούθησε επώαση για 4 ώρες στους 16 ο C και καθ όλη τη διάρκεια της νύχτας στους 4 ο C. β) Μετασχηματισμός επιδεκτικών κυττάρων με το πλασμιδιακό DNA και επαγωγή έκφρασης της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης Το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο εισήχθη στο βακτηριακό στέλεχος E. coli M15 (Qiagen, Germany), ενώ ως μάρτυρας για την αξιολόγηση του μετασχηματισμού χρησιμοποιήθηκε ο πλασμιδιακός φορέας pqe-40. Συγκεκριμένα μεταφέρθηκαν 10 μl του μίγματος σύνδεσης σε 100 μl εναιωρήματος επιδεκτικών βακτηριακών κυττάρων (βλέπε παράρτημα, παρ. 8), τα οποία αποψύχθηκαν αργά σε παγωμένο νερό. Ακολούθησε επώαση σε πάγο για 20 λεπτά και μεταφορά στους 42 ο C για 90 δευτερόλεπτα. Αμέσως προστέθηκαν 500 μl PSi ζωμού και ακολούθησε επώαση στους 37 ο C σε οριζόντιο αναδευτήρα (~150 rpm). Στη συνέχεια, έγινε επίστρωση των κυττάρων σε τριβλία με LB άγαρ που περιείχαν τα αντιβιοτικά καναμυκίνη (25 μg/ml) και αμπικιλλίνη (100 μg/ml). Οι αποικίες που αναπτύχθηκαν στο τριβλίο ενοφθαλμίστηκαν σε 10 ml LB που περιέχει καναμυκίνη (25 μg/ml) και αμπικιλλίνη (100 μg/ml), επωάστηκαν στους 37 ο C και ελέγχθηκαν για την παρουσία του πλασμιδιακού DNA με PCR. Τα βακτηριακά κύτταρα (2,5 ml) που έφεραν το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο μεταφέρθηκαν σε 50 ml LB με τα ίδια αντιβιοτικά και επωάστηκαν υπό ανάδευση (~300 rpm) στους 37 ο C για περίπου μια ώρα. Στον χρόνο αυτό τα βακτήρια εισέρχονται σε λογαριθμική φάση αύξησης (O.D. = 0,5-0,7). Για την επαγωγή 600 έκφρασης της πρωτεΐνης προστέθηκε στην καλλιέργεια βακτηρίων ισοπροπυλο-θειογαλακτοζίδιο (IPTG). Για την αύξηση της διαλυτότητας της επαγόμενης πρωτεΐνης, προκειμένου να απομονωθεί στη φυσιολογική της μορφή, δοκιμάστηκαν διάφορα πρωτόκολλα όπως επώαση της καλλιέργειας στους 27 ο C και 37 ο C, προσθήκη 0,5 mm ή 1 mm IPTG, επώαση για 5 ή 16 ώρες και τέλος προσθήκη του διπεπτιδίου 79

85 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών glycylglycine (1 M). Μετά το τέλος της επώασης ακολουθούσε συλλογή των κυττάρων από 1 ml καλλιέργειας με φυγοκέντρηση στις g για 2 λεπτά και απομάκρυνση του υπερκείμενου υγρού. Στη συνέχεια, το ίζημα των βακτηριακών κυττάρων επαναδιαλυτοποιούνταν σε 100 μl ρυθμιστικού διαλύματος επιστοίβαξης πρωτεϊνών 2X (Παράρτημα Ι, παρ. 10) και ακολουθούσε διαχωρισμός των πρωτεϊνών σε SDS-πηκτή πολυακρυλαμίδης και χρώση της πηκτής για παρατήρηση των πρωτεϊνικών ζωνών (βλέπε παράρτημα Ι, παρ. 10). Το υπόλοιπο εναιώρημα των βακτηριακών κυττάρων συλλεγόταν με φυγοκέντρηση στις g για 20 λεπτά και διατηρούνταν στους -80 ο C μέχρι τη φάση του καθαρισμού. γ) Καθαρισμός και ποσοτικοποίηση της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης Αξιολογήθηκε ο καθαρισμός της πρωτεΐνης υπό φυσιολογικές (native) και αποδιατακτικές (denaturing) συνθήκες με τη χρησιμοποίηση χρωματογραφίας συγγένειας με Ni-NTA ρητίνη (Qiagen) (βλέπε παράρτημα Ι, παρ. 9). Ωστόσο εξαιτίας της χαμηλής διαλυτότητας της επαγόμενης πρωτεΐνης, ο τελικός καθαρισμός έγινε υπό αποδιατακτικές συνθήκες με τη χρησιμοποίηση ιζήματος βακτηριακών κυττάρων που προέρχονταν από καλλιέργεια 200 ml. Η ποσοτικοποίηση της πρωτεΐνης έγινε με σύγκριση της έντασης της πρωτεϊνικής ζώνης με εκείνη αλβουμίνης ορού μόσχου (BSA) σε SDS-πηκτή πολυακρυλαμίδης. Πριν τη χρησιμοποίηση της πρωτεΐνης για την ανοσοποίηση κουνελιού έγινε διαπίδυση σε ½X PBS στους 4 ο C για 24 ώρες, προκειμένου να απομακρυνθεί ο παράγοντας αποδιάταξης (ουρία) και η πρωτεΐνη να επανέλθει ως ένα βαθμό στη φυσιολογική της μορφή (refolding). δ) Εμβολιασμοί κουνελιού και καθαρισμός του επαγόμενου αντιορού Για την παραγωγή των ειδικών αντισωμάτων χορηγήθηκαν σε ένα κουνέλι Νέας Ζηλανδίας τρεις ενδομυικές ενέσεις των 150, 272 και 300 mg, αντίστοιχα της καθαρής ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης αραιωμένης σε ίσο όγκο του ατελούς ανοσοενισχυτικού του Freund (Sigma). Οι εμβολιασμοί πραγματοποιούνταν ανά διαστήματα δύο εβδομάδων. Για τον έλεγχο του τίτλου αντισωμάτων έγινε αιμοληψία (2 ml) 15 ημέρες μετά τον δεύτερο εμβολιασμό και έξι ημέρες μετά τον τρίτο. Τελικά, δέκα ημέρες μετά την τελευταία χορήγηση, συλλέχθηκαν περίπου 20 ml ορού αίματος o οποίoς παρέμεινε για μια ώρα σε θερμοκρασία δωματίου για να 80

86 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών σχηματιστεί θρόμβος και στη συνέχεια στους 4 o C για 16 ώρες. Για την απομάκρυνση του θρόμβου ακολούθησαν δυο διαδοχικές φυγοκεντρήσεις στις g και g για 15 και 10 λεπτά, αντίστοιχα. Στη συνέχεια, έγινε καθαρισμός της γ-σφαιρίνης (IgG) από το υπερκείμενο με χρωματογραφία συγγένειας πρωτεΐνης A και σύζευξή της με το ένζυμο αλκαλική φωσφατάση (βλέπε παράρτημα Ι, παρ. 1) Ορολογικές δοκιμές α) Ανοσοανίχνευση μέσω στυπώματος Western Η καθαρισμένη CP του GLRaV-Pr μαζί με πρωτεΐνες που εκχυλίστηκαν από υγιή πρέμνα αμπέλου και άλλα με μονές προσβολές με τους GLRaV-Pr (απομονώσεις Pr1 και Pr3, κεφ. 2) GLRaV-4, GLRaV-5, GLRaV-6, GLRaV-9 και GLRaV-De, υπεβλήθησαν σε ανοσοανίχνευση μέσω στυπώματος Western σύμφωνα με τη διαδικασία που προτείνεται από τον Minafra και συν. (2000) (βλέπε παράρτημα I, παρ. 11). Αξιολογήθηκαν διάφορες αραιώσεις του αντιορού από 1/100 έως 1/2000 στο στάδιο επώασης της μεμβράνης με το πρωτογενές αντίσωμα. Σε όλες τις περιπτώσεις, 200 mg ιστού από ξύσματα φλοιού ή μίσχους ώριμων φύλλων ομογενοποιήθηκαν απευθείας σε 5 όγκους του διαλύματος επιστοίβαξης (2Χ). β) Ανοσοενζυμική δοκιμή ELISA Αξιολογήθηκε η δυνατότητα ανίχνευσης του GLRaV-Pr σε δοκιμές άμεσης (DAS) ή έμμεσης (Plate trapped antigen, PTA) ELISA με τη χρησιμοποίηση του παραγόμενου αντισώματος. H δοκιμή DAS-ELISA, έγινε σύμφωνα με το πρωτόκολλο που προτάθηκε από τους Clark & Adams (1977) και η PTA-ELISA όπως περιγράφεται από τους Mowat & Dawson (1987) (βλέπε παράρτημα, παρ. 3). Διακόσια mg ιστού από ξύσματα φλοιού ή μίσχους ώριμων φύλλων ομογενοποιήθηκαν σε 10 όγκους PBS-Tween ή διαλύματος επίστρωσης της πλάκας (coating buffer), αντίστοιχα. Επιπλέον για τον προσδιορισμό του τίτλου του αντιορού σε δοκιμές ELISA χρησιμοποιήθηκε και καθαρή κλωνοποιημένη CP του ιού σε αναλογία 2 μg/ml. Αξιολογήθηκαν διάφορες αραιώσεις του ειδικού IgG και του συζεύγματος (1/500 1/1500), ενώ για την ελαχιστοποίηση των μη-ειδικών αντιδράσεων έγινε επώαση για μια ώρα, μετά το στάδιο τοποθέτησης των δειγμάτων, με 2% BSA ή αποβουτυρωμένου γάλακτος σε PBS. 81

87 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών 3.4. Αποτελέσματα Προφίλ dsrna Δύο διαφορετικά μόρια dsrna ανιχνεύθηκαν σε ιστό αμπέλου μολυσμένο με τον GLRaV-Pr μετά από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης (Εικ. 3.1). Το μεγάλο ΜΒ της υψηλότερης ζώνης dsrna είναι ενδεικτικό της αναπαραγωγικής μορφής του γονιδιώματος ιών της οικογένειας Closterovirridae, καθώς είναι το μοναδικό που 8,454 7,242 6,369 5,686 4,822 4,324 3,675 M1 1 2 M2 Ζώνη Band 1 23,130 9,416 Band Ζώνη 2 6,557 4,361 2,323 1,929 2,322 2,027 1,371 1,264 Εικόνα 3.1. Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης (1,3%) εκχυλίσματος dsrna από τον GLRaV-Pr. Διαδρομή 1: Απομόνωση του GLRaV-Pr από την ποικιλία αμπέλου Μαντηλαριά (βιότυπος M3). Διαδρομή 2: Υγιής ιστός αμπέλου ποικιλίας Μαντηλαριά προερχόμενος από ιστοκαλλιέργεια. Διαδρομή Μ1: Δείκτης ΜΒ λ DNA-BstE II Digest. Διαδρομή M2: Δείκτης ΜΒ λ Hind III DNA. Οι αριθμοί δίπλα σε κάθε μοριακό δείκτη υποδεικνύουν το μέγεθος κάθε ζώνης σε χιλιάδες βάσεων (kb). παράγει dsrnas με ΜΒ μεγαλύτερο από 13 kb. Η χαμηλότερου ΜΒ ζώνη dsrna πιθανώς αντιστοιχεί σε υπογονιδιωματικό RNA του ιού ή αποτελεί την αναπαραγωγική μορφή του GRSPaV, ο οποίος συνυπήρχε με τον GLRaV-Pr. Όσον αφορά τον GLRaV-De δεν ήταν δυνατή η ανίχνευση ζωνών dsrna με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης. Για το λόγο αυτό αποκόπηκε τυχαία από την πηκτή ένα τμήμα που αντιστοιχούσε σύμφωνα με τους δείκτες ΜΒ στη μεγαλύτερου μεγέθους ζώνη dsrna και το τμήμα αυτό χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό 82

88 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του ιού σύμφωνα με τις διαδικασίες που περιγράφηκαν προηγουμένως Ανάλυση νουκλεοτιδικής αλληλουχίας και γονιδιακή οργάνωση του GLRaV-Pr Η διαδικασία που ακολουθήθηκε σ αυτή τη μελέτη μείωσε τον αριθμό των σταδίων που απαιτούνται για τον προσδιορισμό του συνόλου του γονιδιώματος του GLRaV-Pr, μήκους νουκλεοτιδίων που κατατέθηκε στην EMBL-EBI με κωδικό πρόσβασης AM (βλέπε παράρτημα ΙΙ). Το γονιδίωμα κωδικοποιεί εφτά ΑΠΑ (Εικ. 3.2), τα οποία χαρακτηρίστηκαν ως 1α, 1β, και 2 έως 6 ακολουθώντας την ονοματολογία που χρησιμοποιήθηκε στον BYV, τον πρώτο πλήρως αλληλουχημένο clostero-ιό (Agranovsky και συν., 1994). Η αμετάφραστη περιοχή (Untranslated region, UTR) του 5 άκρου του γονιδιώματος του GLRaV-Pr Εικόνα 3.2. Πλήρης γονιδιακή οργάνωση του GLRaV-Pr και η στρατηγική προσδιορισμού της αλληλουχίας του. Οι αναγνωρισμένες γενετικές περιοχές αντιπροσωπεύονται με ορθογώνια σχήματα και υιοθετείται η ακόλουθη ονοματολογία: L-Pro: papain-like πρωτεάση, MET: μεθυλοτρανσφεράση, HEL: ελικάση, RdRp: RNA-εξαρτώμενη RNA πολυμεράση, p5: 5 kda πρωτεΐνη, HSP70h: Ομόλογο της πρωτεΐνης θερμικής καταπόνησης 70, p60: 60 kda πρωτεΐνη, CP: καψιδιακή πρωτεΐνη, p23: πρωτεΐνη 23 kda. 83

89 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών έχει μήκος 213 νουκλεοτίδια με υψηλό περιεχόμενο σε A/T (116 A/T), ενώ δεν εμφανίζει σημαντική ομοιότητα με άλλους ιούς. Το ΑΠΑ 1α ξεκινά δυνητικά από το δεύτερο AUG κωδικόνιο (νουκλεοτίδια ), το οποίο βρίσκεται σε πολύ καλή θέση για την έναρξη μετάφρασης καθώς περικλείεται από ένα G στην +4 και ένα A στην -3 θέση (Kozak, 1986), και κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη αμινοξέων. Συγκριτική ανάλυση της αλληλουχίας αυτής της πρωτεΐνης έδειξε, όπως και στην περίπτωση άλλων clostero-ιών, την παρουσία τριών ενζυμικών μοτίβων, μιας papain-like πρωτεάσης (L-Pro) (Εικ. 3.3), μιας μεθυλοτρανσφεράσης (MET) και μιας RNA ελικάσης (HEL) (Εικ. 3.4A, B). Τα * GLRaV-Pr RGFCWLPLYLAS-E IP-LAQY--PTS----GLVR------LFSLYD-KFG GLRaV-9 KGFCWLPLYTAS-D IP-ISQY--PTG----GLVR------LFTLYD-KFG PMWaV-1 KGYCWLPLFLKS-K IP-LSKY--PQC----PYVR------LNHLRR-LFG PBNSPaV RGYCWVNPILDS-G LT-ISEL--PNL----SHVP------KSFVLA-HIK GLRaV-3 KGWCWFNNERLRGEIY RRRC--FSS----SF--SI----GFLMHL-GFR PMWaV-2 RGWCWLTIPGVQKA LRHCETF--PSI------VS------ISYLRKLGCG LIYV DGFCWLDVFADA-N RR-IPEWVKPHCLLTGSVLM------SCGLWD--FA GLRaV-2 NGFCYLAHCRYACAFLLKGFDPKRFD-IGAF--PTA----ADLR-RRMVSVLGDRSLGLN * GLRaV-Pr PVPI-VKT--GKYYHYDV NGRR--HIKFPN--VWVGA GLRaV-9 PVPI-VKS--GKYYHYDV KGKK--HIKFPN--VWVGA PMWaV-1 EVSL-VKA--GEYYHYSE SGIK--NSKLPN--VLVGA PBNSPaV DAKF-VVR--GKYLHFDK TGKT--SVGTAS--TPVGA GLRaV-3 SLKV-IRFAGTNILHMPSLNEERTFGWKGG-DVYLPNVPKT--AIVAG PMWaV-2 RFKV-MPTGDPKVYHFSN NNGILIDSLSYH--LRVAG LIYV KRKMVSVS--HGLLHYDR KLER--SSARAGVRDFVGA GLRaV-2 LYGA-YTS--RGVFHCDYDA KYIK--DLRRMS--AVIAG Εικόνα 3.3. Αναγνώριση και σύγκριση των papain-like πρωτεασών μεταξύ των ampelo- (GLRaV-Pr, GLRaV-9, PMWaV-1, PBNSPaV, GLRaV-3, GLRaV-1, PMWaV-2), clostero- (GLRaV-2) και criniιών (LIYV). Οι αστερίσκοι δείχνουν τα προβλεπόμενα καταλυτικά κατάλοιπα αμινοξέων των πρωτεασών, ενώ το βέλος υποδεικνύει την προβλεπόμενη θέση διαχωρισμού. πιθανά καταλυτικά αμινοξέα Κυστείνη (Cys) και Ιστιδίνη (His) της L-Pro εντοπίστηκαν στις θέσεις 444 και 487 της πολυπρωτεΐνης, αντίστοιχα (Εικ. 3.3). Συγκρίσεις αλληλουχιών με άλλα μέλη της οικογένειας Closteroviridae έδειξαν ότι η θέση διαχωρισμού της L-Pro πιθανώς βρίσκεται μεταξύ των αμινοξικών καταλοίπων G 504 και A 505 (Εικ. 3.3). Διάσπαση της πολυπρωτεΐνης στη θέση αυτή θα οδηγούσε στην παραγωγή μιας οδηγού πρωτεΐνης μεγέθους 55 kda και μιας δεύτερης 198 kda από το C-άκρο του μορίου. Η περιοχή MET, η οποία περιλαμβάνει τα έξι χαρακτηριστικά μοτίβα (I έως IV) που είναι συντηρημένα σε ολόκληρη την Sindbislike υπερομάδα των θετικής πολικότητας RNA ιών (Rozanov και συν., 1992), αναγνωρίστηκε καθοδικά της L-Pro μεταξύ των αμινοξικών καταλοίπων 565 και

90 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών Τα υψηλότερα ποσοστά ομοιότητας της MET του GLRaV-Pr παρατηρήθηκαν με τις ομόλογες περιοχές των PMWaV-1 (46%), PBNSPaV (35%) και GLRaV-3 (32%) (Πίνακας 3.2). Δεν πραγματοποιήθηκε σύγκριση αλληλουχιών με την MET περιοχή των GLRaV-1 και GLRaV-9 καθώς αυτή δεν έχει ακόμη προσδιοριστεί για τον GLRaV-1, ενώ στη διαθέσιμη αλληλουχία για τον GLRaV-9 δεν υπάρχουν τα μοτίβα MET I III πιθανώς λόγω λανθασμένης αλληλούχησης (Εικ. 3.4A). Η περιοχή στο 3 -άκρο του ΑΠΑ 1α (κατάλοιπα ) αναγνωρίστηκε ως ελικάση και περιλαμβάνει τα επτά συντηρημένα μοτίβα (I-VI), χαρακτηριστικά της υπεροικογένειας I των ελικασών των θετικής πολικότητας RNA ιών (Koonin & Dolja, 1993). Αυτή η περιοχή εμφάνισε σημαντικές ομοιότητες με ελικάσες άλλων ampelo-ιών, κυρίως με εκείνη του GLRaV-9 (80%) (Πίνακας 3.2). Θα πρέπει να σημειωθεί πως, με τη βοήθεια της βάσης δεδομένων CDD, εντοπίστηκε μια AlkB δομή μεταξύ των μοτίβων MET και HEL (κατάλοιπα αμινοξέων ). Αυτή η περιοχή, όπως φάνηκε από τις βάσεις δεδομένων, είναι παρούσα και στους γενετικά συγγενείς GLRaV-9 και PBNSPaV. Πολλαπλή στοίχιση των AlkBs των ιών αυτών όπως επίσης και των GLRaV-3, LChV-2 και επιλεγμένων μελών της Flexiviridae έδειξε υψηλά ποσοστά συντήρησης των αλληλουχιών αμινοξέων (Εικ. 3.14) με ομοιότητες που κυμαίνονται από 28% (GLRaV-9 με GRSPaV) έως 67% (GLRaV-Pr με GLRaV-9). Το ΑΠΑ 1β επικαλύπτεται με τα τελευταία 2 νουκλεοτίδια του ORF1α και δυνητικά κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 515 αμινοξέων με προβλεπόμενο ΜΒ 58,2 kda. Στην επικαλυπτόμενη ΑΠΑ 1α/1β περιοχή του GLRaV-Pr υπάρχει η αλληλουχία GUUUAGCC, η οποία περιλαμβάνει το κωδικόνιο τερματισμού (υπογραμμισμένο) του ORF1α, και είναι όμοια με την αλληλουχία που εμπλέκεται στον μηχανισμό +1 ριβοσωμικής αλλαγής πλαισίου άλλων clostero-ιών (GLRaV-2, BYV, BYSV) (Agranovsky και συν., 1994; Karasev και συν., 1996; Zhu και συν., 1998). Η κωδικοποιημένη πρωτεΐνη εμφανίζει σημαντική ομοιότητα με την RdRp άλλων ampelo-ιών κυρίως των GLRaV-9 (63%) και PMWaV-1 (56%) (Πίνακας 3.2) και περιλαμβάνει τα οχτώ μοτίβα που είναι συντηρημένα μεταξύ των RdRps των θετικής πολικότητας RNA ιών (Koonin & Dolja, 1993). Θα πρέπει να σημειωθεί πως η δημοσιευμένη RdRp του GLRaV-9 δεν περιλαμβάνει τα δύο τελευταία συντηρημένα μοτίβα (VII, VIII) (Εικ. 3.4Γ). Ωστόσο, με βάση τη συνολικά ορθή στοίχιση της 85

91 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών πρωτεΐνης με ορθόλογα άλλων clostero-ιών, αυτό μπορεί να αποδοθεί σε λάθος της διαδικασίας αλληλούχησης. Πίνακας 3.2. Ποσοστό ομοιότητας σε επίπεδο αμινοξέων διαφόρων πρωτεϊνών που κωδικοποιούνται από τον GLRaV-Pr και επιλεγμένων μελών της Closteroviridae Ομοιότητα σε αμινοξέα (%) MET α HEL β RdRp p5 HSP70h p60 CP GLRaV-9 n.a GLRaV-5 n.a. n.a. n.a. n.a. 78 γ GLRaV-De n.a. n.a. n.a. n.a. 77 γ GLRaV-4 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. 78 PMWaV PBNSPaV GLRaV GLRaV-1 n.a PMWaV LChV GLRaV LIYV Οι πολλαπλές στοιχίσεις έγιναν με το ProbCons χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες αλληλουχίες της Genebank: GLRaV-9 (AY297819), GLRaV-5 (AF233934), GLRaV-De (AM494935), GLRaV-4 (AM162279), PMWaV-1 (AF414119), PBNSPaV (EF546442), GLRaV-3 (AF037268), GLRaV-1 (AF195822), PMWaV-2 (AF283103), LChV-2 (AF531505), GLRaV-2 (AY881628) και LIYV (U15440, U15441). α αλληλουχία αμινοξέων από MET I έως MET IV, β αλληλουχία αμινοξέων από HEL I έως HEL VI, γ με βάση τμήμα αλληλουχίας, n.a. μη διαθέσιμη Το επόμενο ΑΠΑ (νουκλεοτίδια ) πιθανώς κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη μεγέθους 5,2 kda (p5) η οποία περιλαμβάνει ένα ισχυρά υδρόφοβο τμήμα στο N- τελικό άκρο της (περίπου δύο τρίτα της πρωτεΐνης) σε αντιστοιχία με όμοια μικρά πεπτίδια που κωδικοποιούνται από άλλους clostero-ιούς. Το πεπτίδιο εμφανίζει ένα διαμεμβρανικό μοτίβο μεταξύ των καταλοίπων αμινοξέων 10 και 31. Άμεση στοίχιση αλληλουχιών έδειξε πως η p5 του GLRaV-Pr παρουσιάζει 78% ομοιότητα με την ομόλογη πρωτεΐνη του GLRaV-9, ενώ δεν εντοπίστηκε μη-κωδική διαγονιδιακή περιοχή μεταξύ των RdRp και p5. Καθοδικά της μικρής υδροφοβικής πρωτεΐνης βρίσκεται το τρίτο ΑΠΑ (νουκλεοτιδικά κατάλοιπα ) που κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 533 αμινοξέων και μεγέθους 58,5 kda η οποία εμφανίζει ομοιότητες με την HSP70 οικογένεια των μοριακών συνοδών και διαθέτει στενή γενετική συγγένεια με τις 86

92 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών αντίστοιχες πρωτεΐνες άλλων clostero-ιών (Πίνακας 3.2). Η πιθανή ομόλογη πρωτεΐνη HSP70 του GLRaV-Pr, η οποία περιλαμβάνει όλα τα χαρακτηριστικά μοτίβα που είναι συντηρημένα μεταξύ των κυτταρικών HSP70s (phosphate 1 connect 2) αλλά και μεταξύ ιών της Closteroviridae (A-H) (Ting & Lee, 1988, Εικ. 3.5) εμφανίζει υψηλότερα ποσοστά ομοιότητας με τις αντίστοιχες πρωτεΐνες των GLRaV-9 (79%), GLRaV-5 (78%) και GLRaV-De (77%). Το τέταρτο ΑΠΑ, αναγνωρίστηκε μεταξύ των νουκλεοτιδίων και , και κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 539 αμινοξέων και θεωρητικού ΜΒ 60 kda, η οποία είναι όμοια με αντίστοιχες πρωτεΐνες των GLRaV-9 (72%), GLRaV-De (69%), GLRaV-5 (56%) και PMWaV-1 (45%). Η CP-like περιοχή που εντοπίστηκε στο C- τελικό άκρο ομόλογων γονιδίων άλλων μελών της Closteroviridae (Napuli και συν., 2003) ήταν επίσης παρούσα στον GLRaV-Pr (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα σταθερά αμινοξικά κατάλοιπα R και D, χαρακτηριστικά αυτής της δομής, αναγνωρίστηκαν στις θέσεις 435 και 472, αντίστοιχα. Το επόμενο ΑΠΑ (νουκλεοτίδια ) κωδικοποιεί την CP του ιού και περιλαμβάνει τα σταθερά αμινοξικά κατάλοιπα S 133, R 178 και D 219, τα οποία είναι συντηρημένα στις αντίστοιχες πρωτεΐνες όλων των ραβδόμορφων και νηματοειδών RNA φυτικών ιών (Dolja και συν., 1991). Η CP του GLRaV-Pr με ένα προβλεπόμενο ΜΒ ~ 30 kda εμφανίζει μεγαλύτερη ομοιότητα με τις CP των GLRaV-5 (78%) και GLRaV-4 (78%). Το έκτο ΑΠΑ (νουκλεοτίδια ) κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 207 αμινοξέων με ΜΒ 23 kda (p23), η οποία εμφανίζει μεγαλύτερη ομοιότητα (61%) με τις CPm των GLRaV-5 και GLRaV-9. Μικρότερη ομοιότητα διαπιστώθηκε με την p24 του PMWaV-1 (37%) και τη CPm του PBNSPaV (15%). Θα πρέπει να σημειωθεί πως δεν παρατηρήθηκε καμιά σημαντική ομοιότητα μεταξύ αυτής της πρωτεΐνης του GLRaV-Pr και αντίστοιχων πρωτεϊνών (CPm) άλλων ampelo-, clostero- και crini-ιών. Επιπλέον, αυτή η πρωτεΐνη είναι κατά 16% όμοια με την CP του GLRaV-Pr. Η αμετάφραστη (μη-κωδική) περιοχή του 3 άκρου (UTR) του ιού, μήκους 128 νουκλεοτιδίων, ακολουθεί το ΑΠΑ 6 (θέση στην ακολουθία νουκλεοτιδίων ) και εμφανίζει μεγάλη ομοιότητα με την αντίστοιχη γενετική περιοχή του PMWaV-1 (48%). 87

93 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών MET I GLRaV-Pr -SSRVEKISVSQHLTAEEFELLKGFFGLPFLGNGSQPRNPHSLLNAMRECFNRIYLKAFR GLRaV PMWaV-1 -ERADKRFKVDCSMTAEQLDLLRKMLKINNIEAGYGSPGAHPIFNAMRKFFNEMCARAYR PBNSPaV -LKQSTHIVLNQFLTDEERDMLANIFGGVHMEFKQQWRGSHSFLNSMRAILNHLIHMEYH GLRaV-3 MIREKPSHRCDVFLKPREREKLRELFPELSIQFSDSVRSSHPFANAMRSCFNGIFSRRCG PMWaV-2 VLGKKRVCYISSHLPQEGKDLLRESFPELNLVFFDSVHNEHPMCNSVRYCFNVLFASAYK LChV-2 VLSHKFQCSISANIDQDARSILDSAFPELQIKYTTSSRSEHPMCYCVRTAFNALFHCYGA LIYV -SKESKELDINVCLSMDEKKMITNLFPDIQMSFNQKSYSNHGVFNAMRACENFYFSRKFK GLRaV-2 LKKDRPIVKVPFYMSEATQNSLTRFYPQFELKFSHSSHSDHPAAAASRLLENETLVRLCG MET Iα MET II GLRaV-Pr GVTVSDIGGNLASAVFSDS-GNLHVCMPLIDMKDAARQTKSAISLLNGLD-YKYEDASAL GLRaV PMWaV-1 GVLVSDIGGSTLNCVVNKL-TNTHVCAPNLDLKDAGRLSKACISLLNKVGDFKEFDENY- PBNSPaV CFKISSIGGNFGGHLLYGP-SDVHICCPLLETRDGQRFWKTFHDSFSATHQMKKGDVVDA GLRaV-3 NVCFFDIGGSFTYHVKAGH-VNCHVCNPVLDVKDVKRRINEILFLST-AG-GDSYVSSDL PMWaV-2 NVKFVDVGGSESYHVNMGN-VNAHVCNPMVDWKDGGRRVRESMYLSD-DG-YKVCNVESL LChV-2 VGESIDIGGCPQAHRKMGH-SNVHTCNPTLSGKDVTRRVADLADSLKTLHSDNVERTTS- LIYV NSDYIDAGGDVVSTLRSKN-HNVHICSPRLDLKDAARHIQRATVIDG-L GLRaV-2 N-SVSDIGGCPLFHLNSKTQRRVHVCRPVLDGKDAQRRVVRDLQYSN-V---RSGDDD-- MET IIα MET III GLRaV-Pr AKRLQTLKNLTFCNKPVPCCTHQSTVIIMVDVYDVSLYALLQAMEKKGSLLARCCFMFPP GLRaV PMWaV-1 LKFMTTISNLSVCNASVPNCKHRSSVITMVDVYDIHVEQLLQAMEVKGAVLARLFFMFPP PBNSPaV KK-FMRVLTNSMCYKPCGECDVPSTVLTLVDVYDIPLHTLLRAMEKKGAVIAKVAFMFCP GLRaV-3 LT-EAASKSVSYCSRESQNCDSRADAGFMVDVYDISPQQVAEAMDKKGALVFDIALMFPV PMWaV-2 YK-EVAAAKVTSCGGRFEDCGVSADAGFFVDVYDMSLQQLADGMEKKNMRTFSLALMYPV LChV-2 V--GESVNSVSSCSARFEECSHPAFSAYMVDVYDISLLSLVDGMDKHKTVFTNVALILPA LIYV -K--GYGETISFCTNKTEDCAVNRDIIIAVEVYDMTLRDMAKAMLSHGSRKFEFSCIIPP GLRaV-2 -KILEGPRNVDVCHYPLGACDRESSAMMMVQVYDASLYEICGAMIKKKSHITYLTMVTPG MET IV GLRaV-Pr ELLNSDGTVVHPDTN--VVVTREGELLRYHVANTSDCYTQDVKNVMSYLRNSSVISKSGL GLRaV ETTN--VVVNNSGNIISYSVADTSDNYSHDLANVLSFMKTSSIRSDSGF PMWaV-1 EILAGAESVQYPETS--LTVSKEGRDLVYFIGETGDSYVHSLDTLPSYITRSVVVSKTGN PBNSPaV ELALSNGTCSYPGAG--VTVCREGDLLTYFVGDSGESYVHSFEVLSSYVSSERAMSEQKL GLRaV-3 ELLYGNGEVYLEELD--TLVKREGDYLAYNVGQCGEMYEHSFSNVSGFFTFSYVRTSSGN PMWaV-2 ELLAADGEIYLETLD--VLVKREGDCVRYSVGVTGESYTHSYRCISAYFTAPAVVARGGT LChV-2 ELIEESGEVDIQSLN--TVVRWDHSTVTYFIGNTGDSYMHCRQTLVQYLTTNRVVSTLGK LIYV EIFTKECNVELYEGR--LKVTRIGDNVEYYYGSNGETFSHSCQTLKDILSV-QVFQFGGR GLRaV-2 EFLDGRECVYMESLDCEIEVDVHADVVMYKFGS--SCYSHKLSVIKDIMTTPY-LMLGGF Α) 88

94 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών HEL I HEL Iα GLRaV-Pr VDVERALVGCKFINAVPGAGKTFEIKGLMKSHAVNKNVNGIMLVLT GLRaV ADIERGIVGCKFINAVPGAGKTHEIKLLMKSHAQNKHSEGIMLVLT PMWaV EEVNKAIDNVKFVNAVPGAGKTYQIKQRMLRWFDSEKDGSALLVLT PBNSPaV ILVRKHSFPIEYINAVPGAGKTYAILRKIE------NTTEPLLVLS GLRaV GE-SFKSFEYKCYNAPPGGGKTTTLVDEFVK------SPNSTATIT PMWaV GK-NFSKVTKVCVNAPPGGGKTTKLIQEYFK------DRSGSCIMT GLRaV GE-YMKDVRISAVNSPPGGGNTTRLVDEYFG------RKKRAKIAA LChV EE-RFSSSVVVLEDTPPGGGKTTNMLTRFRS------NPYRTCILT LIYV MVRRPDVNGLKFYNKPPGAGKTTTIAKLMSKDLK---NKVKCLALS GLRaV-2 ASNLFLAGYPFSRSFVFTNSSVDILLYEAPPGGGKTTTLIDSFLKVFK--KGEVSTMILT GLRaV-Pr ASRNAADSLNEYWDS DINSKRVIVMTVDSFIFSGGRFYSEDIY GLRaV-9 SSRNAAESLNEFWDS EICNKKVVVMTVDSFVFSGGRFSSKNVE PMWaV-1 SSRNSADTLKAFAQE KRLGKMIQILTVDAFLFQARGRNVRLYK PBNSPaV STKANKIEIASKVPK HLLKIIRVRTVDSALINFDNSPIYTNC GLRaV-3 ANVGSSEDINMAVKKRD PNLEGLNSATTVNSRVVNFIVR--GMYK PMWaV-2 ANRGSAIDINDTIESIDAANASKAASNNVSGVESIDNYVCARTVNSQIMNCKGV--MNYT GLRaV-1 ANTGSVADINAAIRARE GKKEPDLVAKTANSWVINSHPR--PNSH LChV-2 ANLESSLDINKQLNAE RRTEGVRYARTIDSRVMNSLRA--GKCD LIYV YTKVGRLELIDKLKKD GIEKPEKYVKTYDSFLMNNDNI--LEIV GLRaV-2 ANKSSQVEILKKVEKEVSNIECQKRK------DKRSPKKSIYTIDAYLMHHRG---CDAD HEL II HEL III GLRaV-Pr SVLLDECYMSHAGLCILIAALTNPSFLSFYGDRRQVPFINRNPIFRDSMGML--KVSQGS GLRaV-9 TVLIDECYMSHAGLCILIAAATNPSSLSFYGDRRQVPFINRNPIFRDTMGML--KTAGNL PMWaV-1 TLLIDECYMTHAGILRGIIAAVKPEECVLYGDRRQVPFINRIKLLNDNKSFL--KPSLGN PBNSPaV EMLIDECYLPHAGQLQAIFSLYTPSKVSMYGDRHQIPFIPRTEGFVCTRAEH--NIDEDK GLRaV-3 RVLVDEVHMMHQGLLQLGVFATGASEGLFFGDINQIPFINREKVFRMDCAVF--VPKKES PMWaV-2 CALVDEMYLMHKGLLMLGVFSSGARRAIFYGDINQIPFINREKCFYSKEGVY--CPGKDE GLRaV-1 VGLIDEVYMLHKGMFQLTVVSMGVKEVIAYGDKNQIPFINREKTFVTPNEAV--EFAEEQ LChV-2 TVCIDECFLVHAGELKICAVLAGADEVYLYGDSQQIPFINRLQSFACKNGVV--KTDKFK LIYV NLYCDEVFMMHAGHFLTLLTKIAYQNGYCYGDVNQIPFINRDPYTPAYLSRE--FFRKQD GLRaV-2 VLFIDECFMVHAGSVLACIEFTRCHKVMIFGDSRQIHYIERNDLDKCLYGDLDRFVDLQC HEL IV GLRaV-Pr YTEKLLTYRCPADICYWMSSVDYLKPGGRLYSGPVKTVKDGRP-LKSVRITPFSPSQLDF GLRaV-9 YTEKLLSFRCPADICYWMSTVDYLKPGGRLYSGKVTTVKDSRP-LKSVSIMPFSPDQLNF PMWaV-1 YSEMLITRRCPADICWRMSNVNNGKKGDRLYSGPVKLFTQSKPVLKSVTCKAFSKGDHNL PBNSPaV YSEVLKSYRCPADICYWMNCVA--KAPEKVYSGLVTTFN--KV-LRSVVKIPSAVIPSHL GLRaV-3 VVYTSKSYRCPLDVCYLLSSMTV-RGTEKCYPEKVVSGKDKPV-VRSLSKRPIGTTDDVA PMWaV-2 IIYTSESYRCPADVCMWSSSLKA-QAGSNRYLKGVSCNQREVV-LRSLSKRPVVYAEQVI GLRaV-1 IDYTDISYRCPADVCYVLSSMTD-ARGKKMYPNGVFPNGDVRP-LRSFEKVPIATPEDAL LChV-2 VIKRNVSYRCPSDVCVMLSEKRD-KRGNLCYPAGVKKGNSSRP-DRSVSYKAISSITDVD LIYV LNYDTYTYRCPLDTCYLLSNLKD-EMGNIIYAGGVKNVNEVYPTIRSLNLFGINVVGEVP GLRaV-2 RVYGNVSYRCPWDVCAWLSTV YGNLIATVKGESEGKSSMRINEINSVDDLV HEL V GLRaV-Pr MKHVDRVMTFTQLEKTDLISKFQTA----GFGDRDAAEQLIGTVAESQGETYSRVALVRT GLRaV-9 MKKVDRVMTFTQMEKADMISKFLSA----GFGDREEANQLIGTVAESQGETYARVALVRT PMWaV-1 FSQVDRVMTFTQNEKNELISEYMSR----GIGTIQDAKTLIGTVAESQGETYKRVHLVAF PBNSPaV IKEANAILTFTQADKEMAFKFVAGA----KLGM--KQKIHVSTIHEAQGKTFENVIIYRG GLRaV-3 EINADVYLCMTQLEKSDMKRSLKGK----G------KETPVMTVHEAQGKTFSDVVLFRT PMWaV-2 QLEADAYITFKQECKEKVVRALRAV----G------RRDKVFTSHEAQGMTFGRVVLCRL GLRaV-1 LYEADVYLTMTQNEKAEMQKAVAKMEVVAG-----KKRPDVITTHEAQGKTYENVVLVRL LChV-2 MENGDVFVTFTQDEKHAVSNEARAR----K------LKVSSNTVHEIQGKTVPFVKIIRL LIYV VEYNAKYLTFTQDEKLNLQRHIDSQ----G-----GCRNAVSTVNEAQGCTFSEVNLVRL GLRaV-2 PDMGSTYLCMLQSEKLEISKHFIRK----G-----LTKLNVLTVHEAQGETYARVNLVRL HEL VI GLRaV-Pr KAADDAVFSSFPHRLVALTGHTQSLEFVCLPSKLSKGIGKDVQMIE--KL GLRaV-9 KAADDAVFNSFPHRLVALTRHTVSLQFVCLPTKMSKGIGADCKMIE--KL PMWaV-1 KPTDDQVFSSMPHRLVALSRHTISLQYFCIPNKMNKGIGEDVQSII--KL PBNSPaV RQAEDDVYRSLPHRLVGLTRHTKSLKYVVHPARTADTLSKDIDNIL--KA GLRaV-3 KKADDSLFTKQPHILVGLSRHTRSLVYAALSSKLDDKVGTYISDASPQSV PMWaV-2 SATDDSVFSSEPHILVALSRHTQSCVYATLSSKLADKVGAAIDSVTRKEV GLRaV-1 KKADDPIFSRKPHIVVALSRHTRSMKYAVLSSKMTDTISKLIDGTSAGKV LChV-2 KAAEDSVFTMTGHEIVALSRHTVGARYYSISKRLFDGIGREIRTMM--NF LIYV VQFDNPVMSDINQFVVAISRHTTTFKYFTPHSRLNDRVSNAISSLQ--SV GLRaV-2 KFQEDEPFKSIRHITVALSRHTDSLTYSVLAARRGDATCDAIQKAA--ELVNKFRVFPTS Β) 89

95 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών RdRp I RdRp II GLRaV-Pr GKGGLDRELVNPDILGQNSNKFKLMVKSDVKFKGDAEALEEFAPGQNIVFHDRLTCAHFS GLRaV-9 GRGGLDRELENPDILGPNLNRFKLMVKSDVKFKGDSEALEEFAPGQNIVFHDRLTCAHFS PMWaV-1 GKKALMMELENPVELGTNLNRFKLMVKADVKFKTDLECLSEVPPGQNIVFHDRAICAHFS PBNSPaV GKSALARDLEASPDWRSDLNRFKIMVKADMKSKLDGTAETSLPSGQNIVYHRRNVCLLFS GLRaV-3 AYKSLKRALGSFVFHPSMLTSYTLMVKADVKPKLDNTPLSKYVTGQNIVYHDRCVTALFS PMWaV-2 GYKALLSALGGYFYTPDGMSRYKLMVKSDAKPKLDETPLMKYVTGQNIVYHDRAITSIFS GLRaV-1 AKQSLWVRLRSFVYDLAAMTRYQLMVKADAKPKLDSTPLQQYVTGQNIVYHDRAITAMFS LChV-2 RFNNVLKDMTTQMIPENDLTSFKLMLKTDSKPKLDDSVLSSVPSGQNIVYHRSSVNALFS LIYV KYRMLNRRLDF-ASLADKFKTLNLMVKGETKPKMDLSTYDSYNAPANIVYYQQIVNLYFS GLRaV-2 QIKALMKDVESPLEIDDEICRFKLMVKRDAKVKLDSSCLTKHSAAQNIMFHRKSINAIFS RdRp III RdRp IV GLRaV-Pr SVFCELVLRLRSVSLPNVILFNGLSFEEFAFSLDSALNGEPLCNFKSDEVDISKYDKSQN GLRaV-9 SVFCELVNRLRSICLPNIILFNGLSFEDFAISLDAALGGESLANFKCDEVDISKYDKSQN PMWaV-1 VCFRELVNRLRTVVHKNIVLFNGLSFEEFADQLSAALNDESIDTFNCDEVDISKYDKSQS PBNSPaV SVFQQLTERLKFLLKPHVKLFHGCSLDDFAQSLRDSAVG-DLTSYYCAEVDLSKYDKSQN GLRaV-3 CIFTACVERLKYVVDERWLFYHGMDTAELAAALRNNLG--DIRQYYTYELDISKYDKSQS PMWaV-2 QCFVQMVERLKYVTDSKVILYHGMDPSNLAKRIRADIG--DINKYYCYELDISKYDKSQG GLRaV-1 HIFTQAVERLKYVLHSKVMAYHGMSTDDFSREVCERLR--DISGYYVYELDISKYDKSQG LChV-2 HIFCQTVERLHRVLKRNFLLATGMSQDEFETYLNDGLNN-KVQNLFCSEVDISKFDKSQG LIYV PIFLECFARLTYCLSDKIVLYSGMNTDVLAELIESKLPL-GLNAYHTLEIDFSKFDKSQG GLRaV-2 PIFNEVKNRIMCCLKPNIKFFTEMTNRDFASVVSNMLG--DDDVYHIGEVDFSKYDKSQD RdRp V GLRaV-Pr TFTKAIELEVYRRLGLDQCILDA-WAASEFYGRATTGSRSFSAEVFAQRRTGAANTWIGN GLRaV-9 TFTKALELEVYRRLGLDQNILDT-WAASEFYGRATTGSKSFSAEIFSQRRTGAANTWIGD PMWaV-1 TFTKAVELEIYRTLGLPEKILQI-WAASEFFGKAVTNKRSFSAEVYAQRRTGAANTWIGN PBNSPaV DFTKGIEHEIYRRLGMDTELLEY-WCASDFSSQVGSTSRGFSLSIGSQRRTGTATTWLGN GLRaV-3 ALMKQVEELILLTLGVDREVLST-FFCGEYDSVVRTMTKELVLSVGSQRRSGGANTWLGN PMWaV-2 ALMKDVEQRVLRLLGLHEEIIDM-FFCGEYDCLVSMTTREFETSIGAQRRSGGANTWLGN GLRaV-1 ACMKDVERLILIGLGVAESVVDA-FFCGEYDSVVTMGKNELVLSVGAQRRSGGANTWLGN LChV-2 PLIKQIEEMVLRRLGVDEEVLNW-WYSSEYESVCSTFDKSLTVSVDAQRRTGGSNTWLGN LIYV TCFKLYEEMMYKMFGFSPELYDRDFKYTEYFCRAKA-TCGVDLELGTQRRTGSPNTWLSN GLRaV-2 AFVKAFEEVMYKELGVDEELLAI-WMCGERLSIANTLDGQLSFTIENQRKSGASNTWIGN RdRp VI RdRp VII GLRaV-Pr TIINMCLLSQSVNPNEFSACCFAGDDSLLIYKNKPNIAFDVYETKFDFDVKFFDCAAMYF GLRaV-9 TVINMCLLAQSTDPEKFSACCFAGDDSLLVYRDKPNIEFNVYETKFDFDVNL PMWaV-1 TVINMMLLSQSVDVTSLNAVCFAGDDSLILKKGVPRVNFDVYDLKYEFDVKYFDCASKYF PBNSPaV TVVNMALMARVLGCENFSSMAFSGDDSILFHHSPLDLDISNYELHFAFDVKLFRMTVPYF GLRaV-3 SLVLCTLLSVVLRGLDYSYIVVSGDDSLIFSRQPLDIDTSVLSDNFGFDVKIFNQAAPYF PMWaV-2 TIVVMTLLSILLEESHVDYIVVSGDDSLIFSTEPLDLDTHTLTQNYGFDCKLLNMTAPYF GLRaV-1 TLVLMTLLAISLKGFEPDLVVVCGDDSLIFSKNELVINDRILEESFGFDLKLTCQCVPYF LChV-2 TIVNMVLLAYVKNFDPNTFVCFSGDDSLVLSRDPIYFDFFKLSLELGFDVKFTPVATPYF LIYV TLVTLGMMLSSYDIDDIDLLLVSGDDSLIFSRKHLPNKTQEINKNFGMEAKYIEKSSPYF GLRaV-2 SLVTLGILSLYYDVRNFEALYISGDDSLIFSRSEISNYADDICTDMGFETKFMSPSVPYF RdRp VIII GLRaV-Pr CGKFLISDGLKTHVVPDPLKLFVKLGKERPP----EDKVLVENWRSFYDVTKAFANNTVL GLRaV PMWaV-1 CGKFSIENSGKIKVMPDPFKIFVKFGKERPE----TDKILLEQWQSLFDITEAYTSDANI PBNSPaV CSKFFVVGSSGLNFVPDPVKLFVSLGSEKND----DESVMRERFVSFLDLTKSYEDLTVC GLRaV-3 CSKFLVQVEDSLFFVPDPLKLFVKFGASKTS----DIDLLHEIFQSFVDLSKGFNREDVI PMWaV-2 CSKFLVQCKDLCYFVPDPFKLFVKHGICKST----SVSDLHERFMSFVDVTKDLVSEDVV GLRaV-1 CSKYLVRTPDHCYFLPDPFKLFLKLSLEREP----NEDLLFEVFTSFVDLTRGFGDENAV LChV-2 CSKYIINTEDRIFIVPDIFKLVTKLGRVFAR----TKAEGLETFESFKDTIKWFGRDDVV LIYV CSKFIVELNGKLKVIPDPIRFFEKLSIPIRQEDFVNGSVVKERFISFKDLMKEYDNDVAV GLRaV-2 CSKFVVMCGHKTFFVPDPYKLFVKLGAVKED---VSMDFLFETFTSFKDLTSDFNDERLI Γ) Εικόνα 3.4. Πολλαπλή στοίχιση αμινοξέων των πρωτεϊνών που αντιστοιχούν στο ORF 1α/1β του GLRaV- Pr και επιλεγμένων ampelo- (GLRaV-9, GLRaV-3, GLRaV-1, PMWaV-1, PBNSPaV, PMWaV-2, LChV- 2), clostero- (GLRaV-2) και crini-ιών (LIYV). Παρουσιάζονται τα συντηρημένα μοτίβα των MET, HEL και RdRp περιοχών. 90

96 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών Ανάλυση τμήματος της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας και γονιδιακή οργάνωση του GLRaV-De Η αλληλουχία του προϊόντος της ένθετης PCR μήκους ζβ που προσδιορίστηκε στη μελέτη αυτή συναρμολογήθηκε με τις ήδη γνωστές περιοχές του ιού (κεφ. 2) δίνοντας μια αλληλουχία συνολικού μήκους νουκλεοτιδίων η οποία κατατέθηκε στην EMBL-EBI με κωδικό πρόσβασης AM (βλέπε παράρτημα ΙΙ). Η αλληλουχία αυτή κωδικοποιεί τέσσερα ΑΠΑ (Εικ. 3.5), τα οποία χαρακτηρίστηκαν ως 3, 4, 5 και 6 ακολουθώντας την ονοματολογία που χρησιμοποιήθηκε για τον GLRaV-Pr. Το ΑΠΑ 3 (νουκλεοτιδικά κατάλοιπα ) κωδικοποιεί τμήμα της HSP70h (524 αμινοξέα) το οποίο έχει θεωρητικό ΜΒ 57 kda και συγγενεύει γενετικά με τις αντίστοιχες πρωτεΐνες άλλων clostero-ιών (Πίνακας 3.3). Η πρωτεΐνη περιλαμβάνει όλα τα χαρακτηριστικά μοτίβα που είναι συντηρημένα μεταξύ των κυτταρικών HSP70s (phosphate 1 connect 2) αλλά και μεταξύ ιών της Closteroviridae (A-H) (Ting & Lee, 1988, Εικ. 3.6) και εμφανίζει υψηλότερα ποσοστά ομοιότητας με τις ομόλογες πρωτεΐνες των GLRaV-5 (84%), GLRaV-9 (83%) και GLRaV-Pr (77 %). Εικόνα 3.5. Τμήμα της γονιδιακής οργάνωσης του GLRaV-De και η στρατηγική προσδιορισμού της αλληλουχίας αυτής της περιοχής. Οι αναγνωρισμένες γενετικές περιοχές αντιπροσωπεύονται με ορθογώνια σχήματα και ακολουθείται η ονοματολογία που υιοθετήθηκε για τον GLRaV-Pr (Εικ. 3.2). 91

97 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών Το ΑΠΑ 4, αναγνωρίστηκε μεταξύ των νουκλεοτιδίων και 3.193, και κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη 545 αμινοξέων και θεωρητικού μοριακού βάρους 60,8 kda (p61), η οποία είναι όμοια με αντίστοιχες πρωτεΐνες των GLRaV-9 (82%), GLRaV-Pr (69%), και GLRaV-5 (65%). Η CP-like περιοχή που αναγνωρίστηκε στο C-τελικό άκρο ομόλογων γονιδίων άλλων μελών της Closteroviridae (Napuli και συν., 2003) ήταν επίσης παρούσα στον GLRaV-De (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα σταθερά αμινοξικά κατάλοιπα R και D, χαρακτηριστικά αυτής της δομής, αναγνωρίστηκαν στις θέσεις 435 και 472, αντίστοιχα. Το επόμενο ΑΠΑ (νουκλεοτίδια ) κωδικοποιεί την CP του ιού και περιλαμβάνει τα σταθερά αμινοξικά κατάλοιπα S 129, R 174 και D 215, τα οποία είναι συντηρημένα στις ομόλογες πρωτεΐνες όλων των ραβδόμορφων και νηματοειδών RNA φυτικών ιών (Dolja και συν., 1991). Η CP του GLRaV-De με ένα προβλεπόμενο ΜΒ 29 kda εμφανίζει μεγαλύτερη ομοιότητα με τις CP των GLRaV-5 (85%), GLRaV-9 (85%), GLRaV-4 (80%) και GLRaV-Pr (75%). Πίνακας 3.3 Ποσοστό ομοιότητας σε επίπεδο αμινοξέων των πρωτεϊνών HSP70h, p61 και CP του GLRaV-De και επιλεγμένων μελών της Closteroviridae. Ομοιότητα σε αμινοξέα (%) HSP70h p61 CP GLRaV-5 84 γ GLRaV GLRaV-4 n.a. α n.a. 80 GLRaV-Pr PMWaV PBNSPaV GLRaV GLRaV PMWaV LChV GLRaV LIYV Οι πολλαπλές στοιχίσεις έγιναν με το ProbCons χρησιμοποιώντας τις ακόλουθες αλληλουχίες της Genebank: GLRaV-Pr (ΑΜ182328), GLRaV-4 (AM162279), GLRaV-9 (AY297819), GLRaV-5 (AF233934), PMWaV-1 (AF414119), PBNSPaV (EF546442), GLRaV-3 (AF037268), GLRaV-1 (AF195822), PMWaV-2 (AF283103), LChV-2 (AF531505), GLRaV-2 (AY881628) και LIYV ( U15441) α n.a. = Η αλληλουχία αυτού του τμήματος του γονιδιώματος δεν είναι διαθέσιμη στη βάση δεδομένων 92

98 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών 93

99 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών Εικόνα 3.6. Πολλαπλή στοίχιση αμινοξέων της HSP70h των GLRaV-Pr, GLRaV-De και επιλεγμένων ampelo- (GLRaV-9, GLRaV-5, PMWaV-1, PBNSPaV, GLRaV-3, GLRaV-1, PMWaV-2, LChV-2), clostero- (GLRaV-2) και crini-ιών (LIYV). Παρουσιάζονται όλα τα χαρακτηριστικά μοτίβα που είναι συντηρημένα μεταξύ των κυτταρικών HSP70s (phosphate 1 connect 2) αλλά και μεταξύ ιών της Closteroviridae (A-H). 94

100 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών Το ΑΠΑ 6 (νουκλεοτίδια ) κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη (76 αμινοξέα) που αντιστοιχεί σε τμήμα της p23 και εμφανίζει μεγαλύτερη ομοιότητα με τις CPm των GLRaV-5 (86%), GLRaV-9 (84%) και την p23 του GLRaV-Pr (65%). Χαμηλότερη ομοιότητα διαπιστώθηκε με την p24 του PMWaV-1 (46%) και τη CPm του PBNSPaV (4%) Φυλογενετική ανάλυση Για την πραγματοποίηση φυλογενετικών αναλύσεων επιλέχθηκε ένα μοντέλο αντικατάστασης αμινοξέων που παρήγαγε τη χαμηλότερη τιμή BIC για κάθε ομάδα αλληλουχιών. Πιο συγκεκριμένα, επιλέχθηκε το Blosum62 +di + dγ για τις ομάδες αλληλουχιών της HEL και RdRp, ενώ το μοντέλο WAG + di + dγ ήταν πιο κατάλληλο για την ανάλυση της HSP70h. Τα δύο φυλογενετικά δέντρα, που κατασκευάστηκαν με τις μεθόδους μέγιστης πιθανοφάνειας και ανάλυσης κατά Bayes αντίστοιχα, παρουσίαζαν ταυτόσημες τοπολογίες για κάθε ομάδα αλληλουχιών αμινοξέων (Εικ. 3.7). Επιπλέον, σε όλα τα δέντρα τα γένη Closterovirus και Crinivirus υποστηρίζονται με υψηλές NPB και BPP τιμές και διαχωρίζονται ως ξεχωριστές μονοφυλετικές ομάδες (Εικ. 3.7). Οι φυλογένειες της RdRp και της HSP70h υποστήριξαν την μονοφυλετική προέλευση και των ampelo-ιών, αν και αυτή η ομάδα διαχωρίστηκε περαιτέρω σε δυο ξεχωριστές υποομάδες, οι οποίες χαρακτηρίστηκαν ως I και II ακολουθώντας την ονοματολογία που είχε προηγουμένως υιοθετηθεί (κεφ. 2). Οι GLRaV-Pr και GLRaV-De ομαδοποιήθηκαν στην υποομάδα I μαζί με τους GLRaV-5, GLRaV-9, PMWaV-1 και PBNSPaV, ενώ η υποομάδα II αποτελείται από τους GLRaV-1, GLRaV-3, PMWaV-2 and LChV-2. Ωστόσο, η ανάλυση της περιοχής της HEL οδήγησε σε πολυτομίες, οι οποίες αποτελούνταν από ένα φυλογενετικό κλάδο clostero-ιών, έναν crini-ιών και δύο κλάδους που αντιστοιχούσαν στο γένος Ampelovirus. Θα πρέπει να σημειωθεί πως τα φυλογενετικά δέντρα μέγιστης πιθανοφάνειας και κατά Bayes ανάλυσης της HSP70h παρείχαν βαθύτερη ανάλυση των γενετικών σχέσεων (μεγαλύτερες τιμές bootstrap) μεταξύ ιών της Closteroviridae ακόμα και από την πολύ συντηρημένη RdRp. 95

101 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών 96

102 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών Εικόνα 3.7. Φυλογενετικά δέντρα που υπολογίστηκαν με τις μεθόδους Μέγιστης Πιθανοφάνειας και κατά Bayes ανάλυσης χρησιμοποιώντας ομόλογες αλληλουχίες από τις περιοχές της HEL, RdRp και της HSP70h. Οι συντομογραφίες και οι κωδικοί πρόσβασης ιών της Closteroviridae στην EMBL-EBI συμπεριλαμβάνονται ως εξής: Little cherry virus 1 (LChV-1, Y10237), Tomato chlorosis virus (ToCV, EU284744, EU284745), Beet pseudo-yellows virus (BPYV, AY330918, AY330919), Lettuce infectious yellows virus (LIYV, U15440, U15441), Beet yellow stunt virus (BYSV, U51931), Citrus tristeza virus (CTV, U16304), Beet yellows virus (BYV, X73476), Grapevine leafroll associated virus-2 (GLRaV-2, AY881628), Mint virus 1 (MiV-1, AY792620), Mint vein banding virus (MVBaV, AY548173), Raspberry mottle virus (RMoV, DQ357218), Strawberry chlorotic fleck associated virus (SCFaV, DQ860839), Blackberry yellow vein virus (BYVV, AY776334, AY776335), Strawberry pallidosis associated virus (SPaV, AY488137, AY488138), Sweet potato chlorotic stunt virus (SPCSV, AJ428554, AJ428555), Potato yellow vein virus (PYVV, AJ557128, AJ557129), Cucurbit yellow stunting disorder virus (CYSDV, AJ537493, AJ223619), Little cherry virus 2 (LChV-2, AF531505), Pineapple mealybug wilt associated virus 2 (PMWaV-2, AF283103), Grapevine leafroll associated virus 1 (GLRaV-1, AF195822), Grapevine leafroll associated virus 3 (GLRaV-3, AF037268), Grapevine leafroll associated virus 9 (GLRaV-9, AY297819), Grapevine leafroll associated virus 5 (GLRaV-5, AF233934), Grapevine leafroll associated virus De (GLRaV-De, AM494935), Pineapple mealybug wilt associated virus-1 (PMWaV-1, AF414119), Plum bark necrosis and stem pitting associated virus (PBNSPaV, EF546442), Grapevine leafroll associated virus Pr (GLRaV-Pr, AM182328). Οι επιπρόσθετες ιικές αλληλουχίες που χρησιμοποιήθηκαν προέρχονταν από τους: Tobacco rattle virus (TRV, D00155), Tomato mosaic virus (ToMV, AJ417701), Spring beauty latent virus (SBLV, AB080599) ενώ οι επιπλέον ομόλογες αλληλουχίες της HSP70 ήταν από ντομάτα (L08830), O. sativa (X67711) και A. marginale (AAV86636, bacteria). Οι τιμές πάνω από κάθε κλάδο είναι οι τιμές μη-παραμετρικής ανάλυσης bootstrap (NPB) οι οποίες δίνονται ως ποσοστό επί της % 1000 επαναλήψεων, ενώ εκείνες κάτω από τους κλάδους αντιπροσωπεύουν τη Bayesian posterior probability (BPP). Παρουσιάζονται μόνο οι τιμές NPB και BPP με P > 0.7 and >0.8, αντίστοιχα Παραγωγή ειδικών για τον GLRaV-Pr πολυκλωνικών αντισωμάτων Πραγματοποιήθηκε επιτυχώς η εισαγωγή και έκφραση της ανασυνδυασμένης CP στα βακτηριακά κύτταρα (Εικόνα 3.8). Εικόνα 3.8. SDS-πηκτή πολυακρυλαμίδης για την αξιολόγηση της επαγωγής έκφρασης της ανασυνδυασμένης CP. Διαδρομή 1: Διαλυτή μορφή του μάρτυρα (γονίδιο DHFR στο φορέα pqe-40), Διαδρομή 2: Διαλυτή μορφή της CP, Διαδρομή 3: αδιάλυτη μορφή του μάρτυρα, Διαδρομή 4: αδιάλυτη μορφή της CP, Διαδρομή 5: ολικό κυτταρικό εκχύλισμα βακτηριακής καλλιέργειας μετασχηματισμένης με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pqe-40 πριν την επαγωγή με IPTG, Διαδρομή 6: ολικό κυτταρικό εκχύλισμα βακτηριακής καλλιέργειας μετασχηματισμένης με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pqe-31 πριν την επαγωγή με IPTG, Διαδρομή 7: ολικό κυτταρικό εκχύλισμα βακτηριακής καλλιέργειας μετασχηματισμένης με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pqe-40 μετά την επαγωγή με IPTG, Διαδρομή 8: ολικό κυτταρικό εκχύλισμα βακτηριακής καλλιέργειας μετασχηματισμένης με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pqe-31 μετά την επαγωγή με IPTG. Διαδρομή M: Προχρωματισμένος δείκτης χαμηλού εύρους MB της BioRad. 97

103 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών Μια πρωτεϊνική ζώνη μεγέθους ca. 37 kda αναγνωρίστηκε μετά από επαγωγή με IPTG, η οποία δεν υπήρχε προηγουμένως στο κυτταρικό εκχύλισμα της βακτηριακής καλλιέργειας (Εικ. 3.8, 3.9). Ωστόσο, εξαιτίας της χαμηλής διαλυτότητας της πρωτεΐνης, παρά τις αλλεπάλληλες προσπάθειες με διάφορα πρωτόκολλα, δεν ήταν δυνατή η απομόνωση της φυσιολογικής μορφής της γιαυτό και ακολούθησε καθαρισμός σε στήλη χρωματογραφίας συγγένειας με Ni-NTA ρητίνη υπό συνθήκες αποδιάταξης (Εικ. 3.9). Για την επαγωγή έκφρασης της ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης προστέθηκε 0,5 mm IPTG σε 200 ml καλλιέργειας η οποία επωάστηκε για 5 ώρες στους 37 o C. Συνολικά πραγματοποιήθηκαν δύο καθαρισμοί και συλλέχθηκαν σε κάθε περίπτωση τέσσερα κλάσματα της CP στο στάδιο της έκλουσης από τη στήλη. Εικόνα 3.9. Καθαρισμός υπό συνθήκες αποδιάταξης της ανασυνδυασμένης CP που παράχθηκε από βακτήρια μετασχηματισμένα με το pqe31 μετά από επαγωγή με IPTG. Τα κυτταρικά εκχυλίσματα αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε 12% SDS-πηκτή πολυακρυλαμίδης. Διαδρομή 1: ολικό κυτταρικό εκχύλισμα βακτηριακής καλλιέργειας μετασχηματισμένης με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pqe-31 πριν την επαγωγή με IPTG, Διαδρομή 2: ολικό κυτταρικό εκχύλισμα βακτηριακής καλλιέργειας μετασχηματισμένης με το ανασυνδυασμένο πλασμίδιο pqe-31 μετά την επαγωγή με IPTG, Διαδρομή 3: κυτταρικό εκχύλισμα που εκλούστηκε από τη στήλη (flow-through), Διαδρομές 4-5: στάδια έκπλυσης, Διαδρομές 6-9: Κλάσματα έκλουσης της ανασυνδυασμένης CP. Οι αριθμοί υποδηλώνουν τη σειρά με την οποία συλλέχθηκαν τα κλάσματα. Διαδρομή M: Προχρωματισμένος δείκτης χαμηλού εύρους μοριακών βαρών της BioRad. Για την ποσοτικοποίηση της πρωτεΐνης αναλύθηκαν 10 μl από κάθε κλάσμα σε SDS-πηκτή πολυακρυλαμίδης και συγκρίθηκε η ένταση των πρωτεϊνικών ζωνών με εκείνες δεδομένης ποσότητας BSA (Εικ. 3.10). Τελικά οι συγκεντρώσεις των κλασμάτων της πρωτεΐνης ήταν για τον πρώτο καθαρισμό 0,1, 0,5, 0,5 και 0,25 μg/μl και για τον δεύτερο 0,3, 0,5, 0,5 και 0,3 μg/μl. Κατά τη διάρκεια των εμβολιασμών του κουνελιού έγιναν αιμοληψίες σε διάφορες φάσεις για την παρακολούθηση του τίτλου των IgG. Ήδη δύο εβδομάδες 98

104 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών μετά τον δεύτερο εμβολιασμό του ζώου ήταν δυνατή η ανίχνευση IgG (Απορρόφηση στα 280nm A 280nm =1,116). Έξι μέρες μετά τον τρίτο εμβολιασμό η A 280nm αυξήθηκε σε 1,44 και 4 μέρες αργότερα που έγινε και η τελική αιμοληψία η απορρόφηση ήταν 1,55. Θεωρητικά η τιμή Α 280nm 1,4 αντιστοιχεί σε συγκέντρωση IgG 1mg/ml. Με βάση αυτή την αντιστοιχία η συγκέντρωση ολικών IgG του παραγόμενου αντιορού ήταν 1,107 mg/ml. Εικόνα Σύγκριση της έντασης των πρωτεϊνικών ζωνών των τεσσάρων κλασμάτων της καθαρής ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης με εκείνες δεδομένης ποσότητας BSA. Α) Πρώτος καθαρισμός. Διαδρομές 1-3: 10, 25 και 50 μg BSA αντίστοιχα. Διαδρομές 4-7: Κλάσματα της ανασυνδυασμένης CP με τη σειρά που εκλούστηκαν από τη στήλη. Διαδρομή M: Προχρωματισμένος δείκτης χαμηλού εύρους ΜΒ της BioRad. Β) Δεύτερος καθαρισμός. Διαδρομές 1-4: Κλάσματα της ανασυνδυασμένης CP με τη σειρά που εκλούστηκαν από τη στήλη. Διαδρομές 5-7: 10, 25 και 50 μg BSA αντίστοιχα. M: Προχρωματισμένος δείκτης χαμηλού εύρους ΜΒ της BioRad Ορολογικές δοκιμές α) Ανοσοανίχνευση μέσω στυπώματος Western Με τη χρησιμοποίηση του αντιορού που έχει παραχθεί στην παρούσα μελέτη ήταν δυνατή η ανίχνευση σε δοκιμές στυπώματος Western της καθαρής κλωνοποιημένης πρωτεΐνης που εκφράστηκε in vitro ακόμη και σε πολύ μικρές ποσότητες (30 ng) (Εικ. 3.11). Μετά από αξιολόγηση διαφορετικών αραιώσεων της IgG διαπιστώθηκε μεγαλύτερη ευαισθησία και ταυτόχρονα ειδικότητα ανίχνευσης 99

105 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών στην αραίωση 1/2000 (Εικ. 3.12). Μια ζώνη μεγέθους ca. 37 kda, ανιχνεύτηκε σταθερά σε όλα τα εκχυλίσματα των μολυσμένων από τον GLRaV-Pr φυτών (Εικ. 3.12). Καμία άλλη ζώνη αντίστοιχου ΜΒ δεν ανιχνεύθηκε σε υγιείς ή άλλους ιστούς αμπέλου με μονές μολύνσεις από ιούς που σχετίζονται με την ασθένεια GLRD. Η ανοσοανίχνευση μέσω στυπώματος western έδειξε ότι η πρωτεΐνη που εκφράστηκε από το πέμπτο ΑΠΑ που κωδικοποιεί την CP είχε όμοια ηλεκτροφορητική κινητικότητα με την CP του GLRaV-Pr που εκχυλίστηκε από μολυσμένους ιστούς αμπέλου (Εικ. 3.12). Το μέγεθος αυτής της πρωτεΐνης είναι όμοιο με εκείνων των γενετικά συγγενών GLRaV-4 και -5 (Good & Monis, 2001; Gugerli, 2003). Το θεωρητικό MB των 30 kda που υπολογίστηκε από την ακολουθία αμινοξέων της CP του GLRaV-Pr είναι μικρότερο από τα 37 kda που υπολογίστηκαν με την ανοσοανίχνευση ή και με απευθείας ανάλυση σε SDS-πηκτή πολυακρυλαμίδης (Εικ ). Δεν είναι γνωστό κατά πόσο αυτή η ασυμφωνία οφείλεται σε κάποια μετα-μεταφραστική τροποποίηση της πρωτεΐνης ή σε αλλοίωση που προκλήθηκε από την ανάλυση. Παρόμοιες ασυμφωνίες αναφέρθηκαν και για τις CP των GLRaV-5 και GLRaV-3 (Ling και συν., 1997; Good & Monis, 2003) και θεωρήθηκε ότι βρίσκονται εντός αποδεκτών ορίων. Εικόνα Ανοσοανίχνευση μέσω στυπώματος Western διαφόρων ποσοτήτων της καθαρής κλωνοποιημένης CP. Η αραίωση του πρώτου αντισώματος ήταν 1/200 και του δευτέρου 1/3000. β) Ανοσοενζυμική δοκιμή ELISA Η θετική αντίδραση της ανασυνδυασμένης CP στον αντιορό επιβεβαιώθηκε και με τις δοκιμές PTA-ELISA (Α 405nm =2,962 3,020) και DAS-ELISA (Α 405nm =0,545-0,709) (Πίνακας 3.4). Στη PTA-ELISA ο αντιορός αντέδρασε και με εκχυλίσματα μολυσμένων φυτών σε αραιώσεις πρωτογενούς IgG 1/1000, 1/2000 και δευτερογενούς συζευγμένου αντί-κουνέλι IgG 1/3000. Στην άμεση ELISA τον καλύτερο συνδυασμό IgG - συζευγμένης IgG, έδωσε η αναλογία 1/500 και 1/1500 αντίστοιχα, χωρίς επώαση με 2% BSA ή αποβουτυρωμένο 100

106 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών γάλα. Στην αναλογία αυτή οι τιμές Α 405nm των εκχυλισμάτων μολυσμένων φυτών ήταν, μετά από μια ώρα επώασης, 0,617 και 0,730 αντίστοιχα και του υγιούς 0,393. Εικόνα Ανοσοανίχνευση του GLRaV-Pr μέσω στυπώματος Western. Διαδρομή 1: Απομόνωση του GLRaV-6 από V. vinifera cv. Σκιαδόπουλο, Διαδρομή 2: Απομόνωση του GLRaV-4 από V. vinifera cv. Ρομπόλα, Διαδρομή 3: Καθαρή κλωνοποιημένη CP του GLRaV-Pr, Διαδρομή 4: Απομόνωση του GLRaV-Pr από V. vinifera cv. Μαντηλαριά (βιότυπος M3), Διαδρομή 5: Απομόνωση του GLRaV-Pr από V. vinifera cv. Πρεβεζάνικο, Διαδρομή 6: Υγιής V. vinifera cv. Κοντοκλάδι, Διαδρομή 7: Απομόνωση του GLRaV-5 από V. vinifera cv. Φράουλα, Διαδρομή 8: Απομόνωση του GLRaV-9 από V. vinifera cv. άγνωστη, Διαδρομή 9: Απομόνωση του GLRaV-De από V. vinifera cv. Κολοκυθάς. Διαδρομή M: Προχρωματισμένος δείκτης χαμηλού εύρους ΜΒ της BioRad. Το μέγεθος κάθε ζώνης απεικονίζεται σε kda. Πίνακας 3.4. Αποτελέσματα TAS- και DAS-ELISA (τιμές οπτικής πυκνότητας στα 405nm) από δείγματα αμπέλου χρησιμοποιώντας τον αντιορό που αναπτύχθηκε εναντίον της ανασυνδυασμένης CP του GLRaV-Pr Α 405nm Δείγματα PTA-ELISA IgG / Συζευγμένο αντί-κουνέλι IgG χρόνος επώασης DAS-ELISA IgG / Συζευγμένο IgG χρόνος επώασης 1:1000/ 1: ο C, 12 ώρες 1:2000/ 1: ο C, 12 ώρες 1:500/ 1: λεπτά 1:1000/ 1: λεπτά Καθαρή ανασυνδυασμένη CP 2,962 3,020 0,709 0,545 1:500 (ο/ο) Μαντηλαριά 1:10 (β/ο) 0,656 0,587 0,617 0,289 Πρεβεζάνικο 1:10 (β/ο) 0,543 0,482 0,730 0,486 Υγιές αμπέλι 1:10 (β/ο) 0,271 0,287 0,393 0,

107 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών 3.5. Συζήτηση Οι GLRaV-Pr και GLRaV-De είναι δυο νέα είδη ιών που κατατάσσονται στην ξεχωριστή ταξινομικά υποομάδα Ι του γένους Ampelovirus, η οποία περιλαμβάνει επίσης τους GLRaV-4, GLRaV-5, GLRaV-6 και GLRaV-9 (κεφ. 2). Όλοι οι ιοί-μέλη αυτής της γενεαλογίας (υποομάδα I, Εικ. 3.7) έχουν μια κοινή εξελικτική πορεία με πολύ μικρές δια-ειδικές γενετικές αποστάσεις και διαφοροποιούνται σημαντικά από τους ιούς της υποομάδας II του γένους Ampelovirus (κεφ. 2). Στη μελέτη αυτή προσδιορίστηκε τμήμα της αλληλουχίας του GLRaV-De καθώς και ολόκληρη η αλληλουχία νουκλεοτιδίων του GLRaV-Pr, γεγονός που τον καθιστά τον πρώτο πλήρως χαρακτηρισμένο ιό αυτής της γενεαλογίας. Εικόνα Γενετικοί χάρτες επιλεγμένων αντιπροσώπων των δυο υποομάδων του γένους Ampelovirus που έχουν πλήρως αλληλουχηθεί. Οι ιοί που περιλαμβάνονται είναι οι Grapevine leafroll associated virus-pr (GLRaV-Pr), Pineapple mealybug wilt associated virus-1 (PMWaV-1), Plum bark necrosis stem pittingassociated virus (PBNSPaV), Grapevine leafroll associated virus-3 (GLRaV-3) και Pineapple mealybug wilt associated virus-2 (PMWaV-2, μερικώς χαρακτηρισμένος). Η ονοματολογία των κωδικοποιημένων πρωτεϊνών είναι η ίδια με την Εικόνα 3.2. Οι πρωτεΐνες που είναι μοναδικές σε κάποιο γονιδίωμα παρουσιάζονται με το χαρακτήρα p που ακολουθείται από το μοριακό βάρος της πρωτεΐνης εκτός από την περίπτωση της περιοχής AlkB. 102

108 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών Συγκριτική ανάλυση των γενετικών περιοχών των GLRaV-Pr και GLRaV-De υποδεικνύει με σαφήνεια ότι έχουν παρόμοια μεγέθη γονιδίων και γονιδιακή οργάνωση με τους άλλους συγγενείς ampelo-ιούς, αλλά διαφέρουν από τα γνωστά είδη στις αλληλουχίες αμινοξέων σε ποσοστό πάνω από 10% (Πίνακες 3.2, 3.3). Οι GLRaV-Pr και De εμφανίζουν μικρότερη γενετική ομοιότητα με τους άλλους ampelo-ιούς από ότι ο GLRaV-9 με τον GLRaV-5. Επιπλέον, οι φυλογενετικές αναλύσεις που πραγματοποιήθηκαν με ανάλυση bootstrap της HEL, της RdRp, της HSP70h και της CP (Κεφ. 2) έδειξαν ότι αποτελούν ξεχωριστά είδη. Τέλος, δεν παρατηρήθηκε ορολογική αντίδραση των ιών αυτών με ειδικά αντισώματα εναντίον όλων των ήδη γνωστών ιών που σχετίζονται με την ασθένεια GLRD (Κεφ. 2). Τα δεδομένα αυτά σε συνδυασμό με το μέγεθος της CP και τη γονιδιακή τους οργάνωση δείχνουν ότι οι ιοί αυτοί εκπληρώνουν αρκετά τυπικά κριτήρια για την οριοθέτηση των ειδών σύμφωνα με την 8 η ICTV αναφορά (Fauquet και συν., 2005) και στηρίζουν τον μελλοντικό τους προσδιορισμό ως νέα είδη με τις προτεινόμενες ονομασίες GLRaV-10 και -11. Στα πλαίσια αυτής της εργασίας έχει παραχθεί πολυκλωνικό αντίσωμα εναντίον της ανασυνδυασμένης CP του GLRaV-Pr που εκφράστηκε σε Escherichia coli. Η χρησιμοποίηση του αντισώματος αυτού σε δοκιμές ανοσοανίχνευσης μέσω στυπώματος Western έδειξε την ειδικότητά του καθώς ανιχνεύει μόνο την CP του GLRaV-Pr και όχι εκείνη των γενετικά συγγενών GLRaV-4, -5, -6, -9 και De. Ο αντιορός αξιολογήθηκε επίσης σε δοκιμές άμεσης και έμμεσης ELISA και αντέδρασε τόσο με την καθαρή ανασυνδυασμένη CP όσο και με εκχυλίσματα φυτών μολυσμένων από τον GLRaV-Pr. Τα αντισώματα που παράγονται εναντίον ανασυνδυασμένων ιικών CP, μετά από έκφραση σε βακτηριακά κύτταρα, έχουν χρησιμοποιηθεί στην ανίχνευση διαφόρων φυτικών ιών (Vaira και συν., 1996; Jelkmann & Keim-Konrad, 1997; Ling και συν., 2000; Minafra και συν. 2000; Meng και συν., 2003; Ling και συν., 2007). Ωστόσο μόνο σε λίγες περιπτώσεις ήταν αποτελεσματικά σε δοκιμές ELISA. Αυτό οφείλεται κυρίως σε αλλαγές της τριτοταγούς δομής και των αντιγονικών ιδιοτήτων της CP που μπορεί να συμβούν κατά την έκφραση και τον καθαρισμό της. Στην παρούσα μελέτη ο αντιορός που παράχθηκε χρησιμοποιήθηκε επιτυχώς στις δοκιμές στυπώματος Western και ELISA, πιθανώς λόγω της επαναδίπλωσης της πρωτεΐνης που έλαβε χώρα πριν τον εμβολιασμό του κουνελιού. Ωστόσο οι τιμές οπτικής απορρόφησης στις δοκιμές ELISA ήταν οριακά διπλάσιες από εκείνες των αρνητικών μαρτύρων. 103

109 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών Συγκριτική ανάλυση του συνόλου της αλληλουχίας του GLRaV-Pr έδειξε πως η γονιδιακή του οργάνωση εμφανίζει σημαντικές ομοιότητες με άλλα μέλη της Closteroviridae καθώς περιλαμβάνει τις δύο τυπικές αλληλουχίες γονιδίων που συνδέονται με την αναπαραγωγή και καψιδίωση/μετακίνηση ιών της οικογένειας (Dolja και συν., 1994; Karasev, 2000; Dolja και συν., 2006). Διάφορα μέλη της οικογένειας Closteroviridae κατέχουν μεταξύ των δομών MET και HEL μια μεγάλη μεταβλητή περιοχή με άγνωστη λειτουργία. Στην παρούσα μελέτη, μια AlkB δομή αναγνωρίστηκε μέσα στην περιοχή αυτή των GLRaV-Pr, GLRaV-9 και PBNSPaV όπως αναφέρθηκε προηγουμένως και για τους GLRaV-3 και LChV-2 (Dolja και συν., 2006). Στον PBNSPaV, η AlkB εντοπίστηκε ανοδικά της περιοχής της MET (Εικ. 3.12). Αυτή η δομή έχει επίσης ανιχνευθεί στις ρεπλικάσες πολλών flexi-ιών (Martelli και συν., 2007) όπως επίσης και σε ένα μέλος της οικογένειας Potyviridae (Susaimuthu και συν., 2006) και του γένους Sadwavirus (Halgren και συν., 2007). Ο ρόλος της, σε αντιστοιχία με κάποιες κυτταρικές AlkBs, είναι πιθανό να σχετίζεται με την επιδιόρθωση του RNA μέσω της αντιστροφής της διαδικασίας μεθυλίωσης (Aas και συν., 2003), που παρατηρείται κατά τη διάρκεια της παρατεταμένης αναπαραγωγής του ιού στον ίδιο ξενιστή. Η παρουσία της AlkB σε περιορισμένο αριθμό ιών, σε σύγκριση με τον υψηλό βαθμό συντήρησής της σε κυτταρικούς οργανισμούς, υποδεικνύει ότι πιθανώς αποκτήθηκε πρόσφατα μέσω οριζόντιας γονιδιακής μεταφοράς (Dolja και συν., 2006; Martelli και συν., 2007). Επιπλέον, έχει προταθεί ότι η Flexiviridae, η οικογένεια με το μεγαλύτερο αριθμό ιών με δομές AlkB, πιθανώς δώρισε αυτή τη δομή και σε άλλα είδη εκτός της οικογένειας (Martelli και συν., 2007). Παρά την φυλογενετική κατάταξη του GLRaV-Pr στους ampelo-ιούς, η γονιδιακή του οργάνωση δεν ταυτίζεται με εκείνη της τυπικής περιγραφής του γένους. Οι ampelo-ιοί χαρακτηρίζονται από μέγεθος γονιδιώματος 16,9-19,5 kb, CP kda και ένα γονίδιο που κωδικοποιεί τη CPm το οποίο γενικά ακολουθεί εκείνο της CP (Martelli και συν., 2002). Επιπλέον, μια μεγάλη διαγονιδιακή περιοχή απαντάται σε διάφορα είδη του γένους μεταξύ της RdRp και της p6 (Karasev, 2000). Σε αντίθεση με αυτά τα τυπικά χαρακτηριστικά, το γένος Ampelovirus εμφανίζει μεγάλη ποικιλομορφία. Για παράδειγμα στον LChV-2, η CPm εντοπίζεται πέντε ΑΠΑ ανοδικά της CP (Rott & Jelkmann, 2004) ενώ στον GLRaV-1 υπάρχουν δύο CPm (Fazeli & Rezaian, 2000). Επιπλέον, μοναδικά ειδικά ανά ιό γονίδια υπάρχουν 104

110 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών συνήθως κοντά στο 3 -άκρο των ampelo-ιών και κωδικοποιούν πρωτεΐνες, οι οποίες συχνά δεν έχουν ομόλογα στις βάσεις δεδομένων. Σε αντίθεση με τα τυπικά μέλη του γένους, ο GLRaV-Pr έχει σημαντικά μικρότερο μέγεθος γονιδιώματος (13,7 kb) και μικρότερη CP (30 kda). Επιπλέον, δεν διαθέτει τη μη-κωδική διαγονιδιακή περιοχή μεταξύ των RdRp και p5, ή άλλα επιπρόσθετα γονίδια στο 3 άκρο του γονιδιώματος (Εικ. 3.13). Συγκρίσεις του GLRaV-Pr με τον μοναδικό πλήρως χαρακτηρισμένο και γενετικά συγγενή PMWaV- 1 (Melzer και συν., 2008), και τον μερικώς χαρακτηρισμένο GLRaV-9 έδειξαν ότι, μέσα στο γενετικώς ποικιλόμορφο γένος των ampelo-ιών, αυτοί οι πολύ κοντινοί γενετικά ιοί εμφανίζουν μεγάλη ομοιομορφία στη γονιδιακή οργάνωση (Εικ. 3.13). Επίσης, ο πιο απομακρυσμένος γενετικά PBNSPaV (Εικ. 3.7) που αλληλουχήθηκε Εικόνα Πολλαπλή στοίχιση των AlkB περιοχών διαφόρων ampelo-(glrav-pr, GLRaV-9, GLRaV- 3, PBNSPaV, LChV-2) και flexi-ιών [Shallot virus X (ShVX), Papaya mosaic virus (PapMV), Lily symptomless virus (LSV), Grapevine virus A (GVA), Rupestris stem pitting associated virus (RSPaV)]. Παρουσιάζονται όλα τα συντηρημένα και μη-μεταβλητά κατάλοιπα αμινοξέων. πλήρως πρόσφατα (Al Rwahnin και συν., 2007) έχει παρόμοια γονιδιακή οργάνωση. Πρόκειται για τους μικρότερους (13,1-14,2 kb) και απλούστερους (7 ΑΠΑ) ampeloιούς που έχουν τα βασικά γονιδιακά μπλοκ αναπαραγωγής και καψιδίωσης/μετακίνησης του ιού και στερούνται άλλων επιπρόσθετων γονιδίων. Οι πιο αξιοσημείωτες διαφορές αυτών των ιών από τα άλλα μέλη του γένους με γνωστή αλληλουχία εντοπίζονται εντός του γονιδιακού μπλοκ καψιδίωσης/μετακίνησης. Πιο συγκεκριμένα, το μικρότερο μέγεθος της CP (

111 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών αμινοξέα), με εξαίρεση τον PBNSPaV, είναι ένα κοινό χαρακτηριστικό των GLRaV- Pr, GLRaV-De, GLRaV-9, GLRaV-4, GLRaV-5 και PMWaV-1. Ένα άλλο ιδιαίτερο στοιχείο στα γονιδιώματα των GLRaV-Pr και PMWaV-1 είναι η παρουσία των πρωτεϊνών p23-24 οι οποίες δεν φαίνεται να αποτελούν παράλογα γονίδια της CP και γιαυτό δεν μπορούν να χαρακτηριστούν με ασφάλεια ως CPms, όπως έγινε με τα αντίστοιχα γονίδια στους GLRaV-5 και GLRaV-9. Πρόσφατα, ο Melzer και συν. (2008) αμφισβήτησαν την αναγνώριση της πρωτεΐνης p24 του PMWaV-1 ως CPm εξαιτίας της μικρής της ομοιότητας (15,5%) με την CP του ιού. Θα πρέπει να σημειωθεί πως οι όμοιες περιοχές μεταξύ των γονιδίων της CP και της CPm είναι διάσπαρτες κατά μήκος της πολλαπλής στοίχισης των αλληλουχιών σε αντίθεση με άλλα μέλη της οικογένειας Closteroviridae, στα οποία μεγαλύτερες ομοιότητες εντοπίζονται στο C-τελικό άκρο των πρωτεϊνών. Το ίδιο παρατηρείται και για τους GLRaV-Pr, GLRaV-5, GLRaV-9 και τον πιο απομακρυσμένο γενετικά PBNSPaV. Είναι γνωστό ότι η CPm σχηματίζει την ουρά του ιϊκού σωματιδίου και καψιδιώνει το 5 άκρο του γονιδιώματος ιών του γένους Closterovirus (Agranovsky και συν., 1995; Febres και συν., 1996; Tian και συν., 1999). Εκτός από την CPm, για τη συναρμολόγηση της ουράς απαιτούνται επίσης η HSP70h και η p60 (Alzhanova και συν., 2001; Napuli και συν., 2000, 2003; Peremyslov και συν., 2004; Satyanarayana και συν., 2000, 2004). Η ουρά πιθανώς λειτουργεί ως ένα εξάρτημα που εξελίχθηκε για να διευκολύνει τη διακυτταρική και διασυστηματική μετακίνηση των μεγάλων γονιδιωμάτων των clostero-ιών (Dolja, 2003). Ενδιαφέρον θα είχε να μελετηθεί μελλοντικά κατά πόσον τα ιικά σωματίδια των ampelo-ιών της υποομάδας Ι έχουν ουρά και επίσης εάν η p23 συμμετέχει στη σύνθεσή της ή έχει έναν εντελώς διαφορετικό ρόλο. Οι τοπολογίες που προέκυψαν σ αυτή τη μελέτη με τις μεθόδους Μέγιστης Πιθανοφάνειας και κατά Bayes ανάλυσης των εξελικτικά συντηρημένων πρωτεϊνών της HEL, RdRp και HSP70h (Εικ. 3.7) συμφωνούν με τη γονιδιωματική διαφοροποίηση των ιών αυτής της ομάδας από τους υπόλοιπους ampelo-ιούς. Σύμφωνα με την ανάλυση αυτή, το πρόσφατα καθορισμένο γένος Ampelovirus διακρίνεται σε δύο γενεαλογίες και επιβεβαιώνει προηγούμενες εξελικτικές μελέτες στις οποίες χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικές γονιδιωματικές περιοχές ή μέθοδοι φυλογενετικής ανάλυσης (κεφ. 2; Melzer και συν., 2008). Είναι αξιοσημείωτο ότι στην παρούσα μελέτη η μονοφυλετική προέλευση των δύο γενεαλογιών του γένους Ampelovirus δεν μπορούσε να υποστηριχτεί στην περίπτωση της φυλογένειας της 106

112 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών HEL επιβεβαιώνοντας τους Melzer και συν. (2008) που κατέληξαν στο ίδιο συμπέρασμα εφαρμόζοντας φυλογενετικές αναλύσεις με τις μεθόδους Ένωσης Γειτόνων (Neighbor joining) και Μέγιστης Φειδωλότητας (Maximum Parsimony). Μεταξύ των τριών πρωτεϊνών, οι οποίες είναι συντηρημένες σε όλα τα μέλη της οικογένειας Closteroviridae, η HSP70h παρέχει καλύτερη ανάλυση των τοπολογιών ακόμη και από την RdRp η οποία είναι συντηρημένη σε όλη την τάξη των θετικής πολικότητας RNA ιών (Koonin, 1991). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν την δυνατότητα υπολογισμού φυλογενειών σε βάθος μέσα στην οικογένεια Closteroviridae χρησιμοποιώντας την HSP70h, λόγω του μεγάλου βαθμού συντήρησής της που πιθανώς αποδίδεται σε ισχυρούς λειτουργικούς περιορισμούς που δρουν σε βασικά δομικά μοτίβα της πρωτεΐνης. Εικόνα Σύγκριση του γονιδιώματος του GLRaV-Pr με εκείνο του κοινού προγόνου της οικογένειας Closteroviridae όπως προτείνεται από το υποθετικό εξελικτικό σενάριο των Dolja και συν., (2006). Η γονιδιακή οργάνωση του GLRaV-Pr και των άλλων γενετικά συγγενών ampelo-ιών είναι εξαιρετικά όμοια με εκείνη του κοινού προγόνου της οικογένειας Closteroviridae, όπως περιγράφηκε από το υποθετικό εξελικτικό σενάριο των Dolja και συν. (2006) (Εικ. 3.15). Η μόνη διαφορά έγκειται στην παρουσία μιας διαγονιδιακής περιοχής μεταξύ της RdRp και της p6 στον κοινό πρόγονο και την απουσία του γονιδίου της p23. Θα μπορούσαμε να υποθέσουμε ότι, καθώς η υποομάδα Ι των ampelo-ιών εμφανίζει μια γονιδιακή απλότητα η οποία είναι μοναδική στην οικογένεια Closteroviridae, η μη-κωδική διαγονιδιακή περιοχή μεταξύ 107

113 Κεφ. 3. Μοριακός χαρακτηρισμός των νέων ampelo-ιών της RdRp και p5 δεν ήταν τμήμα του γονιδιώματος του κοινού προγόνου της οικογένειας. Εν κατακλείδι, τα αποτελέσματα των συγκρίσεων γονιδιακής οργάνωσης σε αυτή τη μελέτη δείχνουν ότι οι ampelo-ιοί της υποομάδας Ι αντιπροσωπεύουν ζωντανά απολιθώματα του κοινού προγόνου της Closteroviridae τα οποία απέκτησαν μόνο το γονίδιο p23 κατά την εξέλιξή τους, σε αντίθεση με τους ιούς της υποομάδας II και άλλα μέλη της Closteroviridae που επεκτείνανε το γονιδίωμά τους σημαντικά. Τα φυλογενετικά δεδομένα της εργασίας στηρίζουν περαιτέρω την ξεχωριστή εξελικτική πορεία των ampelo-ιών της υποομάδας Ι καταδεικνύοντας την ανάγκη αναθεώρησης της τρέχουσας ταξινόμησης του γένους. 108

114 Κεφ. 4. Γενική και ειδική ανίχνευση ampelo-ιών της υποομάδας Ι ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 Γενική και ειδική ανίχνευση ιών-μελών της υποομάδας Ι του γένους Ampelovirus 4.1. Περίληψη Αναπτύχθηκε μια δοκιμή ένθετης RT-PCR, η οποία επιτρέπει τη γενική ανίχνευση της εξελικτικά ανεξάρτητης υποομάδας Ι των ampelo-ιών. Η μέθοδος περιλαμβάνει μια πρώτη RT-PCR σ ένα μικροσωλήνα για τη γενική ανίχνευση ιών-μελών της οικογένειας Closteroviridae με τη χρησιμοποίηση εκφυλισμένων εκκινητών που στοχεύουν στο γονίδιο που κωδικοποιεί την HSP70h και ακολουθεί μια δοκιμή ένθετης PCR, η οποία ανιχνεύει ειδικά μόνον τους ιούς-μέλη της υποομάδας Ι. Το παραγόμενο προϊόν 490 ζβ της ένθετης PCR μπορεί να αλληλουχηθεί απευθείας για την απόκτηση γενετικών πληροφοριών οι οποίες μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε φυλογενετικές αναλύσεις για τον προκαταρκτικό χαρακτηρισμό και γρήγορη κατάταξη των ιών αυτών. Επιπλέον, σχεδιάστηκαν εκκινητές οι οποίοι χρησιμοποιήθηκαν επιτυχώς για την ειδική ανίχνευση των GLRaV-4, -5, -6, -Pr και - De σε αντίστοιχες δοκιμές απλής ή πολλαπλής ένθετης PCR. Η εφαρμογή ενός προφίλ θεμοκυκλοποίησης που περιλαμβάνει σταδιακή πτώση της θερμοκρασίας υβριδοποίησης των εκκινητών στο στάδιο της ένθετης PCR επέτρεψε όλες τις αντιδράσεις να πραγματοποιούνται ταυτόχρονα. Το παρόν διαγνωστικό σχήμα προτείνεται ως ένα εργαλείο που μπορεί να εφαρμοστεί σε ελέγχους ρουτίνας, συστήματα πιστοποίησης, αλλά και για την αύξηση των γενετικών πληροφοριών ήδη γνωστών ή και νέων ampelo-ιών, που κατατάσσονται σ αυτή τη γενεαλογία, μέσω της επιλεκτικής ενίσχυσής τους σε μικτές μολύνσεις με άλλους ιούς της οικογένειας Closteroviridae. 109

115 Κεφ. 4. Γενική και ειδική ανίχνευση ampelo-ιών της υποομάδας Ι 4.2. Εισαγωγή Ο πιο κοινός τρόπος διασποράς της ασθένειας GLRD της αμπέλου είναι ο αγενής πολλαπλασιασμός και ο εμβολιασμός. Συνεπώς, η αντιμετώπισή της στηρίζεται κυρίως στην κλωνική επιλογή και την παραγωγή πιστοποιημένου πολλαπλασιαστικού υλικού μέσα από καλά οργανωμένα σχήματα πιστοποίησης. Για να επιτευχθεί όμως αυτό απαιτείται η ανάπτυξη γρήγορων, αξιόπιστων και φθηνών μεθόδων διάγνωσης. Η ειδική ορολογική και μοριακή ανίχνευση απομονώσεων των GLRaV-1 και -3 είναι αξιόπιστη (Sefc και συν., 2000; Ling και συν., 2001; Little & Rezaian, 2006), ενώ αυτό δεν ισχύει για τον GLRaV-2, εξαιτίας της μεγάλης γενετικής του παραλλακτικότητας (Bertazzon & Angelini, 2004). Πρόσφατα, αναπτύχθηκε μια δοκιμή ένθετης PCR με σταδιακή πτώση της θερμοκρασίας υβριδοποίησης των εκκινητών για την ειδική ανίχνευση των GLRaV-1, -2 και -3 (Dovas και συν., 2006). Επιπλέον, η ανάπτυξη μιας RT-PCR πραγματικού χρόνου (real time) σε ένα μικροσωλήνα, επιτρέπει την αξιόπιστη ανίχνευση απομονώσεων του GLRaV-2 (Beuve και συν., 2007). Από την άλλη πλευρά, η ανίχνευση των φυλογενετικά συγγενών GLRaV-4, -5, - 6, -9, -De και -Pr είναι επισφαλής. Η ορολογική τους ανίχνευση είναι δύσκολη, λόγω της αδυναμίας καθαρισμού τους από φυτικό ιστό αμπέλου, ενώ η απουσία επαρκών γενετικών πληροφοριών δεν επέτρεψε την ανάπτυξη αξιόπιστων μοριακών τεχνικών για τη διάγνωσή τους. Μοριακές μέθοδοι ανίχνευσης, καθώς και δοκιμές RT-PCR πραγματικού χρόνου (Osman και συν., 2007) έχουν αναπτυχθεί για τη διάγνωση των GLRaV-4 (Routh και συν., 1998), GLRaV-5 (Routh και συν., 1998; Good & Monis, 2001) και GLRaV-9 (Alkowni και συν., 2004). Ωστόσο, ο αριθμός των διαθέσιμων δημοσιευμένων αλληλουχιών απομονώσεων, που χρησιμοποιήθηκε για το σχεδιασμό των εκκινητών, ήταν στις περισσότερες περιπτώσεις περιορισμένος. Είναι προφανές ότι η ποικιλομορφία των RNA ιών επηρεάζει την αξιόπιστη μοριακή ανίχνευσή τους και η γνώση της γενετικής τους παραλλακτικότητας είναι πολύτιμη προκειμένου να σχεδιαστούν εκκινητές που να ενισχύουν όλα τα γνωστά στελέχη ενός ιού. Πιο συγκεκριμένα, η μοριακή ανίχνευση με PCR των clostero-ιών της αμπέλου επηρεάζεται κυρίως από την σημαντική ενδο-ειδική γενετική παραλλακτικότητά τους, η οποία είναι αποτέλεσμα της εξάπλωσής τους με τον αγενή πολλαπλασιασμό, της μακροχρόνιας μόλυνσης που προκαλούν στο αμπέλι (πολυετής ξενιστής) και του μοντέλου quasispecies (κεφ. 2). Επιπλέον, είναι δυνατόν να υπάρχει μειωμένη ειδικότητα των εκκινητών που σχεδιάζονται για την ανίχνευση της υποομάδας I των 110

116 Κεφ. 4. Γενική και ειδική ανίχνευση ampelo-ιών της υποομάδας Ι ampelo-ιών εξαιτίας των μικρών δια-ειδικών εξελικτικών αποστάσεων (κεφ. 2) και της πιθανής ύπαρξης άλλων άγνωστων συγγενικών ιών, για τους οποίους δεν υπάρχουν ακόμη διαθέσιμες γενετικές πληροφορίες. Στη μελέτη αυτή, αναπτύχθηκε ένα διαγνωστικό σχήμα ένθετης PCR για τη γενική ανίχνευση όλων των γνωστών (GLRaV-4, -5, -6, -9, -De, -Pr) ή άγνωστων ειδών της ανεξάρτητης αυτής γενεαλογίας των ampelo-ιών (υποομάδα I). Στις δοκιμές χρησιμοποιήθηκαν εκφυλισμένοι εκκινητές που στοχεύουν στη γονιδιωματική περιοχή που κωδικοποιεί την HSP70h, η οποία μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε ML φυλογενετικές αναλύσεις για το μερικό χαρακτηρισμό και γρήγορη κατάταξη απομονώσεων αυτών των γενετικά συγγενών ειδών (κεφ. 2). Επιπλέον, νέοι ειδικοί εκκινητές σχεδιάστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν σε δοκιμές απλής ή πολλαπλής ένθετης PCR για την ανίχνευση απομονώσεων κάθε είδους μέλους της υποομάδας Ι. Το προτεινόμενο διαγνωστικό σχήμα αξιολογήθηκε για τον εντοπισμό μονών μολύνσεων με ampelo-ιούς της υποομάδας I, ώστε να ξεπεραστεί το κοινό πρόβλημα των μικτών μολύνσεων στο αμπέλι που εμποδίζει την απόκτηση νέων αλληλουχιών με τη χρησιμοποίηση μεθόδων γενικής PCR. 111

117 Κεφ. 4. Γενική και ειδική ανίχνευση ampelo-ιών της υποομάδας Ι 4.3. Υλικά και Μέθοδοι Φυτικό υλικό και απομονώσεις clostero-ιών Για την προκαταρκτική αξιολόγηση των εκκινητών που σχεδιάστηκαν στην παρούσα εργασία και για την βελτιστοποίηση των δοκιμών PCR χρησιμοποιήθηκαν απομονώσεις των GLRaV-1, -2, -3, -4, -5, -6, καθώς και των δυο νέων GLRaV-Pr και GLRaV-De (Dovas & Katis 2003β, Dovas και συν., 2006) (Πίνακας 4.1). Οι απομονώσεις αυτές προήλθαν από βιοτύπους αμπέλου με μονές ή πολλαπλές μολύνσεις, προϊόντων κλωνικής επιλογής από τη συλλογή της εταιρείας ΒΙΤΡΟ ΕΛΛΑΣ Α.Ε. (Πίνακας 4.1). Επίσης χρησιμοποιήθηκε μια απομόνωση του GLRaV-9, ευγενική χορηγία του Dr. P. Gugerli (Agroscope Changins-Wadenswil Research Station ACW, Switzerland). Για την επιβεβαίωση της ιολογικής τους κατάστασης οι βιότυποι ελέγχθηκαν με RT-PCR και ELISA για την παρουσία των ιών που αναφέρονται στην παρ Πίνακας 4.1. Απομονώσεις των σχετιζόμενων με την ασθένεια GLRD ιών 1, -2, -3, -4, -5, -6, -9, -De και -Pr (GLRaV-1, -2, -3, -4, -5, -6, -9, -De, -Pr) που χρησιμοποιήθηκαν για τη βελτιστοποίηση των δοκιμών PCR Ποικιλία Απομόνωση ιού / Κωδικός πρόσβασης στην EMBL-EBI Παρουσία άλλου clostero-ιού Ρομπόλα GLRaV-4 LR-Rom / AM Ροδίτης GLRaV-4 LR-Rod / AM Σαββατιανό GLRaV-4 LR-Sav / AM Αγριογλυκάδι GLRaV-5 GLRaV-Pr Κοτσυφολιάτικο (βιότυπος 5) GLRaV-5 LR-K5 / AM Ποταμίσι GLRaV-5 LR-Pot / AM Ασύρτικο GLRaV-5 GLRaV-Pr Λαγόρθι GLRaV-5 GLRaV-Pr Σκιαδόπουλο GLRaV-6 LR-Sk / AM Μαλαγουζιά GLRaV-6 LR-Mal / AM Πρεβεζάνικο GLRaV-Pr1 / AM Μαντηλαριά (βιότυπος 1) GLRaV-Pr2 / AM Μαντηλαριά (βιότυπος 3) GLRaV-Pr3 / AM Ντεμπίνα (βιότυπος 1) GLRaV-De1 / AM Ντεμπίνα (βιότυπος 2) GLRaV-De2 / AM Άγνωστη GLRaV-9 - Α. Σουφλί GLRaV-1 GLRaV-2 Βάψα Νάουσας GLRaV-3 - Συμπεριλαμβάνονται οι κωδικοί πρόσβασης των αλληλουχιών Ελληνικών απομονώσεων που χρησιμοποιήθηκαν για το σχεδιασμό των εκκινητών Η ειδικότητα των αναπτυχθέντων διαγνωστικών δοκιμών αξιολογήθηκε περαιτέρω με τη χρησιμοποίηση 148 δειγμάτων προερχόμενων από 13 διαφορετικούς βιοτύπους αμπέλου, με χαρακτηριστικά συμπτώματα της ασθένειας GLRD, τα οποία 112

118 Κεφ. 4. Γενική και ειδική ανίχνευση ampelo-ιών της υποομάδας Ι συλλέχθηκαν από τη Νεμέα. Τα δείγματα ελέγχθηκαν επίσης με RT-PCR και ELISA για την παρουσία των GLRaV-1, -2, -3 (Dovas και συν., 2006) και GLRaV-1, -2, -3 και -7, αντίστοιχα Προετοιμασία φυτικού υλικού Η προετοιμασία του φυτικού υλικού για τις δοκιμές ELISA έγινε όπως περιγράφεται στην παρ Για τις μοριακές δοκιμές, πραγματοποιήθηκε εκχύλιση ολικού RNA από ξύσματα φλοιού σύμφωνα με την τροποποιημένη μέθοδο των Rott και Jelkmann (2001) (παρ ) Δημιουργία ομάδας αλληλουχιών, πολλαπλή στοίχιση και σχεδιασμός εκκινητών Για το σχεδιασμό των εκκινητών, δημιουργήθηκε μια ομάδα αλληλουχιών νουκλεοτιδίων από διάφορες απομονώσεις των GLRaV-4, -5, -6, -9, -Pr και GLRaV- De που αντιστοιχούσαν στο N-τελικό άκρο της HSP70h. Οι ακολουθίες προήλθαν είτε από Ελληνικές απομονώσεις ιών όπως αυτές προσδιορίστηκαν στο κεφ.2 (Πίνακας 2.1, 4.1) ή και από άλλες ήδη κατατεθειμένες στη βάση δεδομένων EMBL- EBI. Συνολικά, χρησιμοποιήθηκαν ακολουθίες από 5 απομονώσεις του GLRaV-4, 4 του GLRaV-5, 3 του GLRaV-6, 1 του GLRaV-9, 4 του GLRaV-Pr και 2 του GLRaV- De. Επιπλέον, συμπεριλήφθηκαν ομόλογες αλληλουχίες από μια απομόνωση των GLRaV-1, GLRaV-2, GLRaV-3 και GLRaV-7. Η στοίχιση των ακολουθιών νουκλεοτιδίων πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τη στοίχιση των αντίστοιχων μεταφρασμένων πρωτεϊνικών ακολουθιών χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο Alignment Explorer του λογισμικού MEGA έκδοση 3.1 (Kumar και συν., 2004). Για τη γενική ανίχνευση των ampelo-ιών της υποομάδας Ι σχεδιάστηκε ένας εκφυλισμένος καθοδικός εκκινητής (LR5-clusdoL, Πίνακας 4.2), ο οποίος χρησιμοποιήθηκε σε συνδυασμό με τον γενικό ανοδικό εκκινητή dhsp-nest2 (Dovas and Katis, 2003γ), για την ενίσχυση ενός προϊόντος 490ζβ. Ο καθοδικός εκκινητής σχεδιάστηκε με βάση υψηλά συντηρημένες αλληλουχίες απομονώσεων των GLRaV- 4, -5, -6, -9, -De και GLRaV-Pr που εμφάνιζαν τον ελάχιστο δυνατό εκφυλισμό του γενετικού κώδικα (Εικ. 4.1). 113

119 Κεφ. 4. Γενική και ειδική ανίχνευση ampelo-ιών της υποομάδας Ι LR5-clusdoL 3 -CAIGTYCGICAICACTTRCTYGG-5 Εικόνα 4.1 Πολλαπλή στοίχιση τμήματος του γονιδίου που κωδικοποιεί το ομόλογο της HSP70 του σχετιζόμενου με τη συστροφή των φύλλων της αμπέλου ιού 1, GLRaV-1 (κωδικός πρόσβασης στην EMBL AF233935), GLRaV-2 (AF039204), GLRaV-3 (AF037268), GLRaV-4 (AF039553, DQ325516, AM745340, AM745341, AM745342), GLRaV-5 (AF039552, AF233934, AM745343, AM745344), GLRaV-6 (AJ496796, AM745345, AM745346), GLRaV-7 (Y15987), GLRaV-9 (AY072797), GLRaV- Pr (AM182328, AM745347, AM745348, EF103905) και GLRaV-De (AM494935, AM745349). Στη στοίχιση παρουσιάζονται τα συντηρημένα κατάλοιπα νουκλεοτιδίων καθώς και ο εκφυλισμένος εκκινητής που σχεδιάστηκε για τη γενική ανίχνευση ampelo-ιών της υποομάδας Ι. Προκειμένου να μειωθεί περαιτέρω ο εκφυλισμός των εκκινητών εισήχθη η βάση δεοξυινοσίνη (di) στις θέσεις τετραπλού εκφυλισμού. Ο εκκινητής σχεδιάστηκε έτσι ώστε να μην υβριδοποιείται με ομόλογες γενετικές περιοχές πιο απομακρυσμένων γενετικά ampelo- ή clostero-ιών που σχετίζονται με την ασθένεια GLRD (π.χ. GLRaV-1, -2, -3, -7) και αξιολογήθηκε με τις απομονώσεις ιών που παρουσιάζονται στον Πίνακα 4.1. Άλλος ένας εκκινητής, ο LR5-clusdoLseq (5 - TCRTTCACGACGGCYTGGAC-3 ) χρησιμοποιήθηκε με τον dhsp-nest2 για άμεσο προσδιορισμό της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του προϊόντος της PCR. Για την ειδική ανίχνευση ιών-μελών της υποομάδας Ι του γένους Ampelovirus, σχεδιάστηκαν πέντε ζεύγη εκκινητών από την ενδιάμεση περιοχή των 490ζβ που ενισχύεται με τους προαναφερθέντες εκφυλισμένους εκκινητές. Συνολικά αξιολογήθηκαν 22 εκκινητές χρησιμοποιώντας τις απομονώσεις που παρουσιάζονται στον Πίνακα

120 Κεφ. 4. Γενική και ειδική ανίχνευση ampelo-ιών της υποομάδας Ι Πίνακας 4.2. Εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση ampelo-ιών της υποομάδας Ι Εκκινητής Ειδικότητα Νουκλεοτιδική αλληλουχία (5 3 ) Συγκέντρωση στην αντίδραση (μμ) Μέγεθος προϊόντος (ζβ) RT-PCR / ένθετη PCR Πολλαπλή PCR dhspup1 α Είδη της οικ. GGIHTIGAITTYGGIACIACITT 1 dhspdo2 α Closteroviridae GTICCICCICCNAARTC 1, dhspdo2c α GTICCICCCCCNAARTC 1,5 dhspup1g α AGTTYGGGACGACGTT 0,2 dhsp-nest2 α GLRaV-4,-5,- TYGGGACGACGTTYTCNAC 1 LR5-clusdoL 6,-9,-De,-Pr GGYTCRTTCACIACIGCYTGIAC LR4up GLRaV-4 CCAACTGTCGTGGGTATAAGGAAT 0,2 0,2 LR4do CCCAGACACCGGTCCTATACTIA 0,4 0,4 204 LR5up GLRaV-5 CTCTGCTTTTCTGCTGGCA 0,2 0,8 LR5do TATCTTTTATCTCCCGATAAACGAG 0,2 0,8 161 LR6up GLRaV-6 CGATAGGTTTGGGGGCACT 0,2 0,6 LR6do GGCACAGAACACACCGACAAAAC 0,2 0,6 283 LRPrup GLRaV-Pr TCTTGTGTACAGGGATATAAAACG 0,2 0,3 LRPrdo GAGCAAACGGAAAGAGACACTTG 0,2 0,3 243 LRDeup GLRaV-De GCTGGGAGAGGCGTTGAA 0,2 0,2 LRDedo GCACAGAACAAACAGACAGAGTG 0,2 0,2 370 α Εκκινητές που αναφέρθηκαν από τους Dovas & Katis (2003γ) (H=A+T+C; R=A+G; Y=C+T; N= A+T+C+G; I=Ινοσίνη) Όλοι οι εκκινητές σχεδιάστηκαν έτσι ώστε να ενισχύουν τις αλληλουχίες στόχους κάτω από τις ίδιες συνθήκες θερμοκυκλοποίησης όπως εκείνες των LR5-clusdoL και dhsp-nest2. Τελικά, για κάθε ιό επιλέχθηκε ένα ζεύγος ειδικών εσωτερικών εκκινητών (Πίνακας 4.2), που εμφάνιζε υψηλή εξειδίκευση και αποτελεσματικότητα ενίσχυσης του εκμαγείου, από τις γονιδιωματικές περιοχές που παρουσιάζονται στην Εικ Οι εκκινητές αυτοί χρησιμοποιήθηκαν σε δοκιμές απλής ή πολλαπλής ένθετης PCR. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι δεν σχεδιάστηκε κανένας εκκινητής για την ειδική ανίχνευση του GLRaV-9, καθώς ήταν διαθέσιμη μόνο μια ομόλογη αλληλουχία του Αντίστροφη μεταγραφή-αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης (Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR) Χρησιμοποιήθηκε η γενική RT-PCR για την ενίσχυση όλων των ιών-μελών της οικογένειας Closteroviridae όπως προτείνεται από τους Dovas και συν. (2006) εφαρμόζοντας μια πολύ χαμηλή θερμοκρασία υβριδοποίησης των εκκινητών με το εκμαγείο (Ta) κατά τη διάρκεια των πρώτων πέντε κύκλων της αντίδρασης (Dovas & 115

121 Κεφ. 4. Γενική και ειδική ανίχνευση ampelo-ιών της υποομάδας Ι Katis, 2003γ) και ένα προφίλ σταδιακής πτώσης της θερμοκρασίας πρόσδεσης των εκκινητών με το εκμαγείο (ramped-annealing thermocycling profile) στους επόμενους 35 κύκλους, όπου το Ta μειώνεται σταδιακά από μια υψηλή σε χαμηλή τιμή μέσα σε κάθε κύκλο (Skantar & Carta, 2000). Πιο συγκεκριμένα το προφίλ που εφαρμόστηκε για την RT-PCR ήταν το ακόλουθο: για την αντίδραση της αντίστροφης μεταγραφής 60 λεπτά στους 42 ºC, και στη συνέχεια για 4 λεπτά στους 94 ºC. Ακολούθησαν για την αντίδραση της PCR δέκα κύκλοι που περιλάμβαναν τα στάδια: α) 30 δευτερόλεπτα στους 95 ºC, β) 30 δευτερόλεπτα στους 38 ºC και γ) 20 δευτερόλεπτα Ομόλογο HSP ζβ Γενική RT-PCR Closteroviridae Ένθετη PCR υποομάδα Ι Ampelo-ιών 490 ζβ Ένθετη PCR GLRaV ζβ 161 ζβ Ένθετη PCR GLRaV ζβ Ένθετη PCR GLRaV ζβ Ένθετη PCR GLRaV-Pr Ένθετη PCR GLRaV-De 370 ζβ Εικόνα 4.2 Σχηματική απεικόνιση των αναμενόμενων προϊόντων και των αντίστοιχων περιοχών υβριδοποίησης των εκκινητών που σχεδιάστηκαν για τη γενική και ειδική ανίχνευση των ampelo-ιών της υποομάδας Ι στο γονίδιο που κωδικοποιεί την HSP70h. στους 72 ºC, τριάντα κύκλοι που περιλάμβαναν τα στάδια: α) 30 δευτερόλεπτα στους 95 ºC, β) 10 δευτερόλεπτα στους 49 ºC, γ) 10 δευτερόλεπτα στους 44 ºC, δ) 15 δευτερόλεπτα στους 38 ºC και ε) 20 δευτερόλεπτα στους 72 ºC και η αντίδραση ολοκληρώθηκε με μια τελευταία επώαση επί 2 λεπτά στους 72 ºC. Το μίγμα της αντίδρασης (25 μl) περιελάμβανε 2 μl RNA, 10 mm Tris-HCl (ph 8.8), 50 mm KCl, 1,5 mm MgCl 2, 0,1% Triton X-100 (F511, Optimised Dynazyme TM 116

122 Κεφ. 4. Γενική και ειδική ανίχνευση ampelo-ιών της υποομάδας Ι Buffer, Finnzymes, Finland), 0.25 mm από κάθε dntp, 5,0 mm DTT, 5% DMSO, 12 μονάδες RNASEOUT αναστολέα ριβονουκλεασών (Invitrogen, The Netherlands), 0,8 μονάδες Superscript TM II Rnase H αντίστροφη μεταγραφάση (Invitrogen, The Netherlands), 0,8 μονάδες AMV αντίστροφη μεταγραφάση (Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase, Finnzymes, Finland) και 1,5 μονάδες Platinum Taq DNA πολυμεράση (Invitrogen, The Netherlands). Οι εκκινητές dhspup1, dhspdo2, dhspdo2c και dhspup1g (Dovas & Katis, 2003γ) προστέθηκαν επίσης στην αντίδραση στις συγκεντρώσεις που αναφέρονται στον πίνακα 4.2. Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν στον θερμοκυκλοποιητή Mastercycler gradient (Eppendorf) Δοκιμές ένθετης PCR Αναπτύχθηκαν έξι διαφορετικές δοκιμές ένθετης PCR (20 µl), χρησιμοποιώντας 1 μl από το προϊόν της πρώτης γενικής RT-PCR, για την ανίχνευση α) όλων των ampelo-ιών της υποομάδας I, β) του GLRaV-4, γ) του GLRaV-5, δ) του GLRaV-6, ε) του GLRaV Pr και ζ) του GLRaV-De, αντίστοιχα (Εικ. 4.3). Οι μέθοδοι αυτές εφαρμόστηκαν επίσης και για τον έλεγχο των δειγμάτων αμπέλου που συλλέχθηκαν από την περιοχή της Νεμέας (Πίνακας 4.3). Εικόνα 4.3. Σχηματική απεικόνιση της διαγνωστικής μεθόδου. 117

123 Κεφ. 4. Γενική και ειδική ανίχνευση ampelo-ιών της υποομάδας Ι Γενική ανίχνευση των ampelo-ιών της υποομάδας Ι Το μίγμα της αντίδρασης (20 μl) περιλάμβανε, 1 μl από την πρώτη RT-PCR, 10 mm Tris-HCl (ph 8.8), 50 mm KCl, 1,5 mm MgCl 2, 0,1% Triton X-100, 3% DMSO, 0,2 mm από κάθε dntp, 1 μονάδα Platinum Taq DNA πολυμεράση (Invitrogen, The Netherlands) και 1 μm από κάθε εκκινητή dhsp-nest2 και LR5-clusdoL. Για την επιλογή του καταλληλότερου προφίλ θερμοκυκλοποίησης ακολουθήθηκε μια παρόμοια προσέγγιση με εκείνη της πρώτης RT-PCR. Πιο συγκεκριμένα, οι βέλτιστες χαμηλότερες και υψηλότερες Ta τιμές προσδιορίστηκαν εμπειρικά με την ενίσχυση όλων των διαθέσιμων απομονώσεων ιών (Πίνακας 4.1) εφαρμόζοντας διαφορετικά θερμικά προφίλ ώστε να επιτευχθεί ειδική και υψηλής αποδοτικότητας ενίσχυση όλων των εκμαγείων (Dovas και συν., 2006; Maliogka και συν., 2007). Τελικά, το άριστο προφίλ θερμοκυκλοποίησης που επιλέχθηκε για την ένθετη PCR περιλάμβανε επώαση για 3 λεπτά στους 94 ºC, 5 κύκλους των 30 δευτερολέπτων στους 95 ºC, 30 δευτερολέπτων στους 55 ºC και 20 δευτερολέπτων στους 72 o C και 35 κύκλους των 30 δευτερολέπτων στους 95 ºC, 15 δευτερολέπτων στους 59 ºC, 15 δευτερολέπτων στους 55 ºC και 20 δευτερολέπτων στους 72 ºC. Η αντίδραση ολοκληρώθηκε με μια τελευταία επώαση για 2 λεπτά στους 72 ºC Ειδική ανίχνευση των ampelo-ιών της υποομάδας Ι Σε όλες τις περιπτώσεις το μίγμα αντίδρασης και το προφίλ θερμοκυκλοποίησης ήταν ίδια με εκείνα που περιγράφηκαν προηγουμένως ( ). Ανάλογα με την ειδικότητα της ανίχνευσης, η κάθε αντίδραση περιλάμβανε ένα από τα ζεύγη εκκινητών και στις συγκεντρώσεις που αναφέρονται στον Πίνακα Δοκιμές πολλαπλής PCR Δύο δοκιμές πολλαπλής ένθετης PCR αξιολογήθηκαν για την ταυτόχρονη ανίχνευση των GLRaV-5, -De, -Pr και GLRaV-4, -6, αντίστοιχα. Η πρώτη RT-PCR πραγματοποιήθηκε όπως αναφέρθηκε προηγουμένως ( 4.3.3). Στο στάδιο της ένθετης PCR, που επωάστηκε ακολουθώντας το προφίλ σταδιακής πτώσης της θερμοκρασίας υβριδοποίησης ( ), προστέθηκε σε κάθε περίπτωση ένα μίγμα των αντίστοιχων ειδικών εκκινητών. Η βελτιστοποίηση των πολλαπλών PCR έγινε με αξιολόγηση της συγκέντρωσης διαφόρων παραγόντων (dntps, Taq πολυμεράση 118

124 Κεφ. 4. Γενική και ειδική ανίχνευση ampelo-ιών της υποομάδας Ι και εκκινητές) που επιδρούν στην ευαισθησία και ειδικότητα της αντίδρασης. Για την επιβεβαίωση της αποτελεσματικότητας της πολλαπλής PCR, αναλύθηκαν φυσικές και τεχνητές πολλαπλές μολύνσεις (Εικ. 4.5) Προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας Ο προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας πραγματοποιήθηκε με τη μέθοδο διδεόξυ-αναλόγων του Sanger (Sanger και συν., 1977). Πέντε προϊόντα ένθετης PCR, απομονώσεων των GLRaV-4, -5, -6, -Pr και De, αλληλουχήθηκαν μετά από καθαρισμό με τη χρησιμοποίηση των ειδικών για κάθε ιό εκκινητών (Πίνακας 4.2). Οι αλληλουχίες των απομονώσεων της μελέτης αυτής συγκρίθηκαν με άλλες ήδη καταχωρημένες στη βάση δεδομένων του NCBI με εφαρμογή του αλγόριθμου BLAST (διεύθυνση διαδικτύου: 119

125 Κεφ. 4. Γενική και ειδική ανίχνευση ampelo-ιών της υποομάδας Ι 4.4. Αποτελέσματα Γενική ανίχνευση των ampelo-ιών της υποομάδας Ι Όλες οι απομονώσεις των GLRaV-4, -5, -6, -9, -De και -Pr, που προήλθαν από μονές ή πολλαπλές μολύνσεις (Πίνακας 4.1), ενισχύθηκαν επιτυχώς με τους εκφυλισμένους εκκινητές LR5-clusdoL και dhsp-nest2 και έδωσαν το αναμενόμενο προϊόν 490ζβ (Εικ. 4.4A). Αντιθέτως, ο υγιής μάρτυρας και οι απομονώσεις των GLRaV-1, -2 και -3 δεν έδωσαν προϊόν. Από τα 148 δείγματα αμπέλου που ελέγχθηκαν από την περιοχή της Νεμέας, 95 βρέθηκαν θετικά σε clostero-ιούς της αμπέλου. Από αυτά, 52 ήταν θετικά (Πίνακας 4.3) σε ampelo-ιούς της υποομάδας Ι, εκ των οποίων 30 βρέθηκαν επιπλέον μολυσμένα με τους GLRaV-1, -3 και/ή GLRaV-7. Τα υπόλοιπα 43 δείγματα ήταν μολυσμένα με τους GLRaV-1, -2, -3 ή GLRaV Ειδική ανίχνευση των ampelo-ιών της υποομάδας Ι Η αξιολόγηση των εκκινητών που σχεδιάστηκαν για την ειδική ανίχνευση των μελών της υποομάδας Ι επέδειξε προβλήματα μειωμένης ειδικότητας για τον GLRaV- 4, για τον οποίο ελέγχθηκαν δέκα διαφορετικοί εκκινητές. Στις περισσότερες περιπτώσεις αυτά τα ζεύγη εκκινητών ανίχνευαν επιπλέον και απομονώσεις των GLRaV-5, -6 και -De (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τελικά, επιλέχθηκε για κάθε ιό ένα ζεύγος εκκινητών που εμφάνιζε μεγάλο εύρος ανίχνευσης και αυξημένη ειδικότητα (Εικ. 4.4, Πίνακας 4.2). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι το προφίλ σταδιακής πτώσης της θερμοκρασίας υβριδισμού των εκκινητών που ήταν βέλτιστο για τη γενική ανίχνευση της υποομάδας Ι των ampelo-ιών ήταν επίσης αποτελεσματικό για την ανίχνευση κάθε είδους ιού. Η εφαρμογή των τελικών βελτιωμένων δοκιμών ένθετης ειδικής PCR επιβεβαίωσε την ιολογική κατάσταση των ποικιλιών αμπέλου που ελέγχθηκαν (Πίνακας 4.1). Σε όλες τις περιπτώσεις οι αντιδράσεις ήταν ειδικές για κάθε ιό, ενώ ο προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας των παραγόμενων προϊόντων (Εικ. 4.4) επιβεβαίωσε την ιική τους προέλευση (βλέπε παράρτημα II). Τα δείγματα (52) από την περιοχή της Νεμέας που βρέθηκαν θετικά με την εφαρμογή της γενικής ένθετης PCR για την ανίχνευση όλων των ampelo-ιών της υποομάδας Ι αναλύθηκαν περαιτέρω με τους ειδικούς εκκινητές για τους GLRaV-4, -5, -6, -De και -Pr. 120

126 Κεφ. 4. Γενική και ειδική ανίχνευση ampelo-ιών της υποομάδας Ι Εικόνα 4.4. Α) Γενική ανίχνευση των ampelo-ιών της υποομάδας Ι. Ειδική ανίχνευση του GLRaV-Pr (Β), GLRaV-4 (Γ), GLRaV-5 (Δ), GLRaV-6 (Ε), GLRaV-De (ΣΤ). M: Δείκτης μοριακού βάρους ανά 100ζβ. Μονές και μεικτές μολύνσεις με ιούς του γένους Ampelovirus, προερχόμενοι από βιότυπους αμπέλου της εταιρείας Βίτρο Ελλάς Α.Ε. ή την περιοχή της Νεμέας, συμπεριλαμβάνονται όπως αναφέρονται. Τα αναμενόμενα προϊόντα όλων των δοκιμών υποδεικνύονται με βέλη. Οι δοκιμές αυτές επιβεβαίωσαν τα αποτελέσματα της γενικής PCR καθώς σε όλα τα δείγματα ανιχνεύτηκε ένας τουλάχιστον ampelo-ιός της υποομάδας Ι. Υψηλότερο ποσοστό μόλυνσης εμφάνισε ο GLRaV-4 (31/148 δείγματα, 20,95%), ενώ ακολούθησαν οι GLRaV-5 (27/148, 18,24%), GLRaV-Pr (13/148, 8,8%), GLRaV-De (10/148, 6,8%) και GLRaV-6 (2/148, 1,35%). Αναγνωρίστηκαν συνολικά είκοσι εννιά μονές μολύνσεις από ampelo-ιούς τις υποομάδας Ι, οι οποίες περιλάμβαναν

127 Κεφ. 4. Γενική και ειδική ανίχνευση ampelo-ιών της υποομάδας Ι με τον GLRaV-4, 12 με τον GLRaV-5, 2 με τον GLRaV-De και τέλος 3 με τον GLRaV-Pr (Πίνακας 4.2). Σε είκοσι τρία δείγματα εντοπίστηκαν μικτές μολύνσεις από τους παραπάνω ampelo-ιούς. Πιο συγκεκριμένα, ανιχνεύθηκαν 17 διπλές, 4 τριπλές και 2 τετραπλές μολύνσεις Δοκιμές πολλαπλής PCR Η βελτιστοποίηση του διαγνωστικού σχήματος πολλαπλής ένθετης PCR (δεδομένα δεν παρουσιάζονται) έδειξε πως οι άριστες συνθήκες αντίδρασης περιλάμβαναν 1,5 μονάδες Platinum Taq DNA πολυμεράση και 0,25 mm από κάθε dntp. Επιπλέον, οι συγκεντρώσεις των εκκινητών που τελικά επιλέχθηκαν για την ταυτόχρονη ανίχνευση των GLRaV-5, -Pr, -De και GLRaV-4, -6 αντίστοιχα παρουσιάζονται στον Πίνακα 4.2. Σχεδόν σε όλες τις περιπτώσεις μονών ή μεικτών μολύνσεων των δειγμάτων αμπέλου που ελέγχθηκαν ενισχύθηκε το αναμενόμενο προϊόν της αντίδρασης (Εικ. 4.5). Ο πολλαπλασιασμός ενός προϊόντος PCR σε δείγματα με μονές μολύνσεις με τη χρησιμοποίηση μίγματος όλων των εκκινητών επέδειξε την ειδικότητα της πολλαπλής ένθετης PCR. Ωστόσο, σε κάποιες περιπτώσεις αντιμετωπίστηκαν προβλήματα χαμηλής ευαισθησίας. Πιο συγκεκριμένα, δεν ήταν δυνατή η ανίχνευση απομονώσεων των GLRaV-5 και GLRaV-6 σε δύο περιπτώσεις πολλαπλών μολύνσεων δειγμάτων από την περιοχή της Νεμέας (αρ. 16, 29, Πίνακας 4.3). 122

128 Κεφ. 4. Γενική και ειδική ανίχνευση ampelo-ιών της υποομάδας Ι Πίνακας 4.3. Ανίχνευση ampelo-ιών της υποομάδας Ι σε δείγματα αμπέλου που συλλέχθηκαν από την περιοχή της Νεμέας με τη χρησιμοποίηση του προτεινόμενου διαγνωστικού σχήματος A/A Ποικιλία Γενική ανίχνευση Ειδική ανίχνευση της υποομάδας Ι των ampelo-ιών GLRaV- 4 GLRaV- 5 GLRaV- 6 GLRaV- De GLRaV- Pr 1 Αττική Ροδίτης Αγιωργίτικο Φράουλα Σαββατιανό Σουλτανίνα Cabernet frank Crimson Syrah Αετονύχι Μαύρο Μοσχάτο Άγνωστη Λευκή Cabernet sauvignon

129 Κεφ. 4. Γενική και ειδική ανίχνευση ampelo-ιών της υποομάδας Ι Εικόνα 4.5. Πολλαπλή ανίχνευση των GLRaV-Pr, -De, -5 και GLRaV-4, -6, αντίστοιχα. Συμπεριλαμβάνονται μονές και μεικτές μολύνσεις ιών του γένους Ampelovirus, σε βιότυπους αμπέλου της εταιρείας Βίτρο Ελλάς Α.Ε. ή της περιοχή της Νεμέας. Μια πολλαπλή μόλυνση με τους GLRaV-5, -De, -Pr και δύο με τους GLRaV-4, -6 είναι τεχνητές. Τα αναμενόμενα προϊόντα όλων των δοκιμών υποδεικνύονται στο αριστερό τμήμα της εικόνας. 124

130 Κεφ. 4. Γενική και ειδική ανίχνευση ampelo-ιών της υποομάδας Ι 4.5. Συζήτηση Η γενεαλογία της υποομάδας I των ampelo-ιών αντιπροσωπεύει μια ταξινομική ομάδα με ανεξάρτητη εξελικτική πορεία μέσα στο γένος Ampelovirus (κεφ. 2). Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι οι περισσότεροι νέοι ampelo-ιοί, ή απομακρυσμένα στελέχη ήδη γνωστών ιών που απομονώθηκαν παγκοσμίως τα τελευταία χρόνια από το αμπέλι, κατατάσσονται σ αυτή την υποομάδα (Dovas & Katis, 2003β; Alkowni και συν., 2004; Saldarelli και συν., 2006; Prosser και συν., 2007). Είναι πιθανόν να υπάρχουν και άλλοι συγγενείς με αυτούς ιοί, οι οποίοι δεν έχουν αναγνωριστεί ακόμη λόγω της απουσίας κατάλληλων διαγνωστικών μεθόδων. Συνεπώς, η ανάπτυξη μιας δοκιμής που θα παρέχει νέες γενετικές πληροφορίες για όλους τους ampelo-ιούς αυτής της υποομάδας θα ήταν πολύ χρήσιμη. Το σύνολο των ιών της αμπέλου, που αποτελούν μέλη της συγκεκριμένης γενεαλογίας, εμφανίζουν πολύ μικρές γενετικές αποστάσεις (κεφ. 2) γεγονός που επέτρεψε την ανάπτυξη μιας γενικής δοκιμής ανίχνευσής τους. Η μέθοδος περιλαμβάνει μια RT-PCR σε ένα μικροσωλήνα για τη γενική ανίχνευση ιών-μελών της οικογένειας Closteroviridae με εκφυλισμένους εκκινητές, που στοχεύουν στο γονίδιο που κωδικοποιεί την HSP70h (Dovas & Katis, 2003γ; Dovas και συν., 2006). Ακολουθεί μια ένθετη PCR, που ανιχνεύει όλους τους ampelo-ιούς της υποομάδας Ι. Ως γνωστόν η επιλογή της άριστης θερμοκρασίας υβριδοποίησης (Ta) είναι κρίσιμη για την επίτευξη αξιόπιστης ανίχνευσης σε διαγνωστικά σχήματα που χρησιμοποιούν εκφυλισμένους εκκινητές (Dovas και συν., 2006; Maliogka και συν., 2007). Στην παρούσα μελέτη ένα προφίλ σταδιακής πτώσης της θερμοκρασίας υβριδισμού, μια προσέγγιση η οποία δίνει άριστα αποτελέσματα σε δοκιμές με εκφυλισμένους εκκινητές, εφαρμόστηκε επιτυχώς στο στάδιο της ένθετης PCR (Dovas και συν., 2006; Maliogka και συν., 2007). Δεκαέξι διαφορετικές απομονώσεις των GLRaV-4, - 5, -6, -9, -Pr και GLRaV-De χρησιμοποιήθηκαν για την αξιολόγηση και βελτιστοποίηση της γενικής μεθόδου που αναπτύχθηκε. Η ειδικότητα και το μεγάλο εύρος ανίχνευσης της ένθετης PCR έδειξαν ότι η μέθοδος μπορεί να πολλαπλασιάσει όλους τους γνωστούς ampelo-ιούς της υποομάδας Ι και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την αξιόπιστη ανίχνευσή τους σε επισκοπήσεις φυτικού υλικού και προγράμματα πιστοποίησης. Μέχρι σήμερα οι γενετικές πληροφορίες αυτών των ιών ήταν περιορισμένες (GLRaV-4, -5, -6 και -9) ή και εντελώς ανύπαρκτες (GLRaV-Pr και GLRaV-De απομονώσεις). Κατά συνέπεια, δεν ήταν δυνατή η εκτίμηση της ενδο-ειδικής 125

131 Κεφ. 4. Γενική και ειδική ανίχνευση ampelo-ιών της υποομάδας Ι γενετικής τους παραλλακτικότητας, γεγονός που δεν επέτρεπε την ανάπτυξη αξιόπιστων και εξειδικευμένων μοριακών μεθόδων ανίχνευσής τους. Η απόκτηση νέων αλληλουχιών με την εφαρμογή μεθόδων γενικής PCR απαιτεί τη χρησιμοποίηση μονών μολύνσεων που είναι σπάνιες στο αμπέλι. Η γενική μέθοδος ανίχνευσης που αναπτύχθηκε εδώ μπορεί να ενισχύσει επιλεκτικά αλληλουχίες ampelo-ιών της υποομάδας Ι από δείγματα πρέμνων με μικτές προσβολές συμβάλλοντας σε σημαντικό βαθμό στον εμπλουτισμό της γενετικής πληροφορίας ιών μελών αυτής της γενεαλογίας. Έτσι, τμήματα αλληλουχίας του HSP70h ήδη γνωστών ή μηχαρακτηρισμένων ιών του γένους Ampelovirus μπορούν εύκολα να αποκτηθούν με απευθείας αλληλούχηση των προϊόντων της ένθετης PCR. Επιπλέον, η χρησιμοποίηση αυτής της περιοχής σε ML φυλογενετικές αναλύσεις αποτελεί ένα αξιόπιστο ταξινομικό εργαλείο για τη διαφοροποίηση των ειδών και την κατάταξη απομονώσεων όλων των ampelo-ιών της υποομάδας Ι (κεφ. 2). Στη μελέτη αυτή σχεδιάστηκαν νέοι ειδικοί εκκινητές, με τη χρησιμοποίηση μιας μεγάλης ομάδα αλληλουχιών που αντιστοιχούν στο Ν-τελικό άκρο της HSP70h, και εφαρμόστηκαν σε δοκιμές ένθετης PCR για την αξιόπιστη ανίχνευση των GLRaV-4, - 5, -6, -De και -Pr. Ωστόσο, κατά την επιλογή των εκκινητών διαπιστώθηκαν δυο κύρια προβλήματα τα οποία και έπρεπε να αντιμετωπιστούν. Πρώτον, οι μικρές διαειδικές γενετικές αποστάσεις καθιστούν δύσκολη την επιλογή εκκινητών υψηλής ειδικότητας όπως στην περίπτωση των εκκινητών που σχεδιάστηκαν για την ανίχνευση του GLRaV-4, η πλειονότητα των οποίων πολλαπλασίαζαν και άλλα είδη. Δεύτερον, η μεγάλη ενδο-ειδική μοριακή παραλλακτικότητα, που παρατηρήθηκε κυρίως στον GLRaV-4, δυσχέρανε το σχεδιασμό εκκινητών για την ταυτόχρονη ανίχνευση του συνόλου των παραλλαγών ενός ιού. Οι εκκινητές οι οποίοι τελικώς επιλέχθηκαν εμφανίζουν μεγάλη εξειδίκευση και εύρος ανίχνευσης. Επιπλέον, σχεδιάστηκαν έτσι ώστε να πολλαπλασιάζουν το στόχο τους κάτω από τις ίδιες συνθήκες θερμοκυκλοποίησης όπως και οι εκφυλισμένοι εκκινητές dhsp-nest2 και LR-5clusdoL, ώστε να διεξάγονται όλες οι δοκιμές PCR ταυτόχρονα. Η εφαρμογή της γενικής μεθόδου σ έναν αριθμό δειγμάτων αμπέλου που συλλέχθηκαν από αμπελώνες της περιοχής Νεμέας έδειξε υψηλή παρουσία των ampelo-ιών της υποομάδας Ι (35%) και επιβεβαίωσε περαιτέρω την ειδικότητα της μεθόδου για τους ιούς αυτούς (Πίνακας 4.3). Επιπλέον, με την εφαρμογή των δοκιμών ειδικής ένθετης PCR αξιολογήθηκε περαιτέρω η υγειονομική κατάσταση των υπό μελέτη πρέμνων, η οποία επέδειξε μια σχετικά υψηλή παρουσία των νέο- 126

132 Κεφ. 4. Γενική και ειδική ανίχνευση ampelo-ιών της υποομάδας Ι χαρακτηρισμένων GLRaV-De (6,8%) και GLRaV-Pr (8,8 %). Κατά συνέπεια, θα έπρεπε να διερευνηθεί η παρουσία τους και σε άλλες χώρες. Αυτή είναι η πρώτη αναφορά ειδικών μοριακών μεθόδων διάγνωσης απομονώσεων των GLRaV-De, -Pr και GLRaV-6. Ακόμη, σε αντίθεση με την άποψη ορισμένων ερευνητών για χαμηλά ποσοστά παρουσίας των GLRaV-4 και GLRaV-5 (Osman και συν., 2007), οι ιοί αυτοί εντοπίστηκαν σε σχετικά υψηλά ποσοστά στην Ελλάδα. Αυτό πιθανώς οφείλεται στη διαφορετική διασπορά των ιών αυτών στη χώρα μας ή στο διαφορετικό εύρος ανίχνευσης των χρησιμοποιούμενων διαγνωστικών τεχνικών. Αν και ο αριθμός των δειγμάτων που ελέγχθηκαν στην παρούσα μελέτη δεν είναι υψηλός, είναι ενδεικτικός της διασποράς των σχετιζόμενων με την ασθένεια GLRD ιών, ενώ μια μελλοντική μεγάλης κλίμακας επισκόπηση θα δώσει περισσότερες και πιο αξιόπιστες πληροφορίες για την εξάπλωσή τους. Ένα ιδιαίτερα υψηλό ποσοστό, περίπου 45% (23/52), των δειγμάτων της Νεμέας που βρέθηκαν μολυσμένα με ampelo-ιούς της υποομάδας Ι, αφορούσαν μικτές μολύνσεις με τους ιούς αυτούς. Ωστόσο, εντοπίστηκε επίσης ένα υψηλό ποσοστό (55%) μονών μολύνσεων χρησιμοποιώντας τη γενική μέθοδο ανίχνευσης συνδυασμένη με τις ειδικές δοκιμές ένθετης PCR που υποδεικνύει τη χρησιμότητα του διαγνωστικού σχήματος για τον εντοπισμό μονών μολύνσεων και κατ επέκταση την απόκτηση γενετικών πληροφοριών γι αυτή τη γενεαλογία. Επίσης αξιολογήθηκαν δοκιμές πολλαπλής ένθετης PCR για την ταυτόχρονη ειδική ανίχνευση των GLRaV-4, -6 και GLRaV-5, -De και Pr. Αν και τα αποτελέσματα ήταν γενικώς τα αναμενόμενα, σε δύο περιπτώσεις μικτών μολύνσεων παρατηρήθηκε χαμηλή ευαισθησία ανίχνευσης των GLRaV-5 και -6. Αυτό το φαινόμενο της επιλεκτικής ενίσχυσης της αλληλουχίας ενός στόχου σε σχέση με τους άλλους (απόκλιση του κλάσματος εκμαγείο-προϊόν) αποδίδεται στην ανταγωνιστική φύση της πολλαπλής δοκιμής PCR λόγω της διαφορετικής αποτελεσματικότητας των εκκινητών και της διαφορετικής συγκέντρωσης των εκμαγείων (Elnifro και συν., 2000; Markoulatos και συν., 2002). Η μοριακή ανίχνευση των ampelo-ιών της υποομάδας Ι πραγματοποιούνταν μέχρι πρόσφατα με δοκιμές ειδικής PCR για ορισμένους από τους ιούς (GLRaV-4, GLRaV-5 και GLRaV-9) (Routh και συν., 1998; Good & Monis, 2001; Alkowni και συν., 2004; Osman και συν., 2007). Επιπλέον, δεν ήταν διαθέσιμες μοριακές δοκιμές για την ανίχνευση του GLRaV-6 και των νέο-χαρακτηρισμένων GLRaV-Pr και GLRaV-De. Η γενική μέθοδος ανίχνευσης της υποομάδας I που αναπτύχθηκε εδώ 127

133 Κεφ. 4. Γενική και ειδική ανίχνευση ampelo-ιών της υποομάδας Ι μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την πραγματοποίηση γρήγορων ελέγχων του φυτικού υλικού, επιτυγχάνοντας αξιόπιστη διάγνωση αυτών των εξελικτικά διαφορετικών συγγενών ειδών. Με τη μέθοδο αυτή μπορεί να αντιμετωπιστεί η ανάγκη ειδικής ανίχνευσης κάθε συγγενικού ιού, μειώνοντας έτσι τον απαιτούμενο χρόνο, αλλά και το κόστος. Τέλος, οι ειδικοί εκκινητές που σχεδιάστηκαν στη μελέτη αυτή μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε συνδυασμό με τη γενική δοκιμή για την περαιτέρω διερεύνηση της παρουσίας των GLRaV-4, -5, -6, -Pr ή GLRaV-De. Παρόλα ταύτα, όταν ένα θετικό αποτέλεσμα, που προκύπτει με τη χρησιμοποίηση των εκφυλισμένων εκκινητών, δεν επιβεβαιώνεται με την εφαρμογή των ειδικών εκκινητών για τους GLRaV-4, -5, -6, -De και -Pr, τότε θα πρέπει να ακολουθήσει αλληλούχηση καθώς στην περίπτωση αυτή πιθανώς εμπλέκεται ένας νέος ampelo-ιός της υποομάδας Ι ή κάποιο απομακρυσμένο στέλεχος ενός ήδη γνωστού είδους. 128

134 Κεφ. 5. Εξυγίανση ποικιλιών αμπέλου από τους GLRaV-Pr και GRSPaV ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 Εξυγίανση δυο ποικιλιών της αμπέλου από τον GLRaV-Pr και τον σχετιζόμενο ιό με τη βοθρίωση του κορμού του Rupestris (GRSPaV) 5.1. Περίληψη Στη μελέτη αυτή έγινε προσπάθεια εξυγίανσης δύο οινοποιήσιμων ποικιλιών, της Μαντηλαριάς και του Πρεβεζάνικου, από τους GLRaV-Pr (οικ. Closteroviridae) και GRSPaV (οικ. Flexiviridae). Η εξυγίανση έγινε με συνδυασμένη εφαρμογή in vitro θερμοθεραπείας και καλλιέργειας μεριστωμάτων ( 0,2 mm) ή βλαστικών κορυφών (0,5 cm). Tο ποσοστό επιβίωσης και αναγέννησης φυταρίων μετά από καλλιέργεια μεριστωμάτων ήταν ιδιαίτερα χαμηλό (2,5% για τη Μαντηλαριά, 0% για το Πρεβεζάνικο). Αντίθετα, ιδιαίτερα υψηλά ποσοστά επιβίωσης των εκφύτων παρατηρήθηκαν στην καλλιέργεια βλαστικών κορυφών και των δύο ποικιλιών (96,36% για τη Μαντηλαριά, 77,77% για το Πρεβεζάνικο), τα οποία συνοδευόταν από αντίστοιχα υψηλά ποσοστά εξυγίανσης και από τους δύο ιούς. Συγκεκριμένα, για τη Μαντηλαριά, από το 59,37% των φυτών που επιβίωσαν της θερμοθεραπείας, το 92,45% και το 39,62% των βλαστικών κορυφών ήταν απαλλαγμένα από τους GLRaV-Pr και GRSPaV, αντίστοιχα. Συνολικά, το 37,73% των νέων φυτών εξυγιάνθηκε και από τους δύο ιούς. Για το Πρεβεζάνικο, από το 41,86% των φυταρίων που επιβίωσαν, το 86,20% ήταν απαλλαγμένο από τον GLRaV-Pr, το 92,85% από τον GRSPaV και το 89,29% και από τους δύο ιούς. Η διάγνωση των ιών στα έκφυτα πραγματοποιήθηκε με δοκιμές ένθετης RT-PCR. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι είναι πιο εύκολη η εξυγίανση των φυτών της αμπέλου από ιούς της οικογένειας Closteroviridae σε σχέση με εκείνη του GRSPaV. Τέλος, η απαλλαγή από τους GLRaV-Pr και GRSPaV είναι εφικτή ακόμη και με χρήση μεγαλύτερων τμημάτων φυτικού ιστού, όταν συνδυάζεται με in vitro θερμοθεραπεία. 129

135 Κεφ. 5. Εξυγίανση ποικιλιών αμπέλου από τους GLRaV-Pr και GRSPaV 5.2. Εισαγωγή Ένα βασικό μέτρο για την αντιμετώπιση των ιώσεων της αμπέλου είναι η χρησιμοποίηση πιστοποιημένου πολλαπλασιαστικού υλικού, σύμφωνα με τις οδηγίες της Ε.Ε. Μεταξύ των ευρέως διαδεδομένων μεθόδων που εφαρμόζονται για την εξυγίανση της αμπέλου είναι η καλλιέργεια μεριστωμάτων (Golino και συν., 1998) ή βλαστικών κορυφών in vitro (Credi & Badini, 1997), η οποία συχνά συνδυάζεται με θερμοθεραπεία (Leonhardt και συν., 1998). Η επιτυχία της εξυγίανσης εξαρτάται από το είδος και τον αριθμό των ιών που ενδέχεται να συνυπάρχουν σ ένα φυτό, την ποικιλία της αμπέλου και το πρωτόκολλο που εφαρμόζεται. Οι διαδικασίες της μεριστωματικής καλλιέργειας και σωματικής εμβρυογένεσης αποδείχτηκαν πολύ αποτελεσματικές στην εξάλειψη ιών που εντοπίζονται στο φλοίωμα, όπως οι GLRaV- 1 και -3, ο ιός Α της αμπέλου (Grapevine virus A, GVA) και ο ιός της κηλίδωσης των φύλλων της αμπέλου (Grapevine fleck virus, GFKV) (Goussard και συν., 1991; Gribaudo και συν., 1997; Popescu και συν., 2003; Gambino και συν., 2006). O συνδυασμός θερμοθεραπείας και in vitro καλλιέργειας μεριστωμάτων ή βλαστικών κορυφών εφαρμόστηκε για την εξάλειψη ιών που εντοπίζονται σε παρεγχυματικά κύτταρα και εισέρχονται σε περιοχές του μεριστώματος όπως αυτοί του γένους Nepovirus (π.χ. ο ιός του ριπιδωτού φύλλου της αμπέλου, Grapevine fanleaf virus, GFLV) (Milkus και συν., 2000; Valero και συν., 2003). Άλλες τεχνικές εξυγίανσης χρησιμοποιούνται σε μικρότερο βαθμό. Η in vitro κρυοδιατήρηση (cryopreservation) βλαστικών κορυφών αμπέλου οδήγησε σε υψηλά ποσοστά εξάλειψης του GVA (Wang και συν., 2003), ενώ η in vitro εφαρμογή αντιικών ουσιών (chemotherapy) συνέβαλλε στην εξυγίανση φυτικού υλικού από τους GLRaV-3 και GVA (Panattoni και συν., 2007α,β). Ωστόσο εξαιτίας των τεχνικών τους δυσκολιών και της πιθανότητας εμφάνισης μεταλλάξεων (σωματική εμβρυογένεση, χημειοθεραπεία), οι παραπάνω μέθοδοι δεν εφαρμόζονται ευρέως. Δεν υπάρχουν μελέτες που να αφορούν την εξυγίανση ποικιλιών αμπέλου από τους ιούς της υποομάδας Ι του γένους Ampelovirus (GLRaV-4, -5, -6, -9, -De, -Pr). Επιπλέον, είναι περιορισμένη η γνώση σχετικά με την αποτελεσματικότητα διαφόρων τεχνικών στην εξάλειψη του σχετιζόμενου ιού με τη βοθρίωση του κορμού του Rupestris (Grapevine rupestris stem pitting associated virus, GRSPaV) (Gribaudo και συν., 2006; Gambino και συν., 2006), ενός fovea-ιού που σχετίζεται με το σύνδρομο βοθρίωσης του ξύλου της αμπέλου (Rugose wood, RW) (Zhang και συν., 1998). Ο 130

136 Κεφ. 5. Εξυγίανση ποικιλιών αμπέλου από τους GLRaV-Pr και GRSPaV GRSPaV από μόνος του συνήθως δεν προκαλεί συμπτώματα ή προκαλεί πολύ ήπια (Meng και συν., 2005), ενώ όταν συνυπάρχει με άλλους ιούς π.χ. τον GVA μπορεί να εκδηλωθούν πολύ έντονα συμπτώματα (Bonfiglioli και συν., 1998). Κατά συνέπεια η απουσία του ιού από το πολλαπλασιαστικό υλικό είναι επιθυμητή. Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η ανάπτυξη ενός απλού και αποτελεσματικού πρωτοκόλλου για την εξάλειψη των GLRaV-Pr και GRSPaV από τις ποικιλίες Μαντηλαριά και Πρεβεζάνικο. Για το σκοπό αυτό εφαρμόστηκε in vitro θερμοθεραπεία και καλλιέργεια μεριστωμάτων και βλαστικών κορυφών. 131

137 Κεφ. 5. Εξυγίανση ποικιλιών αμπέλου από τους GLRaV-Pr και GRSPaV 5.3. Υλικά και Μέθοδοι Εγκατάσταση φυτικού υλικού in vivo και in vitro Επιλέχθηκε φυτικό υλικό δυο οινοποιήσιμων ποικιλιών αμπέλου, από τη συλλογή της εταιρείας Βίτρο Ελλάς Α.Ε., της Μαντηλαριάς και του Πρεβεζάνικου μολυσμένων με τους GLRaV-Pr και GRSPaV (κεφ. 2). Η Μαντηλαριά είναι ερυθρή ποικιλία που προέρχεται από την περιοχή Ηρακλείου Κρήτης, ενώ το Πρεβεζάνικο είναι ροζέ ποικιλία προερχόμενη από την περιοχή της Ζίτσας. Α) Ιn vivo Αρχικά οι ποικιλίες εγκαταστάθηκαν in vivo προκειμένου να δημιουργηθεί ένα υλικό βάσης για πειραματισμό και διατήρηση των μελετούμενων βιοτύπων. Η εγκατάσταση έγινε με ριζοβολία ξυλοποιημένων μοσχευμάτων ενός οφθαλμού σε γλάστρες. Συγκεκριμένα, 20 ξυλοποιημένα μοσχεύματα ανά ποικιλία τοποθετήθηκαν σε μίγμα περλίτη-τύρφης 1:1 (κ.ο.) σε πάγκους ριζοβολίας, εξοπλισμένους με σύστημα υδρονέφωσης και θέρμανσης βάσης, στα θερμοκήπια της εταιρείας. Β) Ιn vitro Για την in vitro εγκατάσταση των ποικιλιών συλλέχθηκαν ξυλοποιημένες κληματίδες κατά το χειμερινό κλάδεμα, από τις μητρικές φυτείες της εταιρείας και μετά από παραμονή 2 εβδομάδων στους 4 o C τοποθετήθηκαν σε δοχεία με νερό και μυκητοκτόνο Captan (0,05 g / 200 ml). Οι κληματίδες διατηρούνταν σε ευήλιο δωμάτιο για τρεις εβδομάδες, όπου η εκβλάστησή τους ήταν αρκετά ικανοποιητική. Τρυφερά τμήματα πράσινων βλαστών με ένα γόνατο και τμήματα μεσογονατίων (έκφυτα) αποκόπηκαν και ξεπλύθηκαν με νερό βρύσης. Κατόπιν τοποθετήθηκαν για απολύμανση σε 500 ml διαλύματος 2% (β/ο) NaOCl, το οποίο περιείχε τρεις σταγόνες απορρυπαντικoύ Tween 20. Ακολούθησε ανάδευση για 15 λεπτά και ξέπλυμα τρεις φορές με αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό. Τα έκφυτα εγκαταστάθηκαν σε δοκιμαστικούς σωλήνες (100 χ 20 mm) που περιείχαν 10 ml υποστρώματος E1 (Πίνακας 5.1). Πριν από την αποστείρωση το ph ρυθμίστηκε σε τιμή 5,75 και στο υπόστρωμα προστέθηκαν 3% (β/ο) σακχαρόζη και 0,6% άγαρ (B&V S.r.L., τύπος S 1000). Οι σωλήνες τοποθετήθηκαν σε θάλαμο με θερμοκρασία 22 ± 2 ο C, ένταση φωτισμού 40 μmol m -2 s -1 και φωτοπερίοδο 16 ωρών. Συνολικά εγκαταστάθηκαν 84 μικρομοσχεύματα της ποικιλίας Πρεβεζάνικο και 30 της Μαντηλαριάς. Τα έκφυτα παρήγαγαν μονούς μασχαλιαίους βλαστούς οι οποίοι 132

138 Κεφ. 5. Εξυγίανση ποικιλιών αμπέλου από τους GLRaV-Pr και GRSPaV Πίνακας 5.1. Σύσταση θρεπτικών υποστρωμάτων εγκατάστασης και πολλαπλασιασμού των ποικιλιών Μαντηλαριά και Πρεβεζάνικο Ε1 Ε2 Π1 Π2 Π3 Π4 Π5 Μ1 Μ2 Μ3 Μ4 Μ5 Μακροστοιχεία ½ QL ½ MS QL MS WPM QL GAL QL MS WPM QL GAL Μικροστοιχεία MS CHI-MS MS MS WPM QL GAL MS MS WPM QL GAL FeSO 4 (mg/lt) MS Βιταμίνες BOT MS BOT MS WPM MS GAL BOT MS WPM MS GAL Na 2 EDTA (mg/lt) BAP (μμ) 3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,13 0,13 0,13 0,13 0,13 NAA (μμ) 0,05 0,005 0,005 0,005 0,005 0,005 0,16 0,16 0,16 0,16 0,16 Σακχαρόζη (g/lt) Άγαρ (g/lt) ph 5,75 5,9 5,9 5,9 5,9 5,9 5,9 5,9 5,9 5,9 5,9 5,9 * Η αναλυτική σύνθεση των QL (Quoirin & Lepoivre, 1967), MS (Murashige & Skoog, 1962), BOT (Bottalico, 1997), WPM (Woody Plant Medium, Lloyd & Mccowd, 1980), GAL (Galzy και συν., 1990) και CΗΙ-MS παρατίθεται στο παράρτημα I (Πίνακες 3, 4). 133

139 Κεφ. 5. Εξυγίανση ποικιλιών αμπέλου από τους GLRaV-Pr και GRSPaV διαιρούνταν ανά γόνατο και μεταφέρονταν σε γυάλινα βάζα των 500 ml που περιείχαν 125 ml του υποστρώματος Ε1. Οι επανακαλλιέργειες των εκφύτων διαρκούσαν έξι εβδομάδες Εύρεση του καταλληλότερου υποστρώματος πολλαπλασιασμού Για την εύρεση του πλέον κατάλληλου υποστρώματος πολλαπλασιασμού της κάθε ποικιλίας αξιολογήθηκαν πέντε υποστρώματα (Π1-Π5) για το Πρεβεζάνικο και πέντε (Μ1-Μ5) για τη Μαντηλαριά (Πίνακας 5.1). Για κάθε μεταχείριση χρησιμοποιήθηκαν 4 βάζα των 10 εκφύτων και έγιναν δυο επαναλήψεις για κάθε πείραμα. Σαράντα ημέρες αργότερα, τα φυτάρια απομακρύνθηκαν από το υπόστρωμα και καταγράφηκαν στοιχεία ανάπτυξης που περιλάμβαναν τον αριθμό βλαστών, το ύψος βλαστού (από τη βάση ως το τελευταίο ορατό γόνατο), τον αριθμό γονάτων, τον αριθμό και μήκος πρωτογενών ριζών, το ρυθμό ανάπτυξης (αριθμός βλαστών χ αριθμός γονάτων) και το μήκος μεσογονάτιων διαστημάτων. Οι μετρήσεις έγιναν σε νεαρούς βλαστούς μεγαλύτερους από 0,5 cm. Τα πειράματα ακολούθησαν ένα πλήρως τυχαιοποιημένο σχέδιο, ενώ η στατιστική ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με το SPSS 8.0 και η σύγκριση των μέσων όρων με το κριτήριο Duncan (Duncan s multiple range test) (P 0.05) Ιn vitro θερμοθεραπεία και καλλιέργεια μεριστωμάτων και βλαστικών κορυφών Α) Ιn vitro θερμοθεραπεία Έκφυτα από βάζα της in vitro καλλιέργειας των δυο ποικιλιών μεταφέρθηκαν στο θρεπτικό υπόστρωμα που βρέθηκε ως το πλέον κατάλληλο για τον πολλαπλασιασμό τους. Τα φυτάρια τοποθετήθηκαν για έξι εβδομάδες σε θάλαμο επώασης (Percival Scientific, I-36LLVL) με ένταση φωτισμού 40 μm m -2 s -1 και φωτοπερίοδο 16 ωρών. Η θερμοκρασία αρχικά ήταν 26 ± 0,5 o C κατά τη διάρκεια της ημέρας και 23 ± 0,5 o C για τη νύχτα, ενώ αυξανόταν σταδιακά κατά 3 o C ανά εβδομάδα. Οι τελικές θερμοκρασίες ήταν 40 ± 0,5 o C κατά τη διάρκεια της ημέρας και 37 ± 0,5 o C για τη νύχτα. Η διαδικασία επαναλήφθηκε δύο φορές και χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 332 έκφυτα, 160 Μαντηλαριάς και 172 Πρεβεζάνικου. 134

140 Κεφ. 5. Εξυγίανση ποικιλιών αμπέλου από τους GLRaV-Pr και GRSPaV Β) Καλλιέργεια μεριστωμάτων και βλαστικών κορυφών μετά τη θερμοθεραπεία Μετά από 6 εβδομάδες θερμοθεραπείας, αποκόπηκαν από τον κορυφαίο οφθαλμό των φυταρίων βλαστικές κορυφές (0,5 cm) και επάκρια μεριστώματα (0,1-0,2 mm) (Εικ. 5.1). Τα μεριστώματα μεταφέρθηκαν στο υπόστρωμα Ε2 (Πίνακας 5.1) και οι βλαστικές κορυφές στο πλέον κατάλληλο υπόστρωμα για τον πολλαπλασιασμό της κάθε ποικιλίας. Μετά την πάροδο 6-8 εβδομάδων και αφού τα έκφυτα των επάκριων μεριστωμάτων που επιβίωσαν άρχισαν να αναπτύσσονται, μεταφέρθηκαν στα υποστρώματα που βρέθηκαν κατάλληλα για την κάθε ποικιλία. Εικόνα 5.1. Διαδικασία λήψης επάκριου μεριστώματος. Α) Επάκριος οφθαλμός πριν την έναρξη της διαδικασίας. Β) Μερίστωμα μετά την απομάκρυνση των φυλλικών καταβολών. Γ) Μερίστωμα in vitro μετά από καλλιέργεια 4 εβδομάδων Ανίχνευση των GLRaV-Pr και GRSPaV με δοκιμές ένθετης RT-PCR Περίπου 40 ημέρες και 12 εβδομάδες, μετά τη λήψη βλαστικών κορυφών και μεριστωμάτων αντίστοιχα από τα φυτάρια στα οποία είχε εφαρμοστεί θερμοθεραπεία, έγινε ο πρώτος ιολογικός έλεγχος. Tα δείγματα προήλθαν κατευθείαν από τα φυτάρια κάτω από ασηπτικές συνθήκες. Η ανίχνευση του GLRaV-Pr έγινε με τη δοκιμή ένθετης RT-PCR που αναπτύχθηκε στο κεφάλαιο 4, ενώ του GRSPaV με τη γενική ένθετη RT-PCR για την ανίχνευση fovea-ιών (Dovas & Katis, 2003α). Ως εκμαγείο χρησιμοποιήθηκε ολικό RNA που εκχυλίστηκε από 200 mg φυτικού ιστού, σύμφωνα με την τροποποιημένη μέθοδο των Rott και Jelkmann (2001) (παρ ). Η πρώτη RT-PCR για τους fovea-ιούς έγινε σε συνολικό όγκο 25 µl που περιείχε 2 μl RNA, 10 mm Tris-HCl (ph: 8,8), 50 mm KCl, 1,5 mm MgCl 2, 0,1% Τriton Χ- 100, 0,25 mm κάθε dntp, 5,0 mm DTT, 5% DMSO, 12 μονάδες RNASEOUT 135

141 Κεφ. 5. Εξυγίανση ποικιλιών αμπέλου από τους GLRaV-Pr και GRSPaV αναστολέα ριβονουκλεασών (Life Technologies TM, USA), 0,8 μονάδες Dynazyme TM II DNA πολυμεράση (Finnzymes, Finland), 0,7 μονάδες AMV αντίστροφη μεταγραφάση (Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase, Finnzymes, Finland), 0,7 μονάδες Superscript TM II Rnase H αντίστροφη μεταγραφάση (Life Technologies TM, USA), 1 µm από κάθε εκκινητή drw up1, drw do2 και drw do2g (Dovas & Katis, 2003α) και συμπληρώθηκε με απεσταγμένο νερό (που υπέστη μεταχείριση με DEPC) μέχρι τελικού όγκου 25 μl. Το προφίλ θερμοκυκλοποίησης περιλάμβανε 60 λεπτά στους 42 o C, 2 λεπτά στους 50 o C και στη συνέχεια, για 4 λεπτά στους 94 o C. Ακολούθησαν πέντε κύκλοι που περιλάμβαναν τα στάδια: (α) 30 δευτερόλεπτα στους 95 o C, (β) 10 δευτερόλεπτα στους 43 o C, (γ) 5 δευτερόλεπτα στους 38 o C και (δ) 15 δευτερόλεπτα στους 72 o C, τριανταπέντε κύκλοι που περιλάμβαναν τα στάδια: (α) 30 δευτερόλεπτα στους 95 o C, (β) 30 δευτερόλεπτα στους 43 o C και (γ) 15 δευτερόλεπτα στους 72 o C και η αντίδραση ολοκληρώθηκε με μία τελευταία επώαση για 2 λεπτά στους 72 ο C. Το μίγμα της ένθετης PCR (20 µl) περιείχε 1 μl από το προϊόν της RT-PCR, 10 mm Tris-HCl (ph: 8,8), 50 mm KCl, 1,5 mm MgCl 2, 0,1% Τriton Χ-100, 0,2 mm κάθε dntp, 0,5 μονάδες Dynazyme TM II DNA πολυμεράση (Finnzymes, Finland), 1 µm από τον εκκινητή drwnest1, 1,5 μμ από τον drwnest2 (Dovas & Katis, 2003α) και συμπληρώθηκε με απεσταγμένο νερό (που υπέστη μεταχείριση με DEPC) μέχρι τελικού όγκου των 20 μl. Οι μικροσωλήνες επωάστηκαν για 3 λεπτά στους 95 o C, 10 δευτερόλεπτα στους 48 o C και στη συνέχεια, για 10 δευτερόλεπτα στους 72 o C. Ακολούθησαν 39 κύκλοι που περιλάμβαναν τα στάδια: (α) 30 δευτερόλεπτα στους 95 o C, (β) 30 δευτερόλεπτα στους 54 o C, (γ) 10 δευτερόλεπτα (με επέκταση του χρόνου κατά 1 δευτερόλεπτο μετά από κάθε κύκλο) στους 72 o C και η αντίδραση ολοκληρώθηκε με μία τελευταία επώαση για 2 λεπτά στους 72 ο C. Ακολούθησε επανέλεγχος των φυταρίων 6 και 12 μήνες μετά την λήψη των μεριστωμάτων και βλαστικών κορυφών. Ένας τελευταίος έλεγχος πραγματοποιήθηκε στα φυτά, μετά τη φάση της σκληραγώγησης, σε γλάστρες στο θερμοκήπιο Σκληραγώγηση έρριζων φυταρίων και εγκλιματισμός σε εδαφικές συνθήκες Οι in vitro ριζοβολημένοι βλαστοί αποτελούν νεαρά φυτάρια, τα οποία είναι πολύ ευαίσθητα και για την περαιτέρω ανάπτυξη τους σε φυσικές συνθήκες θα πρέπει 136

142 Κεφ. 5. Εξυγίανση ποικιλιών αμπέλου από τους GLRaV-Pr και GRSPaV να υπάρξει μια περίοδος προσαρμογής. Αυτή επιτεύχθηκε με τη διαδικασία της σκληραγώγησης. Συγκεκριμένα, 25 και 20 ριζοβολημένα φυτάρια των ποικιλιών Μαντηλαριά και Πρεβεζάνικο αντίστοιχα, που προέκυψαν από τα βάζα καλλιέργειας, απαλλαγμένα και από τους δύο ιούς, μεταφέρθηκαν σε θερμοκήπιο όπου φυτεύτηκαν σε δίσκους με υπόστρωμα τύρφης-περλίτη 4:1 (κ.ο.). Στη συνέχεια, μεταφέρθηκαν σε πάγκους ριζοβολίας που παρέχουν σκίαση με θερμοκουρτίνα και πολύ υψηλή σχετική υγρασία (ως 90%). Τα φυτά παρέμειναν στις συνθήκες αυτές για δέκα ημέρες και στη συνέχεια η σχετική υγρασία μειωνόταν βαθμιαία με ταυτόχρονη αύξηση του φωτισμού για τις επόμενες είκοσι ημέρες. Μετά από τρεις μήνες τα φυτά μεταφυτεύθηκαν σε γλάστρες στο θερμοκήπιο και ένα έτος περίπου αργότερα μεταφέρθηκαν σε δικτυοκήπιο. 137

143 Κεφ. 5. Εξυγίανση ποικιλιών αμπέλου από τους GLRaV-Pr και GRSPaV 5.4. Αποτελέσματα Εγκατάσταση φυτικού υλικού in vivo και in vitro Α) In vivo Η νέα βλάστηση εμφανίστηκε μετά από ημέρες και σε δύο μήνες περίπου είχε ολοκληρωθεί η ριζοβολία. Παράχθηκαν 10 φυτά σε γλάστρες για κάθε ποικιλία τα οποία επαναφυτεύφθηκαν σε γλάστρες χωρητικότητας 15 lt και αποτέλεσαν το υλικό διατήρησης των μελετούμενων βιοτύπων. Τα φυτά διατηρούνταν στο δικτυοκήπιο για την αποφυγή μολύνσεων. Εικόνα 5.2. Ιn vitro διατήρηση του φυτικού υλικού. Α: σωλήνας από εγκατάσταση της ποικιλίας Μαντηλαριά (Μ3) και Β: βάζο με φυτάρια της ποικιλίας Πρεβεζάνικο. Β) In vitro Πραγματοποιήθηκε επιτυχώς η in vitro εγκατάσταση (Εικ. 5.2) και των δυο ποικιλιών, αν και ο γενότυπος επηρέασε τα ποσοστά επιβίωσης των εκφύτων. Συγκεκριμένα, σαράντα περίπου ημέρες μετά την αρχική εγκατάσταση των ποικιλιών το ποσοστό επιβίωσης των εκφύτων ήταν 59,5% (50/84) για το Πρεβεζάνικο και 66,67% (20/30) για τη Μαντηλαριά. 138

144 Κεφ. 5. Εξυγίανση ποικιλιών αμπέλου από τους GLRaV-Pr και GRSPaV Εύρεση του καταλληλότερου υποστρώματος πολλαπλασιασμού Μεταξύ των θρεπτικών υποστρωμάτων Μ1-Μ5 και Π1-Π5 που αξιολογήθηκαν σε αυτή τη μελέτη για τον πολλαπλασιασμό των ποικιλιών Μαντηλαριά και Πρεβεζάνικο αντίστοιχα (Πίνακας 5.2, Εικ. 5.3), παρατηρήθηκαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές. Στο Μ5, το οποίο και τελικά επιλέχθηκε ως το πλέον κατάλληλο υπόστρωμα για τον πολλαπλασιασμό της Μαντηλαριάς, αναπτύχθηκε 1 νέος μικροβλαστός ανά έκφυτο και ο ρυθμός ανάπτυξης ήταν 6,85. Τα φυτάρια ήταν καλής ποιότητας, ζωηρά με πλήρως ανεπτυγμένα πράσινα φύλλα και λίγες μεγάλου μήκους πρωτογενείς ρίζες. Το Μ4 έδωσε καλής ανάπτυξης αλλά χλωρωτικά φυτάρια, ενώ στα υπόλοιπα τρία υποστρώματα τα φυτάρια, αν και εμφάνιζαν καλή μορφολογική εικόνα, υστερούσαν στα μετρήσιμα χαρακτηριστικά ανάπτυξης. Εικόνα 5.3. Ανάπτυξη φυταρίων των ποικιλιών Μαντηλαριά (Α) και Πρεβεζάνικο (Β) σε διάφορα θρεπτικά υποστρώματα. Οι διαδρομές 1-5 στην (Α) αντιστοιχούν στα υποστρώματα Μ1- Μ5 και στην (Β) στα υποστρώματα Π1-Π5 (Πίνακας 5. 1) Στο υπόστρωμα Π4, το οποίο και τελικώς επιλέχθηκε ως το πλέον κατάλληλο για τον πολλαπλασιασμό της ποικιλίας Πρεβεζάνικο, αναπτύχθηκαν 0,95 νέοι μικροβλαστοί ανά έκφυτο και ο ρυθμός ανάπτυξης ήταν 5,71. Τα φυτάρια ήταν ζωηρά με πλήρως ανεπτυγμένα πράσινα φύλλα και αρκετές μεγάλου μήκους 139

145 Κεφ. 5. Εξυγίανση ποικιλιών αμπέλου από τους GLRaV-Pr και GRSPaV πρωτογενείς ρίζες. Τα υποστρώματα Π1, Π3 και Π5, αν και οδήγησαν σε ικανοποιητικούς ρυθμούς ανάπτυξης, εμφάνισαν πολύ μικρό ύψος (Π3) και χλωρωτική εικόνα που συνδυαζόταν με κάποιες καμένες κορυφές. Τέλος, στο υπόστρωμα Π2 ο αριθμός των νέων βλαστών, το μεσογονάτιο διάστημα όπως και ο ρυθμός ανάπτυξης ήταν ιδιαίτερα μικρά. Πίνακας 5.2. Ανάπτυξη φυταρίων των ποικιλιών Μαντηλαριά (Α) και Πρεβεζάνικο (Β) σε διάφορα θρεπτικά υποστρώματα Θρεπτικό υπόστρωμα Αριθμός βλαστών Ύψος βλαστού Αριθμός γονάτων Αριθμός ριζών Μήκος ριζών Μήκος μεσογονατίου Ρυθμός ανάπτυξης διαστήματος (Α) Μ1 0,93 a 4,20 bc 5,93 c 1,96 a 9,00 b 0,72 ab 5,53 c Μ2 0,83 b 3,95 c 6,12 bc 1,98 a 7,60 c 0,68 b 5,36 c Μ3 0,98 a 4,44 bc 7,30 a 1,90 ab 11,78 a 0,60 c 7,30 a Μ4 1,00 a 4,92 ab 6,42 bc 1,98 a 12,63 a 0,76 a 6,41 b Μ5 1,00 a 5,32 a 6,85 ab 1,65 b 12,36 a 0,77 a 6,85 ab (B) Π1 0,86 b 4,12 a 6,06 b 1,47 a 9,35 b 0,77 a 4,45 bc Π2 0,48 c 3,82 ab 7,27 a 1,57 a 7,26 b 0,76 a 3,51 c Π3 1,40 a 2,93 b 6,02 b 0,90 a 14,96 a 0,46 b 8,36 a Π4 0,95 b 3,29 ab 5,99 b 1,60 a 8,44 b 0,57 b 5,71 b Π5 0,98 b 3,45 ab 5,35 b 0,67 a 13,98 a 0,58 b 5,26 b * Σε κάθε μεταχείριση το ίδιο γράμμα αντιπροσωπεύει στατιστικά μη σημαντικές διαφορές σύμφωνα με το Duncan s test (P 0.05) Επιβίωση των εκφύτων και εξυγίανση μετά τη θερμοθεραπεία Μόνο το 59,37 και 41,86% των φυταρίων Μαντηλαριάς και Πρεβεζάνικου αντίστοιχα, που υποβλήθηκαν σε θερμοθεραπεία κατόρθωσαν να επιβιώσουν από τη θερμική καταπόνηση και την παρουσία παθογόνων μικροοργανισμών (Πίνακας 5.3). Η πλειονότητα των φυτών που επιβίωσαν ήταν σε καλή φυσιολογική κατάσταση, 140

146 Κεφ. 5. Εξυγίανση ποικιλιών αμπέλου από τους GLRaV-Pr και GRSPaV χωρίς νεκρώσεις στην κορυφή ή σε άλλα σημεία. Από τα έκφυτα που προήλθαν από βλαστικές κορυφές Μαντηλαριάς και Πρεβεζάνικου επιβίωσε το 96,36% και 77,77%, αντίστοιχα, ενώ το ποσοστό επιβίωσης των εκφύτων που προέρχονταν από μεριστώματα, ήταν ιδιαίτερα χαμηλό (2,5% για το Μαντηλάρι, 0% για το Πρεβεζάνικο) (Πίνακας 5.3). Ο συνδυασμός της in vitro θερμοθεραπείας με τις τεχνικές ιστοκαλλιέργειας ήταν αποτελεσματικός, όπως φάνηκε από τα αποτελέσματα των ιολογικών ελέγχων (Εικ. 5.4), στην εξυγίανση πολλαπλασιαστικού υλικού αμπέλου από τους δύο ιούς. Στα μεριστώματα, το μοναδικό αναγεννημένο φυτάριο ήταν απαλλαγμένο μόνο από τον GLRaV-Pr. Για τη Μαντηλαριά, το 92,45% και το 39,62% των βλαστικών κορυφών ήταν απαλλαγμένα από τους GLRaV-Pr και GRSPaV, αντίστοιχα. Συνολικά, το 37,73% των νέων φυτών εξυγιάνθηκε και από τους δύο ιούς. Μ ζβ A 198 ζβ B Εικόνα 5.4. Ανάλυση σε πηκτή αγαρόζης των προϊόντων των δοκιμών ένθετης RT-PCR, που προήλθαν από έλεγχο μολυσμένου και εξυγιασμένου φυτικού υλικού των ποικιλιών Μαντηλαριά και Πρεβεζάνικο. A) Ανίχνευση του GLRaV-Pr. B) Ανίχνευση του GRSPaV. Διαδρομές 1, 2: Φυτικό υλικό των δύο ποικιλιών από in vitro καλλιέργεια πριν τη διαδικασία εξυγίανσης; Διαδρομή 3: Υγιής μάρτυρας; Διαδρομές 4-7: Φυτάρια που ελέγχθηκαν μετά τη θερμοθεραπεία και in vitro καλλιέργεια; M: Δείκτης μοριακού βάρους ανά 100ζβ. Για το Πρεβεζάνικο, το 89,29% των φυταρίων που προήλθαν από βλαστικές κορυφές ήταν απαλλαγμένο από τον GLRaV-Pr, το 92,85% από τον GRSPaV και το 89,29% και από τους δύο ιούς. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν και στους ιολογικούς ελέγχους που ακολούθησαν 6 και 12 μήνες μετά τη λήψη των 141

147 Κεφ. 5. Εξυγίανση ποικιλιών αμπέλου από τους GLRaV-Pr και GRSPaV μεριστωμάτων και των βλαστικών κορυφών αλλά και στα φυτάρια που εξήλθαν από τις in vitro συνθήκες. Πίνακας 5.3. Ποσοστά επιβίωσης και εξυγίανσης φυταρίων μετά τη θερμοθεραπεία και την καλλιέργεια μεριστωμάτων και βλαστικών κορυφών Ποικιλία Έκφυτα που Μεριστώματα Βλαστικές κορυφές επιβίωσαν από Αναγεννημένα Εξυγίανση Αναγεννημένα Εξυγίανση τη φυτάρια από φυτάρια από θερμοθεραπεία μεριστώματα GLRaV-Pr GRSPaV GLRaV-Pr + G RSPaV βλαστικές κορυφές GLRaV-Pr GRSPaV GLRaV-Pr + GRSPaV Μαντηλαριά 95/160 1/40 1/1 0/1 0/1 53/55 49/53 21/53 20/53 (59,37%) (2,5%) (96,36%) (92,45%) (39,62%) (37,73%) Πρεβεζάνικο 72/172 0/ /36 25/28 26/28 25/28 (41,86%) (77,77%) (89,29%) (92,85%) (89,29%) Σκληραγώγηση έρριζων φυταρίων Έγινε επιτυχής σκληραγώγηση και εγκλιματισμός των υγιών φυταρίων και των δυο ποικιλιών (Εικ. 5.5). Μετά από 30 ημέρες το ποσοστό επιβίωσης ήταν 100% για τη Μαντηλαριά και 80% για το Πρεβεζάνικο. Εικόνα 5.5. Φυτά των ποικιλιών Μαντηλαριά και Πρεβεζάνικο κατά τη διαδικασία σκληραγώγησης, Α: 10 ημερών, Β: 3 μηνών. της 142