ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΓΝΩΣΤΩΝ ΣΗΜΕΙΑΚΩΝ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ΣΤΟ ΓΟΝΙΔΙΟ ΤΗΣ α- ΣΦΑΙΡΙΝΗΣ ΜΕ ΤΗΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΕΠΕΚΤΑΣΗΣ ΕΚΚΙΝΗΤΗ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ-ΜΟΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΓΝΩΣΤΩΝ ΣΗΜΕΙΑΚΩΝ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ΣΤΟ ΓΟΝΙΔΙΟ ΤΗΣ α- ΣΦΑΙΡΙΝΗΣ ΜΕ ΤΗΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΕΠΕΚΤΑΣΗΣ ΕΚΚΙΝΗΤΗ ΑΜΑΛΙΑ ΠΟΥΛΑ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΑΘΗΝΑ 2012

2 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΔΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΣΠΟΥΔΩΝ ΚΛΙΝΙΚΗ ΒΙΟΧΗΜΕΙΑ-ΜΟΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΓΝΩΣΤΩΝ ΣΗΜΕΙΑΚΩΝ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ΣΤΟ ΓΟΝΙΔΙΟ ΤΗΣ α- ΣΦΑΙΡΙΝΗΣ ΜΕ ΤΗΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΕΠΕΚΤΑΣΗΣ ΕΚΚΙΝΗΤΗ ΑΜΑΛΙΑ ΠΟΥΛΑ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΑΘΗΝΑ 2012

3 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΑΝΑΛΥΤΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΓΝΩΣΤΩΝ ΣΗΜΕΙΑΚΩΝ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ΣΤΟ ΓΟΝΙΔΙΟ ΤΗΣ α- ΣΦΑΙΡΙΝΗΣ ΜΕ ΤΗΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΕΠΕΚΤΑΣΗΣ ΕΚΚΙΝΗΤΗ ΑΜΑΛΙΑ ΠΟΥΛΑ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ Π. ΙΩΑΝΝΟΥ - ΑΜΑΡΑΝΤΙΔΟΥ (ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ) Α. ΣΚΟΡΙΛΑΣ (ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ) J. TRAEGER - ΣΥΝΟΔΙΝΟΥ (ΕΠΙΚΟΥΡΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ) ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΔΙΠΛΩΜΑΤΟΣ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΑΘΗΝΑ 2012

4 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωματική εργασία με θέμα: "Ανάπτυξη μεθόδων ανίχνευσης γνωστών σημειακών μεταλλάξεων στο γονίδιο της α-σφαιρίνης με την αντίδραση επέκτασης εκκινητή" εκπονήθηκε στο τμήμα Χημείας, στο εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας, στα πλαίσια του Διατμηματικού Προγράμματος Μεταπτυχιακών Σπουδών "Κλινική Βιοχημεία Μοριακή Διαγνωστική". Στο σημείο αυτό θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαιτέρως την Καθηγήτρια του Τμήματος Χημείας κα. Ιωάννου Αμαραντίδου Πηνελόπη, για τις γνώσεις που μου μετέδωσε κατά τη διεξαγωγή της εργασίας, καθώς και για τις χρήσιμες συμβουλές και την καθοδήγησή της. Την ευχαριστώ πολύ που με εμπιστεύτηκε να φέρω εις πέρας την εργασία αυτή και με υπομονή με βοήθησε να την ολοκληρώσω. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω θερμά την κα. Traeger Συνοδινού Jan, καθώς και τον κ. Σκορίλα Ανδρέα για τις συμβουλές και τις διορθώσεις τους στο κείμενο της εργασίας, ως μέλη της τριμελούς επιτροπής. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω το "Χωρέμειο Ερευνητικό Εργαστήριο" του Νοσοκομείου Παίδων "Αγία Σοφία" για τα κλινικά δείγματα που μας παραχώρησε στα πλαίσια της ερευνητικής εργασίας. Θα ήταν πραγματική παράληψη εκ μέρους μου αν δεν ευχαριστούσα τους διδακτορικούς φοιτητές του εργαστηρίου μου, Φραντζέσκο Παπανίκο και Μαργαρίτα Πετροπούλου, για την πολύτιμη βοήθειά τους, την υπομονή τους και τις υποδείξεις τους κατά τη διάρκεια της εκτέλεσης της διπλωματικής μου εργασίας. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστήσω την συμφοιτήτριά μου Χριστίνα Σκουλάτου, για την εποικοδομητική συνεργασία μας και τις ευχάριστες στιγμές που περάσαμε ως συνάδελφοι κατά την εκπόνηση της διπλωματικής μας εργασίας στο εργαστήριο Αναλυτικής Χημείας. ΑΘΗΝΑ 2012

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΚΕΦΑΛΑΙΟ Η ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗ ΣΕ ΜΟΡΙΑΚΟ ΕΠΙΠΕΔΟ Δομή και λειτουργία της αιμοσφαιρίνης Τα γονίδια της αιμοσφαιρίνης Η οργάνωση των γονιδίων της αιμοσφαιρίνης Η έκφραση των γονιδίων της αιμοσφαιρίνης κατά την ανάπτυξη Η μεταστροφή της ερυθροποίησης Μοριακοί μηχανισμοί μεταστροφής της ερυθροποίησης Τα cis-ρυθμιστικά στοιχεία των γονιδίων των α-σφαιρινών Μοντέλα δράσης των ρυθμιστικών στοιχείων Το ρυθμιστικό στοιχείο HS Η σταθεροποιητική πρωτεΐνη της α-αιμοσφαιρίνης (AHSP) ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΟΙ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΕΣ Διαταραχές στην παραγωγή σφαιρινικών αλυσίδων Μοριακή βάση της α-θαλασσαιμίας Θαλασσαιμίες που προκαλούνται από ελλείμματα (deletional) Θαλασσαιμίες που προκαλούνται από σημειακές μεταλλάξεις (non-deletional) Παραλλαγές της α-θαλασσαιμίας Κλινική ετερογένεια της α-θαλασσαιμίας Κλινικά χαρακτηριστικά της α-θαλασσαιμίας Ετερόζυγος α-θαλασσαιμία Αιμοσφαιρινοπάθεια Η Σύνδρομο Hb Bart s εμβρυϊκού ύδρωπα Οι εξεταζόμενες μεταλλάξεις Hb Heraklion [α1, cd36/37 (-CCC), Pro 0] Hb Taybe [α1, cd38/39 (-ACC), Thr 0] Hb Adana [α1 ή α2, α59(e8)gly Asp] Hb Aghia Sophia [α1, α62(e11) (-GTG), Val 0] Hb Questembert [α1 ή α2, α131(h14) Ser Pro, TCT>CCT] ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ΣΤΟ ΓΟΝΙΔΙΟ ΤΗΣ α-σφαιρινησ Μέθοδοι ανίχνευσης μεταλλάξεων Τεχνικές ανίχνευσης γνωστών μεταλλάξεων Άμεση ανάλυση αλληλουχίας (sequencing) Gap-PCR Αποτύπωση κατά Southern (Southern blot) Ανάλυση προϊόντος PCR με περιοριστικά ένζυμα (Restriction-Enzyme PCR, RE- PCR) Αλληλοειδικός ολιγονουκλεοτιδικός υβριδισμός (Allele-Specific Oligonucleotide, ASO) και ανάστροφη αποτύπωση κηλίδας (Reverse Dot-Blot, RDB) Αλληλοειδική PCR (Amlification Refractory Mutation System, ARMS-PCR) Τεχνικές ανίχνευσης άγνωστων μεταλλάξεων (τεχνικές για screening) DGGE και SSCP Ανάλυση καμπύλης τήξης DNA υψηλής διακριτικότητας (High Resolution melting analysis, HRMA) Αποδιατακτική υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (Denaturing High Performance Liquid Chromatography, DHPLC) Πολλαπλή ενίσχυση ανιχνευτών εξαρτώμενη από αντίδραση λιγάσης (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, MLPA) Αντίδραση επέκτασης εκκινητή (Primer Extension Reaction, PEXT) i

6 3.5 Σκοπός της εργασίας ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Οργανολογία Υλικά Αντιδραστήρια Διαλύματα Ολιγονουκλεοτίδια Μέθοδοι Απομόνωση DNA από περιφερικό αίμα > Απομόνωση γενωμικού DNA για την ενίσχυση τμήματος του γονιδίου ΗΒΑ Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) > Ενίσχυση τμήματος του γονιδίου ΗΒΑ Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης και ποσοτικοποίηση των προϊόντων ενίσχυσης Αντίδραση επέκτασης εκκινητή (Primer Extension Reaction, PEXT) Κατασκευή ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων (strip) Σύζευξη νανοσφαιριδίων χρυσού με αντίσωμα Σύζευξη COOH σφαιριδίων πολυστυρενίου με NH 2 -ολιγονουκλεοτίδια Σήμανση των σφαιριδίων πολυστυρενίου με βιοτίνη για τη χρησιμοποίησή τους στη ζώνη ελέγχου Ενζυμική προσθήκη δεοξυνουκλεοτιδίων στο 3 άκρο των εκκινητών της ΡΕΧΤ παρουσία biotin d-utp Παρασκευή PCR προϊόντος που περιέχει μία μετάλλαξη (mutagenic PCR) Παρασκευή τμημάτων Α και Β Σύνδεση των τμημάτων Α και Β Ενίσχυση του προϊόντος A-B που περιέχει την επιθυμητή μετάλλαξη Κλωνοποίηση των PCR προϊόντων που φέρουν τις μεταλλάξεις Επιδεκτά κύτταρα Μετασχηματισμός των επιδεκτικών κυττάρων με το φορέα, στον οποίο έχει ενσωματωθεί το μεταλλαγμένο προϊόν ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ Ενίσχυση τμήματος του γονιδίου ΗΒΑ Βελτιστοποιήσεις της PCR Μελέτη επίδρασης DMSO στην αντίδραση της PCR Μελέτη επίδρασης θερμοκρασίας υβριδοποίησης των εκκινητών (annealing) Μελέτη επίδρασης συγκέντρωσης ιόντων μαγνησίου Μελέτη επίδρασης ενεργότητας ενζύμου Μελέτη επίδρασης του χρόνου αποδιάταξης του DNA Μελέτη επίδρασης του χρόνου υβριδοποίησης των εκκινητών Αντίδραση επέκτασης εκκινητή (ΡΕΧΤ) Ανίχνευση προϊόντων ΡΕΧΤ σε ταινία ξηρών αντιδραστηρίων Αντιδράσεις ΡΕΧΤ με την Vent(exo-) πολυμεράση Μελέτη επίδρασης πολυμερασών με εξωνουκλεοτιδική δραστικότητα στην αντίδραση ΡΕΧΤ Μελέτη επίδρασης θερμοκρασίας υβριδοποίησης εκκινητών Μελέτη επίδρασης συγκέντρωσης ιόντων μαγνησίου Μελέτη επίδρασης ενεργότητας ενζύμου Μελέτη επίδρασης της ποσότητας των εκκινητών στην αντίδραση ΡΕΧΤ > Μελέτη επίδρασης συγκέντρωσης φορμαμιδίου στην αντίδραση ΡΕΧΤ > Μελέτη επίδρασης της ποσότητας του ζεύγους των αλληλοειδικών εκκινητών για τη μετάλλαξη Hb Questembert σε σχέση με τους άλλους εκκινητές > Μελέτη επίδρασης της αλλαγής διεύθυνσης των 9Ν-9Μ εκκινητών ii

7 > Επίδραση της θέσης απόθεσης των ολιγονουκλεοτιδίων ακινητοποίησης (ΟΑ) στη διαγνωστική μεμβράνη Μελέτη του χρόνου υβριδοποίησης των εκκινητών Μελέτη επίδρασης της συγκέντρωσης των dntps Μελέτη επίδρασης DMSO στην αντίδραση της ΡΕΧΤ Μελέτη ευαισθησίας της αντίδρασης ΡΕΧΤ Μελέτη αριθμού των κύκλων στην αντίδραση ΡΕΧΤ Μελέτη σύστασης διαλύματος ανάπτυξης Μελέτη ειδικότητας των εκκινητών της αντίδρασης ΡΕΧΤ Επαναληψιμότητα της ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων Αξιολόγηση της μεθόδου Σύνθεση μεταλλαγμένων αλληλόμορφων μέσω κατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης (mutagenic PCR) Αξιολόγηση της μεθόδου Κλωνοποίηση των συνθετικών μεταλλαγμένων προϊόντων σε πλασμίδια Αξιολόγηση της μεθόδου Έλεγχος του πλασμιδιακού DNA Έλεγχος εισαγωγής των μεταλλάξεων στα συνθετικά προϊόντα DNA Συζήτηση ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ ABSTRACT ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Α ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Β Βελτιστοποιήσεις στη μεταλλαξιγόνο PCR για τη σύνθεση τμημάτων DNA που φέρουν τις μεταλλάξεις Hb Heraklion, Hb Adana και Hb Questembert > Μελέτη συγκέντρωσης DMSO > Μελέτη θερμοκρασίας υβριδοποίησης της PCR για την παρασκευή του προϊόντος Β (Hb Heraklion) Παρασκευή τμήματος DNA (1087 bp) που φέρει τη μετάλλαξη Hb Questembert Mutagenic PCR για την Hb Adana σε τμήμα 1087 bp iii

8 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1 Η ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗ ΣΕ ΜΟΡΙΑΚΟ ΕΠΙΠΕΔΟ 1.1 Δομή και λειτουργία της αιμοσφαιρίνης Η αιμοσφαιρίνη είναι μία μεταλλοπρωτεΐνη που παράγεται από τα ερυθροκύτταρα και μεταφέρει οξυγόνο από τους πνεύμονες στα υπόλοιπα όργανα και ιστούς. Εκεί, απελευθερώνει το οξυγόνο με τη διαδικασία της οξειδωτικής φωσφορυλίωσης ώστε να επιτευχθεί η γλυκόλυση και η παραγωγή ενέργειας (ΑΤΡ) για τις λειτουργίες του οργανισμού. Στη συνέχεια, συλλέγει το προκύπτον διοξείδιο του άνθρακα, ώστε να το επαναφέρει στα όργανα του αναπνευστικού συστήματος για να το αποβάλλουν από τον οργανισμό. Η αιμοσφαιρίνη εμπλέκεται στη μεταφορά και άλλων αερίων, όπως του διοξειδίου του άνθρακα (περίπου 10% του ολικού) ως διοξυ-αμινο-αιμοσφαιρίνη, στην οποία το CO 2 συνδέεται με την πρωτεΐνη της σφαιρίνης. Η πρωτεΐνη μεταφέρει επίσης ένα σημαντικό ρυθμιστικό μόριο, το νιτρικό οξείδιο, που συνδέεται σε μία ομάδα θειόλης της σφαιρίνης και απελευθερώνεται ταυτόχρονα με το οξυγόνο. Το μόριο της αιμοσφαιρίνης εντοπίζεται επίσης και εκτός των ερυθροκυττάρων και των προγονικών σειρών τους. Τέτοια κύτταρα είναι οι Α9 ντοπαμινεργικοί νευρώνες στη μέλαινα ουσία, τα μακροφάγα, τα κυψελιδικά κύτταρα και τα μεσαγγειακά κύτταρα στους νεφρούς. Σε αυτούς τους ιστούς, η αιμοσφαιρίνη δε λειτουργεί ως μεταφορέας οξυγόνου, αλλά ως αντιοξειδωτικός παράγοντας και ρυθμιστής του μεταβολισμού του σιδήρου. Η αιμοσφαιρίνη ως πρωτεΐνη μεταφοράς οξυγόνου ανακαλύφθηκε το 1840 από τον Hünefeld. Η μοριακή δομή της αιμοσφαιρίνης ανακαλύφθηκε το 1959 από τον Max Perutz με τη χρήση της κρυσταλλογραφίας με ακτίνες Χ, ο οποίος μοιράστηκε το βραβείο Νόμπελ Χημείας με τον John Kendrew το Ο ρόλος της αιμοσφαιρίνης στο αίμα αποσαφηνίσθηκε από τον φυσιολόγο Claude Bernard. Το όνομα της πρωτεΐνης προκύπτει από τις λέξεις αίμη και σφαιρίνη, αντανακλώντας το γεγονός ότι κάθε υπομονάδα αιμοσφαιρίνης είναι μία πρωτεΐνη (σφαιρίνη) συνδεδεμένη με μία ομάδα αίμης. Κάθε ομάδα αίμης περιέχει ένα άτομο σιδήρου, το οποίο μπορεί να συνδεθεί με ένα μόριο οξυγόνου μέσω παραγόμενων ιοντικών διπολικών δυνάμεων. Το ιόν του σιδήρου που συνδέεται στην αίμη μπορεί να είναι 1

9 είτε Fe 2+ είτε Fe 3+, αλλά μόνο ο Fe 2+ έχει τη δυνατότητα να συνδέεται με το οξυγόνο. Όταν η αιμοσφαιρίνη είναι συνδεδεμένη με οξυγόνο ονομάζεται οξυαιμοσφαιρίνη, ενώ όταν δεν είναι συνδεδεμένη λέγεται δεοξυαιμοσφαιρίνη. Ο πιο κοινός τύπος αιμοσφαιρίνης στα θηλαστικά περιλαμβάνει τέσσερεις τέτοιες υπομονάδες. Τα περισσότερα αμινοξέα των αιμοσφαιρινών σχηματίζουν α-έλικες, που συνδέονται με μικρά μη ελικοειδή στοιχεία. Κάθε αλυσίδα αιμοσφαιρίνης αποτελείται από 8 α-έλικες και 8 μη ελικοειδή τμήματα. Οι έλικες ονομάζονται A, B, C, D, E, F, G και Η, από το αμινοτελικό προς το καρβοξυτελικό άκρο των αιμοσφαιρινών. Οι έλικες Α, Β, C και Ε βρίσκονται σε πιο απομακρυσμένη θέση από την αίμη, ενώ οι F, G και Η βρίσκονται κοντά στην αίμη. Οι δεσμοί υδρογόνου σταθεροποιούν τα ελικοειδή τμήματα μέσα στην πρωτεΐνη, δημιουργώντας έλξεις μέσα στο μόριο και αναδιπλώνοντας κάθε πολυπεπτιδική αλυσίδα σε ένα συγκεκριμένο σχήμα [1]. Τα ερυθροκύτταρα του αίματος, που παράγονται στο μυελό των οστών των ενηλίκων, είναι απύρηνα, εφόσον έχουν χάσει τους πυρήνες τους λίγο πριν εξέλθουν από το μυελό. Τα νεαρά ερυθροκύτταρα, τα οποία ονομάζονται δικτυοκύτταρα, περιέχουν ακόμα κάποια ποσότητα αγγελιοφόρου RNA, η οποία εξαφανίζεται μετά από μερικές ημέρες. Για το υπόλοιπο της ζωής τους, που είναι περίπου 120 ημέρες, τα ερυθροκύτταρα κυκλοφορούν στο αίμα ως ελαστικοί σάκοι από μεμβράνη που περιέχουν πρωτεΐνες, από τις οποίες το 70% είναι αιμοσφαιρίνη. Η αιμοσφαιρίνη έχει δομή τετραμερούς που αποτελείται από δύο α- και δύο β-αλυσίδες, οι οποίες αλληλοσυνδέονται με δεσμούς υδρογόνου σχηματίζοντας μία σταθερή δομή (Εικόνα 1.1). Κάθε αιμοσφαιρινική αλυσίδα περιέχει επίσης ένα μόριο αίμης (μία τετρακυκλική οργανική ένωση) που αποτελεί προϊόν ενός πολύπλοκου μεταβολικού μονοπατιού πολλών σταδίων. Σε συνδυασμό με το σίδηρο, το μόριο της αίμης προσδένει μοριακό οξυγόνο [2]. 2

10 Εικόνα 1.1: Απεικόνιση του τετραμερούς της αιμοσφαιρίνης. Κάθε μία από τις δύο α- και β-αλυσίδες προσδένονται με ένα μόριο αίμης (η επίπεδη δομή στο κέντρο κάθε υπομονάδας) [3]. 1.2 Τα γονίδια της αιμοσφαιρίνης Τα γονίδια της α- και της β-σφαιρίνης αποτελούν μέλη γονιδιακών οικογενειών, με την οικογένεια της β-σφαιρίνης στο χρωμόσωμα 11 και της α-σφαιρίνης στο χρωμόσωμα 16. Εκτός από τα σπουδαιότερα γονίδια των ενηλίκων α και β, οι οικογένειες αυτές περιέχουν και άλλες εκφραζόμενες αλληλουχίες, οι οποίες χρησιμοποιούνται σε διαφορετικές χρονικές περιόδους κατά την ανάπτυξη. Και στις δύο οικογένειες τα γονίδια είναι διευθετημένα έτσι, ώστε η κατεύθυνση μεταγραφής τους από 5 προς 3 να είναι για όλα η ίδια. Τα γονίδια που χρησιμοποιούνται σε πρώιμο στάδιο της ανάπτυξης βρίσκονται στο 5 άκρο της οικογένειας και εκείνα που χρησιμοποιούνται τελευταία στο 3 άκρο. Και οι δύο οικογένειες των σφαιρινών περιέχουν ψευδογονίδια, δηλαδή κατάλοιπα άλλοτε λειτουργικών γονιδίων, στα οποία έχουν συμβεί μεταλλάξεις, που τα έχουν καταστήσει πλέον μη ικανά να παράγουν πρωτεΐνη. Και στις δύο οικογένειες η πλειονότητα του DNA βρίσκεται εκτός γονιδίων, στις μεταξύ τους περιοχές, ο ρόλος των οποίων είναι αδιευκρίνιστος [2]. Όλα τα λειτουργικά γονίδια της σφαιρίνης του ανθρώπου έχουν παρόμοια βασική δομή που αποτελείται από περίπου 1500 νουκλεοτίδια με 3 εξόνια, τα οποία διαχωρίζονται από 2 ιντρόνια ή παρεμβαίνουσες αλληλουχίες (IVS). Τα αμινοξέα των αλυσίδων της σφαιρίνης που εμπλέκονται στη σύνδεση της αίμης ή στη σύνδεση των α- και β-αλυσίδων μεταξύ τους, κωδικοποιούνται κυρίως από το εξόνιο 2. Τα μοτίβα 3

11 των συντηρημένων αλληλουχιών που είναι σημαντικά για τη σωστή γονιδιακή λειτουργία, βρίσκονται σε συγκεκριμένες θέσεις μέσα στα γονίδια των σφαιρινών. Βασικά, υπάρχουν τουλάχιστον τρία θετικά μοτίβα cis-αλληλουχιών, που είναι απαραίτητα για την κανονική μεταγραφή των γονιδίων και βρίσκονται στην 5 περιοχή του υποκινητή, bp ανοδικά από το mrna cap. Αυτά περιλαμβάνουν ένα κουτί ΤΑΤΑ (περίπου στις -30 bp), ένα κουτί CCAAT (μεταξύ -70 και -90 bp) και τα CACCC και/ή τα CCGCCC μοτίβα να τοποθετούνται αρκετά πριν από τον υποκινητή. Η 5 μη μεταφραζόμενη περιοχή (5 UTR) του mrna της σφαιρίνης κωδικοποιείται από νουκλεοτίδια μεταξύ του σημείου cap και του κωδικονίου έναρξης (ATG) και περιλαμβάνει συντηρημένα μοτίβα αλληλουχιών που ρυθμίζουν τη γονιδιακή μεταγραφή. Η 3 μη μεταφραζόμενη περιοχή (3 UTR) κωδικοποιείται από την περιοχή ανάμεσα στο κωδικόνιο τερματισμού (ΤΑΑ) και την poly(a) ουρά. Περιέχει την υψηλά συντηρημένη αλληλουχία ΑΑΤΑΑΑ, που βρίσκεται 20 νουκλεοτίδια πριν την poly(a) ουρά και η οποία λειτουργεί ως σήμα για το κόψιμο του 3 άκρου του πρώιμου μετάγραφου και την προσθήκη της poly(a) ουράς, η οποία προσδίδει σταθερότητα στο επεξεργασμένο mrna και ενισχύει τη μετάφρασή του. Επιπλέον, άλλες αλληλουχίες στο 3 UTR φαίνεται να παίζουν ρόλο στο σχηματισμό του pre-mrna, συμπεριλαμβάνοντας τη σειρά των πολυπυριμιδινών που ακολουθεί αμέσως το κωδικόνιο τερματισμού. Επίσης, το σωστό μάτισμα (splicing) του mrna της σφαιρίνης εξαρτάται από την παρουσία σταθερών δινουκλεοτιδίων στα σημεία ένωσης των ιντρονίων/εξονίων (GT στο 5 άκρο και AG στο 3 άκρο κάθε ιντρονίου) και από την παρουσία συγκεκριμένων νουκλεοτιδίων γύρω από τα σημεία συνένωσης [4]. 1.3 Η οργάνωση των γονιδίων της αιμοσφαιρίνης Τα γονίδια των αιμοσφαιρινών εντοπίζονται σε δύο πολυγονιδιακές συστοιχίες (clusters). Η συστοιχία των γονιδίων της α-σφαιρίνης, που βρίσκεται κοντά στην τελομερική περιοχή του κοντού βραχίονα του χρωμοσώματος 16 (16p13.3, GenBank NG ) και εκτείνεται σε μήκος 28 kb, περιλαμβάνει ένα εμβρυονικό γονίδιο ζ- σφαιρίνης (ζ 2 ), δύο γονίδια α-σφαιρίνης (α2, α1), τρία ψευδογονίδια (ψζ 1, ψα 2, ψα 1 ) και το γονίδιο της θ-σφαιρίνης (Εικόνα 1.2), που δεν έχει προσδιοριστεί η λειτουργία του [4]. Πρόσφατες μελέτες έχουν ανακαλύψει ότι το ψα 2 γονίδιο εκφράζει ένα 4

12 μετάγραφο και έχει μετονομαστεί σε μ-σφαιρίνη, παρόλο που δεν έχει ανιχνευθεί κανένα πρωτεϊνικό προϊόν [5]. Εικόνα 1.2: Οι γονιδιακές συστοιχίες των α- και β-σφαιρινών [4]. Τα γονίδια της α1- και α2-σφαιρίνης (ΗΒΑ1: ΟΜΙΜ και ΗΒΑ2: ΟΜΙΜ , αντίστοιχα) είναι σχεδόν όμοια, διαφέροντας μόνο στην εισαγωγή επτά νουκλεοτιδίων κοντά στο άκρο του ιντρονίου 2 στο α2 γονίδιο, σε δύο αντικαταστάσεις βάσεων στο ιντρόνιο 2 (+509 και +573 του σημείου cap) και σε αρκετές διαφορές νουκλεοτιδίων στην περιοχή μετά το εξόνιο 3. Επιπλέον, τα διπλασιασμένα γονίδια της α-σφαιρίνης είναι ενσωματωμένα σε τρεις μεγαλύτερες ομόλογες αλληλουχίες, που είναι γνωστές ως Χ, Ψ και Ζ περιοχές (boxes) (Εικόνα 1.3), οι οποίες παίζουν ρόλο στην παραγωγή των δύο πιο κοινών ελλειμμάτων α + - θαλασσαιμίας. Παρόλο που τα δύο α-γονίδια έχουν υψηλά ομόλογες περιοχές (98,5%), το γονίδιο της α2-σφαιρίνης παράγει φυσιολογικά 2 έως 3 φορές περισσότερες αλυσίδες αιμοσφαιρίνης από το α1 γονίδιο. Εικόνα 1.3: Τα δύο α γονίδια της αιμοσφαιρίνης και η θέση των Χ, Ψ και Ζ ομόλογων περιοχών (boxes) [4]. Τα εμβρυονικά γονίδια των α-σφαιρινών έχουν 58% ομολογία σε αμινοξικό επίπεδο με τα γονίδια του ενήλικα και φαίνεται ότι η ζ-σφαιρίνη μπορεί να 5

13 αντικαταστήσει την α-σφαιρίνη σε έναν ενήλικο οργανισμό, χωρίς να προκαλέσει επιβλαβή αποτελέσματα [6]. Η συστοιχία των γονιδίων της β-σφαιρίνης (ΗΒΒ: ΟΜΙΜ ), που εκτείνεται σε μήκος μεγαλύτερο από 50 kb, βρίσκεται στον κοντό βραχίονα του χρωμοσώματος 11 (11p15.5, GenBank: NM_000518), μαζί με το εμβρυονικό γονίδιο της ε-σφαιρίνης, δύο εμβρυϊκά γονίδια σφαιρίνης ( G γ και Α γ), το γονίδιο της δ-σφαιρίνης, που εκφράζεται σε μικρή ποσότητα στους ενήλικες, και ένα ψευδογονίδιο. Η ιστοειδική και η ειδική για τα στάδια ανάπτυξης συντονισμένη έκφραση των γονιδίων της σφαιρίνης, εξαρτάται από την παρουσία απομακρυσμένων cisρυθμιστικών στοιχείων. Το ρυθμιστικό στοιχείο της συστοιχίας των α-σφαιρινών αναφέρεται ως HS-40 και χαρακτηρίζεται από μία ερυθροειδική περιοχή, υπερευαίσθητη σε κατάτμηση από DNase I, η οποία βρίσκεται 40 kb ανοδικά του εμβρυονικού γονιδίου της ζ-σφαιρίνης. Η ρυθμιστική περιοχή του γενετικού τόπου (Locus Control Region, LCR) της συστοιχίας του γονιδίου της β-σφαιρίνης, περιλαμβάνει πέντε υπερευαίσθητες (HS) σε κατάτμηση από DNase I περιοχές (χαρακτηρίζονται ως HS1-5), που κατανέμονται σε μία περιοχή μεταξύ 6 έως 20 kb ανοδικά του ε γονιδίου, με μία έκτη υπερευαίσθητη περιοχή ~20 kb καθοδικά του β γονιδίου [4]. 1.4 Η έκφραση των γονιδίων της αιμοσφαιρίνης κατά την ανάπτυξη Η μεταστροφή της ερυθροποίησης Κατά την οντογένεση και την οργανογένεση του ανθρώπου, ρόλο ερυθροποιητικού ιστού παίζουν (με χρονική σειρά) τα ερυθροποιητικά νησίδια του λεκιθικού ασκού, ο εμβρυϊκός σπλήνας και το εμβρυϊκό ήπαρ, και ο μυελός των οστών. Η έκφραση των σφαιρινικών γονιδίων στην εμβρυονική και την εμβρυϊκή ζωή μετατοπίζεται σταδιακά από το ένα όργανο στο άλλο. Ενώ στην εμβρυονική και την εμβρυϊκή ζωή η ερυθροποίηση γίνεται εξωμυελικά, στον ενήλικα οργανισμό η ερυθροποίηση γίνεται αποκλειστικά στο μυελό των οστών, σε σημείο που η εξωμυελική ερυθροποίηση να συνιστά σημείο παθολογίας. Είναι φανερό ότι για την τοπική αυτή μεταστροφή της ερυθροποίησης, απαιτείται η ύπαρξη ρυθμιστικών στοιχείων και στους δύο σφαιρινικούς τόπους. Ένας μηχανισμός με τον οποίο ασκείται η ρύθμιση αυτή, είναι η οργάνωση ολόκληρου του γενετικού τόπου σε μεταγραφικά ενεργή, ερυθρο-ειδική χρωματινική δομή. Η αναδιοργάνωση αυτή της 6

14 χρωματίνης της συστοιχίας των β-σφαιρινών εν μέρει χαρακτηρίζεται από αυξημένη ευαισθησία σε κατάτμηση από DNAse I. Εκτός από την τοπική μετάβαση, οι συστοιχίες των σφαιρινών παρουσιάζουν και αναπτυξιακή μεταστροφή, γεγονός το οποίο σημαίνει ότι σε κάθε χρονική περίοδο στην οντογένεση εκφράζεται άλλο γονίδιο. Στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, πλην του ανθρώπου, συμβαίνει ένα μόνο γεγονός μεταστροφής του είδους της συντιθέμενης αιμοσφαιρίνης (switching). Στον άνθρωπο συμβαίνουν δύο, και συντονίζονται με τη μετάβαση της ερυθροποίησης στα διάφορα όργανα. Το αποτέλεσμα είναι ότι στην εμβρυονική, εμβρυϊκή και την ενήλικο ζωή παράγονται διαφορετικά μόρια αιμοσφαιρίνης, τα οποία όμως πάντα περιέχουν ένα ζεύγος σφαιρινών τύπου α και ένα ζεύγος τύπου β [7]. Κατά την εμβρυονική ζωή, η αιμοποίηση γίνεται στο λεκιθικό ασκό, όπου εκφράζονται τα σφαιρινικά γονίδια ζ και ε. Η πρώτη αιμοσφαιρίνη που παράγεται είναι η εμβρυονική αιμοσφαιρίνη Hb Gower-I (ζ 2 ε 2 ). Μεταξύ της 4ης και της 8ης εβδομάδας της κύησης, γίνεται η πρώτη μεταστροφή από την έκφραση των γονιδίων ζ και ε, στα γονίδια α και γ, συμβαίνει δε ταυτόχρονα με τη μετάβαση στην ερυθροποίηση από το λεκιθικό ασκό στο εμβρυϊκό ήπαρ (Εικόνα 1.4). Κατά το μεταβατικό αυτό στάδιο, συντίθενται δύο επιπλέον εμβρυονικές αιμοσφαιρίνες, η Hb Gower-II (α 2 ε 2 ) και η Hb Portland (ζ 2 γ 2 ). Εικόνα 1.4: Αναπτυξιακό διάγραμμα έκφρασης των γονιδίων της αιμοσφαιρίνης στον άνθρωπο. Στο πάνω μέρος της εικόνας φαίνεται ο πρωτογενής τόπος αιμοποίησης κατά τη διάρκεια των διαφόρων σταδίων της ανάπτυξης [9]. 7

15 Μετά την πρώτη μεταστροφή και μέχρι την 36η εβδομάδα κύησης, η κύρια αιμοσφαιρίνη είναι η εμβρυϊκή αιμοσφαιρίνη HbF (α G 2 γ 2 ) και (α Α 2 γ 2 ), η οποία αντιστοιχεί στο 90% της ολικής αιμοσφαιρίνης. Τα γονίδια G γ και Α γ ανήκουν στην οικογένεια της β-σφαιρίνης και διαφέρουν στην κωδικοποιούσα περιοχή τους σε ένα μόνο αμινοξύ, το οποίο είναι η γλυκίνη για την G γ και η αλανίνη για την Α γ στη θέση 136. Τα γονίδια γ εκφράζονται όταν καταστέλλονται τα πρώιμα εμβρυονικά γονίδια και σε όλη την υπόλοιπη εμβρυϊκή ζωή, τα σπουδαιότερα προϊόντα από την οικογένεια της β-σφαιρίνης είναι τα G γ και Α γ [8]. Η αιμοποίηση σ αυτή την περίοδο λαμβάνει χώρα στο εμβρυϊκό ήπαρ και σπλήνα. Ένα άλλο χαρακτηριστικό της αιμοποίησης σε αυτό το μεταβατικό στάδιο, είναι ότι η έκφραση των α2- και α1- σφαιρινικών γονιδίων είναι ισοδύναμη. Η μετάβαση της ερυθροποίησης στο εμβρυϊκό ήπαρ χαρακτηρίζεται και από σταδιακή επαγωγή του α2-σφαιρινικού γονιδίου έναντι του α1, έτσι που στα ερυθροκύτταρα του εμβρύου και του ενήλικα η αναλογία των γονιδίων α2 και α1 τόσο σε επίπεδο mrna, όσο και σε επίπεδο πρωτεΐνης είναι περίπου 2,6:1 [10]. Η δεύτερη μεταστροφή από εμβρυϊκή σε αιμοσφαιρίνη τύπου ενήλικα, σηματοδοτεί τη μετάβαση από την έκφραση της γ- σε β-σφαιρίνη και συμβαίνει ταυτόχρονα με τη μετάβαση της ερυθροποίησης στο μυελό των οστών. Ξεκινάει κατά την 36η εβδομάδα κύησης και ολοκληρώνεται μετά τη γέννηση. Εκτός από την κύρια αιμοσφαιρίνη του ενήλικα HbA (τετραμερές α 2 β 2 ), συντίθεται σε πολύ μικρό ποσοστό και η δευτερεύουσα αιμοσφαιρίνη του ενήλικα HbA2 (α 2 δ 2 ). Το γονίδιο δ είναι και αυτό μέλος της οικογένειας των β-σφαιρινών και έχει παρόμοιο αναπτυξιακό πρόγραμμα έκφρασης με το β, ωστόσο η ποσότητα του mrna του δ είναι σημαντικά χαμηλότερη από εκείνη του mrna του β, κυρίως λόγω της σχετικής ανεπάρκειας του υποκινητή του γονιδίου δ, ο οποίος διαθέτει διαφορετικό πλαίσιο CCAAT από τον υποκινητή του γονιδίου β. Κατά τη γέννηση του ανθρώπου δεν έχει ολοκληρωθεί η δεύτερη μεταστροφή, κι έτσι η εμβρυϊκή αιμοσφαιρίνη αποτελεί το 70% του συνόλου η σύνθεσή της μειώνεται γρήγορα μέχρι τον έκτο μήνα αλλά δεν μηδενίζεται ποτέ, με αποτέλεσμα ένα φυσιολογικό ενήλικο άτομο να συνθέτει περίπου 97-98% HbA, 2-3% HbA2, και 0,5-1% HbF [7]. Ο λόγος ύπαρξης διαφόρων κατηγοριών αιμοσφαιρίνης στον οργανισμό έγκειται στο γεγονός ότι οι πρώιμες και όψιμες εμβρυϊκές αιμοσφαιρίνες εμφανίζουν μεγαλύτερη χημική συγγένεια για το οξυγόνο, ώστε το έμβρυο να μπορεί να 8

16 προσλαμβάνει αρκετό από το αίμα της μητέρας του. Αυτό δικαιολογεί και το γεγονός ότι σε οργανισμούς όπως, για παράδειγμα, το κοτόπουλο, στο οποίο τα εμβρυϊκά στάδια λαμβάνουν χώρα έξω από το σώμα της μητέρας (μέσα στο αυγό), οι εμβρυϊκές αιμοσφαιρίνες απουσιάζουν [11] Μοριακοί μηχανισμοί μεταστροφής της ερυθροποίησης Οι μοριακοί μηχανισμοί που ρυθμίζουν τη μεταστροφή της ερυθροποίησης είναι εξαιρετικά σύνθετοι και πιστεύεται ότι σε αναπτυξιακό επίπεδο καθορίζονται κυρίως από αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης/dna. Σε γονιδιακό επίπεδο, η μεταστροφή των β- σφαιρινικών γονιδίων πιστεύεται ότι είναι μεταγραφικό γεγονός, ενώ η μεταστροφή των α-σφαιρινικών γονιδίων αντανακλά τόσο μεταγραφικές, όσο και μεταμεταγραφικές διαδικασίες ρύθμισης [7]. Οι σημαντικοί παράγοντες που εμπλέκονται σε αυτή τη διαδικασία, είναι τα ανοδικά ρυθμιστικά στοιχεία και οι υποκινητές των γονιδίων της σφαιρίνης. Κάθε στοιχείο συνδέεται είτε με κατασταλτικές, είτε με πρωτεΐνες ενεργοποίησης (μεταγραφικοί παράγοντες). Όταν τα βλαστικά κύτταρα διαφοροποιούνται σε ερυθροκύτταρα, τα ανοδικά ρυθμιστικά στοιχεία συνδέονται με μεταγραφικούς παράγοντες ενεργοποίησης, κάποιοι από τους οποίους εκφράζονται ειδικά στα ερυθροκύτταρα (GATA-1, KLF-1), με αποτέλεσμα η σχετιζόμενη χρωματίνη να ενεργοποιείται. Αυτές οι αλλαγές σχετίζονται με αλλαγές στη μεθυλίωση του DNA, όπου τα κατεσταλμένα γονίδια είναι μεθυλιωμένα και τα ενεργά γονίδια μη μεθυλιωμένα [12-14]. Αλλαγές συμβαίνουν και σε μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των ιστονών, που μπορούν να καταλήξουν σε ενεργοποίηση (π.χ. ακετυλίωση και μεθυλίωση συγκεκριμένων καταλοίπων λυσίνης) ή σε καταστολή (π.χ. μεθυλίωση άλλων λυσινών). Στα μεταγενέστερα στάδια της ερυθροποίησης, τα ανοδικά ρυθμιστικά στοιχεία και οι ενεργοποιημένοι υποκινητές αλληλεπιδρούν μέσω του μηχανισμού βρόχου (loop), που επιτυγχάνεται μέσω των πρωτεϊνών που συνδέονται σε αυτά τα στοιχεία. Η αλληλεπίδραση των ρυθμιστικών στοιχείων και συγκεκριμένων υποκινητών των γονιδίων των σφαιρινών προσελκύουν και ενεργοποιούν την RNA πολυμεράση II, η οποία είναι απαραίτητη για τη μεταγραφή των γονιδίων σε RNA [15]. Αυτό το πυρηνικό RNA επεξεργάζεται σε ώριμο αγγελιοφόρο RNA, μεταφέρεται στο κυτταρόπλασμα των ερυθροκυττάρων και μεταφράζεται στις αλυσίδες των σφαιρινών. 9

17 Οι μοριακές αλλαγές ανάμεσα στις εμβρυονικές, τις εμβρυϊκές και τις ενήλικες αιμοσφαιρίνες, βασίζονται στον ανταγωνισμό ανάμεσα στους υποκινητές των σφαιρινών για πρόσβαση στα ενεργοποιημένα ανοδικά ρυθμιστικά στοιχεία. Η ικανότητα των υποκινητών να ανταγωνίζονται βασίζεται στις αλλαγές των ενεργοποιητικών ή κατασταλτικών μεταγραφικών παραγόντων, με τους οποίους συνδέονται. Τα πρωτεϊνικά σύμπλοκα που συγκεντρώνονται σε αυτά τα στοιχεία, μπορεί να αλλάξουν τη συγγένεια των αλληλεπιδράσεων ανάμεσα στα ανοδικά στοιχεία και τους διάφορους υποκινητές των σφαιρινικών γονιδίων κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης. Για παράδειγμα, στην εμβρυϊκή ζωή, ο υποκινητής της γ-σφαιρίνης συνδέεται με ένα (activating) σύμπλοκο ενεργοποίησης, το οποίο αλληλεπιδρά με μεγαλύτερη συγγένεια με τα ανοδικά ρυθμιστικά στοιχεία. Αντιθέτως, στην ενήλικη ζωή, τα γονίδια της γ-σφαιρίνης συνδέονται με κατασταλτικούς παράγοντες, ενώ της β-σφαιρίνης με ενεργοποιητικούς παράγοντες. Στην πραγματικότητα, η διαδικασία αυτή είναι πιο πολύπλοκη και περιλαμβάνει εκατοντάδες πρωτεΐνες, με διαφορετικούς ρόλους η καθεμιά [16]. 1.5 Τα cis-ρυθμιστικά στοιχεία των γονιδίων των α-σφαιρινών Στη συστοιχία των γονιδίων της α-σφαιρίνης έχουν αναγνωριστεί τέσσερα ερυθροειδικά, υπερευαίσθητα στην κατάτμηση με Dnase I σημεία, τα οποία βρίσκονται 10 (HS-10), 33 (HS-33), 40 (HS-40) και 48 (HS-48) kb ανοδικά του mrna cap της ζ-σφαιρίνης. Ο χαρακτηρισμός των φυσικών ελλείψεων (deletions), η ανάλυση υβριδίων μεταξύ ειδών και μελέτες σε διαγονιδιακά ποντίκια, υποδηλώνουν ότι μόνο το HS-40 έχει σημαντική επίδραση στην έκφραση των γονιδίων της α- σφαιρίνης. Η ακολουθία αυτή ονομάζεται και α-μείζων ρυθμιστικό στοιχείο (α-mre, α-major regulatory element) [17,18]. Όταν τα προγονικά κύτταρα κατευθύνονται προς την ερυθροποιητική σειρά και διαφοροποιούνται για να σχηματίσουν ώριμα ερυθροκύτταρα, ένα υποσύνολο σημαντικών μεταγραφικών παραγόντων και συμπαραγόντων προσδένονται πρώτα στα ανοδικά ρυθμιστικά στοιχεία κατά τα πρώτα στάδια της διαφοροποίησης. Αργότερα, οι υποκινητές των α-σφαιρινικών γονιδίων δεσμεύονται από αυτούς και από άλλους μεταγραφικούς παράγοντες [19]. Παρόλο που στους προερυθροβλάστες, όλα τα ρυθμιστικά στοιχεία και οι υποκινητές φαίνεται να συνδέονται και η σχετιζόμενη πρωτεΐνη να ενεργοποιείται, υπάρχει πολύ λίγη ή καθόλου σύνθεση σφαιρίνης σε αυτό το στάδιο. Η RNA πολυμεράση ΙΙ προσελκύεται πρώτη στις 10

18 ρυθμιστικές περιοχές και στους υποκινητές των σφαιρινών, καθώς ξεκινά η μεταγραφή στους πρώιμους και ενδιάμεσους ερυθροβλάστες. Μέχρι σήμερα, δεν είναι γνωστό αυτό που προκαλεί την προσέλκυση της πολυμεράσης, αλλά μπορεί να είναι αποτέλεσμα της έκφρασης ή προσέλκυσης ενός επιπλέον μεταγραφικού παράγοντα ή πιθανώς της μετα-μεταφραστικής τροποποίησης ενός ή πολλών από τους συνδεόμενους μεταγραφικούς παράγοντες [20] Μοντέλα δράσης των ρυθμιστικών στοιχείων Έχουν προταθεί τρεις τύποι μοντέλων για τον τρόπο με τον οποίο τα απομακρυσμένα ρυθμιστικά στοιχεία επικοινωνούν με τους στόχους τους για τη ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων της α-σφαιρίνης. Το πρώτο προτείνει ότι ενεργοποιητές/προ-εναρκτήρια σύμπλοκα προσδένονται πρώτα στον ενισχυτή και μετά κάποιες ή όλες αυτές οι πρωτεΐνες απομακρύνονται από τον ενισχυτή «σαρώνοντας» το DNA μέχρι τον υποκινητή (μοντέλο ανίχνευσης, tracking model). Επομένως, στο τέλος της διαδικασίας δεν υπάρχει καμία φυσική αλληλεπίδραση μεταξύ του ενισχυτή και του υποκινητή [21]. Σύμφωνα με το δεύτερο μοντέλο, η χρωματίνη σχηματίζει βρόχο με τέτοιο τρόπο ώστε τα πολυπρωτεϊνικά σύμπλοκα, τα οποία συνδέονται με τα ανοδικά ρυθμιστικά στοιχεία και τους υποκινητές, να είναι ικανά να αλληλεπιδρούν (μοντέλο βρόχου, looping model). Παραλλαγές αυτού του μοντέλου, προτείνουν ότι οι αλληλεπιδράσεις μπορεί να έχουν διαφορετικές συγγένειες που εξαρτώνται από τις συμμετέχουσες πρωτεΐνες και μπορεί να είναι προσωρινές (flip-flop model) [22]. Με βάση το τρίτο μοντέλο, τα σύμπλοκα DNA/πρωτεϊνών παραμένουν συνδεδεμένα στα cis-ρυθμιστικά στοιχεία και «σαρώνουν» προοδευτικά την παρεμβαίνουσα χρωματίνη, σχηματίζοντας ένα βρόχο. Πιθανώς, τα ανοδικά στοιχεία να κατευθύνονται προς τον υποκινητή, ή ο υποκινητής προς τα στοιχεία, ή και τα δύο να κατευθύνονται το ένα προς το άλλο (μοντέλο υποβοηθούμενης ανίχνευσης, facilitated tracking model). Οι λεπτομέρειες ως προς τη μοριακή βάση αυτών των γεγονότων δεν έχουν αποσαφηνιστεί. Επίσης, έχει παρατηρηθεί ότι παρόλο που τα διπλασιασμένα α-γονίδια στα περισσότερα είδη έχουν παρόμοιους ή ίδιους υποκινητές, το πλησιέστερο προς τα ανοδικά ρυθμιστικά στοιχεία γονίδιο (α2) εκφράζεται σε υψηλότερο επίπεδο. Αυτό σημαίνει ότι μεγαλύτερη σημασία έχει η θέση (μοντέλο ανίχνευσης), παρά η απόσταση (μοντέλο βρόχου) στην έκφραση των γονιδίων [20]. 11

19 1.5.2 Το ρυθμιστικό στοιχείο HS-40 Το HS-40 συμπεριφέρεται ως ένας κλασικός ενισχυτής, η κύρια λειτουργία του οποίου είναι η ενεργοποίηση και η ενίσχυση της έκφρασης από τους υποκινητές της ζ- και της α-σφαιρίνης. Η λειτουργική περιοχή αυτού του στοιχείου περιορίζεται σε ένα τμήμα 350 bp, στο οποίο υπάρχουν πολλές καλά συντηρημένες περιοχές πρόσδεσης πυρηνικών πρωτεϊνών. Αυτές περιλαμβάνουν τέσσερα σημεία πρόσδεσης για τον ερυθρο-ειδικό παράγοντα GATA-1, τέσσερα CACC μοτίβα και δύο σημεία πρόσδεσης για τον παράγοντα NF-E2 [17]. Οι De Gobbi et al. (2007), χρησιμοποιώντας την τεχνολογία ChIP-chip, υπέδειξαν το μοτίβο πρόσδεσης του συμπλόκου GATA-1/SCL, καθώς και ολόκληρου του πενταμερούς ερυθροποιητικού συμπλόκου (GATA-1, SCL, Ε2Α, LMO2 και Ldb-1), μαζί με τις υπομονάδες p45 και p18 του NF-E2 κατά μήκος του HS-40, αλλά και των υπόλοιπων ρυθμιστικών στοιχείων [19]. Οι υπομονάδες του NF- E2 συνδέονται κυρίως με το HS-40 και σε μικρότερο βαθμό με το HS-48. Η μέγιστη πρόσδεση όλων των μεταγραφικών παραγόντων ανιχνεύεται στους βασεοφιλικούς και πολυχρωματοφιλικούς ερυθροβλάστες, που συμπίπτει με τα μέγιστα επίπεδα ακετυλίωσης των ιστονών Η3 και Η4. Στην έναρξη της μεταγραφής, ο υποκινητής προσδένεται από τους SP/X-Kruppel μεταγραφικούς παράγοντες (SP/X-KLF). Αυτοί οι παράγοντες συμπεριφέρονται ως ενεργοποιητές στα ερυθροποιητικά κύτταρα και αλληλεπιδρούν με τον GATA-1. Σε αυτό το στάδιο, το προ-εναρκτήριο σύμπλοκο, που περιλαμβάνει γενικούς μεταγραφικούς παράγοντες και την RNA πολυμεράση ΙΙ, ανιχνεύεται και στα απομακρυσμένα ρυθμιστικά στοιχεία, αλλά κυρίως στους υποκινητές [6]. Σε μοντέλο ποντικού, όταν αφαιρείται το HS-40 δεν υπάρχει καθόλου έκφραση του γονιδίου της α-σφαιρίνης, ενώ τα υπόλοιπα ρυθμιστικά στοιχεία δεν αλληλεπιδρούν με τον υποκινητή του γονιδίου. Όταν το HS-40 επανεισάγεται σε ένα έκτοπο σημείο στο 3 άκρο των α-γονιδίων, αποκαθίστανται τόσο η έκφραση όσο και οι αλληλεπιδράσεις σε ποσοστό 50% [18]. Σε μία άλλη μελέτη, αποδεικνύεται ότι, ενώ η RNA πολυμεράση ΙΙ προσελκύεται από τα ρυθμιστικά στοιχεία απουσία των υποκινητών των α-σφαιρινών, δεν μπορεί να προσελκυθεί από τους υποκινητές απουσία των ρυθμιστικών στοιχείων [23]. Επομένως, τα ανοδικά ρυθμιστικά στοιχεία παίζουν σημαντικό ρόλο στην προσέλκυση της RNA πολυμεράσης ΙΙ στους υποκινητές των α-σφαιρινών. Επιπλέον, η αφαίρεση μόνο του HS-40 δεν είναι ισοδύναμη με την αφαίρεση όλων των 12

20 ρυθμιστικών στοιχείων. Στη δεύτερη περίπτωση, ούτε η πολυμεράση, ούτε οι γενικοί μεταγραφικοί παράγοντες (π.χ. TFIIB και TFIID) προσελκύονται στον υποκινητή (αποσιώπηση της μεταγραφής), ενώ η απομάκρυνση μόνο του HS-40 φαίνεται να επηρεάζει ειδικά την προσέλκυση της πολυμεράσης (μεγάλη μείωση της έκφρασης των α-σφαιρινών). Αυτό σημαίνει ότι τα υπόλοιπα ρυθμιστικά στοιχεία (με ή χωρίς το HS-40) μπορεί να παίζουν ρόλο στην προσέλκυση του βασικού μεταγραφικού μηχανισμού [20]. 1.6 Η σταθεροποιητική πρωτεΐνη της α-αιμοσφαιρίνης (AHSP) Η μεταγραφική διαδικασία έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή ώριμων και σταθερών μεταγράφων, τα οποία χρησιμοποιούνται επανειλημμένα για να δημιουργήσουν περίπου 280 εκατομμύρια μόρια ολοκληρωμένων μορίων αιμοσφαιρίνης ανά κύτταρο. Καθώς η ελεύθερη α-σφαιρίνη είναι ένα ασταθές, ενεργό μόριο ικανό να καταστρέψει τα ερυθροποιητικά προγονικά κύτταρα, οι α-σφαιρινικές αλυσίδες που βρίσκονται σε πλεόνασμα πρέπει να σταθεροποιηθούν για να περιοριστεί η ενεργότητά τους. Αυτό επιτυγχάνεται με την πρόσδεση μίας άφθονα εκφραζόμενης από τα ερυθροκύτταρα πρωτεΐνης, της σταθεροποιητικής πρωτεΐνης της α- αιμοσφαιρίνης (α-hemoglobin stabilizing protein, AHSP). Αυτή η πρωτεΐνη συνδέεται ειδικά με την α-σφαιρίνη στις διάφορες μορφές της (απο-α-σφαιρίνη, δισθενής, τρισθενής) και μειώνει την καθίζησή της που προκαλείται από την παραγωγή οξειδωτικών παραγόντων (Εικόνα 1.5). Η AHSP συνδέεται με την α- σφαιρίνη στη φάση του διμερούς α1β1, με χαμηλότερη συγγένεια από τη β-σφαιρίνη, και αντικαθίσταται εύκολα από την πρόσδεση της β-σφαιρίνης [6]. Η πρόσδεση της AHSP στην α-σφαιρίνη φαίνεται ότι διευκολύνει το σχηματισμό της τετραμερούς HbA in vitro. Αυτό συμφωνεί με προηγούμενες παρατηρήσεις, όπου οι α-σφαιρινικές αλυσίδες που περιέχουν αίμη συνδέονται με τις απο-β-σφαιρίνες για το σχηματισμό της HbA και η AHSP διατηρεί τη νεοσχηματιζόμενη α-σφαιρίνη σε διαλυτή μορφή ώστε να διευκολύνει αυτή την αλληλεπίδραση. Επιπλέον, παρόμοια με την αίμη, η AHSP δρα ως μοριακή "βοηθός" για να προάγει την αναδίπλωση της αναπτυσσόμενης απο-α-σφαιρίνης, αλλά και την επαναδίπλωση της αποικοδομούμενης α-σφαιρίνης [24]. 13

21 Εικόνα 1.5: Ο ρόλος της AHSP στη σταθεροποίηση και τη σωστή αναδίπλωση της α-σφαιρίνης, καθώς και στην παρεμπόδιση της παραγωγής ROS [24]. Εφόσον η AHSP και η αίμη συνδέονται με την α-σφαιρίνη σε διαφορετικά σημεία, τα δύο μόρια είναι πιθανό να συνεργάζονται για να σταθεροποιήσουν τη φυσική δομή της πρωτεΐνης και να διευκολύνουν την αλληλεπίδρασή της με την β-σφαιρίνη [6]. 14

22 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2 ΟΙ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΟΠΑΘΕΙΕΣ 2.1 Διαταραχές στην παραγωγή σφαιρινικών αλυσίδων Οι μεταλλάξεις στα γονίδια των σφαιρινών μπορούν να διακριθούν σε αυτές που προκαλούν ποιοτικές ανωμαλίες (παρερμηνεύσιμες μεταλλάξεις, μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου ανάγνωσης), όπως η δρεπανοκυτταρική αναιμία και σε αυτές που προκαλούν ποσοτικές ανωμαλίες (θαλασσαιμίες). Όλες αυτές οι διαταραχές αναφέρονται ως αιμοσφαιρινοπάθειες. Οι θαλασσαιμίες είναι κληρονομικές ανωμαλίες παραγωγής αιμοσφαιρίνης, στις οποίες η πρωτογενής επιπλοκή είναι μία ποσοτική ανεπάρκεια είτε της β-σφαιρίνης που οδηγεί στη β-θαλασσαιμία, είτε της α-σφαιρίνης που οδηγεί στην α-θαλασσαιμία. Περιγράφηκαν για πρώτη φορά από τους Cooley και Lee το Ο όρος θαλασσαιμία, από την ελληνική λέξη θάλασσα, δόθηκε από τους Whipple και Bradford το 1936 [25]. Το όνομα αυτό δόθηκε λόγω της υψηλής συχνότητας των ανωμαλιών αυτών σε άτομα που ζουν γύρω από τη Μεσόγειο θάλασσα, γι αυτό και αποκαλείται επίσης μεσογειακή αναιμία. Οι θαλασσαιμίες είναι συχνές και σε τμήματα της Αφρικής και της ΝΑ Ασίας. Η κατανομή των θαλασσαιμιών στις διάφορες περιοχές συμπίπτει με τη συχνότητα εμφάνισης της ελονοσίας. Η υψηλή συχνότητα των αλληλομόρφων θαλασσαιμίας σε αυτές τις περιοχές φαίνεται ότι οφείλεται στην ανθεκτικότητα έναντι του παράσιτου της ελονοσίας των ετεροζυγωτών σε μία από τις θαλασσαιμίες. Σε φυσιολογική κατάσταση, παράγονται ίσες ποσότητες α- και β-αλυσίδων, έτσι ώστε να μπορούν να συνδυαστούν στοιχειομετρικά και να σχηματίσουν τα σωστά τετραμερή της αιμοσφαιρίνης. Τα ερυθροκύτταρα σε έναν φυσιολογικό ενήλικα έχουν υψηλή συγκέντρωση αιμοσφαιρίνης και μέσο κυτταρικό όγκο περίπου 90 μm 3. Η α-θαλασσαιμία χαρακτηρίζεται από μία σχετική ανεπάρκεια των αλυσίδων της α- σφαιρίνης, αλλά φυσιολογική παραγωγή αλυσίδων β-σφαιρίνης. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την περίσσεια β-αλυσίδων και τον σχηματισμό ομοτετραμερών (β4). Η αιμοσφαιρίνη αυτή ονομάζεται αιμοσφαιρίνη Η (Ηb Η) και μπορεί να εμφανιστεί με τη μορφή σωματιδίων εγκλεισμού μέσα στα ερυθροκύτταρα ατόμων με α- θαλασσαιμία. Η Ηb Η έχει σημαντικά μειωμένη ικανότητα να λειτουργήσει ως 15

23 φορέας οξυγόνου. Αποτέλεσμα της περίσσειας των β-αλυσίδων και της ανεπάρκειας των α-αλυσίδων είναι το μειωμένο μέγεθος των ερυθροκυττάρων (50-80 μm 3, ανάλογα με τη βαρύτητα της νόσου) και ο μειωμένος αριθμός τους που οδηγεί σε αναιμία. Στην β-θαλασσαιμία συμβαίνει το αντίθετο, δηλαδή ανεπάρκεια β-αλυσίδων και περίσσεια α-αλυσίδων, με ικανότητα παραγωγής ομοτετραμερών (α4). Αυτά τα τετραμερή είναι εξαιρετικά δυσδιάλυτα και καθιζάνουν μέσα στα ερυθροκύτταρα, με αποτέλεσμα την πρόωρη καταστροφή τους στο μυελό των οστών και τη σημαντική παγίδευσή τους στο σπλήνα. Τα ερυθροκύτταρα ατόμων με β-θαλασσαιμία είναι επίσης ελαττωμένα σε μέγεθος (50-80 μm 3 ) και σε αριθμό [2]. 2.2 Μοριακή βάση της α-θαλασσαιμίας Η α-θαλασσαιμία κληρονομείται με αυτοσωμικό υπολειπόμενο τρόπο. Έχουν περιγραφεί παγκοσμίως περισσότερες από 120 διαφορετικές μεταλλάξεις, οι οποίες προκαλούν α-θαλασσαιμία ( Η πλειοψηφία των διαταραχών αυτών είναι ελλείμματα, με αποτέλεσμα την απομάκρυνση ολόκληρης ή μέρους της συστοιχίας των α-γονιδίων. Πιο σπάνιες είναι οι σημειακές μεταλλάξεις ή τα μικρά ελλείμματα μέσα στα δύο α-γονίδια σφαιρίνης (οι σημειακές μεταλλάξεις αναφέρονται και ως μη ελλειμματικές, non-deletional). Οι μεταλλάξεις που αποφέρουν μικρή απώλεια στη σύνθεση των α-αλυσίδων από το παθολογικό χρωμόσωμα, αναφέρονται ως μεταλλάξεις α + (ή α-θαλασσαιμία-2), ενώ εκείνες που προκαλούν ολοκληρωτική απώλεια της σύνθεσης των α-σφαιρινικών αλυσίδων από το παθολογικό χρωμόσωμα, αναφέρονται ως μεταλλάξεις α 0 (ή α- θαλασσαιμία-1). Χρησιμοποιείται συγκεκριμένος τρόπος για το συμβολισμό των διαφόρων τύπων μεταλλάξεων. Ο συμβολισμός "αα" αντιπροσωπεύει ένα φυσιολογικό αλληλόμορφο με δύο α-γονίδια, ο συμβολισμός "-α" αντιπροσωπεύει έλλειμμα ενός α-γονιδίου, ο "--" έλλειμμα και των δύο α-γονιδίων από το ίδιο αλληλόμορφο και ο "α Τ α" ή "αα Τ " αντιπροσωπεύει γονίδια με σημειακή μετάλλαξη στο α2 ή στο α1 γονίδιο, αντίστοιχα. Χρησιμοποιείται συχνά εκθέτης για να δηλώσει το μέγεθος του ελλείμματος ή τη φύση της σημειακής μετάλλαξης ή του πληθυσμού στον οποίο περιγράφηκε για πρώτη φορά η μετάλλαξη. Έτσι, α 3.7 δηλώνει ένα έλλειμμα α + στο οποίο λείπουν 3.7 kb, ή -- SEA, δηλώνει ένα κοινό έλλειμμα α 0 που πρωτοπεριγράφηκε σε πληθυσμό της ΝΑ Ασίας, ή α PolyA α δηλώνει μία σημειακή μετάλλαξη στο γονίδιο α2, που 16

24 επηρεάζει τη θέση πολυαδενυλίωσης [4]. Οι περισσότερες περιπτώσεις α- θαλασσαιμικών φαινοτύπων συνδυάζονται με τρία ελλείμματα (Εικόνα 2.1), το α 3.7 α + (πιο συνηθισμένο στην Αφρική, Μεσόγειο, Μ. Ανατολή και Ασία), το α 4.2 α + (σε Ασία, Μεσόγειο, Μ. Ανατολή, ΝΑ Ασία και Ειρηνικό) και το -- SEA α 0 (κυρίως σε Κίνα και ΝΑ Ασία) [26]. Εικόνα 2.1: Διαγραμματική απεικόνιση των κοινών ελλείψεων που μπορούν να οδηγήσουν σε φαινότυπο α-θαλασσαιμίας. Τα σκιασμένα κομμάτια υποδεικνύουν το μέγεθος της έλλειψης [25]. Η θαλασσαιμία που προκαλείται από ελλείμματα (deletional) έχει ως αποτέλεσμα είτε α 0 - είτε α + -θαλασσαιμία, ανάλογα με το μέγεθος και το είδος της έλλειψης. Η θαλασσαιμία που προκαλείται από σημειακές μεταλλάξεις (non-deletional) συνήθως είναι ετερόζυγος α-θαλασσαιμία. Οι μη ελλειμματικές θαλασσαιμίες προκαλούνται συχνότερα από μεταλλάξεις στο α2 γονίδιο παρά στο α1, πιθανώς γιατί σε αυτό ο κλινικός φαινότυπος είναι πιο σοβαρός. Μία σημειακή μετάλλαξη στο α2 γονίδιο έχει πιο σοβαρό φαινότυπο από ένα έλλειμμα σε αυτό το γονίδιο, διότι η αυξημένη έκφραση του α1 γονιδίου συμβαίνει μόνο στη δεύτερη περίπτωση Θαλασσαιμίες που προκαλούνται από ελλείμματα (deletional) Τα ελλείμματα που προκαλούν α-θαλασσαιμία χωρίζονται σε δύο κατηγορίες. Έλλειμμα ολόκληρου ή τμήματος του ενός ή και των δύο γονιδίων. Έλλειμμα του ενός α2 γονιδίου (α + -θαλασσαιμία). Έλλειμμα του ενός α1 γονιδίου (α + -θαλασσαιμία). 17

25 Έλλειμμα τμήματος του ενός α2 γονιδίου και του ενός α1 γονιδίου, με σχηματισμό ενός συντηγμένου (fusion) α-γονιδίου (α + - θαλασσαιμία). Έλλειμμα των παρακείμενων α2 και α1 γονιδίων (α 0 -θαλασσαιμία). Έλλειμμα >18 kb του ενός α1 γονιδίου καθοδικά του γονιδίου, αλλά με απενεργοποίηση του εναπομείναντος δομικά φυσιολογικού α2 γονιδίου, λόγω αρνητικής επίδρασης θέσης, (α)-- ZF (α 0 -θαλασσαιμία) [27]. Υπάρχουν τουλάχιστον 36 διαφορετικά γνωστά ελλείμματα, εκ των οποίων κάποια περιλαμβάνουν και το ζ γονίδιο, αλλά και παρεμβαίνουσες ακολουθίες. Αυτή η κατηγορία περιλαμβάνει εκτεταμένα ελλείμματα ή μη ισορροπημένες μετατοπίσεις, που έχουν ως αποτέλεσμα την απώλεια του τελομερούς του χρωμοσώματος 16, προκαλώντας ένα σύνδρομο α 0 -θαλασσαιμίας, δυσμορφισμό και ήπια έως μέτρια πνευματική καθυστέρηση, αναφερόμενο ως ATR-16 σύνδρομο. Έλλειμμα των ανοδικών ρυθμιστικών στοιχείων, που περιλαμβάνει τον ενισχυτή HS-40, με καταστολή ή παύση της έκφρασης και των δύο δομικά φυσιολογικών α-γονιδίων (εκτιμάται ότι η παραγωγή α-αλυσίδων είναι <1% της φυσιολογικής, οπότε στην ουσία προκαλείται α 0 -θαλασσαιμία) [28,30]. Έχουν επίσης αναφερθεί ελλείμματα που απομακρύνουν όλα τα ρυθμιστικά στοιχεία και/ή ολόκληρη τη συστοιχία των α-γονιδίων ή ελλείμματα που αφήνουν κάποια από τα ρυθμιστικά στοιχεία όπως το HS- 10. Το HS-10 μόνο του δεν ενισχύει σημαντικά την έκφραση των α- σφαιρινικών γονιδίων [29]. Επιπροσθέτως, έχουν περιγραφεί πολλά ελλείμματα που απομακρύνουν τα ζ και τα α γονίδια και παρόλο που οι ετεροζυγώτες φαίνεται να αναπτύσσονται φυσιολογικά, οι ομοζυγώτες θα ήταν απίθανο να επιβιώσουν ακόμα και στα πρώτα στάδια της κύησης, εφόσον καμία από τις εμβρυονικές (ζ 2 γ 2 ) ή εμβρυϊκές (α 2 γ 2 ) αιμοσφαιρίνες δεν θα μπορούσε να συντεθεί [4,30]. Έχει περιγραφεί, σε ένα περιστατικό, ένα έλλειμμα περίπου 18 kb, που αφαιρεί μόνο τα α1 και θ γονίδια και προκαλεί α 0 -θαλασσαιμία. Η υπόλοιπη συστοιχία των α γονιδίων, περιλαμβανομένου του α2 γονιδίου και των ρυθμιστικών περιοχών, 18

26 παραμένει ανέπαφο, αλλά παραδόξως, το α2 γονίδιο παραμένει μεταγραφικά ανενεργό. Όταν υπάρχει το έλλειμμα, αφαιρείται ένα τμήμα του γονιδίου LUC7L και ταυτόχρονα προσεγγίζει το α2 γονίδιο. Το γονίδιο αυτό εκφράζεται προς την αντίθετη κατεύθυνση από ότι τα α-γονίδια. Το τροποποιημένο μετάγραφο του RNA από το LUC7L προάγει τη μεθυλίωση της νησίδας CpG του α2 γονιδίου καταστέλλοντας την έκφρασή του. Ο μηχανισμός αυτός προσομοιάζει αυτόν της απενεργοποίησης του χρωμοσώματος Χ και του γονιδιακού εντυπώματος, αποκαλύπτοντας έναν καινούργιο παθογενετικό μηχανισμό [4]. Η πιο συνήθης διαταραχή, που οδηγεί στην απώλεια ενός γονιδίου α-σφαιρίνης σε ένα χρωμόσωμα, είναι ο άνισος επιχιασμός. Υπάρχει μεγάλος βαθμός ομολογίας στη νουκλεοτιδική αλληλουχία που περιλαμβάνει και περιβάλλει τα γονίδια των α2- και α1-σφαιρινών. Τα παραλληλόγραμμα (boxes) Χ και Ψ, που φαίνονται στην Εικόνα 2.2, αντιπροσωπεύουν περιοχές που είναι μεταξύ τους όμοιες κατά περισσότερο από 90%, και τα παραλληλόγραμμα Ζ, περιοχές όμοιες μεταξύ τους κατά περισσότερο από 99%. Αυτό αποτελεί ένα ιδανικό υπόβαθρο για άνισο επιχιασμό κατά τη μείωση. Αν τα δύο ομόλογα χρωμοσώματα στοιχηθούν λανθασμένα, ένας επιχιασμός σε αυτή την περιοχή θα έχει ως αποτέλεσμα την παραγωγή ενός χρωμοσώματος με ένα μόνο α-γονίδιο και ενός με τρία α-γονίδια [2]. Εικόνα 2.2: Μηχανισμός εμφάνισης των ελλειμμάτων των α-γονιδίων μέσω του άνισου επιχιασμού μεταξύ ομόλογων ακολουθιών των α2 και α1 γονιδίων κατά τη διάρκεια της μείωσης [30]. 19

27 Τρεις τύποι ελλειμμάτων, μεγέθους 3.7 kb δημιουργούνται μεταξύ των γονιδίων α1 και α2, εξαιτίας άνισου επιχιασμού μεταξύ των περιοχών Z και είναι τα: α 3,7I, - α 3,7II και -α 3,7III, με αντίστοιχη φαινοτυπική ετερογένεια. Τα δυο πρώτα έχουν ως αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός γονιδίου που μοιάζει με το α1 και το τρίτο ενός υβριδικού γονιδίου που μοιάζει με το α2. Άνισος επιχιασμός μεταξύ των περιοχών X οδηγεί, αντίστοιχα, στη δημιουργία ελλείμματος 4.2 kb, το οποίο αφαιρεί ολόκληρο το γονίδιο α2. Και στις δύο περιπτώσεις προκύπτουν δύο χρωμοσώματα, εκ των οποίων το ένα υπολείπεται ενός γονιδίου α και το άλλο έχει ένα επιπλέον α-γονίδιο (ααα anti3.7 και ααα anti4.2 ) [4,31]. Η πλειοψηφία των ελλειμμάτων της α-θαλασσαιμίας που προκύπτουν εξαιτίας άνισου επιχιασμού, οδηγούν συνήθως στην αφαίρεση και των δύο α-γονιδίων στο χρωμόσωμα που πλήττεται και, σε κάποιες περιπτώσεις, και ολόκληρου του συμπλέγματος των α-γονιδίων αιμοσφαιρίνης, δημιουργώντας το γενετικό αίτιο για α 0 -θαλασσαιμία. Έχουν περιγραφεί περισσότερα από 20 τέτοια ελλείμματα παγκοσμίως. Τα ελλείμματα αυτά δεν παρουσιάζουν περιοχές με εμφανή ομολογία στα σημεία τομής τους και μπορούν να καταταγούν σε τρεις επιμέρους ομάδες που αφορούν αυτά που προέκυψαν από: α) επανασύνδεση μη ομόλογων θραυσμάτων, β) ανασυνδυασμό μεταξύ επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών Alu και γ) τελομερική σταθεροποίηση τμημάτων στα οποία αποκόπηκε το τελικό άκρο του χρωμοσώματος 16 [4] Θαλασσαιμίες που προκαλούνται από σημειακές μεταλλάξεις (nondeletional) Υπάρχουν περισσότερες από 40 σημειακές νουκλεοτιδικές αλλαγές που προκαλούν α-θαλασσαιμία. Οι μεταλλάξεις αυτές εντοπίζονται πιο συχνά στο α2 γονίδιο και λιγότερο στο α1. Οι μισές περίπου από τις διαταραχές αυτές επηρεάζουν την επεξεργασία του RNA ή τη μετάφραση. Μεταλλάξεις που επηρεάζουν το μάτισμα του RNA. Πολλές μεταλλάξεις που επηρεάζουν τις συντηρημένες αλληλουχίες στις περιοχές αποκοπής και επανασυγκόλλησης του mrna έχουν περιγραφεί τόσο στο α1 όσο και στο α2 γονίδιο, και όλες έχουν ως αποτέλεσμα την ολοκληρωτική καταστολή της παραγωγής της α-αλυσίδας από το παθολογικό γονίδιο. Ένα παράδειγμα είναι η IVS1 117 G A στο α1 γονίδιο, η οποία είναι μετάλλαξη στη θέση δέκτη κατά την επεξεργασία του mrna, συναντάται στην Ινδία και κάνει το γονίδιο μη λειτουργικό. 20

28 Ένα κοινό παράδειγμα περιλαμβάνει το έλλειμμα πέντε νουκλεοτιδίων που αφαιρεί το δινουκλεοτίδιο GT (θέση δότη κατά την επεξεργασία του mrna) στο 5 άκρο του ιντρονίου 1 του α2 γονιδίου (α2 IVS1 GAGGGTGAGG>GAGG, γνωστό ως α Hph α). Μεταλλάξεις σε σημεία επεξεργασίας του mrna όπως αυτές, προκαλούν φαινότυπο α + -θαλασσαιμίας [4,25,30] επειδή επηρεάζουν μόνο το ένα από τα δύο α-γονίδια. Μεταλλάξεις που επηρεάζουν την πολυαδενυλίωση. Υπάρχουν τέσσερεις γνωστές μεταλλάξεις που επηρεάζουν την επεξεργασία του RNA, στις οποίες περιλαμβάνονται νουκλεοτιδικές αλλαγές στην ουρά πολυαδενυλίωσης του α2 γονιδίου. Ένα παράδειγμα είναι η α TSAUDI α (α PA6 A G α), που είναι συχνή στη Μεσόγειο, και αποτελεί μία από τις πολλές μεταλλάξεις που επηρεάζουν το υψηλά συντηρημένο σήμα κοπής και πολυαδενυλίωσης του mrna. Αυτή η μετάλλαξη οδηγεί σε μεγάλη μείωση της σύνθεσης της α-αλυσίδας, δίνοντας έναν σοβαρό φαινότυπο α + -θαλασσαιμίας που, κάποιες φορές, χαρακτηρίζεται ως α + α 0. Ο σοβαρός φαινότυπος θαλασσαιμίας που προκύπτει, οφείλεται στην καταστολή της μεταγραφής και από το α1 γονίδιο, ως αποτέλεσμα του μηχανισμού της μεταγραφικής αλληλεπίδρασης των δύο γονιδίων [32]. Μεταλλάξεις που επηρεάζουν τη μετάφραση του RNA. Μεταλλάξεις στο κωδικόνιο έναρξης ή σε ακολουθίες σημαντικές για την έναρξη της μετάφρασης, που οδηγούν σε απώλεια ή μείωση της μετάφρασης. Μεταλλάξεις στο κωδικόνιο τερματισμού έχουν βρεθεί και στα δύο α γονίδια. Μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου ανάγνωσης που προκύπτουν από μικρά ελλείμματα ή από ελλείμματα μαζί με προσθήκη νουκλεοτιδίων ή από μη νοηματικές (nonsense) μεταλλάξεις που δρουν ως πρόωρα κωδικόνια τερματισμού και οδηγούν σε απενεργοποίηση του γονιδίου ή σε σύνθεση μίας πολύ ασταθούς α- αλυσίδας. Συναντώνται κυρίως στο α2 γονίδιο και κάποιες φορές στο α1. Μεταλλάξεις του κωδικονίου τερματισμού σε κωδικεύουσες αλληλουχίες, που οδηγούν σε μία επιμήκη α-αλυσίδα, η οποία συντίθεται σε μειωμένο βαθμό, πιθανώς λόγω αστάθειας του mrna. Πέντε διαφορετικές σημειακές μεταλλάξεις έχουν αναφερθεί στο κωδικόνιο τερματισμού, οι οποίες όλες πλήττουν το α2 γονίδιο. Όλες οι μεταλλάξεις στο 21

29 κωδικόνιο τερματισμού έχουν ως αποτέλεσμα αντί για τον τερματισμό της μεταγραφής, την ενσωμάτωση ενός αμινοξέος και την παραγωγή μιας παθολογικής α- αλυσίδας αιμοσφαιρίνης (από 31 αμινοξέα). Αυτές οι επιμηκυμένες α-αλυσίδες συντίθενται σε χαμηλότερα επίπεδα αλλά έχουν την τάση να καθιζάνουν στα ερυθροκύτταρα, προκαλώντας διαταραχές στη λειτουργία των ερυθροκυττάρων και των κυτταρικών μεμβρανών. Οι πιο κοινές παθολογικές αιμοσφαιρίνες που οφείλονται σε μεταλλάξεις στο κωδικόνιο λήξης του α2 γονιδίου είναι: η Hb Constant Spring (α2 cd142 TAA>CAA), η οποία συναντάται συχνά στη ΝΑ Ασία, αλλά και στην Ελλάδα και την Σικελία, η Hb Icaria (α2 cd142 TAA>AAA), η οποία δεν είναι σπάνια στην Ελλάδα, η Hb Seal Rock και η Hb Paksé. Διαταραχές σε trans-δρώντες παράγοντες που προκύπτουν από μεταλλάξεις στο γονίδιο ATRX στην περιοχή Xq13.3, η οποία κωδικεύει για μία ελικάση. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα ένα σύνδρομο σοβαρής πνευματικής καθυστέρησης, δυσμορφισμού και α-θαλασσαιμίας σε άρρενα άτομα, που ονομάζεται σύνδρομο ATR-X. Έχουν αναφερθεί πάνω από 100 περιπτώσεις σε περισσότερες από 70 οικογένειες [4,25,30]. Μεταλλάξεις που αφορούν σημειακές αντικαταστάσεις ή μικρά ελλείμματα και προκαλούν τη σύνθεση ασταθών α-αλυσίδων αιμοσφαιρίνης. Στις περισσότερες περιπτώσεις, αυτές οι παθολογικές αλυσίδες είναι τόσο ασταθείς, που δεν ανιχνεύονται σε πρωτεϊνικό επίπεδο και γίνονται αντιληπτές μόνο στην αλληλουχία του DNA του γονιδίου. Οι παθολογικές αυτές αλυσίδες είναι αιματολογικά «σιωπηλές» στους φορείς, όταν όμως συνδυαστούν με άλλες μεταλλάξεις α-θαλασσαιμίας, μπορεί να προκαλέσουν ένα μεγάλο εύρος φαινοτύπων όπως αιμοσφαιρινοπάθεια Η ή ενδιάμεση θαλασσαιμία [33,34]. Σε σπάνιες περιπτώσεις, οι μεταλλάξεις αυτές σε ομόζυγη κατάσταση ή σε συνδυασμό με ελλείμματα α 0 μπορεί να προκαλέσουν εμβρυϊκό ύδρωπα [35,36]. Τυπικά παραδείγματα τέτοιων μεταλλάξεων είναι οι: Hb Quong Sze (α2 cd125 CTG>CCG, Leu>Pro), Hb Agrinio (α2 cd29 CTG>CCG, Leu>Pro) και Hb Taybe (α1 cd38 ή cd39 delacc, Thr). Οι περισσότερες παραλλαγές (variants) της αιμοσφαιρίνης που οδηγούν σε θαλασσαιμικό φαινότυπο είναι ασταθείς. Αντιθέτως, όλες οι ασταθείς παραλλαγές της αιμοσφαιρίνης δεν οδηγούν σε τέτοιο φαινότυπο. Η διαφορά στους φαινοτύπους εξαρτάται από τη θέση της μετάλλαξης και από το αν αλλάζει τη φυσιολογική δομή 22

30 στο επίπεδο των αιμοσφαιρινικών αλυσίδων ή του μορίου της αιμοσφαιρίνης. Οι μεταλλάξεις, είτε απλές αντικαταστάσεις βάσεων, είτε μικρά ελλείμματα/προσθήκες, ακόμα και πιο μεγάλα ελλείμματα σε κάποιες περιπτώσεις, όταν εδράζονται σε περιοχές μεταξύ των ελίκων της αιμοσφαιρίνης, δεν τροποποιούν τη γενική δομή της συμβατικής αναδίπλωσης της πρωτεΐνης. Αντιθέτως, η αντικατάσταση ή το έλλειμμα ενός αμινοξέος στην περιοχή μίας έλικας, τροποποιεί όλες τις συνδέσεις των ακόλουθων αμινοξέων. Οι μεταλλάξεις που προκαλούν θαλασσαιμικό φαινότυπο είναι αυτές που, σε πρωτεϊνικό επίπεδο, εμποδίζουν τον σωστό σχηματισμό του τετραμερούς της αιμοσφαιρίνης. Συνήθως προκαλούν δομικές αλλαγές στα σημεία σύνδεσης με τη β- αλυσίδα και η καθίζηση της αιμοσφαιρίνης συμβαίνει πολύ νωρίς στα προγονικά κύτταρα των ερυθροκυττάρων, οδηγώντας σε ένα βαθμό ανεπαρκούς ερυθροποίησης. Ένας άλλος μηχανισμός για τη δημιουργία θαλασσαιμικού φαινοτύπου, είναι η μη σωστή αλληλεπίδραση της ασταθούς α-αλυσίδας με την AHSP και, επομένως, η μη σωστή αναδίπλωση της α-αλυσίδας και η μη σωστή διαλυτότητα των ελεύθερων α- αλυσίδων (Εικόνα 2.3). Αντιθέτως, οι μεταλλάξεις που επιτρέπουν το σχηματισμό του τετραμερούς της αιμοσφαιρίνης, παρά την αστάθειά της, οδηγούν σε καθίζηση των τετραμερών, κυρίως μέσω κάποιας μορφής οξειδωτικού στρες στο περιφερικό αίμα και τείνουν να προκαλούν χρόνια αιμολυτική αναιμία [37]. 23

31 Εικόνα 2.3: Μηχανισμοί που δείχνουν τις αιτίες για τη σοβαρότητα μίας ασταθούς α-αλυσίδας, ειδικά όταν συνυπάρχουν με ελλειμματικές μεταλλάξεις. Οι ασταθείς α- αλυσίδες καθιζάνουν στη μεμβράνη των ερυθροκυττάρων, καταλύουν το σχηματισμό σωματίων Heinz, επομένως, και ROS, οι οποίες διεγείρουν την ανεπαρκή ερυθροποίηση και την απόπτωση. Η περίσσεια των β-αλυσίδων οξειδώνεται επίσης και καθιζάνει στη μεμβράνη [37]. Στην περίπτωση του ελληνικού πληθυσμού, η μελέτη των γονοτύπων σε περιστατικά με Hb H αποκάλυψε ότι το πιο συχνό έλλειμμα που συναντάται σε ποσοστό >50% των παθολογικών αλληλομόρφων, είναι το α 3.7. Ακολουθούν τα -- MED και α 20.5, ενώ σπανιότερα είναι τα α 4.2 και α 5.2. Οι συχνότερες σημειακές νουκλεοτιδικές αλλαγές που προκαλούν α-θαλασσαιμία στην Ελλάδα είναι η α TSAUDI, που εντοπίζεται στην ουρά πολυαδενυλίωσης του α2 (AATAAA>AATAAG) και η α Hph. Σε μικρότερη συχνότητα συναντώνται η α TPA στην ουρά πολυαδενυλίωσης του α2 (AATAAA>AATAAA), καθώς και οι μεταλλάξεις που προκαλούν τις υπερασταθείς αιμοφαιρίνες Hb Agrinio και Ηb Icaria [34]. Σπανιότερα, συναντώνται μεταλλάξεις στο α1 ή το α2 γονίδιο που προκαλούν τη σύνθεση υπερασταθών αιμοσφαιρινών και συνοδεύονται με εικόνα α-θαλασσαιμίας, όπως η Hb Taybe, η Hb Heraklion (α1, cd36/37 delccc, Pro) και η Hb Adana (α1 ή α2, cd59 GGC>GAC, Gly>Asp) [38,39]. 24

32 2.3 Παραλλαγές της α-θαλασσαιμίας Υπάρχουν δύο είδη α-θαλασσαιμίας που συνοδεύονται από πνευματική καθυστέρηση, γνωστές ως σύνδρομα ATR-16 και ATR-X (OMIM # και OMIM #301040, αντίστοιχα). Οι ασθενείς που πάσχουν από το σύνδρομο ATR-16 είναι φορείς μεγάλων ελλειμμάτων (1-2 Mb) στο τελομερικό άκρο του κοντού βραχίονα του χρωμοσώματος 16, στο οποίο περιλαμβάνεται και η συστοιχία των α γονιδίων. Το σύνδρομο έχει εκδήλωση α-θαλασσαιμίας με ποικίλης βαρύτητας επιπτώσεις τόσο σε επίπεδο ανάπτυξης όσο και νοητικής υστέρησης. Οι ανωμαλίες που παρατηρούνται στο σύνδρομο αυτό, οφείλονται στην έλλειψη γονιδίων που εμπλέκονται σε διάφορους μηχανισμούς που σχετίζονται με την ανάπτυξη [40]. Το σύνδρομο ATR-X είναι ένα φυλοσύνδετο νόσημα που οφείλεται σε μεταλλάξεις στο γονίδιο ATR-X που βρίσκεται στη θέση Xq13.3. Οι άρρενες ασθενείς παρουσιάζουν ήπιας βαρύτητας α-θαλασσαιμία με βαρύτατη πνευματική καθυστέρηση, χαρακτηριστικό προσωπείο και άλλες συγγενείς ανωμαλίες. Η πρωτεΐνη ΑTRX είναι μια πρωτεΐνη που εμπλέκεται στην αναδιαμόρφωση της χρωματίνης (chromatin-associated remodelling), που επιδρά στην έκφραση πολλών άλλων γονιδίων κατά την ανάπτυξη. Φαίνεται ότι η πρωτεΐνη αυτή είναι απαραίτητη για την έκφραση των α-γονιδίων της αιμοσφαιρίνης, αλλά όχι για την έκφραση των β [41]. Υπάρχουν επίσης πάρα πολύ σπάνια περιστατικά μιας επίκτητης μορφής α- θαλασσαιμίας, που σχεδόν πάντα συνοδεύονται από μυελοδυσπλαστικό σύνδρομο (MDS). Έχουν αναγνωριστεί δύο τουλάχιστον μηχανισμοί για την επίκτητη α- θαλασσαιμία: α) η δημιουργία επίκτητου ελλείμματος στη συστοιχία των α-γονιδίων αιμοσφαιρίνης που εμφανίζεται μεμονωμένα σε νεοπλασματικό κλώνο και β) συχνότερα, η δημιουργία σωματικών μεταλλάξεων στο γονίδιο της ρυθμιστικής πρωτεΐνης ATRX που την απενεργοποιεί, με αποτέλεσμα την καταστολή της έκφρασης των α-γονιδίων [42]. Τέλος, περιγράφηκε μια σπάνια μορφή α-θαλασσαιμίας που οφείλεται σε μια σημειακή μετάλλαξη (SNP) μεταξύ των ζ και ψζ γονιδίων. Εξαιτίας της μετάλλαξης αυτής δημιουργείται ένας νέος υποκινητής που αναγνωρίζεται από τον ερυθροειδικό μεταγραφικό παράγοντα GATA-1, έχοντας ως αποτέλεσμα την έκφραση μιας εξωγονιδιακής περιοχής. Ο υποκινητής αυτός ανταγωνίζεται τους υποκινητές των α- γονιδίων στο ίδιο χρωμόσωμα περιορίζοντας, σε μεγάλο βαθμό, την έκφρασή τους [26]. 25

33 2.4 Κλινική ετερογένεια της α-θαλασσαιμίας Σύμφωνα με τον αριθμό των α-γονιδίων η λειτουργικότητα των οποίων έχει επηρεαστεί, έχουν χαρακτηριστεί τέσσερεις βασικοί διαφορετικοί αιματολογικοί και κλινικοί φαινότυποι: Η απώλεια ή αδρανοποίηση ενός από τα τέσσερα α-γονίδια συνοδεύεται από καθόλου ή ελάχιστες αιματολογικές διαταραχές και ονομάζεται ετερόζυγος α- θαλασσαιμία-2 ή ήπια ετερόζυγος α-θαλασσαιμία και αναφέρεται ως κατάσταση "σιωπηλού φορέα" (ελαχίστη α-θαλασσαιμία, α-thalassemia minima). Οι φορείς έχουν ένα επηρεασμένο α-γονίδιο είτε λόγω ελλείμματος, είτε λόγω μίας σημειακής μετάλλαξης που προκαλεί α + -θαλασσαιμία. Η έλλειψη δύο α-γονιδίων από το ίδιο χρωμόσωμα ονομάζεται ετερόζυγος α- θαλασσαιμία-1 ή βαριά ετερόζυγος α-θαλασσαιμία και αναφέρεται επίσης ως στίγμα της α-θαλασσαιμίας (ελάσσων α-θαλασσαιμία, α-thalassemia minor). Το άτομο είναι ασυμπτωματικό, αλλά, συνήθως, εμφανίζει μία ήπια υπόχρωμη, μικροκυτταρική αναιμία. Αυτός ο τύπος θαλασσαιμίας είναι πιο συχνός στους Ασιάτες. Τον ίδιο αιματολογικό φαινότυπο εμφανίζουν και οι ομοζυγώτες α-θαλασσαιμίας-2 (απώλεια δύο γονιδίων, ένα από κάθε χρωμόσωμα). Αυτός ο τύπος θαλασσαιμίας είναι πιο συχνός στους Αφρικανούς. Τα επίπεδα αιμοσφαιρίνης των φορέων αυτών είναι φυσιολογικά ή σχεδόν φυσιολογικά. Επιπλέον, το έλλειμμα συμβαίνει, συνήθως, στο λιγότερο ενεργό από τα δύο φυσιολογικά αλληλόμορφα της α-σφαιρίνης, έτσι ώστε ο φαινότυπος (α-/α-) να είναι πιο ήπιος από τον φαινότυπο (αα/--). Η αιμοσφαιρινοπάθεια Η είναι η πιο σοβαρή μορφή της α-θαλασσαιμίας που είναι συμβατή με τη ζωή. Οφείλεται σε συνδυασμό μεταλλάξεων που έχουν ως αποτέλεσμα τη μείωση της παραγωγής των α-αλυσίδων στο ~25% της φυσιολογικής. Η σχετική περίσσεια των β-αλυσίδων σχηματίζει ένα τετραμερές γνωστό σαν Hb H (β4), απ όπου η νόσος πήρε το όνομά της. Περιγράφηκε για πρώτη φορά από τους Rigas et al το 1955 [43]. Στην εμβρυϊκή και νεογνική περίοδο η σχετική περίσσεια των γ-αλυσίδων σχηματίζει ένα άλλο τετραμερές γνωστό ως Hb Bart s (γ4) που περιγράφηκε πρώτα από τους Fessas και Papaspyrou το 1957 [44]. Η αιμοσφαιρίνη Η ονομάστηκε έτσι, επειδή ανακαλύφθηκε ένα χρόνο αργότερα από την αιμοσφαιρίνη G (τώρα ονομάζεται αιμοσφαιρίνη Korle Bu) [45]. Η αιμοσφαιρίνη Η είναι ανίκανη να μεταφέρει οξυγόνο. Επιπλέον, είναι σχετικά 26

34 αδιάλυτη, οπότε συμπεριφέρεται σαν ασταθής αιμοσφαιρίνη κατά τη διάρκεια των τελευταίων σταδίων της ερυθροποίησης και της ζωής των κυκλοφορούντων ερυθροκυττάρων. Ο σχηματισμός σωματιδίων εγκλεισμού κατά τα πρώτα στάδια της ερυθροποίησης είναι λιγότερο σημαντικός, εξαιτίας της κάποιου βαθμού υψηλότερης διαλυτότητας των αζευγάρωτων β- σφαιρινών, οπότε η αναποτελεσματική ερυθροποίηση στους περισσότερους ασθενείς με Hb H να είναι λιγότερο σοβαρή από αυτή που παρατηρείται στην β-θαλασσαιμία. Αντιθέτως, αυτοί οι ασθενείς πάσχουν από χρόνια αιμολυτική αναιμία, λόγω σχηματισμού σωματιδίων εγκλεισμού στα κυκλοφορούντα ερυθροκύτταρα, καθώς η Hb H καθιζάνει [25,46]. Η κλινική έκφραση της νόσου ποικίλλει από ήπιας μορφής αναιμία μέχρι τόσο σοβαρής, ώστε να απαιτούνται μεταγγίσεις. Η απώλεια και των τεσσάρων α-γονιδίων είναι ασύμβατη με τη ζωή, καθώς το έμβρυο είτε αποβιώνει ενδομητρίως, είτε αναπτύσσει ύδρωπα και αποβιώνει μετά τον τοκετό. Ο εμβρυϊκός ύδρωπας οφείλεται συνήθως στην συγκληρονόμηση δύο μεταλλάξεων α 0 -θαλασσαιμίας και, επομένως, στην ολοκληρωτική απουσία παραγωγής α-αλυσίδων (Εικόνα 2.4). Η αδυναμία παραγωγής α-αλυσίδων έχει ως αποτέλεσμα την αντικατάσταση των φυσιολογικών αιμοσφαιρινών από την Hb Portland και την Hb Bart s (γ4). Η Hb Bart s είναι λειτουργικά μη ικανή να μεταφέρει οξυγόνο, ενώ οι μικρές ποσότητες των Hb Portland Ι (ζ 2 γ 2 ) και ΙΙ (ζ 2 β 2 ) υποστηρίζουν την επιβίωση του εμβρύου στα τελευταία στάδια της εγκυμοσύνης [26]. Οι εμβρυϊκοί ιστοί στερούνται οξυγόνου, εκτός από μικρή ποσότητα που διαλύεται στο αίμα. Εξαιτίας των προσπαθειών της μη οξυγονούμενης καρδιάς να ωθήσει τη μικρή ποσότητα του διαλυμένου στο αίμα οξυγόνου προς τους ιστούς, προκαλείται επίσης καρδιακή ανεπάρκεια. Καθώς η καρδιά δεν μπορεί να ανταποκριθεί, δημιουργείται σημαντικό οίδημα (εμβρυϊκός ύδρωπας) και η κατάσταση αυτή είναι γενικά ασύμβατη με τη ζωή [2]. 27

35 Εικόνα 2.4: Η έλλειψη δύο γονιδίων α-σφαιρίνης στο ίδιο χρωμόσωμα (ετερόζυγος α-θαλασσαιμία-1) κάθε γονέα και η μεταβίβαση των "θαλασσαιμικών" χρωμοσωμάτων στον απόγονο έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό εμβρυϊκού ύδρωπα [47]. Η α-θαλασσαιμία είναι πολύ συχνή σε άτομα που κατάγονται από τη ΝΑ Ασία, τη Μεσόγειο και την Αφρική. Η συχνότητα των φορέων θαλασσαιμικών αλληλομόρφων ποικίλλει από 10-20% σε περιοχές της υποσαχάριας Αφρικής, >40% σε πληθυσμούς της Μ. Ανατολής και της Ινδίας και φτάνει μέχρι το 80% στη βόρεια Παπούα-Νέα Γουινέα και απομονωμένες ομάδες στην ΝΑ Ινδία [48]. Στην Ελλάδα, 7% του γενικού πληθυσμού είναι φορείς α + -θαλασσαιμίας (έλλειμμα 3.7 kb, α 3.7 ) και άλλο 1% είναι φορείς κάποιου α 0 -ελλείμματος ή, πιο σπάνια, μετάλλαξης που αδρανοποιεί ένα α γονίδιο (non-deletional, α Τ ). Οι φορείς των μεταλλάξεων στα α-γονίδια είναι δύσκολο να διαγνωσθούν καθώς οι αιματολογικές τους παράμετροι είναι συνήθως εντός φυσιολογικών ορίων και, επίσης, δεν παρατηρείται αύξηση των επιπέδων της HbA2 ή της HbF. Η ανάπτυξη όμως των σύγχρονων μοριακών τεχνικών συνέβαλε σημαντικά στη διάγνωσή τους, καθώς και στη συσχέτιση γονοτύπου-φαινοτύπου [26]. 2.5 Κλινικά χαρακτηριστικά της α-θαλασσαιμίας Ο κλινικός φαινότυπος των ατόμων με α-θαλασσαιμία είναι πολύ ήπιος και μπορεί να μην παρατηρηθεί κατά τη διάρκεια ζωής τους, εκτός εάν γίνει μία ολοκληρωμένη αιματολογική εξέταση ρουτίνας. Οι ασθενείς με αιμοσφαιρινοπάθεια Η έχουν ποικίλο φαινότυπο και αυτοί με Hb Bart s εμβρυϊκό ύδρωπα έχουν θανατηφόρο μορφή αναιμίας. 28

36 2.5.1 Ετερόζυγος α-θαλασσαιμία Οι φορείς α-θαλασσαιμίας, εκτός από ήπια έως μέτρια μικροκυτταρική, υποχρωμική αναιμία, με μικρή μείωση του μέσου κυτταρικού όγκου (MCV) και της μέσης κυτταρικής αιμοσφαιρίνης (MCH), είναι κλινικά ασυμπτωματικοί και η διάγνωση (όταν γίνεται) πραγματοποιείται κατά τη διάρκεια μίας κανονικής εξέτασης ρουτίνας ή στην προγεννητική περίοδο. Κατά μέσο όρο, η συγκέντρωση της αιμοσφαιρίνης είναι κατά 1 g/dl περίπου χαμηλότερη σε σχέση με τα φυσιολογικά άτομα. Όλα τα αιματολογικά στοιχεία (αριθμός ερυθροκυττάρων, αιματοκρίτης, κ.ά.) έχουν σχεδόν φυσιολογικές τιμές. Οι ομοζυγώτες α-θαλασσαιμίας-2 (α-/α-) έχουν πιο παρεκκλίνοντα από τις φυσιολογικές τιμές χαρακτηριστικά, συχνά συγκρίσιμα με αυτά των ατόμων με ετερόζυγο β-θαλασσαιμία. Η ηλεκτροφόρηση αιμοσφαιρίνης ή η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) είναι φυσιολογικές, με το ποσοστό της HbA2 να είναι κανονικό ή μειωμένο. Τα νεογνά με α + -θαλασσαιμία έχουν λίγο χαμηλότερες τιμές αιματολογικών δεικτών και λίγο υψηλότερο ποσοστό αιμοσφαιρίνης Bart s, σε σχέση με τα φυσιολογικά. Κλινικά χαρακτηριστικά όπως κούραση, νωθρότητα και βραχύτητα της αναπνοής είναι ασυνήθιστα και σχεδόν πάντα σχετίζονται με άλλες συνακόλουθες διαταραχές [30,46] Αιμοσφαιρινοπάθεια Η Η αιμοσφαιρινοπάθεια Η παρατηρείται πιο συχνά σε ασθενείς που είναι σύνθετοι ετεροζυγώτες για δύο διαφορετικές μεταλλάξεις ή, λιγότερο συχνά, σε ομοζυγώτες για μία σοβαρή μοριακή διαταραχή. Συνήθως, εμφανίζουν λιγότερο από 30% της φυσιολογικής ποσότητας α-σφαιρίνης. Τα κύρια χαρακτηριστικά της ασθένειας Hb H είναι αναιμία ( g/dl) με διάφορα ποσοστά της Hb H (0,8-40%), που περιστασιακά συνοδεύονται από την Hb Bart s στο περιφερικό αίμα. Οι ασθενείς εμφανίζουν, συνήθως, σπληνομεγαλία, που μπορεί να είναι σοβαρή. Κάποιοι ασθενείς εμφανίζουν ίκτερο σε διάφορους βαθμούς, ενώ τα παιδιά μπορεί να έχουν καθυστέρηση στην ανάπτυξη. Τα νεογέννητα έχουν συμπτώματα της ασθένειας, συχνά παρουσιάζουν νεογνικό ίκτερο, αναιμία και περιστασιακά εμβρυϊκό ύδρωπα [36]. Μεταξύ των άλλων επιπλοκών περιλαμβάνονται μολύνσεις, έλκη στα πόδια, χολολιθίαση, έλλειψη φυλλικού οξέος, ηπατοσπληνομεγαλία, έμμεση υπερχολερυθριναιμία, αυξημένη LDH, μειωμένη απτοσφαιρίνη, πρόωρη νόσος των χοληφόρων οδών και οξεία αιμολυτικά επεισόδια ως απόκριση σε φάρμακα ή μολύνσεις [46,49]. Οι μεγαλύτεροι σε ηλικία ασθενείς συχνά επιδεικνύουν κάποιο 29

37 βαθμό υπερφόρτωσης σιδήρου, οπότε πρέπει να ελέγχονται για τυχόν ύπαρξη ηπατικής ή καρδιακής βλάβης. Η σοβαρότητα των κλινικών χαρακτηριστικών σχετίζεται με τη μοριακή βάση της ασθένειας. Τα άτομα με μη ελλειμματικούς τύπους αιμοσφαιρινοπάθειας Η, έχουν πιο σοβαρό φαινότυπο σε σχέση με αυτούς που έχουν τους κοινούς ελλειμματικούς τύπους της ασθένειας. Παρόλα αυτά, οι περισσότεροι ασθενείς δεν απαιτούν χρόνια υποστήριξη μεταγγίσεων κατά τη διάρκεια της πρώτης δεκαετίας της ζωής τους, αλλά αυτό, συνήθως, γίνεται απαραίτητο κατά τη δεύτερη ή τρίτη δεκαετία [30,34,50] Σύνδρομο Hb Bart s εμβρυϊκού ύδρωπα Τα παιδιά με σύνδρομο Hb Bart s εμβρυϊκού ύδρωπα έχουν τις πιο σοβαρές ελλείψεις στην έκφραση των α-σφαιρινών. Ενώ, συνήθως, το σύνδρομο σχετίζεται με την κληρονόμηση καθόλου α-γονιδίων από τον κάθε γονέα, σε μερικές περιπτώσεις, μπορεί να είναι αποτέλεσμα κληρονόμησης μίας σοβαρής μη ελλειμματικής μετάλλαξης από τον ένα γονέα και καθόλου α-γονιδίων από τον άλλο. Οι ασθενείς που είναι στα όρια μεταξύ σοβαρής αιμοσφαιρινοπάθειας Η και συνδρόμου Hb Bart s εμβρυϊκού ύδρωπα, χαρακτηρίζονται ως άτομα με σύνδρομο Hb H ύδρωπα. Τα κλινικά χαρακτηριστικά του συνδρόμου Hb Bart s είναι τα χλωμά και οιδηματώδη νεογνά, με σημάδια καρδιακής ανεπάρκειας και παρατεταμένη ενδομήτρια αναιμία. Έντονη ηπατοσπληνομεγαλία, καθυστέρηση στην ανάπτυξη του εγκεφάλου, σκελετικές και καρδιοαγγειακές παραμορφώσεις και μεγάλη διεύρυνση του πλακούντα είναι κλασικά χαρακτηριστικά [30]. Τα παιδιά με αυτό το σύνδρομο είτε έχουν ενδομήτριο θάνατο, είτε πεθαίνουν αμέσως μετά τη γέννηση, αν και έχουν αναφερθεί λίγες περιπτώσεις, στις οποίες δόθηκε στο νεογέννητο έντονη υποστήριξη θεραπείας και εκτεταμένες μεταγγίσεις αίματος [51,52]. 2.6 Οι εξεταζόμενες μεταλλάξεις Στην παρούσα εργασία περιγράφεται η ανάπτυξη μεθόδου ανίχνευσης 5 γνωστών μεταλλάξεων στο γονίδιο της α-σφαιρίνης. Εξετάστηκαν μόνο μεταλλάξεις στο α1 γονίδιο της σφαιρίνης. Οι συγκεκριμένες μεταλλάξεις ανήκουν στις μη ελλειμματικές (non-deletional) που προκαλούν α + - ή α 0 -θαλασσαιμία, ανάλογα με το αν συνυπάρχουν με άλλες μεταλλάξεις, ελλειμματικές ή μη. Συγκεκριμένα, οι εξεταζόμενες μεταλλάξεις αποτελούν είτε αντικατάσταση βάσης, είτε ελλείμματα μερικών βάσεων. 30

38 2.6.1 Hb Heraklion [α1, cd36/37 (-CCC), Pro 0] Η αιμοσφαιρίνη Heraklion είναι μία ασταθής α-αλυσίδα που προκύπτει από ένα έλλειμμα μίας προλίνης στη θέση 37 της α-σφαιρινικής αλυσίδας. Το αμινοξύ στη θέση 37 βρίσκεται σε κεντρική θέση στην α-αλυσίδα και εμπλέκεται φυσιολογικά στη σύνδεση α1β2 του μορίου της αιμοσφαιρίνης μέσω της αλληλεπίδρασης με την ιστιδίνη στη θέση β147. Επιπλέον, η προλίνη στη θέση 37 βρίσκεται κοντά με τα αμινοξέα αργινίνη 31 και φαινυλαλανίνη 36 της α-αλυσίδας στη σύνδεση του διμερούς α1β1. Επίσης, παίζει σημαντικό ρόλο στη σταθεροποίηση της Τ- διαμόρφωσης του μορίου της αιμοσφαιρίνης. Η μετάλλαξη προκαλεί αστάθεια της α- αλυσίδας και αλλαγή στη συγγένεια με το οξυγόνο. Η Hb Heraklion έχει εντοπιστεί μόνο σε τέσσερεις περιπτώσεις στην περιοχή της Κρήτης. Και στις τέσσερεις περιπτώσεις η μετάλλαξη συνυπήρχε με άλλες μεταλλάξεις, είτε το έλλειμμα α 3.7, είτε τη μη ελλειμματική μετάλλαξη α Hph α στο α2 γονίδιο. Τα κλινικά χαρακτηριστικά που παρατηρούνται είναι μέτρια αναιμία χωρίς απαραίτητες μεταγγίσεις αίματος και ήπια ή μέτρια σπληνομεγαλία [53,54] Hb Taybe [α1, cd38/39 (-ACC), Thr 0] Η αιμοσφαιρίνη Taybe είναι μία ασταθής παραλλαγή α-αλυσίδας, που προκαλείται από ένα έλλειμμα μίας θρεονίνης στο κωδικόνιο 38 ή 39 στο α1 γονίδιο της σφαιρίνης. Η δομική ανωμαλία της Hb Taybe εντοπίζεται στην έλικα C, η οποία συμμετέχει στη σύνδεση α1β2 και είναι κοντά στη δομή α1β1. Επιπλέον, η θρεονίνη στη θέση 38 αλληλεπιδρά με το γλουταμινικό οξύ στη θέση 35 και το ασπαραγινικό οξύ στη θέση 36 της AHSP. Έχουν παρατηρηθεί τμήματα της Hb Taybe στα ερυθροκύτταρα, μόνο σε κάποιους ομοζυγώτες, ειδικά μετά από σπληνεκτομή. Όταν η Hb Taybe είναι η μόνη μετάλλαξη που υπάρχει, τα άτομα είναι ασυμπτωματικά. Συνήθως όμως συγκληρονομείται με άλλες μεταλλάξεις και δίνουν έναν φαινότυπο ενδιάμεσης ή σοβαρής θαλασσαιμίας (ανάλογα με τη μετάλλαξη). Στην ήπια αναιμία δεν είναι απαραίτητες οι μεταγγίσεις αίματος. Σε ομόζυγη κατάσταση προκαλείται σοβαρή αιμολυτική αναιμία και σε κάποιες περιπτώσεις έχει αναφερθεί σε σύνδρομο του Hb Bart s εμβρυϊκού ύδρωπα. Η Hb Taybe είναι συχνή στους Άραβες του Ισραήλ, ενώ στην Ελλάδα δεν είναι πολύ συχνή [35,37]. 31

39 2.6.3 Hb Adana [α1 ή α2, cd59(e8)gly Asp] Η Hb Adana ταυτοποιήθηκε για πρώτη φορά σε δύο Τούρκους ασθενείς σε συνδυασμό με μια α 0 μετάλλαξη (έλλειμμα). Η κλινική εικόνα είναι από ενδιάμεση θαλασσαιμία έως εμφάνιση αιμοσφαιρινοπάθειας Η, εάν υπάρχει σε συνδυασμό με άλλες μεταλλάξεις. Έχει περιγραφεί και περίπτωση εμβρυϊκού ύδρωπα ως αποτέλεσμα της συνύπαρξης της Hb Adana στο α2 γονίδιο με μια α 0 μετάλλαξη in trans. Αντίθετα, η συνύπαρξη της Hb Adana στο α1 γονίδιο με μια α 0 μετάλλαξη προκάλεσε εικόνα αιμοσφαιρινοπάθειας Η με ανιχνεύσιμα επίπεδα Hb Bart s. Η διαφορά αποδίδεται στην κυρίαρχη έκφραση του α2 γονιδίου. Θεωρείται, ότι η μετάλλαξη παρεμποδίζει την αναδίπλωση της α-αλυσίδας επηρεάζοντας κάποιες θέσεις επαφής εντός αυτής [37,55] Hb Aghia Sophia [α1, cd62(e11) (-GTG), Val 0] Η αιμοσφαιρίνη Aghia Sophia προκύπτει από ένα έλλειμμα τριών βάσεων που οδηγεί σε απώλεια μίας βαλίνης στη θέση 62 (Ε11). Αυτό το αμινοξύ κατέχει σημαντική θέση στην ομάδα της αίμης, αφού κανονικά, το οξυγόνο που συνδέεται με την αίμη τοποθετείται ανάμεσα στην HisE7 και την ValE11. Η απώλεια αυτού του αμινοξέος αλλάζει τις συνδέσεις των υπόλοιπων αμινοξέων της έλικας Ε, οδηγεί στον σχηματισμό μίας υπερασταθούς αιμοσφαιρίνης και εξασθενεί τις αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στην αίμη και την αιμοσφαιρίνη. Στην Hb Aghia Sophia το έλλειμμα φαίνεται να είναι πιο επιζήμιο στη σταθερότητα του τετραμερούς της αιμοσφαιρίνης, από ότι άλλες μεταλλάξεις αντικατάστασης βάσης. Το έλλειμμα του κωδικονίου 62 είναι ασυμπτωματικό στον ετεροζυγώτη φορέα και ανακαλύπτεται, συνήθως, όταν υπάρχει σε συνδυασμό με άλλες μεταλλάξεις [37,56] Hb Questembert [α1 ή α2, cd131(h14) Ser Pro, TCT>CCT] Η αιμοσφαιρίνη Questembert περιγράφηκε πρώτα σε μία γυναίκα από τη Νορμανδία που είχε ήπια, χρόνια αιμολυτική αναιμία. Έχει επίσης αναφερθεί σε έναν Έλληνα ασθενή σε συνδυασμό με το κοινό έλλειμμα α 3.7. Ο συγκεκριμένος ασθενής είχε ποικίλη κλινική έκφραση, από ήπια αιμολυτική αναιμία κάτω από στρες, έως ενδιάμεση θαλασσαιμία κάτω από φυσιολογικές συνθήκες. Η Hb Questembert φαίνεται ότι συνδέεται λιγότερο ισχυρά με την AHSP, με αποτέλεσμα τον σχηματισμό ασταθούς αιμοσφαιρίνης [37,57]. 32

40 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3 ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ΣΤΟ ΓΟΝΙΔΙΟ ΤΗΣ α-σφαιρινησ 3.1 Μέθοδοι ανίχνευσης μεταλλάξεων Οι θαλασσαιμίες κληρονομούνται με αυτοσωμικό υπολειπόμενο τρόπο. Οι ετεροζυγώτες για τις θαλασσαιμίες είναι σε γενικές γραμμές φυσιολογικοί. Η αναγνώριση των ετεροζυγωτών ή των φορέων συμβαίνει, συνήθως, από τις αιματολογικές εξετάσεις. Επιπλέον, οι αιματολογικές και βιοχημικές εξετάσεις παρέχουν ουσιώδεις πληροφορίες για τις διάφορες γενετικές αλληλεπιδράσεις. Η μελέτη των οικογενειών είναι συχνά αναπόφευκτη για την εύρεση φορέων και την ανίχνευση μεταλλάξεων. Οι βασικές αιματολογικές εξετάσεις περιλαμβάνουν τις μετρήσεις όλων των κυττάρων του αίματος με τη χρήση ηλεκτρονικού μετρητή, την ανάλυση της αιμοσφαιρίνης με ηλεκτροφόρηση, ισοηλεκτρική εστίαση (IEF) και/ή με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC) και τη μέτρηση των επιπέδων των HbA 2 και HbF. Συμπληρωματικές εξετάσεις περιλαμβάνουν την εκτίμηση της κατάστασης του σιδήρου (δακτύλιος πρωτοπορφυρίνης στον ορό, φερριτίνη, κορεσμός τρανσφερίνης). Επίσης, υπάρχουν και οι λειτουργικοί έλεγχοι για παραλλαγές τις αιμοσφαιρίνης, όπως η παρατήρηση έγκλειστων σωματιδίων, οι καμπύλες οξυγόνου, η σύνθεση των αιμοσφαιρινικών αλυσίδων και η ενδοκυτταρική διανομή της HbF. Ένας άλλος χρήσιμος και βοηθητικός έλεγχος για την επιβεβαίωση μίας θαλασσαιμίας και την εύρεση του υπεύθυνου γονιδίου (α ή β) είναι η αναλογία α/β των σφαιρινικών πρωτεϊνών. Γι αυτό απαιτείται η επώαση των ερυθροκυττάρων με έναν ραδιενεργό ανιχνευτή, όπως την 3 Η-λευκίνη. Οι κορυφές που αντιπροσωπεύουν τις α και β σφαιρινικές πρωτεΐνες ποσοτικοποιούνται για την εύρεση της αναλογίας α/β, η οποία πρέπει να είναι ίση με 1. Μία αναλογία >1 δείχνει β-θαλασσαιμία, ενώ μία αναλογία <1 προκαλείται από α-θαλασσαιμία. Αν και χρήσιμη, αυτή η τεχνική δε χρησιμοποιείται συχνά στη ρουτίνα των εργαστηρίων. Ο λόγος είναι ότι α) η στρατηγική της επιλογής για έλεγχο γίνεται μέσω της ανάλυσης του DNA και β) η απαίτηση για φρέσκο ραδιενεργό υλικό αποτελεί εμπόδιο. Η αναλογία α/β δεν είναι 33

41 χρήσιμη στην περίπτωση αλληλεπιδράσεων μεταξύ των γονιδίων, όπως συμβαίνει στην συγκληρονόμηση α- και β-θαλασσαιμίας. Για την οριστική διάγνωση των θαλασσαιμιών απαιτείται η ανάλυση του DNA, η οποία καθοδηγείται από τα αποτελέσματα των πρωτογενών και δευτερογενών αιματολογικών εξετάσεων. Σχεδόν όλες οι μέθοδοι ανάλυσης του DNA στις θαλασσαιμίες και γενικά στις αιμοσφαιρινοπάθειες, που χρησιμοποιούνται σήμερα, βασίζονται στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Με την τεχνική αυτή έχει αποκλειστεί η χρήση ραδιενεργών ισοτόπων για την ανίχνευση αλληλουχιών και η διάγνωση έχει καταστεί δυνατή με μικρότερες ποσότητες DNA. Κάποιες από τις τεχνικές που βασίζονται στην PCR και χρησιμοποιούνται στη διάγνωση των αιμοσφαιρινοπαθειών, περιλαμβάνουν την αλληλοειδική ολιγονουκλεοτιδική υβριδοποίηση (ASO) ή την ανάλυση dot-blot, την ανάστροφη dot-blot ανάλυση, την αλληλοειδική PCR (ARMS), την ανάλυση με περιοριστικά ένζυμα (RFLP), την ανάλυση PCR με περιοριστικά ένζυμα (RE-PCR) και την gap-pcr. Αυτές οι τεχνικές είναι κατάλληλες για την ανίχνευση γνωστών μεταλλάξεων. Στην περίπτωση αγνώστων μεταλλάξεων, μεταξύ των τεχνικών που χρησιμοποιούνται περιλαμβάνονται η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα με βαθμίδωση αποδιατακτικών παραγόντων (DGGE), η ανάλυση πολυμορφισμού μονόκλωνης αλυσίδας DNA (SSCP) και η ανάλυση ετεροδιμερών. Τα χαρακτηριστικά αλλαγμένα μοτίβα θέσης σε αυτές τις μεθόδους ανάλυσης, λειτουργούν ως οδηγός για τη θέση της μετάλλαξης, στοχεύοντας την περιοχή για αναγνώριση με άλλες μεθόδους. Η μέθοδος αναφοράς για την ανίχνευση μίας μετάλλαξης είναι η άμεση ανάλυση αλληλουχίας μίας συγκεκριμένης ενισχυμένης περιοχής του DNA (sequencing). Την τελευταία δεκαετία, η χρήση αυτόματων οργάνων αλληλούχισης έχει οδηγήσει σε μη ραδιενεργή και πιο γρήγορη αλληλούχιση, καθιστώντας αυτήν την τεχνική ένα κατάλληλο διαγνωστικό εργαλείο για τη ρουτίνα του εργαστηρίου. Η άμεση ανάλυση αλληλουχίας είναι ιδιαιτέρως εφαρμόσιμη στα γονίδια των σφαιρινών, λόγω του σχετικά μικρού τους μεγέθους ( kb), με την πλειοψηφία των σημειακών μεταλλάξεων μέσα στα γονίδια ή στις παρακείμενες αλληλουχίες. Η αποτύπωση κατά Southern είναι πιθανώς μία από τις λίγες τεχνικές που δεν βασίζονται στην PCR, η οποία παίζει ακόμα σημαντικό ρόλο στη μοριακή διάγνωση των αιμοσφαιρινοπαθειών. Είναι χρήσιμη στην ανάλυση για μεγάλα ελλείμματα ή αναδιατάξεις και είναι κατάλληλη στον χαρακτηρισμό νέων ελλειμμάτων. Τα πιο 34

42 κοινά ελλείμματα μπορούν να ανιχνευτούν με gap-pcr, εφόσον έχουν αναγνωριστεί τα σημεία κοπής των ελλειμμάτων και έχουν σχεδιαστεί ειδικοί εκκινητές. Κάθε μία από τις παραπάνω τεχνικές έχει τους περιορισμούς της. Η επιλογή των τεχνικών που χρησιμοποιούνται σε ένα εργαστήριο για τη μοριακή διάγνωση των αιμοσφαιρινοπαθειών, εξαρτάται από το φάσμα των μεταλλάξεων που συναντάται στην περιοχή ή χώρα και από τα όργανα και τους ειδικούς τεχνικούς του εργαστηρίου. Είναι καλό για κάθε διαγνωστικό εργαστήριο να διαθέτει τουλάχιστον δύο εναλλακτικές μεθόδους για την ανίχνευση κάθε μετάλλαξης [58-60]. Παρακάτω αναλύονται κάποιες από τις τεχνικές που χρησιμοποιούνται στην ανίχνευση μεταλλάξεων στο γονίδιο της α-σφαιρίνης. 3.2 Τεχνικές ανίχνευσης γνωστών μεταλλάξεων Άμεση ανάλυση αλληλουχίας (sequencing) Η τεχνική αυτή μπορεί να χρησιμοποιηθεί τόσο για την ανίχνευση γνωστών, όσο και άγνωστων μεταλλάξεων σε οποιοδήποτε γονίδιο. Για την ανάλυση αλληλουχίας της α-σφαιρίνης απαιτείται η ενίσχυση των δύο γονιδίων (α1 και α2), οπότε η αλληλούχιση του καθενός μπορεί να γίνει με ένα μόνο διάβασμα. Αυτό επιτρέπει την ανίχνευση και αναγνώριση μεταλλάξεων με μία μόνο διαδικασία, σε αντίθεση με άλλα γονίδια που είναι πολύ μεγάλα, όπως αυτό της δυστροφίνης. Η ανάλυση αλληλουχίας είναι μία διαδικασία πολλών σταδίων στην οποία απαιτείται ενίσχυση του γονιδίου με PCR, καθαρισμός του προϊόντος και πρόγραμμα αλληλούχισης σε κατάλληλο όργανο (sequencer). Στη συνέχεια, η αλληλουχία πρέπει να αναλυθεί και να ελεγχθεί για οποιεσδήποτε αλλαγές. Παρόλο που υπάρχει διαθέσιμο λογισμικό ανάλυσης αλληλουχίας, δεν είναι 100% αποδοτικό στην ανίχνευση των ετεροζυγωτών. Δεδομένου ότι οι θαλασσαιμίες εμφανίζονται σε μεγάλο ποσοστό σε κατάσταση ετεροζυγωτίας ή σε φορείς, απαιτείται συχνά ο οπτικός έλεγχος. Αυτό μπορεί να είναι χρονοβόρο καθώς και μία ενδεχόμενη πηγή λάθους. Υπάρχουν διάφορες μέθοδοι αλληλούχισης που βασίζονται στη μέθοδο κατά Sanger, οι οποίες διαφέρουν στον τρόπο ενσωμάτωσης του φθορίζοντος ιχνηθέτη κατά τη διάρκεια του προγράμματος αλληλούχισης [επισήμανση μέσω εκκινητή, νουκλεοτιδίων ή του τελευταίου νουκλεοτιδίου κάθε διαβάσματος (dye terminator)] (Εικόνα 3.1),. Η αλληλούχιση συμβαίνει με τερματισμό της επιμήκυνσης της 35

43 αλυσίδας με ενσωμάτωση ενός δι-δεοξυριβονουκλεοτίδιου (ddntp), το οποίο έχει έλλειψη 3 -ΟΗ. Στην περίπτωση της επισήμανσης μέσω εκκινητή ή των δεοξυριβονουκλεοτιδίων (dntps), το προς ανάλυση DNA χωρίζεται σε τέσσερεις αντιδράσεις αλληλούχισης, σε καθεμία εκ των οποίων προστίθενται η πολυμεράση, τα dntps και μόνο ένα από τα τέσσερα ddntps. Τα νεοσυντιθέμενα και επισημασμένα προϊόντα διαχωρίζονται βάσει μεγέθους (με ανάλυση ενός νουκλεοτιδίου τη φορά) με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή υψηλής διακριτικής ικανότητας ή με αποδιατακτική πηκτή πολυακρυλαμιδίου-ουρίας, όπου καθεμία από τις τέσσερεις αντιδράσεις τρέχεται σε διαφορετική θέση. Οι ζώνες του DNA παρατηρούνται με αυτοραδιογραφία ή με υπεριώδη ακτινοβολία και το διάβασμα των βάσεων γίνεται από κάτω προς τα πάνω. Στην περίπτωση της επισήμανσης του ddntp που τερματίζει την επιμήκυνση της αλυσίδας, η αλληλούχιση γίνεται σε μία μόνο αντίδραση και κάθε ddntp είναι επισημασμένο με διαφορετική φθορίζουσα χρωστική. Λόγω αυτών των πλεονεκτημάτων, η τεχνική αυτή αποτελεί την κύρια μέθοδο της αυτόματης αλληλούχισης. Εικόνα 3.1: Παραλλαγές της αλληλούχισης με τερματισμό αλυσίδας με επισήμανση είτε του εκκινητή, είτε των dntps, είτε των ddntps [61]. Παρόλο που η τεχνική επισήμανσης των ddntps είναι εύκολο να πραγματοποιηθεί, η ένταση του σήματος που προέρχεται από τις διαφορετικές φθορίζουσες χρωστικές κάθε νουκλεοτίδιου στο ηλεκτροφόρημα (μετά από τριχοειδή ηλεκτροφόρηση), διαφέρει λόγω της διαφορετικής απόδοσης φθορισμού. Το γεγονός αυτό καθιστά την επισήμανση του εκκινητή πιο κατάλληλη στην ανίχνευση 36

44 ετεροζυγωτών για α-θαλασσαιμία. Η όλη διαδικασία αλληλούχισης ενός δείγματος από τη λήψη ολικού αίματος, συμπεριλαμβανομένης και μιας δεύτερης τεχνικής για επιβεβαίωση που βασίζεται στην PCR, διαρκεί 4-5 μέρες, πριν δοθεί το αποτέλεσμα [58,61] Gap-PCR Οι α-θαλασσαιμίες προκαλούνται κατά κύριο λόγο από ελλείμματα γονιδίων, αν και, σε δύσκολες περιπτώσεις, ερευνώνται όλο και περισσότερο μη ελλειμματικές μορφές α-θαλασσαιμίας. Η τεχνική που χρησιμοποιείται ευρέως για την ανίχνευση κοινών ελλειμμάτων και αναδιατάξεων που προκαλούν α-θαλασσαιμία είναι η gap- PCR. Τα ζεύγη των εκκινητών της PCR σχεδιάζονται έτσι, ώστε να συνορεύουν με τη γνωστή μετάλλαξη, σχηματίζοντας ένα μοναδικό amplicon (ενισχυμένο προϊόν), το οποίο θα είναι μικρότερο στη μεταλλαγμένη αλληλουχία σε σύγκριση με τη φυσιολογική (wild type). Η gap-pcr βασίζεται στη μη δυνατότητα των εκκινητών που είναι συμπληρωματικοί ως προς αλληλουχίες DNA που βρίσκονται μακριά, να ενισχύσουν το προϊόν, εκτός εάν ένα έλλειμμα τους φέρει κοντά. Στην περίπτωση μικρών ελλειμμάτων, σχηματίζονται διαφορετικού μεγέθους προϊόντα ενίσχυσης μεταλλαγμένων και φυσιολογικών αλληλόμορφων. Όταν τα ελλείμματα είναι μεγάλα (>2 kb), είναι τεχνικά δύσκολο να σχηματιστεί προϊόν ενίσχυσης στη φυσιολογική αλληλουχία. Ως έλεγχος (control), μπορεί να συμπεριληφθεί ένας εκκινητής που υβριδοποιείται μέσα στην αλληλουχία που εξαλείφεται, σχηματίζοντας ένα επιπλέον προϊόν με έναν από τους άλλους εκκινητές που συνορεύουν με το έλλειμμα. Με τον τρόπο αυτό, τα ψευδώς αρνητικά δείγματα ελέγχονται με βάση τις φυσιολογικές αλληλουχίες και αποκαλύπτουν εάν το άτομο είναι ετερόζυγο για το έλλειμμα [58]. Έχουν αναπτυχθεί διάφορα πρωτόκολλα για την ταυτόχρονη ανίχνευση των κοινών ελλειμμάτων που προκαλούν α-θαλασσαιμία, με πολλαπλή PCR σε μία μόνο αντίδραση από τους Chong S. S. et al (2000), οι οποίοι προτείνουν μέθοδο ανίχνευσης 6 κοινών ελλειμματικών μεταλλάξεων σε 115 δείγματα [62], τους Liu Y. T. et al (2000), οι οποίοι, με τη χρήση τριών πολλαπλών PCR, πέτυχαν την ανίχνευση 7 κοινών ελλειμμάτων και της παραλλαγής ααα anti3.7 σε 52 δείγματα [63] και τους Tan A. S. C. et al (2001), οι οποίοι περιγράφουν την ανίχνευση 7 κοινών ελλειμμάτων σε πάνω από 200 δείγματα [64]. 37

45 3.2.3 Αποτύπωση κατά Southern (Southern blot) Η αποτύπωση κατά Southern είναι μία χρήσιμη τεχνική για τον έλεγχο των λιγότερο συχνά εμφανιζόμενων ελλειμμάτων, τα οποία αν δεν υπάρχουν, δημιουργείται υποψία για μία μη ελλειμματική μετάλλαξη. Το όνομα της τεχνικής προέρχεται από τον εφευρέτη της, τον Βρετανό βιολόγο Edwin Southern. Στη μέθοδο Southern blot, το DNA υποβάλλεται σε πέψη με περιοριστικά ένζυμα και μετά ηλεκτροφορείται σε πηκτή αγαρόζης για τον διαχωρισμό των θραυσμάτων βάσει μεγέθους. Εάν κάποια από τα τμήματα του DNA είναι μεγαλύτερα από 15 kb, τότε, πριν την αποτύπωση, η πηκτή εκτίθεται σε ένα οξύ, όπως το HCl, το οποίο αφαιρεί τις πουρίνες (Α και G) από τα τμήματα του DNA και το διασπά σε μικρότερα τμήματα. Με τον τρόπο αυτό καθίσταται πιο αποτελεσματική η μεταφορά του DNA από την πηκτή στη μεμβράνη. Εάν χρησιμοποιούνται μέθοδοι αλκαλικής μεταφοράς, η πηκτή με το DNA τοποθετείται στο πάνω μέρος ενός σπόγγου, το οποίο βρίσκεται σε δίσκο με αλκαλικό διάλυμα (συνήθως περιέχει υδροξείδιο του νατρίου) για την αποδιάταξη του δίκλωνου DNA. Η αποδιάταξη σε αλκαλικό περιβάλλον μπορεί να βελτιώσει τη σύνδεση του αρνητικά φορτισμένου DNA σε μία θετικά φορτισμένη μεμβράνη, διαχωρίζοντάς το σε μονόκλωνο DNA για τη μετέπειτα υβριδοποίηση με ιχνηθέτες και καταστρέφοντας κάθε κατάλοιπο RNA που μπορεί να υπάρχει ακόμα στο DNA. Ένα φύλλο μεμβράνης νιτροκυτταρίνης (ή νάιλον), που χρησιμοποιείται ως φίλτρο, τοποθετείται στο πάνω μέρος της πηκτής. Στην πηκτή ασκείται πίεση είτε μέσω αναρρόφησης, είτε με σωρό από κάποιο απορροφητικό υλικό (συνήθως χαρτί, paper towel) για την καλή επαφή της μεμβράνης με την πηκτή. Εάν η μεταφορά γίνεται μέσω αναρρόφησης, χρησιμοποιείται ένα ρυθμιστικό διάλυμα 20 SSC για την παρεμπόδιση της ξήρανσης της πηκτής. Το απορροφητικό υλικό έλκει το διάλυμα άλατος από το δίσκο στο σπόγγο και μέσω της πηκτής με τριχοειδή δράση, το DNA μεταφέρεται στη μεμβράνη. Οι αλληλεπιδράσεις ανταλλαγής ιόντων συνδέουν το DNA στη μεμβράνη, λόγω του αρνητικά φορτισμένου DNA και της θετικά φορτισμένης μεμβράνης. Έτσι, η μεμβράνη περιέχει τα τμήματα DNA με την ίδια διάταξη όπως και στην πηκτή, αλλά σε πιο κατάλληλο υπόβαθρο για την περαιτέρω χρήση. Η μεμβράνη θερμαίνεται σε φούρνο ή σε κλίβανο στους 80 o C για 2 h ή εκτίθεται σε υπεριώδη ακτινοβολία (νάιλον μεμβράνη) για τη σταθεροποίηση της ακινητοποίησης του μεταφερόμενου DNA στη μεμβράνη. Στη συνέχεια, η μεμβράνη 38

46 εκτίθεται σε έναν ανιχνευτή υβριδοποίησης (μικρό τμήμα DNA με συγκεκριμένη αλληλουχία). Ο ανιχνευτής συνδέεται μόνο σε περιοχές που υπάρχει συμπληρωματικό DNA. Ο ανιχνευτής επισημαίνεται ώστε να μπορεί να ανιχνευθεί, συνήθως με ραδιενέργεια ή με φθορίζουσα ή χρωμογόνο χρωστική. Για την ελάττωση ή/και εξάλλειψη των μη ειδικών αλληλεπιδράσεων χρησιμοποιείται DNA από σπέρμα σολομού ή ρέγγας ως καλυπτικό αντιδραστήριο της επιφάνειας της μεμβράνης, απιονισμένο φορμαμίδιο και παράγοντες όπως το SDS, για την ελαχιστοποίηση της μη ειδικής σύνδεσης του ανιχνευτή. Μετά την υβριδοποίηση, η περίσσεια του ανιχνευτή εκπλένεται από τη μεμβράνη (συνήθως με χρήση ρυθμιστικού διαλύματος SSC) και τα σημεία της υβριδοποίησης παρατηρούνται με αυτοραδιογραφία, στην περίπτωση του ραδιενεργού ιχνηθέτη, ή με εμφάνιση χρώματος στην περίπτωση χρωμογόνου ιχνηθέτη (Εικόνα 3.2). Η υβριδοποίηση του ανιχνευτή σε συγκεκριμένο τμήμα του DNA στη μεμβράνη, δείχνει ότι αυτό το τμήμα περιέχει αλληλουχία DNA συμπληρωματική προς τον ιχνηθέτη [65,66]. Το 2003 αναπτύχθηκε ένα μη ραδιενεργό σύστημα για ανίχνευση του ελλείμματος -- SEA σε προγεννητική διάγνωση στη ΝΑ Ασία, από τους Cheng P. J. et al. Τα 72 δείγματα προέρχονταν από χοριακές λάχνες και τα 30 από αμνιακό υγρό. Οι γονείς ήταν φορείς α-θαλασσαιμίας-1. Το σύστημα ανίχνευσης της υβριδοποίησης με αποτύπωση κατά Southern περιελάμβανε διγοξιγενίνη-anti-διγοξυγενίνη-alp (αλκαλική φωσφατάση) [67]. Εικόνα 3.2: Σχηματική παράσταση της μεθόδου αποτύπωσης κατά Southern [66]. 39

47 3.2.4 Ανάλυση προϊόντος PCR με περιοριστικά ένζυμα (Restriction-Enzyme PCR, RE-PCR) Τα περιοριστικά ένζυμα κόβουν το δίκλωνο DNA σε ειδικές αλληλουχίες αναγνώρισης. Οι ειδικές αυτές αλληλουχίες μπορεί να δημιουργηθούν ή να εξαφανιστούν παρουσία κάποιων μεταλλάξεων. Στην τεχνική αυτή, το γενωμικό DNA που περιέχει τη μετάλλαξη, ενισχύεται με PCR, το προϊόν πέπτεται με το διαγνωστικό ένζυμο περιορισμού και στη συνέχεια ηλεκτροφορείται. Η παρουσία ή απουσία της θέσης περιορισμού καθορίζεται από το μοτίβο του πεπτόμενου προϊόντος PCR. Μία άλλη ορολογία για αυτήν την τεχνική είναι η ανάλυση μεγέθους πολυμορφισμού με περιοριστικά ένζυμα (Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP). Η ανάλυση με ένζυμα περιορισμού είναι απλή, σχετικά φθηνή και οδηγεί σε αξιόπιστα αποτελέσματα. Η τεχνική RFLP αποτελεί ένα δυνατό μοριακό διαγνωστικό εργαλείο. Παρόλα αυτά, η χρήση της είναι περιορισμένη, καθώς μόνο μερικές από τις μεταλλάξεις που προκαλούν θαλασσαιμίες εμπλέκονται στη δημιουργία ή εξαφάνιση ενός σημείου αναγνώρισης του ενζύμου. Κάποιες ατελείς ή μερικές πέψεις μπορούν να προκαλέσουν πρόβλημα για μερικά ένζυμα περιορισμού, οδηγώντας σε ψευδώς αρνητικά ή θετικά αποτελέσματα, γι αυτό πρέπει πάντα να συμπεριλαμβάνονται θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες (controls). Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού χρησιμοποιούνται, συνήθως, όταν υπάρχουν άλλες ενδείξεις που προκαλούν τη μετάλλαξη, όπως η HPLC, η ανάλυση ηλεκτροφόρησης αιμοσφαιρίνης και η εθνική καταγωγή του ατόμου, ή χρησιμοποιείται ως δεύτερη τεχνική επιβεβαίωσης για μία μετάλλαξη, όπως μετά από ανάλυση αλληλουχίας (sequencing) [58]. Σε κάποιες περιπτώσεις, παρά το γεγονός ότι οι μεταλλάξεις δεν εμπλέκονται στη δημιουργία/εξαφάνιση θέσης περιορισμού, η αλληλουχία της γειτονικής περιοχής της μετάλλαξης επιτρέπει τη δημιουργία τεχνητών θέσεων περιορισμού παρακείμενα στην αλληλουχία με τη μετάλλαξη, με εισαγωγή ενός "mismatch" στον εκκινητή. Αυτή η τεχνική, αναφέρεται ως θέση περιορισμού που δημιουργείται από την ενίσχυση (amplification-created restriction site, ACRS) και χρησιμοποιείται για την αναγνώριση της μη ελλειμματικής μετάλλαξης Saudi στο α2 γονίδιο που προκαλεί α- θαλασσαιμία, [68]. 40

48 3.2.5 Αλληλοειδικός ολιγονουκλεοτιδικός υβριδισμός (Allele-Specific Oligonucleotide, ASO) και ανάστροφη αποτύπωση κηλίδας (Reverse Dot-Blot, RDB) Η μέθοδος ASO βασίζεται στην ειδική υβριδοποίηση δύο ολιγονουκλεοτιδικών ανιχνευτών, ενός συμπληρωματικού στη μεταλλαγμένη αλληλουχία και του άλλου στη φυσιολογική. Η διαφορά των δύο ανιχνευτών ASO είναι μία βάση, η οποία βρίσκεται στο κέντρο των ανιχνευτών για τη μεγιστοποίηση της ειδικότητάς τους. Το γενωμικό DNA ενισχύεται με ειδικούς εκκινητές που περικλείουν τη μετάλλαξη και το προϊόν της PCR ακινητοποιείται σε μεμβράνη νάιλον με μορφή κηλίδων. Το 5 άκρο των ASO ανιχνευτών επισημαίνεται με 32 P-dATP, βιοτίνη ή με άλλους ιχνηθέτες και η κηλίδα του PCR προϊόντος υβριδίζεται με τον φυσιολογικό και το μεταλλαγμένο ανιχνευτή ASO. Ο γονότυπος του δείγματος DNA καθορίζεται από την παρουσία ή απουσία σήματος υβριδισμού από τους δύο ανιχνευτές (Εικόνα 3.3). Η τεχνική είναι αξιόπιστη και έχει χρησιμοποιηθεί σε πληθυσμούς με μία ή δύο κυρίαρχες μεταλλάξεις. Παρόλα αυτά, η μέθοδος περιορίζεται στην ανίχνευση πολλών μεταλλάξεων λόγω πολλαπλών σταδίων υβριδοποίησης και εκπλύσεων [58]. Εικόνα 3.3: Εφαρμογή της μεθόδου ASO σε δύο μεταλλάξεις του γονιδίου ARSA, που προκαλούν μεταχρωματική λευκοδυστροφία. Τα δύο δείγματα για την πρώτη μετάλλαξη (αριστερά) είναι φυσιολογικά. Το πρώτο δείγμα για τη δεύτερη μετάλλαξη (δεξιά) είναι φυσιολογικό, ενώ το δεύτερο ετερόζυγο [69]. Το μειονέκτημα αυτής της τεχνικής αίρεται με την ανάπτυξη της μεθόδου της αντίστροφης αποτύπωσης κηλίδας, στην οποία τα ζεύγη των φυσιολογικών και μεταλλαγμένων ανιχνευτών ASO ακινητοποιούνται υπό μορφή κηλίδων ή γραμμών σε ταινίες μεμβράνης (νάιλον). Το προϊόν ενίσχυσης DNA, το οποίο περιέχει την 41

49 αλληλουχία με τη μετάλλαξη, επισημαίνεται με τη χρήση 3 επισημασμένων εκκινητών ή την εσωτερική ενσωμάτωση βιοτινυλιωμένων dutp και μετά υβριδίζεται στις ταινίες. Ο γονότυπος του δείγματος ανιχνεύεται από την παρουσία ή απουσία σημάτων υβριδισμού με τους ASO (Εικόνα 3.4). Η αντίστροφη αποτύπωση κηλίδας επιτρέπει την ταυτόχρονη ανίχνευση πολλαπλών σημειακών μεταλλάξεων, υπό την προϋπόθεση της αυστηρής βελτιστοποίησης των συνθηκών υβριδοποίησης των διαφορετικών ανιχνευτών ASO προς αποφυγή μη ειδικών αλληλεπιδράσεων [58]. Εικόνα 3.4: Ταινίες αντίστροφης αποτύπωσης κηλίδας για μη ελλειμματικές μεταλλάξεις στο α2 γονίδιο που προκαλούν α-θαλασσαιμία, μετά από υβριδοποίηση και οπτική ανίχνευση. Σε κάθε ταινία οι φυσιολογικοί ανιχνευτές βρίσκονται στη δεξιά πλευρά, ενώ οι μεταλλαγμένοι στην αριστερή πλευρά της ταινίας. Δειγμα 1: ομόζυγα μεταλλαγμένο για την α Tsaudi, δείγμα 2: ετερόζυγο για την α Icaria, δείγμα 3: ετερόζυγο για την α Koya Dora, de;igma 4: ετερόζυγο για την α Seal Rock, δείγμα 5: ετερόζυγο για την α Quong- Zse, δείγμα 6: ομόζυγα μεταλλαγμένο για την α CS [70]. Για την ανίχνευση μεταλλάξεων, ελλειμματικών και μη, που προκαλούν α- θαλασσαιμία αναπτύχθηκε πρόσφατα μία ταινία με ακινητοποιημένους ανιχνευτές ASO από τους Bhat V. S. et al (2010). Η μέθοδος βασίζεται σε πολλαπλή ενίσχυση του DNA (συμπεριλαμβανομένης της gap-pcr) και περιλαμβάνει τρία στάδια: α) την απομόνωση του DNA, β) την ενίσχυση με PCR παρουσία βιοτινυλιωμένων εκκινητών και γ) την υβριδοποίηση των προϊόντων ενίσχυσης σε ταινίες ελέγχου που περιέχουν ακινητοποιημένους ανιχνευτές ASO υπό μορφή παράλληλων γραμμών (Εικόνα 3.5) [71]. 42

50 Εικόνα 3.5: Ταινίες ανίχνευσης μεταλλάξεων (Vienna Lab) που προκαλούν α- θαλασσαιμία, για Α) ελλείμματα και Β) σημειακές μεταλλάξεις. Α) Ταινία 1: φυσιολογικό δείγμα ελέγχου. Ταινία 2: δείγμα ασθενή με έλλειμμα 3.7 kb. Ταινία 3: ταινία ανίχνευσης ελλειμμάτων. Β) Ταινία 1: φυσιολογικό δείγμα για σημειακές μεταλλάξεις. Ταινία 2: ταινία ανίχνευσης σημειακών μεταλλάξεων [71] Αλληλοειδική PCR (Amlification Refractory Mutation System, ARMS- PCR) Η ενίσχυση με ειδικούς εκκινητές βασίζεται στην αρχή ότι ένας απόλυτα συμπληρωματικός εκκινητής είναι πιο αποδοτικός στην υβριδοποίησή του με το DNA στόχο και στην επέκτασή του, από έναν εκκινητή που δεν είναι απόλυτα συμπληρωματικός (mismatched). Στην ARMS-PCR η αλληλοειδική ενίσχυση στηρίζεται στην συμπληρωματικότητα του τελικού 3 νουκλεοτιδίου. Για την ενίσχυση της ειδικότητας ως προς το αλληλόμορφο, είναι συνήθης η ενσωμάτωση ενός μη συμπληρωματικού νουκλεοτιδίου, δύο ή τρεις θέσεις πριν το τελικό νουκλεοτίδιο του 3 άκρου. Υπάρχουν διάφορες παραλλαγές της μεθόδου, όμως σε όλες τις περιπτώσεις οι εκκινητές σχεδιάζονται έτσι ώστε το 3 άκρο τους να είναι συμπληρωματικό του νουκλεοτιδίου που θα ανιχνευθεί. Ο DNA στόχος ενισχύεται με δύο αντιδράσεις PCR, χρησιμοποιώντας έναν κοινό εκκινητή και καθέναν από τους αλληλοειδικούς εκκινητές, έναν συμπληρωματικό προς το φυσιολογικό αλληλόμορφο, και τον άλλο ως προς το μεταλλαγμένο. Η 43

51 επέκταση του εκκινητή και ο σχηματισμός προϊόντος πραγματοποιείται μόνο σε περίπτωση απόλυτης συμπληρωματικότητάς του με το DNA στόχο (Εικόνα 3.6). Για τον έλεγχο των ψευδώς αρνητικών αποτελεσμάτων σε ενδεχόμενη αποτυχία της αντίδρασης ενίσχυσης, απαιτείται η χρήση ενός εσωτερικού PCR προϊόντος ελέγχου που ενισχύεται σε άλλη περιοχή του γονιδιώματος. Η πολυμεράση που χρησιμοποιείται στη μέθοδο αυτή, δεν πρέπει να έχει 3 5 εξωνουκλεοτιδική δράση γιατί θα επεκτείνονται και οι δύο εκκινητές [58]. Εικόνα 3.6: Απεικόνιση της μεθόδου ARMS-PCR [72]. Η τεχνική της ARMS-PCR περιγράφηκε για πρώτη φορά από τους Newton et al (1989) [73]. Η εφαρμογή της ARMS-PCR στη διάγνωση θαλασσαιμιών έχει γίνει εκτεταμένα για το γονίδιο της β-σφαιρίνης και όχι τόσο για το γονίδιο της α- σφαιρίνης. Ωστόσο, έχουν αναφερθεί κάποιες εργασίες που χρησιμοποίησαν την ARMS-PCR στην ανίχνευση σπάνιων μη ελλειμματικών μεταλλάξεων στο γονίδιο της α-σφαιρίνης [74]. 3.3 Τεχνικές ανίχνευσης άγνωστων μεταλλάξεων (τεχνικές για screening) DGGE και SSCP Η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα με βαθμίδωση αποδιατακτικών παραγόντων (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE) και η ανάλυση πολυμορφισμού μονόκλωνης αλυσίδας (Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP) είναι δύο τεχνικές που έχουν χρησιμοποιηθεί για την εύρεση άγνωστων μεταλλάξεων σε ένα PCR προϊόν. Και οι δύο τεχνικές βασίζονται στην αλλαγή της κινητικότητας του 44

52 μεταλλαγμένου PCR προϊόντος σε μία πηκτή, σε σύγκριση με το φυσιολογικό προϊόν, ενώ απαιτείται περαιτέρω ανάλυση για την ανίχνευση συγκεκριμένης μετάλλαξης, συνήθως με άμεση ανάλυση αλληλουχίας (sequencing). Η αντικατάσταση μίας βάσης μπορεί να ανιχνευθεί και με τις δύο μεθόδους, αλλά η ευαισθησία της ανίχνευσης κυμαίνεται μεταξύ 70 και 90%. Επιπροσθέτως, στην περίπτωση της τεχνικής SSCP για την επίτευξη υψηλής ευαισθησίας απαιτούνται αυστηρές συνθήκες εκτέλεσης. Αυτές οι μέθοδοι ανίχνευσης βρίσκουν εφαρμογές σε γονίδια με πολλά εξώνια που επεκτείνονται σε μεγάλες περιοχές του γονιδιώματος και με μία σταθερή κατανομή των μεταλλάξεων, λόγω της δυνατότητας πολλαπλής ανίχνευσης (ταυτόχρονη ανάλυση 3 έως 5 PCR προϊόντων) [58]. Η μέθοδος της DGGE βασίστηκε στην παρατήρηση, ότι η αποδιάταξη (τήξη) των τμημάτων του DNA μπορεί να θεωρηθεί σαν ισορροπία για κάθε ζεύγος βάσεων ανάμεσα σε δύο καταστάσεις: α) τη διπλή έλικα και β) μία πιο ασταθή κατάσταση στην οποία οι βάσεις δεν είναι ούτε σε ζεύγη ούτε "στοιβαγμένες" με έναν ακανόνιστο τρόπο. Η αλλαγή από την πρώτη στη δεύτερη κατάσταση προκαλείται από γραμμικά αυξανόμενη συγκέντρωση αποδιατακτικών παραγόντων, όπως η θέρμανση (συνεχής θερμοκρασία ~60 o C) και μία σταθερή αναλογία φορμαμιδίου (από 0-40%) και ουρίας (από 0-7 Μ). Για εξαιρετικά πλούσιες σε GC περιοχές χρησιμοποιούνται υψηλότερες θερμοκρασίες έως και 75 ο C. Η διαδικασία της αποδιάταξης των τμημάτων του DNA είναι σταδιακή καθώς αυξάνεται η συγκέντρωση των αποδιατακτικών παραγόντων στην πηκτή του πολυακρυλαμιδίου. Ξεχωριστές περιοχές του τμήματος (melting domains), γίνονται ξαφνικά μονόκλωνες μέσα σε μία πολύ στενή κλίμακα μεταβολής των αποδιατακτικών παραγόντων. Καθώς το τμήμα του DNA περνά μέσα από την πηκτή, φτάνει σε μια περιοχή όπου η συγκέντρωση των αποδιατακτικών παραγόντων ισοδυναμεί με το σημείο τήξης (T m ) της περιοχής (domain) με τη χαμηλότερη θερμοκρασία τήξης και σχηματίζεται ένα μόριο DNA με διακλαδιζόμενη δομή (ετεροδιμερές) το οποίο σταθεροποιείται στην πηκτή. Όταν δύο τμήματα DNA διαφέρουν κατά μία βάση στην κύρια περιοχή, η θερμοκρασία τήξης θα διαφέρει, οπότε τα τμήματα DNA θα παρουσιάσουν διαφορετική κινητικότητα στην πηκτή (Εικόνα 3.7). Η μέθοδος SSCP βασίζεται στο γεγονός ότι μικρά μονόκλωνα τμήματα DNA μπορούν να τρέξουν σε μία πηκτή χωρίς αποδιατακτικούς παράγοντες με τρόπο που εξαρτάται όχι μόνο από το μέγεθός τους, αλλά και από την αλληλουχία τους. Τα 45

53 ενισχυμένα με PCR τμήματα του DNA υποβάλλονται σε αποδιάταξη είτε με θέρμανση, είτε με αποδιατακτικούς παράγοντες, όπως το φορμαμίδιο και ακολουθεί ταχεία ψύξη. Τα τμήματα του αποδιαταγμένου DNA ηλεκτροφορούνται σε μία πηκτή χωρίς αποδιατακτικούς παράγοντες. Κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης, τα μονόκλωνα τμήματα του DNA αποκτούν μία ειδική τρισδιάστατη δομή, που εξαρτάται από την αλληλουχία τους, και μία μοναδική διαμόρφωση. Έτσι, ακόμα και μία αλλαγή βάσης σε ένα τμήμα DNA σε σχέση με το φυσιολογικό, θα αλλάξει τη διαμόρφωσή του με αποτέλεσμα τη διαφορετική θέση κατά την ηλεκτροφόρηση (Εικόνα 3.7). Οι ζώνες ανιχνεύονται με χρώση αργύρου, ραδιενέργεια ή φθορισμό [69]. Εικόνα 3.7: Απεικόνιση της μεθόδου SSCP (A) και DGGE (B) [75]. Οι ενδείξεις της φύσης και της θέσης των μεταλλάξεων παρέχονται από τα χαρακτηριστικά μοτίβα των ετεροδιμερών. Αυτές οι μέθοδοι απλά επιδεικνύουν την παρουσία μίας μετάλλαξης, η οποία πρέπει να ανιχνευθεί με άλλη μέθοδο, που βασίζεται στην PCR. 46

54 Τα α-γονίδια, αν και μικρά, είναι πλούσια σε GC περιοχές, με αποτέλεσμα τη δυσκολία αποδιάταξής τους και τη μειωμένη απόδοση της ανάλυσης αλληλουχίας. Παρόλα αυτά, με βελτιστοποιήσεις των δύο τεχνικών (DGGE και SSCP) έχει επιτευχθεί ανίχνευση μεταλλάξεων σε συγκεκριμένες περιοχές. Οι Harteveld, K. L. et al (1996) εφάρμοσαν παράλληλα τις δύο τεχνικές σε 7 χαρακτηρισμένα δείγματα για την ανίχνευση 7 γνωστών μεταλλάξεων με σκοπό τη βελτιστοποίηση των δύο τεχνικών καθώς και σε 18 νέα δείγματα, στα οποία ανιχνεύτηκαν δύο νέες μεταλλάξεις και τρεις νέοι πολυμορφισμοί που προκαλούν α-θαλασσαιμία [76]. Το 2003 οι Jorge S. B. et al, βελτίωσαν την ανίχνευση μεταλλάξεων στα γονίδια της α- σφαιρίνης αναπτύσσοντας μία μέθοδο με μη ραδιενεργή SSCP, χωρίς τη χρήση DGGE [77] Ανάλυση καμπύλης τήξης DNA υψηλής διακριτικότητας (High Resolution melting analysis, HRMA) Η ανάλυση HRM επιτελείται σε δίκλωνα DNA μόρια, τα οποία έχουν προηγουμένως ενισχυθεί με PCR, είτε συμβατική είτε πραγματικού χρόνου (Real Time PCR). Η διαδικασία της HRM είναι απλή και περιλαμβάνει θέρμανση του προϊόντος ενίσχυσης PCR από τους 50 ο C έως τους 95 o C περίπου. Κατά τη διάρκεια της θέρμανσης, σε κάποιο σημείο επιτυγχάνεται η θερμοκρασία τήξης του προϊόντος και οι δύο αλυσίδες του DNA διαχωρίζονται. Η διαδικασία της HRM γίνεται σε πραγματικό χρόνο μέσω της χρήσης φθοριζουσών χρωστικών. Οι χρωστικές που χρησιμοποιούνται στην HRM ονομάζονται παρεμβαίνουσες (intercalating), όπως η SYBR Green I και έχουν την ιδιότητα να δεσμεύονται μόνο σε δίκλωνο DNA με αποτέλεσμα την αύξηση του ενδογενούς φθορισμού τους. Απουσία δίκλωνου DNA η χρωστική εμφανίζει πολύ ασθενή φθορισμό. Στο αρχικό στάδιο της ανάλυσης HRM υπάρχει ισχυρός φθορισμός λόγω του μεγάλου αριθμού αντιγράφων του PCR προϊόντος. Καθώς το προϊόν θερμαίνεται και οι δύο αλυσίδες του DNA τήκονται, η παρουσία δίκλωνου DNA μειώνεται και, επομένως, μειώνεται και ο φθορισμός. Το όργανο της HRM καταγράφει τη μεταβολή του φθορισμού και παρουσιάζει τα αποτελέσματα ως γράφημα, γνωστό και ως καμπύλη τήξης. Η θερμοκρασία τήξης του προϊόντος, η οποία εξαρτάται από την αλληλουχία του, μπορεί να αλλάξει με αντικατάσταση μιας βάσης. Η διαφορά της θερμοκρασίας τήξης εντοπίζεται και ανάμεσα σε ετερόζυγα και ομόζυγα για μία μετάλλαξη δείγματα. 47

55 Βασικό μειονέκτημα της HRM αποτελεί το γεγονός ότι το μέγεθος των προϊόντων PCR δεν πρέπει να υπερβαίνει τα bp. Επίσης, οι χρωστικές που χρησιμοποιούνται δεν είναι ειδικές για την αλληλουχία στόχο και επηρεάζονται και από την παρουσία διμερών εκκινητών. Η μέθοδος HRM έχει αναφερθεί στην ανίχνευση μεταλλάξεων που οδηγούν σε α-θαλασσαιμία σε διάφορες εργασίες. Οι Shih H. C. et al (2010) χρησιμοποίησαν την HRM για την ανίχνευση 8 παραλλαγών της α-αιμοσφαιρίνης σε 42 δείγματα και σε 20 φυσιολογικά δείγματα [78]. Οι Sirichotiyakul S. et al (2010) χρησιμοποίησαν την HRM ως μέθοδο ανίχνευσης της -- SEA σε 33 δείγματα από χοριακές λάχνες για προγεννητικό έλεγχο [79], ενώ οι Liu Y. N. et al (2011) σε 74 δείγματα, εκ των οποίων τα 54 είχαν μη φυσιολογικές α-αλυσίδες (τα 33 ανιχνεύτηκαν με μη ελλειμματικές μεταλλάξεις) και τα 20 ήταν φυσιολογικά [80] Αποδιατακτική υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (Denaturing High Performance Liquid Chromatography, DHPLC) Η DHPLC είναι μία αυτοματοποιημένη τεχνική βασισμένη στο διαχωρισμό ετεροδιμερών προϊόντων της PCR από τα αντίστοιχα ομοδιμερή τους, με ένα σύστημα υγρής χρωματογραφίας ιοντικών ζευγών αντίστροφης φάσης. Η στήλη διατηρείται σε καθορισμένη θερμοκρασία στην οποία τα μόρια DNA αποδιατάσσονται. Τα ετεροδιμερή οδηγούνται σε ένωση λάθους συνδυασμού διαμορφώνοντας πιο ασθενείς αλληλεπιδράσεις με την υδρόφοβη στατική φάση. Με βαθμιδωτή έκλουση, τα ετεροδιμερή εκλούονται νωρίτερα από ότι τα ομοδιμερή, λόγω της περισσότερο θερμικά ασταθούς μορφής τους. Τα προϊόντα έκλουσης ανιχνεύονται με απορρόφηση υπεριώδους ακτινοβολίας. Για το σχηματισμό των ετεροδιμερών, το προϊόν ενίσχυσης θερμαίνεται σε συγκεκριμένη θερμοκρασία και στη συνέχεια ψύχεται αργά, με βαθμιαία μείωση της θερμοκρασίας για να επανασυσπειρωθεί. Τα επανασυσπειρωμένα προϊόντα τοποθετούνται στη στήλη της DHPLC. Τα δείγματα που είναι ετερόζυγα ως προς μία μετάλλαξη, σχηματίζουν και ετεροδιμερή και ομοδιμερή, με αποτέλεσμα την παρατήρηση δύο κορυφών. Τα δείγματα που δίνουν μία κορυφή θα μπορούσαν να είναι είτε φυσιολογικά είτε ομόζυγα ως προς μία μετάλλαξη. Αυτό μπορεί να ταυτοποιηθεί με ανάμιξη του δείγματος με φυσιολογικό δείγμα και επανάληψη της ανάλυσης, παρατηρώντας τον σχηματισμό ή μη, ετεροδιμερών. 48

56 Εικόνα 3.8: Σχηματική απεικόνιση της αρχής της DHPLC [81]. Στη μέθοδο DHPLC δεν χρειάζεται επισήμανση ή καθαρισμός των προϊόντων της PCR. Η μέθοδος επίσης είναι σχετικά γρήγορη και έχει υψηλή ειδικότητα. Η DHPLC έχει υψηλή απόδοση, είναι υψηλής προσπελασιμότητας (high throughput) και έχει χαμηλό κόστος. Μειονέκτημα της μεθόδου αποτελεί το γεγονός ότι, για την επιλογή της κατάλληλης θερμοκρασίας αποδιάταξης απαιτείται βελτιστοποίηση της θερμοκρασίας της στήλης για κάθε προϊόν που περιέχει διαφορετική μετάλλαξη [82]. Η DHPLC χρησιμοποιείται για την ανίχνευση γνωστών, αλλά και αγνώστων μεταλλάξεων, είτε αυτές είναι ελλειμματικές είτε σημειακές. Η DHPLC χρησιμοποιείται ως τεχνική ανίχνευσης μεταλλάξεων μετά την ενίσχυση των προϊόντων με PCR. Οι Hung C. C. et al (2007) χρησιμοποίησαν την DHPLC για ανίχνευση των ελλειμμάτων α 3.7 και α 4.2 σε 60 χαρακτηρισμένα δείγματα, εκ των οποίων τα 40 είχαν αυτά τα ελλείμματα, τα οποία είναι κοινά στη ΝΑ Ασία [83]. Οι Liu J. et al (2010) χρησιμοποίησαν τη μέθοδο για την ανίχνευση μεταλλάξεων σε 110 δείγματα, εκ των οποίων τα 92 είχαν μεταλλάξεις στα α-γονίδια, ελλειμματικές και μη [84]. Οι Cao M. et al (2011) χρησιμοποίησαν την DHPLC για την ανάλυση των προϊόντων αντίδρασης από μία άλλη τεχνική, την MLPA. Σε σύγκριση με την τριχοειδή ηλεκτροφόρηση (Capillary Gel Electrophoresis, CGE) που χρησιμοποιείται για την ανάλυση δειγμάτων μετά από MLPA, η ευαισθησία και η ειδικότητα της DHPLC ήταν 100% και για τα 107 δείγματα που αναλύθηκαν [85]. 49

57 3.3.4 Πολλαπλή ενίσχυση ανιχνευτών εξαρτώμενη από αντίδραση λιγάσης (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification, MLPA) Η MLPA είναι μία μέθοδος πολλαπλής PCR με την οποία ανιχνεύονται μη φυσιολογικά αλληλόμορφα μέχρι και 50 διαφορετικών DNA ή RNA αλληλουχιών και μπορούν να διαχωριστούν αλληλουχίες που διαφέρουν μέχρι και ένα νουκλεοτίδιο. Στην τεχνική αυτή ως ανιχνευτές της κάθε μετάλλαξης χρησιμοποιούνται δύο ολιγονουκλεοτίδια, τα οποία σχεδιάζονται έτσι, ώστε τμήμα της αλληλουχίας τους στο 3 άκρο του ενός (20-30 νουκλεοτίδια) και στο 5 άκρο του άλλου (25-43 νουκλεοτίδια), αντίστοιχα, να υβριδοποιούνται στην περιοχή του DNA στόχου που περιλαμβάνει τον πολυμορφικό τόπο. Τα ολιγονουκλεοτίδια του ζεύγους μπορούν να συνδεθούν με αντίδραση λιγάσης μόνο στην περίπτωση που το 3 άκρο του ενός είναι συμπληρωματικό της μετάλλαξης. Όλα τα ζεύγη ολιγονουκλεοτιδίων έχουν τις ίδιες αλληλουχίες στο 5 και 3 άκρο τους, αντίστοιχα, επιτρέποντας την ταυτόχρονη ενίσχυση του προϊόντος της λιγάσης σε μία PCR με ένα κοινό ζεύγος εκκινητών. Κάθε ζεύγος ολιγονουκλεοτιδίων δίνει γένεση σε ένα προϊόν μοναδικού μεγέθους μεταξύ 130 και 480 bp. Το ένα από τα δύο ολιγονουκλεοτίδια της MLPA, συντίθεται χημικά και η αλληλουχία στο 5 άκρο του αναγνωρίζεται από τον πρόσθιο κοινό εκκινητή της PCR. Το δεύτερο ολιγονουκλεοτίδιο έχει μία κοινή αλληλουχία στο 3 άκρο του που, στη συνέχεια, αναγνωρίζεται από τον ανάστροφο εκκινητή της PCR, καθώς και μία ενδιάμεση αλληλουχία stuffer νουκλεοτιδίων, που δίνει γένεση σε προϊόντα διαφορετικού μεγέθους, ώστε να είναι δυνατός ο διαχωρισμός τους με ηλεκτροφόρηση. Το δεύτερο ολιγονουκλεοτίδιο του ζεύγους της MLPA παρασκευάζεται με κλωνοποίηση της ειδικής αλληλουχίας, που είναι συμπληρωματική του DNA στόχου, σε φορείς Μ13, οι οποίοι περιέχουν ήδη τμήματα διαφορετικών μεγεθών. Ο πρόσθιος (κοινός) εκκινητής επισημαίνεται με φθορίζουσα χρωστική, ώστε τα προϊόντα της αντίδρασης να μπορούν να ανιχνευτούν με μετέπειτα ανάλυση. Οι ποσότητες των προϊόντων λιγάσης που παράγονται είναι ανάλογες του αριθμού αντιγράφων του DNA στόχου. Το σχετικό ύψος κορυφών των προϊόντων ενίσχυσης σχετίζεται με το έλλειμμα ή διπλασιασμό της αλληλουχίας-στόχου. Η αντίδραση της MLPA μπορεί να χωριστεί σε πέντε διακριτά στάδια: 1) την αποδιάταξη του DNA και την υβριδοποίηση των ανιχνευτών της MLPA, 2) την αντίδραση λιγάσης, 3) την αντίδραση PCR, 4) το διαχωρισμό των ενισχυμένων τμημάτων με ηλεκτροφόρηση και 5) την ανάλυση των δεδομένων (Εικόνα 3.9). Στη 50

58 διάγνωση, οι εφαρμογές αυτής της μεθόδου περιλαμβάνουν την ανίχνευση ανευπλοειδιών, μη ισορροπημένων μετατοπίσεων, ολικών ή μερικών ελλείψεων ή διπλασιασμών γονιδίων, αλλά και σημειακών μεταλλάξεων ή πολυμορφισμών (SNPs) [69,86]. Εικόνα 3.9: Σχηματική απεικόνιση των σταδίων της τεχνικής MLPA [87]. Η τεχνική MLPA μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση γνωστών, αλλά και αγνώστων μεταλλάξεων. Οι Rugless M. J. et al (2008) ανακάλυψαν ένα νέο έλλειμμα στο χρωμόσωμα 16 ( α 16.6 ) που προκαλεί ήπιο φαινότυπο α-θαλασσαιμίας, αρχικά με τη χρήση Southern blot και MLPA για τη θέση της μετάλλαξης και άλλων τεχνικών και, στη συνέχεια, για την εύρεση των σημείων κοπής [88]. Οι Suemasu C. N. et al (2011) χρησιμοποίησαν την MLPA για την ανίχνευση μεταλλάξεων στο γονίδιο της α-σφαιρίνης σε 8 μη συγγενικά άτομα, τα οποία είχαν φαινότυπο α- θαλασσαιμίας, αλλά οι υπαίτιες μεταλλάξεις δεν μπόρεσαν να βρεθούν με τις συμβατικές τεχνικές. Αποτέλεσμα αυτής της μελέτης ήταν η ανακάλυψη 8 νέων ελλειμμάτων [89]. Επίσης, όπως αναφέρθηκε παραπάνω, οι Cao M. et al (2011) 51

59 χρησιμοποίησαν την DHPLC για την ανάλυση των προϊόντων αντίδρασης της MLPA [85]. 3.4 Αντίδραση επέκτασης εκκινητή (Primer Extension Reaction, PEXT) Η αντίδραση επέκτασης εκκινητή είναι μία διαδικασία δύο σταδίων, κατά την οποία λαμβάνει χώρα αρχικά η υβριδοποίηση ενός ανιχνευτή στην αλληλουχία ακριβώς πριν τον πολυμορφισμό (SNP), ακολουθούμενη από μία αντίδραση "μίνι αλληλούχισης" (mini-sequencing), στην οποία η DNA πολυμεράση επεκτείνει τον υβριδοποιημένο εκκινητή, προσθέτοντας μία ιχνηθετημένη βάση που είναι συμπληρωματική στο νουκλεοτίδιο του πολυμορφισμού. Ο ιχνηθέτης μπορεί να είναι φθορίζον μόριο, απτένιο ή ραδιενεργό μόριο. Η βάση που ενσωματώνεται ανιχνεύεται και καθορίζεται ο πολυμορφισμός. Η μέθοδος είναι γενικά πολύ αξιόπιστη, επειδή βασίζεται στην υψηλής ακρίβειας DNA πολυμεράση. Η αντίδραση επέκτασης εκκινητή καθιστά εφικτή τη γονοτύπιση πολλών SNPs κάτω από τις ίδιες συνθήκες αντίδρασης, καθιστώντας την εξαιρετικά ευέλικτη. Γενικά, υπάρχουν δύο κύριες προσεγγίσεις της ΡΕΧΤ, στις οποίες χρησιμοποιούνται επισημασμένα με φθορίζουσες χρωστικές ddntps ή dntps. Με τα ddntps, οι ανιχνευτές υβριδίζονται στο DNA στόχο ακριβώς δίπλα από το νουκλεοτίδιο του SNP και η DNA πολυμεράση προσθέτει στο 3 άκρο του ανιχνευτή ένα συμπληρωματικό προς το νουκλεοτίδιο του SNP ddntp. Η απουσία του 3 -ΟΗ από το ddntp εμποδίζει την περαιτέρω επέκταση του ανιχνευτή. Κάθε ddntp επισημαίνεται με διαφορετική φθορίζουσα ουσία, επιτρέποντας την ανίχνευση και των τεσσάρων αλληλομόρφων στην ίδια αντίδραση. Με τα dntps, οι αλληλοειδικοί ανιχνευτές έχουν στο 3 άκρο τους τη βάση που είναι συμπληρωματική με το SNP. Εάν το DNA στόχος περιέχει το SNP που εξετάζεται, τότε υβριδοποιείται με τον ανιχνευτή, επιτρέποντας στη DNA πολυμεράση να επεκτείνει το 3 άκρο του. Η ανίχνευση γίνεται με την ενσωμάτωση των επισημασμένων με φθορίζουσες ουσίες dntps στο τέλος του ανιχνευτή. Εάν ο DNA στόχος δεν περιέχει το SNP, τότε θα υπάρχει μία μη συμπληρωματική βάση στο 3 άκρο του ανιχνευτή και η DNA πολυμεράση δεν θα τον επεκτείνει. Το όφελος της δεύτερης προσέγγισης, είναι ότι γίνεται ενσωμάτωση πολλών επισημασμένων dntps, με αποτέλεσμα την ενίσχυση του σήματος. Η αντίδραση επέκτασης εκκινητή μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ταυτόχρονη ανίχνευση πολλών μεταλλάξεων ή SNPs [82]. 52

60 Ένα μεγάλο πλεονέκτημα της αντίδρασης ΡΕΧΤ έναντι της υβριδοποίησης με ανιχνευτές ASO είναι το ότι ο διαχωρισμός των αλληλόμορφων βασίζεται στην υψηλή ακρίβεια της αντίδρασης ενσωμάτωσης του νουκλεοτιδίου, που καταλύεται από μία DNA πολυμεράση, αντί για τις διαφορές στη θερμική σταθερότητα συμπληρωματικών ή μη αλληλουχιών, όπως συμβαίνει στην τεχνική ASO. Συνεπώς, με την αντίδραση ΡΕΧΤ καθίσταται δυνατός ο πολύ ικανοποιητικός διαχωρισμός ανάμεσα σε ομόζυγους και ετερόζυγους γονότυπους. Οι αντιδράσεις ΡΕΧΤ είναι πολύ ανθεκτικές (robust) και δεν επηρεάζονται από μικρές αλλαγές στις συνθήκες της αντίδρασης. Η ευελιξία και η ειδικότητα της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή, την καθιστούν κατάλληλη για αναλύσεις υψηλής προσπελασιμότητας. Οι αντιδράσεις ΡΕΧΤ χωρίζονται σε αντιδράσεις υγρής και στερεής φάσης, ανάλογα με την φάση στην οποία γίνεται η αντίδραση. Οι αντιδράσεις στερεής φάσης παρουσιάζουν μεγάλο ενδιαφέρον, γιατί με την τεχνική αυτή επιτρέπεται η ανάπτυξη μικροσυστοιχιών PEXT (arrayed PEXT, APEX), που οδηγούν στην πλήρη αυτοματοποίηση της μεθόδου [90]. Οι Wang W. et al (2003) χρησιμοποίησαν την τεχνική επέκτασης εκκινητή πολλαπλής ανίχνευσης (mini-sequencing) για τις 7 συχνότερα εμφανιζόμενες σημειακές μεταλλάξεις στη ΝΑ Ασία που προκαλούν α-θαλασσαιμία [91]. 3.5 Σκοπός της εργασίας Η παρούσα εργασία αποτελεί τμήμα μελέτης, που έχει ως σκοπό την ανάπτυξη μεθόδου ανίχνευσης 15 γνωστών σημειακών μεταλλάξεων στο γονίδιο της α- σφαιρίνης με την αντίδραση επέκτασης εκκινητή. Συγκεκριμένα, παρουσιάζεται η ανάπτυξη μεθόδου για την ανίχνευση 5 γνωστών μεταλλάξεων στο γονίδιο της α1 σφαιρίνης. Οι υπόλοιπες 10 μεταλλάξεις της μελέτης αφορούν στο γονίδιο της α2 σφαιρίνης και αποτελούν αντικείμενο μελέτης που πραγματοποιείται παράλληλα στην ερευνητική μας ομάδα. 53

61 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 4.1 Οργανολογία Αναλυτικός ζυγός, Sartorius Επωαστήρες με ανακίνηση Titramax 1000 και Unimax 1000 (Heidolph) Θάλαμος κάθετης νηματικής ροής για PCR (Telstar mini-v/ PCR) Θερμικός κυκλοποιητής MiniCycler PTC-0150 (MJ Research) Θερμικός κυκλοποιητής TaKaRa (Sanyo E&E Europe BV) Κοπτικό γραφείου (Q-Connect) Λυχνία για ασηπτικές συνθήκες Μικροφυγόκεντρος, Micro 20 (Hettich, GmbH) Πεχάμετρο με ηλεκτρόδιο συνδυασμού υάλου καλομέλανος (Orion Research) Πιπέττες ακριβείας, Nichiryo Συσκευή ανάδευσης, Vortex Συσκευή ηλεκτροφόρησης, Sub-Cell GT (Biorad) Τράπεζα υπεριώδους φωτός UV (Vilbert Lourmat) Υδατόλουτρο (Tectron BIO) Φασματοφωτόμετρο, Hitachi U-2000 Φούρνος μικροκυμάτων, Moulinex Φυγόκεντρος, Rotofix 32 (Hettich Gmbh) Ψηφιακή κάμερα KODAK DC 120 (συνοδευόμενη από το λογισμικό πρόγραμμα Gel Analyzer) Scanner Hewlett-Packard, ScanJet 3400C 4.2 Υλικά Αυτοκόλλητο πλαστικό στήριγμα για τη συναρμολόγηση των ταινιών (Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) Διαγνωστική μεμβράνη νιτροκυτταρίνης με πλαστική υποστήριξη, Immunopore FP (Pall & Gelman, Dreieigh, Germany) Χάρτης απορρόφησης (Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) 54

62 Χάρτης εμβάπτισης (Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) Χάρτης εναπόθεσης νανοσφαιριδίων και δείγματος από υαλοβάμβακα (Schleicher & Schuell, Dassel, Germany) Σφαιρίδια πολυστυρενίου (άχρωμα) που φέρουν στην επιφάνεια καρβοξυλομάδες, διαμέτρου 2 μm, Polysciences Μικροβιολογικός κρίκος Ρύγχη πιπεττών Σωληνάρια PCR 200 μl Σωληνάρια τύπου Eppendorf 1,5 ml Σωληνάρια τύπου Falcon 15 και 50 ml Τριβλία Petri 4.3 Αντιδραστήρια 3 Τελική μεταφοράση (τρανσφεράση), TdT, Fermentas Amplitaq DNA Polymerase, Stoffel fragment, Applied Biosystems Agar-agar, Serva Biotin-11-dUTP, Applichem DMF, (C 3 H 7 NO), Lab-Scan, Analytical Sciences DMSO, (C 2 H 6 OS), Roth EDC, (C 8 H 17 N 3 -HCl), Applichem EDTA, (C 10 H 16 N 2 O 8 ), p.a., Fluka IPTG, (C 9 H 18 O 5 S), Sigma-Aldrich Kapa 2G Fast PCR kit, Kapabiosystems MES, (C 6 H 13 NO 4 S), Applichem NucleoSpin Extract II, Macherey-Nagel NucleoSpin Plasmid, Macherey-Nagel PCR cloning kit, Qiagen Tryptone, Sigma Tween-20, (C 58 H 114 O 26 ), Fluka Vent(exo-) DNA πολυμεράση, NEB X-gal, (C 14 H 15 BrCINO 6 ), Applichem Yeast extract, Sigma Αγαρόζη μοριακού βαθμού καθαρότητας, Sigma Αιθανόλη, απόλυτη (C 2 H 6 O), p.a, Pancreac 55

63 Aλβουμίνη Βοείου Ορού, BSA, Serva Αμπικιλλίνη, (Sigma) Αντίσωμα έναντι βιοτίνης (goat anti-biotin), Pierce Βακτηριακό στέλεχος E. coli JM109 Βόρακας (Na 2 B 4 O 7 10 H 2 O), Sigma Βρωμιούχο αιθίδιο, EtBr, p.a, Sigma Γλυκερόλη, (C 3 H 8 O 3 ), Sigma Δεοξυριβονουκλεοτίδια (dntps), datp, dttp, dgtp, dctp, Ultrapure, HT Biotechnology Δισοξινοφωσφορικό κάλιο, (KH 2 PO 4 ), p.a., Merck Δωδεκυλοσουλφονικό νάτριο, SDS, (NaC 12 H 25 SO 4 ), Serva Κιτρικό νάτριο, (Na 3 C 6 H 5 O 7 ), Sigma Μοριακός δείκτης DNA, ΦΧ174 DNA/BsuRI (HaeIII) Marker, 9, 0,25 mg/ml MBI Fermentas Νανοσφαιρίδια χρυσού, 40 nm, British Biocell International, BBI Νατραζίδιο, (NaN 3 ), Merck Ολιγονουκλεοτίδια εκκινητές και ανιχνευτές (πίνακας 4.1), Thermo Electron Oξικό οξύ, (CH 3 COOH), p.a., Merck Όξινο Ανθρακικό Κάλιο, (KHCO 3 ), p.a., Merck Όξινο Ανθρακικό Νάτριο, (NaHCO 3 ), p.a., Merck Όξινο Φωσφορικό Νάτριο, (Na 2 HPO 4 ), p.a., Merck Τρις(υδροξυμεθυλο)αμινομεθάνιο, Tris, (C 4 H 11 NO 3 ), Sigma Υδροξείδιο του Νατρίου, (NaOH), p.a., Fluka Υδροχλωρικό οξύ, (HCl), Merck Φορμαμίδιο, (CH 3 NO), Roth Χλωριούχο Αμμώνιο, (NH 4 Cl), p.a., Sigma Χλωριούχο Κάλιο, (ΚCl), Sigma Χλωριούχο Μαγνήσιο, (MgCl 2 ), Merck Χλωριούχο Νάτριο, (ΝaCl), Fluka 56

64 4.4 Διαλύματα Διάλυμα ανάπτυξης ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων: SSC 2, Tween-20 5 ml/l, SDS 5 g/l, φορμαμίδιο 250 ml/l, γλυκερόλη 20 ml/l, BSA 30 g/l Διάλυμα ανασύστασης του συζεύγματος χρυσού-(anti-biotin): BSA 1 g/l, διάλυμα βόρακα 2 mm, NaN 3 1 g/l Διάλυμα βόρακα 0,2 Μ Θρεπτικό υλικό Luria-Bertani (LB) (ph 7): 5 g Bacto-yeast extract, 10 g Bacto-Tryptone, 10 g NaCl σε τελικό όγκο 1L Θρεπτικό υλικό Luria-Bertani σε άγαρ (ph 7): 5 g Bacto-yeast extract, 10 g Bacto-Tryptone, 10 g NaCl, 15 g agar agar σε τελικό όγκο 1L Ρυθμιστικό διάλυμα SSC 20 (ph 7): NaCl 3 M, C 6 H 5 Na 3 O 7 0,3 M (κιτρικό νάτριο) Ρυθμιστικό διάλυμα ΤΑΕ (ph 8): Tris-HCl 40 mm, CH 3 COOH 20 mm, EDTA 1 mm Ρυθμιστικό διάλυμα ΤΕ (ph 8): Tris-HCl 10 mm, EDTA 1 mm 4.5 Ολιγονουκλεοτίδια Τα ολιγονουκλεοτίδια που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία παρατίθενται στον Πίνακα 4.1. Πίνακας 4.1: Εκκινητές και ανιχνευτές που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία. Ολιγονουκλεοτίδιο Ονομασία Αλληλουχία (5' 3') Μέγεθος (bp) Εκκινητές για την ενίσχυση τμήματος του γονιδίου ΗΒΑ1 5' εκκινητής C1 TGGAGGGTGGAGACGTCCTG 20 3' εκκινητής C2 CTGGCACGTTTGCTGAGGGAA 21 5' εκκινητής HerAdFW AGTATGGTGCGGAGGCCCTG 20 3' εκκινητής HerAdREV GCTCACCTTGAAGTTGACCGGGT 23 5' εκκινητής 5N GCAGGATGTTCCTGTCCTTCC 21 5' εκκινητής HRM-F2 ACAGGCCACCCTCAACCGT 19 Εκκινητές για τη μεταλλαξιγόνο PCR 5' εκκινητής HER-F(M) CTGTCCTTCACCACCAAGACCTACTTCC 28 57

65 3' εκκινητής HER-R(M) GGTGGTGAAGGACAGGAACATCCT 24 5' εκκινητής 3' εκκινητής 5' εκκινητής 3' εκκινητής ADANA- F(M) ADANA- R(M) QUEST- F(M) QUEST- R(M) TAAGGGCCACGACAAGAAGGTG 22 CACCTTCTTGTCGTGGCCCTTA 22 AGTTCCTGGCTCCTGTGAGCAC 22 GTGCTCACAGGAGCCAGGAACT 22 Ολιγονουκλεοτίδιο Ονομασία Αλληλουχία (5' 3') Αλληλοειδικοί εκκινητές της αντίδρασης ΡΕΧΤ Μέγεθος (bp) Εκκινητής για τη μετάλλαξη Hb Heraklion, delccc (N) HbaEXT-301 (5N) [5 εκκινητής] AGTGTGCAGACCTTAGGTGAGCTACCGAATTCT CTCGCAGGATGTTCCTGTCCTTCC 57 Εκκινητής για τη μετάλλαξη Hb Heraklion, delccc (M) Εκκινητής για τη μετάλλαξη Hb Taybe, delacc (N) HbaEXT-F01 (5M) [5 εκκινητής] HbaEXT-101 (6N) [3 εκκινητής] TCAACTAACTAATCATCTATCAATCTTATATCGA GTCTCGCAGGATGTTCCTGTCCTTCA CTTTCTACATTATTCACAACATTACCGAATTCTCT CCGGGAAGTAGGTCTTGGTGGT Εκκινητής για τη μετάλλαξη Hb Taybe, delacc (M) HbaEXT- H00 (6M) [3 εκκινητής] TAACATTACAACTATACTATCTACCCGAATTCTCT CCGGGAAGTAGGTCTTGGTGGG 57 Εκκινητής για τη μετάλλαξη Hb Adana, GGC>GAC (N) HbaEXT- A00 (7N) [5 εκκινητής] TACACAATCTTTTCATTACATCATCCGAATTCTCT CCCCAGGTTAAGGGCCACGG 55 Εκκινητής για τη μετάλλαξη Hb Adana, GGC>GAC (M) HbaEXT-601 (7M) [5 εκκινητής] CTATCTTTAAACTACAAATCTAACCCGAATTCTCT CCCCAGGTTAAGGGCCACGA 55 Εκκινητής για τη μετάλλαξη Hb Aghia Sophia, delgtg (N) HbaEXT-300 (8N) [3 εκκινητής] GATAGTGCTTTACATGGCTCTTCACCGAATTCTC TCTTGGTCAGCGCGTCGGCCAC 56 Εκκινητής για τη μετάλλαξη Hb Aghia Sophia delgtg (M) Εκκινητής για τη μετάλλαξη Hb Questembert TCT>CCT (N) Εκκινητής για τη μετάλλαξη Hb Questembert TCT>CCT (M) Εκκινητής για τη μετάλλαξη Hb Questembert TCT>CCT (N) HbaEXT- A01 (8M) [3 εκκινητής] HbaEXT-B00 (9N) [5 εκκινητής] HbaEXT-B01 (9M) [5 εκκινητής] Rev 9N HBA [3 εκκινητής] CAATAAACTATACTTCTTCACTAACCGAATTCTCT CTTGGTCAGCGCGTCGGCCT TCAAAATCTCAAATACTCAAATCACCGAATTCTC TCTCCCTGGACAAGTTCCTGGCTT CTACAAACAAACAAACATTATCAACCGAATTCTC TCTCCCTGGACAAGTTCCTGGCTC TCAAAATCTCAAATACTCAAATCACCGAATTCTC TCAGGTCAGCACGGTGCTCACAGA

66 Εκκινητής για τη μετάλλαξη Hb Questembert TCT>CCT (M) Rev 9Μ HBA [3 εκκινητής] CTACAAACAAACAAACATTATCAACCGAATTCTC TCGGTCAGCACGGTGCTCACAGG Ολιγονουκλεοτίδια ανιχνευτές (anti-tags) 57 Ανιχνευτής 301 M299 ΝΗ 2 -TAGCTCACCTAAGGTCTGCACACT 24 Ανιχνευτής F01 Anti-F01 ΝΗ 2 -ATTGATAGATGATTAGTTAGTTGA 24 Ανιχνευτής 101 Anti-101 ΝΗ 2 -TAATGTTGTGAATAATGTAGAAAG 24 Ανιχνευτής H00 Anti-H00 ΝΗ 2 -GTAGATAGTATAGTTGTAATGTTA 24 Ανιχνευτής A00 Anti-A00 ΝΗ 2 -ATGATGTAATGAAAAGATTGTGTA 24 Ανιχνευτής 601 Anti-601 ΝΗ 2 -GTTAGATTTGTAGTTTAAAGATAG 24 Ανιχνευτής 300 N299 ΝΗ 2 -TGAAGAGCCATGTAAAGCACTATC 24 Ανιχνευτής A01 Anti-A01 ΝΗ 2 -TTAGTGAAGAAGTATAGTTTATTG 24 Ανιχνευτής B00 Anti-B00 ΝΗ 2 -TGATTTGAGTATTTGAGATTTTGA 24 Ανιχνευτής B01 Anti-B01 ΝΗ 2 -TTGATAATGTTTGTTTGTTTGTAG 24 *Στον παραπάνω πίνακα υπογραμμίζεται με πλάγια γραφή η αλληλουχία αναγνώρισης (tag) καθενός εκκινητή της ΡΕΧΤ, με πράσινο χρώμα ο spacer και με μωβ χρώμα ο αλληλοειδικός εκκινητής για κάθε μετάλλαξη. Στους εκκινητές για τη μεταλλαξιγόνο PCR, υπογραμμίζεται με κόκκινο η βάση που αλλάζει στα δείγματα, τα οποία έχουν την εκάστοτε μετάλλαξη. 4.6 Μέθοδοι Απομόνωση DNA από περιφερικό αίμα Για την ενίσχυση τμήματος του γονιδίου της α1 σφαιρίνης (ΗΒΑ1), μέσω της αντίδρασης PCR, χρησιμοποιήθηκε γενωμικό DNA από περιφερικό αίμα. Τα δείγματα DNA διατέθηκαν από το "Χωρέμειο Ερευνητικό Εργαστήριο" του Νοσοκομείου Παίδων "Αγία Σοφία". Απομόνωση γενωμικού DNA για την ενίσχυση τμήματος του γονιδίου ΗΒΑ1 Η απομόνωση γενωμικού DNA πραγματοποιήθηκε από περιφερικό αίμα με το αυτοματοποιημένο ρομποτικό σύστημα Biorobot M48 Workstation. Χρησιμοποιήθηκε το MAG Attract DNA Blood M48 Extraction Kit, σύμφωνα με τις 59

67 οδηγίες του κατασκευαστή. Το γενωμικό DNA (30-60 ng/μl) χρησιμοποιήθηκε στην αντίδραση PCR για την ενίσχυση τμήματος 1087 bp του γονιδίου ΗΒΑ1, που φέρει τις εξεταζόμενες μεταλλάξεις Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Στην παρούσα εργασία πραγματοποιήθηκε αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) για την ενίσχυση τμήματος του γονιδίου ΗΒΑ1. Ενίσχυση τμήματος του γονιδίου ΗΒΑ1 Για την αντίδραση ενίσχυσης τμήματος 1087 bp του γονιδίου ΗΒΑ1, χρησιμοποιήθηκε το εμπορικά διαθέσιμο kit της πολυμεράσης Kapa 2G Fast. Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε τελικό όγκο 50 μl που περιείχε 1 U ενζύμου, 1 ρυθμιστικού διαλύματος PCR, 1,5 mm MgCl 2, 200 μμ dntps, 0,25 μμ από τους εκκινητές C1 και C2, 75 ml/l DMSO και 3 μl γενωμικού DNA (~100 ng). Ο υπόλοιπος όγκος συμπληρώθηκε με αποστειρωμένο Η 2 Ο. Το πρόγραμμα της αντίδρασης PCR που ακολουθήθηκε ήταν: 95 o C/2 min (στάδιο 1), 95 o C/30 sec (στάδιο 2), 60 o C/30 sec (στάδιο 3), 72 o C/30 sec (στάδιο 4). Τα στάδια 2 έως 4 επαναλήφθηκαν 35 φορές και η αντίδραση συμπληρώθηκε με τελική επέκταση στους 72 o C για 2 min Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης και ποσοτικοποίηση των προϊόντων ενίσχυσης Οι ηλεκτροφορήσεις του DNA πραγματοποιήθηκαν σε πηκτές αγαρόζης 1,2% w/v σε ρυθμιστικό διάλυμα ΤΑΕ 1, που περιείχε 0,5 μg/ml EtBr. Τα δείγματα και ο δείκτης μοριακών βαρών DNA αναμείχθηκαν με διάλυμα χρωστικής και τοποθετήθηκαν στα πηγάδια της πηκτής. Ο ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός πραγματοποιήθηκε σε συσκευή ηλεκτροφόρησης υπό σταθερή τάση 90 V για 35 min. Η παρατήρηση των ζωνών του DNA έγινε σε τράπεζα υπεριώδους φωτός (312 nm). Τα πηκτώματα φωτογραφήθηκαν με ψηφιακή κάμερα και το μέγεθός τους προσδιορίστηκε βάσει του δείκτη μοριακών βαρών ΦΧ 174 DNA/BsuRI Marker 9. Η ποσοτικοποίηση του DNA πραγματοποιήθηκε με πυκνομέτρηση των ζωνών του ηλεκτροφορήματος, βάσει καμπύλης βαθμονόμησης, που κατασκευάζεται με τον δείκτη μοριακών βαρών ΦΧ 174 DNA/BsuRI Marker 9. Η μέτρηση της πυκνότητας 60

68 των ζωνών του δείκτη και των δειγμάτων γίνεται με τη χρήση ειδικού λογισμικού προγράμματος (Gel Analyzer) Αντίδραση επέκτασης εκκινητή (Primer Extension Reaction, PEXT) Η δεκαπλή αντίδραση PEXT πραγματοποιήθηκε σε μίγμα αντίδρασης όγκου 20 μl που περιείχε 1 ρυθμιστικό διάλυμα (10 mm Tris-HCl, 10 mm KCl, ph 8,3), 1 U Stoffel fragment πολυμεράση DNA, ~100 fmol προϊόντος PCR, 1 pmol από καθέναν από τους 10 εκκινητές (5Ν, 5Μ, 6Ν, 6Μ, 7Ν, 7Μ, 8Ν, 8Μ, 9Ν και 9Μ), 4 mm MgCl 2 και 10 μm από τα datp, dctp, dgtp, 5 μμ dttp και 5 μμ biotin-dutp. Το πρόγραμμα της δεκαπλής αντίδρασης PEXT ήταν το εξής: 98 o C/2 min (στάδιο 1), 98 o C/15 sec (στάδιο 2), 65 o C/15 sec (στάδιο 3), 72 o C/15 sec (στάδιο 4). Τα στάδια 2 έως 4 επαναλήφθηκαν 10 φορές Κατασκευή ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων (strip) Η ταινία αποτελείται από το χάρτη εμβάπτισης, το χάρτη εναπόθεσης (υαλοβάμβακας) των νανοσφαιριδίων χρυσού και του δείγματος, το χάρτη απορρόφησης και τη μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Κάθε ένα τμήμα της ταινίας, τοποθετείται πάνω σε αυτοκόλλητο πλαστικό στήριγμα ως ακολούθως: Αρχικά, τοποθετείται η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (25 mm σε μήκος), έτσι ώστε η τελευταία ζώνη προς τα πάνω να είναι η ζώνη ελέγχου. Κάτω από αυτή τοποθετείται ο χάρτης εναπόθεσης από υαλοβάμβακα (15 mm σε μήκος), ώστε να την καλύπτει κατά 2 mm. Στη συνέχεια, τοποθετείται ο χάρτης εμβάπτισης (15 mm σε μήκος) έτσι, ώστε να καλύπτει το χάρτη εναπόθεσης κατά 2 mm. Τέλος, τοποθετείται ο χάρτης απορρόφησης (15 mm σε μήκος), πάνω από τη μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, καλύπτοντάς την κατά 2 mm. Με κοπτικό γραφείου, κόβονται ταινίες πλάτους 4 mm και φυλάσσονται σε ξηρό μέρος, σε θερμοκρασία δωματίου Σύζευξη νανοσφαιριδίων χρυσού με αντίσωμα Για την παρασκευή νανοσφαιριδίων χρυσού συζευγμένων με αντίσωμα έναντι της βιοτίνης (anti-biotin), πραγματοποιείται ρύθμιση του ph (με τη βοήθεια ph-μετρικού χάρτη) του διαλύματος των σφαιριδίων σε τιμή 9 με διάλυμα βόρακα 0,2 M. 2 μl διαλύματος 2 μg/μl του αντισώματος, αραιώνονται αρχικά σε 100 μl διαλύματος βόρακα 2 mm και ακολουθεί η προσθήκη σε αυτό 1 ml νανοσφαιριδίων χρυσού 61

69 (9, σωματίδια/ml). Μετά την προσθήκη ακολουθεί έντονη ανάδευση και το μίγμα αφήνεται να αντιδράσει για ~45 min, ενώ ανά τακτά χρονικά διαστήματα πραγματοποιείται ανάδευση του διαλύματος. Στη συνέχεια, προστίθενται 100 μl διαλύματος BSA 100 g/l σε 20 mm βόρακα και το διάλυμα αφήνεται για επώαση για άλλα 10 min. Ακολουθεί φυγοκέντρηση σε 4500 g για 10 min και στη συνέχεια αφαιρείται το υπερκείμενο υγρό. Το κόκκινο υπόλειμμα ανασυσταίνεται σε 100 μl διαλύματος BSA 10 g/l σε διάλυμα βόρακα 2 mm και επαναφυγοκεντρείται σε 4500 g για 5 min, προκειμένου να απομακρυνθεί η περίσσεια του μη συζευγμένου αντισώματος που υπάρχει στο διάλυμα. Τέλος, το υπόλειμμα ανασυσταίνεται σε 50 μl διαλύματος BSA 1 g/l σε διάλυμα βόρακα 2 mm που περιέχει 1 g/l NaN 3. Τα συζευγμένα νανοσφαιρίδια φυλάσσονται στους 4 C. Τα σωληνάρια τύπου eppendorf και τα ρύγχη πιπεττών που χρησιμοποιούνται κατά την παρασκευή, έχουν υποστεί την κατεργασία της σιλανοποίησης Σύζευξη COOH σφαιριδίων πολυστυρενίου με NH 2 -ολιγονουκλεοτίδια Για την παρασκευή συζεύγματος πολυστυρενίου με ολιγονουκλεοτίδια, χρησιμοποιήθηκαν άχρωμα σφαιρίδια πολυστυρενίου, διαμέτρου 2 μm, που φέρουν στην επιφάνειά τους καρβοξυλομάδες. Αναλυτικότερα, σε 12,8 μl εναιωρήματος σφαιριδίων (7, σφαιρίδια) προστίθενται 150 μl ρυθμιστικού διαλύματος MES (ph 4,5) και το διάλυμα φυγοκεντρείται σε g για 2 min. Το υπόλειμμα ανασυσταίνεται σε 160 μl ρυθμιστικού διαλύματος MES. Στη συνέχεια, προστίθενται 400 pmol του NH 2 - ολιγονουκλεοτιδίου και 5 μl προσφάτως παρασκευασμένου υδατικού διαλύματος EDC, 320 g/l. Ακολουθεί επώαση για 30 min και στη συνέχεια προστίθεται ξανά υδατικό διάλυμα EDC (5 μl). Το διάλυμα αφήνεται να αντιδράσει για ακόμα 30 min. Οι επωάσεις πραγματοποιούνται υπό συνεχή ανάδευση. Μετά το τέλος του δεύτερου μισάωρου προστίθεται 2 μl Tween-20 συγκέντρωσης 100 ml/l και το διάλυμα φυγοκεντρείται σε g για 2 min. Στη συνέχεια, αφαιρείται το υπερκείμενο και ακολουθούν δύο διαδοχικές εκπλύσεις (15000 g, 2 min) με 100 μl Tris-EDTA (ΤΕ) και 2 μl Tween ml/l. Τέλος, τα σφαιρίδια ανασυσταίνονται σε 64 μl ΤΕ. 62

70 4.6.8 Σήμανση των σφαιριδίων πολυστυρενίου με βιοτίνη για τη χρησιμοποίησή τους στη ζώνη ελέγχου Για την κατασκευή της ζώνης ελέγχου χρησιμοποιούνται σφαιρίδια πολυστυρενίου συζευγμένα με ολιγονουκλεοτίδια (τυχαία αλληλουχία) μετά από επέκταση των ολιγονουκλεοτιδίων παρουσία biotin-dutps. Συγκεκριμένα, 128 μl συζευγμένων σφαιριδίων (14, σφαιρίδια) καθαρίζονται εις διπλούν με 200 μl Η 2 Ο και ανασυσταίνονται τελικώς σε 20 μl Η 2 Ο. Η αντίδραση επέκτασης με τελική τρανσφεράση πραγματοποιείται σε τελικό όγκο 40 μl και περιέχει: 20 μl των καθαρισμένων σφαιριδίων, ρυθμιστικό διάλυμα της τελικής τρανσφεράσης (200 mm κακοδυλικό νάτριο, 25 mm Tris, 0,01 % (v/v) Triton X-100, 1 mm CoCl 2, ph 7,2), 0,5 mm dntps, 25 μμ biotin-dutps και 50 U του ενζύμου. Η επέκταση πραγματοποιείται στους 37 ο C για 1 h. Μετά το πέρας της 1 h τα σφαιρίδια εκπλένονται εις διπλούν με 100 μl H 2 O και 2 μl Tween ml/l με φυγοκέντρηση σε g για 2 min. Τέλος, τα σφαιρίδια ανασυσταίνονται σε 512 μl Tris-EDTA Ενζυμική προσθήκη δεοξυνουκλεοτιδίων στο 3 άκρο των εκκινητών της ΡΕΧΤ παρουσία biotin d-utp Οι εκκινητές της PEXT υποβάλλονται σε αντίδραση επέκτασης με τελική τρανσφεράση παρουσία biotin-dutp και χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο της σωστής και ειδικής λειτουργίας των συζευγμένων σφαιριδίων του πολυστυρενίου. Η αντίδραση πραγματοποιείται σε τελικό όγκο 20 μl που περιέχει συνολικά 100 pmol εκκινητών (10 pmol από κάθε εκκινητή), ρυθμιστικό διάλυμα της τελικής τρανσφεράσης (200 mm κακοδυλικό νάτριο, 25 mm Tris, 0,01 % (v/v) Triton X-100, 1 mm CoCl 2, ph 7,2), 0,5 mm dntps, 25 μμ biotin-dutps και 50 U του ενζύμου. Η επέκταση πραγματοποιείται στους 37 ο C για 1 h. Μετά το τέλος της αντίδρασης προστίθενται 2 μl EDTA 0,5 M για την απενεργοποίηση του ενζύμου. 4.7 Παρασκευή PCR προϊόντος που περιέχει μία μετάλλαξη (mutagenic PCR) Επειδή για τρεις από τις εξεταζόμενες μεταλλάξεις (Hb Heraklion, Hb Adana και Hb Questembert) δεν υπήρχαν διαθέσιμα δείγματα ομόζυγα μεταλλαγμένα, παρασκευάστηκαν συνθετικά προϊόντα με τις συγκεκριμένες μεταλλάξεις με τη 63

71 μέθοδο της κατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης (Εικόνα 4.1) με εργαλείο την PCR δύο σταδίων (two-step mutagenic PCR) Παρασκευή τμημάτων Α και Β Η αντίδραση PCR πραγματοποιήθηκε σε τελικό όγκο 50 μl που περιείχε 1 U ενζύμου Kapa 2G Fast, 1 ρυθμιστικού διαλύματος PCR, 1,5 mm MgCl 2, 200 μμ dntps, 0,25 μμ από τους κατάλληλους για την κάθε μετάλλαξη εκκινητές (Πίνακας 4.1), DMSO (η τελική συγκέντρωση ήταν διαφορετική για κάθε μετάλλαξη) και 3 μl γενωμικού DNA (~100 ng), φυσιολογικού ως προς τις εξεταζόμενες μεταλλάξεις. Το πρόγραμμα της αντίδρασης PCR που ακολουθήθηκε ήταν: 95 o C/2 min (στάδιο 1), 95 o C/30 sec (στάδιο 2), 55 ο C ή 60 o C/30 sec (ανάλογα με τη μετάλλαξη) (στάδιο 3), 72 o C/30 sec (στάδιο 4). Τα στάδια 2 έως 4 επαναλήφθηκαν 35 φορές και η αντίδραση συμπληρώθηκε με τελική επέκταση στους 72 o C για 2 min. Για την παρασκευή του τμήματος Α χρησιμοποιήθηκαν οι εξής εκκινητές: Hb Heraklion: HerAdFW και HER-R(M) Hb Adana: HerAdFW και ADANA-R(M) Hb Questembert: 5N και QUEST-R(M) Για την παρασκευή του τμήματος Β χρησιμοποιήθηκαν οι εξής εκκινητές: Hb Heraklion: HER-F(M) και HerAdREV Hb Adana: ADANA-F(M) και HerAdREV Hb Questembert: QUEST-F(M) και C2 Τα προϊόντα των PCR-A και PCR-B απομονώθηκαν από πηκτή αγαρόζης 1% και καθαρίστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του εμπορικά διαθέσιμου kit της Macherey-Nagel, NucleoSpin Extract II. Στη συνέχεια, τα προϊόντα ποσοτικοποιήθηκαν μετά από ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης, με το πρόγραμμα Gel Analyser Σύνδεση των τμημάτων Α και Β Η αντίδραση πραγματοποιήθηκε σε τελικό όγκο 50 μl που περιείχε 1 U ενζύμου Kapa 2G Fast, 1 ρυθμιστικού διαλύματος PCR, 1,5 mm MgCl 2, 200 μμ dntps και ισομοριακές ποσότητες (~200 fmol) από τα τμήματα Α και Β. Οι συνθήκες της αντίδρασης PCR ήταν οι εξής: 95 o C/2 min (στάδιο 1), 95 o C/30 sec (στάδιο 2), 45 ο C ή 50 o C/30 sec (ανάλογα με τη μετάλλαξη) (στάδιο 3), 72 o C/30 sec (στάδιο 4). Τα 64

72 στάδια 2 έως 4 επαναλήφθηκαν 40 φορές και η αντίδραση συμπληρώθηκε με τελική επέκταση στους 72 o C για 2 min Ενίσχυση του προϊόντος A-B που περιέχει την επιθυμητή μετάλλαξη Η αντίδραση PCR πραγματοποιήθηκε σε τελικό όγκο 50 μl, που περιείχε 1 U ενζύμου Kapa 2G Fast, 1 ρυθμιστικού διαλύματος PCR, 1,5 mm MgCl 2, 200 μμ dntps, 0,25 μμ από τους αρχικούς εκκινητές (5Ν και C2 για την Hb Questembert ή HerAdFW και HerAdREV για τις Hb Heraklion και Hb Adana), DMSO (η τελική συγκέντρωση εξαρτάται από την εκάστοτε μετάλλαξη) και 3 μl (~600 fmol) από το εκάστοτε προϊόν Α-Β. Οι συνθήκες της αντίδρασης PCR ήταν οι εξής: 95 o C/2 min (στάδιο 1), 95 o C/30 sec (στάδιο 2), 55 ο C ή 60 o C/30 sec (ανάλογα με τη μετάλλαξη) (στάδιο 3), 72 o C/30 sec (στάδιο 4). Τα στάδια 2 έως 4 επαναλήφθηκαν 35 φορές και η αντίδραση συμπληρώθηκε με τελική επέκταση στους 72 o C για 2 min. Στη συνέχεια, ακολούθησε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1,2%, όπως αναφέρθηκε παραπάνω (4.6.3), για τον έλεγχο του προϊόντος (βάσει μεγέθους) σύμφωνα με το σχεδιασμό των εκκινητών για την εκάστοτε μετάλλαξη. Τέλος, πραγματοποιήθηκε αντίδραση επέκτασης εκκινητή υπό τις συνθήκες που περιγράφηκαν παραπάνω (4.6.4) για τον τελικό έλεγχο της κατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης μέσω της PCR. 4.8 Κλωνοποίηση των PCR προϊόντων που φέρουν τις μεταλλάξεις Τα τρία μεταλλαγμένα προϊόντα που κατασκευάστηκαν, κλωνοποιήθηκαν σε πλασμίδιο σύμφωνα με τις οδηγίες του εμπορικά διαθέσιμου kit της Qiagen (PCR cloning kit). Για τον έλεγχο της εισαγωγής του PCR προϊόντος στον φορέα (πλασμίδιο), πραγματοποιήθηκε μετασχηματισμός βακτηρίων E. coli, καλλιέργεια σε τριβλία Petri για ανάπτυξη αποικιών και επιλογή των μετασχηματισθέντων στελεχών βάσει των μπλε/λευκών αποικιών (blue/white selection). Οι αποικίες που περιείχαν τη μετάλλαξη (λευκές), χρησιμοποιήθηκαν για ανάπτυξη σε υγρή καλλιέργεια. Ακολούθησε η φύλαξη στους -80 ο C μικρού όγκου της καλλιέργειας που περιείχε 20% γλυκερόλη ως δείγματος παρακαταθήκης. Από την υπόλοιπη καλλιέργεια απομονώθηκε το πλασμιδιακό DNA με το εμπορικά διαθέσιμο kit της Macherey Nagel (NucleoSpin plasmid, mini-prep). Στη συνέχεια, έγινε ποσοτικοποίηση του DNA που απομονώθηκε, ώστε να υπολογιστεί η κατάλληλη ποσότητα των 65

73 αντιγράφων που θα χρησιμοποιούνταν στην αντίδραση PCR. Η PCR πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις συνθήκες που είχαν επιλεχθεί για κάθε μετάλλαξη. Μετά την ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 1,2%, ακολούθησε αντίδραση επέκτασης εκκινητή, για τον τελικό έλεγχο της διαδικασίας κλωνοποίησης Επιδεκτά κύτταρα Χρησιμοποιήθηκε το βακτηριακό στέλεχος JM109 του E.coli. Αρχικά, ~5 ml θρεπτικού υλικού Luria-Bertani (LB) χωρίς αντιβιοτικό, εμβολιάστηκαν από δείγμα παρακαταθήκης υγρής καλλιέργειας JM109 (δεν περιέχουν πλασμίδιο). Έγινε επώαση με αερόβια ανακίνηση στους 37 ο C o/n. Την επόμενη μέρα εμβολιάστηκε 1 ml από την καλλιέργεια σε 100 ml θρεπτικού υλικού Luria-Bertani (LB) και επωάστηκε μέχρι η απορρόφηση (600 nm) να φτάσει 0,5. Η καλλιέργεια μεταφέρθηκε σε ψυχρό δοχείο στον πάγο και παρέμεινε εκεί για 20 min. Στη συνέχεια, φυγοκεντρήθηκε στα 1500 g για 10 min στους 4 ο C. Απομακρύνθηκε το υπερκείμενο υγρό και το ίζημα των κυττάρων επαναδιαλύθηκε σε 10 ml ψυχρού διαλύματος CaCl 2 0,1 M. Τα κύτταρα παρέμειναν στον πάγο για 10 min. Πραγματοποιήθηκε ξανά φυγοκέντρηση στις 4000 rpm για 10 min στους 4 ο C. Το υπερκείμενο υγρό απορρίφθηκε και το υπόλειμμα επαναδιαλύθηκε σε 2 ml ψυχρού διαλύματος CaCl 2 0,1 M και 15% γλυκερόλης (το διάλυμα προηγουμένως αποστειρώθηκε με διαβίβασή του από φίλτρο 0,22 μm). Τα κύτταρα διαμοιράστηκαν σε ποσότητες των 100 μl, τοποθετήθηκαν σε σωληνάρια τύπου eppendorf χωρητικότητας 1,5 ml και αποθηκεύτηκαν στους -80 C. Η παραπάνω διαδικασία πραγματοποιήθηκε υπό στείρες συνθήκες. 66

74 4.8.2 Μετασχηματισμός των επιδεκτικών κυττάρων με το φορέα, στον οποίο έχει ενσωματωθεί το μεταλλαγμένο προϊόν Ο μετασχηματισμός των επιδεκτών κυττάρων έγινε με το πλασμίδιο pdrive. Σε 100 μl επιδεκτών κυττάρων προστέθηκαν ~50 ng του φορέα που φέρει το επιθυμητό τμήμα DNA και αφέθηκαν για 30 min στον πάγο. Ακολούθως, το μίγμα τοποθετήθηκε σε υδατόλουτρο στους 42 ο C αυστηρά για 45 s και στη συνέχεια τοποθετήθηκε αμέσως στον πάγο για 2 min. Προστέθηκαν 900 μl θρεπτικού υλικού (LB) και έγινε επώαση για 1 h στους 37 ο C. Στη συνέχεια, 100 μl από τα κύτταρα, αφού είχε πραγματοποιηθεί φυγοκέντρηση μικρής διάρκειας και αφαίρεση του μεγαλύτερου όγκου του υπερκείμενου υγρού, επιστρώθηκαν σε αποστειρωμένο τριβλίο Petri που περιείχε θρεπτικό υλικό Luria-Bertani σε άγαρ και αντιβιοτικό αμπικιλλίνη 50 μg/ml. Πριν την επίστρωση κυττάρων στα τριβλία, προηγήθηκε επίστρωση 40 μl IPTG 100 mm και 40 μl X-gal 20 mg/ml, για την επιλογή μπλε/λευκών αποικιών. Οι καλλιέργειες επωάστηκαν στους 37 C o/n. Οι αποικίες που αναπτύχθηκαν και προέρχονταν από βακτήρια που περιείχαν τον πλασμιδιακό φορέα με το επιθυμητό τμήμα DNA (λευκές αποικίες), μεταφέρθηκαν η κάθε μία σε 5 ml θρεπτικού υλικού LB, που περιείχε 50 μg/ml αμπικιλλίνης. Οι καλλιέργειες επωάστηκαν o/n στους 37 C υπό ήπια ανάδευση. 67

75 ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 5.1 Ενίσχυση τμήματος του γονιδίου ΗΒΑ1 Η σύνθεση των α-αιμοσφαιρινικών αλυσίδων βρίσκεται υπό τον έλεγχο ενός διπλασιασμένου α-γονιδίου (HBA1 και ΗΒΑ2 ή α1 και α2), που βρίσκεται στο άκρο του βραχέος σκέλους του χρωμοσώματος 16. Οι μεταλλάξεις που ευθύνονται για την ελάττωση της σύνθεσης των α-αλυσίδων προκαλούν α-θαλασσαιμία. Μέχρι σήμερα, έχουν περιγραφεί περισσότερες από 120 μεταλλάξεις. Το γονίδιο της α1 σφαιρίνης (NG_000006) έχει μέγεθος 842 bp και βρίσκεται στη θέση 16p13.3 (ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Α). Η μέθοδος πολλαπλής ανίχνευσης μεταλλάξεων στο γονίδιο της α1 σφαιρίνης που αναπτύχθηκε στην παρούσα εργασία περιλαμβάνει τρία στάδια: (i) ενίσχυση τμήματος του γονιδίου που περιλαμβάνει τις υπό εξέταση μεταλλάξεις με την αντίδραση PCR, (ii) αντίδραση επέκτασης αλληλοειδικών εκκινητών, ΡΕΧΤ και (iii) πολλαπλή ανίχνευση των προϊόντων της αντίδρασης ΡΕΧΤ με ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. Στη συνέχεια, παρουσιάζονται οι μελέτες βελτιστοποίησης του κάθε σταδίου της μεθόδου. Το γενωμικό DNA υποβάλλεται σε PCR με τους εκκινητές C1 και C2 (βλέπε πίνακα 4.1) για την ενίσχυση τμήματος 1087 bp του γονιδίου της α1 σφαιρίνης, το οποίο περιλαμβάνει τις υπό μελέτη μεταλλάξεις. Ο εκκινητής C1 είναι κοινός στην αντίδραση PCR για την ενίσχυση των γονιδίων α1 και α2 αφού τα δύο γονίδια είναι ομόλογα κατά 98,5%. Ο εκκινητής C2 υβριδοποιείται αποκλειστικά και μόνο σε περιοχή του γονιδίου α1 που δεν έχει ομολογία με το γονίδιο α2. Η περιοχή του γονιδίου α1 που ενισχύεται είναι πλούσια σε GC (70%). Πραγματοποιήθηκαν μελέτες βελτιστοποίησης σειράς παραγόντων που επηρεάζουν την απόδοση και την εκλεκτικότητα της αντίδρασης PCR, όπως θερμοκρασία υβριδοποίησης εκκινητών, ενεργότητα ενζύμου, συγκέντρωση ιόντων μαγνησίου, κ.ά., καθώς και του χρόνου και κόστους της αντίδρασης. 68

76 5.2 Βελτιστοποιήσεις της PCR Οι εκκινητές της PCR (C1, C2) παραχωρήθηκαν από το "Χωρέμειο Ερευνητικό Εργαστήριο". Οι εκκινητές αυτοί, χρησιμοποιούνται στη ρουτίνα του συγκεκριμένου εργαστηρίου για τη διάγνωση της α-θαλασσαιμίας Μελέτη επίδρασης DMSO στην αντίδραση της PCR Το τμήμα του ΗΒΑ1 που ενισχύεται με την PCR έχει υψηλά ποσοστά GC (70%) με αποτέλεσμα την ανάγκη υψηλής θερμοκρασίας αποδιάταξης. Το DMSO είναι ένας παράγοντας που βοηθάει στην αποδιάταξη του DNA, επειδή παρεμποδίζει το ζευγάρωμα των συμπληρωματικών βάσεων και παρεμποδίζει το σχηματισμό δευτεροταγών δομών του DNA και των εκκινητών. Στην παρούσα εργασία, πραγματοποιήθηκε μελέτη επίδρασης της συγκέντρωσης του DMSO στην αντίδραση της PCR στην περιοχή ml/l και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στην Εικόνα 5.1. Εικόνα 5.1: Μελέτη επίδρασης συγκέντρωσης DMSO στην αντίδραση της PCR. Φ.Χ.: δείκτης μοριακών βαρών. N.C.: αρνητικός μάρτυρας. Η συγκεκριμένη αντίδραση της PCR πραγματοποιήθηκε με θερμοκρασία υβριδοποίησης εκκινητών 55 o C. Όπως φαίνεται και από την εικόνα, η παρουσία του DMSO στην αντίδραση είναι απαραίτητη. Απουσία DMSO, δεν παρατηρείται σχηματισμός του επιθυμητού προϊόντος, Αντιθέτως, παρουσία DMSO εμφανίζεται η ζώνη του επιθυμητού προϊόντος, ενώ η ένταση των ζωνών των μη ειδικών προϊόντων ελαττώνεται με αύξηση της συγκέντρωσης του DMSO μέχρι και 100 ml/l. Για την αποφυγή πολύ υψηλών συγκεντρώσεων οργανικού διαλύτη, για τις περαιτέρω μελέτες επιλέχθηκε συγκέντρωση DMSO 75 ml/l. 69

77 5.2.2 Μελέτη επίδρασης θερμοκρασίας υβριδοποίησης των εκκινητών (annealing) Η θερμοκρασία υβριδοποίησης των εκκινητών εξαρτάται από το μέγεθός τους, αλλά και από την περιεκτικότητά τους σε GC. Ο υπολογισμός του T m των εκκινητών μπορεί να γίνει βάσει του τύπου T m = (Α+Τ) 2 ο C + (G+C) 4 o C, εάν το μέγεθός τους δεν υπερβαίνει τα 14 νουκλεοτίδια. Για εκκινητές με μεγαλύτερο μέγεθος χρησιμοποιείται ο τύπος: T m = 64,9 C + 41 C (αριθμός G+C στον εκκινητή 16,4)/N, όπου Ν είναι ο αριθμός των νουκλεοτιδίων του εκκινητή. Ο υπολογισμός του T m γίνεται επίσης από διάφορα προγράμματα (Primer Premier). Η μελέτη επίδρασης της θερμοκρασίας υβριδοποίησης των εκκινητών για το γονίδιο ΗΒΑ1 περιελάμβανε τις θερμοκρασίες 55 ο C, 60 o C και 65 o C (Εικόνα 5.2). Εικόνα 5.2: Μελέτη επίδρασης θερμοκρασίας υβριδοποίησης εκκινητών. Οι αριθμοί 1 και 2 υποδεικνύουν δύο διαφορετικά δείγματα που υποβλήθηκαν σε PCR για την κάθε θερμοκρασία υβριδοποίησης. Όπως φαίνεται από τα αποτελέσματα της μελέτης, στους 65 o C δεν σχηματίζεται προϊόν PCR. Αντίθετα, στους 55 ο C και στους 60 ο C, η απόδοση της αντίδρασης είναι πολύ ικανοποιητική. Τελικά, ως βέλτιστη θερμοκρασία υβριδοποίησης επιλέχθηκαν οι 60 ο C, διότι στους 55 ο C παρατηρείται, έστω και αχνά, σχηματισμός παραπροϊόντων. Τα T m των εκκινητών είναι κοντά στους 60 ο C (C1: T m = 62,7 o C, C2: T m = 65,7 o C) Μελέτη επίδρασης συγκέντρωσης ιόντων μαγνησίου Τα ιόντα μαγνησίου λειτουργούν ως συμπαράγοντας για τις θερμοσταθερές DNA πολυμεράσες. Κάποιοι από τους παράγοντες της αντίδρασης PCR, όπως η συγκέντρωση του γενωμικού DNA, των dntps και η παρουσία παραγόντων, όπως το EDTA, μπορεί να μειώσουν την ποσότητα του ελεύθερου μαγνησίου και, επομένως, 70

78 να μειώσουν τη δραστικότητα της πολυμεράσης. Οι εκκινητές που συνδέονται σε άλλες θέσεις του DNA εκτός των επιθυμητών, σταθεροποιούνται παρουσία υψηλής συγκέντρωσης μαγνησίου και, έτσι, μειώνεται η ειδικότητα της αντίδρασης. Επίσης, οι υψηλές συγκεντρώσεις μαγνησίου σταθεροποιούν το δίκλωνο DNA και εμποδίζουν την πλήρη αποδιάταξή του, με αποτέλεσμα τη μείωση της απόδοσης της αντίδρασης. Η επίδραση των ιόντων μαγνησίου μελετήθηκε σε συγκεντρώσεις 1,5 mm, 2 mm και 2,5 mm (Εικόνα 5.3). Εικόνα 5.3: Επίδραση συγκέντρωσης ιόντων μαγνησίου στην PCR. Όπως φαίνεται από τα αποτελέσματα της μελέτης, η αύξηση της συγκέντρωσης των ιόντων μαγνησίου μέχρι και 2,5 mm δεν οδηγεί στο σχηματισμό παραπροϊόντων, ενώ η απόδοση της αντίδρασης φαίνεται να ελαττώνεται μερικώς με αύξηση της συγκέντρωσης στα 2,5 mm. Η συγκέντρωση ιόντων μαγνησίου 1,5 mm επιλέχθηκε ως βέλτιστη στις περαιτέρω μελέτες Μελέτη επίδρασης ενεργότητας ενζύμου Στα πλαίσια μελέτης βελτιστοποίησης της ενεργότητας του ενζύμου (Kapa 2G) στην PCR, μελετήθηκαν τρεις συγκεντρώσεις ενζύμου: 0,5 U, 1 U και 1,5 U (Εικόνα 5.4). Εικόνα 5.4: Μελέτη επίδρασης ενεργότητας ενζύμου στην PCR. 71

79 Η απόδοση της αντίδρασης φαίνεται να είναι ικανοποιητική και στις τρεις συγκεντρώσεις ενζύμου με μια μικρή αύξηση της απόδοσης όταν η ενεργότητα είναι >0.5 U. Ως βέλτιστη επιλέχθηκε η ενεργότητα του ενζύμου 1 U Μελέτη επίδρασης του χρόνου αποδιάταξης του DNA Για τη βελτιστοποίηση του χρόνου αποδιάταξης του DNA, πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις PCR με χρόνους αποδιάταξης 15 s, 30 s και 45 s (Εικόνα 5.5). Εικόνα 5.5: Μελέτη επίδρασης του χρόνου αποδιάταξης. Η απόδοση της αντίδρασης παρουσίαζει μία βελτίωση με την αύξηση του χρόνου αποδιάταξης μέχρι και τα 45 s. Επειδή όμως το συγκεκριμένο ένζυμο έχει καλή απόδοση και σε πιο σύντομους χρόνους, ως χρόνος αποδιάταξης επιλέχθηκαν τα 30 s Μελέτη επίδρασης του χρόνου υβριδοποίησης των εκκινητών Για τη βελτιστοποίηση του χρόνου υβριδοποίησης των εκκινητών πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις PCR υπό τις παρακάτω συνθήκες: α) 15 s και 30 s με χρόνο αποδιάταξης τα 30 s και β) 30 s με χρόνο αποδιάταξης τα 45 s (Εικόνα 5.6). Εικόνα 5.6: Μελέτη επίδρασης του χρόνου υβριδοποίησης των εκκινητών. Στις πρώτες δύο θέσεις παρουσιάζονται τα προϊόντα που παρασκευάστηκαν με χρόνο αποδιάταξης 30 s, ενώ στην τρίτη θέση 45 s. 72

80 Όπως φαίνεται από τα αποτελέσματα, η απόδοση της αντίδρασης αυξάνει με την αύξηση του χρόνου υβριδοποίησης στα 30 s, ενώ η μεταβολή του χρόνου αποδιάταξης από 30 s σε 45 s δε φαίνεται να την επηρεάζει. Ως βέλτιστοι χρόνοι υβριδοποίησης και αποδιάταξης επιλέχθηκαν τα 30 s. Οι επιλεχθείσες βέλτιστες συνθήκες χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση με PCR όλων των δειγμάτων που λήφθηκαν από το "Χωρέμειο Ερευνητικό Εργαστήριο". Ένα τυπικό ηλεκτροφόρημα των προϊόντων ενίσχυσης δειγμάτων DNA παρουσιάζεται στην Εικόνα 5.7. Εικόνα 5.7: Ηλεκτροφόρημα προϊόντων ενίσχυσης του γονιδίου ΗΒΑ1 σε δείγματα γενωμικού DNA υπό τις βέλτιστες συνθήκες. 5.3 Αντίδραση επέκτασης εκκινητή (ΡΕΧΤ) Στην αντίδραση ΡΕΧΤ χρησιμοποιήθηκαν 10 αλληλοειδικοί εκκινητές (δύο για κάθε σημειακή μετάλλαξη), ένας για το φυσιολογικό αλληλόμορφο και ένας για το μεταλλαγμένο. Κάθε εκκινητής φέρει στο 5 άκρο του μία χαρακτηριστική αλληλουχία αναγνώρισης (tag), μέσω της οποίας τα προϊόντα επέκτασης υβριδοποιούνται στην ταινία των ξηρών αντιδραστηρίων και ανιχνεύονται από νανοσφαιρίδια χρυσού συζευγμένα με αντίσωμα έναντι βιοτίνης. Η μέθοδος βασίζεται στην ικανότητα ορισμένων DNA πολυμερασών, όπως η Vent(exo-) και η AmpliTaq DNA πολυμεράση, Stoffel fragment, να επεκτείνουν τους εκκινητές μόνο σε περίπτωση απόλυτης συμπληρωματικότητας του 3 άκρου του αλληλοειδικού εκκινητή με τη βάση του πολυμορφισμού στην αλληλουχία στόχο. Αυτό οφείλεται στην πλήρη έλλειψη εξωνουκλεοτιδικής δραστικότητας ή την υπολειπόμενη δράση εξωνουκλεάσης των συγκεκριμένων πολυμερασών. Η αντίδραση PEXT πραγματοποιείται παρουσία επισημασμένων dntps, και συγκεκριμένα biotin-dutps, έτσι ώστε με την επέκταση του εκκινητή να πραγματοποιείται ταυτόχρονα και ιχνηθέτηση του προϊόντος επέκτασης (Εικόνα 5.8).. 73

81 Εικόνα 5.8: Σχηματική απεικόνιση της αντίδρασης ΡΕΧΤ. Το 3 άκρο του κάθε εκκινητή είναι συμπληρωματικό με το αντίστοιχο νουκλεοτίδιο του πολυμορφισμού. Ο εκκινητής επεκτείνεται μόνο όταν υπάρχει απόλυτη συμπληρωματικότητα. Κατά την επέκταση του εκκινητή προστίθενται και biotin-dutps. 5.4 Ανίχνευση προϊόντων ΡΕΧΤ σε ταινία ξηρών αντιδραστηρίων Τα ιχνηθετημένα με βιοτίνη προϊόντα επέκτασης της αντίδρασης PEXT υβριδοποιούνται σε ταινία ξηρών αντιδραστηρίων και ανιχνεύονται μέσω νανοσφαιριδίων χρυσού συζευγμένων με αντίσωμα έναντι βιοτίνης. Η ειδική υβριδοποίηση των προϊόντων και η μετακίνηση των νανοσφαιριδίων χρυσού επάνω στη διαγνωστική μεμβράνη, εξασφαλίζεται με τη χρήση κατάλληλου ρυθμιστικού διαλύματος ανάπτυξης. Η ταινία ξηρών αντιδραστηρίων αποτελείται από τα παρακάτω τμήματα: α) τον χάρτη εμβάπτισης, β) τον χάρτη εναπόθεσης (υαλοβάμβακας) των νανοσφαιριδίων χρυσού και του ΡΕΧΤ προϊόντος, γ) τη διαγνωστική μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και δ) τον χάρτη απορρόφησης (Εικόνα 5.9). 74

82 Εικόνα 5.9: αντιδραστηρίων. Σχηματική απεικόνιση των τμημάτων της ταινίας ξηρών Όπως αναφέρθηκε και παραπάνω, στην παρούσα εργασία χρησιμοποιήθηκαν 10 αλληλοειδικοί εκκινητές για την ταυτόχρονη ανίχνευση 5 γνωστών μεταλλάξεων στο γονίδιο ΗΒΑ1. Τα προϊόντα της αντίδρασης ΡΕΧΤ, σε περίπτωση επέκτασης του εκκινητή, περιέχουν στο 3 άκρο τους μόρια βιοτίνης και στο 5 άκρο τους τη χαρακτηριστική αλληλουχία αναγνώρισης (tag). Σε συγκεκριμένες θέσεις της μεμβράνης νιτροκυτταρίνης έχουν αποτεθεί συμπληρωματικές αλληλουχίες αναγνώρισης (anti-tags), οι οποίες βρίσκονται υπό μορφή συζευγμάτων με σφαιρίδια πολυστυρενίου. Τα νανοσφαιρίδια χρυσού, τα οποία είναι συζευγμένα με αντίσωμα έναντι βιοτίνης, αποτίθενται στο χάρτη εναπόθεσης, ενώ το προϊόν της αντίδρασης ΡΕΧΤ στο πάνω μέρος του. Το άκρο της ταινίας (χάρτης εμβάπτισης) βυθίζεται σε κατάλληλο διάλυμα ανάπτυξης. Το διάλυμα ανέρχεται της ταινίας και παρασέρνει το προϊόν, αλλά και τα νανοσφαιρίδια χρυσού. Στο σημείο αυτό λαμβάνει χώρα η υβριδοποίηση των ακινητοποιημένων ολιγονουκλεοτιδίων-ανιχνευτών με τις ειδικές για κάθε ένα αλληλουχίες αναγνώρισης. Σε περίπτωση που ο εκκινητής έχει επεκταθεί, τα νανοσωματίδια χρυσού δεσμεύονται με τα προϊόντα επέκτασης μέσω αλληλεπίδρασης biotin-anti-biotin, δημιουργώντας χαρακτηριστικές ερυθρές κηλίδες. Εάν ο εκκινητής δεν έχει επεκταθεί, τότε τα νανοσωματίδια δεν συζεύγνυνται με βιοτίνη, οπότε η συγκεκριμένη θέση παραμένει άχρωμη. Τα μη δεσμευμένα νανοσωματίδια αλληλεπιδρούν με βιοτινυλιωμένα ολιγονουκλεοτίδια στη ζώνη ελέγχου της ταινίας, σχηματίζοντας ερυθρή κηλίδα που επιβεβαιώνει τη σωστή λειτουργία του αισθητήρα (Εικόνα 5.10). 75

83 Εικόνα 5.10: Σχηματική απεικόνιση της ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων (αριστερά) και της υβριδοποίησης ενός βιοτινυλιωμένου προϊόντος της αντίδρασης ΡΕΧΤ με την αλληλουχία αναγνώρισης και τα νανοσφαιρίδια χρυσού (δεξιά). Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας πραγματοποιήθηκαν μελέτες βελτιστοποίησης των παραγόντων που επηρεάζουν την απόδοση και εκλεκτικότητα της αντίδρασης ΡΕΧΤ (θερμοκρασία υβριδοποίησης εκκινητών, συγκέντρωση των dntps, συγκέντρωση ιόντων μαγνησίου, κ.ά.), καθώς και για το βέλτιστο οπτικό αποτέλεσμα στην ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. Τα ζεύγη των αλληλοειδικών εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα εξής: για την μετάλλαξη Hb Heraklion οι εκκινητές HbaEXT-301 (ή 5Ν) και HbaEXT-301 (ή 5Μ) που αντιστοιχούν στο φυσιολογικό και μεταλλαγμένο αλληλόμορφο, αντίστοιχα. Το ζεύγος HbaEXT-101 (ή 6Ν) και HbaEXT-Η00 (ή 6Μ) για την Hb Taybe, HbaEXT-Α00 (ή 7Ν) και HbaEXT-601 (ή 7Μ) για την Hb Adana, HbaEXT-300 (ή 8Ν) και ο HbaEXT-Α01 (ή 8Μ) για την Hb Aghia Sophia, και HbaEXT-Β00 (ή 9Ν) και HbaEXT-Β01 (ή 9Μ) για την Hb Questembert. Στην Εικόνα 5.11 απεικονίζονται οι θέσεις των 5 εξεταζόμενων μεταλλάξεων με τη σειρά που αποτίθενται στην ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. 76

84 Εικόνα 5.11: Απεικόνιση των θέσεων των 5 εξεταζόμενων μεταλλάξεων στην ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. Οι αριστερές κηλίδες υποδηλώνουν την παρουσία φυσιολογικών αλληλόμορφων, ενώ οι δεξιές κηλίδες την παρουσία μεταλλαγμένων αλληλόμορφων. Πάνω από τις κηλίδες αναγράφονται οι ονομασίες των εκκινητών για κάθε αλληλόμορφο Αντιδράσεις ΡΕΧΤ με την Vent(exo-) πολυμεράση Στις αρχικές μελέτες της αντίδρασης επέκτασης εκκινητή χρησιμοποιήθηκε η πολυμεράση Vent(exo-) η οποία, όπως έχει αναφερθεί, υπολείπεται της 3 5 και 5 3 εξωνουκλεοτιδικής δράσης. Α) Β) Εικόνα 5.12: Ανίχνευση προϊόντων ΡΕΧΤ με την πολυμεράση Vent(exo-) σε φυσιολογικά δείγματα. A) Αντίδραση ΡΕΧΤ παρουσία όλων των εκκινητών. Β) Αντίδραση ΡΕΧΤ παρουσία μόνο του ζεύγους 9Ν-9Μ. Στην πρώτη ταινία έχουν αποτεθεί όλα τα anti-tags στη μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, ενώ στη δεύτερη μόνο τα anti-tags για τα 9Ν, 9Μ και τη ζώνη ελέγχου. Η συγκέντρωση του κάθε εκκινητή στην αντίδραση ΡΕΧΤ είναι 5 pmol και η αποδιάταξη του προϊόντος PCR πραγματοποιείται στους 95 ο C. Παρατηρήθηκε ότι το προϊόν επέκτασης του εκκινητή 9Ν παρουσία φυσιολογικών αλληλόμορφων για τη 77

85 μετάλλαξη Hb Questembert, σε κάποια δείγματα εξαφανίζεται (Εικόνα 5.12, Α, δείγματα 1-4), ενώ σε κάποια άλλα η κηλίδα στη μεμβράνη είναι αχνή σε σχέση με τις υπόλοιπες (Εικόνα 5.12, Α, δείγματα 5, 6). Όταν η αντίδραση ΡΕΧΤ πραγματοποιείται μόνο παρουσία του ζεύγους εκκινητών 9Ν-9Μ, η επέκταση του εκκινητή 9Ν πραγματοποιείται κανονικά (Εικόνα 5.12, Β). Επίσης, παρατηρούνται προϊόντα μη ειδικής επέκτασης για τις μεταλλάξεις Hb Taybe και Hb Aghia Sophia (Εικόνα 5.12, Α) Μελέτη επίδρασης πολυμερασών με εξωνουκλεοτιδική δραστικότητα στην αντίδραση ΡΕΧΤ Επειδή το πρόβλημα της μη εμφάνισης του προϊόντος επέκτασης του εκκινητή 9Ν, αλλά και των έντονων μη ειδικών προϊόντων επέκτασης για τις μεταλλάξεις Hb Taybe και Hb Aghia Sophia, υπήρχε σε αρκετά δείγματα, πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις ΡΕΧΤ στα ίδια δείγματα με μία επιπλέον πολυμεράση, την AmpliTaq DNA polymerase (Stoffel fragment), με έλλειψη 5 3 εξωνουκλεοτιδικής δράσης. Εικόνα 5.13: Ανίχνευση προϊόντων ΡΕΧΤ με Vent(exo-) και AmpliTaq DNA polymerase (Stoffel fragment) στα ίδια δείγματα. (1-3) φυσιολογικά δείγματα, (4) δείγμα ετερόζυγο για τη μετάλλαξη Hb Taybe. Όπως φαίνεται από τα αποτελέσματα της μελέτης, παρουσία της AmpliTaq DNA πολυμεράσης, δεν παρατηρείται πρακτικά μη ειδική επέκταση εκκινητών (Εικόνα 5.13). Αντιθέτως, και στην περίπτωση της AmpliTaq DNA πολυμεράσης υπάρχει πρόβλημα επέκτασης του φυσιολογικού εκκινητή για τη μετάλλαξη Hb Questembert. Οι συνθήκες στις οποίες πραγματοποιήθηκε η αντίδραση ΡΕΧΤ ήταν: θερμοκρασία αποδιάταξης εκκινητών 98 ο C και θερμοκρασία υβριδοποίησης 65 ο C προς αποφυγή μη ειδικής επέκτασης εκκινητών. Η συγκέντρωση των εκκινητών στην αντίδραση 78

86 ήταν 5 pmol ο καθένας. Για τις περαιτέρω μελέτες βελτιστοποίησης επιλέχθηκε τελικά η AmpliTaq DNA πολυμεράση (Stoffel fragment) Μελέτη επίδρασης θερμοκρασίας υβριδοποίησης εκκινητών Η θερμοκρασία υβριδοποίησης των εκκινητών παίζει σημαντικό ρόλο τόσο στην ειδικότητα της αντίδρασης ΡΕΧΤ όσο και στην απόδοση της αντίδρασης. Οι θερμοκρασίες που μελετήθηκαν ήταν οι εξής: 55 ο C, 60 o C, 65 o C και 68 o C. Η μελέτη της θερμοκρασίας υβριδοποίησης πραγματοποιήθηκε σε ένα δείγμα φυσιολογικό για όλες τις μεταλλάξεις και σε ένα ετερόζυγο για τη μετάλλαξη Hb Taybe (Εικόνα 5.14). Εικόνα 5.14: Μελέτη επίδρασης της θερμοκρασίας υβριδοποίησης των εκκινητών της αντίδρασης ΡΕΧΤ σε δείγμα φυσιολογικό και ετερόζυγο. Όπως φαίνεται από τα αποτελέσματα της μελέτης, η απόδοση της αντίδρασης ΡΕΧΤ δεν επηρεάζεται από τη θερμοκρασία στην περιοχή ο C. Ως βέλτιστη επιλέχθηκε η θερμοκρασία 65 ο C προς αποφυγή μη ειδικών επεκτάσεων (ασθενών) σε χαμηλές θερμοκρασίες και κάποια πτώση της απόδοσης σε θερμοκρασία > 65 ο C. Το μόνο πρόβλημα που παρατηρείται όμως είναι η χαμηλή απόδοση της επέκτασης του φυσιολογικού εκκινητή για τη μετάλλαξη Hb Questembert Μελέτη επίδρασης συγκέντρωσης ιόντων μαγνησίου Η συγκέντρωση των ιόντων μαγνησίου παίζει σημαντικό ρόλο στη δραστικότητα της πολυμεράσης, αφού το μαγνήσιο δρα ως συμπαράγοντας του ενζύμου. Χαμηλή συγκέντρωση ιόντων μαγνησίου μειώνει την απόδοση της αντίδρασης, ενώ υψηλή συγκέντρωση μπορεί να ενισχύσει τη μη ειδική επέκταση των αλληλοειδικών εκκινητών. Για τη μελέτη αυτή πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις ΡΕΧΤ σε δείγμα φυσιολογικό για όλες τις μεταλλάξεις παρουσία διαφορετικής συγκέντρωσης ιόντων μαγνησίου (Εικόνα 5.15). 79

87 Εικόνα 5.15: Μελέτη επίδρασης συγκέντρωσης των ιόντων μαγνησίου στην αντίδραση ΡΕΧΤ. Για την δράση της πολυμεράσης είναι απαραίτητη η παρουσία ιόντων μαγνησίου. Απουσία ιόντων μαγνησίου δεν παρατηρείται σχηματισμός προϊόντων επέκτασης. Αντιθέτως, παρουσία ιόντων μαγνησίου παρατηρείται σχηματισμός προϊόντων επέκτασης, η ποσότητα των οποίων αυξάνει με την αύξηση της συγκέντρωσης μέχρι και 4 mm και χωρίς την εμφάνιση μη ειδικών προϊόντων σε συγκεντρώσεις > 4 mm. Οι συγκεντρώσεις ιόντων μαγνησίου που προτείνονται από τον κατασκευαστή για την AmpliTaq DNA πολυμεράση (Stoffel fragment) κυμαίνεται μεταξύ 2-10 mm. Ως βέλτιστη επιλέχθηκε η συγκέντρωση 4 mm. Η επέκταση του φυσιολογικού εκκινητή για τη μετάλλαξη Hb Questembert συνεχίζει να είναι προβληματική Μελέτη επίδρασης ενεργότητας ενζύμου Η μελέτη επίδρασης της ενεργότητας του ενζύμου είναι απαραίτητη προκειμένου να επιτευχθεί ενίσχυση και των 10 αλληλοειδικών εκκινητών. Για τη μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκε δείγμα ετερόζυγο για τη μετάλλαξη Hb Taybe και πραγματοποιήθηκε σειρά αντιδράσεων ΡΕΧΤ παρουσία 0,5 U, 1 U, 1,5 U και 2 U ενζύμου (Εικόνα 5.16). Εικόνα 5.16: Μελέτη επίδρασης της ποσότητας του ενζύμου στην αντίδραση ΡΕΧΤ. 80

88 Από τα αποτελέσματα της μελέτης γίνεται εμφανές ότι, ακόμη και σε χαμηλή συγκέντρωση ενζύμου (0,5 U), σχηματίζονται προϊόντα επέκτασης. Με αύξηση της συγκέντρωσης του ενζύμου μέχρι 1 U παρατηρείται αύξηση της απόδοσης της αντίδρασης, η οποία παραμένει αμετάβλητη με την παραπέρα αύξηση της συγκέντρωσης μέχρι και 2 U, χωρίς όμως την εμφάνιση μη ειδικών προϊόντων επέκτασης. Ως βέλτιστη επιλέχθηκε η συγκέντρωση 1 U/αντίδραση. Η επέκταση του φυσιολογικού εκκινητή για τη μετάλλαξη Hb Questembert συνεχίζει να είναι προβληματική Μελέτη επίδρασης της ποσότητας των εκκινητών στην αντίδραση ΡΕΧΤ Η ποσότητα των εκκινητών στην αντίδραση ΡΕΧΤ παίζει σημαντικό ρόλο τόσο στην απόδοσή της, όσο και στην αλληλεπίδραση που μπορεί να έχουν μεταξύ τους οι εκκινητές. Η μελέτη της επίδρασης της ποσότητας των εκκινητών πραγματοποιήθηκε σε δείγμα φυσιολογικό στην περιοχή μεταξύ 0,25 έως 7,5 pmol από καθέναν από τους εκκινητές στην αντίδραση (Εικόνα 5.17). Εικόνα 5.17: Μελέτη επίδρασης της ποσότητας των εκκινητών στην αντίδραση ΡΕΧΤ. Ο αριθμός πάνω από κάθε μεμβράνη αναφέρεται στα pmol των εκκινητών στην αντίδραση. Παρατηρείται, ότι το προϊόν επέκτασης του φυσιολογικού εκκινητή για τη μετάλλαξη Hb Questembert εμφανίζεται μόνο όταν η ποσότητα του κάθε εκκινητή είναι 1 pmol. Σε ποσότητες < 1 pmol και > 2 pmol, η ένταση της κηλίδας μειώνεται δραματικά. Πιθανός λόγος αυτής της εικόνας μπορεί να είναι η χαμηλή απόδοση της επέκτασης του εκκινητή στον συγκεκριμένο πολυμορφικό τόπο με αποτέλεσμα, όταν αυξάνει η συγκέντρωση του εκκινητή, το προϊόν επέκτασης να συναγωνίζεται για την ίδια θέση δέσμευσης στη μεμβράνη με μεγαλύτερη ποσότητα ελεύθερου (μη 81

89 επεκταμένου) εκκινητή. Εδώ θα πρέπει να σημειωθεί ότι, γενικότερα, σε συγκεντρώσεις εκκινητών >>1 pmol παρατηρείται εξαφάνιση των μη ειδικών κηλίδων στη διαγνωστική μεμβράνη. Το γεγονός αυτό οφείλεται κυρίως στην εκτόπιση των μη ειδικά ακινητοποιημένων προϊόντων από την περίσσεια των μη επεκταμένων εκκινητών. Μελέτη επίδρασης συγκέντρωσης φορμαμιδίου στην αντίδραση ΡΕΧΤ Με στόχο την ελάττωση σχηματισμού προϊόντων μη ειδικής επέκτασης, μελετήθηκε η επίδραση της συγκέντρωσης του φορμαμιδίου στην αντίδραση ΡΕΧΤ. Για τη μελέτη αυτή πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις ΡΕΧΤ σε φυσιολογικό δείγμα, που περιείχαν διαφορετικές συγκεντρώσεις φορμαμιδίου (0-30 ml/l) σε συνδυασμό με διαφορετικές συγκεντρώσεις εκκινητών (Εικόνα 5.18). και ποσότητες εκκινητών 1 pmol, 2,5 pmol και 5 pmol. Εικόνα 5.18: Μελέτη επίδρασης της ποσότητας των εκκινητών σε συνδυασμό με διαφορετικές συγκεντρώσεις φορμαμιδίου (ml/l) στην αντίδραση ΡΕΧΤ. Τα αποτελέσματα της συγκεκριμένης μελέτης παρουσιάζονται στην Εικόνα Στα 2,5 pmol και τα 5 pmol εκκινητών, το προϊόν επέκτασης του φυσιολογικού εκκινητή για τη μετάλλαξη Hb Questembert είτε χάνεται, είτε είναι πολύ αχνό, ανεξάρτητα από τη συγκέντρωση του φορμαμιδίου. Για ποσότητα εκκινητών 1 pmol παρατηρείται ότι με αύξηση της συγκέντρωσης του φορμαμιδίου στην αντίδραση ελαττώνεται η ένταση του προϊόντος επέκτασης του φυσιολογικού εκκινητή για τη μετάλλαξη Hb Questembert. Έτσι, η προσθήκη φορμαμιδίου στην αντίδραση ΡΕΧΤ κρίθηκε μη απαραίτητη. 82

90 Μελέτη επίδρασης της ποσότητας του ζεύγους των αλληλοειδικών εκκινητών για τη μετάλλαξη Hb Questembert σε σχέση με τους άλλους εκκινητές Στο πλαίσιο βελτίωσης της απόδοσης του προϊόντος επέκτασης των αλληλοειδικών εκκινητών 9Ν-9Μ μελετήθηκε η δυνατότητα διαφοροποίησης της ποσότητας των εκκινητών αυτών (μεγαλύτερη ή μικρότερη) σε σχέση με την ποσότητα των υπολοίπων 8 εκκινητών (5-8, βλέπε Εικόνα 5.11), που διατηρούταν ίδια. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης σε φυσιολογικό δείγμα παρουσιάζονται στην Εικόνα 5.19, Α και Β όπου αναγράφονται οι ποσότητες όλων των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν. Εικόνα 5.19: Μελέτη επίδρασης της συγκέντρωσης των εκκινητών 9Ν-9Μ σε σχέση με τους υπόλοιπους εκκινητές (5-8) στην αντίδραση ΡΕΧΤ. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής καταδεικνύουν ότι η απόδοση του φυσιολογικού προϊόντος επέκτασης για τη μετάλλαξη Hb Questembert δεν βελτιώνεται με τις παραπάνω μεταβολές στις ποσότητες των αλληλοειδικών εκκινητών. Μελέτη επίδρασης της αλλαγής διεύθυνσης των 9Ν-9Μ εκκινητών Τέλος, έγινε επανασχεδιασμός των αλληλοειδικών εκκινητών 9Ν και 9Μ με αλλαγή της διεύθυνσής τους από πρόσθιους σε αντίστροφους (Rev 9N HBA και Rev 9M HBA, αντίστοιχα) και με διατήρηση της αλληλουχίας ανίχνευσης των εκκινητών (tag) και του spacer. Πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις ΡΕΧΤ με ποσότητες των εκκινητών 5 pmol σε δύο θερμοκρασίες υβριδοποίησης εκκινητών (60 ο C, 65 o C, Εικόνα 5.20, Α). Επίσης, πραγματοποιήθηκε συγκριτική μελέτη αντιδράσεων ΡΕΧΤ με μόνο τα ζεύγη των 9Ν-9Μ (αρχικοί εκκινητές) και των επανασχεδιασμένων Rev 9N HBA-Rev 9M HBA σε ποσότητες 5 pmol ο καθένας και θερμοκρασία 83

91 υβριδοποίησης στους 65 ο C (Εικόνα 5.20, Β). Για τη μελέτη αυτή χρησιμοποιήθηκαν δύο δείγματα φυσιολογικά για όλα τα αλληλόμορφα και ένα ετερόζυγο για τη μετάλλαξη Hb Taybe. Εικόνα 5.20: Α) Μελέτη των επανασχεδιασμένων εκκινητών για τη μετάλλαξη «9» σε διαφορετικά δείγματα και δύο θερμοκρασίες υβριδοποίησης (60 ο C, 65 o C), B) μελέτη των επανασχεδιασμένων και των αρχικών εκκινητών στην αντίδραση ΡΕΧΤ παρουσία μόνο του ενός ζεύγους εκκινητών «9». Από τη μελέτη αυτή διαπιστώθηκε ότι ο επανασχεδιασμός των εκκινητών δε βελτίωσε την επέκταση των εκκινητών (Εικόνα 5.20, Α). Αντιθέτως, δεν παρατηρήθηκε σχηματισμός προϊόντος επέκτασης, ακόμη και απουσία των υπόλοιπων 4 ζευγών εκκινητών, σε αντίθεση με το αρχικό ζεύγος (Εικόνα 5.20, Β). Με τους νέους εκκινητές σε ποσότητα 1 pmol πραγματοποιήθηκαν αντιδράσεις ΡΕΧΤ σε 4 φυσιολογικά δείγματα και 1 ετερόζυγο δείγμα (Εικόνα 5.21). Εικόνα 5.21: Ανίχνευση προϊόντων αντίδρασης ΡΕΧΤ με τους νέους εκκινητές σε ποσότητα 1 pmol. Τα δείγματα 1-4 είναι φυσιολογικά, ενώ το δείγμα 5 είναι ετερόζυγο για τη μετάλλαξη Hb Taybe. Από τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής προέκυψε ότι με τον επανασχεδιασμό των εκκινητών όχι μόνο δε βελτιώθηκε η απόδοση της αντίδρασης ΡΕΧΤ, αλλά, αντιθέτως, ελαττώθηκε σε σχέση με το αρχικό ζεύγος. Για το λόγο αυτό διατηρήθηκε 84

92 το αρχικό ζεύγος εκκινητών και πραγματοποιήθηκαν επιπλέον μελέτες για τη βελτίωση της ανίχνευσης του προϊόντος επέκτασης. Επίδραση της θέσης απόθεσης των ολιγονουκλεοτιδίων ακινητοποίησης (ΟΑ) στη διαγνωστική μεμβράνη Μελετήθηκε η επίδραση της θέσης απόθεσης των ολιγονουκλεοτιδίων ακινητοποίησης (ΟΑ) στη μεμβράνη στην ένταση του προϊόντος επέκτασης των αλληλοειδικών εκκινητών για την Hb Questembert. Δοκιμάσθηκε η απόθεση των ΟΑ σε όλες τις θέσεις της μεμβράνης. Το προϊόν της αντίδρασης ΡΕΧΤ προερχόταν από δείγμα ετερόζυγο για τη μετάλλαξη Hb Taybe. Η συγκέντρωση των εκκινητών στην αντίδραση ήταν 5 pmol ο καθένας. Εικόνα 5.22: Απόθεση των ΟΑ (anti-tags) για τους εκκινητές 9Ν και 9Μ σε διαφορετικές θέσεις της μεμβράνης. Τα βέλη υποδεικνύουν τις θέσεις που έχει γίνει η απόθεση σε κάθε μεμβράνη. Από τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης είναι εμφανές ότι η θέση απόθεσης των ΟΑ δεν επηρεάζει την εμφάνιση των προϊόντων επέκτασης (Εικόνα 5.22). Επίσης, συμπεραίνεται ότι για την εμφάνιση προϊόντος επέκτασης για τη μετάλλαξη Hb Questembert η ποσότητα των εκκινητών θα πρέπει να είναι 1 pmol Μελέτη του χρόνου υβριδοποίησης των εκκινητών Ο χρόνος υβριδοποίησης των εκκινητών μπορεί να επηρεάσει σημαντικά την ειδικότητα και την απόδοση της αντίδρασης ΡΕΧΤ. Ο αυξημένος χρόνος υβριδοποίησης μπορεί να οδηγήσει στην επέκταση μη ειδικών προϊόντων, ενώ σε μειωμένο χρόνο υβριδοποίησης οι εκκινητές μπορεί να μην προλαβαίνουν να υβριδοποιηθούν σε ικανοποιητικό ποσοστό. Στο πλαίσιο βελτιστοποίησης της αντίδρασης μελετήθηκε η επίδραση του χρόνου υβριδοποίησης της αντίδρασης ΡΕΧΤ στην περιοχή 5 s έως 45 s σε δείγμα φυσιολογικό για όλα τα αλληλόμορφα. 85

93 Εικόνα 5.23: Μελέτη επίδρασης του χρόνου υβριδοποίησης των εκκινητών στην αντίδραση ΡΕΧΤ. Οι αριθμοί πάνω από κάθε μεμβράνη είναι ο χρόνος σε s. Από τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης συμπεραίνεται ότι η αύξηση του χρόνου υβριδοποίησης πάνω από 15 s οδηγεί στο σχηματισμό έστω και αχνών μη ειδικών προϊόντων, ενώ σε χαμηλούς χρόνους υβριδοποίησης (<10 s) η απόδοση της αντίδρασης μειώνεται. Σε χρόνους υβριδοποίησης μεταξύ 10 και 15 s, δεν παρατηρούνται πρακτικά μη ειδικά προϊόντα, ενώ η απόδοση της αντίδρασης είναι παρόμοια και ικανοποιητική (Εικόνα 5.23). Ως βέλτιστος χρόνος υβριδοποίησης επιλέχθηκαν τα 15 s Μελέτη επίδρασης της συγκέντρωσης των dntps Στην αντίδραση ΡΕΧΤ, εκτός από τα συμβατικά dntps (datp, dgtp, dctp, dttp), προστίθενται και biotin-dutps σε αναλογία 1:1 με τα dttps. Μελετήθηκε η επίδραση της συγκέντρωσης των dntps στην αντίδραση ΡΕΧΤ στην περιοχή συγκεντρώσεων 2,5 μμ έως 40 μμ. Για τη μελέτη χρησιμοποιήθηκε δείγμα φυσιολογικό για όλα τα αλληλόμορφα. Εικόνα 5.24: Μελέτη επίδρασης συγκέντρωσης των dntps στην αντίδραση ΡΕΧΤ. Οι αριθμοί πάνω από κάθε μεμβράνη είναι η συγκέντρωση των dntps σε μμ. 86

94 Όπως φαίνεται από τα αποτελέσματα της μελέτης, με αύξηση της συγκέντρωσης των dntps πάνω από 10 μμ εμφανίζονται έντονα μη ειδικά προϊόντα. Σε συγκεντρώσεις dntps κάτω από 10 μμ ελαττώνεται σημαντικά η ένταση των μη ειδικών προϊόντων, ταυτόχρονα όμως ελαττώνεται και η ένταση των κηλίδων (Εικόνα 5.24). Ως βέλτιστη συγκέντρωση dntps επιλέχθηκαν τα 10 μμ Μελέτη επίδρασης DMSO στην αντίδραση της ΡΕΧΤ Το DMSO είναι ένας οργανικός διαλύτης που μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε αντιδράσεις PCR για να αναστείλει το σχηματισμό δευτεροταγών δομών του DNA, αλλά και των εκκινητών. Μελετήθηκε η επίδραση της συγκέντρωσης του DMSO στην αντίδραση ΡΕΧΤ στην περιοχή 0 έως 50 ml/l με στόχο την παρεμπόδιση σχηματισμού προϊόντων μη ειδικής επέκτασης. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε δείγμα φυσιολογικό και ετερόζυγο για τη μετάλλαξη Hb Taybe. Εικόνα 5.25: Μελέτη επίδρασης της συγκέντρωσης DMSO στην αντίδραση ΡΕΧΤ σε δείγμα φυσιολογικό και ετερόζυγο. Από τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής φαίνεται ότι η προσθήκη DMSO στην αντίδραση της ΡΕΧΤ δεν επιφέρει κάποιες σημαντικές διαφορές στην ανίχνευση των προϊόντων επέκτασης εκκινητών (Εικόνα 5.25) Μελέτη ευαισθησίας της αντίδρασης ΡΕΧΤ Η μελέτη ευαισθησίας της γονοτυπικής αντίδρασης πραγματοποιήθηκε σε προϊόν PCR δείγματος ετεροζυγώτη για τη μετάλλαξη Hb Aghia Sophia. Η ποσότητα του PCR προϊόντος που χρησιμοποιείται συνήθως στην αντίδραση ΡΕΧΤ είναι ~ fmol. Στη συγκεκριμένη μελέτη πραγματοποιήθηκε σειρά αντιδράσεων ΡΕΧΤ παρουσία διαφορετικών ποσοτήτων προϊόντος PCR μεταξύ 1 και 6,4 fmol (Εικόνα 5.26). 87

95 Εικόνα 5.26: Μελέτη ευαισθησίας της αντίδρασης ΡΕΧΤ σε ετερόζυγο προϊόν. Όπως φαίνεται από τα αποτελέσματα της μελέτης, με εξαίρεση την κηλίδα που αντιστοιχεί στο προϊόν επέκτασης του φυσιολογικού εκκινητή για την Hb Questembert, η απόδοση της αντίδρασης ΡΕΧΤ είναι αρκετά ικανοποιητική ακόμη και με τη χρήση 3,2 fmol προϊόντος PCR. Η ελάττωση του προϊόντος PCR (στην αντίδραση ΡΕΧΤ) στα 1,6 fmol έχει ως αποτέλεσμα την εξασθένιση των κηλίδων ιδιαίτερα στις θέσεις που αντιστοιχούν στα προϊόντα επέκτασης των εκκινητών «8Ν και 8Μ» σε βαθμό που να καθίσταται αδύνατη η γονοτύπιση του δείγματος. Με την περαιτέρω ελάττωση της συγκέντρωσης του προϊόντος PCR στα 0,8 fmol, παρατηρείται καθολική εξασθένιση πρακτικά όλων των κηλίδων. Με βάση τα παραπάνω συμπεραίνεται ότι, με εξαίρεση τα προϊόντα επέκτασης για τη μετάλλαξη Hb Questembert, η ευαισθησία του γονοτυπικού προσδιορισμού για τα υπόλοιπα αλληλόμορφα βρίσκεται περίπου στα 3 fmol προϊόντος PCR ( M), δηλαδή εξαιρετικά ικανοποιητική επιτρέποντας τη γονοτύπιση δείγματος ακόμα και σε πολύ μικρές ποσότητες προϊόντος PCR Μελέτη αριθμού των κύκλων στην αντίδραση ΡΕΧΤ Ο αριθμός των κύκλων του προγράμματος του θερμικού κυκλοποιητή για την αντίδραση ΡΕΧΤ σχετίζεται με την απόδοση της αντίδρασης, δηλαδή την ικανοποιητική επέκταση των αλληλοειδικών εκκινητών. Στην παρούσα μελέτη πραγματοποιήθηκε σειρά αντιδράσεων ΡΕΧΤ σε φυσιολογικό δείγμα με μόνη αλλαγή τον αριθμό κύκλων μεταξύ 2 και 15 και τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στην Εικόνα

96 Εικόνα 5.27: Μελέτη επίδρασης του αριθμού των κύκλων της αντίδρασης ΡΕΧΤ. Ο αριθμός πάνω από κάθε μεμβράνη αντιστοιχεί στον αριθμό κύκλων του προγράμματος του θερμικού κυκλοποιητή. Όπως φαίνεται από την εικόνα, ακόμη και στους 2 κύκλους υπάρχει ανιχνεύσιμο προϊόν στις περισσότερες κηλίδες. Με αύξηση του αριθμού των κύκλων η ένταση των προϊόντων επέκτασης αυξάνει σημαντικά. Στους 15 όμως κύκλους καθίσταται έντονη η εμφάνιση προϊόντων μη ειδικής επέκτασης (Εικόνα 5.27). Στους 10 κύκλους η απόδοση της αντίδρασης είναι ικανοποιητική και η ένταση των προϊόντων μη ειδικής επέκτασης αρκετά ασθενής. Ως βέλτιστος αριθμός κύκλων για το πρόγραμμα της αντίδρασης ΡΕΧΤ επιλέχθηκαν οι Μελέτη σύστασης διαλύματος ανάπτυξης Το διάλυμα ανάπτυξης αποτελεί σημαντικό παράγοντα για τη σωστή λειτουργία της ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων. Ο ρόλος του διαλύματος είναι πολλαπλός εφόσον πρέπει να διευκολύνει την απελευθέρωση των σφαιριδίων χρυσού από τον υαλοβάμβακα, να δημιουργεί συγκεκριμένη ταχύτητα ροής, ώστε να υπάρχει επαρκής χρόνος για τις υβριδοποιήσεις και, τέλος, να εμποδίζει τη μη ειδική αλληλεπίδραση των σφαιριδίων χρυσού με τα σφαιρίδια του πολυστυρενίου στη μεμβράνη. Το διάλυμα ανάπτυξης περιλαμβάνει τα εξής συστατικά: ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικών που περιέχει NaCl (Saline Sodium Citrate, SSC), SDS, Tween-20, BSA, γλυκερόλη και φορμαμίδιο. Η BSA (αλβουμίνη βοείου ορού) χρησιμοποιείται ως καλυπτικό αντιδραστήριο των κενών θέσεων, τόσο στην επιφάνεια των σφαιριδίων που χρησιμοποιούνται, όσο και της μεμβράνης, ελαχιστοποιώντας έτσι τις μη ειδικές αλληλεπιδράσεις. Η γλυκερόλη μειώνει την ταχύτητα ροής, ενώ το SDS και το Tween-20 είναι επιφανειοδραστικοί παράγοντες, που βοηθούν στην αποτελεσματική απομάκρυνση των σφαιριδίων χρυσού από τη μεμβράνη και την ελάττωση των μη ειδικών αλληλεπιδράσεων. 89

97 Οι μελέτες βελτιστοποίησης των συστατικών του διαλύματος ανάπτυξης περιελάμβαναν τη συγκέντρωση του SDS, του Tween-20 και του φορμαμιδίου. Οι συγκεντρώσεις του Tween-20 που μελετήθηκαν ήταν στην περιοχή 10 ml/l έως 15 ml/l, και του SDS στην περιοχή 5 g/l έως 15 g/l (Εικόνα 5.28). Το δείγμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν φυσιολογικό για όλα τα αλληλόμορφα. Εικόνα 5.28: Μελέτη της συγκέντρωσης του Tween-20 και του SDS στο διάλυμα ανάπτυξης. Τα γράμματα πάνω από κάθε μεμβράνη αντιστοιχούν στις διαφορετικές συγκεντρώσεις του κάθε παράγοντα.(a): 10 g/l SDS, 5 ml/l Tween-20, (b): 15 g/l SDS, 5 ml/l Tween-20, (c): 5 g/l SDS, 10 ml/l Tween-20, (d): 10 g/l SDS, 10 ml/l Tween-20, (e): 15 g/l SDS, 15 ml/l Tween-20. Η συγκέντρωση του SDS που χρησιμοποιούταν στις μέχρι τώρα μελέτες ήταν 5 g/l, ενώ του Tween-20, 5 ml/l και βασιζόταν σε προηγούμενες εργασίες [92-98]. Η προσθήκη επιπλέον SDS και Tween-20 δεν αλλάζει σημαντικά την εικόνα της μεμβράνης σε σχέση με τις προηγούμενες συγκεντρώσεις των δύο επιφανειοδραστικών παραγόντων. Στην τελευταία περίπτωση (Εικόνα 5.28, e), οι αυξημένες συγκεντρώσεις φαίνεται να αυξάνουν τα μη ειδικά προϊόντα. Οπότε, επιλέχθηκαν οι αρχικές συγκεντρώσεις και για τους δύο παράγοντες. Το φορμαμίδιο στο διάλυμα ανάπτυξης βοηθά στην αποσταθεροποίηση των δίκλωνων τμημάτων DNA και στην παρεμπόδιση σχηματισμού δευτεροταγών δομών του, αυξάνοντας τον αριθμό των διαθέσιμων προς υβριδοποίηση μορίων. Η συγκέντρωση του φορμαμιδίου σε όλες τις προηγούμενες μελέτες ήταν 200 ml/l. Στην παρούσα μελέτη η επίδραση της συγκέντρωσης φορμαμιδίου στο διάλυμα ανάπτυξης μελετήθηκε στην περιοχή συγκεντρώσεων 0 έως 300 ml/l (Εικόνα 5.29). Η μελέτη πραγματοποιήθηκε με δείγματα φυσιολογικά για όλα τα αλληλόμορφα. 90

98 Εικόνα 5.29: Μελέτη επίδρασης φορμαμιδίου στο διάλυμα ανάπτυξης σε τρία διαφορετικά δείγματα. Οι αριθμοί πάνω από κάθε μεμβράνη αντιστοιχούν στις συγκεντρώσεις φορμαμιδίου σε ml/l. Απουσία φορμαμιδίου στο διάλυμα ανάπτυξης εμφανίζονται έντονα μη ειδικά προϊόντα. Με την προσθήκη φορμαμιδίου παρατηρήθηκε ελάττωση μέχρι και εξαφάνιση των μη ειδικών προϊόντων. Σε συγκέντρωση 300 ml/l, τα μη ειδικά προϊόντα εξαφανίζονται, αλλά παράλληλα παρατηρείται (δείγμα 1 και 2) και ελάττωση της έντασης και των ειδικών σημάτων. Ως βέλτιστη συγκέντρωση φορμαμιδίου επιλέχθηκαν τα 250 ml/l. 5.5 Μελέτη ειδικότητας των εκκινητών της αντίδρασης ΡΕΧΤ Η μελέτη ειδικότητας των εκκινητών της αντίδρασης ΡΕΧΤ πραγματοποιήθηκε σε φυσιολογικό δείγμα, το οποίο υποβλήθηκε σε δύο αντιδράσεις ΡΕΧΤ. Στο μίγμα της πρώτης αντίδρασης, προστέθηκαν μόνο οι 5 αλληλοειδικοί εκκινητές για τα φυσιολογικά αλληλόμορφα, ενώ στο δεύτερο, μόνο οι 5 εκκινητές για τα μεταλλαγμένα αλληλόμορφα. Λόγω του ότι δεν υπήρχαν δείγματα ομόζυγα για τις εξεταζόμενες μεταλλάξεις, δεν μπορούσε να πραγματοποιηθεί η αντίστοιχη μελέτη σε δείγμα ομόζυγο για όλες τις μεταλλάξεις (συνθετικό). Εικόνα 5.30: Μελέτη ειδικότητας των εκκινητών της αντίδρασης ΡΕΧΤ. (1) Ανίχνευση προϊόντος αντίδρασης ΡΕΧΤ παρουσία αλληλοειδικών εκκινητών «Ν», (2) ανίχνευση προϊόντος αντίδρασης ΡΕΧΤ παρουσία αλληλοειδικών εκκινητών «Μ». 91

99 Όπως ήταν αναμενόμενο, κατά την αντίδραση ΡΕΧΤ σε φυσιολογικό δείγμα παρουσία φυσιολογικών εκκινητών επεκτείνονται μόνο τα φυσιολογικά αλληλόφορφα (κηλίδες στα αριστερά της μεμβράνης). Αντιθέτως, όταν το ίδιο δείγμα (φυσιολογικό) υποβάλλεται σε αντίδραση ΡΕΧΤ παρουσία μεταλλαγμένων εκκινητών δεν ανιχνεύονται προϊόντα επέκτασης (Εικόνα 5.30). Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής αποδεικνύουν την ειδικότητα επέκτασης και ανίχνευσης των φυσιολογικών αλληλοειδικών εκκινητών. 5.6 Επαναληψιμότητα της ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων Για την αξιολόγηση της μεθόδου πολλαπλής ανίχνευσης των 5 μεταλλάξεων του γονιδίου ΗΒΑ1 με την ταινία ξηρών αντιδραστηρίων, μελετήθηκε η επαναληψιμότητα εντός προσδιορισμού (Εικόνα 5.31) και μεταξύ προσδιορισμών (Εικόνες 5.32, 5.33). Για τις μελέτες χρησιμοποιήθηκε ένα δείγμα φυσιολογικό για όλα τα αλληλόμορφα, ένα ετερόζυγο δείγμα για την Hb Taybe και ένα δείγμα ομόζυγο για την Hb Questembert. Για τη μελέτη της επαναληψιμότητας εντός προσδιορισμού, τα δείγματα υποβλήθηκαν σε αντίδραση ΡΕΧΤ και τα προϊόντα της αντίδρασης ανιχνεύτηκαν τέσσερεις φορές σε ταινίες ξηρών αντιδραστηρίων. Για τη μελέτη της επαναληψιμότητας μεταξύ των προσδιορισμών, κάθε δείγμα υποβλήθηκε σε τρεις αντιδράσεις ΡΕΧΤ και το προϊόν της κάθε αντίδρασης ανιχνεύτηκε δύο φορές σε ταινίες πολλαπλής ανίχνευσης. Εικόνα 5.31: Μελέτη επαναληψιμότητας εντός προσδιορισμού της ΡΕΧΤ για τρία διαφορετικά δείγματα. Το καθένα μετρήθηκε 4 φορές. 92

100 Εικόνα 5.32: Μελέτη επαναληψιμότητας μεταξύ προσδιορισμών σε φυσιολογικό και ετερόζυγο δείγμα. Εικόνα 5.33: Μελέτη επαναληψιμότητας μεταξύ προσδιορισμών σε ομόζυγα μεταλλαγμένο δείγμα. 5.7 Αξιολόγηση της μεθόδου Για την αξιολόγηση της μεθόδου αναλύθηκαν συνολικά 30 χαρακτηρισμένα δείγματα DNA που λήφθηκαν από περιφερικό αίμα ασθενών με χαρακτηριστικά α- θαλασσαιμίας, αλλά και από φυσιολογικά άτομα. Τα δείγματα DNA (~100 ng) υποβλήθηκαν σε αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) για την ενίσχυση τμήματος 1087 bp του γονιδίου ΗΒΑ1. Τα προϊόντα των αντιδράσεων υποβλήθηκαν σε 10-πλή αντίδραση ΡΕΧΤ, παρουσία 5 ζευγών αλληλοειδικών εκκινητών και τα προϊόντα επέκτασης ανιχνεύτηκαν σε ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. Η ανίχνευση στην ταινία είναι οπτική (δια γυμνού οφθαλμού) και βασίζεται στην εμφάνιση ερυθρών κηλίδων που δημιουργούνται λόγω αλληλεπίδρασης και συσσώρευσης των νανοσφαιριδίων χρυσού, που φέρουν αντίσωμα έναντι βιοτίνης, με τα προϊόντα επέκτασης που ακινητοποιούνται σε συγκεκριμένες περιοχές της μεμβράνης μέσω υβριδισμού. 93

101 Τα αποτελέσματα γονοτυπικού προσδιορισμού των 30 χαρακτηρισμένων δειγμάτων βρέθηκαν σε πλήρη συμφωνία με τα αποτελέσματα που βρέθηκαν με μεθόδους αναφοράς (ARMS-PCR, Restriction Enzyme RE-PCR, Sequencing). Εικόνα 5.34: Αποτελέσματα γονοτυπικού προσδιορισμού της μεθόδου ΡΕΧΤ για τις 5 εξεταζόμενες μεταλλάξεις σε 30 κλινικά δείγματα. Πίνακας 5.1: Αποτελέσματα γονοτύπισης δειγμάτων σύμφωνα με την αναπτυχθείσα μέθοδο. Αριθμός Αριθμός Αριθμός Γονότυπος Γονότυπος δείγματος δείγματος δείγματος Γονότυπος 1 αα Taybe /αα 11 αα/αα 21 αα/αα 2 αα Taybe /αα 12 αα/αα 22 αα/αα 3 αα cd62 /αα 13 αα cd62 /αα 23 αα/αα 4 αα/αα 14 αα/αα 24 αα cd62 /αα 5 αα Taybe /αα 15 αα/αα 25 αα cd62 /αα 6 αα Taybe /αα 16 αα/αα 26 αα cd62 /αα 7 αα Taybe /αα 17 αα/αα 27 αα Taybe /αα 8 αα Taybe /αα 18 αα/αα 28 αα Taybe /αα 9 αα/αα 19 αα/αα 29 αα/αα 10 αα/αα 20 αα/αα 30 αα/αα 94

102 * Ο γονότυπος αα/αα δηλώνει ότι το δείγμα είναι φυσιολογικό για όλα τα αλληλόμορφα που εξετάστηκαν. Ο γονότυπος αα cd62 /αα αναφέρεται στη μετάλλαξη Hb Aghia Sophia. Όλα τα παθολογικά δείγματα που εξετάστηκαν ήταν ετερόζυγα ως προς μία μετάλλαξη. 5.8 Σύνθεση μεταλλαγμένων αλληλόμορφων μέσω κατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης (mutagenic PCR) Για τις ανάγκες της παρούσας μελέτης παρασκευάστηκαν τρία ομόζυγα μεταλλαγμένα τμήματα DNA του γονιδίου α1 για τις μεταλλάξεις Hb Heraklion, Hb Adana και Hb Questembert. Η εισαγωγή των μεταλλάξεων αυτών έγινε με τη βοήθεια της PCR ως συνθετικού εργαλείου με εκμαγείο γενωμικό DNA ομοζυγώτη φυσιολογικού για όλα τα αλληλόμορφα. Η πορεία εισαγωγής μίας μετάλλαξης παρουσιάζεται στην Εικόνα Στο πρώτο στάδιο παρασκευάζονται τα τμήματα Α και Β, τα οποία φέρουν στο ένα άκρο τους τη νέα αλληλουχία. Εικόνα 5.35: Αρχή της μεθόδου της κατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης μέσω PCR (mutagenic PCR) δύο σταδίων [99]. Λόγω της θέσης των πολυμορφικών τόπων Hb Heraklion, Hb Adana και Hb Questembert, υπήρχαν δυσκολίες στην κατασκευή ολόκληρου του τμήματος του γονιδίου HBA1 που θα εμπεριείχε και τις 5 εξεταζόμενες μεταλλάξεις 95

103 (ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Β), οπότε, σχεδιάστηκαν εκκινητές για τη σύνθεση μικρότερων τμημάτων DNA που θα περιείχαν τις παραπάνω τρεις μεταλλάξεις. Επίσης, στο ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Β αναφέρονται και οι βελτιστοποιήσεις που έγιναν στην αντίδραση PCR για την εισαγωγή κάθε μετάλλαξης. - Hb Heraklion: Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή του τμήματος Α (164 bp) ήταν οι HerAdFW και HER-R(M), ενώ για το τμήμα Β (201 bp) οι HER-F(M) και HerAdREV (Εικόνα 5.36). - Hb Adana: Οι εκκινητές για το προϊόν Α (236 bp) ήταν οι HerAdFW και ADANA-R(M), ενώ για το προϊόν Β (139 bp), οι ADANA-F(M) και HerAdREV (Εικόνα 5.36). - Hb Questembert: Οι εκκινητές για το προϊόν Α (462 bp) ήταν οι 5Ν και QUEST- R(M), ενώ για το προϊόν Β (200 bp), οι QUEST-F(M) και C2 (Εικόνα 5.37). Εικόνα 5.36: Ηλεκτροφόρημα των προϊόντων Α και Β για τις μεταλλάξεις Hb Heraklion και Hb Adana. Διάδρομος 1: PCR-A για Hb Heraklion, διάδρομος 2: PCR- Β για Hb Heraklion, διάδρομος 3: PCR-A για Hb Adana, διάδρομος 4: PCR-Β για Hb Adana. Εικόνα 5.37: Ηλεκτροφόρημα προϊόντων Α και Β για την Hb Questembert. 96

104 Τα προϊόντα Α και Β απομονώθηκαν από πηκτή αγαρόζης, καθαρίστηκαν (NucleoSpin Extract II, Macherey-Nagel) και ποσοτικοποιήθηκαν. Στη συνέχεια, τα δύο προϊόντα αναμείχθηκαν σε ισομοριακές ποσότητες (~200 fmol) και υποβλήθηκαν σε μία αντίδραση τύπου PCR (χωρίς εκκινητές), που περιλαμβάνει αποδιάταξη, υβριδοποίηση και επέκταση από την πολυμεράση DNA. Λόγω της συμπληρωματικότητας των νεοεισαχθεισών αλληλουχιών στα τμήματα Α και Β, δημιουργούνται δύο νέα υβριδικά τμήματα, από τα οποία μόνο το ένα επεκτείνεται και δίνει την ολοκληρωμένη αλληλουχία του προϊόντος με τη μετάλλαξη. Αυτό συμβαίνει λόγω της καθορισμένης διεύθυνσης που χαρακτηρίζει τον μηχανισμό επέκτασης της πολυμεράσης DNA. Η DNA πολυμεράση χρησιμοποιεί τον ένα κλώνο ως εκκινητή και τον άλλο ως εκμαγείο, επεκτείνοντας τον πρώτο με κατεύθυνση 5 3 (Εικόνα 5.35). Για να παραχθεί μεγαλύτερη ποσότητα του νέου προϊόντος που περιέχει πλέον τη μετάλλαξη, το προϊόν υποβάλλεται σε μία αντίδραση PCR με τους αρχικούς εκκινητές (HerAdFW και HerAdREV για Hb Heraklion και Hb Adana, 5Ν και C2 για Hb Questembert). Τα προϊόντα ηλεκτροφορούνται για την επιβεβαίωση του σωστού μεγέθους τους. Ο υπολογισμός του μεγέθους του τελικού προϊόντος γίνεται με την πρόσθεση των μεγεθών των τμημάτων Α και Β και την αφαίρεση της κοινής αλληλουχίας των εκκινητών. Έτσι, το τελικό προϊόν της Hb Heraklion είναι 350 bp ( ) (Εικόνα 5.38), της Hb Adana 353 bp ( ) (Εικόνα 5.38) και της Hb Questembert 640 bp ( ) (Εικόνα 5.39). Α) Β) Εικόνα 5.38: Ηλεκτροφορήματα των προϊόντων ενίσχυσης των συνθετικών μεταλλαγμένων προϊόντων με τους αρχικούς εκκινητές, Α) για την Hb Heraklion και Β) για την Hb Adana. 97

105 Εικόνα 5.39: Ηλεκτροφόρημα του προϊόντος ενίσχυσης που περιέχει τη μετάλλαξη Hb Questembert. Το τελικό προϊόν της Hb Questembert, επειδή είχε παραπροϊόντα, καθαρίστηκε με εκχύλιση από πηκτή αγαρόζης με το κατάλληλο kit (NucleoSpin Extract II, Macherey-Nagel). 5.9 Αξιολόγηση της μεθόδου Η αξιολόγηση της κατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης μέσω PCR, έγινε με αντίδραση επέκτασης εκκινητή στα προϊόντα PCR του κάθε συνθετικού μεταλλαγμένου DNA. Η ανίχνευση των προϊόντων επέκτασης τόσο του μεταλλαγμένου προϊόντος (Μ για τη μετάλλαξη δείγμα) όσο και μίγματος μεταλλαγμένου και φυσιολογικού δείγματος (Η για τη μετάλλαξη δείγμα) πραγματοποιήθηκε σε ταινία ξηρών αντιδραστηρίων. Στην περίπτωση των συνθετικών μεταλλαγμένων DNA για τις μεταλλάξεις Hb Heraklion και Hb Adana, λόγω σχεδιασμού μικρότερου προϊόντος, στα συνθετικά αυτά προϊόντα δεν περιλαμβάνεται η μετάλλαξη Hb Questembert. Οπότε, κατά την ανίχνευση με την ταινία αναμένεται η απουσία κηλίδων για τα αλληλόμορφα της μετάλλαξης Hb Questembert (Εικόνα 5.40). Τα αποτελέσματα της γονοτύπισης των συνθετικών προϊόντων βρέθηκαν σύμφωνα με τα αναμενόμενα. 98

106 Εικόνα 5.40: Αποτελέσματα ανίχνευσης των προϊόντων επέκτασης των συνθετικών μεταλλαγμένων προϊόντων PCR. Μ: μεταλλαγμένο (mutant), Η: ετερόζυγο (heterozygous) Κλωνοποίηση των συνθετικών μεταλλαγμένων προϊόντων σε πλασμίδια Πραγματοποιήθηκε κλωνοποίηση των τριών μεταλλαγμένων προϊόντων σε πλασμίδια (PCR cloning kit, Qiagen), ούτως ώστε να μπορούν να ληφθούν οποιαδήποτε στιγμή για έλεγχο της σωστής λειτουργίας της ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων. Στη συνέχεια, έγινε μετασχηματισμός επιδεκτικών βακτηριακών κυττάρων E.coli (JM109) με τους κλωνοποιημένους φορείς και η καλλιέργειά τους σε τριβλία υπό ειδικές συνθήκες για την επιλογή των βακτηριακών αποικιών που εμπεριείχαν το PCR προϊόν με τη μετάλλαξη. Η επιλογή έγινε βάσει των μπλε/λευκών αποικιών, όπου οι λευκές ήταν οι επιθυμητές αποικίες. Ακολούθησε καλλιέργεια των λευκών αποικιών, φύλαξη μίας μικρής ποσότητας και απομόνωση πλασμιδιακού DNA από την υπόλοιπη ποσότητα. Το DNA που απομονώθηκε υποβλήθηκε σε PCR με τους κατάλληλους για κάθε μετάλλαξη εκκινητές. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την κλωνοποίηση των προϊόντων που περιείχαν τις μεταλλάξεις Hb Heraklion και Hb Adana, ήταν ο HRM-F2 και ο C2 και το μέγεθος του προϊόντος ήταν 700 bp για την πρώτη μετάλλαξη και 703 bp για τη δεύτερη (Εικόνα 5.41). Το προϊόν που χρησιμοποιήθηκε ως εκμαγείο για την κάθε μετάλλαξη, ήταν το προϊόν σύνδεσης των τμημάτων Α και Β που λήφθηκε με τους παρακάτω εκκινητές: α) C1 και HER-R(M) για το προϊόν Α και HER-F(M) και C2 για το προϊόν Β για τη μετάλλαξη Hb Heraklion και β) C1 και ADANA-R(M) για το προϊόν Α και ADANA-F(M) και C2 για το προϊόν Β για τη μετάλλαξη Hb Adana. Τα προϊόντα αυτά είχαν υποβληθεί σε αντίδραση τύπου PCR χωρίς εκκινητές (βλ. παρ και 5.8) και τα προϊόντα σύνδεσής τους σε ενίσχυση με τους εκκινητές C1 και C2. Επειδή, κατά την ενίσχυση του προϊόντος Α-Β με τους εκκινητές C1 και C2 δε 99

107 σχηματίσθηκαν προϊόντα ή σχηματίσθηκαν προϊόντα χαμηλής απόδοσης, χρησιμοποιήθηκαν οι εκκινητές HRM-F2 και C2 με τους οποίους συντέθηκαν μικρότερα προϊόντα 703 bp και 700 bp για τα προϊόντα που φέρουν τη μετάλλαξη Hb Adana και Hb Heraklion, αντίστοιχα. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση τμήματος DNA (640 bp) που φέρει τη μετάλλαξη Hb Questembert ήταν, όπως και στη μεταλλαξιγόνο PCR, οι 5Ν και C2. Εικόνα 5.41: Ηλεκτροφορήματα προϊόντων PCR που περιέχουν τις μεταλλάξεις. Διάδρομος 1, 2: προϊόν που περιέχει τη μετάλλαξη Hb Adana, διάδρομος 3: την Hb Heraklion και διάδρομος 4: την Hb Questembert. Στην PCR αυτή, το στάδιο της τελικής επέκτασης ήταν 15 min αντί για 2 min, έτσι ώστε η πολυμεράση να προσθέσει αδενίνη (A) στα 3 άκρα του προϊόντος και το προϊόν να εισαχθεί στο φορέα που έχει στα άκρα του ελεύθερες ουρακίλες (U) μέσω αντίδρασης λιγάσης (PCR cloning kit, Qiagen). Τα προϊόντα αυτά καθαρίστηκαν με εκχύλιση από πηκτή αγαρόζης (NucleoSpin Extract II, Macherey-Nagel), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ακολούθησε η ποσοτικοποίηση των προϊόντων για τον υπολογισμό της κατάλληλης ποσότητας για την εισαγωγή στην αντίδραση κλωνοποίησης. Μετά την κλωνοποίηση ακολούθησε ο μετασχηματισμός βακτηρίων και η καλλιέργειά τους (Εικόνα 5.42). 100

108 Α) Β) Εικόνα 5.42: Α) Απεικόνιση του φορέα που χρησιμοποιήθηκε για την κλωνοποίηση των συνθετικών μεταλλαγμένων προϊόντων και Β) της διαδικασίας της κλωνοποίησης και του μετασχηματισμού βακτηριακών κυττάρων [100] Αξιολόγηση της μεθόδου Έλεγχος του πλασμιδιακού DNA Η αξιολόγηση της διαδικασίας της κλωνοποίησης των συνθετικών DNA που φέρουν τη μετάλλαξη έγινε με αντίδραση PCR στο πλασμιδιακό DNA μετά την απομόνωσή τους από βακτηριακές καλλιέργειες. Για την αντίδραση PCR χρησιμοποιήθηκαν οι εκκινητές HRM-F2 και C2 για την Hb Heraklion και την Hb Adana και οι εκκινητές 5Ν και C2 για την Hb Questembert. Τα προϊόντα PCR ηλεκτροφορήθηκαν, τα μεγέθη τους συγκρίθηκαν με τα αναμενόμενα και διαπιστώθηκε απόλυτη συμφωνία (Εικόνα 5.43). 101

109 Εικόνα 5.43: Ηλεκτροφορήματα PCR προϊόντων μετά από mini-preps. Διάδρομοι 1-4: προϊόν που περιλαμβάνει τη μετάλλαξη Hb Heraklion, διάδρομος 5: προϊόν που περιλαμβάνει τη μετάλλαξη Hb Adana και διάδρομοι 6-9: προϊόν που περιλαμβάνει τη μετάλλαξη Hb Questembert. Ο αριθμός των προϊόντων για κάθε μετάλλαξη αντιστοιχεί σε πλασμιδιακό DNA που προερχόταν από διάφορες λευκές αποικίες που αναπτύχθηκαν στα τριβλία. Στο ηλεκτροφόρημα των προϊόντων της Hb Heraklion και της Hb Adana παρατηρούνται κάποια παραπροϊόντα που οφείλονται πιθανώς στη θερμοκρασία υβριδοποίησης των εκκινητών, η οποία ήταν οι 55 o C. Στους 60 ο C τα παραπροϊόντα αυτά εξαφανίζονται Έλεγχος εισαγωγής των μεταλλάξεων στα συνθετικά προϊόντα DNA Για τον έλεγχο εισαγωγής των μεταλλάξεων στα συνθετικά DNA, πραγματοποιήθηκε 10-πλή αντίδραση ΡΕΧΤ στα PCR προϊόντα (Εικόνα 5.44). Τα συνθετικά προϊόντα για τις μεταλλάξεις Hb Heraklion και Hb Adana (700 bp και 703 bp, αντίστοιχα) περιλαμβάνουν και τις 5 υπό μελέτη μεταλλάξεις. Τα αποτελέσματα της γονοτύπισης στην ταινία ξηρών αντιδραστηρίων ήταν τα αναμενόμενα, οπότε συμπεραίνεται ότι η διαδικασία μεταλλαξιγένεσης ήταν επιτυχής. Επίσης, πραγματοποιήθηκε αντίδραση ΡΕΧΤ με ανάμιξη των προϊόντων που περιείχαν τις μεταλλάξεις με φυσιολογικό δείγμα, για να ληφθεί η εικόνα της ετεροζυγωτίας για την εκάστοτε μετάλλαξη στη μεμβράνη. 102

110 Εικόνα 5.44: Αποτελέσματα γονοτυπικής αντίδρασης ΡΕΧΤ στα προϊόντα που περιέχουν τις επιθυμητές μεταλλάξεις, μετά από κλωνοποίησή τους σε πλασμίδια. Μ: μεταλλαγμένο (mutant), H: ετερόζυγο (heterozygous) Συζήτηση Στην παρούσα εργασία περιγράφεται η ανάπτυξη μεθόδου ανίχνευσης των πιο γνωστών σημειακών μεταλλάξεων στο γονίδιο της α1 σφαιρίνης, όσον αφορά τον ελληνικό πληθυσμό. Η μέθοδος περιλαμβάνει μία αντίδραση PCR για την ενίσχυση τμήματος του γονιδίου ΗΒΑ1 (1087 bp), 10-πλή αντίδραση επέκτασης εκκινητή και ανίχνευση των προϊόντων σε ταινία ξηρών αντιδραστηρίων, για τον καθορισμό της γονοτύπισης των δειγμάτων. Για την οπτική ανίχνευση χρησιμοποιήθηκαν νανοσφαιρίδια χρυσού συζευγμένα με αντίσωμα έναντι βιοτίνης. Πραγματοποιήθηκαν βελτιστοποιήσεις για την καλύτερη απόδοση της αντίδρασης PCR, αλλά και της ΡΕΧΤ. Όσον αφορά την αντίδραση PCR, παρατηρήθηκε ότι, λόγω του υψηλού ποσοστού του γονιδίου σε GC (~70%), είναι απαραίτητη η προσθήκη DMSO στο μίγμα της αντίδρασης,. Το DMSO είναι ένας παράγοντας που βοηθάει στην αποδιάταξη του DNA, παρεμποδίζοντας το ζευγάρωμα των συμπληρωματικών βάσεων και αναστέλλοντας τις δευτεροταγείς δομές του DNA και των εκκινητών. Στην αντίδραση ΡΕΧΤ παρατηρήθηκε η χαμηλή απόδοση επέκτασης του εκκινητή 9Ν, που αντιστοιχεί στο φυσιολογικό αλληλόμορφο για τη μετάλλαξη Hb Questembert, σε συγκέντρωση εκκινητών >1 pmol, με αποτέλεσμα όταν αυξάνει η συγκέντρωση του εκκινητή, το προϊόν επέκτασης να συναγωνίζεται για την ίδια θέση δέσμευσης στη μεμβράνη με μεγαλύτερη ποσότητα ελεύθερου (μη επεκταμένου) εκκινητή. Για το λόγο αυτό, επιλέχθηκε το 1 pmol ως συγκέντρωση των εκκινητών στην αντίδραση ΡΕΧΤ. 103

111 Σε συγκεντρώσεις εκκινητών >>1 pmol παρατηρήθηκε εξαφάνιση των μη ειδικών κηλίδων στη διαγνωστική μεμβράνη. Το γεγονός αυτό οφείλεται κυρίως στην εκτόπιση των μη ειδικά ακινητοποιημένων προϊόντων από την περίσσεια των μη επεκταμένων εκκινητών. Το πρόβλημα της εμφάνισης των μη ειδικών κηλίδων σε συγκέντρωση εκκινητών 1 pmol, επιλύθηκε με την αύξηση της συγκέντρωσης του φορμαμιδίου (250 ml/l) στο διάλυμα ανάπτυξης. Για τρεις από τις μεταλλάξεις (Hb Heraklion, Hb Adana και Hb Questembert) δεν υπήρχαν δείγματα, οπότε συντέθηκαν με κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση μέσω PCR. Επειδή το τμήμα ενίσχυσης του γονιδίου είναι μεγάλο, υπήρχαν δυσκολίες στη σύνθεση προϊόντων DNA που φέρουν αυτές τις μεταλλάξεις αυτού του μεγέθους. Το πρόβλημα επιλύθηκε με τη σύνθεση μικρότερου τμήματος που περιείχε την εκάστοτε μετάλλαξη (350 bp για την Hb Heraklion, 353 bp για την Hb Adana και 640 bp για την Hb Questembert). Τέλος, τα συντιθέμενα προϊόντα, στα οποία είχε εισαχθεί η μετάλλαξη, κλωνοποιήθηκαν σε πλασμίδιο και ακολούθησε ο μετασχηματισμός βακτηρίων και η καλλιέργειά τους. Τα μεγέθη των προϊόντων που κλωνοποιήθηκαν ήταν 700 bp για την Hb Heraklion, 703 bp για την Hb Adana και 640 bp για την Hb Questembert. 104

112 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 1. (τελευταία επίσκεψη Ιανουάριος 2012). 2. Καναβάκης, E., Κίτσιου-Τζέλη, Σ., Καλπίνη-Μαύρου, Α. και Στυλιανοπούλου, Φ., Αρχές Ιατρικής Γενετικής. 2 η Ελληνική Έκδοση, Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης, Αθήνα, (τελευταία επίσκεψη Ιανουάριος 2012). 4. Kanavakis, E. and Traeger-Synodinos, J., (2005), Molecular basis of thalassaemia syndromes, Chapter Goh, S.H., Lee, Y.T., Bhanu, N.V., Cam, M.C., Desper, R., Martin B.M., Moharram, R., Gherman, R.B. and Miller, J.L., (2005), A newly discovered human α-globin gene. Blood, 106: Voon, H.P.J. and Vadolas, J., (2008), Controlling α-globin: a review of α-globin expression and its impact on β-thalassemia. Haematologica, 93: Ψιούρη Λ. (2005), Μελέτη του ρόλου της 3 μη μεταφράσιμης περιοχής του γονιδίου της β-σφαιρίνης κατά την επεξεργασία του μηνύματος (διδακτορική διατριβή), Πανεπιστήμιο Πατρών. 8. Wilber, A., Nienhuis, A.W. and Persons, D.A., (2011), Transcriptional regulation of fetal to adult hemoglobin switching: new therapeutic opportunities. Blood, 117: (τελευταία επίσκεψη Ιανουάριος 2012). 10. Liebhaber, S.A. and Russell, J.E., Expression and Developmental Control of the Human α-globin Gene Cluster. Annals New York Academy of Sciences. 11. Lewin, B., GENES VIII, Πρώτος Τόμος, Ακαδημαϊκές Εκδόσεις Ι. Μπάσδρα και ΣΙΑ Ο.Ε., Αλεξανδρούπολη, Goren, Α., Simchen, G., Fibach, E., Szabo, P.E., Tanimoto, K., Chakalova, L., Pfeifer, G.P., Fraser, P.J., Engel, J.D. and Cedar, H., (2006), Fine Tuning of Globin Gene Expression by DNA Methylation. Plos One, Issue 1, e Mabaera, R., Richardson, C.A., Johnson, K., Hsu, M., Fiering, S. and Lowrey, C.H., (2007), Developmental- and differentiation-specific patterns of human γ- and β-globin promoter DNA methylation. Blood, 110:

113 14. Kiefera, C.M., Houa, C., Little, J.A. and Dean, A., (2008), Epigenetics of β-globin gene regulation. Mutation Research, 647: de Laat, W., Klous, P., Kooren J., Noordermeer D., Palstra, R.J., Simonis, M., Splinter, E. and Grosveld, F., (2008), Three-dimensional organization of gene expression in erythroid cells. Current Topics in Developmental Biology, Volume 82: Higgs, D.R., Engel, J.D., Stamatoyannopoulos, G., (2011), Thalassaemia. Seminar, Doi: /S (11) Ribeiro, D.M. and Sonati, M.F., (2008), Regulation of human alpha-globin gene expression and alpha-thalassemia. Genet. Mol. Res. 7(4): Vernimmen, D., Marques-Kranc, F., Sharpe, J.A., Sloane-Stanley, J.A., Wood, W.G., Wallace, H. A.C., Smith, A. J.H. and Higgs, D.R., (2009), Chromosome looping at the human a-globin locus is mediated via the major upstream regulatory element (HS -40). Blood, 114: De Gobbi, M., Anguita, E., Hughes, J., Sloane-Stanley, J.A., Sharpe, J.A., Koch, C.M., Dunham, I., Gibbons, R.J., Wood, W.G. and Higgs, D.R., (2007), Tissuespecific histone modification and transcription factor binding in alpha globin gene expression. Blood, 110(13): Higgs, D.R. and Wood, W.J., (2008), Long-range regulation of α globin gene expression during erythropoiesis. Curr Opin Hematol, 15: Hatzis, P. and Talianidis, I., (2002), Dynamics of Enhancer-Promoter Communication during Differentiation-Induced Gene Activation. Molecular Cell, 10: Tolhuis, B., Palstra, R.J., Splinter, E., Grosveld, F. and de Laat, W., (2002), Looping and Interaction between Hypersensitive Sites in the Active β-globin Locus. Molecular Cell, 10: Vernimmen, D., De Gobbi, M., Sloane-Stanley, J.A., Wood, W.G. and Higgs, D.R., (2007), Long-range chromosomal interactions regulate the timing of the transition between poised and active gene expression. Embo J, 26: Yu, X., Kong, Y., Dore, L.C., Abdulmalik, O., Katein, A.M., Zhou, S., Choi, J.K., Gell, D., Mackay, J.P., Gow, A.J. and Weiss, M.J., (2007), An erythroid chaperone that facilitates folding of α-globin subunits for hemoglobin synthesis. J. Clin. Invest., 117:

114 25. Bain, B.J., Haemoglobinopathy Diagnosis. Second Edition, Blackwell Publishing, Ανάγνου, Ν.Π. και Καναβάκης, Ε., Θαλασσαιμία: Νεώτερα μοριακά, κλινικά και θεραπευτικά δεδομένα. Αίμα, Περιοδική Έκδοση της Ελληνικής Αιματολογικής Εταιρείας, Vita Congress, Barbour, V.M., Tufarelli, C., Sharpe, J.A., Smith, Z.E., Ayyub, H., Heinlein, C.A., Sloane-Stanley, J., Indrak, K., Wood, W.J. and Higgs, D.R., (2000), α- Thalassemia resulting from a negative chromosomal position effect. Blood, 96: Viprakasit, V., Kidd, A.M.J., Ayyub, H., Horsley, S., Hughes, J. and Higgs, D.R., (2003), De novo deletion within the telomeric region flanking the human α globin locus as a cause of α thalassaemia. Br. J. Haematol., 120: Coelho, A., Picanço, I., Seuanes, F., Seixas, M.T. and Faustino, P., (2010), Novel large deletions in the human α-globin gene cluster: Clarifying the HS-40 longrange regulatory role in the native chromosome environment. Blood Cells, Molecules, and Diseases, 45: Harteveld, C.L. and Higgs, D.R., (2010), α-thalassaemia. Orphanet Journal of Rare Diseases, 5: Higgs, D.R., Hill, A.V., Bowden, D.K., Weatherall, D.J. and Clegg, J.B., (1984), Independent recombination events between the duplicated human alpha globin genes; implications for their concerted evolution. Nucleic Acids Res., 12(18): Whitelaw, E. and Proudfoot, N., (1986), α-thalassaemia caused by a poly(a) site mutation reveals that transcriptional termination is linked to 3' end processing in the human α2 globin gene. EMBO J., 5: Chui, D.H.K., Fucharoen, S. and Chan, V., (2003), Hemoglobin H disease: not necessarily a benign disorder. Blood, 101: Kanavakis, E., Papassotiriou, I., Karagiorga, M., Vrettou, C., Metaxotou- Mavrommati, A., Stamoulakatou, A., Kattamis, C. and Traeger-Synodinos, J., (2000), Phenotypic and molecular diversity of haemoglobin H disease: a Greek experience. British Journal of Haematology, 111: Arnon, S., Tamary, H., Dgany, O., Litmanovitz, I., Regev, R., Bauer, S., Dolfin, T., Yacobovich, J., Wolach, B. and Jaber, L., (2004), Hydrops Fetalis Associated 107

115 With Homozygosity for Hemoglobin Taybe (α 38/39 THR deletion) in Newborn Triplets. American Journal of Hematology, 76: Lorey, F., Charoenkwan, P., Witkowska, H.E., Lafferty, J., Patterson, M., Eng, B., Waye, J.S., Finklestein, J.Z. and Chui, D.H.K., (2001), Hb H hydrops foetalis syndrome: a case report and review of literature. British Journal of Haematology, 115: Wajcman, H., Traeger-Synodinos, J., Papassotiriou, I., Giordano, P.C., Harteveld, C.L., Baudin-Creuza, V. and Old, J., (2008), Unstable and thalassemic α chain hemoglobin variants: a cause of Hb H disease and thalassemia intermedia. Hemoglobin, 32(4): Douna, V., Liapi, D., Kampourakis, D., Repapinou, Z., Papassotiriou, I., Stamoulakatou, A., Poziopoulos, C., Kanavakis, E. and Traeger-Synodinos, J., (2008), First observation of Hb Taybe [codons 38/39 (-ACC) Thr 0 (α1)] in Greece: clinical and hematological findings in patients with co-inherited α + - thalassemia mutations. Hemoglobin, 32(4): Douna, V., Papassotiriou, I., Garoufi, A., Georgouli, E., Ladis, V., Stamoulakatou, A., Metaxotou-Mavrommati, A., Kanavakis, E. and Traeger-Synodinos, J., (2008), A rare thalassemic syndrome caused by interaction of Hb Adana [α59(e8)gly Asp] with an α + -thalassemia deletion: clinical aspects in two cases. Hemoglobin, 32(4): Higgs, D.R., (2004), Gene Regulation in Hematopoiesis: New Lessons from Thalassemia. Hematology, Gibbons, R., (2006), Alpha thalassaemia-mental retardation, X linked. Orphanet Journal of Rare Diseases, 1: Steensma, D.P., Higgs, D.R., Fisher, C.A. and Gibbons, R.J., (2004), Acquired somatic ATRX mutations in myelodysplastic syndrome associated with α thalassemia (ATMDS) convey a more severe hematologic phenotype than germline ATRX mutations. Blood, 103: Rigas, D.A., Koler, R.D. and Osgood, E.E., (1955), New hemoglobin possessing a higher electrophoretic mobility than normal adult hemoglobin. Science, 121: Fessas, P. and Papaspyrou, A., (1957), New fast hemoglobin associated with thalassemia. Science, 126: Edington, G.M. and Lehman, H., (1954), A new haemoglobin found in a West African. Lancet, 267:

116 46. (τελευταία επίσκεψη Ιανουάριος 2012). 47. Bridges, K.R. and Pearson, H.A., Anemias and other red cell disorders. The McGraw-Hill Companies, Inc, Weatherall, D.J. and Clegg, J.B., (2001), Inherited haemoglobin disorders: an increasing global health problem. Bulletin of the World Health Organization, 79: Laosombat, V.,Viprakasit, V., Chotsampancharoen, T., Wongchanchailert, M., Khodchawan, S., Chinchang, W. and Sattayasevana, B., (2009), Clinical features and molecular analysis in Thai patients with HbH disease. Ann Hematol, 88: Kohne, E., (2011), Hemoglobinopathies-Clinical Manifestations, Diagnosis, and Treatment. Dtsch Arztebl Int, 108(31 32): Lee, S.Y.R., Chow, C.B., Li C.K. and Chiu, M.C., (2007), Outcome of intensive care of homozygous alpha-thalassaemia without prior intra-uterine therapy. Journal of Paediatrics and Child Health, 43: Yi, J.S., Moertel, C.L. and Baker, K.S., (2009), Homozygous α-thalassemia Treated with Intrauterine Transfusions and Unrelated Donor Hematopoietic Cell Transplantation. The Journal of Pediatrics. 53. Traeger-Synodinos, J., Papassotiriou, I., Metaxotou-Mavrommati, A., Vrettou, C., Stamoulakatou, A. and Kanavakis, E., (2000), Distinct Phenotypic Expression Associated with a New Hyperunstable Alpha Globin Variant (Hb Heraklion, α1cd37(c2)pro>0): Comparison to Other α-thalassemic Hemoglobinopathies. Blood Cells, Molecules, and Diseases, 26(4): Douna, V. Papassotiriou, I., Metaxotou-Mavrommati, A., Stamoulakatou, A., Liapi, D., Kampourakis, D., Tsilimigaki, A., Kanavakis, E. and Traeger- Synodinos, J., (2008), Further identification of the hyperunstable α-globin chain variant Hb Heraklion [codons 36/37 ( CCC); Pro 0 (α1)] in Greek cases with co-inherited α + -thalassemia mutations. Hemoglobin, 32(4): Douna, V., Papassotiriou, I., Garoufi, A., Georgouli, E., Ladis, V., Stamoulakatou, A., Metaxotou-Mavrommati, A., Kanavakis, E. and Traeger-Synodinos, J., (2008), A rare thalassemic syndrome caused by interaction of Hb Adana [α59(e8)gly Asp] with an α + -thalassemia deletion: clinical aspects in two cases. Hemoglobin, 32(4):

117 56. Traeger-Synodinos, J., Harteveld, C.L., Kanavakis, E., Giordano, P.C., Kattamis, C. and Bernini, L.F., (1999), Hb Aghia Sophia [α62(ell)val 0 (αl)], an "In- Frame" Deletion Causing α-thalassemia. Hemoglobin, 23(4): Stamoulakatou, Α., Athanasiou-Metaxa, M., Traeger-Synodinos, J., Lazaropoulou, C., Harteveld, K., Premetis, E., Tsantali, H., Zorai, A., Giordano, P., Papassotiriou, I. and Kanavakis, E., (2004), Rare thalassemic syndrome caused by interaction of Hb Questembert (α1 codon 131, TCT>CCT, Ser>Pro) with an α-thalassemia-2 deletion: implications for diagnosis and management. Blood Cells, Molecules, and Diseases, 32: Clark, B.E. and Thein, S.L., (2004), Molecular diagnosis of haemoglobin disorders. Clin. Lab. Haem., 26: Trent, R.J.A., (2006), Diagnosis of the Haemoglobinopathies. Clin Biochem Rev, 27: Clarke, G.M. and Higgins, T.N., (2000), Laboratory Investigation of Hemoglobinopathies and Thalassemias: Review and Update. Clinical Chemistry, 46: 8(B) (τελευταία επίσκεψη Ιανουάριος 2012). 62. Chong, S.S., Boehm, C.D., Higgs, D.R. and Cutting, G.R., (2000), Single-tube multiplex-pcr screen for common deletional determinants of α-thalassemia. Blood, 95: Liu, Y.T., Old, J.M., Miles, K., Fisher, C.A., Weatherall, D.J. and Clegg, J.B., (2000), Rapid detection of α-thalassaemia deletions and α-globin gene triplication by multiplex polymerase chain reactions. British Journal of Haematology, 108: Tan, A.S.C., Quah, T.C., Low, P.S. and Chong, S.S., (2001), A rapid and reliable 7-deletion multiplex polymerase chain reaction assay for α-thalassemia. Blood, 98: (τελευταία επίσκεψη Ιανουάριος 2012) (τελευταία επίσκεψη Ιανουάριος 2012). 67. Cheng, P.J., Chu, D.C., Lee, C.H., Chiueh, H.Y., Lin, Y.T. and Soong, Y.K., (2003), Prenatal Diagnosis of Alpha-Thalassemia of Southeast Asian Deletion with Non-Radioactive Southern Hybridization. Chang Gung Med J, Vol 26 No

118 68. Jassim, N., Al-Arrayed, S., Gerard, N., Al-Mukharraq, H., Al-Ajami, A., Ramasawmy, R. and Krishnamoorthy, R., (1999), A mismatched-primer polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism strategy for rapid screening of the polyadenylation signal mutation alpha (T-Saudi) (AATAAA AATAAG) in the alpha2-globin gene. Hemoglobin, 23: Patrinos, G.P. and Ansorge, W., Molecular Diagnostics, Elsevier Academic Press, Burlington, Foglietta, E., Bianco, I., Maggio, A. and Giambona, A., (2003), Rapid Detection of Six Common Mediterranean and Three Non-Mediterranean α-thalassemia Point Mutations by Reverse Dot Blot Analysis. American Journal of Hematology, 74: Bhat, V.S., Dewan, K.K., Krishnaswamy, P.R., (2010), The Diagnosis of α- Thalassaemia: A Case of Hemoglobin H α 3.7 Deletion. Ind J Clin Biochem, 25(4): (τελευταία επίσκεψη Ιανουάριος 2012). 73. Newton, C.R., Graham, A., Heptinstall, L.E., Powell, S.J., Summers, C., Kalshekerl, N., Smith, J.C. and Markham, A.F., (1989), Analysis of any point mutation in DNA. The ampliflcation refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Research, 17(7). 74. Eng, B., Patterson, M., Walker, L., Chui, D.H. and Waye, J.S., (2001), Detection of severe nondeletional alpha-thalassemia mutations using a single-tube multiplex ARMS assay. Genetic Testing, 5(4): (τελευταία επίσκεψη Ιανουάριος 2012). 76. Harteveld, K.L., Heister, A.J.G.A.M., Giordano, P.C., Losekoot, M. and Bernini, L.F., (1996), Rapid Detection of Point Mutations and Polymorphisms of the α- Globin Genes by DGGE and SSCA. HUMAN MUTATION, 7: Jorge, S.B., Melo, M.B., Costa, F.F. and Sonati, M.F., (2003), Screening for mutations in human alpha-globin genes by nonradioactive single-strand conformation polymorphism. Braz J Med Biol Res, 36: Shih, H.C., Er, T.K., Chang, T.J., Chang, Y.S., Liu, T.C. and Chang, J.G., (2010), Development of a high-resolution melting method for the detection of haemoglobin alpha variants. Clinical Biochemistry, 43:

119 79. Sirichotiyakul, S., Wanapirak, C., Saetung, R. and Sanguansermsri, T., (2010), High resolution DNA melting analysis: an application for prenatal control of α- thalassemia. Prenat Diagn, 30: Liu, Y.N., Li, R., Zhou, J.Y., Xie, X.M., Li, J., Liao, C. and Li, D.Z., (2011), Screening for mutations in the α-globin genes leading to abnormal hemoglobin variants with high resolution melting analysis. Clin Chem Lab Med Studies (τελευταία επίσκεψη Ιανουάριος 2012) (τελευταία επίσκεψη Ιανουάριος 2012). 83. Hung, C.C., Lee, C.N., Chen, C.P., Jong, Y.J., Hsieh, W.S., Lin, W.L., Su, Y.N. and Hsu, S.M., (2007), Molecular assay of α 3.7 and α 4.2 deletions causing α- thalassemia by denaturing high-performance liquid chromatography. Clinical Biochemistry, 40: Liu, J., Jia, X., Tang, N., Zhang, X., Wu, X., Cai, R., Wang, L., Liu, Q., Xiao, B., Zhu, J. and Wang, Q., (2010), Novel technique for rapid detection of α-globin gene mutations and deletions. Translational Research, Vol. 155, No Cao, M., Liu, Z., Jia, X., Tang, N., Cai, R., Wang, L., Chen, C., Xiao, B., Wang, J. and Liu, J., (2011), Detection of α-globin Gene Deletions Using Denaturing High-Performance Liquid Chromatography and Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification. J. Clin. Lab. Anal., 25: Schouten, J.P., McElgunn, C.J., Waaijer, R., Zwijnenburg, D., Diepvens, F. and Pals, G., (2002), Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Research, Vol. 30, No. 12, e (τελευταία επίσκεψη Ιανουάριος 2012). 88. Rugless, M.J., Fisher, C.A., Old, J.M., Sloane-Stanley, J., Ayyub, H., Higgs, D.R. and Garrick, D., (2008), A large deletion in the human α-globin cluster caused by a replication error is associated with an unexpectedly mild phenotype. Human Molecular Genetics, 17(19): Suemasu, C.N., Kimura, E.M., Oliveira, D.M., Bezerra, M.A.C., Araújo A.S., Costa, F.F. and Sonati, M.F., (2011), Characterization of alpha thalassemic genotypes by multiplex ligation-dependent probe amplification in the Brazilian population. Braz J Med Biol Res, 44(1):

120 90. Syvänen, A.C., (1999), From Gels to Chips: Minisequencing Primer Extension for Analysis of Point Mutations and Single Nucleotide Polymorphisms. HUMAN MUTATION, 13: Wang, W., Ma, E.S.K., Chan, A.Y.Y., Chui, D.H.K. and Chong, S.S., (2003), Multiple Minisequencing Screen for Seven Southeast Asian Nondeletional α- Thalassemia Mutations. Clinical Chemistry, 49(5): Glynou, K., Ioannou, P.C., Christopoulos, T.K., Syriopoulou, V., (2003), Oligonucleotide-functionalized gold nanoparticles as probes in a dry-reagent strip biosensor for DNA analysis by hybridization. Anal Chem, 75(16): Konstantou, J.K., Ioannou, P.C., Christopoulos, T.K., (2009), Dual-allele dipstick assay for genotyping single nucleotide polymorphisms by primer extension reaction. Eur J Hum Genet, Jan, 17(1): Litos, I.K., Ioannou, P.C., Christopoulos, T.K., Traeger-Synodinos, J., Kanavakis, E., (2009), Multianalyte, dipstick-type, nanoparticle-based DNA biosensor for visual genotyping of single-nucleotide polymorphisms. Biosens Bioelectron, Jun, 24(10): Kalogianni, D.P., Litos, I.K., Christopoulos, T.K. and Ioannou, P.C., (2009), Dipstick-type biosensor for visual detection of DNA with oligonucleotidedecorated colored polystyrene microspheres as reporters. Biosensors and Bioelectronics, 24: Vlachou, M.A., Glynou, K.M., Ioannou, P.C., Christopoulos, T.K. and Vartholomatos, G., (2010), Development of a three-biosensor panel for the visual detection of thrombophilia-associated mutations. Biosensors and Bioelectronics 26: Elenis, D.S., Ioannou, P.C. and Christopoulos, T.K., (2011), A nanoparticle-based sensor for visual detection of multiple mutations. Nanotechnology, Kalogianni, D.P., Boutsika, L.M., Kouremenou, P.G., Christopoulos, T.K. and Ioannou, P.C., (2011), Carbon nano-strings as reporters in lateral flow devices for DNA sensing by hybridization. Anal Bioanal Chem, 400: (τελευταία επίσκεψη Ιανουάριος 2012) QIAGEN PCR Cloning Handbook. 113

121 ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΓΝΩΣΤΩΝ ΣΗΜΕΙΑΚΩΝ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΩΝ ΣΤΟ ΓΟΝΙΔΙΟ ΤΗΣ α-σφαιρινησ ΜΕ ΤΗΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΕΠΕΚΤΑΣΗΣ ΕΚΚΙΝΗΤΗ ΠΟΥΛΑ ΑΜΑΛΙΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η σύνθεση των α-αιμοσφαιρινικών αλυσίδων βρίσκεται υπό τον έλεγχο ενός διπλασιασμένου α-γονιδίου (HBA1 και ΗΒΑ2) που βρίσκεται στο άκρο του βραχέος σκέλους του χρωμοσώματος 16. Οι μεταλλάξεις που ελαττώνουν τη σύνθεση των α- αλυσίδων προκαλούν α-θαλασσαιμία και μέχρι τώρα έχουν περιγραφεί περισσότερες από 120. Στην πλειοψηφία τους είναι ελλείμματα που αφαιρούν μέρος ή και ολόκληρο το γενετικό υλικό των γονιδίων. Σπανιότερα πρόκειται για αντικαταστάσεις ενός νουκλεοτιδίου ή για μικροελλείμματα εντός των α1, α2 γονιδίων και ονομάζονται μη ελλειμματικές μεταλλάξεις. Μείωση της παραγωγής των α-αλυσίδων μπορεί να προκληθεί και από μεταλλάξεις που δίνουν γένεση σε υπερασταθείς α- αλυσίδες. Στην Ελλάδα, η συχνότητα των φορέων α-θαλασσαιμίας υπολογίζεται στο 8% και μέχρι σήμερα έχουν ταυτοποιηθεί περίπου 20 μεταλλάξεις υπεύθυνες για τη νόσο. Οι διάφορες κλινικές μορφές της α-θαλασσαιμίας προέρχονται από τον συνδυασμό των διαφόρων γονοτύπων της νόσου. Στην παρούσα διπλωματική εργασία αναπτύχθηκε μέθοδος ταυτόχρονης ανίχνευσης 5 γνωστών σημειακών μεταλλάξεων (3 μικροελλείμματα και 2 αντικαταστάσεις βάσεων) στο γονίδιο της α1 σφαιρίνης με αντίδραση επέκτασης εκκινητή. Οι μεταλλάξεις που εξετάστηκαν ήταν οι: Hb Heraklion, Hb Taybe, Hb Adana, Hb Aghia Sophia και Hb Questembert. Η διαδικασία περιλαμβάνει αρχικά την ενίσχυση τμήματος του ΗΒΑ1 (1087 bp). Στη συνέχεια, το προϊόν της PCR υποβάλλεται σε αντίδραση επέκτασης εκκινητή με 5 ζεύγη αλληλοειδικών εκκινητών (ένα για κάθε μετάλλαξη), biotin-dutps και DNA πολυμεράση με υπολειπόμενη 3 5 εξωνουκλεοτιδική δράση. Η ανίχνευση των προϊόντων πραγματοποιείται σε ταινία ξηρών αντιδραστηρίων με τη χρήση νανοσφαιριδίων χρυσού συζευγμένων με αντίσωμα έναντι βιοτίνης. 114

122 Πραγματοποιήθηκαν βελτιστοποιήσεις για την καλύτερη απόδοση των προϊόντων της PCR και της αντίδρασης ΡΕΧΤ, αλλά και για την καλύτερη οπτική ανίχνευση των προϊόντων της ΡΕΧΤ. Για την αξιολόγηση της μεθόδου πολλαπλής ανίχνευσης σε βιοαισθητήρα τύπου ταινίας ξηρών αντιδραστηρίων, αναλύθηκαν 30 χαρακτηρισμένα κλινικά δείγματα και τα αποτελέσματα βρέθηκαν σε πλήρη συμφωνία. Για τρεις από τις εξεταζόμενες μεταλλάξεις (Hb Heraklion, Hb Adana και Hb Questembert) δεν υπήρχαν διαθέσιμα δείγματα, οπότε έγινε η σύνθεσή τους με τη μέθοδο της κατευθυνόμενης μεταλλαξιγένεσης μέσω PCR και, στη συνέχεια, η κλωνοποίησή τους σε πλασμίδια. Και στις δύο περιπτώσεις η αξιολόγηση των μεθόδων έγινε με αντίδραση PCR, ακολουθούμενη από αντίδραση επέκτασης εκκινητή και τα αποτελέσματα βρέθηκαν σε πλήρη συμφωνία με τα αναμενόμενα. 115

123 DEVELOPMENT OF DETECTION METHODS FOR KNOWN POINT MUTATIONS IN THE α-globin GENE WITH PRIMER EXTENSION REACTION POULA AMALIA ABSTRACT The synthesis of α-globin chains is directed by the duplicated α-globin genes (HBA1 and ΗΒΑ2) located at the tip of the short arm of chromosome 16 (16p13.3). Mutations that reduce the synthesis of α-globin chains cause α-thalassemia and over 120 mutations have been described worldwide. The majority of the most common α- thalassemia determinants are deletions that remove some, or all, of the α-globin gene cluster. Less common are single nucleotide substitutions or microdeletions within either the α1- or α2-globin genes, also known as nondeletional mutations. An apparent reduction in α-globin chain synthesis can also be caused by substitutions that give rise to hyperunstable α-globin chains. In Greece, α-thalassemia has an estimated carrier frequency of 8%, with over 20 different mutations observed to date. The different clinical forms of α-thalassemia come from the combination of different genotypes of the disease. In this diploma thesis a method for simultaneous detection of 5 known point mutations (3 microdeletions and 2 base substitutions) was developed in the α1-globin gene by means of primer extension reaction. The investigated mutations are: Hb Heraklion, Hb Taybe, Hb Adana, Hb Aghia Sophia and Hb Questembert. Initially, the procedure involves the amplification of a fragment of the HBA1 gene (1087 bp). After that, the PCR product is subjected to a primer extension reaction in the presence of 5 pairs of allele-specific primers (one pair per mutation), biotindutps and a DNA polymerase that lacks 3 5 exonuclease activity. The detection of the products is achieved by naked eye using anti-biotin conjugated gold nanoparticles. 116

124 Optimization studies on the yield and specificity of PCR and PEXT reactions as well as optimization of the visual detection of PEXT products by means of dryreagent dipstick type biosensor were performed. For the evaluation of the multiplex detection method using primer extension reaction and dry-reagent multi-allele biosensor, 30 clinical samples of known genotype were analysed and the results were found to be fully concordant. Due to the lack of samples homozygous mutant for three of the investigated mutations (Hb Heraklion, Hb Adana and Hb Questembert), we prepared synthetic mutant fragments using PCR as a tool for site mutagenesis and the products were cloned into plasmids. The insertion of the mutations was confirmed by PCR of the newly synthesided products followed by primer extension reaction and visual detection of the products. 117

125 ΣΥΝΤΟΜΟΓΡΑΦΙΕΣ α-mre ACRS AHSP ΑΤΡ APEX ARMS-PCR ASO bp BSA CGE DGGE DHPLC DMSO DNA dntps Hb HRMA IEF IVS LCR MCH MCV MLPA PEXT RDB RE-PCR RFLP RNA SNP SSCP UTR α-major Regulatory Element Amplification-Created Restriction Site α-hemoglobin Stabilizing Protein Adenosine Triphosphate Arrayed Primer Extension Amplification Refractory Mutation System Allele-Specific Oligonucleotide base pairs Bovine Serum Albumin Capillary Gel Electrophoresis Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Denaturing High Performance Liquid Chromatography Dimethyl Sulfoxide DeoxyriboNucleic Acid deoxyribonucleotide TriPhosphates Haemoglobin High Resolution Melt Analysis Isoelectric Focusing Intervening Sequence Locus Control Region Mean Corpuscular Haemoglobin Mean Corpuscular Volume Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification Primer Extension Reaction Reverse Dot Plot Analysis Restriction Enzyme Polymerase Chain Reaction Restriction Fragment Length Polymorphism RiboNucleic Acid Single Nucleotide Polymorphism Single Strand Conformation Polymorphism Untranslated Region 118

126 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Α Αλληλουχία του γονιδίου ΗΒΑ1 (NG_ ) HbA1 GGGTGCGCGCATTCCTCTCCGCCCCAGGATTGGGCGAAGCCTCCCGGCTCGCACTCGCTC 60 HbA2 GGGTGCGCGCATTCCTCTCCGCCCCAGGATTGGGCGAAGCCCTCCGGCTCGCACTCGCTC 60 ***************************************** ***************** HbA1 GCCCGTGTGTTCCCCGATCCCGCTGGAGTCGATGCGCGTCCAGCGCGTGCCAGGCCGGGG 120 HbA2 GCCCGTGTGTTCCCCGATCCCGCTGGAGTCGATGCGCGTCCAGCGCGTGCCAGGCCGGGG 120 ************************************************************ HbA1 CGGGGGTGCGGGCTGACTTTCTCCCTCGCTAGGGACGCTCCGGCGCCCGAAAGGAAAGGG 180 HbA2 CGGGGGTGCGGGCTGACTTTCTCCCTCGCTAGGGACGCTCCGGCGCCCGAAAGGAAAGGG 180 ************************************************************ HbA1 TGGCGCTGCGCTCCGGGGTGCACGAGCCGACAGCGCCCGACCCCAACGGGCCGGCCCCGC 240 HbA2 TGGCGCTGCGCTCCGGGGTGCACGAGCCGACAGCGCCCGACCCCAACGGGCCGGCCCCGC 240 ************************************************************ HbA1 CAGCGCCGCTACCGCCCTGCCCCCGGGCGAGCGGGATGGGCGGGAGTGGAGTGGCGGGTG 300 HbA2 CAGCGCCGCTACCGCCCTGCCCCCGGGCGAGCGGGATGGGCGGGAGTGGAGTGGCGGGTG 300 ************************************************************ C1 HbA1 GAGGGTGGAGACGTCCTGGCCCCCGCCCCGCGTGCACCCCCAGGGGAGGCCGAGCCCGCC 360 HbA2 GAGGGTGGAGACGTCCTGGCCCCCGCCCCGCGTGCACCCCCAGGGGAGGCCGAGCCCGCC 360 ************************************************************ HbA1 GCCCGGCCCCGCGCAGGCCCCGCCCGGGACTCCCCTGCGGTCCAGGCCGCGCCCCGGGCT 420 HbA2 GCCCGGCCCCGCGCAGGCCCCGCCCGGGACTCCCCTGCGGTCCAGGCCGCGCCCCGGGCT 420 ************************************************************ HbA1 CCGCGCCAGCCAATGAGCGCCGCCCGGCCGGGCGTGCCCCCGCGCCCCAAGCATAAACCC 480 HbA2 CCGCGCCAGCCAATGAGCGCCGCCCGGCCGGGCGTGCCCCCGCGCCCCAAGCATAAACCC 480 ************************************************************ HbA1 TGGCGCGCTCGCGGCCCGGCACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCACCATG 540 HbA2 TGGCGCGCTCGCGGGCCGGCACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCACCATG 540 ************** ********************************************* HbA1 GTGCTGTCTCCTGCCGACAAGACCAACGTCAAGGCCGCCTGGGGTAAGGTCGGCGCGCAC 600 HbA2 GTGCTGTCTCCTGCCGACAAGACCAACGTCAAGGCCGCCTGGGGTAAGGTCGGCGCGCAC 600 ************************************************************ HerAdFW HbA1 GCTGGCGAGTATGGTGCGGAGGCCCTGGAGAGGTGAGGCTCCCTCCCCTGCTCCGACCCG 660 HbA2 GCTGGCGAGTATGGTGCGGAGGCCCTGGAGAGGTGAGGCTCCCTCCCCTGCTCCGACCCG 660 ************************************************************ HbA1 GGCTCCTCGCCCGCCCGGACCCACAGGCCACCCTCAACCGTCCTGGCCCCGGACCCAAAC 720 HbA2 GGCTCCTCGCCCGCCCGGACCCACAGGCCACCCTCAACCGTCCTGGCCCCGGACCCAAAC 720 ************************************************************ a1 Hb Heraklion (5) a1 Hb Taybe (6) HbA1 CCCACCCCTCACTCTGCTTCTCCCCGCAGGATGTTCCTGTCCTTCCCCACCACCAAGACC 780 HbA2 CCCACCCCTCACTCTGCTTCTCCCCGCAGGATGTTCCTGTCCTTCCCCACCACCAAGACC 780 ************************************************************ HER-F(M) 119

127 a1 Hb Adana (7) HbA1 TACTTCCCGCACTTCGACCTGAGCCACGGCTCTGCCCAGGTTAAGGGCCACGGCAAGAAG 840 HbA2 TACTTCCCGCACTTCGACCTGAGCCACGGCTCTGCCCAGGTTAAGGGCCACGGCAAGAAG 840 ************************************************************ a1 Hb Aghia Sophia (8) ADANA-F(M) HbA1 GTGGCCGACGCGCTGACCAACGCCGTGGCGCACGTGGACGACATGCCCAACGCGCTGTCC 900 HbA2 GTGGCCGACGCGCTGACCAACGCCGTGGCGCACGTGGACGACATGCCCAACGCGCTGTCC 900 ************************************************************ HerAdREV HbA1 GCCCTGAGCGACCTGCACGCGCACAAGCTTCGGGTGGACCCGGTCAACTTCAAGGTGAGC 960 HbA2 GCCCTGAGCGACCTGCACGCGCACAAGCTTCGGGTGGACCCGGTCAACTTCAAGGTGAGC 960 *********************************************************** HbA1 GGCGGGCCGGGAGCGATCTGGGTCGAGGGGCGAGATGGCGCCTTCCTCGCAGGGCAGAGG 1020 HbA2 GGCGGGCCGGGAGCGATCTGGGTCGAGGGGCGAGATGGCGCCTTCCTCTCAGGGCAGAGG 1020 ************************************************ *********** HbA1 ATCACGCGGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGCCCTCGGCCC 1080 HbA2 ATCACGCGGGTTGCGGGAGGTGTAGCGCAGGCGGCGGCTGCGGGCCTGGGC CG 1073 *************************************************** * HbA1 CACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGCTGGTGACCCTGGCCGCCC 1140 HbA2 CACTGACCCTCTTCTCTGCACAGCTCCTAAGCCACTGCCTGCTGGTGACCCTGGCCGCCC 1133 ************************************************************ a1 Hb Questembert (9) HbA1 ACCTCCCCGCCGAGTTCACCCCTGCGGTGCACGCCTCCCTGGACAAGTTCCTGGCTTCTG 1200 HbA2 ACCTCCCCGCCGAGTTCACCCCTGCGGTGCACGCCTCCCTGGACAAGTTCCTGGCTTCTG 1193 ************************************************************ QUEST-F(M) HbA1 TGAGCACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTTAAGCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTG 1260 HbA2 TGAGCACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTTAAGCTGGAGCCTCGGTAGCCGTTCCTCCTG 1253 ********************************************** *** * * ** ** HbA1 CCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTT 1320 HbA2 CCCGCTGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTGCACCGGC-CCTTCCTGGTCTTT 1312 *** ********** * * ************ * ****** * ** * ******** C2 HbA1 GAATAAAGTCTGAGTGGGCGGCAGCCTGTGTGTGCCTGAGTTTTTTCCCTCAGCAAACGT 1380 HbA2 GAATAAAGTCTGAGTGGGCAGCAGCCTGTGTGTGCCTGGGTTCTCTCTATCCCGGAATGT 1372 ******************* ****************** *** * ** * ** ** HbA1 GCCAGGCATGGGCGTGGACAGCAGCTGGGACACACATGGCTAGAACCTCTCTGCAGCTGG 1440 HbA2 GCCAACAATGGAGGTGTTTACCTGT CTCAGACCAAGGACCTCTCTGCAGCTGC 1425 **** **** *** * * * * ** * ** *************** HbA1 ATAGGG-TAGGAAAAGGCAGGGGCGGGAGGAGGGGATGGAGGAGGGAAAGTGGAGCCAC HbA2 ATGGGGCTGGGGAGGGAGAACTGCAGGGAGTATGGGAGGGGAAGCTGAGGTGGGCCTGCT 1485 ** *** * ** * * * ** ** * ** ** * ** * **** * * HbA1 CGCGAAGTCCAGCTGGAAAAACGCTGGACCCTAGAGTGCTTTGAGGATGCATTTGCTCTT 1558 HbA2 CAAGAGAAGGTGCTGAACCATCCCCTGTCCTGAGAG-GTGCCAGGCCTGCAGGCAGTGGC 1544 * ** **** * * * * * ** **** * * **** * HbA1 TCCCGAGTTTTATTCCC---AGACTTTTCAGATTCAATGCAGGTTTGCTGAAATAATGAA 1615 HbA2 TCAGAAGCTGGGGAGGAGAGAGGCATCCAGGGTTCTACTCAGGGA-GTCCCAGCATCGCC 1603 ** ** * ** * * * *** * **** * * * * HbA1 TTTATCCATCTTTACGTTTCTGG--GCACTCTTGTGCCAAGAACTGGCTGGCTTT-CTGC 1672 HbA2 ACCCTCCTTTGAAATCTCCCTGGTTGAACCCAGTTAACATACGCTCTCCATCAAAACAAA 1663 *** * * * **** * ** * * ** ** * * * 120

128 HbA1 CTGGGACGTCACTGGTTTCCCAGA--GGTCCTCCCACATATGGGTGGTGGGTAGGTCAGA 1730 HbA2 ACGAAACAAAACAAACTAGCAAAATAGGCTGTCCCCAGTGCAAGTG-CAGGT--GCCAGA 1720 * ** ** * * * * ** **** * *** *** * **** HbA1 GAAGTCCCACTCCAGCATGGCTGCATTGATCCCCCATCGTTCCCACTAGTCTCCGTAAAA 1790 HbA2 ACATTTCTCTCATTCCCACCCCTTCCTGCCAGAGGGTAGGTGGCTGGAGTGAGGGTGCTG 1780 * * * * * ** * * * * *** ** HbA1 CCTCCCAGATACAGGCACAGTCTAGATGAAATCAGGGGTGCGGGGTGCAACTG 1843 HbA2 GC-CCTACTCACACTTCCTGTGTCACGGTGACCCTCTGAGAGCAGCCCAGTC * ** * *** * ** * * * * * * * * ** Υπογραμμίζονται οι εκκινητές για την PCR, για την αντίδραση ΡΕΧΤ και για την μεταλλαξιγόνο PCR (μόνο οι πρόσθιοι). Τα βέλη υποδεικνύουν τη φορά των εκκινητών, ενώ οι υπογραμμισμένες με κόκκινο βάσεις, τις βάσεις που αντικαθίστανται ή που στη μετάλλαξη δεν υπάρχουν (έλλειμμα). Για ευκολία στην υπογράμμιση, οι εκκινητές για τη μεταλλαξιγόνο PCR έχουν υπογραμμιστεί στη σειρά του HBA2, επειδή σε αυτές τις αλληλουχίες υπάρχει ομολογία μεταξύ των δύο γονιδίων. Επίσης, στους εκκινητές αυτούς, δεν αναφέρονται οι βάσεις από τις οποίες αντικαθίστανται οι φυσιολογικές (κενό υπογράμμισης) για την Hb Adana και την Hb Questembert. 121

129 ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Β Βελτιστοποιήσεις στη μεταλλαξιγόνο PCR για τη σύνθεση τμημάτων DNA που φέρουν τις μεταλλάξεις Hb Heraklion, Hb Adana και Hb Questembert Μελέτη συγκέντρωσης DMSO Ο αρχικός σχεδιασμός της παρασκευής μεταλλαγμένου προϊόντος για την Hb Heraklion βασίστηκε στην παρασκευή του μεγάλου τμήματος ΗΒΑ1 (1087 bp). Έτσι, για τη σύνθεση του προϊόντος Α (473 bp) χρησιμοποιήθηκαν οι εκκινητές C1 και HER-R(M), ενώ για τη σύνθεση του προϊόντος Β (626 bp), οι εκκινητές HER-F(M) και C2. Πραγματοποιήθηκαν μελέτες συγκέντρωσης DMSO στην αντίδραση PCR για κάθε προϊόν, διότι η απόδοση της αντίδρασης PCR δεν ήταν ικανοποιητική. Στην περίπτωση του προϊόντος Α, μελετήθηκαν συγκεντρώσεις DMSO στην περιοχή 0 έως 125 ml/l και επιλέχθηκε η συγκέντρωση 125 ml/l (Εικόνα 1). Στην περίπτωση του προϊόντος Β, μελετήθηκαν συγκεντρώσεις DMSO στην περιοχή 0 έως 50 ml/l και επιλέχθηκε η συγκέντρωση 50 ml/l αν και δεν επιτεύχθηκε ικανοποιητική απόδοση της αντίδρασης. Εικόνα 1: Μελέτη επίδρασης συγκέντρωσης DMSO στην αντίδραση PCR για το προϊόν Β (626 bp) και Α (473 bp). Μελέτη θερμοκρασίας υβριδοποίησης της PCR για την παρασκευή του προϊόντος Β (Hb Heraklion) Οι αντιδράσεις PCR στην προηγούμενη μελέτη πραγματοποιήθηκαν σε θερμοκρασία υβριδοποίησης εκκινητών τους 60 ο C. Πραγματοποιήθηκε μελέτη θερμοκρασίας για το προϊόν Β στους 55 ο C και τους 65 o C (Εικόνα 2). Παρατηρήθηκε, ότι η απόδοση της αντίδρασης βελτιώθηκε στους 55 o C, ενώ στους 65 ο C δεν σχηματίζεται προϊόν, οπότε, ως θερμοκρασία υβριδοποίησης επιλέχθηκαν οι 55 ο C. 122

130 Εικόνα 2: Μελέτη θερμοκρασίας υβριδοποίησης εκκινητών στην PCR για την παρασκευή του προϊόντος Β Μετά την ενίσχυση των προϊόντων υπό τις βέλτιστες συνθήκες, ακολούθησε ο καθαρισμός τους με εκχύλιση από πηκτή αγαρόζης (NucleoSpin Extract II, Macherey Nagel) και η αντίδραση τύπου PCR σε μίγμα ισομοριακών ποσοτήτων των δύο προϊόντων χωρίς εκκινητές. Στη συνέχεια, ακολούθησε ενίσχυση του προϊόντος Α-Β με τους αρχικούς εκκινητές C1 και C2. Το αναμενόμενο μέγεθος του προϊόντος ήταν 1084 bp (έλλειμμα CCC). Με τις αντιδράσεις PCR δεν επιτεύχθηκε η ενίσχυση επαρκούς ποσότητας του αναμενόμενου προϊόντος. Αντιθέτως, παρατηρήθηκε η ενίσχυση του προϊόντος Α, είτε του προϊόντος Α και πολύ αχνής ζώνης του αναμενόμενου προϊόντος (Εικόνα 3). Εικόνα 3: Ηλεκτροφόρηση προϊόντων PCR κατά την ενίσχυση του προϊόντος 1084 bp. Διάδρομος 1, 2 (αριστερά): Φαίνεται η ενίσχυση του προϊόντος Α. Διάδρομοι Β, Α: Τα προϊόντα Β και Α μετά από τον καθαρισμό τους με εκχύλιση από πηκτή. Διάδρομοι 1, 2, 3 (δεξιά): ενίσχυση πάλι του προϊόντος Α. Διάδρομος 4: ενίσχυση του προϊόντος Α και του προϊόντος 1084 bp 123

131 Η μη επιτυχής ενίσχυση του προϊόντος 1084 bp οδήγησε στη χρήση των εσωτερικών εκκινητών HerAdFW και HerAdREV για την ενίσχυση μικρότερου προϊόντος 350 bp. Παρασκευή τμήματος DNA (1087 bp) που φέρει τη μετάλλαξη Hb Questembert Ο αρχικός σχεδιασμός της παρασκευής προϊόντος που φέρει τη μετάλλαξη Hb Questembert έγινε με τους εκκινητές C1 και QUEST-R(M) για την ενίσχυση του προϊόντος Α (909 bp ) και τους εκκινητές QUEST-F(M) και C2 για την ενίσχυση του προϊόντος Β (200 bp) (Εικόνα 4). Μετά από σειρά μελετών, η ενίσχυση του κάθε προϊόντος πραγματοποιήθηκε παρουσία DMSO 100 ml/l και θερμοκρασία υβριδοποίησης 55 ο C. Εικόνα 4: Ενίσχυση των προϊόντων Α και Β για την παρασκευή προϊόντος που φέρει τη μετάλλαξη Hb Questembert Μετά τον καθαρισμό τον προϊόντων και την αντίδραση τύπου PCR χωρίς εκκινητές, ακολούθησε η ενίσχυση του προϊόντος Α-Β με τους εκκινητές C1 και C2. Τελικά, η ενίσχυση του προϊόντος 1087 bp δεν επιτεύχθηκε σε οποιεσδήποτε συνθήκες πραγματοποιήθηκε (μεγαλύτερη συγκέντρωση εκκινητών, διαφορετικό ένζυμο, διαφορετική θερμοκρασία υβριδοποίησης) (Εικόνα 5). Το πρόβλημα επιλύθηκε με αντικατάσταση του πρόσθιου εκκινητή C1 με τον εκκινητή 5Ν και τη σύνθεση προϊόντος Α μικρότερου μεγέθους 462 bp. Η τελική ενίσχυση επιτεύχθηκε με μέγεθος τελικού προϊόντος 640 bp (βλ. παρ. 5.8). Η μη δυνατότητα παρασκευής του αρχικού προϊόντος οφειλόταν πιθανότατα στη μεγάλη διαφορά μεγεθών των δύο τμημάτων Α και Β (909 bp και 200 bp) με αποτέλεσμα τη μη αποτελεσματική σύνδεση των Α και Β στην αντίδραση τύπου PCR χωρίς εκκινητές. 124

132 Εικόνα 5: Ηλεκτροφόρημα προϊόντος ενίσχυσης του προϊόντος Α-Β 1087 bp με τους εκκινητές C1, C2. Mutagenic PCR για την Hb Adana σε τμήμα 1087 bp Για την ενίσχυση του προϊόντος Α (545 bp) χρησιμοποιήθηκαν οι εκκινητές C1 και ADANA-R(M), ενώ του προϊόντος Β (564 bp) οι εκκινητές ADANA-F(M) και C2. Όπως προηγουμένως, ακολούθησε ο καθαρισμός των προϊόντων (Εικόνα 6) και η αντίδραση τύπου PCR χωρίς εκκινητές. Στην τελική ενίσχυση με τους εκκινητές C1 και C2 προέκυψε το τμήμα των 1087 bp, αλλά υπήρχαν και δύο παραπροϊόντα (Εικόνα 7). Για το λόγο αυτό, πραγματοποιήθηκε εκ νέου καθαρισμός του τελικού προϊόντος, το οποίο ποσοτικοποιήθηκε, υποβλήθηκε σε 10-πλή αντίδραση ΡΕΧΤ και το προϊόν αναλύθηκε σε ταινία ξηρών αντιδραστηρίων (Εικόνα 8). Όπως φαίνεται από την εικόνα, η κηλίδα που αντιστοιχεί στη μετάλλαξη Hb Adana εμφανίζεται μεν αλλά είναι πολύ αχνή και ταυτόχρονα χάνεται τελείως η κηλίδα που αντιστοιχεί στο φυσιολογικό αλληλόμορφο της μετάλλαξης Hb Questembert. Αντιθέτως, το προϊόν επέκτασης εκκινητή απευθείας στο μη καθαρισμένο προϊόν PCR εμφάνισε την αναμενόμενη εικόνα, δηλαδή ομόζυγα μεταλλαγμένο για την Hb Adana. Αυτό σημαίνει ότι η εισαγωγή της μετάλλαξης στο μεγάλο τμήμα είχε επιτευχθεί, και ότι η παρουσία των παραπροϊόντων δεν επηρέασε το αποτέλεσμα του γονοτυπικού προσδιορισμού. Όσον αφορά το αποτέλεσμα γονοτύπισης στο προϊόν μετά τον καθαρισμό του, μετά την ποσοτικοποίησή του διαπιστώθηκε στη συνέχεια ότι η συγκέντρωση του DNA ήταν πολύ χαμηλή, οπότε εξηγείται η χαμηλή απόδοση των προϊόντων επέκτασης. 125

133 Εικόνα 6: Ηλεκτροφόρημα των προϊόντων Α και Β για την παρασκευή DNA που φέρει τη μετάλλαξη Hb Adana μετά από καθαρισμό με εκχύλιση από πηκτή αγαρόζης. Εικόνα 7: Ηλεκτροφόρημα του προϊόντος ενίσχυσης Α-Β για τη μετάλλαξη Hb Adana.. Εικόνα 8: Αποτελέσματα γονοτύπισης του προϊόντος ΡΕΧΤ σε προϊόντα PCR από mutagenic Hb Adana. (1) PCR προϊόν καθαρισμένο με εκχύλιση από πηκτή. (2,3) προϊόν PCR χωρίς καθαρισμό Για την αύξηση της απόδοσης του προϊόντος Α-Β της Hb Adana χρησιμοποιήθηκε επίσης και το ζεύγος εκκινητών HerAdFW, HerAdREV. 126