«Εκτίμηση δικτύων μετάδοσης HIV σε ΧΕΝ και συσχέτιση με κοινωνικά δίκτυα»

Transcript

1 ΠΜΣ ΒΙΟΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗΣ ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΜΑΘΗΜΑΤΗΚΩΝ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΜΑΘΗΜΑΤΙΚΩΝ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Χελιώτη Γεώργιου (A.M ) «Εκτίμηση δικτύων μετάδοσης HIV σε ΧΕΝ και συσχέτιση με κοινωνικά δίκτυα» ΑΘΗΝΑ 2016

2 Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο πλαίσιο των σπουδών για την απόκτηση του Μεταπτυχιακού Διπλώματος Ειδίκευσης στη ΒΙΟΣΤΑΤΙΣΤΙΚΗ που απονέμει η Ιατρική Σχολή και το Τμήμα Μαθηματικών του Εθνικού & Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών και το Τμήμα Μαθηματικών του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων. Εγκρίθηκε την. από την εξεταστική επιτροπή: ΟΝΟΜΑΤΕΠΩΝΥΜΟ ΒΑΘΜΙΔΑ ΥΠΟΓΡΑΦΗ Δ. ΠΑΡΑΣΚΕΒΗΣ (Επιβλέπων) ΕΠΙΚ. ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Β. ΣΥΨΑ ΕΠΙΚ. ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ. Α. ΧΑΤΖΑΚΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ....

3 Στην Κ.

4 Ευχαριστίες Ευχαριστώ θερμά όλους όσους βοήθησαν, με τον τρόπο του ο καθένας, να ολοκληρωθεί με επιτυχία αυτή η εργασία και μαζί της να κλείσει ένας σημαντικός κύκλος για εμένα. Ένα μεγάλο ευχαριστώ στον επίκουρο καθηγητή και επιβλέποντά μου, κύριο Δημήτριο Παρασκευή, καθώς η συμβολή του τόσο στην ολοκλήρωση της παρούσας εργασίας, όσο και στην ηθική μου ενθάρρυνση για να ασχοληθώ και να αγαπήσω το αντικείμενο της φυλογενετικής ήταν καθοριστική. Επίσης ευχαριστώ θερμά για την εξίσου σημαντική συμβολή της στην ολοκλήρωση της παρούσας εργασίας την επίκουρη καθηγήτρια κυρία Βάνα Σύψα. Επιπλέον, θέλω να ευχαριστήσω μέσα από την καρδιά μου την συνάδελφο κυρία Κωστάκη Ευαγγελία-Γεωργία καθώς και να της ζητήσω συγνώμη για τις μεγάλες νυχτερινές ώρες που ζητούσα την πολύτιμη βοήθειά της. Ευχαριστώ τόσο την οικογένειά μου όσο και όλους τους κοντινούς μου ανθρώπους που όλο αυτό το δύσκολο οικονομικά χρονικό διάστημα υπήρξαν αρωγοί ηθικής αλλά και καθημερινήςπρακτικής υποστήριξης. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον καθηγητή κύριο Άγγελο Χατζάκη, καθηγητή Επιδημιολογίας και προληπτικής ιατρικής του Εργαστηρίου Υγιεινής, Επιδημιολογίας και Ιατρικής Στατιστικής της Ιατρικής Σχολής του Εθνικού & Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών, κατά το διάστημα εκπόνησης της παρούσας εργασίας ήταν επιστημονικός υπεύθυνος του προγράμματος ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΗΣ. Χωρίς εκείνον και το επιστημονικό του έργο, η παρούσα εργασία δεν θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί.

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Περίληψη... 5 Abstract ΕΙΣΑΓΩΓΗ Υπόβαθρο α Τα χαρακτηριστικά της επιδημιολογίας του HIV παγκοσμίως β Η εξάπλωση του HIV-1 παγκοσμίως τα τελευταία χρόνια γ Η εξάπλωση του HIV-1 στην Ευρώπη τα τελευταία χρόνια δ Η εξάπλωση του HIV στην Ελλάδα ε Πρόγραμμα «ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΗΣ» Σκοπός της εργασίας Φυλογενετική ανάλυση Στοίχιση Εξελικτικά μοντέλα και φυλογενετικά δέντρα Μέθοδοι αποστάσεων Μέθοδοι χαρακτήρων i Μέθοδοι Φειδωλότητας-Μέθοδος μέγιστης Φειδωλότητας (Maximum Parsimony,MP) Μέθοδοι Μέγιστης Πιθανοφάνειας Κοινωνικά δίκτυα και Δίκτυα μετάδοσης Respondent-Driven Sampling (RDS) Μέθοδος Πληθυσμός και Δείγμα Διαδικασία συλλογής δείγματος Φυλογενετικά δέντρα και δίκτυα RDS Σχέση φυλογένειας και δικτύων RDS Αποτελέσματα Αποτελέσματα ανάλυσης RDS Αποτελέσματα φυλογενετικής ανάλυσης και διασταύρωση με τα δίκτυα RDS Συμπεράσματα Συζήτηση Βιβλιογραφία... 49

6 Περίληψη Υπόβαθρο: Κατά το έτος 2011 παρατηρήθηκε μια σημαντική έξαρση στην εξάπλωση (1600%) του ιού της ανθρώπινης ανοσολογικής ανεπάρκειας τύπου 1 (HIV-1), μεταξύ χρηστών

7 ενδοφλέβιων ναρκωτικών (ΧΕΝ) στην Αθήνα, την πρωτεύουσα της Ελλάδας. Στην παρούσα μελέτη επιχειρείται να διακριθούν σχέσεις μεταξύ των δικτύων μετάδοσης του ιού και των δικτύων ενδοφλέβιας χρήσης RDS (Respondent Driven Sampling) των ΧΕΝ, όπως αυτά εκτιμήθηκαν με την μέθοδο RDS. Η παρούσα εργασία επικεντρώνεται στα τέσσερα μεγαλύτερα δίκτυα μετάδοσης αυτής της επιδημίας, αυτά των υπότυπων A, B, CRF14_BG και CRF35_AD. Μέθοδος: Πραγματοποιήθηκε φυλογενετική ανάλυση στις αλληλουχίες του pol γονιδίου των HIV-1(+) ΧΕΝ που συμμετείχαν στη μελέτη. Με τη βοήθεια δύο προγραμμάτων, του FASTTREE και του RAxML, εντοπίσθηκαν εντός του κάθε ενός από τα τέσσερα κύρια δίκτυα μετάδοσης όλα τα επιμέρους δίκτυα μετάδοσης. Επιχειρήθηκε η διερεύνηση, στο βαθμό που αυτό ήταν εφικτό, της κοινωνικής δικτύωσης των ΧΕΝ μέσω των δικτύων ενδοφλέβιας χρήσης RDS και της ανάλυσης RDS. Το δείγμα αφορά τον πρώτο κύκλο συμμετοχής του προγράμματος ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΗΣ στην Αθήνα. Η ανάλυση RDS πραγματοποιήθηκε με το RDSAT. Η διερεύνηση των σχέσεων μεταξύ των δικτύων μετάδοσης του ιού και των δικτύων RDS των ΧΕΝ στην Αθήνα, πραγματοποιήθηκε με δύο διαδικασίες. Κατά τη μία, υπολογίσθηκε ο δείκτης Homophily, μέσω της ανάλυσης RDS, για κάθε μια ομάδα υπότυπου των HIV(+) ΧΕΝ. Κατά τη δεύτερη διαδικασία, εξετάσθηκε αν τα άτομα τα οποία ανήκαν στο ίδιο υπο-δίκτυο μετάδοσης του ιού (bootstrap values > 75%), συνέβαινε να βρίσκονται κοντά και στα δίκτυα RDS. Αποτελέσματα: Στο σύνολο του δείγματος ο δείκτης H για τους ΧΕΝ των δικτύων μετάδοσης CRF14_BG, CRF35_AD, Α, και Β υπολογίσθηκε 0.16, -1, -1 και αντίστοιχα. Εντός του υποσυνόλου των ΗΙV(+) ΧΕΝ, ο δείκτης H εκτιμήθηκε (CRF14_BG), -1 (CRF35_AD), -1 (Α) και (Β). Εντοπίσθηκαν 5 υπο-δίκτυα μετάδοσης του ιού, με εύρος 2 αλληλουχιών, και 1 υπο-δίκτυο με 5 αλληλουχίες. Οι 4 HIV(+) (26.7%) που εντοπίστηκαν σε υπο-δίκτυα βρέθηκε ότι ανήκαν στο ίδιο δίκτυο RDS. Συμπεράσματα: Στην παρούσα εργασία αναδεικνύεται η ύπαρξη σχέσης μεταξύ των δικτύων RDS των ΧΕΝ και των δικτύων μετάδοσης του ιού. Το αποτέλεσμα αυτό υποδεικνύει ότι τα άτομα με δικτύωση RDS είχαν αυξημένη πιθανότητα μεταξύ τους μετάδοσης της HIVλοίμωξης. Για τα δίκτυα μετάδοσης των υπότυπων Α και CRF35_AD δεν εντοπίσθηκε κάποια συσχέτιση με τα δίκτυα RDS. Αυτό είναι πιθανό να οφείλεται από τη μία στο σχετικά μικρό μέγεθος των δύο αυτών δικτύων και από την άλλη στο γεγονός ότι αυτά τα δύο δίκτια δεν ήταν

8 πλέον ενεργά κατά την περίοδο συμμετοχής στον πρώτο κύκλο του προγράμματος ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΗΣ σε αντίθεση με τα δίκτυα B και CRF14_BG. Συζήτηση: Η διαδικασία RDS, αν και πετυχαίνει να προσεγγίσει τον κλειστό πληθυσμό των ΧΕΝ, μειονεκτεί στο να καταγράφει με ακρίβεια τις ανά δύο κοινωνικές σχέσεις μεταξύ των συμμετεχόντων. Το γεγονός αυτό πιθανόν να συνετέλεσε στην μη ανάδειξη επιπλέον στοιχείων που να υποστηρίζουν την πιθανή συσχέτιση μεταξύ των δικτύων μετάδοσης και των δικτύων RDS. Νέες προτάσεις θα πρέπει να κατατεθούν στο μέλλον και να διεξαχθούν μελέτες, ώστε να καταστήσουν εφικτή τη διερεύνηση τέτοιων σχέσεων, σε περιπτώσεις επιδημιών σε πληθυσμούς όπως οι ΧΕΝ, με πρώτο στόχο την καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών εξάπλωσης της εκάστοτε επιδημίας και τελικά, τον αποτελεσματικό και γρήγορο περιορισμό της. Abstract Objective: In 2011, a significant increase (1600%) in the number of newly diagnosed HIV-1 (Human Immunodeficiency Virus) infections among intravenous drug users (IDUs) was observed in Athens, the capital of Greece. In the present study, it was attempted to distinguish possible associations between the virus transmission networks and intravenous drug use RDS (Respondent Driven Sampling) networks, as evaluated by the RDS method. This paper focuses on the four major transmission networks identified in this specific epidemic, those of A, B, CRF14_BG and CRF35_AD subtypes. Method: Phylogenetic analysis of pol gene sequences of the HIV-1(+) IDUs participants was conducted. Using two packages, FASTTREE and RAxML, transmission clusters were identified within each of the 4 major transmission networks. The investigation, to the extent that this was possible, of the social IDUs networks, as defined through the intravenous drug use RDS networks and the RDS analysis, was attempted. The sample consists of the participants of the first round of Aristotle program that was conducted in Athens. RDS analysis was performed using RDSAT. The investigation of the existence of possible association between the virus transmission networks and RDS networks was conducted using two approaches. In the first approach, Homophily index was calculated, using RDS analysis, for each subtype group of the HIV(+) IDUs. In the second approach, it was examined whether HIV(+) IDUs that belonged to the same transmission cluster (bootstrap values > 75%), happened to also be close in the RDS networks.

9 Results: In the total sample, H index for IDUs in the CRF14_BG, CRF35_AD, Α, and Β transmission networks was estimated as 0.16, -1, -1 and 0.03, respectively. In the ΗΙV(+) IDUs subgroup, H index was estimated (CRF14_BG), -1 (CRF35_AD), -1 (Α) and (Β). 5 transmission clusters, with a range of 2 sequencies, and 1 cluster with 5 sequences were identified. 4 HIV(+) IDUs (26.7%) found in the same transmission cluster were also found in the same RDS network and were closely associated. Conclusion: This research points out the relationship between HIV-1 IDUs transmission networks and RDS networks in the HIV-1 outbreak in Athens, Hence, IDUs that were tied at the RDS networks had higher odds to be mutually infected. For the transmission networks of the CRF35_AD and A subtypes, we know that during the sampling period they were inactive. This might be a reason for the Homophily index value that was found during the RDS analysis for these two subtype networks. We found few HIV transmissions corresponding directly with the RDS recruitment. However, when the HIV(+) IDUs of a transmission cluster were also members of the same RDS network, they were directly connected (1 st or 2 nd degree connections). Discussion: RDS sampling method, and consequently RDS analysis, seems to be a method that generates relatively unbiased samples of the population, managing to adequately describe the population s network general structure. However, this method is not proper to describe thoroughly all of the pairwise relationships among the subjects. Nonetheless, it seems that there is a relationship between the RDS networks and HIV-1 transmission networks, indicating that the method may be able to reveal at least part of the real association between IDUs HIV epidemic and their social networks. 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το γενετικό υλικό ενός οργανισμού αποτελεί το βιβλίο της ζωής του. Το DNA (ή το RNA για ορισμένους οργανισμούς) περιέχει όλες εκείνες της πληροφορίες που κάνουν τον κάθε οργανισμό αυτό που είναι. Το βιβλίο αυτό είναι γραμμένο σε μια γλώσσα με πολύ φτωχό

10 αλφάβητο, το οποίο αποτελείται από 4 συνολικά γράμματα παρά ταύτα το μήκος του, του επιτρέπει να παρέχει έναν πολύ μεγάλο όγκο πληροφοριών. Για να καταλάβει κανείς το τι πληροφορίες μπορεί να περιέχει ένα μόριο DNA, αρκεί να σκεφτεί πως ένας υπολογιστής «σκέπτεται» και δουλεύει γνωρίζοντας μόλις 2 γράμματα (το 0 και το 1). Συνεπώς, μπορεί να γίνει εύκολο αντιληπτό τα μέγεθος του όγκου πληροφοριών που μπορεί να φέρει ένα και μόνο μόριο DNA. Η εξέλιξη τόσο της τεχνολογίας, όσο και της επιστήμης σχετικά με τον χειρισμό αλλά και την αξιοποίηση αυτής της πληροφορίας έχει επιτρέψει τα τελευταία χρόνια να γίνουν έρευνες που να βασίζονται στο γενετικό μας υλικό, οι οποίες παλιότερα δεν ήταν εφικτό να πραγματοποιηθούν. Έτσι, νέοι τρόποι αξιοποίησης της γενετικής πληροφορίας ξεπηδούν συνεχώς, τόσο σε επίπεδο ακριβέστερης φυλογενετικής ανάλυσης, όσο και σε επίπεδο αξιολόγησης και χρησιμοποίησης των αποτελεσμάτων τέτοιων αναλύσεων. 1.1 Υπόβαθρο Κατά τη διάρκεια του έτους 2011 παρατηρήθηκε μία σημαντική αύξηση νέων κρουσμάτων μόλυνσης από HIV-1 μεταξύ των χρηστών ενδοφλέβιων ναρκωτικών ουσιών (ΧΕΝ) στην πρωτεύουσα της Ελλάδας, την Αθήνα (Paraskevis et al., 2011). Συγκεκριμένα, η αύξηση άγγιξε το 1600% (Paraskevis et al., 2013). Αυτή η έκρηξη στα νέα περιστατικά HIV-1 μεταξύ των ΧΕΝ στην Αθήνα αποτέλεσε έναυσμα και σημείο αναφοράς για μία σειρά μελετών σχετικά με την διερεύνηση των αιτιών του φαινομένου και των χαρακτηριστικών αυτής της επιδημίας. Είναι γνωστό πως μέχρι το 2010 η μετάδοση του HIV-1 στην Ελλάδα περιοριζόταν κυρίως μεταξύ των ανδρών που έχουν σεξουαλικές επαφές με άνδρες (MSN: Men who have Sex with Men), ενώ τα περιστατικά μεταξύ των ΧΕΝ ήταν λίγα και σποραδικά (Sypsa et al., 2015). Η έξαρση αυτή του HIV στους ΧΕΝ δεν περιορίστηκε μόνο στο έτος 2011, αλλά συνεχίστηκε και τα επόμενα χρόνια. Aκόμη και σήμερα, και ενώ τα έτη 2013 και 2014 ο ρυθμός μετάδοσης του ιού στους ΧΕΝ στην Ελλάδα είχε πτωτική τάση (από 9.5 το 2012, σε 7.2 το 2013 και 5.9 το 2014), η κατάσταση που έχει διαμορφωθεί δεν έχει πάψει να είναι επίφοβη, ενώ μπορεί ανά πάσα στιγμή να υποτροπιάσει ή ακόμα να γενικευθεί στον υπόλοιπο πληθυσμό της χώρας (HCDCP & HIV & STIs Office, 2015).

11 Για να μπορέσει να αποφευχθεί μία κατάσταση κατά την οποία η έξαρση στην εξάπλωση του HIV θα πάψει να είναι ένα φαινόμενο περιορισμένο στον πληθυσμό των ΧΕΝ και θα περάσει στο γενικό πληθυσμό, θα πρέπει να ληφθούν κατάλληλα μέτρα. Έτσι, θα πρέπει να μπορέσουμε να περιγράψουμε λεπτομερώς το φαινόμενο αυτό και να καταγράψουμε τα αίτια που το δημιούργησαν και το συντηρούν, ώστε στη συνέχεια να προταθούν παρεμβάσεις βασισμένες στα συμπεράσματα που θα εξαχθούν. Υπάρχουν άλλωστε προτάσεις στη βιβλιογραφία για την αντιμετώπιση τέτοιων καταστάσεων, οι οποίες προτείνουν «peer-driven intervention» (Heckathorn, Broadhead, Anthony, & Weakliem, 1999), δηλαδή παρεμβάσεις στους πληθυσμούς των ΧΕΝ ή των οροθετικών (HIV+), με τη χρήση ατόμων που είναι οι ίδιοι ΧΕΝ (ή οροθετικοί ή ανήκουν σε κάποια άλλη ομάδα-στόχο) και που καλούνται να φέρουν στο πρόγραμμα παρέμβασης άτομα από τους πληθυσμούς-στόχους. Τα άτομα αυτά καλούνται seeds (σπόροι). Έχει φανεί πως σε περιπτώσεις απομονωμένων πληθυσμών με ιδιαίτερα κοινωνικά χαρακτηριστικά, τέτοιες μέθοδοι ενδείκνυνται, καθώς τα άτομα αυτών των κοινωνικών ομάδων εμπιστεύονται κυρίως άτομα από την ίδια ομάδα. Μια τέτοια μέθοδος είναι η μέθοδος RDS (Respondent-Driven Sampling) (Heckathorn, Broadhead, Anthony, & Weakliem, 1999). Στο πλαίσιο της κατανόησης των χαρακτηριστικών της επιδημίας HIV-1 στους ΧΕΝ στην Αθήνα, έχουν γίνει μελέτες για να διαπιστωθούν τυχόν σχέσεις της επιδημίας με την οικονομική κρίση στην Ελλάδα (Paraskevis et al., 2013) και έχει εξετασθεί η επίδραση διαφόρων παραγόντων με την επιδημική έκρηξη (outbreak), όπως η απορία, η χώρα προέλευσης του ατόμου, η ηλικία, το μορφωτικό επίπεδο και διάφοροι άλλοι. Μάλιστα έχουν προκύψει αρκετά συμπεράσματα, τα οποία όμως χρειάζονται περαιτέρω διερεύνηση και ακριβέστερη περιγραφή. Φάνηκε οι άστεγοι να είναι πιο εκτεθειμένοι σε μολύνσεις με HIV, ενώ το πόσο συχνά γίνεται χρήση ναρκωτικών ουσιών, ο τύπος της ναρκωτικής ουσίας αλλά και η συχνότητα με την οποία ένας ΧΕΝ μοιράζεται σύριγγές ή άλλο εξοπλισμό ενδοφλέβιας χρήσης θεωρούνται σημαντικοί παράγοντες κινδύνου για τη μετάδοση του ιού (Sypsa et al., 2015). 1.1.α Τα χαρακτηριστικά της επιδημιολογίας του HIV παγκοσμίως Ο HIV, αν και γενετικά ταξινομείται ως ένας RNA ιός με μονόκλονο γονιδίωμα, δεν παύει να παρουσιάζει αρκετή ετερογένεια, ώστε να μπορεί να διαχωρισθεί σε επιμέρους τύπους και υπότυπους.

12 Ο HIV διαχωρίζεται αρχικά σε HIV-1 και HIV-2, με τον πρώτο να αποτελεί του τύπο του ιού που είναι πιο κοινός παγκοσμίως και τον δεύτερο, ο οποίος διαφέρει σημαντικά από τον HIV-1 (τόσο επιδημιολογικά όσο και αναφορικά με την προέλευσή του), να συνδέεται επιδημιολογικά κυρίως με τη Δυτική Αφρική (Nyamweya et al., 2013). Ο HIV-1, ο οποίος είναι ο τύπος του ιού που ενδιαφέρει κυρίως την παγκόσμια επιστημονική κοινότητα, καθώς ευθύνεται για πάνω από το 75% των κρουσμάτων AIDS παγκοσμίως (Nyamweya et al., 2013) διαχωρίζεται επιμέρους σε ομάδες, τις M,N,P και O. Το μεγαλύτερο πλήθος υποτύπων του HIV- 1 κατατάσσονται στην ομάδα Μ, με την ομάδα αυτή να είναι υπεύθυνη και για το μεγαλύτερο ποσοστό μολύνσεων HIV παγκοσμίως. Τέλος, πέρα από τους υπότυπους, υπάρχει ακόμη μια κατηγορία, αυτή των ανασυνδυασμένων υπότυπων (CRFs) Οι τελευταίοι αποτελούν ανασυνδυασμούς υπότυπων, δηλαδή στελέχη του ιού των οποίων το γενετικό υλικό αποτελείται από τμήματα γενετικού υλικού δύο ή περισσότερων ιών διαφορετικού υπότυπου (McCutchan, 2006). Ορισμένοι από τους υπότυπους HIV-1 της ομάδας Μ είναι οι Α, B, C, D, F, G, H, J, K και αρκετοί CRFs. (McCutchan, 2006). Έξι από αυτούς τους υπότυπους, οι Α, B, C, D, CRF01_AE και CRF02_AG, κυριαρχούν στην παγκόσμια επιδημιολογία του HIV (McCutchan, 2006). Η επιδημιολογία των παραπάνω υποτύπων μπορεί να περιγραφεί συνοπτικά ως εξής (McCutchan, 2006): Υπότυπος Α: Ο υψηλότερος επιπολασμός αυτού του υπότυπου παρατηρείται στην Ανατολική Αφρική και τις χώρες της πρώην Σοβιετικής Ένωσης Υπότυπος Β: Είναι παγκοσμίως διαδεδομένος, ενώ κυριαρχεί στην Αμερική, σε χώρες της Δυτικής Ευρώπης και στην Αυστραλία Υπότυπος C: Ευθύνεται για πάνω από το 50% των μεταδόσεων HIV παγκοσμίως, ενώ εμφανίζει μεγάλη συγκέντρωση στη Νότια και Ανατολική Αφρική και στην Ινδία. Υπότυπος D: Κυριαρχεί κυρίως στην Ανατολική Αφρική. CRF01_AE: Κυρίως στη Νοτιο-Δυτική Ασία. CRF02_AG: Κυριαρχεί στη Δυτική Αφρική. Η παραπάνω περιγραφή αποτελεί βέβαια μια αδρή καταγραφή της πραγματικότητας. Οποιοδήποτε στέλεχος του ιού θα μπορούσε να εντοπισθεί σχεδόν σε κάθε σημείο του πλανήτη,

13 ενώ ακόμη και εντός του κάθε υπότυπου μπορούν να εντοπισθούν επιμέρους υποδίκτυα μετάδοσης, τα οποία διακρίνονται γενετικά από τον αρχικό υπότυπο και τα στελέχη αυτά ονομάζονται υπο-υπότυποι (sub-subtypes) (McCutchan, 2006). Τέλος, πέραν του γεωγραφικού προσδιορισμού της επιδημιολογίας του HIV, έχει ενδιαφέρον και η επιδημιολογία εντός συγκεκριμένων πληθυσμών. 1.1.β Η εξάπλωση του HIV-1 παγκοσμίως τα τελευταία χρόνια Αποτελεί αδιαμφησβήτητη παραδοχή ότι ο HIV συγκεντρώνει παγκοσμίως την προσοχή των επιστημόνων, με την επιδημιολογία του να επιτηρείται σε παγκόσμιο επίπεδο. Το 2014, 36.9 εκατομμύρια άτομα ανά τον κόσμο υπολογίσθηκε πως ζουν έχοντας μολυνθεί με τον HIV (UNAIDS, 2015). Αν και ο ρυθμός εξάπλωσης παγκοσμίως το ίδιο έτος καταγράφηκε να έχει μειωθεί σε σύγκριση με τον αντίστοιχο ρυθμό των προηγούμενων ετών, 2 εκατομμύρια νέα περιστατικά διαγνώστηκαν παγκοσμίως (UNAIDS, 2015).Σε συνέχεια των παραπάνω, το 2015, 36.7 εκατομμύρια άτομα υπολογίσθηκε πως ζούσαν έχοντας μολυνθεί από τον HIV (UNAIDS, 2016). Αν και η εξάπλωση του ιού του HIV διαχρονικά στον Δυτικό κόσμο σχετίζεται, κυρίως, με τους MSM (Men having Sex with Men), τα τελευταία χρόνια έχουν συμβεί επιδημικές εκρήξεις και σε πληθυσμούς με άλλα χαρακτηριστικά. Η χρήση ενδοφλέβιων ναρκωτικών ουσιών αναδεικνύεται σταδιακά σε ένα σημαντικό παράγοντα εξάπλωσης του ιού (Mathers et al., 2008). Το 2008, σε μια συστηματική ανασκόπηση διαπιστώθηκε πως το πλήθος των χωρών στις οποίες έχει καταγραφεί η χρήση ενδοφλέβιων ναρκωτικών αυξήθηκε την προηγούμενη δεκαετία. Έτσι, η αυξημένη επίπτωση του HIV στους ΧΕΝ, σε συνδυασμό με το γεγονός ότι η χρήση ενδοφλέβιων ναρκωτικών ολοένα και αυξάνει παγκοσμίως, συνετέλεσε στην εκτίμηση πως περίπου 3 εκατομμύρια ( εκατομμύρια) ΧΕΝ μπορεί να είναι HIV(+) παγκοσμίως (Mathers et al., 2008). Στην παραπάνω έρευνα, δεν υπήρχαν δεδομένα σχετικά με τη χρήση ενδοφλέβιων ναρκωτικών για χώρες της Αφρικής, της Μέσης Ανατολής και της Λατινικής Αμερικής. Έτσι, δεν ήταν δυνατόν να εξαχθούν αντίστοιχα συμπεράσματα σχετικά με την εξάπλωση του HIV στους ΧΕΝ σε αυτές τις χώρες. Μέρος αυτού του κενού φαίνεται να καλύπτει μια νεότερη συστηματική ανασκόπηση για την εξάπλωση του HIV σε ΧΕΝ σε χώρες της Βόρειας Αφρικής

14 και Μέσης Ανατολής (Mumtaz et al., 2014). Σύμφωνα με τη μελέτη αυτή, υπάρχουν ισχυρές ενδείξεις που υποδεικνύουν την ύπαρξη επιδημικών εκρήξεων HIV μεταξύ ΧΕΝ σε πολλές από αυτές τις χώρες, ενώ οι επιδημίες αυτές φαίνεται να έχουν σαν αφετηρία την τελευταία δεκαετία, πριν το 2014, και να συνεχίζουν να εξαπλώνονται. Τελικά, σε παγκόσμιο επίπεδο φαίνεται ότι ο πληθυσμός των ΧΕΝ σήμερα θεωρείται ένας πληθυσμός «κλειδί» για την εξάπλωση του HIV, με πολύ χαρακτηριστικό παράδειγμα την Ανατολική Ευρώπη και την Κεντρική Ασία, όπου το 51% των νέων περιστατικών HIV για το έτος 2014 αφορούσαν ΧΕΝ (UNAIDS, 2016), καθώς και η επιδημία του HIV-1 που παρατηρήθηκε στον πληθυσμό των ΧΕΝ στην Αθήνα, το έτος 2011 (Paraskevis et al., 2011). 1.1.γ Η εξάπλωση του HIV-1 στην Ευρώπη τα τελευταία χρόνια Οι Likatavicius and van de Laar (2011) αναφέρουν πως το 2010 διαγνώστηκαν νέα περιστατικά ατόμων με HIV εντός της Ευρωπαϊκής ένωσης, όπου μεταξύ των 28 χωρών που έλαβαν μέρος (δε συμμετείχαν στην έρευνα η Αυστρία και το Λιχτενστάιν), οι υψηλότεροι ρυθμοί εξάπλωσης του ιού παρατηρήθηκαν στην Εσθονία (27.8 νέα περιστατικά ανά πληθυσμού), στη Λετονία (12.2 νέα περιστατικά ανά πληθυσμού), στο Βέλγιο ( 11 νέα περιστατικά ανά πληθυσμού) και στο Η.Β. (10.7 νέα περιστατικά ανά πληθυσμού), ενώ οι χαμηλότεροι ρυθμοί παρατηρήθηκαν στη Ρουμανία και τη Σλοβακία (με λιγότερο από 1 περιστατικά ανά πληθυσμού), όταν ο συνολικός ρυθμός εξάπλωσης σε όλες τις 28 χώρες ήταν 5.7 περιστατικά ανά πληθυσμού. Σε αυτή την έρευνα αναφέρεται ότι τα χαρακτηριστικά της επιδημιολογίας του HIV-1 στην ΕΕ υποδεικνύουν πως υπάρχει συνεχής εξάπλωση, δίχως σημάδια για μείωση του ρυθμού εξάπλωσης, κάτι ιδιαίτερα ανησυχητικό. Τα μεγαλύτερα ποσοστά μετάδοσης του ιού σε αυτή τη μελέτη φαίνεται να εντοπίζονται μεταξύ των MSM. Πιο πρόσφατα στοιχεία σχετικά με την εξάπλωση του HIV εντός της Ευρωπαϊκής Ένωσης (31 χώρες της ΕΕ) φαίνεται να συμφωνούν με τις παραπάνω προβλέψεις σχετικά με τους ρυθμούς εξάπλωσης του HIV. Αναλυτικότερα, σύμφωνα με τα τελευταία δεδομένα, διαγνωσθέντα άτομα κατοικούν στις χώρες της ΕΕ, με τον σταθμισμένο ρυθμό μετάδοσης να ανέρχεται στα 6.4 νέα κρούσματα ανά κατοίκων. Το 4% των νέων μεταδόσεων του ιού συνολικά φαίνεται να συμβαίνει μεταξύ ΧΕΝ. Επίσης, φαίνεται πως την τελευταία δεκαετία, το πλήθος των HIV(+) στους MSM συνεχώς αυξάνει. Αντίστοιχα, στον πληθυσμό των ΧΕΝ

15 καταγράφεται μια έκρηξη από το 2010 μέχρι το 2012, ενώ μετά οι ρυθμοί μετάδοσης φαίνεται να φθίνουν (European Centre for Disease Prevention and Control & WHO Regional Office for Europe, 2015). Πιο αναλυτικά, την πενταετία από τις αρχές του 2010 μέχρι το τέλος του 2014 συνεχώς παρατηρούνται πολλά νέα περιστατικά HIV στις χώρες της ΕΕ. Μάλιστα πάρα τις προσπάθειες που γίνονται, ο ρυθμός μετάδοσης του ιού στις χώρες της ΕΕ παραμένει σχεδόν σταθερός, με μια ίσως ελάχιστη μείωση (European Centre for Disease Prevention and Control & WHO Regional Office for Europe, 2015). Κατά τη διάρκεια όλης αυτής της πενταετίας, το μεγαλύτερο ποσοστό νέων περιστατικών HIV αφορούσαν MSM. Την ίδια στιγμή, αν και συνεχώς παρατηρούνται νέα κρούσματα HIV σε ΧΕΝ, και παρά τη μεγάλη έκρηξη των νέων διαγνώσεων HIV σε ΧΕΝ που παρατηρήθηκε σε Ελλάδα και Ρουμανία τα έτη 2011 και 2012, ο ρυθμός μετάδοσης του ιού σε αυτό τον πληθυσμό φθίνει συνεχώς εντός της ΕΕ (European Centre for Disease Prevention and Control & WHO Regional Office for Europe, 2011, 2012, 2013, 2014, 2015). Σε συνέχεια των παραπάνω πληροφοριών, το γεγονός ότι ενώ στις περισσότερες χώρες της ΕΕ ο ρυθμός μετάδοσης του HIV μεταξύ ΧΕΝ έχει συνεχώς φθίνουσα τάση, σημειώθηκαν τα δύο μεγάλες επιδημίες στην Ελλάδα και τη Ρουμανία, υποδεικνύει ότι τέτοια πολύ έντονα φαινόμενα μπορούν να ξεσπάσουν ανά πάσα στιγμή. Άλλωστε, πριν το έτος 2011 οπότε και εντοπίσθηκε σημαντική αύξηση της εξάπλωσης του HIV μεταξύ των ΧΕΝ σε Ελλάδα και Ρουμανία, στις υπόλοιπες Ευρωπαϊκές χώρες δεν διαφαινόταν ότι κάτι τέτοιο θα μπορούσε να συμβεί, με την εξάπλωση της HIV- λοίμωξης μεταξύ των ΧΕΝ να είναι πολύ περιορισμένη (Pharris et al., 2011). Επιπλέον, τα δεδομένα ακόμη και μιας πενταετίας πριν τα περιστατικά σε Ελλάδα και Ρουμανία ( ), δεν προμήνυαν το τι θα ακολουθούσε σε αυτές τις δύο χώρες. Μόλις στα τέλη της πενταετίας αυτής άρχισε να παρατηρείται κάποια αύξηση στο ρυθμό μετάδοσης του HIV σε ΧΕΝ στις δύο χώρες, όταν πλέον το φαινόμενο εξελισσόταν και ήταν αρκετά αργά για να προληφθεί (Nakagawa, Phillips, & Lundgren, 2014; Wiessing et al., 2011). Τα μεγάλα μεταναστευτικά κύματα κυρίως από χώρες της ανατολής, τόσο προς την Ελλάδα, όσο και προς την Ευρώπη γενικότερα το έτος 2015 και 2016, με δεδομένο πως κατά το 2014, το 14% των νέων περιστατικών HIV σε χώρες του Ευρωπαϊκού τομέα του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (WHO European Region) αφορούσαν σε ΧΕΝ (European Centre for

16 Disease Prevention and Control & WHO Regional Office for Europe, 2015), δημιουργούν συνθήκες που θα μπορούσαν να ευνοήσουν νέα περιστατικά εκρήξεων στη μετάδοση του HIV μεταξύ ΧΕΝ ή και άλλων πληθυσμών. 1.1.δ Η εξάπλωση του HIV στην Ελλάδα Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, και σύμφωνα με το επιδημιολογικό δελτίο του ΚΕΕΛΠΝΟ, στην Ελλάδα και πιο συγκεκριμένα στην Αττική, υπήρξε μία σημαντική αύξηση στην εξάπλωση του ιού του HIV μεταξύ των ΧΕΝ. Το φαινόμενο παρατηρήθηκε το 2011 και συνεχίστηκε και το 2012, ενώ από το 2013 και μετά ο ρυθμός εξάπλωσης του ιού στους ΧΕΝ άρχισε να φθίνει. Πριν το 2011, η εξάπλωση του ιού περιοριζόταν κυρίως μεταξύ των MSM, ενώ σε πιο μεγάλες ηλικίες (άτομα άνω των 50 ετών) η μετάδοση γινόταν κυρίως μεταξύ ετεροφυλόφιλων ατόμων. Το 2011, οπότε και ουσιαστικά ξέσπασε η επιδημία HIV μεταξύ των ΧΕΝ στην Ελλάδα, βρέθηκε πως ο τύπος του ιού που αφορούσε την επιδημίας ήταν ο HIV-1 και η προέλευση του φάνηκε να είναι συχνά από άλλες χώρες. Συνεπώς, επισημάνθηκε ότι είναι πιθανό η επιδημία αυτή να συνδέεται με τη μετανάστευση μολυσμένων ΧΕΝ από χώρες εκτός Ελλάδας (Paraskevis et al., 2011). Σε μία προσπάθεια ακριβούς περιγραφής του φαινομένου, έχει γίνει έρευνα σχετικά με διάφορους παράγοντες που μπορεί να σχετίζονται με την εξάπλωση του HIV στους ΧΕΝ. Η έρευνα αφορούσε ΧΕΝ στην πόλη της Αθήνας. Αρχικά βρέθηκε πως οι Έλληνες και οι μη Έλληνες δεν κινδυνεύουν σε διαφορετικό βαθμό για μετάδοση με HIV, αν και φάνηκε πως τα άτομα από Αφγανιστάν και από Ιράν ήταν πιο πιθανό να είναι HIV(+) (Sypsa et al., 2015). Η εξάπλωση του HIV σε νέους ΧΕΝ (ΝΧΕΝ) φάνηκε να είναι μεγαλύτερη σε σχέση με τους ΧΕΝ που κάνουν μακροχρόνια χρήση. Μεταξύ άλλων παραγόντων, η έλλειψη στέγης, ο τύπος ναρκωτικών που χρησιμοποιείται και η συχνότητα με την οποία μοιράζεται σύριγγες ή άλλο εξοπλισμό χρήσης ένας ΧΕΝ, φαίνεται να επηρεάζουν την εξάπλωση της επιδημίας (Sypsa et al., 2015). Τέλος, θα πρέπει να τονισθεί πως από τα άτομα που συμμετείχαν στην παραπάνω έρευνα, σημαντικά ποσοστά ανδρών και γυναικών ΧΕΝ δήλωσαν πως η τελευταία τους σεξουαλική συνεύρεση δεν ήταν με ΧΕΝ (Sypsa et al., 2015). Συνεπώς, καθίσταται αρκετά σαφές το ότι είναι ιδιαίτερα εύκολο να περάσει η συγκεκριμένη επιδημία στο γενικό πληθυσμό, καθώς είναι γνωστό ότι ο HIV είναι ένας ιός ο οποίος μπορεί να μεταδοθεί και με την σεξουαλική επαφή.

17 1.1.ε Πρόγραμμα «ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΗΣ» Στα πλαίσια της περιγραφής και ταυτόχρονα του περιορισμού της επιδημίας του HIV-1 στους ΧΕΝ της Αθήνας, σχεδιάστηκε και πραγματοποιήθηκε το πρόγραμμα ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΗΣ (Hatzakis et al., 2015). Με αφετηρία τον Αύγουστο του 2012, σε συνεργασία του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών (ΕΚΠΑ), του Οργανισμού Κατά των Ναρκωτικών (ΟΚΑΝΑ), και των ΜΚΟ «Θετική Φωνή» και «PRAKSIS», ξεκίνησε η συμμετοχή ΧΕΝ από την Αθήνα. Στόχος του προγράμματος ήταν να εντοπισθούν σε πολύ μικρό χρονικό διάστημα όσο το δυνατόν περισσότεροι ΧΕΝ στην Αθήνα, ώστε να ενημερωθούν σχετικά με το πώς μπορούν να προφυλαχθούν από την μετάδοση του HIV, να εξετασθούν για το αν έχουν προσβληθεί και τελικά να γίνει ένταξη των HIV(+) σε πρόγραμμα αντιρετροϊκής θεραπείας. Αυτές οι τέσσερεις πτυχές του προγράμματος: εντοπισμός, εξέταση, θεραπεία και περιορισμός της εξάπλωσης, ήταν τα βασικά χαρακτηριστικά τα οποία το έκαναν τόσο ξεχωριστό και του επέτρεψαν να πετύχει τους βασικούς του στόχους. Λόγω της εκρηκτικής φύσης της επιδημίας, ο διαθέσιμος χρόνος ήταν περιορισμένος. Έτσι, οι ερευνητές ενήργησαν πολύ πιο γρήγορα, και τελικά πέτυχαν να προλάβουν και να εμποδίσουν την εξάπλωση της επιδημίας σύντομα και αποτελεσματικά (Hatzakis & Malliori, 2014). Στα πλαίσια του προγράμματος ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΗΣ πραγματοποιήθηκαν πέντε κύκλοι συμμετοχής ΧΕΝ, διάρκειας εβδομάδων έκαστος. Η γρήγορη και ταυτόχρονα αποτελεσματική συμμετοχή των ατόμων πραγματοποιήθηκε μέσω της μεθόδου δειγματοληψίας τύπου αλυσίδας, την RDS (Heckathorn, 1997). Στη μέθοδο RDS, οι ερευνητές επιλέγουν αρχικά ένα (μικρό) πλήθος ατόμων από τον πληθυσμό στόχο, τους οποίους αφενός εισάγουν στην έρευνα και αφετέρου τους χρησιμοποιούν ως πρώτους στρατολόγητές (seeds). Οι seeds καλούνται να φέρουν στην έρευνα προς συμμετοχή μέχρι ένα προκαθορισμένο πλήθος ατόμων του πληθυσμού στόχου. Η διαδικασία συμμετοχής συνεχίζεται αλυσιδωτά, με το κάθε νέο συμμετέχοντα να καλείται να παίξει τον ρόλο του seed. Στο πρόγραμμα ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΗΣ κάθε άτομο μπορούσε να συμμετάσχει μόνο μια φορά στον κάθε κύκλο συμμετοχής, ενώ μπορούσε να φέρει προς συμμετοχή 0-3 άτομα. Δεν υπήρχε κάποιος περιορισμός στο σε πόσους κύκλους θα μπορούσε να συμμετέχει ένα άτομο. Στο πρόγραμμα ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΗΣ συμμετείχαν συνολικά 3320 ΧΕΝ σε διάρκεια 16 μηνών, αποτελώντας το μεγαλύτερο RDS πρόγραμμα που πραγματοποιήθηκε ποτέ σε μία μόνο πόλη. Η

18 κάλυψη του προγράμματος επί του συνολικού πληθυσμού των ΧΕΝ στην Αθήνα εκτιμήθηκε περίπου στο 96% (Hatzakis et al., 2015). Η επιτυχημένη διενέργεια της όλης παρέμβασης του προγράμματος ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΗΣ, προσέφερε μια σειρά από σημαντικά αποτελέσματα. Είναι γεγονός πως μέσω του προγράμματος επιτεύχθηκε ο περιορισμός της εξάπλωσης της επιδημίας HIV στους ΧΕΝ της Αθήνας (Hatzakis & Malliori, 2014). Πέρα όμως από το βασικό επίτευγμα του προγράμματος, έγινε εφικτό να συλλεχθεί μεγάλος όγκος δεδομένων τα οποία συνεχίζουν να αποτελούν βάση πληθώρας μελετών σχετικά με το συγκεκριμένο φαινόμενο της μεγάλης επιδημίας HIV-1 στους ΧΕΝ στην Ελλάδα. 1.2 Σκοπός της εργασίας Σε αυτή την εργασία, λαμβάνοντας υπόψη το γεγονός πως οι ΧΕΝ που ζουν στην Αττική έχουν υψηλό κίνδυνο εμφάνισης HIV, θέσαμε ως στόχο την καταγραφή των δικτύων μετάδοσης του ιού μεταξύ των ΧΕΝ που συμμετείχαν στον πρώτο κύκλο του προγράμματος ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΗΣ μέσω φυλογενετικής ανάλυσης, την περιγραφή, μέχρι το βαθμό που αυτό ήταν εφικτό, της κοινωνικής τους δικτύωσης, μέσω των RDS δικτύων που σχηματίστηκαν βάση της δειγματοληψίας που εφαρμόστηκε και της αντίστοιχης ανάλυσης, και τελικά τη διερεύνηση της σχέσης μεταξύ αυτών των δύο δικτύων. Με άλλα λόγια, στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσει αν οι οροθετικοί ΧΕΝ που αναφέρουν δικτύωση RDS σχετίζονται και επιδημιολογικά αναφορικά με τη μετάδοση της HIV-λοίμωξης. Η μετάδοση της HIV λοίμωξης διερευνήθηκε με φυλογενετική ανάλυση. Η διερεύνηση της σχέσης μεταξύ των δικτύων RDS και των δικτύων μετάδοσης του HIV στους ΧΕΝ είναι πιθανό να καταστίσει εφικτό να εντοπισθούν μελλοντικά πιθανές συνήθειες μεταξύ ατόμων και του κοινωνικού τους δικτύου οι οποίες μπορεί να είναι υπεύθυνες για την εξάπλωση της λοίμοξης, σε μία προσπάθεια να προταθούν αποτελεσματικές παρεμβάσεις, για να διακοπεί ο κύκλος της μετάδοσης, ή να αποφευχθούν παρόμοιες καταστάσεις στο μέλλον. 1.3 Φυλογενετική ανάλυση Σε αυτή την παράγραφο θα ορίσουμε τι εννοούμε με τον όρο φυλογενετική ανάλυση και με ποιους βασικούς τρόπους μπορούμε να πραγματοποιήσουμε μία τέτοιου είδους ανάλυση. Αν το γενετικό υλικό των οργανισμών (γονιδίωμα) «εξελίσσεται» λόγω συνεχών μεταλλαγών που συμβαίνουν σε αυτό, τότε οι διαφορές στη νουκλεοτιδική αλληλουχία μεταξύ

19 των γονιδιωμάτων δύο οργανισμών θα μπορούσε να υποδείξει το πόσο πρόσφατα οι δύο οργανισμοί μοιράζονταν τον κοινό τους πρόγονο (Brown, 2002). Έτσι, τα γονιδιώματα δύο οργανισμών που διαχωρίστηκαν εξελικτικά πολύ πρόσφατα, αναμένεται να διαφέρουν λιγότερο σε σχέση με τα γονιδιώματα δύο οργανισμών που διαχωρίστηκαν παλιότερα. Εφόσον μελετήσουμε αυτές τις σχέσεις για ένα μεγαλύτερο σύνολο οργανισμών, θα μπορέσουμε να πάρουμε πληροφορίες για τις εξελικτικές σχέσεις μεταξύ τους (Brown, 2002). Γενικά λοιπόν, τα βασικά ερωτήματα της φυλογενετικής ανάλυσης είναι τα παραπάνω, δηλαδή, το πόσο κοντά εξελικτικά είναι δύο ή περισσότεροι οργανισμοί. Για να μπορέσει κάποιος να πραγματοποιήσει φυλογενετική ανάλυση χρειάζεται ένα δείγμα από αλληλουχίες νουκλεοτιδίων ή πρωτεϊνών. Αυτές μπορεί να είναι ένα συγκεκριμένο γονίδιο που απομονώθηκε από ένα σύνολο οργανισμών του ίδιου είδους, μπορεί να είναι το συνολικό γονιδίωμα ενός πλήθους οργανισμών του ίδιου είδους, ή μέρος του γονιδιώματος, από διαφορετικά είδη οργανισμών, ενώ μπορούμε να μελετήσουμε τις ίδιες σχέσεις και μέσω ανάλυσης των πρωτεϊνικών αλληλουχιών. Το σημαντικό, μιας και κάνουμε σύγκριση, είναι να συγκρίνουμε το αντίστοιχο μέρος του γονιδιώματος των οργανισμών και όχι τυχαία τμήματα. Τέλος, θα πρέπει οι υπό μελέτη αλληλουχίες να είναι στοιχισμένες, ώστε να μπορέσει να γίνει σωστά η φυλογενετική ανάλυση (Brown, 2002). Εδώ θα πρέπει να αναφέρουμε ορισμένες λεπτομέρειες σχετικά με τη δομή του DNA και με τους τρόπους με τους οποίους η φύση του επιτρέπει να αλλάζει με τελικό αποτέλεσμα τη μεγάλη ποικιλία βιοποικιλότητα στη γη. Ένα μόριο DNA είναι συνήθως δίκλωνο, με τους δύο «κλώνους», ή όπως συνήθως ονομάζονται, αλυσίδες, να είναι αντιπαράλληλες και συμπληρωματικές. Η κάθε αλυσίδα αποτελείται από νουκλεοτίδια, με το κάθε ένα από αυτά να φέρει μια αζωτούχο βάση. Οι αζωτούχες βάσεις στο DNA είναι η Αδενίνη (Α), η Θυμίνη (Τ),η Γουανίνη (G), και η Κυτοσίνη (C). Οι παραπάνω βάσεις είναι συμπληρωματικές, δηλαδή η Αδενίνη συνδέεται πάντα με την Θυμίνη, ενώ η Γουανίνη θα συνδέεται πάντα με την Κυτοσίνη, για αυτό και οι δύο νουκλεοτιδικές αλυσίδες που αποτελούν το DNA λέμε πως είναι συμπληρωματικές. Έτσι, αρκεί η μια μόνο από τις δύο αλυσίδες ενός μορίου DNA για να μπορέσουμε να το διαβάσουμε, τα καταγράψουμε δηλαδή το κείμενο που βασίζεται στο

20 αλφάβητο των τεσσάρων γραμμάτων που αντιστοιχούν στις 4 αζωτούχες βάσεις. Έτσι, μια αλληλουχία βάσεων DNA θα είναι της μορφής: GCTCTCGAAATTTGCGCTCGCTATTTGCGCGCGCATATATA Στο DNA ενός οργανισμού υπάρχουν περιοχές που περιέχουν την γενετική πληροφορία σχετικά με τη μορφή, τις ιδιότητες και όλα τα χαρακτηριστικά του οργανισμού. Οι περιοχές αυτές λέγονται γονίδια, ενώ υπάρχουν και κάποιες περιοχές πριν και μετά τα γονίδια που συμμετέχουν στις διαδικασίες με τις οποίες αξιοποιείται η πληροφορία των γονιδίων. Είναι γεγονός πως με την πάροδο του χρόνου συμβαίνουν διάφορες αλλαγές στην αλληλουχία του DNA, οι μεταλλαγές. Συγκεκριμένα, μια αζωτούχος βάση μπορεί να μετατραπεί σε μια άλλη (πχ Α σε Τ, ή σε G κλπ), μια βάση μπορεί να χαθεί από την αλληλουχία (έλλειψη) πχ: ATCGCT AT GCT,ή μια βάση μπορεί να προστεθεί στην αλληλουχία ενώ δεν υπήρχε (προσθήκη) πχ ATCGCT ΑΤCGCTG. Μια μετάλλαξη η οποία οδηγεί σε αντικατάσταση της μορφής: Α G,ή T C, ονομάζεται Μετάβαση (transition), ενώ μια μετάλλαξη που οδηγεί σε αντικατάσταση της μορφής: Α Τ,ή G C, ονομάζεται Μεταστροφή (transversion). Όπως και να έχει, αφού γνωρίζουμε ότι συμβαίνουν τέτοιες αλλαγές, αν γνωρίζουμε με ποιον τρόπο, με πια διαδοχικότητα και πόσο γρήγορα συμβαίνουν, τότε μπορούμε να συμπεράνουμε αρκετά πράγματα για τη γενετική απόσταση δύο οργανισμών Στοίχιση Όπως είπαμε και παραπάνω, στη φυλογενετική ανάλυση, προσπαθούμε να εκτιμήσουμε τις εξελικτικές σχέσεις μεταξύ των διαφόρων οργανισμών. Προκειμένου να συμβεί αυτό, λαμβάνουμε υπόψη το γενετικό υλικό του οργανισμού, ή, τις πρωτεϊνικές αλληλουχίες που παράγονται απ αυτό. Για να μπορέσει να γίνει όμως μία τέτοια ανάλυση, αρχικά θα πρέπει να επιλέξουμε το αντίστοιχο τμήμα του γενετικού υλικού των οργανισμών που θα μελετήσουμε, δηλαδή να επιλέξουμε ομόλογες περιοχές για να συγκρίνουμε. Αυτό θα μπορούσε να σημαίνει να πάρουμε το αντίστοιχο γονίδιο από οργανισμούς του ίδιου είδους, αλλά και αυτό δεν είναι αρκετό. Στην πραγματικότητα, θα πρέπει να πραγματοποιήσουμε μια διαδικασία στις αλληλουχίες που έχουμε

21 στο δείγμα μας, η οποία καλείται «στοίχιση» και κατά την οποία οι ομόλογες περιοχές δύο ή περισσότερων αλληλουχιών «στοιχίζονται» μαζί (η μία κάτω από την άλλη). Γενικά, για την πραγματοποίηση οποιασδήποτε φυλογενετικής ανάλυσης, απαιτείται πρώτα η στοίχιση των αλληλουχιών. Η διαδικασία αυτή γίνεται σήμερα με τη βοήθεια Η/Υ, ενώ έχουν αναπτυχθεί στην πορεία του χρόνου διάφορα μοντέλα για αυτό τον σκοπό, τα οποία βασίζονται σε ένα ποσοτικό βαθμό (score) βέλτιστης στοίχισης. Ονομαστικά αναφέρουμε ορισμένα, όπως τo κριτήριο μέγιστης φειδωλότητας, το διάγραμμα κουκκίδων, και την εισαγωγή μονάδων κόστους, για κάθε κενό που απαιτείται να προσθέσουμε σε μία αλληλουχία ώστε να μπορέσει να στοιχηθεί με τις άλλες Εξελικτικά μοντέλα και φυλογενετικά δέντρα Προκειμένου να πραγματοποιήσουμε φυλογενετική ανάλυση, θα πρέπει να καθορίσουμε με κάποιο μαθηματικό μοντέλο, τον τρόπο με τον οποίο υποθέτουμε πως πραγματοποιούνται οι διάφορες μεταλλάξεις στην αλυσίδα του DNA. Έτσι, με τη βοήθεια ενός τέτοιου μοντέλου και την υπόθεση πως όταν συγκρίνουμε δύο αλυσίδες τότε είτε η μία έχει προκύψει από την άλλη μετά από μια σειρά μεταλλάξεων, ή οι δυο υπό μελέτη αλληλουχίες μοιράζονται κάποιο κοινό πρόγονο, μπορούμε να εκτιμήσουμε την εξελικτική απόσταση που χωρίζει τις δύο αυτές αλληλουχίες, ή κατ επέκταση τις ανά δύο αποστάσεις ενός συνόλου αλληλουχιών. Στη συνέχεια, με τη γνώση αυτή και ομαδοποιώντας τις αλληλουχίες σύμφωνα με την απόσταση που εκτιμήθηκε (οι αλληλουχίες που απέχουν εξελικτικά λιγότερο θα ομαδοποιούνται μαζί), μπορούμε να κατασκευάσουμε ένα γράφημα, το φυλογενετικό δέντρο, όπου το μήκος των κλαδιών του αντιστοιχεί στις εκτιμώμενες εξελικτικές αποστάσεις μεταξύ των αλληλουχιών. Τα πιο διαδεδομένα εξελικτικά μοντέλα είναι: Το μοντέλο των Jukes and Cantor (Jukes & Cantor, 1969) Αποτελεί το πιο απλό εξελικτικό μοντέλο για το DNA. Το μοντέλο αυτό υποθέτει πως το πλήθος των τεσσάρων βάσεων σε ένα μόριο DNA είναι σε ισορροπία, έχουν την ίδια συχνότητα ενώ οι μεταβάσεις και μεταστροφές συμβαίνουν με τον ίδιο ρυθμό. Το μοντέλο Κ80 (Kimura, 1980)

22 Το μοντέλο αυτό επιτρέπει την ύπαρξη διαφορετικού ρυθμού εμφάνισης μεταβάσεων απ ότι μεταστροφών, αν και παραμένει συμμετρικό. Το μοντέλο F81 (Felsenstein, 1981) Στο μοντέλο αυτό πέραν του ότι επιτρέπεται ο ρυθμός μεταβάσεων και μεταστροφών να διαφέρουν μεταξύ τους, επιτρέπετε οι δύο αυτοί ρυθμοί να μην είναι σταθεροί αλλά να μπορούν να διαφέρουν μεταξύ διαφορετικών ειδών οργανισμών. Το μοντέλο HKY85 (Hasegawa, Kishino, & Yano, 1985) Αποτελεί είναι μοντέλο το οποίο συνδυάζει χαρακτηριστικά των Κ80 και F81. Συγκεκριμένα, το μοντέλο υποθέτει πως ο ρυθμός μεταβάσεων και μεταστροφών διαφέρει ανά νουκλεοτίδιο. Ο ρυθμός αφορά την πιθανότητα με την οποία ένα νουκλεοτίδιο μπορεί να μετατραπεί σε κάποιο άλλο συγκεκριμένο νουκλεοτίδιο. Παράδειγμα, η τιμή του ρυθμού για την Θυμίνη (T), αφορά την πιθανότητα με την οποία ένα νουκλεοτίδιο μπορεί να μεταλλαχθεί σε Τ. Το μοντέλο TN93 (Tamura and Nei,1992) Σε συνέχεια των προηγούμενων μοντέλων, εδώ πέραν των διαφορετικών ρυθμών μεταβάσεων και μεταστροφών, δίνεται η δυνατότητα ο ρυθμός μεταβάσεων να είναι διαφορετικός για το ζεύγος (A,G) από τον ρυθμό για το ζεύγος (T,C) και το αντίστοιχο συμβαίνει και με τον ρυθμό μεταστροφών για τα ζεύγη (A,T) και (G,C). Το μοντέλο GTR( Generalised time-reversible) (Tavaré, 1986) Το τελευταίο είναι αυτό με τις πιο πολλές παραμέτρους. Επικεντρώνεται στις αντικαταστάσεις, δέχεται πως αυτές συμβαίνουν με διαφορετικούς ρυθμούς. Συνεπώς, ο ρυθμός για κάθε δυνατή μεταστροφή ή μετάβαση (από και προς οποιαδήποτε βάση) μπορεί να είναι διαφορετικός. Τέλος, το ποσοστό κάθε βάσης μπορεί να διαφέρει μεταξύ των αλληλουχιών. Τα χαρακτηριστικά αυτά μετατρέπουν το μοντέλο GTR σε ένα αρκετά ευέλικτο και ρεαλιστικό μοντέλο για την όσο το δυνατό καλύτερη περιγραφή της όλης διαδικασίας με την οποία συμβαίνουν οι αντικαταστάσεις των βάσεων στις αλληλουχίες DNA ενός δείγματος Μέθοδοι αποστάσεων Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, στη φυλογενετική ανάλυση καλούμαστε να εκτιμήσουμε και στη συνέχεια να αναπαραστήσουμε γραφικά, με τη βοήθεια των φυλογενετικών δέντρων, τις

23 εξελικτικές σχέσεις μεταξύ ενός συνόλου αλληλουχιών DNA ή άλλου τύπου γενετικού υλικού (πρωτεΐνες). Οι σχέσεις αυτές επί τις ουσίας μας πληροφορούν για το πόσο μοιάζουν ή διαφέρουν εξελικτικά οι υπό μελέτη αλληλουχίες μεταξύ τους. Οι δύο βασικές κατηγορίες μεθοδολογικών προσεγγίσεων για την πραγματοποίηση μιας τέτοιας ανάλυσης είναι οι μέθοδοι αποστάσεων (distance methods) και οι μέθοδοι χαρακτήρων (character state) (Παρασκευής, Μαγιορκίνης, & Χατζάκης, 2015). Η δεύτερη κατηγορία περιγράφεται αναλυτικά παρακάτω, στην παράγραφο (1.3.4) Η γενική ιδέα των μεθόδων αποστάσεων είναι αρχικά να υπολογίζονται όλες οι ανά δύο γενετικές αποστάσεις και στη συνέχεια να εκτιμάται ένα δέντρο το οποίο αναπαριστά τις αποστάσεις όσο το δυνατόν καλύτερα. Το μέγεθος των υπολογισθέντων αποστάσεων αντιστοιχούν στο μήκος των κλάδων που συνδέουν τις αντίστοιχες ανά δύο αλληλουχίες (Felsenstein, 2004). Οι αποστάσεις που αντιστοιχούν στον παρατηρούμενο αριθμό μεταλλαγών αποτελούν εκτιμήσεις (υποεκτιμήσεις) της πραγματικής εξελικτικής απόστασης μεταξύ των αλληλουχιών και τις συναντάμε ως p-distance, ενώ για των υπολογισμό των εξελικτικών αποστάσεων (πραγματικό αριθμό μεταλλαγών) βασιζόμαστε σε κάποιο εξελικτικό μοντέλο, όπως αυτά που περιγράφονται στην παράγραφο (1.3.2) (Vandamme, 2009). Αν και θα περίμενε κανείς μια τέτοια μέθοδος να αφήνει ανεκμετάλλευτο ένα τόσο μεγάλο μέρος της πληροφορίας, (αφού τη συνοψίζει σε έναν απλό πίνακα αποστάσεων) ώστε να μη μπορεί να παραχθεί ένα δέντρο που να εκτιμά σωστά την πραγματική φυλογένεια των δεδομένων, έχει φανεί πως τελικά η απώλεια πληροφορίας είναι ιδιαίτερα μικρή (Felsenstein, 2004). Παρακάτω περιγράφονται ορισμένες από τις βασικότερες μεθόδους αποστάσεων: UPGMA (Unweighted pair-group method with arithmetic mean): Η μέθοδος αυτή αποτελεί την απλούστερη των μεθόδων αποστάσεων. Είναι μια μέθοδος ταξινομικών μονάδων-κλάσεων (clustering). Η UPGMA χρησιμοποιεί έναν επαναληπτικό αλγόριθμο, κατά τον οποίο αρχικά η κάθε αλληλουχία θεωρείται μια ταξινομική μονάδα (OTU). Αφού υπολογισθούν όλες οι ανά δύο αποστάσεις των υπό μελέτη αλληλουχιών, οι δύο κοντινότερες (εξελικτικά) αλληλουχίες τοποθετούνται σε μια κοινή ομάδα, η οποία πλέον θεωρείται ως μια νέα ταξινομική μονάδα και η διαδικασία επαναλαμβάνεται από την αρχή, μέχρι να απομείνουν δύο μόνο ταξινομικές μονάδες. Αξίζει να σημειωθεί πως η γενετική απόσταση μεταξύ δύο OTUs διαιρείται διά 2 και αυτό ισούται με το μήκος των κλάδων που τις συνδέουν (Van de Peer, 2009).

24 Neighbor-joining (NJ): Η μέθοδος του πλησιέστερου γείτονα, όπως συχνά συναντάται σε ελληνικά βιβλία και σημειώσεις, αποτελεί μια άλλη μέθοδο αποστάσεων. Το μοντέλο αυτό λέγεται «προσθετικό» (additive), καθώς στο δέντρο που κατασκευάζεται βάσει αυτού, η γενετική απόσταση μεταξύ δύο OTUs αποτελεί το άθροισμα του μήκους των κλαδιών που τις συνδέουν. (Van de Peer, 2009). H NJ έχει ως στόχο, να εκτιμήσει το δέντρο ελάχιστης εξέλιξης (minimum evolution), δηλαδή το δέντρο με το μικρότερο συνολικό μήκος (το μικρότερο άθροισμα των κλάδων). Αν και η NJ μοιάζει με την UPGMA, καθώς σχετίζεται και πάλι με OTUs, καθώς και πάλι χρησιμοποιεί τη βασική ιδέα του να τοποθετεί σε κάθε βήμα μαζί σε ένα OTU τις κοντινότερες αλληλουχίες (ή OTUs), χωρίς όμως να υποθέτει πως οι αλληλουχίες έχουν σταθερούς ρυθμούς εξέλιξης (clock-like behavior) (Van de Peer, 2009) Μέθοδοι χαρακτήρων Στις μεθόδους χαρακτήρων, τα ποιοτικά δεδομένων των αλληλουχιών DNA πολλών taxa αναλύονται ευθέως, ώστε να δώσουν φυλογενετικές εκτιμήσεις, βασισμένες και πάλι σε υποθέσεις και εξελικτικά μοντέλα. Αυτές οι μέθοδοι λοιπόν επικεντρώνονται στις διαφορές χαρακτήρων (A,T,G,C) ανά θέση μεταξύ των υπό μελέτη αλληλουχιών και όχι απλά στη συνολική γενετική απόσταση. Μια τέτοια μέθοδος είναι αυτή της μέγιστης φειδωλότητας (Maximum parsimony), ενώ ιδιαίτερα διαδεδομένες είναι και οι μέθοδοι μέγιστης πιθανοφάνειας. Η τελευταία κατηγορία θα αναλυθεί χωριστά, καθώς συνδυάζει χαρακτηριστικά μεθόδων αποστάσεων αλλά και μεθόδων χαρακτήρων i Μέθοδοι Φειδωλότητας-Μέθοδος μέγιστης Φειδωλότητας (Maximum Parsimony,MP) Η βασική ιδέα των μεθόδων φειδωλότητας είναι η δημιουργία ενός φυλογενετικού δέντρου (ή ενός συνόλου δέντρων) το οποίο να ελαχιστοποιεί το πλήθος των εξελικτικών αλλαγών/μεταλλάξεων. Με άλλα λόγια, θεωρούν πως το πιο αποδεκτό και πιο κοντά στην πραγματικότητα δέντρο(-α), είναι εκείνο με το μικρότερο δυνατό συνολικό μήκος κλαδιών (Avice, 2006). Η μέθοδος Μέγιστη Φειδωλότητας (MP) είναι εκείνη που απαιτεί τον ελάχιστο δυνατό αριθμό εξελικτικών αλλαγών, ώστε να ερμηνεύσει τις παρατηρούμενες διαφορές χαρακτήρωνθέσης μεταξύ των αλληλουχιών που μελετώνται. Με άλλα λόγια, με τη μέθοδο αυτή εκτιμάται ένα φυλογενετικό δέντρο το οποίο να ελαχιστοποιεί τα απαιτούμενα εξελικτικά βήματα για την περιγραφή του δείγματος. Πάντως, και παρά τη διαδεδομένη χρήση της συγκεκριμένης μεθόδου,

25 υπάρχει η κριτική που λέει πως η φύση γενικά δεν λειτουργεί με τους κανόνες της «μέγιστης φειδωλότητας», δηλαδή δεν επιλέγει πάντα τον πιο άμεσο και με τα λιγότερα βήματα δρόμο για να μεταβεί από μια κατάσταση σε μια άλλα (εξέλιξη), συνεπώς μέθοδοι φειδωλότητας παράγουν τοπολογίες, οι οποίες δεν περιγράφουν απαραίτητα την πραγματική εξελικτική ιστορία των δεδομένων (Avice, 2006). Σχετικά με την εφαρμογή της μεθόδου, όταν το σύνολο των αλληλουχιών που πρέπει να αναλυθούν είναι μικρό, τότε είναι εφικτό να δημιουργηθούν όλες οι πιθανές τοπολογίες και να επιλεχθεί εκείνη που απαιτεί το ελάχιστο συνολικό πλήθος εξελικτικών βημάτων. Όταν το πλήθος όμως των αλληλουχιών μεγαλώνει, μια τέτοια διαδικασία απαιτεί πολύ χρόνο και επεξεργαστική ισχύ και συνεπώς έχουν προταθεί διάφορες μέθοδοι ευρετικής αναζήτησης, ώστε να μπορεί να ξεπεραστεί αυτό το πρόβλημα (Παρασκευής et al., 2015) Μέθοδοι Μέγιστης Πιθανοφάνειας Η μέθοδος μέγιστης πιθανοφάνειας επιλέγει το/τα δέντρο(-α) εκείνο, από το οποίο είναι πιο πιθανό να έχουν προκύψει τα δεδομένα (Page & Holmes, 1998; Schmidt & von Haeseler, 2009). Η πιθανοφάνεια ορίζεται ως η δεσμευμένη πιθανότητα να παρατηρηθούν τα συγκεκριμένα δεδομένα του δείγματος, δεδομένου συγκεκριμένου εξελικτικού μοντέλου και συγκεκριμένου φυλογενετικού δέντρου. Έτσι, επί της ουσίας, σε αυτή τη μέθοδο γίνεται προσπάθεια να μεγιστοποιηθεί η ποσότητα: L(εξελικτικό μοντέλο, δέντρο)=p(data/εξελικτικό μοντέλο, δέντρο) Με τον όρο «δέντρο» αναφερόμαστε τόσο στην τοπολογία, δηλαδή στο πως ομαδοποιούνται οι αλληλουχίες του δείγματος, όσο και στα μήκη των κλαδιών του δέντρου, που όπως έχουμε πει συνήθως αντιστοιχούν σε εκτιμήσεις των εξελικτικών αποστάσεων. Έτσι, η μέθοδος μέγιστης πιθανοφάνειας καλείται να απαντήσει σε δύο διαφορετικά ερωτήματα: Για κάθε συγκεκριμένη τοπολογία, ποιο σύνολο μηκών κλαδιών κάνουν τα δεδομένα πιο πιθανά και ποιο δέντρο από τα πιθανά δέντρα τελικά (τοπολογία + μήκη κλαδιών), είναι αυτό με τη μεγαλύτερη πιθανοφάνεια (Page & Holmes, 1998). Αμέσως γίνεται αντιληπτό πως, αν και σαν μέθοδος θα μπορούσε να θεωρηθεί μέθοδος χαρακτήρων, καθώς είναι μια διακριτή μέθοδος που αξιολογεί όλες (ή όσο το δυνατόν

26 περισσότερες) τις πιθανές τοπολογίες, βασιζόμενη στις παρατηρούμενες διαφορές χαρακτήρωνθέσης μεταξύ των αλληλουχιών, ταυτόχρονα επιχειρεί να εκτιμήσει τη βέλτιστη τοπολογία, εκτιμώντας και λαμβάνοντας υπόψη τις εξελικτικές αποστάσεις μεταξύ των αλληλουχιών. Έτσι, συγκεντρώνει στοιχεία τόσο των μεθόδων αποστάσεων, όσο και των μεθόδων χαρακτήρων (Page & Holmes, 1998). Το μειονέκτημα και πάλι εδώ είναι πως όταν το πλήθος των αλληλουχιών αυξάνει, ακόμη και για σχετικά μικρά μεγέθη δείγματος, ο υπολογισμός όλων των τοπολογιών είναι πρακτικά αδύνατος, έτσι και πάλι χρησιμοποιούνται μέθοδοι ευρετικής αναζήτησης, προκειμένου εκτιμώντας ένα σημαντικό πλήθος τοπολογιών, να φτάσουν σε όσο το δυνατό καλύτερο αποτέλεσμα (Παρασκευής et al., 2015). 1.4 Κοινωνικά δίκτυα και Δίκτυα μετάδοσης Με τον όρο κοινωνικό δίκτυο ορίζουμε το σύνολο των σχέσεων, των συσχετίσεων και των δεσμών μεταξύ των μονάδων ενός κοινωνικού συνόλου (Wasserman & Faust, 1994). Ένα κοινωνικό δίκτυο μπορεί να περιγραφεί με ένα γράφημα-δέντρο, στο οποίο κάθε κόμβος αποτελεί ένα άτομο (ή μία ομάδα ατόμων) και κάθε ακμή (βέλος) συμβολίζει τη σχέση που συνδέει 2 άτομα (κόμβους) (Lorrain & Harrison, 1971). Ο χειρισμός και η ανάλυση ενός τέτοιου δικτύου γίνεται αλγεβρικά. Στην παρούσα εργασία, ο ίδιος ο τρόπος με τον οποίο επιλέχτηκε το δείγμα, οδηγεί στην κατασκευή δικτύων RDS και υποδεικνύει ορισμένες πιθανές κοινωνικές σχέσεις μεταξύ των ατόμων (Heckathorn, 1997, 2002) Respondent-Driven Sampling (RDS) Η RDS αποτελεί έναν τύπο δειγματοληψίας, που είναι κατάλληλη για να προσεγγίζει «κρυμμένους πληθυσμούς», η οποία προτάθηκε από τον Heckathorn (1997). Είναι μια δειγματοληψία τύπου αλυσίδας και αποτελεί τη μέθοδο με την οποία έγινε η συλλογή του δείγματος της παρούσας εργασίας. Με τον όρο «κρυμμένος» ορίζουμε έναν πληθυσμό με δύο βασικά χαρακτηριστικά. Πρώτον, δεν υπάρχει δειγματοληπτικό πλαίσιο, οπότε το μέγεθος και τα χαρακτηριστικά του πληθυσμού μας είναι άγνωστα και δεύτερον, υπάρχουν σημαντικά εμπόδια σχετικά με τα ευαίσθητα προσωπικά δεδομένα, καθώς οι πληθυσμοί αυτοί περιέχουν άτομα με στιγματισμένη (κοινωνικά)

27 ή παραβατική συμπεριφορά. Ως αποτέλεσμα των παραπάνω, προκύπτουν προβλήματα κατά τη μελέτη τέτοιων πληθυσμών, αφού συχνά οι συμμετέχοντες αρνούνται να συνεργασθούν ή δίνουν ανακριβείς απαντήσεις (Heckathorn, 1997, 2002). Γενικότερα, οι κλασικές μέθοδοι δειγματοληψίας δε μπορούν να δώσουν αξιόπιστα δείγματα σε περιπτώσεις κρυμμένων πληθυσμών, καθώς οι περισσότεροι τέτοιοι πληθυσμοί είναι σπάνιοι, δηλαδή αριθμούν λίγα άτομα σε σχέση με το γενικό πληθυσμό. Ταυτόχρονα, όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, τα άτομα από τα οποία απαρτίζονται τέτοιοι πληθυσμοί δεν είναι εύκολο να συνεργασθούν (Heckathorn, 1997; Heckathorn et al., 1999; Magnani, Sabin, Saidel, & Heckathorn, 2005), με χαρακτηριστικό παράδειγμα τους ΧΕΝ (Heckathorn et al., 1999) Προκειμένου να καταστεί εφικτή η μελέτη κρυμμένων πληθυσμών, έχουν προταθεί μέθοδοι, οι οποίες ονομάζονται και δειγματοληψίες τύπου αλυσίδας (chain-referral). Αυτές, έχουν θεωρηθεί κατάλληλες για να «φτάνουν», δηλαδή να δειγματοληπτούν, από κρυμμένους πληθυσμούς (Penrod, Preston, Cain, & Starks, 2003). Συγκεκριμένα, τις τελευταίες δεκαετίες έχουν προταθεί κάποια μοντέλα προκειμένου να καταστεί δυνατή η δειγματοληψία από τέτοιους πληθυσμούς, με τη μέθοδο Χιονόμπαλας (Snowball) να αποτελεί μια από τις πιο δημοφιλείς (Magnani et al., 2005). Σε αυτή τη μέθοδο και γενικότερα στις μεθόδους δειγματοληψίας τύπου αλυσίδας, η βασική ιδέα είναι να χρησιμοποιηθούν μέλη της/των κοινωνικών ομάδων που αποτελούν πληθυσμοί-στόχοι, ως «στρατολογητές» (seeds). Οι στρατολογητές, είτε συμμετέχουν απλά στην έρευνα, είτε δίνουν πληροφορίες για άλλα άτομα του κύκλου τους, από τον ίδιο πληθυσμό στόχο, ή ακόμα φέρνουν προς συμμετοχή άτομα του κύκλου τους. Συνδυασμοί όλων των παραπάνω είναι πιθανοί σε μια δειγματοληψία αλυσίδας. Άτομα που «αναφέρθηκαν» από τους seeds (όλα ή ένα μέρος αυτών) εισάγονται στην έρευνα και παίζουν τον ρόλο νέων seeds, δίνοντας με την σειρά τους πληροφορίες για άλλα άτομα που γνωρίζουν από τον πληθυσμό-στόχο. Η διαδικασία συνεχίζεται αλυσιδωτά, με τα άτομα που «στρατολογούνται» να γίνονται οι νέοι seeds, μέχρι είτε να μαζευτεί ένα επιθυμητό μέγεθος δείγματος, είτε το δείγμα σταθεροποιηθεί-κορεσθεί (saturated), δηλαδή τα νέα άτομα που εισάγονται να πάψουν να δίνουν νέες πληροφορίες. Προκειμένου να δοθεί ένα επιπλέον κίνητρο στα άτομα να συμμετάσχουν τελικά στην έρευνα και συνεργασθούν, συχνά δίνεται κάποια επιβράβευση, συνήθως οικονομική (Magnani et al., 2005; Penrod et al., 2003). Αν και θεωρητικά οι αρχικοί seeds επιλέγονται τυχαία από τον πληθυσμό στόχο, συνεπώς μπορούν να

28 προέρχονται από όλα τα υποσύνολά του, κάτι τέτοιο στην πράξη είναι σχεδόν αδύνατο να επιτευχθεί (οι δυσκολίες έχουν να κάνουν με τα χαρακτηριστικά των κρυμμένων πληθυσμών, όπως έχουν περιγραφεί πιο πάνω), έτσι οι δειγματοληπτικές μέθοδοι τύπου αλυσίδας θεωρείται ότι παράγουν δείγματα ευκολίας (Magnani et al., 2005). Στις δειγματοληψίες αλυσίδας παρατηρούνται ορισμένα σημαντικά προβλήματα, χαρακτηριστικά των δειγματοληψιών ευκολίας, τα οποία έχουν να κάνουν ακριβώς με το γεγονός πως τα άτομα δεν επιλέγονται εντελώς τυχαία από τον πληθυσμό στόχο, συνεπώς υπάρχει ο κίνδυνος το τελικό δείγμα που θα συλλεχθεί να μην είναι αντιπροσωπευτικό όλου του πληθυσμού (Magnani et al., 2005; Penrod et al., 2003). Συγκεκριμένα, κατά την μέθοδο Snowball, η αρχική επιλογή seeds έχει φανεί πως επηρεάζει σε πολύ σημαντικό βαθμό τη σύνθεση του τελικού δείγματος (Magnani et al., 2005). Σε μια προσπάθεια να ξεπερασθούν όσο το δυνατό περισσότερα από τα προβλήματα της μεθόδου Snowball, έχουν προταθεί μέθοδοι όπως η facility-based sampling, targeted sampling, time-location sampling και τέλος, η μέθοδος RDS, η οποία φαίνεται να καταφέρνει να υπερπηδά πολλές από τις δυσκολίες και τα προβλήματα των υπόλοιπων μεθόδων αλυσίδας. Η RDS εφαρμόζει τη βασική ιδέα των δειγματοληψιών τύπου αλυσίδας, καθώς τα άτομα εισάγονται στο δείγμα αλυσιδωτά, με τη βοήθεια ατόμων που ήδη αποτελούν συμμετέχοντες (Magnani et al., 2005; Platt et al., 2006). Η σημαντική διαφορά από τη μέθοδο Snowball είναι πως οι seeds και αργότερα τα άτομα που εισάγονται στο δείγμα, δεν καλούνται να δώσουν οποιαδήποτε πληροφορία για άλλα άτομα, παρά μόνο να τα «στρατολογήσουν», να τα φέρουν δηλαδή στην έρευνα προς συμμετοχή, κάτι που είναι πολύ σημαντικό σε περιπτώσεις που βασικά χαρακτηριστικά των ατόμων του πληθυσμού στόχου θεωρούνται παραβατικά (Heckathorn et al., 1999). Η άλλη βασική διαφορά των δύο μεθόδων έχει να κάνει με την επιβράβευση που δίνεται στους συμμετέχοντες. Ενώ στην Snowball μέθοδο, ένα άτομο που δεχόταν να συμμετάσχει στην έρευνα λάμβανε κάποια επιβράβευση (πρωτογενή κίνητρα) στην RDS μέθοδο, δίνεται κάποια επιπλέον επιβράβευση, για κάθε νέο άτομο που στρατολογεί (δευτερογενή κίνητρα), τα οποία φαίνεται να είναι πιο αποτελεσματικά σε σχέση με τα πρωτογενή κίνητρα (Heckathorn, 1997; Heckathorn et al., 1999). Συνοπτικά λοιπόν, η μέθοδος RDS έχει ως εξής (Heckathorn, 1997; Heckathorn et al., 1999):

29 Αρχικά τα άτομα που διενεργούν τη δειγματοληψία εντοπίζουν και στρατολογούν ένα αρχικό πλήθος ατόμων από τον πληθυσμό στόχο, οι οποίοι θα αποτελέσουν τους seeds της μεθόδου. Στους seeds προσφέρεται κάποια οικονομικά κίνητρα ώστε να υποδείξουν και να φέρουν προς συμμετοχή άλλα άτομα του πληθυσμού στόχου στην έρευνα. Σε κάθε έναν από τους seeds δίνεται ένα προκαθορισμένο πλήθος (αριθμημένων με μοναδικό τρόπο) κουπονιών, τα οποία θα δώσουν στα άτομα που πρόκειται να στρατολογήσουν. Κάθε seed ενημερώνονται πως για κάθε άτομο που θα έρθει για να συμμετάσχει στην έρευνα, το οποίο όντως προέρχεται από τον πληθυσμό στόχο, συμμετάσχει εν τέλει στην έρευνα και φέρει κάποιο από τα κουπόνια που το δόθηκαν, θα λάβει κάποιο οικονομικό αντάλλαγμα (όπως έχει αναφερθεί παραπάνω) Κάθε άτομο που έρχεται προς συμμετοχή, αφού ολοκληρώσει τη συνέντευξη ή και τις ιατρικές εξετάσεις που προβλέπονται στην έρευνα, λαμβάνει το ίδιο οικονομικό αντάλλαγμα με τους αρχικούς seeds, ενώ μετατρέπεται σε νέο seed, με ακριβώς τα ίδια οικονομικά ανταλλάγματα και το ίδιο πλήθος κουπονιών με τους αρχικούς seeds Ένα άτομο, πέραν των αρχικών seeds, μπορεί να μπει στην έρευνα μόνο αν φέρει κάποιο από τα κουπόνια που έχει δοθεί προηγουμένως σε κάποιον seed και αφού πρώτα επιβεβαιωθεί πως είναι μέλος του πληθυσμού στόχου. Κάθε άτομο επιτρέπεται να συμμετάσχει μια φορά στον ίδιο κύκλο συμμετοχής. Η μέθοδος δίνει τη δυνατότητα προσανατολισμένης δειγματοληψίας από συγκεκριμένα υποσύνολα του πληθυσμού-στόχου, δίνοντας επιπλέον οικονομικά ανταλλάγματα στους seeds για κάθε άτομο που στρατολογεί από αυτά τα υποσύνολα. Η διαδικασία σταματά, είτε όταν όλα (ή σχεδόν όλα) τα άτομα του πληθυσμού στόχου μπουν στη μελέτη (ουσιαστικά όταν πάψουν να έρχονται νέα άτομα στην έρευνα), είτε όταν ένα συγκεκριμένο προκαθορισμένο μέγεθος δείγματος επιτευχθεί.

30 Σχετικά με τους περιορισμούς της μεθόδου, έχει προταθεί το στατιστικό μέτρο τάσης της Homophily (H), το οποίο μπορεί να υποδείξει αν τα άτομα κάποιου συγκεκριμένου υποσυνόλου του πληθυσμού έχουν την τάση να συνδέονται με μεγαλύτερη πιθανότητα με άτομα εντός του υποσυνόλου στο οποίο ανήκουν, παρά τυχαία από όλο τον πληθυσμό (Heckathorn, 1997, 2002). Το μέγεθος αυτό λαμβάνει τιμές στο διάστημα [-1,1], όπου η τιμή 1 σημαίνει πως τα άτομα ενός υποσυνόλου του πληθυσμού συνδέονται στα δίκτυα RDS αποκλειστικά με άτομα εντός του υποσυνόλου τους, η τιμή -1 σημαίνει πως τα άτομα ενός υποσυνόλου του πληθυσμού συνδέονται στα RDS αποκλειστικά εκτός άτομα εκτός αυτού του υποσυνόλου (αναφέρεται και ως heterophily), ενώ η τιμή 0 υποδεικνύει ότι τα άτομα ενός υποσυνόλου του πληθυσμού συνδέονται τυχαία με άτομα από ολόκληρο τον πληθυσμό (Heckathorn, 2002). Το μέτρο H αποτελεί ένα σχετικό μέτρο, έτσι η τιμή του επηρεάζεται από το βάρος του κάθε υποσυνόλου του πληθυσμού, συνεπώς όσο το δείγμα μεγαλώνει, τόσο λιγότερο μπορεί να επηρεάσει εντέλει τα χαρακτηριστικά του δείγματος η τάση ορισμένων ομάδων να συνδέονται στα RDS άτομα από το εσωτερικό τους (Heckathorn, 1997; Heckathorn, Semaan, Broadhead, & Hughes, 2002). Το μέτρο (H) χρησιμοποιήθηκε αρχικά ώστε να μπορεί να ελεγχθεί η ποιότητα του δείγματος και γενικά συνυπολογίζεται κατά την διόρθωση άλλων εκτιμώμενων χαρακτηριστικών μέτρων ενός δείγματος RDS, τα οποία δίνουν τη γενική εικόνα σχετικά με την πραγματική δομή του πληθυσμού στόχου (όπως το εκτιμώμενο σχετικό και το απόλυτο μέγεθος υποομάδων του πληθυσμού) (Heckathorn, 1997, 2002). Παρά ταύτα, φαίνεται πως το (H), είναι εν δυνάμει και το ίδιο ένα ακόμη χαρακτηριστικό του δείγματος, καθώς είναι ικανό να αποτελέσει μέτρο, τόσο της συμπάγειας, όσο και ενός ιδιαίτερου κοινωνικού χαρακτηριστικού, της αλληλεγγύης (solidarity) (Hechter, 1988), μεταξύ των ατόμων ενός συγκεκριμένου υποσυνόλου του πληθυσμού στόχου (Heckathorn & Rosenstein, 2002). 2. Μέθοδος 2.1 Πληθυσμός και Δείγμα Ο πληθυσμός-στόχος της παρούσας εργασίας ήταν οι ΧΕΝ που ζούσαν στην Αττική και η ανάλυση επικεντρώθηκε στα άτομα που έφεραν HIV-1 λοίμωξη. Το δείγμα αποτελούνταν συνολικά από 1415 ΧΕΝ ( 11 peers και 1404 στρατολογημένα άτομα μέσω RDS δειγματοληψίας) που κατοικούσαν στην Αθήνα κατά τον πρώτο κύκλο συμμετοχής του προγράμματος ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΗΣ. Από αυτούς οι 279 (19.72%) βρέθηκαν να έχουν μολυνθεί από

31 τον HIV-1. Πέρα από ορισμένα περιγραφικά χαρακτηριστικά του δείγματος, 2 είναι τα βασικά χαρακτηριστικά χρησιμοποιήθηκαν προκειμένου να πραγματοποιηθεί η παρούσα μελέτη: 1) Η αλληλουχία του DNA του ιού HIV που απομονώθηκε στον ορό του αίματος των ατόμων του δείγματος και συγκεκριμένα το γονίδιο POL 2) Η σχέσεις που διαμορφώνονται μεταξύ των ατόμων μέσω της ανάλυσης RDS Το δεύτερο χαρακτηριστικό διερευνήθηκε περισσότερο, Οι σχέσεις των ατόμων και η ανάλυση RDS διευκρινίζεται περεταίρω στο κεφάλαιο 2.2. Τελικά, αυτό που ήταν επιθυμητό να διερευνηθεί ήταν η πιθανή σχέση των δικτύων μετάδοσης του ιού μεταξύ των ΧΕΝ και των δικτύων RDS, όπως αυτά καταγράφηκαν μέσω της ανάλυσης RDS που ακολουθήθηκε. 2.2 Διαδικασία συλλογής δείγματος Όπως αναφέρθηκε και προηγουμένως, η δειγματοληψία έγινε με τη μέθοδο RDS, όπως αυτή περιγράφεται από τον Hekathorn (Heckathorn, 1997, 2002; Heckathorn et al., 1999). Το δείγμα των 1415 ΧΕΝ της παρούσας μελέτης επιλέχτηκε στο πλαίσιο του προγράμματος «ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΗΣ» (Hatzakis & Malliori, 2014; Hatzakis et al., 2015), και αφορά τον πρώτο μόνο κύκλο της δειγματοληψίας, από τους πέντε που έγιναν συνολικά. Η διαδικασία της δειγματοληψίας είχε ως εξής: 1) Αρχικά επιλέχθηκε τυχαία, ένα σύνολο 11 συμμετεχόντων, οι οποίοι χρησιμοποιήθηκαν για να φέρουν στην έρευνα άλλα άτομα (seeds). Συγκεκριμένα, σε κάθε έναν τους, δόθηκαν 3 κουπόνια τα οποία θα έπρεπε να διανείμει σε άλλους ΧΕΝ, ώστε να συμμετάσχουν και αυτοί στην έρευνα. Συνολικά, από τους 11 seeds που επιλέχθηκαν αρχικά, 3 παρέμειναν πλήρως αδρανείς και ουσιαστικά δεν συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη. 2) Σε κάθε άτομο που υποδείχθηκε προς συμμετοχή από κάποιον seed στην έρευνα, δόθηκαν 3 κουπόνια, τα οποία καλούνταν να τα διανείμει σε άλλους ΧΕΝ, που όμως δεν είχαν συμμετάσχει ξανά. Η διαδικασία συνεχίστηκε με τον ίδιο τρόπο (κάθε άτομο που έμπαινε στην έρευνα είχε τη δυνατότητα να φέρει μέχρι 3 νέα άτομα) 3) Υπάρχει κάποιο κίνητρο (οικονομικό) για κάθε πιθανό συμμετέχοντα, αν μπει στην έρευνα (πρωτογενή κίνητρα), αλλά και για κάθε άτομο το οποίο φέρνει ένας συμμετέχον στην έρευνα (δευτερογενή κίνητρα).

32 Τα κριτήρια εισαγωγής των ατόμων στη μελέτη ήταν τα εξής: Έχουν κάνει ενδοφλέβια χρήση ναρκωτικών τους τελευταίους 12 µήνες Μένουν στην Αττική 18 ετών Έχουν έγκυρο κουπόνι Είναι σε θέση να δώσουν συνέντευξη σε Ελληνικά ή γλώσσα πολιτισµικών διαμεσολαβητών (Φαρσί, Αραβικά, Κουρδικά και Αγγλικά, Γαλλικά) Οι συμμετέχοντες κατά την εισαγωγή τους στην έρευνα συμπλήρωσαν ένα ερωτηματολόγιο το οποίο ήταν βασισμένο στο National HIV Behavioral Surveillance System (NHBS)-IDU3 (τροποποιημένο ανάλογα για ΧΕΝ στην Ελλάδα), με ερωτήσεις μεταξύ άλλων σχετικά με το μέγεθος δικτύου, τη χρήση ναρκωτικών, προηγούμενους ελέγχους για HIV, πρόσβαση σε δραστηριότητες πρόληψης κ.α., ενώ πέραν της συνέντευξης για τη συμπλήρωση των ερωτηματολογίων, έγινε και λήψη αίματος για έλεγχο HIV (Hatzakis et al., 2015). 2.3 Φυλογενετικά δέντρα και δίκτυα RDS Για τη φυλογενετική ανάλυση και την παραγωγή των φυλογενετικών δέντρων έγινε αρχικά στοίχιση με το πρόγραμμα MEGA έκδοση 6 και ακολούθησε ανάλυση με το FastTree και με το RAxML. Αυτή η επιλογή έγινε γιατί, από τη μία το FastTree είναι πιο γρήγορο ενώ παράγει και πιο ακριβείς τοπολογίες αν και υπολογίζει ένα μόνο δέντρο, ενώ το RAxML φαίνεται να εκτιμά με μεγαλύτερη ακρίβεια το μήκος των κλαδιών και βασίζεται στον υπολογισμό πολλών δέντρων, από τα οποία παράγει την τελική εκτίμηση (Liu, Linder, & Warnow, 2011). Για τη γραφική αναπαράσταση της τοπολογίας-δένδρο χρησιμοποιήθηκε το FigTree. Για τα δίκτυα ενδοφλέβιας χρήσης, υπολογίστηκαν ο δείκτης Η (Homophily), οι εκτιμήσεις για το ποσοστό κάθε ομάδας στον πληθυσμό (estimated population proportion) η κατανομή ισορροπίας του δείγματος (Equilibrium Sample Distribution) και το μέσο μέγεθος δικτύου (Mean Network Size (dual component) 1. Homophily (H) Προκειμένου να γίνουν πιο κατανοητές οι ιδιότητες του (H), παρατίθεται ο τρόπος υπολογισμού του (Heckathorn & Rosenstein, 2002)

33 «Αν Pa είναι το σχετικό μέγεθος μιας ομάδας Α και Saa είναι το σχετικό πλήθος των δεσμών των ατόμων της ομάδας Α με άτομα εντός αυτής, (ένα σχετικό μέγεθος που εκφράζει το ποσοστό των συνδέσεων στα RDS μεταξύ ατόμων τα οποία ανήκουν στην ομάδα Α σε σχέση με το σύνολο των RDS συνδέσεων των ατόμων της ομάδας Α και οποιουδήποτε άλλου ατόμου στο δείγμα), τότε το Ha είναι το μέτρο της Homophily για την ομάδα Α, ενώ υπολογίζεται ως: Pa Saa Ha, Saa P ( P 1) a Saa Pa Ha, Saa P P a (1)» Το (H) μπορεί να ερμηνευθεί ως το ποσοστό των δεσμών στο δίκτυο RDS που δημιουργούν τα άτομα μιας ομάδας από το εσωτερικό της και όχι τυχαία. Έτσι, για παράδειγμα, αν Ha=0.3, τότε λέμε πως τα άτομα της ομάδας Α συνδέονται με άτομα που ανήκουν στην ίδια κοινωνική ομάδα του πληθυσμού σε ποσοστό 30% (ή με πιθανότητα 30%), ενώ το υπόλοιπο 70% των RDS συνδέσεων των ατόμων της ομάδας Α, αφορούν τυχαία το σύνολο του πληθυσμού (συμπεριλαμβανομένης και της ομάδας Α) (Heckathorn & Rosenstein, 2002) Αξίζει να σημειωθεί πως όσο το σχετικό μέγεθος μιας ομάδας μικραίνει (είτε γιατί αυξάνεται το μέγεθος δείγματος, είτε γιατί η συγκεκριμένη ομάδα συγκεντρώνει πολύ μικρό πλήθος ατόμων στον πληθυσμό), το (H) μικραίνει. Πάντως, όταν το μέγεθος ενός δείγματος RDS το επιτρέπει, το μέτρο αυτό μπορεί να δείξει την «τάση» μιας ομάδας να σχηματίζει RDS δεσμούς εκ των έσω. Έτσι, όταν το (H) υπολογισθεί για κάποια ομάδα που ορίζεται βάσει των τιμών ενός συγκεκριμένου χαρακτηριστικού των συμμετεχόντων, μπορεί να υποδείξει την ίδια την ύπαρξη και τη δομή της ομάδας αυτής (Heckathorn & Rosenstein, 2002). 2. Ποσοστό κάθε ομάδας στον πληθυσμό (estimated population proportion) Αποτελεί τις RDS εκτιμήσεις των ποσοστών κάθε ομάδας στον πληθυσμό. Το συγκεκριμένο μέγεθος μπορεί να εκτιμηθεί είτε μέσω του linear least squares αλγόριθμο, ή μέσω του datasmoothing αλγόριθμου. Στην παρούσα μελέτη εκτιμήθηκε με χρήση του δεύτερου αλγορίθμου. 3. Κατανομή ισορροπίας του δείγματος (Equilibrium Sample Distribution)

34 Αντιστοιχεί στο ποσοστό του πληθυσμού κάθε ομάδας, βασισμένο μόνο στην κατανομή ισορροπίας της συγκεκριμένης μεταβλητής, ως προς την οποία δημιουργούνται οι διάφορες ομάδες. Αποτελεί ένα διαγνωστικό μέτρο. 4. Μέσο μέγεθος δικτύου (Mean Network Size (dual component) Αυτό αποτελεί τον προτεινόμενο εκτιμητή του μέσου μεγέθους δικτύου (Heckathorn, 2007). Σαν μέγεθος χρησιμοποιείται για τη στάθμιση άλλων εκτιμήσεων RDS αλλά και σαν χαρακτηριστικό του δείγματος Η ανάλυση RDS πραγματοποιήθηκε με το πακέτο RDSAT και για την επεξεργασία και τη δημιουργία των αντίστοιχων γραφημάτων χρησιμοποιήσαμε το πακέτο NetDraw. 2.4 Σχέση φυλογένειας και δικτύων RDS Η σχέση της φυλογένειας των HIV(+) ΧΕΝ του δείγματος με τα δίκτυα RDS διερευνήθηκε με δύο τρόπους: μέσω της τιμής του homophily, η οποία δε φαίνεται να έχει χρησιμοποιηθεί ξανά με τον συγκεκριμένο τρόπο για τη μελέτη της εξάπλωσης του HIV και μέσω μιας πρακτικής διαδικασίας παρατήρησης. 1) Homophily (H): Το χαρακτηριστικό αυτό μέγεθος αποτελεί ένα μέτρο τάσης και παίρνει τιμές στο διάστημα [-1,1]. Μας επιτρέπει να ελέγξουμε αν τα άτομα που ανήκουν σε ένα υποσύνολο ενός δείγματος RDS δεδομένων έχουν την τάση να συνδέονται (να στρατολογούν) με άτομα από το ίδιο υποσύνολο (θετικές τιμές), αν έχουν την τάση να μη συνδέονται (να μη στρατολογούν) άτομα από το ίδιο υποσύνολο (αρνητικές τιμές) ή αν στρατολογούν τυχαία από όλα τα υποσύνολα του δείγματος (H=0). Εδώ, αφού πραγματοποιήθηκε φυλογενετική ανάλυση και υποτύπηση του HIV των ατόμων, εντοπίσθηκε δηλαδή από ποιον ακριβώς υπότυπο του ιού έχει μολυνθεί κάθε άτομο, ο υπότυπος του ιού προστέθηκε σαν νέο χαρακτηριστικό στο αρχείο με τα δεδομένα από την δειγματοληψία RDS. Έτσι δημιουργήθηκαν ομάδες ατόμων, ανάλογα με τον υπότυπο του ιού του HIV-1 που φέρουν. Στη συνέχεια, το μέτρο (H) χρησιμοποιήθηκε για να διερευνηθεί αν υπάρχει κάποια κοινωνική δομή εντός των ομάδων αυτών. 2) Παρατήρηση αποτελεσμάτων της φυλογενετικής ανάλυσης και των αποτελεσμάτων της ανάλυσης των δεδομένων RDS. Αυτή η μέθοδος έχει χρησιμοποιηθεί ξανά, ώστε να γίνει εφικτός ο εντοπισμός ενδείξεων κάποιας σχέσης μεταξύ της εξάπλωσης του ιού HIV και

35 της κοινωνικής δικτύωσης των ατόμων που τον φέρουν, όπως αυτή περιγράφεται με τα αντίστοιχα δίκτυα RDS (Dennis et al., 2013; Guimaraes et al., 2015; Kuhns et al., 2015). Συγκεκριμένα, η διαδικασία θα πραγματοποιηθεί σε 5 βήματα. i. Διαχωρισμός των ατόμων ανά ομάδα, ανάλογα με τον υπότυπο του ιού, βάσει προηγούμενης διαδικασίας. ii. Θα λάβουμε υπόψη μόνο τις ομάδες που αντιστοιχούν στους 4 βασικούς υπότυπους του ιού στους οποίους οφείλεται κατά κύριο λόγο η επιδημία των ΧΕΝ που μελετάμε (Α_clust, B, CRF14_BG & CRF35_AD) iii. Σε κάθε μια από τις 4 αυτές ομάδες θα πραγματοποιηθεί εκ νέου φυλογενετική ανάλυση, ώστε να υπολογίσουμε τις bootstrap τιμές μεταξύ των αλληλουχιών του ιού, σε μια προσπάθεια να βρούμε σημαντικά φυλογενετικά δίκτυα και συνεπώς να βρούμε αν υπάρχουν άτομα τα οποία είναι πολύ πιθανό να έχουν μεταδώσει τον ιό μεταξύ τους. Η οριακή bootstrap τιμή επιλέχθηκε να είναι το 75%. Η συγκεκριμένη ανάλυση πραγματοποιήθηκε με το πακέτο RaxML, το οποίο όπως έχει αναφερθεί και πιο πάνω, είναι πιο αποτελεσματικό στο να εκτιμά τις πραγματικές γενετικές αποστάσεις. iv. Τέλος, για τα άτομα που συνδέονταν με τιμές bootstrap >75%, θα πραγματοποιηθεί έλεγχος, μέσω παρατήρησης των αποτελεσμάτων της ανάλυσης RDS, για το αν και κατά πόσο βρίσκονται κοινωνικά κοντά. 3. Αποτελέσματα 3.1 Αποτελέσματα ανάλυσης RDS Από τους 1415 συνολικά συμμετέχοντες, οι οποίοι αφορούσαν τον πρώτο κύκλο του προγράμματος ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΗΣ, 11 άτομα ήταν seeds, με 3 από αυτούς να παραμένουν ανενεργοί και να μην συμπεριλαμβάνονται στη μελέτη. Μολυσμένοι με τον ιό του HIV ήταν οι 279 (19.72%). Για 57 από τους 279 ασθενείς, δεν βρέθηκε η αλληλουχία του γονιδιώματος του HIV που έφεραν, καθώς δεν κατέστη δυνατή η απομόνωσή του στο εργαστήριο. Για τους υπόλοιπους 222 πραγματοποιήθηκε στοίχιση και υποτύπηση. Από αυτή τη διαδικασία εξαιρέθηκαν επιπλέον 2 ασθενείς, καθώς οι αλληλουχίες τους δεν είχαν το απαιτούμενο μήκος, ώστε να μπορέσουν να αναλυθούν φυλογενετικά. Το σύνολο των αποτελεσμάτων θα

36 επικεντρωθεί στους 4 μόνο υπότυπους του HIV-1, στους οποίους οφείλεται κυρίως η μεγάλη επιδημία HIV-1 στους ΧΕΝ που ξέσπασε στην Αθήνα το 2011, οι οποίοι είναι οι A, B, CRF14_BG και CRF35_AD. Τα αποτελέσματα της υποτύπησης φαίνονται παρακάτω στον Πίνακα 1 Πίνακας 1:Συχνότητα (Ν) και ποσοστά (%) των υποτύπων HIV-1 στο υποσύνολο των οροθετικών του δείγματος (Ν=220). Υπότυπος N (%) Α 17 (7.73%) B 32 (14.55%) CRF14_BG 116 (52.73%) CRF35_AD 30 (13.64%) Other 21 (9.55%) Unclassified /missing 4 (1.82%) Total 220 (100%) Παρακάτω, στον Πίνακα 2 παρουσιάζουμε τα σχετικά μεγέθη για τους 4 βασικούς υπότυπους, όπως εκτιμήθηκαν από την ανάλυση RDS του δείγματος. Παρουσιάζονται τα μεγέθη τόσο στο σύνολο του δείγματος, όσο και στον υποπληθυσμό των οροθετικών ΧΕΝ. Παρατηρούμε ότι αν και το μεγαλύτερο δίκτυο μετάδοσης αποτελεί αυτό του υπότυπου CRF14_BG, αφού εκτιμάται πως το 53.5% των οροθετικών ΧΕΝ ανήκουν σε αυτή την ομάδα, ταυτόχρονα το μέσο μέγεθος κοινωνικού δικτύου των ατόμων αυτής της ομάδας ( άτομα) έρχεται τρίτο, αρκετά πίσω από το αντίστοιχο μέγεθος για τα άτομα της ομάδας A ( άτομα) και της ομάδας CRF35_AD( άτομα). Παρόμοια αναντιστοιχία του επιπολασμού του ιού και του μέσου μεγέθους δικτύου παρατηρείται και στην ομάδα των οροθετικών ΧΕΝ υπότυπου B

37 Πίνακας 2: Βασικά χαρακτηριστικά της ανάλυσης RDS A B CRF14_BG CRF35_AD (Ν=17) (Ν=32) (Ν=116) (Ν=30) Σύνολο πληθυσμού Εκτιμώμενο ποσοστό 0.4% 2.8% 5.6% 1.2% στον πληθυσμό (0.01%, 0.06%) (0.8%,6.1%) (3.1%, 8%) (0.7&,2.1%) Κατανομή ισορροπίας Μέσο μέγεθος δικτύου Υποπληθυσμός των οροθετικών Εκτιμώμενο ποσοστό 1.5% 15.9% 53.5% 6.8% στον πληθυσμό (0%, 4.5%) (0.2%, 48.4%) (28.4%,84.9%) (0.3%,8.7%) Κατανομή ισορροπίας Μέσο μέγεθος δικτύου Στα παρακάτω γραφήματα παρατηρούμε τα δίκτυα RDS, όπως αυτά προέκυψαν από την ανάλυση RDS. Με κόκκινο χρώμα βλέπουμε κάθε φορά τα άτομα που φέρουν ένα συγκεκριμένο υπότυπο του HIV-1.

38 Διάγραμμα 1: Δίκτυο RDS υπότυπου A Διάγραμμα 2: Δίκτυο RDS υπότυπου B

39 Διάγραμμα 3: Δίκτυο RDS υπότυπου CRF14_BG Διάγραμμα 4: Δίκτυο RDS υπότυπου CRF35_AD