Προϊόντα Elucigene QSTR Οδηγίες χρήσης

Transcript

1 Προϊόντα Elucigene QST*R Οδηγίες χρήσης Προϊόν Μέγεθος Κωδικός Elucigene QST*Rplusv2 50 δοκιμασίες καταλόγου AN0PLB2 Elucigene QST*R 50 δοκιμασίες AN003B2 Elucigene QST*R-XYv2 50 δοκιμασίες AN0XYB2 Elucigene QST*R δοκιμασίες AN013BX Elucigene QST*R δοκιμασίες AN018BX Elucigene QST*R δοκιμασίες AN021BX Για in vitro διαγνωστική χρήση Κατασκευάζεται από την: Elucigene Diagnostics Greenheys House Pencroft Way Manchester Science Park Manchester M15 6JJ, Ηνωμένο Βασίλειο Για πωλήσεις, εξυπηρέτηση πελατών και τεχνική υποστήριξη: Τηλ.: +44 (0) Φαξ: +44 (0) E: E: Elucigene Diagnostics is the trading name of Delta Diagnostics (UK) Limited., a company registered in England and Wales, registration number AN000BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 1 από 38

2 Elucigene QST*R Η σειρά προϊόντων Elucigene QST*R είναι πολλαπλοί προσδιορισμοί που βασίζονται στο DNA για ταχύ προγενετικό προσδιορισμό κατάστασης ανευπλοειδίας για τις τρεις πιο συνηθισμένες βιώσιμες αυτοσωμικές τρισωμίες και τα φυλετικά χρωμοσώματα X και Y. Τα κιτ Elucigene QST*R διατίθενται στις μορφές που παρατίθενται παρακάτω. Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τα κιτ στο εύρος QST*R, επισκεφθείτε την ιστοσελίδα Χρήση για την οποία προορίζεται QST*Rplusv2 Για την τυπική in vitro ποσοτική διάγνωση των τριών πιο συνηθισμένων βιώσιμων αυτοσωμικών τρισωμιών: τρισωμία 13 (σύνδρομο Patau), τρισωμία 18 (σύνδρομο Edwards) και τρισωμία 21 (σύνδρομο Down). Το κιτ περιλαμβάνει επίσης δείκτες για τα χρωμοσώματα X και Y, καθώς και τον δείκτη TAF9L για τον προσδιορισμό της κατάστασης του φύλου. Η μέθοδος που χρησιμοποιείται από το κιτ Elucigene QST*Rplusv2 είναι η τεχνική QF-PCR (Ποσοτική φθορίζουσα αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης). Οι συσκευές προορίζονται για χρήση σε DNA που έχει εξαχθεί είτε από δείγμα αμνιακού υγρό είτε από δείγμα χοριακών λαχνών (CVS) που λαμβάνονται κατά τη διάρκεια αμνιοπαρακέντησης. Ο πληθυσμός-στόχος για τον οποίο προορίζονται είναι έγκυες που έχουν αξιολογηθεί με βιοχημικές ή υπερηχογραφικές διαγνωστικές διαδικασίες ως «υψηλού κινδύνου» να κυοφορούν ένα προσβεβλημένο έμβρυο ή που έχουν αξιολογηθεί ως «υψηλού κινδύνου» λόγω προηγούμενου οικογενειακού ιστορικού ή λόγω της ηλικίας της μητέρας. Η συσκευή προορίζεται για χρήση σε συνδυασμό με άλλες διαγνωστικές διαδικασίες που υποστηρίζουν ή αμφισβητούν την προτεινόμενη κλινική διάγνωση. Η συσκευή προορίζεται για χρήση μόνο από επαγγελματίες εντός περιβάλλοντος μοριακού ή κυτταρογενετικού εργαστηρίου. QST*R Για την τυπική in vitro ποσοτική διάγνωση των τριών πιο συνηθισμένων βιώσιμων αυτοσωμικών τρισωμιών: τρισωμία 13 (σύνδρομο Patau), τρισωμία 18 (σύνδρομο Edwards) και τρισωμία 21 (σύνδρομο Down). Η μέθοδος που χρησιμοποιείται από το κιτ Elucigene QST*R είναι η τεχνική QF-PCR (Ποσοτική φθορίζουσα αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης). Οι συσκευές προορίζονται για χρήση σε DNA που έχει εξαχθεί είτε από δείγμα αμνιακού υγρό είτε από δείγμα χοριακών λαχνών (CVS) που λαμβάνονται κατά τη διάρκεια αμνιοπαρακέντησης. Ο πληθυσμός-στόχος για τον οποίο προορίζονται είναι έγκυες που έχουν αξιολογηθεί με βιοχημικές ή υπερηχογραφικές διαγνωστικές διαδικασίες ως «υψηλού κινδύνου» να κυοφορούν ένα προσβεβλημένο έμβρυο ή που έχουν αξιολογηθεί ως «υψηλού κινδύνου» λόγω προηγούμενου οικογενειακού ιστορικού ή λόγω της ηλικίας της μητέρας. Η συσκευή προορίζεται για χρήση σε συνδυασμό με άλλες διαγνωστικές διαδικασίες που υποστηρίζουν ή αμφισβητούν την προτεινόμενη κλινική διάγνωση. Η συσκευή προορίζεται για χρήση μόνο από επαγγελματίες εντός περιβάλλοντος μοριακού ή κυτταρογενετικού εργαστηρίου. QST*R-XYv2 Για την τυπική in vitro ποσοτική διάγνωση της κατάστασης των φυλετικών χρωμοσωμάτων, συμπεριλαμβανομένων των κοινών ανευπλοειδιών του. Η μέθοδος που χρησιμοποιείται από το κιτ Elucigene QST*R-XYv2 είναι η τεχνική QF-PCR (Ποσοτική φθορίζουσα αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης). Οι συσκευές προορίζονται για χρήση σε DNA που έχει εξαχθεί είτε από δείγμα αμνιακού υγρό είτε από δείγμα χοριακών λαχνών (CVS) που λαμβάνονται κατά τη διάρκεια αμνιοπαρακέντησης. Ο πληθυσμός- AN000BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 2 από 38

3 στόχος για τον οποίο προορίζονται είναι έγκυες που έχουν αξιολογηθεί με βιοχημικές ή υπερηχογραφικές διαγνωστικές διαδικασίες ως «υψηλού κινδύνου» να κυοφορούν ένα προσβεβλημένο έμβρυο ή που έχουν αξιολογηθεί ως «υψηλού κινδύνου» λόγω προηγούμενου οικογενειακού ιστορικού ή λόγω της ηλικίας της μητέρας. Η συσκευή προορίζεται για χρήση σε συνδυασμό με άλλες διαγνωστικές διαδικασίες που υποστηρίζουν ή αμφισβητούν την προτεινόμενη κλινική διάγνωση. Η συσκευή προορίζεται για χρήση μόνο από επαγγελματίες εντός περιβάλλοντος μοριακού ή κυτταρογενετικού εργαστηρίου. QST*R-13, QST*R-18, QST*R-21 Συμπληρωματικά κιτ που περιέχουν πρόσθετους αυτοσωμικούς δείκτες, που θα χρησιμοποιηθούν σε συνδυασμό με τον προσδιορισμό QST*R ή QST*Rplusv2, για την τυπική ποσοτική in vitro διάγνωση των τριών πιο συνηθισμένων βιώσιμων αυτοσωμικών τρισωμιών: τρισωμία 13 (σύνδρομο Patau), τρισωμία 18 (σύνδρομο Edwards) και τρισωμία 21 (σύνδρομο Down), αντίστοιχα. Αυτά τα κιτ διατίθενται για εκτεταμένες χρωμοσωμικές δοκιμασίες σε περιπτώσεις όπου είναι απαραίτητα ή για επιβεβαίωση θετικών αποτελεσμάτων. Η μέθοδος που χρησιμοποιείται από αυτά τα κιτ είναι η τεχνική QF-PCR (Ποσοτική φθορίζουσα αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης). Οι συσκευές προορίζονται για χρήση σε DNA που έχει εξαχθεί είτε από δείγμα αμνιακού υγρό είτε από δείγμα χοριακών λαχνών (CVS) που λαμβάνονται κατά τη διάρκεια αμνιοπαρακέντησης. Ο πληθυσμός-στόχος για τον οποίο προορίζονται είναι έγκυες που έχουν αξιολογηθεί με βιοχημικές ή υπερηχογραφικές διαγνωστικές διαδικασίες ως «υψηλού κινδύνου» να κυοφορούν ένα προσβεβλημένο έμβρυο ή που έχουν αξιολογηθεί ως «υψηλού κινδύνου» λόγω προηγούμενου οικογενειακού ιστορικού ή λόγω της ηλικίας της μητέρας. Η συσκευή προορίζεται για χρήση σε συνδυασμό με άλλες διαγνωστικές διαδικασίες που υποστηρίζουν ή αμφισβητούν την προτεινόμενη κλινική διάγνωση. Η συσκευή προορίζεται για χρήση μόνο από επαγγελματίες εντός περιβάλλοντος μοριακού ή κυτταρογενετικού εργαστηρίου. Σύνοψη και επεξήγηση Το σύνδρομο Down, το σύνδρομο Edwards και το σύνδρομο Patau είναι οι πιο συνηθισμένες, βιώσιμες αυτοσωμικές τρισωμίες. Οι δείκτες γεννήσεων ζώντων βρεφών είναι περίπου 1 στις 700, 1:3.000 και 1:21.700, αντίστοιχα. Το σύνδρομο Turner σε θήλεα βρέφη και το σύνδρομο Klinefelter σε άρρενα βρέφη είναι οι πιο συχνές ανευπλοειδίες των φυλετικών χρωμοσωμάτων. Η πιο συνηθισμένη αιτία του συνδρόμου Turner είναι η μονοσωμία του χρωμοσώματος X (καρυότυπος 45, X) και του συνδρόμου Klinefelter, η παρουσία ενός πρόσθετου αντιγράφου του χρωμοσώματος X (καρυότυπος 47, XXY). Οι δείκτες γεννήσεων ζώντων βρεφών είναι μεταξύ 1:2.000 έως 1:5.000 θήλεα βρέφη για το σύνδρομο Turner και μεταξύ 1:500 και 1:650 άρρενα βρέφη για το σύνδρομο Klinefelter. Ο κίνδυνος γέννησης ενός παιδιού με σύνδρομο Down αυξάνεται σημαντικά όσο αυξάνεται η ηλικία της μητέρας, από περίπου 1:1.600 σε ηλικία 20-24, σε 1:200 σε ηλικία 35 και 1:19 σε ηλικία 45 και άνω. Στις εγκύους παρέχεται τυπικά προγενετικός έλεγχος για σύνδρομο Down στο πρώτο τρίμηνο της κύησης. Μία τυπική δοκιμασία είναι η «δοκιμασία OSCAR», One Stop Clinical Assessment of Risk (Κλινική αξιολόγηση κινδύνου μίας στάσης) που πραγματοποιείται μεταξύ της 10ης και της 13,5ης εβδομάδας της κύησης. Αυτή συνδυάζει δύο βιοχημικούς δείκτες, την ελεύθερη βήτα hcg (ανθρώπινη χοριακή γοναδοτροπίνη) και την PAPP-A (σχετιζόμενη με την κύηση πρωτεΐνη-α του πλάσματος) με τη μέτρηση του πάχους της αυχενικής πτυχής του εμβρύου (αυχενική διαφάνεια) (1). Ο συνδυασμός των αποτελεσμάτων αυτών των τριών δοκιμασιών δίνει μια γενική εικόνα του κινδύνου. Στις γυναίκες για τις οποίες αναγνωρίζεται ότι υπάρχει αυξημένος κίνδυνος να γεννήσουν ένα παιδί με σύνδρομο Down παρέχεται η δυνατότητα εξέτασης αμνιοπαρακέντησης για να εξεταστεί απευθείας η παρουσία της ανωμαλίας. Η αμνιοπαρακέντηση είναι μια επεμβατική εξέταση, η οποία AN000BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 3 από 38

4 περιλαμβάνει την εισαγωγή μιας βελόνας, η οποία κατευθύνεται από υπερήχους, μέσα στον αμνιακό σάκο που περιβάλλει το έμβρυο. Λαμβάνεται και εξετάζεται ένα μικρό δείγμα, συνήθως ml, αμνιακού υγρού, το οποίο περιέχει εμβρυικά κύτταρα. Το σύνδρομο Down πήρε το όνομά του από τον Δρ. John Langdon Down το 1866, παρόλο που είχε περιγραφεί παλαιότερα. Προκαλείται από τρισωμία όλου ή μέρους του χρωμοσώματος 21 (2). Εκτός από τη διανοητική αναπηρία διαφορετικού βαθμού, τα άτομα με σύνδρομο Down έχουν κάποια τυπικά κοινά χαρακτηριστικά, στα οποία συγκαταλέγονται η υποτονία (κακός μυϊκός τόνος), προέχουσα γλώσσα, αμυγδαλωτό σχήμα ματιών που οφείλεται σε επίκανθο, ελαφρώς κυρτά βλέφαρα με ραγάδες, μονήρης παλαμιαία πτυχή και βραχύτερα του φυσιολογικού άκρα. Διατρέχουν επίσης αυξημένο κίνδυνο συγγενών καρδιακών ανωμαλιών και στη μετέπειτα ζωή εκδήλωσης μιας μορφής της νόσου Alzheimer. Το σύνδρομο Edwards περιγράφηκε για πρώτη φορά από τον Δρ. John Edwards το Προκαλείται από τρισωμία όλου ή μέρους του χρωμοσώματος 18. Όπως και στο σύνδρομο Down, υπάρχει μια αύξηση του κινδύνου σύλληψης παιδιού με σύνδρομο Edwards όσο αυξάνεται η ηλικία της μητέρας. Στα τυπικά κλινικά χαρακτηριστικά συγκαταλέγονται το χαμηλό βάρος γέννησης, οι καρδιακές ανωμαλίες, η δυσπλασία του γαστρεντερικού συστήματος, η δυσπλασία του ουρογεννητικού συστήματος, τα νευρολογικά προβλήματα και οι κρανιοπροσωπικές ανωμαλίες. Ο διάμεσος χρόνος επιβίωσης είναι περίπου 4 ημέρες. Το σύνδρομο Patau πήρε το όνομά του από τον Δρ. Klaus Patau, ο οποίος περιέγραψε την ασθένεια με τη χρωμοσωμική της συσχέτιση. Προκαλείται από τρισωμία όλου ή μέρους του χρωμοσώματος 13. Τα μωρά με σύνδρομο Patau επηρεάζονται βαριά από πολλαπλές ανωμαλίες. Στα τυπικά χαρακτηριστικά του συγκαταλέγονται η ενδομήτρια καθυστέρηση της ανάπτυξης, το χαμηλό βάρος γέννησης, οι συγγενείς καρδιακές ανωμαλίες, η μικροκεφαλία, η ολοπροσεγκεφαλία με υπερωιοσχιστία και μικροφθαλμία, κεντρική άπνοια, πολυδακτυλία και πόδια με αναστροφή της ποδικής καμάρας «rocker bottom». Ο διάμεσος χρόνος επιβίωσης είναι περίπου 2,5 ημέρες. Το σύνδρομο Turner σε θήλεα βρέφη οφείλεται σε μονοσωμία του χρωμοσώματος X. Περίπου το 98% των βρεφών με σύνδρομο Turner θα αποβληθούν αυτόματα. Όσα παιδιά επιβιώσουν θα παρουσιάζουν διάφορα τυπικά χαρακτηριστικά, στα οποία συγκαταλέγονται το βραχύ ανάστημα, η πρωτοπαθής αμηνόρροια, πτερύγιο αυχένα (που προκαλείται από κυστικό ύγρωμα, έναν σάκο πληρωμένο με υγρό, κατά την ενδομήτριο ζωή). Αυτά τα βρέφη πάσχουν συνήθως από συγγενείς καρδιοπάθειες και ενδέχεται να έχουν «πεταλοειδείς» νεφρούς. Το σύνδρομο Klinefelter σε άρρενα βρέφη οφείλεται στην παρουσία ενός πρόσθετου αντιγράφου του χρωμοσώματος X. Τα άρρενα βρέφη με σύνδρομο Klinefelter είναι στείρα και ενδέχεται να έχουν κάποια ήπια γνωσιακή αναπηρία. Συνήθως έχουν μεγαλύτερο ύψος από τον μέσο όρο, ενδέχεται να εκδηλώσουν γυναικομαστία που απαιτεί χειρουργική μείωση του μεγέθους των μαστών και διατρέχουν αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης οστεοπόρωσης λόγω μειωμένων επιπέδων τεστοστερόνης. Η δοκιμασία QST*Rplusv2 περιλαμβάνει δείκτες και για τα τρία αυτοσωμικά χρωμοσώματα, καθώς και για το χρωμόσωμα X και το χρωμόσωμα Y. Έχει σχεδιαστεί για την ανίχνευση ανευπλοειδιών ολόκληρου χρωμοσώματος σε αυτά τα χρωμοσώματα, αλλά δεν θα εντοπίσει εξισορροπημένες δομικές αναδιευθετήσεις και δεν μπορεί να διακρίνει την ανευπλοειδία που προκαλείται από συμβάν απουσία αποσύνδεσης από αυτήν που προκαλείται από μη εξισορροπημένη αναδιευθέτηση. AN000BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 4 από 38

5 Αρχές της διαδικασίας Η μέθοδος που χρησιμοποιείται από τα κιτ Elucigene QST*R είναι η τεχνική QF-PCR (Ποσοτική φθορίζουσα αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης) (3-7). Χρησιμοποιώντας ενίσχυση με PCR, οι επισημασμένοι με φθορίζουσα χρωστική εκκινητές στοχεύουν στις περιοχές της αλληλουχίας DNA που παρουσιάζουν έντονο πολυμορφισμό, οι οποίες ονομάζονται σύντομες διαδοχικές επαναλήψεις (short tandem repeats, STR) που βρίσκονται στα χρωμοσώματα που μας ενδιαφέρουν. Κάθε δείκτης μιας στοχευόμενης STR είναι ειδικός για το χρωμόσωμα στο οποίο βρίσκεται αυτή, συνεπώς ο αριθμός των αντιγράφων του δείκτη STR μπορεί να είναι διαγνωστικός του αριθμού των αντιγράφων του χρωμοσώματος. Έχουν επιλεγεί πληροφοριακοί δείκτες STR που παρουσιάζουν υψηλή ετερογένεια, ούτως ώστε να μπορεί να προσδιοριστεί εύκολα ο αριθμός των αντιγράφων. Ένα φυσιολογικό διπλοειδικό δείγμα έχει το φυσιολογικό συμπλήρωμα δύο αντιγράφων καθενός από τα σωματικά χρωμοσώματα, συνεπώς προσδιορίζονται δύο αλληλόμορφα μιας STR που είναι ειδική για ένα χρωμόσωμα με την τεχνική QF-PCR, ως δύο αιχμές σε αναλογία 1:1. Η παρατήρηση ενός επιπλέον αλληλομόρφου STR είτε ως μοτίβο τριών αιχμών σε αναλογία 1:1:1 είτε ως μοτίβο δύο αιχμών σε αναλογία αιχμών 2:1 ή 1:2 είναι διαγνωστική της παρουσίας πρόσθετης αλληλουχίας, η οποία με τη σειρά της ενδέχεται να αντιπροσωπεύει πρόσθετο χρωμόσωμα, όπως στην περίπτωση τρισωμίας. Τα προϊόντα της τεχνικής QF-PCR που έχουν υποστεί ενίσχυση αναλύονται ποσοτικά σε γενετικό αναλυτή τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης για να προσδιοριστεί ο αριθμός των αντιγράφων των αναλυθέντων δεικτών STR. Προειδοποιήσεις και προφυλάξεις 1. Ο φυσιολογικός μάρτυρας DNA που παρέχεται στα κιτ έχει εξεταστεί ξεχωριστά και έχει διαπιστωθεί ότι είναι αρνητικός για τον ιό της ηπατίτιδας Β (HBV), τον ιό της ηπατίτιδας C (HCV) και για τον ιό της ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV) τύπου 1 και Θα πρέπει να προσέχετε κατά τον χειρισμό υλικού ανθρώπινης προέλευσης. Όλα τα δείγματα θα πρέπει να θεωρούνται δυνητικά μολυσματικά. Καμία μέθοδος εξέτασης δεν μπορεί να διασφαλίσει απόλυτα ότι απουσιάζουν οι ιοί HBV, HCV, HIV ή άλλοι μολυσματικοί παράγοντες. 3. Ο χειρισμός των δειγμάτων και των συστατικών της εξέτασης, η χρήση τους, η φύλαξη και η απόρριψή τους θα πρέπει να γίνονται σύμφωνα με τις διαδικασίες που ορίζει η ανάλογη εθνική κατευθυντήρια οδηγία ή κανονισμός ασφαλείας από βιολογικούς κινδύνους. 4.Σύμφωνα με την τρέχουσα ορθή εργαστηριακή πρακτική, τα εργαστήρια θα πρέπει να επεξεργάζονται τα δικά τους δείγματα εσωτερικού ποιοτικού ελέγχου γνωστών γονοτύπων σε κάθε προσδιορισμό, ούτως ώστε να μπορεί αξιολογηθεί η εγκυρότητα της διαδικασίας. 5.Εάν το κουτί του κιτ έχει υποστεί ζημιά, ενδέχεται να έχει προκληθεί ζημιά στο περιεχόμενο. Μη χρησιμοποιήσετε το κιτ, επικοινωνήστε με το τμήμα εξυπηρέτησης πελατών. AN000BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 5 από 38

6 Σύμβολα που χρησιμοποιούνται στις ετικέτες Τα σύμβολα που χρησιμοποιούνται σε όλες τις ετικέτες και τις συσκευασίες συμμορφώνονται με το εναρμονισμένο πρότυπο ISO15223 Παρασκευαστής Αριθμός εξετάσεων Δείτε τις οδηγίες χρήσης X C Φυλάσσετε σε χαμηλότερη θερμοκρασία από την αναγραφόμενη Χρησιμοποιείτε πριν από την αναγραφόμενη ημερομηνία Κωδικός καταλόγου Αριθμός παρτίδας Ιατροτεχνολογικό προϊόν για in vitro διαγνωστική χρήση AN000BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 6 από 38

7 Υλικά που παρέχονται Φυλάσσετε όλα τα συστατικά σε θερμοκρασία χαμηλότερη από -20 C. Κάθε κιτ περιέχει: (TA): 2 x 250 µl (50 δοκιμασίες) ή 1 x 100 µl (10 δοκιμασίες) μίγματος αντίδρασης QST*R, το οποίο περιέχει εκκινητές για την ενίσχυση διαφόρων δεικτών STR (σύντομες διαδοχικές επαναλήψεις). Δείτε το παράρτημα 2 για λεπτομέρειες σχετικά με τους δείκτες κάθε κιτ. Το μίγμα αντίδρασης QST*R περιέχει επίσης DNA πολυμεράση και τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια σε ρυθμιστικό διάλυμα. Κιτ Φιαλίδια PCR των 0,2 ml Αρ. συστατικού Elucigene QST*Rplusv2 Διάφανο μέρους Elucigene QST*R Πορτοκαλί Elucigene QST*R-XYv2 Ροζ Elucigene QST*R-13 Πράσινο Elucigene QST*R-18 Ιώδες Elucigene QST*R-21 Κίτρινο (DC): 1 φιαλίδιο x 50 µl μάρτυρα DNA, διπλοειδικού για τους δείκτες που ανιχνεύονται από το κιτ Elucigene QST*R: Κιτ Αρ. συστατικού μέρους Elucigene QST*Rplusv Elucigene QST*R Elucigene QST*R-XYv Elucigene QST*R Elucigene QST*R Elucigene QST*R (10) φιαλίδια PCR x 0,2 ml, με χρωματική κωδικοποίηση που αναφέρεται παραπάνω. Παρασκευή και φύλαξη του κιτ Κατά το άνοιγμα του κιτ, συνιστάται η διανομή του μίγματος αντίδρασης στα παρεχόμενα φιαλίδια PCR των 0,2 ml (ή ισοδύναμα) σε όγκους 10 µl και η κατάψυξή τους σε θερμοκρασία -20 C. Βεβαιωθείτε ότι τα περιεχόμενα του φιαλιδίου έχουν αποψυχθεί και αναμιχθεί καλά πριν από τη διανομή. AN000BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 7 από 38

8 Απαιτούμενα υλικά που δεν παρέχονται Γενικά Εργαστηριακά αναλώσιμα γάντια, ρύγχη πιπετών. Εργαστηριακός εξοπλισμός πιπέτες ακριβείας (2 σετ: 1 για τον χειρισμό κατά την προενίσχυση και 1 για τον χειρισμό μετά την ενίσχυση [κατά προτίμηση πιπέτες θετικής μετατόπισης]), προστατευτικός ρουχισμός, ανακινητήρας περιδίνησης, μικροφυγόκεντρος, πλάκα μικροτιτλοποίησης 96 κυψελίδων, φυγόκεντρος. Εξαγωγή DNA Προετοιμασία DNA μήτρα InstaGene (Bio-Rad Laboratories, αρ. κατ ), στείρο απιονισμένο νερό. Ενίσχυση PCR Θερμικός κυκλοποιητής που δέχεται πλάκες μικροτιτλοποίησης 96 κυψελίδων ή φιαλίδια 0,2 ml με ορθότητα θερμοκρασίας +/-1 C μεταξύ 33 C και 100 C και ομοιομορφία στατικής θερμοκρασίας +/-1 C. Τριχοειδής ηλεκτροφόρηση Τριχοειδής ηλεκτροφόρηση πρότυπο μεγέθους GeneScan 500 LIZ (αρ. κατ. ABI ), GeneScan 600 LIZ (αρ. κατ. ABI ) ή GeneScan 600v2 LIZ (αρ. κατ. ABI ), DS-33 (σετ χρωστικής G5) πρότυπο μήτρας (αρ. κατ. ABI ), πολυμερές POP-7 (αρ. κατ. ABI ), 10x Genetic Analyzer Buffer (ρυθμιστικό διάλυμα γενετικού αναλυτή) (αρ. κατ. ABI ) και φορμαμίδιο Hi-Di (αρ. κατ. ABI ). Γενετικοί αναλυτές Applied Biosystems ABI 3130 και 3500 (με λογισμικό GeneMapper), συστοιχία τριχοειδών 36 cm (συστοιχία τριχοειδών 50 cm για τον γενετικό αναλυτή 3500), οπτικές πλάκες 96 κυψελίδων, διαφράγματα 96 κυψελίδων, κασέτα 96 κυψελίδων. Ανάλυση δεδομένων Απαιτούνται ένα από τα παρακάτω πακέτα λογισμικού ανάλυσης δεδομένων: GeneMapper 3.7 (Applied Biosystems Inc.) ή νεότερο ή GeneMarker 1.65 (SoftGenetics LLC) ή νεότερο. Πρόσθετο υλικό τεκμηρίωσης Elucigene QST*R Αυτές οι Instructions for Use (Οδηγίες χρήσης) περιλαμβάνουν μια βασική ενότητα σχετικά με την ερμηνεία των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται. Διατίθεται ένα συμπληρωματικό έντυπο Guide to Interpretation (Οδηγός ερμηνείας) με παραδείγματα και ένα γλωσσάρι, καθώς και ένα έντυπο Guide to Analysis (Οδηγός ανάλυσης) από την ιστοσελίδα της Elucigene Diagnostics: Συλλογή και φύλαξη δειγμάτων Θα πρέπει να χρησιμοποιούνται δείγματα χοριακών λαχνών (CV) ή αμνιακού υγρού (AF). Οι διατάξεις συλλογής δειγμάτων έχει αναφερθεί ότι, κατά περιπτώσεις, είναι επιβλαβείς για την ακεραιότητα ορισμένων αναλυτών και θα μπορούσε να παρεμβάλλεται με ορισμένες τεχνολογίες μεθόδων. Συνιστάται να επιβεβαιώνει κάθε χρήστης ότι η επιλεγμένη διάταξη χρησιμοποιείται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και ότι οι διατάξεις συλλογής δειγμάτων και οι μέθοδοι προετοιμασίας DNA είναι συμβατές με αυτή την εξέταση. AN000BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 8 από 38

9 Εξαγωγή DNA Τα κιτ Elucigene QST*R έχουν πιστοποιηθεί με τη μέθοδο εξαγωγής DNA στη μήτρα InstaGene και μπορούν να πραγματοποιηθούν σε ένα σωληνάριο, εξαλείφοντας την ανάγκη για μεταφορά μεταξύ σωληναρίων. Άλλες μέθοδοι εξαγωγής έχει αποδειχθεί ότι παρέχουν εξίσου αξιόπιστα αποτελέσματα, π.χ. τα κιτ Qiagen QIAamp. Η μέθοδος εξαγωγής DNA InstaGene περιγράφεται παρακάτω. Μέθοδος εξαγωγής InstaGene Αμνιακό υγρό (AF) Θα πρέπει να χρησιμοποιηθούν περίπου 1-2 ml αμνιακού υγρού. Χοριακή λάχνη (CV) Τα δείγματα CV θα πρέπει να καθαρίζονται προσεκτικά για να αφαιρεθεί τυχόν προσκολλημένο τμήμα φθαρτού υμένα της μητέρας. Είναι σημαντικό να εξεταστούν κύτταρα από περισσότερες από μίας περιοχές του δείγματος και να αντιπροσωπεύονται κύτταρα από τον μεσεγχυματικό πυρήνα. Συνιστάται η χρήση ενός μικρού κλάσματος του κυτταρικού εναιωρήματος, όπως παρασκευάζεται για τη δημιουργία συμβατικής κυτταρικής καλλιέργειας, για την ανάλυση QST*R. Αυτό θα διασφαλίσει ότι το αποτέλεσμα της ανάλυσης QST*R λαμβάνεται από τον ίδιο πληθυσμό κυττάρων που χρησιμοποιούνται για την ανάλυση καρυότυπου. 1. Επαναιωρήστε τη μήτρα InstaGene στον μαγνητικό αναδευτήρα και ρυθμίστε τον σε μέση ταχύτητα για τουλάχιστον 5 λεπτά. 2. Φυγοκεντρίστε το δείγμα (AF ή CV) στα g για 1 λεπτό, προκειμένου να καθιζάνουν τα κύτταρα. 3. Αφαιρέστε τα δείγματα από τη φυγόκεντρο και ελέγξτε οπτικά το ίζημα για τυχόν χρώση αίματος. Σημειώστε το ποσοστό χρώσης αίματος, εάν υπάρχει. 4. Αφαιρέστε και απορρίψτε προσεκτικά το υπερκείμενο από το ίζημα, φροντίζοντας να μην διαταραχτεί το ίζημα. Αφήστε περίπου µl υπερκείμενου για την επαναιώρηση του ιζήματος. 5. Αναμίξτε ενδελεχώς το δείγμα με περιδίνηση. 6. Εάν παρατηρηθεί χρώση αίματος σε ποσοστό υψηλότερο του 50% προχωρήστε στο βήμα 7. Εάν παρατηρηθεί χρώση αίματος σε ποσοστό χαμηλότερο του 50% προχωρήστε στο βήμα Προσθέστε 200 µl στείρου απιονισμένου νερού στο κυτταρικό ίζημα. Αναμίξτε ενδελεχώς με περιδίνηση. Φυγοκεντρίστε στα g για 1 λεπτό, αφαιρέστε το υπερκείμενο αφήνοντας µl υπερκείμενου για την επαναιώρηση του ιζήματος. Σημείωση: αυτό το πρόσθετο βήμα πλύσης συμβάλλει στη λύση των ερυθρών αιμοσφαιρίων και στην αφαίρεση της αίμης, η οποία θα μπορούσε να αναστείλει την PCR. 8. Προσθέστε 200 µl μήτρας InstaGene για από το βήμα 1 στα δείγματα, χρησιμοποιώντας ένα ρύγχος πιπέτας μεγάλης διαμέτρου, όπως µl. Σημείωση: για να βελτιστοποιήσετε το πρωτόκολλο εξαγωγής, ο όγκος της μήτρας InstaGene (ρητίνη Chelex-100) που θα προστεθεί μπορεί να διαφέρει, χρησιμοποιώντας 100 µl μήτρας InstaGene για ιζήματα κυττάρων AF (μόλις ορατά) ή 300 µl για μεγάλα AN000BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 9 από 38

10 ιζήματα (καλύπτουν τη βάση του σωληναρίου), δείγματα CV και ιστών. Καταγράψτε την ποσότητα της μήτρας InstaGene που προστέθηκε σε κάθε δείγμα. 9. Αναμίξτε ενδελεχώς τα δείγματα περιδινίζοντας και επωάσετε στους 100 C για 8 λεπτά σε θερμαινόμενη πλάκα ή υδατόλουτρο. 10. Αναμίξτε ξανά ενδελεχώς περιδινίζοντας σε υψηλή ταχύτητα για 10 δευτερόλεπτα. 11. Φυγοκεντρίστε τα δείγματα στα g για 3 λεπτά. Το υπερκείμενο περιέχει το DNA που έχει εξαχθεί. 12. Προχωρήστε στη ρύθμιση της PCR ή στη φύλαξη του εξαχθέντος DNA σε θερμοκρασία -20 C, μέχρι να το χρειαστείτε. Συγκέντρωση DNA Συνιστάται η ενδελεχής αξιολόγηση εναλλακτικών μεθόδων εξαγωγής DNA και τύπων δειγμάτων με τη δοκιμασία Elucigene QST*R πριν από τη χρήση των αποτελεσμάτων για διαγνωστικούς σκοπούς. Υπό βέλτιστες συνθήκες PCR και χρησιμοποιώντας τις συνιστώμενες ρυθμίσεις έγχυσης δειγμάτων* που αναφέρονται στη μονάδα ανάλυσης με τριχοειδή στήλη (σελίδα 13), λαμβάνονται συνεπώς αποδεκτά αποτελέσματα με εισερχόμενες ποσότητες DNA από 1,25 ng έως 10 ng. *Σημείωση: οι ρυθμίσεις έγχυσης δειγμάτων μπορούν να τροποποιηθούν ώστε να αντιστοιχούν στην ποσότητα αμπλικονίων που παράγονται κατά τη διάρκεια της αντίδρασης PCR, η οποία μπορεί να διαφέρει εξαιτίας της ποσότητας του εισερχόμενου γενωμικού DNA που προστίθεται. Μπορεί να εφαρμοστεί μικρότερη ποσότητα αμπλικονίων στη στήλη για ανάλυση, με μείωση του χρόνου έγχυσης. Αντίστροφα, μπορεί να εφαρμοστεί μεγαλύτερη ποσότητα αμπλικονίων στη στήλη για ανάλυση, με αύξηση είτε του χρόνου είτε της τάσης έγχυσης. Τα δείγματα που έχουν ενισχυθεί παλαιότερα μπορούν να επανεγχυθούν πολλαπλές φορές για επανάληψη της ανάλυσης. Πρωτόκολλο διαδικασίας Διαδικασία ενίσχυσης Όπου η εξαγωγή των δειγμάτων έχει πραγματοποιηθεί με τη μέθοδο Instagene, συνιστάται η χρήση μη αραιωμένου υπερκείμενου απευθείας από την αντίδραση PCR. Σημείωση: για να ελαχιστοποιήσετε τον κίνδυνο μόλυνσης, τα βήματα 3-5 πρέπει να διεξάγονται σε περιοχή που δεν περιέχει DNA. Θα πρέπει επίσης να ακολουθηθούν ενέργειες για την αποτροπή της μόλυνσης με προϊόν της αντίδρασης PCR. 1. Προγραμματίστε τον θερμικό κυκλοποιητή για κύκλο ενός βήματος για την ενεργοποίηση της DNA πολυμεράσης σε θερμοκρασία 95 C για 15 λεπτά, συνδεδεμένο με ένα πρόγραμμα κύκλου ενίσχυσης 30 δευτερολέπτων σε θερμοκρασία 95 C (αποδιάταξη), 1 λεπτού και 30 δευτερολέπτων σε θερμοκρασία 59 C (υβριδοποίηση) και 1 λεπτού και 30 δευτερολέπτων σε θερμοκρασία 72 C (επιμήκυνση) για 26 κύκλους. Αυτό θα πρέπει να συνδεθεί σε αρχείο χρονοκαθυστέρησης διάρκειας 30 λεπτών σε θερμοκρασία 72 C (επιμήκυνση) στον τελικό κύκλο. AN000BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 10 από 38

11 Ενεργοποίηση ενζύμου Κυκλοποίηση Τελική επιμήκυνση 95 C 95 C 15 λεπτά 30 δευτερόλεπτα 72 C 72 C 59 C 1 λεπτό και 30 λεπτά 30 δευτερόλεπτα Θερμοκρασία περιβάλλοντος 1 λεπτό και 30 δευτερόλεπτα 26 κύκλοι 2. Πρέπει να περιλαμβάνεται ένας αρνητικός μάρτυρας (νερό) με κάθε εκτέλεση ανάλυσης PCR. Ενδέχεται επίσης να κριθεί κατάλληλη η συμπερίληψη και άλλων μαρτύρων, π.χ. θετικός φυσιολογικός μάρτυρας (μάρτυρας DNA που παρέχεται) και θετικός μάρτυρας για τρισωμία (μάρτυρας DNA που δεν παρέχεται). 3. Αποψύξτε επαρκή αριθμό φιαλιδίων ήδη κλασματοποιημένου μίγματος αντίδρασης QST*R για τον αριθμό των δειγμάτων και των μαρτύρων στα οποία θα εκτελεστεί ανάλυση (δείτε τη σημείωση στην ενότητα «Υλικά που παρέχονται») και φυγοκεντρίστε τα φιαλίδια στα g για 10 δευτερόλεπτα. 4. Χρησιμοποιώντας ξεχωριστά ρύγχη πιπέτας, προσθέστε 2,5 µl υπό εξέταση DNA σε ένα φιαλίδιο δείγματος που περιέχει 10 µl μίγματος αντίδρασης QST*R και αναμίξτε αναρροφώντας με την πιπέτα προς τα επάνω και προς τα κάτω. Κάντε το ίδιο για όλα τα δείγματα που θα εξεταστούν. Μην προσθέτετε DNA στο φιαλίδιο του αρνητικού μάρτυρα. Aντ αυτού προσθέστε 2,5 µl στείρου απεσταγμένου νερού. Σημείωση: πρέπει να προσέξετε να μην μολύνετε την αντίδραση PCR με οποιαδήποτε ρητίνη InstaGene. 5. Φυγοκεντρίστε σύντομα τα φιαλίδια μέχρι να βρεθεί όλη η ποσότητα του υγρού στον πυθμένα κάθε φιαλιδίου. 6. Τοποθετήστε όλα τα φιαλίδια σταθερά στο θερμικό κυκλοποιητή. Εκκινήστε το πρόγραμμα ενεργοποίησης στους 95 C, ακολουθούμενο από το πρόγραμμα ενίσχυσης (βλ. βήμα 1). 7. Κατά την ολοκλήρωση του προγράμματος ενίσχυσης, τα δείγματα είναι δυνατόν να φυλάσσονται σε θερμοκρασία δωματίου όλη τη νύχτα ή σε θερμοκρασία 2-8 C για έως και 7 ημέρες, πριν από την ανάλυση με τριχοειδή ηλεκτροφόρηση. AN000BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 11 από 38

12 Τριχοειδής ηλεκτροφόρηση Συνιστάται να επιβεβαιώνει κάθε χρήστης ότι ο επιλεγμένος εξοπλισμός χρησιμοποιείται σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και ότι είναι συμβατός με αυτή τη δοκιμασία. Σε αυτό το πλαίσιο, οι βασικές παράμετροι είναι το πολυμερές και η συστοιχία τριχοειδών. Μπορούν να ληφθούν βέλτιστα αποτελέσματα με χρήση των παρακάτω συνθηκών τριχοειδούς ηλεκτροφόρησης σε γενετικό αναλυτή ABI3130 ή ABI Συνδυάστε 6,85 µl προτύπου μεγέθους με 250 µl φορμαμιδίου Hi-Di και αναμίξτε ενδελεχώς (μίγμα που επαρκεί για 16 κυψελίδες). Διανείμετε 15 µl του μίγματος στον απαιτούμενο αριθμό κυψελίδων μιας οπτικής πλάκας 96 κυψελίδων. 2. Προσθέστε 3 µl προϊόντος του υπό εξέταση δείγματος PCR στο μίγμα του προτύπου μεγέθους (από το βήμα 1) που έχετε ήδη διανείμει στην πλάκα και αναμίξτε χρησιμοποιώντας την πιπέτα. Σφραγίστε την πλάκα. 3. Αποδιατάξτε το προϊόν PCR που έχει διανεμηθεί στην οπτική πλάκα σε θερμικό κυκλοποιητή, χρησιμοποιώντας τις παρακάτω παραμέτρους: 94 C για 3 λεπτά, συνδεδεμένο με 4 C για 30 δευτερόλεπτα. 4. Φυγοκεντρίστε την πλάκα στα g για 10 δευτερόλεπτα για να αφαιρέσετε τυχόν φυσαλίδες που υπάρχουν στις κυψελίδες και φορτώστε τον γενετικό αναλυτή. AN000BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 12 από 38

13 ABI3130 GENETIC ANALYZER (ΓΕΝΕΤΙΚΟΣ ΑΝΑΛΥΤΗΣ) Δημιουργήστε ένα φύλλο δείγματος χρησιμοποιώντας το λογισμικό συλλογής δεδομένων 3130 με τις παρακάτω ρυθμίσεις: Sample Name (Όνομα δείγματος): αυτό πρέπει να είναι το ίδιο όνομα ή αριθμός που είναι ειδικός για το δείγμα. Run owner (Ιδιοκτήτης της εκτέλεσης ανάλυσης): επιλέξτε τον προεπιλεγμένο ιδιοκτήτη του εργαστηρίου. Run Protocol (Πρωτόκολλο εκτέλεσης ανάλυσης): QSTR (περιέχει τη μονάδα εκτέλεσης ανάλυσης QST*R 3130 βλ. παρακάτω)*. *Σημείωση: Είναι απαραίτητο να δημιουργηθεί μια μονάδα εκτέλεσης ανάλυσης που θα περιέχει λεπτομερώς τις ρυθμίσεις του οργάνου και η μετέπειτα εκχώρησή της σε ένα πρωτόκολλο εκτέλεσης ανάλυσης στο οποίο έχει επιλεγεί το σετ χρωστικής G5. Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τη δημιουργία λειτουργικών μονάδων εκτέλεσης αναλύσεων ανατρέξτε στο εγχειρίδιο χρήσης του οργάνου RUN MODULE (ΜΟΝΑΔΑ ΕΚΤΕΛΕΣΗΣ ΑΝΑΛΥΣΗΣ) ΓΙΑ ΤΟ ΠΟΛΥΜΕΡΕΣ POP7 Μονάδα τριχοειδών 36 cm: QSTR # Parameter Name Value Range 1 Oven Temperature 60 int Deg.C 2 Poly_fill_Vol steps 3 Current Stability 5.0 int uamps 4 PreRun_Voltage kvolts 5 Pre_Run_Time sec. 6 Injection_Voltage kvolts 7 Injection_Time sec. 8 Voltage_Number_of_Steps nk 9 Voltage_Step_Interval sec. 10 Data_Delay_Time sec. 11 Run_Voltage kvolts 12 Run_Time sec. AN000BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 13 από 38

14 ABI3500 GENETIC ANALYZER (ΓΕΝΕΤΙΚΟΣ ΑΝΑΛΥΤΗΣ) Πρέπει να δημιουργηθεί ένα πρωτόκολλο οργάνου QSTR, το οποίο να μπορεί να χρησιμοποιηθεί για κάθε εκτέλεση ανάλυσης QSTR. Δημιουργήστε το πρωτόκολλο οργάνου QSTR, μέσω της βιβλιοθήκης πρωτοκόλλων του οργάνου Βεβαιωθείτε ότι έχουν επιλεγεί τα εξής: Run Module (Μονάδα εκτέλεσης ανάλυσης): FragmentAnalysis50_POP7 (Ανάλυση τμήματος 50_POP7) Καταχωρίστε τις ρυθμίσεις που περιγράφονται λεπτομερώς στην παρακάτω εικόνα: Για εκτέλεση ανάλυσης των δειγμάτων, δημιουργήστε μία πλάκα δειγμάτων από την επιλογή «Create Plate from Template» (Δημιουργία πλάκας από μήτρα) στην επιλογή «Dashboard» (Πίνακας οργάνων). Βεβαιωθείτε ότι έχει εκχωρηθεί το σωστό πρωτόκολλο οργάνου για QSTR (βλ. παραπάνω). AN000BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 14 από 38

15 Ανάλυση και ερμηνεία αποτελεσμάτων Συνιστάται κάθε εργαστήριο να αναπτύξει τις δικές του διαδικασίες και τα δικά του κριτήρια ερμηνείας και αναφοράς. Οι οδηγίες βέλτιστης πρακτικής για τη μέθοδο QF-PCR έχουν καταγραφεί από την Association for Clinical Genetic Science του Ηνωμένου Βασιλείου και διατίθενται για αναφορά στην: Τα προϊόντα της PCR παρατηρούνται ως σύστημα επισημασμένο με 5 χρωστικές, με χρήση του σετ φίλτρου G5. Το σετ φίλτρου G5 εντοπίζει τα επισημανθέντα τμήματα 6- FAM (μπλε), VIC (πράσινο), NED (κίτρινο) και PET (κόκκινο) και τον δείκτη προτύπου μεγέθους που επισημαίνεται με την ένδειξη LIZ (πορτοκαλί) στο ηλεκτροφόρημα και στο πρόγραμμα GeneMapper ή GeneMarker. Οδηγοί ανάλυσης λογισμικού για τις εφαρμογές GeneMarker και GeneMapper διατίθενται από την ιστοσελίδα της Gen-Probe: Ο οδηγός ανάλυσης GeneMapper παρέχει λεπτομέρειες σχετικά με τις ρυθμίσεις του λογισμικού και οδηγίες εισαγωγής των αναλυθέντων δεδομένων σε πρότυπο αναφορών Excel. Το λογισμικό GeneMarker διαθέτει μια εφαρμογή ανάλυσης τρισωμίας που είναι συμβατή με το Elucigene QST*R. Σημαντική σημείωση: διαφορετικοί συνδυασμοί οργάνου, πολυμερούς και προτύπου μεγέθους ενδέχεται να προκαλέσουν μικρές διαφοροποιήσεις στον προσδιορισμό μεγέθους. Κατά τη διάρκεια της επικύρωσης του κιτ, οι χρήστες θα πρέπει να ελέγχουν ότι οι προεπιλεγμένες ρυθμίσεις «bin» έχουν ως αποτέλεσμα ακριβή επισήμανση αιχμών και να τις προσαρμόζουν, εάν είναι απαραίτητο. Σε περίπτωση που αντιμετωπίσετε οποιαδήποτε δυσκολία, επικοινωνήστε με το τμήμα τεχνικής υποστήριξης για συμβουλές. Γενικές κατευθυντήριες οδηγίες ανάλυσης για όλα τα κιτ QST*R 1. Ο αρνητικός μάρτυρας δεν θα πρέπει να εμφανίζει καμία οξεία αιχμή εντός του εύρους ανάγνωσης από το 100 έως το 510 ζεύγος βάσεων. 2. Ο θετικός μάρτυρας πρέπει να εμφανίζει τα αναμενόμενα αποτελέσματα και όλες οι αιχμές πρέπει να πληρούν τα παρακάτω κριτήρια. 3. Για την ανάλυση δειγμάτων DNA, θα πρέπει να παρατηρείται τουλάχιστον 1 αιχμή για κάθε δείκτη που εξετάζεται. Το αποδεκτό εύρος των αιχμών των δεικτών που αναλύονται στον γενετικό αναλυτή 3130 είναι μεταξύ 50 και σχετικών μονάδων φθορισμού (rfu) και για τον γενετικό αναλυτή 3500 είναι μεταξύ 175 και rfu. Τα ύψη των αιχμών που βρίσκονται εκτός αυτού του ορίου δεν πρέπει να αναλύονται. 4. Ηλεκτροφορήματα κακής ποιότητας λόγω υπερβολικής διαφυγής και ανάμιξης (bleedthrough) των χρωμάτων των χρωστικών (είναι επίσης γνωστό ως «ανύψωση») ή «ηλεκτροφορητικές οξείες αιχμές» (οξείες αιχμές που υπάρχουν σε περισσότερες από μία χρωστικές) δεν θα πρέπει να ερμηνεύονται. Τα προϊόντα της αντίδρασης PCR θα πρέπει να εγχυθούν και να αναλυθούν εκ νέου. 5. Η ανάλυση πραγματοποιείται με αξιολόγηση των αναλογιών των αιχμών (A1/A2), όπου A1 είναι το εμβαδόν της αιχμής του τμήματος με το μικρότερο μήκος και A2 είναι το εμβαδόν της αιχμής του τμήματος με το μεγαλύτερο μήκος. Η αναλογία που προκύπτει είναι διαγνωστική του αριθμού των αντιγράφων του τόπου. Για δισωμικά χρωμοσώματα, οι ετερόζυγοι δείκτες θα πρέπει να εμφανίσουν δύο αιχμές με παρόμοιο ύψος. AN000BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 15 από 38

16 Πραγματοποιείται πλήρης ανάλυση της κατάστασης του αριθμού των αντιγράφων του χρωμοσώματος, με σύγκριση των αναλογιών του εμβαδού των αιχμών. 6. Οι ετερόζυγοι διαλληλικοί (δηλαδή δύο αλληλόμορφων) δείκτες θα πρέπει να βρίσκονται εντός του εύρους αναλογίας 0,8 έως 1,4. Ωστόσο, για δύο αλληλόμορφα που διαχωρίζονται από περισσότερα από 24 ζεύγη βάσεων, μια αναλογία έως και 1,5 είναι αποδεκτή. Οποιαδήποτε τιμή βρίσκεται εντός αυτής της περιοχής αναφέρεται ως αναλογία 1:1. Εάν το ισοζύγιο ισορροπίας εμπίπτει εκτός αυτού του εύρους, τότε αυτό μπορεί να οφείλεται σε διάφορους παράγοντες, όπως: Τρισωμία ολόκληρου του χρωμοσώματος Τρισωμία μέρους του χρωμοσώματος (συμπεριλαμβανομένων των υπομικροσκοπικών διπλασιασμών) Μωσαϊκισμός Επιμόλυνση με δεύτερο γονότυπο (π.χ. μητέρας, διδύμου, εξωτερικό) Παραγωγή υποπροϊόντων που προκαλούν αλλοίωση της αναλογίας Επιλεκτική ενίσχυση ενός αλληλόμορφου που προκαλεί αλλοίωση της αναλογίας Πολυμορφισμοί της θέσης των εκκινητών Σωματικές μεταλλάξεις μικροδορυφορικών περιοχών Το έντυπο Guide to Interpretation (Οδηγός ερμηνείας) παρέχει παραδείγματα τυπικών προφίλ πολλών από αυτές. Οι ομόζυγοι δείκτες είναι μη πληροφοριακοί καθώς δεν μπορεί να προσδιοριστεί κάποια αναλογία. 7. Για να ερμηνεύσετε ένα αποτέλεσμα ως μη φυσιολογικό (δηλαδή παρουσία τρισωμίας), απαιτούνται τουλάχιστον δύο πληροφοριακοί δείκτες συμβατοί με γονότυπο τριών αλληλόμορφων με όλους τους δείκτες να είναι μη πληροφοριακοί. Δεν συνιστάται η ερμηνεία ενός αποτελέσματος ως μη φυσιολογικό με βάση τις πληροφορίες από έναν μόνο δείκτη. Εάν απαιτείται, η εξέταση παρακολούθησης με κιτ ενός χρωμοσώματος (δηλαδή τα κιτ Elucigene QST*R-13, Elucigene QST*R-18, Elucigene QST*R-21) ενδέχεται να προσφέρει επαρκείς πληροφορίες για την ερμηνεία. Η τρισωμία καθορίζεται από οποιαδήποτε από τις: 7.1. Δύο αιχμές ανόμοιου ύψους λόγω του γεγονότος ότι η μία από τις αιχμές αντιπροσωπεύει δύο αλληλόμορφα τα οποία υπάρχουν είτε στον ένα είτε και στους δύο γονείς. Σε αυτή την περίπτωση η αναλογία μεταξύ των δύο αιχμών θα ταξινομηθεί ως 2:1 ή 1:2, όπου η αναλογία A1/A2 θα δώσει αποτέλεσμα στην περιοχή 1,8 έως 2,4, όταν η αιχμή που αντιπροσωπεύει το αλληλόμορφο μικρότερου μήκους είναι μεγαλύτερη σε εμβαδόν από την αιχμή που αντιπροσωπεύει το αλληλόμορφο μεγαλύτερου μήκους ή όπου η αναλογία A1/A2 θα δώσει ένα αποτέλεσμα στην περιοχή 0,45 έως 0,65, όταν η αιχμή που αντιπροσωπεύει το αλληλόμορφο μικρότερου μήκους είναι μικρότερη σε εμβαδόν από την αιχμή που αντιπροσωπεύει το αλληλόμορφο μεγαλύτερου μήκους Υπάρχουν τρεις αιχμές συγκρίσιμου ύψους. Η αναλογία των δύο αιχμών θα ταξινομηθεί ως 1:1:1 και οι τιμές τους θα εμπίπτουν εντός του φυσιολογικού εύρους 0,8 1,4 (παρόλο που για αλληλόμορφα που διαχωρίζονται κατά περισσότερα από 24 ζεύγη βάσεων, μια αναλογία αλληλόμορφων 1,5 είναι αποδεκτή). Εάν αυτό δεν συμβεί, τότε ενδέχεται να οφείλεται σε έναν από τους παράγοντες που αναφέρθηκαν στο βήμα Για να ερμηνεύσετε ένα αποτέλεσμα ως φυσιολογικό, απαιτούνται τουλάχιστον δύο πληροφοριακοί δείκτες συμβατοί με γονότυπο δύο αλληλόμορφων, με όλους τους άλλους δείκτες να είναι μη πληροφοριακοί. Ένα φυσιολογικό αποτέλεσμα υποδεικνύει τη φυσιολογική συμπληρωματικότητα των δύο από τα χρωμοσώματα που εξετάζονται. AN000BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 16 από 38

17 9. Οι αναλογίες του εμβαδού αιχμών που εμπίπτουν μεταξύ των ευρών φυσιολογικού και μη φυσιολογικού αποτελέσματος ταξινομούνται ως αμφίβολες. Τα αμφίβολα αποτελέσματα ενδέχεται να μη διαλευκανθούν με χρήση κιτ ενός χρωμοσώματος. 10. Εάν ληφθούν τόσο φυσιολογικά όσο και μη φυσιολογικά μοτίβα αλληλόμορφων για ένα συγκεκριμένο χρωμόσωμα, τότε συνιστάται η πραγματοποίηση μελετών παρακολούθησης για την αναγνώριση της αιτίας των αντιφατικών αποτελεσμάτων πριν από την εξαγωγή οποιουδήποτε συμπεράσματος. 11. Σε σπάνιες περιπτώσεις, τα εύρη μεγεθών των αλληλόμορφων ενδέχεται να αλληλοεπικαλύπτονται. Εάν υποψιάζεστε κάτι τέτοιο, η ανάλυση με τα κιτ ενός χρωμοσώματος ενδέχεται να διαλευκάνει αυτό το ζήτημα. Ειδικά για το κιτ QST*R-XYv2 και τους δείκτες φυλετικών χρωμοσωμάτων στο κιτ QST*Rplusv2 1. Ο δείκτης AMEL ενισχύει τις μη πολυμορφικές αλληλουχίες στο χρωμόσωμα X (104 ζεύγη βάσεων) και το χρωμόσωμα Y (110 ζεύγη βάσεων) και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της παρουσίας ή της απουσίας ενός Y χρωμοσώματος, ενώ αντιπροσωπεύει τη σχετική ποσότητα αλληλουχίας X προς Y. Σημειώστε ότι, σε σπάνιες περιπτώσεις, έχει αναφερθεί αστοχία ενίσχυσης λόγω μετάλλαξης στην αλληλουχία AMEL-Y. 2. Ο δείκτης TAF9L είναι ένας μη μεταβλητός παράλογος δείκτης με αλληλουχίες στα χρωμοσώματα 3 και X. Συνεπώς, μπορεί να χρησιμοποιηθεί αιχμή που είναι ειδική για το χρωμόσωμα 3 (116 ζεύγη βάσεων, που αντιπροσωπεύει 2 αντίγραφα του χρωμοσώματος 3) ως αιχμή αναφοράς για να υποβοηθήσει στον προσδιορισμό του αριθμού των χρωμοσωμάτων X που υπάρχουν (αιχμή 121 ζευγών βάσεων). Κατά την ανάλυση σε συνδυασμό με αμελογενίνη και άλλους δείκτες των φυλετικών χρωμοσωμάτων, είναι ιδιαίτερα χρήσιμος στη διάγνωση ανευπλοειδίας φυλετικού χρωμοσώματος. Σε φυσιολογικά θήλεα βρέφη, οι δείκτες θα πρέπει να βρίσκονται εντός του εύρους αναλογίας 0,8 έως 1,4. Σε φυσιολογικά άρρενα βρέφη ή σε μονοσωμία του χρωμοσώματος X, οι δείκτες θα εμφανίσουν μια αναλογία 1,8. Μπορείτε να βρείτε περισσότερες λεπτομέρειες στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων του δείκτη TAF9L στο έντυπο Guide to Interpretation (Οδηγός ερμηνείας). 3. Οι δείκτες πολυμορφισμού STR DXYS267 και DXYS218 υπάρχουν τόσο στο χρωμόσωμα X όσο και στο χρωμόσωμα Y και αντιπροσωπεύουν τον συνολικό αριθμό φυλετικών χρωμοσωμάτων. Για πληροφοριακά αποτελέσματα σε άρρενες δεν είναι δυνατόν να προσδιοριστεί ποιο αλληλόμορφο αντιπροσωπεύει το χρωμόσωμα X ή το χρωμόσωμα Y. 4. Οι πληροφοριακοί δείκτες που είναι ειδικοί για το χρωμόσωμα X, οι δείκτες DXS981, DXS1187, XHPRT, DXS6807, DXS7423, DXS6803 και DXS6809 αντιπροσωπεύουν τον αριθμό των χρωμοσωμάτων X. 5. Ο δείκτης που είναι ειδικός για το χρωμόσωμα Y, ο δείκτης SRY, θα εμφανίσει μία μονήρη αιχμή στους φυσιολογικούς άρρενες και δεν θα ενισχυθεί στα φυσιολογικά θήλεα άτομα. 6. Ο δείκτης που είναι ειδικός για το χρωμόσωμα Y, ο δείκτης DYS448, θα εμφανίσει, στις περισσότερες περιπτώσεις, μία μονήρη αιχμή στους φυσιολογικούς άρρενες και δεν θα ενισχυθεί στα φυσιολογικά θήλεα άτομα. Έχει παρατηρηθεί, σε σπάνιες περιπτώσεις, ότι αυτός ο δείκτης μπορεί να παρουσιάσει ένα κληρονομήσιμο διαλληλικό μοτίβο (υπομικροσκοπικός διπλασιασμός ακολουθούμενος από μετατόπιση κατά την αντιγραφή) ή να μην παρουσιάσει καθόλου ενίσχυση (μηδενικό αλληλόμορφο). AN000BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 17 από 38

18 7. Ένα αποτέλεσμα που δεν παρουσιάζει καθόλου ενίσχυση των δεικτών που είναι ειδικοί για το χρωμόσωμα Y και είναι ομόζυγο για όλους τους άλλους δείκτες δεν είναι απαραίτητα διαγνωστικό συνδρόμου Turner. Με βάση τα δημοσιευμένα δεδομένα, περίπου 1 στα θήλεα άτομα θα είναι ομόζυγο και για τους 7 δείκτες πολυμορφισμού που είναι ειδικοί για το χρωμόσωμα X. Αυτό δίνει Μπεϋζιανή πιθανότητα περίπου 1 στις ένα προφίλ ομόζυγο για όλους τους δείκτες που είναι ειδικοί για το χρωμόσωμα X να αντιπροσωπεύει πραγματικό γονότυπο με μονοσωμία X αντί για φυσιολογικό ομόζυγο θήλυ άτομο. AN000BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 18 από 38

19 Χαρακτηριστικά απόδοσης ΕΣΩΤΕΡΙΚΗ ΕΠΙΚΥΡΩΣΗ QST*Rplusv2 98 δείγματα εξετάστηκαν με εφαρμογή τυφλού, με χρήση του κιτ Elucigene QST*Rplusv2. Από αυτά, τα 22 ήταν φυσιολογικά/xy, τα 17 ήταν φυσιολογικά/xx, τα 12 ήταν με τρισωμία 21/XY, τα 7 ήταν με τρισωμία 21/XX, τα 9 ήταν με τρισωμία 18/XY, τα 8 ήταν με τρισωμία 18/XX, τα 2 ήταν με τρισωμία 13/XY, τα 4 ήταν με τρισωμία 13/XX, τα 8 ήταν φυσιολογικά/x0, το 1 ήταν φυσιολογικό/xyy και το 1 ήταν τριπλοειδές για όλα τα χρωμοσώματα που εξετάστηκαν. Ένα δείγμα έδωσε μη πληροφοριακό αποτέλεσμα. Έξι δείγματα δεν μπόρεσαν να δώσουν αποτελέσματα που να μπορούσαν να αναλυθούν λόγω κακής ποιότητας δείγματος. Όλα τα δείγματα που αναλύθηκαν παρουσίασαν 100% ειδικότητα και ευαισθησία, με τα αποτελέσματα που είχαν ληφθεί προηγουμένως με εναλλακτική καθιερωμένη μέθοδο. QST*R 312 δείγματα εξετάστηκαν με εφαρμογή τυφλού, με χρήση του κιτ Elucigene QST*R. Από αυτά, 286 ήταν φυσιολογικά, 2 παρουσίασαν τρισωμία 13, 7 παρουσίασαν τρισωμία 18, 13 παρουσίασαν τρισωμία 21 και 2 ήταν τριπλοειδικά και για τα 3 χρωμοσώματα που εξετάστηκαν. Ένα δείγμα παρουσίασε μόλυνση με μητρικά κύτταρα, γεγονός που απέτρεψε την ανάλυση και ένα δείγμα δεν έδωσε ερμηνεύσιμο αποτέλεσμα παρά την επανειλημμένη ενίσχυση. Συνολικά, 310 δείγματα έδωσαν αποτελέσματα που να μπορούσαν να αναλυθούν. Όλα τα δείγματα που μπορούσαν να αναλυθούν παρουσίασαν 100% ειδικότητα και ευαισθησία με αποτελέσματα που λήφθηκαν προηγουμένως μέσω καρυοτύπησης. QST*R-XYv2 321 δείγματα εξετάστηκαν με εφαρμογή τυφλού, με χρήση του κιτ Elucigene QST*R- XYv2. Από αυτά, 160 ήταν φυσιολογικοί άρρενες, 147 ήταν φυσιολογικά θήλεα άτομα, 3 παρουσίασαν μονοσωμία X, 2 παρουσίασαν XXY, 2 παρουσίασαν XYY και 1 παρουσίασε XXX. Έξι δείγματα δεν έδωσαν ερμηνεύσιμο αποτέλεσμα παρά την επανειλημμένη ενίσχυση. Συνολικά, 315 δείγματα έδωσαν αποτελέσματα που να μπορούσαν να αναλυθούν. Όλα τα δείγματα που μπορούσαν να αναλυθούν παρουσίασαν 100% ειδικότητα και ευαισθησία με αποτελέσματα που λήφθηκαν προηγουμένως μέσω καρυοτύπησης. QST*R δείγματα εξετάστηκαν με εφαρμογή τυφλού, με χρήση του κιτ Elucigene QST*R-13. Από αυτά, 144 ήταν φυσιολογικά και 2 παρουσίασαν τρισωμία 13. Έξι δείγματα δεν έδωσαν ερμηνεύσιμο αποτέλεσμα παρά την επανειλημμένη ενίσχυση. Όλα τα δείγματα που μπορούσαν να αναλυθούν παρουσίασαν 100% ειδικότητα και ευαισθησία με αποτελέσματα που λήφθηκαν προηγουμένως μέσω καρυοτύπησης. QST*R δείγματα εξετάστηκαν με εφαρμογή τυφλού, με χρήση του κιτ Elucigene QST*R-18. Από αυτά, 143 ήταν φυσιολογικά και 4 παρουσίασαν τρισωμία 18. Πέντε δείγματα δεν έδωσαν ερμηνεύσιμο αποτέλεσμα παρά την επανειλημμένη ενίσχυση. Όλα τα δείγματα που μπορούσαν να αναλυθούν παρουσίασαν 100% ειδικότητα και ευαισθησία με αποτελέσματα που λήφθηκαν προηγουμένως μέσω καρυοτύπησης. AN000BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 19 από 38

20 QST*R δείγματα εξετάστηκαν με εφαρμογή τυφλού, με χρήση του κιτ Elucigene QST*R-21. Από αυτά, 148 ήταν φυσιολογικά και 2 παρουσίασαν τρισωμία 21. Δύο δείγματα δεν έδωσαν ερμηνεύσιμο αποτέλεσμα παρά την επανειλημμένη ενίσχυση. Όλα τα δείγματα που μπορούσαν να αναλυθούν παρουσίασαν 100% ειδικότητα και ευαισθησία με αποτελέσματα που λήφθηκαν προηγουμένως μέσω καρυοτύπησης. AN000BYEL 001 Sep-2014 Σελίδα 20 από 38