Α ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΗ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ κ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ : ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΑΡΤΑΛΗΣ

Transcript

1 ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΔΗΜΟΚΡΙΤΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΡΑΚΗΣ Α ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΗ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ κ ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ : ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΑΡΤΑΛΗΣ Μελέτη μοντέλων συνομιλίας φλεγμονής με συστηματικές εκδηλώσεις Ο ρόλος της φλεγμονής στην υπερπηκτικότητα σε μοντέλα αναπνευστικών παθήσεων ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΤΟΥ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΥ ΚΑΜΠΑ ΜΟΡΙΑΚΟΥ ΒΙΟΛΟΓΟΥ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΥΠΟΛΗ 2009

2 2

3 ΔΗΜΟΚΡΙΤΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΡΑΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΘΟΛΟΓΙΑΣ Α ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΗ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗ ΚΛΙΝΙΚΗ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΑΡΤΑΛΗΣ Μελέτη μοντέλων συνομιλίας φλεγμονής με συστηματικές εκδηλώσεις Ο ρόλος της φλεγμονής στην υπερπηκτικότητα σε μοντέλα αναπνευστικών παθήσεων. ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. ΓEΩΡΓΙΟΣ ΚΑΡΤΑΛΗΣ (Kαθ. Παθολογίας Επιβλέπων) 2. ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΡΙΤΗΣ (Aν. Kαθ. Παθολογίας) 3. ΣΤΑΜΑΤΙΑ ΚΩΤΣΙΟΥ (Aν. Kαθ. Παθολογίας) ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ 1. ΓEΩΡΓΙΟΣ ΚΑΡΤΑΛΗΣ (Kαθ. Παθολογίας Επιβλέπων) 2. ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΡΙΤΗΣ (Aν. Kαθ. Παθολογίας) 3. ΣΤΑΜΑΤΙΑ ΚΩΤΣΙΟΥ (Aν. Kαθ. Παθολογίας) 4. ΙΩΑΝΝΗΣ ΠΝΕΥΜΑΤΙΚΟΣ (Καθηγητής) 5. ΔΗΜΟΣΘΕΝΗΣ ΜΠΟΥΡΟΣ (Καθηγητής) 6. ΣΤΑΥΡΟΣ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΙΔΗΣ (Καθηγητής) 7. ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΚΟΛΙΟΣ (Αν. Καθηγητής) 3

4 4

5 Στην οικογένειά μου και στον καθηγητή μου 5

6 6

7 Περιεχόμενα Πρόλογος...σελ. 11 Συντομογραφίες...σελ. 15 Περίληψη...σελ. 19 Εισαγωγή...σελ. 25 Α. Ιστικός Παράγοντας 1. Ιστορική αναδρομή...σελ Ο ρόλος του TF στο μηχανισμό της πήξης...σελ Δομή και μηχανισμοί δράσης του Ιστικού Παράγοντα...σελ Έκφραση του TF...σελ Θρομβωτική δράση του TF μέσω του συμπλέγματος TF/VII...σελ Μη θρομβωτική δράση του TF...σελ Κατανομή και προέλευση του TF Αιμοστατικός «φάκελος»..σελ Κυκλοφορών στο αίμα ή Blood-Borne TF...σελ. 40 Β. Σύνδρομο οξείας αναπνευστικής δυσχέρειας (ARDS) 1. Ιστορική αναδρομή...σελ Παθογένεια του ARDS...σελ. 44 Γ. Νεογνικό σύνδρομο αναπνευστικής δυσχέρειας (RDS) 1. Γενικά...σελ Παθοφυσιολογία του RDS...σελ Βρογχοπνευμονική δυσπλασία (BPD)...σελ. 50 Δ. Αυξητικός παράγοντας συνδετικού ιστού (Connective Tissue Growth Factor- CTGF) 7

8 1. Γενικά...σελ Το γονίδιο και η πρωτεϊνική δομή του CTGF...σελ Κατανομή και ρύθμιση του CTGF...σελ Η δράση του CTGF στην επούλωση τραυμάτων και στην ίνωση......σελ. 55 Ε. Σκοπός της μελέτης...σελ. 58 Ασθενείς, υλικά και μέθοδοι...σελ Ασθενείς...σελ Συλλογή και προετοιμασία BALF...σελ Διαχωρισμός κυττάρων περιφερικού αίματος...σελ In vitro διεγέρσεις κυττάρων...σελ Τροποποιημένος χρόνος προθρομβίνης (mpt)...σελ Απομόνωση ολικού RNA...σελ Σύνθεση συμπληρωματικού DNA (cdna)...σελ Polymerase Chain Reaction (PCR) πραγματικού χρόνου (Real-Time PCR)...σελ Ανοσοαποτύπωση (Western Blot)...σελ Ανοσοϊστοχημεία...σελ Κυτταρομετρία ροής...σελ Ανάλυση Luminex...σελ Ποσοτικοποίηση του C5a με τη χρήση ELISA...σελ Στατιστική Ανάλυση...σελ. 73 8

9 Αποτελέσματα...σελ. 75 Α. Ασθενείς με ARDS 1. Κυτταρικοί Πληθυσμοί στο Βρογχοκυψελιδικό Έκπλυμα (BALF) ασθενών με ARDS...σελ Η υπερπηκτική ιδιότητα στα υπερκείμενα των BALF ασθενών με ARDS...σελ Η συμβολή των ουδετεροφίλων του κυψελιδικού χώρου των ασθενών με ARDS στην παραγωγή ιστικού παράγοντα...σελ Τοπική διέγερση των ουδετεροφίλων των ασθενών με ARDS για την παραγωγή TF...σελ Ανίχνευση κυτταροκινών στο BALF των ασθενών με ARDS......σελ. 86 Β. Νεογνά με RDS/BPD 1. Διαφορετικότητα κυτταρικών πληθυσμών του BALF μεταξύ νεογνών με RDS και BPD...σελ Διαφορετική έκφραση TF στα κύτταρα του BALF μεταξύ των BPD και RDS νεογνών...σελ Η έκφραση του CTGF ακολουθεί το ίδιο πρότυπο έκφρασης με τον TF στους δυο πληθυσμούς νεογνών. Κινητική ανάλυση του CTGF κατά τη διάρκεια του συνδρόμου...σελ Διέγερση υγιών ουδετεροφίλων με BALF από νεογνά με BPD επάγει την έκφραση του CTGF σε RNA επίπεδο σε αυτά μέσω του εξωγενούς συστήματος της πήξης...σελ. 99 Συζήτηση...σελ

10 Συμπεράσματα...σελ. 115 Βιβλιογραφία...σελ

11 Πρόλογος Ο ρόλος των κυτταροκινών στη φλεγμονή και η σύνδεση αυτής με τη θρόμβωση είναι ένας τομέας που το Εργαστήριο της Α Πανεπιστημιακής Παθολογικής Κλινικής έχει εστιάσει τις έρευνές του εδώ και 5 χρόνια. Με βάση πρόσφατες μελέτες του εργαστηρίου για τη σύνδεση του συμπληρώματος με την έκφραση του ιστικού παράγοντα στο αντιφωσφολιπιδικό σύνδρομο, αποφασίσθηκε να ερευνήσουμε περαιτέρω τη συμμετοχή του ιστικού παράγοντα στη φλεγμονή πνευμονικών συνδρόμων. Στο πλαίσιο αυτό άρχισε η συνεργασία με τον καθ. Ιωάννη Πνευματικό, διευθυντή της ΜΕΘ, ο οποίος έδειξε ιδιαίτερο ενδιαφέρον για το project και με τον οποίο ανταλλάξαµε πολύτιμες πληροφορίες για τα ερευνητικά μας ενδιαφέροντα. Παράλληλα, ήταν ανεκτίμητη η βοήθειά του στη διεξαγωγή της μελέτης καθώς μας παρείχε κλινικά δείγματα από ασθενείς με οξεία πνευμονική δυσχέρεια (ARDS). Οι ασθενείς αυτοί χαρακτηρίζονται από τη δημιουργία μεμβρανών υαλίνης στον κυψελιδικό χώρο, γεγονός που φανερώνει τη συμμετοχή του καταρράκτη της πήξης στην παθοφυσιολογία του συνδρόμου. Για το λόγο αυτό αποφασίσαμε να διερευνήσουμε την παρουσία του ιστικού παράγοντα στο βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα των ασθενών αυτών και την προέλευσή του. Το μεγαλύτερο μέρος των πειραμάτων πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο της Α Πανεπιστημιακής Παθολογικής Κλινικής. Ο καθορισμός του τύπου και της συγκέντρωσης των διαφόρων κυτταροκινών στα εκπλύματα των ασθενών διεξήχθη στο Παθολογοανατομικό εργαστήριο του καθ. Ιωάννη Λάμπρη στο Πανεπιστήμιο της Πενσιλβάνια (UPEN). Στη συνέχεια επεκτείναμε την παραπάνω μελέτη στο ινωτικό πνευμονικό μοντέλο νεογνών με βρογχοπνευμονική δυσπλασία (BPD). Η γιατρός κα. Μαριάνα Σκορδαλά μας παρείχε τα κλινικά δείγματα και βοήθησε καθοριστικά στο σχεδιασμό της μελέτης. Στη συγκεκριμένη μελέτη εξετάσαμε το 11

12 συσχετισμό του ιστικού παράγοντα με την έκφραση του CTGF και με την εξέλιξη του συνδρόμου σε βρογχοπνευμονική δυσπλασία. Η συμβολή των παραπάνω συνεργατών και φίλων για την ολοκλήρωση αυτής της μελέτης είναι αδιαμφισβήτητη. Καταρχήν, θα ήθελα να ευχαριστήσω το διευθυντή της Α Παθολογικής Κλινικής του ΔΠΘ και επιβλέπωντα της διατριβής μου, τον καθηγητή κ. Γεώργιο Καρτάλη. Το ενδιαφέρον, η συμβολή και η επίβλεψη του υπήρξε καθοριστική. Για αυτό θα ήθελα να τον ευχαριστήσω. Η συμβολή του καθηγητή κ. Ιωάννη Πνευματικού ήταν πολύ σημαντική καθώς μας χορήγησε τα κλινικά δείγματα και συμμετείχε σε όλες τις επιστημονικές μας συναντήσεις. Η συνεισφορά του ήταν σπουδαία και μας βοήθησε στο πέρας της μελέτης. Ο κ. Μιχαήλ Δούμας με βοήθησε με τις λειτουργικές εξετάσεις του ιστικού παράγοντα. Παράλληλα, στη μελέτη αυτή συμμετείχε το εργαστήριο του καθηγητή κ. Ιωάννη Λάμπρη και στο σημείο αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω τον ίδιο καθώς και τους συνεργάτες του, Maciej M. Markiewski, Paola Magotti και Robert A. DeAngelis, καθώς η ολοκλήρωση του συγκεκριμένου project θα ήταν αδύνατη χωρίς την πολύτιμη βοήθειά τους. Κατά τη διάρκεια της μελέτης ήταν απαραίτητη η συλλογή κλινικών δειγμάτων. Με αφορµή αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω τη κα. Μαριάνα Σκορδαλά, η οποία συνέβαλε στον σχεδιασμό του project των νεογνών με RDS και στη συλλογή των δειγμάτων και επίσης την κα. Αναστασία Μιχελή, την κα. Βασιλική Θεοδώρου, τον κ. Δημήτρη Κωνσταντώνη και τον κ. Χρήστο Δραγουμάνη για τη συλλογή των κλινικών δειγμάτων των ασθενών με ARDS. Κατά τη διάρκεια της συνολικής παρουσίας μου στην Αλεξανδρούπολη, ήταν πολύ σημαντική η βοήθεια της βιολόγου και τεχνικού του εργαστηρίου κας. Βικτωρίας Τσιρονίδου καθώς επίσης και των διδακτόρων πλέον- επίσης βιολόγων και φίλων, κ Σταύρου Γιαγλή και Σταύρου Ραφαήλ, οι οποίοι 12

13 στάθηκαν δίπλα μου και με βοήθησαν με όλες τις τεχνικές του εργαστηρίου και τους ευχαριστώ πολύ για αυτό. Δεν θα έπρεπε να αγνοήσω φυσικά να ευχαριστήσω και τα νέα μέλη του εργαστηρίου κ. Ιωάννη Κουρτζέλη, κα. Ακριβή Χρυσανθοπούλου και κ. Ιωάννη Μητρούλης, η συμμετοχή και βοήθεια των οποίων ήταν σημαντική. Παράλληλα, είμαι σίγουρος ότι θα εκμεταλλευτούν μελλοντικά ακόμα περισσότερο τις ευκαιρίες για περαιτέρω έρευνα που δίνουν τα αποτελέσματα αυτής της δουλειάς. Για την τεράστια υπομονή αλλά και την ηθική τους συμπαράσταση ευχαριστώ πολύ τους γονείς μου Χρήστο Καμπά και Μαρία Γκεβρέκη-Καμπά, την αδερφή μου Ευδοξία και φυσικά τη σύντροφο μου Ιφιγένεια Δουβίτσα. Τέλος, θα ήθελα να τονίσω ότι η μελέτη αυτή δεν θα μπορούσε να έρθει σε πέρας χωρίς την επίβλεψη και συμμετοχή του αναπληρωτή καθηγητή κ. Κωνσταντίνου Ρίτη, ο οποίος όχι απλώς στάθηκε ως αρωγός και πραγματικός δάσκαλος για μένα, αλλά και ως ένα παράδειγμα ηθικής και επιστημονικής ακεραιότητας. Τον ευχαριστώ απεριόριστα, όχι μόνο για την επιστημονική του καθοδήγηση αλλά και για την προσπάθειά του να μου παρέχει κάθε ευκαιρία για την μελλοντική μου εξέλιξη. 13

14 14

15 Συντομογραφίες Ab antibody AGE - advanced glycation end products ALI acute lung injury APAAP alkaline phosphatase-antialkaline phosphatase ARDS acute respiratory distress syndrome a-sma alpha smooth muscle cell actin astf alternative-spliced human tissue factor BALF bronchoalveolar lavage fluid BPD bronchopulmonary dysplasia C3 complement component 3 C3a complement component 3 alpha C3aR complement component 3 alpha receptor C5 complement component 5 C5a complement component 5 alpha C5aR complement component 5 alpha receptor camp cyclic adenosine monophosphate cdna complementary deoxyribonucleic acid CRP C-reactive protein CTGF connective tissue growth factor CVF cobra venom factor DNA deoxyribonucleic acid DTT dithiothreitol ELISA enzyme-linked immunosorbent assay G-CSF granulocyte colony-stimulating factor GM-CSF - granulocyte macrophage colony-stimulating factor HI healthy individual 15

16 HRP horseradish peroxidase HSC hepatic stellate cells HSPG heparan sulphate proteoglycan HUVEC human umbilical vein endothelial cells IGFBP insulin-like growth factor binding protein IFN-γ interferon gamma IL-1a interleukin-1 alpha IL-1b interleukin-1beta IL-2 interleukin-2 IL-4 interleukin-4 IL-5 interleukin-5 IL-6 interleukin-6 IL-7 interleukin-7 IL-8 interleukin-8 IL-10 interleukin-10 IL-12 interleukin-12 IL-13 interleukin-13 IL-17 interleukin-17 IPF idiopathic pulmonary fibrosis LPS lipopolysaccharide MCP-3 monocyte chemotactic protein 3 MIP-1a macrophage inflammatory protein 1 alpha MIP-1b macrophage inflammatory protein 1 beta mpt modified prothrombin time mrna messanger ribonucleic acid NB-BAL non-bronchoscopic bronchoalveolar lavage NF-κB - nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells oligodt oligo deoxy-thimine PAR protease activated receptor 16

17 PBS phosphate buffered saline PCR polymerase chain reaction PDGF platelet derived growth factor PMN polymorphoneuclear cells PPP platelet poor plasma PT prothrombin time PVDF polyvinylidene fluoride qrt-pcr quantitative real-time polymerase chain reaction RDS respiratory distress syndrome RNA ribonucleic acid Rnase ribonuclease rntp ribonucleotide tri-phosphate TBS tris-buffered saline TBS-T tris buffered saline Tween TF tissue factor TGF-b transforming growth factor beta TNF-α tumor necrosis factor alpha TSP-1 thrombospondin 1 VEGF vascular endothelial growth factor VWF - Von-Willebrand factor 17

18 18

19 Περίληψη 19

20 20

21 Ο TF (tissue factor) είναι ο βασικός in vivo πυροδοτητής της πήξης ο οποίος συμμετέχει σε διάφορα μοντέλα φλεγμονής. Τα σύνδρομα ARDS (acute respiratory distress syndrome) στους ενήλικες και RDS (respiratory distress syndrome) στα νεογνά έχουν κοινές παθοφυσιολογικές εκδηλώσεις, όπως είναι η συσσώρευση φλεγμονωδών μεσολαβητών στον μικροκυψελιδικό χώρο, η διαπήδηση των ουδετεροφίλων σε αυτόν, η συσχέτηση της βαρύτητας του συνδρόμου από τον αριθμό τους και η δημιουργία μεμβρανών υαλίνης στον κυψελιδικό χώρο που προκύπτουν από την εναπόθεση ινικής, το τελικό παράγωγο του πηκτικού μηχανισμού. Παράλληλα, μελέτες κατάδειξαν ότι η θρομβίνη, μια πρωτεΐνη της κοινής οδού της πήξης, μπορεί να επάγει την έκφραση του CTGF (connective tussue growth factor) ο οποίος είναι ένα κατεξοχήν προϊνωτικό μόριο. Ξεκινώντας από το προθρομβωτικό μικροκυψελιδικό περιβάλλον αυτών των συνδρόμων και από το γεγονός ότι τα ουδετερόφιλα μπορούν να εκφράσουν αλλά και να παράγουν λειτουργικό ιστικό παράγοντα, εξετάστηκε η ικανότητα των ουδετεροφίλων να εκφράζουν TF στον κυψελιδικό χώρο κατά την εξέλιξη αυτών των συνδρόμων. Επίσης, διερευνήθηκε η σχέση της έκφρασης TF και CTGF στα νεογνά με RDS που εξελίχθηκαν σε BPD. Παρατηρήθηκε ότι τα κυψελιδικά ουδετερόφιλα των ασθενών με ARDS παράγουν περισσότερο TF και astf από τα ουδετερόφιλα της περιφέρειάς τους και συντελούν με αυτό τον τρόπο στη δημιουργία του θρομβωτικού περιβάλλοντος στους πνεύμονες των ασθενών. Η θρομβωτική ιδιότητα των ουδετεροφίλων παρατηρήθηκε μόνο τοπικά στον κυψελιδικό χώρο και όχι στην περιφέρεια των ασθενών. Παράλληλα, παρατηρήθηκε υπερέκφραση TF και CTGF στα νεογνά που εκδήλωσαν BPD (bronchopulmonary dysplasia) σε σχεση με τα νεογνά με RDS. Η κινητική ανάλυση στα νεογνά αυτά έδειξε παράλληλη μεταβολή του TF και CTGF με την πάροδο του χρόνου. Οι in vitro διεγέρσεις υγιών 21

22 ουδετεροφίλων με BALF (bronchoalveolar lavage fluid) νεογνών έδειξαν μια εξαρτώμενη από τη θρομβίνη και τον TF επαγωγή του CTGF σε επίπεδο RNA στα κύτταρα αυτά. Τα αποτελέσματα είναι μία ακόμη απόδειξη της σύνδεσης της φλεγμονής με τη θρόμβωση σε in vivo μοντέλα με βασικό πρωταγωνιστή τον ιστικό παράγοντα, αλλά και της ικανότητας των ουδετεροφίλων να εκφράζουν λειτουργικό TF. Προτείνουμε λοιπόν ένα πιθανό μηχανισμό μέσω του οποίου αυτά τα φλεγµονώδη κύτταρα συντελούν στη βαρύτητα των δύο αυτών συνδρόμων. Επιπρόσθετα, στην περίπτωση τον νεογνών με BPD φαίνεται μία συμμεταβολή της έκφρασης του TF και του CTGF, που δηλώνει μία πιθανή συσχέτιση της θρόμβωσης με την ίνωση. 22

23 Abstract TF (tissue factor), the main in vivo initiator of coagulation cascade, plays major role in several inflammatory models. The ARDS (acute respiratory syndrome) syndrome in adults and RDS (respiratory syndrome) in preterm infants share several pathophysiological manifestations, such as accumulation of proinflammatory mediators in the microalveolar environment, migration of neutrophils, correlation of the severity of the syndrome with their absolute number and formation of hyaline membranes which are formed by accumulation of fibrin, the end product of coagulation cascade. Furthermore, several studies illustrated that thrombin can induce the expression of CTGF (connective tissue growth factor), which is an eminently profibrotic molecule. Prompted by the prothrombotic microalveolar environment of these syndromes and the fact that neutrophils can express and produce functional TF, we investigated the ability of neutrophils to express TF in the microalveolar environment during the course of these syndromes. Moreover, we examined the correlation between the expression of TF and CTGF in infants with RDS that developed BPD (bronchopulmonary dysplasia). Alveolar neutrophils of ARDS patients expressed more TF and astf compared to their peripheral blood neutrophils and thus they conrtribute to the prothrombotic environment of the patients lungs. This prothrombotic activity was localised in the microalveolar environment and was not observed in the peripheral blood of the patients. Furthermore, we observed TF and CTGF overexpression in infants that developed BPD compared to RDS ones. Kinetic analysis in these infants illustrated the same pattern of expression of the two genes during the course of the syndrome. In vivo stimulations of heathy neutrophils with BALF from 23

24 infants demonstrated in RNA level a thrombin and TF-dependent induction of CTGF expression. These findings are another evidence of the crosstalk between inflammation and coagulation in in vivo models, in which TF plays the central role. Also, this study is another verification of the ability of neutrophils to express and produce functional TF. In this study it is suggested a possible mechanism through which these inflammatory cells contribute to the severity of these syndromes. In addition, in BPD infants a correlation between TF and CTGF expression was observed, suggesting a possible correlation between coagulation and fibrosis. 24

25 Εισαγωγή 25

26 26

27 Α. Ιστικός Παράγοντας 1. Ιστορική αναδρομή του ιστικού παράγοντα Ο ιστικός παράγοντας (Tissue Factor-TF) γνωστός και με το όνομα θρομβοπλαστίνη ή CD142 ή Factor III είναι μία γλυκοπρωτεΐνη 47kDa και θεωρείται ο βασικός in vivo πυροδοτητής της πήξης [1]. Η πρώτη τεκμηριωμένη επιστημονική υπόθεση για τον πρωταγωνιστικό ρόλο του TF δημοσιεύθηκε το 1905 από τον Morawitz [2], όπου αναφέρεται ότι εκχυλίσματα ιστών με μεγάλη περιεκτικότητα σε νουκλεοπρωτεΐνες (λευκοκύτταρα, σπερματοκύτταρα) έχουν ζυμοπλαστική ιδιότητα και είναι ικανά να μετατρέψουν την προθρομβίνη σε θρομβίνη και στη συνέχεια το ινωδογόνο σε ινική, με τελικό αποτέλεσμα την πήξη του αίματος. Στα επόμενα 30 χρόνια που ακολούθησαν πολλές υποθέσεις διατυπώθηκαν, ωστόσο η υπόθεση του Morawitz ήταν αυτή που άντεξε στο χρόνο λόγω της ορθότητάς της. Μέχρι το 1962 είχαν ήδη περιγραφεί 12 παράγοντες που σχετίζονταν με τον καταρράκτη της θρόμβωσης, αλλά δεν υπήρχε σαφής θεωρία που τους συσχέτιζε μεταξύ τους. H θεωρία του καταρράκτη της πήξης ή ενδογενούς συστήματος (intrinsic system) περιγράφτηκε το 1964 χωρίς όμως να είναι σαφής η θέση του TF σε αυτό. Το 1972 διατυπώνεται ότι «η φύση του ιστικού παράγοντα είναι ακόμη άγνωστη αλλά υπάρχουν ενδείξεις ότι με την παρουσία του παράγοντα VII ενεργοποιεί ενζυματικά τον παράγοντα X» [2].Τα παραπάνω δείχνουν ότι μέχρι αυτού του σημείου ο ρόλος και τα συστατικά του εξωγενούς συστήματος ήταν άγνωστα. Χρειάστηκαν 90 χρόνια ερευνητικών προσπαθειών για να διατυπωθεί με βεβαιότητα ο in vivo ρόλος του TF ως πρωταγωνιστή της πήξης και σχεδόν αποκλειστικός πυροδοτητής της διαδικασίας, παρά το γεγονός ότι είχε διατυπωθεί προηγουμένως ότι οι παράγοντες X και IX αποτελούν τον συνδετικό κρίκο ενδογενούς-εξωγενούς συστήματος [3] και είχε απομονωθεί το 27

28 υπεύθυνο γονίδιο που κωδικοποιεί τον TF [4]. Έτσι σήμερα ελάχιστες αμφιβολίες υπάρχουν ότι το σύστημα σύνδεσης TF με τον FVII και οι επακόλουθες αντιδράσεις παίζουν τον ρόλο της «prima ballerina» στη έναρξη της πήξης κατά την διαδικασία της αιμόστασης [4]. 2. Ο ρόλος του TF στον μηχανισμό της πήξης Η έναρξη της πήξης του αίματος πραγματοποιείται όταν ο TF εκτίθεται σε ίχνη ενεργοποιημένου παράγοντα VII (FVIIa) που ήδη κυκλοφορεί στο αίμα [5] γεγονός που εμφανίζεται ως συνέπεια ενδοθηλιακής ενεργοποίησης, συστηματικής φλεγμονής (πχ. ενδοτοξιναιμία, σηψαιμία) ή τοπικής θρομβωτικής ενεργοποίησης των κυττάρων που εκφράζουν TF στο αγγειακό δίκτυο. Το παραγόμενο σύμπλοκο FVIIa/TF, δηλαδή ο εξωγενής παράγοντας Xase (πρωτεϊνάση σερίνης), ενεργοποιεί τους εξαρτώμενους από τη βιταμίνη Κ ζυμογόνους παράγοντες ΙΧ (FIX) και Χ (FX). Οι μικρές ποσότητες του ενεργοποιημένου FX (FXa) μπορούν να παράγουν μικροποσότητες (pmol) θρομβίνης από προθρομβίνη, η οποία με τη σειρά της ενεργοποιεί τα αιμοπετάλια, με συνέπεια την έκθεση ανιονικών φωσφολιπιδίων στην επιφάνειά τους, και μετατρέπει τους συμπαράγοντες FV και FVIII που βρίσκονται σε ανενεργό μορφή, σε ενεργοποιημένο παράγοντα V (Va) και VIII (VIIIa), αντίστοιχα. Στη συνέχεια ο ενεργοποιημένος παράγοντας VIII συνδέεται με τον παράγοντα IXa µέσω επιφάνειας φωσφολιπιδίων (που μπορεί να προέρχεται από αιμοπετάλια ή μικροσωματίδια) για να διαμορφώσουν το σύμπλοκο του εγγενή παράγοντα Xase. Αυτό το σύμπλοκο ενεργοποιεί τον FX σε ένα πολύ υψηλότερο ποσοστό από ότι το σύμπλοκο FVIIa/TF (εξωγενής παράγοντας Χase). Kατόπιν, ο ενεργοποιημένος FX διαμορφώνει σε συνδυασμό με τον ενεργοποιημένο παράγοντα V (τον αρχικό ενεργοποιητή της προθρομβίνης) το σύμπλοκο προθρομβινάσης στην μεμβρανική επιφάνεια [1]. 28

29 Εικόνα 1. Σχηματική αναπαράσταση του καταρράκτη της πήξης Η πλέον μεγαλύτερη σε ποσότητα προκύπτουσα θρομβίνη ενεργοποιεί περαιτέρω τον πηκτικό μηχανισμό μέσω ενίσχυσης της παραγωγής της αλλά και με την ενισχυμένη ενεργοποίηση του παράγοντα ΧΙ, ολοκληρώνοντας έτσι την ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων, του παράγοντα V και του παράγοντα VIII. Αυτή η μαζική παραγωγή θρομβίνης οδηγεί τελικά στην απόσπαση ανά δύο ινωδοπεπτιδίων από τις πολυπεπτιδικές αλύσους Α και Β του ινωδογόνου (2FpA και 2FpB) με αποτέλεσμα την παραγωγή των μονομερών του ινοδογώνου τα οποία στη συνέχεια πολυμερίζονται και παράγουν την ινική, η 29

30 οποία υπό την επίδραση του FXIII με ομοιπολικούς δεσμούς συντελεί στη παραγωγή του σταθερού ινώδους [1]. Όλο το σύστημα της πήξης μετά την ενεργοποίησή του ελέγχεται από ανασταλτικούς μηχανισμούς γνωστούς και ως φυσικούς αντιπηκτικούς ενεργοποιητές που είναι οι αντιθρομβίνες, οι πρωτεΐνες C και ο συμπαράγοντας αυτών S και ο αναστολέας της οδού του ιστικού παράγοντα (Tissue Factor Pathway Inhibitor-TFPI) Η διάλυση των θρόμβων (ινωδόλυση) ελέγχεται από το ινωδολυτικό σύστημα. Αυτό το σύστημα πυροδοτείται από τους ενεργοποιητές του πλασμινογόνου (Plasminogen Activators-PA) και διαλύει την ινική ενώ ταυτόχρονα ελέγχει και τον πολυμερισμό της. Ο αναστολέας του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου (Plasminogen Activators Inhibitor-PAI), ο οποίος παράγεται από μαστοκύτταρα, ενδοθηλιακά και βασεόφιλα κύτταρα, εμποδίζει την ενεργοποίηση του παραπάνω συστήματος. Αν και η καθιερωμένη βιολογική λειτουργία του TF είναι να δρα ως ο αρχικός in vivo εκκινητής του καταρράκτη της πήξης του αίματος, πρόσφατες έρευνες περιγράφουν ότι ο TF εμπλέκεται σε διάφορα άλλα παθοφυσιολογικά γεγονότα. Αυτό καταδεικνύεται εντυπωσιακά από την παρατήρηση ότι knockout διαγονιδιακά TF ποντίκια πεθαίνουν μεταξύ της όγδοης και δέκατης ημέρας της εμβρυϊκής ζωής ως συνέπεια της ελαττωματικής αγγειακής ακεραιότητας και νεοαγγειογένεσης υποδηλώνοντας μια φανερή συμμετοχή του TF στην αγγειογένεση. Πρόσθετες πιθανές λειτουργίες που αποδίδονται στον TF περιλαμβάνουν την προαγωγή της νεοπλασματικής αγγειογένεσης, την ανάπτυξη αγγείων, την μετάσταση, τη μετάδοση ενδοκυτταρικών σημάτων, τη φλεγμονή, την επούλωση τραυμάτων [1] αλλά και τη δημιουργία ίνωσης. Οι μηχανισμοί πρόκλησης των παραπάνω διαταραχών μέσω του TF δεν είναι επαρκώς διευκρινισμένοι. 30

31 3. Δομή και μηχανισμοί δράσης του Ιστικού Παράγοντα. Δομή του γονιδίου του TF και εναλλακτικό λειτουργικό μεταγραφικό ισόφορμο (alternative splicing TF astf): Η δομή του ανθρώπινου cdna του ιστικού παράγοντα περιγράφηκε το 1987 από τέσσερις διαφορετικές ομάδες [6-9]. Το βασικό μεταγράφημα του mrna του TF είναι 2.3 kb [6] ενώ η εναλλακτική μεταγραφή του γονιδίου μπορεί να παράγει μικρότερα μεταγραφήματα [7-9]. Το γονίδιο (F3) εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 1, στη θέση 1p22-23 [10-11]. Έχει μέγεθος 12.4 kb και είναι οργανωμένο σε έξι εξόνια, ανάμεσα στα οποία παρεμβάλλονται πέντε εσόνια [12]. Η περιοχή του υποκινητή περιλαμβάνει δύο θέσεις πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα AP-1, μια θέση πρόσδεσης κβ (NFκB; crel/p65), τρεις θέσεις πρόσδεσης Egr-1 και πέντε Sp1 θέσεις (Sp I-V ) [11]. Πρόσφατα, ταυτοποιήθηκε μια θέση πρόσδεσης για τον πυρηνικό παράγοντα ενεργοποιημένων Τ κυττάρων, η οποία επικαλύπτει τη θέση κβ [13]. Επίσης μια περιοχή πλούσια σε CpG νησίδες εκτείνεται στο πρώτο τμήμα της μη-μεταφραζόμενης περιοχής του υποκινητή του TF [12]. Η μεθυλίωση αυτής της CpG περιοχής μπορεί να καταστείλει την έκφραση του TF γονιδίου σε συγκεκριμένους κυτταρικούς τύπους, όπως αποδείχτηκε στα Β και Τ λεμφοκύτταρα. Εικόνα 2. Δομή του γονιδίου του Ιστικού Παράγοντα (TF) και του εναλλακτικού μεταγράφου του (astf) 31

32 Το ανθρώπινο γονίδιο TF μεταφράζεται σε μια πολυπεπτιδική αλυσίδα 295 αμινοξέων. Η ώριμη μορφή της πρωτεΐνης του TF αποτελείται από 263 αμινοξέα και οργανώνεται σε μια υδρόφιλη εξωκυτταρική περιοχή 219 αμινοξέων, μια υδρόφοβη διαμεμβρανική περιοχή 23 αμινοξέων και μια βραχεία κυτταροπλασματική ουρά 21 αμινοξέων [6-7]. Η εξωκυτταρική περιοχή αποτελείται από δυο τμήματα ομόλογα με την ινονεκτίνη τύπου III (fibronectin class ΙΙΙ), τα οποία ενώνονται με μια διατμηματική περιοχή αρθρώσεων. Με βάση τη δομική ομολογία του υποδοχέα της ιντερφερόνης α, ο TF είναι ταξινομημένος ως υποδοχέας κυτταροκινών τύπου ΙΙ. Ο προσδετικός παράγοντας VII και FVIIa δεσμεύεται στην εξωκυτταρική περιοχή [14-18]. Εικόνα 3. Σχηματική αναπαράσταση της πρόσδεσης του TF με τον FVII πάνω σε φωσφολιπιδική μεμβράνη. Πέρα από το βασικό μετάγραφο του ανθρώπινου TF, πρόσφατα ανακαλύφθηκε ένα εναλλακτικό μεταγραφικό ισόφορμο του, ο astf, που θεωρείται ότι αποτελεί μια ενεργή εκκρινόμενη μορφή του TF [19-20]. Στο μεταγράφημα του astf δεν περιλαμβάνεται το εξώνιο 5 με αποτέλεσμα το προϊόν της μετάφρασής του να αποτελείται από 206 αμινοξέα όπου διατηρείται το εξωκυττάριο τμήμα του πλήρους μεταγραφήματος αλλά λείπει το 32

33 διαμεμβρανικό τμήμα γεγονός που το καθιστά διαλυτό. Επιπλέον υπάρχει μεταβολή του αναγνωστικού πλαισίου του astf μετά τη θέση απάλειψης του εξωνίου 5 με αποτέλεσμα να δημιουργείται μια αποκλειστική περιοχή του astf (unique region of astf) 40 αμινοξέων που βρίσκεται στο 3 άκρο. Το mrna του astf εντοπίσθηκε στα νεφρά, τον εγκέφαλο, την καρδιά, τον πλακούντα, τα κύτταρα των νησιδίων, και τον πνεύμονα και θεωρείται ότι έχει πηκτικές ιδιότητες. Και τα 2 ισόφορμα κυκλοφορούν στο αίμα. Το 10%-30% του αντιγόνου του TF που ανιχνεύεται στο πλάσμα ανήκει στον astf. 4. Έκφραση του TF Ο ιστικός παράγοντας εκφράζεται συστηματικά στο αγγειακό τοίχωμα (vascular wall), στα αστροκύτταρα, στο περίβλημα των οργάνων, στους ινοβλάστες, στα κύτταρα του λιπώδους ιστού και στα επιθηλιακά κύτταρα [21-22]. Οι Sp1 περιοχές θεωρούνται ρυθμιστικά στοιχεία αρμόδια για τη βασική δραστηριότητα του υποκινητή [23], ενώ οι τρεις Sp1 περιοχές που αντιστοιχούν στα Sp1III, Sp1IV και Sp1V του ανθρώπινου υποκινητή του TF είναι συντηρημένες στις ακολουθίες DNA του ανθρώπου, του ποντικού, του αρουραίου και του χοίρου [11]. Η Sp1 είναι μια πυρηνική πρωτεΐνη που υποκινεί την έναρξη της μεταγραφής σε ευκαρυωτικά κύτταρα με τη βοήθεια του σχηματισμού ενός λειτουργικού συμπλόκου που περιλαμβάνει την RNA πολυμεράση ΙΙ, τις πρωτεΐνες ενεργοποιητών και το DNA του στόχου. Οι πολλαπλές περιοχές συνδέσεων Sp1 δρουν συνεργικά και απαιτούνται τουλάχιστον δύο από αυτές για τη βασική μεταγραφή [11]. Διάφορα μέλη της οικογένειας SP έχουν προσδιοριστεί, συμπεριλαμβανομένων των Sp1, Sp2, Sp3 και Sp4. Οι Sp1, Sp3 και Sp4 δεσμεύουν την ίδια περιοχή σύνδεσης στο DNA. Οι Sp1 και Sp3 εκφράζονται συνεχώς, όμως σε ποικίλα επίπεδα στους διάφορους ιστούς και κύτταρα ενώ η Sp3 γενικά λειτουργεί ως ανταγωνιστικός 33

34 αναστολέας της προκληθείσας έκφρασης από την Sp1 και έχει αποδειχθεί ότι περιορίζει την επαγωγή του TF μέσω Sp1 σε κύτταρα ανθρώπινου ενδομητρίου [24]. Κατά συνέπεια, η αναλογία Sp1/Sp3 σε κάθε κύτταρο μπορεί να καθορίσει το επίπεδο έκφρασης του γονιδίου TF. Πολλοί κυτταρικοί τύποι παράγουν σημαντικά ποσά TF, έπειτα από διέγερση με διάφορους παράγοντες. Οι λείες μυϊκές ίνες ύστερα από επαγωγή με αναπτυξιακούς παράγοντες εκφράζουν TF και το ίδιο παρατηρείται και στα ενδοθηλιακά κύτταρα έπειτα από διέγερση με διεγέρτες όπως ο TNF-α, η ισταμίνη, το LPS,οι κυτοκίνες. Πιο συγκεκριμένα, ο ανθρώπινος υποκινητής του TF περιλαμβάνει δύο περιοχές που εμπλέκονται στην επαγόμενη γονιδιακή έκφραση. Η πρώτη περιοχή ονομάζεται LPS-responsive στοιχείο και εκτείνεται από τη θέση έως και περιλαμβάνει τα AP-1, κb, και τον πυρηνικό παράγοντα (NF) στα ενεργοποιημένα Τ κύτταρα [11, 13, 25]. Σε διαφορετικές μελέτες σε κυτταροκαλλιέργειες, έχει αποδειχθεί ότι η LPS περιοχή του υποκινητή μεσολαβεί για την επαγωγή του TF σε απάντηση στο LPS, τους φορβολικούς εστέρες και ερεθίσματα που προάγουν τη φλεγμονή(προφλεγμονώδη) όπως η ιντερλευκίνη- 1 και ο TNF-α [25-27]. Η δεύτερη περιοχή εκτείνεται από τις θέσεις -109 έως -59 και περιλαμβάνει τρεις egr-1- δεσμευτικές περιοχές. Αυτή η περιοχή ρυθμίζει τη μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου TF σε απάντηση στον ορό, τον VEGF, τους φορβολικούς εστέρες, τις οξειδωμένες λιποπρωτεΐνες, και το LPS [28-31]. Άλλοι παράγοντες που επάγουν την παραγωγή TF είναι η ιντερφερόνη, η πρωτεΐνη CRP, η IL-6 και η αναφυλατοξίνη του συμπληρώματος C5a [32]. Γενικά, απαιτείται μια συνεργική ενεργοποίηση διάφορων μεταγραφικών παραγόντων για την επαγόμενη έκφραση του TF, αλλά ταυτόχρονα οι µεταγραφικοί παράγοντες αντιδρούν με τον υποκινητή του ΤF με τρόπο ανταγωνιστικό και συγκεκριμένο για κάθε είδος κυττάρου. 34

35 5. Θρομβωτική δράση του TF μέσω του συμπλέγματος TF/VIIa Ο TF με την δέσμευσή του στον παράγοντα VII ενισχύει την πολύ ασθενή πρωτεασική του ιδιότητα (πρωτεάση σερίνης) περισσότερο από ένα εκατομμύριο φορές. Το σύμπλοκο TF/FVIIa προκειμένου να αναπτύξει τη μέγιστη δραστηριότητά του είναι εξαρτώμενο από την παρουσία αρνητικά φορτισμένης φωσφολιπιδιακής επιφάνειας (π.χ. φωσφατιδυλοσερίνη -CP)] στην οποία ο TF προσδένει τον παράγοντα VII [33-35]. Ο παράγοντας VII και τα υπόλοιπα ζυμογόνα όπως ο FIX και FX που εξαρτώνται από τη βιταμίνη Κ καθώς και η πρωτεΐνη C έχουν μεγάλο βαθμό ομολογίας οι οποίες περιέχουν όλες γ-καρβοξυλογλουταμινικό οξύ (Gla) στο αμινοτελικό άκρο και ακολουθούν δύο EGF-like περιοχές (EGF1 και EGF2) καθώς και μια περιοχή σερίνης πρωτεάσης στο καρβοξυτελικό άκρο [36]. Η ενεργοποίηση αυτών των ζυμογόνων οδηγεί σε μόρια που αποτελούνται από μια αμινοτελική ελαφριά αλυσίδα και μια καρβοξυτελική βαριά αλυσίδα που συνδέεται με δισουλφιδικούς δεσμούς. Η εύκαμπτη ελαφριά αλυσίδα περιέχει τις περιοχές Gla, EGF1 και EGF2, ενώ η βαριά αλυσίδα περιέχει την περιοχή σερινοπρωτεάσης [37-44]. Η εύκαμπτη ελαφριά αλυσίδα του FVIIa τυλίγεται γύρω από τον άκαμπτο διαλυτό TF κατά τέτοιο τρόπο ώστε και οι τέσσερις λειτουργικές περιοχές του FVIIa, καθώς επίσης και οι δύο FNIII περιοχές του εξωκυτταρικού μέρους του TF, να συμβάλλουν στην αλληλεπίδραση. Το γεγονός ότι οι πρωτεΐνες-υποστρώματα του συμπλόκου TF/FVIIa (FIX και FX) καθιστούν πολύ πιθανή τη δέσμεσυσή τους με παρόμοιο τρόπο επάνω στο ΤF/FVIIa σύμπλοκο [45-46]. 6. Μη θρομβωτική δράση του TF Ο TF εκτός από βασικός υποκινητής της πήξης, έχει ενοχοποιηθεί για τη συμμετοχή του σε διαδικασίες όπως η αγγειογένεση, η μετάσταση, η φλεγμονή 35

36 και πρόσφατα η ίνωση. Πειράματα σε έμβρυα ποντικιών έδειξαν ότι knock-out TF ποντίκια πεθαίνουν στην μήτρα κατά την όγδοη με δέκατη μέρα της κύησης λόγω αιμορραγίας και κακής διάπλασης των αγγείων του εμβρυακού σάκκου. Επίσης, ποντίκια knock-out στον VII και Χ επιζούν μέχρι την γέννηση τους, παρουσιάζοντας αγγειακή δυσπλασία, εμπλέκοντας με αυτό τον τρόπο τον ιστικό παράγοντα σε έναν θρομβο-ανεξάρτητο αγγειογενετικό ρόλο [47]. Περαιτέρω πειράματα σε διάφορα ανθρώπινα κύτταρα έδειξαν ότι ο TF προκαλεί την υπερέκφραση του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) [48], ενός σημαντικού παράγοντα της αγγειογένεσης και υποέκφραση της θρομβοσπονδίνης, ενός αντι-αγγειογενετικού παράγοντα. Εικόνα 4. Μη θρομβωτική δράση του TF Λόγω αυτής της αγγειογενετικής ιδιότητας του ιστικού παράγοντα ο ρόλος του έχει εμπλακεί στη καρκινική αύξηση, παρέχοντας αγγείωση απαραίτητη για την πρόοδο του καρκίνου, καθώς και στην μετάσταση, αφού υπερέκφρασή του έχει παρατηρηθεί σε μεταστατικούς καρκίνους. Πιο συγκεκριμένα, ο ιστικός παράγοντας μέσω της θρομβίνης προάγει τη μετάσταση διευκολύνοντας την αλληλοεπίδραση των καρκινικών κυττάρων με 36